Medizinische Mikrobiologie

Köhler Eggers Fleischer Marre Pfister Pulverer (Hrsg.)

Medizinische Mikrobiologie 8., völlig neu bearbeitete Auflage Mit 369 Abbildungen und 197 Tabellen

Mit Beiträgen von Rainer Ansorg, Peter Bartmann, Adolf Bauernfeind, josef Beuth, Renate Blaschke-Hellmessen, Erik C. Böttger, Wolfgang Bredt, Barbara Broker, Joachim Denner, Edeltrud Dietlein, Hans J. Eggers, Volker Erfle, Martin Exner, Bernhard Fleischer, Matthias Frosch, Barbara C. Gärtner, Hans R. Gelderblom, Alexander von Graevenitz, Jörg Hacker, Walter Hampl, Jürgen Heesemann, Franz X. Heinz, Heidi Holzmann, Wolfgang Jilg, Manfred Kist, Hans-Dieter Klenk, Werner Köhler, Dietmar Pierre König, Hans A. Kretzschmar, Joachim Kühn, Reinhard Kurth, Rudolf Lütticken, Walter A. Maier, Reinhard Marre, Gottfried Mauff, Thomas Mertens, Volker ter Meulen, Detlef Michel, Helmut Mittermayer, Lutz von Müller, Nikolaus Müller-Lantzsch, Georg Peters, Herbert Pfister, Georg Plum, Andreas Podbielski, Gerhard Pulverer, Reinhard Rüchel, Hans-Georg Sahl, Klaus Peter Schaal, Jörg Michael Schierholz, Herbert Schmitz, Karl-Eduard Schneweis, Gabriele Schönian, Heidi Schütt-Gerowitt, Hanns Martin Seitz, Günter Siegl, Hans-Jürgen Streckert, Heinz-Jürgen Thiel

URBAN& FISCHER München • Jena

Zuschriften und Kritik an: Urban & Fischer Verlag, Lektorat Medizin. Karlstraße 45, 80333 München Herausgeber: Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. Dr. h.c. Werner Köhler, vorm. Direktor des Instituts für Experimentelle Mikrobiologie, Adolf-Reichwein-Str. 26. 07745 Jena Prof. Dr. med. Hans J. Eggers, vorm. Direktor des Instituts für Virologie der Universität zu Köln, Fürst-Pückler-Slr. 56. 50935 Köln Prof. Dr. med. Bernhard Fleischer, Direktor des Bernhard-Nocht-Instituts für Tropenmedizin, Bernhard-Nocht-Str. 74, 20359 Hamburg Prof. Dr. med. Reinhard Marre, Direktor des Instituts für Mikrobiologie und Immunologie, Universität Ulm, Robcrt-Koch-Straße 8, 89081 Ulm Prof. Dr. rer. nat. Herbert Pfister, Direktor des Instituts für Virologie der Universität zu Köln, Fürst-Pückler-Straßc 56, 50935 Köln Prof. Dr. med. Dr. h. c. Gerhard Pulverer, vorm. Direktor des Instituts für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Universität zu Köln, Goldenfelsstraße 19-21, 50935 Köln Wichtiger Hinweis für den Benutzer Die Erkenntnisse in der Medizin unterliegen laufendem Wandel durch Forschung und klinische Erfahrungen. Herausgeber und Autoren dieses Werkes haben große Sorgfalt darauf verwendet, daß die in diesem Werk gemachten therapeutischen Angaben (insbesondere hinsichtlich Indikation. Dosierung und unerwünschter Wirkungen) dem derzeitigen Wissensstand entsprechen. Das entbindet den Nutzer dieses Werkes aber nicht von der Verpflichtung, anhand der Beipackzettel zu verschreibender Präparate zu überprüfen, ob die dort gemachten Angaben von denen in diesem Buch abweichen und seine Verordnung in eigener Verantwortung zu treffen. Geschützte Warennamen (Warenzeichen) werden besonders kenntlich gemacht. Aus dem Fehlen eines solchen Hinweises kann jedoch nicht geschlossen werden, daß es sich um einen freien Warennamen handelt. Die Deutsche Bibliothek - CIP-Einheitsaufnahme Ein Titeldatensatz für diese Publikation ist bei der Deutschen Bibliothek erhältlich. Alle Rechte vorbehalten 8. Auflage © 2001 Urban & Fischer Verlag Ŷ München • Jena ISBN 3-437-41640-5 Das Werk einschließlich aller seiner Teile ist urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung außerhalb der engen Grenzen des Urheberrechtsgesetzes ist ohne Zustimmung des Verlages unzulässig und strafbar. Das gilt insbesondere für Vervielfältigungen, Übersetzungen. Mikroverfilmungen und die Einspeicherung und Verarbeitung in elektronischen Systemen. Projektmanagement: Elke Klein, München Redaktion: Dr. med. Bettina Haake, München; Sabine Stauber, Erlangen; Susanne Szczepanek. Dachau Zeichnungen: Henriette Rintelen, Velbert Herstellung: Petra Laurer, München Umschlaggestaltung: prepress ulm GmbH, Ulm Satz: Typodata GmbH, München Druck und Verarbeitung: Wilhelm Rock Graphische Betriebe, Weinsberg Printed in Gcrmany Aktuelle Informationen finden Sie im Internet unter der Adresse: http://www.urbanfischer.de

Vorwort zur 8. Auflage Der seit der letzten Auflage des Lehrbuches der Medizinischen Mikrobiologie eingetretene Wissenszuwachs machte eine gründliche Neubearbeitung erforderlich, die vertiefte Einblicke in die Pathogenese und eine verbesserte Diagnostik von Infektionskrankheiten ermöglicht. Bei einigen Erkrankungen gelingt erst jetzt durch molekulargenetische Verfahren ein zuverlässiger Nachweis. Mehr als 50 Autoren haben sich bemüht, diese Sachverhalte für Studierende der Medizin und der Biologie ebenso darzustellen wie für den angehenden Facharzt. Der begrenzte Umfang des Gesamtwerkes machte eine beschränkende Auswahl in den einzelnen Kapiteln erforderlich. Als neuer Teil wurde das Kapitel „Klinische Infektiologie (organorientiert)" aufgenommen. In diesem Teil sind, nach Organsystemen geordnet, die wesentlichen Erreger, die von ihnen hervorgerufenen Infektionskrankheiten und deren Therapie zusammengefaßt, um auch aus klinischer Sicht einen Zugang zur Diagnose, Behandlung und Bekämpfung zu schaffen. Damit ergibt sich zwangsläufig eine gewisse Redundanz, die aber von den Herausgebern gewollt ist. Wir haben den etablierten Begriff „Infektiologie" übernommen, wohl wissend, daß er sprachlich korrekt „Infektologie" lauten muß. Der Glaube, durch Antibiotika und Chemothcrapeutika die Infektionskrankheiten besiegen zu können, hat sich als falsch erwiesen: in den industrialisierten Ländern durch Resistenzentwicklungen, in den Ländern der Dritten Welt durch den Mangel an diesen Therapeutika. Infektionskrankheiten sind, wenn auch mit Änderungen in ihrer jeweiligen Bedeutung, nach wie vor ein ernstzunehmendes Problem. Das vorliegende Buch soll für ihre Erkennung, Bekämpfung und Verhütung eine Hilfe geben.

Jena, Köln, Hamburg, Ulm, im August 2001

Werner Köhler Hans J. Eggers Bernhard Fleischer Reinhard Marre Herbert Pfister Gerhard Pulverer

Inhaltsverzeichnis 1 Allgemeine Infektionslehre .......................................

1

REINHARD MARRE, BERNHARD FLEISCHER, BARBARA M. BROKER, GOTTFRIED MAUFF

2 Mikrobiologische Diagnostik ...................................

73

KLAUS PETER SCHAAL, JOACHIM KÜHN, EDELTRUD DIETLEIN, MARTIN EXNER

3 Allgemeine Bakteriologie

.......................................

155

HANS-GEORG SAHL, JÖRG HACKER, WERNER KÖHLER, ADOLF BAUERNFEIND, GEORG PETERS, HELMUT MITTERMAYER

4 Spezielle Bakteriologie ................................................

247

GEORG PETERS, GERHARD PULVERER, ANDREAS PODBIELSKI, RUDOLF LÜTTICKEN, MATTHIAS FROSCH, JÜRGEN HEESEMANN, RAINER ANSORG, GEORG PLUM, ALEXANDER VON GRAEVENITZ, WERNER KÖHLER, MANFRED KIST, HEIDI SCHÜTT-GEROWITT, JOSEF BEUTH, ERIK C. BÖTTGER, KLAUS PETER SCHAAL, WOLFGANG BREDT

5 Allgemeine Virologie ................................................

485

HANS J. E GGERS, THOMAS M ERTENS , L UTZ VON M ÜLLER

6 Spezielle Virologie .......................................................

549

GÜNTER SIEGL, HERBERT PFISTER, HANS J. EGGERS, KARL-EDUARD SCHNEWEIS, HANS R. GELDERBLOM, WOLFGANG JILG, HANS-JÜRGEN STRECKERT, VOLKER TER M EULEN , HEIDI HOLZMANN, FRANZ X. HEINZ , HANS-DIETER K LENK, HEINZ-JÜRGEN THIEL, HERBERT SCHMITZ, VOLKER ERFLE, HANS A. KRETZSCHMAR

7 Allgemeine Medizinische Mykologie .......................

665

RENATE BLASCHKE-HELLMESSEN, GABRIELE SCHÖNIAN

8 Spezielle Medizinische Mykologie ...........................

681

HEIDI SCHÜTT-GEROWITT, REINHARD RÜCHEL

9 Allgmeine Medizinische Parasitologie ....................... HANNS M ARTIN S EITZ, W ALTER A. M AIER

699

VIII

Inhaltsverzeichnis

10 Spezielle Medizinische Parasitologie .......................

701

HANNS M ARTIN S EITZ, W ALTER A. M AIER

11 Klinische Infektiologie (organorientiert)

..............

749

WERNER KÖHLER, REINHARD MARRE, JÜRGEN HEESEMANN, WOLFGANG JILG, MATTHIAS FROSCH, VOLKER TER MEULEN, PETER BARTMANN, WOLFGANG BREDT, JOACHIM DENNER, REINHARD KURTH, JÖRG MICHAEL SCHIERHOLZ, JOSEF BEUTH, DIETMAR PIERRE KÖNIG, HERBERT PFISTER

12 Prinzipien bei aktiven und passiven Immunisierungen .......................................................

827

DETLEF M ICHEL, THOMAS MERTENS

Farbtafeln I-XIl nach Kapitel 12 Anhang......................................................................

847

Register .....................................................................

851

Autorenverzeichnis Professor Dr. RAINER ANSORG Universität - GH Essen Institut für Medizinische Mikrobiologie Hufclandstr. 55 45122 Essen Professor Dr. Dr. med. PETER BARTMANN Direktor des Zentrums für Kinderheilkunde Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Abteilung Neonatologie Adenauerallee 119 53113 Bonn Professor Dr. ADOLF BAUERNFEIND Max-von-Pettenkofer-lnstitut für Hygiene und Medizinische Mikrobiologie Petlenkoferstraße 9a 80336 München Professor Dr. JOSEF BEUTH Institut zur wissenschaftlichen Evaluation Naturheilkundlicher Verfahren der Universität zu Köln Robert-Koch-Str. 10 50931 Köln Professor Dr. RENATE BLASCHKE-HELLMESSEN Am Park 1 01468 Friedewald Professor Dr. ERIK C. BÖTTÜER Institut für Medizinische Mikrobiologie der Universität Zürich Gloriastr. 30/32 CH-8028 Zürich Schweiz Professor Dr. med. WOLFGANG BREDT Institut für Medizinische Mikrobiologie u. Hygiene Klinikum der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Hermann-Herder-Straße 11 79104 Freiburg Dr. BARBARA BROKER Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin Bernhard-Nocht-Str. 74 20359 Hamburg

Dr. JOACHIM DENNER Robert-Koch-Institut Nordufer 20 13353 Berlin Dr. med. EDELTRUD DIETLEIN Hygiene-Institut der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universiläl Bonn Sigmund-Freud-Str. 25 53127 Bonn Professor Dr. HANS J. EGGERS Institut für Virologie der Universität zu Köln Fürst-Pückler-Str. 56 50935 Köln Professor Dr. VOLKER ERFLE GSF-Forschungszenlrum für Umwelt und Gesundheit Institut für Molekulare Virologie Ingolstädter Landstr. 1 85764 Neuherberg Professor Dr. med. MARTIN EXNER Hygiene-Institut der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Sigmund-Freud-Str. 25 53127 Bonn Professor Dr. BERNHARD FLEISCHER Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin Bernhard-Nocht-Str. 74 20359 Hamburg Professor Dr. MATTHIAS FROSCH Universität Würzburg Institut für Hygiene und Mikrobiologie Josef-Schneider-Str. 2 97080 Würzburg Dr. BARBARA C. GÄRTNER Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Abt. Virologie Gebäude 47 66421 Homburg/Saar

X

Autorenverzeichnis

Dr. med. HANS R. GELDERBLOM Robcrt-Koch-Institut Nordufer 20 13353 Berlin Professor Dr. ALEXANDER VON GRAEVENITZ Institut für Medizinische Mikrobiologie der Universität Zürich Gloriastr. 30/32 CH-8028 Zürich Schweiz Professor Dr. med. JÖRG HACKER Zentrum für Infektionsforschung Institut für molekulare Infektionsbiologie Universität Würzburg Röntgenring ff 97070 Würzburg Dr. WALTER HAMPL Institut für Mikrobiologie der Universität Abt. Virologie Albcrt-Einstein-Allee 11 89069 Ulm Professor Dr. Dr. med. JÜRGEN HEESEMANN Max-von-Pettenkofcr-Institut für Hygiene und Medizinische Mikrobiologie Pettenkoferstraße 9a 80336 München Professor Dr. FRANZ X. HEINZ Universität Wien Institut für Virologie Kinderspitalgasse 15 A-1095 Wien Austria

Professor Dr. MANFRED KIST Institut für Medizinische Mikrobiologie Klinikum d. Albert-Ludwigs-Universität Hermann-Herder-Str. 11 79104 Freiburg Professor Dr. med. HANS-DIETER KLENK Universität Marburg Institut für Virologie Robert-Koch-Straße 17 35037 Marburg Professor Dr. Dr. Dr. h.c. WERNER KÖHLER Adoll'-Reichwein-Str. 26 07745 Jena Dr. DIETMAR PIERRE KÖNIG Klinik für Orthopädie Universitätsklinik Köln Joseph-Stelzmann-Str. 9 50962 Köln Professor Dr. med. HANS A. KRETZSCHMAR Institut für Neuropathologie Ludwig-Maximilians-Universität Marchioninistr. 17 81377 München Professor Dr. med. JOACHIM KÜHN Institut für Medizinische Mikrobiologie und Virologie der Universität Von-Stauffcnberg-Str. 36 48151 Münster Professor Dr. REINHARD KURTH Robert-Koch-Institut Nordufer 20 13353 Berlin

Professor Dr. HEIDI HOLZMANN Universität Wien Institut für Virologie Kinderspitalgasse 15 A-1095 Wien Austria

Professor Dr. RUDOLF LÜTTICKFN RWTH Aachen Institut für Mikrobiologie und Immunologie Pauwelsstr. 30 52074 Aachen

Professor Dr. med. WOLFGANG JILG Klinikum der Universität Regensburg Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Franz-Josef-Strauß-Allee 11 93053 Regensburg

Professor Dr. med. WALTER A. MAIER Institut für medizinische Parasitologie der Rheinischen Friedrich-WilhelmsUniversität Bonn Sigmund-Freud-Str. 25 53127 Bonn

Autorenverzeichnis

Professor Dr. med. REINHARD MARRE Institut für Mikrobiologie und Immunologie der Universität Ulm Abt. Med. Mikrobiologie und Hygiene Robert-Koch-Straße 8 89081 Ulm Professor Dr. med. GOTTFRIED MAUFF Laborärztliche Gemeinschaftspraxis Dr. Kramer & Kollegen Lauenburgerstr. 67 21502 Geesthacht

Professor Dr. rer. nat. NIKOLAUS MÜLLER-LANTZSCH Institut f. Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Abt. Virologie Gebäude 47 66421 Homburg/Saar Professor Dr. med. GEORG PETERS Institut für Medizinische Mikrobiologie Westfälische Wilhelms-Universität Münster Domagkstraße 10 48149 Münster

Professor Dr. med. THOMAS MERTENS Institut für Mikrobiologie und Immunologie der Universität Ulm Abteilung Virologie Albert-Einstein-Allee 11 89081 Ulm

Professor Dr. rer. nat. HERBERT PFISTER Institut für Virologie der Universität zu Köln Fürst-Pückler-Straße 56 50935 Köln

Professor Dr. VOLKER TER MEULEN Institut für Virologie und Immunbiologie Versbacher Str. 7 97078 Würzburg

Dr. med. GEORG PLUM Institut für Medizinische Mikrobiologie u. Hygiene Universität zu Köln Goldenfelsstr. 19-21 50935 Köln

Priv.-Doz. Dr. rer. nat. DETLEF MICHEL Institut für Mikrobiologie und Immunologie der Universität Ulm Abteilung Virologie Albert-Einstein-Allee 11 89081 Ulm Primarius Univ.-Professor Dr. HELMUT MITTERMAYER Institut für Hygiene, Mikrobiologie und Tropenmedizin am Krankenhaus der Elisabethinen Fadingerstr. 1 A-4010 Linz Austria Dr. med. LUTZ VON MÜLLER Institut für Mikrobiologie und Immunologie der Universität Ulm Abteilung Virologie Albert-Einstein-Allee 11 89081 Ulm

Professor Dr. med. Dr. rer. nat. ANDREAS PODBIELSKI Universität Rostock Institut für Medizinische Mikrobiologie Schillingstr. 70 18057 Rostock Professor Dr. med. Dr. h. c. GERHARD PULVERER Direktor des Instituts für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Universität zu Köln Goldenfelsstraße 19-21 50935 Köln Professor Dr. REINHARD ROCHEL Georg-Augusta-Universität Hygiene-Institut, Abt. Med. Mikrobiologie Universitätsklinikum Kreuzbergring 57 37075 Göttingen Professor Dr. HANS-GEORG SAHL Institut für Medizinische Mikrobiologie und Immunologie der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Sigmund-Freud-Str. 25 53127 Bonn

XI

XII

Autorenverzeichnis

Professor Dr. med. KLAUS PETER SCHAAL Institut für Med. Mikrobiologie und Immunologie der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Sigmund-Freud-Straße 25 53127 Bonn

Dr. med. Dr. rcr. nat. HHIDI SCHUTT-GEROWLI I Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Universität zu Köln Goldcnfelsstraße 19-21 50935 Köln

Dr. JÖRG MICHAEL SCHIF.RHOLZ Stiftung caesar Friedensplatz 16 53111 Bonn

Professor Dr. med. HANNS MARTIN SEITZ Institut für Medizinische Parasitologie der Rheinischen Friedrich-WilhelmsUniversität Bonn Postfach 1825 53008 Bonn

Professor Dr. HERBERT SCHMITZ. Bernhard-Nocht-lnstitut für Tropenmedizin Bernhard-Nocht-Straße 74 20359 Hamburg Professor Dr. KARL-EDUARD SCHNEWEIS Institut für Medizinische Mikrobiologie und Immunologie der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Sigmund-Freud-Str. 25 53127 Bonn Dr. GABRIELE SCHÖNIAN Institut für Mikrobiologie und Hygiene Universitätsklinikum Charite Humboldt-Universität zu Berlin Dorotheenstr. 96 10098 Berlin

Professor Dr. rer. nat. GÜNTER SIEGI. Institut für Klin. Mikrobiologie und Immunologie IKMI Frobergstraße 3 CH-9001 St. Gallen Schweiz Priv.-Doz. Dr. HANS-JÜRGEN STRECKERT Alte Straße 41b 58452 Witten Professor Dr. HEINZ-JÜRGEN THIEL Institut für Virologie Fachbereich Veterinärmedizin (FB 18) Frankfurter Str. 107 35392 Gießen

XIII

Abkürzungsverzeichnis A

Adenin

ADCC

antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität Antigen Antigen-AntikörperReaktion Antikörper antigenpräsentierende Zel-

Ag Ag-AkReaktion

Ak APC

len ARDS

EC

enterohämorrhagische

ELISA

Colitis Enzyme linked immuno sorbent assay

FAD FDC FG

Flavin-Adenin-Dinukleotid follikulär dendritische Zellen Fleckfiebergruppe (Rickettsien) Filament-Hämagglutinin (bei Bordetella pertussis) Fluoreszenzimmunoassay Fluoreszenz-Treponema- Antikörper-Test

AT ATP

Acute respiratory distress syndrome Ataxia teleangiectasia Adenosintriphosphat

BS

BLOOM-Syndrom

C

Komplement

G

Guanin

C

Cytosin colony forming units (= KBE) combined immunodeficiency (kombinierte Immunschwäche) cytomegalic inclusion disease (zytomegale Einschlußkörperchen-Krankheit) zervikale intraepitheliale Neoplasien zytopathischer Effekt Komplementrezeptor C.-reaktives Protein koloniestimulierender Fak-

GIT gp

Gastrointestinaltrakt Glykoprotein

HA

Ffämagglutinin (Influenzaviren) Hämagglutinations-Test Human granulocytic Ehrlichia Hämagglutinations-Hemmtest human leukocyte antigen hämolytisch-urämisches Syndrom Harnwegsinfektion

CFXJ

CID

CID

CIN CPE CR CRP CSF

tor CTL CTX DC DNA DNS DTH

EB

CD8+ zytotoxische T-Zellen Choleratoxin dendritische Zellen deoxyribonucleic acid (= DNS) Desoxyribonukleinsäure (= DNA) delayed type hypersensitivity (Typ IV-Allergie, Überempfindlichkeitsreaktion vom Spättyp) Elementarkörperchen

FHA FIA FTA-Test

HAH HGE HHT HLA HUS HWI ID50 IF IFN IfSG Ig IIFT IL IS-Element IVIG

KBE KBR

50%ige Infektionsdosis Immunfluoreszenz Interferon Infektionsschutzgesetz Immunglobulin Indirekter Immunofluoreszenz-Test Interleukin Insertionssequenz intravenöse Applikation von Immunglobulin G Koloniebildende Einheiten (= CFU) Komplementbindungsreaktion

XIV

Abkürzungsverzeichnis

LAS

LD50

LPS LT

MALT MBK MHC MHK MIP mRNA NA

Lymphadenopathie-Syn-

RB

Retikularkörperchen

drom 50%ige letale Dosis Lipopolysaccharid hitzelabile Enterotoxine (bei E. coli)

RES RFLP

retikuloendotheliales System Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus Radio-Immunoassay ribonucleic acid (= RNS) Ribonukleinsäure (= RNA) reactive oxygen intermedia-

mukosaassoziiertes Lymphom minimal bakterizide Konzentration Haupthistokompatibili tätskomplex minimale Hemmkonzentration monocyte chemotactic protein (ein Chemokin) messenger ribonucleic acid

RIA RNA RNS ROI

te rRNA RT RT-PCR

ribosomale RNA reverse Transkriptase reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion

SCID

severe combined immunodeficiency; schwerer kombinierter Immundefekt Glutamat-Oxalazetat-Transaminase Glutamat-Pyruvat-Transaminase systemic inflammatory response syndrome Subspecies hitzestabile Enterotoxine (bei E. coli) sexually transmitted disease (Geschlechtskrankheiten) streptokokkenbedingtes toxisches Schock-Syndrom

SGOT SGPT

NI NK-Zellen NT

Neuraminidase (Influenzaviren) Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid Nukleinsäure-Amplifikations-Technik nicht-gonorrhoische Urethritis Nosokomialinfektion natural killer cells Neutralisationstest

OPSI

overwhelming post-splenec-

T

Thymin

tomy infection Open reading frame

TcP

ORF

Adhäsin (bei Vibrio cholerae) T-Zellrezeptor Treponema pallidumHämagglutinations-Test Treponema pallidum-Immobilisations-Test Transfer-RNA toxic shock syndrome toxic shock syndrome toxin-1

NAD NAT NGU

PAE PAI PBP PCR PGU PKA PML PMN

PT RANTES

postantibiotischer Effekt Pathogenitätsinsel penicillinbindende Proteine Polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion) postgonorrhoische Urethritis Proteinkinase A progressive multifokale Leukoenzephalopathie polymorphkernige neutrophile Leukozyten (polymorphkernige Neutrophile) Pertussis-Toxin regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted (ein Chemokin)

SIRS ssp. ST STD STSS

TcR TPHA-Test TPI-Test tRNA TSS TSST-1

VIP

vasoaktives intestinales Peptid

Yad YOP

Yersinia-Adhäsin Yersinia outer proteins

ZG

Zeckenbiß-Fleckfiebergruppe (Rickettsien)

Abkiirzungsverzeichnis

Abkürzungen von Gattungsnamen bei Bakterien, Pilzen und Protozoen A. actinomycetemcomitans - Actinobacillus

C. burnetii - Coxiella burnetii

actinomycetemcomitans A. bovis - Actinomyces bovis A. gerencseriae - Actinomyces gerencseriae A. hydrophila - Aeromonas hydrophila A. israelii - Actinomyces israelii A. pelletieri - Actinomadura pelletieri A. tumefaciens - Agrobacterium tumefaciens A. salmonicida - Aeromonas salmonicida A. veroni - Aeromonas veroni

C. chauvoei - Clostridium chauvoei C. difficile - Clostridium difficile C. diphtheriae - Corynebacterium diphtheriae C. fetus - Campylobacter fetus C. freundii - Citrobacter freundii C. histolyticum - Clostridium histolyticum C. hominis - Cardiobacterium hominis C. jejuni - Campylobacter jejuni C. koseri - Citrobacter koseri C. novyi - Clostridium novyi C. perfringens - Clostridium perfringens C. pneumoniae - Coxiella burnetii C. psittaci - Chlamydia psittaci C. septicum - Clostridium septicum C. tetani - Clostridium tetani C. trachomatis - Chlamydia trachomatis C. xerosis - Corynebacterium xerosis

B. abortus - Bruceila abortus B. afzelii - Borrelia afzelii B. anthracis - Bacillus anthracis B. avium - Bordetella avium B. bronchiseptica - Bordetella bronchiseptica B. burgdorferi - Borrelia burgdorferi B. canis - Bruceila canis B. catarrhalis - Branhamella catarrhalis B. cepacia - Burkholderia cepacia B. distasonis - Bacteroides distasonis B. fragilis -Bacteroides fragilis B. garinii -Borrelia garinii B. gladioli - Burkholderia gladioli B. henselae - Bartonella henselae B. lusitaniae - Borrelia lusitaniae B. mallei - Burkholderia mallei B. melitensis - Brucella melitensis B. neotomae - Bruceila neotomae B. ovatus - Bacteroides ovatus B. ovis - Brucella ovis B. parapertussis - Bordetella parapertussis B. pertussis - Bordetella pertussis B. pseudomallei - Burkholderia pseudomallei

B. quintana - Bartonella quintana B. suis - Brucella suis B. thetaiotaomicron - Bacteroides thetaiotaomicron B. valaisiani - Borrelia valaisiani B. vulgatus -Bacteroides vulgatus B. wachsworthia - Bacteroides wachsworthia C. albicans - Candida albicans C. botulinum - Clostridium botulinum

DAEC - diffus adhärente Escherichia coli EAEC - enteroaggregative Escherichia coli EHEC - enterohämorrhagisehe Escherichia coli EIEC - enteroinvasive Escherichia coli EPEC - enteropalhogene Escherichia coli ETEC - enterotoxische Escherichia coli E. aerogenes - Enterobacter aerogenes E. agglomerans - Enterobacter agglomerans E. canis - Ehrlichia canis E. chaffensis - Ehrlichia chaffensis E. cloacae - Enterobacter cloacae E. coli - Entamoeba coli E. coli - Escherichia coli E. corrodens - Eikenella corrodens E. dispar - Entamoeba dispar E. equi - Ehrlichia equi E. faecalis — Enterococcus faecalis E. faecium - Enterococcus faecium E. fergusomi - Escherichia fergusonii E. granulosus - Echinococcus granulosus E. hartmanii - Entamoeba hartmanii E. hermanni - Escherichia hermanni E. histolytica - Entamoeba histolytica E. ictaluri - Edwardsieila ictaluri E, koshinae - Edwardsieila koshinae

XV

XVI

Abkürzungsverzeichnis

E. multilocularis - Echinococcus multilocu-

M. avium - Mycobacterium avium

laris E. rhusiopathiae - Erysipelothrix rhusiopathiae E. sennetsu - Ehrlichia sennetsu E. tarda - Edwardsiella tarda E. vulneris - Escherichia vulneris

M. bovis - Mycobacterium bovis M. chelonae - Mycobacterium chelonae M. fortuitum - Mycobacterium fortuitum M. gcnaveuse - Mycobacterium genaveuse M. genitalium - Mycoplasma genitalium M. haemolyticum - Mycobacterium haemolyticum M. hominis - Mycoplasma hominis M. lacunata - Moraxella lacunata M. leprae - Mycobacterium leprae M. marinum - Mycobacterium marinum M. morganii - Morganella morganii M. nonliquefaciens - Moraxella nonliquefaciens M. ozzardi - Mansonella ozzardi M. pneumoniae - Mycoplasma pneumoniae M. streptocera - Mansonella streptocera M. ulcerans - Mycobacterium ulcerans M. xanthus - Myxococcus xanthus

F. necrophorum - Fusobacterium necrophorum F. novicida - Francisella novicida F. tularensis - Francisella tularensis G. vaginalis - Gardnerella vaginalis H. alvei - Hafnia alvei H. aphrophilus - Haemophilus aphrophilus H. ducreyi - Haemophilus ducreyi Hib - Haemophilus influenzae Typ b H. influenzae - Haemophilus influenzae H. paraaphrophilus - Haemophilus paraaphrophilus H. parahaemolyticus - Haemophilus parahaemolyticus H. parainfluenzae - Haemophilus parainfluenzae H. pylori - Helicobacter pylori H. segni - Haemophilus segni

N. abscessus - Nocardia abscessus N. asteroides - Nocardia asteroides N. brasiliensis - Nocardia brasiliensis N. farcinica - Nocardia farcinica N. gonorrhoeae - Neisseria gonorrhoeae N. nova - Nocardia novia O. tsutsugamushii - Orientia tsutsugamushii

K. kingae - Kingella kingae

P. aenes - Propionibacterium aenes

K. ornithinolytica - Klebsieila ornithinolytica K. oxytoca - Klebsieila oxytoca K. planticola - Klebsiella planticola K. pneumoniae - Klebsiella pneumoniae K. terrigena - Klebsiclla terrigena

P. P. P. P. P. P. P. P.

L. canicola - Leptospira canicola L. donovani - Leishmania donovani L. grippotyphosa - Leptospira grippotyphosa L. hyos - Leptospira hyos L. icterohaemorrhagiae - Leptospira icterohaemorrhagiae L. interrogans - Leptospira interrogans L. major - Leishmania major L. micdadei - Legionella micdadei L. pneumophila - Legionella pneumophila L. tarrasovi - Leptospira tarrasovi L. tropica - Leishmania tropica M. abscessus - Mycobacterium abscessus M. agilis - Micrococcus agilis

P. P. P. P. P. P. P. P. P. P.

aeruginosa - Pseudomonas aeruginosa alcalifaciens - Providencia alcalifaciens avidum - Propionibacterium avidum bivia - Prevotella bivia buccae - Prevotella buccae disiens - Prevotella disiens fluorescens - Pseudomonas fluorescens freudenreichii - Propionibacterium freudenreichii intermedia - Prevotella intermedia malariae - Plasmodium malariae micros - Peptostreptococcus micros mirabilis - Proteus mirabilis melaninogenicum - Prevotella melaninogenicum multoeida - Pasteurella multoeida myxofaciens - Proteus myxofaciens ovale - Plasmodium ovale penneri - Proteus penneri propionicum - Propionibacterium propionicum

Abkürzungsverzeichnis

P. rettgeri - Providencia rettgeri

S. pyogenes - Streptococcus pyogenes

P. stuartii - Providencia stuartii P. stützen - Pseudomonas stutzeri P. vivax - Plasmodium vivax P. vulgaris - Proteus vulgaris

(A-Streptokokken) S. sobrinus - Streptococcus sobrinus S. sonnei - Shigella sonnei S. suis - Streptococcus suis

R. prowazekii - Rickettsia prowazekii

T. b. gambiense - Trypanosoma brucei

R. rickettsii - Rickettsia rickettsii R. typhi - Rickettsia typhi

gambiense T. b. rhodesiense - Trypanosoma brucei rhodesiense T. gondii - Toxoplasma gondii T. pallidum - Treponema pallidum T. phagedenis - Treponema phagedenis T. refringens - Treponema refringens T. saginata - Taenia saginata T. solium - Taenia solium T. vaginalis - Trichomonas vaginalis T, vincentii - Treponema vincentii

S. agalactiae - Streptococcus agalactiae (B-Streptokokken) S. anginosus - Streptococcus anginosus S. aureus - Staphylococus aureus S. boydii - Shigella boydii S. bovis -Streptococcus bovis S. downei - Streptococcus downei S. dysenteriae - Shigella dysenteriae S. flexneri - Shigella flexneri S. gordonii - Streptococcus gordonii S. haematobium - Schistosoma haematobium S. intcrmedius - Streptococcus intermedius S. japonicum - Schistosoma japonicum S. mansoni - Schistosoma mansoni S. moniliformis - Streptobacillus moniliformis

S. mutans - Streptococcus mutans S. liquefaciens - Serratia liquefaciens S. maltophilia - Stenothrophomonas maltophilia S. marcescens - Serratia marcescens S. oralis - Streptococcus oralis S. pneumoniae - Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken)

U. urealyticum - Ureaplasma urealyticum V. alginolyticus - Vibrio alginolyticus V. cholerae - Vibrio cholerae V. damsela - Vibrio damsela V. fluvialis - Vibrio fluvialis V. furnissi - Vibrio furnissi V. hollisae - Vibrio hollisae V. metschnikovii - Vibrio metschnikovii V. mimicus - Vibrio mimicus V. parahaemolyticus - Vibrio parahaemolyticus Y. pestis - Yersinia pestis Y. pseudotuberculosis - Yersinia pseudotuberculosis

XVII

XVIII

Abkürzungsverzeichnis

Abkürzungen von Virusbezeichnungen AIDS

Acquired immunodeficiency Syn-

ALV

drome, Immunschwächesyndrom avian leucosis virus

BIV BKV BLV

bovine immunodeficiency virus BK-Virus (ein Papillomvirus) bovines Leukämie virus

CJD CMV CPE

CREUTZFELDT-JAKOB-Krankheit

DHV

Zytomegalievirus zytopathischer Effekt duck hepatitis virus (Enten-Hepatitis-Virus)

EBV EEV

EPSTEIN-BARR-Virus extrazelluläre infektiöse Viren (bei Poxviren)

FIV FSME

feline immunodeficiency virus Frühjahr-Sommer-Meningoencephalitis

GSHV

ground squirrel hepatitis virus (Erdhörnchen-Hepatitis-Virus)

HBcAg HBsAg HBV HCMV HCV HDV HERV HHV HIV

Hepatitis B core antigen Hepatitis B surface antigen Hepatitis B-Virus Humanes Zytomegalievirus Hepatitis C-Virus Hepatitis D-Virus humane endogene Retroviren Humane Herpesviren humanes Immundefizienzvirus (human immunodeficiency virus) humanpathogene Papillomviren Herpes simplex Virus humanes T-Zell Leukämievirus

HPV HSV HTLV

IMV

intrazelluläre, reife, infektiöse Viren (bei Poxviren)

JCV

JC-Virus (ein Papillomvirus)

LCMV LTR

Lymphozytäres Choriomeningitis-Virus long tcrminal repeat

MCV MLV MMTV

Molluscum contagiosum Virus Maus-Leukämievirus Maus-Mammatumorvirus

NLV

Norwalk-like virus (ein Calicivirus) neue Variante der CREUTZFELDTJAKOB-Krankheit

nvCJD

PRP

progressive Röteln-Panencephalitis

RSV RSV RT

Respiratory Syncytial Virus Rous-Sarkomvirus reverse Transkriptase

SIV SLV

simian immunodeficiency virus Sapporo-like virus (ein Calicivirus) Subakute sklerosierende Panencephalitis simian T cell lymphotropic virus Slow virus Infektion

SSPE STLV SVI

vzv

Varizella-Zoster-Virus

WHV

Woodchuck hepatitis virus (Waldmurmeltier-Hepatitis-Virus)

Allgemeine Infektionslehre

1.1

1.1.1 1.1.2 1.1.3 114

1.2

Grundlagen der Infcktionslehre

1

2

1.2.8

T-Zelleffektorfunktionen

46 49 50

REINHARD MARRE Stellung der Infektionslehre in Geschichte und Gegenwart Konzepte der Klinischen Infektiologie Allgemeine Infektionslehre

2

1.2.9 1.2.10 1.2.11

4 5

1 212 1.2.13

Natural-Killer-Zellen Interleukine und ihre Rezeptoren Die Begrenzung und Beendigung einer Immunreaktion Spezielle Infektabwehr Pathologische Auswirkungen der

Pathogenität und Virulenz der Bakterien

7

1.2.14 1.2.15

Immunreaktion Immundefizienz Immunabwehr von Tumoren

57 59 59

Epidemiologie übertragbarer Krankheiten GOTTFRIED MAUFF

60

50 52

Prinzipien der immunologischen Infektabwehr BERNHARD FLEISCHER BARBARA M. BROKER

17

121 1.2.2

Das Immunsystem Zellen der Immunabwehr

17 22

13 1 1.3.2

Grundbegriffe der Epidemiologie Epidemiologische Methoden

61 62

1.2.3 1.2.4 12 5 126 1.2.7

Anatomie des Immunsystems Humorale Abwehrmechanismen Das Komplementsystem Phagozyten T-Lymphozyten mit DE-T-Zellrezeptor

24 27 36 38

1.3.3 1.3.4

Epidemiologische Faktoren Spektrum der Infektionskrankheiten Nosokomialinfektionen Verhütung und Bekämpfung über-

62

tragbarer Erkrankungen

69

38

1.3

135 1.3.6

65 68

2

Allgemeine Infektionslehre

1.1 Grundlagen der Infektionslehre REINHARD MARRE

(Die Ausführungen in diesem Abschnitt bauen auf dem gleichnamigen Kapitel der 7. Auflage von Herrn M. Röllinghoff auf.) 1.1.1 Stellung der Infektionslehre in Geschichte und Gegenwart Infektionskrankheiten gehören ebenso wie Hunger, Kriege und Naturkatastrophen zu den ständigen, häufig mörderischen Begleitern der Menschheit. Die Infektionserreger haben die Entwicklung der Menschheit geprägt und sind ko-evolutionär von ihr geprägt worden (Abb. 1.1). Gleichzeitig sind sie Spiegel der jeweiligen Lebensformen. Dabei traten die Infektionskrankheiten auf 1. als Teilaspekl eines intakten ökologischen Systems (z.B. Malaria), 2. als Ergebnis eines geänderten ökologischen Systems (z.B. Darminfektionen nach Urbanisation ohne gleichzeitige Trennung von Fäkalentsorgungs- und Lebensmittelversorgungssystemen), 3. als epidemiologische Einbahnstraße (z.B. Toxoplasmose des Menschen, die im Gegensatz zur Toxoplasmose der Maus normalerweise nicht auf die Katze rückübertragen wird) und 4. als Ergebnis des veränderten Ökosystems Mensch (z.B. nach Zytostatikagabe, Organtransplantation). Aus Sicht des Mikroorganismus wäre im Falle von Geschlechtskrankheiten vermutlich auch die Promiskuität unentbehrlicher Teil eines intakten Ökosystems. Infektionskrankheiten haben stets eine Sonderrolle gespielt, weil sie nicht nur das Individuum, welches in vielen gesellschaftlichen Kulturen nur gering geschätzt wird, sondern die Bevölkerung in ihrer Existenz bedrohten, so daß Religion und Staat Vorschriften zur Bekämpfung von Seuchen erließen. Das explosionsartige Auftreten von Infektionskrankheiten führte und führt immer noch zu Angst und Panik unter der Bevölkerung, was durch Unwissenheit und eventuelle Wirkungslosigkeit von Schutzmaßnahmen noch verstärkt wird und die Empfänglichkeit für Außenseitermeinungen erhöht. Diese Sonderrolle haben sich die Infektionskrankheiten bis in die Neuzeit bewahrt. Keine andere Gruppe von

Krankheiten wird durch gesetzliche Vorschriften und Verordnungen (Infektionsschutzgesetz, Biostoffverordnung, Lebensmittel- und Trinkwasserverordnung) so detailliert erfaßt wie die Infektionskrankheiten und bei kaum einer anderen Gruppe von Krankheiten nimmt der Staat einen solchen Einfluß auf Präventionsmaßnahmen (staatlich empfohlene Impfungen, amtsärztlich verordnete Hygienemaßnahmen). Eine Sonderposition haben die Infektionskrankheiten auch, weil viele Präventivmaßnahmen (z.B. Impfungen) besonders einfach und nachhaltig wirksam sind und die voraussichtliche Wirksamkeit von Therapeutika bereits durch in vitro Untersuchungen ermittelt werden kann. Der Nachweis von Infektionskrankheiten mit den Laborverfahren der Mikrobiologie besitzt daher verschiedene Funktionen, die sich nicht nur auf die individuell kurativen Zwecke beschränken: Er ist die Basis für eventuell erforderliche Präventivmaßnahmen und Therapieentscheidungen. Er ermöglicht zuverlässige Aussagen über die Erregerepidemiologie und die Epidemiologie der Resistenzentwicklung. Er ist, ebenso wie die Pathologie, Teil eines wirksamen Programms zur Sicherung der Qualität der Patientenversorgung, weil klinische Diagnosen durch Anwendung naturwissenschaftlicher Verfahren verifiziert bzw. korrigiert werden können.

Auch die zur Therapie eingesetzten Antibiotika nehmen innerhalb der Gruppe der Arzneimittel wegen ihrer notwendigen Vielfältigkeit hinsichtlich Wirkspektrum, Wirkintensität. Pharmakokinetik eine besondere Position ein. Im Gegensatz zu den üblichen Medikamenten ist ihre Wirkung vergänglich. Eine Zunahme des Verbrauchs von Antibiotika führt unweigerlich zu einer Zunahme des Selektionsdrucks und fördert die Selektion antibiotikaresistenter Bakterienstämme. Beispiele aus jüngster Zeit sind die Penicillinresistenz von Pneumokokken, die in einigen Staaten bereits bei 40% der Isolate nachgewiesen werden kann, und die Ampicillinund Makrolidresistenz von Ilaemophilus influenzae. Die Resistenzentwicklung verengt somit das Spektrum verfügbarer und wirksamer Antibiotika und gefährdet Therapieoptionen.

1.1 Grundlagen der Infektionslehre

Wir sind besiedelt! Im Biotop Mensch ist der Mensch in der Unterzahl Kein Mensch ist allein. Er ist ein Ökosystem. In unserem Körper zählt man Billionen von Zellen. Rund 90% von ihnen sind aber nicht menschlich, sondern sie gehören zu jenen Geschöpfen, denen die Evolution den Menschen zugewiesen hat: als Nahrungsmittel und Schlafplatz, Hochzeitsmarkt und Raststätte. Bakterien stellen das Gros; allein auf der etwa 1,6 qm großen Haut eines Menschen leben soviele Mikroben wie Menschen auf unserem Planeten. In unserer Mundhöhle schwimmt die Amöbe Entamoeba gingivalis; in den Poren unseres Gesichts die wurmähnliche Milbe Demodex folliculorum. Schließlich existieren auch Flöhe, Fliegen, Mücken, Wanzen, Egel, Zecken im Habitat Mensch.

Wir sind besiedelt! Ins Positive gewendet: Kein Mensch ist allein und war jemals allein. Das wirkt sich unweigerlich auf das Bild des Menschen aus. Wenn wir in unserem Körper nur eine Art unter Hunderten stellen, kann keine Rede mehr davon sein, Homo sapiens sei die mächtigste Spezies. Falls Außerirdische jemals einen Menschen treffen sollten, würden sie ihn vermutlich als Ansammlung vieler kleiner Lebewesen bezeichnen, die sich auf einen ziemlich großen niedergelassen haben. Angesichts der Mehrheitsverhältnisse in uns und auf uns stellt sich die Frage, wer hier wessen Untertan ist. Hat der Mensch wirklich das Tier domestiziert? Oder haben Geschöpfe wie Kopfläuse und Amöben den Mensch gezähmt? Eines ist sicher: der Mensch meistert die Fährnisse des Lebens nicht allein; vielmehr hat sich da in den vergangenen Jahren eine ungemein bunte Lebensgesellschaft gefunden, in der immer etwas los ist. Erst in vergleichsweise kurzer Zeit, in der Steinzeit, ist die Kleiderlaus zu uns gestoßen. Der echte Menschenfloh dagegen, eben noch begafftes Zierkustierchen, findet sich mittlerweile auf der Liste der vom Aussterben bedrohten Arten. Einige unserer Bewohner gehören zu den gefährlichsten Tieren der Welt, übertragen sie doch Malaria, Typhus, Gelbfieber und die Pest. Chlamydien scheinen Herzinfarkte zu begünstigen, bestimmte Mundbakterien bewirken Karies, und die säurefesten Mikroben Helicobacter pylori fressen uns Geschwüre in den Magen. Der Keim Mikrococcus sedentahus schließlich steht im Verdacht, käsigen Fußgeruch zu verbreiten. Doch die allermeisten sind harmlose Tischgenossen, Kommensalen. Mehr noch. Ortsansässige Bakterien bilden auf der Haut eine Schützenlinie, um schädliche Mikroorganismen abzuwehren. Im Darm wiederum assistieren Bakterien bei der Verdauung und versorgen die Menschen mit lebenswichtigen Vitaminen. Dieses dichte ökologische Miteinander in Gut und Böse unterteilen zu wollen, wäre vermessen. Als hätten sie dies geahnt, sind unsere Vorfahren mit ihren Bewohnern weit gelassener umgegangen. Ötzi ertrug einen Peitschenwurm namens Trichuris und andere Plagegeister. Noch vor 200 Jahren verstieß es nicht gegen die guten Sitten, auch in vornehmster Gesellschaft mit einem Flohglas nach Ungeziefer zu suchen. Heute empören wir uns, wenn eine Mücke unser Blut trinkt. Denn Körpersäfte sind das geheimste, was wir austauschen können. Doch schlagen wir die vollgesogene Mücke dann voller Rachsucht tot, haben wir vornehmlich uns selbst totgeschlagen, denn mehr als die Hälfte des Flecks auf der Tapete besteht aus unserem eigenen Blut. Fast scheint es, mit unseren Besiedlern verhielt es sich wie mit Kindern: ohne sie wäre unser Dasein ärmer, dunkler und einsamer. Und ähnlich wie wir unsere Gene an die nächste Generation geben, vererben Mutter und Vater dem Nachwuchs ihre persönliche Flora und Fauna. Bereits mit dem Durchtritt durch die Scheide nimmt es Bakterien auf, die sich in den ersten Tagen noch vermehren. Vom ersten Schrei an lassen uns die Bakterien nicht mehr allein und respektieren unsere Gastfreundschaft ein ganzes Leben lang. Dann erst, wenn wir tot sind, fressen sie uns auf. Von JÖRG BLECH, aus „Das Leben auf dem Menschen - die Geschichte unserer Besiedler" Abb. 1.1 Biotop und Ökosystem Mensch. Dieser Beitrag ist in dem Buch „Leben auf dem Menschen - die Geschichte unserer Besiedler" von JÖRG BLECH enthalten (Rowohlt-Verlag, 2000).

3

4

Allgemeine Infektionslehre

1.1.2 Konzepte der Klinischen Infektiologie Während sich die Medizinische Mikrobiologie mit der Laboratoriumsdiagnostik befaßt, besteht die Aufgabe der Klinischen Infektiologie in der patientennahen Diagnostik, der Veranlassung der Laboratoriumsdiagnostik, der Umsetzung der Laborbefunde in praktische Medizin und in der Therapie und Beratung des Patienten. Im Gegensatz zum amerikanischen Gesundheitssystem hat sich die Klinische Infektiologie in Deutschland als eigene Disziplin nicht etabliert, sondern ist der mehr oder weniger umfangreiche Teil der verschiedenen klinischen Fächer, insbesondere der Inneren Medizin und der Kinderheilkunde. Wichtige Bereiche der Klinischen Infektiologie werden durch die Medizinische Mikrobiologie abgedeckt. Die Zersplitterung der Klinischen Infektiologie hat dazu geführt, daß eine strukturierte klinisch-infektiologische Aus- und Weiterbildung in Deutschland nicht angeboten wird und die Vermittlung klinisch-infektiologischen Wissens sowohl durch Lehrbücher und Unterrichtsveranstaltungen der Medizinischen Mikrobiologie als auch durch die Lehre der verschiedenen klinischen Fächer erfolgt. Da jedoch die wesentlichen Konzepte der klinisch-infektiologischen Krankenversorgung in allen klinischen Fächern gleich sind, bietet es sich an, diese in einem Lehrbuch für Medizinische Mikrobiologie darzustellen.

Zur klinischen Infektionsdiagnostik gehört zusätzlich zur allgemeinen Anamnese stets die spezifische Anamnese, die besondere Infektionsrisiken aufdecken soll und z.B. Auslandsaufenthalte, ähnliche Erkrankungen in der Umgebung, Tierkontakte oder riskante persönliche Verhaltensmaßnahmen (z.B. i.v. Drogenmißbrauch) erfragt. Bei der körperlichen Untersuchung ist die Suche sowohl nach primären Manifestationen der Infektion, den Eintrittspforten als auch nach metastatischen mikrobiellen Absiedlungen an Haut und inneren Organen, Lymphknotenvergrößerungen, Leber- und Milzvergrößerungen für die späteren differentialdiagnostischen Überlegungen wichtig. Auf der Basis dieser Vorinformationen sollte es möglich sein, Verdachts- und Ausschlußdiagnosen zu entwickeln und mit Hilfe mikrobiologischer und laborchemischer Untersuchungen und bildgebender Verfahren weiter einzuengen. Einfache laborchemische Verfahren können bereits Hinweise auf Infektionserreger geben: Leukozytose, Linksverschiebung, toxische Granulation in den Granulozyten, Erhöhung der Blutsenkungsgeschwindigkeit, Erhöhung des C-reaktiven

Proteins. Diese Befunde sind typisch für bakterielle Infektionen, während viele virale Infektionen nur eine geringfügige Veränderung der unspezifischen Entzündungsmarker verursachen. Eine Bluteosinophilie spricht für parasitär bedingte Infektionen. Die Aussagekraft der mikrobiologischen Laboruntersuchung wird nicht nur durch die Leistungsfähigkeit des Laboratoriums bestimmt. Sie wird ebenfalls ganz erheblich von dem am Patientenbett tätigen Arzt abhängen:

1. Es muß das richtige Untersuchungsmaterial zum richtigen Zeitpunkt entnommen werden. 2. Es müssen geeignete Materialtransportbedingungen eingehalten werden. 3. Es muß durch geeignete klinische Informationen sichergestellt sein, daß im mikrobiologischen Labor diejenigen Untersuchungsverfahren ausgewählt werden, die die klinisch relevanten Infektionserreger erfassen. Damit der spätere Untersuchungsbefund auch Basis der Therapie sein kann, sollte sich der Kliniker bereits vor Materialanforderung über Antworten zu den in Abb. 1.2 genannten Fragen im klaren sein. Die mikrobiologische Untersuchung kann einen mikroskopischen und kulturellen Erregernachweis, einen Nachweis erregerspezifischer Genomabschnitte durch PCR und andere Amplifi-

• Welches Erregerspektrum kommt bei der Erkrankung in Frage? • Welche Untersuchungsmaterialien eignen sich zum Erregernachweis? • Welches ist der geeignete Zeitpunkt zur Materialentnahme? • Sind im Erregerspektrum Erreger enthalten, die durch eine routinemäßige Anforderung nicht erfaßt werden? • Sind sehr seltene Erreger zu erwarten, die eine vorherige Kontaktaufnahme mit dem mikrobiologischen Labor erforderlich machen? • Sind besondere Materialtransportbedingungen zu beachten? • Sind aufgrund therapeutischer Probleme besondere Resistenztestungen anzufordern? Abb. 1.2 Fragen, die vor der Materialabnahme zu stellen sind.

1.1 Grundlagen der Infektionslehre

kationstechniken, Antigen- und Antikörpernachweise sowie den Nachweis mikrobieller Toxinc umfassen. Die mikroskopischen und kulturellen Erregernachweise haben den Vorteil, daß sie ein breites Erregerspektrum erfassen, so daß erregerspezifische Untersuchungsanforderungen häufig nicht erforderlich sind. Desweiteren steht bei dem kulturellen Nachweis ein Isolat auch für weitere Charakterisierungen (Antibiotikaempfindlichkeit, Vorhandensein von Virulenzeigenschaften) zur Verfügung. Nachweise durch PCR, Antigen- und Antikörpernachweise hingegen sind speziesspezifisch ausgerichtet, so daß ausschließlich eine Aussage über die eine untersuchte mikrobielle Spezies/Gattung möglich ist. Ihr Vorteil besteht darin, daß auch nicht mehr lebens- und vermehrungsfähige Mikroorganismen und ihre „immunologischen Hinterlassenschaften" (Antikörper) nachgewiesen werden können. Nach Entnahme des Probenmaterials und bei hinreichendem Infektionsverdacht kann, wenn es der Zustand des Patienten erfordert, die antimikrobielle Chemotherapie veranlaßt werden. Von einer Blindtherapie spricht man, wenn der Infektionserreger völlig unbekannt ist, von einer kalkulierten Therapie, wenn sich die Wahl des Antibiotikums an dem Spektrum der wahrscheinlichsten Infektionserreger ausrichtet. Je unklarer die Infektionserreger sind, desto breiter sollte das Wirkspektrum der verordneten Antibiotika sein. Bei dem Eintreffen des mikrobiologischen Befundes sollte bewertet werden, ob es sich bei dem nachgewiesenen Erreger auch um den wirklichen Infektionserreger handelt, der durch eine gezielte Antibiotikatherapie erfaßt werden soll. Mißverständlich positive Befunde (es sind ja „richtig" positive Befunde, die nur hinsichtlich der Interpretation mißverstanden werden können) entstehen bei dem kulturellen Nachweis von Erregern der Standortflora und bei Kontaminationen, bei der serologischen Untersuchung durch polyklonale Mitreaktionen, unspezifische anamnestische Reaktionen, Leihimmunität oder nach Impfung. Falsch-negative Befunde können auftreten, wenn der Patient zuvor behandelt war, die Untersuchungsprobe den Infektionserreger nicht enthielt, dieser während des Transportes abgestorben ist, durch Begleitflora überwuchert wurde oder wenn der Infektionserreger durch den Untersuchungsauftrag nicht erfaßt wurde.

1.1.3 Allgemeine Infektionslehre Der Mensch ist nur bis zu seiner Geburt frei von Mikroorganismen, anschließend wird er von verschiedensten Arten besiedelt, so daß normalerweise ein ökologisches Gleichgewicht zwischen Mikroorganismus und Makroorganismus entsteht, bei dem der Mikroorganismus zwar auf der Haut oder den Schleimhäuten des Wirts lebt, ihn jedoch nicht schädigt. Mikroorganismen, die den Wirt schädigen, werden als krankmachend (pathogen) bezeichnet. Die auf bzw. im Wirt wachsenden Mikroorganismen werden als Kommensale (Mitesser) benannt und bilden die Standortflora. Sie können Infektionen verursachen, wenn sie entweder durch Verletzungen in normalerweise keimfreie Bereiche des Körpers gelangen oder wenn die Infektabwehr des Wirts beeinträchtigt ist. Man nennt sie deshalb auch fakultativ pathogene Mikroorganismen oder Opportunisten. Der Wirt verfügt über Mechanismen der unspezifischen und der spezifischen Abwehr (natürliche Resistenz und erworbene Immunität). Es stehen sich also die infektionserzeugenden (pathogenen) Eigenschaften eines Mikroorganismus und die Abwehrfunktionen eines Wirts gleich den hochbewaffneten Armeen verschiedener Völker gegenüber. Das Gast/Wirtverhältnis befindet sich im instabilen Gleichgewicht: Gelangen pathogene Mikroorganismen in den Körper und kann die Infektabwehr überwunden werden oder kommt es zu einer spezifischen Minderung der Infektabwehr, so werden aus harmlosen Kommensalen Infektionserreger. Die Besiedlung des Wirts durch die mikrobielle Flora erfolgt normalerweise während der Geburt und durch Kontakt mit der belebten und unbelebten Umwelt. Man spricht von Kolonisation. Diese Mikroorganismen sind in charakteristischer Weise an ihren Standort angepaßt. Es wird zwischen der residenten Standortflora, welche in einem gewissen Lebensalter regelmäßig an einem Ort vorgefunden wird, und der transienten Flora, welche aus Mikroorganismen zusammengesetzt ist, die nur für kurze Zeit Haut oder Schleimhäute besiedeln, unterschieden. Eine Infektion bedeutet, daß sich ein pathogener oder fakultativ pathogener Mikroorganismus im Wirt oder auf Haut- und Schleimhaut angesiedelt hat. Viele Infektionen zeigen klinisch keine Symptome, sie werden im Gegensatz zu den apparenten Infektionen als inapparent bezeichnet. Inapparente Infektionen können

5

6

Allgemeine Infektionslehre

gleichwohl über eine Stimulation des Immunsystems zu einer stillen Feiung führen, also zu einem Schutz des Wirts gegenüber einer erneuten Infektion mit dem gleichen Erreger. Im Anschluß an eine Infektionskrankheit kann der Körper vor weiteren Infektionen mit demselben Erreger geschützt sein. Es entsteht eine Immunität, die, wie manche Impfung auch, einen lebenslangen Schutz verleihen kann. Erkrankungen, die eine hohe Kontagiosität (Ansleckungsfähigkeit) besitzen und zu einer lang anhaltenden Immunität führen, imponieren meist als Kinderkrankheiten, weil bereits der allererste Kontakt mit dem Erreger über die ausgelöste Erkrankung vor weiteren Infektionen praktisch ein Leben lang schützt. Nach Überstehen einer Krankheit wie z.B. Typhus. Paratyphus oder Diphtherie kommt es bei einigen Menschen nicht zu einer restlosen Eliminierung der Erreger. Diese leben noch in bestimmten Nischen des Körpers und werden von dort aus mehr oder minder lange ausgeschieden. Solche Personen werden Dauerausscheider oder Ausscheider genannt und sind epidemiologisch von großer Bedeutung. Werden pathogene Mikroorganismen nur vorübergehend ausgeschieden, spricht man von Keimträgern. Ein Beispiel dafür sind Personen, die mit Staphylococcus aureus kolonisiert sind (meist im Naseneingangsbereich), nicht erkrankt sind, jedoch diese Mikroorganismen an Dritte weitergeben. Infektionen können ihren Ausgang von sehr verschiedenen Bereichen nehmen. Exogene Infektionen stammen aus der belebten und unbelebten Umwelt; bei endogenen Infektionen ist die Standortflora Ursprung der Infektion. Als nosokomiale Infektionen bezeichnet man Infektionen, die im Krankenhaus oder in der ärztlichen Praxis erworben werden. Sie können als endogene oder als exogene Infektion entstehen. Begünstigt werden nosokomiale Infektionen durch Erkrankungen (z.B. Krebserkrankungen, AIDS), diagnostische und therapeutische Verfahren (z.B. Zytostatikatherapie, Fremdkörperimplantationen), welche die Infektabwehrfunktionen beeinträchtigen. Wegen der bestehenden Grunderkrankung verlaufen nosokomiale Infektionen häufig besonders schwer; viele der nosokomialen Infektionserreger sind darüber hinaus durch eine besonders hohe erworbene oder natürliche Resistenz gegenüber Antibiotika ausgezeichnet. Entscheidend für eine erfolgreiche Infektion ist das Eindringen des Mikroorganismus in den

Wirt. Als wichtigste Eintrittspforte dienen die Schleimhäute des Respirations-, Magen-Darmund des Urogenitaltraktes. Desweiteren sind die Bindehaut des Auges und die manchmal mikroskopisch kleinen Verletzungen der Haut oder Insektenstiche als Eintrittspforte zu nennen. Nur ganz wenige Krankheitserreger können direkt durch die intakte Haut eindringen. Ist der Mikroorganismus in den Körper gelangt, dann muß er sich an Zellen oder extrazelluläre Matrixsubstanzen binden, um im Wirt zu überleben und um nicht weggeschwemmt zu werden. Nach erfolgler Bindung kann der Infektionserreger in manchen Fällen Toxine bilden, welche das Gewebe schädigen, so daß sich der Infektionserreger einen Weg in den Makroorganismus bahnt. Die Infektionskrankheit ist ein Ergebnis der Invasion des Erregers und der Infektabwehrreaktionen. Verstärkte Blutzufuhr, Einwandern von Entzündungszellen, Störungen der Kapillarpermeabilität, Zeil- und Gewebsuntergang und sich aufbauende reparative Prozesse erklären die Lokalsymptomatik von Schwellung, Rötung, Schmerz und Eiterbildung. Die Allgemeinsymptomatik wird von Interleukin-1, Interleukin-6 und Tumornekrosefaktor vermittelt. Das Zeitintervall zwischen der Aufnahme eines Krankheitserregers und der Ausbildung von Krankheitssymptomen wird als Inkubationszeit bezeichnet. Ihre Dauer ist vielfach charakteristisch für bestimmte Krankheiten, sie kann sich insbesondere bei vielen Viruserkrankungen und klassischen Infektionskrankheiten in einem sehr engen zeitlichen Rahmen bewegen und ist somit für die Diagnose und die Aufklärung epidemiologischer Zusammenhänge bedeutsam. Epidemiologisch besonders wichtig ist, daß ein Mensch bereits während der Inkubationszeit Erreger ausscheiden und somit zur Infektionsquelle für andere werden kann (z.B. Hepatitis A). Schließlich ist darauf hinzuweisen, daß nicht bei allen Infektionskrankheiten die Inkubationszeiten angegeben werden können, besonders bei inapparent verlaufenden und bei primär chronischen Infektionskrankheiten (z.B. Tuberkulose). Viele pathogene Mikroorganismen haben im Körper bevorzugte Besiedlungsgebiete, so z.B. Meningokokken in den Hirnhäuten, Shigellen im Dickdarm, Streptococcus mutans im Zahnschmelz. Dieses Verhalten wird als Tropismus bezeichnet. Die molekularen Grundlagen des Tropismus sind für einige wichtige Infektionserreger bekannt.

1.1 Grundlagen der Infektionslehre

Die sich vermehrenden Infektionserreger können sich jedoch, insbesondere wenn sie keinen ausgeprägten Zeil- oder Gewebstropismus aufweisen, im Wirtsorganismus hämatogen oder lymphogen ausbreiten. Man unterscheidet dann zwischen Lokalinfektionen und systemischen AHgemeininfektionen. Bei der Lokalinfektion bleibt der Erreger auf die Eintrittspforte und ihre Umgebung beschränkt (z.B. Diphtherie, Gonorrhoe, Tetanus, Staphylococcus aureusAbszeß). Fernwirkungen auf den Gesamtorganismus sind dann zu beobachten, wenn die Infektionserreger Toxine wie z.B. das Diphtherieoder Tetanustoxin freisetzen. Auch bei einer Lokalinfektion kann es zu einem Fortschreiten des Krankheitsprozesses im Gewebe kommen (z.B. Phlegmone durch ß-hämolysierende Streptokokken der Gruppe A oder Gasbrand durch Clostridium perfringens). Es handelt sich dabei um eine kontinuierliche Ausbreitung ausgehend von der Eingangspforte. Dieser Vorgang wird durch vorgeformte Kanäle wie z.B. Gallengängc, Bronchiola, Faszienschichten begünstigt. Im Bereich der Eintrittspforte können die Erreger auch durch den Flüssigkeitsstrom in die Lymphbahnen oder Blutgefäße gelangen. Bei der systemischen oder der Allgemeininfektion gelangen die Mikroorganismen in das die Eintrittspforte drainierende lymphatische Gewebe. Nach einer erregertypischen Periode der Vermehrung treten dann die Bakterien in die Blutbahn über (Generalisationsstadium) und gelangen anschließend in die Organe (Stadium der Organmanifestation). Durchbricht nach einer Lokalinfektion der Infektionserreger die lokalen Abwehrbarrieren, so kann sich eine Sepsis entwickeln (s. Kapitel 11.7).

1.1.4 Pathogenität und Virulenz der Bakterien In der zweiten Hälfte des 19. Jahrhunderts stand die Frage im Raum, ob die nachgewiesenen Mikroorganismen Krankheitsursache oder nur bedeutungslose Begleiterscheinung darstellen. Von verschiedenen Forschern wurde daher eine Art Katalog von Kriterien entwickelt, die erfüllt sein sollten, um einen Mikroorganismus als Krankheitserreger bezeichnen zu können. Diese später als KOCHsche Postulate bezeichneten Bedingungen lauten: Um einen Mikroorganismus als Krankheitserreger bezeichnen zu können, ist es erforderlich, daß

1. der Keim regelmäßig im erkrankten Organismus nachweisbar ist, 2. der Keim aus dem Infizierten isoliert und in Reinkulturen gezüchtet werden kann, 3. mit der Reinkultur beim Versuchstier die Krankheit wieder experimentell erzeugt werden kann und 4. in den Versuchstieren der Mikroorganismus nachgewiesen und isoliert werden kann.

Die Postulate 1 bis 3 finden sich explizit formuliert erstmals in FRIEDRICH LOEFFLERS Diphtheriearbeit 1884; in KOCHS Publikationen (1878 Wundinfektionskrankheiten, 1884 TuberkuloseArbeit) sind sie enthalten, aber nicht als Postulate formuliert. Vor KOCH hat EDWIN KLEBS, nach dem die Bakteriengattung Klebsieila benannt wurde, 1877 drei Forderungen aufgestellt, die exakt den Postulaten 1 bis 3 entsprechen. Bei JAKOB HF.NLE findet sich 1840 nur die Bemerkung „Daß sie [die Mikroorganismen] wirklich das Wirksame sind, wäre empirisch nur zu beweisen, wenn man .... [das] Kontagium isolieren [und seine Wirkung] beobachten könnte, ein Versuch, auf den man wohl verzichten muß". Davon wird - zu Unrecht - die Bezeichnung HENLE-KocH-Postulate abgeleitet (siehe auch bei MOCHMANN und KÖHLER). Die KoCHschen Postulate waren außerordentlich befruchtend für das Verständnis von Infektionskrankheiten. Am Beispiel dieser Postulate konnte erstmalig unter Anwendung naturwissenschaftlicher Verfahren nachgewiesen werden, daß es sich bei der Tuberkulose nicht um eine Erbkrankheit handelt, obwohl die Tuberkulose familiär auftritt, sondern um eine Infektionskrankheit. Es steht jedoch außer Zweifel, daß für viele sichere Krankheitserreger die KoCHschen Postulate nicht erfüllbar sind, weil diese Krankheitserreger entweder in vitro nicht kultivierbar sind (z.B. Treponema palüdiim) und/oder ein auf eine einzige Spezies beschränktes Wirtsspektrum aufweisen (z.B. HIV). Daß die ernsthafte Befassung mit den KoCHschen Postulaten auch heutzutage noch Bedeutung besitzt, zeigt exemplarisch die Entdeckung der Borreliose, bei der das erste Postulat dank sorgfältiger epidemiologischer Analyse von einer selbst betroffenen Hausfrau erfüllt wurde (Abb. 1.3). Davon ausgehend konnten gezielte Untersuchungen, die zur Entdeckung des Erregers der Borreliose (Borrelia burgdorferi) führten, veranlaßt werden.

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Allgemeine Infektionslehre

Die Entdeckung der Borreliose - von der Schwierigkeit, eine Infektionskrankheit zu diagnostizieren Im Städtchen Lyme, Connecticut, USA, kam es zu Beginn der 60iger Jahre zu einer Zunahme von unklaren Erkrankungen mit Arthritiden, Erythem, neurologischen Störungen, chronischer Müdigkeit, Gewichtsverlust, die, erst nachdem die Hausfrau Polly Murray die entsprechenden Daten zusammengestellt und am 20. November 1975 einem Epidemiologen an der Yale Rheumatology Clinic, Dr. A. C. Steere, präsentiert hatte, kausal geklärt werden konnte. Bis dahin hatte Frau Murray mehr als zwanzig Ärzte konsultiert, die meistens Diagnosen aus den Kategorien Hypochonder, Depression, Psychose stellten. Die lokalen Cesundheitsbehörden nahmen die Klagen von Frau Murray auf die leichte Schulter und sahen in ihr eine notorische Querulantin. Erst als es auch zu einer Epidemie von Erkrankungen mit juveniler rheumatoider Arthritis kam, wurden die Behörden hellhörig. Sie stellten den Kontakt zwischen Frau Murray und Dr. Steere her, der gerade vom Center for Disease Control kam und auf der Suche nach einem neuen Forschungsgebiet war. Die sorgfältige klinische und epidemiologische Bewertung der Erkrankungen widerlegte die Diagnose der juvenilen rheumatoiden Arthritis und ergab Hinweise auf eine Umweltexposition. Aufgrund der Ähnlichkeiten der Hauterscheinungen mit dem seit 1908 aus Europa bekanntem Erythema chronicum migrans und der in diesem Zusammenhang diskutierten Zeckengenese wurden die Untersuchungen auf Ektoparasiten gelenkt. In der Tat konnten die Bewohner von Lyme über eine Zunahme von Zecken seit ca. 1960 berichten, und es wurde im Vergleich mit einer benachbarten, von der rätselhaften Erkrankung nicht befallenen Region ein um den Faktor 16 höherer Zeckenbefall von Damwild gefunden. 1981 konnte schließlich Dr. W. Burgdorfer, Rocky Mountain Laboratories, Montana, USA, die Spirochäten nachweisen, die später als Borrelia burgdorferi benannt und als eindeutige Ursache der in Lyme beobachteten Erkrankung identifiziert wurden. ARONOWITZ, P. B.: A Connecticut housewife in Francis Bacon's court: Polly Murray and Lyme disease. ThePharos52:9-12(1989) Abb. 1.3 Wie wird eine Infektionskrankheit entdeckt?

Die KocHschen Postulate wurden in den letzten Jahren auf die molekulare Pathogenitätsforschung übertragen und wurden als molekularbiologische Postulate oder KocH-FALKOWsche Postulate bezeichnet, da der amerikanische Forscher STANLEY FALKOW erstmalig den Begriff „Virulenzfaktor" definierte. Die drei molekularbiologischen Postulate lauten: 1. Die der Pathogenität zugeordneten Eigenschaften eines Mikroorganismus müssen ausschließlich bei den pathogenen Vertretern eines Genus oder den pathogenen Stämmen einer Spezies nachweisbar sein. 2. Die Inaktivierung der putativen Virulenzgene muß zu einer erkennbaren Abnahme der Pathogenität führen. 3. Die Wiedereinführung der ursprünglichen Gene muß die Pathogenität des Erregers wiederherstellen.

Pathogenität beschreibt die Gesamtheit der Eigenschaften eines Mikroorganismus, die es diesem erlauben, eine Infektion hervorzurufen. Sie

ist die Folge der Wirkung von meist mehreren Pathogenitätsfaktoren, die in charakteristischer Weise von einem Mikroorganismus produziert werden und deren koordiniertes Zusammenwirken zur Infektion des Wirts führt. Dabei haben sie die Fähigkeit, sich an Wirtszellen anzuheften (Adhärenz), sich an der Eintrittspforte zu vermehren (Kolonisation), in den Wirtsorganismus einzudringen (Invasivität) sowie Zellen und Gewebe zu zerstören (Toxizität). Diese Faktoren besitzen zentrale Bedeutung für das Infektionsgeschehen. Unter Virulenz versteht man das Ausmaß der Pathogenität eines bestimmten Krankheitserregers. Pathogenität ist folglich eine Spezieseigenschaft, während Virulenz das Merkmal eines Stammes ist. So gibt es beispielsweise Diphtheriebakterien, die kein Toxin bilden und daher avirulent sind. Die Virulenz eines Mikroorganismus wird, ähnlich wie die Toxizität eines Toxins, definiert als die Zahl von Bakterien, die notwendig ist, um 50% einer Gruppe infizierter Wirtsorganismen zu töten. Man bezeichnet dies als die Letale Dosis50 oder LD50.

1.1 Grundlagen der Infektionslehre

Allgemeine Prinzipien der Pathogenität und Virulenz Die am Infektionsgeschehen beteiligten mikrobiellen Faktoren lassen sich in die Adhäsine, Invasine, Evasine und Toxine einteilen.

Die mikrobielle Adhärenz an Zellen, extrazelluläre Matrixsubstanzen oder Sekrete sind für den Infektionsprozeß von zentraler Bedeutung, weil andernfalls die Mikroorganismen von Haut, Schleimhaut und Endolhel wieder abgeschwemmt oder wegtransportiert werden. Die Adhärenz ist gleichzeitig die Vorbedingung und Vorbereitung für das Entstehen von Mikrokolonien und die anschließende Kolonisation. Die Bakterien verfügen daher über eine Reihe verschiedener, z.T. hochspezialisierter Adhäsine, die sensiblen Regulationsprozessen unterworfen sind (Tab. 1.1). Die Adhäsine sind entweder zellständig (nicht-fimbrielle Adhäsine) oder bilden die Kappe von z.T. 2-3 um. langen, tentakelähnlichen Proteinanhängseln (Abb. 1.4). die im europäischen Schrifttum als Fimbrien, im amerikanischen Schrifttum als Pili bezeichnet werden.

Galaktose-(l-4)-Galaktose. Bestandteil der Blutgruppensubstanz P, die auf Erythrozyten, aber auch auf Epithelzellen des Harntraktes vorkommt. Die S-Fimbrien hingegen erkennen sialylsäurehaltige Rezeptoren. Darüber hinaus gibt es M-Adhäsine, Dr-Adhäsine. Typ-1-Fimbrien und CFA-Adhäsine für colonization factor antigen. Typische uropathogene E.-coliStämme bilden in mehr als 90% P-Fimbrien, während E. co/i-Stämme bei der neonatalen Meningitis mit S-Fimbrien verschen sind. Auch Gonokokken sind auf die Bildung von Fimbrien angewiesen, um pathogen zu sein. Daraus hatte sich die Vorstellung entwickelt, daß ein Fimbrien-basierter Impfstoff Schutz vor einer Gonorrhoe vermitteln müßte. Dieses Ziel ließ sich jedoch nicht erreichen, weil, wie molckulargenetische Studien zeigten, die Fimbrienbildung einer Phasenvariation unterworfen ist. also über einen genetischen Ein/Ausschalter reguliert wird. Darüber hinaus werden die antigenen Eigenschaften der Fimbrien durch homologe Rekombination verändert, so daß das durch eine Impfung aktivierte Immunsystem gleichsam ins Leere läuft.

Einige Adhäsine steuern auch Funktionen der Wirtszelle und bereiten die bakterielle Aufnahme in Zellen vor, indem sie an Integrine binden, die in der zellulären Kommunikation eine Rolle spielen (z.B. Yersinia enterocolitica, Shigella flex-

neri\ Tab. 1.2). Auch grampositive Bakterien verfügen über Adhäsine. Hierbei handelt es sich beispielsweise um Lipoteichonsäure, einen Be-

Die Nomenklatur der Adhäsine ist historisch gewachsen und folgt daher keiner Einordnung in ein logisches System. Bei Escherichia coli sind die verschiedenen Adhäsine im Detail bekannt. Sie werden meist nach denjenigen Wirtszcllstrukturen bezeichnet, an die sie binden. P-Fimbrien binden an das Disaccharid u-DTab. 1.1 Bakterielle Adhäsine und Rezeptoren (modifiziert nach DOMANN) Adhäsine

typische Beispiele

Lektine

Glykanbindungslektine von Streptococcus sobrinus

Fimbrien (Pili)

Filamentöse P-, S-, Typ 1, K88, K99 und CFA1 -Fimbrien pathogener Escherichia co//-Stämme; Typ 4-Fimbrien von Neisseria gonorrhoea; Tcp-Fimbrien von Vibrio cholerae

Nicht-FimbrienAdhäsine

Pertactin von Bordetella pertussis; Fibronektin-Bindungsprotein von Treponema pallidum; Lipoteichonsäuren von Streptococcus pyogenes

Glykosaminglykane

Heparansulfat-ähnliches Clykosaminglykan von Chlamydia trachomatis

Abb. 1.4 Fimbrielle und nicht-fimbrielle Adhäsine (modifiziert nach SALYERS und WHITT).

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Allgemeine Infektionslehre

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Tab. 1.2 Bekannte Invasionsmechanismen (modifiziert nach DOMANN) Bakterium bakterieller Ligand Wirtszellrezeptor Bemerkungen Yersinia enterocolitica

Invasin

ß1-lntegrine ß1-Integrine

„Zipper-Mechanismus"'; effizient weniger effizient als das Invasin

Intemalin A

E-Cadherin

„Zipper-Mechanismus"; effizient

D5ß1lntegrin?

„Trigger-Mechanismus" ; effizient

Salmonella Typhimurium SipB-D

unbekannt

„Trigger-Mechanismus"; effizient

Neisseria gonorrhoeae

CD66a, CGM1

„Zipper-Mechanismus" ?; Invasion zur Überwindung von Epithelbarrieren durch Transzytose?

YadA

Listeria monocytogenes Shigella flexneri

IpaB-D

Opa/Opc

2

1

„Zipper-Mechanismus": Die Wechselwirkung zwischen Ligand und Rezeptor führt in der Regel zur Aufnahme einzelner Bakterien 2 „Trigger-Mechanismus": Durch die Induktion von Signaltransduktionsketten kommt es zu dramatischen Umorganisationen des lokalen Zytoskeletts, und induzierte Membranausstülpungen der Wirtszelle nehmen in der Regel mehrere Bakterien in einem Pinozytose-ähnlichen Prozeß auf

standteil der Zellwand, oder um Oberflächenmoleküle wie z.B. das M-Protein von Streptococcus pyogenes. Streptokokken, Staphylokokken, Enterokokken binden auch an extrazelluläre Matrixsubstanzen wie z.B. Fibronektin, was die Haftfähigkeit im Gewebe erklärt. An dieser Bindung sind bei Staphylococcus aureus das Fibronektin-bindende Protein, welches auch kloniert und sequenziert wurde, und bei Enterococcus faecaüs die Aggregationssubstanz beteiligt. Invasine erlauben das Eindringen bzw. die Aufnahme in Zellen des Wirtsorganismus. Sie sind wichtig, damit die pathogenen Mikroorganismen nicht auf der Epithelschicht verbleiben, wo sie gleichsam Wind und Wetter ausgesetzt sind. Invasine sind mikrobielle Faktoren, die der Vermeidung der Infektabwehr dienen. Die intrazelluläre Phase kann bei obligat intrazellulären Mikroorganismen die Sicherung des Überlebens bedeuten und erschwert die Erkennung als fremd durch den Wirtsorganismus. Bei den fakultativ intrazellulären Bakterien (z.B. Legionella pneumophila, Mycobacterium tuberculosis) ist die Zelle eine Art Lebensabschnittsgefährte. Zu den Wirtszellen gehören sowohl professionelle Phagozyten, die eigentlich trainiert sind, eindringende Bakterien effizient abzuwehren, als auch Epithelien oder Endothelien. Das erfolgreiche intrazelluläre Überleben von Mykobakterien oder Legionellen in Makrophagen ist besonders bemerkenswert. Bei dem Übergang in die intrazelluläre Lebensphase werden entweder natürliche Phagozytoseprozesse benutzt (z.B. bei den von Makrophagen phagozy-

tierten Mykobakterien und Legionellen) oder eine Art Reißverschlußsyslem oder ein Triggermechanismus (Beispiele s. Tab. 1.2). Die Vermeidung der intrazellulären Bakterizidie erreichen Mikroorganismen z.T. dadurch, daß sie sich in atypischen Vakuolen aufhalten, die nicht mit den Lysosomen fusionieren (z.B. Legionella in replikativen Vakuolen, die nicht mit dem Lysosomenmarker LAMP-1 dekoriert sind) oder von dem endozytotischen in den exozytotischen Pfad wechseln (Chlamydien). Da das intrazelluläre Leben den Bakterien in bestimmten Phasen nützt, können einige Bakterien vorübergehend das normalerweise ausgelöste zelluläre Selbstmordprogramm (Apoptose; programmierter Zelltod), welches zur Freisetzung der Bakterien führen würde, unterbinden. Andere Bakterien hingegen (z.B. Shigella) induzieren die Apoptose, damit anschließend die aus der Zelle befreiten Bakterien an die basal lokalisierten ßplntegrine von Darmepithelien binden und diese von der Basis ausgehend zerstören können. Toxine

Die Fähigkeit von Bakterien, Krankheiten zu verursachen, ist in vielen Fällen das Ergebnis ihrer Toxinproduktion. Man unterscheidet zwischen Exotoxinen, die von den Bakterien sezerniert werden, und den Endotoxinen, die biologisch hochaktive Zellwandbestandteile gramnegativer Bakterien darstellen.

1.1 Grundlagen der Infektionslehre

Häufig werden Exotoxine, Enterotoxine (s.u.) und Endotoxine verwechselt. Die grundlegenden Eigenschaften beider Toxingruppen sind in der Tab. 1.3 zusammengefaßt. Die verschiedenen Toxine zeigen eine sehr unterschiedliche und z.T. sehr spezifische Toxizität. Tetanus- oder Botulinus-Toxine sind bakterielle Proteine mit der höchsten Toxizität, die wir kennen. Schon 100 ng reichen aus, um einen Menschen zu töten und 1 g, um die gesamte Menschheit zu vernichten, wenn nicht das Verteilungsproblem wäre. Exotoxine

Aufbau und Wirkmechanismus vieler Exotoxine sind dank der modernen Methoden der Zell-und Molekularbiologie im Detail gut bekannt (Tab. 1.4). Die Gene für Exotoxine sind entweder in temperenten Phagen (Scharlach-, Diphtherieund Botulinusloxin), in Plasmiden (Staphylokokken-Entcrotoxin und -Exfoliatin, E.coliEnterotoxine) oder im bakteriellen Chromosom lokalisiert. Die Exotoxine sind häufig sehr effizient an den Infektionsprozeß adaptiert. So ist z.B. das Staphylokokken-Enterotoxin sehr resistent gegenüber Magen- oder Darmenzymen, so daß es bei oraler Aufnahme seine Toxizität nicht

verliert. Eines der Bolulismus-Toxine hingegen ist in der vom Bakterium sezernierten Form inaktiv, es muß zuvor von Enzymen des Magens oder Darmes aktiviert werden. Die Wirkung anderer Toxine ist daran gebunden, daß die entsprechenden Rezeptoren auf der Zelloberfläche vorhanden sind. So gibt es beispielsweise im Säuglingsalter kaum Fälle von pseudomembranöser Enterokolitis, weil das entsprechende Zytotoxin nur vom ausgereiften Darm aufgenommen wird. Umgekehrt gibt es einen Säuglingsbotulismus, der entsteht, wenn Säuglinge mit Honig gefüttert werden, der die Sporen von Clostridium botulinum enthält. Im Säuglingsdarm keimen diese Sporen aus und produzieren das Botulinus-Toxin. Im Erwachsenenalter hingegen bedarf es der Aufnahme des präformierten Botulinus-Toxins, um an Botulismus zu erkranken. Die Erkenntnis, daß es Exotoxine sind, die eine Infektionskrankheit verursachen, war die Basis für die Entwicklung von Impfstoffen, bei denen entweder das Toxoid als aktive Impfung oder spezifische Antikörper als passive Impfung verabreicht werden. Das Toxoid ist ein chemisch modifiziertes Toxin, welches nicht mehr toxisch, jedoch unverändert immunogen

Tab. 1.3 Eigenschaften von Exotoxinen und Endotoxinen Exotoxine

Endotoxine

Sekretionsprodukte gram-positiver und -negativer Bakterien

Zellwandbestandteile gram-negativer Bakterien, die bei Zellteilung oder Zelltod freigesetzt werden

Polypeptide

Lipopolysaccharide, Lipid A-Teil für Toxizität verantwortlich

Relativ instabil, meist temperaturempfindlich (60° C)

über 2,5 h hitzestabil (100° C)

hoch immunogen, induzieren neutralisierende Antikörper

wenig immunogen, induzieren neutralisierende Antikörper

hochtoxisch, LD50 im Mikrogramm-Bereich

weniger toxisch, LD50 im Milligramm-Bereich

durch Formalin in nichttoxische, aber immunogene Toxoide umwandelbar (z.B. Diphtherie- oder Tetanus-Toxoid)

nicht in Toxoide umwandelbar

binden an spezifische Zeil-Rezeptoren

bindet an CD14 Rezeptoren und an das LPS-bindende Protein

verursachen meist kein Fieber, Ausnahmen sind die Exotoxine mit Superantigenwirkung

induzieren neben anderen unspezifischen Effekten die Freisetzung von Interleukin 1 und 6 sowie Tumornekrosefaktor aus Makrophagen und verursachen Fieber

Synthese oft Plasmid- oder Phagen-kontrolliert

Synthese chromosomal kodiert

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Allgemeine Infektionslehre

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Tab. 1.4 Bakterielle Toxine Toxin

Bakterienart

Wirkungsweise

Auswirkung in der Erkrankung

A-B-Typ Diphtherie-Toxin

Corynebacterium diphtheriae

ADP-ribosyliert den Wirtszell-ElongationsFaktor-2, beendet die Proteinsynthese

Schädigung des Herzmuskels und anderer Organe

Cholera-Toxin

V. cholerae

wäßrige Durchfälle

Shiga-Toxin

Shigella dysenteriae

ADP-ribosyliert ein regulatorisches Protein der Wirtszelle und unterbricht 1 dadurch die Kontrolle des cAMP spaltet rRNA der Wirtszelle und beendet die Proteinsynthese

Tetanus-Toxin

Clostridium tetani

Endopeptidase-Aktivität beeinflußt die Kontrolle der Reizübertragung im Nervensystem

spastische Lähmung

Botulismus-Toxin

Clostridium botulinum

Endopeptidase-Aktivität beeinflußt die Kontrolle der Reizübertragung im Nervensystem

schlaffe Lähmung

porenbildendes Toxin

erlaubt den Bakterien aus phagozytischen Vakuolen zu entkommen

Membranschädigung Listeriolysin Listeria monocytogenes

unklar

a-Toxin

Clostridium perfringens

Phospholipase

tötet Phagozyten, verursacht Gewebeschäden

Superantigen Toxic-Shock-Toxin (Toxic-ShockSyndrom)

Stapbylococcus aureus (grampositiv)

verstärkt Zytokin-Produktion von T-Zellen

Fieber und Schock

1

cAMP, zyklisches AMP

ist. so daß es als Impfstoff eingesetzt werden kann. Aufgrund ihrer biologischen Wirkungen lassen sich die Exotoxine in verschiedene Wirkgruppen einteilen, die im folgenden exemplarisch besprochen werden: Mein branschädigende Toxine 1. Enzymatische Wirkung. Das a-Toxin von Clostridium perfringens ist eine Phospholipase C, die das Lezithin der Zellmembran hydrolisiert und damit die Zelle abtötet (Abb. 1.5b). Es ist die Hauptursache für den oft tödlichen Ausgang des Gasbrandes. 2. Physikalische Wirkung. Das a-Toxin von Staphylococcus aureus führt zu einer funktionellen Pore der Wirtszellenmembran und dadurch zur Lyse der Zelle (Abb. 1.5a). 3. Durch Thiolgruppen aktivierbare Zytolysine. Diese Zytolysine (z.B. Streptolysin O, Pneumolysin, Tetanolysin, Listeriolysin und das

theta-Toxin von Clostridium perfringens) sind sauerstofflabil, durch Cholesterin hemmbar, werden durch reduzierende Agenzien aktiviert und wirken auf Erythrozyten hämolysierend. Jedoch können sie auch andere Zellen schädigen. 4. Andere membranschädigende Toxine. Staphylokokken-ß-Toxin (Hämolysin), Staphylokokken-y-Hämolysin, Staphylokokken-Leukozidin, das O2-stabile Streptolysin S der Streptokokken, a-Toxin von Clostridium novyi. Neurotoxine Zu den Neurotoxinen gehören die biologisch hochwirksamen Tetanus- und Botulinus-Toxine. Obschon die biologische Wirkung beider Toxine außerordentlich unterschiedlich ist, bestehen erhebliche Ähnlichkeiten. Bei beiden Toxinen handelt es sich um zinkabhängige Endopeptidasen, welche die Freigabe von Neurotransmittern unterbinden. Das Tetanustoxin blockiert inhibi-

1.1 Grundlagen der Infektionslehre

Abb. 1.5 a-b Wirkungsweise oberflächenschädigender Toxine. a) Einbau des Hämolysins beispielsweise von Staphylococcus au reu s in die Zellmembran, Entstehung einer funktionellen Pore, b) Destabilisierung der Zellmembran durch Abspaltung von Phosphatresten der Phospholipide (modifiziert nach SALYERS und WHITT).

torische Zwischenneurone (RENSHAW-Zellen) im Rückenmark, was zu unkontrollierter Aktivierung der motorischen Vorderhornzellen führt. Die spezifische neurotoxische Wirkung besteht in der enzymatischen Inaktivierung des Synaptobrevin/Vesicular Associated Membrane Complcx und damit in einer Blockierung der Freisetzung von Neurotransmittern über die Exozytose. Klinisch bewirkt dies eine spastische Kontraktion und tonisch-klonische Anfälle bei erhaltenem Bewußtsein. Das Botulinus-Toxin inhibiert die Erregerübertragung an cholinergen Synapsen und führt daher zu schlaffen Lähmungen von Skelettmus-

keln und zu einer Gleichgewichtsstörung zwischen dem sympatischen und dem parasympatischen Nervensystem. Das Botulinus-Toxin ist ein Neurotoxin, welches die Freisetzung von Azetylcholin verhindert. Es handelt sich um eine Metalloprotease, die in die Exozytose der neurotransmitterhaltigen Vesikel inhibierend eingreift. Enterotoxine Enterotoxine wirken auf Darmepithelien und führen zu einer verstärkten Sekretion von Flüssigkeit im Darm. Beispiele für Enterotoxine sind das Cholera-Toxin, Enterotoxine von Staphylo-

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Allgemeine Infektionslehre

coccus aureus und E. coli. Letztere werden auch als enterotoxische E. coli bezeichnet, sie sind für die sog. Reisediarrhoe verantwortlich. Superantigene Superantigene sind Proteine, die direkt an HLA-Moleküle der Klasse II, z.B. HLA-DR von Monozytcn und Makrophagen und an den variablen Teil der ß-Kettc (Vß) des T-Zellrezeptors binden. Dies bewirkt eine massive Freisetzung von Intcrleukin 2 und Interferon-y aus TZellen, welches dann eine Freisetzung von Interleukin 1, Tumornekrosefaktor und weiteren Zytokinen zur Folge hat. Klinisch manifestiert sich der „Zytokin-GAU" als Schock. Superantigene sind beispielsweise das Toxic-Shock-Syndrom Toxin 1 und die Enterotoxine von Staphylococcus aureus bzw. die erythrogenen Toxine A und C von ß-hämolysierenden Streptokokken der Gruppe A (Ursache des streptococcal toxic shock syndrome) (s. auch Kapitel 4.2). AB-Toxine: Viele bakterielle Toxine gehören dem sog. AB-Typ an (Diphtherie-Toxin, Cholera-Toxin, Shiga-Toxin, Tetanus-Toxin, Botulinus-Toxin), welches aus einem Heterodimer mit

einer A- und einer oder mehreren B-Untereinheiten besteht (Abb. 1.6a). Beide Untereinheiten sind durch eine Disulfid-Brücke verknüpft. Die B-Untereinheit bindet an die Zelle, während die A-Untereinheit für die toxische Wirkung verantwortlich ist (Abb. 1.6b). Bei einigen Toxinen vom AB-Typ wurde eine enzymatische Wirkung nachgewiesen. Dazu gehört die Endopeptidase-Aktivität des Tetanus- und des Botulismus-Toxins (s.o.) und die Fähigkeit der ADPRibosylierung von Proteinen. Die ADP-ribosylyierenden Toxine können unterschiedliche biologische Aktivitäten entfalten, weil sie verschiedene Proteine ribosylieren (Abb. 1.7). So führt die ADP-Ribosylierung des Diphtherie-Toxins zu einer Inaktivierung des Elongationsfaktors 2, ein Faktor, der bei der Translation wichtig ist, während das Cholera-Toxin ein regulalorisches Protein der Wirtszelle ribosyliert und damit die Flüssigkeitssekretion auslöst. Zellwandbestandteile mit toxischer Wirkung

Endotoxine sind hitzestabile Komplexe aus Lipopolysacchariden (LPS), die sich in der äußeren Zellmembran von gramnegativen Bakterien

Abb. 1.6 a-b Wirkungsweise von A-B-Toxinen. a) Einfache und komplexe A-B-Toxine. b) Bindung des Toxins über die B-Untereinheit und Translokation der A-Untereinheit, die die toxische Domäne aufweist, in das Zellinnere (modifiziert nach SALYERS und WHITT).

1.1 Grundlagen der Infektionslehre

Variabilität und Adaptationsfähigkeit sind daher auch bei Bakterien für das Überleben und den (Infektions-)Erfoig wichtige Eigenschaften. Grundsätzlich verfügen die Bakterien über die in Abb. 1.8 gezeigten Möglichkeiten, sich zu verändern (s. Kapitel 3.3). Die Kommunikation der Bakterien mit ihrer Umwelt bedient sich, je nach Bakterienart, verschiedener Sensoren, die pHWerte, Temperatur, Sauerstoffdruck. Nährstoffund Metabolitkonzentrationen wahrnehmen können. Wichtig ist für Bakterien auch, die eigene Populationsdichtc zu überwachen. Eine hohe Populationsdichte könnte als Signal verstanden werden, in eine mobile Phase einzutreten, um Biotope zu finden, in der die Konkurrenz um Nährstoffe geringer ist. Auch lohnt nur bei hoher Populationsdichte die Ausbildung von Systemen, die der Übertragung genetischer Informationen dienen. Für die Kommunikation miteinander benutzen die Bakterien häufig Botenstoffe, die über globale Regulatoren Regulationskaskaden in Gang setzen. Einige gramnegative Bakterien verfügen über ein Kommunikationssystem, das Bakteriendichte mißt und auch als Quorum Sensing bezeichnet wird (Abb. 1.9). Abb. 1.7 ADP-ribosylierende Toxine. Abspaltung der ADP-Ribosylgruppe von NAD und Ribosylierung eines Proteins, welches dadurch in die inaktive Form übergeführt wird (modifiziert nach SALYERS und WHITT).

befinden. Das LPS verursacht viele der für Infektionskrankheiten typischen Symptome und ist für schwere Schockzustände bei Infektionen durch gramnegative Bakterien verantwortlich (s. Kapitel 11.7). Peptidoglykane, die Hauptbestandteile der Zellwand von grampositiven Bakterien, haben allem Anschein nach viele Eigenschaften, die denen von Endotoxin ähnlich sind. Allerdings sind diese weit weniger gut charakterisiert.

Unter „Quorum" wird die für eine Abstimmung geringste Zahl an stimmberechtigten Mitgliedern verstanden. Das Quorum Sensing der Bakterien wurde erstmalig an Vibrio fischen und anderen Vibrio-Arten untersucht, die in hohen Konzentrationen als leuchtende Bakterien in den Lichtorganen einiger Fischarten vorkommen. Die bakterielle Luminiszcnz entsteht (vernünftigerweise) nur. wenn die Vibrionen in hohen Konzentrationen (highdensity) wie z.B. im Lichtorgan der Fische zusammenleben. Die Luminiszenz wird durch Autoinducer. die von den Bakterien abgegeben werden, in Gang gesetzt. Bei geringen bakteriellen

Bakterielle Adaptation, Kommunikation und Interaktion Umweltsignale Eine wichtige Voraussetzung für die erfolgreiche Invasion und Überwindung der Infektabwehr ist nicht nur das Vorhandensein von Pathogenitätsmerkmalen sondern auch die Fähigkeit, diese Merkmale koordiniert, auf die Situation angepaßt, zu exprimieren.

Abb. 1.8 Mikrobielle Möglichkeiten, sich zu verändern (modifiziert nach SALYERS und WHITT).

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Allgemeine Infektionslehre

Abb. 1.9 Wie stimmen Bakterien ab? Quorum sensing. Produktion einer Autoinducersynthetase, die zur Bildung von Autoinducern (Homoserinlakton) führt. Homoserinlakton diffundiert durch die bakterielle Zellwand. Bei hoher Populationsdichte kommt es zu einer Rückdiffusion genügender Mengen, so daß der zunächst inaktive transkriptionelle Aktivator aktiviert wird und die Promotoraktivität erhöht. Damit wird gleichzeitig die Transkriptionsaktivität zahlreicher weiterer Gene, zu denen auch das lux-Operon gehört, erhöht (modifiziert nach GREENBERC).

Dichten ist die Konzentration der Autoinducer so niedrig, daß sie intrazellulär keine Effekte verursachen können. Von einer Schwellenkonzentration an kommt es zur Autoinduktion, verstärkter Produktion des Autoinducers und erhöhter Transkription anderer Gene. Die Autoinducer der verschiedenen gramnegativen Bakterien gehören alle der chemischen Gruppe der Homoserinlaktone an. Pathogene Bakterien, bei denen Homoserinlakton-Signale nachgewiesen wurden, sind beispielsweise Pseudomonas aeruginosa, Aeronwnas, Citrobactei; Prnteus, Serratia und Yersinia.

Bei grampositiven Bakterien gibt es nur wenige detaillierte Vorstellungen über die Messungen der Bakteriendichte. Anstelle von Homoserinlaktonen einiger gramnegativer Bakterienarten werden Peptide von 5-10 Aminosäuren Länge produziert, die, wegen ihrer geringen Wahrnehmungskonzentration, z.T. auch als Sexpheromone bezeichnet werden. Bei Enterokokken bewirken die Sexpheromone, daß sich die bakterielle Oberfläche verändert und eine sog. Aggrcgationssubstanz gebildet wird. Die Bakterien verklumpen, so daß sie ihre Plasmide an den plasmidfreien Sexpheromon-produzierenden Stamm weitergeben können. Bemerkenswerterweise besitzen auch Peptide des Wirtsorganismus Scxpberomon-Eigcnschaften, so daß bei einer Infektion die Aggregationssubstanz gebildet wird. Diese wiederum besitzt Erkennungsmotive für Integrine, so daß eine Bindung an Integrin-positive Wirtszellen möglich ist. Eisenaufnahmesysteme

Bei vielen Krankheitserregern spielt die ausrei-

chende Versorgung mit Eisenionen eine für die Pathogenität wichtige Rolle. Unter anaeroben Bedingungen liegt Eisen in der leicht wasserlöslichen zweiwertigen Form vor, unter aeroben Bedingungen bilden sich schwerlösliche Fc3*Komplexe, die von Bakterien nicht direkt aufgenommen werden können. Innerhalb des Wirts kompetieren die Mikroorganismen um Eisen, das von Laktoferrin oder Transferrin mit hoher Affinität gebunden wird. Um an das wertvolle Eisen heranzukommen, bilden einige Mikroorganismen Siderophore, das sind Eisenbindeproteine mit Bindungskonstanten von 102"-10M). Die Siderophore gehören der Gruppe der Katecholate oder Hydroxamate an und können polyzyklisch aufgebaut sein. Verschiedene Bakterienarten können auch Siderophore anderer Spezies zur Eisengewinnung verwenden (Eisenschmarotzer). Die Fev-beladenen Siderophore binden sich an Rezeptoren, werden in das Zytoplasma transportiert, wo dann das dreiwertige Eisen zum zweiwertigen Eisen umgewandelt wird. Eine alternative Möglichkeit, Eisen aufzunehmen, besteht in der Bindung von Hämoproteinen (z.B. Hämoglobin) an bakterielle Rezeptoren. Mit Hilfe von ATP-abhängigen Permeasen wird Häm aus dem Komplex gelöst und in das Zytoplasma transportiert, wo es an Hämproteine wiedergebunden wird. Das Eisen kann auch aus dem Porphyrinkomplex freigesetzt werden und in den Eisenpool der Bakterienzelle übergehen.

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

Sekretionssysteme - Biochemischer Cross-talk

Neben den bakteriellen Stoffwechselprodukten, die toxische Wirkungen ausüben, besitzen einige gramnegative Bakterien eine Gruppe von sezernicrten Pathogenitätsmerkmalen, die genetisch häufig in Clustern, sogenannten Pathogenitätsinseln, organisiert sind und als Sekretionssysteme bezeichnet werden. Unter Sekretion wird hierbei der aktive Transport vom Zytoplasma über die innere und äußere Membran in den Kulturüberstand verstanden. Proteine, die über den Typ-IF und den Typ-IV- Sekretionsweg transportiert werden, besitzen eine ca. 30 Aminosäuren lange, meist hydrophobe Signalsequenz, die von einer periplasmatischen Peptidase abgespalten wird und den Proteintransport durch die innere Membran unterstützt. Der Proteintransport ist energieabhängig und erfordert zahlreiche akzessorische Proteine. Typisch für das TypIV-Syslem ist, daß im Gegensatz zum Typ-II-System alle Informationen, die für den Transport durch die äußere Membran erforderlich sind, bereits auf dem sezernierten Protein enthalten sind. Es wird daher auch als Autotransporter bezeichnet. Über diesen Weg werden beispielsweise die Gonokokken-Protease (IgG-Protease) und ein Toxin von Helicobacterpylori sezerniert. Die Sekretion über den Typ-I-Weg erfordert keine proteolytische Spaltung des Proteins, sie benötigt insgesamt auch nur drei Proteine: ein Protein für den Transport durch die innere Membran (inner membrane transport ATPase), ein Protein der äußeren Membran und ein Membranfusionsprotein, welches den periplasmatischen Spalt überbrückt. Typ-III-Sekretionssysteme sind, ebenso wie das Typ-I-Sekretionssystem, nicht auf eine periplasmatische Peptidase angewiesen, außerdem ist eine sekretorische Signalsequenz nicht erkennbar. Der Sekretionsapparat besteht aus ca. 20 Proteinen, die in der inneren Membran lokalisiert sind und Homologien mit dem Flagella-Biosynthesesystem aufweisen. Proteine, die auf dem Typ-III-Sekretionsweg sezerniert werden, sind offensichtlich dazu gedacht, daß sie direkt in das Zytoplasma der Wirtszclle transloziert werden, wo sie in die zelluläre Signaltransduktion eingreifen, immunologische Funktionen stören, eine Reorganisation des Zytoskeletts verursachen und damit die intrazelluläre Aufnahme des Bakteriums in effizienter Weise vorbereiten. Beispiele für Bakterien, die über ein Typ-III-Sekretionssystcm verfü-

gen, sind Yersinien, Salmonellen, Pseudomonas aeruginosa, möglicherweise auch die obligat intrazelluläre Bakterienart Chlamydia trachomatis und eine Reihe pflanzenpathogener Bakterien. Eine Zusammenstellung der mikrobiellen Abwehrmechanismen zeigt Tabelle 1.5. Literatur D OMANN , E.: Pathogenitätsfaktorcn bakterieller Krankheitserreger. Dtsch. Med. Wochenschr. 123:229-236 (1998). GRUÜNBERG . P.: Quorum sensing in Gram-negative bacleria. ASM News 63: 371-377 (1997). Hucck, C. J.: Type TTI protein secretion Systems in bacterial palhogens of animals and plants. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:379-433 (1998). MOCHMANN, H., und W. KÖHLER:. Meilensteine der Bakteriologie. 2. Aufl., Wötzel, Frankfurt/M 1997, pp. 300, 324ff. SALYERS. A. A.. and D. D. WIIITT: Baeterial Pathogenesis. American Society for Microbiology. Washington. USA, 1997.

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr BERNHARD FLEISCHER, BARBARA M. BROKER

1.2.1 Das Immunsystem Vielzeller sind eine attraktive Umwelt für Mikroorganismen. Die komplexen Organismen investieren einen Großteil ihrer Energie in die Homöostase, die Aufrechterhaltung des inneren Milieus mit seinen konstanten Parametern wie z.B. Temperatur. pH-Wert, Osmolarität und Angebot an Nährstoffen. Für Mikroorganismen ist die Anpassung an diese stabile Umgebung einfacher als Überleben und Vermehrung unter den stark wechselnden Bedingungen in der freien Natur. Um ihre Integrität zu wahren und den Befall durch Mikroorganismen auf ein verträgliches Maß zu beschränken, haben die vielzelligen Wirtsorganismen ein breites Spektrum von Abwehrmechanismen entwickelt. Hierbei lassen sich Mechanismen der angeborenen Resistenz von solchen der adaptiven Immunität unterscheiden. Die Resistenzmechanismen haben sich im Laufe der Phylogenese an ihre Aufgaben angepaßt. Sie sind sofort funktionsbereit, können aber nicht weiter für die Infektionen opti-

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Allgemeine Infektionslehre

BSSIlIll Mikrobielle Mechanismen zur Vermeidung einer Infektionsabwehr (modifiziert nach DOMANN) Mechanismus

allgemein

typische Beispiele

Toleranz

bakterielle Antigene induzieren schwache Immunantworten (z.B. durch molekulares Mimikry)

M-Protein (Streptokokken); Syphilis (Treponema pallidum)

Immunsuppression

Mikroorganismus schwächt Immunantwort (z.B. durch Töten infizierter Zellen des Immunsystems)

HIV

Ausweichen vor einer Immunantwort

intrazellulärer Lebensstil

Bruceila

Induktion unwirksamer Antikörper

induzierte Antikörper besitzen geringe Affinität oder sind gegen „unwichtige" Epitope gerichtet

Plasmodium; Trypanosoma

lösliche mikrobielle Antigene

freigesetzte Antigene fangen zirkulierende Antikörper ab

Trypanosoma cruzi; Candida albicans

schwach wirksame Antigene

Kapselpolysaccharide

tscherkhla coli; Gruppe B Meningokokken

Camouflage

Vortäuschen wirtseigenen Gewebes

Wirtsfibrin nach Hydrolyse durch Koagulase (Staphylococcus aureus)

Antigenvariation

Veränderung von Pili und äußeren Membranproteinen

Neisseria gonorrhoeae

Induktion einer Immunantwort unterbleibt

typischerweise bei lang persisitierenden Erregern

Erreger von Scrapie, Kuru, CREUTZFELDT-JAKOB,BSE

miert werden, denen der Wirt im Laufe seines Lebens tatsächlich ausgesetzt ist. Die Mechanismen der adaptiven Immunität haben sich in der Evolution später entwickelt. Sie werden erst mit einer Latenz von 4-5 Tagen nach Infektion wirksam, sind dann aber spezifisch für den jeweiligen Infektionserreger. Außerdem entsteht dabei ein Immungedächtnis, welches ebenfalls spezifisch für den Infektionserreger ist. Dieser kann dann bei einem zweiten Kontakt mit dem Wirtsorganismus viel effizienter abgewehrt werden. So kann sich die adaptive Immunität in der Ontogenese des Wirtsorganismus an dessen individuelle Infektionsrisiken anpassen. Resistenz und Immunität sind eng miteinander verzahnt: Resistenzmechanismen sind an der Initiierung der adaptiven Immunität beteiligt und die adaptive Immunität setzt viele Resistenzmechanismen als Effektorfunktionen ein, wodurch deren Wirkung zielgcnauer und auch effektiver wird. Deshalb erscheint die Trennung von Resistenz und Immunität oft künstlich. Für dieses Kapitel wählen wir eine breite Definition von Immuiisystem: Das Immunsystem umfaßt sowohl die angebore-

ne Resistenz als auch die adaptive Immunität. Entsprechend der Bedeutung der Abwehr ist das Tmmunsystem eines der größten Organe des Körpers. Dies wird jedoch nicht auf den ersten Blick deutlich, weil die Zellen und Organe des Immunsystems über den ganzen Körper verteilt sind. Mechanismen der angeborenen Resistenz

Die Keratinschicht der Haut bildet für viele Mikroorganismen bereits eine unüberwindliche Barriere. Mucopolysaccharide, welche von den Schleimhäuten abgegeben werden, haben eine ähnliche Funktion, da sie die Anheftung von Erregern verhindern. Hinzu kommen Selbstreinigungssysteme wie z.B. das Flimmerepithel der Atemwege. Auch die kommensale Flora, welche innere und äußere Körperoberflächen besiedelt, verhindert durch Konkurrenz um Ressourcen und durch anti-mikrobiell wirkende Sekretionsprodukte viele Infektionen. Ein intensiver Kontakt mit potentiell pathogenen Erregern findet über die Nahrung im Magen-Darmtrakt statt. Der niedrige pH des Magens bietet hier einen Schutz.

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

Wenn Mikroorganismen die Epithelien der Körperoberflächen überwunden haben, werden sie mit weiteren Abwehrmechanismen konfrontiert. Verschiedene Freßzellen (Phagozyten), nämlich Makrophagen und Granulozyten tragen

auf ihrer Oberfläche Rezeptoren für konservierte Oberflächenstrukturen von Bakterien, z.B. für LPS. Damit binden sie die Erreger, um sie danach aufzunehmen und zu verdauen. Die Phagozytose wird erheblich effizienter, wenn die Erreger durch Proteine des Komplementsystems markiert sind (Opsonisierung). Dieses Abwehrsystem besteht aus einer komplizierten Kaskade von Proteasen. nach deren sequentieller Aktivierung Zellen mit Proteinen beladen und lysiert werden (s. Kap. 1.2.5). Viele Mikroorganismen aktivieren mit ihrer Zelloberfläche direkt dieses System. Läßt sich eine Infektion durch diese Mechanismen nicht innerhalb von Stunden eliminieren, wird die nicht-adaptive Abwehrreaktion intensiviert: Es ensteht eine Entzündung. Blutgefäße werden weitgestellt (calor und rubor) und für Flüssigkeit und hochmolekulare Substanzen permeabel, so daß ein lokales Ödem entsteht. Außerdem werden mehr Phagozyten an den Infektionsherd gelockt (tumor). Aktivierte Makrophagen setzen Zytokine frei, die Hormone des Immunsystems. Die Zytokine Interlcukin (IL)-l und Tumornekrosefaktor

(TNF)-a erweitern und permeabilisieren die lokalen Kapillaren, aktivieren deren Endothelzellen und lösen dadurch die Extravasation weiterer Entzündungszellen aus, zunächst von neutrophilen Granulozyten, später auch von Monozyten. Die Kapillaren exprimicren zunächst Selektine, Adhäsionsmoleküle für Monozyten und neutrophile Granulozyten. Hierdurch entsteht ein lockerer, reversibler Membrankontakt zwischen den Endothelzellen und den Phagozyten, so daß die Zellen „klebrig" werden und im verlangsamten Blutstrom an der Gefäßwand entlangrollen. Hierbei tauschen sie weitere Signale mit den Endothelzellen aus, welche darauf mit der zusätzlichen Expression von weiteren Adhäsionsmolekülcn, z.B. CD54 (dem intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1) reagieren. Auf der Oberfläche der Phagozyten wird dessen Ligand CDlla/CD18 aktiviert. Die Zellen hören nun auf zu rollen und binden fest an das Endothelium. Sie quetschen sich daraufhin zwischen zwei Epithelzcllcn hindurch {Diapedese), lösen mit proteolytischen Enzymen die Basalmembran auf und wandern dann orientiert an Konzentrationsgradienten von chemotaktischen Faktoren durch das Gewebe zum Infeklionsort (Abb. 1.10). Chemotaktisch wirken sog. Chemokine, Produkte verschiedener Zellen des Immunsystems, aber auch Spaltprodukte des Komplementsystems.

Abb. 1.10 Stadien der Wanderung eines Granulozyten ins Gewebe.

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Allgemeine Infektionslehre

Die Zytokine der Makrophagen gelangen auch ins Plasma und haben dann systemische Effekte. Interleukin (IL)-l, Tumomckrosefaktor (TNF)a und IL-6 induzieren als starke endogene Pyrogene Fieber, sie lösen in der Leber die Akutphasereaktion aus, eine vermehrte Sekretion der Akutphase-Proteine, unter anderem von C-reaktivem Protein und Mannan-bindendem Lektin. Das C-reaktive Protein kann an die Oberfläche mancher Bakterien binden und sie für die Aufnahme durch Phagozyten opsonisieren, ebenso opsonisiert das Mannan-bindende Lektin, das an freies Mannan auf Bakterienoberflächcn bindet. Ferner induzieren diese Zytokine eine verstärkte Freisetzung von Granulozyten im Knochenmark. Bei einer Generalisicrung der Infektion, gerade mit gramnegativen Bakterien, kommt es zur systemischen Aktivierung der Makrophagen mit massiver Ausschüttung von entzündlichen (proinflammatorischen) Zytokinen wie TNF-a. Als Konsequenz einer solchen „systemischen Entzündung" kommt es zur allgemeinen Gefäßerweiterung und -permeabilisierung, die zum Blutdruckabfall, zu Ödemen in allen Organen und damit zu Multiorganversagen und Schock führen kann. Auf Befall mit Viren und auch anderen Erregern reagieren viele Körperzellen mit der Sekretion von Interferon-a (IFN-a) und IFN-ß (nicht zu verwechseln mit IFN-y, einem T-Zellzytokin). Diese Intcrferone induzieren einen antiviralen Status in den benachbarten Zellen. Außerdem aktivieren IFN-a und IFN-ß die Natural-KillerZellen (NK-Zellen), die als wichtige Zellen der natürlichen Resistenz ohne vorherige Immunisierung in der Lage sind, infizierte und transformierte Zellen des Körpers zu zerstören (s. Kap. 1.2.9). Interferone fördern auch die adaptive Immunantwort. Alle diese angeborenen Resistenzmechanismen stehen dem Organismus jederzeit sofort zur Verfügung (first line of defense). Sehr viele Infektionen werden durch sie verhindert, sehr früh eliminiert oder stark abgeschwächt.

der einzelne Lymphozyt besitzt Erkennungsstrukturen (Rezeptoren) mit der Spezifität für nur ein einziges bestimmtes Epitop. Auf die Erkennung ihres spezifischen Antigens reagieren einzelne Lymphozyten mit Zellteilung (klonale Expansion). In der Immunantwort wählen Antigene also aus einem vorhandenen Repertoire von Zellen mit vorgeformten Rezeptorspezifitäten diejenigen Zellklone aus, die spezifisch reagieren können (klonale Selektion; Abb. 1.11). Diese Rezeptoren sind auf B-Lymphozyten Antikörper, d.h. Immunglobuline (Ig), und auf T-Lymphozyten T-Zellrezeptoren (TcR). Es gibt eine sehr große Vielfalt von Antikörpern und TcR. ja man kann individuelle B-Zellen und T-Zellen und ihre Nachkommen an den feinen Unterschieden zwischen ihren Rezeptoren erkennen. Jede Zelle exprimicrl nur einen Antikörper bzw. einen T-Zcllrezeptor. Die Vielfalt der Rezeptoren, das Repertoire, entsteht also auf der Ebene der B- und T-Zellpopulationen. Die individuellen (klonotypischen) Rezeptoren jedes Klons unterscheiden sich besonders jeweils

Die adaptive Immunantwort Die adaptive Immunantwort setzt erst mit einer Latenz von einigen Tagen ein. Sie ist spezifisch für die Moleküle, die diese Immunantwort auslösten (Antigene), und wird von Lymphozyten getragen, den einzigen Zellen, die zu dieser Anligen-spezifischen Erkennung befähigt sind. Je-

Abb. 1.11 Prinzip der klonalen Selektion am Beispiel der Differenzierung eines B-Lymphozytenklones zur Plasmazelle. Nicht dargestellt ist die Bildung von Gedächtniszellen.

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

in ihrer Antigen-Spezifität. In der Regel binden sie nur an einen kleinen Bereich der antigenen Moleküle, die antigenen Determinanten oder Epitope. Mit Hilfe der großen Populationen der antigen-spezifischen Zellen kann das Immunsystem feine Unterscheidungen zwischen verschiedenen Antigenen treffen, hierauf beruht die Spezifität der adaptiven Immunantwort. Die Adaptivität entsteht durch vielfältige Veränderungen, welche beim ersten Kontakt mit einem Antigen im Verlauf der primären Immunantwort eingeleitet werden. Sie führen dazu, daß der wiederholte Kontakt mit demselben Antigen eine sekundäre Immunantwort auslöst. Hierbei ist die Reaktion wesentlich schneller, intensiver und an den Erregertyp angepaßt. Dieses Phänomen bezeichnet man als Immungedächtnis. Das Immungedächtnis ist spezifisch: Nur die Antigcne, mit denen sich das Immunsystem bereits auseinandergesetzt hat, können eine sekundäre Immunantwort auslösen; alle anderen werden mit einer primären Immunreaktion beantwortet, selbst wenn sie das Immunsystem gleichzeitig mit einem bereits bekannten Antigen treffen. Die Theorie der klonalen Selektion wurde von McFARLANF, BUR.NET in den 50er Jahren entwickelt, bevor die Natur der B-Zellen, T-Zellen und ihrer Rezeptoren bekannt war. Auch heute noch ist sie die beste Erklärung für die Abläufe der adaptiven Immunantwort und für viele Fragen der immunologischen Selbsttoleranz. Grundsätzlich erkennen aus einem breiten Repertoire von Zellen mit jeweils einem spezifischen Rezeptor nur wenige Klone ein gegebenes Antigen. Auf Reaktion mit dem Antigen proliferieren diese Klone stark (positive Selektion). Sie bilden einen Klon von Tochterzellen mit derselben Spezifität, die dann bei B-Lymphozyten zu Antikörper-produziercnden Plasmazellen differenzieren oder bei T-Lymphozyten zu Zytokin-produzierenden Helferzellen oder zytotoxischen Killerzellen. Bei der sekundären Immunantwort steht daher eine vergrößerte Zahl an Zellen mit dieser Spezifität zur Verfügung. Das Repertoire an spezifischen Lymphozytenklonen ist bei der Geburt bereits fertig. Es ist im Prinzip groß genug, um mit allen möglichen Antigenen reagieren zu können. Im Laufe der Entstehung des Immunsystems werden Lymphozyten mit Rezeptoren, die mit körpereigenen Strukturen reagieren (autoreaktive Zellen), durch negative Selektion eliminiert. Dies führt zur zentralen Toleranz (Abb. 1.11).

Die adaptive Abwehrreaktion besitzt zwei verschiedene Modi, die miteinander vernetzt sind: 1. Die humorale Immunantwort wird hauptsächlich durch Antikörper getragen, welche von B-Zellen und ihren Nachkommen in die Extrazellulärflüssigkeit sezerniert werden. Antikörper binden an lösliche Antigene in

nativer Form. Wichtig ist besonders die 3-dimensionale Struktur ihrer Epitope. Diese können chemisch sehr heterogen sein, Proteine, Zucker, Lipide u.a. Niedermolekulare, lösliche Moleküle, welche ein B-Zellepitop bilden und von Antikörpern spezifisch gebunden werden können, sind meist nicht in der Lage, eine Immunantwort auszulösen. Solche „unvollständigen" Antigene weiden als Haptene bezeichnet. Erst nach chemischer Kopplung an einen Träger (Carrier), meist ein großes Protein, können Haptene eine Antikörperantwort auslösen. 2. Dagegen sind T-Zellen die Effektoren der zellulären Immunantwort. Ihre Antigen-spezifischen Rezeptoren sind zellgebunden und erkennen als Epitope fast ausschließlich lineare Peptide, welche von anderen Zellen auf der Oberfläche aktiv präsentiert werden (Antigenpräsentation). Die Präsentationsstrukturen für diese Peptide sind Peptid-bindende Transportmoleküle, die MHC-Moleküle (s. Kap. 1.2.7). Nur auf diesen Komplex von Peptid und präsentierendem Molekül können T-Zellen reagieren, nicht auf das lösliche Peptid allein. Antigene, welche eine humorale und/oder eine zelluläre Immunantwort auslösen, bezeichnet man auch als Immunogene. Das Immunsystem kann aber auch mit Toleranz auf Antigene reagieren, d.h. weder eine humorale noch eine zelluläre Immunantwort gegen ein bestimmtes Antigen findet statt. Toleranz ist ein aktiver Prozeß: entweder werden Zellen mit bestimmter Spezifität bei der Entstehung des Immunsystems eliminiert (zentrale Toleranz), oder, wenn sie der zentralen Toleranz entkommen sind, im reifen Immunsystem unterdrückt oder zerstört (periphere Toleranz). Toleranz ist ebenfalls spezifisch für das jeweilige Antigen. Sie verhindert eine Immunantwort gegen Antigene des Organismus selbst (Autoantigene). Lymphozyten sind morphologisch nicht voneinander unterscheidbar. Wie die anderen Zellen des Immunsystems besitzen sie jedoch charakteristische Muster von Oberflächemnolckülen, welche sich mit Hilfe von spezifischen Antikörpern aus anderen Spezies, insbesondere mit monoklonalen Antikörpern, nachweisen lassen. Deshalb wurden funktioneil wichtige Zelloberflächenmoleküle zunächst durch die Bindungsprofile von monoklonalen Antikörpern charakterisiert, bevor ihre molekulare Identität aufgeklärt werden konnte. Alle monoklonalen Anti-

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Allgemeine Infektionslehre

körpcr, welche dasselbe Molekül binden, bilden einen ..düster of differentiation" (CD). Diese Cluster werden fortlaufend numeriert. Das durch den Antikörpcr-Cluster charakterisierte Oberflächenmolekül bekommt als „cluster determinant" dieselbe CD-Nummer. Die CD-Nomenklatur für Leukozytcn-Oberflächenmolekülc hat die Verständigung unter den Immunologen stark vereinfacht. Sie wird deshalb auch in diesem Kapitel verwendet (Tab. 1.6). Monoklonale Antikörper werden von monoklonalcn

Hybridomzcllen produziert, die durch Fusion einer defekten Plasmozytomzelle mit einem normalen B-Lymphozyten hergestellt wurden. Da sie zu 100% aus einem einzigen Typ molekularidentischer Antikörpermoleküle bestehen, sind sie nur gegen ein einziges F.pitop des Antigens gerichtet. Die meisten monoklonalen Antikörper stammen aus Hybridomzellen von Maus oder Ratte.

1.2.2 Zellen der Immunabwehr Die meisten Zellen des Immunsystems stammen aus dem Knochenmark und zirkulieren in bestimmten Phasen ihrer Entwicklung als weiße Blutzellen in den Gefäßen. Im Knochenmark entstehen sie, wie auch die Erythrozyten und Thrombozyten, aus selbsterneuernden Stammzellen. Nach einer Transplantation dieser Stammzellen kann sich das gesamte blutbilden-

de System rekonstituieren. Aus den Stammzellen entwickeln sich spezialisiertere Stammzellen, welche ein begrenztes Differenzierungspotential aufweisen, die myeloischen Vorläuferzellen und lymphoiden Vorläuferzellen (Abb. 1.12). Zellen der nicht-adaptiven Resistenz Die Zellen der nicht-adaptiven Resistenz entstammen fast alle der myeloischen Reihe. Es ist bemerkenswert, daß T-Lymphozyten die Bildung dieser Zellen durch Bildung von Koloniestimulierenden Faktoren stimulieren können. 1. Die Monozyten des peripheren Blutes können in die Gewebe einwandern und sich dort zu Makrophagen differenzieren, spezialisierten Phagozyten. Makrophagen präsentieren Antigen für T-Zellen und sind Effcktorzellen gegen Infektionserreger. Typische Oberflächenmoleküle sind CDllb, CD14 und MHC-II Moleküle. 2. Neutrophile Granulozyten sind ebenfalls potente Phagozyten, welche u.a. aufgenommene Bakterien abtöten können und eine zentrale Rolle in der akuten Entzündungsreaktion spielen. 3. Eosinophile Granulozyten greifen vielzellige Parasiten an, wenn diese durch Antikörper markiert sind.

Abb. 1.12 Schematische Darstellung der Hämatopoese. Die Differenzierung der Vorläuferzellen wird durch koloniestimulierende Faktoren gesteuert.

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

Tab. 1.6 CD - Nomenklatur wichtiger Oberflächenmoleküle CD-Nr.

Verteilung

MW

bekannte Eigenschaften

CD1a,b,c,c i Thy, LC

45

MHC Klasse l-ähnliche Moleküle, 4 versch. Gene

CD2 CD3

Thy, T, NK T

50 16-25

Adhäsionsmolekül, Ligand für CD58 TCR-assoziierte Transmembran-Glykoproteine (y, ö, t, £, >i)

CD4 CD5 CD7 CD8

T Subset, Mo T T T Subset

55 67 40 32

CD10

T, B, u.a.

100

Rezeptor für MHC-Il-Moleküle, assoz. mit Tyrosinkinase Lck Rezeptor für CD72 früher T-Zell-Marker Rezeptor für MHC-I-Moleküle, aß-Heterodimer, assoz. mit Tyrosinkinase Lck Neutrale Endopeptidase, CALLA

CD11a,b,c CD14 CD15 CD! 6

Leukoz. Mo, (B) Mo, Gr. NK, Mo, Gr.

150-180 Integrin a-Ketten, assoz. mit CD18, Rezeptoren für ICAM bzw. C3b 55 LPS-Rezeptor Lewis X 50-80 FcyRHI, niedrig affin, versch. Isoformen

CD18 CD! 9 CD20 CD21 CD23 CD25 CD28 CD32 CD40

Leukoz. B, FDC B B, FDC B, Mo, Eo akt. T, B, NK T Subset B, Mo, Gr B, DC

95 95 35 145 45 55 44 40 50

CD44 CD45

Leukoz. Leukoz.

CD54

breit

CD55 CD56 CD58

breit NK, akt.T breit

Integrin ß2 Untereinheit, assoz. mit CD11 gibt Signale an B-Zelle Regulation der B-Zellaktivierung und -proliferation Rezeptor für C3d und Epstein-Barr-Virus, reguliert B-Zellproliferation FCER mit niedriger Affinität a-Kette des IL-2 Rezeptors Adhäsions- und Signalmolekül, Ligand für CD80, CD86 FcyRH, versch. Isoformen Rezeptor für CD154 auf aktiv. T-Zellen, induziert Klassenwechsei, TNF-R homolog 80-95 Lymphozyten, verschiedene Isoformen 180-240 versch. Isoformen auf versch. Leukozyten, Tyrosin-Phosphatase, nötig für TCR-Funktion 85 ICAM-1 (Intercellular adhesion molecule-1), Ligand für CD1 1abc/CD18-lntegrine, Rezeptorf. Rhinoviren 60-70 Decay-accelerating factor (DAF), schützt vor Komplement-Lyse 185 N-CAM Isoform 55 Lymphocyte function associated antigen (LFA)-3, Ligand für CD2

CD64 CD72

Mo, DC B

72 42

hoch-affiner FcyRI Ligand für CD5, Signalfunktion an B-Zelle

CD74 CD79a,b

B, Mo, DC B

33-43 33, 39

invariante Kette der MHCII-Moleküle Iga, Igß, Membran-Ig assoziierte Proteine, Signaltransduktion

CD80 CD86 CD95

B,DC B, DC breit

60 60 42

CD122 CD132

akt. T, B, NK akt. T, B

70 64

CD152 CD154

akt.T akt.T

33 39

sog. B7.1 -Molekül, Ligand für CD28 und CD152 sog. B7.2-Molekül, Ligand für CD28 und CD152 Fas oder Apo-1, induziert Zelltod, Ligand für Molekül auf zytotox. Zellen IL-2Rß-Kette gemeinsame y-Kette der Rezeptoren für IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 und IL-15 CTLA-4, Ligand für CD80 und CD86, gibt inhibitorisches Signal Ligand für CD40, gibt Signal an B-Zelle

(vorwiegend)

B: B-Zellen, DC: interdigitierende dendritische Zellen, Eo: Eosinophile, f DC: follikuläre dendritische Zellen, Gr: Cranulozyten, LC: Langerhans-Zellen, Leukoz: Leukozyten, Mo: Monozyten/Makrophagen, NK: natürliche Killerzellen, T: T-Zellen,

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Allgemeine Infektionslehre

4. Basophile Granulozyten und 5. Mastzellen kommen im Bindegewebe und den Schleimhäuten vor, sezernieren vasoaktive Substanzen und sind u.a. wichtig für den Schutz der Schleimhäute. 6. Interdigitierende dendritische Zellen, oft einfach „dendritische Zellen" (DC) genannt, befinden sich besonders in den T-Zellarealen der lymphatischen Organe. Vorläufer dieser Zellen sind in fast allen Organen zu finden; die in der Haut nachweisbar sind die Langerhans-Zellen. Die Vorläufer nehmen Antigen auf, wandern in die lymphatischen Organe und präsentieren es dort T-Zellen. DC sind weitaus am besten in der Lage, T-Zellen zu aktivieren; sie sind „professionelle" Antigenpräsentiercnde Zellen (APC). Sie tragen CD80 und MHC-Il-Moleküle (s. Kap. 1.2.7). 7. Follikuläre dendritische Zellen (FDC) befinden sich in den Keimzentren der peripheren lymphatischen Organe. Sie binden dort Antigen/Antikörperkomplexc und präsentieren die Antigene den B-Zellen. Follikuläre dendritische Zellen stammen nicht aus dem Knochenmark wie die DC, sondern sie sind wahrscheinlich mesenchymalen Ursprungs. 8. Natural-Killer-Zellen (NK-Zellen) sind große granuläre Lymphozyten. Sie spielen eine wichtige Rolle in der Frühphasc von Virusinfektionen und bei der Abwehr von Tumorzellen. Sie tragen CD2 und CD16, aber keinen TcR und nicht CD3. Zellen der adaptiven Immunantwort Die Träger der adaptiven Immunreaktion sind die B- und T-Lymphozyten. Im Blut erscheinen sie als kleine, ruhende Lymphozyten, welche man ohne Bestimmung der Oberflächenmarker nicht voneinander unterscheiden kann. 1. B-Zellen entstehen in der fötalen Leber und im Knochenmark (bei Vögeln in einem speziellen Organ, der Bursa), sie tragen Immunglobulin (Ig) auf ihrer Oberfläche und können nach ihrer Differenzierung zu Plasmazellen Antikörper sezernieren, die Effektormoleküle der spezifischen humoralen Immunität. Sie sind erkennbar am Oberflächen-Ig, tragen MHC-Il-Moleküle und spezifische Marker wie CD19. CD2Ü, CD40. Eine Subpopulation von B-Lymphozyten exprimiert zusätzlich das CD5-Molekül (sog. Bl-Zellen). Diese Zellen scheinen sich in einer separaten Linie zu entwickeln und im Gegensatz zu nor-

malen B-Lymphozyten zur Selbsterneuerung fähig zu sein. Die von Bl-Zellen produzierten Antikörper, üblicherweise nur vom IgM-Typ, reagieren präferentiell mit mikrobiellen Antigenen wie Polysacchariden oder Phosphorylcholin. Die Funktion der CDS-positiven B-Zellen ist noch unklar. Manche von ihnen produzieren Antikörper gegen Autoantigene. Chronisch-lymphatische B-Zell-Leukämien scheinen vorwiegend von diesen Zellen zu stammen. 2. T-Zellen reifen im Thymus, sie sind CD2\ CD3~, TcR+. Die meisten T-Zellen tragen einen TcR aus ex- und ß-Kctte auf ihrer Membran. Zu ihnen gehören die CD4+ T-Helfcrzellen, welche die adaptive Immunantwort steuern, und die CD8+ zytotoxischen T-Zellen. welche als Effektoren der adaptiven zellulären Immunantwort infizierte Zellen lysieren können. Alle T-Zellsubpopulationen üben auch wichtige Regulatorfunktionen durch die Sekretion von Zytokincn aus. Eine Subpopulation von etwa 5% besteht aus Zellen mit einem TcR aus y- und 6-Kcttcn, diese yö-Zellen spielen eine Rolle in der Frühphase der Infektabwehr (s. Kap. 1.2.8).

1.2.3 Anatomie des Immunsystems Das Immunsystem besteht überwiegend aus beweglichen Zellen, die im Blut und in fast allen Geweben zirkulieren. Hierdurch wird sichergestellt, daß Erreger, welche meist über die Körperoberflächen in den Organismus eindringen, vom Immunsystem sofort wahrgenommen werden. Bei einer Immunreaktion müssen jedoch viele verschiedene Zeil-Populationen zusammenwirken; diese komplexen Kommunikationsvorgänge finden in spezialisierten lymphatischen Organen statt. Man unterscheidet zentrale und periphere lymphatische Organe. In den zentralen lymphatischen Organen reifen die Lymphozyten, Phagozyten und dendritischen Zellen, die peripheren lymphatischen Organe sind die Schaltstellen der adaptiven Immunität. Zu den zentralen lymphatischen Organen gehören das Knochenmark (beim Fötus die Leber als blutbildendes Organ) und der Thymus. Im Knochenmark entstehen die meisten Zellen des Immunsystems aus Stammzellen; die B-Zellen reifen hier auch. Dagegen können T-Zellen nur in einem spezialisierten Organ, dem Thymus, differenzieren (s. Kap. 1.2.7). Zu den peripheren lymphatischen Organen gehören die Lymphknoten.

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

die Milz und das Mucosa-assoziierte lymphatische Gewebe: Tonsillen, Peyersche Plaques und Appendix. Hier treffen die migratorischen Zellpopulationen des Immunsystems mit Antigen und residenten Zellen zusammen und orchestrieren die Immunantwort. Lymphknoten

AUS den Epitheloberflächen der Haut, der Atemwege und des Verdauungstrakts sowie aus den meisten soliden Organen wird die Extrazellulärflüssigkeit durch ein Netz von Lymphgefäßen drainiert. Die Lymphe transportiert dabei Antigene und Zellen des Immunsystems zu den Lymphknoten (Abb. 1.13). Lymphknoten sind kleine, von einer Bindegewebskapsel umgebene Organe, welche sich in Größe und Aufbau dynamisch an die Anforderungen der Immunantwort anpassen können. Dabei halten sie jedoch eine regelmäßige Organisation aufrecht. Die Lymphgefäße münden in einen Randsinus, der sich direkt unter der Kapsel des Lymphknotens befindet. Von hier sickert die Lymphe von außen erst durch den Cortex und danach durch die Mcdulla, bevor sie den Lymphknoten durch ein zentrales efferentes Lymphgefäß verläßt. Lymphknoten besitzen eine eigene Blutversorgung mit zuführender Arterie und ableitender Vene. Diese Gefäße haben eine Besonderheit: die postkapillären Venolen in der Medulla tragen ein kuboides Endothel (high endothelial venules). Durch diese Strukturen können Lymphozyten die Blutzirkulation verlassen und in den Lymph-

knoten einwandern. So können Lymphozyten sowohl aus den Geweben als auch aus dem Blut in die Lymphknoten gelangen. Im Cortex der Lymphknoten befinden sich die B-Zell-Areale: primäre B-Zellfollikel, in denen sich ruhende B-Zellen und follikulär-dendritische Zellen aufhalten, und die wesentlich größeren sekundären B-Zellfollikel. welche im Verlauf einer Immunreaktion entstehen und nach einigen Wochen wieder verschwinden. Sekundäre Follikel enthalten Keimzentren, hochorganisierte dynamische Strukturen mit starker B-Zellaktivierung und -prohferation. Hier treten aktivierte B-Zellen in intensiven Kontakt mit Antigen auf follikulär-dendritischen Zellen und mit antigenspezifischen T-Zellen. Dabei reift die Antikörperantwort (s. Kap. 1.2.4). Terminal differenzierte B-Zellen, welche Antikörper sezernieren (Plasmazellen), halten sich meist in der Medulla auf. Außerhalb der B-Zellfollikel, im parafollikulären Cortex sowie in der Medulla, findet man bevorzugt T-Zellen. Sie haben dort engen Kontakt mit einem dichten Netzwerk aus interdigitierenden dendritischen Zellen (DC) und Makrophagen. Milz Während die Lymphknoten darauf spezialisiert sind, Antigene aus den Geweben zu filtern, erfüllt die Milz diese Aufgabe für das Blut. Die Milzarterie verzweigt sich vielfach, und aus den feinen Arteriolen ergießt sich das Blut in die Milzsinus, ein Maschenwerk aus Bindegewebs-

Abb. 1.13 Schematische Darstellung der Struktur eines Lymphknotens. In dem von T-Zellen angefüllten Cortex des Lymphknotens liegen Lymphfollikel, die vorwiegend aus B-Zellen bestehen. Innerhalb des Follikels bilden sich Keimzentren als Ort der Proliferation und Differenzierung von B-Lymphozyten.

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Allgemeine Infektionslehre

zollen und Makrophagen. Dort werden gealterte oder veränderte (z.B. Plasmodien-infizierte) Erythrozyten entfernt, und das Blut wird in den Milzvenen wieder gesammelt. Die Milzarteriolen sind umgeben von periarteriolären lymphatischen Scheiden, dichten Ansammlungen von Lymphozyten, dendritischen Zellen und Makrophagen. Sie sind ähnlich organisiert wie ein Lymphknoten: Hier gibt es ebenfalls B-Zellfollikel, zum Teil mit Keimzentren, und T-Zellareale. Dieses lymphatische Gewebe wird in seiner Gesamtheit auch als weiße Pulpa bezeichnet. Die Milzsinus, welche von Blut durchströmt werden, heißen rote Pulpa. Eine wesentliche Aufgabe der Milz bei der Infektabwehr ist die Entfernung von opsonisierten Erregern aus dem Blut. Dies erklärt die hohe Anfälligkeit für Infektionen mit kapseltragenden Bakterien nach Milzentfernung. Mucosa-assoziiertes lymphatisches Gewebe

Viele Antigene gelangen mit der Atemluft oder mit der Nahrung in den Körper, deshalb ist die Immunüberwachung der Mucosa besonders intensiv. T-Zellen befinden sich direkt im Epithel oder aber zusammen mit Plasmazellen und Makrophagen unmittelbar darunter in der Lamina propria; Lymphgefäße leiten Antigene und Zellen in die regionären Lymphknoten. Darüberhinaus gibt es noch weitere spezialisierte Organe: den lymphatischen Rachenring mit den Tonsillen und die Peyerschen Plaques im Dünndarm. Tonsülen ähneln im Aufbau den Lymphknoten, allerdings gelangen Antigene nicht durch Lymphgefäße in das Organ, sondern direkt durch das Epithel. Dies geschieht besonders effektiv in den Krypten der Tonsillen, denn dort gibt es Bereiche, in denen das nicht verhornende mehrschichtige Plattenepithel des Mund- und Rachenraumes von einem einschichtigen Lymphoepithel abgelöst wird. Ähnlich verhält es sich bei den Peyerschen Plaques: auch hier übernehmen spezialisierte Epithelzellen, die M-Zellen, den Transport der Antigene aus dem Darmlumen in das lymphatische Gewebe. M-Zellen tragen keine Mikrovilli; aber sie pinozytieren auf der Seite des Darmlumens, und sezernieren in Richtung der lymphozytenreichen Areale. Das Immunsystem des Verdauungstraktes ist sehr groß und weist im Vergleich mit den Lymphknoten noch weitere Besonderheiten auf: Antikörper der Klasse IgA spielen eine zentrale Rolle beim Schutz der Schleimhäute vor Krankheits-

erregern; entsprechend sind in den Peyerschen Plaques B-Zellen besonders zahlreich. Sie machen 70% der Lymphozytenpopulation aus. Da das Immunsystem nicht mit den mit der Nahrung aufgenommenen Antigenen reagieren soll, ist neben der Bekämpfung von Mikroorganismen die Entwicklung und Erhaltung der Nahrungsmitteltolcranz eine wichtige Aufgabe des mucosalen Immunsystems. Deshalb führen oral aufgenommene Antigene oft zur spezifischen Toleranz (orale Toleranz). Rezirkulation

Dynamik ist die herausragende Eigenschaft des Immunsystems. Lymphozyten und Phagozyten sind bewegliche Zellen, die mit dem Blut im Gefäßsystem zirkulieren. Zusätzlich besitzen sie mit den Lymphgefäßen ein eigenes Kanalsystem. Die Rezirkulation dieser Zellen zwischen Geweben, lymphatischen Organen und Gefäßsystem ist ein geordneter Vorgang, der durch den Austausch von Signalen zwischen Immunzellen und Endothel gesteuert wird. Die Auswanderung von Lymphozyten aus den Gefäßen verläuft ähnlich wie die Granulozytenextravasation bei der Entzündung. Homing-Rezeptoren und Chemokinrezeptoren auf der Oberfläche der Lymphozyten sorgen dafür, daß die Zellen ihr Ziel, ihre „Heimat", finden, welche sie an komplementären Rezeptoren auf den Endothelzellen und am Muster der im Gewebe exprimierten Chemokine erkennen: Naive T-Zellen wandern z.B. bevorzugt in die Lymphknoten ein. um dort ihr Antigen zu erwarten. Dagegen steuern aktivierte T-Zellen die Gewebe an, wo sie ihre Effektorfunktionen ausüben. Die typischen Rezirkulationswege der Lymphozyten werden hier am Beispiel einer naiven T-Zelle beschrieben, welche gerade den Thymus verlassen und sich in den Blutstrom begeben hat. Aus den großen Arterien wird die T-Zelle durch eine Lymphknotenarterie in einen Lymphknoten getragen. Nach Passage der Kapillaren erkennt sie dann auf dem kubischen Epithel der postkapillären Venolen ihre Homing-Signale und wandert in den Lymphknoten ein. Dort hat sie die Chance, auf interdigitierenden dendritischen Zellen ihr Antigen zu treffen. Nun wird die TZelle aktiviert, und sie verläßt den Lymphknoten wieder durch das efferente Lymphgefäß am Hilus. Die efferenten Lymphgefäße sammeln sich z.T. nach mehreren Lymphknotenstationen in großen Lymphgefäßen, welche schließlich in

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

den Ductus Ihoracicus münden. Mit dem Lymphstrom gelangt die aktivierte T-Zelle nun über die Vena subclavia in den Blutkreislauf zurück. In Reaktion auf den Antigenkontakt hat sie ihre Ausstattung mit Homing-Rezeptoren verändert. Jetzt kann sie an das Epithel von Kapillaren binden und in das Gewebe auswandern. Trifft die aktivierte T-Zelle dort wieder auf ihr Antigen, übt sie für eine bestimmte Zeit ihre Effektorfunktionen aus. Danach folgt sie dem Lymphstrom, welcher sie durch ein afferentes Lymphgefäß wieder in einen Lymphknoten trägt. Auch T-Zellen, welche in der Peripherie ihr Antigen nicht finden, kehren regelmäßig in einen Lymphknoten zurück. Wenn Lymphozyten mit dem arteriellen Blut in die Milz gelangen, werden sie nach Passage der Arteriolen in die Milzsinus gespült. Von hier aus können sie in die periarteriolären lymphatischen Scheiden (weiße Pulpa) einwandern. Dort werden ihnen auf dendritischen Zellen Antigene präsentiert, welche aus dem Blut stammen. Aus der weißen Pulpa migrieren die Lymphozyten zurück in die Milzsinus und gelangen durch die Milzvenen wieder in den zentralen Blutkreislauf.

1.2.4 Humorale Abwehrmechanismen Die humorale Abwehr wird durch lösliche Moleküle vermittelt, welche im Plasma und in der Extrazellulärflüssigkeit entzündeter Gewebe zirkulieren. Zum humoralen Teil der natürlichen Resistenz gehört das phylogenetisch alte Kom-

plementsystem, das direkt durch Bakterienoberflächen aktiviert werden kann. Neben der Lyse des Erregers durch Porenbildung in seiner Membran führt die Komplementaktivierung zur Opsonisierung der Erreger. Der humorale Arm der adaptiven Immunität besteht aus den Antikörpern, die von B-Lymphozyten und Plasmazellen sezerniert werden. Bindung dieser Antikörper an Erreger löst verschiedene Effektormechanismen aus, viele werden durch T-Zellen vermittelt. Diese sind wichtige Schnittstelle zwischen dem humoralen und dem zellulären Arm der Immunabwehr. Antikörper Antikörper (Immunglobuline, Ig) kommen in hoher Konzentration löslich in der Extrazellulärflüssigkeit und im Serum vor. Sie sind das Substrat des humoralen Arms der adaptiven Immunität. Als ein typischer Vertreter soll zuerst das IgG-Molekül vorgestellt werden (Abb. 1.14). Es handelt sich beim IgG um ein Heterotetramer bestehend aus zwei gleichen Dimeren aus jeweils einer leichten L-Kette (ca. 24 kD) und einer schweren H-Kette (ca. 55 oder 70 kD). Es gibt zwei Typen von leichten Ketten: K-Ketten, welche beim Menschen auf etwa 80% der Antikörper vorkommen, und /.-Ketten, welche die restlichen 20% ausmachen. Schwere und leichte Kette sowie die beiden schweren Ketten sind durch Disulfidbrücken kovalent miteinander verbunden. Das IgG-Molekül gleicht einem Y mit einem Stamm und zwei gleichen Armen. Ein solches Y wird auch als „Antikörper-Monomer"

Abb. 1.14 Schematische Darstellung der Struktur eines menschlichen IgC-Moleküls.

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Allgemeine Infektionslehre

bezeichnet. An den Enden der beiden Arme befinden sich die Antigenbindungsstellen, auch Paratope genannt, während der Stamm die meisten Effektorfunktionen des Moleküls vermittelt. Die beiden Arme können fast beliebige Winkel ausbilden, weil die Peptidsequenzen am Übergang ähnlich wie ein Gelenk wirken und außerordentlich flexibel sind. Diese Aminosäuren sind deshalb auch besonders exponiert und durch Proteasen leicht angreifbar. Es gibt zwei klassische Spaltstellen im Ig-Molekül: Pepsin trennt den Stamm des Y unterhalb der verbindenden Disulfidbrücken ab; es entsteht ein F(ab')2-Fragment mit den beiden Antigenbindungsstellen, der Stamm wird zu kleinen Peptidfragmenten verdaut. Papain spaltet die beiden Arme einzeln ab; es entstehen zwei monovalente Fab-Fragmente mit jeweils nur einer Antigenbindungsstelle, der Stamm bleibt als FcFragment erhalten. Diese beiden Enzymreaktionen haben die Aufklärung der Ig-Struktur ermöglicht und werden heute noch häufig eingesetzt, weil bei vielen Anwendungen von Antikörpern kleine oder monovalente Moleküle benötigt werden. Die Ig-Ketten bilden unabhängig gefaltete Domänen aus, welche durch interne Disulfidbrücken stabilisiert werden. Von diesen besitzt die leichte Kette 2, die schwere Kette 4. Die N-terminalen Domänen beider Ketten unterscheiden sich stark zwischen verschiedenen Ig-Molekülen, sie werden deshalb als variable Domänen (VL bzw. VH) bezeichnet. Die Kontaktstellen zwischen den variablen Domänen der leichten und der schweren Kette befinden sich an den Enden der beiden Arme des Y, hier liegen die Antigenbindungsstellen des Antikörpers. Ein Sequenzvergleich zwischen verschiedenen Ig-Molekülen ergab, daß sich in den variablen Domänen Abschnitte von besonders ausgeprägter Polymorphie befinden, die hypervariablen Regionen. Die Aminosäuren der hypervariablen Regionen bilden Schleifen, welche mit dem Antigen in der Bindungstasche Kontakt aufnehmen und daher auch als „complementarity determining regions'" bezeichnet werden. Da ein IgG-Molekül aus zwei identischen Paaren aus leichter und schwerer Kette besteht, besitzt es auch zwei gleiche Antigenbindungsstellen. Die C-terminalen Domänen sind dagegen konstant und charakteristisch für die jeweilige Ig-Subklasse. Sie heißen konstante Domänen: CL bei der leichten Kette und CH1, CH2 und CH3 bei der schweren Kette. Die konstanten Domänen eines Antikörpers vermitteln seine

Effektorfunktionen (s.u.), während die variablen Domänen für die Erkennung des Antigens zuständig sind. Die Antigen-Antikörper-Reaktion Antikörper binden ihre Antigene in nativer Form, d.h. sie erkennen die drei-dimensionale Struktur von antigenen Molekülen. Dabei ist die Antikörperbindungsstelle des Antigens, das Epitop, in der Regel ein recht kleiner Bereich des Moleküls. Peptide, Kohlenhydrate, Lipide, ja sogar künstliche Moleküle, welche in der Natur nicht vorkommen, können Epitope für Antikörper sein. Dabei ist die Antigen-Antikörperbindung sehr spezifisch für die dreidimensionale Oberfläche des Epitops. Es handelt sich nicht um eine chemische Bindung, sondern um eine reversible physikalische Interaktion, welche sehr hochaffin sein kann. Die Bindungsstärke wird bestimmt durch die räumliche Paßform zwischen Antigen und Antikörper sowie durch elektrostatische Wechselwirkungen, Wasserstoffbrücken, van der Waals-Kräfte und hydrophobe Interaktionen zwischen den beiden Molekülen. Die Antikörper-Klassen Der Fc-Teil (Stamm) des Antikörpes vermittelt die Effektorfunktionen des Moleküls. Er wird durch konstante Domänen der schweren Ketten gebildet. Es gibt beim Menschen schwere Ketten verschiedener Isotypen; \i, ö, y, et und E. Nach ihnen teilt man die Antikörper in Klassen, z.T. mit Subklassen, ein: IgM, IgD, IgG (4 Subklassen), IgA (2 Subklassen), und IgE. Identische Antigenbindungsstellen können auf verschiedenen Isotypen vorkommen, so daß das gleiche Antigen verschiedene immunologische Konsequenzen auslösen kann. IgM ist der Membranrezeptor der naiven B-Zellen. IgM wird daher im Verlauf einer Immunreaktion als erster Isotyp sezerniert. Der Nachweis von spezifischen IgM-Antikörpern gegen einen Erreger ist deshalb ein Zeichen für eine frische Infektion. Da B-Zellen für einen Klassenwechsel zu anderen Isotypen unbedingt T-Zellhilfe benötigen, wird IgM über lange Zeiträume gebildet, wenn diese T-Zellhilfe fehlt. Dies ist charakteristisch für eine Antikörperreaktion gegen bestimmte Polysaccharide. Auf der B-Zellmembran kommt IgM in hoher Dichte als Monomer vor, sezerniert wird es dagegen als Penta- oder

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

Hexamer, die einzelnen Monomere durch eine J-Kette (joining-chain) verbunden (Abb. 1.15). Lösliches IgM hat also 10 oder 12 Antigenbindungsslellcn, und es bindet deshalb multivalente Antigene mit besonders hoher Avidität. IgM ist zu groß, um die Plazenta zu passieren. Dies ist ein Grund dafür, daß eine Erstinfektion der Mutter in der Schwangerschaft oftmals ein besonders hohes Risiko für den Föten mit sich bringt. IgM im Serum von Föten und Neugeborenen ist von diesen selbst gebildet und gibt deshalb einen Hinweis auf eine konnatale Infektion. IgM interagiert mit verschiedenen angeborenen Resistenzmechanismen: Ein einziges gebundenes IgM-Molekül kann bereits Komplement aktivieren. Dadurch kann IgM auch sehr effizient opsonisieren, d.h. die Phagozytose stimulieren. IgD kommt auf der B-Zellmembran der reifen B-Lymphozyten zusammen mit IgM als Rezeptor vor und ist dort ein wichtiger Regulator. Es wird praktisch nicht löslich abgegeben.

IgG ist das häufigste Immunglobulin im Serum (ca. 15 mg/ml). IgG wird nach einer Erstinfektion später gebildet als IgM, denn es kommt auf naiven B-Zellen nicht vor. Als einziger Isotyp passiert IgG die Plazenta und hat deshalb eine wichtige Funktion beim Schutz des Föten und Neugeborenen vor Infektionen. Bei ungünstigen Konstellationen, z.B. bei Rhesusinkompatibilität zwischen Mutter und Kind, kann der Fötus durch mütterliches IgG jedoch auch geschädigt werden. Die Serumkonzentrationen und Effektorfunktionen der verschiedenen IgG-Subklassen unterscheiden sich stark voneinander (Tab. 1.7). Gegen Proteine werden vorwiegend Antikörper der IgGl- und IgG3-Subklassen aber auch IgG4 produziert. Gegen Kohlenhydrat-Antigene werden besonders lgG2- (und auch IgG4) Antikörper gebildet, allerdings erst im zweiten Lebensjahr. Ein selektiver Mangel an Immunglobulin der IgG2- und IgG4-Subklasse ist nicht selten. Für diese Individuen sind ebenso wie für Klein-

Abb. 1.15 Schematische Struktur unterschiedlicher Immunglobulin-Isotypen. Die leichten Ketten sind nicht mitgezeichnet.

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Allgemeine Infektionslehre

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Tab. 1.17 Eigenschaften von Immunglobulinisotypen des Menschen

IgM

Serumkonz. (mg/ml)

Halbwertzeit (Tage)

Valenz

Bindung an C1q

1.5

10

10,12

+++

IgG, lgG2

8 4

22 22

2 2

lgC3

0.8

8

2

lgG4

0-4

22

2

IgA, lgA2 IgD

3 0.5 0.03

6 2-8

2,4, (6) 2, 4, (6) 2

IgE

0.0003

1-5

2

6

++ (+) ++ -

Bindung an CD16

Opsonisierung

+++

(über Komplement) ++

+++

+

+

+

_

+ +

+++

+

-

-: keine Bindung; (+): schwache Bindung; + bis +++: zunehmende Bindungsstärke

kinder Infektionen mit Kapsel-tragenden Bakterien besonders gefährlich. IgG4 wird auch besonders in allergischen Situationen und bei Wurmerkrankungen gegen Proteine gebildet. Mil den angeborenen Resistenzmechanismen kann igG auf zwei Arten zusammenwirken: Erstens aktivieren die Subklassen IgGl und IgG3 die Komplementkaskade sehr effizient, und zweitens besitzen Phagozyten und NK-Zellen spezifische Rezeptoren für IgG (Fcy-Rezeptoren), so daß diese Zellen durch gebundenes IgG aktiviert werden. IgA ist das häufigste Immunglobulin überhaupt. Im Serum stellt es zwar nur etwa 15% der Antikörper dar, aber es wird in großen Mengen auf die Schleimhautoberflächen sezerniert und verhindert dort die Adhärenz von Bakterien. So kommt IgA in hoher Konzentration auf den Schleimhäuten der Atemwege, des Verdauungstraktes, im Speichel, in der Tränenflüssigkeit und in der Milch vor. Die dominante Form von IgA im Serum sind Monomere (80%), aber IgA kann mit Hilfe einer J-Kette auch Dimerc bilden. Diese Dimere werden bevorzugt sezerniert. wobei sie die Epithelicn wie folgt durchqueren: Nachdem IgA-Dimere von der Plasmazelle in den extrazellulären Raum abgegeben wurden, binden sie an einen Poly-Ig-Rezeptor, welcher sich auf der basalen Seite der Epithelzellen befindet. Nun werden sie von den Epithelien in kleine Vesikel aufgenommen, an die apikale Seite transportiert und auf die luminalc Oberfläche gebracht. Hier wird der Poly-Ig-Rezeptor gespalten, das IgA gelangt an die Schleimhaut-

oberfläche, immer noch gebunden an ein 70 kD Fragment des Poly-Ig-Rezeptors, die sekretorische Komponente. IgA kann Komplement über den alternativen Weg aktivieren und über spezielle Fca-Rezeptoren an die Oberfläche von Makrophagen binden. IgE kommt im Serum nur in Spuren vor. Es wird von Mastzellcn und basophilen Granulozyten mit sehr hoher Affinität an Fce-Rczeptoren gebunden und so aus dem Serum entfernt. Bindung von Antigen an das gebundene IgE stimuliert dann diese Zellen zur Exozytose von vorgeformten Granula, und es kommt zur Ausschüttung von Histamin und anderen Mediatoren sowie von biologisch aktiven Proteinen. Dieser Mechanismus spielt eine wichtige Rolle bei der Abwehr von Parasiten und in der Pathogenese von allergischen Erkrankungen. Bei diesen Erkrankungen ist IgE im Serum erhöht. Effektorfunktionen der Antikörper

Wesentliche Schutzfunktionen der Antikörper werden durch die reine Bindung an Antigene vermittelt. Die am längsten bekannte Wirkung ist die Neutralisation von Exotoxinen verschiedener Bakterien, die besonders von IgGl- und IgG3-Antikörpern übernommen wird, auf den Schleimhäuten von IgA. In gleicher Weise wird die Infektiosität von Viren neutralisiert oder die Adhärenz von Bakterien oder Parasiten, die Voraussetzung für das Eindringen in Zellen oder Organe ist. Die Invasion von Erregern durch Schleimhautbarrieren oder ihre Ausbreitung im Gewebe ist oft von Enzymen abhängig, wie z.B.

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

Hyaluronidase, Proteinasen, Desoxyribonukleasen, gegen die ebenfalls funktionshemmende Antikörper gebildet werden können. Die spezifische Aktivierung des klassischen Weges des Komplementsystems durch den FcTeil ist ein wichtiger Abwehrmechanismus gegen extrazelluläre Infektionserreger. Sie führt einerseits zur Lyse des Mikroorganismus durch Porenbildung, zum anderen aber zur Opsonisierung als erleichterte Phagozytose. Der Fc-Teil des Antikörpers kann auch zelluläre Mechanismen in Gang setzen. Diese Mechanismen werden bestimmt von der Verteilung von Fc-Rezeptoren auf verschiedenen Effektorzellen, sie führen zur Aufnahme von Antikörper-bedeckten extrazellulären Erregern in Phagozyten oder zur Abtötung oder Schädigung von Erregern durch entsprechend armierte Zellen (Tab. 1.8). Eine durch Antikörper erleichterte Phagozytose durch neutrophile Granulozyten und Makrophagen ist ein wichtiger Mechanismus zur Abwehr von extrazellulären Bakterien. Dieser Mechanismus arbeitet im Konzert mit der erleichterten Phagozytose über Komplement-Rezeptoren nach Komplementaktivierung. Zytotoxische Effektorzellen, die den Fcy-Rezeptor III (CD16) tragen, können durch eine Anhäufung von IgGMolekülen auf Zellen oder Parasiten zur Lyse aktiviert werden. Die Zellen, die das CDI6-M0lekül tragen, gehören dem nicht-adaptiven Immunsystem an, die Spezifität wird durch den Antikörper vermittelt. Natural-Killer-Zellen, neutrophile und eosinophile Granulozyten üben diese Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxi-

zität (ADCC) aus. Sie wird besonders durch igGl- und IgG3-Antikörper aktiviert und führt zur Zerstörung von Antikörper-bedeckten Zellen. Ein ähnlicher Mechanismus besteht in der

Aktivierung von Mastzellcn, eosinophilen und basophiien Granulozyten über den hochaffinen Rezeptor für IgE. Die Zellen werden aktiviert, den Inhalt ihrer Granula freizusetzen und so Parasiten zu schädigen oder eine Entzündungsreaktion auszulösen.

B-Lymphozyten Als Teil der adaptiven Immunität ist die Antikörperantwort hoch spezifisch für die Antigene, mit denen der Organismus sich auseinandersetzt. Dabei ist die Flexibilität des Immunsystems erstaunlich: selbst gegen künstliche Materialien, denen die Spezies in der Evolution niemals begegnet sein kann, können spezifische Antikörper gebildet werden. Das Immunsystem scheint auf das Unvorherschbare vorbereitet zu sein. Tatsächlich wird vom Immunsystem bereits vor jedem Kontakt mit Antigen eine sehr große Vielfalt von Antikörpcrspezifitäten gebildet: Man schätzt das Repertoire auf 109—10'' verschiedene Spezifitäten. Eine sinnvolle Immunantwort entsteht daraus aber erst durch die genaue Regulation dieser Vielfalt. Dabei wird das Immunsystem mit schwierigen Problemen konfrontiert: 1. Auf konventionelle Weise hintereinander kodiert, würden die Gene für die Antikörper den gesamten Platz auf der DNA verbrauchen. 2. Es wäre unökonomisch, ja unmöglich, alle Antikörperspezifitäten in der Konzentration zu produzieren, wie sie für die Errcgerkontrolle notwendig wäre. Antikörper sollten in hoher Konzentration nur gegen die Mikroorganismen erzeugt werden, mit denen sich der Organismus tatsächlich auseinandersetzen muß. 3. Der Beitrag der adaptiven Immunität zur Infektabwehr ist ihre Lernfähigkeit, das Immungedächtnis. Bei wiederholter Auseinandersetzung mit demselben Er-

Tab. 1.8 Fc-Rezeptoren Rezeptor

Affinität zum Fc-Teil

Expression vorwiegend auf

Funktion

FcyRI (CD64)

hoch

Makrophagen, interdig. dendritische Zellen

Aufnahme von Immunkomplexen

FcyRIl A(CD32)

mittel

Makrophagen, Granulozyten

Aufnahme von Immunkomplexen

FcyRIl B (CD32) mittel

B-Lymphozyten

FCYRIM (CD16)

niedrig

NK-Zellen

negative Regulation der Antikörperproduktion Zytotoxizität

niedrig

Granulozyten Mastzellen, eosinophile und basophile Granulozyten

FaRI

sehr hoch

Zytotoxizität, Mediatorausschüttung Degranulation, Mediatorausschüttung

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Allgemeine Infektionslehre

reger muß die Antikörperantwort schneller, intensiver und mit höherer Affinität erfolgen. 4. Mit dem großen Repertoire der Anlikörperspezifitäten entsteht auch eine große Gefahr: Das Antikörperrepertoire wird unabhängig vom Antigenkontakt angelegt. Dabei ist nicht zu verhindern, daß Spezifitäten entstehen, welche an Epitope des Organismus selbst binden: autoreaktive Antikörper. Solche Antikörper gefährden den Organismus; ihre Produktion muß verhindert werden, damit die Selbsttoleranz erhalten bleibt.

Die Kontrolle der Antikörperantwort wird durch Regulation ihrer Produzenten, der B-Zellen, ermöglicht. Wenn die Antikörper auf der BZelloberfläche an ihre Epitope binden, erhalten die B-Zcllen Signale, die Wachstum, Differenzierung zu Antikörper-sezernierenden Plasmazellen, Klasscnwechsel oder auch den Tod der BZelle zur Folge haben können. Aus dem Konzert der Reaktionen individueller B-Zellen auf ihre Antigene entsteht so die Antikörperantwort. Entstehung des Antikörperrepertoires Während ihrer Reifung im Knochenmark muß sich jede B-Zelle auf eine Antikörperspezifität festlegen. Die Gene für ihren Antikörper findet sie jedoch nicht fertig vor; vielmehr muß sie diese durch somatische Rekombination (oder Rearrangement) von verschiedenen Genelementen erst zusammenstellen. Hierbei werden bei dem Zusammenbau der schweren Kette je ein V („variable")-, ein D („diversity")- und ein J („joining")-Element zufällig ausgewählt und zusammengefügt (Abb. 1.16). Bei den leichten Ketten fehlen die D-Elemente. Die rekombinierten V, D und J-Elemente kodieren für die variable Domäne der Antikörper. Auf RNAEbene wird dieser Genabschnitt an das jeweilige C-Element angesetzt („gespleißt"), die für die konstanten Domänen des AK kodieren. Die Organisation der Ig-Genloci ist in Abb. 1.16a dargestellt. Durch die kombinatorische Verknüpfung der V-, D- und J-Elemente und durch die stochastische Paarung von schwerer und leichter Kette in jeder B-Zellen wird bereits eine beachtliche Vielfalt von Antigenspezifitäten erreicht. Es können z.B. durch die Rekombination etwa 104 verschiedene VH-Domänen erzeugt werden, jedoch in jeder B-Zelle nur eine. Darüberhinaus gibt es zwei Mechanismen, die diese Möglichkeiten noch wesentlich erweitern: 1. Die Rekombination der V-, D- und J-Ele-

mente ist nicht präzise; durch Leserasterverschiebungen ergeben sich neue Aminosäuresequenzen. Außerdem fügt das Enzym terminale Desoxyribonukleotidyl-Transferase nach einem Zufallsprinzip an den Verknüpfungsstellen weitere Basen ein. Hierdurch entstehen Nukleotidsequenzen (N-Regionen), welche auf der DNA nicht vorhanden waren. 2. Nachdem das Rearrangement beendet ist. kann der Antikörper eines B-Lymphozyten im Laufe der Immunantwort in der Peripherie noch weiter reifen. Hierbei werden im variablen Teil der rearrangierten DNA Punktmutationen (somatische Mutationen) eingefügt. Diese Mutationen werden insbesondere in den hypervariablen Regionen gefunden, welche die Kontaktpunkle mit dem antigenen Epitop sind; sie erhöhen die Affinität des Antikörpers. Zwar spielt der Zufall eine große Rolle bei der Erzeugung des Antikörperrepertoires, aber trotzdem handelt es sich um einen geordneten Prozeß. Damit die Spezifität der Antikörperantwort über die Aktivität der B-Zellen reguliert werden kann, muß gewährleistet sein, daß jede individuelle B-Zelle nur eine Antikörperspezifität ausbildet. Sie hat aber zwei Genloci für schwere und vier Genloci für leichte Ketten. Mechanismen des Allelausschlusses (allelic exclusion) verhindern, daß eine B-Zelle mehr als eine Antikörper-Spezifität produziert. Allerdings kann die Rekombination der leichten Kette wieder aufgenommen werden (RezeptorEdition), wenn der entstandene B-Zellrezeptor den Anforderungen nicht genügt, weil er z.B. ein Autoantigen bindet. Bei der Rezeptor-Edition wird eine bereits rearrangierle K-Kette erneut rearrangiert. Ist dies unmöglich oder nicht erfolgreich, wird das zweite K-Allel oder sogar eine X-Kette rearrangiert. Schlagen alle Versuche fehl und kann die B-Zelle endgültig keinen „nützlichen" Antikörper bilden, dann muß sie sterben. Eine reife naive B-Zelle bildet gleichzeitig membrangebundenes IgM und IgD mit gleichem VH durch eine lange mRNA für u-Kette und gleichzeitig ö-Kette. Wird die Zelle aktiviert, erfolgt ein Übergang von membrangebundenem Immunglobulin zur sezernierten Form (nur noch IgM), ebenfalls durch Prozessierung der RNA. Durch das Herausspleißen der Kodons für die C-terminalen hydrophoben Aminosäuren entstehen schwere Ketten, welche sich nicht mehr in der Membran verankern können und deshalb sezerniert werden.

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

a

Abb. 1.16 a-c ) Organisation der Gene für die verschiedenen Ketten humaner Immunglobuline auf den Chromosomen. b) Rekombination der humanen Immunglobulingene. In der Keimbahnkonstellation liegen VH-, D- und J-Gene getrennt. Nach DJ-Rekombination und VDJ-Rekombination liegt ein vollständig rekombiniertes Antikörper-Gen in der B-Zell-DNA vor. Es wird hier zunächst ein Transkript für IgM und IgD abgelesen, die die Membranrezeptoren des Lymphozyten bilden. c) Immunglobulin-Klassenwechsel. Der Wechsel des Isotyps des produzierten Antikörpers erfolgt durch Rekombination, indem der VDJ-Komplex an ein anderes CH-Gen herangebracht wird.

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Allgemeine Infektionslehre

Klassenwechsel Im Laufe der klonalen Expansion des B-Lymphozyten nach Antigenkontakt kommt es zu einem Wechsel der Klasse des produzierten Immunglobulins. Hierbei findet eine weitere Rekombination der Antikörpergene statt: das rekombinierte VDJ-Gensegment der schweren Kette wird an ein Gen für einen anderen konstanten Teil der schweren Kette gesetzt (s. Abb. 1.16c). wobei die dazwischen liegende DNA mit anderen C-Genesegmenten deletiert wird. Somit produziert der B-Lymphozyt den Antikörper der gleichen Spezifitäl erst als membranständige IgM- und IgD-Moleküle, dann als sezerniertes IgM, schließlich als igG, igA oder IgE. Der Klassenwechsel ist abhängig von der Interaktion der B-Zelle mit T-Helferzellen. Er ist irreversibel, da die dazwischen liegenden Gensegmente für andere H-Ketten deletiert werden. Ablauf der B-Zellantwort In ihrer Art, B-Lymphozyten zu aktivieren, unterscheidet man zwei Arten von Antigenen: TZeil-abhängige (oder auch Thymus-abhängige) und T-Zell-unabhängige Anligene. Bei T-Zell-abhängigen Antigenen, die üblicherweise Proteine sind und wenig repetitive Epitope haben, gibt die Bindung an Immunglobuline auf der Membranoberfläche das erste Signal für die B-Zcllaktivierung. Dieses erste Signal ist notwendig aber in der Regel noch nicht hinreichend: ein zweites Signal muß erfolgen, um B-Zellproliferation und -Differenzierung auszulösen. Das zweite Signal erhalten B-Zellen von T-Helferzellen, welche dasselbe Antigen (jedoch ein anderes Epitop) erkennen und dadurch aktiviert werden. Auf molekularer Ebene besteht das zweite Signal für B-Zellen in der Ligation ihres Oberflächenmoleküls CD40 durch seinen Liganden, CD40-L (CD154), der auf der Oberfläche der T-Zelle exprimiert wird. Hinzu kommen Signale durch Zytokine, wie z.B. Interleukin-4, welche von aktivierten T-Zellen sezerniert werden. Nach heutigen Vorstellungen läuft die T-Zellabhängige Antwort wie folgt ab: Nachdem sie auf ihr Antigen gestoßen sind, hören die naiven B-Zellen auf zu wandern und nehmen in den T-Zellarealen der sekundären lymphatischen Organe Kontakt mit T-Helferzellen auf. Danach wandern einige von ihnen in die

Nähe primärer B-Zellfollikel und die Keimzentrumsreaktion beginnt. Die aktivierten B-Zellen bilden einen Fokus von proliferierenden Zellen und verdrängen dabei die ruhenden follikulären B-Zellen aus dem Netzwerk der follikulär-dendritischen Zellen. Die ruhenden B-Zellen bilden nun eine Mantelzone um das entstehende Keimzentrum. Außerdem wandern aktivierte T-Zellen in das Keimzentrum. Ein Teil der Zellen differenziert zu Plasmazellen. die für einige läge hohe Mengen an IgM produzieren und dann absterben. Die weiter proliferierenden B-Zellen nehmen weiter Antigen auf, präsentieren es T-Helferzellen und erhalten weitere Signale, die sie zum Klassenwechsel zu IgG, IgA oder IgE befähigen. Nach dem Klassenwechsel tragen die B-Zellen ihren spezifischen Antikörper entsprechend als IgG. IgA oder IgE auf der Oberfläche. Gleichzeitig kommt es in den Genen für die variablen Teile des Antikörpers zu somalischen Mutationen, die den Antikörper (den die B-Zellen auf der Oberfläche tragen) verändern. Durch die starke Vermehrung der B-Zellen und die allmähliche Eliminierung des Antigens müssen individuelle B-Zellen jetzt um das Antigen konkurrieren. Natives Antigen befindet sich als Immunkomplex auf der Oberfläche der follikulärdendritischen Zellen gebunden an Fc-Rezeptoren oder Komplement-Rezeptoren. Es wird in kleinen Mengen freigesetzt. Solche B-Zellen, deren Antikörper durch die Mutationen besser Antigenmolcküle binden können, können Antigen besser aufnehmen und präsentieren. Sie haben dann eher eine Chance, Hilfe von T-Helferzellen zu erhalten und werden bevorzugt proliferieren. Dies ist wiederum eine klonale Selektion, durch die sich im Lauf der Immunantwort B-Zellen anreichern, bei denen die somatischen Mutationen zu einer höheren Affinität geführt haben (Affinitätsreifung). Diese B-Zellen durchlaufen weitere Runden von Proliferation, Mutation und Selektion oder sie differenzieren sich zu Plasmazellen oder zu Gedächtnis-B-Zellcn und hören auf zu proliferieren. Offenbar konkurrieren die einzelnen B-Zellen eines Keimzentrums heftig um die Ressourcen, und diejenigen mit der höchsten Affinität zum Antigen haben dabei große Vorteile. Nur so ist es vorstellbar, daß nach wenigen Wochen sehr viele B-Zellen in den Keimzentren die äußerst seltenen Punktmutationen tragen, welche eine höhere Affinität zum Antigen vermitteln. Ist der Antikörper aber durch die Mutationen ungünstig verändert und

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

kann Antigen nicht mehr binden, erhalten diese B-Zellen keine Hilfe mehr und müssen sterben. Ebenso werden B-Zellen, deren Antikörper-Rezeptor autoreaktiv geworden ist, keine T-Zellhilfe erhalten und auch sterben. Da im Laufe einer Infektion die Antigene des Erregers lange und in großen Mengen im Organismus vorhanden sind, fuhren diese molekularen Vorgänge dazu, daß die meisten für diesen Erreger spezifischen B-Zellen den Klassenwcchsel durchführen. Bei einer Zweitreaktion gegen diese Erreger ist in der Regel spezifisches IgM nicht nachweisbar. Außerdem reagiert durch die höhere Zahl an Gedächtniszellen das Immunsystem bei der sekundären Immunantwort schneller, der Antikörperanstieg erfolgt ohne Latenz. Schließlich ist die durchschnittliche Affinität der IgG-Antikörper zum Antigen deutlich größer als zu Beginn der primären Immunantwort. Klassenwechsel und Affinitälsreifung gibt es nur bei der Immunreaktion auf Thymus-abhängige Antigene. da diese Vorgänge auf die Kooperation von antigenspezifischen T-Zellen angewiesen sind . T-Zell-unabhängige (oder auch Thymus-unabhängige) Antigene sind in der Lage, B-Zellen ohne die Hilfe von T-Lymphozyten zu aktivieren und zur Sekretion von Immunglobulin zu bringen. Sie bestehen typischerweise aus sehr repetitiven Strukturen wie z.B. den Polysacchariden auf der Oberfläche bekapselter Bakterien. Hier sind in regelmäßiger Anordnung viele gleichartige Epitope exponiert, welche beim Kontakt mit der spezifischen B-Zelle viele Membranantikörper gleichzeitig engagieren. Dadurch werden die Antikörper auf der Zelloberfläche vernetzt, und diese räumliche Ballung der Immunglobuline auf der B-Zellmembran löst im Zytoplasma die Aktivierungsvorgänge aus. Die T-zellunabhängige Antikörperantwort wird insbesondere von CD5+ Bl-Zellen hervorgebracht. Da keine T-Zellhilfe zur Verfügung steht, findet kein Klassenwechsel statt, es werden nur IgM-Antikörper gebildet. Diese Antikörper enthalten auch keine oder kaum somatische Mutationen, es findet keine Affinitätsreifung statt. Solche Antikörper schützen insbesondere gegen extrazelluläre Bakterien, die durch Polysaccharidkapseln die Phagozytose verhindern. Die Antigene dieser Bakterien können deshalb auch nicht gut prozessiert oder präsentiert werden, so daß T-Zellen ebenfalls nicht aktiviert werden können. Hier schließt die Thymus-unabhängige Antikörperantwort eine Lücke.

Regulation der B-Zellen durch Antikörper Antikörper können selbst Antigene sein. Die Antikörper einer Spezies lösen in einer anderen eine starke Immunantwort aus, die bevorzugt gegen den Fc-Teil des Antikörpers gerichtet ist, gegen seinen Isotyp. Aber auch innerhalb derselben Spezies sind Antikörper immunogen: Es gibt allele Varianten der konstanten Bereiche der Immunglobuline, so daß sich bei zwei Individuen die Antikörper desselben Isotyps geringfügig unterscheiden können. Diese Unterschiede charakterisieren den Allotyp eines Antikörpers. Schließlich ist die Antigenbindungsstelle jedes Antikörpers eine einzigartige Struktur, sein Idiotyp, und kann ebenfalls eine Antikörperantwort provozieren. Bei Therapien mit monoklonalen Antikörpern kann die Immunantwort des Patienten gegen den Antikörper limitierend sein, denn sie neutralisiert die therapeutische Wirkung oder löst eine Übcrcmpfindlichkeitsreaktion aus. Bisher wurden die meisten therapeutischen Antikörper in der Maus gewonnen. Um die starke Antikörperantwort gegen die Speziesunterschiede zu vermeiden, kann man die Antigenbindungsstellen der murinen Antikörper gentechnisch abtrennen und auf humane Antikörper ..transplantiercn". Nach einer solchen Humanisierimg der murinen Antikörper wird die Immunreaktion der Patienten dagegen schwächer. Allerdings läßt sich das Problem auch durch diese Humanisierung der Antikörper nicht ganz lösen, weil die Bindungsstelle, der Idiotyp, selbst immunogen ist. Bei manchen Immunreaktionen dominieren wenige Antikörperspezifitäten. Dann können die Idiotypen der Antikörper genau charakterisiert werden und man stellt fest, daß im selben Individuum mit zeitlicher Latenz auch anti-idiotypische Antikörper gebildet werden. Gegen diese anti-idiotypischen Antikörper können nun anti-anti-idiotypische Antikörper gebildet werden u.s.w. In experimentellen Systemen beeinflußten anti-idiotypische Antikörper die idiotypischen BZcllen; meist wurden diese gehemmt. Diese Beobachtungen führten NILS JERNE zur Formulierung der Netzwerkhypothese. Sie postuliert, daß sich das Immunsystem im Gleichgewicht hält durch ein Netz interner Idiotyp/anti-Idiotyp-Reaktionen. Da aber das hypothetische Netz von Beziehungen zwischen Antikörpern und B-Zellen sehr komplex ist, ließ sich bis heute nicht experimentell klären, ob diese Form der B-Zellkommunikation tatsächlich eine wichtige Funktion in der Regulation des Immunsystems hat.

Antikörper, welche als Antwort auf ein Antigen gebildet werden, können die Immunantwort spezifisch hemmen, wenn sie mit diesem Antigen multivalente Komplexe bilden. Die Antigen-Antikörperkomplexe exponieren nämlich sowohl Epitope als auch Fc-Teile und können

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damit auf der Oberfläche von spezifischen BZellen die Antigenrezeptoren mit CD32-Molekülen (Fcy-Rezeptoren) vernetzen. Durch diese Vernetzung erhält die B-Zelle ein negatives Signal. Dieser Mechanismus erlaubt der B-Zelle die Entscheidung, ob sie mit ihren Membran-Ig freies Antigen erkennt (Aktivierung) oder solches, gegen das bereits genügend Antikörper vorhanden sind (Hemmung).

1.2.5 Das Komplementsystem Es wurde früh entdeckt, daß spezifische Antikörper die Lyse von Bakterien induzieren können. CHARLES BÜRDET stellte 1895 fest, daß die Antikörper dies nicht allein bewirken. Sie mußten komplementiert werden durch weitere hitzelabile Plasmabestandteile: das Komplement. Durch diese Beobachtung wurde die Erforschung eines hochdifferenzierten Abwehrsystems eingeleitet, welches phylogenetisch viel älter ist als die Antikörperantwort. Es hat sich aber in der Evolution eine Schnittstelle zwischen beiden entwickelt, so daß in der humoralen Immunantwort nun die breite aber spezifische Antigenerkennung durch Antikörper mit den Effektormechanismen des bewährten Komplementsystems eng verknüpft ist. Das Komplementsystem besteht aus einer großen Vielfalt löslicher Proteine. Ein Teil von ihnen ist im MHC-Genlocus kodiert (s. Kap. 1.2.7). Werden sie auf Oberflächen aktiviert, kann dies folgende Konsequenzen haben:

1. Opsonisierung zur Phagozytose 2. Lyse durch Membranporen 3. Chemotaxis und dadurch Verstärkung der Entzündungsreaktion. Der Angelpunkt der Komplementreaktion ist die Aktivierung der Komponente C3 durch proteolytische Spaltung zu C3a und C3b (Abb.1.17). C3b besitzt eine interne hochreaktive Thioesterbindung, so daß es schnell kovalent an Zelloberflächen bindet. Dies genügt bereits zur Opsonisierung. Es gibt zwei wesentliche Proteasekaskaden, welche zur Aktivierung von C3 führen können: 1. Der klassische Weg wird durch Antikörper induziert. 2. Der Lektinweg wird durch Assoziation des Mannan-bindenden Lektins mit Bakterienoberflächen initiiert. 3. Der phylogenetisch älteste alternative Weg kann direkt durch die Oberflächenstruktur von Bakterien aktiviert werden. Der klassische Weg wird durch Bindung der Komplementkomponente Cl an IgM, IgGl, IgG2 oder IgG3 induziert. Hierzu müssen die Immunglobuline mit einer festen Oberfläche assoziiert sein, denn eine multimere Bindung von Cl ist notwendig. Dies wird bei IgG durch die benachbarte Bindung mehrerer Moleküle erreicht; IgM erfährt durch Bindung an eine Oberfläche eine Konformationsänderung, wodurch seine Cl-Bindungsstellen exponiert werden. Weil IgM bereits selbst ein Multimer ist, kann ein einziges Molekül genügend Bindungsstellen

Abb. 1.17 Schematische Darstellung der Aktivierung des Komplementsystems und der daraus resultierenden Effektormechanis-

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

für die Aktivierung von Cl bereitstellen, für IgG ist eine relativ hohe Beladung nötig, um die erforderliche Nähe der Moleküle zu gewährleisten. Cl ist ein multimolekularer Komplex von etwa 750 kD. Es besteht aus Clq, der Bindeeinheit, und jeweils 2 Proenzymen Clr und Cls. Cl q seinerseits besteht aus 6 identischen Heterotrimeren, welche über ihre Collagen-ähnlichen Tripelheliccs multimerisieren und mit ihren globulären Domänen an [mmunglobuline binden. Wenn Clq eine multivalente Bindung eingeht, bewirkt dies eine Konformationsänderung, welche sich den Proenzymen mitteilt. Diese werden jetzt durch autokatalytische Proteolyse aktiviert, und sie spalten dann weitere lösliche Komponenten des Komplementsystems, die C2 und C4 genannt werden. Die Spaltprodukte C2b und C4b binden kovalent an die Erregeroberfläche und bilden gemeinsam die C3-Konvertase, welche schließlich C3 durch Proteolyse aktiviert. Es gibt noch weitere Möglichkeiten, Clr und Cls zu aktivieren, z.B. durch C-reaktives Protein oder bestimmte Lektine.

Beim Lektinweg führt die Anlagerung des Mannan-bindenden Lektins (eines Akut-PhaseProteins) zur Aktivierung von spezifischen Serumproteasen, welche die Komplementkomponenten C2 un C4 proteolytisch zu einer C3Konvertase aktivieren. Der alternative Weg der Komplementkaskade wird durch eine langsame spontane Aktivierung von C3 auf mikrobiellcn Zelloberflächen ausgelöst. Es entsteht oberflächengebundenes C3b, welches das lösliche Komplementprotein Faktor B bindet und dessen Spaltstelle für Faktor D exponiert. Faktor D ist eine Protease, welche in sehr geringer Konzentration im Plasma vorkommt und bereits spontan aktiv ist. Das Produkt dieser Protease, Bb, bildet gemeinsam mit C3b die C3-Konvertase des alternativen Wegs. Die C3-Konvertase spaltet C3 zu C3a und C3b, so daß eine positive Rückkopplung entsteht. Aktivierung von C3 leitet die Bildung der Membranporen ein, des lyrischen Komplexes. Durch Assoziation von C3b mit den C3-Konvertascn (C2bC4b aus dem klassischen Weg, C3bBb aus dem alternativen Weg) entstehen C5-Konvertasen, welche C5 zu C5a und C5b spalten. C5b bleibt zunächst mit seiner Konvertase assoziiert und rekrutiert C6, C7 und C8 aus dem Plasma. C7 und C8 verankern dann diesen Komplex durch lipophile Ketten stabil in der Zellmembran. Dieser Komplex kann bereits manche Zellen lysieren; besonders effektiv wird er aber durch die Rekrutierung von mehreren Einheiten von C9, welche in der Zellmembran polymerisieren und dadurch eine Pore bilden, welche die Doppelmembran durchspannt. Faktor C9 hat

Ähnlichkeit mit Perforin, welches zum Arsenal zytotoxischer Zellen gehört und auf der Zielzelle ebenfalls Membranporen bilden kann. Durch die Poren kommt es zum Verlust des intrazellulären Milieus. Die Phagozyten exprimieren auf ihrer Membran Komplementrezeptoren, mit denen sie die mit C3b opsonisierten Erreger aufnehmen können. Die kleinen Fragmente der Komplementfaktoren, besonders C3a und C5a, sind chemotaktisch sehr aktiv. Sie diffundieren ins Gewebe und locken dadurch Phagozyten an, welche sich an den Konzentrationsgradienten dieser Fragmente orientieren. Dadurch wird die Entzündungsreaktion verstärkt. Viele Defekte des Komplementsystems führen zu Immunkomplex-GJomerulonephritis. Dies zeigt, daß eine sehr wichtige Aufgabe des Komplementsystems die Eliminierung von AntigenAntikörperkomplexen aus dem Plasma ist, weil sich diese sonst auf der Basalmembran der Glomeruli ablagern und dort die Ultrafiltration beeinträchtigen. Hierfür ist der Komplementrezeptor Typ 1 (CR1, CD35) entscheidend, welcher auf Phagozyten, aber auch auf Erythrozytcn exprimiert wird. Weil die Erythrozyten im Blut mit Absland der häufigste Zelltyp sind, tragen sie am meisten zum Abbau von Immunkomplexen bei. Mit CR1 können sie Immunkomplexe binden und zu Leber oder Milz transportieren. Dort werden die Komplexe von den residenten Makrophagen aufgenommen. Es ist klar, daß das Komplementsystem sehr stringent reguliert sein muß, damit die Zellmembranen des Organismus selbst vor seinem Angriff geschützt sind. Endothelien und Leukozyten sind ja in ständigem direkten Kontakt mit dem Komplementsystem. Die Komplementreaktion kann auf vielen Ebenen reguliert werden, durch lösliche Faktoren oder durch Membranproteine auf den körpereigenen Zellen. Lösliche Faktoren sind der Cl-Inhibitor, Faktor H und Faktor I. Der Cl-Inhibitor führt zur irreversiblen Hemmung der Proteasen Clr und Cls. Faktor H dissoziiert Bb von C3b und inaktiviert dadurch die C3-Konvertase des alternativen Wegs. Faktor I inaktiviert C3b und C4b durch eine weitere proteolytische Spaltung. Viele Membranproteine beschleunigen den Zerfall der C3-Konvertasen und schützen dadurch die Zellmembran vor den Effektorstadien der Komplementreaktion. Eine solche Wirkung haben CR1, das Membran-Kofaktorprotein (CD46) und der Decay accelerating factor. Aber auch nach Konver-

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sion von C3 und C5 ist die Zelle noch nicht wehrlos: Der homologe Restriktionsfaktor sowie CD59 blockieren die Bildung des lytischen Komplexes. Die Wirkung dieser Faktoren ist spezies-spezifisch, d.h. nur das Komplementsystem des Organismus selbst kann gehemmt werden.

1.2.6 Phagozyten Ein lebenswichtiger Resistenzmechanismus ist die Aufnahme. Abtötung und Verdauung von Erregern durch Phagozyten. Dies leisten vor allem die neutrophilen Granulozyten, die Monozyten und die aus ihnen differenzierten Makrophagen. Zunächst müssen die Phagozyten an den Ort der Infektion gelangen. Dies geschieht durch Interaktion mit aktivierten Endothelzellen gefolgt von der Extravasation der Phagozyten und ihrer Migration zum Infektionsherd (s. Abb. 1.10). Meist kommen die Granulozyten zuerst an und verhindern durch ihre Aktivität bereits die weitere Ausbreitung der Infektion. Phagozyten können viele Bakterien mit ihren nicht-polymorphen Rezeptoren für LPS oder Mannose erkennen. Monozyten besitzen keinen Mannoserezeptor; hier vermittelt das Mannosebindende Lektin, ein Akutphase-Protein. Die Aufnahme von Erregern wird aber sehr viel effizienter, wenn die Partikel durch Bindung von Antikörpern und/oder Komplement an ihre Oberfläche opsonisierl sind. Die Bindung der Fc-Rezeptoren (s. Tab. 1.8) der Phagozyten an ein mit IgG bedecktes Bakterium führt zu einer gewissen Aktivierung des Phagozyten. Komplement wird entweder über den alternativen Weg direkt auf der Bakterienoberfläche aktiviert oder über den klassischen Weg, angestoßen durch gebundene Antikörper oder z.B. Mannose-bindendes Lektin. Mit Hilfe der Komplementrezeptoren CR1 und CR3 binden Phagozyten dann an C3b oder dessen inaktivierte Form C3bi auf der Erregeroberfläche. Nach der Bindung werden Bakterien oder Parasiten in ein membranumhülltes Phagosom aufgenommen. Dieses fusioniert mit Lysosomen zum Phagolysosom. Die Lysosomen besitzen einen niedrigen pH von 3-4 und enthalten antimikrobiell wirksame Peptide, degradierende Enzyme wie z.B. Lysozym sowie das Eisen-bindende Lactoferrin und ein Vitamin Bl2-bindendes Protein, welche den Erregern lebenswichtige Substanzen entziehen. In diesem Milieu sterben viele Erreger bereits ab. Zusätzlich produzieren die Phagozyten reak-

tive Sauerstoffmetabolite und Stickoxide (respiratory burst), welche ebenfalls toxisch wirken. Zum Teil gelangen die toxischen Substanzen allerdings auch in die Umgebung der Zellen, besonders dann, wenn ein Partikel so groß ist, daß es nicht phagozytiert werden kann (z.B. Helminthen oder Pilze). Dann wird der Lysosomeninhalt in den Kontaktspalt zwischen Phagozyt und Erreger abgegeben. Deshalb schädigen Entzündungsreaktionen bei starker Aktivierung der Phagozyten auch den Organismus selbst. Die adaptiven Abwehrsysteme beeinflussen die Phagozytose und nutzen sie als Effektormechanismus: B-Zellen durch die Opsonisierung von Erregern mit Antikörpern, T-Zellcn dadurch, daß sie Makrophagen durch Zellkontakt und durch das Zytokin Interferon-y (IFN-y) stark aktivieren (siehe unten).

1.2.7 T-Lymphozyten mit aß-T-Zellrezeptor T-Zellen steuern das Immunsystem und erfüllen zusätzlich wichtige Effektorfunktionen. T-Zellen regulieren die Immunantwort einschließlich eines großen Teils der B-Zellantwort und der meisten zellulären Abwehrreaktionen. Sie sind auch an der Aufrechterhaltung von Toleranz beteiligt und müssen deshalb noch genauer kontrolliert werden als B-Zellen. Durch die Art ihrer Antigenerkennung sind T-Zellen auf die direkte Interaktion mit anderen Zellen angewiesen; durch die Sekretion von Zytokinen (Lymphokinen) wirken sie über das direkte lokale Geschehen hinaus. Der T-Zellrezeptor (TcR)

Der TcR ähnelt einem Antikörper-Fab-Fragment; er besteht aus einem membranverankerten Heterodimer aus zwei Ketten von der Größe und Struktur von leichten Antikörper-Ketten. Bei der Hauptpopulation der T-Zellen wird der TcR aus einer ex- und einer ß-Kette gebildet aßT-Zellen), bei etwa 5% aus einer y- und einer 5Kette (yö-T-Zellen). Die TcR-Ketten bestehen jeweils aus einer variablen und einer konstanten Domäne und sind durch Disulfidbrücken miteinander verbunden. Die Antigenbindungsstelle wird aus den variablen Domänen beider Ketten gebildet. Ähnlich wie bei den Immunglobulinen werden die Gene der TcR durch Rekombination von V-, D- und J-Elementen erzeugt, an die durch Splicing der RNA-Transkripte die Gen-

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

Segmente für die konstanten Domänen angefügt werden. Die Genorganisation der ß-Kette und der 6-Kette ähnelt der der schweren Antikörperkette, während sie bei der TcR-a-Kette und der -y-Kette mit den leichten Antikörperketten vergleichbar ist. Die Genloci der TcR-Ketten sind in Abb. 1.18 dargestellt. Durch Rekombination können etwa 70.000 verschiedene aß-TcR gebildet werden, hinzu kommt noch die Variabilität durch Einfügung von zusätzliche Nukleotiden (N-Regionen), die viel ausgeprägter ist als bei den Antikörpern. Im Vergleich zu Antikörpern ist der Antigenrezeptor der T-Zellen stabil: einmal gebildet, wird er nicht mehr verändert; Hypermutation und Rezeptoredition fehlen. Auch werden TcR nicht in den extrazellulären Raum abgegeben; sie bleiben membrangebunden. T-Zellen regulieren die gesamte Immunantwort einschließlich eines großen Teils der B-Zellantwort. Deshalb sind autoreaktive T-Zellen gefährlicher als autoreaktive B-Zellen und müssen noch strenger kontrolliert werden. Die Stabilität des TcR trägt dazu bei. Antigenpräsentation durch MHC-Moleküle T-Zellen erkennen ihr Antigen, meist ein Protein, nicht in löslicher Form sondern nur auf

Zelloberflächen, wo es ihnen gebunden an spezialisierte Moleküle präsentiert wird. Das Antigen muß dazu aufbereitet, prozessiert werden. Der Genkomplex, der die Präsentationsmoleküle kodiert, wurde bei Untersuchungen zur Transplantatabstoßung entdeckt (siehe unten), und er heißt deshalb Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibiliiy complex, MHC), beim Menschen auch HLA (human leukocyte antigen). Der riesige Genkomplex von etwa 4 x 106 Basenpaaren auf dem menschlichen Chromosom 6 enthält etwa 100 Gene. An der Antigenpräsentation unmittelbar beteiligt sind zwei Klassen von MHC-Molekülen: Klasse-IMoleküle (MHC-I) und Klasse-II-Moleküle (MHC-II), welche jeweils aus zwei Proteinketten bestehen. Beim Menschen sind hierfür drei MHC-T-Loci wichtig, HLA-A, IILA-B und HLA-C, und drei MHC II-Loci, HLA-DR (2 Typen), HLA-DP und HLA-DQ (Abb. 1.19). Die Genloci zeichnen sich durch einen sehr ausgeprägten allelen Polymorphismus in der menschlichen Bevölkerung aus; z.B. gibt es mindestens 59 HLA-A-Allele und mindestens t l l HLA-B-Allele. MHC-Moleküle werden kodominant exprimiert, und ihre Vererbung folgt den Mendelschen Regeln (Abb. 1.20). Dies führt dazu, daß eine MHC-Identität zweier Menschen extrem selten vorkommt (Ausnahme: monozy-

Abb. 1.18 Organisation der Gene, die für die Ketten von aß-und yö-Zell-Rezeptoren kodieren (Keimbahnkonfiguration).

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Abb. 1.19 Organisation des menschlichen MHC auf Chromosom 6.

gote Zwillinge). Im riesigen MHC-Genlocus sind auch Gene für andere wichtige Proteine des Immunsystems kodiert: TNF-a und Lymphotoxin sowie die Komponenten des Komplementsystems C2, C4 und Faktor B. Diese Gene werden als MHC-Klasse-III-Gene bezeichnet. MHC-I-Moleküle werden auf allen Körperzellen exprimiert mit Ausnahme von Erythrozyten. Sie bestehen aus einer membranverankerten polymorphen ex-Kette (44 kD) mit 3 Domänen, welche assoziiert mit einer kleinen konstanten ß-Kette, dem ß2-Mikroglobulin (ß2M, 12 kD). ß2M ist nicht im MHC-Komplex kodiert. Der

polymorphe Teil der a-Kette bildet eine Grube, an den Rändern begrenzt durch zwei a-Helices, unten abgeschlossen durch eine ß-Faltblattstruktur. In diese Grube passen Peptide mit einer Länge von meist 8-10 Aminosäuren in linearer Formation genau hinein: dies sind die potentiellen T-Zellepilope. Außerdem besitzt die MHC-I-a-Kette in ihrem konstanten Teil eine Bindungsstelle für das CD8-Molekül. Dies führt dazu, daß MHC-I-gebundene Peptide von CD8+ T-Zellen erkannt werden. Die auf MHC-I präsentierten Peptide stammen hauptsächlich aus dem Zyloplasma der Zelle. Zytotoxische

Abb. 1.20 Ko-dominante Vererbung der HLA-Merkmale. Väterliche und mütterliche Zellen enthalten je zwei Sätze von HLA-Genen (Haplotypen). Die Zellen exprimieren alle diese HLA-Moleküle (Phänotyp). ]e ein väterlicher und ein mütterlicher Haplotyp werden auf die Kinder vererbt.

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

T-Zellen können deshalb den Befall von jeder Körperzelle mit intrazellulären Erregern, besonders Viren, wahrnehmen und die infizierten Zellen lysieren. MHC-II-MoIeküle werden konstitutiv nur auf spezialisierten Zellen des Tmmunsystems exprimiert: auf dendritischen Zellen, auf Makrophagen, auf B-Zellen sowie auf Thymusepithel. Erst die Stimulation mit Zytokinen wie IFN-y und TNF-a induziert MHC-II-Moleküle auch auf der Oberfläche mancher anderer Zellen. MHCII-Moleküle sind Dimere aus jeweils einer a-Kette (35 kD) und einer ß-Kette (30 kD), welche nicht kovalent miteinander assoziiert sind. Beide Ketten besitzen 2 Domänen. Die Kristallstrukturen von MHC-I und MHC-II sind sehr ähnlich; bei MHC-II sind jedoch ex- und ß-Kette gleichermaßen am Aufbau der Antigenbindungsgrubc beteiligt. Die Grube der MHC-IIMoleküle ist im Gegensatz zu MHC-I an den Enden offen, deshalb kann die Länge der präsentierten Peptide variieren; die Überlänge der Peptide hängt einfach an beiden Enden heraus. Auf der ß-Kette der MHC-11-Moleküle befindet sich eine nicht-polymorphe Bindungsstelle für das CD4-Molekül. MHC-II-positive Zellen präsentieren also Antigen für CD4+ T-Helferzellcn. T-Helferzellen kontrollieren und orchestrieren die adaptive Immunantwort. Durch die begrenzte Expression von MHC-II auf spezialisierten Zellen des Immunsystems wird die Aktivität dieser regulatorischen Zellen auf die lymphatischen Organe fokussiert. Antigene, welche im Kontext von MHC-II präsentiert werden sollen, werden von den Antigen-präsentierenden Zellen durch Endozytose aus dem Extrazellulärraum aufgenommen. So gewinnen CD4^ T-Hclfcrzellen Informationen über extrazelluläre Erreger, und sie können dann spezifischen BZcllen Hilfe zur Antikörperproduktion leisten. Antigenprozessierung

Sowohl MHC-I als auch MHC-II werden im endoplasmatischen Reticulum synthetisiert. Dort wird MHC-1 assoziiert mit ß2M durch Calnexin solange stabilisiert, bis ein passendes Pcptid in der MHC-I-Bindungsgrube gebunden ist. Die beiden MHC-II-Ketten werden durch eine dritte, invariante Kette stabilisiert, welche sich durch die Antigcnbindungsgrube schlängelt und sie für Peptide blockiert (Abb. 1.21). Antigene, welche im Zytoplasma synthetisiert werden, werden zum Teil auch dort wieder de-

Abb. 1.21 Intrazelluläre Prozessierung und Präsentation von Antigen. Peptide zytoplasmatischer Proteine (gepunktet) werden von MHC-Klasse-I-Molekülen, Peptide exogen aufgenommener Proteine (rot) von MHC-Klasse-Il-Molekülen präsentiert. Das CD8-M0lekül der zytotoxischen T-Zelle bindet an das MHCKlasse-I-Molekül, das CD4 Molekül der T-Helferzelle bindet an das MHC-Klasse-Il-Molekül.

gradiert. Dies geschieht durch einen multimolekularen Komplex mit Proteaseaktivität, das Proteasom. Einige Komponenten des Proleasoms sind im MHC-Komplex kodiert. Nach ihrer Spaltung werden die Peptide durch den TAPTransporter (transporter associated with antigen processing) unter Energieverbrauch in das endoplasmatische Reticulum transportiert. Der TAP-Komplex ist ebenfalls im MHC-Komplex kodiert. Wenn ein Peptid im endoplasmatischen Reticulum mit hoher Affinität an die Bindungsgrube einer MHC-I-a-Kette binden können, wird seine Assoziation mit ß2M stabilisiert, der vollständige Peptid/MHC-I-Komplex durchquert den Golgiapparat und wird an der Zclloberfläche exprimiert. MHC-II-Komplexe werden gebunden an die invariante Kette in ein endosomales Kompartiment transportiert. Dorthin gelangen auch Peptide, welche nach Endozytose von extrazel-

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lulären Antigenen und durch partielle proteolytische Degradation in den Lysosomen entstanden sind. Die invariante Kette wird hier ebenfalls degradiert; dadurch wird die Peptidbindungsstelle des MHC-II-Dimers frei, und hochaffine Peptide können nun daran binden. Jetzt wird der Peptid/MHC-II-Komplex auf die Zelloberfläche transportiert. Die Affinität der antigenen Peptide zu den MHC-Molekülen ist außerordentlich hoch. Einmal gebunden können sie praktisch nicht mehr ausgetauscht werden. Dies ist wichtig, damit auf der Zelloberfläche tatsächlich die Peptide präsentiert werden, welche auf den Prozessierungswegen in die MHC-Moleküle gelangt sind. Entstehung von T-Zell-Epitopen Wichtig ist bei MHC-I zunächst die Länge der Peptide, da die Grube an den Enden verschlossen ist. Dies spielt bei MHC-1I eine geringere Rolle. Außerdem gibt es in jedem Peptid Aminosäuren, deren Reste aus der Grube herausragen, und solche, deren Reste mit dem MHC-Molekül Kontakt aufnehmen. Auf diese Ankerpositionen kommt es an: jedes MHC-Molekül hat in der Peptidbindungsgrube 1-3 taschenartige Vertiefungen, welche mit bestimmten Aminosäureresten hochaffine Interaktionen eingehen können, und nur Peptide mit den passenden Aminosäuren in diesen Ankerposilionen binden mit ausreichender Affinität. Die Ankerstellen befinden sich im polymorphen Teil der MHC-Moleküle, deshalb sind auch die Ankerpositionen und damit die Peptidsequenzen, die präsentiert werden können, spezifisch für die verschiedenen MHC-Allele. Die aus der Grube herausragenden Aminosäurereste werden vom TcR gebunden. Jede Zelle präsentiert Peptide aller ihrer Proteine, selbst synthetisierte (MHC-I) und aufgenommene (MHC-II). Erst die T-Zellen können entscheiden, ob eines dieser Peptide erkannt werden soll. Durch Mechanismen der Toleranz sind in der Regel gegen körpereigene Peptide keine reagierenden T-Zellen vorhanden. Längst nicht jedes Protein eines Erregers kann demnach von T-Zellen erkannt werden. Voraussetzungen sind, daß es von den Proleasen im Proteasom oder im Lysosom zu einem passenden Fragment degradiert wird und schließlich mit hoher Affinität an eines der MHC-Moleküle der Zelle bindet. Das Spektrum der präsentierten T-Zellepitope hängt also wesentlich vom MHC-Genotyp eines Individuums ab, und jedes

Individuum präsentiert ein individuelles Repertoire an Peptiden. Eine dritte Voraussetzung ist, daß es reagierende T-Zellen gegen das präsentierte Epitop gibt, denn ist dieses einem körpereigenen Epitop ähnlich, sind durch Toleranzmechanismen keine reagierenden T-Zellen vorhanden. Daher gibt es in einem beliebigen Erregerprotein oft nur wenige oder gar keine vom T-Zellsytem erkannten Peptide. Es kommt in Einzelfällen sogar vor, daß gegen keines der Proteine eines Erregers eine T-Zellantwort gebildet werden kann (Non-Responder). Manche MHC-Allele sind mit einem erhöhten Risiko verbunden, eine Autoimmunerkrankung zu entwickeln. Ein bekanntes Beispiel ist die Assoziation von HLA-B27 mit der ankylosierenden Spondylitis (Morbus Bechterew), einer Autoimmunerkrankung unbekannter Pathogenese. Das Risiko, an M. Bechterew zu erkranken, ist für HLA-B27-Träger im Vergleich zu HLA-B27negativen Personen um den Faktor 90 erhöht. Man vermutet, daß das HLA-B27-Molekül Peptide eines infektiösen Erregers präsentiert, die körpereigenen ähnlich sind und dadurch Toleranzmechanismen durchbrechen. T-Zellreifung im Thymus Der Thymus ist der wichtigste Ort der Reifung von T-Lymphozyten. obwohl T-Zellen auch im Knochenmark oder im Darm unabhängig vom Thymus heranreifen können. In den Thymusläppchen lassen sich morphologisch und funktioneil jeweils Rinde (Cortex) und Mark (Medulla) unterscheiden. Das Gerüst des Thymus ist ein Netzwerk aus kortikalen Thymusepithelzellen ektodermalen Ursprungs und medullären Thymusepithelzellen entodermalen Ursprungs. Später wandern aus dem Knochenmark drei Typen von Zellen ein: dendritische Zellen, welche sich bevorzugt in der Medulla ansiedeln, Makrophagen, welche sich in Cortex und Medulla niederlassen, und die Vorläufer der T-Zellen, welche zunächst in den Cortex eindringen. Hier durchlaufen diese Stammzellen eine Serie von Reifungsschritten, in denen die TcR-Gene rekombiniert und schrittweise die T-zellspezifischen Moleküle erworben werden, aß- und yö-T-Zellen entstehen aus einer gemeinsamen Stammzelle, aber in separaten Linien unabhängig voneinander. Die Vorläufer der aß-T-Zellen exprimieren weder einen TcR noch die Korezeptoren CD4 oder CDS; man nennt sie „doppeltnegativ".

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

Im Kontakt mit dem Thymusepithel rearrangieren die T-Zellvorläufer ihre ß-Kette und exprimieren diese zunächst zusammen mit einer Ersatz-a-Kette auf der Oberfläche. Diese erfolgreiche Expression eines vorläufigen TcR ist nötig für die weitere Entwicklung; erst dann kann die Umlagerung der a-Kcttc stattfinden. Allel-Exklusion gibt es bei der ß-Kettc, aber nicht bei der a-Kettc, so daß etwa 30% der pcripheren T-Zellen eine ß-Kette und zwei a-Kcttcn und damit zwei TcR mit unterschiedlicher Spezifitat tragen. Zellen, die keinen funktionierenden T-Zellrezeptor produzieren, nehmen an der weiteren Entwicklung nicht teil und sterben ab. Die Zellen mit einem intakten TcR proliferieren stark und bringen nun sowohl CD4- als auch CD8-Moleküle an die Oberfläche. Diese sog. „doppeltpositiven" Thymozyten stellen den größten Teil der Zellen im Thymus dar. Nur etwa 2 Prozent dieser Zellen reifen zu „einzelpositiven" CD4+8" oder CD4"8+ T-Zellen heran und verlassen den Thymus (Abb. 1.22). Der größte Teil der CD4+8* stirbt innerhalb von wenigen Tagen nach Entstehung ab, da in diesem Stadium zwei Selektionsschrittc erfolgen. Nur Thymozyten, welche mit ihrem TcR Kontakt zum Thymusepithel aufnehmen können,

weil sie eine ausreichende Affinität zu einem der dort exprimierten MHC-Moleküle besitzen, bekommen ein Signal, welches sie dazu veranlaßt, sich weiter zu teilen und zu differenzieren (positive Selektion); die Thymozyten mit zu niedriger Affinität sterben. In einem zweiten Selektionsschritt werden diejenigen T-Zellen eliminiert, die Peptide von körpereigenen Proteinen auf Antigen-präsenticrenden Zellen im Thymus erkennen (negative Selektion). Auf diese Weise werden im Thymus sowohl potentiell gefährliche, autoreaktive als auch nutzlose T-Zellen, die nicht mit eigenen MHC-Molekülen reagieren können, beseitigt. Obwohl die zugrunde liegenden Mechanismen nicht ganz klar sind, wird vermutet, daß Thymozyten zum Überleben und weiteren Differenzieren ein Signal über den TcR von intermediärer Stärke benötigen. Ein zu starkes Signal führt zum Tod der Zelle (negative Selektion), ein zu schwaches Signal erlaubt keine weitere Proliferation (fehlende positive Selektion) und führt letzlich auch zum Absterben der Zelle. Im Laufe dieser Selektionsvorgänge wird die Expression von entweder CD4 oder CDS abgeschaltet, so daß einzelpositive Zellen entstehen. Für die positive Selektion ist anscheinend die Bindung von CD4-

Abb. 1.22 Stadien der Reifung von T-Lymphozyten im Thymus. Die in den Thymus einwandernden Stammzellen aus dem Knochenmark differenzieren über verschiedene Zwischenstadien zu reifen Helfer- oder zytotoxischen T-Zellen heran. Deletionsschritte erfolgen zu verschiedenen Zeiten im Reifungsprozeß.

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bzw. CD8-Molekülen an das vom TcR gebundene MHC-Molekül nötig. Eine positive Selektion kann nur stattfinden, wenn der T-Zellrezeptor einer CD4-positiven Zelle zusammen mit dem CD4-Molekül auch mit einem Klasse Il-Molekül reagiert, bzw. der TcR einer CDS'-Zelle mit einem Klasse I-Molekül. Nur etwa 2% der Thymozyten gelingt es, den Thymus als reife T-Zellen zu verlassen. Die meisten Thymozyten sterben bereits im Cortex infolge der positiven Selektion, weil ihre stochastisch zusammengebauten TcR keine ausreichende Affinität zu den MHC-Molekülen des Organismus besitzen. Von den Überlebenden werden durch negative Selektion noch einmal 75% vernichtet, weil ihre Affinität zu MHC und den im Thymus präsentierten Selbstpeptiden zu hoch ist (autoreaktive Thymozyten). Die negative Selektion kann bereits beim ersten Antigenkontakt im Cortex oder beim Übergang vom Cortex in die Medulla erfolgen. Das Repertoire der aus dem Thymus entlassenen T-Zellen enthält also keine T-Zellen mehr, die mit den Peptiden reagieren, die im Thymus präsentiert worden waren, und ist beschränkt auf die Erkennung von Peptiden auf denjenigen MHC-Molekülen, die im Thymus vorhanden sind (MHC-Restriktion). Alloreaktivität Da also im Thymus T-Zellen auf die Erkennung von autologen MHC-Molekülen selektioniert werden, war das Phänomen der alloreaktiven TZellen lange Zeit schwer zu verstehen. Alloreaktive T-Zellen nehmen einen großen Teil des Repertoires ein; gegen manche allogenen MHCMoleküle reagieren mehrere Prozent aller TZellen. Dies erklärt die Stärke der Transplantatabstoßung. Die wahrscheinliche Erklärung ist, daß die alloreaktive Antwort darauf beruht, daß der Komplex (Selbstpeptid + fremdes MHCMolekül) für einen gegebenen TcR genauso „aussieht" wie der Komplex aus seinem spezifischen Fremdpeptid + eigenem MHC-Molekül. Da die allogenen MHC-Moleküle zahllose Selbstpeptide aus dem Zellinnercn präsentieren, führt diese Kreuzreaktion zur Aktivierung vieler, eigentlich selbst-restringierter T-Zellen. Aktivierung und Differenzierung von T-Lymphozyten Die reifen naiven T-Zellen, welche den Thymus

gerade verlassen haben, wandern durch das kubische Epithel der poslkapillären Venolen in die Lymphknoten ein. Dort nehmen sie Kontakt zu „professionellen" Antigen-präsentierenden Zellen (APC) auf, z. B. den interdigitierenden dendritischen Zellen in den T-Zellarealen. Sie suchen deren Oberfläche nach ihrem Antigen ab, den Peptid/MHC-Komplexen, welche sie mit ihrem spezifischen TcR binden können. Der Membrankontakt zwischen T-Zelle und APC wird durch Paare von Adhäsionsmolekülen hergestellt und über längere Zeit aufrechterhalten: dabei ist die Bindung von CD2 auf der Oberfläche der T-Zellen an seinen Liganden CD58 sehr wichtig. Das erste Signal für die T-Zellaktivierung ist dann die Bindung des antigenspezifischen TcR an seinen Liganden. Auf ihr Antigen reagieren die T-Zellen äußerst sensitiv: nur 10-300 Peptid-beladenc MHC-Moleküle auf einer APC reichen aus, eine T-Zelle mit 50000 TcR zu triggern. Dieses erste Signal reicht aber nicht dazu aus, eine naive T-Zelle voll zu aktivieren. Im Gegenteil, die isolierte Ligation des TcR führt dazu, daß die T-Zellen inaktiviert und gegen weitere TcR-vermittelte Signale resistent werden; man spricht von Anergie. Zur vollständigen Aktivierung benötigen naive T-Zellen ein zweites Signal , das sie ebenfalls von den APC erhalten. Die Ligation des kostimulatorischen Moleküls CD28 auf der T-Zelloberfläche durch CD80- oder CD86-Moleküle auf der Membran der APC spielt dabei eine zentrale Rolle. Auf die vollständige Aktivierung durch erstes und zweites Signal reagieren die T-Zellen mit starker Proliferation, so daß sich ein T-Zellklon mit derselben Antigenspezifität bildet. Außerdem erwerben die T-Zellen neue Eigenschaften, sie differenzieren zu Effektorzellen und zu MemoryZellen. Zytotoxische Effektorzellen haben nicht so strenge Aktivierungsbedingungen wie naive T-Zellen; sie können bereits durch das erste Signal allein aktiviert werden (Abb. 1.23). Also können T-Zellen auf ihr Antigen mit Aktivierung oder Anergie reagieren; es kommt auf den Kontext an. Die meisten Zellen des Organismus exprimieren nicht CD80 und CD86, können naive T-Zellen nicht aktivieren und deshalb auch keine Immunreaktion in Gang setzen. Dies ist sehr wichtig für die Erhaltung der Selbsttoleranz, denn nicht alle autoreaktiven T-Zellen werden durch negative Selektion bereits im Thymus entfernt. Das zweite Signal für die TZellaktivierung vermitteln nur professionelle APC, besonders effizient interdigitierende den-

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

Abb. 1.23 Ein zweites Signal über CD28 (Ko-Stimulation) ist nötig für die Aktivierung der TZelle zu autokrinem Wachstum.

dritische Zellen. Diese dendritischen Zellen befinden sich in fast allen Organen; als Langerhans-Zellen bilden sie ein dichtes Netzwerk im Epithel der Haut. Dort pinozytieren sie ständig und nehmen dabei Antigenc aus ihrer Umgebung auf. Erhalten sie bei einer Infektion ein Gefahrensignal, welches molekular noch nicht definiert ist, beenden sie die Pinozytoseaktivität, wandern durch die Lymphgefäße in die regionaren Lymphknoten und präsentieren dort eine Probe des Antigenspektrums, welches sie am Ort der Gefahr vorgefunden haben. In den Lymphknoten treffen also APC, ruhende T-Zellen und Antigen zusammen und bringen die adaptive Immunantwort in Gang. So kommt es, daß eine antigenspezifische schützende Immunantwort besonders dann entsteht, wenn auch die Mechanismen der natürlichen Resistenz provoziert werden, wie dies ein typischer Erreger tut, welcher z.B. über eine kleine Verletzung der Haut in den Organismus eindringt. Werden die gleichen Antigene dagegen direkt i.v. injiziert oder oral aufgenommen und sind sie deshalb nicht mit einem Gefahrensignal assoziiert, reagiert das adaptive Immunsystem häufig mit Toleranz. Bei der Impfung wird eine „immunogene Situation" durch die Applikationsweise und durch Adjuvantien erreicht, welche die APC antigen-!(«spezifisch aktivieren sollen. Das erste Signal, die Ligation des TcR, induziert bereits viele Veränderungen in der T-Zelle: Erstens wird der Membrankontakt zur APC weiter intensiviert, unter anderem dadurch, daß auf den T-Zellen ein weiteres Adhäsionsmolekül, CDlla/CD18, aktiviert wird und nun an seinen Liganden CD54 auf der APC bindet. Zweitens exprimiert die T-Zelle nun hochaffine Rezeptoren für den T-Zellwachstumsfaktor Interleukin-2 (IL-2). Erhält eine T-Zelle gleichzeitig das

zweite Signal, sezerniert sie zusätzlich den Wachstumsfaktor IL-2. IL-2 bindet nun an seinen Rezeptor auf derselben Zelle und induziert die Proliferration der Zelle (autokrines Wachstum; Abb. 1.23). Wie gelangen die Signale von der Membran in den Kern? Die Signalübertragung von der T-Zclltnembran in den Kern ist komplex und reflektiert die extreme Sensitivität, mit der T-Zellen ihre Signale wahrnehmen, und die Flexibilität, mit der sie auf die Vielfalt der Reize reagieren. Tatsächlich reichen wenige MHC-Moleküle mit dem spezifischen Peplid auf der Oberfläche der antigenpräsentierenden Zelle aus, um die T-Zellc zu aktivieren. Die ex- und ß-Ketten des antigenspezifischen TcR haben sehr kurze zytoplasmatische Teile, die für sich allein das Signal nicht weiterleiten können. Durch seine Transmembranteile ist der TcR jedoch fest assoziiert mit anderen nicht-polymorphen Transmembranproteinen. dem sog. CD3-Molekülkomplex. Diese Moleküle sind essentiell für die Signalweitcrlcitung des TcR. sie sind daher nur auf T-Zellen vorhanden. Das erste meßbare Ereignis nach Anügenerkcnnung im Zcllinncrn ist die Phosphorylierung der Tyrosine in den CD3-Molekülen. Diese führt zur Aggregation von mullimolckularen Komplexen an der Innenseite der T-Zellmcmbran und zur Aktivierung mehrerer Signalwege, die schließlich zur Modifikation von zytoplasmatischcn Transkriptionsfaktoren führen, welche sich nun in den Zellkern bewegen, dort an spezifische DNA-Sequenzmotive binden und die Transkription von Genen beeinflussen (Abb. 1.24). Einer dieser Signalwege wird durch die Immunsuppressiva Cyclosporin A und Fk506 blockiert, die daher eine selektive Blockade der T-Zcllreaktion hervorrufen, ohne das Immunsystem zu schädigen. Wie das TcRSignal und das nötige kostimulatorische zweite Signal von der T-Zelle verarbeitet werden, ist noch nicht voll verstanden. Die Signalübertragung in B-Zellen ist der in T-Zellen sehr ähnlich, es gibt ebenfalls mit dem BZellrezeptor (Membran-Ig) assoziierte signalweiterleitende Proteine, welche in den B-Zellen die Rolle des CD3-Komplexes der T-Zcllen übernehmen.

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Allgemeine Infektionslehre

Abb. 1.24 Schematische Darstellung der Signaltransduktion im Laufe der T-Zell-Aktivierung. Die Bindung von Liganden an der Zellmembran durch T-ZellRezeptor und Ko-Rezeptor führt über verschiedene Zwischenschritte zur enzymatischen Modifikation von Transkriptionsfaktoren im Zytoplasma. Im Zellkern werden die Signale integriert durch Bindung verschiedener Transkriptionsfaktoren an Promotoren, z.B. des IL-2-Gens.

1.2.8 T-Zelleffektorfunktionen T-Helferzellen (CD4+)

Wenn naive CD4+ T-Zellen durch erstes und zweites Signal voll aktiviert werden, sezernieren sie IL-2, proliferieren und bilden einen T-Zellklon. Später tritt unter dem Einfluß äußerer Signale häufig eine Spezialisierung oder Polarisierung der T-Helferantwort ein; die beiden Extreme des Spektrums werden T-Helfer-1- und T-Helfer-2-Antwort genannt. T-Helfer-1-Zellen (Till). Diese produzieren große Mengen von IL-2 und IFN-Y. Die wichtigsten Differenzierungssignale für eine Thl-Antwort sind IL-12 und IFN-Y. IL-12 wird von dendritischen Zellen und Makrophagen sezerniert und regt NK-Zellen zur Produktion von IFN-y

an. Dies stimuliert dann die Entwicklung von Th]-Zellen (Abb.1.25). Thl-Zcllen vermitteln die zelluläre Immunantwort. Sie aktivieren Makrophagen, welche ihnen Antigen präsentieren, durch IFN-Y. Dadurch können die Makrophagen intrazelluläre Erreger wie Mykobakterien, welche sich in endozytotischen Vesikeln. den parasitophoren Vakuolen, befinden, sehr viel effizienter abwehren und töten. T-Helfer-2-ZeIlen (Th2). Diese sind charakterisiert durch die Produktion von IL-4, IL-5 und IL-10. IL-4 ist das entscheidende Signal für die Differenzierung der Th2-Zellen. Sobald Th2Zellen IL-4 sezernieren, fördern sie dadurch die Entwicklung weiterer Th2-Zellen (s. Abb.1.25). Es ist noch nicht endgültig geklärt, woher das IL-4 stammt, welches diese Vorgänge überhaupt in Gang bringt. Eine Th2-Antwort induziert

Abb. 1.25 Differenzierung von naiven T-Helferzellen zu Zellen vom Thl-, ThO- oder Th2-Typ. Verschiedene Zytokine beeinflussen diesen Prozeß, beispielhaft sind hier die wichtigsten angegeben.

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

durch IL-4 bei B-Zellcn den Klassenwechsel zu IgE. welches an die Fee-Rezeptoren auf Mastzellen bindet. IL-5 induziert eosinophile Granulozyten. Diese Effektormechanismen dienen der Abwehr von extrazellulärcn Erregern und von Helminthen. Aber auch allergische Reaktionen werden von Th2-Zellen gesteuert. Wenn eine T-Zellantwort einmal polarisiert ist, kann sich ihr Profil selbst stabilisieren. Denn IFN-Y, das Sekretionsprodukt der Thl-Zcllcn. fördert die Differenzierung von weiteren ThlEffektoren, während es die Entwicklung von Th2-Zellen hemmt. Umgekehrt unterstützt das Th2-Zytokin IL-4 die Bildung von Th2-Zcllcn, während es zusammen mit IL-IO die Generation einer Thl-Antwort hemmt. Das Überleben des Wirtsorganismus kann davon abhängen, ob auf eine Infektion hin das richtige Zytokinmuster produziert wird, ob also die Entscheidung, Thl- oder Th2-Zellen zu stimulieren, richtig oder falsch ist. Th2-Zellen sind nicht in der Lage, intrazelluläre Erreger zu bekämpfen und behindern die Wirkung der Th l Zellen. Das Immunsystem verwendet daher bestimmte für Klassen von Infektionserregern typische Moleküle als Leitsubstanzen für die Induktion der entsprechenden T-Zellantwort (z.B. Zellwandbestandteilc von Mykobakterien als Induktoren von IL-12 und damit der Thl-Antwort). Natürlich bedarf es für die Ausrichtung einer polarisierten Antwort eines Zusammenspiels verschiedener derartiger Leitsubstanzen, um dem Wirt die Möglichkeit einer sicheren Induktion der richtigen Antwort zu geben. Entscheidend für die Induktion einer Thl- oder Th2-Antwort im Laufe einer Infektion ist das lokale Zytokinmilieu zu Beginn der Infektion. Starke Induktoren einer Thl-Antwort sind IL12 sowie IL-18, die zur Interfcron-y- Produktion führen. Die entscheidenden Induktoren der Th2-Antwort sind IL-4 und IL-10. Die meisten Immunantworten des Menschen bewegen sich allerdings auf einer Achse zwischen den beiden Polen Thl und Th2: Man findet dann sowohl Thl- als auch Th2-Zellen und zusätzlich viele ThO-Zellen. welche ein breites Spektrum von Thl- und Th2-Zytokinen produzieren. Das Konzept der Polarisierung der TZellantwort auf ein Thl- oder Th2-Profil hat Konsequenzen für die rationale Entwicklung von Impfstoffen: Nicht nur die richtigen Antigene sind für den Erfolg wichtig, sondern man benötigt zusätzlich Signale, welche die Differenzierung der richtigen Effektoren fördern.

T-Zellhilfe für B-Zellen

Differenzierte CD41 T-Helferzellen können mit B-Zellen kooperieren. B-Zellen nehmen über ihren Ig-Rezeptor lösliches natives Proteinantigen sehr effizient auf. Sie prozessieren es dann und bringen Peptide gebunden an MHC-II auf ihre Zelloberfläche. So kann das Antigen von T-Zellen erkannt werden: auf diese Weise treffen sich T-Zellen mit B-Zellen, welche dasselbe Antigen (nicht jedoch dasselbe Epitop) erkennen (kognate Interaktion). Auf dieser direkten Interaktion beruht der HaptenTräger-Effckt: Haptene sind kleine lösliche Moleküle, die zwar ein B-Zellepitop darstellen können, die aber allein keine Antikörperantwort auslösen, denn sie sind ja Thymus-abhängige Anligene ohne T-Zellepitopc. Erst ihre Kopplung an ein Träger-Protein macht aus den Haptenen ein Immunogen: der Protein-Träger liefert T-Zellepitope. so daß nun Helfer-T-Zcllen aktiviert werden. B-Zellen binden mit ihren Rezeptoren das Haplen, nehmen dadurch den Hapten-TrägerKomplex auf und präsentieren Pcptidc des Trägers mit MHC-II auf ihrer Oberfläche (Abb. 1.26).

Die T-Zcllen werden durch ihren Kontakt mit den B-Zellen aktiviert und exprimieren den

Abb. 1.26 Interaktion von T-Helferzelle und B-Lymphozyt bei der Antikörper-Produktion. Die CD4 T-Zelle erkennt Antigen, das vom B-Lymphozyten präsentiert wird und erhält ein ko-stimulierendes Signal über CD28. Die T-Zelle exprimiert daraufhin den Liganden für CD40, dessen Bindung an CD40 der BZelle das Signal zu Proliferation und Klassenwechsel gibt, und produziert Lymphokine, die den Klassenwechsel dirigieren. Die B-Zelle nimmt das Antigen über ihren Oberflächenrezeptor auf, hier dargestellt als ein an einen Proteinträger gebundenes Hapten.

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CD40-Liganden (CD 154) auf ihrer Oberfläche, welcher an CD40 auf den B-Zellen bindet. Dies ist das nötige zweite Signal für die B-Zellen, welche nun zur Proliferation aktiviert werden und eine Keimzentrumsreaktion mit Klassenwechsel und Hypermutation einleiten. Das Signal über CD40 ist für den Klassenwechsel unverzichtbar. Angeborene Defekte in der Expression des CD40-Liganden auf den T-Zellen führen zum Hyper-IgM-Syndrom. In den Lymphknoten der Patienten gibt es keine Keimzentren, und man findet als einziges Immunglobulin IgM in extrem hohen Konzentrationen. Die Zytokinc der TZellen steuern den Klassenwechsel: Thf-Zytokine fördern die Produktion von IgGf, während Th2-Zytokine den Klassenwechsel zu lgG4 begünstigen und den zu IgE erst ermöglichen. T-Zellhilfe für Phagozyten Wie bereits oben beschrieben, können Thl-Zellen durch Zellkontakt, aber besonders auch durch die Sekretion ihres Leitzylokins IFN-y Makrophagen stark aktivieren. Z.B. können die Phagozyten erst nach ihrer Aktivierung durch T-Zellen intrazelluläre Erreger (z.B. Mykobakterien) abtöten. Zytotoxische T-Zellen Die CD8" zytotoxischen T-Zellen (CTL) sind die wichtigsten Effektoren der adaptiven Immunabwehr von Viren und anderen Erregern, welche sich im Zytoplasma der Wirtszellen aufhalten. Alle viralen Proteine werden im Zytoplasma der befallenen Zelle synthetisiert. Einige werden im Proteasom sofort wieder degradiert, die Peptid-Fragmente werden ins endoplasmatische Reticulum transportiert und schließlich gebunden an MHC-I auf der Zelloberfläche präsentiert. Zwar können alle Körperzellen von Viren befallen werden und virale Antigene im Komplex mit MHC-I auf ihrer Zelloberfläche präsentieren; aber naive CD8+ T-Zellen benötigen zur Proliferation neben diesem ersten Signal ein zweites Signal durch CD28, das nur Zellen mit CD80 oder CD86 vermitteln können. Deshalb kann eine zytotoxische T-Zellantwort nur durch professionelle APC initiiert werden. In manchen Fällen genügt dieser Kontakt zwischen CD8r T-Zelle und APC, um die Proliferation der T-Zellen und ihre Differenzierung zu CTL zu induzieren. Oft ist jedoch die zusätzliche Hilfe von CD4+ T-Zellen nötig. Die T-Helferzellen müssen

durch einen Peptid/MHC-II-Komplex von derselben APC aktiviert werden. Ihre Hilfe für die CD8+ T-Zellen kann dann darin bestehen, daß sie die APC zur vermehrter Expression von CD80 und CD86 aktivieren, oder darin, daß sie den Wachstumsfaktor IL-2 in hohen Konzentrationen sezernieren. Vollständig aktivierte CD8+ T-Zellen proliferieren und differenzieren zu CTL und Memory-T-Zellen. CTL besitzen zytoplasmatische Granula, welche das porenbildende Protein Perforin und Proteasen enthalten. Außerdem exprimieren sie auf ihrer Zelloberfläche den Liganden für CD95/Fas/APO-l (CD95L). Wenn CTL nun auf ihren antigenen Peptid/MHC-I-Komplex treffen, werden sie sofort „getriggerf; sie benötigen jetzt kein zweites Signal mehr. Deshalb können CTL alle MHC-Ipositiven Zellen des Organismus lysieren, wenn diese z.B. von Viren befallen sind. Es gibt zwei Hauptmechanismen, durch die CTL ihre Zielzelle töten können: 1. CD95L kann an CD95 auf der Oberfläche der angegriffenen Zelle binden. Dieses Signal löst in der Zielzelle ein Zelltodprogramm aus. Apoptose genannt. 2. Der Inhalt der zytotoxischen Granula wird in den Kontaktspalt zwischen CTL und Zielzelle abgegeben (Abb. 1.27). Perforin ähnelt der Komplementkomponente C9, es kann ebenfalls in der Zellmembran Poren bilden. Dies führt zur Auslösung von Apoptose durch Proteasen aus den zytotoxischen Granula, z. B. Granzym B, welche durch die Poren ins Zytoplasma der Zielzelle gelangen und dort eine Proteasekaskade auslösen. Die CTL ist selbst gegen den Inhalt ihrer Granula resistent. Sie verläßt die sterbende Zelle und macht sich auf die Suche nach weiteren Opfern. Da CTL so leicht getriggert werden, dann kaum noch kontrollierbar sind und viele Zielzellen lysieren können, sind sie potentiell sehr gefährlich: Eine einzige autoreaktive CTL könnte erheblichen Schaden im Organismus anrichten. Der Schaden wird aber dadurch begrenzt, daß CTL terminal differenzierte Zellen mit begrenzter Lebenszeit sind. Die Reifung neuer CTL aus naiven CD8+ T-Zellen ist jedoch, wie oben beschrieben, ein streng regulierter Vorgang. Der Mechanismus der Apoptose ist gut charakterisiert: im [nnern der Zelle bildet sich um die zytoplasmatischen Teile von CD95 herum ein multimolekularer Komplex aus, der sogenannte DISC (death inducing signaling complex). Zentraler Bestandteil des DISC ist die Protease Caspase 3, welche in diesem

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

Proteasen, lytische Moleküle

Komplex durch autokatalytische Spaltung aktiviert wird. Dies setzt eine Proteasekaskade in Gang, welche schließlich zur Zerstörung lebenswichtiger Zellproteine führt. Außerdem wird DEDD (death effector domain-containing DNA-binding protein) aktiviert, welches im Nukleolus mit sehr hoher Affinität an alle zugänglichen DNA-Sequenzen bindet und dadurch die Transkription blockiert. Schließlich kommt es zur Aktivierung einer Caspase-aktivierten DNAse (CAD), welche im Kern die DNA zwischen den Nukleosomen schneidet und sie dadurch in Fragmente mit charakteristischer Länge (Vielfache von 200 Basenpaaren) zerlegt. Morphologisch scheint die Zellmembran der apoptotischen Zelle zu „kochen", es entstehen kleine Bläschen. Der Kern und die ganze Zelle schrumpfen, das Chromatin wird zu elektronendichten Massen kondensiert (Kcrnpyknose), der Zellkern wird fragmentiert. Schließlich fragmentiert die ganze Zelle und bildet sogenannte apoptotic bodies aus, welche sehr schnell von Makrophagen aufgenommen werden. Die apoptotic bodies sind noch von einer impermeablen Zellmembran umgeben, so daß der Zellinhalt, z.B. die lysosomalen Enzyme, bei der Apoptose nicht in die Umgebung abgegeben werden. Auch Makrophagen werden durch die Aufnahme von apoptotische Zellen in der Regel nicht aktiviert, so daß die Apoptose unauffällig und ohne Entzündung verläuft. JG-T-Zellen

Etwa 5% aller T-Zellen exprimieren einen yö-TZellrezeplor. Im Epithel des Darmes sind sie angereichert. yS-T-Zellen exprimieren entweder eine geringe Dichte von CD8 oder sie kommen ganz ohne die CD4/CD8- Korezeptoren aus. In der Ontogenese entstehen die ersten yö-T-Zellen bereits vor den ctß-T-Zellen. Über ihre Reifung und Selektion ist wenig bekannt; yö-T-Zellen können auch unabhängig vom Thymus entstehen. Die Funktion dieser Zellen ist nicht voll

Abb. 1.27 S c h e m a t i s c h e Darstellung der Mechanismen der Zytotoxizität durch CD8+ T-Zellen. Antigen-Erkennung durch den TCR führt zur Exozytose von Granula. Das hierin enthaltene Perforin (rot) bildet Poren, durch die zytolytische Moleküle ins Innere der Zelle dringen können. Außerdem wird der Ligand für CD95 auf der Oberfläche der T-Zelle hochreguliert. Seine Bindung an CD95 auf der Zielzelle induziert über die Aktivierung von Caspasen ebenfalls Apoptose.

verstanden. Man schreibt ihnen eine Rolle bei der frühen Abwehr von Infektionen zu, weil sie sich bei Infektionskrankheiten wie Malaria oder Brucellose vermehren, und weil im Mausmodell manche Erreger nur in Anwesenheit von y6-TZellen abgewehrt werden können. Es sind yö-TZellen beschrieben worden, die wie uß-T-Zcllen ein Peptidantigen MHC-restringiert erkennen. Typischer scheinen jedoch yö-T-Zellen zu sein, welche keine Peptide, sondern niedermolekulare, chemisch sehr diverse Liganden erkennen. So wurden Spezifitäten für Oligosaccharide, Nukleoside und phosphorylierte Fettsäuren aus der Zellwand von Mycobacterium tuberculosis beschrieben. Diese Antigene scheinen nicht von MHC-Molekülen präsentiert zu werden. Dies steht im Einklang damit, daß der yö-TcR den Fab-Fragmenten der Immunglobulinmoleküle strukturell ähnlicher ist als dem aß-TcR.

1.2.9 Natural-Killer-Zellen Natürliche Killer-Zellen (NK-Zellen) sind Lymphozyten, welche in vieler Hinsicht zytotoxischen T-Zellen ähneln: z.B. exprimieren sie CD2 und können Zellen lysieren; sie haben aber keinen TcR. Auch lysieren sie ihre Zielzellen sofort ohne eine Phase der Immunisierung und Differenzierung. NK-Zellen spielen deshalb eine wichtige Rolle in der frühen, nicht-adaptiven Phase der Abwehr einer Infektion durch intrazelluläre Erreger. NK-Zellen tragen auf ihrer Oberfläche sowohl stimulatorische Rezeptoren als auch die inhibitorischen KIR (killer cell inhibitory reeeptor). Die Mitglieder der großen KIR-Familie haben Spezifität für MHC-I-Allele; NK-Zellen werden also durch MHC-I ge-

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hemml. In der Ontogenese durchlaufen die NKZellen einen Selektionsprozeß, so daß alle reifen NK-Zellen durch die MHC-I-Allele gehemmt werden, die normalerweise im Organismus exprimiert sind. Dies führte zur sog. Missing-selfHypothese: NK-Zellen werden aktiviert, wenn MHC-I-Moleküle auf der Zelloberfläche fehlen. Viele Viren haben Mechanismen zur Unterdrückung der MHC-I-Expression und der Antigenpräsentation entwickelt, um den CTL zu entgehen. Hier springen NK-Zcllen ein. NK-Zellen wirken eng mit dem adaptiven Immunsystem zusammen: Erstens sezernieren aktivierte NK-Zellen IFN-y und treiben dadurch die T-Zellantwort in Richtung auf ein Thl-Profil. Dies ist sinnvoll bei einer Infektion mit intrazellulären Erregern. Zweitens werden NK-Zellen stark aktiviert durch IL-2, das Sekretionsprodukt voll aktivierter T-Zellcn. Drittens sind NK-Zellen auch Effektoren des humoralen Arms der Immunantwort. Sie exprimieren Fcy-Rezeptoren vom Typ III (CDJ 6) in hoher Dichte auf ihrer Oberfläche. Damit binden sie an Zellen, welche durch Antikörper markiert sind, und lysieren sie (ADCC, s. Kap. 1.2.4). NK-Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Tumorabwehr (s. Kap. 1.2.15).

1.2.10 Interleukine und ihre Rezeptoren Interleukine (IL) sind lösliche Mediatoren des Immunsystems. Viele IL können von mehreren Zelltypen produziert werden; die meisten haben ihrerseits Wirkungen auf eine Vielfalt von Zielzcllen, die die entsprechenden Rezeptoren tragen. Ein einzelnes Interleukin kann daher vielfältige (pleiotrope) Wirkungen haben. Die Komplexität wird dadurch noch erhöht, daß verschiedene Interleukine synergistisch oder antagonistisch wirken können. Wahrscheinlich sind es Muster von Interleukinen, welche im Verlauf einer Abwehrreaktion immer wieder in sinnvoller Sequenz gebildet werden, die gemeinsam den beteiligten Zellen des Immunsystems die notwendigen Informationen über den „Stand der Dinge" vermitteln. Hierdurch sind die Interleukine an der Feinabstimmung der Immunantwort beteiligt. Viele Interleukine sind in diesem Kapitel bereits erwähnt worden. Hier soll noch einmal ein kurzer Überblick gegeben werden (Tab. 1.9). Lymphokine. So werden Interleukine bezeichnet, die von T-Zellen produziert werden. Hierzu

gehören z.B. IL-2, IFN-y, IL-4 und 1L-5 sowie koloniestimulierende Faktoren (CSF), welche die Hämatopoese regeln. Das Muster der sezernierten Zytokine charakterisiert funktioneil die verschienen T-Zcllsubpopulationen (ThO, Thl. Th2). Proinflammatorische Zytokine wie IL-1, TNF-a

und IL-6 werden von Monozyten und Makrophagen nach Aktivierung sezerniert. Sie induzieren und unterhalten die Entzündungsreaktion. Chemokine. Das sind kleine Proteine (8-10 kD). die auf verschiedene Zelltypen chemotaktisch wirken. Zur Zeit sind etwa 15 verschiedene Chemokine beschrieben und etwa 12 Chemokin-Rezeptoren bekannt. Einige Rezeptoren reagieren auf mehr als ein Chemokin, viele Rezeptoren sind auf mehreren Zelltypen vorhanden. So werden gleiche Chemokinrezeptoren oftmals von allen Zelltypen gebildet, welche bei einer bestimmten Abwehrreaktion zusammenwirken. Der Rezeptor CCR5 ist z.B. spezifisch auf ThlZellen und Monozyten zu finden, CCR3 auf Th2-Zellen und eosinophilen und basophilen Granulozyten. Deshalb sorgen die Chemokine anscheinend für die richtige Zusammensetzung des Zellinfiltrats am Ort einer Immunantwort, damit an einer gegebenen Immunreaktion alle Zellen teilnehmen, die benötigt werden. Die Chemokinrezeptoren CCR5 (auf Monozyten) und CXCR4 (auf T-Zellen) sind als Ko-Rczeptoren für HIV identifiziert worden. Die Vielfalt der Rezeptor-Moleküle für die verschiedenen Zytokine spiegelt die Komplexität des Interleukinsystems wider. Man findet hier Mitglieder der lmmunglobulin-Superfamilie (z.B. IL-1R), Rezeptoren mit 7 Transmembranabschnitten (Chemokinrezeptoren) und Fasähnliche Rezeptoren mit death domains (TNFR). Andere Rezeptoren bilden eigene Familien: die Rezeptorfamilie der hämatopoetischen Wachstumsfaktoren (z.B. die ß- und y-Ketten des IL-2-R) und die Familie der Interferon-Rezeptoren. Viele Interleukinrezeptoren bestehen aus mehreren Ketten. Manche Rezeptoren werden sezerniert und inaktivieren in löslicher Form das entsprechende Zytokin.

1.2.11 Die Begrenzung und Beendigung einer Immunreaktion Jede Abwehrreaktion durch die Effektormechanismen des Immunsystems birgt die Gefahr der Schädigung des Organismus selbst. Die Begren-

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr Zytokin

vorwiegend produzierende

hauptsächliche Wirkungen

IL-1

Zellen Makrophagen, fast alle Zellen

inflammatorisch, pyrogen, aktivierend für fast alle Zellen des

IL-2 IL-3

+

CD4 und CD8- T-Zellen + CD4 -T-Zellen +

IL-4

CD4 -T-Zellen (vorw. Th2), Mastzellen

IL-5

T-Lymphozyten

IL-6

viele verschiedene Zellen, besonders Makrophagen Monozyten, T-Zellen, Thrombozyten, Endothelzellen

IL-8

IL-9

T-Lymphozyten

IL-10

Makrophagen, B-Zellen, T-Zellen

IL-12

Makrophagen, dendrit-Zellen

IL-13

T-Lymphozyten

Interferon-y

T-Zellen, NK-Zellen

Tumornekrosefaktor-a

Monozyten, T-Zellen

Immunsystems Wachstum von T-Zellen, NK-Zellen und B-Zellen Wachstum von hämatopoetischen Vorläuferzellen (Multi-CSF) und Mastzellen Proliferation von B-Lymphozyten, Klassenwechsel zu IgE, Wachstum von Mastzellen, Wachstum von Th2-Zellen, Klassenwechsel zu lgG4, Hemmung der Bildung von Th1 -Zellen Wachstum und Aktivierung von eosinophilen Granulozyten, Wachstum von B-Lymphozyten Wachstum von B-Lymphozyten, Induktion von „AkutphaseProteinen" in der Leber Mitglied der Familie der Chemokine, inflammatorisch, chemotaktisch für verschiedene Zellen, aktivierend für verschiedene myeloide und lymphoide Zellen Wachstum von T-Lymphozyten, Mastzellen und bestimmter hämatopoetischer Vorläuferzellen Unterdrückung von Wachstum und Interferon-y-Produktion bei Th1 -Zellen, Hemmung der Wirkung von Interferon-y, Hemmung der Antigenpräsentation von Makrophagen Aktivierung von NK-Zellen zur Interferon-y-Produktion, Stimulation von Thi-Zellen, Differenzierung von CTL Wirkungen denen des IL-4 sehr ähnlich Aktivierung von Makrophagen zur Abtötung intrazellulärer Bakterien und Parasiten und zur Produktion von Mediatoren wie IL-1, Tumornekrosefaktor-a, IL-6; verstärkte Expression von MHC-Molekülen, Verstärkung der Phagozytose, Hemmung des Wachstums von TH2-Zellen, Klassenwechsel zu IgGI, Hemmung des Klassenwechsels zu IgE Inflammatorisch, pyrogen, zytotoxisch, aktivierend für Granulozyten, Makrophagen, B-Zellen, synergistisch mit vielen Zytokinen. Freisetzung von PGE2, Hypotension, „AkutphaseAntwort"

zung und Beendigung der Immunreaktion sind deshalb für den Organismus lebenswichtig. Diese Mechanismen sind an verschiedenen Stellen schon erwähnt worden und sollen hier noch einmal zusammengefaßt werden. Immunreaktionen dürfen nur dort ausgelöst werden, wo Gefahr droht. Gegen Antigene des Organismus selbst muß das System tolerant sein. Bei T-Zcllen entsteht während ihrer Reifung zunächst die zentrale Toleranz, welche durch negative Selektion und Apoptose autoreaktiver TZellen im Thymus etabliert wird. Aber nicht alle Autoantigene werden im Thymus präsentiert. Deshalb muß die zentrale Toleranz durch periphere Toleranzmechanismen ergänzt werden. In

der Regel treffen autoreaktive T-Zellen, welche

den Thymus überlebt haben, ihr Autoantigen als erstes auf einer Körperzelle. Diese gibt ihnen das erste, nicht aber das zweite, für die Aktivierung erforderliche Signal. Dadurch werden diese autoreaktiven T-Zellen anerg oder sterben. Auch das B-Zellrepertoire unterliegt während der Reifung der Zellen einer Selektion, wobei die zentrale B-Zelltoleranz etabliert wird. In der Peripherie ist diese Toleranz jedoch stets gefährdet durch die somalische Mutation der Immunglobulin-Genc. Die periphere B-Zellfoleranz wird nun durch die T-Zelltoleranz garantiert: BZellen mit mutierten Immunglobulinen sind für ihr Überleben und für ihre Differenzierung zu Antikörper-sezernierenden Plasmazellen unbedingt auf T-Zellhilfe angewiesen. Wenn die B-

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Allgemeine Infektionslehre

Zellen in den Keimzentren autoreaktiv geworden sind, präsentieren sie den T-Helferzellen Autoantigen. Hierfür sind die T-Zellen jedoch tolerant, und sie verweigern die Hilfe. Ist eine Immunreaktion jedoch einmal in Gang gekommen, bewirken vielfältige positive Feedback-Mechanismen, daß sie schnell ein hohes Niveau erreicht. Der Vorteil der adaptiven Immunität für den Organismus besteht ja gerade darin, daß Schnelligkeit und Intensität bei einer wiederholten Infektion mit demselben Erreger noch wesentlich gesteigert werden können. Welche Mechanismen dämpfen diesen Ausbruch dann wieder? Zunächst sind die Effektorzellen lerminal differenziert, d.h. sie können sich nicht mehr teilen und haben eine begrenzte Lebenszeit. So klingen die Antikörper-Sekretion durch Plasmazellen und die CTL-Antwort von allein ab, sofern sich nicht permanent neue Zellen differenzieren. Die Rekrutierung und Differenzierung von Effektorzellen hört aber auf, sobald das Antigen eliminiert ist. Aber das Immunsystem besitzt darüberhinaus Mittel, eine Immunreaktion aktiv zu beenden: 1. IL-10, ein Sekretionsprodukt aktivierter Th2Zellen und Makrophagen hemmt die Funktionen der APC. 2. Nach ihrer Aktivierung kann in T-Zellen selbst leicht Apoptose ausgelöst werden. 3. Aktivierte T-Zellen exprimieren auf ihrer Oberfläche CTLA-4 (CD 152), ein Homodimer mit Sequenzhomologie zum kostimulatorischen Rezeptor CD28. CTLA-4 bindet ebenfalls CD80 und CD86-Moleküle auf der Oberfläche der APC, gibt der T-Zelle jedoch ein negatives Signal, welches ihre Proliferation beendet. 4. B-Zellen tragen auf ihrer Oberfläche den FcyRezeptor CD32. Wenn ihr spezifisches Antigen bereits mit Antikörper komplexiert ist, können diese Komplexe gleichzeitig den spezifischen Antigen-Rezeptor und den Fcy-Rezeptor binden. Hierdurch wird die B-Zelle abgeschaltet.

1.2.12 Spezielle Infektabwehr Das Immunsystem ist mit einer Vielfalt von Erregern konfrontiert, die eine Vielzahl von verschiedenen Strategien der Infektion verwenden. Für jeden Erregertyp, fast für jeden Erreger selbst, gibt es spezifische Kombinationen von Abwehrmechanismen. Eine vollständige enzyklopädische Auflistung aller molekularen Ab-

wehrmechanismen gegen alle verschiedenen Erreger ist an dieser Stelle nicht möglich. In diesem Kapitel sollen anhand von Beispielen wesentliche Prinzipien der spezifischen Abwehr erklärt werden, die gegen exemplarische Erreger angewendet werden. Die meisten Kenntnisse dieser Abwehrmechanismen stammen aus experimentellen Infektionen, im allgemeinen der Maus. Nur relativ wenige Daten wurden aus klinischen Beobachtungen gewonnen oder aus der Untersuchung von Patientenmaterial. Da sich die Immunsysteme von Maus und Mensch in wesentlichen Einzelheiten unterscheiden, muß dies bei der Beurteilung der Abwehrmechanismen berücksichtigt werden. Abwehr von intrazellulären Erregern Viren

Mechanismen der unspezifischen Resistenz wehren Viren vor oder zu Beginn der Infektion ab. Physikalische Barrieren bestehen z.B. in Epithelien wie Flimmerepithel oder Haut, oder im Magensaft. Früh nach Infektion werden Interferone gebildet (IFN-a aus vorwiegend mesenchymalen Zellen und IFN-ß vorwiegend aus Leukozyten), welche die Ausbreitung der Virusinfektion durch Schutz nicht infizierter Zellen verhindern. Ihre antivirale Wirkung beruht auf verschiedenen Mechanismen, u.a. einer Degradation von RNA in der Zelle und einer Hemmung der Proteinsynthese. Weitere Wirkungen dieser Interferone sind eine Aktivierung von Natural-Killer-Zellen, die virusinfizierte Zellen lysieren können und IFN-y produzieren, das neben anderen Wirkungen auch antivirale Wirkung besitzt. Außerdem induzieren diese Interferone eine verstärkte Expression von MHC-IMolekülen, die infizierte Zellen leichter erkennbar für T-Zellen macht und nicht-infizierte Zellen vor dem Angriff von NK-Zellen schützt. Wenige Tage nach der Infektion sind die Mechanismen der spezifischen adaptiven Abwehr, Antikörper und T-Zellen, nachweisbar. Die drei wesentlichen Effektormechanismen sind Neutralisierung von Viruspartikeln durch Antikörper, Zerstörung der infizierten Zellen durch zytotoxische T-Zellen und das von diesen Zellen produzierte IFN-y. Als Neutralisation wird die Hemmung der Infektion durch Viren bezeichnet. Viren besitzen spezifische Rezeptoren für Wirtskomponenten. Diese Rezeptoren können, wie im Falle der Myxoviren, spezifische Lektine für Neuramin-

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

säure oder ähnliche Zuckerstrukturen sein. Sie können auch über Protein-Protein-Wechselwirkung mit Zeiloberflächenmolekülen reagieren, wie im Falle des Glykoproteins des HIV mit CD4 und Chemokin-Rezeptoren oder im Falle des Rhinovirus mit dem intercellular adhesion molecule-I (CD54). Antikörper-Bindung an die Rezeptorstrukturen der Viren verhindert die Infektion der Zelle. Neutralisierende Antikörper sind daher ein wichtiger Schutzmechanismus gegen eine Reinfektion (insbesondere in Form von IgA-Antikörpern an den Eintrittspforten) und auch während der Infektion. Freigesetzte Viruspartikel werden durch Antikörper gegen externe Virusproteine, wie z.B. das Hämagglutinin des Influenzavirus, neutralisiert. Dies geschieht entweder direkt durch molekulare Blockade in verschiedenen Stadien der Zellinfektion oder indirekt durch Mitwirkung von Komplement oder Fc-Rezeptor-tragenden Phagozyten. Da virale Proteine wie zelluläre Proteine im ER synthetisiert werden, werden virale Antigene vorwiegend durch MHC-I präsentiert. Daher sind CD8+ T-Zellen, die virale Peptide auf MHC-Klasse-I-Molekülen erkennen, die klassischen antiviralen Effektorzellcn. Durch die weite Verbreitung der MHC-I-Moleküle können CD8T Zellen prinzipiell alle durch eine Infektion veränderten Zellen des Organismus zerstören. Sowohl zytopathische als auch nicht-zytopathische Viren werden durch diese Zellen abgewehrt. Die virusinfizierte Zelle kann früh (in der Eklipse) erkannt werden, zu einem Zeitpunkt, an dem zwar frühe Virusproteine hergestellt werden, aber noch kein infektiöses Virus gebildet wird. Sogenannte „immediate early"- und „early"-Proteine sind daher bei zytopathischen Viren die entscheidenden Zielantigene. Ein Problem der späten Zerstörung virusinfizierter Zellen ist die Freisetzung dann schon gebildeter infektionstüchtiger Viruspartikel durch die Zytolyse. In diesem Fall kommt die Zellzerstörung als entscheidender Schutzmechanismus zu spät. Die schützende Wirkung der CD8-positiven Zellen wird dann durch Zytokine (insbesondere IFN-y) vermittelt, das sie nach Antigenerkennung produzieren. Daher schützt die Zytotoxizität gegen eine virusinfizierte Zelle spät im Infektionszyklus nur bei nicht-zytopathogenen Viren, die in infizierten Zellen persistieren und infektiöse Virionen ohne Zelltod dauernd freisetzen. Auch CD4+ T-Zellen spielen eine wichtige Rolle. Als Helferzellen sind sie entscheidend für die

Produktion von neutralisierenden Antikörpern. Im Keimzentrum präsentieren B-Lymphozyten, die mit ihrem Antigenrezeptor gegen ein externes Virusprotein Viruspartikel aufgenommen haben, virale Antigene mit MHC-11-Molekülen für CD4-Zellen. Da Peptide aus allen viralen Antigenen präsentiert werden, können auch THelferzellen, die Peptide von internen Virusproteinen erkennen, mit den B-Zellen interagieren. CD4-Zellen sind auch wichtig für die Aufrechterhaltung der CD8-Antwort. Sie können auch selbst, durch die Produktion von Zytokinen. als Effektorzellen wirken und möglicherweise in begrenztem Umfang auch als zytotoxische Effektorzellcn. Intrazelluläre Bakterien und Parasiten

Fakultativ intrazelluläre Erreger, die auch außerhalb ihrer Wirtszellen wachsen können, sind z.B. Mykobaktcrien , Salmonellen, Brucellen. Legionellen, Listerien, Toxoplasmen oder Leishmanien. Alle diese Erreger nutzen den eigentlich für sie gefährlichen Makrophagen als wichtigste oder oft einzige Wirtszelle. Sie werden durch eine erleichterte Phagozytose aufgenommen, indem sie Rezeptoren der Makrophagen binden, und werden dann in ein Phagosom verbracht. Hier können sie entweder verbleiben oder ins Zytoplasma entkommen (Listerien). Obligat intrazellulär wachsen z.B. Rickettsien und Chlamydien. Sie benutzen vorwiegend Endothclzellen oder Epithelzellen als Wirtszellen, in die sie über Rezeptoren gelangen. Chlamydien bleiben im Phagosom, Rickettsien entkommen ins Zylosol. Der Schutz gegen diese Erreger ist vollständig T-Zell-abhängig. Im Gegensatz zu anderen Mikroorganismen können diese Erreger im ruhenden Makrophagen überleben, da sie die Fusion des Phagosoms mit dem Lysosom verhindern oder resistent gegen die intrazellulären Abtötungsmechanismen des Phagolysosoms (lysosomale Enzyme und niedrigen pH, Sauerstoffmetaboliten) sind. Erst nach „Aktivierung" durch Zytokine von T-Zellen erhalten Makrophagen die Fähigkeit, die meisten intrazellulären Parasiten abzutöten oder in ihrem Wachstum zu hindern. Das entscheidende Zytokin in dieser Hinsicht ist IFN-y, das u.a. die Produktion bakterizider reaktiver Saucrstoffmetabolite bewirkt, durch Induktion der NO-Synthase reaktive Stickstoffmetabolite entstehen läßt und durch den Abbau von Tryptophan intrazelluläre Erreger aushungert. Die Effektor-Zellen, die die Makrophagen zur

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Allgemeine Infektionslehre Abtötung befähigen, sind in erster Linie CD4"1" T-Zellen vom Thl-Typ, die in der Lage sind, IFN-Y zu sezernieren. Daher ist für die Abwehr dieser Erreger von größter Bedeutung, daß früh die Immunreaktion auf die Bildung von ThlZellen gerichtet wird. Entscheidend ist die frühe Bildung von IL-12, das NK-Zellen zur Bildung von IFN-y anregt und die Reifung von Thl-Zellen bewirkt. IL-12 und IFN-Y bewirken gleichzeilig eine Unterdrückung der Bildung von Th2Zellen. Das von Th2-Zellen gebildete IL-4 wirkt auf den Makrophagen direkt antagonistisch zur aktivierenden Wirkung des IFN-y. Das klassische Beispiel für die Bedeutung der Thl-Zellen ist die Infektion der Maus mit Leishmania major. Schutz gegen dieses in Makrophagen ansässige, obligat intrazelluläre Protozoon wird nur durch IFN-Y vermittelt, das von CD4+ Thl-Zellen produziert wird. Mäuse, die eine Immunantwort vom Th2-Typ generieren, können das Wachstum des Parasiten nicht kontrollieren und sterben an der Infektion. Ähnlich scheint bei der lepromatösen Lepra des Menschen eine Immunreaktion vom Th2-Typ mit IL-4 Produktion vorzuliegen, während bei der tuberkulösen Form IFN-Y gefunden wird. Die typische histologische Struktur, die bei der Thl-Reaktion entsteht, ist das Granulom mit TZellen und Makrophagen in verschiedenen Differenzierungstadien, inklusive Epitheloidzellen und Riesenzellen. Es ist essentiell für die lokale Begrenzung der Infektion. Allerdings führt die Bildung von Granulomen meist zu einer Störung der Gewebefunktion bis hin zur Gewebezerstörung wie z.B. bei der tuberkuloiden Lepra. CD8-positive Zellen stellen auch einen effizienten Effektormechanismus gegen diejenigen Erreger dar, denen es gelingt, ins Zytoplasma zu entkommen. Dies ist z.B. der Fall bei Listeria monocytogenes, das durch das porenbildende Listeriolysin die phagozytische Vakuole aktiv verlassen kann. Die Proteine, die der Erreger dort synthetisiert, können damit auch von MHC-Klasse-I-Molekülen präsentiert werden. Es werden aber auch Antigene von Mycobacteriuni tuberculosis oder von Yersinien und Salmonellen durch Klasse-I-Moleküle präsentiert. CD8-positive T-Zellen wirken sowohl durch Zytolyse als auch über sezernierte Zytokine, in erster Linie IFN-Y. Zwei unabhängige Mechanismen der zellulären Zytotoxizitäl stehen ihnen zur Verfügung. Der wichtigste Mechanismus ist die Sekretion des porenbildenden Proteins Perforin und das Eindringen von Esterasen (Gran-

zymen) und lytischen Peptiden durch die Perforinpore. Dieser Weg scheint auch zu einer direkten Schädigung der intrazellulären Erreger zu führen. Der zweite Weg ist die Hochregulation des Liganden für Fas (CD95), das in der Zielzelle Apoptose induziert. CD8-Zellen spielen auch eine Rolle gegen Erreger in anderen Zellen als Makrophagen. Ein typisches Beispiel ist die Lyse der mit Plasmodien-Sporozoiten infizierten Hepatozyten durch CDS* CTL. Nach entsprechender Immunisierung können durch Zerstörung der infizierten Leberzellen die Sporozoiten nicht zu den Blutformen heranreifen und es kommt zu einer sterilen Immunität bei einer Reihe von Versuchstieren.

Abwehr von extrazellulären Erregern Bakterien und Protozoen

Extrazelluläre Bakterien können nur im Wirt überleben, wenn sie den entscheidenden Abwehrmechanismus, die Zerstörung durch professionelle Phagozyten, Granulozyten und Makrophagen, umgehen. Sie tun dies, indem sie die Phagozytose durch Polysaccharid-Kapseln oder antiphagozytäre Proteine wie das M-Protein von Streptococcus pyogenes verhindern. Daher ist eine durch Antikörper und Komplement erleichterte Phagozytose (Opsonisierung) ein wichtiger Mechanismus zur Abwehr dieser Bakterien, bedeutender als die Lyse der Bakterien durch die terminale Komplementsequenz. Defekte der frühen Komponenten des Komplementsystems führen ebenso wie Granulozytendefekte zur Häufung eitriger Infektionen. Die besonders gegen Kohlenhydrat-Antigene gebildeten IgG2- (und auch IgG4-) Antikörper werden erst im zweiten Lebensjahr produziert. Daher sind Infektionen mit Kapsel-tragenden Bakterien, wie Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae oder Neisseria meningitidis für Kleinkinder besonders gefährlich. Ein selektiver Mangel der Immunglobuline der IgG2- und IgG4-Subklasse ist ein nicht seltener Immundefekt. Diese Patienten sind besonders anfällig für Infektionen mit Kapsel-tragenden Bakterien. Typischerweise produzieren viele extrazelluläre Bakterien Toxine und Enzyme, die entscheidende Pathogenitätsfaktoren sind und sich oft gegen Bestandteile des Immunsystems richten. Die Neutralisation von Exotoxinen verschiedener Bakterien, die besonders von IgGl- und IgG3Antikörpern übernommen wird (auf den

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

Schleimhäuten von IgA), ist die am längsten bekannte Wirkung der Antikörper. Die Adhärenz von Bakterien durch spezifische Adhäsine ist eine Voraussetzung für die Infektion von Zellen oder für die Anheftung an die Oberfläche von Epithelien. Das extrazelluläre Bakterium Neisseria gonorrhoeae adhäriert an Epithelzellen des Urogenitaltraktes durch ein spezifisches Oberflächenprotein, das als „Pilin" bezeichnet wird. Antikörper gegen Pilin hemmen die Adhärenz und verhindern die Infektion. Durch die Hemmung der Adhärenz kann der Erreger über mechanische Reinigungsmechanismen entfernt werden. Für die Hemmung der Kolonisierung auf Schleimhäuten sind TgA-Antikörper von besonderer Wichtigkeit, allerdings erst bei Sekundärinfektionen, da ihre Bildung beim primären Kontakt mit dem Erreger zu spät kommt. Als Evasionsmechanismus bilden dieser und andere Erreger spezifische IgA-Proteasen, um dieser Adhärenzinhibition zu entgehen. Die einzigen Protozoen, die dauernd extrazellulär leben und dem Immunsystem immer zugänglich sind, sind die afrikanischen Trypanosomen, die Erreger der Schlafkrankheit. Durch die dauernde Variation ihrer Antigene sind sie für das Immunsystem nicht erreichbar (s.u.). Plasmodien sind als Blutformen nur für Sekunden frei im Blut zugänglich, sonst sind sie in den infizierten Erythrozyten verborgen. Die Antikörper-abhängige Sequestration und Phagozytose dieser an der Oberfläche durch ein Parasitenprotein veränderten Erythrozyten in der Milz ist der wesentliche Abwehrmechanismus gegen Plasmodien.

be toxischer Moleküle zu aktivieren. Dies geschieht meist durch Antikörper-abhängige zelluläre Abwehrmechanismen. Gegen viele Würmer ist eine IgE-abhängige Aktivierung von eosinophilen, basophilen und neutrophilen Granulozyten und auch Mastzellen über ihre hochaffinen Fc-Rezeptoren für IgE entscheidender Effektormechanismus. Der Wirt bildet hierzu üblicherweise eine T-Zellantwort vom Th2-Typ mit Produktion von 1L-4 und 1L-5 aus, die zur Bildung von spezifischem IgE und einer Eosinophilie führt. Auch IgG-Antikörper gegen Wurmantigene können neutrophile und eosinophile Granulozytcn über den Fcy-Rezeptor (CD16) aktivieren. Die Aktivierung dieser Zellen führt zur Freisetzung von Mediatoren und Proteinen aus Granula der Zellen und damit einerseits zur direkten Schädigung der Parasiten, andererseits auch zu einem lokalen entzündlichen Milieu, das ungünstig für den Wurm ist und seine Fruchtbarkeit reduziert. Dieser Mechanismus trifft sowohl für Würmer im Gewebe als auch für intestinalc Helminthen zu.

Pilze

Antigenetische Heterogenität ist eine der häufigsten Ursachen für eine fehlende Immunität gegenüber Mitgliedern einer bestimmten Spezies von Mikroorganismen. Die meisten Beispiele für Heterogenität bei Mikroorganismen betreffen eine Variabilität durch antigenetisch unterschiedliche Stämme derselben Spezies. Beispiele sind die Kapselserovare bei Pneumokokken und vielen Enterobacteriaceae, die M-Proteine bei Streptokokken oder die LPS-Variabilität der O-Seitenkette bei Enterobacteriaceae. Ein besonderer Selektionsvorteil ist jedoch die Antigenvariation, d.h. die Variation der antigenetischen Struktur von Oberflächenmolekülen innerhalb eines Klones eines bestimmten Erregers. Viele Krankheitserreger sind in der Lage, ihre Antigenität stark zu verändern, indem sie durch

Evasionsmechanismen

Infektionserreger haben eine Vielzahl von Strategien entwickelt, dem Angriff des Immunsystems zu entgehen. Dies umfaßt sowohl ein Ausweichen vor der Immunantwort als auch eine aktive Interferenz mit Mechanismen der Immunabwehr. Einige Beispiele sollen hier beschrieben werden. Antigenvariation

Die Abwehr von Pilzinfektionen ist komplex und abhängig vom jeweiligen Erreger. Generell ist, trotz ihrer extrazellulären Lokalisation, die Resistenz abhängig von IFN-y-produzierenden Thl-Zellen. Daher sind Infektionen mit Pilzen bei HlV-Infizierten häufig. Jedoch spielen bei manchen Pilzen, z.B. bei Hefen, Opsonisierung und Phagozytose oder Angriff durch Granulozyten eine wichtige Rolle, C. albicans bietet daher Probleme bei neutropenischen Patienten. Helminthen

Bei der Wurminfektion ist der Wirt mit einem vielzelligen Erregerorganismus konfrontiert, der nur in Teilen und oberflächlich zu attackieren ist. Daher besteht die Abwehr dieser Parasiten darin, an ihrer Oberfläche Zellen zur Abga-

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Allgemeine Infektionslehre

Mutationen oder Rekombination von Genen anligene Determinanten ersetzen. Das klassische Beispiel sind die Antigenvariationen der afrikanischen Trypanosomen, der Erreger der Schlafkrankheit. Die Parasitämie durch Trypanosoma brucei verläuft wellenförmig, indem immer wieder eine neue Subpopulation entsteht, die eine antigenetisch neue Form des Haupt-Oberflächenglycoproteins VSG auf ihrer Oberfläche trägt. Daher können diese Erreger frei im Blut vorliegen; eine Antikörperantwort ist, durch die Vielzahl der Variationsmöglichkeiten des Glykoproteins, nicht in der Lage, die Infektion dauerhaft zu kontrollieren. Ähnliche Veränderungen gibt es bei den Pili von Neisseria meningitidis und Neisseria gonorrhoeae. Sie werden von virulenten Stämmen gebildet und ermöglichen die Anheftung an das Wirtsepithel. Plasmodium falciparum exprimiert das Protein PfEMPl, das auf der Oberfläche von infizierten Erythrozyten erscheint und für deren Sequestration in der Mikrozirkulation verantwortlich ist. Es bestimmt die Antigenilät des infizierten Erythrozyten. Es wird von Mitgliedern der varGenfamilie kodiert, wobei individuelle Parasiten nur ein var-Gcn aus einem großen Repertoire von Genen exprimieren. Antigene Variation ist sehr häufig bei Viren anzutreffen, sie beruht hier üblicherweise auf Mutationen. Die antigenetischen Veränderungen betreffen entweder die Oberflächenproteine, die von neutralisierenden Antikörpern erkannt werden (besonders bekannt als anligener Drift beim Influenza-Virus), oder die Sequenz von Epitopen, die an MHC-I-Moleküle binden und von CD8" T-Zellen erkannt werden. Diese sog. Escape-Varianten können sich dann im Organismus verbreiten, bis der Wirt wieder passende Antikörper und T-Zellen produziert hat. Ein solches Entkommen eines Virus vor der CTLAntwort wurde für das HIV, das Hepatitis B-Virus und das Hepatitis C-Virus beim Menschen beschrieben. Derartige Mutationen können dazu führen, daß entweder das Epitop nicht mehr vom Klasse-I-Molekül gebunden wird, oder es wird zwar gebunden, aber nicht mehr vom T-Zellrezeptor erkannt. Es können durch die Mutation auch sogenannte antagonistische Peptide entstehen, die in der Lage sind, zytotoxische T-Zellen zu inaktivieren und damit diese Immunantwort zu unterdrücken. Hemmung der Antigen-Präsentation

Bei Viren sind verschiedene Mechanismen zu

finden, die Antigen-Präsentation durch MHCKlasse I-Moleküle in infizierten Zellen verhindern, um der Kontrolle durch CD8-Zellen zu entgehen. Während Viren mit kleinem Genom durch die Geschwindigkeit ihrer Replikation der Zellyse durch CTL zuvorkommen, haben Viren mit größerem Genom, wie z.B. Herpesviren, die bis zu 200 verschiedene Proteine während ihres Replikationszyklus exprimieren, Mechanismen entwickelt, um die Antigen-Präsentation viraler Epitope zu hemmen. Virale Proteine degradieren MHC-I-Molekülc oder hemmen den TAPTransporter, der Peptide ins ER transportiert. Diese infizierten Zellen tragen nur wenige MHC-I-Moleküle, sind aber dann durch NKZellcn lysierbar, da MHC-1-Moleküle die Lyse durch NK-Zellen verhindern. Das Zytomegalievirus kann wiederum die Lyse durch NK-Zellen verhindern, indem es ein MHC-I-artiges Molekül auf die Oberfläche von infizierten Zellen bringt, das die NK-Zellen abschaltet. Auch eine Hemmung der Antigen-Präsentation durch Klasse II ist für einige Erreger, z.B. für Leishmanien, beschrieben worden. Manche Erreger können auch die Stimulation der T-Zellen durch Herabregulation von kostimulierenden Molekülen auf infizierten Zellen beeinträchtigen. Interferenz mit Abwehrmechanismen

Um sich gegen Effektormechanismen der Immunantwort zu schützen, können Erreger diese direkt stören. So zerstören das a-Toxin und ßToxin von Staphylococcus aureus präferenziell die für das Bakterium gefährlichen phagozytierenden Zellen. Die M-Proteine von Streptococcus pyogenes interferieren mit den Phagozytosemechanismen. Zudem sind sie Rezeptoren für eine Reihe von Plasmaproteincn, die durch Bindung an die M-Proteine die Streptokokken maskieren. Kapseln von Bakterien wie Neisseria meningitidis oder Haemophilus influenzae haben ebenfalls Phagozytose-hemmende Eigenschaften. Erst durch Opsonisierung können diese bekapselten Erreger von Phagozyten aufgenommen werden. Daher sind Kapseln essentielle Virulenzfaktoren. Auch Interferenz mit dem Komplementsystem ist häufig zu beobachten. Es ist bemerkenswert, daß Herpes- und Poxviren für Komplement-regulierende Proteine kodieren, deren Gene von homologen Genen des Wirtes abstammen dürften. Die Induktion einer fehlerhaften oder ungeeigneten Immunantwort ist im Interesse des Erregers. Daher kodieren eine Reihe von Viren im-

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

munregulatorische Proteine. Das Epstein-BarrVirus z.B. kodiert ein virales IL-10, das eine hohe Sequenzhomologie zum menschlichen IL10 und identische Wirkungen besitzt. Gene für weitere immunregulatorische Proteine (z.B. für Zytokine, Zytokinrezeptoren und Komplementregulatorische Proteine), mit hoher Sequenzidentität zu homologen humanen Genen, wurden bei der Sequenzierung u.a. verschiedener Herpesviren und von Pox-Viren gefunden. Eine weitere Methode, der Immunantwort zu entkommen, ist die Persistenz an sog. iminunprivilegierten Orten. Viele Erreger persistieren im zentralen Nervensystem, weil dieses keine immunologischen Strukturen besitzt und daher vom Immunsystem nur unzureichend kontrolliert wird. Superantigene

Grampositive Kokken produzieren T-Zell-stimulierende Exotoxine wie die Enterotoxine und das Toxic-Shock-Syndrom-Toxin-1 von Staphylococcus aureus und die erythrogenen Toxine von Streptococcus pyogenes. Diese sogenannten Superantigene benutzen als molekularen Wirkmechanismus die Vernetzung von variablen Teilen des T-Zellrezeptors mit MHC-Klasse-TI-Molekülen auf Antigen-präsentierenden Zellen (Abb. 1.28). Damit stimulieren sie eine beträchtliche Fraktion der peripheren T-Zellen, die große Mengen von Zytokinen produzieren, was eine koordinierte Immunantwort erschwert. Eine immunsuppressive Wirkung dieser Moleküle ist beschrieben worden. Superantigene werden auch von weiteren Erregern gebildet (z.B. von Y. pseudotuberculosis), sie sind anscheinend mehrfach in der Evolution unabhängig voneinander entwickelt worden. Eine massive Ausschüttung von immunologischen Mediatoren kann zu schwersten Symptomen bis hin zum Schock führen. Dem toxischen Schock, der durch die Superantigene ausgelöst wird, liegt eine Überproduktion von Zytokinen zugrunde. Wahrscheinlich ist die aktive Endstrecke letztlich die gleiche wie beim gramnegativen Schock. Im Rahmen gramnegativer Infektionen kann ein Schocksyndrom durch eine massive Stimulation der Makrophagen durch Lipopolysaccharid der Bakterien entstehen. Von den Makrophagen werden verschiedene biologisch aktive Mediatoren freigesetzt, insbesondere TNF-a, IL-1, IL-6 und IL-12. Diese Zytokine setzen eine Kaskade in Gang, die weitere Zytokine freisetzt, darunter auch IFN-y und Lipid-

Abb. 1.28 Mechanismus der Aktivierung von

T-Zellen durch Superantigen.

mediatoren, und die letztlich zu Fieber, Hypotonie und Organversagen führt. Der wesentliche Unterschied zwischen grampositivem und gramnegativem Schock liegt in der Quelle der Zytokine: der Supcrantigen-induzierte Schock ist auf die Produktion von Lymphokinen durch T-Lymphozyten zurückzuführen. Das toxische Schocksyndrom ist also ein T-Zell-abhängiges, immunpathologisches Ereignis.

1.2.13 Pathologische Auswirkungen der Immunreaktion Immunreaktionen können zu schweren Schäden im Organismus führen. Historisch werden nach den zugrundeliegenden Mechanismen immunpathologische Reaktionen in die Typen I bis IV eingeteilt. Typ I. So wird die „anaphytaktische Reaktion" bezeichnet, die unmittelbar nach Vernetzung zellgebundener IgE-Moleküle auf Mastzellen durch die Freisetzung von Mediatoren eintritt (Beispiel: Heuschnupfen, anaphylaktischer Schock). Typ II. So werden Reaktionen bezeichnet, die durch die Bindung von Antikörpern an zellgebundene Antigene ausgelöst werden. Der FcTeil des Antikörpers vermittelt durch Bindung von Komplement oder Fc-Rezeptoren Entzün-

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Allgemeine Infektionslehre

düngen oder Gewebsschäden. Ein Beispiel ist die Schädigung der Basalmembran beim Goodpasture-Syndrom. Auch der Antikörper-abhängige Abbau durch Phagozyten z.B. bei autoimmunhämolytischen Anämien oder AutoimmunThrombopenien wird als eine Typ IT Reaktion betrachtet. Typ III. Diese Reaktionen werden durch Immunkomplexe ausgelöst. Klassisches Beispiel mit eher historischer Bedeutung sind die sog. ..Serumkrankheit" (Injektion einer größeren Menge von xenogenem Serum) und das „Arthus-Phänomen" (lokale Injektion eines Antigens in einen vorimmunisierten Wirt). Gleichzeitige Anwesenheit von Antigen und spezifischen Antikörpern führt zur Bildung von Immunkomplexen, die dann systemisch (Serumkrankheit) oder lokal (Arthus-Phänomen) Entzündungsreaktionen hervorrufen. Typ IV. So oder als Überempfindlichkeitsreaktion vom Spättyp (Delayed Type Hypersensitivity, DTH) wird die T-Zell-vermittelte Entzündung durch Infiltration mit mononukleären Zellen bezeichnet. Typisches Beispiel ist die Tuberkulinreaktion; eine Typ I V-Reaktion ist bei den meisten T-Zellvermittelten Entzündungen beteiligt, z.B. beim Kontaktekzem. Die Typ IV-Reaktion wird von Thl-Zellen vermittelt, entscheidendes Zytokin ist IFN-y. Da aus der Aktivierung von ThlZellen eine Entzündungsreaktion resultiert, werden diese auch als inflammatorische T-Zellen bezeichnet. Wird eine Immunantwort von Th2-Zellen vermittelt, entsteht keine Typ IVReaktion, Th2-Zellen sind daher anti-inflammatorisch. Diese Einteilung der immunpathologischen Reaktionen in isolierte Typen ist heute nicht mehr angebracht, sie wird der Komplexität der Immunreaktion nicht gerecht und ist nicht vollständig. Sie erfaßt nicht die pathogenetisch direkt (ohne Beteiligung von Komplement oder Zellen) wirksamen Autoantikörper, wie z.B. bei Myasthenia gravis gegen den Acetylcholinrezeptor und bei Pemphigus gegen Desmosomen, und auch nicht die zytotoxische Aktivität von CD8+ T-Zellen. Immunpathologische Konsequenzen von Infektionen Immunpathogenese durch CD8* T-Zellen

Immunpathologische Reaktionen sind nicht nur Konsequenzen einer Immunantwort gegen Selbstantigene, sondern entstehen auch bei fast

jeder normalen Antwort gegen Infektionserreger. Die Zerstörung von Virus-infizierten Zellen durch CD8+ CTL führt zwar zur Eliminierung des Virus, kann aber auch ausgedehnte GewebsZerstörungen hervorrufen. Daher ist der Schaden durch die CTL-Antwort in vielen Fällen ausgeprägter als durch die eigentliche Infektion mit dem Virus selbst. Insbesondere bei Viren, die keinen zytopathischen Effekt hervorrufen, sondern in befallenen Zellen eine persistierendc Infektion etablieren, führt erst die CTL-Antwort zur Pathologie. Dies wurde zuerst bei der Infektion der Maus mit dem LCM-Virus gefunden, dem nun klassischen Experimentalmodell für die Interaktion von Virus-und Immunsystem. Ein Ausbleiben der CTL-Antwort durch z.B. Toleranz bei neonataler Infektion führt zur persistierenden Infektion ohne Pathologie, die infizierte Maus wird Träger und Ausscheider des Virus. Ein typisches Beispiel beim Menschen ist die Infektion der Leberzellen durch Hepatitis A-Virus, das Zellen in vitro produktiv und persistierend infiziert, ohne sie zu zerstören. Die Hepatitis wird erst durch die Zerstörung infizierter Hepatozyten hervorgerufen. Zur Zeit der maximalen Virusproduktion und Virusausscheidung ist noch keine Hepatitis festzustellen, der Anstieg der Transaminasen erfolgt erst, wenn die Virusproduktion durch die zytotoxischen T-Zellen erniedrigt wird. Ähnliche Verhältnisse gelten für die Mumps-Erkrankung des Menschen, die Hepatitis B und viele andere mehr. Immunpathogenese durch CDA* T-Zellen

Die Eigenschaft der „inflammatorischen" ThlZellen, Mediatoren der Entzündung zu sezernieren, führt bei Stimulation dieser Zellen regelmäßig zu begleitenden Entzündungen. Dieser Tatsache liegen die Gewebszerstörungen z.B. bei Tuberkulose und bei tuberkuloider Lepra zugrunde, während die Infektion mit Mycobakterien im immunsuppremierten Patienten nicht die ausgeprägten Zeichen der Entzündung und Fieber zeigt. Die lokale Persistenz von Antigenen eines Erregers, der ThJ-artige CD4+-Zellen stimuliert, führt ebenfalls zu lokaler Entzündung. Ein Beispiel ist die u.a. durch Enterobakterien. wie Yersinien oder Salmonellen, ausgelöste sog. Reaktive Arthritis. Nach einer gastrointestinalen Infektion gelangen diese Bakterien in die Zirkulation, die Aufnahme des Erregers führt über noch unklare Mechanismen (Transport durch Makrophagen?) zur Ablagerung von Proteinen

1.2 Prinzipien der immunologischen Infektabwehr

des Erregers im Gelenk, die dann von IFN-y produzierenden CD4+-Zellen erkannt werden. Dies führt zur lokalen Entzündung. Es ist dabei umstritten, ob überhaupt eine Replikation des Erregers im Gelenk stattfinden muß, oder ob nur Erregermaterial ins Gelenk transportiert wird. Die Eliminierung des Antigens führt dann zum Sistieren der Entzündung. Die Ausprägung einer Th2-Antwort hat daher anti-inflammatorische Konsequenzen. Bei der lepromatösen Form der Lepra ist IL-4, aber kein IFN-y in der befallenen Region zu finden, begleitet von einer massiven Vermehrung der Mykobakterien. Entzündungszeichen und Gewcbszerstörung fehlen, allerdings zerstören die Bakterien ihre speziellen Wirtszellen. Auslösung von Autoreaktivität

Im Rahmen einer Infektion kann es auch zu einer spezifischen Sensibilisierung des Immunsystems gegen körpereigene Strukturen kommen. In den meisten Fällen ist dies auf eine Kreuzreaktion zwischen Epitopen des Erregers und Molekülen des Wirtes zurückzuführen. Entweder handelt es sich um sehr konservierte Proteine, die hohe Sequenzhomologien zwischen Wirt und Erreger aufweisen, wie z.B. die „HeatShock-Proteine", oder um Epitope, die zufällig sonst nicht verwandten Proteinen gemeinsam sind. Beispiele für solche Kreuzreaktionen für Antikörper sind die M-Proteine von Streptococcus pyogenes, bei denen bestimmte Serotypen Epitope besitzen, die mit menschlichem Herzmuskel und anderen Geweben kreuzreagieren. Für die Stimulation autoreaktiver T-Zellen müssen Toleranzmechanismen durchbrochen werden.

1.2.14 Immundefizienz In dem komplexen System verschiedener Zellen, multipler Interaktionen und mannigfaltiger Rezeptoren können einzelne Defekte starke Auswirkungen auf das Funktionieren des Ganzen haben. Angeborene Immundefekte sind auf der Ebene fast aller Zellen und vieler Rezeptoren gefunden worden (s. Kap. 11.11). Fast alle wurden inzwischen molekular definiert. Die Untersuchung von Immundefekten hat entscheidend zum Verständnis des Immunsystems beigetragen. Beim schweren kombinierten Immundefekt (SCID) sind sowohl T-Zell- als auch B-Zellsystem betroffen. Dies kann mehrere Ursachen haben. Ein Defekt in den sog. Rekom-

binase-aktivierenden Genen, der die Rekombination der Immunglobulin- und TcR-Gene nicht erlaubt, führt zum Ausbleiben der T-Zcll- und B-Zelldifferenzierung. Defekte sind auch in einzelnen Linien beschrieben worden, sie betreffen sowohl Defekte in der Expression einzelner Membranrezeptoren als auch in Signal-transduzicrenden Molekülen in Lymphozyten. Die Xchromosomale Againmaglobulinämie beruht z.B. auf der fehlenden Expression der Tyrosinkinase btk, die in einer frühen Phase der B-Zellreifung benötigt wird. Defekte sind auch beschrieben worden in verschiedenen Komponenten des TCR, die dann zu Ausfällen des T-Zellsystems führen. Beispiele von Defekten, die die Kommunikation der Zellen betreffen, sind z.B. der Defekt des CD40-Liganden (führt zum Hyper-IgM-Syndrom) oder der Defekt der signaltransduzierenden y-Kette, die den Rezeptoren für IL-2, IL-4, IL-7 und IL-13 gemeinsam ist (führt zum X-chromosomalen SCID). Viele Immundefekte verlaufen ohne klinische Manifestationen. Ein typisches Beispiel ist der sog. angeborene selektive totale IgA-Mangel, ein relativ häufiger Defekt, bei dem IgM die Funktionen des IgA übernehmen kann. Die Möglichkeit, gezielt Gene aus der Keimbahn von Mäusen durch genetische Rekombination zu entfernen („k.o.Mäuse"), hat interessante Einblicke in die Funktion vieler immunologisch wichtiger Moleküle gegeben und erlaubt es, Modelle für angeborene Immundefekte zu etablieren. Immundefekte können auch erworben werden, am bekanntesten bei der Infektion mit dem HIV. Hier ist zwar der Verlust der CD4+ T-Zellen besonders auffällig, es darf aber nicht vergessen werden, daß andere Komponenten des Immunsystems, z.B. die dendritischen Zellen, ebenfalls betroffen sind. Ein Immundefekt liegt auch bei Mangelernährung, konsumierenden Erkrankungen oder schweren Infektionen vor, wie z.B. bei der Masernerkrankung oder der Malaria.

1.2.15 Immunabwehr von Tumoren Tumorzellen sind in vieler Hinsicht pathogenen Infektionserregern ähnlich und das Immunsystem spielt eine entscheidende Rolle bei ihrer Bekämpfung. Sie enthalten Antigene, die vom Immunsystem erkannt und gegen die humorale und zelluläre Effektoren gebildet werden können. Das Konzept der Immunüberwachung (immunological surveillance) besagt, daß die immer

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Allgemeine Infektionslehre

wieder im Organismus entstehenden malignen Zellen vom Immunsystem kontrolliert und an der Expansion gehindert werden. In der Tat entstehen unter Immunsuppression häufiger Tumoren. Tumorzellen enthalten verschiedene Arten sogenannter Tumorantigene. Einerseits produzieren sie Proteine, die nur oder vorwiegend in embryonalen Zellen vorkommen (onkofetale Antigene) oder eine sonst ganz eingeschränkte Gewebsverteilung haben, z.B. exprimieren viele Tumorzellen sonst nur in Spermatogonien exprimierte Gene (MAGE). Auch gewebsspezifische Antigenc, wie die Tyrosinase beim Melanom, können vom Immunsystem erkannt werden. Diese Antigene sind meist bei allen Tumoren der gleichen Art vorhanden. Da manche dieser Moleküle sezerniert werden, sind sie für die Tumordiagnostik wertvoll. Tumorantigene auf der Zelloberfläche können über Antikörper erkannt werden, dies läßt sich für therapeutische und diagnostische Zwecke nutzen: Toxin-gekoppelle monoklonale Antikörper werden zur Zerstörung der Tumorzellen eingesetzt oder radioaktiv markierte Antikörper zur Lokalisierung des Tumors. Als besonders wichtig hat sich die spezifische Abwehr von Tumorzellen durch CD8+ zytotoxische T-Zcllen herausgestellt. Durch die hohe Teilungsrate häufen sich Punktmutationen in verschiedenen Genen der Tumorzellen an, die resultierenden Proteine tragen dann Aminosäureaustausche und enthalten so veränderte Peptide, die von MHC-I-Molekülen präsentiert werden. Diese veränderten Peptide sind spezifische Tumorantigene, spezifisch allerdings nur für diesen individuellen Tumor, und können prinzipiell wirkungsvoll zur Immunisierung gegen den Tumor ausgenutzt werden. Daneben erkennen CTL auch bestimmte gewebsspezifische Proteine, z.B. unveränderte Epitope der Tyrosinase beim Melanom. Eine erfolgreiche Melanomabstoßung nach Immunisierung mit Tyrosinasepeptiden wird oft von Vitiligo begleitet, da die Tyrosinase auch in Melanozyten vorkommt. Hier wurde anscheinend die Toleranz gegen die körpereigene Tyrosinase durchbrochen. Einen weiteren wichtigen Mechanismus stellen die NK-Zellen dar. Die CTL-Antwort selektioniert für Tumorzellen, die ihre MHC-I-Moleküle herunterregulieren, um nicht von CTL erkannt zu werden. Da NK-Zellen nur durch ihre inhibitorischen Rezeptoren für MHC-I-Moleküle an der Lyse gehindert werden, ist ihre Aufgabe ge-

rade die Zerstörung dieser Tumorzellen, die den CD8+ T-Zellen entkommen sind. Literatur ABBAS, A. K., A. H. L. LICHTMAN and J. S. POBER: Cellular and Molekular lmmunology, 4th. ed., W. B. Saundcrs. Philadelphia (2000). JANEWAY, C. A., P. TRAVERS and M. WALPORT: Immunobiology. The Immune System in Health and Disease, 4th ed. Elsevier London (1999). PAUL W. E.: Fundamental lmmunology, 4th ed., Lippincott-Raven, Philadelphia, (1999). Einzelheiten zu den angesprochenen Themen sind in Zeitschritten mit Übersichtsartikcln zu finden, z.B. Current Opinion in lmmunology, Immunological Reviews, Trends in lmmunology.

1.3 Epidemiologie übertragbarer Krankheiten GOTTFRIED MAUFF Zu den ältesten medizinischen Überlieferungen zählen die großen Seuchen, die als epidemische Ereignisse die Menschheit heimgesucht haben. Unter ihnen waren Aussatz (Lepra) und Pocken bereits vor unserer Zeitrechnung bekannt; im Alten Testament wird die „Pestilenz" als eine der sechs Plagen der Ägypter erwähnt. Präventivmedizinische Maßnahmen sind vermutlich ebenso alt. Aus dem China der Sung-Dynasüc (961-1126) wird über die Variolation durch Einblasen von pulverisiertem Pustelinhalt Pockenkranker in die Nase als die f'rüheste Form einer gezielter Schutzimpfung berichtet. Quarantänemaßnahmen sollten durch Absonderung der Kranken einer Verbreitung von Infektionen vorbeugen. Mittelalterliche Handschriften berichten über Lepröse, denen der Zugang zu öffentlichen Gebäuden verboten war; bei Annäherung mußten sie zur Warnung gesunder Personen eine Rassel schwingen (Abb. 1.29). Mangels mikrobiologischer Erkenntnisse waren die Schutzmaßnahmen jedoch zum Scheitern verurteilt. So wurde in der dritten großen Pestepidemie zwischen 1347 und 1352 mit schätzungsweise 25 bis 42 Millionen Toten die europäische Bevölkerung um etwa ein Viertel dezimiert. Die moderne Epidemiologie der letzten zwei Jahrhunderte beschäftigt sich mit der Beziehung zwischen Umwelt, krankheitsverursachendem Agens und dem Menschen (oder Tier) als Wirt. Zu ihren bedeutenden Fortschritten zählen u.a. die 1796 erstmalig dokumentierte Pockenschutzimpfung mit dem Kuhpocken-Virus, die Einführung antiseptischer Maßnahmen im 19. Jahrhundert oder die Einführung der moderneren Trinkwasserver- und Abwasserentsorgung. Obwohl die Epidemiologie zunächst auch ohne Kenntnis der spezifischen Ätiologie auskam, haben erst die zahlreichen Entdeckungen von Infektionserregern etwa ab 1880 moderne epidemiologische Verfahren ermöglicht.

1.3 Epidemiologie übertragbarer Krankheiten

Abb. 1.29 Der Lepröse. Miniatur aus einer Handschrift des Buches von den Eigenschaften der Dinge von Bartholomäus dem Engländer (Paris, Bibliotheque Nationale; aus SOURNIS et al., 1980).

1.3.1 Grundbegriffe der Epidemiologie Die Epidemiologie (gricch. epi, demos, logos: „Wissenschaft von dem, was in einem Volk vorkommt") ist als „die Wissenschaft vom Auftreten der Krankheiten in einer Bevölkerung" definiert. Dabei wird die Erforschung von Ursachen nicht-übertragbarer Volkskrankheiten des Menschen (z.B. Tumoren, Diabetes, Herz-KreislaufErkrankungen) von der Wissenschaft der klassischen übertragbaren Seuchen in der Humanund Veterinärmedizin sowie in neuerer Zeit der Nosokomialinfektionen („Krankenhausinfektionen") unterschieden. Beiden ist als Ziel die Prävention der in einer Bevölkerung gehäuft zu beobachtenden Erkrankungen gemeinsam. Das vorliegende Kapitel befaßt sich ausschließlich mit der Epidemiologie übertragbarer Krankheiten. Hinsichtlich der Bedeutung der Epidemiologie für nicht übertragbare Volkskrankheiten wird auf die entsprechende Fachliteratur verwiesen. Die Epidemiologie benötigt zunächst deskriptive Verfahren und statistische Erhebungen. Auf einen definierten Bevölkerungsumfang bezogen werden ermittelt: 1. Häufigkeit oder Morbidität (absolute Zahl der Erkrankten auf 10000 oder 100000 Personen pro Zeiteinheit; meist 1 Jahr)

2. Inzidenz (Zahl der Neuerkrankungen) 3. Prävalenz (Bestand an Erkrankten, Anzahl der Erkrankten an einem Stichtag) 4. Mortalität (Zahl der Verstorbenen in % bezogen auf eine bestimmte Gruppe, Gesamtbevölkerung, 1000 oder 10000 Personen, in einer Zeiteinheit, meist 1 Jahr) und 5. Letalität (Prozentzahl der Todesfälle bei den Erkrankten) als relatives Maß der Sterblichkeit. Die epidemiologische Analyse induktiv gewonnener Daten, als Summe der retrospektiven Beobachtungen, und deduktiver Daten, als Summe der Kenntnisse über Agens, Wirtsorganismus und Umwelt, gestatten eine effiziente präventivmedizinische Epidemiologie. Aus der Verteilung übertragbarer Infektionskrankheiten können für die zeitlichen und örtlichen Abläufe wichtige Rückschlüsse gezogen werden. Der Begriff Epidemie bedeutet im engeren Sinne das gehäufte, zeitlich und räumlich begrenzte Ereignis einer bestimmten Infektionskrankheit, die jeweils nach ihrem Manifestationszeitraum als Explosivepidemie oder bei protahiertem Verlauf als Tardivepidemie auftreten kann. Beispiele für beide Epidemieformen finden sich unter den zahlreichen, bis in die zweite Hälfte des 20. Jahrhunderts hinein zu beobachtenden Typhusepidemien. Endemien finden sich dagegen bei örtlich umschriebenen, aber zeitlich unbegrenzten Infektionskrankheiten, wie z.B. bei Malaria oder Bilharziose. Pandemien kommen sowohl zeitlich begrenzt als auch unbegrenzt als globale Infektionskrankheiten vor. Beispiele sind die Influenzavirus-Grippe oder die sich von Asien bis nach Südamerika ausbreitende Cholera. Sporadische Häufungen von Infektionskrankheiten sind als unregelmäßig, aber wiederholt vorkommende Ereignisse mit bestimmter örtlicher Bevorzugung zu beobachten. Solche Verlaufsformen sind typisch für Meningokokkeninfektionen. Wichtige Kriterien eines epidemischen Ereignisses sind ihre Extensität (Anzahl der Erkrankten in einer definierten Bevölkerung), sowie die Intensität (Anzahl der Verstorbenen). Als Kontagionsindex bezeichnet man die Erkrankungswahrscheinlichkeit nach Erstinfektion, d.h. das Verhältnis Erkrankter auf 100 exponierte, empfängliche, nicht-immune Personen. Ein Kontagionsindex von 1,0 bedeutet, daß 100% der erstmalig Infizierten erkrankt. Infektionen mit hohem Kontagionsindex sind z.B. Windpocken oder Masern (0,95), mit niedrigem Kontagions-

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Allgemeine Infektionslehre

index Diphtherie, Poliomyelitis oder bakterielle Ruhr (0,15).

1.3.2 Epidemiologische Methoden Die erfolgte Exposition läßt sich für viele Infektionserreger durch den Erregernachweis oder die Immunantwort (Antikörpertiter oder Hauttests) belegen. Da für die Epidemiologie alle an der Entstehung und Verbreitung einer Erkrankung beteiligten Einflüsse von Bedeutung sind, wird der Begriff der Risikofaktoren dem der Krankheitsursachen vorgezogen. Als relatives Risiko läßt sich die Wahrscheinlichkeit, an einer Krankheit beim Vorliegen bestimmter Risikofaktoren in bezug auf eine Vergleichspopulation zu erkranken, berechnen. Zur frühzeitigen Beurteilung epidemiologischer Ereignisse ist die Zusammenarbeit zwischen dem behandelnden Arzt, dem Mikrobiologen und dem Epidemiologen eine entscheidende Voraussetzung. Das rechtzeitige Erkennen einer Epidemie beruht oft schon auf der klinischen Verdachtsdiagnose. Der behandelnde Arzt muß bei Verdacht auf eine meldepflichtige Erkrankung umgehend entsprechende Untersuchungen einleiten. Bei Infektionskrankheiten, die aufgrund von Rechtsvorschriften bereits bei Verdacht meldepflichtig sind, darf der behandelnde Arzt nicht auf das mikrobiologische Laborergebnis warten, ehe er das zuständige Gesundheitsamt informiert. Die Erfassung von Infektionsdaten ist die entscheidende Voraussetzung für die epidemiologische Analyse. Sie erfolgt sowohl für das Infektionsgeschehen in der Gesamtbevölkerung, einer Bevölkerungsstichprobe als auch bei Nosokomialinfektionen aufgrund der Meldedaten zentral am Robert Koch Institut, Berlin. Die Meldekriterien sind einerseits durch gesetzliche Regelungen (z.B. Infektionsschutzgesetz, Tierseuchengesetz, Länderverordnungen), andererseits durch vereinbarte Empfehlungen festgelegt. Zur experimentellen Aufklärung epidemiologischer Zusammenhänge von Infektionskrankheiten ist die komplexe Typisierung, d.h. die gleichzeitige Anwendung mehrerer Methoden zur Charakterisierung eines Erregertyps erforderlich. Zur Anwendung kommen je nach Erregerart verschiedene technische Verfahren (Serotypie, Lysotypie. Biotypie, Bakteriozinotypie, Antibiogramm, Typisierung äußerer Membranproteine OMP, Typisierung von Plasmiden und chromosomalen DNA-Fragmenten). Die mit

diesen Methoden gewonnenen Ergebnisse werden zu einer Klonformel zusammengefaßt. Serologische Untersuchungen beim Menschen oder bei Erregerisolaten können dem Epidemiologen einen Einblick in die immunologische Situation geben für die Erfolgsbeurteilung von Schutzimpfungen (z.B. Diphtherie, Tetanus, Poliomyelitis), die Bewertung der optimalen Zusammensetzung der Immunogene von Impfstoffen (z.B. Influenzavirus-Impfstoffe) und die Einschätzung zukünftiger Trends und Risiken bei bestimmten übertragbaren Krankheiten. Biomathematische Methoden sind für die epidemiologische Analyse eine wichtige Voraussetzung. Neben den grundlegenden statistischen Verfahren (Normalverteilung, Prüfverteilung, Varianzanalyse, Regression und Korrelation) sind für die Planung und Durchführung von epidemiologischen Erhebungen Stichprobendefinitionen, Risikobewertungen, Schätzungen von Fehlern erster und zweiter Art, Tendenzen und Assoziationen von entscheidender Bedeutung für die Schlußfolgerungen. Näheres findet sich in der entsprechenden Fachliteratur.

1.3.3 Epidemiologische Faktoren Die Beziehungen zwischen Erreger, Wirtsorganismus und Umweltfaktoren bestimmen das epidemische Vorkommen von Infektionskrankheiten. Sowohl für ihre akute Bekämpfung als auch für prophylaktische Maßnahmen sind daher spezielle Kenntnisse über mögliche Infektionsquellen, Übertragungswege und Infektionsketten sowie potentielle Eintrittspforten erforderlich. Jede Infektionskrankheit weist darüber hinaus ihre eigenen epidemiologischen Gesetzmäßigkeiten auf. die im speziellen Teil des Buches beschrieben sind. Infektionsquellen Zum natürlichen Erregerreservoir zählen infizierte Personen bzw. Ausscheider (sogenannte Keimträger) von Erregern, in der Inkubation befindliche Personen, manifest oder abortiv Erkrankte, Kontaktkeimträger, die selbst nicht erkrankt sind, ferner rekonvaleszente Patienten. Dauerausscheider nach erfolgter Heilung. Auch Tiere als Ausscheider oder Zwischenwirte bleiben als Infektionsquelle häufig unerkannt, wenn sie nicht selbst erkranken. Zoonosen sind Infektionen, an denen gleichermaßen Wirbeltiere und der Mensch erkranken, und die auf

1.3 Epidemiologie übertragbarer Krankheiten

natürliche Weise zwischen beiden übertragen werden können. Anthropozoonosen werden vom Menschen auf Wirbeltiere, Zooanthroponosen vom Wirbeltier auf den Menschen übertragen (Tab. 1.10). Die Aufnahme virulenter Mikroorganismen kann zu einer Infektion, d.h. zu deren Ansiedlung und Vermehrung führen und damit zur biologischen Auseinandersetzung des Wirtsorganismus mit dem Erreger. Menschen und Tiere, welche Krankheitserreger aufgenommen haben, d.h. in oder an sich tragen, bezeichnet man als infiziert, Stoffe und Gegenstände, die mit ihnen behaftet sind, als kontaminiert. Tierische Le-

bensmittel können infiziert oder kontaminiert sein, je nachdem, ob sie von infizierten Tieren stammen oder mit Krankheitserregern sekundär verunreinigt sind. Sekundäre Infektionsquellen sind z.B. kontaminierte Gegenstände oder infizierte Lebensmittel. Bieten sie Vermehrungsmöglichkeiten (z.B. Milch), können sie zu Massenerkrankungen führen. Bei manchen Infektionen ist das primäre Erregerreservoir außerhalb von Mensch und Tier zu suchen (z.B. Legionellen in Warmwasserleitungen: Erde kann Sporen von Tetanus- und/oder Gasbrandbazillcn enthalten, die über Wunden in den Körper gelangen).

Tab. 1.10 Beispiele von Zooanthroponosen und Vektor-übertragenen Infektionen Erkrankung beim

Erreger

tierisches Reservoir

Menschen

Ektoparasiten als Vektor

bakterielle Infektionen Campylobakteriose

Geflügel, Schweine u.a.

_

enterale Salmonellose Fleckfieber

thermophile Campylobacter spp. Salmonella enterica Rickettsia spp.

Rinder, Schweine, Geflügel u.a. Nagetiere

Läuse, Flöhe, Milben

Leptospirosen

Leptospira spp.

Ratten, Hunde, Feldmäuse u.v.a.

-

Lyme-Borreliose Maltafieber, Morbus Bang

Borrelia spp. Bruceila spp.

Rotwild, Mäuse,Vögel u.v.a. Rinder, Schafe, Ziegen

Zecken -

Ornithose (Psittakose)

Chlamydia psittaci

Papageien u.a. Vögel

Pest Q-Fieber Tularämie

Yersinia pestis Coxiella burnetii Francisella tularensis

Ratten u.a. Nagetiere, Hunde Rinder, Schafe, Ziegen, Nagetiere Feldhasen u.a. Nagetiere u.v.a.

Yersiniose (enteral) Milzbrand

Yersinia enterocolitica Schweine, Hunde, Katzen u.a. Rinder, Schweine, Schafe, Ziegen Bacillus anthracis

Flöhe Zecken Zecken u.a. Arthropoden -

parasitäre Infektionen Chagas-Krankheit Echinokokkose Leishmaniasen

Trypanosoma cruzi Echinococcus spp. Leishmania spp.

Hunde, Katzen, Ratten u.v.a. Hunde, Füchse Hund, Nagetiere u.a.

Raubwanzen Phlebotomen

Malaria Schlafkrankheit

Plasmodium spp. Trypanosoma brucei

Affen Wildtiere, Rinder

Anopheles Clossina

Toxoplasmose

Toxoplasma gondii

Schweine, Katzen u.v.a.

-

Frühsommer-Meningoenzephalitis Gelbfieber

FSME-Virus

Vögel, Rehe

Zecken

Celbfiebervirus

Affen

Tollwut

Rabiesvirus

Füchse u.a. Wildtiere, Hunde, Katzen

Aedes u.a. Mückenarten _

virale Infektionen

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Allgemeine Infektionslehre

Übertragungswege

Pathogenität der Erreger

Die von Menschen und Tieren mit Körperflüssigkeiten (Blut), mit Sekreten oder Exkreten ausgeschiedenen Erreger gelangen über das kontaminierte Material direkt oder von der jeweiligen Austrittspforte (Mund, Nase, Haut, Schleimhaut, Wunden, After, Harnröhre) zur Eintrittspforte des Menschen. Eine direkte Übertragung ist die Inokulation des Erregers durch den Biß blutsaugender Arthropoden. Die Übertragungswege beeinflussen die Ausbreitung einer Infektionskrankheit ebenso wie die Infektionsquellen. Sowohl die direkte Übertragung durch Kontakt von Mensch zu Mensch, von Tier zu Mensch oder von Tier zu Tier ist so bedeutsam wie indirekte Wege über ein Infcktionsvehikel (z.B. kontaminierte Lebensmittel. Staubpartikel, Gebrauchsgegenstände u.a.). Manche Erreger sind auf eine unmittelbare Übertragung angewiesen, da sie in der Außenwelt nicht lange überlebensfähig sind (z.B. Gonokokken. Meningokokken, Immundefizienzviren u.a.). Eine vertikale Übertragung erfolgt diaplazentar von der Mutter auf den Föten (z.B. Toxoplasmose, Syphilis, Listeriose, Röteln, Varizellen). Auf die iatrogene Übertragung von Infektionen infolge ärztlicher oder medizinischer Maßnahmen (z.B. unsterile Instrumente, Bluttransfusion) wird im Abschnitt Nosokomialinfektionen ausführlicher eingegangen.

Die Erreger tragen zum Ausbreitungsmuster einer Infektionskrankheit mit konstanten und variablen Eigenschaften bei. Diese lassen sich unter dem Begriff der Pathogenität zusammenfassen, wobei zwischen obligat und fakultativ pathogenen Erregern unterschieden wird. Der Grad der Pathogenität wird auch als Virulenz definiert. Weitere für die Ausbreitung wichtige Erregereigenschaften sind Umweltresistenz und Wirtsadaptation. Gemeinsam mit den Pathogenitätsfaktoren bestimmen sie die Übertragbarkeit einer Infektionskrankheit, die Lokalisation der Eintrittspforten, die Ausbreitung der Erreger im Wirtsorganismus sowie ihre Ausscheidung. Es lassen sich daher kontagiöse (ansteckende; z.B. Varizellen) von nicht-kontagiösen (nicht-ansteckenden; z.B. Borreliose) Infektionskrankheiten unterscheiden, wobei epidemiologische Veränderungen vom Wandel in der Virulenz eines spezifischen Erregers beeinflußt werden.

Infektionsketten Sie bestimmen den Weg der epidemischen Ausbreitung von Infektionskrankheiten durch zufällige Ausbreitungsmuster, insbesondere bei sekundären Infektionsquellen und indirekten Übertragungswegen, oder durch typische Grundmuster bei belebten Infektionsquellen. Sie lassen sich als homogen-homonome Infektketten klassifizieren (d.h. Übertragung von Mensch zu Mensch, z.B. Influenzavirusgrippe), oder innerhalb einer Tierart als homogen-heteronome Infektketten zwischen zwei verschiedenen Wirtsspezies (Tier -» Mensch, z.B. Tollwut), als heterogen-homonome Infektkette, bei der die Infektion auf verschiedenen Wegen auf nur eine Warmblüterspezies übertragen wird (z.B. enterale Salmonellosen) oder als heterogen-heteronome Infektketten bei Übertragung auf verschiedene Arten (z.B. Brucellose).

Resistenz des Wirtsorganismus

Der Wirtsorganismus hat dem Infektionserreger die natürliche Resistenz, und die erworbene Immunität entgegenzusetzen. Die Empfänglichkeit (oder Disposition) des Wirts bezeichnet den Grad seiner Resistenz. Neben unspezifischen (natürlichen) Abwehrmechanismen (anatomische Barrieren, humorale und zelluläre Faktoren) spielt die spezifische (erworbene) Abwehr unter Beteiligung des Immunsystems nicht nur bei der Ausbreitung, sondern auch für die Prävention von Infektionskrankheiten eine wichtige Rolle. Genauso wie die Veränderungen von Erregereigenschaften beeinflußt daher das Ausmaß der erworbenen Immunität in einer Population das epidemiologische Geschehen, sei es durch Überstehen einer klinisch inapparenten „stillen Feiung'", einer manifesten Erkrankung oder aber aufgrund einer gezielten Immunprophylaxe (aktive Schutzimpfung). Darüber hinaus können angeborene Merkmale der Wirtsdisposition gegenüber speziellen Infektionen (erhöhte Malariaresistenz bei Sichelzellanämie) oder Lebensalter die Krankheitsdisposition bestimmen (z.B. Haemophilus influenzae-Infektionen bei Kleinkindern, Pneumokokken-Pneumonien bei älteren Menschen).

1.3 Epidemiologie übertragbarer Krankheiten

Umweltfaktoren Die örtliche Disposition umfaßt die speziellen klimatischen und geographischen Verhältnisse, die Lebensbedingungen für tierische Vektoren und menschliche Überträger, besonders aber die Lebensbedingungen innerhalb einer Bevölkerung, wie Bevölkerungsdichte, Lebensgewohnheiten und Gebräuche, Wohnverhältnisse, die berufliche Exposition am Arbeitsplatz, Bevölkerungswanderung, Tourismus und Verkehr. Dazu gehören aber auch die sozioökonomischen und soziomedizinischen Verhältnisse und der Ernährungszustand innerhalb einer Population. Die Ausbreitung übertragbarer Infektionskrankheiten wird bestimmt durch das Zusammenwirken typischer Merkmale der Erreger und der Wirtsorganismen und Umweltfaktoren. Dabei führen der Wandel der Erregervirulenz und/oder die Lebensbedingungen in der Umwelt zu epidemischen Verdichtungswellen. Hierbei kann es sich um gelegentliche oder um kontinuierliche, progrediente Ereignisse handeln; häufiger aber treten diese Verdichtungswellen mit einer jahreszeitlichen (saisonalen) oder über Jahre verteilten Periodizität (säkularer Rhythmus) auf. Als typische Beispiele seien das epidemisch progredient verlaufende erworbene (engl. „acquired") Immundefizienz Syndrom (AIDS), die saisonalen Influenza-Pandemien oder das säkulare Auftreten der Diphtherie erwähnt. Der Spätsommer-Herbstgipfel bei enteralen Infektionen oder das Auftreten der Cholera in subtropischen und tropischen Entwicklungsländern sind weitere Beispiele für klimatisch bedingte epidemische Infektionskrankheiten.

1.3.4 Spektrum der Infektionskrankheiten Die bemerkenswerteste Tatsache in der Epidemiologie übertragbarer Infektionskrankheiten ist ihr Wandel in den Industrieländern innerhalb der vergangenen 150 Jahre. Er fällt zusammen mit der Aufklärung ihrer Ätiologie, mit der Verbesserung der Lebensbedingungen und der medizinischen Versorgung. Den historischen Seuchen lagen als primäre Risikofaktoren die Empfänglichkeit weiter Bevölkerungsgruppen gepaart mit dem Auftreten virulenter Erreger zugrunde. Sie führten zu hohen Morbiditäts- und Mortalitätsraten. Heute bestimmen dagegen die veränderten Lebensgewohnheiten überwiegend das Bild epidemischer Infektionen.

So verstarben etwa während der „Pest des Thukydides" 429 v. Chr. im antiken Athen angeblich 50000 Personen (es handelte sich aber nicht um die Pest nach heutigem Verständnis, sondern vermutlich um eine Fleckfieberepidemie) oder während der verheerenden Pockenepidemien im 18. und teilweise bis Anfang des 19. Jahrhunderts noch Hunderttausende von Menschen. Typhus und Diphtherie nehmen, wie bis vor kurzem auch die Tuberkulose, in Mitteleuropa an Häufigkeit ab. An ihre Stelle sind in den Industrieländern als typische Zivilisationsseuchen andere Infektionen getreten, wie die enteralen Infektionen oder die infektiösen Hepatitiden. Obwohl man auch ihre Übertragungswege inzwischen aufgeklärt hat, sind diese im Einzelfall häufig so komplex, daß eine Verfolgung der Glieder innerhalb der Infektionskette kaum möglich ist.

Infektionsepidemiologie in Deutschland Betrachtet man die geschätzte Inzidenz aller Infektionskrankheiten, so stellen in Deutschland die akuten respiratorischen Erkrankungen mit mehr als 80% den überwiegenden Anteil dar. gefolgt von den endemischen übertragbaren Kinderkrankheiten Masern, Mumps, Windpocken, Röteln, Keuchhusten, Scharlach sowie von den Nosokomialinfektionen und Parasitosen. Die meldepflichtigen Infektionskrankheiten folgen mit kaum mehr als 300000 gemeldeten Fällen. Die relativen epidemiologischen Verhältnisse, von lokalen Besonderheiten abgesehen, sind weitgehend vergleichbar mit denen anderer Industrieländer. Unter den bis zum Inkrafttreten des Infektionsschutzgesetzes meldepflichtigen Infektionskrankheiten (Abb. 1.30) überwiegen nach der Anzahl der gemeldeten Fälle die enteralen Salmonelloscn, die Gonorrhoe, die Tuberkulose und die Virushepatitiden. Bei den akuten Infektionskrankheiten, insbesondere den Lebensmittel-bedingten enteralen Infektionen und Intoxikationen, führt wegen der meist kurzen Krankheitsdauer und Selbstheilungstendenz eine den Umfang der gemeldeten Fälle um ein vielfaches übersteigende Dunkelziffer weder zu einer diagnostischen Abklärung noch zur Meldung. Ähnliches muß für die Geschlechtskrankheiten angenommen werden, insbesondere für die nicht mehr meldepflichtige Gonorrhoe. Die seit 1980 nicht mehr meldepflichtigen Schar-

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Allgemeine Infektionslehre

Abb. 1.30 Die häufigsten meldepflichtigen übertragbaren Infektionskrankheiten in Deutschland; bis 1990 alte Bundesländer, ab 1991 Gesamtdeutschland; rechte Ordinate: enterale Salmonellosen ab 1991 (Meldungen nach dem alten Bundesseuchengesetz bis 1998).

lacherkrankungen liegen einschließlich der neuen Bundesländer vermutlich auch heute bei jährlich mehr als 50000 Fällen. Parallel zum Rückgang der klassischen epidemischen Infektionskrankheiten in den Industriestaaten hat in noch stärkerem Maße ihre Mortalität abgenommen. Sie beträgt in den Industrienationen kaum mehr als 1 % aller Todesfälle. Dies gilt besonders für die Tuberkulose, aber auch für andere Infektionskrankheiten. An Häufigkeit zugenommen haben dagegen die Ausbrüche von Lebensmittel-bedingten Infektionen. Eine große Herausforderung sind die „neuen" übertragbaren Infektionskrankheiten. Als Beispiele seien die Hepatitis B und C und das „erworbene Immundefizienz-Syndrom" (AIDS) genannt. Selbst wenn die jährlichen Fallzahlen in den entwickelten Ländern bisher begrenzt bleiben, so stellt die Bekämpfung dieser Infektionskrankheiten weltweit ein zunehmend ungelöstes Problem dar.

Infektionsepidemiologie in Entwicklungsländern Anders als in den Industrienationen sieht dagegen das Infektionsspektrum in den Entwicklungsländern aus, wo neben den in fast unvorstellbarem Ausmaß anzutreffenden parasitären Infektionen, den enteralen und respiratorischen Infektionen, nach wie vor Tuberkulose, Lepra, Cholera, Ruhr, Poliomyelitis, Meningitiden, um nur einige zu nennen, regelmäßig zu größeren epidemischen Ausbrüchen führen oder aber endemisch etabliert sind. Die Situation der übertragbaren Infektionskrankheiten in den Entwicklungsländern wird im wesentlichen von fünf Faktoren bestimmt: 1. den sozioökonomischen Umständen, welche aufgrund des Mißverhältnisses zwischen Bevölkerungswachstum und Nahrungsmittelproduktion denen im Europa vergangener Jahrhunderte vergleichbar ist

1.3 Epidemiologie übertragbarer Krankheiten

2. den soziokulturellen Eigenheiten, die z.T. eine wirksame Bekämpfung übertragbarer Krankheiten behindern 3. den soziomedizinischen Verhältnissen, durch den Mangel an zeitgemäßen medizinischen Einrichtungen sowie der traditionellen Inanspruchnahme von „Medizinmännern" 4. den klimatischen und geographischen Besonderheiten in tropischen und subtropischen Ländern, welche spezielle Vektoren oder Erreger begünstigen, anderen dagegen kein geeignetes Reservoir bieten

5. dem von den Industrieländern abweichenden Durchseuchungsgrad. Spektrum und Umfang der Infektionskrankheiten, Manifestationsalter und Empfänglichkeit unterscheiden sich daher z.T. erheblich von denen der Industrieländer, besonders der nördlichen Hemisphäre. Die Mortalität beträgt mehr als 42%. Eine Schätzung weltweit häufiger Infektionskrankheiten findet sich in Tab. 1.11. Es sind jedoch nur für solche Erkrankungen verläßliche Zahlen erhältlich, die unter langfristige nationa-

Tab. 1.11 Jährliche Inzidenz und Prävalenz der häufigsten übertragbaren Infektionskrankheiten (nach Meldungen bzw. Schätzungen derWHOfür 1997, World Health Report, 1998)

Erkrankung/Erreger - enterale Infektionen und Intoxikationen (akut, einschließlich Shigellosen, - Ascariasis - Hakenwurm-Erkrankungen (Ancylostoma/Necator) - Trichuriasis/Trematoden - Malaria - Infektionen der unteren Atemwege (akut) - Geschlechtskrankheiten Syphilis übrige - Hepatitis B - Amöbiasis - Pertussis - Masern - Filariasis - Tuberkulose - HIV/AIDS - Dengue (alle Formen) - Leishmaniasen (alle Formen) - Hepatitis C - Lepra - endemische Treponematosen - Chagas (amerik. Trypanosomiasis) - Poliomyelitis - Schistosomiasis (beide Formen)

Inzidenz (In Mio) 4000 1330 1250 > 1000 500 395 365 (12) (373) 67,7 48 45,1 31,1 8 7,3 5,8 3,1 2 1 0,6 0,5 0,3 0,04 -

- Trachom - Onchocerciasis * langfristige Behinderung

Prävalenz (In Mio)

weltweit 250 151 85,5 _ 251 (28) (223) _ 119 16,3 30,6 12 170 1,2 2,6 18 10,6* 200 152

-

Vorkommen

7,7

weltweit weltweit weltweit weltweit (Subtropen und Tropen) weltweit weltweit weltweit weltweit weltweit weltweit Subtropen, Tropen weltweit weltweit Subtropen, Tropen Afrika, Südamerika weltweit westl. Pazifik, Südostasien, östl. Mittelmeer, Afrika, Südamerika Subtropen, Tropen Zentral- und Südamerika weltweit Ostasien, naher Osten, Afrika, Südamerika Naher Osten, Nordafrika, Nordindien trop. Afrika, Mittel- und Südamerika

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Allgemeine Infektionslehre

le oder internationale Überwachungsprogramme der Weltgesundheitsorganisation (WHO) fallen und von den Mitgliedsländern gemeldet werden. Für die zwölf häufigsten Infektionskrankheiten liegen dagegen nur unzuverlässige Zahlen zur Inzidenz bzw. zur Prävalenz vor. Zu ihnen zählen vor allem parasitäre Erkrankungen wie Askariasis, Ankylostomiasis, Trichuriasis, Amöbenruhr, Lamblienruhr, Malaria, Schistosomiasis mit weltweit mehr als acht Milliarden Infizierten (d.h. mindestens ein Drittel der Weltbevölkerung ist mit mehr als einem parasitären Erreger infiziert). Unter den bakteriellen und viralen Infektionen stehen an erster Stelle die Geschlechtskrankheiten, Hepatitis B und C, Tuberkulose und die HIV-Infektion, allen voran aber die akuten enteralen Infektionen und Intoxikationen (s. Tab. 1.11), mit einer für die Länder der Dritten Welt allein bei Kindern unter fünf Jahren geschätzten Fallzahl von jährlich 1 Milliarde Erkrankter. Von diesen versterben in der Folge ca. 4,5 Millionen. Eine völlig neue und erschreckende Dimension ergibt sich aus den gegenwärtigen Zahlen zur HIV-Infektion. Es wird geschätzt, daß weltweit mehr als 35 Millionen Personen mit HIV infiziert sind, > 25 Millionen davon allein in Afrika (WHO, 2000). Erhebungen aus Ost- und Zentralafrika weisen Häufigkeiten bis zu 30% HIVInfizierter in städtischen und 18% in ländlichen Gebieten aus. Diese Zahlen verdeutlichen, wo zukünftige epidemiologische Bekämpfungsmaßnahmen ihren Schwerpunkt finden müssen. Darüber hinaus werden, bedingt durch die mit dem Luftverkehr weltweit zunehmende Mobilität, künftig auch sogenannte exotische Infektionen häufiger über große Entfernungen transportiert werden und als eingeschleppte Infektionen in nicht endemischen Gebieten zu beobachten sein.

1.3.5 Nosokomialinfektionen Als sogenannte „Krankenhausinfektionen" oder korrekter Nosokomialinfektionen bezeichnet man die in einem zeitlichen, räumlichen und kausalen Zusammenhang mit einem Krankenhausaufenthalt aufgetretenen Infektionen. Diese Definition umfaßt nach heutigem Verständnis auch Heime, Ambulanzen und Arztpraxen. Systemische oder lokale Symptome einer Infektion müssen dabei erkennbar sein. Eine klinische Erkrankung kann aber auch nach dem Kranken-

hausaufenthalt manifest werden (IfSG §§2, 23; CDC Definitionen). Epidemische Nosokomialinfektionen mit dem gleichen Erregerstamm sind besonders gefürchtet. Die Häufigkeit von Nosokomialinfektionen wird in den USA auf 5,5% aller Krankenhausaufenthalte geschätzt, was einer Absolutzahl von ca. 2 x 106 Infektionen pro Jahr entsprechen würde. Die Verhältnisse sind in Deutschland sicher vergleichbar, wobei mit 500000 bis 1 Million Nosokomialinfektionen pro Jahr zu rechnen ist. Die Erreger von Nosokomialinfektionen lassen sich in mindestens drei unterschiedliche Gruppen einteilen: 1. Virulente Erreger. Sie können auch außerhalb der Krankenhäuser eine hohe Kontagiosität aufweisen und epidemisch verlaufen. Sie betreffen, nachdem sie in Krankenhäuser eingeschleppt worden sind, Patienten und Personal gleichermaßen. Reservoir sind bereits erkrankte Menschen, Inkubationsausscheider oder unbelebte Vehikel (z.B. Hustentröpfchen, Lebensmittel). Als berichtete Beispiele seien Influenzaviren, Hepatitisviren, oder Shigellen genannt. 2. Weniger virulente, fakultativ pathogene Erreger exogener Infektionen. Diese können direkt oder indirekt von kranken Patienten, von klinisch inapparent befallenen Patienten und gesunden Keimträgern oder evtl. von einem unbelebten sekundären Reservoir in der Umgebung des Kranken ausgehen. Da überwiegend abwehrgeschwächte Patientengruppen erkranken, sind diese Erreger für das Krankenhauspersonal selbst harmlos. Als Beispiele sind multiresistente gramnegative Bakterien, sogenannte ESBL („extendedspectrum-beta-lactamase")-produzierende Angehörige der Enterobacteriaceae (E.coli, Klebsieila spp., Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, u.a.), Vertreter der nichtfermentierenden gramnegativen Bakterien (Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter spp., u.a.) oder multiresistente Korynebakterien (C. jeikeium, u.a.), Nocardia spp., aber auch Zytomegaloviren, Pilze und viele andere Nosokomialerreger anzuführen. Eine besondere Rolle fällt zunehmend den multiresistenten, betalaktamaseproduzierenden und isoxazolylpenicillinresistenten Staphylococcus-aureus-Stämmen zu (sog. MRSA = Methicillin-resistente S. aureus). 3. Fakultativ pathogene Erreger der normalen

1.3 Epidemiologie übertragbarer Krankheiten

Oberflächenflora der Haut und Schleimhäute

des Menschen. Diese führen auf endogenem Wege zur Infektion, da ihr Reservoir primär im Patienten selbst liegt. Medizinische Eingriffe erfüllen die Funktion einer Infektionsbahnung, z.B. Besiedlung von Kathetern, künstlichen Herzklappen u.a. Hierunter finden sich Koagulase-negative Staphylokokken (vor allem Staphylococcus epidermidis als wichtiger Erreger von Implantatinfcktionen, s. Kap. 11.12), ferner auch fakultativ aerobe und obligat anaerobe Vertreter der normalen Darmflora. Aus dieser Klassifizierung ergeben sich unterschiedliche Infektionsverläufe, wobei besonders in der ersten Gruppe epidemische Häufungen vorkommen. Voraussetzung für die Einstufung gehäufter Infektionen als zusammenhängende Nosokomialinfektionen ist ein bei allen Fällen einheitlicher Erregertyp. Es genügt in diesen Fällen nicht nur die Artdiagnose (z.B. Staphylococcus aureus), vielmehr muß eine Stammidentifizierung mit phänolypischen oder molekularen Methoden vorgenommen werden. Neben einer ungezielten Chemotherapie und der damit zusammenhängenden Verbreitung von Resistenzfaktoren sind als weitere Ursachen für das vermehrte Auftreten von Nosokomialinfektionen die durch den medizinischen Fortschritt verursachte Zunahme resistenzgeminderter Patienten mit malignen Erkrankungen oder immunologisch bedingter Abwehrschwäche, höheres Lebensalter der Patienten, Vernachlässigung Krankenhaus-hygienischer Maßstäbe, und die mit der fortschreitenden medizinischen Technologie komplexer gewordenen Eingriffe zu nennen. Die Übertragungswege sind vielfältig und manchmal unerwartet, wenn neue medizinische Verfahren zur Anwendung gelangen. Als Risikofaktoren kommen außer der Besiedlung der Haut und der Schleimhäute besonders invasive Eingriffe im perioperativen Umfeld, in der intensivmedizinischen, endoskopischen und intravasalen Diagnostik und Therapie in Frage. Gelegentlich werden kritische Punkte in der Infektionskeltc erst durch epidemische Ereignisse entdeckt. Als Beispiel läßt sich hierzu aus einer Kinderklinik eine Serratia marcescens-Epidemie anführen, die von einem Transportinkubator für Frühgeborene ihren Ausgang nahm. Der Inkubator wurde von einem unabhängigen Hilfsdienst betrieben und bis zum Eintritt dieses Vorfalls bei den hausinternen Vorsorgemaßnahmen

gegenüber Nosokomialinfektionen nicht berücksichtigt.

1.3.6 Verhütung und Bekämpfung übertragbarer Erkrankungen Die Bekämpfung übertragbarer Infektionskrankheiten hat erst nach Entdeckung der wesentlichen Risikofaktoren und der spezifischen Erreger ihre heutige Effektivität erlangen können, obwohl empirische Methoden (wie Variolation, Absonderung der an kontagiösen Infektionen Erkrankten) lange zuvor erfolgreich angewandt wurden. Aus praktischen und methodischen Gründen werden die Maßnahmen zum Schutz gegen übertragbare Krankheiten in Vorbeugungsmaßnahmen und Maßnahmen zur Verhütung und

Bekämpfung unterteilt. Vorbeugungsmaßnahmen beruhen primär auf Schutzimpfungen (individuelle Dispositionsprophylaxe) während die Bekämpfung und die prospektive Verhütung auf der Expositionsprophylaxe beruhen. Expositionsprophylaxe Die Maßnahmen zur Expositionsprophylaxe werden in der Umwelt des Menschen wirksam. Zu diesen zählen u.a.: Ŷ Ausschaltung von Infektionsquellen und endemischen Herden, Ŷ Unterbrechung der Übertragungswege und Einschränkung der Übertragungsmöglichkeiten. Als Beispiele lassen sich anführen die Bekämpfung von Gesundheitsschädlingen, Maßnahmen zur Vernichtung des Lebensraumes von Ungeziefer bzw. Vektoren, Sanierung von Tierbcständen, Raubwildbekämpfung; Erfassung und Betreuung von Ausscheidern; Sterilisation von Gegenständen und Materialien, gezielte Desinfektion in bestimmten Bereichen; Erhaltung einer ununterbrochenen Kühlkette beim Transport von leicht verderblichen Lebensmitteln, Pasteurisierung von Milch und Konservierung von Lebensmitteln; Hygienevorschriften für Wäschereien, Reinigungsanstalten, Wasch- und Duschräume, Saunaanlagen, Badeanstalten und öffentliche Toiletten; Schutzmaßnahmen der Überwachung und Vorbeugung im nationalen und internationalen Reise- und Güterverkehr, z.B. Expositions- und Chemoprophylaxe zur Malariaverhütung.

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Allgemeine Infektionslehre

Dispositionsprophylaxe Die individuelle Dispositionsprophylaxe durch Schutzimpfungen hat mehr zur Eliminierung einzelner übertragbarer Infektionskrankheiten beigetragen als die Verminderung zahlreicher Risikofaktoren in der Umwelt oder die Verbesserung der Lebensbedingungen. Beispiele sind die Ausrottung der Variola major, die sich auf die weltweit konsequent und gezielt durchgeführte Pockenschutzimpfung zurückführen läßt, oder die Eliminierung der Poliomyelitis. Zu den bereits im Kindes- und Jugendalter durchzuführenden Schutzimpfungen zählen heute nach den Empfehlungen der Ständigen Impfkommission (STIKO) am Robert Koch Institut die Impfungen gegen Diphtherie, Tetanus, Pertussis (mit azellulärem Impfstoff), Poliomyelitis (inaktivierter Impfstoff), Haemophilus-influenzae-BInfektion, Hepatitis B, Masern, Mumps und Röteln. Der Rückgang der klassischen Seuchen ist jedoch nicht allein auf Schutzimpfungen zurückzuführen, da im Ablauf jeder Infektionskrankheit eigene Gesetzmäßigkeiten erkennbar sind. Ein Vergleich von drei Infektionskrankheiten im Verlauf von viereinhalb Jahrzehnten findet sich in Abb. 1.31. Während sich das eindrucksvolle Verschwinden der Poliomyelitis aus dem epidemiologischen Spektrum in Deutschland auf die Einführung der oralen Schutzimpfung zurückführen läßt, folgen die Erkrankungen an Meningokokken-Meningitis einem unregelmäßigen säkularen Rhythmus. Schwieriger zu begründen ist dagegen der Rückgang der Diphtherie. Zwei-

felsfrei hat dazu jedoch die seit Jahrzehnten durchgeführte aktive Schutzimpfung einen wesentlichen Beitrag geleistet. Betrachtet man die Fortschritte durch die Entwicklung rekombinanter Impfstoffe, so wird deutlich, daß auch für die Zukunft die individuelle Resistenzsteigerung durch Schutzimpfungen von weitgehend allen Bevölkerungskreisen einen wesentlichen Bestandteil der Bekämpfung von Infektionskrankheiten bilden wird. Infektionsschutzgesetz und Tierseuchengesetz Eine wirksame Infektionsbekämpfung erfordert gesetzliche Vorgaben, welche die schutzwürdigen Belange der Allgemeinheit im Fall eines Seuchenausbruchs regeln, aber auch Interventionen im Bereich der Individualrechte ermöglichen. Diese Voraussetzungen werden gegenwärtig durch das seit 01.01.2001 wirksame Infektionsschutzgesetz („Seuchenrechtsneuordnungsgesetz" SeuchRNeuG) erfüllt, das das Bundesseuchengesetz (Gesetz zur Verhütung und Bekämpfung übertragbarer Krankheiten beim Menschen = BSeuchG) und das Gesetz zur Bekämpfung der Geschlechtskrankheiten abgelöst hat. sowie das Tierseuchengesetz erfüllt. Im Infektionsschutzgesetz sind der zu erfassende Personenkreis und die unter die gesetzliche Regelung fallenden Infektionserreger und Krankheiten definiert sowie die im Einzelfall zu treffenden Maßnahmen vorgeschrieben. Die Meldung hat für bestimmte Infektionskrankheiten im Verdachtsfall, bei Erkrankung und/oder im Todes-

Abb. 1.31 Der Einfluß von Bekämpfungsmaßnahmen, Umwelt- und Erregerfaktoren auf den Verlauf übertragbarer Infektionskrankheiten am Beispiel der Häufigkeit von Po2 liomyelitis (xiO ), Diphtherie 3 (x10 ) und MeningokokkenMeningitis in Deutschland 2 (xlO )(bis 1990 alte Bundesländer, ab 1991 Gesamtdeutschland).

1.3 Epidemiologie übertragbarer Krankheiten

fall zu erfolgen, u.a. bei Botulismus, Diphtherie, nicht-hereditärer humaner spongioformer Enzephalopathie, akuter Virushepatitis, enterpathischem hämolytisch-urämisehem Syndrom, Masern, Meningokokken-Meningitis/Sepsis, Poliomyelitis, Tollwut. Eine größere Zahl weiterer Erreger bzw. Erkrankungen sind seit Inkrafttreten des Infektionsschutzgesetzes künftig von den diagnostischen Laboratorien bei akuten Erkrankungen zu melden. Zur Meldung verpflichtet sind Ärzte/Tierärzte, Krankenhäuser, Untersuchungslaboratorien oder sonstige Personen mit verantwortlichen Aufgaben, die Kenntnis von einer der in den Gesetzen genannten Infektionen erhalten. Die Schutzmaßnahmen umfassen im wesentlichen die Verpflichtung zur Meldung an die überwachenden Institutionen (Gesundheitsämter, Länderbehörden, das Robert Koch Institut in Berlin, ggf. Länder- und Bundesgesundheitsminister) und die Ermittlungs- und Bekämpfungspflicht. Zu diesen zählen u.a. die Untersuchung von Kontaktpersonen, Berufsverbot bzw. -einschränkungen von Ausscheidern, die im Lebensmittelgewerbe tätig sind, oder Desinfektionsmaßnahmen zur Beseitigung von sekundären Infektionsquellen und Übertragungswegen. Präzisiert wurden ferner die Rechtsvorschriften zur Durchführung von Schutzimpfungen, Impfstoffen und Impfdokumentation (KSG §§ 20, 21, 22). Die prophylaktischen Aufgaben der Gesundheitsorgane bei der Verhütung von Seuchen basieren in Grundzügen ebenfalls auf den gesetzlichen Regelungen. Sie erfordern die Erfassung der Morbiditäts- und Mortalitätsraten, deduktive Erhebungen über Virulenzeigenschaften der Erreger und Risikofaktoren in Bevölkerung und Umwelt. Zu den vorbeugenden Vorschriften zählen u.a. die Maßnahmen zur Verhütung einer Ausbreitung von übertragbaren Infektionskrankheiten (Untersuchungspflicht, Quarantäne. Behandlungspflicht usw., Beseitigung und Desinfektion), die Überwachung von potentiellen sekundären Infektionsquellen (z.B. Trinkwasser, Wasser in lebensmittelverarbeitenden Betrieben, Schwimm- und Badewasser, Abwasser), die Kontrolle und Bekämpfung von tierischen Überträgern und von Vektoren Die Zunahme von Nosokomialinf'ektionen hat ebenfalls die gesetzliche Regelung zu ihrer Verhinderung und Bekämpfung erforderlich gemacht (§ 23, IfSG). Durch das Robert Koch Institut sind darüber hinaus Empfehlungen und Richtlinien für die Krankenhaushygiene und In-

fektionsprävention sowie zur Erfassung multiresistenter Infektionserreger herausgegeben worden. Die Empfehlungen befassen sich mit der rechtzeitigen Feststellung von Nosokomialinfektionen und Epidemien. Sie ergänzen und aktualisieren die Richtlinien für die Erkennung, Verhütung und Bekämpfung von Krankenhausinfektionen des ehemaligen Bundesgesundheitsamtes, welche die funktioneilen und baulichen Einrichtungen und Anforderungen an die Ausstattung von Krankenhäuser sowie den organisatorischen Ablauf des Krankenhausbetriebes regeln. Nach ihnen lassen sich die Krankenhausberciche ihrem Infektionsrisiko entsprechend einteilen. Ferner sind die krankenhaushygienischen Aufgaben des ärztlichen und sonstigen medizinischen Personals definiert und die Einrichtung von Hygienebeauftragten und Hygienekommissionen festgelegt worden. Darüber hinaus behandeln die Richtlinien die hygienischen Belange im Versorgungs- und technischen Bereich der Krankenhäuser (Sterilisation und Desinfektion. Wäscheentsorgung und Aufbereitung, Abfallbeseitigung, Klimaanlagen usw.), aber auch in Arztpraxen und sonstigen medizinischen Einrichtungen.

Literatur BARKE.R. D. J. R. C. COOPF.R. and G. ROSE: Epidemiology in Medical Practicc. 5th ed., Churchill Livingstone. New York 1998. Gesetz zu Neuordnung seuchenrechtlichcr Vorschriften. (Seuchenrechtsncuordnungs-Gesetz). Gesetz zur Verhütung und Bekämpfung von Infektionskrankheiten beim Menschen (Infektionsschutzgcsetz), Bundesgesetzblatt I, 1045 (2000). MCGOWAN, J. E. JR and B. G. METCHOCK: Infection control epidemiology and clinical microbiology. In: MURRAY. P. R. et al. (eds.) Manual of Clinical Microbiology, 7lh ed.. ASM Press, Washington, pp 107-115 (1999). OSTROFF. S. M„ J. W. LF.DUC: Global epidemiology of infeclious diseases: In: MANDELL, G. L. et al. (eds.) Prinicples and Practice of Infectious Diseases. 5th ed., Churchill Livingstone, New York. pp. 167-178 (2000). Robert Koch Institut (Hrsg.) Richtlinien für Krankenhaushygiene und Infektionsprävention Fortsetzungsreihe, Urban & Fischer, München OSTERHOLM. M. T.. C .W. HEDBERG and K. A. MOORE. Epidemiology of infectious diseases. In: MANDFLL , G. L. et al. (eds.) Principles and Practice of Infectious Diseases, 5Ih ed.. Churchill Livingstone. New York. pp. 156-167 (2000).

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Mikrobiologische Diagnostik

2.1

2.1.1 2.1.2 2.1.3

2.1.4 2.2

2.2.1

Gewinnung und Transport von Untersuchungsmaterial für die mikrobiologische Diagnostik KLAUS PETER SCHAAL, JOACHIM KÜHN

74 74 75

2.2.4 2.2.5 2.2.6

75

2.2.7

Transportgefäße

84

2.3

87 87

2.3.1

Transportmedien und -Systeme Gewinnung und Handhabung verschiedener menschlicher Untersuchungsmaterialien Probenzustellung zum Laboratorium Umgang mit infektiösem Material EDELTRUD DIETLEIN, MARTIN EXNER Einflußfaktoren der Keimabtötung

2.2.2 Indikation Desinfektion Sterilisation 2.2.3 Desinfektion

2.3.2 2.3.3

88 88

2.3.4

Sterilisation Überprüfung der Desinfektion und Sterilisation Desinfektion und Sterilisation beim CREUTZFELDT-JAKOB(CJ)Erreger Schlußbemerkung Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren KLAUS PETER SCHAAL, JOACHIM KÜHN Mikrobiologische Untersuchungsverfahren Serologische Untersuchungsverfahren Schnellverfahren zur Diagnose von Infektionskrankheiten Molekularbiologische Verfahren in der mikrobiologischen Diagnostik

2 95 97

97 98 98 99

122 136

139

74

Mikrobiologische Diagnostik

2.1 Gewinnung und Transport von Untersuchungsmaterial für die mikrobiologische Diagnostik KLAUS PETER SCHAAL, JOACHIM KÜHN Einleitung

Der diagnostische Aussagewert mikrobiologischer und serologischer Untersuchungsergebnisse wird nicht nur durch den jeweiligen Leistungsstand der Laboratoriumstechnik, sondern häufig in viel maßgeblicherer Weise von der Beschaffenheit des Materials beeinflußt, das dem Mikrobiologen für die Durchführung seiner Untersuchungen zur Verfügung gestellt wird. Denn auch eine organisatorisch und methodisch optimale Arbeit des Laboratoriums vermag Fehler bei der Auswahl des richtigen Untersuchungsstoffes, bei der Probenentnahme, bei der Bestimmung des Enlnahmezeitpunktes und beim Probentransport nur unvollkommen oder gar nicht auszugleichen. Der behandelnde Arzt sollte deshalb alle Maßnahmen im Vorfeld der mikrobiologischen Diagnostik in enger Zusammenarbeit und nach möglichst detaillierter orga-

nisatorischer Abstimmung mit dem Mikrobiologen treffen.

2.1.1 Transportgefäße Gefäße zur Aufnahme von Untersuchungsproben für die Diagnostik von Infektionskrankheiten müssen eine Reihe obligatorischer Anforderungen erfüllen, um bei ihrer Benutzung weder die Aussagekraft der Befunde zu beeinträchtigen noch unbeteiligte Personen zu gefährden. Wichtigste Voraussetzung ist ihre Sterilität. Sterile Transportgefäße sollten auch zur Einsendung von Blut oder Serum für serologische Zwecke verwendet werden, da besonders bei hohen Umgebungstemperaturen bakterielle Kontaminationen zu Zersetzungserscheinungen führen können, die serologische Reaktionen stören. Weiterhin sind chemische Reinheit und Korrosionsbeständigkeit unerläßlich, um unkalkulierbare chemische Einflüsse auf den Inhalt (Desinfektionswirkung, antikomplementäre Wirkung) auszuschließen. Zur Verhütung von Laboratoriumsinfektionen und zum Schutz unbeteiligter Personen während des Transports müssen die Transportgefäße sicher, das heißt fliissigkeitsdicht und verschließbar sein. Außerdem sollten Form und Fassungsvermögen dem vorgesehenen Verwendungszweck möglichst gut entsprechen. Die mikrobiologischen Untersuchungsstellen geben üblicherweise auf Anforderung einen Satz geeigneter Transportgefäße - heute in der Regel aus Kunststoff mit Schraubverschluß - ab. die alle genannten Anforderungen erfüllen (Abb. 2.1a-d). In Deutschland werden traditionsgemäß vier verschiedene, vor der Abgabe sterilisierte Gefäßtypen verwendet: 1. einfache Röhrchen mit Schraubverschluß und einem Fassungsvermögen von 5-10 ml für flüssige

Abb. 2.1 Transportgefäße für mikrobiologische Untersucnungsmaterialien. a) Röhrchen für flüssige Untersuchungsmaterialien (Blut für serologische Untersuchungen); b) Stuhlröhrchen; c) Abstrichtupfer; d) Sputumröhrchen.

Untersuchungsstoffe (Liquor, Punklate, Blut, Urin) 2. Röhrchen gleicher Abmessung, an deren Deckel ein Löffelchen aus Metall oder Kunststoff befestigt ist, für Stuhlproben 3. weitlumigere Röhrchen (10-15 ml Inhalt) für Sputum 4. Abstrichtupfer in 12-15 cm langen Röhrchen, deren Stiel ebenfalls am Schraubverschluß befestigt ist. Stieltupfer aus weichem Metall lassen sich leicht unter sterilen Kautelen abwinkein, um Abstriche an schwer zugänglichen Stellen (z.B. Rachenmandel) vornehmen zu können; solche aus Holz können im unteren Drittel abgebrochen werden, um ohne Kontaminalionsgeiahr in Kultur- oder Transportmedien eingebracht zu werden.

2.1 Gewinnung und Transport von Untersuchungsmaterial

2.1.2 Transportmedien und -Systeme (Verschiedene Transportmedien in guter Qualität sind im Handel erhältlich.) Einige Krankheitserreger des Menschen sind so eng an ihren Wirt angepaßt, daß sie in der Außenwelt rasch absterben. Um solche Erreger trotzdem zur ätiologischen Diagnostik zuverlässig anzüchten zu können, muß man sie entweder unmittelbar vom Kranken in geeignete Nährmedien einbringen oder während des Transports durch spezielle Maßnahmen lebens- und vermehrungsfähig halten. Andererseits können sich Kontaminantcn zwischen Entnahme und Verarbeitung erheblich im Untersuchungsmaterial vermehren, wodurch die mikrobiologische Untersuchung selbst und die Beurteilung ihrer Ergebnisse oft wesentlich erschwert werden. Zur Umgehung dieser Schwierigkeiten werden Transportmedien in geeigneten Gefäßen eingesetzt, die speziell an die jeweiligen Untersuchungsziele angepaßt sind. Nach ihrer Zusammensetzung und Handhabung lassen sich für die Bakteriologie und Mykologie vier Haupttypen unterscheiden: 1. Flüssige, meist reichhaltige Nährlösungen (in der Regel in Flaschen), in denen schon während des Transports eine Mikrobenvermehrung stattfinden kann und die durch ihren Verdünnungseffekt störende Nachwirkungen von antimikrobiellen Substanzen oder zellulären und humoralen Abwehrmechanismen ausschalten (z.B. Blutkulturflaschen, s. Kap. 2.1.3). Ihr Nachteil ist die Anfälligkeit für „sekundäre Verunreinigungen", die zu Fehldiagnosen Anlaß geben können. Diese Medien sollten während des Transports bei Umgebungstemperatur gehalten oder, wenn die Überstellung an das Laboratorium nur mit Verzögerung erfolgen kann, eventuell auch bei 36±1 °C vorbebrütet werden. 2. Selektive Transport- und Kulturmedien (in Flaschen oder Reagenzgläsern), welche den gesuchten Erregern gute Vermehrungsbedingungen bieten und gleichzeitig ihre Überwucherung durch Mikroben aus der Umwelt oder von den Körperoberflächen unterdrücken sollen (z.B. Transgrow®-Medium). Auch diese Medien sollten schnellstens bei Umgebungstemperatur transportiert oder nach der Beimpfung bei 36±1°C gehalten werden. 3. Selektive und nicht-selektive Agarmedien (auf speziellen Trägern in sterilen Gefäßen), die quantitative Rückschlüsse auf die Mikro-

benkonzentrationen im Ausgangsmaterial erlauben, sofern ihre Beimpfung standardisiert wird (z.B. Objektträgerkultur). Objektträgerkulluren können am Entnahmeort bebrütet werden; nur die bewachsenen Medien werden dann bei Umgebungstemperatur zur weiteren Bearbeitung an das untersuchende Laboratorium geschickt. Alternativ kann die beimpfte Objektträgerkultur ohne Vorbebrütung versandt werden. 4. Medien ohne Nährstoff- und Energiequellen (in Fläschchen, Reagenzgläsern oder Kunststoffröhrchen), die schädliche Milieuveränderungen (pH-Verschiebungen, Sauerstoffzutritt) verhindern oder verzögern können (z.B. STUART-Medium. CARY-BLAIR-Medium). Diese Medien können bei Umgebungstemperatur oder gekühlt transportiert werden. Manche Anaerobier sind allerdings kälteempfindlich. Auch in der Virologie hat sich zur Anzucht umweltlabiler viraler Erreger der Einsatz spezieller Transportmedien bewährt. Diese enthalten neben Puffersubstanzen Proteine (Gelatine, Rinderserumalbumin) als „Schutzkolloide" sowie Antibiotika bzw. Antimykotika. Sie sind für die Aufnahme und den Transport von Tupferabstrichen, Bläschenflüssigkeiten, Exsudaten. Spülflüssigkeiten und Biopsaten geeignet. Für die parasitologische Diagnostik, bei der es überwiegend um den mikroskopischen Nachweis der diagnostischen Stadien der Parasiten geht, spielen Transportmedien keine nennenswerte Rolle. In den Fällen, in denen die diagnostische Kultur von Parasiten (etwa von Trichomonas vaginalis) möglich und sinnvoll ist, ergibt die unmittelbare Vcrimpfung des frischen Untcrsuchungsmaterials die besten Ergebnisse.

2.1.3 Gewinnung und Handhabung verschiedener menschlicher Untersuchungsmaterialien Die Qualität menschlichen Untersuchungsmaterials hängt einerseits ab von seiner Art, Beschaffenheit und Menge sowie dem Ort, dem Zeitpunkt und der Technik seiner Entnahme, andererseits von der Geschwindigkeit und den Umständen seines Transports zum untersuchenden Laboratorium. Die optimale Art des Untersuchungsstoffes. Sie wird durch die Lokalisation des Infektionsherdes, die Form der vorliegenden Entzündungsvorgänge sowie die Gewinnungsmöglichkeiten

75

76

Mikrobiologische Diagnostik

bestimmt. Wenn irgend möglich und dem Patienten zumutbar, sollten Verunreinigungen der Untersuchungsmaterialien durch die körpereigene Haut- oder Schleimhautoberflächenflora vermieden werden, da die Anwesenheit fakultativ pathogener Vertreter der Normalflora nahezu unausweichlich zu Interpretationsschwierigkeiten führt. Die entnommene Materialmenge sollte ausreichend groß sein, um falsch-negative Befunde zu vermeiden. Tupferabstriche aus Hohlräumen, aus denen unmittelbar vorher größere Eiter- oder Exsudatmengen entleert wurden, sind grundsätzlich als inadäquat zu bewerten. Der Entnahmeort. Er sollte möglichst immer an der Stelle oder in der Region des Körpers liegen, wo das Infektionsgeschehen auch tatsächlich abläuft. Leider ist der primäre Infektionsherd aber nicht immer bekannt oder liegt in inneren Organen, die ohne eingreifende operative Maßnahmen nicht erreichbar sind. In diesen Fällen muß man sich gegebenenfalls mit Materialien begnügen, in die die Erreger erfahrungsgemäß vom Parenchymherd aus übertreten oder über die sie ausgeschieden werden und die technisch einfach und gefahrlos zu gewinnen sind. Man muß sich dabei aber vergegenwärtigen, daß dieses Vorgehen häufig nur indirekte Rückschlüsse auf die pathogenetischen Vorgänge im betroffenen Organsystem erlaubt und deshalb zu diagnostischen Fehlschlüssen führen kann, insbesondere wenn es sich um Ex- oder Sekrete handelt, die per vius naturelles ausgeschieden werden. Deshalb lassen sich in manchen Fällen eingreifende Entnahmctcchnikcn nicht umgehen, wenn eine eindeutige diagnostische Aussage erzielt werden soll. Dies gilt z.B. für die transtracheale Sekretaspiration oder die transthorakalc Lungenpunktion bei Verdacht auf pulmonale Anaerobierinfektion, die perkutane Nadelbiopsie zur Diagnostik tief gelegener Abszesse oder die suprapubische Blasenpunktion zur exakten Diagnose von Harnwegsinfektionen.

Der optimale Entnahmezeitpunkt. Er ist für verschiedene Untersuchungsstoffe in Abhängigkeit von der vorhandenen Erregerart (siehe z.B. Typhus abdominalis) zum Teil recht unterschiedlich und kann deshalb nicht generell oder schematisch festgelegt werden. Jede Erstentnahme, gerade bei hochakuten Krankheitsbildern, sollte jedoch unbedingt vor Beginn einer antimikrobiellen Chemotherapie erfolgen, um falsch-negative Kulturergebnisse zu vermeiden. Dadurch darf natürlich die vielleicht lebensrettende Sofortbehandlung nicht verzögert werden, mit der unmittelbar nach der Materialentnahme begonnen werden kann. Nur in bestimmten Fällen, etwa zur Kontrolle der Wirksamkeit eines Therapeutikums oder bei Ausbleiben jeglicher Bes-

serung, kann auch einmal eine Untersuchung unter der antibiotischen Behandlung sinnvoll sein. Allerdings muß dann der Mikrobiologe über Art und Dosierung der angewandten Pharmaka ausreichend informiert werden. Akute virale Erkrankungen. In diesem Fall sind Proben für den Virusnachweis möglichst in der Frühphase der klinischen Erscheinungen zu entnehmen. Im Gegensatz zu Bakteriologie und Mykologie haben in der virologischen Diagnostik Tupferabstriche (Nasen-, Konjunktival-, Mundschleimhaut-, Rachenabstriche) sowie Spülflüssigkeiten und Gurgelwasser große praktische Bedeutung. Parasitologischen Diagnostik. Dabei ist für die Auswahl geeigneter Untersuchungsstoffe auch noch die Entwicklung des Parasiten im menschlichen Wirt (Mensch als End- und/oder Zwischenwirt) mit Ort und Zeitpunkt des Auftretens diagnostischer Stadien zu berücksichtigen. Außerdem werden z.T. spezielle Materialien (z.B. Hautstanzen) oder Entnahmeverfahren (z.B. Klebestreifenabklatsch von Analregion) benötigt. Die wichtigsten Gesichtspunkte und Fehlerquellen, die bei der Gewinnung und Handhabung der verschiedenen Materialarten im einzelnen zu berücksichtigen sind, werden im folgenden kurz dargestellt. Biopsie-, Operations- und Sektionsmaterial Operations- und Biopsiematerial. Ganze Organe, Organteile oder mehrere Gewebeproben aus verschiedenen Organbezirken, die intra vitam unter aseptischen Bedingungen erhalten werden können, werden zur Vermeidung akzidenteller Verunreinigungen unverzüglich in sterile Gefäße (bei kleineren Gewebsproben in eines der genannten Transportgefäße, bei Organen oder größeren Organteilen in sterile Weithalsflaschen oder sterile Plastikbeutel) gegeben und ohne Zusätze gut verschlossen und möglichst rasch (autolytische Veränderungen!) zur Untersuchungsstelle gebracht. Für längeren Transport ist eine Kühlung mit Eiswürfeln empfehlenswert. Sehr kleine Gewebsproben sollten durch Zugabe von einigen Tropfen steriler Kochsalzlösung feucht gehalten werden oder auf die Oberfläche eines STUART-Transportmediums (in Röhrchen mit Schraubverschluß) aufgebracht werden (Tab. 2.1). Sektionsmaterial. Die Probenentnahme sollte in jedem Falle bald nach Todeseintritt erfolgen

2.1 Gewinnung und Transport von Untersuchungsmaterial

Tab. 2.1 Transportbedingungen für verschiedene menschliche Untersuchungsmaterialien Transportmedien/ -verfahren keine (nativ)

+ 4 °C

1

Transporttemperatur + 25 °C (Umgebungstemperatur)

Sektionsmaterial, Bronchialspülflüssigkeit, Katheterspitzen, Liquor (auf Viren), Lungenbiopsat, Perikarderguß, Sputum, Urin

Liquor (auf Bakterien), Synovialflüssigkeit

anaerober Transport oder anaerobes Transportmedium

Exsudate aus Bauchhöhle, Amnionflüssigkeit, Punktate, Galle, IUP auf Aktinomyzeten, transthorakale und transtracheale Aspirate, Plazenta, Nebenhöhlenaspirate, Gewebe, Blasenpunktionsurin

unmittelbare Beimpfung von Kulturmedien

Hornhautgeschabsel, Blutkulturen, Material zum Nachweis von ß. pertussis, Material zum Nachweis von N. gonorrhoeae, Augenkammerwasser

aerobe Transport2 medien

1 2

Verbrennungswunden-ßiopsate, Rektalabstriche auf Campylobacter spp., Shigella spp., Vibrio spp., Yersinia spp., Abstriche bei Otitis externa

Knochenmark, Material zum Nachweis von Bordetella spp., Zervixabstriche, Bindehautabstriche, Material zum Nachweis von Corynebacterium spp., Innenohrabstriche, Material aus Genitaltrakt, Nasopharynx und oberem Respirationstrakt, Material zum Nachweis von Neisseria spp. oder Salmonella spp.

modifiziert nach MILLER und HOLMES, 1999; z.B. StuART-Medium, AMIES-Medium, CARY-ßuiR-Medium

(kritischer Zeitraum etwa 6 Stunden), da es später zu einer Ausbreitung von Zersetzungsbakterien aus dem Verdauungstrakt des Toten kommt. Um trotz der großen Kontaminationsgefahr bei der Sektion zu brauchbaren Untersuchungsergebnissen zu kommen, können zwei Wege zur Materialgewinnung beschritten werden: 1. Man verzichtet auf jede Dekontamination am Sektionstisch, entnimmt ein größeres (wenigstens 2 x 2 x 2 cm) zusammenhängendes Gewebestück, kühlt sofort auf 0 bis +4 °C und läßt die Probe ohne Unterbrechung der Kühlkette durch Boten dem Laboratorium überstellen. Es obliegt dann dem Mikrobiologen, unter besonderen Vorkehrungen nicht verunreinigtes Gewebe aus dem Zentrum des Stückes herauszupräparieren. 2. Man versucht durch Abbrennen, Abglühen oder kurzes Eintauchen (einige Sekunden) in kochendes Wasser eine Desinfektion der Organoberfläche zu erreichen, exzidiert dann unter mehrfachem Wechsel steriler Instru-

mente mehrere kleinere Gewebsstücke aus dem Zentrum und handhabt die Probe anschließend wie bioptisch gewonnenes Material (s. Tab. 2.1). Blut und Sternalmark Blutkulturen. Da die Erreger von septischen oder zyklischen (polysystemischen) bakteriellen oder pilzlichen Infektionskrankheiten häufig nur in geringer Zahl und/oder intermittierend in die Blutbahn ausgeschwemmt werden, darf das Volumen der einzelnen Blutprobe nicht zu klein sein (beim Erwachsenen 10-20 ml), bei Kindern 1-10 ml, und es sind mehrere (3 in 24 Stunden), zu verschiedenen Zeitpunkten und eventuell an verschiedenen Orten entnommene Proben zu untersuchen, um die Erreger sicher aufzufinden. Als günstigster Entnahmezeitpunkt gilt der Beginn eines Fieberanstiegs. Da er aber oft nicht bestimmbar ist, verpaßt wird oder die Mikrobeneinschwemmung in die Blutbahn dem Fieberanstieg deutlich vorausgehen kann, hat sich, ins-

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Mikrobiologische Diagnostik

besondere nach amerikanischen Erfahrungen, folgendes Vorgehen bewährt: Bei Patienten mit Verdacht auf akute bakterielle Endokarditis reichen in der Regel 3 separate Blutproben zur Sicherung der Diagnose aus, die innerhalb von 1-2 Stunden an 3 verschiedenen Stellen abgenommen werden. Zur Diagnose der subakuten Endokarditis werden 3 Proben im Abstand von wenigstens 15 Minuten entnommen. Bleiben diese nach 24stündiger Bebrütung negativ, werden weitere 3 Proben untersucht. Bei akuter Sepsis werden 3 Blutproben von 3 verschiedenen Enlnahmcstellen innerhalb von 10 Minuten gewonnen. Wurde der Patient bereits antibiotisch behandelt, sind häufig 4 bis 6 separat entnommene Blutproben erforderlich, um den Erreger doch noch aufzufinden. Bleibt Venenblut trotz klinischer Sepsiszeichen in der Kultur wiederholt steril, gelingt die Anzüchtung der Erreger manchmal noch aus arteriellem Blut oder Sternalpunktat. Zur ätiologischen Abklärung von „Fieber unklarer Ursache" werden 3 Proben von verschiedenen Entnahmestellen im Abstand von wenigstens einer Stunde entnommen; bei negativem Kulturergebnis nach 24 Stunden werden weitere 3 oder mehr Proben benötigt. Häufiger als allgemein angenommen kommt es bei der Gewinnung von Blutproben zu sekundären „Verunreinigungen". Diese lassen sich nur durch streng aseptisches Arbeiten vermeiden. Dazu gehören die zuverlässige, zweiphasige Hautdesinfektion an der Punktionsstelle (erst Anwendung von Alkoholen, dann von Jodtinktur, PVP-Jod oder Jodcrsatzmitteln mit jeweils ausreichender Einwirkungszeit), die sorgfältige chirurgische Händedesinfektion des Entnehmenden oder der Gebrauch steriler Handschuhe, die Vermeidung unnötiger Manipulationen (z.B. Umfüllen des Blutes) nach der Entnahme und die Verwendung sterilen Instrumentariums. Um ein ungewolltes Absterben der Erreger während des Transportes zu verhindern (bei generell empfindlichen Mikroben, durch Antibiotika-Nachwirkung oder Blutbakterizidie). sind heute spezielle Transportmedien, die sogenannten Blutkulturflaschen, unerläßlich. Diese enthalten zumeist Liquoid® (Na-Polyanetholsulfonat, das die Blutbakterizidie hemmt, manche Antibiotika in ihrer Wirkung abschwächt und Blut ungerinnbar macht) und eine hochwertige Nährlösung. Sie bewirken gleichzeitig eine Verdünnung und Hemmung bakterienschädigender Faktoren im Blut, wenn das Verhältnis von Blut

zu Nährmedium in der Größenordnung von 1:10 liegt. Im Laboratorium dienen diese Blutkulturflaschen unmittelbar zur Primärkultur. Die im Handel erhältlichen Systeme (z.B. der Firmen Becton Dickinson, Biotest, Organon Teknika) sind in der Regel evakuiert, so daß sie mit einem sterilen Entnahmebesteck direkt beschickt werden können. Verhindert man Luftzutritt bei der Füllung, lassen sich mit ihnen Anaerobier recht zuverlässig nachweisen, wenn die Kulturflüssigkeit, wie meist der Fall, ausreichende Qualität besitzt und unter CDs abgefüllt wurde. Es gibt aber auch spezielle Medien für Anaerobier, die auf Na-Polyanetholsulfonat verzichten, da es das Wachstum von Peptostreptocoecus anaerobius hemmt, und die gegebenenfalls Organstückchen analog der TAROZZI- oder RosnNOw-Bouillon enthalten. Zur Anzüchtung obligater Aerobier müssen evakuierte Flaschen nach der Blutzugabe über ein bakteriendichtes Filter mit Luft geflutet werden. Üblicherweise werden pro Entnahme je eine aerobe und eine anaerobe Flasche beschickt; die oben genannten Zahlen beziehen sich jeweils auf ein solches Pärchen als „Probe". Neuerdings wird von einigen amerikanischen Autoren aber empfohlen, eine zweite aerobe oder eine mit einem Pilznährmedium gefüllte Flasche anstelle der anaeroben zur Erzielung einer optimalen diagnostischen Aussage zu verwenden. Einige moderne kommerzielle Blutkultursysteme enthalten zusätzlich Harze, die Antibiotika binden sollen und deshalb auch bei bereits eingeleiteter Chemotherapie noch brauchbare Kulturergebnisse liefern können. Zur Beschleunigung und Ökonomisicrung der Blutkulturdiagnostik werden heute überwiegend Blutkulturautomaten verwendet, in denen die Bebrütung der Flaschen erfolgt und die mikrobielles Wachstum frühzeitig. z.B. an vermehrt freigesetztem CO2 oder an pH-Verschiebungen des Mediums, erkennen und dies auch akustisch und optisch anzeigen.

Blutkulturflaschen sind auch als Transport- und Züchtungsmedien für andere flüssige Untersuchungsmaterialien, insbesondere Sternalpunktate und Knochenmarkstanzen bei Verdacht auf Brucellose oder generalisierende Pilzinfektion, geeignet, wenn es um den Nachweis sehr empfindlicher Erregerarten geht und wenn eine Quantifizierung der Mikroben nicht erforderlich ist. Auch bei Verdacht auf Sepsis durch schnell wachsende Mykobakterien oder Nocardien sollten Blutkulturflaschen beimpft werden. Leishmania donovani, Trypanosomen und Plasmodien werden dagegen in gefärbten Ausstrichpräparaten von Sternalpunktat nachgewiesen.

2.1 Gewinnung und Transport von Untersuchungsmaterial

Der Transport der Blutproben sollte, schon wegen der Gefährlichkeit septischer oder zyklischer Infektionskrankheiten, grundsätzlich so schnell wie möglich vorgenommen werden. Wenn längere Zeiten zwischen Entnahme und Verarbeitung unvermeidbar sind, werden Blutkulturflaschen schon am Entnahmeort bei 36±1 °C vorbebrütet (bei den Verfahren mit COyNachweis nicht so günstig), um das Kulturergebnis zu beschleunigen. Aber auch Umgebungstemperatur führt in den meisten Fällen nicht zum Absterben der Erreger (s. Tab. 2.1). Blut zum Antikörpernachweis. Für serologische Untersuchungen wird in der Regel Venenblut in einer Menge von 5 bis 8 ml benötigt, das ohne Zusätze nativ in ein steriles „Blutröhrchen" (Abb. 2.1a) gefüllt wird. Entnahme und Transport sind meist nicht kritisch. Nur bei hohen und sehr niedrigen (Frost) Außentemperaturen ist es zur Vermeidung von Hämolysevorgängen günstiger, das Serum unter sterilen Bedingungen abzutrennen und dem Laboratorium allein zuzustellen. Liegt der Verdacht auf eine akute Erkrankung vor, sollte eine Serumprobe möglichst bald nach Krankheitsbeginn und eine weitere 10-14 Tage später entnommen werden, um Bildung und Anstieg spezifischer Antikörper zuverlässig erfassen zu können. Ist das Vorliegen von Störfaktoren bekannt, die häufig zu Verfälschungen der Ergebnisse serologischer Tests führen, sollte die Untersuchungsanforderung Hinweise darauf enthalten. Störungen serologischer Teste (z.B. falsch-positive Ergebnisse) können auftreten bei Gammopathien, dem Vorhandensein von Kälteagglutininen, Kryoglobulinen, Rheumafaktoren und Autoantikörpern sowie nach Gabe von Immunglobulinpräparaten, aber auch nach Transfusionen und Verabreichung größerer Mengen von Blutprodukten. Katheterspitzen. Vor allem bei Verdacht auf kathelerassoziierte Sepsis (z.B. durch Staphylococcus epidermidis) ist es sinnvoll, die Spitze des nach Desinfektion der Insertionsstellc gezogenen Katheters (4-6 cm) abzuschneiden und in einem sterilen Gefäß zum Laboratorium zu bringen (s. Tab. 2.1). Andere Körperflüssigkeiten

Liquor. Von dem durch Lumbai- oder Subokzipitalpunktion unter sterilen Kautelen aspirierten Liquor sollte eine Portion sogleich nach der Gewinnung zentrifugiert werden; aus dem Sediment fertigt man zwei Präparate. (Methylenblau-

und Gramfärbung), die oft eine Schnelldiagnose und allein eine sofortige Beurteilung des Zellbefundes erlauben. Da mit sehr empfindlichen Erregern zu rechnen ist, muß der Transport des nativen restlichen Liquors (in einem gut verschlossenen Gefäß) rasch erfolgen, wenn die Kultur sichere Ergebnisse erbringen soll. Bei Verdacht auf bakterielle Meningitis wird die Probe bei Raum-(LJmgebungs-)Temperatur gehalten; sie sollte keinesfalls gekühlt werden. Eine parallel gewonnene Blutkultur kann die diagnostische Aussage zuweilen erheblich verbessern oder beschleunigen (s. Tab. 2.1). Längere Transportzeiten überstehen empfindliche Meningitis-Erreger zuweilen besser, wenn das Material in nicht zu geringer Menge in eine Blutkulturflasche gegeben wird. Allerdings sind konventionelle Blutkulturmedien für einige der besonders anspruchsvollen, bakteriellen Meningitiserreger nur bedingt brauchbar. Bei Verdacht auf Meningitis luberculosa kommt dieses Vorgehen überhaupt nicht in Betracht. Zum Nachweis von Protozoen (Toxoplasmen, Amöben) und Viren sind ebenfalls besondere Gesichtspunkte zu beachten. Parasiten und Anaerobier lassen sich eher aus Abszeßaspirat oder Biopsieproben nachweisen als aus Liquor. Gerade nach längerer Transportdauer oder bei Proben, die nach Antibiotikagaben abgenommen wurden, kommt dem Antigennachweis große praktische Bedeutung zu. Wird eine Liquorprobe zum Nachweis erregerspezifischer Antikörper entnommen, sollte stets parallel eine Blut- bzw. Serumprobe gewonnen werden. Pleura-, Perikardial-, Peritoneal- und Synovialtlüssigkeiten. Für diese Materialien gelten grundsätzlich dieselben Gesichtspunkte wie für Liquorproben. Vor allem bei Peritoneal- oder Pleurapunktaten sollte aber beachtet werden, daß hier Anaerobierinfektionen zu erwarten sind (fötider Geruch!), die nach speziellen Transportverfahren verlangen (s. Tab. 2.1). Eiter und Wundsekrete

Eiter aus geschlossenen Prozessen. Bei geschlossenen Einschmelzungsherden sollte die Materialgewinnung, wenn irgend möglich, vor der therapeutischen Inzision durch Punktion und Aspiration mit einer Spritze unter aseptischen Bedingungen erfolgen. Bei schleimhautnahen Prozessen versuche man ebenfalls, den Herd von der äußeren Haut aus zu erreichen, da

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es bei Punktionen durch die Mukosa fast immer zu einer massiven Einschleppung von Mikroben der Schleimhautflora kommt, die das Ergebnis der Untersuchung verfälschen kann. Besteht kein Verdacht auf Anaerobierbeteili-

gung, wird eine nicht zu kleine Portion des Eiters in ein steriles Röhrchen gefüllt und so zur Untersuchung wcitergeleitet. Übliche aerob wachsende Eitererreger überstehen meist auch verlängerte Transportzeiten relativ gut. Anaerobier sind vor allem bei Eiterungen zu erwarten, die vom Verdauungskanal und vom weiblichen Genitale ausgehen. Hier ist jeder unnötige Kontakt des Probenmaterials mit Luft zu vermeiden, sowohl während der Entnahme als auch während des Transports. Der Eiter wird deshalb möglichst ohne Luftbeimengung mit der Spritze aspiriert. Der Transport, der immer ohne Verzögerung erfolgen sollte, kann auf folgende Weise geschehen: 1. Das Material wird unter sterilen Kautelen in ein sauerstofffreies, reduzierendes Transportmedium mit Redoxindikator (z.B. Port-ACul®. Portagerm(1<)) übertragen (längerer Transport prinzipiell möglich). 2. Das Eitersekret wird in ein normales, steriles Röhrchen umgefüllt; letzteres wird geöffnet in einen tragbaren Anaerobier-Topf gestellt und, nachdem der Sauerstoff entfernt wurde, per Boten zur Untersuchungsstelle gebracht. 3. Aus Sicherheitsgründen (erhöhte Verletzungs- und Infektionsgefahr) kann der Transport (durch Boten) in der Entnahmespritze heute nur noch empfohlen werden, wenn die Kanüle vorher durch eine sterile Kappe ersetzt wird. Auch bei Anaerobierverdacht ist Kühlung der Probe grundsätzlich kontraindiziert (s. Tab. 2.1). Eiter aus offenen Wunden. Tupferabstriche von der Wundoberfläche oder von an der Austrittsöffnung erscheinendem Fistelsekret sind für die mikrobiologische Untersuchung wenig geeignet, da sie üblicherweise stark kontaminiert sind. Bessere Ergebnisse liefern Gewebeteilchen, die nach Reinigung der Wundoberfläche oder Fistelöffnung mit einem scharfen Löffel vom Wundrand, der Abszeßwand oder möglichst tief aus dem Fistelkanal abgekratzt werden. Bei tiefen Wunden oder Fisteln kann außerdem versucht werden, Sekret über einen sterilen Venenkatheter aus der Tiefe anzusaugen. Ist die Abstrichentnahme nicht zu umgehen, sollte der Tupfer unbedingt in einem konservierenden Transportmedium (z.B. nach STUART, S. Kap.

2.1.2) transportiert werden. Gewebeteilchen werden am besten in ein Röhrchen mit einer geringen Menge Nährbouillon übertragen (Kochsalzlösung weniger geeignet). Bei Verdacht auf Anaerobier gelten die oben erwähnten Gesichtspunkte; für Tupferabstriche, die hier allerdings nur ausnahmsweise genügen, gibt es spezielle reduzierende Transportmedien (z.B. PortA-Cul®-Röhrchen mit Schraubverschluß). Vor allem um Überwucherung des Erregers durch Mikroben, welche die Wunde sekundär besiedelt haben oder bei der Entnahme eingebracht wurden, zu vermeiden, sind kurze Übersendungszeiten unbedingt anzustreben. Bindehautsekrete, Tränenflüssigkeit Materialgewinnung mittels Tupfer führt oft zu unbefriedigenden Ergebnissen; auf jeden Fall sind Tupfer vorher mit steriler Kochsalzlösung anzufeuchten. Besser ist das Aufsaugen von Sekreten mit einer Glaskapillare oder die Gewinnung von Haut- oder Bindehautgeschabsel. Da oft sehr empfindliche Erreger vorliegen, sollten geeignete Kulturmedien unmittelbar nach Materialentnahme beimpft werden oder der Transport hat schnell und unter Verwendung von Transportmedien (z.B. STUART-Medium) zu erfolgen. Auch wenn nur an einem Auge Krankheitszeichen erkennbar sind, sollten Proben von beiden Augen gewonnen werden, da das nicht infizierte Auge als „Negativkontrolle" zur Beurteilung der natürlichen Besiedlungsverhältnisse dienen kann. Bei Verdacht auf Gonoblennorrhoe ist wie bei den übrigen Manifestationen von Gonokokken-Infcktionen zu verfahren (s. Tab. 2.1). Gehörgangs- und Mittelohrsekrete Material wird mit einem Tupfer unter Sicht direkt von den Läsionen bzw. aus dem entzündeten Bereich gewonnen. Die weitere Handhabung entspricht der bei offenen Wundeiterungen, auch im Hinblick auf eine mögliche Anaerobierbeteiligung. Materialien aus dem Respirationstrakt Sekrete aus Mund, Rachen, Nase. Wie bei den

Ohrerkrankungen wird unter Sicht ein Tupferabstrich vom entzündeten Bereich durchgeführt, nachdem die Entnahmestelle vorher mit einem anderen Tupfer gereinigt worden war. Dabei ist

2.1 Gewinnung und Transport von Untersuchungsmaterial

ein flexibler Stieltupfer hilfreich, um auch schwerer zugängliche Stellen einfach erreichen zu können. Finden sich membranöse Beläge, müssen diese zur Materialgewinnung von ihrer Unterseite oder vom Grund der Läsion angehoben werden. Zu lange Transportzeiten sind bei Tupfereinsendungen die wichtigste Ursache für negative oder irreführende Kulturergebnisse, da die Krankheitserreger hier besonders leicht durch Austrocknung und/oder Oxidation geschädigt werden können. Zur bakteriologischen Diagnostik von Gingivitis, Parodontitis oder Stomatitis ulcerosa ist die Entnahmestelle zunächst sorgfältig zu reinigen. Dann wird infiziertes Gewebe abgetragen und sofort in ein Anaerobiertransportsystem überführt. Nasennebenhöhlensekrete. Material aus den Nebenhöhlen wird meist durch Spülung gewonnen. Da Kochsalzlösung manche Erreger schädigt, ist als Spülflüssigkeit eher Ringer-Lösung mit Laktatzusatz zu empfehlen. Die schnelle kulturelle Weiterverarbeitung der Probe im Laboratorium ist eine weitere Voraussetzung für ein verwertbares Ergebnis. Bei kurzen Transportzeiten genügen dann auch die normalen Materialgefäße (s. Tab. 2.1). Sputum, Bronchialsekrete. Sputum ist an sich ein wenig geeignetes Untersuchungsmaterial, da es selten eindeutige Ergebnisse liefert. Entscheidend für eine aussagefähigere Sputumdiagnostik ist, den Patienten anzuhalten, morgens den ersten Auswurf durch kräftiges Abhusten aus den tieferen Atemwegen und nicht nur Speichel zutage zu fördern. Der Auswurf wird entweder direkt in das dafür vorgesehene, weitlumige Versandgefäß (Abb. 2.1d) abgegeben oder zunächst in eine sterile Glasschale entleert, aus der dann unter sterilen Bedingungen eitrige oder flockige Bestandteile in das Transportgefäß umgefüllt werden. Wenn bei Tuberkulose-Verdacht Sputum über einen längeren Zeitraum gesammelt werden soll, ist jede Einzelportion bis zur Überstellung an das untersuchende Laboratorium bei 4 °C zu kühlen. Die Transportzeiten sollten generell kurz sein, da sonst erhebliche Veränderungen der mikrobiologischen Ausgangssiluation eintreten (s. Tab. 2.1). Da Sputum praktisch immer mit Mundbakterien kontaminiert ist, erhält man klarere Aussagen, wenn Sekret aus den tieferen Atemwegen direkt durch Bronchoskopie (geschützte Bürste) oder transtracheale Aspiration gewonnen wird. Bei Anaerobierinfektionen der Lunge ist letzteres

Vorgehen nahezu die einzige Möglichkeit, zu einer verläßlichen Diagnose zu kommen. Untersuchungsmaterial aus dem Verdauungskanal

Magen-, Duodenal-, Gallensaft. Eine direkte bakteriologische Diagnostik von Infektionen der Magenschleimhaut hat bis auf den Nachweis von Helicobacter pylori aus Biopsiematerial keine praktische Bedeutung. Magennüchternsaft wird aber zum Nachweis verschluckter, aus der Lunge stammender Tuberkelbakterien benutzt. Kann dieser Magensaft nicht alsbald für die Kultur oder den Tierversuch aufgearbeitet werden, sollte man die Probe vor dem Versand unter sterilen Bedingungen neutralisieren. Duodenal- und Gallensaft (A-, B- und C-Galle) werden nach der Gewinnung über die Duodenalsonde getrennt in sterilen Röhrchen aufgefangen. Ihr Transport ist meist nicht übermäßig kritisch (Ausnahme: Lamblien). Stuhl und Rektalabstriche. Stuhl für die mikrobiologische Diagnostik wird nicht in ein Toilettenbecken, sondern in ein sauberes Gefäß (Bettpfanne) ohne Urinbeimengung abgesetzt. Bei geformten Exkrementen wird mit dem Löffelchen eine etwa bohnengroße Portion aus dem mittleren Teil der Faeces in ein Stuhlröhrchen übertragen. Bei dünnflüssigem Stuhl genügen 0,5 bis 1 ml. In manchen Fällen ist es günstiger, mit einem Tupfer unter Drehung aus der Region proximal des Sphincter ani Material für die Untersuchung abzustreichen. Obwohl die meisten darmpathogenen Bakterien relativ widerstandsfähig sind, können sie doch durch die bei Abkühlung und Saprophytenwucherung in der Stuhlprobe entstehenden Veränderungen (z.B. pH-Veränderung) geschädigt werden. Trotzdem haben sich bis auf die Fälle mit Cholera-Verdacht (alkalisches Peptonwasser) in Deutschland konservierende Transportmedien für Stuhleinsendungen kaum durchsetzen können. Man sollte deshalb wenigstens für eine schnelle Probenzustellung sorgen oder alternativ bzw. gleichzeitig einen Rektalabstrich verwenden, der in STUART- oder CARYBLAIR-Medium transportiert wird (s. Tab. 2.1). Im Vergleich zum letztgenannten Vorgehen leistungsfähiger bleibt aber der Einsatz einer flüssigen Konservierungslösung, die zum Beispiel aus 0,033 M Phosphatpuffer und Glyzerin, zu gleichen Teilen gemischt, bestehen kann (für Enterobacteriaceae). Für Salmonellen und Shi-

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gellen speziell eignet sich das Medium nach HAJNA. Untersuchungsmaterial aus dem Urogenitalsystem Urin. Urin passiert bei seiner Ausscheidung per vias naturales in der vorderen Harnröhre ein Gebiet, das eine natürliche mikrobielle Besiedlung aufweist, die sich qualitativ nicht vom Erregerspektrum der Harnwegsinfektionen unterscheiden muß. Dadurch kommt es oft zu einer starken sekundären Beladung des Harns mit diesen Schleimhautmikroben, welche die bakteriologische Diagnostik der „echten" Infektionen erheblich stören. Bei der Entnahme von Urinproben muß deshalb diese sekundäre Verunreinigung soweit wie möglich vermieden werden. Dazu sind die folgenden Techniken gebräuchlich: 1. Mittelstrahlurin (der Patient spült mit seiner ersten Harnportion die Harnröhre aus; aus der mittleren Portion wird ohne Anhalten des Strahls die Probe gewonnen). Vorgehen beim Mann (in der Regel vom Patienten selbst auszuführen): Hände sorgfältig mit Wasser und Seife waschen, mit frischem oder Einweghandtuch abtrocknen: Vorhaut mit der einen Hand vollständig zurückziehen, mit der anderen Hand Glans penis mittels eines mit sauberem (sterilem) Wasser befeuchteten, sterilen Tupfers reinigen, mit zweitem Tupfer nachreinigen; Umgebung des Orificium urethrae mit drittem Tupfer trocknen; erste Urinportion (ca. 50 ml) in die Toilette oder ein Gefäß entleeren, dann - ohne den Harnstrahl zu unterbrechen - 5 bis 10 ml Harn in dem vorher griffbereit gestellten Transportgefäß auffangen, und zwar unter strikter Vermeidung einer Verunreinigung des Gefäßrandes durch Hand. Kleidung etc.; Verschluß sofort aufsetzen; Gefäß beschriften und bis zur Weiterleitung an das Laboratorium sofort in den Kühlschrank stellen; alternativ Urin in sterilem Einwegbechcr auffangen und sofort einen Eintauchobjektträger beimpfen (s.u.). Vorgehen bei der Frau (gegebenenfalls unter Hinzuziehung eines Hilfsperson): Unterwäsche ausziehen, Rock hochschlagen; Hände sorgfältig mit Wasser und Seife waschen und wie oben trocknen; mit einer Hand die Labien spreizen und so lange geöffnet halten, bis die Uringewinnung abgeschlossen ist: Vulva mit der anderen Hand mit angefeuchtetem Tupfer durch Wischen von vorn nach hinten reinigen und mit zweitem Tupfer nachreinigen; Bereich des Orificium urethrae mit drittem Tupfer trocknen und diesen in den Introitiis vaginae einlegen; weiteres Vorgehen wie beim Mann bis auf die Empfehlung, grundsätzlich sterile Einwegbecher zu verwenden, aus denen der Urin gegebenenfalls anschließend in ein Transportgefäß umgefüllt wird; abschließend Tupfer aus der Scheide entfernen.

Trotz aller Vorsicht bleibt der Gehalt des Urins an Kontaminanten bei dieser Technik leider häufig noch hoch. Ein oder mehrere Kontrolluntersuchungen können aber zusätzliche Sicherheit für die Beurteilung der Untersuchungsergebnisse geben. 2. Katheterisieren der Harnblase bringt gegenüber dem obigen Vorgehen keinen prinzipiellen Vorteil, es kann aber den Patienten zusätzlich durch die mit dem Katheter hochgeschobenen Erreger belasten. Nur wenn aus anderen Gründen die Katheterisierung indiziert ist, kann Urin über diesen Weg - dann aber auch nach der Mittelstrahltechnik - für die bakteriologische Analyse gewonnen werden. 3. Suprapubische Blasenpunktion. Die einzige Möglichkeit, einen weitgehend kontaminationsfreien Harn zu erhalten, ist die Umgehung der Harnröhre durch diese Methode, die sich insbesondere zur Abklärung unklarer Fälle eingebürgert hat. Da sich, außer bei der letztgenannten Entnahmetechnik, Verunreinigungen der Urinprobe nicht sicher vermeiden lassen, muß alles getan werden, um eine sekundäre Vermehrung dieser Mikroben während des Transportes zu verhindern, oder man muß wenigstens eine Aussage über die Mikrobenkonzentrationen bei der Entnahme machen können. Eine sekundäre Mikrobenvermehrung bis zur Ankunft der Probe im Laboratorium läßt sich ausschließen, wenn der Urin innerhalb einer Stunde nach Gewinnung zur Untersuchung kommt oder wenn man ihn von der Entnahme bis zur Ankunft im Labor ununterbrochen auf 4 °C kühlt (s. Tab. 2.1). Einfacher ist es allerdings, unmittelbar am Patienten einen nährbodenbeschichteten Objektträger (Objektträgerkultur, EintauchobjektträgerTechnik, Dip-Slide-Verfahren) in den Urin einzutauchen und das so beimpfte System als Transportmedium zu verwenden, dessen Überstellung an das Laboratorium bei richtiger Handhabung nicht kritisch ist. Genitalsekrete. Harnröhren-, Prostata-, Zervikal- oder Vaginalsekrete können meist unter Sicht (Spekulum bei der Frau!) mit dem Tupfer entnommen werden. Versendung dieses Tupfers ohne besondere Vorkehrung wird aber meist negative Ergebnisse bringen, da gerade im Genitaltrakt mit empfindlichen Erregern zu rechnen ist. Auch wenn kein Gonorrhoe-Verdacht besteht, sollten deshalb Transportmedien wie das STUART-Medium, das Port- A-Cul®-Medium, das Portagerm®-Medium oder das Transmed®-Me-

2.1 Gewinnung und Transport von Untersuchungsmaterial

dium eingesetzt werden. Zum Nachweis der Gonokokken sind diese Medien jedoch nur bei nicht zu langen Transportzeiten geeignet. Sonst ist die direkte Verimpfung des Eiters oder Sekretes (mit Herstellung eines Originalpräparates) auf die entsprechenden Spczialnährböden (s. Kap. 2.1.2) oder auf das selektive, in der Gasatmosphäre abgestimmte, für Züchtung und Transport geeignete Transgrow®-Medium (modifiziertes THAYER-MARTIN-Medium als Schrägagar in Flaschen mit Schraubverschluß; die Luft in der Flasche enthält 20% CO2) vorzuziehen. Alle Materialien aus dem Genitaltrakt sollten, wenn möglich grundsätzlich, durch Boten oder den Patienten selbst im Laboratorium angeliefert werden (s. Tab. 2.1). Spezielle Gesichtspunkte für Mykoplasmen, Chlamydien und Rickettsien

Mykoplasmen. Mykoplasmen sind auffällig empfindlich gegenüber Austrocknung. An Tupfern aufgenommene Untersuchungsmaterialien müssen deshalb sofort weiterverarbeitet oder in ein Transportmedium (z.B. Trypticase-SojaBrühe mit 0,5% Rinderalbumin und Penicillin G) eingebracht werden. Gewebe- und Sputumproben können nativ transportiert werden. Erwartet man stark verlängerte Transportzeiten, sollte das Transportmedium bei -70 "C eingefroren werden. 24- bis 48stündige Intervalle zwischen Entnahme und Verarbeitung des Materials können in der Regel auch durch Kühlung auf +4 °C überbrückt werden. Chlamydien. Zum Nachweis von Chlamydien sind Epithelgeschabsel, zellhaltige Sekrete, Sputum, Blut oder Biopsiematerial (Leber, Milz) geeignet. Sie sollten grundsätzlich sofort in ein Transportmedium gelangen (z.B. SaccharosePhosphat-Glutamat-Transportmedium), das hyperton ist und z.B. folgende Antibiotika bzw. Antimykotika enthalten kann: Streptomycin, Vancomycin und Nystatin. Wenn die Proben innerhalb von 24 Stunden verarbeitet werden können, sollten sie bei Kühlschranktemperatur gehalten werden. Verzögert sich die Bearbeitung voraussichtlich länger, ist Einfrieren bei -60 °C zu empfehlen. Rickettsien. Materialien (z.B. Blut, Gewebe), aus denen Rickettsien isoliert werden sollen, müssen innerhalb von 30 Minuten weiterverarbeitet werden. Wenn dies nicht möglich ist, sollten sie sofort in einem Alkohol-Trockeneis-Bad eingefroren und konstant bei -70 °C gehalten

werden, bis sie zur Untersuchungsstelle gelangen (Vorsicht: Infektionsgefahr!) oder im Saccharose-Phosphat-Glutamat-Medium mit Zusatz von Rinderserumalbumin transportiert werden. Sind verdächtige Arthropoden (Läuse, Zecken, Milben) vorhanden, die untersucht werden sollen, werden diese in einem dicht verschlossenen Gefäß transportiert, das etwas angefeuchtete Watte enthält. Spezielle Gesichtspunkte für die Virusisolierung

Virusisolierungsversuche sind meist nur erfolgreich, wenn Untersuchungsmaterial zu Beginn der klinischen Krankheitserscheinungen (am besten innerhalb der ersten drei Tage, allenfalls bis zum 7. Tag) gewonnen wird. Der Transport dieses Materials sollte rasch, d.h. innerhalb weniger Stunden, und wenn notwendig (z.B. bei sommerlich hohen Außentemperaturen) gekühlt bei +4 °C (auf Naßeis) erfolgen. Eintrocknen oder Erwärmung des Probenmaterials über physiologische Temperaturen ist ebenso wie unbeabsichtigtes Einfrieren auf alle Fälle zu vermeiden. Sind längere Transportzeiten zu erwarten, sind die Proben bei -70 °C oder weniger einzufrieren und in gefrorenem Zustand (z.B. auf Trockeneis) zu transportieren. Bei umweltlabilen viralen Erregern kommen die oben genannten Transportmedien (s. Kap. 2.1.2) zum Einsatz. Typische, für die Virusanzucht brauchbare Untersuchungsmaterialien sind Nasenabstriche und -spülflüssigkeiten (physiologische Kochsalzlösung), Konjunktivalabstriche, Abstriche von Mundschleimhaut und Rachen sowie Rachengurgelwasser (physiologische Kochsalzlösung), Sputum, Bronchiallavage, Hautabstriche, Bläscheninhalte und Hautgeschabsel, Urin und Urogenitalabstriche, Stuhl und Analabstriche, Liquor, Gewebeproben und Biopsate, Augenkammerwasser und Fruchtwasser. Zur Anzucht viraler Erreger aus dem peripheren Blut eignet sich Vollblut mit gerinnungshemmenden Zusätzen, in einigen Fällen lassen sich nicht-zellassoziiertc Erreger auch aus Serumproben anzüchten. Für die Elektronenmikroskopie brauchbare Materialien zum Virusnachweis müssen reichlich intakte Viruspartikel enthalten. Dies trifft insbesondere auf Bläschenflüssigkeiten und -abstriche sowie Stuhlproben zu, seltener auf Liquor, Urin und Abstriche bzw. Spülfüssigkeiten aus den Atemwegen.

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Probenmaterial für den Nukleinsäurenachweis sollte ebenfalls rasch und gekühlt transportiert werden, wenn virale RNA nachgewiesen werden soll. DNA ist im Gegensatz zu RNA wesentlich stabiler und meist auch noch über einen längeren Zeitraum im Probenmaterial nachweisbar, z.B. auch in angetrockneten Blutresten in Injektionsnadeln bei Stichverletzungen. Zu beachten ist aber auch, daß lange Transportzeiten und Lagerung des Untersuchungsmaterials vor der Aufarbeitung im Labor bei quantitativen Nukleinsäurenachweisen stets vermieden werden sollten, da es zu unkontrollierbaren Effekten auf die viralen Nukleinsäurekonzentrationen kommen kann. Geeignete Probenmaterialien für Nukleinsäurenachweise sind Serum, Vollblut mit gerinnungshemmenden Zusätzen (Heparinzusatz kann zur Hemmung der PCR führen, HeparinBlut ist daher meist ungeeignet für den PCRNachweis), Liquor, aber auch Abstrichmaterialien und Biopsate. Ferner kann auch aus bereits fixierten histologischen Materialien erregerspe-

zifische Nukleinsäure freigesetzt und nachgewiesen werden. Virale Antigene lassen sich direkt in Rachenspülflüssigkeiten oder Bronchiallavagen, Abstrichen, Serum und Vollblut (Leukozytenpräparationen) nachweisen. Eine Übersicht über geeignete Untersuchungsmatcrialien für den direkten Virusnachweis durch Anzucht, Antigen- und Nukleinsäurenachweis gibt Tab. 2.2.

2.1.4 Probenzustellung zum Laboratorium Deklarierung der Untersuchungsproben Jede einzelne Materialprobe ist mit Vor- und Zunamen des Patienten, Datum und möglichst auch Uhrzeit unmittelbar nach der Gewinnung zu kennzeichnen. Werden mehrere verschiedene Stoffe gleichzeitig vom selben Kranken oder die gleiche Malerialart kurz hintereinander mehrfach entnommen, ist es zwingend erforderlich.

Tab. 2.2 Geeignete Probenmaterialien für einige der häufiger angeforderten Virusdirektnachweise Material Serum EDTA- oder Zitratblut Heparinblut

Erreger HBV (Ag, NAT, Hyb), HCV (NAT, Hyb), HIV (Ag, NAT, Hyb), HCMV (NAT), Parvovirus B19 (NAT) HIV (Ag, NAT, Iso), HCV (NAT, Hyb), HCMV (NAT, Hyb, Iso), HHV-6 (NAT, Iso), HHV-7 (NAT) HCMV (Ag, Iso)

Abstriche und Spülflüssigkeiten der oberen Atemwege Bronchiallavage, tiefe Atemwege Konjunktivalabstriche Augenkammerwasser

Adeno- (Iso), Enteroviren (Iso) CMV (NAT)

Hautabstriche und Biopsate, Bläscheninhalt Urin

HSV (iso, NAT, EM), VZV (iso, NAT, EM), Molluscum contagiosum (Iso, EM), HHV-8 (NAT), HPV (NAT) CMV (Iso, NAT), Rötelnvirus (Iso), Mumpsvirus (Iso)

Urogenitalabstriche

HSV (Iso, Ag, NAT), HPV (NAT, Hyb)

Analabstriche Stuhl

Augenkammerwasser

HSV (Iso, Ag, NAT), HCMV (Iso, NAT), Enteroviren (Iso), Adenoviren (Iso) Rotaviren (EM), Adenoviren (Iso, EM), Enteroviren (Iso, EM), HAV (Ag), Caliciviren (EM), Norwalkviren (EM), Coronaviren (EM), Astroviren (EM) Enteroviren (Iso, NAT), HSV (NAT), VZV (NAT), HCMV (NAT), HIV (Iso, NAT), Masernvirus (NAT) HCMV (NAT)

Fruchtwasser

HCMV (NAT, Iso), Rötelnvirus (NAT, Iso), Parvovirus B19 (NAT)

Liquor

Influenza A und B (Ag, Iso), Parainfluenza 1-3 (Iso), RSV (Ag, Iso), Adenoviren (Iso), Enteroviren (Iso), HSV (Iso), Masern (Iso), Mumps (Iso) CMV (Iso, NAT), HSV (Iso, NAT), VZV (Iso, NAT), RSV (Iso, Ag)

Ag: Antigennachweis, EM: Elektronenmikroskopie, NAT: Nukleinsäureamplifikationstechniken, Hyb: Nukleinsäurehybridisierung, Iso: Virusanzucht

2.1 Gewinnung und Transport von Untersuchungsmaterial

auch Materialart und Entnahmezeitpunkt zu vermerken. Außerdem muß jeder Probe ein Begleitschreiben beigefügt werden, das möglichst alle der folgenden Informationen enthalten sollte: Personalien des Patienten (Name, Vorname, Geburtsdatum, Wohnanschrift, Krankenkassenmitgliedschaft, Patienten-Nr.), Art des Untersuchungsmaterials, Entnahmezeitpunkt (Tag, u.U. Uhrzeit), gewünschte Untersuchung(en) (z.B. Stuhl auf Salmonellen), Datum und eventuell Buchungsnummer früherer Einsendungen von demselben Patienten, Hinweise auf klinische Symptomatik und/oder Verdachtsdiagnose, Haupt- und Nebenlokalisationen des Krankheitsprozesses, bisheriger Verlauf (Beginn der klinischen Erscheinungen oder des Krankenhausaufenthaltes), Art und Dauer einer schon erfolgten antimikrobiellen Chemotherapie, genaue Anschrift des einsendenden Arztes mit Telefonnummer, bei Krankenhäusern auch Station. Personalien des Patienten (Probanden), Bezeichnung der Materialprobe, Entnahmezeitpunkt, Arztstempel und Unterschrift sind unabdingbare Voraussetzungen für Untersuchung und Befundmitteilung. Von den Untersuchungsstellen werden üblicherweise Begleitscheinvordrucke ausgegeben, die einfach auszufüllen sind und den Einsender an die genannten wichtigen Punkte erinnern. Rechtsvorschriften für Transport und Versand von Untersuchungsmaterial und Erregerkulturen

Für den rechtskonformen Transport und Versand von menschlichem Untersuchungsmaterial und Erregerkulturen sind eine Reihe verschiedener nationaler und internationaler Vorschriften zu beachten. Die für deutsche Verhältnisse wichtigsten unter ihnen sind: Ŷ die europäische Norm CEN EN 829 „Transportverpackungen für medizinisches und biologisches Untersuchungsgut - Anforderungen, Prüfung" von 1996; Ŷ die Gefahrgutverordnung Straße - GGVS - mit Anlagen A und B des ADR (ADR-Rahmenrichtlinie 94/55/EG) von 1996; Ŷ die Dangerous Goods Regulations der International Air Transport Association (IATA) von 1998; Ŷ sowie die Regelungen über den Poslversand von medizinischem und biologischem Untersuchungsgut von 1996. Der Anwendungsbereich der Norm CEN EN 829 beschränkt sich dabei auf Proben, bei denen Ŷ das Nennvolumen der Probengefäße 100 ml nicht überschreitet.

Ŷ bei mehreren Proben das Gesamtvolumen der Proben im Schutzgefäß 500 ml nicht überschreitet, Ŷ in der Probe keine ansteckungsfähigen Stoffe vorhanden sind oder eine verhältnismäßig geringe Wahrscheinlichkeit besteht, daß ansteckungsfähige Stoffe vorhanden sind. Die Norm gilt deshalb formal für Untersuchungsgut im Rahmen von Routine-Überwachungsuntersuchungen oder im Rahmen der Erstdiagnosc. Transportverpackungen für Untersuchungsgut, das bekanntermaßen ansteckungsgelährliche Stoffe der Risikogruppen 2 bis 4 nach WHO bzw. Biostoffverordnung enthält oder wahrscheinlich enthält, unterliegen den Regelungen für Gefahrguttransport.

Unter Transport versteht die CEN EN 829 die Ortsveränderung von Untersuchungsproben außerhalb des Grundstücks des Absenders oder Empfängers des Untersuchungsgutes. Sie gilt demnach nicht für den Probentransport auf dem Gelände eines Krankenhauses oder Klinikums! Die zusammengesetzte Transportverpackung nach CEN EN 829 besteht aus B einem oder mehreren flüssigkeitsdichten Probengefäßen Ŷ aufsaugendem Material, das ausreichen muß, die gesamte aus den Probengefäßen austretende Flüssigkeit aufzunehmen Ŷ einem Schutzgefäß, das ebenfalls flüssigkeitsdicht sein und mechanischen Belastungen. Temperaturschwankungen und einem Abfall des Außendrucks standhalten muß Ŷ einer kistenförmigen Verpackung oder Versandhülle, die den üblichen Transportbelastungen standhalten muß. Die kistenförmige Außenverpackung oder Versandhülle muß mit dem graphischen Symbol nach Abb. 2.2 in den Maßen 62 mm x 44 mm gekennzeichnet sein. Begleitpapiere sollten nicht in das Schutzgefäß, sondern in die Versandhülle gegeben werden.

Abb. 2.2 Graphisches Symbol zur Kennzeichnung menschlichen Untersuchungsgutes.

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Mikrobiologische Diagnostik

Die Gefahrgutverordnung Straße (GGVS) unterschei det in der Anlage A zwischen A. „Ansteckungsgefährlichen Stoffen mit hohem Gefährdungspotential" und B. „Sonstigen ansteckungsgefährlichen Stoffen". Zur Kategorie A gehören Stoffe, die den Risikogruppen 3 oder 4 zugeordnet sind (oder diese enthalten); die Kategorie B umfaßt Stoffe, die der Risikogruppe 2 zugeordnet sind (oder diese enthalten), oder unspezifizierte klinische Abfälle, die wahrscheinlich keine Stoffe der Risikogruppen 3 oder 4 enthalten. Verpackungen nach Kategorie A müssen aus folgenden, wesentlichen Teilen bestehen: a) einer Innenverpackung, bestehend aus: - einem wasserdichten Gefäß als erster Verpackung, - einer wasserdichten zweiten Verpackung, - absorbierendem Material zwischen der ersten und zweiten Verpackung; b) einer in Bezug auf ihren Fassungsraum, ihre Masse und den Verwendungszweck ausreichend widerstandsfähige Außenverpackung, deren geringste Außenabmessung mindestens JO cm betragen muß. Der wesentliche Unterschied dieser Bestimmungen zu den Vorschriften der CEN EN 829 besteht in den höheren Anforderungen an die Widerstandsfähigkeit der Außenverpackung gegen mechanische Belastungen. Durchfeuchtung und Temperaturschwankungen. Für Stoffe nach Kategorie B der GGVS gelten Verpackungsvorschriften ähnlich CEN EN 829, außer daß nur Kisten und keine Versandhüllen verwendet werden dürfen. Die Dangerous Goods Regulations der IATA, die auch für jeden Postversand gelten, da die Deutsche Post AG Lufttransport grundsätzlich nicht ausschließen kann, definieren als „infektiöse Substanzen" alle Materialien, die aus Organismen der Risikogruppen 2 bis 4 bestehen oder diese wahrscheinlich enthalten. Für diese gelten ebenfalls höhere Anforderungen an die Widerstandsfähigkeit der Außenverpackung und sie schließen somit auch Erreger der Risikogruppc 2 ein. Außerdem ist das Formblatt „Shipper's Declaration for Dangerous Goods" vollständig auf Englisch auszufüllen und in doppeller Ausfertigung vorzulegen, und die Außenverpackung ist u.a. mit dem Namen und der Telefonnummer der Person zu beschriften, die für den Versand verantwortlich ist. Hinsichtlich der vielen weiteren Details sei auf die Broschüre „Shipping of Infectious, Non-lnfectious and Genetically Modified Biological Materials: International Regulations" der DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH 1999 (Autorin: Dr. Christine Rohde) - verwiesen. Die „Regelungen über den Postversand von medizinischem und biologischem Untersuchungs-

gut" der Deutschen Post AG unterscheiden zwischen „Sendungen mit Untersuchungsgut ohne oder mit geringem Infektionsrisiko" und „Sendungen mit infektiösem Untersuchungsgut". In der ersten Kategorie werden weiterhin flüssige und nicht-flüssige Untersuchungsmaterialien unterschieden. Für flüssiges Untersuchungsgut gelten die Verpackungsvorschriften nach CEN

EN 829; nicht-flüssiges Untersuchungsgut muß nur den allgemeinen Verpackungsvorschriften (keine Beschädigung durch Bruch, Stoß, Fall) entsprechen. Infektiöses Untersuchungsgui ist generell wie flüssiges Untersuchungsmaterial zu handhaben. Darüber hinaus ist es unter Wertangabe (in der Regel als Wertbrief) zu versenden, um die Bearbeitung mit automatischen Sortieranlagen zu umgehen. Für den Frachtdienst sind solche Sendungen nicht zugelassen. Schließlich muß die Sendung auf der Aufschriftseite links neben der Anschrift den auffälligen Vermerk ..Untersuchungsgut - Vorsicht infektiös!" tragen. Ist die Versandhüllc bereits mit den Bildzeichen nach Abb. 2.2 versehen, genügt der Zusatz „Vorsicht infektiös!" Postversand. Postversand von Materialproben für mikrobiologische Untersuchungen ist wegen der häufig schlecht kalkulierbaren Transportzeit die am wenigsten geeignete Form des Materialtransportes. Dennoch läßt er sich in vielen Fällen nicht umgehen und muß auch nicht notwendigerweise zu einer Verfälschung des Befundes führen.

Transport durch Boten. Der Materialtransport durch Boten ist dann obligatorisch, wenn Verdacht auf eine der gefährlichen, hochkontagiösen Seuchen (z.B. Pest) besteht. Für ein brauchbares Untersuchungsergebnis ist er außerdem bei sehr hinfälligen Erregern (z.B. Gonokokken) dringend angezeigt. Zwischen Krankenhäusern und Praxen, in denen täglich größere Mengen von Materialproben anfallen, und der Untersuchungsstelle sollte deshalb, wenn irgend möglich, ein regelmäßiger Botendienst eingerichtet werden, der dann natürlich die Überstellung sämtlicher anfallender Materialproben übernehmen kann. Dabei sind die Bestimmungen der GGVS einzuhalten. Bessere und schnellere Befunderhebung und -mitteilung rechtfertigen diesen Mehraufwand ohne Frage. In manchen Fällen und höchstens bei geringem Infektionsrisiko können der Patient selbst oder seine Angehörigen mit der Überbringung der Probe beauftragt werden; auch Taxiunternehmen lassen sich für diesen Zweck heranziehen. In Ausnahmesituationen (z.B. Pest-Verdacht) kann selbst die Polizei für die Zustellung des Materials eingeschaltet werden. Unmittelbare Probenverarbeitung. Durch die heute erhältlichen Transportmedien ist eine Sofortverarbeitung des Untersuchungsstoffes unmittelbar nach Entnahme nur noch in bestimmten Einzelfällen erforderlich (s. Tab. 2.1). Zum Teil handelt es sich dann auch

2.2 Umgang mit infektiösem Material

um den mikroskopischen Direktnachweis sehr labiler Erreger (z.B. Treponema pallidum, Trichomonas vaginalis, Entamoeha histolytica), der vom erfahrenen Kliniker oft selbst durchgeführt wird. Sonst ist eine intervallfrcie Verarbeitung des Materials nur möglich, wenn der Patient das mikrobiologische Laboratorium aufsucht oder wenn, bei gegebenen Voraussetzungen. der Mikrobiologe zum Krankenbett gerufen wird. Nur bei ausreichender Einübung kann auch einmal die Beimpfung entsprechender Spezialnährböden vom Personal der Krankenabteilung vorgenommen werden. Die beimpften Nährböden müssen dann unter Warmhaltung durch Boten zum Laboratorium transportiert werden. Literatur BURKHARDT, F. (Hrsg.): Mikrobiologische Diagnostik, Thieme, Stuttgart-Ncw York 1992. MAUCH, H.. R. LüvncKEN und S. GATERMANN (Hrsg.): MiQ - Qualitätsstandards in der mikrobiologisch-infektiologischen Diagnostik, Fischer, Stuttgart-Jena-Lübeck-Ulm 1997 -2000ff. MURRAY, P. R.. E. J. BARON, M. A. PFALLFR, F. C. TENOVER and R. H. YOLKF.N (Eds.): Manual of Clinical Microbiology, 7th ed., American Society for Microbiology, Washington, D. C. 1999. SCHAAL, K. P.: Entnahme und Transport von Untersuchungsmaterial zur mikrobiologischen, parasilologischen und serologischen Diagnostik von Infektionskrankheiten. Krankenhausarzt 49. Hefte 6-12 (1976). WERNER. H.: Anaerobier-Infektioncn: Pathogencse, Klinik, Therapie, Diagnostik, 2. Aufl., Thieme, Stuttgart-New York 1985.

2.2 Umgang mit infektiösem Material EDELTRUD DIETLEIN, MARTIN EXNER Der Umgang mit infektiösem Material erfordert Kenntnisse in den Gebieten Desinfektion und Sterilisation. Wie zahlreiche Fallbeschreibungen von Infektionen im Zusammenhang mit fehlerhafter Aufbereitung und Entsorgung zeigen, haben alle Teilbereiche in dem Gesamtgefüge der Prophylaxe von Infektionserkrankungen einen wichtigen Stellenwert. Ende des 19. Jahrhunderts ermöglichten physikalische und chemische Methoden der Keimabtötung die Bereitstellung keimfreier chirurgischer Materialien sowie steriler Arzneimittel. SEMMELWEIS (1847) bewirkte durch Einführung der Waschung der Hände mit Chlorkalklösung in der Geburtshilfe eine drastische Reduktion der Wöchnerinnensterblichkeit. LISTER (1876) führte in der Chirurgie Phenol als antiseptisches Mittel

für Luft, Instrumente und Haut ein und bewirkte hierüber eine Reduktion der postoperativen Wundinfektionen. Der Chirurg HAESTED registrierte, daß trotz antiseptischer Maßnahmen die Hände nicht komplett von Bakterien befreit werden können und führte 1889 die Benutzung von Gummihandschuhen beim Operationsteam ein. Die letzten 100 Jahre führten - nicht zuletzt vor dem Hintergrund des Wissens um die mikrobiclle Ätiologic von Infektionen (ROBERT KOCH) - zur Strukturierung und Verbesserung der Techniken und Mittel der Desinfektion und Sterilisation, die in der modernen Medizin unentbehrlich geworden sind.

2.2.1 Einflußfaktoren der Keimabtötung Bei der Desinfektion und Sterilisation werden, bezogen auf eine bestimmte Keimart, in gleichen Zeitspannen jeweils 90% der überlebenden Keime abgetötet. Für jede Keimart existiert ein spezieller D-Wert (dezimale Reduktionszeit). Es ist der Zeitwert, der benötigt wird, um eine Reduktion der Keimzahl um eine 10er Potenz bzw. 90% zu erreichen. Die graphische Darstellung der Abtötung von Mikroorganismen ergibt eine logarithmische Kurve. Dies zeigt die Bedeutung von Zeil, Ausgangskeimzahl und Keimart für den Effekt einer Desinfektionsbzw. Sterilisationsmaßnahme. Die Aktivität der meisten Desinfektions- und Sterilisationsmaßnahmen steigt mit der Temperatur (Ausnahme: NaOH, Peressigsäure): der /7/7-Werfanstieg steigert den Desinfektionserfolg von Glutaraldchyd und quaternären Ammoniumverbindungen, aber vermindert ihn von Phenolen, Chloriden und Jod. Wasserhärte-bildende Ionen (Magnesium und Kalzium) reduzieren den Effekt von oberflächenaktiven Verbindungen, weil sie mit ihnen unlösliche Präzipitate bilden. Die Expositionsdauer gegenüber Desinfektions- und Sterilisationsverfahren bestimmt deren Wirksamkeit. Bis auf wenige Ausnahmen (Jod. Alkohol) verkürzen steigende Konzentrationen des Desinfektionsmittels die notwendige Einwirkzeit. Die Notwendigkeit einer mechanischen Reinigung, beispielsweise im Rahmen der ScheuerWisch-Desinfektion, zur Erzielung eines adäquaten Desinfektionseffektes ergibt sich nicht zuletzt aus dem Problem der Biofilmbildung durch viele Mikroorganismen. Prionen (Erreger der CREUTZFELÜT-JAKOB-EI-krankung) haben die höchste natürliche Resistenz neben Bakteriensporen; hiernach folgen

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Mikrobiologische Diagnostik

Mykobakterien, hüllenlose (hydrophile) Viren (z.B. Polio, Coxsackie), Hepatitis B-Viren, Pilze, Viren mit Lipidhülle (z.B. HIV, Herpes) und vegetative Bakterien, mit abnehmender Resistenz von Enterokokken/Staphylokokken zu Colibakterien/Salmonellen, wobei allerdings Pseudomonas aeruginosa resistenter ist als die meisten übrigen fakultativ-pathogenen Bakterien.

2.2.2 Indikation Desinfektion Sterilisation Eine exakte Abgrenzung der Notwendigkeit von Desinfektion und Sterilisation ist aus wirtschaftlichen wie aus praktikablen Gründen unbedingt erforderlich. Die Centers for Disease Control and Prevention (CDC/USA) stellten 1985 eine Einteilung der medizinischen Gerätschaften und Ausstattungen in verschiedene Kategorien auf. Kritische Objekte. In diese Gruppe fallen Objekte, die in steriles Gewebe oder in das Gefäßsystem eingehen und steril sein sollten. Hierzu zählen chirurgische Instrumente, Herz- oder Blasenkatheter, Implantate, Nadeln, Laparoskope und Arthroskope. Zu diesen Utensilien können auch Hand- und Winkelstücke sowie Luft- und Absaugansatzstücke in der Zahnmedizin zählen. Wenig kritische Objekte. Diese kommen in Kontakt mit der Schleimhaut oder nicht intakten Haut. Sie sollten frei sein von Mikroorganismen mit Ausnahme einer kleinen Anzahl an Sporen. Hierzu zählen Anästhesie- und Beatmungsgerätschaften, Endoskope und Thermometer. Nachfolgende hochpotente Mittel sind hierzu geeignet: Aldehyde, Wasserstoffperoxid, Peressigsäure und Chlorverbindungen. Zum Abspülen der Desinfektionsmittelreste sollte

nur steriles Wasser benutzt werden, damit es nicht zu einer Rekontamination durch atypische Mykobakterien, Legionellen, Pseudomonas u.a. kommt. Nicht kritische Objekte. Diese kommen nur mit intakter Haut in Kontakt, die eine effektive Barriere gegen die meisten Mikroorganismen bildet. Hierzu zählen Bettpfannen, Urinflaschen, Gehhilfen, Blutdruckmanschetten, Bettwäsche, Geschirr, Krankenzimmermobiliar und Fußboden. Aufgrund des geringen Übertragungsrisikos genügt hier in der Regel eine gründliche Reinigung oder Desinfektion (letztere insbesondere bei multiresistenten Mikroorganismen) mit weniger breit wirksamen Desinfektionsmitteln. Abb. 2.3 gibt eine Übersicht über verschiedene Dekontaminationsverfahren.

2.2.3 Desinfektion Definition

Ziel der Desinfektion ist es, die Zahl an Infektionserregern auf einer Fläche oder einem Gegenstand soweit zu reduzieren, daß eine Übertragung von Infektionserregern im Sinne einer Infektion nicht mehr möglich ist. Die Desinfektion führt zur Abtötung oder Inaktivierung der meisten bzw. aller pathogenen Mikroorganismen mit Ausnahme der Bakteriensporen.

Ein Desinfektionsverfahren muß eine Reduktion der Keimzahl um 5 logm-Stufen, entsprechend um 99,999%, bewirken. Vergleichsweise führt eine Reinigung nur zu einer Reduktion um 2-3 log,o-Stufen. Das RoßERT-KocH-Institut/Berlin (RK1) gibt hierzu 4 Wirkungsbereiche an:

Abb. 2.3 Wirksamkeit von Dekontaminationsverfahren.

2.2 Umgang mit infektiösem Material

A: Zur Abtötung von vegetativen bakteriellen Keimen einschließlich Mykobakterien sowie von Pilzen einschließlich ihrer Sporen geeignet. B: Zur Inaktivierung von Viren geeignet. C: Zur Abtötung von Sporen des Erregers des Milzbrandes geeignet. D: Zur Abtötung von Sporen der Erreger von Gasödem und Wundstarrkrampf geeignet (hierzu müssen Sterilisationsverfahren angewendet werden).

Die Liste der DGHM (Liste der nach den Richtlinien für die Prüfung chemischer Desinfektionsmittel geprüften und von der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie als wirksam befundenen Desinfektionsverfahren, mhp-Verlag/Wiesbaden) ist eine Liste über Desinfektionsmittelpräparate unter Angabe von Wirksubstanz, Hersteller, Einsatzbereich, Konzentrations- und Einwirkungszeit. Sie dient der Auswahl für die routinemäßige und prophylaktische Desinfektion, insbesondere zur Verhütung von Infektionen im Krankenhaus und in der ärztlichen/zahnärztlichen Praxis. Die Liste des RoBERT-KocH-Institutes führt die vom RKI geprüften und anerkannten Mittel und Verfahren für Entseuchung gemäß § 18 SeuchRNeuG auf. Hier werden neben Präparatenamen auch Gerätschaften mit Temperatur und Einwirkungszeit aufgelistet. Entseuchungen sind behördlich durch den Amtsarzt angeordnete Desinfektionsmaßnahmen bei meldepflichtigen Infektionserkrankungen oder bei nicht nur vereinzeltem Auftreten von ansteckungsfähigen Erkrankungen. Die RKI-Liste wird in der jeweils gültigen Neufassung im Bundesgesundheitsblatt veröffentlicht. Aufgrund der Auflistung spezieller Präparate, höherer Konzentrationen und Einwirkungszeiten sollte auf die Liste wirklich nur im Seuchenfall zurückgegriffen werden. Für den Lebensmittelbereich existiert die Desinfektionsmittelliste der Deutschen veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG) zur Desinfektion von Flächen und die Liste der DGHM für die Händedekontamination, einer kombinierten Desinfektion und Waschung der Hände, die in der Wirksamkeit zwischen Reinigung und Desinfektion steht. Verfahren Thermische Desinfektion

Verbrennen (Wirkungsbereich ABC), Ausglühen, Ab flammen, Erhitzen in Wasser, Dampfdes-

infektionsverfahren und die Desinfektion in vollautomatischen Reinigungs- und Desinfektionsmaschinen. Ausglühen und Abdämmen finden praktisch als nichtstandardisierbare Verfahren ausschließlich in Laboratorien Anwendung. Das RKI gibt für das Kochen mit Wasser bei einer Mindcsteinwirkungszeit von 3 min den Wirkungsbereich AB, bei 15 min ABC an. Das Dampfdesinfektionsverfahren kommt bei gegenüber Feuchtigkeit empfindlichen Materialien - z.B. Bettdecken, Bettkissen und Matratzen - zur Anwendung. Verfahren der Wahl ist das sogenannte VDV-Verfahren (fraktioniertes Vakuumverfahren); für Wirkungsbereich AB außer Virushepatitis werden 75 °C/20 min angewendet, für Wirkungsbereich ABC 105 °C/ 5 min. Vollautomatische Reinigungs- und Desinfektionsautomaten arbeiten thermisch mit 93 °C und einer Einwirkungszeit von 10 min (Wirkungsbereich AB). Neuere Geräte verfügen zur Verbesserung der Reinigungsleistung über ein Vorspülprogramm mit < 45 °C. Sie werden für die adäquate Reinigung und Desinfektion von chirurgischem Instrumentarium, Anästhesie- sowie Intensivgerätschaften aus Personal- wie Patientenschutzgründen eingesetzt. Für die thermische Wäschedesinfektion und -reinigung gibt das RKI 85 °C/15 min Einwirkungszeit bzw. 90 °C/10 min (Wirkungsbereich AB) an. Die Desinfektion von Steckbecken und Urinflaschen erfolgt vorzugsweise in sogenannten thermischen Steckbeckenspülen, die nach einer Reinigungsphase von einigen Minuten mittels Dampf oder Heißwasser mit 90-95 °C/l-2 min desinfizieren. Chemothermische Desinfektion

In den Waschmaschinen kann bei thermolabilen Materialien auch eine chemothermische Desinfektion durchgeführt werden. Laut RKI-Liste sollten hier vorwiegend Temperaturen von 60-70 °C in Kombination mit Perverbindungen oder aktivem Chlor als Wirkstoff bei Einwirkungszeiten zwischen 10-20 min für den Wirkungsbereich AB eingesetzt werden. Mit Ausnahme des Seuchenfalles kann eine chemothermische Desinfektion von Utensilien in vollautomatischen Reinigungs- und Desinfektionsmaschinen mit speziellen maschinenkompatiblen Instrumentendesinfektionsmitteln durchgeführt werden (z.B. für OP-Schuhe oder andere thermolabile Materialien).

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Mikrobiologische Diagnostik

Die Sprühdesinfektion ist nur punktuell, besitzt keine mechanische Reinigungskomponente, führt zu erhöhter Raumluftbelastung mit Desinfektionsmittel und sollte beispielsweise nur bei unzugänglichen Flächen zur Anwendung kommen. Da eine Unterdosierung der häufigste Fehler in der Desinfektionspraxis ist (sogenannte „Schuß"Methode), ist auf die exakte Dosierung von Desinfektionsmitteln zu achten; bei den empfohlenen Angaben handelt es sich um Mindestkonzentrationen und -Einwirkungszeiten.

Chemische Verfahren

Desinfektionsmitte] (Tab. 2.3) reagieren nicht nur mit Mikroorganismen, sondern auch mit Begleitmaterialien wie organischen Substanzen. Halogene, Schwermetalle und Oxidationsmittel werden durch organische Substanzen, Formaldehyd durch Ammoniak inaktiviert (sog. Eiweißfehler), quaternäre Ammoniumverbindungen durch anionische Seifen vollständig neutralisiert (sog. Seifenfehler). Dies bedeutet, daß eine sorgfältige Vorreinigung unerläßliche Voraussetzung für einen adäquaten Desinfektionserfolg ist. Ein Zumischen von Reinigungszusätzen - es sei denn durch den Hersteller werden kompatible Präparate angegeben - ist unbedingt zu vermeiden.

Alkohole Es kommen Ethanol (77-80%), Isopropanol (60-70%) und n-Propanol (42-60%) zum Einsatz. Höhere Konzentrationen sind infolge starker Entwässerungen der Bakterien weniger wirksam. Ihre Vorteile sind: schnelle Wirkung,

Grundsätzlich ist der Scheuer-Wisch-Desinfektion gegenüber der Sprühdesinfektion der Vorzug zu geben.

Tab. 2.3 Übersicht über Desinfektionsmittelgruppen und deren Wirksamkeit auf verschiedene Bakterien, Pilze, Viren und Bakteriensporen (modifiziert nach R UTALA 1997, DASCHNER 1997) Wirkstoffgruppe

Effektivität Bakterien

Pilze

behüllte Viren

Alkohole

unbehüllte Viren

Mycobacterium tuberculosis

Bakteriensporen

mittel

+

+

+

(+)

+

-

hoch hoch mittel

+ + +

-t-

+

+ +

+

+ +

(+) (+)

+

+ + -

hoch mittel

+ (+)

+

+

+

+

(+)

+ (+)

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+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

(+) (+)

+

+

+

+

+

(+)

Aldehyde Formaldehyd Glutaraldehyd Glyoxal Halogene Chlor

Jod

+

Peroxidverbindungen Ozon Peressigsäure Wasserstoffperoxid

hoch

Phenole

niedrig

+

(+)

+

-

+

-

hoch

+

+

+

(+)

+

-

niedrig

(+)

(+)

+

-

-

-

niedrig niedrig mittel

(+) (+) +

(+)

+ (+) +

-

(+)

(+) +

-

Oberflächenaktive Verbindungen Glucoprotamin quaternäre Verbindungen amphotere Verbindungen Chlorhexidin Octenisept

+: Wirksamkeit; (+): eingeschränkte Wirksamkeit-: keine Wirksamkeit

,

-

2.2 Umgang mit infektiösem Material

gutes Eindringvermögen, gute Verträglichkeit, schnelle Trocknung. Anwendungsgebiete sind: Händedesinfektion (hygienisch und chirurgisch), Hautdesinfektion, Wunddesinfektion, Flächendesinfektion (cave: Brennbarkeit und Explosionsgefahr wegen starker Flüchtigkeit bei großflächiger Anwendung).

längerfristige Besiedlung mit ortsfremden Bakterien. Für jede Maßnahme, bei der eine mikrobielle Kontamination der Hände zu erwarten ist, soll der Grundsatz gelten „Hände sauberhalten", denn das ist einfacher, als die Hände wieder effektiv zu reinigen.

Das Wirkungsspektrum umfaßt:

• Bakterien (vegetative Formen; bei Tuberkelbakterien längere Einwirkungszeit und höhere Desinfektionsmittelmenge erforderlich) • Pilze und deren Sporen • Viren (bei unbehüllten Viren und Hepatitis-BViren längere Einwirkungszeit und höhere Desinfektionsmittelmenge erforderlich)

Wegen der fehlenden Sporizidie müssen für die Hautdesinfektion geschlossene Gebinde („Sprühflaschen") bzw. präoperativ sterile sporenfreie Lösungen verwendet werden, weil sonst die Möglichkeit der Übertragung von Gasbrandund Tetanus-Sporen besteht. Ethylalkohol hat die beste Gewebeverträglichkeit und ist der potenteste viruzide Alkohol, der auch unbehüllte Viren wie Polio-, ECHO-, Coxsackie- und Rotavircn erfaßt. Die RKI-Liste gibt für die meisten Alkohole nur den Wirkungsbereich A an. Bei der Hautdesinfektion beträgt die Mindesteinwirkungszeit 15-30 sec je nach Hersteller. Das Desinfektionsmittel wird mit sterilisierten Tupfern (Tupfer, die einer Sterilisation unterzogen und geschlossen gelagert wurden, z.B. Rolle in Trommel) gleichmäßig aufgetragen. Bei der präoperativen Hautdesinfektion müssen sterile Tupfer verwendet werden; die Einwirkungszeit beträgt 5 min. Bei Lumbaipunktion, Arthroskopie werden ebenfalls sterile Tupfer verwendet, die Einwirkungszeit sollte mindestens 3 min betragen. Die Effektivität der Hautdesinfektion ist durch Studien dokumentiert, die nach Desinfektion nur noch 6-12% der Hautflora über Hauthiopsien nachwiesen. Es ist zu unterscheiden zwischen der residenten und transienten Hautflora. Die Residentflora ist die ständig vorhandene sogenannte Normalflora der Haut und umfaßt Mikrokokken, Staphylokokken, Corynebakterien und Propionibakterien; sie hat eine ungefähre Populationsdichte von 102-103/cm2. Die Transientflora ist die nur zeitweise vorhandene Flora; hierzu zählen beispielsweise Staphylococcus aureus und Enterobakterien. Verletzungen der Haut fördern die

Deshalb sollten vorzugsweise die sogenannte non-touch-Technik und die großzügige Anwendung von Einmalhandschuhen, die selbstverständlich nach jedem Patienten gewechselt werden sollten, zur Anwendung kommen. Eine Desinfektion der Handschuhe ist nicht zu befürworten, da in Studien nachgewiesen wurde, daß hier die Entfernung von Mikroorganismen weniger effektiv ist und nicht selten auftretende Leckagen in den Handschuhen darüber hinaus eine Händedesinfektion nach Ablegen der Handschuhe erforderlich machen. Die Händedesinfektion ist 400-800 mal effektiver bezüglich der Reduktion der Hautflora im Vergleich zum einminütigen Waschen der Hände mit Seife; der Effekt der Händedesinfektion kann auch nicht durch Verlängerung der Waschphase erreicht werden. Darüber hinaus führt das Händewaschen nicht zur Abtötung der Mikroorganismen, so daß die Gefahr der Keimverbreitung über Waschutensilien und Waschbecken besteht. Zur Verbesserung der Hautverträglichkeit bei der Händedesinfektion enthalten die Präparate in der Regel rückfettende Substanzen; zur Erzielung eines Remanenzeffektes (Verlängerung der Wirkung, insbesondere bei der chirurgischen Händedesinfektion erwünscht) finden sich Zusätze wie Chlorhexidin. Bei Unverträglichkeitsreaktionen sollte das Präparat gewechselt werden; selbst Präparate mit den gleichen Wirksubstanzen können aufgrund verschiedener Zusätze eine unterschiedliche Hautverträglichkeit zeigen. Bei der hygienischen Händedesinfektion wird zunächst mindestens 30 sec (je nach Präparat) desinfiziert, hierbei werden mindestens 3 ml Händedesinfektionsmittel (3 Hübe aus Wandspender) gleichmäßig in beide Hände unter besonderer Beachtung der Fingerkuppen und Nagelfalze eingerieben, bis die Hände trocken sind. Gegebenenfalls werden die Hände anschließend gewaschen. Bei starker Kontamination werden die Hände zunächst vorsichtig abgespült, mit Desinfektionsmittel-getränkten Einmaltüchern grob vorgereinigt, danach gewaschen und zum

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Mikrobiologische Diagnostik

Schluß desinfiziert. Die Reihenfolge soll einer Verbreitung von Infektionserregern vorbeugen. Die hygienische Händedesinfektion führt zur Entfernung der transienten Hautflora und zu einer Keimzahlreduktion um bis zu 5 logm-Stufen. Bei der chirurgischen Händedesinfektion werden zunächst die Hände und Unterarme bis zum Ellbogenniveau gewaschen (3 min; zuletzt nur noch die Hände; cave: Hände hochhalten, um ein Zurückfließen von Wasser und Seife zu vermeiden). Nach sorgfältigem Abwaschen und Abtrocknen mit sterilisierten Handtüchern (cave: Verdünnungseffekt durch Wasser, Seifenfehler) werden je nach Präparat die Hände und Unterarme 3-5 min desinfiziert; dabei soll die Haut über die gesamte Einwirkungszeit mit Alkohol völlig benetzt sein. Auch hier werden zum Schluß nur noch die Hände eingerieben. Die adäquat durchgeführte chirurgische Händedesinfektion führt zur Beseitigung der transienten und deutlichen Reduktion der residenten Hautflora. Aldehyde Zur Anwendung kommen vorwiegend Formaldehyd und Glutaraldehyd. Ihre Vorteile sind: breites Wirkungsspektrum, gute Materialverträglichkeit und geringer Eiweißfehler (insbesondere Glutaraldehyd). Anwendungsbereiche sind: Instrumentendesinfektion, Flächendesinfektion. Das Wirkungsspektrum umfaßt: • Bakterien einschließlich einem Teil der Sporen; Tuberkelbakterien • Pilze und deren Sporen • Viren (behüllte und unbehüllte)

Formaldehyd ist im Vergleich zu Glutaraldehyd langsamer gegen Sporen wirksam. Nachteilig sind die Schleimhautirritation, der stechende Geruch und das allergisierende Potential. Die sorgfältige Abspülung nach Desinfektion zwecks Entfernung von Desinfektionsmittelresten ist besonders wichtig (Glutaraldehydproktitis nach Endoskopie, Keratopathie über Tonometer). Die Desinfektion mit Aldehyden sollte nur in gut belüfteten Räumen bzw. in abgedeckten Desinfektionsmittelwannen erfolgen. Beim Umgang mit Desinfektionslösungen sind langschaftige Gummihandschuhe zu tragen. Die Raumdesinfektion mittels Verdampfung oder Verneblung von verdünnten FormaldehydLösungen mittels spezieller Apparate sollte nur noch in Ausnahmesituationen (seltene konta-

giöse, aerogen übertragene Krankheiten, wie z.B. virusbedingtes hämorrhagisches Fieber) zur Anwendung kommen. Oxidationsmitlel Ozon. Ozon wird bei der Desinfektion von Trink- und Badewasser angewendet. Da es in der notwendigen Konzentration toxisch ist, wird es nach der Desinfektion wieder aus dem Wasser entfernt. Peressigsäure. Vorteile sind: breites Wirkungsspektrum, unschädliche Desinfektionsmittelrückstände, geringer Eiweißfehler. Das Wirkungsspektrum umfaßt: • Bakterien und deren Sporen; Tuberkelbakterien • Pilze und deren Sporen • Viren (behüllte und unbehüllte)

Nachteilig ist die Korrosion von Metallen; dieser Effekt kann jedoch reduziert werden durch Zusätze und pH-Modifikationen. Die gebrauchsfertige Lösung ist instabil. Anwendungsgebiete sind: Wäschedesinfektion. Instrumentendesinfektion in Verbindung mit korrosionshemmenden Substanzen. Wasserstoffperoxid. Anwendungskonzentrationen sind 3-6%. Das Wirkungsspektrum umfaßt: ƒ Bakterien einschließlich Tuberkelbakterien und ein Teil der Sporen ƒ Pilze und deren Sporen ƒ Viren (behüllte und unbehüllte)

Anwendungsbereiche sind: Wunddesinfektion, Mundspülungen, Instrumentendesinfektion (z.B. Tonometer, weiche Kontaktlinsen). Halogene Jod. Zum Einsatz kommen sogenannte Jodophore, d.h. Kombinationen aus Jod mit einem löslichen Carrier-Molekül (z. B. Polyvinylpyrrolidon), die nur geringe Mengen freien Jodes freisetzen, infolge dessen geringe toxische, allergisierende, reizende und färbende Nebenwirkungen zeigen. Das Wirkungsspektrum umfaßt: ƒ Bakterien (gramnegative Bakterien zum Teil nicht; Mykobakterien eingeschränkt) ƒ Viren (behüllte und bedingt unbehüllte) ƒ eingeschränkt Pilze sowie Sporen (unter verlängerter Einwirkungszeit, höherer Konzentration)

2.2 Umgang mit infektiösem Material

Anwendungsbereiche sind: Schlcimhautdcsinfektion, Hautdesinfektion. In der Schwangerschaft, bei Neugeborenen und Säuglingen (transienle Hypothyreose) und Schilddrüsenerkrankungen (Hyperthyreose) sowie vor Untersuchungen und Therapien mit radioaktivem Jod sollen Jodpräparate nicht eingesetzt werden. Chlor. Beispielsweise kommen Natriumhypochlorit (Chlorbleichlauge), Kalziumhypochlorit (Chlorkalk), Chloramin und Chlorgas sowie Chlordioxid zur Anwendung. Ihre Vorteile sind: breites Wirkungsspektrum, schnelle Wirkung; Nachwirkung beispielsweise noch im Wasscrleitungsnetz, Preisgünstigkeit. Das Wirkungsspektrum umfaßt: einschließlich Tuberkelbakterien und ein Teil der Sporen • Pilze und deren Sporen • Viren (behüllte und unbebüllte)

• Bakterien

Anwendungsbereiche sind: Desinfektion von Trink- und Badewasser, Desinfektion von Hydrotherapie-Gerätschaften, Flächendesinfektion (z.B. Fußboden, Tonometerköpfe), Desinfektion von Ausscheidungen (Chlorkalk), Händedesinfektion (nur in Ausnahmefällen wegen guter Viruzidie, aber schlechter Hautverträglichkeit). Nachteilig ist ihre starke Korrosivität sowie ihre relative Instabilität. Die Reaktion mit organischen Stoffen führt zur sogenannten Chlorzehrung, bedingt aber auch die Bildung von toxischen oder krebserzeugenden Substanzen (sog. Trihalogenmethane). Wegen der Persistenz im Abwasser werden chlorhaltige Desinfektionsmittel zur Wäschedesinfektion nicht mehr eingesetzt. Oberflächenaktive Verbindungen (Tenside) Vertreter dieser Gruppe sind nichtionische, anionische, kationische (z.B. quaternäre Ammoniumsalze, Fettamine, Octenidinhydrochlorid, Biguanide), amphotere Tenside. Desinfizierende Wirksamkeit ist bei den nichtionischen und anionischen Verbindungen (handelsübliche Seifen und Haushaltswaschmittcl) allerdings so gut wie nicht vorhanden. Vorteilig ist ihre gute Reinigungswirkung, relativ gute Hautverträglichkeit sowie geringe Geruchsbelästigung und Toxizität. Nachteilig ist ihre Wirkstofflücke gegenüber gramnegativen Bakterien, Mykobakterien und unbehüllten Viren.

Biguanide. Chlorhexidin findet überwiegend als Zusatz zu anderen Desinfektionsmitteln (Remanenz) oder als Schleimhautdesinfektionsmittel Verwendung, weil es nur zu einer Keimzahlreduktion von 2 Logarithmusstufen führt. Octenidinhydrochlorid (Octenisept®). Octenisept® ist eine kationenaktive Verbindung, die etwa lOfach wirksamer ist als Chlorhexidin, ohne Wirkungslücken im gramnegativen Bereich, mit antiviraler Wirksamkeit überwiegend gegen behüllte Viren, aber auch Hepatitis-B-Viren. Es wird vorwiegend zur Schleimhautdesinfektion eingesetzt. Quaternäre Ammoniumverbindungen. Hierzu zählt u. a. Benzylammoniumchlorid. Nachteilig ist ihr begrenztes Wirkungsspektrum. Beispielsweise wurde Wachstum von gramnegativen Bakterien in ihnen wie auch in Phenol nachgewiesen. Darüber hinaus besitzen sie einen großen Eiweiß- und Seifenfehler; Zusatz von Reinigungsmitteln oder hartes Wasser führen zu einer starken Reduktion ihrer Desinfektionswirkung. Das Wirkungsspektrum umfaßt: • Bakterien (bedingt nur gram-negative Bakterien, keine Tuberkelbakterien und keine Sporen) • Pilze und deren Sporen • Viren (nur behüllte)

Anwendungsbereich: Desinfektion nichtkritischer Flächen, insbesondere im Küchenbereich. Glucoprotamin. Es handelt sich um ein Alkylamin bzw. Fettamin, ein Reaktionsprodukt aus der Aminosäure Glutaminsäure und Cocospropylen-l,3-diamin. Das Wirkungsspektrum kommt dem der Aldehyde nahe (Bakterien einschließlich Tuberkelbakterien, Pilze und teilweise Viren). Amphotere Tenside. Wirkungslücken bestehen gegenüber gram-negativen Bakterien, Mykobakterien und unbehüllten Viren. Vorteilhaft ist ihr geringer Eiweißfehler und ihre geringe Humantoxizität, weswegen sie vorrangig in der Lebensmittelindustrie verwendet werden. Phenole Nachteilig ist die Aufnahme der Phenole durch poröse Materialien, was trotz gründlicher Nachspülung zu Gewebeirritationen führen kann. Von Vorteil ist ihr geringer Eiweißfehler, weswegen ihr Haupteinsatzgebiet die Desinfektion von Ausscheidungen ist. Ansonsten finden sie sich

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Mikrobiologische Diagnostik

überwiegend nur noch in Kombinationspräparaten mit anderen Desinfektionsmitteln. Das Wirkungsspektrum umfaßt: • Bakterien, einschließlich Tuberkelbakterien • begrenzt Pilze • Viren (nur behüllte)

Anwendungsgebiete sind: Desinfektion unkritischer Flächen, Desinfektion von Ausscheidungen. Vorsicht ist bei der Anwendung in der Pädiatrie wegen möglicher Hypcrbilirubinämien geboten. Nicht zuletzt deswegen sollten Flächen nach adäquater Einwirkungszeit sorgfältig mit Wasser abgespült werden und Gerätschaften wie Inkubatoren nicht mit Phenol desinfiziert werden. Weitere Desinfektionsgruppen Es gibt weitere Substanzen, die antimikrobielle Wirksamkeit besitzen, die aber bisher nicht oder nur begrenzt in den Bestand der Krankcnhausdesinfeklionsmittel übernommen wurden. Hierzu zählen Metalle, Ether, Aceton, Chloroform, NaOH/KOH, Säuren. Teils hat dies toxikologische Gründe (z.B. Quecksilber, Kaliumpermanganat), teils bestehen bisher zu wenig Studien und Erfahrungen mit diesen Mitteln, so daß vor ihrer breiten Anwendung Forschungsarbeit notwendig ist. Säuren sind oft materialaggressiv. Kalilauge (KOH) hat einen unsicheren keimabtötenden Effekt (u.a. Wirkungslücken im gramnegativen bakteriellen Bereich). Kalkmilch muß frisch zubereitet werden und kann zur Desinfektion von Fäkalien (lt. RKIListe Wirkungsbereich AB außer Tbc) eingesetzt werden. Hoffnungsträchtige Versuche wurden bereits unternommen, Wasser mit Silber. Kupfer oder Eisen zu desinfizieren oder intravasale Katheter weniger anfällig gegenüber der bakteriellen Besiedlung durch Inkorporation der genannten Metalle zu machen. Silbernitrat findet sich in Augentropfen zur sogenannten CKLDF.schen-Prophylaxc bei Neugeborenen. Da bereits sehr geringe Konzentrationen von Metallionen eine Wirkung entfalten können, sprich! man von oligodynttmischer Wirkung. Anwendungsbereiche der Desinfektion und praktische Anwendung

Bei der Desinfektion von Flächen ist eine Scheuer-Wisch-Desinfektion durchzuführen. Moderne Reinigungssysteme gewährleisten eine sichere Trennung von reiner Desinfektionslösung und schmutzigen Reinigungstüchern und verhindern eine Kontamination der Desinfektionslösung.

Entweder wird aus einem Reinigungsgerät Desinfektionslösung aufgetragen oder es wird stets nur ein frischer Lappen in die Desinfektionsmittellösung eingetaucht und nach Auftragen auf einen bestimmten Bereich (z.B. ein Raum) durch einen frischen ersetzt. Dies dient der Verhinderung der Keimverschleppung über die kontaminierte Desinfektionslösung. Für jeden Pflegebereich (z.B. Patientenzimmer, reiner Pflegedienst, Sanitär) wird ein gesonderter Eimer mit Desinfektionslösung und Tuch, jeweils farblich gekennzeichnet, eingesetzt. Die genannten Verfahren sind der 2-Eimer-Methode überlegen. Die Wisch- und Reinigungsutensilien sind anschließend durch thermische Waschverfahren zu desinfizieren und trocken zu lagern. Überwiegend kommen die 4-Slunden- und 1-Stunden-Werte (letztere insbesondere in Risikobereichen, wie z.B. Intensiv, OP) der Desinfektionsmittel zur Anwendung. Die Instrumentendesinfektion erfolgt bevorzugt thermisch in Desinfektionsmaschinen. Sollte eine manuelle Aufbereitung erforderlich sein, ist darauf zu achten, daß die Instrumente vollständig zerlegt sowie luftblasenfrei eingelegt werden und komplett mit Desinfektionslösung bedeckt bzw. gefüllt sind. Insbesondere bei starker Verschmutzung und englumigen Instrumenten (z.B. Endoskopen) ist zusätzlich eine mechanisch unterstützende Reinigung z.B. durch Bürsten erforderlich. Die Desinfektionsmittclwannen sind zur Vermeidung erhöhter Luftkonzentrationen von Desinfektionsmittel dicht abzudecken. Es sind langschaftige Handschuhe zu tragen. Resistenz gegenüber Desinfektionsmitteln

In der Praxis werden viel höhere Konzentrationen angewendet als die minimale Hemmkonzentration bestimmter Desinfektionsmittel bei resistenteren Bakterienstämmen beträgt, so daß im Desinfektionsmittclbereich bei adäquater Präparateauswahl und Anwendung nicht mit Versagerquoten zu rechnen ist. Der sicherste Weg zur Vermeidung von Resistenzen ist die ausreichend hohe Dosierung, der regelmäßige Wechsel verunreinigter Lösungen und die Vermeidung der chemischen Aufbereitung von Reinigungs-/Desinfektionsutensilien (bevorzugt thermische Desinfektion).

2.2 Umgang mit infektiösem Material

2.2.4 Sterilisation Definition Die Sterilisation bewirkt die komplette Eliminierung oder Zerstörung aller Mikroorganismen einschließlich deren Sporen.

Numerisch ausgedrückt muß sie zu einer Keimzahlreduktion von mindestens 6 logm-Stufen führen. Statistisch ist mit einer Kontaminationswahrscheinlichkeit von 1:1 Mio. sterilisierter Einheiten zu rechnen. Ein für jedes Sterilisiergut geeignetes Sterilisationsverfahren gibt es nicht. So müssen für empfindliche Sterilgüter suboptimale, materialschonende Verfahren angewendet werden. Dieser unvermeidbare Kompromiß darf jedoch nicht dazu verleiten, daß aus Gründen der Wirtschaftlichkeit weniger sichere Verfahren angewendet werden. Thermische Sterilisation Dampfsterilisation

Beim Autoklavieren mittels gesättigtem, gespanntem Wasserdampf handelt es sich um das mit Abstand sicherste Verfahren. Die Verfahren zur Dampfstcrilisation unterscheiden sich durch die Art der Luftentfernung aus der Kammer. Beim Strömungsverfahren ist zu unterscheiden zwischen dem Gravitationsverfahren (der leichtere Sattdampf verdrängt die schwerere Luft nach unten aus der Kammer) und dem fraktionierten Strömungsverfahren (Verdrängung der Luft durch mehrere Stöße mit Sattdampf). Zur sichersten Entfernung von Restluft als häufigster Fehlerquelle bei der Dampfsterilisation, führt das fraktionierte Vakuumverfahren, bei dem die Kammer mehrfach im Wechsel aktiv evakuiert und mit Dampf geflutet wird. Unter der Voraussetzung, daß der Dampf völlig luftfrei ist, kann aus dem Druck auf seine Temperatur geschlossen werden und umgekehrt. Die Sterilisation erfolgt durch Kondensation des Wasserdampfes an dem kälteren Material, worüber eine Erwärmung des zu sterilisierenden Gutes erreicht wird. Textilien und andere poröse Gegenstände sind schwerer zu erwärmen als Metallwcrkstoffe. Wegen der Gefahr der Rekontamination darf Sterilgut nur in eindeutig trockenem Zustand dem Sterilisator entnommen werden. Eine langsame Abkühlung des Sterilgutes vermeidet Kondenswasserbildung. Die

Luftentfernung aus dem Gut wird durch seine Verpackung nachhaltig beeinflußt. So kommen beim Gravitationsverfahren nur Verpackungen in Betracht, die oben und unten für Dampf durchlässig sind, wie z.B. Behälter mit Lochung in Deckel und Boden oder Sterilisationspapier. Die DIN-Norm 58946 gibt Auskunft über spezielle Fragestellungen der Dampfsterilisation. Die Richtlinie des RoBERT-KotH-Institutcs für Krankenhaushygiene und Infektionsprävention empfiehlt zur Sterilisation mit Dampf: 120 °C bei 2 bar und eine Mindesteinwirkungszeit von 20 min; 134 "C bei 3 bar und eine Mindesteinwirkungszeit von 5 min. Die Einwirkungszeit entspricht der Zeit, die die Temperatur auf das gesamte Sterilisiergut einwirken muß und das bis ins Zentrum des Sterilisiergutes. Die Sterilisierzeit setzt sich zusammen aus der Ausgleichszeit (Zeitspanne zwischen Erreichen der Temperatur am Außenthermometer des Autoklaven und dem Erreichen der Temperatur in allen Sterilisiergütern) plus Einwirkungszeit. Sogenannte Blitzsterilisatoren (Gravilationsverfahren 132 °C, 3 min) sollten wegen des geringen Sicherheitsspielraumes und der Schwierigkeit der Validierung (Dampfsterilisations-Bioindikatoren nicht kompatibel) nur in Notfallsituationen bei unverpacktem Sterilgut zur Anwendung kommen. Heißluftsterilisation

Die Resistenz von Mikroorganismen gegen trockene Hitze ist wesentlich höher als gegen feuchte Hitze, bedingt durch die schlechtere Wärmeleitfähigkeit der Luft. Im Heißluftsterilisator treten an verschiedenen Punkten sowohl niedere als auch höhere Temperaturen auf als zum gleichen Zeitpunkt am Thermometer des Gerätes angezeigt wird. Da Heißluftsterilisatoren über eine temperaturgeregelte Heizung verfügen, kann es zu erheblichen Unsicherheiten bei diesem Sterilisierverfahren kommen. Durch entsprechende Betriebszeiten können die Temperaturdifferenzen meist ausgeglichen werden; zumindest größere Sterilisatoren (>40 1) sollten mit einer mechanischen Luftumwälzung ausgestattet sein. Bei der Beschickung ist darauf zu achten, daß die Luft ungehindert zirkulieren kann. Eine zu volle Beschickung oder eine Beladung der Kammer bei bereits laufender Sterilisation ist unbedingt zu vermeiden. Die bestehenden Möglichkeiten der Wirksamkeitsüberprüfung sind bei der Heißluftsterilisation im

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Mikrobiologische Diagnostik

Vergleich zur Dampfsterilisation begrenzt und unzuverlässiger. Deshalb wird dieses Verfahren bevorzugt im Laborbereich eingesetzt. Darüber hinaus können nur Materialien sterilisiert werden, die eine Temperatur bis 200 °C tolerieren wie z.B. Metall, Porzellane, Glas, Pulver, Öle und Fette. Seitens des RoBERT-KocH-Institutes wird folgende Empfehlung bei Betrieb von Heißluftsterilisatoren zu Einwirkzeiten in Abhängigkeit von der Temperatur gegeben:160 °C, 200 min Mindesteinwirkungszeit;180 °C, 30 min Mindestein wirkungszeit. Gassterilisation

Die Gassterilisation sollte nur zur Anwendung kommen, wenn eine thermische Sterilisation beispielsweise bei thermolabilem Material nicht möglich ist. Sterilisation mit Ethylenoxid (EO). EO liegt bei Raumtemperatur als Gas vor. Es ist giftig, brennbar, explosiv, kanzerogen und teratogen. Nach Evakuierung der Kammer des EO-Sterilisators erfolgt die Einwirkung des EO-Gases bei 50-60 °C auf das Sterilisiergut bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 40-90%. Da kleinste Schmutz-, Eiweiß- oder Salzkristallumhüllungen den Sterilisationserfolg beeinträchtigen, muß das Sterilisiergut zuvor sorgfältig gereinigt und mit destilliertem Wasser gespült werden.

Lumina müssen freien Durchgang haben und dürfen nicht durch Wassertropfen blockiert werden. Instrumente müssen, soweit möglich, zerlegt sein. Das zu sterilisierende Material muß absolut sauber und trocken sein. Vor Entnahme des Sterilisiergutes aus der Kammer ist durch Desorptionsprogramme sicherzustellen, daß die technische Richtkonzentration für EO in der Luft aus Personalschutzgründen eingehalten wird. Darüber hinaus ist zu beachten, daß unterschiedliche Materialien verschiedene Auslüftungszeiten benötigen, weil auch beim Patienten EO durch direkten Kontakt mit dem sterilisierten Gut zu gesundheitlichen Schäden führen kann. Räume, in denen Sterilgut aus Gassterilisaloren entnommen wird, müssen einen mindestens achtfachen stündlichen Luftwechsel besitzen. Der Leiter der Sterilisationsabteilung benötigt einen Befähigungsschein, der in anerkannten Lehrgängen erworben werden kann. Sterilisation mit Formaldehyd (FA). Die Formaldehydsterilisation wird bei 60-75 °C mit einer

relativen Luftfeuchtigkeit von 100% durchgeführt. Beim sogenannten Pendelverfahren wird vor der eigentlichen Einwirkungsphase ein fraktioniertes bzw. pulsierendes Vorvakuum aufgebaut, bei dem Kammerevakuierung und Einspeisung des Formaldehyd-Wasserdampfgemisches abwechseln. Hierdurch soll das Eindringen in poröses und englumiges Material erleichtert werden. Durch ein pulsierendes Nachvakuum wird die Desorption erreicht. Obgleich die FA-Sterilisalion nicht in dem Maß durch Salze beeinflußt wird wie die EO-Sterilisation, ist eine gründliche Vorreinigung und Spülung sehr wichtig. Nachteilig ist das gegenüber EO geringere Penetrationsvermögen, vorteilig die geringere Gefährdung des Personals. Niedrigtemperatur-Plasmasterilisation. Bei der Plasmasterilisation wird zunächst ein Hochvakuum in der Sterilisierkammer erzeugt, anschließend Wasserstoffperoxid injiziert, das in das zu sterilisierende Gut diffundiert. Durch Anlegung eines hochfrequenten elektromagnetischen Feldes wird die Bildung des sogenannten Plasmas (4. Aggregrationszustand) mit mikrobizid wirkenden Radikalen erzeugt. Die Sterilisation verläuft bei 37-44 °C über ca. 75 min. Vorteilig ist die Rückstandsfreiheit von toxischen Substanzen, es bleiben nur Sauerstoff und Wasser übrig. Nachteilig ist, daß Papier, Stoffe und Flüssigkeiten nicht sterilisiert werden können. Für einen festgelegten Indikationsbereich stellt die Plasmastcrilisation eine interessante Alternative zum EO- oder FA-Sterilisationsverfahren dar. Wie bei allen Sterilisationsverfahren ist auch hier eine vorhergehende gründliche Reinigung und Trocknung erforderlich. Das bisher einzige kommerziell erhältliche Gerät Sterrad* 100 der Firma JOHNSON & JOHNSON wurde 1993 in den USA durch die Food and Drug Administration zugelassen. Leistungsgrenzen bei Instrumenten mit längeren inneren Hohlräumen scheinen durch sogenannte Diffusionsverstärker und durch die Entwicklung einer neuen Geräteversion (Sterrad8 100 S) mit Verdoppelung der Wirkstoffmenge und verbesserter Diffusion mittels Druckerhöhung zu bewältigen zu sein. Als Verpackung kommt nur papierfreie spezielle Kunststoffolie in Betracht, weil Zellulose H2O2 absorbiert und somit seinen Zutritt zum Sterilgut behindert. Es sind spezielle Polypropylen- oder Edelstahlbioindikatoren mit Bacillus stearothermophilus ATCC 7953 für die Überwachung erforderlich. Lagerung von Sterilgut

Sterilgut soll bevorzugt geschützt (in Schränken, Schubladen etc.) gelagert werden, um mechani-

2.2 Umgang mit infektiösem Material sehe Belastungen sowie eine Kontamination der Verpackung durch Staub oder Feuchtigkeit zu vermeiden. In der Regel erfolgt eine ZweifachVerpackung in Klarsichtsterilisier-Verpackungsmaterial, speziellem Sterilisierpapier oder eine Verpackung in Metallcontainern mit Vliespapier und speziellen dampfdurchlässigen Filtereinsätzen bei der Dampfsterilisation. Bei der Heißluftsterilisation kann eine Verpackung in Aluminiumfolie (dreifach) oder Laborkartuschen, bei der Gassterilisation in speziellem Klarsichtsterilisier-Verpackungsmaterial stattfinden. Die Lagerung kann nach DIN 58953 in der Zweifachverpackung geschützt über 6 Monate erfolgen; bei ungeschützter Lagerung sollte das Sterilgut alsbaldig verbraucht werden (Lagerung in der Zweifach Verpackung 6 Wochen, Einfach Verpackung 24 h). Industriell gefertigte Produkte haben in wiederverschließbaren Sterilgut-Lagerverpackungen vom Hersteller angegebene Verfallsdaten.

2.2.5 Überprüfung der Desinfektion und Sterilisation Die regelmäßige Kontrolle von Desinfektionsbzw. Sterilisationsgeräten ist eine wichtige Maßnahme im Sinne der Qualitätssicherung. Es ist zu unterscheiden zwischen dem biologischen (sogenannte Bioindikatoren), chemischen und physikalischen Monitoring (z.B. Zeit, Temperatur, Druck). Bioindikatoren sind spezielle Aufbereitungen von Testorganismen, die den Desinfektions- bzw. Sterilisationsverfahren unterzogen werden und die bei einwandfreier Funktion eine bestimmte Keimzahlreduktion erfahren bzw. nicht mehr anzüchtbar sind. Sie dienen dem Nachweis der korrekten Funktion von Desinfektions- und Sterilisationsgeräten unter Praxisbedingungen. Der Überprüfung von Desinfektionsmaschinen (z.B. Instrumenten-, Anästhesie-, Steckbecken- und Waschmaschinen) dient als Bioindikator Enterococcus faecium ATCC 6057 (siehe DIN Norm 58949). Autoklaven werden nach DIN überprüft mit Bacillus stearothermophilus ATCC 7953, Heißluftsterilisatoren mit B. sublilis ATCC 9372 nach DIN 58947, Formaldehydsterilisatoren mit B. stearothermophilus ATCC 7953 und Ethylenoxidsterilisatoren mittels B. subtilis ATCC 9372. Weitere Angaben zur Validierung der Sterilisation finden sich in den europäischen DIN EN-Normen. Die Überprüfung sollte in der Regel routinemäßig mindestens lA-jährlich erfolgen bzw. abhängig von der Chargen-Zahl. Die CDC empfehlen die Überprüfung mittels Bioindikatoren bei Sterilisatoren sogarwöchentlich und bei Implantaten je Charge.

Darüber hinaus sollten sogenannte Chemoindikatoren bei jeder Charge mitgeführt werden, die anzeigen, ob die Charge einer Sterilisation unterzogen wurde (sogenannte Behandlungsindikatoren) und Chemoindikatoren, die aufgrund des Farbumschlages eine chargenbezogene orientierende Aussage zur Effektivität der Sterilisation ermöglichen. Für jedes Sterilisiergerät besteht eine chargenbezogene Dokumentationspflicht über Chemo-, Bioindikatoren sowie physikalische Parameter. Außerdem ist arbeitstäglich vor Beginn der Sterilisation bei Autoklaven eine sogenannte Leercharge zur Überprüfung des ordnungsgemäßen Programmablaufes zu fahren, ein Vakuumtest sowie ein BOWIE-DICKTest (Dampfdurchdringungs- oder Entlüftungstest mittels spezieller Indikatorbögen) durchzuführen. Selbstverständlich ist die korrekte Beschriftung des Sterilgutes mit Sterilisations- und Verfallsdatum, Gerätebezeichnung. ChargenNummer und Inhaltsangabe. Das System der subtilen engmaschigen Überprüfung, insbesondere bei der Sterilisation, gewährleistet, daß nahezu jeder Sterilisationsfehler rechtzeitig erkannt wird und Chargen nicht ausgeliefert oder zurückgezogen werden können.

2.2.6 Desinfektion und Sterilisation beim CREUTZFELDT-JAKOB(CJ)Erreger Prionen (infektiöse Eiweiße) als Erreger der CJ-Erkrankung, zeichnen sich durch eine besondere Resistenz gegen Desinfektions- und Sterilisationsmaßnahmen aus. Infolgedessen sollten bevorzugt Einmalmaterialien bei Patienten mit CREUTZFELDT-JAKOB-Erkrankung - insbesondere bei Eingriffen an Gehirn, Rückenmark oder Auge - verwendet werden. Das RKI gab nachfolgende Empfehlungen. Zur effektiven Sterilisation ist Autoklavieren bei 134 °C über 1 h erforderlich. Zuvor ist bei Instrumenten nach Eingriffen außerhalb von ZNS und Auge eine Desinfektion mit 1-2 M NaOH oder 2,5-5% Natriumhypochlorit für 1 h mit mechanischer Zwischenreinigung und anschließendem Aufbereitungszyklus in einem Desinfektions- und Reinigungsapparat bei 93 °C durchzuführen. Nach neurochirurgischen Eingriffen ist vor der Dampfsterilisation eine Desinfektion mit 1-2 M NaOH oder 2,5-5% Natriumhypochlorit über 24 h durchzuführen. Oberflächen, die mit Liquor kontaminiert wurden, sollten mit 2,5% Natriumhypochlorit oder

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Mikrobiologische Diagnostik

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1-2 M NaOH 1 h desinfiziert werden. Abfälle, die mit erregerhaltigem Material kontaminiert sein können, sind als Abfall der Gruppe C (sog. infektiöser Abfall) durch Verbrennen zu entsorgen. Schnitt- und Stichverletzungen bei der Liquor-Entnahme oder bei der Probenentnahme und Weiterverarbeitung von Material außerhalb von ZNS/Auge sollten nach ausgiebigem Spülen mit Wasser mittels 2,5% Natriumhypochlorit für 5 min desinfiziert und anschließend erneut mit Wasser gewaschen werden. Nach Verletzung an Instrumenten/Material, die mit Hirn, Rückenmark oder Augengewebe in Berührung gekommen sind, sollte nach intensivem Spülen mit Wasser die Wunde mit 2,5% Natriumhypochlorit für 5 min desinfiziert, danach exzidiert und chirurgisch versorgt werden. Nach Spritzern von potentiell mit CREUTZFELDT-JAKOB-Erregern kontaminiertem Material ins Auge oder auf Schleimhäute sollte unverzüglich ausgiebig mit Wasser gespült werden. Nach Kontamination der unverletzten Haut mit Geweben hoher Infektiosität sollte eine Desinfektion mit 1 M NaOH bzw. 2,5% Natriumhypochlorit-Lösung für 5 min mit nachfolgendem Abwaschen mit Wasser erfolgen. Ansonsten genügt das gründliche Abwaschen mit Seife. Die Natriumhypochlorit-Lösung ist max. 4 Wochen in einer geschlossenen Plastikflasche aufzubewahren.

2.2.7 Schlußbemerkung Grundsätzlich gelten Blut/Sekrete von allen Patienten als potentiell infektiös, so daß alle benutzten Instrumente/Gerätschaften aus Personal- wie Patientenschutzgründen vorsichtig und sorgfältig gehandhabt und wiederaufbereitet bzw. entsorgt werden sollen. Desinfektionsund Sterilisationsmaßnahmen können bei korrekter Anwendung die sichere Nutzung von invasiven und nichtinvasiven medizinischen Utensilien garantieren. Dies setzt die strikte Einhaltung der Arbeitsanleitung, die in Hygiene- und Desinfektionsplänen schriftlich fixiert sein sollten, sowie die regelmäßige fachgerechte Schulung des medizinischen Personals voraus. Literatur Desinfektionsmittelliste der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM).mhp-Verlag, Wiesbaden 2000.

Desinfektionsmittelliste der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG) für den Lebensmittelbereich. Schlüter'sche GmbH. Hannover 2/1999 und 10/2000. DKTTENKOKER, M. und F. DASCHNER: Umweltschonende Sterilisation und Desinfektion In: Praktische Krankenhaushygiene und Umweltschutz (Hrsg.: F. DASCHNHR), Springer, Berlin 1997. Liste der vom RoBERT-KoCH-Institut geprüften und anerkannten Desinfektionsmittel und -verfahren. Bundesgesundheitsbl. 9. 1997. Richtlinie für Krankenhaushygiene und Infektionsprävention des RoBERT-Koc'H-Institutes. Fischer, Stuttgart 2000. RUTALA, W. A.: Disinfection. Sterilisation and waste disposal. In: Prevention and control of nosocomial infections. (Ed. R. P. WENZEL), Williams & Wilkins. Baltimore 1997.

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren KLAUS PETER SCHAAL, JOACHIM KÜHN

Die mikrobiologische Diagnostik, d.h. die Diagnostik von Infektionskrankheiten mittels mikrobiologischer, serologischer und molekularbiologischer Untersuchungsverfahren, ist ihrem Wesen nach immer ätiologisch ausgerichtet; sie versucht also, die Ursache einzelner Infektionsprozesse durch den Nachweis der jeweils verantwortlichen Erregerart(en) individuell aufzuklären. Dazu bedient sie sich traditionell mikroskopischer und kultureller Techniken, denen Proben des entzündeten oder nekrotischen Gewebes oder Körperflüssigkeiten, Ex- und Sekrete unterworfen werden und mit denen die Anwesenheit pathogener Mikroorganismen am unmittelbarsten belegt oder ausgeschlossen werden kann. Zuweilen gelingt die ätiologische Abklärung einer Infektionskrankheit aber zuverlässiger und gegebenenfalls schneller durch die gezielte biochemische oder serologische Suche nach typischen Stoffwechsel- (z.B. Exotoxinen. niederen Fettsäuren) oder Zerfallsprodukten (z.B. Kapselantigenen) der verdächtigen Erreger, durch den Nachweis erregerspezifischer Nukleinsäuren oder durch den diagnostischen Tierversuch. Angezüchtete Mikroben, die nicht a priori als Kontaminanten oder Vertreter der physiologischen Körperoberflächenflora erkennbar sind, bedürfen grundsätzlich der anschließenden genauen Identifizierung (Tab. 2.4)

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

Tab. 2.4 Identifizierung von Bakterien Merkmale (Auswahl)

Nachweisverfahren (Auswahl)

Zellmorphologie Zellform und -lagerung Färbeverhalten Kapselbildung Sporenbildung, -Form, -Position Beweglichkeit Begeißelung

Nativpräparat, Phasenkontrast- oder Dunkelfeldmikroskopie verschiedene Färbungen, Hellfeldmikroskopie Tuschepräparat Einfachfärbung oder Sporenfärbung „Hängender Tropfen" 1 Geißelfärbung oder EM

Kulturmorphologie Kolonieform Wachstum in flüssigen Medien

Lupenbetrachtung, Stereoauflichtmikroskopie makroskopische Betrachtung

Molekularbiologische Merkmale

DNA-Sonden, rRNA-Sonden mit und ohne PCR

Chemotaxonomische Merkmale Peptidoglykan-Bausteine Lipide

DC , CLC DC, CLC

Physiologische Eigenschaften enzymatische Leistungen Assimilationsvermögen Stoffwechselendprodukte

„Bunte Reihe", miniaturisierte Identifizierungssysteme Auxanogramm 5 GLC, HPLC

Antigen Struktur

verschiedene serologische Verfahren

Toxinbildung

Toxin-Antitoxin-Tierversuch, Gewebekulturtests, serologische Nachweisverfahren

Pathogenität/Virulenz

Tierversuch, evtl. Gensonden

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2

3

4

Elektronenmikroskopie;2 Polymerase-Ketten-Reaktion; 3 Dünnschichtchromatographie;" Gaschromatographie; Hochdruckflüssigkeitschromatographie

und, in Abhängigkeit von der Natur des Erregers, der Empfindlichkeitsprüfung gegenüber geeigneten antimikrobiellen Chemotherapeutika. Aufgabe dieses Kapitels ist es nicht, detaillierte Kenntnisse mikrobiologischer Untersuchungsverfahren zu vermitteln, wie sie erst im Rahmen der Weiterbildung zum Facharzt für Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie erworben werden müssen. Die folgenden Ausführungen sollen vielmehr Verständnis für die Möglichkeiten und Grenzen der mikrobiologischen Diagnostik wecken. Sie sollen dem nicht mikrobiologisch tätigen (angehenden) Arzt soviel an Basiswissen an die Hand geben, daß er in die Lage versetzt wird, geeignete Untersuchungsmaterialien auszuwählen und technisch einwandfrei zu gewinnen, mikrobiologische Befunde sachgerecht zu bewerten und - am besten im Dialog mit dem Mikrobiologen - das optimale therapeutische Vorgehen festzulegen und eventuell geeignete Maßnahmen zur Ausbreitungskontrolle einzuleiten.

2.3.1 Mikrobiologische Untersuchungsverfahren Untersuchungsdauer

Die im mikrobiologischen Laboratorium eingetroffene Materialprobe muß oft mehrere verschiedene Arbeitsgänge durchlaufen, bevor eine endgültige und fachgerechte Beurteilung abgegeben werden kann. Dies ist an sich schon ein zeitfordernder Prozeß. Darüber hinaus haben aber insbesondere Erregerkultur und Tierversuch auch einen eigenen, charakteristischen Zeitbedarf, der, in Abhängigkeit von der individuellen Generationszeit - oder Virulenz - der jeweiligen Mikrobenart, in Stunden, Tagen oder Wochen (z.B. zum Nachweis von Tuberkelbakterien) zu bemessen ist. Damit wird verständlich, daß ein verläßlicher mikrobiologischer Befund, von den seltenen Ausnahmen einer rein

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Mikrobiologische Diagnostik

mikroskopischen Diagnosestellung oder von den modernen Verfahren zum Antigen- oder Nukleinsäure-Nachweis abgesehen, frühestens nach ein bis zwei Tagen, zuweilen aber auch erst nach einer oder mehreren Wochen erbracht werden kann. Sogenannte Schnellverfahren, auch solche auf der Basis von Nukleinsäure-Amplifikations-Techniken (NAT), auf deren Entwicklung in letzter Zeit vermehrt Gewicht gelegt wurde, haben daran bisher grundsätzlich wenig geändert, da sie in der Regel nur einen sehr speziellen Einsatzbereich haben und die kulturellen Verfahren in vielen Fällen eher ergänzen als ersetzen können. Zur eigentlichen Untersuchungsdauer addieren sich häufig noch die Transportzeiten für die Proben und die Zeit für die Übermittlung des schriftlichen Befundes, so daß der behandelnde Arzt gerade bei akuten oder gar lebensbedrohenden Infektionen das mikrobiologische Untersuchungsergebnis selbst bei Verwendung von Schnellverfahren für die Planung der erforderlichen Sofortbchandlung oft nicht abwarten kann. Wegen dieser Problematik sollte er aber nicht auf die mikrobiologische Untersuchung verzichten, sondern sie unbedingt zur Bestätigung seiner klinischen Verdachtsdiagnose und zur oft notwendigen, ja lebensrettenden Korrektur der Primärtherapie einsetzen. Außerdem läßt sich durch organisatorische Maßnahmen wie Botentransport und telefonische, Fax- oder E-Mail-Übermittlung vorläufiger Befunde das informatorisch leere Intervall zwischen Materialentnahme und erstem Untersuchungsergebnis in der Regel erheblich verkürzen. Eine „do-it-yourself -Mikrobiologie in Klinik oder Praxis, die heute mit dem Argument der Zeit- und Kostenersparnis vermehrt propagiert und praktiziert wird, hat sich aus unserer Sicht als Ausweg aus den genannten Schwierigkeiten nicht als sinnvoll erwiesen. Denn die medizinische Mikrobiologie hat sich inzwischen wie viele andere medizinische Disziplinen zu einem so komplexen und methodisch so aufwendigen Fach entwickelt, daß sie, wie die Ergebnisse der externen Qualitätssicherung über Ringversuche belegen, nur der erfahrene Spezialist in einem gut ausgerüsteten Laboratorium mit optimalen Ergebnissen, ohne Verstöße gegen ethische und rechtliche Normen kostengünstig ausüben kann. Die unabdingbaren Kenntnisse und Erfahrungen können verständlicherweise auch nicht durch industriell vorgefertigte, einfache Nachweis- und Identifizierungssysteme ersetzt werden, selbst wenn Gebrauchsanleitungen und umfangreiche Auswertungsschemata einschließlich der zuge-

hörigen EDV-Datensammlungen und Auswertungsprogramme dies nahezulegen scheinen.

Allgemeine mikrobiologische Arbeitsbedingungen Alle mikrobiologischen Untersuchungsgänge erfordern Arbeitsbedingungen, welche die Gefährdung des im Laboratorium tätigen Personals so gering wie möglich halten, Kontaminationen von klinischem Material und Kulturmedien vermeiden und beste Möglichkeiten bieten, vorhandene Erreger auch tatsächlich nachzuweisen. Dazu wurden aus der Erfahrung heraus und gestützt durch den Erkenntnisfortschritt Instrumente, Methoden und Verhaltensweisen entwickelt, die in ihrer Anwendung und Zielsetzung dem strengen Ritual der Antiseptik in der Chirurgie ähnlich sind. Wichtigstes Instrument in der Bakteriologie ist seit Jahrzehnten die Impfnadel oder Impföse aus Platindraht (Abb. 2.4), die in einem geeigneten Halter (z.B. nach KOLLE) befestigt ist. Vor und nach jedem Gebrauch wird sie in der nichtleuchtenden, also besonders heißen Bunsenbrennerflamme zur Sterilisation ausgeglüht. Mit einer solchen sterilen Öse werden Untersuchungsmaterialien auf Objektträger und verschiedene Kulturmedien übertragen oder bereits gewachsene Kulturen von einem Nährboden auf den anderen überimpft. Das vom Erfahrenen automatisch vorgenommene Ausglühen der Öse verhindert die ungewollte Verbreitung von Krankheitserregern im Laboratorium und die irreführende Verunreinigung von Lösungen und Kulturansätzen. Heute werden häufig sterile Einmalösen aus Kunststoff verwendet, bei denen sich das Ausglühen erübrigt, das bei unsachgemäßer Ausführung zu einer erhöhten Infektionsgefahr beim technischen Personal führen kann. Funktionen sind die Einmalösen allerdings den Platinösen eindeutig unterlegen. Kontaminationen von Instrumenten, Medien und Kulturen durch luftgetragene, mikrobenhaltige Teilchen können durch rasches Arbeiten gering gehalten werden. Sicher lassen sich aerogene Verunreinigungen aber nur durch Arbeiten an einer „reinen Werkbank" verhin-

Abb. 2.4 Bakteriologische Impföse mit Halter.

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

dern, die eine bis auf einen Spalt zur Einführung der Hände abgeschlossene Kabine ist, welche mit keimfrei gefilterter Luft durchströmt wird. Bei entsprechender Führung der turbulenzarmen Luft sichert ein solches System auch das Personal vor Infektionen durch infektiöse Aerosole {„Sicherheitswerkbank"). Eine weitere Reduktion der Infektions- und Kontaminationsgefahr wird durch eine häufige desinfizierende Reinigung der Arbeitstische und durch die Desinfektion und anschließende Sterilisation der Werkzeuge (z.B. Pipetten, Spritzen. Reagenzgläser) unmittelbar nach jedem Gehrauch erreicht. Mikroskopische Untersuchungsverfahren

Mikroskopische Untersuchungsverfahren können zur Auffindung, Zählung, morphologischen Beurteilung und (seltener) Identifizierung von Mikroorganismen eingesetzt werden. In der medizinischen Bakteriologie dienen sie hauptsächlich der vorläufigen Orientierung über den Baktericngehalt klinischer Materialproben und der Prüfung der Zellformen, Beweglichkeit, Färbeeigenschaften und Einheitlichkeil von Kulturen; eine mikroskopische Artdiagnose bakterieller Krankheitserreger ist nur in Verbindung mit serologischen Methoden (Immunfluoreszenztechnik) zuverlässig möglich. Protozoen und viele Pilze lassen sich demgegenüber oft allein anhand ihres mikroskopischen Erscheinungsbildes identifizieren; das Mikroskop besitzt daher für die Untersuchung dieser Kleinstlebewesen einen deutlich höheren Stellenwert als für die bakteriellen Mikroorganismen. Wegen der Größenordnung und Lichtbrechungseigenschatten der meisten Bakterien müssen Lichtmikroskope mit leistungsfähigen Objektiven und Einrichtungen zur Erhöhung des Kontrastes (z.B. verstellbaren Blenden und Kondensoren) ausgerüstet sein. Die Gestalt dieser Mikroorganismen läßt sich am besten mit Immersionsobjektiven prüfen, die bei hohem Auflösungsvermögen eine Endvergrößerung zwischen 500- und lOOOfach ermöglichen. Eine Verstärkung der Lichtbrechung kann durch Anfärben oder Spezialverfahren wie die Dunkelfeld- oder Phasenkontrast-Mikroskopie erreicht werden. Zur Detaildarstellung von Oberflächen- oder Innenstrukturen bakterieller Zellen ebenso wie zur Darstellung von Viren müssen allerdings raster- oder transmissionselektronenmikroskopische Techniken herangezogen werden, welche freilich nicht zum Routineprogramm des mikrobiologischen Laboratoriums gehören.

Im folgenden wird nur auf die einfacheren Präparationsmethoden für die Lichtmikrosko-

pie näher eingegangen, weil diese Verfahren auch außerhalb des mikrobiologischen Laboratoriums in Klinik und Praxis sinnvoll einsetzbar sind: Nativpräparate

Bei mittlerer bis starker Vergrößerung, ausreichender Abblendung des Hellfeldes oder Verwendung der Dunkelfeld- oder Phasenkontrasttechnik lassen sich Bakterien und andere, wenigstens gleich große Mikroorganismen nativ, das heißt ohne vorausgehende abtötende und eventuell formverändernde Fixierung und Färbung, unter dem Lichtmikroskop sichtbar machen. Da aus optischen und physiologischen Gründen meist wäßrige Aufschwemmungen untersucht werden, kann man in solchen Nativpräparaten besonders einfach den Nachweis der Beweglichkeit führen. Deckglaspräparate. Ein Tropfen bewachsener Kulturflüssigkeit oder bakterienhaltiger Ex- und Sekrete wird mit der sterilen Öse unmittelbar auf einen sauberen Objektträger aufgebracht, möglichst ohne Luftblaseneinschlüsse mit einem Deckglas bedeckt und mil einem Objektiv ausreichender Auflösung (mit oder ohne Öl- oder Wasserimmersion) mikroskopiert. Dieses Verfahren wird z.B. zum Nachweis lebender Syphilisspirochäten im Reizserum, von Leptospiren in Kulturflüssigkeiten oder von Rückfallfiebererregern (Borrelien) im Zitratblut unter Zuhilfenahme des Dunkclfeldmikroskopes eingesetzt. Deckglaspräparate mit Vitalfärbung. Morphologisch differenziertere Mikroorganismen wie Aktinomyzeten, Pilze oder Protozoen lassen ihre verschiedenen diagnostisch wichtigen Strukturen besser erkennen, wenn man der Suspensionsflüssigkeit einen Farbstoff zugibt, der von den lebenden Zellen rasch aufgenommen wird. Für Pilze und Aktinomyzeten erfüllt diesen Zweck Laktophenol-Baumwollblau-Lösung; Protozoen färben sich mit gepufferter Methylenblau-Lösung typisch an. Außerdem kann man für die Pilzdiagnostik undurchsichtiges, verhorntes Material (Hautschuppen, Haare, Nagelgeschabsel) durch Einbetten in etwas Kalilauge aufhellen. Bei myzelial wachsenden Mikroorganismen (Aktinomyzeten, Pilzen), deren Geflechtstruktur und Fruchtformen in der Originalanordnung beobachtet werden sollen, kann eine Modifikation des Deckglaspräparates, die Deckglaskultur, nützlich sein. Dabei läßt man den zu untersuchenden Mikroorganismus von einem geeigneten Agarnährboden auf die Oberfläche des verwendeten Deckglases hinüberwachsen, das dann vorsichtig abgenommen und, mit der Schichtseite z.B. in Laktophenol-Baumwollblau-Lösung eingebettet, mikroskopiert wird. „Hängender Tropfen". Die Beweglichkeit bakterieller und anderer Kleinstlebewesen läßt sich unter Routinebedingungen bequem und zuverlässig mit der Methode des „hängenden Tropfens" prüfen. Dazu benötigt

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Mikrobiologische Diagnostik

man ein Deckglas, einen Hohlschliffobjektträger und etwas Vaseline oder dickflüssiges Paraflinöl, welche ringförmig um die Aushöhlung des Objektträgers gestrichen werden. Ein Tropfen der zu untersuchenden mikrobenhaltigen Suspension wird in die Mitte des Deckglases gegeben und der Hohlschliffobjektträger wird so daraufgesetzt, daß der Tropfen in der Mitte der Vertiefung liegt und das Deckglas durch die Vaseline luftdicht fixiert wird. Das Präparat kann nun ohne Mühe umgedreht und durch das Deckglas, von der Rückseite des Tropfens, mikroskopiert werden. Die Beweglichkeit vorhandener Mikroorganismen läßt sich vor allem im Randbereich des Tropfens zuverlässig beurteilen (cave: Verwechslung mit BROWNscher Molckularbewcgung!). Negativdarstellung (Tuschepräparat). Zur exakteren Darstellung der äußeren Konturen mikrobiellcr Zellen und zum Nachweis von Kapseln empfiehlt sich das Tuschepräparat nach BURRI: Die mit schwarzer Tusche vermischte Mikrobensuspension (Untersuchungsmaterial. Bouillonkulluren oder Kolonieaufschwemmungen) wird wie ein Blutausstrich auf dem Objektträger ausgezogen, luftgetrocknet und gegebenenfalls schonend fixiert. Sodann wird das Präparat ohne Deckglas mit Ölimmersion mikroskopiert. Wenn man den Ausstrich vorher mit einem der in der Mikrobiologie üblichen Farbstoffe (s.u.), die nur vom Zellkörper, nicht aber von den Kapselsubstanzen aufgenommen werden, anfärbt, kann man mikrobielle Schleimkapseln als farblose Aussparungen im Tuschefilm, die den Zelleib umgeben, besonders einfach und deutlich erkennen.

Gefärbte Präparate Die Färbung mikroskopischer Präparate dient zur besseren Sichtbarmachung und Differenzierung von Mikroorganismen, aber auch zur gezielten Darstellung bestimmter Zelleinschlüsse und Organellen. Vorbereitung der Präparate. Das zu untersuchende Material wird in einem vorher mit Fettstift (an der Unterseite) oder Diamantschreiber (an der Oberseite) markierten Bezirk mit Öse oder Tupfer dünn und gleichmäßig auf den Objektträger aufgetragen. Nach vollständiger Lufttrocknung wird es fixiert, was für alle Routinefärbungen durch dreimaliges langsames Durchziehen durch die leuchtende Bunsenbrennerflamme (mit der Schichtseite nach oben) geschieht. Diese Hitzefixierung ist notwendig, damit die Bakterien bei den nachfolgenden Färbeund Waschvorgängen am Objektträger haften bleiben. Einfachfärbungen. Bei den Einfachfärbungen wird in einem Arbeitsgang eine Farbstofflösung, die nur eine färbende Komponente enthält, auf den Objektträger aufgebracht; die Mikroorganismen nehmen dabei den Farbton der verwen-

deten Lösung an. Solche Einfachfärbungen erlauben eine bessere Unterscheidung der Mikroorganismen von unbelebtem organischen Material und eine gute Beurteilung ihrer Gestalt und Größe. Am gebräuchlichsten ist die LOEFFLERsche Färbung mit alkalischem Methylenblau; vergleichbare Ergebnisse kann man aber auch mit anderen basischen Farbstoffen erzielen. Zur Durchführung der Färbung wird das fixierte Präparat mit der Schichtseile nach oben auf eine Färbebank gelegt und reichlich mit Farblösung überdeckt. Alternativ kann es in eine Färbeküvette, welche die entsprechende Farblösung enthält, eingetaucht werden. Nach einer Einwirkungszeit von etwa 1 min wird der Objektträger mit Leitungswasser abgespült und unter leichtem Andrücken zwischen Fließpapier getrocknet. Anschließend wird das Präparat ohne Deckglas mit Ölimmersion mikroskopiert. Differentialfärbungen. Differentialfärbungen arbeiten mit mindestens zwei verschiedenen Farbstoffen, deren Lösungen nacheinander oder gemischt verwendet werden. Häufig liegen zwischen den einzelnen Färbeschritten Waschvorgänge, welche die zuerst applizierte Farbe aus manchen Mikroorganismen oder Strukturen wieder herauslösen, so daß sich diese am Ende nur im Farbton der zweiten Farblösung (Gegenfärbung) darstellen, während die übrigen Mikroben oder Mikrobenbestandteile eine Färbung zeigen, welche der ersten, meist stärkeren Komponente oder einer Mischung aus beiden Farbstoffen entspricht. Die sich auf diesem Wege ergebenden unterschiedlichen Reaktionsausfälle können zur Differenzierung und Identifizierung von Bakterien und anderen Mikroorganismen herangezogen werden. Differentialfärbung nach GRAM. Im Jahre 1884 wurde von dem dänischen Internisten, Pathologen und Pharmakologen HANS CHRISTIAN JOACHIM GRAM (1853-1938) eine Färbemethode angegeben, die er zur besseren Sichtbarmachung von Bakterien in Gewebeschnitten entwickelt halte. Erst später stellte sich heraus, daß dieses Verfahren eine weit über seinen ursprünglichen Zweck hinausgehende praktische und taxonomische Bedeutung besitzt. Es erlaubt nämlich, das Bakterienreich einfach und schnell in zwei große Gruppen zu unterteilen, deren Mitglieder sich hinsichtlich ihres Zellwandaufbaus (s. Kap. 3.1.2) und einiger anderer Eigenschaften grundlegend unterscheiden. Zur Durchführung einer GRAM-Färbung, die seit langem zu einem der wichtigsten Verfahren

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

in der diagnostischen Mikrobiologie geworden ist, gehören die folgenden Arbeitsgänge: Hitzefixiertc Präparate werden zunächst auf der Färbebank für 1 bis 2 min mit einer frisch filtrierten, wäßrig-alkoholischen Lösung (eventuell mit Zusatz von Ammoniumoxalat, Anilinöl und/oder Phenol) einer der basischen Pararosanilinfarben (Gentianaviolett, Methylviolett, Kristallviolett. Hexamethylviolett) bedeckt. Anschließend wird die Farbe mit LuGOLscher Lösung (Jodjodkalilösung) abgespült, und das Präparat bleibt zur Beizung für weitere f bis 2 min mit dieser Lösung überflutet. Nach Abkippen der Beize entfärbt man mit mehreren Portionen 95%igen Äthylalkohols (oder mit Azeton oder einer Alkohol-Azeton-Mischung, die rascher entfärbend wirken), bis keine sichtbaren Farbwolken mehr abgehen. Unmittelbar anschließend wird der Entfärbungsprozeß durch kurzes Abspülen mit Leitungswasser unterbrochen (dieser Schritt der Färbung bzw. Entfärbung ist kritisch und muß genau terminiert werden), und das Präparat wird für 1/2 bis f min mit verdünnter Safraninlösung gegengefärbt. Bakterien, deren Zellwand aus mehreren, miteinander vernetzten Peptidoglykanschichten besteht, halten die eingebeizte GRAM-Farbe (z.B. Phenol-Gentianaviolctt) im Inneren, nicht in der Zellwand, trotz der entfärbenden Wirkung des Alkohols oder Alkohol-Azeton-Gemisches fest; sie werden als gram-positiv bezeichnet und

stellen sich unter dem Mikroskop blau-schwarz bis dunkel-violett dar (Abb. 2.5; Abb. 2.6-2.11, Farbtafeln). Bakterien, deren Zellwand demgegenüber nur über eine dünne, einzelne Murcinschicht verfügt, geben den violetten Farbstoff unter Alkohol- bzw. Azetoneinwirkung schnell und vollständig ab und nehmen die rosa bis rote Farbe der Gegenfärbung an. Diese Bakterien nennt man gram-negativ (Abb. 2.5; Abb. 2.12-2.14, Farbtafeln). Der Ausfall der GRAM-Färbung wird allerdings nicht nur von der chemischen Zusammensetzung und Struktur der Zcllwändc der untersuchten Bakterien bestimmt, sondern er wird zusätzlich auch durch das Alter der Kulturen, den Vitalilätszusland der Organismen, die Schichtdicke des Präparates und die Übung und Erfahrung des Untersuchers beeinflußt. Unter ungünstigen biologischen und/oder technischen Bedingungen können deshalb gram-positive Bakterien fälschlich gram-negativ erscheinen und umgekehrt. Differentialfärbung nach ZIKHI und NKKI.SF.N.

Die meisten Bakterien lassen sich mit den erwähnten und vielen anderen Farbstofflösungen einfach und schnell anfärben. Einige Arten, insbesondere solche der Gattungen Mycobacterium und Nocardia, nehmen die üblichen Farbstoffe jedoch nur schlecht oder langsam an; dies ist auf die Anwesenheit von Lipidcn (Wachsen, freien Mykolsäuren) zurückzuführen, die in der äußeren Zellwand lokalisiert sind und eine Penetrationsbarriere für wäßrige Lösungen bilden. Haben sich solche Mikroben allerdings einmal

Abb. 2.5 Schematische Darstellung des Färbeverhaltens bei der GRAMFärbung.

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Mikrobiologische Diagnostik

angefärbt, geben sie den Farbstoff selbst bei Behandlung mit drastischen Entfärbungsmitteln nur schwer wieder ab. Sogar starke Säuren wie Salz- oder Schwefelsäure oder Salzsäure-Alkohol-Gemische vermögen auch bei relativ langer Einwirkung keine Entfärbung herbeizuführen. Diese Mikroorganismen werden deshalb als säurefest, oder in diesem Zusammenhang besser färberisch-säurefest, bzw. säure-alkohol-fest, bezeichnet. Der Entdecker dieses Phänomens ist PAUL EHRLICH, der 1882 zur Darstellung des Tubcrkelbakteriums die Färbung mit Anilin-Methylviolett, die Differenzierung mit Salzsäure und die anschließende Gegenfärbung mit Bismarck-Braun empfahl. Der Lübecker Neurologe FRANZ ZIF.HL (1857-1926) und der Dresdner Pathologe FRIEDRICH KARL ADOLF NEELSEN (1854-1894) haben das EHRLiCHsche Verfahren 1882 und 1883 durch Einführung anderer Farben und Entfärbungsmittel soweit vervollkommnet, daß es im Prinzip trotz verschiedener, geringfügiger Modifikationen bis heute unverändert unter dem Namen ,.ZIKHL-NEKLSEN-/W/}I«I£" erhalten geblieben ist. Methodisch geht man bei der ZlEHL-NEELSEN-Färbung wie folgt vor: Der hitzefixierte Bakterienausstrich wird vollständig mit wäßrig-alkoholischer Karbolfuchsinlösung bedeckt. Um den Farbstoff rasch in die Bakterien eindringen zu lassen, wird der Objektträger auf der Färbebank von unten mit der leuchtenden Bunsenbrennerflamme dreimal vorsichtig bis zum Dampfen (nicht Kochen!) erhitzt. Dann wird er mit Leitungswasser kurz abgespült und anschließend mit 3%igcm Salzsäurealkohol kräftig entfärbt. Nach erneutem Abspülen wird mit 0,3-1.0%iger, wäßriger Methylenblaulösung gegengefärbt.

Säurefeste Bakterien erscheinen unter dem Mikroskop rot (s. Abb. 2.16, 2.17, Farbtafeln), während alle anderen Bakterien sowie Schleim, Leukozyten und Epithelzellen blau aussehen. Die Färbung ist von außerordentlichem Wert bei der Suche nach Mykobakterien, insbesondere Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium leprae, in klinischen Untersuchungsmaterialien und für die Differenzierung von verdächtigen Kulturen. Die Säurefestigkeit von aeroben Aktinomyzeten (z.B. Nocardia- und RhodococcusArten) ist meist schwächer ausgeprägt und wird nur nach kurzer Entfärbung mit l%iger Schwefelsäure zuverlässig nachweisbar. Auf dem Prinzip der ZiEHL-NEELSEN-Färbung beruhen auch die Fluoreszenzfärbungen, bei denen sich Mykobakterien selektiv mit fluoreszierenden Farbstoffen (z.B. Auramin oder Auramin-Rhodamin) anfärben und dadurch auch bei schwächeren Vergrößerungen mit dem Fluoreszenzmikroskop einfach und zuverlässig auffindbar werden.

Polkörnchenfärbung nach NEISSER. Die Zellen mancher gram-positiver Bakterien, vor allem von Corynebacterium diphtheriae, enthalten metachromatische Granula, sogenannte Polkörnchen, die für die mikrobiologische Diphtheriediagnostik große praktische Bedeutung besitzen. Ein spezielles Färbeverfahren, welches diese Granula blau-schwarz hervorhebt, wurde 1897 von dem Bakteriologen MAX NEISSEK (1869-1938) in Frankfurt am Main entwickelt und wird nach ihm heute NEiSSER-Färbung genannt. Bei der NRISSER-Färbung wird das hitzefixierte Präparat zunächst für 2 min mit einer frisch hergestellten Mischung aus 2 Teilen einer wäßrig-alkoholischen Eisessig-Methylenblau-Lösung und 1 Teil einer wäßrig-alkoholischen Kristallviolettlösiing bedeckt und anschließend für 1 min mit wäßriger Chrysoidinlösung gegengefärbt. Polkörnchen stellen sich schwarz-blau in einem gelb-braun gefärbten Baklerienkörper dar. Weitere in der Mikrobiologie gebräuchliche Fär-

bungen. Für besondere Fragestellungen können bakterielle Geißeln, Kapseln oder Endosporen zur lichtoptischen Darstellung angefärbt werden. Die GRAM-Färbung von Gewebeschnitten kann nach der von KARL WEIGERT angegebenen Modifikation erfolgen. Aktinomyzeten, Pilze oder Spirochäten lassen sich im Gewebe besonders deutlich durch die GROCOTT-GOMORI-Versilberungsmethode sichtbar machen. Zur Untersuchung von Protozoen und zum Nachweis von Chlamydien oder Dermatophilus eignet sich die GiEMSA-Färbung. Auf die fluoreszenzserologischen Methoden, die einen vielschichtigen Einsatzbereich haben, wird im serologischen Kapitel eingegangen. Spezielle mikroskopische Techniken

Verfahren wie die bereits erwähnte Phasenkontrast- und Dunkelfeld-Mikroskopie werden in erster Linie zur genaueren Beurteilung der Gestalt ungefärbter, lebender Bakterien, zur Darstellung bestimmter Zelleinschlüsse, zur Sichtbarmachung sehr dünner Mikroben (Spirochäten) und sogar zur lichtoptischen Erkennung von Geißeln eingesetzt. Polarisations- und Interferenz-Mikroskopie werden bisher in der Mikrobiologie relativ selten verwendet, können aber vor allem zur Klärung wissenschaftlicher Fragestellungen nützlich sein. Fluoreszenzmikroskopie. Fluoreszenzfarbstoffe - Fluorochrome - sind chemische Verbindungen, die kurzwelliges Licht oder UV-Strahlen absorbieren und dabei Licht längerer Wellenlän-

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

ge emittieren. Sie können einerseits, in Analogie zu den bereits genannten Farbstoffen, zur unmittelbaren Fluorochromierung von Mikroorganismen und anderen biologischen Strukturen verwendet werden (z.B. Auramin); sie lassen sich aber auch an Immunglobulinmoleküle koppeln (z.B. Fluoreszeinisothiocyanat), ohne daß ihre Fluoreszenzeigenschaften und die spezifische Bindungsfähigkeit der Antikörper verlorengehen, und dienen dann der serologischen Charakterisierung oder Lokalisierung der entsprechenden Antigene. Um den Effekt der Fluorochromierung mikroskopisch sichtbar zu machen, muß das Mikroskop mit einer speziellen Fluoreszenzeinrichtung ausgerüstet sein. Für die klassische Durchlicht-Fluoreszenzmikroskopie bestehl diese aus einer Hochleistungslichtqueile (z.B. Hochdruck-Quecksilberdampflampe), die auch kurzwelliges Licht und UV-Strahlen ausreichender Intensität emittiert, einem Erregerfilter, welches nur für ein schmales Band kurzwelliger Strahlen durchlässig ist. und einem Sperrfilter, das kurzwellige Strahlen vollständig zurückhält, während es das längerwellige Fluoreszenzlicht ungehindert zum Okular durchtreten läßt. Das abzubildende Objekt leuchtet bei mehr oder weniger dunklem Hintergrund in der jeweiligen Farbe des verwendeten Fluorochroms (meist rot oder gelbgrün) auf. Kontrastreichere Darstellungen ohne störende Hintergrundhelligkeit lassen sich mit dem 1967 von PLOEM entwickelten Auflichtilluminator erzielen. Im Unterschied zur Durchlichtfluoreszenz wird hierbei die kurzwellige Erregerstrahlung von oben, durch das Objektiv, auf den Objektträger geleitet. Dazu wird ein dichroischer Spiegel benötigt, der so im Mikroskoptubus angeordnet ist. daß er die über das Erregerfilter seitlich eintretenden, kurzwelligen Strahlen nach unten, zum Objektiv, umlenkt, von wo sie gebündelt auf das Präparat gelangen. Das entstehende Fluoreszenzlicht tritt zusammen mit reflektierten Errcgcrstrahlen über dasselbe Objektiv ins Mikroskop zurück und erreicht, von der Gegenseite, wieder den dichroischen Spiegel, der aus dieser Einfallsrichtung längerwelliges Licht ungebrochen durchtreten läßt. Dieses Licht, eventuell „gereinigt" durch ein zusätzliches Sperrfilter, bildet die Untersuchungsobjekte äußerst kontrastreich vor in der Regel völlig dunklem Hintergrund ab. Wegen ihrer problemloseren Darstellungseigenschaften wird die Auflichtfluoreszenztechnik heute in der Mikrobiologie meist dem Durchlichtverfahren vorgezogen.

Elektronenmikroskopie. Anstelle der Lichtstrahlen bedient sich die Elektronenmikroskopie eines Elektronenstrahls (Kathodenstrahls), der im Vakuum von einer erhitzten Kathode ausgesandt wird, sich beschleunigen läßt und, analog zum lichtoptischen Strahlengang, mit elektromagnetischen „Linsen" und metallischen Lochblenden so geleitet werden kann, daß sich

auf einem fluoreszierenden Bildschirm oder auf der photographischen Platte Abbilder der untersuchten Objekte erzielen lassen. Entsprechend der Wellenlänge der Elektronenstrahlen ist das Auflösungsvermögen des Elektronenmikroskops bis zu KPmal größer als das des Lichtmikroskops. Deshalb ist es unersetzlich zur Aulklärung der Ultrastruktur von Mikroorganismen, zur Darstellung von Viren und zur Sichtbarmachung von Makromolekülen. Bei der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) macht man sich ähnlich wie bei der Durchlichtmikroskopie die unterschiedliche Brechung und Absorption von Elektronenstrahlen an biologischen und anderen Strukturen zunutze. Damit ein größeres Objekt (z.B. eine Bakterienzelle) allerdings überhaupt von Elektronen durchdrungen werden kann, muß es in extrem dünne Schnitte (Ultradünnschnitte: 20-80 nm dick) zerlegt werden, was technisch aufwendig ist und Artefakte verursachen kann. Trotzdem hat dieses Verfahren unsere Kenntnisse über den Feinaufbau der mikrobiellen Zellen außerordentlich erweitert. Sollen dagegen sehr kleine Objekte (z.B. Makromoleküle wie DNA oder auch Viren, Bakteriophagen) zur Darstellung gebracht werden, müssen sie in der Regel zunächst mit kontrastierenden Verfahren vorbehandelt werden. Diese können entweder in einer Negativ-Kontrastierung mit Uranylazetat (s. Abb. 5.1) oder Phosphorwolframsäure oder in einer Bedampfung mit Schwermetallen (z.B. Gold) bestehen. Außerdem können die Gefrierätztechnik, welche die Untersuchung von subzellulären Feinstrukturen (z.B. Membranaufbau) anhand einer Platin-Kohlenstoff-Kopie der durch Einfrieren und Aufbrechen freigelegten Strukturbestandteile erlaubt, oder immunchemische Verfahren (z.B. mit Ferritin-markierten Antikörpern) den Anwendungsbereich der TEM erweitern. Ein ganz anderes Einsatzgebiet hat die Rasterelektronenmikroskopie (REM). Technisch beruht sie auf der Tatsache, daß ein mit Metall (gewöhnlich Gold oder Platin) bedampftes Objekt unter Beschüß mit Kathodenstrahlen (primären Elektronen) sekundäre Elektronen aussendet, die mit ähnlichen Mitteln wie beim Fernsehen visualisiert werden können und zu einem Abbild des Untersuchungsgegenstandes führen. Das Auflösungsvermögen der REM ist geringer als das der TEM; dafür lassen sich mit der REM aber dreidimensionale Darstellungen in einem weiten Vergrößerungsbereich erzielen, so daß sie z.B. zur Unter-

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suchung der Oberflächen- und Koloniestruktur von morphologisch komplexen Mikroorganismen (z.B. Pilzen, Aktinomyzeten), aber auch zur detailreichen Darstellung von Endo- und Ektoparasiten herangezogen werden kann (s. Abb. 4.1, 4.2).

Kulturelle Untersuchungsverfahren für Bakterien und Pilze Die meisten Bakterien und Pilze können mit vergleichsweise einfachen Mitteln in chemisch mehr oder weniger gut definierten, unbelebten Nährmedien zur Vermehrung gebracht werden. Obligat intrazelluläre Parasiten wie Chlamydicn, Rickcttsien und alle Viren benötigen demgegenüber zur Vermehrung lebende Zellen und bedürfen aus diesem Grunde zur Anreicherung und Weiterzucht des Versuchstiers, des embryonierten Hühnereis oder der Zellkultur (s. Kap. 5.1.6). Allgemeine Kulturbedingungen für Bakterien und Pilze

Alle menschen- und tierpathogenen Bakterien sowie die Pilze sind heterotroph oder wenigstens Kohlenstoff-heterotroph (s. Kap. 3.2.1); das Nährmedium muß ihnen deshalb organische Kohlcnstoffvcrbindungen zur Deckung ihres Kohlenstoff- und Energiebedarfs und zuweilen auch organisch gebundenen Stickstoff für ihre Eiweißsynthese zur Verfügung stellen. Außerdem benötigen sie wie alle lebenden Zellen Wasser in ausreichender Menge und von Fall zu Fall zusätzlich Mineralien, Spurenelemente und Wachstumsfaktoren (Vitamine). Für Routinezwecke werden diese Ingredienzien dem Nährmedium nicht einzeln und individuell zugegeben (vollsynthetisches Nährmedium), sondern es werden komplexe biologische Substrate verwendet, von denen man annehmen darf, daß sie eine natürliche Mischung wichtiger Nähr- und Wachstumsfaktoren enthalten. Gebräuchliche Bestandteile bakteriologischer

Nährmedien. Zu den gängigsten Bestandteilen bakteriologischer Nährmedien gehören Peptone. Dies sind Spaltprodukte tierischer oder pflanzlicher Eiweiße, die durch partielle Säurehydrolyse oder enzymatische Verdauung gewonnen werden. Die kommerziellen Peptonzubcreitungen für die Bakteriologie sind chemisch nicht genau definiert, sondern setzen sich aus vielen verschiedenen, vor allem stickstoffhaltigen Komponenten einschließlich der Aminosäuren zusammen. Diese Heterogenität macht sie zu ei-

nem universellen Stickstofflieferanten für Mikroorganismen mit unterschiedlichsten Nährstoffbedürfnissen. Ein weiterer, äußerst wertvoller und vielfältig verwendbarer Nährmedienzusatz ist Fleischextrakt. Er ist ein dehydriertes Konzentrat von wäßrig abgekochtem magerem Rindfleisch und enthält unter anderem Kreatin, Xanthin, Hypoxanthin, Harnsäure, Adenylsäure, Inosinsäure, Glykokoll, Harnstoff und Glutamin als Stickstoffverbindungen sowie Glykogen, Hexosephosphate, Milchsäure, Bernsteinsäure und wasserlösliche Lipidderivate als stickstoffreie Komponenten. Darüber hinaus besitzt der käufliche Fleischextrakt einen merklichen Vitamingehalt und bietet den Mikroben so ein breites Spektrum verschiedenartiger Wuchs- und Nährstoffe. Wenn es speziell um die Bereitstellung von Wachstumsfaktoren geht, wird allerdings gewöhnlich Hefeextrakt eingesetzt, der aus kontrolliert autolysierten Hefezellen hergestellt wird und besonders reich an Vitaminen des BKomplexes ist. Viele mikrobiologische Nährmedien enthalten Kochsalz. Natriumchlorid-Zusatz in Konzentrationen von 1-10% wird zur Anzüchtung halophiler Bakterien benötigt; in isotonischen Konzentrationen dient er der Stabilisierung osmotisch fragiler Mikroorganismen (z.B. Mykoplasmen) und roter Blutkörperchen, die manchen Medien zugemischt werden. Darüber hinaus gehören zur Rezeptur der meisten Kulturmedien Puffersalze (Phosphate oder Karbonate), die den pHWert des bewachsenen Systems trotz Anhäufung saurer oder basischer Stoffwechselschlacken möglichst lange konstant halten sollen.

Auch Kohlenhydrate (Mono-, Di-, Tri- und Polysaccharide), Alkohole (z.B. Glyzerin, Mannit) oder Glykoside (z.B. Salizin) verbessern häufig die Qualität von Nährmedien, da sie für viele Mikroorganismen besonders leicht verwertbare Kohlenstoff- und Energiequellen darstellen. Außerdem unterliegt ihr Abbau artspezifischen Unterschieden, so daß sie zur Differenzierung und Identifizierung von Bakterien und Pilzen herangezogen werden können (s.u.). Eine wäßrige Lösung der genannten Ingredienzien in wechselnden Kombinationen und Konzentrationen bildet, nach Sterilisation im Autoklaven, eine flüssige Nährlösung, die traditionsgemäß auch als Nährbouillon oder Nährbrühe

bezeichnet wird. Durch Zugabe gelierender Substanzen lassen sich solche Brühen zu einer Gallerte verfestigen, die dann Nährboden heißt. Feste Nährböden waren schon für die Pilzzüch-

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

tung verwendet worden, als ROBERT KOCH ihren Wert für die Bakteriologie entdeckte und damit erstmals die methodischen Voraussetzungen schuf, schnell, einfach und sicher Reinkulturen zu erzielen. Denn auf dem stark wasserhaltigen Gel vermehren sich Bakterien ebensogut wie in der Bouillon; aufgeimpfte lebende Zellen bleiben aber, von Ausnahmen abgesehen (Schwärmphänomen), mit all ihren Nachkommen ortsständig, so daß sich schließlich Bakterienhaufen bilden, die mit bloßem Auge sichtbar werden und die man Kolonien nennt. Diese Kolonien sind Ansammlungen weitgehend erbgleicher Individuen (Klone), da sie, wenigstens im Idealfall, durch viele Teilungsschritte aus einer einzigen Zelle hervorgegangen sind. Überpflanzt man Material einer Kolonie auf einen frischen Nährboden, erhält man eine weitere starke Vermehrung derselben erbgleichen Mikrobenpopulation, die Reinkultur.

Die Einführung fester Nährböden stellt nicht nur die eigentliche Geburtsstunde der medizinischen und naturwissenschaftlichen Mikrobiologie, sondern auch die der mikrobiologischen Diagnostik dar: denn die Kolonien verschiedener Mikrobenarten unterscheiden sich oft in Größe, Oberflächen- und Randbeschaffenheit, Farbe und Konsistenz (Abb. 2.18a—1) und erlauben deshalb die rasche Erkennung von Mischkulturen oder liefern wichtige Hinweise für die Identifizierung. Wenn man mikrobenhaltige

Flüssigkeiten mit einem gelierfähigen Nährmedium vermischt, bevor die Gelbildung einsetzt, wachsen vermehrungsfähige Organismen nach dem Erstarren zu einzeln stehenden Tiefenkolonien aus, deren Zahl einen unmittelbaren quantitativen Rückschluß auf den Mikrobengehalt des Ausgangsmaterials erlaubt: Keimzahlbestimmung im KoCHschen Plattenguß verfahren, aus-

gedrückt in koloniebildendcn Einheiten (KBE = colony forming units, CFU) pro Volumen- oder Gewichtseinheit des Ausgangsmaterials. Als ersten gallertigen Nährboden verwendete KOCH ab 1881 mit Gelatine verfestigte Nährbrühe (Nährgelatine). Gelatine hat allerdings für den Einsatz als Geliermittel in der medizinischen Mikrobiologie zwei entscheidende Nachteile: 1. Viele Mikroorganismen können diesen einfachen Eiweißkörper enzymatisch (Gelatinasen) abbauen; dadurch wird das Gel verflüssigt, und die Kolonicbildung geht verloren. 2. Gallertc auf Gelatincbasis „schmelzen" bei Temperaturen über 28 °C und können deshalb zur Züchtung vieler Krankheitserreger nicht benutzt werden, da deren optimale Vermehrungstemperatur um 37 °C liegt.

Auf der Suche nach besser geeigneten Nährbodenverfestigern stieß KOCH 1882, durch einen Hinweis der Ehefrau seines Mitarbeiters HESSE, auf ein aus Ostasien stammendes Geliermittel, das aus roten Meeresalgen (Rhodophyzcen) gewonnen wird und das den malaiischen Namen Agar-Agar trägt. Agar-Agar, oder einfach Agar,

Abb. 2.18 Typische Kolonieformen. I. a) rund, glattrandig; b) unregelmäßig; c) amöboid; d) wurzelig; e) filamentös-myzelial II. f) glatt, halbkugelig; g) flach; h) flach mit zentralem Hütchen; i) glatt und mit zentraler Delle; k) rauh und unregelmäßig aufgehäuft; I) myzelial mit Luft- und Substratmyzel.

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Mikrobiologische Diagnostik

besteht aus hochmolekularen Galaktose-Schwefelsäure-Estern und ist fast geschmack-, geruchund farblos und nach Reinigung atoxisch für Mikroorganismen. Er ist unlöslich in kaltem Wasser, löst sich jedoch in kochendem Wasser und erstarrt noch in 0,5-1,0%iger Lösung zu einer Gallerte, wenn die Temperatur unter 45^18 °C absinkt. Einmal verfestigt läßt sich das Agargel erst bei Temperaturen zwischen 80 und 100 °C wieder verflüssigen. Außerdem wird die Substanz von bakteriellen Enzymen nur ausnahmsweise angegriffen. Damit besitzt sie Eigenschaften, die sie zu einem bis heute unersetzbaren Hilfsmittel für die Mikrobiologie werden ließen. Einige besonders anspruchsvolle Krankheitserreger benötigen für ihre optimale Vermehrung zusätzlich noch Blut (hämophile Bakterien) oder Serum im Nährmedium. In Agarnährböden dient die Zugabe von defibriniertem Schafblut (seltener Kaninchen-, Pferde-, Menschenblut) vor dem Erstarren oft nicht nur der Wachstumsförderung, sondern auch der Beurteilung des Hämolyseverhaltens (s.u.) bestimmter Bakterienarten. Komplexe natürliche Proteingemische (Serum, Hühnereier) können neben ihrer Funktion als Nährstofflieferanten außerdem zur Verfestigung bestimmter Nährmedien verwendet werden, da sie bei Erhitzung gerinnen und dann ähnlich wie Geliermittel wirken (z.B. LOEFFLER-Serumnährboden zur Diphtheriediagnostik; LöWENSTEiN-JENSEN-Eiernährboden für Mykobakterien). Einfache bakteriologische Nährmedien. Ein einfaches flüssiges Nährmedium und Grundbestandteil vieler Spczialsubstrate ist die Nährbouillon nach ROBERT KOCH. Sie enthält Fleischwasser (500 g fettfreics, gehacktes Rindfleisch in 1 1 Wasser kochen und nach dem Erkalten durch Papierfilter filtrieren) oder Fleischextrakt, 0,5% Kochsalz und 1% Pepton. Durch Zusatz von 12% Gelatine oder 1-3% Agar erhält man die einfachsten festen Nährböden (Nährgelatine und Nähragar nach KOCH). Nährmedien, die gelierende Substanzen enthalten, werden nach dem Autoklavieren auf etwa 50 °C abgekühlt und dann in sterile Kulturgefäße abgefüllt. Dazu dienen überwiegend Petrischalen und Reagenzgläser. In Petrischalen läßt man das Medium in etwa 5-7 mm hoher, gleichmäßig dicker Schicht erstarren („Nährbodenplatte"; früher wurden anstelle der Kulturschalen Glasplatten verwendet, der Name hat sich erhalten); Reagenzgläser bleiben nach Einfüllen des noch flüssigen Nährbodens senkrecht stehen (für Stich-Kulturen) oder werden bis zum Gelieren leicht (für Stich-Schräg-Kulturen) oder stark geneigt (für Schräg-Kulturen) gehalten. Kultivierung in flüssigen Nährmedien. Flüssige

Nährmedien dienen vor allem der Anreicherung

von Mikroorganismen, die im Untersuchungsmaterial in geringer Zahl oder in vorgeschädigtem Zustand vorhanden sind. Reinkulturen lassen sich allein über Nährbrühen nicht oder nur unsicher erreichen. Dies ist der Grund für den großen Fortschritt, welchen die Einführung der Geliermittel durch ROBERT KOCH im Vergleich zu den Arbeitsmethoden von Louis PASTEUR mit sich brachte. Liegen Reinkulturen bereits vor, kann die Bouillon zur Prüfung physiologischer Leistungen oder der Antibiotikaempfindlichkeit sowie zur Beurteilung des Wachstumsverhaltens herangezogen werden. Folgende Wuchsformen werden bei Bakterien, die in flüssigem Milieu kultiviert werden, beobachtet: 1. Vermehrung mit diffuser Trübung der Brühe (z.B. bei den meist beweglichen Mitgliedern der Familie Enterohacteriaceae) 2. Bildung eines Obcrflächenhäutchens (Kahmhaut) durch obligat aerobe Bakterien wie Pseudomonaden, Mykobakterien oder Nocardien 3. Wachstum in Form eines körnigen Bodensatzes ohne nennenswerte Trübung der Bouillon bei Arten mit fermentativem Stoffwechseltyp, die bei der Vermehrung größere, mehr oder weniger fest zusammenhängende Zcllaggregate ausbilden (z.B. Streptokokken, anaerobe Aktinomyzeten). In flüssigen Kulturen können außerdem charakteristische Merkmale wie Gasbildung oder Produktion wasserlöslicher Pigmente besonders gut geprüft werden. Um Kontaminationen aus der Luft zu vermeiden, werden Nährbrühen unter Schräghaltung des Kulturgefäßes beimpft, und dessen oberer Rand wird vor dem Aufsetzen des Verschlusses und dem Aufrichten in der Bunsenbrennerflamme abgeflammt. Zur Inokulation können Platinösen oder sterile Pipetten verwendet werden. Kultivierung auf festen Nährböden. Wie bereits

erwähnt, dienen feste Universalnährböden an erster Stelle zur Herstellung und Überprüfung von Reinkulturen. Dabei ist die Morphologie der entstehenden Kolonien ein wichtiges Hilfsmittel (s. Abb. 2.6a-l). Diese läßt sich am einfachsten bei Lupenbetrachtung (6 x) beurteilen und erlaubt dem Erfahrenen unter Berücksichtigung weiterer Eigenschaften wie Vorhandensein diffusibler oder kolonieständiger Pigmente, Hämolyseverhalten, Konsistenz und Größe der Kolonien eine rasche, vorläufige Einordnung der gewachsenen Mikroben, ihre gezielte Abimpfung sowie den ökonomischen Einsatz der erforderlichen Differenzierungsreaktionen. Um unterschiedliche Kolonieformen in der Oberflächenkultur sicher erkennen zu können, müssen mikrobenreiche Materialien allerdings so aufgeimpft werden, daß sie einzeln stehende

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

Kolonien entwickeln können. Unter Routinebedingungen bedient man sich dazu des sogenannten fraktionierten (Verdünnungs-) oder DreiÖsen-Ausstrichs (Abb. 2.19). Dieser verteilt das Tnokulum in drei Arbeitsschritten so auf der Agarplatte, daß selbst Untersuchungsstoffc hoher Mikrobendichte ausreichend ausgedünnt werden, um Einzelkolonien entstehen zu lassen. Spczialnährmedien. Die meisten Nährböden werden heute auch kommerziell hergestellt (Fertignährböden), oder ihre jeweiligen Ingredienzien sind fertig gemischt in Trockenform im Handel erhältlich. Hinsichtlich der Einzelheiten wird auf die Broschüren der in Frage kommenden Firmen wie z.B. Becton Dickinson, bioMerieux, Biotest, Merck, Oxoid verwiesen.

Die bisher besprochenen Universalmedien ermöglichen einer Vielzahl verschiedener Mikroorganismen ungehinderte Vermehrung. Sie sind deshalb weniger geeignet, aus Materialien, die gleichzeitig mehrere unterschiedliche Mikrobenarten enthalten (z.B. Sputum-, Stuhlproben), bestimmte wichtige Spezies (z.B. Krankheitserreger) gezielt nachzuweisen, insbesondere wenn letztere nur in geringer Menge vorhanden sind. Für diesen Zweck benötigt man vielmehr Spezialnährmedien, die das Wachstum unerwünschter Mikroben unterdrücken (Selektivmedien), die Vermehrung der gesuchten Arten überproportional fördern (Elektivmedien) oder biologische Unterschiede innerhalb der wachsenden Mischflora erkennbar machen (Differentialmedien). Anreicherungsmedien (Elektivmedien). Werden mehrere Mikrobenarten gleichzeitig in eine Nährbrühe eingeimpft, kann es zu einem Wettstreit um vorhandene Nährstoffe und zu gegenseitiger Behinderung durch anfallende Stoffwechselschlacken kommen. Dabei werden langsam wachsende oder zahlenmäßig unterlegene Spezies häufig überwuchert und entziehen sich so dem Nachweis. Durch Zugabe bestimmter selektiver Hemmstoffe oder durch Veränderung des pH-Wertes und der Kulturbedingungen kann man jedoch die an sich benachteiligten Mikroorganismen so begünstigen, daß sie sich gegen ihre Konkurrenten in der Nährlösung durchsetzen können und dadurch anreichern lassen. Beispiele für Elektivmedien, die mit chemischen Inhibitoren arbeiten, sind die TetrathionatBrühe nach MÜLLER und die Selenit-F-Brühe nach LEIFSON zur Anreicherung von Salmonellen aus Stuhlproben. Die Nährlösungen, die der Anzüchtung von Mykoplasmen dienen, werden

Abb. 2.19 Technik des Drei-Ösen-Austrichs: 1. Auftragen des Untersuchungsmaterials mit Öse oder Tupfer. 2. Verdünnungsausstrich mit frisch ausgeglühter Öse durch das Ende von 1. 3. Verdünnungsausstrich mit frisch ausgeglühter Öse durch das Ende von 2.

zur Unterdrückung anderer Bakterien mit Penicillin G (20 IE/ml) und/oder Thalliumazetat (0,0033%) versetzt. Weitere clektive Anreicherungsprinzipien sind vom Neutralpunkt stark abweichende pH-Werte (alkalisches Pcptonwasser pH 9,5 für Vibrionen; saure Pilznährmedien pH 5,6), extreme Bebrütungstemperaturen (Kälteanreicherung bei +4 °C von Listerien; Anzucht thermophiler Bakterien bei 55 °C und mehr), hoher Kochsalzgehalt (z.B. für Staphylokokken 7,5%, Enterokokken 6,5% und halophile Vibrionen 7-10%) oder die Bereitstellung ungewöhnlicher Nährstoffe in Mangelmedien (z.B. Paraffin-Köder-Methode für Nocardien). Selektivnährböden. Das oben genannte Prinzip der selektiven Unterdrückung unerwünschter Mikroben durch verschiedene Inhibitoren kann auch in festen Nährböden zur Anwendung kommen. Solche reinen Selektivmedien sind u.a. der Malzagar nach GRütz und der SABOURAUDAgar mit Chloramphenicol- und/oder Streptomycin-Zusatz, die beide durch saures Milieu und ihren Antibiotikagehalt eine Herauszüchtung von Pilzen aus bakteriell stark verunreinigten Untersuchungsproben gestatten, der Kanamycin-Vancomycin-Blutagar zum kulturellen Nachweis gramnegativer Anaerobier sowie das

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Mikrobiologische Diagnostik

LÖWENSTEIN-JENSEN- und das STONEBRINK-MCdium, die durch ihren Malachitgrüngehall das Wachstum anderer grampositiver Bakterien zugunsten von Mykobakterien unterdrücken. Diffcrentialnährbüden. Mit Differential- oder Differenzierungsmedien werden bestimmte, diagnostisch relevante physiologische („biochemische") Leistungen von Mikroorganismen geprüft und durch primäre oder sekundäre Zugabe geeigneter Indikatorreagenzien sichtbar gemacht. Überwiegend dienen derartige Nährböden der Charakterisierung und Identifizierung bereits vorliegender Reinkulturen (s.u.); zuweilen werden sie aber auch zur Erkennung und Quantifizierung einzelner Komponenten einer natürlichen, ohne Selektionsmechanismen angezüchteten Mischflora herangezogen (z.B. Zählung von Gelatineverflüssigern oder LLS-bildenden Clostridien in Trinkwasserproben). Kombinierte Differential- und Selektivmedien. Kulturmedien, die gewisse Mikrobengruppen selektiv anwachsen lassen und gleichzeitig innerhalb der gewachsenen Arten Unterscheidungen erlauben, haben für die medizinische Mikrobiologie größte praktische Bedeutung. Dies soll an folgenden Beispielen verdeutlicht werden: Einer der Standardnährböden für die kulturelle Diagnostik entcraler Infektionen - und allgemein für Selektion und Differenzierung anspruchsloser, gramnegativer Bakterien - war der Fuchsin-Sulfit-LaktoseAgar nach ENDO. Er unterdrückt das Wachstum der meisten gram-positiven Bakterien, während sich Enterobakteriazeen und einige obligat aerobe gram-negative Bakterien ungehindert vermehren können und nach ihrem Laktose-Spaltungsvermögen differenziert werden. Beim fermentativen Abbau der im Medium enthaltenen Laktose entstehen nämlich intermediär Aldehyde, welche aus der farblosen, bei der Nährbodenzubereitung entstandenen fuchsinschwefligen Säure den Farbstoff Fuchsin freisetzen, der die entsprechenden Kolonien und ihre Umgebung rot färbt und auf manchen von ihnen als ..Fuchsinglanz" auskristallisiert (typisch für normale Darmbakterien wie z.B. Escherichin-, Enterobacter-, Citrobacter-Aitcn). Bakterien ohne die Fähigkeit zur Laktosevergärung (z.B. Krankheitserreger wie Salmonellen und Shigellen) bilden demgegenüber auf ENDO-Agar farblose oder blaß-rosa Kolonien. Einen ähnlichen Einsatzbereich hat der MAC-CoNKEY-Agar, der heute dem ENDOAgar wegen der krebserzeugenden Wirkung von Fuchsin vorgezogen wird. Nährböden mit stärkerer Selektivität für Salmonellen sind der WiLSON-BLAiR-Agar (Hemmstoff: Brillantgrün: Differenzierungsreaktion: ELS-Bildung: Indikatorreaktion: Bildung von schwarzem Wismutsulfid) und für Salmonellen, Shigellen und Yersinien der LF.IFSON-Agar (Hemmstoff: Na-Desoxycholat: Differenzierungsreaktion: Laktose-Spaltung und HiS-Bil-

dung: Indikatorreaktion: Fällung von Dcsoxycholat und Eisensulfid-Bildung) oder der Salmonella-Shigella-Agar (SS-Agar) mit 2% Desoxycholat. Häufig verwendete Differential- und Selektivnährböden sind ferner der Kaliumtellurit enthaltende CLAUBERG-II- bzw. -III-Nährboden sowie der TINSDALEAgar zur Isolierung und Differenzierung von Corynebaktcrien. Auf weitere Differential- und Selektivnährböden wird im speziellen Teil bei den einzelnen Bakterienarten hingewiesen. Kulturverfahren für Anaerobier

Obligate (strikte) Anaerobier können sich in Gegenwart von Luftsauerstoff nicht in Oberflächenkultur vermehren, häufig werden sie sogar durch Sauerstoff oder, wahrscheinlich eher, durch Anhäufung seiner toxischen Reaktionsprodukte, z.B. Wasserstoffperoxid und das Superoxid-Radikal, rasch abgetötet, offenbar weil ihnen die „entgiftenden" Enzyme SuperoxidDismuta.se und/oder Katalase bzw. Peroxidase

fehlen (s. Kap. 3.2.1). Zur erfolgreichen Anzüchtung anaerober Bakterien ist deshalb eine Gasatmosphäre erforderlich, aus der auf physikalischem, chemischem oder biologischem Wege der Luftsauerstoff mehr oder weniger weitgehend entfernt worden ist. Darüber hinaus sollten die verwendeten Kulturmedien ein ausreichend niedriges Redoxpotential (Eh) aufweisen, was durch Zugabe von geeigneten Reduktionsmitteln, „anaerobe Sterilisation" und Verhinderung sekundärer Aufoxidation erreicht wird. Nährmedien für Anaerobier. Die einfachsten

Nährböden zur Züchtung anaerober Krankheitserreger bestehen aus hochwertigen, komplexen Universalmedien (z.B. Hirn-Herz-Glukose-Medium, Hefeextrakt-Blutagar), denen Reduktionsmittel (z.B. Zystein, Na-Thioglykolat, Askorbinsäure) und eventuell ein Redoxindikator (z.B. Resazurin) zugesetzt werden. Beim Autoklavieren wird der gelöste Sauerstoff ausgetrieben und die Ingredienzien liegen in reduziertem Zustand vor. Um eine sekundäre Aufoxidation gering zu halten, müssen sie alsbald verbraucht oder unter Sauerstoffabschluß gelagert werden. Beispiele für diese Art von Anaerobiermedien sind die Thioglykolat-Boiällon als flüssiges Anreicherungsmedium oder der Glukose-Hefeextrakt-Zystein-Blutagar nach BEHRENS. Für besonders sauerstoffempfindliche Arten werden allerdings aufwendigere Herstellungstechniken benötigt, bei denen der Nährboden in luftdicht verschließbaren Röhrchen in sauerstofffreier Atmosphäre sterilisiert wird (PRAS-Medien = Pre-Reduced

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

Anaerobically Sterilized). Eine Reihe klinisch wichtiger Anaerohier vermag sich nur dann ausreichend zu vermehren, wenn das Kulturmedium mit bestimmten Wuchsstoffen supplementiert wird. Dazu gehören u.a. Bikarbonat (als CO^-Licfcrant), Hämin. Vitamin K. Succinat und/oder Pyruvat. Methoden zur Schaffung der sauerstoffreien Gasatmosphäre bzw. zur Erhaltung des niedrigen Redoxpo-

tentials. Flüssige Anreicherungsmedien, in „hoher Schicht" in Reagenzgläser abgefüllt, werden beim Stehen an der Luft nur langsam von oben nach unten aufoxidiert. Besonders mit Zugabe einer geringen Agarmenge, die diesen Prozeß weiter verlangsamt, erlauben sie deshalb vielen Anaerobiern Tiefenwachstum (Tiefenkulturcn). wenn vor der Beimpfung durch Erhitzen im Dampftopf der Sauerstoff entfernt, ein großes Inokulum eingebracht und das Medium während der Bebrütung nicht aufgeschüttelt wird. Durch Überschichten mit fest werdendem, sterilem Paraffin oder steriler Vaseline nach der Beimpfung kann weiterer Luftzutritt unterbunden werden, so daß anaerobe Verhältnisse auch für längere Bebrütungszeiten erhalten bleiben. Besonders leistungsfähige Anreicherungsmedien, die nach diesem Prinzip arbeiten, enthalten zusätzlich Gewebestückchen, welche, etwa durch die SulfhydrylGruppen ihrer Proteine, eine ausgeprägte Sauerstoffbindungsfähigkeit besitzen und verschiedenste Nährstoffe bereitstellen. Verwendet werden Leberstückchen (TAROZZi-Bouillon). Hirnbrei oder -Stückchen (VON HiBLER-Medium: RosENOW-Bouillon) oder Muskelfleisch („chopped/cooked meat medium"). Anaerobe Obcrflächenkulturen auf Agarnährböden erfordern die Entfernung des Luftsauerstoffs aus der umgebenden Atmosphäre. Dies kann individuell für jedes Kulturgefäß einzeln oder für mehrere gleichzeitig erfolgen. Einfache Verfahren zur Bindung des Sauerstoffs in Reagenzgläsern (mit Schräg- oder Stichagar) oder Petrischalen sind das Pyrogallol-Verfahren nach BUCHNER (Pyrogallol in alkalischer Lösung bindet in geschlossenen Gefäßen den Luftsauerstoff) und das FORTNER- Verfahren (Sauerstoffzehrung durch Serratia marcescens. die in Kokultur mit den Anaerobiern auf einer mit Plastilin luftdicht verschlossenen Agarplatte wächst). Wesentlich aufwendiger, aber auch leistungsfähiger ist die Roll-Tube-Methode nach HUNGATE, die PRAS-Medien in Reagenzgläsern mit Schraubverschluß benutzt und bei der alle Arbeitsgänge unter einem sauerstoffreien Gasstrom erfolgen. Für anaerobe Oberflächenkulturen am meisten verwendet werden heute aber sogenannte Anaerobiertöpfe (Anaerostaten) und Anaerobier-Brutschränke. Im einfachsten Falle werden diese mit Kulturschalen beschickten Behältnisse nur evakuiert, um die Sauerstoffspannung abzusenken (ZEISSEER-Topf). Sie können aber auch, nach Evakuieren, mit sauerstoffreien Gasgemischen (z.B. 10% H,, 5% CO2. 85% N2) geflutet werden, was die Austrocknung der Nährböden verringert und die Zufuhr von wachstumsförderndem Kohlendioxid erlaubt. Modernere kommerzielle Verfahren (z.B. GasPak*-System) können auf die vorherige Evakuierung verzichten, da sie den im verschlossenen Anaerobier-

topf verbleibenden Luftsauerstoff mit Wasserstoffgas katalytisch zu Wasser verbrennen. Umgang mit Anaerobiern im Routinelaborato-

rium. Die kulturelle Diagnose einer Anaerobierinfektion wird um so zuverlässiger, je weniger das klinische Untersuchungsmaterial, die Nährmedien und die Primärkulturen mit Luft in Kontakt kommen. Die meisten anaeroben Krankheilserreger vertragen es allerdings durchaus, kurzfristig dem Luftsauerstoff ausgesetzt zu werden. Für Routinezwecke genügt es deshalb in der Regel, wenn die Materialproben rasch oder in reduzierenden Transportmedien transportiert und im Laboratorium baldigst verarbeitet werden. Außerdem sollten frisch hergestellte oder vor der Verwendung nochmals erhitzte Nährmedien zum Einsatz kommen, und die Kultivierung muß natürlich in Sauerstofffreier oder -armer Atmosphäre erfolgen. Anlage und Beurteilung der Primärkulturen sowie Überimpfungen werden meist an der Luft vorgenommen. Um die Dauer dieser Luftexposition bei vertretbarem Arbeits- und Materialaufwand nicht zu lange werden zu lassen, werden vielfach sogenannte „holding jars" eingesetzt. Dies sind Gefäße, die kontinuierlich mit Stickstoff und/oder Kohlendioxid durchströmt werden und in denen Untersuchungsproben, Kulturen und beimpfte Nährböden so lange aufbewahrt werden, bis sie weiterverarbeitet oder in Anaerostaten übertragen werden können. Die viel aufwendigere HuNGATE-Technik oder die Anaerobier-Kammer (glove box), bei denen alle Arbeitsgänge in einem O2-freien Gasgemisch ablaufen, werden zwingend für ökologische Studien, aber nicht unbedingt für die Routinediagnostik benötigt. Züchtung von karboxiphilen und mikroaerophi-

len Bakterien. Bakterien mit fermentativem Stoffwechseltyp, die durch Sauerstoff nicht oder nur unwesentlich beeinträchtigt werden, aber eine erhöhte CO2-Spannung für optimale Vermehrung benötigen, werden als fakultativ anaerob-karboxiphil oder kapnophil bezeichnet (z.B. Actinomyces viscosus, Capnocytophaga spp.). An der Luft zeigen sie kein oder nur stark gehemmtes Wachstum; dasselbe gilt für eine O2und CO2-freic Atmosphäre. Dagegen vermehren sie sich gut, wenn sie in Anwesenheit von 5-10% CO2 mit und ohne Sauerstoff bebrütet werden. Ein einfaches Verfahren, um diese Kulturbedingungen zu schaffen, ist der sogenannte Kerzentopf, ein luftdicht verschließbares Gefäß aus

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Mikrobiologische Diagnostik

Glas oder Kunststoff, in welches vor Aufsetzen des Deckels zusammen mit den beimpften Nährböden eine brennende Kerze gestellt wird, die von selbst verlöscht, wenn ein Teil des Luftsauerstoffs verbraucht und die CCVSpannung angestiegen ist. Alternativ können Gefäße oder gasdichte Brutschränke verwendet werden, die mit einem 10%igen CO2-Luft-Gemisch begast werden. Die Bezeichnung „mikroaerophil" wird häufig noch als Synonym für „karboxiphil" gebraucht. Dies widerspricht aber dem eigentlichen Wortsinn und auch der wissenschaftlichen Definition des Begriffes. Denn danach gelten nur solche Bakterien als mikroaerophil, die Sauerstoff als terminalen Elektronenakzeptor benötigen, aber bei dem natürlichen Sauerstoffgehalt der Luft von etwa 21 vol% ebensowenig wachsen können wie bei vollständiger OvFreiheit (z.B. Campylobacter-Arten). Sie benötigen deshalb speziell abgestimmte Gasgemische (z.B. 5% O2,10% CO2, 85% N2), die in geeigneten Gefäßen oder Inkubatoren bereitgestellt werden. Halb- und vollautomatische Kultursysteme

Zur Arbeitserleichterung und Ergebnisbeschleunigung wird seit Jahren von verschiedenen Firmen an der Entwicklung von Flüssigkulturverfahren gearbeitet, die grundsätzlich für eine teilweise oder weitgehende Automatisierung der wichtigsten Arbeitsgänge geeignet sind. Ausgangspunkt und Vorreiter dieser Entwicklung waren die radiometrischen Kultursysteme der Firma Becton Dickinson, Sparks, USA, die unter dem Namen BACTEC in den Handel kamen. Diese Systeme, die sowohl für die Blutkulturdiagnostik als auch für die kulturelle Diagnostik der Tuberkulose und anderer Mykobakteriosen angeboten wurden und teilweise noch werden, haben zum Prinzip, daß wachsende Bakterien aus radioaktiv markierten Nährstoffen im Kulturmedium radioaktives Kohlendioxid in die Gasphase der mit einem Durchstichstopfen luftdicht verschlossenen Kulturflasche abgeben. Durch periodische Punktion des Durchstichstopfens kann jeweils ein kleines Volumen der Gasphase aus der Blutkulturflasche abgesaugt und hinsichtlich seiner Radioaktivität gemessen werden. Aktiv wachsende und damit stoffwechselaktive Kulturen erzeugen zunehmende Mengen von radioaktivem CO2, dessen Konzentration damit ein direktes Maß der bakteriellen Vermehrung darstellt, sofern gewährleistet ist, daß die eingesetzten, mit radio-

aktivem 14C markierten Verbindungen von allen oder doch allen üblichen zu erwartenden Bakterien metabolisiert werden. Die radiometrischen Kulturverfahren haben sowohl die Blutkulturdiagnostik als auch die Tuberkulosediagnostik erheblich verbessert und beschleunigt. Der Zeitbedarf für die Tuberkulosediagnostik konnte von im Mittel 4 bis 6 Wochen bei Anwendung der konventionellen Kulturverfahren (z.B. Eiernährböden) auf durchschnittlich 9 bis 14 Tage bei Anwendung des BACTEC-Systems gesenkt werden. Auch der Zeitbedarf der häufig lebensrettenden Blutkultur-, das heißt Sepsisdiagnostik, konnte deutlich verkürzt werden. Leider haben die radiometrischen Verfahren aber zwei wichtige Nachteile: Der erste Nachteil ist die Notwendigkeit, den Verschlußstopfen der Kulturflasche immer wieder zu punktieren, um die Gasphase auf Radioaktivität prüfen zu können. Dadurch kann es zu Kontaminationen, vor allem zu Kreuzkontaminationen zwischen schon bewachsenen und nicht bewachsenen Kulturflaschen kommen. Ein zweiter, heute besonders kritisch zu sehender Nachteil ist der Anfall recht großer Mengen schwach radioaktiven Abfalls, dessen Entsorgung immer teurer geworden ist und der natürlich auch ökologisch nicht unbedenklich ist. Folgerichtig wurden sehr bald, auch von der Firma Becton Dickinson. Versuche unternommen, andere, nicht-radioaktive Indikatoren des mikrobiellen Wachstums zu verwenden. Gleichzeitig wurde versucht, die erforderlichen Arbeitsläufe so weit wie möglich zu automatisieren. Automatische Blutkultursysteme. Vollautomatische Blutkultursysteme haben den entscheidenden Vorteil, beimpfte Blutkulturen kontinuierlich auf Erregerwachstum überwachen zu können. Sie haben sich deshalb, auch in Deutschland, praktisch in allen Laboratorien durchgesetzt. Die gebräuchlichsten Systeme sind gegenwärtig das BacT/Alert-Systcm (Organon Teknika Corporation, Durham, USA), das BACTEC 9240-System (Becton Dickinson Diagnostic Instrument Systems, Sparks. USA) und das Vital-System (BioMerieux, Marcy LEtoile, Frankreich). Als mikrobieller Wachstumsindikator dient bei allen drei Systemen das aus dem Nährmedium freigesetzte Kohlendioxid. Nicht radiometrisch kann dieses spektrophotomelrisch bzw. fluorometrisch oder auch manometrisch am entstehenden Überdruck nachgewiesen werden. Für die automatische Überwachung ist erforderlich, daß die Geräte über eine Inkubationseinheit verfügen, in der die Blutkulturflaschen über die gesamte Kulturdauer gehalten und unter Schütteln bebrütet werden. Außerdem gehört zum Gerät eine Meßeinheit sowie ein PC, der die Meßwerte sammelt und in geeigneter Weise auswertet. Eine unmittelbare Online-Übertragung der erhaltenen Ergebnisse in die oft vorhandenen Labor-EDV-Systeme ist in der Regel ebenfalls möglich. Aufgrund der unterschiedlichen CO2-Detektionstechnik weisen die genannten kom-

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

merziellcn Systeme gewisse Unterschiede in Handhabung und Fehlermöglichkeiten auf. Grundsätzlich sind sie aber alle für den Routineeinsatz geeignet und tragen dazu bei, die Blutkullurdiagnostik erheblich zu beschleunigen. Automatische Kultursysteme für Mykobakterien.

Auch in der Diagnostik von Mykobakterieninfektionen. die von der Einführung der radiometrischen Verfahren besonders profitiert hat, ist die Entwicklung inzwischen in Richtung nicht-radioaktiver Verfahren weitergegangen, obwohl das klassische, radiometrische BACTEC-System für Mykobakterien immer noch vielerorts im Einsatz ist und auch als Standardverfahren gilt. Im BACTEC-9000-MB-System der Firma Becton Dickinson Diagnostic Instrument Systems wird als Wachstumsindikator ein Sauerstoffsensor verwendet. Dieser besteht aus einem Ruthenium-Metall-Komplex, dessen Fluoreszenz in Anwesenheit von Sauerstoff unterdrückt wird. Mit zunehmendem Wachstum der obligat aeroben Mykobakterien wird Sauerstoff verbraucht, was eine zunehmend stärker werdende Fluoreszenz des Indikators auslöst, wenn die Flaschen mit UV-Strahlen von 365 nm Wellenlänge bestrahlt werden. Im Gegensatz zu den Blutkulturen benötigen die Mykobakterien-Flüssigkultursysteme komplexe hemmende Zusätze, die das Wachstum anderer Bakterien und das Pilzwachstum so weil wie möglich unterdrücken sollen. Das resultierende Elektivmedium ist aber natürlich nicht in der Lage, auch das Wachstum aller phylogenetisch nahe verwandten Baktcrienartcn und ggf. multiresistenter Stämme anderer Arten zuverlässig zu unterdrücken. Deshalb gilt für alle flüssigen Mykobakterien-Kullursysteme, daß ein Bewuchs immer hinsichtlich der Identität der vorhandenen Mikroorganismen zu überprüfen ist, bevor auch nur eine Verdachtsdiagnose gestellt werden kann. Das MB/BacT-System der Firma Organon Teknika verwendet demgegenüber einen kolorimetrischen Kohlendioxidscnsor, der im Boden jeder Kulturflasche angebracht ist und Wachstum an der Konzentrationszunahme von Kohlendioxid mißt. Andere Systeme, die bisher in Deutschland weniger gebräuchlich sind, verwenden auch zum Mykobakterien-Wachstumsnachweis Druckveränderungen in der luftdicht verschlossenen Kulturflasche.

Identifizierung von Bakterien Der Vorgang der Identifizierung besteht in der Beschaffung möglichst umfassender Informationen (s. Tab. 2.4) über die Eigenschaften einer unbekannten Reinkultur, im Vergleich der erhaltenen Merkmale mit denen gut definierter Taxa und in der Benennung des Isolates nach demjenigen Taxon, mit dessen Beschreibung sich eine vollständige oder nahezu vollständige Übereinstimmung feststellen läßt. Da die zelluläre und kulturelle Morphologie der Bakterien nur eine vergleichsweise geringe Vielfalt auf-

weist, reichen morphologische Kennzeichen bei diesen Mikroben in der Regel zur Artdiagnose nicht aus (s.o.). Diese erfordert vielmehr die Untersuchung zusätzlicher molekularbiologischer, chemischer, physiologischer oder ggf. antigenetischer Eigenschaften, deren Zahl und Art von der Erfahrung und Intuition des Bakteriologen und von den biologischen Besonderheiten der jeweils bearbeiteten Bakteriengruppe abhängen (s. Tab. 2.4). Alle für die Identifizierung herangezogenen Merkmale sollten zuverlässig bestimmbar und konstant ausgeprägt sein. Molekularbiologische Identifizierungsverfahren

Moderne molekularbiologische Verfahren wie die Bestimmung des Guanin- und Zytosingehaltes der chromosomalen DNA, DNA-DNAoder DNA-rRNA-Hybridisierungen oder die Sequenzierung größerer Teile des DNA-Gens der ribosomalen RNA (rRNA) sind das methodische Rüstzeug, mit dessen Hilfe die Taxonomie der Bakterien inzwischen zunehmend auf eine präzisere phylogenetische Basis gestellt werden konnte. Viele dieser Methoden sind prinzipiell auch für den diagnostischen Einsatz geeignet, sind aber für diesen Zweck meist immer noch recht aufwendig und kostenintensiv. Ihre methodischen Grundlagen ebenso wie ihre Einsatzbereiche werden im Abschnitt „Molekularbiologische Verfahren in der mikrobiologischen Diagnostik" (Kap. 2.3.4) ausführlich besprochen. Chemotaxonomische Identifizierungsverfahren

Aufbau und Struktur der bakteriellen Zellwändc, Komponenten der Zytoplasmamembran und des Zytoplasmas selbst sowie Inhaltsstoffe der äußeren Zellumhüllungen stellen taxonomische Merkmale dar, welche der Aussagekraft der später zu besprechenden molekularbiologischen Marker nur wenig nachstehen (s. Kap 3.1.2). Die entsprechenden Untersuchungsverfahren konnten inzwischen, wenigstens teilweise, so stark vereinfacht und standardisiert werden, daß sie sich auch für die Identifizierung von Krankheitserregern unter Routinebedingungen hervorragend nutzen lassen. Dies gilt z.B. für den relativ einfachen, dünnschicht- oder papierchromatographischen Nachweis der Isomeren der Diaminopimelinsäure aus bakteriellen Zellwänden, für die gaschromatographische Analyse von zellulären Fettsäuren oder für die dünnschichtoder gaschromatographische Bestimmung der Mykolsäuren von Mykobakterien, Nocardien

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Mikrobiologische Diagnostik

und Corynebakterien, denen allen erhebliche differentialdiagnostische Bedeutung zukommt. Physiologische Identifizierungsverfahren

Bakterien unterscheiden sich vielfältig in ihrer Enzymausstattung und damit in ihren Fähigkeiten, organische und anorganische Verbindungen ab- oder umzubauen. Vor allem die leicht meßbaren physiologischen („biochemischen") Leistungen ihres katabolcn und Atmungsstoffwechsels haben sich seit langem für Identifizierungszwecke bewährt. Da viele dieser Stoffwechselleistungen durch verschiedene Indikatorreaktionen sichtbar gemacht werden können und da in der Regel mehrere Eigenschaften gleichzeitig in einer Reihe von Reaktionsansätzen überprüft werden, entsteht wegen der unterschiedlichen Farbreaktionen der einzelnen Indikatoren bei der Ablesung ein buntes Bild: Man spricht von einer „Bunten Reihe". Nachweis von Atmungskettenenzymen. Vorhandensein oder Fehlen von Katalase, Zytochromoxidase und Peroxidasen haben große differcntialdiagnostische Bedeutung. Die Katalase-Aktivität einer Kultur läßt sich einfach prüfen, indem man sie direkt (auf einem blutfreien Nährboden) oder nach Übertragung einer kleinen Menge Koloniemassc auf einen Objektträger mit 3%iger H2C>2-Lösung übergießt. Aufsteigende Gasblasen (O2) zeigen die Anwesenheit des Enzyms an. Zytochromoxidase kann z.B. durch Übergießen der Kultur mit einer l%igen Tetramcthyl-p-phenylendiamin-Lösung nachgewiesen werden. Im positiven Falle entwickelt sich innerhalb von Sekunden bis Minuten eine dunkel-violette Verfärbung der Kolonien. Nitratreduktasen reduzieren Nitrat zu Nitrit, welches im Kulturmedium nach Zugabc von sulfanilsaurem «Naphthylamin (GRiFSsches Reagenz) durch die Bildung eines roten Azo-Farbstoffes sichtbar gemacht wird. Weitere Reduktion des Nitrits wird an der N2Gasbildung oder am Verschwinden des Nitrits aus dem Medium gemessen.

Vergärung von Kohlenhydraten, Alkoholen und Glykosiden. Fermentative, saccharolytische Bakterien vergären Kohlenhydrate und ähnliche Verbindungen unter Bildung saurer Stoffwechselendprodukte. Diese führen zu einer Absenkung des pH-Wertes in flüssigen und festen Nährmedien, welche mit Indikatoren oder pHmetrisch festgestellt wird. Indikatoren wie Phenolrot oder Bromthymolblau sind für die meisten Bakterien nicht toxisch, so daß sie den Differenzierungsmedien schon vor der Beimpfung zugesetzt werden können. Wegen der Vielzahl der verfügbaren, geeigneten Kohlenstoffverbindungen und wegen des unterschiedlichen En-

zymmusters der Bakterien gehören diese Vergärungstests zu den einfachsten und wichtigsten Identifizierungsverfahren. Assimilation von Kohlenhydraten, Alkoholen, Glykosiden und Fettsäuren. Bakterien mit oxidativem Energiestoffwechsel bilden beim Abbau von Kohlenhydraten, wenn überhaupt, nur wenig Säure. Eine pH-Absenkung tritt deshalb nur dann ein, wenn das Züchtungsmedium wenig Pepton enthält, aus dem alkalische Valenzen freigesetzt werden können. Dieses Prinzip findet im OF-Medium nach HUGH und LEIFSON Verwendung, mit dem oxidative und fermentative Bakterien unterschieden werden können. Häufig prüft man die Verwertung von organischen Kohlenstoff- (und Stickstoff-) Verbindungen aber im sogenannten Auxanogramm. Hierbei wird ein Mangelmedium eingesetzt, das - im Falle des C-Quellen-Auxanogramms - eine anorganische Stickstoffquelle (z.B. Ammoniumsulfat), die zu testende Kohlenstoffverbindung und Puffersalze enthält. Wenn der eingeimpfte Mikroorganismus in der Lage ist. die angebotene Kohlenstoffverbindung zu assimilieren, tritt makroskopisch sichtbares Wachstum ein; im anderen Falle bleibt das Medium unbewachsen. Auxanographische Verfahren werden sowohl zur Identifizierung obligat aerober (Nocardien, schnell wachsende Mykobakterien, Pseudomonaden) und fakultativ aerober Bakterien (z.B. Serratien) als auch verschiedener Pilze, insbesondere Candida-AxXcn. verwendet.

Dasselbe Verfahren ist auch bei fermentativen Bakterien zur Prüfung der Zitrat-Verwertung gebräuchlich (SiMMONS-Zitrat-Nährboden). Nachweis von Enzymen des EiweißstofTwechsels. Die Produktion proteolytischer Enzyme kann einfach, aber relativ grob durch Prüfung des Gelatine- (Verflüssigung), Kasein- (Klärung von milchhaltigen Agarmedien) oder Serumabbaus (Verflüssigung von LöFFLHR-Medien) nachgewiesen werden. Eine ähnliche Technik (Klärung der durch das Testsubstrat getrübten Nährböden) findet auch für die Untersuchung der „Hydrolyse" von Tyrosin und Purinen Anwendung. Im weiteren Sinne gehört zu den Identifizierungsreaktionen, die auf Enzymen des Eiweißstoffwechsels basieren, auch die Indolbildung aus Tryptophan: Indol ergibt mit EHRLICHSoder Kov'ACs-Reagenz eine Rotfärbung, wodurch es leicht in bewachsenen Kulturen erkennbar wird. Freisetzung von Schwefelwasserstoffgas aus SH-Gruppen-haltigen Aminosäuren (oder anderen Schwefelverbindungen) durch bakterielle Desulfhydrasen wird mit Me-

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

tallsalzen (z.B. Eisen-, Bleisalzen) nachgewiesen, die entweder dem Nährmedium zugegeben (Eisen) oder in Filterpapier (Bleiazetat) über der Nährbodenoberfläche aufgehängt werden und mit H2S schwarze Niederschläge von Sulfiden ergeben. Polytrope Differenzierungsmedieii. Zur Arbeits- und Materialeinsparung wurden sogenannte polytrope Differenzierungsmedien entwickelt, in denen gleichzeitig mehrere Stoffwechselleistungen geprüft werden können. Ein typisches Beispiel dafür ist der Zwei-Zucker-Eisen-Agar nach KLIGLER, mit welchem die Vergärung von Glukose und Laktose, die H2S-Bildung und die Gasbildung untersucht werden können. Wie der Triple-Sugar-Iron-Agar (Glukose, Laktose, Saccharose, H?S, Gas) hat sich dieses Medium besonders zur Identifizierung von Enterobakteriazeen bewährt. Weitere polytrope Medien mit ähnlichem Einsatzbereich sind u.a. der Lysin-Eisen(Iron)-Agar (LIA) zum Nachweis von Lysindekarboxylase. Lysindesaminase und H2S-Bildung oder das MotilitätsIndol-Ornithin-Medium (MIO), mit dem auf Beweglichkeit, Indolbildung und Ornithindekarboxylase geprüft wird. Nachweis von Desaminasen und Dekarboxylasen. Lysin- und Ornithindekarboxylasen, Arginindihydrolase und Phenylalanindesaminase liefern wertvolle Kriterien zur Differenzierung von Enterobakteriazeen und Vibrionazeen. Einen breiteren Einsatzbereich haben die Medien zur Prüfung der bakteriellen f//'ef«
nen (z.B. API 20E®, API 20 Strep®, Crystal E/NF®, Rap 1D ANA II®) und die neben den klassischen Differenzierungsreaktionen auch chromogene oder fluorogene Substrate zum Nachweis mikrobieller Enzymprofile enthalten. Für Bakterien mit oxidativem Kohlenhydratmetabolismus (API 20 NE®, Rap ID NF Plus®) und für Pilze (API 20 C AUX®, Uni-Yeasl Tek®, YT® Biolog) werden darüber hinaus inzwischen auch miniaturisierte Testkits für Assimilationsprüfungen (Auxanogramme) kommerziell angeboten. Einige dieser Systeme werden manuell beimpft, weiterbearbeitet und mit bloßem Auge anhand des Farbumschlags verschiedener beigegebener Indikatoren oder anhand anderer makroskopisch sichtbarer Indikatorreaktionen abgelesen. Es gibt aber auch schon mechanisierte und teilweise oder völlig automatisierte Identifizierungssysteme (z.B. Cobas-Bact ID®, V1TEK®, NEG ID Type 2®, Rapid Anaerobe®, Micronaut®), bei denen sowohl Schritte der Beimpfung und die Inkubation der Reaktionsansätze als auch die (photometrische oder nephelometrische) Ablesung der Ergebnisse einem Gerät überlassen werden, das zuweilen sogar über eine in einen Elektronenrechner eingespeicherte Datenbank das fertige Identifizierungsergebnis (Spezies-Diagnose) auswirft. Manuelle kommerzielle Systeme zur Identifizierung von Mitgliedern der Familie Enterobacteriaceae haben inzwischen besonders weite Verbreitung gefunden. Darüber hinaus werden auch Testkits zur Identifizierung von nicht-fermentierenden und Oxidase-positiven, fermentierenden Bakterien, von Anaerobiern sowie von Streptokokken, Staphylokokken, Corynebakterien. Bazillen, Neisserien, Haemophilus spp. und Hefen angeboten. Die meisten mechanisierten und/ oder automatisierten Identifizierungssysteme verwenden ebenfalls klassische Differenzierungsreaktionen (z.B. Säurebildung aus Kohlenhydraten, Zitratverwcrtung, H2S-Bildung usw.), überlassen aber die Bcimpfung bzw. die gleichmäßige Verteilung des Inokulums, die Bebrütung und/oder Ablesung (und gegebenenfalls Auswertung) der Ergebnisse dem Automaten.

Beurteilung dieser kommerziellen Identifizierungssysteme. Ein Vorteil dieser Systeme ist ohne Zweifel ihre gleichbleibende Qualität, die sich in industrieller Großserie besser gewährleisten läßt als in einer kleineren Nährbodenküche. Außerdem sind sie wegen der Miniaturisierung und Vorfertigung arbeits- und materialsparend und können mit speziell dazu gelieferten Auswertungscodes oder Auswertungsprogrammen einfach und schnell beurteilt werden. Einige Automaten nehmen dem Untersucher sogar diese

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Arbeit ab und werfen ein fertiges Identifizierungsergebnis aus. Nachteilig ist jedoch, neben dem vergleichsweise hohen Preis, der besonders bei Automaten und Halbautomaten erheblich ins Gewicht fällt, daß der Benutzer entwöhnt wird oder überhaupt nicht mehr in der Lage ist, Einzelreaktionen abzulesen und auf Plausibilität bzw. technische Fehler (Nichtbeimpfung, Kontamination einzelner Reaktionskammern) zu überprüfen. Dadurch entsteht ein „Black-boxEffekt", der einen vermehrten Aufwand an Kontrollen erfordert, um die Fehlerhäufigkeit auf einem akzeptablen Niveau zu halten. Als annehmbar gilt international eine durchschnittliche Übereinstimmung der Identifizierungsergebnisse von etwa 95% mit denen einer anerkannten Referenzmethode. Unter Routinebedingungen darf die so verstandene Richtigkeitsquote höchstens auf 90% absinken. Dabei sollten Aufwand und Kosten der erforderlichen Bestätigungs- und Überprüfungsuntersuchungen so niedrig wie möglich gehalten werden. Von entscheidender Bedeutung für die Qualität der erhaltenen Identifizierungsergebnisse sind neben praktikablen Anwendungsvorschriften und grundsätzlicher Funktionssicherheit des jeweiligen Systems in erster Linie die Vollständigkeit, Fehlerarmut und Aktualität der zugrunde liegenden Datenbasis. Gerade im Hinblick auf die stetig und rasch wachsende Zahl pathogener Bakterien ist die Pflege und laufende Überprüfung dieser Datenbank von zentraler Bedeutung für den Gebrauchswert kommerzieller Identifizierungssysteme. Außerdem darf auch die Angabe einer hohen Wahrscheinlichkeit für die Richtigkeit eines Identifizierungsergebnisses den Benutzer nicht dazu verführen, dem Befund blindlings zu glauben. Das Fehlen wichtiger Schlüsselreaktionen in praktisch allen kommerziellen Systemen kann zu gravierenden Fehldiagnosen führen, die sich nur korrigieren lassen, wenn die fachkundige Bewertung aller verfügbaren taxonomischen Informationen einschließlich der zellulären und kulturellen Morphologie, aber auch anderer Basismerkmale wie Katalase- und Oxidaseaktivität sowie Stoffwechseltyp grundsätzlich in das Endergebnis einfließt. Sind Lücken oder Schwächen eines Systems bekannt, ist der Mikrobiologe verpflichtet, die mit ihm zusammenarbeitenden Kliniker und Praktiker darüber zu informieren, damit diese bestimmte Untersuchungsaufträge gegebenenfalls an andere Laboratorien vergeben können.

Nennenswerte Fchlermöglichkeiten bzw. die Notwendigkeit einer lückenlosen Kontrolle der Ergebnisse durch qualifiziertes Fachpersonal sind auch der Grund dafür, daß die Benutzung kommerzieller Idenlifizierungssysteme mit und ohne Mechanisierung oder Automatisierung eine „do-it-yourself-Bakteriologie" im Praxis- oder Krankenhauslaboratorium ohne entsprechende Fachkenntnisse des Personals keinesfalls rechtfertigt. Denn einerseits kann das Arbeiten mit Krankheitserregern außerhalb der dafür vorgesehenen und eingerichteten Untersuchungsstellen zu einem nicht unerheblichen Sicherheitsrisiko werden, wenn die Grundregeln guter mikrobiologischer Technik nicht beherrscht oder nicht beachtet werden. Andererseits ist nur der erfahrene Mikrobiologe in der Lage, die käuflichen Systeme über eine qualifizierte Verdachtsdiagnose entsprechend ihrem recht begrenzten Anwendungsbereich einzusetzen, die unbeabsichtigte Untersuchung von Mischkulturen zu vermeiden oder zu erkennen und die erhaltenen Ergebnisse abschließend kritisch zu werten. Wo dies nicht gewährleistet ist, kann es, wie Ringversuche immer wieder zeigen, zu zum Teil grotesken Fchlidentifizierungcn kommen, die dem betroffenen Patienten erheblichen Schaden zufügen können und die in sich selbst oder wegen erforderlicher Folgeuntersuchungen Unkosten verursachen, die gerade in der heutigen Zeit nicht vertretbar sind. Nachweis weiterer, diagnostisch relevanter bakterieller Stoffwechselleistungen. Einige weitere,

bisher nicht genannte bakterielle Stoffwechselleistungen haben diagnostische (und ggf. pathogenetische) Bedeutung. Unter den dafür verantwortlichen extrazellulären Stoffwechselprodukten sind die Hämolysine praktisch besonders wichtig (s. Kap. 4.1). Diese Enzyme lösen rote Blutkörperchen, z.T. in Abhängigkeit von der Spenderspezics, ganz oder teilweise auf und können auch das Hämoglobin chemisch verändern (ß-Hämolyse). Andere diagnostisch und pathogenetisch relevante, extrazelluläre Stoffwechsclprodukte von Bakterien sind Lipasen, Lezithinasen, Hyaluronidasen, Koagulasen, Kollagenasen und Desoxyribonukleasen. Nachweis von bakteriellen Stoffwechselendprodukten mit Hilfe der Gaschromatographic (GLC) oder Hochdruckfliissigkeitschroniato-

graphie (HPLC). Fermentierende Bakterien, insbesondere Anaerobier, bilden als Endprodukte ihres Kohlenstoff- und Energiestoffwechsels verschiedene, vom Gärsubstrat abgeleitete organische Verbindungen, die sich im Nährmedium wie auch in Eiter oder Exsudaten anhäufen und mit GLC- oder HPLC-Verfahren nachweisen lassen. Art und Menge dieser Endprodukte (vor allem niedere Fettsäuren und Alkohole) sind spezies- oder gruppenspezifisch; sie

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

stellen damit ein wichtiges Diagnostikum dar, auf das gerade bei der Identifizierung von Anaerobiern nicht verzichtet werden kann. Bei entsprechend modifizierter Anwendung sind GLC und HPLC auch für die Bestimmung chemotaxonomischer Merkmale (zellulärer Fettsäuren, Chinone, Kohlenhydrate, Proteine, Peptide, Aminosäuren) hervorragend geeignet. Typisierung von Krankheitserregern

Die Identifizierung eines möglichen Krankheitserregers bis zur Speziesebene reicht in der Regel für eine zuverlässige diagnostische Bewertung aus; nur in Einzelfällen ist darüber hinaus die Bestimmung der Pathovarietät oder des spezifischen Toxinbildungsvermögens erforderlich. Für die Aufklärung von epidemiologischen Zusammenhängen, etwa bei Tnfektionshäufungen in Krankenhäusern, Schulen, Kindergärten oder Altenheimen, reicht die exakte Feststellung der Spezieszugehörigkeit der ursächlichen Erreger dagegen meist nicht aus, insbesondere dann nicht, wenn es sich um ubiquitäre Arten wie z.B. Staphylococcus aureus, Enteritis-Salmonellen, opportunistische Enterobakteriazeen oder Pseudomonaden handelt. Um hier Infektionsketten und Infektionsquellen nachvollziehen bzw. aufklären zu können, sind feinere Differenzierungen erforderlich, die Spezies oder Subspezies in eine mehr oder weniger große Zahl kleinerer Untereinheiten unterteilen. Diesen Vorgang nennt man „Typisieren" und die erhaltenen Untereinheiten werden als Typen oder, moderner, als Varietäten (var) bezeichnet. Typisierungen lassen sich mit einer Reihe verschiedener Methoden erreichen. So kann man durch die Prüfung einer größeren Zahl stoffwechselphysiologischer Leistungen innerhalb des stoffwechselphysiologischen Basismusters einer Spezies Biovarietäten unterscheiden. Serologische Verfahren erlauben eine ggf. sehr feine Differenzierung ansonsten phänotypisch recht einheitlicher Spezies wie z.B. der Spezies Salmonella enterica oder Yersinia enterocolitica in verschiedene Serovarietäten. Neuerdings werden vermehrt molekularbiologische Verfahren zur Typisierung eingesetzt (z.B. Pulsfeldgelelektrophorese der durch Restriktionsenzyme geschnittenen chromosomalen Gesamt-DNA eines Bakteriums, Elektrophorese der durch Restriktionsenzyme gespaltenen Teile des mikrobiellen Genoms, die vorher über PCR amplifiziert wurden). Die molekularbiologischen Typisierungsverfahren erfreuen sich inzwischen großer

Beliebtheit, weil sie praktisch universell einsetzbar sind und bei entsprechender Erfahrung und apparativer Ausrüstung zuverlässige Ergebnisse liefern. Neben der Bio- und Serotypisierung hat in der Vergangenheit vor allem die Lysotypie, d.h. die Typisierung von Bakterien mit Hilfe spezifischer Bakteriophagcn, große praktische Bedeutung gehabt und hat sie teilweise auch heute noch. Prinzip der Lysotypie ist, daß es Bakteriophagen (Bakterien-befallende Viren) mit so schmalem Wirtsspektrum gibt, daß sie jeweils nur bei einzelnen Stämmen einer Art eine lytische Infektion hervorrufen. Bei geschickter Auswahl von Tcstphagen mit unterschiedlichem Wirtsspektrum läßt sich ein System aufbauen, dessen Phagensatz zu unterschiedlichen Lysisbildern oder Lysismustcrn (phage patterns) führt. Stämme, die das gleiche Lysismuster zeigen, gehören einem Lysotyp oder einer Phagovar an. Voraussetzung für die praktische Nutzbarkeit der Lysotypie ist einerseits, daß sich eine Spezies auch tatsächlich hinsichtlich der Empfänglichkeit ihrer Mitglieder für eine lytische Phageninfektion unterscheidet und andererseits, daß es gelingt, ein genügend breites Spektrum von Bakteriophagen mit unterschiedlicher Spezifität zu finden. Dies setzt jähre- oder jahrzehntelange Arbeit voraus, so daß praktisch funktionierende Lysotypiesysteme nur für einzelne Bakterienarten existieren. Dies sind in erster Linie Salmonella Typhi (S. enterica subsp. enterica Serovar Typhi), Salmonella Paratyphi B (S. enterica subsp. enterica Serovar Paratyphi B), Salmonella Enteritidis (S. enterica subsp. enterica Serovar Enteritidis), Salmonella Typhimurium (S. enterica subsp. enterica Serovar Typhimurium) und Staphylococcus aureus. Bei allen genannten Bakterienarten, insbesondere aber vor allem bei S. aureus, hat die internationale Standardisierung der Lysotypie (internationaler Bakteriophagenbasissatz) in der Vergangenheit wie heute wieder erheblich zur Erkennung von epidemischen Häufungen, zur Aufklärung der Infektionsquellen und -ketten und damit zur Bekämpfung der Ausbrüche beigetragen. Lysotypieverfahren wurden auch für eine ganze Reihe anderer Bakterienarten entwickelt, haben aber bei weitem nicht die Verbreitung und Bedeutung erlangt, die sie bei den vorher genannten Bakterien besaßen oder immer noch besitzen. Neben der Typisierung, also der Differenzierung unterhalb der Speziesebene, können lytische

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Bakteriophagen mit breiterem Wirtsspektrum auch zur Identifizierung auf Gattungs- oder Speziesebene verwendet werden. Besondere Bedeutung hat dieser Anwendungsbereich z.B. bei der Unterscheidung der Biovarietäten cholerae und cltor von Vibrio cholerae erlangt. Diagnostische Tierversuche

Mit der Entwicklung leistungsfähiger ln-vitroMethoden für die Mikrobiologie hat die Bedeutung des diagnostischen Tierversuchs abgenommen. Für bestimmte Fragestellungen ist er aber auch heute noch nicht oder nicht völlig ersetzbar. Dies gilt insbesondere für die folgenden drei Anwendungsbereiche: Nachweis von pathogenen Bakterien und Viren. Krankheitserreger mit hoher Virulenz für bestimmte Tierarten und schlechter oder fehlender /«-v/fra-Züchtbarkeit müssen oder können über geeignete Versuchstiere aus klinischem Untersuchungsmaterial nachgewiesen werden. Seit Einführung der radiometrischen Kulturverfahren hat der diagnostische Tierversuch auf Mvcobacterium tuberculosis (Tbc-Tierversuch), der sich die maximale Empfänglichkeit des Meerschweinchens für diesen humanpathogenen Erreger nutzbar macht, erheblich an Boden und Berechtigung verloren. Er wird deshalb gegenwärtig praktisch nicht mehr verwendet. Außerdem kann der Tierversuch z.B. zur Erkennung von Legionellosen, Rattenbißfieber (Sodoku), Dermatophilosen, Borreliosen, Tularämie, Leptospirosen oder Enterovirus-Infektionen hilfreich sein. Pathogenitäts- und Virulenztests. Bei Erregern wie Erysipelothrix rhusiopathiae, Bacillus anthracis, pathogenen Clostridien, Pneumokokkcn. Mycobacterium bovis oder Listerien kann die Diagnose durch Einimpfung der Reinkulturen in geeignete Versuchstiere abgesichert bzw. die Virulenz des jeweiligen Isolates überprüft werden. Nachweis bakterieller Toxine. In Lebensmitteln oder menschlichen Untersuchungsstoffen vorhandene bakterielle Toxine (z.B. Botulinus-, Tetanus-Toxin) sowie die Fähigkeit von angezüchteten Bakterien, Toxin zu produzieren (z.B. Diphtherie-Toxin), werden hochspezifisch im Toxin-Antitoxin-Tierversuch untersucht. Dabei handelt es sich um einen Neutralisationstest (s. Kap. 4.20) nach folgendem Schema: Ein Tier (meist Maus oder Meerschweinchen) erhält eine Injektion des verdächtigen Materials oder des Kulturfiltrats ei-

ner verdächtigen Kultur, ein zweites Tier wird zusätzlich vorher mit einer ausreichenden Dosis des jeweiligen Antitoxins (Antiserums) behandelt, und einem dritten Tier werden zur Kontrolle (z.B. thermisch) inaktiviertes Untersuchungsmaterial oder toxinfreie Kulturflüssigkeit verabreicht. Erkrankt oder stirbt nur das erste Versuchstier, ist die Anwesenheit des gesuchten Toxins sehr zuverlässig bewiesen. Zeigen zwei oder alle drei Tiere Intoxikationserscheinungen, handelt es sich um andere als die erwarteten Giftstoffe. Bleiben alle Tiere gesund, kann die Anwesenheit von Toxinen in wirksamen Konzentrationen ausgeschlossen werden.

Mechanisierung und Automation in der Medizinischen Mikrobiologie Wie bereits in den vorstehenden Abschnitten mehrfach angesprochen, gibt es in Analogie zur klinischen Chemie auch in der Medizinischen Mikrobiologie immer stärker werdende Bestrebungen, die diagnostischen Arbeitsgänge zu mechanisieren und automatisieren. Dabei ist allerdings zu berücksichtigen, daß die Medizinische Mikrobiologie wie etwa die Histologie eine primär überwiegend analysierend-interpretierendc und weniger eine wägend-messendc Disziplin ist. Der diagnostische Arbeitsablauf im mikrobiologischen Laboratorium als Ganzes von der Verarbeitung des Untersuchungsmaterials bis zur Befundcrstellung ist deshalb einer Automation auch aus grundsätzlichen Erwägungen heraus kaum zugänglich; entsprechende Versuche mußten deshalb scheitern und werden wohl auch nicht mehr unternommen. Einzelne Arbeitsschritte des mikrobiologischen Arbeitsspektrums sind dagegen, wie oben ausgeführt, grundsätzlich durchaus einer Automation zugänglich. Uneingeschränkt positiv müssen in diesem Zusammenhang die Blutkulturautomaten und die Automaten zur Mykobakteriendiagnostik gesehen werden, die tatsächlich einen großen Fortschritt gegenüber manuellen Vorgehensweisen gebracht haben. Ebenso positiv sind Automalen oder Halbautomaten für die serologische Diagnostik, etwa die sogenannten ELISAProzessoren oder die Wcstcrn-blot-Automaten zu werten, die zur Arbeitsentlastung des Personals beitragen, die Arbeitsgänge besser standardisieren und u.U. auch größere Sicherheit vor Laborinfektionen bieten, die aber, außer den Gerätekoslen, keine auffälligen Nachteile gegenüber der manuellen Testdurchführung aufweisen. Vergleichbar in der Bewertung sind auch noch Geräte zur mehr oder weniger weitgehend automatischen Empfindlichkeitsprüfung, obwohl sich bei diesen schon als Nachteil bemerkbar machen kann, daß Kontaminationen selbst bei Anwendung eines sog. Expertensystems zur Überprüfung der Ergebnisse nicht immer so leicht und zuverlässig erkannt werden können, wie das bei manuellen, insbesondere den Makroverfahren, möglich ist. In verstärktcrem Maße gilt diese etwas zurückhaltendere Einschätzung auch für die automatisierten Identifizierungssysteme, bei denen das „Black-box-Phänomen" der ganz oder überwiegend fehlenden, unmiltel-

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

baren Überprüfbarkeit der Ergebnisse besonders störend ins Gewicht fallen kann. Auf der anderen Seite kann der Einsatz von Computerprogrammen zur Auswertung einer größeren Anzahl von Identifizierungsmerkmalen zweifellos zur Vereinfachung und Objektivierung der Ergebnisse beitragen. Denn diese, von der numerisch-phenetischen Klassifizierung abgeleitete Methode der Computer-gestützten Identifizierung erlaubt es. Datenmengen vergleichend zu bewerten, welche die Gedächtnis- und Verarbeitungskapazität des Durchschnittsmenschen erheblich übersteigen. Auch bei den grundsätzlich leistungsfähigen automatischen Systemen ist die Automalion kein Vorteil an sich. Ihr Einsatz muß deshalb in jedem Einzelfalle im Sinne einer Kosten-Nutzen-Rechnung geprüft werden, bei der auch die Aufwendungen für zwingend erforderliche Kontrollen und Back-up-Systeme nicht vergessen werden dürfen.

Empfindlichkeitsprüfung von Krankheitserregern gegenüber antimikrobiellen Chemotherapeutika Neben dem möglichst raschen und zuverlässigen Nachweis und der genauen Identifizierung der Erreger menschlicher Infektionskrankheiten kommt in vielen Fällen auch der Bestimmung ihrer individuellen Empfindlichkeit für potentiell wirksame antimikrobielle Pharmaka (Empfindlichkeitsprüfung, Resistenzbestimmung, Antibiogrammerstellung) entscheidende Bedeutung für die rasche und folgenlose Ausheilung des Krankheitsgeschehens zu. Dabei ist die Empfindlichkeitsprüfung ein in-vitro-Verfahren, dessen Ergebnisse nur unter bestimmten Voraussetzungen und mit Einschränkungen auf die Verhältnisse beim Menschen übertragen werden können. Die hierbei zu beachtenden Gesichtspunkte sind im Kapitel 3.5 („Antibakterielle Chemotherapie") ausführlich dargestellt; im folgenden sollen deshalb nur die wichtigsten methodischen Aspekte der Resistenzbestimmung kurz dargestellt werden. Vom methodischen Vorgehen her lassen sich unter den traditionellen Techniken Reihenverdünnungsverfahren von Diffusionstesten unterscheiden. Man kann aber auch hinsichtlich der Qualität der Ergebnisse zwischen weitgehend oder vollständig quantitativen und semiquantitativen Methoden differenzieren. Die Basis für die Beurteilung der Wirksamkeit eines antimikrobiellen Pharmakons gegen einen bestimmten Erregerstamm stellen grundsätzlich die verschiedenen Modifikationen des Reihenverdünnungstests dar. Diese liefern prinzipiell ein

quantitatives Ergebnis und erlauben wenigstens die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK), unter bestimmten Bedingungen auch die Bestimmung der minimalen bakteriziden Konzentration (MBK). Voraussetzung für einwandfreie und reproduzierbare Ergebnisse der Empfindlichkeitsprüfung mittels kultureller Verfahren ist die Verwendung geeigneter Nährmedien, die einerseits den zu prüfenden Erregern ein gutes Wachstum erlauben müssen und andererseits möglichst wenig oder besser keine Antagonisten enthalten dürfen, welche die Wirksamkeit einzelner Chemotherapeutika behindern können. Weiterhin wichtig ist die Standardisierung des Inokulums (der Mikrobeneinsaat), da stärkere Schwankungen der Einsaatdichte erhebliche Schwankungen des Ergebnisses der Empfindlichkeitsprüfung zur Folge haben können. Weitere Parameter, die zu beachten und zu standardisieren sind, sind Bebrütungszcit und -temperatur (letztere ist besonders kritisch bei der Prüfung von Staphylokokken auf Methicillin-Resistenz!). Empfindlichkeitsprüfung schnell wachsender Bakterien

Rouillon-Reihenverdünnungstest (Bouillon-Dilutionstest). Die am längsten gebräuchliche, traditionelle Methode zur quantitativen Resistenzbestimmung schnell wachsender Bakterien ist der Makro-Bouillon-Verdünnungstest (Röhrchenreihenverdünnungstest). Sein Prinzip ist in Abb. 2.20 dargestellt: Mehrere Röhrchen (Reagenzgläser) enthalten jeweils gleiche Volumina einer geeigneten Bouillon mit geometrisch verdünntem Gehalt des jeweiligen Chemotherapeutikums. Nach Beimpfung und anschließender Bebrütung wird anhand makroskopisch sichtbarer Trübung festgestellt, bis zu welcher Konzentration des eingesetzten Chemotherapeutikums (in mg/l) noch Wachstum des eingeimpften Bakterienstammes feststellbar ist. Die niedrigste Konzentration des Wirkstoffs (A/4 in Abb. 2.20), bei der makroskopisch kein mikrobielles Wachstum feststellbar ist, wird als minimale Hemmkonzentration (MHK) bezeichnet. Die Unterdrückung sichtbaren Wachstums ist primär nur Zeichen einer wachstumshemmenden (bakteriostatischen), nicht unbedingt aber auch einer bakterientötenden (bakteriziden) Wirkung des Chemotherapcutikums. Um die letztere festzustellen, werden nach Ablesung der MHK definierte Bouillonmengen der Röhrchen mit nicht getrübter Kulturflüssigkeit und ggf. zur

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Abb. 2.20 Bouilllon-Reihenverdünnungstest (Bouillon-Dilutionstest) und Bestimmung der minimalen bakteriziden Konzentration (MBK) - schematische Darstellung. A: Ausgangskonzentration, MHK: A/4, MBK: A, K: Kontrolle ohne Chemotherapeutikum.

Kontrolle der ersten getrübten Röhrchen auf chemotherapeutikafreie Medien subkultiviert und für etwa einen Tag bebrütet. Als minimale bakterizide Konzentration (MBK) gilt nach Abb. 2.20 dann diejenige Konzentration (A in Abb. 2.20), welche die höchste Verdünnung des Wirkstoffs darstellt, bei der in der Subkultur kein Bakterienwachstum erkennbar ist. Das Prinzip des Bouillon-Reihenverdünnungstestes kann auch in miniaturisierter Form als Mikro-Bouillon-Verdünnungstest zur Anwendung kommen. Dabei erfolgt die Kultur nicht in Reagenzgläsern, sondern in den Kavitäten von Mikrotiterplatten oder analogen Kunststoffträgern in Volumina von 0,05 bis 0,1 ml. Prinzip und Ablesung entsprechen denen des Makro-BouillonVerdünnungstestes. Bei den miniaturisierten Versionen kommt aber der Konstanthaltung des Inokulums auf relativ niedrigem Niveau (1 x 103 koloniebildende Einheiten - KBE/ml) besonders große Bedeutung zu. Mit der Miniaturisierung wurde der Bouillon-Reihenverdünnungstest auch der Mechanisierung und Automation zugänglich. Sowohl die Beschickung der Systeme als auch vor allem die Ablesung der bebrüteten Tests lassen sich besonders leicht automatisieren (z.B. Micronautl!'-System, Merlin, Bornheim). Weitere, heute bereits im Einsatz befindliche Automalen für die

Identifizierung und Empfindlichkeitsprüfung oder allein die Empfindlichkeitsprüfung von Bakterien weichen hinsichtlich der Methodik für letzleren Zweck z.T. erheblich von dem Prinzip der Standardverfahren ab. Die Abweichungen bestehen einerseits in speziellen Beimpfungstechniken und daraus resultierenden Kulturkammern (z.B. COBAS MICRO0, Hoffmann-La Röche. MD-ABAC*. Madaus Diagnostic, VITEK'S-System, BioMcricux), andererseits in der Verwendung z.B. von Fluoreszenzreaktionen als Wachstumsindikatoren (SENSITITRES;-System, Radiometer Deutschland), die schneller bakterielles Wachstum anzeigen als die Trübungsmessung oder die visuelle Beurteilung der Flüssigkulturen. Dabei darf man allerdings nicht übersehen, daß die große Empfindlichkeit der Fluoreszenzreaktion ein grundsätzlich anderes Maß für das bakterielle Wachstum darstellt als die Bewertung der Trübung, so daß die Ergebnisse solcher automatischer Verfahren nicht ohne weiteres und bei allen Arten mit denen der Standard-Dilutionstcchniken zur Deckung zu bringen sind.

Agar- Verdünnungstest (Agar-Dilutionstest). Das Prinzip des Agar-Dilutionstestes entspricht dem des Bouillon-Dilutionstestes mit dem Unterschied, daß geometrisch abfallende Konzentrationen eines Chemotherapeutikums mit einem flüssigen Agar-Medium vermischt werden. Nach Erstarren dieses Mediums in Petrischalen werden die zu prüfenden Bakterienstämme jeweils zu mehreren auf die Oberfläche jedes der

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

Agarmedien mit unterschiedlichen Antibiotikakonzentrationen aufgeimpft. Nach Bebrütung wird wiederum auf makroskopisch sichtbares Wachstum geprüft und die MHK analog dem Vorgehen beim Bouillonverdünnungstest festgelegt. Mit dem Agarverdünnungstest läßt sich die MBK nicht feststellen; auf der anderen Seite lassen sich nur ganz vereinzelt vorhandene resistente Varianten einer Population (als ganz wenige Einzelkolonien im Inokulationsbereich) erkennen, was für die Gesamtbewertung des Ergebnisses bedeutsam sein kann. Agardiffusionstest. Beim Agardiffusionstest (Abb.2.21 )werden mit einer bestimmten Menge von Chemotherapeutika beschickte, runde Filterpapierblättchen auf die Oberfläche eines zuvor mit dem zu testenden Bakterienstamm beimpften Agarmediums aufgelegt. Durch Diffusion der Wirkstoffe entsteht ein Konzentrationsgefälle, das sich radiär um das Testblättchcn entwickelt. Empfindliche Bakterien wachsen unter Ausbildung eines kreisrunden Hemmhofs, dessen Durchmesser ein Maß für die Empfindlichkeit des jeweiligen Stammes ist. Die Bewertung der Hemmhofdurchmesser erfolgt durch vergleichende Untersuchungen entsprechender Stammkollektive im Dilutions- und Diffusionstest, so daß im Idealfall eine Beziehung zwischen MHK-Werten und ihren Bewertungsgrenzen und entsprechenden Hemmhofdurchmessern herzustellen ist.

Abb. 2.21 Agardiffusionstest - schematische Darstellung.

Wegen seiner vergleichsweise einfachen Durchführbarkeit war der Agardiffusionstest lange Zeit das Routineverfahren der Wahl für die Empfindlichkeitsprüfung schnell wachsender Bakterien, auch wenn er die Genauigkeit der Dilutionstests bei weitem nicht erreicht. Wegen der möglichen Mechanisierung und Automatisierung hatten miniaturisierte Bouillondilutionstests, eventuell nach der sogenannten Breakpoint-Methode auf die beiden Grenzkonzentrationen für die Bewertung „empfindlich/intermediär" bzw. „intermediär/resistent" verkürzt, begonnen, den Agardilutionstest aus den Routinelaboratorien zu verdrängen. Wegen des immer schärfer werdenden Kostendrucks ist hier aber leider - kürzlich wieder eine Umkehr eingetreten, da der Agardilutionstest im Vergleich zu den anzusetzenden Gebühren wesentlich kostengünstiger ist als der Bouillondilutionstest. Empfindlichkeitsprüfung von langsam wachsenden oder besonders anspruchsvollen bakteriellen Erregern

Die vorstehend kurz dargestellten Techniken eignen sich zunächst nur für schnell, d.h. über Nacht, wachsende, nicht allzu anspruchsvolle Bakterienarten. Bei langsamerem Wachstum und deshalb erforderlicher, längerer Bebrütung kann es zu kaum kontrollierbaren spontanen Zerfallserscheinungen der antibakteriellen Chemotherapeutika kommen, die eine zuverlässige Beurteilung des Ergebnisses erheblich stören. Komplexe Nährmedien für anspruchsvolle Erreger enthalten zudem häufig große Mengen von Antagonisten, die wenigstens bestimmte antibakterielle Pharmaka in ihrer Wirkung nennenswert beeinträchtigen können. Dennoch lassen sich einige der hier in Frage kommenden bakteriellen Krankheitserreger bei entsprechender Modifikation der Testmethodik durchaus prüfen. Dies gilt insbesondere für Anaerobier, die besonders zuverlässig mit Hilfe eines anaerob bebrüteten Agardilutionstestes hinsichtlich ihrer Antibiotikaempfindlichkeit untersucht werden können. Auch miniaturisierte Bouillondilutionstests können grundsätzlich so standardisiert werden, daß sie zur Resistenzbestimmung wenigstens der robusteren Anaerobierarten geeignet sind. Der Agardilutionstest hat allerdings gegenüber dem Bouillondilutionstest bei Anaerobiern den Vorteil, daß man ihn schon nach vergleichsweise kurzen Bebrütungszeiten (nicht

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mehr als maximal 48 Stunden) zuverlässig mit der Lupe ablesen kann, was bei Bouillontests nicht immer ohne weiteres möglich ist. Bei den langsamer wachsenden aeroben und anaeroben Aktinomyzeten hat sich ein Agardilutionstest mit mikroskopischer Ablesung als besonders aussagekräftig erwiesen. Auch die z.T. sehr langsam wachsenden Mykobakterien lassen sich prinzipiell mit einer Modifikation der Dilutionstests hinsichtlich ihrer Chemotherapeutikaempfindlichkeit prüfen. Früher dienten hierzu als Nährböden die genannten Eiernährmedien, denen entsprechende Chemotherapeutikakonzentrationen zugesetzt wurden. Heute werden zunehmend die Flüssigmedien eingesetzt, die bei den automatisierten Kulturverfahren für Mykobakterien beschrieben wurden. In analoger Weise lassen sich ggf. auch noch anspruchsvollere bakterielle Erreger wie etwa Chlamydien in einem Gewebekullurassay prüfen. Außerdem wird bei schlecht kultivierbaren Erregern neuerdings zunehmend ein molekularbiologischer Ansatz zur Resistenzbestimmung durch Nachweis entsprechender Resistenzgene verfolgt. Soweit es sich dabei um konstitutiv exprimierte Genprodukte handelt, läßt sich durch den gezielten Nachweis eines Resistenzgens durchaus eine Aussage zur therapeutischen Brauchbarkeit des entsprechenden Chemotherapeutikums machen. Allerdings kann man gegenwärtig molekularbiologisch noch keineswegs ein Antibiogramm. also einen Überblick über die gesamte Chemotherapeutikaempfindlichkeit eines Stammes, erstellen, zumal dies auch beim gegenwärtigen Entwicklungsstand wirtschaftlich kaum vertretbar wäre. Bestimmung des Chemotherapeutikumgehaltes in menschlichem Untersuchungsmaterial

Die Bestimmung des Gehaltes an antimikrobiellen Chemotherapeutika in menschlichen Untersuchungsmaterialien, die sogenannte Antibiotikaspiegelbestimmung, verfolgt im wesentlichen zwei Zwecke: Sie dient einerseits der therapiebegleitenden Überwachung des Blutspiegels (Drug-monitoring) und wird andererseits zur Analyse der Pharmakokinetik neuer Wirkstoffe benötigt. Aus Gründen der Praktikabilität und der problemlosen Gewinnbarkeit werden in der Regel Serumspiegel gemessen, und zwar vor allem bei Chemotherapeutika mit geringer therapeutischer Breite, d.h. mit geringem Abstand zwischen den notwendigen therapeutischen und den ggf. toxischen Konzentrationen. In der Praxis hat das vor allem bei der Therapie mit Aminoglykosiden, Peptidantibiotika und dem Fungistatikum Fluorcytosin Bedeutung.

Je nach zu analysierender Substanzgruppe und apparativer Ausrüstung des Labors kommen mikrobiologische Methoden (Bioassay), enzymatische Methoden, immunologisch-serologische Methoden und chromatographische Methoden zur Konzentrationsbestimmung in Betracht. Wegen der Störanfälligkeit bei Kombinationstherapie werden Bioassays heute kaum mehr eingesetzt. Durchgesetzt haben sich demgegenüber vor allem serologische Verfahren im Sinne von Enzym- oder Fluoreszenzimmunassays, vereinzelt aber auch chromatographische Techniken, etwa mit der Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie. Empfindlichkeitsprüfung bei anderen menschlichen Krankheitserregern

Die Bestimmung der Wirksamkeit von Antimykotika kann grundsätzlich mit denselben Verfahren, die oben für Bakterien beschrieben wurden, vorgenommen werden. Dabei ist allerdings der Einsatzbereich des Agardiffusionstestes deutlich begrenzter und kommt im wesentlichen nur zur Prüfung von 5-Fluorcytosin in Betracht. Ansonsten sind Reihenverdünnungstests zur Prüfung sowohl von Sproßpilzen als auch von Fadenpilzen vorzuziehen oder unverzichtbar. Auch in der Virologie ergibt sich inzwischen zunehmend die Notwendigkeit einer individuellen Resistenzbestimmung einzelner Erregerstämme, insbesondere im Zusammenhang mit der HIV-Infektion. Hinsichtlich der methodischen Einzelheilen sei hier auf die entsprechenden Kapitel des virologischen Teils dieses Lehrbuchs verwiesen. In der Medizinischen Parasitologie haben Sensibilitätsprüfungen unter Routinebedingungen bisher keine praktische Bedeutung erlangt.

2.3.2 Serologische Untersuchungsverfahren Basis aller serologischen Untersuchungsverfahren ist die Antigen-Antikörper-Reaktion (AgAk-Reaktion), welche nicht nur in vivo, sondern unter geeigneten Bedingungen auch in vitro abläuft. Dabei bleibt die spezifische Bindung von Antigen und Antikörper (Primärreaktion) solange unsichtbar, bis es in einer zweiten Phase (Sekundärreaktion) zur Aggregatbildung oder Komplementaktivierung kommt oder die AgAk-Bindung auf anderem Wege sichtbar gemacht wird. Die hohe Spezifität der Ag-Ak-Reaktionen und ihre vergleichsweise einfache

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

Nachweisbarkeit im Laboratorium machen es möglich, sie - mit bekanntem Antigen - zur Suche nach Antikörpern im Patientenserum einzusetzen (Prinzip der serologischen Krankheits-

diagnose). Mit bekannten Antikörpern kann andererseits auch eine serologische Identifizierung unbekannter, an Korpuskeln gebundener oder gelöster Antigene herbeigeführt werden (Prinzip der serologischen Identifizierung oder Typisierung von Krankheitserregern, Toxinen und anderen Antigenen).

Die Empfindlichkeit serologischer Untersuchungsverfahren ist in der Regel wesentlich höher als die chemischer Nachweisreaktionen. Das hat aber auch zur Folge, daß die Ag-AkReaktion potentiell anfällig für methodische Störungen ist. Aus diesem Grunde muß jeder serologische Test durch positive und negative Kontrollansätze abgesichert und überprüft werden. Dies gilt grundsätzlich auch für die Verwendung monoklonaler Antikörper (s. Kap. 1.2.1), obwohl deren Homogenität hinsichtlich Immunglobulin-Klasse, Idiotyp, Spezifität und Affinität manche Fehlermöglichkeiten, die dem Umgang mit polyklonalen Antiseren eigen sind, vermeidet. Zum diagnostischen Antikörpernachweis wird

gewöhnlich menschliches oder tierisches Serum benutzt. Bei manchen Krankheiten kann es aber auch zweckmäßig sein, die jeweiligen Antikörper in anderen Körperflüssigkeiten wie Liquor, Gclcnkpunktaten, Augenkammerwasser, Urin und verschiedenen Ex- und Transsudaten zu suchen. Einige serologische Reaktionen erfordern bestimmte Mischungsverhältnisse von Antigen und Antikörper, um sichtbar zu werden. Je nach gewähltem Verfahren ist dieser kritische Konzentrationsbereich unterschiedlich groß. Verdünnt man antikörperhaltige Körperflüssigkeiten, dann nimmt natürlich die vorhandene Antikörpermenge entsprechend dem jeweiligen Verdünnungsfaktor ab. In einer schrittweisen, meist geometrischen Verdünnungsreihe muß also der Antikörpergehalt schließlich so gering werden, daß sich die Folgen der Ag-Ak-Reaktion nicht mehr erkennen lassen. Die höchste Verdünnungsstufe, bei der noch eine eindeutige Reaktion ausgelöst wird, gibt den Titer (Endtiter) der antikörperhaltigen Flüssigkeit an. Der Titer stellt also ein indirektes Maß für die Antikörpermenge dar, die in dem komplexen Gemisch von Serumkomponenten enthalten ist. Er kann entweder als Verdünnungsstufe (z.B. 1:260) oder

- richtiger - als deren Kehrwert (z.B. 260) angegeben werden. Bei entsprechender Standardisierung des Reaktionsablaufs kann daraus die Antigen-bindende Kapazität des Serums in mg/ml Serum oder „Einheiten" errechnet werden. Bei der Austitrierung von Agglutinationsreaktionen wird manchmal folgende Erscheinung beobachtet: Die Reaktion bleibt bei geringen Serumverdünnungen aus, wird dann bei stärkerer Verdünnung sichtbar und verschwindet schließlich bei Überschreiten des Endtiters wieder. Ein solcher Reaktionsausfall wird als Prozonenphänomen bezeichnet. Er kann auftreten, wenn im Serum gleichzeitig „komplette" (IgM) und „inkomplette" (z.B. IgG) Antikörper vorliegen. Letztere können die antigenen Determinanten besetzen, ohne zur Sekundärreaktion zu führen. Außerdem blockieren sie die Antigene für die Bindung der «kompletten» Antikörper. Da bei gleichzeitigem Vorkommen üblicherweise mehr „komplette" als „inkomplette" Antikörper vorhanden sind, kann durch stärkere Scrumverdünnung doch noch eine sichtbare Reaktion herbeigeführt werden. Dasselbe gilt, wenn die inkomplette Reaktion durch einen starken Antikörper-Überschuß ausgelöst ist. Prozonenphänomene können außerdem durch Veränderung der Serumproteinc (Erhitzung) oder durch die Anwesenheit großer Mengen kolloidalen Frcmdmaterials hervorgerufen werden. An die Möglichkeit des Auftretens eines Prozoncnphänomens muß beim serologischen Arbeiten gedacht werden; gegebenenfalls muß die abgelaufene Primärreaktion mit Hilfe des CüOMßS-Testes oder des Blocking-Testes gezielt aufgedeckt werden (s.u.).

Beurteilung Fällt ein serologischer Test mit einem Patientenserum positiv aus, darf man folgern, daß der Patient spezifische Antikörper gegen das verwendete Antigen gebildet hat, sofern technische Fehler und Kreuzreaktionen ausgeschlossen werden können. Ob diese Antikörperbildung allerdings auf unmittelbar vorausgegangenen oder noch bestehenden Kontakt mit dem Antigen zurückgeht oder ob sie nur als Ausdruck einer früher abgelaufenen Auseinandersetzung des Immunsystems mit diesem Antigen zu werten ist (Antikörper können zuweilen nach Überstehen einer Infektionskrankheit lebenslang persistieren), kann von einer einzigen Untersuchung meist nicht abgeleitet werden. Es ist vielmehr notwendig, den Titerverlauf zu kontrollieren. Zeigen eine oder mehrere Folgeuntersuchungen im Abstand von je ein bis drei Wochen deutlich ansteigende Titer (mindestens um 2 Stufen), hat wahrscheinlich zum Zeitpunkt der ersten Probenentnahme eine frische Infektion vorgelegen. Ein gleichbleibender oder leicht abfallender Ti-

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Mikrobiologische Diagnostik

terverlauf spricht demgegenüber für einen länger zurückliegenden natürlichen Kontakt mit dem Erreger oder für den Folgezustand nach einer vorausgegangenen Schutzimpfung. Eleganter läßt sich die Frage, ob es sich um eine floride oder in der Vergangenheit abgelaufene Infektion handelt, häufig durch Nachweis erregerspezifischer IgM- oder IgA-Antikörper (s.u.) beantworten. Agglutinationsreaktionen Unter Agglutination versteht man die Zusammenballung (Aggregation) und Sedimentation in wäßrigem Milieu suspendierter, Antigen-tragender Zellen oder Partikel (z.B. Erythrozyten, Bakterien, Latex-Partikel) als Folge einer Immunkomplexbildung durch Bindung spezifischer Antikörper. Die Entstehung makroskopisch sichtbarer Agglutinate geht dabei sowohl auf eine Veränderung der negativen Oberflächenladung (Z-Potential) der Partikel als auch auf eine Vernetzung der Antigcn-tragenden Elemente durch makromolekulare Antikörper zurück (Abb. 2.22). Das makroskopische Erscheinungsbild der Agglutinate kann dabei variieren und hängt vor allem von der Beschaffenheit der Antigen-tragenden Teilchen ab. Der Ablauf der Erythrozyten- ebenso wie der der Bakterien-Agglutination wird offenbar durch eine Reihe weiterer Faktoren beeinflußt. Diese umfassen die Größe der Antikörpermoleküle (IgM-Moleküle wirken mehr als lOOfach stärker agglutinierend als IgG-Moleküle), die Anzahl bzw. Dichte antigener Epitope auf der Zeil- oder Partikeloberfläche, den Expositions-

Abb. 2.22 a-c Schematische Darstellung der Agglutinationsreaktion (modifiziert nach KELLER,1977). a) Antigen-tragende Zellen oder Partikeln; b) spezifischer IgM-Antikörper; c) Agglutinat.

grad der antigenen Determinanten in bezug auf diese Oberfläche, das Summenpotential der Außenladung der Partikel sowie Viskosität und Ionenstärke des Testmediums. Bakterien, die zur Bildung von Kapseln befähigt sind, werden darüber hinaus nicht selten bei Anwesenheit dieser Kapselsubstanzen in ihrer Agglutinabilität verändert. Komplement ist für den Ablauf der Agglutinationsreaktionen nicht erforderlich; neben den genannten Faktoren müssen aber auch noch Mindestreaktionszeit und geeignete Reaktionstemperaturen berücksichtigt werden. Wie bei allen anderen serologischen Verfahren hängt die Zuverlässigkeit der Ergebnisse entscheidend von der exakten Durchführung und sorgfältigen Ablesung des Testes ab. Agglutinationsreaktionen kann man sowohl auf dem Objektträger als auch im Reagenzglas oder als „Mikroagglutination" in den Vertiefungen von Mikrotiterplatten durchführen. Typische Beispiele der Objektträgeragglutination sind die Blutgruppenhestimmung oder die serologische Identifizierung bzw. Typisierung von Salmonellen und Shigellen. Bakterienagglutinationen

Agglutinationsreaktionen mit lebenden oder toten Bakterien finden sowohl bei der Diagnostik von Infektionskrankheiten als auch zur Identifizierung angezüchteter Bakterien Verwendung. Je nach Zielsetzung und Erregerarten werden die folgenden Verfahren unterschieden: Reaktion nach GRUBER und DURHAM. Schon 1896 entdeckten GRUBER und DURHAM, daß Bakterien durch die Seren von Tieren, denen Zellen der entsprechenden Bakterienart einige Zeit vorher injiziert worden waren, spezifisch zusammengeballt werden können. Auf dieser Beobachtung aufbauend lassen sich spezifische tierische Antiseren herstellen, mit denen man unbekannte Bakterien identifizieren kann. Die GRUBER-Reaktion wird meist als ObjektträgerAgglutination, vielfach mit Hilfe „abgesättigter", d.h. durch Absorption spezifischer gemachter Antiseren, durchgeführt und dient zur detaillierten serologischen Bestimmung von Salmonellen (Serovarbestimmung), Shigellen, Listerien und vielen anderen Bakterien. Reaktion nach WIDAL. Kurz nach der Entdeckung GRUBERS und DURHAMS fand WIDAL, daß diese Reaktion auch umgekehrt verwendbar ist. Setzt man z.B. dem Serum eines Patienten mit Typhusverdacht in vitro Typhusbakterien zu, dann kommt es im Falle einer tatsächlich und

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

genügend lange bestehenden oder ggf. früher durchgemachten Typhuserkrankung zur Agglutination der Bakteriensuspension. Bei diesem Test wird demnach ein unbekannter Antikörper mit Hilfe eines bekannten Antigens bzw. einer bekannten, Antigene tragenden bakteriellen Zelle nachgewiesen. Für die Reaktion sind abgetötete Suspensionen der jeweiligen Bakterienarten geeignet. Neben Antikörpern gegen Körperantigene (O-Antigene) lassen sich mit der WiDAL-Reaktion auch Antikörper gegen Geißel- (H-Antigene) und Kapsel-Antigene (K-Antigene) nachweisen (s. Kap. 4.4). WEiL-FELix-Reaktion. 1915 züchteten WEIL

und FELIX aus dem Urin von Fleckfieberpatienten Proteus-SVdmmc, die mit dem Serum dieser Patienten eine Agglutination ergaben. Der Protefw-Stamm OX 19 erwies sich als besonders reaktionsstark. Heute wissen wir, daß dieses Bakterium und der Fleckfiebererreger Rickettsiu prowazekii gemeinsame Antigen-Determinanten besitzen, so daß die WEiL-FELix-Rcaktion auf einer echten Kreuzreaktion (heterophilen Reaktion) und nicht auf Unspezifität beruht. Der Erreger des murinen Fleckfiebers zeigt dieselbe Antigengemeinschaft, während Proteus OX 2 beim Rocky-Mountain-Spotted Fever und Proteus OX K beim Tsutsugamushi-Fieber bessere Ergebnisse liefern. Agglutinations-Lysis-Reaktion. Die Agglutinations-Lysis-Reaktion ist ein mikroskopischer Agglutinationstest zur Identifizierung von Leptospiren oder zum Nachweis gegen sie gerichteter Antikörper. Zur Lysis der Leptospiren kommt es trotz des Namens der Reaktion nicht, sondern nur zu einer besonders dichten und formverändernden Zusammenballung der fragilen Erreger zu kleinen Körnchen, die unter dem Dunkelfeldmikroskop eine partielle Auflösung vortäuschen. Nachweis „inkompletter" Antikörper. Soge-

nannte komplette Antikörper sind Immunglobuline, mit denen sich Agglutinationen ohne besondere Kunstgriffe auslösen lassen; sie gehören, wie oben ausgeführt, nahezu ausschließlich der IgM-Klasse an. Antikörper anderer Immunglobulinklassen führen dagegen unter den üblichen, einfachen Reaktionsbedingungen nur ausnahmsweise zu einer Agglutination. Diese Antikörper werden deshalb auch als „inkomplett'" bezeichnet. Da nach ihrer Bindung an das spezifische Antigen die spontane Sekundärreaktion meist ausbleibt, läßt sich die abgelaufene Primärreaktion nur durch Kunstgriffe, z.B.

durch Verminderung der Oberflächenladung, feststellen. Darüber hinaus kann die erfolgte Bindung „inkompletter" Antikörper unter Ausnutzung des Agglutinationsprinzips aber noch mit folgenden, in der Praxis wichtigen Verfahren nachgewiesen werden: Antiglobulin-(CoOMBS-)Test. Der CooMBS-Test beruht auf der Zugabe eines zweiten, im Tier erzeugten Antikörpers, der gegen menschliche Immunglobuline gerichtet ist (Antihumanglobulinserum: Coo.MBS-Serum) und am Fc-Stück des „inkompletten" Antikörpers angreift. Darüber hinaus spielen Antikörper gegen C3- und C4-Fragmente des Komplementsystems, die sich in den meisten Anliglobulinseren linden, eine Rolle, da bei der Bindung der „inkompletten" Antikörper über die Komplementaktivierung auch C3 und C4 an die Zellmembran bzw. die Hüllstrukturcn der Mikroorganismen angelagert werden. Sind Antigentragende Zellen oder Partikel mit „inkompletten" menschlichen Antikörpern besetzt, können sie somit durch Zugabe des CoOMBS-Serums zur Agglutination gebracht werden, da letzteres die erforderliche Quervernetzung herbeiführt. Ein positives Ergebnis des CooMBS-Tests besagt also, daß vorher die zu beweisende Ag-Ak-Rcaktion mit „inkompletten" Antikörpern abgelaufen ist. Blocking-Test. Beim Blocking-Test geht man von derselben Annahme wie beim CooMBS-Test aus: Man erwartet, daß die antigenen Oberflächendeterminanten korpuskularer Elemente durch „inkomplette" Antikörper besetzt wurden. Ist dies der Fall, können die Antigen-tragenden Partikel durch nachfolgende Zugabe spezifischer, „kompletter" Antikörper nicht zur Agglutination gebracht werden, da für letztere nicht mehr genügend Bindungsstellen zur Verfügung stehen. Hier entspricht demnach das negative Resultat des zweiten Versuchsschritts (Zugabe „kompletter" Antikörper) einem positiven Ausfall der ursprünglich zu prüfenden Ag-Ak-Reaktion.

Beide Verfahren sind in der serologischen Diagnostik von Brucellosen von praktischer Wichtigkeit, da bei diesen Infektionskrankheiten charakteristischerweise mit der Anwesenheit größerer Mengen „inkompletter" Antikörper zu rechnen ist. Der Antiglobulin-Test findet darüber hinaus in der Transfusionsmedizin und bei der Schwangerenvorsorge (jeweils Nachweis „inkompletter", antierythrozytärer Antikörper) verbreitete und unersetzliche Anwendung. Hämagglutinationen

Bei der Hämagglutination ist das rote Blutkörperchen Antigen-tragendes korpuskulares Element. Sind die reagierenden Antigene Bestandteil der Oberfläche der Erythrozytenmembran, spricht man von aktiver oder direkter Hämagglutination. Man kann die Erythrozyten aber auch sekundär, oft nach geeigneter Vorbehandlung,

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Mikrobiologische Diagnostik

mit Fremdantigenen beladen, die dann durch Bindung spezifischer Antikörper eine Agglutination der Trägcrerythrozyten herbeiführen können (passive oder indirekte Hämagglutination). Typisches Beispiel für die Anwendung der direkten Hämagglutination ist die Bestimmung der klassischen Blutgruppeneigenschaften. Weitere diagnostische Einsatzbereiche der Hämagglutinalion sind im folgenden kurz beschrieben. Passive Hämagglutinationsreaktionen. Eines der ersten Verfahren, welches auf dem Prinzip der passiven Hämagglutination beruhte, war die Reaktion nach M IDDLEBROOK und D UBOS (1948), die mit Tuberkulinantigenen beladene Erythrozyten verwendete und entsprechend zur serologischen Tuberkulose-Diagnostik entwickelt worden war, aber keine nennenswerte praktische Bedeutung erlangt hat. Wesentlich gebräuchlicher und von hoher Aussagesicherheit ist aber heute der TPHA-Test (Treponemaprt///rfi«7?-Hämagglutinationstest), der mit Erythrozyten arbeitet, deren Oberflächen mit Treponema-pallidum-Antigcncn besetzt sind (s. Kap. 4.24). Dieser Test hat die Lues-Serologie im Vergleich zu früher erheblich einfacher und sicherer gemacht. Weitere analoge Methoden existieren u.a. auch für den Nachweis von Antikörpern gegen Tetanus- oder Diphtherie-Toxin sowie für die serologische Erkennung von Pilzund Protozoeninfektionen oder von Erkrankungen durch höher organisierte Parasiten. Heterohämagglutination. Unter Heterohämagglutination versteht man die Fähigkeit mancher Antikörper, artfremde Erythrozyten zusammenzuballen, ohne daß diese das spezifische Immunogen darstellen. Diagnostisch auswerten lassen sich solche heterophilen Antikörper bei der infektiösen Mononukleose und bei der Serumkrankheit nach therapeutischen oder prophylaktischen Tierserumgaben, wo sie typischerweise in größerer Menge auftreten (PAUL -B UNNELL Reaktion bzw. FfANGANUTZiu-DEiCHER-Reaklion). Kältehamagglutination. Bei atypischen Pncumonien. insbesondere solchen durch Mycoplasma pneumoniae. und bei Blutkrankheiten treten im Serum der Patienten Antikörper auf, die in der Lage sind, die körpereigenen Erythrozyten und Erythrozyten der Blutgruppe 0 bei Temperaturen um 4 bis 6 "C zu agglutinieren. Diese Källcagglutinine sind Autoantikörper, die auch in vivo bei Temperaturen unter 20 °C zu einer intravasalcn Aggregation der Blutkörperchen führen und dadurch Krankheitserscheinungen auslösen können (Kältehämagglutinationskrankhcit). Wegen ihrer Unspezifität läßt sich die Reaktion diagnostisch (Lungen-

infektionen) nur verwerten, wenn höhere Titer vorliegen oder ein deutlicher Titeranstieg zu beobachten ist. Weitere indirekte Agglutinationsreaktionen

Neben Erythrozyten können auch andere homogen suspendierbare Trägerpartikel geeigneter Größe (z.B. solche aus Bentonit, Latex, Kollodium. Aktivkohle oder Bakterienzellen) mit Antigenen oder Antikörpern beladen werden und dann zur Sichtbarmachung einer serologischen Reaktion durch Aggregation dieser Partikel dienen. Latex-Agglutinationen. Besonders breiten und vielfältigen Einsatz haben inzwischen Reaktionssysteme gefunden, bei denen Latexteilchen (Polystyrol) von etwa 0,8 (im Durchmesser mit Antigenen, auch solchen mit Haptcncharaktcr, oder Antikörpern adsorptiv beladen werden. Wegen der daraus resultierenden „Teilchenvergrößerung'" lassen sich mit den homologen Reaktionspartnern Agglutinationen erzielen, die als Flockung der sonst homogen milchigen Latexsuspension makroskopisch sichtbar werden. Derartige Latextests werden heute für verschiedenste Zwecke kommerziell angeboten. Bei ihrer Verwendung sollte man aber berücksichtigen, daß sie relativ störanfällig sind und deshalb der Mitführung und sorgfältigen Beurteilung von Kontrollansätzen unbedingt bedürfen. Latextests zum Antikörpernachweis: Werden mikrobielle oder andere Antigene an Latexpartikel adsorbiert, lassen sie sich zum Nachweis spezifischer Antikörper verwenden. Dieses Prinzip liegt z.B. dem viel gebrauchten Latex-Rhcumafaktor-Test zugrunde. Der Rheumafaktor ist ein bei primär chronischer Polyarthritis, anderen Kollagenosen und chronischen Erkrankungen gebildetes Anti-Gammaglobulin, das mit normalem IgG auf den Latexteilchen (als Antigen) reagiert. Darüber hinaus finden analoge Testsysteme z.B. zum Antikörpernachweis gegen Histoplasma capsulatum oder Trichinella spiralis Anwendung. Latextests zum Antigennachweis: Latex-Testsysteme, bei denen die Partikel mit spezifischen Antikörpern beladen sind (umgekehrte passive Agglutination), finden zum Nachweis mikrobieller Antigene in Körperflüssigkeiten immer weitere Verbreitung. Besonders zur Beschleunigung der Meningitis-Diagnostik haben sie sich bewährt, können aber auch zur Untersuchung anderer Körperflüssigkeiten eingesetzt werden. Inzwischen gibt es kommerzielle Latex-Reagenzien zum Antigennachweis einer ganzen Reihe

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

verschiedener Mikroorganismen; dazu gehören u.a. Streptokokken verschiedener Serogruppen, Strepiococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Serovare A, B, C. Y und W 135, Haemophilus influenzae Typ b. Cryptococcus neoformans und Hepatitis-B-Virus. Außerdem kann auch der Clumping-Faktor von Siaphylococcus aureus, ggf. zusammen mit Protein A. mit Hilfe der Latex-Agglutination nachgewiesen werden. Koagglutination. Die meisten Stämme von Staphylococcus aureus, insbesondere aber der Stamm COWAN I, besitzen das Zclloberflächenprotein Protein A. Dieses ist in der Lage, IgGMoleküle über ihr Fc-Stück zu binden, so daß wie beim umgekehrten Latex-Test Antikörperbeladene Teilchen entstehen, deren serologische Reaktionsfähigkeit durch Exposition der FabStücke der angelagerten Immunglobuline vollständig erhalten ist. Bei Kontakt mit dem homologen Antigen kann es so zu einer Agglutination dieser „sensibilisierten" Staphylokokken kommen (Abb. 2.23). Der Einsatzbereich der Koagglutination entspricht dem der umgekehrten Latex-Agglutination. Käufliche Koagglutinations-Rcagenzien umfassen u.a. Tests zum Nachweis von Streptokokken der serologischen Gruppen A, B, C, G und H, Streptococciis pneumoniae, Neisseria meningitidis und Haemophilus influenzae.

Antikörper im Testmedium mit löslichem Antigen, wodurch die anschließende Agglutination von Indikatorpartikeln oder -zellen gehemmt wird. Als inzwischen klassischer Anwendungsbereich der spezifischen Agglutinationshemmung kann der Nachweis von menschlichem Choriongonadotropin (HCG) im Urin zur Feststellung einer Schwangerschaft gelten. Bei diesem Schwangerschaftstest wird zunächst der zu untersuchende Urin mit Antikörpern gegen HCG zusammengebracht. Enthält der Urin HCG. können anschließend zugegebene LatexPartikel oder Erythrozylen, die mit HCG beladen sind, nicht zur Agglutination gebracht werden. Ist der Urin HCG-frei. führt der Testantikörper zu einer Agglutination der sensibilisierten Partikel oder Zellen. Ein ähnliches Prinzip liegt dem Ilämagglutinations-Hemmtest (HHT) zugrunde, der zur serologischen Diagnostik bestimmter Viruskrankheiten gebräuchlich ist (s. Kap. 5.1.13). Dieser Test beruht auf der Tatsache, daß Erythrozytenmembranen über spezifische Virusrezeploren verfügen, die bei Zugabc dieser Viren (z.B. Influenza-, Röteln-Virus) als Reaktionspartner eine Agglutination der Erythrozyten herbeiführen. Die Anwesenheit spezifischer anliviraler Antikörper hemmt diese Hämagglutination.

Agglutinations-Hemmtests

Präzipitationsreaktionen

Die Hemmung von Ag-Ak-Reaktionen als Teslprinzip wurde zuerst von K. LANDSTEINER angewendet. Bei derartigen Verfahren reagiert der

Bei der Immunpräzipitation werden gelöste oder kolloidal gelöste Antigene durch ihre homologen Antikörper zu einem makroskopisch

Abb. 2.23 Schematische Darstellung der Koagglutinationsreaktion.

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Mikrobiologische Diagnostik

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sichtbaren Niederschlag ausgefällt. Die Ursache für die Überschreitung der Löslichkeitsgrcnze der Ag-Ak-Komplexe ist wahrscheinlich die Entstehung eines Netzwerks aus multivalenten Antigenen und wenigstens bivalenten Antikörpern, wodurch Aggregate erheblicher Größe entstehen können (s.o.). Außerdem haben pHWert und Ionenstärke einen Einfluß auf das Zustandekommen der Präzipitation. Stärker als bei der Agglutination ist die Bildung sichtbarer Präzipitate vom richtigen Mengenverhältnis von Antigen und Antikörper abhängig. Bei größerem Antigen- oder Antikörperüberschuß bleiben die Ag-Ak-Komplexe in Lösung, oder die bereits gebildeten Niederschläge lösen sich wieder auf. Ringtest

Die methodisch einfachste Form der Immunpräzipitation wird im Reagenzglas oder in dünnen Glaskapillaren durchgeführt. In ihnen werden Antigen- und Antikörper-haltige Lösungen vorsichtig überschichtet; an der Berührungsfläche beider Lösungen bilden sich dann im positiven Falle Präzipitate aus, die als weißliche Scheibe oder Trübungsring erkennbar werden und später im Reaktionsgefäß zu Boden sinken. Im Rahmen der mikrobiologischen Diagnostik wird diese einfache Technik zum Nachweis von Milzbranderregern in tierischen Organen („Thermopräzipitation" nach Ascou: Milzbrandimmunserum wird mit Kochextrakten der Organe überschichtet) und zur serologischen Gruppierung von Streptokokken nach LANCEFIELD verwendet (s. Kap. 4.2). Immunpräzipitationen in Gelen

Immunpräzipitationen kommen nicht nur in flüssigen Medien, sondern auch in Gelen zustande. Die Präzipitate sind hier sogar meist beständiger und deshalb besser zu beurteilen. Außerdem können Gemische aus mehreren Antigenen und Antikörpern analysiert werden, da die homologen Ag-Ak-Komplexe jeweils eigene Präzipitationsbanden ausbilden. Als Geliermittel werden überwiegend Agar-Agar oder Agarose verwendet. Zur besseren Sichtbarmachung können die Präzipitationslinien mit Protein-Färbeverfahren angefärbt werden. Passive Immunpräzipitationsverfahren

Bei den passiven Immunpräzipitationsverfahren bewegen sich die Reaktionspartner, lösliches Antigen und Antikörper, durch Diffusion im

Gel aufeinander zu. An den Stellen optimaler Konzentrationsverhältnisse von Antigen und Antikörper bilden sich Präzipitationsbanden oder -linien aus, die mit bloßem Auge gegen dunklen Hintergrund sichtbar werden und sich durch Anfärbung deutlicher darstellen lassen. Eindimensionaler, einfacher Agardiffusionstest. In ih-

rer einfachsten Modifikation wird die Geldiffusion als eindimensionaler einfacher Agardiffusionstest nach OUDIN im Reagenzglas durchgeführt. Dazu wird Antiserum mit flüssigem Agar vermischt und das Gemisch in ein Glasröhrchen gefüllt. Nach der Verfestigung des Gels wird mit Antigenlösung überschichtet. Nach Stunden bis Tagen entstehen im Agar Präzipitationsbanden. die bei längerer Beobachtung nach unten zu wandern scheinen, da sich bei zunehmendem Antigenüberschuß die Präzipitate wieder auflösen und in etwas weiterer Entfernung von der Oberfläche des Gels neu ausbilden. Die Präzipitationsprobe auf Milzbrand kann mit Vorteil nach dieser Technik ausgeführt werden. Zweidimensionalcr, einfacher Agardiffusionstest. Für

den zwcidimensionalen, einfachen Agardiffusionstest wird mit Antiserum vermischter Agar in einer Petrischale in gleichmäßiger Schichtdicke ausgegossen. Aus dem erstarrten Gel werden Löcher ausgestanzt, in welche Antigenlösung eingefüllt wird. Bei passendem Mengenverhältnis von Antigen und Antikörper entwickeln sich kreisförmige Präzipitationshöfe. deren Durchmesser bei Standardisierung des Verfahrens zur quantitativen Bestimmung des Antigens herangezogen werden kann (quantitative radiale Immundiffusion [RID] nach MANCINI). Die Methode wird vor allem zur Quantifizierung menschlicher Serumproteine verwendet. Doppeldiffusion in einer Dimension. 1953 haben OAKLKY und FULTHORPE eine Methode zur AntigenAnalyse angegeben, bei der Antigen und Antikörper in zwei aufeinander stehenden Agarsäulen im Reagenzglas gegeneinander diffundieren.

Doppeldiffusion in zwei Dimensionen. Bei der 1948 von ÖRJAN OUCHTERLONY eingeführten Agargel-Doppeldiffusionstechnik werden Antigen- und Antikörperlösungen in Stanzlöeher gefüllt, die vorher aus einer gleichmäßig dicken Agar- oder Agaroseschicht ausgehoben wurden. Im Bereich der aufeinander zu diffundierenden Reaktionspartner bilden sich Präzipitationslinien aus, wenn optimale Konzentrationsverhältnisse erreicht sind. Der Vorteil dieses Verfahrens liegt darin, daß Antigene und Antikörper direkt miteinander verglichen werden können. Denn bei immunologisch identischen Antigenen und Antikörpern vereinigen sich die Präzipitatlinien zweier benachbarter Einfüllöcher, gegen die der andere Reaktionspartner aus einem gemeinsamen Stanzloch diffundiert, in einem Bogen vollständig miteinander (Identitätsreaktion). Bei

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

Kreuzreaktionen entsteht ein sogenannter Sporn (partielle Identität) und bei unterschiedlichen Antigenen oder Antikörpern kommt es zur Überschneidung der Banden. Die OUCHTERLONY-Technik hat sich außerordentlich zur Identifizierung verschiedener Plasmaeiweißkörper und zum Vergleich tierischer und mikrobieller Antigene sowie zur Charakterisierung tierischer und mikrobieller Toxine bewährt. Als Sonderform der Doppeldiffusionstechnik kann der ELEK-OucHTERLONY-Test zum Nachweis des Toxinbildungsvermögens von Corynebacterium diphtheriae gelten (s. Kap. 4.17). Aktive Immunpräzipitationen

Bei den sogenannten aktiven Immunpräzipitationsverfahren erfolgt die Fortbewegung von Antigen und/oder Antikörper im Gel nicht durch Diffusion, sondern durch die Antriebskräfte einer elektrischen Potentialdiffcrenz. Je nachdem, ob nur einer der Reaktionspartner oder beide elektrophoretisch aufgetrennt werden, spricht man von kombiniert aktiv-passiven oder rein aktiven Verfahren. Kombinierte aktiv-passive Immiinpräzipitationsver-

fahren. Zu den kombinierten Verfahren gehören z.B. die klassische Immunelektrophorcse (IEP) nach GRABAR und WILLIAMS, die Immunfixationselektrophorese (1FE) und die Radioimmunelektrophorese. Immunelektrophorese. Die IEP, die 1953 von GRAB AR und WILLIAMS eingeführt wurde, ist eine Kombination der Doppeldiffusionstechnik mit der elektrophoretischen Auftrennung komplexer Antigengemische. Sobald die Elektrophorese abgeschlossen ist, wird in der Laufrichtung ein Graben im Gel ausgehoben, der mit entsprechendem Antiserum gefüllt wird. Die Antikörper diffundieren in Richtung auf die getrennt vorliegenden Antigene und bilden mit diesen Präzipitationslinien, wenn optimale Konzentrationsverhältnisse erreicht sind. Mit dieser Methode wird eine sehr genaue Analyse auch äußerst vielschichtiger biologischer Systeme möglich. So kann sie z.B. Humanserum in mehr als dreißig antigenetisch unterschiedliche Proteinkomponenten auftrennen. Inimunfixationselektrophorese. Die IFE (ALPER und JOHNSON, 1969) ähnelt der IEP: im Gegensatz zu letzterer wird das Antiserum aber nach elektrophoretischer Auftrennung der Antigene auf die Oberfläche des Gels aufgebracht. Dabei kann das Antiserum auch in Zelluloseazetat- oder Füterpapierstreifen enthalten sein, in welche ihrerseits die Antigene hineindiffundieren können, so daß im Gel ebenso wie in den Antiserum-haltigen Streifen („Immunoprint") Ag-Ak-Reaklionen ablaufen. Der Einsatzbereich der IFE ist ähnlich dem der IEP. nur daß die erstere ein deutlich besseres Auflösungsvermögen, erheblich kürzere Reaktionszeiten und direkte Vergleichbarkeit mit rein elektrophoretischen Auftrennungen besitzt.

Radioimniunelektrophorese. Die Radioimmunelektrophorese wird als empfindliches Verfahren zum qualitativen Nachweis von Antikörpern gegen Antigene benutzt, die in reiner Form mit einem gammastrahlenden Isotop markiert sein müssen. Nach elektrophoretischer Auftrennung des Testserums wird das radioaktiv markierte Antigen zusammen mit einem komplexen Antiserum gegen Globuline des Testserumspenders in die Rinnen gefüllt und der Diffusion überlassen. Nach deren Abschluß wird das vollständig gewaschene Gel mit einem empfindlichen Röntgenfilm in Kontakt gebracht. Die erhaltene Autoradiographie zeigt an, in welcher oder welchen Präzipitationsbanden das markierte Antigen vorhanden ist. Rein aktive Immunpräzipitationsverfahren. Als

Beispiele für die aktiven Immunpräzipitationsverfahren seien die Gegenstromimmunelcktrophorese (Counter[current]immunoelectrophoresis, CIEP) und der Elektroimmunassay („Rocket Immunoclcctrophoresis") erwähnt. Gegenstromimmunelektrophorese. Unter den verschiedenen Modifikationen der immunelektrophoretischen Technik hat die CIEP besondere praktische Bedeutung für die medizinische Mikrobiologie. In Analogie zur Doppeldiffusion nach OUCHTKRLONY werden Antigen- und Antikörperlösung in zwei Stanzlöcher eines Agarose-Gels eingefüllt, aber in diesem Fall nicht durch Diffusion, sondern elektrophoretisch aufeinander zu getrieben. Antigen wird in die kalhodenwärts gelegene Vertiefung und das Antiserum in das anodale Stanzloch gegeben. Bei Anlegen einer elektrischen Spannung wandert das negativ geladene Antigen anodenwärts; die Antikörper werden durch den Ionenfluß zur Kathode mitgerissen (Elektroendoosmose). Im Bereich optimaler Konzentrationsverhältnisse beider Reaktionspartner bilden sich Präzipitationslinien aus. Die CIEP hat sich besonders zur Auffindung mikrobieller Antigene in Körperflüssigkeiten bewährt: zum Antikörpernachweis ist sie wegen geringer Empfindlichkeit weniger geeignet. Da die Ergebnisse vergleichsweise schnell verfügbar sind, gehört sie zu den diagnostischen Schnellmethoden. Ihr Anwendungsbereich ist unter anderem der Nachweis von HBs-Antigen sowie von Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis-, Pneumokokken- und Streptokokken-Oberflächenantigenen. Außerdem kann sie zur Auffindung von Clostridium diffkile-Toxin verwendet werden. Elektroimmunoassay - Rocket Immunelectrophoresis: Der von LAURELL in den sechziger Jahren entwickelte Test ist mit der radialen Immundiffusion verwandt mit der Abweichung, daß ein elektrisches Potential benutzt wird, um die Antigene in das Antikörper-haltige Agarose-Gel zu treiben. Die resultierenden dreieckförmigen oder felsnasenähnlichen Präzipitate erlauben eine quantitative Auswertung, da die Antigenkonzentrationen direkt proportional zur Höhe bzw. Fläche der Dreiecke sind. Eine Modifikation des Elektroimmunoassays ist die „Crossed Immunoelectrophorcsis", bei welcher die Primärauftrennung durch Elektrophorese oder isoelektrische Fokussierung erfolgt.

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Mikrobiologische Diagnostik

Western-Blot-Technik (Immunoblot). Mit Hilfe der Immunoblot-Technik werden heute z.B. sehr spezifisch Antikörper gegen verschiedene Bestandteile der AIDS-Erreger, von Borrelia burgdorferi (B. afzelii) oder von Yersinia enterocolitica nachgewiesen. Bei dieser Methode werden zunächst die Proteinantigene mit Hilfe der SDS-Gradienten-Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufgetrennt. Die getrennten Proteine werden dann durch Elektrotransfer (Elektroblotting) auf eine geeignete Membran (z.B. Nitrozelluloscfiltermembran) übertragen und hier mit dem zu untersuchenden Patientenserum zur Reaktion gebracht. Haben sich Antikörper an die auf die Membran übertragenen Proteine gebunden, können diese mit der Technik eines Enzymimmunassays z.B. mit Meerrettich-Peroxidase-markiertem Antihumanglobulinscrum oder eines Radioimmunassays (s. Kap. 5.1.13) z.B. mit 12M-markiertem Protein A (nach Autoradiographie) sichtbar gemacht werden. Seinem Wesen nach ist der Immuno(elektro)blot ein qualitatives, aber sehr spezifisches serologisches Verfahren. Patientenseren, in denen Antikörper gegen den jeweils gesuchten Erreger enthalten sind, bringen im Western Blot eine Reihe verschiedener Proteinbanden zur Darstellung. Nur bei Anwesenheit von Antikörpern gegen mehrere verschiedene Erregerproteine kann man sicher davon ausgehen, daß der Patient tatsächlich mit dem Erreger Kontakt gehabt hat. Reaktivität mit einzelnen Banden erfordert demgegenüber große Vorsicht bei der Interpretation des Ergebnisses („spezifische" und „unspezifische"' Banden) und die Durchführung von Kontrolluntersuchungen. Immerhin gilt der Western Blot als Bestätigungsverfahren, mit dessen Hilfe positive Reaktionsausfälle z.B. des ELISA und der Immunfluoreszenztechnik überprüft werden können. Im Zusammenhang mit Yersinia enterocolif/cfl-Infektionen dient er vor allem der diagnostischen Abklärung von postinfektiösen Gelenkentzündungen. Lysisreaktionen

Zelluläre Antigen-tragende Elemente wie Blutkörperchen, andere menschliche oder tierische Zellen sowie Bakterienzellen können in einem spezifischen immunologischen Prozeß, bei dem Antikörper über ihr Fc-Stück das Komplementsystem aktivieren, zur Auflösung gebracht werden.

In der praktischen bakteriologisch-serologischen Diagnostik spielt die direkte Anwendung der Immunbakteriolyse keine wesentliche Rolle. Historisch hat aber der PFEiFFERsche Versuch (1896), hei dem es nach Injektion virulenter Cholera-Vibrionen in die Bauchhöhle vorher gegen Cholera immunisierter Meerschweinchen zu einer mikroskopisch nachweisbaren Lysc der Vibrionen kommt, große Bedeutung für die Entwicklung der Immunitätsforschung gehabt. Der gleiche Effekt der Vibriolyse läßt sich im umgekehrten PFFJFFF.R.VC/H;« Versuch auch dann erzeugen, wenn die Vibrionen zusammen mit spezifischem Antiserum bei nicht immunisierten Versuchstieren in die Peritoncalhöhle eingespritzt werden. Das Phänomen der Bakteriolyse, das sich analog bei anderen gramnegativen Bakterien beobachten läßt, kommt, wie wir heute wissen, durch Aktivierung des in der Pcritonealflüssigkcit des Meerschweinchens vorhandenen Komplcmentsystems (s. Kap. 1.2.5) zustande.

Komplernentbindungsreaktion (KBR). Das 1901 von BORDET und GENGOU erarbeitete Prinzip der Komplementbindungsreaktion beruht darauf, daß Ag-Ak-Komplexe das im Blutplasma gesunder Tiere und Menschen vorkommende Komplementsystem „binden", d.h. unter Verbrauch der aktivierbaren Komponenten aktivieren können. Abgesehen von Zytolysevorgängen bei Zellen und Förderung der Phagozytose und Immunadhärenz wird diese Komplementaktivierung in der Regel nicht direkt sichtbar; das Komplement wird jedoch für weitere immunolytische Vorgänge im selben Versuchsansatz verbraucht. Dadurch kann man durch nachträgliche Zugabe eines Indikatorsystems aus Schaferythrozyten und gegen sie gerichteten Kaninchenantikörpern („Ambozeptor"), das ebenfalls zu einer komplementabhängigen Zytolyse (Immunhämolyse) befähigt ist, Aussagen über die erfolgte oder nicht erfolgte Komplementaktivierung im ersten Teil der Reaktion machen (Abb. 2.24). Voraussetzung für das einwandfreie Gelingen des gesamten Testablaufs ist natürlich eine sorgfältige mengenmäßige Abstimmung aller Reaktionspartner aufeinander, die in Vorversuchen vorgenommen wird. Vor allem der Komplementgehalt des Systems ist dadurch zu standardisieren, daß es zunächst aus den verwendeten Seren (bekanntes Antiserum oder Patientenserum, Ambozeptorserum) durch Erwärmen auf 56 CC entfernt wird (einige Komplementkomponenten sind hitzelabil). Anschließend wird es dann dosiert, in vorher ausgetesteter Menge, mit frischem Mecrschweinchenserum oder aus käuflichen, durch Lyophilisation haltbar gemachten Präparationen zugegeben.

Nach Abb. 2.24 sind die möglichen Reaktionsausfälle wie folgt:

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

Abb. 2.24 Schematische Darstellung der Komplementbindungsreaktion (KBR); oben: positiver Reaktionsausfall; unten: negativer Reaktionsausfall.

1. Die Hämolyse im Indikatorsystem bleibt aus. In diesem Fall darf angenommen werden, daß eine Komplement-verbrauchende Ag-AkReaktion zwischen den primär eingesetzten Reaktionspartnern stattgefunden hat. Das Ergebnis des Testes ist positiv. 2. Tritt eine Lyse der Schaferythrozyten ein, ist das Komplement im ersten Teil des Reaktionsablaufes nicht aktiviert worden. Es hat also die gesuchte Ag-Ak-Reaktion nicht stattgefunden, der Test ist negativ. Manche, vor allem bakteriell kontaminierte Seren binden Komplement unspezifisch, ohne daß Antigen hinzugefügt wurde. Die KBR fällt dadurch falsch-positiv aus (keine Hamolyse). Man spricht in einem solchen Fall von Eigenhemmung. Hier muß die Untersuchung mit einer anderen Serumprohc wiederholt werden. Aus der Möglichkeit des Vorkommens einer Eigenhemmung ergibt sich die Notwendigkeit, für jedes Serum neben dem eigentlichen Versuchsansatz eine Kontrolle ohne Antigenzugabe mitzuführen. Methodisch läßt sich die KBR im Laboratorium unterschiedlich handhaben. Die früher übliche Durchführung im Reagenzglas (Kot.MHR-Technik) ist arbeits- und materialaufwendig und heute weitgehend zugunsten einer Mikromethode in Mikrotiterplatten verlassen worden, bei der sich auch die Herstellung der Verdünnungsreihen zur Austitrierung mechanisieren läßt. Grundsätzlich kann die KBR sowohl zur Identifizierung unbekannter Antigene als auch zum Nachweis unbekannter oder gesuchter Antikör-

per verwendet werden. Letzterer Einsatzbercich hat im Rahmen der serologischen Diagnostik von Infektionskrankheiten die weitaus größere praktische Bedeutung erlangt. Das klassische Anwendungsgebiet der KBR war die SyphilisDiagnostik, bei der sie als WASSERMANNscheReaktion (WaR) (WASSERMANN, NF.ISSER und B RÜCK , 1906) jahrzehntelang unschätzbare Dienste geleistet hat. Darüber hinaus erwies sie sich auch bei vielen anderen bakteriellen, pilzbedingten, parasitären und vor allem viralen Erkrankungen als hervorragendes serologisch-diagnostisches Hilfsmittel und wurde erst in neuerer Zeit zunehmend durch modernere serologische Untersuchungsverfahren ersetzt. Die heute üblichen Komplement-unabhängigen Lysisreaktionen dienen im wesentlichen der Überprüfung der Funktionsfähigkeit des zellulären Immunsystems (z.B. T-Lymphozyten, natürliche Killerzellen).

Immunfluoreszenzmikroskopische Verfahren Immunglobuline lassen sich chemisch mit bestimmten fluoreszierenden Farbstoffen - Fluorochromen - (z.B. Fluoreszeinisothiocyanat FITC oder Tctramethylrhodaminisothiocyanat TMRI) markieren, ohne daß ihre spezifische Bindungsfähigkeit an das homologe Antigen verlorengeht. Auf dieser Erkenntnis basierend haben COONS und Mitarbeiter (1941/42) eine se-

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Mikrobiologische Diagnostik

rologische Technik entwickelt, die sowohl zur Identifizierung unbekannter Antigene und Antikörper als auch zum topographischen Nachweis von Antigenen in Zellen und Geweben geeignet ist. Das Prinzip dieser mikroskopischen Immunfluoreszenzverfahren besteht darin, daß auf einem Objektträger fixierte Antigen-tragende zelluläre Elemente, die mit Fluorochrommarkierten Antikörpern besetzt sind, unter einem Fluoreszenzmikroskop als farbig leuchtende Objekte oder Strukturbestandteile gegen dunklen Hintergrund sichtbar werden. Hat keine Ag-Ak-Reaktion stattgefunden, bleibt die „Anfärbung" aus, vorausgesetzt daß überschüssiges markiertes Antiserum sorgfältig abgewaschen wurde. Die mikroskopische Immunfluoreszenztechnik kann in verschiedenen Modifikationen zur Anwendung kommen. Direkter mikroskopischer Immunfluoreszenztest

Die direkte Immunfluoreszenztechnik dient zur Identifizierung von Mikroorganismen oder zur Lokalisation verschiedener Antigene in Zellen und Gewebe. Sie benutzt fluorochromierte, in der Regel im Tier hergestellte spezifische Antikörper gegen das erwartete Antigen (Abb. 2.25, Farbtafeln). Neben der Identifizierung von Erregerkulturen kann die direkte Immunfluoreszenz auch zum Erregernachweis in klinischen Untersuchungsmaterialien herangezogen werden und gehört damit zu den spezifischen Schnellmethoden der mikrobiologischen Diagnostik. Käufliche, Fluorochrom-markierte Antiseren sind u.a. zum Nachweis folgender Erreger erhältlich: Bordetella pertussis und parapertussis, Escherichia coli (K- und O-Antigene). Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Klebsiella-Arten, Legionella-Arten, Leptospiren, Listerien, Neisseria gonorrhoeae und menin-

gitidis, Burkholderia pseudomallei, Salmonellen, Shigellen, Staphylokokken, Pneumokokken, Streptokokken verschiedener serologischer Gruppen, Treponema pallidum, Chlamydia trachomatis, Candida albicans, Kryptosporidien, sowie für eine ganze Reihe von Viren (Adeno-, Cytomegalie-, EPSTEIN-BARR-, Herpes-simplex-, Influenza-, Röteln-, Mumps-, Parainfluenzaund Tollwut-Viren). Indirekter mikroskopischer Immunfluoreszenztest

Zur Suche nach unbekannten Antikörpern wird die indirekte Technik eingesetzt (s. Abb. 2.25. Farbtafeln): In einem ersten Arbeitsschritt werden auf dem Objektträger fixierte Zellen mit bekannter Antigenstruktur mit Serum (z.B. Patientenserum), in dem nach Antikörpern gegen diese Antigene gesucht werden soll, überschichtet und inkubiert. Nach sorgfältigem Waschen des Präparates wird anschließend ein fluorochromiertes Antigammaglobulin (z.B. Antihumangammaglobulin) aufgebracht. Letzteres kann die Antigen-tragenden Zellen nur zum Aufleuchten bringen, wenn in dem untersuchten Serum (z.B. Patientenserum) spezifische Antikörper vorhanden waren, die sich im ersten Schritt der Methode an die homologen Antigene gebunden haben und nun als Antigen mit dem markierten Antigammaglobulin reagieren. Aufleuchten des Antigens unter dem Fluoreszenzmikroskop bedeutet also, daß das untersuchte Serum (z.B. Patientenserum) den gesuchten Antikörper enthält; das Testergebnis ist positiv. Ein negativer Reaktionsausfall, d.h. das Fehlen des gesuchten Antikörpers, wird am Ausbleiben der Fluoreszenz erkennbar. In gleicher Weise kann auch ein unbekanntes Antigen mit Hilfe von bekannten Antiseren er-

Abb. 2.25 Schematische Darstellung des direkten und indirekten mikroskopischen Immunfluoreszenztests.

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

mittelt werden. Werden tierische Antiseren im Testsystem benutzt (z.B. im Kaninchen erzeugte Antiseren), muß ein fluorochromiertes Antigammaglobulinserum gegen das Gammaglobulin der betreffenden Tierart (z.B. Anti-Kaninchen-Gammaglobulinserum) verwendet werden. Der Vorteil des indirekten Verfahrens (Doppelschichttechnik) liegt in seiner größeren Empfindlichkeit im Vergleich zur direkten Technik und in der Tatsache, daß man mit wenigen markierten Antigammaglobulinseren auskommt. Unter den indirekten diagnostischen Immunfluoreszenzverfahren hat der FTA-Test (Fluoreszenz-Treponema-Antikörper-Test), heute meist als FTA-ABS-Test mit Vorabsorption des Patientenserums zur Entfernung kreuzreagierender Antikörper, besonders weite Verbreitung gefunden. Ebenso bewährt haben sich inzwischen auch indirekte Immunfluorcszenzmethoden zum Nachweis von Antikörpern gegen Legioncllcn, Chlamydia Irachomatis, Toxoplasma gondii (Ablösung des wegen Infektionsgefahr nicht ungefährlichen Serofarbtestes nach SABIN und FELDMAN), Plasmodien, Sproßpilze und viele Viren. Als weitere Modifikation kann zum Nachweis erfolgter Komplementbindung ein fluorochromiertes Antikomplemcntserum verwendet werden, mit dessen Hilfe speziell Komplement-bindende Ag-Ak-Reaktionen nachgewiesen werden können. Immunperoxidase- Tests

Analog der Immunfluoreszenztechnik lassen sich Antikörper anstatt mit Fluorochromen auch mit Enzymen wie der Meerrettich-Peroxidase markieren. Haben sich derartig markierte Antikörper an ein Antigen angelagert, kann ihre Anwesenheit durch die nachfolgende Reaktion mit einem Entwicklungsreagenz sichtbar gemacht werden. Bei Verwendung von 3,3-Diaminobenzidin oder 4-Chloro-l-naphlhol tritt z.B. im positiven Falle eine Braunfärbung auf; im Negativfall bleibt die Färbung aus. Die aufgetretene Farbreaktion kann sowohl mikroskopisch mit Hilfe eines einfachen, laborüblichen Durchlichtmikroskops als auch sogar makroskopisch festgestellt werden. Wegen der einfacheren Durchführbarkeit und Auswertbarkeit gewinnen Immunperoxidase-Teslverfahren zunehmend an Bedeutung. Ihr Einsatzbereich entspricht völlig dem der Immunfluoreszenztechnik: Sie können sowohl zur Identifizierung oder Lokalisierung von Antigenen als auch zum Antikörpernachweis eingesetzt werden. Anwendungsgebiete sind u.a. der Antigennachweis von Treponema pallidum, Chlamydien oder Herpes-simplex-Virus bzw. der Antikörpernachweis gegen diese Antigene.

Neutralisationsreaktionen

Mit den Neutralisationsreaktionen prüft man die Fähigkeit spezifischer Antikörper, die lnfektiosität von Mikroorganismen oder die Toxizität ihrer Stoffwechselprodukte für lebende biologische Objekte aufzuheben, zu „neutralisieren"'. Damit stehen diese Untersuchungsverfahren in direkter Beziehung zu den Schutzmechanismen, die auf diese Antikörper in vivo zurückgehen. Toxin-Antitoxin-Tierversuche

Wie im Kap. „Diagnostische Tierversuche'" ( in Kap. 2.3.1) besprochen, dienen Toxin-Antitoxin-Tiervcrsuche zum Nachweis mikrobieller Giftstoffe in menschlichem Untersuchungsmatcrial, Lebensmitteln oder Kulturüberständen, oder sie werden zur Standardisierung therapeutischer oder prophylaktischer Antiseren (z.B. Diphtherie-Antitoxin) benutzt. Weitere Toxin-Neutralisationsreaktionen

Ihrem Wesen nach ebenfalls Neutralisationsreaktionen sind die Antistreptolysin-O-Reaktion (ASL-O) und der AntidesoxyribonukleaseB-Test (ADB), die beide zur Diagnose einer durchgemachten oder noch laufenden Infektion mit Streptococcus pyogenes dienen. Das von diesen Bakterien gebildete, gewebstoxische Stoffwechsclprodukt Strcptolysin O besitzt die Fähigkeit, Erythrozyten aufzulösen. Bei Infektionen mit Streptokokken bildet der menschliche Körper spezifische Immunglobuline gegen das Streptolysin, welche seine hämolysierende Wirkung in vitro zu neutralisieren vermögen. Ähnlich hemmen im ADB-Test neutralisierende Antikörper die Aktivität des Streptokokkenenzyms Desoxyribonuklease B (Streptodornase). Neutralisationsreaktionen in der Virologie

Für die Virologie haben Neutralisationsreaktionen (Neutralisation der Infektiosität) nur noch begrenzte praktische Bedeutung (s. Kap. 5.1.13). Sie dienen dabei einerseits zur Identifizierung von Viren oder zur Bestimmung von Antigenverwandtschaften; andererseits werden sie zum Nachweis spezifischer Antikörper, also zur serologischen Krankheitsdiagnose, eingesetzt. Immobilisationsreaktionen

Bei einzelnen beweglichen Bakterienarten führt der Kontakt mit den gegen sie, vor allem aber mit den gegen ihre Geißelantigene gerichteten

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Mikrobiologische Diagnostik

Antikörpern zu einer raschen Hemmung ihrer Beweglichkeit im mikroskopischen Nativpräparat. Darauf aufbauend wurden Verfahren zur schnellen Identifizierung von Bakterien und zur serologischen Krankheitsdiagnostik entwickelt. Wichtigstes Beispiel für den letzteren Anwendungsbereich ist der Treponema pallidum-lmmobilisationstest (TPI-Test), der 1949 von NELSON und MAYER eingeführt wurde und den Durchbruch zu einer spezifischen Lues-Scrodiagnostik darstellte, inzwischen aber durch den FTA-ABS- und den TPHA-Test abgelöst wurde. Gute Dienste zur Schnellerkennung der Cholera leistet der Vibrio c/io/erae-Immobilisationstest, der sowohl mit nativem Reiswassersluhl der Kranken als auch mit kurz bebrüteten, flüssigen Anreichcrungskulturen durchgeführt werden kann und eine vorläufige Erregeridentifizierung erlaubt. Kapselquellungsreaktionen

Antikörper können bei bekapselten Bakterienarien mit der Kapselsubstanz als homologem Antigen reagieren, was unter dem Mikroskop, auch wegen eintretender Änderung des Brechungsindex, als erhebliche Verbreiterung und Abrundung der Schleimkapsel in Erscheinung tritt (sogenannte Kapselquellung). Hauptsächlich gebräuchlich ist dieses Verfahren zur serologischen Typisierung von Pneumokokken (NEUEELDschc Kapselquellungsreaktion), KlebsiellaSpczies und Haemophilus influenzae. Radio-, Enzym- und Fluoreszenzimmun(o)assays

In neuerer Zeit haben Radio-, Enzym- und Fluorcszcnzimmun(o)assays immer stärkere Verbreitung gefunden, da sie, obwohl methodisch recht aufwendig, außerordentlich empfindliche Nachweisreaktionen für gesuchte Antigene oder Antikörper sind. Radioimmun(o)assay (RIA) Der RIA vereinigt die Spezifität der immunologischen Reaktion mit der Empfindlichkeit der Radiochemie. Im Prinzip kann er in zwei Modifikationen ausgeführt werden: Bei der ersten Modifikation handelt es sich um ein kompetitives Proteinbindungsverfahren, bei dem der gesuchte Analyt (meist das Antigen) radioaktiv markiert wird (z.B. mit I2M) und mit demselben, im Untersuchungsmaterial enthaltenen, unmarkicrlcn Analytcn in Konkurrenz um die Bindungsstellen auf einem spezifischen Antikörper tritt. Nach Erreichen

des Äquilibriums werden gebundene und ungebundene Anteile des Analyten voneinander getrennt (z.B. durch Präzipitation des Ag-Ak-Komplexes oder durch primäre Adsorption des Antikörpers an die Wand des Reaktionsgefäßes) und die Radioaktivität der Ag-AkKomplexe wird gemessen. Je höher die Konzentration des gesuchten (unmarkierten) Analyten im Untersuchungsmaterial war, desto geringer wird die Radioaktivität der Ag-Ak-Komplexe sein. Die zweite Modifikation des RIA wird als ReagenzÜberschuß- oder Sandwich-Technik bezeichnet. Zu ihrer Durchführung wird gewöhnlich der Antikörper radioaktiv markiert und in Überschußkonzentrationen eingesetzt. Der Analyt wird aufgrund seiner Bindung an den radioaktiv markierten Antikörper gemessen. Seinem Wesen nach ist der RIA ein quantitatives Verfahren; er erlaubt also die Mengenbestimmung des gesuchten Analyten (Anligcn oder Antikörper). In der medizinischen Mikrobiologie wurde er früher hauptsächlich zur Bestimmung von Aminoglykosid-Konzentrationen im Patientenserum und zum Nachweis bakterieller oder viralcr (z.B. HBsAg) Antigene in Körperflüssigkeiten eingesetzt. Die Entwicklung einfacherer (z.B. Latex-Agglutination, Koagglulination, Gegenstromclektrophorese) oder analoger Verfahren, die ohne radioaktiv-markierte Reagenzien auskommen, keine Entsorgungsprobleme machen und für denselben Anwendungsbereich geeignet sind, hat allerdings in jüngster Zeit den RIA wieder weitgehend aus den diagnostischen mikrobiologischen Routinelaboratorien verdrängt. Enzymimmun(o)assay (EIA)

Enzymimmunassays basieren auf der Möglichkeit, Antigene oder Antikörper mit Enzymen so zu koppeln, daß weder die immunologische noch die enzymatische Aktivität verlorengehen. Die immunologisch spezifische Bindung des Enzymmarkierten Reaktionspartners wird am Ende des Versuchsablaufs durch eine Enzym-SubstratReaktion gemessen und kann, entsprechende Standardisierung des Tests vorausgesetzt, ebenfalls quantitative Ergebnisse liefern. Von besonderer praktischer Bedeutung ist heule der Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) in seinen verschiedenen Modifikationen. Prinzip und Ablauf einer der Modifikationen des ELISA sind in Abb. 5.33 schematisch dargestellt. ELISA-Methoden zum Antikörpernachweis.

Zum Antikörpernachweis und zur Antikörperquantifizierung bei nahezu allen Infektionskrankheiten hat die indirekte Methode des Festphasen-ELISA besonders weite Verbreitung gefunden. Sie beruht auf folgendem Prinzip: Die Vertiefungen von Plastik-Mikrotitcrplatten werden durch passive Adsorption mit dem jeweiligen Antigen beladen („sensibilisiert"). Nach Auswaschen des überschüssigen Antigens wird

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

die zu uniersuchende Serumprobe in den „sensibilisierten" Vertiefungen inkubiert, um etwa vorhandene Antikörper an das immobilisierte Antigen zu binden. Dann werden alle Serumbestandteile, die nicht reagiert haben, ausgewaschen und ein Enzym-markiertes Antihumanimmunglobulin (Konjugat) wird zugegeben, welches sich an den vorher gebundenen spezifischen Antikörper anlagert. Nach erneutem Waschen wird eine Lösung der Substanz, die dem zur Markierung verwendeten Enzym als Substrat dient, zugegeben, die Reaktion wird nach ausreichender Inkubationszeit unterbrochen und die Umsatzleistung des Enzyms wird, gewöhnlich anhand einer Farbreaktion, gemessen. Diese indirekte Methode läßt sich nur durchführen, wenn ausreichend gereinigtes Antigen zur Verfügung steht. Wenn das nicht der Fall ist, kann die feste Phase (z.B. Plastikoberfläche der Vertiefungen in den Mikrotiterplatten) mit dem spezifischen Antikörper beladen werden. Im weiteren Tcstablauf werden dann zugegeben: ungereinigtes Antigen, zu untersuchendes Serum, Enzym-markiertes Antihumanglobulin (Konjugat), Substrat. Eine weitere Modifikation ist, zunächst nichtmarkiertes Antihumanglobulin nach folgendem Schema einzusetzen: Antigen auf der festen Phase, zu untersuchendes Serum, nicht-markiertes Antihumanglobulin, Enzym-markiertes Antihumanglobulin, Substrat. Bei der SandwichMethode wird die feste Phase mit Anligen beladen, dann werden das zu untersuchende Serum, dann Enzym-markiertes Antigen und schließlich Substrat zugegeben. ELISA-Methoden zum Antigennachweis. Zum Antigennachweis hat die Sandwich-Methode mit Überschuß an markiertem Antikörper die weiteste Verbreitung gefunden. Sie läuft nach folgendem Schema ab: Spezifische Antikörper an der festen Phase, zu untersuchende Probe (Antigen), Enzym-markierter spezifischer Antikörper, Substrat. Unter Einfügung eines zusätzlichen Versuchsschrittes kann auch mit Antikörpern von zwei verschiedenen Spender-Spezies gearbeitet werden: Festphasen-Antikörper (z.B. vom Schaf), zu untersuchende Probe (Antigen), spezifischer Antikörper (z.B. vom Kaninchen). Enzym-markiertes Anti-Kaninchen-Immunglobulinserum, Substrat. Weitere Modifikationen sind erforderlich, wenn es um den Nachweis von kleinmolekularcn Haptenen geht.

Der Anwendungsbereich der ELISA-Technik in der Mikrobiologie erweitert sich ständig und

umfaßt inzwischen u.a. folgende Gebiete: Nachweis von mikrobiellen und viralen Antigenen in Körperflüssigkeiten; Nachweis von Toxinen (Aflatoxinen, Clostridium difficile-Toxm); Nachweis von Parasitenantigenen (z.B. Schistosoma mansoni, Toxoplasma gondii); Konzentrationsbestimmungen von Aminoglykosiden; Nachweis von Antikörpern gegen viele verschiedene Krankheitserreger. Fluoreszenzimmun(o)assay (FIA) FIA-Techniken finden gegenwärtig in klinischen Laboratorien breite Anwendung zum Nachweis und zur Quantifizierung von Arzneimitteln, Hormonen, Proteinen und Peptidcn in Körperflüssigkeiten. Diese Verfahren sind schnell, empfindlich und automatisierbar und stellen Alternativen zum RIA ebenso wie zum ELISA dar. Der Versuchsaufbau ist ähnlich wie beim RIA und ELISA, nur daß hier Fluorochrome zur Markierung verwendet werden und die Bindung der fluorochromierten Reaktionspartner, gegebenenfalls nach vorheriger enzymatischer Abspaltung, über ein Fluorometer nachgewiesen und quantifiziert wird. In die Mikrobiologie hat der kompetitive FIA vor allem zur Konzentrationsbestimmung von Aminoglykosiden oder Peptidantibiotika im Patientenserum Eingang gefunden.

Nachweis von IgM-Antikörpern Wegen ihrer Größe können die makromolekularen IgM-Antikörper den Kreislauf kaum verlassen und werden deshalb auch nicht diaplazentar von der Mutter auf den Föten übertragen. Außerdem werden sie im Verlauf einer Infektion als erste ausgebildet, verschwinden aber während der Heilungsphase bald (in Wochen oder Monaten) und werden gegenläufig durch IgG-Antikörper ersetzt. Diese beiden Eigenschaften verleihen ihnen spezielle diagnostische Bedeutung: Einerseits kann man sie dazu benutzen, auf serologischem Wege zwischen floriden und abgelaufenen Infektionskrankheiten zu unterscheiden; andererseits erlauben sie festzustellen, ob beim Neugeborenen vorhandene Antikörper von der Mutter stammen (Leihimmunität - IgG) oder im Rahmen einer intrauterin erworbenen Infektion vom Kind selbst gebildet wurden (IgM) und damit auf eine behandlungsbedürftige Erkrankung des Kindes hinweisen. Methodisch ist der IgM-Nachweis relativ aufwendig, da er in der Regel, obwohl grundsätzlich mit mehreren der genannten serologischen Verfahren durchführbar, zunächst eine Entfernung des IgG und des Rheumafaktors erfordert (z.B.

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Mikrobiologische Diagnostik

durch Dichtegradienten-Ultrazentrifugation, [gG-Immunpräzipitation, Serumabsorption mit Protein A bzw. Staphylococcus aureus, Gel-Ionenaustauscher-, Affinitäts- oder HochdruckFlüssigkeitschromatographie). Monoklonale Antikörper in der diagnostischen Mikrobiologie Monoklonale antivirale, antibakterielle und antiparasitäre Antikörper haben sich besonders zur raschen und zuverlässigen Identifizierung verschiedener Mikroben in der Kultur außerordentlich bewährt. Dabei kann man sowohl Antikörper mit sehr enger Spezifität zur Identifizierung auf Subspezies- und Typenebene einsetzen; man kann aber auch monoklonale Antikörper breiterer Reaktivität verwenden, die dann zur Erkennung von Mikrobengruppen (z.B. Genera) oder zur phylogenetischen Klassifizierung von Mikroorganismen herangezogen werden können. Gerade wegen ihrer hohen und definierten Spezifität sind monoklonale Antikörper darüber hinaus besonders gut zum unmittelbaren Erregernachweis in klinischen Untersuchungsmaterialien geeignet. In Kombination mit empfindlichen immunoassays bieten sie sich zur automatisierten Analyse von Blut und anderen Körperflüssigkeiten auf mikrobielle Antigene an. Schließlich eignen sie sich auch als hochspezifische Reaktionspartner für chromatographische Trennungen und möglicherweise sogar zur Immuntherapie mikrobieller oder neoplastischer Erkrankungen. Der Vorteil des monoklonalen Antikörpers ist seine hohe und definierte Spezifität sowie, wenn die hybridisierte Zellinie einmal etabliert ist, seine theoretisch unbegrenzte Verfügbarkeit in gleichbleibender Qualität. Dem stehen allerdings auch Nachteile gegenüber: Die HybridomTechnik (Fusion einer Myelom-Zelle mit einer Antikörper-bildenden Zelle) ist immer noch arbeitsintensiv, nicht billig und zeitaufwendig. Außerdem stellt jeder monoklonale Antikörper nur einen in einer großen Zahl von Antikörpern dar, welche die gesamte Immunantwort ausmachen, so daß er auch nur einen kleinen Teil der Eigenschaften eines konventionellen Anliserums besitzen kann. Es darf deshalb nicht angenommen werden, daß ein polyklonales Antiserum automatisch und in jedem Falle durch einen monoklonalen Antikörper ersetzt werden kann.

2.3.3 Schnellverfahren zur Diagnose von Infektionskrankheiten Der Zeitbedarf der konventionellen mikrobiologischen Diagnostik, die auf die Anzüchtung und Identifizierung des jeweiligen Krankheitserregers abzielt, läßt sich wegen der vorgegebenen Generationszeit der Mikroorganismen nicht beliebig verringern und ist zumindest in Stunden, meist in Tagen und zuweilen sogar in Wochen zu messen. Daraus resultieren notwendigerweise Schwierigkeiten für den Arzt am Krankenbett, der gerade bei hochakuten oder lebensbedrohenden Krankheitszuständen möglichst bald wissen möchte, ob es sich um eine Infektionskrankheit handelt, welche Erreger gegebenenfalls vorliegen und wie er sie am besten behandeln kann. Um diesem verständlichen Anliegen nach rascher Information Rechnung zu tragen, wurden sogenannte Schnellverfahren entwickelt. Unter Schnellverfahren verstehen wir in diesem Zusammenhang solche Techniken, die mindestens innerhalb einiger Stunden nach Eintreffen des Untersuchungsmaterials im Laboratorium, also am gleichen Tag, ein verwertbares Ergebnis liefern. Einige der bereits angesprochenen Methoden können grundsätzlich diesem Anspruch gerecht werden. Ihre diagnostische Aussagekraft reicht aber nicht ohne weiteres an die Sicherheit und Genauigkeit der Erregerkultur heran, und sie ermöglicht auch keine individuelle Prüfung der Wirksamkeit geeigneter Therapeutika. In der Tabelle 2.5 sind einige wichtige, heute gebräuchliche Schnellverfahren mit ihrem hauptsächlichen Einsatzbereich und ihrem Zeitbedarf zusammengestellt. In der Spalte „Diagnostische Zuverlässigkeit" haben wir versucht, anhand der Empfindlichkeit, Spezifität und Störanfälligkeit der jeweiligen Methode eine Bewertung ihrer praktischen Brauchbarkeit vorzunehmen. Dabei wird eingeräumt, daß sich einige Techniken noch verbessern oder feiner adaptieren lassen, so daß sie in Zukunft vielleicht einen höheren Stellenwert einnehmen können. Der in Tab 2.5 angegebene Limulus-Test wurde bisher nicht besprochen und soll deshalb zum besseren Verständnis hier noch kurz beschrieben werden: Das Amöbozytenlysat (Blutzcllysat) des Pfcilschwanzkrebses Limulus polyphemus (Königskrabbe) wird dureh Endotoxin zum Gelieren gebracht. Diese Reaktion beruht darauf, daß Lipopolysaccharid eine Serinprotease aktiviert, die lösliches Protein in einen

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

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Mikrobiologische Diagnostik

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

unlöslichen Komplex umwandelt, und sie ist so empfindlich, daß sie zum Nachweis sehr kleiner Endotoxinmengen in menschlichen Körperflüssigkeiten, vor allem im Blut und im Liquor. geeignet ist. Bei der Diagnostik von Meningitiden, die durch gram-negative Bakterien (z.B. Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Haemophilus Influenza?) hervorgerufen sind, hat sich das Verfahren recht gut bewährt. Dagegen kommt es bei Blutuntersuchungen häufig zu positiven Reaktionsausfällen, ohne daß sich eine Sepsis mit gram-negativen Erregern verifizieren läßt. Inzwischen gibt es kommerzielle Varianten des Limulus-Testes, die einfacher anzuwenden sind und deshalb heute meist eingesetzt werden.

2.3.4 Molekularbiologische Verfahren in der mikrobiologischen Diagnostik In den vergangenen Jahren haben sich eine ganze Reihe von molekularbiologischen Techniken, die ursprünglich für die Grundlagenforschung geschaffen worden waren, zu wichtigen Werkzeugen der mikrobiologischen Diagnostik weitercntwickelt. Unter dem etwas unscharfen Oberbegriff .,molekularbiologische Verfahren" werden in der diagnostischen Medizinischen Mikrobiologie Techniken für den Nachweis und die weitere Charakterisierung erregerspezifischer Nukleinsäuren zusammengefaßt (sog. Nukleinsäurediagnostik). Da die entsprechenden Techniken sich derzeit hinsichtlich ihres Einsatzgebietes und ihrer methodischen Durchführung rasant weiterentwickeln, kann in diesem Abschnitt naturgemäß nur ein kurzer methodischer Abriß der momentan gebräuchlichsten molekularbio-

logischen Nachweisverfahren gegeben werden. ]n der Tabelle 2.6 sind die Ersatzmöglichkeiten molekularbiologischer Verfahren in der mikrobiologischen Diagnostik zusammengefaßt. Nachweis erregerspezifischer Nukleinsäuren

Nukleinsäurenachweisverfahren weisen eine hohe Spezifität und meist auch eine hohe bis sehr hohe Sensitivität auf. Dies erlaubt es in vielen Fällen, Mikroorganismen direkt aus klinischem Untersuchungsmaterial nachzuweisen, ohne daß eine vorherige Erregeranzucht notwendig wird. Dabei können auch solche Mikroorganismen erfaßt und quantitativ bestimmt werden, die entweder nicht oder nur mit unverhältnismäßig großem Aufwand kultivierbar sind oder deren Kultur mit erheblichen Sicherheitsrisiken verbunden ist. Schließlich kann der Nachweis erregerspezifischer Nukleinsäuren auch in Probenmaterialien durchgeführt werden, die aufgrund ihrer Vorbehandlung, beispielsweise durch histologische Fixierungs- und Einbettungstechniken, keine vermehrungsfähigen Erreger mehr enthalten. Die in diesem Abschnitt zu besprechenden Verfahren können neben dem alleinigen Nachweis von Erregern auch zur Identifizierung und Charakterisierung bereits vorhandener Isolate eingesetzt werden. Bei den Techniken des Nukleinsäurenachweises läßt sich prinzipiell zwischen Verfahren, die auf der in-vitro-Amplifikation der nachzuweisenden Nukleinsäuresequenzen basieren (Nukleinsäureamplifikationstechniken, NATs) und sol-

Nachweis und Charakte-

- qualitativer und quantitativer Erreger-

risierung erregerspezifischer Nukleinsäuren

nachweis - Therapieüberwachung - Identifizierung von Isolaten - Erregertypisierung und taxonomische Untersuchungen - epidemiologische Untersuchungen, Aufklärung von Infektketten - Mutationsanalyse - Resistenztestungen - Transkriptionsanalyse

Gentechnologie (rekombi-

- Klonierung und Sequenzierung von

nante DNA-Technologie)

Erregergenomen - Herstellung von Gensonden - Produktion rekombinanter Proteine als diagnostische Antigene - Erzeugung poly- und monoklonaler Antikörper gegen Erregerbestandteile

Tab. 2.6 Einsatz molekularbiologischer Verfahren in der mikrobiologischen Diagnostik

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Mikrobiologische Diagnostik

chen, die ohne In-vitro-Amplifikationsschritt auskommen, unterscheiden. Nachweis von erregerspezifischen Nukleinsäuren ohne in-vitro-Amplifikationsschritt

Der direkte Nachweis erregerspezifischer Nukleinsäuren im Probenmaterial durch Anfärbung bzw. Anreicherung und die nachfolgende gclelektrophoretische Auftrennung hat nur in Ausnahmefällen praktische Bedeutung. So kann beispielsweise die im Stuhl Infizierter in großen Mengen vorhandene Rotavirus-spezifische doppelsträngigc RNA nach Aufreinigung und Gelclcktrophorese direkt dargestellt und anhand ihrer Wanderungseigenschaften (fragmentiertes Genom, vergleiche auch Kap. 6.10 über Rotaviren) identifiziert werden. Ganz überwiegend werden jedoch zum Nachweis erregerspezifischer Nukleinsäuren Gensonden (sog. GensondenanaIvtik) eingesetzt. Hierbei wird die Eigenschaft von Nukleinsäuren ausgenützt, sich aufgrund der Ausbildung einer spezifischen ßasenpaarung unter geeigneten experimentellen Bedingungen reversibel an für sie komplementäre Nukleinsäuresequenzen zu binden. Diesen Vorgang bezeichnet man als Hybridisierung (Abb. 2.26). Gensonden können durch Klonierung von Erregernuklcinsäurefragmenten oder in Form synthetischer Oligonukleotide erhalten werden. Da die meisten Erreger neben konservierten, spezies- bzw. genusspezifischen Nukleinsäuresequenzcn auch über variable Genomabschnitte verfügen, kann durch die Wahl geeigneter Gensonden festgelegt werden, ob die Nachweisgenauigkeit bis zur Genus-, Spezies- oder Erregerstammebene gehen soll.

Vor Durchführung der eigentlichen Hybridisierungsreaktion wird in den meisten Fällen ein Aufschluß des Probenmaterials mit schonender Freisetzung und anschließender Extraktion der gesuchten Nukleinsäuren notwendig sein. Die nachzuweisende Erregersequenz wird hierbei als Zielsequenz bezeichnet. Handelt es sich bei der Zielsequenz um doppelsträngige DNA oder RNA, so müssen die im Probenmaterial vorliegenden Nukleinsäurestränge zunächst durch thermische oder alkalische Denaturierung voneinander getrennt werden, um eine Anlagerung der Gensonde zu ermöglichen. Im Falle von RNA ist zudem die hohe Instabilität der Zielsequenzen durch ubiquitär vorhandene RNAsen bei der Wahl von Extraktionsverfahren zu berücksichtigen. Nach der Anlagerung der Gensonde an ihre Zielsequenz wird nichtgebundenes Sondenmaterial durch Auswaschen entfernt. Die Spezifität der Hybridisierungsreaktion wird maßgeblich bestimmt durch die Basenzusammensetzung und Länge der Gensonde sowie durch die Inkubationsbedingungen, insbesondere Temperatur, Salzgehalt und das Vorhandensein chaotroper Substanzen (wie Formamid) während der Hybridisierungsreaktion und dem anschließenden Auswaschen nichtgcbundcncr Nukleinsäure. Als Maß für die während der Hybridisierung gewählten Reaktionsbedingungen wurde der Begriff Stringenz eingeführt. Je höher die Stringenz einer Hybridisierungsreaktion gewählt wird, desto weniger Basenfehlpaarungen zwischen Gensonde und Zielsequenz werden toleriert. Umgekehrt gilt, daß bei niedriger Strin-

Abb. 2.26 Bindung einer Gensonde an ihre Zielsequenz. Zwischen Censonde und Zielsequenz kommt es zur Ausbildung einer spezifischen Basenpaarung. Dargestellt ist eine Hapten-markierte Gensonde (Einbau von dUTP-Haptenkonjugat [U-*-H] statt dTTP), die den nichtradioaktiven Nachweis hybridisierter Sonden erlaubt. Die Bindung der Gensonde an die Zielsequenz wird in einer nachgeschalteten Enzymimmunreaktion dargestellt. Dies kann mittels eines Enzym-markierten Hapten-spezifischen Antikörpers (>-E) und einer nachfolgenden Farbreaktion geschehen.

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

genz eine Bindung zwischen Gensonde und lediglich teilweise zu ihr komplementären Zielsequenzen ermöglicht wird. In der Praxis kann dies beispielsweise bedeuten, daß Nukleinsäuresequenzen einer anderen Spezies des gleichen Genus von der Gensonde erkannt werden. Um eine stattgefundene Hybridisierung mit der Zielsequenz sichtbar zu machen, werden Gensonden spezifisch markiert. Dies kann durch Einbau radioaktiver Isotope (meist !2P oder 35S, aber auch 12:>J) oder von Haptenen in die Gensonde geschehen. Bei Verwendung radioaktiv markierter Gensonden erfolgt der Nachweis einer stattgefundenen Hybridisierung über die Messung der an die Zielsequenz gebundenen Radioaktivität. Der Trend geht heute verständlicherweise zu nichtradioaktiven Nachweisverfahren. In der Praxis genutzt wird hier insbesondere der Einbau Biotin- oder Digoxigenin-markierter Nukleotide in die Gensonde. Die als Haptcn wirksamen Biotin- bzw. DigoxigeninSeitengruppen führen zu keiner nennenswerten Einschränkung der Bindungsfähigkeit der Gensonde. Nach Durchführung der Hybridisierungsreaktion können sie in einem nachgeschalteten Versuchsschritt, der im wesentlichen einem Enzymimmun(o)assay entspricht, hochempfindlich nachgewiesen werden. Ein weiteres, ebenfalls nichtradioaktives Verfahren zum Nachweis gebundener Gensonden bedient sich monoklonaler Antikörper, die spezifisch mit Doppelstrang-DNA (z.B. spezifisch an ihre DNA-Zielsequcnz gebundene DNAGensonde) oder aber mit DNA:RNA-Hybridmolekülen (z.B. spezifisch an ihre DNA-Zielsequenz gebundene RNA-Gensonde) reagieren.

Da die Abgrenzung gebundener von freier Gensonde bei Hybridisierungsreaktionen, die frei in Lösung stattfinden, sich als methodisch schwierig erweisen kann, wird die nachzuweisende Nukleinsäure meist in einem vorgeschalteten Versuchsschritt an ein Trägermaterial, typischerweise eine Nylon- oder Nitrocellulose-Filtermembran, fixiert. Die nachfolgende Bindung der Gensonde findet dann auf der Oberfläche der Filtermembran statt. Diese Art der Reaktion bezeichnet man als Blotverfahren. Seit einigen Jahren kommen zunehmend Techniken zur Anwendung, bei der die Zielsequenz entweder nach spezifischer Hybridisierung an eine Fangsonde (engl. capture probe) oder über Bindung von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch an den doppelsträngigen Nukleinsäurekomplex aus Zielsequenz und Gensonde binden (z.B. DNA:RNA-Hybrid-spezifischer monoklonaler Antikörper, vergleiche auch oben), an die Oberfläche von Reaktionsgefäßen fixiert wird und somit für den Nachweis in nachgeschalteten Versuchsschritten verfügbar gemacht wird (sog. hybrid-capture-Verfahnzn). Diese Vorgehensweise erlaubt eine weitgehend automatisierbare Bearbeitung der Proben (Abb. 2.27). Die Sensitivität des DNA-Nachweises mittels Gensonden liegt bei Einsatz konventioneller Techniken, z.B. Blotverfahren mit radioaktiv-markierter Gensonde, bei etwa 1Ü4 Molekülen der Zielsequenz und ist somit um mehrere Größenordnungen niedriger als die theoretisch erreichbare, maximale Sensitivität von in-vitroNukleinsäureamplifikationstechniken (NATs; s.u.). Im Gegensatz zu NATs besteht jedoch keine Gefahr einer unbeabsichtigten Kontamination von Probenmaterial durch Amplifikationsprodukte, so daß die Durch-

Abb. 2.27 Nukleinsäurenachweis mittels HybridCapture- Verfahren.

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Mikrobiologische Diagnostik

führung von DNA-Nachweisen mittels Gensonden keine aufwendigen technischen und organisatorischen Maßnahmen zur Kontaminationsvermeidung erfordert (vergleiche auch unten). Der Einsatz von verzweigten Gensonden (engl. bremched DNA) in Verbindung mit weiteren Signalverstärkungsschritten und Einsatz von atypischen Basen (isoG und isoC in den Sonden) sowie Chcmolumineszcnzfarbstoffen erlaubt es. die Empfindlichkeit des direkten NukleinsäurcNachweises mittels Hybridisicrungsverfahrcn auf ca. 100 Moleküle der Ziclscquenz pro ml Probenmaterial zu steigern (Abb. 2.28, Farbtafeln, branched DNA Nachweisverfahren). Nukleinsäureamplifikationstechniken (NATs)

Polymerase-Keüenreaktion (PCR). Den Prototyp der Verfahren zur in-vitro-Amplifikation

von Nukleinsäuresequenzen stellt die Polymcrase-Kettenreaktion (engl. polymerase chain reaction, PCR) dar. Sie soll daher im folgenden detaillierter dargestellt werden. Die PCR läßt sich als hochsensitives Verfahren zum Nachweis spezifischer Nukleinsäureabschnitte einsetzen. Wie in Abb. 2.29a-c gezeigt, erfolgt in der PCR eine zyklische DNA-Neusynthese der Zielsequenzen in vitro mit Hilfe des Enzyms DNA-Polymerase, eines Paares synthetischer DNA-Oligonukleotide. die als Startermoleküle (engl. primer) für die Enzymreaktion dienen, und der vier Desoxyribonukleosidtriphosphate. Die gewöhnlich in der PCR eingesetzten DNAPolymerasen sind DNA-abhängige DNA-Poly-

Abb. 2.28 Nukleinsäurenachweis und Signalamplifikation mittels b (branched) DNA-Technik. In der rechten Hälfte der Abbildung sind die Einzelkomponenten des Verfahrens schematisch dargestellt, die linke Hälfte der Abbildung zeigt das vollständige Nachweissystem. Zielsequenz und an die Zielsequenz bindende Anteile der Fangsonden sind rot dargestellt; Sonden, die für die Bindung an die Festphase benötigt werden, Vorverstärker, bDNAund Detektionssonden sind schwarz dargestellt. AP: Alkalische Phosphatase.

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

Abb. 2.29 a-c In-vitro-Amplifikation von DNA-Sequenzen mittels Polymerase-Kettenreaktion. a) zeigt die während des ersten PCR-Zyklus ablaufenden Reaktionsschritte, in b) und c) ist das exponentielle Anwachsen von PCR-Produkten während der ersten PCR-Zyklen dargestellt. Die im jeweiligen Zyklus neu synthetisierten PCR-Produkte sind rot markiert.

merasen, d.h. sie akzeptieren als Gegenstrang des neu zu synthetisierenden DNA-Stranges lediglich DNA. Viele virale Erreger besitzen jedoch ausschließlich RNA als genetisches Mate-

rial. Sollen virale oder andere RNA-Sequenzen in der PCR vervielfältigt werden, müssen diese zunächst in einem Prozeß, der als reverse Transkription bezeichnet wird, in komplementäre

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Mikrobiologische Diagnostik

DNA-Stränge (engl. c-DNA = copy) umgeschrieben werden. Erst dann kann eine In-vitroVervielfältigung dieser Nukleinsäuresequenzen in der PCR erfolgen. Zur reversen Transkription bedient man sich entweder einer retroviralen reversen Transkriptase (RT, RNA-abhängige DNA-Polymerase) oder nutzt die RT-Aktivität einiger thermostabiler DNA-Polymerasen, die auch zur DNA-Vervielfältigung in der PCR eingesetzt werden (vergleiche auch Abb. 2.30). Die Sequenzen beider PCR-Primer werden so gewählt, daß sie jeweils komplementär zu gegenüberliegenden Nukleinsäuresträngen der

Zielsequenz sind, daß sie den in der PCR zu vervielfältigenden Bereich flankieren und daß die Richtung der durch die DNA-Polymerase neu synthetisierten DNA-Moleküle gegenläufig ist. Der Einsatz der PCR in der Diagnostik setzt daher in der Regel voraus, daß zumindest die Nukleinsäuresequenzen der Primerbindungsstellen bekannt sind. Bis zu einem gewissen Maß können Sequenzvariationen der Primerbindungsstelle jedoch durch den Einsatz sogenannter degenerierter Primer, d.h. von Primern, die an einigen Positionen zufällige Basenfolgen enthalten, ausgeglichen werden.

Abb. 2.30 Amplifikation von RNA-Zielsequenzen mittels RT-PCR. RNA-Sequenzen sind rot, DNA-Sequenzen schwarz dargestellt; RT Reverse Transkriptase; cDNA zu der RNA-Zielsequenz komplementäre copy DNA.

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

DNA-Polymerase, Primer und Dcsoxyribonukleosidtriphosphate werden dem Reaktionsansatz in hohem Überschuß zugegeben. Um eine Bindung der Primer an ihre Zielsequenzen zu ermöglichen, erfolgt als erster Schritt eine Trennung der in der Probe vorhandenen Nukleinsäure-Doppelstränge in Einzelstränge durch thermische Denaturierung. Anschließendes Abkühlen des Reaktionsansatzes erlaubt eine Anlagerung der Primer (typischerweise etwa 20 Basen lange DNA-Oligonukleotide) und die nachfolgende DNA-Synthese. Dieser Zyklus bestehend aus Denaturierung, Primer-Bindung und DNA-Synthese wird in der PCR vielfach wiederholt (meist 20-40fach). Der Einsatz einer thermostabilen DNA-Polymerase, beispielsweise der Taq-Polymerase, die aus dem thermophilen Bakterium Thermits aquaticus stammt, erübrigt die wiederholte Zugabe von Enzym nach jedem Denaturierungsschritt und erhöht die Spezifität der Reaktion. In jedem PCR-Zyklus erfolgt im Idealfall eine Verdopplung der Zielsequenz. Da die Syntheseprodukte ihrerseits als Zielsequenz nachfolgender Synthesen dienen, kommt es zu einer exponcntiellen Vermehrung von Syntheseprodukten. Mit steigender Zykluszahl überwiegen hierbei rasch diejenigen Syntheseprodukte, deren Länge dem von den Primern begrenzten Nukleinsäureabschnitt entspricht (s. Abb. 2.29c). Mangel an Primermolekülen und freiem Enzym begrenzt nach 20 bis 40 PCR-Zyklen schließlich die weitere exponentielle Vermehrung der Zielsequenz. In der Praxis lassen sich in der PCR Vervielfältigungsraten der Zielsequenz um den Faktor 108 bis 1010 erzielen. Soll eine noch höhere Empfindlichkeit erreicht werden, kann eine weitere PCR der ersten Reaktion nachgeschaltet werden. Hierbei wird ein zweites Paar spezifischer Primer verwendet, deren Bindungsstelle innerhalb des Reaktionsproduktes der ersten PCR liegt (engl. nested PCR). Die Empfindlichkeit der Gesamtreaktion kann letztlich soweit gesteigert werden, daß der Nachweis eines einzelnen Moleküls der Ziclsequenz in einem 1012- bis 10l3-fachen Überschuß begleitender DNA-Sequenzen möglich wird. Da die spezifischen kurzen Syntheseprodukte nach Abschluß der PCR im Reaktionsansatz in hohen Konzentrationen vorliegen (0,5 bis 1 ^g DNA-Gesamtmenge oder lO'-lO11 Moleküle pro \x\ Reaktionsgemisch), lassen sie sich anhand ihrer charakteristischen Größe und DNASequenz mit gängigen molekularbiologischen Verfahren wie Gelelektrophorese und/oder Nukleinsäurehybridisierungsverfahren (s.o.) problemlos nachweisen.

Besondere methodische Anforderungen an die Durchführung der PCR stellt die quantitative

Bestimmung von erregerspezifischen Zielsequenzen im klinischen Probenmaterial. Quantitative Aussagen werden beispielsweise benötigt, um die Belastung mit Erregergenomen im peripheren Blut zu bestimmen oder Aussagen über den Effekt einer antiviralen Therapie machen zu können. Aufgrund ihrer exponentiellen Vermehrungscharakteristik führen jedoch bereits kleinste Schwankungen der Amplifikationseffizienz zwischen einzelnen Ansätzen zu sehr großen Unterschieden in der Menge an Reaktionsprodukten nach Abschluß der PCR. Die Menge der nach der PCR vorhandenen Reaktionsprodukte erlaubt daher bestenfalls eine grobe Abschätzung der vor Durchführung der PCR in der Probe vorhandenen Ziclsequenzen. Ein bewährtes Verfahren zur exakten Quantifizierung von Zielsequenzen im Probenmaterial ist die kompetitive PCR (Abb. 2.31). Hierbei wird dem Probenmaterial vor Durchführung der PCR eine definierte Menge eines internen Standards zugesetzt, der mit gleicher Effizienz zusammen mit der in unbekannter Menge in der Probe vorhandenen Zielsequenz in der PCR vervielfältigt wird. Nach Abschluß der PCR kann dann über das Verhältnis vervielfältigter Zielsequenzen zu Standardsequenzen die Anzahl der ursprünglich in der Probe vor Durchführung der PCR vorhandenen Zielsequenzen berechnet werden. Gleichzeitig erlaubt die Mitführung eines internen Standards eine effektive Kontrolle der Probenvorbehandlung und den Ausschluß falsch-negativer PCR-Ergebnisse. Aufgrund ihrer extrem hohen Sensitivität und der schnellen Verfügbarkeit von Ergebnissen bietet sich die PCR als Nachweisverfahren in der Medizinischen Mikrobiologie in allen Situationen an, in denen ein direkter Erregernachweis nicht möglich, zu gefährlich oder zu zeitaufwendig wäre. Weiterhin gewinnt die PCR als Methode zur Identifizierung von Erregerisolaten zunehmend an Bedeutung. Als generell problematisch ist jedoch die hohe Störanfälligkeit der PCR gegenüber Kontaminationen aus vorhergehenden Reaktionen oder stark positiven klinischen Proben anzusehen. Bei Einsatz der PCR zu diagnostischen Zwekken sind daher besondere Vorkehrungen zur Kontaminationsvermeidung zwingend erforderlich. Eine grundlegende Maßnahme zur Kontaminationsvermeidung ist die strikte räumliche, apparative und organisatorische Trennung derjenigen Bereiche, in denen Puffer- und andere Lösungen für die PCR angesetzt werden, von

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Mikrobiologische Diagnostik

Abb. 2.31 Kompetitive RT-PCR.

denjenigen, in denen die klinischen Proben für die PCR aufbereitet werden, die Amplifikationsrcaktion durchgeführt wird und in denen die Nachweisreaktionen für PCR-Produkte erfolgen. Ein weiteres bewährtes Vorgehen zur Kontaminationsvermeidung besteht darin, dem PCR-Ansatz Desoxyuridintriphosphat zuzusetzen. Bei versehentlicher Verschleppung der hierdurch entstehenden Uracil-haltigen PCRProdukte in klinische Proben können diese durch Vorbehandlung des Probenmaterials mit dem Enzym Uracil-N-Glykosidase (UNG) spezifisch zerstört und somit als Kontaminationsquelle ausgeschaltet werden.

Insgesamt hat sich das methodische Spektrum der PCR und ihrer Anwendungsmöglichkeiten in den letzten Jahren ganz erheblich erweitert. Methodisch gehl der Trend zunehmend zu weitgehend automatisiert durchführbaren Anwendungen. Gleichzeitig wurden Verfahren entwickelt, mit denen sich die Synthese von PCR-Produkten im Reaktionsgefäß unmittelbar verfolgen läßt, ohne daß Produkte dem Reaktionsansatz zur weiteren Analyse entnommen werden müssen (sog. real-time-PCR). Hierdurch können Kontaminationen weitgehend vermieden und die Dauer der Gesamtreaktion deutlich verringert werden, außerdem wird eine Quantifizierung von Zielsequcnzen ermöglicht. Ligase-Kettenreaktion (LCR). Die Ligase-Kettenreaktion (engl. ligase chain reuetion, LCR) ist ein weite-

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

Abb. 2.32 a-c In-vitroAmplifikation von DNA-Sequenzen mittels LigaseKettenreaktion. a) zeigt die während des ersten LCR-Zyklus ablaufenden Reaktionsschritte, in b) und c) ist das exponentielle Anwachsen von LCR-Produkten während der ersten LCR-Zyklen dargestellt. Die im jeweiligen Zyklus ligierten Produkte sind rot markiert.

res Verfahren zur in-vitro-Vervielfältigung von Nukleinsäuresequenzen, das sich zum Nachweis von erreger-

spezifischen Nukleinsäuren nutzen läßt. Abb. 2.32a-c zeigt schematisch das methodische Prinzip der LCR.

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Mikrobiologische Diagnostik

Wie bei der PCR läuft die Reaktion zyklisch ab, wobei im ersten Teil des LCR-Zyklus eine thermische Denaturierung der Nukleinsäurescquenzen stattfindet und im zweiten Teil des Zyklus sich zur Zielsequenz komplementäre Oligonukleotide anlagern. Im Gegensatz zur PCR erfolgt jedoch im dritten Teil des Zyklus in der LCR normalerweise keine Neusynthese von DNA, sondern es werden die spezifisch an die Zielsequenz hybridisierten Oligonukleolide durch eine thermostabile DNA-Ligase miteinander kovalent verknüpft. Jede LCR-Reaktion enthält vier Oligonukleotide, von denen jeweils zwei sich nebeneinander und lückenlos an die beiden Nukleinsäurestränge der Zielsequenz anlagern. Unter den in der LCR gewählten Bedingungen schließt die thermostabile DNA-Ligase ausschließlich Einzelstrangbrüche in DNA-Doppelsträngen, d.h. katalysiert die Verknüpfung von 5'-Phosphatresten mit den 3'-OH-Enden aneinandergrenzender, spezifisch hybridisierter Oligonukleotide. Aus der Ligationsreaktion mit vier Oligonukleotidcn resultieren zwei Ligationsprodukte, die der Zielsequenz entsprechen und wiederum als Gegenstrang für weitere Ligationsreaktionen dienen können, wodurch es zu einer exponentiellen Vermehrung der spezifischen Ligationsprodukte kommt. Die Spezifität der Reaktion wird dadurch sichergestellt, daß unter den gewählten Bedingungen keine Ligation freier oder fehlgepaarter Oligonukleotide staltfindet. Der Einsatz einer thermostabilen DNA-Ligase erlaubt zudem die Ligation unter Temperaturbedingungen, die die unspezifische Anlagerung von Oligonukleotiden verhindert. Der Nachweis der Ligationsprodukte der LCR kann über gängige molekularbiologische Verfahren erfolgen, meist wird jeweils ein Oligonuklcotid Hapten- (z.B. Biotin) markiert, während dessen Ligationspartner z.B. mit einem Fluoreszenzfarbstoff konjugiert wird. In diesem Fall erlaubt die Bestimmung der Menge des über das Hapten an die Oberfläche einer Festphase gebundenen Fluoreszenzfarbstoff-markierten Ligationsprodukts die Beurteilung der Reaktion. Wie bereits bei der PCR beschrieben, besteht auch bei der LCR die Gefahr von falsch-positiven Ergebnissen durch Kontamination des Probenmaterials mit verschleppten Ligationsprodukten aus vorhergehenden Reaktionen, so daß auch bei der LCR entsprechende Maßnahmen zur Kontaminationsverhütung zu ergreifen sind. Da zur Erzielung eines positiven Ergebnisses in der LCR die perfekte Basenpaarung zwischen Oligonukleotidcn und Zielsequenz im Bereich des zu ligierenden Bereichs erforderlich ist. ist die LCR ein geeignetes Verfahren zum Nachweis von Punktmutationen in der Zielsequenz. Selbsterhaltcnde isothermische Sequenzreplikation. Neben den durch zyklische Temperaturveränderungen charakterisierten in-vitro-Vervielfältigungstechniken wie PCR und LCR wurden auch Methoden entwickelt, die eine kontinuierliche, isothermische invitro-Vervielfältigung von Nukleinsäuren erlauben. Von diesen Ansätzen haben derzeit lediglich die von ihrem Aufbau her sehr ähnlichen und als NASBA (Abkürzung steht für engl. micleic aeid sequence based

amplification), 3SR (Abkürzung steht für engl. selfsustained sequence replication) und TMA (Abkürzung steht für engl. transcription-mediated amplification) bezeichnete Verfahren praktische Bedeutung erlangt. Das Methodenprinzip der NASBA ist in Abb. 2.33 schematisch dargestellt. Die NASBA arbeitet mit einem komplexen Reaktionsgemisch, das neben den für die RNA- und DNA-Synthese benötigten Nukleosidund Desoxynukleosidtriphosphatcn und Kationen zwei Zielsequenz-spezifische DNA-Oligonukleotidprimer sowie die Enzyme reverse Transkriptase (RT). RNase H und DNA-abhängige RNA-Polymerase enthält. Ausgehend von einer RNA- oder auch DNAZielsequenz erfolgt zunächst in einer niehlzyklischcn Phase über einen Primer (Primer 1), der zusätzlich an seinem 3'-Ende eine RNA-Polymerase-Promotorsequenz (z.B. der DNA-abhängigen RNA-Polymerase des Bakteriophagen T7, T7-RNA-Polymerase) trägt, die Neusynthese eines Gegenstranges mit Hilfe der RT. Die RT erzeugt hierbei an RNA-Zielsequenzen einen cDNA-Strang, kann aber auch einen komplementären DNA-Strang an DNA-Zielsequenzcn synthetisieren. Im nächsten Schritt erfolgt bei RNA-Zielsequenzen der Abbau der RNA-Zielsequenz der RNA:cDNA-Uybridmoleküle über das Enzym RNase H. DNA-Doppelstränge, die aus einer DNA-Zielsequenz resultieren, müssen durch Denaturierung voneinander getrennt werden. Anschließend kann sich der zweite Primer (Primer 2) anlagern und es kommt zur Synthese eines DNA-Doppelstranges durch die RT. Hierbei entsteht am 3'-Endc des ersten Primcrs ein funktioncllcr Promotor für die RNA-Polymerase, die zahlreiche Kopien eines zur Zielsequenz komplementären RNA-Stranges (RNA-Minusstrang (-)) erzeugt. Diese RNA-Molekülc dienen nun in der zweiten, zyklischen Phase der NASBA als Zielsequenz für Primer 2, nach dessen Bindung die RT einen komplementären DNA-Strang (cDNA-Plusstrang (+)) synthetisiert. Nach Verdauung der RNA-Anteile des RNA(-):cDNA(+)-Hybridmoleküls durch die RNase H katalysiert nach Bindung von Primer 2 die RT die DNA-Gegenstrangsynthese und elongiert den cDNA (+)-Strang, so daß wiederum ein funktioneller RNAPromotor entsteht. Mit der Neusynthese von zahlreichen RNA (-)-Molekülen schließt sich der Kreislauf, der letztendlich zur massiven Synthese der Zielsequenz führt. Der Nachweis der in vitro vervielfältigten Nuklcinsäuresequenzen, die ein Gemisch aus RNA(-)und in geringerem Umfang vertretenen DNA-Sequenzen darstellen, erfolgt wiederum über gängige molekularbiologische Verfahren. Aufgrund ihres Aufbaues eignet sich die NASBA insbesondere zum Nachweis von Einzelstrang-RNA-Zielsequenzen. Ihre Nachteile sind vor allem in ihrem aufwendigen Protokoll begründet, das, um erfolgreich durchgeführt werden zu können, ganz erheblichen, auf die jeweilige Fragestellung bezogenen Optimierungsbedarf beinhaltet, so daß derzeit nur eine begrenzte Anzahl von NASBA-Protokollen zum Nachweis erregerspezifischer Nukleinsäuren zur Verfügung steht.

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

Abb 2.33 Isothermische Nukleinsäureamplifikation mittels NASBA (Nucleic Acid Based Sequence Amplification). DNA-Sequenzen sind schwarz, RNA-Sequenzen rot dargestellt; die jeweiligen Reaktionswege sind durch rote Pfeile markiert, die daran beteiligten Enzyme sind unterlegt. RT: Reverse Transkriptase.

Charakterisierung erregerspezifischer Nukleinsäuren Neben dem alleinigen Nachweis erregerspezifischer Nukleinsäuren, der lediglich Aussagen über die Präsenz, die Anzahl und ggf. auch die transkriptionelle Aktivität von Erregern im Untersuchungsmaterial erlaubt, kommt der weitergehenden Charakterisierung von erregerspezifischen Nukleinsäuren eine zunehmende diagnostische Bedeutung zu. Hierbei lassen sich anhand der Sequenz der entweder unmittelbar aus

Probenmaterial oder (in den meist Fällen) nach einem vorgeschalteten in-vitro-Amplifikationsoder Kulturschritt gewonnenen Nukleinsäuren eine Reihe von weitergehenden Aussagen erhalten (zusammengefaßt in Tab. 2.6). Zu nennen sind an dieser Stelle insbesondere die Identifizierung und Bestimmung verschiedener Spezies bzw. Typen einer Erregergruppe oder -familie, die Erfassung von Varianten einer Erregerspezies bzw. eines Erregertyps und der Nachweis von Sequenzvariationen innerhalb eines Erregerstammes.

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Mikrobiologische Diagnostik

Die Charakterisierung von erregerspezifischen Nukleinsäuren kann somit wertvolle Hilfe bei epidemiologischen Fragestellungen leisten (sog. molekulare Epidemiologie), sie erlaubt zudem in einigen Fällen Aussagen über zu erwartende

Abb. 2.34 a-b Spaltung von DNA durch Restriktionsendonukleasen und Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP). a) DNA-Spaltung durch Restriktionsendonukleasen. Die Abb. zeigt die Erkennungssequenzen (rote Basensymbole) und Spaltprodukte einiger typischer Restriktionsendonukleasen (Hindlll, EcoRV und Kpnl). Beachte, daß die dargestellten Enzyme jeweils 6 Basenpaare lange Erkennungssequenzen aufweisen, die palindromisch auf beiden DNA-Strängen angeordnet sind. Die Restriktionsendonukleasen Hindlll und Kpnl erzeugen jeweils überlappende DNA-Enden, wogegen die Spaltung der DNA mit EcoRV zu nichtüberlappenden DNA-Enden führt. b) Inkubation von zwei DNA-Molekülen mit den Restriktionsendonukleasen Hindlll (H), EcoRV (E) und Kpnl (K), die sich durch eine Punktmutation im Bereich der Erkennungssequenz von EcoRV (rot markiert) unterscheiden, führt zu charakteristischen Spaltprodukten, die sich mittels Agarose-Gelelektrophorese auftrennen und darstellen lassen; die entstehenden Spaltprodukte sind mit a, b, c, d bzw. bc markiert, ihre Wanderungsgeschwindigkeit in der Gelelektrophorese verhält sich umgekehrt proportional zum Logarithmus ihres Molekulargewichts bzw. ihrer Fragment-Länge.

Resistenzen gegen antimikrobielle Substanzen und über das Auftreten von Erregermutanten (vgl. z.B. HIV). Ferner können durch Einsatz von konservierten PCR-Primern, d.h. von Primern, die eine in-vitro-Vervielfältigung von Zielsequenzen einer gesamten Erregergruppe oder -familie erlauben, und nachfolgende Charakterisierung der amplifizierten Sequenzen die Spezieszugehörigkeit unklarer Isolate oder die Präsenz von schwer- bzw. nichtkultivierbaren Erregern im Untersuchungsmaterial nachgewiesen werden. Methodisch bestehen zwischen den Verfahren des Nukleinsäurenachweises und weiterführenden Untersuchungen, die der Charakterisierung von Nukleinsäuren dienen, naturgemäß fließende Übergänge. Ein relativ einfaches Verfahren zur Untersuchung von isolierten Nukleinsäuresequenzen ist die Analyse mittels bakterieller Restriktionsendonukleasen. Diese Klasse von Enzymen erkennt auf DNA-Doppelsträngen eine für die jeweilige Restriktionsendonuklease charakteristische - meist palindromische - Abfolge von Basen und verursacht an dieser Erkennungssequenz einen DNA-Doppelstrangbruch (Abb. 2.34a). Ausgehend von einer definierten DNA-Sequenz entsteht somit ein reproduzierbares und charakteristisches Muster an Spaltprodukten. Anzahl und Größe dieser DNA-Restriktionsfragmente können mittels gelelektrophoretischer Auftrennung leicht überprüft werden (Abb. 2.34b). Zahlreiche Restriktionsendonukleasen mit unterschiedlichen Erkennungssequenzen wurden bislang beschrieben, ein großer Teil dieser Enzyme ist kommerziell erhältlich. Durch Einsatz von verschiedenen Restriktionsendonukleasen bzw. von Enzymkombinationen lassen sich Sequenzvarianten und Punktmutationen nachweisen, die durch Hinzukommen neuer Erkennungssequenzen oder durch Verlust bestehender Erkennungssequenzen zu Unterschieden von Größe und Anzahl der DNA-Restriktionsfragmente führen (s. Abb. 2.34b). Die Länge der Erkennungssequenzen von Restriktionsendonukleasen liegt typischerweise zwischen 4 und 8 Basenpaaren. Eine 4 Basenpaare lange Erkennungssequenz kommt statistisch alle 44 (= 256) Basenpaare in einer Zufalls-DNA-Sequenz vor. Somit erzeugen Restriktionsendonukleasen mit kurzen Erkennungssequenzen kürzere DNA-Restriktionsfragmente als solche mit langen, z.B. 8 Basenpaare langen Erkennungssequenzen. Zusätzlich beeinflußt jedoch auch die Basenzusammenset-

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

zung der Erkennungssequenz das Vorkommen von Schnittstellen in erregerspezifischen Nukleinsäuren. Zur Analyse langer DNA-Abschnitte bzw. gesamter Erregergenome mittels Restriktionsendonukleasen (sog. Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus, RFLP) eignen sich daher bevorzugt solche Restriktionsenzyme, die lange und verhältnismäßig seltene Erkennungsequenzen aufweisen (engl. rare cutters), wohingegen zur Analyse kurzer DNA-Abschnitte, z.B. von PCR-Produkten, Restriktionsendonukleasen mit häufig vorkommenden Erkennungsequenzen eingesetzt werden. Abhängig von der Größe der Spaitprodukte werden unterschiedliche elektrophoretische Auftrennungsverfahren verwendet. Für die zuverlässige Auftrennung sehr großer DNA-Fragmente wird typischerweise die sog. Pulsfeldgelelektrophorese eingesetzt. Die Auftrennung kurzer DNA-Fragmente kann dagegen in einem konstanten Spannungsfeld mittels konventioneller Agarose- oder Acrylamidgelelektrophorese erfolgen. Ein weiteres Verfahren zur Charakterisierung von erregerspezifischen Nukleinsäuren sind die bereits oben beschriebenen Techniken der Hybridisierung mit Gensonden. Im Kontext der Nukleinsäurecharakterisierung lassen sich Sonden beispielsweise zur Identifizierung von Erregervarianten einsetzen, indem zunächst eine invitro-Vervielfältigung von erregerspezifischen Nukleinsäuren mittels konservierter Primer in der PCR erfolgt und in einem nachfolgenden Schritt das PCR-Produkt mittels variantenspezifischer Gensonden analysiert wird. Indirekte Informationen über die Sequenz von Nukleinsäurefragmenten lassen sich auch durch Analyse ihres Schmelzverhaltens und ihrer Sekundärstruktur in denaturierenden Gelelektrophoresesystemen erhalten. Zur vollständigen Bestimmung der Sequenz eines DNA-Fragmentes stehen heute eine Reihe unterschiedlicher Techniken zur Verfügung, die teilweise bereits einen sehr hohen Automatisierungsgrad erlangt haben. Die eigentliche Sequenzierungsreaktion basiert meist auf dem von SANGER entwickelten Didesoxynukleotid-Kettenabbruchverfahren. Sie kann sowohl bei Einzelstrang- als auch bei Doppelstrang-DNA-Molekülen durchgeführt werden und erlaubt beispielsweise die direkte Sequenzierung von PCRProdukten (Abb. 2.35). Die Computer-gestützte Auswertung der Sequenzierungsreaktion ist Voraussetzung für weitergehende Analysen, wie

z.B. Vergleiche mit bereits veröffentlichten Sequenzdaten durch Zugriff auf elektronische Datenbanken und die Erstellung von Stammbaumanalysen, Aussagen über Mutationen und deren Effekte auf den Phänotyp (z.B. Chemotherapeutikaresistenzen) etc. Eine interessante Neuentwicklung in der Nukleinsäureanalytik stellen Techniken dar, welche die gleichzeitige Testung eines Nukleinsäuregemisches auf seine Reaktion mit einer Vielzahl verschiedener Gensonden ermöglichen. Die sog. Gen-Chip-Technik ist ein typisches Beispiel dieses methodischen Ansatzes und basiert auf einer Kombination der für die Mikroelektronik entwickelten Siliziumchip-Technologic und der oben beschriebenen Gensonden-Technologic. indem mittels photolithographischer Verfahren und kombinatorischer Nuklcinsäurechemie in miniaturisierter Form Gensonden auf Siliziumchips synthetisiert werden. Die Gen-Chip-Technik ermöglicht die gleichzeitige Testung eines Nukleinsäuregemisches auf seine Reaktion mit zehntausenden definierter, synthetischer Gensonden. Die Auswertung der Ergebnisse erfolgt auf mikrooptischem Weg. Die Stärke diese Verfahrens liegt darin begründet, daß es eine Vielzahl von Parametern gleichzeitig zu erfassen und zu quantifizieren vermag. Hierdurch werden Aussagen über komplexe Regulationsvorgänge ermöglicht, die einer Analyse bislang nicht zugänglich waren. Die Interpretation der riesigen Datenmengen, die dieses Verfahren liefert, stellt jedoch hohe Anforderung an Computer-gestützte Auswertungsprogramme. Derzeit wird dieses Verfahren eingesetzt, um Aussagen über die zelluläre Transkriptionsaktivität und somit die Genregulation zu erhalten (parallele Genexpressionsdetektion). Weitere Anwendungen der Gen-Chip-Technologie bestehen in der Mutationsanalyse und der Sequenzierung von Nukleinsäuren, beispielsweise um Aussagen über mögliche Resistenzentwicklungen viraler Erreger zu erhalten (vgl. auch HIV und HCV), sowie in der raschen und spezifischen Detektion von Krankheitserregern im stark mikrobenbcladenen Materialien (z.B. Lebensmitteln) und der zuverlässigen Identifizierung einschließlich dem Nachweis spezieller Resistenzgene bei schwer zu handhabenden Bakterien (z.B. Mykobakterien).

Gentechnische Verfahren in der mikrobiologischen Diagnostik (s.a. Kapitel 3.3) Grundlage gentechnischer Verfahren, die unmittelbare diagnostische Bedeutung in der Medizinischen Mikrobiologie aufweisen, ist die Klonierung von erregerspezifischen Nukleinsäuren in extrachromosomale genetische Elemente, die zusätzliche Frcmd-DNA-Sequenzen aufnehmen können und als Klonierungsvektoren bezeichnet werden. Am häufigsten werden bakterielle Plasmide als Klonierungsvektoren eingesetzt. Diese Plasmide sind kleine ringförmige DNA-Mole-

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Mikrobiologische Diagnostik

Abb. 2.35 DNA-Doppelstrangsequenzierung mittels Didesoxynukleotid-Kettenabbruchverfahren. Die zu bestimmende DNA-Sequenz ist dunkelrot dargestellt, der für die Sequenzierungsreaktion eingesetzte Primer hellrot; dNTPs: Gemisch aus allen 4 Desoxynukleotidtriphosphaten, ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP: Didesoxynukleotidtriphosphate. Wird ein Didesoxynukleotid bei der DNA-Synthese eingebaut, erfolgt Kettenabbruch. Im unteren Teil der Abbildung sind die durch Kettenabbruch jeweils resultierenden Syntheseprodukte der Sequenzierungsreaktion und ihr Wanderungsverhalten bei elektrophoretischer Auftrennung sowie die hieraus abzulesende DNA-Sequenz dargestellt.

küle, die in Bakterienzellen extrachromosomal vorliegen und einen Replikationsursprung aufweisen, welcher für die Plasmidreplikation in der Bakterienzelle benötigt wird. Typischerweise tragen sie zudem ein Antibiotikarcsistenzgen, das die in-vitro-Selektion plasmidhaltiger Bakterien erlaubt, sowie an geeigneter Stelle Erkennungssequenzen einer Reihe von Restriktionsendonukleasen. die nach Restriktionsendonukleaseschnitt die Aufnahme von Fremd-DNAMolekülen mit geeigneten (sog. kompatiblen) DNAEnden erlauben. Die mit großem Abstand am häufigsten eingesetzten Wirtszcllen zur Aufnahme und Vermehrung rekom-

binanter Plasmide sind Laborstämme von Escherichia coli, die bestimmte Sicherheitskriterien, wie z.B. fehlende Pathogenität und Rekombinationsaktivität, erfüllen müssen. Zur Aufnahme von Fremd-DNA-Sequenzen, z.B. aus aufgereinigten Erregern, aber auch von Produkten aus in-vitro-Vervielfältigungsreaktionen, wird typischerweise gereinigte, zirkuläre PlasmidDNA mittels Restriktionsendonukleasen linearisiert. mit der aufzunehmenden Fremd-DNA, die kompatible DNA-Enden aufweisen muß (s. Abb. 2.34a), gemischt und die DNA-Stränge mit Hilfe des Enzyms DNA-Ligase wieder verknüpft. Nach Aufnahme des Ligationsproduktes aus Plasmid-DNA und zu klonierender Fremd-DNA durch E. co/i-Zellen (sog. Trans-

2.3 Mikrobiologische und serologische Untersuchungsverfahren

formation), die durch entsprechende Vorbehandlung aufnahmefähig für Fremd-DNA gemacht wurden, erfolgt ein Antibiotikaselektionsschritt. Lediglich der Bruchteil von Zellen, der ein Plasmid mit intaktem Antibiotikaresistenzgen aufgenommen hat, ist in der Lage, auf einem festen Nährboden mit entsprechendem Antibiotikazusatz in Kolonieform auszuwachsen. Die Identifikation derjenigen Kolonien, die neben den Plasmid- auch Frcmd-DNA-Sequenzen enthalten, erfolgt meist durch erneute Vermehrung antibiotikaresistenter Einzelkolonien in Flüssigkulturen. Extraktion von Plasmid-DNA und deren Analyse mittels Restriktionsendonukleaseverdauung und nachfolgender gelelektrophoretischer Auftrennung der DNA-Fragmente. Durch den Vorgang der Klonierung stehen die entsprechenden Abschnitte erregerspezifischer Nukleinsäuren reproduzierbar und in praktisch unbegrenzter Menge für weitere Schritte, wie z.B. Sequenzierungsreaktionen, zur Verfügung. Erfolgt die Klonierung von DNA-Sequenzen, die für Erregerproteine kodieren, in der Weise, daß eine Plasmid-vermittelte Proteinexpression auch in vitro (z.B. in Bakterienzellen) ermöglicht wird, lassen sich die hierdurch erzeugten rekombinanten Proteine nach ihrer Reinigung beispielsweise als diagnostische Antigene in der Serologie (aber auch als Impfstoffe) einsetzen. Plasmide, die eine Expression von rekombinanten Proteinen ermöglichen, werden als Expressionsplasmide bezeichnet. Sie enthalten zusätzliche Kontrollelemente (Promotoren), welche die Transkription der klonierten DNA-Sequenzen in der Wirtszelle ermögli-

chen. Um z.B. im Fall viraler Antigene möglichst „authentische" Proteine bzw. Antigene zu erzeugen, die die Vielfalt von Proteinmodifikationen enthalten, die typisch für Säugerzellen sind, aber bakteriell exprimierten Proteinen fehlen, wurden Vektoren entwickelt, die eine Expression rekombinantcr Proteine in eukaryonten Zellen (Hefezellen, Insektenzellen. Säugerzellen) erlauben (z.B. für die Herstellung von Hepatitis-B-Virus-Impfstoff).

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153

Allgemeine Bakteriologie 3.1

Aufbau und Morphologie der Bakterienzelle

156

HANS-GEORG SAHL 3.1.1 3 12

Morphologie und systematische Einteilung der Bakterien Die Bakterienzelle

156 157

3.5.2

Anfänge der antimikrobiellen Chemotherapie

200

3.5.3

Mikrobiologische Grundlagen

200

3.5.4 3.5.5

Pharmakologische Grundlagen Klassifizierung antimikrobieller Substanzen Charakterisierung einzelner

210

Antibiotikagruppen Klinische Grundprinzipien der antibakteriellen Chemotherapie Antibiotika und körpereigene

215

Abwehr Prophylaktische Antibiotikagabe Schlußbemerkungen

236 236

Mikrobielle Besiedlung des gesunden Menschen HELMUT MITTERMAYER Funktionen der physiologischen Flora Bedeutung der physiologischen Flora für die mikrobiologische Diagnostik

238

3.5.6 3.2 3.2.1 3 22

Physiologie der Bakterien HANS-GEORG SAHL Wachstum von Bakterien Mechanismen des Stoffwechsels

171 3.5.7 171 176 3.5.8

3.3

Genetik der Bakterien JÖRG HACKER

180

33 1 3.3.2

Struktur der DNA Das bakterielle Genom

182 182

3.3.3

Semikonservative Replikation der DNA Transkription Translation Mutationen Rekombination und Gentransfer Restriktion und Modifikation

184 184 185 186 188 192

Genetische Regulationsmechanismen Grundlagen der Gentechnik

192 194

3.6.3

197

3.6.4

3.3.4 3.3.5 336 337 3.3.8 3.3.9 3.3.10 3.4.

Taxonomie der Bakterien WERNER KÖHLER

3.5.9 3.5.10 3.6

36 1 3.6.2

3.6.5 3.5

3.5.1

Antimikrobielle Chemotherapie ADOLF BAUERNFEIND, GEORG PETERS Definition und Abgrenzung

199

199

3 215

233

238

239 240

Zusammensetzung der physiologischen Flora Änderungen während des Lebens und durch äußere Einflüsse Die physiologische Flora als Quelle endogener und nosokomialer Infektionen

241 244

244

156

Allgemeine Bakteriologie

3.1 Aufbau und Morphologie der Bakterienzelle HANS-GEORG SAHL

Lebewesen, die meist einzellig sind und infolge ihrer Kleinheit nur mit mikroskopischen Verfahren erkannt werden können, werden unter dem Begriff Mikroorganismen zusammengefaßt. Man hat sie zu den Protisten subsummiert. Diese Einteilung beruht jedoch nur auf der geringen Größe der Organismen und berücksichtigt nicht den völlig unterschiedlichen Stoffwechsel und Zellaufbau. Für ein natürliches System der Lebewesen, das im Idealfall auf ihren in der Evolution begründeten verwandtschaftlichen Beziehungen aufbauen sollte, ist diese Einteilung deshalb nicht relevant. Man zählt zu den Protisten: ƒ einzellige Pilze (pflanzenähnlicher Zellaufbau, Kohlenstoff-heterotropher Stoffwechsel) ƒ einzellige Algen (Zellaufbau und Stoffwechseltyp der Pflanze, Kohfenstoff-autotroph) ƒ Protozoen (Zellaufbau und Stoffwechseltyp der Tiere, Kohlenstoff-heterotroph) ƒ Bakterien (einfacher, prokaryontischer Zellaufbau, verschiedene Stoffwechseltypen).

Die genannten Pilze, Algen und Protozoen werden auch als höhere Protisten zusammengefaßt, denn sie besitzen ƒ von Membranen umgebene Organellen (Chloroplasten, Mitochondrien) ƒ 80 S Ribosomen und vor allem eine arttypische Anzahl von Chromosomen, die zu einem von einer Membran umgebenen echten Zellkern organisiert sind.

Sie gehören deshalb zu den Eukaryonten (griechisch: Karyos = der Kern). Diesen gegenüber stehen die Prokaryonten (niedere Protisten, Bakterien). Sie zeichnen sich aus durch ƒ das Fehlen von Organellen, die von Membranen umgeben sind ƒ kleinere Ribosomen (70 S) ƒ und durch ein Kemäquivalent (Nukleoid), wobei die DNA als ein einziges großes Molekül (Bakterienchromosom genannt) frei im Zytoplasma liegt.

Im Hinblick auf eine korrekte Einordnung der Prokaryonten in ein natürliches System der Lebewesen wurden in den letzten Jahren durch Methoden der Hybridisierung und Sequenzierung von bestimmten Nukleinsäuren (vor allem der I6S rRNA) große Fortschritte erzielt. Das Schema eines darauf basierenden phylogenetischen Stammbaums zeigt Abb. 3.1. Dabei wird ein hypothetischer, primitiver Vorläuferorganismus (Progenot) postuliert, aus dem sich drei Urreiche, die Eukaryonten, die Eubakterien und die Archaebakterien entwickelten. Die Viren können nicht in dieses System eingeordnet werden, da sie nicht die Organisationsform einer Zelle besitzen. Sie haben ƒ nur einen Typ von Nukleinsäure ƒ keinen eigenen Stoffwechsel ƒ und vermehren sich nicht durch Zweiteilung.

Sie sind nicht als eigenständige Organismen zu betrachten, sondern in ihrer Existenz von Eukaryonten oder Prokaryonten abhängig.

3.1.1 Morphologie und systematische Einteilung der Bakterien Abb. 3.1 Stellung der Bakterien im phylogenetischen Stammbaum.

Das bisherige, künstliche System beruht hauptsächlich auf phänotypischen Eigenschaften, wie

3.1 Aufbau und Morphologie der Bakterienzelle

z.B. Zellmorphologie, Färbeverhalten, Nachweis bestimmter Enzyme, Stoffwechselleistungen, chemische Zusammensetzung und Aufbau von Zellwänden, etc. Es ermöglicht die eindeutige Identifizierung von unbekannten Isolaten und ist damit für medizinisch-diagnostische Fragestellungen wertvoll und ausreichend. In der letzten Ausgabe von BERGEY'S HANDBUCH zur Bestimmung von Bakterien (1984-1988) wird das Reich der Prokaryonten noch in vier Abteilungen unterteilt, die sich haupsächlich in Bezug auf die Zellwand unterscheiden: Ŷ Bakterien mit starrer, dünner Zellwand, gramnegative Bakterien Ŷ Bakterien mit starrer, dicker Zellwand, gram-positive Bakterien Ŷ Bakterien ohne Zellwand, Mykoplasmen Ŷ Bakterien mit einer Zellwand, die nicht aus Murein besteht, Archaebaktcricn. Durch die bereits erwähnten neuen Ergebnisse zur Phylogcnic der Prokaryonten und die dadurch vorhandenen Ansätze zu einem natürlichen System werden weitreichende Änderungen in der z.Zt. etablierten Baktcriensystematik notwendig. Es zeichnet sich eine komplette Neuordnung, wie sie z.B. in „The Procaryotes" (2. Aufl., BALOWS et al, 1992) zugrunde gelegt wurde: Die Prokaryonten werden in zwei Reiche eingeteilt, Ŷ Archaea (Archaebaktcricn) und Ŷ Bacteria (Eubakterien). Alle medizinisch relevanten Bakterien gehören in das Reich der Eubakterien.

Dieses wird z.Zt. in wenigstens 12 Abteilungen (Divisionen) unterteilt, wobei pathogene Bakterien in den Abteilungen der Firmicutes (grampositive Bakterien), Proteobacteria (gram-negative Bakterien), Spirochäten, Bacteroides-Gruppe und Chlamydien zu finden sind. Die Archaebakterien spielen in der Medizin keine Rolle; sie werden häufig aus extremen Standorten (Temperaturen bis 110 °C. hoher Druck, extreme pHWerte und Salzkonzentrationen) isoliert und können unter „Normalbedingungen" nicht wachsen. Aber auch die große Mehrzahl der Eubakterien sind medizinisch nicht relevant. Sie haben als freilebende Organismen durch ihre vielfältigen Stoffwechselleistungen in der Natur eine essentielle Bedeutung für Aufbau und Abbau der Biomasse.

Bakterien dar. Im systematischen Sinne, weder im künstlichen noch im sich abzeichnenden natürlichen System, repräsentieren sie aber keine einheitliche Gruppe; vielmehr fanden in allen Abteilungen der Eubakterien unabhängige Entwicklungen hin zu einer saprophytären bis parasitären Lebensweise statt.

3.1.2 Die Bakterienzelle Bakterien sind einzellige Mikroorganismen, die vier Grundformen der Gestalt zeigen: Ŷ runde oder kugelähnliche Zellen (Kokken) Ŷ stäbchenförmige Zellen Ŷ spiralige Zellen (Spirillen, Spirochäten) oder solche, die Teil einer Schraubenwindung sind (Vibrionen, Campylobacter) Ŷ fadenförmige Bakterien {Actinomyces u.a.). Die Morphologie wird weitgehend durch die Form der relativ starren Zellwand bestimmt (Abb. 3.2). Kokken

Die Kokken (Kugelbakterien), die entweder ganz rund oder leicht länglich sein können, zeigen vielfach eine charakteristische Lagerung zueinander, so daß bei der mikroskopischen Betrachtung eines gefärbten Ausstrichpräparates eine Verdachtsdiagnose möglich ist. Man unterscheidet: Ŷ haufenförmig gelagerte Kokken. Dies sind die Staphylokokken (Haufen- oder Traubenkokken) und Peptokokken; Ŷ kettenförmig gelagerte Kokken: Streptokokken (Kettenkokken) und Peptostreptokokken; Ŷ paarweise gelagerte Kokken (Diplokokken): Pneumokokken (Streptococcus pneumoniae), Neisserien {Neisseria meningitidis bzw. N. gonorrhoeae); Ŷ relativ regelmäßige Lagerung von 4 Zellen (Tetrakokken); Ŷ paketförmige kubische Aggregate von 8 oder mehr Kokken (Sarcinen, ohne medizinische Bedeutung). Stäbchenförmige Bakterien

Die Bakterien, die für die medizinische Mikrobiologie interessant sind (z.B. Bakterien der physiologischen Körperflora, opportunistische oder fakultativ-pathogene Bakterien sowie pathogene Bakterien, deren Wirte der Mensch oder Tiere sind), stellen also nur einen sehr kleinen, aber bedeutungsvollen Teil im Reich der

Bei den stäbchenförmigen Bakterien sind die morphologischen Unterschiede gering. Die Zellen der einzelnen Arten weisen eine unterschiedliche Länge und Dicke auf, so daß die Stäbchen groß oder klein sind, plumpe oder schlanke Formen haben. Manche BakterienGattungen umfassen Zellen, die eine Keulen-

157

158

Allgemeine Bakteriologie

Abb. 3.2 Schematische Darstellung verschiedener Bakterien: 1. Staphylokokken (Trauben- oder Haufenform), 2. Neisserien (Kaffeebohnenform), 3. Pneumokokken (Kerzenflammenform), 3a. Bekapselte Pneumokokken, 4. Streptokokken (Kettenform), 5. Tetrakokken, 6. Paketkokken (Sarcinen), 7. Enterobakteriazeen, 8. Kettenförmig angeordnete Milzbrandbazillen mit mittelständigen, nicht auftreibenden Sporen in einer Kapsel, 9. Corynebakterien (Keulenform), 9a. Pseudodiphtheriebakterien (palisadenförmige Lagerung), 10. Fusobakterien, 11. Peritrich begeißelte Typhusbakterien, 12. Monotrich begeißelte Vibrionen (gekrümmte Stäbchen), 13. Lophotrich begeißelte Pseudomonas fluorescens, 14-16 Spirochäten, 14. Borrelia recurrentis, 15. Treponema pallidum, 16. Leptospiren (Kleiderbügel-, Hakenform).

form zeigen (Gattung Corynebacterium) oder an den Enden zugespitzt sind (Spindelform; Fusobacterium). Andere haben Fadenform (Gattungen Actinomyces, Streptomyces). Wichtige Unterscheidungsmerkmale sind ferner die Sporenbildung (Gattungen Bacillus und Clostridiuni) sowie das Vorkommen von Geißeln.

mende Art (Spihllum minus, Rattenbißkrankheit) keine medizinische Bedeutung haben. Eine Untergruppe bilden die gebogenen Stäbchen (z.B. Vibrio) und gebogen bis schraubenförmige Zellen in der Gattung Campylobacter. Flexible, spiralige Zellen mit nur geringer Dicke sind die Spirochäten (Gattungen Treponema, Borrelia, Leptospira).

Schraubenförmige Bakterien

Die schraubenförmigen Bakterien gliedern sich in solche mit starrer Zellwand und andere mit flexibler Zellwand. Starre Zellen weisen die Spirillen auf, die bis auf eine sehr selten vorkom-

Bakterien ohne Zellwand

Eine Sonderstellung nehmen die Mycoplasmen (s. Kap. 4.25) ein, denen im Gegensatz zu allen übrigen Bakterien eine Zellwand fehlt. Sie haben

3.1 Aufbau und Morphologie der Bakterienzelle

ein vielgestaltiges (pleomorphes) Aussehen in Form von veränderlichen, bläschenförmigen Gebilden.

Ŷ das Vorhandensein von Kapseln Ŷ Geißeln Ŷ Fimbrien (Pili) Ŷ Sporen (Gattung Bacillus und Clostridium).

Abweichungen von der typischen Gestalt

Aufgetriebene Formen, einseitige Anschwellungen, Fadenform, unterschiedliche Anfärbbarkeit entstehen durch degenerative Veränderungen. Sie werden durch äußere Einflüsse hervorgerufen und können z.B. durch Einwirkung von Chemotherapeutika zustande kommen. Dies muß bei der Beurteilung von Originalpräparaten beachtet werden.

Das Kernäquivalent (Nukleoid) Das Nukleoid enthält die Erbinformation (Genom). Es besteht aus einem in der Regel ringförmig geschlossenen DNA-Molekül (dem sogenannten Bakterienchromosom), das in stark gefalteter und verdrillter Form ohne Abgrenzung durch eine Kemmembran frei im Zytoplasma liegt (Abb. 3.3, 3.4).

Größe der Bakterien

Die Länge vieler Bakterien liegt im Bereich von 0,5 bis 5 [im (1 um = ICH' m). Die Dicke liegt meist unter 1 um. Kokken haben einen Durchmesser von etwa 1 [im (Hefezcllen sind größer und haben einen Durchmesser von 3-5 um). Das zur normalen Dickdarmflora gehörende Bakterium Escherichia coli hat eine Länge von 1-3 [im und eine Dicke von 0,5 um. Milzbrandbazillen sind 3-10 um lang und 1-1,3 um dick. Spirochäten sind 10-20 um lang (Erythrozyten-Durchmesser 7,5 um), aber sehr zart (Dicke etwa 0,1 um). Infolge ihrer geringen Dicke sind Spirochäten lebend im Hcllfeldmikroskop nicht mehr darzustellen. Hierfür muß das Dunkelfeldmikroskop herangezogen werden. Fadenförmige Bakterien, z.B. der Gattung Actinomyces, können erheblich länger als Spirochäten sein. Pilzfäden unterscheiden sich von den fadenförmigen Bakterien durch ihre wesentlich größere Dicke (2-10 um). Allgemein schwankt die Größe der Einzelzellcn stark mit dem physiologischen Zustand, (z.B. während der Wachstumsphase). Außerdem sind lebende Zellen größer als gefärbte, da Fixierung und Färbung zu starken Schrumpfungen führen.

Es besteht je nach Bakterienart aus 0.5 bis 10 Millionen Nukleotidpaaren. Eine nähere Beschreibung findet sich in Kap. 3.3.2. Das Chromosom liegt meist in mehreren Kopien vor (z.B. 2^1 bei E. coli). Außer dem Bakterienchromosom können im Zytoplasma von Bakterienzellcn noch meist ringförmig geschlossene, kleinere DNA-Moleküle vorkommen, die etwa 2000 bis 200 000 Nukleotidpaare groß sind (2 bis 200 kb); zur Größenbeschreibung von DNA hat sich der Begriff Kilobasen (kb) eingebürgert, wobei 1 kb 1000 Basen(Nukleotid)paaren entspricht. Diese Plasmide genannten DNA-Moleküle liegen meist in viel höherer Kopienzahl vor (bis zu 100 pro Zelle). Das Nukleoid wird bei den gängigen Färbeverfahren für Bakterien (z.B. nach Gramfärbung) optisch nicht hervorgehoben. Dies erreicht man jedoch durch Spezialfärbung z.B. nach GIEMSA, bei der ein basischer Farbstoff verwendet wird, der mit Nukleinsäuren reagiert. Im elektronenmikroskopischen Bild hebt sich das Nukleoid in der Regel als heller, weniger dichter Bereich vom Zytoplasma ab (Abb. 3.4).

Die Anatomie der Bakterienzelle

Das von der Zytoplasmamembran umschlossene Zytoplasma enthält in Wasser gelöst Salze, Enzyme, Ribosomen und Strukturproleine, Stoffwechselintermediärprodukte und Ribonukleinsäuren (RNA); das Wasser macht etwa 80% des Zellgewichtes aus. Die RNA kommt in mindestens drei Arten vor (mRNA, rRNA, tRNA, s. Kap. 3.3.4). Die Ribosomen, an denen die Proteine synthetisiert werden, finden sich in großer Anzahl im Zytoplasma (bei E. coli bis 15 000 pro Zelle). Sie haben eine Größe von 16 x 18 nm und eine Sedimentationskonstantc von 70 S (S = SVEDBERG-

Zytoplasma

Eine Bakterienzelle (Abb. 3.3) besteht aus Ŷ einer relativ starren Zellwand Ŷ der Zytoplasmamembran Ŷ dem Zytoplasma Ŷ dem Kernäquivalent.

Zytoplasmamembran und Zellwand werden auch als Zellhülle (cell cnvelope) zusammengefaßt (Abb. 3.3: 3.5). Zusätzliche morphologische Merkmale bei einer Reihe von Bakterienarten sind:

159

160

Allgemeine Bakteriologie

Abb. 3.3 Schematischer Aufbau einer Bakterienzelle mit Darstellung der wichtigsten Zellkomponenten; Längsschnitt durch eine stäbchenförmige Zelle.

Einheiten), daher auch die Bezeichnung 70 S Rihosomen im Gegensatz zu den 80 S Ribosomcn der Eukaryonten. Ribosomen, die perlschnurartig an einem mRNA-Strang aneinandergereiht sind, bezeichnet man als Polysomen. Die Ribosomen bestehen zu etwa 60% aus RNA und zu 40% aus Protein. Jedes Ribosom setzt sich aus einer großen und einer kleinen Untereinheit zusammen, deren Sedimentationskoeffizienten bei 50S und bei 30S liegen. In der großen Untereinheit findet sich je ein 23S und ein 5S rRNA-Molekül, sowie 31 verschiedene Proteine. Die kleine Untereinheit setzt sich aus einem 16S rRNA-Molekül und 21 Proteinen zusammen. Die Nukleotidsequenzen der rRNA-Moleküle vieler Bakterien ist inzwischen aufgeklärt. Die rRNA, insbesondere die 16S rRNA ist von großem biologischen Interesse, da Sequenzvergleiche von RNA verschiedener Arten eine genaue Analyse von Verwandtschaftsbe-

ziehungen der Bakterien ermöglichen und damit für den Aufbau eines natürlichen Systems herangezogen werden können.

Die Ribosomen sind ferner wichtig als Angriffsort chemotherapeutisch bedeutender Antibiotika. Die Unterschiede im Feinbau zu den 80S Ribosomen der Eukaryonten ermöglichen eine gezielte Hemmung der bakteriellen Proteinbiosynthese, ohne den Wirt zu beeinträchtigen. Antibiotika, die hier eingreifen, sind u.a. die Tetracycline, Chloramphenicol, Erythromycin und A minoglykoside. Im mikroskopischen Bild von Bakterien tauchen häufig im Zytoplasma eingelagert Granula auf, die aus Speicherstoffen bestehen (z.B. Polyhydroxybuttersäure). Bei den Diphtheriebakterien findet man regelmäßig die Volutinkörperchen

3.1 Aufbau und Morphologie der Bakterienzelle

Abb. 3.4 Elektronenmikroskopische Aufnahme eines Ultradünnschnitts einer Zelle von Listeria monocytogenes im Stadium der Zellteilung. Elektronenmikroskop-Vergrößerung 70.000:1. Die dreischichtige zytoplasmatische Membran, der nach außen die Zellwand aufliegt, ist sichtbar (s. Abb. 3.5). Die weniger kontrastierten, unscharf begrenzten Bereiche sind Nukleoide mit fädiger DNA-Struktur, die unmittelbar ohne Begrenzung durch eine Membran im Zytoplasma liegen. Im Bereich der Ausbildung des Querseptums ein Mesosom (Aufnahme W. LENZ).

pide sind in Form einer Doppelschicht gelagert, wobei die hydrophilen Kopfgruppen jeweils nach außen zu den wässrigen Phasen innerhalb und außerhalb der Zelle zeigen, während die hydrophoben Fettsäureketten nach innen liegen und eine wasserundurchlässige Schicht bilden. In die Doppelschicht sind eine Vielzahl von Proteinen eingelagert, welche die Membran ganz durchkreuzen können (integrale Membranproteine) oder sich nur an einer Seite befinden (periphere Membranproteine). Sterole fehlen im Gegensatz zu den Pilzen in der Membran der Bakterien (mit Ausnahme von Mykoplasmen). Die Polyen-Antimykotika, wie Nystatin und Amphotericin, die sich an Sterole binden, haben daher keinen Angriffspunkt bei Bakterien. Als funktionsanaloge Substanzen zu den Sterolen kommen bei Bakterien Hopanoide vor. Ohne eine intakte Zytoplasmamembran ist eine Bakterienzelle nicht lebensfähig. Sie erfüllt essentielle Funktionen: Ŷ als Permeabilitätsbarriere, die die Akkumulation von Nährstoffen, Metabolitcn etc. ermöglicht;

(der Namen leitet sich von Spirillum volutans her, wo diese Granula ebenfalls vorkommen), die aus Polyphosphaten bestehen. Zytoplasmamembran Die zytoplasmatische Membran ist als Ort wichtiger Stoffwechselvorgänge für die Lebensfähigkeit der Zelle von entscheidender Bedeutung.

Sie besitzt eine Dicke von 6-8 nm und begrenzt das Zytoplasma. Sie zeigt im fixierten und konstrastierten Dünnschnittpräparat bei der Elektronenmikroskopie eine dreischichtige Struktur (Abb. 3.5, 3.9) und hat den typischen Aufbau aller biologischen Membranen. Im natürlichen Zustand ist die Membran ein Mosaik von Lipiden flüssiger Phase und Proteinen. Die Proteine machen über 60% des Trockengewichts der Membran aus, die Lipide (hauptsächlich Phospholipide) 20-30%. Die Li-

Abb. 3.5 Ausschnitt aus Abb. 3.4. Die Zellhülle des gram-positiven Bakteriums, bestehend aus Zellwand (1) und Zytoplasmamembran (2) ist gut zu erkennen.

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162

Allgemeine Bakteriologie

Ŷ als Sitz von spezifischen Transportenzymen,

die die selektive Aufnahme und Abgabe von Substanzen steuert; Ŷ als Energie-transduzierende Membran, in der

die Elektronentransportsysteme und die ATPase organisiert sind, die die ATP-Synthese durch Atmungskettenphosphorylierung bewerkstelligen (s. Kap. 3.2.2); Ŷ als Sitz von Enzymen und Multienzymkomplexen, die komplexe Biosynthesen katalysieren (z.B. Lipidbiosynthese, Zusammenbau von Zellwand- und Kapsclpolymeren, DNAReplikation, Export und Prozessierung von Exoproteinen etc.). Periplasmatischer Raum

Zwischen der Zytoplasmamembran und dem Peptidoglykan findet sich bei gramnegativen Bakterien ein periplasmatischer Raum (Abb. 3.9), der mit Enzymen und anderen Proteinen gefüllt ist. Darunter sind z.B. Hydrolasen, Phosphatasen, Nukleasen und andere Enzyme, die den Abbau von Polymeren und Oligomeren bewerkstelligen, um sie in die Zelle aufnehmen zu können. Zahlreiche spezifische Bindeproteine leiten den Transport von Nährstoffen (Aminosäuren, Zucker, Nukleotidcn, Vitaminen etc.) durch die Zytoplasmamembran ein, indem sie diese binden und an Transportproteine in der Membran weitergeben. Auch Antibiotika-inaktivierende Enzyme, wie die E-Laktamase sowie

Zellwand auf- bzw. abbauende Enzyme sind im Periplasma lokalisiert. Bei den gram-positiven Bakterien liegen diese Proteine ebenfalls zwischen Zytoplasmamembran und Zellwand, jedoch läßt sich hier im Elektronenmikroskop kein deutlich abgegrenzter periplasmatischer Raum erkennen. Zellwand

Das Peptidoglykan als Grundstruktur Nach dem von GRAM (1884) eingeführten Färbeverfahren (s. Kap. 2.3.1) werden Bakterien in gram-positive (blau-schwarz gefärbte Zellen) und gram-negative (rot gefärbte Zellen) unterteilt. Später stellte sich heraus, daß das unterschiedliche Färbeverhalten der beiden Gruppen auf Unterschiede im Zellwandaufbau zurückzuführen ist. Allerdings ist das Gerüst der Zellwand bei gram-positiven und gram-negativen Bakterien im Prinzip übereinstimmend (Abb. 3.6, 3.9). Es handelt sich hierbei um eine netzartige Struktur von Polysaccharidketten, dem Glykan, die über kurze, meist vier Aminosäuren lange Peptidketten miteinander verknüpft sind.

Dieses daher Peptidoglykan (oder Murein) genannte Polymer bildet ein dreidimensionales Makromolekül, das sich über die gesamte Zelloberfläche erstreckt und die Zelle sackartig

Abb. 3.6 Schematische Darstellung der Zellhülle gram-positiver Bakterien und ihrer wichtigsten Komponenten. Lipoteichonsäuren, Teichon- und Teichuronsäuren sowie die Peptidquervernetzung (molekularer Aufbau s. Abb. 3.7) sind rot dargestellt.

3.1 Aufbau und Morphologie der Bakterienzelle

Abb. 3.7 Struktur des Mureins von Staphylococcus aureus. Zwei Glykanstränge, bestehend aus N-Acetylglukosamin (G) und N-Acetyl-Muraminsäure (M) sind durch Peptidbrücken quervernetzt. Die Spaltstellen des Zellwand-hydrolysierenden Enzyms Lysozym sind eingezeichnet. Weitere Erläuterungen im Text.

einschließt (Murein-Sacculus, Abb.3.8). Es gibt der Zelle ihre Form und wirkt als Exoskclett, das die fluide Membran in osmotisch nicht stabilisiertem Milieu vor dem Zerplatzen schützt. An dem Aufbau des Glykans sind zwei Aminozucker beteiligt, das N-Acetylglucosamin und die N-Acetylmuraminsäure (Abb. 3.7), die sich alternierend über eine ß-l,4-Bindung zu langen (etwa 200 Disaccharid-Einheiten), unverzweigten Ketten anordnen. An die Carboxylgruppe jedes Muraminsäurerests ist ein Tetrapeptid gebunden, das bei vielen Bakterienarten folgende Aminosäuresequenz hat: L-Alanin, D-Glutaminsäure, meso-Diaminopimelinsäure (diese Aminosäure kommt nicht bei Eukaryonten vor) und D-Alanin. Bei den meisten gram-negativen Bakterien und den Bazillen sind die Tetrapeptidketten direkt durch Peptidbindungen untereinander verbunden, und zwar die 4. Aminosäure (D-Alanin) des Tetrapeptids einer Glykankette mit der 3. Aminosäure (wi-Diaminopimelinsäure) der benachbarten Glykankette. Die Anzahl der Tetrapeptide, die kreuzgebunden sind, schwankt in Abhängigkeit von den einzelnen Bakterienarten (bei E. coli z.B. nur ca. 20%). Ferner können die Aminosäuren (vor allem in der Position 3) variieren. So ist z.B. die mDiaminopimelinsäure bei gram-positiven Bakterien (z.B. Staphylococcus aureus) meist durch L-Lysin ersetzt. Auch kann die Verbindung der beiden Tetrapeptidketten über eine Interpeptidbrücke erfolgen, wie es z.B. durch eine Kette von 5 Glycinmolekülen bei Staphylococcus aureus der Fall ist (s. Abb. 3.7).

Angriffsort für Antibiotika. Es ist bemerkenswert, daß die Mureinstruktur der bakteriellen Zelle nicht bei Pflanzen und Tieren anzutreffen ist. Dies ermöglicht die Anwendung von Antibiotika (z.B. Penicilline, Cephalosporine, Vancomycin, Bacitracin).

Sie interferieren mit der Biosynthese des Peptidoglykans, ohne daß die Zellen des Makroorganismus geschädigt werden (s. weiter unten). Zellwand der gram-positiven Bakterien Die Zellwand der gram-positiven Bakterien, die 30 bis 70% des Trockengewichts der Bakterienzelle ausmacht, stellt sich elektronenmikrosko-

Abb. 3.8 Elektronenmikroskopische Aufnahme isolierter Zellwände von Staphylococcus aureus (Vergrößerung 30.000:1; nach HAMMOND et al. 1984).

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Allgemeine Bakteriologie

pisch als eine 20 bis 80 nm dicke, relativ einheitlich kontrastierte Schicht dar (Abb. 3.5, 3.6). Sie besteht aus vielen miteinander verknüpften Lagen von Peptidoglykan. Die Aminosäuren der Tetrapeptidketten variieren von Spezies zu Spezies; dies hat für taxonomische Zwecke Bedeutung. Weiterhin sind bei gram-positiven Bakterien Teichon- und/oder Teichuronsäuren kovalent in das Mureinnetz eingewoben. Durch die Teichonsäuren (lineare Polymere aus repetitiven Einheiten von Glycerolphosphat oder Ribitolphosphat) und Teichuronsäuren (Glucuronsäureketten) erhält das Mureinpolymer eine negative Gesamtladung, die offensichtlich für die Versorgung der Bakterienzelle mit Kationen wichtig ist. Als weitere Komponenten der Zellwand, allerdings nicht kovalent verknüpft mit dem Murein, sind die Lipoteichonsäuren zu nennen. Diese stellen ebenfalls Polyglyccrolphosphatketten dar, die an einem Ende mit einem Glykolipid verestert sind und mit diesem in der Zytoplasmamembran verankert werden. Die Polyglycerolkette durchdringt die Zellwand und ist an der Oberfläche mit Antikörpern nachweisbar. Die Lipoteichonsäuren spielen eine Rolle bei der Adhäsion der Bakterienzelle an der Oberfläche, z.B. Epithclzellen. Die Mykobakterien-Zellwand zeichnet sich ferner durch einen hohen Gehalt an Mykolsäureestern (hochmolekulare Lipide) aus, die für die Säurefestigkeit dieser Bakterien verantwortlich sind. Weiterhin kommt eine Anzahl von Zellwand-assoziierten, d.h. nicht kovalent gebundenen Proteinen vor, z.B. findet man bei A-Streptokokken als Oberflächenprotein das M-Protein, einen wichtigen Virulenzfaktor. Nahezu alle Stämme von Staphylococcus aureus bilden das sogenannte Protein A, das ebenfalls außen auf dem Murein-Sacculus abgelagert wird. Protein-A bindet IgG über dessen Fc-Teil (s. Kap. 1.2.4). In der Zellwand und auch Membran-assoziiert kommen ferner Zellwand-hydrolysierende Enzyme (sog. Autolysine) vor, die u.a. bei der Zellteilung die Auftrennung in zwei Tochterzellen ermöglichen. Sie bedürfen einer genauen Regulation, um keine unkontrollierte Zell-Lysis zu verursachen. Das in Eiklar, Speichel und Tränenflüssigkeit vorkommende, von A. FLEMING 1922 entdeckte Enzym Lysozym spaltet die ß-l,4-glykosidische Bindung zwischen N-Acetylglucosamin und NAcetylmuraminsäure (s. Abb. 3.7) und ist somit eine Muraminidase. Es wirkt auf gram-positive

Bakterien lytisch und damit bakterizid. Zellen gram-negativer Bakterien werden erst nach Vorbehandlung mit EDTA gelöst, wodurch die äußere Membran (s.u.) für Lysozym permeabel wird. Zellwand der gram-negativen Bakterien Die Zellwand der gram-negativen Bakterien ist mit 15-20 nm dünner als die der grampositiven (Abb. 3.9). Im elektronenmikroskopischen Bild ist sie deutlich geschichtet. Bei näherer Betrachtung zeigt sich, daß Ŷ die Peptidoglykanschicht nur 2-3 nm dick ist und aus 2 bis 3 Lagen besteht, und daß ihr außen Ŷ eine weitere Membran aufliegt, die sogenannte äußere Membran, die prinzipiell dem Aufbau einer Elementarmembran entspricht, jedoch eine deutlich andere Zusammensetzung und andere Funktionen hat als z.B die Zytoplasmamembran (s. Abb. 3.9). Die äußere Membran ist viel stärker asymmetrisch aufgebaut als andere Membranen, d.h. die beiden Lipidschichten unterscheiden sich stark in ihren Komponenten. Die innere, dem Peptidoglykan zugewandte Schicht besitzt in etwa die gleiche Phospholipidzusammensetzung wie die Zytoplasmamembran. In sie eingelagert ist der Lipidteil des sogenannten BRAUNSchen Lipoproteins. Dieses ist an dem anderen Ende kovalent mit dem Peptidoglykan verbunden und stellt so eine stabile Verbindung von äußerer Membran und Murein her. In der nach außen zeigenden Lipidschicht der Membran ist das Lipid A das mengenmäßig dominierende Lipid. Das Lipid A stellt den lipophilen Anker der Lipopolysaccharide dar und hat stark toxische Eigenschaften (s.u.). In die äußere Membran eingelagert, sowohl peripher als auch integral, sind zahlreiche Proteine, sogenannte outer membrane proteins (Omp) (Abb. 3.9). Einige davon, z.B. OmpA haben Struktur-stabilisierende Funktion, während andere, z.B. OmpC und OmpF Poren in der Membran bilden und deshalb Porine genannt werden. Die Poren entstehen dadurch, daß sich meist drei identische Porinmoleküle so in der Membran zusammenlagern, daß ein wassergefüllter Kanal entsteht, durch den gelöste Substanzen mit Molekulargewichten bis zu 700 Dalton (z.B. Ionen, Aminosäuren, Monosaccharide) relativ ungehindert in den periplasmatischen Raum gelangen. Die eben genannten Proteine kommen praktisch immer und in hoher Kopienzahl (bis

3.1 Aufbau und Morphologie der Bakterienzelle

Abb. 3.9 Schematische Darstellung der Zellhülle gram-negativer Bakterien.

zu KP pro Zelle) in der Außenmembran vor, während andere nur unter bestimmten Wachstumsbedingungen oder nur in wenigen Kopien vorliegen. Diese haben spezielle Funktionen in der Nährstoff aufnähme, z.B. als spezifische Maltose-Pore (LamB Protein), Phosphat-Pore (PhoE), oder als Rezeptorproteine für Komplex-gebundenes Eisen (Fe3+-Chelate). Allein bei E. coli sind vier verschiedene Eisentransportsysteme mit spezifischen Rezeptorproteinen bekannt. Die zuletzt genannten Proteine der äußeren Membran werden häufig von Bakterienviren (= Bakteriophagen) und Bacteriocinen (antibiotische Proteine mit engem Wirkungsspektrum) als Rezeptoren benutzt; diese mißbrauchen also existierende Aufnahmesysteme, um in die Bakterienzelle zu gelangen. Die äußere Membran gramnegativer Bakterien hat also eine wichtige Molekularsiebfunktion; sie ist auch dafür verantwortlich, daß viele Antibiotika, die grampositive Bakterien abtöten, gegen gramnegative nicht wirksam sind, weil diese die Membran aufgrund ihrer Größe nicht penetrieren können.

Von großer medizinischer Bedeutung sind auch die Lipopolysaccharide (LPS) der Außenmembran, weil

Ŷ der Lipidanker (Lipid A) toxische Eigenschaften besitzt und Ŷ der Polysaccharidanteil wichtige Antigcndeterminanten enthält. Die LPS sind mit dem Lipidanteil fest in der Lipidmatrix verankert und werden erst bei ZellLyse frei. Man bezeichnet sie daher als Endotoxine im Gegensatz zu den Exotoxinen, (z.B. Diphtherietoxin, Choleratoxin, Tetanustoxin etc.), die Proteine sind und von den Bakterien während des Wachstums produziert und aktiv sekretiert werden (zur pathogenetischen Bedeutung des Endotoxins s. Kap. 1.1.4). Das Lipopolysaccharid-Molekül (Abb. 3.10) kann man in drei Abschnitte (Regionen I-III) unterteilen: das Lipid A (Region III), das Kernpolysaccharid (Region II) und die variable Seitenkette (Region I). Das Lipid A ist ein ungewöhnliches Phospholipid.

An ein Glukosamindisaccharid sind über die Hydroxy- und die Aminogruppen des Zuckers Fettsäuren unterschiedlicher Kettenlänge verestert. Diese bilden die äußere Lipidschicht der Außenmembran. Das Lipid A ist bei allen Enterobacteriaceae sehr ähnlich und dadurch in seiner Toxizität vergleichbar. An das Lipid A schließt sich die Kernzone (II) an: Sie besteht aus fünf basalen Zuckern (Keto-

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Allgemeine Bakteriologie

Ausimpfung auf Nährböden nicht in Form von Kolonien, sondern überziehen den ganzen Nährboden mit einem zarten, hauchförmigen Wachstum (H-Form, davon abgeleitet der serologisch-diagnostisch gebrauchte Begriff H-(Geißel-)Antigen). Geißellose Varianten wachsen dagegen in Kolonien, d.h. ohne Hauch (O-Form, davon abgeleitet O-(Körper-)Antigen.

Abb. 3.10 Aufbau des Lipopolysaccharids gramnegativer Bakterien am Beispiel der Enterobakteriazeen. Glc = Glukose, GIc-NAc = N-Acetylglukosamin, Gal = Galaktose, Hep = Heptose, KDO = 2-Keto-3desoxyoctonsäure, Glc-N = Glukosamin.

desoxyoctonat, Heptose, D-Glukose, D-Galaktose und D-Glukosamin). Die Kernpolysaccharidzusammensetzung ist bei allen Salmonellen übereinstimmend. Bei anderen Genera gramnegativer Bakterien kann sie jedoch hiervon verschieden sein. Auf das Kernpolysaccharid folgt dann als äußere Region (I) eine Kette von sich wiederholenden Oligosaccharid-Einheiten, meist Trisacchariden. Sie kann eine große Variation in Zusammensetzung und Struktur zeigen und wird Ospezifische Seitenkette genannt. Diese O-spezifischen Seitenketten sind Bestandteile der Oberfläche der Zellwand und stellen thermostabile antigene Determinanten dar, die als Körper- oder O-Antigene bezeichnet werden. Sie rufen im Makroorganismus die Bildung von O-spezifischen Antikörpern hervor. Derartige Zuckerstrukturen können auch spezifische Anheftungspunktc (Rezeptoren) für Bakteriophagen sein. Die Bezeichnung O-Antigen leitet sich ursprünglich her von Beobachtungen bei Bakterien der Gattung Proleus. Stark begeißelte Stämme wachsen bei

Die O-spezifische Seitenkette von Salmonella newington besteht z.B. aus 10-20 sich wiederholenden Trisaccharid-Einheiten (Mannose, Rhamnose und Galaktose). Infolge der großen Variationsmöglichkeit in der Zuckerzusammensetzung, ihrer Sequenz und der Art ihrer Bindung gibt es bei E. coli, Salmonellen und anderen gramnegativen Bakterien eine große Zahl von unterschiedlichen O-Antigenen mit verschiedener serologischer Spezifität. Auf diese Weise lassen sich innerhalb einer Art viele Serovarietäten (Serovare) unterscheiden, was für epidemiologische Fragestellungen sehr nützlich ist; darüber hinaus korreliert in manchen Fällen die Fähigkeit von Stämmen, bestimmte Pathogenitätsfaktoren auszubilden mit der Serovarietät, so daß deren Bestimmung auch direkte diagnostische Bedeutung hat: z.B. sind für die Entstehung von Yers/n/a-Enteritiden nur die Serovare O:3, O:8 und O:9 relevant. Rauh- und Glattformen. Während Salmonellen und andere Enterobacteriaceen mit ausgebildeten O-Seitenketten des LPS mit runden, gewölbten, spiegelnden Kolonien wachsen und als Glattformen (oder S[smooth]-Form) bezeichnet werden, können Verlust-Mutanten auftreten, die flache, unregelmäßig begrenzte Kolonien mit gekörnter Oberfläche aufweisen. Diese Mutanten werden als Rauhformen (R-|roughjForm) bezeichnet und haben die Fähigkeit, die O-spczifischc Seitenketten und/oder Teile des Kempolysaccharides zu synthetisieren, verloren. Die Rauhformen sind gegenüber Serum empfindlich und nicht mehr pathogen. Die medizinische Bedeutung der Zellwand Die Zellwand ist der Teil der Bakterienzelle, der mit der Außenwelt, also auch mit dem Makroorganismus, in Wechselwirkung tritt. Sie enthält Oberflächenkomponenten, die für die spezifische Anheftung an Epithelien verantwortlich sind. Die antigenen Determinanten der Zellwand rufen im Makroorganismus die Bildung von Antikörpern hervor, die zur Agglutination oder in Gegenwart von Komplement und phagozytierenden Zellen zu einer Immunphagozytose oder Zellabtötung führen.

3.1 Aufbau und Morphologie der Bakterienzelle

Die Zellwand gram-negativer Bakterien enthält toxische Substanzen (Endotoxine). Unvollständig abgebaute Fragmente des Peptidoglykans (vor allem gram-positiver Bakterien) sind pyrogen und spielen eine Rolle bei der Entstehung von Arthritiden. Die Zellwand ist Angriffspunkt wichtiger Antibiotika und von Lysozym. Die E-Laktam-Antibiotika (z.B. Penicilline, Cephalosporine) verhindern die Bildung einer funktionstüchtigen Zellwand dadurch, daß sie die Quervernetzung der einzelnen Pcptidoglykanstränge beeinträchtigen. Die Quervernetzung erfolgt enzymatisch durch Transpeptidasen und Carboxypeptidasen. Diese binden die E-Laktam-Antibiotika aufgrund sterischer Ähnlichkeit mit ihrem eigentlichen Substrat, dem D-AlanylD-Alanin-Ende der Peptidseitenkette des naszierenden, noch nicht quervernetzten Peptidoglykans. Dabei wird eine kovalente Bindung zwischen Enzym und Antibiotikum ausgebildet. Auf diese Weise werden die Enzyme weitgehend irreversibel inaktiviert. Aufgrund ihres Penicillin-Bindevermögens werden diese Enzyme, von denen bisher 7 bekannt sind, als penieillinbindende Proleine bezeichnet. Das Fehlen einer intakten Zellwand führt zu einer osmotischen Schädigung der Zelle. Aus diesem Zusammenhang ergibt sich, daß ELaktam-Antibiotika nur für wachsende BakterienzelIcn eine bakterizide Wirkung besitzen und nicht, wenn die Peptidoglykan-Biosynthese ruht. Protoplastcn und L-Formen. Wie schon zuvor erwähnt, löst das Enzym Lysozym die Zellwand der meisten gram-positiven Bakterien leicht auf. Bei geeigneten osmotischen Verhältnissen entsteht hierdurch eine wandlose, noch lebensfähige Zelle, der Protoplast. Dieser besitzt ohne das stützende Exosklett keine definierte Form und ist gegen physikalische Einflüsse außerordentlich labil. Bei geeigneten Grenzkonzentrationen von Penicillin, d.h. bei gestörter Zcllwandbiosynthese. bilden sich bei stäbchenförmige Bakterien, wie z.B. E. coli oder Proteus, bläschenförmige Gebilde von 10 (.im Größe und darüber. Dieses Gebilde, die auch als Sphüroplasten bezeichnet werden, da sie im Gegensatz zu den Protoplastcn noch Reste der Zellwand besitzen, können sich in Gegenwart von Penicillin vermehren und bilden auch auf Nähragar kleine, etwa 0,5 mm große Kolonien, die nur aus solchen blasigen Elementen bestehen. Diese bläschcnförmi-

Geißeln

gen Gebilde wurden von Emmy KLIENEBERGER-NOBEL als L-Formen (L = Abkürzung für Lister-Institut in London) bezeichnet. KLIENEBERGER entdeckte 1935 zuerst L-Formen bei Kulturen von Streptobacillus moniliformis, bei dem diese L-Formcn bereits spontan, d.h. ohne Anwesenheit von Penicillin entstehen. Werden L-Formen in Abwesenheit von Penicillin weitergezüchtet, entstehen wieder normale stäbchenförmige Bakterien. Allerdings können in seltenen Fällen die künstlich induzierten L-Formen auch in Abwesenheit von Penicillin stabil bleiben. Ob bakterielle LFormen bei Infektionen bzw. Krankheiten eine Rolle spielen, ist unklar.

Geißeln, Pili, Kapseln, Sporen

Geißeln Die Zellen vieler Bakterienarten sind begeißelt. Die Ceißeln dienen der aktiven Fortbewegung der Bakterien.

Man kann also zwischen begeißelten und beweglichen sowie unbegeißelten und unbeweglichen Bakterien unterscheiden. Es handelt sich bei den Geißeln um sehr feine Fäden von etwa 20 nm Dicke und einer Länge bis zu 20 um (Tab. 3.1). Grundbaustein der Geißeln ist das Protein Flagellin; die einzelnen Proteinmoleküle werden helical angeordnet, so daß ein schraubenförmiger, innen hohler Zylinder entsteht. Die Geißeln treten durch die Zeilwand hindurch und sind mit einem basalen Körper in der zytoplasmatischcn Membran und auch der Zellwand verankert. Dieser basalc Anker wird in Rotation versetzt, so daß die lange Geißel schraubenartige Wellenbewegungen durchführt; sie kann wie ein Propeller die Zelle ziehen oder analog zur Schiffschraube die Zelle schieben. Infolge des geringen Durchmessers sind Geißeln nicht mit den üblichen Färbemethoden (z.B. nach GRAM) lichtmikroskopisch darstellbar. Im Elektronenmikroskop sind Geißeln nach Me-

Fimbrien (Typ 1)

F-Pili

Durchmesser

12-20 nm

3-10 nm

9-10 nm

Länge

15-20 um

0,2-10 um

< 20 jxm

Proteinbaustein

Flagellin

Typ 1-Pilin

F-Pilin

Molekulargewicht

40,000

16,000

11,000

Aufgabe

Beweglichkeit

Adhäsion

Zellkontakt für DNA-Austausch

Tab. 3.1 Eigenschaften von Geißeln, Fimbrien und Pili bei E. coli

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168

Allgemeine Bakteriologie

Abb. 3.11 Elektronenmikroskopische Aufnahme von zwei Escherichia coli K12-Zellen mit Geißeln und Pili. Elektronenmikroskop-Vergrößerung 7000:1 (Aufnahme W. LENZ).

tallschrägbedampfung der Präparate oder Kontrastierung mit Schwermetallsalzen gut sichtbar zu machen (Abb. 3.11, 3.12). Für die Taxonomie ist es wichtig, daß bei den einzelnen Bakterienspezies die Art der Begeißelung verschieden sein kann. Es gibt polar oder ringsum (peritrich) begeißelte Bakterien. Bei der polaren Begeißelung (s. Abb. 3.12) kann eine Geißel vorhanden sein (monotrich), wie

z.B. bei Vibrio cholerae, oder ein ganzes Geißelbüschcl (lophotrich), wie z.B. bei Pseudomonas fluorescens. Auch ist eine Begeißelung an beiden Polen möglich (amphitrich, z.B. Spirillen). Peritrich angeordnete Geißeln (s. Abb. 3.11) finden sich z.B. bei den Salmonellen, E. coli oder Proteus. Die Prüfung der Beweglichkeit eines Bakterienisolates für diagnostische Zwecke erfolgt durch Stichbeimpfung eines halbweichen (0,6%igcn) Nähragars, den bewegliche Bakterien durchwachsen, während unbewegliche sich nur längs des Stichkanals vermehren. In seltenen Fällen, z.B. bei der Cholera, kann auch durch Mikroskopieren einer frischen Flüssigkultur im hängenden Tropfen die Beweglichkeit geprüft werden. Die Ausbildung der Geißeln erfolgt nicht immer. Farbstoffe im Nährboden wie z.B. Kristallviolett oder Brilliantgrün können die Geißelausbildung phänotypisch unterdrücken. Durch Mutation kann es auch zu einem erblichen Verlust der Geißelbildung kommen. Solche Zellen liegen dann in der O-Form vor. Zur WEIL-FELIXReaktion (s. Kap. 2.3.2) zum Nachweis von Antikörpern im Patientenserum bei Flcckficber wird z.B. der geißellose Proteus OX 19-Stamm (die Bezeichnung O deutet darauf hin, daß es sich um einen Stamm in der O-Form, d.h. einer geißellosen Form, handelt; X 19 ist die Stammbezeichnung) benutzt. Bedeutung. Für die krankmachenden Eigenschaften der Bakterien scheinen die Geißeln keine große Bedeutung zu haben. Sie sind aufgrund ihrer Proteinnatur gute Antigene. Bei den Salmonellen und anderen begeißelten Bakterien werden die in den Geißeln determinierten Antigene als Geißel (H)-Antigene bezeichnet. Salw7o/ie//ö-Bakterien rufen demnach im Organismus sowohl die Bildung von Antikörpern gegen Körper-(O)-Antigene als auch gegen H-Antigene hervor (s. Kap. 4.4). Fimbrien (Pili) Die Zellen vieler Bakterienarten, insbesondere der gram-negativen, können Fimbrien, auch Pili genannt, besitzen, die kürzer und dünner sind als Geißeln (s. Abb. 3.3).

Abb. 3.12 Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Zelle von Pseudomonas aeruginosa; neben der Geißel liegen einige stäbchenförmige Pyocin-Partikeln. Elektronenmikroskop-Vergrößerung 15 000:1 (Aufnahme W. LENZ ).

Sie können in großer Zahl (100 und mehr) vorhanden sein. Sie sind ebenfalls wie die Geißeln aus einem Protein aufgebaut, das in diesem Fall Pilin genannt wird (s. Tab. 3.1).

3.1 Aufbau und Morphologie der Bakterienzelle

Fimbrien spielen bei der Haftung von Bakterien, z.B. auf Schleimhäuten, eine Rolle und sind für die Kolonisation von Oberflächen wichtig.

Die Ausbildung von Fimbrien ist reversibel. Über die Bedeutung der Fimbrien s. auch Kap. 1.1.4. Neben den Fimbrien gibt es vor allem bei den Enterobacteriaceae die Fertilitäts-Pili (Sex-Pili), die pro Zelle nur in wenigen Exemplaren (etwa bis 20) vorhanden sind und hohle Röhren darstellen. Die Sex-Pili finden sich bei Zellen, die einen Fertilitätsfaktor, z.B. den F-Faktor, besitzen (s. in Kap. 3.3.7: „Konjugation"), der den Zellen „männliche" Eigenschaft verleiht. Die Sex-Pili sind ein Ausdruck dieser Eigenschaft. Die Zellen können mit Hilfe dieser Sex-Pili Kontakt mit einer «weiblichen» Zelle bekommen und durch diese beim Vorgang der Konjugation DNA und damit Erbmerkmale übertragen (s. Tab. 3.1). Kapseln

Stämme einer Reihe von Bakterienarten bilden extrazelluläre Polysaccharide oder andere Polymere, die der Zellwand nach außen aufliegen und Kapseln genannt werden (Tab. 3.2). Diese können in ihrer Dicke ein Mehrfaches des Bakteriendurchmessers ausmachen (s. Abb. 3.2. 3.3). Die chemische Zusammensetzung der Kapseln ist bei den einzelnen Bakterienarten verschieden.

E. coli Kl und Neisseria meningitidis (Typen B und C) besitzen Kapseln aus Polymeren der NAcetylneuraminsäure. Bei Streptokokken-Arten besteht die Kapsel aus Hyaluronsäure, bei Klebsiellen, die schon durch ihre schleimigen, gewölbten Kolonien auffallen, aus komplexen Polysacchariden, bei Pneumokokken (Streptocoecus pneumoniae), die in der virulenten Form

immer bekapselt sind, aus stickstoffhaltigen Polysacchariden. Die Kapsel der Milzbrandbazillcn setzt sich aus einem D-Glutaminsäure-Polypeptid zusammen. In einer Kapsel können mehrere Bakterienzellen liegen; bei den Pneumokokken ist meist ein Kokkenpaar von einer Kapsel umschlossen. Die Kapsel ist vor allem bei frisch isolierten Stämmen gut ausgeprägt. Bei manchen Bakterien wird ihre Produktion durch das Wachstumsmilieu gesteuert, so daß sie bei der Anzüchtung im Kulturmedium verlorengehen kann, während sie in Nativpräparaten noch sichtbar ist. Sie läßt sich nicht mit gewöhnlichen Färbemethoden darstellen. Sehr geeignet zum Nachweis einer Kapsel ist das Tuschepräparat. Die Kapsel erscheint hell gegenüber dem dunklen Hintergrund der Tusche. Bedeutung. In der Pathogenese von Infektionskrankheiten spielt die Kapsel eine wichtige Rolle, da sie die Bakterien vor phagozytierenden Zellen schützt. Nicht-virulente, unbekapselte Pneumokokken-Stämme werden z.B. sofort phagozytiert. Kapseltypen. Auch innerhalb einer Spezies (z.B. Streptococcus pneumoniae, Klebsiella sp.) kann die chemische Zusammensetzung der Kapselpolysaccharide variieren. Stämme mit gleicher Kapselsubstanz bilden einen Typ. Diese Typen, die für epidemiologische Fragestellungen Bedeutung haben, können mit Hilfe von spezifischen Antiseren z.B durch die Kapselquellungsreaktion nach NEUFELD (durch Anlagerung von homologem Antikörper wird im mikroskopischen Präparat gegenüber den Kontrollen eine wesentlich größere Kapsel sichtbar) festgestellt werden. Bei Pneumokokken sind 83 und bei den Klebsiellen mehr als 80 Kapseltypen bekannt. Häufig ist die Virulenz einzelner Bakterienstämme mit einem bestimmten Kapseltyp korreliert. So ist z.B. von den sechs Kapseltypen des Haemophilus influenzae der Typ b bei der Meningi-

gram-positiv

gram-negativ

Tab. 3.2 Medizinisch

Streptococcus pneumoniae

Klebsiella pneumoniae

wichtige kapselbildende Bakterien

Streptococcus pyogenes (Gruppe A Streptokokken) Streptococcus agalactiae (Gruppe B Streptokokken)

Neisseria meningitidis Escherichia coli (K-Antigene) Salmonella typhi (Vi-Antigen) Haemophilus influenzae

Baällus anthracis

Bacteroides fragilis

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Allgemeine Bakteriologie

der Spore vor; ihr Gehalt korreliert mit der Hitzebeständigkeit der Spore. Die Vorspore wird von der Zytoplasmamembran vollständig umwachsen, so daß eine Spore von zwei Membranen umgeben ist. Von diesen Membranen wird eine spezielle Sporenzellwand synthetisiert. Außerdem wird von der Sporenmutterzelle noch eine Proteinhülle aufgelagert. Diese mehrschichtige Umhüllung, die etwa 50% der Trockenmasse der Sporen ausmacht, ist ebenfalls für die Widerstandsfähigkeit der Spore sehr wichtig: außerdem ist bemerkenswert, daß der Wassergehalt in der Spore auf ca. 15% reduziert wird, im Vergleich zu mehr als 80% in einer vegetativen Zelle. Wenn die Sporenbildung abgeschlossen ist, beginnt sich die Sporenmutterzelle durch Autolyse aufzulösen. Bakteriensporen behalten über lange Zeiträume die Fähigkeit zur Wiederauskeimung; über 100 Jahre alte Bodenproben enthalten noch lebensfähige Sporen.

Abb. 3.13 Elektronenmikroskopische Aufnahme des Ultradünnschnitts einer versporten Zelle von Clostridium septicum. Elektronenmikroskop-Vergrößerung 20.000:1. Spore mit mehrschichtiger Sporenhülle (Aufnahme W. LENZ).

Nachweis. Endosporen sind nur sehr schwer anfärbbar. Im mikroskopischen Präparat ungefärbter oder auch Gram-gefärbter Bakterien fallen sie jedoch sofort als stark lichtbrechende Zelleinschlußkörper auf. Ihre Lage innerhalb der Sporenmutterzellc (zentral oder polar) und ihre Größe (kleinerer oder größerer Durchmesser als die Bakterienzelle) sind arttypisch und können für die Diagnostik herangezogen werden. Bedeutung der Sporen für die medizinische Mi-

tis von Kleinkindern besonders häufig; bei Neisseria meningitidis sind vor allem die Typen A, B und C virulent. Sporen Nur wenige ßakteriengattungen vermögen Sporen zu bilden, wobei die medizinisch relevanten alle in die Gattungen Bacillus (aerobe Sporenbildner) und Clostridum (anaerobe Sporenbildner) gehören. Sporen sind runde oder elliptische Gebilde (Abb. 3.13), die sich durch große Widerstandsfähigkeit gegen Umwelteinflüsse auszeichnen. Es sind keine Vermehrungsformen wie die Exosporen der Pilze, sondern Dauerformen, die der Erhaltung der Art bei ungünstigen äußeren Verhältnissen dienen. Pro Zelle wird eine Spore ausgebildet, und zwar in der Zelle, weshalb sie genauer als Endosporen bezeichnet werden. Die Ausbildung einer Endospore ist ein sehr komplexer Differenzierungsprozeß. Er wird durch Nährstoffmangel induziert und beginnt damit, daß ein Teil des Zytoplasmas durch Invagination der Zytoplasmamembran von der übrigen Zelle abgeschirmt wird. In diese sogenannten Sporenprotoplasten werden ein komplettes Genom sowie alle zur Wiederauskeimung notwendigen Makromoleküle eingelagert. Außerdem wird Dipicolinsäure gebildet, die als Kalziumsalz eingelagert wird und bis zu 15% der Sporentrockenmasse ausmacht. Dipicolinsäure kommt nur in

krobiologie. Die Bedeutung liegt nicht nur in der Tatsache, daß einige pathogene Bakterien Sporen bilden; vielmehr ist es ihre enorme Widerstandsfähigkeit, auch nichtpathogener Arten, die die aufwendigen Sterilisationstechniken für Nährmedien und medizinische Geräte notwendig macht (s. Kap. 2.2.4) Während vegetative Zellen bei Austrocknung, durch Behandlung mit Desinfektionsmitteln in üblicher Konzentration oder durch Erhitzen auf 100 °C absterben, bleiben Sporen unbeschadet. Andererseits sind Sporen die zuverlässigsten Indikatoren zur regelmäßigen Prüfung der Funklionstüchtigkeit von Heißluftsterilisatoren und Autoklaven (s. Kap. 2.2.4). Man verwendet dazu standardisierte Teststreifen, die mit Sporen des thermophilen Bacillus stearothermophilus beladen sind. Diese Sporen müssen innerhalb der vorgeschriebenen Sterilisationszeit (z.B. 10 Minuten bei 121 °C heißem Wasserdampf oder 120 Minuten bei 160 °C Heißluft) abgetötet werden. Literatur BALOWS. A., H. G. TRCPER, M. DWORKIN, W. HÄRDER, K.H. SCHLEIFFER: The Prokaryotes (vol. 1-4. 2nd ed.), Springer Verlag. New York (1992).

3.2 Physiologie der Bakterien

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3.2 Physiologie der Bakterien HANS-GEORG SAHL 3.2.1 Wachstum von Bakterien Zum Wachstum benötigen Bakterien, wie alle Lebewesen, Wasser und darin gelöste Nährstoffe. Die Nährstoffe müssen alle chemischen Elemente enthalten, die für den gesamten Stoffwechsel, d.h. für die Energiegewinnung, für den Aufbau von Zellmaterial und für die Aktivität von Enzymen benötigt werden.

allen oder nur in bestimmten physiologischen Situationen benötigt werden. Stoffwechseltypen Im Gegensatz zu den Pflanzen und den Tieren, die jeweils auf einen Ernährungstyp festgelegt sind, zeigen die Bakterien eine erstaunliche Vielfalt.

Sie sind oft in der Lage, je nach Nahrungsangebot auf verschiedene Ernährungsweisen umzuschalten. Zur Charakterisierung des Stoffwechscltyps werden die genutzte Kohlenstoffquelle, die Energiequelle und der Wasserstoffdonator unterschieden. Kann der Zellkohlenstoff hauptsächlich aus CO2 assimiliert werden, bezeichnet man diese Bakterien als autoiroph, während heterotroph solche Bakterien sind, die organische Kohlenstoffquellen benötigen. Wenn das Sonnenlicht als Energiequelle genutzt werden kann, spricht man von pholutrophen Bakterien und von chemotrophen, wenn chemisch gebundene Energie benötigt wird. Stammt schließlich der Wasserstoff bzw. die Elektronen, aus einer organischen Verbindung, so wird diese Ernährungsweise als organolroph bezeichnet, im Gegensatz zu lithotroph, wenn anorganische Quellen wie H?S oder NH4* erschlossen werden können.

Alle für die Medizin wichtigen Bakterien benötigen energiereiche organische Verbindungen zum Wachstum und sind somit chemo-organoheterotroph. Es wird deutlich, daß sie damit nur einen kleinen Ausschnitt aus dem großen Bakterienspektrum darstellen.

Grundelemente und Spurenelemente

Zu den Grundelemcnten, die in höheren Konzentrationen (> 10 4M) benötigt werden, gehören 12 der chemischen Elemente. Kohlenstoff, Sauerstoff, Wasserstoff und Stickstoff sind die Hauptkomponenten aller organischen Verbindungen. Schwefel ist in den Aminosäuren Cystein und Methionin enthalten, und Phosphor ist in Form von Phosphat u.a. Bestandteil der Nukleinsäuren und vieler Koenzyme des Energiestoffwechsels (z.B. ATP). Kalium als K+ ist das wichtigste anorganische Kation in der Bakterienzellc. Magnesium, Calcium, Eisen, Natrium und Chlor sind in Form ihrer Ionen (Mg2+, Ca2+, Fe2+, Fe-V, Na+ und Cl~) u.a. wichtige Kofaktoren von Enzymreaktionen oder in Enzymen selbst gebunden. Die Spurenelemente sind in Konzentrationen < 10~7M vorhanden und meist Bestandteile von Enzymen. Hierzu zählen Zn2+, Mn2+, Ca2+, Cu2', Co2', Ni2', MoO42-, SeO32" und WO42~. Zn2+ und Mn2+ sind essentiell für alle Bakterien, während die anderen Ionen nicht von

Nährstoffansprüche medizinisch wichtiger Bakterien

Die Ansprüche der für die Medizin wichtigen Bakterien an das Nährstoffangebot sind sehr unterschiedlich. Es gibt solche, die mit wenigen Grundnährstoffen wachsen, und andere, die sehr komplexe Nährmedien benötigen. Anspruchslose heterotrophe Bakterien vermehren sich schon, wenn die N-Quelle anorganisch ist und nur eine organische C-Quelle vorliegt. Escherichia coli z.B. wächst in einem synthetischen Nährmedium, das außer D-Glukose nur anorganische Verbindungen enthält: (NH4)H2PO4 1,5 g; K2HPO4 1,0 g; MgSO4 0,2 g; Glukose 2.0 g; Aqua dcst.1000 ml; pH 7,2; die benötigten Spurenelemente sind meist als Verunreinigung in den Chemikalien enthalten. Aus diesen wenigen Stoffen baut E. coli die gesamten Zellbestandteilc wie Proteine, Nukleinsäuren, Polysaccharide, Lipide und niedermolekulare Metabolite auf.

Eine Reihe von Bakterien stellt aber weit höhere Ernährungsansprüche. Infolge einer Anpassung an eine parasitäre Lebensweise oder

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Allgemeine Bakteriologie

bestimmte Umweltverhältnisse haben sie die Fähigkeit der Synthese für einen oder für mehrere lebensnotwendige Stoffe verloren. Für sie müssen diese Substanzen deshalb im umgebenden Milieu zur Verfügung stehen. Die für das Wachstum unbedingt erforderlichen Bausteine, die außerhalb der Zelle verfügbar sein müssen, werden Wachstumsfaktoren genannt. Wichtige Wachstumsfaktoren für Bakterien sind Nicotinamid, Thiamin, Riboflavin, Pantothensäure, Biotin und Folsäure. Aber auch p-Aminobenzoesäure, Aminosäuren, Purine und Pyrimidine können Wachstumsfaktoren darstellen. Einen sehr hohen Bedarf an Wachstumsfaktoren haben z.B. die Milchsäurebakterien, die alle diese Stoffe in der Milch oder auf Schleimhäuten vorfinden. Eine extreme Form der Abhängigkeit von der Nährstoffzufuhr zeigen obligat zellparasitäre Bakterien wie die Rickettsien und die Chlamydien. Die Chlamydicn können z.B. keinen eigenen Energiestoffwechsel betreiben und sind auf die Zufuhr von ATP sowie einer Reihe weiterer Wachstumsfaktoren angewiesen. Sie lassen sieh außerhalb von eukaryontischen Zellen praktisch nicht anzüchten.

In den üblicherweise bei der diagnostischen Bakteriologie benutzten Komplexnährböden, deren Grundlage Pepton, Blut oder andere organische Bestandteile darstellen, sind die erforderlichen Wachstumsfaktoren im allgemeinen bereits enthalten.

Wachstum und Vermehrung

Unter Wachstum versteht man die irreversible Zunahme an Biomasse. Sie läßt sich messen, indem man z.B. das Trockengewicht oder den organisch gebundenen Stickstoff bestimmt. Die Zunahme der Biomasse wird bewirkt durch eine Vergrößerung der Bakterienzelle, bis eine Querteilung in zwei Tochterzellen erfolgt (Abb. 3.14). Die Querteilung wird wahrscheinlich eingeleitet, wenn das Verhältnis von Zellvolumen und Zelloberfläche einen bestimmten, für die einzelnen Bakterienarten unterschiedlichen Wert erreicht. Die Zeit, in der sich die Zahl der Bakterienzellen verdoppelt, wird als Generationszeit bezeichnet. Die Generationszeit einzelner Bakterienarten ist sehr unterschiedlich und von äußeren Einflüssen abhängig.

Sie kann sinnvollerweise nur während der exponentiellen Wachstumsphase (s.u.) bestimmt werden. Unter optimalen Bedingungen beträgt sie bei E. coli durchschnittlich 20 Minuten, bei züchtbaren Treponemen aber 4 bis 18 Stunden und bei Mycobacterium tuberculosis 18 Stunden. Die kurze Generationsdauer bei E. coli bedingt, daß auf festen Nährböden bei 37 °C aus einer Zelle in weniger als 24 Stunden eine sichtbare Anhäufung von Bakterien, eine Kolonie, gebil-

Abb. 3.14 Schematische Darstellung der exponentiellen Vermehrung von Bakterien. Bei Querteilung entstehen aus einer Zelle zwei Tochterzellen (aus einer Originalarbeit von W. ARBER, Zürich, Mannheimer Forum 81/82, hrsg. von Boehringer Mannheim GmbH).

3.2 Physiologie der Bakterien det wird, die viele Millionen (108 oder mehr) Zellen enthält. Bei M. tuberculosis dagegen dauert es etwa 14 Tage oder noch länger, bis auf geeigneten Nährböden ein Koloniewachstum erkennbar wird. Aus dieser Tatsache geht hervor, daß die kulturelle Diagnose der Tuberkulose wesentlich länger dauert als z.B. die von E. coli. Wachstum in statischer Kultur

In einem flüssigen Nährmedium erfolgt nach Einimpfen einer definierten Bakterienzahl das Wachstum in bestimmten Phasen, da sich die Bedingungen ständig ändern. Die Kinetik der Vermehrung kann grafisch dargestellt werden, wenn regelmäßig die Zellzahl bestimmt und als Logarithmus gegenüber der Zeit in einem Koordinatensystem eingetragen wird (Abb. 3.15). 1. Anlauf- oder Latenzphase (lag-Phasc). Zunächst passen sich die Bakterien an das neue Medium an. Dann erfolgt eine Größenzunahme und schließlich beginnen Zellteilungen, die an Geschwindigkeit mit der Zeit zunehmen. 2. Die Phase des exponentiellen Wachstums (logPhase). Der Logarithmus der Zellzahl nimmt linear mit der Zeit zu. 3. Stationäre Phase. Kommt es zum Mangel an einzelnen Komponenten des Mediums oder treten hemmende Stoffwechselprodukte auf, nimmt die Geschwindigkeit der Zellteilungen wieder ab. Es sterben ebenso viele Bakterienzcllen ab, wie durch Teilung hinzukommen. 4. Phase der Abnahme der Zellzahl. Hier überwiegt die Zahl der absterbenden Bakterien, wobei jedoch durch die sich auflösenden Zellen neue Nährstoffe für die noch lebenden Zellen entstehen. Es wird

schließlich ein Gleichgewichtszustand erreicht, bei dem nur noch wenige lebende Zellen vorhanden sind. In diesem Zustand kann die Kultur über Wochen oder Monate verharren.

Auch das Wachstum auf einem festen Nährboden, bei dem eine Zelle zu einer Kolonie auswächst, ist eine statische Kultur, die nach einer bestimmten Zeit zum Stillstand kommt. Jedoch lassen sich hier die einzelnen Wachstumsphasen aus methodischen Gründen nicht verfolgen. Bakterien kommen an ihren natürlichen Standorten praktisch nie als Reinkulturen vor, es sei denn, die äußeren Bedingungen sind so selektiv (z.B. der pH-Wert), daß nur noch eine extrem angepaßte Art hier wachsen kann. Vielmehr leben sie in komplexen Mischkulturen (siehe Kapitel 3.6: Normalflora), in denen sie sich nicht so ungehindert vermehren können, wie es unter definierten Bedingungen in Reinkultur der Fall ist. Ein limitiertes Nährstoffangebot, toxische Stoffwechselendprodukte und die Produktion von antagonistischen Substanzen (Bacteriocine, Antibiotika) führen zu einer natürlichen Begrenzung des Wachstums und zu einem labilen Gleichgewichtszustand, zu dem auch der Wirtsorganismus durch seine zahlreichen spezifischen und unspezifischen Schutzeinrichtungen einen wichtigen Beitrag leistet. Physikalische Einflüsse auf das Wachstum

Es wurde bereits erwähnt, daß äußere Bedingungen einen entscheidenden Einfluß auf das Wachstum von Bakterien haben. Es sind vor allem physikalische Parameter, wie Temperatur,

Abb. 3.15 Schematische Darstellung der Wachstumskurve einer Bakterienkultur in einer Nährflüssigkeit.

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Allgemeine Bakteriologie

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pH-Wert, Gaskonzentrationen und verfügbares Wasser, die jeweils nur in einem bestimmten Bereich ein Wachstum von Bakterien ermöglichen. Temperatur

Entsprechend ihrer Temperaturoptima kann man die bisher bekannten Bakterienarten in psychrophile (Optimum < 15 °C), mesophile (20-45 °C) und thermophile (> 55 °C) einteilen. Naturgemäß liegt das Wachslumsoptimum der medizinisch bedeutsamen Bakterien im Bereich der Körperwärme (ca. 35-37 °C). Andere Bakterien vermögen jedoch durch strukturelle Besonderheiten ihrer Zellkomponenten noch in Extrembereichen wie 0 °C oder über 100 °C zu wachsen. Auch können Bakterien unterhalb 0 °C über lange Zeit am Leben bleiben, wobei jedoch kein Wachstum stattfindet. Einige medizinisch relevante Bakterien (z.B. Listerien) können sich allerdings noch bei Kühlschranktemperaturen vermehren (Verderben von Nahrungsmitteln). Andere, wie die Meningokokken, sind auf 37 °C adaptiert und wachsen schon bei Zimmertemperatur nicht mehr. Die meisten (z.B. Enterobacteriaceae) können aber einen breiteren Temperaturbereich nutzen. Über 60 "C werden vegetative Zellen (mit Ausnahme der thermophilen Bakterien) geschädigt; Bakterien-Sporen werden erst durch Temperaturen über 100 °C abgetötet. Wassergehalt

Wichtig für das Wachstum von Mikroorganismen ist die Verfügbarkeit von freiem Wasser. Auch hierin sind ihre Ansprüche recht unterschiedlich. Während sich medizinisch wichtige Bakterien nur in wäßrigem Milieu vermehren können - auch bei Wachstum auf festen Nährboden oder in vivo auf Epithelien steht Wasser praktisch unbegrenzt zur Verfügung - können viele Pilze Nahrungsmittel, die durch Wasserentzug haltbar gemacht werden (z.B. Käse, Marmeladen), besiedeln und durch Aflatoxinproduk-

tion verderben. Bei der Lyophilisierung (Gefriertrocknung) wird den Mikroorganismen im tiefgefrorenen Zustand das freie Wasser nahezu vollständig entzogen. Auf diese Weise können Bakterien jahrelang aufbewahrt werden, ohne ihre Vermehrungsfähigkeit zu verlieren. pH-Wert Die meisten Bakterien wachsen optimal im Neutralbereich um pH 7. Laktobazillen, die unter physiologischen Bedingungen in der Vagina dominieren, und viele Pilze bevorzugen einen leicht sauren pH-Wert (ca. pH 5) und halten ihn durch Produktion von organischen Säuren aufrecht. An Extremstandorte adaptierte Bakterien (bis pH 1 und pH 14) spielen in der Medizin keine Rolle. Sauerstoff Im Verhalten gegen Luftsauerstoff (Tab. 3.3) lassen sich die obligat aeroben Bakterien, die auf das Vorhandensein von Luftsauerstoff angewiesen sind, die fakultativ anaeroben Bakterien, die sowohl bei Gegenwart von Luftsauerstoff als auch bei dessen Fehlen wachsen können, und die obligat anaeroben Bakterien unterscheiden.

Medizinisch relevante Bakterien findet man in allen drei Gruppen; die meisten gehören jedoch zu den fakultativ anacroben (z.B. Enterobacteriaceae) und den obligat anaeroben Bakterien (z.B. Clostridicn). Für alle obligat aeroben Bakterien ist der Sauerstoff zum Wachstum notwendig. Er dient im Zuge der Atmung als terminaler Elektronenakzeptor in der Atmungskette (s.u.) und kann in dieser Funktion nicht ersetzt werden. Im Gegensatz dazu können fakultativ anaerobe Bakterien auch andere Elektronenakzeptoren benutzen (Abb. 3.16). Fakultativ Anaerobe vermögen aber auch durch Gärung Energie für ihren Stoffwechsel zu gewinnen (s.u.). Sie können somit äußerst flexibel unter den jeweili-

Bakteriengruppe

Stoffwechsel

obligat Aerobe

aerobe Atmung (O2 ist notwendig zur Oxidation

fakultativ Anaerobe

organischer Substrate zu CO2 und H2O) aerobe Atmung (in Gegenwart von O2)

obligat Anaerobe

Gärung oder anaerobe Atmung (in Abwesenheit von O2) Gärung oder anaerobe Atmung (O2 ist toxisch)

Tab. 3.3 Bedeutung von Luftsauerstoff für Bakterien

3.2 Physiologie der Bakterien

Abb. 3.16 Vereinfachtes, nicht stöchiometrisches Schema des bakteriellen Stoffwechsels *)Hexosen können durch Bakterien auf drei verschiedenen Wegen in Pyruvat überführt werden, die je nach Bakterienart in unterschiedlichem Ausmaß am Zuckerabbau beteiligt sind oder auch anabolische Aufgaben haben können: 1. Glykolyse (Emden-Meyerhof-Parnas-Weg); 2. Pentosephosphat-Weg; 3. 2-Keto-3-desoxy-6-phoshoglukonat-Weg (Entner-Doudoroff-Weg).

gen Gegebenheiten den effektivsten Stoffwechselweg benutzen und an vielen Standorten wachsen. Für anaerobe Bakterien ist der Sauerstoff toxisch.

Das hat folgende Gründe: Bei der Reduktion des Sauerstoffs entstehen neben H2O (Reduktion von Os durch die Zytochrom-Oxidase) auch O22" und O2 , wenn nur zwei bzw. ein Elektron auf ein OvMolekül übertragen werden, bzw. wird, wie z.B. bei Aminosäure-Oxidasen oder der Xanthinoxidase. O22-, das durch Protonen-

anlagerung zu H2O2 wird, und das Superoxidradikal O2 sind jedoch toxisch. Für ihre Entgiftung sorgen vor allem die Katalane (2 H2O? Æ 2 H2O + O2) und die Superoxid-Dismutase (2 O2" + 2 H+ Æ H2O2 + O2); bei vielen Anaerobiern fehlen entweder beide oder nur die Superoxid-Dismutase. Neben diesen Gruppen gibt es noch aerotolerante und mikroaerophile Bakterien. Aerotolerante Bakterien sind anaerobe Bakterien, die einen geringen Oi-Partialdruck tolerieren können. Mikroaerophile hingegen sind aerobe Bakterien (z.B. die Gattung Campylobacter), die jedoch nur in Gegenwart eines reduzierten

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Allgemeine Bakteriologie

Oi-Partialdrucks (ca. 5-10 Volumenprozent) wachsen können.

Da der Luftsauerstoff bei den obligat anaeroben Bakterien zum Absterben führt, muß Untersuchungsmaterial, das auf Anwesenheit anaerober Bakterien geprüft werden soll, sofort nach der Entnahme durch geeignete Maßnahmen vor dem Zutritt von Luftsauerstoff geschützt werden, wenn ein optimales Ergebnis der Untersuchung erzielt werden soll. Kohlendioxid Nur die autotrophen Bakterien können CO2 als alleinige C-Quelle nutzen. Trotzdem vermögen viele heterotrophe Bakterien, die reduzierte CQuellen benötigen, auch CO2 in den Stoffwechsel einzuschleusen. Dies geschieht hauptsächlich durch Karboxylierung des Phosphoenolpyruvats (PEP-Carboxylase und PEP-Carboxykinase) und des Pyruvats (Pyruvat-Carboxylase). Viele der medizinisch wichtigen Bakterien sind an das Wachstum im Wirtsorganismus adaptiert, wo höhere CO2-Konzentrationen als in der Luft (0,04 Volumenprozent) herrschen. So wachsen z.B. Neisserien und viele Streptokokken zumindest bei der Erstisolierung erst bei 5-10% CO2.

3.2.2 Mechanismen des Stoffwechsels Alle Lebewesen benötigen zur Aufrechterhaltung ihrer Lebensfunktionen die ständige Zufuhr von Energie. Die primäre Energiequelle für heterotrophe Lebewesen wie Tiere, Pilze und viele Bakterien, darunter alle potentiell pathogenen. sind Zucker und Polysaccharide, aber auch Fette und Aromaten, die von photoautotrophen Lebewesen produziert werden. Heterotrophe Organismen oxidieren die organischen C-Verbindungen zu CO2 oder organischen Säuren und nutzen die dabei freigesetzte Energie zum Aufbau eigenen Zellmaterials. Die Energiespeicherung und die Energiegewinnung, der Aufbau und Abbau von Zellmalerial erfordern eine Vielzahl von chemischen Reaktionen, die hochspezifisch durch Enzyme (s.u.) katalysiert werden und in ihrer Gesamtheit als Stoffwechsel (Metabolismus) bezeichnet werden. Der Stoffwechsel läßt sich vereinfacht in drei Abschnitte einteilen, die naturgemäß fließend ineinander übergehen (Abb. 3.16). Alle Reaktionen, die dem Abbau von organischem Material zum Ziel der Gewinnung von Energie die-

nen, bezeichnet man als Katabolismus. Dieser mündet in zentralen Stoffwcchsel-lntcrmediärprodukten (Phosphatestern und organischen Säuren), die als Vorstufen für Biosynthesen und für die weitere Energiegewinnung verwendet werden. Dieser Abschnitt wird als Intermediärstoffwechsel bezeichnet. Die Reaktionen, die der Synthese von Bausteinen und dem Aufbau von zelleigencn Makromolekülen dienen, werden als Anabolismus zusammengefaßt. Es ist an dieser Stelle nicht möglich, die Vielzahl der bekannten Stoffwechselreaktionen zu beschreiben. Diese sind in den Lehrbüchern der Biochemie und allgemeinen Mikrobiologie detailliert behandelt. Es ist lediglich beabsichtigt, die grundlegenden Prinzipien herauszuarbeiten und die Besonderheiten des bakteriellen Stoffwechsels im Vergleich zu anderen heterotrophen Lebewesen darzustellen.

Enzyme, Koenzyme und Stoffwechselregulation Die Stoffwechselschritte der Zelle werden von Enzymen durchgeführt. Enzyme fungieren als Katalysatoren, d.h. sie setzen die Aktivierungsenergie einer chemischen Reaktion herab und beschleunigen den Reaktionsablauf bis zum Erreichen der Gleichgewichtskonzentrationen.

Durch sie können Reaktionen, die bei „normalen" Temperatur- und Druckverhältnissen kaum meßbar sind, mit hoher Geschwindigkeit ablaufen. Enzyme - ganz überwiegend sind sie Proteine, in seltenen Fällen auch Ribonukleinsäuren - haben gegenüber chemischen Katalysatoren den Vorteil der äußerst hohen Spczifität und der Regulierbarkeit ihrer Aktivität. Es gibt einfache Enzyme, die ein Substrat binden, die Umsetzung katalysieren und die Produkte entlassen. Andere brauchen für ihre Aktivität Kofaktoren. die fest gebunden sein können (prosthetische Gruppen) oder nur bei der Katalyse mit dem Enzym in Verbindung treten (Koenzyme, Kosubstrate). Die wichtigsten Koenzyme und prosthetischen Gruppen im Stoffwechsel sind NAD, FAD, Zytochrome, Ubichinone und Chinone, sowie ATP. ADP und AMR Die genannten Koenzyme fungieren als Überträger von Elektronen bzw. Wasserstoff oder als Gruppenüberträger (z.B. Methylgruppen, Phosphatgruppen). Die Regulation des Stoffwechsels findet auf zwei Ebenen statt: Ŷ Feinregulation direkt am Enzym durch Aktivierung und Hemmung der Enzymaktivität;

dies erfolgt über die Konzentrationen der Substrate und Produkte, sowie durch kompetitive und nicht-kompetitive Hemmung.

3.2 Physiologie der Bakterien

Ŷ Grobregulation auf der Ebene der Transkription durch Induktion oder Repression der Enzymsynthese: Ein gut untersuchtes Beispiel dafür ist die Induktion der ß-Galaktosidase, einem Enzym, das Laktose zu Glukose und Galaktose hydrolysiert. Die Synthese dieses Enzyms findet bei Abwesenheit von Laktose nicht statt. Erst Laktose oder Strukturanaloge im Medium wirken als Induktoren, die letztlich die Transkription des Laktose-Operons ermöglichen. Allerdings werden zahlreiche Enzyme auch in jeder physiologischen Situation gebildet (konstitutive Enzyme), und daher nicht auf der Ebene der Transkription reguliert. Stoffaufnahme Jede Zelle ist gegenüber ihrer Umgebung durch eine Membran abgegrenzt, die als Permeabilitätsbarriere fungiert. Fast alle Bakterien besitzen außerhalb der Membran eine Zellwand, welche die mechanische Stabilität der Zelle gewährleistet. Nährstoffe, die im Zytoplasma benötigt werden, müssen deshalb zunächst über die Zellwand und die Zytoplasmamembran aufgenommen werden.

Polymere Substanzen (Polysaccharide, Proteine) können in der Regel von Bakterien nicht direkt in die Zelle geschleust werden. Sie müssen durch Enzyme, die in die Umgebung ausgeschieden werden (Exoenzyme) zuerst in Monomere oder kurze Oligomere zerlegt werden. Diese können per Diffusion zunächst durch die Zellwand in den periplasmatischen Raum (s. Kap. 3.1.2) gelangen. Für die Aufnahme über die Zytoplasmamembran stehen der aktive Transport und die Gruppentranslokation als hochspezifische und energieverbrauchende Prozesse zur Verfügung. Die Spezifität wird durch Transportsysteme gewährleistet, die aus mehreren Proteinen bestehen können. Durch die Energieaufwendung ist es möglich, Substanzen gegen ein Konzentrationsgefälle in der Zelle anzuhäufen.

Beim aktiven Transport (u.a. von Zuckern, Aminosäuren, anorganischen Ionen) wird das betreffende Molekül unmodifiziert in die Zelle geschleust. Die Energie stammt aus dem ATP oder direkt aus dem Protonengradienten (s.u.). Bei der Gruppentranslokation wird das aufzuneh-

mende Molekül (z.B. Glukose und Fruktose bei E. coli) modifiziert. Die Energie stammt aus dem Phosphatester des Phosphoenolpyruvats (PEP), wobei die Phosphatgruppe auf den Zucker übertragen wird und dieser nach dem Transport als Zuckerphosphat in der Zelle vorliegt. Energieum Wandlung Viele der in die Zelle transportierten Nährstoffe (z.B. Aminosäuren, Zucker, Purin- und Pyrimidinbasen) werden von Bakterien nach entsprechender Aktivierung direkt in anabole Prozesse eingeschleust. Sie können aber auch häufig zur Energiegewinnung verwendet werden, wenn geeignetere Substrate fehlen. In der Regel gilt, daß zunächst immer das am effektivsten und mit dem geringsten Aufwand zu metabolisierende Substrat verwertet wird. E. coli baut z.B. zuerst Glukose ab, bevor es andere Zucker oder gar Aminosäuren nutzt. Die bevorzugten Substrate für den Energiestoffwechsel sind die Kohlenhydrate, zuallererst die Glukose, anhand derer die Energiegewinnung heterotropher Bakterien im folgenden gezeigt werden soll. Die Überführung der Glukose in COi und Wasser bei gleichzeitiger ATP-Synthese erfolgt im günstigsten Fall durch Atmung in drei Abschnitten (s. Abb. 3.16): Ŷ Abbau bis zum Pyruvat (Brenztraubensäure); hierfür stehen Bakterien neben der universellen Glykolyse noch weitere Wege zur VerfügungŶ Abbau des Pyruvats über verschiedene Reaktionen mit unterschiedlichen Endprodukten (Reaktionen charakteristisch für unterschiedliche Bakteriengruppen). Ŷ Endabbau im Trikarbonsäurezyklus, wenn das Pyruvat vorher zu Acetyl-Koenzym A (Acetyl-CoA) und CO2 oxidiert wird. Der Trikarbonsäurezyklus ist bei vielen Bakterien, vor allem bei den gärenden (s.u.), nur unvollständig oder gar nicht vorhanden. Es kann an dieser Stelle nicht auf die einzelnen Reaktionen der Glukoseoxidation zu CO2 eingegangen werden. Wichtig für die Betrachtung der Energieumwandlung ist, daß in ihrem Verlauf die Möglichkeit besteht, ATP zu generieren. Diese ATP-Bildung im ersten Abschnitt erfolgt enzymatisch im Zytoplasma direkt am Substrat und wird deshalb als Substratphosphorylierung bezeichnet im Gegensatz zur Elektronentransportketten-Phosphorylierung an Membranen (s.u.). Bisher wurde nur der Verbleib des Kohlenstoffs betrachtet, nicht aber auf die bei der Oxidation

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Allgemeine Bakteriologie

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freiwerdenden Elektronen eingegangen. Diese werden auf NAD oder FAD übertragen, die danach in reduzierter Form als NADH2, bzw. FADH2 vorliegen, da jeweils zwei Elektronen transportiert werden. Die reduzierten Koenzyme müssen aber wieder oxidiert werden, um für weiteren Glukoseabbau zur Verfügung zu stehen. In der Art, wie die Bakterien sich der Elektronen, bzw. des Wasserstoffs entledigen oder sogar die darin fixierte Energie weiter nutzen, unterscheiden sich die einzelnen Bakteriengruppen beträchtlich; die jeweils realisierten Wege lassen sich in zwei prinzipiell unterschiedliche Gruppen zusammenfassen: die Atmungen und die Gärungen.

Atmung Organismen, die eine Atmung betreiben, nutzen das hohe Energieniveau, auf dem sich der an NAD gebundene Wasserstoff befindet, zur weiteren Energiegewinnung in Form von ATP aus.

Sie oxidieren den Wasserstoff mit O2 zu H2O, jedoch nicht in einer unkontrollierten Knallgasreaktion, wobei die Energie in Form von Wärme

frei wird, sondern stufenweise in einer enzymatisch kontrollierten Reaktion. Die an dieser Reaktion beteiligten Enzyme sind zu einem in der Zytoplasmamembran angeordneten funktioneilen Komplex, der Atmungskette, zusammengefaßt (Abb. 3.17). Diese besteht aus einer Reihe von Proteinen, die Elektronen- bzw. Wasserstoff-übertragende prostethische Gruppen und Koenzyme gebunden haben, bzw. binden (NAD, FAD, Chinone, Zytochrome). Eine Vorstellung über die molekularen Mechanismen, die die Oxidation des Wasserstoffs mit der Gewinnung von ATP koppeln, liefert die chemiosmotische Theorie von MITCHELL. Danach pumpt die Atmungskette ständig Protonen aus der Zelle. Durch diesen vcktoriellen Protonentransport nach außen entsteht über die H+ impermeable Membran ein Ladungsungleichgewicht, der sog. Protonengradient (s. Abb. 3.17). Die Energie des Wasserstoffs wird also zunächst in diesem Gradienten gespeichert, der, physikalisch gesehen, in der Lage ist, Arbeit zu leisten. Das geschieht an bestimmten Stellen in der Membran, an denen die Protonen gezielt in das Zytoplasma zurückströmen und den Gradienten wieder ausgleichen.

Abb. 3.17 Schema der Energieumwandlung in einer aerob atmenden Bakterienzelle (nicht stöchiometrisch).

3.2 Physiologie der Bakterien

Diese Stellen sind vornehmlich das membrangebundene Enzym ATPase und Enzymsysteme des aktiven Transports. Hier wird der Rückfluß der Protonen mit der Synthese von ATP, bzw. der Aufnahme von Metaboliten gekoppelt (Abb. 3.17). Auch andere energieabhängige Prozesse, wie die Geißelbewegung, werden durch den Protonengradienten getrieben. Diese Art der ATP-Bildung durch die membrangebundenen Enzyme der Atmungskette und die ATPase wird im Gegensatz zu der im Zytoplasma ablaufenden Substratphosphorylierung als Elektronentransportketten-Phosphorylienmg bezeichnet. Sie erst ermöglicht die vollständige Ausnutzung der in reduzierten organischen Verbindungen enthaltenen Energie. Anaerobe Atmung, Der Sauerstoff als terminaler Akzeptor der Elektronen kann bei Bakterien durch andere Verbindungen obligat oder fakultativ ersetzt werden. Bei der Nitratatmung werden die Elektronen auf NO.c übertragen und dieses zum N2 oder bis zum NH3 reduziert. Andere Akzeptoren sind z.B. NO2. SO42~ und andere oxidierte Schwefelverbindungen. HCO_v und Fumarat. Wenn Bakterien über die entsprechenden Überträgerenzyme verfügen, können sie also auch in Abwesenheit von Sauerstoff die energetischen Vorteile der Atmung nutzen. Da hier ein membrangebundener Elektronentransport stattfindet, spricht man von einer anaeroben Atmung (s. Abb. 3.16). Gärung Wie die anaerobe Atmung verläuft die Gärung ebenfalls unter Ausschluß von O2.

Jedoch findet zumindest bei der klassischen Gärung keine Elektronentransportketten-Phosphorylierung statt, entweder weil den jeweiligen Bakterien die notwendigen Enzyme fehlen (obligate Gärer) oder ein verwertbarer Elektronenakzeptor nicht zur Verfügung steht (fakultative Gärer). Unter diesen Bedingungen stehen die Bakterien vor dem Problem, sich des Wasserstoffs zu entledigen, um NADH2 für weiteren Glukoseabbau zu oxidieren. Der einfachste Fall, den Wasserstoff als gasförmigen H2 freizusetzen, findet man bei einigen medizinisch unbedeutenden Arten verwirklicht. Weiter verbreitet ist die Möglichkeit, den Wasserstoff auf organische Intermediärprodukte zu übertragen und diese auszuscheiden. Bei der Milchsäuregärung wird z.B. Pyruvat zur Milchsäure (Laktat) reduziert. Diesen Weg gehen die Laktobazillen und einige Streptokokken. Die Enterobacteriaceae führen eine gemischte

Säuregärung durch, bei der Laktat. Succinat. Azetat, Formiat, H2 und auch Ethanol und 2,3Butandiol entstehen. Bakterien der Gattung Clostridium produzieren vornehmlich Buttersäure und Butanol. In Abb. 3.18 sind die wichtigsten Gärungswege und Produkte zusammengefaßt. Alle Reaktionen erbringen aber keinen weiteren Energiegewinn in Form von ATP, sondern dienen nur der Entfernung des Wasserstoffs.

Die Gärungen sind von großer Bedeutung in der Lebensmittelindustrie. Milchprodukte wie Käse und Joghurt, Sauerkraut, Bier und Wein sind nur einige der durch mikrobielle Gärungen produzierten Nahrungsmittel. Energiebilanz bei Gärung und Atmung Für gärende Bakterien stellt die Substratphosphorylierung die wichtigste Form der ATP-Regenerierung dar. Wird die Glukose über die Glykolyse abgebaut, entstehen dabei netto 2 Mol ATP pro Mol Glukose. Da aber auch andere Abbauwege möglich sind und in einigen Fällen auch Acetyl-CoA über Acetylphosphat in Acetat und ATP überführt werden kann, können bei Gärungen allgemein 1-4 Mol ATP pro Mol Glukose gewonnen werden. Atmende Organismen dagegen können den Wasserstoff über die Atmungskette oxidieren. Für den theoretischen Fall, daß alle im Zuge der Oxidation der Glukose zu CO2 gebildeten Reduktionsäquivalente

Abb. 3.18 Schema der Entstehung wichtiger Gärungsprodukte.

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Allgemeine Bakteriologie

(NADH2, FADH,,) vollständig zur ATP-Synthese genutzt werden, können maximal 38 Mol ATP pro Mol Glukose gewonnen werden, wenn man die durch Substratphosphorylierung gebildeten ATP addiert. Dieses dokumentiert die enorme Effizienz der Atmung im Vergleich zur Gärung sehr eindrucksvoll. Allerdings können klassische Gärer wie die Clostridien auch in gewissem Umfang einen Elektronentransport durchführen, z.B. mit Hilfe der membrangebundenen Fumaratreduktase, die bei der Reduktion von Fumarat zu Succinat Protonen im Sinne der chemiosmotischen Theorie aus dem Zytoplasma schleust und somit einen Protonengradienten erzeugt, der zur ATPSynthese beiträgt. Dadurch wird zwar die ungünstige Bilanz der Gärung im Vergleich zur Atmung verbessert, deren Effizienz jedoch nicht erreicht. Sekundärstoffwechsel Die bisher beschriebenen Stoffwechselwege zur Energiegewinnung und auch die nicht näher betrachteten Biosynthesewege der Zellbausteine und Biopolymere sind für die Zelle essentiell. Daneben produzieren Bakterien und Pilze eine Reihe weiterer Substanzen, deren Nutzen primär nicht ersichtlich ist. Sie werden deshalb als sekundäre Metabolite und die Stoffwechselwege, die zu ihrer Synthese führen, als Sekundärstoffwechsel bezeichnet. Die bekanntesten Produkte des Sekundärstoffwechsels sind Antibiotika, Mykotoxine und andere Wirkstoffe mit z.T. großer industrieller Bedeutung.

Bedeutung der Stoffwechselleistungen für die Diagnostik von Bakterien Das Vermögen einer Bakterienart, einen bestimmten Stoffwcchsclweg zu beschreiten, eine bestimmte Substanz zu verwerten oder ein bestimmtes Produkt zu bilden, sind wichtige Kriterien für eine systematische Klassifizierung und die Diagnostik der Bakterien. Soll z.B. ein Krankheitserreger identifiziert werden, so untersucht man auch seine Stoffwechselleistungen und Enzymausstattung. Man überprüft z.B. das Vorhandensein von Katalase, Oxidase, das Wachstum in Gegenwart von O?, das Wachstum bei verschiedenen Temperaturen, oder das Vorhandensein von zahlreichen Enzymen. Einzelheiten sind bei der Besprechung der verschiede-

nen Bakterienarten angegeben (s. auch Kap. 2.3: Mikrobiologische Untersuchungsverfahren). Literatur DAVIS , B., R. D ULBECCO , H. E ISEN and H.S. GINS BERG : Microbiology, 4th ed. Harper International Edition, 1990. GOTTSCHAI.K. G.: Bacterial Mctabolism, Springer Verlag,New York, Heidelberg, Berlin, 2nd ed., 1986. MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.M., PARKER, J.: Brock: Biology of Microorganisms, 8th ed., Prentice Hall Inc., Upper Saddle River (1997). SCHI.F.CIF.L, H.: Allgemeine Mikrobiologie, 7. Aufl.. G. Thieme, Stuttgart, New York 1991. SALYERS, A.A., WHITT , D.D.: Bacterial pathogenesis a molecular approach, ASM Press, Washington, D.C. (1994). STRYER. L.: Biochemie. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 4. Aufl., 1996.

3.3 Genetik der Bakterien JÖRG HACKER

Die Genetik beschäftigt sich mit den Mechanismen der Vererbung bestimmter Merkmale von einer Organismengeneration auf die nächste. Unter Gen wird ein Teilbereich der Nukleinsäure verstanden, der eine bestimmte Information trägt, die meist in eine Aminosäuresequenz übersetzt wird. In der Genetik wird zwischen Genotyp und Phänotyp von Organismen unterschieden. Unter Genotyp wird die Gesamtheit der genetischen Anlagen verstanden, während als Phänotyp die Gesamtheit der exprimierten Merkmale bezeichnet wird. Die Gesetze der Vererbung werden seit langem intensiv studiert. Mit dem Aufkommen der molekularen Genetik, vor allem aber mit der Entwicklung der Gentechnologie, haben sich viele genetische Methoden zu Standardlabortechniken entwickelt, mit deren Hilfe Probleme aus den verschiedensten Bereichen der Biologie und Medizin untersucht werden können. Auch unser Wissen um die Mechanismen der mikrobiellen Pathogenität und um die Ausbreitung pathogener Erreger ist durch die Anwendung genetischer Methoden revolutioniert worden. Die Entwicklung der molekularen Genetik als relativ eigenständige Wissenschaftsdisziplin hat die Entstehung einer Reihe von z.T. neuen Fachtermini nach sich gezogen, von denen einige in Tabelle 3.4 aufgeführt sind.

3.3 Genetik der Bakterien

Tab. 3.4 Erklärung einiger Begriffe aus der molekularen Genetik Aktivator BakterienChromosom Bakteriophage DNA-Polymerasen downstream Gen Genomics Genotyp, Genom Gensonde Induktor Insertionssequenz (IS) Konjugation Modifikation Mutation Operator Operon Phänotyp Plasmid „Polymerase chain reaction" (PCR) Promotor Proteom Replikation RNA-Polymerase Repressor Restriktion „Restriction length fragment polymorphism" (RLFP) Transfektion Transformation

Regulatorprotein, bindet an DNA-Bereiche in der Nähe der Promotoren, fördert eine effektive Transkription und führt zur „positiven" Genregulation ringförmiges, großes, selbstreplizierendes DNA-Molekül, Träger aller wichtigen Gene eines Bakteriums „Bakterien-Virus", kann nur kurze Zeit autonom existieren, Nukleinsäure kann in Bakterien-Genom integrieren Enzyme, die die Neusynthese von DNA-Strängen katalysieren in Richtung auf das 3'-Ende einer DNA Teilbereich einer Nukleinsäure, der eine genetische Information trägt, kann meist in eine Aminosäuresequenz übersetzt werden beschreibt die Analyse der Genome von Organismen Gesamtheit aller genetischen Anlagen eines Organismus bekanntes kloniertes Gen und Teilsequenz eines Gens; wird nach Markierung als Werkzeug zur Charakterisierung von unbekannter Nukleinsäure eingesetzt biologisch wirksame Substanz, die an Regulatorproteine bindet und so die Aktivität von Regulatoren beeinflusst, kann als Co-Repressor oder Co-Aktivator wirken genetisches Element, hat die Fähigkeit zu springen (transponieren) und in das Genom zu inserieren Übertragung von DNA mit Hilfe von Plasmiden von einem Spender- auf ein Empfänger-Bakterium Methylierung von DNA-Molekülen, Schutzmechanismus gegen das Wirken der Restriktion sprunghafte, ungerichtete Änderung einer Nukleinsäuresequenz DNA-Sequenz, zwischen Promotor und Startcodon eines Gens gelegen, dient als Bindungsstelle für Repressoren aus mehreren benachbarten Genen bestehende Determinante, die Gene werden gemeinsam reguliert, häufig wird eine gemeinsame (polycistronische) mRNA gebildet Gesamtheit aller Merkmale eines Organismus außerhalb des Chromosoms liegendes, kleines, selbstreplizierendes DNA-Molekül, kodiert meist für nicht-essentielle Eigenschaften Amplifizierung eines Nukleinsäure-Fragments aus einem Nukleinsäuregemisch durch Einsatz spezifischer Primer und einer hitzeresistenten DNA-Polymerase vor einem Gen lokalisierte DNA-Sequenz, dient als Bindungsbereich für die RNAPolymerase Proteinkomposition eines Organismus Weitergabe der Nukleotidabfolge von Nukleinsäuren von einer Organismengeneration auf die nächste DNA-abhängiges Enzym, das die Neusynthese von mRNA auf der Grundlage der DNA-Basensequenz katalysiert Regulatorprotein, das an eine Operatorstruktur bindet, behindert eine effektive Transkription und führt zur „negativen" Genregulation Abbau von DNA mittels Restriktionsendonukleasen Unterschied im Muster von verschiedenen DNA-Molekülen nach Spaltung mit Restriktionsenzymen und Auftrennung der Fragmente im elektrischen Feld

Transkription

Übertragung von (nackter) Bakteriophogen-DNA in Bakterienzellen Übertragung von (nackten) DNA-Molekülen in Bakterienzellen mit nachfolgender Rekombination Übertragung der DNA-Nukleotidabfolge auf die mRNA

Transkriptom Translation Transposon upstream

Gesamtheit der Transkripte (insbesondere mRNAs) eines Organismus Übersetzung der RNA-Basensequenz in eine Aminosäuresequenz von Proteinen springendes (transponierbares) genetisches Element, trägt zusätzliche Gene in Richtung auf das 5'-Ende einer DNA

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Allgemeine Bakteriologie

Es sind vor allem drei Makromoleküle, die in der Genetik von Interesse sind. Die Desoxyribonukleinsäure (DNS, engl. „deoxyribonucleic acid", DNA) fungiert bei den meisten Organismen, darunter auch bei Bakterien, als Träger der genetischen Information. Diese Information wird im Verlauf eines als Transkription bezeichneten Prozesses in Boten-Ribonukleinsäure (engl. „messenger ribonucleic acid", mRNA) übersetzt. Während der Translation werden auf der Grundlage der in der mRNA verankerten Botschaft Proteine gebildet, die eine spezifische, schon in der DNA vorgezeichnete Aminosäuresequenz besitzen. Diese von FRANCIS CRICK als „Dogma der Molekularbiologie" bezeichneten Gesetzmäßigkeiten gelten sowohl für Eukaryonten als auch für Prokaryonten, also auch für Bakterien. Dennoch unterscheiden sich die genetischen Prozesse bei Bakterien von denen der Eukaryonten in einer Reihe von Details. Eine gewisse Modifikation hat das „Dogma" „DNA zu mRNA, mRNA zu Protein" durch die Entdeckung der Reversen Transkriptase erfahren. Mit Hilfe dieses Enzyms ist es möglich, RNA, die bei bestimmten Tumorviren als genetisches Material vorkommt, in DNA umzuschreiben.

3.3.1 Struktur der DNA Das bakterielle Genom besteht aus DNA. Die DNA selbst ist aus Nukleotiden aufgebaut, die durch Phosphodiesterbrücken miteinander verbunden sind. Ein Nukleotid wiederum besteht aus einer Purinbase (Adenin oder Guanin) oder einer Pyrimidinbase (Cytosin oder Thymin), einem Phosphatanteil und einem Zucker (Desoxyribose). Das Zucker-Phosphatgerüst der DNA wird über die 3'- bzw. die 5'-OH-Gruppen der Pentosen miteinander verknüpft, wodurch das Molekül eine Polarität erhält. DNA-Moleküle sind in der Regel doppelsträngig aufgebaut (Abb. 3.19). Die Basen eines Stranges der DNA paaren komplementär über A-T- bzw. G-CBrücken mit den entsprechenden Basen des zweiten Stranges, die Paarung erfolgt über Wasserstoffbrückenbindungen. So entsteht das DNA-Molekül mit zwei rechtsgängig umeinander gewundenen Strängen, wie es von WATSON und CRICK 1953 vorgeschlagen wurde. Bedingt durch die Struktur einer Doppelhelix bildet ein DNA-Molekül nun zwei Furchen, die sog. „major groove" und die „minor groove". Diese Furchen spielen eine wichtige Rolle bei der Interaktion von DNA-Molekülen mit anderen Makromolekülen, beispielsweise mit DNA-Bindeproteinen, deren Wirken für die Regulation von Genen eine große Bedeutung hat.

3.3.2 Das bakterielle Genom

Abb. 3.19 Modell einer DNA-Doppelhelix und Darstellung der Replikation. Im unteren Bereich dienen die beiden voneinander gelösten Stränge als Matrize für die Neusynthese. Abkürzungen: A, Adenin; C, Cytosin; C, Guanin; T, Tyrosin.

Zum Genom von Bakterien zählen das Bakterienchromosom und extrachromosomale Elemente, beispielsweise Plasmide oder Prophagen. Im Jahre 1995 wurde erstmals die gesamte DNA-Sequenz eines Bakteriums, des Meningitis-Erregers Haemophilus influenzae publiziert. Seitdem sind die Totalsequcnzen weiterer medizinisch bedeutsamer Bakterien, aber auch die Sequenzen von Escherichia coli K-12 und von Saccharomyces cerevisiae bestimmt worden; auch die Bestimmung der vollständigen DNASequenz des menschlichen Genoms schreitet voran (Tab. 3.5). Diese Flut neuer Informationen hat eine neue Disziplin, „Genomics", entstehen lassen, die sich mit der Struktur und Organisation von Genomen beschäftigt. Ausgehend von der DNA-Sequenz einzelner Organismen wird die Gesamtheit der mRNA-Moleküle im „Transkriptom" und die Protein-Komposition eines Organismus im „Proteom" erfaßt (Abb. 3.20).

3.3 Genetik der Bakterien

Tab. 3.5 Genome verschiedener Organismen Organismus Bakteriophage )X 1 74 Bakteriophage T4

Länge

Kilobasenpaare

DNA-Sequenz

1,7 um

5,3

liegt vor

61 (im

180

liegt vor

Mycoplasma genitalium Helicobacter pylori

61 (im 400 (im

580 1660

liegt vor liegt vor

Haemophilus influenzae Escherichia coli Myxococcus xanthus

500 pm 1360 um 2700 um

1830 4600 9500

liegt vor liegt vor teilsequenziert

Saccharomyces cerevisiae Drosophila Maus Mensch

5 mm

13 000

50 mm 1000 mm 1000 mm

130000 3 000000 3 000000

Die Größe von DNA-Molekülen wird meistens in Basenpaaren (bp) oder in Kilobasenpaaren

(kbp) angegeben. Die Analyse bakterieller Genom-Sequenzen zeigt, daß bakterielle Genome eine Größe von ca. 600 kbp (Mycoplasma genitalium, siehe Tab. 3.5) bis zu 9.500 kbp {Myxococcus xanthus) haben können. Das Escherichia co//'-Genom hat eine Größe von 4.600 kbp. Ein Großteil des bakteriellen Genoms besteht aus kodierenden Sequenzen, die auch als „open reading frames" (ORFs) bezeichnet werden und die oftmals identisch mit Strukturgenen sind. Das £.-co//-Genom weist 4405 ORFs auf. In den nächsten Jahren werden die Totalscqucnzen der Genome von 100-150 Organismen erwartet. Die zutage tretenden Informationen werden zur Aufdeckung neuer Gene und Genfamilien, zur Beantwortung von Fragen der Evolutionsbiologie, aber auch zur Identifizierung neuer Targets für die antimikrobielle Chemotherapie führen.

liegt vor liegt vor teilsequenziert liegt vor

Neben den Strukturgenen trägt das bakterielle Genom auch die Informationen für sich wiederholende (repetitive) Sequenzen, die eine Rolle bei der Genregulation spielen können. Weiterhin sind „springende Gene" (IS-Elemente, Transposons) auf dem Bakterienchromosom lokalisiert. Das Bakterienchromosom übertrifft in seiner Länge eine prokaryontischc Zelle um das 500 bis lOOOfachc. Um trotz dieser Größenverhältnisse eine „Verpackung" des Chromosoms in der Zelle zu gewährleisten, liegt das Molekül in gedrillter Form vor. Die DNA befindet sich aber nicht wie bei Eukaryontcn in einem Zellkern, sondern sie liegt als enggepacktes Knäuel frei im Zytoplasma. Die Topologie von DNAMolekülen wird durch das Wirken von zwei Enzymen, der Topoisomera.se I und der Topoisomerase II (Gyrase) bestimmt. Während die Gyrase superhelikale Windungen in die DNA einbaut, ist die Topoisomerase I in der Lage, gespannte DNA zu entspannen. Diese Enzyme spielen eine Rolle bei der Transkription, der Rekombination und der Replikation der DNA. Interes-

Abb. 3.20 Schematische Darstellung zur umfassenden genetischen Analyse von Mikroorganismen.

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Allgemeine Bakteriologie

santerweise reagieren bestimmte Antibiotika, die Gyrasehemmer genannt werden, beispielsweise Nalidixinsäure und Chinolone, mit einer Untereinheit der Topoisomcrase II, was zu einer Blockierung der DNAReplikation und damit zu einem bakteriziden Effekt führt. Punktmutationen innerhalb von Gyrasegenen führen wiederum zur Ausbildung von Resistenzen gegenüber solchen Antibiotika.Weiterhin spielen für die Packung von bakterieller DNA basische Proteine eine Rolle. Einer dieser Faktoren, das H-NS-Protein, trägt über eine Veränderung der DN A-Topologie zur Regulation bestimmter Gene bei. Das H-NS-Protein wird von einem Genlocus kodiert, der als osml. („osmotic regulation") bezeichnet wird, da er ursprünglich bei der Suche nach Mutanten, die die Osmoscrcgulation von Bakterien beeinflussen, identifiziert wurde. Einige dieser o.vmZ-regulierten Loci kodieren für Faktoren, die einen Beitrag zur Virulenz von palhogenen Enterobakterien leisten.

3.3.3 Semikonservative Replikation der DNA Die genetische Information, die durch die Nukleotidabfolge in der DNA repräsentiert wird, muß von einer Organismengeneration auf die nächste weitergegeben werden. Dieser Prozeß, der als identische Replikation der DNA-Sequenz bezeichnet wird, ist eine wesentliche Grundlage für die Konstanz der biologischen Arten. Wichtige Experimente zur Replikation der DNA sind um 1960 von MESFXSON und STAHL und von CAIRNS und Mitarbeitern durchgeführt worden. Bei der Replikation kommt es an einer bestimmten chromosomalen DNA-Sequenz, dem sog. „origin of replication", zu einer Trennung der beiden DNA-Stränge (s. Abb. 3.19). Die alten Stränge stellen jeweils die Matrizen („templates") für die Synthese der beiden neuen DNA-Stränge dar. Da das DNA-Molekül nach erfolgter Replikation aus einem alten („konservierten") und einem neuen Strang besteht, spricht man auch von semikonservativer Replikation. Ausgehend von der sog. „Replikationsgabel" erfolgt die Replikation des Chromosoms in beide Richtungen (bidirektional). Die Replikation der DNA ist ein sehr komplizierter Prozeß, an dem über 20 unterschiedliche Enzyme beteiligt sind. Zunächst wird durch eine DNA-abhängige RNA-Polymerase (Primase) ein kurzer RNA-Einzelstrang synthetisiert. Dieses Oligonukleotid paart mit einem entwundenen DNA-Einzelstrang und bildet einen Startpunkt („primer") für die Neusynthese der DNA. Der DNA-Primcr wird später entfernt. Bei der Synthese neuer DNA wird vor allem ein Enzym wirksam: die DNA-Polymerase III. Da das Wachsen der DNA-Stränge immer in 5'-3'-Richtung erfolgt, kann

ein Strang kontinuierlich synthetisiert werden, die Synthese am anderen Strang dagegen muß diskontinuierlich erfolgen. Die neu synthetisierten DNA-Fragmente (OKAZAKi-Fragmcnte) an diesem Strang werden dann durch eine Ligasc miteinander verbunden. Interessanterweise besitzt die DNA-Polymerase III auch eine 3'-5'-Exonukleasc-Aktivität, so daß eine fehlerhafte Replikation in vielen Fällen repariert werden kann („proofreading"). Neben dieser Form der bidirektionellen, semikonservativen Replikation des Chromosoms ist bei Plasmiden und Bakteriophagen auch das sog. „rolling circle model" der Replikation bekannt. Hier beginnt die Replikation des zirkulären DNA-Moleküls mit einem nukleolytischen Schnitt an einem Strang. Von diesem Wachstumspunkt aus erfolgt die Neusynthese der DNA. Im Verlauf der Replikation kommt es zu einer vollständigen Verdrängung eines Einzelstranges aus dem zirkulären Molekül. Durch die Synthese eines zum verdrängten Strang komplementären Stranges entsteht dann wiederum ein doppclslrängiges DNAMolekül. Um eine kontinuierliche DNA-Replikation bei einem fest fixierten Ort der Synthese zu gewährleisten, muß sich der innere Ring der DNA drehen, damit dem Replikationsapparat stets neue Nuklcotidsequenzen zur Verfügung stehen.

3.3.4 Transkription Ein Schlüsselvorgang bei der Realisierung der genetischen Information ist die Übertragung der Nukleotidabfolge von DNA auf „messenger"RNA (mRNA). Dieser Vorgang wird Transkription genannt. Die RNA ist ähnlich aufgebaut wie die DNA, allerdings kommt als Pentose nicht Desoxyribose sondern Ribose vor. Weiterhin wird Uracil statt Thymin als Pyrimidinbase in die Nukleinsäure eingebaut. Neben der mRNA, die als einsträngiges Molekül vorliegt, sind zwei weitere RNA-Spezies bekannt: die Transfer-RNA (tRNA) und die ribosomale RNA (rRNA). Die tRNAs sind für die Synthese der Proteine von Bedeutung. Die rRNAs sind Bestandteile der Ribosomen. Die 16S RNA spezifischen Gene, die für die 16S rRNAs kodieren, sind bei Prokaryonten stark konserviert. Allerdings treten auch geringe Unterschiede zwischen den 16S RNA spezifischen Genen unterschiedlicher Arten auf, so daß die Sequenzen dieser Gene zur Artbestimmung mit herangezogen werden. Weiterhin stellen rRNA-Moleküle Zielstrukturen für die Spezies-spezifische Identifizierung von Bakterien mit Hilfe von DNA-Sonden dar.

Essentiell für die Synthese der mRNA und damit für die Realisierung der genetischen Information ist die DNA-abhängige RNA-Polymerase. Dieses Enzym besteht aus mehreren Untereinheiten und ist in der Lage, unter Beteiligung des sog. Sigma-Faktors an eine spezifische DNA-Se-

3.3 Genetik der Bakterien

quenz, den sog. Promotorbereich zu binden (Abb. 3.21). Promotoren sind vor den kodierenden Bereichen der Gene lokalisiert. Sie zeigen sog. Konsensus-Sequenzen, die bei E. coli 10 Nukleotide (-10 Region oder PRIBNOW-BOX) bzw. 35 Nukleotide (-35 Region) stromaufwärts von den mRNA Startpunkten liegen. Die Basenabfolge der „idealen" E. coli -10-Box lautet TATAAT, die Sequenz der -35-Box ist TTGACA. Oftmals sind weitere DNA-Sequenzen und zusätzliche Proteine bei der Bindung der RNAPolymerase an die Promotoren beteiligt. Mit Hilfe verschiedener Methoden ist es heute möglich, den genauen mRNA-Startpunkt für bestimmte Gene zu identifizieren und so auch die Konsensus-Sequenzen für die Promotoren festzulegen. Wenige Nukleotide vor dem Startcodon für prokaryontische Gene (ATG) ist die sog. „Shine-Dalgarno" (SD)-Sequenz lokalisiert, die bei der Translation eine Bedeutung hat und als Bindungsstelle für das Ribosom verwendet wird. Die mRNA-Synthese erfolgt nach Aulwindung des DNA-Moleküls stets am sog. „codogenen Strang" in 3'-Richtung. Am Ende der kodierenden Bereiche bilden sich häufig Terminationsstrukturen aus, die ein Ablösen der RNA-Polymerase von der DNA zur Folge haben. Die Terminatoren bestehen aus palindromischen (spiegelbildlichen) Nukleotidsequenzen, die eine Haarnadelstruktur ausbilden können. Einige Antibiotika (beispielsweise Rifampicin) sind in der Lage, die RNA-Polymerase zu inaktivieren und so eine antimikrobielle Wirkung zu erzielen. Im Gegensatz zu eukaryontischen Organismen können bei Bakterien sowohl Gene einzeln als auch en bloc transkribiert werden. Mehrere hintereinanderliegende Gene werden als Operon bezeichnet. Man spricht auch von monocistronischen bzw. polycistronischen mRNAs. Bei eukaryontischen Organismen kennt man noch den Vorgang des „splicings", bei dem die kodierenden Bereiche (Exons) aus einem GesamtmRNA-Molekül herausgeschnitten und neu zusam-

mengesetzt werden. Die nicht-kodierenden Bereiche werden dabei als Intron-Bereiche bezeichnet. Das Transkriptom

Einhergehend mit der Analyse der vollständigen DNA-Sequenzen einzelner Organismen („Genotnics") verspricht die möglichst vollständige Erfassung der mRNA-Moleküle eines Organismus in Form von Transkriptomen neue Erkenntnisse über die Expression von Genen. Dabei spielt der Einsatz von Mikroarrays oder „Bio-Chips" eine große Rolle (s. Abb. 3.20). Auf die Chip-Matrices können viele (bis zu mehreren tausend) DNA-Sequenzen, repräsentiert durch Oligonukleotide auf engsten Raum (z.B. 1 mm2) aufgebracht werden. Diese verschiedenen Oligonukleotide können etwa ein Genom oder Teile davon repräsentieren. Nach Hybridisierung von isolierter mRNA oder umgesetzter cDNA eines Mikroorganismus mit einer solchen Chip-Matrix läßt sich ein Expressionprofil ganzer Genome erstellen. In Zukunft wird diese Technologie auch dazu dienen, in einer erweiteren Analyse für Infektionserreger die Expression von Virulenzgenen (z.B. Toxin-Genen) oder von Resistenzgenen zu bestimmen.

3.3.5 Translation Im Verlauf der Translation wird die Basensequenz der mRNA in die Aminosäuresequenz der Proteine übersetzt. Während bei Eukaryontcn Transkription und Translation zu unterschiedlichen Zeiten an unterschiedlichen Orten (Zellkern und Zytoplasma) stattfinden, gehen beide Prozesse bei Prokaryonten ineinander über. Orte der Eiweißsynthese sind Multienzymkomplexe aus RNA und Proteinen, die sog. Ribosomen. An bestimmte Stellen der Ribosomen kön-

Abb. 3.21 Schematische Darstellung eines Promotor-Bereiches von Escherichia coli. Es sind die KonsensusSequenzen (-35-Region, -10-Region), das Startnukleotid für die mRNA, die Ribosomen-Bindungsstelle (Shine-Dalgarno-Sequenz, SD) und das Startcodon für den kodierenden Bereich dargestellt.

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Allgemeine Bakteriologie

nen nun mRNA-Moleküle und mit Aminosäuren beladcne Transfer-RNA-Moleküle binden, um die Translation zu initiieren. Innerhalb einer mRNA-Basensequenz sind jeweils Dreiergruppen von Nukleotiden (sog. Codons oder Tripletts) spezifisch für eine Aminosäure. Spiegelbildlich zu diesen Codons besitzen die tRNA-Moleküle sog. Anticodons, die mit den korrespondierenden Dreiersequenzen der mRNA paaren können. Die Tatsache, daß bestimmte Codons für nur eine Aminosäure kodieren, wird als genetischer Code bezeichnet. Mit wenigen Ausnahmen gilt der genetische Code universell, d.h. er ist für alle Lebewesen gültig. Bei Bakterien ist noch die Tatsache von Interesse, daß das Codon AUG (selten auch GUG), das für die Aminosäure Methionin kodiert, als Startcodon gilt (s. Abb. 3.21) und daß die Codons UAA, UAG, sowie UGA als Stoppsignale verwendet werden. Aufgrund der Tatsache, daß es zwar 21 Aminosäuren, aber (abzüglich der Stoppsignale) 61 mögliche Tripletts gibt, werden für bestimmte Aminosäuren mehrere Codons verwendet. Dieses Phänomen wird auch als „Degeneriertheit des genetischen Codes" bezeichnet. Der Gebrauch einzelner Codons („codon usage"') kann typisch für bestimmte Organismen sein. Der Translationsprozeß selbst läßt sich in die Phasen Initiation, Elongation und Tcrmination unterteilen. Nach erfolgter Eiweißsynthese kommt es zu einem Ablösen der neu synthetisierten Polypeptidkette sowie der tRNA- und der mRNA-Moleküle von den Ribosomen. Das Proteom

In Analogie zu den Begriffen Genom und Transkriptom wurde 1995 der Terminus „Proteom" eingeführt, der die Gesamtproteinkomposition eines Organismus beschreibt. Mit Hilfe neuer oder verbesserter Analyse- und Auswertungstechniken wie der zweidimensionalen Polyacrylamidgelelektrophorese (2D-Gele) und der Massenspektrometrie lassen sich Protein-Karten für einzelne Organismen erstellen (s. Abb. 3.20). So konnten für die 4405 E. coli K-12-ORFs mittlerweile 1600 Proteine durch ihre Position auf dem 2D-Gel erfaßt werden. Mittels Proteom-Analyse lassen sich Regulationskaskaden bestimmen, die Quantität einzelner Proteine kann studiert werden, Effekte von Mutationen können analysiert und posttranslationelle Modifizierungen können vorhergesagt werden.

3.3.6 Mutationen Mutationen werden definiert als sprunghafte, angerichtete Veränderungen der Nukleinsäuresequenz. Mutationen führen zu Veränderungen des Genotyps eines Organismus. Mutationen können, müssen aber nicht notwendig zu einer Änderung des Phänotyps, also zu einem neuen Merkmal führen. Generell gilt, daß die Mutationsbildung eine treibende Kraft der Evolution darstellt, da durch mutative Ereignisse immer wieder neue Varianten eines Merkmals herausgebildet werden können, die dann der Selektion unterliegen. Dies gilt letztlich auch für Virulenz-assoziierte Gene, die durch Punktmutationen eine Veränderung erfahren können und die so für funktioneil unterschiedliche Produkte kodieren können. Unterschiedliche mutative Formen eines Gens werden auch als Allele bezeichnet, wobei zwischen dem Ausgangsgen, dem Wildtyp-Allel und dem Mutanten-Allel unterschieden werden muß. Verschiedene Allele eines Gens führen zu einem genetischen Polymorphismus. Mutationen können spontan auftreten, wobei die Mutationsrate (mutatives Ereignis in einem Gen, in einer Generation) bei Bakterien zwischen 10 6 bis 10""' liegen kann. Daneben können Mutationen auch durch verschiedene mutagene Substanzen induziert werden. Zu diesen Mutagenen gehören desaminierende Substanzen wie salpetrige Säure sowie alkylierende Verbindungen wie Älhylmethansulfonat (EMS) oder N-Mcthyl-N-Nitro-Nitroso-Guanidin (MNNG). Auch Farbstoffe wie Akridinorange und ionisierende Strahlen (Röntgenstrahlen, Gamma-Strahlen) können Mutationen auslösen. Die mutative Wirkung einzelner chemischer Verbindungen oder Strahlen kann mit Hilfe des bakteriologischen Arnes-Tests analysiert werden. Aufgrund der Veränderungen der Basensequenz eines Gens können unterschiedliche Typen von Mutationen unterschieden werden (Abb. 3.22). Erfolgt bei einer Mutation der Austausch einer Purinbase durch eine andere (oder einer Pyrimidinbase durch eine andere), so spricht man von Transitionen. Im Gegensatz dazu sind Transver-

sionen Austausche von Purinbasen gegen Pyrimidinbasen oder umgekehrt. Bedingt durch die Degeneriertheit des genetischen Codes müssen Austausche von einzelnen Basen, die als Punktmutationen bezeichnet werden, nicht in jedem Falle eine Änderung der Aminosäuresequenz nach sich ziehen. Der Austausch von Basen, die in dritter Position eines Codons stehen, führt

3.3 Genetik der Bakterien

zwar zur Änderung der Nukleotidsequenz, diese Änderung muß aber nicht notwendigerweise zur Aminosäuresequenzänderung führen. Bleibt die Aminosäuresequenz konstant, so wird diese Mutation als „neutral" bezeichnet. Bei echten Punktmutationen kommt es dagegen zu Veränderungen der kodierenden Nukleotidsequenzen und zur Entstehung neuer Proteinvarianten. Dabei kann es sich um „missense"-Mutationen handeln, die durch einen Nukleotidaustausch zu einem veränderten Protein führen. Bei „nonsense"-Mutationen wird dagegen ein neues Stopcodon generiert, das zu einem Abbruch der Proteinbiosynthese führt. Darüber hinaus sind Änderungen des Leserahmens (sog. Raster- oder „irame shift"-Mutationen) bekannt, bei denen es zur Insertion oder Deletion von Basen kommt. Durch diese Mutationen können völlig neue Proteine oder verkürzte Polypeptide entstehen. Punktmutationen können auch zu einer Änderung der Basensequenz von virulenzassoziierten Genen bei Mikroorganismen und damit zu funktionell veränderten Proteinen führen. Eine große Rolle spielen solche Mutationen bei Viren, etwa beim Auftreten von Resistenzen gegenüber antiviralcn Substanzen (z.B. ProtcaseInhibitor-Resistenzen bei HIV). Auch die Expression bestimmter bakterieller Virulenzgene, etwa von Membranproteinen bei N. gonorrhoeae kann auf "frame shiff'-Mutationen und dadurch bedingter Expression bzw. Nicht-Expression des entsprechenden Gens zurückzuführen sein. Mit Hilfe neuer molekularbiologischer Verfahren ist es möglich, die Sequenzen einzelner Gene gezielt zu verändern („site directed mutagenesis"), um so den Einfluß bestimmter Aminosäuremotive oder Domänen auf die Funktion von Proteinen zu untersuchen. Mutationen müssen nicht in jedem Fall zu Änderungen von Mcrkmalskomplexen führen. Neben den „neutralen"' Mutationen werden gelegentlich echte Reversionen beobachtet, bei denen es zu Rückmutationen zum Wildtyp-Allel gekommen ist. Daneben sind Suppressionen bekannt, in deren Verlauf eine zweite Mutation die erste mutative Veränderung ausgleicht. Als „Gegenspieler" der Mutationsfähigkeit haben sich im Laufe der Evolution Reparaturmechanismen herausgebildet, die in der Lage sind, DNASchäden zu erkennen und zu beheben. Einmal ist hier die Photoreaktivierung bekannt, in deren Verlauf unter Einwirkung von Licht Pyrimidin-Dimere, die durch UV-Einwirkung entstanden sein können, gespalten werden. Im Zuge der Dunkelreaktivierung werden schadhafte DNA-Bereiche enzymatisch eliminiert und durch neu synthetisierte Abschnitte ersetzt.

Transpositionen Transpositionen stellen eine besondere Form von Mutationen dar, bei denen ein „springendes

Abb. 3.22 Darstellung verschiedener Typen von Punktmutationen (verändert nach KNIPPERS, 1997).

Gen" (Insertionssequenz, Transposon) in eine definierte Ziel („target")-Sequenz des Genoms inseriert. Durch diese Transpositionsereignisse können Gene inaktiviert, aktiviert, deletiert oder amplifiziert werden. Das einfachste springende Gen stellt die Insertionssequenz (IS; auch IS-Element) dar. Wie in Abb. 3.23 dargestellt, wird von einem IS-Elemcnt das Enzym Transposase kodiert, das den Transpositionsvorgang selbst katalysiert. Die „inverted repeats" an den Enden des IS-Elementes interagieren während des Transpositionsvorganges mit der TargetDNA-Sequenz im Genom. Neben den IS-Elementen sind auch etwas komplizierter aufgebaute genetische Elemente, die Transposons in der Lage, zu transponieren. Transposons tragen neben der genetischen Information, die für die Transposition verantwortlich ist, zusätzliche Gene, meistens solche, die Resistenzen gegen Antibiotika determinieren. Insofern spielen Transposons eine wichtige Rolle bei der Entstehung und Ausbreitung von Antibiotika-resistenten Krankheitserregern. Man unterscheidet „zusammengesetzte" Transposons (Klasse-I-Transposons), die an den Rändern jeweils identische oder sehr ähnliche IS-Elemente tragen, von „einfachen" Transposons, an deren Enden „inverted repeats" lokalisert sind (s. Abb. 3.23). Darüberhinaus sind konjugative Transposons bekannt, die neben der Transposition auch die Fähigkeit zur konjugativen Übertragung zeigen. Integrons als eine besondere Form von transponierbaren Elementen stellen kom-

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Allgemeine Bakteriologie

Abb. 3.23 Struktur von ISElementen und Transposons. Abkürzungen: tnpA, Transponase-Cen; res, Resolvase site; tnpR, Resolvase-Cen; kan, Kanamycin-Resistenzgen; str, Streptomycin-Resistenzgen; bleo, Bleomycin-Resistenzgen; bla, E-Laktamase; die oberen Pfeile geben die Transkriptionsrichtung von Genen an, die unteren Pfeile stellen IR (inverted repeats) dar.

plexe genetische Gebilde dar, die eine eigene TargetScqucnz und ein Gen, das für eine spezifische Integrase kodiert, tragen, [ntegrons können so bestimmte Gene, insbesondere Resistenzgene, „sammeln" und übertragen. Transposons werden in der Molekulargenetik u.a. verwendet, um mittels Transposonmutagenese Gene von Bakterien zu inaktivieren und dann funktional zu studieren.

3.3.7 Rekombination und Gentransfer Neben dem Auftreten von Mutationen sind Rekombinationsereignisse eine weitere Möglichkeit der Veränderung von genetischem Material von Bakterien. Dabei kommt es zu einem physikalischen Austausch von Nukleinsäure (meist DNA) an einem bestimmten Ort des Genoms. Bei der homologen Rekombination treten Austauschprozesse an Orten gleicher oder ähnlicher (homologer) DNA-Sequenzen auf. Rekombinationsprozesse spielen eine Schlüsselrolle bei der Variation wichtiger Virulenzeigenschaften pathogener Mikroorganismen. Im Verlaufe dieser Prozesse können sich Oberflächenmoleküle der Mikroorganismen (Kapseln, Fimbrien, Membranproteine) schnell hinsichtlich Expression bzw. Nicht-Expression (Phasenvariation) oder hinsichtlich der Struktur der exprimierten Varianten (antigene Variation) ändern. Diese Variationsprozesse können eine enorme pathogenetische Bedeutung haben. Oftmals beruhen Rekombinationen auf der Übertragung von Nukleinsäuren, wobei DNA

von einem Spenderorganismus (Donor) auf einen Empfänger (Rezipient oder Akzeptor) transferiert wird. Bei Genübertragungen zwischen unterschiedlichen Stämmen oder zwischen Vertretern verschiedener Arten spricht man auch von „horizontalem Gentransfer". Im Gegensatz zu dem Prozeß der Meiose bei Eukaryonten, der mit einer Neukombination von genetischem Material verbunden ist und häufig mit sexueller Paarung einhergeht, spricht man bei Bakterien von „parasexuellen Prozessen". Zu diesen genetischen Austauschprozessen bei Bakterien zählen die Transformation, die Transduktion und die Konjugation. Die Entwicklung der Bakteriengenetik als eigenständige wissenschaftliche Disziplin war eng verbunden mit der Aufklärung dieser parasexuellen Prozesse von Prokaryonten und mit der Ausnutzung dieser Vorgänge für das experimentelle Arbeiten im Labor. Transformation Unter Transformation wird die Übertragung von „nackter" DNA in Bakterien verstanden (Abb. 3.24). Zum erfolgreichen Ablauf einer Transformation ist es notwendig, daß die Empfängerzelle in einem kompetenten Zustand vorliegt, d.h. die Zellwand des Rezipienten muß permeabel für fremde DNA sein. Nach der Aufnahme der fremden DNA kommt es zu Rekombinationsprozessen, in deren Verlauf die aufgenommene Nukleinsäure in das Empfängergenom integrieren kann.

3.3 Genetik der Bakterien

Abb. 3.24 Möglichkeiten des Gentransfers bei Bakterien, a) Transformation, b) Transduktion, c) Konjugation.

Bei gram-negativen Bakterien wird ein derartiger kompetenter Zustand u.a. durch Behandlung der Zellen mit CaCl2 erreicht. Neuerdings können Bakterien auch durch das Ausnutzen elektischer Felder (Elektroporation) in einen kompetenten Zustand versetzt werden. Eine Reihe von Bakterien, u.a. Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae oder Streptococcus pneumoniae liegen jedoch in einem Zustand der natürlichen Kompetenz vor. Die biologische Bedeutung dieser natürlichen Kompetenzstadien mag darin liegen, daß so eine größtmögliche Variabilität bestimmter genetischer Merkmale, etwa die Ausbildung unterschiedlicher Formen von Zeliwandanhängseln (Pili) bei N. gonorrhoeae oder die Expression der Penicillinresistenz bei Pneumokokken erreicht wird. Als Sonderform der Transformation gilt die Transfektion, in deren Folge Bakteriophagen-DNA in Bakterien transferiert wird. Die Transformation hat sich in den vergangenen Jahren zu einer Standardmethode entwickelt, um neurekombinierte DNA in Zellen zu übertragen; sie ist damit eine grundlegende Methode der modernen Molekularbiologie und der Gentechnologie. Transduktion

Bei der Transduktion als zweiter Möglichkeit des Gentransfers bei Bakterien kommt es

zur Übertragung von bakterieller DNA durch Bakteriophagen (s. Abb. 3.24). Bakteriophagen sind Viren, die Bakterien als Wirtszellen verwenden. Die meisten Bakteriophagen, beispielsweise die E.coli-Phagen T4 besitzen DNA als genetisches Material, einige Phagen wie MS2 oder Qß enthalten jedoch RNA-Moleküle. Bakteriophagen sind in der Lage, sich durch einen lytischen oder einen lysogenen Zyklus zu vermehren. Während des lytischen Zyklus adsorbieren Bakteriophagen an spezifische Rezeptoren der Bakterienoberfläche. Danach entlassen die Bakteriophagen ihre Nukleinsäure, meist DNA, in das Zytoplasma der Bakterien. Innerhalb kurzer Zeit kommt es zu einem „Umschalten" des bakteriellen Stoffwechsels auf die Bedürfnisse der Phagen. Es werden Strukturproteine der Phagen gebildet und nach Lyse der Bakterienzellwand werden einige hundert Phagenpartikel abgegeben, die jetzt ihrerseits neue Wirtsbakterien befallen können. Allerdings kann die DNA der Bakteriophagen auch in das Bakterienchromosom integrieren. Man spricht dann von temperenten Phagen oder Prophagen; die Weitergabe der phagenspezifischen Nukleinsäure von einer Bakteriengeneration auf die nächste erfolgt dann durch Replikation des Chromosoms (lysogener Zyklus). Die Phagen-DNA kann aber auch aus dem Chromosom herausgeschnitten werden, wobei dann der lytische Zyklus neu eingeleitet wird.

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Allgemeine Bakteriologie

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Tab. 3.6 Bakteriopha-

Mikroorganismus

Gensymbol

Toxin

Vibrio cholerae

ctx

Cholera Toxin

E. coli (EHEC)

stx

Shiga Toxin

Corynebacterium diphtheriae Clostridium botulinum Streptococcus pyogenes

dtx botC, botD speA, speC

Diphtherie Toxin ßotulinum-Neurotoxine C,D Erythrogene Toxine

Staphylococcus aureus

entk

Enterotoxin A

gen-kodierte Toxine

Dieses Ereignis kann durch spezifische Umweltsignale induziert werden.

Bei der Exzision von Prophagen aus dem bakteriellen Chromosom können auch der PhagenDNA benachbarte chromosomale Sequenzen mitgenommen und auf andere Bakterienstämme übertragen werden. Dieser Vorgang wird als Transduktion bezeichnet. Bei bestimmten Phagen wie dem E. co/z'-Phagen X. werden immer die gleichen chromosomalen Gene transduzierl, da der Phage immer an einer bestimmten Stelle des Chromosoms integriert (spezielle Transduktion). Andere Bakteriophagen, wie der E. coliPhage Pl , sind in der Lage, zufällig an unterschiedliche Stellen des Chromosoms zu integrieren. Somit kann dieser Phage potentiell alle Bereiche des Chromosoms auf andere Stämme

übertragen (allgemeine Transduktion). Interessanterweisc sind viele Toxin-Genc. darunter solche, die für sehr potente Bakteriengifte kodieren (s. Tab. 3.6), Teile von BaktcriophagenDNA. Diese Toxin-Gene können auch Iransduktiv übertragen und in das bakterielle Genom integriert werden. Plasmide

Die dritte Form des Gentransfers bei Bakterien, die Konjugation, ist an die Präsenz von Plasnüden gekoppelt. Plasmide sind extrachromosomal sich autonom replizierende DNA-Moleküle, die sich stabil in Bakterien etablieren können. Sie haben eine Größe von 1,5 kb bis zu 500 kb und liegen meist in der CCC („circular covalcnt clo-

Abb. 3.25 Schema eines transferablen Resistenz-Plasmides mit Transposon und Integron. Abkürzungen: Tra-Region, Transfer-Region; rep, Replikationsregion; ine, Inkompatibilitätsregion; sull, Sulfonamid-Resistenz-Cen; IR, „inverted repeats" (nach LENCELER et al., 1999).

3.3 Genetik der Bakterien

sed") Form vor. Plasmide können in einigen Spezies (u.a. Borrelia) aber auch durch lineare DNA-Moleküle repräsentiert werden. Plasmide sind in 1 bis 100 Kopien in der Zelle vorhanden. Größere Plasmide sind oftmals durch Konjugation transferierbar. Das Modell eines TransferPlasmides ist in Abb. 3.25 dargestellt. Neben den Genen für Transfer und Replikation tragen viele dieser Plasmide ein ine- („incompatibility") Gen, dessen Produkt die gemeinsame Replikation von zwei Plasmiden derselben /«c-Gruppe in einer Zelle verhindert. Plasmide können eine Reihe von „zusätzlichen" Genen tragen, die bei Krankheitserregern eine große Bedeutung für das Infeküonsgeschchen haben. Zum einen sind Resistenz (R)-Plasmide bekannt, die oft mehrere Antibiotika-Resistenzen vermitteln. Die Resistenzgene können wiederum auf Transposons oder Integrons lokalisiert sein, wie dies in Abb. 3.25 dargestellt ist. Die oftmals über Artgrenzen hinweg beobachtete Übertragung von Multiresistenz-Plasmiden ist ein großes Problem in der klinischen Mikrobiologie. Darüberhinaus können auch virulenzassoziicrtc Gene auf Plasmiden vorkommen. Wie in Tabelle 3.7 dargestellt, können dies Gene sein, die für Adhäsinc, Toxine, lnvasine oder Eisenaufnahmesystemc kodieren und deren Produkte direkt zur Pathogenität der Erreger beitragen. Bei den jetzt häufig beschriebenen chromosomal kodierten „Pathogenitätsinseln" kann es

sich auch um integrierte und mutativ veränderte Plasmide handeln. Darüber hinaus können Plasmidc für eine Reihe von weiteren Funktionen kodieren (s.Tab. 3.7) von denen die Bakteriocine ebenfalls eine Bedeutung für die Medizinische Mikrobiologie haben können. Mit Hilfe der Bakleriocine können Bakterien sensitive Vertreter der eigenen Art abtöten und so einen Wachstumsvorteil in einer Bakterienpopulation erlangen.

Konjugation Zur Konjugation sind nur Bakterien befähigt, die transferierbare oder mobilisierbare Plasmi-

de tragen. Die tra+ Gene dieser Plasmide kodieren u.a. für „Sex-Pili". Diese Pili stellen Zellwandanhängsel von ca. 5 nm Dicke und 2 um Länge dar. Sie sind in der Lage, Rezeptoren auf anderen, nicht plasmidtragenden Zellen zu erkennen. Nach Kontaktaufnahme von Pili und Rezeptor kann der Konjugationsvorgang beginnen. Während der Konjugation kommt es wahrscheinlich zu einem kurzzeitigen Verschmelzen der Zellwände beider Konjugationspartner und zur Übertragung eines Stranges der PlasmidDNA. Nach Replikation dieser Kopie in der Empfängerzellc etabliert sich das übertragene Plasmid im Rezipienten (s. Abb. 3.24).

Plasmid-kodierte Funktion

Beispiel

Mikroorganismus

Konjugation

F-Plasmid, verschiedene Plasmide

E. coli, verschiedene Bakterien

Antibiotika-Resistenz

R-Plasmide

verschiedene Bakterien

Antibiotika-Produktion

verschiedene Plasmide

Streptomyceten

Bacteriocin-Produktion

Col-Plasmide

E. colii

Physiologische Funktionen

Nif-Plasmid Deg-Plasmide Lac-Plasmide

Rhizobien

Virulenzfaktoren Toxine Adhäsine lnvasine Eisenaufnahme

Enterotoxin-Plasmid Cytolysin-Plasmid Tetanustoxin-Plasmid K88-, K99-, CFA-Plasmid Yop-Plasmid Ipa-Plasmid Spv-Plasmid Aerobactin-Plasmid

E. coli Enterococcus faecalis Clostridium tetani E. coli Yersinia spp. Shigella spp. Salmonella spp. E. coli

DNA-Transfer

Ti-Plasmid

Agrobacterium tumefaciens

Tab. 3.7 Plasmid-Typen

Pseudomonas

Enterobakterien

191

192

Allgemeine Bakteriologie

Besonders gut sind die Konjugationsprozesse bei F-Plasmid-tragenden (F für „Fertilitäf'J E.coli-Stämmen untersucht; ähnliche Phänomene werden jedoch auch durch andere Plasmide induziert und sind bei einer Reihe von pathogenen Bakterien bekannt. Neben der direkten Übertragung von Plasmiden sind durch Konjugation auch Bereiche des Bakterienchromosoms von Zelle zu Zelle transferierbar. In diesen Fällen müssen die Plasmide in das Chromosom integriert sein. Bei derartigen Hfr-Stämmen („high frequency of recombination") werden dann mit Teilen des Plasmides auch angrenzende Bereiche des Donorchromosoms in den Rezipienten übertragen. Die übertragenen Sequenzen können durch Rekombinationsereignisse in das Empfängerchromosom integrieren. Nach HfrTransfer von F-Plasmiden und angrenzenden chromosomalen Donorsequenzen kann es auch zur Bildung von sog. F' (prime)-Plasmiden kommen. F'-Plasmide bestehen aus F-Plasmiden und Genen des Spenderchromosoms. Sie entstehen, wenn es nach Hfr-Transfer nicht zu einer Integration von Donor-DNA in das Rezipientenchromosom kommt, sondern wenn F-Plasmid und übertragene benachbarte Donorsequenzen im Rezipienten zyklisieren und so ein neues extrachromosomales Element - das F'-Plasmid bilden, das nun seinerseits transferabel ist. Experimente mit Hfr-Stämmen und F'-Plasmiden werden in der Bakteriengenetik u.a. durchgeführt, um Genkarten von Chromosomen unterschiedlicher Bakterien zu erstellen („chromosomal mapping").

3.3.8 Restriktion und Modifikation Im Zusammenhang mit Gentransfer und Rekombinationsereignissen bei Bakterien spielen Restriktions- und Modifikationsprozesse eine Rolle. Bakterien synthetisieren artspezifisch, in Ausnahmefällen stammspezifisch Enzyme, die als Restriktionsendonukleasen bezeichnet werden. Diese Enzyme, die als grundlegende Werkzeuge der Gentechnik große Bedeutung erlangt haben, schneiden DNA-Moleküle an bestimmten Nukleotidabfolgen. Häufig zeigt jedoch die homologe DNA eines Bakteriums oder eines Phagen an diesen Target-Sequenzen Methylierungen, die von Modifikationsenzymen determiniert werden. Ein bestimmtes Methylierungsmusler der DNA kann charakteristisch für eine bestimmte Spezies sein, es schützt die homologe Nukleinsäure vor dem Abbau durch die eigenen

Endonukleasen. Fremde, beispielsweise durch Gentransfer eingeführte DNA, die nicht methyliert ist oder die an anderen Stellen Methylgruppen trägt als die eigene DNA, kann dem Restriktionsprozeß unterworfen sein und somit abgebaut werden.

3.3.9 Genetische Regulationsmechanismen Die meisten Gene von Bakterien werden nicht ständig exprimiert, sondern über fein abgestimmte Mechanismen in ihrer Aktivität reguliert. Signale für die Genregulation sind häufig Umweltfaktoren wie Temperatur, lonenstärkc, Osmolarität oder die Zusammensetzung des Nährmediums. Einige Gene tragen zwischen ihren Promotoren und dem Startcodon der entsprechenden Gene (ATG) eine DNA Sequenz, die als Operator bezeichnet wird (Abb. 3.26). An diese Sequenz können Proteine binden, die als Repressoren bezeichnet werden. Besetzt ein Repressor-Protein die Operator-Sequenz, so wird die RNA-Polymerase bei ihrer Bindung an die DNA massiv behindert, so daß eine effektive Transkription nicht möglich ist. Durch die Wirkung eines Repressors wird das entsprechende Gen „negativ" reguliert. Häufig sind die Repressor-Moleküle jedoch nur aktiv, wenn sie ihrerseits an einen Co-Repressor binden. Andererseits können sog. Induktoren Repressoren daran hindern, an die jeweilige Operatorsequenz zu binden. Im Falle des Tryptophan (frp)-Operons beispielsweise kann der Repressor die Aminosäure Tryptophan als Co-Repressor binden; erst nach dieser Bindung kommt es zu einer Interaktion zwischen Repressor und Operator und damit zu einer Repression des IrpOperons. Durch diesen Mechanismus ist sichergestellt, daß das Gen nur bei entsprechendem Bedarf (Tryptophan-Mangel) aktiv ist. Gene, die für Enzyme des Synthesestoffwechsels kodieren, werden häufig durch die entsprechenden Endprodukte in ihrer Aktivität reguliert. Aber auch Gene, die eine Bedeutung für die Pathogenität von Bakterien haben, können durch CoRepressoren negativ reguliert werden. Ein Beispiel dafür ist das Für („ferric uptake regulator")-Protein. das Bedeutung für die Regulation von Eisenaufnahmesystemen, aber auch von anderen Virulenzfaktoren wie Toxinen hat. Als Co-Repressoren binden Fc2~-Ionen an das Fur-Protein, das dann die entsprechenden Gene blockiert. Bei Eisenmangel wiederum werden die Fur-regulierten Gene aktiv, da unbeladene FurProteine nicht an die Promotorbereiche binden können. Im Gegensatz zu diesen Beispielen werden Gene, deren Produkte am Zellkatabolismus teilhaben, oft von

3.3 Genetik der Bakterien

Abb. 3.26 Darstellung genetischer Regulationsmechanismen.

Verbindungen, die durch die Genprodukte umgesetzt werden, induziert. Dies geschieht im Falle des Laktose (Znc)-Operons. Das Hauptgenprodukt des lac-Operons, das Enzym ß-Galaktosidase, spaltet das Disacharid Laktose in Galaktose und Glukose. Das lacOperon wird jedoch nur transkribiert, wenn der LacRepressor durch ein Laktose-Derivat, das als Induktor wirkt, gebunden wird. In diesem Fall ist der Repressor nicht mehr in der Lage, an die Operatorsequenz zu binden, um die Transkription des /oc-Operons zu inhibieren. Das Enzym ß-Galaktosidase wird dann produziert.

Neben diesen „negativen", durch Repressoren beeinflußten Regulationsmechanismen sind auch Beispiele für eine „positive" Regulation bakterieller Gene bekannt. In diesen Fällen bindet ein sog. Aktivator meist „stromaufwärts" („upstream") von der Promotorregion an die DNA, um die Bindung der RNA-Polymerase an die Konsensus-Sequenzen zu unterstützen. In der Nähe der Promotorregion des /ac-Operons bindet beispielsweise der Crp („catabolite repression protein")-Faktor, der so die Transkription unterstützt. Interessanterweise ist das Crp-Molekül nur aktiv, wenn als Co-Faktor ein Molekül zyklisches AMP (cAMP) gebunden wird. Der cAMP-Spiegel wiederum sinkt drastisch, wenn Glukose im Medium vorhanden ist, so daß hier eine weitere, durch Umweltfaktoren determinierte Regulationsebene realisiert ist. Auch andere genetische Determinanten wie das Arabinoscopcron werden durch Aktivatoren reguliert. Derartige Aktivierungen sind auch für Gene bekannt, deren Produkte eine Rolle in der Pathogenität von Bakterien spielen.

Repression und Aktivierung von Genen spielen auch eine bedeutende Rolle bei Regulationsereignissen, die durch das „Zwei-Komponenten-

Modell" beschrieben werden können. Gene, die durch ein „Zwei-Komponenten-Modell" reguliert werden, unterliegen einer strikten Umweltkontrolle, die in der Regel über zwei Kontrollproteine, dem „Sensor" und dem „Receiver" ausgeübt wird. Das Schema eines „Zwei-Komponenten-Modells" ist in Abb. 3.27 dargestellt. Bei dem sog. „Sensor-Protein" handelt es sich um ein Membranprotein, dessen N-Terminus ins Periplasma reicht und das hier bestimmte Umwcltsignale wie Osmolarität oder Temperatur aufnimmt. Die Sensor-Proteine sind Histidinkinasen. Sie sind in der Lage, unter bestimmten äußeren Bedingungen (Signal) Autophosphorylierungen durchzuführen. Die Phosphatgruppen werden dann an sog. „Receiver-Proteine" weitergegeben, hier kommt es zu einer Phosphorylierung von Aspartatresten. Die Receiver-Proteine stellen ihrerseits DNA-Bindungsproteinc dar, die direkt mit der DNA interagieren und so die Aktivität bestimmter Operons dirigieren. Die Fähigkeit der Regulator-Proteine, an DNA zu binden, ist wiederum direkt abhängig von ihrer Phosphorylierung, so daß ein Signaltransfer von Umweltparametern auf die Aktivität bestimmter Gene möglich wird. Als klassisches Beispiel für die „Zwei-Komponenten"-Regulation gelten die äußeren Membranproteine OmpC und OmpF, die bei pathogenen Enterobakterien zur Virulenz beitragen können. Sie werden durch den Sensor EnvZ und den Receiver OmpE reguliert. Diese Regulatoren reagieren auf Änderungen der Osmolarität. Auch andere Virulcnz-assoziierte Gene bei Salmonellen, Bordetella pertussis, Vibrio cholerae und anderen pathogenen Organismen unterliegen einer Kontrolle durch „Zwei-Komponenten-Systeme". Ein ebenfalls häufig bei pathogenen Bakterien realisiertes Regulationsprinzip ist das des „Quorum sensing". Dabei werden von Bakterien kleine Moleküle (bei gram-negativen Bakterien häufig Homoscrin-Lakton-Derivate) produziert, die wiederum als Indukto-

193

194

Allgemeine Bakteriologie

Abb. 3.27 Schema eines ZweiKomponenten-Regulationssystems. a) Darstellung von Sensor- und Regulator-Molekülen b) Signalübertragung (nach HACKER und HEESEMANN, 1999).

ren von Operons fungieren können. Allerdings kommt es erst dann zu einer Induktion, wenn genügend große Mengen des Induktor produziert werden, d.h. wenn die Bakterienpopulation eine bestimmte Diehtc erreicht hat. Besonders gut untersucht ist das ..Quorum sensing"-System bei Pseudomonas aeruginosa. dem auch die Regulation von Toxingcnen unterliegt.

3.3.10 Grundlagen der Gentechnik Bei der Gentechnik handelt es sich um ein Methodenspektrum, mit dessen Hilfe Gene isoliert und neu rekombiniert (kloniert) werden können. Die „klassische"' Mikrobengenetik, die Mikrobiologie und die Biochemie haben mit der Identifizierung von Plasmiden, der Entdeckung entsprechender Enzyme (Restriktionsendonukleasen, Ligasen) und der Etablierung von Transfermethoden diese Technologie erst möglich gemacht. Wie in Abb. 3.28 dargestellt, werden mittels gentechnischer Methoden Gene aus ihrem Genomverband heraus isoliert und in Vektor-Plasmide kloniert, die dann wiederum in verschiedene Organismen oder Zellen übertragen werden können. Somit können Gene und ihre Produkte isoliert analysiert werden. Gene können auch gezielt in Expressionsvektoren kloniert werden, um das Produkt in größerer Menge zu erhalten, eine Methode, die in der Biotechnologie vielfach zur Anwendung kommt. Mit Hilfe von „shuttleVektoren" können Gene dann auch in unterschiedliche Spezies übertragen werden. Reportergene wurden u.a. entwickelt, um die Aktivität von Promotoren zu bestimmen und die Lokalisation von Genprodukten in der Zelle zu studieren.

Molekulare Pathogenitätsforschung Eine Reihe von Fragen aus der Medizinischen Mikrobiologie konnte in den letzten Jahren durch die Anwendung von gentechnischen Methoden neu gestellt und teilweise beantwortet werden. Einige der dabei verwendeten Methoden sind in Tabelle 3.8 zusammengefaßt. Erstmals ist es mit Hilfe dieses neu etablierten molekularbiologischen Methodenbestecks möglich, Pathogenitätsfaktoren von Bakterien kausal zu analysieren. Zum einen können Pathogenitäts-assoziierte Gene kloniert und charakterisiert werden. Rekombinante Plasmide, die solche Gene tragen, können in nicht-virulente Bakterienstämme eingeführt werden, um den spezifischen Beitrag der entsprechenden Determinanten zur Virulenz der Stämme einschätzen zu können. Weiterhin ist es möglich, Pathogenitäts-assoziierte Gene, die auf dem Chromosom oder auf Plasmiden von Wildstämmen lokalisiert sind, durch Transposons oder durch die Einführung von spezifischen Mutationen zu inaktivieren und so isogenc, d.h. genetisch identische Stämme zu konstruieren, die nur in dem veränderten Locus differieren. Mit Hilfe dieser und ähnlicher Ansätze ist es gelungen, Pathogenitätsfaktoren verschiedener gram-negativer und gram-positiver Bakterien zu identifizieren und deren Gene zu charakterisieren. Durch die Methodik der DNA-Sequenzierung und eine anschließende ortsspezifische Mutagenese ergeben sich neue Möglichkeiten bei der Analyse von Struktur-Wirkungsbeziehungen verschiedener Pathogenitätsfaktoren. Mit Hilfe von neuen „Differenzmethoden" (RDA, mRNA-dd) ist es möglich, Gene bzw. Transkripte zu identifizieren, die spezifisch von pathogenen Vertretern einer Art oder einer Gattung gebildet werden. Die Analyse der korrespondierenden Loci

3.3 Genetik der Bakterien

Abb. 3.28 Das Prinzip der Cenklonierung; res, Resistenzgen; rep, Replikationsregion. eröffnet die Möglichkeit, neue virulenzassoziierte Gene nachzuweisen und die Wirkung der Produkte zu studieren. Neue /«-vj'vo-Expressionsysteme (DFI, IVET) bzw. Mutagenesestratcgien (STM) machen zunehmend die Identifizierung von mikrobiellen Faktoren möglich, die spezifisch nur während einer Infektion, also in vivo aktiv sind.

Gentechnik und Medizinische Mikrobiologie Auch für praktische Belange der Medizinischen Mikrobiologie spielen gentechnische Methoden heute eine wichtige Rolle. Einige der in Frage kommenden Verfahren sind in Tabelle 3.9 zu-

Tab. 3.8 Molekulargenetische Verfahren zur Analyse von pathogenen Mikroorganismen Verfahren

Anwendung

Transposonmutagenese, Mutantenanalyse

Identifizierung, Charakterisierung von Virulenzgenen

repräsentative Differenz-Analyse (RDA)

Identifizierung von Virulenzgenen

mRNA „differential display" (dd) differential fluorescence induetion (DFI) technology in vivo expression technology (IVET)

Identifizierung von Transkripten Identifizierung von in vivo aktiven Promotoren Identifizierung von in vivo exprimierten Genen

signature tagging mutagenesis (STM)

Identifizierung von in vivo essentiellen Cenprodukten

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196

Allgemeine Bakteriologie

Tab. 3.9 Molekulargenetische Verfahren in der Medizinischen Mikrobiologie Verfahren Anwendung Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE)

Analyse von Infektionsketten

arbitrary primed (AP) polymerase chain reaction (PCR) DNA-DNA-Hybridisierung (Sondentechnik), PCR, DNA-Sequenzierung

fluorescence based in situ hybridization (FISH) Herstellung rekombinanter Antigene

Analyse von Infektionsketten Nachweis von Erregern, Nachweis von Virulenzgenen, Nachweis von Resistenzgenen Einsatz bei serologischen Nachweisverfahren (ELISA) in situ Erregernachweis Subunit-Impfstoffentwicklung (z.B. HBV)

Herstellung attenuierter Bakterien oder Viren

Lebendimpfstoffentwicklung (z.B. V. cholerae)

Herstellung rekombinanter Proteine

sammengefaßt. So können Präparationen genomischer DNA unterschiedlicher BakterienStämme mit Hilfe von Restriktionsenzymen verdaut werden; die entstehenden DNA-Fragmente unterschiedlicher Größe werden dann im Agarosegel aufgetrennt. Der auftretende Rest riktions-Fragment länge n-Polymorphismus („restriction fragment length polymorphism",

RFLP) stellt dabei ein Kriterium für die Identifikation und die Zuordnung von Stämmen, beispielsweise innerhalb einer Infektionskette dar. In letzter Zeit wurde die Puls-Feld-Gelelektrophorese (PFGE) als eine wichtige Methode etabliert. Mit Hilfe selten schneidender Restriktionsendonukleasen werden relativ große DNAFragmente erzeugt, die in einem elektrischen Wechselfeld aufgetrennt werden können und so ein überschaubares, individuelles Bandenmuster für einzelne Stämme ergeben. Auch Variationen der Polymerasekettenreaktion („polymerase chain reaction" = PCR) lassen sich zur Analyse von Infektketten heranziehen. Für epidemiologische und krankenhaushygienische Fragestellungen, etwa bei der Einschätzung des pathogenen Potentials von Stämmen, aber auch für die medizinische Diagnostik hat sich die DNA-Sonden-Technik zu einem wichtigen molekularbiologischen Werkzeug entwickelt. Während einer DNA-DNA-Hybridisierung wird die DNA einzelner Bakterienstämme im Agarosegel aufgetrennt, die DNA-Fragmente werden dann auf eine Trägerfolie (Nitrozellulose, Nylon) transferiert und dort gebunden (SouTHKRN-Transfer). Es ist auch möglich, Bakterien direkt auf einer Folie anzuziehen und die DNA durch Lyse freizusetzen (DNA-DNA-Dot Technik). Nachdem die zu untersuchende DNA auf der Folie gebunden und behandelt wurde, wird eine bekannte, spezifische, mit einem radioaktiven oder

nicht-radioaktiven Nachweissystem markierte DNASonde eingesetzt, um auf der Folie durch Bindung der Sonde an homologe DNA-Bereiche bekannte Nukleotidsequenzen nachzuweisen. Mit Hilfe dieser Technik ist es möglich, die DNA unbekannter Stämme zu analysieren und bestimmte Gene zu identifizieren.

In der mikrobiologischen Diagnostik haben sich noch weitere Methoden fest etabliert. Mit Hilfe von neu synthetisierten Starter-Oligononukleotiden (primern) ist es möglich, unter Zuhilfenahme der Polymerase-Ketten-Reaktion DNA von pathogenen Bakterien anzureichern und zu analysieren. Die PCR-Technik wird vor allem zur Identifizierung von schwer kultivierbaren Bakterien (Mykobakterien, Chlamydien) aus Untersuchungsmaterial verwendet. Darüber hinaus werden, bedingt durch die bessere Verfügbarkeit von DNA-Sequenzen, zunehmend DNASequenzierungen, z.B. von 16S rRNA-Genen, zur Identifizieung von Krankheitserregern herangezogen. Die 16S rRNA-Moleküle werden auch als Target-Strukturen bei der FISH-Technologie verwendet, um Infektionserreger im Gewebe in situ nachzuweisen. Weiterhin werden klonierte Gene, die bestimmte Antigene kodieren, verwendet, um reine und hochspezifische Diagnostika herzustellen. Dies kann einmal in der Etablierung von spezifischen Nachweissystemen für Serumantikörper etwa im ELISA oder im Immuno-Blot bestehen, indem rekombinante Antigene als Detektionssystem verwendet werden. Weiterhin können rekombinante Proteine als Ausgangsmaterial für die Herstellung hochspezifischer polyklonaler oder monoklonaler Antikörper dienen, die in der mikrobiologischen Diagnostik eingesetzt werden können. Auch zur Herstellung von Impfstoffen wer-

3.4 Taxonomie der Bakterien

den zunehmend gentechnologische Verfahren eingesetzt. Dabei könen Antigene kloniert und Subunit-Vakzine in großer Menge rein hergestellt werden, wie das bei dem Impfstoff gegen Hepatitis-B-Viren der Fall ist. Auch die Konstruktion von Lebendimpfstoffen mittels gentechnischer Verfahren ist nunmehr möglich. Weitere Einsatzmöglichkeiten gentechnischer Verfahren werden sich vielleicht bald durch die Entwicklung von DNA-Impfstoffen ergeben. Literatur BERLYN, M.K.B.: Linkage Map of Escherichia coli K12, Edition 10: The traditional Map. Microb. Molec. Biol.Rev. 62, 814-984(1998). DORMAN, C. J.: Genctics of bacterial virulence. Blackwell Scientific Publications Oxford. 1994. F INLEY . B. AND S. F ALKOW : Common Themes in Microbial Pathogenicity Revisited. Microb. Molec. Biol. Rev. 61, 136-169 (1997). HACKER , J. AND J. H EESEMANN: Molekulare Infektionsbiologie. Spektrum-Verlag Heidelberg, 2000. KAPER , J. AND J. H ACKER (Eds.): Pathogenicity islands, plasmids and other mobile genetic elements. ASM Press, Washington DC. 1999. KNIPPERS , H.: Molekulare Genetik. Thiemc Verlag Stuttgart, New York, 7. Aufl. 1997. LENGELER, J., G. DREWS AND H. SCHLEGEL: Biology of the prokaryotes, Thieme Verlag, Stuttgart, New York, 1999. LEWIN. B.: Gene. Molekularbiologie der Gene. VCH Verlagsgesellschaft Weinheim. New York, Cambridge, 1998. NHIDHARDI, F. C.,R. CURTIS III. J. L. INGRAHAM, E. C. C. LIND , K. B. L OW, B. M AGASANIK , W. S. R E /. NI KOFF, M. RlLEY. M. SCIIAECHTER AND H. E. UM-

(Eds.): Escherichia coli and Salmonella. Cellular and molecular biology. 2nd cd. ASM Press, Washington D. C. 1996. SALYERS, A. A.: Bacterial pathogenesis. A molecular approach. ASM Press, Washington D. C. 1994. BARGER

3.4. Taxonomie der Bakterien WERNER KÖHLER

Zu den wichtigsten Aufgaben des Klinischen Mikrobiologen gehören die Isolierung und Identifizierung von Krankheitserregern. Die Ergebnisse sind dem behandelnden Arzt in einer allgemein verbindlichen Form mitzuteilen, es bedarf also einer einheitlichen Nomenklatur, deren Regeln für die Bakteriologie im „International Code of Nomenclature of Bacteria" geregelt ist.

Die Klassifizierung richtete sich ursprünglich nach morphologischen Eigenschaften (Kokken, Stäbchen, Spirillen usw.) und wurde durch physiologische Charakteristika (Vergärung von Kohlenhydraten und anderen Substanzen, Nährstoffanforderungen, Temperaturoptimum und vieles andere mehr), Gram-Reaktion, Beweglichkeit, Sporenbildung sowie chemotaxonomische Merkmale (Zcllwandzusammensetzung usw.) erweitert. Wie die Systematik der Tiere und Pflanzen folgt auch die Taxonomie der Bakterien einem hierarchischen Prinzip. Taxonomie und Systematik sind Synonyme, obwohl manche Autoren Unterschiede machen und die (mehr künstlich-nomenklatorische) Taxonomie als Teilgebiet der (natürlichen) Systematik betrachten. Die Lebewesen werden in drei Domänen ( Domain; „Ur-Reiche" nach WOESE; „Domain" ist derzeit der übergeordnete Begriff über „kingdom". Die Ordnungsbegriffe wurden entsprechend zunehmender Erkenntnisse in den letzten 10 Jahren sehr unterschiedlich angewandt) unterteilt: ƒ Bacteria • Archaea ƒ Eucarya

wobei Bacteria und Archaea Prokaryonten (kernlose Zellen), Tiere und Pflanzen (einschließlich Protophyten) Eukaryonten (Zellen mit Nukleus. Kernmembran und mehreren Chromosomen) sind. Die hierarchischen Ränge (Taxa, Singular: 7axon) sind für die Bakterien in Tab. 3.10 zusammengestellt. Die taxonomische Grundeinheit ist die Art (Species). Die Organismen einer Art sind einander in ihren morphologischen, physiologischen, biochemischen, serologischen und anderen untersuchten Eigenschaften in hohem Maße ähnlich. Absolut identisch sind nur Stämme, die aus einem Klon, d.h. aus einer einzelnen Zelle, hervorgegangen sind. Die Bestimmung eines Klons kann für epidemiologische Zwecke bedeutsam sein. So führen z.B. Stämme der Species Streptococcus pyogenes zum Streptokokken-bedingten toxischen Schock Syndrom. Bevorzugt werden dabei Stämme der Serotypen Ml und M3 gefunden, und es zeigte sich, daß ein Klon des Serotyps Ml besonders häufig war und sich über die ganze Welt verbreitet hat. Ähnliches gilt für andere Species. Species, die in wesentlichen Merkmalen übereinstimmen, werden zu einer Gattung (Genus, pl. Genera) zusammengefaßt, Gruppen ähnli-

197

Allgemeine Bakteriologie

198

Tab. 3.10 Taxa der Bakterien Taxon

lateinisch

englisch

Klasse

classis

class

Unterklasse Ordnung Unterordnung Familie Unterfamilie Stamm Unterstamm Gattung Art Unterart

subclassis ordo subordo familia subfamilia tribus subtribus genus species subspecies

subclass order suborder family subfamily tribe subtribe genus species subspecies

eher Genera zu einer Familie usw. bis in die höheren Ordnungen (s. Tab. 3.10). Der Code regelt die Nomenklatur nur bis zur Subspecies. Synonym von „Subspecies" ist - entgegen häufigem Gebrauch - „Varietät" (variety), ein Begriff, der nach geltenden Nomenklaturregeln nicht mehr gebraucht werden darf. Zur Bezeichnung infrasubspezifischer Ränge empfiehlt der Code trotzdem die Endsilbe „var", je nachdem, auf welcher Basis die jeweilige Gruppe definiert wurde. Häufig wird aber auch noch die Endung ,,-typ" verwandt, wie z.B. Ŷ Serovar/Serotyp: Antigene Eigenschaften Ŷ Biovar/Biotyp: Biochemische oder physiologische Eigenschaften Ŷ Chemovar/ Chemische ZusammensetChemotyp: zung (meist der Zellwand) Ŷ Phagovar/Lyso- Reaktionen gegenüber Baktyp oder teriophagen Phagentyp: Ŷ Pathovar/Patho- Besondere pathogene Eityp: genschaften, z.B. bei verschiedenen Tierarten Beachte: es muß heißen die Scrovar, die Phagovar, da von Varietät abgeleitet; meist wird fälschlich das Maskulinum gebraucht, das im Deutschen für Typ zutrifft und deshalb auch besser unser Sprachgefühl trifft.

Ein Bakterien-Stamm (engl. strain) ist eine Population weitgehend ähnlicher Zellen, die im Idealfall aus einer Zelle hervorgegangen ist (= Klon). Das gleiche gilt für einen Pilz-, Virusoder Protozoenstamm. In der Praxis geht ein Stamm bei der Isolierung aus klinischem Material oder bei der Weiterimpfung (Subkultivierung) aus mehreren Individuen hervor, z.B. bei Streptokokken aus den Zellen einer Streptokokken-

Wortendung

Beispiel

- ales - ineae - aceae —oideae - eae - ineae

Pseudomonadales Pseudomonadineae Pseudomonadaceae Pseudomonadoideae Pseudomonadeae Pseudomonadineae Pseudomonas Pseudomonas aeruginosa -

Kette. Selbst in einer Kolonie (mit ~109–1012 Zellen) finden sich meist einige Zellen mit biologischen Eigenschaften, die von der Mehrzahl der Zellen in der Population abweichen. Nach den Regeln des o.a. „International Code of Nomenclature of Bacteria" soll ein Typ-Stamm (type strain) in Reinkultur vorliegen, der in seinen Eigenschaften mit denen der Originalbeschrcibung weitgehend übereinstimmt. Numerische Taxonomie (ADANSONsche Taxo-

nomic): Numerisch taxonomische Untersuchungen, die zahlreiche physiologische, biochemische und ggf. serologische und morphologische Merkmale der zu untersuchenden Bakterienstämme gleichgewichtet miteinander vergleichen, sind heute nur noch für die Bearbeitung der mittels 16S rRNA-Vergleich als hochverwandt bekannten Organismen von praktischer Bedeutung. Genotypische (Molekulare) Taxonomie: Die Fortschritte molekularbiologischer Forschung haben auch die taxonomischen Untersuchungen beeinflußt. 765 rRNA-Basenvergleich: Die heutige Methode der Wahl für phylogenetische Untersuchungen ist der von WOESE eingeführte Vergleich der Basensequenzen der 16S ribosomalen RNA (16S rRNA). DNA-DNA-Hybridisierung: Dieses Verfahren berücksichtigt gleichfalls die Basensequenz. DNA-Einzelstränge von zwei zu untersuchenden Stämmen werden hybridisiert. Bei einer nachgewiesen Homologie weit über 70% wird angenommen, daß beide Stämme einer Species angehören. GC-Gehalt: Die Bestimmung des Verhältnisses von A - T zu G - C Basenpaaren der chromosomalen Bakterien-DNA, ausgedrückt in mol% GC ist heute nur noch von untergeordneter Bedeutung zum Nachweis von Verwandtschaften.

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie

Nomenklatur

Die Benennung der Bakterien folgt dem LINNEschen binären (oder binominalem) System, d.h. zur Kennzeichnung einer Bakterienart werden Gattungsname und Speziesbezeichnung angegeben (z.B. Escherichia coli, Streptococcus pyogenes). Der Gattungsname wird in der Regel abgekürzt und zwar mit seinem ersten Buchstaben (E. coli, S. pyogenes). Dem Einsender von Untersuchungsmaterial sollte zur Vermeidung von Irrtümern stets die volle Bezeichnung mitgeteilt werden, da es natürlich gleichartige Abkürzungen unterschiedlicher Bedeutung gibt (Staphylocoecus aureus, Streptococcus pyogenes = S. aureus, S. pyogenes). Bei Publikationen wird bei der erstmaligen Erwähnung der volle Name ausgeschrieben und dann abgekürzt. Neben den „offiziellen" Bakteriennamen existieren „Vulgärnamen", wie Tuberkelbaktericn, Typhusbazillen, Keuchhustenbakterium etc., die bei Bcfundübermittlungen nicht anzuwenden sind. Nach den Nomenklaturregeln wird bei wissenschaftlichen Veröffentlichungen nicht nur der Name von Gattung und Species angegeben, sondern auch der Name dessen, der die jetzt gültige Bezeichnung erstmals prägte. Dieser muß mit dem Entdecker des Keimes nicht identisch sein: der 1883 von Robert KOCH entdeckte Choleraerreger wird korrekt als Vibrio cholerae PACINI 1854 bezeichnet; der 1879 von Albert NEISSER entdeckte und 1885 von Ernst BUMM erstmals reingezüchtete Gonococcus: Neisseria gonorrhoeae (ZOPF 1885) TREVISAN 1885 und der 1884 von Friedrich LOEFFLF.R entdeckte Diphtherieerreger: Corynebacterium diphtheriae (KRUSE 1886) LEHMANN und NEUMANN 1896. Durch die fortschreitende Entwicklung molckularbiologischer Techniken ändern sich zwangsläufig Zuordnungen von Bakterien zu Genera oder höheren Taxa. Das hat zur Folge, daß sich auch die Namen ändern, für den behandelnden Arzt eine unerfreuliche, aber nicht zu vermeidende Entwicklung. So hat man z.B. vorgeschlagen (Oux 1992), alle Salmonellen. die man bisher als Species betrachtete (Salmonetla typhi, S. paralyphi B, S. typhimurium) in einer Art als Salmonella enterica zusammenzufassen und die mehr als 1000 bisherigen Arten als Serovare zu betrachten. Der Befund müßte dann lauten: Salmonella enterica spp. enterica Serovar typhi. Um dies zu vermeiden, wurde entgegen allen Nomcnklaturregeln vorgeschlagen, die Serovarbezeichnung mit einem Großbuchstaben zu beginnen: Salmonella Typhi. Unter Berücksichtigung der geltenden Nomenklaturregeln wurde dieser Vorschlag von der Judicial Commission eindeutig zurückgewiesen: „Salmonella enterica has no Standing in nomenclature". Dennoch wird in der Literatur von dieser Schreibweise zunehmend Gebrauch gemacht und man muß mit diesen Formulierungen vertraut sein.

Bei einer Änderung der Nomenklatur sollten dem einsendenden Arzt über eine längere Zeit beide Benennungen, die alte und die neue, mitgeteilt werden, damit er nicht durch neue Bezeichnungen, die er z.B. in der Literatur findet, verwirrt wird. Sämtliche bekannten Species der Prokaryonten sind gemäß dem jeweiligen Stand des Wissens in Bergey's Manual of Systematic ßacteriology zusammengefaßt, Neubeschreibungen sollten im Journal of Systematic Bacteriology veröffentlicht werden. Bergey's Manual berücksichtigt in zunehmenden Maße auch genotypische Merkmale. Trotz meist dichotomer Schlüssel kann sich die Artidentifizierung in bestimmten Gattungen als schwierig erweisen. Literatur BALOWS, A.. H. G. TRÜPER, M. DWORKIN and W. HÄRDER: The Prokaryotes. Springer, New York, 2. Aufl. 1992. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Ed. J. G. Holt). Williams & Wilkins, Baltimore, Vol. I 1984. Vol. II 1986, Vols. III und IV 1989. GOODFELLOW, M.. and A. G. O'DONNELL (Eds.): Handbook of New Bacterial Systematics. Academic Press, Orlando, FL 1993. International Code of Nomenclature of Bacteria (Bacteriological Code) (Ed. P. H. A. SNEATH), 1990 Revision. Amer. Soc. Microbiol., Washington, DC 1992. Old, D. C: Nomenclature of Salmonella. J. Med. Mikrobiol. 37. 361-363 (1992).

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie ADOLF BAUERNFEIND, GEORG PETERS

3.5.1 Definition und Abgrenzung Antimikrobielle Chemotherapie umfaßt die Behandlung mikrobiell verursachter Erkrankungen mit Arzneimitteln, die schon in geringen Konzentrationen das Wachstum von Mikroorganismen hemmen oder sie abtöten.

Dabei soll der Wirkstoff nicht mit Stoffwechselvorgängen oder Funktionen des Makroorganismus (Patienten) interferieren. Nach der Natur der Krankheitserreger werden antibakterielle, antivirale, antimykotische und antiparasitäre Chemotherapie unterschieden. Darunter ist die

199

200

Allgemeine Bakteriologie

antibakterielle Chemotherapie das umfangreichste und differenzierteste Teilgebiet. Das folgende Kapitel beschäftigt sich mit der Charakterisierung der antibaktericllen Chemotherapeutika. deren Grundlagen und ihrer klinisch-praktischen Anwendung. Die Darstellung der antituberkulotischen Chemotherapeutika erfolgt im Kapitel Mycobacteriaceue bzw. Tuberkulose.

3.5.2 Anfänge der antimikrobiellen Chemotherapie Die gezielte Suche nach antimikrobiellen Stoffen Anliseptika und Therapeutika - wurde erst nach der Entdeckung der Mikroorganismen als Ursache von Infektionen gegen Ende des vorigen Jahrhunderts möglich. So leitete Lord JOSEPH LISTER (1827-1912) von den Erkenntnissen Louis PASTEURS (1822-1895) über die Rolle von Bakterien und Sproßpilzen bei Fäulnis und Gärung sowie der Verbreitung von Mikroorganismen durch die Luft die Nützlichkeit des Phenols als Antiseptikum zur Vermeidung der postoperativen Septikämic her (1866). Trotz enormer Bakterizidie ist Phenol jedoch mit dem Nachteil fehlender Selektivität behaftet: seine Toxizität ist für eukaryontische Zellen mindestens ebenso groß wie für prokaryontische. Erst PAUL EHRLICH (1854-1915) hat die selektive Toxizität als Prinzip antimikrobieller Therapie in den chemotherapeutischen Index gefaßt: dem Verhältnis zwischen maximal tolerierter Dosis eines Chemotherapeutikums zu dessen minimaler kurativer Dosis. Zugleich gelang es ihm, dieses Prinzip am Beispiel der Chemotherapie der Syphilis in die Praxis umzusetzen: die bis dahin etablierte Therapie der Lues mit anorganischen Quecksilberpräparaten war mit schwersten Nebenwirkungen belastet. Demgegenüber zeigte das Präparat EH 606 in der Reihe der von PAUL EHRLICH erprobten organischen Arsenverbindungen, das Salvarsan. entscheidend verbesserte therapeutische Wirkung bei sehr viel geringerer Toxizität. Ein höheres Niveau der selektiven Toxizität als das mit anorganischen oder metallorganischen Verbindungen crziclbare ließ sich aber erst erreichen, als es gelang, Substanzen zu finden, welche spezifisch mikrobielle Stoffwechselvorgänge oder Strukturen treffen. Diese neue Ära der antimikrobiellen Chemotherapie begann mit der Beobachtung, daß Textilfarbstoffe. speziell die Sulfanilamid-Derivate der Di- und Triphenylmethan-Farbstoffe über eine antimikrobielle Wirkung verfügen. GERHARD DOMAGK (1895-1964) entdeckte eher zufällig, daß Prontosil (Sulfonamido-chrysoidin, ein Farbstoff für Seide und Wolle) Mäuse vor der Schlafkrankheit schützte, obwohl es in vitro keine erkennbare Wirkung auf die Trypanosomen hatte (1935). Damals wurde bereits das Pro-drug-Prinzip demonstriert: die Wirksubstanz wird erst im Organismus aus einer inaktiven Vorstufe freigesetzt. Von GERHARD DOMAGK wurde noch ein weiteres Grundphänomen der antimikrobiellen Chemotherapie aufgezeigt: die Fähigkeit von mikrobiellen Erregern, sich der Wirkung einer Chemotherapie durch Entwickeln von Re-

sistenzmechanismen (s.u., Sulfonamide) zu entziehen. Dieser Weg, antimikrobielle Stoffe durch Derivatisierung synthetischer organischer, metallfreier Moleküle zu entwickeln, setzte die traditionelle Linie der Chemotherapie - Therapie mit Chemikalien - fort. Parallel dazu lief eine zweite Entwicklungsrichtung der antiinfektiösen Therapie, die biologische. Das Phänomen, daß lebende Mikroorganismen oder Produkte derselben imstande sind, andere Mikroorganismen zu hemmen („La vie empeche la vie" - Louis PASTEUR), war bekannt und in Therapie umgesetzt worden (z.B. die Pyocyanase aus Pseudomonas aeruginosa). PAUL VUILLEMIN hatte 1889 den Begriff der Antibiose charakterisiert als einen Zustand, in dem ein Lebewesen in absolutem Gegensatz zu einem anderen steht. Am fruchtbarsten erwies sich die Beobachtung Sir ALEXANDER FLEMINGS (1881-1955), daß ein Stamm von Penicillium notutum ein Stoffwechselprodukt abgibt, welches bakterizid und bakteriolytisch insbesondere auf Kokken wirkt (1928). FLEMING befürchtete zunächst, daß die antibakterielle Wirkung therapeutisch nutzlos bleiben würde, falls zugleich der natürliche Abwehrmechanismus des Patienten beeinträchtigt würde. Erst sein Nachweis, daß Rohpenicillin ohne Wirkung auf Leukozyten blieb und seine antibakterielle Wirkung auch in Gegenwart von Blut und Gewebsflüssigkeit behielt, ließ ALEXANDER FLEMING an die Zukunft des Penicillins als Therapeulikum glauben. Penicillin wurde nach Überwinden der Probleme der Anreicherung, Reinigung und Großproduktion seit 1944 in die Therapie eingeführt.

3.5.3 Mikrobiologische Grundlagen Wirkungsmechanismen von Antibiotika Ziel der antibakteriellen Therapie ist die Beseitigung der Infektionsursache durch Hemmung der Vermehrung oder Abtöten des Erregers.

Dazu greifen Antibiotika möglichst selektiv in den bakteriellen Stoffwechsel ein. Angriffspunkte beim Erreger liegen in der Synthese von Peptidoglykan, Proteinen, Nukleinsäuren, Folsäurc bzw. der Struktur und Funktion der Zytopiasmamembran (vgl. Kap. 3.1). Hemmung der Peptidoglykansynthese (vgl. E-Laktame)

Peptidoglykan ist die formstabilisierende Schicht der bakteriellen Zellwand. Es legt sich netzförmig um die Zytoplasmamembran. Die Synthese des Peptidoglykans (s. Kap. 3.1.2) vollzieht sich in einer Serie von Einzelschritten, und zwar zunächst im Zytoplasma, im weiteren Verlauf an der definitiven Lokalisation des Peptidoglykans außerhalb des Zytoplasmas. Der Ablauf der Peptidoglykansynthese bietet verschiedene

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie

Angriffspunkte für Antibiotika. Sie alle hemmen letztlich die Fertigstellung des starren Peptidoglykannetzes. Die Hemmung der Peptidoglykansynthese allein, z. B. mit E-Laktam-Antibiotika, tötet die Zelle zumeist nicht ab, sie löst jedoch autolytische Vorgänge aus, die zum Zelltod führen. Dadurch wirken Antibiotika, welche in die Peptidoglykansynthese eingreifen, bakterizid. Dazu gehören alle Substanzen mit ß-Laktam-Ring und zusätzlich einige Verbindungen mit anderen chemischen Strukturen wie Cycloserin, Bacitracin, Vancomycin, Fosfomycin. Sie setzen in der Biosynthese des Peptidoglykans an unterschiedlichen Stufen ein. |i-l.uktiiiii-Antibiotika interferieren mit der letzten Phase der Peptidoglykansynthese. Zu diesem Zeitpunkt sind N-Acetylglukosamin und N-Acetylmuraminsäure bereits zum linearen Polymer verkettet. Die Ketten liegen schon außerhalb der Zytoplasmamembran am definitiven Ort, sie sind aber noch hydrophil und flexibel. Erst die Quervernetzung macht sie zum formgebenden mehrschichtigen Mureinsacculus. Dazu werden die Polysaccharidketten z. B. bei Escherichia coli über die Peptide aus alternierenden D- und L-Aminosäuren ihrer Muraminsäurereste verknüpft. Die Quervernetzung erfolgt über die Aminogruppe des Lysins oder der meso-Diaminopimelinsäure des einen und die Carboxylgruppe des D-Alanins des benachbarten Polysaccharidstranges. Bei Staphylococcus aureus werden die Stränge anders als bei E. coli durch Einbau einer fünfgliedrigen Peptidbrücke vernetzt (indirekter Quervernetzungstyp). Penicillin-bindende Proteine (PBPs)

Penicillin-bindende Proteine katalysieren die Quervernetzung benachbarter Glykanstränge und sind damit für die Synthese des Peptidoglykans essentielle Enzyme. Die Quervernetzung kann von einem anderen PBP (einer Endopeptidase) wieder geöffnet werden, wenn dies z.B. für das Wachstum des Peptidoglykans durch Einbau weiterer Ketten notwendig wird. Alle E-Laktam-Antibiotika, nicht nur Penicilline, binden an PBPs.

Ursache dafür ist die sterische Ähnlichkeit zwischen der Amidbindung im E-Laktam-Ring und der Azyl-D-Alanyl-D-Alanyl-Struktur in der Pentapeptidkette, der natürlichen Bindungsstelle der PBPs. Direkte Folge ist der Stop der Synthese des Peptidoglykannetzes, indirekte der

Zelltod durch Selbstauflösung (Autolyse). Diese Autolyse ist ein aktiver Prozeß, der durch die Hemmung der PBPs ausgelöst wird und an dem mehrere zelleigene Enzyme beteiligt sind. Wird er nicht angeschaltet, kann die Zelle in Gegenwart von E-Laktamen überleben (Toleranz). Hemmung der Proteinbiosynthese

Unterschiede in der Proteinbiosynthese (vgl. Kap. 3.2) zwischen Eukaryonten und Prokaryonten ermöglichen die Hemmung der Synthese von Protein in Prokaryonten, ohne zugleich die Eukaryontenzelle zu schädigen. Der Grad der selektiven Toxizität ist jedoch im Vergleich zur Hemmung der Peptidoglykansynthese deutlich geringer. Dies kommt in Häufigkeit, Art und Schwere unerwünschter Nebenwirkungen bei antimikrobieller Therapie mit Proteinbiosynthese-Hemmern zum Ausdruck. Antibiotika setzen an unterschiedlichen Stellen der Proteinbiosynthese an. Aminoglykoside und Tetrazykline inhibieren Funktionen im Bereich der 3()S-Untereinheit, Chloramphenicol. Makrolide, Lincosamine in dem der SOS-Untereinheit des bakteriellen Ribosoms. Der Wirktyp ist zumeist bakteriostatisch, bei Aminoglykosiden bakterizid, bei Makroliden werden beide Wirktypen beobachtet. Hemmung der Nukleinsäuresynthese

Die Mechanismen der DNA-Replikation und -Transkription unterscheiden sich - obwohl grundsätzlich bei Eukaryonten und Prokaryonten dieselben - so weit, daß eine selektive Toxizität zugunsten der Prokaryonten möglich wird (vgl. Kap. 3.5.6: Chinolone, Rifampicin). Hemmung von Funktionen der Zytoplasmamembran

Die Strukturen der Zytoplasmamembranen von Bakterien und Pilzen unterscheiden sich nicht nur von denjenigen tierischer Zellen, sondern auch untereinander hinreichend, um eine selektive Zerstörung ihrer Funktion durch bestimmte Substanzen zu ermöglichen. So töten Polymyxine nur Bakterien, Polycnc oder Imidazole lediglich Pilze (nur deren Zytoplasmamembran enthält Sterole). Antibiotika-Resistenz Natürliche, erworbene, phänotypische Resistenz

Alle verfügbaren Antibiotika weisen Lücken im Spektrum der humanpathogenen Erreger auf.

201

202

Allgemeine Bakteriologie

Sind alle Stämme einer natürlichen Population einer Art oder Gattung gegen ein Antibiotikum resistent, so gilt dies als natürliche, primäre oder intrinsische Resistenz. Beispiele für derartige Taxon-spezifische Resistenz sind die Resistenz von gramnegativen Stäbchen gegenüber Vancomycin oder Bacitracin, von Burkholderia-Arten gegenüber Polymyxin, von S. maltophilia gegenüber Carbapenemen. Ist dagegen die Resistenz begrenzt auf nur einen Teil der Stämme einer natürlichen Population, handelt es sich um erworbene, sekundäre Resistenz. Klinische Resistenz setzt die Empfindlichkeit in Relation zur Wahrscheinlichkeit eines Therapieerfolgs: die minimale Hemmkonzentration (MHK, Resistenzbestimmung s.u.) eines Erregers liegt oberhalb der Grenzkonzentration, bei der hinsichtlich der zugelassenen Höchstdosierung noch ein Therapieerfolg erwartet werden kann. Klinische Sensibilität liegt vor, wenn die MHK eines Erregers gleich oder kleiner ist als die festgelegte Grenzkonzentration, so daß im allgemeinen ein Therapieerfolg bei üblicher Dosierung und geeigneter Indikation zu erwarten ist. Natürliche Sensibilität aller Stämme einer Spezies gegenüber bestimmten Antibiotika ist seit Beginn der antimikrobiellen Therapie immer seltener geworden. Beispiele für heute noch sichere Empfindlichkeit sind die von Streptococcus pyogenes und Treponema pallidum gegenüber Penicillin G. Sind die Ursachen der Unempfindlichkeit eines Stammes nicht vererbbar, liegt eine phänotypische Resistenz vor.

So bleiben E-Laktame bei den peptidoglykanarmen Formen der gram-negativen (Spbäroplasten) oder den peptidoglykanfreien Formen der gram-positiven (Protoplasten) wirkungslos. Trotzdem überleben sie eine E-Laktam-Therapie nur in seltenen Fällen (Persisters) als zellwandfreie Formen, um anschließend zu kompletten Erregern zu revertieren, da sie zumeist durch die Aktivität der körpereigenen Abwehr abgetötet werden. Resistenzbestimmung

Sie charakterisiert einen Stamm nach der Wirkung eines Antitiotikums auf dessen Vermehrungs- oder Überlebensfähigkeit. Parameter dafür sind die niedrigste vermehrungshemmende (bakteriostatische) Konzentration (minimale Hemmkonzentration, MHK, vgl. Abb. 3.29)

bzw. die niedrigste Abtötekonzentration (minimale bakterizide Konzentration, MBK). Diese liegt bei Antibiotika mit bakterizidem Wirktyp (E-Laktame, Aminoglykoside, 4-Chinolone) im allgemeinen nur um das Zweifache über der MHK. Das ermöglicht die therapeutische Wirksamkeit derartiger Substanzen auch bei Infektionen abwehrgeschwächter Patienten (z.B. bei Granulozytopenie). In seltenen Fällen kann die MBK um das 32fache und darüber höher sein als die MHK (vgl. Toleranz). Dann muß für die Therapie auf eine Substanz mit unverminderter Bakterizidie ausgewichen werden. Der Therapieerfolg resultiert aus dem Zusammenwirken zwischen Antibiotikum und den Infektabwehrmechanismen des Patienten. Resistenzbestimmungen sollen ermitteln, ob die Mindestvoraussetzungen für einen Therapieerfolg von Seiten des Antibiotikums erfüllt sind, nämlich das Erreichen der bakteriostatischen Antibiotikum-Konzentration am Infektionsort. Der Wert des in vitro Ergebnisses für die Voraussage des Therapieergebnisses wird vom Grad der Vergleichbarkeit der antimikrobiellen Faktoren in vitro und in vivo determiniert. Diese wird bei den verschiedenen Methoden zur Resistenzbestimmung in unterschiedlichem Ausmaß, aber nie vollständig erreicht (Tab. 3.11). So können die Pharmakokinetik des Antibiotikums am Infektionsort sowie die körpereigenen humoralen und zellulären Abwehrfunktionen nicht oder nur unvollständig in ein praktikables Routine-Testsystem einbezogen werden. Der prädiktive Wert der in vitro Aktivität eines Antibiotikums als Therapieempfehlung ist wesentlich vom pharmakokinetischen Verhalten des Antibiotikums im Patienten abhängig. Informationen darüber liegen nicht einmal als Durchschnittswerte für alle Antibiotika, Dosierungen, Infektionsorte und Funktionen der Eliminationsorgane vor. In bewußter Generalisierung im Sinne einer praktikablen Orientierung wurde deshalb bisher als Grenzkonzentration zwischen Empfindlichkeit und Resistenz eines Erregers z.B. die nach der Hälfte des Dosierungsintervalls im Serum Gesunder nachweisbare Konzentration des Antibiotikums herangezogen. Diese nähert sich bei einer Reihe von Antibiotika der Konzentration in verschiedenen Geweben an. Erreicht oder übersteigt sie die MHK eines Stammes, gilt er als sensibel, bleibt sie unterhalb der MHK, als resistent. Ergänzend werden Therapieergebnisse klinischer Studien zur Grenzwertfindung herangezogen. Derartige Grenz-

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie

Abb. 3.29 SchachbrettTitration (Checkerboard) zur Ermittlung der Wirkung von AntibiotikaKombinationen (aus: BAUERNFEIND und SHAH, 1995).

konzentrationen (cut-off points, break-poinls) werden für die verschiedenen Antibiotika vorgeschlagen, z.B. von DIN (DIN 58940) oder vom National Committee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS, der USA. Beispiele für DIN-MHK-Grenzwerte gibt Tab. 3.12. Weiterführende Interpretation der Resistenzbestimmung. Das Resistenzverbalten eines Bakterienstammes gegenüber einem Satz von Antibiotika aus verschiedenen Gruppen beschreibt dessen Resistotyp.

Dieser reflektiert den zugrundeliegenden Genotyp, soweit die Resistenzgene des Stammes phänotypisch exprimiert werden. Darauf beruht die Möglichkeit, aus den MHK-Werten für verschiedene Antibiotika die Resistenzmechanismen ei-

nes Stammes herauszulesen („interpretive reading"). Beispiele sind in Tab. 3.13 zusammengefaßt. Daneben kann ein Resistenzmuster Hinweise für die Identifizierung eines Erregers oder einer Erregergruppe geben (Tab. 3.14). Antibiotika-Kombinationen. Grundsätzlich sind Kombinationen aus bakteriostatisch und bakterizid wirkenden Substanzen wegen des Risikos eines Antagonismus zu vermeiden.

Dies ist der Fall, wenn z.B. ein Antibiotikum nur auf proliferierende Zellen bakterizid wirkt, deren Vermehrung jedoch in Gegenwart eines bakteriostatischen Kombinationspartners verhindert wird. Ein Antagonismus kann jedoch auch bei Kombination von Antibiotika gleichen Wirktyps auftreten, so z.B., wenn ein E-Laktam-Anti-

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Allgemeine Bakteriologie

204

Tab. 3.11 In vitro Bestimmung der antibakteriellen Wirkung von Antibiotika Methode

Prinzip, Meßgröße

Besonderheiten

Verfahren mit Endpunktbestimmung Die Beurteilung erfolgt anhand eines Meßwertes, der erst am Ende der Bebrütungszeit erfaßt wird. Reihenverdün-

geometrische Verdünnungsreihe des

quantitatives Ergebnis; aufwendig:

nungstest, RVT

Wirkstoffes

für jeden Wirkstoff ist eine eigene Verdünnungsreihe notwendig. Resultat für schnell wachsende Erreger nach 16stündiger Bebrütung, für langsam wachsende (Anaerobier) nach 48 Stunden bzw. 3-4 Wochen (Myco-

Minimale Hemmkonzentration, MHK, 1 engl. MIC : niedrigste Wirkstoffkonzentration mit vermehrungshemmender (bakteriostatischer) Wirkung. Minimale bakterizide Konzentration, 2 MBK, engl. MBC : niedrigste Konzentration, welche die eingesäte Bakterienzahl (z.B. 5 5 x 10 KBE/ml) um mindestens 99,9% abtötet.

bacterium tuberculosis).

Bestimmen der Zahl der überlebenden Bakterien in Kulturen mit AntibiotikaKonzentrationen in Höhe der MHK und darüber; Dauer bis zum Ergebnis doppelt so lang wie bei der MHK-Bestimmung.

Agardiffusionstest,

Radiale Diffusion vom Wirkstoffträger

Resultate müssen mit denen des Reihen-

ADT, Blättchentest

in den beimpften Agarnährboden. Der Durchmesser des Hemmhofs im Bakterienrasen ist Maß für die Empfindlichkeit des Stammes.

verdünnungstests korrelieren. Strikte Standardisierung der Testbedingungen notwendig (u.a. Dichte des Bakterienrasens, Zusammensetzung und Schichthöhe des Nährbodens, Bebrütungsdauer und -temperatur, aktive Konzentration des Wirkstoffes auf dem Blättchen).

Verfahren mit Verlaufsbeobachtung Für die Beurteilung werden Meßwerte zu verschiedenen Zeitpunkten im Verlauf der Exposition erfaßt. Bakterizidiekinetik - bei konstanter Wirkstoffkonzentration

- bei variabler Wirkstoffkonzentration

1 2

nach Zugabe eines Antibiotikums zur beimpften Nährlösung wird die Zahl der vermehrungsfähigen Bakterien in verschiedenen Zeitabständen (meist 2, 4, 6, 8, 24 Stunden) bestimmt.

erfaßt Abtötegeschwindigkeit und Verlauf bei gleichbleibender Konzentration des Antibiotikums. Für jede Konzentration (zumeist MHK und Vielfache davon) ist ein eigener Testansatz erforderlich.

Flüssigkeitskulturen werden variablen Wirkstoffkonzentrationen ausgesetzt und - wie oben - nach der Überlebenskinetik der Bakterienpopulation analysiert.

bezieht die Pharmakokinetik in die in-vitro-Analyse ein. Wirkstoffkonzentrationsverläufe (z.B. im Serum) werden in der Kultur des Teststammes reproduziert. Bakterizidiekinetik verschiedener Dosierungen und Dosierungsintervalle in Relation zur MHK eines Stammes erfaßbar. Wichtiger pharmakodynamischer Parameter für die präklinische Charakterisierung neuer Antibiotika.

minimum inhibitory concentration minimum bactericidal concentration

biotikum im Erreger die Synthese einer E-Laktamase induziert, welche den E-Laktam-Ring des zweiten Antibiotikums spaltet (Abb. 3.30). In Antibiotika-Kombinationen kann die Wirkung der beteiligten Einzelsubstanzen gemessen

an ihrer Wirkung allein erhöht, vermindert oder unverändert sein. Die Wirkung einer Antibiotika-Kombination läßt sich nicht vorhersagen, sie muß jeweils für den einzelnen Erreger bestimmt werden. Quantifizierbar werden Kombinations-

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie

205

Tab. 3.12 Beispiele für Grenzwerte von antibakteriellen Wirkstoffen (nach DIN 58940, 1998, verändert) antibakterieller Wirkstoff

Bewertungsstufe

Benennung Kurzzeichen gilt auch für folgende Wirkstoffe

Testergebnis „sensibel"

sensibel 1 (S) <

Penicillin

Penicillin G

0,13

0,25-1

2

PEN

intermediär 2 (I)

resistent 3 (R) >

Oxacillin

OXA

Oxacillin Dicloxacillin Flucloxacillin

1

-

2

Ampicillin

AMP

Ampicillin Amoxicillin

2

4-8

16

Cefaclor Cefuroxim-Axetil Cefpodoxim-Proxetil Cefetamet-Pivoxil Cefotiam-Hexetil Ceftibuten Cefixim Loracarbef

1 1 4

2-A 2 4-8

8 4 16

Ceftazidim Cefoperazon Ceftriaxon Cefepim Cefotetan Cefotaxim Cefodizim

4 2 4

8-16 4-8 8

32 16 16

orale Cephalosporine

Ceftazidim

CAZ

' MHK so gering (kleiner oder gleich der gewählten Grenzkonzentration), daß bei üblicher Dosierung und geeigneter Indikation ein Therapieerfolg zu erwarten ist. 2 Der zu erwartende Therapieerfolg ist abhängig davon, ob der Erreger Gene für einen Resistenzmechanismus exprimiert und ob der Infekt in einem leicht zugänglichen (Harnwege) oder einem nur schwer erreichbaren Bereich (Lunge, Atemwege) lokalisiert ist. Im ersten Fall kann der Erreger mit einer Regeldosierung eliminiert werden, im zweiten auch nicht mit der maximal zugelassenen Dosierung. 3 MHK so hoch (über einer Grenzkonzentration), daß auch bei Verwendung der zugelassenen Höchstdosierung ein therapeutischer Erfolg nicht zu erwarten ist.

Wirkungen durch spezielle Verfahren (Schachbrett-Titrationen), mit denen sich die Wirkung der beiden Partner in verschiedenen Konzentrationsverhältnissen erfassen läßt. Als Synergismus gilt dabei die Verminderung der MHK-Werte für jede der beiden Substanzen auf wenigsten 1/4 der MHK der Einzelsubstanzen (vgl. Abb. 3.29). Resis tenzentstehung Natürliche Funktion der Antibiotika für Mikro-

organismen. Die Mehrzahl der antimikrobiellen Substanzen wird von Mikroorganismen (Bakterien, Pilzen) selbst produziert. Welcher Nutzen für den Produzenten steht Aufwand und Risiken bei deren Produktion gegenüber?

Mikroorganismen leben zumeist in Verbänden, entweder als Reinkulturen (in Form von Mikrokolonien oder Biofilmen) oder als Lebensgemeinschaften aus verschiedenen Arten oder deren Untergruppen (wie z. B. Bacteriocintypen).

Diese sind das Ergebnis der Selektion koexistenzfähiger Stämme derselben oder verschiedener Spezies. Sowohl beim Zustandekommen als auch bei der Erhaltung derartiger Biozönosen sind Mechanismen der Symbiose (z.B. crossfeeding) und der Antibiosc beteiligt. Für die Antibiose kommt neben Bakteriocinen den selbst produzierten Antibiotika eine natürliche Funktion in der Kompetition mit anderen Mikroorga-

206

Allgemeine Bakteriologie

Spezies

Resistenz-Phänotyp

Resistenzmechanismus

S. pneumoniae

Penicillin-R

PBP

H. influenzae

Amoxicillin-R, Augmentan'-R

PBP

Ampicillin-R, Augmentan-S

TEM-1

Ampicillin-R, Ceftazidim-S

TEM-1,TEM-2, SHV-1

Ampicillin-R, Augmentan-R, Ceftazidim-S

Inhibitor-resistente TEM-1 ELaktamasen

Ampicillin-R, Ceftazidim-R, Cefoxitin-S

ESBL

Ampicillin-R, Ceftazidim-R, Cefoxitin-R

Plasmid-codierte AmpC E-Laktamasen

E. coli

Tab. 3.13 Interpretation eines Antibiogramms

1

Kombination aus Amoxicillin und Clavufansäure Spezies oder Genus

Resistenz

Enterococais spp., Listeria spp.

Cephalosporine

Klebsiella spp. Proteus mirabilis

Aminopenicilline Tetrazykline

Stenotrophomonas maltophilia Burkholderia spp., S. maltophilia Burkholderia spp., Proteus spp.

Carbapeneme

Tab. 3.14 Beispiele für taxon-spezifisches Resistenzverhalten

Aminoglykoside Colistin

Providencia spp., Serratia spp.

nismen um den Standort zu. Dabei sollen die Abwehrfunktionen nicht dem Produzenten selbst schaden. Für diesen Selbstschutz wurden Resistenzmechanismen entwickelt. Die Resistenzgene sind im Verlauf der Evolution durch horizontalen Transfer auf andere Spezies übergegangen und dort zu stabilen Bestandteilen des Genoms geworden. Sie schützen diese Organismen vor Antibiotika, wobei der Aufwand (costs of fitness) für die Expression des Resistenzmechanismus häufig am Bedarf orientiert wird, und zwar über Mechanismen, mit denen Signale aus dem Milieu rezipiert und in die Zelle transduziert werden, ehe Synthese und Sekretion von Abwehrstoffen (z.B. inaktivierende Enzyme von Antibiotika) in Gang gesetzt werden.

Resistenzentwicklung. Eine anlibiotische Therapie kann trotz in vitro Empfindlichkeit des initial isolierten Erregers erfolglos bleiben. Häufigste mikrobiclle Ursache ist die Resistenzentwicklung unter Therapie mit Persistenz des Erregers. Dies wird oft nicht abgeklärt, da hei Nichtansprechen auf eine initiale Therapie (klinisch meist nach 2-3 Tagen erkennbar) mit zusätzlichen oder alternativen Antibiotika ohne erneute bakteriologische Analyse weiter therapiert wird. Die Therapie kann aber auch trotz Elimination des ursprünglichen Erregers erfolglos bleiben, wenn ein neuer, die Infektion fortsetzender Erreger mit Resistenz gegenüber dem Ausgangsantibiotikum hinzugekommen ist. Dies kann noch während der Therapie eintreten (Erregerwechsel) oder erst nach deren Ah-

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie

Schluß (Reinfektion). Wird eine erneute Infektion von einem in allen Merkmalen mit dem initialen Erreger identischen Stamm verursacht (z.B. durch DNA-Fingerprint nachgewiesen), so liegt ein Rezidiv (relaps) vor, u.U. als Folge einer Suppression der Erregervermehrung infolge zu niedriger Antibiotika-Dosierung oder zu kurzer Therapiedauer. Resistenzentwicklung unter Therapie hat die Frage nach der Rolle der Antibiotika bei der Entstehung der Resistenz aufkommen lassen („Gewöhnung"). Tatsächlich ist der Nachweis für das vom Antibiotikum unabhängige Entstehen der Resistenz dadurch erschwert, daß die resistenten Zellen nur in Gegenwart des Antibiotikums identifiziert werden können, also so nicht entschieden werden kann, ob sie bereits vor Anwesenheit des Antibiotikums vorhanden waren oder erst in Gegenwart des Antibiotikums aufgetreten sind. DCLBRÜCK und LURIA (1943) lösten dieses Problem mit dem Fluktuationstest. Er widerlegt die LAMARCKJstische Erklärung („Gewöhnung" als Ursache der Resistenz) für die Resislenzentstehung bei Bakterien. Das Prinzip des Experimentes (Abb. 3.31) liegt darin, daß bei Annahme eines Adaptationsmechanismus bei initial Antibiotikum-empfindlichen Bakterien aus mehreren unabhängigen Kulturen nach Transfer auf einen Antibiotikum-haltigen Nährboden aus jeder dieser Kulturen auch jeweils etwa die gleiche Zahl resistenter Zellen nachweisbar sein müßte (gleiche Adaptationsbedingungen für alle Bakterien in allen Kulturen). Tatsächlich jedoch schwankt (fluktuiert) die Zahl resistenter Zellen zwischen den verschiedenen Kulturen beträchtlich, und zwar signifikant stärker als zwischen mehreren Proben, die aus nur einer der Kulturen entnommen werden. Vergegenwärtigt man sich

Abb. 3.30 Antagonismus Imipenem - Piperacillin bei Pseudomonas aeruginosa.

den exponentiellen Vermehrungsgang innerhalb der Bakterienpopulation, so wird deutlich, daß bei Annahme von Spontanmutationen als Ursache der Resistenzentstehung das Eintreten der Mutation (das Entstehen der resistenten Zellen) in verschiedenen Kulturen zu unterschiedlichen Zeitpunkten (in unterschiedlichen Generationen) zu erwarten ist. Damit muß auch die Anzahl der resistenten Zellen am Ende des Experimentes ungleich sein, hatten doch zufällig in einer früheren Generation auftretende Mutanten über eine größere Anzahl noch bevorstehender Generationen

Abb. 3.31 Fluktuationstest nach DELBRÜCK und LURIA. S. Text.

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208

Allgemeine Bakteriologie

Zeit, sich zu vermehren, als das bei Mutationen gegen Ende der Vermehrungsphase der Population einer Bakterienkultur möglich ist. Damit war Spontanmutation als Ursache vererbbarer Resistenz bewiesen und dem Antibiotikum lediglich die Rolle der Selektion bereits resistenter Mutanten aus der Mischpopulation zugewiesen. Therapieprobleme als Folge von Mutationen zur Resistenz entstehen bevorzugt dann, wenn am natürlichen Standort (Intestinum, Oropharynx) oder am Infektionsort große Erregerpopulationsdichten vorliegen, die sich auch unter Therapie nur langsam reduzieren lassen.

Beispiel: bei chronischen oder chronisch rezidivierenden Infekten der tiefen Atemwege (z.B. Tuberkulose, Mukoviszidose) oder der Harnwege (z.B. bei Querschnittgelähmten). Dort ist der antibiotische Selektiondruck zugunsten resistenter Stämme hinreichend, um sie anzureichern, selbst dann, wenn z.B. als Folge einer Deletion die Generationsdauer der resistenten Zellen im Vergleich mit den sensiblen verlängert sein sollte. Die Mutationshäufigkeit scheint sich unter Streßbedingungen, wie hoher Bakterienkonzentration in der stationären Wachstumsphase, zu erhöhen und damit auch die Wahrscheinlichkeit der Selektion von Mutanten mit größerer Fitneß in der gegebenen Streßsituation. Mißverständlich wurden diese Vorgänge als „directed" (gerichtete) oder adaptive Mutationen bezeichnet, obwohl sie nicht im Widerspruch zum Prinzip der Spontaneität von Mutationen stehen. Mutationen im bakteriellen Chromosom führen im allgemeinen zur Resistenz gegenüber nur einem Antibiotikum.

Gleichzeitige Mutationen zur Resistenz gegenüber zwei Antibiotika mit verschiedenen Resistenzmechanismen bei demselben bakteriellen Individuum (Doppelresistenz) sind extrem selten (bei einer Mutationsfrequenz von z.B. jeweils 10~7 für eines der beiden Gene also 10~14 für ein Bakterium, das zugleich gegen beide Antibiotika resistent ist). Das Risiko für den Aufbau chromosomaler Multi-Resistenzen ist deshalb selbst bei langdauernden chronischen Prozessen bei Kombinationstherapie gering (z.B. Tuberkulose), bei konsekutiver Monotherapie jedoch beträchtlich (z.B. Chinolon-, Makrolid-, und Tetrazyklin- Resistenz bei zunächst nur Methicillinresistenten Staphylokokken).

Resistenzübertragung

Chromosomale Resistenz bleibt zumeist beschränkt auf dasjenige bakterielle Individuum, in dem das Mutationsereignis eingetreten ist und dessen folgende Generationen (vertikale Resistenzweitergabe). Mikroorganismen können aber auch Gene von bereits resistenten Zellen übernehmen (horizontale Resistenzweitergabe). Dies kann erfolgen durch Aufnahme freier DNA (Transformation) oder als Teil eines Bakteriophagengenoms (Transduktion), bzw. im Anschluß an Zellkontakt (Konjugation). Dadurch wird überwiegend nur ein einziges chromosomales Resistenzgen transferiert und kann nach Rekombination in das Genom an die folgenden Generationen vererbt werden. Die Mobilität von Resistenzgenen kann beträchtlich gesteigert sein durch deren Integration in Transposons. Mit ihnen können Gene springen („jumping genes") von Chromosom zu Chromosom, von Plasmid zu Plasmid oder zwischen Chromosom und Plasmid. Der gleichzeitige Transfer mehrerer Resistenzgene wird möglich bei deren extrachromosomaler Lokalisation auf Plasmiden.

Diese können neben Genen für vom Chromosom unabhängige (autonome) Replikation und für den Übertragungsmechanismus (tra-Gene) Gene für Resistenz gegenüber Antibiotika verschiedener Gruppen tragen (vgl. Kap. 3.3). Vereinzelt wurden in derselben Kopplungsgruppe zusätzlich Gene für Virulcnzfaktoren wie Toxine oder Adhäsine gefunden. Antibiotika-empfindliche Wildtypstämme (Rezipienten) werden nach Aufnahme derartiger Resistenz- (R-) Faktoren resistent und gleichzeitig zu Überträgern (Donatoren). So kann es zu rascher („infektiöser") Ausbreitung von Resistenz innerhalb einer Bakterienpopulation, aber auch auf Stämme anderer Spezies oder Genera kommen. Dadurch kann ein Erreger zugleich resistent werden gegenüber Penicillinen, Cephalosporinen, Monobaktamen, Carbapenem, Aminoglykosiden. Chloramphenicol, Tetrazyklinen, Sulfonamiden. Trimethoprim. Da alle Resistenzdeterminanten auf einem DNA-Stück hintereinander liegen (Kopplungsgruppe), selektiert jedes einzelne der Antibiotika die Multiresistenz. So findet man auch heute noch Chloramphenicol-resistente E. co//-Stämme, obwohl mit diesem Antibiotikum kaum mehr therapiert wird, da es häufig mit Determinanten für andere, noch verwende-

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie

te Antibiotika (z.B. Ampicillin) auf einer Kopplungsgruppe angeordnet ist. Resistenzmechanismen

Antimikrobielle Wirkung einer Substanz setzt deren Vordringen in aktiver Form bis zu ihrem nativen Angriffspunkt voraus. Wirkungsmindernd sind demnach alle Mechanismen, welche das Eindringen der Substanz in die Zelle erschweren, ihre Bindefähigkeit an den Angriffspunkt verringern oder sie inaktivieren. Mikroorganismen schützen sich vor Chemotherapeutika durch verschiedenartige Mechanismen. Diese, sowie die Lokalisation der Resistenz-Gene sind in Tab. 3.15 zusammengestellt. Für dieselbe Substanzgruppe können bis zu 4 verschiedene Resistenzmechanismen existieren. Der Resistenz-Phänotyp einer Bakterienzelle kann das Ergebnis des Zusammenwirkens mehrerer Resistenzmechanismen sein, z.B. von enzymatischer Inaktivierung plus verminderter Permeabilität oder von vermindertem Eindringen (Influx) plus aktivem Efflux. Die spezifi-

209

schen Resistenzmechanismen und deren jeweilige Bedeutung für einzelne Substanz- und Erregergruppen werden bei den einzelnen Antibiotika behandelt. Ihnen gegenüber stehen unspezifische Mechanismen der Antibiotika-Resistenz, welche gleichzeitig die MHK-Werte für Substanzen unterschiedlicher Substanzklassen erhöhen. Das gilt insbesondere für solche Mechanismen, durch die bereits in die Zelle eingedrungene Antibiotika wieder aktiv entfernt werden, noch bevor sie ihren Wirkort im Zytoplasma erreichen konnten. Charakteristisch für viele dieser Efflux-Pumpen ist das breite Spektrum der von ihnen aus der Zelle entfernten Substanzen (Multidrug-Efflux-Systems). Sie weisen eine ähnliche Architektur auf wie Mechanismen zur Proteinsekretion (z.B. von Hämolysinen). Derartige Efflux-Mechanismen sind im Zusammenwirken mit verminderter Permeation durch die äußere Membran Ursache der primären Resistenz gramnegativer Bakterien gegenüber den meisten Schmalspektrum-Antibiotika (Makroli-

Tab. 3.15 Mechanismen der Antibiotika-Resistenz Antibiotika-Gruppe Resistenzmechanimus

ß-Laktarne

AminoChloramglykoside phenicol

enzymatische

C/P

C/P

P

P

–

–

–

–

–

C

C

P

–

C

C/P

–

C

C

–

–

–

C

–

C/P

C

–

–

C/P

–

C/P

–

–

–

C/P

–

Inaktivierung MembranImpermeabilität aktives Herauspumpen des Antibiotikums (Efflux) Veränderung des Ribosoms Veränderung der Zellwandbausteine Veränderung der Zielenzyme Überproduktion der Zielenzyme Mutanten zur Auxotrophie

C

Makro SulfonTetraChinolide amide/ zykline lone Trimethoprim

Vancomyein

Polymyxin

–

C

–

–

–

–

–

–

–

C

–

–

–

C/P

–

C

–

–

–

–

–

–

C

–

–

–

–

–

–

–

–

C/P

–

–

–

–

P = Plasmid-codiert, C = chromosomal codiert

210

Allgemeine Bakteriologie

Abb. 3.32 Pharmakokinetik antibakterieller Substanzen (SÖRCEL, 1993). - Cm„ = Maximale Plasmakonzentration am Ende der Infusion nach parenteraler Applikation oder der Zeitpunkt der maximal erreichbaren Konzentration nach oraler Applikation. AUC = Area under curve - Fläche unter der Plasmaspiegelkurve. Die Fläche, die zwischen der Zeitachse (Abszisse) und Konzentrationsachse (Ordinate) und der Plasmakonzentrationskurve gebildet wird. -\}/2 = terminale Halbwertszeit. Sie wird bestimmt, wenn alle Resorptions- (orale Gabe) und Verteilungsvorgänge (i.v. oder oral) abgeschlossen sind. - MHK = minimale Hemmkonzentration. Als Zielparameter für die Wirksamkeit, zu dem die maximale Konzentration als Cmax/MHK-Quotienten bzw. die Zeit oberhalb der MHK (in der Abbildung durch einen Pfeil nach unten gekennzeichnet) dargestellt ist.

de, Fusidinsäure, Rifampicin). Die Expression stummer oder die verstärkte Expression konstitutiver Multidrug-Efflux-Gene (z.B. durch Mutation im Repressor-Gen des Operons) kann zur Resistenzentwicklung führen (z.B. bei P. aeruginosa zur Doppelrcsistenz gegen Fluorochinolone und Imipenem). Efflux-mechanismus-korrelierte Resistenz gegen Chloramphenicol, Tetrazykline, Fluorochinolone, Imipenem und E-Laktame tritt unter einem Teil der Isolate von Enterobakterien, P. aeruginosa und Neisseria gonorrhoeae auf. Neuerdings werden Substanzen entwickelt, welche Efflux-Mechanismen inhibieren.

3.5.4 Pharmakologische Grundlagen Pharmakokinetik

Chemotherapeutika unterscheiden sich in ihrem pharmakokinetischen Verhalten im Organis-

Abb. 3.33 Simulation einer Plasmaspiegelkurve nach intravenöser und nach oraler Applikation (SÖRCEL, 1993). Aus den jeweils berechneten AUCWerten wird ein Quotient F = AUC p.o. 4- AUC i.v. gebildet, der die absolute Bioverfügbarkeit, also die Resorbierbarkeit der Substanz aus dem Magen-DarmTrakt, angibt.

mus. Aber auch für dieselbe Substanz können z.T. erhebliche Unterschiede je nach Alter des Patienten, Grundkrankheit und Funktionszustand von Niere und Leber bestehen. Eine für die praktische Anwendung entscheidende Größe ist die Bioverfügbarkeit einer antibiotischen Substanz. Darunter versteht man das Ausmaß und die Geschwindigkeit, mit der das Antibiotikum in der systemischen Zirkulation des Organismus verfügbar ist. Zur Messung der Bioverfügbarkeit wird die Serumkonzentrationszeitkurve nach einmaliger Applikation des Antibiotikums bestimmt (Abb. 3.32). Aus dieser Kurve lassen sich die maximale Serumkonzentration (Cmax) und der Zeitpunkt der maximalen Serumkonzentration (tmax) bestimmen. Aus der Fläche unter der Plasmaspiegelkurve (area under the curve, AUC) und der verabreichten Dosis läßt sich die Gesamtkörper-Clearence, d.h. also die Gesamtfähigkeit des Organismus, diese Substanz auszuscheiden, berechnen. Multipliziert man diese mit der renal ausgeschiedenen Menge (in Prozent), so erhält man die renale Clearence. Die Differenz zwischen totaler und renaler Clearence ist die nichtrenale Clearence. Bei der oralen Gabe eines Antibiotikums ist seine Resorbierbarkeit eine wichtige Größe (Abb. 3.33). Voraussetzung dafür ist zunächst die Säurestabilität, d.h. die Substanz muß den Magen

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie

unbeeinflußt passieren und so an die Resorptionsorte im Dünndarm gelangen können. Weiterhin muß die Substanz in gelöster Form vorliegen und ausreichend fettlöslich sein. Die Resorbierbarkeit eines Antibiotikums wird einmal durch seine galenischen Eigenschaften (z.B. Partikelgröße, Löslichkeit) sowie physiologische oder pathologische Zustände des Patienten (Alter, Magen- und Darmmotilität, gleichzeitige Nahrungsaufnahme) bestimmt. Von Einfluß ist auch die präsystemische Elimination; darunter versteht man die potentielle Metabolisierung eines Arzneimittels in der Darmschleimhaut und/oder der Leber, die vor dem Eintreten in den systemischen Kreislauf stattfindet (,,first-pass"-Effekt). Eine weitere wichtige Größe ist die Art der Verteilung des Antibiotikums im Organismus. Sie wird im wesentlichen durch 3 Faktoren bestimmt. Zum einen durch die Fähigkeit, in Gewebe zu gelangen bzw. besondere Organschranken wie z.B. die Blut-Hirn-Schranke oder die Plazentarschranke zu passieren und sich passiv oder durch aktiven Transport intrazellulär anzureichern. Diese Eigenschaften hängen wesentlich von der chemischen Struktur der jeweiligen Substanz ab. So erreicht z.B. Nalidixinsäure keine wesentlichen Plasmaspiegel, aber hohe Urinspiegel. Chinolone erreichen hohe Gewebskonzentrationen, etwa in Höhe der Plasmaspiegel, und Chloramphenicol, Makrolide. Tetrazyklinc und Chinolone können intrazellulär angereichert werden. Nur wenige Substanzen sind in der Lage, auch bei intakter Blut-Liquor-Schranke in hohen Konzentrationen in den Liquor zu gelangen wie z.B. Chloramphenicol. Penicilline können dies nur aber auch nur eingeschränkt - wenn die Blut-LiquorSchranke, z.B. bei Meningitis, zusammengebrochen ist, während Aminoglykoside auch dann nicht in den Liquorraum gelangen. Dieses hat direkt klinisch-praktische Konsequenzen für die Auswahl von Chemotherapeutika bezogen auf die Infektionslokalisation (z.B. Meningitis), aber auch auf den Erreger (Chlamydien intrazelluläre Erreger - Tetrazykline). Ein weiterer, die Verteilung bestimmender Faktor sind Höhe und Stärke der Plasmaproteinbindung. Für Antibiotika gilt, daß nur der nicht gebundene Anteil wirkfähig ist. Der dritte, die Verteilung eines Antibiotikums charakterisierende Faktor ist das Verteilungsvolumen. Dies ist eine hypothetische Größe, welche die Antibiotikakonzentration im Plasma zu der im Gesamtkörper in Beziehung setzt. Das Verteilungsvolumen setzt sich aus drei Kompartimenten zusammen: dem vasalen Raum, dem extravasalen Raum und dem intrazellulären Raum. Vor allem

bedingt durch Penetrationsfähigkeit und Plasmaproteinbindung ergeben sich für die einzelnen antibiotischen Substanzen zum Teil erhebliche Unterschiede im Verteilungsvolumen von überwiegend intravasal (z.B. Aminoglykoside) bis hin zu überwiegend intrazellulär (z.B. Chinolone). Schließlich sind Art und Schnelligkeit der Elimination wichtige pharmakokinetische Parameter. Die Elimination eines Antibiotikums kann entweder in unveränderter Form erfolgen oder nach vorhergehender Metabolisierung in der Leber. Wichtigstes Eliminationsorgan ist die Niere, über die durch glomeruläre Filtration und/oder tubuläre Sekretion die meisten Antibiotika bzw. ihre Metaboliten ausgeschieden werden. Weiteres Ausscheidungsorgan ist die Leber, aus der viele der gebildeten Metaboliten via Galle in den Darm gelangen und dann mit den Fäzes ausgeschieden werden. Das Maß für die Elimination durch den Organismus ist die Clearance (s.o.), für die Geschwindigkeit der Elimination die Halbwertszeit (Un)- die wiederum durch das Verteilungsvolumen und die Clearance festgelegt wird. Bezüglich des Eliminationsweges lassen sich drei Typen von Antibiotika festlegen (Tab. 3.16). Antibiotika des Typs 1 (Pcnicillin-Typ) werden nicht oder nur gering metabolisiert und damit überwiegend unverändert über die Nieren ausgeschieden. Damit kumulie-

Tab. 3.16 Ausscheidungstyp von Chemotherapeutika 1. Penicillintyp Penicilline Cephalosporine (Ausnahmen: Typ 2) Aminoglykoside Ofloxacin Enoxacin 2. Chlorampnenicoltyp Chloramphenicol Doxycyclin Clindamycin *Ciprofloxacin

*MetronidazoI *Cefoperazon

*Ceftriaxon 3. Nitrofurantointyp Nitrofurantoin Pipern idsäure * Bei funktionell Nierenlosen Dosisreduktion erforderlich wegen der nicht metabolisierten Anteile

211

212

Allgemeine Bakteriologie

ren diese Substanzen in direkter Abhängigkeit von der Nierenfunktion. Zum Typ 2 (Chloramphenicol-Typ) gehören die Antibiotika, die nahezu völlig metabolisiert und nur ganz gering in unveränderter Form ausgeschieden werden. Diese Substanzen können unabhängig von der Nierenfunktion dosiert werden, sind aber problematisch bei starken Leberfunktionseinschränkungen. Substanzen vom Typ 3 (Nitrofurantoin-Typ) erreichen keine bedeutenden Plasmaspiegel, werden aber in hoher Konzentration im Urin ausgeschieden. Auch diese Substanzen kumulieren natürlich bei Nierenfunktionsslörung. Art und Geschwindigkeit der Elimination eines Antibiotikums sind praktisch einmal mitentscheidend für die Festlegung von Dosis und Applikationsintervall und entscheiden andererseits darüber, wann bei welcher Organfunktionseinschränkung - Niere und/oder Leber - eine Anpassung zu erfolgen hat (s. Kap. 3.5.7). Pharmakodynamische Prinzipien

Erst in jüngerer Zeit rücken vermehrt pharmakodynamische Gesichtspunkte bei der antibakteriellen Chemotherapie in den Blickpunkt. Pharmakodynamik beschreibt die Beziehung zwischen pharmakokinetischen Parametern eines Antibiotikums zu seiner antibakteriellen Wirkung und damit letztlich zum erzielten klinischen Effekt (clinical outcome). Einmal können pharmakokinetische Meßgrößen, die den Konzentrations-Zeit-Verlauf einer Substanz bestimmen, zu einer wichtigen Meßgröße der antibakteriellen Wirkung, der minimalen Hemmkonzentration (MHK) in Beziehung gesetzt werden: Dauer der Konzentration oberhalb der MHK (time over MIC, toMIC), Verhältnis von Serumspitzenspiegel zur MHK (peak/MIC-ratio) und Verhältnis von Fläche unter der Kurve zur MHK (AUC/MIC-ratio). Unter Verwendung dieser Meßgrößen aus in vitro Untersuchungen, tierexperimentellcn Modellen und klinischen Studien lassen sich die einzelnen Substanzen unterschiedlich charakterisieren und Ableitungen für Dosierung, Applikationsintervall etc. treffen. So ist z.B. der antibakterielle Effekt der meisten E-Laktame konzentrationsunabhängig, hier ist also die „toMIC" wichtig. Dies gilt nicht für Aminoglykoside und Fluorochinolone, hier sind „AUC/M1C" und „peak/MIC" entscheidend. Praktisch bedeutet dies, daß E-Laktame häufiger oder als Dauerinfusion appliziert werden müssen, Aminoglykosi-

de dagegen als Einmalgabe gegeben werden können. Ein weiteres wichtiges pharmakodynamisches Prinzip betrifft den postantibiotischen Effekt (PAE) einer Substanz. Hierunter versteht man die fortdauernde Wachstumshemmung eines Bakteriums über den Zeitpunkt hinaus, wo noch meßbare Konzentrationen der Substanz nachweisbar sind. Der PAE ist für die jeweiligen Antibiotika bezogen auf eine bestimmte Erregerart vorhanden oder nicht bzw. unterschiedlich lang. So haben Penicilline und Cephalosporine keinen PAE auf gramnegative Bakterien, dafür aber Carbapencmc, Aminoglykoside und vor allem Fluorochinolone. Für praktische Belange hat daher die Dauer des PAE auch einen Einfluß auf das Dosierungsintervall (z.B. Einmaldosierung von Aminoglykosiden). Nebenwirkungen Jede Gabe von Antibiotika ist auch mit dem potentiellen Risiko von Nebenwirkungen verbunden.

Man unterscheidet dabei Nebenwirkungen, die auf ihrer Hauptwirkung beruhen von solchen, die eine „echte" Nebenwirkung darstellen. Unerwünschte Nebenwirkungen als Folge der Hauptwirkung, d.h. der antibakteriellen Wirkung, lassen sich als biologische Nebenwirkungen zusammenfassen (s.u.). Die „echten" Nebenwirkungen sind Folge der unerwünschten, aber nicht vermeidbaren Interaktion mit eukaryonten Zellen. Für praktische Belange hat sich hierbei die Unterscheidung in toxische, allergische sowie teratogenc und karzinogene Nebenwirkungen bewährt. Ihnen liegen auch entsprechend unterschiedliche Pathomechanismen zugrunde. Toxische Nebenwirkungen

Alle toxischen Effekte sind dosisabhängig und setzen keine vorherige Sensibilisierung voraus. Sie sind daher häufig Folge einer absoluten oder relativen Überdosierung oder einer unsachgemäßen Applikation. Man unterscheidet bei den toxischen Nebenwirkungen akut-toxische Schädigungen von chronisch-kumulativen Schädigungen, die als Folge einer zu hohen Gesamtdosis über eine bestimmte Zeiteinheit auftreten. Akut-toxische Schädigungen sind z.B. die unmittelbar im Zusammenhang mit der oralen Gabe auftretende Magen-Darmunverträglichkeit oder Venenwandschä-

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie

digungen mit starken Schmerzen bei zu schneller i.v.Applikation eines Antibiotikums. In diese Kategorie gehört auch das Auftreten von Gevvebsnekrosen durch falsche, paravasale Injektionen. Klassisches Beispiel für chronisch-kumulativ-toxische Schädigungen sind die Beeinträchtigung von Gleichgewichtsorgan und Innenohr nach zu langer Aminoglykosidgabe. Toxische Schädigungen können also sowohl lokal als auch systemisch auftreten. Eine weitere Unterscheidung der toxischen Nebenwirkungen ergibt sich daraus, ob die Schädigung reversibel oder irreversibel ist. So ist eine Knochenmarksdepression mit vorübergehender Leukopenie und/oder Thrombopcnie fast immer nach Absetzen des Antibiotikums reversibel, während eine Innenohrschädigung durch Aminoglykoside mit einem dauerhaften Hörverlust verbunden sein kann. In der Tab. 3.17 sind häufige Nebenwirkungsmöglichkeiten und Beispiele für verursachende Substanzen aufgeführt. Zu beachten ist, daß bestimmte Patientengruppen von vornherein stärker in Richtung toxischer Nebenwirkungen gefährdet sind. Hierzu gehören einmal Patienten, die schon physiologischerweise Einschränkungen der Elimination und/ oder Metabolisierung aufweisen, wie Früh- und Neugeborene (noch keine vollständige Ausreifung von Leber und Knochenmark) oder ältere Menschen (deutlich verminderte renale Clcarance, herabgesetzt von normal 120 ml/min auf 60-70 ml/min). Dann Patienten mit pathologischer Einschränkung bestimmter Organfunktionen wie z.B. bei Hcpatopathie oder Niereninsuffizienz. Allergische Nebenwirkungen

Das Auslösen einer allergischen Reaktion ist nicht immer wirkstoffspezifisch und auch nicht

dosisabhängig, setzt aber die vorherige Sensibilisierung voraus. Allergische Nebenwirkungen sind unabhängig von der Hauptwirkung und kommen durch eine spezifische Immunantwort bei entsprechend sensibilisierten Patienten zustande, frühestens nach einer Latenzzeit von 1-2 Wochen nach der Erstexposition. Aufgrund der beteiligten Immunmechanismen werden 4 Typen allergischer Reaktionen unterschieden (Tab. 3.18). Da allergische Wirkungen nicht wirkstoffspezifisch sind, können sie durch strukturell verwandte Verbindungen ausgelöst werden (partielle oder absolute Kreuzallergie). Da viele antibiotische Substanzen zumindest aß Grundsubstanz Naturstoffe sind, kann die notwendige Sensibilisierung auch durch Kontakt mit dem Naturstoff erfolgen, muß also nicht Folge einer früheren Antibiotikagabe sein (z B. Penicillinallergie). Diagnostisch abzutrennen von den echten allergischen Nebenwirkungen sind die pseudoallergischen Reaktionen, die nicht immunologisch bedingt sind, sondern nur ein ähnliches Reaktionsmuster bieten. Sie sind immer Folge einer Freisetzung von Mediatoren allergischer Reaktionen z.B. aus Mastzellen durch die direkte Wirkung des Antibiotikums. Hieraus kann das gleiche klinische Bild wie bei einer echten anaphylaktischen Reaktion entstehen. Typisches Beispiel ist das sogenannte „Red-Neck"- oder „Red-Man"-Syndrom bei zu schneller Gabe von (nicht chromalographisch gereinigtem) Vancomycin, bei dem es zu einer rasch aufschießenden Hautrötung im Schulter-Nackenbe-

toxische Nebenwirkung

Chemotherapeutikum

gastrointestinale

Ampicillin, Amoxicillin/Clavulansäure,

Störungen

Transaminasenerhöhung

Cefuroxim-Axetil, Chinolone, Makrolide, Nitrofurantoin, Tetrazykline Ciprofloxacin, Dicloxacillin, Imipenem, Metronidazol Apalcillin, Cefuroxim, Cefoxitin, Ciprofloxacin

Nierenschädigung

Aminoglykoside, Vancomycin

Leberschädigung Innenohrschädigung

Clindamycin, Erythromycin, Rifarnpicin Aminoglykoside, Glykopeptide

Knochenmarksaplasie

Chloramphenicol

Leukopenie Thrombozytopenie

E-Laktame, Glykopeptide, Ofloxacin Cotrimoxazol, Glykopeptide, Ofloxacin

Gerinnungsstörungen Alkoholintoleranz

Methylthiotetrazol-Cephalosporine (z.B. Latamoxef), Penicilline Methylthiotetrazol-Cephalosporine

periphere Neuropathien

Metronidazol, Tetrazykline

ZNS-Störungen

Imipenem, Metronidazol, Minocyclin, Ofloxacin

Thrombophlebitis

Tab. 3.17

Beispiele für mögliche toxische Nebenwirkungen von Chemotherapeutika

213

Allgemeine Bakteriologie

214

TAB. 3.18 Allergische Nebenwirkungen Chemotherapeutika Allergietyp Manifestation Typl (Reagintyp)

Rötung, Schwellung, Urtikaria, Ödeme incl. Clottisödern, abdominelle Angina, Bronchospasmus, Hemikranie, anaphylaktischer Schock

Typ II (zytotoxischer Typ)

Leukopenie, hämolytische Anämie, thrombozytopenische Purpura

Typ III (Serumkrankheitstyp)

Serumkrankheit, vaskuläre Purpura

Typ IV (Spättyp)

Kontaktekzem, Photoallergie

von

Typ I-Ill: humoral-vermittelte Frühreaktionen; Typ IV: zellulär-vermittelt

reich, verbunden mit Angstgefühlen und Kreislaufdysregulationen kommt. Teratogene Wirkungen

Teratogene Wirkungen von Antibiotika können durch mutagene Wirkungen, aber auch durch toxische Schädigungen während der Organogenese bedingt sein. So führt die Gabe von Aminoglykosiden bei einer Schwangeren je nach Abhängigkeit von Dosierung und Dauer mit hoher Wahrscheinlichkeit zu einer Innenohrschädigung des Föten. Präklinische Untersuchungen von Antibiotika zur potentiell teratogenen Wirkung sind sehr schwierig und nicht immer aus Tiermodellen auf den Menschen übertragbar. Entsprechend ist eine höchstmögliche Zurückhaltung bei der Applikation von Antibiotika während einer Schwangerschaft geboten. Hier wird die Indikationsstellung maßgeblich durch die vitale Bedrohung der Mutter beeinflußt. Lediglich die meisten Penicilline und Cephalosporine, und mit Einschränkung Makrolide, können während der Schwangerschaft angewendet werden. Noch schwieriger ist die Feststellung einer potentiell karzinogenen Wirkung von Antibiotika, weil sich diese erst nach einer sehr langen Latenzzeit feststellen läßt. Hier sind Langzeitbeobachtungen nach Registrierung einer antibiotischen Substanz von entscheidender Bedeutung.

Biologische Nebenwirkungen

Biologische Nebenwirkungen beruhen auf unerwünschten Effekten der Hauptwirkung, also der antibakteriellen Wirkung von Antibiotika. Jede Antibiotikagabe ist mit einer mehr oder weniger starken Beeinflussung der Normalflora verbunden. Folge ist die zumindest partielle und zeitweise Reduktion der Normalflora und das isolierte Überwuchern resistenter Keimarten der jeweiligen Standortflora. Da die Normalflora z.B. durch die Produktion inhibitorischer Substanzen eine Rolle in der antiinfekliösen Barrierefunktion von Haut- und Schleimhäuten spielt, kann es zur Kolonisierung mit fakultativ-pathogenen Bakterien, Pilzen und Viren kommen. Klinisch manifestieren sich diese Nebenwirkungen z.B. als Soorkrankheit von Mund und Vagina, orale Aphthosis ulcerosa oder schwere Sekundärinfektionen wie eine Candidapneumonie. Eine solche Nebenwirkung ist auch die Antibiotika-assozierte Pseudomembranöse Kolitis (AAPC). Unter oder nach Antibiotikatherapie kommt es zu einem Überwuchern mit Clostridium difficile, das zwei Toxine bildet, die einen enterotoxischen bzw. zytopathischen Effekt auf die Mukosa des Darmes haben. Klinisch imponieren blutige Durchfälle mit kolikartigen abdomincllen Schmerzen, bis hin zum akuten Abdomen. Gleichzeitig besteht hohes Fieber mit Schüttelfrost. Klinisch-chemisch findet man Leukozytosc. BSG-Erhöhung. Thrombopenie und Hypalbuminämie. Koloskopisch zeigen sich ein Ödem der Mukosa. weiße Plaques und Pseudomembranen aus Fibrin, Granulozyten und Zelldetritus. Komplikationen sind das toxische Megakolon. spontane Dickdarmperforationen. Peritonitis und Sepsis (siehe auch spezielles Kapitel). Dem Vollbild der pseudomembranösen Kolitis kann eine Antibiotika-assoziiertc Diarrhöe ohne koloskopisch sichtbare Zeichen vorausgehen. Mit Ausnahme der Glykopeptide Vancomycin und Teicoplanin und von Metronidazol kann eine Therapie mit sämtlichen Antibiotika dieses Krankheitsbild zur Folge haben. Eine besondere Häufung findet sich nach oraler Gabe von Aminopcniciüinen mit geringer enteraler Resorption wie Ampicillin sowie nach systemischer Therapie mit Clindamycin.

Eine weitere wichtige biologische Nebenwirkung einer Antibiotikatherapie sind die HERXHEIMER-Reaktion oder HERXHEiMER-ähnliche Reaktionen. Darunter versteht man das Auftreten von Fieber. Schüttelfrost, Schweißausbruch, Tachykardie und eventuell akuter Niereninsuffizienz kurz nach Beginn einer Antibiotikatherapie. In schweren Fällen kann es zum Vollbild des Schocks kommen. Pathogenetisch zugrunde liegt die durch die Antibiotikawirkung einset-

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie

zende Bakleriolyse mit starker Anflutung von Endo toxin gram-negativer Bakterien. Zuerst wurde diese Reaktion in der Therapie klassischer Infektionskrankheiten wie Typhus abdominalis und Lues beschrieben. Eine ähnliche Reaktion kann in der Therapie von schweren Pneumokokkeninfektionen vor allem bei Säuglingen auftreten, hier verläuft der Pathomechanismus wahrscheinlich über einen initial hohen Anfall von Peptidoglykan bzw. Kapselpolysaccharid, was ebenfalls mit einer starken Mediatorfreisetzung einhergeht.

Struktur wurde 1987 vorgestellt (Oxazolidinone). Die eindrucksvolle Substanzvielfalt wurde durch Variationen bekannter Grundstrukturen erreicht. Wesentliche Kriterien für funktionale Klassifizierung von Antibiotika sind ihr Wirkungs- und Resistenz-Mechanismus, ihr Wirktyp, ihr antibakterielles Erregerspektrum, ihre Pharmakokinetik sowie ihre unerwünschten Nebenwirkungen.

3.5.5 Klassifizierung antimikrobieller Substanzen

3.5.6 Charakterisierung einzelner Antibiotikagruppen

Wichtigstes Einteilungskriterium für Antibiotika ist deren chemische Struktur.

Die derzeit klinisch bedeutsamen Substanzen können etwa 15 verschiedenen chemischen Grundstrukturen zugeordnet werden innerhalb eines Molekulargewichtsbereiches zwischen 200 (Fosfomycin, 182) und 2000 (Teicoplanin, 1900). Die meisten von ihnen wurden zwischen 1944 (Streptomycin) und 1962 (Clindamycin) entdeckt. Die letzte bemerkenswert innovative

Abb. 3.34 Kernstruktur von E-Laktamasen.

E-Laktame Antibiotika mit einem E-Laktam-Ring. Dieser entsteht durch Zyklisierung der ß-Aminopropionsäure (CH2NH2CH2COOH; vgl. Abb. 3.34). Der E-Laktam-Ring kann als Einzelring vorliegen (Monobaktame) oder - wie bei den meisten E-Laktam-Antibiotika - Teil eines bizyklischen Moleküls sein. Die Vielfalt der E-Laktame kommt durch Strukturvarialionen sowohl im zyklischen Teil des Moleküls (s. Abb. 3.34) als auch an dessen Seitenketten zustande (s. Tab. 3.19).

215

216

Allgemeine Bakteriologie

Penicilline (Pename)

Derivate der 6-Aminopenicillinansäure mit dem fünfgliedrigen Thiazolidin-Ring mit einem Schwefel- (thia-) und einem Stickstoff- (azo-) Atom. Derivatisierung durch unterschiedliche Azylreste an C„ (Tab. 3.19). Cephalosporine (Cepheme)

Grundstruktur ist die 7-Aminocephalosporansäure mit dem sechsgliedrigen Dihydrothiazin-Ring. Er erhöht die Stabilität gegenüber

Tab. 3.19 E-Laktame

E-Laktamasen, vermindert aber zugleich wegen seiner ungesättigten Bindung zwischen den C-Atomen 2 und 3 die chemische Stabilität der Cephalosporine (s. Abb. 3.34). Gegenüber den Penicillinen sind Derivatisierungen zusätzlich zur Acylierung der Aminogruppe an C7 (R,) auch noch am Q-Atom (R2) möglich. So entstand die im Vergleich zu den Penicillinen größere Substanzvielfalt der Cephalosporine. Eine Methoxy-Gruppe (CH3-O) am Kohlenstoffatom 7 bringt Aktivität gegen Anaerobier und erhöht

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie

Tab. 3.19 (Fortsetzung)

217

218

Allgemeine Bakteriologie

Tab. 3.19 (Fortsetzung)

die E-Laktamase-Festigkeit (Cephamycine, z.B. Cefoxitin, Cefotetan). Die Bedeutung dieser zweiten großen Gruppe der E-Laktam-Antibiotika liegt in der im Vergleich mit den Penicillinen insgesamt höheren Aktivität pro Gewicht und dem breiteren Spektrum. Alle Cephalosporine sind jedoch - im Gegensatz zu Penicillinen - inaktiv gegen Enterokokken, Listericn und Bordetella pertussis (s. Tab. 3.19). Carbapeneme

Bei Carbapenemen ist der endozyklische Schwefel durch ein Kohlenstoffatom ersetzt (vgl. Abb. 3.34). Wichtige Vertreter sind das Thienamycin sowie das Meropenem (Abb. 3.35). Thienamycin ist chemisch instabil und liegt deshalb als Amidinderivat vor. Formamidin-Thienamycin (Imipenem) wird intrarenal durch ein Bürstensaumenzym (Dehydropeptidase I) größtenteils hydrolysiert. Dieser Zinkmetallopeptidase der proximalen Tubuli kommt als physiologische

Abb. 3.35 Carbapeneme.

Funktion die Spaltung der filtrierten Oligopeptide in rückresorbierbare Aminosäuren zu. Imipenem wird nur in Kombination (1:1) mit einem Dchydropeptidase-Inhibitor, dem Cilastatin, appliziert. Cilastatin verlängert die Eliminationshalbwertszeit des Imipenems auf etwa 60 Minuten, erhöht seine Urinwiederfindungsrate und neutralisiert weitgehend die Nephrotoxizität des reinen Imipenems. Meropenem ist ein Carbapenem, das ohne Dehydropeptidase-Inhibitor hinreichend stabil ist. Carbapeneme sind im Vergleich mit der Mehrzahl anderer E-Laktame stabil gegen E-Laktamasen und traversieren zudem die äußere Membran deutlich besser. Dementsprechend ist ihr Wirkspektrum breiter. Wenig empfindlich sind Enterokokken, Proteus spp. (insbesondere P. mirabilis), resistent S. maltophilia und Methicillin-resistente Staphylokokken. Unter Therapie kommt es bei P. aeruginosa zu Resistenz als Folge eingeschränkter Permeabilität (Fehlen des Proteins OmpD2 der äußeren Membram). Ver-

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie

einzelt wurden Carbapenemasen (mit Zink im aktiven Zentrum) als Resistenzmechanismus nachgewiesen (Tab. 3.20). Monobaktame

Einziges E-Laktam mit monozyklischer Kernstruktur, der 3-Amino-monobaktamsäure (s. Abb. 3.34), ist das Aztreonam. Aztreonam erhält aufgrund seiner fehlenden Aktivität gegen grampositive sowie anaerobe Spezies die physiologische grampositive Flora der Haut und der Schleimhäute wie z.B. die anaerobe Flora der intestinalen Mukosa und deren natürliche Abwehr- (Platzhalter-) Funktion und trägt so zur Kolonisationsresistenz bei (Resi-

stenz gegenüber Kolonisierung der Darmmukosa mit Enterobacteriaceae nach deren Entfernung durch vorangegangene selektive Darmdekontamination). Aztreonam ist eine Alternative bei Allergie gegenüber anderen E-Laktam-Substanzen, da Parallelallergie mit ihnen extrem selten vorkommt. E-Laktamase-lnhibitoren

E-Laktamase-bedingter Resistenz kann durch die Synthese E-Laktamase-fester E-LaktamStrukturen oder durch Substanzen, welche die E-Laktamasen irreversibel inaktivieren, begegnet werden. Diese ß-Laklamase-Inhibitoren besitzen ebenfalls E-Laktam-Struktur und werden

Tab. 3.20 Klassifizierung bakterieller E-Laktamasen funktionale 1 Klasse 1a

molekulare Klasse C

bevorzugte Substrate

1b

C

repräsentative Enzyme

–

Lokalisation des 2 Wo-Gens C

auch Cephamycine

–

–

P

negativer Bakterien MIR-1, CMY-1, CMY-2, FOX-1, FOX-2, ACC-1, u.a.

2a

A

Penicilline

+

–

P

Penicillinasen gram-

2b

A

Penicilline, Cephalosporine Penicilline, Cephalosporine, Monobaktame

+

–

C/P

positiver Bakterien TEM-1,TEM-2, SHV-1

2be

A

+

–

P

2br

A

Penicilline, SchmalspektrumCephalosporine Penicilline, Carbenicillin Penicilline, Oxacillin Cephalosporine

–

–

P

2c

A

+

–

P

2d 2e

D A

+ +

– –

P C

2f

A

Penicilline, Cephalosporine, Carbapeneme

+

–

C/P

3

B

E-Laktame einschließ-

–

Cephalosporine, meist

hemmbar von Clavulan- EDTA säure

–

+

C/P

lich Carbapeneme 4

?

Penicilline

AmpC Enzyme gram-

TEM-3 und 63 weitere, SHV-2 und 31 weitere, CTX-M-1 bis 17, PER-1 und -2, K. oxytoca K1 TEM-30 und 18 weitere, Mutanten von TEM-1 oder TEM-2 sowie SHV-10 PSE-1, -3 und-4, CARB-3,4, AER-1 OXA-1 bis -35, PSE-2 induzierbare Cephalosporinasen bei P. vulgaris NMC-A, IMI-1 bei Enterobacter cloacae, KPC-1 bei K. pneumoniae, Sme-1 bei 5. marcescens Metallo- (2n-) Enzyme: L1 bei 5. maltophilia, CcrA bei Bacteroides fragilis

–

–

C

Pencillinase bei Burkhotderia, SAR-2

1

nach BUSH, K. et al., Antimicrob. Agents Chemother. 1995, aktualisiert auf Stand Mai 2001

² P = Plasmid-codiert, C = chromosomal codiert

219

220

Allgemeine Bakteriologie

daher „versehentlich" an das aktive Zentrum der Enzyme gebunden. E-Laktamase-Inhibitoren hemmen die Mehrzahl der Plasmid-codierten E-Laktamasen (s. Tab. 3.20, Gruppe 2b, 2be), sind aber nur wenig aktiv gegen AmpC E-Laktamasen (Gruppe la, lb). Derzeit sind als ß-Laktamase-Inhibitoren verfügbar: Clavulansäure in Kombination mit Amoxycillin oder Ticarcillin, Tazobactam in Kombination mit Piperacillin und Sulbactam in Kombination mit Ampicillin. Sulbactam steht auch zu freier Kombination zur Verfügung. Da sie selbst über keine relevante antibakterielle Aktivität verfügen, werden sie nur zusammen mit E-Laktam-Antibiotika eingesetzt. Resistenzmechanismen

Resistenz, durch E-Laktamasen Häufigste Ursache der Resistenz gegenüber ß-Laktam-Antibiotika ist deren hydrolytische Inaktivierung durch E-Laktamasen. Bakterien produzieren eine große Vielfalt von E-Laktamasen. Sie werden unterschieden nach ihrer Aktivität gegenüber verschiedenen E-Laktam-Antibiotika (Substratprofile, zumeist charakterisiert als relative Hydrolyserate mit Penicillin G oder Cephaloridin als Bezugssubstraten), ihrer Hemmbarkeit durch E-Laktamase-Inhibitoren, der Induzierbarkeit ihrer Synthese, der Lokalisation des ßLaktamase-Gens in der Zelle (chromosomal oder plasmidisch), chemischen Merkmalen (Molekulargewicht, isoelektrischer Punkt) oder ihrer spezifischen Aminosäuresequenz. Durch Vergleich der Aminosäuresequenz sowie der Raumstruktur der reifen, gefalteten Enzyme lassen sich E-Laktamasen in vier molekulare Klassen einteilen. Drei darunter (A, C und D) haben Serin im aktiven Zentrum, während bei ß-Lak-

tamasen der Gruppe B Zink anstelle von Serin im aktiven Zentrum steht (Metallo-Enzyme). Eine Klassifizierung, die sowohl molekulare Struktur als auch funktionale Eigenschaften integriert, gibt Tab. 3.20. E-Laktamasen bei Gram-positiven. Hier haben die Penicillinasen der Staphylokokken (Gruppe 2a) die größte Bedeutung erlangt. Bei durchschnittlich 80% der nosokomialen Infektionen mit 5. aureus muß auf die Penicillinase-stabilen Isoxazolylpenicilline (z.B. Oxacillin) oder auf Cephalosporinc ausgewichen werden. E-Laktamasen bei Gram-negativen. Bei gram-negativen Spezies ist die Vielfalt der E-Laktamasen wesentlich größer. Bisher wurden über 200 verschiedene charakterisiert. Unter ihnen haben E-Laktamasen der Klasse 1 (AmpC-Enzymc z.B. bei Citrobacter freundii, Enterobacter spp., Serratia spp., Morganella morganii, P. aeruginosa) und der Klasse 2b (TEM- sowie SHVEnzyme - häufig bei K. pneumoniae, E. coli, TEM-1 zusätzlich bei Haemophilus influenzae, N. gonorrhoeae, N. meningitidis) die größte Verbreitung und therapeutische Relevanz. Die PSE- (Pseuclomonas-speciRc enzymes) sind ebenso wie die OXA-E-Laktamasen neben denen der Klasse 1 unter E-Laktam-resistenten P. aeruginosa-Stämmen häufig. Carbapenemase-produzierende Stämme sind ein charakteristisches Merkmal für S. maltophilia, dagegen unter Enterobacteriaceae bisher selten. Die Raumstruktur einer E-Laktamase der A-Klasse (TEM-1) läßt eine rein helikalc Domäne und eine gemischte Domäne aus ß-Faltblättern (5, antiparallel), die von a-Helices umgeben sind, erkennen (Abb. 3.36, Farbtafeln). Das aktive Zentrum mit Serin in Position 70 findet sich am N-Terminus der Helix 2. Zwischen ihm und dem B3-Faltblatt liegt die Oxyanion-Tasche, in der das Substrat (hier Cefotaxim) in einer für seine Hydrolyse optimalen Position fixiert wird. Beispiele für Austausche von Aminosäuren im TEM-1 Enzym sind mit der Numerierung ihrer Position angegeben.

Abb. 3.36 Tertiärstruktur einer Klasse A-E-Laktamase (TEM) (aus: KNOX, Antimicrobial Agents Chemother. 39(1995)2593-2601; verändert).

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie

Diese Mutationen wurden in Wa-Genen von Erregern aus Patienten gefunden. Die Stämme waren verglichen mit TEM-1 produzierenden Stämmen gegen zusätzliche E-Laktam-Antibiotika (auch solche mit OxyiminoStruktur) resistent (extended spectrum E-Laktamascn, ESBL, Gruppe 2be in Tab. 3.19).

Veränderung der Bindefähigkeit der PBPs

Insbesondere bei Gram-positiven ist E-Laktam-Resistenz nicht selten durch Verminderung der Konzentration an PBPs in der Zytoplasmamembran oder/und durch Reduktion von deren Bindefähigkeit bedingt. So sind an der Penicillin-Resistenz von Pneumokokken zugleich reduzierte Bindefähigkeit, Verlust einzelner PBPs und Zugewinn neuer PBPs beteiligt. Die Gene für PBPs sind mosaikartig angeordnet aus DNASegmenten empfindlicher Pneumokokken und Sequenzen resistenter saprophytärer Streptokokken. Die zunehmende klinische Bedeutung dieses Mechanismus der E-Laktam-Resistenz steht im Zusammenhang mit dem Selektionsdruck durch jahrzehntelange Verwendung von Penicillinen für die Therapie von Infektionen mit S. pneumoniae, S. viridans-Gruppe, Enterokokken. N. gonorrhoeae. H. infliienzae und 5. aureus. Bei S. aureus kommt die E-Laktamase-bedingte ßLaktam-Rcsistenz im Gegensatz zu der bei N. gonorrhoeae und H. infliienzae zustande durch Synthese eines neuen zusätzlichen PBPs, des PBPs 2a (auch 2:) mit sehr geringer Affinität für E-Laktame einschließlich der Pcnicillinase-festen Isoxazolylpenicilline (z.B. Oxacillin und Methicillin). Das kodierte Strukturgen mec-a liegt auf einem zusätzlich in das S. aureus-Genom intergrierten DNA-Element und benötigt zur Expression in einer komplexen Regulation weitere Gene wie vor allem fem-a-fem-d. Die Methicillin-Resistenz wird daher bei vielen 5. aureus-Slämmcn unter Standardbedingungen nur von einem geringen Anteil (1 unter 106) der Zellen einer Population exprimiert (Heteroresistenz) und kann deshalb übersehen werden. Zuverlässig erkennbar wird sie, wenn die Bebrütungstemperatur abgesenkt (30-32 "C), die Kochsalzkonzentration auf 2-4% erhöht und die Bcbrütungsdauer auf 24^48 Stunden verlängert wird. Die Methi-

cillin-Resistenz bedeutet zugleich Resistenz gegenüber allen Antibiotika mit E-Laktamstruktur und ist häufig kombiniert mit Resistenz gegen Nicht-E-Laktame wie Makrolidc, Clindamycin, Aminoglykoside, Tetrazyklin, Cotrimoxazol und Chinolone.

Aminoglykoside Sie sind sekundäre Stoffwechselprodukte von Bakterien (Streptomyces-Derivate wie Streptomyein, Neomycin, Kanamycin, Tobramycin) oder von Pilzen (Micromonospora-Denvale wie Geniamicin, Sisomicin, Netilmicin, hepamicin). Aminoglykoside sind Polyamine aus mindestens zwei Aminozuckern, die glykosidisch an einen sechsgliedrigen Aminocyclitol-Kern (meist 2Desoxy-streptamin) gebunden sind. Sie unterscheiden sich hauptsächlich in ihren Aminozuckern (Abb. 3.37). Wirkungsmechanismus

Aminoglykoside verhindern die Bindung der Formyl-Methionyl-Transfer-RNA an das Ribosom. Damit kommt es nicht zur Bildung des für den Fortgang der Proteinbiosynthese notwendigen Initiationskomplexes. Streptomycin kann zusätzlich Ablesefehler des mRNA-Codons verursachen, die zum Verlust der Proteinfunktion führen. Voraussetzung für die Aminoglykosidwirkung ist eine hinreichend hohe Konzentration an den Ribosomen. Dazu ist intrazelluläre Akkumulation der Aminoglyokoside notwendig. Resistenzmechanismen

Eingeschränkte Aufnahme Aminoglykoside müssen, um zu ihrem ribosomalen Angriffspunkt vorzudringen, die Zytoplasmamembran durchqueren, bei gramnegativen Erregern vorher

Abb. 3.37 Aminoglykoside (Beispiel Kanamycin ß) (aus: BAUERNFEIND und SHAH, 1995).

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Allgemeine Bakteriologie

222

zusätzlich die äußere Membran. Initial werden Aminoglykoside bei Gramnegativen an positive Ladungen der Lipopolysaccharide, der outer-membrane-Proteine oder der Phospholipidc gebunden. Von dort werden sie mit Hilfe eines von den Aminoglykosiden selbst ausgelösten Mechanimus durch die äußere Membran transportiert. Dabei verdrängen die stark positiv geladenen Aminoglykoside Mg2~-Ionen aus ihrer Brückenbildung zwischen benachbarten LPS-Molekülcn. Dadurch erhöht sich die Durchlässigkeit der Zytoplasmamembran. Die unterschiedliche Wirkung desselben Aminoglykosids bei verschiedenen Spezies (z.B. E. coli, P. aeruginosa) konnte auf Abweichungen in der Zusammensetzung der LPS-Phosphate oder Proteine in der äußeren Membran zurückgeführt werden. Der Transport der Aminoglykoside durch die Zytoplasmamembran erfordert Energie. Er erfolgt aktiv (energieabhängig) mit Hilfe von AminoglykosidTransportproteinen und wird von Anaerobiosc. niedrigen pH-Werten, divalenten Kationen, Polyaminen und Chloramphenicol beeinträchtigt. Transportdcfiziente Erregergruppen wie Anaerobicr, Entcrokokken, Streptokokken, sind nur vermindert empfindlich bzw. resistent gegen Aminoglykoside. Transportdcfiziente Mutanten sind häufig wachstumsvcrzögcrl und nur zur Ausbildung von Zwergkolonien befähigt (z.B. small colony variants von S. aureus).

Enzymatische

Veränderung

(Modifikation)

Die Inaktivierung erfolgt durch Addition eines Acetylrestes (N-Acetylierung) an eine Aminogruppe oder eines Nucleotid- (O-Nucleolidylierung) oder Phosphatrestes (O-Phosphorylicrung) an eine Hydroxylgruppe des Aminoglykosid-Moleküls. Die Aminoglykoside können so während der Passage durch die Zytoplasmamembran noch vor dem Erreichen ihrer Zielstruktur am Ribosom inaktiviert werden. Für jede dieser Modifikationen gibt es unterschiedliche Enzyme, die jeweils bestimmte Amino- oder Hydroxylgruppen modifizieren. Die Aminoglykosidmodifizierenden Enzyme werden nach dem Typ der Modifikation und der Position benannt, an welcher sie erfolgt. Da dieselben Modifikationen bei unterschiedlichen Aminoglykosiden von mehreren Enzymen ausgeführt werden können, werden sie noch durch römische Ziffern unterschieden (vgl. Abb. 3.37). Zudem werden Enzym-Subtypen je nach Art der modifizierten Aminoglykosid-Substrate differenziert. So acetyliert z.B. ACC(3)-I die Aminogruppe in Position 3 des zentralen Aminozuckers von Gentamicin, ACC(3)-II hingegen die von Gentamicin, Tobramycin und Netilmicin. Wirkspektrum

Das Wirkspektrum der Aminoglykoside umfaßt Enterobacteriaceae und P. aeruginosa (nicht bei Kanamycin), Staphylokokken, Mycobacterium tuberculosis (Streptomycin, Amikacin, Kanamycin). Gentamicin ist im klinischen Gebrauch das „Basis"-Aminoglykosid, Tobramycin weist eine

erhöhte Wirksamkeit gegen Pseudomonas spp. auf, Netilmicin gegen Staphylokokken, und Amikacin hat die Bedeutung eines „Reserve"'Aminoglykosids. Sie sind nur schwach aktiv gegen Streptokokken und inaktiv gegenüber Anaerobiern. Die vorherrschende Verwendung von Aminoglykosiden ist die Kombination mit anderen Antibiotika, zumeist mit E-Laktamen. Damit wird das Risiko der Resistenzentwickking unter der Therapie verhindert oder vermindert, zudem kann ein Synergismus der Kombinationspartner erreicht werden (z.B. wirkt Penicillin plus Gentamicin häufig synergistisch und bakterizid gegen Enterokokken und ist damit wirksam bei Enterokokken-Endocarditis; ähnliches gilt für Staphylokokken und Streptokokken). Aminoglykoside sind in erhöhter Konzentration toxisch für Niere, Gehör- und Gleichgewichtsorgan. Entscheidend ist hier die chronisch-kumulative Toxizität, nicht der akut hohe Serumspitzenspicgel wie früher angenommen. Deshalb können sie einmal täglich appliziert werden. Das Bestimmen der Aminoglykosidkonzentrationen im Serum des Patienten ist bei eingeschränkter Nierenfunktion indiziert, um nach Wirkung und Nebenwirkungen optimal zu dosieren (geringe therapeutische Breite, d.h. kleiner Konzentrationsabstand zwischen wirksamer und toxischer Konzentration). Tetrazykline

Ihr Grundgerüst besteht aus vier fusionierten 6er Kohlenstoffringen (Hydronaphthazen) (Abb. 3.38). Wirkungsmechanismus

Tetrazykline binden reversibel (bakteriostatischer Wirktyp!) an die 30S-Untereinheit des bakteriellen Ribosoms. Der Bindekomplex schließt neben 16S rRNA ribosomale Proteine ein. Tetrazykline zerstören die Bindung zwischen Codon (mRNA) und Anti-Codon (tRNA). Dadurch gelangt die Aminoazyl-tRNA nicht mehr an den ribosomalen Akzeptor. Die Selektivität der Tetrazyklinwirkung läßt sich nicht mit strukturellen Unterschieden zwischen pro- und cukaryontischen Ribosomen allein erklären. Hauptursache ist die auf bakterielle Zellen beschränkte Fähigkeit, Tetrazyklin aktiv aufzunehmen und intrazellulär anzureichern (20-30fach in S. aureus, lOOfach in E. coli). Resistenzmechanismen

Tetrazyklin-Resistenz kann bedingt sein durch aktives Ausschleusen von intrazellulärem Tetra-

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie

Abb. 3.36 Tetrazyklin-Crundgerüst.

zyklin durch in die Zytoplasmamembran integrierte Effluxpumpen, der häufigste Mechanismus bei Enterobacteriaceae, durch Ausschluß der Bindung an die Ribosomen (ribosomal protection). z.B. bei Neisserien, Haemophilus, Mykoplasmcn, Ureaplasmcn, oder durch Modifizierung der Tetrazyklinstruktur zu einem inaktiven Produkt bei Bacteroides spp. Wirkspektrum

Es umfaßt aerobe und anaerobe gram-positive und gram-negative Arten, auch intrazelluläre Erreger wie Chlamydien, Mykoplasmen, Rickettsien, Borrelien, Mycobacterium marimim. Bei fast allen Spezies treten resistcntc Stämme auf. Häufig oder immer (natürlich) resistent sind Proteus, Providencia, Serratia, P. aeruginosa, S. maltophilia, Enterokokken. Tetrazyklin-Resistenzgene liegen überwiegend auf Plasmiden oder Transposons. Die Tetrazyklin-Derivate unterscheiden sich nur wenig in ihrer antibakteriellen Aktivität, sondern hauptsächlich in ihrer Pharmakokinetik bei oraler Gabe: niedrigere Resorption von Tetrazyklin (30%), höhere von Doxyzyklin (80%), vollständige von Minozyklin; Eliminationshalbwertszeiten zwischen 6 Stunden (Chlortetrazyklin) und 18 Stunden (Doxyzyklin). Die Exkretion erfolgt renal, ausgenommen Doxyzyklin mit überwiegend hepatischer Ausscheidung (bei Niereninsuffizienz verwendbar). Charakteristische Nebenwirkungen des Tetrazyklins sind gastrointestinale Störungen, Photosensibilisierung, Zahndekolorisierung (deshalb erst ab 8 Jahren empfohlen).

Wirkungsmechanismus

Chloramphenicol blockiert die Bindung der Aminoacyl-tRNA. Die Aminosäuren können nicht mehr an die Peptidtransferasen fixiert werden, die Peptidsynthese wird abgebrochen. Resistenzmechanismen

Resistenzmechanismen sind verminderte Permeation oder Acetylierung zum inaktiven Diacctyl-Chloramphenicol. Die Gene für die Acetyl-Transferase sind auf R-Faktoren lokalisiert, oft mit dem Gen für Ampicillin-Resistenz gekoppelt. Daher auch heute trotz nur noch seltener Verwendung von Chloramphenicol z.T. noch hohe Resistenzquoten.

Wirkspektrum Therapeutisch wichtig ist die Aktivität gegenüber den häufigsten Erregern von Meningitis im Kindesalter (H. influenzae, N. meningitidis, S. pneumoniae). Die Therapie mit Chloramphenicol ist aufgrund seiner hämatologischen Nebenwirkungen (reversible Knochenmarksdepression, selten irreversible aplastische Anämie) und häufig auftretender Resistenz auf wenige Indikationen eingeschränkt wie Hirnabszeß (Anaerobierwirkung) und Meningitis (hohe Liquorgängigkeit). Bei Typhus sowie Paratyphus A und B wurde es inzwischen von den Chinolonen (Ciprofloxaein) abgelöst.

Chloramphenicol Chloramphenicol (Abb. 3.39) wurde ursprünglich aus Streptomyces venezuelae isoliert, wird heute aber totalsynthetisch hergestellt.

Abb. 3.37 Chloramphenicol.

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224

Allgemeine Bakteriologie

Trimethoprim und Kombinationen mit Sulfonamiden Trimethoprim ist ein vollsynthetisches, als Naturstoff nicht bekanntes Pyrimidinderivat (Abb. 3.40). Sulfonamide sind vollsynthetische Amide aromatischer Sult'onsäuren (s. Abb. 3.40). Wirkungsmechanismus

Trimethoprim inhibiert die Dihydrofolatreduktase, eine Stufe der bakteriellen Folsäuresynthese, welche der von den Sulfonamiden gehemmten unmittelbar folgt. Die bakterielle Dihydrofolsäurereduktase ist etwa 50000mal Trimcthoprim-empfindlicher als die des Menschen. Sulfonamide werden aufgrund ihrer Strukturähnlichkeit mit para-Amino-benzocsäure (PABS) an deren Stelle gebunden und antagonisieren so kompetetiv die bakterielle Synthese der Dihydropteridinsäure, der Vorstufe der Dihydrofolsäure. Da eukaryontische Zellen Dihydrofolsäure und andere Folate exogen aufnehmen, trifft die Blockade selektiv Prokaryonten, in hohen Konzentrationen auch eukaryonte Mikroorganismen (z.B. Pneumocystis carinü). Die sequentielle Blockade des Folsäurcsyntheseweges durch Sulfonamide und Trimethoprim führt häufig zu einem hohen Synergismus. Da Trimethoprim die Bereitstellung von Tetrahydrofolsäure für die Synthese von Nukleinsäurebausteinen blockiert, kann seine Wirkung durch Zusatz von Thymidin antagonisiert werden. Nährmedien für die Resistenzbestimmung von Trimethoprim, Sulfonamiden oder Kombinationen daraus müssen deshalb Thymidin-frei sein.

Trimethoprim-Sulfonamid- Kombinationen bestehen zumeist aus einem Teil Trimethoprim auf vier Teile eines Sulfonamids. Mit ihnen lassen sich im Mittel in vitro Aktivitätssteigerungen gegenüber den Einzelsubstanzen um mehr als das Sfache erzielen. Synergismus ist am häufigsten

Abb. 3.40 Trimethoprim und Sulfonamide.

bei gleichzeitiger Empfindlichkeit gegenüber beiden Partnern (95%), bei nur Sulfonamid-resistenten Stämmen 60%, bei nur Trimethoprimresistenten Stämmen 45% und bei Resistenz gegenüber beiden Partnern in etwa 10%. Die optimale Konzentrationsrelation liegt bei einem Teil Trimethoprim auf 19 Teile Sulfonamid. Für Sulfonamide allein gibt es kaum noch therapeutische Indikationen wegen häufiger Resistenz und unerwünschter Nebenwirkungen. Sie sind jedoch weiterhin wesentliche Bestandteile von Antibiotika-Kombinationen, z.B. mit Pyrimethamin (Toxoplasmose, Chloroquin-resistente Malaria), vor allem aber mit Pyrimidinderivaten wie Trimethoprim. Wesentliche Indikationen für eine Therapie mit Trimethoprim-Sulfonamid-Kombinationen sind Prostatitis (Trimethoprim wird im Prostatasekret angereichert), Orchitis, Epididymitis mit empfindlichen Erregern, Harnwegsinfektionen, Suppressionstherapie bei chronisch-rezidivierenden Harnwegsinfekten bei Frauen (nicht während der Schwangerschaft), Infektionen mit Pneumocystis carinii (bei HlV-infizierten oder anderen abwehrgeschwächten Patienten in dreifacher Dosierung, etwa 6 g pro Tag). 4-Chinolone 4-Chinolone sind vollsynthetische Verbindungen, die erst vor kurzem auch als Naturstoffe nachgewiesen werden konnten (bei Aktinomyzeten). Sie sind Derivate der 4-Oxo-l,4-dihydrochinolincarbonsäureStruktur (Abb. 3.41). Substanzen mit einem zweiten N-Atom in Position 8 des Bizyklus (Naphthyridine, Azachinolone) werden aufgrund von Gemeinsamkeiten in ihrem Wirkungs- und Resistenzmechanismus

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie

Abb. 3.41 4-Chinolone.

(Parallelresislenz) sowie unerwünschten Nebenwirkungen chemisch ungenau ebenfalls den Chinolonen zugeordnet (z.B. Nalidixinsäure und Trovafloxacin). Die Nalidixinsäure, die erste therapeutisch bedeutsame Substanz dieser Gruppe (1962), ist unwirksam gegen grampositive Erreger und P. aeruginosa und aufgrund geringer Gewebepenetration nur für die Therapie unkomplizierter Harnwegsinfektionen brauchbar. Seither wurden zahlreiche Modifikationen der Grundstruktur durchgeführt zur Verbreiterung des antibaktcriellen Spektrums, zur Verbesserung der Aktivität (pro Gewicht) und der Pharmakokinetik (Gewebegängigkeit, Eliminationshalbwertszeit, die Einmalgabe pro Tag zuläßt) sowie zur Verminderung unerwünschter Wirkungen. Unter den in den vergangenen 35 Jahren erprobten Substitutionen erwiesen sich als besonders effektiv die Addition eines Fluoratoms (F/woro-chinolone) in Position 6 (erhöhte Aktivität gegen gramnegative Stäbchen und gramposilive Kokken, Norfloxacin, 1980), eines Cyclopropyl-Ringes in Position i (verstärkte Aktivität gegen P. aeruginosa, Ciprofloxacin, 1983) und verschiedene Substituenten in Position 7 (weitere Steigerung der Aktivität gegen grampositive Kokken, verlangsamte Elimination, verminderte Effluxierbarkeit bei bizyklischen Resten) (vgl. Tab. 3.21). Durch eine Methoxy-Gruppe an X« anstelle eines Chlors konnte die photosensibilisierende Wirkung vermindert werden. Wirkungsmechanismus

Zur Replikation der DNA müssen die ineinander verwundenen Stränge des zirkulären bakteriellen Chromosoms aufgedreht werden. Dies würde ein positives Überspiralisieren im Bereich des Replikationspunktes verursachen und die Fortsetzung des Replikationsvorganges blockieren. Das verhindert die DNA-Gyrase, eine Topoisomerase. Topoisomerasen sind Enzyme, welche die räumliche Beziehung der DNA-Stränge zueinander ordnen. Sie durchschneiden dazu einen (Typ I) oder beide (Typ II) Stränge der DNA und führen einen anderen Abschnitt des DNA-Doppelstranges durch die Schnittstelle (Abb. 3.42). Dieser wird für die Dauer des Vorgangs fixiert, so daß die Enden nicht frei rotieren können. Nach dem Durchführen der DNA wird die Schnittstelle wieder geschlossen.

Die Gyrase A-Untereinheit (GyrA) ist neben derParC-Untereinheit der Topoisomerase IV Angriffspunkt der Chinolonc. Sie binden an die ungepaarten Basen im Anschluß an den Doppelstrangschnitt. Dort verhindern sie das Wiederversiegeln der Schnittstelle und die weitere Funktion der Gyrase durch deren Einschließen in eine kovalente Bindung aus Enzym und DNA. Resistenzmechanismen

Mechanismen für bakterielle Chinolon-Resistenz bei Gramnegativen beruhen auf mutativen Veränderungen der DNA-Gyrase oder der Topoisomerase IV (Tab. 3.22) sowie erhöhtem Efflux der Chinolone oder verminderter intrazellulärer Akkumulation. Veränderungen der Typ I Topisomerase Die Aminosäure-Austausche mit Resistenzfolge liegen gehäuft in den „quinolone resistance determining regions" (ORDR) der Gyrase und der Topoisomerase IV. Für die Chinolon-Resistenz sind bei gramnegativen Erregern primär Mutationen im gyrA-Gen, bei grampositiven hingegen im parC-Gen entscheidend. Verminderte Aufnahme der Chinolone Auf dem Weg zu ihrem Angriffspunkt, der DNA-Gyrase im Zytoplasma, müssen die Chinolone die Zytoplasmamembran traversieren, bei Gramnegativen zusätzlich die äußere Membran. Dies erfolgt entweder passiv durch Diffusion, wobei Chinolone ähnlich wie Aminoglykoside sich selbst die Passage erleichtern, indem sie die Durchlässigkeit der Zytoplasmamembran durch Herauslösen der für die Geschlossenheit der Lipopolysaccharid-Struktur notwendigen divalenten Kationen erhöhen (self-promoted uptake). Daneben nutzen Chinolone den Weg durch Porin-Proteine, insbesondere des OmpF, in die Zelle. Bei fehlendem OmpF ist die Aufnahme hydrophiler Chinolone (z.B. bei Ciprofloxacin) auf die Hälfte vermindert. Dadurch erhöht sich die MHK auf das 2-4fache, und da es sich um einen unspezifischen Mechanismus handelt, zugleich auch für Tetrazykline, Chloramphenicol und

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Allgemeine Bakteriologie

226

Tab. 3.21 Struktur-Modifikationen bei neueren Fluorochinolonen

einige E-Laktam-Antibiotika. Die Expression des ompF-Gens wird reguliert entsprechend den Milieubedingungen. Dies erfolgt z.T. über nicht-assoziierte Gene, z.B. marA (multiple antibiotic resistance).

Aktiver Efflux Zur Chinolon-Resistenz kann das Herauspumpen eingedrungener Moleküle, z.B. bei K. pneumoniae oder S. aureus beitragen . Der Mechanismus ist im Prinzip derselbe wie für die Sekretion von Proteinen und für

die Resistenz gegen Tetrazyklin oder von menschlichen Zellen gegen Zytostatika. Neuere Chinolone mit einer bizyklischen Seitenkette an C7 (Moxifloxacin. Trovafloxacin, vgl. Tab. 3.20) können aufgrund ihrer Größe nicht mehr effluxiert werden. Die breite Verwendung der Chinolone, begünstigt durch deren Verfügbarkeit in resorbierbarer Form, erzeugt Selektionsdruck zugunsten resistenter Stämme. Dies zeigt eine Zunahme der Resistenz z.B. von P. aeragmasa-Isolaten von 1983 und 1997 gegenüber Ci-

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie

Abb. 3.42 DNA-Cyrase (aus HOOPER und WOLFSON: Quinolone - Antimicrobial d Agents. 2" ed.,1993).

profloxacin von 6,5% auf 36%. Ein ähnlicher Trend ist zu erkennen bei Staphylokokken und neuerdings auch bei Enterobacteriaceae. Von besonderer therapeutischer Relevanz ist dabei, daß Chinolon-Resistenz unter Stämmen mit Resistenz gegen andere AntibiotikaGruppen (wie z.B. E-Laktame) höher ist als bei sensitiven. So z.B. unter K. pneumoniae-lsolaten aus nosokomialer Pneumonien, die aufgrund ihrer Fähigkeit zur Produktion einer E-Laktamase mit erweitertem Spektrum (ESBL) resistent sind gegen Oxyimino-Cephalosporine. Ebenso ist unter Methicillin-resistenten S. aureus der Anteil Chinolon-resistenter deutlich hoher als unter Methicillin-sensitiven. Diese Beispiele zeigen einen Trend hin zur Multiresistenz durch Akkumulation von Genen für die Resistenz gegenüber Antibiotika verschiedener Gruppen auf. Wirkspektrum

Moderne Fluorochinolone sind aktiv sowohl gegen gram-positive als auch gram-negative Spezies einschließlich P. aeruginosa. Sie sind im allgemeinen weniger aktiv gegen Streptokokken, Enterokokken, Borrelien, Listerien, Mycobacterium tuberculosis. Primäre Indikationen für die Therapie mit 4Chinolonen sind bakterielle Enteritiden, Typhus (Sanieren von Dauerausscheidern), Osteomyelitiden, Otitis externa maligna und andere Infektionen mit P. aeruginosa (z.B. Harnwegsinfektionen bei Querschnittgelähmten, Mukoviszidose), Haut- und Weichteilinfektionen (hohe Gewebskonzentrationen!).

Da bei Hunden irreversible Knorpelschäden stark belasteter Gelenke sowie Schädigungen am Auge beobachtet wurden, ist die Anwendung von 4-Chinolonen vor Abschluß der Knochenbildung und während der Schwangerschaft ausgeschlossen. Fosfomycin

Fosfomycin wird von verschiedenen Streptomyceten produziert. Die chemische Struktur (Abb. 3.43) läßt keine Verwandtschaft mit anderen Antibiotika erkennen, deshalb keine Parallelresistenz oder Kreuzallergie. Fosfomycin gehört zu den kleinsten Antibiotika (MG 182). Es kann die Zytoplasmamembran jedoch nur per aktivem Transport passieren und hemmt die Peptidoglykansynthese.

Tab. 3.22 Topoisomerasen

Typ

Enzym

Untereinheiten

1 I II 11

1 111 II (DNA-Cyrase) IV

TopA TobB GyrA, CyrB ParC, ParE

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Allgemeine Bakteriologie

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Wirkungsmechanismus

Makrolide, Lincosamide und StreptograminB binden an die 50S-Untereinheit am Ribosom und blockieren dort die Elongation der Peptidketten. Resistenzmechanismen

Abb. 3.43 Fosfomycin, (-)-(i R, 2S)-1,2-Epoxypropyl-phosphonat-di-natrium.

Antibakterielles Spektrum: Staphylokokken (höherer Anteil resistenter Stämme bei MRSA und Koagulase-negativen Staphylokokken), Streptokokken, Enterobacteriaceae (ausgenommen Klebsiella spp., Providencia spp., M. morganii), Haemophilus, Neisseria, eingeschränkt P. aeruginosa. Kombinationspartner für Aminoglykoside, E-Laktame und evtl. Gylokopeptide. Makrolide Grundstruktur ist ein Laktonring (Laktone sind innere Ester von Hydroxycarbonsäuren), an den z.B. beim Erythromycin Aminozucker (ß-D-Desoxamin) sowie ein neutraler Zucker (cx-L-Cladinose) gebunden sind (Abb. 3.44). Neue Makrolide sind in Tab. 3.23 charakterisiert. Ketolide sind Makrolide mit einer Ketogruppe anstelle der Cladinose.

Makrolide können wegen ihrer Größe und hohen Hydrophobizität die äußere Membran gramnegativer Stäbchen nur in sehr niedrigen Konzentrationen durchdringen (Sphäroplasten derselben Spezies sind Makrolid-empfindlich). Sie gelten deshalb als primär resistent gegen Makrolide und zugleich gegen Lincosamide und StreptograminB (MLSB-Komplex). Verbreitete Mechanismen erworbener Resistenz sind die Änderung des ribosomalen Angriffspunktes sowie enzymatische Inaktivierung. Aktives Ausscheiden eingedrungener Makrolide durch Effluxpumpen wurde bei Staphylococcus epidermidis beobachtet.

Änderung des Angriffspunktes Die Bindung von MLSB wird blockiert durch die Methylierung eines Adenins in der 23S rRNA. Die damit verbundene Konformationsänderung im Ribosom reduziert die Affinität für Makrolide und zugleich die der überlappenden Bindungsstellen für Lincosamide und StreptograminB. Verschiedene mw-Gene (Erythromycin-Methylase-Gene) wurden identifiziert. Ihre Expression kann induziert oder konstitutiv erfolgen. Induzierend wirken alle MLSB-Substanzcn (nicht die Ketolide). Lediglich bei Staphylokokken ist die Induzierbarkeit auf die 14- und 15-gliedrigen Makrolide eingeschränkt. Die Gene für MLSe-Resislenz sind häufig auf nicht-konjugativen Plasmiden lokalisiert (z.B. bei Streptokokken, ausgenommen die Pneumokokken); bei S. pneumoniae können chromosomale MLSu-Resistenzgene mit einem Transposon übertragen werden.

Abb. 3.44 Säure-katalysierte intramolekulare Zyklisierung bei Erythromycin.

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie

Tab. 3.23 Makrolide Zahl der Atome im Laktonring

Substanz

Stabilität im sauren Magenmilieu

gastrointestinale Nebenwirkungen

Eliminationshalbwertszeit t1/2, (Stunden)

14

Erythromycin Clarithromycin Dirithromycin' Roxithromycin Flurithromycin

instabil, intramolekulare Cyclisierung stabil stabil stabil

häufig selten selten selten

2 (nach 1 g p.o.) 4.7 (nach 400 mg p.o.) 20-50 (nach 500 mg p.o.) 12 (nach 300 mg p.o.)

Azithromycin

stabil

selten

41 (nach 500 mg p.o.)

josamycin

stabil

selten

1,5 (nach 1 g p.o.)

15 16 1 2

2

in vivo Spontanhydrolyse zu Erythromycylamin darunter ein Stickstoffatom, deshalb Azalid

Inaktivierung der Makrolide Esterasen können Makrolide durch Öffnen des Laktonrings inaktivieren. Esterase-Gene (z.B. ereA, ereB) können zusammen mit Methylase-Genen im gleichen Stamm auftreten. Sie wirken synergistisch und verleihen besonders hohe Makrolid-Resistenz (gefunden in Enterobakterien nach selektiver Darmdekontamination durch Erythromycin bei neutropenischen Patienten). Therapeutisches Spektrum

Erythromycin ist in saurem Milieu (z.B. des Magens) chemisch instabil. Durch intramolekulare Ringbildung entstehen dabei Anhydride, die für die beim Erythromycin häufigen gastrointestinalen Nebenwirkungen verantwortlich sind. Deshalb sowie wegen der kurzen Verweildauer im Organismus (vgl. Tab. 3.22) und der relativ niedrigen intrazellulären Konzentrationen des Erythromyeins wurden Derivate des Erythromycins mit größerer Stabilität synthetisiert (vgl. Tab. 3.23). Ihre antibakterielle Aktivität entspricht weitgehend der des Erythromycins. Die langsame Elimination erlaubt für die meisten von ihnen eine nur einmal tägliche Gabe. Häufigkeit und Schwere der gastrointestinalen Nebenwirkungen sind zudem deutlich vermindert. Das therapeutische Spektrum der Makrolide umfaßt Staphylokokken, Streptokokken, Bordetella pertussis, Listerien, Legionellen, Haemophilus spp. (eingeschränkt), Neisserien, Corynebakterien, Mycoplasmen, Mycobacterium avium-intracellulare (nur Clarithromycin) und gram-positive Anaerobier, d.h. viele obligat oder fakultativ intrazellulär lokalisierte Erreger. Re-

sistente Stämme treten unter Staphylokokken, Streptokokken (S. pyogenes, S. pneumoniae), Haemophilus, Listerien, Legionellen und Anacrobiern auf. Lincosamide

Lincosamide sind Kondensationsprodukte aus einer Aminosäure und einem Aminozucker (Pyranosid) (Abb. 3.45) und werden von Streptomyces lincolnensis produziert. Lincosamide greifen in die bakterielle Proteinbiosynthese ein. Die Wirkung ist meist bakteriostatisch, bakterizid bei S. pneumoniae, S. pyogenes und S. aureus. Der einzige therapeutisch relevante Vertreter ist das Cliiidamycin. Es besitzt hohe Aktivität gegenüber Bacteroides-Arlen (Anteil resistenter

Abb. 3.45 Lincosamin-Crundgerüst (links); durch Chlorsubstitution am C7 entsteht Clindamycin.

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Stämme zwischen 5% und 17%, Resistenz z.T. R-Faktor-vermittelt). Hauptanwendungsgebiete sind Anaerobier-Infektionen oder Mischinfektioncn mit Anaerobiern sowie StaphylokokkenInfektionen; hier vor allem Lungen-, Weichteilund Knocheninfektionen. Die Anwendung von Clindamycin ist beeinträchtigt sowohl durch Resistenzentwicklung als auch wegen des Risikos der selektiven Anreicherung von Clostridium difficile, sowohl nach oraler als auch nach parentcraler Applikation mit der Möglichkeit des Auftretens einer Antibiotika-assoziierten Diarrhöe bzw. pseudomembranösen Kolitis. Streptogramine Streptogramine sind natürliche Fermentationsprodukte von Streptomyces pristinaespiralis. Sie können in zwei Gruppen eingeteilt werden: BStreptogramine (Streptograminn = Pristimamycin I) und A-Streptogramine (StreptograminA = Pristinamycin II). Quinopristin ist ein halbsynthetisches StreptograminB-Derivat und Dalfopristin ein halbsynthetisches StrcptograminADerivat. Eine fixe Kombination aus Quinapristin und Dalfopristin ist das erste parenteral applizierbare Antibiotikum dieser Wirkstoffklasse. Der Wirkungsinechanisinus besteht in der Hemmung der Proteinbiosynthese durch eine irreversible Bindung an das Peptidyltransferase-Zentrum in der 50S-Untereinheit des bakteriellen Ribosoms. Es wirkt gegen die meisten empfindlichen Bakterienstämme bakterizid. Bestimmte Stämme von Staphylokokkcn sind gegen den Quinopristin-Anteil resistent (MLSß-ResistenzPhänotyp, s.a. Makrolide), bleiben aber wegen der verbleibenden Aktivität von Dalfopristin (StreptograminA) empfindlich gegenüber der Kombination (RP 59500). Zum Spektrum zählen Staphylokokken. inklusive Methicillin-resistente Stämme, Streptokokken, inklusive Penicillin-resistenter Pneumokokken, und E. faecium, einschließlich Glykopeptid-resistenter Stämme, nicht aber E. faecalis. Ein klinisch-pharmakologisches Problem besteht in der hohen Venenunverträglichkeit der parenteralen Formulation. Glykopeptide Die Glykopeptide Vancomycin und Teicoplanin sind hochmolekulare hydrophobe Substanzen (Molekulargewicht von Vancomycin 1449, von Teicoplanin 1900).

Wirkungsmechanismus

Glykopeptide hemmen die Synthese des Peptidoglykans. Sie binden an das terminale DAlanyl-D-Alanin des Muramyl-pentapeptids. Dadurch kann die Transpeptidase die wachsenden Glykanketlen nicht mehr quervernetzen, die Zelle ist nicht mehr vermehrungsfähig. Resistenzmechanismus

Glykopeptid-resistente Zellen (z.B. von Enterococcus faecium) können Glykopeptide nicht mehr binden, da deren Bindungsstelle verändert ist (Substitution des zweiten D-Ala des terminalen Dipeptids durch D-Lac oder D-Ser). Dies hat jedoch zugleich zur Folge, daß die normale Transpeptidase nicht mehr quervernetzen kann. Das käme einer letalen Mutation gleich. Die für den Erhall der Vermehrungs- (Überlebens-) Fähigkeit unverzichtbare Transpeptidierung wird jedoch in Glykopeptid-resistenten Zellen sichergestellt durch Ligasen (alternative Transpeptidasen), welche auch an DAla-D-Lac bzw. D-Ala-D-Ser binden und damit Glykansträ'ngc quervernetzen können. Die wichtigste darunter ist VanA, ein 38-40 kD Protein (genetisch kodiert von van a). Die Glykopeptide werden an die veränderten terminalen Dipeptide nicht mehr gebunden und bleiben somit ohne Wirkung auf die alternative Ligase. Die Glykopeptid-resistenten Zellen können sich also in Gegenwart von Glykopeptiden vermehren. Die van a-resistenten Enterokokken sind resistent gegenüber Vancomycin und Teicoplanin, Enterokokken mit dem Resistenzgen van b und van c (= natürliche Resistenz von E. gallinarum und E. casseliflavus) nur gegenüber Vancomycin. nicht Teicoplanin. Der Mechanismus bei resistenen Staphylokokkenstämmen ist noch nicht exakt geklärt, beruht aber nicht auf van a van c-ähnlichen Genen. Wirkspektrum

Vancomycin verfügt über gute bakterizide Aktivität gegen Staphylokokken, Streptokokken (gegenüber Enterokokken nur bakteriostatisch). Corynebakterien, Listerien sowie gram-positive Anaerobier (z.B. C. difficile). Resistenz wurde bisher nur selten, und zwar bei S. epidermidis, S. haemolyticus und Enlerokokken beobachtet. Seit kurzem sind auch - bisher selten - Glykopeptidresistente S. aureus-Stämme beschrieben worden, jedoch nur im MRSA-Kollektiv. Die perspektivische biologische und klinische Relevanz kann noch nicht abgeklärt werden. Es besteht keine Parallelresistenz mit anderen Antibiotika-Gruppen. Vergrünende Streptokokken können bis zu einem Drittel tolerant gegenüber Vancomycin sein (MBK > 32mal MHK). Gram-negative sind primär resistent, da deren äußere Membran die Glykopeplide vom Ort ih-

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie

rer Wirkung, der Peptidoglykansynthese im Periplasma, fernhält. Hauptindikationen für Vancomycin sind schwere gram-positive Infektionen bei E-Laktam-Allergie, schwere Staphylokokkeninfektionen mit Methicillin-(= E-Laktam-)resistenten Stämmen, Infektionen mit Corynebacterium JK, sowie schwere Fälle der Antibiotika-assoziierten Kolitis (orale Applikation). Aufgrund von Nebenwirkungen wie Gehörschädigung und Nephrotoxizität sollten die Serumspitzen- und Talspiegelkonzentrationen von 30 ug/ml bzw. 5-10 u.g/ml nicht überschreiten. Wegen der kompletten renalen Elimination ist deshalb die Kontrolle der Vancomycin-Konzentration im Serum des Patienten unter Therapie bereits bei leichten Einschränkungen der Nierenfunktion erforderlich. Tcicoplanin besitzt vergleichbare Aktivität wie Vancomycin gegen S. aureus, ist stärker aktiv gegen Enterokokken, aber schwächer gegen Koagulase-negative Staphylokokken (van a). Teicoplanin-Resistenz nimmt bei Enterokokken zu. Teicoplanin penetriert ungewöhnlich gut in Phagozyten. Pharmakokinetisch bemerkenswert ist die langsame Elimination von Teicoplanin (Serumhalbwertszeit nach i.v. Applikation 30-50 Stunden, nach i.m. Gabe etwa 100 Stunden, bei Vancomycin i.v. etwa 6 Stunden). Fusidinsäure

Fusidinsäure wurde aus dem Pilz Fusidium coccineum isoliert. Strukturelle Ähnlichkeit mit Steroiden, jedoch ohne Hormonwirkung. Fusidinsäure ist aktiv gegen Kokken, einschließlich multiresistenter Staphylokokken, inaktiv gegen gram-negative Stäbchen. Resistenzentwicklung durch chromosomale Mutation. Hauptindikationen sind Infektionen mit Staphylokokken (z.B. Osteomyelitis. Mukoviszidose). Fusidinsäure kann oral und parenteral appliziert werden, die Halbwertszeit der Elimination aus dem Serum liegt bei 5 Stunden. Fusidinsäure wird in der Leber so gut wie vollständig metabolisiert. Rifamycine (Rifampicin, Rifampin) Rifampicin ist die therapeutisch wichtigste Substanz aus der Familie der Rifamycine (B, C, D, O, S, SV, X), die von Streptomyces mediterranei produziert werden (1957). Rifamycine sind relativ große Antibiotika (Molekulargewicht für Rifampicin 823) aus einer chromophoren Grup-

pe, die in einen aliphatischen Ring eingeschlossen ist. Rifampicin wird semisynthetisch produziert als Derivat des Rifamycin SV mit geringer Wasser-, aber hoher Lipidlöslichkeit. Rifamycine hemmen die DNA-abhängige RNA-Polymerase an deren ß-Untereinheit durch Blockade des Initiationsschrittes. Sie wirken bakterizid, auch bei intrazellulärer Lagerung der Erreger (in Makrophagen) z.B. bei Mykobakterien. Das Wirkspektrum umfaßt Stämme grampositiver und gramnegativer Spezies. Monotherapie mit Rifampicin ist wegen des Risikos der Resistenzselektion unter Therapie kontraindiziert. Die Mutationsrate zu Rifampinresistentcr Polymerase mit MHK-Werten über 512 ng/ml liegt zwischen 10"6 und 10 1(l. Die höhere Frequenz gilt für Kokken nach Punktmutation mit Austausch einer Aminosäure des Enzyms. Weniger häufig ist die Resislenzentwicklung dagegen bei Mycobacterium tuberculosis. Hauptindikationen für Rifampicin-Therapie sind Infektionen mit sensitiven Mykobakterien in Kombination mit anderen Substanzen, die Kombinationstherapie der Staphylokokken-Endocarditis und die Prophylaxe von Kontaktinfektionen bei endemischer Meningitis durch Meningokokken oder //. influenzae Typ B. Unter Rifampicin-Therapie muß berücksichtigt werden, daß Rifampicin seine eigene Mctabolisierung bzw. die anderer Medikamente (Theophyllin, Corticosteroide, Cyclosporin) induzieren kann. Polypeptidantibiotika Von Bacillusarten produzierte bakterizide Antibiotika mit zyklischer Peptidstruktur. Polymyxine binden an Phospholipide der Zytoplasmamembran und zerstören deren Semipermeabilität (ähnlich wie kationische Detergentien, z.B. Quartamon), Bacitracin greift in die Synthese des Peptidoglykans ein (s. Kap. 3.1). Das Spektrum der Polymyxine (Polymyxin E = Colistin) ist begrenzt auf aerobe gram-negative Spezies (unwirksam jedoch gegenüber Proteus-, Providencia-, Serratia-, Burkholderia- und Neisseria-Arten). Bacitracin ist demgegenüber ausschließlich gegen gram-positive Spezies aktiv. Wegen hoher Toxizität kommen beide Polypeptidantibiotika nur für lokale Anwendung (z.B. Infektionen der Haut) in Frage, z.T. zur Spektrumsverbreiterung in Kombination miteinander oder mit Neomycin (Nebacetin). Polymyxi-

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Allgemeine Bakteriologie

ne sind Bestandteile der selektiven Dekontamination des Oropharynx oder der Darmmukosa (nicht resorbierbar). Polymyxin-Inhalation kann die Lungenkolonisation durch P. aeniginosa bei Mukoviszidosepatienten hinausschieben. Nitroimidazole

Metronidazol, 1 -(2-hydroxyethyl)-2-methyl-5nitroimidazol, ist der wichtigste Vertreter aus der Gruppe der Nitroimidazole (Abb. 3.46). Vollsynthetische Herstellung. Metronidazol wird erst wirksam nach Reduktion der Nitrogruppe. Es wirkt durch Hemmung der Nukleinsäuresynthese bakterizid gegen viele gramnegative und grampositive Anaerobier einschließlich C. difficile und antiparasitär (vgl. Parasitologie, Kap. 10). Neuentwicklungen und Perspektiven in der antimikrobiellen Chemotherapie

Die derzeit in der anti-infektiven Chemotherapie einsetzbaren Wirkstoffe sind ihrer Herkunft nach überwiegend Produkte von Mikroorganismen. Solche wurden bisher mit immer weiter verbesserten Suchverfahren als sekundäre Stoffwechselprodukte von Mikroorganismen natürlicher Standorte (z.B. im Boden, Abwasser) isoliert. Ihre Strukturen sowie ihre spezifischen Angriffspunkte in der Erregerzelle sind zumeist bekannt, wurden jedoch für die meisten Substanzen erst lange nach der Entdeckung ihrer Wirkung und ihre klinische Anwendung aufgeklärt. Es stellt sich die Frage, ob über diese bekannten Targets hinaus bisher noch unentdeckte oder nicht genutzte Angriffspunkte der Bakterienzelle mit vitaler Funktion ausschließlich für mikrobielle Erreger sowie dem Ausschluß der Möglichkeit zur Entwicklung von Resistenzmechanismen vorhanden sind. Es wird davon ausgegangen, daß von den insgesamt auf 200 ge-

schätzten Targets bereits ca. 150 bekannt sind und die restlichen 50 ein relevantes Restpotential für innovative Antibiotika darstellen. Auf dieser Basis werden bakterielle Genome (die komplette Sequenz liegt bereits für eine Reihe von Spezies vor) nach neuen Angriffspunkten für Antibiotika durchsucht. Damit, sowie durch Computer-gesteuerte chemische Synthese sollten die Chancen für das Auffinden von neuen Substanzen, vor allem auch mit Aktivität gegen multiresistente Erreger, verbessert werden können. Im einzelnen zielt die Entwicklung verbesserter Antibiotika entweder auf die Modifikation bekannter und das Auffinden neuer Substanzen für bereits bisher fokussiertc Targets oder auf Funktionen, die bisher nicht als Angriffspunkte für Antibiotika genutzt wurden wie Einzelschritte im Ablauf der Synthese von Zellwand, von Nukleinsäuren und von Proteinen. Vielversprechend erscheinen hier z.B. Inhibitoren der Amino-acyl-tRNA-Synthetasen. Dabei könnte die Entstehung von Inhibitor-resistenten Enzymen durch Kombination von Inhibitoren gegen mehrere Synthetasen so gut wie ausgeschlossen werden. Verstärkt wird ferner die Zytoplasmamembran als Zielstruktur für neue Antibiotika fokussiert. Membran-aktive Substanzen bestehen meist aus kleinen Peptiden, die sich in die Zytoplasmamembran integrieren und diese durch Ausbildung von Porinkanälen letal permeabilisieren ( z.B. der Defensine mukosaler Zellen). Andere Ansätze zielen auf die Hemmung der Transkription von Genen für Produkte, welche das Überleben von Bakterien in der stationären Wachstumsphase sicherstellen. Neuere Entwicklungen konzentrieren sich auf die Hemmung der Synthese oder der Funktion von Virulenz- (z.B. von Adhäsion) oder PathogenitätsFaktoren sowie auf die Inhibition von Signaltransduktions- und Proteinsekretions-Mechanismen. Eine positive Perspektive der anti-infektiven Therapie erscheint möglich mit Hilfe innovativer antimikrobieller Substanzen und Prinzipien, strenger Indikationsstellung für die Verwendung vorhandener Antibiotika in Therapie und Prophylaxe, wirksamer Kontrolle ihres Einsatzes in der Tierernährung (z.B. als Wachstumsförderer) sowie Intensivierung geeigneter Maßnahmen zur Verhinderung des Transfers multiresistenter Erreger zwischen Patienten.

Abb. 3.46 Metronidazol.

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie

3.5.7 Klinische Grundprinzipien der antibakteriellen Chemotherapie Indikationsstellung Die Gabe von Antibiotika ist nur dann indiziert, wenn eine behandlungsbedürftige, durch Bakterien hervorgerufene Infektionskrankheit vorliegt.

Die Indikation wird zunächst klinisch gestellt. Anamnese, Befunde der klinischen Untersuchung sowie klinisch-chemische und radiologische Zusatzbefunde ermöglichen in aller Regel eine Verdachtsdiagnose. In akuten Fällen muß nach der Indikationsstellung und der Entnahme von Untersuchungsmaterial die Therapie unverzüglich begonnen werden. Da Erregerdiagnose und Antibiogramm noch nicht vorliegen, muß die Chemotherapie zunächst kalkuliert erfolgen. Dies heißt, es wird eine empirische Therapie eingeleitet, welche die aufgrund des klinischen Bildes zu erwartenden Erreger eingrenzt und deren anhand lokaler Erfahrungen zu erwartende Antibiotikaempfindlichkeit berücksichtigl. Das mögliche Erregerspektrum muß so breit wie nötig abgedeckt werden, auch unter Einbeziehung des Grades der Bedrohung des Patienten durch die Infektion. Erst Erregerdiagnose und Antibiotikaempfindlichkeitsprüfung ermöglichen die Einleitung einer gezielten Chemotherapie und damit eine mögliche Deeskalation. Daher muß vor dem Beginn der kalkulierten Chemotherapie eine gezielte und sorgfältige Entnahme von geeignetem Untersuchungsmaterial zur bakteriologischen Diagnostik unter Berücksichtigung der klinisch wahrscheinlichen Infektionslokalisation erfolgen (s. Kap. 2.1). Die Qualität des Materials bestimmt die Wertigkeit des bakteriologischen Befundes. Erregerbefund und Antibiogramm müssen auf klinische Plausibilität überprüft werden. Eine Antibiotikatherapie „ex iuvantibus'" ohne klinische Verdachtsdiagnose und bakteriologische Absicherung darf nur in seltenen Ausnahmefällen durchgeführt werden, z.B. beim Syndrom des unklaren Fiebers nach einer umfangreichen Diagnostik. Bei der Indikationsstellung ist weiterhin zu berücksichtigen, daß bei einigen Infektionskrankheiten andere Therapiemaßnahmen vorrangig oder flankierend durchgeführt werden müssen. Dies sind in erster Linie chirurgische Interventionen wie die Eröffnung von Abszessen und

Phlegmonen, Ausräumung von infizierten Hämatomen oder die Entfernung von Fremdkörpern. Häufig erscheinen Infektionen als Sekundärphänomene anderer Grundkrankheiten, wie z.B. Infektionen von Hohlraumsystemen bei obstruierenden Prozessen durch Konkremente oder Tumoren. Hier ist die akute Gabe von Antibiotika zwar indiziert und notwendig, sie allein kann jedoch ohne chirurgische Sanierung der Grundsituation nicht zur Ausheilung führen, Rezidive wären dann vorprogrammiert. Ähnliches gilt für ursächlich oder flankierend notwendige andere konservative Therapiemaßnahmen wie z.B. zur Behebung einer Mikrozirkulationsstörung oder zur Sekretolyse oder Antitoxingabe z.B. bei Diphtherie. Eine zu früh begonnene oder nicht indizierte Antibiotikagabe kann ein Krankheitsbild verschleiern und damit die Indikation zu anderen entscheidenden Therapiemaßnahmen verzögern (z.B. Anastomoseninsuffizienz und Peritonitis). Wahl des Chemotherapieregimes

Bei der kalkulierten Chemotherapie müssen der in Frage kommende Erreger bzw. das Erregerspektrum eingegrenzt werden. Bei einigen Infektionskrankheiten gibt es eine pathognomonische Erregerkorrelation wie z.B. bei Typhus abdominalis oder Scharlach. Entscheidend ist weiter, ob die Infektion außerhalb des Krankenhauses erworben wurde oder ob es sich um eine nosokomiale Infektion handelt. Auch aus der Infektlokalisation lassen sich zum Teil definitive Rückschlüsse auf die Erregernatur ziehen. Bei geschwächter körpereigener Abwehr, z.B. bei der Sepsis bei Frühgeborenen oder Patienten in Aplasie sind nur bakterizid-wirksame Therapeutika indiziert. Gleichzeitig ist daran zu denken, daß das Spektrum der zu erwartenden Erreger bei abwehrgeschwächten Patienten völlig anders sein kann, z.B. atypische Mykobakterien, Legionellen, Nokardien, Cryptococcus, Pneumoeystis carinii bei Pneumonie. Alle Erkrankungen, welche die Pharmakokinetik beeinflussen, können dazu führen, daß Antibiotika nicht an den Infektionsort gelangen oder nicht normal metabolisiert bzw. eliminiert werden können. Schwere Erkrankungen bestimmter Organe können die Verwendung solcher Antibiotika von vornherein ausschließen, zu deren potentiellen Nebenwirkungsspektren diese Organe gehören. Auch physiologische Zustände können bestimmte Antibiotika von vornherein

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Allgemeine Bakteriologie

ausschließen, wie z.B. Schwangerschaft, Stillperiode, Neonatalpcriode oder noch wachsender Organismus. Gleiches gilt auch für bekannte Allergien. Bei der gezielten Chemotherapie legt die bakteriologische Erregerdiagnose mit Antibiogramm die Antibiotikaauswahl vorrangig fest. Das Antibiogramm schließt primär die Antibiotika aus, die schon in vitro nicht wirksam sind. Umgekehrt müssen nicht alle in vitro aktiven Antibiotika auch therapeutisch wirksam sein. Hier sind wiederum die schon oben genannten klinischen und pharmakokinetischen Kriterien mitentscheidend. Grundsätzlich gilt der Satz der „abgestuften" Therapie, d.h. es sollen nur Substanzen mit der gerade notwendigen Breite ihres Wirkspektrums eingesetzt werden. Durchführung der Chemotherapie Sie folgt im Prinzip den allgemeinen Grundsätzen der konservativen Pharmakotherapie. Die Dosierung muß der klinischen Situation des individuellen Patienten angepaßt werden. Wann immer möglich sollte die Dosierung nach Körpergewicht oder Körperoberfläche festgelegt werden. Feste Regeldosierungen für Erwachsene bedürfen auf jeden Fall einer Anpassung bei größeren Körpergewichtsschwankungen. Die Dosierung von Antibiotika im Kindesalter erfordert ein differenzierteres Vorgehen. Bezogen z.B. auf die Richtdosis für ein öjähriges Kind mit einem durchschnittlichen Gewicht von 22 kg muß für ein 2jähriges Kind eine 2Ü%ige, für einen 4 Monate alten Säugling eine 3ü%ige Erhöhung, für ein Schulkind von 12 Jahren dagegen eine 20%ige Reduktion erfolgen. Es gibt für Kinder keine einheitliche auf das Gewicht bezogene Richtdosierung.

Je nach Art des verwandten Antibiotikums können durch entsprechende Organdysfunktionen bedingte Störungen der Metabolisierung bzw. renalen Eliminierung eine primäre oder sekundäre Dosisreduktion erzwingen. Die Höhe des Serumkreatinins kann dabei nur grob zur Dosiskorrektur verwandt werden, besser eignet sich die Kreatininclearance bzw. die Dosisanpassung nach Spiegelbestimmung (s.u.). Die Therapiedauer ist abhängig von der Abwehrlage des Patienten, dem klinischen Verlauf, der Infektionslokalisation, der Art des Erregers usw. Die Faustregel, daß mindestens 3-5 Tage über die deutliche klinische Besserung hinaus weiter behandelt werden muß, muß differenziert werden. Neuere Ergebnisse sprechen dafür, daß bei unkomplizierten Harnwegsinfektionen oder bei der akuten Go-

norrhoe bei Verwendung bestimmter Antibiotika eine Ein-Dosis- oder Drei-Dosistherapie ausreichend sein kann. Auf der anderen Seite muß bei einer Septikämie beim abwehrgeschwächten Patienten häufig so lange weiter therapiert werden, bis es zum Wiederanstieg der Granulozyten kommt. In der Behandlung einer akuten Osteomyclitis kann zwar die klinische Besserung relativ rasch erfolgen, dennoch ist in den meisten Fällen eine Therapie über 8-12 Wochen notwendig, um die Erkrankung sicher zu beherrschen und zu verhindern, daß ein chronisches Krankheitsbild durch nicht eliminierte Erreger entsteht. Bei einer auf die Therapie sofort ansprechenden subakuten Endokarditis durch vergrünende Streptokokken beim jungen Patienten wird heute eine 2wöchige Therapie für völlig ausreichend gehalten, während man für eine Enterokokkenendokarditis beim gleichen Patienten eine mindestens 6wöchigc Therapie für erforderlich hält.

Die Art der Applikation eines Antibiotikums wird bestimmt durch die klinische Situation des Patienten und durch die pharmakokinetischen Eigenschaften des Antibiotikums. Grundsätzlich sollte bei schweren oder vital bedrohlichen Infektionen zumindest am Anfang die parenterale Applikation zur Anwendung kommen. Hierbei ist die Gabe in einer Kurzinfusion der intravenösen Bolusinjektion immer vorzuziehen. Die intramuskuläre Anwendung von Antibiotika schließt sich bei vielen Substanzen wegen der starken Schmerzhaftigkeit von vornherein aus, sie sollte auch sonst nur in Ausnahmefällen (z.B. Depotpräparate, ambulante Therapie, Compliance-Probleme) durchgeführt werden. Bei der intravenösen Applikation kommt es zu einem raschen Wirkungseintritt, die Therapiesicherheit ist hoch. Das Risiko liegt in der Gefahr der Überdosierung und der höheren Gefahr einer allergischen Reaktion. Bei der oralen Applikation kommt es zu einem verzögerten Wirkungseintritt. Nachteile sind individuelle Schwankungen der Resorption und geringere Therapiesicherheit als Folge unzuverlässiger Einnahme durch den Patienten (Compliance). Vorteile sind die geringere Belastung der Patienten und die ambulante Therapiemöglichkeit. Enteral nicht resorbierbare Substanzen werden dann oral gegeben, wenn die Chemotherapeutikawirkung auf den Darmkanal beschränkt bleiben soll. Bei der Durchführung einer Sequenzialtherapie - Beginn parenteral, Fortsetzung oral - müssen die Substanzen eine äquivalente Aktivität besitzen. Vorteile einer lokalen Applikation sind die Wirkungsbegrenzung auf den Applikationsort und die Möglichkeit wesentlich höherer Konzentrationen, Nachteile die Wirkungsbeschränkung auf Oberflächen, das

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie

höhere Risiko der Selektion resistenter Erreger und ein größeres Allergisierungsrisiko. Daher beschränkt sich die Anwendungsmöglichkeit auf das äußere Auge, das äußere Ohr, Mundhöhle, Vagina etc. Spülungen von Wunden und Körperhöhlen sollten - wenn überhaupt - nur mit Zusatz von Dcsinfizicntien durchgeführt werden.

Mit den heute zur Verfügung stehenden Antibiotika kann in vielen Fällen eine Monotherapie durchgeführt werden. Eine Kombinationstherapie (z.B. aus E-Laktamantibiotikum + Aminoglykosid) kann in der Phase der kalkulierten Chemotherapie notwendig sein, um das bei dem klinischen Bild mögliche Erregerspektrum in seiner ganzen Breite abzudecken. Ähnliches gilt auch für die gezielte Chemotherapie, wenn es sich um eine Mischinfektion handelt. Bei einer bakteriologisch abgesicherten Monoinfektion kommt eine Kombinationstherapie klinisch nur aus zwei Gründen in Frage: Es kann ein additiver oder synergistischer Effekt (s. Kap. 3.5.3) erwartet werden. Ein synergistischer Effekt ist bisher nur für wenige Kombinationen, bezogen auf einige Erregergruppen, bewiesen oder wahrscheinlich, so für die Kombinationen aus ß-Laktam-Antibiotika oder Glykopeptiden mit Aminoglykosiden gegen grampositive Kokken z.B. bei Endokarditis. Bei jeder Kombinationstherapie ist zu beachten, daß sich die Kombinationen nicht schon von vornherein aus bakteriologischen (Antagonismus) und/oder pharmakologischen Gründen (s. Kap. 3.5.4) ausschließen, und daß sich auch das potentielle Nebenwirkungsrisiko für den Patienten erhöhen kann. Fixe Kombinationen von Antibiotika, mit Ausnahme der Kombination von E-Laktam-Antibiotika mit ßLaktamase-lnhibitoren und der Kombination von Trimethoprim oder Tetroxoprim mit Sulfonamiden, sind therapeutisch nicht sinnvoll. Von erheblicher Bedeutung in der Durchführung der Chemotherapie ist die Kontrolle der Effektivität und damit das rechtzeitige Erkennen des Versagens einer Therapie sowie das - auch schon vorbeugende - Untersuchen auf potentielle Nebenwirkungen. Die Effektivität wird einmal anhand von klinischen Kriterien überprüft, das heißt z.B. Rückgang von Fieber und allgemeine Besserung des klinischen Bildes, zunehmende Normalisierung von klinisch-chemischen Parametern wie Rückgang der Lcukozytose und Rückgang von Prozessen, die durch bildgebende Verfahren objektivierbar sind, wie z.B. pneumonische Infiltrate. In vielen Fällen ist auch die bakteriologische Effektivitätskontrolle notwendig: es muß über-

prüft werden, ob der ursächliche Erreger eliminiert wurde z.B. bei der Endokarditis, der Meningitis oder bei einer Salmonellenenteritis. Dies kann für den Patienten selbst von Bedeutung sein, um z.B. ein Rezidiv bei der Endokarditis von vornherein zu verhindern oder der Entwicklung eines Postinfektionssyndroms vorzubeugen. Es kann aber auch Seuchen- bzw. Krankenhaus-hygienische Gründe haben, um einen Ausscheider (Salmonellen) oder einen Keimträger (S. aureus) zu erkennen. Wenn nach einer klinisch tolerierbaren Zeit keine Besserung erfolgt, muß zunächst die Indikation überprüft werden: Besteht weiter der klinische Verdacht, daß es sich um eine Infektionskrankheit handelt? Liegt eine Situation vor, die die Ineffektivität einer Antibiotikatherapie erklärt wie Abszedierung, Anastomoseninsuffizienz usw.? Ist die Dosierung adäquat? Dann muß überlegt werden, ob die Antibiotikawahl richtig war. Bei ausbleibender Effektivität bringt die Therapie für den Patienten nicht nur keine Vorteile, sondern Nachteile durch die erwähnten unerwünschten Nebenwirkungen. In diesem Zusammenhang muß auch auf die Möglichkeit eines antibiotikainduzierten Fiebers („Drug"-Fieber) hingewiesen werden. Der zweite wichtige Gesichtspunkt in der Chemotherapiekontrolle ist das frühzeitige Erkennen von Nebenwirkungen. Alle klinisch, klinisch-chemisch oder durch anderweitige Untersuchungen erkennbare Veränderungen unter einer Chemotherapie müssen daraufhin überprüft werden, ob sie in direktem oder indirektem Zusammenhang mit der durchgeführten Chemotherapie stehen könnten. Je nach Art der verwendeten Substanzen und unter Berücksichtigung ihrer potentiellen Toxizität (s. Kap. 3.5.4) müssen schon vorsorglich - zumindest bei bestimmten Patienten - Untersuchungen zur Nierenfunktion, zur Funktion und/oder Schädigung der Leber, zur Schädigung des Knochenmarks oder zur Funktion des Innenohres durchgeführt werden. Ziel muß es sein, schon sehr frühzeitig die beginnende Nebenwirkung bzw. Schädigung zu erkennen. Zur Prävention von Nebenwirkungen kann die Bestimmung von Antibiotika-Serumspiegeln entscheidend sein. Obligat notwendig ist sie für folgende Substanzen und bei folgenden Patienten: Aminoglykoside bei Patienten mit deutlich eingeschränkter Nierenfunktion und bei älteren Patienten, Vancomycin wegen der hohen Kumulationsgefahr schon bei leichten Einschränkungen der Nierenfunktion und alte-

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ren Patienten und Chloramphenicol bei Kindern bis zum Schulkindesalter. Bei Auftreten von Nebenwirkungen muß in der Regel die Beendigung der Chemotherapie bzw. die Umstellung auf andere Substanzen erfolgen. Bei einigen akuten Unverträglichkeitsreaktionen wie beim „redneck"-Syndrom durch Vancomycin oder bei Auftreten von Fieber und Schüttelfrost bei der Injektion von Amphotericin B (Antimykotikum) kann bei vitaler Notwendigkeit der Gabe eine Therapie der Nebenwirkungen durch die gleichzeitige Gabe von Pentoxifyllin (Mediatorhemmung) oder Kortikosteroiden versucht werden. Allergische Nebenwirkungen erfordern immer das Absetzen oder die Umstellung der Chemotherapie. Die Überwachung muß auch biologische Nebenwirkungen einschließen. Eine HERXHHIMER-RCaktion bzw. HERXiiEiMER-ähnliche Reaktion (s. Kap. 3.5.4) läßt sich durch eine einschleichende Therapie meist von vorherein verhindern. Biologische Nebenwirkungen, die sich aus der Störung der köpereigenen Normalflora ergeben, zwingen nicht unbedingt zum Abbruch der Therapie bzw. zur Umstellung, bedürfen aber der sorgfältigen prospektiven klinischen Beobachtung. Dies gilt auch für eine unter der Antibiotikatherapie auftretende Diarrhöe; abgeklärt werden muß aber in jedem Fall, ob es sich um das Vorstadium der Antibiotika-assoziierten pseudomembranösen Kolitis (AAPC) handelt. Wichtig ist hier der frühzeitige Nachweis von Clostridium difficile bzw. von dessen Toxinen aus Stuhl. Auch muß rechtzeitig die Indikation zur klinisch beweisenden Koloskopie gestellt werden. Bei der Antibiotikaassoziierlcn Diarrhöe kann die notwendige systemische antibiotische Therapie weitergeführt werden, es muß jedoch schon eine orale Behandlung mit Vancomycin. Teicoplanin oder Metronidazol begonnen werden. Beim Vollbild der AAPC muß in aller Regel die Antibiotikatherapie gestoppt werden. Ausnahmen sind Fälle, wo die Weiterführung der systemischen Antibiolikatherapie aus vitaler Indikation her notwendig ist. Auch ein Erregerwechsel oder eine Superinfektion müssen im Rahmen des Therapiemonitorings frühzeitig erkannt werden.

3.5.8 Antibiotika und körpereigene Abwehr Es gibt eine Reihe von Hinweisen dafür, daß Antibiotika in der Lage sind, auch in subinhibitorischen Konzentrationen körpereigene Ab-

wehrmechanismen positiv oder negativ zu beeinflussen. Dies bezieht sich sowohl auf die unspezifische Abwehr z.B. durch Granulozyten, als auch auf spezifische Abwehrmechanismen im Bereich der humoralen und zellulären Immunität. Ein einzelnes Antibiotikum kann sowohl positive als auch negative Effekte haben, entscheidend wäre dann für die Gast-Wirt-Beziehung die Summe der Effekte. Diese noch auschließlich auf in vitro- und tierexperimcntcllen Untersuchungen fußenden Erkenntnisse können z.Zt. noch nicht in praktische Konsequenzen für die klinische Anwendung von Antibiotika umgesetzt werden. Gesichert ist heute schon, daß eine frühzeitige Antibiolikagabe bei bestimmten Infektionskrankheiten spezifische Immunisierungsprozesse so stören oder verhindern kann, daß keine spezifische Immunität aufgebaut und damit Zweitinfektionen möglich werden, z.B. bei Keuchhusten. In Zukunft wird es auch von zunehmender Bedeutung sein, die wechselseitige Beeinflussung einer gleichzeitigen Therapie mit Antibiotika und Immuntherapeutika (z.B. Antikörper und Mediatorantagonisten) zu erforschen.

3.5.9 Prophylaktische Antibiotikagabe Die prophylaktische Gabe von Antibiotika beschränkt sich auf wenige definierte Ausnahmesituationen. In seltenen Fällen kann eine Expositionsprophylaxe mit Antibiotika indiziert sein. Dies gilt für Personen, in deren enger häuslichen Umgebung Erkrankungen mit bestimmten Erregern aufgetreten sind, insbesondere dann, wenn es sich um Säuglinge, Kleinkinder oder Personen mit stark abgeschwächter Abwehrlage handelt. Akzeptiert ist diese Art der Expositionsprophylaxe gegen Pertussis (Makrolid oder Aminopenicillin) und gegen Meningokokken-Meningitis (Rifampicin), mit Einschränkungen auch bei Haemophiliis influenzae-Meningitis, Lues und Scharlach (Penicillin oder Aminopenicillin). Ausreichend ist hier eine orale Gabe über 4-6 Tage. Indiziert ist weiter die Antibiotikagabe zur Endokarditisprophylaxe. Bei allen Personen, bei denen aufgrund genau definierter kardialer Vorerkrankungen ein erhöhtes Endokarditisrisiko besteht, muß bei invasiven diagnostischen oder therapeutischen Eingriffen, die zu einer transienten Bakteriämie führen können, eine Antibiotikagabe erfolgen. Man unterscheidet hierbei eine Niedrig- und Hochrisikogruppe, die jeweils durch die Art der kardialen Vorerkrankung fest-

3.5 Antimikrobielle Chemotherapie

gelegt wird. Diese Klassifizierung sollte normalerweise für jeden betroffenen Patienten in einem „Herzpaß" exakt definiert sein. Art und Dauer der prophylaktischen Antibiotikagabe sind bezogen auf die Risikogruppe festgelegt. Bei Patienten der Niedrigrisikogruppe ist eine einmalige orale Gabe ausreichend, während bei Patienten der Hochrisikogruppe dreitägige Applikationen notwendig werden können. Ein weiteres Indikationsgebiet für eine prophylaktische Gabe von Antibiotika ist die perioperative Antibiotikaprophylaxe. Ihr Ziel ist die Verhinderung von Wundinfektionen bzw. daraus entstehenden Septikämien. Man unterscheidet gesicherte, akzeptierte und ungesicherte Indikationen. Zu den gesicherten Indikationen gehören z.B. die Kolorektalchirurgie, die Chirurgie von Ocsophagus- und Magenkarzinomen, die Gallenwegschirurgie bei obstruierenden Prozessen oder die Cholezystektomie bei Patienten mit erhöhtem Risiko. Hier konnte die Effektivität der perioperativen Antibiotikagabe eindeutig gesichert werden. Zu den akzeptierten Indikationen gehören bestimmte Eingriffe in der Kardiovaskularchirurgie und in der Implantationschirurgie. Hier konnte wegen der primär sehr niedrigen Infektionsrate die klinische Effektivität aus statistischen Gründen bisher nicht sicher bewiesen werden. Wegen der besonderen Pathogenitätsmechanismen (z.B. bei Fremdkörperinfektionen) und der für den einzelnen Patienten zum Teil drastischen Konsequenzen einer Infektion (z.B. Gefäßprotheseninfektion) gilt eine perioperative Antibiotikagabe als möglich aber nicht obligat. Andere operative Eingriffe zählen als unsichere Indikationen, so lange nicht in überzeugenden klinischen Studien die Effektivität bewiesen werden kann. Hier gilt die Antibiotikagabe als nicht indiziert. Für die Durchführung ist entscheidend, daß die Gabe des Antibiotikums kurz vor oder mit dem Beginn des operativen Eingriffes erfolgt. Bei einer Operationsdauer von ca. 2-3 Stunden wird eine einmalige Gabe als völlig ausreichend angesehen. Bei einem länger dauernden Eingriff erfolgt dann eine zweite und eventuell noch eine dritte Gabe. Eine über den perioperativen Zeitraum hinausgehende Gabe z.B. für 1-3 postopcraüve Tage gilt nicht als perioperative Antibiotikagabe, sondern würde eine Therapie sein, die natürlich anderen Indikationskriterien unterliegt. Üblicherweise wird in der Kardiovaskulär- und Implantationschirurgie bezogen auf die zu erwartenden Erreger (grampositive Kokken und Stäbchen aus der normalen Hautflora) ein Cephalosporin der ersten oder zweiten Generation verwandt, bei allen übrigen

Eingriffen, wo auch Anaerobier der Pharynx- oder Darmflora ätiologisch in Frage kommen, zusätzlich Metronidazol oder von vornherein ein E-Laktam mit Anaerobier-Wirksamkeit. Substanzen mit sehr breitem Spektrum, die in der Therapie als Reservesubstanzen Verwendung finden, sollten nicht zur perioperativen Antibiotikagabe benutzt werden.

Eine prophylaktische Antibiotikagabe im weiteren Sinne - man könnte hier auch von einer „Frühtherapie" sprechen - ist die Gabe von Antibiotika bei abwehrgeschwächten Patienten bei Beginn und während einer aggressiven zytostatischen Therapie, während der Aplasiephase oder in der Konditionierungsphase für eine Knochenmarkstransplantation. Beispiele sind die orale Gabe von Cotrimoxazol zur Prävention einer Pneumocystis-carinü-Pneumonie. und die orale Gabe von enteral nicht resorbierbaren Substanzen wie Polymyxinen zur selektiven Dekontamination des Darmes zur Prävention von „gramnegativen" Bakteriämien aus dem Darmbereich. In letzter Zeil werden zunehmend Strategien zur Pneumonieprophylaxe bei primär nicht abwehrgeschwächten, aber Intensiv-pflegebedürftigen, beatmeten Patienten evaluiert. Ein zunehmend praktiziertes Konzept besteht in der selektiven Dekontamination von Gastrointestinaltrakt und Oropharynx (SDD), auch als „selektive Florasuppression" bezeichnet. Es basiert darauf, daß Pneumonien beim beatmeten Patienten infolge Deszension aus dem Oropharynx oder aber auch durch Mikroaspiration aus dem Gastrointestinaltrakt in den Tracheobronchialbaum entstehen können. Daher wird bei den entsprechenden Patienten der Oropharynx mehrmals täglich mit einer Paste mit Amphotericin B, einem Polymyxin und einem Aminoglykosid behandelt und der Gastrointestinaltrakt mit einer entsprechenden Lösung über eine Magensonde. Zusätzlich erfolgt während der ersten Tage eine systemischc Cephalosporingabe, um von außen akquirierte Erreger wie z.B. Pneumokokken, 5. aureus und //. influenzae zu eliminieren. Bei exakter Durchführung und bei bestimmten Patientengruppen (operative Intensivstation) wird die Pneumonieinzidenz signifikant gesenkt. In eine ähnliche Richtung zielt das Konzept, nosokomiale S. «w/'e«sTnfektionen bei bestimmten Patientengruppen z.B. Haemodialysepatienten zu verhindern: Durch die kurzzeitige lokale Applikation von Mupirocin, einem lokalen Antibiotikum mit starker Staphylokokkenwirksamkeit, in beiden Nasenvorhöfen soll eine dauerhafte Keimclimination erreicht und die Möglichkeit einer autogenen Infektion verhindert werden. Es sind auch Strategien in der wissenschaftlichen Untersuchung bzw. klinischen Erprobung, ob sich Fremdkörperinfektionen durch eine wie auch immer geartete Kopplung von Antibiotika in oder an Polymere verhindern lassen.

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Allgemeine Bakteriologie

238

3.5.10 Schlußbemerkungen Die antibakterielle Chemotherapie ist durch eine Reihe von Entwicklungen, die sich nach Regionen, Kliniken und Stationen differenzieren, schwieriger geworden: bei immer mehr Spezies treten resistente Stämme auf, zugleich nimmt der Anteil resistenter Stämme innerhalb vieler Spezies zu. Zudem entstehen neue Resistenzmechanismen wie z.B. E-Laktamasen mit verbreitertem Spektrum bei Enterobacteriaceae oder Resistenz gegen Glykopeptide bei Enterokokken. Nicht selten verfügt ein Stamm über mehrere Resistenzmechanismen. Die Gesamtzahl an Präparaten vergrößert sich schneller als die innovativer Substanzen. Unter den Patienten steigt der Anteil der Abwehrgeschwächten und Intensivpfegebedürftigen. Aufgrund dieser zunehmenden Komplexität der antibakteriellen Chemotherapie ist eine krankenhaus- und stationsspezifische Standardisierung der primären Chemotherapielinie unter Berücksichtigung neuer Entwicklungen aus medizinischen und ökonomischen Gründen erforderlich. Nicht zuletzt ist eine enge Vernetzung zwischen den klinischen Disziplinen, Infektiologen und klinischen Mikrobiologen zur Optimierung der antibakteriellen Chemotherapie unverzichtbar. Literatur BAUhRNFETND. A. und P. M. SHAH (Hrsg.): Lexikon der Mikrobiologie und Infektiologie. 2. Aufl.. Schattauer, Stuttgart, New York 1995. DAVIS, B. D.. R. DL'LBECCO. H. N. EISEN and H. S. GINSBERG (Eds.): Microbiology. 4 lh ed., Lippincott. Philadelphia.PA. 1990. LORIAN. V. (Ed.): Antibiotics in Laboratory Medicine. 3ld ed., Williams & Wilkins, Baltimore, Hong Kong. London, Munich, Philadelphia. Sydney, Tokyo 1991. M ADIGAN , M. L, J. M. M ARTINKO and J. P ARKER (Eds.): Brooks Biology of Microorganisms. 8th ed., Prentice-Hall Inc.Hemel Hempstead, Herts. 1997. MANUELE , G. L.. R. G. DOUGLAS JR . and .). E. BENNETT (Eds.): Principles and Practice of Infecüous Diseases. 4Ib ed., Churchill Livingstone. New York. Edinburgh. London, Melbourne 1995. MURRAY. P. R.. E. J. BARON, M. A. PFALLER, F. C. TENOVER and R. H. YOLKEN (Eds.): Manual of Clinical Microbiology. 7th ed.. ASM Press, Washington, DC 1999. PETERS. G.: Prinzipien der antibakteriellen Chemotherapie. In: BÖNTE, H., W. DOMSCHKE , T. MEINERTZ, D. R EINHARDT , R. T OLLE und W. W ILMANNS (Hrsg.): Therapie-Handbuch. 5. Aufl., Urban & Fischer. München 1999.

Roor, R. R. (Ed.): Clinical Infectious Disease. Oxford Univ. Press, New York, Oxford 1999. RYAN, K. J. (Ed.):Sherris Medical Microbiology.3rcl ed.. Prentice Hall, Hemel Hempstead, Hcrls. 1994. SIMON, C und VV. STILLE (Hrsg.): Antibiotika-Therapie in Klinik und Praxis. 9. Aufl., Schattauer. Stuttgart, New York 1997.

3.6 Mikrobielle Besiedlung des gesunden Menschen HELMUT MITTERMAYER

Nahezu alle Bereiche des menschlichen Körpers, die in direktem Kontakt zur Außenwell stehen, sind mit Mikroorganismen besiedelt (s. Kap. 1.1). Diese Mikroorganismen, die als normale oder physiologische Flora bezeichnet werden, sind so zahlreich, daß sie die Menge der körpereigenen Zellen zumindest um das zehnfache übertreffen. Mit einer Organismenzahl von mehr als 1014 entfällt dabei auf den Darmtrakl der mit Abstand größte Anteil. Die Gesamtzahl der Mikroorganismen auf der Haut wird auf etwa 10'2 geschätzt, in der Mundhöhle auf ca. 10'°. Die Interaktion zwischen Mikro- und Makroorganismus, also die Beziehungen zwischen Gast und Wirt werden üblicherweise mit den Begriffen Symbiose. Kommensalismus und Parasitismus bezeichnet. Bei der Symbiose ziehen beide Organismen Nutzen aus dem Zusammenleben. Beim Kommensalisinus liegt der Nutzen auf seiten des Mikroorganismus, wobei dieser, der Kommensale, seinen Wirt nicht schädigt. Der Parasit lebt auf Kosten seines Wirtes, biologisch am effektivsten allerdings, wenn er den Wirt nur minimal oder gar nicht schädigt, also Kommensale ist. Zwischen diesen Kategorien des Zusammenlebens bestehen fließende Übergänge. Keime der normalen Flora sind hauptsächlich als Kommensalen anzusehen, wenngleich für einzelne Teilbereiche dieser komplexen Wechselbeziehung der Begriff Symbiose duchaus angebracht ist. An ihrem natürlichen Standort ist die physiologische Flora apathogen, eine scharfe Grenze zur Pathogenität läßt sich allerdings nicht ziehen. Üblicherweise pathogene Keime können vorübergehend oder auch dauernd Bestandteil der Flora werden, ohne daß Krankheitserscheinungen auftreten müssen. Andererseits können typische Vertreter der kommensalen Flora Krankheit erzeugen, wenn sie in normalerweise keimfreie Körperbereiche gelangen oder wenn eine Abwehrschwäche des

3.6 Mikrobielle Besiedlung des gesunden Menschen

Wirtsorganismus vorliegt, sind also fakultativ pathogen. Mikroorganismen, die nur bei Abwehrschwäche Infektionen hervorrufen, werden auch opportunistische Erreger genannt. Infektionen, die von der normalen Keimbesiedlung ausgehen, werden als endogen bezeichnet.

3.6.1 Funktionen der physiologischen Flora Die Rolle der normalen Flora beim gesunden Menschen ist seit den Anfängen der Mikrobiologie Gegenstand von Spekulationen und wissenschaftlichen Auseinandersetzungen. Zwei gegensätzliche Meinungen, vorgebracht von hervorragenden Vertretern des Faches, beherrschten die Diskussion. PASTEUR vertrat die Ansicht, daß die normale Flora lebensnotwendig sei, während METSCHNIKOFF diese Mikroorganismen als Antagonisten bezeichnete, die mit dem Wirtsorganismus im Wettbewerb um essentielle Stoffe stünden. Auch heute sind bei weitem noch nicht alle Fragen beantwortet, doch steht eine Fülle experimenteller und epidemiologischer Daten zur Verfügung, die eine Bewertung der Rolle der normalen Flora erleichtern.

Als Bestandteil des Abwehrsystems schützt die normale Flora den Organismus vor einer Besiedlung und Invasion durch unerwünschte, meist pathogene Mikroorganismen. Mechanismen dieser Schutzwirkung sind die Konkurrenz um das Nährstoffangebot (Interferenz) und um Rezeptoren an Zellen des Wirtes (Tropismus), die Bildung von Bakteriozinen, die Aufrcchtcrhaltung eines für fremde Mikroorganismen ungünstigen Milieus (z.B. niedriges Redoxpotential im Dickdarm), die kontinuierliche Stimulation des Immunsystems durch Antigenpräsentation an Makrophagen und andere Zellen und durch Anregung der Bildung kreuzreaktiver, sogenannter natürlicher Antikörper (Tab. 3.24). Die metabolische Aktivität trägt einerseits zur Schutzfunktion bei, so hemmt etwa die Erniedrigung des pH-Wertes durch Milchsäure-produzierende Bakterien (Lacotobazillen, Biiidobakterien, Streptokokken) das Wachstum coliformer Keime in der Vagina und beim brustgefütterten Säugling im Darmtrakt und hat andererseits vielfältige andere Wirkungen, die teils günstig, teils ungünstig, meist aber indifferent oder zumindest unklar in ihrem Einfluß auf den Mikroorganismus sind. Hautbakterien setzen das Sekret der apokrinen Schweißdrüsen um und tragen damit zur Bildung des charakteristischen Körpergeruchs bei. Wenngleich dieser Geruch vom modernen Menschen als unerwünscht angesehen und daher durch Deodorants unterdrückt wird, hat er für andere Säugetiere und auch

Tab. 3.24 Wirkung der intestinalen Flora bei der Erhaltung der Kolonisationsresistenz und in der Infektionsabwehr Schutz gegen standortfremde Besiedlung Ŷ Konkurrenz um Nährstoffe und Wachstumsfaktoren Ŷ Besetzung von Rezeptoren, Behinderung der Adhärenz Ŷ Bildung von Bakteriozinen und toxischen Metaboliten Ŷ Senkung des pH-Wertes und des Sauerstoffpartialdruckes (Redoxpotential) Ŷ Anregung der Peristaltik Hemmung der Translokation von Mikroorganismen aus dem Darm Abbau von Toxinen Immunstimulation Ŷ kontinuierliche Antigenpräsentation an Makrophagen Ŷ Stimulation der Phagozytose Ŷ Bildung kreuzreaktiver Antikörper („natürliche" Antikörper) Ŷ Anregung der Interferonbildung

wahrscheinlich für den Menschen urtümlicher Kulturen eine große Bedeutung im sozialen und sexuellen Leben. Hautbakterien erfüllen damit zumindest für die letztgenannten Lebewesen die Kriterien von Symbionten.

Im Darm als größtem Keimreservoir spielen sich naturgemäß viele Stoffwechselprozesse ab. Gasbildung und Säureproduktion fördern die Peristaltik. Nahrungsmittelbestandteile und Medikamente, entweder oral aufgenommen oder über die Galle ausgeschieden, sind potentielle Substrate für bakterielle Umsetzungsprozesse. Es kann dabei sowohl zur Detoxifikation von Giftstoffen und zur Inaktivierung von Wirksubstanzen als auch zur Bildung toxischer Verbindungen und von Mutagenen und Kanzerogenen kommen. Die Zusammensetzung und damit die Enzymaktivität der Darmflora ist zu einem gewissen Teil von der Diät abhängig. Die Aktivität der Enzyme ß-Glukuronidase, Nitroreduktase, Azoreduktase und Steroid-7-Alpha-Dehydrogenase, die in erster Linie die Bildung von Kanzerogenen fördern, ist bei einer vorwiegend aus Kohlenhydraten, Faserstoffen und pflanzlichem Einweiß bestehenden Ernährung im Vergleich zu einer fleischreichen Kost deutlich erniedrigt. Ob dies in einem direkten Zusammenhang zur Häufigkeit des Kolonkarzinoms steht, muß offenbleiben, da bei der ballastreichen Ernährung

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Allgemeine Bakteriologie

durch die Beschleunigung der Darmpassage auch die Kontaktzeit für Kanzerogene verkürzt ist. Einige bedeutsame Enzymaktivitäten (Tab. 3.25): Bakterielle Glykosidascn, vornehmlich ßGlukosidase, ß-Galaktosidase und ß-Glukuronidase hydrolysiercn die ß-glykosidische Bindung, was zur Freisetzung biologisch aktiver Substanzen führt. So ist z.B. die Wirkung des Herzglykosides Digoxin davon abhängig, daß durch die Bakterienflora die Freisetzung der aktiven Substanz Digoxigenin katalysiert wird. Bei etwa 10% der Patienten erfolgt jedoch ein weiterer Abbau, der zu einer pharmakologisch inaktiven Substanz führt. Durch Esterbildung können Sulfonamide und manche Aminoglykosidantibiotika, durch Hydrolyse Chloramphcnicol inaktiviert werden. Durch Trinkwasser oder Nahrungsmittel zugeführte Nitrate werden zu Nitriten reduziert. Nitrite führen bei Säuglingen zu Methämoglobinämie. Aromatische Nitrosaminc mit stark kanzerogenen Eigenschaften entstehen in einem komplexen Umsetzungsprozeß durch die Wirkung der Nitroreduktase. Salizylazosulfapyridin, das in der Therapie der Colitis ulcerosa verwendet wird, wird erst durch die bakterielle Azoreduktase in seine aktiven Bestandteile zerlegt. Der künstliche Süßstoff Zyklamat wird durch Sulfatase zu dem für die Blase karzinogenen Zyklohexylamin. das über den Harn ausgeschieden wird. Ein Teil des Cholesterins, das über biliäre Sekretion, Nahrung und abgeschilferte Epithelien in den Darm gelangt, wird durch Bakterien metabolisiert. Das Ausmaß dieser Metabolisierung ist von diätetischen Faktoren abhängig.

Tab. 3.25 Metabolische Aktivität der Darmflora Wichtige Enzyme Glykosidasen ß-Clukosidase ß-Glukuronidase ß-Galaktosidase Azoreduktasen, Nitroreduktasen Sulfatasen, Esterasen Dehydroxylasen, Dekarboxylasen Auswirkungen Detoxifikation von Giftstoffen Aktivierung und Inaktivierung von Pharmaka Bildung von toxischen Verbindungen, Mutagenen und Kanzerogenen Dekonjugation von Gallensäuren Cholesterinabbau Vitaminsynthese: Vitamin K, B2, Bä, Bi2, Folsäure, Biotin, Pantothensäure

Gallensalze werden normalerweise im Dickdarm dekonjugiert. Eine massive - unphysiologische - Kolonisation des Dünndarms führt bereits hier zu einem verstärkten Gallensäureabbau, der sich in Diarrhöe, Steatorrhoe, Vitamin B 12-Mangel und Malabsorption äußert. Vitamin K wird unabhängig von der Zufuhr von außen durch die normale Flora in ausreichendem Maße synthetisiert. Antibiotika können durch Verminderung der Darmbakterien die Vitamin K-Bildung hemmen und damit zu einer Gerinnungsstörung führen. Manche Cephalosporinantibiotika wirken allerdings auch zusätzlich noch als direkte Vitamin K-Antagonisten. Zur Behebung der Gerinnungsstörung muß in beiden Fällen Vitamin K von außen zugeführt werden. Auch andere Vitamine wie Folsäure, Vitamin B 12, Pyridoxin, Biotin, Pantothensäure und Riboflavin werden von Bakterien gebildet. Die Ureaseaktivität von Darmbakterien ist wahrscheinlich die einzige Quelle für Ammoniak im tierischen Organismus. Beim Ausfall der Leberfunktion kann es zur Anhäufung von Ammoniak im Blut kommen, was zur Ausbildung einer hepatischen Enzephalopathie beiträgt. Durch orale Gabe nicht resorbierbarer Antibiotika versucht man, die Entstehung von Ammoniak zu verhindern.

3.6.2 Bedeutung der physiologischen Flora für die mikrobiologische Diagnostik Für die Interpretation mikrobiologischer Befunde sind Kenntnisse der normalen Standortflora des Untersuchungsgebietes unbedingt erforderlich.

Dies gilt für alle Materialien, die normalerweise Anteile der physiologischen Flora enthalten, wie Sputum, und ebenso für solche, deren Gewinnung über keimhaltige Körperbereiche erfolgen, z.B. Mittelstrahlharn. Bei der Beurteilung ist zu berücksichtigen, daß üblicherweise als pathogen bezeichnete Mikroorganismen, wie z.B. Pneumokokken im Oropharynx, in kleiner Keimzahl als Bestandteil der normalen Flora angesehen werden können und daß Keime mit geringer Virulenz, die sonst als normale Standortflora betrachtet werden, bei einem Abwehrgeschwächten u.U. infektionsauslösend sind. Der Befund muß daher eine quantitative oder zumindest semiquantitative Angabe der Keimverteilung ent-

3.6 Mikrobielle Besiedlung des gesunden Menschen

halten. Zur Bewertung der Befunde müssen klinische Daten bekannt sein.

ganismen aus Materialien, die stark mit normaler Flora durchsetzt sind.

Bereits bei der Gewinnung der Probe muß danach getrachtet werden, daß eine Verunreinigung mit der normalen Flora möglichst gering gehalten wird. Ein rascher Probentransport und Transportmedien sollen dafür sorgen, daß die ursprüngliche Keimzusammensetzung erhalten bleibt, und daß nicht etwa anspruchslose Organismen aus der Normalflora in der Probe überwuchern.

3.6.3 Zusammensetzung der physiologischen Flora

Die Verwendung von Selektivmedien ermöglicht ein sicheres Erkennen relevanter Mikroor-

Die normale Flora setzt sich aus Bakterien, Pilzen und Protozoen zusammen (Tab. 3.26). Obwohl manche Viren gelegentlich auch aus Materialien von Gesunden kultiviert werden können, wird eine physiologische Virusbesiedlung beim Menschen nicht angenommen. Die Artenvielfalt der normalen Flora ist beträchtlich. Allein im Darmtrakt sind wahr-

Tab. 3.26 Keimbesiedlung beim Gesunden Körperregion

Keimzahlen 3

2

vorherrschende Flora

Haut, äußerer

ca10 /cm Axilla,

Koagulase-negative Styphylokokken

Gehörgang äußere Nasenhöhlen

Inguinalregion bis 6 2 10 /cm

Micrococcus spp., Corynebactehum spp., („diphtheroide Stäbchen"); Propionibacterium aenes, Brevibacterium, Acinetobacter, Pitymsporum; transient oder resident auch Staphylococcus aureus

Mundhöhle,

bis 107ml Speichel

vergrünende Streptokokken, Neisseria, Moraxella, Haemo-

Nasopharynx

(obligate Anaerobier überwiegen um das 10-1 OOfache)

philus spp., Laktobazillen, gelegentlich Enterobakteriazeen, Enterokokken, Pseudomonaden, Sproßpilze; Besiedlung mit Streptococcus pneumoniae und Neisseria meningitidis möglich, artenreiche anaerobe Flora (Prevotella, Porphyromonas, Fusobactehum, Bacteroides, Actinomyces spp., anaerobe Kokken etc.

Ösophagus,

variabel

transiente Mundhöhlenflora

Magen

meist < 10/ml

und exogene Mikroorganismen

Dünndarm Duodenum Jejunum

3

bis10 /ml 5

ca 10 /ml 8

9

lleum

10 -10 /ml

Dickdarm

bis 10 /g

12

wie Ösophagus und Magen, retrograde Besiedlung möglich Laktobazillen, Streptokokken Enterobakteriazeen, Bacteroides spp., Prevotella, Porphyromonas, Fusobakterien, Bifidobakterien, Enterokokken Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas spp., Fusobakterien, Eubakterien, Bifidobakterien, Streptokokken, Peptostreptokokken, E. coli u.a., Enterobakteriazeen, Enterokokken, Veillonella, Laktobazillen, Clostridium spp., Staphylokokken, Pseudomonaden, Sproßpilze, Protozoen

distale Urethra

Vagina

2

4

10 -10 ml

Flora der umgebenden Hautregionen, zusätzlich Strepto-

Erststrahlurin

kokken, Enterokokken, Mykoplasmen, Ureaplasmen

5

9

10 -10 /ml Sekret

Laktobazillen, Streptokokken, Prevotella spp., u.a. Anaerobier (Mykoplasmen, Ureaplasmen)

vor der Pubertät und in der Postmenopause

Anteile der Haut- und Dickdarmflora

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Allgemeine Bakteriologie

scheinlich 400-500 Spezies und Subspezies vertreten, von denen allerdings nur wenige Gruppen als Erreger endogener Infektionen beobachtet werden und damit überhaupt in das Bewußtsein des diagnostisch tätigen Mikrobiologen treten. Trotz hoher Artenvielfalt und einer beträchtlichen individuellen Variationsbreite bleibt beim einzelnen Menschen die physiologische Flora relativ stabil und kehrt nach einer Störung normalerweise rasch wieder zur Ausgangslage zurück. So konnte bei Versuchspersonen über Monate eine ähnliche Zusammensetzung der Flora auch nach kurzfristiger experimenteller Störung durch Antibiotika festgestellt werden. Die verschiedenen Körperbereiche haben eine für sie charakteristische Standortflora, die residente Flora. Mikroorganismen, die in einem bestimmten Bereich nicht heimisch sind, sondern durch exogene oder endogene Einflüsse zeitweilig nachweisbar sind, bezeichnet man als transiente Flora. Gelegentlich können auch solche temporären Besiedlungskeime zum dauernden Bestandteil der normalen Flora, also resident werden. Dies trifft auf Staphylococus aureus zu, der beim Krankenhauspersonal häufig in der Nase und auf der Haut gefunden wird, wobei Stämme, die gegen eine Vielzahl von Antibiotika resistent sind, eine große epidemiologische Bedeutung haben. Der Widerstand, der standortfremden Keimen oder einer Besiedlung von normalerweise keimfreien Regionen entgegengesetzt wird, wird als Kolonisationsresistenz bezeichnet. Die Kolonisationsresistenz besteht aus Faktoren, die vom Wirtsorganismus herrühren und von solchen, die von der physiologischen Besiedlung ausgehen. Wirtsfaktoren, welche die weitgehende Keimfreiheit des Respirationstrakts nach dem Larynx und des Harntrakts ab dem oberen Teil der Harnröhre bedingen, sind die mechanische Entfernung von Bakterien durch den Zilienschlag und durch die hydrodynamischen Kräfte des Harnflusses und die Hemmung der Adhärenz von Bakterien an Epilhelien durch Schleimbildung und sekretorisches Immunglobulin A. Auch in Mundhöhle und Verdauungstrakt tragen Wirtsfaktoren zur stabilen mikrobiellen Ökologie bei, neben den bereits erwähnten unspezifischen Abwehrfaktoren wie Lysozym, Laktoferrin, das Peroxidase-Thiozyanat und das Komplementsystem sowie die einwandernden Leukozyten, weiter die Peristaltik, die die Verweildauer nicht adhärenter Bakterien verkürzt.

Der mikrobielle Beitrag zur Kolonisationsresistenz wurde bereits erwähnt. Besonders im Dickdarm hemmt allein die gewaltige Zahl anaerober Bakterien, welche die Epithelien wie eine Tapete überziehen, die Adhärenz transienter Organismen. Besiedlung der Haut

Die Hautflora besteht in erster Linie aus Bakterien der Gattungen Staphylococcus, Micrococcus, Corynebacterium, Propionibacterium, Brevibacterium und Acinetobacter. Ebenso finden sich verschiedene anaerobe Kokken und Sproßpilze der Gattung Pityrospontm (Malassezia). Darüber hinaus können als transiente Flora viele andere Keimgruppen nachgewiesen werden, die aber meist keine günstigen Bedingungen für die dauernde Ansiedlung auf dem komplexen Ökosystem der Haut vorfinden. Diese Anflugoder Kontaktkeime sind leicht durch mechanische Maßnahmen wie etwa das Händewaschen zu entfernen, wogegen eine deutliche Reduktion der residenten Flora nur durch längere Einwirkung von Desinfektionsmitteln möglich ist. Die Keimdichte ist je nach Körperregion unterschiedlich und ist auch vom Feuchtigkeitsgehalt und vom Nährstoffangebot abhängig. An trockenen Körperstellen ist mit Keimzahlen von etwa 1(P pro cm2 zu rechnen, in der Axilla und im Inguinalbereich sind es 106 Keime pro cm2 und darüber. Der überwiegende Teil der Hautkeime liegt im Stratum corneum und im oberen Teil der Haarfollikel. Die Keimbesiedlung in der Nase und im äußeren Gehörgang entspricht mit geringen standortbedingten Unterschieden der anderer Hautareale. Besiedlung des Auges

Die Zahl der Keime auf den Konjunktiven ist niedrig, da die Tränenflüssigkeit durch ihren Lysozymgehalt stark hemmend wirkt. Hauptsächlich finden sich Corynebakterien, verschiedene (apathogene) Neisserien, gramnegative Stäbchen der Gattung Moraxella und Bestandteile der Hautflora aus der Umgebung. Besiedlung der Mundhöhle

Die Mundhöhle mit ihrem komplexen Aufbau enthält unterschiedliche Mikrobiotope und ökologische Nischen. Zu diesen gehören die Tonsillarkrypten, die Zunge, die glatte Oberfläche der

3.6 Mikrobielle Besiedlung des gesunden Menschen

Wangenschleimhaut und des Gaumens, die Gingiva, die harten Oberflächen der Zähne und die Zahnplaques. Die Mundhöhle ist außerdem Durchgangsstation für viele Mikroorganismen, die mit der Nahrung und durch direkten Kontakt eingebracht werden. Substanzen des spezifischen und des unspezifischen Abwehrsystems im Speichel (s.a. Kolonisationsresistenz) tragen trotzdem zur Stabilität des Ökosystems bei. Die Keimzahlen im Speichel betragen bis zu 109/ml. Die überwiegende Zahl der Mikroorganismen sind obligate Anaerobier, welche die aerob wachsenden Keime um 1-2 Zehnerpotenzen übertreffen. Leitkeime der aerob wachsenden Flora sind vergrünende Streptokokken und Neisserien. Weiterhin finden sich HaemophilusArten, Moraxellen, Staphylokokken, Corynebakterien, Laktobazillen, Entcrokokken sowie gelegentlich Enterobakteriazeen und Pseudomonaden, ebenso Sproßpilze, Amöben und Trichomonaden. Die anaerobe Bakterienflora ist äußerst artenreich, unter den gramnegativen sind Arten der Gattungen Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas, Campylobacter, Fusobacterium, Leptotrichia, Selenomonas, Wolinella und Veillonella zu finden, unter den gram-positiven Arten Actinomyces, Arachnia, Bifidobacterium, Eubacterium, Lactobacillus, Propionibacterium und Peptostreptococcus. An der Entstehung der Karies ist die normale Mundflora beteiligt. Durch sie werden hochmolekulare Dextrane und Levane gebildet, die sich an der Zahnschmelzoberfläche als Plaques ablagern und ideale Bedingungen für Adhärcnz und Wachstum von säureproduzierenden Bakterien bieten. Durch die Säure wird der Zahnschmelz demineralisiert. Eine besondere Bedeutung bei diesen Vorgängen hat Streptococcus mutans, jedoch auch andere Strepto- und Peptostreptokokken. Zuckerzufuhr erhöht die metabolische Aktivität der Bakterien. Besiedlung von Speiseröhre, Magen und Darm Keime der Mundhöhlenflora werden über die Speiseröhre in den Magen befördert. Durch die Wirkung der Magensäure sind die Keimzahlen dort sehr gering. Je nach pH-Wert betragen sie zwischen 10' und 105 pro ml, können jedoch nach der Nahrungsaufnahme kurzfristig auf höhere Werte ansteigen. Die Keimarten spiegeln im wesentlichen die Verhältnisse in der Mundhöhle wider. Von einer eigenständigen re-

sidenten Flora des Magens kann nicht gesprochen werden, wenn man von Helicobacter pylori absieht, dessen Anwesenheit offensichtlich mit Krankheit in Verbindung zu setzen ist. Keimarm ist auch das Duodenum mit ähnlichen Werten wie der Magen, die Keimzahlen nehmen nach aboral zu, erreichen im Jejunum bis zu 10-\ im Ileum bis zu 109 und steigen im Kolon auf ihre maximalen Werte bis zu 1012 pro g Darminhalt an. Letztere sind auch die Keimzahlen, die in den Fäzes gefunden werden. Wegen der Artenvielfalt der Darmflora ist eine exakte Beschreibung kaum möglich. Als häufige Vertreter der aeroben und fakultativ anaeroben Bakterien sind Enterobakteriazeen - hier überwiegend Escherichia coli - Enterokokken, Streptokokken, Staphylokokken und Laktobazillen zu finden, weiterhin Pseudomonaden, Vibrionen und Sproßpilze, hauptsächlich Candidaarten. Unter den obligaten Anaerobiern finden sich Bacteroides- Arten, Fusobakterien, Bifidobakterien, Eubacterium- und Clostridium-Äxten, Pcptokokken, Peptostreptokokken, Veillonella und viele andere. Das Verhältnis zwischen obligat anaeroben und aerob wachsenden Bakterien ändert sich vom Dünndarm, wo beide Gruppen in etwa gleichen Keimzahlen vertreten sind, bis zum Dickdarm, wo die obligaten Anaerobier die anderen um das 100- bis lOOOfache übertreffen. Richtung aboral nehmen die Enterobakteriazeen sowie Bacteroides und Clostridien absolut und relativ zu. Zu den Clostridien der normalen Flora gehören auch Clostridium perfringens und - meist nur in kleinen Keimzahlen - Clostridium difficile. Weiterer Bestandteil der Flora sind verschiedene Protozoen wie Trichomonaden und Amöben. Besiedlung des Urogenitaltrakts Nierenbecken, Ureter und Blase sind normalerweise steril. Im distalen Teil der Urethra sind Enterokokken, Streptokokken, Staphylokokken, Laktobazillen aber auch Enterobakteriazeen und andere gramnegative Keime in kleinerer Zahl vorhanden. Die urethrale Mischflora kann in Harnproben, abhängig von der Art der Gewinnung, als Verunreinigung in Keimzahlen von 102 bis ]04 pro ml aufscheinen. Laktobazillen und verschiedene Anaerobier der Gattungen Bacteroides, Prevotella und Porphyromonas sind der dominierende Anteil der Vaginalflora bei der geschlechtsreifen Frau. In ge-

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Allgemeine Bakteriologie

ringeren Mengen finden sich auch Strepto- und Enterokokken, Enterobakteriazeen, Mykoplasmen und Ureaplasmen, anaerobe Kokken, Clostridien, Bifidobaktcrien und Fusobakterien sowie auch Sproßpilze. Die Milchsäureproduktion der Laktobazillen senkt den pH-Wert und hindert damit das Überwuchern anderer Keime. Die Scheidenflora ist starken physiologischen Schwankungen unterworfen, sie ändert sich im Laufe des Menstruationszyklus, während der Schwangerschaft und in der Menopause. In der Schwangerschaft kommt es häufig zu einer Besiedlung mit Sproßpilzen und Streptokokken, vor allem mit ß-hämolysierenden Streptokokken der Gruppe B (Strepiococcus agalactiae). ]n der Menopause erfolgt vermehrt eine Besiedlung, die von der Darmflora ausgeht. Im Zervikalkanal nimmt die Besiedlung gegenüber der Vagina ab und sinkt im Cavum uteri auf minimale Werte.

3.6.4 Änderungen während des Lebens und durch äußere Einflüsse Bis zur Geburt ist der Fötus im Mutterleib keimfrei. Während des Geburtsvorganges kommt es zum ersten Kontakt mit Mikroorganismen aus der mütterlichen Flora. Innerhalb weniger Tage werden Haut und Schleimhäute mikrobiell besiedelt.

Die Keimaufnahme in den Darm erfolgt über die Mundhöhle. Erste Besiedlungskeime des Säuglingsdarms sind Escherichia coli und Streptokokken sowie Laktobazillen und Staphylokokken. Erst einige Tage später treten beim brustgestillten Säugling die Bifidobakterien in den Vordergrund. Durch deren Milchsäureproduktion sinkt die Zahl der anderen Bakterien ab, so daß während der Stillperiode eine typische Bifidobakterienflora vorhanden ist. Nach dem Abstillen kommt es rasch zur Besiedlung mit denjenigen Keimen, die als typische Bestandteile der Darmflora beschrieben wurden. Im höheren Lebensalter steigt in der Mundhöhle der Anteil von Enterobakteriazeen und Enterokokken an, so daß in Sputumproben oft diese Bakterien vorherrschend gefunden werden. Ebenso nimmt die Besiedlung mit diesen Bakterien im Urogenitaltrakt zu.

Antibiotika und Antiseptika üben erwartungsgemäß einen starken Einfluß auf die normale Flora aus.

Auf der Haut senken vor allem Tetrazykline und Clindamycin die Keimzahl, wogegen Penicilline nur geringe Wirkung haben. Den deutlichsten Einfluß auf die Keimzahlen haben allerdings Desinfektionsmittel wie Alkohol und lokale Antiseptika wie Hexachlorophen und Chlorhexidin. Letztere führen zu einer länger anhaltenden Suppression der Hautflora. Ob allerdings eine präoperative Waschung mit Chlorhexidin die Häufigkeit von Wundinfektionen senken kann, bleibt umstritten. Wenn durch Antibiotika die Kolonisationsresistenz im Darm, die vor allem durch Anaerobier bedingt ist, gestört wird, so kommt es leicht zur Neubesiedlung mit resistenten Mikroorganismen oder zum Überwuchern einzelner Keimarten, wie z.B. Clostridium difficile, dem Erreger der Antibiotika-assoziierten Colitis. Die Bedeutung der Kolonisationsresistenz und der Einfluß der Antibiotika kann an einem Experiment demonstriert werden. Verabreicht man gesunden Probanden eine Suspension von Pseudomonas aerogenosa, so kommt es nur zu einer kurzfristigen Ausscheidung dieses Keimes mit dem Stuhl. Wird jedoch gleichzeitig mit der externen Keimbelastung Ampicillin gegeben, wird der Darm dauerhaft besiedelt. Die Wiederherstellung normaler Verhältnisse erfolgt erst nach Absetzen des Antibiotikums. Weitere Medikamente mit Wirkung auf die Keimbcsiedlung sind Zytostatika mit Antibiotika-ähnlichen Eigenschaften, Kontrazeptiva und Steroide, die eine Besiedlung mit Sproßpilzen fördern, sowie Antazida und Histamin H2-Rezeptorenblocker, bei deren Anwendung die Besiedlung des Magens mit Darmbakterien und Sproßpilzen zunimmt. Fremdkörper wie Harnkatether oder Trachealtuben können Schienen für eine mikrobielle Besiedlung üblicherweise keimfreier Körperbereiche bilden. Krankheiten wie Diabetes mellitus disponieren zu einer Besiedlung mit Sproßpilzen.

3.6.5 Die physiologische Flora als Quelle endogener und nosokomialer Infektionen Endogene Infektionen können sowohl außerhalb des Krankenhauses auftreten, als auch im Krankenhaus erworben werden, also nosokomi-

3.6 Mikrobielle Besiedlung des gesunden Menschen

al sein. Beispiele für endogene Infektionen sind Harnwegsinfektionen, die ihren Ausgang meist von der Darmflora nehmen, oder die Endocarditis lenta, deren Erreger, vorwiegend Streptokokken, während flüchtiger Bakteriämien, die in der oropharyngealen Flora ihren Ursprung haben, durch den Blutkreislauf zum Herzen gelangen und sich auf bereits geschädigten Klappen festsetzen können. Ebenfalls endogen ist eine Peritonitis, die durch Austritt von Darminhalt entsteht, etwa bei der Perforation einer entzündeten Appendix oder eines Sigmadivertikels. Bei einer derartigen Infektion wird massenhaft Endotoxin aus gram-negativen Darmbakterien freigesetzt, was zum septischen Schock führt. Wird bei einer Ohnmacht oder Krcislaufstillstand Magensaft und Speichel aspiriert, so können sich Bakterien aus der Mundhöhlenflora in dem durch die Säure geschädigten Lungengewebe vermehren und eine Aspirationspneumonie verursachen. Die Beatniungspneumonie, eine gefürchtele Komplikation beim Patienten auf der Intensivstation, entsteht durch gram-negative Bakterien, die, vom Darm ausgehend, retrograd den Oropharynx besiedeln und entlang des Bcatmungstubus in die Lunge gelangen. Durch eine antibiotikahaltige Paste, die auf die Mundschleimhaut aufgebracht wird, kann dieser endogene Infektionsweg unterbrochen werden. Auch postoperative Wundinfektionen können von der normalen Flora ausgehen, etwa nach Eingriffen am Darmtrakt (z.B. Dickdarm- und Gallenwegschirurgic), oder bei Infektionen durch Hautkeime. Die Häufigkeit derartiger Infektionen kann durch eine perioperative Antibiotikaprophylaxe verringert werden. Zur Vermeidung einer Selektion resistenter Keime soll die Prophylaxe nur kurzfristig sein (Einzeldosis oder bis maximal 24 Stunden postoperativ). Die Auswahl der Antibiotika richtet sich in erster Linie nach den als Erreger in Frage kommenden Keimen der normalen Flora. Abwehrgeschwächte Patienten erkranken häufig an endogenen Infektionen. Bei Granulozytopenie (Neutropenie), z.B. nach zytostatischer Behandlung einer Leukämie, ist der Gastrointestinaltrakt das wichtigste Reservoir und die häufigste Eintrittspforte für Sepsiserreger. Das Übertreten von Bakterien aus dem Darm in die Lymphbahn und ins Blut wird auch als Translokation bezeichnet. Die größte Bedeutung für septische Infektionen beim Neutropeniker haben Enterobakteriazeen, Pseudomonaden und andere gramnegative Stächen sowie Pilze. Pro-

phylaktisch wird bei diesen Patienten eine selektive Darmdekontamination mit Antibiotika, die speziell gegen diese Keime gerichtet sind, jedoch die anaerobe Flora und damit die Kolonisationsresistenz wenig beeinflussen, mit gutem Erfolg eingesetzt. Bei Ausfall der Filterfunktion der Leber oder bei Umgehung des Pfortaderkreislaufes, etwa bei Zirrhose, treten vermehrt - allerdings meist gutartig verlaufende - Bakteriämien durch Darmbakterien auf. Eine Schlüsselstellung für die Entwicklung und die Ausbreitung antibiotikaresistenter Bakterienstämme im Krankenhaus hat die Keimbesiedlung bei Patienten und Personal (Abb. 3.47). Es ist bekannt, daß mit zunehmender Aufenthaltsdauer im Krankenhaus immer mehr Patienten mit Bakterien kolonisiert werden, die Resistenzplasmide tragen. Zur Selektion solcher Bakterienstämme kommt es durch Antibiotikagabe.

Die resistenten Stämme können auf Personal und andere Patienten übertragen werden und diese Personen entweder transient besiedeln oder residenter Bestandteil der Flora werden. Die Prophylaxe einer derartigen Resistenzausbreitung im Krankenhaus stützt sich auf die kritische und problemorientierte Anwendung von Antibiotika (Antibiotikapolitik), die Selektion und Ansiedlung resistenter Keime verhindern soll, und auf hygienische Maßnahmen, die die Weitergabe von Mensch zu Mensch unterbrechen. Neben mehrfachresistenten Enterobakteriazeen und Pseudomonaden sind es heute vor allem die Methicillin- und Aminoglykosid-resistenten (multiresistenten) Staphylocoocus aura<s-Stämme (MARSA) und die Glykopeptid(Vancomycin-)resistenten Enterokokken (GRE,

Abb. 3.47 Schematische Darstellung zur Rolle der normalen Keimbesiedlung in der Ausbreitung resistenter Bakterienstämme im Krankenhaus.

245

246

Allgemeine Bakteriologie

VRE), die Anlaß zur Sorge geben. MARSA besiedeln vor allem den Nasen-Rachen-Raum und die Perianalregion und können von da aus streuen. Das Auftreten von MARSA erfordert rigorose Maßnahmen der Händehygiene, der Isolierung und der Sanierung der Keimträger durch topische oder systemische Antibiotika. GRE bedeuten vor allem für immunkompromittierte Patienten, etwa nach Leber- oder Knochenmarktransplantation, eine Bedrohung, sind aber derzeit in Europa noch wenig verbreitet.

Literatur DRASAR, B. S. and P. A. BARROW: Intestinal Microbiology. Amer. Soc. Microbiol., Washington, DC. 1985. FINEGOLD, S. M. and W. L. GEORGE (cds.): Anaerobic Infections in Man. Academic Press, London. New York 1989. HILL. M. J. and P. D. MARSH (eds.): Human Microbial Ecology. CPR Press, Boca Baton. FL, 1990. S KINNER , F. A. and J. G. C ARR (eds.): The Normal Microbial Flora of Man. Academic Press, London, New York 1974.

Spezielle Bakteriologie 4.1

Die Familie der Micrococcaceae

411 4 1.2 4.1.3

GEORG PETERS, GERHARD PULVERER Genus Stanhvlococcus S. aureus-Gvuppe Koagulasenegative Staphylo-

4.1.4

250

4

4.4.11

Enteroaggregative E. coli (EAEC)

309

4.4.12 4.4.13

Diffus-adhärenle E. coli (DAEC) Fakultativ-pathogene En terobacteri azecn Plesiomonas shigelloides

310

250 250

4.4.14

kokken Micrococcus und Stomatococcus

257 259

4.5

Die Gattung Yersinia, Yersiniosen JÜRGEN HEESEMANN

315

4.2

Die Familie der Streptococcaceae ANDREAS PODBIELSKI RUDOLF LÜTTICKEN

260

4.5.1 4.5.2 453 4.5.4

Überblick und Systematik Pathogentitätsprinzip Yersinia pestis Pest Enteropathogene Yersinien,

315 316 319

4.2.1 422 4.2.3

Streptococcus pyogenes Streptococcus agalactiae Streptococcus pneumoniae

263 267 268

4.2.4 425 426 427

Mitis-Mutans-Gruppe Anginosus-Bovis-Gruppe Enterokokken Gram-positive anaerobe GPAK

271 273 273 274

4.6

461 4.6.2

Die Familien Vibrionaceae und Aeromonadaceae JÜRGEN HEESEMANN Die Gattung Vibrio Vibrio cholerae, Cholera

4.3

Die Familie der Neisseriaceae . . . . MATTHIAS FROSCH Die Gattung Neisseria Die Gattungen Branhamella Moraxella, Kingella, Eikenella und

276

4.6.3

Die Gattung Aeromonas

336

276

4.7

Die Gattung Pasteurella, Pasteurellosen RAINER ANSORG

337

Veillonella

283 4.8

Die hämophilen Bakterien

341

283

4.8 1 4.8.2

GEORG PLUM Die Gattung Haemophilus Haemophilus influenzae

341 341

288

4.8.3

4.3.1 432

4.4

4.4.1 4.4.2 4.4.3

Die Familie der Enterobacteriaceae JÜRGEN HEESEMANN Die Gattung Salmonella Salmonella Typhus und S. Paratyphus: Typhus/Paratyphus Enteritische Salmonellen Salmonellosen

292 4.8.4 295

4.4.4

Shigellen und die Gattung

4 4.5 4.4.6

Escherichia Escherichia coli Darmpathogene Escherichia coli

298 303 304 306

4.4.8

Enterohämorrhagische E. coli (EHEC) Enteropathogene

449 4.4.10

E coli (EPEC) Enterotoxische E coli (ETEC) Enteroinvasive E. coli (EIEC)

307 308 309

4.4.7

Y. pseudotuberculosis und Y enterocolitica .

4.8.5

Haemophilus parainfluenzae und andere Arten der HACEKGruppe Haemophilus ducreyi (Ulcus molle)

491 4.9.2

323

329 330 331

347 347

Gardnerella vaginalis, unspezifische Kolpitis

4.9.

310 314

348

Pseudomonaden und andere anspruchslose, nicht fermentierende gram-negative Bakterien ALEXANDER VON GRAEVENITZ

350

Die Gattung Pseudomonas und P. aeruginosa Die Gattung Burkholderia

350 352

Spezielle Bakteriologie

248

4.9.3

4.9.4 4.9.5 4.9.6

4.9.7 4.9.8 4.9.9

4.10

Die Gattung Ralstonia, Comamonas, Acidovorax, Brevundimonas und Stenotrophomonas Die Gattung Alcaligenes Die Gattung Alcinelobacter Das Gattung Chryseomonas und Verwandte .. Die Gattung Ochrobactrum Die Gattung Psychrobacter Die Gattungen Agrobacterium, Balneatrix, Methylobacterium, Roseomonas, Shewanella und Sphingomonas Die Familie der Legionellaceae, Legionellose ALEXANDER VON GRAEVENITZ

352 353 353 353 353 353 353

4.15

4.15.1 4.15.2 4.15.3 4.15.4 4.15.5 4.15.6 4.16

354

4.16.1 4.16 2

4.11

Die Gattung BrucellaBrucellose WERNER KÖHLER

Die Gattung Bordetella (Keuchhusten) GEORG PLUM 4.12.1 Bordetella pertussis, Keuchhusten 4.12.2 Bordetella parapertussis 4.12.3 Bordetella bronchiseptica und Bordetella avium

356

Anaerobe gram-negative Stäbchen (Bacteroides und andere) HEIDI SCHÜTT-GEROWITT Geschichte Erregereigenschaften Normales Vorkommen und Pathogenese Klinik Laboratoriumsdiagnose Therapie und Prophylaxe Gram-negative, fakultativ anaerobe bzw. mikroaerophile Bakterien (HACEK-Gruppe) GERHARD PULVERER Actinobacillus (Haemophilus) actinomycetemcomitans Eikenella corrodens

4.16.3 4.16.4 4.16.5 4.16.6

Haemophilus aphrophilus Carciobacterium hominis Kingella Capnocytophaga

4.17 4.17.1 4.17.2 4.18 4.18.1 4.18.2 4.18.3 4.18.4 4.19

Die Gattung Corynebacterium, Diphtherie HEIDI SCHÜTT-GEROWITT, JOSEF BEUTH Corynebacterium diphteriae Andere Corynebakterien

376 376 376 377 378 379 380

381

381 382 382 382 382 382

4.12

4.13 4.13.1 4.13.2 4.13.3 4.13.4 4.13.5 4.13.6

Die Gattung Francisella Tularämie WERNER KÖHLER Eigenschaften Pathogenese Klinik Laboratoriumsdiagnose Therapie Epidemiologie und Bekämpfung

4.14

4.14.1 4.14.2 4.14.3 4.14.4

Die Gattungen Streptobacillus, Campylobacter, Arcobacter und Helicobacter MANFRED KIST Rattenbiß-Erkrankungen Die Gattung Campylobacter Die Gattung Arcobacter Helicobacter pylori

359

359 365 365

365 366 366 366 367 367 367

4.19.1 4.19.2 4 19.3 368 368 368 372 372

4.19.4 4.19.5 4.19.6

Die Gattung Erysipelothrix, Rotlauf JOSEF BEUTH, HEIDI SCHÜTT-GEROWITT Eigenschaften Pathogenese, Klinik Laboratoriumsdiagnose Therapie Die Gattung Listeria, Listeriose JOSEF BEUTH, HEIDI SCHÜTT-GEROWITT Eigenschaften Pathogenese Klinik Laboratoriumsdiagnose Therapie Epidemiologie und Prophylaxe

382

383 386

387

387 387 387 388

388

388 388 389 389 390 390

249

Inhaltsverzeichnis

4.20

4.20.1 4.20.2 4.20.3 4.20.4

4.20.5 4.20.6

4.21

4.21.1 4.21.2

Sporenbildende gram-positive Bakterien (Bacillus, Clostridium) Milzbrand, Tetanus, Gasbrand, pseudomembranöse Colitis, Botulismus WERNER KÖHLER Bacillus anthracis, Milzbrand Bacillus cereus, B. mycoides, B. subtilis Clostridium tetani, Tetanus

4.23.9 4.23.10 4.23.11

Die Familie der Propionibacteriaceae GERHARD PULVERER Das Genus Propionibacterium Das Genus Eubacterum

391

4.24

394 395

4.24.1 4.24.2 4.24.3 4.24.4 4.24.5 4.24.6 4.24.7

4.22.1 4.22.2 4.22.3 4.22.4 4.22.5 4.22.6 4.23 4.23.1 4.23.2 4.23.3

4.23.4 4.23.5

4.23.6 4.23.7 4.23.8

Die Familie der Mycobacteriaceae ERIK C. BÖTTGER Eigenschaften Allgemeine Pathogenesemechanismen Laboratoriumsdiagnose Tuberkulose Nichttuberkulöse Mykobakterien Lepra Die Aktinomyzeten KLAUS PETER SCHAAL Allgemeine Eigenschaften Aktinomykosen Entzündungen der Tränenkanälchen-Canaliculitis lacrimalis Karies und Parodontitis Menschliche Erkrankungen durch weitere fermentative Aktinomyzeten Nocardiosen Aktinomyzetome Rhodococcus-, Gordonia- und Tsukamurella-Infektionen

450 451

Die Familie der Spirochaetaceae Spriochätosen HEIDI SCHÜTT-GEROWITT Die Gattung Treponema Syphilis (Lues) Andere Terponematosen Die Gattung Borrelia Lympe-Erkrankung Rückfallfieber Die Gattung Leptospira

452 452 452 456 458 458 461 462

402

406 406 407

4.25

Mycoplasma und Ureaplasma WOLFGANG BREDT

464

4.25.1 4.25.2

Allgemeines Erkrankungen durch Mycoplasma pneumoniae Erkrankungen im Urogenitaltrankt Sonstige Mycoplasmalnfektionen Mykoplasmen und Zellkultur

465

470

4.26.2 4.26.3 4.26.4 4.26.5 4.26.6

Obligat intrazelluläre Bakterien WOLFGANG BREDT Die Gattungen Rickettsia und Orientia Fleckfieber-Gruppe Zeckenbißfieber-Gruppe Tsutsugamushi-Fieber Die Gattung Ehrlichia Coxiella burnetii

4.26.7

Die Gattung Chlamydia

4.26.8 4.26.9 4.26.10

Chlamydia trachomatis Chlamydia psittaci Chlamydia pneumoniae

475 477 479 480

4.27

Die Gattung Bartonella WOLFGANG BREDT Eigenschaften der Erreger Epidemiologie Diagnostische Verfahren und Therapie Infektionen mit Bartonella bacilliformis Infektionen mit Bartonella quinatan und Bartonella henselae

4.25.3 4.25.4

4.22

450

390

Clostridium difficile, pseudomembranöse Colitis, antibiotika398 assoziierte Diarrhöe ................................ Clostridium botulinum, Botulismus 399 Werner Clostridien, Gas- und Rauschbrand

Dermatophilose Exogen allergische Alveolitis Aktinomyzeten als AntibiotikaProduzenten

407 408 411 412 418 428 431

434 434 437

443 443

444 444 448 449

4.25.5

4.26 4.26.1

4.27.1 4.27.2 4.27.3 4.27.4 4.27.5

467

469 469 469

470 472 473 473 473 474

481 481 481 482 482 482

250

Spezielle Bakteriologie

4.1 Die Familie der Micrococcaceae

te 1926 klare Zusammenhänge zwischen der Plasmakoagulase-Aktivität von Staphylokokken und ihrer pathogenen Bedeutung.

GEORG PETERS, GERHARD PULVERER

Die Familie der Micrococcaceae umfaßt grampositive, meist katalasepositive Kokken, die überwiegend fakultativ anaerob wachsen und bis auf wenige Ausnahmen unbeweglich sind. Man unterscheidet vier Gattungen (Tab. 4.1): Ŷ Staphylococcus Ŷ Micrococcus Ŷ Planococcus Ŷ Stomatococcus.

Aufgrund moderner, phylogenetischer Untersuchungen können die Gattungen Staphylococcus und Planococcus auf der einen Seite sowie Micrococcus und Stomatococcus auf der anderen Seite zwei völlig verschiedenen phylogenetischen Linien zugeordnet werden. Es stellt sich daher die Frage, ob es richtig ist, diese so differenten Bakteriengruppen in einer gemeinsamen Familie zu belassen. So wurde schon vorgeschlagen, die in sich inhomogene Gattung Micrococcus völlig herauszulösen und gleichzeitig in sechs neue Gattungen zu retaxonomieren: Micrococcus, Kocuria, Nesterenkonia, Kytococcus, Dermacoecus und Arthrobacter. Sie werden hier jedoch aus differentialdiagnostisch-mikrobiologischen Gründen weiter behandelt. Von Interesse für die Humanmedizin sind die Gattungen Staphylococcus, „Micrococcus" und Stomatococcus. Geschichte Bereits aus den Jahren 1871/72 liegen Berichte über den Nachweis von rundlichen kokkoiden Elementen in Abszessen, im Eiter sowie im Blut von pyämischen Patienten vor. Bei Staphylokokken gelang es R. KOCH erstmals, die Postulate zur Anerkennung der Erregernatur einer Bakterienart zu erfüllen. L. PASTEUR veröffentlichte 1880 seine entsprechenden Untersuchungsergebnisse zur Ätiologie von Furunkeln. Osteomyelitis und Puerperalfieber. Dem schottischen Chirurgen A. OGSTON gebührt aber das Verdienst der ersten wirklich grundlegenden Arbeiten über Staphylokokken. in typischen Eiterungsprozessen konnte er stets in reichlicher Menge traubenförmig angeordnete Kokken nachweisen. OGSTON gab diesen Mikroorganismen den Namen Staphylococcus. Im Jahre 1881 klassifizierte F.J. ROSENBACH die Staphylokokken aufgrund der Pigmentierung ihrer Kolonien auf Agarmedien in die gelbpigmentierte Art „Staphylococcus pyogenes aureus" und in die weißpigmentierte Art „Staphylococcus pyogenes albus". J. PASSET fügte 1885 die in zitronengelb gefärbten Kolonien wachsende Art „Staphylococcus citreus"* hinzu. J. v. DARÄNYI erkann-

4.1.1 Genus Staphylococcus Das Genus Staphylococcus weist eine große Spezies-Vielfalt auf, laufend wird im Schrifttum über neu gefundene Arten berichtet. Obwohl die von v. DARÄNYI vorgeschlagene Einteilung der Staphylokokken in plasmakoagulasepositive (S. aureus-Gruppe) und plasmakoagulasenegative Arten molekulargenetisch nicht untermauert ist, hat man sie aus Gründen der klinischen Relevanz und Praktikabilität beibehalten. Bedeutung als Krankheitserreger beim Menschen haben vor allem drei StaphylokokkenSpezies: • Staphylococcus aureus • Staphylococcus epidermidis • Staphylococcus saprophyticus.

4.1.2.5. aureus-Gruppe S. aureus-Stämme sind an Mensch und Tier adaptiert, sie können aber auch im umgebenden Milieu einige Zeit überdauern. Bezüglich ihrer „spezifischen" Virulenz lassen sich tierische von menschlichen S. aureus-Stämmen unterscheiden, sie werden deshalb auch als „Standortvarietäten" bezeichnet. Weitere koagulasepositive Spezies, S. intermedius, S. schleifen ssp. coagulans, S. delphini sowie die koagulasevariable Art S. hyieus kommen natürlicherweise nur bei Tieren vor, sie haben dementsprechend vorwiegend veterinärmedizinische Bedeutung. Eigenschaften des Erregers

Staphylokokken sind gram-positive, meist in Haufen gelagerte Kokken, sie sind unbeweglich und bilden keine Sporen. Sie sind ohne größere Schwierigkeiten auf vielen künstlichen Nährböden anzüchtbar. Sie bilden runde, glänzende Kolonien (1-2 mm Durchmesser). Die Pigmentierung der Kolonien ist variabel, sie reicht von weiß bis goldgelb. Die Staphylokokken-Pigmente gehören zu den Karotinoiden, sie werden als Schutzmechanismus gegen Licht und UV-Strahlen gebildet. Zusammenhänge zwischen Pathogenität bzw. Virulenz eines Stammes und seiner Pigmentbildung bestehen nicht. Auf bluthalti-

4.1 Die Familie der Micrococcaceae

Tab. 4.1 Kriterien zur Unterteilung der Familie Micrococcaceae in vier Gattungen Eigenschaften

Planococcus

Basis-Kriterien: Basenzusammensetzung der DNA (Mol % G + C) Zellwandzusammensetzung > 2 Mole Glycerin pro Mol Glutaminsäure im Peptidoglykan Teichonsäure Fruktose-1,6-diphosphat-Aldolase-Typ Zytochrom C Beweglichkeit diagnostische Kriterien: Wachstum in 5% NaCI Lysostaphinempfindlichkeit Bactracinempfindlichkeit

251

1

Micrococcus

Stomatococcus

Staphylococcus

40-51

70-75

56-60

30-38

_

_

_

+

NB NB +

II + **

II + _

+

+ + +

NB

NB nicht bekannt; * Ausnahmen kommen vor; ** M. agilis +; zung durch positive Koagulasereaktion 1 phylogenetisch sehr heterogene Familie (s. Einleitung)

gen Nährmedien sind S.aureus-Kolonien häufig von einem Hämolysehof umgeben. In flüssigen Medien kommt es meist zur diffusen Trübung. Die Wachstumstemperatur hat ihr Optimum bei 30-37 °C, das Temperaturspektrum, in dem Wachstum möglich ist, reicht von etwa f 0 °C bis zu 45 °C. Vermehrung ist auch noch bei hohen Kochsalzkonzentrationen (bis zu 10% und mehr) möglich (relativ weiter pH-Bereich). Diese hohe Kochsalztoleranz kann zur selektiven Anzüchtung von S. aureus aus Lebensmittelund Stuhlproben verwendet werden. Staphylokokken sind relativ resistent gegen UV-Strahlen, Hitze, Austrocknung und auch gegen verschiedene Desinfektionsmittel. Eine Reihe von Zelloberflächenstrukturen und extrazellulären Produkten von S.aureus sind als potentielle Virulenzfaktoren, z.T. auf molekularer Ebene, charakterisiert worden:

+ 1*

*** Ausnahmen bei 5. aureus häufig möglich, sichere Abgren-

rungseffekt der Antikörper wird somit umgekehrt, da Fc-Stücke der als Opsonine funktionierenden Immunglobuline nicht mehr für die Fc-Rezeptoren der Phagozyten zur Verfügung stehen. Dieses Merkmal kann auch für die serologische Diagnostik genutzt werden: S. aureiis-Zcllen können über ihre Fc-Stücke mit spezifischen Antikörpern beschichtet und damit zum Antigennachwcis (Koagglulination) verwendet werden. Clumpingfaktor

Auch der Clumpingfaktor (Fibrinogenrezeptor) ist ein Bestandteil praktisch aller S. aureus-Z.el\oberflächen. Er führt vorwiegend durch Aktivierung von Fibrinmonomeren zu einer Verklumpung von Plasma und ist durch seine spezifische Bindungsfähigkeit an Fibrinogen ein wichtiges Adhäsin.

Protein A

Fibronektin-Bindeproteine

Auf der Oberfläche von S. aureus-SVÄmmen kann bis auf ganz wenige Ausnahmen ein Protein mit einem Molekulargewicht von rund 42 kD nachgewiesen werden, das als Protein A bezeichnet wird. Protein A ist dank seiner antiphagozytären Eigenschaft ein wichtiger Virulenzfaktor. Dazu trägt auch die Fähigkeit bei, Immunglobuline über deren Fc-Stücke zu binden. Vom Menschen wird vor allem IgG der Subklassen 1, 2 und 4 gebunden. Der Opsonisie-

Die meisten S. aureus-Si'Ämme besitzen auf ihrer Oberfläche zusätzliche Bindungsproteine („Rezeptoren") für weitere Matrixproteine, die alle wichtige Adhäsionsfunktion haben. Gut charakterisiert sind die Fibronektin-bindenden Proteine FnbpA und FnbpB. Kapsel

Wohl die meisten S. aureiis-Stämme besitzen eine Polysaccharid-Kapsel. Bisher lassen sich 11

252

Spezielle Bakteriologie

serologisch unterschiedliche Typen definieren. Sehr selten ist die Makroschleimkapsel (Serotyp 1), meist handelt es sich um eine Mikrokapsel (am häufigsten die Serotypen 5 und 8). Beide Kapsclformcn haben in unterschiedlicher Ausprägung antiphagozytäre Eigenschaften. Extrazelluläre Produkte

S. aureus-Stämme sind in der Lage, verschiedenste extrazellulär abgegebene Stoffe zu produzieren, die auch toxisch wirken können. Sie sind Hilfsmittel für die Staphylokokkenzellen, sich im Gewebe festzusetzen, dort zu überleben, sich zu vermehren sowie in die Umgebung vorzudringen und sich gegen die Abwehrmechanismen des Wirtsorganismus zu schützen. Dadurch wird auch verständlich, daß im Verlauf einer Staphylokokkeninfektion Antikörper gegen verschiedene Staphylokokken-Produkte auftreten können. Man kann zwischen folgenden extrazellulär abgegebenen Stoffen unterscheiden: Plasmakoagulase. Dieses extrazellulär von S. «««"(«-Stämmen abgegebene Enzym führt zu einer Verklumpung von Blutplasma, wobei die Mechanismen denen der physiologischen Blutgerinnung ähnlich, aber nicht identisch sind. Die Koagulase verbindet sich mit dem Prothrombin zum sogenannten Staphthrombin, welches dann die Aktivierung des Fibrinogens zu Fibrin auslöst. Das so gebildete Fibrinpolymer unterscheidet sich physiko-chemisch von dem, das im Verlauf der normalen Blutgerinnung gebildet wird. Die pathogenetische Bedeutung der Koagulase liegt in der Bildung eines Fibrin-Schutzwalles um die ins Gewebe eingedrungenen Staphylokokkenzellen. Dieser Fibrinschutzwall kann später, nach entsprechender Vermehrung, durch das von denselben Staphylokokkcn gebildete Fibrinolysin (Staphylokinase) wieder gelöst werden. Die Staphylokokken, die sich in der Zwischenzeit vermehrt haben, können sich dann in die Umgebung ausbreiten. Leukozidin. Dieses Toxin schädigt selektiv Granulozyten und Makrophagen des Menschen in vitro und in vivo, es ist somit ebenfalls ein wichtiger Virulenzfaktor. Hämolysine. Staphylokokken können verschiedene Hämolysine produzieren, die zur Auflösung von Erythrozyten führen. Bekannt sind die Hämolysine a, ß, y und ö. Pathogenetisch mit Abstand am wichtigsten ist das a-Hämolysin = a-Toxin, ein porenbildendes Toxin, das von den meisten S. ««/-ews-Stämmen aus humanem Material gebildet wird. Es wirkt letal-zytotoxisch

vor allem auf Thrombozyten, Endothelzellen und einige Epithelzellen. Das ß-Hämolysin (eine Sphingomyelinase C) und das y-Hämolysin wirken hämolysierend und zytotoxisch, während die Bedeutung des ö-Hämolysins noch unklar ist. Im Wirkungsspektrum der einzelnen Hämolysine gegen die roten Blutkörperchen verschiedener Säugetier-Spezies gibt es Unterschiede. Das ß-Hämolysin wird besonders von Tierstämmen gebildet. Hyaluronidase. Die meisten S. aureus-Stämme bilden Depolymeridasen, mit denen sie die interzellulären Kittsubstanzen auflösen. Dadurch wird ihre Gcwcbsinvasivität mitbedingt. Exfoliativtoxinc. Diese epidennolytischen Toxinc führen beim Menschen und bei einigen wenigen Säugetieren zur intraepidermalen Spaltbildung zwischen dem Stratum spinosum und dem Stratum granulosum der Epidermis. Klinisch wird dadurch das Staphylococcal Scalded SkinSyndrome (SSSS) ausgelöst. Nach chemischen (Molekulargewicht, Aminosäuresequenz etc.) und genetischen Kriterien (chromosomale bzw. plasmidärc Kodierung) lassen sich zwei Proteine, das Exfoliatin A und B unterscheiden, während ihre biologische Wirkung gleich ist. Interessanterweise werden diese Exfoliatine nicht von allen 5. aureus-Stämmen gebildet, sondern meist nur von Stämmen der ansonsten seltenen Phag-Gruppe II (s. Lysotypie). Enterotoxine. Bislang werden die Enterotoxine A, B, Cl-3, D, E, G und H voneinander abgegrenzt. Nicht alle S. aureus-Stämme bilden Enterotoxine, die Nachweisfrequenz liegt bei 18-76 %. Wohl für den Menschen am gefährlichsten sind die Enterotoxine A und B. Meistens wird nur ein einziges Enterotoxin produziert, es können aber auch mehrere Enterotoxine gleichzeitig gebildet werden. Die Enterotoxine sind sehr hitzeresistent, sie werden auch nach 30-minütigem Erhitzen auf C 100 C nicht völlig inaktiviert {cave Verzehr enterotoxinhaltiger Nahrungsmittel nach angeblich „sicherem" Aufkochen!). Über die genaue Wirkungsweise der einzelnen Enterotoxine ist noch wenig bekannt. Gesichert ist die (zentrale?) emetische Wirkung nach oraler Aufnahme. Akzeptiert ist heute auch, daß Enterotoxine ein ToxicShock-Syndrom (s.u.) auslösen können. Toxic-Shock-Syndrome Toxin 1. Das TSST-1

wird ebenfalls nur von einem Teil der S. aureus; (überwiegend zur Phag-Gruppe 1 gehö-

4.1 Die Familie der Micrococcaceae

rig oder nicht typisierbar) gebildet. Dieses Toxin verursacht das „Toxic Shock Syndrome" (TSS, s.u.). Es ist ein relativ hitzeresistentes Protein, das chromosomal kodiert wird. Die biologische Hauptwirkung besteht darin, daß die Endotoxin-Wirkung amplifiziert und die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen, vor allem von Interleukin-1 und Tumornekrosefaktor-a stimuliert wird (TSST-1 als „Superantigen"). Superantigene sind eine neue Klasse von Molekülen, die mit hoher Potenz T-Lymphozyten stimulieren. Auch einige Enterotoxine gehören zu dieser besonderen Antigenklasse. Weitere Enzyme und Toxine. S. aureus-Slämme sind meist in der Lage, noch weitere Enzyme und Toxine zu bilden und extrazellulär abzugeben, wie z.B. Lipasen, Nukleasen und Proteasen. Eine der drei bekannt gewordenen Staphylokokken-Protcasen kann zu einer Pseudokoagulation von Plasma führen, indem proteolytisch Prothrombin aktiviert und damit die Blutgerinnung ausgelöst wird. Bacteriocine. Viele S. aureus-Stämme sind in der Lage, Bacteriocine oder andere wachstumshemmende Substanzen zu produzieren. Wahrscheinlich werden sie gebildet, um dem Produzenten einen Wachstumsvorteil durch Hemmung der kompetitiven gram-positiven Mischflora seiner Umgebung zu verschaffen. Persistenz. Die meisten S. aureus-Stämme besitzen die Fähigkeit zur extra- und intrazellulären Persistenz. Zugrunde liegt ein besonderer Phänotyp - „Small Colony Variant" (SCV) -, der ein verzögertes Wachstum, kleinere Koloniegröße und eine drastisch reduzierte Stoffwechselaktivität (Koagulase, a-Toxin) zeigt. Dieser SCVPhänotyp kann revertieren und beruht auf komplexen regulativ bedingten Änderungen im Elektronentransportsystem (z.B. Hämin-Auxotrophismus).

Pathogenese und Klinik Die durch S. aureus verursachten Erkrankungen lassen sich in pyogene invasive Prozesse und toxinvermittelte Erkrankungen einteilen. Bei den invasiven Prozessen kommt es nach Infektion und in situ-Vermehrung zur fortschreitenden Schädigung durch den jeweiligen S. aureusStamm, bedingt durch die Gesamtaktivität seiner Virulenzfaktoren (Kapsel, Protein A, Zellwandbestandteile, extrazelluläre Produkte, s.o.). Keiner dieser Faktoren ist für sich allein ent-

scheidend für die Staphylokokken-Virulenz. Die Schwere der Erkrankung wird durch Infektionsort, Abwehrlage des Patienten und Virulenz des Infektionsstammes festgelegt. Im Gegensatz dazu kommt bei den Toxin-vermittelten Erkrankungen einem bestimmten Toxin die entscheidende pathogenetische Bedeutung zu. Dabei kann der eigentliche (Infektions-) Herd, wo die Toxinproduktion stattfindet, klinisch inapparent bleiben, im Falle der Enterotoxin-bedingten Gastroentcritis findet die Toxinproduktion sogar überwiegend außerhalb des Patienten statt (in Lebensmitteln). Invasive S. aureus-Erkrankungen

Man unterscheidet lokal-oberflächliche von tiefen, bzw. systemischen Prozessen. Eine häufige und typische S. t«/ra«-Infektion ist der Furunkel, ein in der Haut von Talgdrüsen oder Haarbälgen ausgehender „Mini"-Abszeß: ein zentraler eitriger Einschmelzungsherd aus Bakterien und Granulozyten wird von einer „Abszeßwand" aus Fibrin und Entzündungszellen abgegrenzt. Mehrere, zusammenfließende Furunkel werden als Karbunkel bezeichnet. Weitere oberflächliche Prozesse sind die Pyodermie (meist Mischinfektionen mit Streptococcos pyogenes, Impetigo

contagiosa) und Wundinfektionen.

Die eitrige Parotitis ist pathognomonisch mit S. aureus verbunden, ebenso die Mastitis puerperalis. Auch die primär hämatogene Osteomyelitis, eine vor allem im Kindesalter häufige und zum Teil schwer verlaufende Allgemcinerkrankung, ist eine Domäne von S. aureus. Die sekundäre Osteomyelitis (postoperativ, posttraumtisch) ist durch einen häufig chronischen Verlauf belastet. Die S. «wraw-Pneumonie tritt meist sekundär nach Viruspneumonien (Influenza!) auf oder auch nach Aspiration, sie neigt zur Abszedierung und ist immer noch mit einer relativ hohen Letalität behaftet (häufig sind Mischinfektionen zu beobachten). Abszesse durch S. aureus können sowohl in Weichteilen als auch in Organen auftreten, Empyeme in Körperhöhlen (Pleura) und Gelenken. Sämtliche oberflächliche und tiefe Prozesse können eine Keimeinschwemmung in die Blutbahn nach sich ziehen und damit zur Endokarditis oder Sepsis führen. Die akute ulzeröse Endokarditis verläuft zum Teil sehr foudroyant, mit der Gefahr der progredienten Klappenzerstörung.

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Spezielle Bakteriologie

Eine Sonderform der Endokarditis ist die Rechtsherzendokarditis bei Heroinsüchtigen.

Jede S. aureus-Sepsis kann in einen häufig irreversiblen septischen Schock münden. Pathogenetisch kommt hier der biologischen Wirkung des Peptidoglykans, des a-Toxins und der Superantigene (TSST-1, Enterotoxin B) die entscheidende Bedeutung zu. Hämodialyseshunt- und Gelaßprotheseninfektionen sind typische S. aure«.s-Fremdkörperinfektionen, aber auch andere Plastikfremdkörper können mit S. aureus infiziert werden. Bei subakuten/chronischen, rezidivierenden S. aureus-lnfektionen spielt offensichtlich der „Small Colony Varianf-Phänotyp eine besondere Rolle. Toxinvermittelte S. aureus-Erkrankungen

Die generalisierte Form des Staphylococcal Scalded Skin Syndrome (SSSS) tritt vorwiegend bei Säuglingen (M. RITTER VON RITTEKSHAIN) und Kleinkindern auf. Der Krankheitsbeginn ist abrupt mit generalisiertem Erythem (erythematöses Stadium) und Fieber. Nach wenigen Stunden kommt es zur großflächigen Epidermolyse mit Blasenbildung, das NiKOLSKi-Zeichen ist positiv in allen Hautbereichen (epidermolytisches Stadium). Klinisch imponiert das Bild der „verbrühten Haut", ähnlich einer Verbrennung vom Stadium I-]Ia. Nach Ablösung der oberen Epidermisschicht verkrusten die befallenen Hautareale, unter den Krusten erscheinen die neugebildeten oberen Epidermisanteilc (regeneratives Stadium). Pathogenetisch zugrunde liegt eine intraepidermale Spaltbildung mit folgendem Ödem zwischen dem unterem Stratum spinosum und dem oberem Stratum granulosum (Zelldesintegration durch die Exfoliativtoxinwirkung). Differentialdiagnostisch läßt sich die schwerste Form des Arzneimittelexanthems, das LYKix-Syndrom, histologisch sicher abgrenzen: hier ist die Spaltbildung subepidermal. Die Erkrankung verläuft überwiegend gutartig, Komplikationen sind bedingt durch Flüssigkeits- und Elektrolytverlust mit folgender Volumenmangelsymptomatik bis hin zum Schock. Das neuerdings bei immunsupprimierten Erwachsenen auftretende generalisierte SSSS hat dagegen eine Letalität bis zu 50% . Zur (nur) lokalisierten Verlaufsform des SSSS (bullöse Impetigo, Pemphigus neonatorum) kommt es bei nur lokal begrenzter Toxinproduktion und/oder Verhinderung der Toxingeneralisation durch schon vorhandene spezifische Antikörper.

Das Toxic Shock Syndrome (TSS) wurde erstmals f978 als Krankheitsentität beschrieben. Die im Zusammenhang mit der Menstruation auftretende Form (menstruelles TSS) ist wesentlich häufiger als das nichtmenstruelle TSS, betroffen sind vor allem junge Frauen. Das Vollbild des TSS imponiert durch die obligaten Leitsymptome Fieber, Hypotonie und Exanthcm in der Akut- und Desquamation in der Rckonvaleszenzphase. Das Exanthem ist scarlatiniform bis hin zur Erythrodermie. Prädilektionsstellen sind die Extremitäten. Schultergürtel und Stamm, der Kopf bleibt meistens ausgespart. Die groblamellöse Schuppung ist an Palmarbzw. Plantarflächen von Händen und Füßen besonders ausgeprägt. Obligat ist auch die Beeinträchtigung mindestens zweier weiterer Organsysteme: Es entsteht ein Symptomenreiches klinisches Bild, da meistens mehrere Organe in ihrer Funktion bis hin zum völligen Versagen eingeschränkt werden (Herz-Kreislauf-Versagen, respiratorische Insuffizienz. Bewußtseinsstörungen etc.). Die pathogenetische Kaskade wird durch die direkte Wirkung des „Toxic Shock Syndrome Toxins-1", (TSST-1, s.o.) sowie durch die Gewebshypoxie nach Minderdurchblutung, bedingt durch den protrahierten Schockzustand, bestimmt. Die Letalität des fulminanten Krankheitsbildes liegt bei 5-8%. Häufige Spätfolgen sind chronische Niereninsuffizienz, Extremitätengangrän, Karpal-Tunnel-Syndrom und Verhaltensstörungen. Die klinische Diagnose des Vollbildes ist relativ einfach, die der milden Vcrlaufsformen (Prä-TSS) nur schwer möglich. Klinisch-chemische Parameter sind unspezifisch, auffallend sind lediglich Hypokalzämie (ionisiertes Ca2+) bei gleichzeitiger Hyperkalzitoninämie. Spezifische Antikörper spielen offenbar eine wesentliche Rolle in der Protektion gegen das TSS. Der Antikörperkataster steigt mit zunehmendem Lebensalter exponentiell an. Der frühzeitige Kontakt mit dem Toxin ist wahrscheinlich, da etwa ein Viertel bis ein Drittel aller S. aureus-Siämmt TSST-1-Produzenten sind. Das TSS kann auch durch Enterotoxine (s.o.) ausgelöst werden sowie durch pyrogene Exotoxine von S. pyogenes. Dies muß differentialdiagnostisch beachtet werden.

Der sogenannte Staphylokokken-Scharlach wird nicht mehr als eigenständiges Krankheitsbild angesehen, sondern als milde Verlaufsform

4.1 Die Familie der Micrococcaceae

des SSSS (ohne Schleimhautbeteiligung) oder des TSS (mit Schleimhautbeteiligung). Die durch Enterotoxine (s.o.) verursachte hochakute Gastroenteritis ist eine Enterotoxikose, da überwiegend präformiertes Toxin mit verdorbenen Lebensmitteln (Milch- und Eiprodukte, Fleisch) aufgenommen wird. Nur bei Säuglingen wird auch die Möglichkeit einer in situ-Produktion von Toxin angenommen. Wenige Stunden nach Toxin-Aufnahme kommt es zu massivem Erbrechen (Wirkung des Toxins auf das vegetative Nervensystem) mit möglicher Kreislaufdysregulation, Fieber, starkem allgemeinen Krankheitsgefühl und vereinzelt Diarrhöe. Ebenso rasch klingt die Symptomatik nach 24-28 Stunden ohne Spätfolgen ab. Diagnose

Mikroskopie. Die mikroskopische Untersuchung von Originalmaterial erlaubt keine definitive Diagnose, kann aber den Verdacht auf eine Staphylokokken-Infektion lenken und ist daher für den Kliniker wertvoll. Von Bedeutung ist der gleichzeitige Zellbefund (Granulozyten!). Staphylokokken imponieren als gram-positive, überwiegend in Haufenform gelagerte Kokken. Kultur. Staphylokokken haben keine speziellen Nährstollansprüche, ihre Isolierung erfordert daher keine Spezialnährböden. Da sie in einer Mischflora nicht im Wachstum unterdrück! werden und morphologisch von anderen Bakterien normalerweise gut abgrenzbar sind, sind auch Selektivnährböden meist nicht erforderlich (Ausnahme: Stuhlproben). Die Routinckultur sollte auf Blutagar (meist Schafblutagar) erfolgen, dank der typischen Koloniemorphologic ist die Staphylokokkendiagnosc problemlos. 5. aureus wächst in leicht gelben bis goldgelben, manchmal aber auch in weißen Kolonien. Die Abgrenzung zu Mikrokokken und Stomatokokken ist meist nicht schwierig, die Zuordnung zur Spezies S. aureus erfolgt mit Hilfe der Plasmakoagulase, dem Plasmakoagulase-Nachweises im Röhrchentest (= Referenzmethode): Die zu prüfende Kolonie wird in 0,5 ml Kaninchen- oder Humanzitratplasma eingerieben, in gleicher Weise negative sowie positive Kontrollstämme. Die Röhrchen werden bei 37 °C über 24 Stunden bebrütet, abgelesen wird nach 4 und nach 18-24 Stunden. Der größte Teil der S. aureus-Stämme führt bereits nach 4 Stunden zu einer Koagulation des Plasmas. Zu beachten ist, daß das zunächst koagulierte Plasma bei längerer Bebrütung durch die Fibrinolysin-Aktivität desselben Staphylokokkenstammes wieder verflüssigt werden kann.

Wegen des Zeitaufwandes für den KoagulaseRöhrchentcst werden heute für Routinezwecke

unterschiedliche kommerzielle ObjektträgerAgglutinationsverfahren angewendet, die allein oder in Kombination S. aureus-typische Oberflächenstrukturen nachweisen (Clumpingfaktor, Protein A, etc.). Selten sind weitere biochemische Untersuchungen notwendig, in wichtigen Fällen kann auch eine 5.öwrei«-spezifische PCR (nuc-, coa-Gen) durchgeführt werden. Aus epidemiologischen Gründen (z.B. Nachweis einer Hospitalepidemie) kann es erforderlich sein, eine weitere Feindifferenzierung der als S.aureus diagnostizierten Staphylokokkenstämme durchzuführen. Früher spielte hier die Phagentypisierung (Lysotypie mit dem internationalen Bakteriophagen-Basissatz) die bedeutende Rolle. Heute werden überwiegend molekulare genomischc Typisierungsmethoden wie DNA-Restriktionsprofile in der Pulsed-FieldGelelektrophorese oder PCR-Verfahren durchgeführt. Spezielle Untersuchungen sind in der Diagnostik der Toxin-vermittelten 5. ö«r
Vor jeder Chemotherapie einer invasiven 5. aurews-Infektion ist zu prüfen, ob andere, insbesondere chirurgische Maßnahmen indiziert sind: Eröffnung, Drainage und Ausräumung von Empycmen und Abszessen, Entfernung von Sequestern und Fremdkörpern. Chemotherapeutisch sind Benzylpenicilline Mittel der Wahl gegen nichtpenicillinasebildende Stämme und Isoxazolylpenicillinc (z.B. Flucloxacillin) gegen

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Spezielle Bakteriologie

Penicillinasebildner, bei schweren Infektionen evtl. kombiniert mit einem Aminoglykosid (z.B. Gentamicin). Alternative Substanzen sind Cephalosporine der I. und II. Generation. Zur kalkulierten Chemotherapie (vor Antibiogramm) müssen primär Isoxazolypenicilline eingesetzt werden, da heute ca. 80% aller S. aureus-Stämme Penicillinasebildner sind. Isoxazolypenicillinresistente (= methicillinresistente) Stämme (MRSA) treten zeitlich und örtlich gehäuft auf, sie sind resistent gegen sämtliche E-Laktame.

Therapie der Wahl bei MRSA sind Glykopcptide, z.B. Vancomycin oder, falls in vilro wirksam, auch Clindamycin und Cotrimoxazol. Glykopeptide sind ebenfalls erste Wahl bei Penicillinallergie. Clindamycin ist ein Mittel der Wahl bei Osteomyelitis und Pneumonie. Weitere Reserveantibiotika sind Fusidinsäure, Fosfomycin und Rifampicin (cave nie als Monotherapie!), überwiegend als Kombinationspartner. Die Penicillinase-Bildung wie auch viele andere Antibiotika-Resistenzen von 5. aureus werden von Resistenz-Plasmiden gesteuert. Die Methicillin-Resistenz ist eine Atfinitätsresistenz bedingt durch ein verändertes Penicillin-Bindeprotein (PBP2a). Dieses wird durch das mec/1-Strukturgen codiert, ein zusätzlich in das S.aureus-Chromosom integriertes (exogenes!) DNA-Fragment. Die phänotypische Expression ist überwiegend heterogen, d.h. nicht alle Zellen in einem Klon sind phänotypisch resistent. Daher kommt der exakten Resistenzbestimmung im Labor große Bedeutung zu.

In der Therapie der Toxin-vermittelten S.-aurewi-Erkrankungen steht die symptomatische Therapie (Flüssigkeits- und Elektrolytersatz, Schockbehandlung, etc.) im Vordergrund, bei der Enterotoxikose ist dies die ausschließliche Therapie. Für schwere TSS-Verläufe wird die frühzeitige einmalige und hochdosierte Gabe von Kortikosteroiden empfohlen. Chemotherapeutisch steht an erster Stelle die Unterbindung der Toxin-Nachproduktion. Mittel der Wahl ist hier Clindamycin, da schon in subinhibitorischen Dosen die Toxinbildung gestoppt wird (Hemmung der Proteinbiosynthese). Erst in (zeitlich) zweiter Linie ist die Eradikation des S. aureus-Herdes wichtig. Epidemiologie und Prophylaxe

Wie schon ausgeführt, ist S. aureus als Kommensale der physiologischen Körperflora von

Mensch und Tier anzusehen. Dabei kommen die beim Menschen anzutreffenden S. aureus-Slämme normalerweise beim Tier nicht vor und umgekehrt. Haustiere und auch wildlebende Tiere sind daher kein Reservoir für humanmedizinisch bedeutsame S. aureus Stämme. S. aureus ist beim Menschen auf der Hautoberfläche (Perinealregion und Achselhöhlen), in der vorderen Nasenhöhle, im Rachen, den Ausführungsgängen der Brustdrüse und im geringen Umfang auch im Darm anzutreffen.

Die Nachweisfrequenz schwankt, sie ist im Krankenhausmilieu generell höher. Man muß zwischen intermittierenden und persistierenden Staphylokokken-Trägern unterscheiden. Epidemiologisch besonders bedeutsam sind die persistierenden S. aureus -Träger. Bei lokaler oder allgemeiner Antibiotikabehandlung bleiben persistierende S. aureus-Träger meist nur während der Behandlungszeit frei vom Erreger, nach Absetzen der Therapie erscheinen die ursprünglichen S. aureus-Stämme häufig sehr schnell wieder. Eine lokale (nasale!) Therapie mit Mupirocin bringt heute noch die besten Ergebnisse, auch gegen Methicillin-resistente Stämme. Innerhalb der Spezies S. aureus gibt es beträchtliche Virulenz-Unterschiede, beruhend auf der unterschiedlichen biologischen Gesamtaklivität der einzelnen Stämme. Eine epidemiologisch wichtige Feststellung betrifft die sogenannte Epidemietendenz bestimmter S. aureus-Stämme: Bei gleicher Virulenz bleibt der eine Staphylokokkenstamm auf seinen Infektionsprozeß begrenzt, der andere Stamm dagegen neigt dazu, sich in der näheren und auch weiteren Umgebung des betreffenden Patienten auszubreiten.

Worauf diese Epidemietendenz beruht, ist bisher nicht bekannt. Der infektionsauslösendc Staphylokokkenstamm kommt meistens aus der patienteneigenen Körperflora (endogene Infektion), kann aber auch im Sinne einer Schmutz/Schmicr-Infektion aus der Umgebung des Patienten kommen. Wie die Erfahrungen der 50er und 60er Jahre gezeigt haben, kommen auch echte 5. aurews-Epidemien und -Pandemien (z.B. ausgelöst durch den Lysotyp 80/81) vor. Heute dominiert die zunehmend globale Epidemie mit MRSASubklonen, die auch in Deutschland von immer

4.1 Die Familie der Micrococcaceae

größerer Bedeutung sind; dies auf dem Hintergrund einer generell zunehmenden Bedeutung von S. aureus als nosokomialem Infektionserreger. Da es keine Impfung oder spezifische Expositionsprophylaxe gegen 5. aMreMs-Infektionen gibt, liegt die einzige Möglichkeit der Prävention in hygienischen und vor allem krankenhaushygienischen Maßnahmen.

4.1.3 Koagulasenegative Staphylokokken

keit in zwei Gruppen einteilen. Bei den Novobiocin-empfindlichen Spezies dominiert S. epidermidis (ca. 75% aller Isolate), weitere wichtigte Spezies sind S. haemolyticus und S. lugdunensis. Die wichtigste Novobiocin-resistente Spezies ist S. saprophyticus. Die Taxonomie der koagulasenegativen Staphylokkken ist aber sicherlich noch nicht abgeschlossen, mit weiteren Änderungen und Ergänzungen muß gerechnet werden. Eigenschaften der Erreger

Früher hat man geglaubt, daß koagulasenegative Staphylokokken für Mensch und Tier generell apathogen sind. Aufgrund entsprechender klinischer Erfahrungen mußte man diesen Standpunkt revidieren. Auch koagulasenegative Staphylokokken können schwere Infektionsprozesse bei Mensch und Tier verursachen. Die koagulasenegativen Staphylokokken sind eine Gruppe von sehr vielen differenten Arten, mit unterschiedlichem natürlichen Habitat.

Aufgrund unterschiedlicher morphologischer, chemischer, physiologischer und genetischer Eigenschaften werden bis heute 30 Spezies unterschieden, einige davon mit zwei oder mehreren Subspezies (Tab. 4.2). Nur wenige Spezies haben humanmedizinische Bedeutung. Sie lassen sich aus klinisch-mikrobiologischen Gründen (s.u.) nach ihrer Novobiocin-Empfindlich-

Mikroskopisch, im Wachstumsverhalten und in ihrer Resistenzsituation bestehen zwischen den koagulasenegativen Staphylokokken und der S.aureus-Gruppe keine grundsätzlichen Unterschiede. Auf der Oberfläche fester Nährböden wachsen koagulasenegative Staphylokokken in weißen bis ockergelben Kolonien. Einzelne der bei S. aureus besprochenen extrazellulären Produkte sowie Zelloberflächen-Adhäsine können auch von koagulasenegativen Staphylokokken gebildet werden. Definitionsgemäß fehlen jedoch, bis auf wenige Ausnahmen, Plasmakoagulase, Clumpingfaktor und Protein A sowie Exfoliativtoxine, Enterotoxine und TSST-1. Generell ist die biologische Gesamtaktivität und damit auch die Virulenz der koagulasenegativen Staphylokokken für gewöhnlich bedeutend geringer als die der Stämme der S. aureus-Gruppe. Sie zeigen aber ein hohes Maß an phänotypischer Variabilität und eine ausgeprägte Fähigkeit, sich

Tab. 4.2 Koaqulaseneqative Staphylokokken Koagulasenegative Staphylokokken Spezies mit humanmedizinischer Bedeutung

andere Spezies (überwiegend von Tieren isoliert)

Novobiocin-empfindlich

- S. epidermidis-Cruppe - 5. lugdunensis S. epidermidis sensu stricto 5. haemolyticus, S. hominis S. warnen, 5. capitis - 5. schleifen - 5. simulans - S. auricularis

S. caprae, 5. pasteuri, S. saccharolyticus, S. carnosus, S. caseolyticus, 5. chromogenes, S. felis, S. lutrae, 5. muscae, S. pisäfermentans

Novobiocin-resistent

- saprophyticus - S. cohnii

S. xylosus, S. sciuri, S. arlettae, S. equorum, S. gallinarum, S. kloosii, S. pulvereri, S. lentus, S. vitulus

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Spezielle Bakteriologie

schnell an wechselnde Umwelteinflüsse zu adaptieren. Pathogenese und Klinik Wegen der generell geringeren Virulenz sind Infektionen mit Novobiocin-empfindlichen koagulasenegativen Staphylokokken unter normalen Umständen, d.h. wenn keine prädisponierenden Faktoren (s.u.) vorliegen, selten. Ihr Nachweis in klinischem Untersuchungsmaterial muß demnach sehr kritisch beurteilt werden, in den meisten Fällen wird es sich um eine exogene oder endogene (Normalflora!) Kontamination handeln. Für ein bestimmtes Patientengut jedoch sind Staphylokokken der S. epidermidis-Gruppe -vor allem S. epidermidis sensu stricto, S. haemolyücus und S. lugdunensis- als Krankheitserreger von hoher Bedeutung: Sie sind in der Lage, bei Heroinsüchtigen eine (Rechish&rz-)Endokarditis zu verursachen. Bei abwehrgeschwächten Patienten - vor allem llämoblastosen, aber auch soliden Tumoren, besonders unter zytostatischcr Therapie mit Leukopenie - sowie Frühund Neugeborenen (noch nicht ausgereiftes Phagozytosesystem) zählen sie zu den häufigsten Sepsiserregern. Zugrunde liegt die (transiente) Supprcssion der OpsonophagozytoseAktivität dieser Patienten, des wohl wichtigsten Abwehrmechanismus des Menschen gegen Staphylokokken. S. epidermidis dominiert auch als Erreger bei Infektionen (Sepsis, Ventrikulitis, Endokarditis, Peritonitis etc.). assoziiert mit implantierten Fremdkörpern und intravasalen Ka-

Abb. 4.1 Adhärente koagulasenegative Staphylokokken in Oberflächendefekten eines Polyäthlyenkatheters (rasterelektronenmikroskopische Aufnahme, G. PETERS,C. PULVERER,R. LOCCI).

thetern aus Plastikmaterial (Liquor-Ableitungssysteme, Herzklappen, Schrittmacherelektroden, CAPD-Katheter-Systeme, Venenkatheter etc.). Die wesentlichen Pathomechanismen liegen in der Fähigkeit dieser Staphylokokken. irreversibel an Plastikoberflächen zu adhärieren, sich dort zu vermehren und auf der Oberfläche zu akkumulieren (Abb. 4.1 und 4.2). Der schnell ablaufende Vorgang der Adhäsion erfolgt durch spezifische Interaktionen zwischen OberI'lächenslrukturen (Adhäsinc) und Matrixproteinen, welche die Polymeroberlläche überziehen. Daran schließt sich der langsamer verlaufende Prozeß der Akkumulation an, vermittelt durch interzelluläre Adhäsion. Verantwortlich hierfür sind ein lineares Glukosamin-Glykan (Polysaccharid-interzellular-Adhäsin = PIA) und ein 140 kD großes Oberflächenprotein (Accumulation Associated Protein = AAP). Es entsteht so ein komplexer Biofilm aus mehrschichtigen Staphylokokkenzell-Lagen, extrazellulärer Schleimsubstanz (überwiegend abundante Teichonsäure) und Wirtsproteinen. Dadurch werden die eingeschlossenen Staphylokokken offensichtlich vor Wirtsabwehrmechanismen (Opsonophagozytose), aber auch vor der Wirkung von Chemotherapcutika geschützt.

Die Klinik imponiert durch einen chronisch-larvierten Verlauf mit relativ diskreten Symptomen (z.B. Fieber, Schüttelfrost). Im fortgeschrittenen Stadium kommt es zur Anämie und Splenomegalie. Ohne Eliminierung des Infektionsherdes kann es zur generalisierten, abszedierenden Metastasierung in parenehymatösen Organen und schließlich zum Tode kommen. Novobiocin-resistente Staphylokokken der S. saprophyticus-Gruppe sind verantwortlich für

Abb. 4.2 Biofilm auf der inneren Oberfläche eines Polyäthylenvenenkatheters von einer Patientin mit assoziierter 5. epidermidis-Sepsls (rasterelektronenmikroskopische Aufnahme, C. PETERS, C. PULVERER, R. LOCCI)

4.1 Die Familie der Micrococcaceae

das Dysurie-Syndrom bei jüngeren Frauen sowie für einen Teil der unspezifischen Urethritis bei Männern. Im Vordergrund stehen dysurische Beschwerden, oft ohne Fieber. In Einzelfällen kann es zur Pyelonephritis oder auch zur Urosepsis kommen. Pathogenetisch liegt eine besondere Affinität zum Uroepithel zugrunde, vermittelt durch adhäsive Oberflächenproteine dieser Staphylokokken. Ein weiterer wohl sehr bedeutender Virulenzfaktor ist die Urease (Zytotoxizität). Diagnose Die mikrobiologische Diagnose von koagulasenegativen Staphylokokken folgt den schon für S. aureus dargestellten (s.o.) Leitlinien. Sie wachsen als mittelgroße, weiße bis ockergelbe Kolonien auf Blutagar, seltener mit Hämolyse als S. aureus. Die Abgrenzung zu S. aureus ist einfach (s.dort): Sie sind Plasmakoagulase-, Clumpingfaktor- und Protein-A-negativ. Zu beachten ist aber, daß S. lugdunensis und S. schleifen Clumpingfaktor-positiv sind (bei Prüfung mit humanem Zitratplasma) und S. schleifen subsp. coagulans Koagulase-positiv ist. Eine routinemäßige Abgrenzung zu „Mikrokokken" und Stomatococcus ist nicht unbedingt erforderlich (seltenes Vorkommen, vor allem der weißpigmentierten Vertreter dieser Gattungen). Eine Differenzierung gegenüber „Mikrokokken" ist möglich, z.B. durch Prüfung der Bacitracin-Resistenz: koagulasenegative Staphylokokken sind resistent (Agardiffusion: kein Hemmhof bei Bacitracin-Blättchen mit 0.04 units; Agardilution: MHK > 2 mg/1). Zur „groben" Differenzierung reicht die Prüfung der Novobiocin-Resistenz aus (Agardiffusion: Hemmhofdurchmesser > 14 mm, Beschickung 5 ng; Agardilution: MHK > 1,6 mg/1). Novobiocin-empfindliche Stämme gehören zur S. epidermidis-Gruppc, Novobiocin-resistente Stämme zur S. saprophyticus-Gmppe. Eine weitergehende Spezifizierung ist routinemäßig nicht erforderlich, bei besonderer Fragestellung aber basierend auf dem Differenzierungsschema von KLOOS-SCHLEIFER mit kommerziellen Testverfahren möglich. Therapie Die Therapie von koagulasenegativen Staphylokokkeninfektionen folgt den für S. aureus genannten Kriterien (s.o.). Generell neigen diese

Staphylokokken jedoch mehr zur Methicillinund Multiresistcnz. Eine Ausnahme bildet lediglich die S. saprophyticus-Gruppe, die relativ gut antibiotikaempfindlich ist und deshalb meist keine Therapicproblcmc aufwirft. Abwehrgeschwächte Patienten sind besonders in der leukopenischen Phase gefährdet. Hier sollte primär bis zum Vorliegen einer Resistenztestung Vancomyein, evtl. kombiniert mit Gentamicin, Rifampicin oder Fosfomycin, in der Chemotherapie eingesetzt werden. Ähnliches gilt für Fremdkörperinfektionen, wenn eine Sepsis angenommen werden muß sowie bei Endokarditis, vor allem der Prothesenendokarditis. Besondere Probleme kann die Therapie der Liquor-VentilSepsis bereiten, wenn auch der intrakranielle Anteil betroffen ist (Ventrikulitis). Grundsätzlich gilt, daß die Entfernung des infizierten Materials die beste Therapie ist, sie genügt häufig allein (z.B. bei Venenkatheter-Sepsis). Der Fremdkörper muß rechtzeitig entfernt werden, wenn eine Chemotherapie in angemessener Zeit nicht zum Erfolg führt oder Rezidive auftreten. Epidemiologie und Prophylaxe Die koagulasenegativen Staphylokokken sind Hauptbestandteil der Normalflora von Haut und Schleimhäuten von Mensch und Tier, sie spielen dort offensichtlich eine bedeutende Rolle in der antiinfektiösen Barriere. Damit ist die potentielle Quelle für Infektionen, aber auch der Kontamination von Untersuchungsmaterialien evident. Ausbrüche, vor allem von nosokomialen Infektionen mit einem Stamm, kommen vor, sind aber wohl erheblich seltener als bei S. aureus.

Dies gilt auch für Methicillin-resistente Stämme, die im Krankenhausbereich in hoher lnzidenz (40-60%), aber polyklonal vorkommen. Deshalb sind hier anders als für MRSA rigorose krankenhaushygienische Maßnahmen nur selten (Ausbruch mit einem Klon!) sinnvoll und notwendig. Epidemiologische Untersuchungen folgen den Methodenvorschlägen für S. aureus (s.o.). Dies gilt auch für generelle prophylaktische Maßnahmen. Die Implantationschirurgic erfordert ein Höchstmaß an Asepsis.

4.1.4 Micrococcus und Stomatococcus Die Angehörigen der „Gattung" Micrococcus kommen maßgeblich in der normalen Haut- und

259

260

Spezielle Bakteriologie

Schleimhautflora von Mensch und Tieren vor, die der Gattung Stomatococcus (früher Micrococcus mucilaginosus) vorwiegend in der normalen Mund- und Rachenflora. Über ihre physiologische Bedeutung ist wenig bekannt. Ihr Auftreten als Krankheitserreger ist selten. Mikrokokken sind aus Blutkulturen von immunsupprimierten Patienten und bei Prothesenendokarditis isoliert worden, Stomatokokken wurden als Endokarditiserreger beschrieben. Weitergehende Bewertungen sind zur Zeit nicht möglich, ihre klinisch-praktische Bedeutung ist aber wahrscheinlich zu vernachlässigen. Die Therapie ist zudem problemlos, da die Stämme nahezu ausnahmslos voll empfindlich sind. „Mikrokokken" lassen sich diagnostisch durch Plasmakoagulase, Clumpingfaktor und Protein A (alles negativ) von 5. aureus und z.B. durch die Bacitracin-Empfindlichkeit von den koagulasenegativen Staphylokokken abgrenzen. Schon rein morphologisch lassen sich die pigmentierten Vertreter (am häufigsten) auf der Blutplatte erkennen: M. luteus ist zitronengelb, M. roseus rot bis rosa und M. lyae sowie M. kristinae sind weiß bis gelblich und können daher mit Staphylokokken verwechselt werden, wie auch Stomatococcus mucilaginosus. Die exakte Subspezifizierung ist nicht erforderlich; zudem wurde ihre Taxonomie völlig revidiert (s. Einleitung).

Literatur CROSSLEY, K.B., and G.L. ARCHER: The staphylococci in human disease. Churchill Livingstone Inc. New York, Edinburgh, London, Madrid. Melbourne, San Francisco, Tokyo, 1997. HEILMANN, C, and G. PETERS: Biology and pathogenicity of Staphylococcus epidermidis. In: FISCHETTI, V. A., R.-P. NOVICK, J. J. FERRETT, A. PORTNOY, and J. I. R OOD (eds.): Gram-Positive Pathogens, S. 442-449, ASM-press, Washington, DC 2000. MÖLLBY, R., J.I. FLOCK, C.E. NORD and B. CHRISTENSSON: Staphylococci and staphylococcal infections. Zbl. Bakt. Suppl. 26, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart - New York, 1994. PETERS, G., and F. SCHUMACHER-PERDREAU: Micrococcaceae. In: F. BURKHARDT (Hrsg.): Mikrobiologische Diagnostik, S. 68-74, Georg Thieme Verlag, Stuttgart - New York, 1992. PROCTOR, R. A., and G. PETERS: Small Colony Variants in staphylococcal infections: Diagnostic and therapeutic implications. Clin. Infect. Dis. 27: 419-423, 1998.

4.2 Die Familie der Streptococcaceae ANDREAS PODBIELSKI, RUDOLF LÜTTICKEN

Streptokokken sind gram-positive Diplo- oder Kettenkokken. Die Familie umfaßt mehr als ein Dutzend pathogene und zahlreiche apathogene Spezies. Viele Arten haben einen hohen wirtschaftlichen Nutzen, z.B. bei der Prozessierung von Milch- und Fleischprodukten. Andere besiedeln bzw. infizieren primär die Haut und Schleimhaut des Respirations- und Verdauungstraktes von Tieren und Menschen. Streptokokken gehören zu den häufigsten bakteriellen Krankheitserregern. Die wichtigsten humanpathogenen Arten sind Streptococcus pyogenes (Gruppe A-Streptokokken), der Erreger von Pharyngotonsillitiden und Pyodermien, S. agalactiae (Gruppe B-Streptokokken), ein Erreger der Neugeborenensepsis, S. pneumoniae (Pneumokokken), ein Erreger von Pneumonien und Meningitiden, S. mutans, der wichtigste Karieserreger, verschiedene vergrünende Streptokokken als Erreger der Endokarditis lenta und Enter oeoecus faecalis sowie E. faecium, Erreger

von Endokarditiden, Harnwegs- und Krankenhausinfektionen. Einige Streptokokken-bedingte Erkrankungen wie das Kindbettfieber, die Wundrose und Phlegmonc waren schon in der Antike als eigenständige Erkrankungen bekannt. In der 2. Hälfte des 19. Jahrhunderts ermöglichte die Arbeit zahlreicher Ärzte (z.B. BILLROTH, 1868; CHEYNE, 1877: OGSTON, 1881: ROSENBACH, 1884; WIDAL, 1889) die ätiologische Zuordnung dieser Erkrankungen zur Infektion mit Streptokokken. Die Bezeichnung Streptococcus stammt von BILLROTH (1874). Sie orientierte sich am mikroskopischen Bild der Bakterien (Streptos (gr.): Kette; kokkos (gr.): Beere, Samenkorn). Abgesehen von den Pneumokokken (STERNBERG, 1881; PASTEUR, 1881; FRÄNKEL, 1884) gelang es erst in den ersten drei Jahrzehnten des 20. Jahrhunderts, einzelne Streptokokken-Arten serologisch und biochemisch zu unterscheiden.

Eigenschaften der Streptokokken Systematik Alle Spezies der Streptokokken-Familie sind gram-positive sporenlose Kokken oder kokkoide Stäbchen mit einem Durchmesser von < 2 p.m.

Sie bilden keine Eisen-Porphyrinverbindungen und können daher energiereiche organische

4.2 Die Familie der Streptococcaceae

Substanzen nicht über die Atmungskette, sondern nur durch Fermentation (häufig zur Milchsäure) nutzen. Sie bilden zudem keine Katalase. Durch das Fehlen dieser effizienten Entgiftungsmöglichkeit für toxische Sauerstoffverbindungen wächst die Mehrzahl der Arten besser in Gegenwart von erhöhten COvMengen bzw. unter anaeroben Bedingungen als unter aeroben. In der ersten umfassenden Klassifizierung (SIIERMAN, 1937) wurde die Familie der Streptococcaceae in vier Gruppen geordnet: Pyogene-, Viridans- und Milchsäure-Streptokokken sowie Enterokokken. Die Bezeichnung ViridansStrcptokokkcn, die zahlreiche a- und nicht-hämolysierende (s.u.) Gattungen und Arten umfaßt, wird auch heute noch von Klinikern verwendet. Die aktuelle Klassifizierung in 13 Gattungen (Tab. 4.3) beruht auf der Erfassung biochemischer Leistungen und auf DNA-Hybridisierungen bzw. -Sequenzierungen. Zu den Gattungen Streptococcus und Enterococcus können zur Zeit mit diesen Mitteln gesichert 31 bzw. 17 Arten gezählt werden. Die Gattung Streptococcus wird in sechs genetisch verwandte Gruppen aufgeteilt: Pyogene Gruppe (z.B. S. pyogenes, S. agalactiae, Streptokokken der serologischen Gruppen C und G), S. mitis- (z.B. S. pneumoniae, S. mitis, S. oralis, S. sanguis, S. gordonii),

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S. salivarius-, S. anginosus-, S. mutans- und S. boWs-Gruppe. Die hcrausragende medizinische und ökonomische Bedeutung der einzelnen Vertreter der Streptococcaceae dokumentiert sich darin, daß im Vergleich zu allen anderen Familien bisher die mit Abstand größte Zahl von Spezies Gegenstand von Genomsequenzierungsprojekten war. Morphologie

Durch Teilung in nur einer Ebene wachsen die Vertreter der Gattungen Abiotrophia, Enterococcus, Globicatella, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus und Vagococcus zu Bakterienketten aus. Die Vertreter der Gattungen Aerococcus, Alloiococcus, Getnella, Helcococcus, Pediocoecus und Tetragenococcus wachsen dagegen eher in Paaren (Diplokokken) oder durch Teilung in einer weiteren Ebene in Tetraden. Kultur

Infolge einer hochgradigen Spezialisierung und Anpassung an eine besondere Umgebung benötigen die meisten Gattungen der Familie die Anwesenheit von komplexen Substanzen im Nährmedium, sind also bezüglich ihrer Kulturbedingungen anspruchsvolle Bakterien. Die komplexen Nährstoffbedürfnisse können durch

Tab. 4.3 Einfache biochemische und physiologische Differenzierung von Gattungen innerhalb der Familie der Streptococcaceae Genus

PYR

LAP

VAN

Gas

Äsculin

NaCI

Streptococcus

V

+

S

-

V

V

Enterococcus

+ +

+ +

(S) s

+ -

+

Alloiococcus

§ +

§ +

s s

V +

+ +

Gemella

+

V

S

-

-

Globicatella Helcococcus

+ +

-

s s

-

+ +

+ V

Lactococcus

V

+

S

(+)

v

V

V

Abiotrophia Aerococcus

R

Leuconostoc Pediococcus

+

R

+

(+)

Beweglichkeit

Hämolyse a, ß, n

V

a, ß, n

-

et

a

-

a a, n

-

a

a, n a, n a

n

v

-

Tetragenococcus

-

+

s

-

+

+

-

a

Vagococcus

+

+

s

-

+

+

+

a, n

Abkürzungen: PYR, LAP = Produktion von Pyrrolidonyl-Arylamidase bzw. Leucin-Aminopeptidase; VAN = Vancomycin-Empfindlichkeit; Gas = Gasbildung aus Glucose; Äsculin = Ä.-Spaltung; NaCI = Wachstum in Gegenwart von 6,5% NaCI. +, (+) = mehr als 95% (80%) der Isolate zeigen die Eigenschaft; -, (-) = weniger als 5% (20%) der Isolate zeigen die Eigenschaft; V = 20-80% der Isolate zeigen die Eigenschaft; S, (S), R = mehr als 99% (95%) der Isolate sind sensibel/resistent; et, ß, n = <x-, ß-, nicht-hämolysterend; § Aerococcus viridans und A. urinae unterscheiden sich in PYR: + bzw. - und LAP: - bzw. +.

262

Spezielle Bakteriologie

Zusatz von Blut („Schafsblutagar"), Serum, peplisch-verdautcm Fleischextrakt („RinderHirn-Herz-Bouillon") oder Hefeextrakt („Todd-Hewitt-Hefeextrakt-Medium") zu Standardmedien gedeckt werden. Die ausschließlich Tier- oder Mensch-besiedelnden Arten haben zudem ein enges Temperatur- und pH-WertSpektrum, das den Verhältnissen im jeweiligen Wirt entspricht. Abiotrophia braucht zum Wachstum Pyridoxal (Vitamin B6) oder L-Cystein. Deswegen wurden Bakterien dieser Gattung bis 1995 als „Pyridoxal-abhängige Streptokokken" bezeichnet. Biochemische Differenzierung

Die einzelnen Gattungen innerhalb der Familie können durch wenige biochemische und physiologische Tests (s. Tab. 4.3) vorläufig differenziert werden. Eine althergebrachte (SCHOTTMÜLLER, 1903) Einteilung der Streptokokken beruht auf ihrem Hämolysevermögen bei Wachstum auf Blutagarplatten. Diese Einteilung wird den heutigen Speziesdefinitionen nicht mehr gerecht, ist aber zur Differenzierung der Arten weiterhin nützlich. Bei Betrachtung des Blutagars in der Umgebung von (und auch unter) einzelnen StreptokokkenKolonien unterscheidet man zwei Hämolyse-Typen: 1.) komplette Hämolyse (= ß-Hämolyse). In einer scharf begrenzten Zone im Agar in der Umgebung der Kolonien werden die Erythrozyten durch die auf die Membran wirkenden Lysine aufgelöst und das Hämoglobin durch Proteaseaktivität vollständig abgebaut. Der Agar dieser Zone wird hell und durchscheinend (Abb. 4.3. Farbtafel). Die verantwortlichen „Hämolysine" werden als Virulenzfaktoren (s.u.) von den Streptokokken produziert und in ihre Umgebung abgegeben. 2.) Vergrünung (= a-Hämolyse). In einer weniger scharf begrenzten Zone um die Kolonien wird das Hämoglobin durch das von den Bakterien in ihre Umgebung ausgeschiedenes Peroxid (H2O2) zu Methämoglobin umgewandelt. Die rote Farbe des Agars wechselt in diesem Bereich zu einer grünen Farbe unterschiedlicher Intensität. Die H2OvAusscheidung der Bakterien ist zunächst eine Entgiftungsreaktion, um toxische Sauerstoffmetaboliten zu entsorgen, denn unter anaeroben Bedingungen bilden die Bakterien keinen Vergrünungshof. Sie kann auch zu einem Virulenzprinzip werden, wenn andere Bakterien oder eukaryote Zellen in der Nachbarschaft auf

das Peroxid empfindlicher als die Streptokokken selbst reagieren. Einige Spezies aus der Familie sind grundsätzlich oder unter bestimmten Kulturbedingungen nicht zu einer der beiden Hämolyseformen fähig. Diese Streptokokken bezeichnet man als nicht-hämolysierend (gelegentlich fälschlich als „y-Hämolyse" bezeichnet). Weitere traditionelle Differenzierungsschemata für Streptokokken beruhen auf serologischen Methoden. Für die Speziesdifferenzierung der ß-hämolysicrenden Streptokokken und für eine epidemiologische Typisierung von mehreren Arten der Familie sind diese Methoden auch weiterhin wertvoll. Allerdings finden sich die durch diese Methoden nachgewiesenen Antigene auch bei Isolaten verschiedener Spezies. Daher reichen die serologischen Methoden für eine vollständige oder abschließende Differenzierung der Streptokokken nicht aus.

Drei Oberflächenantigene können in diagnostischen Laboratorien differenziert werden: das Zellwand-Polysaccharid, M-Proteine und Kapsel-Polysaccharide. Das Zellwand-Polysaccharid (= C-Substanz; „C" von engl. carbohydrate) ist kovalent an das Peptidoglykan der Zellwand gebunden und dient den Bakterien zum Schutz ihrer Zellwand gegenüber unspezifischen Abwchrmechanisnien des Wirts wie z.B. der Verdauung durch Lysozym. Die C-Substanz ist immunogen, gegen sie gebildete Antikörper haben aber wahrscheinlich keine protektive Wirkung. Die chemische Zusammensetzung der C-Substanz weist insbesondere für ß-hämolysierende Streptokokken Spezies-spezifische Unterschiede auf. Nach chemischer oder enzymatischer Extraktion kann die C-Substanz serologisch differenziert werden (LANCEFIELD). Dies ermöglicht eine Einteilung der Streptokokken in serologische Gruppen, wobei sich die wichtigsten humanpathogenen ßhämolysierenden Streptokokken in den Gruppen A, B, C und G finden. M-Proteine sind langgestreckte, dimere Oberflächenproteine, die von Streptokokken der serologischen Gruppen A, C und G gebildet werden. Im Elektronenmikroskop bietet die Oberfläche dieser Streptokokken daher einen „behaarten" Aspekt. M-Proteine können in vier, in ihrer Sequenz unterschiedlich stark konservierte Abschnitte gegliedert werden (Abb. 4.4). Diese Abschnitte haben jeweils besondere Funktionen, so z.B. die Bindung von Faktoren des Komplementsystems, eine anti-phagozytäre Wirkung und die Adhäsion an Wirtszelloberflächen. Daher sind die M-Proteine wichtige Vi-

4.2 Die Familie der Streptococcaceae

lokokken-Spezies gebildet. Sie dienen den Bakterien zur Hemmung der Phagozytose durch Granulozyten und Makrophagen. Innerhalb einer Spezies sind die Kapsel-Polysaccharide in der Mehrzahl gleichförmig. Allerdings finden sich insbesondere bei S. pneumoniae (Pneumokokken), S. agalactiae (Gruppe B-Streptokokken) und S. suis biochemische und in der Folge auch antigenetische Unterschiede beim Kapselmaterial. Dies ist z.B. im Fall der Pneumokokken Grundlage einer Kapscltyp-spezifischen Immunität des Menschen. Serologisch und teilweise nach Sequenzierung der verantwortlichen Synthese-Operons auch auf DNA-Ebene können bei Pneumokokken >90 und bei Gruppe BStreptokokken 9 Kapseltypen unterschieden werden. Klinische Bedeutung

Außer den Vertretern der Gattungen Streptococcus und Enterococcus werden die anderen Gattungen nur selten oder nie aus Material von Infektionen des Menschen isoliert. Am relativ häufigsten findet man Abiotrophia in Verbindung mit der Endocarditis lenta, Alloiococcus bei der chronischen Otitis media, Aerococcus bei Harnwegsinfekten, Gemella bei Endocarditis lenla sowie Meningitis, Helcococcus bei Wundinfektionen sowie Leuconostoc bei Sepsis, Meningitis oder Peritonitis von Neugeborenen und abwehrgeschwächten Erwachsenen.

Abb. 4.4 Schematische Darstellung zweier M-Protein-Moleküle (rot) von Streptococcus pyogenes (in Anlehnung an FISCHETTI, V.A.: Clin. Microbiol. Rev. 2. 285-314, 1989). Das bei den verschiedenen Serotypen variable N-terminale Ende der Moleküle ist nach außen gerichtet; das C-terminale Ende ist nach dem Einwirken einer Transpeptidase wahrscheinlich ausschließlich in der Zellwand verankert.

rulenzfaktoren. Die N-terminalcn Abschnitte der M-Proteine weisen eine besonders hohe Sequenzvarianz auf. Einerseits ist dies Grundlage für eine M-Typ-spezifische Immunität des Menschen, andererseits können so M-Typen innerhalb der drei serologischen Gruppen A, C und G der Streptokokken differenziert werden. Bei S. pyogenes kennt man zur Zeit ca. 80 serologisch und >150 durch DNA-Sequenzierung unterscheidbare M-Typen. Kapsel-Polysaccharide werden von vielen Strep-

4.2.1 Streptococcus pyogenes (Gruppe A-Streptokokken) und Streptokokken der serologischen Gruppen C und G S. pyogenes ist ein ausschließlich human-pathogenes Bakterium, das häufig eitrige Infektionen der Haut (z.B. Pyodermien) und Schleimhäute (z.B. Pharyngitiden) verursacht, seltener auch invasive Infektionen mit vitaler Gefährdung (streptokokkenbedingtes toxisches Schock Syndrom, Fasciitis. Myositis). An die Infektionen können sich nicht-eitrige Folgeerkrankungen wie das akute rheumatische Fieber (ARF) und die akute diffuse Glomerulonephritis (ACN) anschließen. Bis auf Scharlach und ARF können alle genannten klinischen Bilder auch durch Infektionen mit Gruppe C- bzw. G-Streptokokken bewirkt werden.

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Spezielle Bakteriologie

Eigenschaften der Gruppe A-, C- und G-Streptokokken

Die systematische Stellung der Gruppe C- und G-Streptokokken ist zur Zeit unklar. Beide Gruppen enthalten mehrere Spezies. Für die humanpalhogenen Spezies sind gegenwärtig die Bezeichnungen S. equisimilis bzw. S. dysgalactiae gebräuchlich. Zusätzlich zu den oben genannten Eigenschaften wachsen S. pyogenes und die beiden anderen Spezies auf Schafsblutagar in großen Kolonien, die von großen Hämolysehöfen umgeben sind. Darin unterscheiden sich die drei Spezies von Streptokokken der S. anginosus- („S. milleri") Gruppe. Letztere bilden ebenfalls C-Substanzen der serologischen Gruppen A, C, F und G, wachsen aber in kleinen Kolonien und sind häufig cxoder nicht-hämolysierend. Eine schnelle Unterscheidung zwischen S. pyogenes und den Gruppe C- und G-Streptokokken ermöglicht der PYRTest (s. Tab. 4.3), nur 5. pyogenes läßt diesen Test positiv ausfallen. Das einzige Reservoir für S. pyogenes ist der Mensch. Aber auch außerhalb des Menschen können die Bakterien längere Zeit überleben. So sind sie auch nach Monaten in Staub oder getrocknetem Blut vermehrungsfähig! Pathogenese

Die Epidemiologie von Infektionen insbesondere mit S. pyogenes weist auf das Vorkommen unterschiedlich virulenter Stämme unter den ß-hämolysierenden Streptokokken hin. Solche mit geringer Virulenz bedingen ein endemisches Auftreten der eitrigen Haut- und Schleimhautinfektionen. Andere mit ausgeprägter Virulenz sind für das sporadische oder epidemische Auftreten systemischer Infektionen verantwortlich. Diese verschiedenen S. pyogenes-Stämmc exprimieren ein teils überlappendes, teils unterschiedliches Sortiment an Virulenzfaktoren. Ein zeitweiliger oder dauerhafter Wechsel einzelner Stämme zwischen den Virulenzniveaus ist zumindest wahrscheinlich, da sich das Vorkommen von Mutationen in verantwortlichen Virulenzgenen, Gen-Transduktionen durch Bakteriophagen und adaptative Regulationsmechanismen in vitro nachweisen lassen. Deswegen hat es wenig Sinn, einen oder wenige ,Hauptvirulenzfaktoren' der Streptokokken in den Vordergrund zu stellen.

Alle 5. pyogenes-Stämme bilden Adhäsine, um an ihre Zielzellen zu binden.

Dazu dienen die unspezifisch bindende Lipoteichonsäure, ein Zellwandbestandteil, und verschiedene Oberflächenproteine mit Affinitäten für Bestandteile der menschlichen interzellulären Matrix. Insbesondere sind dies Fibronektin-, aber auch Kollagen- und Laminin-bindende Proteine. Stämme, die invasive Infektionen auslösen, exprimieren zudem eine Reihe von Aggressinen.

Plasminogen-bindende Proteine, die Streptokinase und die Cystcin-Protease SpeB aktivieren humane Proteasen, so daß diese nicht mehr ausreichend durch ihre natürlichen Inhibitoren (z.B. ai-Antiplasmin) gehemmt werden können. Zusammen mit der Wirkung der Hyaluronidase ermöglicht dies den Bakterien die schnelle Ausbreitung im menschlichen Gewebe. Lylische Enzyme wie die Streptolysine S und O zerstören menschliche Zellen und setzen so Nährstoffe frei. Die Immunabwehr wird währenddessen an vielen Stellen gestört. Die Phagozytose wird durch die Kapsel und durch M- und M-ähnliche Proteine (s. Abb. 4.4) blockiert. Die Komplementaktivierung wird durch Spaltung von aktiven Komplementfaktoren und Bindung menschlicher Steuerproteine verhindert. Die T- und mittelbar auch die B-Zell-Antwort wird durch Produktion einiger Superantigene gestört. Mit endemischen Infektionen assoziierte Stämme besitzen offenbar die Fähigkeit, nach einer Phase der intensiven Vermehrung die Expression der genannten Virulenzfaktoren herunterzuregulieren und ihre Aufnahme in epitheliale Zellen zu provozieren. In diesen können sie geschützt persistieren, um nach unbekannten Auslösemechanismen erneut Infektionen hervorzurufen.

Die mit einer Streptokokken-Infektion assoziierten Krankheitsbilder werden durch die Wirkung der aufgezählten Virulenzfaktoren und durch die Entzündungsreaktionen des erkrankten Menschen bedingt. Bei den StreptokokkenFolgeerkrankungen ARF und Akute Glomerulonephritis (AGN) ist die überschießende oder entgleiste Immunantwort sogar hauptverantwortlich. Für diese Erkrankungen wird postu-

4.2 Die Familie der Streptococcaceae

liert, daß die betroffenen Personen kreuzreagierende Antikörper produzieren. Diese richten sich eigentlich gegen Streptokokkenproteine wie vielleicht das M-Protein oder die Streptokinase. Die Reaktion dieser Antikörper mit Proteinen des Herzmuskels und der Synovialis oder die Ablagerung dieser Antikörper in Form von Immunkomplexen in den Glomeruli, die Bildung von Superantigenen seitens der Bakterien und mögliche Defekte in der begrenzenden Steuerung des Immunsystems führen dann zu den pathologischen Veränderungen der beiden Krankheitsbilder. Bisher ungeklärt ist, warum das ARF nur nach einer Pharyngitis mit S. pyogenes, die AGN aber nach Pharyngitis oder Pyodermien mit S. pyogenes und Gruppe GStreptokokken auftritt. Klinik Nach ihrer Lokalisation können durch S. pyogenes sowie Gruppe C- und G-Streptokokken bedingte Infektionen in drei Gruppen eingeteilt werden: Schleimhautinfektionen manifestieren sich meist als Tonsillopharyngitis. Typischerweise sind von der Infektion mit S. pyogenes Kinder im Aller von vier bis zwölf Jahren betroffen. Nach einer Inkubationszeit von zwei bis vier Tagen kommt es zur schmerz- und hochfieberhaften exsudativen Tonsillitis (Angina lacunaris), die selbstlimitiert bis zu einer Woche andauert. Durch direkte oder hämatogene Fortleitung (daher sind auch andere initiale Foci möglich) können eitrige Komplikationen wie Peritonsillarabszeß, Sinusitis, Otits media und Pneumonie entstehen. Da nur eine stammspezifische Immunität auf die Infektion folgt, kann es aufgrund des Vorkommens zahlreicher antigenetisch verschiedener S. pyogenes-Stämmc zu häufigen Reinfektionen kommen. Der Scharlach tritt als Komplikation der Pharyngitis, aber auch der Hautinfektionen auf. Voraussetzung ist, daß der verursachende S. pyogenes-Siamm einen oder zwei temperente Bakteriophagen im Genom trägt. Diese Phagen kodieren in ihrer DNA je eines der beiden bisher bekannten Gene für erythrogene Toxine Typ A und Typ C („streptococcal pyrogenic exotoxins"; SPE). Diese Toxine sind Superantigene und für die spezifische Symptomatik verantwortlich. Klinisch äußert sich Scharlach zusätzlich zu den Pharyngitissymptomen durch ein kleinfleckiges, zentrifugales Exanthem und

Enanthem. Spätestens nach zwei Wochen endet die Erkrankung, häufig unter grob-lamellärer Schuppung der Handflächen und Fußsohlen (Abb. 4.5. Farbtafel). Hautinfektionen können sich als puslulös-eitrige Pyodermien manifestieren. Nach einer Inkubationszeit von wenigen Tagen sind insbesondere Kinder im Alter von zwei bis sechs Jahren betroffen. Pyodermien sind häufig Mischinfektionen zusammen mit Staphylocoecus aureus (Impetigo contagiosa), deren Genese mit einem engen sozialen Zusammenleben (Kindergarten) und mangelnder Hygiene in Verbindung steht. Das Erysipel tritt nach kleinen Verletzungen insbesondere im Gesicht und an den Beinen auf und betrifft tiefere Hautschichten. Es zeichnet sich durch eine rasch fortschreitende, scharf begrenzte, schmerzhafte Hautrötung und Fieber aus (Abb. 4.6, Farbtafel). Nach tiefen Verletzungen und Operationen kann es zur Phlegmone, einer eitrigen Infektion der Subkutis und der Faszien, kommen. Weitergehende Komplikationen mit einer ungünstigen Prognose sind die Faseiitis necroticans und die Myositis mit ausgedehnten Gewebszerstörungen, die immer ein schnelles chirurgisches Eingreifen erfordern, und das Strcptokokken-assozierte Toxische Schock Syndrom (STSS). Hierbei kommt es durch die konzertierte Wirkung der Virulenzfaktoren, auch ohne Bakteriämic, innerhalb von wenigen Stunden zum Schock und Multi-Organversagen, die beide immer eine Intensivtherapie erfordern. Eine bis zur Einführung und Beachtung von Hygieneregeln (SEMMELWEIS, 1847), von Regeln der operativen Asepsis und bis zur Verwendung von Antibiotika häufige Infektion war die Puerperalsepsis (Kindbettfieber) durch ß-hämolysierende Streptokokken. Abhängig vom Sozialstatus waren bis zu 10% der Gebärenden betroffen. In Deutschland ist diese Erkrankung inzwischen sehr selten. Nicht-eitrige Folgeerkrankungen sind das akute rheumatische Fieber (ARF) und die akute diffuse Glomerulonephritis(AGN). Das ARF ist durch konsequente Therapie von Streptokokkeninfektionen in den Industrieländern sehr selten. Es ist aber in Entwicklungsländern weiterhin einer der häufigsten Wegbereiter für tödliche Herzerkrankungen vor dem 40. Lebensjahr. Es tritt durchschnittlich 18 Tage nach einer S. pyogenes-bedingen Pharyngitis besonders bei Sechs- bis Fünfzehnjährigen auf. Es kommt zu schmerzhaften, entzündlichen aber vorüberge-

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Spezielle Bakteriologie

hendcn Schwellungen der großen Gelenke. Eine Endocarditis verrucosa besonders im Bereich der Herzklappen verursacht bleibende Schäden („leckt an den Gelenken, beißt ins Herz"). Seltener ist eine Enzephalitis, die sich als Chorea minor manifestiert. Ungefähr zehn Tage nach einer Pharyngitis oder drei Wochen nach einer Hautinfektion kann es besonders bei Zwei- bis Sechsjährigen zur AGN kommen. Sie äußert sich durch Ödeme, Hypertension und Erythrozyturie. In der überwiegenden Zahl der Fälle besteht eine günstige Prognose. Als weitere Gruppe A-Streptokokkenassoziierter Folgeerkrankungen werden Exazerbationen der Psoriasis und neurologische Ticks („obsessive-compulsive disorders", OCD) diskutiert. Laboratoriumsdiagnose

Das Untersuchungsmaterial für einen kulturellen Nachweis ß-hämolysierender Streptokokken wird durch Abstriche mit einem sterilen Wattetupfer, bei tiefen Infektionen durch Punktion oder Biopsie gewonnen. Bei vitaler Indikation und Materialien aus sonst sterilen Körperregionen sollte ein Präparat für eine mikroskopische Begutachtung gefertigt werden (Abb. 4.7, Farbtafel). Die Einsendung in das Labor erfolgt in einem geeigneten Transportmedium, um die Nachweisausbeute zu erhöhen. Die Kultivierung erfolgt mittels 3-Ösen-Ausstrichtechnik auf Schafsblutagar und Bebrütung in CO2-angereicherter Atmosphäre. Nach ein bis zwei Tagen wachsen typisch aussehende Kolonien, deren Gruppenantigen (C-Substanz) serologisch differenziert wird. Eine weitergehende Charakterisierung einzelner Stämme z.B. zur Aufdeckung von Infektionsketten ist aufwendig und wird nur von Speziallaboratorien durchgeführt. Innerhalb von Minuten durchführbare Tests zum Nachweis des A-Streptokokken-Gruppenantigens direkt aus dem Abstrich gestatten eine Diagnostik noch im Beisein des Patienten.

Dem Vorteil einer schnellen Diagnose steht der Nachteil einer geringen Sensitivität gegenüber. Bei negativem Ausfall des Schnelltests sollte noch ein kultureller Nachweis versucht werden. Eine serologische Diagnostik ist nur bei Verdacht auf Bestehen einer nicht-eitrigen Folgeerkrankung indiziert. In diesen Fällen bleibt der kulturelle Nachweis häufig erfolglos, während

spezifische Antikörper ca. zwei Wochen nach Beginn der eitrigen Infektion nachweisbar werden. Diese Antikörper richten sich gegen Exoproteine der ß-hämolysierenden Streptokokken. Typischerweise werden die Antikörper gegen das Streptolysin O (Antistreptolysin O; Abk.: ASL, ASO oder AST) und die DNase B (Antidesoxyribonuklease B; Abk.: ADB, Anti-DNase B, Anti-Streptodornase B) quantifiziert. Die Meßergebnisse werden in internationalen Einheiten (bezogen auf einen WHO Standard) angegeben. Da Gruppe C- und G-Streptokokken ebenfalls Streptolysin O bilden, können ASLTiter auch bei Infektionen mit C- und G-Strcptokokokken vorkommen. Für die Bewertung „frische Infektion" ist der Nachweis eines Titeranstiegs die sicherste Grundlage. Daneben kennt man Basistiter (ASL < 160IE, ADB < 240 IE), deren deutliches Überschreiten zumindest einen Hinweis auf eine entsprechende Infektion liefert. Nach einer Infektion sind die Titer meist merklich erhöht und können für einige Monate auf diesem Niveau bleiben. Selektiv erhöhte ADB-Titer deuten auf eine vorangegangene Hautinfektion durch Gruppe A-Streptokokken hin. Therapie Jede symptomatische S. pyogenes-infeküon sollte durch systemische Antibiotikagabe therapiert werden.

Für Gruppe C- und G-Streptokokken trifft dies mindestens bei tiefen und invasiven Infektionen zu. Therapeutikum der Wahl ist Penicillin, welches bei leichteren Infektionen über zehn Tage per os verabreicht wird. Eine kürzere Therapiedauer erhöht die Gefahr des Wiederauftretens der Infektion. Alternative Therapieschemata mit fünftägiger Gabe eines Oral-Cephalosporins oder neueren Makrolid-Antibiotikums scheinen der Penicillintherapie ebenbürtig zu sein. Makrolide sind auch bei Penicillinallergie Mittel der Wahl. Allerdings ist zu beachten, daß wechselnd hohe Resistenzraten gegenüber Makroliden bestehen (daher unbedingt Resistenztestung durchführen), während eine PenicillinResistenz bei ß-hämolysierenden Streptokokken der Gruppen A, C und G bisher noch nicht nachgewiesen wurde. Symptomlose Keimträger werden wegen des bisher nicht nachgewiesenen therapeutischen Wertes und zur Vermeidung

4.2 Die Familie der Streptococcaceae

unnötiger Resistenzentwicklungen nicht behandelt. Bei schweren Infektionen insbesondere mit S. pyogenes ist häufig eine chirurgische Therapie zwingend notwendig. Ferner wird initial auch Clindamycin und polyvalentes Immunglobulin verabreicht. Epidemiologie und Bekämpfung Bei bis zu 20% der Bevölkerung ist der obere Respirationstrakt symptomlos mit ß-hämolysierenden Streptokokken kolonisiert.

Die Ansteckung geht aber effizienter von akut Erkrankten aus. Die Übertragung der ß-hämolysierenden Streptokokken erfolgt durch Tröpfchen- oder Schmicr-Infektion, selten auch durch kontaminierte Lebensmittel. Die Empfänglichkeit für S. pyogenes ist besonders im Alter von drei bis zwölf Jahren hoch, während Gruppe C- und G-Streptokokken am häufigsten 15- bis 20-Jährige infizieren. Nach dem jetzt geltenden Infektionsschutzgesetz ist Scharlach nicht meldepflichtig. Daher liegen keine umfassenden Zahlen zur Inzidenz der Infektionen durch ß-hämolysierende Streptokokken vor. Auf Grund der in Deutschland ambulant verabreichten Oral-Penicillin-Menge isl von ca. I Million Erkrankungen pro Jahr auszugehen. Zur Prophylaxe von Epidemien bestehen besondere Empfehlungen bezüglich des Kindergarten- oder Schulbesuchs infizierter Personen. Bei diesen ist davon auszugehen, daß sie nach einem Tag suffizienter Therapie nicht mehr ansteckend sind. Eine Rezidivprophylaxe mit Oralpenicillinen über mindestens 5 Jahre ist nach einem ARF indiziert. Obwohl Gegenstand einiger Forschungsprojekte, ist eine Schutzimpfung gegen 5. pyogenes in den nächsten Jahren noch nicht absehbar.

4.2.2 Streptococcus agalactiae (Gruppe-B-Streptokokken) S. agalactiae ist ein tier- und humanpathogenes

Bakterium. Tierpathogene Stämme (z.B. Erreger der Mastitis der Rinder) sind genetisch deutlich von humanpathogenen Stämmen verschieden, so daß eine Infektion des Menschen durch tierpathogene Stämme kaum vorkommt. Humanpathogene Stämme infizieren insbesondere

Neugeborene sowie Schwangere und Erwachsene mit Grunderkrankungen wie Diabetes mellitus, Tumoren und Schädigungen des Immunsystems. Eigenschaften der Gruppe-B-Streptokokken

Auch S. agalactiae zeigt bei Wachstum auf Schafsblutagar eine ß-Hämolyse, die meist deutlich schwächer ausgeprägt ist als die von S. pyogenes. Einfache Tests zur Bestätigung der Identität von 5. agalactiae sind die orange-bräunliche Pigmentbildung der Kolonien bei anaerober Anzucht und der Nachweis des CAMP-Faktors. eines Co-Hämolysins. Pathogenese

Tm Vergleich zu S. pyogenes oder Pneumokokken haben größere Schwierigkeiten bei der genetischen Manipulation der Gruppe B-Streptokokken eine ähnlich umfassende Analyse von deren Virulenzfaktoren und Regulationsmechanismen bisher verwehrt. Trotzdem wurden einige Virulenzfaktoren schon eingehend charakterisiert. Bei den invasiven Infektionen der Neugeborenen spielt offenbar die Kapsel eine entscheidende Rolle. Zur Erkennung und Opsonisierung der verschiedenen Kapseltypen (Ia, Ib, Ic, II-VITI) müssen Typ-spezifische Antikörper vorhanden sein. Bei Müttern von infizierten Neugeborenen werden häufig sehr niedrige Antikörperspiegel gegen den Kapseltyp des verantwortlichen Gruppe-BStreptokokken-Stammes gefunden, so daß der passive Schutz der Kinder durch Antikörper ihrer Mütter in solchen Fällen wahrscheinlich nicht ausreicht. Für jegliche Art von Infektionen durch Gruppe B-Streptokokken ist die Expression von Laminin-bindenden Oberflächenproteinen und des Hämolysins wichtig. Seitens der Patienten ist bei der NeugeborenenInfektion die Reife des Kindes von ausschlaggebender Bedeutung.

Je unreifer das T-Zellsystem der Kinder ist, desto höher ist deren Infektionsrisiko und desto weniger Symptome bieten sie trotz einer Sepsis. Klinik

Bei den potentiell dramatisch verlaufenden Neugeborenen-Infektionen unterscheidet man

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Spezielle Bakteriologie

zwischen zwei Infektionstypen. Beim häufigeren „early-onset"-Typ stammen die infizierenden Bakterien von der vaginal besiedelten Mutter. Sie werden meist prä- oder perinatal, ansonsten durch Stillen auf das Kind übertragen, so daß es innerhalb der ersten Lebensstunden bis acht Lebenstage zu einer Sepsis kommt. Diese äußert sich durch eine gestörte Hautperfusion und Atemstörungen. Trotz Therapie kann die Letalität bis zu 6% betragen. Beim selteneren „lateonset"-Typ erfolgt die Bakterienübertragung wahrscheinlich aus der Umgebung des Kindes (Krankenhauspersonal, Mutter) ein bis sechs Wochen nach Geburt. Klinisch auffällig werden die Kinder durch eine Meningitis. Die Letalität im Vollbild des entzündlichen Hirnödems liegt bei 25%, zudem kann es zu Defektheilungen kommen.

Therapie

Kommt es während der Schwangerschaft zur Infektion des Feten, so können daraus Frühgeburtlichkeit, vorzeitiger Blasensprung oder septischer Abort resultieren.

Die allgemeine Kolonisations- und Infektionsrate durch S. agalactiae ist aufgrund der mangelnden Erfassung unbekannt. Die vaginale Kolonisalionsrate bei Schwangeren ist von sozialen Faktoren abhängig und schwankt zwischen 5 und 20%. Ohne Antibiotika-Prophylaxe werden die Bakterien in 50% der Fälle von der besiedelten Mutter auf das Kind übertragen. Davon erkranken zwischen 1% (reife Kinder) und 100% (extreme Frühgeborene) an der „early onsefInfektion. Spezifische Maßnahmen zur Prävention der „late onset"-Infektion sind nicht bekannt. Gruppe B-Streptokokken-assoziierte Erkrankungen sind als solche nicht meldepflichtig. Krankenhaus-Infektionen sollen dem zuständigen Krankenhaushygieniker gemeldet werden. Trotz intensiver Bemühungen um eine Entwicklung einer Kapsel-Vakzine ist die allgemeine Einführung eines Gruppe B-StreptokokkenImpfstoffes in den nächsten Jahren nicht absehbar.

Infektionen in höherem Alter äußern sich als Haut- und Harnwegsinfektionen, seltener als Endokarditis, Osteomyelitis, Pneumonie oder Peritonitis. Im Zusammenhang mit den oben aufgeführten Grunderkrankungen sind häufig Patienten in Heimen oder Krankenhäusern betroffen.

Laboratoriumsdiagnose

Untersuchungsmaterial ist je nach klinischem Bild Blut oder Liquor bzw. Abstriche der besiedelten oder infizierten Stellen, ggfs. auch Urin. Für die Untersuchung Schwangerer im letzten Trimenon werden Vaginal- und Rektalabstrichc, für ein prophylaktisches Neugeborenen-Screening Ohr- und Rachen-Abstriche sowie Magensaft verwendet. Für den Erregernachweis und das Antibiogramm erfolgt eine kulturelle Anzucht. Die Verwendung einer Anreichcrungsbouillon für wenige Stunden mit nachfolgender Kultur auf festem Medium erlaubt einen sensitiven Nachweis innerhalb von 24 bis 48 h. In Deutschland werden auch „Schnellkulturmedien" verwendet, die auf dem Nachweis eines S. agalactiae-typischen Pigments innerhalb von 18-24 h beruhen. Serologische Nachweismethoden existieren nur für Forschungsaufgaben.

Therapeutikum der Wahl sind Penicilline. Bei Neugeborenen- und invasiven Infektionen bei anderen Altersgruppen werden Ampicillin plus Aminoglykoside über mindestens zehn Tage verabreicht. Bei vaginal besiedelten Müttern wird eine Prophylaxe der Neugeborenen-Infcktion durch Gabe von Penicillin G oder Ampicillin in festgelegten mehrstündigen Intervallen vor der Geburt erreicht. Gleiches gilt auch für Mütter mit Risikofaktoren (z.B. Fieber, deutliche Entzündungszeichen, vorzeitiger Blasensprung, kindliche Unreife, vorangegangene Geburt mit „early onset" Infektion) ohne den Nachweis einer vaginalen Besiedlung. Epidemiologie und Bekämpfung

4.2.3 Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) Pneumokokkken sind bekapselt und liegen häufig in Diplokokken-Anordnung vor. Sie kolonisieren den oberen Respirationstrakt der Menschen. Davon ausgehend kann es zu endogenen, aber auch zu exogenen Infektionen des oberen und unteren Respirationstraktes kommen. Daneben können die Bakterien eine Arthritis, Peritonitis oder Hornhautinfektion auslösen und sind die häufigsten Erreger bakterieller Meningitiden.

4.2 Die Familie der Streptococcaceae

Eigenschaften der Pneumokokken

Pathogenese

Taxonomisch werden die Pneumokokken der S. m(to-Gruppe der Streptokokken zugeordnet. Unter aeroben Bedingungen wachsen sie auf Schafsblutagar in Kolonien mit einem deutlichen a-Hämolysehof. Bei starker Kapselbildung (insbesondere Kapseltyp 3) bieten die Kolonien einen schleimig-glänzenden Aspekt. Pneumokokken bilden beim Ausbleiben von Nährstoffen ein Autolysin. Am Ende ihrer Wachstumsphase überwiegt die Aktivität des Autolysins die Aktivität der Zellwand-aufbauenden Enzyme. Dies induziert ein Absterben der Zellen. Beim Wachstum auf Agar äußert sich dies durch Bildung einer zentralen Delle in der Kolonie (Abb. 4.8). Im Patientenmaterial führt es nach Entnahme des Materials zu einem schnellen Absterben der Bakterien. Wie die anderen Vertreter der S. mith-Gruppc besitzen Pneumokokken eine natürliche Kompetenz, d.h. die Fähigkeit, fremde DNA aktiv aufzunehmen. Die DNA kann durch Rekombination dem eigenen Genom einverleibt werden. Insofern hat die autolytische Aktivität den Sinn, Pneumokokken-DNA freizusetzen und sie der Population zur Verfügung zu stellen. Damit wird eine schnelle genetische Variabilität und somit eine erhöhte Anpassungsfähigkeit an die Umgebung der Population erreicht. Durch die Eigenschaft der Kompetenz konnte GRIFFITH (1928) Kapselsynthesegene von toten bekapsellen auf lebende unbekapselte Pneumokokken übertragen und damit beweisen, daß die Erbinformation zwischen Zellen weitergegeben werden kann.

Die Polysaccharidkapsel (Abb. 4.9, Farbtafel) ist ein notwendiger Virulenzfaktor der Bakterien. Unbekapselte („rauhe") Stämme werden, außer bei Hornhautinfektionen, nicht von infizierten Stellen isoliert. Etwa 10 unter den über 90 Kapseltypen sind mit einer besonderen Virulenz des Kapsel-produzierenden Stammes assoziiert, so daß diese Stämme ca. zwei Drittel der Pneumokokken-Infektionen bei Erwachsenen und ca. 80% der Infektionen bei Kindern auslösen. Die Funktion der Kapsel ist die Inhibition der Phagozytose. Dies geschieht durch Effizienzminderung des alternativen Komplementaktivierungsweges und Maskierung anderer bakterieller Oberflächenantigene. Das Pneumolysin ist ein Toxin, das nach Autolyse der Bakterien freigesetzt wird und durch Insertion und Oligomerisierung zur Porenbildung in eukaryoten Zellmembranen und letztlich zur Lyse von Ziclzellen führt. Daneben aktiviert es das Komplementsystem und führt zur StickoxidAusschüttung aus Wirtszellen. Dies führt zur Hemmung der Zilien-Bewegung respiratoriseher Epithelzellen. Bei Hornhautinfektionen spielt es die Rolle eines zentralen Virulenzfaktors. Daneben exprimieren Pneumokokken Oberflächenproteine mit Adhäsinfunktion wie verschiedene Lektine oder PspA. dessen Funktion weiterhin unklar ist. Aufgrund von Deletionsexperimenten weiß man aber, daß PspA für das Angehen einer Infektion unerläßlich ist. Ferner werden nach der Autolyse eine Reihe von Enzymen freigesetzt: eine IgApProtease, die sekretorische Antikörper inaktiviert, eine Ncuraminidase, die Schleim verflüssigt und mögliche Bindungsstcllcn auf Wirtszellen freilegt, sowie eine Hyaluronidase, die Matrixmoleküle degradiert und damit zur Ausbreitung der Pneumokokken beiträgt. Reguliert wird die Expression dieser Virulenzfaktoren u.a. durch die Aktivität verschiedener Mctallionenbindender Lipoproteine. die intrazelluläre Ca^-Konzentralion und die gezielte Aufnahme von Oligopeptiden. Die Abwehr der Infektion erfolgt in erster Linie durch Kapseltyp-spezifische Antikörper.

Abb. 4.8 Typische Pneumokokken-Kolonien auf Blutagar. Die zentrale Delle der älteren Kolonien ist eine Folge der Autolyse.

Zusammen mit beiden Komplementaktivierungswegen und reger Phagozytose durch Granulozyten und Makrophagen sowie einer intakten T-Zellfunktion können die Bakterien intrazellulär lysiert werden. Bei Bakteriämien findet dies im Retikulo-Endothelialen System, also z.B. in der Milz statt.

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Spezielle Bakteriologie

Klinik Bei bis zu 50% der Bevölkerung ist der obere Respirationstrakt asymptomatisch mit Pneumokokken besiedelt. Nach Schwächung der lokalen Abwehr, z.B. durch einen Virusinfekt, kommt es von dort aus häufig zu einer endogenen Infektion. Aber auch exogene Infektionen werden nachgewiesen. Die häufigsten Pneumokokken-bedingten Infektionen sind Sinusitiden und die Otitis media, von der praktisch alle Kinder bis zum Alter von sechs Jahren mindestens einmal betroffen sind. Falls keine adäquate Therapie eingeleitet wird, kann es ausgehend von diesen Infektionen durch direkte Fortleitung oder hämatogener Streuung der Bakterien zu Komplikationen wie Mastoiditis, Meningitis und Hirnabszeß kommen. Typisch ist die Pneumunie. Während in der vorantibiotischen Ära sich diese eher als LobärPncumonie manifestierte, überwiegt heute das Bild der Bronchopneumonie. Die Pneumonien betreffen überwiegend Personen mit eingeschränkter Abwehr- und Phagozytose-Funktion. Diese Situation ist bei älteren Personen sowie durch Rauchen, Alkoholabusus und Malignome gegeben. Wichtige Komplikationen sind lokal das Pleuraempyem und die Perikarditis, hämatogen fortgeleitet die Meningitis und. seltener, die Arthritis. Bei Milz-extirpierten Personen besteht die Gefahr der bakterämischen Ausbreitung, so daß es zum OPSI (overwhelming postsplenectomy infection)-Syndrom mit disseminierter Koagulopathie kommen kann. Insbesondere bei Leber-Zirrhose besteht auch die Gefahr einer spontanen Peritonitis. Die Meningitis durch Pneumokokken ist die häufigste bakteriell bedingte Meningitis im Jugendlichen- und Erwachsenen-Alter, seit Einführung der Haemophilus influenzae-\m\)i\mg auch im Säuglings- und Kleinkind-Alter. Sie kann durch Fortleitung als sekundäre, aus der kolonisierenden Flora heraus auch als primäre Infektion entstehen. Bei fulminantem Verlauf kann es zum WATERHOUSE-FRIDERICHSEN-Syndrom kommen. Schließlich ist auch eine Konjunktivitis mit der Komplikation eines UIcus serpens corneae eine mögliche Manifestation einer PneumokokkenInfektion.

Laboratoriumsdiagnose Untersuchungsmaterial aus dem Respiralionstrakt sowie aus den belüfteten Höhlen des Gesichtsschädcls sind Abstriche oder Aspirate und Sputuni bzw. Trachealsekret. Bei Verdacht auf Pneumonie sollten grundsätzlich Blutkulturen angelegt, bei Verdacht auf Meningitis zusätzlich auch Liquor abgenommen werden. Wegen der Autolysin-Bildung überleben die Pneumokokken im Untersuchungsmaterial nur kurze Zeit. Deswegen ist es wichtig, das Material in geeigneten Transportmedien schnell einer Diagnostik zuzuführen. Trotzdem lassen sich die Pneumokokken manchmal nur mikroskopisch im Material nachweisen (s. Abb. 4.9), aber nicht mehr kultivieren (Antigennachweis s.u.). Nach kultureller Anzucht der Bakterien auf Schafsblutagar in CO2-angercicherler Atmosphäre erfolgt die Diagnose aufgund des typischen Aspekts der Kolonien in Verbindung mit einem Optochin- oder Galle-Löslichkeits-Test. Mit beiden Tests wird die Autolysin-Produktion der Bakterien geprüft. Vornehmlich aus epidemiologischen Gründen kann der Kapscltyp durch die Neufeld-Quellungsreaktion differenziert werden. In diesem Ansatz wird die Kapsel durch Reaktion mit dem homologen Antiserum gut sichtbar. Im Rahmen einer serologischen Diagnostik können Pneumokokken direkt aus dem Untersuchungsmaterial (in aller Regel nur aus Liquor durchgeführt) durch eine Agglutinationsreaktion mit ihren Kapselantigenen nachgewiesen werden. Diese Methode kann die MeningitisDiagnostik entscheidend beschleunigen, ist aber nicht sonderlich sensitiv. Der serologische Nachweis von spezifischen Anti-Kapsel-Antikörpern ist nur für epidemiologische Untersuchungen oder für die Dokumentation eines Impferfolges sinnvoll. Hierzu müssen die Antikörperspiegel vor und nach der Impfung bestimmt werden. Therapie Therapeutikum der ersten Wahl für Pneumokokken-lnfektionen ist weiterhin Penicillin C bzw. ein Oral-Penicillin. Allerdings werden seit einigen Jahren in den USA, Südafrika, Spanien und Ungarn gehäuft Penicillin mäßig empfindliche oder resistente Stämme isoliert (Penicillin G MHK > 1 mg/1).

4.2 Die Familie der Streptococcaceae

Ein Teil davon ist auch gegen Cephalosporine resistent. Die Inzidenz dieser Stämme liegt in Deutschland zur Zeit noch bei < 2% der Isolate. Dies unterstreicht die Notwendigkeit der Resistenztestung von Pneumokokken-Isolaten zur Therapieoptimierung. Die Therapie-Empfehlung beim Verdacht auf oder nachgewiesener Infektion durch einen Penicillin-resistenten Pneumokokken-Stamm lautet für den hiesigen Raum Cefotaxim oder Ceftriaxon. Diese E-Laktame sind auch für die Pneumokokken-Meningitis Chemotherapeutika der ersten Wahl. Bei Penicillin-Allergie können Alternativen nur nach Antibiogramm sicher gewählt werden, da Tetrazyklin-, Makrolid-, Clindamycin- und Chloramphenicol-Resistcnzen bei Pneumokokkcn nicht selten sind. Zukünftig bieten auch Tri-fluoridierte Chinolone (z.B. Moxifloxacin) eine Alternative für die Chemotherapie. Epidemiologie und Bekämpfung

Pneumokokken-Infcktionen sind nach dem Infektionsschutzgesetz nicht meldepflichtig. Da Pneumokokken offenbar physiologischerweise beim Menschen weit verbreitet sind, stellen sich für eine sichere Prophylaxe einige Probleme. Es existiert die Möglichkeit einer aktiven Immunisierung mit einer Vakzine, die die 23 empirisch häufigsten Kapselantigene enthält. Diese wirkt bei Milz-exstirpierten Personen gut und kann für andere Risikopersonen (z.B. ältere Menschen) indiziert sein. Da Kinder < 2 Jahren keine signifikante Immunantwort gegen Polysaccharid-Antigene aufbauen, wird eine proteinhaltige, sog. Konjugat-Vakzine für diese Risikogruppe entwickelt.

4.2.4 Streptokokken der S. mitis- und S. mutans-Cruppen Diese von Klinikern häufig noch als ViridansStreptokokken bezeichneten Bakterien besiedeln physiologischerweise den Mund- und Nasenraum. Hier haben sie eine probiotische Funktion, weil sie die Zahl pathogener Bakterien durch Verdrängung von den Bindungsstellen an Wirtszellen und durch die Sekretion toxischer Substanzen wie H2O2 und Bakteriozinen vermindern. Unter einer Ernährung mit hohem Zuckergehalt verursacht Streptococcus mutans Karies. Strepto-

kokken der 5. m/t/s-Gruppe besitzen nur eine geringe Virulenz und sind häufig an Mischinfektionen beteiligt.

Bei vorgeschädigtem Endokard können sich die Streptokokken im Rahmen von Bakteriämien auf den Herzklappen absiedeln und dort eine Endocarditis lenta erzeugen. Eigenschaften der Erreger

Vor allem die Streptokokken der S. mutans-Gruppe (S. mutans, S. sobrinus, S. downei) zeigen keine Hämolyse bei Wachstum auf Schafsblutagar. Ansonsten gehören die Bakterien dieser Gruppen zu den a-hämolysierenden Streptokokken. Die Speziesdifferenzierung ist am sichersten durch Analyse der rRNA-Gene durchführbar. Da die DNA-Sequenzierung noch wenigen Speziallaboratorien vorbehalten ist. werden zahlreiche Zuckerfermentationstests zur Feststellung der Art benutzt. Pathogenese

Die Streptokokken der S. mutans-Gruppc exprimieren mindestens drei verschiedene Oberflächenproteine, die ihnen die feste Anheftung an die Zahnoberfläche gestatten. Ferner besitzen sie die Fähigkeit, Nahrungszucker in langkettige Exopolysaccharide (Glukane) umzuwandeln. In der aus dieser Substanz zusammengesetzten, die Bakterien umgebenden Schleimhülle sind sie gegen mechanischen und chemischen Streß in der Mundhöhle gut geschützt. Andere Bakterienarten bilden spezifische Rezeptoren für Oberflächenstrukturen der erstbcsiedelnden Streptokokken. Der resultierende Belag aus Streptokokken, anderen Bakterien und Schleim wird Plaque genannt. Die Streptokokken der S. mutans-Gruppe zeichnen sich gegenüber anderen Streptokokken durch ihre ausgeprägte Milchsäurefermentation aus. Diese findet auch noch bei sehr niedrigen UmgebungspH-Werten statt, sofern Zuckermoleküle konstant zur Verfügung stehen. Die dadurch anfallende große Laktatmenge löst nachhaltig Ca2'Ionen aus dem die Bakterien tragenden Zahnschmelz (Schmelzkaries). Durch diesen Mechanismus weichen die Bakterien den Schmelz auf und gelangen bis zum Dentin, in dem das Spektrum der Erreger hin zu gram-positiven Stäben und die verantwortlichen Virulenzfaktoren zu Proteasen wechseln (Dentin-Karies).

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Spezielle Bakteriologie

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Die Kontrolle und Abwehr der Bakterien durch den Wirt beruht auf der vielfältigen Wirkung des Speichels (Spülung, lytische Faktoren, sekretorisches IgA, Kationen-bindende Proteine).

Während auf der Schleimhaut auch Makrophagen und Lymphozyten zur Kontrolle beitragen, entfallen diese Mechanismen auf der Zahnoberfläche. Nach dem Durchdringen des Zahnschmelzes schreitet daher die kariöse Läsion praktisch ungehindert bis zum Eindringen in die Pulpa voran. Streptokokken der S. miiis- und S. muiansGruppen werden durch mechanische Manipulationen vom Mund (z.B. Zähneputzen, Zahnextraktion) in die Blutbahn geschwemmt. Durch die Ausbildung von Fibronektin-bindenden und Thrombozyten-aggregierenden Oberflächenproteinen besitzen sie die Fähigkeit besonders an vorgeschädigten Endothelien (z.B. Herzklappen nach akutem rheumatischen Fieber) zu adhärieren. Der Wirt kann gegen diese im Gefäßlumen lokalisierten Bakterien alle Wege der unspezifischen und spezifischen Abwehr nutzen. Hinzu kommen bakterizide Peptide, die von aktivierten Thrombozytcn ausgeschüttet werden. Allerdings werden die Bakterien durch eine Thrombozyten-Fibrinhülle. ihre Glukansynthese und die Bildung einer IgA-Protease vor den Abwehrmechanismen geschützt, so daß sie persistieren können. Durch lytische Enzyme zerstören sie das umgebende Gewebe und vergrößern den Defekt. Klinik

Karies führt zur Kavitation der Zähne. Komplikationen sind der Einbruch der Infektion in die Pulpa (Pulpilis. Pulpa-Nekrose) und periapikale Infektionen unter Involvierung der Alveolarknochen und angrenzender Strukturen. Die Besiedlung des Endokard mündet in die Endocarditis lenta mit langsamer Destruktion der befallenen Klappe und multiplen peripheren Eiterherden in Folge septischer Embolisation. Bei neutropenischen Patienten (Leukämie, Chemotherapie, Strahlentherapie) verursachen Streptokokken der S. »n'to-Gruppe von allen Bakterien am häufigsten Bakteriämien (besonders wegen der oft stark geschädigten Mundschleimhaut) mit den Komplikationen einer möglichen fulminanten Sepsis.

Laboratoriumsdiagnose

Zur Diagnose der Karies bedarf es in aller Regel keiner mikrobiologischen Untersuchungen. S. mutans läßt sich auf dem Mitis-Salivarius (MS)-Selektivagar kultivieren und visuell differenzieren. Für die Diagnose der Endocarditis lenta werden mehrere Blutkulturen angelegt. Wegen der Sauerstoff-Empfindlichkeit einiger der potentiell beteiligten Streptokokken müssen auch immer anaerobe Medien inokuliert bzw. für die spätere Differenzierung mitbenutzt werden. Eine Resistenztestung ist auf Grund der Schwere der Erkrankung und der auch in Deutschland bei bis zu 20% der S. mitis- und S. oralis- Stämme vorhandenen Penicillin-Resistenz erforderlich. Gegebenenfalls müssen auch die exakten MIIK/ MBK-Werte zum Ausschluß einer ausgeprägten Aminoglykosid-Resistenz bzw. einer Antibiotika-Toleranz ermittelt werden. Mit „Schachbretf'-Testungen kann die synergistische Wirkung verschiedener Antibiotika-Klassen überprüft werden. Serologische Untersuchungen werden nicht benötigt. Therapie

Die Therapie der Karies ist die mechanische Entfernung der Läsion bis zur Grenze der gesunden Zahnhartsubstanz und die bakteriendichte Defektfüllung mit einem biokompatiblen Füllungsmaterial. Die Endocarditis lenta wird mit Penicillin G, evtl. über einen definierten Zeitraum kombiniert mit einem Aminoglykosid, therapiert.

Bei neutropenischen Patienten werden Kombinationen von Aminoglykosiden plus Cephalosporinen oder Glykopeptiden bevorzugt. Epidemiologie und Bekämpfung

Das cnorale Vorkommen von Streptokokken der zwei Gruppen ist bei der gesamten Bevölkerung physiologisch. Deswegen können zur Zeit nur die pathologischen Folgen der Kolonisation angegangen werden. Zur Prävention der Karies gehören Zuckerkarenz („nicht die Menge, sondern die Frequenz hat die größere Bedeutung") und Fluoridgaben zur Schmelzaushärtung. Die Entwicklung einer Impfung wird intensiv vorangetrieben.

4.2 Die Familie der Streptococcaceae

Eine Chemoprophylaxe der Endocarditis lenta mit Oral-Penicillinen ist bei Vorschädigung der Herzklappen indiziert.

4.2.5 Streptokokken der S. anginosusund S. bovis-Gruppen Streptokokken der S. anginosus-Gruppe (S. anginosus, S. intermedius, S. constellatus) können alle Hämolyseformen auf Schafsblutagar zeigen. Sie kommen physiologischerweise im oberen Respirations- und im Darmtrakt vor. In der Regel werden sie aus Mischinfektionen mit Abszeßbildung aus Lunge, Abdomen und Hirn, aber auch aus dem Urogenitaltrakt und dem Endodontium isoliert. S. bovis als humanpathogen relevanter Vertreter der gleichnamigen Gruppe wächst nicht-hämolysierend auf Schafsblutagar. Er findet sich physiologischerweise im Darmtrakt. Eine Bakteriämie oder Sepsis mit dieser Spezies kann mit dem Vorliegen von Kolon-Karzinomen assoziert sein. Penicilline eignen sich zur Therapie der durch diese Bakterien ausgelösten Infektionen.

4.2.6. Enterokokken Enterokokken sind in der Natur weit verbreitete Bakterien. Sie besiedeln das Darmlumen von Wirbellosen und Wirbeltieren und finden sich auf Pflanzen, im Wasser sowie im Erdboden. Die 17 Spezies haben jeweils eine Assoziation zu spezifischen Wirten. Beim Menschen finden sich vor allem E. faecalis und E. faecium als Kommensalen in Darm, Mundhöhle, Urethra und Vagina. Enterokokken beherbergen häufig Resistenzplasmide, die durch konjugativen Transfer auf Bakterien der eigenen und anderer Spezies übertragen werden können. Typische durch Enterokokken ausgelöste Infektionen betreffen die Harnwege, Operationswunden, Endokard und Peritoneum. Eigenschaften der Enterokokken

Die Enterokokken bilden eine eigene Gattung, die phylogenetisch von den übrigen Streptococcaceae abgegrenzt ist. Sie zeichnen sich durch hohe Toleranz gegenüber Schwankungen von Temperatur, Salzkonzentration und pH-Wert aus. Die Nomenklatur einiger EnterokokkcnSpezies ist im Zuge der Sequenzierung von rRNA- und anderen Marker-Genen gegenwär-

tig im Fluß. Auf Schafsblutagar wachsen die Enterokokken mit Vergrünung oder nicht-hämolysierend. Typischerweise sind sie im LAPund PYR-Test (s. Tab. 4.3) positiv. Den serologischen Typ D ihres Gruppenantigens teilen sie mit anderen Streptokokkenarten, so daß diese Reaktion nicht zur Differenzierung von Enterokokken ausreicht. Pathogenese

In Abhängigkeit von ihrer Umgebung exprimicren die Enterokokken Virulenzfaktoren wie Adhäsine für Matrixproteine und ein Zytolysin. Die Vorrangstellung von E. faecalis unter den die Menschen kolonisierenden und infizierenden Enterokokken erklärt sich womöglich aus der Fähigkeit zur Bildung der Aggregationssubstanz. Dieses Adhäsin bindet an ßplntegrine eukaryoter Zellen und wird offenbar besonders in Gegenwart von Serumpeptiden exprimiert. Damit hat das Adhäsin wahrscheinlich eine herausragende Bedeutung im Rahmen der Pathogenese der Entcrokokken-Endokarditis. Die Aggregationssubstanz wird auf einer Familie von Plasmiden kodiert, auf denen sich auch die Gene für Anlibiolikarcsistenzen und das Zylolysin befinden können. Ein einzelnes dieser Plasmide wird auf einen Pheromon-Stimulus hin durch Konjugation von Plasmid-tragenden auf Plasmid-frcic Enlcrokokken übertragen. Damit sind die Plasmide in vielen E. faecalisund einigen F.. faecium-Slämmcn verbreitet. Durch einen besonders kontrollierten Replikalionsmechanismus sind die Plasmide in ihren Wirten sehr stabil, auch ohne dal.! z.B. durch Antibiotikatherapie ein Selektionsdruck in Richtung Plasmid-tragcnder E. faecafo-Stämme bestände. Deswegen sind die Plasmidtragenden Enterokokken ein stabiles Reservoir für die auf diesen Plasmiden kodierten Antibiotika-Resistenzgene. Klinik Enterokokken verursachen Harnwegsinfektionen, insbesondere bei hospitalisierten Patienten. Eine schwerwiegende und therapeutisch häufig problematische Infektion ist die Enterokokken-Endokarditis.

Die Bakterien verursachen 5-15% aller Endokarditiden. Eine Vorschädigung der Herzklappen ist keine notwendige Voraussetzung für die Entwicklung dieser Infektion. Schließlich sind Enterokokken die zweit- bis dritthäufigsten Erreger von Hospitalinfektionen. Dies sind vor-

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Spezielle Bakteriologie

nehmlich Harnwegsinfektionen und Wundinfektionen, insbesondere von Bauchwunden und hier häufig als Mischinfektionen mit aeroben und anaeroben gram-negativen Stäbchen. Ferner sind Enterokokken im Krankenhaus Erreger von Katheter-assoziierten Infektionen und von Infektionen bei Säuglingen.

gehalten werden, um den Therapieerfolg zu sichern. Die MHK des auslösenden Enterokokken-Isolats ist für die Aminoglykoside Gentamicin und Streptomycin zu ermitteln, um Alternativen für eine Kombinationstherapie nicht zu übersehen. Bei Penicillin-Allergie oder hochgradiger Penicillin-Resistenz sind Glykopeptide eine Therapie-Alternative.

Laboratoriumsdiagnose Untersuchungsmaterialien für die mikrobiologische Diagnostik sind in Abhängigkeit von der klinischen Symptomatik Urin, Abstriche, Sekrete, Punktate oder Blutkulturen. Die kulturelle Anzucht von Enterokokken auf einer Vielzahl von Medien ist unproblematisch. Eine Differenzierung mittels biochemischer Tests, insbesonderer Zuckerfermentationstests, ist in der Regel möglich. Eine Stamm-spezifische Epidemiologie, z.B. zur Aufdeckung von Hospital-Infektionsketten, kann nur von darauf spezialisierten Laboratorien durchgeführt werden. Besonderes Gewicht ist auf die Antibiotika-Resistenztestung der Enterokokken zu legen. Enterokokken sind aus den oben geschilderten Gründen das wichtigste Reservoir für Antibiotikaresislenz-Gene, die auch auf andere gram-positive und gram-negative Organismen übertragen werden können. E-Laktam-, Aminoglykosid-, Makrolid- und in jüngster Zeit Glykopeptid-Resistenzen (sog. VRE (Vancomycin-resistente Entcrokokken)-Stämme) stammen häufig ursprünglich aus Enterokokken. Je nach klinischem Bild und zu testendem Antibiotikum müssen auch die MHK-Werte des entsprechenden Enterokokken-Stammes ermittelt werden. Serologische Methoden stehen für die Routinediagnostik nicht zur Verfügung. Therapie Enterokokken zeigen eine intrinsische Resistenz gegen alle Penicillinase-stabilen Penicilline, Cephalosporine und Clindamycin. Co-Trimoxazol ist in vivo unwirksam. Penicillin und Carbapcneme sind nur eingeschränkt wirksam. Aminoglykoside wirken nur, wenn die Zellmembran der Bakterien durch andere Antibiotika (z. B: Aminopenicilline) permeabilisiert wird. Daher ist Ampicillin als Monotherapie bei harmloseren Enterokokken-Infektionen Medikament der Wahl. Im Fall der Endokarditis soll das Ampicillin mit einem Aminoglykosid kombiniert und diese Therapie sechs Wochen durch-

Epidemiologie und Bekämpfung Enterokokken sind beim Menschen ubiquitär verbreitet. Im Rahmen von Hospitalinfektionen stammt offenbar ein großer Anteil der verursachenden Isolate vom Patienten selbst (endogene Infektion). Übertragungen über medizinische Materialien und Geräte sowie die Hände des Personals sind wegen der weiten Verbreitung der Enterokokken und ihrer langen Überlebensdauer in der unbelebten Umgebung ebenfalls wahrscheinlich. Enterokokken-bedingte Erkrankungen sind nicht mcldcpflichtig, während Hospitalinfektionen als solche dem zuständigen Klinikhygieniker zu melden sind. Schutzimpfungen existieren nicht.

4.2.7. Gram-positive anaerobe Kokken (GPAK) Diese Bakterien werden hier aufgeführt, da sie morphologisch, d.h. häufig durch Wachstum in Ketten, den Streptokokken ähneln. Die für Infektionen des Menschen relevanten Gattungen Peptostreptococcus, Peptococciis und Atopobium stehen phylogenetisch allerdings den Clostridien näher. Sie besiedeln physiologischerweise den Mund, oberen Respirations- und Magen-DarmTrakt, die Haut sowie den weiblichen Genitaltrakt. Die Peptostreptokokken sind die häufigsten anaeroben Krankheitserreger.

Sie sind meist im Rahmen von Mischinfektionen an Endo- und Parodontalinfektionen, abszedierenden Lungen- und Intraabdominalinfektionen, Fußinfektionen bei Diabetes mellitus und der bakteriellen Vaginose beteiligt. Eigenschaften der GPAK Die Taxonomie der GPAK ist weiterhin im Fluß. Mittels Sequenzierung der für die molekulare

4.2 Die Familie der Streptococcaceae

Systematik am besten geeigneten Gene werden bisherige Gattungs- und Spezieszuordnungen überprüft. Dabei zeichnet sich ab, daß sich die Gattung Peptostreptococcus in mehrere neue Gattungen unterteilen läßt. Aufgrund der Sequenz ihrer rRNA-Gene sind sie mit den Clostridien verwandt. Die Bakterien der drei Galtungen sind obligat anaerobe, nicht-sporenbildende Kokken. Sie wachsen als Diplokokken oder in kurzen Ketten (Peptostreptococcus, Atopobium) bzw. in Haufen (Peptococcus). Einzelne Spezies zeigen dabei ein Nebeneinander unterschiedlich großer Kokken. Ihre Energie beziehen sie aus dem Abbau von Peptiden und Aminosäuren. Sie bilden daraus Essigsäure als wesentliches Abbauprodukt. Die Bakterien der drei Gattungen lassen sich auf mit Natriumoleat, Hämin und Vitamin K angereichertem Blutagar oder anderen typischen Anaerobier-Medien gut kultivieren. Da sie in der Regel aus Mischinfektionen angezüchtet werden müssen und relativ langsam wachsen, sollte das Medium Selektiv/.usätze zur Unterdrückung der aeroben und gram-negativen anaeroben Begleitflora enthalten. Auf festen Medien bilden die Bakterien nach 48 bis 72 Stunden Bebrütung kleine, konvexe, glattrandige, helle Kolonien. Ähnlich der Größenvarianz der einzelnen Kokken können auch die Kolonien einer Spezies in einer Passage unterschiedliche Durchmesser aufweisen. In Flüssigmedien wachsen sie typischerweise in Flocken oder Säulen. Pathogenese Die CPAK besiedeln physiologischerweise den Mund, den oberen Respirations- und Darmtrakt, die Haut und den Genito-Urethral-Trakt der Frauen.

Peptostreptococcus micros stellt bis zu 15% der kultivierbaren oralen bakteriellen Flora und findet sich besonders in der Plaque und im gingivalen Sulcus. Die Zusammensetzung der Darmflora hängt vom Alter und der Nahrung eines Menschen ab, trotzdem gehören Peptostreptococcus-Spezies immer zu den häufigsten Arten. In der Vagina wechselt die bakterielle Flora in Abhängigkeit vom Menstruationszyklus und einer Schwangerschaft. Peptostreptococus magnus, P. asaccharolyticus und P. prevotii werden bei 40% aller Frauen und 90% der Schwangeren

nachgewiesen. P magnus findet sich zudem regelhaft in der Hautflora. Werden in Infektionsherden anaerobe Bakterien nachgewiesen, so gehören 25 bis 30% dieser Isolate zu den GPAK. Zur Auslösung einer Infektion benötigen die GPAK in aller Regel die synergistische Aktivität anderer Bakterien mit größerer Virulenz. Häufig ist dies Staphylococcus aureus, wobei in Modellinfektionen schon der Kulturüberstand dieser Spezies zur Unterstützung einer Peptostreptokokkeninfektion ausreicht. Die GPAK bilden selber Oberflächenproteine, die Serum- und Matrix-Proteine binden können. Daneben werden Hämolysine und eine Reihe von Exoenzymen exprimiert. P. micros schließlich kann ohne Schaden für die eigene Population große Mengen an HiS synthetisieren. Dieses wirkt zytotoxisch auf eukaryote Zellen. Klinik

P. micros ist vor allem an oralen Infektionen beteiligt. Zusammen mit Streptokokken der S. anginosus-Gruppe und Prevolella verursacht die Spezies endodontal abszedierende Infekte, zusammen mit Porphyromonas, Prevotella und Racteroides forsythus kann sie die Parodontitis unterhalten. Ferner spielt sie bei der enoralen Implantat-Lockerung, chronischen Sinusitiden und Peritonsillar-Abszessen eine Rolle. In intra-abdominellen Abszessen findet sich von den GPAK am häufigsten Peptostreptococcus anaerobius, genauso wie bei der bakteriellen Vaginose. Diese wiederum zeigt empirisch eine Assoziation zu Frühgeburtlichkeit, niedrigem Geburtsgewicht und Amnion-Infektions-Syndrom. P. magnus schließlich wird besonders in Hautinfektionen wie Talgdrüsenabszessen, FußUlzera bei Diabetikern und chirurgischen Wundinfektionen nachgewiesen. Seltener wird diese Spezies auch aus intrazerebralen Abszessen und osteomyelitischen Foci isoliert. Laboratoriumsdiagnose

Da die GPAK obligat anaerobe Bakterien sind, muß der Luftkontakt des Untersuchungsmaterials und auch der anschließenden Kulturen minimiert werden. Deswegen sind Punktate und Bioptate Abstrichen in der Nachweissensitivität überlegen. Weiterhin sind die Bakterien gegenüber Austrocknung besonders empfindlich. Daher muß das Material sofort in ein Transportme-

275

Spezielle Bakteriologie

276

dium gegeben werden, wobei sich das Port-aCul®-Medium als besonders geeignet erwiesen hat. Im Transportmedium soll das Material bei Raumtemperatur so schnell wie möglich ins Untersuchungslabor transportiert werden. Die anaerobe Anzucht der Bakterien auf geeigneten Kulturmedien bereitet wenig Probleme, ist aber wegen der geringen Teilungsrate der Bakterien langwierig. Aufgrund der zur Zeit teilweise unsicheren Nomenklatur ist die biochemische Differenzierung unbefriedigend. Von Routinelaboratorien können die häufigsten humanpathogenen Peptostreptococcus-Arten relativ sicher erkannt werden. Jede weitergehende Differenzierung bleibt Speziallaboratorien vorbehalten. Im Bereich der Parodontitis-Diagnostik befinden sich Nachweissysteme u.a. für P. micros mittels DNA-Hybridisierung unter Verzicht auf die Anzüchtung der Bakterien im Stadium der Markteinführung. Serologische Untersuchungsmethoden existieren nicht. Therapie Die Therapie beruht, soweit erforderlich, auf einem chirurgischen Eingriff zur Beseitigung des Abszeßherdes und auf der Gabe von Antibiotika. In der Regel sind dies E-Laktame, wobei Penicillin G, Ccfoxitin und die Carbapeneme die beste Wirksamkeit zeigen. Allerdings können gegen diese wie auch gegen typische Anaerobier wirksame Antibiotika wie Metronidazol oder Clindamycin einige GPAK-Stämme resistent sein. Makrolide sind meist unwirksam. Alternativen für die Therapie sind die Gabe von Glykopeptiden oder Tri-fluoridierten Chinolonen (z.B. Moxifloxacin). Epidemiologie und Bekämpfung Infektionen mit GPAK sind in aller Regel endogene Infektionen, so daß kaum Präventionsmöglichkeiten bestehen. Die Erkrankungen sind nicht meldepflichtig. Eine Vakzine wird nicht entwickelt. Es stellt sich die Frage, ob eine solche Vakzine, weil gegen einen Teil der physiologischen Flora gerichtet, nicht sogar schädlich sein könnte. Literatur BOCHUT. P.Y.. T. CALANDRA and P. FRANCIOLI: Bactcremia due to viridans streptococci in neutropenic patienls: a review. Am. J. Med. 97. 256-264 (1994).

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krotisierende Fasziitis. Dt. Ärztebl. 95. A-414-420 (1998). SCHUCIIAT, A.: Epidemiology ofgroup B streptococcal disease in the United States: Shilling paradigms. Clin. Microbiol. Rev. 11, 497-513 (1998). TUOMANEN, E.I.. and H.R. MASURE: Molecular and cellular biology of pneumococcal infection. Microb. Drug Rcsist. 3, 297-308 (1997).

4.3 Die Familie der Neisseriaceae MATTHIAS FROSCH

Neben den Genera Acinetobacter, Branhamella, Kingella und Moraxella umfaßt die Familie der Neisseriaceae auch die Gattung Neisseria, die unter den genannten Gattungen humanmedizinisch am bedeutsamsten ist. Neisserien sind unbeweglich und stellen sich als gram-negative Diplokokken dar. Neisseria meningitidis (Meningokokken), der wichtigste Erreger einer eitrigen Meningitis und Sepsis, und Neisseria gonorrhoeae (Gonokokken), der Erreger der Geschlechtskrankheit Gonorrhoe, sind ausschließlich beim Menschen anzutreffende pathogene Vertreter der Neisserien. Daneben existieren zahlreiche apathogene Arten (z.B. N. lactamica, N. cinerea, N. sicca, N. miicosa, N. subflava, N. flavescens, N. elongata), die zur normalen Standortflora der Schleimhäute des Nasopharynx und des Genitaltraktes des Menschen zählen. Diese wurden in sehr seltenen Fällen auch aus anderen Körperstellen als Ursache von Infektionen isoliert und mit Sepsis, Endokarditis, Meningitis, Osteomyelitis, Arthritis, Konjunktivitis, Endophtalmitis und Infektionen des Respirationstrakts ursächlich in Zusammenhang gebracht.

4.3.1 Die Gattung Neisseria Die Gonorrhoe ist eine der ältesten bekannten Krankheilen. Ihre Beschreibung findet sich schon im alten Testament, in alten chinesischen Schriften und mesopotamischen Tontafeln. Die Bezeichnung Gonorrhoe geht auf GALEN (130-200 n. Chr.) zurück, der den eitrigen Ausfluß aus der Harnröhre des Mannes als Samenfluß deutete. ALBERT NEISSKR entdeckte 1879 die Gonokokken als erste Ncissericn-Spezies in Granulozyten aus eitrigem Harnröhrenexudat von Patienten mit einer Gonorrhoe. Der nach seinem Entdecker bc-

4.3 Die Familie der Neisseriaceae

nannte Erreger Neisseria gonorrhoeae wurde 1882 erstmals durch LEISTIKOFF und LOEFFLER in Kultur gezüchtet. Die epidemisch auftretende Genickstarre, Meningitis epidemica, ist seit dem Beginn des 19. Jahrhunderts als eigenständiges Krankheitsbild bekannt. 1887 gelang ANTON WEICHSELBAUM erstmals die Isolation von Meningokokkcn als Ursache für dieses Krankheitsbild bei Patienten mit akuter eitriger Meningitis.

Eigenschaften der Erreger Morphologie

Im mikroskopischen Präparat stellen sich Neisserien als Kokken mit einem Durchmesser von 0,6-0,8 (im dar, die paarweise zusammengelagert sind. Die einander zugewandten Seiten sind abgeflacht, so daß die Diplokokkcn im mikroskopischen Bild in Semmel- oder Kaffccbohncnform imponieren. Die gram-negativen Bakterien haben die Tendenz, sich dem Alkohol-Entfärbeschritt in der Gram-Färbung zu entziehen und erscheinen deshalb vereinzelt auch schwach violett. In der elektronenmikroskopischen Darstellung zeigen Ncisserien den typischen Aufbau von gram-negativen Bakterien. Eine aus sauren Polysacchariden aufgebaute Kapsel ist bei Meningokokken in der Regel vorhanden, fehlt aber bei Gonokokken grundsätzlich. Auffallend ist bei beiden Arten die Fähigkeit, Teile der äußeren Membran abzuschnüren. Diese sogenannten ,,blebs'\ die die typische Zusammensetzung der äußeren Membran mit Membranproteinen und LPS reflektieren, spielen in der Pathogenese eine besondere Rolle (Abb. 4.10). Wachstumseigenschaften

Neisserien sind strikt aerob wachsende Organismen; die Zytochromoxidase als Leitenzym ist regelmäßig nachweisbar. Die Beschränkung von Meningokokken, Gonokokken und den meisten apathogenen Neisserien-Arten auf den Menschen als einziges Habitat läßt sehr komplexe und anspruchsvolle Wachstumsbedingungen vermuten. Gonokokken wachsen nur auf Kochblutagar; Meningokokken können nach primärer Isolierung sowohl auf Kochblutagar als auch auf Blutagar weiter gezüchtet werden. Die anspruchsvollen Kulturbedingungen basieren auf genetischen Defekten in wichtigen Biosynthesewegen für verschiedene Aminosäuren, Purine, Pyrimidine und Vitamine. Zudem werden Glukose, Pyruvat oder Laktat als Energiequellen essentiell benötigt. Das Wachstum von Meningokokken und Gonokokken auf Kochblutagar läßt

Abb. 4.10 Elektronenmikroskopische Aufnahme von Neisseria meningitidis. Membran-„blebs" sind durch Pfeile markiert.

sich durch Zusatz der genannten Faktoren noch weiter verbessern. Die Fähigkeit der meisten apathogenen Neisserien-Arten auf einfachem Nähragar zu wachsen, gilt als wichtiges Differenzierungskritcrium (Tab. 4.4). Meningokokken und Gonokokken wachsen bei Temperaturen von 36-38 °C, hoher Luftfeuchtigkeit und einer CO? Konzentration von 5-10%. Einige Vertreter aus der Gruppe der apathogenen Neisserien lassen sich auch bei 22 °C ohne erhöhte COs-Spannung kultivieren (Tab. 4.4). Gonokokken benötigen meist bis zu 2 Tagen, bis sie als kleine, farblose, glatte Kolonien mit einem Durchmesser von 0,5-2 mm auf dem Nährboden sichtbar werden. Meningokokken wachsen dagegen schneller und lassen sich bereits nach einem Tag als 1-2 mm große, nicht pigmentierte Kolonien erkennen, die aufgrund der Kapselexpression eine schleimige Konsistenz aufweisen können. Die Produktion eines gelben Pigments ist bei einigen apathogenen Neisserien-Arten anzutreffen und gilt als wichtiges Abgrenzungsmerkmal gegenüber Meningokokken und Gonokokken (Tab. 4.4). Die biochemische Differenzierung von Neisserien basiert auf der Überprüfung der Zytochromoxidase- und Katalase-Produktion, der Säureproduktion aus Glukose, Maltose, Laktose, Sukrose und Fruktose, sowie der Reduktion von Nitrat und Nitrit (Tab. 4.4). Virulenzfaktoren von Conokokken und Pathogenese der Gonorrhoe Für die Pathogenese der Gonorrhoe sind mehrere Oberflächenstrukturen von Bedeutung, die

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Spezielle Bakteriologie

Laktose

Sukrose

Fruktose

Pigment

+

-

+

+

+

-

-

-

-

-

N. meningitidis N. lactamica N. cinerea

+ + V

V +

-

+ -

+ +

+ +

V

V

N. flavescens

-

N. elongata

-

+ + + -

+ + + + + -

V

N. mucosa N. subflava

+ + + + + -

-

-

+ + + + + + + +

-

N. sicca

+ + + + + + +

Glukose

Oxidase +

Maltose

Wachstum bei 22°C

N. gonorrhoeae

Katalase

Wachstum auf Thayer-Ma rtin

Tab. 4.4 Differenzierungskriterien von Neisseria-Spezies

-

-

-

Reduktion von NO3- NO2-

-

V V

+ +

+ +

+

+

-

+

V

+

+ +

v, variabel

für die Interaktion mit dem Schleimhautepithel des Menschen verantwortlich sind und die Adhärenz an Epithelzellen und ihre Invasion vermitteln, zytotoxische Effekte ausüben und dazu beitragen, daß sich der Erreger der lokalen und systemischen Immunabwehr entzieht. Pili

Frisch aus Urethralexudat isolierte Gonokokken sind von einem dichten Besatz an Pili umgeben, die für den initialen Kontakt mit der humanen Mukosa-Oberflächc verantwortlich sind. Der Pilus ist aus ca. 10.ÜÜ0 identischen Untereinheiten, dem Pilin, aufgebaut. Bemerkenswert ist die Tatsache, daß eine einzige GonokokkenZelle mehr als 1 Million antigenetisch unterschiedlicher Pilin-Varianten sukzessive exprimieren kann und dadurch in der Lage ist, sich der Immunantwort zu entziehen. Die antigenetische Vielfalt erklärt sich aus der Organisation der Pilin-Gcne im Gonokokkcn-Genom. Neben zwei Genorten, pilEl und pi/E2, die zusätzlich zu einem funktionellen Promotor und einem Translationsstartsignal das komplette Strukturgen besitzen und für die Expression des Pilin verantwortlich sind, existieren noch eine Reihe von „stillen"' Genorten (pilS), die jeweils über mehrere Gcnkopicn verfügen, aber nicht den Promotor und das 5'-Ende des Strukturgens besitzen. Durch Genkonversion werden Teile des Strukturgens von pilE durch Duplikate von Teilen des/«7S-Lokus, sogenannte Minikassetten, ersetzt und lassen so antigenetisch neue Pilin-Varianten entstellen.

Opa-Proteine

Nach der initialen Pilus-vermittelten Anheftung an die Epithelzelle wird die Adhäsion durch Proteine der äußeren Membran, die Opa-Proteine, verstärkt. Ihre Bezeichnung leitet sich von der Morphologie der Bakterienkolonie ab, die durch die Expression von Opa-Proteinen ein opukes Aussehen erhält. Eine Gonokokkenzelle verfügt über bis zu 11 vollständige Opa-Gene, die für Proteine unterschiedlicher AminosäureAbfolge und Antigenität kodieren. Ihre Expression erfolgt meist nicht gleichzeitig und unterliegt translationellen Regulationsvorgängen. Die Expression unterschiedlicher Opa-Proteine trägt zur Anpassung des Mikroorganismus an infizierbare Gewebstypen des Wirtsorganismus (z.B. Urcthra, Cervix, Konjunktiva, Phagozyten) bei, da einzelne Opa-Formcn einen selektiven Tropismus für nur bestimmte Gewebe aufweisen. Die Invasion von Gonokokkcn in Epithelzellen ist ebenfalls Opa-vermittelt. Nach endozytotischer Aufnahme werden die Bakterien in einer Vakuole durch die Zelle in die Nähe der Basalmembran oder direkt in das submuköse Gewebe transportiert. Zugleich läßt sich eine Destruktion der Epithelzellschicht beobachten. Hierfür wird insbesondere das Endotoxin (LPS) verantwortlich gemacht, das in großen Mengen in den Membran-„blebs" (s.o.) enthalten ist. Das Immunsystem antwortet auf diese Veränderungen und die Invasion der Erreger mit einem massiven Einstrom von neutrophilen Granulozyfen.

4.3 Die Familie der Neisseriaceae

der Entwicklung submuköser Mikroabszesse und der Exudation von Eiter (Abb. 4.11).

Enzym wurde deshalb eine mögliche Schutzfunktion gegenüber sekretorischem Ig A auf den Schleimhäuten zugewiesen.

Andere Membranproteine

Neben den Opa-Proteinen wurden noch mehrere andere Membranproteinc identifiziert. Für die Pathogenese der Gonorrhoe von besonderer Bedeutung sind dabei eine Reihe von Membranproteinen, die unter Eisenmangel-Bedingungen exprimiert werden und selektiv humanes Transferrin und humanes Lactoferrin binden und zur Deckung des Eisenbedarfs der Bakterienzellc essentiell sind. LPS

Das LPS von Gonokokken ist eine niedermolekulare Struktur, die neben dem Lipid A-Anteil noch über etwa 10 Kohlenhydratreste verfügt, welche in unterschiedlicher chemischer Zusammensetzung und Antigenität vorliegen. Einige LPS-Formen können terminal durch ein Bakterien-eigenes Enzym mit N-Acetyl-Neuraminsäure, die aus Körperflüssigkeiten des Wirtsorganismus stammt, substituiert werden. Diese Modifikation schützt den Erreger vor der bakteriziden Wirkung des Komplementsystems, die durch das entzündliche Exudat am Infektionsort entfaltet wird. Das LPS besitzt starke endotoxische Aktivität und ist für den Zelltod des Epithels mitverantwortlich. IgA-Protease

Gonokokken exprimieren eine Protease, die IgAl-Moleküle spaltet und inaktiviert. Diesem

Abb. 4.11 Pathogenese der Gonokokken Infektion. Stadium I: Pilus-vermittelte Adhäsion an Epithelzellen; Stadium II: Transzytose; Stadium III: Epithelzellnekrose und Immigration von neutrophilen Granulozyten.

Klinik der Gonorrhoe Die Gonorrhoe wird durch Sexualkontakte übertragen und manifestiert sich weitgehend als lokale, auf die Genitalorgane beschränkte Infektionskrankheit. Beim Mann tritt sie als akute Urethritis auf, die zunächst nur den vorderen Teil der Lirethra betrifft. Nach einer Inkubationszeit von durchschnittlich 2-5 Tagen nach Sexualkontakt tritt ein zunächst mukoider. später aber zunehmend eitriger Ausfluß verbunden mit einer ausgeprägten Dysurie auf. Im Eiter lassen sich mikroskopisch massenhaft Granulozyten mit einer großen Zahl an vornehmlich phagozytierten Diplokokken erkennen. In sehr seltenen Fällen verläuft die Gonorrhoe beim Mann symptomlos ohne die Zeichen einer Urethritis. Bei der Frau ist die Cervix der primär betroffene Infektionsort. Zusätzlich (aber extrem selten allein) lassen sich Gonokokken auch aus der Urethra isolieren. Eine vaginale Infektion findet sich aber niemals. Klinisch präsentiert sich die Infektion als Cervicitis mit mukopurulentem vaginalem Ausfluß, Urethritis, Dysurie und intermenstruellen Blutungen. Bis zu 80% der Frauen durchlaufen aber die Infektion symptomlos und sind damit eine wichtige Infektionsquelle. Ohne Behandlung breitet sich die Infektion retrograd im Genitaltrakt und über die Ausführungsgänge der regionären Drüsen (periurethrale Drüsen, BARiHOLiNsche Drüsen) weiter aus. Für den Mann typisch sind Prostatitis, Epididymitis und Harnröhrenstrikturen mit Urinretention als Folge der submukösen Entzündung. Periurethrale Abszesse, Abszesse der BARTIIOLiNschen Drüsen, Endometritis, Adnexitis verbunden mit der Gefahr ektopischer Schwangerschaften und Infertilität, sowie Peritonitis finden sich als mögliche Komplikationen bei der Frau. Bei 1-3% der Patienten mit einer Gonorrhoe ist eine disseminierte Infektion zu beobachten. Frauen sind wesentlich häufiger betroffen als Männer. Die disseminierte Infektion korreliert im Auftreten mit dem Beginn der Menstruation und einer bestehenden Schwangerschaft. Die systemische Ausbreitung der Gonokokken über den Blutstrom manifestiert sich dabei charakteristischerweise als eitrige Arthritis und Dermati-

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Spezielle Bakteriologie

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äs mit Puslelbildung und hämorrhagisch-nekrotischen Effloreszenzcn. Anorektale Infektionen treten bei beiden Geschlechtern auf und manifestieren sich als akute Proktitis, analer Pruritus, eitriger Ausfluß und anale Blutungen. In der Mehrzahl der Fälle verläuft die anorektale Gonorrhoe jedoch asymptomalisch. Betroffen sind vor allem homosexuelle Männer. Bei Frauen kann die Tnfektion durch analen Geschlechtsverkehr oder durch vaginalrektale Auto-Inokulation erfolgen. Eine pharyngeale Gonorrhoe wird nach oralem Geschlechtsverkehr unter dem klinischen Bild einer eitrigen Pharyngitis beobachtet, verläuft aber in den meisten Fällen symptomlos. In der Schwangerschaft führt eine Gonorrhoe zu einem erhöhten Risiko spontaner Aborte, vorzeitigem Einsetzen der Wehen und vorzeitigem Blasensprung.

Unter der Geburt ist eine Übertragung von Gonokokken auf das Kind möglich. Die wichtigste Manifestationsform ist eine eitrige Konjunktivilis des Neugeborenen, die als Blennorrhoea gonorrhoica neonatorum bekannt ist und in früheren Zeiten als wichtigste Ursache der Erblindung galt. Mit der auch heute noch praktizierten Prophylaxe durch den Leipziger Gynäkologen CREDE im Jahr 1884, der die Einträufelung einer 1 %igen Silbernitratlösung in den Bindehautsack des Neugeborenen als effektive Schutzmaßnahme einführte, ist die gonorrhoische Neugeborenen-Konjunktivitis heute nahezu vollkommen verschwunden. Therapie

Während noch in den 50er und 60er Jahren alle Gonokokken-Stämme gegenüber Penicillin G empfindlich waren, ist heute verbreitet mit Gonokokken-Isolaten zu rechnen, die gegenüber Penicillin, aber auch gegenüber Streptomycin, Tetrazyklin, Erythromycin, Rifampicin und Chloramphenicol resistent sind. Die PenicillinResistenz beruht auf Mutationen der Penicillinbindenden Proteine und einer Plasmid-vermittcltcn E-Laktamase-Produktion. Für die initiale Therapie werden Cephalosporine der 3. Generation und Gyrasehemmer empfohlen. Aber auch hier sind bereits die ersten resistenten Isolate beschrieben, so daß der kulturelle Erregernachweis mit anschließender Resistenztestung bei jedem Fall einer Gonorrhoe obligat ist.

Epidemiologie und Prophylaxe

Bei der Bekämpfung der Gonorrhoe muß beachtet werden, daß es kein tierisches Reservoir gibt und die Verbreitung ausschließlich von menschlichen Verhaltensweisen abhängt. Die Gonorrhoe wird, wie auch andere Geschlechtskrankheiten, vornehmlich durch Individuen übertragen und verbreitet, deren Infektion asymptomatisch verläuft, oder welche die Symptome ignorieren und auf Scxualkontaktc nicht verzichten. Eine wichtige Rolle bei der Übertragung der Erkrankung spielen Prostituierte, die nach einigen Schätzungen für 80-90% der Infektionen bei Männern verantwortlich sind. In das Konzept zur Verhütung der Weiterverbreitung von Geschlechtskrankheiten müssen auch die Ehe- und Sexualpartner von Erkrankten einbezogen werden, deren Untersuchung und Therapie (gegebenenfalls auch ohne Erregernachweis!) erforderlich ist. Nach dem „Gesetz zur Verhütung und Bekämpfung von Infektionskrankheiten beim Menschen" (Infektionsschutzgesetz) ist die Gonorrhoe nicht mehr meldepflichtig. Neben Infektionen mit Chlamydia trachomatis ist die Gonorrhoe weltweit die häufigste Geschlechtskrankheit. Die Zahl der Infizierten in Deutschland ist hoch; man rechnet jährlich mit 40000 Neuinfektionen. Die lnzidenz zeigt deutliche altersabhängige Unterschiede. Während die durchschnittliche lnzidenz auf 4,6 Fälle pro 100000 Einwohner geschätzt wird, beläuft sich die lnzidenz bei jungen und sexuell aktiven Menschen auf etwa 16 pro 100000. Parallel zu der Entwicklung in anderen europäischen Ländern ist seit der ersten Hälfte der 80er Jahre ein rückläufiger Trend zu beobachten, nachdem die lnzidenz in den späten 60er und den 70er Jahren sprunghaft angestiegen war, was mit der Verbreitung oraler Kontrazeptiva und steigender Promiskuität in Verbindung gebracht wurde. Mit dem Auftreten von HIV und dem Propagieren von Kondomen als Infektionsprophylaxe ist auch die Zahl der Gonokokken-Infektionen spürbar zurückgegangen. Trotz weltweiter intensiver Bemühungen ist die Verfügbarkeit eines Impfstoffes gegen Gonokokken nicht absehbar. Die antigene Variabilität der wichtigsten Oberflächenmoleküle, wie Piliund Opa-Proteinen, ist der wichtigste Grund für die bisherigen Fehlschläge in der Impfstoffentwicklung.

4.3 Die Familie der Neisseriaceae

Virulenzfaktoren von Meningokokken und Pathogenese Die bei Gonokokken beschriebenen Virulenzfaktoren sind auch bei Meningokokken anzutreffen. Sie determinieren die Fähigkeit der Erreger zur Kolonisation der Mukosa des Nasopharynx und tragen auch zur Überwindung der Mukosa-Barriere und systemischen Ausbreitung bei. Zusätzlich zu den genannten Virulenzfaktoren exprimieren Meningokokken eine Kapsel, die aus sauren Polysacchariden aufgebaut ist. Die antigenetischen Unterschiede der Kapseln bilden die Grundlage für die Einteilung von Meningokokken in Serogruppen. Zur Zeit sind 13 Serogruppen (A, B, C, D, E, H, I, K, L, W135, X, Y und Z) bekannt, die durch Agglutination mit Kapsel-spezifischen Antiseren bestimmt werden können. Von den 13 Serogruppen sind aber nur fünf (A, B. C. W135 und Y) mit Meningokokken-Infektionen assoziiert. Mit Ausnahme von Meningokokken der Serogruppe A besteht ihr Kapselpolysaccharid zum Teil oder ausschließlich aus N-Acctyl-Neuraminsäure. Dies ist von Bedeutung, da diese Struktur wesentlich die lytische Aktivität des Komplements inhibieren kann und somit den Erregern während der systemischen Ausbreitung in Blut und Liquor vor den bakteriziden Eigenschaften des Serums und auch der Komplement-vermittelten Opsonisierung und Phagozytose schützt. Das Kapselpolysaccharid von Meningokokken der Serogruppc B besteht aus homopolymerer a-2,8-glykosidisch verknüpfter N-Acetyl-Neuraminsäure. Eine identische Struktur ist auch in neuralem Gewebe, assoziiert mit einem Zeiladhäsionsmolekül mit der Bezeichnung N-CAM, zu finden. Durch dieses antigene Mimikry unterlaufen Meningokokken der Scrogruppe B auch die spezifische humorale Immunantwort (Immuntoleranz). Es erklärt, daß während einer Infektion keine Antikörper gegen diese Kapselstruktur gebildet werden, und daß kein Impfstoff gegen Meningokokken der Gruppe B zur Verfügung steht.

Die systemische Meningokokken-Infektion präsentiert sich primär als Sepsis, die mit sekundären Infektionen und Schädigungen der Meningen, der Haut und einiger weiterer Organe auftritt. Die für diese Organschädigungen verantwortlichen pathophysiologischen Veränderungen sind auf das LPS mit seiner ausgeprägten endotoxischen Wirkung zurückzuführen. Die Menge an zirkulierendem Endotoxin korreliert direkt mit dem Schweregrad und der Prognose der Erkrankung. Als wichtigste Quelle für die endotoxische Aktivität werden die Membran-

„blebs" angesehen. Die auf das Endotoxin zurückzuführenden pathophysiologischen Veränderungen und Mechanismen der Organschädigung werden detailliert im Kapitel 11.6 („Infektionen des ZNS") besprochen. Klinik der Meningokokken-Infektion Die klinische Manifestation der systemischen Meningokokken-Infektion ist sehr variabel und reicht von der transienten Bakteriämie, über eine Sepsis mit und ohne Meningitis bis hin zur fulminant und innerhalb weniger Stunden letal verlaufenden Erkrankung. Mehr als die Hälfte der Patienten berichtet über prodromale Symptome, die bereits 1 Woche vor Beginn der akuten Erkrankung als Infektionen der oberen Atemwege einsetzen. Dabei ist aber unklar, ob diese Infektzeichen bereits auf die Invasion von Meningokokken mit einer anschließenden lokalen Entzündung oder auf vorangehende, möglicherweise die systemische Ausbreitung von Meningokokken prädisponierende Virusinfekte zurückzuführen sind. Die systemische Meningokokken-Erkrankung setzt typischerweise sehr schnell ein und beginnt mit hohem Fieber und Schüttelfrost, Erbrechen und Hypotension. Hämorrhagische Hautläsionen, die von 1-2 mm großen petechialen Blutungen, bevorzugt am Körperstamm und den unteren Extremitäten, bis hin zu großflächigen, ecehymatösen Hautblutungen reichen, sind ein klassisches Merkmal der systemischen Meningokokken-Infektion. „Berstende" Kopfschmerzen, Nackensteifheit mit positivem KERNicschen und BRUDZINSKIschen Zeichen und Bewußtseinseintrübungen weisen auf die ZNS-Beteiligung und Meningitis hin. Die Mortalität ist trotz frühzeitigem therapeutischen Einsatz von Antibiotika hoch und beträgt ca. 10%. Bei bis zu 30% der Überlebenden bleiben neurologische Defekte zurück. Bei der unter dem Bild des WATERHOUSE-FRIDERiCHSEN-Syndroms fulminant verlaufenden Meningokokken-Infektion steht das septische Krankheitsbild im Vordergrund, das mit massiven Hämorrhagien und Nekrosen der Haut und der inneren Organe (bevorzugt der Nebennierenrinde!) innerhalb weniger Stunden nach Auftreten der ersten Symptome tödlich verläuft. Meningokokken sind auch Ursache von Infektionen des Respirationstrakts. Pneumonien können bei systemischen Meningokokken-Infektionen auftreten oder sich als isolierte, primäre In-

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Spezielle Bakteriologie

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fektion manifestieren. Weitere Symptome sind Konjunktivitis, Rhinitis, Pharyngitis und Otitis media. Therapie Penicillin G gilt als Mittel der Wahl. Resistenzen sind in Deutschland noch nicht beschrieben, wurden aber in anderen europäischen Ländern vereinzelt beobachtet. Alternativ werden Ccphalosporine der 3. Generation verwendet. Epidemiologie und Prävention Die jährliche Inzidenz der systemischen Meningokokken-Infektion in Deutschland beträgt 1 pro 100 000 Einwohner. Demgegenüber steht eine hohe Rate an Meningokokken-Trägern im Nasopharynx von 10%. Neben der Variabilität von Virulenzeigenschaftcn der Meningokokken-Isolate ist die Immunitätslage des Wirts von entscheidender Bedeutung für den Ausbruch der Infektion. Die Immunität entwickelt sich durch die nasopharyngeale Kolonisation mit Meningokokken oder apathogenen Neissericn. wie N. laclamica, die kreuzreagierende Anligenc tragen. Neugeborene sind durch maternale Antikörper gegen Meningokokken- Infektionen relativ geschützt, während die Altersgruppe zwischen 6 Monaten und 4 Jahren aufgrund der noch fehlenden eigenen Antikörperantwort ein hohes Infektionsrisiko besitzt. In dieser Altersgruppe ist die Inzidenz mit ca. 20-40/100000 am höchsten. Eine relative Häufung findet sich bei Jugendlichen im Alter von 1.1-19 Jahren insbesondere in epidemischen Situationen. Verantwortlich für solche Ausbrüche sind oft neue antigenetische Meningokokkcn-Varianten. gegen die noch keine Immunität vorhanden ist. Zugleich nimmt in dieser Altersgruppe - wahrscheinlich durch veränderte Sozialkontakte die Rate der Kolonisation mit Meningokokken sehr stark zu.

In Europa und Nordamerika tritt die systemisehe Meningokokken-Infektion meist nur sporadisch auf. Verantwortlich sind hierfür Meningokokken der Serogruppe B in ca. 70% und der Serogruppe C in 25%. Die Erkrankung kommt gehäuft in den Wintermonaten vor. In einigen Entwicklungsländern, besonders im „Meningitis-Gürtel" Nordafrikas, der sich vom Senegal und Gambia im Westen bis nach Äthiopien im Osten Afrikas erstreckt, treten Epidemien regelmäßig im Abstand von 5-10 Jahren mit mehreren 100.000 Erkrankten auf. Verantwortlich hierfür sind Meningokokken der Serogruppe A. Die Übertragung von Meningokokken erfolgt durch Tröpfcheninfektion. Kontaktpersonen

wird eine Chemoprophylaxe mit Rifampicin oder Ciprofloxacin empfohlen. Bei Ausbrüchen und Epidemien, die durch Meningokokken der Serogruppen A und C verursacht werden, steht ein Impfstoff, der aus den gereinigten Kapselpolysacchariden besteht, zur Verfügung. Er hinterläßt aber keine lang anhaltende Immunität und ist bei Kindern unter 2 Jahren unwirksam.

Laboratoriumsdiagnostik von Neisserien-Infektionen Für die Diagnostik von Bedeutung ist die Empfindlichkeit von Neisserien gegenüber Kälte und Austrocknung. Sie sind durch eine ausgeprägte autolytische Aktivität gekennzeichnet, die durch eigene Enzyme vermittelt wird. Zur diagnostischen Abklärung einer Gonorrhoe sollten beim Mann Urethralexsudat, bei der Frau Cervixabstriche (aber keine Vaginalabstriche!) gewonnen werden. Bei entsprechendem anamnestischen Hinweis ist auch die Untersuchung von Anal- und Pharyngcalabstrichen erforderlich. Ein aus dem Urethralexsudat des Mannes angefertigtes Methylenblau- (als Suchpräparat!) und Gram-Präparat mit den in großer Zahl in den Granulozyten liegenden Gonokokken hat eine hohe diagnostische Sensitivität (>90%). Die Sensitivität des mikroskopischen Präparates von Untersuchungsmaterialien der Frau ist dagegen wegen oftmals geringer Keimzahlen gering; die Spezifität wird zudem durch die vorhandene Standortflora des Genitallrakts stark eingeschränkt. Für den Transport ins Laboratorium zum kulturellen Nachweis stehen Transportmedien zur Verfügung, welche die Austrocknung der Erreger verhindern. Sollte ein unmittelbarer Transport nicht möglich sein, empfiehlt sich die Vorbebrütung des inokulierten Transportmediums bei 37 °C. Für die weitere Diagnostik werden Urethral-, Cervical- und Rachenabstriche auf Selektivnährböden beimpft, um das Wachstum der physiologischen Standortflora zu unterdrücken. Solche Selektivnährböden sind z.B. als Tt-iAYER-MARTiN-Medium bekannt und enthalten auf Kochblut-Basis zusätzlich antimikrobiell wirksame Substanzen wie Vancomycin, Colistin, Trimethoprim, Nystatin oder Amphotericin B. Untersuchungsproben aus primär sterilen Körperflüssigkeiten und Geweben (Blut, Synovialflüssigkeit, Konjunktivalabstriche) werden direkt auf Kochblutagar verbracht.

4.4 Die Familie der Enterobacteriaceae

Der Verdacht auf eine systemische Meningokokken-Erkrankung erfordert die Gewinnung und kulturelle Untersuchung von Liquor, Blut und Nasopharynxabstrich des Patienten vor Beginn der Antibiotikagabe.

Selektivnährmedien sind nur für den Nasopharynxabstrich vonnöten. Auch hier ist ein schneller Transport in das Laboratorium erstrebenswert. Ein Gram-gefärbtes Präparat des Liquors isl bei Keimzahlen von > 104/ml diagnostisch sehr hilfreich. Die gram-negativen Bakterien finden sich cxtrazellulär und intrazellulär in Granulozyten. Als dritte Säule der Diagnostik gilt der immunologische Nachweis von Kapselantigenen im Liquor durch Latexagglutination, der ebenfalls eine zuverlässige Diagnose zu einem frühen Zeitpunkt gewährleisten kann. Zu beachten ist aber die Identität und damit Kreuzreaktivität des Meningokokken B-Kapselpolysaccharids mit dem Kapselantigen von E. coli Kf. der als Meningitiserreger bei Neugeborenen angetroffen wird.

4.3.2 Die Gattungen Branhamella, Moraxella, Kingella, Eikenella und Veillonella Spezies der Gattung Moraxella sind kurze, plumpe, kokkoide Stäbchen, die in kurzen Ketten auftreten können. Sie haben einen obligat aeroben Stoffwechsel und sind Zytochromoxidase- und Katalase-positiv. M. lacunata wurde als Ursache einer eitrigen Konjunktivitis beschrieben. M. nonliquefaciens wird gelegentlich bei Infektionen des Respirationstrakts isoliert. Seit kurzem wird Branhamella catarrhalis, das mikroskopisch von Neisserien nicht zu unterscheiden ist, der Gattung Moraxella zugerechnet. B. catarrhalis ist Katalase- und Zytochromoxidase-positiv, bildet aus Kohlenhydraten aber keine Säure. Für die Differenzierung typisch ist die Produktion einer DNase. B. catarrhalis ist eine häufige Ursache von Infektionen des unteren Respirationstrakts, von Sinusitis und Otitis media. Alle Isolate sind wegen der Produktion einer E-Laktamase gegenüber Penicillin resistent. Kingella kingae als wichtigster Vertreter der Gattung Kingella stellt sich als kokkoides Stäbchen dar, das in kurzen Ketten gelagert sein kann. Es bildet eine Zytochromoxidase, ist aber im Gegensatz zu anderen Mitgliedern der Familie der Neisseriaceae Katalase-

negativ. Der Erreger wurde mit einer Vielzahl von Erkrankungen, wie Meningitis, Infektionen des Auges, Pneumonie. Endokarditis und Osteomyelitis in Verbindung gebracht. K. kingae gilt als häufigste Ursache einer septischen Arthritis im Kindesalter. Familie der Veillonellaceae

Spezies aus der Gattung Veillonella sind strikt anaerob wachsende gram-negative Kokken mit einer Größe von nur 0,3-0,5 um. Veillonellen sind Bestandteil der physiologischen Rachenflora. Ihre Bedeutung als Ursache von Infektionskrankheiten ist gering. Sie fanden sich assoziiert mit Sinusitis, Bißwunden, Abszessen der Mundhöhle, Osteomyelitis und gynäkologischen Infektionen. Literatur C ARIWRIGHT . K. (ed.) Meningococcal Discasc. John Wiley and Sons. New York 1995. MEYER, T. F., .1. POIILNLR, and J. R M. VAN P I T I E N : Biology of the Pathogenic Neisseriae. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 192. 2S3-317 (1994).

4.4 Die Familie der Enterobacteriaceae JÜRGEN HEESEMANN Überblick und Systematik

Die Familie der Enterobacteriaceae umfaßt inzwischen über 30 verschiedene Gattungen, wovon die Hälfte auch von medizinischer Bedeutung ist (Tab. 4.5). Das natürliche Habitat dieser Bakterienfamilie ist der Darm von Mensch und Tier (Enterobaktericn, Darmbakterien). Allerdings stellen die Enterobakterien mit 1% eine Minderheit der gesamten Darmmikroflora dar. Durch fäkale Ausscheidungen gelangen sie in die Umwelt, in der sie in der Regel gut überleben können. Diese Tatsache hat dazu geführt, daß der Nachweis des Darmbakteriums Escherichia coli in Trinkwasser, Badewasser oder Lebensmittel als fäkale Verunreinigung beurteilt wird (Indikatorkeim). Die Enterobakterien sind gram-negative, nicht sporenbildende Stäbchenbakterien (Dicke: 0,5-1,5 um, Länge: 2-4 (im), die aerob und anaerob auf relativ anspruchslosen Nährböden wachsen. Unter optimalen

283

284

Spezielle Bakteriologie

Wachstumsbedingungen (z.B. Peptonwasser, 37 °C) liegt die Generationszeit vieler Enterobakterien bei ca. 30 Minuten, d.h., sie gehören zu den schnell wachsenden Bakterien (innerhalb von 10 Stunden können 1 Million Bakterien aus einer Zelle entstehen!). Alle Arten der Enterobacteriaceae können Glukose unter Säurebildung und häufig auch Gasbildung fermentieren. Die Enterobakterien sind befähigt, diverse Zucker, Aminosäuren und Harnstoff zu metabolisieren und Nitrat zu Nitrit zu reduzieren. Diese Stoffwechseleigenschaften werden zur biochemischen Differenzierung der Arten und zur Subdifferenzierung in Biovare/Biotypen genutzt (Stoffwechselleistungstest im Röhrchen mit Farbstoffindikator: „Bunte Reihe").

Typisch für Enterobacteriaceae ist auch, daß sie im Cytochromoxidase-Test negativ (Ausnahme die Gattung Plesiomonas) und im Katalase-Tcst positiv (Ausnahme Shigella dysenteriae 1) sind. Die Zellhülle der Enterobacteriaceae (Dicke: >= 24-27 nm) zeigt den typischen Aufbau von gram-negativen Bakterien: Zytoplasmatische Membran, Peptidoglykannetz mit periplasmatischem Raum, äußere Membran. Einige Enterobakterien produzieren eine Polysaccharidschleimkapsel (K-Antigen), welche die äußere Membran umhüllt und die durch Kochen der Bakterien entfernt werden kann. Dagegen ist das bei allen Enterobakterien vorkommende Lipopolysaccharid (LPS) in der äußeren Membran fest verankert und hitzestabil (O-Antigen). Das LPS der Enterobakterien zeigt einen typischen dreiteiligen Aufbau. Die Fettsäure-Glucosamin-haltige Komponente wird als Lipid A bezeichnet. Aufgrund ihrer toxischen Wirkung und ihrer Verankerung in der äußeren Membran wird sie auch als Endotoxin bezeichnet. Dem Lipid A schließt sich eine wenig variable sog. Kernregion von Zuckerketten an, die von einer hochvariablen, aus repetitiven Oligosaccharideinheiten (10-20 Einheiten bestehend aus 3-8 Zuckern) zusammengesetzte Seitenkette abgeschlossen wird (O-Antigenspezifität, häufig stammspezifisch). Mutationen in den LPS-Biosynthesegenen können zum Verlust der LPS-Seitenketten bzw. des O-Antigens führen. Solche Mutanten wachsen auf Nähragar als matte Kolonien und werden deshalb als Rauhformen bezeichnet. Sie verklumpen beim Suspendieren in 3%-Kochsalzlösung (Autoagglutination).

Enterobakterien können in ihrer Zellhülle zwei Arten von Proteinfortsätzen verankern: Fimbrien (Pili) und Flagellen (Geißeln). Fimbrien

sind in der äußeren Membran verankert (50-100/Zelle) und stellen sich elektronenoptisch als 2-8 nm dicke und bis zu 3 um lange „Stachel" dar, die aus helikal angeordneten Fimbrinbausteinen entstehen. An der Spitze der Fimbrien befindet sich ein Protein mit spezifischer Bindungsfähigkeit für bestimmte Zuckerkomponenten (z.B. D-Mannose: Typ-1-Fimbrien, Galaktosylgalaktose: P-Fimbrien). Fimbrien spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese, da sie für das spezifische Haften der Bakterien an Wirtszellen verantwortlich sind (Adhäsine). Darüber hinaus können mit entsprechenden Antiseren Fimbrien serologisch typisiert werden (F-Antigen). Während die Fimbrien als starre Funktionselemenle in der äußeren Membran verankert sind, sind die Flagellen aktiv beweglich (Rotation) und von der Bakterienzelle steuerbar. Der Rotationsapparat der Flagellen ist fest in der Zellhülle verankert und reagiert auf chemotaktische Reize. Durch propellerartige Rotation der Flagellen können die Bakterien sich in Flüssigmedien oder Weichagar fortbewegen (Motilität, Schwärmen). Die meisten Enterobakterien sind peritrich (rundherum) oder lophotrich (polar, büschelartig) begeißelt. Die Flagellenproduktion ist von der Wachstumstemperatur abhängig. Die Flagellen der Enterobakterien können serologisch typisiert werden, was für epidemiologische Fragestellungen von Bedeutung ist (H-Antigen, von //auch, der auf kalter Glasscheibe dem Überschwärmen einer Agarplatte durch motile Bakterien ähnelt). Manche Bakterienarten wie Salmonellen besitzen zwei serologisch unterscheidbare Flagellentypen, die alternativ produziert werden (H-Phasenvariation bei Saimonellen). Unter Berücksichtigung der O-, H-, K- und F-Antigene kann ein „Steckbrief" für jedes Bakterienisolat bestimmt werden (Serovar-Formel:O:H:K:F). Besondere Bedeutung hat die Serotypisierung für Salmonellen und E. coli. Trotz dieser Feintypisierung von Enterobacteriaceae haben sich die traditionellen mikrobiologischen Differenzierungsmethoden als nicht zufriedenstellend für die taxonomische Einordnung und Pathogenitätsbestimmung von gram-negativen Stäbchenbakterien erwiesen. Untersuchungen des genomischen Verwandtschaftsgrades haben zur Neuordnung der Familie der Enterobacteriaceae geführt, die bis heute nicht abgeschlossen ist. So wird der Pesterreger, Y. pestis (früher Pasteurella pestis) seit 1965 der Familie der Enterobac-

4.4 Die Familie der Enterobacteriaceae

terlaceae zugeordnet, dagegen steht die offizielle Zuordnung der Gattung Plesiomonas zur Familie der Enterobacteriaceae noch aus. In Abb. 4.12 ist das Dendrogramm, bestimmt aus Sequenzdaten der 16S rDNA der wichtigsten Enterobacteriaceae-Arten, dargestellt. Es fällt auf, daß die f6S rDNA-Verwandtschaft zwischen Escherichia coli und Shigella dysenteriae eine Aufspaltung in zwei Arten nicht rechtfertigt. Bemerkenswert ist auch, daß die Gattung Sahnonella nur zwei Arten - 5. enterica und Salmonella bongori - umfaßt. Aus dem Vergleich der phylogenetischen Distanz der Gattungen/Arten lassen sich Gruppen von Gattungen zusammenfassen (Abb. 4.12): Ŷ Escherichia bis Serratia Ŷ Edwardsiella Ŷ Yersinial Hafnia

Ŷ Proteus Ŷ Plesiomonas. Der Guanin + Cytosin (G+C)-Gehalt des Genoms der meisten Arten der Enterobacteriaceae beträgt 49-59 Mol%, größere Abweichungen zeigen die Gattungen Yersinia (46-47 Mol%) sowie Proteus und Providencia (37-42 Mol%). Die Genomgrößc der Enterobakterien beträgt 4-5 Megabasenpaare (Mb). Die Eruerobacteriaceae-Arten können sich durch horizontalen Genaustausch über Phagen und Plasmide genotypisch und phänotypisch verändern und sich so an

neue Lebensbedingungen anpassen (Aufnahme von Antibiotikaresistenzgenen, Biosynthesegenen, Virulenzgenen). Für die Infektiologie spielt diese Art der genetischen Variabilität eine große Rolle bei der Antibiotikaresistenzcntwicklung und der Konversion von nicht pathogenen zu pathogenen Varianten. Durch Aufnahme von Toxingen-tragendcn Phagen und Plasmiden sowie von mobilen, komplexen Pathogenitätsdeterminanten, die als ft/thogenitäts/nscln (PAI. 20-200 Kilobasen. Kb) bezeichnet werden, können neue Erreger entstehen und bekannte Erreger sich in ihrer Virulenz verändern.

Wie in Tab. 4.5 dargestellt, können die Enterobacteriaceae-Arien hinsichtlich ihrer medizinischen Bedeutung bzw. ihrer Pathogenität in Gruppen unterteilt werden. Eine Gruppe bilden die obligat pathogenen Arten wie Salmonella enterica (Subspezies enterica), Shigellcn und Yersinien, die zu den häufigen Erregern von Darminfektionen gehören sowie Yersinia pesds und die Typhus- und Paratyphus-Erreger, die schwere Allgemeininfektionen verursachen. Zur zweiten Gruppe zählen verschiedene Gattungen/Arten der Enterobacteriaceae, die als fakultativ pathogene Erreger (opportunistische

Erreger) bezeichnet werden. Sie können bei Prädisposition des Wirtes vom Darm ausgehend (endogene Infektion) Urogenital- und Respirationstraktinfektionen sowie Wundinfektionen und Septikämien verursachen. Eine Besonderheit hinsichtlich der Variabilität der Pathogenität zeigt sich bei Escherichia coli. Diese Bakterienart zeigt die bisher größte Variabilität im Pathogenitätsgenrepertoire. Je nach genetischer Ausstattung kann E. coli Krankheitsbilder erzeugen, die z.B. einer Cholera (Pathovar ETEC) oder einer Ruhr (Pathovar EIEC) ähneln. Andere E. coli verursachen bestimmte opportunistische Infektionen (z.B. Harnwegsinfektionen durch Pathovar UPEC). Darüber hinaus gibt es völlig apathogene E. coli, die beim Menschen als Infektionserreger praktisch nicht vorkommen (apathogene Gruppe). Bei Verdacht auf Enteritis mit E. coli sind daher molekularbiologischc Methoden angezeigt, um den Erreger und die Pathovarietät zu identifizieren. Geschichte

Abb. 4.12 Dendrogramm der medizinisch bedeutsamen Arten der Familie Enterobacteriaceae ermittelt aus der Sequenzverwandtschaft der 16S rDNA. Die phylogenetische Distanz 0,05 ist als Einheit dargestellt.

Seit Jahrtausenden wurde die Weltbevölkerung immer wieder durch schwere Seuchen wie Typhus, Ruhr, Cholera, Pest u.a. dezimiert. Seuchenerreger haben zahlreiche Kriege entschieden. Als ROBERT KOCH 1876 zum ersten Mal den kausalen Zusammenhang zwischen mikrobiellem Erreger (Bacillus anlhracis) und Milz-

285

Spezielle Bakteriologie

286

Tab. 4.5 Medizinisch bedeutsame Erregerarten der Familie Enterobacteriaceae mit zugeordneten Erkrankungen Pathogene Erreger

Erkrankung

Salmonella enterica Serovar Typhi Serovar Paratyphi A-C Serovar Enteritidis Serovar Typhimurium

Typhus Paratyphus Enteritis/Salmonellose

Shigella dysenteriae S. flexneri

Ruhr Dysenterie

Plesiomonas shigelloides

Ruhrartiger Durchfall

Yersinia enterocolitica Serovare O3, O9, O5,27 Y. pseudotuberculosis Serovare I-VIH

Gastroenteritis, mesenteriale Lymphadenitis

Y. pestis

Pest

Escherichia coli Pathovar ETEC, enterotoxische E. coli Pathovar EPEC, enteropathogene E. coli Pathovar EAEC, enterooggregative E. coli Pathovar EHEC, entero/iämorrhagische E. coli Pathovar EIEC, enteroinvasive E. coli

Reisediarrhoe Säuglingsenteritis/Dyspepsie Persistierende Enteritis Hämorrhagische Colitis ruhrartige Enterocolitis/Dysenterie

Fakultativ pathogene Erreger Escherichia coli Pathovar UPEC, uropathogene E. coli Pathovar SEPEC, Sepsis E. coli

Harnwegsinfektion Sepsis

Klebsiella pneumoniae

„Friedländer Pneumonie"

Citrobacter freundii

Nosokomiale Infektionen: Harnwege, Atemwege, Wunden, Sepsis, Darminfektionen (selten)

Hafnia alvei Enterobacter cloacae Serratia marcescens Edwardsieila tarda Morganella morganii Proteus mirabilis Providenäa rettgeri

brand veröffentlichte, folgten wenige Jahre später die Entdeckungen der Seuchenerreger aus der Familie der Enterobacteriaceae (Tab. 4.6). THEODOR ESCHERICH führte mikrobiologische Stuhluntersuchungen durch. Das von ihm am häufigsten aus Stuhlproben aerob angezüchtete gram-negative Stäbchenbakterium nannte er „Bacterium coli commune"". Diese Bezeichnung wurde 1919 in Escherichia coli umgewandelt. Heute ist E. coli zum paradigmatischen Mikroorganismus für die Molekularbiologie, Gentechnologie und Inf'ektionsbiologie geworden.

Zur erfolgreichen Geschichte der Medizinischen Mikrobiologie der Enterobacteriaceae gehören auch die bis heute verwendete Färbetechnik von Mikroorganismen nach CHRISTIAN GRAM (1884), die eine Unterscheidung zwischen grampositiven und gram-negativen Bakterien ermöglicht, der Nachweis von agglutinierenden Antikörpern gegen den Erreger im Serum von Typhuspatienten durch FERNAND WIDAL 1896 und die Serotypisierung der Salmonellen durch KAUFFMANN und White (KAUFFMANN-WHITESchema, 1934).

4.4 Die Familie der Enterobacteriaceae

Isolierung, Kultivierung und Differenzierung von Enterobacteriaceae

Die Auswahl von Untersuchungsmaterial für mikrobiologische Untersuchungen bei Infektionen mit Enterobacteriaceae hängt von dem

Erkrankungstyp ab. Bei gastrointestinalen Erkrankungen werden in der Regel Stuhlproben (ca. 1 g/l ml) und ggf. Rektalabstriche untersucht. Bei langdauernden Transporten sind spezifische Transportmedien wie CARY-BI.AIR-MCdium oder gepufferte Glycerin-Kochsalzlösung geeignet. Der Transport sollte gekühlt erfolgen, um ein Überwachsen mit Darmflora zu verhindern. Bei Verdacht auf Ruhr/Dysenterie steigt der Erfolg der Anzüchtung von Shigellen mit der Schnelligkeit des Stuhlproben-Transports und der Verarbeitung. Bei typhösem Krankheitsbild können die Typhus-/Paratyphus-Erreger zuerst aus dem Blut (Blutkultur) und erst eine Woche nach Krankheitsbeginn aus Stuhl-

proben angezüchtet werden. Bei extraintestinalen Infektionen mit Verdacht auf fakultativ pathogene Enterobacteriaceae werden entsprechend der Erkrankung Urin, Wundabstriche, Sputum, Punklate, Exsudate, Blut, Gewebe u.a. untersucht. Stuhluntersuchungen auf pathogene Bakterien erfordern aufgrund der hohen Konzentration 12 von kommensalischer Darmflora (10" bis 10 Bakterien/g) selektive Anzuchtmethoden.

Hierzu stehen unterschiedliche Nährmedien mit selektiven Hemmstoffen für nicht pathogene Flora und Indikatoren für potentiell pathogene Bakterien zur Verfügung. Als Hemmstoffe werden Gallensäuren, Farbstoffe (z.B. Krislallviolett), Antibiotika u.a. eingesetzt. Stoffwechselleistungen werden mit pH-Indikatorfarbstoffen (Ansäuerung durch Zuckerabbau oder Alkalisierung durch Decarboxylierung von Aminosäu-

Tab. 4.6 Entdeckungsgeschichte der wichtigsten Erreger aus der Familie der Enterobacteriaceae. Jahr

Erreger (damalige Bezeichnung)

Erstbeschreiber

1880/1884

Salmonella enterica, Serovar Typhi (Typhus Pilz/Typhusbacillus)

C. J. EBERTH (Nachweis) C. GAFFKY (Anzucht)

1883

Klebsiella pneumoniae (Micrococcen der Pneumonie/Kapselkokken)

C. FRIEDLÄNDER

1885

Escherichia coli (Bacterium coli commune)

TH. ESCHERICH

1888

Salmonella enterica, Serovar Enteritidis (Bacillus enteritidis)

A. GÄRTNER

1889

Yersinia pseudotuberculosis (Bacillus pseudotuberculosis rodentium)

R. PFEIFFER

1891

Salmonella enterica, Serovar Cholerasuis (Hogcholerabacillus)

TH. SMITH (D.SALMON 1886)

1892

Salmonella enterica, Serovar Typhimurium (Bacillus typhi murium)

F. LOEFFLER

1894

Yersinia pestis (Pestbazillus)

A. YERSIN

1898

Shigella dysenteriae (Bacillus dysenteriae)

K. SHIGA

1901

Salmonella enterica, Serovar Paratyphi A und B (Paratyphusbazillen)

H. SCHOTTMÜLLER

1917

Salmonella enterica, Serovar Paratyphi C (S. paratyphi C)

E. WEIL

287

288

Spezielle Bakteriologie

ren) oder durch andere Indikatoren (H2S-Bildüng durch Überführung in schwarzes, unlösliches Eisensulfid) angezeigt. Folgende zwei Nährböden sind für die differenzierte Anzucht von Enterobacteriaceae besonders wertvoll und sollen hier beispielhaft erläutert werden. Ŷ MAcCONKEY-Agar: Der Zusatz von 1% Lactose und Neutralrot führt zu roten Kolonien bei Laktose-Abbau, wozu alle „coliformen Gattungen'VArten in der Lage sind (Laktose-positiv, z.B. Escherichia, Klebsieila, Enterobacter und Citrobacter). Dagegen bilden die darmpathogenen Enterobakterien wie Salmonellen, Shigellen und Yersinien aufgrund ihrer Auxotrophie im Laktoseabbau farblose Kolonien. Darüber hinaus können auch die enteropathogenen Vibrionen und Aeromonaden auf MAcCüNKtiY-Agar wachsen, während das Wachstum der meisten gram-positiven Bakterien durch die im Nähragar enthaltenen Gallcnsäuren und das Kristallviolctt gehemmt werden. Bei Stühlen von Säuglingen und Kleinkindern müssen auch die Laktose-positiven Kolonien (E. coli) untersucht werden, um z.B. E. coli der Pathovare EHEC oder EPEC zu erfassen. Ŷ Aylosc-Lysin-Desoxycholat-(XLD)-Agar: Der XLDAgar enthält drei Zucker (Saccharose, Xylose und Laktose), die bei Metabolisierung zur Ansäuerung führen (Phenolrot wird gelb) und Lysin, das bei Decarboxylierung zur Alkalisierung führt (Phenolrot wird rot). Darüber hinaus enthält das Medium noch Natriumthiosulfat / Ammoniumeisenzitrat zum Nachweis der H:S-Produktion. Die coliformen Bakterien sowie Proteus spp. und Serratia spp. bilden gelbe Kolonien, da bei ihnen der Zuckerabbau bzw. die Ansäuerung überwiegen (mindestens zwei Zucker). Shigellen können keinen der vorhandenen drei Zucker abbauen und bei Salmonellen wird die Ansäuerung durch Abbau von Xylose durch die gleichzeitige Decarboxylierung von Lysin kompensiert, so daß eine Alkalisierung bzw. Rotfärbung der Kolonien entsteht. Salmonellen (außer S. enterka, Serovar Paralyphi A) produzieren zusätzlich H>S, wodurch die Kolonien einen schwarzen Kern erhalten. Eine noch höhere Selektivität als mit XLD-Agar wird mit dem Ccfsulodin-Irgasan-Novobiocin-(CIN)-Agar erzielt, der für die selektive Anzucht von enteropathogenen Yersinien verwendet wird (s. Kapitel 4.5).

Neben festen Selektivmedien haben sich auch flüssige Selektivmedien zur Anreicherung der Erreger bei niedrigen Konzentrationen im Untersuchungsmaterial bewährt (z.B. Stuhlproben bei Dauerausscheidern, Darmbiopsien, Gelenkpunktate bei reaktiver Arthritis). Für Salmonellen werden Tetrathionat-haltige oder Selenithaltige Medien zur Anreicherung bei 37 °C verwendet, während für Yersinien das Kältewachstum bei 5 °C durch Kälteanreicherung ausgenutzt wird.

Nach Isolierung und evtl. Subkultivierung verdächtiger Kolonien folgt die Keim-Identifizierung und -Differenzierung. Die Erregerart wird mit kommerziellen oder hauseigenen „Bunten Reihen" entsprechend des Stoffwechselleistungsprofils bestimmt. Eine weitere serologische Differenzierung ist bei Nachweis von Salmonellen, Shigellen und Escherichia coli erforderlich. Da einerseits das Erregerspektrum der infektiösen Gastroenteritis sehr umfangreich ist und andererseits das Keimspektrum sich bei Kenntnis von anamnestischen Patientendaten (Auslandsaufenthalt, Genuß von bestimmten Speisen, Patientenalter, Stuhlcharakleristika u.a.) einschränken läßt, wird eine mikrobiologische Stufendiagnostik für Stuhlproben durchgeführt. Im Basisprogramm bei enterilischen Stühlen wird nach Salmonellen, Shigellen, Yersinien und Campylobacter jejuni gesucht, bei Kleinkindern wird die E. (.-«//-Diagnostik mitaufgenommen. Bei Hinweisen auf andere darmpathogene Erreger (Vibrio cholerae, Parasiten, Viren) wird das Diagnostikprogramm entsprechend erweitert (s. Kapitel 11.4).

4.4.1 Die Gattung Salmonella Gattung, Art, Subspezies, Serovar

Die biochemische und serologische Charakterisierung von Salmonellen-lsolaten von Menschen. Tieren und aus der Umwelt hat aufgrund der großen genotypischen und phänotypischen Variabilität in der Vergangenheit zur Benennung einer Vielzahl von SalmonellaArten geführt (z.B. 5. typhi, S. lyphimurium etc.). rRNA-Sequenzvergleiche sprechen aber gegen diese Spezies-Vielfalt und für die Unterteilung der Gattung Salmonella in zwei Arten. Aufgrund der Hcterogenität der metabolischen Leistungen von Salmonella enterica-Isolatcn wurde S. enterka in sechs Subspezies, die mit Namen oder Nummern bezeichnet werden, unterteilt Ŷ Salmonella enterka Ŷ Subspezies enlerica (I) Ŷ Subsp. salamae (II) Ŷ Subsp. arizonae (lila) Ŷ Subsp. diarizonae (Illb) Ŷ Subsp. houtenae (IV) Ŷ Subsp. indka (V) Ŷ Salmonella bongori Intcressantcrwei.se gehört die Subspezies enlerica zu den typisch humanpathogenen Salmonellen, während die übrigen Subspezies 11-111 nur sporadisch bei Durchfallpaticnten, aber häufiger bei Geflügel-Darmerkrankungen isoliert werden. Die anderen 5. enlerica Subspezies IV und V sowie die Spezies S. bongori kolonisieren den Darmtrakt von Kaltblut-Tieren wie z.B. Reptilien oder Schildkröten.

Die humanpathogene Subspezies enterica wird

4.4 Die Familie der Enterobacteriaceae

hinsichtlich infektiologischer und pathogenetischer Unterschiede in zwei Gruppen unterteilt: Ŷ typhöse Salmonellen Ŷ enteritische Salmonellen

289

auch für die Veterinärmedizin von Bedeutung ist, werden die alten Bezeichnungen z.B. S. enteritidis oder Kurzformen wie Salmonella enterica, Serovar Enteritidis oder Salmonella Enteritidis verwendet. Bei der Serotypisierung von Umweltisolaten ist zu beachten, daß die Subspezies I-V von S. enterica kreuzreagierende O-Antigene tragen können. Die partielle Kreuzreaktivität der verschiedenen O-Serovare von Subspccics enterica hat zur Einteilung von Gruppen (A, B, Cl, C2 etc.) geführt, was von labordiagnostischer Bedeutung ist, aber nicht in Beziehung zur Pathogenität der Salmonellen steht. So gehören z.B. die Serovar Typhi und die Serovar Enteritidis der Gruppe Dl an. Signifikante Serumantikörpertiter gegen Dl-Gruppenantigen erlauben daher nicht die Differenzierung zwischen Salmonella Typhi- und Salmonella Enteritidis-lnfektion. In Tabelle 4.7 sind die z.Zt. am häufigsten isolierten Serovare der über 2000 bekannten Serovare von S. enterica, Subspezies enterica angegeben sowie die primären Wirte. Es fällt auf, daß die enteritischen Salmonellen primär bei Geflügel, Rindern und Schweinen vorkommen und dort häufig chronisch-subklinisch verlaufende Infektionen verursachen. Die typhösen Salmonellen sind dagegen auf den Menschen und Primaten beschränkt und verursachen in der Regel schwere zyklische Allgemeininfektionen.

Die Unterscheidung erfolgt im wesentlichen durch Serotypisierung nach dem KAUFFMANNWHITE-SCHEMA, wobei die O-Antigenformel durch Zahlen, das H-Antigen der Phase 1 (Hl) i.d.R. durch Kleinbuchstaben und das H2-Antigen (Phase 2) wiederum durch Zahlen angegeben werden (Tab. 4.7).

Nur bei wenigen Salmonellen kann auch das Kapselantigen Vi (V/rulenzantigen: ein a-(l-4)N-Acctyl-D-Galaktosaminouronsäure-Polymer. unterschiedlich azetyliert) durch Objektträgeragglutination mit Vi-Antiserum nachgewiesen werden. Mit der neuen taxonomischen Einteilung der Gattung Salmonella und unter Berücksichtigung der Serotypisierung nach dem KAUFFMANN-WmTE-Schema lautet die korrekte Bezeichnung für Salmonella-lsofate wie folgt (Tab. 4.7): Ŷ statt S. enteritidis: S. enterica, Subspezies enterica, Serovar Enteritidis Ŷ statt S. typhi: S. enterica, Subspezies enterica, Serovar Typhi Da praktisch nur S. enterica, Subspezies enterica für die Humanmedizin und im wesentlichen

Tab. 4.7 Salmonella enterica, Subspezies enterica I Enterische Salmonellen Serovar

Seroformel O:Hl:H2:K

Gruppe

Häufigkeit beim Menschen in Westeuropa

primärer Wirt

Enteritidis

1,9,12:gm:(1,7):-

DI

+++

Geflügel

Typhimurium Heidelberg

1,4,(5),12:i:1,2:1,4,(5),12:r:1,2:-

B B

+++ +

Maus, Rind -

Hadar Choleraesuis

6,8:z7o:e,n,x:6,7:(c):1,5:-

C2 Cl

+ (+)

Schwein

Dublin

1,9,12:gp:-:(Vi)

D1

(+)

Gallinarum

1,9,12:-:-:-

DI

+

Geflügel

Rind

Typhöse Salmonellen Typhi

9,12:d:-:(Vi)

DI

1,2,12:a:/1,5):

A

(+) (+)

Mensch

Paratyphi A Paratyphi B Paratyphi C

1,4,12:b:1,2: 6,7:c:1,5:(Vi)

B Cl

(+) (+)

Mensch Mensch

Mensch

290

Spezielle Bakteriologie

Pathogenität

Salmonellen sind während der letzten zwanzig Jahre zum Modellerreger für die molekularbiologische und zellbiologische Analyse der Darminvasivität und der fakultativen intrazellulären Lebensweise aufgestiegen. Das hat verschiedene Gründe: * Der Salmonellen-lnfektionsprozeß kann sehr gut in Zellkultur und im Mausinfeklionsmodell (orales oder parenterales Modell) untersucht werden * Salmonellen sind genetisch sehr gut manipulierbar * Es existieren diverse Pathovare mit unterschiedlicher Wirtsspezifität. Aus den Ergebnissen der histopathologischen Analyse des Infektionsprozesses von Sahnonella Typhimurium in Versuchstieren wurden zahlreiche Pathogenitätsfunktioncn postuliert. Hierzu gehören die Adhärenz an und die Internalisierung durch Darmepithel und M-Zellcn der PEYER-Plaques (Abb. 4.13), Entzündungsinduktion (Infiltration der Darmmukosa mit neutrophilen Granulozyten), Elektrolytsekretion. Abtötung von Zellen, intra- und extrazelluläres Überleben. Dissemination von der Darmmukosa über mesenleriale Lymphknoten in Blutbahn. Milz und Leber u.a. Wahrend der letzten Dekade wurden die wichtigsten chromosomalcn und extrachromosomalen Determinanten, die an bestimmten Schritten des Infektionsprozesses beteiligt sind, charakterisiert. Wie in Tab. 4.8 dargestellt, sind Pathogenitätsdetcrminanten bei Salmonellen in größere Funktionseinheiten (7-40 kb) zusammengefaßt. Diese Merkmale sprechen dafür, daß Determinanten durch horizontalen Gentransfer (z.B. Transduktion oder Konjugation) von Salmonellen erworben und in das Genom integriert wurden (häufiger Insertionsort: tRNA Gene). Diese chromosomalen Bereiche werden deshalb auch als Saliniiiiclla Pathogcnitäts-/nseln (SPI) bezeichnet. Durch Deletionen von Mobilitätsregionen in den SPI-flankiercnden Bereichen wurden die SPIs dann im Laufe der Wirtsadaptation stabilisiert. Die zuerst entdeckte SPI-1 trägt Gene für einen TypIII Protcin-Sekretions-Translokationsapparat und für Effektorproteine, die für die Darminvasivität verantwortlich sind. Bei der Interaktion von Salmonellen mit den Wirtszellen werden im Bereich der Kontaktstelle (z.B. M-Zellen der PEYERPlaques) der TypIII-Apparat aktiviert und die Effektorproteine in das Zytosol „injiziert". Das Effektorprotein SopE aktiviert über Aktinpolymerisierung das „ruffling" bzw. die Makropinozytose (tulpenartige Ausstülpung der Zellmembran), wodurch die Salmonelle internalisiert wird (Abb. 4.14 und 4.15). Durch das GTPasc-aktivierende Protein SptP wird das „ruff-

Abb. 4.13 Raster-Elektronenmikroskopische (REM) Darstellung der Darmmukosaoberfläche im Bereich eines PEYER-Plaques (PP) der Maus. Oben in der Übersicht ist ein sog. Dom mit Follikel-assoziiertem Epithel (FAE) umgeben von Darmzotten gezeigt (Meßstrich: 200 um). In der Ausschnittsvergrößerung (unten, Meßstrich: 10 um) ist das mit Bürstensaum besetzte FAE zu sehen und eingestreut neun isoliert vorliegende „microfold cells" (M-Zellen). (Aufnahme: AUTENRIETH/FIRSCHING)

ling" dann wieder abgeschaltet. Die im Phagosom eingeschlossenen Salmonellen inaktivieren danach die Genexpression der SPI-1 und aktivieren die Genexpression der übrigen Pathogenitätsinseln (SPI-2 bis SP1-5). Die SPI-2 besitzt einen eigenen Typ IIl-Transportapparat, der Effektorproteine durch die Phagosomenmembran in das Zytosol oder in die Phagosomenmembran transloziert. Zusammen mit den Determinanten von SPI-3 bis SPI-4 und dem Sfilinonella-Vnulenz/Masmid (SVP) haben Salmonellen das Rüstzeug für intrazelluläres Überleben und Vermehren im Phagosom von warmblütigen Tieren. Hierzu gehören Funktionen wie Inhibition von Endosom-EndosomFusion, Versorgung mit zweiwertigen Kationen unter extrem niedrigen Konzentrationsverhältnissen (SPI-3: Mg2-Transport), Abtötung von Wirtszellen (insbesondere Makrophagen) durch programmierten Zelltod (Apoptose, SipB) u.a. Durch Apoptose freige-

4.4 Die Familie der Enterobacteriaceae

Abb. 4.14 REM-Darstellung von Salmonellen, die Kontakt mit COS7-Zellen in vitro aufnehmen und über Makropinozytoseinduktion internalisiert werden. (Aufnahme: HARDT/ROHDE)

setzte Salmonellcn ühcrleben und vermehren sich auch extrazellulär. Für dieses Stadium sind die SVPkodierten Faktoren Komplementlyse-Resistenz (Rck) und aggregative Fimbrien (Agf) von pathogenetischer Bedeutung (Tab. 4.8). Salmonellen produzieren verschiedenartige Fimbrien. Die aggregativen Fimbrien führen einerseits zur „Verklumpung" bzw. Mikrokoloniebildung und andererseits zur Haftung der Salmonellen an das extrazelluläre Matrixprotein Fibronektin im Gewebe. Ein anderer Typ von Fimbrien, die sog. langen, polar ausgebildeten fimbrien (Lpf). scheinen dagegen für die Anheftung der Salmonellen an M-Zellen der PEYKR-Plaques und damit indirekt für die Invasion der PPs verantwortlich zu sein. Die Funktion der Typ I-Fimbrien (Mannosc-bindend) im Infektionsprozeß ist unbekannt.

Über die ursächlichen Faktoren, die an dem wässrigen Durchfall als Folge von Chloridsekrction beteiligt sind, wird zur Zeit viel spekuliert. Neben der Produktion von Choleratoxin-ähnlichen Toxincn wird die durch Salmonellen induzierte Infiltration von neutrophilcn Granulozyten in die infizierte Darmmukosa und die damit verbundene Prostaglandin (PGE;)-FreiSetzung als Hauptursache der Chloridsekrction angesehen. Tatsächlich aktivieren Salmonellen während der Invasion die Mukosa zur verstärkten Produktion von IL-8 (auf Neutrophilc chemotaktisch wirkendes Chemokin). Wie bereits erwähn!, sind enteritische Salmonellen für ein breites Wirtsspektrum pathogen, während die Pathogenität von typhösen Salmonellcn auf wenige Primaten (incl. Mensch) beschränkt ist. Diese Wirtsspezifität der typhösen Salmonellcn kann bisher nur auf das

Abb. 4.15 Schematische Darstellung der Interaktion von Salmonellen, Shigellen und £. co///Pathovar EPEC mit Darmmukosaepithel. Salmonellen und Shigellen induzieren „ruffling" bzw. Makropinozytose, wobei die Effektorproteine (Ipas bei Shigellen, SopE/SptP bei Salmonellen) in die Wirtszellen durch das Typ Ill-System injiziert werden. SopE aktiviert die kleinen G-Proteine Cdc42 und Rac (Induktion des „ruffling") gefolgt durch Inaktivierung mittels SptP. Shigellen lysieren die Phagosomenmembran und bilden einen Aktinschweif zur Ausbreitung in die Nachbarzelle. EPECs binden auch an den Bürstensaum, aber sie werden nicht internalisiert. Stattdessen induzieren sie die Bildung von Aktinbündeln zu einem „Adhärenzpodest" und den Verlust der Bürstensaumstruktur (effacement).

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Spezielle Bakteriologie

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Tab. 4.8 Pathogenitätsdeterminanten von Salmonella enterica, Subspezies enterica Determinante Pathogenitäts-Funktion Molekulare Funktion (Größe in Pathomechanismus Kilobasen) Sa/morce/fa-Pathogenitäts/nseln (SPI) SPI-1 (40 kb)

Invasion von M-Zellen und Darmepithel, Typ-Ill-Sekretion/Translokation

SptP: sezernierte Protein- FyrosinPhosphatase und GTPase-Aktivator SipA: Aktinbündelungsprotein SipB: Apoptose-Induktionsprotein SopE: Makropinozytose (ruffling) über Aktivierung von Cdc42 und Rac-GTPase (GDP^GTP Austauschfaktor)

SPI-2 (40 kb)

Intrazelluläres Überleben und Vermehren, Typ-Ill-Sekretion/ Translokation

SpiC: Inhibition der Endosorn-Endosom-Fusion

SPI-3 (17 kb)

Mg *-Transport im Phagosom

Mg -Transport bei geringer 2+ Mg -Konzentration

SPI-4 (25 kb)

Typ-I-Sekretion

Sekretion eines unbekannten porenbildenden Toxins?

SPI-5 (7 kb)

Chloridsekretion, Mukosaentzündung

SopB: lnositolphosphat- Phosphatase

2+

2

Sa/mone//a-l/irulenzplasmid SVP (60-100 kb)

Komplementresistenz Mukosa-Adhärenz Intrazelluläres Überleben/ Vermehren in Makrophagen

Rck: Membranprotein Resistance complement killing) Pef: Plasmid-encoded-fimbriae

Chromosomale Determinanten fim

Zelladhärenz

Typ-I-Fimbrien

Ipf

Adhärenz an M-Zellen

Lpf: Long-polar-fimbriae (fehlt bei typhösen Salmonellen)

agf

Adhärenz an Zellen und Fibronektin, Autoaggregation

Agf: /Sggregative, dünne, zu Kordeln verdrehte Fimbrien

via

Erhöhung der Virulenz

Kapselpolysaccharid (V/rulenzontigen) (fehlt bei enteritischen Salmonellen)

Fehlen des Virulenzplasmids SVP und der Fimbriendeterminante ///; sowie auf die Fähigkeit, die Polysaccharidkapsel Vi zu produzieren, zurückgeführt werden. Interessanterweise haben aber auch die für warmblütige Wirte apathogenen 5. enterica, Subspezies II-V und 5. bongori kein Virulenzplasmid und keine IpfDeterminante. S. bongori fehlt zusätzlich auch die SPI2. Man kann sich deshalb gut vorstellen, daß sich aus S. bongori durch Aufnahme verschiedener Pathogenitätsinseln und anderer Virulenzgene in einem Zeitraum von 100 Millionen Jahren die typhösen und die enteritischen Salmonellen in einer Art Koevolution mit ihren warmblütigen Wirten entwickelt haben.

4.4.2 Salmonella Typhus und S. Paratyphus: Typhus/Paratyphus Pathogenese und Klinik Beim Typhus/Paratyphus handelt es sich um eine in Stadien ablaufende generalisierte Allgemeininfektion mit zyklischem Charakter. Die Infektion erfolgt in der Regel über den Verzehr von Lebensmitteln (inkl. Trinkwasser), die mit typhösen Salmonellen kontaminiert sind. Je nach Infektionsdosis (105 bis 109 Typhus-Erreger

4.4 Die Familie der Enterobacteriaceae

bei Freiwilligenversuchen) dauert die Inkubationszeit 8 bis 14 Tage. In seltenen Fällen sind Inkubationszeiten von mehr als vier Wochen beschrieben worden. Die natürliche Infektionsdosis liegt wahrscheinlich weit unter 105 Salmonellen. Nach Magen-Darm-Passage werden die Salmonellen von M-Zellen der PEYER-Plaques und Darmepithelzellen internalisiert (Makropinozytose) und zum Subepithelium (PKYHRsche Plaques, Submukosa) transloziert. Dort werden sie wahrscheinlich von Makrophagen aufgenommen. Sie gelangen nach kurzer Zeit in die Blutzirkulation (wahrscheinlich über Lymphgefäße) und disseminieren von dort in das /?etikuloendotheliale System (RES: Milz, Leber, Knochenmark u.a.). Dieser Vorgang führt zu einer transienten Bakteriämie und macht sich i.d.R. klinisch nicht bemerkbar. In seltenen Fällen können auch leichte Durchfälle auftreten. Mit der schnellen Vermehrung der Salmonellen im RES und der daraus folgenden Bakteriämie wird das 1. Stadium (Stadium incrementi) des Ty phus/Paratyphus eingeleitet (Abb. 4.16). Es beginnt mit stufenweise (0,5 °C Intervall) ansteigendem Fieber bis zu 40 °C innerhalb einer Woche. Hinzu kommen allgemeines Krankheitsgefühl mit Kopfschmerzen, Appetitlosigkeit und nicht selten bronchialen Affektionen. Charakteristisch sind auch eine relative Bradykardie (im Verhältnis zum Fieber), Leukopenie, Splenomegalie und das Fehlen von Durchfall. Der Organbefall (Milz, Leber, Darm, Lunge, Nieren) nimmt zum Ende der ersten Woche zu. die Bak-

teriämie und das hohe Fieber gehen über in ein Kontinuum (2. Stadium, Stadium aemes). Die Patienten werden häufig apathisch und desorientiert (typhos: griechisch Nebel, Rauch), nicht selten auch psychotisch. In diesem zweiten Stadium kann es zu Pneumonie, Myokarditis, Durchfall mit erbsbreiartigen Stühlen, zu Nekrosen der PEYER-Plaques und hämorrhagischen Darmulzeralionen mit Darmperforation kommen sowie zum Koma bis hin zum letalen Ausgang. Die Absiedelung der Salmonellen in Hautgefäßen führt zu sichtbaren kleinen embolischen Läsionen (Roseolen). Nach 1-3 Wochen dieses schweren Krankheitsbildes folgt das 3. Stadium (Stadium decrementi) mit undulierendem Abfall des Fiebers, der sich 1-2 Wochen hinziehen kann. Die Patienten erholen sich nur langsam und bleiben über Wochen geschwächt. In etwa 10-20% der Fälle kann es nach 1-3 Wochen (selten sogar noch nach 10 Wochen) der Fieberfreiheit zu Rückfällen kommen, die in der Regel milder verlaufen. Bei unzureichender Antibiotikabehandlung treten Rückfälle etwa 2 Wochen nach Ende der Antibiotikagabe in 15-35% der Fälle auf. Die Erreger können offensichtlich über Monate im Knochenmark persistieren und bei ungenügender Immunantwort von dort erneut disseminieren. Zu beachten ist auch, daß typhöse Salmonellen fokale Infektionen verursachen können, wie Abszesse in Milz, Leber, Niere und Knochen sowie septische Arthritis. Die fäkale Ausscheidung der typhösen Salmo-

Abb. 4.16 Verlauf einer S. Typhus-Infektion mit Rezidiv: Körpertemperaturverlauf, Stadien und labordiagnostische Parameter (+: positive Anzucht oder signifikanter Titer).

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Spezielle Bakteriologie

nellen dauert in der Regel 3 Monate und seltener bis zu einem Jahr. Bei 2-5% der Typhus-Patienten können die Erreger lebenslang in der Gallenblase persistieren und über den Darm ausgeschieden werden (bis zu 109 Salmonellen/g Stuhl). Zu dieser als Dauerausscheider bezeichneten Gruppe zählen hauptsächlich Erwachsene mit vorgeschädigter entzündlicher Gallenblase (insbesondere Frauen). Infektionen mit Sahnonella enterica Serovar Paratyphi führen seltener zur Dauerausscheidung als die mit Serovar Typhi.

entsprechender Fragestellung ist auch die aufwendige Punktion von Knochenmark zur Gewinnung von Untersuchungsmaterial indiziert. Zur Anzucht werden Anreicherungs- und Selektivmedien sowie Blutagar benutzt (s.o. „Isolierung, Kultivierung und Differenzierung von Enterobacteriaceae^). Verdächtige Kolonien werden auf biochemische Leistungen untersucht und serologisch typisiert. Frisch isolierte Salmonella Typhi agglutinieren mit Vi-Antiserum und nach Hitzezerstörung der Kapsel mit O- und Hspezifischen Seren (Objektträgeragglutination, KAUhFMANN-WHiTK-Schema, s. Tab. 4.7). Die

Die Dauerausscheider haben aufgrund der chronischen Cholezystitis ein erhöhtes Risiko für Gallenblasenkrebs.

Da die Klinik des Typhus/Paratyphus meist unspezifisch beginnt, können Hinweise über Aufenthalt in Endemiegebieten (Südamerika, Südostasien, Afrika) diagnostisch wichtig sein. Differentialdiagnostisch müssen Malaria, viszerale Leishmaniasis, Dengue-Fieber u.a. bedacht werden. Laboratoriumsdiagnose

In Abb. 4.16 ist der zeitliche Verlauf der verschiedenen Infektionsstadien beim Typhus/Paratyphus sowie die zu erwartenden Ergebnisse der Kulturen aus entsprechenden Proben dargestellt. Während der Inkubationszeit gelingt es in wenigen Fällen aus Blut- oder Stuhlproben bei Patienten mit Prodromalsymptomatik typhöse Salmonellen anzuzüchten. In 50-70% der Fälle werden die Erreger im 2. Stadium während des Fieberkonlinuums aus Blutkulturen (2-3 Blutkulturen im zeitlichen Abstand von 2-10 Stunden abnehmen) isoliert. Stuhlproben werden i.d.R. erst zum Ende des 2. Stadiums positiv. Auch Urinproben und Duodenalsaft sollten untersucht werden. Die aufwendigsten, aber sichersten Untersuchungsproben sind Knochenmarkspunktate (85-95% der Fälle positiv in Kultur). Aus diesen Proben können typhöse Salmonellen auch nach erfolgter Antibiotikatherapie oder während der Rekonvaleszenz angezüchtet werden. Stuhlproben sind bei Kindern häufiger positiv (60%) als bei Erwachsenen (27%). Aufgrund des schweren Krankheitsbildes und der Differentialdiagnostik sollten bei Verdacht auf Typhus/Paratyphus grundsätzlich Stuhl, Urin, Blutkulturen und evtl. Duodenalsaft mikrobiologisch untersucht werden. Bei

serologische Diagnostik mittels O- und H-Titerbestimmung (WiDAL-Agglutination) ist unsicher. Die in der ersten Krankheitswoche festgestellten Agglutinationstitcr sind aufgrund zu geringer Spezifitäl diagnostisch wenig hilfreich (z.B. Kreuzreaktivität mit Serovar Enteritidis, Gruppe Dl, s. Tab. 4.7). Bei Kindern sind serologische Untersuchungen (O- und H-Titer) am sinnvollsten. Antikörper gegen das Kapselpolysaccharid Vi werden nicht in der akuten Phase sondern erst in der Rekonvaleszenz gebildet. Der Vi-Antikörper-Test (ELISA. Hämagglutination) ist bei Dauerausscheidern positiv und ist daher für diese Gruppe als Suchtest geeignet (Bestätigung durch Anzucht aus Stuhlproben oder Duodenalsaft anschließend erforderlich). Therapie

Typhus/Paratyphus sind Antibiotikatherapiepflichtige Infektionskrankheiten. Vor fünfzig Jahren konnte bereits die Mortalität des Typhus durch Chloramphenicol-Therapie von 20-30% auf unter 1% gesenkt und die hoch fieberhafte Krankheitsphase von 10-20 Tagen auf 3-5 Tage verkürzt werden. Allerdings erhöhte sich nach Chloramphenicol-Therapie die Rate der Dauerausscheider auf 10-25%. Auch kann eine zu früh begonnene Chloramphenicol-Therapie die Rezidivrate als Folge einer nur schwachen spezifischen Immunantwort und der bakteriostatischen Wirkung von Chloramphenicol erhöhen. Auch aufgrund der Toxizität von Chloramphenicol werden heute Drittgenerationscephalosporine (z.B. Ceftriaxon), Ampicillin/Amoxycillin, Cotrimoxazol und als Mittel der 1. Wahl Fluorchinolone (z.B. Ciprofloxacin, 2 x 500 mg/Tag für 10-14 Tage) bevorzugt. Auch Dauerausscheider können mit Ciprofloxacin effektiv saniert werden (Therapiedauer: 4 Wochen), so daß

4.4 Die Familie der Enterobacteriaceae

auf die Gallenblasenrcsektion verzichtet werden kann. Epidemiologie In den Industriestaaten wie USA und Deutschland ging die Inzidenz von Typhus/Paratyphus nach dem zweiten Weltkrieg von ca. 40/l(P auf 0,1/ltP Einwohner pro Jahr rapide zurück. Seit einigen Jahren liegt in Deutschland die Zahl der gemeldeten Typhus- und Paratyphusfälle jeweils bei ca. 75 pro Jahr. Es handelt sich hier vorwiegend um „importierte Infektionen'4 durch Touristen oder Gastarbeiterfamilien aus Endemiegebieten. Typhusausbrüche sind in Deutschland selten geworden, was als Erfolg der strikten Lebcnsmittelüberwachung, des Meldesystems und der Sanierung von Dauerausscheidern zu bewerten ist. Da der Mensch der einzig relevante Wirt für typhoide Salmonellen ist, sind schlechte hygienische Lebensbedingungen Grundlage für das endemische Vorkommen dieser Erreger. Zu den Endemiegebieten gehören nichteuropäische Mittelmeerländer, Südostasien. Afrika, Zentralund Südamerika. Neben den ländlichen Regionen zählen auch die Großstädte zu Endemiegebieten. Als primäre Infektionsquelle fungieren Erkrankte und besonders Dauerausscheider, die Trinkwasser und Lebensmittel (sekundäre Infektionsquelle) kontaminieren. Prävention Endemiegebiete: Die Infektion mit Typhuserregern erfolgt in der Regel durch kontaminierte Lebensmittel. Wirkungsvoll ist deshalb eine Expositionsprophylaxe, d.h. Nahrungsmittel inklusive Trinkwasser sollten vor dem Genuß ausreichend erhitzt und Obst sollte frisch geschält werden. Eine Antibiotikaprophylaxe hat sich nicht als zweckmäßig erwiesen. Für die von der WHO genannten Endemiegebiete Zentral- und Südamerika, Afrika und Südostasien (insbesondere auch Großstädte wie Kairo, Jakarta, Bombay, New Delhi, Karachi und Lahore) ist bei Aufenthalten unter einfachen Lebensbedingungen eine Impfung empfehlenswert. Kommerziell erhältlich sind orale Lebendimpfstoffe (3 x 1 Kapsel innerhalb einer Woche, nach 1 Jahr Auffrischungsimpfung) und parenterale Totimpfstoffe (gereinigtes Vi-Antigen, 1 Dosis i.m. oder s.c), die für 5 Jahre bzw. für zwei Jahre einen 60%igen Impfschutz bieten. Nicht-Endemiegebiete: Ziele der präventiven

Maßnahmen in Nicht-Endemiegebieten sind: Ŷ frühzeitige Identifizierung von Erkrankten, deren Kontaktpersonen und der Infektionsquelle (z.B. Trinkwasser, Lebensmittel u.a.) • Identifizierung und Kontrolle von Dauerausscheidern, insbesondere von Beschäftigten in Lebensmittelbetrieben, Verpflegungseinrichtungen (Gaststätten, Großküchen u.a.) und Gemeinschaftseinrichtungen (z.B. Schulen, Krankenhäuser). Um dieses Ziel zu erreichen, wurde sowohl die Meldepflicht bei Krankheitsverdacht, Erkrankung und Tod an Typhus oder Paratyphus sowie bei Ausscheidung von S. Typhi, S. Paratyphi A, B, oder C nach §6 und §7 Infektionsschutzgesetz (IfSG) als auch die Überwachung der Erkrankten oder Ausscheider durch das regionale Gesundheitsamt eingeführt. Dieser Personenkreis wird so lange überwacht, bis drei Stuhlproben im Abstand von jeweils zwei 'lagen für typhöse Salmonellen negativ sind (1. Stuhlprobe frühestens 2 Tage nach letzter Antibiotikagabe). Erkrankte oder Ausscheider dürfen nach §42 IfSG nicht in Betrieben beim Herstellen. Behandeln oder Inverkehrbringen bestimmter Lebensmittel (z.B. Fleisch, Geflügel, Milch, Fisch, Eiprodukte. Speiseeis, Säuglingsnahrung u.a.) tätig werden.

4.4.3 Enteritische Salmonellen Salmonellosen Pathogenese und Klinik Die enteritischen Salmonellen unterscheiden sich hinsichtlich ihres Pathogenitätsrepertoires nur wenig von den typhösen Salmonellen (s. Tab. 4.8). Um so erstaunlicher sind die großen Unterschiede in der Pathogenese und im klinischen Verlauf zwischen Salmonella-Ententis und Salmonella- Typhus/Paratyphus. Nach oraler Aufnahme über Nahrungsmittel (Infektionsdosis: KP-KP) invadieren enteritische Salmonellen in das Darmmukosaepithel und die M-Zellen der PEYER-Plaques des terminalen Ileums (s. Abb. 4.13 und 4.14). Diese Mukosainvasion führt im Unterschied zu der durch typhöse Salmonellen zur basolateralen Freisetzung von IL-8 durch Epithelzellen und damit zur massiven Einwanderung von polymorphkernigen «eutrophilen Leukozyten (PMN) in die Darmmukosa und zur Transmigration in das Darmlumen. Die aktivierten PMNs setzen Prostaglan-

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Spezielle Bakteriologie

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din PGE2 frei, das über die Stimulation der Adenylzyklase der Mukosaepithelzellen zur verstärkten Chlorid-Sekretion führt. Da gleichzeitig die Natrium-Resorption gehemmt wird, kommt es zu einem choleragenen Effekt. Diese Wirkung wird von einigen enteritischen Salmonellen durch die Sekretion eines Choleratoxinähnlichen Toxins noch verstärkt. Von der Submukosa aus disseminieren die Salmonellen in mesenterialc Lymphknoten, Milz und Leber. Dieser Vorgang spielt sich innerhalb der ersten vier Tage nach Infektion ab und manifestiert sich klinisch als ein akutes unspezifisches ga-

monellose gehört damit zu den sclbstlimitierenden Infektionskrankheiten, die nicht mit Antibiotika therapiert werden. Die Ausscheidungsdauer bei unkomplizierter Salmoncllose beträgt i.d.R. 4-5 Wochen, nach 10 Wochen sind Salmonellen bei mehr als 90% der Patienten im Stuhl nicht mehr nachweisbar. Unter Antibiotikatherapic kann sich die Ausscheidungsdaucr über mehr als sechs Monate hinziehen. Säuglinge mit Salmonellose scheiden nach Abklingen der klinischen Symptomatik nicht selten über ein Jahr lang Salmonellen im Stuhl aus.

stroenteritisches Krankheitsbild mit kurzer In-

Eine Salmonellose führt im Gegensatz zum Typhus nicht zu Dauerausscheidern.

kubationszeit (5-72 Stunden): Ŷ Übelkeit und Brechreiz Bauchkrämpfe Ŷ Durchfall (breiig, wässrig, seltener blutigschleimig) Ŷ Fieber (38-39"C) Kopfschmerz, Myalgien Ŷ manchmal Pseudoappendizitis-Syndrom. Die Darminfektion bleibt nicht auf das Ileum beschränkt, sondern breitet sich auf das Colon aus. Endoskopisch zeigt sich eine diffus entzündliche Colonmukosa, histopathologisch finden sich Kryptenabszesse und Mikroabszesse in den Mukosa-assoziicrten Lymphfollikeln. Im Gegensatz zum Typhus/Paratyphus werden bei Salmonellosen nur selten Bakteriämien festgestellt (positive Blutkultur in weniger als 5% der Fälle bei Immunkompetenten). In der Regel dauert das Fieber nicht länger als 2-3 Tage und der Durchfall 3-7 Tage. Die unkomplizierte Sal-

Disposition

Die Letalität einer Salmonellose ist gering (ca. 0,5%), wobei bevorzugt ältere Menschen an einer Salmonellen-Sepsis versterben. Enteritische Salmonellen können bei Patienten mit bestimmten Dispositionsfaktoren systemische oder fokale extraintestinale Infektionen verursachen (Tab. 4.9).

Während der Entbindung kann es bei Müttern mit einer vor kurzer Zeit durchgemachten Salmonellose zur Übertragung von Salmonellen auf das Neugeborene kommen. Aufgrund der Abwehrschwäche entwickeln Säuglinge nicht selten eine Sepsis oder Salmonellen-Meningitis. Bei Säuglingen und Kleinkindern kann es über eine Salmonellenbakteriämie auch zu extraintestinalen Absiedelungcn kommen, die bevorzugt zu

Erkrankung

Alter Neugeborene

Meningitis

Säuglinge/Kinder

Osteomyelitis Septische Arthritis Sepsis

Senium Grunderkrankungen AIDS, Leukämie u.a. Sichelzellanämie, Thalassämie vorgeschädigte Herzklappen, Klappenprothesen, ventrikuläres Aneurysma Aortenaneurysma, Arteriosklerotische Plaques

fulminante Enterocolitis mit rezidivierenden Bakteriämien (hohe Letalität) Osteomyelitis Endokarditis

Arteritis

Tab. 4.9 Extraintestinale Salmonellen-Infektionen

4.4 Die Familie der Enterobacteriaceae

chronischen Osteomyelitiden oder septischen Arthritiden der unteren Extremitäten führen. Bei älteren Menschen (z.B. Salmonellenepidemien in Altersheimen) führt eine Salmonellose nicht selten zur Sepsis mit hoher Letalität. Zu den Grunderkrankungen, die als Dispositionsfaktoren für systemische oder fokale Salmonelleninfektionen anerkannt sind, gehören hämolytische Anämien, vorgeschädigtes Endocard, Aortcnancurysma und Arteriosklerose. Zu den typischen Folgeerkrankungen einer Salmonellose gehört die reaktive Arthritis (bei ca. 2% der Salmonellosen), die nicht selten mit Urethritis und einer Iridozyklitis/Konjunktivitis (REITER-Trias) assoziiert ist. Bei der reaktiven Arthritis handelt es sich um eine Synovitis unter häufiger Beteiligung der Gelenke der unteren Extremitäten (Mono- oder Oligoarthritis). Sie manifestiert sich 10-20 Tage nach Salmonelleninfektionsbeginn und heilt meist spontan nach 1-6 Monaten aus. In den betroffenen Gelenken können keine kultivierbaren Salmonellen, sondern nur „5a/OTO«e//fl-Briichstücke7Antigen" mit immunhistologischen Methoden nachgewiesen werden. Patienten mit reaktiver SalmonellenArthritis sind zu 40-60% Träger des Histokompatibilitätsantigens HLA B27 (HLA-B27-Häufigkeit in Westeuropa 6-9%). Laboratoriumsdiagnose Bei Verdacht auf Salmonellen-Gastroenleritis wird die Diagnose durch Anzucht und Typisierung des Erregers aus Stuhlproben ab Beginn der ersten klinischen Symptome gestellt. Stuhlproben werden direkt auf Selektivmedien (SS-, MACCONKEY- und/oder XLD-Agar) ausgestrichen und bei 37 °C inkubiert. Häufig sind nach einem Tag schon massenhaft Kolonien mit schwarzem Zentrum (SS- oder XLD-Agar) zu erkennen, die einerseits isoliert und zur weiteren Differenzierung subkultiviert und andererseits auch direkt zur groben Schnellserotypisierung (KAUFFMANN-WHiTE-Schema) verwendet werden können. Die Labordiagnose kann nach 24-48 Stunden abgeschlossen sein. Bei extraintestinalen fokalen oder systemischen Infektionen sind Blutkulturen und Punktate für Anreicherungsmedien angezeigt. Nach Subkultivierung sollten dann auch Antibiogramme erstellt werden. Bei reaktiver Salmonellen-Arthritis oder kurz zurückliegender Salmonellose (2-8 Wochen) sind Stuhlproben zunächst in Anreicherungsme-

dien (Selenit- oder Tetrathionatbouillon) zu inkubieren. Darüber hinaus kann Serum für die serologische Diagnostik (WiDAL-Agglutination, ELISA) auf spezifische Antikörper untersucht werden. Titerbewegungen um vier Verdünnungsstufen von paarigen Seren im Abstand von 1-2 Wochen sind für eine vor kurzer Zeit durchgemachte Salmonellose hinweisend. Therapie Unkomplizierte Verläufe einer SalmonellenGastroenteritis werden symptomatisch durch Flüssigkeit- und Elektrolytzufuhr therapiert. Eine Antibiotikatherapie (z.B. Amoxicillin oder Fluorchinolon) verkürzt die enteritische Phase kaum und führt gehäuft zu Rezidiven und verlängerter Ausscheidungsdauer und sollte deshalb unterlassen werden. Dagegen sind bei komplizierten Verläufen (systemische oder fokale Infektionen) Antibiotika dem Antibiogramm entsprechend indiziert (Betalaktamantibiotika wie Ampicillin, Amoxicillin, Ceftriaxon oder Chinolone wie Ciprofloxacin). Die Therapiedauer sollte 10-14 Tage betragen. SalmonellenBakteriämien bei AIDS-Patienten, endovaskuläre Infektionen und Salmonellcn-Osteomyelitiden sollten vier bis sechs Wochen mit Antibiotika behandelt werden. Lokalisierte Abszesse und infizierte Aneurysmcn müssen zusätzlich chirurgisch saniert werden. Epidemiologie und Prävention Die enterilischen Salmonellen sind im Tierreich weit verbreitet. In den Industriestaaten gehören landwirtschaftliche Nutztiere zum Hauptreservoir von Salmonellen. Wie in Tab. 4.7 gezeigt, ist eine Serovar-abhängige Wirtsspezifität feststellbar. Salmonella Enteritidis besiedelt/infiziert bevorzugt Geflügel, insbesondere Legehühner und Masthähnchen, während Salmonella Typhimurium gehäuft bei Rindern nachgewiesen wird. Die besiedelten/infizierten Tiere zeigen kein auffälliges Krankheitsbild. Bei Hühnern können die Eier transovariell vor der Kalzifizierung der Schale infiziert sein (vertikale Transmission). Durch den Schlachtprozeß wird das Fleisch mit Salmonellen kontaminiert und durch fäkale Ausscheidungen gelangen Salmonellen in die Umwelt (Badewasser, Trinkwasser, Kontamination von Salat und Gemüse nach Fäkaldüngung). Salmonellen sind sehr umweltresistent.

Sie können über 200 Tage im Erdboden, 10 Mo-

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nate in Staub, 5 Monate in Fäzes und über 4 Jahre in Trockeneipulver überleben. Schwach saure Medien (bis pH 4,5) und Temperaturen zwischen 7 °C und 46 °C wirken nicht vermehrungshemmend. Nicht ausreichend erhitztes Fleisch (z.B. Tiefkühlhühnchen, die vor dem Grillprozeß nicht vollständig aufgetaut waren) oder Speisezubereitungen mit Roheiern (Eis, Eiscreme), die nicht schnell abgekühlt wurden, sind häufige Infektionsquellen für Salmonellosen. In diesen Fällen liegen gute Bedingungen für ein schnelles Vermehren der Salmonellcn in dem zunächst gering kontaminierten Lebensmitteln vor. Hieraus ergibt sich auch, daß im Sommer und Frühherbst die Sahnonellosen am häufigsten sind. Auch wenn über die Medien immer wieder über Salmonellose-Ausbrüchen berichtet wird (z.B. Hochzeitsfeier, Kongreßkantine, Krankenhaus), so ist die Mehrzahl der Salmonellosefälle privaten Haushalten zuzuordnen (Mangelhafte Küchenhygiene!). Für epidemiologische Analysen werden Salmonellen über die Identifizierung des Serovars hinaus auch mittels eines Bakteriophagen-Sets lysotypisiert. Von den Salmonellenisolaten sind z.Zt. in Deutschland ca. 58% vom Serovar Enteritidis, von denen 80% dem Lysotyp PT4 (LT 4/6) angehören. Die Serovar Enteritidis zeigt bisher keine Antibiotikamultiresistenz. Anders verhält es sich mit der Serovar Typhimurium, Lysotyp DT 104, die als multiresistenter Epidemiestamm bekannt ist (Resistenz gegen Tetracyclin. Chloramphenicol, Sulfonamid, Betalaktamantibiotika). Die Salmonellosen sind mit ca. 80000-100000 gemeldeten Fällen pro Jahr die häufigsten bakteriellen Durchfallerkrankungen in Deutschland (wahrscheinlich werden nur 10% der Salmonellosen gemeldet). Zur Prävention wird versucht, die Nutztierbestände (insbesondere Geflügelfarmen) Salmonellen-frei zu bekommen. Darüber hinaus sollten Aufklärungen über den Übertragungsweg der Salmonelleninfektion und die daraus folgenden Hinweise für strenge küchenhygienische Maßnahmen präventive Wirkungen zeigen. Nach dem neuen Infektionsschutzgesetz (It'SG) sind der Verdacht auf oder die Erkrankung an Salmonellose nur dann meldepflichtig (§6), wenn Personen betroffen sind, die in Küchen von Gaststätten und sonstigen Einrichtungen mit oder zur Gemeinschaftsverpflegung tätig sind oder wenn zwei oder mehr gleichartige Erkrankungen auftreten, bei denen ein epidemischer Zusammenhang vermutet wird. Der Nach-

weis von enteritischen Salmonellen bei Erkrankten ist nach §7 IfSG meldepflichtig.

4.4.4 Shigellen und die Gattung Escherichia Gattung, Art, Serovar, Pathovar Aus historischen und praktischen Gründen werden die Shigellen als eigenständige Gattung geführt, auch wenn phylogenetische Daten dagegen sprechen. DNA-DNA Hybridisierungen zwischen Shigellen und Escherichia coli und DNA-Scquenzvergleiche von konservierten Genen (rDNA, Malatdehydrogenasegen und andere ,,housekeeping"-Gene) weisen darauf hin, daß die vier Shigella-Arten der Art Escherichia coli zuzuordnen sind. Man unterscheidet: ƒ S. dysenteriae ƒ S. flexneri • S. boydii • S. sonnei Die DNA-Scquenzvergleiche haben zudem weitere überraschende Ergebnisse erbracht: 1. Shigellen sind wahrscheinlich erst vor 50000 bis 250000 Jahren nach Aufnahme eines ca. 200 Kilobasen-großen Virulenzplasmids aus E. coli hervorgegangen. Das Virulenzplasmid befähigt Shigellen. die Darmmukosa von Hominiden zu durchdringen und sich intrazellulär auszubreiten. Damit haben Shigellen im Unterschied zur normalen E. co/i-Darmflora (Kommcnsalen) eine neue ökologische Nische (intrazellulär, submukosal) gefunden. Durch diese „Standortveränderung" begünstigt, haben sich wahrscheinlich chromosomale Mutationen bei Shigellen durchgesetzt, die sich phänotypisch als Defekte in bestimmten metabolischen Genen (z.B. Verlust der Laktoseverwertung und der Lysindecarboxylicrung) und Motilitätsgenen (Shigellen sind im Gegensatz von E. coli unbeweglich) manifestieren. Inwieweit diese Gendefekte (sog. „black holes") einen Selektionsvorteil für Shigellen haben, ist noch unklar. 2. Die verschiedenen Shigellen sind nicht aus einem E. coli-Vorläuferklon, sondern aus verschiedenen Klonen, die das Virulenzplasmid erhalten haben, entstanden. Heute können wir die Shigellen phylogenetisch auf drei Hauptgruppen und einige Einzelklone verteilen: Ŷ Gruppe 1: S. boydii S. dysenteriae-Stämma einige S. flexneri-Stämme Gruppe 2: S. boydii einige 5. dysenteriae-Stamme Gruppe 3: S. flexneri wenige S. boydii-Stämme

4.4 Die Familie der Enterobacteriaceae

Überraschenderweise können S. sonnei-Stämme als homogene Gruppe bzw. Klon angesehen werden und auch der Typstamm S. dysenteriae. Serovar 1, ist ein eigenständiger Klon, der phylogenelisch relativ weit von den übrigen S. dysenteriae-Sxäxaraen entfernt ist. Die Shigcllcn sind damit in den F. coli Stammbaum eingegliedert und auf zahlreiche kleine Äste in enger ..Nachbarschaft" zu E. coli verteilt. Ähnlich wie E. coli können auch Shigcllcn serologisch in zahlreiche Serovarietäten unterteilt werden (außer 5. sonnei), was von epidemiologischen Interesse ist.

Im Vergleich zu E. coli sind Shigellcn genetisch relativ stabil und fixiert auf einen Wirt, den Menschen. E. coli ist sehr empfänglich für horizontalen Genaustausch (Konjugation, Transduktion), wodurch die große genetische und damit verbunden die phenetische Variabilität dieser Art erklärt werden kann. E. coli hat die besondere Fähigkeit, sich an sehr unterschiedliche Lebensbedingungen (belebte und unbelebte Umwelt) zu adaptieren. Dies wird deutlich durch die schnelle Antibiotikaresistenzentwicklung von E. coli im Krankenhaus, dem breiten Spektrum unterschiedlicher Scrovarietäten (O:K:H:F) und den zahlreichen Palhovarietäten. Über 166 O-Serovarictäten, die sich z.T.mit den Serovarietäten von Shigellen überschneiden (identische LPS-Bausteine), können bei E. coli mit verschiedenen Kombinationen von K-, Hund F-Antigen vorkommen und zur serologischen Differenzierung genutzt werden. Die Serotypisierung von E. coli hat eine lange Tradition und wird zur epidemiologischen Analyse und als Hilfsmittel bei der Pathotypisierung

herangezogen. Einerseits sind bestimmte O- und H-Typen mit Pathovarietäten assoziiert und andererseits können K-Antigene (z.B. Kl Kapselpolysaccharid wirkt anti-opsonierend) und FAntigene (Fimbrien wirken als zellspezifischc Adhäsine) selbst als Pathogenitätsfaktoren wirksam sein. In Tab. 4.10 sind beispielhaft Serovarietäten von E. coli mit typischen Pathovarietäten verknüpft. Es fällt auf, daß diese Verknüpfung in vielen Fällen nicht eindeutig ist, insbesondere in den Gruppen „normale Darmflora", „uropathogene E. coir (UPEC) und „Septikämie-/^. coli" (SEPEC). die der Dannflora entstammen. Dagegen gibt es stärkere Korrelationen zwischen Serovarietäten und den verschiedenen Pathovarietäten der darmpathogenen E. coli. Zur Differenzierung dieser Pathovarietäten gehören Toxinnachweismethoden und molekularbiologische Techniken (z.B. PCR, DNA-Hybridisierung), um das Palhogcnitätsgenrepertoire zu bestimmen. Pathogenität von Shigellen Shigellen gehören zur Gruppe der hochinfektiösen enteroinvasiven, intrazellulär replizierenden Erreger, welche die Colonmukosa schädigen. Die hohe Tnfektiosität der Shigellen (10-100 Bakterien) hängt mit ihrer besonderen Säureresistenz zusammen, die sie in der stationären Wachstumsphase besonders im mikroaerophilen und sauren Milieu ausbilden (z.B. Lebensmittel).

Pathovar

Typische O-, H-, K- oder F-Antigene

Normale Stuhlflora

O1, O2, O6, O18 F1 (Typi-Fimbrien) 01, O2,O6, O18, O75 F1, F7, P-Fimbrien O1, O2, O6, O75 F1, S-Fimbrien

Uropathogene E. coli, UPEC Sepsis E. coli, SEPEC

K1 Enterotoxische f. coli, ETEC Enteropathogene f. coli, EPEC Enterohämorrhagische f. coli, EHEC Enteroinvasive E. coli, EIEC Enteroaggregative E. coli, EAEC Diffus-adhärente f. coli, DAEC

O1,O6, O27, O126, O128 F2 (CFAI-Typ), F3 (CFA2-Typ) 026,055,0111,0126,0127, O128, O157 O26:H11, 055, O111:H-, O157:H7, O157:H" 028,0112,0124,0144 O3, 044, O86, O119, O125 075,0126

Tab. 4.10 Verknüpfung von Serovarietäten bei E. coli mit Pathovarietäten

299

300

Spezielle Bakteriologie

Nach Magenpassage verlieren sie die Säureresistenz und beginnen, sich im Darm zu vermehren (logarithmische Wachstumsphase). Ihre zellinvasiven Eigenschaften werden von einem 180-220 Kilobasen-großcn Virulcnzplasmid kodiert (Tab. 4.11). Auf etwa 35 Kb befinden sich die Gene für ein kontaktinduzierbares Typ III-Protein-Sekretions/Translokalionssystcm, sowie für zahlreiche sezernierte Effektorproteine (/nvasion-Plasmid-zlntigen, Ipa). Bei Zellkontakt werden Ipa-Proteine sezerniert und in die Wirlszellc transloziert, was zum „ruffling" bzw. zur Makropinozytose der Shigellen führt (Einschluß in ein Phagosom. ähnlich wie bei Salmonellcn, s. Abb. 4.15). Im Unterschied zu Salmonellen können die Shigellen mittels Ipa-Porcnbildner die Phagosommembran lysieren und in das Zytoplasma gelangen. Nach kurzer Vermehrungsphase bildet sich dann an einem Ende der Bakterien durch Aktinpolymerisation am Oberflächcnprotein IcsA ein Aktinschweif aus. Die Bakterien werden dadurch in Nachbarzellen „geschoben" (baso-laterale Ausbreitung). In den neu ..infizierten" Zellen wiederholt sich dieser Prozeß: Mcmbranlyse —* Replikation —> laterale Dissemination. Über diesen Mechanismus gelangen die Shigellen auch in Makrophagen, in denen sie durch Caspase-1 -Aktivierung (mittels lpaB) den programmierten Zelltod (Apoptose) auslösen können. Die Caspase-1 bewirkt auch durch prolcolytische Aktivierung die Freisetzung von IL-lß. Dieses Interleukin regt die Freisetzung weiterer proinflammatorischer

Zytokine (IL-6, IL-8. TNF-a) von benachbarten Zellen an. was zum massiven Einstrom von polymorphkernigen Neutrophilen (PMN) in die infizierte Mukosa/Submukosa führt. Diese induzierte Entzündungsreaktion führt in erster Linie zur Zerstörung der Colonmukosa mit Kryptenabszessen und hämorrhagischen Läsionen, was die Ausbreitung der Shigellen-Invasion begünstigt. Andererseits werden extrazclluläre Shigellen von den PMNs abgetötet, wodurch die Infektion auf die Mukosa und Lumina propria beschränkt bleibt. Bei Shigelleninfeklionen (insbesondere S. dysenteriae und S. flexneri) wird Endotoxin (Lipopolysaccharide) in relativ hohen Mengen in den Blutkreislauf freigesetzt; dies führt einerseits zu Fieber und andererseits zu neurologischen Auffälligkeiten wie Enzcphalopathic mit Krampfanfällcn und Meningitissymptomatik („Pscudomeningitis") oder zur reaktiven Arthritis. Besonders schwere Verläufe mit hämolytisch urämischem Syndrom (HUS) werden bei 5. dysenteriae Ol beobachtet und der synergistischen Wirkung von Shigatoxin und Endotoxin zugeschrieben. Das Shigatoxingen (stx) kommt nur bei S. dysenteriae Ol vor und ist chromosomal kodiert. Es gehört zur selben AB5Toxinfamilie wie das Choleratoxin und hat durch Inhibition der Proteinsynthese eine zytotoxische Wirkung. Shigellen produzieren auch diverse enterotoxisch wirkende Faktoren (Sen, Sig, Pic), deren molekulares Wirkprinzip und Bedeutung für die Pathogenesc der Shigellose noch unklar ist.

Tab. 4.11 Pathogenitätsdeterminanten bei Shigellen Determinante

Vorhanden bei 5. dys. S. flex.

Pathogenitätsfunktionen

S. boy. S. sonn.

Chromosomal Shigatoxingen (stx)

+

-

-

-

Zytotoxin vom AB5-Typ B-Untereinheit bindet an Clobotriaosylceramid Cb3: A-Fragment spaltet als N-Glycosidase spezifisch die 28S rRNA der Wirtszelle. Stx kommt nur bei S. dysenteriae O1 vor

Pathogenitätsinseln SHI-1 SHI-2

? ?

+ +

? ?

? ?

Sezernierte Serinproteasen, Enterotoxine Aerobactinbiosynthese und Aufnahme (Fe'"-Aufnahmesystem)

Virulenzplasmid (180Kb-220Kb) ipa-ics-mix-spa-Reg\on

+

+

+

+

sen Gen LPS-Biosynthesegene

+ -

+ -

+ -

+ +

35Kb mit Genen für Typ Ill-ProteinSekretions / Translokationssystem, Effektorproteine für Zellinvasion (Ipa), intrazelluläre Ausbreitung (les) und Apoptoseinduktion (Caspase 1 -Aktivierung durch IpaB) sowie IL1 -ß-Freisetzung Enterotoxin Sen O-Antigenbiosynthese

9Kb-Plasmid

+

-

-

-

Galaktosyltransferase (LPS-Biosynthese)

Plasmide

*) 5. dys.: S. dysenteriae Ol, S. flex.

: 5. flexneri, S. boy.: S. boydii, S. sonn.: S. sonnei

4.4 Die Familie der Enterobacteriaceae

Pathogenese und Klinik der Shigellose

Shigellen werden über konlaminierte Lebensmittel (inkl. Trinkwasser) aufgenommen. Nach Magenpassage vermehren sie sich im Dünndarm (107 Erreger/ml) und invadieren dann die Darmmukosa wahrscheinlich zunächst über M-Zellen, die die PEYER-Plaques bedecken (terminalcs Ileum). Es wird auch diskutiert, daß Shigellen den dichten Mukosazellverband auflockern können (Zerstörung der „tight junetions"), um basolateral Bürstensaumzellen zu invadieren. Diese erste Infektionsphase führt innerhalb von 2-5 Tagen (Inkubationszeit) zu einem akuten Krankheitsgefühl mit Fieber, Abgeschlagenheit, Bauchschmerzen und wässrigem Durchfall. Nach 4-12 Stunden kann dieses Krankheitsbild übergehen in das der klassischen Dysenterie bzw. Ruhr: Die Patienten leiden an Bauchkrämpfen und schmerzhaftem Stuhldrang (Tcnesmus aufgrund einer Proktitis). der zu häufigen kleinen Stuhlabgängen mit Schleim. Blut und Eiter führt. Der Infektions- und Entzündungsprozeß spielt sich in der dysenterischen Phase hauptsächlich im distalen Teil des Colons ab, in dem oberflächliche Ulzerationen und Kryptenabszesse vom Colon descendens bis zum Rectum entstehen können. Der Schweregrad der Shigellose wird wesentlich vom Erregertyp, aber auch vom Allgemeinzustand und Alter der Patienten mitbestimmt.

Das schwerste Krankheitsbild verursacht S. dysenteriae 01, gefolgt von 5. flexneri und S. boydii. S. sonnei Infektionen verlaufen in der Regel milder, eine Dysenterie mit blutigem Stuhl kann auch fehlen. Kinder, die in einem schlechten Ernährungszustand sind (Dritte Welt), entwickeln nicht selten ein toxisches Megacolon mit Darmperforation und einer Shigellen-bedingten Sepsis, wobei auch Bakterien der Darmflora in die Blutbahn gelangen (Letalität: 10-50%). Nach Abklingen der akuten Phase einer S. dysenteriae Ol-Infektion kann sich insbesondere bei Kindern ein /lämolytisch-urämisches Syntli(»in (HUS) entwickeln. Beim HUS handelt es sich um einen mikroangiopathischen hämolytischen Prozeß, der zur hämolytischen Anämie, Thrombozytopenie und akutem Nierenversagen aufgrund einer Gefäßschädigung führt. Neben dem HUS werden bei S. dysenteriae Ol und 5. flexneri während der akuten Phase nicht selten Meningitis- oder Enzephalitis-ähnliche

Krankheitsbilder mit Krampfanfällen beobachtet. Der Liquor ist in diesen Fällen unauffällig (Pseudomeningitis). Die Pathogenese dieser neurologischen Krankheitsbilder ist unbekannt. Wie bei anderen invasiven bakteriellen Darminfektionen werden auch bei Shigelleninfektionen in 5-20% der Fälle 1-2 Wochen nach Krankheitsbeginn reaktive Arthritiden beobachtet (selbstlimitierte Oligoarthritis, häufig mit HLAB27 assoziiert). Bei Patienten mit gutem Allgemeinzustand heilt eine Shigellose nach 6-10 Tagen spontan aus. Bei schlechtem Ernährungszustand kann sich eine Shigellose als rezidivierende Erkrankung über Wochen hinziehen und die Shigellen-Ausscheidung über Monate persistieren. Laboratoriumsdiagnose der Shigellose

Bei Verdacht auf Shigellose müssen Stuhlproben (insbesondere mit schleimig-blutigen Bestandteilen) zur Anzucht von Shigellen und zum mikroskopischen Nachweis von Leukozyten und Erythrozyten untersucht werden. Hierbei muß beachtet werden, daß Shigellen in den Stuhlproben schlecht überleben (Schädigung durch Begleitflora und metabolischc Ansäuerung). Eine sofortige mikrobiologische Untersuchung der Stuhlproben ist deshalb angezeigt. Andernfalls müssen Transportmedien (gepufferte GlycerinLösung oder CARRY-BLAiR-Transportmedium) verwendet werden. Die Stuhlproben werden auf feste Selektivmedien (MACCONKEY, SS-Agar. XLD-Agar) und ggf. in Selenit-Anreicherungsbouillon bei 37 °C angezüchtet. Nach 18-24 stündiger Bebrütung können verdächtige Kolonien durch Testung auf fehlende Beweglichkeit und typische biochemische Reaktionen (Tab. 4.12) und durch serologische Typisierung identifiziert werden. Die serologische Diagnostik durch Nachweis Shigellen-spezifischcr Antikörper im Serum von Patienten mittels WiDAL-Agglutination hat sich nicht bewährt. Einerseits sind die O-Antigen-Titer häufig nicht hoch und andererseits fehlt die Spezifität aufgrund der Kreuzreaktivität mit zahlreichen E. cx>//-Serotypen. Therapie der Shigellose

Die Therapie einer Shigellose richtet sich nach dem Schweregrad der Erkrankung und dem Erregertyp. Patienten mit gutem Allgemeinzustand und leichtem ruhrartigen Durchfall müssen nicht antibiotisch behandelt werden. Zum

301

Spezielle Bakteriologie

302

Tab. 4.12 Differenzierungsmerkmale der Gattung Escherichia einschließlich Shigella-Arten Metabolische Aktivität

Beweglichkeit Gelbes Pigment Indolproduktion Lysindecarboxylase Ornithindecarboxylase Fermentation von: Glukose mit Gas Laktose D-Sorbitol D-Mannitol

E. coli

f. fergusonii

E. hermanni

+

+

-

-

+ + +/-

+ + +

+

+ +

-

+ + + +

+ -

+ +/+

+

Ausgleich der in der Regel mäßigen Elektrolytverluste können Salz-Zuckerlösungen oral zugeführt werden. Bei schweren Verläufen sind Infusionen mit Kochsalz und Glukose zur Behebung der Hyponatriämie und Hypoglykämie angezeigt. Infektionen mit S. dysenteriae Ol und .S'. flexneri sollten frühzeitig auch mit Antibiotika behandelt werden, um komplizierte Verläufe (HUS, toxisches Megacolon, Sepsis u.a.) zu verhindern. Im Gegensatz zum HUS durch enterohämorrhagische E. coli (EHEC), kann die Entwicklung eines HUS bei S. dysenteriae Ol-Infektion durch Antibiotika verhindert werden. Wahrscheinlich hängt dieser Unterschied damit zusammen, daß bei EHEC die Phagen-kodierten Shigatoxine Antibiotika-abhängig produziert werden, was für das chromosomal-kodierte Shigatoxin von S. dysenteriae Ol nicht gilt. Da Shigellen häufig chromosomale und extrachromosomale Antibiotikaresistenzgene tragen (z.B. gegen Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Ampicillin, Trimethoprim-Sulfmethoxazol/TMZ), sollte unbedingt ein Antibiogramm angefertigt werden. Als sichere Soforttherapie können 3. Gencrationscephalosporine oder 4-Fluorchinolone gegeben werden. Falls empfindlich, werden Ampicillin oder TMZ als 1. Wahl empfohlen. Auch eine 1-2 Tagestherapie mit Chinolonen hat sich als erfolgreich erwiesen. Epidemiologie der Shigellose

Shigellen kommen besonders häufig in Ländern mit hygienisch unzureichenden Lebensbedin-

E. vulneris S. dysenteriae S. flexneri S. boydii

5. sonnei

-

-

-

-

+/-

+/-

+

+ +/+

+/+

+ +

-

gungen vor (Südostasien, Mittel- und Südamerika, Afrika u.a.). In diesen Ländern sind S. dysenteriae Ol und S. flexneri am häufigsten. In Deutschland waren früher S. flexneri und S. sonnei endemisch. Heute werden Shigellosen durch Touristen, die sich im Urlaubsland infiziert haben, „importiert" (gemeldete Shigellosen pro Jahr in Deutschland 1200-1500 Fälle). Prävention der Shigellose

Das Shigellen-Reservoir ist auf den Menschen begrenzt. Aufgrund der hohen Infektiosität der Shigellen können Übertragungen direkt durch Kontakt mit Infizierten erfolgen oder über kontaminierte Lebensmittel (fäkale Verunreinigung, Übertragung durch Fliegen). Präventive Maßnahmen müssen sich deshalb auf die Identifizierung und Kontrolle der Infizierten (z.B. Hygienebelchrung, gesonderte Toiletten) und auf Hygienemaßnahmen wie Abdeckung von Latrinen in Zeltlagern, Pasteurisierung von Lebensmitteln (inkl. Trinkwasser) in Endemiegebieten, Händewaschen (ggf. mit Desinfektionsmittel) u.a. konzentrieren. Über die erworbene Immunität gegen Shigellose bestehen keine klaren Vorstellungen. Wahrscheinlich verhindern Serumantikörper gegen Shiga-Toxin extraintestinale Komplikationen (z.B. HUS). Einen Impfstoff gegen Shigellen gibt es nicht. Fluorchinolone sind prophylaktisch bei Kurzaufenthalten in Endemiegebieten wirksam, werden aber nicht empfohlen. In Deutschland sind nach dem Infektionsschutzgesetz (IfSG §7) der direkte oder indirekte Nachweis einer akuten Shigellose namentlich zu melden.

4.4 Die Familie der Enterobacteriaceae

4.4.5 Escherichia coli Pathogenität Escherichia coli gehört zur normalen Darmflora des Menschen und warmblütiger Tiere. In die Umwelt gelangt E. coli über fäkale Ausscheidungen. Da kein natürliches Habitat für E. coli in der Umwelt bekannt ist, wird der Nachweis von E. coli in Lebensmitteln und Wasser als Hinweis einer fäkalen Verunreinigung bewertet (Fäkalindikatorkeim). Die humanmedizinische Bedeutung von E. coli war bereits vor hundert Jahren TH. ESCHERICH klar. Allerdings war es schwierig, das Virulenzpotential von E. coli Isolaten vorherzusagen. Mit der Einführung von molekularen Methoden (Gensonden, Sequenzvergleiche, Afulti/ocusenzymelektrophorese, MLEE) kann jetzt E. coli weit besser charakterisiert und die Evolution der Pathogenität verstanden werden. E. co/z'-Isolate der normalen Darmflora von gesunden Menschen können phylogenetisch fünf Gruppen zugeordnet werden (A, Bl, B2, D und E). Es fällt auf, daß E. co//'-Isolate aus Blutkulturen (Patienten mit Bakteriämie/Sepsis) oder aus Urin (Harnwegsinfekte) in der Mehrzahl den Gruppen B2 und D zugeordnet werden können. Interessanterweise kommen bei diesen zwei Gruppen sehr häufig (90%) die typischen Pathogenitätsfaktoren für fakultativ pathogene E. coli vor: ƒ P-Fimbrien oder S-Fimbrien (Adhäsine) • Polysaccharidkapsel (Kl, K5, K12 u.a., wirken als Serum- und Phagozytose-Resistenzfaktoren) • Hämolysine (Porenbildner, Zytokine) • Eisenaufnahmesysteme (Yersiniabactin, Aerobactin, Häminverwertung) Einige dieser Pathogenitätsdeterminanten sind chromosomal auf mobilen „Pathogenitätsinseln" (s.o.) von 40-50 Kb oder extrachromosomal auf Plasmidcn lokalisiert und damit horizontal übertragbar. E. co/i-Isolate, die den Gruppen A, Bl oder E angehören, haben praktisch keine Bedeutung als extraintestinale Erreger beim Menschen.

tionen, Pneumonien, Cholezystitis, Abszesse u.a. Gemeinsam ist all diesen Infektionen eine Abwehrschwäche des Wirtes aufgrund einer Vorschädigung von Infcktionsbarricren (Hautverletzung, Gallensteine, Darmmukosaschädigung, Hypoxie von Schleimhäuten, operative Eingriffe, Immunsuppression etc.), eine Störung der autochthonen Flora z.B. durch Antibiotika. Chemotherapie sowie die Kolonisierung der Patienten mit dem jeweiligen Erreger-Isolat im Darm (endogene Infektion). Die Erreger können durch Schmierinfektion vom Perianalbereich in die Harnwege oder Wunden gelangen (Pathogenese der Harnwegsinfektionen s. Kapitel 11.9). Nicht selten werden die Erreger auch von medizinischem Personal von Patient zu Patient übertragen (Prävention durch Händedesinfektion). Darüber hinaus spielt E. coli eine wichtige Rolle als Sepsiserreger (ca. 30% der gram-negativen Blutkulturisolate sind E. coli). Die Dissemination in die Blutbahn kann von infizierten Harnwegen, Gallenwegen oder Abszessen ausgehen. Die „Translokation" der Erreger von der Darmmukosa in die Submukosa mit anschließender Dissemination über Lymph- und Blutgefäße kann eine wichtige Rolle für endogene E. coliInfektionen spielen. Bei Neugeborenen kann es unter der Geburt zur Kontamination der Atemwege mit E. coli Kapseltyp Kl kommen, woraus sich in wenigen Stunden eine Pneumonie, Septikämie und/oder Meningitis entwickeln kann (Neugeborenenmeningitis). Die hohe Letalität dieser systemischen E. coli- Infektionen ist eine Folge des septischen Schocks bzw. Endotoxinschocks, bedingt durch die Wirkung des Endotoxins (Lipopolysaccharid). Das Lipopolysaccharid von gram-negativen Bakterien wird im Blut durch das LPS-bindende Protein (LBP) oder lösliches CD14-Protein komplexiert. LPS/LBPKomplcxe lösen eine Entzündungsreaktion aus (Bildung reaktiver Sauerstoffmoleküle, Stickoxyd (NO), proinflammatorische Zytokine u.a.). Als Folge der Endotoxinwirkung kommt es zu Fieber, Blutgerinnungsstörungen, Blutdruckabfall, Gefäß- und Gewebeschädigung und schließlich zu irreversiblem Organversagen. Wichtige

Pathogenese und Klinik

klinische Parameter des Sepsis-Syndroms sind: * Tachypnoe

Je nach Pathogenitätsfaktorenausstattung verursachen die fakultativ pathogenen E. coli Harnwegsinfektionen (uropathogene E. coli, Pathovar UPEC), Septikämien (Sepsis-erzeugender E. coli, Pathovar SEPEC), Wundinfek-

* * * * *

Hypoxämie Tachycardie Hypotonie Hyperthermie Oligourie

303

304

Spezielle Bakteriologie

Laboratoriumsdiagnose und Therapie Für die mikrobiologische Diagnostik sollte Material aus Bereichen des mutmaßlichen Infektionsherdes (Urin, Punktate, Wundabstriche, Sputum u.a.) und Blutkulturen (mehrmalige intravenöse Abnahme möglichst zum Zeitpunkt des Fieberanstiegs und im Antibiotika-freien Zeitintervall) gewonnen werden. Nach Isolierung des Erregers folgt eine Antibiotikatestung. Die Antibiotikatherapie der Sepsis erfolgt zu-

nächst breit mit z.B. Cephalosporinen der 3. Generation und Aminoglykosiden oder mit Carbapenemen und wird dann nach Antibiogramm auf eine gezielte Therapie umgestellt. Eine erfolgreiche Therapie schließt die Herdsanierung ein.

4.4.6 Darmpathogene Escherichia coli Im Gegensatz zu den apathogenen und fakultativ pathogenen E. coli gehören die obligat

Abb. 4.17 Schematische Darstellung der Pathomechanismen von verschiedenen Pathovarietäten darmpathogener E. coli (siehe auch Text zur näheren Erläuterung). EPEC und EHEC translozieren den Rezeptor TIR, um dann über das Intimin an der Mucosazelle zu binden (Podestbildung durch Aktinbündelung). ETEC und EAEC produzieren Enterotoxine (ST, LT), die den cCMP oder den cAMP-Spiegel erhöhen. EAEC bildet einen Biofilm im Mucus. EIEC ist invasiv und breitet sich über Aktischweifbildung in Nachbarzelle aus (wie Shigellen, siehe Abb. 4.15).

4.4 Die Familie der Enterobacteriaceae

darmpathogenen E. coli nicht zur normalen Colonflora des Menschen, sondern ihre Anwesenheit im Intestinaltrakt ist in der Regel mit akuten Darmerkrankungen unterschiedlicher Symptomatik verbunden. Die verschiedenen Krankheitsbilder können den entsprechenden Pathovarietäten zugeordnet werden. Es konnten in den vergangenen zwanzig Jahren sechs verschiedene Pathovarietäten phänotypisch und genotypisch definiert werden (Tab. 4.13, Abb. 4.17). In

Deutschland und anderen industrialisierten Ländern (Westeuropa, USA, Japan u.a.) sind die enterohämorrhagischen E. coli (Pathovar EHEC) aufgrund des endemischen Vorkommens (Reservoir: Wiederkäuer, insbesondere Rinder) und des Schweregrades der Erkrankung (z.B. HUS) von besonderer Bedeutung. Die medizinische Bedeutung der enteroaggregativen E. coli (Pathovar EAEC) wurde in Deutschland bisher unterschätzt. Neuere Studien sprechen

Tab. 4.13 Pathogenitätsdeterminanten von darmpathogenen Escherichia coli Pathovarietäten Pathovar (Infektionsort)

Pathogenitätsdeterminante

Pathomechanismus, molekulare Funktion

EHEC enterohämorrhagische E. coli (Colon)

chromosomale Pathogenitätsinsel: \ocus of enterocyte effacement, LEE, 43 Kb

Adhärenz an Enterozyten über Intimin (Bakterienmembran) und fransloziertem /ntimin Rezeptor (TIR, Wirtszellmembran), Typ IIIProtein-Sekretion/Translokation, Induktion von Bürstensaum-Podesten durch Auflösen der Microvilli (Aktinakkumulation)

Shiga-Toxin-Gen (stx)-tragende Prophagen/Stx-Bakteriophagen

Shiga-Toxin-Familie: Stxi, Stx2 etc. spalten rRNA der Wirtszelle, Zytotoxin

Virulenzplasmid, 90 Kb

Determinanten für EHEC-Hämolysin (hly), sezernierte Serinprotease (espP) und Katalase/ Peroxidase (katP)

EPEC

Pathogenitätsinsel LEE, 35 Kb

ähnlich wie EHEC-LEE

enteropathogene E. coli (jejunum/lleum)

Virulenzplasmid, 90 Kb

vermittelt ersten Schritt in der Zelladhärenz über Expression gebündelter Fimbrien (Typ-IV-Fimbrien)

ETEC enterotoxische E. coli (jejunum)

Virulenzplasmid, Größe variabel

Determinanten für: '9, hitzeiabiles Enterotoxin (LT), stimuliert Adenylzyklase hitzestabiles Enterotoxin (ST, stimuliert Guanylzyklase) 8 Colonisierungsfciktoren (CFA-Familie). dünndarmspezifische Adhäsine

EIEC entero/nvasive E. coli (Colon)

Virulenzplasmid, 220 Kb

il hohe Homologie zum Shigellen-Virulenzplasmid, # vermittelt Invasion von Colonenterozyten und interzelluläre Ausbreitung 8 kodiert für Enterotoxin (Sen)

EAEC enterooggregative E. coli (Jejunum/lleum)

Virulenzplasmid, 100 Kb

Determinanten für: oggregative 4dhärenz vermittelnde fimbrien (AAF/I oder AAF/II) EAEC hitzstabiles Toxin (EAST) 9 Plasmid-encoded toxin (Pet) U Sezernierte Serinprotease (Pic)

DAEC diffus adhärenter E. coli (Jejunum/lleum)

Virulenzplasmid, 100Kb

Determinanten für diffuse Adhärenz: F1845 Fimbrien B AIDA-I, 100 kDA großes Membranprotein

305

306

Spezielle Bakteriologie

für ein gehäuftes Vorkommen bei Kleinkindern mit chronisch-persistierenden Durchfällen in Europa. Die enteropathogenen E. coli (Pathovar EPEC) waren früher häufig in Europa für Durchfallepidemien in Kinderkliniken und Kindergärten verantwortlich (Säuglingsenteritis, Dyspcpsie-Coli), wogegen heute EPEC-Infektionen überwiegend in tropischen und subtropischen Ländern mit schlechtem Hygienestatus vorkommen. Enterotoxische E. coli (ETEC) und enteroinvasive E. coli (EIEC) kommen fast ausschließlich in warmen Ländern mit schlechtem Hygienestatus vor und werden, wie auch EPEC, typischerweisc durch Touristen „importiert" (Reisediarrhoe). Die medizinische Bedeutung der diffus-adhärenten E. coli (DAEC) ist am wenigsten untersucht. In Frankreich und Südamerika wurden DAECs gehäuft bei Kindern mit wässrigen Durchfällen isoliert. Im Folgenden sollen die wichtigsten Punkte dieser Pathovarietäten besprochen werden.

4.4.7 Enterohämorrhagische E. coli (EHEC) Pathogenität Die Pathogenität der Pathovar EHEC wird im wesentlichen von drei genetisch mobilen Elementen bestimmt (s. Tab. 4.13): Pathogenitätsinsel LEE. Shigatoxin-konvertierende lambdoide Phagen und Virulenzplasmide. Im ersten Schritt binden die Erreger über fimbrielle Adhäsine („distanziert") am Bürstensaum der Colonozyten (Abb. 4.15 und 4.17). Sie produzieren eine Proteintransportröhre, die die Wirtszellwand konlaktiert. Es folgt dann der Transport bzw. die 7ranslokation des /ntimin Rezeptors (TIR) und die Insertion von TIR in die Bürstensaummembran. TIR bewirkt dann die Akkumulation von Aktinfilamenten, die zur breiten Ausstülpung von Mikrovilli und Bildung eines Adhärenzpodestes führt, so daß das Bakterium über Intimin an TIR binden kann. Die Colonepithelzellen verlieren ihren Bürstensaum („effacemenf) und damit ihre Elektrolytresorptionsfähigkeit. An der zytotoxischen Schädigung der Colonzellen sind wahrscheinlich die Phagen-kodierten Shigatoxine Stxl und Stx2 sowie das Plasmid-kodiertc Hämolysin und die Serinprotease beteiligt. Die Shigatoxine Stxl und Stx2 von EHEC spalten die rRNA der Wirtszellribosomen (Proteinsyntheseinhibition) und wirken zytotoxisch. Sie gelangen auch in die Blutzirkulation und können wahrscheinlich zusammen mit Endotoxin Endothelzellen und Glomeruli der Niere schädigen und so zum hämolytisch-urämischen Syndrom führen (HUS). Durch subinhibitorische Konzentrationen von Antibiotika (insbesondere Cotrimoxazol, Fluor-Chinolone, Azithromycin, Gentamicin u.a.) wird die StxProduktion in vitro stark induziert. Dieses Phänomen könnte erklären, warum Patienten mit EHEC-lnfek-

tionen und hämorrhagischer Colitis nach Antibiotikatherapie (inkl. Betalactam-Gruppe) besonders häufig ein HUS entwickeln. Bemerkenswert ist auch, daß überwiegend die EHEC-Stxl/Stx2-Doppelproduzenten. nicht aber die auch vorkommenden Stxl-Monoproduzenten ein HUS verursachen können. Die Shigatoxine von E. coli wurden früher als Verotoxine bezeichnet, da sie zytotoxisch für Vcro-Zellen (Affennicrenzelllinien) sind. Da auch Shiga/oxin-produzierende E_. coli (STEC) vorkommen, die LEE-negativ sind, kann die Pathovar EHEC als eine Untergruppe des STECs betrachtet werden.

Pathogenese und Klinik Enterohämorrhagische E. coli werden i.d.R. über kontaminierte Rindfleisch- und Milchprodukte, die nicht ausreichend erhitzt wurden, sowie kontaminierte Salate und Gemüse (bedingt durch Fäkaldüngung) übertragen. Aufgrund der Säureresistenz reicht die Aufnahme von 10-100 Erreger für eine akute Infektion aus. Nach Passage des Magen-Dünndarmtrakles adhärieren die Erreger am Colonepithel und verursachen zunächst hämorrhagische Läsionen mit ödematösen Veränderungen der Mukosa und Submukosa. Nach einer Inkubationszeit von 1-3 Tagen (max. 8 Tagen) entwickeln insbesondere Säuglinge, Kleinkinder und alte Menschen eine Colitis mit wässrigen Durchfällen, Bauchkrämpfen, Erbrechen und subfebrilcn Temperaturen (Krankheitsdauer 7-10 Tage). Bei 20% der Fälle (noch häufiger bei alten Menschen) verschlimmert sich das Krankheitsbild (blutiger Durchfall, enterohämorrhagische Colitis, EC). Bei etwa 5-10% dieser Patienten können wenige Tage nach der Colitis extraintestinale Krankheitsbilder entstehen wie das HUS (mikroangiopathische hämolytischc Anämie, akutes Nierenversagen mit Urämie und Thrombozytopenie, insbesondere bei Kindern unter 6 Jahren) und die thrombotisch-thrombozytopenische

Purpura (TTP, insbesondere bei Erwachsenen). Darüber hinaus werden in einigen Fällen neurologische Symptome (z.B. Krampfanfälle wie bei Shigella dysenteriae-Infektion) und Schädigungen des Pankreas beschrieben. Das HUS ist die schwerwiegendste Folgeerkrankung der EHECInfektion. Bei 15-30% der HUS-Fälle kommt es zu irreversiblen dialysepflichtigen Nierenschädigungen, 2-10% überleben das HUS nicht. EHEC-Infektionen bei Jugendlichen und Erwachsenen (bis ca. 65 Jahre) verlaufen i.d.R. mild und nicht selten ohne auffällige Symptomatik. Inwieweit diese relative Infektionsresistenz

4.4 Die Familie der Enterobacteriaceae

mit einer erworbenen Immunität zusammenhängt, ist noch unklar. Laboratoriumsdiagnose EHEC-Erreger werden typischerweise aus Stuhlproben angezüchtet, isoliert und typisiert hinsichtlich Serovar (am häufigsten O157) und Pathovar (Stxl, Stx2, LEE-Gene, PlasmidGene, Stx-Produktion). Als Suchtest kann mittels Stx-spezifischer serologischer Verfahren (z.B. EL1SA) oder Vero-Zell-Toxizitätstest das Shigatoxin in Stuhlaufschwcmmungcn oder Anreicherungskulturen nachgewiesen werden. Verdächtige Isolate sollten Speziallaboratorien zur weiteren Charakterisierung eingesandt werden (z.B. Nachweis von stxl- und s/x2-Genen). Neben der Kultivierung besteht auch die Möglichkeit mittels Immunoblot oder Agglutinationsreaktionen Serumantikörper gegen das O-Antigen von EHEC-Serotypen nachzuweisen (hat sich für Infektionen mit Serovar O157 EHEC bewährt).

Prävention EHEC-Infektionen können durch klassische Hygienemaßnahmen verhindert werden: Ŷ Einhaltung strikter Hygienerichtlinien bei der Lebensmittelherstellung (Rindfleisch, Milchprodukte) Ŷ keine Fäkaldüngung im Salat- und Gemüseanbau • ausreichende Erhitzung von Rindfleisch- und Milchprodukten vor dem Verzehr Ŷ Isolierung von EHEC-infizierten Patienten • Aufklärung über die hohe Infektiosität (< 100 Erreger) von EHEC-Patienten im Krankenpflegebereich (Händedesinfektion) St Erfassung aller symptomatischen und asymptomatischen Ausscheider. Eine Impfung gegen EHEC gibt es bisher nicht. Der Nachweis von EHEC-Erregern und das Krankheitsbild enteropalhisches hämolytischurämisches Syndrom (HUS) sind nach §7 bzw. nach §6 des IfSG meldepflichtig.

4.4.8 Enteropathogene E. coli (EPEC) Therapie Zahlreiche Beobachtungen und Studien haben gezeigt, daß eine Antibiotikatherapie von EHEC-Infektionen eher zu einer Verschlechterung (z.B. HUS) als zu einer Verbesserung des Krankheitsbildes führt. Die Therapie beschränkt sich deshalb dem Krankheitsbild angepaßt auf Flüssigkeit- und Elektrolytersatz, Dialyse zur Korrektur harnpflichtiger Substanzen und eventuell Plasmapherese. Epidemiologie Die EHEC-Erreger haben ihr Reservoir in Wiederkäuern und gelangen von dort in die Nahrungskette des Menschen. Inwieweit die Veränderungen der Tierhaltung (Heufütterung —» Grassilage, Freilandhaltung -» Massentierhaltung im Stall) und der Lebensmittelherstellung (Verarbeitung und Vertrieb pasteurisierter Milchprodukte —» unpasteurisierte Milchprodukte) in den letzten Jahrzehnten zum gehäuften Auftreten von EHEC-Infcktionen beigetragen haben, ist noch unklar. Neben Infektionen durch kontaminierte Nahrungsmittel spielen auch Kontaktinfektionen innerhalb von Kindergärten, Familien oder Krankenhausstationen eine wichtige Rolle für die epidemische Ausbreitung von EHEC.

Pathogenität Enteropathogene E. coli tragen wie die Pathovar EHEC die Pathogenitätsinsel LEE, die für die Adhärenz und Bürstcnsaumzcrslörung verantwortlich ist. Allerdings binden die EPECs über gebündelte Typ IVFimbrien an Dünndarmepithel und nicht wie EHECs an Colonepilhel. Nach der fimbriellen Adhäsion kommt es dann zur engen Bindung über Intimin und transloziertem T1R an die durch Aktinbündelung erzeugten „Podeste" der Darmepithelzellen (s. Abb. 4.15 und 4.17). Die Zerstörung der Mikrovilli kann zur funktionellen Schädigung der Enterozyten des Dünndarms führen. Darüber hinaus kontrolliert EPEC Signaltransduktionskaskaden der Enterozyten und stört so den transepithelialen Elektrolytfluß. Typische Enterotoxine wurden bei EPEC bisher nicht nachgewiesen (wichtiger Unterschied zu EHEC).

Pathogenese und Klinik Nach Aufnahme von EPEC-Erregern (Infektionsdosis ca. 10s Bakterien) kann es nach einer Inkubationszeit von 12 Stunden bis 6 Tagen zu einer akuten Diarrhöe mit breiigen oder profus wässrigen Stühlen, Erbrechen und subfebrilen Temperaturen kommen. Besonders betroffen sind Säuglinge und Kleinkinder (1-4 Jahre), die durch die entstehende Exsikkose bei nicht adäquater Therapie und bei Mangelernährung vital gefährdet sind (Letalität: 25-50%).

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Spezielle Bakteriologie

308

Laboriumsdiagnose Enteropathogenc E. coli werden durch Kultivierung aus Stuhlproben mit anschließender Charakterisierung, Serotypisierung, Genotypisierung (EPEC-LEE) und Zellkulturinfektion (/^luorescein-Zlktin-Stam, FAS) nachgewiesen. Die serologische Diagnostik ist nicht möglich. Therapie Die Therapie beschränkt sich auf Wasser- und Elektrolytersatz und bei schweren Fällen können auch Antibiotika nach Resistenztestung eingesetzt werden. Epidemiologie EPEC-Epidemien werden in industrialisierten Ländern seit mehr als 40 Jahren nur noch selten registriert. Sporadische Fälle bei Touristen treten als Reisediarrhoe auf. Am häufigsten werden EPECs bei der Säuglingsentcritis (Alter <6 Monate) in Süd- und Mittelamerika sowie in Afrika nachgewiesen. Kleinkinder können häufig asymptomatische Ausscheider sein. Das einzig bekannte Reservoir für EPECs ist der Mensch.

sekretion gefördert, was im Dünndarm zu hohen Elektrolytverluslen führt (s. Abb. 4.17). ETEC binden mittels spezifischer Colonization factors (fimbriclic und nicht-fimbrielle Adhäsine, CFA) an Dünndarmepithel und sind nicht invasiv (vergleiche Vibrio cholerae).

Pathogenese und Klinik ETEC-Erreger werden über kontaminierte Lebensmittel und Trinkwasser aufgenommen (Infektionsdosis ca. 105 Erreger) und kolonisieren über CFA (s.o.) die Jejunummukosa. Die Bildung von LT und ST führen zu wässrigen Cholera-ähnlichen Durchfällen, selten mit Fieber oder Erbrechen. Die Inkubationszeit ist kurz (6-48 Stunden), der Krankheitsverlauf meist auf wenige Tage begrenzt und für Erwachsene nicht bedrohlich. Lebensbedrohliche Infektionen kommen häufig bei Säuglingen in der Dritten Welt während der Abstillphase vor. Laboratoriumsdiagnose In Deutschland gehört zur Differentialdiagnostik der „Reisediarrhoe" der Nachweis von E. coli Pathovar ETEC. Nach Anzucht aus Stuhlproben werden E. co/r'-Isolate auf Kocxpression von LT und ST mit Antiseren oder auf das Vorkommen der Gene mittels PCR getestet.

Prävention

Therapie

Enteropathogene E. coli werden durch Lebensmittel und zwischenmenschliche Kontakte übertragen. Erhitzen von Lebensmitteln, Händedesinfektion, Muttermilchernährung von Säuglingen gehören zu den präventiven Maßnahmen. Eine Impfung gibt es nicht. Der Nachweis von EPEC bei akuter Enteritis ist nach §7 IfSG mel-

Bei schweren Verläufen muß für ausreichenden Wasser/Elektrolytersatz gesorgt werden. Antibiotika wie Fluorchinolonc können die Durchfallphase verkürzen.

depflichtig.

ETECs kommen überwiegend in warmen Klimazonen mit schlechten hygienischen Lebensverhältnissen vor (Südostasien, Süd- und MittelAmerika, Afrika). Über Exkremente von ETEC-Infizierten gelangen die Erreger in die Nahrungskette (fäkal-oraler Infektionsweg).

4.4.9 Enterotoxische E. coli (ETEC) Pathogenität Enterotoxische E. coli (ETEC) besitzen Plasmide, die mobile Gene (Transposons) für zwei Enterotoxine tragen: 1. Choleratoxin-ähnliche hitzelabile Enterotoxine (LT-Familie) und 2. hitzestabile Enterotoxine (ST-Familie). Das LT bindet wie das Choleratoxin an das Gangliosid GM1 der Dünndarmenterozyten und wird transloziert. Als ADP-Ribosyltransferase aktiviert LT hetcrotrimere G-Proteine und darüber indirekt die Adenylzyklase (Anstieg von cAMP). ST aktiviert direkt die membranständige Guanylzyklase (Anstieg von cGMP) durch Bindung an die extrazelluläre Rezeptordomäne. In beiden Fällen wird die Chlorid-

Epidemiologie

Prävention Klassische Hygieneregeln bei der Nahrungsaufnahme (inkl. Getränke) sollten strikt eingehalten werden. Darüber hinaus können prophylaktisch eingenommene Antibiotika (z.B. Fluorchinolone) hilfreich sein. Der Nachweis von ETEC bei einer akuten Infektion ist nach §7 IfSG meldepflichtig.

4.4 Die Familie der Enterobacteriaceae

4.4.10 Enteroinvasive E. coli (EIEC)

Epidemiologie

Pathogenität

Wie Shigellen, so kommen auch EIECs nur beim Menschen vor. Besonders häufig ist das EIECVorkommen in warmen Ländern, insbesondere Südamerika. In Europa gehören EIEC zu den importierten Erregern (Reisediarrhoe). EIECInfektion werden durch kontaminierte Lebensmittel und Trinkwasser verursacht.

Enteroinvasive E. coli (EIEC) tragen ein Shigellenähnliches Virulenzplasmid, das für einen Protein-Typ III-Sekretions/Translokations-Apparat und zahlreiche translozicrbare Effektorproteine kodiert. Die Effektorproteine induzieren die basolateralc Aufnahme der Erreger durch Colonepithel (Makropinozytose), die Lyse der Phagosomenmembran, die ausschließlich intrazelluläre Ausbreitung mittels Aktinschweifbildung und die interzelluläre Ausbreitung (Abb. 4.17). Mit der Invasion ist die Freisetzung von IL-8 durch Darmepithel verbunden, die zur Infiltration der Mukosa durch polymorphkernige Neutrophilc mit anschließender Mukosaschädigung führt. Darüber hinaus ist das Virulenzplasmid Träger eines neuartigen Enterotoxins (Shigclla-Enterotoxin, Sen), das für die Elcktrolytresorptionsstörungen mitverantwortlich sein soll. Wie Shigellen können auch EIECs die Aminosäure Lysin nicht decarboxylieren (LDC-negativ) und damit kein Cadaverin (Diamin) produzieren (im Gegensatz zu der Mehrzahl von E. coli). Dieser LDCDcfekt ist für die Pathogenität von Bedeutung, weil Cadaverin das Enterotoxin Sen inhibiert.

Prävention Einen EIEC-Impfstoff gibt es nicht. Die üblichen Hygienemaßnahmen für Aufenthalte in tropischen Ländern bei der Nahrungsaufnahme sollten eingehalten werden. Eine Antibiotikaprophylaxe für Kurzaufenthalte in Endemiegebieten ist zwar wirksam (z.B. Fluor-Chinolone), wird aber nicht allgemein empfohlen.

4.4.11 EnteroaggregativeE.coM (EAEC)

Pathogenese und Klinik

Pathogenität

EIEC-Infektionen verlaufen in der Regel milder als die Shigellen-Dysenterie. Nach kurzer Inkubationszeit (2-4 Tage) entwickeln die Patienten einen wässrigen Durchfall, der selten in eine Dysenterie übergeht. Eine EIEC-Infektion kann bei fehlender Dysenterie klinisch kaum von einer ETEC-Infektion abgegrenzt werden. Die Infektion heilt häufig nach wenigen Tagen aus. Aufgrund der fehlenden Säureresistenz von EIEC im Vergleich zu Shigellen, ist die Infektionsdosis relativ hoch und die Infektiosität entsprechend geringer als bei Shigellen.

Die Bezeichnung enteroaggregative E. coli (Pathovar EAEC) beruht auf der Beobachtung, daß EAECs an HEp-2 Zellkulturen binden und dabei dicht gepackte flächige Aggregate bilden. Für diese „aggregative Adhärenz" sind zwei Fimbrien-Typen verantwortlich (aggregative /tdhärenz/imbrien, AAF I und II). die von einem Virulenzplasmid kodiert werden. Das Virulenzplasmid trägt häufig auch noch Gene für ein hitzestabiles Enterotoxin (EAST), ein Zytotoxin (Pet) und eine sezernierte Protease. EAST kommt bei 70% der EAEC aber auch bei EHECs vor. Der Beitrag dieser Toxine zur Pathogenität ist noch unklar.

Pathogenese und Klinik Laboratoriumsdiagnose EIEC-Infektionen werden durch Anzucht der Erreger aus Stuhlproben nachgewiesen. Verdächtige Isolate (z.B. LDC-negative E. coli, EIEC-Serovarietäten, s. Tab. 4.11) müssen hinsichtlich der Virulenzgene typisiert werden (PCR). Therapie EIEC-Infektionen werden i.d.R. nicht antibiotisch therapiert. Hohe Elektrolytverluste müssen ersetzt werden. Eine Antibiotikatherapie z.B. mit Fluor-Chinolonen ist wirksam.

Tierversuche und Infektionen von Freiwilligen haben ergeben, daß EAECs die Dünndarmzotten in Form eines Biofilms besiedeln. Offensichtlich sind sie auch befähigt, eine Mucusschicht zu induzieren, in der sie eingebettet sind (Abb. 4.17). Diese dichte oberflächliche Kolonisierung der Zotten kann stellenweise zu hämorrhagischen Nekrosen führen. EAEC-Infektionen führen besonders bei kleinen Kindern unter 3 Jahren zu wässrigen, schleimigen und selten zu blutigen Durchfällen mit Bauchkrämpfen und seilen Fieber. Bemerkenswert sind die häufig chronischen Verläufe über 14 Tage. Besonders betroffen sind unterernährte Kinder.

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310

Spezielle Bakteriologie

Laboratoriumsdiagnose

Pathogenese und Klinik

Aus Stuhlproben werden auf McCoNKEY-Agar E. coli angezüchtet. Verdächtige E. co/z-Kolonien werden im Zellkulturmodell auf aggregative Adhärenz getestet. Darüber hinaus können Gene für AAF I oder II mittels PCR nachgewiesen werden.

Die Pathogenese der DAEC-Infektion ist unklar. Der Erreger infiziert wahrscheinlich ähnlich wie EAECs den Dünndarm von Kleinkindern und erzeugt wässrige Durchfälle, die länger anhalten können (> 14 Tage). Laboratoriumsdiagnose

Therapie Da es sich hier i.d.R. nicht um massive Elektrolytverlustc handelt, ist ein gesonderter Flüssigkeitsersatz nicht notwendig. EAECs zeigen häufig Multiresistenzen. Für die Nützlichkeil einer Antibiotikatherapie gibt es keine überzeugenden Daten.

Stuhlproben werden zur Anzucht von E. coli verarbeitet und dann differenziert (Zellkultur, PCR zum Nachweis von F1845-Gen). Therapie Flüssigkeitsersatz wie bei anderen Durchfallerkrankungen

Epidemiologie EAECs sind weltweit verbreitet. Besonders häufig kommen sie bei Säuglingen und Kleinkindern in warmen Ländern (Mexico, Brasilien, Indien u.a.) vor. Sporadische Fälle und Epidemien sind beschrieben. Die Infektionsdosis liegt wahrscheinlich hoch (10s Erreger). Die Übertragung erfolgt wahrscheinlich durch kontaminierte Lebensmittel.

Epidemiologie DAECs wurden zunächst in Chile, Mexico und Bangladesh beschrieben und später auch in Europa. Wahrscheinlich stellt der Mensch das Reservoir dar. Die Verbreitung erfolgt wahrscheinlich über Lebensmittel und kontaminiertes Trinkwasser. Prävention

Prävention Der Nachweis von akuten EAEC Infektionen sind nach §7 IfSG meldepflichtig. Einhaltung von allgemeinen Hygienerichtlinien bei der Herstellung und beim Verzehr von Lebensmitteln wird empfohlen.

4.4.12 Diffus-adhärente E. coli (DAEC) Pathogenität E. coli Pathovar DAEC zeigen im Zellkulturinfektionsmodell diffus verteilte adhärierende Bakterien ohne Aggregatbildung und können dadurch gut von Pathovar EAEC unterschieden werden (s. Abb. 4.17). Für dieses Adhärenzmuster sind bestimmte Fimbrien (F1845) und/oder ein Protein der äußeren Membran (AIDA-I) verantwortlich, die häufig exlrachromosomal (Plasmid) und selten chromosomal kodiert sind. Weitere Pathogenitätsfaktoren (z.B. Enterotoxine oder LEE-Determinante) sind nicht bekannt. Im Tiermodell konnte gezeigt werden, daß DAECs entzündliche Reaktionen im Ileum erzeugen. Infektionen von Freiwilligen mit 10'" Erregern führten zwar zur mehrtägigen Ausscheidung, aber nicht zur Enteritis.

Es werden übliche Hygienemaßnahmen empfohlen. Der Nachweis von DAEC bei enteritischen Patienten ist nach §7 IfSG ineldepflichtig.

4.4.13 Fakultativ-pathogene Enterobacteriazeen Überblick Die Gruppe der fakultativ-pathogenen Enterobacteriazeen kommt häufig im Darmtrakt von Mensch und Tier vor und gelangt durch Exkremente in die Umwelt und auch in die Nahrungskette. Sie sind saprophytär lebende, anspruchslose und widerstandsfähige Mikroorganismen, die in destilliertem Wasser überleben können (z.B. Luftbefeuchter) und häufig gegen Desinfektionsmittel und zahlreiche Antibiotika resistent sind. Im Vergleich zu obligat pathogenen Enterobacteriazeen (z.B. Salmonellen und Shigellen) sind die fakultativ-pathogenen Gattungen i.d.R. nur mit unspezifischen Pathogenitätsfaktoren ausgestattet wie Prolcasen, Lipasen. Ureasen, Hämolysine, fimbrielle Adhäsine, Siderophorsysteme (Eisenversorgung), Polysac-

4.4 Die Familie der Enterobacteriaceae

charidkapscl u.a. (Tab. 4.14). Mit dieser Ausstattung können sie nur vorgeschädigte, insbesondere hospitalisierte Patienten infizieren (nosokomiale Infektion, NI). Die häufigsten NIs sind Harnwegsinfektionen, Pneumonien, postoperative Wundinfektionen und Septikämien, die durch endogene Infektionen (ausgehend vom Darm oder Nasopharynx) und seltener exogen durch Übertragung von Pflegepersonal verursacht weiden. Neben NIs verursachen die fakultativpathogenen Enterobacteriazeen auch im ambulanten Bereich Harnwegsinfektionen, Wundinfektionen, Osteomyelitiden, Septikämien (bei Drogensüchtigen etc.). Auf Neugcborenenstationen können sie als Meningitiserreger bei Frühgeborenen auftreten.

Zu den Risikofaktoren für Infektionen mit fakultativ-pathogenen Enterobacteriazeen zählen: » Häufige und großzügige Antibiotikagabe (Schädigung der protektiven autochthonen Flora und Selektion von multiresistenten Enterobacteriazeen)

Ŷ Fremdkörperimplantation (Katheter, endotrachealer Tubus bei künstlicher Beatmung u.a.) Ŷ Abwehrschwäche durch Neoplasien, Tmmunsuppressionstherapie, Polytrauma, Diabetes mellitus, Leberzirrhose, Drogensucht oder bei Abwehrschwäche durch Neoplasien oder Drogensucht oder bei Frühgeborenen und hohen Alter Ŷ lange Liegezeiten auf Intensivstationen Ŷ mangelhafte Krankenhaushygiene. Gefürchtet sind Epidemien im Krankenhaus durch multiresistente Enlerobacteriazeen (z.B. Klebsieila pneumoniae. Enterobacter aerogenes), die meist durch Pflegepersonal auf Patienten übertragen werden. Solche Hospitalepidemien können am effektivsten durch Schließung der betroffenen Station und „Sanierung"" des Pflege-

TAB. 4.14 Wichtige Merkmale von fakultativ-pathogenen Arten der Familie der Enterobacteriaceae Mot*

LDC*

Lac*

Cit*

H2S*

Pathogenitätsfakoren und andere Besonderheiten

Citrobacter C. freundii C. kosen

+ +

-

-/+ -/+

+

+

Vi-Antigen von S. Typhi, Shigatoxin, hitzestabiles Enterotoxin

Enterobacter

+ +

Gattung/Art

E. aerogenes E. cloacae

HPI von Yersinia

+ +

+ +

-

K. pneumoniae K. oxytoca

—

-/+ +

Serratia

+ +

+ +

Proteus P. mirabilis P. vulgaris

+ +

-

Morganella

+

-

+ +

— -

+ +

-

-

-/+ -/+

+ +

-

-

-

+

-

Urease, Resistenzen gegen zahlreiche Antibiotika und Desinfektionsmittel

+

-

einige Isolate sind wahrscheinlich Träger der Pathogenitätsinsel LEE (siehe E. co/i/EPEC)

+

Hämolysin, Invasivität für HEp-2 Zellen

-

Providencia P. rettgeri P. stuartii

+

Hafnia

+

+

_

+

+

-

LDC: Lysindecarboxylase, Lac:

Bildung von rotem Pigment (Prodigiosin), Chitinase, Hämolysin Resistenzen gegen zahlreiche Antibiotika Urease, Hämolysin, fimbrielle Adhäsine, Ig-spezifische Protease Resistenzen gegen zahlreiche Antibiotika Urease, Hämolysin

H. ab/ei

* Mot: Motilität,

Polysaccharidkapsel, fimbrielle Adhäsine, Siderophore, Träger von AntibiotikaResistenzplasmiden, HPI von Yersinia

+ +

M. morganii

Bdwardsiella E. tarda

Pathogenitätsfaktoren? Resistenzen gegen zahlreiche Antibiotika HPI von Yersinia

Klebsieila

S. marcescens S. liquefaciens

+ +

Laktoseverwertung (Ansäuerung), Cit: Zitratverwertung, H2S: H2S-Bildung

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Spezielle Bakteriologie

312

Zur Gattung Citrobacter (Citrat-Verwerter) gehören inzwischen 8 Arten, von denen C. freundii und C. kosen (früher C. diversus) als extraintestinale (NI. Harnwegsinfektionen) und intestinale Infektionserreger medizinisch bedeutsam sind. Einige C. freundii Stämme produzieren ein Kapselpolysaccharid, das identisch zum Vi-Antigen von Salmonellu Typhi ist und andere produzieren Shigaloxin und sind enteropathogen wie E. coli Pathovar EHEC. C. koseri verursacht Harnwegsinfektionen, Septikämien, Meningitis bei Neugeborenen u.a.

tung als Erreger nosokomialen Infektionen (insbesondere Pneumonien und Harnwegsinfektionen) zukommt. K. pneumoniae ssp. rhinoscleromatis ist der Erreger des Rhinoskleroms (chronische granulomatöse Entzündung der Nase) und K. pneumoniae ssp. ozaenae soll ursächlich an der Rhinitis atrophkans cum foetore (Stinknase) beteiligt sein, was aber nicht bewiesen ist. Mikrobiologische Besonderheiten von Klebsiellen sind das Fehlen von Flagellen (unbeweglich) und die nicht übersehbare Polysaccharidschleimkapsel (schleimige Kolonie), die bei K. pneumoniae für die Phagozytoseresistenz und Serumresistenz verantwortlich ist. Die Kapseltypisierung hat für K. pneumoniae ssp. pneumoniae epidemiologische Bedeutung (Kl-Stämme sind häufig an HWI beteiligt). Im Krankenhaus können bei Pflegepersonal in 70-80% der Stuhlproben und 40% der Handflächenabstriche K. pneumoniae nachgewiesen werden. Damit ist das Pflegepersonal ein wichtiges Keimreservoir für nosokomiale Infektionen. Therapeutisch kann K. pneumoniae problematisch sein, da die Stämme häufig Multiresistenzplasmide erworben haben mit Betalaktamasen gegen Drittgenerationscephalosporine.

Enterobacter

Serratia

Zur Gattung Enterobacter gehören über 12 Arten. Medizinisch bedeutsam sind E. aerogenes und E. cloacae. Die früher als E. agglomerans bezeichnete Art wurde kürzlich der Gattung Pantoea zugeordnet und wird als P. agglomerans bezeichnet (bildet gelb-pigmentierte Kolonien, wächst schlecht auf McCoNKEY-Agar). Enterobacter-Arlcn sind in der Umwelt weit verbreitet. Isolate aus Patientenmaterial zeichnen sich häufig durch multiple Antibiotikaresistenzen aus. In Intensivstationen sind 5-10% der Baktericnisolate aus Trachealabsaugung, Wundabstrichen, Urin und Blutkulturen der Gattung Enterobacter zuzuordnen.

Von den mehr als zehn Arten der Gattung Serratia spielen S. liquefaciens und insbesondere S. marcescens eine Rolle bei nosokomialen Infektionen. S. marcescens kann auf kohlenhydratreichen Oberflächen Bluttropfen-ähnliche Kolonien bilden (Hostienwunder, „blutende Polenta" etc.), was auf die Produktion des roten Pigments Prodigiosin zurückzuführen ist. Als Pathogenitätsfaktor wird ein zellgebundenes Hämolysin bewertet, das bei einigen Stämmen vorkommt. Wie Klebsiellen und EnterobacterArten erweisen sich 5. marcescens und 5. liquefaciens häufig als hoch resistenl gegen Aminoglykoside und Betalaktamantibiotika.

Klebsiella

Proteus

Die Gattung Klebsiella umfaßt 5 Arten: Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, K. terrigena, K. planticola und K. ornithinolytica. Von medizinischer Bedeutung ist K. pneumoniae (mit den Subspezies K. pneumoniae ssp. pneumoniae, K. pneumoniae ssp. ozaenae und K. pneumoniae ssp. rhinoscleromatis) und K. oxytoca, wobei K. pneumoniae ssp. pneumoniae die größte Bedeu-

Die Gattung Proteus zeigt einige Besonderheilen gegenüber den bisher besprochenen Enterobacteriazeen: Ŷ Der G+C-Gehalt ist mit 38-40% ca. 10% niedriger als bei den meisten anderen Mitgliedern der Familie Enter ob acteriaceae (s. Abb. 4.12) Ŷ Proteus-Arten zeigen eine auffällige Beweg-

Personals beherrscht werden. Auch kontaminierte Inf'usionslösungen, Heparinspritzen, Spülflüssigkeit etc. können die Ursache von NIs mit Enterobacteriazeen sein.In Tab. 4.14 sind wichtige Merkmale der medizinisch bedeutsamen Gattungen/Arten der fakultativ-pathogenen Enterobacteriazeen zusammengestellt. Die Serotypisierung nach O-. H-, K- und F-Antigcnen wurde als nützlich angesehen bei der Analyse von Epidemien und Pathogenität, hat sich aber letztlich nicht durchgesetzt. Citrobacter

4.4 Die Familie der Enterobacteriaceae

lichkeit auf festen Nährböden, die als „Schwärmen" bezeichnet wird, da die Bakterien sich über die gesamte Oberfläche wellenartig als Film ausbreiten (Kolonien sind kaum zu erkennen) Ŷ Die starke Ureasebildung wird als Pathogenitätsfaktor bewertet (Alkalisierung des Urin und dadurch Förderung der Calziumphosphatsteinbildung) Ŷ Proteus-Arten sind resistent gegen Polymyxin aufgrund des modifizierten Lipopolysaccharids. Die Gattung Proteus umfaßt vier Arten: P. vulgaris, P. rnirabilis, P. petmeri und P. myxofaciens, wobei die drei ersten Arten medizinische Bedeutung insbesondere als Harnwegsinfekterreger haben (P. mirabilis ist der dritthäufigste Erreger von komplizierten Harnwegsinfekten), die zuletzt genannte Art ist Insekten-pathogen. Neben der Urease zählen bei Proteus ssp. fimbrielle Adhäsine, die Motilität und IgG/IgA-Proteasen zu den Pathogenitätsfaktoren. Besonderes Interesse hat das O-spezifische Polysaccharid von P. vulgaris OX19 und OX2 und das OXK von P. mirabilis, da diese Antigene mit Rickettsien kreuzreagieren und in der serologischen Diagnostik für Rickettsiosen eingesetzt werden (WEIL-FELIX-Reaktion). Morganella Zum Genus Morganella gehört bisher nur eine Art: Morganella morganii. Durch den G+C-Gehalt von 50% grenzt sich diese Gattung deutlich von Proteus und Providencia ab. Morganellen spielen bei Harnwegsinfektionen, Pneumonien, Wundinfektionen, Abszessen und NIs eine weit geringere Rolle als die oben bereits besprochenen Gattungen. Providencia Die Gattung Providencia umfaßt 5 Arten, von denen P. rettgeri, P. stuartii und P. alcalifaciens medizinische Bedeutung haben. Sie hat einen ähnlichen G+C-Gehalt (39-42%) wie die Gattung Proteus und ist auch resistent gegen Polymyxin. Über die Pathogenität ist wenig bekannt. Providencia-Arten werden für nosokomiale Infektionen verantwortlich gemacht. Sie können wegen ihrer Desinfektionsmittel- und multiplen Antibiotika-Resistenz ein Problem im Krankenhaus darstellen.

Hafnia Zur Gattung Hafnia gehört bisher eine Art: Hafnia alvei. Phylogenetisch ist sie in die Nähe von Yersinia einzuordnen (s. Abb. 4.12). H. alvei kommt ubiquitär vor. Sie wurde aus Stuhlproben von Patienten mit Enteritis und nekrotisier ender Enterocolitis isoliert, was auf ihre Enteropathogenität hinweisen könnte. Interessanterweise konnte bei einigen Isolaten Sequenzen der Pathogenitätsinsel LEE von E. co/z'/Pathovar EPEC nachgewiesen werden. H. alvei spielen auch als opportunistische Infektionserreger eine Rolle. Edwardsiella Die Gattung Edwardsieila hat einen hohen G+C-Gehalt von 55-59% und umfaßt drei Arten: Edwardsieila tarda, E. koshinae und E. ietaluri. Das natürliche Reservoir dieser Gattung ist wahrscheinlich der Darmtrakt von kaltblütigen Tieren (Reptilien, Fische u.a.). Nur E. tarda wurde bisher bei Patienten mit Meningitis, Osteomyelitis, Cholecystitis, Septikämien und Enteritis isoliert. E. rarda-Darminfektionen können als wässrige Enteritis oder als Dysenterie verlaufen. Edwardsiellen sind hochempfindlich für die üblichen Antibiotika (inkl. Penicillin). Der Nachweis als Infektionserreger beim Menschen ist selten. Laboratoriumsdiagnose Der Nachweis fakultativ-pathogener Enterobacteriazeen erfolgt aus entsprechendem Material (Urin, Blut, Stuhl, Abstriche) durch Anzucht auf Blut- und McCüNKEY-Agar (aerob, 37 °C). Einzelkolonien werden auf Stoffwechselleistungen („Bunte Reihe") für die Artidentifizierung getestet. Die serologische Differenzierung spielt eine untergeordnete Rolle. Aufgrund der multiplen Antibiotikaresistenzen bei dieser Keimgruppe ist die Erstellung von Antibiogrammen für eine gezielte Therapie unerläßlich. Therapie Bei schweren Verläufen ist eine kalkulierte Antibiotika-Soforttherapie erforderlich. In Frage kommen Drittgenerationscephalosporine/Aminoglykoside, Carbapeneme oder Fluorquinolone. Es folgt dann eine Therapie nach Antibiogramm.

313

Spezielle Bakteriologie

314

Epidemiologie

Die fakultativ-pathogenen Enterobacteriazeen kommen ubiquitär vor. Krankenhausepidemien insbesondere durch Enterobacter aerogenes und Klebsiella pneumoniae sind schwer zu beherrschen und häufig ein Hinweis auf irrationalen Antibiotikaeinsatz und ungenügende krankenhaushygienische Zustände. Prävention Die Einhaltung von Krankcnhaushygicncrichtlinien hei der Versorgung und Therapie von Patienten ist eine der wichtigsten präventiven Maßnahmen. Nach §6 IfSG ist das Auftreten von zwei oder mehr gleichartigen Erkrankungen, bei denen ein epidemischer Zusammenhang wahrscheinlich ist oder vermutet wird meldepflichtig. Darüber hinaus sind nosokomiale Infektionen und spezielle Resistenzen (z.B. Carbapenem-Resistenz) und Multiresistenzen von der Leitung der Einrichtung aufzuzeichnen (§23 IfSG).

4.4.14 Plesiomonas shigelloides Mikrobiologie und Vorkommen

Zur Gattung Plesiomonas gehört bisher nur eine Art: P. shigelloides. Dieses gram-negalive Stäbchenbaktcrium ist lophotrich begeißelt und wie Aeromonaden und Vibrionen Cytochromoxidase-positiv. Dennoch sprechen folgende Merkmale von Plesiomonaden für eine Zugehörigkeit zur Familie der Enterobacteriaceae: », G+C-Gehalt51% (Vibrionen 38-51%) 8 Lipopolysaccharide zeigen Kreuzreaktivität bzw. Identität zu verschiedenen Serotypen von Shigellen « 16S rDNA Sequenzvergleich spricht für Enterobacteriaceae-Zxiordmmg (s. Abb. 4.12). Plesiomonaden sind anspruchslos, sie wachsen bei Temperaturen von 8-45 °C und tolerieren bis zu 5% NaCl und pH-Werte von 4,5-8,5 (Anreicherung in alkalischem Peptonwasser). Auf McCONKEY-Agar wachsen sie als „Laktose-negative" Kolonien, auf Blutagar bilden sie nicht-hämolysierende Kolonien. Plesiomonaden kommen in Flußmündungen, Brackwasser und Abwasseranlagen weltweit vor. Fische, Frösche, Schnecken, Muscheln, Krabben sind häufig mit Plesiomonaden besiedelt. Auch bei Schweinen,

Katzen und Hunden werden Plesiomonaden nachgewiesen. In den warmen Jahreszeiten sind die Plesiomonaden-Konzentrationen am höchsten und damit auch das Infektionsrisiko. Pathogenese, Klinik und Epidemiologie

Plesiomonaden-Infektionen entstehen durch den Verzehr von kontaminierten rohen oder ungenügend erhitzten Fischen, Muscheln oder Schalentieren oder kontaminiertem Trinkwasser. Nach einer Inkubationszeit von 24-48 Stunden beginnt die Infektion mit Darmkrämpfen, Erbrechen, ruhrartigen Durchfällen (Dysenterie-ähnlich). Fieber tritt nur bei einem Drittel der Erkrankten auf. Der Krankheitsverlauf kann 2-14 Tage dauern und in seltenen Fällen auch letal enden. Als Pathogenitätsfaktoren werden hitze-stabile und hitze-labile Entcrotoxine sowie Hämolysine diskutiert. Frische Isolate zeigen Zellinvasivität wie Shigellen. Am häufigsten werden Plesiomonas-Rntenüden in warmen Ländern wie Mexico und Bangladesh beschrieben. Therapie

Plesiomonas-lnfeklionen können erfolgreich mit Antibiotika wie Cotrimoxazol, Fluorchinolonen und Cephalosporinen behandelt werden. Prävention

In Risikogebieten sollten Wasser und Meeresfrüchte vor dem Verzehr ausreichend erhitzt werden. Eine akute Enteritis mit Nachweis von P shigelloides ist nach §7 IfSG meldepflichtig. Literatur BlNGEN, E., B. PlCARD, N. BRAHIMI, S. MATHY, P D E SJARDINS, J. Elion and E. DENAMUR: Phylogenetic

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4.5 Die Gattung Yersinia, Yersiniosen

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4.5 Die Gattung Yersinia, Yersiniosen JÜRGEN HEESEMANN

4.5.1 Überblick und Systematik Yersinicn sind gram-negative Stäbchenbakterien, die seit 1964 der Familie Enterobacteriaceae zugeordnet werden. Die inzwischen elf Arten umfassende Gattung Yersinia trägt den Namen zu Ehren des Entdeckers des Pesterregers, ALEXANDRE YERSIN (Hongkong-Pest, 1894). Yersinien sind hinsichtlich biochemischer, mikrobiologischer und pathogenetischer Eigenschaften ungewöhnlich heterogen, was ihre taxonomische Zuordnung erschwert. Von den elf bekannten Arten sind Y. pestis, Y. pseudotuberculosis und Y. enterocolitica humanpathogen. Y. pestis wird typischerweise durch den Biß von

Flöhen, die mit Y. pestis kolonisiert sind, übertragen und verursacht die als Pest bekannten, akuten, häufig fulminant verlaufenden Infektionen (Letalität 30-60%). Dagegen werden Y. pseudotubercidosis und Y. enterocolitica durch kontaminierte Nahrungsmittel aufgenommen und verursachen akute intestinale Infektionen mit in der Regel benignem Ausgang (sog. Yersiniose). Die Pathogenität dieser drei YersiniaArtcn wird von einem 70-Kilobasen (kb) großen Virulenzplasmid (pYV) determiniert. Yersinien. die kein pYV tragen, gelten als apathogen. Die übrigen Yersinia-Arlen sind in der Umwelt weit verbreitet. Nicht selten werden sie aus Stuhlproben von Mensch und Tier isoliert, ohne pathogene Bedeutung zu haben. Neben den für Warmblüter pathogenen Arten gibt es auch eine fischpathogenc Art: Y. ruckeri. Dieser Erreger verursacht die Rotmaulerkrankung bei Lachsen und Forellen. Aufgrund der häufig fulminant hämorrhagischen Verläufe entstehen große Verluste in Fischfarmen. Die medizinische Bedeutung der humanpathogenen Yersinien hat sich mit Beginn des 20. Jahrhunderts stark gewandelt. So spielt der Pesterreger, der in Asien, Europa und Afrika über 2000 Jahre lang verheerende Pandemien mit 50%-Dezimierung der Bevölkerung verursacht hatte, heute in Europa als Seuchenerreger keine Rolle mehr. Dagegen haben die enteropathogenen Yersinien insbesondere in Europa seit 1950 an medizinischer Bedeutung gewonnen. Nach Salmonellen und Campylobacter jejuni gehören sie zu den dritthäufigsten bakteriellen Enteritiserregern. Wie für Enterobacteriazeen typisch, können auch Yersinien aufgrund ihrer biochemischen Leistungen („Bunte Reihe") charakterisiert und nach Arten differenziert werden. Die humanpathogenen Yersinien werden weiter subtypisiert nach Biotypcn/Biovare und Serotypen/Serovare. Die Heterogenität und teilweise schlechte Reproduzierbarkeit der biochemischen Leistungen hat viele Jahre Schwierigkeiten bei der taxonomischen Zuordnung das Genus Yersinia bereitet. Mit der genomischen Charakterisierung der Enterobacteriazeen konnte schließlich auch ein Stammbaum für den Genus Yersinia erstellt werden. In Abb. 4.18 ist ein Dendrogramm dargestellt, das sich aus dem Homologiegrad der 16S-r-RNA (bzw. r-DNA)-Sequenzen ergibt. Drei Besonderheiten fallen auf: K Y. pestis und Y. pseudotubercidosis haben identische 16S rDNA Sequenzen und müßten daher einer Art

315

316

Spezielle Bakteriologie

Abb. 4.18 Dendrogramm des Genus Yersinia errechnet aus der Sequenzverwandtschaft der 16-S rDNA. Die phylogenetische Distanz 0.05 ist als Einheit dargestellt.

zugeordnet werden (z.B. Y. pseudotiiberculosis, Subspecies pseudotiiberculosis und Subspecies pestis). Darüber hinaus zeigen Homologieverglcichc mit anderen konservierten Genen, daß Y. pestis aus Y. pseudotuberculosis hervorgegangen ist. Y. enterocolitica kann in zwei Gruppen autgetrennt werden: Die Biovar 1 B-Gruppe kommt praktisch nur in Nordamerika vor („Neuwelt-Yersinien") und hat sich wahrscheinlich sehr früh von der übrigen Biovar 1A, 2-4-Gruppe („Altwelt-Yersinien") getrennt entwickelt. Der nächste Verwandte zu der hochpathogenen Y. peslis/Y. pseudotuberculosis-Grwppe ist Y. frederiksenii, ein harmloser Umweltkeim. Damit wird deutlich, daß phylogenetische Marker mit hochkonservierten Sequenzen (wie 16S rDNA u.a.) die taxonomische Eingruppierung der Mikroorganismen in ein allgemeingültiges System ermöglichen, dagegen aber keine Aussagen zur Pathogenität einer Bakterienart zulassen.

colitica Biovare 1B und 2-5 sind Träger eines gemeinsamen Virulenzplasmids von 70 kb (pYV, Abb. 4.19). Etwa 50% der genetischen Information des pYV dient dem Aufbau eines Typ IIIProt ein -Sekret ions/Translokations- Systems. Typ III-Systeme werden von zahlreichen pflanzen- und tierpathogenen gram-negativen Bakterien (z.B. Salmonellen, Shigellen, Escherichia coli, Pseudomonas spp.) genutzt, um Pathogenitätsfaktoren in Wirtszcllcn zu „injizieren". Bei diesen Pathogenitätsfaktorcn handelt es sich in der Regel um Effektorproteine, die modulierend (aktivierend oder inaktivierend) auf Signaltransduktionskaskaden , Zytoskelettumlagerungen und Regulation von Genen der Wirtszelle einwirken (sog. Moduline). Da der BakterienZellkontakt das Typ III-System aktiviert bzw. den Transportkanal öffnet, spricht man auch von polarisierter Protcin-Translokation (Abb. 4.20). Als weitere Besonderheit bietet das Typ III-System der Bakterienzelle die Möglichkeit. Effektorproteine mit Chaperonen (Stabilisatorproteine) zu stabilisieren und im Zytoplasma zu speichern, um sie dann nach Kontakt mit z.B. Makrophagen blitzschnell zu injizieren. Die Typ III-Systeme der gram-negativen Bakterien ähneln sich in der Genorganisation und -sequenz und haben sich wahrscheinlich aus den Genen der Flagellen-Basalkörper entwickelt.

4.5.2 Pathogentitätsprinzip Das Pathogenitätsprinzip von Yersinien ist ein Paradigma für extrazelluläre Erreger. Die Pathogenität wird von mobilen genetischen Elementen determiniert, die chromosomal und extrachromosomal lokalisiert sind (Pathogenitätsinsel und Plasmide). Y. pestis, Y. pseudotuberculosis und die humanpathogenen Y entero-

Abb. 4.19 Elektronenoptische Darstellung des Virulenzplasmids von Y. enterocolitica, Serotyp 03 (8000x, Länge ca. 23 Lim).

4.5 Die Gattung Yersinia, Yersiniosen

Abb. 4.20 Interaktion von Yersinia enterocolitica mit einem Makrophagen (schematisch). Die Adhärenz wird über das Invasin/ßl Integrin und über YadA mit unbekanntem Rezeptor dargestellt. Der Typ Ill-Sekretions/Translokationsapparat bildet wahrscheinlich eine durchgängige „Röhre" zwischen bakteriellem und zellulärem Zytoplasma. Die Effektorproteine (Yop E, H, M, O, P und T) werden in die Wirtszelle transloziert und inhibieren die Bildung von Streßfasern (RhoA) und Lamellopodien (Rac), sowie die Signaltransduktionskaskade von Integrinen zu Transkriptionsfaktoren (NF K-B). Weitere Erläuterungen im Text.

Trotz dieser Gemeinsamkeiten im Typ Ill-Sekretionsapparat unterscheiden sich die verschiedenen Erreger durch ihr Repertoire an Effektorproteinen und damit auch hinsichtlich ihres Pathomechanismus. Welche Funktionen sollten Effektorproteinc erfüllen, damit die Strategie eines extrazellulären Erregers Erfolg haben kann? In Abb. 4.20 sind Signaltransduktionswege und zelluläre Reaktionen dargestellt, die durch Yersinia-Kontakt moduliert werden. Zum angeborenen Immunsystem gehört ein Frühwarnsystem, das mikrobiclle Zucker- und Peptidmuster („pathogen recognition pattern") über Membranrezeptoren von z.B. Makrophagen erkennt und in Signale für Zellreaktionen (z.B. Zytokinproduktion. Ausschüttung von Defensinen und reaktiven Oxygen-/ntermcdiaten (ROI), Phagozytose u.a.,) weiterleitet. Durch Injektion der Ei'fcktorproteine (Yersinia outer proteins YopE, H, M, O, P und T) können Yersinien diese Zellreaktionen inhibieren. Die an Phagozytose und Immunreaktionen beteiligten Rezeptoren (Fc-Rezeptoren, Integrine) werden nach Proteintyrosinphosphorylierung aktiviert und durch die Tyrosinphosphatase YopH dephosphoryliert und damit inaktiviert (Tab.

4.15). Signale, die zur Aktivierung von NF K-B (nuklearer Faktor, aktiviert als Transkriptionsfaktor zahlreiche Zytokin- und Antikörpergenc und inhibiert den programmierten Zelltod/Apoptose) führen, werden durch YopP blockiert. Phagozytose und ROI-Bildung werden durch kleine GTP-bindende Proteine (Rho und Rac) reguliert. Die Effektorproteine YopE und YopT inaktivieren Rac bzw. Rho. Zusammenfassend führt die Translokation der Yops zur Zellparalyse und ggf. zum programmierten Zelltod, wodurch den Yersinien die extrazelluläre Lokalisation ermöglicht wird. Neben den Yops produzieren die enteropathogenen Yersinien ein plasmidkodiertes äußeres Membranprotein, das oligomere Fibrillen mit Köpfchenstrukturen bildet (sog. „lollipops"). Dieses Membranprotein hat Zelladhäsinfunktion (Yersinia /Idhäsin, YadA), es bindet diverse extrazelluläre Matrixproteine und schützt die Bakterienzelle vor Komplementlyse. Defensinen und LPS-Erkennungsproteinen. Das YadA wird wie die Yops erst bei Wachstumstemperaturen über 30 °C produziert. YadA-spezifisches Antiserum agglutiniert YadA-positive Yersinien und kann deshalb zur schnellen Differenzierung von pathogenen und apathogenen Yersinien aus Stuhlproben genutzt werden. Das Y. pestis-pW trägt ebenfalls das yadA-

317

Spezielle Bakteriologie

318

Tab. 4.15 Pathogenitätsfaktoren bei humanpathogenen Yersinien Determinante

Y. pestis Y. pseudotuberculosis colitica

Phänotyp/Funktion

Y. entero-

chromosomal inv

Invasin, Interaktion mit ß1-lntegrin, Translokation durch M-Zellen

-

+

+

HPI

Pathogenitätsinsel, Eisenversorgung über Yersiniabactin, Yersiniabactin/Pestizinrezeptor

+

+/-

+/-

hms

Hämin-Speicherproteine, Kolonie-Pigmentation, Y. pest/s-Aggregation im Vormagen des Rattenflohs

+

-

ysc

Typ Ill-Sekretion/Translokation

+

+

+

yadA

Yersinia-Adhäsin für Zellen und ECM, Schutz vor Komplementlyse, Defensine

-

+

+

YopE

Inhibition der Aktivierung von Rac und damit von Phagozytose und ROI-Produktion

+

+

+

YopH

Proteintyrosinphosphatase

+

+

+

YopO

Protein-Serin/Threoninkinase, Interaktion mit Rho und Rac

+

+

+

YopP

Inhibition des Transkriptionsfaktors NF K-B, Apoptoseinduktion

+

+

+

YopT

Inhibiert RhoA und damit Streßfaserbildung

+

-

+

YopM

Hemmung der Thrombozytenaggregation

+

+

+

caf

Fraktion 1 Protein, Proteinkapsel

+

-

-

ymt

Yersinia murines Toxin, wirkt als Lipase D im Flohvormagen auf Erythrozyten, kein Virulenzfaktor

+

pla

Plasminaktivator im Warmblüter, Erregerdissemination

+

-

psm

Pestizin, lysozym-ähnliche Wirkung auf HPI-tragende Yersinien (FyuA/Psn-Rezeptor), keine pathogenetische Bedeutung

+

-

-

pim

Pestizin-Immunität

+

-

-

extrachromosomal pYV (70 kb)

pFRA(100kb)

pCPC (10 kb)

Gen. Es wird aber nicht exprimiert aufgrund einer Punktmutuation. Der Pesterreger bildet stattdessen eine Proteinkapsel aus. die aus dem Fraktion 1(F1)Protein besteht, das nicht in der äußeren Membran

verankert ist. Das Fl-Protein wird in großen Mengen von Y. pestis produziert und freigesetzt (Nachweis in Blut. Urin. Pestbeule). Wahrscheinlich schützt Fl Y. pestis vor Phagozytose. Das Fl-Protein wird von ei-

4.5 Die Gattung Yersinia, Yersiniosen

nein Operon auf dem für Y. pestis typischen 100 kbPlasmid pTOX kodiert. Auf dem pTÖX befindet sich auch ein üen für eine Lipase D, das für das Überleben und Vermehren von Y. pestis im Rattenflohmagen verantwortlich ist. Y. pestis trägt noch ein drittes Plasmid von 10 kb (pCPC), das für eine Protease mit Plasminogen-aktivierender Potenz kodiert und für die Dissemination der Pesterreger nach Inokulation durch Flohbiß verantwortlich ist Darüber hinaus kodiert pCPC für ein Bakteriozin mit Lysozym-ähnlicher Wirkung (Pestizin. s. Tab. 4.15). Der Rezeptor des Pestizins ist das äußere Membranprolein FyuA/Psn (/erric yersiniabactin »ptake Rezeptor bzw. Pertizin-Rezeptor). das zur Aufnahme des von hochpathogenen Ycrsinien produzierten Siderophores (Yersiniabactin) dient. Y. pestis ist in der Lage. FyuA-positive enteropathogene Yersinien durch Pestizin zu schädigen. Es wird spekuliert, daß Y. pestis Nagetierpopulationen vom „Konkurrenten" Y. pseiidottiberctdosis frei hält, und damit ausschließlich die eigene Ausbreitung sichert. Interessanterweise sind die Gene für YcrsiniabactinBiosynthese und Transport (incl. FyuA/Psn) auf einer /'nthogenitätsmsel (PAI) von 45 kb organisiert, die zwischen zwei asn /-RNA-Gcnen (r-DNA) lokalisiert ist. Da diese PAI für die Nagcticrvirulcnz der Yersinien verantwortlich ist (aufgrund der verbesserten Eisenversorgung durch Yersiniabactin), wird sie auch als „high pathogenicity island" (HP1) bezeichnet. HPITräger sind Y. pestis, Y. pseuäotuberculosis (Scrotyp O:l und andere Serotypen) und Y. enlerocolitica Biovar 1 B. Interessanterweise tragen fast alle Escherichia to//'-Isolate von Patienten mit Sepsis oder Harnwegsinfektionen die HPI von Y. pestis (Virulenzfaktor für E.colH). Benachbart zur HPI ist bei Y. pestis ein Gencluster für Hämin-Bindung lokalisiert (hem'm .vtorage locus, hms). Neben Hämin kann auch der Farbstoff Congorot gebunden werden. Auf Hämin- oder Congorothaltigcn festen Nährmedien bildet Y. pestis bei 26 °C dunkelrot pigmentierte Kolonien (Pgm+). Dieser Phänotyp Pgm ist in der Regel mit dem Vorhandensein der HPI gekoppelt, weshalb Pgm -Mutanten als weniger virulent gelten. Inzwischen konnte gezeigt werden, daß die Hms-Proteine für die Autoaggregation von Y. pestis im Ratlenflohvormagen verantwortlich sind und damit für die Übertragung von Y. pestis vom Floh auf den warmblütigen Wirt. Ein weiterer Unterschied zwischen Y. pestis und enteropathogenen Yersinien besteht hinsichtlich der Zcllinvasivität. Y. enlerocolitica und Y. pseudoluberculosis produzieren ein Invasin (Inv), das im Darm für die Bindung an M-Zellen («ricrofold-cells, die zur Mucosa der PEYER-Plaquc gehören) und Translokation der Erreger basalwärts verantwortlich ist. Bei Y. pestis ist das Gen für Inv zwar im Chromosom auch vorhanden, jedoch durch eine Insertion inaktiviert (keine Darminvasivität).

Zusammenfassend nutzen alle pathogenen Yersinien im warmblütigen Wirt eine ähnliche Strategie, um als extrazelluläre Erreger zu überleben und sich zu vermehren. Für die Initialphase der Infektion haben sie aber unterschiedliche Über-

tragungs- bzw. Invasionsmechanismen entwickelt. Die enteropathogenen Yersinien müssen die Magen-Darmpassage überleben und über M-Zellen der PKYHR-Plaque-Mukosa in das Subepithelium eindringen. Y. pestis muß dagegen im Rattenfloh (Vektor, 28 °C) so überleben, daß er effektiv durch den Flohbiß auf den Wirt (37 °C) übertragen wird. Nach Dissemination muß es zur Bakteriämie mit Y. pestis kommen, damit Rattenflöhe bei der Blutmahlzeit infiziert und damit zu Vektoren werden.

4.5.3 Yersinia pestis, Pest Geschichte der Pest

Drei Pestpandemien können als gesichert angenommen werden. Die erste Pandemie im 6. Jahrhundert breitete sich von Ägypten über Europa aus und dauerte über 50 Jahre. Im Jahr 1347 breitete sich dann von Zentralasien über die Halbinsel Krim die zweite Pandemie aus, die bis 1353 fast alle Teile Europas und Nordafrikas erfaßt hatte. Ein Viertel der Bevölkerung wurde durch den „Schwarzen Tod" ausgerottet. Danach wurden in zeitlichen Abständen von 10 bis 40 Jahren bis zum Beginn des 18. Jahrhunderts zahlreiche Pestepidemien in Europa registriert. Nach zwei Jahrhunderten der Erholung führte die um 1860 beginnende Pestepidemie in China zur dritten Pandemie, in der der Erreger global nach Südamerika (1899), Nordamerika (1900) und Südafrika (1900) verbreitet wurde. Während dieser Pandemie wurde der Pesterreger 1894 von dem Welschschweizer A. YERSIN in Hongkong entdeckt und charakterisiert. Wenige Jahre nach YERSINS Entdeckung wurde auch klar, daß der Pesterreger durch Ratten verbreitet und durch Rattenflöhe auf den Menschen übertragen wird. Eigenschaften von Yersinia pestis

Mikrobiologisch stellt sich der Erreger als gramnegatives kokkoides Stäbchen ohne Polysaccharid-Kapsel und Geißeln dar. Subkultivierung führt häufig zu Pleomorphismus. Der Erreger wächst auf anspruchslosen Nährmedien aerob und fakultativ anacrob bei Wachstumstemperaturen zwischen 4-37 °C. Gut sichtbare Kolonien entstehen nach 48-72 Stunden bei 28 °C. Wird Y. pestis auf scrumhaltigen Nährmedien angezüchtet, zeigen frische Isolate im Dunkelfeld die Fraktion 1-Proteinkapsel. Wegen der fehlenden Synthese von O-spczifischen Zuckerketten ent-

319

Spezielle Bakteriologie

320

hält das LPS von Y. pestis nur das Kerngerüst und kann nicht nach O-Serovarietäten differenziert werden. Stattdessen können drei Biovarietäten unterschieden werden, die von großer epidemiologischer Bedeutung sind. Von den zwei Substraten Glycerin und Nitrat kann die Biovar „antiqua" beide Substrate, die Biovar „mediaevalis" nur Glycerin und die Biovar „orientalis" nur Nitrat umsetzen. Subkultivierungen bei 37 °C können schnell zum Verlust der Pathogenität (Verlust des Virulenzplasmids pYV) führen. Auf festen Nährmedien mit geringer Calciumionenkonzentration ( Calciumpräzipitation mit Natriumoxalat) und hoher Magnesiumionenkonzentration (20 mM) wachsen pathogene Yersinien extrem langsam (kaum sichtbare Kolonien), wogegen apathogene keine Wachstumshemmung erfahren (calciumabhängiges Wachstum ist Plasmid-abhängig). Der Pesterreger kann durch Hitze (56 °C über 15 min), UVLicht und Desinfektionsmittel in kurzer Zeit abgetötet werden. Jedoch kann Yersinia pestis über Wochen in getrocknetem Blut und über Monate in Flohkot und in feuchter Erde (Nagetierbauten) bei Dunkelheit und Temperaturen zwischen 10 °C und 25 °C überleben. Pathogenese Infizierte Flöhe übertragen Y. pestis durch Rcgurgitation des Vormageninhalts beim Saugversuch am Menschen. Zunächst wird der Erreger von den Phagozyten (Granulozyten, Monozyten) internalisiert. Der Temperaturwechsel vom Kaltblüter (Floh) zum Warmblüter sowie die niedrige intrazelluläre Calciumkonzentration aktivieren Plasmidgene, was zur Zerstörung des Phagozyten führt. Der jetzt extrazellulär lokalisierte Erreger wird phagozytoscresistent durch Produktion des Fl-Kapselproteins. Schnelle extrazclluläre Vermehrung und Produktion des Plasminogenaktivators Pia begünstigen eine lymphogene Dissemination bis hin zur Septikämie. Trotz transitorischer Bakteriämien muß es nicht primär zur Pestseptikämie kommen. In den meisten Fällen werden zunächst die regionären Lymphknoten befallen (Beulen- oder Bubonenpest, Abb. 4.21), die dann eitrig nekrotisch zerfallen. Auch andere Organe können massive hämorrhagischc Schädigungen (siehe plasmidkodierle Pathogenilätsfaktoren) entwickeln. Beim Husten von Pesterkrankten entstehen Aerosole, die Pesterreger enthalten können. Übertragun-

gen dieser Art führen innerhalb von 2-5 Tagen zur letal verlaufenden Lungenpest. Klinik Die häufigste Form der Pesterkrankung (80-90% der Fälle), ist die Beulenpest (Bubonenpest). Besonders betroffen sind beim Erwachsenen inguinalc, gefolgt von axillaren Lymphknoten, während Kleinkinder häufiger eine zervikale Lymphadenopathie entwickeln (Abb. 4.21). Bereits zwei Tage (in der Regel 5-7 Tage) nach Infektion durch einen Flohstich können uncharakteristische Krankheitssymptome wie Fieber, Übelkeit, Durchfall, Kopfschmerzen und Schwindel auftreten. Typisch für die Beulenpest sind einer und manchmal mehrere tastbare, schmerzhafte Lymphknoten, die den Patienten zur Schonhaltung veranlassen. Hautverletzungen, die evtl. auf einen Flohstich oder ein Trauma hinweisen könnten, fehlen in der Regel. In wenigen Tagen können die Bubonen Hühnereigröße erreichen und haben eine gelatinöse Konsistenz. In wenigen Fällen (10-5%) manifestiert sich eine Pestseptikämie ohne vorhergehende Lymphadenitis. Auch aus der Bubonenpest kann sich eine systemische Infektion mit Endotoxinschocksymptomatik (Verbrauchskoagulopathie, Organversagen, Meningitis, Purpura) entwickeln. Gangröse Hautnekrosen, die einer Pestpurpura folgen, haben wahrscheinlich zu der Bezeichnung „Schwarzer Tod" geführt. Die Pestpneumonie oder Lungenpest ist besonders gefährlich. Sie zeigt einen fulminanten Verlauf

Abb. 4.21 Beulenpest bei l0jährigem Mädchen (B. Velimirovic).

4.5 Die Gattung Yersinia, Yersiniosen

und ist hoch infektiös (primäre Lungenpest, Ausbreitung über Aerosole, besonders bei Versammlungen in feucht-kalter Luft, z.B. in Kirchen). Während der dritten Pandemie um die vorige Jahrhundertwende betrug die Letalität der Pest 50-90%. Bei rechtzeitiger Gabe von Antibiotika nimmt die Pesterkrankung einen benignen Verlauf. Die Letalität liegt heute zwischen 10-14%. Diagnose

Wenn eine ausführliche Anamnese und Patientenuntersuchung vorgenommen wurden, sollte in der Regel die Diagnose „Bubonenpest" keine Schwierigkeiten bereiten. Differentialdiagnostisch kommen in erster Linie Tularämie (Francisella tularensis) aber auch Infektionen mit Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Viren und Toxoplasma gondii in Frage. Bei Verdacht auf Bubonenpest sollten immer mehrere Blutkulturen (50-80% positiv) abgenommen werden. Bubonenaspirat kann nach Präinjektion von 1 ml physiologischer Kochsalzlösung leichter gewonnen werden. Aspiratausstriche sollten nach GRAM (negative Stäbchen) und nach WAYSON (bipolare Stäbchen, Sicherheitsnadelform) angefärbt werden. Die Erregeridentifizierung kann mittels Antikörper gegen Fl-Antigen in der indirekten Immunfluoreszenz erfolgen. Darüber hinaus gibt es einen hochsensitiven „capture-ELISA" und ein „dipstick" zum schnellen Nachweis von Fl-Antigenen in BuboAspirat. Weiteres Aspiratmaterial dient zur Erregeranzucht (Blutagar, MACCONKEY Agar). Eine akute Pesterkrankung kann serologisch nicht diagnostiziert werden. Deshalb dient der Antikörpernachweis gegen Fl-Antigen (auch im Tier) mehr epidemiologischen Zwecken. Akutund Konvaleszentenseren sollten deshalb gesammelt werden. Wegen des hohen Infektionsrisikos ist das Arbeiten mit Pestbakterien nur bei ministerieller Sondergenehmigung in entsprechenden Sicherheitslaboratorien erlaubt. Therapie

Als wirksame therapeutische Antibiotika haben sich Streptomycin (1. Wahl), Tetrazyklin und Chloramphenicol bei Pestmeningitis erwiesen. Als Antibiotikaprophylaxe kann Sulfmethoxazol/Trimethoprim empfohlen werden. Multiresistente Pesterreger wurden 1995 in Madagaskar

nachgewiesen (resistent gegen Ampicillin, Chloramphenicol, Tetracyclin, Sulfonamid, Slreptomyein). Epidemiologie

Das Reservoir des Pesterregers sind Wildnagetiere, die durch Flöhe chronisch mit Yersinia pestis infiziert werden. Wildnagerpestreservoire („Sylvatic plague foci") haben sich überall dort etabliert, wo entsprechende klimatische und topographische Voraussetzungen für eine PestEnzootie bestehen (Abb. 4.22). Über 200 verschiedene Nagetierarten, aber auch Carnivora, unterhalten das Reservoir der sylvatischen Pest. Klimatische Einflüsse, der Anteil von Yersinia pesfts-empfänglichen und -resistenten Wildtieren, die Flohpopulation, die Art des Kontaktes zur zivilisierten Umwelt sowie die sozialen und hygienischen Lebensbedingungen der Bevölkerung entscheiden darüber, ob aus der Enzootie der Wildnager eine Epizootie der urbanen Rattenbestände (Wanderratte, Hausratte) wird, aus der sich dann nach wenigen Wochen des Rattensterbens die Pestepidemie in der Bevölkerung entwickeln kann (Abb. 4.23). Voraussetzung der Pestausbreitung beim Menschen sind infizierte Rattenflöhe (Xenopsylla cheopis), die mit viel höherer Effizienz als Menschenflöhe (Pulex irritans) Y. pestis übertragen

können.

Pestepidemien sind in der Regel selbstlimitierend. Mit dem Sterben der urbanen Ratten (Rattiis norvegicus, Rattus rattus) wird auch die Population der wirtsadaptierten Rattenflöhe und damit der Pest-Vektor reduziert. Daneben spielen die jahreszeitlich bedingten Veränderungen des Klimas eine Rolle. Die optimale Überlebenszeit von infizierten Rattenflöhen liegt bei 10 °C und höher. Luftfeuchtigkeit, Trockenkaltes oder trockenheißes Klima wirken der Pestausbreitung durch Flöhe entgegen. Voraussetzungen für Pestepidemien sind in industrialisierten Regionen wie z.B. Westeuropa nicht mehr gegeben. Trotzdem muß mit sporadischen Pestkranken (Touristen aus Enzootiegebieten) weiterhin gerechnet werden (s. Tab. 4.16 und Abb. 4.22). Pestinfektionen nach Verarbeitung von infizierten Ziegen, Kamelen und Wildtieren wurden ebenfalls beschrieben.

321

322

Spezielle Bakteriologie

Abb. 4.22 Pestgebiete oder -herde (WHO 1977).

Prophylaxe Immunprophylaxe (aktive Immunisierung) ist nur von kurzer Dauer (ca. 6 Monate). Naturpestherde sollten kontrolliert werden, damit Epizootien rechtzeitig erkannt werden. Der Ver-

dacht, die Erkrankung und der Tod an einer Pesterkrankung sowie der Nachweis von Yersinia pesüs sind meldepflichtig (IfSG §6 und §7). Die Pest gehört zu den quarantänepflichtigen Krankheiten.

Abb. 4.23 Übertragungsweise des Pesterregers und die daraus resultierende Pestepidemie.

4.5 Die Gattung Yersinia, Yersiniosen

Tab. 4.16 Gemeldete Fälle an Pestkranken und -toten 1980-1994 WHO, 1996) Kontinent Afrika Madagaskar Tansania Zaire

Erkrankte

Tote

10155 1 390 4964 2242

1344 302 419 531

Amerika Brasilien Peru USA

2923 700 1722 229

184 9 112 33

Asien Indien Myanmar Vietnam

5661 876 1 160 3 304

325 54 14 158

18739

1853

Total

zu einer weiteren Aufspaltung in bis heute 11 Arten des Genus Yersinia (s. Abb. 4.18).

4.5.4 Enteropathogene Yersinien, Y. pseudotuberculosis und Y. enterocolitica Geschichte

MALASSEZ und VIGNAL beschrieben 1883 eine tuberkuloseähnliche Erkrankung bei einem Meerschweinchen, das zuvor mit eitrigem Material eines an einer „tuberkulösen Meningitis" verstorbenen Patienten inokuliert wurde. Histopathologisch fanden sich im Gegensalz zur typischen Tuberkulose gallertig verquollene Bakterienmassen (Zoogloea) in den betroffenen Organen. Für diese Erkrankung wurde die Bezeichnung „Pseudoluberculose" eingeführt. PFEIFFER konnte 1889 schließlich den Erreger der „Meerschweinchen-Pseudotuberculose" isolieren und charakterisieren. Er nannte ihn „Bacillus pseudotuberculosis rodentium". Die ersten humanen Yersinia pseudotuberculosis-lntektionen wurden 1910 von AEBRFXHT beschrieben. Im Jahr 1954 wurde schließlich der ätiologische Zusammenhang zwischen Y. psendotuberculosis und der retikulozytär abszedierenden mesenterialen Lymphadenitis aufgezeigt. Die Geschichte der Yersinia enterocolitica beginnt 1938 mit der Isolierung von „Bacterium entcrocoliticum" aus einer granulomatös veränderten Hautläsion. Danach wurden immer häufiger Pasteurella pseudoüibercuIosis-ähnMchc Isolate von Nagetieren und Menschen beschrieben, die an der sogenannten Pseudotuberkulose. Enteritis oder mesenterialen Lymphadenitis erkrankt waren. Diese biochemisch und serologisch uneinheitliche Gruppe von Erregern, zu der noch ubiquitär vorkommende apathogene Isolate hinzukamen, wurde zunächst als Pasteurella X und 1965 als Yersinia enterocolitica zusammengefaßt. DNA-Hydridisierungsuntersuchungen und Sequenzvergleiche der 16S rDNA führten schließlich ab 1980

Eigenschaften

Wie Y. pestls sind auch Y. pseudotuberculosis und Y. enterocolitica gram-negative, sporenlose, nicht selten kokkoide Stäbchenbaklerien, die aerob und fakultativ anaerob wachsen sowie Zytochromoxidase negativ und Katalasc positiv sind. Tm Unterschied zu Y. pestis sind die enteropathogenen Yersinien mono- bis peritrich begeißclt und beweglich.Die Beweglichkeit wird optimal bei Wachstumstemperaturen von 22-28 °C ausgebildet, jedoch nicht bei 37 °C, und wird daher als Differenzierungsmerkmal verwendet (Tab. 4.17). Für die Testung biochemischer Aktivitäten mit kommerziellen Testsystemen sollten Temperaturen um 28 °C gewählt werden, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Yersinien sind psychrophil (kälteliebend),d.h. sie können sich noch bei Temperaturen zwischen 0-4 °C vermehren, was bei der Erregerisolierung aus Patientenmaterial durch Kälteanreicherung genutzt wird (s.u.). Die enteropathogenen Yersinien haben unterschiedliche Eisenversorgungssysteme. Alle humanpathogenen Yersinien können Hämin verwerten. Die enteropathogenen Yersinien können zusätzlich Hydroxamat-gebundencs Eisen (z. B. Ferrioxamin B, Desferral®) aufnehmen. Die für Mäuse hoch virulenten Stämme (Y. pseudotuberculosis und Y. enterocolitica Biovar 1B) haben ein endogenes Eisenversorgungssystem (Yersiniabactin, HPI, Tab. 4.15), das als wichtiger Pathogenitätsfaktor (Maus-Virulenzfaktor) und als Überlebensfaktor in der unbelebten Natur (z.B. Flußwasser) zu bewerten ist. Biochemische und serologische Differenzierung

Biochemisch scheinen die Y. pseudotuberculosisIsolate einer einheitlichen Gruppe anzugehören. Dagegen wurden bei Y. enterocolitica von WAUTERS (1987) sechs Biovarietäten definiert (1-6, Tab. 4.18), wobei die Biovarietäten 1B in Nordamerika sowie 2 und 4 in Europa medizinisch besonders bedeutsam sind. Die Biovarietäten 3 und 5 sind in der Regel tierpathogen (Chinchilla, Ziege, Hase u.a.), wogegen die als Biovar 1B bezeichneten Y. enterocolitica-lsolate keine humanpathogene Bedeutung haben. Die enteropathogenen Yersinien können nach O- und H-Antigenen in Serovarietäten unterteilt werden. Diese serologische Differenzierung

323

Spezielle Bakteriologie

324

Wichtige biochemische Differenzierungsmerkmale der verschiedenen Vers/n/a-Arten Beweglichkeit bei 28°C

Art

Ornithin

Saccha- Äskulin rose

Melibiose

Calciumabhängiges Wachstum, 37 °C

-/+ + -

+ + +

+ -

-

Humanpathogene Yersinien Y. pestis

-

-

-

-

Y, pseudotuberculosis

+

-

-

+

Y. enterocolitica Biovar 1B-5

+

+

+

-

Nicht-humanpathogene Yersinien Y. enterocolitica Biovar 1A

+

+

+

+

Y. intermedia

+ + +

+

+

+

+ +

+ -

+ -

Y. frederiksenii Y. kristensenii + = vorhanden bzw. Spaltung von;

- = fehlt bzw

keine Spaltung von, -/+ = wechselndes Verhalten

ist nicht nur aus epidemiologischen Gründen sinnvoll, sondern sie hat bei Y. enterocolitica auch pathogenetische Bedeutung. Für Y. pseudotuberculosis wurden acht Serogruppen beschrieben (I-VIII), die in Untergruppen (z. B. IA, IB) weiter differenziert werden können. In Europa haben praktisch nur die Serogruppen T, II und III humanmedizinischc Bedeutung. Von den über 60 verschiedenen O-Antigenen, die bei Y. enterocolitica beschrieben wurden, kommen in Europa mit fallender Häufigkeit die Serovarietäten O3 (Biovar 4), O9 (Biovar 2) und O5,27 (Biovar 2 oder 5) bei Patienten vor, während in Nordamerika Biovar IB mit den

Serovarietäten O8. O13, O20 und O21 medizinisch bedeutsam ist. In den letzten Jahren haben allerdings Patientenisolate der „europäischen" Serovar O3 in den USA rapide zugenommen und die Häufigkeit von Biovar 1 B-Isolaten übertroffen. Bei der serologischen Differenzierung sollten Kreuzreaktivitäten mit anderen gramnegativen Bakterien beachtet werden, um eine voreilige falsche Speziesidentifizierung zu vermeiden (s. Tab. 4.19). Pathogenese

Im oralen Mausinfektionsmodell, bei dem die akute Yersiniose ähnlich verläuft wie beim Men-

Spezies

Serovar

Kreuzreaktivität

Y. pseudotuberculosis

II A

Salmonella der Gruppe (O4,27)

IV A

f. co//017,077 Enterobacter cloacae

Y. enterocolitica

IV B VA VI

Salmonella der Gruppe D (O9,46) Salmonella der Gruppe H (O14) E. coli O55

O:3

Y. frederiksenii (O3)

O:9

O : 5 , 27

Y. intermedia (O3) Y. kristensenii (O3) Brucella spp. £. co//(O157) Morganella morganii Salmonella der Gruppe N (030) Pseudomonas maltophilia Vibrio cholerae (O1) Y. enterocolitica (O5, Biovar IA) E. coli O97

Tab. 4.18 Kreuzreaktivitäten zwischen Yersinien und anderen gram-negativen Bakterien

4.5 Die Gattung Yersinia, Yersiniosen

Ŷ Reaktive Arthritis

Ŷ Urticaria

Ŷ Morbus REITER

Ŷ Sweet-syndrom

Ŷ S Arthralgien, Myalgien Ŷ Erythema nodosum

Ŷ Fernöstliches scharlachähnliches Fieber Ŷ KAWASAKi-ähnliches Syndrom

Ŷ Uveitis anterior

Ŷ CUILWIN-BARRE-Syndrom

sehen, konnte gezeigt werden, daß die enteropathogenen Yersinien zunächst in das darmassoziierte lymphatische Gewebe (vorwiegend in die PEYER-PIaques des terminalen Ileums) eindringen, sich dort vermehren und Abszesse bilden. Dann brechen sie einerseits in das Darmlumen ein, andererseits breiten sie sich über die abfließenden Lymphgefäße in die mesenterialen Lymphknoten aus. Nachfolgend weiden wahrscheinlich luminal wie auch retrograd weitere Darmabschnitte durch Y. enterocolitica befallen und geschädigt, wodurch die endoskopisch und histologisch beobachteten oberflächlichen aphthoiden Ulzerationen des Ileums und Kolons bei Yersiniose-Patienten zu erklären sind. Die Y. pseudotuberculosis-lnfeklion beschränkt sich dagegen vorwiegend auf das lymphatische Gewebe des terminalen Ileums und die mesenterialen Lymphknoten. Histologisch manifestiert sich diese Yersiniose als retikulozytär abszedierende Lymphadenitis (MASSHOFF) oder als unspezifische mesenteriale Lymphadenitis. In der Regel bleibt die Yersinia pseudotuberculosis-lnfektion auf den mesenterialen Bereich begrenzt. Bei schweren Grunderkrankungen wie Leukämie, hämolytische Anämie (Thalassämie u.a.), Diabetes mellitus, Leberzirrhose, Hämosiderose u. a. kann auch ohne vorhergehende Enteritis eine Yersinia-lnfektion zur Sepsis führen mit Abszedierung in Leber und cxtramesenterialen lymphatischen Organen. Offenbar spielt die zelluläre Immunabwehr bei der Yersinia-lniektion eine wichtige Rolle. Im Tiermodell konnte gezeigt werden, daß Interfcron-aktivierte Makrophagen eine wichtige Effektorfunktion für die Eliminierung der Yersinien haben. Das therapeutisch besonders bei Dialysepatienten verwendete Eisenkomplexon Desferrioxamin B (Desferral®) kann von enteropathogenen Yersinien als „Eisenquelle" genutzt werden. Es ist deshalb nicht verwunderlich, daß gerade unter dieser Therapie Patienten häufiger eine Yersi«/a-Sepsis entwickeln. Die nicht seltene Übertragung von Y. enterocolitica auf Patienten durch Bluttransfusionen spricht dafür, daß latente YerS7ttw-Infektionen beim Menschen (z.B. Blut-

Tab. 4.19 YersinioseBegleit- und Folgeerkrankungen

spender) zu symptomfreien, transitorischen Bakteriämicn führen können. Klinik Yersinia pseudotuberculosis- und Y. enterocolitica-Infektionen (Yersiniosen) können ein breites Spektrum von klinischen Syndromen verursachen, die vom Alter, Abwehrzustand, Histokompatibilitätstyp (HLA-Systcm) und Geschlecht des Patienten abhängen. Säuglinge und Kleinkinder reagieren auf eine Y. enterocolitica-lnieklion in der Regel mit einer selbstlimitierenden (1-2 Wochen dauernden) akuten Gastroenteritis (Fieber, wäßriger bis blutiger Durchfall, Erbrechen u.a.). Die Erregerisolierfrequenz aus Stuhlproben ist bei dieser Altersgruppe am höchsten. Yersinia pseudotuberculosis- und Y. enlerocotitica-Infektionen manifestieren sich bei Schulkindern und Jugendlichen meistens als akute mesenteriale Lymphadenitis (Ileozökalwinkel) mit Fieber (> 38 °C), abdominalen Schmerzen im rechten unteren Quadranten („Pseudoappendizitis") und seltener mit Durchfällen (10-20% bei Y. pseudotuberculosis). Auch diese Erkrankungsform verläuft normalerweise ohne Komplikationen und heilt nach etwa zwei Wochen spontan aus. Aufgrund der Appendizitis-Symptomatik wird nicht selten eine unnötige Appendektomie vorgenommen (unauffällige Appendix bei akuter Lymphadenitis).

In diesem Zusammenhang muß erwähnt werden, daß bei Appendektomien mit positiver Appendizitis-Symptomatik nur in 2-4% der Fälle enteropathogene Yersinien (davon 95% Y. enterocolitica) aus Operationsmaterial angezüchtet werden. Bei jugendlichen Patienten mit Y. pseudotuberCM/o.v/.s-Infektionen ist häufiger auch das terminale Ileum betroffen (akute terminale Ileitis). Yersiniosen bei Erwachsenen können sehr unterschiedliche klinische Formen annehmen wie

325

326

Spezielle Bakteriologie

die des .,grippalen Infektes" mit Pharyngiüs, Myalgien und Fieber oder die der chronisch-rezidivierenden Ileokolitis mit Beteiligung der mesenterialen Lymphknoten („Pscudo-CROHN"). Nicht selten verursachen enteropathogene Ycrsinien bei Erwachsenen mit Grunderkrankung (Diabetes mellitus, Leberzirrhose, Immunsuppression) extramesenterialc fokale Infektionen wie Hepatitis mit Leberabszessen, Pleuritis, Perikarditis, Endokarditis, Osteomyclitis u.a. Neben fokal-septischen Erkrankungen können auch Yere/ma-Septikämien bei der zuvor genannten Patientengruppe und bei Patienten mit hämolytischer Anämie (z.B. Thalassämie) und Dialyse-Patienten während DesferrioxaminTherapie (s. o.) auftreten. Neben den mesenterialen und extramesenlerialen septischen Formen der Yersiniosen, bei denen in der Regel der Erreger aus den akut entzündlichen Bereichen kultiviert werden kann, können bis zu 30% der Yersiniosen mit aseptischen extramesenterialen Begleit- oder Folgeerkrankungen assoziiert sein (Tab. 4.19). Am häufigsten ist die HLA-B27-assoziierte, durch Yersinia induzierte reaktive Arthritis (40-80% HLAB27-positiv). Ein bis zwei Wochen nach einer ym/'/mj-Darminfcktion entwickeln Patienten (10-30% der Jugendlichen und Erwachsenen, selten Kinder) eine sterile Mono- oder Oligoarthritis, die in der Regel nach 4-12 Wochen wieder abklingt. Es kommen aber auch chronischrezidivierende Verläufe vor. Die Pathogenese ist nicht geklärt. Inzwischen konnten aber YersiniaAntigen und Immunkomplexe in der Synovia dieser Patienten nachgewiesen werden. Offensichtlich handelt es sich um eine durch bakterielles Antigen induzierte Entzündungsreaktion in der Synovialis (Synovitis). Das Erythema nodosum („infektallergische Vasculitis") tritt gehäuft bei Frauen an den unteren und selten an den oberen Extremitäten (Abb. 4.24) auf. Es kann auch mit einer reaktiven Arthritis assoziiert sein. Die in Tab. 4.19 (unvollständig) aufgelisteten Yersinia-Begicitoder Folgeerkrankungen zeigen, daß Yersiniosen keine medizinische Disziplin auslassen.

bei 28 °C, wogegen selektive Medien für Enterobacteriaceae nicht gut geeignet sind. Die Isolierung von Yersinia enterocolitica gelingt dagegen viel häufiger aus Stuhlproben. Die Isolierungsfrequenz kann fast verdoppelt werden, wenn zusätzlich Darmbiopsien und evtl. Operationsmaterial zur Verfügung stehen. Als besonderes Selektivmcdium hat sich Cefsulodin-Irgarsan-Novobiocin (CIN)-Agar erwiesen, aber auch Salmonella-Shigella (SS)-Agar erlauben eine effektive Isolierung. Kommerzieller CTNAgar mit 15 ug/ml Cefsulodin inhibiert das Wachstum von Yersinia pseudotuberculosis (besser 5 ug/ml) Die Bebrütung sollte bei 28 °C über 24-48 Stunden erfolgen. Die Psychrophilie der Yersinien wird bei der Kälteanreicherung genutzt. Patientenmaterial (Homogenat) wird in Phosphatpuffer aufgenommen und 2-5 Wochen bei 4 °C inkubiert. Wöchentlich werden Keimisolierungen auf Selektivmedien versucht. Bei der Kälteanreicherung werden jedoch häufig auch nicht-humanpathogene Yersinien isoliert (s. Tab. 4.17).

Laboratoriumsdiagnose Isolierung von enteropathogenen Yersinien

Yersinia pseudotuberculosis wird in der Regel aus Lymphknoten, Blutkulturen, Abszeßpunktaten und seltener aus Stuhlproben isoliert. Die Erstisolierung gelingt am besten auf Blutagar

Abb. 4.24 Patientin mit Erythema nodosum und nachgewiesener Yersiniose (Stuhlprobe: Y. enterocolitica O3).

4.5 Die Gattung Yersinia, Yersiniosen

Neben Anzuchtversuchen des Erregers aus Stuhlproben, Biopsie- und Operationsmaterial bieten sich drei Verfahren zur serologischen Diagnose an, die aber bei Kindern mit akuter Gastroenteritis in den ersten Krankheitstagen häufig negative Ergebnisse geben: Agglutination, ELISA und Immunoblot. Erhöhte WIDAI.Agglutinationstiter von (> 1:80 bis 1:5120) werden bei akuten Yersiniosen ab der 2. Krankheitswoche beschrieben. Die ELISA-Technik erlaubt eine klassenspezifische Analyse der Scrumantikörpertiter. Bei Verwendung von Ganzzcllantigen haben beide Methoden die geographisch bedingte Häufigkeit der Serotypen sowie unspezifische Reaktionen (Kreuzreaktivitäten, s. Tab. 4.18) zu berücksichtigen. Die Immunoblot-Methode verwendet dagegen pYVkodierte Yop-Antigene. Als besonders starke Antigene haben sich YopE, YopD und das VAntigen erwiesen, die Serotyp-unabhängig sind. Ein positiver IgA/IgM-lmmunoblot spricht für eine bestehende Yersiniose und positives igG/IgA für eine bestehende oder vor kurzer Zeit durchgemachte Yersiniose. Mit den klassenspezifischen serologischen Testen (ELISA, Immunoblot) konnte gezeigt werden, daß YersiHM-Begleiterkrankungen mit einer Yersinia-spezifischen IgA-Persistenz assoziiert sind. Blutspender mit latenter Yersiniose (transiente Bakteriämie) werden im IgM-Immunoblot erfaßt.

Therapie Da die mesenterialen Formen der Yersiniose gutartig verlaufen, ist eine Antibiotikatherapie nicht erforderlich. Dagegen müssen septische Verläufe antibiotisch therapiert werden. Die europäischen Y. enterocolitica Serotypen O3. O9 und O5,27 sind gegen Ampicillin resistent. Dagegen sind in der Regel Ureidopenicilline (Acylaminopenicilline), Cephalosporine der dritten Generation, Cotrimoxazol, Tetrazyklin, Aminoglykoside und Gyrasehemmer wirksame Therapeutika bei schweren Yersiniosen. Ob eine Antibiotikatherapie eine Kfr.s7«/fl-Folgeerkrankung günstig beeinflußt, ist bisher nicht erwiesen. Epidemiologie und Ökologie Trotz der nahen Verwandtschaft zu Y. pesris verläuft die Übertragung von Y. pseudotiiberculosis nicht über Flöhe, sondern über die mit Exkrementen von infektiösen Tieren kontaminierte Nahrung und Wasser (besonders Jungtiere sind empfänglich). Neben den Haus- und Wildnagetieren können auch Vögel zum natürlichen Reservoir von Y. pseudotiiberculosis gehören. Über die Nahrungsaufnahme infizieren sich wahrscheinlich auch Haus- und Nutztiere, die dann die Infektkette zum Menschen fortsetzen (Abb. 4.25).

Abb. 4.25 Übertragungswege von Yersinia pseudotubereuiosis und Kopplung der Reservoire.

327

328

Spezielle Bakteriologie

Die europäischen Serovarietäten O3, O9 und O5,27 von Y. enterocolitica können aufgrund ihrer geringeren Tiervirulenz (HPI-negativ) bei den meisten Nagetieren keine persistierenden Infektionen verursachen. Nagetiere spielen deshalb für diese Erreger allenfalls eine untergeordnete Rolle als natürliches Reservoir. Zahlreiche epidemiologische Untersuchungsergebnisse sprechen dafür, daß Wild- und Schlachtschweine die Hauptkeimreservoire für die weniger virulenten, humanpathogenen Y. enterocolitica-Serovarietäten sind (Abb. 4.26). Die Infektion beim Menschen erfolgt oral-alimentär wahrscheinlich über rohes Schweinefleisch, kontaminierte Milchprodukte, Salat (Fäkaliendüngung) und durch den Kontakt mit infektiösen Haustieren (Ratte, Hund, Katze). Auffällig ist die Häufung der Yersiniosen in der kälteren Jahreszeit. Inwieweit die Psychrophilie der entcropathogenen Ycrsinien oder das jahreszeitlich abhängige enzootische Auftreten von Y. pseudoiuberculosis bei Wildnagetieren hierfür eine Rolle spielen, ist noch unklar. Meldepflicht

Der Nachweis von Yersinia enterocolitica (darmpathogen) bei akuten Erkrankungen ist zu melden (IfSG §7). Auch wenn es vom Gesundheitsamt nicht gefordert wird, sollten eine exakte Speziesidentifizierung, Serotypisierung und Bio-

typisierung durchgeführt werden (Einsendung an Fachinstitute). Literatur K NAPP , W., und A. W EBER : Zur epidemiologischen und seuchenhygienischen Bedeutung von Yersinia pestis und Yersinia enlcrocolitica. Ulf. Gcsundh.Wesen 44 (1982) 552-556 BUTLER, TH.: Plague and other Yersinia infections. Plenum Press, New York 1985. COVER, T. L., and R. C. ABER: Yersinia enterocolitica. N. Engl. J. Med. 521 (1989) 16-24 STÄHIBEKG, T. H.. J. HFKSEMANN , K. GRANFORS and A. TOIVANEN: Immunoblot analysis of human IgM. lgG and IgA responses to plasmid-encoded released proteincs of Yersinia enterocolitica O:3: A study on patients with or without Yersinia-triggcred reactive arthritis. Ann. Rheum. Dis. 48 (1989) 577-581 Ai.KKSic, S., und J. BOCKEMÜHI.: Mikrobiologie und Epidemiologie der Yersiniosen. Immun. Infekt. 18 (1990)178-185 HF.F.SKMANN, J.: Enteropathogcnc Yersinien: Pathogenitätsfaktoren und neue diagnostische Methoden. Immun. Infekt. 18 (1990) 186-191. HOOGKAMP-RORSTANJK, J. A. A., J. Dt RONING : Klinik. Diagnostik und Therapie von Yersinia entcrocolitica-Infektionen. Immun. Infekt 18 (1990) 192-197 BOTTONE. E.J.: Yersinia enterocolitica: The Charisma continues. Clin. Microbiol. Rev. 10 (1997) 257-276 PERRY, R. D., and J. D. FETHERSTON : Yersinia pestis-

Abb. 4.26 Epidemiologie von Yersinia enterocolitica.

4.6 Die Familien Vibrionaceae und Aeromonadaceae etiologic agent of plaguc. Clin. Microbiol. Rev 10 (1997)35-66 AEPFELBACHER, M., R. ZUMBIHL. K. RUCKDESCHEL, CHR. A. JACOBI, C. BARZ and J. HEESEMANN: The tranquilizing injeetion of Yersinia proteins: A pathogen's strategy to resist host defense. Biol. Chem. 380 (1999)795-802

4.6 Die Familien Vibrionaceae und Aeromonadaceae JÜRGEN HEESEMANN Überblick und Systematik

Der Typstamm der Familie Vibrionaceae ist Vibrio cholerae, ein Seuchenerreger ersten Ranges (Cholera asiatica), der über sieben Pandemicn in den letzten zweihundert Jahren verursacht hat. Der Erstbeschreiber ist der Florentiner Arzt FILIPPO PACINI, der diesen Erreger 1854 entdeckte und als „Vibrio cholera" bezeichnete. ROBERT KOCH gelang es schließlich 1883, den Erreger anzuzüchten (Kommabazillus, Vibrio comma). In der Familie Vibrionaceae wurden 1965 von VKRON gram-negative, bewegliche (vibrarc = vibrieren),

polar begeißelte, fermentative, Cytochromoxidase-positive Bakterien aus Süß- und Salzwasserhabitaten zusammengefaßt. Dieser Familie wurden dann die Gattungen Vibrio. Photobacterium, Aeromonas, Plesiomonas und weitere Gattungen zugeordnet. Jedoch zeigten DNA-DNA Hybridisierungsergebnisse und Sequenzvergleiche der 5S und 16S rRNA so große Unterschiede zwischen diesen Gattungen, daß eine Zuordnung zu einer Familie phylogenetisch nicht gerechtfertigt erscheint. In Abb. 4.27 ist das Dendrogramm, errechnet aus der Sequenzverwandtschaft der zugänglichen 16S rDNA Daten von Vibrio-, Aeromonas- und Plesiomonas-Arlen, beispielhaft dargestellt. Drei phylogenetisch zusammengehörende Gruppen werden deutlich: Vibrio, Aeromonas und Escherichia coli/Plesiomonas shigelloides. Entsprechend sollten Ptesiomoiuis-Arten der Familie Enterobacteriaceae zugeordnet, Vibrionen zur Familie Vibrionaceae und Aeromonadcn zur Familie Aeromonadaceae zusammengefaßt werden. Vibrionen. Aeromonadcn und Plesiomonaden sind medizinisch bedeutsam als Durchfall-, Wund- und Sepsiserreger. Die auch zur

Familie Vibrionaceae gehörende Gattung Photobacterium ist phylogenetisch zwischen Vibrio und Aeromonas einzuordnen, wobei eine größere Nähe zu Vibrio besteht (nicht dargestellt). Als Krankheitserreger für Mensch und Tier haben diese Leuchtbakterien, die in Wasser saprophytär oder in Symbiose mit Wassertieren leben, keine Bedeutung. Erwähnenswert ist. daß neben Photobakterien auch Vibrionen (V. harveyi und V. fischeri) Biolumineszenzlicht (Luziferase-positiv) emittieren können. Zusammenfassend ist zu hoffen, daß die Familie der Vibrionaceae eine taxonomische

Abb. 4.27 Dendrogramm repräsentativer Vibrio-, Aeromonas- und Plesiomonas-Arten sowie Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa zum Vergleich. Die Sequenzverwandtschaft wurde aus 16-S rDNA Daten errechnet. Die phylogenetische Distanz 0.1 ist als Einheit dargestellt.

329

Spezielle Bakteriologie

330

Neuordnung nach phylogenetischen Gesichtspunkten erfährt. In diesem Kapitel werden die medizinisch wichtigsten Arten der Gattung Vibrio und der Gattung Aeromonas besprochen. Flesiomonas-Arten siehe Kapitel 4.4 Enterobacteriaceae.

4.6.1 Die Gattung Vibrio Morphologie und physiologische Eigenschaften Der Gattung Vibrio werden inzwischen über 30 Arten zugeordnet. Neben Vibrio cholerae haben 12 weitere Arten medizinische Bedeutung als Erreger von Gastroenteritiden, Wundinfektionen oder Septikämien. Mikroskopisch stellen Vibrionen sich als gekrümmte Stäbchen („Kommabakterien". Größe 0,5-0,8 um —> 1,5-2,5 um) dar. Je nach Wachstumsbedingung können sie auch längliche oder kokkoide Stäbchen bilden (Pleomorphismus) und damit z.B. von Enterobakteriazeen nicht unterschieden werden. In Flüssigmedien zeigen sie eine intensive „vibrierende" Beweglichkeit, die auf die monotriche (selten lophotriche) Begeißclung zurückzuführen ist. Die polare Geißel ist in der Regel von Komponenten der äußeren Membran ummantelt (Flagellenscheide). Vibrionen bilden diverse Fimbrientypen aus und können von einer Polysaccharidkapsel umgeben sein. Die Zellhülle zeigt den typischen Aufbau von gram-negativen Bakterien (innere Membran, Peptidoglykanzellwand, äußere Membran) und enthält u.a. charakteristische Lipopolysaccharide, die zur OAntigcntypisierung dienen können (s. u.). Vibrionen wachsen fakultativ anaerob. Sie tolerieren einen breiten Wachstumstemperaturbereich (lO°-44 °C). Glukose reicht als einzige Kohlenstoffquelle zur Vermehrung aus. Bemerkenswert ist das halophile Verhalten (bis 600

mM/3,5% NaCl) der meisten Vibrionen: Kochsalz wirkt nicht nur wachstumsfördernd, sondern ist für die Vermehrung der halophilen Vibrionen notwendig (z.B. 1 % NaCl-Zusatz zum Nährmedium führt zur Induktion von Aminosäure- und Zuckertransport). Interessanterweise wachsen V. cholerae und V. mimicus auch ohne Kochsalz-Zusatz (nicht-halophile Vibrionen), was eine praktische Bedeutung für die Vibrionen-Differenzierung hat. Eine weitere Besonderheit ist die Toleranz alkalischer pHWerte (bis zu pH 9). Vibrionen sind wie Aeromonaden, Plesiomonaden und Pseudomonaden Cytochromoxidase-positiv. Schlüsselreaktioncn zur Differenzierung der Vibrionen und Abgrenzung zu anderen phänotypisch ähnlichen Bakterienarten sind in Tab. 4.20 dargestellt. Die genaue Differenzierung der Vibrionen-Arten erfolgt über übliche biochemische Reihen, wobei die Testmedien 0,5-1% NaCl enthalten sollten, um das Wachstum bzw. den Metabolismus zu fördern. Vibrio cholerae-lsolale müssen hinsichtlich ihres O-Antigens serotypisiert werden (inzwischen wurden 154 Serogruppen beschrieben). Von Bedeutung ist zunächst, ob es sich um Isolatc der Serovare Ol oder O139 (typische Choleraepidemiccrreger) oder um andere Serovare handelt, die bisher als Choleraerreger im strengen Sinne nicht aufgetreten sind. Medizinische Bedeutung Vibrionen können hinsichtlich ihrer medizinischen Bedeutung in drei Gruppen unterteilt werden: Ŷ Choleraerreger - Vibrio cholerae, Serovare Ol und O139 Ŷ Gastroenteritiserreger - V. cholerae/non-Ol/O139 - V. mimicus - V. parahaemolyticus

Tab. 4.20 Charakteristische Merkmale zur Differenzierung von Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas und EnternMerkmal

Vibrio halophil Nicht-halophil

Aeromonas

Plesiomonas

Enterobacteriaceae

Oxidase

+

+

+

+

-

NaCl-Zusatz zum Nährmedium 0% 6%

+ +

+

+

+

+

4.6 Die Familien Vibrionaceae und Aeromonadaceae

- V. fluvialis - V. furnissi - V. hollisae u.a. Ŷ Wund- und Sepsiserreger - V. vulnificus - V. parahaemolyticus - V. damsela - V. alginolyticus - V. metschnikovii u.a. Zu den Choleraerregern, die während der letzten zweihundert Jahre Epidemien und Pandemien verursacht haben, gehören V. cholerae der Serovare Ol und O139. Die biochemische und molekularbiologische Analyse der Pathogenität dieser Pandemieerreger hat zur Identifizierung zahlreicher typischer Pathogenitätsfaktoren geführt (Choleratoxin. Zytotoxine. Adhäsine u.a.), die bei anderen Serovarietäten von V. cholerae in dieser Zusammenstellung nicht vorkommen. Bemerkenswert ist, daß nicht alle V. cholerae Ol-Isolate Choleratoxin produzieren (und damit keine Choleraerregcr im strengen Sinne sind) und daß V. cholerae non-Ol/O139 und V. mimicus in seltenen Fällen auch Choleraloxin produzieren können, ohne ein der Cholera vergleichbares Krankheitsbild zu verursachen. Das natürliche Habitat der Vibrionen ist das Wasser mit seiner Fauna und Flora. Aufgrund ihres Salzbcdürfnisses und der sehr guten Wachstumstemperatur ab 20 °C kommen Vibrionen insbesondere in der Sommerzeit in tropischen und gemäßigten Klimazonen im Bereich der Küstengebiete und der Mündungstrichter großer Flüsse (in Deutschland z.B. Eibmündung) vor. Sie besiedeln Plankton, Muscheln, Krebse und Fische und gelangen so in die Nahrungskette des Menschen. Der Verzehr solcher „Meeresfrüchte" im rohen oder ungenügend erhitzten Zustand kann zu Gastroenteritiden mit wässrigem oder blutigem Durchfall, Erbrechen, Fieber und Darmkrämpfen und in seltenen Fällen zur Sepsis führen. In Japan gehört V. parahaemolyticus zu den häufigsten bakteriellen Gastroenteritiserregern. Die humanpathogenen V. parahaemolyticus Isolate produzieren ein hitzestabiles Hämolysin (KANAGAWA-TCSI: Hämolysehof auf Blutagar mit Mannitol- und Kochsalzzusatz). Ähnliche Hämolysine (Porenbildner) können auch bei V. mimicus, V. hollisae und V. cholerae non-Ol/O139-Gruppe vorkommen. Wund- und Ohr-Infektionen mit Vibrionen kön-

nen beim Baden (Hautkontakt) in entsprechend kontaminierten Gewässern oder bei der Zubereitung von Vibrionen-kontaminierten Meeres-

früchten erworben werden. Die hierbei auftretenden Vibrionen-Arten produzieren eine Polysaccharidkapsel und verschiedene Zytotoxine. Zu den häufigsten und am stärksten pathogenen Erregern dieses Typs gehört V. vulnificus. Neben Wundinfektionen kann dieser Keim schwere Septikämien mit hoher Letalität verursachen (insbesondere bei Eisenüberladung, z.B. hämolytische Anämien).

4.6.2 Vibrio cholerae, Cholera Geschichte der Cholera

Das Vorkommen der Cholera als klinisches Syndrom läßt sich durch schriftliche Überlieferungen aus Griechenland, China und Indien bis ins Altertum verfolgen. Der Name dieser Durchfallerkrankung kann auf das griechische Wort XoAipa (Dachrinne, Traufe) und auf das hebräische Wort „chaul rah" (böse Krankheit) zurückgeführt werden. Mit der Zunahme von Pilgerfahrten (z.B. nach Mekka), durch kriegsbedingte Flüchllingsströme und durch das Aufblühen des internationalen Handels breitet sich die Cholera seit Jahrhunderten in Schüben pandemisch aus. Ausgangspunkt war und ist weiterhin das klassische Endemiegebiet Bengalen und die Flußdelta des Ganges und Brahmaputra (Tab. 4.21). 1854 wurde der Choleraerregcr von PAC INI erstmals beschrieben. Zur gleichen Zeit (Choleraepidemie in München, 1854) begann MAX VON PETTENKOLLR mit seinen epidemiologischen Untersuchungen zur Cholera, die zunächst keinen Hinweis auf eine Trinkwasserinfektion ergaben, während aber die Untersuchungen von JOHN SNOW während der Cholcraepidemie in London (1854) einen klaren Zusammenhang zwischen Cholera und Trinkwasserversorgungssystem zeigten. Die ..Trinkwassertheorie" wurde dann durch die Anzucht und Isolierung der „Kommabakterien" durch ROBERT KOCH 1883 bestätigt. KOCH vermutete bereits ein toxisches Pathogenitätsprinzip, aber erst 1959 konnte dies bestätigt werden. Nach der Pandemie 1923 blieb die Cholera fast 40 Jahre auf das klassische Endemiegebiet beschränkt (klassischer Erreger Serovar Ol/Biovar cholerae, angloamerikanisch: „classical biotype"), bis sich 1961 eine neue Erregervariante, Vibrio cholerae Serovar Ol, Biovar eltor (angloamerikanisch: „El Tor biotype") pandemisch von Indonesien ausbreitete und erstmalig im zwanzigsten Jahrhundert Süd- und Mittelamerika erfaßte. Die Bezeichnung El Tor stammt von einem Quarantänelager für Mekka-Pilger am Roten Meer, wo 1905 von FELIX GOTTSCHLICH bereits ein V. cholerae Stamm isoliert wurde. Bis 1992 wurde angenommen, daß nur V. cholerae Serovar Ol als Choleracrre-

331

Spezielle Bakteriologie

332

TAB. 4.21 Cholera-Pandemien (nach R. POLLITZER, WHO) No.

Zeit

Ursprung

Erregertyp

Ausbreitung

Serovar/Biovar

Asien

Europa

Afrika

Amerika

+

—

+

—

+ + +

+

+

+

+ + +

+ + +

1.

1817-1823

Indien

?

2.

1829-1851

Indien

? ?

3. 4. 5.

1852-1859 1863-1879 1881-1896

Indien Indien Indien

O1, cholerae

+

+ + +

6.

1899-1923

Indien

O1, cholerae

+

-

Indonesien Indien

O1, eltor O139, (eltor)

+ + +

+

19611992-

-

+ -

+ -

7. 8.(?)

?

ger zu bewerten ist. Um so überraschender war das Auttauchen eines neuen Choleraerregers, V. cholerae Serovar O139 im Jahre 1992 in Indien, der sich seitdem über Südostasien ausbreitet (wahrscheinlich eine Variante des Pandemie-Stamms Biovar eltor).

Die Cholera hat in Deutschland wie kaum eine andere Seuche zu großen Veränderungen in der Gesundheitspolitik geführt. MAX VON PETTENKOFER hat durch seine Aktivitäten hinsichtlich der Erneuerung des Trinkwassersystems und der Einführung der Abwasserkanalisation München vor zukünftigen Choleraepidemien bewahrt. Hamburg mußte dagegen noch 1892 eine schwere Choleraepidemie erleiden (ca. 17 000 Erkrankte und 8605 Tote), bevor auch dort die miserable Trinkwasserversorgung und Abwasserentsorgung erneuert wurden. Auf PETTENKOFERS Initiative wurde schließlich das Fach Hygiene zum Lehr- und Prüfungsfach für Mediziner. Eigenschaften Das Genom Das Genom von V. cholerae Serovar Ol besteht im Gegensatz zu Escherichia coli aus zwei ringförmigen Chromosomen von 2,4 Megabasen (Mb) und 1,6 Mb. Die beiden Chromosomen sind Träger mobiler genetischer Elemente, die für die Pathogenität von V. cholerae verantwortlich sind. Von pathogenetischer Bedeutung ist die Integration der Genome zweier filamentöser Phagen: VPIO (Vibrio cholerae Pathogenitätsinsel Phage) und CTX<J> (Cholera-Tox'm-Phage). VPI kodiert für ein fimbrielles Adhäsin (,,/oxin-coregulated /;ilus" TCP), das einerseits den Vibrionen die Kolonisierung der Dünndarmmukosa erlaubt und andererseits dem Phagen CTX als Rezeptor dient. CTXO trägt Gene für die zwei Untereinheiten des Choleratoxins (ctxA,B), und für Phagenstrukturproteine, die wahrscheinlich auch zytotoxische Aktivitäten haben. Eine CTX Phagenkonversion setzt also eine Lysoge-

nisierung von Vibrionen mit VPIO voraus. Für die Pathogenität ist auch bedeutsam, daß CTX<1> in beide Chromosomen gleichzeitig und mehrfach integrieren kann, was die Toxizitäl der Vibrionen erhöht („Gendosiseffekt'"). Bemerkenwert ist, daß die integrierten Phagengenome CTX und VPI zu defekten Prophagen degenerieren können und damit ihre Infektiosität verlieren. Für den Lebenszyklus des Choleraerregers scheint bedeutsam zu sein, daß die Freisetzung von Phagen und die Phagcntransduktion im Dünndarmmilieu besonders gefördert wird. Da es sich bei CTX<J> und VPIO um filamentösc Einzelstrang-DNA-Phagen handelt, können die Phagen ohne Bakteriolyse freigesetzt werden. Die Cholcratoxinwirkung und die genetischen Mechanismen der Toxingen-Übertragung und -Amplifikation sind wahrscheinlich die entscheidenden Faktoren für die epidemiologische Ausbreitung und die endemische Pcrsistenz des Choleraerregers. Die zwei „Pathophagen" CTX<1> und VPI4> sind Beispiele für mobile genetische Elemente, die aus apathogenen V. cholerae in zwei „Quantensprüngen" (1. VPI Integration, 2. CTXC" Integration) einen Choleraerreger entstehen lassen können. Die Konversion zum Choleraerreger setzt aber noch das Vorhandensein weiterer Gene für Pathogenitätsfaktoren voraus (Hämolysin, diverse Hämagglutinine/Adhäsine, Lipasen, Proteasen u.a.). Diese Bedingung ist wahrscheinlich nur bei wenigen V. cholerae Stämmen der Serovar Ol gegeben. Durch genetische Analysen konnte gezeigt werden, daß auch der Serovar O139Endemiestamm aus einem Ol Stamm (wahrscheinlich Serovar 01 / Biovar eltor) nach Austausch der 01 -Antigenbiosynthesegene (rfb) durch O139 rfb Gene entstanden ist. Gleichzeitig mit den O139 rfb Genen ist auch eine Kapselpolysaccharid-Determinante aufgenommen worden (zusammen 35 Kb DNA). Zusammenfassend lassen die Ergebnisse der genetischen Analyse der Pathogenität von Vibrio cholerae vermuten, daß es sich bei den Choleracrregern nur um wenige Klone handelt, die durch Koevolution mit dem Menschen ihre Pathogenität erworben haben und sich deshalb von den nicht-pathogenen V. cholerae Stämmen, die sich an die Wasserfauna adaptiert haben, wesentlich unterscheiden.

4.6 Die Familien Vibrionaceae und Aeromonadaceae

Charakteristische biologische Eigenschaften

Vibrio cholerae-Bakterien sind fakultativ anaerob, bevorzugen allerdings für ihr Wachstum aerobe Verhältnisse. Sie wachsen in einfachen Nährlösungen (z.B. Peptonwasser), tolerieren erhöhte pH-Werte (Alkalitoleranz maximal bis pH 10) und werden bei erhöhten Kochsalzkonzentrationen im Wachstum beschleunigt. Als gram-negative Bakterien können sie die typischen Oberflächenantigene (Lipopolysaccharid: O-Antigen, Flagellen: H-Antigen und Polysaccharidkapsel: K-Antigen) ausbilden. Für die Serotypisierung haben sich bisher nur die O-Antigene bewährt, das H-Antigen ist wenig stammspezifisch und K-Antigen bilden nur V. cholerae Of39 und andere non-Ol Serovare aus. Da bisher nur die Serovare Ol und O139 als Choleraerreger in Frage kamen, hat sich die Subtypisicrung bzw. Differenzierung auf diese zwei Serovare beschränkt. Aufgrund von Mutationen in den Biosynthesegenen des Ol-Antigens können Varianten der Scrovar Ol-Erreger entstehen, die serologisch in die drei Serotypen Ogawa, Inaba und Hikojima unterteilt werden können. Diese Serotypen sind nicht stabil und Konversionen zwischen Serotyp Ogawa und Inaba werden beobachtet. Der Serotyp Hikojima kommt selten vor. Die Serovar Ol-Stämme können darüber hinaus aufgrund physiologisch-biochemischer Merkmale in die Biovare cholerae und eltor unterteilt werden. Aber auch Biotypisierungsmerkmale (z.B. positive VOGES-PROSKAUF.R-Reaktion und Polymyxin-Resistenz bei Biovar eltor) können variieren und die epidemiologische Analyse erschweren. Für die klonale Analyse werden deshalb molekularbiologische Methoden bevorzugt (genomischer Fingerprint, PCR für das Gen des TCP Pilus, tcpA. und des Choleratoxins, ctxA,B). Hier soll nochmals darauf hingewiesen werden, daß auch V. cholerae der Serovare non-Ol/O139 und V. mimicus ctc/4,ß-positiv sein können, ohne die Virulenz von Choleraerregern zu haben. Vibrio c/io/erae-Bakterien können sehr gut in Fluß- und Küstengewässern überleben, wobei die non-Ol/O139-Serogruppen besser an die Umwelt angepaßt sind als die Choleraerreger. Vibrionen reagieren empfindlich auf Austrocknung, Sonnenlichteinstrahlung und sauren pH. Choleraerreger können mehrere Wochen in Umweltgewässern überleben, wahrscheinlich sind sie auch in der Lage, Zooplankton und Krustazeen zu besiedeln, was ihre Überlebensfähigkeit in der Umwelt verbessert. Eine besondere

Eigenschaft von V. cholerae ist die Fähigkeit, unter Streßbedingungen (z.B. „Aushungern" in Phosphatpuffer bei 4 °C) sogenannte „viable but non-culturable" (VNC) Formen zu bilden (Dormanz-Stadien), die ihre Infektiosität behalten. Zu den besonderen Eigenschaften der Choleraerreger gehört die spezifische Anpassung an den Gastrointestinaltrakt des Menschen, eine ökologische Nische, die den non-Of/O139 V. cholerae Bakterien nicht zur Verfügung steht.

Pathogenese und Pathogenitätsfaktoren

Der Choleraerregcr kolonisiert nach oraler Aufnahme im wesentlichen die Dünndarmmukosa und erzeugt dort eine massive Elektrolytsekretion, die zu voluminösen wässrigen Durchfällen führt. Für dieses Krankheitsbild sind im wesentlichen zwei Pathogenitätsfaktoren verantwortlich: Ŷ Choleratoxin CTX Ŷ fimbrielles Adhäsin TCP.

Das CTX ist der Prototyp der ADP-Ribosyltransferasen vom AB5-Typ. CTX besteht aus fünf zu einem Ring angeordneten B-Untereinheiten von je 11,6 kDa. Die B-Untcrcinheiten vermitteln die Bindung des CTX an das Gangliosid GM1 des Mukosaepithels (Toxinrezeptor). Innerhalb des B5-R.in.ges befindet sich das Holotoxin von 27,2 kDa (A-Untereinheit). Vibrionen sezernieren Neuraminidase, die andere Gangliosidtypen zu GM1 konvertiert und damit die CTX-Rezeptordichte auf Mukosazellen erhöht. Die CTX-Rezeptorbindung führt zum Einschleusen des Holotoxins in die Zelle. Es ist unklar, inwieweit nur die A-Untereinheit oder der gesamte ABs-Komplex (z.B. über Endozytosc) transloziert wird. Entscheidend ist die Toxinprozessierung, d.h. die A-Untereinheit muß protcolytisch in die toxinwirksame AI-Untereinheit (21,8 kDa) und die nicht wirksame A2-Untereinheit (5,4 kDa) gespalten und in das Zytosol freigesetzt werden (Abb. 4.28). Af aktiviert über Rcgulatorproteinc die Adenylzyklase. Dies führt zum zytosolischen Anstieg von c-AMP („second messenger") und folglich zur Aktivierung von c-AMP-abhängigen Proteinkinasen (z.B. Proteinkinase A, PKA). In Mukosazellen aktiviert PKA durch Phosphorylierung ChloridKanäle, wodurch insbesondere in Kryptenzellen die Chloridsekretion stark erhöht und in Villus-

333

334

Spezielle Bakteriologie

Abb. 4.28 Wirkung des Choleratoxins (CTX) auf eine Kryptenzelle. Physiologische Rezeptor (R)-Stimulierung führt zum GDP-»GTP-Austausch an der GaUntereinheit. Die Choleratoxin Untereinheit Aj inhibiert die GTPase-Aktivität von Ga-GTP durch ADP-Ribosylierung (Spaltung von NAD in Mkotinsäureamid (NS) und Transfer der ADP- Ribosylrestes (AD) auf Arginin-201 von Ca). Für weitere Erklärungen siehe Text.

zellen die NaCl-Rückresorbtion erniedrigt wird. Aufgrund des transepithelialen osmotischen Gradienten ergibt sich ein zum Darmlumen gerichteter Wasser-Elektrolytstrom, der vom nachfolgenden Colonepithel nicht ausreichend resorbiert werden kann. Zellen von Patienten mit der Erbkrankheit Cystische Fibröse (CF) reagieren auf Choleratoxin nicht mit Chloridsekretion. Aufgrund einer einzigen Punktmutation ist der Chloridkanal CFTR (CF-7Yansmembranregulator) defekt. CF-Patienten sollten keine Cholera mit Reiswasserstühlen entwickeln. Der molekulare Wirkmechanismus des Choleratoxins ist inzwischen aufgeklärt. Die Adenylzyklase wird unter physiologischen Bedingungen über Rezeptor-gekoppelte heterotrimere G-Proteine (a-, ß- und y-Untereinheit) reguliert. Die GaUntereinheit wirkt wie ein molekularer Schalter. Durch Austausch von Ga-gebundenem GuanyWiphosphat (GDP, ,.Aus-Zustand") gegen das Triphosphat GTP wird der „An-Zustand" erreicht. Gleichzeitig wird die intrinsische GTPase-Aktivität von Ga-GTP erhöht und der „Aus-Zustand" (GDP-Bindung) begünstigt. Das Choleratoxin hemmt durch ADP-Ribosylierung von Ga-GTP die GTPase-Aktivität, was

eine dauerhafte Aktivierung der Adenylzyklase durch Ga-GTP zur Folge hat. Neben diesem Mechanismus soll das CTX auch zur erhöhten Produktion der Prostaglandine PGE1 und PGE2 sowie Sekretion des vasoaktiven mtestinalen /'eptids VIP führen. Alle drei Substanzen bewirken eine Erhöhung der Wasser-Elektrolytsekretion. Der zweite wichtige Pathogenitätsfaktor ist das TCP-Adhäsin (Rezeptor für CTX-Phage), das die Bindung der Choleraerreger an Mucus und Darmepithelzellen vermittelt. Dieses Adhäsin besteht aus hydrophoben gebündelten Filamenten, die zur Gruppe der Typ IV-Pili gehören. Darüber hinaus werden zahlreiche Faktoren mit zytotoxischen Wirkungen (Hämolysin, Enterotoxine, Zonula-occludens-Toxin, Zot) und mit Adhäsinfunktionen (Mannosyl- und Fucosylspezifische Fimbrien) beschrieben, deren Bedeutung für die Pathogenese bis heute aber unklar geblieben ist. Im Gegensatz zu Salmonellen und Shigellen haben Choleracrreger keine Invasionsfaktoren. Es kann deshalb bei der Cholera von einer nichtinvasiven Mukosainfektion des Dünndarms mit Intoxikation ausgegangen werden. Klinik und Therapie

Der klinische Verlauf einer Infektion mit Choleraerregern ist nicht einheitlich und hängt von der Infektionsdosis, des Erregertyps und Wirtsparametern wie Alter, Blutgruppe (Blutgruppe 0 besonders empfänglich), Ernährungszustand, Immunität u.a. ab. Das schwerste Krankheitsbild wird als Cholera gravis bezeichnet. Es wird bei Infizierten mit Biovar cholerae häufiger (ca. 11% der Fälle) als mit Biovar eltor (ca. 2%) beobachtet. Etwa 12-72 Stunden nach Erregeraufnahme entwickeln die Betroffenen zunächst wenig charakteristische abdominale Beschwerden mit leichten breiigen Durchfällen und Bauchkrämpfen. Es folgt dann schnell der Übergang zu massiven wässrigen Durchfällen (500-1000 ml/Stunde, nach 7 Stunden bis zu 10% Gewichtsverlust) mit Reiswasser-ähnlichem Aussehen (trüb und flockig) und manchmal Erbrechen. Ab Flüssigkeitsverlusten von ca. 5% des Körpergewichtes zeigen sich typische Zeichen von Dehydration wie Reduktion des Hautturgors („Wäscherinnenhände''), der Tränenflüssigkeit und des Speichels sowie extremes Durstgefühl. Bei fehlender Therapie und fortschrei-

4.6 Die Familien Vibrionaceae und Aeromonadaceae

tendem Flüssigkeitsverlust kommt es zu Blutdruckabfall, Tachykardie, Wadenmuskelkrämpfcn und hypovolämischem Schock mit Azidose und Nierenversagen. Fieber ist für eine Cholera untypisch. Werden die schweren Elektrolytverluste (Na*, K\ Cl, HCO3") nicht schnellstens ausgeglichen, sterben die Patienten an HerzKreislauf-Schock. WHO-empfohlene Trinklösung: 1000 ml abgekochtes Wasser, 20 g Glukose, 2,5 g NaHCO3, 3gNaCI, 1,5gKCI.

Milde Verläufe der Cholera mit nicht lebensbedrohlichen Gastroentcritiden sind häufiger (20-30% der Infizierten) als die Cholera gravis. Werden alle Infizierten eines Choleraausbruchs erfaßt, so wird ein hoher Anteil von inapparenten Verläufen festgestellt (60% bei V. cholerae Biovar cholerae, und 75% bei Biovar eltor). Inwieweit Immunität oder andere Faktoren der Wirtsempfänglichkeit hier eine Rolle spielen, ist ungeklärt. Bei Verdacht auf Cholera darf das Ergebnis der mikrobiologischen Stuhluntersuchung nicht abgewartet werden, sondern es muß sofort die Re hydratationstherapie eingeleitet werden: Parenteral Ringer-Laktat-Infusion (bis zu 2000 ml innerhalb der ersten 30 Minuten) und/oder oral Glukose/Elektrolytlösung (s.o.). Die Dauer der Cholera-Durchfälle und die Vibrionenausscheidung kann durch orale Gabe von Antibiotika (Doxycyclin, Erythromycin, Trimethoprim/Sulfmethoxazol oder Fluorochinolone über drei Tage) verkürzt werden. Die Antibiotikatherapie darf nicht überschätzt werden. Einerseits gibt es in Endemiegebieten inzwischen multiresistente Choleraerreger und andererseits ersetzt eine Antibiotikatherapie nicht die Rehydratationstherapie. In der Regel erholen sich die Cholera-Patienten nach wenigen Tagen adäquater Rehydratation. Auch wenn die Durchfälle dann sistieren, werden Vibrionen noch 2-3 Wochen ausgeschieden. Laboratoriumsdiagnose

Bei Verdacht auf Cholera sollen unbedingt mikrobiologische Stuhluntersuchungen zur Bestätigung der Diagnose und aus epidemiologischen Gründen durchgeführt werden. Stuhlproben, Erbrochenes und Rectalabstriche müssen auf dem schnellsten Wege dem Labor zugeleitet werden (ggf. Transportmedium nach CARY-

BLAIR verwenden). Die Proben werden auf festem Selektivmedium wie 7Tiiosulfat-Citrat-.öileSucrose (TCBS) Agar ausgestrichen und bei 36 °C aerob inkubiert. Nach 18-24 Stunden wächst V. cholerae als große gelbliche Kolonie (Oxidase-positiv). die zur weiteren biochemischen Differenzierung und Serotypisicrung mit Antiseren gegen Ol- und O139-Antigen auf Blutagar und Ki.iGLER-Schrägagar subkultiviert werden. Für Lebensmittel- und Wasserproben sowie zeitlich verzögert eingegangenes Patientenmaterial wird eine 8-stündige Anreicherungskultur in alkalischem Peptonwasser mit anschließender Beimpfung von TCBS-Agar empfohlen. Zur Schnclldiagnose kann der direkte mikroskopische Nachweis von typisch beweglichen Vibrionen dienen, allerdings ist die Spezifität und Sensitivität dieser Methode gering. Besser geeignet ist die Polymcrasekettenreaktion (PCR) mit Oligonukleotidcn für den Nachweis des Choleratoxingens ctx (Nachweisgrenze ca. 103 Vibrionen/g Stuhl). Aus epidemiologischen Gründen kann die serologische Diagnostik sinnvoll sein. Etwa zehn Tage nach Krankheitsbeginn können spezifische agglutinierende Antikörper (WiDAi.-Agglutination) und Vibrionen-abtötende Antikörper (Serum-Vibriozidie-Test) nachgewiesen werden. Choleratoxin-neutralisierende Antikörper treten 3-4 Wochen nach Infektion auf. Epidemiologie

Die Cholera gehört zu den klassischen Seuchenerregern mit pandemischer Ausbreitung. 1961 begann die Ausbreitung des 7. Pandemie-Erregers V. cholerae, Biovar eltor von Indonesien aus. Wellenartig hat dieser Erregertyp inzwischen alle Kontinente erfaßt: 1966 Asien, 1971 Afrika, 1981 Australien, 1991 die Pazifikküstenländer und 1994 auch die Atlantikküste Mittclund Südamerikas. Allein in Mittel- und Südamerika erkrankten 1991/1992 schätzungsweise 750.000 und verstarben 6.500 Menschen an der Cholera. Diese Region war davor über hundert Jahre frei von Choleraausbrüchen. Es wird vermutet, daß ein Frachter an der Küste eines asiatischen Epidemiegebicts V. cholerae-hahiges Brackwasser für Baiastzwecke getankt hatte und nach der Pazifiküberquerung das Baiastwasser an der peruanischen Küste wieder entleert und damit die Küsten-Flora und -Fauna mit V. cholerae kontaminiert hatte. Der 7. Pandemie-Stamm ist auch weiterhin auf allen Kontinenten außer

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Spezielle Bakteriologie

Europa und Antarktis präsent. 1992 wurde auf dem indischen Subkontinent (Madras) ein neuer Choleraerreger beschrieben, der überraschenderweise zur Serovar O139 gehört und bekapselt ist. Dieser Stamm zeigt eine hohe Verwandtschaft zu V. cholerae Serovar Ol/Biovar eltor (7. Pandemie). Diese Serovar O139 breitet sich kontinuierlich über Südostasien aus und könnte sich zum 8. Pandemie-Stamm entwickeln. In den klassischen Cholera-Endemiegebieten Indien und Bangladesh koexistieren Serovar Ol/Biovar cholerae, Biovar eltor und Serovar O139. Epidemiologische Daten sprechen dafür, daß die Mehrzahl der Infektionen durch V. choleraekontaminiertes Trinkwasser und kontaminierte Lebensmittel (Salat, Obst, Meeresfrüchte) entstehen. Die an Freiwilligen bestimmte Infektionsdosis liegt bei einer Million Vibrionen. Andererseits sprechen Trinkwasseruntersuchungen dafür, daß 100-1000 Vibrionen für eine Infektion ausreichen könnten. Die enorme Ausscheidung von Vibrionen durch Cholera-Kranke (107—10s Vibrionen/g Darminhalt) und schlechte hygienische Lebensverhältnisse erklären die explosionsartigen lokalen Ausbrüche. Dauerausscheider von Choleraerregern werden praktisch nicht beobachtet. Die direkte Übertragung von Mensch zu Mensch spielt wahrscheinlich keine Rolle bei Einhaltung üblicher Hygieneregeln. Die Ausscheidungen der Cholerakranken führen zur Kontamination der Umwelt. Unter günstigen klimatischen Bedingungen können sich die Vibrionen in der Umwelt schnell vermehren (Ausbrüche besonders in den Sommermonaten). Unklar ist bisher die Frage geblieben, in welcher ökologischen Nische die Choleraerreger in der kühleren Jahreszeit persistieren, und ob die verschiedenen Choleraerreger auch unterschiedliche Habitate besiedeln. Weltweit hat die Anzahl der Cholerafälle im Zeitraum 1991-1997 abgenommen. Der Schwerpunkt hat sich von Südamerika (1991/92) nach Afrika (1998) verlagert. Die WHO hat 1998 weltweit 293 121 Cholerafälle mit 10586 Toten registriert. Prophylaxe und Meldepflicht

Da die Cholerainfektion durch orale Aufnahme von kontaminierten Lebensmitteln verursacht wird, sollten alle Nahrungsmittel incl. Trinkwasser durch ausreichendes Erhitzen desinfiziert werden. In Behältern aufbewahrtes Trinkwasser sollte chloriert oder mit Zitronensäure angesäuert werden. Ansonsten gilt die Regel „Boil it, cook it, peel it or forget it" (Center for Disease

Control, CDC. Atlanta). Impfstoffe gegen Cholera sind zwar kommerziell erhältlich, aber bis heute wenig protektiv (50-60% Protektivität für 6 Monate). Die geringste Protektivität haben parenterale Totimpfstoffe, wogegen orale Totimpfstoffe (inaktivierte Vibrionen plus Choleratoxin-B-Untereinheit) und orale attenuierte Lebendimpfstoffe (z.B. V. cholerae CVD 103-HgR: defektes ctxA-Gen und Hämolysingen) eine bessere Wirkung zeigen. Interessanterweise sind vibriozide Antikörper für die Protektivität wichtiger als Choleratoxin-neutralisierende Antikörper. Zusammenfassend ist die Vakzinierung gegen Cholera bis heute unbefriedigend. Der beste Schutz gegen Cholera wird daher noch immer durch Einhaltung einfacher Hygieneregeln erzielt. Bei beginnenden isolierten Ausbrüchen (z.B. Passagierschiff, Krankenhaus, Familie) kann eine fünftägige Antibiotikagabe weitere Infektionen verhindern. Die Cholera gehört zu den Quarantänekrankheiten der WHO (Cholera, Pest. Gelbfieber. 5 Tage bei Cholera) und zu den meldepflichtigen Erkrankungen (IfSG §§6 und 7: Verdacht, Erkrankung, Tod, Ausscheider). Bei der Stuhldiagnostik sollte auf die Isolierung von CholeraLebendvakzinstämmen geachtet werden (nicht meldepflichtig).

4.6.3 Die Gattung Aeromonas Morphologie und biochemische Eigenschaften Aeromonaden (Aeromonas: gasbildende Monade) sind gram-negative, Oxidase- und Katalasepositive, fakultativ-anaerobe Stäbchenbakterien, die in der Regel unipolar begeißelt sind. Im Gegensatz zu Vibrionen wird ihr Wachstum nicht durch Salzzusatz gefördert (bis 4%). Salzkonzentrationen von 6-7% wirken wachtumshemmend. Sie kommen in Süß- und Brackwasser vor und sezernieren ähnlich wie Vibrionen hydrolytische Enzyme (Proteasen, Lipasen, Chitinase, Amylase u.a.), Enterotoxin und Hämolysine. Die Aeromonaden können nach ihrer optimalen Wachstumstemperatur in zwei Gruppen eingeteilt werden: * psychrophile Gruppe: 22-28 °C * mesophile Gruppe: 35-37 °C Zur ersten Gruppe gehört A. salmonicida, die pathogen für Fische ist, während zur zweiten Gruppe die humanpathogene Art A. hydrophila gehört. Eine Besonderheit einiger Aeromona-

4.7 Die Gattung Pasteurella, Pasteurellosen

den ist die Ausbildung einer Proteinkapsel, die aus einer parakristallinen monomolekularen äußeren Schicht eines mit der äußeren Membran nicht verankerten Proteins von ca. 50 kDa besteht (sog. 5urface-layer). S-layer gelten als Pathogenitätsfaktoren. Aeromonaden können wie Vibrionen angezüchtet werden. Auf Blutagar bilden sie häufig einen einfachen oder auch einen doppelten Hämolysehof (Doppelzonenbildung). Sie können eine Vielzahl von Zuckern metabolisieren, was bei der biochemischen Differenzierung ausgenutzt wird. Klinik und Therapie

Aeromonaden sind anspruchslose Bakterien, die ubiquitär in wässrigen Systemen vorkommen. Entsprechend sind auch die Infektionsquellen Badeseen, mit Oberflächenwasser kontaminierte Lebensmittel und im Krankenhaus kontaminierte Luftbefeuchter oder Dialysegeräte. Medizinisch bedeutsam ist A. hydrophila und in seltenen Fällen A. veroni. Beide produzieren ein porenbildendes Hämolysin und in manchen Fällen auch ein Enterotoxin, das choleragen wirkt. Aeromonaden können Augeninfektionen, Pneumonien, Wundinfektionen und Gastroenteritiden verursachen. Bei abwehrschwachen Patienten wurden auch septische Verläufe mit Peritonitis und multiplen Muskelabszessen beobachtet. Für die Antibiotikatherapie erwiesen sich Aminoglykosidc, Cephalosporine der 3. Generation und Trimethoprim-Sufmethoxazol als wirksam. Ein Antibiogramm sollte nach Isolierung des Erregers unbedingt erstellt werden. Inwieweit es sich bei Aeromonaden um opportunistische Erreger handelt wird kontrovers diskutiert. Jedenfalls handelt es sich hier um eine seltene Infektionskrankheit. Literatur B OCKEMÜHL , J.: Vibrionaceae. In: B URKHARD !, F. (ed.) Mikrobiologische Diagnostik. Thieme, Stuttgart, pp. 102-108,1992 FARUQUE, S. M.. M. J. ALBERT and J. J. MEKALANOS: Epidemiology, Genetics, and Ecology of Foxigenic Vibrio cholerae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62. pp. 1301-1314, 1998 JANDA, J. M.: Vibrio, Aeromonas und Plesiomonas. In: L. COLLIER, A. BALOWS. M. SUSSMAN (cds.) Fopley Wilson's Microbiology and Immunology, Vol 2, 9"1 ed.. Arnold, London 1998, pp. 1065-1089 KAPER , J.B., J. G. MORRISJR.and M.M. LEVINE: Cholera, Clin. Microbiol. Rev. 8, pp. 48-86, 1995

M1Q, Qualitätsstandards in der mikrobiologischen Diagnostik, Band 9, Infektionen des Darmes, Urban & Fischer, München/Jena 2000 SCHUBERT, R.: Aeromonas und Plesiomonas. In: B URKHARDT . F. (ed.) Mikrobiologische Diagnostik, Fhieme, Stuttgart, pp. 109-111, 1992

4.7 Die Gattung Pasteurella, Pasteurellosen RAINER ANSORG

Pasteurellae sind Kommensalen auf den Schleimhäuten verschiedener Wild-, Haus- und Nutztierarten, u.a. Ratte, Kaninchen, Katze, Hund, Rind, Schwein, Schaf und Geflügel. Sie können aber auch sporadische und epizootische Erkrankungen verursachen, die in der Viehzucht ökonomisch relevant sind. Beim Menschen sind Pasteurellosen seltene, meist akzidentelle Infektionen. Wichtigster Erreger ist Pasteurella multoäda.

Taxonomie Die Gattung Pasteurella, die zusammen mit den Gattungen Haemophilus und Actinobacillns die Familie Pasteurellaceae bildet, umfaßt aufgrund genetischer Kriterien 11 Spezies: * P. nvi/locida (mit den Subspezies multoeida, septica und gallicida) * P. dagmatis * P. stomatis * P. canis * Pasleurella species B * P. volantium * P. gallinarum * P. avium * P. langaa * P. anatis * Pasteurella species A Diese genetisch orientierte Definition der Gattung Pasteurella sensu stricto schließt einige, noch traditionell als Pasteurella klassifizierte Spezies aus, u.a. P. haemolytica, P lestudinis, P. aerogenes, P. pneumotropica, P. „bettii" oder CDC-Gruppe HB-5. Ihre taxononomische Positionierung ist weitgehend unklar.

Eigenschaften

Zellmorphologie: Pasteurellae sind kleine (0,2-0,4 x 0,6-2,5 um), plumpe, unbewegliche, sporenlose, gram-negative Stäbchen. Frische Isolate zeigen häufig eine bipolare Anfärbung. Ältere Kulturen neigen zur Pleomorphie und

337

Spezielle Bakteriologie

338

zielle Fragestellungen in Betracht. Auf MacCoNKEY-Agar und ähnlichen Laktose-Indikatornährböden wachsen Pasteurellae sensu stricto nicht. Biochemische Leistungen: Gemeinsame Kennzeichen der Gattung Pasteiirella sensu stricto sind Nachweis von Katalase, Oxidase und alkalischer Phosphatasc, Reduktion von Nitrat zu Nitrit, fermentativer Glukoseabbau (Oxidations-Fermentations-Test fO/F-Tcst]), Fermentation von Saccharose, D-Galaktose. D-Mannose und D-Fruktose, kein Abbau von m-lnsosit, Salicin, Aesculin und L-Rhamnose. Differenzierende Stoffwechselmerkmale sind in Tab. 4.22 zusammengefaßt. Serologische Varietäten: P. multocida weist die kapsulären (K-) Serovarc A, B, D, E, F und 16 somatische (O-) Serovare auf. Da die Kapsel der K-Serovar A im Gegensatz zu anderen K-Serovaren Hyaluronsäure enthält, kann die Zugehörigkeit zu dieser Serovar mittels Hyaluronidasetest festgestellt werden. Die Kapsel wird bei Wachstum in der Nähe eines Hyaluronidase produzierenden Stammes von Staphylocoecus aureus depolymerisiert. K-Serovar D wird durch Acriflavin agglutiniert. Enzyme und Toxine: P. multocida besitzt zellgebundene Neuraminidasen mit Molekularge-

zur Ausbildung filamentöser Formen. Bei P. multocida ist in der Regel eine Kapsel vorhanden. Koloniemorphologie: Auf Blutagar entwickeln sich nach aerober Kultur für 18-24 Std. bei 37 °C 0,5-1 (-3) mm große, flache, konvexe, runde, glattrandige, tautropfenartig glänzende Kolonien ohne Hämolyse. Charakteristisch ist ihr spermaartiger Geruch. Bei P. multocida kommen neben dieser glatten (S-) Form auch mukoide (M-) Formen, die zu konfluierendem Wachstum neigen, und rauhe (R-) Formen vor. Die verschiedenen Kolonievarianten können gleichzeitig auftreten. Wachstumsbedingungen: Für die primäre Anzüchtung und für Subkulturen sind komplexe Medien auf Peptonagarbasis mit Zusatz von 5-8% Serum oder Blut geeignet. Das Temperaturoptimum liegt bei 35-37 °C. Die aeroben, fakultativ anaeroben Mikroben wachsen am besten unter mikroaeroben Bedingungen, d.h. in einer sauerstoffarmen Kulturatmosphäre mit 5-10 Vol% CO2. Komplexe flüssige Nährmedien sind für die primäre Anzüchtung wegen des Überwucherns durch weniger anspruchsvolle Keime meistens nicht geeignet, jedoch für die Subkultivierung von Reinkulturen. Selektivmedien mit Antibiotikazusätzen kommen für spe-

Tab. 4.22 Biochemische Differenzierungsmerkmale der Spezies und Subspezies der Gattung Pasteurella sensu stricto mit humanmedizinischer Bedeutung (modifiziert nach W. MANNHEIM, 1989)

Indol

Dulcit

Sorbit

Mannit

Trehalose

Maltose

Urease

E-Galactosidase1

L-Arabinose

Biochemische Reaktionen

OrnithinDecarboxylase

Spezies

P. multocida subsp. multocida

+

-

-

-

subsp. septica subsp. galliäda

+ +

d

-

-

-

-

P. dagmatis

-

-

-

+

P. stomatis P. canis

+

-

-

P. species B

+

P. volantium

d

1

(o-Nitrophenyl-ß-Calactosidase-Test,

-

+

+

+

-

+

+ -

+ +

+

-

(+)

+ +

+

+

-

-

-

+

-

-

-

+ +

-

-

+ +

-

-

-

+

+

-

+

+

-

+

-

+

+

+

d

-

-

ONPG.

+ = mehr als 90% der Stämme innerhalb 48 Std . (+) = verzögert positiv, d = unterschiedliche Reaktionen, - = mehr als 90% der Stämme negativ.

4.7 Die Gattung Pasteurella, Pasteurellosen

wichten zwischen 10 und 200 kDa. Von manchen Stämmen (K-Serovar B) wird Hyaluronidase gebildet. Ein mannose-resistentes Hämagglutinin, das mit menschlichen Erythrozyten der Blutgruppe 0 reagiert, kommt bei K-Serovar A vor. Die Lipopolysaccharide der Pasteurella-Ze\\wand wirken als Endotoxin. Ein Exotoxin mit hämorrhagischen und dermonekrotischen Eigenschaften im Meerschweinchen-Hauttest und letaler Wirkung auf verschiedene Labortiere wird von Stämmen der K-Serovare D und - seltener - A produziert. Es handelt sich um ein Protein mit einem Molekulargewicht von ca. 145 kDa. Der Nachweis toxigener Isolatc erfolgt mittels Zellkulturen, Enzymimmunoassays und PCR-Techniken. Bakteriophagen, Bakteriozine, Plasmide: Spezifische Bakteriophagen und Bakteriozine können zur entsprechenden Typisierung von P. multoa'rffl-Stämmen verwendet werden. Plasmide mit Molekulargewichten von 1,3-28,8 MDa kodieren u.a. für Resistenz gegen Tetrazykline, Streptomyzin und Sulfonamide. Umweltresistenz: In Blut, Schleim, Auswurf und Kot kann P. multocida bis zu 10 Tagen, in Wasser bis zu 14 und in eingetrocknetem Zustand bis zu 3 Tagen vermehrungsfähig bleiben. Abtötung erfolgt durch Erhitzen auf 60 °C oder durch 0,5% Phenol innerhalb von 15 min.

Pathogenese

Eintrittspforten des Erregers sind Wunden, z.B. Biß- und Kratzverletzungen, und die Schleimhäute des oberen Respirationstraktes. Nach lokaler Kolonisation oder manifester Infektion können sich die Erreger lymphogen oder hämatogen ausbreiten. Akute Lokalinfektionen sind durch Ödembildung und granulozytäre Infiltration, evtl. gefolgt von Abszeßbildung, charakterisiert. Bei hämatogener Aussaat können Mikroabszesse und hämorrhagische Läsionen in nahezu allen Organen auftreten. Die molekularbiologischen Grundlagen der Pathogenität und Virulenz der Pasteurellae sind nicht eindeutig geklärt. Bei P. multocida kommen Kapselbildung, Neuraminidase- und Hyaluronidasebildung, Endotoxine und Exotoxin als Virulenzfaktoren in Frage. Da Pasteurellae praktisch nur nach traumatischer Inokulation oder bei abgeschwächter Infektabwehr zu manifesten Infektionen beim Menschen führen, sind sie als opportunische Infektionserreger zu qualifizieren.

Klinik

Manifeste Infektionen durch P. multocida und eng verwandte Pasteurellae lassen sich hauptsächlich in drei Kategorien einteilen: §8 Wundinfektionen nach Biß- und Kratzverletzungen (ca. 66%), '• iexpiratorische Infektionen (ca. 19%) und « bakteriämische Infektionen mit septischen Metastasen (ca. 11%). In einigen kasuistischen Berichten werden Urogenitalinfektionen, Appendizitis, Peritonitis nach Endoskopie und gynäkologische Infektionen mitgeteilt. Die Verletzungswunden sind in der Regel an Händen, Armen, Beinen oder im Hals-NackenBereich lokalisiert. Die klassischen Zeichen der akuten Entzündung treten häufig bereits wenige Stunden, seltener 1-3 Tage nach der Verletzung auf. Typisch ist die Diskrepanz zwischen geringer entzündlicher Reaktion und subjektiv stark empfundenen Schmerzen.

Eine serös-blutige oder eitrige Sekretion zeigt sich in der Regel 24-48 Std. nach Beginn der Symptome. Eine regionäre Lymphadenitis entwickeln 30-40% der Patienten, in manchen Fällen tritt Fieber auf. Lokale Komplikationen wie Tendovaginitis, Periostitis, Arthritis, Osteomyelitis werden bei ca. 40% der Patienten beobachtet. Eine Knochenbeteiligung wird oft erst verzögert manifest und kann chronisch mit Defektheilungen verlaufen. Bei Wundinfektionen im Kopfbereich können Meningitis. Gehirnabszeß und subdurales Empyem resultieren. Bei Augenverletzungen besteht die Gefahr einer Endophthalmitis. Pasteurellosen des Respirationstraktes entstehen in der Regel auf dem Boden prädisponierender Grunderkrankungen (chronische Bronchitis, Emphysem, Bronchiektasen, chronisch obstruktive Lungenerkrankungen). Sie imponieren als akute bis subakute Bronchitis, Pneumonie oder Pleuraempyem oder als Kombination dieser Krankheitsbilder. Durch Aszension der Erreger kann es zu Otitis, Sinusitis, Mastoiditis und intrakraniellen Infektionen kommen. Bakteriämische Pasteurellosen können von Wundinfektionen oder respiratorischen Infektionen ausgehen, vielfach ist ein Sepsisherd aber nicht zu lokalisieren. Die generalisierten Infektionen involvieren u.a. Meningitis, Pneumonie,

339

340

Spezielle Bakteriologie

Peritonitis, Arthritis, Endokarditis. Prädisponierende Grundleiden sind Leberzirrhose und maligne Erkrankungen. Die Letalität beträgt ca. 35% und wird in erster Linie von Art und Schwere der Grunderkrankung bestimmt. Laboratoriumsdiagnose Eine sichere ätiologische Diagnose erfordert den kulturellen Nachweis der Erreger.

Untersuchungsmaterial: In Abhängigkeit von der Infektionslokalisation sind Wundsekret, respiratorische Sekrete, Blut, Liquor cerebrospinalis, Spülwasser der Nasennebenhöhlen, Punktate und Biopsien bakteriologisch zu untersuchen. Die Proben sollten innerhalb 2-3 Std. nach Gewinnung im Labor verarbeitet werden.

Erregernachweis und -differenzierung: Der mikroskopische Nachweis bipolar gefärbter, evtl. bekapselter kokkoider Stäbchen in Primärpräparaten des Untersuchungsmaterials ist von beschränktem diagnostischen Wert; die mikroskopische Untersuchung von Blut ist wegen geringer Keimzahlen sinnlos. Zur Anzüchtung wird Blut zunächst auf flüssige Nährmedien verimpft und bei Keimwachstum auf festen Nährböden subkultiviert; Liquor cerebrospinalis wird gleichzeitig auf flüssige und feste Nährmedien verimpft; bei anderen Untersuchungsmaterialien kommen wegen des Überwucherns durch weniger anspruchsvolle Begleitkeime nur feste Nährmedien in Frage. Die Bebrütung erfolgt in COvangereicherter Atmosphäre bei 37 °C für 1-3 Tage, bei Blut und Liquor cerebrospinalis für mindestens 1 Woche. Da häufig Begleitkeime vorliegen, ist eine sorgfältige Ausstrichtechnik, eine aufmerksame Inspektion der Koloniemorphologie und in der Regel wiederholte Subkultur erforderlich. Zur Spezies-Identifizierung verdächtiger Kolonien führen neben Gramreaktion und Beweglichkeitsprüfung im wesentlichen die charakteristischen Stoffwechselleistungen (s. Tab. 4.22). Zur Qualitätssicherung sollten Referenzstämme mitgeführt werden. Serologische Diagnostik: Der Nachweis von Antikörpern im Serum spielt in der Diagnostik humaner Pasteurellosen keine Rolle.

Therapie und Prophylaxe

Bei Infektionen, die allein durch P multoeida verursacht werden, gilt Penicillin als Antibiotikum der Wahl. Ampicillin, systemische Cephalosporine der 2. und 3. Generation, Carbapcneme und Tetrazykline kommen alternativ in Frage. Die 4-Chinolone (Ciprofloxacin, Levofloxacillin, Trovafloxacin) zeigen in vitro eine gute antibakterielle Aktivität, die klinischen Erfahrungen in der Behandlung von Pasteurellosen sind jedoch gering. Aus Sicherheitsgründen sollte die antibiotische Empfindlichkeit (Antibiogramm) bestimmt werden. Bei Wundinfektionen ist die chirurgische Intervention in Kombination mit Chemotherapie obligat. Für die Prophylaxe nach Biß- und Kratzverletzungen ist die sofortige Wunddesinfektion und falls erforderlich chirurgische Wundtoilette mit offener Wundversorgung entscheidend. Eine zusätzliche Chemoprophylaxe ist bei tiefen Wunden und bei Patienten mit Infektabwehrschwäche angezeigt. Nur bei hochgradig immuninsuffizienten Patienten ist eine Prophylaxe nicht-traumatischer Infektionen durch Beschränkung des Kontakts mit Tieren indiziert. Aktive und passive Immunisierung gegen Pasteurellosen sind in der Humanmedizin ohne Bedeutung. Epidemiologie

Erregerreservoir der weltweit verbreiteten Pasteurellae sind domestizierte und wildlebende Säugetiere und Vögel. Die Häufigkeit von P. multocida-Kcimträgern variiert je nach Tierart und epizootischer Situation: Katzen 50-70%. Hunde 12-66%, Schweine ca. 50%, Ratten 14%. Veterinärmedizinisch und für die Tierzucht bedeutsame Pasteurellosen werden am häufigsten durch P. multoeida verursacht: Pneumonie und hämorrhagische Septikämie bei Rindern. Schweinen und Schafen sowie die sog. Geflügelcholera bei Hühnern, Truthühnern und Enten. Pasteurellosen des Menschen, die nahezu ausschließlich von P. multoeida und eng verwandten Pasteurella-Arten ausgelöst werden, sind seltene Erkrankungen. Ihre Inzidenz wird auf 0,5-25 Erkrankungsfälle/l Million Einwohner/ Jahr geschätzt. Die Übertragung der Erreger von Tieren auf den Menschen erfolgt über Bißund Kratzwunden, durch häufigen direkten, nicht-traumatischen Kontakt oder auf aeroge-

4.8 Die hämophilen Bakterien

nein Wege (Tröpfcheninfektion). Betroffen sind vorzugsweise Tierhalter, Tierhändler, Tierzüchter, Landwirte, Schlachthofpersonal. Bei 5-15% der P. multocida-Infektionen ist Tierkontakt jedoch nicht nachzuweisen. Gesunde Keimträger kommen in Berufsgruppen mit intensivem Tierkontakt (Tierärzte, Veterinärstudenten, Tierhändler, Landwirte) in einer Häufigkeit von 2% vor. Eine Übertragung der Erreger von Mensch zu Mensch ist bislang nicht belegt. Literatur ADLAM. C, and .1. M. RUTTER (Eds.): Pastcurella and Pasteurellosis. Academic Press, London 1989. BOYCF, J. M.: Pasteurella Specics, in: MANDFXL, G. L., R. G. DOUGLAS and J. E. BENNETT (Eds.): Principles and Practicc of Infectious Discases, p. 1746-1748. Churchill Livingslone. New Yok 1990. MANNHEIM, W.: Family III. Pasteurellaceae Pohl 1981, in: KRIEG, N. R., and J. G. HOLT (Eds.): Bergey's Manual of Systematic Bactcriology, Vol. 1, p. 550-575, Williams & Wilkins, Baltimore/London 1984 SMITH, G. R.. and J. E. PHILLIPS: Pastcurella and Actinobacillus, in: PARKER, M. T, and B. I. DUERDEN (Eds.): Topley and Wilson's Principles of Bacteriology, Virology and Immunity, Vol. 2, Systematic Bacteriology, p. 384-414, Edward Arnold, London 1990

4.8 Die hämophilen Bakterien GEORG PLUM

4.8.1 Die Gattung Haemophilus Bakterien der Gattung Haemophilus sind gramnegative Stäbchen, die zur Anzüchtung anspruchsvolle Anforderungen an Nährböden stellen: sie benötigen die Wachstumsfaktoren Hämin und/oder NAD, wie sie in hämolysiertem Blut vorkommen. Der medizinisch wichtigste Erreger dieser Gattung ist Haemophilus influenzae Typ b. Die effektivste Möglichkeit, die negativen Auswirkungen dieser Infektion zu verhindern, besteht in der breiten Anwendung der Hib-Impfung. Weitere, als Infektionserreger wesentlich weniger bedeutende Spezies sind H. parainfluenzae, H. ducreyi, H. aphrophilus. Darüber hinaus können die Spezies H. paraphrophilus, tl. haemolyticiis, H. parahaemolyticus und H. segni in sehr seltenen Fällen Infektionskrankheiten hervorrufen. Die Zugehörigkeit der

Arten H. aphrophilus und H. ducreyi zum Genus ist neuerdings umstritten. 4.8.2 Haemophilus influenzae Geschichte

Haemophilus influenzae wurde von RICHARD PFEIFFER entdeckt und 1892 beschrieben. PFEII FHR glaubte seinerzeit, den Erreger der Influenza entdeckt zu haben. Bei der schweren Influenza-Pandemie von 1918/1919 stellte sich allerdings heraus, daß die „Influenza-Bakterien" nur bei einem Teil der Betroffenen nachgewiesen werden konnten und folglich nicht ausschließlich als ätiologisches Agens der Influenza anzusehen waren. Die Bezeichnung des Genus wurde im Jahre 1920 eingeführt. 1933 "wurde schließlich der Nachweis erbracht, daß das Influenzavirus der verantwortliche Erreger dieser Erkrankung ist. Der von diesem Virus verursachte zytopathische Effekt in der Schleimhaut schafft jedoch die Voraussetzung für eine Superinfektion durch H. influenzae, was den häufigen Nachweis dieser Bakterien bei einer Influenza erklärt.

Eigenschaften des Erregers Morphologie

hl. influenzae sind gram-negative, unbewegliche Bakterien, die sich mikroskopisch als zarte Stäbchen, zuweilen aber auch als kokkenähnliche (kokkoide) Stäbchen darstellen. Eine Kapsel, sofern vorhanden, läßt sich nicht mit der Gramfärbung, jedoch mit der Quellungsreaktion, ähnlich wie bei S. pneumoniae, oder durch direkte Immunfluoreszenz nachweisen (Abb. 4.29). Der mikroskopische Kapselnachweis spielt in der Routinediagnostik im Gegensatz zum Nachweis des Kapselpolysacccharids (siehe unten) keine Rolle. Kultur

Bei der Kultur von H. influenzae sind die Nährstoffansprüche dieser anspruchsvollen Mikroorganismen zu berücksichtigen: Alle Spezies dieses Genus benötigen entweder Hämin (Faktor X) oder NAD (Faktor V) oder beides. Die meisten Spezies wachsen gut auf Kochblutagar. aber nicht auf den konventionellen SchafblutagarNährböden, da in letzterem zwar genügend Hämin vorhanden sein kann, nicht jedoch intaktes NAD. Das Wachstum auf Schafblutagar kann dennoch erreicht werden, wenn quer zur Animpfung der Haemophilus-Baktenen ein Impfstrich mit einem anderen Bakterium erfolgt (sogenannte Amme; meistens verwendet man Staphylococcus aureus). In unmittelbarer Umge-

341

342

Spezielle Bakteriologie

Abb. 4.30 Ammen- oder Satellitenphänomen bei H. influenzae (der Pfeil zeigt auf den Impfstrich von S. aureus).

Abb. 4.29 Bekapselte Zellen von H, influenzae (nach KATLIN et al., 1969). Darstellung mit Immunfluoreszenz.

bung des gewachsenen Ammen- Impfstrichs wächst Haemophilus in der Form von kleinen, glatten, glasig-durchscheinenden Kolonien, deren Größe mit zunehmender Entfernung vom Ammenstrich sich kontinuierlich verkleinern. Dieses Wachstum wird als Animenphänomen bezeichnet, und dient auch heute noch zur Erkennung bzw. vorläufigen Identifizierung der Erreger aus klinischem Untersuchungsmaterial (Abb. 4.30). Dieses Phänomen beruht darauf, daß der Ammenkeim Faktor V in den Nährboden abgibt und zusätzlich durch die Freisetzung seiner Hämolysine zu einem gesteigerten Angebot an Faktor X führt. Das Bedürfnis für die Faktoren X und V kann auch zur Differenzierung der Spezies innerhalb dieses Genus genutzt werden. Dazu werden mit den Faktoren X,V sowie X+V getränkte Testblättchen auf blutfreien Nährböden verwendet. H. influenzae wächst nur im Hof des mit X+V beschickten Testblättchens.

Bei dieser Testmethode der X- Faktorabhängigkeit kann es durch Verschleppung des Faktors z.B. aus einem zu üppigen Inokulum zu Ablesefehlern kommen. Für die definitive Bestätigung eignet sich der Porphyrintest, llaemophilus-Arten, die X-Faktor abhängig sind, setzen während des Wachstums kein Porphobilinogen und keine Porphyrine aus der Umwandlung der 6-Aminolävulinsäure frei, da sie nicht die entsprechenden Enzyme zur Biosynthese bilden. Die Porphyrinbildung zeigt sich durch Fluoreszenz unter UVAnregung. Fluoreszierende Stämme sind demnach nicht Faktor X-abhängig. Zusätzlich zur Abhängigkeit von den Faktoren X und V dienen biochemische Tests zur Identifizierung der Isolate bis zur Spezies-Ebene. Dazu gehören der Nachweis der Fähigkeit zur Hämolyse von Pferdeblut sowie Fermentationstests für Glukose, Saccharose, Laktose und Mannose in Faktor X + V angereicherter Nährbouillon und die Bildung von Katalase (Tab. 4.23). Es werden kommerzielle Testkits für diese Reaktionen angeboten, die eine Durchführung der Identifizierung mit minimalem Aufwand erlauben. Eine besonders zuverlässige Methode der Bestätigung der Spezies //. influenzae wird durch eine kommerzielle Gensonde erreicht, die die

4.8 Die hämophilen Bakterien

spezifische Zielsequenz in einer Chemilumineszenzreaktion nachweist. Der Einsatz dieses Verfahrens ist jedoch in der Regel nicht notwendig. Kapseltypen

Bekapselte Stämme werden eingeteilt in sechs Serotypen a-f. die sich in ihrem chemischen Aufbau und ihrer Antigenität unterscheiden. Nicht-bekapselte Stämme sind in diesem System nicht typisierbar, da sie nicht mit den spezifischen Antiscren reagieren. Die Polysaccharidkapsel ist der Virulenzfaktor, dessen Bedeutung für die Pathogenese schwerer Infektionen am besten belegt ist.

Unter den verschiedenen Kapseltypen a.b.c.d.c.f ist es das Polyribosyl-Ribitolphosphat (PRP) des Typs b, das für die ausgeprägte Invasivität der Erreger mitverantwortlich ist und die Phagozytose der Erreger durch Granulozyten des Wirts blockiert. Pathogenese und Virulenzfaktoren

Haemophilus influenzae kommt nur beim Menschen vor und stirbt außerhalb seines Wirtes rasch ab. Eine Erkrankung setzt daher immer eine vorangehende Kolonisierung des oberen Respirationstraktes voraus.

In den meisten Fällen besteht dieser Zustand asymptomatisch über längere Zeit. Es kann je-

343

doch zu einer „Durchwanderung" zu anderen Geweben, insbesondere des Respirationstraktes kommen. Dies führt zu Infektionen des Mittelohres, der Sinus, der Konjunktiven oder der tieferen Lungenbezirke. Gelegentlich gelangen die Bakterien in die Blutbahn und, wenn sie im intravasalen Raum überleben können, in andere Regionen des Körpers, z.B. in die Meningen, die Gelenke oder die Lunge. H. influenzae verfügt über mehrere Virulenzfaktoren, welche die Kolonisicrung des Respirationstraktes ermöglichen: Das sekretorische igA und der mukoziliale Transport als Mechanismen der Abwehr werden überwunden, indem ein Zilien-toxisches Lipo-Oligosaccharid (LOS) und eine extrazelluläre Serin-Protease (Iga) mit Endopeptidaseaktivität freigesetzt werden. Diese Protease inaktiviert spezifisch IgAl. Zusätzlich verfugt der Erreger über ein ganzes Arsenal von Adhäsionsmolekülen (s.u.), welche spezifische Wirtszeil-Rezeptoren erkennen und die Anhaftung an das Epithel stabilisieren. Da die Anhaftung an das Epithel für die Bakterien ein besonders wichtiger Überlebensfaktor ist, sind die Faktoren für die Aufrechterhaltung dieser Fähigkeit genetisch redundant. Fimbrien

Wie viele andere gram-negative Bakterien vermag auch //. influenzae Fimbrien bzw. Pili auszubilden, die eine Agglutination von Erythrozyten und das Anhaften der Erreger an die Epithelien des Oropharynx bewirken. Daher sind Isolate vom Nasopharynx im Gegensatz zu den isogenen Isolaten aus dem Blut oder Liquor

Tab. 4.23 Differenzierung von Haemophilus-Arten Species

Faktorabhängigkeit X V

H. influenzae

+

+

H. parainfluenzae H. ducreyi H. aphrophilus

+

-

H. paraphrophilus H. haemolyticus H. parahaemolyticus H. segnis

+ -

+

+ + + +

+ = positive Reaktion;- = negative Reaktion; negative Reaktion möglich

Hämolyse

Fermentation

Katalase

Pferdeblut Glukose Saccharose Laktose + -

+ +

+ + + + + (+)

+ + + + (+)

Mannose -

+ + -

+ +

D -

+

+ + D

-

+

-

(+) = schwach-positive Reaktion; D = differente Reaktion, d.h. positive oder

Spezielle Bakteriologie

344

mit Fimbrien ausgestattet. Die Gene sind auf dem Chromosom in einer Gruppe angeordnet, hifA-hifE, die neben dem Hauptstrukturgen /H/A weitere Gene für die Translokation, den Zusammenbau und die Stabilisierung enthalten. Die Expression wird durch einen komplizierten genetischen Mechanismus bestimmt und der Wechsel von Fimbricn-tragendcn zu Fimbrienfreien Stämmen phänotypisch als Phasenvariation umschrieben.

Die Persistenz im Wirt erfordert einen ständigen Nachschub an Nährstoffen und gleichzeitig Schutz vor dem Immunsystem des Wirts. Um dies zu erreichen, hat H. influenzae komplexe Systeme der Phasen- und Antigenvariation entwickelt, die durch reversible und irreversible Änderung der genetischen Steuerelemente der entsprechenden Gene die Expression der Virulenzfaktoren im weitesten Sinne modulieren. Klinik

Fibrillen und andere H. influenzae-Adhäsine

Ein weiteres System, das die Anhaftung der Bakterien an Epilhelzellen gewährleistet, besteht in den sogenannten Fibrillen, dem Genprodukt des hsf Locus. Die Reichweite der Fibrillen ist allerdings wesentlich geringer als die der Fimbrien. Darum kann bei vorhandener Kapsel eine effektive Bindung der Bakterien an Epithelien über die Fibrillen nicht erfolgen. Ein verwandtes Molekül der nichtbekapselten Stämme ist das Adhäsin Hia, das Genprodukt des hia Locus. Nicht-bckapselte Stämme besitzen andere nicht-pilusartige Adhäsionsmoleküle (high molecular weight adhesin) HMW1 und HMW2. Diese beiden oberflächenexponierten Proteine haben große Ähnlichkeit untereinander und besitzen eine Antigenverwandschaft zum filamentösen Hämagglutinin von Bordeteüa pertussis, einem bekannten Adhäsions- und Kolonisationsfaktor. Hap

Dieses Protein hat Ähnlichkeit mit der bereits erwähnten IgAl-Protease Iga. Beide Proteine sind Serin-Proteasen und gehören zur Familie der autosekretorischen Peptide, deren Mitglieder bei einer Reihe von gram-negativen Bakterien angetroffen werden. Hap ist möglicherweise an der Invasion von Epithelzellen durch die Bakterien beteiligt. Koordinierte Aktion der Adhäsine Die Fimbrien der bekapselten Stämme sind für den ersten Kontakt wichtig, während die spezifischere, spätere Adhäsion durch Hia vermittelt wird. Bei den nicht-bekapselten Stämmen fehlen in der Regel die Fimbrien und die Adhäsine HMW1/HMW2 bzw. Hia nehmen deren Stellenwert ein. Hap ist für einen weiteren Adhäsionseffekt verantwortlich, bildet aber auch Wechselwirkungen zwischen den Bakterien aus. Es kann als Biofilm-bildender Faktor angesehen werden, der zu größeren Bakterienaggregaten auf der Mukosa und damit zu erhöhter Resistenz gegenüber den unspezifischen Abwehrmechanismen führt.

Nach Schätzungen der WHO ist H. influenzae Typ b weltweit jährlich für mehr als 3 Millionen schwere Erkrankungen und für 400000 bis 700 000 Todesfälle bei Kleinkindern verantwortlich.

Wegen der Übertragung mütterlicher Antikörper treten systemische Infektionen nur selten vor dem dritten Lebensmonat auf. Der Häufigkeitsgipfel liegt zwischen dem 4. und dem 18. Lebensmonat.

Ab dem 6. Lebensjahr sind die schweren Infektionen selten. Neben den lebensbedrohlichen invasiven Erkrankungen wie Meningitis, Epiglottitis oder Sepsis kann H. influenzae ein Spektrum weiterer Infektionen verursachen wie Endokarditis, Osteomyelitis, septische Arthritis, Zellulitis, bronchopulmonale Infektionen bis hin zu den nicht-invasiven Erkrankungen wie Konjunktivitis, Sinusitis und Otitis media. Meningitis

Haemophilus influenzae ist weltweit der wichtigste Erreger der bakteriellen (septischen) Meningitis mit einer Letalität von 3-5% in Ländern mit hohem medizinischen Standard und bis zu 30% in den Entwicklungsländern. In unbehandelten Fällen liegt die Letalität bei über 80%. Die Rate derer, die auch bei adäquater Therapie unter erheblichen neurologischen Folgen leiden, ist mit 20% beachtlich. Die Klinik der akuten Meningitis erlaubt keine Unterscheidung zu den septischen Meningitiden durch andere Erreger in der typischen Altersgruppe. Seit der Einführung der Hib-Konjugatvakzine sind die schweren Infektionen in Westeuropa, Canada, den USA, Australien und Neuseeland stark zurückgegangen. In einigen Ländern mit fast 100%iger Durchimpfung tritt die HibMeningitis nicht mehr auf. Allerdings scheint in

4.8 Die hämophilen Bakterien

allerletzter Zeit die Bedeutung der anderen Serotypen, insbesondere des Typ f, bei den invasiven Erkrankungen zuzunehmen. Epiglottitis

Die Epiglottitis ist eine sehr seltene, meist hochakut einsetzende Erkrankung mit Schwellung des submukösen Gewebes im oberen Kehlkopf. Der Zustand ist dramatisch und verschlechtert sich schnell: die Patienten ringen nach Luft und drohen zu ersticken. Da es jederzeit zur Verlegung der Atemwege und Laryngospasmus kommen kann, ist der Epiglottitisverdacht immer als pädiatrischer Notfall anzusehen.

wie bronchoalveoläre Lavage. Sputum, Eiter, Abstriche vom Auge, der Nase, Rachen. Blutkulturen können auch bei Infektionen der Atemwege diagnostisch wegweisend sein. Kurze Versandzeiten und schnelle Verarbeitung des Materials im Labor sind wegen der Empfindlichkeit der Erreger für eine optimale Diagnostik entscheidend. Liquor: Um eine diagnostisch wegweisende GRAM-Färbung, einen Antigennachweis und eine Kultur zu ermöglichen, sollte wenigstens 1 ml nativen Liquors an das mikrobiologische Labor eingesandt werden. Zusätzliche Beimpfung von Liquorkulturflaschen unmittelbar nach Entnahme erhöht die kulturelle Ausbeute.

Bronchopulmonale Infektionen

Diese werden in den Industrieländern überwiegend von nicht-bekapselten Stämmen verursacht und treten als Tracheobronchitis und Pneumonie bei Erwachsenen und Kindern auf. In den Entwicklungsländern sind nach WHOSchätzungen jährlich zwei bis drei Millionen Fälle von akuter Pneumonie auf den Kapseltyp b zurückzuführen. Auch bei den pulmonalen Infektionen kommt es häufig zu passageren Bakteriämien. Die Mehrzahl der Patienten in unseren Breiten weist prädisponierende Faktoren auf, wie z.B. Malignome, chronisch-obstruktive Lungenerkrankungen, Alkoholismus, HIV-Infektion oder Schwangerschaft. Infektionen im HNO-Bereich, andere Infektionen

Haemophilus influenzae ist bei Kindern der am zweithäufigsten identifizierte Erreger einer Otitis media nach S. pneumoniae. In der Regel handelt sich um nicht-bekapselte Stämme, die auch bei der Sinusitis des Erwachsenen von Bedeutung sind. Ein bestimmter Biotyp von H. influenzae (Biotyp III, früher als H. aegyptius oder KOCHWEEKS-Bazillus bezeichnet) ist der wichtigste Erreger der eitrigen, bakteriellen Konjunktivitis. Selten ist H. influenzae auch als Erreger einer Infektion des Herzens (Perikarditis, Endokarditis), des Abdomens (Peritonitis) und des weiblichen Genitaltraktes (Adnexitis, Endometritis) zu finden. Laboratoriumsdiagnose

Geeignetes Untersuchungsmaterial sind bei den systemischen Infektionen vor allem Blutkulturen und Liquor, ansonsten Proben/Abstriche vorzugsweise aus der erkrankten Körperregion

Proben, die zur Anzucht von Haemophilus entnommen werden, sollten möglichst nicht mit anderen Mikroorganismen (z.B. Bakterien der Mundflora) kontaminiert sein, da diese die Erkennung und Isolation der Erreger beeinträchtigen. Um die Mischflora zu unterdrücken, kann ein Kochblutagar mit Zusatz des Antibiotikums Bacitracin verwendet werden, gegen das H. influenzae resistent ist.

Empfehlenswert sind Entnahmetechniken, die einen Schutz der aus tiefer liegenden Lungenabschnitten gewonnenen Probe vor Kontamination mit Mikroorganismen des oberen Respirationstraktes gewährleisten, z.B. bronchoskopisch gewonnene broncho-alveoläre Lavage. Der diagnostische Wert von Nasopharynxabstrichen zur Klärung der Ätiologie der Infektionen des oberen Respirationstraktes und der Otitis media ist wegen des häufigen asymptomatischen Trägerlums als gering anzusehen. Probenmaterial wird auf Blutagar mit Amme (s.o.) und auf Kochblutagar ausgeimpft. Die Nährböden sollten in einer aeroben Atmosphäre mit Zusatz von 5-10% CO2 bei 35-37 °C für 48 bis 72 Stunden bebrütet werden. Haemophi/MS-Kolonien sind klein, durchscheinend und weisen wegen der Produktion von Indol aus Tryptophan einen charakteristischen Geruch auf, der an Mäuseurin erinnert. Die definitive Diagnose erfolgt auf Grund der GRAM-Färbung, dem Bedürfnis für die Wachstumsfaktoren und dem Porphyrintest. Für klinische Belange ist der Nachweis der Betalaktamasebildung wichtig, da die Produktion dieses Enzyms durch den isolierten Erreger Konsequenzen für die Wahl des geeigneten Antibiotikums hat. Antigennachweise: Der Test ist brauchbar bei

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Spezielle Bakteriologie

Infektionen durch den Kapseltyp b, da das Kapselpolysaccharid im Liquor, Blut, Gelenkpunktat oder in dem durch Ultrafiltration konzentrierten Urin nachweisbar sein kann. Dazu werden Suspensionen von Latexpartikeln benutzt, an deren Oberfläche kapseltypspezifische Antikörper gekoppelt wurden. Dieser Nachweis ist für den geübten Untersucher einfach in der Handhabung und schnell durchzuführen. Er kann jedoch wegen eingeschränkter Sensitivität und fehlender Information zum Resistenzverhalten die Kultur nicht ersetzen. Zu beachten ist, daß eine frische Hib-Impfung für eine Dauer von drei Wochen einen falsch-positiven Antigennachweis im Urin oder Liquor verursachen kann. Therapie Schnelle Diagnose und frühe empirische Chemotherapie sind die wichtigsten Voraussetzungen für eine optimale Behandlung der schweren Infektionen, insbesondere der Meningitis. Ohne Kenntnis des Antibiogramms sollte die Therapie mit einem Cephalosporin der dritten Generation (Cefotaxim, Ceftriaxon o.a.) begonnen werden.

In Entwicklungsländern wird aus Kostengründen weiterhin häufig Ampicillin eingesetzt, dessen Wirksamkeit aber wegen der fortschreitenden Verbreitung des Betalaktamase-Gens nicht sicher ist. Die gleichzeitige Gabe eines Betalaktamase-Inhibitors (Clavulansäure, Sulbactam o.a.) kann das Ampicillin erfolgreich vor der Spaltung durch die Betalaktamase schützen. Bei Infektionen des Respirationstraktes, des Mittelohres und der Sinus ist Amoxicillin weiterhin das Mittel der Wahl, wenn die Erreger empfindlich sind. Bilden die Erreger Betalaktamase, so können bei Kindern neuere Oralcephalosporine (Cefixim, Ceftibuten, CefpodoximProxetil), Amoxicillin/BetalaktamaseinhibitorKombinationen, Cotrimoxazol oder Makrolide, bei Erwachsenen auch Tetrazykline oder Fluorchinolone eingesetzt werden. Zur Vermeidung von Therapieversagen sollte zu Beginn der Antibiotikatherapie durch eine mikrobiologische Untersuchung das Resistenzverhalten des jeweiligen Isolats untersucht werden.

Die Konjunktivitis wird durch lokal applizierte Antibiotika (Augentropfen, Augensalben) be-

handelt, die Chloramphenicol, Rifampicin. Sulfonamide oder auch Fluorochinolone enthalten. Zum Schutz empfänglicher Personen ist bei Erkrankung eines Kindes an einer Haemophilus influenzae-Mcmntg\t\s oder -Epiglottitis eine Rifampidn-Prophylaxe der nicht-geimpften Kontaktpersonen (nicht jedoch Schwangere) im Haushalt oder der Kindereinrichtung empfehlenswert. Besonders der Schutz von Kindern unter 2 Jahre ist zu beachten. Eine Chemoprophylaxe ist nicht mehr sinnvoll, wenn der Kontakt zum Indexpatienten mehr als 7 Tage zurückliegt. Säuglinge im ersten Lebensmonat erhalten 10 mg/kg KG/Tag, ältere Säuglinge und Kinder unter 12 Jahren erhalten 20 mg/kg KG/ Tag. Kinder über 12 Jahre und Erwachsene erhalten 600 mg/Tag alle jeweils in einer Einzeldosis über 4 Tage. Epidemiologie und Bekämpfung Das einzige Reservoir für H. influenzae ist der Mensch. Die Übertragung erfolgt durch Tröpfcheninfektion ausgehend von asymptomatischen Trägern. Bei nicht-geimpften Kindern fanden sich bis zu 15% Träger des Typs Hib. Jedoch nur ein sehr kleiner Teil der Besiedelten erkrankt später tatsächlich (Tab. 4.24). Wegen der großen Zahl von Keimträgern sind Umgebungsuntersuchungen nicht sinnvoll. Ein Ausschluß eines Ausscheiders von z.B. einer Schule oder Tageseinrichtung ist nicht erforderlich, solange bei ihm keine meningitis- oder epiglottitisverdächtigen Symptome auftreten. Unabhängige Risikofaktoren für eine Infektion sind fehlende Stillzeit als Säugling, beengte Lebensverhältnisse und Unterbringung in einer Gemeinschaftseinrichtung. Der direkte Nachweis von H. influenzae aus Liquor oder Blut ist nach dem Infektionsschutzgesetz meldepflichtig. Personen, die an einer H. influenzae Typ b-Meningitis erkrankt sind, dürfen erst nach ärztlicher Genehmigung wieder in Gemeinschaftseinrichtungen arbeiten. Immunität, Immunprophylaxe

Bei älteren Kindern oder Erwachsenen induziert die Polysaccharidkapsel bakterizide Antikörper, ohne jedoch zu einer langandauernden Immunisierung zu führen, da nicht ausreichend Gedächtniszellen gebildet werden und somit eine natürliche Boosterung durch wiederkehrende Kontakte mit dem Erreger unterbleibt. Bei Kindern unter 18 Monaten werden durch

4.8 Die hämophilen Bakterien

Erkrankungsalter

Kapseltyp b

nicht-bekapselt

Kleinkinder

Kinder und Erwachsene

Träger in Nasopharynx

40-80%

Typische Erkrankungen

Meningitis Pneumonie Epiglottitis Arthritis Perikarditis Zellulitis

Otitis media Sinusitis Bronchitis Pneumonie Konjunktivitis

Bakteriämie

häufig

selten

das Polysaccharid allein keine sicher bakteriziden Titer erreicht. Eine neue Generation von Hib-Impfstoffen wurde daraufhin so konstruiert, daß ein T-Zcll abhängiges Proteinantigen mit dem Hib-Polysaccharid konjugiert wurde. Diese Konjugatvakzinen führen nicht nur zu einem guten immunologischen Gedächtnis und protektiven Antikörpertitern in Kleinkindern, sondern vermindern zusätzlich die nasopharyngeale Trägerrate für Hib. Es wird also zusätzlich zum individuellen Schutz ein Kohortenschutz durch verminderte Transmission dieses Erregertyps aufgebaut.

4.8.3 Haemophilus parainfluenzae und andere Arten der HACEK-Gruppe Haemophilus parainfluenzae, H. aphrophilus, H. paraphrophilus, H. haemolyticus und H. segnis sind Bestandteil der Normalflora des oberen Respirationstraktes. In bestimmten Situationen können diese Erreger jedoch lebensbedrohliche Infektionen, z.B. Endokarditis, Meningitis, Gehirnabszess und sekundäre Bakteriämien verursachen. Der Nachweis aus Blutkulturen erfordert besondere Sorgfalt wegen des anspruchsvollen und langsamen Wachstums der Erreger, ist aber diagnostisch wegweisend, wenn er gelingt.

4.8.4 Haemophilus ducreyi (Ulcus molle) H. ducreyi ist der Erreger des „weichen Schankers", Ulcus molle, einer sexuell übertragenen Erkrankung, die als schmerzhafte Ulzerationen am Genitale auftreten und mit Schwellung inguinalcr Lymphknoten vergesellschaftet sein kann. In Deutschland ist sie selten, jedoch hat

Tab. 4.24 Verteilung des Vorkommens bekapselter (Typ b) und nicht-bekapselter Haemophilus influenzae

ihre Bedeutung durch den Ferntourismus zugenommen. Als Ursache von Ulzerationen der Genitalschleimhaut ist der Erreger als Wegbereiter für andere sexuell übertragbare Infektionen, nicht zuletzt der HIV-Infektion, anzusehen. Klinik An der Kontaktstelle entsteht anfangs nach einer Inkubationszeit von einem Tag bis zu mehreren Wochen (im Mittel 2-5 Tage) eine weiche Papel mit erythematösem Hof. Diese eröffnet sich nach kurzer Zeit und ulzeriert zu einer schmerzhaften, nicht-indurierten Pustel mit ausgefranstem, unterminierten Rand. Die Läsionen haben eine Größe bis zu 20 Millimeter. Sie können einzeln oder zu mehreren vorkommen und zu größeren Ulzera konfluieren. Durch Superinfektion mit anderen Erregern kann es zu Exazerbation der Entzündung und Destruktion der äußeren Genitalien kommen. Beim Mann sind häufig die Glans penis, der Sulcus coronarius, das innere Blatt der Vorhaut und das Frenulum, bei Frauen die Labien, die Klitoris, die Cervix und die Analregion betroffen. Bei der Hälfte der Patienten kommt es gleichzeitig zum einseitigen, schmerzhaften Befall der inguinalen Lymphknoten, die unbehandelt nach außen rupturieren können. Die klinische Diagnose ist unsicher, da andere sexuell übertragene Erkrankungen ein ähnliches Bild verursachen können und Mehrfachinfektionen möglich sind.

Insbesondere ist in jedem Fall von vermuteter oder bestätigter H. ducreyi-lnicküon der Ausschluß einer gleichzeitigen Infektion mit Treponema pallidum erforderlich, da beide Erkran-

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Spezielle Bakteriologie

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klingen ähnliche klinische Bilder hervorrufen und gleichzeitig vorliegen können (Ulcus durum als Primäraffekt der Syphilis). H. ducreyi verursacht keine disseminierten Infektionen selbst bei deutlicher Immunsuppression z.B. durch HIV. Läsionen außerhalb des Genitalbereichs können jedoch auftreten und werden durch Autoinokulation erklärt. Die relativ niedrige optimale Wachstumstemperatur von 33-35 °C schließt möglicherweise eine Infektion tieferer Körperregionen aus. Laboratoriumsdiagnose Die Diagnose wird durch die Kultur der Erreger aus dem Abstrichmaterial vom Ulcus, von rupturierten Lymphknoten oder Lymphknotenaspirat gestellt.

In ca. der Hälfte der Fälle kann bereits die GuAM-Färbung aus dem Abstrichmaterial durch die für H. ducreyi typische ..Fischzuganordnung" der Massen von gram-negativen, kokkoiden Stäbchen einen Hinweis auf den Erreger geben. Die Anzucht ist schwierig und benötigt reichhaltige Spezialnährböden wie z.B. GC-HgS (Gonokokken-Agarbasis angereichert mit Hämoglobin, fötalem Kälberserum, IsoVitaleX und mit 3 ug/ml Vancomycin zur Unterdrückung der grampositiven Begleitflora) oder MH-HB (MÜLLERHIN TON-Agar mit gekochtem Pferdeblut, IsoVitaleX und Vancomycin). Für die erfolgreiche Anzucht ist eine möglichst direkte Beimpfung und die Verwendung von mindestens zwei verschiedenen Nährböden hilfreich. Die Nährböden werden bei 33-35 °C für mindestens 72 Stunden in einer aeroben Atmosphäre mit 5-10% CO2 inkubiert. Verdächtige Kolonien sind klein, graubraun, von fester Konsistenz und lassen sich mit einer Impföse schlecht verreiben. Die Bestätigung der Spezies geschieht mit den oben beschriebenen Verfahren. Serologische Methoden (IgG-EIA, IgM-EIA) zum Nachweis der H. dMCTeyMnfektion wurden entwickelt, zeigten bisher aber eine niedrige Sensitivität und Spezifität. Der direkte Antigen-Nachweis und PCR-Methoden sind in der Entwicklung aber gegenwärtig noch nicht standardisiert.

Ŷ Erythromycin (500 mg) dreimal täglich für 7 Tage Ersatzweise: Ŷ 1 g Azithromycin oral als Einmalgabe Ŷ 250 mg Ceftriaxon i.m. als Einmalgabe Ŷ 500 mg Ciprofloxacin oral als Einmalgabe Ŷ 2 g Spectinomycin i.m. als Einmalgabe Cotrimoxazol (160/800 mg) zweimal täglich für 7 Tage Resistenzen wurden mit der Ausnahme von Ceftriaxon mit unterschiedlicher Häufigkeit bei allen erwähnten Substanzen gefunden, Therapieversagen kann bei der empirischen Therapie folglich nicht ausgeschlossen werden. Selbst Kombinationen von Amoxicillin mit Betalaktamase-Inhibitoren sind nicht in jedem Fall wirksam. Epidemiologie und Bekämpfung Die Infektion kommt weltweit vor und ist typischerweise mil niedrigem sozioökonomischem Status assoziiert. Besonders häufig ist sie in Afrika, Asien und Lateinamerika. Zur Aufrechterhaltung der Endemic des Erregers trägt ein häufiger Wechsel des Sexualpartners und ungeschützter Verkehr bei. Die Weiterverbreitung des Erregers durch eine infizierte Person findet in einem Zeitraum von ca. 45 Tagen nach Ausbruch der Erkrankung statt. Asymptomatische Träger kommen besonders bei Frauen vor. Die Identifizierung und Behandlung der Sexualpartner, ob symptomatisch oder nicht, ist wichtig zur Unterbrechung der Infektionskette.

4.8.5 Gardnerella vaginalis, unspezifische Kolpitis Die Spezies Gardnerella vaginalis und die ihr zugeschriebene ätiologische Bedeutung haben in der Vergangenheit mehrfach zu Kontroversen geführt. Der Erreger wurde 1955 von GARDNER und LUKES als Haemophihts vaginalis bezeichnet. Seine fehlende Abhängigkeit von den Faktoren X und V, sein gram-labiles bis gram-positives Färbeverhalten und andere Eigenschaften führten dazu, daß die Art zwischenzeitlich als Corynebacterium vaginale bezeichnet wurde. Durch zwei große taxonomische Studien im Jahre 1980 wurde die Eigenständigkeit der nunmehr neuen Spezies in einer eigenen Gattung etabliert. Der strukturelle Zellwandaufbau zeigt gewisse Ähnlichkeiten mit gram-positiven Bakterien der Genera Actinomyces, Arcanobacterium und Corynebacterium, jedoch besitzt die G. vaginalis-ZeWwdnd eine dünnere PeptidogykanSchicht.

Therapie

Klinik

Bewährte und von der WHO empfohlene Therapieregime:

Der Terminus „unspezifische Kolpitis" bezeichnet ein klinisches Syndrom vermuteter infektiö-

4.8 Die hämophilen Bakterien

ser Genese, für das keiner der akzeptierten spezifischen Erreger wie Candida-Arten, Trichomonas vaglnalis oder andere nachgewiesen werden konnten. GARDNER führte statt dessen die G. vag/n«/»"-Vaginitis als definiertes, spezifisches Krankheitsbild ein, dem die meisten der früher unter dem Sammelbegriff 'unspezifischc Kolpitis" diagnostizierten Krankheiten zuzurechnen seien. G. vaginalis ist allerdings nicht als alleiniger Erreger anzusehen, vielmehr zeigen neuere Untersuchungen eine polymikrobielle Ätiologie dieser Erkrankung mit weiteren Bakterien wie Mycoplasma hominis, verschiedenen Anaerobiern wie Prevotella, Bacteroides, Peptostreptocoecus, Fusobacterium und MobiluncusArten. Die „unspezifische Kolpitis" zeigt als auffallendstes klinisches Symptom einen vermehrten gräulichen vaginalen Ausfluß (Fluor) mit fischigem Geruch. Da eine entzündliche Reaktion des Vaginalepithels und der Cervix in der Regel nicht vorliegt, handelt es sich korrekter um eine bakterielle Vaginose. Zur Diagnosestellung ist die Erfassung klinischer Kriterien und die direkte mikroskopische Untersuchung besser geeignet als der kulturelle Nachweis von C. vaginalis.

Klinischen Kriterien sind: Ŷ dünne, homogene Konsistenz des Ausflusses Ŷ erhöhter pH-Wert (> 4,5) Ŷ fischiger Geruch nach Zugabe von 10% KOH Ŷ Nachweis von „clue cells" (s.u.), die bis zu 20% aller vaginaler Zellen ausmachen Ŷ Verschiebung der normalen Vaginalflora von Laktobazillen zu G. vaginalis, Anaerobiern, Mycoplasma hominis Ŷ Verschiebung des Verhältnisses Succinat zu Lactat (> 0,4) Ŷ Vorkommen von Putrescin und Cadaverin Mindestens drei der erstgenannten fünf Kriterien sollten bei einer bakteriellen Vaginose vorliegen. Andere Infektionen durch G. vaginalis sind sehr selten. Bakteriämien kommen fast ausschließlich bei Frauen mit gynäkologischen Erkrankungen vor wie postpartaler Endometritis, Chorioamnionitis, septischer Abort. Laboratoriumsdiagnose

Die GRAM-Färbung zeigt dünne, gram-labile Stäbchen oder Kokkobazillen. Die Bakterien

sind nicht beweglich, wachsen fakultativ anacrob mit nur schwach ausgeprägtem fermentativem Stoffwechsel, bilden keine Kapsel und sind Katalase- sowie Oxidase-negativ. Der Goldstandard der Diagnose ist die mikroskopische Beurteilung des Direktpräparats aus dem Vaginalabstrich und nicht die kulturelle Anzüchtung, da diese Bakterien auch Bestandteil der Normalflora sind. Der typische Befund zeigt in großer Zahl die von dünnen, pleomorphen Stäbchen bedeckten Epithelzellen, die in dieser Konstellation als „clue cells" bezeichnet werden, da sie den entsprechenden Hinweis (engl. clue) auf die G. vaginalis Vaginose geben. Zusätzlich ist eine Verschiebung der Normalflora erkennbar, d.h. Laktobazillen fehlen fast vollständig, während gram-labile und gram-negative Stäbchen und Kokkobazillen überwiegen. Die Bakterien lassen sich auf komplexen Nährböden, z.B. Kochblutagar oder Columbia CNA-Agar unter COvangereicherter Atmosphäre oder im Kerzentopf bei 37 °C anzüchten und bilden dann kleine (0,5 mm in 48h), glatte, runde, opake Kolonien. Auf Nährböden, die Menschen- oder Kaninchenerythrozyten enthalten, sind die Kolonien zur ß-Hämolyse fähig. Die Bestätigung der Differenzierung erfolgt mit biochemischen Tests wie sie in kommerziellen Identifizierungssystemen, z. B. API-Corynesystem, zum Einsatz kommen. Therapie

Das Mittel der Wahl sowohl für die lokale als auch die systemische Therapie ist Metronidazol. Penicillin und Ampicillin sind in der Regel auch wirksam und bieten sich für die systemische Therapie der postpartalcn Sepsis an, wenn G. vaginalis ohne die anaerobe Begleitflora nachgewiesen wurde. Cephalosporinc, Tetrazykline, Makrolide, Chinolone und Sulfonamide sind zur Therapie nicht geeignet.

Epidemiologie

Das natürliche Habitat für G. vaginalis ist die Vagina. Dort ist es Bestandteil der Normalflora und kann bei fast 70% der gesunden Frauen ohne Zeichen einer Vaginalinfektion isoliert werden. Bei bakterieller Vaginose findet sich G. vaginalis jedoch in fast 100% der Fälle in der Vagina und ebenfalls in der Mehrzahl in der Urethra der männlichen Partner.

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Spezielle Bakteriologie

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4.9 Pseudomonaden und andere anspruchslose, nicht fermentierende gram-negative Bakterien ALEXANDER VON GRAEVENITZ Taxonomie Zu den für den Menschen relevanten nicht fermentierenden gram-negativen Stäbchen („Nonfermenter") zählen eine große Anzahl anspruchsvoller (Bartonella, Bordetella, Brucella, Francisella) und anspruchsloser Gattungen, deren verwandtschaftliche Beziehungen bisher nicht vollständig geklärt sind. Zu den anspruchslosen Nonfermentern zählen die Gattungen Acidovorax, Acinetobacter, Agrobacterium, Alcaligenes, Balneatrix, Bergeyella, Brevundimonas, Burkholderia, Chryseobacterium, Comamonas, Empedobacter, Methyiobacterium, Moraxella (s. Kap. 4.3), Myroides, Ochrobactrum, Oligella, Pseudomonas, Psychrobacler, Ralstonia, Roseomonas, Shewanella, Sphingobacterium, Sphingomonas, Stenotrophomonas, Weeksella, einige bisher nicht klassifizierte Gruppen, sowie ein Teil der Gattungen Bordetella (z.B. B. bronchiseptica, s. Kap. 4.12) und Neisseria (z.B. N. elongata, s. Kap. 4.3).

Die Taxonomie der nicht fermentierenden Gallungen ist in den letzten Jahren aufgrund molekularbiologischcr Untersuchungen teilweise erheblich verändert worden; für einige Gattungen sind die älteren Bezeichnungen im Text aufgeführt.

Vorkommen Die natürlichen Standorte dieser Keime sind Erdboden, Wasser, Pflanzen und Nahrungsmittel; einige wenige Spezies (z.B. Oligella, Burkholderia mallei) sind bisher nur bei Tier oder Mensch beobachtet worden. Für den Menschen sind Häufigkeit und palhogenetischer Wert der einzelnen Spezies unterschiedlich; am häufigsten werden Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp. und Stenotrophomonas maltophilia gefunden. Physiologie Die Hauptfunktion der freilebenden nichtfermenlierenden Stäbchen ist der Abbau organischer (auch aromatischer) Substanzen, wodurch sie auch als Lebensmittelverderber auftreten können. Die meisten können sich bei Anwesenheit nur einer Stickstoff- oder Kohlenstoffquelle vermehren und wachsen gut bei 20-30 °C. Allen Vertretern dieser Gruppe gemeinsam sind fehlendes Wachstum bei Anacrobiose (einige Spezies vermögen allerdings Nitrat oder Arginin als Elektronenakzeptor zu verwenden) und fehlende Fermentation von Kohlenhydraten (Oxidation hingegen ist häufig). Differenzierung Wichtige morphologische Kriterien sind Anzahl und Lokalisation der Begeißelung, Koloniemorphologie, Wachstumsparameter und biochemische Leistungen, v.a. Vorhandensein von Oxidase, Nitratreduktion, Urcase, Zuckeroxidation etc. Hier muß auf die entsprechenden diagnostischen Handbücher verwiesen werden. 4.9.1 Die Gattung Pseudomonas und P. aeruginosa Die Gattung Pseudomonas ist beschränkt auf die frühere rRNA-Gruppe I, die sich von den anderen rRNA-Gruppen zusätzlich in der Zusammensetzung der zellulären Fettsäuren unterscheidet. Die Angehörigen der Gattung sind 1,5-5,0 x 0,5-1,0 um groß und besitzen eine oder mehrere polare Geißeln.

4.9 Pseudomonaden

Die Entdeckung dieser humanmedizinisch wichtigsten Art im 19. Jahrhundert ist an die Namen LÜCKE. SCHROETER und GKSSARD geknüpft. Die anfängliche Bezeichnung als Bacterium pyocyaneuni (Bakterium des blauen Eiters) wurde später durch Pseudomonas acruginosa (= die blaugrüne Pseudomonade) ersetzt (beachte: die Pseudomonas: das „ae" wird nicht getrennt gesprochen). Neben zahlreichen anderen, für die Humanmedizin bedeutungslosen Arten sind als weitere relevante Vertreter der Gattung zu nennen: P. fhiorcscens und P. putida, die psychrophil (kältcliebend) sind. Pyoverdin produzieren und als Erreger menschlicher Infektionen nur ausnahmsweise (etwa nach Bluttransfusionen) auftreten; ferner P. stutzeri, P. alcaligenes, P. pseudoalcaligenes, P. (früher Chryseomonas) luleolu und P. (früher Flavimonaa) oryzihabitans, die ebenfalls selten Infektionen hervorrufen, aber biochemisch leicht von P. aeruginosa abzutrennen sind.

Pathogenese Zu den Virulenzfaktorcn von P. aeruginosa zählen Fimbrien zur Adhäsion, Hämolysin (Elastase, alkalische und allgemeine Protease), Lipase, Siderophore (eine hiervon ist Pyoverdin), Lipopolysaccharid sowie das Exotoxin A; letzteres ist eine ADP-Ribosyltransferase, welche - ähnlich wie das Diphthcric-Toxin - den Elongationsfaktor (EF) 2 und damit die Proteinsynthese hemmt. Der molekularbiologische Nachweis des Toxin A-Gens ist spezifisch für P. aeruginosa. Das unregelmäßig anzutreffende Exotoxin S ist ebenfalls eine ADP-Ribosyltransferase mit anderem Angriffspunkt. Mukoide Stämme bilden Alginat, das Mikrokolonien einschließt und vor Phagozytose und Antibiotikaeffekten schützt. Laboratoriumsdiagnose Typische Kolonien von P. aeruginosa sind groß, hämolytisch, flach, zeigen gezackte Ränder mit Ausbreitungstendenz, riechen nach Weintrauben (o-Aminoacetophenon), haben eine metallisch glänzende Oberfläche und zeigen Pseudophagcnlöchcr. Zwei wasserlösliche Pigmente das blaugrüne Pyozyanin und das gelbgrüne Pyoverdin (Fluoreszein) - kommen vor: nur das erstere ist spezifisch für P. aeruginosa. Bei vielen Stämmen fehlen einige dieser Charakteristika; andere (besonders von Patienten mit Mukoviszidose) sind mukoid; andere wieder bilden braunes Pyomelanin- oder rotes Pyorubin-Pigment. P. aeruginosa ist Oxidase-positiv, oxidiert viele Zucker, bildet N2 aus NO^ und wächst bei 42 °C.

Klinik Nicht im Spital erworbene Infektionen bei Immunkompetenten sind: Folliculitis oder Otitis externa nach Besuch von Schwimmbädern, Keratitis bei Trauma durch Kontaktlinsen, Calcaneus-Osteomyelitis als Folge einer penetrierenden Wunde. Endokarditis und Osteomyelitis nach Verwendung kontaminierter Drogen und maligne (d.h. fortschreitende) Otitis externa bei Diabetikern. Wichtiger ist P. aeruginosa als Erreger bei 1miminkompromittierten. Prädisponierend sind Mukoviszidose, Verbrennungen, Neutropenie, AIDS sowie die Früh- und Neugeborenenperiode. Hierbei kann es zu Infektionen des unteren Respirationstraktes, des Urogenitaltraktes, von Wunden, seltener des Peritoneums (bei Dialyse), der Knochen (Osteomyelitis). der Meningen und der Blutbahn kommen, die eine schlechte Prognose haben. Der Großteil dieser Infektionen ist nosokomial und wird durch Manipulationen wie künstliche Beatmung, Dauerkatheter und Operationen begünstigt. Bei Mukoviszidose kommt es im Wirtsorganismus zu chronischer Besiedlung und Gewebszerstörung der Lunge, jedoch nicht zu Septikämie. Es ist zweifelhaft, ob P. aeruginosa Enterokolitiden hervorrufen kann. Der Keim gehört nicht zur Normalflora des Menschen, kann jedoch bei prädisponierten Patienten den Respirationstrakt und den Intestinaltrakt besiedeln. Therapie Sie richtet sich nach dem Ergebnis der Resistenzbestimmung. Gegen Penicillin, Ampicillin, Amoxicillin-Clavulansäure, Tetrazykline sowie Cephalosporine der 1. und 2. Generation und orale der 3. Generation ist P. aeruginosa resistent. Ccftriaxon besitzt nur schwache Aktivität, hingegen sind Ceftazidim. die Carbapeneme, Piperacillin, die Aminoglykoside und die Chinolone meist wirksam, obwohl Resistenzen gegen jedes dieser Antibiotika bekannt sind. Epidemiologie und Bekämpfung P. aeruginosa ist ein Umgebungskeim, der sich wie die meisten nicht fermentierenden gram-negativen Stäbchen im Boden, Wasser, auf Nahrungsmitteln und im Spital in sogenannten Naßzonen (d.h. da, wo sich unsteriles Wasser ansammeln kann) hält. Von diesen Quellen aus erfolgt

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Spezielle Bakteriologie

auch die Übertragung auf den Menschen. Im Spital sind vor allem Geräte (z.B. Respiratoren), kontaminierte Medikamente und Wasserquellen als Reservoire wichtig. Auch in manchen Desinfektionsmitteln, z.B. den traditionellen quaternären Ammoniumverbindungen, vermag sich P. aeruginosa (wie auch viele andere nicht fermentierende Keime) zu halten. Wichtig sind auch Übertragungen durch mangelnde Hygiene beim Pflegepersonal. Bei Mukoviszidose kann es infolge intensivem Kontakt zu Übertragung von Mensch zu Mensch kommen. Die Übertragung kann durch Keimtypisierung festgestellt werden, wobei heutzutage die Sero- und PyozinTypisierung gegenüber molekularbiologischen Verfahren in den Hintergrund getreten sind. Die Prophylaxe stützt sich auf spitalhygienische Maßnahmen; aktive Immunisierung hat sich nicht bewährt. Routinemäßige Antibiotikaprophylaxe ist wegen der möglichen Selektion von P. aeruginosa abzulehnen.

4.9.2 Die Gattung ßurkholderia Hierbei handelt es sich um die frühere rRNA-Gruppe II der Gattung Pseudomonas mit den humanpathogenen Spezies B. cepacia, B. gladiolu, B. mallei und B. pseudomallei und weiteren mit B. cepacia verwandten Spezies.

B. cepacia vermag, wie P. aeruginosa, in bestimmten Desinfektionsmitteln zu überleben und ist von Natur aus resistenter als P. aeruginosa gegen Antibiotika: zur Zeit ist Empfindlichkeit gegen Piperacillin, Ccftazidim und Cotrimoxazol die Regel; Resistenztestung ist jedoch obligatorisch. Der Keim kommt besonders im unteren Respirationstrakt bei Mukoviszidose (mit oder ohne P. aeruginosa) und bei Patienten mit chronischer Granulomatose vor; bei ersteren kann es zu extensiver Lungenzerstörung und Septikämie kommen. Die Signifikanz von B. gladiola entspricht der von B. cepacia. Beide Keime können biochemisch (Pigmentbildung, Decarboxylasen) leicht von Pseudomonaden abgetrennt werden. B. mallei ist der Erreger der Rotz-Krankheit, die vor allem bei Einhufern (insbesondere Pferden, Eseln und Maultieren) vorkommt und auf den Menschen durch engen Kontakt übertragen werden kann. Sie wird heute nur noch sporadisch in Asien und im Nahen Osten beobachtet; Ausnahmen sind Laborinfektionen. Bei Tieren kommen primäre Lungeninfektionen mit systemischer Ausbreitung („glanders") oder primäre Hautinfektionen mit granulomatöser Lympha-

denitis und Abszeßbildung („farey") vor. Beim Menschen werden akute und chronische Hautund Schleimhautinfektionen mit Nah- und Fernmelaslasen, akute Lungeninfektionen und meist tödliche Septikämien gesehen. Die Länge der Inkubationszeit hängt von der Eintrittspforte ab (1-5 Tage bei Haut- und 10-14 Tage bei Lungeninfektionen). Die Diagnose kann durch Kultur (unbeweglicher, anspruchsvoller Keim), serologische Verfahren und bei Tieren auch durch einen Hauttest gestellt werden. Gute Therapieerfahrungen liegen nur mit Sulfonamiden vor. B. pseudomallei, der 1913 von WHITMORE beschriebene Erreger der Melioidose, kommt praktisch nur in der Zone zwischen 20. Breitengrad nördlich und südlich des Aequators vor, vor allem in Südostasien. Er wächst gut auf allen Routine-Nährböden und bildet nach einigen Tagen gefaltete Kolonien mit erdigem Geruch, die biochemisch leicht von anderen nichtfermentierenden gram-negativen Keimen (außer von P. stützen) abzutrennen sind. Primäre Standorte sind Erdboden und Oberflächenwasser, von wo aus der Erreger in tiefere Wunden in den menschlichen Körper gelangen kann. Der Respirationstrakt ist eine seltene Eintrittspforte; Übertragung von Mensch zu Mensch kommt nicht vor. Die klinischen Manifestationen der Melioidose sind Pneumonie (am häufigsten), Septikämie oder lokalisierte Haut-/Subkutaninfektionen sowie Kombinationsformen. In manchen Fällen wird eine latente Infektion erst bei einer später auftretenden Abwehrschwäche des Wirtes manifest. Die Inkubationszeit kann demnach von Tagen bis Monaten variieren. Pathologisch-anatomisch imponieren Granulome. Die Diagnose wird am besten durch Kultur gestellt. Unter den serologischen Reaktionen sind wegen der Durchseuchung und Kreuzreaktionen in endemischen Gebieten IgM ELISA- und IGM IF-Teste am geeignetsten. Therapeutisch werden heutzutage Ceftazidim, Ampicillin-Clavulansäure oder Imipenem bevorzugt.

4.9.3 Die Gattungen Ralstonia, Comamonas, Acidovorax, Brevundimonas und Stenotrophomonas Ralstonia pickettii (früher Pseudomonas pickettü) zählt zur rRNA-Gruppe II von Pseudomonas. Sie kommt häufig in Humanproben vor und weist auf Verunreinigung mit unsterilen Flüssigkeiten hin. Auch Comamo-

4.9 Pseudomonaden

nas (C. acidovnrans und C. terrigena), Acidovnrax spp. (v.a. A. delafieldü) und Brevundimonas (B. diminuta und B. vesicularis) wurden früher der Gattung Pseudomonas zugerechnet. Sie sind den rRNA-Gruppen III und IV zuzuordnen und treten selten auf. Stenotrophomonas maltophilia (früher Pseudomonas maltophilia, dann Xanthomonas maltophilia, rRNAGruppe V) ist in letzter Zeit häufig geworden und bereits makroskopisch erkennbar an der lavendelblauen bis violetten Farbe der (Oxidase-negativen) Kolonien, die nach Ammoniak riechen. Infektionen können alle Organsysteme betreffen, sind meist nosokomial und folgen auf künstliche Beatmung, Gabe von Breitspektrum-Antibiotika und Neutropenie. Der Keim ist multipel resistent und im allgemeinen empfindlich auf Cotrimoxazol und Ticarcillin-Clavulan.

4.9.4 Die Gattungen Achromobacter (A.) und Alcaligenes A. piechaudii, A. Alcaligenes faecalis und A. xylosoxidans sind peritrich begeißelt. Sie sind phylogenetisch der Gattung Bordetella verwandt. A. xylosoxidans mit 2 Subspezies ist die beim Menschen am häufigsten vorkommende Spezies, die vor allem Septikämie hervorrufen und multipel resistent sein kann (Ausnahme: Piperacillin).

4.9.5 Die Gattung Acinetobacter Den Vertretern dieser Gattung (Familie Moraxellaceae, früher Neisseriaceae) sind unbewegliche, Oxidase-negative, vorwiegend in Diploform auftretende Stäbchen. Man unterscheidet 21 Genospezies, für die zum Teil nur unzureichende phänotypische Unterscheidungsmerkmale existieren. Die für die Humanmedizin wichtigsten Arten sind A. bautnannii (früher auch als A. anitratus bezeichnet, schwierig von A. calcoaceticus zu trennen), A. Iwoffii, A. haemolyticus, A. junii und A. johnsonii. Sie sind in der Natur weit verbreitet und können sowohl in trockener als auch in feuchter Umgebung lange überleben. Beim gesunden Menschen kommen sie gelegentlich auf der Haut vor, in menschlichem Untersuchungsmaterial in Rein- und in Mischkulturen. In den letzten Jahren haben auch multiresistente Stämme des A. baumanniiA. cö/coacericMS-Komplexes und von A. haemolyticus zugenommen, insbesondere auf Intensivstationen. Sie können dort meist über Vektoren, etwa Wasserquellen, von Mensch zu Mensch übertragen werden und Infektionen verschiedener Organsysteme (z.B. Pneumonien, Septikämien, Wundinfektionen) hervorrufen. Antibio-

tische Vorbehandlung, intravenöser Katheterismus und Operationen finden sich in der Anamnese vieler dieser Patienten. Die meisten Stämme sind empfindlich gegen AmoxicillinClavulansäure, Piperacillin, Cotrimoxazol und Tmipenem. Resistenzbestimmung ist jedoch obligatorisch.

4.9.6 Das Gattung Chryseomonas und Verwandte Die frühere Gattung Flavobacterium ist inzwischen in die Gattungen Chryseobacterium (humane Spezies C. meningosepticum, C. indologenes). Empedobacter (Spezies E. brevis), Sphingobacterium (Spezies S. multivorum, S. mizutae, S. thalpophilum), Myroides (Spezies M. odoratus), Weeksella (Spezies W. virosa) und Bergeyella (Spezies B. zoohelcum) aufgeteilt worden. Alle Vertreter dieser Gattungen sind unbeweglich. Chryseobacterium, Empedobacter, Sphingobacterium und Myroides zeigen gelb pigmentierte Kolonien und sind multipel resistent, klinisch jedoch bisher meist nicht signifikant. Chryseobacterium, Empedobacter, Weeksella und Bergeyella sind Indol-positiv. Eine seltene Ncugeborenen-Meningitis kann durch C. meningosepticum hervorgerufen werden. B. zoohelcum wird gelegentlich in Hundebißwunden gefunden.

4.9.7 Die Gattung Ochrobactrum Die peritrich begeißelte Spezies O. anthropi sowie verwandte 1,Achromobacter"-Spczies wurden bei intravenösen Kathetcr-Septikämien isoliert.

4.9.8 Die Gattung Psychrobacter Hierzu zählen der seltene P. immobilis und P. phenylpyruvicus (früher Moraxella). P. phenylpyruvicus ist Urease-positiv und asaccharolytisch und kann daher mit Brucellen verwechselt werden.

4.9.9 Die Gattungen Agrobacterium, Balneatrix, Methylobacterium, Roseomonas, Shewanella und Sphingomonas Sie werden beim Menschen nur selten gefunden, so daß auf die Spezialliteratur verwiesen werden kann.

Literatur KISKA, D. L., and P. H. GILLICAN: Pseudomonas, in: MURRAY, P. R.. E. J. BARON, M. A. PFALI.ER, F. C. TENOVER and R. H. YOLKEN (Eds.): Manual of Clinical Microbiology. 7lh ed., pp.517-525. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1999. GILLIGAN, P. H., and S. WHITTIER: Burkholderia, Stenotrophomonas, Ralstonia, Brevundimonas, Comamonas, and Acidovorax, in: MURRAY. P. R., E. J. BA-

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Spezielle Bakteriologie

RON. M .A. PEALLER. F .C. TENOVER and R. H. YOLlh KEN (Eds.): Manual of Clinical Microbiology, 7 ed.. pp. 526-538 American Society t'or Microbiology. Washington, D.C. 1999. Sc'HRECKENBERGER, P. C. and A. VON ÜRAEVENITZ:

Acinetobacter, Alcaligenes, Moraxella, Methylobacterium and other nonfermentative Gram-negative rods. in: MIIRRAY, P. R., E. J. BARON. M. A. PFALLHR. F. C. TENOVER and R. H. Yoi.KEn (Eds.): Manual of Clinical Microbiology. 7"1 ed.. pp.539-560 . American Society for Microbiology. Washington. D.C. 1999.

4.10 Die Familie der Legionellaceae, Legionellose ALEXANDER VON GRAEVENITZ Die Legionellose („Legionärskrankheit") trat 1976 erstmals ins öffentliche Bewußtsein, als anläßlich der Tagung der American Legion in Philadelphia eine Epidemie von Pneumonien bei den teilnehmenden Kriegsveteranen auftrat. Innerhalb eines Jahres wurden Erreger und kausale Verknüpfung mit dem bereits früher beschriebenen Pontiac-Fieber erkannt.

Morphologie und physiologische Eigenschaften Die Gattung Legionella ist die einzige Gattung der Familie Legionellaceae und umfaßt zur Zeit 41 Spezies und 62 Serogruppen. Es handelt sich um obligat aerobe, gram-negative (allerdings oft schlecht anfärbbare) Stäbchen mit monopolarer Begeißelung; vier Spezies sind unbegeißelt. Im Direktpräparat herrschen kurze, in der Kultur unterschiedlich lange Einzelorganismen mit spitz zulaufenden Enden vor. Legionellen bilden aus Zuckern keine Säure, sondern verwenden vor allem Aminosäuren als Energiequelle und benötigen L-Cystein und Fe3+-Salze zum Wachstum. Urease und Nitralase sind nicht vorhanden; Katalase wird produziert. Legionellen besitzen verzweigte Fettsäuren, Ubichinone mit > 10 Isopreneinheiten und einen Guanin-Cytosin-Anteil von 38-52 Mol %. Sie überleben 56°C während 30 Minuten. 60°C nur für ca. 5 Minuten, sind aber gegen Desinfektion und Austrocknung - wie andere gram-negative Stäbchen - empfindlich. Die Speziesunterschiede betreffen chemotaxonomische Kriterien, das Vorhandensein oder Fehlen von Hippurathydrolyse, Oxidase, E-Laktamase und Gelatinase sowie Pigmentierung und Autofluoreszenz bei 366 nm.

Pathogenese Von den bisher 18 beim Menschen isolierten Spezies kommen die Serogruppen 1, 4 und 6 der Spezies L. pneumophila als Erreger von 80-85 % der Erkrankungen in Betracht, gefolgt von L. miedadei und den seltenen Spezies L. bozemanii, L. dumoffü, L. longbeachae, L. jordanis und L. feeleii. Mögliche Virulenzfaktoren sind intrazelluläres Überleben und Vermehrung in Alveolarmakrophagen sowie ein 24 kDa MIP (macrophage infectivity potentiator)-Protein. Die Pathogenese ist bisher nur lückenhaft bekannt. Mehrere Formen der Legionellose existieren: die häufigste Form ist die Legioncllcn-Pneumonie (s.u.), viel seltener sind das Pontiac-Fever und extrapulmonale Infektionen (Endokarditis, Pyelonephritis, Wundinfektionen). Klinik Die pulmonale Legionellose beginnt nach einer Inkubationszeit von 2 Lagen mit grippeähnlichen Symptomen, hohem Fieber, Schüttelfrost, Myalgien (besonders im Thorax), anfangs unproduktivem, später produktivem Husten, häufig Durchfällen, gelegentlich auch Zeichen einer Enzephalopathie. Die Lungeninfiltrate sind multilobulär. Der Prozentsatz der Legionellosen unter allen Pneumonieformen ist unbekannt und von lokalen Faktoren abhängig (s.u.); möglicherweise sind in endemischen Gebieten 5-10 % aller nosokomialcn Pneumonien durch Legionellen bedingt. Risikofaktoren sind vorbestehende Lungenschäden, Tumorerkrankungen (z.B. Haarzell-Leukämie), Immunsuppression (z.B. nach Transplantation, viel seltener bei AIDS) und Alkoholismus. Etwa ein Drittel der Legionellenpneumonien sind nosokomial erworben. Die Letalität beträgt unbehandelt bis 80 %, bei rechtzeitiger Behandlung 0-20 %. Das Pontiac-Fieber ist eine akute grippeähnliche Erkrankung ohne Pneumonie, die nach kurzer Inkubationszeit im allgemeinen ohne spezifische Therapie innerhalb einer Woche ausheilt. Laboratoriums-Diagnose Als Untersuchungsmaterial kommen vor allem bronchoalveoläre Lavagc und Lungenbiopsien sowie Urin in Frage. Legionellen wachsen nicht auf Routine-Nähr-

4.10 Die Familie der Legionellaceae, Legionellose

böden und werden auf gepuffertem Kohle-Hefe exlrakt-Agar mit Zusatz von a-Ketoglutarat („aBCYE agar") und evt. von Antibiotika (z.B. Polymyxin B, Cefamandol und Anisomycin) gezüchtet. Die Kolonien erscheinen in 2-7 Tagen bei 37 °C in einer 2-5 % CGvAtmosphäre. Die Bestätigung erfolgt durch fehlendes Wachstum auf Blutagar, sowie durch morphologische, biochemische und serologische Charakteristika (s.o.). Da sich Legionellen im Direktmaterial nach GRAM schlecht färben, kommen für die Direktmikroskopie vor allem fluoreszierende monoklonale Antikörper in Betracht (polyklonale Antikörper zeigen Spezifitätsprobleme). die speziesspezifisch sind und eine Sensitivität von ca. 60-70 % zeigen. Eine radioaktive cDNASonde, die mit der rRNA von allen Legionellen reagiert, hat etwa die gleiche Sensitivität. Die Sensitivität der Kultur liegt etwas höher, wobei Sputum zunächst verdünnt oder für 30 Min. bei 50 CC erhitzt werden sollte; für Blut ist die Sensitivität niedriger (10-30 %). Der Antigennachweis im Urin mittels Enzymimmunoassay hat die höchste Sensitivität (75-90 %), wird häufig zuerst positiv und kann in 4 Std. durchgeführt werden, deckt aber verläßlich nur Serogruppe 1 von L. pneumophila ab. Daten für andere Serogruppen liegen z. Zt. nicht vor. Persistenz des Antigens ist allerdings nicht mit Weiterbestehen der Krankheit gleichzusetzen. Neuerdings ist die PCR zum Legionellen-Nachweis aus respiratorischen Proben, Urin und Serum verwendet worden; zur Zeit lassen sich aber noch keine Aussagen über Sensitivität und Spezifität dieser Methode machen. Mittels indirekter Immunfluoreszenz. EIA oder Western Blot lassen sich Antikörper ab ca. 10 Tagen nach Erkrankungsbeginn, gelegentlich jedoch erst nach 4-9 Wochen nachweisen. Kreuzreaktionen mit diversen gram-negativen Stäbchen sind beobachtet worden. In Kollektiven von Gesunden wurden Titer von > 1:128 bei ca. 1-10 % registriert. Wegen der geringen endemischen Prävalenz der Legionellose ist bei der Interpretation der serologischen Tests zu beachten, daß ihr positiver prädiktiver Wert selbst bei hoher Spezifität mit Vorsicht zu beurteilen ist. Legionellen gehören nicht zur Normalflora des Menschen.

Therapie

Als Standard-Therapeutika gelten Erythromycin, Azithromycin oder Fluorochinolone, als Alternativen kommen Clarithromycin, Cotrimoxazol oder Doxycyclin in Betracht. Epidemiologie und Bekämpfung

Die Legionellose tritt im Spätsommer und Herbst gehäuft auf und befällt vor allem die Altersgruppe über 50 Jahre; Männer 2-3mal häufiger als Frauen. Legionellen finden sich - lokal verschieden häufig - in natürlichen Gewässern und in den ihnen benachbarten Böden, außerdem in Kühltürmen. Klimaanlagen, Befeuchlern, Wasserleitungen, an Wasserhähnen und Brauseköpfen. Sie leben bei Temperaturen zwischen 5 °C und 65 °C vor allem in stagnierendem Wasser; das TemperaturOptimum für ihre Vermehrung liegt zwischen 35 °C und 45 °C. Ein Reservoir in bestimmten Amöben-Spezies ist erwiesen und vermag das Überleben dieser sonst anspruchsvollen Bakterien in der Natur erklären. Trotz des häufigen Vorkommens der Lcgionellen im Wasser von Haushalten und Krankenhäusern sind Erkrankungen selten. Die Übertragungswahrscheinlichkeit beträgt für pulmonale Legionellose 1-5 %, für das Pontiac-Fieber 90 %. Die Krankheit wird offenbar durch Aerosole - aber nicht von Mensch zu Mensch - übertragen; assoziierte Umgebungsfaktoren sind nicht bekannt. Zur Prävention sind Routine-Kulturen von Wasserquellen nicht angezeigt; hingegen sollte eine Wassertemperalur (am Hahn) von 50 "C Infektionen weitgehend verhindern. Wenn in einem Krankenhaus eine Häufung nosokomialer Fälle bei gleichzeitigem Nachweis von Legionellen im Wasser (> 30 % aller Proben aus verschiedenen Stellen) beobachtet wird, wird Erhitzen des Wassers auf 70-80 °C (cave Verbrühungen!) oder Chlorierung (zunächst 6-20, dann 1-2 mg/1 freies Chlor) empfohlen. Meldepflicht: Nach dem Infektionsschutzgesetz ist der direkte oder indirekte Nachweis von Legionella spp. meldepflichtig. Literatur: RUKF, C: Nosocomial Legionnaires' disease - stratcgies for prevention. J. Microbiol. Mcthods 33, 81 91 (1998). MAIWALD, M., J. G. HELBIG and P.C. LÜCK: Laboratory mcthods for the diagnosis of Legionella infections. J. Microbiol. Mcthods 33 (1998) 59-79.

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Spezielle Bakteriologie

4.11 Die Gattung BrucellaBrucellose

Bezeichnung der bestehenden Arteinteilung festgehalten (Tab. 4.25).

WERNER KÖHLER

Morphologie

Die Brucellose des Menschen ist eine von Bakterien der Gattung Bruceila verursachte, durch direkten Kontakt (meist Berufskrankheit) oder durch den Genuß infizierter Milchprodukte übertragene Zooanthroponose, die zu einer langdauernden, mit undulierendem Fieber verlaufenden systemischen Infektion führt.

Der britische Militärarzt DAVID BRUCE auf Malta isolierte 1887 aus Mib.proben von an Maltafieber verstorbenen Soldaten einen Keim, den er wegen seiner kokkoiden Gestalt „Micrococcus melitensis" benannte. Von dem maltesischen Arzt THEMISTOKLES ZAMMIT wurde später der Keim auch aus roher Ziegenmilch isoliert. - Der dänische Arzt und Tierarzt BERNHARD BANG fand 1897 den Erreger des infektiösen Aborts der Rinder, den er als „Bacilhts abortus" bezeichnete. In kulturellen Vergleichsuntersuchungen stellte die amerikanische Bakteriologin ALICE EVANS die Verwandtschaft beider Keime fest, die 1920 von MEYER und SHAW in der Gattung Bnicella zusammengefaßt wurden. Bereits 1914 hatte TRAUM in Amerika einen Keim aus Schweinefeten isoliert, der später ebenfalls zu den Brucellen gestellt wurde (Bnicella suis). BUDDLE entdeckte 1956 B. ovis, STOENNER und LACHMAN 1957 B. neotomae und CARMICIIAEL und BRUNER 1968 B. canis.

Taxonomie

Die Prüfung von DNA-DNA Homologien legt nahe, nur eine Spezies, Bruceila melitensis, anzunehmen und die übrigen als Biovarietäten zu bezeichnen. Aus praktischen Gründen wird an der

Brucella melitensis

Brucellen sind kurze (0,6-1,5 x 0.5-0,7 um), gram-negative, unbewegliche, nichtsporenbildende Stäbchen. In frischen Kulturen und in Organausstrichen liegen sie einzeln oder paarweise, in letzteren intrazellulär. Für den Nachweis in Geweben eignen sich Abstriche oder Abklatschpräparate, die mit speziellen Färbungen (z.B. nach STABI.EFORTH, KOSTER oder WEGENER und BORGER) behandelt werden. Auf festen Nährböden (Tryptoseagar, Serumagar) erscheinen nach mehreren (2-4) Tagen kleine Kolonien von etwa 1 mm Durchmesser, die sich bis auf 2-3 mm vergrößern. Sie sind rund, glatt und durchscheinend. Brucellen neigen zur Dissoziation; nach mehreren Passagen treten avirulente Rauh-(R-)Formen auf. In flüssigen Medien wachsen die Keime mit leichter Trübung und Bodensatzbildung. Pathogenese

Brucellen dringen bei menschlichen Infektionen über die (verletzte) Haut oder Schleimhaut (Conjunctiva) nach direktem Kontakt mit infizierten Tieren oder abortierten Feten ein. Bei Aufnahme infizierter Milch oder von Molkereiprodukten erfolgt die Aufnahme vermutlich schon über die Schleimhaut des Rachenraumes, da die Keime durch die Magensäure abgetötet werden. Nach Aufnahme in neutrophile Granulozyten und Makrophagen gelangen sie über das Lymphsystem in den Blutkreislauf. Virulente

Hauptwirt

Infektion des Menschen

Tab. 4.25 Gattung

Ziege und Schaf

Maltafieber

Bruceila: Hauptwirte und Infektion des Menschen

Hauptwirt Rind

Morbus BANG

Schwein (Seh weinebrucel lose) Schaf (Schafbrucellose: infektiöse Epididymitis des Schafbocks) Hund Vorkommen bei der Waldratte (Neotoma lapida)

Infektion möglich

(3 Biovare) Brucella abortus

(9 Biovare) Brucella suis

(4 Biovare) Brucella ovis

Bruceila canis Brucella neotomae

keine Infektion

leichte Infektion Infektion nicht nachgewiesen

4.11 Die Gattung Brucella-Brucellose

Brucellen werden in Makrophagen (in den Lebersinusoiden, in Milz, Knochenmark, RES) nicht abgetötet, sie können sich darin sogar vermehren. Sie erreichen dies durch Ausschüttung von 5'-Guanosinmonophosphat und Adenin, wodurch die Degranulierung der Monozyten verhindert wird. In diesem Milieu sind sie vor der Wirkung von Antikörpern und Antibiotika geschützt. Besonders in der Leber können bei Morbus BANG die sogen. BANU-Granulome entstehen, die aus epitheloiden Zellen, Eosinophilen und Ncutrophilen, Riesenzellen und Fibroblasten gebildet und nur schwer von anderen Granulomen (z.B. bei produktiver Tuberkulose) abzugrenzen sind. Bei Tieren (nicht beim Menschen) können die Milchdrüsen befallen werden, wodurch es zur Ausscheidung mit der Milch kommt. Brucellen können außerdem - nur bei Kühen, Schafen. Ziegen und Schweinen - die Plazenta infizieren und dadurch zum Abort führen. Dies wird durch den hohen Gehalt der Plazenta an Erythrit (Erythrol, einem vierwertigen Zuckeralkohol) bewirkt, der das Wachstum der Brucellen fördert.

Klinik Der Verlauf der menschlichen Erkrankung ist vom Erregertyp abhängig. Besonders schwer verlaufen Melitensis-, am leichtesten BANG-Erkrankungen. Die porcine Brucellose nimmt eine Mittelstellung ein. Die Inkubationszeit wird sehr unterschiedlich angegeben, im Mittel 7-21 Tage, bei der Melitensis-Inl'ektion werden bis zu 3 Monate angenommen. Das klinische Bild der Brucellose ist sehr unterschiedlich. Erste unspezifische Krankheitser-

scheinungen sind Abgeschlagcnheit, Unwohlsein, Leistungsminderung, Schweißausbrüche, Kopfschmerzen und Gliederschmerzen mit unterschiedlich ausgeprägtem Krankheitsgefühl. Im weiteren Verlauf wird die charakteristische Fieberkurve beobachtet: normale und subfebrile Morgentemperaturen wechseln mit hohen Abendtemperaturen (39-40 °C) ab. Es entsteht das typische Bild der Fieberkurve, das der Krankheit die frühere Bezeichnung „Febris undulans" gegeben hat. Der Temperaturanstieg geht mit Schüttelfrost einher. Das Fieber bleibt einige Stunden bestehen, unter starken Schweißausbrüchen fällt es gegen Morgen wieder ab.Bei leichtem Verlauf fiebern die Patienten etwa 1 Woche, bei schwerem 3-4 Wochen. Der Kranke ist stark geschwächt, leidet an Nau-

sea, Erbrechen, Durchfall, Gliederschmerzen und starkem Gewichtsverlust. Die Untersuchung ergibt eine Leber- und Milzvergrößerung sowie geschwollene Lymphknoten. Wird diese akute, septische Form nicht rechtzeitig erkannt und behandelt, kann sie in eine chronische Form mit zahlreichen Organmanifestationen übergehen, vor allem mit Lcberbefall (Hepatitis), Orchitis, Arthritiden (besonders Spondylarthritis). Bei Morbus BANG kann auch eine abortive Erkrankung auftreten, die sich als „grippaler Infekt" mit Mattigkeit, leichten Kopfschmerzen, erhöhten Temperaturen und Schweißausbrüchen äußert. Die nach wenigen Tagen überstandene Erkrankung wird meist nicht als Brucellose erkannt, sondern nur zufällig durch serologische Tests nachträglich verifiziert. Dies trifft auch für die inapparente Brucellose zu, die ohne Krankheitserscheinungen einhergeht. Beide Formen können jedoch in eine chronische Brucellose übergehen. Die klinische Diagnose stützt sich auf die Anamnese (berufliche Exposition, Milchproduktverzehr in Mittelmeerländern) und auf die klinische Symptomatik undulierendes Fieber. Bei der Vielgestaltigkeit des klinischen Bildes sind differentialdiagnostisch zahlreiche andere Erkrankungen zu berücksichtigen, wie z.B. Typhus/Paratyphus, Lymphogranulomatose, Malaria, Leptospirosen, Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises, Endokarditiden und Mcningitiden anderer Ätiologie. Laboratoriumsdiagnose Für das Vorliegen einer Brucellose ist der Erregernachweis beweisend. Im chronischen .Stadium besteht wenig Aussicht auf die Isolierung von Brucellen. Untersuchungsmaterial: Blut (Zitratblut), das mehrfach zu entnehmen ist (am besten im Fieberanstieg oder während des Fieberanfalls). Geeignet sind auch Sternal- und Gclenkpunktatc, Lymphdrüsen-, Leber- oder Milzbiopsien. Kultur: Das Untersuchungsmaterial wird in flüssige Medien eingebracht (Tryptose- oder BrainHcart-Infusion-Bouillon) sowie auf feste Medien ausgestrichen (Tryptose-Blut- oder Tryptose-Soja-Nährboden) und in einer 5-10% CCKAtmosphäre sowie parallel aerob bei 37 °C (Optimaltemperatur; Wachstumsgrenzen 10°C bzw. 42 °C) bebrütet, da die aeroben Brucellen für die Erstisolierung meist eine erhöhte (5-10%) CO2-Spannung benötigen. Nach

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Spezielle Bakteriologie

4-5 Tagen werden die flüssigen Medien erstmals auf feste Nährböden übertragen. Die Primärkullur ist bis zu 21 Tagen zu beobachten, ehe ein negatives Ergebnis mitgeteilt wird. Biochemische Eigenschaften: Verschiedene Kohlenhydrate werden zwar fermentiert, sind aber für diagnostische Untersuchungen ohne größere Bedeutung. Indol wird nicht gebildet, Gelatine nicht verflüssigt, Nitrate werden zu Nitriten reduziert. Als ,Bn/ce//a-verdächtig gellen die auf festen Nährböden langsam wachsenden Kolonien (3-5 Tage), die mikroskopisch kokkoide, pleomorphe, gram-negative Stäbchen zeigen, oxydasepositiv sind, Harnstoff hydrolysieren (positiver Urease-Tesl, ausgenommen B. ovis), Glukose und Laktose nicht spalten und mit ßn/ct'//«-Antiseren eine Objektträgeragglutination ergeben. Zur Speziesidentifizierung, die meist Speziallaboratorien vorbehalten ist, werden zusätzlich eine Bestimmung des COi-Bedarfs und die HiS-Bildung herangezogen, sowie das Wachstum (oder die Hemmung des Wachstums) auf basischem Fuchsin-Tryptose-Agar und Thionin-Tryptose-Agar (s. Tab. 4.26) Zur serologischen Bestimmung der Brucellen sind monospezifische Seren zu empfehlen. Die drei Hauptarten besitzen (in unterschiedlichen Quantitäten bei den Arten und Biovaren) zwei Oberflächenantigene (A = Abortus-Komplex; B = Melitensis-Komplex). Zur Herstellung der monospezifischen Anliseren werden BrucellaAntiseren kreuzweise mit Abortus- bzw. Melitensis-Stämmen absorbiert. Zur Bestimmung von D. ovis und B. canis wird ein Anti-R-Serum benutzt, mit dem nur diese beiden Arten reagieren. Die Bestimmung erfolgt mit der Objektträger- (oder Röhrchen-) Agglutination.

Nachweis von Antikörpern im Patientenserum

Antikörperbestimmungen werden meist mit hitzeabgetöteten Brucellen in Form der LangsamAgglutination als Röhrchentests durchgeführt (WiDAL-Reaklion). Ein Titer von 1:160 oder höher, noch besser ein vierfacher Titeranstieg bei zwei im Abstand von 10-14 Tagen entnommen Blutproben, gelten als positiv. Erste positive Titer sind 7-10 Tage nach der Infektion zu erwarten und können monatelang bestehen bleiben. Niedrigere Titer sind bei chronischen Infektionen oder bei Kreuzreaktionen (s.u.) zu erwarten. Die Komplementbindungsreaktion wird später (ab der 4. Krankheitswoche) positiv und früher negativ als die Agglutinationsreaktion. Bei chronischer Brucellose ist mit einer positiven KBR zu rechnen (bei negativer Agglutinationsreaktion). Bei einigen Patienten existieren blockierende Antikörper, die zu einem Prozonenphänomen führen. In diesen Fällen ist das Serum stärker zu verdünnen oder es ist ein COOMBSTest durchzuführen. Neueren Datums sind ELISA-Tests, mit deren Hilfe rezente Infektionen (IgM-Antikörper) oder länger zurückliegende bzw. chronische Infektionen (Antikörper vom IgG-Typ) erfaßt werden. Wie bei der Mehrzahl serologischer Nachweisverfahren ist mit Antigengemeinschaf'ten zwischen unterschiedlichen Bakterien zu rechnen, die bei der Interpretation der Ergebnisse zu beachten sind. Dies betrifft im Falle von B. abortus, B. melitensis und B. suis vor allem die Antigengemeinschaft mit Yersinia enterocolilica O:9, außerdem mit Francisella tularensis, E. coli

Tab. 4.26 Differenzierung von Bruceila-Arten Spezies

CO2-Bedarf

H 2S -Bildung

Wachstum auf Thionin-Medium a b

Fuchsin-Agar**

ß. abortus

+

+*

-*

+

+

B. melitensis B. suis B. ovis B. canis B. neotomae

+ -

-

+* + + -

+ + + + +

+

* unterschiedliche Reaktionen der Biovarietäten ** Konzentration 1 a Konzentration 1 b Konzentration 1

: 50 000 : 25 000 : 50 000

+* +

+ -

4.12 Die Gattung Bordetella (Keuchhusten)

O157:H7 und einigen Salmonellen. Infektionen mit diesen Erregern können zu scheinbar niedrigen Anti-ßA-MC
Literatur DUNIEWICZ, M., und J. VICKLKKY: Brucella-Infektionen. In: Handbuch der Inneren Medizin. Bd. 5: Infektionskrankheiten (Hrsg. OCKLITZ. H. W.. H. MOCHMANN, W. Köm.FR und K. ZIHGLER), Fischer. Jena 1983, 655- 660 (ausführliche Angaben zur Klinik)

4.12 Die Gattung Bordetella (Keuchhusten) GEORG PLUM Gegenwärtig umfaßt die Gattung Bordeiella die vier akzeptierten Spezies B. pertussis, B. parapertiissis, B. bronchiseptica, B. avium und die drei neu vorgeschlagenen Spezies B. hinzu, B. holmesii und B. trematum, die nun eine Reihe von früher nicht genau zuzuordnenden Isohttcn aufnehmen. B. pertussis, B. parapertussis, und B. bronchiseptica sind genetisch so nahe verwandt, daß sie neuerdings als Subspezies der gleichen Art diskutiert werden. B. pertussis und B. parapertussis sind Erreger des Keuchhustens beim Menschen, während B. bronchiseptica hauptsächlich bei Tieren Infektionen des oberen Respirationstraktes mit Rhinitis und Husten verursacht. Nur selten ist B. bronchiseptica an Keuchhusten-ähnlichen Krankheitsbildern oder opportunistischen Infektionen beteiligt. B. avium ist ein pathogener Erreger bei Vögeln und von ökonomischer Bedeutung in der Tierhaltung. 4.12.1 Bordetella pertussis, Keuchhusten Als Erreger des Keuchhustens, der weltweit immer noch zu den häufigsten Infektionskrankheiten des Kindesalters gehört, konnte 1906 von BORDET und GENGOI; ein schwer anzüchtbares Baktcriura identifiziert werden, das zunächst den hämophilen Stäbchenbaktcrien zugeordnet wurde. Bei der später notwendigen Abgrenzung und Klassifizierung als eigene Gattung wurde zu Ehren BORDEIS die Bezeichnung Bordetella pertussis gewählt.

Vorkommen und Morphologie Die züientragenden Epithelzellen des menschlichen Respirationstraktes sind das alleinige Habitat für B. pertussis und B. parapertussis. Bordeteilen sind kleine (ca. 0,8 x 0,4 um), kokkoide, gram-negative Stäbchen, die einzeln oder

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Spezielle Bakteriologie

paarweise gelagert im mikroskopischen Präparat erscheinen. B. pertussis und B. parapertussis sind unbeweglich, während B. bronchiseptica und B. avium peritrich begeißelt und dadurch beweglich sind. Kolonien von B. pertussis sind klein, glatt und glänzend mit einer hohen Konvexität (wie eine Quecksilberperle). B. pertussis, B. parapertussis und B. bronchiseptica können mit ß-Hämolyse wachsen und lassen sich morphologisch nur schwer voneinander unterscheiden. Pathogenese

B. pertussis überwindet die lokalen Immunmechanismen des oberen Respirationstraktes und kann bei völliger Gesundheit des Wirts ohne prädisponierende Faktoren eine Erkrankung auslösen. Wenn die Erreger nach Übertragung durch Tröpfcheninfektion die Zilien des Flimmerepithels erreichen, binden sie dort im empfänglichen Wirt mittels verschiedener Adhäsine sehr fest und können dann durch die Freisetzung von Toxinen die Erkrankung auslösen. Obwohl die Erreger in der Regel nicht über das Epithel hinaus in das Gewebe oder in die Blutbahn gelangen, also nicht invasiv sind, treten durch die produzierten Toxine dennoch systemische Effekte auf. Neben der Kapsel, die dem Erreger einen Schutz vor der Inaktivierung durch Komplement bietet, lassen sich funktioneil zwei Gruppen von 'Virulenzfaktoren unterscheiden: Toxine, die zu einer Schwächung der Abwehr beitragen, und Adhäsine, die ein Verbleiben der Erreger auf dem Wirt sicherstellen. Von entscheidender Bedeutung für die Pathogenese des Keuchhustens ist das Pertussis-Toxin (PT). ein Exotoxin. Dieses wurde früher wegen seiner verschiedenen biologischen Aktivitäten auch als „lymphocytosis-promoting factor" (LPF), „histaminc-sensitizing factor" (HSF), „islet-activating protein". „pertussigen" oder „late-appearing factor" bezeichnet. PT ist für viele der physiologischen, immunologischen und pharmakologischen Effekte verantwortlich, die nach Injektion abgetöteter Zellen von B. pertussis zur Ausbildung gelangen. Hierzu gehören Lcukozytose mit absoluter Lymphozytose, Splenomegalie, Hypoglykämie und Hyperinsulinismus, Hypoproteinämie. potenzierte Immunantwort gegenüber nichtverwandten Antigenen, Ausbildung einer anaphylaktischen Schockbereitschaft, verstärkte Empfindlichkeit für Histamin, Endotoxin und viele andere Stoffe, Resistenzsteige-

rung gegen bakterielle und virale Infektionen sowie prompte Induktion von experimentellen „allergischen" Erkrankungen. Das Pertussis-Toxin ist aus sechs Untereinheiten (Hexamer) aufgebaut und zeigt Verwandschaft zu anderen Toxinen des A-B-Typs (s. Kap. 1.1) wie dem Choleratoxin. Shigatoxin oder Diphtherietoxin. Die eigentliche toxische Komponente (Monomer A) wird von fünf anderen Untereinheiten, die zusammen das Oligomcr B bilden, stabilisiert. Letzlere sind auch für die spezifische Bindung an die Zielzelle verantwortlich. Die A-Untereinheit ist eine ADP-Ribosyltransferase, die den Transfer der ADP-Ribosc von NicotinamidAdenindinucleotid (NAD) an Proteine der Wirtszelle katalysiert. Daraus resultiert u.a. eine veränderte Signaltransduktion innerhalb der Epithelzclle. PT wird nur von B. pertussis gebildet. B. parapertussis und B. bronchiseptica besitzen zwar ein PT-Gen, jedoch wird die phänotypische Ausprägung durch Mutationen in der Promotorregion verhindert. Adenylatzyklase (CyaA) ist ein Polypeptid mit einer Molekularmasse von 216 kDa. das in die Wirtszelle eindringen kann und dort zu einer unphysiologisch hohen Konzentration des cAMP-Spiegels führt. Das Molekül hemmt verschiedene Effektorfunktionen wie z.B. bei Makrophagen, Monozyten und polymorphkernigen Granulozyten die Bildung von Sauerstoffradikalen, die Phagozytose, die bakterizide Aktivität, die Phagosom-Lysosom-Fusion und die Chemotaxis. CyaA hemmt ferner die zytolytische Aktivität von NK-Zellcn. Tracheales Cytotoxin (TCT) wird aus dem Peptidoglykan der Zcllwand gebildet. Es führt zur Stase der Zilienbewegung und im Tierversuch durch Stimulation einer Zytokinproduktion in der Mucosa zur Abtötung des Epithels der Trachea. Ein weiteres Toxin ist das hitzelabile Toxin, auch dermonekrotisches Toxin genannt. Es wird von den Bakterien nicht aktiv sezerniert, sondern erst bei der Lyse der Zellen aus dem Zytosol freigestzt. Es besteht aus einer einzelnen Polypeptidkettc. die bei subkutaner Injektion schon geringer Dosen zu Vasokonstriktion der peripheren Gefäße und Hautnckrose führt. Der molekulare Wirkungsmechanismus ist bisher nicht geklärt. In der äußeren Membran der Bakterien befinden sich Lipooligosaccharide (LOS), die chemisch und in ihrer Wirkung auf den Wirt den Lipopolysacchariden anderer gram-negativer Erreger ähnlich sind. Wie diese führen sie zur Induktion von Interleukin 1-Sekretion, Fieber, Blutdruckabfall und SANARELLI-SIIWARTZMAN-Phänomen. Wenn auch die LOS bei der natürlichen Infektion keine Rolle zu spielen scheinen, so sind sie doch möglicherweise für einen Teil der unerwünschten Nebenwirkungen der zellulären Vakzine (Vollkeim-Impfstoff, siehe unten) verantwortlich. Bordetella-Adhasine: Bordetella pertussis besitzt einen ausgeprägten Tropismus für das Flimmerepithel der oberen Atemwege. Eine Reihe von Faktoren gewährleistet die Anheftung der Erreger an die Schleimhaut. Dazu gehört das Filamenthäniagglutinin (FHA), ein rutenförmiges Protein, das zu einer starken Anheftung der Erreger an die Zilien führt. Weil Antikörper.

4.12 Die Gattung Bordetella (Keuchhusten)

die gegen FHA gerichtet sind, für eine Immunität von Bedeutung sind, enthalten die in Deutschland empfohlenen azellulären Impfstoffe adsorbiertes FHA als eines der Antigene. Daneben besitzt B. pertussis verschiedene, antigenetisch unterschiedliche Fimbrien (Pili). Diese sind für die weitere Stabilisierung der Anheftung an die Epithelzellen des oberen Respiralionstraktes verantwortlich. Eine einzelne Zelle kann gleichzeitig zwei verschiedene Typen von Fimbrien tragen. Die meisten klinischen Isolate tragen Fimbrien der Typen 1. 2 oder 3. beziehungsweise Kombinationen dieser Typen. Auch Antikörper gegen die Fimbrienantigene korrclicren positiv mit einem Schutz vor Pertussis. Einige azelluläre Impfstoffe enthalten neben PT-Toxoid und FHA auch gereinigte Fimbrienbestandteile als Antigen. Pertactin und BrkA (Bordetella Resistance to Adlling) sind Membranproteine der äußeren bakteriellen Membran, die zur Bindung an die Wirtszellen beitragen. Spezifische Antikörper gegen Pertactin haben einen protektiven Effekt im Tiermodell und führten dazu, daß dieses Protein ebenfalls als Komponente in einigen Impfstoffen Verwendung findet. Die Expression der Virulenzfaktoren unterliegt wie bei vielen anderen Erregern auch einer vielschichtigen Steuerung. Eine schon früh beobachtete Änderung des Virulenzverhaltens wird phänotypisch als Phasenvariation beschrieben. Sie tritt in einer Frequenz von 1(H bis 10~6 spontan auf und geht mit dem Verlust der Produktion einer Reihe von Virulenzfaktorcn und Oberflächenproteinen einher. Auf diese Weise vermögen die Erreger die Ausprägung der Virulenz an ihre äußeren Bedingungen und damit an den jeweiligen Schritt des Infektionsablaufs anzupassen.

ist relativ symptomarm mit subfebrilen Temperaturen und uncharaktcristischem Husten. Das nachfolgende Stadium convulsivum, das 4-8 Wochen, in Ausnahmefällen bis zu 20 Wochen andauern kann, zeigt die typische klinische Symptomatik. Nach anfallsartigem Husten mit mehreren Hustenstößen kommt es zu einem hörbaren inspiratorischen Stridor und zu anschließendem Erbrechen. Durch Wiederholung der Hustenstöße in kurzen Abständen entwickelt sich eine zunehmende Zyanose bis zur Gefahr der exspiratorischen Apnoe mit Atemstillstand. Die Zahl der Hustenanfälle kann zwischen 5-50 pro Tag schwanken, mit besonderer Häufung während der Nachtstunden. Säuglinge entwickeln an Stelle des typischen Hustens häufiger Apnoeattacken und sind durch diese besonders gefährdet. Die Letalität in der Altersgruppe unter 1 Jahr beträgt 0,6%. Das Stadium decrementi ist durch abnehmende Häufigkeit und Schwere der Hustenanfälle gekennzeichnet. Nach einer Phase der deutlichen Besserung kann jedoch durch interkurrente Atemwegsinfektionen eine Wiederkehr der klinischen Symptomatik ohne mikrobiologisch faßbaren Rückfall oder Reinfektion erfolgen .

Klinik

Nicht selten werden bei Säuglingen und Kleinkindern langandauernde Bronchiolitiden beobachtet. Am gefürchtetsten ist aber die gelegentlich auftretende Enzephalopathie, da sie mit hoher Letalität und großer Defektheilungsquote belastet ist. Die neurologischen Komplikationen

Der Keuchhusten, der durch B. pertussis ausgelöst wird, verläuft nach der Inkubationszeit von 7 bis 10 Tagen typischerweise in drei Phasen (Tab. 4.27). Das Stadium catarrhale dauert 1-2 Wochen und

Eine Pneumonie ist eine häufige Komplikation (ca. 25% der Fälle) und für etwa die Hälfte der Todesfälle als Folge der B. pertuss/s-lnfektion verantwortlich.

Tab. 4.27 Klinische Stadien der Pertussis Stadium der Erkrankung

I Inkubationszeit

II Stadium catarrhale

III Stadium convulsivum

IV Stadium decrementi

Dauer in Wochen

1-2

1-2

2-6

3-A

Symptomatik

keine

Rhinorrhoe Rhinopharyngitis Konjunktivitis uncharakteristischer Husten subfebrile Temperatur

anfallsartiger Husten Erbrechen Zyanose Apnoeattacken

abnehmende Hustenfrequenz und Intensität Bronchitis

361

362

Spezielle Bakteriologie

können sowohl Folge der Hypoxie als auch einer Einblutung in das Ventrikelsystem sein. Bei größeren Kindern und bei Erwachsenen mit teilweiser Immunität verläuft der Keuchhusten weniger schwer, mit einer weniger typischen Symptomatik, z.B. als lange andauernde Bronchitis. Neuere Untersuchungen zeigen, daß Erwachsene auch nach Infektion im Kindesalter oder nach Impfung von einer B. perfuss/s-lnfektion betroffen sein können.

Bei der Mehrzahl der symptomatischen, erwachsenen Kontaktpersonen von pertussiskranken Kindern ist chronisch bestehender Husten (> 3 Wochen), häufig als anfallsartiger Husten, das herausragende Symptom. Serologische Untersuchungen der Familien von kulturell bestätigten Pertussis-Fällen zeigen, daß asymptomatischc bzw. milde atypische Verläufe bei älteren Kindern, Jugendlichen und Erwachsenen häufig sind. Diese stellen deshalb für empfängliche Säuglinge eine potentielle Gefahr als Infektionsquelle dar. Die Infektiosität ist während des Stadium catarrhale am höchsten und nimmt danach schnell ab. In der Regel können die Bakterien etwa 6 Wochen nach Beginn der klinischen Symptomatik nicht mehr nachgewiesen werden, aber 20% der Patienten sind auch zu diesem Zeitpunkt noch infektiös. Diagnose

Die klinische Symptomatik des Keuchhustens während des Stadium convulsivum ist sehr

typisch und führt häufig zu einer ersten Verdachtsdiagnose. Da jedoch auch andere Erreger wie z.B. B. parapertussis, B. bronchiseptica, Chlamydia trachomatis, RSV (respiratory syncytial virus) und Adenoviren u.U. vorübergehend ähnliche Symptome verursachen können, kommt der bakteriologisch-serologischen Diagnostik die entscheidende Bedeutung zu. Wie die schematische Darstellung in Abb. 4.31 zeigt, ist der Einsatz bakteriologischer und serologischer Verfahren abhängig vom Stadium der Erkrankung. Eine definitive Diagnosesicherung ist derzeit allein durch den kulturellen Nachweis möglich. Die Isolation der Erreger auf unmittelbar beimpften Nährböden gelingt noch am leichtesten im frühen Konvulsivstadium, d.h. in den ersten beiden Wochen nach Beginn der typischen klinischen Symptome. Die Probe sollte mit einem flexiblen Calciumalginat- oder Dacron-Tupfer vom hinteren Nasopharynx, nicht jedoch aus dem Rachen, gewonnen werden.

Der Erfolg der Isolierung hängt entscheidend von der Entnahmetechnik ab. Der Abstrichtupfer wird möglichst tief in das Nasenloch eingeführt und etwa 5-10 Sekunden dort belassen. Anschließend sollte er entweder sofort zur Beimpfung eines Sclektivmediums benutzt oder bis zur Anlage in ein Transportmedium (z.B. REGAN LÖWE-Medium oder bei sehr kurzen Transportzeiten AMIES-Medium mit Holzkohle) gegeben werden. REGAN LowE-Agar oder frisch zubereitetes BoRDET-GENGOU-Medium werden gewöhnlich für die Kultur benutzt. Die Erfolgs-

Abb. 4.31 Stadien und Laboratoriumsdiagnostik der Pertussis.

4.12 Die Gattung Bordetella (Keuchhusten)

rate der Erregeranzucht sinkt deutlich bei antibiotisch (Erythromycin oder Trimethoprim-Sulfamethoxazol) vorbehandelten Patienten, bei verzögerter Anlage des Abstrichmaterials, bei lange zurückliegendem Beginn der Symptomatik (> 3 Wochen) und bei geimpften Patienten. Kultur: Bordetella-Arten sind strikte Aerobier mit recht einfachen Anforderungen an Nährböden. Dazu gehört ein Angebot an Nikotinsäureamid, Zystin oder Zystcin und weiteren Aminosäuren als Stickstoffquelle. Sie sind jedoch nicht von den Faktoren X und V abhängig (vgl. Haemophilus, Kap. 4.8). Schwierigkeiten bei der Anzüchtung von B. pertussis beruhen v.a. auf der Wachstumshemmung durch Begleitstoffe im Nährboden, wie z.B. ungesättigte Fettsäuren, Metallionen, kolloidaler Schwefel und Peroxide. Auf der Unschädlichmachung dieser „Inhibitoren'' durch Bindung an Stärke, Aktivkohle, Albumin, Blut, Cyclodextrin oder andere Substanzen beruht die erhöhte Ausbeute beim Einsatz von Spezialnährböden wie dem von BÜRDET und GENGOU 1906 beschriebenen Kartoffel-Glyzerin-Blut-Medium. Das Wachstum von B. pertussis ist mit einer Generationszeit von 2,5 bis 5 Std. unter optimalen Bedingungen recht langsam und erfordert deshalb eine 3-4 tägige Bebrütung bei 37°C zur Ausbildung von Kolonien. Eine ausreichende Feuchtigkeit über dem Nährboden ist für eine erfolgreiche Anzüchtung wichtig, da die Bakterien sehr empfindlich gegenüber Austrocknung sind. Die Nährböden sind mindestens für eine Dauer von sieben Tagen zu bebrüten, bevor ein negatives Kulturergebnis mitgeteilt werden kann. Ein klinischer Pertussis-Fall wird diagnostisch durch eine positive B. pertussis-K.vM.nr gesichert. Die definitive Identifizierung der angezüchteten

363

Bakterien als Bordetella pertussis wird durch den direkten Immunfluoreszenztest (s.u.) oder durch Agglutination mit spezifischen, kommerziell erhältlichen Seren erreicht. Biochemisches Verhalten: Bordctellen besitzen das Enzym Katalase. sind aber ansonsten biochemisch relativ inaktiv. Ihre Differenzierung mittels Prüfung auf bestimmte biochemische Leistungen und Wachstumseigenschaften ist dennoch möglich (Tab. 4.28) Die direkte lmmunfluorcszenz (DFA. direct fluorescent antibody tcsling) von Nasopharyngealabstrichen ist zum Screening (Suchtest) von Pertussisfällen geeignet und crfassl je nach verwendetem Antiserum R. pertussis oder B. paruperlussis. Da die Sensitivität und Spezifität sehr stark von der Erfahrung des Untersuchers abhängig und insgesamt eher niedrig sind, bedarf es zusätzlich mindestens eines weiteren Nachweisverfahrens. Die schnelle Durchführbarkeit macht diesen Test jedoch für klinische Fragestellungen interessant. Die Schnelligkeit des Nachweises ist ebenfalls ein Vorteil der Nukleinsäureamplifikationsverfahren (PCR). Sensitivität und Spezifität erwiesen sich in kleineren Studien als erfreulich hoch, größere Evaluationsstudien stehen noch aus. Gegenwärtig sollte dieser Test nur in Verbindung mit dem kulturellen Nachweis oder dem Nachweis von spezifischen Antikörpern zur Bestätigung der Verdachtsdiagnose genutzt werden. Selbst wenn evaluierle PCR-Vcrfahrcn zur Verfügung stehen, sollte weiterhin zusätzlich die Anzüchtung der Erreger angestrebt werden, um eine Testung der Empfindlichkeit für Antibiotika und eine molekulare Typisierung für epidemiologische Zwecke zu ermöglichen. Serologische Diagnostik: Der Nachweis von B. pertitsiu-spezifischen Antikörpern hat erst in den letzten Jahren zunehmende Bedeutung für die Diagnostik des Keuchhustens erlangt. Humorale Antikörper werden frühestens 15-25 Tage nach Erkrankungsbeginn nachweisbar und erreichen 6-8 Wochen später, also 8-10 Wochen nach Erkrankungsbeginn, ihr Maximum. Die Anwendung enzymimmunologischer Verfahren (EL1SA) gestattet in fast allen Fällen nach Infektion den

Tab. 4.28 Differenzierungskriterien von Bordeteilen B. pertussis Beweglichkeit Wachstum auf Peptonagar Pigmentproduktion Nitratreduktion Harnstoffspaltung Oxidasereduktion

B. parapertussis

B. bronchiseptica

B. avium

_

+ + + +

+ +

+

+

+ = nachweisbar (+) = bei 50-75% der Stämme nachweisbar - = nicht nachweisbar

+ -

(+)

364

Spezielle Bakteriologie

Nachweis einer Serokonversion. Dabei kommt dem Nachweis von spezifischem IgA eine besondere Bedeutung zu, da es nur nach einer natürlichen Infektion gebildet wird und in der Regel nur wenige Monate nach Infektionsbeginn nachgewiesen werden kann (Abb. 4.31). Bei der Infektion von bis zu drei Monate alten Säuglingen kommt es allerdings nicht zur Bildung von IgA. Hier kann der Nachweis von spezifischem IgM als Hinweis auf eine rezente Infektion gewertet werden. Differentialblutbild: Eine Leukozytose mit Lymphozytose ist ein häufiger Laborbefund bei Pertussis. Die absolute Lymphozytenzahl kann dabei über 20.000/mm-1 steigen. Bei Säuglingen, geimpften Kleinkindern oder Jugendlichen sowie Erwachsenen mit mildem Krankheitsverlauf ist dieser Laborparameter jedoch kein geeignetes Kriterium. Das Differcnlialblulbild sollte deshalb nicht zur Bestätigung eines klinischen Pertussisverdachts veranlaßt werden. Therapie

R. pertussis und B. parapertussis sind in vitro für eine Vielzahl von Antibiotika empfindlich. Bei der Therapie hat sich das Erythromycin, insbesondere Erythromycinestolat-Ester wegen hoher Zuverlässigkeit und klinischer Wirksamkeit als vorteilhaft erwiesen. Andere Antibiotika, z.B. Ampicillin, zeigen zwar in vitro gute Aktivität, sind aber klinisch nicht ausreichend wirksam und sollten deshalb nicht eingesetzt werden. Entgegen dem früheren Dogma scheint die Antibiolikatherapie auch noch im Stadium convulsivum neben der unstrittigen Verkürzung der Infektiosität auch einen klinischen Gewinn in Form von verminderter Schwere und Länge der Erkrankung zu haben. Der Erfolg der Antibiotikatherapie ist dennoch sicherlich am größten, wenn die Menge der freigesetzten Toxine niedrig und der irreversible Schaden an der Schleimhaut gering ist, die Therapie also zeitig begonnen wurde. Epidemiologie und Prophylaxe

Die weitaus überwiegende Zahl der Infektionen erfolgt durch Inhalation bakterienhaltiger Tröpfchen bei direktem Kontakt mit Erkrankten. Eine Übertragung durch kontaminierte Gegenstände kann jedoch nicht ausgeschlosen werden, da Keuchhustenbakterien für einige Tage außerhalb des Organismus überleben können. Der an Keuchhusten Erkrankte ist vornehmlich während der frühen katarrhalischen Phase infektiös, also zu einem Zeitpunkt, an dem die Erkrankung noch nicht als Keuchhusten erkennbar

ist. Darüber hinaus dürften auch subklinische Infektionen und asymptomatische, passagere Träger von epidemiologischer Bedeutung sein. Subklinische Infektionen treten als Erstinfcktion oder Reinfektion bei älteren Kindern, Jugendlichen und Erwachsenen auf, die entweder als Kind nicht erkrankt waren oder deren Immunität nach Jahrzehnte zurückliegender Erstinfektion bzw. Impfung nicht mehr ausreicht. Diese Keimträger können eine Gefährdung für nicht-geimpfte Säuglinge und Kleinkinder sein. Wegen des hohen Kontagionsindex bei empfänglichen, d.h. nicht-immunen Menschen, kann sich B. pertussis in Bevölkerungen mit einer niedrigen Durchseuchungsrate epidemisch ausbreiten. In Ländern mit hoher Pertussisimpfrate bleibt der Erreger endemisch, da die nachlassende Immunität eine Kolonisierung erlaubt. Alle zwei bis fünf Jahre finden sich gehäuft Pertussisfälle, die in Ländern mit hoher Impfbeteiligung bei älteren Kindern und Erwachsenen, in Ländern mit geringer Impfimmunität hauptsächlich in der Altersgruppe der Zwei- bis Fünfjährigen auftreten. Es besteht kein Unterschied in der Morbidität von Mädchen und Jungen. Jahreszeit und Klima spielen für die Erkrankungshäufigkeit keine signifikante Rolle.

Die natürliche Infektion hinterläßt im ersten Jahrzehnt nach der Erkrankung eine tragfähige Immunität. Bei Untersuchungen der Wirksamkeit unterschiedlicher azellulärer Impfstoffe im Vergleich zu Vollkeim-Impfstoffen konnte festgestellt werden, daß Antikörper gegen das Toxin nicht mit einem Schutz gegen die Erkrankung gleichzusetzen sind. Es gibt vielmehr Hinweise, daß Antikörper gegen andere Antigenkomponenten, z. B. FHA, Fimbrien und Pertactin. größere Bedeutung für die Immunität haben. Schutzimpfungen: Die gegenwärtig zugelassenen Pertussis-Impfstoffe lassen sich in zwei Kategorien zusammenfassen: Vollkeim-Iinpfstoffe („whole cell vaccine", aus inaktivierten B. pertussis-ZeUen gewonnene Lysate) und azelluläre Impfstoffe („subunit vaccines", Gemische von B. pertow/i'-Komponenten). Die gegenwärtig zugelassenen Präparate beider Kategorien bieten bei Durchführung eines vollständigen Immunisierungsschemas einen sehr guten Impfschutz; nach Impfung mit den früher ausschließlich verwendeten Vollkeim-Impfstoffen wurden jedoch sehr selten (5 Fälle/1 Million Impfungen)

4.13 Die Gattung Francisella - Tularämie

postvakzinale Enzephalopathien beobachtet. Aus medizinischer Sicht sind Impfraten von > 90% anzustreben, um einen Kohortenschutz aufzubauen, der einen maximalen Schutz der besonders gefährdeten Kinder in den ersten Lebensmonaten bietet. Weder die Impfung noch die Erkrankung garantiert einen lebenslangen Schutz vor einer Infektion durch Bordetella pertussis.

Dies hat zur Folge, daß auch bei hoher Impfrate der Kinder der Erreger weiterhin unter den Erwachsenen zirkulieren kann. Erwachsene erkranken seltener und weniger schwer als Kinder oder gar Säuglinge, spielen aber als Infektionsquelle für Kinder in ihrer Umgebung eine Rolle. Das Ziel einer dauerhaften Eliminierung dieser Erkrankung würde folglich mehrfache Wiederimpfungen bei den Jugendlichen und Erwachsenen erfordern; dies wird unter Experten gegenwärtig diskutiert. Vorerst ist an eine vollständige Elimination der Pertussis nicht zu denken. Eine prophylaktische Impfung bzw. Boosterung von Kontaktpersonen ist z.Zt. nicht üblich. Gegen Pertussis geimpfte Kinder können nach Keuchhustenkontakt vorübergehend Bordetella abhusten. Ein langdauernder Trägerstatus bei Gesunden ist bisher nicht dokumentiert worden. Chemoprophylaxe: Die Ausbreitung des Keuchhustens kann durch antibiotische Behandlung der Erkrankten und der Personen mit innigem Kontakt eingedämmt werden. Als Personen mit „innigem Kontakt" sind jene anzusehen, die mit dem gesicherten Pertussis-Fall Speichelkontakt z.B. über gemeinsam benutztes Eßgeschirr hatten bzw. dem Nasensekret des Erkrankten beim Niesen oder Husten direkt ausgesetzt waren. Kontakte ab dem fünften Tag nach Beginn einer Erythromycintherapie des Patienten gelten nicht mehr als ansteckend.

4.12.2 Bordetella parapertussis Infektionen durch B. parapertussis sind nicht selten. Etwa 40% verlaufen asymptomatisch, weitere 40% gehen mit Bronchitis einher und bei weniger als 20% tritl ein Pertussis-ähnliches Krankheitsbild auf, das klinisch nicht von der durch B. pertussis verursachten Infektion unterschieden werden kann. B. parapertussis stellt weniger als 5% der unter klinischen Gesichtspunkten diagnostizierten Pertussis-Fälle. Da B. parapertussis außer der Bildung von PT über

die gleichen Virulenzfaktoren wie B. pertussis verfügt, ist dieses Toxin wahrscheinlich nicht ursächlich für die typischen klinischen Erscheinungen verantwortlich.

4.12.3 Bordetella bronchiseptica und Bordetella avium Das natürliche Habitat von B. bronchiseptica ist der Respirationstrakt von kleineren Tieren wie Kaninchen, Katzen und Hunden. B. avium wird meist bei Truthühnern, die an einer Rhinotracheitis leiden, gefunden. Dementsprechend verursachen B. bronchiseptica und B. avium bevorzugt bei derartigen Tieren Pneumonien und andere respiratorischc Erkrankungen. Infektionen des Menschen sind extrem selten. Literatur EDWARDS, K. M: Pertussis in older children and adults. Adv. Pediatr. Infect. Dis. 13 (1997) 49-77 HEWLETT, E. L.: Bordetella species. In: MANDELL, G. L.. .1. E. BhNNEn and R. DOLIN (eds.) Principlcs and Practicc of Infectious Diseases. 4'h ed.. Churchill Livingstone. New York, NY, 1995, Vol. 2. pp. 2078-2084 Hoppe, J. E.: Bordetella. In: MURRAY, P. R., E. .1. BARON, M. A. PKALLER, F. C. TENOVKR and R. H. YOLIh KEN (eds.): Manual ot Clinical Microbiology. 7 ASM Press, Washington, DC, 1999, 614-624

4.13 Die Gattung Francisella Tularämie WERNER KÖHLER Die Tularämie ist eine durch Francisella tularensis hervorgerufene Zoonose zahlreicher Tierarten, die in Naturherden vor allem durch Ektoparasiten übertragen wird. Sie kann auf den Menschen übertragen werden und führt zu einem vielgestaltigen Krankheitsbild mit Primärläsion, Lymphdrüsenschwellungen und Fieber.

Geschichte Der Erreger der Tularämie wurde 1912 von MACCOY und CHAPIN aus toten Erdhörnchen im kalifornischen Bezirk Tulare als „Bactcrium tularense" isoliert. Die erste menschliche Infektion wurde 1914 von WHERRY, I.AMB und VAIL beschrieben, die bereits auf Hasen als mögliche Infektionsquelle hinwiesen. Die Aufklärung der Epidemiologie, die Erregeranzüchtung auf Spe-

365

Spezielle Bakteriologie

366

zialnährböden und die Erarbeitung der serologischen Diagnostik ist (ah 1919) das Verdienst von E. FRANCIS.

4.13.1 Eigenschaften Systematik

Zur Gattung Francisella gehören zwei Arten: F. tularensis und die 1951 in Utah aus Wasser als „Pasteurella novieida" isolierte F. novieida, die experimentell bei Mäusen, Meerschweinchen und Hamstern eine tularämieähnliche Erkrankung hervorruft. Für Kaninchen, Laborratten und Tauben ist der Keim apathogen, Erkrankungen des Menschen wurden in wenigen Fällen bei Immunsupprimierten beobachtet. Francisella tularensis tritt in zwei Biovarietäten auf: die hochinfektiöse F. tularensis Biovar tularensis in Nordamerika und die weniger virulente, in Europa, Nord-, Mittel- und Südamerika vorkommende Biovar palaearctica.

Morphologie

Mikroskopisch: F. tularensis ist ein kleines (0.3-0,5 x 0,2 (im), gram-negatives, unbewegliches, nichtsporenbildendes. bekapseltes Bakterium. Die Keime färben sich bipolar an und weisen eine ausgesprochene Pleomorphie auf, vor allem in älteren Kulturen. Im Gewebe sind die Keime mit Fluoreszein-markierten Antikörpern nachzuweisen. Kultur: F. tularensis wächst obligat aerob und ist auf den gewöhnlichen Nährmedien nicht anzüchtbar. Geeignet sind koagulierte Eigelbnährböden nach MACCOY und CHAPIN oder Glukose-Zystin-Blutagar nach FRANCIS. Das Wachstumsoptimum liegt bei 37 °C. Bei der Erstisolierung muß bis zu 14 Tagen gewartet werden, Subkulturen gehen nach 2-5 Tagen an. Auf FkANCis-Agar bilden die Tularämiebakterien rundliche, feuchte, grauweiße, anfangs 1-1,5. nach einigen Tagen 3-4 mm große Kolonien, auf Eiernährböden wachsen sie als tautropfenähnliche Kolonien und behalten die Virulenz länger als auf FRANCIS-Agar.

4.13.2 Pathogenese Francisella tularensis wird zu den für den Menschen am virulentesten Mikroorganismen gerechnet, weshalb bei Arbeiten im Laboratorium besondere Vorsichtsmaßnahmen erforderlich

sind. Die Ursachen für diese außergewöhnliche Virulenz sind, mit Ausnahme der antiphagozytär wirkenden Kapsel, unbekannt. Nach dem Eindringen in den Wirt befallen die Tularämieerreger das retikuloendotheliale System, es kommt vermutlich zur Bakteriämie. In den Lymphknoten (und in anderen befallenen Organen) bilden sich Granulome. Francisellen können in Makrophagen und polymorphkernigen Leukozyten überleben und sich vermehren, wodurch sie vor den normalen Abwehrkräften des Organismus - Destruktion, Lyse durch Antikörper und Komplement - sowie vor der Antibiotika-Einwirkung relativ geschützt sind.

4.13.3 Klinik Die Tularämie ist auch unter den Bezeichnungen Hasenpest. in den USA als FRANCIS Disease. Market Men's Disease, Deer Fly Fever (deer fly = Bremsen), in Norwegen als Lemmingfieber und in Japan als OMARA Disease bekannt.

Die Inkubationszeit beträgt 3-5 (1-10) Tage. In Abhängigkeit von der Eintrittspforte entwickelt sich: Ŷ eine äußere Tularämie (mit sichtbarer Primärläsion): kutano-glanduläre (ulzero-glanduläre) Form okulo-glanduläre Form oral-glanduläre Form eine innere Tularämie: Ŷ thorakale (pulmonale) Form abdominale (typhöse) Form. Die Erkrankung beginnt abrupt mit hohem Fieber, Schüttelfrost, (Stirn-)Kopfschmerzen, Rückenund Gliederschmerzen. Bei Erregereintritt über die Haut (direkter Kontakt, Insektenbiß) tritt am Ende der Inkubationszeit am Infektionsort eine Papel auf, die nach 7-8 Tagen ulzerieren kann. Die regionalen Lymphknoten (Achsel-, Hals-, Leistenregion) schwellen an und können abszedieren. Dringen die Erreger über die Konjunktiven ein, entsteht als Primäraffekt eine PARINAUDSCIIC Conjunctivitis (eine follikulär-ulzeröse PARINAUDschc Conjunctivitis wird auch bei Katzenkratzkrankheit, bei bovincr Tuberkulose, bei Infektionen mit Newcastle Disease Virus, BOECKSarkoid u.a. beobachtet). Bei Eintritt über den Mund können dort lokal aphthenartige Veränderungen oder Ulzerationen (z.B. an den Tonsillen) auftreten. Diese Form bildet gleichsam einen Übergang zur abdominalen (typhösen) Form, die je nach Organ-

4.13 Die Gattung Francisella-Tularämie

befall klinisch mit Bauchschmerzen einhergeht, zu Durchfall oder Obstipation, teilweise auch zu ileusartigen Symptomen führt. Es kommt zu intermittierenden Fieberschüben. Werden die Francisellen per Aerosol in die Lunge aufgenommen oder erreichen sie diese auf hämatogenem Wege, kann es zur Ausbildung der thorakalen Form kommen, die sich als trockener, unproduktiver Husten äußert und die im Röntgenbild nur schwer in Form pneumonischer Infiltrate mit Vergrößerung der Hiluslymphknoten zu erfassen ist; teilweise ist die Pleura beteiligt. Differentialdiagnostisch ist an Tuberkulose zu denken, an Grippe, Typhus, infektiöse Mononukleose, Pneumonien anderer Genese. Fieber und Tachykardie können sich über Monate erstrecken, Komplikationen sind selten.

verlässiger, als Mikroagglutinationstest durchgeführt. Sofern keine frühere Tularämie-Infektion vorlag, gilt ein Titer ab 1 : 40 als sehr verdächtig, die Diagnose muß aber durch den 4fachen Titeranstieg in einer später entnommenen Serumprobe bestätigt werden. Erste erhöhte Titer treten in der 2. Krankheitswoche auf, die danach auf 1: 320 und höher steigen. Für den Antikörpernachweis steht auch ein ELIS A zur Verfügung, der mit ultraschallbehandelten Tularämiebakterien (Sonicat) als Antigen arbeitet und mit dem getrennt F. tularensisAntikörper der Klassen IgM, IgG und IgA nachweisbar sind. Ältere Verfahren sind die indirekte Hämagglutination und die Komplementbindungsreaktion.

4.13.4 Laboratoriumsdiagnose

Das Mittel der Wahl ist für alle Tularämieformen Streptomycin 1,0 g tgl. i.m. für 10-14 Tage (mindestens bis 5 Tage nach Entfieberung). Empfehlenswert ist auch die Kombination von Streptomycin und Doxycyclin. In den USA wird teilweise auch Gentamicin empfohlen. Tetracyclin und Chloramphenicol sind auch wirksam, führen aber zu häufigeren Rückfällen.

Der direkte Erregernachweis aus der Primärläsion kann mit Fluoreszein-markierten Antikörpern versucht werden. Die Anzucht der Keime erfordert wegen ihrer besonderen Wachstumsansprüche die oben genannten Spezialnährböden. Als Untersuchungsmaterial dienen z.B. Abstriche von der Primärläsion, Eiter, Biopsiematerial von Lymphknoten, Konjunktivalabstriche, Sputum. Mit dem Tierversuch, subkutane Injektion des Materials bei Meerschweinchen, können auch geringe Keimzahlen erfaßt werden, da bereits 1-5 Keime den Tod des Tieres nach 2-1 ü Tagen herbeiführen. Aus Leber, Milz und Herzblut können die Erreger dann angezüchtet werden. Bei der Obduktion zeigt sich die Milz des Tieres 4-5mal vergrößert und mit zahlreichen kleinen, grauen Nekroseherden durchsetzt. Bei der hohen Infektiosität sind für Kultur- und Tierversuche besondere Schutzmaßnahmen zu treffen! Die Identifizierung der Keime erfolgt am besten durch Objektträgeragglutination mit spezifischen Antiseren oder durch fluoreszeinmarkierte Antikörper. Für die Obejektträgeragglutination wird die Kolonie der Infektionsgefahr wegen in physiologische Kochsalzlösung mit Zusatz von 0,5% Formalin eingerieben. Antikörpernachweis Der Antikörpernachweis im Patientenserum wird als Röhrchen-Agglutinationstest oder, zu-

4.13.5 Therapie

4.13.6 Epidemiologie und Bekämpfung Die Tularämie ist eine Zoonose, die in Naturherdgebieten (in Deutschland: Mecklenburg, Schleswig-Holstein, Mainfranken) gelegentlich auf den Menschen übertragen wird. Die Erkrankungszahlen sind in der Bundesrepublik Deutschland rückläufig; 1998 wurden drei und 1999 zwei Erkrankungen gemeldet. Höher liegen die Zahlen in den USA (5-36/1 Million Einwohner), in den Staaten der ehemaligen Sowjetunion und in Japan. In Europa treten Fälle u.a. in Norwegen, der Tschechischen Republik und Slowakei, in Österreich und in der Schweiz auf. Als Reservoire sind mehr als 100 Säugetierarten bekannt, zudem Vögel, Reptilien, Fische und Insekten. In Deutschland sind Hasen und Wildkaninchen die häufigsten Infektionsquellen für den Menschen. Als Vektoren bei tierischen Infektionen kommen vor allem Zecken und blutsaugende Fliegen (Bremsen) in Betracht. In Europa tritt die Mehrzahl der Infektionen des Menschen nach direktem (Haut-) Kontakt mit erkrankten Tieren (Blut, Organe) auf, z.B. bei

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Spezielle Bakteriologie

der Verarbeitung erlegter Wildtiere (Hasen). Hierbei kann es zur Aerosolbildung kommen, die zu der selteneren thorakalen (pulmonalen) Tularämie führt, die ausnahmsweise von Mensch zu Mensch übertragbar ist. Die Übertragung kann auch durch blutsaugende Arthropodcn erfolgen oder durch Trinken von Wasser, das durch Wildtiere kontaminiert wurde, und durch Kratzer oder Bisse von Hunden oder Katzen, die infizierte Nagetiere gejagt und gefressen haben (die letzteren sind meist nicht erkennbar krank). Risikogruppen sind Jäger (Aufbrechen der Tiere), Waldläufer, Wildbrethändler und Personen, die durch den Straßenverkehr getötete Feldhasen verzehren. Meldepflicht besteht für den direkten oder indirekten Nachweis von Francisella tularensis. Eine Prophylaxe mit abgetöteten oder attenuierten Tularämieerregern ist möglich, aber in Deutschland, Österreich und der Schweiz nicht erforderlich. Risikogruppen (s.o.) sollten sich in den genannten Naturherdgebieten der möglichen Gefahren bewußt sein.

4.14 Die Gattungen Streptobacillus, Campylobacter, Arcobacter und Helicobacter MANFRED KIST

Die Vertreter dieser Gattungen verursachen Infektionen u.a. im Magen-Darm-Bereich. Ihre Übertragung erfolgt u.a. durch verschmutztes Wasser bzw. mangelnde Hygiene.

4.14.1 Rattenbiß-Erkrankungen Streptobacilliis moniliformis (Vorkommen: Amerika) und Spirillum minus (Vorkommen: Asien) sind die Erreger der selten beobachteten sog. Rattenbiß-Krankheit. Beide Erreger sind taxonomisch nicht eindeutig klassifiziert. Streptobacillus moniliformis S. moniliformis besiedelt saprophytisch den Nasopharynx von Ratten und anderen Nagetieren. Die gram-negativen, sporenlosen, pleomorphen Stäbchen neigen zur Filamentbildung und wachsen auf bluthaltigen, nährstoffreichen Nährböden. Häufig wird die Ausbildung von L-Formen (s. Kap. 3.1) beobachtet. Die Rattenbißkrank-

heit, die protrahiert verlaufen kann, geht mit Fieber, Erbrechen, starken Kopfschmerzen und Exanthem einher. Bei disponierten Menschen kann eine Endokarditis entstehen, arthritische Symptome sind häufig. Geeignete Untcrsuchungsmaterialien sind Blut, Gelenkpunktat und Wundabstrich. Die Erreger sind sensibel gegen Penicillin (nicht L-Form) und Tetrazykline. Das Haverhill-Fieber wird ebenfalls S. moniliformis zugeschrieben. Es ähnelt im Verlauf der Rattenbiß-Krankheit, tritt aber epidemisch auf und wird möglicherweise durch Wasser übertragen, das von Ratten verschmutzt wurde. „Spirillum minus" „S. minus" ist der Erreger einer weiteren, sehr selten beobachteten Rattenbiß-Erkrankung des Menschen, im japanischen als ,,Soduku" bekannt. Es handelt sich um ein stark bewegliches, gram-negatives, schraubenförmiges Bakterium. Es ist auf künstlichen Medien nicht anzüchtbar. Die Diagnostik ist deshalb auf den direkten mikroskopischen Nachweis im Patientenmaterial oder auf die Probeinokulation von Meerschweinchen mit Blut des Patienten angewiesen. Die fieberhafte Erkrankung geht mit einer lokalen Entzündung, mit Lymphangitis und Lymphadenitis einher.

4.14.2 Die Gattung Campylobacter Die Gattungsbezeichnung wurde 1963 von SEBALD und VERON eingeführt und löste die historisch bedingte Zuordnung als „mikraerophile Vibrionen" zur Familie der Vibrionaceae ab. Als Typspezies gilt Campylobacter fetus SEBALD und VERON 1963. Spiralförmige Darmbakterien wurden erstmals 1886 von ESCHERICH bei durchfallskranken Kindern mit „Cholera infantum" in einem Kinderspital in München beobachtet und beschrieben. Seine Entdeckung geriet jedoch nach wenigen Jahrzehnten wieder in Vergessenheit, da eine Anzüchtung zum damaligen Zeitpunkt nicht gelang. Seit der Einführung antibiotikahaltiger Selektivnährböden durch SKIRROW (1977) gehört die Anzucht dieser Mikroorganismen zur Routinediagnostik darmpathogencr Erreger. Sie gelten heute als weltweit häufigste bakterielle Ursache infektiöser Durchfallskrankheiten. Die ersten Isolierungen von tierpathogenen Campylobacter Spezies erfolgten 1913 beim Schaf und 1919 beim Rind. Eigenschaften

Morphologie: Es handelt sich um schlanke, gebogene bis spiralig gewundene, gram-negative, nicht sporenbildende Stäbchen, 0,2-0,5 x 0,5 bis

4.14 Streptobacillus, Campylobacter, Arcobacter, Helicobacter

5 (Jtn groß (Abb. 4. 32). In älteren Kulturen können sich kokkoide Degenerationsformen ausbilden. Die Bakterien tragen uni- oder bipolar jeweils eine Geißel und zeigen eine lebhafte korkenzicherartige Beweglichkeit. Biologie: Bakterien der Gattung Campylobacter wachsen mikroaerophil, d. h. in Gegenwart von etwa 5 % Sauerstoff. Sie werden sowohl durch eine aerobe als auch durch eine anaerobe Atmosphäre im Wachstum gehemmt: dies hat wichtige Konsequenzen für die mikrobiologische Diagnose von Campylobacter-lnfcktioncn. Die Bakterien sind Oxydase-positiv. reduzieren in der Regel Nitrat und verwenden Aminosäuren und Intermediärprodukte des Tricarbonsäurezyklus als Energiequelle. Kohlenhydrate werden weder fermentiert noch oxidiert; die mei-

sten Spezies bilden Katalase. Campylobacter besitzen ein mit 1500-1700 kb vergleichsweise kleines Genom. Toxine. Sowohl Zytotoxine als auch ein Cholcratoxin-ähnlichcs Enterotoxin sind bei C. jejuniund C. co//-Stämmen beschrieben worden. Die Bedeutung dieser Toxine für die Pathogencsc ist umstritten. Antigenstruktur. Campylobacter besitzen thermostabile und thermolabile Oberflächenantigene. die bei C. jejuni/coli eine Einteilung in 65 bzw. 160 Serogruppen erlauben. Sie werden nach PENNER durch passive Hämagglutination (hitzestabile Antigene) und nach LIOR durch Objeklrägeragglutinalion mit absorbierten Antiseren (hitzelabile Antigene) nachgewiesen und haben in erster Linie Bedeutung zur Aufklärung von Infektketten. Bei C. fetus werden aufgrund hitzestabiler Antigene 3 Serogruppen (A, B. C) unterschieden. C. fetiis und C. rechts besitzen eine Mikrokapsel aus einem sog. s-layer Protein, das Serum- und Phagozytoscresistenz vermittelt. Pathogenese

Bereits eine Infektionsdosis von 500 Erregern, z.B. in Milch aufgenommen, kann beim Menschen zu einer Campylobacter-Eaterokolitis führen. Die Motilität des Erregers scheint dabei ein wichtiger Virulenzfaktor zu sein, die es zusammen mit seiner Spiralform erlaubt, sehr schnell die schützende Mukusschicht der Darmschleimhaut zu passieren und wahrscheinlich über Geißelstrukluren, aber auch Oberflächenproteine und -polysaccharide, am Epithel von Jcjunum und Colon zu adhärieren. Für den weiteren Verlauf der Pathogenese spielen chemotaktische Faktoren, möglicherweise toxische Effekte, eine Zellinvasivität sowie eine Schleimhautdurchwanderung mit nachfolgender submuköser Entzündung (wie bei Salmonellen) eine bisher nicht genau definierte Rolle. C. fetus zeigt Merkmale eines fakultativ pathogenen Erregers, da vorwiegend resistenzgeschwächte Patienten an typischen extraintestinalen Manifestationen wie Sepsis oder Meningitis erkranken.

Über die Pathogenese der C. /eto-Infektion ist noch wenig bekannt. Klinik Abb. 4.32 Elektronenmikroskopische Aufnahme von Campylobacter jejuni(modifiziert aus GOODWIN et al., 1985).

Die spiralförmigen Bakterien der Gattung Campylobacter (Campylobacter = griech. „ge-

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Spezielle Bakteriologie

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krümmtes Stäbchen") verursachen zwei große Gruppen von Erkrankungen, nämlich eine akute Enterokolitis des Menschen und fetale und enterale Infektionen bei Rind, Schaf und Schwein. Einige Campylobacter spp. werden auch bei Parodontitis des Menschen vermehrt gefunden. Infektionen: Die wichtigsten menschenpathogenen Spezies zur Gattung Campylobacter im engeren Sinne sind: Ŷ die Durchfallserreger C. jejuni (verantwortlich für ca. 90 % aller Campylobacter-lnfektionen des Menschen), C. coli, C. upsaliensis und C. lari; Ŷ C. fetus als Ursache überwiegend extraintestinaler Infektionen (s.Tab. 4.29); Ŷ C. curvus, C. rectus, C. showae und C. gracilis, letzterer unbegeißelt, finden sich in Zahnfleischtaschen und werden mit der Parodontitis in Verbindung gebracht. Weitere Spezies sind C. sputorum und C. concisus, beides harmlose Kommensalen der Mundhöhle, sowie C. hyointestinalis und C. muco.salis; letztere verursachen beim Schwein eine nekrotisierende Enterokolitis. C. jejuni ist weltweit eine der häufigsten Ursachen der bakteriellen Enteritis und Enterokolitis. Andere darmpathogene Campylobacterarten sind von untergeordneter Bedeutung.

Die Inkubationszeit beträgt 2—11 Tage, bei C. jejuni im Mittel 2-5 Tage. Nach einem Prodromalstadiuni von 12-24 Stunden mit unspezifischem Krankheitsgefühl, Frösteln und häufig quälenden Kopf- und Gliederschmerzen kommt es am ersten Krankeitstag häufig zu einem plötzlichen Fieberanstieg mit Temperaturen, die 40 "C erreichen können. Kopf- und Gliederschmerzen halten an, krampfartige abdominclle Schmerzen, Schwindel und andere Kreislaufsymptome, selten Erbrechen, kommen hinzu. Im fieberhaften Frühstadiuni können offenbar auch passagere Bakteriämien auftreten. Sehr schwere Fälle können unter dem Bild eines „akuten Abdomens" zur Krankenhauseinweisung führen. Gelegentlich ist das akute Stadium von schweren Arthralgien begleitet. Die Diarrhöe beginnt meist explosiv und steigert sich auf bis zu 20 Entleerungen pro Tag. Die Stuhlbeschaffenhcit ist stets wässrig, in bis zur Hälfte der Fälle auch schleimig und mit blutigen Auflagerungen; mikroskopisch sind in der Regel massenhaft Leukozyten nachweisbar. Die Durchfälle sistieren meist nach 5-7 Tagen, nur selten beträgt die Krankheitsdauer über 10 Tage. Die mittlere Ausscheidungsdauer der Erreger nach Abklingen der akuten Symptomatik ist mit 14 Tagen deutlich kürzer als die der Salmonellen, eine Langzeitausscheidung ist mit Ausnahme von AIDS-Patienten extrem selten. Mischinfektionen mit anderen enteropathoge-

Tab. 4.29 Für den Menschen bedeutsame Campylobacter- und /4/robacter-Spezies Spezies

Krankheitssymptome

Nachweis in

Häufigkeit

wichtigstes natürliches Reservoir

C. fetus

Septikämie, Meningitis

Blut

seltener

Schaf, Rind

C. jejuni. ssp. jejuni C. jejuni, ssp. doylei C. coli

Enterokolitis, CBS, Septikämie

Faeces

häufig

Diarrhöe, Sepsis

Faeces

selten

Vögel (v.a. Geflügel), Rind, Wasser Mensch

Enterokolitis, CBS

Faeces

seltener

C. lari

Diarrhöe

Faeces

selten

C. upsaliensis

Diarrhöe, Sepsis

Faeces

selten

Schwein, Rind, Schaf, Geflügel Hund, Katze, Vogel, Wasser Hund, Katze

C. helveticus C. curvus

Diarrhöe Parodontitis

Faeces Mundhöhle

sehr selten häufig

Hund, Katze Mensch

C. rectus C. showae

Parodontitis Parodontitis

Mundhöhle Mundhöhle

häufig häufig

Mensch Mensch

A. butzleri

Diarrhöe, Sepsis

Faeces

sehr selten

Geflügel, Wasser

4.14 Streptobacillus, Campylobacter, Arcobacter, Helicobacter

nen Erregern kommen vor. Sehr selten kann C. jejuni auch extraintestinale Infektionen wie Septikämie bei Abwehrschwäche, septischen Abort, Cholezystitis oder Meningitis, letztere beim Neugeborenen, verursachen. Folgekrankheiten. Zwei bis drei Wochen nach dem Beginn einer Campylobacter-F.nteriüs können aseptische reaktive Arthritis, das REITERsche Syndrom, Hautexantheme oder als gravierendste Komplikation ein GUILLAIN-BARRESyndrom auftreten. Patienten mit einer reaktiven Arthritis können als ätiologischen Hinweis eine Antikörperreaktion gegen Campylobacter zeigen; die Campylobacter-Arthritis - meist sind große Gelenke befallen - kann Wochen bis Monate andauern. Das GuiLLAiN-BARRE-Syndrom, eine aufsteigende Parese bis hin zur Atemlähmung, wird nach 1-3 %o der manifesten Campylobacteriosen beobachtet und kann bis zur meist unvollständigen Restitution über ein Jahr benötigen. C. fetus verursacht beim Menschen verschiedene, in der Regel extraintestinale Infektionen, die am ehesten durch passagere oder chronische Bakteriämien mit sekundären Organabsiedlungen zu erklären sind. Neben einer fieberhaften Septikämie können deutlich seltener Meningitis, Endokarditis, Phlebitis, Arthritis, Abszesse oder ein fieberhafter Abort, letztere mit oder ohne Erregernachweis aus dem Blut, das klinische Bild bestimmen. C. /eftu-Infektionen des Menschen sind eher selten und werden vor allem bei vorgeschädigten Patienten beobachtet. Prädisponierende Faktoren sind z.B. Leukämien, Leberzirrhose, Neoplasicn, Diabetes, kardiovaskuläre Grundlciden, Alkoholismus und immunsuppressive Therapie. Vermehrtes Vorkommen bei AIDS-Patienten wurde bisher nicht beobachtet. Bei Schafen, seltener bei Rindern, verursacht C. fetus sporadisches, fieberhaftes Verwerfen. Laboratoriumsdiagnostik

Erregernachweis: Bei Enteritis ist die Untersuchung von Stuhlproben - möglichst frühzeitig im akuten Stadium - am aussichtsreichsten. Bei hohem Fieber können Erreger auch aus Blutproben isoliert werden. Stuhlproben sollten bei längeren Versandwegen (> 24 Std), Rcktalabstriche und Biopsate immer in Transportmedium zum Labor transportiert werden. Kühlung des Untersuchungsmaterials bis zur Verarbei-

tung verbessert die Nachweissicherheit. Bei extraintestinalen Infektionen sind, abhängig vom klinischen Bild und der vermuteten Erregerlokalisation, Blutkulturen, Liquor, Biopsiematerial oder Punktate geeignet. Stuhlproben: Stuhlproben werden direkt auf bluthaltige oder spezielle Charcoal-haltige Selektivnährböden ausgeimpft, denen verschiedene Antibiotikakombinationen zur Unterdrückung der begleitenden Stuhlflora zugemischt sind. Die Inkubation erfolgt in der Regel für 44 Std. bei 37 °C in einem mikroaerophilen Gasgemisch aus 5 % O2,10 % CO2 und 85 % N2. Die 1-3 mm großen, durchscheinenden Kolonien gleichen verspritzten Flüssigkeitströpfchen und ziehen sich oft entlang des Impfstrichs. Die vorläufige Identifizierung erfolgt mikroskopisch im Phasenkontrastpräparat, sowie durch die positive Oxidase- und die Katalasereaktion. Zur Unterscheidung menschenpathogener Campylobacter-Speziea in der mikrobiologischen Diagnostik werden in erster Linie die Katalasereaktion, die Nitratreduktion, die Hippurat-Hydrolyse, die Indoxylacetat-Hydrolyse. die Harnstoffspaltung und das Wachstum bei unterschiedlichen Temperaturen herangezogen. Die ätiologische Diagnose einer CampylobacterInfektion kann nur mikrobiologisch gestellt werden. Antikörpernachweis: Einige Tage nach Krankhcitsbcginn treten Serumantikörper auf. Zum Nachweis können eine Komplementbindungsreaktion (KBK), aller dings geringer Sensitivität. sowie ELISA-Verfahren mit Antigenextrakten durchgeführt werden. Wegen der starken antigenen Heterogenität der Stämme ist die Campylobacter-Sero]og\e bis heute noch nicht als serologische Routinemethode eingeführt.

Therapie Die unkomplizierte Campylobacter-Enteritis verläuft selbstlimitierend, sie sollte lediglich symptomatisch, d.h. mit Flüssigkeits- und Elektrolytersatz, mit Bettruhe und ggf. leichten Spasmolytika behandelt werden.

Bei schweren Verläufen ist ist eine antimikrobielle Therapie angezeigt, Mittel der Wahl ist Erythromycin. Die Resistenzquote gegen Erythromycin beträgt in verschiedenen Ländern, abhängig von der Häufigkeit der Anwendung, 1-20 %, in Deutschland etwa 1-9 % und liegt bei C. coli durchweg höher als bei C. jejuni.

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Spezielle Bakteriologie

Weitere therapeutische Möglichkeiten bieten Tetracyclin (5-25 % resistent) und, insbesondere bei septikämischen Verläufen, Aminoglykoside, z.B. Gentamicin. Gegen Trimethoprim und Cephalosporine, mit Ausnahme von Cefotaxim, sind alle C. jejuni resistent, ein Großteil der Stämme bildet ß-Laktamasen.

Die 4-Fluoro-Chinolone (Gyrase-Hemmer) sind bei sensiblen Stämmen gut wirksam, allerdings bestehen sowohl primäre Resistenzen als auch die Möglichkeit einer schnellen Resistenzentwicklung mit Resistenzquoten um 50 %. Epidemiologie

Häufigkeit: Die Campylobacter-Entehüs ist in entwickelten Ländern etwa so häufig wie die Salmonellose, ca. 2-10 % der Enteritisfälle werden durch C. jejuni verursacht. In Entwicklungsländern werden bei Erkrankten, aber auch bei symptomlosen Trägern in bis zu 40 % Campylobacler isoliert. Die Durchseuchung erfolgt dort bereits im frühen Kindesalter, während in Industrieländern der Häufigkeitsgipfel bis in das Schulalter verschoben ist. Die Infektion tritt gehäuft in ländlichen Gebieten und während der Sommermonate auf. In England wird die jährliche Campylobacter-lnzidenz auf 1100/100000 Einwohner geschätzt. In Deutschland betrug die Inzidenz gemeldeter Fälle 1997 zwischen 66 bis 94 pro 100000 Einwohner. Tiere sind die wichtigsten Infektionsquellen der Compy/obocter-Infektion.

So wurden die Erreger bei Schlachtgeflügel in 60-100 %, bei Rindern in bis zu 40 %, bei Schweinen (C. coli) zwischen 17 und 100 %, bei Schafen in 8-22 %, bei Hunden in 2-50 % und bei Katzen in bis zu 45 % nachgewiesen. Auch bei wilden Vögeln, z.B. Krähen oder Möwen, werden sie sehr häufig gefunden. Die Übertragung auf den Menschen erfolgt in erster Linie über tierische Lebensmittel. Schlachtgeflügel, besonders deren Innereien, und Rohmilch sind bedeutende Risikofaktoren; Innereien von Rind und Schaf können ebenfalls kontaminiert sein. Erregerübertragungen von durchfallskranken jungen Hunden und Katzen auf den Menschen sind in Einzelfällen beobachtet worden; in den USA, Schweden und Israel

konnten Massenerkrankungen auf nicht chlorierte Oberflächenwässer zurückgeführt werden. Touristen in warmen Ländern gehen ebenfalls ein erhöhtes Risiko ein. eine Campylobacto'-Infektion zu akquirieren. Die Epidemiologie der menschlichen C. fetusInfektion ist bis heute unklar. Überlebensfähigkeit der Keime: Campylobacter werden bei einem pH < 5,0 oder > 9,0 inaktiviert. Auf feuchten Oberflächen (z.B. Schlachtgeflügel), in Kuhmilch oder in Faeces bleibt C. jejuni bei 4 °C bis zu drei Wochen lebensfähig, in Flußwasser bis über 4 Wochen.

Bei 25° C sterben die Bakterien deutlich früher ab, in Milch bereits nach drei Tagen. Durch Pasteurisieren werden sie nach wenigen Sekunden abgetötet. Sie sind empfindlich gegen Austrocknung, besonders an Oberflächen. Bei -20 "C, z.B. in tiefgefrorenem Geflügel, überleben sie mehrere Monate, jedoch wird im Unterschied zu Salmonellen praktisch keine sekundäre Keimvermchrung nach dem Auftauen beobachtet. Prophylaxe. Verzicht auf Rohmilch, Vermeidung von nicht durcherhitztem Geflügel und einwandfreies Trinkwasser haben einen hohen prophylaktischen Stellenwert. Nach dem Infektionsschutzgesetz §7 besteht für die Catnpyloftßcfer-Enteritis Meldepflicht.

4.14.3 Die Gattung Arcobacter Arcobacter sind spiralförmige, gram-negative, aerotolerante Bakterien, die in der Umwelt vorkommen und nur selten beim Menschen als Ursache von Diarrhöe oder Septikämie nachgewiesen werden. Bakterien der Gattung Arcobacter ähneln in vieler Hinsicht Campylobacter, können jedoch bei 15 °C wachsen und zeigen eine ausgesprochene Aerotoleranz bei 30 °C. Die Typspezies A. nitrofigilis ist ein freilebendes, nicht-wirtsgebundenes Bakterium. A. butzleri hat Bedeutung als seltener Durchfallerreger des Menschen, während A. cryaerophila und A. skirrowii bisher nur in Einzelfällen in menschlichem Untersuchungsmaterial gefunden wurden.

4.14.4 Helicobacter pylori Als es 1982 drei Australiern, dem Pathologen WARREN, dem Internisten MARSHALI. und dem Mikrobiologen GOODWIN, gelang, „Campylobacter-ähnliche" Bakterien aus Gewebsproben magenkranker Patien-

4.14 Streptobacillus, Campylobacter, Arcobacter, Helicobacter

ten anzuzüchten, kennzeichnete dies das erfolgreiche Ende eines langen Slreits um die Bedeutung einer bakteriellen Kolonisierung des Magens im Zusammenhang mit Gastritis und peptischcr Ulkuskrankheit. Bereits 1874 hatte BoETTCHhR eine Infektion als Ursache der chronischen Gastritis vermutet. KONJETZNY, ein Chirurg in Kiel, belegte diese Ansicht 1923 mit einer fundierten Studie, die durch den mikroskopischen Nachweis spiralförmiger Bakterien im Magen u.a. durch DOKNGF.S 1938 und durch FREEDBERG und BARON 1940 gestützt wurde. Bis zum kulturellen Nachweis des Erregers konnte sich diese Ansicht jedoch nicht gegen das Paradigma der prinzipellen Keimfreiheit des Magens und der Säure als alleiniger Ursache der Geschwürskrankheit durchsetzen. Inzwischen gilt die kausale Bedeutung von Helicobacter pylori für die chronisch aktive Gastritis und die peptische Ulkuskrankheit als gesichert. Weiterhin wurde eine hochsignifikante Assoziation mit dem Adenokarzinom und dem MALTLymphom des Magens nachgewiesen.

Eigenschaften

Morphologie: Helicobacter sind spiralförmige, gram-negative, bewegliche, mikroaerophile Bakterien, die entweder im Magen oder im Darmtrakt von Säugetieren vorkommen. Im Gegensatz zu den ähnlichen CampylobacierVertretern zeigen Helicobacter lophotriche Begcißelung (bis 7 Geißeln) an einem oder beiden Polen und umscheidete Geißeln mit terminalcr Auftreibung (Abb. 4. 33). Das Geißelfilament ist aus den Proteinen FlaA und FlaB aufgebaut. Weitere wesentliche Unterschiede zu Campylobacter liegen im GC-Gehalt der DNA von 35-37 mol %, der Zellwand mit 19-C-Cyclopropansäure als ungewöhnlicher Fettsäure und als auffälligste Eigenschaft die Bildung von Urease. Das inzwischen komplett sequenzierte zirkuläre Chromosom ist etwas über 1.6 Megabasenpaare groß und weist eine extreme Heterogenität innerhalb der H. pylori Population auf. Pathogenese

H. pylori besiedelt nahezu ausschließlich die Mukosa des menschlichen Magens und selten des Zwölffingerdarms, bei Schweinen und Katzen wurde er in Einzelfällen gefunden. Bei der Pathogenese der Helicobacter-assoziierlen Gastritis und peptischen Ulkuskrankheit spielen die folgenden Faktoren eine Rolle: Die Schraubenform und gute Motilität er-

Abb. 4.33 Elektronenmikroskopische Aufnahme von Helicobacter pylori (JOSENHANS, 1998).

möglicht eine schnelle Durchwanderung des Magenschleims, um die nahezu pH-neutrale Grenzschicht zwischen Schleim und Mucosa zu erreichen; unbewegliche Mutanten sind für Versuchstiere nicht infektiös. Die bakterielle Urease katalysiert die Umsetzung von Harnstoff in Kohlendioxid und Ammoniumionen; in ihrer Abweseneit ist die Infektiosität ebenfalls deutlich reduziert. Die lokale Neutralisierung der Magensäure durch Ammoniumionen könnte zum Überleben von H. pylori im sauren Habitat beitragen. Die native Urease ist ein 550 KDa großes, multimeres Enzym, das aus jeweils sechs Dinieren der zwei Untereinheiten UreA (26.5 kDa) und UreB (60.3 kDa) aufgebaut ist. Bei etwa 50 % der //. pv/on-Stämme ist eine cytotoxische Aktivität nachweisbar, die auf ein vakuolisierendes Cytotoxin (VacA) zurückgeht, das aus einem 140 KDa großen Vorläuferprotein gebildet und als 95 KDa großes Protein aus der Zelle ausgeschleust wird. Dieses komplexiert dann extrazcllulär zu einem etwa 600-900 KDa großen, radialsymmetrischen nativen Toxin. Das vocA-Gen ist in allen Stämmen vorhanden, weist jedoch eine große genetische Variabilität insbesondere in der Signalsequenz und in der Mittelregion auf, die mit einer unterschiedlich starken Cytotoxizität einhergeht. Der vacA-Gcnotyp sl korreliert mit einer starken Toxizität des gebildeten Proteins und mit der Entstehung der Ulkuskrankheit, während der Genotyp s2 mit einer geringen zytotoxischen Aktivität und mit der Ausbildung der Gastritis assoziiert ist. Die Genotypen können durch PCR-Analyse bestimmt werden. Die bevorzugte Adhärenz von H. pylori an die Magenschleimhaut (Gewebetropismus) ist noch nicht vollständig verstanden. Möglicherweise spielt dabei eine Bindung an Blutgruppenantigene eine Rolle.

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Spezielle Bakteriologie

die von Magenepithelzellen exprimiert werden. Polysaccharidstrukturen. die mit den humanen Blutgruppenantigenen Lewis x und Lewis y identisch sind, wurden auch in den LPS-Seitcnketten von H. pxiori nachgewiesen. Diese Mimikry des Bakteriums mit wirtseigenen Strukturen könnte einer erfolgreichen Immunabwehr entgegenwirken. Die Infektion induziert sowohl eine lokale als auch eine systemische humorale Immunantwort, ohne dabei eine wirksame Elimination des Erregers bewirken zu können. Über die Rolle der zellulären Immunreaktion besteht noch keine einheitliche Auffassung. Folge der chronischen Schleimhautbesiedlung ist eine entzündliche granulozytäre, später monozytäre Infiltration des Epithels, die über Entzündungsmediatoren wiederum zur Gewebedestruktion beiträgt. Die Intensität der Entzündungsreaktion und die Induktion von Entzündungsmediatoren ist korreliert mit der Präsenz eines Proteins (CagA), das vom sog. C'ytotoxin-flssoziierten Gen cagA codiert wird. Dieses Gen gilt als Marker für das Vorhandensein einer sog. Pathogenitätsinsel cag. Derartige DNA-Regionen wurden zuerst bei Enterobacteriaceae entdeckt, und umfassen Gene, die für Virulenzfaktoren kodieren. Neuere Untersuchungen haben gezeigt, daß die cag-Gcnc anscheinend für einen mikrobiellen sog. Typ IV Sekretionsapparat kodieren, mit dessen Hilfe das CagA-Protein in eukaryote Zellen „injiziert" wird. Dort findet eine Tyrosinphosphorylierung des Proteins statt, welches dann wiederum als Startpunkt für eine Reihe für die Pathogenität bedeutsamer intrazellulärer Signalwege fungieren kann.

Klinik H. pylori, die für den Menschen wichtigste Spezies, besiedelt weltweit etwa 50 % der Bevölkerung, mit der höchsten Prävalenz in Entwicklungsländern. Gegenwärtig sind bei Mensch und Säugetieren eine Reihe von Helicobacter-Spezics bekannt (s. Tab. 4.30), die im Magen bzw. im Darm gefunden werden. Für den Menschen hat H. pylori die weitaus größte Bedeutung, H. heilmannii gilt als seltene Ursache einer Gastritis, H. cinaedi und H. fennelliae sind seltene Durchfallerreger bei Homosexuellen und Immunsupprimierten. Selbstversuche (MARSHALL, 1985 und MORRIS, 1986) zeigten, daß die Infektion der Magenschleimhaut zu den typischen histologischen Merkmalen einer chronisch-aktiven Gastritis führt, die sich nach Eradikation des Erregers zurückbildet. Die Erkrankung kann symptomlos verlaufen, in einigen Fällen jedoch auch durch ein Ulcus duudeni oder Ulcus ventriculi kompliziert werden, für dessen Entstehung die Helicobacter-Infektion mit ursächlich ist. Umfangreiche epidemiologische Studien weisen auch darauf hin, daß daß Risiko eines Adenokarzinoms sowie eines MALT-Lymphoms des Magens signifikant mit einer chronischen H. pv/on-Gastritis assoziiert ist.

Tab. 4.30 Gastrale und intestinale Helicobacter-Spezies Spezies

Vorkommen und ggf. Krankheitsbild

Wirt und Reservoir

H. pylori

Magenschleimhaut; Gastritis, Ulkuskrankheit,

Mensch (Affe, Katze?)

H. heilmannii H. mustelae

Magenkarzinom, MALT-Lymphom Magenschleimhaut, Gastritis Magenschleimhaut, Gastritis

Katze, Hund, selten Mensch Frettchen

H. felis

Magenschleimhaut, Gastritis

Katze, Hund

H. nemestrinae

Magenschleimhaut

Affe (Macaca nemestrina)

H. acinonyx

Magenschleimhaut

Gepard

H. bizzozeronii

Magenschleimhaut

Hund

H. cinaedi

Intestinum, Proktitis

Mensch, Nagetiere

H. fennelliae

Intestinum, Proktitis

Mensch

H. pullorum

Intestinum, Diarrhöe

Geflügel, selten Mensch

H. muridarum

Intestinum

Mäuse, Ratten

H. canis

Intestinum

Hund

H. bilis

Leber, Galle, Darm

Maus

H. hepaticus

Leber, Intestinum

Maus

H. rappini

Leber, Intestinum

Maus, Mensch, Schaf

4.14 Streptobacillus, Campylobacter, Arcobacter, Helicobacter

Laboratoriumsdiagnostik

Die Diagnose der H. /3>'/on'-Infektion wird in der Regel vom Pathologen durch den histopathologisch-bakterioskopischen Erregernachweis in gastroskopisch gewonnenen Magenbiopsien gestellt, darüber hinaus durch den Ureaseschnellnachweis aus dem Bioptat durch den Gastroenterologen sowie vom Mikrobiologen durch die Kultur auf Spezialnährböden. Die Anzucht von //. pylori ermöglicht vor allem eine antimikrobielle Resistenztestung des Erregers. Nicht invasive Methoden sind der Harnstoff-Atemtest. bei dem nach einer Probemahlzeit aus 13C- markiertem Harnstoff das durch die bakterielle Urease freigesetzte markierte CO2 in der Atemluft gemessen wird, sowie der Nachweis von Serumantikörpern im ELISA und im Western Blot. Die erstgenannten Verfahren eignen sich auch als Verlaufskontrolle nach antimikrobicller Therapie, während die Serologie in erster Linie als prätherapeutischer Screeningtest verwendet wird.

Therapie

Mit einer 7-tägigen Kombinationslherapie aus einem Protonenpumpeninhibitor, zusammen mit zwei Antibiotika, meist einem Makrolid und Aminopenizillin oder Metronidazol (TripelTherapie), können 80-90 % der Infizierten erfolgreich behandelt werden. Resistenzentwicklungen, vor allem gegen Metronidazol und Clarithromyein, stellen jedoch ein zunehmendes Problem dar. Die prätherapeutische Isolierung von H. pylori ermöglicht es, die jeweilige Antibiotikakombination auf die individuelle Empfindlichkeit des Erregers abzustimmen und somit die Entwicklung multiresistenter Stämme zu vermeiden.

Epidemiologie Zwischen 70-90 % der Antrumgastritiden und > 90 % der Duodenalulzera sind mit einer H. pylori-lnfektion assoziiert.

In den Industrieländern entspricht die Infektions-Prävalenz in Prozent etwa dem Alter der untersuchten Gruppe und erreicht bei 50-60jährigen mit 50-60 % Durchseuchung ihren

Höhepunkt. In Ländern mit geringerem Hygienestandard erfolgt die Infektion meist bereits vor dem 5. Lebensjahr. Die Durchseuchung kann bei 20-jährigen bereits 80 % betragen. Nach dem bisherigen Kenntnisstand scheint der Mensch das ausschließliche Erregerreservoir zu sein. Die Übertragung erfolgt von Mensch zu Mensch. In Entwicklungsländern ist der fäkoorale Übertragungsweg der wahrscheinlichste, wobei eine infizierte Mutter, hohe Populationsdichte, schlechte Ernährung und häufige Infektionen im Kindesalter, insbesondere Durchfallskrankheiten, mit einem besonders hohen Risiko verknüpft sind. Bei Patientengruppen mit Magenkarzinoin wurde in retrospektiven Kohortenstudien im Vergleich zu Kontrollen signifikant häufiger eine vorausgehende H. pv/on'-Infektion ermittelt. Ähnliches gilt für das MALT-Lymphom, bei dem im Frühstadium durch eine erfolgreiche Eradikalion des Erregers sogar eine Remission der malignen Veränderung erreicht werden kann. Die Rolle von H. pylori bei der Karzinogenese wird noch untersucht. Literatur WASHBUKN, R. G.: Streptobacillus moniliformis (RatBite-Disease). In: MANDF.II, G.L., BF.NNFT. J.E.. DOLIN.R.: Principles and Praclicc of Infectious Diseases. 4"' cd. Churchill Livinstone, New York. 1995: S. 2084. - ders.: Spirillum minus (Rat-Bite-Disease). In: ebda. S. 2155 KIST. M: Wer entdeckte Campylobacter jejuni/coli? Eine Zusammenstellung bisher unberücksichtigter Lhcralurstcllcn. Zbl. Bakt.Hyg., I. Abt. Orig. A 261. 177(1986) MALFERTHEINER, P. (Hrsg.) : Helicobacter pylori Von der Grundlage zur Therapie. 2. Aufl., Thieme, Stuttgart 1996 NACHAMKIN, I.. and M. B. SKIRROW.: Campylobacter, Arcobacter and Helicobacter. in: COLLIER, L.H.. A. BALOWS and M. SUSSMAN (Eds): Toplcy & Wilsons Microbiology and Microbial Infections. 9"1 ed. Arnold. London (1997), vol. 2, Kap.54 SKIRROW, M. B.: Campylobacter enteritis: a „new" disease. Br. Med. J. 2, 9 (1977) SKIRROW, M. B., and M. J. BI.ASKR: Campylobacter jejuni, in: BLASER M.J.. P. D. SMITH and J. 1. RAVDIN et al. (Eds.): Infections of the Gastrointestinal Tract, Raven Press, New York (1995) S. 825 SKIRROW, M. B.: Infection with Campylobacter and Arcobacter, in: COI.LIKR, L.H., A. BALOWS and M. SUSSMAN (Eds.): Topley & Wilsons Microbiology and microbial infections. 9lh ed. Arnold, London (1997), vol. 3, Kap.29

375

Spezielle Bakteriologie

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4.15 Anaerobe gram-negative Stäbchen (Bacteroides und andere) HEIDI SCHÜTT-GEROWITT

Die medizinisch relevanten anaeroben gram-negativen Stäbchen sind der Familie der Bacteroiduceae und einigen verwandten Gattungen zugeordnet (Tab. 4.31). Da sie sämtlich in der normalen Körperflora des Menschen vorkommen, sind die von ihnen hervorgerufenen Infektionsprozesse in der Regel endogen. Es sind meistens Mischinfektionen mit anderen Anaerobiern oder mit fakultativ anaeroben Bakterienarten, die zur Abszeßbildung neigen. Häufig findet man die aneroben gram-negativen Stäbchen bei intraabdominellen Infektionen, Infektionen des weiblichen Genitaltraktcs und bei Parodontalerkrankungen, seltener bei anderen Krankheitsprozessen. Besonders hervorzuheben sind die Arten der Bacteroides fragilis-Gmppe, da sie häufiger als die übrigen Arten zum Krankheitserreger werden und ihre Resistenzeigenschaften den Einsatz spezieller Antibiotika erfordern.

4.15.1 Geschichte Im Jahre 1898 wurde von VFILLON und ZUBER darauf hingewiesen, daß auch nicht-sporcnbildende anaerobe Bakterien Krankheiten verursachen können. Zuvor hatte VINCENT 1896 ein fusiformes Bakterium zusammen mit Spirochäten bei nekrotischen, ulzcrösen Läsionen der Mundhöhle beschrieben. KNORR bestätigte 1923 diesen Befund und führte die Gattungsbezeichnung Fusobacterium ein. In den 30er Jahren wurden von LEMIERRE und anderen verschiedene durch anaerobe gram-negative Stäbchen hervorgerufene Krankheitsbildcr beschrieben; in den 50er und 60er Jahren bemühten sich u.a. PREVOT, BEERENS.TAHON-CASTEL, DAVID und BAIRD-PARKER um ihre Klassifizierung. Die Systematik und damit auch die Namen der Bakterien wurden häufig geändert und einige Bakterien wurden sogar ganz anderen Gruppen zugeordnet (Bei-

spiel: die Gattung Mobiluncus wurde in der 7. Auflage dieses Buches noch unter den gram-negativen Stäbchen besprochen, sie wird jetzt zu den Aktinomyzeten gerechnet!). Die der Tab. 4.32 zugrunde liegende, heute güllige Einteilung wurde 1988/f990 von SHAH und Coi.uNS vorgenommen.

4.15.2 Erregereigenschaften Die mikroskopische Morphologie der Gattungen ist unterschiedlich. Die Zellen von Bacteroides-, Porphyromonas- und Prevotella-Arten sowie auch von Bilophila sind kokkoid, die der Fusobakterien lang und dünn, meist mit zugespitzten Enden und ausgesprochener Pleomorphie. Leptotrichia-Arien sind überwiegend gram-labile, fädige Strukturen (Abb. 4.34). Die zur Gattung Selenomonas gehörenden Stäbchen sind gebogen. Einige Arten besitzen Geißeln bzw. flagellenähnliche Strukturen und sind beweglich. Für die kulturelle Anzüchtung sind anaerobe Wachstumsbedingungen erforderlich. Einige Arten sind aerotolerant, andere sind so strenge Anacrobicr, daß sie bei Sauerstoffzufuhr schnell absterben. Sie haben alle besondere Nährstoffansprüche, so daß sie nur auf angereicherten Medien, z.B. Hirn-Herz-Extrakt-Mcdien mit oder ohne Blutzusalz, wachsen. Die Entwicklung der Kolonien dauert mindestens zwei Tage, bei einigen Arten auch länger. Porphyromonasund Prevotella-Anen werden durch Hämin im Wachstum gefördert und bilden nach einwöchiger Bebrütung kleine braun bis schwarz pigmentierte Kolonien. Bei jungen Kulturen kann man unter UV-Licht eine ziegelrote Fluoreszenz beobachten. Bacteroides fragilis und verwandte Arten („Bacteroides fragilh-Gruppc") bilden bereits nach zwei Tagen 1-3 mm große, glänzen-

Tb. 4.31 Systematik der anaeroben gramnegativen Stäbchen Bacteroidaceae:

Weitere Gattungen

Gattungen Bacteroides

Selenomonas

Porphyromonas Prevotella Fusobacterium Leptotrichia

Bilophila

Abb. 4.34 Mikroskopische Morphologie der Bacteroidaceae (nach WERNER, 1982).

4.15 Anaerobe gram-negative Stäbchen (Bacteroides und andere)

de Kolonien. Für die endgültige Identifizierung, die für die Bacteroides fragilis-Gvuppe obligat ist, werden biochemische Reaktionen (Zuckervergärungen, Harnstoffspaltung, Indolbildung) und/oder gaschromatographische Untersuchungen benutzt. Für die Gattungszuordnung kann auch die unterschiedliche Empfindlichkeit für Antibiotika herangezogen werden (Tab. 4.32). Die pigmentierten Bacteroidaceae werden aufgrund ihrer Fähigkeit bzw. Unfähigkeit zur Zuckervergärung in saccharolytische und asaccharolytische Arten eingeteilt. Insbesondere bei den asaccharolytischen Arten ist die genaue Identifizierung schwierig und im Routinelabor nicht immer möglich.

4.15.3 Normales Vorkommen und Pathogenese Die anaeroben gram-negativen Stäbchen sind keine Umweltbakterien, sondern kommen in der normalen Flora des Menschen sowie auch bei Tieren vor. Sie machen vor allem im Mund und im Darm den größten Teil der Normalflora aus: im Colon ist das Verhältnis von Anaerobiern zu Aerobiern 1000: 1, die absolute Zahl der Anaerobier beträgt 10" pro Gramm Stuhl. Bacteroides- und Prevotella-Arten sind hier zahlenmäßig am häufigsten vertreten. Die Besiedlung mit diesen Bakterien erfolgt in den ersten Lebensjahren: im Mund mit der Dentition, im Darm am Ende des zweiten Lebensjahres, in der Vagina mit der Pubertät. Anaerobier können sich in diesen Bereichen halten, wenn sich ein negatives Redoxpotential eingestellt hat, welches im Mund bis -350 mV betragen kann. Die Artenzusammensetzung in den verschiedenen Körperbereichen weist beim gesunden Menschen deutliche Unterschiede auf: Im Mund kommen vor allem Fusobacterium nucleatum und F. necrophorum, Prevotella oralis, P. disiens und P. buccae, Porphyromonas gingivalis sowie Bacteroides forsythus vor. Im Darm

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überwiegt zahlenmäßig bei weitem Bacteroides vulgatus, während in Infektionsprozessen am häufigsten B. fragilis und B. thetaiotaomicron gefunden werden. In der Vagina sind hauptsächlich Prevotella melaninogenica, P. bivia und P. disiens vertreten. Wie auch andere Bakterien der normalen Körperflora sind die anaeroben gramnegativen Stäbchen größtenteils an die Mukosa adhäriert. Obgleich bezüglich der physiologischen Rolle der Anaerobier für den Gesamtorganismus noch keine Klarheit besteht, läßt sich doch sicher sagen, daß auch sie im Sinne der „Kolonisationsresistenz" gegen die Besiedlung mit potentiell pathogenen Bakterien schützen. Sie können in unterschiedlichem Maße Erreger schwerer, lebensbedrohlicher Infektionsprozesse sein, nachdem sie aufgrund einer unbedeutenden Schleimhautläsion oder einer passageren Abwehrschwäche ihren natürlichen Lebensraum verlassen haben und in die umliegenden Gewebe eingedrungen sind. Dort können sie ein lokales Krankheitsgeschehen auslösen und nach lymphogener oder hämatogener Streuung metastatische und septische Prozesse verursachen. Ein wichtiger Faktor in der Pathogenese ist das Zusammenwirken der verschiedenen Bakterien in den mischinfizierten Prozessen. Schon 1930 konnte SMITH experimentell zeigen, daß mehrere Arten gemeinsam zur Abszeßbildung führten, aber nicht eine allein. Dies kann verschiedene Gründe haben: Ŷ Eine Art produziert eine Substanz, die die andere braucht. Ŷ Insbesondere Bacteroides fragilis produziert antiphagozytäre Substanzen und schützt dadurch sich selbst und die Begleitbakterien vor der Phagozytose. Die Produktion von E-Laktamasen führt zur Zerstörung von Penicillinen und Cephalosporinen, so daß dann auch die empfindlichen Arten nicht mehr angegriffen werden kön-

Tab. 4.32 Einige Unterscheidungsmerkmale der Bacteroidaceae Kolonien

Colistin

Kanamycin

Vancomycm

rote Fluoreszenz

Bacteroides

grau, glänzend

resistent

resistent

resistent

nein

Porphyromonas Prevotella

klein, dunkel pigmentiert klein, dunkel pigmentiert

variabel variabel

resistent resistent

variabel variabel

meistens meistens

Fusobacterium

flach, unregelmäßig

empfindlich

empfindlich

resistent

nein

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Spezielle Bakteriologie

Virulenzfaktoren einzelner Arten bedingen, daß manche Arten häufiger als Erreger zu finden sind als andere. Hierbei ist vor allem die Kapsel von Bacteroides fragilis zu nennen, die dieses Bakterium wirkungsvoll vor der Phagozytose schützt. Eine ähnliche Kapselstruktur kommt auch bei Prevotella melaninogenica vor. Bacteroides fragilis und B. ovatus sowie auch Porphyromonas gingivalis besitzen Fimbrien und können dadurch besser an Zellen adhärieren. Weitere wichtige Pathogenitäts- bzw. Virulenz-Faktoren sind Exoenzyme. Bacteroides- Arten produzieren Hyaluronidase, Neuraminidase, Kollagenasen, Phospholipase A, Fibrinolysin u.a. I'orphyromonas gingivalis bildet ebenfalls Kollagcnasen und spaltet Fibrinogen. Prevotella melaninogenica und P. intermedia zerstören Epithelzellen durch ihre Phospholipase A. Bacteroides fragilis sowie einige andere Arten schützen sich gegen die Einwirkung von Sauerstoff durch die Produktion des Enzyms Superoxid-Dismutase

4.15.4 Klinik Die von den anaeroben gram-negativen Stäbchen hervorgerufenen Krankheitsprozesse sind unspezifisch. Sie lassen sich prinzipiell in zwei Gruppen einteilen: Die häufig vorkommenden Mischinfektionen und die seltenen, foudroyant (septisch) verlaufenden Monoinfektionen. Mischinfizierte Prozesse enthalten in unterschiedlicher Zusammensetzung mehrere anaerobe Bakterienarten oder Anaerobier zusammen mit fakultativ anaeroben Bakterien. Sie können allein nach Eröffnung ausheilen und verlaufen meist gutartig, jedoch kann auch von diesen Prozessen eine Sepsis ausgehen, die unbehandelt eine hohe Letalität hat. Einige Krankheitsprozesse, bei denen grundsätzlich an die Beteiligung der anaeroben gramnegativen Stäbchen gedacht werden muß und die hierbei am häufigsten nachgewiesenen Arten sollen nun im einzelnen besprochen werden.

Bacteroides fragilis ganz im Vordergrund, aber auch die anderen Arten der Bacteroides fragilisGruppe (B. thetaiotaomicron, B. vulgaius, B. distasonis, B. ovatus) und seltener auch Porphyromonas-Arlen werden nachgewiesen. Nicht alle intraabdominellen Infektionen haben eine Anaerobier-Ätiologie, denn bei der spontanen Peritonitis. bei der Peritonitis nach Peritonealdialyse sowie bei der akuten Cholezystitis und bei infizierten Pankreas-Pseudozysten werden meist Reinkulturen anderer Bakterienarten gefunden. Bilophila mit der bisher einzigen Art B. wadsworthia wurde erst 1989 als neue Gattung etabliert und bei 50% der gangränösen perforierten Appendizitis-Fälle als Erreger gefunden. Es handelt sich um ein anaerobes, gram-negatives, unbewegliches Stäbchen, das sich in seinen Eigenschaften von den Bacteroidaceae unterscheidet. Insbesondere glaubte man zunächst, daß es besondere Resistenzeigenschaften gegen die speziellen Anaerobier-wirksamen Präparate habe; letzteres hat sich jedoch nicht bestätigt. Auch diese Bakterienart kommt meist in Mischinfektionen vor und wurde außer bei der perforierten gangränösen Appendiziits auch bei den anderen Prozessen gefunden. Infektionen des weiblichen Genitaltraktes Tuboovarial-Abszeß, Bartholinischer Abszeß, Salpingitis, Endometritis, Amnionitis und diffuse Entzündungen im Beckenbereich (PID) sowie Wundinfektionen nach gynäkologischen Operationen müssen an die Beteiligung der anaeroben gram-negativen Stäbchen denken lassen. In diesem Bereich sind überwiegend Prevotella- Arten (P. bivia, P. disiens) zu finden, jedoch kommt auch Bacteroides vor. Bei dem häufigen Krankheitsbild der bakteriellen Kolpitis spielen die anaeroben gram-negativen Stäbchen ebenfalls eine große Rolle; sie kommen hierbei meist zusammen mit Gardnerella vaginalis und/oder Mobiluncus- Arten vor. Sepsis

Intraabdominelle Infektionen Bei der Peritonitis und bei intraabdominellen Abszessen, die sich nach Darmperforation verschiedener Ursache entwickeln können, sowie auch beim Leberabszeß findet man vor allem Bacteroides-Arten, in der Regel zusammen mit Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae. Bei diesen mischinfizierten Prozessen steht

Die intraabdominellen Infektionen sind in ca. 50% und die Infektionen des weiblichen Genitaltraktes in ca. 20% der Fälle der Ausgangspunkt für eine Sepsis durch Anaerobier. Andere Primärlokalisationen des Anaerobierprozesses (Dekubitalulzera, Infektionen des Oropharyngeal- und des Respirationstraktes) kommen ebenfalls dafür in Betracht. Bacteroides fragilis

4.15 Anaerobe gram-negative Stäbchen (Bacteroides und andere)

macht 70% der Isolate aus Blutkulturen aus, dann folgen die anderen Arten der Bacteroides fragilis-Gmppc und viel seltener kommen Fusobakterien vor. Der Nachweis anaerober gramnegativer Stäbchen im Blut ist praktisch immer mit klinischen Symptomen verknüpft. Die Lelalität beträgt bei unbehandelten Fällen bis zu 60%. jedoch auch bei behandelten Fällen noch 15-30%. Klinisch läßt sich das septische Geschehen durch Anaerobier nicht von dem durch andere gram-negative Stäbchen unterscheiden. Da Bacteroides fragilis kein Lipid A in der Zellwand besitzt, kommen die typischen Symptome des Endotoxin-Schocks zwar seltener vor. aber die anderen Virulenzfaktoren bedingen die Gefährlichkeit der Bacteroides-Sepsis. Infektionen der Mundhöhle, des Respirationstraktes und der benachbarten Bereiche Die große Zahl der im Mund vorkommenden Anaerobier führt dazu, daß an Infektionen in diesem Bereich die Anaerobier fast immer mitbeteiligt sind. Das häufigste Krankheitsbild im Mund ist die Parodontitis mit ihren verschiedenen Formen, der lokalisierten juvenilen Form und den beiden Verlaufsformen der Erwachsenen-Parodontitis, der chronischen und der rapid progressiven. Insbesondere bei der juvenilen und der rapid progressiven Form ist Actinobacillus actinomycetemcomitans oft als „Leitkeim'" anzusehen (s. Kap. 4.16.1). Darüber hinaus haben aber einige gram-negative anaerobe Stäbchen eine ätiologische Bedeutung, vor allem Porphvromonas gingivalis, Prevotella intermedia, und P. melaninogenica, Bacteroides forsythus und Fusobakterien. denen aufgrund ihrer Virulenzfaktoren eine Rolle in der Entstehung dieses Krankheitsbildes zukommt, welches in der schwersten Form zur Zerstörung des Knochens und somit zum Zahnverlust führt. Lebensbedrohlich ist die vor allem durch Fusobacterium necrophorum hervorgerufene LUDwiG-Angina (Angina Ludovici), eine Zeliulitis der Sublingual- und Submandibulärspalten, die zu einer so starken Anschwellung der Zunge führen kann, daß Erstickung droht. Bei der Angina Plaut-Vincenti oder Fuso-Treponematose handelt es sich um eine meist einseitig auftretende nekrotisierende ulzeröse Angina, die mit starken Schmerzen einhergeht (s. auch Kap. 4.24). Die gram-negativen anaeroben Stäbchen, insbesondere Fusobakterien, werden auch bei Peritonsillarabszessen, Mundbodenabszes-

sen sowie als Begleitbakterien bei der Aktinomykose nachgewiesen. Während bei den akuten Formen der Sinusitis und der Otitis media Anaerobier praktisch keine Rolle spielen, kommen sie bei den chronischen Formen in bis zu 30% (Sinusitis) bzw. 50% und mehr (Otitis) vor. Bei der Sinusitis sind es vor allem Fusobakterien und nicht zur B. fragi/w-Gruppe gehörende Bacteroides-Arien, während bei der Otitis auch Bacteroides fragilis und andere Arten aus der Gruppe gefunden werden. Ausgehend von diesen Prozessen kann es zur septischen Sinusthrombose oder Jugularvenenthrombose kommen. Bei den pleuropulmonalen Infektionen sind die anaeroben gram-negativen Stäbchen an der Entstehung von Aspirationspneumonie. nekrotisierender Pneumonie, Lungenabszeß und Plcuraempyem beteiligt. Weichteil-, Knochen- und Gelenkinfektionen In hohem Prozentsatz kommen anaerobe gramnegative Stäbchen bei Dekubitalulzera und diabetischen Ulzera, bei Hunde- und Menschenbißverletzungen, infiziertem Pilonidalsinus und bei der nekrotisierenden Fasziitis vor. Bei den Ulzera ist überwiegend Bacteroides fragilis beteiligt, bei den übrigen Prozessen neben Bacteroidesauch Prevotella- und Porphyromonas- Arien sowie Fusobakterien. Auch bei Osteomyelitis und septischer Arthritis muß an die Möglichkeit einer - seltenen - Anaerobierinfektion gedacht werden. Hirnabszesse und subdurale Empyeme sind weitere Krankheitsprozesse, bei denen die gram-negativen Anaerobier eine große Rolle spielen. Hierbei kommen überwiegend Fusobakterien in Mischinfektion mit bis zu zehn weiteren Bakterienarten vor. Bei epiduralem Abszeß und bei Meningitis sind Anaerobier dagegen äußerst selten zu finden.

4.15.5 Laboratoriumsdiagnose Der Verdacht auf eine Anaerobierinfektion ergibt sich aus der Lokalisation des Prozesses und dem klinischen Gesamtbild sowie möglicherweise auf Grund einer vorangegangenen antibiotischen Therapie, die keine Wirkung gegen Anaerobier hatte (z.B. Gyrasehemmer, manche Cephalosporine, Aminoglykosidc). Wenn dann bei der Materialentnahme ein foetider Geruch auffällt, ist die Diagnose „Anaerobier" praktisch

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Spezielle Bakteriologie

schon gestellt. Ob eine kulturelle Anzüchtung mit nachfolgender genauer Identifizierung erforderlich ist, hängt vom Infektionsprozeß ab. Bei den typischen Lokalisationen und Verläufen ist sie nicht immer notwendig, denn die spezielle Therapie muß ohnehin bereits auf Grund des Verdachtes begonnen werden. Bei generalisierter Peritonitis und Bakteriämie sowie bei Patienten mit schweren Grunderkankungen oder wenn eine Langzeittherapie erforderlich wird (z.B. bei Osteomyelitis), muß eine genaue Erregeridentifizierung angestrebt werden. Bei der Probenentnahme darf kein Kontakt mit den Schleimhautoberflächen stattfinden, da die in Frage kommenden Erreger auch Bestandteil der Normalflora sind. Es muß versucht werden, durch Aspiration oder Punktion Material aus der Tiefe zu gewinnen; wegen der Verletzungsgefahr sollte es aber nicht in der Spritze selbst verschickt werden. Abstriche von diesen Prozessen sind praktisch unbrauchbar, weil sie nicht kontaminationsfrei zu gewinnen sind und weil an ihnen zuwenig Material haftet. Auf jeden Fall muß das Material in ein Transportmedium für Anaerobier mit einem Oxidations-ReduktionsIndikator gegeben werden. Der Transport zum Labor muß schnell und bei Zimmertemperatur (Sauerstoff diffundiert in der Kälte besser) erfolgen. Bei der Materialbearbeitung im Labor ist ein Grampräparat obligat. Es ist im Hinblick auf Körperzellen (Phagozyten) und auf Bakterien zu beurteilen, es läßt jedoch nur bei Vorhandensein typischer Strukturen (z.B. Fusobakterien) eine weitergehende Aussage zu. Andere mikroskopische Methoden sind die direkte Immunfluoreszenz, die sich bisher nicht besonders bewährt hat, und die Dunkelfeldmikroskopie, die insbesondere bei der Untersuchung von periodontalem Material von Bedeutung ist. Die direkte Gaschromatographie konnte sich als eine Methode zur schnellen Diagnosestellung nicht durchsetzen. Als Nährmedien für die kulturelle Anzüchtung werden Hirn-Herz-Infusion-Bouillon und -Agar oder der Agar nach SCHAKDLER benutzt. Kanamycin-Vancomycin-Agar ist ein Selektivmedium zur Anzüchtung der anaeroben gram-negativen Stäbchen, das das Wachstum der fakultativ anaeroben gram-negativen Stäbchen und gram-positiver Bakterien unterdrückt. Nach Beimpfung der Medien ist zu beachten, daß viele Anaerobier bei Sauerstoffzufuhr absterben und deshalb die beimpften Nährmedien so schnell

wie möglich in die anaerobe Atmosphäre gelangen müssen. Für die endgültige Identifizierung durch biochemische Reaktionen und auch für die Bestimmung der zelluäre Fettsäuren mittels Gaschromatographie müssen Reinkulturen vorliegen, deren Herstellung viel Zeit in Anspruch nehmen kann. Die Durchführung der biochemischen Reaktionen ist aufwendig; sie wird durch den Einsatz industriell gefertigter Testkits (Minitek®, API 20A) vereinfacht. Gensondentechnik und PCR sind bisher noch nicht für die Routinediagnostik einsetzbar. Die Testung der Antibiotikaempfindlichkeit von Anaerobiern ist im Agardiffusionstest nicht möglich. Es müßte die MHK bestimmt werden, wofür die technisch aufwendigeren Dilutionstechniken (Agardilutionstest, Bouillondilutionstest) einzusetzen wären. Ob sich dafür auch der in letzter Zeit eingeführte E-Test bewähren wird, kann noch nicht abschließend beurteilt werden. Eine routinemäßige Testung ist nicht in allen Fällen erforderlich, sie muß aber bei schweren Verläufen, bei Therapieversagern, bei Nachweis der Anaerobier aus sterilen Körperbereichen und bei langfristiger Therapie angestrebt werden. Damit empirische Therapieempfehlungen gegeben werden können, müssen von Zeit zu Zeit größere Stammkollektive getestet werden.

4.15.6 Therapie und Prophylaxe Da es sich bei den Infektionen mit den anaeroben gram-negativen Stäbchen um abszedierende, gewebszerstörende Mischinfektionen handelt, stehen in den meisten Fällen chirurgische Maßnahmen - Abszeßdrainage, Abtragung von nekrotischem Gewebe - an erster Stelle der therapeutischen Maßnahmen. Außerdem ist die Gabe von Antibiotika erforderlich, die zumindest zu Beginn der Therapie immer empirisch erfolgen muß. Aufgrund obengenannter Studien zur Anaerobierwirksamkeit von Antibiotika ist bekannt, daß Metronidazol zu 100% gegen alle gram-negativen aneroben Stäbchen wirkt. Penicilline in Kombination mit E-Laktamase-Inhibitoren haben ebenfalls eine gute Wirkung (Amoxicillin plus Clavulansäure gegen 90%, Piperacillin plus Tazobactam gegen 100%der Stämme), die Carbapeneme (Imipenem, Meropenem) wirken gegen 99% und Clindamycin gegen 92% der Stämme. Diese Angaben beziehen sich auf die

4.16 Gram-negative, fakultativ anaerobe bzw. mikroaerophile Bakterien

resistentcren anaeroben gram-negativen Stäbchen der Bacteroides fragilis-Gruppe, deren wichtigster Resistenzmechanismus die E-Laktamase-Bildung ist. Die übrigen Arten sind meist sogar empfindlich für Penicillin G. Bei den Überlegungen zur Therapie ist in Betracht zu ziehen, daß manche Antibiotika überhaupt keine Wirkung gegen die anaeroben gram-negativen Stäbchen haben, so daß ihre Gabe sogar zur Selektionierung dieser Bakteriengruppe führen kann. Hierzu gehören insbesondere die Aminoglykoside, aber auch die bis jetzt verfügbaren Gyrasehemmer und einige Cephatosporine.

Primäre Prophylaxe ist die Vermeidung des Eindringens der Anaerobier von den besiedelten Körpcrbcrcichen ins Gewebe. Sekundär ist die Blockierung ihrer Vermehrung durch Aufrechterhaltung eines hohen Redoxpotentials erforderlich, wofür die wichtigsten die Förderung der Durchblutung und gute Operationstechniken sind. Literatur DUKKDFN. B. I., and B. S. DRASAR: Anaerobes in Human Disease; E. Arnold. London 1991 FINEGOLD, S. M, and W. L. GHORGH: Anaerobic Infections in Humans. Academic Press, San Diego, New York 1989 LORBER, B.: Bacteroides, Prevotella and Fusobacterium species (and other medically important anaerobic gram-negative bacilli). in: MANDELL. DOUGLAS and BENNETT's. Principles and Practice of Infectious Diseases. 4th ed., Churchill Livingstone. New York 1995 WADSWORTII Anaerobic Bacteriology Manual 5lh ed. Star Publishing Company, Belmont CA 1993 WERNER, H.: Klinische Anaerobier-Bakteriologie. Thieme, Stuttgart. New York 1982

4.16 Gram-negative, fakultativ anaerobe bzw. mikroaerophile Bakterien (HACEK-Gruppe) GERHARD PULVERER In der HACEK-Gruppe faßt man folgende Bakterienarten zusammen: H — Haemophilus, A = Actinobacillus, C = Cardiobacterium, E = Eikenella, K = Kingella. Die laxonomischc Zuordnung dieser Bakterienarten,

die ausnahmslos zur normalen Körperflora von Mensch und auch Tieren gehören, ist noch nicht abgeschlossen. So wird z.B. Actinobacillus actinomyceiemcomitans auch als separate Gruppe mit der Bezeichnung Haemophilus actinomycetemcomitans angesehen. Im folgenden werden jedoch weiterhin die bislang gebräuchlichen Namen beibehalten.

4.16.1 Actinobacillus (Haemophilus) actinomycetemcomitans Nur A. actinomycetemcomitans kommt als Kommensale beim Menschen vor und hat hier auch zweifelsohne klinische Bedeutung. Die übrigen Actinobacillus-Arten sind nur bei Tieren zu finden, sie werden daher im folgenden nicht weiter besprochen. Eigenschaften und Laboratoriumsdiagnose

Es handelt sich hier um gram-negative, nicht versporende. unbewegliche, sehr zarte Stäbchen, die als mikroaerophil anzusprechen sind. Die Anzüchtung von A. actinomycetemcomitans ist nicht schwierig, CO2 übt auch hier einen wachstumsstimulierenden Effekt aus. Die Verdachtsdiagnose kann aufgrund der charakteristischen Kolonie-Morphologie gestellt werden, da auf festen, durchsichtigen Nährmedien die typischen gewölbten, glatten Kolonien mit irregulärem gezacktem Rand und Schollenbildung erscheinen. Im Zentrum tritt eine typische stern- oder zigarrenförmige Struktur auf.

Eine Enddifferenzierung ist leicht möglich mit Hilfe verschiedener biochemischer und serologischer Tests. Einige biologische Aktivitäten dieser Bakterienart sind als Pathogenitätsfaktoren anzusprechen: Hämolysin, Fibrinolysin, Plasmakoagulase, Depolymeridase, Kollagenase, Endotoxin, Leukotoxin, immunsuppresiver Faktor. Humanmedizinische Bedeutung

Diese Bakterienart zählt zur normalen Mundflora des Menschen, sie ist aber nicht immer nachweisbar. Wie der Name andeutet, kommt A. actinomycetemcomitans häufig (in etwa einem Viertel der Fälle) zusammen mit Actinomyces israelii in Aktinomykosen des Menschen vor, dies besonders bei schwerem und chronischem Verlauf mit Drusennachweis. Nur selten kann

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Spezielle Bakteriologie

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diese Bakterienart auch als alleiniger Erreger einer Endokarditis u.a. nachgewiesen werden. Eine ursächliche Beteiligung an der Periodontitis-Ätiologie wird diskutiert. Worauf dieses enge Symbiose-Verhältnis zwischen Aktinomyzeten und A. actinomycetemcomitans beruht, ist unbekannt. Praktisch wichtig ist die Feststellung, daß A. actinomycetemcomitans per se wohl keine Aktinomykose auslösen kann. Diese Bakterienart ist jedoch in der Lage, diesen spezifischen Prozeß weiter zu unterhalten, wenn der ursächliche Erreger A. israelii z.B. mit Hilfe einer Penicillin-Therapie eliminiert wurde (A. actinomycetemcomitans ist resistent gegen Benzylpenicillin).

4.16.3 Haemophilus aphrophilus Diese mikroaerophile Bakterienart (zarte gram-negative Stäbchen) ist in der physiologischen Mundrachenflora des Menschen anzutreffen und kann leicht mit A. actinomycetemcomitans verwechselt werden. H. aphrophilus ist offensichtlich wenig virulent und kann gelegentlich aus aerob/anaeroben Mischinfektionsprozessen angezüchtet werden. In seltenen Fällen ist diese Spezies auch als ursächlicher Erreger einer Endokarditis nachzuweisen.

4.16.4 Cardiobacterium hominis Diese zarten gram-negativen Stäbchenbakterien sind mikroaerophil und gehören ebenfalls zur normalen Mund-/Rachenflora des Menschen. Wie der Name es schon ausdrückt, kann C. hominis Endokarditiden verursachen, seine Antibiotikaempfindlichkeit ist gut.

Therapie Die neueren Breitspektrum-Penicillin- und Cephalosporinpräparate sowie Nitroimidazole wirken für gewöhnlich gut gegen A. actinomycetemcomitans, mit einzelnen resistenten Stämmen muß jedoch gerechnet werden. Chloramphenicol und die Tetrazykline zeigen eine gute Wirksamkeit. Clindamycin und die Aminoglykoside sind, wenn überhaupt, nur mäßig effektiv. 4.16.2 Eikenella corrodens E. corrodens wird als einzige Art des Genus Eikenella aufgeführt. Es handelt sich um zarte, gram-negative Kurzstäbchen, die unbeweglich und fakultativ anaerob sind und auf der Oberfläche fester Nährböden in sehr charakteristischen Kolonien wachsen (die Kolonien sind flach, erscheinen ausgelaufen und oft in den Nährboden eingesunken). E. corrodens kann auf den üblichen bluthaltigen Nährmedien gut angezüchtet werden, verhält sich oxidase-positiv, katalase-negativ und ist nicht in der Lage, Säure aus Glukose oder anderen Zuckern zu bilden. Die fehlende Harnstoffspaltung erleichtert eine Abgrenzung zur im Wachstum ähnlichen anacroben Bakterienart Bacteroides urealyticus. Die optimale Wachstumstemperatur liegt bei 37 °C. E. corrodens ist normaler Kommensale der Mund- und Darmflora des Menschen, kann aber auch häufig in den verschiedensten Krankheitsprozessen nachgewiesen werden. Meist ist er dort in Mischinfektion mit anderen Aerobiern oder Anaerobiern anzutreffen, es sind aber auch Monoinfektionen mit E. corrodens beschrieben worden. Es besteht kein Zweifel daran, daß E. corrodens ein fakultativ palhogener Mikroorganismus ist. Sein Nachweis in Krankheitsprozessen sollte daher entsprechend beachtet werden. E.corrodens ist empfindlich für Benzylpenicillin, Ampicülin, Cefoxitin, Chloramphcnicol und Tetrazykline, resistent gegen Clindamycin und Metronidazol. Die Aminoglykoside sind ebenfalls zumeist unwirksam.

4.16.5 Kingella Diese früher zu den Moraxellen gerechneten gram-negativen Kurzstäbchen sind Bewohner der Schleimhäute der oberen Luftwege des Menschen, ihre pathogene Bedeutung ist gering. Kingella kingae ist am bekanntesten.

4.16.6 Capnocytophaga Es handelt sich hier um eine ebenfalls beim Menschen als Kommensale vorkommende Bakterienart mit Ähnlichkeiten zu Eikenella, Actinobacillus, Gardnerella und Haemophilus. Diese mikroskopisch als gramnegative fusiforme Stäbchen erscheinenden Bakterien wachsen aerob nur bei Anwesenheit von 5% CO2. Auch Capnocytophaga kann verschiedentlich in aeroben/anaeroben Mischinfektionen angetroffen werden und wird daher auch als fakultativ pathogener Erreger diskutiert. Von den verschiedenen CapnocylophagenArten sei lediglich C. ochracea erwähnt.

4.17 Die Gattung Corynebacterium, Diphtherie HEIDI SCHÜTT-GEROWITT, JOSEF BEUTH

Corynebaklerien sind gram-positive Stäbchen, die diesen Gattungsnamen aufgrund ihrer keulenförmigen Struktur erhielten. In der normalen Haut- und Schleimhautflora des Menschen kommen zahlreiche apathogene Arten vor. Toxinbildende Stämme von Corynebacterium diphtheriae sind die Erreger der meldepflichtigen, epidemisch auftretenden Diphtherie. Die übrigen Corynebakterien spielen heute - wie andere Normalflorabakterien - bei immunsupprimierten Patienten als Erreger eine Rolle.

383

4.17 Die Gattung Corynebacterium, Diphtherie

Geschichte Die Diphtherie ist schon seit dem Altertum bekannt. Sie tritt in Intervallen von 25-100 Jahren epidemisch auf. Im 20. Jahrhundert nahmen - vor allem bedingt durch die Impfung - die Fallzahlen in den industrialisierten Ländern kontinuierlich ab. Ende der 80er Jahre begann eine Epidemie in den GUS-Staaten, die auf die durch die Umstrukturierung entstandenen Impflücken zurückgeführt wird, seit 1996 sind die Zahlen wieder rückläufig. In Deutschland gab es die letzten Kleinepidemien 1975/76, z. Zt. kommen nur sporadische, eingeschleppte Fälle vor. Wegen des schlechten Impfstatus der Bevölkerung durch fehlende Auffrischungsimpfungen wäre aber eine epidemische Ausbreitung auch bei uns jederzeit möglich. Als spezifischer Erreger wurde 1884 C. diphtheriae von FRIEDRICH LOF.FFI.F.R entdeckt. Er konnte auch zeigen, daß es gesunde Keimträger gibt und vermutete aufgrund der Tatsache, daß der Erreger nicht invasiv ist, ein toxisches Geschehen. Das Toxin wurde 1888 von Roux und YERSIN im Tierversuch nachgewiesen. 1890 konnte EMIL VON BEHRING Versuchstiere durch ein Antiserum gegen die Toxinwirkung schützen und bereits 1894 wurde das Antiserum vom Pferd zur Therapie beim Menschen eingesetzt; die Letalität wurde dadurch von 50 % auf 25 % gesenkt.

Abb. 4.35 C. diphtheriae. NEISSER-Färbung, (gelbbraune) Stäbchen mit zahlreichen (schwarz-blauen) Polkörperchen (metachronmatische Granula). Abb.-Maßstab 1:1000.

gefärbte Stäbchen mit regelmäßig an den Enden sichtbaren schwarz-blauen Polkörnchen (Abb. 4.35). Die Zellwand der Corynebakterien enthält Diaminopimelinsäure und kurzkettige Mykolsäuren, was ihre Verwandschaft mit den Nokardien und den Mykobakterien betont. Der Stoffwechsel der Corynebakterien ist fakultativ anaerob. Sie wachsen auf Blutagar in Form von kleinen grauen Kolonien mit matter Oberfläche und besitzen das Enzym Katalase. Bezüglich der zur Gattung Corynebacterium gerechneten Arten gibt es immer wieder Umgruppierungen und Neudefinitionen. Die definierten Arten werden mittels biochemischer Reaktionen (Harnstoffspaltung, Abbau von Zystin, Zuckervergärung, Nitratreduktase) bestimmt (Tab. 4.33, Abb. 4.36, s. Farbtafel). Bei C. diphtheriae

4.17.1 Corynebacterium diphteriae Eigenschaften und Taxonomie

Corynebakterien sind keulenförmige gram-positive Stäbchen, 3-5 um lang, sporenlos, unbekapselt und unbeweglich. In der Spezialfärbung nach NEISSER lassen sich Polkörnchen darstellen, bei denen es sich um Polyphosphate handelt, die in das Zytoplasma eingelagert sind. C. diphtheriae erscheinen in dieser Färbung als V- oder Y-förmig gelagerte, schlanke, gelb

Tab. 4.33 Biochemische Abgrenzung von Corynebacterium diphtheriae Abbau von Harnstoff (Urease)

Cystin (H2S)

Vergärung von Glukose (ohne Gasbildung)

Saccharose

C. diphtheriae

_

+

+

_U

C. ulcerans C, jeikeium

+ -

+ -

+ +

-

Corynebacterium D2

+

-

-

-

C. pseudodiphtheriticum

+

-

-

C. xerosis

-

-

+

r> 21

Selten positiv Selten negativ. Werden dann als C. diphtheriae, Typ belfanti bezeichnet.

Reduktion von Nitrat +2)

+ +

+

Spezielle Bakteriologie

384

muß die Toxinbildung nachgewiesen werden. Aufgrund von Koloniemorphologie, Zuckerfermentation und Hämolyseverhalten werden bei C. diphtheriae die Typen gravis, intermedius und mitis unterschieden. Eine Korrelation des Typs mit der Schwere des Krankheitsbildes wird heute nicht mehr angenommen und auch für epidemiologische Fragestellungen, für die man die Typeneinteilung heranzog, werden heute andere Methoden eingesetzt. C. diphtheriae ist relativ resistent gegen Umwelteinflüsse; es kann sich daher einige Zeit an trockenen Gegenständen halten, was für die Erregerübertragung von Bedeutung ist. Durch Erhitzen und Desinfektionsmittel wird es jedoch rasch abgetötet. Pathogenese C. diphtheriae ist nicht invasiv. Seine Pathogenität beruht auf dem Diphtherie-Toxin, einem Exotoxin. Es ist der alleinige Virulenzfaktor dieser Bakterien. C. diphtheriae-Stämme, die kein Toxin bilden, sind apathogen.

Die genetische Information für die Toxinbildung liegt auf dem Genom eines Bakteriophagcn, der sich in die DNA der Wirtszelle integriert. Somit haben nur lysogenc Stämme die Fähigkeit zur Toxinbildung und können sie bei Verlust des Phagen verlieren. Atoxische Stämme können nach Phagenbefall toxinbildend werden. Das Toxin ist ein Enzym, dessen Untereinheit A in Eukaryotenzcllen den Elongationsfaktor 2 der Proleinsynthese hemmt. Seine Bindung an Zellrezeptoren und Aufnahme in die Körperzellen wird durch die Untereinheit B vermittelt. Durch die Hemmung der Proteinsynthese sowie durch DNA-Fragmentation bewirkt es den Zelltod.

Im Körper des Erkrankten kommt es zu lokalen Symptomen und zu toxischen Fernwirkungen. Das lokale Geschehen besteht in Nekrotisierung, Gefäßdilatation, Ödembildung, Blutungen und Fibrinausscheidung. Die dadurch entstehenden Pscudomembranen enthalten Fibrin, Eeukozyten, Erythrozyten, abgetötete Epithelzellen und Bakterien. Unter den Membranen ist die Submukosa ödematös geschwollen. Durch die toxischen Fernwirkungen ist insbesondere das Herz betroffen (Myokarditis), ferner das Nervensystem (Demyelinisierung) und die Niere (tubuläre Nekrosen). Die tödliche Dosis des Toxins beträgt 0,1 ug/kg Körpergewicht.

Epidemiologie und Klinik

Das Erregerreservoir für C. diphtheriae ist ausschließlich der Mensch. Die Bakterien werden überwiegend durch Tröpfcheninfektion von Erkrankten oder von gesunden Keimträgern übertragen. Selten ist eine Übertragung durch kontaminierte Gegenstände nachgewiesen worden. Nach einer Inkubationszeit von 2-5 Tagen erkranken ca. 20 % der nicht-immunen, infizierten Personen. Die häufigste Manifestation ist die Rachendiphtherie, die mit Tonsillitis bzw. Pharyngitis, schwerem Krankheitsgefühl, aber geringem Fieber beginnt. Bald erscheinen die festsitzenden, weißlichen Pseudomembranen, die beim Abheben bluten. Durch spontane Einblutungen verfärben sich die Membranen bräunlich; dies führte zur Bezeichnung Rachenbräune. Außerdem können Adenopathie, Halsschwellung. Heiserkeit, Stridor und Dyspnoe auftreten. Wenn es zur weiteren lokalen Ausbreitung kommt, können die membranösen Strukturen den Kehlkopf erreichen und verlegen. Diese Manifestationsform, bei der durch die Stenosierung der Erstickungstod droht, wird LarynxDiphtherie genannt. Auf dem Blutweg breitet sich das Toxin im Körper aus und schädigt Nervenzellen, was sich zuerst in einer Lähmung des Gaumensegels äußern kann. Der Patient kann dann nicht mehr richtig schlucken mit der Folge, daß Flüssigkeit aus Nase und Mund wieder herausläuft. Außerdem können Augenmuskellähmungen, Fazialisparese oder andere Nervenlähmungen auftreten; eine periphere Neuritis wird 10 Tage bis 3 Monate nach Krankheitsbeginn beobachtet. Alle neurologischen Symptome sind nach mehr oder weniger langer Zeit reversibel. Die toxische Wirkung auf den Herzmuskel zeigt sich häufig bei der ersten Belastung des Patienten, u.U. kommt es zum plötzlichen Herztod beim Aufstehen. Als weitere toxische Wirkung kann eine Nierenschädigung auftreten, die zu einer vorübergehenden Proteinurie führt. Bei den Diphtheriefällen der letzten Zeit stand die toxische Fernwirkung ganz im Vordergrund, während die Larynxbeteiligung nur selten zum Problem wurde. Die schwerste Form der Diphtherie ist die primär toxisch verlaufende, bei der praktisch keine Rachensymptome, sondern nur die toxischen Fernwirkungen in Form von Myokarditis. Niereninsuffizienz, Haut- und Schleimhautblu-

4.17 Die Gattung Corynebacterium, Diphtherie

tungen auftreten. Bei manchen Patienten kommt es zu einer diffusen riesigen Schwellung des Halsbereiches, die Caesarenhals genannt wird. Die toxischen Wirkungen können sich zwar auch noch längere Zeit nach Krankheitsbeginn zeigen, in der Regel haben sie ihren Höhepunkt aber am 3.-4. Krankheitstag, an denen auch die meisten Todesfälle registriert werden. Eine andere Manifestation der Diphtherie ist die Wunddiphtherie, die vor allem in den Tropen vorkommt und neuerdings auch in den USA in Form von ulzerierenden Prozessen bei Alkoholikern zunehmend beobachtet wird. Die Wunden sind mit schmierigen Belägen bedeckt, es kommt aber zu keiner nennenswerten toxischen Fernwirkung. Patienten mit Wunddiphtherie sind eine wichtige Infektionsquelle auch für die Rachendiphtherie. Die Nasendiphtherie, die mit blutig-seröser Sekretion einhergeht, die Augendiphtherie und die Nabeldiphtherie kamen vor allem bei Säuglingen vor. Es sind heute äußerst seltene Krankheitsbilder. Eine überstandene Diphtherie hinterläßt in der Regel eine langanhaltende Immunität. Differentialdiagnose Differentialdiagnostisch zur Rachendiphtherie kommen andere Erkrankungen des Rachenraumes in Betracht: Ŷ Die infektiöse Mononukleose, bei der sich im Unterschied zur Diphtherie die Membranen nicht über die Tonsillen hinaus ausbreiten, hell bleiben und nicht bluten. Das Blutbild zeigt die typische Monozytenvermehrung. « Die Streptokokkenangina: Sie geht mit starker Rötung des Rachens und hohem Fieber einher, es treten keine Membranen auf. Ŷ Die Angina Plaut-Vincenti, die sich als eine meist einseitige nekrotisierende Angina manifestiert und durch den mikroskopischen Nachweis von Schraubenbakterien und Fusobakterien abgegrenzt werden kann. Ŷ Die Epiglottitis durch Haemophilus: Sie verläuft akuter, die Epiglottis ist hellrot ohne Mcmbranauflagerungen. Ferner sind auch virale Pharyngitiden bzw. Tonsillitiden sowie die Mumpserkrankung differentialdiagnostisch in Betracht zu ziehen. Laboratoriumsdiagnose Ein großes Problem für die Diagnostik der

Diphtherie ist die Tatsache, daß das Krankheitsbild bei uns nicht mehr bekannt ist. Bei entsprechender Symptomatik muß aber die Diphtherie mit in die Überlegungen einbezogen werden, da nur der frühzeitige Therapiebeginn den Patienten retten kann. Der klinische Verdacht ergibt sich aufgrund der Pseudomembranen, aber auch der evtl. vorhandene süßliche Geruch, der von dem Patienten ausgeht, muß den Arzt an Diphtherie denken lassen. Der unten geschilderte Untersuchungsgang nimmt drei bis vier Tage in Anspruch. Die Therapie muß somit allein aufgrund des klinischen Verdachtes begonnen werden. Probenentnahme: Um den Verdacht zu bestätigen, muß sofort ein Abstrich - möglichst unter Anheben der Membranen - entnommen und schnell zum Labor gebracht werden. Nur wenn es sich um einen Verdacht auf Wunddiphtherie handelt, wird direkt von dem Abstrich ein NEISSER-Präparat gemacht. Bei Rachen- und NasenDiphtherie ist ein solches Präparat nicht indiziert, da einerseits in diesen Bereichen apathogene Corynebakterien mit ähnlicher Morphologie vorkommen, andererseits der negative Ausfall keinen Ausschluß der Erkrankung bedeutet. Kultur: Das Abstrichmaterial wird auf Rinderserum-Platten nach LÜEFFLER, dem Cystein und Tellurit enthaltenden TiNSDALE-Agar oder auf CLAUBERG-III-Agar, einem selektiven Medium zur Unterdrückung der Begleitflora, ausgestrichen. Der CLAUBERG-Agar nutzt die Telluritresistenz von C. diphtheriae aus; verdächtig sind die durch Telluriteinlagerung schwarz gefärbten Kolonien, die von einem blauen Hof umgeben sind. Von den auf Blutagar und auf LOEFFLERMedium gewachsenen Kolonien kann direkt ein NEISSER-Präparat gemacht werden, vom CLAUBERG-Agar erst nach Subkultivierung. Wenn schlanke, V- und Y-förmig gelagerte Stäbchen mit regelmäßigen Polkörnchen zu sehen sind, kann der Verdacht auf Diphtherie gemeldet werden. Identifizierung: Die verdächtigen Kolonien werden in Reinkultur isoliert, damit ihre biochemische Identifizierung vorgenommen und der Stamm auf Toxinbildung geprüft werden kann. Der Nachweis der Toxinbildung erfolgt im Präzipitationstest nach ELEK: Mit Diphtherie-Antitoxin getränkte Filterpapierstreifen werden in den Agar eingelegt und der zu prüfende Stamm aufgeimpft. Wenn er Toxin bildet, diffundiert es in den Nährboden und reagiert mit den Antikörpern, was zur Bildung einer weißen Präzipitati-

385

Spezielle Bakteriologie

386

onslinie führt. Eine weitere Möglichkeit ist der Nachweis des Toxin-Gens mitteis PCR. Therapie

Wenn klinische Symptome an Diphtherie denken lassen, muß der Patient als erstes nach seinem Impfstatus befragt werden. Ist dieser unklar oder liegt definitiv keine Auffrischungsimpfung vor, ist die einzige wirksame therapeutische Maßnahme die passive Immunisierung, d.h. die Gabe von Diphtherie-Antitoxin. Es muß so früh wie möglich gegeben werden, da es nur wirkt.solangc das Toxin noch nicht in die Zellen eingedrungen ist. Leider steht bei uns kein menschliches Antiserum zur Verfügung, so daß Serum vom Pferd, in Ausnahmefällen von anderen Tieren, mit der entsprechenden Problematik (Serumkrankheit, Immunisierung gegen das tierische Eiweiß) benutzt werden muß. Je nach Schwere des Krankheitsbildes gibt man 500 bis 2000 1E Antitoxin pro kg Körpergewicht oder mehr. Eine bereits vorliegende Allergisierung gegen das tierische Serum muß vorher durch einen Intrakutantest oder einen Orbitaltest ausgeschlossen werden. Erst an zweiter Stelle steht die Gabe von Antibiotika (Penicillin G oder Erythromycin). Die Antibiotika hemmen die weitere Vermehrung der Bakterien und bewirken ihre Eliminierung, sie können die Wirkung des bereits gebildeten Toxins aber nicht verhindern. Bei der LarynxDiphtherie ist u.U. nur die rechtzeitige Intubation und die operative Entfernung der verlegenden Membranen lebensrettend. Prophylaxe

Die wichtigste Maßnahme zur persönlichen Prophylaxe und zur Vermeidung von Epidemien ist die aktive Immunsierung zum Aufbau einer antitoxischen Immunität. Dies hat die geschilderte Entwicklung in Rußland deutlich gezeigt, und auch bei den Kleinepidemien in Deutschland waren ausschließlich Personen ohne oder mit unzureichendem Impfschutz betroffen. Die aktive Immunisierung wird mit DiphtherieToxoid, dem chemisch veränderten DiphtherieToxin, durchgeführt. Bereits im ersten Lebensjahr muß zur Grundimmunisierung dreimal geimpft werden, dann erfolgen Auffrischungen im zweiten Lebensjahr, im Schuleintrittsalter und weiterhin alle 10 Jahre. Bei lege artis durchgeführter Grundimmunisierung wird, auch wenn

die letzte Impfung länger als 10 Jahre zurückliegt, nur eine Auffrischungsimpfung gegeben (s. Tab. 12.7). Durch die Immunisierung mit dem Töxid wird eine antitoxische Immunität erzeugt, die die Besiedlung mit Diphtheriebakterien und somit das Keimträgertum nicht verhindert. Dennoch ist die Trägerrate unter geimpften Personen viel geringer als bei Ungeimpften. Möglicherweise ist das Toxin ein wichtiger Faktor für die Adhäsion der Bakterien an die Körperzellen. Die Prophylaxe nichtimmuner Kontaktpersonen eines Erkrankten kann mit einer niedrig dosierten Antitoxingabe oder mit Penicillin G durchgeführt werden. Meldepflicht: Nach dem Infektionsschutzgesetz sind Krankheitsverdacht, Erkrankung und Tod an Diphterie sowie der direkte und indirekte Nachweis von toxinbildenden C. diphtheriae mcldepflichtig.

4.17.2 Andere Corynebakterien Wie bereits erwähnt, kommen zahlreiche Corynebakterien in der normalen Körperflora des Menschen vor. Von diesen sind es die Arten C. xerosis, C. pseudodiphtheriticum und insbesondere C. jeikeutm, die bei immunsupprimierten Patienten als Sepsis- oder Endokarditis-Erreger gefunden werden und auch bei Patienten mit kontinuierlicher ambulanter Pcritonealdialyse (CAPD) als Erreger eine Rolle spielen. Wie die Koagulase-negativen Staphylokokken können diese Bakterien Katheter oder andere Plastikmaterialien besiedeln und damit Ausgangspunkt für eine Infektion mit anschließender Sepsis sein. Problematisch ist die hohe Resistenz von C. jeikeium, so daß zur Therapie praktisch nur die Glykopeptidantibiotika Vancomycin bzw. Teicoplanin in Frage kommen. Eine weitere Corynebakterienart, die sogar Diphtherietoxin produzieren kann, ist C. ulcerans. Sie kommt primär bei Pferden und Kühen vor, selten wurde sie beim Menschen als Erreger gefunden. C. minulissimum wurde 1961 als Erreger des Erythrasma erkannt, einer oberflächlichen Hauterkrankung, die vor allem in intertriginösen Bereichen in Form von rötlichen bis bräunlichen, schuppenden Stellen auftritt und Juckreiz hervorruft. Die Diagnose wird zunächst aufgrund der roten Fluoreszenz der befallenen Stellen im WoOD-Licht gestellt, die Anzüchtung des Erregers gelingt nur unter besonderen Bedingungen. Die Identifizierung der Corynebakterien erfolgt biochemisch durch den Nachweis von Urease.

4.18 Die Gattung Erysipelothrix, Rotlauf

Nitratreduktase und der Säurebildung aus Dextrose, Saccharose, Trehalose und ggf. weiteren Zuckern. Literatur CLARRIDOE, J.E., and C. A. SPIEGEL: Corynebactcrium and Misccllaneous Irregulär Gram-positive Rods, Erysipelothrix and Gardnerella, in: MURRAY. P. R.. .1. E. BARON. M. A. PFALLER. F. C. TENOVFR and R. H. YOLKEN (Eds.): Manual of Clinical Microbiology, ASM Press, New York 1995 KRECII, T.: Die Korynebakterien, Diphtherie, in: BRANDIS, H.. H. J. EGOERS, W. KÖHLER und G. PULVERER (Hrsg.) Lehrbuch der Medizinischen Mikrobiologie 7. Aufl., Gustav Fischer Verlag, Stuttgart 1994 NAUMANN, P.. und T. KRECH: Gattung Corynebacterium. In: BURKHARD!. F. (Hrsg.) Mikrobiologische Diagnostik. Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1992 Epidemiologisches Bulletin 6/2001, Robert KochInstitut, Nordufer 20, 13353 Berlin

4.18 Die Gattung Erysipelothrix, Rotlauf JOSEF BEUTH, HEIDI SCHÜTT-GEROWITT

Die Gattung Erysipelothrix enthält als einzige Spezies Erysipelothrix rhusiopathiae, den Erreger des Rotlaufs, der als Erkrankung insbesondere beim Schwein, seltener bei Pferd. Rind, Geflügel und Fisch vorkommt. Bei den Tieren verläuft die Infektion mit E. rhusiopathiae meist lokal mit Hauterscheinungen, zuweilen systemisch als Arthritis, Endokarditis oder Sepsis. Sie geht in der Regel von kontaminiertem Erdboden aus, in dem die Erreger jahrelang überleben können. Auch beim Menschen sind lokale Infektionen mit E. rhusiopathiae als Erysipeloid bekannt, während sich systemische Infektionen als Endokarditis manifestieren können. Die besondere Bedeutung von E. rhusiopathiae ist in der hohen Letalität der Endokarditis durch diesen Erreger begründet.

0,3 x 1,0-1,5 um großes Stäbchen. Seine Kettenund Fadenbildung hat zur Namensbildung: thrix = Faden geführt. Bei aerober, mehrtägiger Bebrütung unter erhöhter CO2-Spannung wächst E. rhusiopathiae auf Blutagar in kleinen, glatten, grauweißen Kolonien mit leichter Vergrünung bzw. als Rauhform in größeren Kolonien mit unregelmäßigem Rand. E. rhusiopathiae zeigt im Hochschichtbcrcich des KLIGLER-Agars eine charakteristische H2S-Bildung und ist katalasenegativ. 4.18.2 Pathogenese und Klinik Über kleine Verletzungen, meist an den Händen, führt der Kontakt mit infizierten Tieren bzw. deren Fleisch zur Infektion, dem Erysipeloid. Nach einer Inkubationszeit von 1-4 lagen tritt an der Eintrittspforte eine juckende, schmerzende Schwellung mit blaurötlicher Verfärbung auf. Allgemeinerscheinungcn und Fieber treten nicht auf, die kulane Manifestation heilt in der Regel nach ca. 2-3 Wochen unter Schuppung ab. Das Erysipeloid kommt insbesondere als Berufskrankheit bei Tierärzten sowie Arbeitern in der fleisclWfischverarbeitenden Industrie vor, sehr selten in der häuslichen Küche im Umgang mit tierischen Produkten. Neben dieser gutartigen Manifestation an der Haut kommt es sehr selten zu systemischer Ausbreitung. Arthritis, Endokarditis und Sepsis mit hohem Fieber sind bekannt und gefürchtet, da die Infektion oft nicht erkannt wird, weil der Erreger als Kontaminationskeim fehlinterpretiert wird. 4.18.3 Laboratoriumsdiagnose Untersuchungsmaterial Biopsiematerial, Gewebeflüssigkeit und bei septischem Erscheinungsbild Blutkulturen sind adäquate Proben. Gewebeflüssigkeit bzw. exzidiertes Gewebe muß unmittelbar in eine Dextrose-haltige Nährbouillon gegeben werden.

4.18.1 Eigenschaften

Mikroskopie

Erysipelothrix rhusiopathiae (griech. rote Haut, Faden) wurde 1882 von LOEFFLER beim Schweinerotlauf entdeckt und wenig später im Jahr 1884 von ROSENBACH als Erysipeloid-Erreger des Menschen erkannt. Es ist ein unbewegliches, schlankes gram-positives, zuweilen gram-labiles.

Im Kulturpräparat findet man von glatten Kolonien schlanke gram-positive/gram-labile Stäbchen bzw. von Rauhformen gram-positive Ketten-/Fadenbildungen. Direktpräparate sind wegen geringer Erregerdichte wenig erfolgversprechend.

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Spezielle Bakteriologie

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Kultur Probenmaterial wird auf Glukose-haltigen Blutagar ausgeimpft und mehrere Tage bei 36 °C und 5-8% CO2-Spannung inkubiert. E. rhusiopathiae wächst in kleinen glatten, grauweißen Kolonien von 0,5 mm Durchmesser mit leichter Hämolyse. Rauhformen bilden größere Kolonien mit unregelmäßigem Rand. Keimidentifikation Der definitive Nachweis von E. rhusiopathiae wird geführt durch: & biochemische Merkmale in der bunten Reihe (insbesondere Glukose/Saccharose-Metabolismus), il fehlende Katalaseaktivität, H2S-Bildung (Leitreaktion). 4.18.4 Therapie Das Antibiotikum der Wahl bei der kutanen und arthritischen Form der Erkrankung ist Penicillin G, die optimale Dosis beträgt 3-4 Mega E/Tag. Endokarditis und Sepsis durch E. rhusiopathiae werden hochdosiert mit 30 Mega E/Tag Penicillin G und langfristig therapiert. Bei Penicillinallergie sind Cephalosporine, Erythromycin oder Clindamycin angezeigt, gegen Vancomycin ist E. rhusiopathiae resistent. Literatur B ILLE , J.. and M. P. D OYLE : Listeria and Erysipelothrix. In: BALI.OWS. A.. W. J. HALSLEV. K. L. HERRMANN , H. D. I SENBERG and H. J. SHADOMY (Eds.): Manual of Clinical Microhiology, 5lh ed.. Amercian Society for Microbiology, Washington, DC. 1991,287-295. GORBY, G. L., and J. E. PEACOCK: Erysipelothrix rhusiopathiae endocarditis: microbiologic, epidemiologic and clinical features of an occupational disease. Rev. Inf. Dis. 10 (1988) 317-325.

4.19 Die Gattung Listeria, Listeriose ]OSEF BEUTH, HEIDI SCHÜTT-GEROWITT

Die Gattung Listeria, benannt nach Lord JOSEPH LISTER, dem britischen Chirurgen und Entdecker der Antisepsis, wird derzeit keiner Familie definitiv zugeordnet. DNA-Analysen und

biochemische Merkmale deuten auf fünf Genomgruppen hin. Humanpathogene Arten sind Listeria monocytogenes und L. ivanovii. 4.19.1 Eigenschaften Listericn sind gram-positive, kokkoide, sporenlose. 0.4-0,5x0,5-2 um große Stäbchen mit abgerundeten Enden, die bei Bebrütung im Temperaturbereich von 20-30 °C durch taumelnde, rotierende Beweglichkeit erkennbar sind. Die charakteristische Beweglichkeit ist bei höheren Bebrütungstemperaturen nicht mehr gegeben, da keine Geißeln ausgebildet werden. Auf Schafblutagar wachsen Listerien als kleine grauweiße Kolonien mit schwachem (L. monocytogenes) bzw. deutlichem (L. ivanovii) ß-Hämolysehof, hervorgerufen durch Listeriolysin O, das eine dem Streptolysin O nahezu identische Struktur aufweist. R-Formen manifestieren sich morphologisch als rauhe Kolonien mit unregelmäßigen Rändern, mikroskopisch als längere Stäbchen bzw. Fäden und kulturell durch angedeutete Hämolyse. 4.19.2 Pathogenese Pathogene Listerien werden in Wirtszellcn internalisiert Ŷ nach Phagozytose durch Monozyten, Makrophagen, Granulozyten; Ŷ durch Invasion in alle Körperzellen. Sie werden zunächst in eine Vakuole eingeschlossen, deren Membran nach Freisetzung von Listeriolysin O und begleitender pH-Wert-Senkung perforiert wird, so daß die Bakterien in das Zytoplasma der Zelle eingeschleust werden, wo sie sich vermehren können. Listerien gehören zur Gruppe der fakultativ intrazellulären Erreger, wie u.a. auch Salmonellen, Yersinien, Mykobakterien, Legionellen. Intrazelluläre Listerien werden u.a. über Proteinfilamente von Zelle zu Zelle weitergegeben oder zerstören sie. Die weitere Verbreitung im Organismus mit nachfolgender systemischer Erkrankung erfolgt innerhalb von Phagozyten/Monozyten oder auch extrazellulär mit der Blutzirkulation. L. monocytogenes kann nach Phagozytose in Monozyten persistieren, proliferieren und eine Monozytose mit begleitender Immunreaktion hervorrufen. Die monozytogene Wirkung der Infektion mit L. monocytogenes wurde initial tierexperimentell beobachtet und hat zur Na-

4.19 Die Gattung Listeria, Listeriose

mensgebung des Erregers geführt. Die Rolle von Toxinen für die Pathogencsc ist bislang nicht vollständig geklärt und bedarf weiterer Forschungsaklivitäten. Zur definitiven Eliminicrung intraphagozytärer Listerien ist eine T-Zellen-vermittclte Immunreaktion notwendig. Unter dem Einfluß von T-Lymphozyten entsteht ein Granulom, ähnlich dem Tuberkulom bei der Abwehr von Mykobakterien, mit ortsständigen Makrophagen, die durch definierte Zytokine stimuliert werden und antibakterielle Aktivität entfalten. Experimentelle murine (in Mäusen/Ratten) Modelle deuten auf eine bislang nicht vermutete Bedeutung von polymorphkernigen Leukozyten (Granulozyten) bei der Überwindung von L. monocytogenes-lnfeküonen hin. Der definitive Nachweis, daß funktionsfähige Granulozyten den Krankhcitsverlauf einer Listeriose beeinflussen, steht allerdings noch aus.

4.19.3 Klinik Die Listeriose ist bei immunkompetenten Erwachsenen selten und äußert sich in der Regel als selbstlimitierende, grippeähnliche Symptomatik. Voraussetzung für manifeste Erkrankungen durch L. monocytogenes sind immunsuppressive Zustände, u.a. therapeutisch induziert im Gefolge von Transplantationen, Autoimmunund malignen Erkrankungen. Virus-Infektionen sowie altersbedingt. L. monocytogenes verursacht bei immunkompromitlierten Patienten akute lebensbedrohliche Erkrankungen, u.a. Meningitis, Sepsis, Endokarditis und Konjunktivitis. Von besonderer Bedeutung sind L. monocytogenes-lnfektionen während der Gravidität mit diaplazentarer Übertragung und kaum erkennbarer, grippeähnlicher Symptomatik bei der Schwangeren. Wenn es nicht zum intrauterinen Fruchttod kommt, manifestiert sich die Neugeborenenlisteriose u.a. als Meningitis, Sepsis sowie mit entzündlichen Organveränderungen in Lunge, Hirn, Milz und Leber.

Auch unmittelbar konnatale Infektionen sind bekannt und verlaufen meist unter dem Krankheitsbild einer fulminanten Sepsis, Meningitis oder Pneumonie. Wegen der akuten Vcrlaufsform von L. monocytogenes Infektionen während der Schwangerschaft und bei Neugeborenen ist eine frühzeitige adäquate Therapie obligat.

4.19.4 Laboratoriumsdiagnose Untersuchungsmaterial: In Abhängigkeit von der Krankheitssymptomatik wird Blut, Liquor, Stuhl, Mekonium, Amnionflüssigkeit, Lochialsekret oder Sektionsmaterial mikrobiologisch untersucht. Die Proben sollten unverzüglich gekühlt in einem adäquaten Transportmedium zur Diagnostik gelangen. Serologische Untersuchungen haben sich nicht bewährt. Mikroskopie: Im Originalpräparat von Blut, Liquor, Amnionflüssigkeit sieht man extra- und intrazelluläre, gram-positive, kokkoide, an den Enden abgerundete Stäbchen. In Mischfloraproben wie Stuhl oder Lochialsekret können grampositive, kokkoide Stäbchen diagnostisch auf /.. monocytogenes hinweisen. Kultur: Die kulturelle Anzüchtung von Listerien gelingt auf/in wenig anspruchsvollen konventionellen Kulturmedien, z. B. Tryptosebouillon/ -agar. optimal bei pH Werten um 7,6, einer Temperatur von 36 °C, unter erhöhter CO; Spannung, optimal unter Zusatz von 5% Schafblut. Die Eigenschaft, sich bei 4°C vermehren zu können, kann zur Anreicherung von Listerien aus kontaminierten Untersuchungsmaterialien ausgenutzt werden. Selektivmedien zur Anzüchtung von L. monocytogenes aus bakterienhaltigem Material, z.B. Stuhl, Lochialsekret, sollten u.a. Nalidixinsäure-Trypaflavin. Acriflavin oder Cephalosporin enthalten. Keimidentifikation: Der definitive Nachweis von L. monocytogenes bzw. anderen Listericnarten aus Kulturmaterial wird geführt durch Analyse/Nachweis (s. Tab. 4.34) 8 biochemischer Merkmale, u.a. Kohlenhydratund Äskulinspaltung der Katalaseaktivität Ŷ der Beweglichkeit im hängenden Tropfen, nach 8-stündigcr Bebrütung bei Zimmertemperatur in Nährmedium; im Tryptoschochschichtagar, Wachstum nach 2-tägiger Inkubation, 30-36°C Ŷ im CAMP-Test charakteristische Hämolyse in der Nähe des Staphylokokken-Impfstriches durch L. monocytogenes, L. seeligeri; fehlende Hämolyse durch L. Ivanova, L. innocua, L. welshimeri Ŷ definierter Serovare mittels Objektträgeragglutination isolierter L. monocytogenes Stämme durch Immunsera. Beim Menschen werden meist die Serovare l/2a oder 4b gefunden.

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390

Spezielle Bakteriologie

L. monocytogenes

L. ivanovii

Beweglichkeit (20-25 °C)

+

+

Katalase 1 ß-Hämolyse CAMP-Test (S. aureus) Hippurat-Hydrolyse Metabolisierung Mannitol L-Rhamnose D-Xylose Stärke a-Methyl-D-Mannosid Mauspathogenität

+

+

1

auf Schafblutagar

2

große/multiple Hämolysezone(n) 3 wenige nichthämolysierende Stämme 4 Serovar 5 negativ 5 Serovar 5 positiv

+

+2 -

+

+

+4

-

_5

Tab. 4.34 Speziesdifferenzierung der Gattung Listeria

+ +

-

+

+ Symbole

+ > 90 % der Stämme positiv - > 90 % der Stämme negativ

4.19.5 Therapie Listerien sind bisher u.a. empfindlich für Aminopenicillin, Chloramphenicol, Aminoglykoside und Tetracycline. Zur Behandlung wird insbesondere die Kombination von Ampicillin mit einem Aminoglykosid empfohlen, bei Penicillinallergie sind Chloramphenicol oder Tetracycline angezeigt. Da L. monocytogenes-InfckUonen in der Regel akut und fulminant verlaufen, kann nur durch einen möglichst frühzeitigen Behandlungsbeginn die Prognose signifikant verbessert werden.

4.19.6 Epidemiologie und Prophylaxe Listerien verfügen über eine relativ große Widerstandsfähigkeit. Sie werden beispielsweise durch eine bei 70 °C durchgeführte Pasteurisierung der Milch nicht sicher abgetötet und sind in der Lage, sich auch bei Kühlschranktemperaturen noch zu vermehren. Neben di