Pharmakognosie - Phytopharmazie 8. Auflage

R. Hänsel x O. Sticher Pharmakognosie – Phytopharmazie

R. Hänsel xO. Sticher (Hrsg.)

Pharmakognosie – Phytopharmazie Mitbegründet von E. Steinegger

8., überarbeitete und aktualisierte Auflage Mit 743 Abbildungen und 191 Tabellen

123

Professor Dr. Rudolf Hänsel Früher: Institut für Pharmakognosie und Phytochemie der Freien Universität Berlin Jetzt privat: Westpreußenstraße 71, D-81927 München Professor Dr. Dr. h.c. Otto Sticher Früher: ETH Zürich, Institut für Pharmazeutische Wissenschaften Jetzt privat: Lebernhöhe 22, CH-8123 Ebmatingen

Umschlag: Das Umschlagbild zeigt Taxus baccata L. Mit freundlicher Genehmigung Prof. Dr. Wilhelm Barthlott, Friedrich-Wilhelm-Universität Bonn, Botanisches Institut, Meckenheimer Allee 170, 53115 Bonn

ISBN-10 3-540-26508-2 ISBN-13 978-3-540-26508-5 8. Auflage Springer Medizin Verlag Heidelberg Bibliografische Information der Deutschen Bibliothek Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet unter http://dnb.ddb.de abrufbar Dieses Werk ist urheberrechtlich geschützt. Die dadurch begründeten Rechte, insbesondere die der Übersetzung, des Nachdrucks, des Vortrags, der Entnahme von Abbildungen und Tabellen, der Funksendung, der Mikrover filmung oder der Vervielfältigung auf anderen Wegen und der Speicherung in Datenverarbeitungsanlagen, bleiben, auch bei nur auszugsweiser Verwertung, vorbehalten. Eine Vervielfältigung dieses Werkes oder von Teilen dieses Werkes ist auch im Einzelfall nur in den Grenzen der gesetzlichen Bestimmungen des Urheberrechtsgesetzes der Bundesrepublik Deutschland vom 9. September 1965 in der jeweils geltenden Fassung zulässig. Sie ist grundsätzlich vergütungspflichtig. Zuwiderhandlungen unterliegen den Strafbestimmungen des Urheberrechtsgesetzes. Springer Medizin Verlag Ein Unternehmen von Springer Science+Business Media springer.de © Springer Medizin Verlag Heidelberg 2007 Printed in Germany Die Wiedergabe von Gebrauchsnamen, Warenbezeichnungen usw. in diesem Werk berechtigt auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, dass solche Namen im Sinne der Warenzeichen- und Markenschutzgesetzgebung als frei zu betrachten waren und daher von jedermann benutzt werden durften. Produkthaftung: Für Angaben über Dosierungsanweisungen und Applikationsformen kann vom Verlag keine Gewahr übernommen werden. Derartige Angaben müssen vom Anwender im Einzelfall anhand anderer Literaturstellen auf ihre Richtigkeit überprüft werden. Planung: Dr. Rolf Lange und Dr. Thomas Mager, Heidelberg Redaktion: Susanne Friedrichsen und Christine Lodge, Heidelberg Umschlaggestaltung: deblik Berlin Satz: Fotosatz-Service Köhler GmbH, Würzburg Druck und Bindearbeiten: Stürtz GmbH, Würzburg Gedruckt auf säurefreiem Papier

SPIN: 10971277

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Vorwort zur achten Auflage Das Werk „Pharmakognosie – Phytopharmazie“ vermittelt die wissenschatlichen Grundlagen für eine Spezialitätenkunde der Arzneimittel biogener Herkunt, insbesondere für die Phytopharmaka. Es handelt sich um ein multidisziplinäres Werk basierend auf Teilgebieten der Biologie, bioorganischen Chemie, Biochemie und Pharmakologie. Das Buch hält an dem Ziel fest, die küntigen Apotheker und Apothekerinnen zu kompetenten Fachpersonen auf dem Gebiet der Phytopharmaka auszubilden. Schwerpunkte der Stofauswahl sind folglich Phytochemie und Phytopharmakologie. Die achte Aulage hat ein vollständig neues Konzept. Neben den schon bisher für das Fachgebiet wichtigen phytochemischen Grundlagen (Kapitel 1–4) und der Einzeldarstellung wichtiger Stofgruppen (Kapitel 18–27) enthält das Buch eine ganze Reihe von Kapiteln zu pharmazeutischen Aspekten (Kapitel 5–11) sowie zu Problemen der Anwendung planzlicher Arzneimittel (Kapitel 12–17). Teile des früheren Kapitels 9 (7. Aulage) sind dabei zu eigenen Kapiteln erweitert worden. Im Weiteren hat das Buch ein neues Layout sowie ein größeres Format erhalten. Dabei sind besonders erwähnenswert ein zweispaltiger Druck, ferner Einleitungen zu den einzelnen Kapiteln, Infoboxen, Kernaussagen und Schlüsselbegrife. Die neue Darstellung bringt dem Leser zusätzliche Informationen und Erklärungen sowie eine bedeutend bessere Übersicht über die behandelten Teilgebiete der Pharmazeutischen Biologie. Die folgenden neuen Kapitel seien hervorgehoben: x Prinzipien des Sekundärstofwechsels; x Einführung in die Analytik sekundärer Planzenstofe; x Grundzüge der Biosynthese sekundärer Planzenstofe; x Biologische und chemische Screening-Methoden für Planzenextrakte; x Moderne Bioassay-Methoden; x Das medizinische Potential von Planzenstofen; x Glykosaminoglykane einschl. Heparin; x Abnorme Pharmakawirkungen durch genetische Ursachen;

x Überempindlichkeitsreaktionen beim Umgang mit x x x x

Drogen und bei der Anwendung planzlicher Arzneimittel; Plazebos und Plazebowirkungen; Sekundäre Planzenstofe in Nahrungsergänzungsmitteln; Drogen der traditionellen chinesischen Medizin (TCM); Aromatherapie.

Auf dem Gebiet der phytochemischen Analytik, insbesondere auf dem Gebiet der chromatographischen Methoden, haben sich Apotheker und Pharmakognosten – erinnert sei an Egon Stahl (1924–1986) – international proiliert. In der pharmazeutischen Industrie ist der/die Pharmazeut/in seit jeher als Analytiker/in gefragt. Aber auch in der Oizin sind die pharmazeutischen Qualitätsdaten für eine kompetente Beratung unerlässlich. Der Analytik wurde daher ein großes Gewicht eingeräumt. Neben der Behandlung allgemeiner Fragen der pharmazeutischen Qualität – von der Droge über die Extraktherstellung bis zum Fertigarzneimittel (Kapitel 8–10) – werden in Kapitel 2 eine Einführung in die Analytik sekundärer Planzenstofe anhand ausgewählter Beispiele und in Kapitel 5 Screening-Methoden zur Suche neuer bioaktiver Naturstofe beschrieben. Daneben werden innerhalb der einzelnen Arzneidrogenkapitel in bisheriger bewährter Weise die wichtigsten analytischen Methoden der Prüfung auf Identität, Reinheit und der Gehaltsbestimmung behandelt (nachgeführt bis einschließlich Nachtrag 5.5 der PhEur). Für die Beratungskompetenz des Apothekers und der Apothekerin sind die Kenntnisse über Anwendung und therapeutischen Nutzen planzlicher Arzneimittel von besonderer Bedeutung. Vielfach handelt es sich bei den beschriebenen Arzneidrogen um Arzneistofe, zu denen die Lehrbücher der Pharmakologie und der herapie keine Auskünte geben, sodass sich Apotheker und Apothekerinnen sowie an der Phytotherapie interessierte Ärzte und Ärztinnen, auf wissenschatlich nicht immer verlässliche Informationsquellen stützen müssen. Das vorliegende

VI

Vorwort zur achten Auflage

Buch schließt hier eine Lücke und bringt nicht nur bei den Drogeneinzelbesprechungen pharmakologische Informationen sondern geht auch in weiteren Kapiteln aus rational-naturwissenschatlicher Sicht den Problemkreis der Wirkung komplementärer herapien wie der Phytound Aromatherapie sowie der TCM an. Der/die ungeübte Student/in dürte von den klinischen Studien und den experimentell-pharmakologischen Untersuchungsergebnissen, die zu Arzneidrogen vorliegen, beeindruckt sein, sich aber vermutlich fragen, weshalb die Phytopharmaka trotz so viel Wissenschat nur partiell Teil des Arzneischatzes der naturwissenschatlich-orientierten Medizin sind. Das Nachdenken über diese Nichtakzeptanz wissenschatlicher Ergebnisse kann dem Benutzer des Lehrbuches vielleicht zu einer fundamentalen Erkenntnis verhelfen: Nicht das Experiment per se entscheidet über Wissenschatlichkeit oder Unwissenschatlichkeit eines Sachverhaltes, sondern erst die Interpretation des Einzelergebnisses im Rahmen eines größeren Kontextes. Jedes kleine Naturstofmolekül hat, wenn es nur in hinreichender Konzentration zur Einwirkung gelangt, auf ein makromolekulares System – Rezeptoren, Ionenkanäle, Enzyme, Carriermoleküle – irgendeine Wirkung. Wer experimentiert, der wird somit auf molekularer und zellulärer Ebene Efekte inden. Leicht lassen sich von hier ausgehend putative Wirksamkeiten ableiten. Ob aber der nachgewiesene Efekt therapeutisch tatsächlich relevant ist, darauf allein kommt es an, also auf der kritischen Interpretation des Versuches. Meist belegen bereits die Dosisrelationen die Irrelevanz der Versuche. In anderen Fällen machen die pharmakokinetischen Eigenschaten einer postulierten Wirksubstanz therapeutische Efekte am Menschen unwahrscheinlich. Im Weiteren entsprechen die mit Phytopharmaka durchgeführten klinischen Studien vielfach in ihrem Studiendesign nicht den heutigen Anforderungen, d. h. sie wurden nicht nach den Normen der Good Clinical Practice (GCP) durchgeführt. An zahlreichen Stellen beziehen wir über die bloße Information hinaus unmittelbar Stellung. Den Studierenden soll rechtzeitig bewusst werden: Anders als Chemie und Physik ist die Arzneitherapie keine reine Wissenschat, denn nicht selten haben wissenschatliche Untersuchungen rein dienende Funktion, wie z. B. die, eine vorgefasste Meinung zu bestätigen, für ein Produkt die Zulassung zu erhalten oder einfach für ein Produkt zu werben. Bedauerlicherweise befassen sich unabhängige Universitätsinstitute nur selten mit der Untersuchung von

Phytopharmaka mit dem Ergebnis, dass Bias-verdächtige Publikationen viel zu selten von unabhängiger Seite nachgeprüt werden. Hinzugefügt sei, dass diese Situation nicht etwa nur für planzliche Arzneimittel zutrit, sondern auch für eine ganze Reihe synthetische Arzneimittel. Die Wirkung vieler Phytopharmaka wird kontrovers diskutiert. Beispiele dazu sind Präparate von Baldrian, Mönchspfefer, Teufelskralle, Arnika, Mutterkraut, Cimicifuga, Ginseng, Weidenrinde, etc. Auf diese Situation wird am Ende einzelner Kapitel mit einem Hinweis aufmerksam gemacht. In Kapitel 14 werden bei der Besprechung des Plazebophänomens die meisten Phytopharmaka den Arzneimitteln mit plazeboäquivalenten Wirkungen zugeordnet – eine Ansicht, die vermutlich nicht von allen Lesern geteilt werden wird. Wir hofen, dass der Versuch einer Wissensvermittlung im Sinne einer evidenzbasierten herapie positiv aufgenommen wird. Der Fließtext des Buches ist durch viele Tabellen und Abbildungen aufgelockert. In der Regel wird der in der Abbildung dargestellte Sachverhalt in einer ausführlichen Legende beschrieben. Abbildung und die zu ihrem Verständnis notwendige Legende ermöglichen eine rasche Kurzinformation unabhängig vom laufenden Text. Bisweilen enthalten sie Einzelheiten, die im Fließtext nicht erwähnt sind: Text und Legenden sollen daher mit gleicher Aufmerksamkeit gelesen werden. Neu in der achten Aulage ist ein Anhang mit einer Übersicht über Ordnungen und Familien im System der Spermatophyten. Der dabei verwendete Code erscheint im ganzen Buch jeweils hinter dem Familiennamen in eckiger Klammer. Hinsichtlich der Wiedergabe von Artnamen folgen wir dem Beispiel der Arzneibücher und nennen ergänzend zur binären Nomenklatur den Namen des Autors (meist als Namenskürzel), der die betrefende Planzenart zuerst beschrieben hat. Grundlage dazu ist der Kew Index, nach dem sich auch die PhEur richtet. Wir denken, die botanischen Erstbenenner verdienen es, dass ihr voller Name bekannt wird. Ein Anhang bringt daher die Aulösung der Namenskürzel, ergänzt durch kurze biographische Angaben. Jedes Kapitel enthält Literaturhinweise, die ohne Anspruch auf Vollständigkeit und ohne Berücksichtigung von Prioritäten, es dem interessierten Leser ermöglichen, die Darstellung der Autoren zu überprüfen. Die Autoren hofen, dass es gelungen ist, trotz der Stoffülle und trotz des heterogenen Charakters des Lehrstofes, ein Buch zu schreiben, das die Zeit des Lesens und Studierens lohnt. Wir wünschen uns kritische Benützer des Lehrbuches und

Vorwort zur achten Auflage

erhofen dementsprechend um Rückmeldungen von Verbesserungsvorschlägen bzw. Formel- oder Textfehlern. Unser besonderer Dank gilt Margarete Hänsel (München) sowie Miriam Sticher (Zürich) für ihre Geduld und tatkrätige Unterstützung während der Bearbeitung des Buches sowie vielen Kolleginnen und Kollegen für München und Zürich, im September 2006

wertvolle Hinweise. Namentlich genannt seien Frau Dr. med. Margit Heier (München), Professor Dr. med. homas R. Weihrauch (Wuppertal), Dr. Jürg Gertsch (Zürich) sowie die Professoren Dr. Jörg Heilmann (Regensburg), Dr. Adolf Nahrstedt (Münster) und Dr. Guido Pauli (Chicago). Rudolf Hänsel und Otto Sticher

VII

Inhaltsverzeichnis Phytochemische Grundlagen . . . .

1

Prinzipien des Sekundärstofwechsels W. Kreis 1.1 Ana-, Kata- und Amphibolismus . . . 1.2 Primär- und Sekundärstofwechsel . . 1.3 Zusammenhang zwischen Primärund Sekundärstofwechsel . . . . . . . 1.4 Auklärung von Biosynthesewegen . . 1.4.1 Tracer- oder Isotopentechnik . . . . . . 1.4.2 Enzymatische Methoden. . . . . . . . . 1.4.3 Genetische und molekulargenetische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3

A 1

Einführung in die Analytik sekundärer Planzeninhaltsstofe anhand ausgewählter Beispiele . . . . . . . . . . . J. Heilmann 2.1 Allgemeines . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2 Aufarbeitung und Extraktion . . . . . 2.3 Chromatographische Trennung und Isolierung . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.1 Dünnschichtchromatographie und Fließmitteloptimierung . . . . . . . . . 2.3.2 Säulenchromatographie . . . . . . . . . 2.3.3 MPLC und HPLC . . . . . . . . . . . . 2.4 Strukturauklärung und Substanzcharakterisierung . . . . . . . . . . . . 2.4.1 NMR-Spektroskopie . . . . . . . . . . . 2.4.2 Massenspektrometrie . . . . . . . . . . 2.4.3 Ultraviolettspektroskopie (UV-Spektroskopie) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4 5 8 18 18 21 25 30

2

3

3.1

Biosynthese planzlicher Sekundärstofe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R. Lukačin, U. Matern Grundlegende Methoden zur Auklärung von Biosynthesewegen . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

31 32 34 35 35 40 40 43 43 50 55 59

61

62

3.1.1 Isotopentechnik . . . . . . 3.1.2 Enzymatische Methoden. 3.1.3 Genetische Methoden . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

Postbiosynthetische Umsetzungen und Akkumulation von sekundären Planzenstofen . . . . . . . . . . . . . R. Hänsel 4.1 Änderungen im Sekundärstofgehalt während der Ontogenese . . . . . . . . 4.2 Diurnale Schwankungen, Fließgleichgewicht . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3 Oxidative Veränderungen an sekundären Planzenstofen . . . . . . 4.3.1 An katabolischen Reaktionen beteiligte Enzyme. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.2 Abbau phenolischer Planzenstofe . . . 4.3.3 Oxidative Modiikation der Quassinoide . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.4 Oxidative Modiikation der Limonoide . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.5 Phytoecdysone: Oxidative Modiikationen in der Cholesterinreihe . . . . . 4.4 Sekretion und Speicherung von Sekundärstofen . . . . . . . . . . . . . 4.4.1 Gewebe- und segmentspeziische Akkumulation. . . . . . . . . . . . . . . 4.4.2 Speicherung in Kompartimenten innerhalb der Zelle . . . . . . . . . . . . . . . 4.4.3 Vacuole als Speicherkompartiment . . 4.4.4 Transportvorgänge an Tonoplasten . . 4.4.5 Sekretion in Zellwand und periplasmatischem Raum. . . . . . 4.4.6 Innergewebliche Sekret- und Akkumulationsstrukturen . . . . . . . . . . . 4.4.7 Exotrope Sekretion und deren morphologische Strukturen . . . . . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

62 69 73 77

4

79

80 82 82 83 88 90 91 91 95 96 96 97 98 99 99 105 109

X

Inhaltsverzeichnis

B

Pharmazeutische Aspekte . . . . . .

Biologische und chemische Screening-Methoden für Planzenextrakte . . . . . . . . . . . . . . . . . K. Hostettmann, A. Marston, E. Ferreira Queiroz 5.1 Biologische Screening-Methoden . . 5.1.1 DC-Bioautographie. . . . . . . . . . . 5.1.2 HPLC-online-Bioassay . . . . . . . . . 5.2 Chemische Screening-Methoden . . 5.2.1 LC/UV . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.2 LC/MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.3 LC/NMR . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.4 Beispiele für chemisches OnlineScreening . . . . . . . . . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Weiterführende Literatur. . . . . . . . . . . . .

111

5

6 6.1 6.2

6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.3

6.4 6.4.1 6.4.2 6.4.3 6.5 6.5.1 6.5.2 6.5.3 6.6 6.7

.

113

. . . . . . .

114 115 116 118 118 118 120

. . .

120 123 124

Moderne Bioassay-Methoden . . . . . J. Heilmann Allgemeines . . . . . . . . . . . . . . . . Testsysteme mit Bezug zur Entzündungshemmung (Phospholipase-, Cyclooxygenase- und Lipoxygenasehemmung) . . . . . . . . . . . . . . . . Phospholipase-A2-Hemmung . . . . . Cyclooxygenasehemmung . . . . . . . . Lipoxygenasehemmung . . . . . . . . . Messung von Radikalfängereigenschaten und antioxidativen Eigenschaten . . . . . . . . . . . . . . . Messung der Beeinlussung von mRNA-Spiegeln . . . . . . . . . . . . . Testsysteme auf der Basis von Reportergenen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Real-time-RT-PCR . . . . . . . . . . . . Microarrays (Gen-Chips) . . . . . . . . Testsysteme mit Bezug zur Bekämpfung von Tumoren . . . . . . . . . . . . Messung der metabolischen Aktivität Inkorporationsassays . . . . . . . . . . . Bestimmung von Zellvitalität und Zelltod (Apoptose und Nekrose) . . . . . . Testsysteme mit Bezug zur Bekämpfung von Plasmodien . . . Testsysteme zur Bestimmung der Permeabilität . . . . . . . . . . . . . . .

125 127

129 130 130 131

6.8

Testsysteme mit Bezug zur Metabolisierung . . . . . . . . . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Das medizinische Potential von Planzenstofen . . . . . . . . . . . . . R. Hänsel, h. Dingermann 7.1 In unveränderter Form genutzte Planzenstofe. . . . . . . . . . . . . . . 7.2 Planzliche Sekundärstofe als Ideengeber (Leitstofe) für Arzneistofe . . 7.2.1 Verbesserung bekannter Strukturen . . 7.2.2 Auswertung ethnomedizinischer Beobachtungen . . . . . . . . . . . . . . 7.2.3 Auswertung von Gitwirkungen am Menschen . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.2.4 Gitwirkungen auf Tiere als Primäranregung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.2.5 Planzenphysiologische Beobachtungen als Primäranregung: Entdeckung der Indolylessigsäure als Pharmakophor 7.3 Planzliche Einzelstofe als Rohstofquelle für Arzneimittel . . . . . . . . . 7.4 Planzenstofe als Wirkstofe – Die wichtige Unterscheidung von Wirkstof und Arzneistof . . . . . . . 7.5 Planzenstofe im Vergleich mit synthetischen Stofen . . . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

7

8 132 133 133 134 136

144 148

8.1 8.1.1 8.1.2 8.2

136 137 138

8.2.1

138 141

8.2.3 8.2.4 8.2.5

142

8.3

8.2.2

Planzliche Arzneidrogen und einfache Arzneizubereitungen . . . . R. Hänsel, E. Spieß Pharmakognostische Grundlagen . . Grundbegrife . . . . . . . . . . . . . . . Strukturierte Drogen und deren . . . . morphologische Kennzeichnung . . . . Pharmazeutische Qualität planzlicher Arzneidrogen . . . . . . . . . . . . . . Hauptfaktoren, die die Qualität bestimmen . . . . . . . . . . . . . . . . Qualitätsanforderungen nach Arzneibuch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Lagerung von Drogen . . . . . . . . . . Kontamination . . . . . . . . . . . . . . Spezielle Probleme des Qualitätsnachweises . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Planzliche Arzneizubereitungen . . .

151

154 157 157 162 164 171

180 181

183 185 187

189 190 190 191 194 195 196 205 206 217 218

XI

Inhaltsverzeichnis

8.3.1 8.3.2 8.3.3

Zubereitungen aus Frischplanzen Teedrogen und Teegemische . . . Einfache nichtwässrige Drogenauszüge . . . . . . . . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Weiterführende Literatur. . . . . . . . . . . 9

9.1 9.1.1 9.1.2 9.1.3 9.1.4 9.1.5 9.1.6 9.1.7 9.1.8 9.1.9 9.2 9.2.1 9.2.2 9.2.3 9.2.4 9.2.5 9.2.6 9.3

9.3.1 9.3.2 9.3.3 9.3.4 9.4 9.4.1 9.4.2 9.4.3

. . . . . .

218 219

. . . . . . . . .

221 223 223

Trockenextrakte als Arzneistof: Herstellung, Qualitätsprüfung . . . . M. Veit Begrifserklärungen und Deinitionen . . . . . . . . . . . . . . . Leitsubstanzen („analytical marker“) Pharmazeutisch relevante Inhaltsstofe („active marker“) . . . . . . . . . . . . . Wirkstofe („active substance, active pharmaceutical ingredient“) . . . Fingerprint . . . . . . . . . . . . . . . . Referenzsubstanzen . . . . . . . . . . . Inprozesskontrollen . . . . . . . . . . . Speziikation . . . . . . . . . . . . . . . Droge-Extrakt-Verhältnis . . . . . . . . Validierung von Prüfverfahren . . . . . Herstellung von Trockenextrakten . . Typen von Extrakten . . . . . . . . . . . Grundzüge der Herstellung . . . . . . . Planzliche Extraktivstofe . . . . . . . . Variable Zusammensetzung von Trockenextrakten . . . . . . . . . . . . . Extraktzubereitungen: Instanttees und Granulattees . . . . . . . . . . . . . . . . Sonderformen der Extraktzubereitungen . . . . . . . . . . . . . . . Einteilung von Trockenextrakten: standardisierte, quantiizierte und andere Extrakte. . . . . . . . . . . . . . Standardisierung auf pharmazeutisch relevante Inhaltsstofe . . . . . . . . . . Quantiizierung auf pharmazeutisch relevante Inhaltsstofe . . . . . . . . . . Extrakte, die ausschließlich über den Herstellungsprozess deiniert sind . . . Lagerung . . . . . . . . . . . . . . . . . . Qualitätsprüfung von Trockenextrakten . . . . . . . . . . . . . . . . . Identitätsprüfung . . . . . . . . . . . . . Reinheitsprüfungen. . . . . . . . . . . . Prüfung auf Lösungsmittelrückstände

225

226 226 226 227 227 227 227 228 228 229 231 231 231 234 236 238 239

240

9.4.4

Prüfung auf Alatoxine und andere Mykotoxine . . . . . . . . . . . . . . . 9.4.5 Prüfung auf Schwermetalle . . . . . . 9.4.6 Prüfung auf Pestizidrückstände . . . 9.4.7 Bestimmung der mikrobiologischen Reinheit . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.4.8 Prüfung auf sonstige Kontaminanten 9.4.9 Gehaltsbestimmung . . . . . . . . . . 9.4.10 Stabilitätsuntersuchungen . . . . . . . 9.4.11 Sonstige Prüfungen . . . . . . . . . . 9.5 Speziikation von Extrakten . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Weiterführende Literatur . . . . . . . . . . . .

. . .

247 247 248

.

248 249 249 253 254 254 258 259

. . . . . .

Planzliche Fertigarzneimittel . . . . M. Veit 10.1 Arzneiformen . . . . . . . . . . . . . . 10.1.1 Arzneiformen und Applikationsarten . 10.1.2 Herstellung lüssiger Arzneizubereitungen aus Trockenextrakten . . 10.1.3 Herstellung fester Arzneiformen aus Trockenextrakten . . . . . . . . . . . . . 10.1.4 Planzliche Parenteralia . . . . . . . . . 10.1.5 Validierung der Herstellung (Prozessvalidierung) . . . . . . . . . . . 10.2 Qualitätssicherung von Fertigarzneimitteln . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.2.1 Identität . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10.2.2 Reinheitsprüfungen . . . . . . . . . . . 10.2.3 Gehaltsprüfungen . . . . . . . . . . . . 10.2.4 Weitere Prüfungen . . . . . . . . . . . . 10.2.5 Haltbarkeit . . . . . . . . . . . . . . . . 10.2.6 Wirkstoffreigabe (Dissolution-Test) . . 10.2.7 Vergleichbarkeit von planzlichen Fertigarzneimitteln . . . . . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Weiterführende Literatur . . . . . . . . . . . . . 10

261 262 264 265 265 265 266 266 269 270 271 271 272 275 276 283 283

241 11 242 243 243 243 243 244 247

11.1 11.1.1 11.1.2 11.2

Enzyme bei der Gewinnung von Drogen und der Herstellung von Phytopharmaka . . . . . . . . . . . . W. Kreis Fermentation . . . . . . . . . . . . . . Substratveränderungen durch zelleigene Enzyme . . . . . . . . . . . . . Fermentation als Aubereitung planzlicher Produkte. . . . . . . . . . Nacherntephysiologie und Verderb .

.

285

.

286

.

286

. .

288 289

XII

Inhaltsverzeichnis

11.3

Enzymatischer Abbau von Inhaltsstofen während der Herstellung von Phytopharmaka . . . . . . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

C

Praxis und Probleme der Anwendung pflanzlicher Arzneimittel . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Abnorme Phytopharmakawirkungen durch genetische Ursachen . . . . . . R. Hänsel 12.1 Glucose-6-Phosphat-DehydrogenaseMangel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12.1.1 Favismusfaktoren . . . . . . . . . . . . . 12.1.2 Weitere Naturprodukte, die bei Glc-6PDG-Mangel vorsichtig anzuwenden sind . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12.2 Polymorphismus von Biotransformationsenzymen . . . 12.2.1 Cytochrom-P450-Polymorphismus . . 12.2.2 N-Acetyltransferasepolymorphismus: Beispiel für einen Phase-II-Polymorphismus . . . . . . . . . . . . . . . . 12.3 Nahrungsmittelidiosynkrasien: Rote Beete und Spargel . . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Weiterführende Literatur . . . . . . . . . . . . .

13.4

290 291

293

12

13

13.1 13.1.1 13.1.2 13.1.3 13.2

13.3 13.3.1 13.3.2

Überempindlichkeitsreaktionen beim Umgang mit Drogen und bei der Anwendung lanzlicher Arzneimittel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R. Hänsel und A. Vollmar Begrife: Idiosynkrasie, Allergie und Pseudoallergie . . . . . . . . . . . . . . Idiosynkrasie . . . . . . . . . . . . . . . Allergie . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pseudoallergien . . . . . . . . . . . . . . Mit dem Autreten welcher allergischen Erkrankungen ist beim Umgang mit Drogen und Phytopharmaka zu rechnen? . . . . . . . . . Welche Hinweise gibt es auf Vorliegen einer Arzneimittelallergie? . . . . . . . Anamnese . . . . . . . . . . . . . . . . . Allergiediagnostik . . . . . . . . . . . .

295

296 296

298 299 300

301 302 305 305

Was versteht man unter Sensibilisierung? . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13.4.1 Sensibilisierung im Falle IgE-bedingter Allergien . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13.4.2 Sensibilisierungsphase der allergischen Spättypreaktion . . . . . . . . . . . . . . 13.5 Arzneimittelallergische Krankheitsbilder . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13.5.1 Heuschnupfen (allergische Rhinokonjunktivitis) . . . . . . . . . . . . . . 13.5.2 Allergisches Asthma bronchiale . . . . 13.5.3 Gastrointestinale Allergien . . . . . . . 13.5.4 Allergische Kontaktdermatitis: Beispiel für eine Typ-IV-Reaktion nach Gell und Coomb . . . . . . . . . . . . . . . . 13.6 Allergenquellen . . . . . . . . . . . . . 13.6.1 Deinitionen . . . . . . . . . . . . . . . 13.6.2 Inhalationsallergene . . . . . . . . . . . 13.6.3 Allergene in Nahrungs- und Genussmitteln . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13.6.4 Kontaktallergene . . . . . . . . . . . . . Anhang: Wichtige Begrife der Immunologie und Allergologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Weiterführende Literatur . . . . . . . . . . . . . 14

14.1 14.2 307 14.3 308 308 308 310

14.4 14.5 14.6 14.7

310 311 311 312

14.7.1 14.7.2

Plazebos und Plazebowirkungen: theoretische Konzepte und experimentelle Befunde . . . . . . . . R. Hänsel Plazebo – das umstrittene Medikament . . . . . . . . . . . . . . . Erste Annäherung an das hema anhand eines konkreten Beispiels . . Einseitige Deinition des Plazebobegrifs . . . . . . . . . . . . . . . . . . Plazeboefekte als unspeziische Efekte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Psychophysische Wechselwirkungen: Basis für Plazeboefekte. . . . . . . . . Plazeboartefakte (falsche Plazeboefekte) . . . . . . . . . Nachweis einer pharmakodynamischen Wirkungskomponente nur durch Vergleich von Kollektiven möglich . . Reine Plazebos . . . . . . . . . . . . . . Plazebo im Vergleich zu Nichtbehandlung . . . . . . . . . . . . . . . .

312 312 314 317 317 317 319

319 320 320 321 322 223 324 338 338

339

341 342 343 344 345 346

350 350 350

XIII

Inhaltsverzeichnis

14.7.3 14.7.4 14.8 14.8.1

14.8.2

14.9 14.9.1 14.9.2 14.9.3 14.9.4 14.10 14.10.1 14.10.2 14.11

14.11.1 14.11.2 14.11.3 14.11.4 14.11.5 14.12 14.12.1 14.12.2 14.12.3 14.12.4 14.12.5 14.12.6 14.12.7 14.12.8

Plazeboäquivalente Arzneimittel (unreine Plazebos) . . . . . . . . . . . . Unberechtigter Glaube an Wirkungsmechanismen . . . . . . . . . . . . . . . Besondere herapierichtungen und das Plazeboproblem . . . . . . . . Medikamente der besonderen herapierichtungen gelten als glaubensbasiert . . . . . . . . . . . . . Kritik an der kontrollierten klinischen Studie als alleinigem Maß der Wirksamkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . Der Plazeboefekt: Vorstellungen zum Wirkungsmechanismus . . . . . Bedingte Relexe (Konditionierung) . . Erwartungshaltung . . . . . . . . . . . . Suggestion (Instruktion, Präparatesuggestion) . . . Widerspiegelung von Plazeboefekten auf biochemischer Ebene . . . . . . . . Äußere Einlüsse auf die Plazebowirkung . . . . . . . . . . . . . . . . . . Iatroplazebogenese: Der Arzt als Plazebo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Beitrag von Arzneiform und Sensorik zum Plazebophänomen . . . . . . . . . Einsatz von Plazebos: Reine Plazebos und plazeboäquivalente Arzneimittel in verschiedenen herapierichtungen Plazeboäquivalente Arzneimittel in der internistischen Medizin. . . . . . Anthroposophische Arzneitherapie . . Arzneimittel der Homöopathie . . . . . Die Arzneimittel der Phytotherapie . . Traditionelle chinesische Medizin . . . Indikationen für plazeboäquivalente Arzneimittel . . . . . . . . . . . . . . . Adjuvant bei Krankheiten ohne langfristig erfolgreiche herapie . . . . Zur Behandlung funktioneller (somatoformer) Störungen . . . . . . . . . . . . Beindlichkeitsstörungen . . . . . . . . Nervöse Herzbeschwerden . . . . . . . Funktionelle Beschwerden im gastrointestinalen Bereich. . . . . . . . . . . . Reizdarmsyndrom (Colon irritabile) Prämenstruelles Syndrom . . . . . . . . Klimakterisches Syndrom . . . . . . . .

351 351

Unerwünschte Plazebowirkungen . Biologische Bedeutung des Plazeboefekts . . . . . . . . . . . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Weiterführende Literatur . . . . . . . . . . . .

14.13 14.14

.

377

. . .

379 380 384

352 15 352 15.1 354 356 356 357 358 359

15.1.1 15.1.2 15.1.3 15.1.4 15.2 15.3 15.3.1

360 360

15.3.2 15.4

361

15.4.1

361 362 363 364 365 370

15.4.2 15.4.3 15.4.4 15.4.5 15.4.6 15.4.7

371

15.4.8

371

15.4.9

372 373 373

15.4.10

15.5 374 374 375 376

15.5.1 15.5.2 15.5.3

Sekundäre Planzenstofe in Nahrungsergänzungsmitteln . . . . . . . . . . . R. Hänsel Sekundäre Planzenstofe in Nahrungsergänzungsmitteln: Probleme des Wirksamkeitsnachweises . . . . . . . . Begrife, Allgemeines . . . . . . . . . . Realistische Heilversprechen? . . . . . . Grenzen retrospektiver Korrelationsstudien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Überbewertung von Laborstudien . . . Rotwein und seine schützenden Phenole . . . . . . . . . . . . . . . . . . Soja und Sojaprodukte . . . . . . . . . Botanische Herkunt und Inhaltsstofe der Sojabohne . . . . . . . . . . . . . . . Einzelne Sojaprodukte . . . . . . . . . . Antioxidative Wirkung sekundärer Planzenstofe. . . . . . . . . . . . . . . Oxidativer Stress: biologische Bedeutung . . . . . . . . . . . . . . . . . Reaktive Sauerstofspezies (ROS) . . . . Biologische Quellen für ROS . . . . . . Biologische Wirkungen von ROS . . . . Antioxidative Schutzmechanismen gegen ROS . . . . . . . . . . . . . . . . . Biochemische Marker für oxidativen Stress . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Die Rolle von ROS bei der Entstehung von Krankheiten . . . . . . . . . . . . . Mehrfach ungesättigte Fettsäuren und oxidativer Stress . . . . . . . . . . . . . Wirkt Knoblauch antiarteriosklerotisch und krebshemmend? . . . . . . . . . . . Selenverbindungen in Planzen: antioxidativ und antikanzerogen wirkend . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ascorbinsäure (Vitamin C): das wasserlösliche Antioxidans . . . . Chemische Struktur und Eigenschaten Vorkommen . . . . . . . . . . . . . . . . Pharmakokinetik . . . . . . . . . . . . .

385

386 386 387 388 388 390 391 392 395 397 397 398 400 401 402 405 405 410 412

417 420 420 420 422

XIV

Inhaltsverzeichnis

15.5.4

Biochemische Bedeutung der Ascorbinsäure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15.5.5 Ascorbinsäure als Nahrungsergänzungsmittel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Weiterführende Literatur. . . . . . . . . . . . . . 16

16.1

16.2 16.3 16.4 16.5 16.6 16.7 16.8 16.8.1 16.8.2 16.9 16.10 16.10.1 16.10.2 16.10.3 16.10.4 16.11 16.12

16.13 16.13.1 16.13.2 16.13.3 16.13.4 16.13.5 16.13.6 16.13.7 16.14

Drogen der Traditionellen Chinesischen Medizin in westlichen Ländern . . . . . . . . . . . . . . . . . E. Stöger Die traditionelle chinesische Medizin (TCM) und ihre Akzeptanz in westlichen Ländern . . . . . . . . . . . . . . Beindlichkeitsstörungen als Domäne der TCM . . . . . . . . . . . . . . . . . Die TCM: der andere Denkstil erschwert das Verständnis . . . . . . . Die Relevanz des theoretischen Überbaus . . . . . . . . . . . . . . . . . Die Yin-Yang-Lehre . . . . . . . . . . . Die Fünf-Wandlungsphasen-Lehre (wuxing) . . . . . . . . . . . . . . . . . . Qi und Xue . . . . . . . . . . . . . . . . Pathogenese. . . . . . . . . . . . . . . . Äußere Ursachen . . . . . . . . . . . . . Innere Ursachen . . . . . . . . . . . . . Diagnostik . . . . . . . . . . . . . . . . Die acht diagnostischen Leitkriterien (bagang) . . . . . . . . . . . . . . . . . . Yin und Yang . . . . . . . . . . . . . . . Inneres und Oberläche . . . . . . . . . Kälte und Hitze . . . . . . . . . . . . . . Leere und Fülle . . . . . . . . . . . . . . Diferentialdiagnose. . . . . . . . . . . herapeutische Umsetzung des Befundes – die therapeutischen Verfahren (zhifa) . . . . . . . . . . . . . Arzneimittelwirkungen . . . . . . . . . Das Temperaturverhalten (qi) . . . . . . Die Geschmacksrichtung (wei) . . . . . Der Funktionskreisbezug (guijing) . . . Wirkungsstärke, Toxizität (duxing) . . . Wirkungsdeinition (yingyong zhuzhi) Dosierung . . . . . . . . . . . . . . . . . Inkompatibilitäten, Anwendung in der Schwangerschat . . . . . . . . . . Pharmazeutische Drogenaubereitung

422 425 428 430

431

433 433 434 435 436 437 439 439 439 440 440 441 441 442 442 442 443

443 443 445 445 445 445 447 447 447 447

16.14.1 16.14.2

Wirkungsinerte Aubereitungsverfahren Wirkungsrelevante, traditionelle Vorbehandlungsverfahren . . . . . . . . 16.15 Rezepturen . . . . . . . . . . . . . . . . 16.16 Verarbeitung zu Arzneiformen . . . . 16.16.1 Dekokte . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16.16.2 Traditionelle Fertigarzneimittel . . . . . 16.16.3 Neuzeitliche Extraktzubereitungen . . . 16.16.4 Zubereitungen für die äußerliche Anwendung . . . . . . . . . . . . . . . . 16.17 Das Potential der chinesischen Arzneidrogen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16.18 Sicherheitsaspekte . . . . . . . . . . . . 16.18.1 Verwechslungen chinesischer Arzneidrogen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16.18.2 Kontamination mit Schwermetallen . . 16.19 Verfügbarkeit von TCM-Drogen in Europa . . . . . . . . . . . . . . . . . Anhang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Weiterführende Literatur . . . . . . . . . . . . . Aromatherapie: Biologische und psychodynamische Wirkungen von Aromastofen . . . . . . . . . . . . R. Hänsel 17.1 Einschränkung des hemas: Abgrenzung zur esoterischen Aromatherapie . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17.2 Biologische Bedeutung des Riechens 17.3 Psychodynamische Wirkungen von Gerüchen . . . . . . . . . . . . . . . . . 17.4 Weitere Wirkungen ätherischer Öle via Osmorezeptoren . . . . . . . . . . . 17.5 Wirkungen über das trigeminale System . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17.6 Zurück zur Aromatherapie. . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

448 448 449 450 450 450 451 451 451 452 452 453 454 456 461 461

17

D

18

18.1 18.2

Einzeldarstellung wichtiger Stoffgruppen . . . . . . . . Kohlenhydrate I: Chemie, wichtige Mono- und Oligosaccharide . . . . . . W. Blaschek, S. Alban Allgemeines . . . . . . . . . . . . . . . Deinition der Kohlenhydrate . . . . .

463

464 465 467 468 469 469 470

473

475 477 477

XV

Inhaltsverzeichnis

18.3 18.3.1 18.3.2 18.4 18.4.1 18.4.2 18.4.3 18.4.4 18.4.5 18.4.6 18.4.7 18.4.8 18.4.9 18.4.10 18.5 18.5.1 18.5.2 18.5.3 18.6 18.7 18.8 18.8.1 18.8.2 18.9 18.9.1 18.9.2 18.9.3 18.9.4 18.9.5 18.9.6 18.9.7 18.9.8 18.10 18.11 18.11.1 18.11.2 18.11.3

Klassiizierung von Kohlenhydraten Monosaccharide . . . . . . . . . . . . . Di- und Oligosaccharide . . . . . . . . Strukturprinzipien von Monosacchariden . . . . . . . . . . . . . . . . Aldosen und Ketosen . . . . . . . . . . Halbacetalbildung. . . . . . . . . . . . . Nomenklatur und Darstellung . . . . . Aldonsäuren, Uronsäuren und Aldarsäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Aminozucker und Acetyl-Aminozucker Deoxy-Zucker . . . . . . . . . . . . . . Zuckeralkohole: Alditole . . . . . . . . Cyclitole . . . . . . . . . . . . . . . . . . Zuckerester: phosphorylierte und sulfatierte Monosaccharide. . . . . Besondere Monosaccharide . . . . . . . Strukturprinzipien von Oligosacchariden . . . . . . . . . . . . . . . . Vollacetalbildung und O-glykosidische Bindung . . . . . . . . . . . . . . . . . . N-glykosidische und C-glykosylische Bindung . . . . . . . . . . . . . . . . . . Di- und Oligosaccharide . . . . . . . . Organoleptische Eigenschaten von Kohlenhydraten . . . . . . . . . . Kohlenhydrate im Stofwechsel . . . . Analytik von Kohlenhydraten . . . . . Nachweisreaktionen für Kohlenhydrate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Strukturauklärung von Kohlenhydraten . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pharmazeutisch bedeutsame Monosaccharide . . . . . . . . . . . . . Xylose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Glucose . . . . . . . . . . . . . . . . . . Galactose . . . . . . . . . . . . . . . . . Fructose . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sorbitol . . . . . . . . . . . . . . . . . . Mannitol . . . . . . . . . . . . . . . . . . Xylitol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Myo-Inositol . . . . . . . . . . . . . . . Honig . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pharmazeutisch bedeutsame Oligosaccharide . . . . . . . . . . . . . . . . Saccharose . . . . . . . . . . . . . . . . Lactose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Lactulose . . . . . . . . . . . . . . . . .

478 478 478 479 479 480 481 483 485 486 487 487 488 488 488 488 489 491 493 496 498 498 498 500 500 500 501 502 503 504 504 505 505 507 507 508 509

18.11.4 Lactitol 18.11.5 Maltose 18.11.6 Isomalt 18.11.7 Maltitol Literatur . . . . . 19

19.1 19.1.1 19.1.2 19.1.3 19.1.4 19.2 19.2.1 19.2.2 19.2.3 19.2.4 19.2.5 19.2.6 19.2.7 19.2.8 19.2.9 19.2.10 19.2.11 19.3 19.3.1 19.3.2 19.3.3 19.4 19.4.1 19.4.2 19.4.3 19.4.4 19.4.5 19.4.6 19.4.7 19.4.8 19.4.9 19.4.10 19.4.11 19.4.12 19.4.13 19.5

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

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. . . . .

Kohlenhydrate II: Polysaccharide und Polysacchariddrogen . . . . . . . S. Alban, W. Blaschek Allgemeines . . . . . . . . . . . . . . . Struktur . . . . . . . . . . . . . . . . . . Eigenschaten . . . . . . . . . . . . . . . Abbau von Polysacchariden . . . . . . . Vorkommen und Funktionen . . . . . . Isolierte planzliche Polysaccharide und wichtige Derivate . . . . . . . . . Cellulose . . . . . . . . . . . . . . . . . . Natürliche Cellulosepräparate . . . . . Modiizierte Cellulosen . . . . . . . . . Verbandstofe auf Cellulose-Basis . . . Cellulosederivate . . . . . . . . . . . . . Stärke . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Modiizierte Stärken . . . . . . . . . . . Stärkederivate . . . . . . . . . . . . . . . Fructane . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pektine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Anhang: Ballaststofe . . . . . . . . . . . Planzliche Gummen . . . . . . . . . . Arabisches Gummi . . . . . . . . . . . . Tragant . . . . . . . . . . . . . . . . . . Karaya-Gummi . . . . . . . . . . . . . . Polysacchariddrogen/Schleimdrogen Charakteristika, Qualitätsprüfung und Anwendungsgebiete . . . . . . . . . . . Bockshornsamen . . . . . . . . . . . . . Eibischwurzel und -blätter . . . . . . . Flohsamen, Indische Flohsamen und -schalen . . . . . . . . . . . . . . . . . . Guar und Guargalactomannan . . . . . Hulattichblätter . . . . . . . . . . . . . Isländisches Moos/Isländische Flechte Johannisbrotkernmehl . . . . . . . . . . Leinsamen . . . . . . . . . . . . . . . . . Lindenblüten . . . . . . . . . . . . . . . Malvenblüten und -blätter . . . . . . . . Spitzwegerichblätter . . . . . . . . . . . Wollblumen/Königskerzenblüten . . . Bakterienpolysaccharide . . . . . . . .

510 510 511 512 513

515 517 517 521 524 526 528 529 531 533 534 535 539 548 552 554 555 559 570 571 573 576 579 579 584 586 589 592 594 595 598 600 602 603 604 605 607

XVI

Inhaltsverzeichnis

19.5.1

Bakterielle Zellwand-, Kapsel- und Exopolysaccharide . . . . . . . . . . . . 19.5.2 Dextrane . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19.5.3 Xanthan . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19.5.4 Beispiele weiterer Exopolysaccharide . . . . . . . . . . . . . . . . . 19.6 Pilzpolysaccharide . . . . . . . . . . . 19.6.1 Pullulan . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19.6.2 Pilzglucane in der adjuvanten Tumortherapie . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19.6.3 Zellwandglykane in der Pathogenese von Mykosen . . . . . . . . . . . . . . . 19.7 Algenpolysaccharide . . . . . . . . . . 19.7.1 Allgemeines zu Algen und Algenpolysacchariden . . . . . . . . . . . . . . . . 19.7.2 Alginsäure und Alginate . . . . . . . . . 19.7.3 Agar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19.7.4 Carrageen und Carrageenane . . . . . . 19.7.5 Furcelleran . . . . . . . . . . . . . . . . 19.7.6 Weitere sulfatierte Polysaccharide marinen Ursprungs . . . . . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Weiterführende Literatur . . . . . . . . . . . . . Kohlenhydrate III: Aminoglykane und Glykosaminoglykane . . . . . S. Alban 20.1 Aminoglykane . . . . . . . . . . . . 20.1.1 Chitin und Chitosan . . . . . . . . . 20.1.2 Modiizierte Chitosane . . . . . . . 20.2 Glykosaminoglykane . . . . . . . . 20.2.1 Proteoglykane und Glykosaminoglykane der Vertebraten . . . . . . . 20.2.2 Hyaluronsäure . . . . . . . . . . . . 20.2.3 Keratansulfat . . . . . . . . . . . . . 20.2.4 Chondroitinsulfat . . . . . . . . . . 20.2.5 Dermatansulfat . . . . . . . . . . . . 20.2.6 Heparansulfat . . . . . . . . . . . . . 20.2.7 Heparin . . . . . . . . . . . . . . . . 20.2.8 Niedermolekulare Heparine . . . . 20.2.9 „Heparinoide“ . . . . . . . . . . . . 20.2.10 Anhang: Fondaparinux, ein synthetisches Pentasaccharid . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Weiterführende Literatur . . . . . . . . . . .

21 607 612 615 618 620 621

21.1

622

21.3

625 628

21.4 21.5 21.6 21.7 21.8 21.9

629 632 638 642 647 648 651 653

20

21.2

21.10 21.11

22 . .

655

. . . .

656 656 661 663

. . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . .

664 671 673 675 677 680 682 691 696

. . . . . .

697 703 703

22.1 22.1.1 22.1.2 22.1.3 22.1.4 22.1.5 22.2 22.2.1 22.2.2 22.2.3 22.2.4 22.2.5 22.2.6 22.2.7 22.2.8 22.2.9 22.2.10

Planzliche Lectine: Vorkommen, Eigenschaten, Analytik und Bewertung ihrer immunmodulatorischen Aktivität . . . . . . . . . . . . . H. Rüdiger, R. Hänsel und H.-J. Gabius Kohlenhydrate als vielseitige Informationsträger . . . . . . . . . . . Lectine als Bindungspartner für zelluläre Glykane . . . . . . . . . . . . Weite Verbreitung planzlicher Lectine . . . . . . . . . . . . . . . . . . Planzliche Lectine als Gite . . . . . . Isolierung von Lectinen . . . . . . . . Funktionen planzlicher Lectine . . . Anwendung . . . . . . . . . . . . . . . . Analytik . . . . . . . . . . . . . . . . . . Immunmodulation durch planzliche Lectine . . . . . . . . . . . . . . . . . . Von der „Immunstimulation“ zur Ambivalenz der Immunmodulation Risikopotential der lectinbezogenen Mistelanwendung . . . . . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . Lipide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R. Hänsel Fettsäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . Nomenklatur, Einteilung . . . . . . . . Weit verbreitete Fettsäuren . . . . . . . Fettsäuren mit ungewöhnlicher Struktur . . . . . . . . . . . . . . . . . . Biosynthese von Fettsäuren . . . . . . . Eicosanoide . . . . . . . . . . . . . . . . Triacylglyceride (Fette und Öle) . . . . Nomenklatur, chemischer Aubau . . . Schmelzverhalten, einige chemische Eigenschaten . . . . . . . . . . . . . . . Prüfung auf Identität und Reinheit . . . Chemische Kennzahlen . . . . . . . . . Farbreaktionen . . . . . . . . . . . . . . Begleitstofe in Fetten und Ölen . . . . Biosynthese von Triacylglyceriden; Fettspeicherung . . . . . . . . . . . . . . Technische Gewinnung von Fetten und Ölen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Verwendung in Pharmazie und Medizin . . . . . . . . . . . . . . . . . . Planzliche Fette und Öle. . . . . . . . .

705

706 709 713 718 720 723 725 727 729 730 733 735 739 740 740 741 744 747 752 757 757 757 759 760 761 763 766 768 769 770

XVII

Inhaltsverzeichnis

Phospholipide . . . . . . . . . . . . . . Phosphoglyceride (Phosphatidylsäurederivate) . . . . . . 22.3.2 Sojabohnenlecithin . . . . . . . . . . . . 22.3.3 Etherphospholipide. . . . . . . . . . . . 22.4 Glykolipide . . . . . . . . . . . . . . . . 22.4.1 Glyceroglykolipide . . . . . . . . . . . . 22.4.2 Sphingolipide . . . . . . . . . . . . . . . 22.5 Beteiligung von Lipiden am Aubau von Membranen . . . . . . . . . . . . . 22.5.1 Einheitliches Bauprinzip biologischer Membranen . . . . . . . . . . . . . . . . 22.5.2 Unterschiede in der Zusammensetzung 22.5.3 Oxidative Schädigung von Membranlipiden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22.6 Lipopolysaccharide . . . . . . . . . . . 22.6.1 Vorkommen . . . . . . . . . . . . . . . . 22.6.2 Chemischer Aubau. . . . . . . . . . . . 22.6.3 Biologische Wirkungen von LPS bzw. von Endotoxinen . . . . . . . . . . . . . 22.7 Wachse und wachsähnliche Stofe . . 22.7.1 Deinitionen, Übersicht . . . . . . . . . 22.7.2 Carnaubawachs . . . . . . . . . . . . . . 22.7.3 Jojobaöl . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22.7.4 Blütenwachse . . . . . . . . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22.3 22.3.1

23 23.1

23.2

23.3 23.3.1 23.3.2 23.3.3 23.3.4 23.4 23.4.1 23.4.2 23.4.3

Isoprenoide als Inhaltsstofe . . . . . . O. Sticher Terminologie, Isoprenregel, Biosynthese, Einteilung, Vorkommen und biologische Funktion . . . . . . . Mono- und Sesquiterpene, die in ätherischen Ölen vorkommen ( > Kap. 25) . . . . . . . . . . . . . . . . Iridoide . . . . . . . . . . . . . . . . . . Terminologie, Biosynthese, Unterteilung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Iridoidglykoside . . . . . . . . . . . . . Secoiridoidglykoside . . . . . . . . . . . Nichtglykosidische Iridoide . . . . . . . Sesquiterpene. . . . . . . . . . . . . . . Häuig vorkommende Strukturvarianten, Einteilung, Vorkommen . . . . . . . . . Biologische Aktivitäten von Sesquiterpenen – Wirkungsmechanismen . . Sesquiterpene als Reinstofe und Inhaltsstofe planzlicher Arzneidrogen . . . .

784

801 803 803 805 805 806 807

Diterpene . . . . . . . . . . . . . . . . . Einige häuige Strukturtypen, biologische Aktivitäten, Vorkommen 23.5.2 Beispiele biologisch aktiver Diterpene . . . . . . . . . . . . . . . . . 23.5.3 Diterpene als Inhaltsstofe planzlicher Arzneidrogen . . . . . . . . . . . . . . . 23.6 Triterpene einschließlich Steroide ( > Kap. 24) . . . . . . . . . . . . . . . . 23.7 Tetraterpene: Carotinoide und biochemisch verwandte Planzenstofe . . 23.7.1 Chemischer Aubau, Einteilung, Nomenklatur . . . . . . . . . . . . . . . 23.7.2 Physikalische und chemische Eigenschaten, Stabilität . . . . . . . . . 23.7.3 Analytische Kennzeichnung . . . . . . 23.7.4 Vorkommen, Lokalisation. Hinweise auf Carotinoidführung in Arzneidrogen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23.7.5 Biosynthese der Carotinoide. . . . . . . 23.7.6 Schicksal der Carotinoide im Säugetierorganismus . . . . . . . . . . . . . . . . 23.7.7 Wirkungen und Anwendungsgebiete 23.7.8 Apocarotinoide und andere Carotinoidabbauprodukte . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

809

24

784 787 787 789 790 790 791 791 793 794 800 800 800

23.5 23.5.1

24.1 810

815 815 815 817 832 838 847 847 850 855

24.2 24.3 24.4 24.5 24.5.1 24.5.2 24.5.3 24.5.4 24.5.5 24.5.6 24.6 24.6.1 24.6.2 24.6.3 24.6.4

Triterpene einschließlich Steroide . . O. Sticher Übersicht über die pharmazeutisch interessierenden Stofgruppen . . . . Allgemeine Nachweisreaktionen . . . Squalen . . . . . . . . . . . . . . . . . . Phytosterole (Phytosterine) . . . . . . Triterpene verschiedener Struktur . . Cucurbitacine . . . . . . . . . . . . . . . Cimicifuga-Triterpene . . . . . . . . . . Quassinoide . . . . . . . . . . . . . . . . Boswelliasäuren . . . . . . . . . . . . . . Betulinsäure . . . . . . . . . . . . . . . . Ringelblumenblüten . . . . . . . . . . . Saponine. . . . . . . . . . . . . . . . . . Begrifsbestimmung . . . . . . . . . . . Vorkommen, chemische und physikalische Eigenschaten, Einteilung . . . Analytik von Saponindrogen . . . . . . Saponine als Hämolysegite, hämolytischer Index, Strukturspeziität . . .

882 882 885 889 892 892 892 892 896

896 899 899 900 903 908 915

916 916 920 920 927 927 930 934 935 938 940 943 943 943 944 946

XVIII

Inhaltsverzeichnis

24.6.5

Metabolismus, Pharmakokinetik und Toxikologie der Saponine . . . . . 24.6.6 Wirkungen der Saponine . . . . . . . . 24.6.7 Arzneidrogen mit Saponinen . . . . . . 24.6.8 Triterpensaponine . . . . . . . . . . . . 24.6.9 Steroidsaponine . . . . . . . . . . . . . . 24.7 Herzwirksame Steroide . . . . . . . . . 24.7.1 Begrifsbestimmung, Geschichtliches . 24.7.2 Aubau der herzwirksamen Steroidglykoside . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24.7.3 Einige chemische Eigenschaten, Farbreaktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . 24.7.4 Verbreitung im Planzenreich, verwendete Extrakte/Reinstofe . . . . . 24.7.5 Pharmakokinetik und Metabolismus 24.7.6 Wirkungen auf biochemischer Ebene und Anwendungsgebiete . . . . . . . . . 24.7.7 Analytische Kennzeichnung . . . . . . . 24.7.8 Digitalis lanata und Lanataglykoside . . 24.7.9 Digitalis purpurea und Purpureaglykoside. . . . . . . . . . 24.7.10 Strophanthin und andere Reinglykoside mit großer Abklingquote. . . . . . . . . 24.7.11 Weitere Drogen mit herzwirksamen Steroiden . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24.8 Verschiedene Substanzen mit einem Steroidgerüst . . . . . . . . 24.8.1 Uzarawurzel . . . . . . . . . . . . . . . . 24.8.2 Condurango- oder Kondurangorinde Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

25.1 25.1.1 25.1.2 25.1.3 25.1.4 25.1.5 25.1.6 25.1.7 25.1.8 25.2 25.2.1 25.2.2

Ätherische Öle und Drogen, die ätherisches Öl enthalten . . . . . . O. Sticher Einführung . . . . . . . . . . . . . . . . Natürliche und künstliche Öle. . . . . . Terpentinfreie Öle, naturbelassene Öle Extraktionsöle . . . . . . . . . . . . . . Extrakte aus Ätherischöldrogen . . . . Blütenwässer, Blütenwasseröle, aromatische Wässer. . . . . . . . . . . . Aromastofe . . . . . . . . . . . . . . . . Parfüms . . . . . . . . . . . . . . . . . . Vorkommen . . . . . . . . . . . . . . . . Eigenschaten . . . . . . . . . . . . . . . Einige physikalische und organoleptische Eigenschaten. . . . . . . . . . Chemische Zusammensetzung . . . . .

948 949 951 951 980 989 989 990 992 996 996 998 1000 1001 1005

25.2.3 25.2.4 25.2.5 25.3 25.3.1

25.3.2 25.3.3 25.3.4 25.3.5 25.3.6 25.3.7 25.3.8 25.4 25.4.1 25.4.2 25.4.3 25.5 25.5.1 25.5.2

1007 25.5.3 1008 25.5.4 1013 1013 1014 1017

25.5.5 25.6 25.6.1

1023 1025 1025 1025 1025 1026 1026 1026 1027 1028 1028 1028 1029

25.6.2 25.6.3 25.6.4 25.6.5 25.6.6 25.6.7 25.7 25.8 25.8.1 25.8.2 25.8.3 25.8.4

Qualitätskontrolle . . . . . . . . . . . . Hinweise zur Lagerung und Aubewahrung . . . . . . . . . . . . . . Wirkungen . . . . . . . . . . . . . . . . Gewürze . . . . . . . . . . . . . . . . . Gewürze, Gewürzmischungen, Gewürzzubereitungen, gesundheitliche Aspekte des Würzens . . . . . . . . . . . . . . . . Galgant . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ingwerwurzelstock . . . . . . . . . . . . Koriander . . . . . . . . . . . . . . . . . Majoran . . . . . . . . . . . . . . . . . . Piment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Vanille . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Zimtrinde . . . . . . . . . . . . . . . . . Stomachika, Cholagoga, Carminativa Stomachika . . . . . . . . . . . . . . . . Cholagoga . . . . . . . . . . . . . . . . . Carminativa . . . . . . . . . . . . . . . . Ätherische Öle als Expektoranzien . . Vorstellungen zur Wirkweise . . . . . . Ätherische Öle, die bevorzugt inhalativ angewendet werden. . . . . . . . . . . . Bevorzugt systemisch oder relektorisch wirkende ätherische Öle . . . . . . . . . Ätherische Öle in Arzneiformen zum Lutschen . . . . . . . . . . . . . . . Ätherischöldrogen als Bestandteile von Brusttees . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ätherische Öle zur Mundplege und zum Gurgeln . . . . . . . . . . . . . . . Allgemeines über Mundsprays, Mundwässer und Gurgelwässer (Gargarismen) . . . . . . . . . . . . . . Ätherische Öle aus Mentha-Arten . . . Salbei und Salbeiöl . . . . . . . . . . . . hymianöl und hymol . . . . . . . . . Wintergrünöl . . . . . . . . . . . . . . . Myrrhe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Benzoe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ätherische Öle in Rhinologika . . . . Ätherische Öle als Zusatz zu Externa Übersicht. . . . . . . . . . . . . . . . . . Hyperämisierende Einreibungen . . . . Juckreizstillende Mittel (Antipruriginosa) . . . . . . . . . . . . Mittel zur Durchblutung der Kophaut . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1036 1040 1040 1044

1044 1045 1046 1050 1051 1053 1053 1054 1057 1057 1069 1078 1097 1097 1098 1105 1110 1111 1113

1113 1114 1118 1120 1121 1122 1123 1125 1125 1125 1125 1128 1131

XIX

Inhaltsverzeichnis

25.8.5 25.8.6

Antiseptika und Antiphlogistika . . . . Anhang: Nelkenöl und Eugenol in der konservierenden Zahnheilkunde . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1132

Phenolische Verbindungen . . . . . . . O. Sticher Allgemeine Einführung . . . . . . . . Deinition, Eigenschaten . . . . . . . . Dünnschichtchromatographie (DC), Farbreaktionen . . . . . . . . . . . . . . Biosynthetische Einordnung. . . . . . . Oxidative Kupplung von Phenolen . . . Enzymatische Bräunungsreaktionen . . Toxikologische Eigenschaten . . . . . . Phenolcarbonsäuren und Derivate . . Freie Phenolcarbonsäuren . . . . . . . . Ester mit anderen Säuren . . . . . . . . An Zucker glykosidisch gebundene Phenolcarbonsäuren . . . . . . . . . . . Einfache Phenolglykoside – Bärentraubenblätter . . . . . . . . . . . . . . . Cumarine . . . . . . . . . . . . . . . . . Allgemeine Merkmale . . . . . . . . . . Hinweise zur Analytik . . . . . . . . . . Beispiele für Cumarine als analytische Leitstofe . . . . . . . . . . . . . . . . . . Wirkungen. . . . . . . . . . . . . . . . . Lichtsensibilisierende Cumarine . . . . Cumarin, Cumarindrogen . . . . . . . Ammi-visnaga-Früchte . . . . . . . . . Lignane . . . . . . . . . . . . . . . . . . Einführung . . . . . . . . . . . . . . . . Lignane als analytische Leitstofe . . . . Kubeben . . . . . . . . . . . . . . . . . . Taigawurzel . . . . . . . . . . . . . . . . Podophyllin . . . . . . . . . . . . . . . . Indisches Podophyllin . . . . . . . . . . Guajakharz. . . . . . . . . . . . . . . . . Larrea-tridentata-Kraut . . . . . . . . . Flavonoide . . . . . . . . . . . . . . . . Geschichtliche Einleitung . . . . . . . . Bauprinzip, Einteilung . . . . . . . . . . Chalkone . . . . . . . . . . . . . . . . . Flavanone . . . . . . . . . . . . . . . . . Flavone und Flavonole . . . . . . . . . . Anthocyane . . . . . . . . . . . . . . . . Proanthocyanidine . . . . . . . . . . . .

1141

26 26.1 26.1.1 26.1.2 26.1.3 26.1.4 26.1.5 26.1.6 26.2 26.2.1 26.2.2 26.2.3 26.2.4 26.3 26.3.1 26.3.2 26.3.3 26.3.4 26.3.5 26.3.6 26.3.7 26.4 26.4.1 26.4.2 26.4.3 26.4.4 26.4.5 26.4.6 26.4.7 26.4.8 26.5 26.5.1 26.5.2 26.5.3 26.5.4 26.5.5 26.5.6 26.5.7

1133 1135

1143 1143 1143 1145 1145 1145 1145 1150 1150 1155 1161 1162 1165 1165 1166 1166 1168 1169 1171 1176 1178 1178 1178 1178 1181 1184 1185 1186 1187 1188 1188 1188 1188 1192 1193 1199 1201

26.5.8 26.5.9

Wirkungen der Flavonoide . . . . . . . Bioverfügbarkeit, Metabolismus und Pharmakokinetik . . . . . . . . . . . . . 26.5.10 Flavonoiddrogen . . . . . . . . . . . . . 26.6 Kava-Kava. . . . . . . . . . . . . . . . . 26.7 Cannabinoide. . . . . . . . . . . . . . . 26.8 Gerbstofe . . . . . . . . . . . . . . . . . 26.8.1 Catechingerbstofe (kondensierte Proanthocyanidine) . . . . . . . . . . . . . 26.8.2 Hydrolysierbare Gerbstofe (Gallotannine). . . . . . . . . . . . . . . 26.8.3 Anwendung der Gerbstofdrogen und Wirkungen der Gerbstofe . . . . . . . . 26.8.4 Bioverfügbarkeit und Toxikologie von Gerbstofen . . . . . . . . . . . . . . . . 26.8.5 Gerbstofdrogen und Reinstofe . . . . 26.9 Anthranoide . . . . . . . . . . . . . . . 26.9.1 Einleitung, Begrife . . . . . . . . . . . . 26.9.2 Chemie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26.9.3 Metabolismus und Pharmakokinetik . 26.9.4 Wirkweise . . . . . . . . . . . . . . . . . 26.9.5 Anwendung, Risiken und unerwünschte Wirkungen. . . . . . . . . . . . . . . . . 26.9.6 Faulbaumrinde . . . . . . . . . . . . . . 26.9.7 Kreuzdornbeeren . . . . . . . . . . . . . 26.9.8 Sennesblätter und Sennesfrüchte . . . . 26.9.9 Aloe. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26.9.10 Cascararinde. . . . . . . . . . . . . . . . 26.9.11 Rhabarberwurzel . . . . . . . . . . . . . 26.10 Johanniskraut. . . . . . . . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 27.1 27.1.1 27.1.2 27.1.3 27.1.4 27.1.5 27.1.6 27.1.7 27.2 27.3 27.4 27.4.1 27.4.2

Alkaloide . . . . . . . . . . . . . . . Rudolf Hänsel und Heinz Pertz Allgemeines . . . . . . . . . . . . . . Was sind Alkaloide? . . . . . . . . . Einteilung . . . . . . . . . . . . . . . Vorkommen . . . . . . . . . . . . . . Stofwechselphysiologische Aspekte Biochemisch-ökologische Aspekte . Bedeutung für die Arzneimittelforschung . . . . . . . . . . . . . . . Pharmazeutische Aspekte . . . . . . Chinolizidinalkaloide . . . . . . . . Pyrrolizidinalkaloide . . . . . . . . Tropanalkaloide . . . . . . . . . . . Chemischer Aubau, Vorkommen . Biosynthese . . . . . . . . . . . . . .

1205 1208 1213 1241 1244 1249 1249 1253 1254 1256 1257 1269 1269 1270 1277 1278 1281 1283 1284 1285 1288 1292 1294 1296 1306

. .

1315

. . . . . .

. . . . . .

1318 1318 1318 1320 1322 1325

. . . . . . .

. . . . . . .

1326 1331 1338 1340 1346 1347 1347

XX

Inhaltsverzeichnis

27.4.3 27.4.4 27.4.5 27.5 27.5.1 27.5.2 27.5.3 27.5.4 27.6 27.6.1 27.6.2 27.6.3 27.6.4 27.7 27.7.1 27.7.2 27.8 27.9 27.10 27.10.1 27.10.2 27.10.3 27.10.4 27.10.5 27.10.6 27.10.7 27.10.8 27.10.9 27.10.10 27.10.11 27.11 27.11.1 27.11.2 27.11.3 27.11.4 27.11.5 27.11.6 27.11.7 27.11.8 27.11.9 27.11.10 27.11.11 27.11.12

Drogen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Reinalkaloide . . . . . . . . . . . . . . . Calystegine und andere Polyhydroxyalkaloide . . . . . . . . . . . . . . . . . . Nicotianaalkaloide. . . . . . . . . . . . Chemie und Biochemie . . . . . . . . . Tabak und Tabakplanzen . . . . . . . . Tabak und Gesundheitsrisiken durch Tabakrauch . . . . . . . . . . . . . . . . Ökobiochemie . . . . . . . . . . . . . . Benzylisochinolinalkaloide . . . . . . Phytochemie: Untergruppen und deren biogenetische Beziehungen . . . . . . . Opium und Opiumalkaloide . . . . . . Drogen mit Protoberberin-Akaloiden Phthalidisochinolin-Alkaloide . . . . . Ipecacuanha-Alkaloide . . . . . . . . . Ipecacuanhawurzel und Zubereitungen Emetin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Lycorin und Galanthamin . . . . . . . Colchicin . . . . . . . . . . . . . . . . . Mutterkorn und Ergolinalkaloide . . Geschichtliches . . . . . . . . . . . . . . Secale cornutum . . . . . . . . . . . . . Inhaltsstofe . . . . . . . . . . . . . . . . Allgemeines zu Wirkungen der Mutterkornalkaloide . . . . . . . . . . . . . . . Ergometrin (Ergobasin, Ergonovin) . . Ergotamin . . . . . . . . . . . . . . . . . Toxische Wirkungen des Mutterkorns Saprophytische Kultur von ClavicepsArten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Biosynthesestudien . . . . . . . . . . . . Lysergsäureamide in höheren Planzen Hinweise zur Analytik . . . . . . . . . . Monoterpenoide Indolalkaloide . . . Chemischer Aubau . . . . . . . . . . . Sensorische Eigenschaten . . . . . . . . Verbreitung im Planzenreich . . . . . . Biosynthese . . . . . . . . . . . . . . . . Yohimbin . . . . . . . . . . . . . . . . . Rauwoliaalkaloide . . . . . . . . . . . . Catharanthusalkaloide . . . . . . . . . . Camptothecin . . . . . . . . . . . . . . . Ellipticin . . . . . . . . . . . . . . . . . . Strychnin und Brucin . . . . . . . . . . C-Toxiferin und Calebassen-Curare . . Chinarinde und Cinchonaalkaloide . .

1349 1355 1359 1362 1362 1364 1365 1367 1368 1368 1377 1386 1388 1390 1390 1393 1395 1397 1403 1403 1403 1404 1406 1407 1408 1409 1410 1411 1411 1411 1415 1416 1416 1416 1418 1418 1420 1424 1426 1428 1430 1432 1434

. . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . .

1442 1444 1445 1445 1446 1446 1449 1453 1453 1454 1455 1456 1459 1462 1463 1463

. . . . .

. . . . .

. . . . .

1464 1465 1466 1468 1468

. . . . . . . . .

. . . . . . . . .

. . . . . . . . .

1471 1471 1476 1477 1478 1485 1487 1488 1492

Das System der Spermatophyta: Übersicht über Ordnungen und Familien . . .

1495

Abkürzungen der Botanikernamen (Autoren der Planzennamen) . . . . . . . . . .

1505

Sachregister . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1515

Artnamenregister . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1561

27.12 27.13 27.13.1 27.13.2 27.13.3 27.13.4 27.13.5 27.13.6 27.13.7 27.13.8 27.13.9 27.13.10 27.13.11 27.13.12 27.13.13 27.13.14 27.13.15

Jaborandiblätter und Pilocarpin Purinalkaloide . . . . . . . . . . . Einschränkung des hemas . . . . Vorkommen . . . . . . . . . . . . . Biosynthetische Einordnung . . . Analytik . . . . . . . . . . . . . . . Wirkungen der Methylxanthine . Ökobiochemie . . . . . . . . . . . Cofeindrogen als Genussmittel . Kolasamen (Kolanuss) . . . . . . . Guarana (Guaranasamen) . . . . . Kafee . . . . . . . . . . . . . . . . Schwarzer und grüner Tee . . . . . Mate (Mateblätter) . . . . . . . . . Yoco . . . . . . . . . . . . . . . . . Kakaobohnen, Kakaoschalen . . . Cofeinhaltige Getränke und Limonaden. . . . . . . . . . . . . . 27.14 Terpenoide Alkaloide . . . . . . . 27.14.1 Aconitin und Pseudoaconitin . . . 27.14.2 Ryanodin. . . . . . . . . . . . . . . 27.14.3 Taxol (Paclitaxel) . . . . . . . . . . 27.15 Alkaloide mit exozyklisch angeordnetem Stickstof . . . . . . . . 27.15.1 Ephedrakraut und Ephedrin . . . 27.15.2 Kat (Kath) . . . . . . . . . . . . . . 27.15.3 Peyotl und Mescalin . . . . . . . . 27.15.4 Paprika und Capsaicinoide . . . . 27.15.5 Piper-Alkaloide . . . . . . . . . . . 27.15.6 heanin . . . . . . . . . . . . . . . Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Weiterführende Literatur . . . . . . . . . .

E

Anhänge

Autorenverzeichnis Prof. Dr. Susanne Alban Pharmazeutisches Institut Abteilung Pharmazeutische Biologie Christian-Albrechts-Universität zu Kiel Gutenbergstr. 76 24118 Kiel

Prof. Dr. Kurt Hostettmann Laboratoire de Pharmacognosie et de Phytochimie Section des Sciences Pharmaceutiques Université de Genève Quai Ernest-Ansermet 30 CH-1211 Genève 4

Prof. Dr. Wolfgang Blaschek Pharmazeutisches Institut Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie Christian-Albrechts-Universität zu Kiel Gutenbergstr. 76 24118 Kiel

Dr. Andrew Marston Laboratoire de Pharmacognosie et de Phytochimie Section des Sciences Pharmaceutiques Université de Genève Quai Ernest-Ansermet 30 CH-1211 Genève 4

Prof. Dr. Theodor Dingermann Institut für Pharmazeutische Biologie Universität Frankfurt Marie-Curie-Str. 9 60439 Frankfurt

Prof. Dr. Wolfgang Kreis Institut für Botanik und Pharmazeutische Biologie Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Staudtstraße 5 91058 Erlangen

Prof. Dr. Hans-Joachim Gabius Institut für Physiologische Chemie Tierärztliche Fakultät Ludwig-Maximilians-Universität Veterinärstr. 13 80539 München

Dr. Richard Lukačin Chromsystems Instruments & Chemicals GmbH Heimburg-Str. 3 81243 München

Prof. Dr. Rudolf Hänsel Westpreußenstraße 71 81927 München

Prof. Dr. Ulrich Matern Institut für Pharmazeutische Biologie Philipps-Universität Marburg Deutschhausstraße 17A 35032 Marburg.

Prof. Dr. Jörg Heilmann Institut für Pharmazie Lehrstuhl Pharmazeutische Biologie Universität Regensburg Universitätsstraße 31 93053 Regensburg

Prof. Dr. Heinz H. Pertz Institut für Pharmazie Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie Freie Universität Berlin Königin-Luise-Str. 2+4 14195 Berlin

XXII

Autorenverzeichnis

Prof. Dr. Harold Rüdiger Institut für Pharmazie und Lebensmittelchemie Universität Würzburg Am Hubland 97074 Würzburg Edda Spieß Erbstetter Straße 23 70374 Stuttgart Prof. Dr. Otto Sticher Lebernhöhe 22 CH-8123 Ebmatingen Erich A. Stöger Apotheker Bischoff-Hartl-Straße 8 83410 Lauffen

PD Dr. Markus Veit Westendstr. 17 86916 Kaufering Prof. Dr. rer. nat. Angelika Vollmar Institut für Pharmazeutische Biologie Zentrum für Pharmaforschung Butenandtstr. 5–13 81377 München Dr. Ilse Zündorf Johann Wolfgang Goethe-Universität Institut für Pharmazeutische Biologie Biozentrum Marie-Curie-Str. 9 60439 Frankfurt

Abkürzungsverzeichnis Im Abkürzungsverzeichnis sind folgende Abkürzungen aufgeführt: x Allgemeine Abkürzungen, x Abkürzungen analytischer Methoden, x Medizinische Abkürzungen, x Molekularbiologische Abkürzungen. Abkürzungen von Substanznamen sind nur in Einzelfällen aufgeführt. [D]D20 14C A

A Å AA AACC AACT AAS

Abb. ABC Ac AC ACE AChE (s. auch CHE) Ac-MVA-Weg (s. auch MEV) ACP ACS

Optische Drehung radioaktives Kohlenstoisotop als Suix hinter Symbolen für Zucker: Abkürzung für Säure (engl.: „acid“), z. B. GlcA = Glucuronsäure Absorption Ångström(einheit), 1 Å = 10–10 m „ascorbinic acid“, Ascorbat American Association of Cereal Chemists Acetoacetyl-CoA-thiolase „atomic absorption spectroscopy (spectrometry)“, Atomabsorptionsspektroskopie (-spektrometrie) Abbildung „ATP-binding cassette“ Acetyl Adenylatcyclase „angiotensin converting enzyme“, Angiotensinkonversionsenzym Acetylcholinesterase klassischer Acetat-MevalonatBiosyntheseweg (von „acetyl mevalonic acid“) „acyl carrier protein“, Acylcarrierprotein „acute coronary syndrom“, akutes Koronarsyndrom

ACT ACTH ADAS ADI ADP ADPG ADPR AES AGP AIDS

AK ALD AMD AMG AMP AP-1 Apaf-1 APC (APZ)

APCI APP aPTT AR Ara Arg Asn Asp ASS AT ATBC ATCC

„artemisinin combination therapy“ adrenokortikotropes Hormon „Alzheimer’s disease assessment scale“ „acceptable daily intake“ Adenosindiphosphat Adenosindiphosphatglucose Adenosindiphosphat-Ribose Atomemissionsspektralanalyse Arabinogalactan-Protein „acquired immunodeiciency syndrome“, erworbenes Immundefekt-, Immunmangel- oder Immunschwächesyndrom Antikörper Adrenoleukodystrophie altersbedingte Makuladegeneration Arzneimittelgesetz Adenosin-5ʹ-monophosphat „activator protein 1“, AktivatorProtein-1 [Transkriptionsfaktor] „apoptotic protease activating factor 1“ „antigen presenting cells“, Antigen präsentierende Zellen; APC auch für aktiviertes Protein „atmospheric pressure chemical ionization“ „amyloid precursor protein“ aktivierte partielle hromboplastinzeit Adenosinrezeptoren Arabinose Arginin Asparagin Asparaginsäure Acetylsalicylsäure Antithrombin D-Tocopherol-E-Carotene Prevention Study American Type Culture Collection

XXIV

Abkürzungsverzeichnis

ATP ATPase AUC

AZM BAH BAN BASYC BAz Bax BCG Bcl-2 Bcl-xL BfArM Bid BNaC BP BPH BRM BRS Bq BSE

Bz ºC C5a cADPR Caf CAM cAMP CARET

Adenosintriphosphat Adenosintriphosphatase „area under the plasma concentration time curve“, Fläche unter der Plasmakonzentrationszeitkurve Auszugsmittel Bundesfachverband der Arzneimittel-Hersteller „British approved name“ „bacterial synthesized cellulose“ Bundesanzeiger, herausgegeben vom Bundesminister für Justiz proapoptotisches Protein der Bcl-2Familie Bacillus Calmette-Guérin antiapoptotisches Protein der Bcl-2Familie antiapoptotisches Protein der Bcl-2Familie Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte proapoptotisches Protein der Bcl-2Familie „brain Na-channels“, Amiloridsensitive Na-Kanäle British Pharmacopoeia, Her Majesty’s Stationary Oice, London benigne Prostatahyperplasie (syn. Prostatahypertrophie) „biological response modiiers“ biologische Referenzsubstanz Becquerel; SI-Einheit der Radioaktivität „bovine spongiforme encephalopathie“, bovine spongiforme Enzephalopathie [Rinderwahnsinn] Benzoyl (Grad) Celsius; Maßeinheit für Temperatur Komplementfaktor zyklische AdenosindiphosphatRibose (E)-Cafeoyl „cell adhesion molecules“, Zelladhäsionsmoleküle zyklisches Adenosinmonophosphat E-Carotene and Retinol Eicacy Trial

CB CBG CD CDP cdks CE CF c-fos (c-Fos) CFTR CGI

cGMP CGRP CGTase CHD CHE (s. auch AChE) CHI CHS Ci CI Cinn c-jun (c-Jun) Cmax CMK CMP CMR CMS cpm c-myc CNV

CPMP

CoA-SH COSY CoV COX CPR

Cannabinoidrezeptoren cystolische E-Glucosidase „cluster of diferentiation“ Cytidindiphosphat Cyclinabhängige Kinasen „capillary electrophoresis“, Kapillarelektrophorese „continuous low“ Proonkogen [Transkriptionsfaktor] „cystic ibrosis transmembrane conductance regulator“ „clinical global impression“ [Nutzen-Risiko-Bewertung der Behandlung] zyklisches Guanosinmonophosphat „calcitonin gene-related peptide“ Cyclodextringlykosyltransferase „coronary heart disease“ Cholinesterase Chalkonlavonisomerase Chalkonsynthase Curie [wird heute in Bq angegeben] chemische Ionisation (E)-Cinnamoyl Proonkogen [Transkriptionsfaktor] maximaler Plasmaspiegel CDP-Me-Kinase Cytidinmonophosphat „cold and menthol sensitive receptor“ CDP-Me-Synthase „counts per minute“, Impulse pro Minute Proonkogen [Transkriptionsfaktor] „contingent negative variation“ [Sonderform der Elektroenzephalographie] Committee for Proprietary Medicinal Products, wissenschatlicher Beirat der Europäischen Arzneimittelbehörde Coenzym A „correlated spectroscopy“ Coronarviren Cyclooxygenase NADPH-Cytochrom P450-Oxidoreduktase

Abkürzungsverzeichnis

CR CRH CRS CS

CSE CT CTZ CVI CYP Cys G 20 d20 DA (Da) d

DAB

DAC

DAD DAT DB DBÄ DC (s. auch TLC) DCI DEPT DEV DFR DG DGDG DGE DHFR DHPR

„conditioned reaction“, bedingte bzw. konditionierte Reaktion „corticotropin releasing hormon“ chemische Referenzsubstanz „conditioned stimulus“, konditionierter Reiz; auch für Chondroitinsulfat Cholesterol-Synthese-Enzym „threshold cycle“ Chemorezeptortriggerzone chronische venöse Insuizienz Cytochrom P450 Cystein chemische Verschiebung Relative Dichte Dalton [Atommasseneinheit] Kennzeichnet als Vorsatz die Konigurationen am asymmetrischen C-Atom einer in Fischer-Projektion wiedergegebenen Verbindung Deutsches Arzneibuch, Deutscher Apotheker Verlag, Stuttgart, GoviVerlag, Pharmazeutischer Verlag GmbH, Eschborn Deutscher-Arzneimittel-Codex, Bundesvereinigung Deutscher Apothekerverbände, Govi-Verlag, Pharmazeutischer Verlag GmbH, Eschborn, Deutscher Apotheker Verlag, Stuttgart Diodenarray-Detektor Demenz vom Alzheimer-Typ „degree of branching“ Doppelbindungsäquivalente Dünnschichtchromatogramm, Dünnschichtchromatographie, dünnschichtchromatographisch direkte chemische Ionisation „distortionless enhancement by polarisation transfer“ Droge-Extrakt-Verhältnis Dihydrolavonolreduktase Dehydrogenase Digalactosyldiacylglycerol Deutsche Gesellschat für Ernährung Dihydrofolatreduktase Dihydropyridinrezeptor

5ʹ-DI DIC Dig (s. auch Dox) Di-OH-Bz DMAPP DNA DOPA DOX Dox (s. auch Dig) DOZ DP

5ʹ-Monodeiodinase disseminierte intravasale Gerinnung (Koagulation) Digitoxose Protocatechuoyl Dimethylallyldiphosphat Desoxyribonucleinsäure 3,4-Dihydroxyphenylalanin 1-Desoxy-d-Xylulose Digitoxose

Desoxyzucker „degree of polymerisation“, Polymerisationsgrad DPP „diferential pulse polarography“ DQF „double quantum iltered“ DS „degree of sulfatation“, Sulfatierungsgrad; auch für Substitutionsgrad und für Dermatansulfat DSM „diagnostic and statistical manual of mental disorders“ [American Psychiatric Association] Dte Digitalose DVT „deep vein thrombosis“, tiefe Venenthrombose DXP/MEP-Weg Nicht-Mevalonat-Biosyntheseweg (auch MEP) (von 1-Deoxy-d-xylulose-5phosphat/2C-Methylerythritol-4phosphat) DXR DXP-Reduktoisomerase DxS Dextransulfat DXS DXP-Synthase EBM „evidence-based medicine“, evidenzbasierte Medizin EBV Epstein-Barr-Virus EC Enzyme Commission; auch für Enzymkodex ECP „eosinophil cationic protein“, eosinophiles kationisches Protein „efective dose“, Efektivdosis. Die ED50 statistisch ermittelte Menge einer Substanz, die nach Verabreichung in der vorgeschriebenen Weise bei der Hälte der Versuchstiere eine bestimmte Wirkung hervorrut EDN Eosinophilen-deriviertes Neurotoxin

XXV

XXVI

Abkürzungsverzeichnis

EDQM EEG EF EGCG EGF(R) Egr-1 EI EKZ ELLA ELISA ELSD

EMEA

EMS EPL EPO EPSP EPX ER ERK ES ESCOP ESI ESR Extr. Extr. l. EZM f F FAB FACS FAD FADD

European Directorate for the Quality of Medicine Elektroenzephalogramm, Elektroenzephalographie Elongationsfaktor Epigallocatechin-3-O-gallat „epidermal growth factor (receptor)“ „early growth response-1“ [Transkriptionsfaktor] Elektronenstoß-Ionisation extrakorporaler Kreislauf (extrakorporale Zirkulation) „enzyme-linked lectin-binding assay“ „enzyme-linked immunosorbent assay“ „evaporative light scattering detector“, Verdampfungs-LichtstreuDetektor European Medicines Evaluation Agency, Europäische Zulassungsbehörde eosinophiles Myalgiesyndrom essentielle Phospholipide „eosinophil peroxidase“ exzitatorisches postsynaptisches Potential eosinophiles Protein X endoplasmatisches Retikulum; auch für Östrogen-Rezeptor „extracellular signal-regulated kinase“ Elektrospray European Scientiic Cooperation of Phytotherapy Elektrospray-Ionisation ElektronenspinresonanzSpektrometrie Extractum, Extrakt Extractum luidum, Flüssigextrakt extrazelluläre Matrix als Suix: Furanose Faktor „fast atom bombardment“ „luorescence activated cell sorting“, luoreszenzaktivierte Zellanalyse Flavinadenindinukleotid „fas-associated death domain“

FDA FGF FHT (F3H) FKS FLS fMLP fMRT FNS (FS) Fru FSH Fuc GA

GÄ GABA GACP GAPDH GAG Gal J-GT GAP GBG GC (s. auch GLC) GCP GDP GERRI GFC GGPP GH GLC Glc Glc-6-P Glc-6-DPG Gln Glu Gly GM-CSF (GMCSF)

Food and Drug Administration „ibroblast growth factor“ Flavanon 3E-Hydroxylase fötales Kälberserum Flavonolsynthase Formyl-methionyl-leucyl-phenylalanin funktionelle Magnetenzephalographie Flavonsynthase Fructose Follikel-stimulierendes Hormon Fucose „glycyrrhetic acid“, Glycyrrhetinsäure; auch „gibberellinic acids, “Gibberelline Glucoseäquivalent J-Aminobuttersäure „good agricultural and collection practice“ Glycerinaldehyd-3-phosphatDehydrogenase Glykosaminglykane Galactose J-Glutamyltransferase „good agricultural practice“ cytosolische E-Glucosidase Gaschromatogramm, Gaschromatographie, gaschromatographisch „good clinical practice“ Guanosindiphosphat „geriatric evaluation by relative’s rating instrument“ „gel iltration chromatography“ Geranylgeranyldiphosphat „growth hormone“, Wachstumshormon „gas liquid chromatography“ Glucose Glucose-6-phosphat Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Glutamin Glutaminsäure; in einzelnen Kapiteln für Glucuronsäure Glycin „granulocyte macrophage colony stimulating factor“ [Zytokin]

Abkürzungsverzeichnis

GMG GMP

GnRH GPC GPI GPT GRAS GSH GSSG GTP GZ h HA HAB

HAMA

HAMD

HC HCV H6D HDL HDS HeLa-Zellen

Helv

HER-2 HET-CAM

HETE H.I. His

GesundheitssystemModernisierungsgesetz „good manufacturing practice“ [WHO-Richtlinien]; auch für Guanosin-5’-monophosphat Gondadotropin-Releasing-Hormon „gel permeation chromatography“, Gelpermeationschromatographie Glykosylphosphatidylinositol Glutamattransaminase „generally recommended as safe“ reduziertes Glutathion oxidiertes Glutathion Guanosintriphosphat Glycyrrhizinsäure Stunde „hyaluronic acid“, Hyaluronsäure Homöopathisches Arzneibuch, Deutscher Apotheker Verlag, Stuttgart, Govi-Verlag, Frankfurt/ Main „Hamilton anxiety scale“. Hamilton Angst-Skala [Bewertung von Angstzuständen] „Hamilton rating scale for depression“, Hamilton DepressionsSkala [Bewertung von Depressionen] „heparin cofactor“ Hepatitis C Virus Hyoscyamin-6-dioxygenase „high density lipoproteins“, Lipoproteine hoher Dichte HMBPP-Synthase „human epithelial cervical carcinoma cells“ [Zellen einer etablierten Carcinoma-Zellinie einer Frau Henrietta Lacks] Pharmacopoea Helvetica, Eidgenössische Drucksachen- und Materialzentrale, Bern HER-2 Neuonkogen „hen’s egg chorioallantoic membrane test“, Hühnerei-Test an der Chorion Allantois Membran Hydroxyeicosatetraensäure hämolytische Aktivität Histidin

HIT HIV

HLA HLB HLE HMBC HMBPP HMG-CoA HMGR HMGS HMP HO-Bz HPA

HPETE HPLC

HPTLC

HRT HS HSCCC HSQC HSV 5-HT HVL HWZ IA IBS IC50

ICAM-1 ICBN

Heparin-induzierte hrombozytopenie „human immunodeiciency virus“, humanes Immundeizienzvirus humane Leukozytenantigene „hydrophil-lipophil balance“ humane Leukozytenelastase „heteronuclear multiple bond correlation” Hydroxymethylbutenyl-4-diphosphat Hydroxymethylglutaryl-CoA HMG-CoA-Reduktase HMG-CoA-Synthase „herbal medicinal products“ p-Hydroxybenzoyl „hypothalamic-pituitary-adrenal”, Hypothalamus-Hypophyse-Nebennierenrinde Hydroxyperoxyeicosatetraensäure „high performance liquid chromatography, Hochleistungslüssigkeitschromatographie „high performance thin layer chromatography, Hochleistungsdünnschichtchromatographie „hormone replacement therapy“ Heparansulfat „high-speed countercurrent chromatography“ „heteronuclear single quantum coherence“ Herpes-simplex-Virus 5-Hydroxytryptamin (Serotonin) Hpophysenvorderlappen Halbwertszeit instabile Angina pectoris „irritable bowel syndrom“, Reizdarmsyndrom „inhibitory concentration“. Die statistisch ermittelte Konzentration einer Substanz, die eine Hemmung von 50% verursacht „intercellular adhesion molecule 1“, interzelluläres Ädhäsionsmolekül 1 Internationaler Code der botanischen Nomenklatur

XXVII

XXVIII

Abkürzungsverzeichnis

ICD

„international classiication of diseases“ [WHO] ICH International Conference on Harmonization, Internationale Harmonisierungskonferenz ID Säuleninnendurchmesser IDS IPP/DMAPP-Synthase I.E. Internationale Einheit IEC „ion exchange chromatography“, Ionenaustauschchromatographie IFN Interferon Ig Immunglobulin INB Inhibitor von NF-NB IKK INB-Kinasekomplex IL Interleukin Ile Isoleucin i.m. intramuskulär IMP Inosin-5ʹ-monophosphat INADEQUATE „incredible natural abundance double quantum transfer“ INN „international nonproprietary name“, internationaler Freiname iNOS „inducible nitric oxid synthase“, induzierbare Nitroxidsynthase i.p. intraperitoneal IPP Isopentenyldiphosphat IPSP inhibitorisches postsynaptisches Potential IR Infrarot IRMS „isotope ratio mass spectrometry“, Isotopenverhältnisspektrometrie ISF Isolavonsynthase ISO International Standard Organization itol als Suix für Zuckeralkohole IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry i.v. intravenös IZ Iodzahl J Kopplungskonstante Jak Januskinase JNK „c-jun N-terminal kinase“ Kap. Kapitel kDA Kilodalton KG Körpergewicht KI Kristallinitätsindex kGy Kilogray KHK Koronare Herzerkrankung KS Keratansulfat

KSHV Kt KUVA

l

l O LAR LBR LC

LD50

LDH LDL LDOX LDPP LE LH LMBG LOX LPH LPS LSD LT Lys m P m/m m/V MAC (MAK)

„Karposi sarcoma-associated herpes virus“ Karat herapie mit Khellin (K) plus langwelligem ultravioletten Licht (UVA) Kennzeichnet als Vorsatz die Koniguration am asymmetrischen C-Atom einer in Fischer-Projektion wiedergegebenen Verbindung Liter Wellenlänge Leukoanthocyanidinreduktase Liebermann-Burchard-Reaktion „liquid chromatography“, Flüssigkeitschromatographie; auch für „Langerhans cells“, Langerhans-Zellen „lethal dose“, mittlere lethale Dosis. Die statistisch ermittelte Menge einer Substanz, die nach Verabreichung in der vorgeschriebenen Weise den Tod der Hälte der Versuchstiere innerhalb einer bestimmten Zeit herbeiführt Lactatdehydrogenase „low density lipoproteins“, Lipoproteine niedriger Dichte Leukanthocyanidindioxogenase Labdadienyldiphosphat Lungenembolie „luteinizing hormone“, luteinierendes Hormon Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetz Lipoxygenase Lactase-Phlorizinhydrolase Lipopolysaccharide Lysergsäurediethylamid Leukotrien Lysin meta Symbol für das Präix Mikro (10–6) Masse in Masse [Konzentrationsangabe] Masse in Volumen [Konzentrationsangabe] „membrane attack complex“, membranangreifender Komplement-

Abkürzungsverzeichnis

MAGL MALDI MAO MAPK MBP MCCh MCI MCS MDHA MDO MDR MEG MEKK MEP-Weg (s. auch DXP/MEP) meso

MEV-Weg (s. auch Ac-MVA) MG MGDG MHC

MHK MI

min MIP MMP MPLC

komplex; MAC auch für „macrophage antigen“ Monoacylglycerollipase „matrix-assisted laser chemical ionization“ Monoaminooxidase „mitogen-activated protein kinase“, mitogenaktivierte Proteinkinase „major basic protein“ mikrokristallines Chitosan „mild cognitive impairment“ „multiple chemical sensitivity“; auch Me-cPP-Synthase Monodehydroascorbatradikal „membrane-derived oligosaccharide“ „multi-drug resistance“ Magnetenzephalographie Kinase des INB Kinasekomplexes 2-Methylerithrolphosphat-Weg

Präix zur Kennzeichnung organischer Verbindungen mit symmetrischer Molekülform und kompensierten Asymmetriezentren, d. h. optisch inaktive Moleküle klassischer Acetat-MevalonatBiosyntheseweg Molekulargewicht [heute relative Molekülmasse Mr] Monogalactosyldiacylglycerol „major histocompatibility complex“, Haupthistokompatibilitätskomplex; auch für MHC-Antigene minimale Hemmkonzentration he Merk Index, an encyclopedia of chemicals, drugs und biologicals, Budavari (ed), Merck Laboratories, Whitehouse Station, NJ Minute „macrophage inlammatory protein“ „matrix metalloproteinase“, MatrixMetalloproteinase „medium pressure liquid chromatography“, Mitteldrucklüssigkeitschromatographie

MPO Mr MRS MRT MS

MT MTOC

MVA MVK nD20 N NAc

NAD NAD-H

NADP NADP-H

NAT NCCAM

NF-AT NF-NB NEL NIK NIR NK NMH NMR

Myeloperoxidasesystem; auch für Methylputrescinoxidase relative Molekülmasse „menopause rating scale“ Magnetresonanztomographie; auch für mittlere Verweildauer Massenspektrum, Massenspektrometrie; auch für multiple Sklerose Mikrotubulus „microtubule organizing center“, mikrotubuläres Organisationszentrum „mevalonic acid“, Mevalonsäure Mevalonat-Kinase Brechungsindex als Suix für Aminozucker (z. B. GlcN = Glucosamin) als Suix für acetylierte Aminozucker (z. B. GalNAc = N-Acetyl-Galactosamin) Nicotinamid-adenin-dinukleotid Nicotinamid-adenin-dinukleotid (NADH) (reduzierte Form) Nicotinamid-adenin-dinukleotidphosphat Nicotinamid-adenin-dinukleotid(NADPH) phosphat (reduzierte Form) N-Acetyltransferase National Center for Complimentary and Alternative Medicine; Nationales Zentrum für komplimentäre und alternative Medizin der USA „nuclear factor of activated T cells“ [Transkriptionsfaktor] „nuclear factor NB“ [Transkriptionsfaktor] „no efect level“ „NF-NB-inducing kinase“ [Kinase des INB Kinasekomplexes] nahes Infrarot natürliche Killerzellen niedermolekulare Heparine „nuclear magnetic resonance“, Kernmagnetische Resonanz, Kernspinresonanz

XXIX

XXX

Abkürzungsverzeichnis

NNRTI NNT NO NOE NOESY Nramp NRTI NSAIDs

NSTEMI

NYHA o ÖAB

ODC OHZ OPC OPLC

Orn p PA PAF PAL

PAMP pAVK PARP PBMC

nichtnukleosidische ReverseTranskriptase-Inhibitoren „number needed to treat“ „nitric oxide“, Stickstofmonoxid „nuclear Overhauser efect“, KernOverhauser-Efekt „nuclear Overhauser enhancement and exchange spectroscopy“ natürliches resistenzassoziiertes Makrophagenprotein nukleosidische ReverseTranskriptase-Inhibitoren „non steroidal anti-inlammatory drugs“, nichtsteroidale Antiphlogistika „non ST elevation myocardial infarction, Myokardinfarkt ohne ST-Streckenerhebungen New York Heart Association ortho Österreichisches Arzneibuch, Verlag der Österreichischen Staatsdruckerei, Wien Ornithindecarboxylase Hydroxylzahl oligomere Proanthocyanidine „over pressure layer chromatography“, Überdruckschichtchromatographie Ornithin Als Präix: para, als Suix: Pyranoseform Pyrrolizidinalkaloide; auch für Proanthocyanidine verwendet „platelet activating factor“, Plättchenaggregationsfaktor Phenylalanin AmmoniumLyase, Phenylalanin-AmmoniakLyase pathogenassoziierte Molekularmuster periphere arterielle Verschlusskrankheit Poly(ADP-ribose)polymerase [Caspase-Substrat] „human peripheral blood mononuclear cells“, humane periphere mononukleare Blutzellen

PC PCI

PCR p-Cum PDE PEP PET PF PI3K PG PGHS P-gp pH Phe PhEur

Pi PMD PMK PK PL PMA PMNL

PMS PMT p.o. POD POMS

Papierchromatographie; auch für Phosphatidylcholin „percutaneous coronary intervention“, perkutane koronare Intervention [Herzkatheterisierung] „polymerase chain reaction“, Polymerasekettenreaktion p-(E)-Cumaroyl Phosphodiesterase Phosphoenolpyruvat „positron emission tomography“, Positronenemissionstomographie „platelet factor“ Phosphatidylinositol-3-kinase Prostaglandine; auch für Proteoglykane verwendet Prostaglandin-H2-Synthasen P-Glykoprotein negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoionenkonzentration Phenylalanin European Pharmacopoeia, Council of Europe, Strasbourg (englische Originalausgabe) bzw. Europäische Pharmakopöe, Deutsche/Schweizer Ausgabe, Deutscher Apotheker Verlag, Stuttgart. Mit wenigen Ausnahmen sind die 5. Ausgabe 2005 und Nachträge der 5. Ausgabe zitiert anorganisches Phosphat Phosphomevalonat-Decarboxylase Phosphomevalonat-Kinase Proteinkinase Phospholipase; auch für Phospholipide „phorbol myristate acetate“ „polymorphonuclear leukocytes“, polymorphkernige neutrophile Leukozyten prämenstruelles Syndrom Putescin-N-methyltransferase per os, peroral Peroxidasen „proile of mood scale“ [Selbstbeurteilungsskala zur Erfassung wechselnder Stimmungszustände]

Abkürzungsverzeichnis

PONV

POZ PPC PPi ppm PPT PPW Pro PS PSE PTCA

PTK PUVA

PXR R R rac. RANTES RAR RCT

Rf

RFA Rha RHmVO RIA RIP RNA RNS

„postoperative nausea and vomiting“, Erbrechen in der postoperativen Phase Peroxidzahl polymere Proanthocyanidine anorganisches Diphosphat „parts per million“ partielle hromboplastinzeit Pentosephosphatweg Prolin Phytosterole; auch für Polysaccharide verwendet Phytosterol-/Stanolester „percutaneous transluminal coronary angioplasty“, perkutane transluminale koronare Angioplastie Proteintyrosinkinase herapie mit Psoralen (P) plus langwelligem ultravioletten Licht (UVA) Pregnan-X-Rezeptor Symbol für einen unbestimmten organischen Rest Symbol zur Festlegung der absoluten Koniguration Racemisch [Racemat, Enantiomerengemisch] „regulated on activation, normal T-cell expressed and secreted“ „retinoic acid receptor“, Retinoidrezeptor „randomized clinical trial“, randomisierte plazebokontrollierte Doppelblindstudie „retention factor“, Rf-Wert. In der Chromatographie der Quotient aus Laufstrecke der Substanz zur Laufstrecke der mobilen Phase Röntgenluoreszenzanalyse Rhamnose RückstandshöchstmengenVerordnung „radioimmunosorbent assay“ [zur Immunoisotopendiagnostik] ribosomeninaktivierende Proteine Ribonucleinsäure „reactive nitrogen species“, reaktive Stickstofspezies

ROESY ROS RP Rst

RT RTM Rul RXR RyR2 S s SALT SAR SARS

SC s.c. SCP Schmp Ser SERCA SERM

SGLT-1

SH SIRA SIRS SL s.l.

„rotating frame nuclear Overhauser efect spectroscopy“ „reactive oxygen species“, Reaktive Sauerstofspezies „reversed phase“ In der Chromatographie der Quotient aus Laufstrecke der Substanz zur Laufstrecke einer Referenzsubstanz „reverse transcriptase“, Reverse Transkriptase „regression towards the mean“, Regression zum Mittelwert Ribulose „retinoid X receptor“, Retinoidrezeptor Ryanodinrezeptor Symbol zur Festlegung der absoluten Koniguration Sekunde „skin-associated lymphoid tissue“, hautassoziiertes Immunsystem „structure-activity relationship“ „severe acute respiratory syndrome”, schweres akutes Atemwegssyndrom Säulenchromatographie subkutan „single cell protein“ Schmelzpunkt Serin „sarco-endoplasmatic reticulum Ca2-ATPase“ „selective estrogen receptor modulator“, selektiver Östrogenrezeptormodulator „sodium glucose transporter 1“, natriumabhängiger Glucosetransporter-1 Sulhydrylgruppe „stable isotope ratio analysis“ systemisches inlammatorisches Response-Syndrom Sesquiterpenlacton; auch für Sulfolipid „sensu latiore“, im weiten oder weiteren Sinn. In der Taxonomie so viel wie Sammelart

XXXI

XXXII

Abkürzungsverzeichnis

SMase SNIF SOD SPiNEM SR SRS SSHA SSRI

STAT STEMI

SZ t1/2 TCA TCM TEER

TF TFPI TGF

TH THC TLC hr Tinct. tmax TMS TNF TOCSY TPA TR I TR II tRNA TRP Trp (s. auch Try)

Sphingomyelinase „site speciic natural isotope fractionation“ Superoxiddismutase sekundäre Planzenstofe in Nahrungsergänzungsmitteln Sarkoplasmatisches Retikulum „slow reactive substance“ „semisynthetic heparin analogue“ „selective serotonin reuptake inhibitors“, selektive Serotoninwiederaufnahmehemmer „signal transducer and activator of transcription“ „ST elevation myocardial infarction“, Myokardinfarkt mit ST-Streckenerhebungen Säurezahl Eliminationshalbwertszeit Tricarbonsäurezyklus Traditionelle Chinesische Medizin „transepithelial electrical resistance“, transepithelialer elektrischer Widerstand „tissue factor“, Gewebefaktor „tissue factor pathway inhibitor“ „ransforming (tumor) growth factor“, transformierender Wachstumsfaktor T-Helferzellen Tetrahydrocannabinol „thin layer chromatography“ hreonin Tinctura, Tinktur Zeit bis zum Erreichen von Cmax Tetramethylsilan „tumor necrosis factor“, Tumornekrosefaktor „total correlation spectroscopy“ 12-O-Tetradecanoylphorbol-13Acetat tropinbildende Tropinonreduktase pseudotropinbildende Tropinonreduktase transfer-RNA „transient receptor potential“ Tryptophan

TSE TSH

TSP Try (s. auch Trp) TX Tyr UDP(G) UE UFH USP

UR US UTP UV UV 254 (365) nm Van VEGF(R)

VIP VLC

V/V (v/v) Val var. VLDL

VR VTA VTE VZ

„transmissible spongiforme encephalopathies“ „thyreoid-stimulating hormone“, thyreotropes Hormon des Hypophysenvorderlappens hermospray Tryptophan Tromboxane Tyrosin Uridindiphosphat (-glucose) Untereinheit unfraktioniertes Heparin he United States Pharmacopeia, he United States Pharmacopeial Convention, Inc. Rockville, MD „unconditioned reaction“, unkonditionierte Reaktion „unconditioned stimulus“, unkonditionierter Reiz) Uridintriphosphat Ultraviolett [visuell nicht mehr wahrnehmbares Licht] ultraviolettes Licht bei einer Wellenlänge von 254 (365) nm Vanilloyl „vascular endothelial cell growth factor (receptor)“, vaskularer endothelialer Wachstumsfaktor (-rezeptor) Vasoaktives intestinales Polypeptid „vacuum liquid chromatography“, Vakuum-Flüssigkeitschromatographie Volumen in Volumen [Konzentrationsangabe] Valin Varietät „very low density lipoproteins“, Lipoproteine sehr niedriger Dichte Vanilloidrezeptor ventrales Tegmentum „venous thromboembolism“, venöse hromboembolien Verseifungszahl

Abkürzungsverzeichnis

WHO WOMACIndex

World Health Organization, Weltgesundheitsorganisation Western Ontario Mac Master University-Index [OsteoarthritisIndex; Schmerzskala]

XMP Xyl ZNS ZP ZZR

Xanthosin-5ʹ-monophosphat Xylose Zentralnervensystem Zwischenprodukte Zlatkis-Zak-Reaktion

XXXIII

A A Phytochemische Grundlagen 1

Prinzipien des Sekundärstoffwechsels

–3

2

Einführung in die Analytik sekundärer Pflanzenstoffe anhand ausgewählter Beispiele – 31

3

Grundzüge der Biosynthese sekundärer Pflanzenstoffe – 61

4

Postbiosynthetische Umsetzung und Akkumulation sekundärer Pflanzenstoffe – 79

1 1 Prinzipien des Sekundärstoffwechsels W. Kreis 1.1

Ana-, Kata- und Amphibolismus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4

1.2

Primär- und Sekundärstofwechsel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5

1.3

Zusammenhang zwischen Primär- und Sekundärstofwechsel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

8

1.4

Auklärung von Biosynthesewegen . . . . . . . . . . . 1.4.1 Tracer- oder Isotopentechnik . . . . . . . . . . . 1.4.2 Enzymatische Methoden . . . . . . . . . . . . . . 1.4.3 Genetische und molekulargenetische Methoden

. . . .

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18 18 21 25

Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

30

4

1

Prinzipien des Sekundärstoffwechsels

1.1 Ana-, Kata- und Amphibolismus > Einleitung Pflanzen und Mikroorganismen produzieren eine zunächst unüberschaubar anmutende Vielfalt von Naturstoffen, deren Bedeutung für die Produzenten selbst nicht offensichtlich ist, da diese Verbindungen für einen funktionierenden Zellstoffwechsel sowie Zellwachstum und -teilung nicht notwendig sind. Man fasst diese Metaboliten, zu denen auch die Mehrzahl der pharmazeutisch genutzten Pflanzenstoffe zählt, als sekundäre Naturstoffe zusammen und stellt sie den ubiquitär vorkommenden Produkten des Primärstoffwechsels, wie z. B. Aminosäuren, Zuckern, Nukleotiden, Vitaminen und Fettsäuren, gegenüber. Während die Biosynthesewege des Primärstoffwechsels, die zu den Bausteinen der Proteine, Nucleinsäuren, Kohlenhydrate und Fette führen, in fast allen Organismen vorhanden und in sehr ähnlicher Weise ausgebildet sind, bleiben bestimmte Wege des Sekundärstoffwechsels häufig auf wenige Taxa beschränkt. Alle Sekundärstoffe lassen sich aus Bausteinen des Primärstoffwechsels herleiten. Die Grundgerüste einiger Aminosäuren findet man in den Alkaloiden wieder, Essigsäure wird über Mevalonsäure bzw. Malonsäure zur Synthese von Terpenoiden bzw. Polyketiden verwendet. Man kann die Bildung sehr vieler Sekundärstoffe auf drei biosynthetische Prinzipien, nämlich die Isopren-, die Acetat- und die Aminosäureregel zurück führen. Mit der biosynthetischen Sichtweise lässt sich die Vielfalt der Produkte des Sekundärstoffwechsels besser ordnen und verstehen als durch die rein strukturchemische Betrachtung. Die exakte Zuordnung eines bestimmten Sekundärstoffes zu einer bestimmten Stoffgruppe erfordert unter Umständen die genaue Kenntnis des Biosyntheseweges. Solche Biosynthesewege, die Ausschnitte eines kompliziert verflochtenen metabolischen Netzwerks darstellen, können mit Hilfe von chemischen und spektroskopischen Verfahren unter Verwendung radioaktiver oder schwerer Isotope aufgeklärt werden. Außerdem werden biochemische, genetische und molekulargenetische Methoden genutzt.

Unter Stofwechsel oder Metabolismus versteht man die Gesamtheit der in einem lebenden Organismus ablaufenden chemischen Reaktionen. Man unterscheidet drei Stofwechselbereiche: den Anabolismus, den Katabolismus und den Amphibolismus. Anabolismus. Der Anabolismus (Assimilation) umfasst

die pauschal endergonen Prozesse, die für den Aubau energiereicher Substanzen aus den energieärmeren verantwortlich sind; der Katabolismus (Dissimilation) umfasst die pauschal exergonen Prozesse, d. h. die Abbauprozesse des Stofwechsels. Der Anabolismus ist der divergierende Stofwechselzweig; letztlich entsteht aus CO2 , H2O und NH3 die gesamte Vielfalt der Biomoleküle. Katabolimus. Der Katabolismus ist der konvergierende Stofwechselzweig: Die vielfältigen Biomoleküle werden in einfache Stofe, letztlich bis zu CO2 , H2O und NH3 zerlegt. Zwar sind auf bestimmte Strecken hin Anabolismus und Katabolismus durch reversible Reaktionen miteinander verknüpt, doch verlaufen die abbauenden und die ihnen jeweils korrespondierenden aubauenden Stofwechselprozesse in der Zelle räumlich voneinander getrennt ab; auch die durchlaufenen Reaktionsketten sind in der Regel nicht identisch. Amphibolismus. Unter Amphibolismus (griech.: amphi

[auf beiden Seiten, doppelt]) versteht man Phasen des Ineinanderumsetzens (Interkonversion) von Stofwechselprodukten als Kreuzungsbereich zwischen abbauenden und aubauenden Reaktionsketten und/oder Reaktionszyklen. Das typische Beispiel eines amphibolen Stofwechselweges ist bei grünen Planzen und anderen aeroben Organismen der Citratzyklus (Tricarbonsäurezyklus): So ist z. B. Acetyl-SCoA (Acetylcoenzym A) ein gemeinsames Zwischenprodukt des Abbaus von Fetten, Kohlenhydraten und von Aminosäuren. Acetyl-SCoA kann entweder – in Verbindung mit der Atmungskette – weiter zur Energiegewinnung abgebaut oder aber als Substrat für die Synthese zahlreicher Substanzen ( > Tabelle 1.1) herangezogen werden. Wenn Acetyl-SCoA oder andere Zwischenstufen des Citratstofwechsels (z. B. Pyruvat, SuccinylSCoA) für die Verwendung als biosynthetische Vorstufen entnommen werden, würde der Zyklus an Zwischenstufen verarmen und käme schließlich zum Erliegen, wenn nicht durch so genannte anaplerotische (griech.: anaplerein

1.2 Primär- und Sekundärstoffwechsel

1

. Tabelle 1.1 Wichtige Stoffwechselwege des Grundstoffwechsels Stoffwechsel

Anabol: Biosynthesen

Katabol: Abbau

Kohlenhydrate

Photosynthese, Calvin-Zyklus, C4-SäureZyklus, Gluconeogenese

Hydrolytische Spaltung der Kohlenhydrate, Glykolyse, Pentosephosphatzyklus

Fette

Lipidsynthese: Fettsäure-Synthase-Komplex, Acylglyceride, Phospholipide, Glykolipide, Carotinoide, Sterole

Hydrolytische Spaltung der Fette, β-Oxidation der Fettsäuren

Proteine

Biosynthese der Aminosäuren und Proteine (Translation)

Hydrolytische Spaltung der Proteine, Abbau und Umbau der Aminosäuren (Decarboxylierung, Desaminierung, Transaminierung)

Acetylcoenzym A

Kohlenhydrate, Fettsäuren, Aminosäuren, Ketogenese, Terpene, Steroide

Citratzyklus, Atmungskette, Glyoxylatzyklus

Nucleinsäuren

Biosynthese von Purin- und Pyrimidinnukleotiden, von RNA, Replikation von DNA, Bildung von Flavinen und Pteridinen aus GTP

DNA- und RNA-Spaltung

[aufüllen]) Prozesse diese Zwischenprodukte ersetzt würden. Lipidmobilisierung und Einschleusen von AcetylSCoA sei als Beispiel einer anaplerotischen Reaktion genannt.

1.2 Primär- und Sekundärstoffwechsel Primärstoffwechsel. Der Primärstofwechsel dient in ers-

ter Linie der Erhaltung des Lebens und der Vermehrung. Im Primärstofwechsel (syn.: Grundstofwechsel) von Planzen, Tier und Mensch sowie von prokaryotischen Mikroorganismen zeigt sich große Übereinstimmung. Die Einheit lebender Materie zeigt sich vor allem im Folgenden: 1. Der genetische Code ist für alle Organismen derselbe: Die Zuordnung der jeweiligen Nukleotidtriplets zu bestimmten Aminosäuren ist für alle Organismen, vom Bakteriophagen bis zum Menschen, die gleiche. Der genetische Code ist aber „degeneriert“, d. h. für identische Aminosäuren codieren unterschiedliche Nukleotidtriplets. Tatsächlich nutzen die unterschiedlichen Organismen bestimmte Kodons bevorzugt („codon usage“). Dies ist bei der Übersetzung von Proteinsequenzen in Nucleinsäuresequenzen (z. B. zur Herstellung von Oligonukleotid-Primern im Rahmen molekularbiologischer Ansätze zum Verständnis des Sekundärstofwechsels) zu berücksichtigen.

2. Alle Zellen benützen zur Energiespeicherung und zum Energietransfer Phosphate, besonders ATP. 3. Alle Zellen synthetisieren und speichern ähnliche Stofe – Fette, Kohlenhydrate und Proteine –, wobei sie ähnliche Stofwechselwege benützen. Die Stofe werden katabolisch in den meisten Zellen auf ähnliche Weise abgebaut. 4. Die Stofwechselreaktionen werden durch bestimmte Proteine, die Enzyme, katalysiert. Proteine ähnlicher Funktion zeigen organismenunabhängig häuig ähnliche dreidimensionale Strukturen sowie ähnliche Aminosäuresequenzen. Dies ist die Grundlage vieler molekularbiologischer Ansätze zur Auklärung von Biosynthesewegen ( > Kap. 1.4). 5. Es existiert eine beschränkte Zahl ubiquitär (überall vorkommender) niedermolekularer Verbindungen, von denen lebenswichtige Stofwechselprozesse abhängen. Dazu zählen bestimmte Kofaktoren von Enzymsystemen (hiamin, Nicotinsäureamid, Flavine, Hämine, Pyridoxal, Panthotensäure).

! Kernaussage

Der Primärstoffwechsel umfasst alle Stoffe und Prozesse, die für Wachstum und Entwicklung des Individuums unentbehrlich sind. Gekennzeichnet ist der Primärstoffwechsel dadurch, dass er universell und einheitlich ist und sich auch unter evolutionären Einflüssen wenig verändert hat.

5

6

1

Prinzipien des Sekundärstoffwechsels

Sekundärstoffwechsel. Dem Grund- oder Primärstofwechsel stellt man den Sekundärstofwechsel (spezieller Stofwechsel) gegenüber, bei dem nicht die Gemeinsamkeiten, sondern gerade die Unterschiede im Stofwechsel der verschiedenen Organismentypen vergleichend gegenüber gestellt werden. Der Sekundärstofwechsel ist sehr variabel ausgeprägt. Viele Gene des Sekundärstofwechsels haben sich möglicherweise durch Genduplizierungen und anschließende Mutation oder Neuorganisation aus Genen des Primärstofwechsels entwickelt. Besonders einsichtig ist dieses Prinzip bei der Erklärung der strukturellen und mechanistischen Ähnlichkeit der mikrobiellen Polyketidsynthasen mit der Fettsäuresynthase. Bei Mikroorganismen liegen Biosynthesegene häuig als so genannte Gencluster vor, d. h. die einzelnen Enzyme einer bestimmten Biosynthese werden von Genen codiert, die in enger Nachbarschat zueinander liegen und teilweise gemeinsame regulatorische Elemente besitzen. Stofwechselwege darf man sich nicht als zweidimensionale Strecken vorstellen, die von A über B nach C und schließlich zum Produkt P führen, sondern eher als multidimensionale metabolische Netze („metabolic grid“). Zwischenprodukte eines Stofwechselweges können daher vielfältig genutzt und verbaut werden. Andrerseits können Bausteine aus anderen Stofwechselnetzen eingespeist werden. Dies ist zu berücksichtigen, wenn Stofwechselwege mit Hilfe molekularbiologischer Techniken modiiziert werden sollen („metabolic engineering“, > Kap. 1.4).

! Kernaussage

Der Sekundärstoffwechsel umfasst alle Stoffe und Prozesse, deren Funktionen allenfalls die Wechselbeziehungen des Individuums mit seiner Umwelt betreffen können. Der Sekundärstoffwechsel ist entbehrlich für Wachstum und Entwicklung des isoliert betrachteten Individuums, jedoch unentbehrlich für die Existenz und den Fortbestand der Art in ihrer Umwelt.

Produkte des Sekundärstoffwechsels. Produkte des Sekundärstofwechsels nennt man sekundäre Naturstofe. Der Zusatz „sekundär“ impliziert, dass diese Produkte aus bekannten und ubiquitären Metaboliten des Primärstofwechsels gebildet werden. Obwohl eine didaktische Trennung zwischen Primär- und Sekundärstofwechsel

üblich ist, sollte man eingestehen, dass eine allzu strikte Trennung der Betrachtung von primären und vermeintlich sekundären Stofwechselprodukten biologisch und physiologisch wenig sinnvoll ist. Phytosterole sind Produkte des Primärstofwechsels, während nur geringfügig modiizierte Derivate der Phytosterole als Steroidsaponine den Sekundärstofen zugeordnet werden. Die Ansicht, ob es sich bei einer bestimmten Substanz um einen Primär- oder Sekundärstof handelt, kann sich mit der Zeit auch ändern. So wurde die Shikimisäure ursprünglich als ein sekundärer Naturstof (isoliert aus Shikimi (jap.), dem Gitigen Sternanis Illicium religiosum Siebold & Zucc.) angesprochen, bevor sich herausstellte, dass sie ein wichtiges Zwischenprodukt in der Biosynthese der aromatischen Aminosäuren darstellt. Ester der Salicylsäure und Jasmonsäure, ursprünglich als Komponenten ätherischer Öle beschrieben, wurden mittlerweile als wichtige Signalmoleküle in Planzen erkannt. Sekundäre Naturstofe sind durch die folgenden Merkmale gekennzeichnet: 1. Sie sind nicht allgemein verbreitet, sondern kommen jeweils in nur einigen Organismengruppen vor. Die Palette an sekundären Naturstofen ist von Spezies zu Spezies verschieden. Einige sind innerhalb der Angiospermen auch nahezu ubiquitär anzutrefen, wie einige Phenolcarbonsäuren oder Purinalalkaloide. 2. Sekundärstofe besitzen häuig eine große Variabilität ihrer Struktur. So treten sie in der Regel in Form einer ganzen Palette nahe verwandter Strukturen auf. Dabei müssen strukturähnliche Verbindungen oder Verbindungen mit gleichartigen Bauprinzipien nicht identische biologische Eigenschaten besitzen; manche haben möglicherweise gar keinen Nutzen. Dies ist ein Grund dafür, weshalb der Sekundärstofwechsel gelegentlich auch als „Spielwiese der Evolution“ betrachtet wird. 3. Sekundäre Planzenstofe werden vielfach nur während ganz bestimmter Entwicklungsstadien der Planze gebildet. Folglich ändert sich der Gehalt an bestimmten Sekundärstofen im Verlauf der Individualentwicklung (ontogenetische Variabilität). Beispielsweise enthalten die Blätter junger Pfeferminzplanzen ein menthonreiches, aber mentholarmes ätherisches Öl; gegen Blühbeginn dreht sich das Verhältnis Menthon zu Menthol um. Oder: Die jungen Früchte der Tomatenplanze sind alkaloidreich; in dem Maße wie

1.2 Primär- und Sekundärstoffwechsel

die Frucht zur Reife gelangt, werden die Alkaloide abgebaut, bis die reifen Tomaten nur noch Spuren an Tomatin enthalten. Auch in anderen Fällen ist das Autreten von Planzeninhaltsstofen kein permanentes Merkmal. Bestimmte sekundäre Planzenstofe wie die sog. Phytoalexine (griech.: phyton [Planze]; alexein [schützen]) werden nur synthetisiert, wenn die Planze mit einem mikrobiellen Schädling in Kontakt kommt. Wiederum andere Planzenarten nehmen, wenn im Boden vorhanden, von Bodenpilzen produzierte Produkte auf, wandeln sie chemisch ab und speichern sie in ihren Blättern (Beispiel: die Trichothecene der Baccharis-Arten). Mit der Erforschung der biochemischen Anpassung von Planzen an die

1

Umwelt befasst sich die ökologische Biochemie (Schlee 1992; Harborne 2002). 4. Bei höheren Planzen werden sekundäre Planzenstoffe nach ihrer Bildung in der Regel an ganz bestimmten Stellen abgelagert und gespeichert: lipidlösliche Produkte in besonderen Drüsenhaaren, Ölzellen, Ölräumen oder Chromoplasten, wasserlösliche Sekundärstofe (Glykoside, Alkaloidsalze) in Vakuolen ot spezialisierter Zellen (z. B. den Latexvesikeln milchsatführender Planzen). 5. Syntheseort und Speicherort der sekundären Naturstofe sind häuig nicht identisch. 6. Die Fähigkeit, bestimmte Sekundärmetabolite zu bilden, kann durch Mutation gewonnen werden oder verloren gehen (chemische Variabilität).

Biopolymere

. Abb. 1.1 Proteine

Nucleinsäuren

Nukleotide

Primär - oder Grundstoffwechsel

Aminosäuremeta bolismus

Kohlenhydrate

Lipide

Glycerol

Zucker metabolismus

Fettsäure metabo lismus

Pyruvat 1-Desoxyxylulose Acetyl- CoA Shikimat

Mevalonat 4

TCA

sekundäre Naturstoffe

Phenylpropankörper

5

Isopentenyl diphosphat

2

3

Lignin Flavonoide

Polyketide

Terpenoide

1

Alkaloide

Aminosäure derivate

organische Säuren

Zuckerderivate

Biosynthetische Beziehungen zwischen Primär- und Sekundärstoffwechsel. Wege der Bildung sekundärer Pflanzenstoffe. Beide Naturstoffklassen leiten sich von identischen Präkursoren ab (mod. nach Schlee 1992). 1 Aminosäureweg; 2 Shikimisäureweg (Aromatenbiosynthese); 3 Polyketidweg; 4 Mevalonsäureweg; 5 Methylerythritolphosphatweg; TCA Tricarbonsäurezyklus

7

8

1

Prinzipien des Sekundärstoffwechsels

. Tabelle 1.2 Stofflicher Zusammenhang zwischen Grund- und Sekundärstoffwechsel (nach Luckner 1984, leicht verändert) Verbindung des Grundstoffwechsels Zucker (insbesondere D-Erythrose, D-Ribose, D-Glucose

Sekundäre Naturstoffe Anormale Zucker (Amino- und Desoxyzucker, methylierte Zucker, Zucker mit verzweigter C-Kette), Oxidationsprodukte (Uronsäuren, Aldonsäuren, Ascorbinsäure), Reduktionsprodukte (Zuckeralkohole, Cyclitole, Streptidin)

Metabolite von Glykolyse und Citratzyklus (besonders Fructose-6-phosphat, Glycerinaldehyd-3-phosphat, Phosphoenolpyruvat)

Pyridoxylderivate, Milchsäure, Glycerol, C3-Teil im Chorismat

Acetylcoenzym A

Ungewöhnliche Fettsäuren, Eicosanoide, Fettsäurederivate (n-Alkane, Acetylenderivate), Polyketide, Anthranoide, Tetracycline, Griseofulvin, Phenolcarbonsäuren aus Pilzen und Flechten, Pyridinderivate

Isopentenyl-diphosphat

Monoterpene, Sesquiterpene, Diterpene, tetra- und pentacyclische Triterpene, Steroide, Carotinoide und Xanthophylle

Shikimat

Naphthochinone, Anthranoide (Alizarintyp), Phenazine, Chinolin- und Chinazolinalkaloide

Aliphatische Aminosäuren

Amine, methylierte Aminosäuren, Hydroxamsäuren, cyanogene Glykoside, Glucosinolate, Betaine, Alkaloide (insbesondere Tropan- und Pyrrolizidinalkaloide), Konjugate mit Glycin, Glutamin, Ornithin, S-Alkylcysteinderivate, Lauchöle, Diketopiperazine, Peptide (z. B. Penicilline)

L-Phenylalanin, L-Tyrosin

L-DOPA und Indolalkaloide, Phenylalkylamine, Isochinolinalkaloide,

Melanine, Betalaine, Zimtsäuren, Cumarine, Lignane, Stilbene, Flavonoide, Hydrochinonderivate L-Tryptophan

Anthranilsäure, Chinolin-, Acridin- und Benzodiazepinalkaloide, Nikotinsäurederivate, Ergolinalkaloide, Carbolinalkaloide, Cinchonaalkaloide

Purine

Methylierte Purine, Purinantibiotika, Pteridine, Benzopteridine, Pyrrolopyrimidine

1.3 Zusammenhang zwischen Primär- und Sekundärstoffwechsel Die Bausteine für die biogenetischen Stofwechselprozesse sind einfache Metabolite des amphibolen Stofwechsels ( > Kap. 1.1). Sie stammen v. a. aus der Glykolyse, dem Citrat- und dem Pentosephosphatzyklus. Es handelt sich um Carbonsäuren (Acetat, Pyruvat, 2-Oxoglutarat) und um verschiedene Zucker (Triosen, Erythrosephosphat). Die Untersuchung der Biogenesewege sowohl von essentiellen Zellbestandteilen als auch von sekundären Planzenstofen führt auf Intermediärmetabolite als gemeinsame Bauelemente ( > Abb. 1.1). > Tabelle 1.2 zeigt Beispiele für Metabolite, die sowohl am Aubau primärer als auch sekundärer Planzenstofe beteiligt sind.

Infobox Herkunft weiterer Synthesebausteine. C1-Bausteine, deren Bedeutung besonders hervorgehoben werden soll, stellen sowohl im Primär- als auch im Sekundärstoffwechsel häufige und wichtige Elemente für Biosynthesen dar. Sie kommen in allen denkbaren Oxidationsstufen vor, als Methyl-, Hydroxymethyl-, Formyl- und Carboxylgruppen ( > Abb. 1.2). Im Mittelpunkt der C1-Kohlenstoffübertragung stehen Enzyme mit Folsäure als Coenzym. Träger der C1-Kohlenstoffgruppen sind die N-Atome in Position N-5 bzw. N-10 des Pteridylrestes. Durch Dehydrogenase-Reaktionen können die C1-Reste in die unterschiedlichen Oxidationsstufen übergehen und als Methyl-, Formyl- oder Carboxylgruppe auf andere Moleküle übertragen werden

6

1.3 Zusammenhang zwischen Primär- und Sekundärstoffwechsel

Sekundäre Naturstoffe. Sekundäre Naturstofe werden nach biosynthetischen Gesichtspunkten geordnet. Die Gesamtzahl der bisher allein aus höheren Planzen isolierten Sekundärmetabolite umfasst etwa 60.000 deinierte chemische Strukturen. Da nur eine begrenzte Zahl von Molekülbausteinen zur Synthese verwendet wird, lassen sich diese vielen Sekundärprodukte zu wenigen Stofgruppen zusammen fassen. > Abbildung 1.5 bringt eine Übersicht über die aus pharmazeutischer Sicht wichtigen Gruppen von Sekundärstofen. Das Ordnen einer Mannigfaltigkeit im Hinblick auf Ähnlichkeiten und Unterschiede ist für die wissenschatliche Vorgehensweise generell kennzeichnend. In den Strukturformeln der Naturstofe sind die Ergebnisse phytochemischer Untersuchungen kompakt zusammengefasst. Das Ordnen dieser Formeln nach strukturellen Ähnlichkeiten unter Berücksichtigung biogenetischer Aspekte führt zu einem „Stammbaum“ der Sekundärstofe. Zu den ältesten Ordnungsprinzipen zählen die Acetatregel und die Isoprenregel. Auch die Herkunt der ot komplex aufgebauten Alkaloide konnte schon

( > Abb. 1.3). Die Methylgruppe wird in der Regel nicht direkt von der Methylfolsäure auf ein anderes Substrat übertragen, vielmehr ist S-Adenosylmethionin dazwischen geschaltet. S-Adenosylmethionin fungiert als der unmittelbare Methyldonator. Methyl kann dabei auf O-, N-, Sund C-Atome übertragen werden. Eine weit verbreitete derartige Methylierungsreaktion ist die Erweiterung der Seitenkette von Cholesterol bzw. Cycloartenol zu den für höhere Pflanzen typischen ethylsubstituierten Phytosterolen ( > Abb. 1.4). Stickstoff kann durch Prozesse übertragen werden, die der Transaminierung von Aminosäuren ähneln; hierbei dient Pyridoxalphosphat als Coenzym. Außerdem ist die Knüpfung eines primären oder sekundären Amins an eine Aldehydfunktion möglich. Auch Reduktionsäquivalente (z. B. NADPH+H+), ATP und Zuckernukleotide (z. B. UDP-Glucose) werden aus dem Primärstoffwechsel beigesteuert und machen die Biosynthese von Sekundärmetaboliten erst möglich.

. Abb. 1.2

O H

CH4 Methan

H3C

X

an O, N, S oder C gebundene Methylgruppen

O

C

H H

C OH

Formaldehyd

Ameisensäure

CO 2 Kohlendioxid

O CH2OH

C H

Hydroxymethylgruppe

CH2

Formylgruppe

C H

Methylengruppe

Methenylgruppe NH C H Formiminogruppe C

1

O

Kohlenmonoxid

Im Primär- und Sekundärstoffwechsel auftretende C1-Bausteine, geordnet nach ihrem Oxidationswert

9

10

1

Prinzipien des Sekundärstoffwechsels

. Abb. 1.3

Übersicht über den Teil des C1-Stoffwechsels, der auf der Ebene der THF-Derivate abläuft. Die Hydroxymethylgruppe des Serins ist die Hauptquelle für C1-Bausteine; sie wird als Formaldehydäquivalent auf THF unter Bildung von 5,10-MethylenTHF übertragen. Dieses auch als „aktivierter Formaldehyd“ bezeichnete Stoffwechselprodukt kann unter dem Einfluss von Dehydrogenasen sowohl dehydriert als auch hydriert werden

früh auf eine „Aminosäureregel“ zurück geführt werden.

! Kernaussage

Die Produkte des Sekundärstoffwechsels nennt man sekundäre Naturstoffe. Der chemische Aufbau der meisten sekundären Naturstoffe folgt bestimmten biogenetischen Regeln: Der Acetatregel, der Isoprenregel oder der Aminosäureregel.

Polyketide. Für alle Polyketide gilt die Acetatregel. Die

Acetatregel, 1907 von J. N. Collie konzipiert, besagt, dass Naturstofe mit alternierenden (metaständigen) Sauerstoffunktionen eine zusammengehörige Gruppe von Naturstofen bildet, die dadurch ausgezeichnet sind, dass man sie sich formal als aus mehreren Acetatbausteinen aufgebaut denken kann ( > Abb. 1.6). In Analogie zu der Leichtigkeit, mit der sich bei organischen Synthesen aus

ofenkettigen Di- oder Triketoverbindungen (Acetessigester, Diacetylaceton u. a.) Aromaten vom Typus der Orsellinsäure oder hydroxylierter Naphthalinderivate bilden, sollten solche Reaktionen, so die Vorstellung, auch in lebenden Zellen einfach realisierbar sein. Zu den Naturstoffen, die man sich aus C2-Bruchstücken entstanden denken kann, gehören nicht nur einfache Resorcin- und Phloroglucinderivate, sondern auch Alatoxine, Anthranoide, Griseofulvin, Makrolide, Tetracycline, Xanthone u. a. Man bezeichnet sie als Acetogenine oder als Polyketide und unterteilt sie nach der Zahl (n) von C2-Bausteinen im Molekül als Triketide (n = 3), Tetraketide (n = 4), Pentaketide (n = 5) usw. Die Variationsmöglichkeit ist aber nicht allein durch die Kettenlänge (bis n >20) gegeben: Hinzu kommen unterschiedliche Kettenfaltungen vor der Kondensation zu zyklischen Verbindungen, Variationen bei den Reduktionsschritten, Methylierungen, Substitution durch Isopentenylgruppen, Glykosylierung und Umlagerungen. Außerdem können unterschiedliche „Startercarbonsäu-

1

1.3 Zusammenhang zwischen Primär- und Sekundärstoffwechsel

. Abb. 1.4

NH2 N

CH3 HOOC

S

N

+

O

N

N

NH2

HO

OH

S-Adenosylmethionin CH3 CH2 S CH3

+

CH2

CH2 S

S-Adenosylmethionin

CH3

CH2

S-Adenosylhomocystein

CH3

CH3

H

+

C CH3

R

R

CH3

C8-Seitenkette eines C27-Steroids

CH3

+

H CH3

CH3

R

H

S-Adenosylhomocystein

CH3 CH3

C10-Seitenkette eines C29-Steroids (Typus Sitosterol)

S-Adenosylmethionin

CH3

CH3

R

CH3 CH2

C9-Seitenkette eines C28-Steroids (Typus Ergosterol)

Beispiel für eine Methylierung eines pflanzlichen Sekundärprodukts: die Bildung von C29-Sterolen (Typus Sitosterol) aus C27-Sterolen (Typus Cholesterol). Die Methylgruppe wird als Methylkation (= „aktives Methyl“) von S-Adenosylmethionin als Methyldonator übernommen. Die S-Methylgruppe des Donatormoleküls stammt ihrerseits aus 5-MethylTHF ( >Abb. 1.3)

ren“ in Form ihrer SCoA-Ester zur Bildung der vielgestaltigen Polyketide genutzt werden ( > Abb. 1.7). So bekommen strukturell so unterschiedliche Verbindungen wie die Flavonoide, Stilbene, Acridonalkaloide, Hopfenbitterstoffe und Xanthone einen gemeinsamen biogenetischen Nenner. Es ist sogar möglich, durch ortsgerichtete Mutagenese („site-directed mutagenesis“, > Kap. 1.4) eine Acridon-Synthase (Endprodukt: Acridon-Alkaloide) durch Austausch von nur 3 Aminosäuren so zu manipulieren, dass sie funktionell zur Chalkonsynthase (Endprodukt: Flavonoide) wird (Lukačin et al. 2001). Terpenoide. Für alle Terpenoide gilt die Isoprenregel. Auch die Isoprenregel basiert auf Beobachtungen aus der organischen Chemie. Als Erstem iel P.E.M. Berthelot

(1860) auf, dass die meisten der damals bekannten Terpene periodisch aus verzweigten C5-Einheiten aufgebaut sind. O. Wallach (1885) vertiete diese Beobachtungen und klassiizierte die Terpene auf der Basis von C5-Einheiten. Als „biogenetische Isoprenregel“ formulierte sie Ruzicka (1953) wie folgt: Bestimmte azyklische Terpene können nach ionischen oder radikalischen Mechanismen kondensieren, sodass alle natürlich vorkommenden Mono-, Sesqui- und Diterpene sowie im Falle von Squalen als azyklische Vorläufer auch die Triterpene und Steroide abgeleitet werden können (Näheres dazu vgl. > Kap. 23.1). Baustein aller natürlich vorkommenden Terpene ist Isopentenyldiphosphat (IPP) als „aktives Isopren“, das im Gleichgewicht mit dem isomeren Dimethylallyldiphosphat (DMAPP) steht. Die Kondensationsreaktionen der

11

12

1

Prinzipien des Sekundärstoffwechsels

. Abb. 1.5

Terpene verlaufen somit unter Beteiligung von Phosphat, anders als die klassischen Kondensationsreaktionen (z. B. Aldol-Addition oder Claisen-Kondensation).

Hemiterpen-Bausteine Monoterpene

1-Desoxy-Xylulose

Diterpene

Mevalonat

Tetraterpene

Terpenoid-Biosynthese. Es gibt zwei Wege der Terpeno-

Sesquiterpene

id-Biosynthese. Bis vor wenigen Jahren nahm man an, dass in höheren Planzen die zwei Schlüsselverbindungen IPP und DMAPP grundsätzlich über Mevalonsäure durch die Kondensation von drei Molekülen Acetyl-SCoA und anschließender Decarboxylierung gebildet werden. Heute weiß man, dass es einen alternativen Biosyntheseweg der Isopren-Bausteine gibt, der – ausgehend von Glucose – über die Zwischenstufen 1-Desoxy-d-Xylulose (DOX) und 2-Methylerythritolphosphat (MEP) führt (Lichtenthaler et al. 1997). Dieser MEP-Weg (syn.: GAP-Pyruvat-Weg, DOX-Weg) wird in Plastiden beschritten. Über ihn werden sowohl Hemiterpen-Bausteine angeliefert als auch Monoterpene, Diterpene und Tetraterpene synthetisiert ( > Abb. 1.5). Neben Markierungsexperimenten mit 13C-markierten Vorstufen ( > Kap. 1.4) war es die Beobachtung, dass Statine die Bildung von Monoterpenen

Triterpene, Steroide Polyketide Polyacetylene

Acetyl-SCoA

Flavonoide, Stilbene Phenylpropane Phanolcarbonsäuren

Zimtsäure

Cumarine Amine Alkaloide Aminosäuren

Cyanglykoside Glucosinolate

Wichtige Klassen sekundärer Pflanzenstoffe und ihre biogenetische Herkunft

. Abb. 1.6

O

OH

CH3

CH3

O

O

O

OH

COOH O

O

HO

O

O

Alternariol (Pilzprodukt) O

O

O COOH

O

O

O

OH O

CH3 −CO2

HO

OH O

OH

Phloroglucin

OH

O

OH

OH

COOH

HO

OH Resorcin

CH3

HO H

H

C16-Anthron (in Pilzen)

CH3

HO H

H

C15-Anthron (in höheren Pflanzen)

Beispiel für den formalen Ausbau von Pflanzenstoffen – hier Anthranoiden – nach der Acetatregel

1.3 Zusammenhang zwischen Primär- und Sekundärstoffwechsel

1

. Abb. 1.7

Biogenetischer Zusammenhang der verschiedenen Polyketide mit Strukturbeispielen. Am oberen Rand sind die jeweiligen „Startersäulen“ dargestellt

13

14

1

Prinzipien des Sekundärstoffwechsels

. Abb. 1.8

Mevalonat-Weg (MEV-Weg) und 2-Methylerythritolphosphat-Weg (MEP-Weg) der IPP- und DMAPP-Biosynthese. Nur der MEV-Weg kann durch den HMG-CoA-Reduktase-Inhibitor Mevastatin gehemmt werden

nicht beeinlussten, die die Existenz eines alternativen Terpenoid-Wegs nahe legten. Statine sind Hemmstofe der HMG-CoA-Reduktase, einem zentralen Enzym des Mevalonat-Wegs, das die Bildung der Mevalonsäure aus 3Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA katalysiert ( > Abb. 1.8). Alkaloide. Für die meisten Alkaloide gilt die Aminosäure-

regel. Sie geht auf den Hinweis von E. Winterstein und G. Trier im Jahre 1910 zurück, der besagt, dass alle (echten) Alkaloide ihrer Struktur nach Derivate von Aminosäuren sein müssten. Die Aminogruppe der Aminosäure liefert demnach den heterozyklisch gebundenen Stickstof eines Alkaloids. Alkaloidogene Aminosäuren im engeren Sinn sind: Ornithin, Arginin, Lysin, Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan. Durch initiale Decarboxylierung zum entsprechenden biogenen Amin werden die Aminosäuren in die Alkaloid-Biosynthese eingespeist. Diese biogenetische Klammer hält die ansonsten sehr heterogene und strukturell vielfältige Gruppe sekundärer Planzenstofe zusammen. Allerdings folgen nicht alle Alkaloide dieser Biosyntheseregel (z. B. Acridon-, Steroid-, Imidazol-, Purin-Alkaloide). Bezüglich der Biosynthese von Aminosäuren haben sich besondere Regulationsmechanismen herausgebildet, die es ermöglichen, zwischen der Belieferung der Proteinbiosynthese und einer Alkaloidbiosynthese zu diskrimi-

nieren. Hierzu zwei Beispiele: Acridon-Alkaloide (Sekundärstof ) und Tryptophan (Primärstof ) haben bis zur Anthranilsäure gemeinsame biogenetische Vorstufen. Die Bildung von Acridon-Alkaloiden kann bei einigen Planzen durch exogene Reize induziert werden. Dazu wird ein Anthranilat-Synthase-Gen aktiviert, das für die Tryptophan-Biosynthese nicht notwendig ist. Ähnliches gilt für die Bildung von Alkaloiden, die sich von Tyrosin bzw. Phenylalanin ableiten lassen: Hierfür sind zusätzliche Chorismat-Mutase-Gene1 mit eigenständiger Regulation ihrer Expression notwendig. Alle drei aromatischen Aminosäuren (Tryptophan, Tyrosin, Phenylalanin) werden in den Plastiden gebildet. Daher sind auch die beteiligten Enzyme in den Plastiden zu inden. Es gibt aber auch eine cytosolische Chorismat-Mutase, was für die Biosynthese von Phenylalanin und Tyrosin bzw. deren Derivate ein von den Plastiden unabhängiges Reaktionskompartiment schat. Phenylpropanoide und Phenole. Phenylpropanoide und viele Phenole entstehen über den Shikimisäureweg. Planzen können auf allen der bisher skizzierten Biosynthese1

Die Chorisminsäure – von altgriech.: chôrisma [getrennt] – ist das Intermediat des Shikimisäureweges, an dem sich die Wege zu den aromatischen Aminosäuren Tyrosin und Phenylalanin einerseits und Tryptophan andrerseits trennen.

1

1.3 Zusammenhang zwischen Primär- und Sekundärstoffwechsel

. Abb. 1.9

. Abb. 1.10 COOH

O

C3

C6 C3

Prephensäure

C1

HOOC

C3

COOH

C4 OH

NH2

R1

Prephensäure

R2

O P

I C3

H2C

COOH

Phosphoenolbrenztraubensäure CHO

OH

H ≡

P OCH2

O

H

OH

H

OH

OH

CH2OP

COOH C6 C3 R1 R2

C4 Erythrose-4-phosphat

Prephensäure, eine hydroaromatische Säure, stellt den Knotenpunkt im Stoffwechsel aller jener Naturstoffe dar, die einen aromatischen Ring im Molekül enthalten, ausgenommen jene Aromaten, die Polyketide oder Terpenoide darstellen. Prephensäure ist aus 10 Kohlenstoffatomen aufgebaut: Als Bauelement fungieren 2 Moleküle Brenztraubensäure und 1 Molekül eines C4-Zuckers, der Erythrose

wege phenolische Substanzen bilden. Die wenigen phenolischen Terpenoide (z. B. hymol, Carvacrol) sind leicht an ihrer Isoprenstruktur zu erkennen, phenolische Polyketide an der meta-ständigen Anordnung von Hydroxylgruppen. Die phenolischen Alkaloide (z. B. Morphin, Cephaelin) leiten sich in der Regel vom Tyrosin ab. Nicht unmittelbar an ihrer Strukturformel ablesbar ist die gemeinsame Herkunt der aromatischen und phenolischen Zimtsäuren, der Gallussäure, der Phenolcarbonsäuren (z. B. Salicylsäure) und einfachen Phenole (z. B. Arbutin). Sie entstehen alle über den Shikimisäureweg, leiten sich also wie die aromatischen Aminosäuren aus Zuckern ab ( > Abb. 1.9). Außer der Gallussäure werden vermutlich alle Stofe dieser Gruppe aus Phenylalanin oder – sehr viel seltener – aus Tyrosin gebildet. Ein wichtiges Enzym des Sekundärstofwechsels, die Phenylalanin-AmmoniakLyase, katalysiert die oxidative Desaminierung des Phe-

II R1

R2

H OH OH

H H OH

I

II

Phenylalanin Tyrosin DOPA

Zimtsäure Cumarsäure Kaffeesäure

Herkunft der C6-C3-Bausteine. Prephensäure verliert im Verlauf ihrer Umwandlung zu den aromatischen Aminosäuren ein C1-Element in Form von CO2. Aus den aromatischen Aminosäuren entstehen die Zimtsäuren, die einfachsten Vertreter der Phenylpropanoide. Stereochemie nicht berücksichtigt

nylalanins zur Zimtsäure. Das resultierende C6-C3-Bauelement ( > Abb. 1.10) ist charakteristisch für die Gruppe der Phenylpropanoide, zu denen die Zimtsäuren selbst, die Cumarine und auch die Lignane zählen. Sie stellen eine außerordentlich umfangreiche Gruppe von planzlichen Naturstofen dar. Durch oxidativen Abbau der Seitenkette der Zimtsäuren entstehen die Phenolcarbonsäuren und einfachen Phenole. Sekundäre Pflanzenstoffen mit gemischtem Bautyp.

Verschiedene Bauelemente können zu sekundären Planzenstofen mit gemischtem Bautyp zusammengefügt wer-

15

16

1

Prinzipien des Sekundärstoffwechsels

. Abb. 1.11 H3C

CH3

CH3 OH

H3C

CH3

H3C

CH3

O

H3C

O O

Anisoxid C6 − C3 + C5

OH

H3C CH3

CH3

CH3

CH3 H3C

CH3

O

Lupulon (u.a. Hopfenwirkstoffe) 3 • C 2 + 4 • C5

Foeniculin C6 − C3 + C5 O

H3C

H3C

OH

H3C

O

H3C

HO

O

CH3

CH3

O

n-C5H11

O CH3

HO HO

O

O

C6 − C3 + C5 (C 14-Furanocumarin)

C6 − C3 + C5

O

OH CH3

O CH3 H3C C-Skelett der Cannabiswirkstoffe 6 • C2 + 2 • C5

Bergamottin 1 • C 6 − C3 + 2 • C 5 + C 2 CH2 H3C

O

O

OH

C1-Baustein

H3C

O

O

4

HO 1

H3C

O

O

CH3

O OCH3 OCH3 Rotenon C6 − C3 − C6 + C5 + Extra-C1

Visamminol 5 • C2 + 1 • C5

O H3C

O H3C

OH

Essigsäure

OH

C6 − C3 =

C5 =

C2 =

CH2

H3C Isopenten

HO p-Cumarsäure

1.3 Zusammenhang zwischen Primär- und Sekundärstoffwechsel

. Abb. 1.12

1

C1-Pool O

CH3 N

N H

O

Cyclopeptin

O

O OH

OH NH2

NH2

Phenylalanin

Anthranilsäure

*CH3 6

CH 3

H3*CO

O O

O

*CH3 H2N

O O

O

O

CH3

N H OH

CH3

OH OH

V Novobiocin

Weitere Beispiele zur vergleichenden Betrachtung von Sekundärstoffen. Obere Hälfte: Das Cyclopeptin mit dem Benzodiazepingerüst lässt den Aufbau aus Anthranilsäure und Phenylalanin erkennen. Für Mikroorganismen ist dieser biogenetische Aufbau durch In-vivo-Experimente gesichert, nicht aber für höhere Pflanzen. In einigen höheren Pflanzen wurden die Benzodiazepine Diazepam und Lorazepam in geringen Mengen gefunden (ng-Bereich). Untere Hälfte: Novobiocin baut sich wie folgt auf: I = 6-Desoxy-gulose, II = Phenylalanin (Tyrosin), III = C6-C1-Baustein, IV = C5-Baustein, V = Carbaminat (CO2 + NH3). Ferner sind im Molekül 3 C1-Bausteine (Methyl) enthalten (durch * gekennzeichnet)

9 Vergleichende Betrachtung von Strukturformeln sekundärer Pflanzenstoffe. Drei Bausteine führen zu jeweils unterschiedlichen Molekülstrukturen. Das C2-Element des Bergamottins entsteht nicht aus Acetat, sondern durch oxidative Eliminierung eines C4-Körpers aus einem C5-Baustein. Der Molekülvergleich bedarf der Verifizierung durch Biogenesestudien

17

18

1

Prinzipien des Sekundärstoffwechsels

den. Eine verhältnismäßig kleine Zahl von Bauelementen führt durch unterschiedliche Verknüpfung dieser Bausteine zu einer großen Vielfalt von Naturstofen. An Bausteinen wurden bisher vorgestellt: C1-, C2-, C5- und C6C3-Körper sowie die Aminosäuren. Konstitutionsformeln von Naturstofen enthalten somit Informationen über die sie aubauenden einfachen Bausteine. Die > Abbildungen 1.11 und 1.12 zeigen, dass es möglich ist, komplizierte Naturstofstrukturen gedanklich in Bauelemente zu zerlegen. Dieses „Lesen“ von Strukturformeln, zusammen mit dem Durchmustern von Formeln nach Ähnlichkeiten und Unterschieden, dient dem didaktischen Ziel, in der Vielzahl von Strukturen ein ordnendes Prinzip zu erkennen. Wo immer es angezeigt erscheint, wird im vorliegenden Werk von diesem didaktischen Prinzip des Molekülvergleichs Gebrauch gemacht.

! Kernaussage

Die sekundären Naturstoffe lassen sich nach biogenetischen Gesichtspunkten in Polyketide, Terpenoide, Alkaloide, Phenylpropanoide und Naturstoffe mit gemischtem Bautyp gliedern. Auch in komplexen Strukturen sind die biogenetischen Bauelemente erkennbar.

1.4 Aufklärung von Biosynthesewegen Bei der Auklärung von Biosynthesewegen geht es um folgende Problemkreise: x das Zwischenprodukt des Primärstofwechsels zu identiizieren, aus dem das Sekundärprodukt gebildet wird, x die Zwischenprodukte (Präkursoren) zu identiizieren, die zwischen Primär- und Sekundärprodukt liegen, d. h. die vollständige Reaktionskette (Biosynthesesequenz) zu entschlüsseln, x die an den Umsetzungen beteiligten enzymatischen Reaktionen und Reaktionsmechanismen zu beschreiben. Die zur Auklärung von Bildungswegen herangezogenen Methoden sind: x Tracertechniken, x enzymatische Methoden, x genetische und molekulargenetische Methoden.

1.4.1 Tracer- oder Isotopentechnik Tracer (engl.: to trace [einer Spur folgen]) sind Substanzen, die mit einer gegebenen Substanz gemischt werden, mit dem Ziel, die Verteilung oder Lokalisation einer bestimmten Substanz qualitativ zu ermitteln. Den Vorgang selbst bezeichnet man auch als Markieren. Chemische Tracer haben gleiche oder zumindest fast gleiche chemische Eigenschaten wie die markierte Substanz, mit der sie homogen mischbar sind. Markieren lassen sich Substanzen entweder durch stabile Isotope oder durch Radioisotope. Besondere Bedeutung haben in der Biosyntheseforschung die stabilen Isotope 2H (Deuterium), 15N, 18O, 13C sowie die radioaktiven Isotope (Radionuklide) 14C, 3H (Tritium) und 32P. Durch stabile Isotope markierte Substanzen können am besten massenspektrometrisch, aber auch NMR-spektrometrisch gemessen werden. Radioaktiv markierte Stofe werden vorzugsweise mittels Autoradiographie, Szintillationsmessung und Radiochromatographie geortet bzw. gemessen. Einfache Tracerexperimente. Einfache Tracerexperimen-

te belegen die Verwendung eines bestimmten Bauelements. Zur Auklärung der Biosynthese müssen die markierten Präkursoren in den Stokreislauf der Planze eingeschleust werden, wozu verschiedene Techniken entwickelt wurden. Bei Mikroorganismen ist dieses Einschleusen einfach, indem man die Präkursoren dem Nährmedium zusetzt. Bei höheren Planzen kommen die folgenden Applikationsmöglichkeiten in Betracht: Injizieren in hohle Stängel, Einstellen der Planze mit der Wurzel in eine Nährlösung samt Präkursor, Sprühen auf das Blatt und Aufsaugen über Dochte, die in bestimmte Organe eingestochen werden. Vermieden werden muss, dass durch zu intensives „Zufüttern“ markierter Substanzen der normale Ablauf des Stofwechsels gestört wird. Häuig werden Untersuchungen an planzlichen Zellkulturen durchgeführt; ähnlich wie bei Mikroorganismen können hier die Präkursoren dem Nährmedium zugesetzt werden. Zur Auklärung der Biosynthese müssen sodann die gewünschten Endprodukte isoliert werden, und es muss vor allen Dingen durch geeignete Methoden festgestellt werden, welche Atome des Sekundärprodukts die Markierung tragen. Die qualitative Feststellung, dass das Endprodukt markiert ist, bedeutet für sich allein keine Gewähr dafür, dass die markierte Substanz Teil des unmittelbaren Biosynthesewegs ist. Die „zugefütterte“ Substanz könnte auch, in den allgemeinen Stofwechsel eingeschleust, erst

1.4 Aufklärung von Biosynthesewegen

1

. Abb. 1.13 2

HO

*

COOH

H3CO

*

Biosynthese

NH2

N H3CO

*

D,L-Tyrosin-[2−14C]

OCH3

OCH3 Papaverin 1) Isolierung 2) Chemischer Abbau über mehrere Stufen

H3CO

* CH2 * COOH

H3CO Hydrierung

* CO 2

SchmidtAbbau (HN3)

H3CO

H3CO

* CH3 * COOH

Ozonierung

H3CO

CHO

+

+ H3CO

* HCHO

* COOH

Am C-2 radioaktiv markiertes Tyrosin liefert nach kontrolliertem chemischen Abbau sowohl markiertes CO2 als auch markierten Formaldehyd. Daraus lässt sich schließen, dass 2 Moleküle Tyrosin am Aufbau des Papaverins beteiligt sind. Darüber hinaus liefert der Abbau die Information, dass die C-2 Atome des Tyrosins in die Positionen C-1 und C-3 des Papaverins eingebaut werden

in Form von Abbauprodukten in das fragliche Endprodukt eingebaut werden. Man war früher darauf angewiesen, das Endprodukt chemisch abzubauen und die Isotopenzusammensetzung der für die jeweilige Fragestellung wichtigen Molekülteile oder Atome zu ermitteln. Ein Beispiel für diese Art des Vorgehens bringt > Abb. 1.13. Pulse-Chase-Experimente. Pulse-Chase-Experimente

geben Auskunt über Zwischenprodukte der Biosynthese. Die Markierung einer einzelnen Vorstufe und die Analyse des Endprodukts geben keine Aufschlüsse über die durchlaufenen Zwischenstufen, d. h. über die Biosynthesesequenz. Mittels Autoradiographie und Analysen in zeitlichem Abstand lassen sich Zwischenstufen der Biosynthese festlegen. Das Vorbild für ein derartiges Vorgehen ist die Erforschung der CO2-Fixierung im reduktiven Pentosephosphatzyklus (Calvin-Zyklus). Suspensionen von Grünalgen (Chlorella spec.) wurden mit 14CO2 versorgt. In un-

terschiedlichen Zeitabständen wurden Algenproben extrahiert; der Extrakt wurde papierchromatographisch aufgetrennt, wobei die Substanzzonen autoradiographisch geortet wurden. Es zeigte sich, dass das früheste fassbare Produkt der CO2-Fixierung das 3-Phosphoglycerat ist. Nach 1 s Einbauzeit entfallen über 70% der Radioaktivität auf diese Verbindung, die sich rasch auf immer mehr Verbindungen überträgt. Bereits nach weiteren 30 s sind mehr als 20 Substanzen markiert, darunter mehrere Zucker. Nach diesem Modell sind zahlreiche Sequenzen von Sekundärstof-Biosynthesen aufgeklärt worden, beispielsweise in Mentha × piperita die zeitliche Sequenz: 14CO2 o Piperiton o Menthon o Menthol. Schwere Isotope. Die Forschung bedient sich heute aller-

dings vorzugsweise der Markierung durch stabile Isotope. Der Einbau schwerer Isotopen wird über Massenspektrometrie nachgewiesen. Stabile Isotope stehen in stark

19

20

1

Prinzipien des Sekundärstoffwechsels

. Abb. 1.14 10

CH3 CH3

8

9

H

CH3 5

1 3

2

H

4

H

7

6

H H

Hα

Hβ

α - Pinen 4

10 9

6 7 8

3 5

a 45

40

35

30

25

20

[ppm]

100-MHz-13C-Spektrum von α-Pinen in CDCl3 (ohne sp2-Alken-Signale). Im Erscheinungsbild fällt auf, dass die Signale – anders als bei Protonenspektren – aufgrund der Breitbandentkopplung der Protonen nicht aufgespalten sind. 13C-13CKopplungen werden nicht sichtbar, da die Wahrscheinlichkeit, dass gerade zwei 13C-Kerne benachbart sind, die dann miteinander koppeln, sehr gering ist. Erst nach künstlicher Anreicherung von 13C-Isotopen und Einbau in Verbindungen werden Kopplungen sichtbar

angereicherter Form, nahe 100%, zur Verfügung. Bestimmt werden können massenspektrometrisch die Isotopenverhältnisse 2H/1H, 13C/12C und 18O/16O. Als Isotopenverhältnis wird immer das Verhältnis von Nebenisotop zu Hauptisotop berechnet. Der Einbau einer 18Omarkierten Vorstufe zeigt sich im erhöhten M+2-Peak im Massenspektrum des Sekundärprodukts an. Das Fragmentierungsmuster lässt darüber hinaus Schlüsse auf die Lokalisation des markierten Sauerstofs zu. Auf diese Art wurde z. B. nachgewiesen, dass die Epoxidierung von Hyoscyamin zu Scopolamin nicht über 6,7-Dehydrohyoscyamin laufen kann, weil nämlich der Sauerstof der Zwi-

schenstufe 6-Hydroxyhyoscyamin im Epoxid erhalten bleibt. Mit Hilfe der 13Clokalisiert man Kernresonanz-Spektroskopie Synthesebausteine. Durch die Entwicklung der HochfeldNMR-Geräte wurde die 13C-Tracertechnik zu einem sehr leistungsfähigen Verfahren der Biosyntheseforschung ausgebaut. Ein 13C-NMR-Spektrum ist im Vergleich zu einem 1H-NMR-Spektrum einfach gebaut, weil 13C-13C-Kopplungen aufgrund der geringen Wahrscheinlichkeit benachbarter 13C-Isotope nicht beobachtet wer13C-Kernresonanz-Spektroskopie.

(13C-NMR)

1.4 Aufklärung von Biosynthesewegen

. Abb. 1.15 [1,2 - C2 ] Acetat (im

13

erkennbar sind. Wird eine Bindung einmal gesprengt, verschwindet das Dublett und wird durch ein verstärktes (erhöhtes) Singulettsignal ersetzt ( > Abb. 1.15). Beim Einbau von doppelt markiertem Acetat in Mevalonat erscheinen sämtliche Signale für die 6 C-Atome als Dubletts. Beim Fortschreiten der Biosynthese zum Farnesol zeigen sich im 13C-NMR-Spektrum 3 Singuletts, die vom C-2 des Mevalonats stammen ( > Abb. 1.16).

C - NMR 2 Dubletts)

Biosyntheseexperiment

Sekundärprodukt isolieren

13

C - NMR - Spektrum aufnehmen

Dubletts: bedeutet Einbau von intaktem Acetat

1.4.2 Enzymatische Methoden

Signalverstärkung von Singuletts: bedeutet Einbau nach Spaltung der C - C -Bindung

Biosyntheseenzyme. Eine weitere Möglichkeit der Erfor-

Schema zur Auswertung von 13C-NMR-Spektren nach Inkorporation von doppelt 13C-markiertem Acetat

schung von Biosynthesewegen ist die Nutzung zellfreier Extrakte, speziell der Isolierung von Enzymen und der Ermittlung ihrer kinetischen Eigenschaten durch Umsetzung mit Intermediaten der Biogenese. Um Reaktionen in vitro nachvollziehen zu können, besteht der schwierigste Schritt darin, die betrefenden Enzyme des Sekundärstof wechsels anzureichern und – wenn möglich – sie bis zur Homogenität zu reinigen. Aus Organen ausdiferenzierter Planzen lassen sich die entsprechenden Enzyme häuig nicht gewinnen, weil sie zum einen in sehr niedriger Konzentration vorliegen und zum anderen beim Extrahieren durch Tannine und andere Phenole inaktiviert werden können. Durch geeignete Behandlung, z. B. mit unlöslichem Polyvinylpolypyrrolidon kann man diese störenden Substanzen aber auch binden und dadurch die Enzymaktivität erhalten. Besonders gut zur Isolierung von Enzymen sind planzliche Zell- oder Gewebekulturen geeignet ( > folgende Infobox). Allerdings produzieren Zellkulturen bei weitem nicht alle jene sekundären Planzenstofe, die in der Ganzplanze vorkommen und dementsprechend

den ( > Abb. 1.14). Ob ein 13C-markierter Präkursor in ein Sekundärprodukt eingebaut wurde und an welcher Stelle, gibt sich in einfacher Weise durch eine Verstärkung der betrefenden Signale zu erkennen. Noch wesentlich leistungsfähiger wird die 13C-NMR-Technik, wenn doppelt markierte Präkursoren eingesetzt werden, beispielsweise [1,2–13C2]-Acetat. In dieser Verbindung liegen die 13CIsotope benachbart, was sich an der Aufspaltung der Signale in Dubletts zu erkennen gibt. Bei der Verfütterung des doppelt markierten Acetats wird das markierte mit dem planzeneigenen Acetat vermischt. Die Menge an markiertem Acetat ist gering im Vergleich zum Acetat, das der planzliche Stofwechsel genuin beisteuert, mit dem Ergebnis, dass das markierte Acetat statistisch verteilt in den Sekundärstofmolekülen autritt. Das wiederum gibt sich im 13C-NMR-Spektrum daran zu erkennen, dass die beiden Dubletts des markierten Acetats im Sekundärprodukt . Abb. 1.16

CH3

3'

HO

CH3

CH3− COO − Na 13

+

4

2

5

1

O

•

•

3 13

1

CH3

O H3C

•CH

3

OPP

In-vivo-Markierung von Mevalonsäure und Farnesyldiphosphat durch Zufuhr von [1,2-13C2] Acetat. In der Mevalonsäure erscheinen im 13C-NMR-Spektrum 3 Dubletts entsprechend einer 13C-13C-Kopplung zwischen den C-Atomen 1 und 2, 3 und 3’ sowie 4 und 5. Die 13C-NMR-Signale der mit dem Punkt versehenen C-Atome geben sich als verstärkte Singuletts zu erkennen

21

22

1

Prinzipien des Sekundärstoffwechsels

Infobox In-vitro-Kultur von Zellen höherer Pflanzen. Pflanzliche Zellsuspensionskulturen werden vorrangig aus Kalluskulturen angelegt (lat.: „callus“ [Schwiele, Schwarte]). Bringt man aus Organteilen herausgeschnittenes Gewebe, sog. Explantate, unter sterilen Bedingungen auf einen geeigneten Nährboden, so bildet sich an den Schnittstellen ein Wundgewebe: Durch Proliferation bildet sich aus meristematischen oder meristematisch gewordenen Bereichen eine amorphe Masse wenig differenzierter, stark wuchernder Zellen, eben der Kallus. Als Explantate eignen sind Gewebestücke mit Meristemen wie Knospen, Wurzelspitzen, Knotenbereiche des Sprosses oder keimende Samen. Stark proliferierendes Kallusgewebe wird nur dann gebildet, wenn dem Nährmedium Phytohormone (besonders Auxine und Cytokinine) zugefügt werden. Zellteilungs- und wachstumsfördernd sind außerdem komplexe organische Zusätze wie Kokosnussmilch (flüssiges Endosperm), Hefeextrakt oder Caseinhydrolysat. Das Kallusgewebe lässt sich durch Subkultivierung auf frischen Nährmedien beliebig lange weiter erhalten. Überführt man Kallus in flüssiges Nährmedium, löst sich die Masse unter Schütteln zu kleinen Zellaggregaten auf. Man spricht jetzt von einer Suspensionskultur. Diese ist nicht nur eine geeignete Quelle für Enzyme, man kann auch sehr einfach Tracerexperimente durchführen, weil die gefütterten Substanzen sehr effizient in die Zellen aufgenommen werden können. Ähnlich wie Mikroorganismen lassen sich Zellsuspensionskulturen auch in großvolumigen Bioreaktoren vermehren. Man versucht dabei, pflanzliche Zellkulturen in Analogie zur Produktion von Antibiotika technisch zur Sekundärstoffproduktion einzusetzen. Aller-

werden auch nicht alle Enzyme in diesen Zellen oder Geweben zu inden sein. Manche Enzyme benötigen zudem „Helferproteine“, wie es z. B. für den initialen Schritt der Lignanbildung nachgewiesen werden konnte. Fügt man das Helferprotein dem gereinigten Enzym zu, erfüllt dies seine biosynthetische Aufgabe auch in vitro korrekt. Trotz dieser Einschränkungen ist es aber gelungen, zahlreiche Biosyntheseschritte im Reagenzglas ablaufen zu lassen sowie die betrefenden Enzyme anzureichern und zu charakterisieren. Als Beispiel zeigt > Abb. 1.17 einen wichtigen Teilschritt der Berberin-Biosynthese, nämlich die oxidative Veränderung einer N-Methylgruppe, wobei letztlich das tetrazyklische Ringsystem der Protoberberinalkaloide entsteht.

dings ist dies bisher nur in wenigen Fällen überzeugend gelungen. Jede Zelle einer Suspensionskultur trägt die gesamte genetische Information zur Biosynthese der der Spezies eigentümlichen Sekundärprodukte. Es muss jedoch für jeden Einzelfall experimentell geprüft werden, ob unter den Bedingungen der Zellkultur die betreffenden Stoffe gebildet und akkumuliert werden. Mit dem Verlust der morphologischen Differenzierung ist nämlich nicht selten der Verlust der chemischen Spezialisierung korreliert. Hinsichtlich der Biosynthesefähigkeit lassen sich bei Zellkulturen drei Kategorien unterscheiden (Dougall 1981): x Die Biosynthese läuft in der Zellkultur in gleicher Weise wie in der Ganzpflanze ab. Dies trifft für viele Phenylpropane und einige Alkaloide (z. B. Berberin) zu. Nur in solchen Fällen kann die gesamte Biosynthese in der Zellkultur aufgeklärt werden. x Der Sekundärstoff wird in Zellkulturen nicht gebildet. Beispiel dafür sind Zellkulturen von Catharanthus roseus, die nicht imstande sind, die therapeutisch wichtigen Alkaloide Vinblastin und Vincristin zu biosynthetisieren. x Zwar läuft in der Zellkultur nicht die gesamte Biosynthesesequenz ab, doch können Teilreaktionen nachvollzogen werden. Beispielsweise wird in Zellkulturen von Papaver somniferum kein Morphin biosynthetisiert, doch gelingt es, die Morphinvorstufe (-)-Codeinon in (-)-Codein zu transformieren. Zellkulturen von Digitalis lanata sind in der Lage, Digitoxin und seine Derivate in Position C-12E selektiv zu hydroxylieren. So kann aus E-Methyldigitoxin der Arzneistoff Methyldigoxin hergestellt werden.

Enzymkomplexe. Enzyme können in Komplexen zusammengefasst sein und Zwischenprodukte können von Enzym zu Enzym „weitergereicht“ werden. Bisher lässt sich nicht jeder Einzelschritt einer Biosynthese für sich isoliert im Reagenzglas nachstellen. Einige Enzyme sind so fest an Membranen oder andere Zellstrukturen gebunden, dass sie einerseits schlecht von diesen Strukturen abgetrennt werden können und andererseits diese Strukturen sogar für ihre Aktivität brauchen. Mit den Methoden der Molekulargenetik ( > weiter unten) gelingt es aber mittlerweile auch, Enzyme, z. B. Cytochrom-abhängige Monooxygenasen, zu sequenzieren und ihre Funktionalität und Speziität zu prüfen, obwohl man sie mit den klassischen Methoden der Proteinreinigung nicht isolieren kann.

1.4 Aufklärung von Biosynthesewegen

1

. Abb. 1.17 H3CO

H3CO O2

N HO H

+

N

CH3

CH2

HO H OH

OH

H2O 2

OCH3

OCH3

(S)-Reticulin

H3CO N HO H OH

OCH3 (S)-Scoulerin

Beispiel einer enzymatischen Umwandlung durch zellfreie Extrakte. Die Bildung der „Berberinbrücke“ erfolgt oxidativ, wobei pro Mol eingesetztem (S-)-Reticulin 1 Mol O2 verbraucht wird. Das diese Reaktion katalysierende Enzym wurde aus Zellkulturen von Berberis beaniana SCHNEID. angereichert, es kommt aber auch in ausdifferenzierten Berberis-Pflanzen vor. Es hat ein Molekulargewicht von ca. 50 kDa und ein Temperaturoptimum bei 45 °C (Zenk 1985)

In vivo wird das naszierende Produkt unter Umständen wie in einer Kette von Enzym zu Enzym weiter gereicht („metabolite channeling“). Diese Situation ist in vitro schwierig nachzuahmen, für die Enzymreaktion aber möglicherweise entscheidend. Die Schwierigkeit, einzelne Enzyme zu isolieren, erklärt sich also teilweise durch ihre räumliche Anordnung in der Zelle und ihre Abhängigkeit von der Anwesenheit anderer Strukturen ( > Abb. 1.18). Von einigen Enzymen weiß man, dass sie zu ganzen Aggregaten („Multienzymkomplexen“) zusammen gefasst sind, die funktionelle Einheiten darstellen und nach dem Autrennen anders funktionieren als in der lebenden Zelle oder völlig inaktiv sind. Daneben gibt es noch Enzyme, die aus nur einem Protein bestehen, das aber zwei oder mehrere katalytische Zentren aufweist. Man bezeichnet sie als multifunktionelle Proteine. Beispiele für Reaktionssequenzen, die an Enzymkomplexen ablaufen, sind:

x x x x

die E-Oxidation der Fettsäuren ( > Abb. 1.19), die Aromatenbiosynthese, die Tryptophanbiosynthese, die Flavanon- und die Stilbenbiosynthese (Luckner 1990; Staford 1981).

Das räumliche Zusammenrücken (Aggregieren) funktionell zusammengehöriger Enzyme zu Multienzymkomplexen bewirkt die Bildung eines Mikrokompartiments, d. h. eines gegenüber dem übrigen Zellraum abgeschlossenen Reaktionsraumes, was ein sehr eizientes Umsetzen der Metabolite sowie den ungestörten Reaktionsluss in eine einzige Richtung gewährleistet. Die Reaktionskette läut nach dem „Fließbandprinzip“ ab, d. h. ohne Ablösung der umgesetzten Substrate nach jedem Teilschritt. Der Prototyp eines derartigen Reaktionsverlaufs ist der Ablauf der Fettsäurebiosynthese am Multienzymkomplex der Fettsäuresynthase, einem Mikrokompartiment, das „mit Ace-

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1

Prinzipien des Sekundärstoffwechsels

. Abb. 1.18 A B C D E Ausgangs Endprodukt substanz E1 E2 E3 E4 E5 E6

E7

Endprodukt

E6

E2 E1

Ausgangs substanz

Das Produkt der einen Enzymreaktion ist Substrat für die nächste Reaktion. A - E sind diffundierende Zwischenprodukte 2 Multienzymkomplex (Fettsäuresynthese) Reaktionskette für Zwischenprodukte nicht frei zugänglich

E3

E5

1 Frei im Plasma (Glykolyse)

E4 Ausgangs substanz E1 E2 E3 E4 E5

3 Membrangebunden (Atmungskette) Die Enzyme können nicht einzeln von der Membran gelöst und isoliert werden

A B C D Endprodukt

Typen räumlicher Anordnung von Enzymen in der Zelle (aus Herder Lexikon der Biochemie und Molekularbiologie, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg Berlin New York, 1995). Kennzeichnend für Multienzymkomplexe, die aggregiert (2) oder an Membranen gebunden (3) vorliegen können, ist es, dass die Zwischenprodukte einer Reaktionskette nicht frei zugänglich sind, d. h., sie sind nicht nachweisbar. Auch können von außen zugeführte Zwischenprodukte nicht als Substrat für die Enzyme dienen. Wenn in einer Biosynthesekette die Zwischenprodukte nie in das Lösungsmittel freigesetzt, sondern von Enzym zu Enzym weitergeschleust werden, spricht man von einem „Fließbandprinzip“ oder von einer „kanalisierten Weitergabe (engl.: channeling). Ein „channeling“, das an der Membran des endoplasmatischen Reticulums abläuft, ist der direkte Übergang von Phenylalanin in p-Cumarsäure (s. Abb. 1.20)

tyl-SCoA, Malonyl-SCoA und NADP-H gefüttert wird und Stearoyl-SCoA ausspuckt“ (Kindl 1994). Dieses „Fließbandprinzip“ bietet den Vorteil, dass die Zwischenstufen einer Reaktionskette nicht in einer bestimmten Mindestkonzentration vorliegen müssen, um durch Difusion die Enzym-Substrat-Bindung in zeitlich vertretbarer Abfolge zu sichern. Ein einzelnes Substratmolekül pro Teilenzym reicht aus, um die Reaktionsfolge in Gang zu halten, was für die Zelle höchst ökonomisch ist: Bei kleinsten stationären Konzentrationen lassen sich große Stofumsätze erzielen ( > Abb. 1.20).

Spezifische Hemmung von Enzymen. Mit geeigneten, genügend speziischen Inhibitoren lassen sich einzelne Biosyntheseschritte gezielt auf der Ebene der Enzyme inhibieren. Die selektive Hemmung des Mevalonat-Wegs der Terpenoidbildung durch Statine wurde weiter oben bereits dargestellt ( > Kap. 1.3). Selektive Inhibitoren der Ornithin-Decarboxylase einerseits und der Arginin-Decarboxylase andrerseits wurden eingesetzt, um den Hauptweg der Tropanalkaloid-Biosynthese zu inden. Dieser scheint zumindest in Datura stramonium nicht über die direkte Decarboxlierung von Ornithin zu Putrescin zu führen, sondern über Arginin und Agmatin ( > Abb. 1.21).

1.4 Aufklärung von Biosynthesewegen

1

. Abb. 1.19 CH

CH CH

CH2

C O

OH

HYDRATASE

CH2

DEHYDROGENASE

EPIMERASE

ISOMERASE

Schema zur Verdeutlichung des Begriffes „multifunktionelles Protein“ am Beispiel der Enzyme der β-Oxidation von Fettsäuren (aus Kindl 1994). Ein einziges Protein hat mehr als nur 1 katalytisches Zentrum. Hinweis: Von einem multifunktionellen Protein zu unterscheiden ist ein Multienzymkomplex, der aus mehreren assoziierten Enzymen (einem Enzymaggregat) besteht . Abb. 1.20 COOH H

COOH

NH2

COOH

H

H

H H

H

H Hydroxylase

PAL

L-Phenylalanin

Zimtsäure

weitere Sekundärstoffe

OH p-Cumarsäure

Trotz hoher Umsätze von L-Phenylalanin zu p-Cumarsäure kommt Zimtsäure nur in sehr geringen Konzentrationen in der Zelle vor. Das Zwischenprodukt Zimtsäure wird an einem Enzymkomplex sofort weitergereicht, um hydroxyliert zu werden, Beispiel für einen Vorgang, der nach dem „Fließbandprinzip“ abläuft („channeling“). PAL Phenylalaninammoniumlyase. Die Zimtsäurehydroxylyase arbeitet in einem Komplex mit PAL zusammen, stellt aber bereits selbst einen Enzymkomplex mit der NADPH-Cyt-P450-Oxidoreduktase dar (Kindl 1994)

1.4.3 Genetische und molekulargenetische Methoden Zu den genetischen und molekulargenetischen Methoden gehören alle Techniken, bei denen das Erbmaterial mehr oder weniger gezielt verändert wird. Dazu zählen die klassischen Kreuzungsexperimente und die ungerichtete Mutagenese unter Einsatz von Strahlung oder mutagenen

Substanzen, aber auch die modernen Ansätze der gerichteten, punktgenauen In-vitro-Mutagenese und dem horizontalen, also über Artgrenzen hinweg erfolgenden Gentransfer. Kreuzungsexperimente. In Kreuzungsexperimenten

wird das biosynthetische Potential der Kreuzungspartner kombiniert. Durch Kreuzungsexperimente und Akku-

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26

1

Prinzipien des Sekundärstoffwechsels

. Abb. 1.21

Durch die spezifische Inhibierung der Ornithindecarboxylase (DFMO, α-Difluormetyhlornithin) einerseits bzw. der Arginindecarboxylase (DFMA, α-Difluormethylarginin) andrerseits konnte gezeigt werden, dass der bevorzugte Weg der Tropanalkaloid-Biosynthese in Datura stramonium L. über Arginin und Agmatin läuft (Robins et al. 1991)

mulatanalyse lassen sich in einigen Fällen Rückschlüsse auf Biosyntheseschritte ziehen. Mittels dieser Methode wurde beispielsweise gefunden, dass in Papaver-Arten Codein nicht durch Methylierung aus Morphin entsteht, sondern dass der letzte Biosyntheseschritt in einer Entmethylierung besteht ( > Abb. 1.22). Von Papaver bracteatum lindl. ist eine Form bekannt, die viel hebain und praktisch kein Codein und Morphin enthält, während Papaver somniferum sowohl Morphin als auch Codein führt. Beide Arten wurden gekreuzt mit dem Ergebnis, dass im Bastard neben wenig hebain erhebliche Mengen an Morphin gefunden wurden. Dieses Versuchsergebnis wurde wie folgt interpretiert: Die genetische

Konstitution der thebainreichen Mutante von P. bracteatum erlaubt zwar die Synthese von hebain, doch fehlen die Gene zum Aubau der demethylierenden Enzyme; P. somniferum verfügt über diese Gene und steuert sie dem Bastard bei. Idiotrophe Mutanten. Idiotrophe Mutanten lassen Bio-

synthesewege und Zwischenstufen erkennen. Genetische Methoden der Auklärung von Biosynthesewegen sind v. a. für Sekundärstofe in Mikroorganismen angewendet worden. Zu diesen Methoden zählt die Identiikation von Biosynthesesequenzen durch idiotrophe Mutanten. Idiotrophe Mutanten beziehen sich auf den Sekundärstof-

. Abb. 1.22 H3CO

H3CO

HO

O-Methyloxidase O

O N

O

CH3

N

Thebain

N

CH3

HO

HO

H3CO

CH3

Codein

Morphin

Als Ergebnis einer induzierten Mutation akkumuliert eine Mutante von Papaver bracteatum über 95% der Gesamtalkaloide in Form von Thebain. Der Biosyntheseweg bis zum Thebain ist noch möglich, die Gene bzw. Enzyme für die weitere Umwandlung aber sind blockiert. Durch Einkreuzen von P. somniferum erhalten die Hybride die Fähigkeit, Thebain zu entmethylieren, erkennbar daran, dass nunmehr wenig Thebain akkumuliert wird

1

1.4 Aufklärung von Biosynthesewegen

. Abb. 1.23

. Abb. 1.24 G2

G1

Enzym 1 A

Enzym 2 B

G4

G3

Mutante X

Mutante Y

A

A

A

B

B

B

C

C

C

D

D

D

Enzym 4

Enzym 3 C

WILDSTAMM

D

Produkt

Normalform (Wildform)

G2 mutiert

G1

kein Enzym 2

Enzym 1 A

B

Biosynthese unterbrochen

Genetische Blockierung in einer auxotrophen Mutante durch Ausfall des Enzyms E2. Rückschlüsse auf die Konstitution der Zwischenstufen B und C ergeben sich a) aus der Anhäufung des Zwischenproduktes B und b) durch Normalisierung nach künstlicher Zufuhr (Supplementierung) der Substanz C zur Nährlösung. Die Methode geht von der Voraussetzung aus, dass jedes Gen G2 bis G4 für einen spezifischen Reaktionsschritt verantwortlich ist

wechsel und bilden eine Art Pendant zu den auxotrophen Mutanten des Primärstofwechsels, mit dem Unterschied, dass Letztere durch so genannte Komplementierungsexperimente ( > unten) sehr viel einfacher identiiziert und isoliert werden können als die idiotrophen Mutanten, deren Überlebensfähigkeit ja durch die Mutation nicht beeinträchtigt ist. Auxotrophe Mutanten (oder Defektmutanten) haben durch Mutation die Fähigkeit zur Synthese eines oder mehrerer primärer Stofwechselprodukte verloren ( > Abb. 1.23). Um auxotrophe Mutanten am Leben zu erhalten, muss dem Nährmedium der fehlende Stof zugesetzt werden, daher die Bezeichnung „auxotroph“ von griech.: auxe [Zuwachs, Vergrößerung] und trophein [ernähren], das übliche Nährmedium muss um einen weiteren Stof ergänzt werden. Idiotrophe Mutanten (griech.: idios [eigen, selbst]) sind hinsichtlich der Ernährungsansprüche unverändert (selbst), ihr Wachstum ist uneingeschränkt, sie haben aber durch Mutation die Fähigkeit zur Biosynthese eines oder mehrerer Sekundärstofe verloren. Würde man von außen den Stof zusetzen, der hinter einem blockierten Biosyntheseschritt liegt, so würde natürlich, ganz in Analogie zu den auxotrophen Mutanten, die

Sekundärprodukt

Anreicherung von A

Anreicherung von B

Mutante X

Mutante Y gemeinsame Kultur

Sekundärprodukt

Analyse eines Biosyntheseweges bei Mikroorganismen durch idiotrophe Blockmutanten. Komplementierung einer frühen Blockmutante X durch Metabolit B als Produkt einer Blockmutante Y mit späterer Unterbrechung im Syntheseweg (nach Gräfe 1992). Durch Einbeziehung weiterer Mutanten lässt sich die ganze Biosynthesesequenz ermitteln

Biosynthese weiterlaufen. In der Regel sind diese Zwischenprodukte nicht bekannt: Zur Komplementierung zieht man sekretierte Produkte von idiotrophen Stämmen heran, deren Biosynthese an einer späteren Stelle blockiert ist ( > Abb. 1.24). Dieses Prinzip wird als Kosynthese bezeichnet (McCormick et al. 1960). Bei der Identiizierung der verschiedenen Zwischenprodukte, die jeweils vor dem blockierten Enzym (fehlendes oder funktionsuntüchtiges Enzym) liegen, lässt sich die Reihenfolge der einzelnen Biosyntheseschritte nach und nach aufrollen – eine gelegentlich sehr mühsame Aufgabe, wenn z. B. über 80 verschiedene Blockmutanten induziert und isoliert werden müssen (Gräfe 1992). Idiotrophe Blockmutanten wurden bisher charakterisiert als vermehrungsfähige Mutanten, bei denen der Bio-

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1

Prinzipien des Sekundärstoffwechsels

syntheseweg eines Sekundärproduktes an einer oder an mehreren Stellen infolge fehlender Enzymaktivität unterbrochen ist. Daneben gibt es zwei weitere Blockadetypen: 1. Die Synthese essentieller Kofaktoren, die zur Biosynthese gebraucht werden, kann blockiert sein. 2. Es können regulatorische Gene ausfallen, die im Normalfall den Gesamtbiosyntheseweg einschalten. Kombinatorische Biosynthese. Kombinatorische Bio-

synthese erlaubt gezielte Veränderungen von Biosynthesewegen. Die Kosynthese im deinierten Sinne ( > oben) ist zu unterscheiden von der kombinatorischen Biosynthese (Hybridbiosynthese). Diese basiert auf der Anwendung molekulargenetischer Methoden zur Übertragung von Genen („Klonierung“), die für bestimmte Biosyntheseschritte notwendig sind und aus einem Spenderorganismus in einen Empfänger mit Hilfe geeigneter Vektoren (z. B. bakterielle Plasmide, Viren) übertragen und dort exprimiert werden. Es können auch mehrere Gene übertragen werden. Ziel der genetischen Transformation ist in diesem Falle nicht die Herstellung eines rekombinanten

Proteins, sondern die Integration des durch Genexpression gebildeten Proteins in den anabolen oder amphibolen Stofwechsel. In Mikroorganismen, wo die Biosynthesegene für bestimmte Stofe (z. B. Polyketide) häuig „geclustert“ vorkommen ( > Kap. 1.2), ist die genetische Manipulation des Biosyntheseweges relativ einfach. Zusätzlich können Biosynthesegene modular organisiert sein. Das bedeutet, dass bestimmte Gene oder Gengruppen als funktionelle Blocks zusammen gefasst sind. So gelingt es mittlerweile, Gene und Genfragmente ganz unterschiedlicher Organismen zu kombinieren ( > Abb. 1.25). Neben der Möglichkeit, zusätzliche Gene oder ganze Biosynthesemodule einzufügen, ergibt sich so die Möglichkeit, bestimmte Gene durch ortsgerichtete Mutagenese („site-directed mutagenesis“) so zu verändern, dass Enzyme mit veränderten katalytischen Eigenschaten entstehen. Dazu nutzt man unterschiedliche Techniken (z. B. PolymeraseKettenreaktion) mit deren Hilfe in vitro in klonierter DNA deinierte Mutationen erzeugt werden können. Durch Übertragung fremder Gene in antibiotikaproduzierende Mikroorganismenstämme ist es in einigen Fällen gelungen, neue Produktvarianten zu erhalten (Gräfe 1992).

. Abb. 1.25

Kombinatorische Biosynthese und „metabolic engineering“ bei der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Folgende Gene wurden in die Hefe übertragen: ∆7-Reduktase (aus dem Genom der Ackerschmalwand), CYP11A1 (aus dem Genom des Rindes) und 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (aus dem menschlichen Genom). Zur Umgehung von Ergosterol wurde außerdem das hefeeigene Gen ∆22-Desaturase inaktiviert. Ergosta-5,7,22,24(28)-tetraen-3β-ol ist nämlich auch ein Substrat der ∆7-Reduktase (Duport et al. 1998)

1.4 Aufklärung von Biosynthesewegen

! Kernaussage

Für die erfolgreiche Ordnung der sekundären Naturstoffe nach biogenetischen Prinzipien ist es notwendig, die Biosynthesewege, auf denen die verschiedenen Stoffe bzw. Stoffgruppen gebildet werden, aufzuklären. Mit Hilfe von Isotopen lassen sich synthetisierte Stoffe markieren; die Markierung kann durch Strahlungsmessung (radioaktive Isotopen), Massenspektrometrie oder Kernresonanzspektroskopie (schwere stabile Isotopen) nachgewiesen und lokalisiert werden. An der Biosynthese beteiligte Enzyme

und Gene werden mit Hilfe biochemischer und molekulargenetischer Methoden isoliert und charakterisiert. Durch gerichtete oder ungerichtete Mutagenese lassen sich bestimmte Biosynthesegene ausschalten oder verändern. Durch Kreuzungsexperimente und Gentransfer können Biosynthesewege ergänzt oder komplementiert werden. Pflanzliche Zellsuspensionskulturen sind für Biosynthesestudien besonders gut geeignet, weil sie in großen Mengen ähnlich wie Mikroorganismen gezüchtet werden können.

6 Schlüsselbegriffe 1-Desoxy-D-Xylulose (DOX) 13C-Kernresonanz-Spektroskopie (13C-NMR) 2-Methylerythritolphosphat (MEP) 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Acetatregel Acetylcoenzym A Alkaloide Aminosäureregel Amphibolismus Anabolismus ATP Auxotrophe Mutanten C1-Bausteine C2-Bausteine C5-Bausteine Chorisminsäure Citrat-Zyklus Codon usage Dimethylallyldiphosphat (DMAPP) Enzyminhibitoren Enzyme Enzymkomplexe

1

Enzymreinigung Evolution Gen-Cluster Genduplizierung Genetischer Code Glykolyse Idiotrophe Mutanten Isopentenyldiphosphat (IPP) Isoprenregel Katabolismus Kombinatorische Biosynthese Lysin Massenspektrometrie Metabolic engineering Metabolisches Netz Metabolite channelling Mutagenese Mutationen Naturstoffe Ontogenetische Variabilität Ornithin Ortsgerichtete Mutagenese Pentosephosphat-Zyklus

Pflanzliche Zellsuspensionskultur Phenylalanin Phenylpropane Phytoalexine Polyketide Primärstoffwechsel Pulse-Chase-Experiment Pyridoxalphosphat Radioaktive Isotopen S-Adenosylmethionin Schwere Isotopen Sekundäre Naturstoffe Sekundärstoffe Sekundärstoffwechsel Shikimisäureweg Terpenoide Tracertechnik Transaminierung Tryptophan Tyrosin Zuckernukleotide

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30

1

Prinzipien des Sekundärstoffwechsels

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2 2 Einführung in die Analytik sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe anhand ausgewählter Beispiele J. Heilmann 2.1

Allgemeines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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2.2

Aufarbeitung und Extraktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

34

2.3

Chromatographische Trennung und Isolierung . . . . . . . . . . . 2.3.1 Dünnschichtchromatographie und Fließmitteloptimierung 2.3.2 Säulenchromatographie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.3 MPLC und HPLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.4

Strukturauklärung und Substanzcharakterisierung 2.4.1 NMR-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.2 Massenspektrometrie . . . . . . . . . . . . . . 2.4.3 Ultraviolettspektroskopie (UV-Spektroskopie)

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35 35 40 40

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43 43 50 55

Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Einführung in die Analytik sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe anhand ausgewählter Beispiele

> Einleitung Bei einer Betrachtung der Analytik von sekundären Pflanzeninhaltsstoffen kann man auf den ersten Blick den Eindruck gewinnen, dass sich die dort angewendeten analytischen Methoden nicht wesentlich von denen anderer Fachrichtungen unterscheiden. Ebenso wie in der organischen oder pharmazeutischen Chemie sind die Dünnschichtchromatographie (DC), die Chromatographie mittels einer offenen Säule (SC) sowie die Hochdruckflüssig- bzw. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unentbehrliche Methoden zur Isolierung und Reinigung einer Substanz. Ebenso verhält es sich mit den zur Strukturaufklärung bzw. Substanzcharakterisierung eingesetzten Techniken. Zentrale Methoden der Strukturaufklärung sind die Ultraviolett-Spektroskopie (UV), die Massenspektrometrie (MS), die Kernresonanzspektroskopie (NMR) und die Röntgenstrukturanalyse. Bei der Substanzcharakterisierung sind neben der Elementaranalyse, die Bestimmung der optischen Drehung (Polarimetrie) und die Bestimmung des Schmelzpunktes zu nennen. Bei näherer Betrachtung fallen jedoch zahlreiche Besonderheiten auf, die in ihrer Summe zu einer eigenen Identität des Fachgebietes Analytik sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe führen. Diese Besonderheiten basieren wesentlich auf der Herkunft, der Qualität und der Beschaffenheit des in der Regel sehr komplex zusammengesetzten Untersuchungsmaterials. Ganz besonders deutlich wird dies am Beispiel der Gehaltsbestimmungen im Bereich der Qualitätskontrolle und -sicherung von pflanzlichen Extrakten. Sie werden in Anlehnung an das Europäische Arzneibuch in standardisierte, quantifizierte und andere Extrakte eingeteilt (Franz 2002). Der Begriff „standardisiert“ fasst Extrakte zusammen, für die bekannt ist, auf welche Inhaltsstoffe die therapeutische Wirkung zurückgeht (z. B. bei Sennesblättern) und die Gehaltsbestimmung wird entsprechend darauf ausgerichtet. Bei quantifizierten Extrakten wird der therapeutische Effekt nicht von einer einzelnen Substanz (bzw. -klasse) bestimmt, sondern von mehreren. Für diese „wirksamkeitsmitbestimmenden“ Inhaltsstoffe wird ein definierter Gehaltsbereich eingestellt (z. B. bei Extrakten aus Johanniskraut). Als „andere Extrakte“ werden diejenigen bezeichnet, die eine nachgewiesene klinische Wirksamkeit besitzen, jedoch kei-

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ne der enthaltenen Inhaltsstoffklassen direkt mit dieser Wirkung in Zusammenhang gebracht werden kann (z. B. bei der Baldrianwurzel). Die Qualitätssicherung eines solchen Extrakts kann nur über den Herstellungsprozess erfolgen und man behilft sich mit der Quantifizierung einer Leitsubstanz. Es ist daher nicht die Absicht dieses Kapitels, die theoretischen Grundlagen der verschiedenen chromatographischen und spektroskopischen Verfahren im Detail herauszuarbeiten. Hier sei auf bereits vorhandene Lehrbücher und Literatur (wie z. B. von Hesse et al. 2005; Adam u. Becker 2000; Neugebauer et al. 2001) verwiesen. Vielmehr sollen spezifisch pharmazeutisch-biologische Frage- und Problemstellungen an ausgewählten Beispielen aufgezeigt sowie Strategien und praktische Hinweise zur deren Lösung gegeben werden.

2.1 Allgemeines Wie im Kapitel „Moderne Bioassay-Methoden“ (Kap. 6) erläutert, leistet die Pharmazeutische Biologie mit der Aufindung, Isolierung und Charakterisierung von biologisch aktiven Sekundärstofen aus lebenden Organismen (Planzen, Mikroorganismen) einen wesentlichen Beitrag zur Entwicklung von neuen Leitstrukturen. Das Planzenmaterial kann in der Regel nicht direkt einer Analyse zugeführt werden, sondern muss zunächst geschnitten bzw. zerkleinert und danach extrahiert werden. Die enthaltenen Extrakte können zum einen mittels aufeinander folgender säulenchromatographischer Verfahren an verschiedenen stationären Phasen aufgetrennt werden. Die Auswahl einer sinnvollen Methode und einer geeigneten stationären Phase ist dabei wesentlich von der Art und der Menge des vorhandenen Extrakts abhängig ( > Abb. 2.1). Führt die Verwendung von ofenen Säulen oder das Anlegen eines leichten Drucks (bzw. Vakuums) noch nicht zur Isolierung von Reinsubstanzen, so kommen mit abnehmender Komplexizität und kleiner werdenden Fraktionen auch leistungsfähigere Methoden wie die MPLC (Mitteldrucklüssigkeitschromatographie) und die (präparative bzw. semipräparative) HPLC zum Einsatz. Eine andere Möglichkeit, komplexe Extrakte aufzuarbeiten, beruht in der Anwendung von Verteilungs- und Ausschüttelvorgängen (Flüssig/Flüssig-Verteilungen), die auch automatisiert ablaufen können („high-speed countercurrent chromato-

2.1 Allgemeines

2

. Abb. 2.1

Isolierung der Hauptinhaltsstoffe (Lignane) aus einem lipophilen Extrakt der oberirdischen Teile von Phyllanthus piscatorum (Euphorbiaceae). Die Aufarbeitung erfolgt zunächst mittels VLC, an die sich offene Säulen- und HPLC-Verfahren zur Isolierung bzw. Endreinigung anschließen. VLC Vakuum-Flüssig-Chromatographie, DCM Dichlormethan

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2

Einführung in die Analytik sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe anhand ausgewählter Beispiele

graphy“, HSCCC). Beide Strategien, die Anwendung von Säulenchromatographie oder Verteilungsverfahren, können auch miteinander kombiniert werden. Zur Beurteilung des Trennerfolgs und der Analyse von entstandenen Fraktionen wird fast immer die DC eingesetzt. Mit Hilfe verschiedener speziischer und unspeziischer Sprühreagenzien können auch erste Strukturinformationen erhalten werden. Infobox Präparative und semipräparative Methoden. Eine Methode wird als präparativ bezeichnet, wenn sie die Isolierung und Reinigung einer Substanz zum Ziel hat. Semipräparative Methoden haben das gleiche Ziel, jedoch sind die dafür gewählten Bedingungen, wie z. B. Säulengröße oder Flussrate, zum Teil eher analytischer Natur. Die isolierten Substanzmengen liegen bei semipräparativen Methoden etwa im Bereich von 0,1–10 mg.

Unter den Methoden zur Strukturauklärung einer isolierten Verbindung hat neben der NMR-Spektroskopie auch die Massenspektrometrie eine herausragende Bedeutung erlangt. In den letzten Jahren ist die Kopplung dieser beiden Verfahren mit der HPLC immer wichtiger geworden, da sie auch die Identiizierung von sehr kleinen Substanzmengen in einem komplexen Gemisch ohne vorherige Isolierung erlaubt. Die HPLC/MS und HPLC/NMRKopplungen sollen im folgenden Kapitel jedoch ausgeklammert werden, da sie eine besonders wichtige Rolle bei verschiedenen Screening-Methoden spielen und entsprechend im Kap. 5 besprochen werden. Es muss jedoch an dieser Stelle explizit darauf hingewiesen werden, dass diese modernen Techniken nicht die Isolierung einer Substanz ersetzen sollen. Vielmehr kann die aufwendige Isolierung bereits bekannter Naturstofe vermieden und die Auindung von neuartigen Strukturen wesentlich erleichtert werden. Zur Durchführung einer pharmakologischen Testung ist die saubere Isolierung und physikalisch-chemische Charakterisierung einer Verbindung nach wie vor ein nicht umgehbares Muss. Ein weiteres großes Aufgabengebiet der Pharmazeutischen Biologie ist die Sicherung der Qualität von Arzneiplanzen und der verschiedensten daraus gewonnenen Zubereitungen. Für zahlreiche Drogen, Extrakte und Naturstofe werden die Standards zur Qualitätssicherung vom Europäischen bzw. Deutschen Arzneibuch durch die Erstellung von Monographien festgelegt. Mit Hilfe ver-

schiedener Verfahren, wie der Mikroskopie, der klassischen DC, der Hochleistungsdünnschichtchromatographie („high performance thin layer chromatography“, HPTLC), der Gaschromatographie (GC) und der HPLC werden die Anforderungen für die Identität, die Reinheit und den Gehalt einer Droge (bzw. einer entsprechenden Zubereitung) überprüt. Bei den Gehaltsbestimmungen muss dabei prinzipiell zwischen der Bestimmung eines Gesamtgehalts und der Gehaltsbestimmung für eine einzelne Verbindung unterschieden werden. Bei einer Gesamtgehaltsbestimmung, die u. a. typisch für Flavonoid-, aber auch für Gerbstof- und Anthranoiddrogen ist, werden verschiedene Verbindungen, die eine gleichartige oder gleichartig reagierende Partialstruktur besitzen, über eine Gruppenreaktion gemeinsam erfasst. Bei der getrennten quantitativen Bestimmung einer oder auch mehrerer deinierter Verbindungen nebeneinander, muss der Bestimmung eine geeignete Trennmethode mit Hilfe einer chromatographischen Methode vorangehen. Dieser Bereich, der neben den Gehaltsbestimmungen auch die quantitativen Reinheits- und Stabilitätsprüfungen umfasst, ist eine fast absolute Domäne der gekoppelten Verfahren wie z. B. der HPLC/UV-, HPLC/MS-, GC/MS- oder HPTLC/Scanner-Kopplungen. Da in einer Droge bzw. der entsprechenden Zubereitung ein sehr komplexes Gemisch von Substanzen vorliegt, ergeben sich für die Identitäts- und Reinheitsprüfung sowie für die Gehaltsbestimmung außerordentliche Herausforderungen, die so in anderen Fachgebieten nicht existieren.

2.2 Aufarbeitung und Extraktion Die Isolierung von Sekundärstofen aus Planzen beginnt in der Regel mit der schonenden Trocknung des Ausgangsmaterials (30–40 °C). Nach einem Zerkleinerungsschritt werden die niedermolekularen Inhaltsstofe durch fraktionierte Extraktion mit einer eluotropen Lösungsmittelreihe, d. h. in Richtung steigender Elutionswirkung geordnet, von den polymeren Trägersubstanzen (Cellulose, Lignin usw.) abgetrennt. Um eine efektive Extraktion zu gewährleisten, muss das Material eine bestimmte Korngröße aufweisen, wobei eine geringe Korngröße (und Wärme) maßgeblich die Extraktion fördert. Mahlvorgänge zur Zerkleinerung und Homogenisierung des Probenmaterials sind aber in der Regel zeitaufwendig und belasten die Probe thermisch wie mechanisch, sodass die Körnung stets nur so fein wie nötig gewählt werden sollte. Dies

2.3 Chromatographische Trennung und Isolierung

trit besonders für verholzte (= harte) Planzenteile wie Rhizome, Wurzeln oder Rinden zu, die insbesondere bei der Verwendung einer kleineren bzw. weniger leistungsstarken Mühle einer Vorzerkleinerung bedürfen. Zur Einstellung des gewünschten Korngrößenbereichs dient ein in die Mühle integrierter Siebeinsatz, wobei für Naturstofextraktionen eine mittlere Körnung von 0,34,0 mm üblicherweise genügt. Im Europäischen und Deutschen Arzneibuch wird der Zerkleinerungsgrad einer Droge durch eine Siebnummer deiniert, die die lichte Maschenweite in Mikrometern bezeichnet. Zur Durchführung der in den Monographien vorgeschriebenen Untersuchungen werden bei Drogen häuig die Siebe 180 und 355 verwendet. Von Sonderfällen abgesehen, muss bei der Extraktion zwischen folgenden vier Arbeitstechniken diferenziert werden: 1) Mazeration, 2) Digestion, 3) Perkolation und 4) Soxhlet-Extraktion. Mazeration und Perkolation laufen unter Raumtemperatur ab, Digestion und Soxhlet-Extraktion hingegen bei 40–50 °C. Andererseits spielen sich 1) und 2) jeweils in stehendem, 3) und 4) aber in ließendem Lösungsmittel ab. Zur Extraktion können generell nicht nur Lösungsmittel, sondern auch überkritische Gase, insbesondere CO2, verwendet werden. Für phytochemische Untersuchungen stellt die Perkolation mit ihren Vorzügen, d. h. erschöpfende Extraktion (ständiger Austausch von gesättigtem gegen frisches Lösungsmittel) unter Schonung der Inhaltsstofe bei Raumtemperatur und apparativ einfacher Durchführung, im Allgemeinen die Methode der Wahl dar. Zu diesem Zweck wird das – zur Äquilibrierung der Durchlussrate – mit Seesand ausgiebig gemischte und in Lösungsmittel vorgequollene Drogenpulver langsam bei einer Abtropfgeschwindigkeit von 25 ml pro Minute (für >500 g Arzneidroge) so vollständig wie möglich unter DC-Kontrolle extrahiert. Im Verlauf einer mehrtägigen Extraktion wird über Nacht der Auslauf verschlossen und die Droge somit mazeriert. Ferner ist zu beachten, dass sich eine 100%ige Extraktion prinzipiell aufgrund ständig neu entstehender Konzentrationsgleichgewichte ausschließt und das Perkolationsverfahren somit nur bis zu einem bestimmten Grad ökonomisch fortgeführt werden kann und soll. Die hermolabilität zahlreicher Naturstofe erfordert das Einengen von Extrakten unter schonenden Bedingun-

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gen und zugleich geringem Zeitbedarf. Als Apparatur der Wahl haben sich Vakuum-Rotationsverdampfer bewährt, da durch ständiges Drehen des maximal halbvollen Kolbens der dünne Extraktilm an der Gefäßinnenwand ein rasches Verdampfen des Lösungsmittels ohne lokale Überhitzung ermöglicht.

2.3 Chromatographische Trennung und Isolierung 2.3.1 Dünnschichtchromatographie und Fließmitteloptimierung Bei diesem Trennverfahren beindet sich eine dünne, aus feinkörnigem Material bestehende stationäre Phase auf einer Trägerplatte aus Glas oder Metall. Der entscheidende Vorteil dieser Methode liegt im geringen apparativen Aufwand und Zeitbedarf neben minimalem Verbrauch an Untersuchungsmaterial. Die zur DC geeignete Anordnung umfasst zunächst die vollständig (!) gelöste Probe in punkt- oder strichförmiger Autragung (Abstand zum unteren Rand: 10–15 mm, Abstand zu den Seitenrändern 10 mm, Abstand untereinander ~10 mm). Bei der DCTrennung von Extrakten (= Vielstofgemischen) erhält man mit einer bandenförmigen Applikation ein einheitlicheres und übersichtlicheres Chromatogramm. Nach Einstellen der Platte oder Folie in eine dicht schließende Kammer mit geeignetem Fließmittel wandert dieses über Kapillarkräte in der Sorptionsschicht nach oben, wobei die Trennung der im Startleck enthaltenen Komponenten entsprechend ihren chromatographischen Eigenschaten erfolgt. Sehr häuig wird Kieselgel als stationäre Phase verwendet. Es ermöglicht die Trennung von Substanzen unter den Bedingungen der Adsorptions- und Verteilungschromatographie. Das Kieselgel ist häuig mit einem anorganischen Lumineszenzindikator belegt. Bei einer Bestrahlung mit Licht der Wellenlänge 254 nm können so direkt Substanzzonen identiiziert werden, die auf Grund von Absorptionsvorgängen ( > UV-Spektroskopie) zu einer Löschung auf der Platte führen. Das Fließmittel sollte von seiner Polarität so ausgewählt werden, dass die in der Analyse enthaltenden Substanzen Rf-Werte zwischen ~0,2–0,8 zeigen. Bei Verbindungen, die auf Grund ihrer Basizität oder Azidität zur Dissoziation neigen, empiehlt sich der Zusatz von Fließmittelkomponenten, die die Dissoziation zurückdrängen, da es sonst zum Tailing (= Schwanzbil-

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36

2

Einführung in die Analytik sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe anhand ausgewählter Beispiele

. Abb. 2.2

366

Vergleich der konventionellen DC mit der HPTLC am Beispiel des Citronenöls (PhEur). Als Fließmittel wurde Ethylacetat– Toluol (15 : 85) gewählt. Detektion: UV 254 und 366 nm. Als Referenzsubstanzen wurden Citropten (10 mg/10 ml) und Citral (50 µl/10 ml) gewählt. Sowohl bei DC als auch bei der HPTLC sind auf Bahn 1 und 3 die Untersuchungslösungen und auf der Bahn 2 die Referenzlösungen aufgetragen. Die Bandenbreite bei der DC lag bei 2 cm (je 10 µl Untersuchungs- bzw. Referenzlösungen), bei der HPTLC dagegen bei 1 cm (Untersuchungslösung 1 und 3: 2 und 3 µl, Referenzlösung: 5 µl). Das mit der HPTLC erhaltene Bandenmuster entspricht der Beschreibung nach dem Arzneibuch, sodass ein Identitätsnachweis mittels HPTLC eindeutig möglich ist. Insgesamt liegen die Rf -Werte bei der HPTLC (Citral: 0,54 vs. 0,46; Citropten: 0,39 vs. 0,31) etwas höher, die Entwicklungszeit ist um knapp 30 Minuten verkürzt und das Auftragevolumen konnte reduziert werden. Laufstrecke: 15 cm DC, 7,5 cm HPTLC (mit freundlicher Erlaubnis von Prof. Dr. G. Franz, Regensburg)

2.3 Chromatographische Trennung und Isolierung

dung) kommt. Bei sauren Verbindungen wie z. B. Phenolen (Flavonoide, Kafeesäurederivate) eignet sich der Zusatz von Essigsäure und/oder Ameisensäure (ein typisches Fließmittel für Flavonoidglykoside ist: Ethylacetat Ameisensäure–Essigsäure–Wasser 100 : 11 : 11 : 27); bei basischen Verbindungen wie z. B. Alkaloiden verwendet man gerne Ammoniakwasser. Kieselgel kann durch die kovalente Bindung von Alkylgruppen, Alkylamino- oder Alkylcyanogruppen modiiziert werden, wodurch sich eine wesentliche Veränderung der Trenneigenschaten ergeben kann. Sehr häuig werden Alkylgruppen mit einer Kettenlänge von 8 oder 18 Kohlenstofatomen verwendet. Es entsteht RP-(„reversed phase“-)8 bzw. -18Material. Als Fließmittel für diese stationären Phasen bieten sich Methanol-Wasser- bzw. Acetonitril-WasserGemische an. Die HPTLC stellt hinsichtlich des Trennvermögens, des Materialverbrauchs (u. a. geringere Fließmittelmengen) und des Zeitbedarfs eine Verbesserung der klassischen DC dar ( > Abb. 2.2). Die stationäre Phase liegt auf einem Glasträger und ist mit Schichtdicken von 0,1– 0,2 mm dünner aufgetragen als bei konventionellen analytischen DC-Platten (0,2–0,25 mm). Daneben unterscheiden sich DC und HPTLC hinsichtlich Korngrößenverteilung und mittlerer Korngröße. Zur Herstellung von HPTLC-Platten werden mittlere Korngrößen um die 6 µm (15 µm bei DC) bei gleichzeitig sehr einheitlicher Korngrößenverteilung verwendet. Dies führt zu einer Verbesserung der Trennleistung bei gleichzeitig geringerer Trennstrecke. Dies macht sich durch eine verbesserte Auflösung neben geringerer Bandenverbreiterung bemerkbar. Eine besonders gute Aulösung erhält man im Rf-Bereich zwischen 0,3 bis 0,4. Das Autragevolumen für die HPTLC liegt bei etwa 10–30% des für die klassische DC vorgeschriebenen Volumens. Die Entwicklung erfolgt idealerweise über eine Trennstrecke von 6 cm. Bei der HPTLC liegt die Entwicklungszeit etwa bei der Hälte der Zeit, die man für die Entwicklung der DC benötigen würde. Ein weiterer, durchaus wichtiger Kostenfaktor sind die nach Arzneibuch vorgesehenen, zuweilen relativ teuren Referenzsubstanzen. Dies kann durch die Einführung der HPTLC ebenfalls reduziert werden. Auch im Bereich der quantitativen Bestimmungen hat die Einführung der HPTLC wesentliche Fortschritte erbracht. Über die Kopplung mit einem DC-Scanner (densitometrische Bestimmung) sind für Extrakte leistungsfähige Trennungen und daran anschließende Gehaltsbestimmungen etabliert worden (Oberthür et al. 2004), die

2

den äquivalenten HPLC-Methoden nicht oder nur wenig nachstehen (Günther u. Schmidt 2004). In der Naturstofchemie verwendet man die DC vor allem als analytisches, aber auch als präparatives Verfahren. Analytische Problemstellungen sind beispielsweise die Optimierung von Fließ- und Extraktionsmittel, die Kontrolle von Fraktionen und Unterfraktionen bei Trennprozessen, die Identitäts-, Stabilitäts- und Reinheitsprüfung von Drogen (beispielsweise durch Fingerprint-Chromatogramme), die Identiizierung von bekannten Substanzen sowie die Gehaltsbestimmung. Bei analytischen Fragestellungen werden in der Regel Substanzmengen von 1–10 µg aufgetragen. Die präparative Dünnschichtchromatographie basiert auf dem Trennprotokoll des analytischen Ansatzes und dient zur raschen Isolierung kleiner Substanzmengen im Milligrammbereich. Mit konventionellen analytischen DC-Platten können auch in semipräparativem Maßstab Substanzen getrennt und isoliert werden. Für die präparative Trennung empiehlt sich die Verwendung von Platten mit einer Schichtdicke von 1–2 mm. Zur Durchführung wird das Substanzgemisch in einem möglichst lüchtigen Lösungsmittel vollständig gelöst und am Start in einer schmalen Bande über die gesamte Breite der Platte aufgetragen ( > Abb. 2.3). Nach der Entwicklung wird die Substanz lokalisiert und (nach dem Abkratzen oder Ausschneiden der entsprechenden Zone) mit einem geeigneten Lösungsmittel desorbiert. In der Regel werden bei der Verwendung von Kieselgel-Platten aber auch Bestandteile der stationären Phase mit gelöst, die die Aufnahme sauberer NMR- und MS-Spektren behindern. Infobox Rf -Wert. Der Rf -Wert oder Retentionsfaktor berechnet sich aus dem Quotienten aus der Entfernung von Start und der Substanzzone (Zähler) und der Entfernung von Start und der Front der mobilen Phase (Nenner). Er besitzt keine Dimension und nimmt Werte zwischen 0 (Substanz verbleibt am Start) und 1 (Substanz wandert mit der Front der mobilen Phase) an. Fingerprint. Mit einem Fingerprint-Chromatogramm wird geprüft, ob zwei zu untersuchende Proben das gleiche Inhaltsstoffsmuster (Fingerprint) aufweisen. Dies ist beispielsweise bei der Reinheitsprüfung von Phytopharmaka von erheblicher Bedeutung. Da vielfach der

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2

Einführung in die Analytik sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe anhand ausgewählter Beispiele

gesamte Extrakt als Wirkstoff aufgefasst wird, gilt es nicht als ausreichend, nur die Stabilität einiger Substanzen mit bekannter therapeutischer Aktivität nachzuweisen. Vielmehr müssen auch andere Substanzen im Extrakt konstant bleiben. Mit einer Analyse des Fingerprints kann überprüft werden, ob sich das Inhaltsstoffsmuster auch nach bestimmten Lagerungsfristen nicht wesentlich verändert hat.

Der Erfolg einer jeden chromatographischen Trennung wird wesentlich von der sorgfältigen Auswahl des Fließmittels mit bestimmt. Die Auswahl kann rein empirisch, in Anlehnung an Literaturangaben oder auch systematisch „ab initio“ erfolgen. Eine systematische Optimierung eines Fließmittels, sei es zur Verwendung für die DC oder SC, lässt sich dünnschichtchromatographisch mit Hilfe des „PRISMA“-Modells erreichen (Nyiredy . Abb. 2.3

Schematische Darstellung einer präparativen DC, wobei die einzelnen Zonen jeweils einer Substanz entsprechen. Die Substanzen 1 und 2 sind überlagert und können nicht als Reinsubstanzen gewonnen werden. Bei den Substanzen 4 und 5 handelt es sich um Minorkomponenten. Bei solchen Verbindungen reicht häufig die isolierbare Menge nicht für eine Strukturaufklärung aus. Substanz 3 ist die Hauptkomponente und nicht durch andere Substanzzonen überlagert. Zu ihrer Gewinnung wird die stationäre Phase in dieser Zone abgekratzt und die Verbindung mit Hilfe eines geeigneten Lösungsmittels desorbiert

et al. 1985). Die Optimierung geht von der Einteilung gebräuchlicher Lösungsmittel in Selektivitätsgruppen ( > Tabelle 2.1) aus, unter Berücksichtigung der jeweiligen Eigenschaten als Protonenakzeptor, -donator und/ oder Dipol. Innerhalb einer Selektivitätsgruppe herrschen trotz unterschiedlicher Lösungsmittelstärken (Si) ähnliche chromatographische Merkmale vor, wobei sich die Lösungsmittelstärke ST einer Mehrkomponentenphase mit . Tabelle 2.1 Gebräuchliche Lösungsmittel zur Optimierung einer DC-Trennung Gruppe

Lösungsmittel

Lösungsmittelstärke (Si)

n-Hexan

0,1

I

n-Butylether Isopropylether Methyl-tert-butylether Diethylether

2,1 2,4 2,7 2,8

II

n-Butanol Isopropylalkohola n-Propanol Ethanol Methanol

3,9 3,9 4,0 4,3 5,1

III

Tetrahydrofuran Pyridin Methoxyethanol Dimethylformamid

4,0 5,3 5,5 6,4

IV

Essigsäureb Formamid

6,0 9,6

V

Dichlormethan Ethylenchlorid

3,1 3,5

VI

Essigsäureethylester Methylethylketon Dioxan Aceton Acetonitril

4,4 4,7 4,8 5,1 5,8

VII

Toluol Benzol Nitrobenzol

2,4 2,7 4,4

VIII

Trichlormethan Nitromethan Wasser

a b

4,1 6,0 10,2

nicht „Isopropanol“, da ein Alkan „Isopropan“ nicht existiert! Zusatz als Modifikator zu 0,5% (v/v).

2.3 Chromatographische Trennung und Isolierung

dem Volumenbruch \L pro Lösungsmittel wie folgt berechnet: n

ST = ∑ i = 1 Si ψi

(1)

wobei Si die Lösungsmittelstärke eines Lösungsmittels, ST die Lösungsmittelstärke einer Mehrkomponentenphase und ψi der Volumenbruch pro Lösungsmittel darstellt. Si beziehungsweise ST bestimmen dabei maßgeblich die Retentionszeit und somit den Rf -Wert für aufzutrennende Komponenten. Bei „PRISMA“ handelt es um ein geometrisches Modell ( > Abb. 2.4) zur Beschreibung aller beliebigen quaternären (Innenraum), ternären (Seitenlächen) und binären (Kanten) Lösungsmittelgemische unter vertikaler Autragung der Lösungsmittelstärken (Kantenhöhe) und horizontaler Darstellung der Fließmittelselektivität (Mischungspunkte im gleichseitigen Dreieck). Zur Entfernung des oberen, irregulären Teils schneidet man das Prisma auf der Höhe der kürzesten Kante, in diesem Fall für die Lösungsmittelstärken ST (2) = ST (3), parallel zur Grundläche ab, indem gemäß obiger Gleichung ST (1) durch Zu-

2

mischen benötigter Volumenanteile von n-Hexan auf das Niveau der beiden anderen, unverdünnten Elutionsmittel (ST (2/3) = S2/3) gesenkt wird. So muss beispielsweise zur Halbierung von ST (1) der Anteil an n-Hexan, eines weitgehend inerten Lösungsmittels von vernachlässigbarer Stärke (S = 0,1), 50% (v/v) betragen. Zu Beginn der „PRISMA“-Optimierung prüt man konkret mindestens zwei der in > Tabelle 2.1 genannten Lösungsmittel pro Gruppe in unverdünnter Form auf ihre Eignung zur Separation vorliegender Fraktionen, wobei Wasser sowie Essigsäure als Modiikatoren für stark polare Komponenten nur verdünnt zum Einsatz kommen. Die Beurteilung der Trenneigenschaten hat im Rf -Bereich von 0,20,8 zu erfolgen (bei Übertragung auf eine SC-Trennung besser nur im Rf -Bereich 0,20,5), unter eventueller Korrektur durch n-Hexan, womit die jeweiligen Elutionsmittel unbegrenzt mischbar sein müssen. Auf DC-Folien können diese Untersuchungen rasch und ökonomisch mit je 10 ml Fließmittelgemisch durchgeführt werden. Nach Auswahl der drei am besten geeigneten Elutionsmittel gemäß maximaler Anzahl an getrennten Substanzen bei größtmöglichen ∆Rf-Werten konstruiert man durch An-

. Abb. 2.4a,b

a

b Das Prisma Modell (verändert nach Nyiredy et al. 1985). a Angleichung der Lösungsmittelstärken; b Kombination der mobilen Phase

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40

2

Einführung in die Analytik sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe anhand ausgewählter Beispiele

gleichen der Lösungsmittelstärken – in Orientierung an der schwächsten Komponente – den regulären Teil des Prismas. Für die Ermittlung der besten LösungsmittelKombination wird die Dreiecksläche primär anhand der Eck- und Mittelpunktskoordinaten (811, 181, 118, 433) abgetastet. Sofern nötig, lässt sich auch die Lösungsmittelstärke der Gesamtmischung unter Beibehaltung der gewählten Selektivität mit n-Hexan erniedrigen. Sollte bei besonders schwierigen Trennproblemen für unpolare Gemische dieses Prozedere nicht zum Erfolg führen, so konstruiert man ein neues reguläres Prisma mit weiteren geeigneten Fließmitteln, überprüt andere Kombinationskoordinaten oder reduziert die Zahl der Elutionskomponenten auf zwei. Im Falle entsprechender Probleme mit polaren Gemischen setzt man wiederum zuerst weitere geeignete Fließmittel ein, weicht anschließend in den irregulären Teil des Prismas aus, prüt andere Selektivitätspunkte oder verringert die Zahl der in Frage kommenden Fließmittel auf zwei (Nyiredy et al. 1985, 1988).

2.3.2 Säulenchromatographie Phytochemisch zieht man die klassische oder ofene SC als Trenn- und Reinigungsverfahren im kleinen wie großen Maßstab am häuigsten heran. Die stationäre Phase beindet sich eingeschlossen in einem nach unten verjüngten Glasrohr. Die mobile Phase transportiert das zu trennende Substanzgemisch bei unterschiedlich starker Retention der Einzelkomponenten durch die Säule. Als wichtigste Trennprinzipien kommen Adsorptions-, Gel-, Ionenaustausch- und Verteilungschromatographie in Frage. Optimale Trennungen mit Hilfe der SC setzen stationäre Phasen in möglichst kleiner und gleichmäßiger Körnung, eine gleichmäßige Säulenfüllung und eine geeignete Fließgeschwindigkeit voraus ( > van Deemter Gleichung; Rücker et al. 2001). Für die SC mit Kieselgel als stationärer Phase wird in der Regel Material mit einem Durchmesser von 63–200 µm verwendet, da mit kleiner werdendem Partikeldurchmesser der Widerstand gegenüber der mobilen Phase zu stark wächst und die Tropfgeschwindigkeit sehr gering wird. Bei einer Trennung mittels SC gilt die grobe Faustregel, dass ein Teil des zu trennenden Substanzgemisches die hundert- bis fünhundertfache Menge an stationärer Phase und die fünhundert- bis füntausendfache an mobiler Phase erfordert. Zum Autragen auf die Säule wird die Fraktion entweder vorher in möglichst wenig Fließmittel gelöst und lüssig aufgetragen oder an möglichst

wenig stationärer Phase adsorbiert und vorsichtig auf die eingeschlämmte Säule gestreut. Zur Grobtrennung von Rohextrakten wird die Vakuumlüssigkeitschromatographie (VLC) eingesetzt. Das Substanzgemisch wird an eine möglichst kleine Menge der stationären Phase adsorbiert auf die (trockene) Säule aufgegeben und das Fließmittel mit Hilfe von Unterdruck (Wasserstrahlpumpe) durch die Säule gesaugt. Im Vergleich zur SC kann mit kleineren Korngrößen (30–70 µm) und einer erheblich höheren Beladung der Säule mit Probenmaterial gearbeitet werden (maximal 1:10, normalerweise ~1:25). Als Fließmittel werden in der Regel Stufengradienten, beispielsweise längs einer eluotropen Reihe, verwendet.

2.3.3 MPLC und HPLC Während es sich bei der MPLC um ein typisches präparatives Verfahren handelt (Çalis et al. 2002), lässt sich die HPLC unter Variation der Säulengröße und der Flussrate sowohl als analytisches wie auch als präparatives Verfahren einsetzen. Bei der MPLC werden stationäre Phasen mit Partikeldurchmessern von 15–40 µm (bezogen auf Kieselgel oder RP Material) eingesetzt. Die Säulen bestehen aus druckfestem Glas, sodass mit einem Druck von maximal etwa 30–40 bar gearbeitet werden kann. Die Säulendimensionen sowie die entsprechenden Flussraten und trennbaren Fraktionsgrößen können sehr variabel gewählt werden (Länge: Zentimeter bis Meter, Durchmesser: Millimeter bis mehrere Zentimeter). Die HPLC ist eines der am weitesten verbreiteten chromatographischen Verfahren zur Trennung von Substanzgemischen. Die mit der HPLC erzielbare hohe Trennleistung ist dafür nur ein Grund (die an einer HPLC-Säule mit einer Länge von 10 cm und einem Partikeldurchmesser von 5 µm erzielbare Trennstufenzahl liegt zwischen ~4000 und 10.000 und damit mindestens um den Faktor 10 über den mit der DC erreichbaren Werten). Des Weiteren kann neben der hohen Variabilität der stationären (Partikelgröße, Modiikation, Form) und mobilen (Lösungsmittelgradient) Phase die HPLC mit verschiedenen Detektoren gekoppelt werden, sodass für nahezu jede Substanz nicht nur eine geeignete Trennung, sondern auch gleichzeitig die entsprechende Detektion und bei ausreichender Empindlichkeit auch eine Möglichkeit zur Quantiizierung gefunden werden kann. Unter den verwendeten Detektoren (Fluoreszenz-, Leitfähigkeits-, UV/VIS-, Brechungsindex- u. a.), ist bis heute der UV-DAD der gebräuchlichste.

2.3 Chromatographische Trennung und Isolierung

2

. Abb. 2.5a,b

a

b Verschiedene Detektoren liefern für die gleiche Analyse nicht immer das gleiche Ergebnis. Dargestellt ist das Chromatogramm eines Ethylacetat-Extrakts von Crataegus-Blättern und Blüten a gekoppelt mit einem UV-DAD Detektor (Wellenlänge 280 nm) und b gekoppelt mit elektrochemischer Detektion. Gleiche Ziffern bedeuten identische Substanzen. Es entstehen zwar ähnliche Chromatogramme, jedoch liegen in quantitativer Hinsicht deutliche Unterschiede vor. Beispielsweise existieren UV-inaktive Verbindungen, die aber elektrochemisch detektiert werden können. Auch das Verhältnis der Peakflächen zueinander ist unterschiedlich. Die Auswahl der am besten geeigneten Methode erfordert eine entsprechend aufwendige Überprüfung der Selektivität, Richtigkeit, Linearität und Präzision der Methode (aus Rohr 1999)

Wie aus > Abb. 2.5 deutlich wird, muss auch für die Auswahl eines geeigneten Detektors große Sorgfalt aufgewendet werden. Auf dem Gebiet der Leitstruktursuche arbeiten besonders leistungsfähige Systeme mit hintereinander geschalteten Detektoren (HPLC-UV/MS, HPLC-UV/ NMR) und ermöglichen damit eine weitestgehende Strukturauklärung im Gemisch ( > Kap. 5; Literatur bei Bringmann u. Lang 2003, Wolfender et al. 2005). Auf Grund der in der Regel geringen Probenmenge kommen „echte“ präparative HPLC-Verfahren bei der Isolierung von sekundä-

ren Planzeninhaltsstofen eher selten zum Einsatz, da der hohe Verbrauch an Lösungsmittel (bis zu mehreren 100 ml/min) und die Anschafung einer präparativen HPLC-Säule (Säuleninnendurchmesser (ID) 5–15 cm; der ID einer analytischen Säule liegt bei ~1–4,6 mm) auch eine ökonomische Frage darstellt. Vielfach behilt man sich mit semipräparativen Verfahren, wobei man entweder mit semipräparativen (Fließgeschwindigkeiten bis ~25 ml/min) oder analytischen Anlagen (Fließgeschwindigkeiten bis 10 ml/min) arbeitet und unter Verwendung einer größe-

41

42

2

Einführung in die Analytik sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe anhand ausgewählter Beispiele

. Abb. 2.6

a

b HPLC-Chromatogram (UV-DAD, 280 nm) eines Ethylacetat-Extrakts nach (a) und vor einer Festphasenextraktion (b) mit einer Sep-Pak® tC18-Kartusche. Gleiche Ziffern bedeuten identische Substanzen (aus Rohr 1999)

ren analytischen HPLC-Säule mehrmals hintereinander ein Aliquot der Probe einspritzt (Winkelmann et al. 2000). Hinter dem Detektor (in der Regel ein UV-DAD) werden dann die interessierenden Peaks in separaten Kolben gesammelt. Werden für die präparative Säulenchromatographie, sei es ofene Säulen, MPLC oder HPLC, Säuren oder Basen im Fließmittel benötigt, so ist die Verwendung von lüchtigen Verbindungen, die mit dem Einrotieren des Lösungsmittels ebenfalls verdampfen, solchen Verbindungen vorzuziehen, die in der Probe verbleiben. Eine Säure, die sich gut für präparative Zwecke verwenden lässt, ist die Triluoressigsäure (CF3COOH, ~0,5%; Winkelmann et al. 2000).

Auch beim Einsatz einer so leistungsfähigen Methode wie der HPLC ist die Probenvorbereitung bzw. -säuberung, das so genannte „sample clean up“ von entscheidender Bedeutung, um ein ausreichend aufgelöstes Chromatogramm zu erhalten. Erst die selektive Abtrennung der störenden Begleitstofe ermöglicht eine brauchbare qualitative (Fingerprint) oder quantitative HPLCAnalytik ohne Überlagerungen. Die gebräuchlichsten Methoden zur Probenvorbereitung sind die Flüssig-Flüssig-Verteilung (z. B. zur Entfernung von Lipiden und Chlorophyll aus einer Probe) oder die Festphasenextraktion (z. B. mit C18-Kartuschen oder einer anderen stationären Phase). > Abbildung 2.6 zeigt den Unterschied

2.4 Strukturaufklärung und Substanzcharakterisierung

eines HPLC-Chromatogramms vor und nach einer Festphasenextraktion.

2.4 Strukturaufklärung und Substanzcharakterisierung Mit der Entwicklung von hochleistungsfähigen spektroskopischen und spektrometrischen Verfahren, insbesondere der NMR und der MS, ist es heute möglich geworden, im unteren Milligrammbereich (und darunter) isolierte Naturstofe in ihrer Struktur aufzuklären. Die zugrunde liegende Strategie kombinierter Messverfahren lässt sich dabei in die folgenden Schritte gliedern: 1. Ermittlung der Molekularformel mit Hilfe der eindimensionalen NMR-Spektroskopie, 1H- und 13C-Spektren sowie einer geeigneten MS-Methode; Berechnung der Doppelbindungsäquivalente, von denen jedes einer Doppelbindung oder einem Ring entspricht ( > Gleichung 2). 2. Bestimmung und Absicherung der Konnektivitäten mit Hilfe der zweidimensionalen NMR, homonukleare und heteronukleare Spektren, und der MS. 3. Bestimmung der relativen/absoluten Stereochemie durch NOE-Daten und Röntgenstrukturanalyse sowie 4. Bestimmung der wichtigsten Kenndaten zur eindeutigen Charakterisierung einer Substanz, wie den Schmelzpunkt, die optische Drehung und die UVDaten. (2n + 2) – x DBÄ = 00 2

(2)

Die Doppelbindungsäquivalente (DBÄ: Ringe, Doppelbindungen) in einem Molekül lassen sich auf der Basis ihrer Valenzen berechnen. Bei einer Verbindung, die nur C, H, O, N, S oder Halogene enthält, wird der Sauerstof und zweibindiger Schwefel aus der Formel entfernt, Halogene durch Wasserstof und dreibindiger Stickstof durch CH ersetzt. Man erhält eine Summenformel CnHx, die mit dem gesättigten CnH2n+2 verglichen wird. Für zahlreiche Naturstofe sind in der Literatur 1H und 13C-NMR Daten publiziert, sodass die Struktur von isolierten (und bereits bekannten) Verbindungen häuig bereits anhand der eindimensionalen NMR-Spektren, dem MS-Spektrum und der chemisch-physikalischen Daten identiiziert werden kann. Da NMR-Messkapazitäten nicht unbegrenzt zur Verfügung stehen, empiehlt es sich,

2

beim Messen der verschiedenen Spektrenarten gemäß dem Grundsatz „So viel wie nötig, so wenig wie möglich“ zu verfahren. Beschätigt man sich erstmals mit einer Substanzklasse, so ist es sehr hilfreich, auch bei einer bekannten Verbindung sämtliche Spektren zu messen, um sich mit den Besonderheiten vertraut zu machen. Darüber hinaus ist es hilfreich, möglichst viele Informationen aus dem Verhalten der Substanz bei der Isolierung zu erhalten (Polarität, Detektionsverhalten, verwendete Fließmittel usw.).

2.4.1 NMR-Spektroskopie Besitzt ein Atomkern ein magnetisches Moment (µ) z 0, so ist die Voraussetzung zur Durchführung von Kernresonanz-(NMR-)Experimenten mit dieser Kernsorte erfüllt. Für die Strukturauklärung von Naturstofen sind die Isotope 1H und 13C von besonderer Bedeutung. Zur Messung von NMR-Spektren wird die Probe zunächst in deuteriertem Lösungsmittel aufgenommen, in ein Röhrchen gefüllt und im NMR-Spektrometer in ein homogenes Magnetfeld eingebracht. Dabei sollten in der Probe weder ungelöste Bestandteile, noch Schwebeteilchen oder gar Kieselgel zu inden sein, da diese die Homogenität des Magnetfeldes beeinträchtigen und die Qualität des Spektrums deutlich verschlechtern können. Das NMR-Röhrchen beindet sich im Spektrometer in permanenter Rotation, um vorhandene horizontale Inhomogenitäten des Magnetfeldes zu beseitigen. Es ist daher ebenfalls besser, auf Klebestreifen oder direkt am NMR-Röhrchen angebrachte Aukleber zu verzichten. Mit Hilfe eines Hochfrequenzsenders werden durch eine spezielle Abfolge von Impulsen, der so genannte Puls, alle Kerne einer Kernsorte angeregt. Nach der Anregung fallen die Kerne wieder in den durch das Magnetfeld vorgegebenen Gleichgewichtszustand zurück (Relaxation), bis sie durch den nächsten folgenden Puls wieder angeregt werden. In einer Empfängerspule wird ein Abfall der durch den Impuls zusätzlich aufgetretenen Magnetisierung (FID, „free induction decay“) aufgezeichnet. Das NMR-Spektrum entsteht durch Fourier-Transformation der im Verlauf der gesamten Messung akkumulierten FIDs. Während die Dauer des Pulses im Bereich von Mikrosekunden liegt, muss zwischen den einzelnen Pulsen eine Pause im Sekundenbereich liegen, damit die Kerne wieder relaxieren können. Das efektive Magnetfeld, in dem sich ein Kern beindet, ist abhängig von der Kernumgebung und variiert von

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44

2

Einführung in die Analytik sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe anhand ausgewählter Beispiele

. Abb. 2.7

Feinstruktur von (aromatischen) Protonensignalen am Beispiel eines Flavonoids. Die Aufnahme erfolgte in DMSO-d6 (300 MHz) und das in einer Wasserstoffbrücke eingebundene Proton der Hydroxylgruppe an C-5 (OH) kommt als Singulett (s) zur Resonanz (keine Kopplungspartner, Verschiebung ins tiefe Feld). Die Protonen an 6 und 8 koppeln miteinander und erscheinen entsprechend als Dublett (d). Die Kopplungskonstante ist klein (J = 1,7 Hz, „Metakopplung“), sodass die Signalaufspaltung bei einem 300-MHz-Gerät nur schwach erkennbar ist. Proton 5’ koppelt mit dem benachbarten H-6’ jedoch nicht mit H-2’ und erscheint als Dublett (d) mit einer mittelgroßen Kopplungskonstante (J = 8,5 Hz). H-6’ koppelt mit H-2’ („Metakopplung“) und H-5’ („Orthokopplung“) und erscheint als Dublett vom Dublett (dd). H-2’ kommt entsprechend als Dublett zur Resonanz

Kernsorte zu Kernsorte. Die Abweichung vom äußeren Magnetfeld wird wesentlich von einer Abschirmung des Kerns durch eigene oder benachbarte Elektronen, magnetische Anisotropie von Bindungen und sterische Efekte bestimmt. Funktionelle Gruppen können durch induktive und/oder mesomere Efekte die Elektronendichte um einen Kern erhöhen oder erniedrigen und führen so zu einer veränderten Abschirmung. Die Stärke der Abschirmung wird durch die dimensionslose Abschirmkonstante V beschrieben, die auch in die Gleichung zur Berechnung der Resonanzbedingung für einen Kern eingeht (Hesse et al. 2005; Friebolin 1999). Die Lage, bei der eine Kernspezies zur Resonanz kommt, wird relativ zur Referenzverbindung Tetramethylsilan [TMS, Si(CH3)4] als chemische Verschiebung δ (in ppm) ausgedrückt. Die chemischen Verschiebungen fast aller Naturstofe können bei den 1H-Resonanzen mit einer etwa bis 14 ppm, bei den 13C-Resonanzen mit einer bis etwa 220 ppm reichenden Skala beschrieben werden. Mit zunehmender Entschirmung eines Kerns (sog. Tiefeldverschiebung) ist die Lage eines Signals zu höheren δ-Werten verschoben. Der umgekehrte Efekt (Erhöhung der Elektronendichte um einen Kern) wird als Hochfeldverschiebung bezeichnet. Die Referenzierung eines zu messenden Spektrums bzw. Festlegung des Nullpunktes kann zum einen direkt über eine Zugabe der Referenzsubstanz TMS erfolgen (δ = 0). Damit das Referenzsignal nicht zu intensitätsstark

wird, entnimmt man nur eine Probe aus dem Dampfraum über dem TMS oder gibt vorab einige Tropfen in das Vorratsgefäß mit deuteriertem Lösungsmittel. Eine andere Möglichkeit beruht auf dem stets unter 100% (beispielsweise bei 99,9 oder 99,99%) liegenden Deuterierungsgrad eines Lösungsmittels, die auch eine Referenzierung über die Restsignale von undeuteriertem Lösungsmittel (z. B. CHCl3 in CDCl3) erlaubt. Auf eine TMS-Zugabe kann bei dieser Methode verzichtet werden, jedoch kann es hier zu kleinen Ungenauigkeiten bei den δ-Werten kommen. Die Interpretation eines NMR-Spektrums erfolgt anhand der Parameter Signallage (im 1H- und 13C-NMR), -intensität, -breite und -feinstruktur (hauptsächlich 1H-NMR, > Abb. 2.7). Es hat sich in den meisten Publikationen eingebürgert, die 1H-NMR und 13C-NMR Daten mit einer Genauigkeit von nur einer Dezimalen anzugeben. Dabei können zwei Signale, die in einer Tabelle den gleichen Wert erhalten haben, im entsprechenden Spektrum klar voneinander separiert seien. Zur reproduzierbaren Angabe von NMR-Daten werden in wissenschatlichen Arbeiten zusammen mit den δ-Werten das verwendete Lösungsmittel, die Messtemperatur, die Methode zur Referenzierung und die Angabe der Betriebsfrequenz aufgeführt. Im Bereich der NMR-Spektroskopie von niedermolekularen Naturstofen (MG <1000) lassen sich mit Hilfe von Spektrometern, die mit Frequenzen von 400– 600 MHz (1H) arbeiten, nahezu alle Probleme der Struk-

2.4 Strukturaufklärung und Substanzcharakterisierung

turauklärung lösen. Ein häuig autretendes Problem im Bereich der Naturstofe ist die Isolierung einer so geringen Probenmenge, dass die Strukturauklärung auch mit diesen Geräten nicht mehr gelingt. Neben der oben erwähnten HPLC-NMR-Kopplung stehen hier zwei weitere Lösungsstrategien zur Verfügung. Zum einen lässt sich mittels spezieller NMR-Röhrchen („microtubes“) das Volumen der Probe erniedrigen (und damit die Konzentration erhöhen), das normalerweise bei ~400–800 µl liegt. Zum anderen kann das NMR-Spektrometer mit einem speziellen Kryomesskopf versehen werden. Auch innerhalb einer einzelnen Substanzklasse ist die Strukturvielfalt bei Naturstofen so groß, dass es extrem schwierig ist, zu ihrer „Ad-hoc-Erkennung“ charakteristische Signale, Signalverteilungen oder Multiplizitäten in 1H- und 13C-NMR-Spektren anzugeben. Eine allgemein anwendbare Strategie zur Strukturauklärung von Naturstofen auf der Basis der NMR-Spektroskopie indet sich bei Walch et al. (2005). Neben der Strukturauklärung als zentraler Applikation in der Naturstofchemie besitzt die NMR-Spektroskopie auch eine Bedeutung bei der Quantiizierung von Verbindungen (Kim et al. 2004; Li et al. 2004) und der Beobachtung von Reaktionsabläufen (Schmidt 1997). Infobox Anisotropie. Mit dem Begriff Anisotropie wird generell die Richtungsabhängigkeit einer Eigenschaft kennzeichnet. Eine chemische Bindung besitzt in Bezug auf ihre Raumrichtungen eine unterschiedliche magnetische Suszeptibilität F (diese Konstante beschreibt die Magnetisierbarkeit einer Bindung).

Eindimensionale Techniken 1H-NMR.

Die Wechselwirkung mit Nachbarprotonen (Kopplung) wird über Bindungen vermittelt und führt zur Aufspaltung eines Signals sowie zur Ausbildung einer Feinstruktur. Aus der Art der Aufspaltung können Informationen zu Anzahl und Art der wechselwirkenden Protonen gezogen werden. Diese Informationen erhält man aus der Anzahl der Linien (Multiplizitität), ihrer Intensität und der aus dem Signal zu ermittelnden Kopplungskonstante J ( > Abb. 2.7). Die Kopplungskonstante (in Hz) wird mit einer zunehmenden Zahl von Bindungen, die zwischen zwei Atomen liegen, kleiner. Im Fall von starren

2

Gerüsten (z. B. bei Ringen) hängt J auch vom Diederwinkel (Torsionswinkel) zwischen den Spin-Spin-gekoppelten Protonen ab und erlaubt so Rückschlüsse auf die geometrische Anordnung. Die Abhängigkeit der 3J (= vicinalen Kopplungskonstante) vom Diederwinkel wird in der Karplus-Kurve deutlich. Mit ihrer Hilfe lässt sich näherungsweise vorhersagen, in welchem Bereich eine Kopplungskonstante bei vorgegebenem Torsionswinkel zu erwarten ist. Die Größe der meisten im Naturstobereich beobachtbaren Kopplungskonstanten liegt zwischen ~16 (transDoppelbindungen) und 0,6 Hz (Fernkopplungen über mehr als 3 Bindungen). Soll die Signallage (δ, chemische Verschiebung) für ein Proton angeben werden, so wählt man dafür in der Regel den Signalschwerpunkt. In zahlreichen Publikationen indet sich aber auch der Bereich angegeben, in dem alle Linien des Signals enthalten sind. Bei der Analyse von Kopplungsmustern ist zu beachten, dass eine Kopplung von magnetisch äquivalenten Kernen nicht im Spektrum sichtbar ist. Lässt sich ein Kopplungsmuster eines Signals nicht eindeutig charakterisieren, so wird es als Multiplet (Abkürzung: m) bezeichnet. Ein unklares Kopplungsmuster kann auf Grund von Überlagerungen entstehen (Kennzeichnung: m*), aber auch durch das Vorliegen eines Spektrums höherer Ordnung (Kennzeichnung: m). Die Fläche unter einem 1H-NMR-Signal ist direkt proportional zur Anzahl absorbierender Protonen und ermöglicht über die Integration der Fläche die Bestimmung der relativen Zahl von Protonen, die dieses Signal erzeugen. Im Verlauf einer Integration kann der kleinste durchführbare Schritt von nicht weniger als einem Proton stammen. Es empiehlt sich, für die Integration ein freies Signal ohne Überlagerungen auszuwählen. Bei hochsymmetrischen Verbindungen kann das kleinste Signal auch für mehrere Protonen integrieren. Bei der Auswahl des Lösungsmittels spielt nicht nur die Lipophilie oder Hydrophilie der Substanz eine wichtige Rolle. In einem protischen Lösungsmittel (z. B. CD3OD) kommt es zum Austausch von labilen Protonen gegen Deuterium (beispielsweise an OH und NH-Gruppen), wobei Protonensignale verloren gehen können. Dies lässt sich u. a. bei Wasserstobrücken von Flavonoiden, Anthranoiden oder Phloroglucinolderivaten beobachten, die in CDCl3 oder DMSO-d6, nicht jedoch in MeOD als mehr oder weniger scharfe Singuletts >11 ppm zu beobachten sind (Winkelmann 2001). Bei anderen Verbindungen (z. B. Glykosiden) können bei der Verwendung von protischen Lösungsmitteln andere (einfachere) Kopplungs-

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46

2

Einführung in die Analytik sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe anhand ausgewählter Beispiele

. Abb. 2.8a,b

a

b

Separierung zweier Protonensignale durch den Wechsel des Lösungsmittels. a In CDCl3 überlagern sich die Signale beider Protonen, während durch die Aufnahme in C6D6 eine klare Trennung zu erzielen ist. Dies ist nicht nur für die Erkennung der Feinstruktur, sondern auch für die Zuordnung der dargestellten Kreuzsignale in einem 2DSpektrum wesentlich. Durch die Separierung der beiden Protonensignale in b können die Kreuzsignale eindeutig zugeordnet werden. In a lassen sich die Korrelationen zu anderen Protonen nicht eindeutig bestimmen

muster entstehen als bei der Verwendung von aprotischen. Ein solcher Austausch kann auch gezielt vorgenommen werden, indem man die Verbindung kurz mit D2O schüttelt. Erschweren deutliche Überlagerungen im Spektrum die Interpretation, so sollte man auch einen Wechsel des Lösungsmittels in Betracht ziehen. Besonders deutliche Signalverschiebungen können bei einem Wechsel von aliphatischen zu aromatischen Lösungsmitteln (bzw. umgekehrt) beobachtet werden, da deuteriertes Pyridin oder Benzol ausgeprägte Anisotropieefekte aufweisen ( > Abb. 2.8). Die geringe Häuigkeit (1,1%) des 13C-Nuklids bedingt, dass eine Kopplung von zwei benachbarten 13CKernen in der Routine-13C-NMR nicht sichtbar ist. Jedes C-Atom erscheint im Spektrum als scharfes Singulett, da eine Kopplung mit 1H-Kernen (die normalerweise anhand einer Signalaufspaltung bemerkbar würde) routinemäßig mit einer 1H-Breitband-Entkopplung unterdrückt wird

13C-NMR.

( > Abb. 2.9). Die Aufnahmezeit für ein 13C-Spektrum ist um ein Vielfaches länger als für ein 1H-Spektrum, da das magnetische Moment des 13C-Nuklids im Vergleich zum 1H-Kern bei einem Viertel und gleichzeitig die natürliche Häuigkeit von 1H bei fast 99,99% liegt. Für eine Probe von 5 mg Substanz (in einem Volumen von 500 µl) mit einem Molekulargewicht von etwa 500 muss an einem 300-MHzSpektrometer etwa 6–9 Stunden gepulst werden, um ein brauchbares 13C-Spektrum zu erhalten. Im Gegensatz zu den 1H-NMR-Spektren sind die entsprechenden 13C-Signale nicht ohne weiteres integrierbar, da die Intensität des Signals zum einen entscheidend von der sehr unterschiedlichen Relaxationszeit verschieden hybridisierter C-Atome abhängig ist. Insbesondere quartäre C-Atome zeigen eine langsame Relaxation, sodass sie noch nicht in den Gleichgewichtszustand zurückgekehrt (relaxiert) sind, wenn der nächste Puls zu einer erneuten Anregung führt. Sie sind daher ot nur als sehr schwache Signale im Spektrum zu erkennen ( > Abb. 2.9). Zum anderen wird auf Grund der 1H-Breitbandentkopplung ein heteronukleärer Kern-Overhauser-Efekt (NOE) beobachtet, der zu einer Intensitätserhöhung von protonentragenden C-Atomen führt. Daher würde auch eine deutliche Verlängerung der Zeit zwischen den Pulsen immer noch zu vergleichsweise kleineren Signalen bei den quartären Kohlenstofen führen. Zuverlässig integrierbare 13C-Signale erhält man entweder durch den Zusatz von paramagnetischen Relaxationsreagenzien (Chrom- und Eisenacetylacetonaten) oder mit Hilfe eines 13C-Inverse-Gated-Decoupling-Experiments ( > Abb. 2.10). Im Verlauf dieses Experiments bleibt die 1H-Breitbandentkopplung nur für die Dauer des Beobachtungspuls und der Datenaufnahme eingeschaltet, sodass die 1H,13C-Kopplung aufgehoben wird, sich in dieser kurzen Zeit aber kein NOE aubauen kann. Bedingt durch die 1H-Breitbandentkopplung wird das 13C-NMR-Spektrum zwar einfacher, es geht aber die Information zur Multiplizität der Kohlenstofatome verloren. Diese Information lässt sich mit Hilfe der DEPT-(„disortionless enhancement by polarization transfer“-)13CExperimente wiedergewinnen. In den mit Impulswinkeln von 135° (DEPT 135) und 90° (DEPT 90) aufgenommenen Teilspektren können CH3, CH2, CH und quartäre Kohlenstofatome voneinander unterschieden werden. Im DEPT 135 erscheinen CH3- und CH-Gruppen in der positiven Phase, während die CH2-Gruppen als negative Signale sichtbar sind. Im DEPT 90 liefern dagegen nur die CH-Gruppen Signale (positive Phase). Quartäre Signale sind in beiden DEPT-Experimenten nicht sichtbar

2

2.4 Strukturaufklärung und Substanzcharakterisierung

. Abb. 2.9

13C, DEPT-135- und DEPT-90-Spektren (125 MHz, 295 K) von Aculeatin A (isoliert aus den Rhizomen von Amomum aculea-

tum, Heilmann et al. 2000) in CDCl3. Die Bezifferung der Signale nimmt Bezug auf die Nummerierung des Kohlenstoffskeletts von Aculeatin A . Abb. 2.10

OH OCH3 8

HO

1 O

9

7 6

4' 2

1' 3

10

5

4

2'

3'

OH

OH

OH

2'/6'

3'/5' 1'

4'

OCH3

10 2

7 5

4

9 6

160

3

140

120

100

8

80

60

40

ppm

13C-Inverse-gated-Spektrum von Ourateacatechin (aus Ankli 2000) gemessen in MeOD/Pyridin-d (125 MHz, 295 K). 5

Über den Signalen sind die Integrale der Flächen dargestellt. Es wird deutlich, dass die Signale der quartären Kohlenstoffe annähernd gleich intensiv sind wie diejenigen der protonentragenden

47

48

2

Einführung in die Analytik sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe anhand ausgewählter Beispiele

( > Abb. 2.9). Das DEPT ist sensitiver als das 13C-Experiment (Polarisationstransfer durch 1J-(C,H)-Kopplungen), sodass nur etwa die Hälte der Zeit benötigt wird, um ein auswertbares Spektrum zu erhalten.

. Abb. 2.11

Infobox NOE („nuclear Overhauser effect“, Kern-OverhauserEffekt). Der NOE beruht auf einer direkten Wechselwirkung von zwei Kernen durch den Raum. Führt man eine Veränderung der durch das Boltzmann-Gleichgewicht vorgegebenen Spin-Populationen herbei (z. B. durch einen Puls), so resultiert daraus auch für einen räumlich benachbarten Kern eine Störung des Gleichgewichts.

Zweidimensionale (2D) Techniken Mit Hilfe von zweidimensionalen, korrelierten NMR-Experimenten lassen sich chemische Verschiebungen und Kopplungskonstanten sowie unterschiedliche chemische Verschiebungen von Kernen derselben Art (homonukleare 2D: 1H,1H, aber auch 13C,13C bei einem INADEQUATE) oder verschiedener Art (heteronukleare 2D: 1H,13C) auf zwei orthogonalen Achsen unabhängig darstellen, während gleichzeitig in einem Konturendiagramm, die miteinander koppelnden Kerne an Hand von Kreuzungspunkten, den Cross-Peaks, erkannt werden können ( > Abb. 2.11). 1H,1H-COSY, 1H,1H-TOCSY, 1H,13C-HSQC, 1H,13C-HMBC

und INADEQUATE. Im Konturdiagramm eines 1H,1H-

COSY-Experiments sind für das ganze Molekül die Kopplungen zwischen Protonen als Kreuzsignale erkennbar ( > Abb. 2.11). Das gebräuchlichste Experiment ist das DQF-(„double quantum iltered“-)1H,1H-COSY-90, bei dem fast alle Signale in Absorption erscheinen und ein 90°-Puls verwendet wird. Bei einem 1H,1H-TOCSY („total correlation spectroscopy“) entstehen Kreuzsignale für die Protonen eines gemeinsamen Spin-Systems. Dies ist insbesondere nützlich bei Naturstofen, die mehrere Zucker (mit den entsprechend überlagerten Signalen) enthalten, da jedes Monosaccharid ein eigenes Spin-System bildet. In einem 1H,13C-HSQC-(„heteronuclear single quantum coherence“-)Spektrum werden die Korrelationen zwischen direkt gebundenen Kohlenstof- und Wasserstofatomen sichtbar. Ganz besonders nützlich für komplexe Natur-

Ausschnitt eines 1H,1H-COSY-Spektrums (600 MHz, 295 K in CDCl3) von Ialibinon A, einem aus Hypericum papuanum isolierten Acylphloroglucinol-Derivat (Winkelmann 2001). Gekennzeichnet ist die Kopplung von H-2’’ mit den beiden Methylgruppen H3–3’’ und H3–4’’, die die gleiche chemische Verschiebung und die gleiche Kopplungskonstante besitzen. Ebenfalls erkennbar sind für die gleichen Protonen die Kopplungen des ebenfalls (als Minorkomponente) in der Lösung vorliegenden Tautomers. In dieser Verbindung zeigen die Methylgruppen die gleiche Signalaufspaltung, jedoch eine unterschiedliche chemische Verschiebung

stofe mit verschiedenen Spin-Systemen (wie beispielsweise bei Triterpen- oder Steroidglykosiden) ist das HSQC/TOCSY-Experiment, das die Vorteile beider Methoden miteinander kombiniert. Im 1H,13C-HMBC werden 2J-(C,H)- und 3J-(C,H)-Kopplungen detektiert (so genannte Long-range-Kopplungen). Ist dabei ein quartäres C-Atom involviert, so werden auch 4J-(C,H)-Kopplungen sichtbar ( > Abb. 2.12). Mit Hilfe eines HMBC-Expe-

2.4 Strukturaufklärung und Substanzcharakterisierung

2

. Abb. 2.12

1H,13C-HMBC-Spektrum (300 MHz in MeOD, 295 K) des Cumarinderivats Aesculetin. Es wird deutlich, dass nicht nur die

typischen 2J-(C-6, H-5), sondern, bedingt durch die zahlreichen quartären C-Atome, auch 3J-(C-4, H-5 oder C-7, H-5) und (schwache) 4J- (C-8, H-5)Kopplungen als Kreuzsignale sichtbar sind

riments können die ermittelten Teilstrukturen eines Moleküls miteinander verknüpt werden. Gleichzeitig ist das Experiment eine interessante Möglichkeit, um die 13C-Verschiebungen von (quartären) Kohlenstofatomen zu ermitteln, wenn die zur Verfügung stehende Probenmenge kein 13C-Experiment erlaubt (größere Empindlichkeit des 1H-gegenüber dem 13C-Kern). Mit einem INADEQUATE („incredible natural abundance double quantum transfer experiment“) lassen sich 13C,13C-Kopplungen sichtbar machen und so kann das Kohlenstofskelett einer Verbindung eindeutig detektiert werden ( > Abb. 2.13). Es ist im Naturstobereich jedoch nur selten zu inden, da sehr hohe Substanzkonzentrationen und lange Messzeiten benötigt werden (Faustregel: Pro 100 Masseneinheiten werden mindestens 20 mg Substanz benötigt; eine solche Menge steht für isolierte Naturstofe nur selten zur Verfügung). 1H,1H-NOESY und -ROESY. Im

Vergleich zu den oben besprochenen zweidimensionalen Experimenten, bei denen die Korrelationen der Signale auf der Konnektivität über Bindungen beruhen, nutzt man bei NOESY-(„nuclear

Overhauser enhancement and exchange spectroscopy“-) und ROESY-(„rotating frame nuclear Overhauser efect spectroscopy“-)Aufnahmen die Wechselwirkung von zwei Protonen durch den Raum. Kreuzsignale zeigen die räumliche Nachbarschat von Kernen an, wodurch entscheidende Informationen zur Ermittlung von Molekülkonformationen, Ringverknüpfungen sowie zur Stellung von Substituenten erhalten werden. Problematisch ist dabei, dass der Abstand zwischen zwei Kernen in der sechsten Potenz in die Intensität eines NOE eingeht, sodass bereits bei einer geringen Vergrößerung des räumlichen Abstands ein NOE deutlich kleiner wird. Der maximale Abstand zwischen zwei Wasserstofatomen, für den im Allgemeinen ein NOE noch gemessen werden kann, liegt bei <5 Angström. Darüber hinaus ist zu beachten, dass beim NOESY-Experiment der NOE für kleine Moleküle positiv und für große Moleküle negativ ausfällt, während für mittelgroße Moleküle der Nulldurchgang (MG ~500 bis 800) beobachtet werden kann. Vereinfacht könnte man dies so zusammenfassen, dass ein vorhandener NOE zuverlässig eine räumliche Nähe zweier Kerne anzeigt, während das

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50

2

Einführung in die Analytik sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe anhand ausgewählter Beispiele

. Abb. 2.13

13C,13C-INADEQUATE-Spektrum von Aculeatin A (Heilmann et al. 2000; 125 MHz, 110 mg in CDCl , 295 K, Messzeit: 3

24 Stunden (!) unter Zusatz von 1 mg Chrom(III)-acetylacetonat)

Fehlen eines NOE nicht unbedingt ein sicheres Kennzeichen für einen großen Abstand ist. Für planzliche Sekundärstofe scheint daher die ROESY-Messung geeigneter zu sein, da die NOE für alle Molekulargewichte positiv sind und zahlreiche Naturstofe von ihrem Molekulargewicht in den kritischen Bereich des Nulldurchgangs fallen.

2.4.2 Massenspektrometrie In der MS werden (im Hochvakuum) aus einem Molekül geladene (!) und in der Gasphase beschleunigte Teilchen erzeugt und durch elektrische und magnetische Felder so

aufgetrennt und fokussiert, dass Teilchen mit einheitlichem Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) an derselben Stelle des Detektors autreten. Die resultierenden Massenspektren bestehen aus den Linienspektren der gebildeten Ionen, deren relative Intensitäten (in %) gegen die m/zWerte aufgetragen werden, wobei der größte Peak (Basispeak) die Intensität 100% zugeordnet bekommt ( > Abb. 2.14). Eine Ionisierung, d. h. die Erzeugung von geladenen Teilchen, kann beispielsweise durch den Beschuss mit energiereichen Elektronen (Elektronenstoß-Ionisation, EI), mit einem Reaktandgas (chemische Ionisation, CI) oder durch das Verdampfen eines Sprühnebels von Substanz und Lösungsmittel erfolgen (Elektrospray-Ionisation,

EI-Massenspektren (70 eV) von Apigenin (a) und Aculeatin A (b). Beim Flavonoid Apigenin (MG 270) bildet das Molekülion den Basispeak. Neben dem Molekülion treten nur noch Fragmente von geringer Intensität auf. Das Fragment bei m/z 153 kann dem A-Ring des Apigenins zugeordnet werden. Im Fall des Aculeatin A (MG 418) fehlt dagegen das Molekülion vollständig und das erste sichtbare Ion ist [M – H2O]+ bei m/z 400. [Ich danke Herrn J. Kiermaier (Zentrale Analytik der Universität Regensburg, NWF IV) herzlich für die Aufnahme des EI-Massenspektrums von Apigenin]

7

2

2.4 Strukturaufklärung und Substanzcharakterisierung

. Abb. 2.14a,b

a

b

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2

Einführung in die Analytik sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe anhand ausgewählter Beispiele

. Abb. 2.15

High-resolution-(HR-)EI-Massenspektrum eines aus Warionia saharae (Asteraceae, Hilmi 2002) isolierten Sesquiterpenlactons. Die exakte Masse (berechnet auf vier Dezimalen) der Verbindung mit der Summenformel C15H18O4 liegt bei 262,1205 (gemessen wurden 262,1201)

ESI). Abhängig von der Art der Ionisierung können Fragmente der ursprünglichen Verbindung (dominierend bei einer harten Ionisierung, bei der eine hohe Energie eingesetzt wird), Molekülionen oder Molekülionenaddukte (dominierend bei einer weichen Ionisierung) entstehen. Bei der Wahl der Ionisierungsmethode ist generell zu unterscheiden, ob es sich um eine verdampbare oder schwer bzw. nicht verdampbare Substanz handelt. Für gut verdampbare Proben werden die EI oder die CI verwendet. Bei schwer oder nicht verdampbaren Proben (dies sind z. B. nahezu alle Glykoside) sind für den Naturstobereich die „atmospheric pressure chemical ionization“ (APCI), die direkte chemische Ionisation (DCI), die ESI und die „matrix-assisted laser chemical ionization“ (MALDI) zu nennen. Deutlich an Bedeutung verloren hat das FastAtom-Bombardment (FAB), da es als sehr „schmutzige“ Methode gilt. Beim Einbringen der Probe in das Massenspektrometer sind zwei Systeme zu unterscheiden, der Gaseinlass und der Direkteinlass (D als Präix vor der Abkürzung für die Ionisierungsmethode, z. B. beim DEI). Im Vergleich wird beim Gaseinlass eine größere Menge an Substanz benötigt (Gaseinlass: 0,1–1 mg, Direkteinlass: 0,001–0,1 mg; Hesse et al. 2005). Da die meisten Elemente in organischen Verbindungen als Isotopengemische vorliegen, erhält man für die (Molekül)Ionen nicht ein einzelnes Signal, sondern eine Signalverteilung, die bei der EI auch die Isotopenverhältnisse annährend korrekt wiedergibt. Neben der Bestimmung der relativen Molekülmasse in Massenspektrometern mit niedriger Aulösung hat die Messung von hochaufgelösten Massenspektren zur Bestimmung der exakten Molekülmasse eine zunehmende

Bedeutung erlangt, da sich darüber die elementare Zusammensetzung einer Substanz bestimmen lässt ( > Abb. 2.15). Für ein hochaufgelöstes Massenspektrum wird in einschlägigen Fachjournalen eine relative Massengenauigkeit von ~5 ppm gewünscht (ppm: (gemessene Masse – exakter Masse) u 106/exakte Masse. Cave: Ein ppm-Wert ist entsprechend abhängig von der Molekülmasse). Bei der massenspektrometrischen Untersuchung von Alkaloiden und anderen Verbindungen, die Stickstofatome enthalten (z. B. cyanogene Glykoside oder Senfölglykoside), ist die „Stickstofregel“ von Interesse. Gemäß dieser Regel ist die Molmasse eines Molekülions geradzahlig, wenn die Substanz entweder keine oder eine gerade Anzahl von Stickstofatomen enthält. Eine ungerade Anzahl von Stickstofatomen bedingt dagegen eine ungerade Anzahl von Masseneinheiten in der Molekülmasse. Infobox Relative und exakte Molekülmasse. Die relative Molekülmasse berechnet sich aus den Mittelwerten der exakten Massen der natürlich vorkommenden Isotope und ihrer Häufigkeiten, die exakte Molekülmasse berücksichtigt nur die Masse des jeweils häufigsten Isotops (daher auch monoisotopische Masse). Nominale Molekülmasse. Die Ermittlung der monoisotopischen Masse liefert für Atome nur annähernd ganze Zahlen. Die nominale Molekülmasse setzt sich aus den auf die nächste ganze Zahl gerundeten monoisotopischen Atommassen zusammen.

2.4 Strukturaufklärung und Substanzcharakterisierung

Elektronenstoß-Ionisation (EI) Die Fragmentierung von organischen Molekülen bei der EI erfolgt durch Beschuss mit energiereichen Elektronen (sehr häuig 70 eV). Es entstehen zunächst radikalische Kationen vom Typ M+x, die sich, auf Grund eines hohen inneren Energiegehalts, zu stabileren Molekülen umlagern oder zu Fragmenten [M – R]+ zerfallen. Bedingt durch die hohe eingesetzte Energie sind die Fragmentierungen in der Regel dominierend und die entstehenden Molekülionen [M]+ oder durch Anlagerung eines Protons entstehenden [M + H]+-Ionen können sehr intensitätsschwach werden ( > Abb. 2.14). Die Art der Fragmentierung hängt wesentlich von der Anwesenheit bestimmter funktioneller Gruppen ab und verläut unter konstanten Bedingungen immer gleich. Entsprechend können wichtige Strukturinformationen aus der Fragmentierung erhalten werden. Eine Übersicht zu den Hauptfragmentierungsreaktionen, wie die Benzyl-Spaltung, die McLaferty-Umlagerung, die D-Spaltung oder die Retro-Diels-Alder-Reaktion sowie ausführliche Erläuterungen dazu inden sich bei Hesse et al. (2005) oder Budzikiewicz u. Schäfer (2005). Im Bereich der Naturstofchemie ist die EI-MS das Standardverfahren für verdampbare Verbindungen bis zu einem MG von ~1000. Wichtige Schwerpunkte liegen u. a. auf der Strukturauklärung von terpenoiden Verbindungen, (lipophilen) Flavonoidaglykonen, Pyrrolizidinalkaloiden und im Rahmen der gesamten Analytik von ätherischen Ölen. Eine der gebräuchlichsten Methoden zur Identiizierung der Komponenten in einem ätherischen Öl besteht in der Kopplung von Gaschromatographie (GC) und EI-MS (Literatur bei Marriot et al. 2001). Im Rahmen dieses Verfahrens wird das ätherische Öl zunächst mit Hilfe einer dem Trennproblem angepassten Kapillarsäule aufgetrennt und dann in ein mit dem GC gekoppelten Massenspektrometer geleitet. Die Identiizierung erfolgt dabei über die Parameter Retentionszeit und Fragmentierung, die beide mit den Daten aus einer Bibliothek authentischer Vergleichssubstanzen verglichen wird (Kordali et al. 2005; Skaltsa et al. 2003). Werden für Flavonoidaglykone Massenspektren im EI-Modus aufgenommen ( > Abb. 2.14), so erhält man neben einem Molekül-Ionenpeak hoher Intensität eine charakteristische Fragmentierung, die wichtige Aufschlüsse zur Struktur dieser Verbindungen erlaubt. Die Abspaltung von H2O [M – 18]+, Methylgruppen [M – 15]+, Methyl- + CO-Gruppen [M – 43]+ sowie der Zerfall in A- und B-Ringfragmente erfolgt in Abhängigkeit von der vorliegenden Flavonoidklasse bzw. ihrer Substitution

2

(Flavone, Flavonole bzw. deren 6- oder 8-methoxylierte Derivate) in unterschiedlichem Ausmaß (Goudard et al. 1978; Mabry u. Markham 1975). Liegen komplexe Gemische von Flavonoidaglykonen vor, so besteht auch hier die Möglichkeit, mittels einer GC/MS-Kopplung eine Identiizierung vorzunehmen, ohne dass die Einzelkomponenten isoliert werden müssen (Schmidt et al. 1994). Auch zur Identiizierung von komplexen Gemischen von Pyrrolizidin-Alkaloiden ist die GC/MS die Methode der Wahl (Jenett-Siems et al. 2005).

Direkte chemische Ionisation (DCI) Die chemische Ionisation arbeitet mit einem Reaktandgas, das zunächst durch Elektronen ionisiert wird und durch eine nachfolgende Reaktion mit weiteren Gasmolekülen stabile Ionen bildet. Diese übertragen entweder ein Proton auf das zu untersuchende Molekül [M + H]+ oder bilden damit ein Addukt (z. B. [M + NH4]+ bei der Verwendung von Ammoniak). Eine Fragmentierung wird bei diesem Verfahren deutlich zurückgedrängt, sie ist jedoch abhängig vom verwendeten Reaktandgas. Je weniger exotherm die Übertragung des Protons erfolgt (d. h. je größer die Protonenainität des Gases ist), desto weicher ist das Verfahren und umso geringer die Fragmentierung. Unter den gängigen Reaktandgasen ist Wasserstof das härteste Gas, während mit Ammoniak die weichste Ionisierung erzielt wird. Bei der DCI wird die gelöste Substanz auf eine Drahtschlaufe gebracht und das Lösungsmittel verdampt. Nach dem Einbringen ins Vakuum wird die Schlaufe erwärmt und die Substanz in die Gasphase gebracht. Dieses Verfahren ermöglicht die MS-Analyse auch schwer verdampbarer Glykoside ( > Abb. 2.16). Die DCI kann auch in einem negativen Modus betrieben werden, da durch das Einfangen von Elektronen auch negativ geladene Ionen entstehen.

Elektrospray-Ionisation (ESI) Bei diesem Verfahren wird mittels einer Kapillare eine Lösung der Substanz in ein elektrisches Feld versprüht, wobei es zu einer feinen Zerstäubung und zur Ionisierung der Verbindung kommt. Die entstandenen Tröpfchen enthalten Ionen und verkleinern sich zunehmend, bis sämtliches Lösungsmittel verdampt ist und die Ionen in die Gasphase überführt werden. Das Verfahren ist ideal für die Unter-

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54

2

Einführung in die Analytik sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe anhand ausgewählter Beispiele

. Abb. 2.16a,b

a

b DCI-Spektren des Flavonoidglykosids Patuletin-7-O-glucosid (C22H22O13, MG 494; 6-Methoxyderivat von Quercetin-7-Oglucosid) im negativen (a) und positiven Modus (b). Unter Verwendung von Ammoniak als Reaktandgas (weiche Ionisierung) dominieren als negative Ionen [Aglykon]– und [M]–, bei den positiven Ionen [Hexose – H2O + NH4]+, [Aglykon + H]+ und [M + H]+. Es lassen sich aus beiden Spektren sowohl Informationen über den Zucker wie auch über das Aglykon erhalten

2.4 Strukturaufklärung und Substanzcharakterisierung

suchung von glykosidischen Sekundärstofen mit längeren Zuckerketten geeignet ( > Abb. 2.17), da neben [M + H]+Ionen unter geeigneten Bedingungen auch eine sukzessive Abspaltung der Zucker bis hinunter zum Aglykon beobachtet werden kann (Broberg et al. 2004). Bei der ESI-MSMessung kann ebenso wie beim DCI auch im negativen Modus gemessen werden, wobei häuig intensitätsstarke [M – H]–-Peaks detektiert werden können. Dem ESI-Verfahren sehr ähnlich ist die APCI, wobei das Lösungsmittel hier zuerst verdampt und dann der Analyt an einer Metallnadel ionisiert wird. Beide Verfahren sind auch für eine Kopplung mit der HPLC geeignet (Li et al. 2005; Ma et al. 2005).

2

2.4.3 Ultraviolettspektroskopie (UV-Spektroskopie) Nach dem Durchgang eines Lichtstrahls durch eine Substanzlösung kann seine Intensität beim Austritt in Folge von Absorption vermindert sein. Im Bereich des sichtbaren (400–700 nm) und des ultravioletten Lichts (10– 200 nm fernes UV, 200–400 nm nahes UV) können durch die Absorption von Photonen (Lichtquanten) Valenzelektronen zunächst angeregt werden und dann wieder in den Grundzustand zurückfallen. Strukturelemente, die durch eine Anregung von V-, S- und n-Elektronen zu einer Absorption von UV-Strahlen führen, werden als Chromo-

. Abb. 2.17a,b

a ESI-Spektren des herzwirksamen Steroidglykosids Lanatosid C im positiven (a) und negativen Modus (b). Unter Zusatz von MeOH und NH4-Acetat wird zunächst das Molekülion erzeugt und dann im zweiten Quadrupol mit Argon als Stoßgas weiter fragmentiert. Sich ergänzend liefern die beiden Modi Informationen über die sequentielle Abspaltung der Acetylgruppe, der endständigen Glucose, der Digitoxosen und dem Molekulargewicht des Aglykons. Die zusätzlich zu beobachtenden Eliminationen von m/z 18 sind typisch für die Abspaltung von Wasser (aus den Zuckern). [Ich danke Herrn J. Kiermaier (Zentrale Analytik der Universität Regensburg, NWF IV) herzlich für die Aufnahme der ESI-Massenspektren]

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2

Einführung in die Analytik sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe anhand ausgewählter Beispiele

. Abb. 2.17b

b

phore bezeichnet. Von besonderem Interesse sind miteinander verbundene (konjugierte) Chromophore organischer Moleküle, die ot zu Absorptionen im nahen UVsowie im Bereich des sichtbaren Licht führen. Sie enthalten neben konjugierten Doppel- bzw. Dreifachbindungen und aromatischen Systemen (S-Elektronen), auch daran gebundene Atome und Atomgruppen mit nichtbindenden Elektronenpaaren (n-Elektronen). Bei sekundären Planzeninhaltsstofen sind dies sehr häuig Hydroxyl-, Carbonyl- oder Aminogruppen. Die Erweiterung eines Chromophors führt zu einer mehr oder weniger starken Verschiebung der Absorptionsbanden in den langwelligeren Bereich (bathochromer Efekt). Ein UV-Spektrum einer Substanz wird erhalten, indem gemäß des Bougier-Lambert-Beer-Gesetzes ( > Gleichung 3) für jede Wellenlänge O die Absorption A und der molare Absorptionskoeizient H bestimmt wird. Dieser berechnet sich durch Umformung der Gleichung a) aus der Absorption A (keine Dimension), der molaren Pro-

benkonzentration c (mol u l–1) und der Küvetten-Schichtdicke d (cm), wobei ein linearer Zusammenhang nur bei verdünnten Proben (EO d0,7) gilt: a) A = εcd AO b) εO = 4 cd

(3)

mit der Absorption A (bzw. AO), dem molaren Absorptionskoeizienten ε (bzw. εO, in l u cm–1 u mol–1) und der Konzentration c (mol u l–1) sowie der Schichtdicke d (cm). Die Aufnahme von UV-Spektren erfolgt gewöhnlich in optisch reinen Lösungsmitteln, wobei in einem Bereich von 180–400 nm Küvetten aus Quarzglas erforderlich sind. Es ist darauf zu achten, dass die verwendeten Lösungsmittel im angestrebten Messbereich keine Eigenabsorption aufweisen. Wasser und Acetonitril können oberhalb von 200 nm, Methanol oberhalb von 210 nm und Chloroform oberhalb von 240 nm verwendet werden.

2

2.4 Strukturaufklärung und Substanzcharakterisierung

. Abb. 2.18

. Abb. 2.19

O

60 000

50 000

40 000

OH

OH

OH

OH

1

588 nm Hypericin 546 nm Hypericin 470 nm Hypericin 589 nm Pseudohypericin 546 nm Pseudohypericin 473 nm Pseudohypericin

HO HO OH

ε

OH

O 1

6

30 000

O OH

20 000

OH 10 000 6

0 20%

OH 40%

60%

80%

100%

%MeOH

Dargestellt sind die Werte für den molaren Absorptionskoeffizienten ε von Hypericin und Pseudohypericin in Abhängigkeit vom Wassergehalt des zum Lösen verwendeten Methanol-Wasser-Gemisches und gemessen bei verschiedenen Wellenlängen (Konzentration: jeweils 8 × 10–6 mol/l) (aus Wirz 2000; Wirz et al. 2001)

Die wichtigsten Einsatzgebiete der UV-Spektroskopie sind die Detektion und Quantiizierung von Substanzen oder Substanzgemischen. Ihr Einsatz erfolgt dabei vielfach in Kombination mit einer leistungsfähigen chromatographischen Methode wie der HPLC oder der MPLC ( > entsprechendes Kapitel). Des Weiteren indet die UV-Spektroskopie Anwendung bei der Charakterisierung einer isolierten Verbindung. Wichtige Kenngrößen für ein Molekül sind die Absorptionsmaxima Omax und, bezogen auf eine bestimmte Wellenlänge O (in der Regel ist dies auch Omax), der molare Absorptionskoeizient HO bzw. HOmax (l u mol–1 u cm–1). Es sollte in jedem Fall beachtet werden, dass bei einigen Substanzen, die Wahl des Lösungsmittels erheblichen Einluss auf die Charakteristika eines UV-Spektrums hat. Ein interessantes Beispiel aus dem Bereich der Naturstofe ist das Hypericin ( > Abb. 2.18, Wirz et al. 2001), da zahlreiche Umstände zu einem heterogenen Bild der publizierten UV-Daten beitragen. Je nach gewähltem Lösungsmittel, gewählter Konzentration bzw. Temperatur ändern sich durch die Bildung von intermolekularen Assoziaten, unterschiedlichen Tautomeren, Ionisation oder verschiede-

OH

O

Bildung von intermolekularen Wasserstoffbrücken zwischen den 1,6-Dioxo-Tautomeren des Hypericins führt zur Entstehung von Homoassoziaten (aus Wirz 2000)

nen vorliegenden Konformationen die Intensität und die Lage der Absorptionsbanden. So bilden sich z. B. in Gegenwart steigender Wasseranteile in Ethanol-Wasser- oder DMSO-Wasser-Gemischen an Stelle der monomolekularen Lösungen vermehrt Homoassoziate, in denen Hypericin-Moleküle über Wasserstobrücken verbunden sind ( > Abb. 2.19). Dies führt für das Hypericin auch zum Vorliegen sehr heterogener Daten bei Gehaltsbestimmungen, die auf UV-spektroskopischen Verfahren beruhen (Literatur bei Wirz 2000). Ein wichtiges Einsatzgebiet der UV/VIS-Spektroskopie im europäischen Arzneibuch (PhEur 5) ist die Bestimmung von Gesamtgehalten, d. h. die gemeinsame Quantiizierung einer Gruppe von gleichartig reagierenden Sekundärstofen. Unabhängig von der Stoklasse ist das prinzipielle Vorgehen recht ähnlich. Mit einem geeigneten Lösungsmittel wird die Substanzgruppe zunächst möglichst quantitativ aus der Droge extrahiert und beispielsweise durch Flüssig-Flüssig-Verteilungen weiter angereichert. Zur Quantiizierung muss für die gesamte Gruppe ein gemeinsames Strukturelement gefunden werden, das in einer einheitlichen Reaktion umgesetzt wird. Dieses Strukturelement muss in einigen Fällen erst „freigelegt“ werden, sodass im Rahmen der Aufarbeitung ot noch eine weitere Reaktion enthalten ist, die es für alle Verbindungen erzeugt (z. B. die Bildung von Formaldehyd aus Methylendioxygruppen bei den Schöllkraut-Alkaloiden).

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2

Einführung in die Analytik sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe anhand ausgewählter Beispiele

Wichtige Beispiele für Gesamtgehaltsbestimmungen auf der Basis photometrischer Bestimmungen sind (neben anderen) die Quantiizierung von Flavonoiden (PhEur 5: z. B. Birkenblätter, Echtes Goldrutenkraut und Holunderblüten), Anthranoiden (PhEur 5: z. B. Curaçao- bzw. KapAloe, Faulbaumrinde und Sennesblätter), Gerbstofen (PhEur 5: z. B. Blutweiderichkraut, Eichenrinde und Hamamelisblätter) und Alkaloiden (PhEur 5: z. B. Chinarinde und Schöllkraut). Zur Berechnung des prozentualen Gehaltes wird dabei auf die speziische Absorption einer einzelnen Substanz zurückgegrifen.

! Kernaussagen

Die vielfältigen und komplexen Problemstellungen im Bereich der Analytik von sekundären Pflanzeninhaltsstoffen haben zur Integration einer großen Palette von chromatographischen, spektroskopischen und spektrometrischen Methoden in diesem Fachgebiet geführt. Zur Isolierung pflanzlicher Sekundärstoffe bedient man sich zunächst eines geeigneten Verfahrens zur Extraktion (Mazeration, Perkolation, Soxhlet, überkritisches CO2), dem eine Auftrennung des Extraktes folgt. Dazu stehen neben verschiedenen säulenchromatographischen Methoden (SC, VLC) auch Verfahren zur Verfügung, die auf einer Flüssig-Flüssig-Verteilung beruhen. Die für die Trennung ausgewählte Strategie ist u. a. von der anvisierten Substanzklasse sowie von der Art (polar, unpolar) und der Menge des Extrakts abhängig. Eine zentrale Rolle nimmt dabei auch die DC ein, da mit ihrer Hilfe nicht nur die Fließmittel für die SC optimiert werden können, sondern auch der Erfolg einer Extraktion oder Trennung überprüfbar ist. Die endgültige Isolierung bzw. Reinigung einer Substanz (Reinheit im Idealfall t99%) kann in der Regel spätestens auf Basis eines MPLC- oder HPLC-Einsatzes erreicht werden. Der Isolierung schließt sich zum einen die Strukturaufklärung, zum anderen die Charakterisierung der gewonnenen Substanz an. Dominierende Methoden der Strukturaufklärung sind die MS und die NMR-Spektroskopie. Bedingt durch verschiedene Ionisierungstechniken (EI, DCI, ESI, APCI und MALDI) sind nahezu alle sekundären Pflanzeninhaltsstoffe einer massenspektrometrischen Analyse zugänglich. In der NMRSpektroskopie kommen neben den 1D-Spektren auch zahlreiche 2D-Verfahren (COSY, HSQC, HMBC, ROESY) im Routinebetrieb zum Einsatz wobei manchmal die geringe isolierte Substanzmenge der Strukturaufklärung eine

Im Bereich der Strukturauklärung ist die UV-Spektroskopie heute deutlich hinter der MS und der NMR zurückgetreten. Für einige Substanzklassen, wie z. B. bei den Flavonoiden, kann sie jedoch nützliche Hinweise, insbesondere durch den Einsatz von Verschiebungsreagenzien, liefern (Markham 1982). Diagnostische Hinweise sind hier die Lage von Absorptionsmaxima sowie die Intensität und die Feinstruktur (z. B. das Autreten von Schultern) einer Bande.

nicht mehr überschreitbare Grenze setzt. Eine wichtige Ergänzung zur Substanzisolierung steht mit den verschiedenen Kopplungstechniken zur Verfügung, bei denen insbesondere die GC/MS, die HPLC/MS (Ndjoko et al. 2000) und die HPLC/NMR (Literatur bei Wolfender et al. 2005) von erheblicher Bedeutung sind. Weitere wichtige Aufgabenfelder phytochemischer Analytik sind die Reinheitsprüfung und Gehaltsbestimmung von einzelnen Naturstoffen und Extrakten. Zur qualitativen Analyse von Stoffgemischen ist neben der HPLC nach wie vor die DC-Analyse eine der wichtigsten Verfahren, die auch bei der Fingerprint-Analyse eines Extrakts wertvolle Hinweise liefert. Als leistungsfähigere Alternative zur DC ist die HPTLC etabliert worden, die auch den Eingang in die Arzneibücher geschafft hat (vgl. PhEur 5.4, Kap. 2.2.27). Auch wenn mit der HPTLC und der Kopplung an einen DC-Scanner, die Möglichkeit zur Etablierung von leistungsfähigen Gehaltsbestimmungen gegeben ist, so ist auf dem Gebiet der quantitativen Analyse von Extrakten bei Reinheitsprüfungen und Gehaltsbestimmungen die HPLC gekoppelt mit einem UV-/ UV-Dioden-Array-Detektor das eindeutig dominierende Verfahren. Neben der Auftrennung eines Substanzgemisches und der quantitativen Bestimmung einzelner Substanzen ist auch die Gesamtgehaltsbestimmung einer ganzen Stoffgruppe noch immer von erheblicher Bedeutung. Die Quantifizierung erfolgt dabei über ein gemeinsames Strukturelement, das die Reaktion ermöglicht und das alle Vertreter dieser Stoffgruppe aufweisen. Beispiele dafür sind die photometrische Bestimmung nach einer Komplexierung von Flavonoiden mit Aluminiumchlorid oder von Anthranoiden mit Magnesiumacetat in der BornträgerReaktion. Damit die Quantifizierung nicht gestört wird, geht ihr eine sorgfältige Anreicherung und Abtrennung von Begleitsubstanzen voran.

Literatur

2

Schlüsselbegriffe Analytische Verfahren Chemische Verschiebung DC Detektoren Eindimensionale NMR (1HDEPT, „inverse-gated“) Extraktion Extrakte Fingerprint Fließmitteloptimierung Gekoppelte Verfahren Gesamtgehaltsbestimmung

13C-NMR,

HPLC HPTLC Isolierungsverfahren Kieselgel Massenspektrometrie Mobile Phasen MPLC Multiplizität NMR-Spektroskopie NOE Perkolation Präparative Verfahren

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Prisma-Modell Qualitätssicherung Reinheit Säulenchromatographie Stabilität Stationäre Phase Strukturaufklärung UV-Spektroskopie VLC Zerkleinerung von Drogen Zweidimensionale NMR (COSY, HSQC, HMBC, TOCSY und ROESY)

taxon subgenus Quamoclit, section Mina. Phytochemistry 66: 223–231 Kim HK, Choi YH, Luijendijk TJ et al. (2004) Comparison of extraction methods for secologanin and the quantitative analysis of secologanin from Symphoricarpos albus using 1H-NMR. Phytochem Anal 15: 257–261 Kordali S, Cakir A, Mavi A et al. (2005) Screening of chemical composition and antifungal and antioxidant activities of the essential oils from three Turkish Artemisia species. J Agric Food Chem 53: 1408– 1416 Li B, Abliz Z, Tang M et al. (2006) Rapid structural characterization of triterpenoid saponins in crude extract from Symplocos chinensis using liquid chromatography combined with electrospray ionization tandem mass spectrometry. J Chromatogr A 1101: 53–62 Li CY, Lin CH, Wu CC et al. (2004) Efficient 1H nuclear magnetic resonance method for improved quality control analyses of Ginkgo constituents. J Agric Food Chem 52: 3721–3725 Ma XQ, Liang XM, Xu Q et al. (2005) Identification of ginsenosides in roots of Panax ginseng by HPLC-APCI/MS. Phytochem Anal 16: 181–187 Mabry TJ, Markham KR (1975) Mass spectrometry of flavonoids. In: Harborne JB, Mabry TJ, Mabry H (Hrsg) The flavonoids. Chapman and Hall, London Markham KR (1982) Techniques of flavonoid identification. Academic Press, London New York Marriot PJ, Shellie R, Cornwell C (2001) Gas chromatographic technologies for the analysis of essential oils. J Chromatogr A 936: 1–22 Ndjoko K, Wolfender JL, Hostettmann K (2000) Determination of trace amounts of ginkgolic acids in Ginkgo biloba L. leaf extracts and phytopharmaceuticals by liquid chromatography–electrospray mass spectrometry. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 744: 249– 255 Nyiredy S, Dallenbach-Tölke K, Sticher O (1988) The „PRISMA” optimization system in planar chromatography. J Planar Chromatogr 1: 336–342 Nyiredy S, Erdelmeier CAJ, Meier B et al. (1985) „PRISMA”: Ein Modell zur Optimierung der mobilen Phase in der Dünnschichtchromatographie, vorgestellt anhand verschiedener Naturstofftrennungen. Planta Med 3: 241–246

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60

2

Einführung in die Analytik sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe anhand ausgewählter Beispiele

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3 3 Biosynthese pflanzlicher Sekundärstoffe R. Lukain, U. Matern . . . .

62 62 69 73

Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

77

3.1

Grundlegende Methoden zur Auklärung von Biosynthesewegen 3.1.1 Isotopentechnik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.2 Enzymatische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.3 Genetische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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3

Biosynthese pflanzlicher Sekundärstoffe

> Einleitung Ein wesentlicher Teilbereich der Pharmakognosie und Phytopharmazie (Lehre von biogenen Arzneimitteln) beschäftigt sich mit der Erforschung von Biosynthesen tierischer, mikrobieller und insbesondere pflanzlicher Wirkstoffe. Im Vordergrund steht dabei die Identifizierung der Ausgangs- und Zwischenprodukte (Intermediate) der vollständigen Biosynthesesequenzen. An die analytischen Untersuchungen schließt sich üblicherweise die Beschreibung der Enzyme an, die die einzelnen Umsetzungen katalysieren. Dazu werden die Enzyme möglichst chromatographisch gereinigt und dann biochemisch und molekular charakterisiert. Die Ermittlung von Partialsequenzen der Enzympolypeptide kann zur Klonierung der entsprechenden cDNS genutzt werden. Die Überführung von einzelnen, vollständigen cDNSn in Expressionsvektoren und die Expression der funktionalen rekombinanten Enzyme in einem heterologen System beweist letztlich die Identität des jeweiligen Enzyms. Die Expression größerer Mengen der rekombinanten Enzyme eröffnet zudem die Möglichkeit, die Reaktionsmechanismen und die räumlichen Strukturen der Enzyme zu studieren.

3.1 Grundlegende Methoden zur Aufklärung von Biosynthesewegen Zu den grundlegenden Methoden, die zur Auklärung von Biosynthesewegen eingesetzt werden, gehören die Fütterung von markierten Vorstufen (Isotopentechnik), die Messung einzelner Enzymreaktionen in vitro und der Einsatz von Mutanten.

3.1.1 Isotopentechnik Die Einführung der Isotopen-, Tracer- oder Indikatortechnik in die biochemische Forschung durch G. von Hevesy im Jahre 1913 ermöglichte es erstmals, komplexe Biosynthesevorgänge in verschiedenen Organismen genau zu verfolgen. Der Vorteil dieser Technik beruht, bei geeigneter Wahl der isotopenmarkierten Vorstufe, auf der selektiven Markierung von Intermediaten und Produkten

ohne grundlegende Änderung ihrer chemischen Eigenschaten. Elemente werden durch ihre Ordnungszahl deiniert. Diese ergibt sich aus der Anzahl der Protonen im Kern. Der positiven Kernladung steht die negative Ladung der Elektronen in der Elektronenhülle gegenüber. Weiterer Bestandteil des Atomkerns sind die Neutronen, beide Kernbestandteile werden als Nukleonen bezeichnet. Die Anzahl der Neutronen innerhalb eines Atomkerns kann bei gleichbleibender Protonenzahl und somit gleicher Ordnungszahl diferieren, sodass verschiedene Massen eines Elements, die Isotope, resultieren. Da Isotope die gleiche Anzahl an Elektronen besitzen, ist ihr chemisches Verhalten weitestgehend identisch.

! Kernaussage

Isotope eines Elements unterscheiden sich voneinander durch die Zahl der Neutronen und somit in ihrer Kernmasse.

Ein großer Vorteil der Tracertechnik liegt in der Möglichkeit, die Mengen der markierten Verbindungen über die Zeit zu verfolgen. So ist man in der Lage, die Aufnahme und Verteilung bzw. metabolische Umsatzraten, Translokations- und Akkumulationsvorgänge, Pool-Bestimmungen oder die Verweildauer eines Stofes innerhalb eines Organismus genauestens festzustellen. Darüber hinaus lassen sich unter geeigneten experimentellen Bedingungen das Ausmaß und die Geschwindigkeit der Neubildung von Stofen direkt verfolgen. In biochemischer Hinsicht mündet die Anwendung der Isotopentechnik in der Auklärung von Biosynthesewegen. Dabei geht es um die Identiizierung von Produkten des Intermediärstofwechsels, um die Gleichgewichtsbeziehung zwischen den einzelnen Stofen, die an den chemischen Umwandlungen beteiligt sind und um die Frage nach dem kinetischen Verlauf dieser Reaktionen. So lässt sich relativ leicht ermitteln, ob eine Verbindung Vorstufe (Präkursor) oder Produkt einer Reaktion ist, welche Stofwechselwege bei der Metabolisierung überwiegend beschritten werden oder aber welcher Reaktionsmechanismus einer gegebenen biologischen Umwandlung zugrunde liegt. Unter methodischen Gesichtspunkten ist die Unterscheidung von stabilen und instabilen (radioaktiven) Isotopen notwendig. Beispielsweise stellt der in der Natur vorkommende Sauerstof ein Gemisch aus drei stabilen

3.1 Grundlegende Methoden zur Aufklärung von Biosynthesewegen

Isotopen dar; er besteht zu 99,759% aus 16O, zu 0,0374% aus 17O und zu 0,2036% aus 18O. Alle Isotope des Sauerstofs enthalten also 8 Protonen, unterscheiden sich aber dadurch, dass sie 8, 9 oder 10 Neutronen besitzen. Messtechnisch besonders relevant ist auch das stabile Isotop 13C, das zu 1,108% im Kohlenstof unserer natürlichen Umgebung enthalten ist und wie das Isotop 2H (Deuterium) oder 15N einen Kernspin aufweist. Im Gegensatz zu diesen Isotopen zeichnen sich die radioaktiven Isotope durch ihre Instabilität aus. Das Phänomen der Radioaktivität (Kernstrahlung) wurde zufällig von dem französischen Physiker H.A. Becquerel (1852–1908) beobachtet, der die Schwärzung einer fotograischen Schicht durch Pechblende nachwies. Kurz darauf wurde das Element Uran als Quelle der Strahlung in diesem Mineral identiiziert, und M. Curie (1867–1934) und P. Curie (1859–1906) entdeckten Polonium und Radium, das ein weitaus größeres Strahlungsvermögen hat. Radium ist ein Erdalkalimetall, das eine gewisse Ähnlichkeit zum Barium aufweist und in der Pechblende nur in ganz geringer Menge vorkommt.

! Kernaussage

Die Eigenschaft eines Elements, Strahlung zu emittieren, wird als natürliche Radioaktivität bezeichnet.

Die Strahlung eines natürlichen Isotops beruht auf der Instabilität seines Atomkerns, der mit einer speziischen Zerfallszeit zu einem neuen Atom zerfällt, das meist wieder radioaktiv und instabil ist. Um die mittlere Lebensdauer eines radioaktiven Isotops zu beschreiben, wird die physikalische Halbwertszeit angegeben, die der Zeit entspricht, nach der die Hälte einer ursprünglich vorhandene Anzahl von radioaktiven Kernen zerfallen ist. Im Falle von 14C beträgt die Halbwertszeit 5730 Jahre. Diese muss deutlich von der so genannten biologischen Halbwertszeit unterschieden werden, die den Verbleib eines inkorporierten Radionuklids im Organismus beschreibt. Die biologische Halbwertszeit, die im Bereich von einigen Wochen bis Monaten liegt, ist stark von der Art der inkorporierten Verbindung und des untersuchten Organs abhängig. Die beim radioaktiven Zerfall freiwerdende Energie wird in Form dreier verschiedener Strahlungsarten ausgesandt: x α-Strahlung: Aus dem Atomkern wird beim Zerfall ein α-Teilchen (Heliumkern) freigesetzt.

3

x β-Strahlung: Der instabile Atomkern sendet entweder ein negatives Elektron (Negatron, β–) oder ein Positron (β+) aus. x γ-Strahlung: eine der Röntgenstrahlung analoge elektromagnetische Wellenstrahlung, aber von kürzerer Wellenlänge. Die Radioaktivität eines Radionuklids wird gemessen als Anzahl der Zerfälle pro Sekunde in Becquerel (Bq; die früher übliche Einheit von einem Curie, Ci, entspricht 3,7 u 1010 Bq). In der Praxis wichtiger ist die speziische Radioaktivität einer Verbindung, die als Radioaktivität pro mol (Bq/mol) angegeben wird. Für die aktuelle Forschung relevant sind insbesondere die Radioisotope 3H (Tritium), 14C, 32P, und 35S, die durch Neutronenbeschuss geeigneter Ausgangsverbindungen künstlich hergestellt werden. Der Beschuss führt in allen Fällen zur instabilen Anordnung der Nukleonen im Kern, ein Neutron zerfällt unter Aussendung eines Elektrons (β-Strahlung) zu einem Proton, wobei ein neues Element mit gleicher Masse, aber nächst höherer Ordnungszahl (3H1 zu 3He2 ; 14C6 zu 14N7 ; 32P15 zu 32S16 und 35S16 zu 35Cl17) entsteht. > Tabelle 3.1 gibt einen Überblick über die im Labor am häuigsten verwendeten Isotope. Beim Einsatz von stabilen oder radioaktiven Isotopen sind unterschiedliche Vor- und Nachteile zu beachten. Stabile Isotope sind, wie der Name bereits sagt „sehr stabil“, d. h. der Verbleib kann auch nach längeren Zeiträumen gemessen werden. Bei Fütterung stark angereicherter Vorstufen ist es eventuell sogar möglich, Folgeprodukte auf Grund ihrer Dichte zu unterscheiden; beispielsweise wurde die Neusynthese von Enzymen durch Einbau von 15N-markierten Aminosäuren verfolgt. Andererseits kann der Kernspin von z. B. 13C zur Strukturanalyse durch Kernresonanzmessungen genutzt werden. Zudem sind stabile Isotope relativ unschädlich, wenn sie nicht in zu hoher Konzentration angewendet werden. Die Markierung von Verbindungen mit stabilen Isotopen kann allerdings im Vergleich zur unmarkierten Kontrolle zu unterschiedlichen Reaktionskinetiken in vitro führen, und einige Enzyme können sogar Isotope in gewissem Umfang diskrimieren. Darüber hinaus ist der Nachweis der stabil markierten Metabolite meist aufwendig, da sie abgetrennt und durch Massenspektrometrie oder Kernresonanz bestimmt werden müssen. Allerdings liefern diese Methoden, insbesondere die Kernresonanzmessung, über den qualitativen Nachweis hinaus auch strukturelle Informationen. Im Gegensatz dazu lassen sich radioaktiv markierte Verbindun-

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3

Biosynthese pflanzlicher Sekundärstoffe

. Tabelle 3.1 In der biologischen Forschung häufig verwendete Isotope Element

Stabiles Isotop

Radioaktives Isotop

Halbwertszeit (physikalisch)

Strahlung

Maximale Reichweite der β−-Partikel in

Wasserstoff

2H(D)

–

–

–

Wasserstoff

–

3H(T)

12,26 Jahre

β, sehr weich

Kohlenstoff

13C

–

–

–

–

–

14C

5736 Jahre

β−

24

0,028

Stickstoff

15N

–

–

–

–

–

Sauerstoff

18O

–

–

–

–

–

Schwefel

35S

87,1 Tage

β−

26

0,32

Phosphor

32P

14,3 Tage

β−

790

0,8

Phosphor

33P

25,4 Tage

β−

49

0,6

Iod

125I

60,0 Tage

γ

–

–

Iod

131I

8,1 Tage

β

Luft (cm)

Kohlenstoff

gen relativ einfach und sehr empindlich nachweisen. Die Intensität der radioaktiven Strahlung kann mit verschiedenen Messverfahren verfolgt werden, wobei sogar die unterschiedliche Energiedichte der emittierten Strahlung bei Doppelmarkierung mit verschiedenen Isotopen unterschieden werden kann. Technisch wird die Strahlung durch ihre ionisierende Wirkung auf ein Zählgas (GeigerMüller-Zählrohr), die Anregung von Substanzen zur Emission von Photonen (Szintillationszählung), die Zersetzung lichtempindlicher Emulsionen (Autoradiographie) oder die Anregung von Übergangsmetallen in einer festen Matrix (Bio-Imager) erfasst. Die Zeit, in der die Hälte der Ausgangsmenge des Isotops zerfällt (physikalische Halbwertszeit), variiert von ca. 14,2 Tagen für 32P bis zu 5730 Jahren für 14C und reicht in jedem Falle für übliche Messungen aus. Als schwerwiegender Nachteil kann die Strahlenwirkung radioaktiver Isotope auf das menschliche Gewebe gesehen werden. Allerdings ist die Reichweite der β-Strahlung der genannten künstlichen Radioisotope bereits in Lut relativ gering. Deshalb ist das Arbeiten mit radioaktiven Stofen nicht so gefährlich wie häuig angenommen. Dennoch sollte dabei nie leichtfertig ofen hantiert werden; die üblichen Schutzmaßnahmen, wie die Verwendung von Schutzschilden oder das Einhalten des größtmöglichen Abstands (die Strahlungsintensität sinkt mit dem Quadrat der Entfernung), müssen beachtet werden.

–

+γ

Wasser (cm) –

0,6

0,0006

165

Die Bedeutung stabiler Isotope beim Nachweis von Biosyntheseprodukten Etwa 300 stabile, nichtstrahlende Isotope sind bekannt, und einige davon inden Verwendung in der biologischen, medizinischen und pharmazeutischen Forschung. Darunter haben 18O und 15N Bedeutung, weil von diesen Elementen keine radioaktiven Isotope existieren, während 2H (Deuterium, schwerer Wasserstof ) und 13C häuig für Untersuchungen zur Stereospeziität von Enzymreaktionen bzw. wegen des Kernspins verwendet werden. Diese stabilen Isotope stehen heute in hoch angereicherter Form (ca. 100%) zur Verfügung, was ihre Nützlichkeit für die Aufklärung von Biosynthesewegen im Zusammenhang mit den modernen spektroskopischen Möglichkeiten sehr fördert. Dabei wird in der Regel das Isotopenverhältnis von Haupt- zu Nebenisotopen verfolgt (1H/2H, 13C/14C, 14N/15N oder 16O/18O), das sich massenspektrometrisch bestimmen lässt. Massenspektrometrie. Der Massenspektrograph, der be-

reits 1919 von F.W. Aston konstruiert wurde, besteht im Grunde aus einer Ionenquelle zur Erzeugung von Molekülionen, einem Analysator zur Trennung der Ionen nach m/z (Ionenmasse zu Ladungsverhältnis) und einem Detektor, zur Erfassung der Messdaten. Der Aubau entspricht dem Messprinzip, das die zu untersuchenden Sub-

3.1 Grundlegende Methoden zur Aufklärung von Biosynthesewegen

stanzen mit verschiedenen Techniken (thermisch, durch elektrische Felder oder durch Beschuss mit Elektronen, Ionen oder Photonen) in positive Ionen überführt und diese analysiert. Dabei kann es sich um einzelne ionisierte Atome, ionisierte Moleküle und deren Bruchstücke oder Assoziate handeln. Diese Ionen werden im magnetischen Feld nach Masse und Ladung getrennt und mittels eines Registriersystems in ihrer Häuigkeit erfasst. Ionen gleicher Summenformel, aber verschiedener Isotopenmassen werden so gleichzeitig erfasst, wodurch ein charakteristisches Isotopenmuster entsteht. Neben der Masse des eigentlichen Molekülions (M+) inden sich dabei auch die der schweren Isotope (z. B. M+1 oder M+2), wobei je nach Messbedingungen auch ein [M + H]+ autreten kann. Die Massenspektrometrie mit hoher Aulösung (4 Dezimalen hinter dem Komma) verrät die exakte Zusammensetzung der einzelnen Ionen. Die Veränderung des Isotopenmusters einer Verbindung kann so zur Untersuchung eines Biosyntheseweges genutzt werden. Der Einbau einer markierten Vorstufe äußert sich in der Erhöhung des jeweiligen Signals (z. B. M+2-Signal bei 18O). Darüber hinaus kann aus den übrigen Ionen, die direkt oder mehrstuig durch Fragmentation entstanden sind, auf die Lokalisation der markierten Vorstufe im Produkt geschlossen werden. Für die Interpretation von Massenspektren ist die Analyse solcher Zerfallsschemata nicht unerheblich. Eine besondere Bedeutung hat die moderne Isotopenverhältnismassenspektrometrie (IRMS, „isotope ratio mass spectrometry“, oder SIRA, „stable isotope ratio analysis“) in weiten Bereichen der Analytik erlangt. Hier wird die Probe vollständig verbrannt und das 12C/13C-Verhältnis im resultierenden CO2 durch GC-IRMS gemessen. Die Messungen stützen sich auf die Kenntnis, dass die unter „Anwendung der Isotopentechnik“ besprochene Ribulosebisphosphat-Carboxylase/Oxygenase bei der CO2-Fixierung 12CO2 von 13CO2 unterscheiden kann. Es handelt sich zudem um ein allosterisches Enzym, das durch unterschiedlichen CO2-Partialdruck moduliert wird, sodass sich der 12CO2/13CO2-Quotient (die Molekularionen m/z 44 für 12CO2 und m/z 45 für 13CO2 können mit einer Präzision bis 0,0002% bestimmt werden) der Fixierung in den so genannten C4-Planzen (höherer CO2-Partialdruck) und C3-Planzen unterscheidet. Auf diesem Weg wurde z. B. Wein auf Zusatz von Rohrzucker oder echtes Kamillenöl auf Verfälschung geprüt (Carle 1996). Eine gewisse Brisanz ergibt sich für die Doping-Kontrolle, weil nun auch die verbotene Einnahme von körperidentischen Steroidhormonen, wie Testosteron, Dihydrotestosteron

3

oder Dehydroepiandrosteron, möglich wird. Kommerziell werden Steroidhormone aus planzlichen Vorstufen synthetisiert, die ein anderes 12C/13C-Verhältnis aufweisen als die körpereigenen Hormone (Ueki u. Okano 1999). NMR-Spektroskopie. Ein weiteres sehr leistungsfähiges

Verfahren der modernen Biosyntheseforschung, das die Markierung mit stabilen Isotopen nutzt, ist die Kernresonanzspektroskopie, kurz NMR-Spektroskopie („nuclear magnetic resonance“). Diese Technik misst den so genannten Kernspin einiger Atomkerne, insbesondere 1H und 13C, die ein magnetisches Moment besitzen. Magnetische Atomkerne besitzen eine ungerade Anzahl an Neutronen oder Protonen. Die Messungen werden in einem starken Magnetfeld ausgeführt, das die Moleküle zunächst ausrichtet. Zusätzlich eingestrahlte Radiowellenpulse (elektromagnetische Strahlung) werden absorbiert und führen zur Anregung der magnetischen Kerne, die dadurch ihre Orientierung im angelegten Magnetfeld ändern. Nachdem der Impuls abgeklungen ist, fällt der Spin der Kerne in den Ruhezustand zurück (Relaxation). Bei dieser Veränderung des Kernspin-Zustandes wird die zuvor absorbierte Anregungsenergie wieder frei, das Signal wird mit Radiowellendetektoren registriert und durch mathematische Umformung in ein NMR-Spektrum übersetzt, in dem die jeweiligen Resonanzfrequenzen relativ zu einer Standardfrequenz (chemische Verschiebung) aufgelöst sind. Neben der 1H-NMR-Spektroskopie hat die 13CNMR-Spektroskopie für die Strukturauklärung von Naturstofmolekülen große Bedeutung erlangt, da schon der natürliche 13C-Gehalt organischer Verbindungen (1,108%) für strukturelle Messungen ausreicht. Dabei treten wegen der relativ niedrigen Prozentzahl kaum 13C/13C-Kopplungen auf (geringe Wahrscheinlichkeit für direkt benachbarte 13C-Kerne), und die Kopplung mit 1H-Kernen kann technisch ausgeblendet werden (1H-Breitbandentkopplung). Mit dieser Methode kann die Zahl der Kohlenstofatome einer Substanz und die chemische Umgebung der einzelnen Kerne erfasst werden. Der Informationswert von 13C-NMR-Spektren wird im Vergleich zu 1H-NMRSpektren höher eingeschätzt, weil signiikant größere Unterschiede in der chemischen Verschiebung der Resonanzen autreten und sich die Auswirkungen von Substituenten auf die chemische Verschiebung ot additiv verhalten. Ohne Breitbandentkopplung sind zudem vielfache 13C/1HNah- und Fernkopplungen möglich, die zu komplexen Spektren mit größerer Aussagekrat führen. Allerdings ist die Empindlichkeit der 13C-NMR-Spektroskopie im Ver-

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3

Biosynthese pflanzlicher Sekundärstoffe

gleich zur 1H-NMR-Spektroskopie geringer, was eventuell durch Einsatz von 13C-angereicherten Vorstufen ausgeglichen werden kann.

. Abb. 3.1

! Kernaussage

Die Leistungsfähigkeit der 13C-NMR-Spektroskopie kann durch Verwendung angereicherter Vorstufen erhöht werden.

In Fütterungsexperimenten kann das Schicksal einer Vorstufe, die unmittelbar benachbarte 13C-Isotope enthält, spektroskopisch verfolgt werden, da die Resonanzen im 13C-NMR-Spektrum für jedes dieser Isotope aufspalten (magnetische Kopplung). Wird die Verbindung so metabolisiert, dass einzelne 13C/13C-Bindungen gespalten werden, dann verringert sich die Multiplizität der Resonanzsignale unter gleichzeitiger Verstärkung der Signale. So führte der Einbau von [U-13C]Pyruvat in Bakterien zu der Erkenntnis, dass C2 und C3 dieser Vorstufe die Kohlenstofatome 3 und 4 von Isopentenyldiphosphat auf dem Weg zu den Hopanoiden bilden müssen ( > Abb. 3.1a; Eisenreich et al. 2001). Allerdings können solche Messungen sehr anspruchsvoll sein, insbesondere wenn die Einbauraten niedrig sind. Beispielsweise wurde durch Einbau von [U-13C]Glucose in Mischung mit unmarkierter Glucose die Biosynthese von Gallussäure in Blättern von Rhus typhina (Essigbaum) studiert. Formal könnte sich die Gallussäure aus einem frühen Intermediat des Shikimatweges oder aus 4-Hydroxyphenylpyruvat unter Verkürzung der Seitenkette ableiten, womit das Carboxylat der Gallussäure C1 oder C3 von Pyruvat zuzuordnen wäre. Mit der ge-

4

4

3

3

a

a Einbau von 13C-markiertem Pyruvat in Hopanoide. 7 Bakterien synthetisieren Isopentenyldiphosphat (IPP) im Gleichgewicht mit Dimethylallyldiphosphat als Vorstufen 3 der Hopanoide aus Pyruvat und Glycerinaldehyd-3-phosphat. Nur C3 und C4 im IPP leiten sich aus Pyruvat ab (C2 und C3). b Relativer Einbau von 13C aus [U-13C]Glucose in das Gallussäure-Carboxyl in Rhus typhina im Vergleich zum β-Kohlenstoff von L-Phenylalanin. Der erheblich geringere Einbau in das Gallussäure-Carboxyl (2,9% gegenüber 23,4% im β-Kohlenstoff von L-Phenylalanin) zeigt, dass Gallussäure nicht aus Phenylpropanen (L-Phenylalanin, L-Tyrosin oder 4-Hydroxyphenylpyruvat) unter Verkürzung der Seitenkette entsteht, sondern aus einer früheren b Stufe des Shikimatweges abgeleitet wird

HOPANOIDE

c

Prephenat

L

3.1 Grundlegende Methoden zur Aufklärung von Biosynthesewegen

sicherten Kenntnis, dass das β-Kohlenstofatom in Phenylalanin oder Tyrosin aus C3 von Pyruvat stammt, konnten die Einbauraten in das Gallussäure-Carboxyl mit denjenigen im β-Kohlenstof von Tyrosin oder Phenylalanin aus derselben Planze verglichen werden ( > Abb. 3.1b). Dazu war es allerdings erforderlich, einige Metabolite, z. B. Tyrosin, chemisch abzubauen und den Markierungsgrad für die einzelnen Kohlenstofatome zu ermitteln. Diese „retrobiosynthetische“ Studie erlaubte den Schluss, dass sich Gallussäure nicht von Phenylpropanen (z. B. 4-Hydroxyphenylpyruvat oder Tyrosin), sondern aus einer frühen Stufe des Shikimatweges ableitet (Werner et al. 1997).

Applikationstechniken zur Aufnahme von Isotopen Zur Auklärung von Biosynthesewegen müssen die isotopenmarkierten Verbindungen in den Stokreislauf von Planzen oder Mikroorganismen eingeschleust werden. Hierfür wurde eine Reihe von Methoden entwickelt. Welche dieser Techniken zum Einsatz kommt, wird durch das vorliegende Versuchsmaterial und die zu bearbeitende experimentelle Fragestellung entschieden. Außerdem sollte bei der Auswahl darauf geachtet werden, dass das „intensive Einschleusen“ markierter Verbindungen das normale Stof wechselgeschehen des zu untersuchenden Organismus nicht übermäßig beeinträchtigt. Die folgenden Applikationstechniken sind üblich: 1. Aufnahme der markierten Verbindung über den Transpirationsstrom: a) Aufsaugen (Aufnahme der markierten Verbindungen über Wundlächen oder in natürlicher Weise über die Wurzel intakter Planzen, z. B. Keimlinge) b) Aufsprühen (Methode nur bei großen Blättern geeignet) oder in einer Matrix aubringen (im Englischen als „wick-feeding“ bezeichnet) c) Dochtverfahren (hierbei erfolgt die Aufnahme durch einen Docht, der von der Planze zur Applikationslösung führt). 2. Injektionsverfahren: Hierbei wird die Lösung des markierten Stofs (Präkursor) mit einer Spritze in das Versuchsmaterial oder den Versuchsorganismus injiziert (z. B. in den hohlen Stängel einer Planze).

3

3. Applikation gasförmiger Stofe: Zur Aufnahme gasförmiger Verbindungen (z. B. 14CO ) werden intakte Planzen oder Planzenorgane 2 in so genannte Assimilationskammern platziert. Dabei handelt es sich um ein abgeschlossenes System. 4. Aufnahme über Vakuuminiltration: Zunächst wird das Untersuchungsmaterial, wie z. B. Wurzeln, Samen oder Blätter, in der Lösung der markierten Verbindung in einem Exsikkator unter mildes Vakuum gesetzt, um die Lut aus dem Gewebe zu entfernen. Nach Evakuierung dringt die Lösung auf Grund der nachfolgenden Entspannungsphase durch Spaltöfnungen oder Wundlächen in das zu untersuchende Objekt ein. 5. Replacement-Methodik: Zur Untersuchung von planzlichen Zellkulturen oder Mikroorganismen wird dem jeweiligen Nährmedium die markierte Verbindung in Form einer Lösung zugesetzt.

Anwendung der Isotopentechnik Aufklärung eines Schrittes aus der Flavonoidbiosynthese. Anhand eines Beispiels aus der Flavonoidbiosyn-

these soll das Vorgehen zur mechanistischen Klärung eines Biosyntheseschritts näher erläutert werden. Im Jahre 1964 wurde postuliert, dass Chalkone Vorstufen von Dihydrolavonolen sein könnten, und im daraufolgenden Jahr konnte dieses Postulat durch gezielte Tracerexperimente untermauert werden (Grisebach u. Kellner 1965). Folgt man chemischen Modellreaktionen, könnten formal verschiedene Wege vom Chalkon zum Dihydrolavonol führen ( > Abb. 3.2), d. h. 1. ein Ringschluss zum Flavanon gefolgt von der 3β-Hydroxylierung, 2. die Oxidation zum Chalkonepoxid mit nachfolgender Öfnung zum Dihydrolavonol, 3. eine sequentielle Umsetzung zum Flavanon und Oxidation zum Flavon, das dann 3-hydroxyliert und anschließend reduziert wird, oder 4. das intermediär entstandene Flavon wird hydrolytisch zum Dihydrolavonol umgesetzt. Die zitierten Untersuchungen untermauerten einen Reaktionsmechanismus nach (1), durch den 3-Hydroxylavanone (Dihydrolavonole) durch stereospeziische 3β-Oxydation des J-Pyronringes (C-Ring des Flavonoids;

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3

Biosynthese pflanzlicher Sekundärstoffe

. Abb. 3.2

Schematische Möglichkeiten zur Biosynthese von Taxifolin aus Tetrahydroxychalkon. Nach Fütterung von [β-14C,β-3H]Tetrahydroxychalkonglucosid an Chamaecyparis obtusa wurde [2–14C,2–3H]Taxifolinxylosid unter Erhalt der relativen Markierung (14C:3H im Verhältnis 1:2,1) isoliert. Das Ergebnis schließt die Wege 3 und 4 aus, Weg 2 wurde später ausgeschlossen > Abb. 3.2) entstehen. Zum Beweis wurde 4,2ʹ,4ʹ,6ʹ-Tetrahydroxy-[β-3H, β-14C]chalkon-2ʹ-glucosid (Markierungsverhältnis 2,3:1) hergestellt und über die 2–3 cm langen Blattrispen an die Scheinzypresse (Chamaecyparis obtusa) gefüttert, die relativ große Mengen eines Dihydrolavonols (Taxifolin-3-xylosid syn. Dihydroquercetin-3-xylosid) produziert. In diesen Versuchen diente das 14C-Isotop lediglich als interne Bezugsgröße für den jeweiligen 3H-Gehalt. Falls das Dihydrolavonol über Weg 3 oder 4 gebildet würde, hätte das Tritium verloren gehen müssen. Nach 4tägiger Versuchsdauer unter Belichtung wurde das Blattmaterial aufgearbeitet und das Taxifolin-3-xylosid aus dem hydrophilen Anteil des Extraktes isoliert. Die Analyse zeigte ein 14C:3H-Verhältnis im Produkt von 1:2,1, was dem des eingesetzten Chalkonglucosids in etwa entsprach und den entscheidenden Hinweis für die Biosynthese über Weg 1 oder 2 gab. Welcher dieser beiden Wege beschritten wird, ließ sich aus dieser Studie noch nicht ableiten. Erst einige Jahre später konnte die direkte Hydroxylierung vom Flavanon zum Dihydrolavonol in Blüten eines deinierten Genotyps von Matthiola incana (Levkoje) bestätigt werden ( > Abschn. 3.1.2). Der qualitative Nachweis der Markierung in einem Endprodukt nach Fütterung eines markierten Präkursors beweist allein nicht, dass der Präkursor die unmittelbare Vorstufe darstellt. Es ist möglich, dass die Vorstufe zunächst metabolisiert wird und die Markierung mittelbar in das Endprodukt gelangt. Das Ausmaß der Metabolisierung kann stark von der Art des Präkursors abhängen und

auch hier eine genaue Analyse der Isotopenzusammensetzung des Produkts nach chemischem Abbau erforderlich machen. Pulsmarkierungen mit 14CO2. Zur Auklärung von Bio-

synthesesequenzen können kinetische Untersuchungen erforderlich sein, in denen der autoradiographische Nachweis von markierten Produkten über verschieden lange Zeiträume geführt wird. Ein eindrucksvolles Beispiel lieferten die Untersuchungen, die M. Calvin ab 1945 zum Einbau von CO2 in Kohlenhydrate im Verlauf der Dunkelreaktion der Photosynthese durchführte. Eine Suspension der Grünalge Chlorella, die in einfacher Weise dauerhat in Kultur gehalten werden kann, wurde mit 14CO2 begast, das mittels Phosphorsäure aus Ba14CO3 freigesetzt werden kann. Danach wurde die Suspension kurzfristig belichtet, die Algen zu verschiedenen Zeitpunkten durch Zugabe von Ethanol abgetötet und die radioaktiv markierten Produkte durch zweidimensionale Papierchromatographie aufgetrennt. Die Ergebnisse der autoradiographischen Auswertung mit Hilfe von Photoilmen waren zunächst verwirrend, da bereits nach 60-sekündiger Bestrahlung zahlreiche markierte Verbindungen nachzuweisen, aber kaum zuzuordnen waren. Schließlich führte die verkürzte Bestrahlung zum Erfolg, da nach 5 Sekunden nur ein Produkt nachgewiesen und als 3-Phosphoglycerat identiiziert werden konnte. Es wurde zunächst vermutet, dass es sich dabei um das erste Produkt der CO2-Fixierung in den Algen handelt und ein Akzeptormolekül aus zwei C-Atomen

3.1 Grundlegende Methoden zur Aufklärung von Biosynthesewegen

3

. Abb. 3.3

Fixierung von 14CO2 im reduktiven Pentosephosphatzyklus (Calvin-Zyklus). Die Markierung aus 14CO2 wurde im 3-Phosphoglycerat nachgewiesen

beteiligt ist. Diese Annahme war – wie wir heute wissen – falsch, da die Reaktionsfolge viel komplexer ist und das 3-Phosphoglycerat erst nach hydrolytischer Spaltung einer intermediären C6-Verbindung aus der Fixierung von CO2 an Ribulose-1,5-bisphosphat durch die Ribulosebisphosphat-Carboxylase/Oxygenase entsteht ( > Abb. 3.3). In weiteren kinetischen Studien wurden schließlich alle Zwischenprodukte der Photoassimilation (reduktiver Pentosephosphatzyklus) identiiziert. Die Anordnung der Versuche hatte Modellcharakter und wurde auch zur Auklärung zahlreicher Biosynthesewege des Sekundärstofwechsels in Planzen eingesetzt. So konnte in Mentha × piperita die Bildung des Menthols aus 14CO2 über die Zwischenstufen Piperiton und Menthon nachgewiesen werden.

3.1.2 Enzymatische Methoden Eine weitere Möglichkeit zur Untersuchung von Biosynthesewegen eröfnet sich mit In-vitro-Studien der beteiligten Enzyme, die angereichert und kinetisch analysiert werden können. Allerdings muss zu Beginn solcher Arbeiten der Verlauf der zu untersuchenden Biosynthesesequenz wenigstens annähernd bekannt sein. Hierfür eignen sich die unter Abschnitt 3.1.1 beschriebenen Vorstufenexperimente. Für die In-vitro-Untersuchungen einzelner Enzyme müssen zunächst einige Voraussetzungen erfüllt sein: 1. Das natürliche Substrat für die enzymatische Reaktion sollte in ausreichender Menge vorhanden sein; die Parameter für die Auswertung müssen festgelegt werden (z. B. photometrisch, chromatographisch oder autoradiographisch). 2. Die zu untersuchende Umsetzung sollte tatsächlich enzymatisch verlaufen. Dies kann durch einen einfachen Vortest geprüt werden, z. B. in Form einer

„Kochprobe“ (Denaturierung des Proteins durch Erwärmung auf 95 °C für 5 min). Danach sollte keine Enzymaktivität mehr nachzuweisen sein. 3. Das Ausgangsmaterial, aus dem das jeweilige Enzym angereichert werden soll, muss in ausreichender Menge zur Verfügung stehen. In vielen Fällen ist es gelungen, Biosyntheseabläufe durch Anreicherung und Charakterisierung der beteiligten Enzyme zu beschreiben und letztlich auch mechanistisch aufzuklären.

Anreicherung von Enzymen aus Pflanzenorganen Die Vorgehensweise lässt sich am Beispiel der bereits zitierten Hydroxylierung von Flavanonen zu Dihydrolavonolen ( > unter „Anwendung der Isotopentechnik“) erläutern. Obwohl die durch Einbau von Isotopen nachgewiesene Hydroxylierung des Flavanons zum Dihydrolavonol mit Hilfe permeabilisierter Zellkulturen von Haplopappus gracilis 1975 bestätigt werden konnte, war der enzymatische Ablauf bis Ende der 1970er-Jahre noch nicht verstanden. Dies gelang erst 1980 im Rahmen der Untersuchungen zur Biosynthese von Anthocyanen mit einer weißblühenden Mutante von Matthiola incana. Zellfreie Extrakte der Petalen katalysierten die gewünschte Hydroxylierung ( > Abb. 3.4) in Abhängigkeit von 2-Oxoglutarat, O2, Fe2+ und Ascorbat. Diese Kofaktorabhängigkeit ist charakteristisch für eine Klasse von Dioxygenasen. Kurz darauf wurde die Hydroxylierung auch mit Extrakten aus PetersilieZellkulturen beschrieben und das beteiligte Enzym als Flavanon 3β-Hydroxylase („FHT“) vorläuig charakterisiert (Britsch et al. 1981). Schließlich wurde das Enzym aus Kronblättern einer rotblütigen Mutante von Petunia hybrida gereinigt. Die Wahl des Ausgangsgewebes, das die

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3

Biosynthese pflanzlicher Sekundärstoffe

. Abb. 3.4

Hydroxylierung von 2S-Flavanonen zu 2R,3R-Dihydroflavonolen durch die Flavanon 3β-Hydroxylase (FHT). Das Enzym wurde aus Blüten der Petunie gereinigt und katalysiert in vitro stereospezifisch die Hydroxylierung in Gegenwart von molekularem Sauerstoff, zweiwertigem Eisen, Ascorbat und 2-Oxoglutarat

höchste speziische Enzymaktivität zeigte, war entscheidend, weil das Enzym in rohen Extrakten äußerst labil gegenüber Oxidation und proteolytischem Abbau war. Trotz dieser Schwierigkeiten konnte die FHT aus 2,7 kg Blütengewebe über sieben Stufen zur apparenten Homogenität gereinigt werden, allerdings mit geringer Ausbeute von nur wenigen 100 µg. Diese Menge genügte jedoch zur Bestimmung der kinetischen Parameter für die Umwandlung von Flavanonen zu Dihydrolavonolen und zur Ermittlung von Partialsequenzen des Polypeptids für die nachfolgende cDNS-Klonierung. Die Klonierung erlaubte schließlich die funktionale Expression von größeren Mengen des rekombinanten Enzyms in E. coli, das zudem in einer optimierten Reinigungsprozedur rasch zu reinigen war (Lukačin et al. 2000). Die Reinigung der FHT aus Petunienblüten bildet eines der wenigen Beispiele für die Isolierung eines Sekundärstofwechselenzyms aus diferenziertem planzlichen Gewebe. Dies ist aus verschiedenen Gründen ot kaum möglich, z. B. weil die Enzyme in sehr geringer Konzentration bzw. abhängig vom Entwicklungszustand der Zellen exprimiert oder während der Isolierung durch endogene Begleitstofe wie Phenole, Tannine usw. gehemmt und inaktiviert werden. In vielen Fällen haben sich deshalb Zellsuspensionskulturen der betrefenden Planzen für enzymatische Untersuchungen bewährt. Solche Zellkulturen können aus verwundetem planzlichen Gewebe über Kalluskulturen auf Agar-Nährböden und unter Zusatz von Hormonen entwickelt werden ( > unten). Die Zellen in Zellsuspensionskulturen repräsentieren ein junges Wachstumsstadium, da z. B. unter Belichtung die Biosynthese von Flavonoiden induziert werden kann, wie dies auch in einem sehr frühen Entwicklungsstadium in der Planze (z. B. beginnende Entfaltung von Blattknospen) beobachtet wird. Es ist aber auch möglich, dass Zellkultu-

ren nicht die gewünschten Sekundärmetabolite produzieren. In solchen Fällen gelingt es gelegentlich, die Synthese durch Zugabe bestimmter Stofe (Sucrose, Hefeextrakt, Zellwandbestandteilen von Pilzen, Schwermetalle, Methyljasmonat u. a.) zu induzieren.

Anreicherung aus pflanzlichen Zellsuspensionskulturen Die besondere Bedeutung planzlicher Zellkulturen für enzymatische Untersuchungen lässt sich am Beispiel der Flavonsynthase erläutern. Flavone zeichnen sich innerhalb der Flavonoide durch den Oxidationszustand des C-Ringes (J-Pyron) aus und sind Hauptinhaltsstofe in Planzen der Apiaceen. In Rohextrakten aus sehr jungen Keimlingen der Petersilie wurde bereits 1975 eine Aktivität beobachtet, die Naringenin (Flavanon) zu Apigenin (Flavon) umsetzt und molekularen Sauerstof sowie Eisensalze erforderte. Später wurde das beteiligte Enzym als 2-Oxoglutarat-abhängige Dioxygenase erkannt und als Flavonsynthase I („FNS I“) bezeichnet ( > Abb. 3.5). Die Reinigung dieses Enzyms aus Keimlingen war wegen der inherenten Labilität und der geringen Mengen aussichtslos. Später stellte sich aber heraus, dass lichtinduzierte Zellsuspensionskulturen wesentlich besser für diesen Zweck geeignet sind. Aus 2,3 kg lichtinduzierten Petersilienzellen konnten schließlich 450 µg der FNS I gereinigt und das Enzym biochemisch charakterisiert werden (Lukačin et al. 2001).

! Kernaussage

Multienzymkomplexe erschweren die Anreicherung von Enzymen.

3.1 Grundlegende Methoden zur Aufklärung von Biosynthesewegen

3

. Abb. 3.5

Oxidation von Flavanonen zu Flavonen durch die Flavonsynthase I (FNS I). Das Enzym, das aus belichteten Zellsuspensionskulturen der Petersilie gereinigt und als lösliche 2-Oxoglutarat-abhängige Dioxygenase klassifiziert wurde, ist bisher nur in Arten der Apiaceae nachgewiesen worden

Die zitierten Enzyme aus dem Flavonoid-Stofwechsel (FHT, FNS I), katalysieren einzelne Schritte in einer Biosynthesesequenz und können individuell in vitro studiert werden. Dies gilt nicht generell für alle Biosynthesesequenzen, die beispielsweise auch in Multienzymkomplexen oder an Membranen ablaufen und experimentell unzugänglich sein können ( > Abb. 3.6). Multienzymkom-

plexe stellen funktionelle Einheiten dar, deren Einzelenzyme sich nach Ablösung aus einem Verband in ihren katalytischen Eigenschaten deutlich ändern könnten. Ein bekanntes Beispiel dafür ist die Fettsäurensynthase, die aus verschiedenen Einzelenzymen und einem Acyl-CarrierProtein aufgebaut ist und an der sämtliche Teilreaktionen der Fettsäurenbiosynthese ablaufen ( > Abb. 3.6). Auch

. Abb. 3.6

Mögliche Anordnungen von Enzymen einer mehrstufigen Biosynthese in der Zelle. Die Enzyme können als lösliche Einzelenzyme im Zytoplasma aktiv oder als Multienzymkomplexe im Zytoplasma bzw. entlang einer Membran angeordnet sein. Ein Vorteil von Multienzymkomplexen liegt darin, dass die Biosynthesesequenz vom Ausgangssubstrat bis zum Endprodukt ohne Dissoziation oder Verlust von Zwischenprodukten (ZP) abläuft. Dies ermöglicht eine effiziente Biosynthese auch bei geringer Substratkonzentration

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3

Biosynthese pflanzlicher Sekundärstoffe

. Abb. 3.7

Umsetzung von L-Phenylalanin zu 4-Cumaroyl-CoA im generellen Phenylpropanstoffwechsel. Es wird angenommen, dass die Enzyme (Phenylalanin-Ammoniak-Lyase, „PAL“; Zimtsäure 4-Hydroxylase, „C4H“ zusammen mit NADPH-Cytochrom P450-Oxidoreduktase, „CPR“, und eventuell 4-Cumarat:CoA-Ligase, „4CL“) in einem Enzymkomplex assoziiert vorliegen, der am endoplasmatischen Retikulum lokalisiert sein muss. In dieser Anordnung würde 4-Cumarsäure bzw. 4-CumaroylCoA auch bei geringen Konzentrationen von L-Phenylalanin entstehen

die Biosynthese der Flavonoide soll nach Modellvorstellungen an einem im Zytoplasma lokalisierten Multienzymkomplex verlaufen, der allerdings nur relativ lose assoziiert sein kann. Erste experimentelle Hinweise deuten auf diesen Sachverhalt hin, aber eine genaue Klärung steht noch aus. Die Aggregation funktionell zusammengehöriger Enzyme zu großen Komplexen in der lebenden Zelle (in situ) ist vergleichbar mit der Ausbildung eines Mikrokompartiments, durch das ein vom übrigen Zytoplasma abgeschlossener Reaktionsraum entsteht, der die eiziente Umsetzung von Substraten und Intermediaten bis zum Endprodukt gewährleistet. Die Zwischenprodukte entstehen analog einem Fließbandprinzip, das auch „channeling“ genannt wird, und es müssen keine Mindestkonzentrationen der jeweiligen Intermediate vorliegen, um durch Difusion die Enzym-Substrat-Bindung in zeitlich vertretbarer Abfolge zu sichern. Folgt man diesem Prinzip, so reicht bereits ein Substratmolekül pro Teilenzym aus, um die Reaktionsfolge in Gang zu halten. Nach diesem Prinzip würde in der Zelle äußerst efektiv gearbeitet, da kein Zwischenprodukt verloren geht und selbst bei geringen Substratkonzentrationen große Mengen an Endprodukten gebildet werden können. Ein Beispiel liefert die enge Assoziation von Einzelenzymen des generellen Phenylpropanweges, der von l-Phenylalanin über trans-Zimtsäure zu 4-Cumaroyl-CoA führt ( > Abb. 3.7). Experimentelle Evidenzen sprechen für einen an der Membran des endoplasmatischen Retikulums lokalisierten Komplex der löslichen Phenylalanin-Ammoniak-Lyase, der membrangebundenen Zimtsäure 4-Hydroxylase und eventuell der löslichen 4-Cumarat:CoA-Ligase. Genauere Untersuchungen zu

diesem Phänomen des „channeling“ liegen jedoch auch hier nicht vor. Infobox Zellsuspensionskulturen höherer Pflanzen. Seit die Technik zur Suspensionskultur von Pflanzenzellen entwickelt wurde (vor etwa 50 Jahren) wird versucht, die beliebige Vermehrung und die spezifischen Stoffwechselleistungen der Zellen zu nutzen. Kultivierte Pflanzenzellen produzieren im Vergleich zur differenzierten Pflanze allerdings häufig weniger oder in der Zusammensetzung modifizierte Sekundärmetabolite. Die Gründe sind nicht immer offensichtlich. Obwohl jede Zelle die volle Erbinformation zur Biosynthese der ihr eigenen Sekundärstoffe trägt, könnten die Kulturbedingungen zur Repression einzelner Synthesegene führen. Außerdem ist es möglich, dass die Syntheseleistung einer Zellkultur nach Jahren der Kultivierung nachlässt. Nur im günstigen Falle läuft die Biosynthese von Sekundärmetaboliten in der Zellkultur mit ähnlicher oder gleicher Effizienz ab wie in der differenzierten Ursprungspflanze. Diese Bedingungen erlauben schließlich die Charakterisierung von Enzymen aus relevanten Biosynthesewegen. Nur in wenigen Fällen akkumulieren die Zellkulturen größere Mengen an Sekundärmetaboliten als die differenzierte Pflanze, wie beispielsweise Lithospermum erythrorhizon das Shikonin, Panax ginseng die Ginsenoside oder Thalictrum minor das Berberin. Außerdem bieten sich Zellkulturen besonders dann zur Nutzung an, wenn die Pflanze sehr langsam wächst oder selten und in ihrem Bestand gefährdet ist (wie Lithospermum erythrorhi-

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3.1 Grundlegende Methoden zur Aufklärung von Biosynthesewegen

3

3.1.3 Genetische Methoden zon). Pflanzenzellen werden aber nicht nur zur Produktion von bekannten Naturstoffen eingesetzt, sondern auch zur klonalen Massenvermehrung oder Züchtung wichtiger Nutzpflanzen. Darüber hinaus werden sie inzwischen auch in transformierter Form zur biotechnologischen Gewinnung von Antikörpern oder anderen nützlichen Proteinen verwendet.

Unter den „genetischen Methoden“, die zur Auklärung von Biosynthesewegen angewendet werden, versteht man vornehmlich die Mutantentechnik, die besonders bei der Untersuchung von Stofwechselleistungen in Mikroorganismen eine bedeutende Rolle spielt.

Mutantentechnik Anlage einer Pflanzenzellkultur Werden Zellen eukaryotischer Vielzeller in künstlichen Medien kultiviert, dann spricht man von einer Zellkultur. Vergleichbar der tierischen Zellkultur können auch Zellen aus planzlichen Gewebeverbänden isoliert in speziellen Gefäßen propagiert werden. Man beginnt üblicherweise mit auf Agar explantierten Organstücken, wie z. B. Wurzelspitzen, Knospen, Blatt- und Markstückchen, Stängelscheibchen oder keimende Samen, die an den Wundlächen Wucherungen entdiferenzierter Zellen als so genannte Kalli (lat.: callus [Schwarte, Schwiele]) bilden. Die Kallusbildung erfordert in den meisten Fällen zusätzlich die Anwesenheit von Phytohormonen (Auxine, Cytokinine oder Gibberelline). Die Einzelzellen erhält man aus dem Kallus durch mechanisches Schütteln der Gewebekomplexe oder durch enzymatischen Abbau der Zellwände in einem isoosmotischen Medium. Es entsteht dann eine so genannte Protoplastenkultur, wobei eine solche Kultur die Zellwände wieder regenerieren kann. Kalli zerfallen meist nicht zu Einzelzellen, sondern zu kleinen Zellverbänden oder Zellklumpen, die zur Propagierung besser geeignet sind. Da planzliche Zellkulturen in ihren Ansprüchen eher heterotrophen Organismen gleichen, kann ihre Vermehrung oder Kultivierung nur durch Zuführung von geeigneten Nährstofen erfolgen. Die hierfür gebräuchlichen Medien müssen neben bestimmten Mineralien und Vitaminen eine geeignete Kohlenstofquelle, z. B. Saccharose, enthalten. Sowohl das Kallusgewebe als auch die Planzenzellkultur lassen sich beliebig lange weiterzüchten, sofern sie, oder Teile davon, in gewissen Zeitintervallen („Kallus“ jede 4 Wochen, „Zellen“ etwa alle 5–7 Tage) auf frisches Nährmedium überimpt werden (Dauerzelllinien).

Wildstämme von Mikroorganismen, z. B. Escherichia coli oder Saccharomyces cerevisiae, benötigen zum Wachstum lediglich ein gepufertes Mineralsalzmedium, das außer einer einfachen Energie- und Kohlenstofquelle (Glucose) keine weiteren organischen Verbindungen enthalten muss. Das resultiert aus der umfassenden Ausstattung zur Eigensynthese aller erforderlichen organischen Moleküle. Verliert nun ein solcher Organismus aufgrund einer Mutation die Fähigkeit zur Synthese eines essentiellen Zellbausteins (Aminosäure oder Vitamin), so ist er normalerweise nicht mehr vermehrungsfähig, es sei denn, der fehlende Baustein wäre im Nährmedium vorhanden. Diesen als Defektoder Mangelmutanten bzw. auch als „auxotrophe“ Mutanten (abgeleitet von griech.: auxé [Vergrößerung bzw. Zuwachs] und trophein [ernähren]) bezeichneten Mikroorganismen fehlt ein erforderliches Enzym, weil es entweder nicht mehr oder in inaktiver Form synthetisiert wird (Gendefekt). In beiden Fällen entstehen so genannte Blockmutanten. Je nach Lage des genetischen Blocks, wachsen Mangelmutanten nicht nur bei Supplementation mit dem Endprodukt der unterbrochenen Biosynthesekette, sondern auch mit Zwischenprodukten, die direkt hinter der Unterbrechung liegen ( > Abb. 3.8). In der Regel sind die Zwischenprodukte nicht bekannt. Auxotrophe Mutanten reichern aber die nicht mehr weiter verarbeiteten Intermediate an, und die genaue Analyse der Produktzusammensetzung im Medium erlaubt Rückschlüsse auf die Stofwechselleistung des betrefenden Organismus. Darüber hinaus lässt sich mit Hilfe der Supplementation die Lage des genetischen Blocks erkennen. In einigen Fällen ermöglicht das im Nährmedium akkumulierende Zwischenprodukt anderen Mangelmutanten, die ihren genetischen Block an einer früheren Stelle in der gleichen Biosynthesesequenz haben, das Wachstum. Hier spricht man von der so genannten „Kreuzfütterung“ ( > Abb. 3.9). Wesentlich komplexer wird es, wenn sich der genetische Block innerhalb einer verzweigten Biosynthesekette bein-

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Biosynthese pflanzlicher Sekundärstoffe

. Abb. 3.8

Schematische Auswirkung einer auxotrophen Mutation im Gen 3 eines beliebigen linearen Biosyntheseweges. Enzym 3 wird nicht mehr synthetisiert, das Zwischenprodukt C kann nicht zu D umgesetzt werden und akkumuliert im Nährmedium. Bei Zugabe von Metabolit D oder E ins Nährmedium (Supplementation) wird das Endprodukt wieder gebildet. Damit muss C die Vorstufe von D und E sein. Die Interpretation stützt sich auf die „Ein-Gen-Ein-Enzym“-Hypothese nach Beadle, Tatum und Horowitz, wonach jedes Gen nur die Synthese einer einzigen Art von Enzymen kontrolliert, und bezieht sich nur auf die primäre Wirkung von Genen (dennoch kann die Mutation Auswirkungen auf mehrere phänotypische Merkmale des Organismus haben; andererseits kann das Gen auch nur einen Teil eines Enzyms, eine Untereinheit, codieren) . Abb. 3.9

Schematische Auswirkung einer „Kreuzfütterung“. Die Mutanten 1 und 2 sind nicht in der Lage, aus dem Substrat A das Endprodukt D zu bilden. Der Gendefekt in Mutante 1 kann aber durch Komplementation des fehlenden Zwischenproduktes C aus Mutante 2 ausgeglichen werden. Die Analyse weiterer Blockmutanten kann zur Aufklärung der gesamten Biosynthesesequenz führen

3.1 Grundlegende Methoden zur Aufklärung von Biosynthesewegen

. Abb. 3.10

Polyauxotrophie bei Block innerhalb einer verzweigten Biosynthesekette. Wenn die Bildung von Homoserin unterbleibt, entsteht ein Bedürfnis für die Aminosäuren Threonin und Methionin, und das Wachstum der doppelt betroffenen Mutante bleibt aus

det und die auxotrophen Mutanten mehrere organische Stofe zum Wachstum benötigen (Polyauxotrophie) ( > Abb. 3.10). Auch können sich die Defekte von Mangelmutanten auf die Synthese anderer essentieller Kofaktoren der jeweiligen zu untersuchenden Biosynthese beziehen, sodass aus einer fehlenden Syntheseleistung nicht unmittelbar auf das geblockte Gen geschlossen werden kann. So läut die Flavonoidbiosynthese der Planzen nur in Anwesenheit von 2-Oxoglutarat ab. Folglich würden in Abwesenheit des Kosubstrats keine Flavonoide gebildet werden und die Synthese der Naturstofe erscheint blockiert. Ähnliches gilt, wenn regulatorische Gene von einem Defekt betrofen sind.

Idiotrophe Mutanten Im Gegensatz zu den auxotrophen Mutanten, die einen Mangel im Primärstofwechsel kennzeichnen, spricht

3

man von idiotrophen Mutanten (griech.: idios [selbst, eigen]), wenn sich die Organismen bezüglich ihrer Nährstofansprüche zwar unverändert zeigen, aber die Synthese eines Sekundärmetaboliten, infolge fehlender Enzymaktivitäten, unterbrochen ist. Mit den oben geschilderten Methoden (Supplementierung und Kreuzfütterung) und angemessener Analyse lassen sich auch hier die einzelnen Schritte einer Biosynthesesequenz identiizieren. Allerdings ist dafür in vielen Fällen ein hoher zeitlicher und experimenteller Aufwand erforderlich. Die Analyse von Mutanten hat primär Bedeutung im Bereich der Mikroorganismen erlangt, weil hier die Mutanten leichter zugänglich sind. Dennoch gibt es auch einige Beispiele aus dem planzlichen Sekundärstofwechsel, die sich hauptsächlich aus der züchterischen Farbselektion von Blütenplanzen ergeben haben. So haben idiotrophe Blockmutanten in der Vergangenheit u. a. wichtige Dienste bei der Auklärung der Anthocyanidin-Biosynthese geleistet. Beispielsweise konnte auf diesem Weg gezeigt werden, dass Leukoanthocyanidine (Flavan-3,4-diole) Zwischenprodukte der Anthocyanbildung in Blüten von Matthiola incana sind (Heller et al. 1985). Dazu wurden farblose Blüten einer genetisch deinierten Linie von Matthiola incana (Linie 17) mit verschiedenen möglichen Vorstufen der Anthocyanidine supplementiert, wobei nur die Zugabe von Leukoanthocyanidinen zur Pigmentierung der Blüten führte. Aus zuvor durchgeführten Tracerexperimenten und dem Erscheinungsbild der Blütenfarbe wurde geschlossen, dass die Linie 17 eine Blockmutante ist, bei der die enzymatische Reduktion der Dihydrolavonole zu den entsprechenden Flavan-3,4-diolen unterbleibt ( > Abb. 3.11).

. Abb. 3.11

Matthiola incana

cis cis

Supplementation von 3,4-cis-Leukoanthocyanidinen als Vorstufen von Anthocyanidinen. Anthocyanidine leiten sich von 2R,3R-Dihydroflavonolen ab. Die Fütterung von 2R,3R-Dihydroflavonolen an Blüten der weißblütigen Matthiola incana-Mutante, Linie 17, führte nicht zur Pigmentierung, wohingegen die Fütterung von 3,4-cis-Leukoanthocyanidinen die Blüten rot färbte. Daraus folgt, dass 2R,3R-Dihydroflavonole Vorstufen der 3,4-cis-Leukoanthocyanidine sind

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Biosynthese pflanzlicher Sekundärstoffe

Kombination von Mutantentechnik und Kreuzungsexperiment Schließlich lassen sich Biosynthesewege noch durch ein anderes Verfahren auklären. Hierbei erzeugt man künstlich Mutanten von höheren Planzen, die in der Biosynthese eines Sekundärstofes blockiert sind. In einigen wenigen

! Kernaussagen

Die Aufklärung von Biosynthesen pflanzlicher oder mikrobieller Sekundärstoffe ist ein wesentlicher Teilbereich der Pharmazeutischen Biologie. Zur Identifizierung der einzelnen Syntheseschritte werden verschiedene Techniken angewendet: 1. Isotopentechnik: Grundlage ist die Markierung von Metaboliten durch Einbau von Vorstufen, die mit radioaktiven oder stabilen Isotopen markiert sind. Der Verbleib der markierten Atome in den Stoffwechselprodukten eines Organismus wird mit unterschiedlichen Methoden, wie Autoradiographie, NMR- oder Massenspektrometrie, verfolgt. 2. Methoden der Enzymologie: Enzymatische Untersuchungen finden vor allem dann Anwendung, wenn aus Vorversuchen (Isotopentechnik) der Ablauf einer Biosynthese prinzipiell bekannt ist. Ohne Kenntnis der Biosyntheseschritte ist die Verwendung dieser Methode nicht zu empfehlen. Die entsprechenden Enzyme werden üblicherweise chro-

Fällen lassen sich dann durch Analyse des Produktmusters solcher Mutanten im Vergleich zu dem des Wildtyps und in Kombination mit Kreuzungsexperimenten gezielte Rückschlüsse auf Biosyntheseschritte ziehen. So konnte beispielsweise ermittelt werden, dass Codein in PapaverArten nicht durch Methylierung aus Morphin entsteht, sondern durch Demethylierung aus hebain.

matographisch aufgereinigt und biochemisch charakterisiert. 3. Methoden der Genetik: Erforderlich ist der Rückgriff auf Mutanten. Diese werden entweder isoliert oder selbst künstlich erzeugt. Die durch Mutationen veränderte Merkmalsausprägung wird dann zur Identifizierung einzelner Biosyntheseschritte herangezogen. Die drei hier vorgestellten Techniken können aber nicht jede für sich isoliert betrachtet werden. Nur die Kombination führt letztlich zur Identifizierung eines Biosyntheseweges und der daran beteiligten Enzyme. Die Mengen der einzelnen Enzyme, die an der Biosynthese von Sekundärmetaboliten im pflanzlichen Gewebe beteiligt sind, sind in der Regel gering. Die Isolierung der entsprechenden Gene und ihre Expression in heterologen Systemen (z. B. in Bakterien oder Hefen) ermöglichen aber die präparative Gewinnung. Die rekombinanten Enzyme können so zur Produktion pharmazeutisch relevanter Sekundärprodukte eingesetzt werden.

Literatur

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Schlüsselbegriffe Atomkern Applikation von Isotopen Auxotrophie Becquerel Biochemische Enzymcharakterisierung Biochemische Forschung Biologische Halbwertszeit Biosynthese von Sekundärstoffen Calvin-Zyklus Channeling Curie Dauerzelllinien Endoplasmatisches Retikulum Enzymatische Methoden Enzymmechanismus Fettsäuresynthasekomplex Flavonoidbiosynthese Fragmentierung

Genetische Methoden Genetischer Block Gewebeverband Idiotrophie Intermediärstoffwechsel Isotopen Kallus Kernladung Kohlenstoffquelle Kreuzungsexperimente Massenspektrometrie Molekülion Multienzymkomplexe Mutantentechnik Nährmedium Neutronen NMR-Spektroskopie Phenylpropanstoffwechsel

Literatur Britsch L, Heller W, Grisebach H (1981) Conversion of flavanone to flavone, dihydroflavonol and flavonol with enzyme system from cell cultures of parsley. Z Naturforsch 36c: 742–750 Carle R (1996) Kamillenöl Gewinnung und Qualitätsbeurteilung. Deutsche Apotheker Zeitung 136: 2165–2176 Eisenreich W, Rohdich F, Bacher A (2001) Deoxyxylulose phosphate pathway to terpenoids. Trends Plant Science 6: 78–84 Grisebach H, Kellner S (1965) Untersuchungen zum Mechanismus der Umwandlung von 4,2’,4’,6’-Tetrahydroxychalkon in Taxifolin in Chamaecyparis obtusa. Z Naturforsch 20b: 446–450 Heller W, Britsch L, Forkmann G, Grisebach H (1985) Leucoanthocyanidins as intermediates in anthocyanidin biodynthesis in flowers of Matthiola incana R Br Planta 163: 191–196

3-Phosphoglycerat Physikalische Halbwertszeit Phytohormone Präkursor Proteinreinigung Protonen Protoplastenkultur Pulsmarkierung Radioaktivität Retrobiosynthetisch Rubisco Stabile Isotopen α-, β-, γ-Strahlung Supplementation Tracertechnik Wildstamm Zellkulturen Zwischenprodukt

Lukačin R, Gröning I, Schiltz E, Britsch L, Matern U (2000) Purification of recombinant flavanone 3β-hydroxylase from Petunia hybrida and assignment of the primary site of proteolytic degradation. Arch Biochem Biophys 375: 364–370 Lukačin R, Matern U, Junghanns KT, Heskamp M-L, Britsch L, Forkmann G, Martens S (2001) Purification and antigenicity of flavone synthase I from irradiated parsley cells. Arch Biochem Biophys 393: 177–183 Ueki M, Okano M (1999) Analysis of exogenous dehydroepiandrosterone excretion in urine by gas chromatography/combustion/isotope ratio mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom 13: 2237–2243 Werner I, Bacher A, Eisenreich W (1997) Retrobiosynthetic NMR Studies with 13C-Labeled Glucose. Formation of gallic acid in plants and fungi. J Biol Chem 272: 25474–25482

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4 4 Postbiosynthetische Umsetzungen und Akkumulation von sekundären Pflanzenstoffen R. Hänsel 4.1

Änderungen im Sekundärstofgehalt während der Ontogenese . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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4.2

Diurnale Schwankungen, Fließgleichgewicht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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4.3

Oxidative Veränderungen an sekundären Planzenstofen . . . . . . . . 4.3.1 An katabolischen Reaktionen beteiligte Enzyme . . . . . . . . . . . 4.3.2 Abbau phenolischer Planzenstofe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.3 Oxidative Modiikation der Quassinoide . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.4 Oxidative Modiikation der Limonoide . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.5 Phytoecdysone: Oxidative Modiikationen in der Cholesterinreihe

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4.4

Sekretion und Speicherung von Sekundärstofen . . . . . . . . . . 4.4.1 Gewebe- und segmentspeziische Akkumulation . . . . . . . 4.4.2 Speicherung in Kompartimenten innerhalb der Zelle . . . . 4.4.3 Vacuole als Speicherkompartiment . . . . . . . . . . . . . . . 4.4.4 Transportvorgänge an Tonoplasten . . . . . . . . . . . . . . . 4.4.5 Sekretion in Zellwand und periplasmatischem Raum . . . . 4.4.6 Innergewebliche Sekret- und Akkumulationsstrukturen . . 4.4.7 Exotrope Sekretion und deren morphologische Strukturen .

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Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109

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4

Postbiosynthetische Umsetzungen und Akkumulation von sekundären Pflanzenstoffen

> Einleitung Im vorangegangenen Kapitel wurde der Aufbau sekundärer Pflanzenstoffe geschildert. Von der chemischen Synthese unterscheidet sich die Biosynthese dahingehend, dass das biosynthetisierte Produkt kein statisches Produkt ist, sondern Teilnehmer am Gesamtstoffwechsel der Pflanze bleibt und ständig ab- und wieder neu aufgebaut wird, d. h. es befindet sich in einem dynamischen Gleichgewicht. Wenn der Chemiker ein Pflanzenorgan erntet, trocknet und analysiert, dann gibt das Analysenergebnis einen eingefrorenen Momentanzustand wieder. Das Analysenergebnis hängt davon ab, in welchem Entwicklungsstadium sich das Organ befindet, ja selbst davon, zu welcher Tageszeit „die Analysenprobe“ entnommen wurde. Auf diese Phänomene der ontogenetischen Variabilität und der diurnalen Wirkstoffschwankungen wird im Abschnitt 4.1 eingegangen. Der Abbau, dem sekundäre Pflanzenstoffe unterliegen, stellt chemisch gesehen eine wohlgeordnete „Verbrennung“ dar. Die Pflanzenstoffe werden enzymatisch mit immer mehr Sauerstoffunktionen beladen, um schließlich als CO2 ausgeschieden zu werden, es sei denn, dass sie zuvor in den Stoffwechsel neu eingeschleust werden. Informationen über Enzyme der Oxidation und Beispiele für oxidativ veränderter Sekundärstoffe bringen die Abschnitte 4.2 und 4.3. Sekundäre Pflanzenstoffe verteilen sich keineswegs gleichmäßig über alle Zellen, Gewebe und Organe einer Pflanze, vielmehr werden sie in höchst unterschiedlichen Strukturen gespeichert. Über die unterschiedlichen Akkumulationsmöglichkeiten sekundärer Pflanzenstoffe informiert Abschnitt 4.4.

4.1 Änderungen im Sekundärstoffgehalt während der Ontogenese Ontogenese ist ein Terminus, der sich auf die Entwicklung der Einzelindividuen bezieht. Samenkeimung und Blütenbildung sind die kardinalen Einschnitte bei den Angiospermen. Die Tatsache, dass sich das Inhaltsstofspektrum von Blatt, Spross, Wurzel und Rhizom im Verlauf einer Vegetationsperiode ändert, ist ein deutlicher Hinweis auf den dynamischen Stofwechsel (Aubau, Speicherung, Mobilisierung, Abbau) von Sekundärstofen. Die stoli-

chen Änderungen äußern sich in ot großen Schwankungen in Gehalten an Inhaltsstofen, vor allem im Stadium der Seneszenz und bei Früchten im Verlaufe der Fruchtreifung. Einige Beispiele für Änderungen im Wirkstoffgehalt.

Der Gehalt an Primulaverin, dem Xyloglucosid des Gentisinsäuremethylesters, sinkt in der Primula-elatior-Wurzel von 1,6% im März auf 0,2% im Juni. Analoge Gehaltsschwankungen, die innerhalb einer ganzen Zehnerpotenz liegen, zeigen die Phenolglykoside in Salix purpurea. Der Alkaloidgehalt in Catharanthus roseus ist 3 Wochen nach dem Auskeimen der Planzen am höchsten, er beginnt nach diesem Zeitpunkt auf nahezu Null abzusinken und erreicht nach weiteren 8 Wochen erneut einen Maximalwert (Barz u. Köster 1981). Bei den Tropanalkaloide-führenden Arten der Nachtschattengewächse (Solanaceae [IIB24A]) wurden übereinstimmend Verschiebungen des Verhältnisses Hyoscyamin zu Scopolamin gefunden. Datura stramonium und Atropa belladonna führen in jugendlichen Stadien als Hauptalkaloid Scopolamin und als Nebenalkaloid Hyoscyamin. Mit fortschreitender Entwicklung nimmt Hyoscyamin allmählich überhand, bis es etwa zur Blütezeit als Hauptalkaloid vorliegt. Blätter weisen zum Zeitpunkt des Blühens oder kurz vorher einen Maximalgehalt an Sekundärstofen auf. Mit der Blüte ist eine Umstimmung der gesamten Stofwechsellage verbunden, die sich in einem Absinken an Sekundärprodukten zeigt. Ein Beispiel: Im Pfeferminzblatt Mentha × piperita ist der Gehalt an ätherischem Öl bei Blühbeginn am höchsten; zugleich beginnt sich dessen Zusammensetzung zu ändern ( > Abb. 4.1). Physiologische Untersuchungen dieser Art bestätigen im Allgemeinen die alte Erfahrungsregel, Blattdrogen möglichst kurz vor oder während der Blütezeit zu ernten. Änderungen bei der Fruchtreife: Beispiel Tomate. Dass

Änderungen vor sich gehen, ist sehr augenfällig: die Früchte werden weich, ändern ihre Farbe von Grün nach Rot und entwickeln ein typisches Aroma. Diese Phänomene sind von sehr komplexen Änderungen im Stofwechsel begleitet, der sich bei der Tomate in einem Anstieg der Atmung äußert, der bis nach der Ernte anhält. Der Planzenphysiologe spricht von einem klimakterischen Atmungsanstieg und er unterscheidet klimakterische (Tomate, Banane, Apfel, Pirsich) von nichtklimakterischen Früchten (Ananas, Melone, Weintraube, Apfelsine). Zwar werden

4.1 Änderungen im Sekundärstoffgehalt während der Ontogenese

4

. Abb. 4.1 ätherisches Öl (Gesamtgehalt)

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CH3

6 O

[µmol / Blatt]

5

H3C

CH3

CH3

(–)- Menthon

4

OH H 3C

3

CH3

(–)- Menthol

2

1

0

0

2

4

6

Blühbeginn

8

10

12 [ Wochen]

volle Blüte

Die Zusammensetzung des ätherischen Öles in Pfefferminzblättern ist eine Funktion der Blattentwicklung. Das Verhältnis von Menthol zu Menthon kehrt sich während der Blütezeit um (nach Croteau u. Martinkus 1979) . Abb.4.2

Die Tomatenfrucht gehört zu den Früchten mit einem so genannten klimakterischen Atmungsanstieg. Abbauende Reaktionen führen mit einsetzender Fruchtreife zu einer ergiebigen CO2-Produktion. Im Verlauf des Reifevorganges wird auch das giftige Glykoalkaloid Tomatin, man nimmt an bis zu CO2, abgebaut;. Gefasst werden konnte als Zwischenstufe ein C21-Steroid vom Typus der Pregnenolone (Heftmann u. Schwimmer 1972)

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4

Postbiosynthetische Umsetzungen und Akkumulation von sekundären Pflanzenstoffen

die Ursachen für den Anstieg der CO2-Produktion noch nicht voll verstanden, ein wesentlicher Faktor dürte jedoch das Überhandnehmen abbauender (katabolischer) Stofwechselreaktionen sein. Im Falle der Tomaten erfolgt u. a. auch ein Abbau der toxischen Steroidalkaloide vom Typus des Tomatins ( > Abb. 4.2). Mittels 14C-Tomatin wurde nachgewiesen, dass der Abbau über Pregnenolon verläut (Hetmann u. Schwimmer 1972). Unreife Früchte vieler Solanum-Arten enthalten das dem Tomatidin eng verwandte Steroidalkaloid Solasonin. Solasonin beansprucht technisches Interesse als Rohstof zur Partialsynthese von Steroidhormonen. Sofort nach der Ernte der unreifen Früchte beginnt, wie beim Tomatin gezeigt ( > Abb. 4.2), der Abbau, was die technische Ausbeute an Solasodin mindert.

4.2 Diurnale Schwankungen, Fließgleichgewicht Das Angebot an Intermediärprodukten des Primärstofwechsels ändert sich als direkte Folge des üblichen tagesperiodischen Licht-Dunkel-Wechsels. Wenn Sekundärstofe keine aus dem Stofwechselkreislauf für immer ausgeschiedene Produkte darstellen, so darf man erwarten, dass korrelativ zum Primärstofwechsel diurnale Schwankungen im Sekundärstofwechsel beobachtet werden. Monoterpene, die in Drüsenköpfchen abgelagert sind, ändern dieser Vorhersage gemäß luktuierend ihre Konzentrationen: Tagsüber nimmt die Konzentration zu, mit beginnender Dunkelheit nimmt sie rasch ab (Croteau 1981). Die Monoterpene werden, zumindest partiell, nach Einsetzen der Dunkelheit, wieder in den Primärstofwechsel eingeschleust. Analoge diurnale Fluktuationen sind auch bei Papaver somniferum bezüglich des Morphingehaltes beobachtet worden (Waller u. Nowacki 1978). In anderen Fällen bleibt der Gehalt an Sekundärstofen ziemlich konstant, aber nicht notwendigerweise deshalb, weil diese Sekundärstofe aus dem aktiven Stofwechselgeschehen ausgeschieden wären: Mittels der Isotopentechnik konnte an mehreren Beispielen gezeigt werden, dass ein Fließgleichgewicht („steady state“) vorliegt, d. h. die Menge an neu synthetisierten und an katabolisierten Sekundärprodukten halten sich die Waage. Bei einem im Fließgleichgewicht beindlichen System interessieren nicht nur die stationären Konzentrationen (die „Poolgrößen“), wissenswert ist vor allem, wie schnell die Reaktanten umgesetzt werden. Die Halbwertszeiten konnten in einigen Fällen

bestimmt werden: Sie liegen bei Ricinin bei 4 h, Dhurrin 10 h, Morphin 7,5 h, Chlorogensäure 20 h und im Bereich von Tagen (7–12 Tage) bei den Flavonolglykosiden in den Blättern von Cicer arietinum (Luckner 1984).

4.3 Oxidative Veränderungen an sekundären Pflanzenstoffen Die ersten fassbaren Stufen der Biosynthese von Sekundärstofen sind vergleichsweise lipophile, sauerstofarme Verbindungen. Sie kommen im Planzenreich in nur wenigen Varianten vor und in der Einzelplanze in meist geringer Konzentration. Dem gegenüber steht eine überaus große Fülle an Sekundärstofen, die oxidierte Varianten der lipophilen Vorstufen darstellen. Ofensichtlich verfügen Planzen über Enzyme, die imstande sind, in Sekundärprodukte O-Funktionen einzuführen und sie u. U. bis zu CO2 abzubauen. Die allgemeine Richtung des Sekundärstofwechsels lässt sich als eine Reaktionskette von katabolischen Prozessen, als eine regulierte stufenweise „Verbrennung“ charakterisieren ( > Abb. 4.3). Dass Sekundärstofe zeitlichen Veränderungen unterliegen, zeigt sich sinnfällig an der Herbstfärbung und an den Veränderungen während der Fruchtreifung. Der Abbau des Chlorophylls erfolgt stufenweise. Zunächst wird die Bindung zwischen dem lipophilen Phytylrest, mit dem das Molekül in der Membran verankert ist, und dem farbigen Porphyrinring gelöst. Aus dem nun besser wasserlöslichen Restmolekül spaltet ein Enzym das Magnesium heraus, das in Stamm und Wurzeln transportiert und dort gespeichert wird. Der entscheidende Schritt, der aus einem farbigen ein farbloses Molekül macht, besteht in einer oxygenolytischen Spaltung – unter dem Einluss einer Oxygenase – indem der Chlorin-Makroring (2,3-Dihydroporphyrin) zu einem linearen Tetrapyrrolderivat geöfnet wird (Hörtensteiner et al. 1998; Oberhuber et al. 2003). Auch bei reifenden Früchten ist der Farbwechsel auffallend, der ebenfalls durch Abbau des Chlorophylls zustande kommt, aber zugleich von der Neusynthese von Carotinoiden oder Anthocyanen begleitet ist. Die in unreifen Früchten von Solanum- und Lycopersicon-Arten vorkommenden Steroidalkaloide verschwinden während der Reife, erst dadurch werden die reifen Früchte genießbar. Erwähnenswert ist auch die Bildung von Ascorbinsäure, die in vielen Früchten während der Reifung abläut.

4.3 Oxidative Veränderungen an sekundären Pflanzenstoffen

. Abb. 4.3

4

CO2 Photosynthese

Primärstoffwechsel Bausteine des Primärstoffwechsels Biosynthese

lipophile Sekundärstoffe

Speicherung Mobilisierung, weitere Umsetzung

weitere Umsetzungen

polare Sekundärstoffe

Speicherung

Abbau

Polymerisation

CO2

Lignine, Suberine, Melanine, Phlobaphene, Sporopollenine

Stark vereinfachtes Schema zum Sekundärstoffwechsel. Erste Biosyntheseprodukte sind lipophile Sekundärstoffe, die vorübergehend gespeichert oder die unmittelbar weiter enzymatisch umgesetzt werden, sodass modifizierte, in der Regel stärker polare Sekundärstoffe entstehen. Auch sie unterliegen weiteren Umwandlungen: sie können vorübergehend gespeichert werden, andere werden bis zu Atmungssubstraten und CO2 abgebaut, wiederum andere werden als Polymerisate für Dauer festgelegt

4.3.1 An katabolischen Reaktionen beteiligte Enzyme Im Bereich des Sekundärstofwechsels herrscht in Bezug auf Aubau, Umbau und Abbau ähnliche Dynamik wie im Grundstofwechsel. Wir richten im Folgenden das Augenmerk auf abbauende Prozesse. Diese sind im Wesentlichen oxidativer Natur und bestimmen das weitere Schicksal des Sekundärstofes: Abbau zu Primärmetaboliten und Wiedereinschleusung in den Primärstofwechsel, Polymerisation zu unlöslichen Produkten mit endgültiger Ausscheidung aus dem Stofwechsel („echte Exkrete“), Transformation zu O-reichen Sekundärstofen oder zu polyfunktionellen, reaktionsfähigen Verbindungen, die sich spontan zu labileren Produkten umlagern. An diesen oxidativen Veränderungen von Substraten des Sekundärstofwechsels sind u. a. die folgenden Enzyme beteiligt: Oxygenasen, Oxidasen und Peroxidasen ( > Abb. 4.4).

Oxygenasen. Oxygenasen werden in Monooxygenasen

und in Dioxygenasen unterteilt. Monooxygenasen spalten molekularen Sauerstof (O2) und übertragen 1 Sauerstofatom auf das Substrat, das andere wird zu Wasser reduziert. Das O-Atom wird entweder in C-H-Bindungen eingeschoben ( > Abb. 4.5) oder an Doppelbindungen und freie Elektronenpaare addiert ( > Abb. 4.6). Dioxygenasen hingegen inserieren beide O-Atome des molekularen Sauerstofs. Beispiele: Die Ringspaltung im Tryptophan durch die Tryptophan-2,3-dioxygenase ( > Abb. 4.7) oder von Catechinderivaten durch Catecholoxygenasen ( > Abb. 4.8). Oxidasen. Zum Unterschied von den Oxygenasen führen

die Oxidasen keinen Sauerstof in das Substratmolekül ein. Oxidasen katalysieren den Transfer von Elektronen vom Substrat auf molekularen Sauerstof, unter Bildung von reduzierten Sauerstofspezies, wie Superoxidanionen, Peroxid oder Wasser. Oxidasen sind vornehmlich Enzyme des Primärstofwechsels, erinnert sei an die Funktion der Cytochrom-c-Oxidase als Endglied der mitochondrialen

83

84

4

Postbiosynthetische Umsetzungen und Akkumulation von sekundären Pflanzenstoffen

. Abb. 4.4 S

+

S

+ O

O

O

S

O

Dioxygenase

O O + NADP-H + H

+

+ NADP

S

+

Monooxygenase

+ H2O

OH 2 (Cu

2+

+

)-Enzym

2 (Cu )-Enzym

H S

S H z. B.

•

+ 2H

+ 2H

a)

S

b) 2

S

+ H S

+ HO

2

OH

H S

•

Oxidase

+

O

O

OH

+

O

O

OH

•

S

•

+ 2 H2O

Peroxidase

S

Übersicht über Oxygenasen, Oxidasen und Peroxidasen. S Substratmolekül

. Abb. 4.5 O2 R

O

NADP-H + H

+

NADP

+

NADP-H + H

+

CH3

R H2O

O2

R1 N R2

CH3 H2O

NADP

+

O

CH2 O

H

N

CH2 O

H

R1

OH + HCHO

R

R1

R2

N

H + HCHO

R2

Oxidative Entmethylierung, eingeleitet durch Monooxygenasen. Die enzymatisch gebildeten Hydroxyderivate können spontan Formaldehyd abspalten. Experimentell konnte das Hydroxyzwischenprodukt bisher in freier Form nicht aufgefunden werden, doch konnte seine Existenz indirekt bewiesen werden, indem es durch Bindung an Zucker abgefangen und damit stabilisiert wurde (Luckner 1984). In zahlreichen Alkaloiden stammt der sog. „Extra-C1-Baustein“ aus dem latenten Formaldehyd des enzymatisch oxidierten N-Methylderivates. Beispiel: Reticulin o Protoberberinalkaloide

Atmungskette. Im Zusammenhang mit katabolen Stofwechselreaktionen interessieren bestimmte Phenolasen, die sich durch die Eigenschat auszeichnen, dass Oxygenasefunktion – Übertragung von molekularem Sauerstof – und Oxidasefunktion – Übertragung von Elektronen bzw. von Wasserstof – miteinander verkoppelt sind ( > Abb. 4.9). Phenoloxidasen sind in der Natur weit ver-

breitet. Bei Planzen verursachen sie das Nachdunkeln von Schnittlächen, bestens bekannt von Kartofeln, Äpfeln und Pilzen. Peroxidasen. Sie verwenden Wasserstofperoxid (H2O2)

oder organische Peroxide als Oxidationsmittel, um Substrate unter Bildung von Wasser bzw. Alkoholen zu reduzie-

4.3 Oxidative Veränderungen an sekundären Pflanzenstoffen

4

. Abb. 4.6 COOH +

O

Hydroxylase

Tetrahydropteridin

+

O

Zimtsäure COOH Dihydropteridin

+

+

H2O

HO p-Cumarsäure

Die Hydroxylierung durch Monooxygenasen (= mischfunktionelle Oxygenasen) ist dadurch charakterisiert, dass sie unter Verbrauch von Reduktionsäquivalenten stattfindet, wobei ein Atom des Luftsauerstoffs im Substrat, das andere im Wasser erscheint . Abb. 4.7 O2

COOH

COOH

3 2

N

H

O

Tryptophan-2,3-Oxygenase

NH2

N

H

H

H

O

NH2

Tryptophan O

COOH NH2

O N

H

H N-Formylkynurenin

Der Abbau bzw. Umbau der Aminosäure Tryptophan (Trp) beginnt mit dem Angriff der Tryptophan-2,3-Dioxygenase (TrpPyrrolase) unter Bildung von N-Formylkynurenin. Als Dioxygenase (O2-Transferase) katalysiert das Enzym den Einbau aller beiden O-Atome des Luftsauerstoffs in den Pyrrolring des Trp-Moleküls. Man kann sich die Reaktion verständlich machen, indem man die Bildung eines peroxidischen Zwischenproduktes annimmt, das spontan unter Ringöffnung zerfällt . Abb. 4.8.a–c OH

HO

R Oxygenasen

a)

OH 1,2-Oxygenasen O2, –4e

b) OH OH

OH

O R

COOH COR

COOH COOH OH

2,3-Oxygenasen O2, –4e

c)

O

COOH CHO

O COOH CHO

Aromatische Ringe werden durch die verschiedenen Oxygenasen in unterschiedlicher Weise gesprengt (a,b). Die durch die 2,3-Catecholoxygenase katalysierte Reaktion (c) ist in der Alkaloidchemie als „Extradiolspaltung“ bekannt (Butt u. Lamb 1981)

85

86

4

Postbiosynthetische Umsetzungen und Akkumulation von sekundären Pflanzenstoffen

. Abb. 4.9 R

Cytochrom-P450-abhängige Monooxygenasen und Epoxidhydrolasen. Bei den Monooxygenasen erfolgt die

R

R O2

Aktivierung des molekularen Sauerstofs entweder durch das Cytochrom-P450-System oder durch Flavinenzyme. Die Bezeichnung Cytochrom P450 leitet sich von der Eigenschat her, dass die reduzierte Form des Enzyms mit einem Fe2+-Atom im aktiven Zentrum mit Kohlenstofmonoxid einen Komplex bildet, dessen maximale UV-Absorption bei 450 nm liegt. Das Cytochrom-P450-System ist allgemein verbreitet und kommt sowohl in tierischen als auch planzlichen Organismen im endoplasmatischen Retikulum lokalisiert vor. Die Analyse solubilisierter Cytochrom-P450-Enzyme hat erbracht, dass es sich um kein einheitliches Enzym handelt; es existieren viele Formen mit unterschiedlichen Substratspeziitäten. Die CytochromP450-Enzyme haben eine breite Substratspeziität und inserieren Sauerstof in Alkane und Alkenderivate sowie in aromatische Ringe. Bei der Einführung von Sauerstof in Alkene und Aromaten treten Epoxide als Zwischenstufen auf, die weiteren Veränderungen unterliegen. Im tierischen Organismus ist dem mikrosomalen Cytochrom-P450-Enzymsystem die Epoxidhydrolase benachbart. Dieses Enzym katalysiert die Hydrolyse von aromatischen und aliphatischen Epoxiden zu den entsprechenden threo- bzw. trans-Diolen. Beide Enzyme sind bei der Entgitung dem

spontan

½O2

OH H2

O

OH

OH

O

1

2

3

Die im Pflanzenreich weit verbreitete Phenoloxidase, auch als Polyphenoloxidase bezeichnet, ist ein Enzym, von dem zwei Reaktionsschritte katalysiert werden: die Hydroxylierung eines Monophenols zum o-Diphenol (1o2) und dessen weitere Oxidation zum o-Chinon (2o3). Der Reaktionsschritt (2o3) liefert formal die beiden Reduktionsäquivalente zur Bildung von H2O aus molekularem Sauerstoff. Da die Chinone spontan zu dunkel gefärbten Produkten polymerisieren, wird die Phenoloxidasereaktion auch als enzymatische Bräunungsreaktion bezeichnet

ren. Peroxidasen sind wenig substratspeziisch. Sie katalysieren Reaktionen, die kataboler Natur sind – beispielsweise den Abbau von Flavonen ( > Abb. 4.10 und Abb. 4.11) – sodann aber auch Biosynthesereaktionen. Insbesondere fungieren sie als Agenzien für die Verknüpfung zwischen aromatischen Ringen (oxidative Kupplung > Kap. 26.1.4). . Abb. 4.10

3'

OH

B

O

HO

OR

OR 3'

HO

O

POD H2O2

A

OH

A

H

OH OH

B

OH

OH

O H2O2

O

POD

OR OH

HO

OH +

A COOH

B HOOC

OH

CO2 aus Ring A und Ring B

Peroxidasen (POD) bauen Flavonole zu Phenolcarbonsäuren ab (Barz u. Hösel 1978)

OH

4

4.3 Oxidative Veränderungen an sekundären Pflanzenstoffen

. Abb. 4.11

Oxidation

OH OH

Glc

O

O

Glc

O

O

POD H2O2

2

7

OH

H

OH + HO

OH

O

OH

Flavanon-7-glucosid

O

Chromon-7-glucosid

2-Hydroxy-hydrochinon

Flavanone, deren Hydroxylgruppe an C-7 durch Glykosidierung oder Methylierung verschlossen ist, werden durch Peroxidasen (POD) zu Chromonen und Hydrochinonderivaten abgebaut (Janistyn u. Stocker 1976)

. Abb. 4.12

Linolsäure 18:2 (9,12) HS-CoA O SCoA

H3C Monooxygenase (ω-Hydroxylierung) O HO

SCoA Monoxygenase (Epoxidierung) O

O

O

HO

SCoA Epoxidhydrolase OH

OH

HO

O SCoA

18

OH

OH

9,10,12,13,18-Pentahydroxystearinsäure Dehydrogenase

O 18

Rest wie Formel zuvor

Einbau in Suberin und Cutin

OH

Monomere Hauptbestandteile des Suberins sind Ester von Di- bis Pentahydroxyfettsäuren mit langkettigen Alkoholen (>20). Die Hydroxyfettsäuren leiten sich überwiegend von der Stearinsäure ab. Die Abbildung zeigt die bisher wahrscheinlichste, auf Experimente gestützte Biosynthese der C18-Familie (Kolattukudy et al. 1977). Vor der Polymerisierung (Suberinisierung) wird der Hauptteil der ω-Hydroxyfettsäuren zu den entsprechenden Dicarbonsäuren dehydriert

87

88

4

Postbiosynthetische Umsetzungen und Akkumulation von sekundären Pflanzenstoffen

. Abb. 4.13 H

R1

H

R2

+

NADP-H, O2 Monooxygenase

CH3 H

O

H

R1

H

Methyltransferase

OCH3

H

OCH3

R1

R2

R2

R2

R1

H +

H

Z-Alken

Methoxyalken

H2O, Epoxidhydrolase

R1

H HO H

R1 HO

≡

HO

H

H

R2

OH R2

threo-Diol

Folgereaktionen der nach Einwirkung von Monooxygenasen gebildeten Epoxide. Der Epoxidring kann sich durch Angriff eines elektrophilen Agens öffnen; das kationische Zwischenprodukt stabilisiert sich durch Abspaltung eines Protons. Nach diesem Formalismus zyklisiert Squalen-2,3-epoxid (2,3-Oxidosqualen) zu tetra- und pentazyklischen Triterpenen. Enzymatisch bildet sich unter dem Einfluss der Epoxidhydrolase das dem Epoxid entsprechende threo-Diol

tierischen Organismus fremder Substanzen (xenobiotischer Verbindungen planzlicher oder synthetischer Herkunt) wichtig. Die Hydroxylierung erhöht die Löslichkeit lipophiler Xenobiotika und erleichtert ihre Ausscheidung. Ein vergleichbares Ineinandergreifen von CytochromP450-Enzymen und Epoxidhydrolasen indet sich, evolutiv gesehen, bereits bei grünen Planzen voll entwickelt, und zwar bei der Bildung des Baumaterials für die Kutinisierung (Suberinisierung). Ausgehend von in der Regel ungesättigten C18-Fettsäuren werden Di- bis Pentahydroxyfettsäuren gebildet, die nach Veresterung mit höheren Alkoholen die monomeren Bausteine der wasserundurchlässigen Biopolymere Cutin bzw. Suberin darstellen ( > Abb. 4.12). Im Primärstofwechsel ist die Epoxidierung durch eine NADP-H-abhängige Monooxygenase funktionell verknüpt mit der Aktivität weiterer Enzyme wie beispielsweise der Wirkung von 2,3-Oxidosqualen-Cyclasen, die zum Aubau von Steroiden und zyklischen Triterpenen führen ( > Kap. 24.3). Der Umbau und Abbau sekundärer Planzenstofe beginnt analog mit der Epoxidierung einer Doppelbindung. Häuig wird der Epoxidring durch den Angrif eines Methyldonators unter Bildung entsprechender Methoxyderivate geöfnet ( > Abb. 4.13). Das durch den elektrophilen Angrif entstehende Kation stabilisiert sich unter Abspaltung eines Protons, nicht selten erst nach intramolekularen Umlagerungen. Beispiel: Die in bestimm-

ten Piper-Arten vorkommenden Piperolide kann man sich über Epoxidierung der 5,6-Doppelbindung und Ringverengung aus sauerstofärmeren Vorstufen entstanden denken ( > Abb. 4.14).

4.3.2 Abbau phenolischer Pflanzenstoffe Ein einfacher oxidativer Abbauschritt besteht in der Verkürzung der C3-Seitenkette von Zimtsäuren um 2 C-Atome. Für diese Herkunt der Benzoesäurederivate aus Zimtsäuren spricht das Autreten analoger Substitutionsmuster. Sehr wahrscheinlich verläut die Abspaltung der C2-Kette analog der bekannten α-Oxidation von Fettsäuren ( > Abb. 4.15). Einschränkend sei hinzugefügt, dass es bisher nicht gelungen ist, an Coenzym A gebundene Zimtsäuren experimentell nachzuweisen. C6-C1-Phenolcarbonsäuren entstehen sodann beim Abbau von Flavonolen und zwar unter der Einwirkung von Peroxidasen ( > Abb. 4.10). Hydroxylavanone werden enzymatisch hingegen zu Chromonen und Hydrochinonderivaten abgebaut ( > Abb. 4.11). Dioxygenasen attackieren, wie bereits gezeigt ( > Abb. 4.8), den Benzolring direkt. Aus l-DOPA bilden sich abhängig von der Ringöfnungsstelle und der Art der Rezyklisierung, Stizolobinsäure oder Betalaminsäure ( > Abb. 4.16). Die Betalaminsäure ist die Muttersubstanz der Betalaine ( > Infobox).

4.3 Oxidative Veränderungen an sekundären Pflanzenstoffen

4

. Abb. 4.14 OCH3

OCH3

OCH3

H3CO

5

H

O

6

O

O

2 Desmethoxyangonin

1 Kavain OCH3

O

OH

H3CO 5 Epoxypiperolid

4 Piperolid

CH3

O b

H

O O

H3CO

a

OCH3

O O

O

3 5-Methoxy-2

OCH3

O

+

O

O

O OH H3CO 6 threo-Piperoliddiol

OCH3

a

O

O

a

Piperolide

b

5-Hydroxy-Yangonine

Einige vom Kavain (1) sich ableitende Inhaltsstoffe von Piper sanctum und Piper methysticum, angeordnet nach ihrem Oxidationsgrad (1o6). Das Inhaltsstoffspektrum stellt sich dar, als lägen Moleküle eines katabolen Abbaus vor, eingeleitet durch Epoxidierung des Yangoninderivates 2 in Position 5,6

Infobox Betalaine. Die Betalaine sind eine Gruppe von zellsaftlöslichen, stickstoffhaltigen Pflanzenfarbstoffen, die als chromophore Gruppe das 1,7-Diazaheptamethinium-System enthalten und damit natürliche Vertreter der Polymethinfarbstoffe darstellen ( > Abb. 4.17). Unterteilt werden die Betalaine in die rotviolett gefärbten Betacyane und die gelben Betaxanthine. Die Betacyane bestehen aus einem 5,6Dihydroxydihydroindol-2-carbonsäure-Teil (Cyclo-DOPA), der mit einer Dihydropyridin-2,6-dicarbonsäure-Einheit (Betalaminsäure) verbunden ist, z. B. Betanin, ein Betanidin5-O-glucosid, oder Amaranthin, ein Betanidin-5-O-(glucuronid)-glucosid. Betaxanthine sind nicht glykosidiert. Bei ihnen sind statt des Dihydroindolringes der Prolinrest

(Indicaxanthin aus Opuntia ficus-indica MILLER) bzw. andere Aminosäuren oder Amine wie Glutaminsäure, Glutamin, Methioninsulfat, Asparaginsäure oder Tyramin mit Betalaminsäure verknüpft. Betalaine kommen ausschließlich bei bestimmten Familien der Caryophyllales [IIB3] vor. Pflanzenarten, die Betalainfarbstoffe führen, enthalten keine Anthocyanpigmente: Anthocyan- und Betalainbildung schließen sich wechselseitig aus. Allerdings kommen die mit den Anthocyanen biosynthetisch eng verwandten Flavone (Typus Quercetin) auch in den Betalainpflanzen vor. Somit ist die Fähigkeit zum Aufbau des C15-Flavonoidgerüstes vorhanden, es ist lediglich die Ausbildung der Anthocyane blockiert.

89

90

4

Postbiosynthetische Umsetzungen und Akkumulation von sekundären Pflanzenstoffen

. Abb. 4.15 O

OH H2O

R1

O

R1

SCoA

R2

SCoA

R2 NAD

+

+

H, NAD O

O R1

SCoA

CH3CO

H

SCoA

SCoA

R1

H O SCoA

R2

R2 H2O H

R1

SCoA

CHO

H2O, + NAD

+

H, NAD

H

R1

COOH

R2

R2

z. B. : R1 = OCH3, R2 = OH: Vanillin

z. B.: R1 = R2 = H: Benzoesäure R1 = H, R2 = OH: p-Hydroxybenzoesäure R1 = OCH3, R2 = OH: Vanillinsäure

C6-C1-Verbindungen vom Typus des Vanillins und der Benzoesäure entstehen vermutlich aus Zimtsäuren in einem der βOxidation der Fettsäuren vergleichbaren Prozess. Daneben gibt es aber einen zweiten, direkten Weg zu C6-C1-Säuren, der nicht über Zimtsäuren führt, sondern von der Shikimisäure abzweigt

4.3.3 Oxidative Modifikation der Quassinoide Die Quassinoide sind sauerstofreiche trizyklische Planzenstofe, die biogenetisch durch oxidativen Abbau aus trizyklischen Triterpenen (C30) entstanden sind. Das Grundgerüst der Quassinoide besteht aus 20 Kohlenstofatomen, sodass 10C-Atome abgebaut werden (Decanortriterpene). Daneben gibt es C25-Quassinoide (Pentanortriterpene). Einige wenige Quassinoide enthalten nur mehr einen Restbestand aus 10- oder 18C-Atomen (Undecanortriterpene bzw. Dodecanortriterpene). Die Quassinoide sind in ihrer Verbreitung auf die Simaroubaceae [IIB18f] beschränkt. Die meisten Quassinoide schmecken intensiv bitter; Quassin und Neoquassin ( > Abb. 4.18) sind die Planzenstofe mit den höchsten Bitterwerten. Viele Quassinoide besitzen fraßhemmende, antivirale, anthelmintische, insektizide und amöbizide Wirkungen. Besonders gut untersucht sind die Quassinoide des aus China

stammenden Götterbaumes, Ailanthus altissima (Mill.) Swingle, aus dessen Rinde u. a. Ailanthon und Glaucorubinon isoliert wurden, die beide auf Entamoeba histolytica sowie auf chloroquinresistente Formen von Plasmodium falciparum hemmend wirken. Insektizid wirken auch die Quassinoide des Bitterholzes. Das Bitterholz, Quassiae lignum, stammt von dem in Surinam heimischen QuassiaBaum, Quassia amara L. Die Droge enthält 0,1–0,2% Quassinoide mit Quassin ( > Abb. 4.18) als Hauptkomponente. Die Quassinfraktion kann als Spritzmittel gegen Fliegen, Blattläuse und Raupen verwendet werden. Eine Paralleldroge, die ebenfalls Quassiaholz (Jamaika-Quassiaholz) liefert, stammt von Picrasma excelsa (Swartz) Planch. Hinweis. Das Quassin des Handels ist ein Gemisch aus Quassin, Neoquassin, Isoquassin und 18-Hydroxyquassin. Es ist ein im Lebensmittelbereich verwendeter Bitterstof. Nach der Aromenverordnung dürfen Trinkbranntweine bis zu 50 mg/l als Zusatz enthalten.

4.3 Oxidative Veränderungen an sekundären Pflanzenstoffen

4

COOH

. Abb. 4.16 H2N

COOH

O

H2N

COOH

Stizolobsäure

COOH

OHC

OHC HOOC

H2N

O

OH

HOOC

N H

OH

COOH

Betalaminsäure

OH COOH

L-DOPA

HOOC

NH2

H2N CHO COOH OH

O

O

COOH

Stizolobinsäure

Oxidative Ringspaltung von L-DOPA durch eine Dioxygenase und Rezyklisierung

4.3.4 Oxidative Modifikation der Limonoide Ähnlich wie die Quassiarinde der Simaroubaceae stellen auch die Limonoide oxidativ veränderte, katabolische Derivate tetrazyklischer Triterpene dar ( > Abb. 4.19). Das charakteristische Kohlenstofskelett der Limonoide entsteht x durch oxidative Modiizierung der Seitenkette des C30Steroids unter Ausbildung eines β-substituierten Furanringes unter Abspaltung eines C4-Restes, x durch Sprengung eines carbozyklischen Ringes unter Bildung ofenkettiger Derivate (Beispiel: Obacunonsäure) oder von Lactonen (Beispiel: Nomilin). In der synthetischen Chemie hat die oxidative Sprengung eines Ringketons unter Lactonbildung ein Analogon in der Keton- o Ester-Oxidation nach Baeyer-Villiger. Limonoide sind charakteristische Inhaltsstofe von Planzen aus den Familien der Rutaceae [IIB18d] und der Meliaceae [IIB18c]. Viele Vertreter weisen einen bitteren Ge-

schmack auf. Limonin ( > Abb. 4.19) beispielsweise ist der Bitterstof in Samen, Sat und Fruchtleisch von Apfelsine und Grapefruit. Die Limonoide sind bemerkenswerte Fraßabwehrstofe. Am eingehendsten untersucht ist das Azadirachtin ( > Abb. 4.20), ein systemisch wirkendes Fraßabschreckungsmittel für Insekten. Es hat Antiecdysonwirkung und verursacht Wachstumsstörungen im Larvenstadium der Tiere. Es wird als „biologisches Schädlingsbekämpfungsmittel“ kommerziell eingesetzt.

4.3.5 Phytoecdysone: Oxidative Modifikationen in der Cholesterinreihe Phytoecdysone sind stark hydroxylierte Steroide mit variabler Seitenkettenlänge, entsprechend einer Verwandtschat zum Cholesterin (C27-Steroid, C8-Seitenkette), Ergosterin (C28-Steroid, C9-Seitenkette) oder Sitosterin (C29Steroid, C10-Seitenkette). Ein weiteres charakteristisches

91

92

4

Postbiosynthetische Umsetzungen und Akkumulation von sekundären Pflanzenstoffen

. Abb. 4.17 3

2'

HO

1'

2

HO

H

HO

3'

H

4'

HO

6'

H2N

COOH

N H

HO

5'

L-(S)-DOPA

H +

COOH

N

HO

COOH

(S)-Cyclo-DOPA 5'

OHC

6'

HOOC

1' 2'

3

HOOC

3'

2

N H

H

4'

COOH

N H

H Betanidin

COOH

H

(S)-Betalaminsäure +

N

COOH

H N H

COOH HOOC

L-Prolin

H

N H

COOH

Indicaxanthin H R

R

R

H +

N

N

R

R

H

R

R

+

R

N

N

R

R

H

Betalainchromophor als pentasubstituiertes 1,7-Diazaheptamethinsystem

Biosynthese von Betalainen. Die Betalaine sind Immoniumderivate der Betalaminsäure. Die Biosynthese verläuft von L-DOPA ausgehend, das einerseits zu Cyclo-DOPA zyklisiert, andererseits nach Extradiolspaltung ( > Abb. 4.8 [2,3 Catecholoxygenase]) zur Betalaminsäure rezyklisiert. Kondensation von Betalaminsäure mit Cyclo-DOPA führt zu den rotgefärbten Betanidinen, das sind die Glykoside und Acylglucoside des Betanidins (λmax = 573 nm). Erfolgt die Kondensation der Betalaminsäure mit einer Aminosäure oder einem biogenen Amin, so entstehen Betalaine mit einem verkürzten Chromophor. Indicaxanthin ist ein Vertreter der gelb gefärbten Betaxanthine (λmax = 477 nm)

Merkmal ist das 14D-Hydroxy-7-en-6-on-System, das Basis eines spektralphotometrischen Nachweises für Phytoecdysone ist ( > Abb. 4.21). Ecdyson (Synonym: D-Ecdyson) selbst ist ein C27-Steroidhormon, das bei Insekten die Häutung der Raupe zur Puppe und der Puppe zum Schmetterling bewirkt. Als Hormon wird es von den Tieren in nur geringen Mengen gebildet: Seidenspinnerraupen enthalten es in einer Konzentration von 5–10–6 Prozent. Planzen hingegen speichern Ecdysone nicht selten in etwa der 10.000fach höheren Konzentration.

Die Akkumulation von Phytoecdysonen wird als ein ökobiochemisches Moment in dem andauernden koevolutionären Prozess zwischen Planzen und Insekten betrachtet. Zwar können die meisten Insekten oral aufgenommene Phytoecdysone entgiten, doch hat die Planze dagegen die Strategie der Ausbildung unterschiedlicher Strukturvarianten entwickelt, deren Inaktivierung erschwert ist. So ist beispielsweise das insekteneigene D-Ecdyson bereis 7 h nach der Verfütterung inaktiviert, Cyasteron aus Palmfarn hingegen erst nach 32 h. Wahrschein-

4.3 Oxidative Veränderungen an sekundären Pflanzenstoffen

. Abb. 4.18

OCH3

OCH3 CH3

O

O

CH3

H3CO

O

CH3

CH3

O

H3CO

CH3

CH3 H

H

CH3

H

O

H

4

O CH3

H

Quassin

H H

O

OH

Neoquassin

C8 H3C

CH3

C8

O

CH3 CH3 CH3

•

O

CH3

Oxidative Veränderungen

•

CH3

O

CH3 OH

H3C

CH3

H3C

COOH C30−Seco-Tirucallol-Typ

C30−Tirucallol-Typ

Oxidation

OH O

CH3

O

A

CH3 B

C8 CH3

O

C9

CH3 C

O

CO2

O CH3

CH3

•

O CH3

O

OH

•

COOH

OH H3C

COOH

C20−Simarubalid-Typ

Quassin und Neoquassin, die Bitterstoffe des Quassiaholzes, sind Vertreter der sog. Simarubalide, das sind C20-Lactone mit zahlreichen O-Funktionen im Molekül. Biosynthetische Untersuchungen führten zu dem Ergebnis, dass die Simarubalide aus tetrazyklischen Triterpenen durch oxidative Veränderungen entstehen. Das Schema zeigt die formal-biogenetischen Beziehungen. Wichtigstes Zwischenprodukt ist ein Secotriterpen. Retroaldolspaltung führt zur Absprengung eines C9-Restes; Aufspaltung des Lactons im Seco-Tircucallol ermöglicht eine Rezyklisierung zum typischen Lactonring C der Simarubalide. Das Symbol x soll die Orientierung beim Verfolgen der Oxidationssequenzen erleichtern

93

94

4

Postbiosynthetische Umsetzungen und Akkumulation von sekundären Pflanzenstoffen

. Abb. 4.19 CH3

H3C

CH3

H3C CH3

CH3

CH3

CH3

O

CH3

CH3

CH3 CH3

CH3 CH3

HO H3C

CH3 Tetrazyklisches Triterpen C30H50O

Squalenepoxid

O

O

CH3

CH3 OH CH3 O

O

O O

OAc CH3

O

CH3

O O

O

H3C

O CH3 Nomilin

Deacetylnomilin O

O

CH3 CH3

CH3 O

CH3

O O

CH3 O

O

HOOC

HO

Obacunon

O

CH3 O

H3C

O CH3

H3C

O

O

CH3

H3C

O

CH3

O

O CH3 Obacunonsäure

O 17

O

CH3 O

3 2

H O

4

H3C

O

CH3

1

15

H

5

H

O O

16

O

H

CH3

Limonin C26H30O8

Die Limonoide stellen oxidativ veränderte Kataboliten tetrazyklischer Triperpene dar. Der angegebene Mechanismus des Abbaus ist aufgrund der aufgefundenen Zwischenverbindungen als wahrscheinlich anzusehen

4

4.4 Sekretion und Speicherung von Sekundärstoffen

. Abb. 4.20 O H3CO

OH

OO

H3C O H3C

H

O

CH3 O

O

CH3

O CH3

O

OH

H

4.4 Sekretion und Speicherung von Sekundärstoffen

OH

H

H3CO

lich genügen bereits geringfügige Auswirkungen auf die Metamorphose oder die Fortplanzung, um die Widerstandskrat des Schädlings herabzusetzen und das Überleben der Planzenspezies zu ermöglichen.

H

O

O

Sekundärstofe werden synthetisiert, sie werden in andere Gewebe transportiert, vorübergehend gespeichert und letztlich an die Umwelt abgegeben. Die Abgabe an die Umwelt erfolgt bei der Autolyse von Zellen, bei lüchtigen Stofen durch Verdunsten, bei polaren Stofen durch Auswaschen und schließlich durch den herbstlichen Blattfall sowie beim Absterben der ganzen Planze. Der folgende Abschnitt befasst sich mit der Akkumulation von Sekundärstofen. Speicherung von Sekundärstofen hat man lange Zeit als eine Art von Ablagern der für die Planze unnützen Produkte gesehen: Man sprach von Exkretion.

Azadirachtin, C35H44O16

Azadirachtin ist ein Limonoid, das im indischen Neembaum, Antelaea azadirachta (L.) Adelbert (Synonym: Azadirachta indica Juss.; Familie Meliaceae [IIB18c]), vorkommt. Es ist ein sehr wirksames, systemisch wirkendes Fraßabschreckungsmittel für Insekten, das für Säugetiere nicht toxisch ist

. Abb. 4.21

H3C R

H3C

OH 22

CH3

25

CH3

H3C

OH

CH3

CH3 CH3

HO

14

H

3

HO

H

O

OH

O OH

CH3

CH3

HO

OH

H HO

H

O

OH

O

R = H : α-Ecdyson, C27H44O6 R = OH : β-Ecdyson, C27H44O7

Cyasteron, C29H44O8 H3C

21

H3C CH3

H

26 22

20

25

24

CH3

H3C

H

H

CH3

CH3

23 27

CH3

CH3

H C8-Seitenkette des Cholesterins

H C10-Seitenkette der Sitosterine

Ecdysone sind Derivate des Cholesterins (C27) oder des Sitosterins (C29), deren Seitenkette oxidativ verändert ist. Weitere Eigentümlichkeiten des Molekülbaus sind: Ringe A/B sind cis-verknüpft, 2 β-ständige sekundäre alkoholische Gruppen in den Positionen C-2 und C-3; α-OH am C-14, sodass die Ringe C/D trans-verknüpft sind; und schließlich das 7-en-6-onSystem

95

96

4

Postbiosynthetische Umsetzungen und Akkumulation von sekundären Pflanzenstoffen

Als man dann Funktionen bestimmter Sekundärstofe kennen lernte, diferenzierte man in Exkrete und Sekrete. Exkrete sieht man als Sekundärstofe an, die als Ballastoder Schadstofe von den Zellen abgegeben werden; Sekrete sind von Planzen abgegebene Stofe, die eine ökologische Funktion haben. Diese aus der Zoologie übernommene Trennung von Exkreten und Sekreten ist in der Botanik schwer durchführbar: Ein und derselbe Stof kann bei der einen Art eine erkennbare Funktion haben, bei der anderen Art aber – scheinbar – funktionslos sein. Die Biochemie und Physiologie der Akkumulation von Sekundärstofen hat zahlreiche Aspekte, von denen genannt seien: Korrelation der Stofspeicherung mit der Zell- und Gewebediferenzierung, Adaptation an sich ändernde Umweltbedingungen oder biochemische Wechselwirkungen mit anderen Lebewesen (Harborne 1995; Roshchina u. Roshchina 1993; Schlee 1992). Die folgende Übersicht beschränkt sich auf den topographischen Aspekt: Wo in Zellen, Organen oder spezialisierten Strukturen (d. h. Drüsenzellen und Gewebe) sind Sekundärstofe gespeichert? Welche Art von Sekundärstofen wird in welchen Kompartimenten gespeichert?

4.4.1 Gewebe- und segmentspezifische Akkumulation Innerhalb eines Organs sind die Sekundärstofe nicht in allen Geweben gleichmäßig verteilt. Beispielsweise sind innerhalb der Pseudanthien der Kamille, Matricaria recutita L., Proazulene in bestimmten Geweben der Blüten akkumuliert, Polyine fehlen, wohingegen die Blütenstandsböden reich an Polyinen und frei von Proazulenen sind. Flavonolglykoside sind bei zahlreichen Arten in den Zellen der oberen Blattepidermis angereichert, Anthocyanglykoside in denen der unteren. Flavonole absorbieren UV-B-Strahlen und bilden auf diese Weise einen wirksamen Schutzilter für das Assimilationsparenchym. Die Speicherung von Anthranoiden beschränkt sich bei Morinda citrifolia L. auf das Wurzelsystem, doch verteilen sie sich nicht gleichmäßig innerhalb des Organs, sondern akkumulieren in der Wurzelrinde. Ähnlich verhält es sich mit der Ipecacuanhawurzel. Die Alkaloide inden sich hauptsächlich in der Rindenschicht, nicht im Holzkörper, der folglich für die technische Alkaloidextraktion minderwertig ist. Bei Samen sind toxische Substanzen ot im Sa-

menmantel konzentriert, wie z. B. beim Kreuzstrauch (Baccharis megapotamica Spreng.). Sie schützen den Samen so vor Insektenangrifen und mikrobiellen Infektionen. Bei den Früchten der Paranuss-Arten ist es hingegen gerade der innerste Teil der Frucht, der Samenkern, in dem die cyanogenen Glykoside lokalisiert sind. Beim Gemeinen Greis- oder Kreuzkraut, Senecio vulgaris L., enthalten die Epidermiszellen des Stängels 10-mal mehr Pyrrolizidin-Alkaloide als die übrigen Zellen. Selbst chemisch nahe verwandte Inhaltsstofe können innerhalb eines Organs unterschiedlich verteilt sein, wie das Beispiel der beiden Isolavone Biochanin A (5,7-Dihydroxy-4ʹ-methoxyisolavon) und dessen 5-Desoxyderivat Formononetin (7-Hydroxy-4ʹ-methoxyisolavon) zeigt. Biochanin A wird hauptsächlich in der Rhizodermis (griech.: rhíza [Wurzel]; dérma [Haut]) lokalisiert, Formononetin hingegen ziemlich gleichmäßig über das gesamte Wurzelgewebe verteilt. Eine segmentspeziische Akkumulation innerhalb eines Blattes wurde für Digoxin im Digitalis-lanata-Blatt nachgewiesen. Das Gewebe entlang des Mittelnervs und das der unteren Blattregionen sind glykosidarm, wohingegen das Parenchym des distalen Blattdrittels und der marginalen Blattregionen hohe Digoxinkonzentrationen aufweist (Weiler u. Zenk 1976). Am ofenkundigsten ist die segmentspeziische Akkumulation bei vielen Blütenblättern, insbesondere denen, die Farbmale (Satmale) aufweisen, das sind Farbzeichnungen, die durch unterschiedliche Verteilung von Anthocyanen, Flavonen und Carotinoiden zustande kommen; ihr Zweck ist es, bestäubende Insekten zum Blütenzentrum hinzuleiten, wo sich Nektar, Staubblätter und Grifel beinden.

4.4.2 Speicherung in Kompartimenten innerhalb der Zelle Hydrophobe Sekundärstofe werden in den Chromoplasten gespeichert, hydrophile bevorzugt in Vacuolen. Sekundärstofe unterschiedlicher Polarität können in periplasmatischen (extraplasmatischen) Bezirken und in der Zellwand abgelagert werden. Chromoplasten (griech.: chróma [Farbe]; plastós [geformt]) sind Plastiden, die kein Chlorophyll enthalten und daher photosynthetisch inaktiv sind, in denen aber Carotinoide und Xanthophylle akkumuliert sind und die daher gelb, orange oder rot gefärbt sind. Sie inden sich besonders in Blütenblättern (Forsythien) und Früchten

4.4 Sekretion und Speicherung von Sekundärstoffen

(Tomaten, Hagebutten, Zitrone, Orange), seltener in unterirdischen Organen (Möhre). In gefärbten Blütenblättern und unreifen Früchten entstehen die Chromoplasten durch Umwandlung aus Chloroplasten, ein Vorgang, der mit der Zerstörung von hylakoiden einhergeht, wohingegen die Plastoglobuli, in denen die Carotinoide akkumuliert sind, sowohl der Zahl als auch dem Volumen nach zunehmen. Es indet eine Neusynthese von Carotinoiden statt. In den Mohrrüben (Möhren) werden die Plastiden von vornherein als Chromoplasten angelegt. Wiederum anders ist die Situation in herbstlichen Laubblättern: Als Ergebnis einer gelenkten Autolyse werden in den Chloroplasten Chlorophylle, neben Fetten und Eiweiß, abgebaut, die Carotinoide bleiben zurück, womit sich der Farbwechsel erklärt. Eine Neusynthese von Carotinoiden indet nicht statt. Die Zellen des Herbstblattes sind auf Katabolismus eingestellt: Da es sich bei den „Chromoplasten“ des Herbstblattes um Chloroplasten im Altersstadium handelt, ist für sie die Bezeichnung Gerontoplasten (griech.: géron [alt]) vorgeschlagen worden (Sitte et al. 1980). Sowohl in Chromoplasten wie in Gerontoplasten kommen Xanthophylle (Carotinoide mit OH-Gruppen) mit Fettsäuren verestert vor. Diese auch als „Sekundärcarotinoide“ bezeichneten Xanthophylle fehlen in (zur Photosynthese) funktionstüchtigen Chloroplasten. Die Feinstruktur der Chromoplasten variiert stark. Es galt, evolutiv das Problem zu lösen, wie die hydrophoben (lipophilen) Carotinoide in einem hydrophilen Stroma verteilt gehalten werden können. In den Gerontoplasten, aber auch häuig in Chromoplasten, kommen sog. Plastoglobuli, das sind Lipidtropfen, vor, kugelige Gebilde, in deren unpolarem Inneren die Pigmente konzentriert sind. Sodann können die Carotinoidpigmente als fädige (nematische) Flüssigkristalle vorliegen, die von einem Mantel aus amphipolaren Strukturlipiden und einem Strukturprotein umhüllt sind. In elektronenmikroskopischen Querschnittbildern ähneln sie gebündelten Röhren (Tubuli) beispielsweise bei Blüten von Chelidonium majus und Tropaeolum-Arten. Wiederum in anderen Fällen sind Pigmentpartikel in Membranen eingehüllt und erscheinen als Membrankonvolute (z. B. bei gelbblütigen Narzissen) oder als membranumschlossene Carotinoidkristalle (z. B. in der Wurzel von Daucus carota L.) (Sitte et al. 1980; Mohr u. Schopfer 1992).

4

4.4.3 Vacuole als Speicherkompartiment Alle metabolisch aktiven planzlichen Zellen besitzen mehr oder weniger große Vacuolen. In voll entwickelten Organen kann die große Zentralvacuole bis zu 90% des Zellvolumens ausfüllen. In Vacuolen werden Metabolite zwischengelagert, allerdings für sehr unterschiedlich lange Zeiträume. Es herrscht eine ausgesprochene Spezialisierung: von Planzenart zu Planzenart, von Organ zu Organ und selbst innerhalb eines Gewebes. Zunächst einmal ist die Vacuole ein Speicherraum für Primärmetabolite und Ionen. Osmotisch wirksame anorganische Ionen, einfache Carbonsäuren (Äpfel-, Zitronen- und Oxalsäure), Aminosäuren und Zucker dienen der Turgorregulation. Malat wird beim diurnalen Säuremetabolismus der Crassulaceae nachts als CO2-Speicher deponiert, woraus tagsüber wieder CO2 für die Photosynthese freigesetzt wird. In spezialisierten Speichergeweben werden Saccharose, Fructose und Speicherproteine ebenfalls nur in Vacuolen deponiert. Für die Saccharoseakkumulation sind Zuckerrohr und Zuckerrübe bekannt. Fructane, nach Saccharose und Stärke die wichtigsten Kohlenhydratspeicher, sind leicht wasserlösliche, nichtreduzierende Polyfructosylsaccharosen, die als Speichersubstanzen in überdauernden Knollen, Rüben und Rhizomen, z. B. in Topinambur, Alant und Cichorium-Arten, vorkommen. Proteinspeichervacuolen werden bei der Samenreife in den Zellen von Karyopsen (Poaceae) oder den Speichercotyledonen von Hülsenfrüchtlern (Fabaceae) gebildet. Man bezeichnet sie meist als Aleuronkörner. Was die Sekundärstofe anbelangt, so können nahezu alle Stofgruppen in Vacuolen gespeichert werden, jedoch ausschließlich als polare und damit wasserlösliche Derivate. Erwähnt seien: x Anthocyan-, Flavonoid- und Cumaringlykoside, x Phenole, insbesondere Tannine, x Alkaloide, meist als Salze, x Triterpenglykoside, darunter Saponine und Cardenolidglykoside, x Proteine, darunter lytische Enzyme, Proteinaseinhibitoren und Lectine. In den Vacuolen vieler Zellen inden sich Kristalle von Calciumoxalat in unterschiedlichsten Kristallformen: als Raphiden (griech.: raphis [Nadel]), das sind Bündel von nadelförmigen Kristallen, als Drusen, als Kristallsand und als tetragonale Solitärkristalle.

97

98

4

Postbiosynthetische Umsetzungen und Akkumulation von sekundären Pflanzenstoffen

4.4.4 Transportvorgänge an Tonoplasten Der Tonoplast bildet die Barriere zwischen dem Lipidraum im Zytoplasma und dem wässrigen Vacuolenraum. Für die zahlreichen Leistungen und Funktionen der Vacuolen existieren entsprechend viele Mechanismen der Stofverschiebung, die nicht alle besprochen werden können; hier sei auf Übersichtsarbeiten verwiesen (Wink 1993). Auf Akkumulationen, die nach Art einer Falle wirken, wird im Folgenden eingegangen. Angenommen, Substanzmoleküle gelangen durch Difusion oder mittels passiven Transports via Tonoplast aus dem Plasma- in das Vacuolenkompartiment. Die

Transportbewegung kommt zum Stillstand, sobald zu beiden Seiten des Tonoplasten gleiche Konzentrationen herrschen. Nimmt man nun an, ein Molekül, das den Vacuolenraum erreicht, würde ausgefällt oder anderweitig gebunden werden und somit aus dem Gleichgewicht herausgenommen, so können weiterhin Moleküle transportiert werden, so lange bis auf beiden Seiten die Zahl der „freien Moleküle“ gleich ist. Überschüssiges Calcium, so lässt sich vermuten, kann im Vacuolenraum als schwer lösliches Oxalat abgefangen und ixiert werden. Die Fixierung einer Spezies im Vacuolenraum kann sodann in einer Protonierung bestehen, wozu es einen Modellversuch gibt ( > Abb. 4.22). Auch für die Alkaloidakkumulation wird

. Abb. 4.22

H 3C

N

N

CH3

N

NH2

N H 3C

CH3

N

+

N H

CH3 NH2

CH3

B

A

Molekül

Ion

Ionenfallenmodell nach Sitte: Akkumulation von Neutralrot in der Vacuole einer Pflanzenzelle. Neutralrot hat die chemische Eigenschaft eines Säure-Base-Indikators mit Farbumschlag im pH-Wertbereich 6,8–8,0, d. h. bei pH-Werten >8,0 überwiegen Neutralmoleküle der Sorte A, bei pH-Werten <6,8 protonierte Moleküle der Sorte B. Bringt man Pflanzenzellen in eine sehr stark verdünnte (1:10.000) schwach alkalische Lösung (pH 8,0), so lässt sich eine starke Anreicherung des Farbstoffs im Vacuolenraum (sowie in den Golgi-Vesikeln) beobachten. Aus der schwach alkalischen Badlösung diffundieren die apolaren Moleküle A über den Tonoplasten hindurch in die Vacuole, werden dort protoniert und können als polare Spezies nicht rückdiffundieren. Neue Neutralmoleküle können in die Vacuole gelangen, so lange, bis die Konzentrationen an Neutralmolekülen A im Vacuolenraum und außerhalb in der Badlösung gleich sind. Das ist der Fall, wenn die Konzentration in der Vacuole ca. das 1000fache beträgt (nach Sitte 1977)

4.4 Sekretion und Speicherung von Sekundärstoffen

seit langem ein Ionenfallenmechanismus diskutiert. Als Basen sind Alkaloide lipophil und können ohne aktive Transportprozesse durch den Tonoplasten permeieren. Im sauren Zellsat werden sie protoniert und damit in eine nicht rücktransportierbare Form überführt. Auch durch Komplexbildung mit Tanninen oder Chelidonsäure können Alkaloide im Vacuolenraum ixiert werden. Zur „Falle“ wird die Vacuole für lipophile Phenole, wenn sie in der Vacuole konjugiert, d. h. an Zucker oder Sulfat gebunden werden. Durch Überführen in Glykoside und Sulfatester ändern sich die Löslichkeiten drastisch, sodass die Lipidschicht des Tonoplasten zur Difussionsbarriere wird. Das Phänomen wird als „vektorielle Synthese“ bezeichnet: Die betrefenden Synthasen nehmen ihre Substrate an der plasmaseitigen Oberläche der Tonoplasten auf und geben das Konjugat an der nichtplasmatischen Seite ab. Die Biosynthese vieler Glykoside erfolgt allerdings bereits im Zytoplasmaraum. Für den Glykosidtransport in die Vacuole, entgegen einem Konzentrationsgradienten, muss man Energie benötigende Translokation in Tonoplasten postulieren, analog zu den Translokatoren von metabolisch wichtigen Primärmetaboliten. Einige Glykoside, z. B. Apigenin-7-O-glucosid, werden nicht als solche in den Vacuolen gespeichert, sondern in Form von Acylglykosiden, insbesondere als Malonsäurehalbester. Bei dieser chemischen Modiizierung durch die Malonyltransferase könnte es sich um eine besonders „rainierte“ Form einer Vacuolenfalle handeln, die sich der physiologischen pH-Diferenz zwischen Zytoplasma und Vacuole bedient. Die räumliche Gestalt (Konformation) der Esterglykoside ist pH-Abhängig, sodass die Moleküle leichter in den Vacuolenraum hinein- als aus dem Vacuolenraum heraustransportiert werden (Matern 1987; Matern et al. 1983, 1986).

4.4.5 Sekretion in Zellwand und periplasmatischem Raum Zellwand und Plasmamembran (Plasmalemma) bilden in der Regel einen Komplex, der nur schwer trennbar ist. Durch die sekretorische Tätigkeit bestimmter Zellen können sich periplasmatische Lücken bilden, die mit Sekreten angefüllt werden. Viele Enzyme z. B. werden im Zytoplasma synthetisiert und über die Plasmamembran hinweg (Exozytose) in periplasmatische Bezirke transportiert und schließlich in der Zellwand lokalisiert. Die Zellwand ist

4

Sitz vieler Enzyme, sodass sie sich geradezu als ein Enzymdepot aufassen lässt (Literaturübersicht bei Roshchina u. Roshchina 1993). Über das Plasmalemma hindurch in periplasmatische Räume gelangen sodann lüchtige Stofe wie Ethylen und Kohlenwasserstofe. Auch Monoterpene können sich in extraplasmatischen Bezirken anreichern. Gebildet werden Monoterpene in großen amöboiden Leukoplasten, die von einer Hülle aus endoplasmatischem Retikulum (ER) umgeben sind, das mit den äußeren Plastidenmembranen verbunden ist ( > unter Ölzellen, S. 99). Sodann ist auch von Phenolen bekannt, dass sie sich in periplasmatischen Bezirken anreichern können. In keimenden Samen von Brassica-Arten bilden bestimmte Phenole ofensichtlich eine Barriere der Zelle gegen Infektion (Zobel 1989).

4.4.6 Innergewebliche Sekret- und Akkumulationsstrukturen Auf Speicherung spezialisierte Einzelzellen; Idioblasten Idioblasten. In bestimmten parenchymatischen Geweben

sind alle Zellen fähig, Sekundärprodukte zu synthetisieren und zu speichern. In anderen Geweben hingegen gibt es Zellen, die auf die Speicherung spezialisiert sind. Sie unterscheiden sich unter dem Mikroskop von den umliegenden Zellen durch ihre Größe und histochemisch durch ihren Inhalt. Man nennt sie Idioblasten (griech.: idios [eigen, einzeln]; blastós [Gebilde]). Idioblasten ist ein morphologischer, kein physiologischer Terminus, insbesondere sind mit der Verwendung des Begrifes keine Aussagen über den Sekretionsmechanismus verknüpt. Es gibt sowohl Idioblasten mit lipophilen als auch mit polaren Inhaltsstofen. Selbst Zellen, die keine Akkumulationsfunktion haben, wie die Sklereiden (griech.: sklerós [hart]), zählen zu den Idioblasten, wenn sie isoliert in andersartigem Gewebe autreten. Ölzellen. Es liegen Einzelzellen vor. Der Inhalt, ätheri-

sches Öl, ist von einer besonderen Hülle umgeben, die der Zellwand ansitzt. Zur Genese: Die im Plasmaraum der Zelle synthetisierten lipophilen Terpenoide und Phenylpropanoide sammeln sich in periplasmatischen Bezirken, einer „extraplasmatischen Tasche“ (Ölbeutel) an, die der Zellwand ansitzt. Die Tasche erfüllt allmählich den ganzen

99

100

4

Postbiosynthetische Umsetzungen und Akkumulation von sekundären Pflanzenstoffen

. Abb. 4.23 le

. Abb. 4.24 ge

ö

p

i

i

i i

a Querschnitt durch den Rand eines Kronblattes der Lindenblüte (Tilia cordata MILL.): neben Idioblasten mit Oxalatdrusen eine Schleimidioblaste a zeigend (aus Gilg et al. 1927)

Acorus-calamus-Rhizom. Querschnitt durch ein Gefäßbündel des Zentralzylinders. le Siebteil, ge Gefäßteil, i Interzellularräume, ö Ölzellen (Ölidioblasten), p Parenchymzellen, die meisten mit winzigen Stärkekörnern gefüllt, andere – besonders um die Ölzellen herum – färben sich mit Vanillin-Salzsäure-Reagenz prächtig rot an (Catechingerbstoffidioblasten sind im ungefärbten Präparat nicht als solche kenntlich). Vergrößerung 1:175 (aus Gilg et al. 1927)

Zellraum. Das Plasma stirbt ab. Ölzellen sind typisch für Arten der Acoraceae, Lauraceae, Piperaceae und Zingiberaceae. Idioblasten mit Tanninen. Tannine können in Idioblasten in Mengen gespeichert werden, sodass sie unter dem Mikroskop als „Gerbstoballen“ zu erkennen sind, z. B. im Querschnitt der Eichenrinde als im Parenchym verstreute dünnwandige Zellen, die einen dichten, tief gelbbraunen Inhalt führen. In anderen Geweben geben sich Tannineführende Idioblasten erst nach Anfärbung zu erkennen. Als Beispiel sei auf > Abb. 4.23 verwiesen, die einen Querschnitt durch den Kalmus, Calami rhizoma zeigt. Die Droge enthält zwei unterschiedlich spezialisierte Idioblasten: neben den Gerbstofzellen noch zahlreiche Ölzellen. Tannine können schließlich in schlauchartigen Zellen, den Gerbstofschläuchen, gespeichert werden, beispielsweise bei Vertretern der Wolfsmilchgewächse (Euphorbiaceae [IIB12c]).

Idioblasten mit weiteren Sekundärstoffen. Für sehr unterschiedliche Stofgruppen wurde gefunden, dass sie in Idioblasten selektiv gespeichert werden können. Zu erwähnen sind zunächst die Schleimzellen. Sie zeichnen sich durch ihre Größe aus und dadurch, dass ihr Zelllumen extrem eingeengt ist, ähnlich wie das bei den Sklereiden der Fall ist. Meist wird der Schleim in den freien Zellraum zwischen Zellwand und Plasmalumen sezerniert. Volumen von Zytoplasma und Vacuole werden zunehmend zurückgedrängt, so lange bis die Zelle abstirbt. Schleimidioblasten dieser Art kommen in vielen Arten der Cactaceae, Crassulaceae und Orchidaceae vor. Bekannt für den Pharmazeuten sind die Schleimzellen der Althaea-, Malva- und Tilia-Arten ( > Abb. 4.24). Von den Schleimidioblasten zu unterscheiden sind die schleimsezernierenden Epidermiszellen, wie sie für Blätter sehr vieler zweikeimblättriger Planzen kennzeichnend sind. Morphologisch-anatomisch weichen sie von den übrigen Epidermiszellen nicht ab, sondern lediglich physiologisch durch die Fähigkeit zur Schleimabsonderung. Zu den Idioblasten zählen auch die Myrosinzellen (griech.: mýron [Balsam]), schlauchförmige Idioblasten, die in getrennten Zellkompartimenten Myrosinase (eine hioglucosidhydrolase) und Glucosinolate enthalten (Pihakaski u. Iversen 1976). Auch Steroidglykoside und Saponine können bei einigen Arten in Idioblasten gespeichert werden. Bei Dioscorea-Arten sind Teilmengen der Epidermiszellen beider Blattseiten als idioblastische Saponinspeicher ausgebildet (Roshchina u. Roshchina 1993).

4.4 Sekretion und Speicherung von Sekundärstoffen

. Abb. 4.25

4

Milchröhren

sp ep p

g cr

a

m gfb

Querschnitte durch die Randpartie eines Blattes von Aloe succotrina ALL. mit den Aloin-führenden Zellen a. Weitere Abkürzungen: sp Spaltöffnungen, ep Epidermiszellen, p und g Assimilationsgewebe, m schleimhaltiges Mark, cr Raphidenzellen, gfb Gefäßbündel

Anthranoide werden in Aloe-Arten in Zellen gespeichert, die in Gruppen halbkreisförmig die Gefäßbündel umgeben ( > Abb. 4.25). Auch Alkaloide können in Idioblasten gespeichert werden. Beispiele dafür sind die Acridonalkaloide in Wurzeln und Suspensionskulturen von Ruta graveolens (Eilert et al. 1986) und die Benzophenanthridinalkaloide im Rhizom von Sanguinaria canadensis L. Letzteres Beispiel ist insofern bemerkenswert, als es zeigt, dass Alkaloide in isodiametrischen Idioblasten, in anderen Organen derselben Planze aber in Milchsatschläuchen gespeichert werden. Im Rhizom von Sanguinaria canadensis L. kommen isodiametrisch gebaute, Alkaloideführende Zellen vor; die Alkaloide sind in einer großen Zentralvacuole lokalisiert (Literatur bei Wiermann 1981).

Milchröhren oder Milchschläuche sind Sekretbehälter, die von einer milchigen Flüssigkeit, auch als Latex bezeichnet, erfüllt sind. Bei Verletzung milchsatführender Planzenorgane ließt der Inhalt ot mit beträchtlicher Geschwindigkeit aus, ein Zeichen dafür, dass der Milchsat wegen der Turgeszenz der Milchröhren und der sie umgebenden Zellen unter Druck steht. Vom Melonenbaum, Carica papaya L., wird berichtet, dass bei oberlächlichem Anritzen des Stammes oder der Blattstiele Latex geradezu herausspritzen kann. Gelangt ein Spritzer ins Auge, kann ein unheilbarer Defekt die Folge sein (Brücher 1977). Bei Chelidonium majus L. entwickeln sich Milchröhren aus Primordialzellen, die deutlich sichtbar zwischen den Parenchymzellen junger Blätter zu erkennen sind. Die weitere Diferenzierung besteht darin, dass die Zahl an Vacuolen zunimmt, doch verschmelzen in der Regel die kleinen Vacuolen nicht zu einer einzigen Vacuole; Protoplasma und Zellorganellen werden an die Zellwände abgedrängt; in späteren Entwicklungsstadien werden die Organellen abgebaut. Die Funktionsfähigkeit einer Milchröhre als sekretorische Zelle ist von Planzenart zu Planzenart unterschiedlich, die Lebenszeit von Milchröhren ist in jedem Fall kürzer als die der Gesamtplanze. Zur Entwicklung von Milchröhren kommt es auf zweierlei Weise: x durch Zellverschmelzung unter Aulösung ursprünglich vorhandener Querwände (gegliederte Milchröhren), x durch Ausbildung von Rieseneinzelzellen, die das Parenchym durchwuchern (ungegliederte Milchröhren). Gegliederte Milchröhren bilden im Endzustand ein durch zahlreiche Querverbindungen ausgezeichnetes Röhrensystem. Milchröhren dieser Art sind bei den Papaveraceae [IIB1c] verbreitet: Papaver somniferum mit weißem, Chelidonium majus mit gelbem und Sanguinaria oicinalis mit rotem Latex. Weiterhin inden sie sich bei bestimmten Korbblütlern (Asteraceae [IIB28b]), insbesondere bei Lactuca- (Lattich) und Taraxacum-Arten (Löwenzahn; > Abb. 4.26). Auch Melonenbaumgewächse (Caricaceae) besitzen gegliederte Milchröhren, darunter der oben erwähnte Melonenbaum, ferner einige Vertreter der Wolfsmilchgewächse (Euphorbiaceae), darunter der Kautschukbaum, Hevea brasiliensis Muell. Arg. Den gegliederten Milchröhren stehen die ungegliederten Milchröhren gegenüber, die ihren Namen deshalb führen, weil sie nicht aus der Fusion zahlreicher Zellen her-

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Postbiosynthetische Umsetzungen und Akkumulation von sekundären Pflanzenstoffen

. Abb. 4.26

B

l obl rp l

m sb

a

sb m

c g hp

b a Tangentialer Längsschnitt durch die Innenrinde von Taraxaci radix, den Verlauf der Milchsaftschläuche (1) zeigend. b Querschnitt durch die Wurzel, um die Lokalisation der Milchsaftschläuche innerhalb der Wurzel zu illustrieren. Die Milchsaftschläuche (m) begleiten die Siebstränge (sb). Weitere Abbkürzungen: obl obliterierte Siebstränge, rp Rindenparenchym der sekundären Rinde, c Kambium, g Gefäße, hp Holzparenchym (aus Gilg et al. 1927)

vorgehen, sondern Entwicklungen aus idioblastenartigen Einzelzellen darstellen. Diese idioblastischen „Mutterzellen“ sind schon im Keimling nachweisbar, um sich im selben Maße wie der gesamte Vegetationskörper zu verlängern. Die einzelne Milchröhre kann sich verzweigen, doch enden alle Fortsätze blind, d. h. es kommt zu keiner Verbindung zwischen 2 oder mehreren Milchröhren einer Planze. Ungegliederte Milchröhren stellen Rieseneinzelzellen dar, die bei Bäumen Meterlängen erreichen können. Entsprechende Milchröhren indet man z. B. beim Feigenbaum (Ficus carica L.; Moraceae [IIBc] und beim Oleander (Nerium oleander L; Apocynaceae [IIBc]. In der Regel zeigt der aus Milchröhren ausließende Sat ein milchiges Aussehen, doch gibt es Ausnahmen, so bei zahlreichen Hundsgitgewächsen (Apocynaceae), deren „Milchsat“ transparent ist. Das milchige Aussehen beruht darauf, dass lipophile Stofe – Polyisoprenkohlenwasserstofe, Triterpene, Sterole, Fettsäuren, Carotinoide, Phospholipide u. a. – in Wasser (50–82%) emulgiert vorliegen, wobei Eiweißstofe als Schutzkolloide dienen. Polyisoprene ( > Abb. 4.27) treten häuig als Inhaltsstofe planzlicher Milchsäte auf. Technische Bedeutung haben Kautschuk, Guttapercha, Balata und Chicle.

Während einige tropische Vertreter der Wolfsmilchgewächse (Euphorbiaceae [IIB12c]) Polyisoprene führen, enthalten die Milchsäte der in gemäßigten Zonen wachsenden Euphorbia-Arten vielfach Triterpene, insbesondere Euphol, und Sitosterol. Ansonsten wurde im Milchsat von Wolfsmilchgewächsen eine breite Palette von Stofen gefunden: u. a. Lectine, antimikrobiell wirksame Proteine und Calmodulin. Im Latex von Euphorbia lathyris entfällt 7,5% des Trockengewichts auf Calcium, das wahrscheinlich durch Bindung an Calmodulin entgitet wird. Auf die zahlreichen weiteren Funktionen dieses Proteins kann nicht eingegangen werden. Wechselnd von Art zu Art kommen in Milchsäten die unterschiedlichsten Enzyme vor, werden doch viele Sekundärstofe, die im Latex gefunden werden, in den Plasmiden oder im Zytoplasmaraum der Milchröhren synthetisiert. Daneben wurden Enzyme gefunden, die nicht am Aubau planzeneigener Stofe beteiligt sind, beispielsweise Acetylcholinesterase, Hydrolasen, saure Phosphatasen oder Proteasen. Erwähnt sei das Papain, eine im Milchsat von Carica papaya L. (Caricaeae [IIB15c]) vorkommende Proteinase. Der eingetrocknete und gereinigte Milchsat bildet das Handelsprodukt Papain.

4.4 Sekretion und Speicherung von Sekundärstoffen

4

. Abb. 4.27 a) cis-1,4 = all-Z H3C

H3C

H3C

HeveaKautschuk b) trans-1,4 = all-E CH3

CH3

CH3 Balata Guttapercha

Polyisoprene, die als Bestandteil von pflanzlichen Milchsäften auftreten

An basischen Stofen können in Milchröhren Amine, u. a. Dopamin, und Alkaloide angereichert vorkommen. Das bekannteste Beispiel bietet Opium; es stellt den eingetrockneten Milchsat des Pericarps der unreifen Fruchtkapsel des Schlafmohns dar ( > Kap. 27.6.2). Infobox Ökobiochemische Aspekte der Milchsaftbildung. In über 12.000 Pflanzenarten wurden bisher Milchsaftröhren nachgewiesen. Der evolutive Vorteil der Milchsaftführung dürfte darin bestehen, die Pflanzen vor Herbivorie zu schützen, insbesondere dann, wenn die Milchsäfte bitter schmeckende und toxische Prinzipien enthalten. Bei Vertretern der Apocynaceae und Asclepiadaceae sind es Substanzen vom Typus herzwirksamer Glykoside, bei denen der artenreichen Euphorbiaceae (Wolfsmilchgewächse), Diterpene vom Typus der Phorbolester, die bei Säugetieren Hautreizungen hervorrufen und bei systemischer Zufuhr hoch toxisch sind. Viele Phorbolderivate (Tigliane) wirken tumorpromovierend, eine Wirkung, die aber wohl wegen ihrer langen Lagphase am akuten Deterrenseffekt kaum beteiligt sein kann. Auch auf Insekten wirken Phorbolderivate akut toxisch. Zur Insektenabwehr dürfte auch die Klebrigkeit von Milchsäften beitragen. Miniermotten z. B. vermeiden es, von Vertretern der Cichorieae zu fressen. Dass die Wegwarte, Cichorium intybus L., bemerkenswert wenig von Schadinsekten befallen wird, könnte ebenfalls mit den Latexbestandteilen Lactupikrin und 8-Desoxylactucin zu tun haben (Harborne 1995).

Sekretgänge und Sekretbehälter Es gibt keine eindeutige Sprachregelung: Anstelle von Sekretbehältern spricht man auch von Ölbehältern, Ölräumen und Exkretbehältern; Sekretgänge werden auch als Exkretgänge, Ölgänge, Ölkanäle und – eingeengt auf die Umbelliferenfrüchte – als Ölstriemen bezeichnet. Bei der Benennung überlagern sich physiologische Gesichtspunkte (Sekret, Exkret), morphologisch-anatomische Gesichtspunkte (Behälter, Gänge, Kanäle, Räume) mit historischen Inhaltsstobezeichnungen (Harze, Öle). Es gibt die mannigfachsten Überschneidungen. Lang gestreckte Gebilde können Latex, Harze oder Schleime enthalten. Harze, Schleime und Öle können aber auch in kugeligen Räumen gespeichert vorliegen. Noch mehr erschwert wird eine übersichtliche Gliederung durch den folgenden Umstand: Sekrete und Strukturen können physiologischer Natur sein, sie können aber auch das Ergebnis pathologischer Prozesse sein, d. h. erst nach Verletzung von Planzenorganen autreten oder nach Parasitenbefall. Die folgende Darstellung beschränkt sich auf die Beschreibung von Sekretbehältern und Sekretgängen, die lipophile Sekundärstofe in nichtemulgierter Form (Unterschied zu hydrophoben Stofen in Latexform) enthalten. Um diese Einschränkung zu kennzeichnen, wird anstelle von Sekreten (bzw. Exkreten) von Ölen und Harzen gesprochen. Öl steht im vorliegenden Zusammenhang als Abkürzung für ätherisches Öl, eine Sammelbezeichnung für ein komplexes Gemisch von mehr oder weniger lüchtigen, lipophilen Sekundärstofen: von Mono-, Sesquiund Diterpenen mit lipophilen Flavonen, Cumarinen, Benzofuranen u. a. Ist der Anteil leicht lüchtiger Stofe gering oder fehlt er ganz, spricht man von Harzen: Aus den

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Postbiosynthetische Umsetzungen und Akkumulation von sekundären Pflanzenstoffen

. Abb. 4.28 c ep

stä o

p1

rp ve

o

ca

p2 ge g

Schizogene (links) und lysigene Ölbehälter (rechts) im Vergleich. Die linke Abbildung zeigt einen mikroskopischen Querschnitt (Teilausschnitt) durch die Pimpinellwurzel (Pimpinella-saxifraga-Wurzel [Apiaceae]). Man erkennt am Ölbehälter o deutlich sezernierende Zellen, die den Interzellularraum auskleiden. Die rechte Abbildung mit einem Querschnittsbild (Teilausschnitt) durch die Gewürznelken (Hypanthium der Caryophylli flos von Syzygium aromaticum [Myrtaceae]) weist Ölräume o auf, die am Rand des Interzellularraums Zellwandreste erkennen lassen. Vergrößerung ca. 250fach (nach Gilg et al. 1927)

Ölbehältern und Ölgängen werden Harzbehälter und Harzgänge. Bei den Ölbehältern und Ölgängen handelt es sich um interzelluläre Akkumulationsräume (Sekret-/Exkreträume). Dabei stellen die Ölbehälter große, kugelige Hohlräume dar, die Ölgänge lang gestreckte, zylindrische Kanäle. Ihrer Entstehung nach plegt man Ölbehälter und Ölgänge in 2 Gruppen einzuteilen. Schizogene Ölbehälter und Ölgänge. Als schizogen (griech.: schízein [spalten]; gennáo [erzeugen]) bezeichnet man die Bildung von Hohl- oder Sekreträumen durch Auseinanderweichen von Zellen. Dazu muss die Mittellamelle aufgelöst werden. Diese Aulösung der Mittellamellen erfolgt in jungen Parenchymzellen, wodurch sich ein Spalt eröfnet, der sich mit dem Heranwachsen der Zellen zu einem Hohlraum vergrößert. Die den Hohlraum begrenzenden Zellen wandeln sich durch Radialteilung in ein kleinzelliges Epithel um, das nach innen lipophile Substanzen ausscheidet ( > Abb. 4.28). Schizogenen Ursprungs sind die Ölstriemen der Umbelliferenfrüchte, die Harzgänge in den Nadeln und im Holz der Pinaceae und die Ölbehälter des Johanniskrauts. Auch die Vertreter der Asteroideae (Unterfamilie der Asteraceae) enthalten in ihren Geweben schizogene Ölräume. Von pharmakognostischem Interesse sind die schizogenen Ölgänge im Blütenboden der Kamillenblüten, Matricariae los, mit einem ätherischen Öl, das erheblich von dem der Drüsenschup-

pen abweicht, insbesondere durch das Fehlen von Azulenbildnern. Lysigene Ölbehälter und Ölgänge. Als lysigen (griech.: lýein [aulösen]; gennáo [erzeugen]) bezeichnet man die Entstehung von Hohl- oder Sekreträumen durch Aulösung von Zellen. In einem parenchymatischen Gewebe bildet eine Zelle durch fortgesetzte Teilung einen zartwandigen Zellverband. In dem Maße, wie diese Zellen lipophile Exkrete/Sekrete sezernieren, lösen sich die Zellen, beginnend im Zentrum des Komplexes, auf. Der Aulöseprozess schreitet fort und kann zu Räumen von makroskopischen Ausmaßen führen, beispielsweise in Orangenschalen. Es hinterbleibt ein mit lipophilen Sekreten ausgefüllter Raum, der von Plasmaresten und Membranfetzen durchsetzt ist. Lysigenen Ursprungs sind die Ölbehälter der Rutaceae mit dem Pomeranzenblatt, den Orangenblüten, den Jaborandi- und den Buccoblättern, ferner die Ölräume bei Gossypium-Arten (Malvaceae [IIB16b]), in denen das toxische Gossypol gespeichert wird. Hinweis. Neben den schizogenen und lysigenen Ölbehältern kennt die Literatur eine 3. Gruppe: die schizolysigenen Ölbehälter. Schizolysigene Behälter entsprechen weitgehend den lysigenen Ölbehältern, doch geht während ihrer Bildung der Aulösung der Zellwände die Bildung eines Interzellularraumes voraus. Nach Buvat

4.4 Sekretion und Speicherung von Sekundärstoffen

(1989) sind schizolysigene Ölbehälter für die Rautengewächse (Rutaceae) charakteristisch. Im Endzustand lassen sich Ölbehälter lysigener und schizolysigener Genese mikroskopisch nicht auseinanderhalten, sodass – in Übereinstimmung mit der neueren Literatur (Stahl-Biskup u. Reichling 2003) – diese Diferenzierung für wenig bedeutsam angesehen wird.

4.4.7 Exotrope Sekretion und deren morphologische Strukturen In diesem Abschnitt sind Sekrete zusammengefasst, die nahe der Oberläche von Planzen lokalisiert sind. Sie haben in der Regel physiologische und/oder ökologische Funktionen.

Drüsenhaare

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amöboiden Plastiden und dem großen Zellkern auf. Die Ausgestaltung der Drüsenhaare ist artspeziisch und stellt daher ein gutes diagnostisches Merkmal bei der Drogenerkennung dar. Tollkirschenblätter z. B. tragen kurzgestielte Drüsenhaare mit vielzelligem Kopf und daneben noch kurz- und langgestielte Drüsenhaare mit einzelligem Kopf. Für Labiaten (Lamiaceen) sind die sog. Labiatendrüsenschuppen charakteristisch. Sie werden zu Beginn ihres Entwicklungsstadiums als kleine Köpfchenhaare mit scheibenförmiger Stielzelle und 1-, 2-, 4-, 8- oder 12-zelligen Köpfchen angelegt. In dem Maße, wie ätherisches Öl produziert wird, wird die Cuticula von der Außenwand der Zelle(n) abgehoben und überspannt als mit Öl gefüllte Blase die Köpfchenzellen ( > Abb. 4.29). Das zarte Häutchen der Cuticula kann schließlich platzen und das ätherische Öl freisetzen. Neben den Drüsenschuppen kommen bei den Labiaten auch gestielte Drüsenhaare vor. Die Compositendrüsenschuppen ( > Abb. 4.29) bestehen aus einer zwei Epidermiszellen aufsitzenden, aufrechten, 3- bis 5-etagigen Zellscheibe, die sich aus zwei seitlich miteinander verwachsenen Reihen von Zellen zusammensetzt.

Drüsenhaare und Trichome (Haare) mit Sekretionsfunktion (Drüsenfunktion), äußerlich, unter dem Mikroskop, erkenntlich an der vergrößerten Endzelle oder an einem mehrzelligen Köpfchen am Ende. Im einfachsten Fall besteht ein Drüsenhaar aus einer einzigen Stielzelle und nur einer vergrößerten sezernierenden Endzelle. Elektronenmikroskopisch fällt die Endzelle durch Reichtum an

Hinweis. Die Korbblütler (Asteraceae) speichern ätherisches Öl außer in Drüsenschuppen auch in schizogenen Ölgängen. Die stoliche Zusammensetzung der Öle in den beiden Speichern ist unterschiedlich. So sind die

. Abb. 4.29

c

cut dr

a b

stz f 0

a

50

c

100 µ

b

c

a Eine zwölfzellige, in die Blattfläche eingesenkte Labiatendrüsenschuppe in Seitenansicht. f Fußzelle, stz Stielzelle, dr Drüsenzellen, cut das von den Drüsenzellen abgeschiedene Sekret (ätherisches Öl) hat die Cuticula blasenartig abgehoben (aus Staesche 1970). b Fruchtknotenwand der Arnikablüte (Arnicae flos) im Längsschnitt. a Zwillingshaare, b Compositendrüsenschuppe, c Epidermis. Die Phytomelanschicht (dunkle Zonen) tritt deutlich hervor (aus Gilg et al. 1927). c Drüsenhaar vom Wiesensalbei (Salvia pratensis) mit blasenartig abgehobener Cuticula c; überproportional im Vergleich zu a und b vergrößert. Maßstab zum Original nicht angegeben (aus Troll 1973)

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4

Postbiosynthetische Umsetzungen und Akkumulation von sekundären Pflanzenstoffen

Drüsenschuppen bei der Kamille (Matricariae los) und bei der Schafgarbe (Millefolii herba) alleiniger Speicherort für Matricin (Proazulen). Hinzu kommen organspeziische Verteilungen: Bei der Kamille führen nur die Drüsenköpfchen der Blütenstände Matricin (Reichling et al. 1984). Der Durchmesser der verschiedenen Drüsenhaare, die bei höheren Planzen gefunden werden, variiert im Bereich 15–115 µm; die Sekretmenge pro Drüsenhaar liegt im Bereich von 0,2–2,4 µg. Es gibt wenig Studien dazu, wie viel lüchtige Substanzen die einzelnen Planzenarten freisetzen. Beim Walnussbaum, Juglans regia L., sollen es, bezogen auf 100 g Blattmasse (Trockengewicht) 1,87–2,16 mg/h sein, bei Pinus nigra ssp. pallasiana 1,30–1,50 mg/h. Pro 1 ha Wald sollen innerhalb von 24 h 2 kg lüchtige Stofe frei werden (Roshchina u. Roshchina 1993). Höhere Planzen sollen pro Jahr insgesamt 108 Tonnen Terpenoide und „nichtoxidierte Kohlenwasserstofe“ in die Biosphäre freisetzen (Went 1960). Dass aus Sekreträumen, die im Inneren von Geweben liegen, ätherisches Öl in die Umwelt gelangt, zeigt das bekannte Beispiel des Diptams, Dictamus albus L. Die Fruchtstände setzen ätherisches Öl in einer Konzentration frei, die die Planze an heißen und windstillen Tagen in eine Terpenwolke hüllt, die sich entzünden lässt.

Blattharze und mehlige Überzüge Die verschiedenartig ausgebildeten Drüsenhaare auf Blättern und Stängeln scheiden in dem Raum zwischen Außenwand und Cuticula ätherisches Öl ab, das, besonders bei heißem Wetter, verdunsten kann. Bei vielen Arten besteht die Menge des Sekrets jedoch nicht aus leicht lüchtigen Sekundärstofen, sondern aus nichtlüchtigen Verbindungen, die dann als harziger Blattbelag in Erscheinung treten. Die Harze stellen ein Vielstofgemisch dar, das den unterschiedlichsten Stofgruppen angehören kann. Eine Eigenschat aber ist allen Harzbestandteilen gemeinsam: Es handelt sich stets um hydrophobe (lipophile) Sekundärstofe. Das Harz beindet sich zunächst, wie das für ätherische Öle beschrieben wurde, zwischen Außenwand des Drüsenköpfchens und der Cuticula. Wenn immer mehr Harz ausgeschieden wird, platzt unter dem Überdruck die Cuticula, und Harz breitet sich über die Blattoberläche aus, Teile können sich u. U. auch im Cuticulawachs der Epidermiszellen lösen. Außer durch Drü-

sen können lipophile Sekundärstofe direkt von den Epidermiszellen durch die Cuticula nach außen gelangen. Die ausgeschiedenen Mengen sind manchmal beträchtlich: Bei Baccharis-Arten (Asteraceae [IIB29b]) sind es, bezogen auf die Blatttrockensubstanz 3–14%, bei Larrea divaricata Cav. (Zygophyllaceae [IIB6b]), dem Kreosotstrauch, 10–15% und bei Flourensia resinosa (Asteraceae [IIB29b]) sogar 28% (Wollenweber 1989). Harzige Epicutarausscheidungen sind außerordentlich weit verbreitet. Pharmazeutisches Interesse besitzt das als Haschisch bezeichnete Harz von Cannabis sativa L. Das Harz besteht hauptsächlich aus Cannabinoiden (Näheres > Abschnitt 26.7). Die Cannabinoide werden zunächst in den subcuticularen Zonen der Drüsenköpfchen gespeichert, wo sie mehr als 90% der Ablagerung ausmachen. Sobald die Blüte einsetzt, wird zunehmend mehr Harz produziert und ausgeschieden, das schließlich als klebriger Überzug, v. a. im Bereich der Triebspitzen weiblicher Planzen, in Erscheinung tritt. Neben den Cannabinoiden werden von der Haschischplanze lüchtige Terpene (ätherisches Öl) sezerniert. Die in der Rauschgitfahndung eingesetzten Haschischhunde sprechen nicht auf die mengenmäßig dominierenden Cannabinoide an, sondern auf Caryophyllenepoxid als bevorzugte Leitkomponente (Kunde 1974). Anstelle harzigklebriger Überzüge treten bei bestimmten Planzen mehlartige Überzüge auf. Die Mehlprimel, Primula farinosa L., verdankt dieser Eigenart ihren Namen.

Knospensekret Die Knospen der einheimischen Laubbäume, die nach winterlicher Ruhe im Frühjahr neue Triebe entwickeln, werden im Allgemeinen schon im Herbst angelegt. Ohne besondere Schutzeinrichtungen würden sie der Nässe und Kälte des Winters erliegen. Zu den Schutzeinrichtungen zählen besondere Hüllorgane, die bei einigen Arten noch durch „Leimausscheidungen“ miteinander verklebt sind und das Innere der Knospe nach außen hin vollkommen abdichten. Knospensekrete können auf verschiedene Weise gebildet werden: bei Pappeln durch ein sezernierendes Epithel (einschichtiges Drüsengewebe) auf der Innenseite der Knospenschuppen, bei Birken, Erlen, Rosskastanien durch mehrzellige Drüsenköpfchen, bei der Platane durch einzellige, gestielte Drüsen (Wollenweber 1989). Qualita-

4.4 Sekretion und Speicherung von Sekundärstoffen

tive und quantitative Gesamtanalysen fehlen bisher, doch wurden zahlreiche lipophile Zimtsäureester, Stilbene, Phenylpropane und Flavone identiiziert. Das Knospensekret wird im Frühjahr von Bienen gesammelt: Viele der im Sekret vorkommenden Stofe inden sich unverändert im sog. Propolis wieder.

Duft- und Aromastoffe aus nichtspezialisierten Zellen Flüchtige Stofe werden von den meisten höheren Planzen gebildet. In vielen Fällen ist die Produktion aber so beschränkt, dass keine spezialisierten Speicher ausgebildet werden. Viele Blütenblätter enthalten im Zytoplasma ihrer Epidermiszellen Tröpfchen lipophiler Stofe, die, kenntlich am Geruch, in die Umwelt freigesetzt werden. Bestimmte als Dutfelder bezeichnete Blütenblätter zeichnen sich dadurch aus, dass deren Epidermiszellen durchlässiger (poröser) sind; durch die Cuticula können die lipophilen Stofe hindurchdifundieren. Für diese Existenz von Dutfeldern spricht, dass sie sich mit dem Vitalfarbstof Neutralrot nach einer bestimmten Inkubationszeit stark anfärben (Heß 1990). Der Farbstof dringt in umgekehrter Richtung ein, in der die lipophilen lüchtigen Stofe Wände und Cuticula verlassen. Blütenbereiche ohne Dutstofabsonderung nehmen Neutralrot nicht oder kaum auf. Die lüchtigen Blütendüte von Rosen, Veilchen, Jasminblüten usw. beruhen auf den unterschiedlichsten aliphatischen und aromatischen Substanzen. Eine Auswahl davon zeigt > Abb. 4.30. Der Blütendut spielt bei Angiospermen die Rolle eines Lockstofes für bestäubende Insekten. Bienen z. B. reagieren auf Dutnoten, die auch der Mensch als angenehm empindet. Daneben gibt es Planzenarten, deren Blüten ausgesprochen unangenehm riechen. Unangenehme Gerüche stellen eine Art chemische Mimikry dar (Harborne 1995): Die Gerüche von verwesendem Eiweiß oder von Fäkalien werden produziert, um Aasliegen anzulocken. Die planzlichen Stinkstofe sind aliphatische Amine mit ihrem Geruch nach verdorbenem Fisch, Diamine mit ihrem Geruch nach verwesendem Eiweiß und die nach Fäkalien riechenden heterozyklischen Verbindungen Indol und Skatol ( > Abb. 4.31). Zu den Planzenarten mit unangenehm riechenden Blüten gehören v. a. viele Araceen, darunter Amorphophallus titanum Becc. (Stinkende Titanenwurz), Arum maculatum L.

4

(Aronstab) und Symplocarpus foetidus (L.) Nutt. („Skunk cabbage“), und Apiaceen, darunter Heracleum sphondylium L. (Bärenklau). Von einheimischen Planzen sind zu nennen Helleborus foetidus L. (stinkende Nieswurz) und Crataegus laevigata (Poir.) DC. (Weißdorn). Ebenso wenig wie den Dutstofen der Blüten lassen sich auch den Aromastofen zahlreicher Früchte keine spezialisierten Sekretionsstrukturen zuordnen. Vermutlich gelangen die Aromastofe auf ähnlichem Weg in die Außenwelt, wie das von vielen Blättern, Blüten und Früchten gebildete Ethylen, ein gasförmiges, lipophiles Sekret, das als Phytohormon fungiert. Ethylen wird laufend biosynthetisiert, ohne dass es entsprechend laufend abgebaut würde; es wird vielmehr unverändert aus der Planze durch Abgabe an die Außenwelt entfernt, wobei Difusionsvorgänge wesentlich beteiligt sein dürten. Über die ökologische Bedeutung der von Früchten freigesetzten Geruchsstofe liegen kaum Untersuchungen vor. Wenn das Obst in der Ernährung des Menschen einen hohen Stellenwert einnimmt, so tragen Aromastofe ganz entscheidend dazu bei: Bei der Banane ist Isopentenylacetat der charakteristische Aromaträger, bei Äpfeln 2-transund 3-cis-Hexenal oder bei der Himbeere das „HimbeerKeton“ 1-(p-Hydroxyphenyl)-3-butanon, wobei jeweils ein ganzes Bukett von Begleitstofen den Hauptdutträger unterstützt. Am Erdbeeraroma sind 4-Hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanon, Essigsäure und (Z)-3-Hexenal beteiligt. Dass Früchte höchst unangenehm riechen können, zeigt sich beim Ginkgobaum (Ginkgo biloba L.), wenn im Herbst die „Früchte“ vom Baum fallen. Bei den „Früchten“ handelt es sich um die Samenanlagen, deren äußere Schicht des Integuments, die Sarcotesta, zu einer harzig-leischigen Außenschicht geworden ist (Melzheimer 1992). Im reifen Zustand verströmt diese Schicht einen widerlichen Geruch nach Buttersäure. Eine von den Europäern als „Stinkfrucht“ bezeichnete Frucht, die Durianfrucht, wird in Ostasien als Delikatesse angesehen und gegessen. Die Stammplanze ist Durio zibethinus Mur., ein bis 20 m hoher Baum aus der Familie der Bombacaceae. Der unangenehme Geruch beruht auf lüchtigen Inhaltsstofen mit Schwefel im Molekül, darunter Schwefelwasserstof und Diethyldisulid.

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4

Postbiosynthetische Umsetzungen und Akkumulation von sekundären Pflanzenstoffen

. Abb. 4.30 H3C

CH3

O

CH3 CH3

OH

CH3

CH3

O

β-Damascenon

CH3

(−)-Rosenoxid

2-Phenylethanol

in Rosenblüten CH3

R

COOH

O CH3

CH3 NH2

O

O

Jasmon

(−)-Methyljasmonsäure

R = CH3, R = OCH3 in CastanopsisBlüten

in Jasminblüten O R3

CH3

R2

H3C

O

CH3

CH3

OH

CH3

R1 R1

R2

R3

H

H

CH3

H

CH3

H

CH3

H

H

β-Ionon in Veilchenblüten

in Mimosenblüten

Strukturen einiger Duftstoffe von Blüten . Abb. 4.31 Monoamine CH3NH2 CH3CH2NH2 CH3(CH2)2NH2 CH3(CH2)3NH2 CH3(CH2)4NH2 CH3(CH2)5NH2

Methylamin Ethylamin Propylamin Butylamin Amylamin Hexylamin

R

N H R = H: Indol R = CH3: Skatol

Diamine NH2−(CH2)4−NH2 NH2−(CH2)5−NH2

Indole

Putrescin Cadaverin

Von Blüten freigesetzte Stoffe mit für den Menschen unangenehmer Geruchsnote. Stets liegen komplizierte Gemische vor; jede Pflanzenart produziert ihre eigene Mischung als Signal für ganz bestimmte Insektenarten

Literatur

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Schlüsselbegriffe Akkumulation (von Sekundärstoffen) Betalaine Chlorophyllabbau Chromoplasten Cytochrom P450 Diurnale Schwankungen Drüsenhaare Ecdysone Exkrete (pflanzliche) Fließgleichgewicht Harze katabole Prozesse

Knospensekrete Idioblasten Kutinbildung Limonoide Milchöhren Milchschläuche Myrosinzellen Ölbehälter Ölgänge Ölzellen Ontogenese Oxidasen

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Postbiosynthetische Umsetzungen und Akkumulation von sekundären Pflanzenstoffen

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B B Pharmazeutische Aspekte 5 Biologische und chemische Screening-Methoden für Pflanzenextrakte – 113 6

Moderne Bioassay-Methoden

– 125

7

Das medizinische Potential von Pflanzenstoffen

8

Pflanzliche Arzneidrogen und einfache Arzneizubereitungen – 189

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Trockenextrakte

– 225

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Pflanzliche Fertigarzneimittel

– 261

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Enzyme bei der Gewinnung von Drogen – 285

– 151

5 5 Biologische und chemische Screening-Methoden für Pflanzenextrakte K. Hostettmann, A. Marston, E. Ferreira Queiroz 5.1

Biologische Screening-Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 5.1.1 DC-Bioautographie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115 5.1.2 HPLC-online-Bioassay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116

5.2

Chemische Screening-Methoden . . . . . . . . . . 5.2.1 LC/UV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.2 LC/MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.3 LC/NMR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2.4 Beispiele für chemisches Online-Screening

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Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123 Weiterführende Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124

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Biologische und chemische Screening-Methoden für Pflanzenextrakte

> Einleitung Biologisches und chemisches Screening gehört heute zu den täglich verwendeten Routinearbeiten des Phytochemikers bei der Suche nach neuen bioaktiven Naturstoffen. Das folgende Kapitel beschreibt das einfache und schnelle biologische Screening von Extrakten und daraus isolierten Reinsubstanzen. Beispiele sind DC-Bioautographie und HPLC-online-Bioassay zur Auffindung von antimikrobiell, antimykotisch und antioxidativ wirkenden Naturstoffen sowie zur Entdeckung von Radikalfängern und neuen Enzyminhibitoren. Zum Nachweis von Pflanzeninhaltsstoffen sowie zur Trennung von komplexen Naturstoffgemischen in Extrakten werden heute in erster Linie chromatographische Methoden in Kombination mit spektrometrischen [Massenspektrometrie (MS)] bzw. spektroskopischen [UV-Dioden-Array-Detektion, Kernresonanzspektroskopie (NMR)] Methoden verwendet. Die am meisten verwendeten Kopplungen der HPLC (LC) mit UV, MS und NMR werden näher beschrieben und anhand neuer Beispiele aus der Naturstoffforschung erläutert.

Um neue Wirkstofe in Planzen zu entdecken, müssen Extrakte auf das Vorhandensein neuer Verbindungen und ihrer biologischen Wirkung untersucht werden. Neue Verbindungen werden anschließend isoliert, damit Material zur Strukturauklärung und für weitere biologische und . Abb. 5.1

Die Isolierung reiner Verbindungen aus Pflanzen

toxikologische Tests zur Verfügung steht ( > Abb. 5.1). Der Weg von der Gesamtplanze bis zu ihren reinen Inhaltstoffen ist lang. Die Arbeiten können Wochen bis Jahre in Anspruch nehmen.

5.1 Biologische Screening-Methoden Wenn eine Planze zur Ermittlung der Wirkstofe untersucht wird, ist es unmöglich, alle Inhaltsstofe zu isolieren. Von den Hunderten oder sogar Tausenden unterschiedlicher Substanzen ist nur eine oder sind nur einige verantwortlich für die therapeutische Wirksamkeit (oder die toxische Wirkung, falls es darauf ankommt). Deshalb müssen zum Nachweis der Wirksubstanz(en) in Planzenextrakten oder in einzelnen Fraktionen, die bei der Aufarbeitung des Planzenmaterials zum reinen Wirkstof anfallen, relativ einfache biologische oder pharmakologische Tests zur Verfügung stehen (Hostettmann 1991). Solche Tests müssen sehr empindlich sein, weil die Wirkstofe in der Planze ot nur in kleinen Konzentrationen vorliegen. Sie müssen auch für das verfolgte Ziel, d. h. für die zu untersuchende Wirkung, speziisch sein. Die Objekte („targets“) biologischer Tests können in sechs Gruppen eingeteilt werden: x niedere Organismen: Mikroorganismen (Bakterien, Pilze, Viren); x wirbellose Organismen: Insekten, Krebstiere, Weichtiere; x isolierte subzelluläre Systeme: Enzyme, Rezeptoren; x Kulturen tierischer oder menschlicher Zellen;

5.1 Biologische Screening-Methoden

x isolierte Organe von Wirbeltieren; x lebende Tiere. Bei der Untersuchung einer antimykotischen, antiviralen oder antibakteriellen Wirkung ist das Vorgehen relativ einfach: ein Planzenextrakt oder eine isolierte Substanz wird in Kontakt mit humanen pathogenen Pilzen oder Bakterien gebracht. Dabei wird nur die Hemmung des Sporenwachstums oder das Absterben der Sporen bzw. die Hemmung des Bakterien- oder Virenwachstums beobachtet. Bestimmte Planzen weisen Insekten vertreibende oder insektizide Eigenschaten auf, während andere gegen Insektenlarven oder Weichtiere (Molluskizide) wirken. Screening-Tests auf diese Wirkung gegen wirbellose Organismen sind einfach durchzuführen. Insektizid oder larvizid wirksame Planzenextrakte können bei der Vorbeugung von tropischen Parasitenerkrankungen, die durch Mücken übertragen werden, wie Malaria oder Gelbieber, von großer Bedeutung sein. Molluskizid wirksame Planzenextrakte können die Verbreitung der Schistosomiasis (Bilharziose) stoppen, eine Parasitose mit einem Weichtier (Süßwasserschnecke) als Zwischenwirt, von der in Ländern der Dritten Welt über 250 Millionen Menschen befallen sind. Spektakuläre Fortschritte der letzten zwei Dekaden in der Zell- und Molekularbiologie ermöglichen heute unzählige biologische und pharmakologische Bioassays zum Nachweis von Wirkungsmechanismen von Substanzen. Wenn die Ursache einer Erkrankung bekannt ist, kann man direkt die Rezeptoren oder Enzyme hemmen bzw. induzieren, die an der Ätiologie der Krankheit beteiligt sind. So sind Substanzen, die die an Entzündungsprozessen beteiligten Enzyme Cyclooxygenase oder 5-Lipoxygenase hemmen, bei der Suche nach neuen antiphlogistischen Wirkstofen von großem Nutzen. Im Kampf gegen Krebs sind Inhibitoren der Enzyme Topoisomerase I und II, Proteinkinase C sowie Stofe, die die Polymerisierung von Tubulin beeinlussen, Ziele dieser Tests. Bei benigner Prostatahyperplasie (BPH), die häuig bei älteren Männern autritt, sind Hemmstofe von Enzymen, die den Testosteronspiegel modiizieren (5α-Reduktase, Aromatase), von großer Bedeutung. Zur Behandlung von Depressionen wird nach selektiven Inhibitoren von Enzymen gesucht (z. B. Monoaminooxidasehemmer), die den oxidativen Abbau von Monoaminen blockieren. Bei den angesprochenen Tests handelt sich um In-vitro-Tests mit Enzymen menschlichen oder tierischen Ursprungs.

5

Enzymatische Tests sind in der Regel sehr speziisch und empindlich. Bei Reihenuntersuchungen großer Probenmengen sind sie von besonderem Nutzen. Die Versuche sind ot relativ einfach und benötigen nur geringe Materialmengen. Andere In-vitro-Tests erfolgen mit Zellkulturen. In der Krebsforschung sind diese von großer Bedeutung. Einer der grundlegenden Tests verfolgt den Zweck, zytotoxische Moleküle oder Wachstumsinhibitoren für Tumorzellen menschlicher Herkunt zu inden. Manchmal werden anstelle von Tests mit Zellkulturen solche mit isolierten Tierorganen durchgeführt. Pharmakologische Modelle wie das perfundierte Froschherz werden in der Untersuchung von herzwirksamen Glykosiden eingesetzt. Andere Tests erfolgen beispielsweise mit der perfundierten Leber, dem Meerschweinchenherz oder isolierten Hühnervenen. Die Informationen, die mit diesen Tests gewonnen werden, sind ot hilfreich, geben aber kaum Aufschluss über die Wirkweise der Probe und können nicht auf den Menschen übertragen werden. Bioassays der Zell- und Molekularbiologie werden in Kap. 6 behandelt.

5.1.1 DC-Bioautographie Bei diesem Verfahren wird die Dünnschichtchromatographie (DC) in Kombination mit einem Bioassay in situ angewandt, sodass aktive Inhaltsstofe in einem Planzenextrakt lokalisiert werden können. Sporenbildende Pilze wie Aspergillus, Penicillium und Cladosporium spp. können alle als Zielorganismen eingesetzt werden, weil sie für bioautographische Verfahren geeignet sind. Nach der Autrennung der Substanzen und der Trocknung des DC-Lösungsmittels werden die Platten mit einer Mischung von Mikroorganismen und Nährmedium besprüht ( > Abb. 5.2). Anschließend werden sie in feuchter Atmosphäre inkubiert. Bereiche der Inhibition erscheinen dort, wo das Pilzwachstum durch die aktiven Inhaltsstofe des Planzenextrakts verhindert wird. Die Bioautographie mit Cladosporium cucumerinum wird schon seit längerer Zeit erfolgreich eingesetzt (Homans u. Fuchs 1970). Da mit Hefepilzen wie Candida albicans eine direkte Bioautographie nicht möglich ist, wurde ein einfacher und schneller Agar-Overlay-Assay entwickelt (Rahalison et al. 1991). Bei diesem Kontakt-Bioautographieverfahren werden über einen Difusionsprozess die aktiven Verbindungen aus der stationären Phase in die Agarschicht (die

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5

Biologische und chemische Screening-Methoden für Pflanzenextrakte

. Abb. 5.2

Direkte antimykotische DC-Bioautographie mit dem pflanzenpathogenen Pilz Cladosporium cucumerinum. Nach der Auftrennung der Substanzen und der Trocknung des DC-Lösungsmittels wird die Platte mit einer Mischung aus dem Mikroorganismus und dem Nährmedium besprüht und anschließend inkubiert. Bereiche der Inhibition erscheinen dort, wo das Pilzwachstum durch die aktiven Inhaltsstoffe des Pflanzenextrakts verhindert wird

den Mikroorganismus enthält) übertragen. Nach der Inkubation wird die Platte mit Methylthiazolyltetrazoliumchlorid (MTT) besprüht, das vom Pilz zu einem MTTFormazanfarbstof umgewandelt wird. Die Inhibitionsbereiche werden als helle Flecken auf rotem Untergrund sichtbar. Die DC-Bioautographie kann auch für die Entdeckung von antioxidativen Aktivitäten und von Radikalfängern eingesetzt werden. Für Radikalfänger wird die DC-Platte mit einer methanolischen Lösung des stabilen 2,2ʹ-Diphenyl-1-picrylhydrazyl-Radikal (DPPH) besprüht. Auf der Platte erscheint die violette Farbe des DPPH. Nur in den Regionen, wo sich Radikalfänger beinden, ist keine . Abb. 5.3

violette Farbe vorhanden, sondern gelb-weiße Flecken ( > Abb. 5.3). Eine andere Alternative ist die Anwendung der DCBioautographie für die Entdeckung neuer Enzyminhibitoren. Die Methode ist z. B. für die Cholinesterasehemmer geeignet. Die Cholinesterasen spielen nach heutiger Kenntnis eine Rolle bei der Entstehung der AlzheimerKrankheit, und die Hemmung dieser Enzyme zeigt einen Efekt im Sinne einer Progressionsverzögerung der Symptome der Krankheit (vgl. dazu Kap. 26.5.10.5, Infobox Demenz). Bei der DC-Methode wird ein Substrat, α-Naphtyl-Acetat, durch das Enzym in α-Naphtol umgewandelt ( > Abb. 5.4). Das α-Naphtol gibt mit Echtblausalz B einen Diazo-Farbstof. Die violette Farbe dieses Farbstofs bildet einen Hintergrund auf der DC-Platte. Hemmer des Enzyms hindern die Bildung des α-Naphtols und führen zu weißen Flecken auf der DC-Platte (Marston et al. 2002) ( > Abb. 5.5).

5.1.2 HPLC-online-Bioassay

DC-Bioautographie für die Entdeckung von Radikalfängern. Die Platte wird mit einer 0,2% Lösung von DPPH in Methanol besprüht. Radikalfänger erscheinen als gelbweiße Flecken auf einem violetten Hintergrund

Um ein rasches Screening von Planzenextrakten zu erreichen, ist die Kopplung der HPLC mit einem Bioassay möglich. Mit dieser Methode können komplexe Mischungen in kürzester Zeit analysiert werden. Ein Beispiel ist die Kopplung der HPLC mit dem DPPH-Verfahren für das Screening für Radikalfänger (Koleva et al. 2000). Die Probe wird über eine HPLC-Säule getrennt und die Komponenten werden mittels UV-Detektor nachgewiesen ( > Abb. 5.6). Gleichzeitig wird ein Teil vom Eluens aufgesplittet und mit einer DPPH-Lösung reagieren gelassen. Radikalfänger werden als negative Peaks bei 517 nm detektiert. Dabei ist es möglich, eine Aktivität direkt mit

5.1 Biologische Screening-Methoden

. Abb. 5.4

Reaktion von α-Naphtyl-Acetat mit Acetylcholinesterase (AChE) und Bildung eines Diazo-Farbstoffs aus α-Naphtol . Abb. 5.5

DC-Bioautographie für Acetylcholinesterase-Hemmer. Aktive Substanzen erscheinen als weiße Flecken

. Abb. 5.6

HPLC-DPPH Nachweis von Radikalfängern in einem Gemisch

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5

Biologische und chemische Screening-Methoden für Pflanzenextrakte

einem Peak im Chromatogramm nachzuweisen. Ebenfalls kann eine Quantiizierung erreicht werden.

5.2 Chemische Screening-Methoden Bei der Suche nach aktiven planzlichen Metaboliten ist das biologische Screening, gefolgt von wirkungsorientierter Fraktionierung („bioassay-guided fractionation“), das Standardverfahren. Bioassays dienen auch als Leitlinie während des Isolierungsprozesses. Allerdings ist die Anzahl der verfügbaren Tests beschränkt und die Bioassays sagen nichts über die klinische Wirksamkeit aus. Die Strategie der aktivitätsgeleiteten Fraktionierung endet ot mit der Isolierung schon bekannter Stofwechselprodukte. Das chemische Screening planzlicher Rohextrakte stellt deshalb einen eizienten ergänzenden Ansatz dar, der die Lokalisierung und die gezielte Isolierung neuer bzw. neuartiger Inhaltsstofe mit potentieller Wirksamkeit ermöglicht. Dieses Verfahren erlaubt auch die Erkennung bekannter Metaboliten in der frühesten Phase der Trennung, wodurch die kostspielige und Zeit raubende Isolierung ubiquitärer Inhaltsstofe vermieden wird (Dereplikation). Das Potential der Strategie des chemischen Screenings wurde durch die Entwicklung von gekoppelten Verfahren beträchtlich vergrößert. Diese ermöglichen eine eiziente Trennung von Metaboliten und liefern parallel dazu „online“ wertvolle strukturelle Informationen (Hostettmann et al. 1997). Die HPLC wird in der Phytochemie routinemäßig zur „Steuerung“ der präparativen Isolierung von Naturstofen und zur Kontrolle der endgültigen Reinheit der isolierten Verbindungen eingesetzt. Die HPLC ist das am besten geeig-

nete Verfahren für eine eiziente Trennung planzlicher Rohextrakte und kann mit verschiedenen spektroskopischen Nachweismethoden kombiniert werden. Auf diese Weise lassen sich mit nur wenigen Mikrogramm Probematerial große Mengen struktureller Informationen über die Inhaltsstofe eines Planzenextraktes gewinnen.

5.2.1 LC/UV HPLC gekoppelt mit einem UV-Dioden-Array-Detektor (LC/UV) ( > Abb. 5.7) wird schon seit über zwanzig Jahren von Phytochemikern zum Screening von Planzenextrakten eingesetzt und ist in vielen Laboratorien ein übliches Verfahren geworden. Die UV-Spektren von Naturstofen liefern wertvolle Informationen über die Art der Inhaltsstofe und, wie bei den Polyphenolen, über das Oxidationsmuster. Neue Instrumente ermöglichen die Erfassung der UV-Spektren von Bezugsverbindungen in Datenbanken. Damit kann bei der Prüfung auf bekannte Inhaltsstofe ein automatischer Datenvergleich mit dem Computer durchgeführt werden. Neben der LC/UV-Kopplung wurde in neuerer Zeit die HPLC in Kombination mit der Massenspektrometrie (LC/MS) und mit der Kernresonanzspektroskopie (LC/ NMR) eingeführt.

5.2.2 LC/MS Derzeit ist die MS eines der empindlichsten Verfahren zur molekularen Analyse. Weiterhin kann sie Informationen

. Abb. 5.7

Chemisches Screening mit simultanen LC/UV, LC/MS und LC/NMR-Analysen

5.2 Chemische Screening-Methoden

über das Molekulargewicht wie auch über die Struktur des zu analysierenden Stofes liefern. Aufgrund der hervorragenden Massentrennung kann auch eine sehr gute Selektivität erreicht werden. Die Kopplung von LC und MS ist nicht einfach, da die üblichen Betriebsbedingungen eines Massenspektrometers (Hochvakuum, hohe Temperatur, Analyse in der Gasphase und geringe Flussrate) denjenigen der HPLC genau entgegengesetzt sind, nämlich Analyse in der Flüssigphase, hoher Druck, hohe Flussrate und relativ niedrige Temperatur. Wegen der grundlegenden Gegensätze von HPLC und MS ist eine Online-Kopplung dieser Verfahren schwierig. Es wurden deshalb verschiedene LC-MS-Interfaces (Verbindungsglieder zwischen den Systemen, vgl. Infobox „Interfaces in der HPLC/MSKopplung“) konzipiert, um diese Probleme zu überwin-

5

den. Jede der Kopplungsmöglichkeiten hat ihre speziischen Eigenschaten und Anwendungsbereiche. Mehrere davon eignen sich zur Analyse planzlicher Sekundärstofe. Für das HPLC-Screening von planzlichen Rohextrakten werden vier Schnittstellen eingesetzt, nämlich „atmospheric pressure chemical ionization“ (APCI), hermospray (TSP), Durchluss-FAB (CF-FAB) und Electrospray (ES) (Wolfender et al. 1995). Sie decken die Ionisierung relativ kleiner nichtpolarer Stofe (MG ~200, z. B. Aglykone) bis hin zu hoch polaren Molekülen (MG ~2000, z. B. Glykoside) ab. LC/APCI-MS ermöglicht eine ausreichende Ionisierung mäßig polarer Inhaltsstofe wie Polyphenole oder Terpenoide. Bei größeren polaren Molekülen wie Saponinen (MG >800) ist ES das Verfahren der Wahl.

Infobox: Interfaces in der HPLC/MS-Kopplung Thermospray(TSP)-Interface. Die mobile Phase wird durch Erhitzen verdampft und vernebelt und erzeugt dabei einen Dampfstrahl, der feine Tröpfchen oder Partikel enthält. Ein Teil des in der Ionenquelle erzeugten Dampfes und der Ionen wird in das Vakuumsystem des Massenspektrometers überführt, während der Rest des Dampfes von einer mechanischen Pumpe abgesaugt wird. Um die Ionisation zu verbessern, wird ein Puffer, z. B. Ammoniumacetat, zugegeben. Für Naturstoffe liefert TSP ähnliche Spektren wie diejenigen, die durch chemische Ionisation mit NH3 als Reaktantgas erhalten werden. Atmospheric Pressure Chemical Ionization-(APCI-)Interface. APCI läuft, wie ES, unter Atmosphärendruck ab. Nach der Verdampfung der mobilen Phase in einer Kapillare, wird der Dampfstrahl durch eine beheizte Keramik (300–400 °C) geführt und anschließend über eine Corona-Entladungsnadel geführt, wobei Lösungsmittelmoleküle ionisiert werden. Diese wiederum ionisieren die Analytmoleküle, die dann ins Vakuum überführt werden. Die Methode ist auch für weniger polare Analyten geeignet. Es treten vermehrt Fragmentionen als bei der ES-Ionisation auf.

Continuous-flow-FAB-(CF-FAB-)Interface. Die mobile Phase wird mit Hilfe einer Kapillare direkt in die Ionenquelle des Massenspektrometers überführt. Die Kapillare endet an der Metallspitze, die wie beim statischen FAB („fast atom bombardment“) von Xenonatomen beschossen wird. Bevor die Probe ins Interface gelangt, wird eine Lösungsmittelmischung, die eine nichtflüchtige Matrix, z. B. Glycerol (2– 10%), enthält, beigegeben. Die Flussrate der Probe beträgt 5–10 µl/min. Dank der niedrigen Flussrate ist kein zusätzliches Pumpensystem für die MS-Analyse notwendig. Electrospray-(ES-)Interface. Durch ein hohes Potential werden geladene Tröpfen erzeugt. Im Gegensatz zu TSP oder CF-FAB, bei denen sich die Ionenquelle im Vakuumbereich des Massenspektrometers befindet, bleibt die Ionenquelle beim ES unter Atmosphärendruck. Die Probelösungen werden durch eine Injektionsnadel mit einer Flussrate von 5–20 µl/min in die Verdampfungskammer überführt. Der Laufmitteldampf wird durch ein Gasbad weggeführt, während die ionisierten Substanzen zu einer Transferkapillare gelangen und durch einen Überschallstrom in die erste Vakuumkammer des MS-Analysators transportiert werden. Die Vernebelung kann auch pneumatisch unterstützt werden, was eine Flussrate von bis zu 1 ml/min erlaubt.

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Biologische und chemische Screening-Methoden für Pflanzenextrakte

5.2.3 LC/NMR LC/NMR ist zwar schon seit zwanzig Jahren bekannt, hat sich aber vor allem wegen seiner unzureichenden Empindlichkeit noch nicht allgemein durchgesetzt. Aber die Fortschritte jüngeren Datums im Bereich der Impulsfeldgradienten und der Verringerung der Lösungsmittelmenge, die Verbesserung in der Sondentechnik und der Bau von Hochfeldmagneten haben diesem Verfahren einen neuen Impuls gegeben. LC-NMR bietet ein gutes Potential für die Online-Bestimmung der Struktur von Naturstofen in Planzenextrakten, d. h. ohne sie isolieren zu müssen.

Die Kernresonanzspektroskopie ist bei weitem das leistungsfähigste Spektroskopieverfahren zur Ermittlung detaillierter Informationen über die Struktur organischer Verbindungen in Lösung.

5.2.4 Beispiele für chemisches Online-Screening Ein Beispiel ist die Online-Identiizierung bioaktiver Substanzen aus der afrikanischen Planze Blumea gariepina (Asteraceae [IIB28b]). Der Dichlormethan-Extrakt der

. Abb. 5.8a–c

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c Chemisches Screening eines CH2Cl2-Extrakts aus Blumea gariepina. a LC/UV (50 µg Extrakt); b LC/UV Steuerung der LC/1HNMR-Analyse (10 mg Extrakt); c Aktivitäten der Fraktionen gegen Acetylcholinesterase und Cladosporium cucumerinum

5.2 Chemische Screening-Methoden

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. Abb. 5.9

Inhaltsstoffe von Blumea gariepina, identifiziert mittels LC/UV/MS und LC/NMR. 1: 5,7,2’,5’-Tetrahydroxy-3,4’-dimethoxyflavon; 2: 5’-Acetoxy-5,7,2’-trihydroxy-3,4’-dimethoxyflavon; 3: 3’,5,7-Trihydroxy-3,4’-dimethoxyflavon; 4: 2-Methyl-5-hydroxyacetylthymol (vorgeschlagen); 5: 2-Hydroxyacetylthymol; 6: 5-Hydroxyacetylthymol; 7: Thymol; 8: Acetylthymol

oberirdischen Planzenteile zeigte eine Hemmung der Acetylcholinesterase (AChE) und eine Aktivität gegen Cladosporium cucumerinum. Eine LC/UV-Trennung des Extrakts zeigte 8 Peaks, die als Flavonoide oder Phenole zugeordnet werden konnten ( > Abb. 5.8a). Zusätzliche Information ergab eine LC/APCI-MSn-Trennung. Anschließend wurde eine On-low-LC/1H-NMR-Analyse durchgeführt. Um genügend Probe (10 mg) einspritzen zu können, wurde eine C-18-Säule (8 mm Durchmesser) angewendet. Bei einem Durchluss von 1 ml/min (CH3CN–D2O als Lösungsmittel) konnte eine ausreichende Aulösung erreicht werden ( > Abb. 5.8b). Während der LC-Trennung wurden die NMR-Spektren der Peaks aufgenommen. Gleichzeitig wurden Fraktionen in Eppendorf-Röhrchen gesammelt (LC-Mikrofraktionierung). Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels konnten Bioassays (AChE-Hemmung und C. cucumerinum) durchgeführt werden. Die aktiven Peaks sind in > Abb. 5.8c zu sehen. Die Interpretation der NMRSpektren (mit Hilfe von so genannten „Shit-Reagenzien“ in der Online-LC/UV Analyse) zeigte die Anwesenheit von 3 Flavonolen und 5 hymolderivaten im Extrakt ( > Abb. 5.9) (Queiroz et al. 2005).

. Abb. 5.10a–c

a

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Chemisches Screening eines CH2Cl2-Extrakts aus Erythrina 7 vogelii. a LC/UV (50 µg Extrakt); b LC/UV Steuerung der LC/1H-NMR-Analyse (10,5 mg Extrakt); c Aktivitäten der Fraktionen gegen Cladosporium cucumerinum (LC-Mikrofraktionierung). Miconazol wird als Referenzsubstanz c verwendet. Nach einer Retentionszeit von 8,3 Stunden eluiert eine unbekannte fungizide Substanz

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Biologische und chemische Screening-Methoden für Pflanzenextrakte

. Abb. 5.11

Online-UV- und 1H-NMR-Spektren von zwei Inhaltsstoffen aus Erythrina vogelii

. Abb. 5.12

Inhaltsstoffe von Erythrina vogelii, identifiziert mittels LC/UV/MS und LC/NMR. 1: Isowighteon; 2: Vogelin B; 3: Vogelin A; 4: Vogelin D; 5: Isoderon; 6: Vogelin C; 7: Isolupalbigenin; 8: 6,8-Diprenylgenistein

Literatur

Erythrina vogelii (Fabaceae [IIB9a]), ein Baum von der Elfenbeinküste, wurde untersucht, weil die Wurzel antimykotisch wirksame Verbindungen enthält. Ein Dichlormethanextrakt der Wurzel wurde mit LC/1H-NMR, Hochaulösung LC/APCI-Q-TOF/MS/MS und LC/UV (mit „Shit-Reagenzien“) analysiert, um die Strukturaufklärung der aktiven Verbindungen online zu erreichen. LC/UV zeigte ein Dutzend Peaks ( > Abb. 5.10a). LC/ APCI-MS/MS gab Hinweise über die Molekulargewichte und Fragmentierungen dieser Substanzen. Mit Hilfe von LC/Q-TOF/MS Experimenten war es möglich, die Strukturformel abzuleiten. Diese Ergebnisse deuteten auf Isolavone oder Isolavanone. Um weitere Daten zu erhalten, wurde eine On-low-LC/1H-NMR-Analyse durchgeführt. Eine Probemenge von 10,5 mg wurde auf einer C-18Säule (8 mm Durchmesser) getrennt. Bei einem Durchluss von 0,1 ml/min (CH3CN–D2O als Lösungsmittel) konnte eine ausreichende Aulösung in einer Laufzeit von 18 Stunden erreicht werden ( > Abb. 5.10b). Aktivitäten gegen den planzenpathogenen Pilz C. cucumerinum wurden durch eine LC-Mikrofraktionierung nachgewiesen ( > Abb. 5.10c). Dabei wurden Aktivitäten in 5 Fraktionen gefunden. Das Oxidationsmuster konnte durch LC/UV mit „Shit-Reagenzien“ (AlCl3 und NaOAc) festgestellt werden ( > Abb. 5.11). Die endgültige Strukturauklärung konnte mit On-low-LC/1H-NMR-Analysen (für die

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Verbindungen 1 und 3 in > Abb. 5.11 dargestellt) erzielt werden. Damit konnten die Strukturen von 5 Isolavonen und 3 Isolavanonen aufgeklärt werden ( > Abb. 5.12) (Queiroz et al. 2002).

! Kernaussagen

Die schnelle Entdeckung biologisch aktiver Naturstoffe spielt eine entscheidende Rolle in der phytochemischen Untersuchung von Pflanzenextrakten. Biologische Prüfung, DC- und HPLC-Analysen (DC-Bioautographie und HPLC-online-Bioassay) werden gleichzeitig eingesetzt, um ein rationelles Screening der Extrakte durchzuführen. Die Kopplung der HPLC (LC) mit spektroskopischen/spektrometrischen Methoden wie der Dioden-Array-Detektion (LC/UV) und der Massenspektrometrie (LC/MS) liefert erhebliche Strukturinformationen über Inhaltsstoffe von Pflanzenextrakten, ohne dass diese isoliert werden müssen. Die Kopplung der HPLC mit der Kernresonanzspektroskopie (LC/NMR) stellt eine wesentliche Ergänzung des LC/ MS/UV-Screenings dar. Mit Hilfe dieser Methoden wird die wiederholte Aufreinigung längst bekannter Naturstoffe vermieden und die gezielte Isolierung neuer bzw. neuartiger Substanzen mit interessanten biologischen oder chemischen Eigenschaften ermöglicht.

Schlüsselbegriffe Acetylcholinesteraseinhibitoren Biologische Screening-Methoden Blumea gariepina Chemische Screening-Methoden

Cladosporium cucumerinum DC-Bioautographie Erythrina vogelii HPLC-online-Bioassay

Literatur Homans AL, Fuchs A (1970) Direct bioautography on thin layer chromatograms as a method for detecting fungitoxic substances. J Chromatogr 51: 327–329 Hostettmann K (1991) Methods in plant biochemistry, vol. 6. Assays for bioactivity. Academic Press, London Hostettmann K, Wolfender JL, Rodriguez S (1997) Rapid detection and subsequent isolation of bioactive constituents of crude plant extracts. Planta Med 63: 2–10 Koleva II, Niederländer HAG, van Beek TA (2000) An on-line HPLC method for detection of radical scavenging compounds in complex mixtures. Anal Chem 72: 2323–2328 Marston A, Kissling J, Hostettmann K (2002) A rapid TLC bioautographic method for the detection of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase inhibitors in plants. Phytochem Anal 13: 51–54

LC-Mikrofraktionierung LC/UV-, LC/MS- und LC/NMR-Analysen Radikalfänger Targets für Bioassays

Queiroz EF, Ioset JR, Ndjoko K, Guntern A, Foggin CM, Hostettmann K (2005) On-line identification of the bioactive compounds from Blumea gariepina by LC/UV/MS and LC/UV/NMR, combined with LC/micro-fractionation. Phytochem Anal 16: 166–174 Queiroz EF, Wolfender JL, Atindehou K, Traore D, Hostettmann K (2002) On-line identification of the antifungal constituents of Erythrina vogelii by liquid chromatography with tandem mass spectrometry, ultraviolet absorbance detection and nuclear magnetic resonance spectrometry combined with liquid chromatographic micro-fractionation. J Chromatogr A 974: 123–134 Rahalison L, Hamburger M, Hostettmann K, Monod M, Frenk E (1991) A bioautographic agar overlay method for the detection of antifungal compounds from higher plants. Phytochem Anal 2: 199– 203 Wolfender JL, Rodriguez S, Hostettmann K, Wagner-Redeker W (1995) Comparison of liquid chromatography-electrospray, atmospheric

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5

Biologische und chemische Screening-Methoden für Pflanzenextrakte

pressure chemical ionization, thermospray and continuous-flow fast atom bombardment mass spectrometry for the determination of secondary metabolites in crude plant extracts. J Mass Spectrom & Rapid Commun Mass Spectrom S35–46

Weiterführende Literatur Atta-ur-Rahman, Choudhury MI (2002) Bioassay techniques for drug development. CRC Press, Baton Rouge

Hostettmann K, Wolfender JL, Potterat O (1997) Rationelles Screening. Dtsch Apoth Ztg 137: 1451–1458 Hostettmann K, Wolfender JL, Marston A (2003) Hyphenated HPLC techniques for screening and quality control. In Society for Medicinal Plant Research – 50 years 1953–2003: A Jubilee Edition. Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart, pp 99– 108 Williamson EM, Okpako DT, Evans FJ (1996) Selection, preparation and pharmacological evaluation of plant material. John Wiley, Chichester.

6 6 Moderne Bioassay-Methoden J. Heilmann 6.1

Allgemeines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127

6.2

Testsysteme mit Bezug zur Entzündungshemmung (Phospholipase-, Cyclooxygenaseund Lipoxygenasehemmung) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2.1 Phospholipase-A2-Hemmung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2.2 Cyclooxygenasehemmung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2.3 Lipoxygenasehemmung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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6.3

Messung von Radikalfängereigenschaten und antioxidativen Eigenschaten . . . . . . . . . . . 132

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Messung der Beeinlussung von mRNA-Spiegeln . . 6.4.1 Testsysteme auf der Basis von Reportergenen . 6.4.2 Real-time-RT-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . 6.4.3 Microarrays (Gen-Chips) . . . . . . . . . . . .

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6.5

Testsysteme mit Bezug zur Bekämpfung von Tumoren . . . . . . . . . . 6.5.1 Messung der metabolischen Aktivität . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.5.2 Inkorporationsassays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.5.3 Bestimmung von Zellvitalität und Zelltod (Apoptose und Nekrose)

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6.6

Testsysteme mit Bezug zur Bekämpfung von Plasmodien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141

6.7

Testsysteme zur Bestimmung der Permeabilität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142

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Testsysteme mit Bezug zur Metabolisierung

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Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148

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Moderne Bioassay-Methoden

> Einleitung Versucht man sich in der retrospektiven Betrachtung phytochemischer Publikationen der letzten zwei Jahrzehnte, so fällt auf, dass es in diesem Bereich in wenigen Jahren zu einer unübersehbaren Verschiebung des wissenschaftlichen Schwerpunktes gekommen ist. Während sich noch vor gut zehn Jahren ein großer Anteil phytochemischer Arbeiten ausschließlich mit der Isolierung, Strukturaufklärung sowie der physikalischen und chemischen Charakterisierung von pflanzlichen Sekundärstoffen beschäftigt hat, so finden sich in der Mehrzahl der heutigen Publikationen auch umfangreiche Daten zu den biologischen und pharmakologischen Eigenschaften der isolierten Verbindungen. Dieser Trend ist inzwischen soweit fortgeschritten, dass die zunehmende Schwierigkeit rein phytochemische Arbeiten in Zeitschriften mit höherem Impact Factor zu platzieren unübersehbar ist. Die Frage der Reviewer nach den biologischen und pharmakologischen Eigenschaften einer isolierten Substanz ist hier in vielen Beurteilungen Kernpunkt der Kritik.

Der Fortschritt in den Methoden der Biochemie, der Zellund Molekularbiologie sowie neue wissenschatliche Denkansätze zur Untersuchung des Proteoms und Genoms („Proteomics“ und „Genomics“) haben zur Entwicklung einer fast unübersehbaren Anzahl von neuen Testsystemen geführt, die in die Suche nach neuen Naturstofen integriert worden sind (vgl. Kap. 5). Der mit der Einführung der kombinatorischen Chemie geäußerte Verdacht, dass Naturstofe zuküntig bei der Leitstruktursuche (Auindung von neuen Leitstrukturen: „lead identiication“) und -optimierung nur eine geringe Rolle spielen könnten, hat sich nicht bestätigt. Heute sind sich zunehmend mehr Autoren darüber einig, dass im Rahmen der Neuentwicklung von Arzneistofen nicht auf Naturstofe verzichtet werden kann (Koehn u. Carter 2005). Ihre Strukturvielfalt (Strukturdiversität), die insbesondere deutlich wird an den zahlreichen verschiedenen Kohlenstofskeletten der terpenoiden Verbindungen und der Alkaloide (vgl. Kap. 23–25 und 27), wird von der Synthesechemie ot nicht erreicht, sodass sich beide Arbeitsgebiete im Bereich der Wirkstofsuche ideal ergänzen ( > Abb. 6.1). Die möglichst frühe Integration von Bioassays in den Screening-Prozess ermöglicht es, auch in einer komplexen

Matrix vorkommende bioaktive Substanzen zu detektieren und zu isolieren (vgl. Kap. 5). Darüber hinaus konnten für zahlreiche in der traditionellen Medizin erfolgreich verwendete Planzen, wie z. B. bei Arnica montana und Echinacea-Arten, durch die Entwicklung von modernen Bioassays erstmals mögliche rationale Erklärungen für die Wirkung ihrer Extrakte oder Inhaltsstofe gefunden werden (Lyss et al. 1998; Gertsch et al. 2003, 2004). Für zahlreiche Naturstofe und Extrakte, deren pharmakologische Wirkung man zu kennen glaubte, konnte auch bedingt durch die Vielfalt der Bioassays erst die Mannigfaltigkeit ihrer Wirkungen aufgeklärt werden. Ein gutes Beispiel ist hier das Curcumin (aus Curcuma-Arten). Die Verbindung gilt als eine der am intensivsten untersuchten Naturstofe und trotzdem werden fast wöchentlich neue Erkenntnisse publiziert (Literatur bei Duvoix et al. 2005). In diesem Zusammenhang wurde auch der Begrif des „broadband proilings“ eingeführt, das auf eine möglichst umfassende pharmakologische Charakterisierung von Naturstofen Bezug nimmt. Vice versa proitiert jedoch auch die Zell- und Molekularbiologie von der Phytochemie, da gleichzeitig zahlreiche Naturstofe als unverzichtbare Werkzeuge zur Aufklärung zellulärer Wirkungsmechanismen benötigt werden und damit auch zur Auindung von neuen Zielstrukturen („Target identiication“) beitragen. Die Entwicklung von Strategien mit einem multidisziplinären Denkansatz ist in vielerlei Hinsicht positiv zu sehen, da eine gegenseitige Befruchtung von Molekularbiologie und Phytochemie nicht zu übersehen ist. Es sei aber erlaubt darauf hinzuweisen, dass es im Verlauf der zunehmenden Verknüpfung der Phytochemie mit molekularen Aspekten nicht zu einer Verdrängung klassischer phytochemischer Arbeitsweisen kommen darf. Es sei hier nur auf die Bedeutung der Isolierung von Sekundärstofen für die systematische Einordnung der Organismen verwiesen (Chemotaxonomie). Darüber hinaus sollte von modernen Naturwissenschatlern, denen es auf Grund der Wissensexplosion und der heute erzwungenen Spezialisierung nicht mehr möglich ist, zu Universalwissenschatlern von der Größe eines Alexander von Humboldts oder eines Gottfried Wilhelm Freiherr von Leibniz zu werden, die Frage nach dem Wert von Wissen, das aus heuristischen Motiven erworben worden ist, nicht einfach unbeantwortet beiseite geschoben oder sogar negiert werden. Wer kann heute abschätzen, was eine morgen isolierte Substanz übermorgen wert ist.

6.1 Allgemeines

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. Abb. 6.1

Übersicht zu den verschiedenen Stufen der Arzneistoffsuche

Infobox Impact Factor. Der Impact Factor ist ein Maß für die Häufigkeit, mit der der „durchschnittliche Artikel“ eines Journals in einem bestimmten Jahr zitiert wird. Er wird zur jährlichen Evaluierung der relativen Bedeutung eines Journals herangezogen, ist aber nur dann ein leidlich objektives Kriterium, wenn der Vergleich mit anderen Journalen desselben Sachgebietes und derselben Ausrichtung vorgenommen wird.

6.1 Allgemeines Die ungeheure Vielzahl von Bioassays macht die Auindung eines einheitlich anwendbaren Ordnungsprinzips und damit eine Gliederung nicht einfach. Regelmäßig beschrittene Wege sind zum einen die Strukturierung gemäß der angewendeten Technik oder zum anderen eine Gliederung, die sich an den zu messenden pharmakologischen Efekt anlehnt. Eine dritte Möglichkeit besteht in der Gliederung auf Grund der verwendeten Organismen. Da die

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Moderne Bioassay-Methoden

gleiche Technik (z. B. die Polymerasekettenreaktion) ot in unterschiedlichen Feldern und verschiedenen Zellen angewendet werden kann, ist eine strikte Trennung der drei Wege kaum durchzuhalten. Es erscheint daher sinnvoll, die in Kap. 5.1 vorgestellte Grobgliederung biologischer Tests, die auf den verwendeten Objekten beruht, zunächst zu übernehmen und dann eine Feingliederung je nach Bedarf über die verwendete Technik oder den zu beobachtenden Efekt vorzunehmen. Die vorliegenden Kapitel werden sich im Wesentlichen auf die Besprechung von zellulären Systemen beschränken (In-vitro- und Ex-vivoSysteme), da die Darstellung von Bioassays unter Verwendung von niedrigen Organismen, Wirbellosen, isolierten Organen und lebenden Tieren den Rahmen vollkommen sprengen würde. Auf die Arbeit mit subzellulären Strukturen (Rezeptoren und Enzyme) wird vereinzelt eingegangen. Infobox In-vitro- und Ex-vivo-Systeme. In vitro ist eine Bezeichnung für Experimente, die unter künstlichen Bedingungen („im Reagenzglas“) durchgeführt werden. Typische Beispiele für In-vitro-Systeme sind unsterbliche Tumorzelllinien oder subzelluläre Strukturen. Bei Ex-vivo-Systemen werden Zellen oder Gewebe einem Organismus entnommen, die Testungen aber rasch und unter möglichst physiologischen Bedingungen durchgeführt. Auch für Experimente, die in vivo durchgeführt, aber in vitro analysiert worden sind, findet man den Begriff ex vivo. Ein typisches Ex-vivo-System sind aus Blut isolierte polymorphkernige Leukozyten.

Die Suche nach pharmakologisch interessanten Substanzen in Extrakten, d. h. in komplexen Naturstofgemischen, ist in mehrfacher Hinsicht eine Herausforderung. Sie wird nur dann zur Isolierung von viel versprechenden neuen Leitstrukturen und Arzneistofen führen, wenn sowohl die Testsysteme als auch die Suchstrategie selbst an die besonderen Bedingungen der Naturstofchemie angepasst sind. Die frühzeitige Integration eines Bioassays in den Isolierungsprozess macht es zunächst erforderlich, dass auch in geringen Konzentrationen vorhandene bioaktive Substanzen in einem Gemisch nicht aktiver Verbindungen detektierbar sein müssen. Gleichzeitig dürfen vorhandene Begleitstofe, auch wenn sie in hohen Konzentrationen vorliegen, keine falsch-positive Reaktion hervorrufen. Ein typisches Beispiel dafür sind die in zahlreichen Testsyste-

men durch Gerbstofe (Okuda 2005) oder Abbauprodukte von Chlorophyll hervorgerufenen Efekte (Heinrich et al. 2001). Dies bedingt eine Suchstrategie mit einer eizienten, aber speziischen Abtrennung dieser Substanzen, wobei keine anderen Verbindungen verloren gehen dürfen. Ein weiterer beachtenswerter Punkt besteht darin, dass die in einem Testsystem gemessene Aktivität nicht immer mit der eigentlichen Aktivität an der Zielstruktur korreliert ist. Glykosidische Verbindungen zeigen in zellulären Systemen auch deswegen eine niedrige Aktivität (und werden entsprechend diskriminiert), da sie auf Grund ihrer Hydrophilie nicht in der Lage sind, in einer bestimmten Zeit die Zellmembran zu passieren und so die Zielstruktur nicht erreicht werden kann. Bei lipophilen Verbindungen sind dagegen Schwierigkeiten mit der Löslichkeit im wässrigen Medium keine Seltenheit. Daher ist für die Ermittlung valider pharmakologischer Daten in Bioassays auch eine gesicherte Analytik für die zu untersuchenden Substanzen eine „conditio sine qua non“. Aus dem Bereich der Naturstofe ist das Hypericin (aus Hypericum perforatum) ein klassisches Beispiel für die Bedeutung einer guten Analytik, da das Löslichkeitsverhalten und die Quantiizierung dieser Substanz erhebliche Probleme aufwerfen und dies zu einer dramatischen Beeinlussung der pharmakologischen Ergebnisse führt (Wirz 2000). Die pharmakologische Untersuchung von Extrakten und das in Kap. 5 beschriebene Verfahren der bioaktivitätsgeleiteten Fraktionierung ist heute eines der wichtigsten Verfahren zur Isolierung von bioaktiven Naturstofen, es wirt jedoch auch zwei generelle Probleme auf. Zum einen stellt sich die Frage nach der Bewertung der in einem Testsystem gemessenen Aktivität. Wann ist eine Fraktion sehr aktiv, aktiv oder nicht aktiv und bei welcher biologischen Aktivität wird sie weiter fraktioniert? Legt man den Grenzwert („Cut“) zu niedrig, so besteht die Möglichkeit, dass Substanzen, die als Leitstrukturen dienen könnten, verpasst werden. Wird der Grenzwert zu hoch angesetzt, ist die Gefahr groß, dass man auch zahlreiche Verbindungen isoliert, deren biologische Aktivität vernachlässigbar ist. Zum anderen besteht die Erwartung, dass im Rahmen der weiteren Aufreinigung und Fraktionierung die entstehenden Fraktionen eine immer höhere Bioaktivität aufweisen, bis man letztendlich zu einer sehr stark wirksamen Einzelsubstanz kommt. Interessanterweise ist aber nicht selten zu beobachten, dass die hohe Aktivität des Ausgangsextrakts in den nachfolgenden Fraktionen abnimmt und man zu mehreren Verbindungen mittlerer Aktivität kommt. Die Gründe dafür sind komplex und vielfach auch

6.2 Testsysteme mit Bezug zur Entzündungshemmung

. Abb. 6.2

Die Untersuchung zur zeitabhängigen Zytotoxizität von Hypericin verdeutlicht den Einfluss von unterschiedlichen Messzeiten auf das Ergebnis. Aufgetragen ist die Lebensfähigkeit von Tumorzellen (hier T-Helferzellen) in Abhängigkeit von der eingesetzten Substanzmenge für drei verschiedene Messzeiten (Raute: 6 Stunden; Quadrat: 24 Stunden; Dreieck: 48 Stunden). Mit zunehmender Versuchsdauer steigt die Zytotoxizität der Verbindung deutlich an

noch nicht im Detail untersucht. Sie können in synergistischen oder additiven Efekten innerhalb der Substanzen eines Extrakts ebenso ihre Ursache haben, wie im verbesserten Transport durch Zellmembranen, Lösungsvermittlung (Butterweck et al. 2003) oder verringerter Metabolisierung. In-vitro- und Ex-vivo-Testsysteme sind unverzichtbare Werkzeuge bei der Suche nach und der Charakterisierung von Arzneistofen. Es ist aber bedeutsam, die pharmakologische und klinische Relevanz der ermittelten Daten mit Augenmaß und Realismus zu bewerten. Hier ist auch kein Unterschied zwischen Naturstofen und synthetisch gewonnenen Substanzen zu sehen. In-vitro und Exvivo-Tests sind immer mehr oder weniger reduzierte Modellsysteme, die Erklärungen für die Wirkung einer Substanz liefern, aber nicht eins zu eins auf In-vivo-Bedingungen übertragen werden können. In diesem Zusammenhang ist auch zu bemängeln, dass die Versuchsbedingungen selbst konzeptionell ähnlicher Testsysteme so uneinheitlich gewählt sind, dass bereits eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse auf der In-vitro-Ebene de facto nicht gegeben ist. Variationen in der Zellzahl, der Versuchsdauer ( > Abb. 6.2) und der Detektionsparameter, um nur die wichtigsten Variabeln zu nennen, haben dazu geführt, dass für dieselbe Substanz zahlreiche quantitativ wie qua-

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litativ vollkommen voneinander abweichende Daten vorliegen können, deren Einordnung vielfach nicht einfach ist. Prominentes Beispiel ist die für das Sesquiterpenlacton Parthenolid beschriebene Beeinlussung des MikrotubuliTubulin-Gleichgewichtes (Miglietta et al. 2004). Dieser Befund konnte in anderen Laboratorien nicht nachvollzogen werden (Gertsch, persönliche Mitteilung). Eine weitere Facette der gleichen Problematik besteht darin, dass zahlreiche Naturstofe als speziische Inhibitoren oder Aktivatoren von biologisch bedeutsamen Proteinen oder von Stofwechselprozessen bezeichnet werden. Dies ist ot nicht zutrefend und zum einen der Tatsache geschuldet, dass diese Verbindungen nur unzureichend pharmakologisch charakterisiert sind. Zum anderen wird auch nicht selten eine Speziität postuliert, die aus den in der Literatur vorliegenden Daten nicht ableitbar ist. Vergleichsweise wenig ist über die Art und den Umfang der Metabolisierung und Resorption von Extrakten und Naturstofen bekannt. Ein sich daraus ableitendes konzeptionelles Deizit besteht in der fehlenden oder unvollständigen pharmakologischen Charakterisierung der tatsächlich am Wirkort ankommenden Metabolite. In diesem Zusammenhang sei insbesondere auf die Klasse der Flavonoide verwiesen, die nach oraler Aufnahme eine vielgestaltige Metabolisierung erfahren. Während jedoch die biologischen Aktivitäten der Ausgangsverbindungen, wie diejenigen des Quercetins, zum Teil extensiv untersucht sind, indet man zu den Metaboliten (Phenylcarbonsäure-Derivate oder Quercetinglucuronide) ot nur wenige Informationen.

6.2 Testsysteme mit Bezug zur Entzündungshemmung (Phospholipase-, Cyclooxygenaseund Lipoxygenasehemmung) Phospholipase (PL), Cyclooxygenase (COX) und Lipoxygenase (LOX) sind Enzyme des Arachidonsäurestofwechsels. Die Substrate dieser Enzyme sind ungesättigte Fettsäuren, insbesondere die Arachidonsäure, die in den Zellen zum größten Teil in Membranphospholipiden gebunden vorliegen. Die Freisetzung erfolgt durch die cytosolische Phospholipase A2 (PLA2) oder auf einem alternativen Weg mittels Phospholipase C und Diacylglyceridlipase in zwei Schritten. Durch die Aktivität der Cyclooxygenasen (synonym auch Prostaglandin-H2-Synthasen, PGHS) entstehen aus der Arachidonsäure Prostaglandine und

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Moderne Bioassay-Methoden

hromboxane. Die Lipoxygenasen (5-, 12- und 15-LOX) setzen die Arachidonsäure zu Hydroxy- und Hydroperoxytetraensäuren sowie zu Leukotrienen um (Literatur und Übersicht zum Eicosanoidstofwechsel bei Funk 2001).

6.2.1 Phospholipase-A2-Hemmung Die Hemmung der enzymatischen Aktivität der PLA2 führt zu einer verminderten Freisetzung von Arachidonsäure aus den Membranen und damit zu einer verringerten Bildung von Entzündungsmediatoren auf dem Cyclooxygenase- und Lipoxygenaseweg. Entsprechend einfach gestaltet sich daraus das Grundprinzip der PLA2-Testsysteme. Dem als Esterase wirksamen Enzym wird ein geeignetes Substrat z. B. ein Phospholipid angeboten und die Hydrolyse der Esterbindung (= Freisetzung der Fettsäure) wird quantiiziert. Die Situation wird dadurch deutlich komplexer, dass es beim Menschen zahlreiche verschiedene Phospholipasen gibt. Unter diesen muss zwischen den sekretorischen (sPLA2) und den cytoplasmatischen (cPLA2) Phospholipasen A2 unterschieden werden. Die bisher vorliegenden pharmakologischen Daten deuten darauf hin, dass die cPLA2 im Entzündungsgeschehen die bedeutendere Rolle spielen. Zunehmend unübersichtlich wird die Situation durch die Verwendung von zellulären Testsystemen und reinen Enzymassays sowie durch die unterschiedlichen Detektionsverfahren. Die gereinigten Enzyme können entweder über Isolierung aus Zellen oder rekombinant gewonnen werden. Werden intakte Zellen, beispielsweise hrombozyten verwendet, so müssen noch Stimuli [Formyl-methionyl-leucyl-phenylalanin (fMLP), Zymosan oder andere] zur Aktivierung des Enzyms hinzugegeben werden. Die Quantiizierung kann entweder über radioaktiv- oder luoreszenzmarkierte Substrate sowie nach HPLC-Autrennung mit UV-Detektion erfolgen (Schmitt u. Lehr 2004; dort auch Literatur). Auch wenn bereits planzliche Sekundärstofe gefunden worden sind, die eine Hemmung der PLA2 zeigen, so ist die Suche nach wirklich potenten PLA2-Inhibitoren aus Planzen bisher erfolglos geblieben.

6.2.2 Cyclooxygenasehemmung Die Umsetzung der Arachidonsäure durch die COX liefert nach der Cyclooxygenasereaktion zunächst PGG2, dann nach der Peroxidasereaktion PGH2 als primäre Metaboli-

ten. Weitere Reaktionen führen zu zahlreichen abgeleiteten Derivaten (u. a. PGE, PGF, PGI und hromboxane), die nicht nur im Rahmen des Entzündungsgeschehens eine sehr vielfältige Bedeutung besitzen. Die Aktivität von COX-Hemmstofen wird in den vorliegenden In-vitro-Assays über die verminderte Bildung der aus Arachidonsäure entstehenden Metabolite bestimmt. Dabei hat sich die Quantiizierung von PGE2 als das wichtigste Prinzip zur Aktivitätsbestimmung herauskristallisiert. Zunächst wird in einem Kontrollversuch die nach der Aktivierung einer deinierten COX-Präparation entstehende Menge an PGE2 ermittelt. Im Vergleich dazu wird im zweiten Schritt die Testsubstanz mit der COX-Präparation inkubiert und das gebildete PGE2 bestimmt. Können in Abhängigkeit von den Testbedingungen neben PGE2 noch signiikante Mengen anderer Eicosanoide entstehen, so geht der Bestimmung eine Autrennung mittels HPLC voran. Die Kopplung mit einem UV- oder UV-Dioden-Array-Detektor ermöglicht die photometrische Bestimmung von PGE2. Daneben ist auch der Einsatz radioaktiver, 1–14Cmarkierter Arachidonsäure als Substrat für die COX verwirklicht, wobei mittels HPLC und Radioaktivitätsdetektor das 14C-markierte PGE2 bestimmt wird ( > Abb. 6.3). Alternativen zu diesen Methoden bestehen im Einsatz von Enzym- und Radioimmunoassays, die aber andere Testbedingungen benötigen. Die Heterogenität der In-vitro-Testsysteme zur Bestimmung von COX-Hemmung ergibt sich nicht nur aus den verschiedenen Möglichkeiten zur quantitativen Bestimmung von PGE2, sondern auch aus den verschiedenen für die Gewinnung der COX-genutzten Präparationen. In der Literatur sind Testsysteme mit intakten Zellen, Mikrosomen oder gereinigtem Enzym beschrieben, die teils humanen Ursprungs sind, teils aber auch von Schafen oder anderen Tieren stammen (Danz et al. 2002; Norreen et al. 1998; Reininger 2001, dort auch Literatur). Weitere Unterschiede ergeben sich aus der Verwendung von verschiedenen Kofaktoren oder Stimulanzien, die notwendig sind, um die COX zu aktivieren. Umso wichtiger ist es, eine besondere Sorgfalt bei der Auswahl der Positivkontrollen walten zu lassen, um eine gewisse Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Häuig werden als Kontrolle die nichtsteroidalen Antiphlogistika Diclofenac und Indometacin ausgewählt. Bis heute sind zwar zahlreiche Naturstofe beschrieben, die eine signiikante Hemmung der COX aufweisen, jedoch inden sich darunter keine hochpotenten Verbindungen.

6.2 Testsysteme mit Bezug zur Entzündungshemmung

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. Abb. 6.3

Die Umsetzung der Arachidonsäure durch die COX liefert zunächst die beiden Metabolite PGG2 und PGH2. Daraus gehen weitere Folgeprodukte wie das PGE2 hervor. Nach der Durchführung eines Cyclooxygenase-Assays können die entstandenen Metaboliten und die Reste des im Überschuss zugesetzten Substrats Arachidonsäure mittels HPLC getrennt und durch Kopplung mit einem UV- oder Radioaktivitätsdetektor quantifiziert werden. Das Chromatogramm zeigt eine Auftrennung an RP-18-Material unter Verwendung eines Fließmittels aus Methanol-Wasser-Phosphorsäure

6.2.3 Lipoxygenasehemmung Die Umsetzung der Arachidonsäure durch Lipoxygenasen führt im ersten Schritt unter Anlagerung von Sauerstof zur Bildung von Hydroperoxyeicosatetraensäuren (HPETEs). Im zweiten Schritt werden durch die 12- und 15-LOX die entsprechenden 12- und 15-Hydroxyeicosatetraensäuren (HETEs), durch die 5-LOX Leukotrien (LT) A4 und 5-Hydroxyeicosatetraensäure gebildet. In Neutrophilen und Makrophagen wird das instabile LTA4 zu LTB4 umgesetzt, während in Eosinophilen und Mastzellen eine Kopplung mit Glutathion erfolgt, wobei LTC4 entsteht. Das Schlüsselenzym für die Bildung der Leukotriene stellt die 5-LOX dar, die entsprechend häuig für den Aubau von Bioassays herangezogen wird. Im Vergleich zu den COX-Bioassays ist die Situation für die korrespondieren LOX-Bioassays etwas weniger komplex. Dies kann zum einen darauf zurückgeführt werden, dass die Handhabung des isolierten Enzyms erheblich schwieriger ist und ent-

sprechend bevorzugt zelluläre Bioassays eingesetzt werden. Zum anderen wird Lipoxygenaseaktivität in einer geringeren Zahl von Zelltypen gefunden (z. B. in Neutrophilen, Eosinophilen, hrombozyten und Makrophagen). Die in der Literatur beschriebenen Testsysteme nutzen insbesondere Neutrophile, die jedoch von verschiedenen Tieren (Schweine, Rinder) oder vom Menschen stammen können (Schweizer et al. 2000; Paulus 2002, dort auch Literatur). Zur Quantiizierung werden entweder LTB4 oder die HETEs herangezogen. Es stehen hier die gleichen Detektionsarten wie bei der Bestimmung der Cyclooxygenase-Metaboliten zur Verfügung (UV- und Radioaktivitätsdetektion nach HPLC-Trennung oder die Anwendung von Enzym- und Radioimmunoassays). Der Einsatz von 5-LOX-Bioassays hat zur Isolierung zahlreicher planzlicher Sekundärstofe geführt, die sich als potente Hemmstofe der 5-LOX erwiesen haben (Literatur bei Schneider u. Bucar 2005). Eine große Anzahl dieser Verbindungen wirkt als unspeziische Redox-Inhibitoren, d. h. sie redu-

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Moderne Bioassay-Methoden

zieren das Fe3+ im aktiven Zentrum zu Fe2+, sodass das Enzym im inaktiven Zustand verbleibt. Zu diesen Verbindungen gehören Chinone (Resch et al. 1998) oder typische Antioxidanzien wie Flavonoide und Kafeesäurederivate mit Catecholstruktur (Lobitz et al. 1998). Potente NonRedox-Inhibitoren sind das Lignan Justicidin E (herien et al. 1993) und die Triterpensäure 3-Acetyl-11-ketoβ-boswelliasäure (aus verschiedenen Boswellia-Arten; Safayhi et al. 1992).

6.3 Messung von Radikalfängereigenschaften und antioxidativen Eigenschaften Die Bildung von freien Radikalen beruht auf einer wichtigen physiologischen bzw. pathophysiologischen Abwehrreaktion des Körpers. Hierzu gehört die Produktion von reaktiven Sauerstofspezies, insbesondere von Sauerstofradikalen, wie dem Superoxid-Radikal-Anion (O2·–) und das Hydroxyl-Radikal (OH·–), sowie von reaktiven Stickstofverbindungen mit dem Stickstofmonoxid (NO·) als wichtigstem Vertreter. Die Bildung von Sauerstofradikalen im Rahmen von Entzündungsreaktionen wird getragen von Monozyten, Makrophagen und polymorphkernigen Leukozyten. Dabei wird die physiologisch niedrige Produktion von Sauerstofradikalen nach der Aktivierung um mehr als das 10fache gesteigert („oxidative burst“), wobei das durch eine membranständige NADPH-Oxidase gebildete O2·– ins extrazelluläre Milieu abgegeben wird. Die Aktivierung der Radikalproduktion kann nicht nur durch opsonisierte Bakterien, sondern ebenfalls durch eine Vielzahl endogener oder exogener Substanzen angeregt werden (Literatur bei Baggiolini et al. 1993). Dazu gehört der Proteinkinase-C Aktivator Phorbolmyristatacetat (PMA) oder bakterielle Peptide wie das fMLP. Es liegt daher auf der Hand, zum Aubau eines Testsystems zur Überprüfung der antioxidativen Aktivität die verantwortlichen Zellen wie z. B. die polymorphkernigen Leukozyten aus menschlichem Blut zu isolieren und diese dann mit geeigneten Stimuli zur Radikalproduktion, d. h. zum „oxidative burst“ anzuregen. Durch Inkubation der Testsubstanzen mit den polymorphkernigen Leukozyten lässt sich die Verminderung der Produktion an reaktiven Sauerstofspezies gegenüber einer unbehandelten Kontrolle mittels Chemilumineszenzmessung bestimmen. Als häuigste Aktivatoren werden dabei fMLP, opsonisiertes Zymosan und PMA verwendet. Es ist zu beachten, dass

je nach aktivierender Substanz unterschiedliche Kinetiken der Radikalbildung zu beobachten sind, worauf durch unterschiedlich lange Messzeiten eingegangen wird ( > Abb. 6.4). Der beobachtete Gesamtefekt einer Substanz setzt sich dabei aus verschiedenen Teilefekten zusammen. Er kann zum einen auf dem direkten Abfangen von Radikalen („radical scavenger activity“), aber auch auf der Hemmung von Enzymen, z. B. der NADPH-Oxidase, aber auch der Myeloperoxidase beruhen, die in die Produktion der Radikale involviert sind. Um den genauen Mechanismus zu ermitteln, muss auch dieses zelluläre System mit den entsprechenden Enzymassays ergänzt werden. Viel genutzte Beispiele dafür sind verschiedene Modelle des Xanthinoxidase-/Xanthin- bzw. /Hypoxanthin-Systems (Heilmann et al. 2003; Literatur bei Udilova 1999), das zur Messung von Radikalfängereigenschaten gegenüber O2·– verwendet wird, oder die Messung der Myeloperoxidaseaktivität (Auchere u. Capeillere-Blandin 1999; dort auch weitere Literatur). Aus dem Gebiet der Naturstofe existieren vor allem für Kafeesäurederivate und Flavonoide umfangreiche Untersuchungen zu Radikalfängereigenschaften und der antioxidativen Aktivität. Unter den Flavonoiden zeigen insbesondere Quercetin und Quercetinglykoside in diesen Testsystemen eine hohe Aktivität, die im unteren mikromolaren Bereich liegt (Limasset et al. 1993; Heilmann et al. 2000). Wie aus den obigen Ausführungen deutlich wird sind die Begrife Radikalfängereigenschaten und antioxidative Aktivität nicht synonym zu gebrauchen. Während der Begrif Radikalfang auf die direkte Reaktion mit allen Radikalen Bezug nimmt, versteht man unter der antioxidativen Aktivität einer Verbindung die reduzierte Bildung (durch Enzymhemmung) und/oder die direkte Reaktion mit reaktiven Sauerstofspezies. Beschreibungen und Literatur zu weiteren grundsätzlichen Messtechniken und Methoden zur Bestimmung der Radikalproduktion beim „oxidative burst“ inden sich bei Dahlgren u. Karlsson (1999). Substanzen, die als Antioxidanzien oder Radikalfänger wirken, können zum einen eine antiinlammatorische Aktivität entfalten, besitzen zum anderen aber auch eine erhebliche Bedeutung bei der Chemoprävention, da Radikale wesentlich an der Entstehung von Tumoren beteiligt sein können.

6.4 Messung der Beeinflussung von mRNA-Spiegeln

. Abb. 6.4a,b

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6.4 Messung der Beeinflussung von mRNA-Spiegeln 6.4.1 Testsysteme auf der Basis von Reportergenen

a

b Polymorphkernige Leukozyten können durch verschiedene Stimuli zur Produktion von Sauerstoffradikalen angeregt werden. Die Kinetiken wie auch die Menge der entstehenden Radikale unterscheiden sich dabei deutlich. Aufgetragen sind die „counts per minute“ (cpm) gegen die Zeit. a zeigt die Reaktion von isolierten polymorphkernigen Leukozyten nach Stimulation mittels fMLP für einen Blindwert und unter dem Einfluss von einer steigenden Konzentration eines Radikalfängers. Nach einem raschen Anstieg in den ersten 2 Minuten fällt unter dem Einfluss von fMLP die Radikalproduktion rasch wieder ab. b zeigt die Reaktion der gleichen Anzahl von Leukozyten (ebenfalls für einen Blindwert und für drei verschiedene Konzentrationen eines Radikalfängers) nach der Anregung mit opsonisiertem Zymosan. Die Produktion von Radikalen steigt hier langsam auf einen deutlich höheren Wert an und fällt im Verlauf von 30 Minuten dann langsam wieder ab

Unter Reportergenen versteht man Gene oder Genfragmente, die mit anderen Genen oder regulatorischen Einheiten (Promotoren) gekoppelt werden, um die Aktivität dieser Einheiten sichtbar zu machen. Das Reportergen codiert für ein leicht identiizierbares Protein, sehr häuig eine Luciferase, und beindet sich unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenz. Zum Aubau eines Testsystems wird zunächst die ausgewählte Zelllinie mit dem Reportergen und der zu untersuchenden Promotoreinheit stabil transiziert. Ein nach der Zugabe der Substanzen zugesetzter Stimulus (z. B. PMA) aktiviert eine verstärkte Promotoraktivität und nach deinierter Inkubationszeit kann über die Menge der entstandenen Luciferase auf die Aktivität der regulatorischen Einheit geschlossen werden ( > Abb. 6.5). Die Quantiizierung erfolgt bei Verwendung der Leuchtkäfer-Luciferase nach Zusatz von Luciferin (Substrat) über eine Biolumineszenzreaktion ( > Abb. 6.6). In der Literatur sind zahlreiche Beispiele für die Aktivität von Naturstofen auf Promotoren beschrieben, die proinlammatorischen Faktoren zugehörig sind (Keiss et al. 2003; Takada u. Aggarwal 2003). Infobox Lumineszenz. Bei der Lumineszenz gibt ein System Energie über die kalte Aussendung von Licht ab, während es von einem angeregten Zustand in den Grundzustand übergeht. Zunächst werden dabei Elektronen angeregt und in ein höheres Energieniveau angehoben. Unter Lichtemission fallen sie dann wieder in den Grundzustand zurück. Biolumineszenz. Werden die Lumineszenzreaktionen in lebenden Organismen erzeugt, so spricht man von Biolumineszenz. Eine große Bedeutung für Reportergenkonstrukte hat die vom amerikanischen Leuchtkäfer („firefly“) Photinus pyralis stammende Luciferase (Firefly-Luciferase). Chemi-(Chemo-)lumineszenz. Bei der Chemilumineszenz stammt die Anregungsenergie aus einer vorgeschalteten chemischen Reaktion.

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Moderne Bioassay-Methoden

. Abb. 6.5

. Abb. 6.6

Übersicht zur Funktionsweise eines Reportergen-Assays. Zunächst wird ein Luciferasegen dem zu untersuchenden Promotor nachgeschaltet und stabil in Zellen eingebaut. Ein geeigneter Stimulus bewirkt eine erhöhte Promotoraktivität und das nachgeschaltete Luciferasegen wird verstärkt exprimiert. Nach der Transkription und Translation kann die erhöhte Luciferaseaktivität über eine Biolumineszenzreaktion detektiert werden

6.4.2 Real-time-RT-PCR Geht man davon aus, dass die in einer Zelle vorhandene Menge an mRNA von der Aktivität des korrespondierenden Gens abhängig ist, so lässt sich vice versa über die quantitative Erfassung der Veränderungen in den mRNASpiegeln ein Rückschluss auf die Aktivität des entsprechenden Gens vornehmen. Als ein etabliertes Verfahren zur Bestimmung der mRNA-Mengenverhältnisse gilt die RT-PCR (Reverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion). Sie ist insbesondere dann die Methode der Wahl, wenn kleine Probengrößen vorliegen, d. h. die mRNA nur in geringer Menge exprimiert wird. Im Vergleich zur Vermehrung von DNA-Matrizen mit der herkömmlichen PCR, werden in der RT-PCR RNA-Moleküle vervielfältigt, indem man sie zunächst mit Hilfe der Reversen Transkriptase in die cDNA umschreibt und dann die PCR nach dem herkömmlichen Schema ablaufen lässt. Die Intensität der nach einer Gelelektrophorese mit Agarose entstehenden Banden erlaubt Rückschlüsse auf die ursprünglich vorliegende mRNA-Menge. Zum einen können die Banden im Verhältnis zueinander verglichen werden, zum anderen kann eine Quantiizierung durch den Vergleich mit Kontrollen erfolgen, die durch eine PCR mit einer deinierten

Ablauf einer Luciferasereaktion. Die Firefly-Luciferase katalysiert die Bildung von Oxyluciferin aus Luciferin in Anwesenheit von Magnesium, ATP und O2. Zunächst wird ein Zwischenprodukt aus Luciferin und AMP gebildet, das unter dem Einfluss von O2 decarboxyliert und wieder gespalten wird. Gleichzeitig wird ein Photon bei 562 nm emittiert. Die Quantenausbeute der Reaktion liegt bei etwa 90%

Menge DNA gewonnen worden sind. Ein wesentlicher Fortschritt in der RT-PCR-Technologie hat sich durch die Real-time-RT-PCR ergeben. Sie stellt ein Verfahren dar, in dem in einem System die Ampliikation sowie die direkte Detektion und Quantiizierung der Akkumulation des PCR-Produktes möglich ist. Die quantitative Echtzeitanalyse („real time“) der PCR ist über die Messung von laserinduzierten Fluoreszenzsignalen realisierbar. Um dies zu verwirklichen, wird neben den speziischen Primern auch eine sequenzspeziische Probe dem PCR-Ansatz zugefügt, die an eine Gensequenz zwischen den beiden Primern bindet. Diese ist am 3ʹ-Ende mit einem Quencherfarbstof und am 5ʹ-Ende mit einem luoreszierenden Reporterfarbstof markiert. Solange die Probe (oder Sonde)

6.4 Messung der Beeinflussung von mRNA-Spiegeln

6

. Abb. 6.7 Forward Primer 5' 3'

Quencher 5' 3' Reverse Primer

5'

Reporter

Die Probe (Oligonukleotid, Quencher und Reporterfarbstoff) lagert sich spezifisch zwischen den Primern an die DNA an.

5' 3' 5'

5'

5' 3'

Die Taq-Polymerase verdrängt und zerschneidet die TaqMan-Probe. Ein Fluoreszenzsignal erscheint, da der Reporterfarbstoff vom Quencher getrennt wird.

Messung der Fluoreszenzintensität während der PCR!! DNA-Synthese ist beendet und der DNA-Strang dupliziert 3' 5'

5' 5'

5' 3'

Neustart des Prozesses im nächsten Zyklus (Denaturierung, Hybridisierung usw.)

Schema zur Funktionsweise der Real-time-PCR unter Verwendung eines Taqman®-Systems

intakt ist, wird bei einer Anregung durch einen ArgonLaser die Fluoreszenzemission des Reporterfarbstofs durch die räumliche Nähe zum Quencher unterdrückt [die Energie des Reporterfarbstofes (R) auf den Quencherfarbstof (Q) übertragen und nur dieser emittiert Licht]. Während der PCR-Reaktion wird die hybridisierte DNA-Sonde durch die 5ʹ-3ʹ-Exonukleaseaktivität der Polymerase zerschnitten. Der Reporterfarbstof kann das Fluoreszenzlicht nun emittieren, da durch die Hydrolyse der Sonde Reporter und Quencher voneinander getrennt sind (fehlender Energietransfer). Eine Hydrolyse der Sonde durch die 5ʹ-3ʹ-Exonukleaseaktivität kann nur dann erfolgen, wenn es zu einer sequenzspeziischen Hybridisierung zwischen Sonde und Zielsequenz kommt ( > Abb. 6.7). Entsprechend der Ampliikation des speziischen PCR-Fragments steigt das Fluoreszenzsignal an. Dabei ist die Fluoreszenzzunahme dem Zuwachs an PCRAmpliikat direkt proportional. Die Auswertung der Analyse erfolgt über den so genannten CT-Wert („threshold cycle“). Der CT-Wert drückt die Zyklenzahl aus, bei der

zum ersten Mal ein Anstieg der Reporterluoreszenz über das Grundrauschen ermittelt wird. Die Real-time-RTPCR ist sehr vielseitig einsetzbar, da die mRNA-Spiegel der verschiedensten Proteine (Zytokine, Transkriptionsfaktoren und viele mehr) analysierbar sind. Entsprechend lassen sich mit dieser Technologie Testsysteme entwickeln, die einen Bezug zu den verschiedensten Gebieten haben, wie zum Beispiel zum Entzündungsgeschehen oder zur Entstehung von Tumoren (Literatur bei Mocellin et al. 2003). Je nach vorliegender Problemstellung kann es notwendig sein, die Ergebnisse aus der quantitativen Realtime-PCR zu normalisieren. Eine häuig angewandte Methode ist die Normalisierung gegenüber einem Referenzgen. Die Ergebnisse werden dabei relativ zu einem möglichst konstant exprimierten (!) Referenzgen ausgedrückt, dessen Expression parallel zum Zielgen in derselben Probe gemessen wird. Besonders häuig werden so genannte „House-Keeping“-Gene, wie diejenigen von GAPDH und β-Actin, zur Normalisierung herangezogen (Literatur bei Giuletti et al. 2001). Die Methode ist jedoch

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Moderne Bioassay-Methoden

nicht unproblematisch, da beispielsweise die Expression dieser Gene aktiv reguliert sein kann. Es sollte daher immer nachgewiesen werden, ob sich das ausgewählte Gen zur Normalisierung eignet.

6.4.3 Microarrays (Gen-Chips) Mit Hilfe der Microarray-Technologie ist es möglich, die Expression zahlreicher Gene parallel nebeneinander zu analysieren. Dazu wird auf einer festen Matrix (Glas oder Nylon/Nitrocellulose) eine bestimmte Anzahl von Erkennungsmolekülen (Sonden oder Probes) immobilisiert. Diese Sonden können aus cDNA (500–5000 Basen) oder aus Oligonukleotiden (15–90 Basen) bestehen („oligonucleotide arrays“) und hybridisieren mit der luoreszenzmarkierten RNA (dem Analyt oder der Probe). Die Speziität eines einzelnen Oligonukleotids ist jedoch nicht ausreichend, um eine hochspeziische Hybridisierung der korrespondierenden RNA zu gewährleisten. Für jedes zu analysierende Gen wird daher bei Oligonucleotid-Arrays ein Sondensatz aus verschiedenen Oligonukleotiden auf dem Chip ixiert. Die Intensität des detektierbaren Signals steigt mit der Menge der an der Sonde gebunden Probe an. Entsprechend können nur relative Transkriptionsniveaus miteinander verglichen werden. Die Fluoreszenzmessungen werden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskop oder speziellen Fluoreszenz-Scannern vorgenommen. Heute existiert eine große Palette von verschiedenen Microarrays, die es ermöglichen, mehrere tausend Gene nebeneinander zu analysieren. Die dabei anfallenden Datenmengen sind kaum zu überschauen. Ihre eiziente und korrekte Auswertung und Verarbeitung erfordern fundierte Kenntnisse auf dem Gebiet der Bioinformatik. Wesentlich praktikabler sind kleinere Microassays, die sich auf Gene in einem bestimmten Funktions- oder Regulationsbereich fokussieren (Tumore, Entzündungen, Stofwechselerkrankungen und viele mehr). Die unterschiedliche Herstellung, Probenaufarbeitung und andere methodische Probleme können auch bei der MicroarrayTechnologie manchmal zu schwer reproduzierbaren Ergebnissen führen. Eine akzeptierte Strategie, um verlässliche Daten zur Expression von Genen zu erhalten, ist die Kombination der Chip-Technologie mit der Real-timePCR. Dabei wird zunächst mit Hilfe eines Microarrays der Einluss der zu untersuchenden Substanz auf die Expressionslevel verschiedener Gene im Überblick analysiert und im nächsten Schritt die Veränderungen bei einzelnen,

besonders interessanten Genen mittels Real-time-RT-PCR exakt analysiert. Die in der Naturstofforschung mit Hilfe der Realtime-PCR und der Microarrays bearbeiteten Fragestellungen unterscheiden sich kaum von denen anderer Bereiche der Arzneistofsuche. Obgleich beide Techniken noch relativ jung sind, haben bereits zahlreiche Publikationen die Beeinlussung der Genexpression durch Naturstofe und Extrakte thematisiert. Prominente Beispiele dazu sind die Untersuchungen zu Epigallocatechin-3-O-gallat, dem pharmakologisch vermutlich wichtigsten Polyphenol aus grünem Tee, und dem Diferuloylmethanderivat Curcumin. Für beide Verbindungen ist die günstige Beeinlussung der mRNA-Spiegel tumorrelevanter Faktoren beschrieben worden (Lin et al. 2005; Chen et al. 2004). Für Epigallocatechin-3-O-gallat ist darüber hinaus auch die reduzierte Expression proinlammatorischer Gene bekannt (Porath et al. 2005). Wichtige Aspekte sind, insbesondere vor dem Hintergrund von Struktur-WirkungsBeziehungen, die selektive Beeinlussung der Genexpression oder auch Veränderungen der Expression als Funktion der Zeit (kinetische Fragestellungen). Von großem Interesse sind diese Methodiken auch für das Screening von Planzen (Gertsch et al. 2002) und die Untersuchungen von Arzneiplanzen, die in der traditionellen Medizin bereits längere Zeit erfolgreich verwendet werden, deren Wirkprinzip aber bisher noch nicht oder nur unzureichend bekannt ist. Sie können aus einem neuen Blickwinkel heraus bearbeitet werden, um die molekularen Ursachen ihrer Wirkung exakter zu ergründen. Beispiele hierfür sind die Reduktion der mRNA-Spiegel von proinlammatorisch wirksamen Faktoren durch Capsaicin (aus Capsicum annuum; Gertsch et al. 2002) und Chamissonolid (aus Arnica-Arten; Gertsch et al. 2003).

6.5 Testsysteme mit Bezug zur Bekämpfung von Tumoren Zahlreiche Testsysteme, die eingesetzt werden, um Verbindungen zur herapie von Tumorerkrankungen zu inden, tragen die Bezeichnung Zytotoxizitäts-, Viabilitätsoder Proliferations-Assay. Auch wenn sich die Begrife etabliert haben, so müssen sie doch als etwas unglücklich bezeichnet werden. Deiniert man zytotoxische Verbindungen als Zellgite, die Zellfunktionen zum Erliegen bringen, und Viabilität als die Lebens- bzw. Überlebensfähigkeit von Zellen, so ergibt sich eine entsprechend gro-

6.5 Testsysteme mit Bezug zur Bekämpfung von Tumoren

ße Schnittmenge zwischen beiden Begrifen und die Differenzierung ist schwierig. Unter Proliferation ist die Vermehrung von Zellen, hier insbesondere Tumorzellen, zu verstehen, sodass eine eindeutige Abgrenzung der entsprechenden Testverfahren möglich sein sollte. Diese ist aber nicht immer vollzogen, da bei einigen Detektionsverfahren, wie zum Beispiel bei der Messung der metabolischen Aktivität, der ermittelte Efekt nicht einem einzelnen Mechanismus zuzuordnen ist, sondern sich als Summe von Zytotoxizität und Hemmung der Proliferation präsentiert. Bei einer Einteilung und Bezeichnung der Testsysteme sollte daher besser auf das tatsächliche Messverfahren Bezug genommen werden. Die Etablierung eines solchen Bioassays beginnt man zunächst mit der in Kulturnahme und Züchtung einer bestimmten Tumorzelllinie. Dazu müssen nicht nur das entsprechende Medium, sondern auch die für das Wachstum der Zellen notwendigen Zusätze, wie Salze, Zucker und Aminosäuren, gefunden werden. Daneben ist die Zugabe von Antibiotika und antifungal wirksamen Substanzen in Erwägung zu ziehen. Eine gute Hilfe für die Kultivierung sind die von der American Type Culture Collection (ATCC) für zahlreiche Zelllinien zusammengestellten Richtlinien. Die Wachstumsgeschwindigkeit der Zellen kann wesentlich über die Menge an fötalem Kälberserum (FKS) gesteuert werden. Zum Aubau eines Bioassays sollten nur Tumorzellen verwendet werden, die eindeutig als solche charakterisiert und nicht mit anderen Zellen verunreinigt sind. Insgesamt sind optimale Kulturbedingungen sicherzustellen, damit es während der Durchführung des Tests nicht zur Beeinträchtigung des Wachstums oder der Viabilität der Zellen kommt. Bis heute sind zahlreiche Naturstofe mit einer hohen Aktivität gegenüber den verschiedensten Tumorzellen gefunden worden. Dazu gehören insbesondere Verbindungen, die zu den Alkaloiden (Literatur bei Cozzi et al. 2004), Lignanen (Literatur bei Gordaliza et al. 2004) und Sesquiterpenlactonen (Literatur bei Schmidt 1999) zu zählen sind. Auf Grund der beschränkten Aussagekrat eines einzelnen In-vitro-Assays, sind zahlreiche Arbeitsgruppen dazu übergegangen, die Aktivität einer Substanz gegenüber einer ganzen Serie von Zelllinien zu testen (Bestimmung der diferentiellen Zytotoxizität). Mit Hilfe einer solchen Strategie können wichtige Hinweise darüber gewonnen werden, ob es sich um eine unspeziische oder speziische Toxizität gegenüber Tumorzellen handelt. Werden in dieses Screening auch Zelltypen integriert, in denen bestimmte Stofwechselwege verstärkt ablaufen

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oder fehlen, so lassen sich auch wesentliche Rückschlüsse auf den möglichen Wirkungsmechanismus ziehen. Diese werden mittels Testsystemen erhärtet, die zur Auindung der möglichen biologischen Zielstrukturen dienen. Für Naturstofe sind die Hemmung der Topoisomerasen I und II, Störung des Tubulin/Mikrotubuli-Gleichgewichtes, Interkalation in die DNA oder deren Alkylierung sowie der Angrif an elektronenreichen Positionen essentieller Proteine häuig beobachtete Mechanismen (Literatur bei Srivastava et al. 2005). Weitere interessante Targets scheinen die Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), Aminopeptidase N, Tyrosinkinase oder die Farnesyltransferase zu sein (Literatur bei Li u. Xu 2005). Einige Naturstofe und deren Abkömmlinge wie Paclitaxel (aus Taxus-Arten) und Camptothecin (aus Camptotheca accuminata) gehören zu den wichtigsten Arzneistofen im Kampf gegen den Krebs.

6.5.1 Messung der metabolischen Aktivität Das Messprinzip bei diesen Tests beruht auf der Reduktion von verschiedenen Tetrazoliumsalzen zu Formazanen, die durch Übertragung von Elektronen in Mitochondrien von metabolisch aktiven Zellen gebildet werden. Sie werden von der Succinat-Reduktase, die ein Enzymkomplex der Atmungskette darstellt, als Substrat akzeptiert. Die am häuigsten verwendeten Verbindungen sind 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid (MTT), 2,3-Di-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2Htetrazolium-5-carboxanilid (XTT) und 2-(4-Iodophenyl)3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium (WST-1). Im Verlauf einer 48 oder 72 Stunden dauernden Inkubation der Zellen mit den Testsubstanzen, werden die Tetrazoliumsalze in den letzten 1–4 Stunden zugesetzt. Bei der Verwendung von MTT entsteht ein wasserunlösliches, bei XTT und WST-1 ein wasserlösliches Formazan, das photometrisch vermessen werden kann ( > Abb. 6.8). Der bereits 1983 eingeführte, recht kostengünstige MTT-Assay (Mosmann 1983) erfordert entsprechend die Solubilisierung des Farbstofs (z. B. mit Natriumdodecylsulfatlösung 10%, SDS) vor der Vermessung. Es ist leicht ersichtlich, dass die Menge an produziertem Farbstof sowohl von der Anzahl der Zellen (Bezug zur Proliferation) wie auch von ihrer Vitalität (Bezug zur Viabilität) abhängig ist. Darüber hinaus sind auch Interaktionen mit der Succinat-Reduktase denkbar. Die Messung mit MTT, aber vermutlich auch mit den anderen Tetrazo-

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Moderne Bioassay-Methoden

. Abb. 6.8

6.5.2 Inkorporationsassays In den Inkorporationsassays wird die im Verlauf einer Zellvermehrung stattindende Neusynthese von DNA und der damit verbundene Einbau von Basen zur Messung einer antiproliferativen Wirkung genutzt. Zur Quantiizierung können radioaktive („heiße“ Testsysteme) und nichtradioaktive Basen („kalte“ Testsysteme) verwendet werden. Ein typisches „kaltes“ Testsystem ist der BrdU-(5Bromo-2ʹ-desoxyuridin-)Bioassay. Nach einer Inkubationsphase wird dem Testansatz brommarkiertes Desoxyuridin zugesetzt und die proliferierenden Zellen bauen an Stelle von hymidin nun Nukleotide mit dem Pyrimidinderivat 5-Bromo-2ʹ-desoxyuridin in die DNA ein. An den Abbruch der Reaktion schließt sich die Denaturierung der DNA und die Zugabe von Peroxidase-gekoppelten BrdUAntikörpern an. Die entstehenden Immunkomplexe und damit die Menge an eingebautem BrdU können mit Hilfe einer Substratlösung photometrisch bestimmt werden. Die Kopplung der BrdU-Antikörper mit luoreszierenden Farbstofen ist ebenfalls möglich. Zur Erfassung des Einbaus von radioaktiv markierten DNA-Basen stehen Messverfahren zur Verfügung, die auf der Inkorporation von [3H]-hymidin und [3H]-Uridin beruhen.

Messung der metabolischen Aktivität von Zellen mittels 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid (MTT). Der gelbe Farbstoff wird durch mitochondriale und im Zytoplasma vorhandene Dehydrogenasen zu einem blauen, wasserunlöslichen Formazan umgesetzt. Nach der Zugabe von SDS-Lösung (meist nach dem Absaugen des Mediums) kann die optische Dichte der Lösung bei 540 bzw. 570 nm bestimmt werden. Bei der Verwendung von XTT und WST-1 entsteht ein wasserlöslicher Farbstoff, der bei einer Wellenlänge von 450 nm detektiert wird

liumverbindungen, kann gestört werden durch Substanzen, die sich auf Grund ihres Redoxpotentiales selbst an der Reaktion mit MTT beteiligen (Bruggisser et al. 2002). Es ist daher empfehlenswert die metabolischen Assays mit einem weiteren Testsystem zu kombinieren, in dem eine Zellzahlbestimmung durchgeführt wird. Zahlreiche Ergebnisse deuten darauhin, dass der Bildung von Formazanen nicht nur in den Mitochondrien, sondern auch im Zytoplasma abläut, sodass dieses Messprinzip streng genommen nicht nur auf die mitochondriale Aktivität Bezug nimmt.

6.5.3 Bestimmung von Zellvitalität und Zelltod (Apoptose und Nekrose) Die einfachste Methode zur Bestimmung der Lebensfähigkeit von Zellen besteht in der Färbung mit Trypan-Blau ( > Abb. 6.9). Dieser Farbstof kann durch eine geschädigte Zellmembran in das Zytoplasma eindringen, sodass nicht vitale Zellen blau angefärbt werden. Die Bestimmung der Lactatdehydrogenase (LDH) im umgebenden Medium wird ebenfalls als Maß für die Vitalität von Zellen und zur Bestimmung der Zytotoxizität einer Substanz herangezogen. LDH ist in vitalen Zellen hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert, wohingegen im Medium nur eine niedrige Aktivität dieses Enzyms messbar ist. Eine Schädigung der Zellmembran führt zu einer verstärkten Freisetzung von zytoplasmatischen Bestandteilen und damit auch zu einer Anreicherung der LDH im Medium. Die Aktivität der LDH kann mit Hilfe von NADH als Substrat photometrisch bestimmt werden ( > Abb. 6.10). In den letzten Jahren ist die Durchlusszytometrie zu einer der wichtigsten Techniken zur Bestimmung von (molekularen) Zelleigenschaten geworden. Die luores-

6.5 Testsysteme mit Bezug zur Bekämpfung von Tumoren

6

. Abb. 6.9

Trypanblau ist ein saurer Farbstoff, der als Anion an Zellproteine bindet. Oft wird eine 0,4%ige (m/V) Lösung verwendet, die mit der Zellsuspension kurz gemischt wird. Das Trypanblau dringt durch defekte Zellmembranen in die toten Zellen ein und färbt sie tiefblau an. Lebende Zellen werden dagegen nicht gefärbt. Trypanblau wirkt selbst zytotoxisch, sodass bei zu langer Einwirkzeit eine erhöhte Zahl von toten Zellen zu beobachten ist . Abb. 6.10a,b

a

b Unter Zusatz von Pyruvat und NADH kann die Aktivität der Lactatdehydrogenase im Überstand photometrisch bei 340 nm über die Abnahme der NADH-Konzentration direkt bestimmt werden (a). Bei manchen der im Handel befindlichen „Kits“ wird dagegen Lactat und NAD+ zum Testansatz gegeben und das entstehende NADH + H+ von einem Enzym zur Bildung von Formazanen aus Tetrazoliumverbindungen genutzt (b)

zenzaktivierte Zellanalyse („luorescence activated cell sorting“, FACS) arbeitet mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstofen, die gekoppelt an Antikörper oder andere Moleküle, speziische Strukturen und Merkmale in einer Zelle bzw. in einer Zellpopulation kennzeichnen können ( > Abb. 6.11). Bei der Analyse von zytotoxischen Naturstofen spielt die FACS-Analyse z. B. zur Charakterisierung von apoptotischen Vorgängen bzw. bei der Diferenzierung zwischen Apoptose (programmierter Zelltod) und Nekrose eine wichtige Rolle. Faktoren wie Zellgröße und Zellgranularität, die Hinweise auf apoptotische Vorgänge liefern, sind mittels Durchlusszytometrie bereits durch Streulichtmessungen erkennbar. Die Größe der Zellen beeinlusst vor allem das Vorwärtsstreulicht („forward light scatter“), während das Seitwärtsstreulicht („side light scatter“) auch sehr stark von der Granularität der Zellen abhängt. Markiert man darüber hinaus die zu untersuchende Zellpopulation mit Propidiumiodid (PI) und einem mit Annexin V gekoppelten Farbstof, so geben sich nekrotische Zellen in einer FACS-Analyse als PI-positiv und Annexin-V positiv, apoptotische Zellen als PI-negativ und Annexin-positiv, und lebende Zellen als PI- und AnnexinV-negativ zu erkennen. Bei PI handelt es sich um einen DNA-Farbstof, der aber nur in die Zelle eindringen kann, wenn sie nekrotisch geschädigt ist. Annexin V ist ein Protein mit einer hohen Ainität für Phosphorylserin. Dieses

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Moderne Bioassay-Methoden

. Abb. 6.11

Eine Zellsuspension wird zunächst mit einem Farbstoff versetzt, der an einen spezifischen Antikörper gekoppelt ist. Der Antikörper bindet in den Zellen an das entsprechende Antigen, soweit es dort vorhanden ist. Die Zellen werden als Strom durch eine vibrierende Düse geführt, wodurch es hinter der Düse zu einer Tropfenbildung kommt. Kurz bevor der Strom bricht und die Tropfen entstehen, passiert er einen Laser und die Markierung der Zellen führt zu einer Fluoreszenz, die in einer Photozelle detektiert wird. Neben der Fluoreszenz wird auch die Lichtstreuung („scatter“) durch die Zellen detektiert. Jede Zelle wird dabei einzeln detektiert. Sie muss im Zentrum des Laserstrahls fokussiert werden, was durch einen Hüllstrom („sheath fluid“) gelingt, in den die Probenflüssigkeit injiziert wird und der die Zellen mitführt (hydrodynamische Fokussierung). Die der Detektion nachfolgende Sortierung gelingt, da jeder entstehende Tropfen mit einer markierten Zelle eine elektrische Ladung erhält. In einem hinter der Düse angelegten Feld werden die geladenen Tropfen, je nach ihrer Ladung abgelenkt, während unmarkierte und nichtgeladene keine Ablenkung erfahren

ist normalerweise an der Innenseite der Membran lokalisiert, wird jedoch im Verlauf der Apoptose an die Membranaußenseite verlagert und kann dort an das Annexin V binden. Nekrotische Zellen färben sich jedoch ebenfalls, da die Membran bereits so stark geschädigt ist, dass Annexin V sie passieren kann. Daneben können mittels DNAFarbstofen wie PI auch Zellzyklusanalysen durchgeführt werden, da sich der DNA-Gehalt während der verschiedenen Phasen des Zellzyklus ändert und PI in einem stöchiometrisch konstanten Verhältnis in die DNA eingelagert wird.

Hat die Zelle das Signal für den Start des programmierten Zelltods erhalten, so werden festgelegte Signalwege durchlaufen, die wesentlich von der Aktivierung von Caspasen getragen werden. Diese gehören zur Familie der Cysteinyl-Proteasen und zerschneiden Proteine speziisch hinter Asparaginsäure. Caspasen liegen zunächst als inaktive Procaspasen vor und erhalten erst nach einer Proteolyse und Dimerisierung ihre enzymatische Aktivität. Dabei sind sie in der Lage, sich gegenseitig zu aktivieren und bilden eine Kaskade, die letztlich in den Tod der Zelle mündet. Im Verlauf dieser sehr komplexen Kaskade kann

6.6 Testsysteme mit Bezug zur Bekämpfung von Plasmodien

zwischen Initiatorcaspasen (Caspasen 8 und 9) und Efektorcaspasen wie die Caspasen 3, 6 und 7 unterschieden werden. Initiatorcaspasen stehen am Anfang des Signalweges und werden durch extrinsische und intrinsische Signale aktiviert. Dies kann über die Aktivierung von Todesrezeptoren (extrinsisch) wie auch über die Schädigung der Mitochondrien (intrinsisch und extrinsisch) und Freisetzung von Cytochrom C erfolgen (vgl. dazu auch > Abb. 24.15). Substrate der aktivierten Initiatorcaspasen sind die Efektorprocaspasen, die nun ihrerseits durch die Spaltung aktiviert werden. Die entstandenen Efektorcaspasen zerlegen Substrate, die essentiell für das Überleben der Zelle sind, und führen damit den Zelltod herbei. Sie werden auch als die Exekutoren der Apoptose bezeichnet. Durch die Caspasen wird mittelbar auch die Zerstörung der DNA eingeleitet, da durch die proteolytische Spaltung ihres Inhibitors auch eine DNase aktiv wird. Die Zerschneidung der DNA erzeugt Fragmente, deren Größe jeweils ein Vielfaches von 180 Bp (Windung der DNA um ein Histon) beträgt. Im Agarosegel können diese Fragmente aufgetrennt werden und geben ein charakteristisches regelmäßiges Leitermuster. Das Vorhandensein der so genannten DNA-Leiter ist ein wichtiger Nachweis für den apoptotischen Zelltod. Eine umfangreiche Übersicht zur Apoptose (inklusive Literaturangaben), die hier in ihrem Ablauf nur angedeutet worden ist und bei der noch zahlreiche weitere Proteine beteiligt sind, indet sich bei Kim et al. (2005). Die Bedeutung der Caspasen im Rahmen des programmierten Zelltods hat dazu geführt, dass zur Charakterisierung der Apoptose sehr ot auch Tests zu ihrer Aktivierung herangezogen werden. Dazu wird zunächst eine deinierte Anzahl von Zellen mit der Lösung der zu untersuchenden Substanz inkubiert. Im nächsten Schritt werden die Zellen vom Medium abgetrennt und lysiert. Der nach erneuter Zentrifugation entstandene Überstand wird entnommen und mit einem (luoreszenz-)markierten Substrat der Caspasen versetzt. Durch deren proteolytische Aktivität wird der (Fluoreszenz-)Farbstof abgespalten und detektierbar (Messung im Photometer oder Fluorometer). Eine weitere Möglichkeit ist die Kopplung des Substrats mit einer Substanz, die nach der Spaltung von einer Luciferase umgesetzt werden kann (Messung im Luminometer). Zum Vergleich wird sowohl ein Nullwert als auch eine Kontrolle (unbehandelte oder nur mit der entsprechenden Lösungsmittelkonzentration behandelte Zellen) bestimmt. Die Aktivität einer speziischen Caspase kann durch Zugabe eines speziischen Substrates und/oder

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durch speziische Inhibition der nicht relevanten Caspasen erreicht werden. In den letzten Jahren sind zahlreiche Arbeiten über die Induktion der Apoptose durch Naturstofe publiziert worden. Unter den planzlichen Sekundärstofen haben hier insbesondere phenolische Verbindungen wie Flavonoide, Curcuminoide (Literatur bei Karunagaran et al. 2005) und Resveratrol (Literatur bei Ulrich et al. 2005) ein großes Interesse gefunden. Zahlreiche Arbeiten existieren aber auch über terpenoide Verbindungen wie die Sesquiterpenlactone (Literatur bei Zhang et al. 2005). Aus dieser Stofklasse liegen aufschlussreiche Arbeiten über das Parthenolid (aus Tanacetum parthenium; Guzman et al. 2005) und die Helenanolide aus Arnica-Arten (Dirsch et al. 2001a,b; Gertsch et al. 2003) vor.

6.6 Testsysteme mit Bezug zur Bekämpfung von Plasmodien Die erythrozytären Formen von Plasmodium falciparum, dem Erreger der Malaria tropica, können unter Verwendung von Medien, die rote Blutkörperchen enthalten, kontinuierlich in Kultur genommen werden. Die Parasitämie, das ist die prozentuale Anzahl von mit Plasmodien inizierten Erythrozyten liegt in diesen Kulturen bei etwa 5–10%. Ähnlich wie bei den Tumorzellen ( > Inkorporationsassay) kann auch die Replikations- und Transkriptionstätigkeit der Parasitenzellen als ein Maß für das Wachstum (einschließlich der Vermehrung) genutzt werden. Mit Plasmodien inizierte humane Erythrozyten werden in Mikrotiterplatten der Testsubstanz ausgesetzt, vorinkubiert und nach Zugabe von [3H]-Hypoxanthin nochmals inkubiert. An Hand der Inkorporationsrate des markierten Hypoxanthins in die parasitären Nucleinsäuren kann dann die hemmende Wirkung der Testsubstanz auf das Wachstum bestimmt werden. Besondere Vorsicht ist hier geboten, wenn Substanzen untersucht werden, die eine hohe Zytotoxizität gegenüber Erythrozyten aufweisen. Bei einer Schädigung der Erythrozyten sind die Plasmodien ebenfalls nicht mehr in der Lage sich zu vermehren und es werden nur scheinbar hohe antiplasmodiale Aktivitäten gemessen. Es empiehlt sich daher immer, in einer Kontrolle auch die fehlende Zytotoxizität der Verbindung nachzuweisen. Über die Analyse von speziischen Stofwechselwegen und Zellfunktionen konnten in Plasmodien Targets (= biologische Ziele) identiiziert werden, die sich zur Bekämpfung des Erregers nutzen lassen. Als

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Moderne Bioassay-Methoden

mögliche Angrifsorte werden u. a. der Folsäurestofwechsel, die Mevalonat-unabhängige Isoprenoidsynthese oder die Metabolisierung des Häms angesehen (Literatur und Übersicht bei Wiesner et al. 2003). Letztere Möglichkeit soll im Folgenden kurz erläutert werden. Die Infektion mit Plasmodien geht mit dem Befall und der Zerstörung von Erythrozyten einher. Die Erreger bauen dabei mittels Proteasen das Hämoglobin ab, um daraus ihre essentiellen Aminosäuren zu gewinnen. Das freigesetzte Häm ist jedoch für den Parasiten toxisch und muss metabolisiert werden. Zur Entgitung stehen neben der Polymerisation von Ferriprotoporphyrin IX zu Hämozoin (Malariapigment), ein oxidativer Abbau sowie auch ein Glutathionabhängiger Stofwechselweg zur Verfügung. Gelingt es, die Detoxiizierung des Häms zu verhindern, so vergitet sich der Parasit selbst. Gelingt die Hemmung der für den Hämoglobinabbau notwendigen Proteasen, so stehen ihm nicht die notwendigen Aminosäuren zur Verfügung. Entsprechend wurden Testsysteme aufgebaut, in denen nach Inhibitoren der Plasmodien-speziischen Proteasen, der Hämpolymerisation oder des Glutathion-abhängigen Abbaus gesucht werden kann (Desai et al. 2004; Frölich et al. 2005).

6.7 Testsysteme zur Bestimmung der Permeabilität Auf dem Weg vom Applikations- zum Wirkort muss eine Substanz zahlreiche Barrieren passieren. Je nach Art der Applikation sind dies die Haut, Schleimhäute, das Epithel des Gastrointestinaltrakts oder die Blut-HirnSchranke. Diese Barrieren weisen eine unterschiedliche Dicke und verschiedene Eigenschaten auf, sodass sich

Transportvorgänge nicht nur hinsichtlich der Geschwindigkeit, sondern auch ganz grundsätzlich unterscheiden können. Dies begründet sich wesentlich auf der Existenz von aktiven Transportern, die für einen verstärkten Hineintransport, aber auch für das Ausschleusen von Substanzen (z. B. durch P-Glykoprotein, P-gp) verantwortlich sein können. Darüber hinaus sind an den Membranen auch Metabolisierungsvorgänge, beispielsweise durch Enzyme der Cytochrom-P450-Familie (CYPs), möglich. Zelluläre In-vitro-Systeme können ein gutes Modell für diese Barrieren sein, wenn sie hinsichtlich Morphologie, Transporter- und Enzymausstattung die In-vivo-Situation möglichst vollständig repräsentieren können. Da die perorale Gabe von Arzneistofen die bedeutsamste Applikationsform darstellt, kommt dem Dünndarm eine besondere Bedeutung als Resorptionsort zu. Ein besonders verbreitetes Modell zur Untersuchung intestinaler Resorptionsvorgänge ist die Caco-2-Zelllinie (Artursson 1990), sodass es sinnvoll erscheint, an dieser Stelle die Vorgehensweise für die Herstellung eines zellulären Permeationsmodells exemplarisch darzustellen ( > Abb. 6.12). Die Caco-2-Zelllinie stammt von einem Kolonkarzinom ab, das unter geeigneten Kulturbedingungen ein einschichtiges Epithel bildet und im ausdiferenzierten Zustand zahlreiche wichtige Eigenschaten des Dünndarmepithels zeigt. Es sei jedoch angemerkt, dass diesen Zellen die typische Mukusschicht der Dünndarmmukosa fehlt. Zu Beginn werden die in der Kultur adhärenten Caco-2-Zellen von der Wand und voneinander gelöst und eine bestimmte Anzahl auf einer Membran ausgesät. Im Verlauf von 19–22 Tagen bildet sich eine geschlossene, einschichtige Zellmembran. Vor und nach einem Transportexperiment muss die Integrität einer ver-

. Abb. 6.12

Schematischer Versuchsaufbau für ein Permeationsmodell mit adhärierenden Zellen, die auf einer Filtermembran mit definierter Porengröße eine einschichtige Zellmembran (Monolayer) bilden

6.7 Testsysteme zur Bestimmung der Permeabilität

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. Abb. 6.13a–c

a

b

c Calcein-AM ist ein lipophiler Ester, der rasch durch die Zellmembran penetriert. In der Zelle ist die Verbindung ein Substrat von verschiedenen Esterasen und wird zu Calcein umgesetzt (a). Calcein selbst ist zu hydrophil, um die Zelle wieder zu verlassen, sodass über das akkumulierende Calcein, die Zunahme der intrazellulären Fluoreszenz gemessen werden kann. Gleichzeitig ist Calcein-AM auch ein Substrat von P-Glykoproteinen, die es wieder aus den Zellen herausschleusen, bevor es von Esterasen umgesetzt werden kann (b). In diesen Zellen akkumuliert es nur dann intrazellulär, wenn ein P-Glykoprotein-Inhibitor hinzugesetzt wird (c)

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Moderne Bioassay-Methoden

wendeten Membran nachgewiesen werden. Dies erfolgt z. B. durch die Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER), der einen Kontrollwert nicht unterschreiten darf. Mit der Messung der TEER-Werte wird bereits in den letzten Tagen vor dem Versuch begonnen, da sie zu Versuchsbeginn idealerweise einen stabilen Plateaubereich erreichen sollen. Eine zusätzliche Kontrolle ist über Verbindungen möglich, die eine Membran nur im geschädigten Zustand oder durch undichte „tight junctions“ passieren können. Verwendet wird nach einem Experiment beispielsweise 14C-markiertes Mannitol, dessen Konzentration auf der basalen (Akzeptor) und apikalen (Donor) Seite mit einem Szintillationszähler bestimmt werden kann. Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung von Fluorescein-Na und die photometrische Quantiizierung. Zur Durchführung des Transportversuchs wird die Substanzlösung zunächst in das apikale Kompartiment pipettiert. Nach festgelegten Zeitintervallen wird auf der basalen Seite ein deiniertes Volumen entnommen und die Substanzkonzentrationen bestimmt. Diese einfacheren Experimente können auch modiiziert werden, um aktive und passive Transportvorgänge von einander zu unterscheiden. Dazu können metabolische Inhibitoren zugegeben werden, die die Bildung von ATP unterbinden und selektiv die vorhandenen aktiven Transportsysteme verlangsamen oder ausschalten können. Auch ein entzündeter Status des Epithels kann durch die Zugabe von PMA oder Lipopolysacchariden (LPS) simuliert werden. Die Blut-Hirn-Schranke („blood–brain barrier“) stellt eine, morphologisch wie metabolisch, besonders „dichte“ und komplexe Barriere für Arzneistofe dar. Die wichtigsten In-vitro-Modelle für die Blut-Hirn-Schranke sind aus verschiedenen Lebewesen isolierte zerebrale Kapillarendothelzellen (aus Primärkulturen oder Zelllinien), die als Mono- oder Kokultur mit Astrozyten gezüchtet werden. Die Simulation von Transportprozessen an der Blut-HirnSchranke ist ein wichtiger Schritt bei der Suche nach herapieoptionen für die Alzheimer-Erkrankung, Hirntumore oder Meningitiden, da eine genügend hohe Konzentration des Arzneistofs diese Barriere passieren muss. Dies ist nicht nur durch die dort lokalisierten metabolisierenden Enzyme, sondern auch durch die P-Glykoproteine ein gravierendes Problem, da Letztere ein breites Substratspektrum besitzen und die aufgenommenen Substanzen wieder zurücktransportieren können. Entsprechend wird auch intensiv nach Verbindungen gesucht, die bei Koapplikation diese Transportmechanismen inhibieren können. Die Testung von Verbindungen mit P-gp inhibieren-

der Wirkung erfolgt entweder in subzellulären Strukturen oder in P-gp überexprimierenden Tumorzellen. Dazu wird beispielsweise die Aktivität von Zytostatika unter dem Einluss von möglichen P-gp-Inhibitoren bestimmt oder der Calcein-AM-Assay angewendet ( > Abb. 6.13).

6.8 Testsysteme mit Bezug zur Metabolisierung Für den Phase-I-Metabolismus spielen die mischfunktionellen Monooxygenasen aus der Cytochrom-P450-Familie (CYPs) eine entscheidende Rolle. Es handelt sich um membranständige Hämproteine, die auf der cytosolischen Seite des endoplasmatischen Retikulums lokalisiert sind. Durch die Einführung von funktionellen Gruppen erhöhen sie die Hydrophilie unpolarer Verbindungen und erleichtern damit die renale Ausscheidung. In der Regel sind die entstehenden Metabolite auch pharmakologisch weniger aktiv, sodass den CYPs auch eine wichtige Bedeutung bei der Detoxiizierung zukommt. Man geht davon aus, dass mehr als 90% des im Körper vorhandenen Cytochrom-P450-Gehaltes in der Leber lokalisiert ist. Die Cytochrom-P450-Enzyme, von denen im Menschen bisher mehr als 30 Isoformen gefunden worden sind, werden basierend auf Homologien in ihrer Primärstruktur in Familien und Unterfamilien eingeteilt. Zu den wichtigsten an der Arzneistofmetabolisierung beteiligten CYPs gehören die Genfamilien CYP1, CYP2 und CYP3. Unter diesen hat CYP3A4 ein besonderes Interesse gefunden, da es an der Biotransformation zahlreicher Arzneistofe beteiligt ist. Die Metabolisierung einer Verbindung kann auch über Phase-II-Reaktionen folgen. Es handelt sich dabei um Konjugationsreaktionen in deren Verlauf Transferasen sehr polare Moleküle wie die Glucuronsäure (UDP-Glucuronosyltransferase), Glutathion (Glutathion-S-transferase) oder ein Sulfatrest (Sulfotransferase) auf die funktionelle Gruppe eines Substrats übertragen werden. Häuig geht die Phase-I-Reaktion einer solchen Konjugation voran, um die entsprechende funktionelle Gruppe zu erzeugen. Eine gute Möglichkeit zur Untersuchung von Biotransformationsvorgängen, Interaktionen und Induktionsvorgängen sowie zur Bestimmung von hepatotoxischen und zytotoxischen Eigenschaten ist die Verwendung von (humanen) Hepatozyten. Obwohl ihre Gewinnung als ebenso aufwendig wie kostspielig gilt, werden sie u. a. auf Grund von guten In-vivo-/In-vitro-Korrelationen

6.8 Testsysteme mit Bezug zur Metabolisierung

in einem frühen Stadium der Arzneimittelforschung eingesetzt (Literatur bei Fröhlich 2004). Bedingt durch Speziesunterschiede im Rahmen von Biotransformationen gilt der Einsatz humaner Zellen als Methode der Wahl. Es werden jedoch auch von Ratten und Schweinen isolierte Hepatozyten verwendet, da gesundes humanes Lebergewebe nicht ausreichend verfügbar ist. Die Kultivierung erfolgt in Monolayern und Sandwich-Modellen, da die Lebensfähigkeit von suspendierten Hepatozyten im Bereich von wenigen Stunden liegt. Die metabolische Aktivität der in den Hepatozyten, aber auch in Mikrosomen vorhandenen Enzyme kann durch die Zugabe von speziischen Substraten selektiv quantiiziert werden (Markerreaktionen). Als Markerreaktion für die Aktivität der humanen CYP3A4

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gilt die Einführung einer Hydroxylgruppe im Testosteron an 6β-Position (Rendic u. Di Carlo 1997, > Abb. 6.14). Eine häuig verwendete Reaktion zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen, die Glucuronsäure und Sulfat übertragen, beruht auf der Umsetzung von 4-Nitrophenol (Szotakova et al. 2004; > Abb. 6.14). Neben zellulären Testsystemen spielen bei Untersuchungen zur Biotransformation aber auch Mikrosomenpräparationen und gereinigte oder rekombinant gewonnene Enzyme eine wichtige Rolle. Wie wichtig und gleichzeitig auch problematisch Invitro-Untersuchungen zur Biotransformation auch für Naturstofe sind, ist eigentlich erst mit den Arbeiten über Extrakte aus dem Johanniskraut (Hypericum perforatum)

. Abb. 6.14a–c

a

b

c Markerreaktionen für metabolisierende Enzyme. a Für die humane CYP3A4 und die porcine CYP3A29 gilt die 6β-Hydroxylierung von Testosteron als Markerreaktion. b,c Für die Aktivitätsbestimmung von Glucuronyl- und Sulfotransferasen kann die Glucuronidierung und Sulfatierung von 4-Nitrophenol herangezogen werden

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deutlich geworden. In den Mittelpunkt sind dabei vor allem Untersuchungen gerückt, die sich mit der Induktion und Inhibition von CYPs beschätigen. Nach der Anwendung von Johanniskrautextrakten kann es auf Grund einer (in vivo!) Induktion von CYP3A4 und P-gp zu einem klinisch relevanten Abfall der Blutspiegel von Cyclosporin und Indinavir kommen, die über Cytochrom-P450-Enzyme metabolisiert werden (vgl. dazu auch Kap. 26.10 und >Tabelle 26.18). An Hand der bisher vorliegenden Daten lässt sich dieser Efekt hauptsächlich auf das Phloroglucinderivat Hyperforin zurückführen. Für Hyperforin ist in vitro eine verstärkte Expression von CYP3A4 nachgewiesen, die auf der Ainität zum nukleären PregnanX-Rezeptor beruht (Moore et al. 2000). Gleichzeitig ist für Hyperforin und Hypericin, aber auch eine potente In-vitro-Inhibition von CYP3A4 beschrieben (Obach 2000), die sich aber klinisch nicht ausprägt. Ein unklares Bild bezüglich der In-vitro-Ergebnisse an CYPs und Hepatozyten ergibt sich beim Rauschpfefer (Piper methysticum, Kava-Kava). Kava- bzw. Kavain-haltige Arzneispezialitäten sind auf Grund einer negativen Nutzen-Risiko-Analyse durch das BfArM (Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte) seit 2002 nicht mehr auf dem deutschen Markt zu inden, wobei der Verdacht auf Hepatotoxizität geäußert worden ist (vgl. dazu auch Kap. 26.6). Ohne an dieser Stelle auf die sehr kontrovers diskutierten In-vivo-Daten einzugehen, ist festzuhalten, dass die in Hepatozyten und Enzymassays gewonnen Invitro-Daten ebenso heterogen wie unvollständig sind und noch keinen gesicherten Rückschluss auf eine Hepatotoxizität erlauben. Während beispielsweise in Untersuchungen mit rekombinant gewonnenen CYPs für die Kava-Lactone Methysticin, Desmethoxyyangonin und Yangonin eine signiikante Inhibition beobachtet werden konnte (Zou et al. 2004), wurde von Ma et al. 2004 für Desmethoxyyangonin and Dihydromethysticin in Rattenhepatozyten eine Expressionserhöhung von CYP3A23 beschrieben. Seit 2004 liegt unter Umsetzung einer EU-Richtlinie von Sei-

! Kernaussagen

Auf Grund ihrer großen Strukturvielfalt kann bei der Suche nach neuen Arzneistoffen und Leitstrukturen nicht auf Naturstoffe verzichtet werden. Die Auffindung und Gewinnung von biologisch aktiven Verbindungen, die in Pflanzen, Moosen, Pilzen und anderen Organismen vorkommen, wird durch die frühzeitige Eingliederung

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ten des BfArM ein Entwurf zur Bewertung von möglichen pharmakokinetischen Arzneimittelinteraktionen mit Phytopharmaka vor. In diesem Papier ist vorgesehen, dass anhand der dem Institut vorgelegten Unterlagen (z. B. in Form einer Literaturübersicht) der Einluss eines Phytopharmakons auf Transportproteine, speziell P-Glykoprotein und die Aktivität des Cytochrom-P450-Systems, insbesondere CYP3A4, 2D6, 2C9, 1A2 und 2C19 deutlich werden soll. Inzwischen liegen für zahlreiche Naturstofe und Phytopharmaka In-vitro-Daten über eine Induktion oder Inhibition von CYPs vor. Es sei aber, auf Grund der oben aufgeführten Beispiele ein maßvoller Umgang mit diesen Ergebnissen empfohlen, da zahlreiche Gewürze und Genussmittel des täglichen Gebrauchs denen gesundheitsfördernde Aspekte zu geschrieben werden, z. B. schwarzer Tee, in vitro ebenfalls signiikante Induktionen hervorrufen können. Die Vielseitigkeit von Testsystemen, basierend auf Enzymen, die im Verlauf von Biotransformationen eine wichtige Rolle spielen, wird ebenfalls daran deutlich, dass sie auch als In-vitro-Assays zur Auindung von chemopräventiv wirksamen Substanzen eingesetzt werden. Im Rahmen der Chemoprävention versucht man, entweder der Krebsentstehung vorzubeugen, d. h. sie zu verhindern, oder sie zu verlangsamen oder sogar rückgängig zu machen. Substanzen, die diese Wirkung entfalten, bezeichnet man als chemopräventiv. Entsprechende Testsysteme untersuchen beispielsweise, inwieweit die metabolische Aktivierung von Karzinogenen oder Tumorpromotern durch CYPs verhindert werden kann. Ein anderer Ansatz sind Testsysteme, die sich mit der Aktivierung von detoxiizierenden Enzymen (Glutathion-STransferase) beschätigen. In den letzten Jahren hat das hema Chemoprävention, insbesondere im Zusammenhang mit einer gesunden Ernährung, zunehmend an Bedeutung gewonnen und zahlreiche Naturstofe, werden als Inhibitoren der Tumorentstehung diskutiert (Kinghorn et al. 2004). von In-vitro- und Ex-vivo-Testsystemen in den Isolierungsprozess erheblich erleichtert. Neben mehr oder weniger komplexen zellulären Testsystemen, die aus Zelllinien oder frisch isolierten Zellen bestehen, kommen auch solche zum Einsatz, die auf subzellulären Strukturen (Enzyme oder Rezeptoren) basieren. Auf die Isolierung und die chemische, physikalische Charakterisierung eines biologisch aktiven

6.8 Testsysteme mit Bezug zur Metabolisierung

Sekundärstoffs folgt (fast zwangsläufig) seine umfassende pharmakologische Charakterisierung und die Identifizierung der biologischen Zielstrukturen als der nächste logische Schritt. Entsprechend haben alle wichtigen Methoden aus der Zell- und Molekularbiologie auch in die Naturstoffchemie Einzug gehalten. Dazu gehören, um nur einige wichtige Beispiele zu nennen, verschiedene Blotting-Verfahren, die FACS Analyse, die Real-timeRT-PCR, die Genchips, die ELISA-Technologie oder die Transfektion von Zellen. Noch weitaus komplexer als die pharmakologische Charakterisierung von Einzelsubstanzen ist die Analyse der pharmakologischen Wirkung eines Extrakts. Ohne eine vorangehende exakte analytische und spektroskopische Charakterisierung des Extraktes, ist dieses Problem kaum lösbar. Wichtige Einsatzgebiete für Sekundärstoffe oder standardisierte Extrakte aus Pflanzen sind die Behandlung von entzündlichen Erkrankungen, Tumoren, Infektionen mit Protozoen sowie psychische Erkrankungen, sodass eine Vielzahl der existierenden Testsysteme in diesen Bereichen angesiedelt ist. Bei der Suche nach Verbindungen mit entzündungshemmenden Eigenschaften sind die Enzyme der Arachidonsäurekaskade PL, COX und LOX wichtige Zielstrukturen, aber auch Verbindungen, die als Antioxidanzien wirken oder Radikalfän-

gereigenschaften besitzen, zeigen ein interessantes antiinflammatorisches Potential. Verbindungen, die zur Behandlung von Krebs eingesetzt werden sollen, müssen eine selektive Toxizität gegen Tumorzellen besitzen und so ist die an verschiedenen Tumorzelllinien durchgeführte Analyse der Zytotoxizität ein wichtiges Einstiegselement für eine solche Suchstrategie. Häufig wird sie durch Testsysteme ergänzt, die die Beschreibung der dabei ablaufenden apoptotischen und nekrotischen Prozesse ermöglichen. Neben der Auffindung und pharmakologischen Charakterisierung von pflanzlichen Sekundärstoffen findet auch deren Resorption und Metabolisierung zunehmend Interesse. Ein wichtiges In-vitro-Modell zur Untersuchung der Resorptionsvorgänge am Dünndarmepithel ist die Caco-2-Zelllinie. Bei der Analyse von aktiven Transportprozessen werden in Testsystemen Transportproteine wie die P-Glykoproteine untersucht. P-Glykoproteine gehören zur großen Superfamilie der ABC-Transporter („ATP-binding cassette transporter“), die mit zur Multidrug-Resistenz beitragen. Testsysteme auf der Basis von humanen Hepatozyten liefern gute Modelle zur Beschreibung von Biotransformationsvorgängen. Im Rahmen von Phase-I-Reaktionen sind Untersuchungen an Enzymen aus der Cytochrom-P450-Familie bedeutsam, da ihre Hemmung oder Induktion Abbau gleichzeitig verabreichter Arzneistoffe beeinflussen kann.

Schlüsselbegriffe Aktiver und passiver Transport Antioxidative Aktivität Apoptose Arachidonsäurestoffwechsel Arnica Bioaktivitätsgeleitete Isolierung Blut-Hirn-Schranke Caco-2-Zellen Caspase Chemoprävention Curcumin Cyclooxygenase Cytochrom-P450-Familie Flavonoide Fluoreszenzaktivierte Zellanalyse (FACS) Gen-Chips Genexpression Hepatozyten

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Hypericum perforatum Hyperforin Inkorporationsassay Leitstruktursuche 5-Lipoxygenase Luciferase Metabolisierung Metabolische Aktivität MTT-Assay Myeloperoxidase NADPH-Oxidase Nekrose Normalisierung P-Glykoproteine Piper methysticum Oxidative burst Pharmakologische Charakterisierung von Naturstoffen Phospholipase

Plasmodium falciparum Polymorphkernige Leukozyten Positivkontrolle Primer Quencher Radikalfänger Real-time-RT-PCR Reportergene Resorption Strukturvielfalt Viabilität Zytotoxizität

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149

7 7 Das medizinische Potential von Pflanzenstoffen R. Hänsel, Th. Dingermann 7.1

In unveränderter Form genutzte Planzenstofe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154

7.2

Planzliche Sekundärstofe als Ideengeber (Leitstofe) für Arzneistofe . . . . . 7.2.1 Verbesserung bekannter Strukturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.2.2 Auswertung ethnomedizinischer Beobachtungen . . . . . . . . . . . . . . 7.2.3 Auswertung von Gitwirkungen am Menschen . . . . . . . . . . . . . . . . 7.2.4 Gitwirkungen auf Tiere als Primäranregung . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.2.5 Planzenphysiologische Beobachtungen als Primäranregung: Entdeckung der Indolylessigsäure als Pharmakophor . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . .

. . . . .

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. . . . .

. . . . .

. . . . .

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. . . . .

. . . . .

. . . . .

157 157 162 164 171

. . . . . . . . . . 180

7.3

Planzliche Einzelstofe als Rohstofquelle für Arzneimittel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181

7.4

Planzenstofe als Wirkstofe – Die wichtige Unterscheidung von Wirkstof und Arzneistof . . 183

7.5

Planzenstofe im Vergleich mit synthetischen Stofen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185

Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 187

152

7

Das medizinische Potential von Pflanzenstoffen

> Einleitung Vor kurzem hat man entdeckt, dass menschliche Zellen imstande sind, aus Dopamin Morphin zu synthetisieren (Boettcher et al. 2005). Somit vermag der Säugetierorganismus Biosynthesen auszuführen, die bis dahin als eine Domäne der grünen Pflanze angesehen wurden. Offensichtlich gibt es auf molekularer Ebene enge Beziehungen zwischen allen Formen von Lebewesen. Diese Sonderstellung der Naturstoffe ergibt sich auch daraus, dass die Wahrscheinlichkeit, mittels Screening eine biologisch aktive Substanz zu finden, im Bereich der Naturstoffe um zwei Zehnerpotenzen höher ist, als im Bereiche der etwa 1,5 Millionen synthetischer Substanzen. Im Abschnitt 7.5 wird auf diesen Unterschied zwischen Naturstoff und Synthesestoff näher eingegangen. Weitere Abschnitte lenken die Aufmerksamkeit aber auf jene sekundären Pflanzenstoffe, die heute in der Arzneitherapie Bedeutung haben, einmal unmittelbar in Form isolierter Reinsubstanzen, vor allem aber als partialsynthetisch modifizierte Varianten. Der letzte Abschnitt befasst sich mit sekundären Pflanzenstoffen, die zwar selbst pharmakologisch inaktiv sind, die sich aber partialsynthetisch in wichtige Arzneistoffe überführen lassen. Die weite Anwendung von Corticosteroiden und von Sexualhormonen (u. a. auch „der Pille“) wäre ohne diese natürlichen Ausgangsmaterialien kaum verwirklicht worden.

Fortschritte und Erfolge der modernen Arzneibehandlung gründen sich auf konsequente naturwissenschatliche Forschung. Dabei gibt es keine Monopolstellung einer Einzeldisziplin, die sich mit der Entwicklung von neuen Arzneimitteln befassen. Vielmehr sind die Arzneimittel der naturwissenschatlich orientierten Medizin das Ergebnis aus sehr unterschiedlichen methodischen Ansätzen. An den bahnbrechenden Pioniererindungen sind zahlreiche Wissenschatszweige beteiligt. Die wichtigsten sind in der > Tabelle 7.1 zusammengestellt. Überblickt man die Zeitspanne von etwa 200 Jahren Geschichte der Arzneimittelforschung, so stand die Entdeckung der chemischen Einzelsubstanz als Wirkprinzip bestimmter planzlicher Arzneizubereitungen am Beginn dieser Entwicklung. Die Isolierung des Morphins aus dem Opium im Jahre 1806 war das erste Beispiel dieser Vorgehensweise. Seither ist der deinierte Einzelstof das Kenn-

zeichen der Arzneimittel der naturwissenschatlich orientierten Medizin. Nur mit Reinsubstanzen können toxikologische, pharmakodynamische und pharmakokinetische Untersuchungen frei von Störungen durch Begleitstofe und Schwankungen im Wirkstofgehalt durchgeführt werden. Noch wichtiger aber ist, dass die Konstitution des wirksamkeitsbestimmenden Drogeninhaltsstofes bekannt sein muss, um Analoga des Naturstofs synthetisieren zu können. Nur in den wenigsten Fällen sind die genuinen Naturstofe für die gewünschte Anwendung optimiert. Ziele der Molekülvariation sind meist bessere Verfügbarkeit und größere therapeutische Breite. Dementsprechend ist die Liste der aus Arzneidrogen isolierten Planzenstofe, die in genuiner Form therapeutisch verwendet werden, nicht sehr umfangreich ( > dazu Abschnitt 7.1 und > Tabelle 7.2). Diese kleine Zahl an planzlichen Arzneistofen, die in unveränderter Form in der modernen Arzneitherapie verwendet werden, spiegelt jedoch die wahre Bedeutung der Planzenstofe für die Arzneitherapie in keiner Weise wider. An erster Stelle sei ihre Bedeutung als Ideengeber zur Entwicklung neuer Arzneimittel genannt. Nach wie vor ist ein Arzneimitteldesign, die Entwicklung von therapeutisch brauchbaren Stofen gleichsam am „Reißbrett“, eine Utopie: Die Arzneimittelforschung bleibt auf Anregungen aus den unterschiedlichsten Wissensgebieten angewiesen. Welche Primäranregungen für neue Arzneimittel auf Beobachtungen über Wirkungen von Planzenstofen zurückgehen, wird im Abschnitt 7.1 dargestellt. Rückblickend betrachtet, bewährten sich bei der Suche nach neuen Arzneistofen vor allem die folgenden Strategien: x Verbesserung bereits in Anwendung stehender Arzneistofe, x Auswertung ethnomedizinischer Beobachtungen und x Entwicklung von Planzengiten zu Arzneistofen. Damit ist die Bedeutung von Planzenstofen für die Arzneitherapie keineswegs erschöpt. Was nutzt ein Arzneistof mit brauchbarem Wirkungsproil, wenn er nicht in den erforderlichen Mengen für die Allgemeinheit zur Verfügung steht? Dies ist der Fall bei den Hormonen, die, zieht man tierische Drüsen zur Gewinnung heran, nur in winzigen Mengen vorkommen. Im Falle der Steroidhormone trit es sich glücklich, dass chemisch ähnlich gebaute Substanzen als Planzeninhaltsstofe autreten, in bestimmten Drogen in sehr in hohen Konzentrationen, um den Rohstof für chemische Partialsynthesen liefern zu

Einleitung

7

. Tabelle 7.1 Zur Chronologie der Arzneistoffentwicklung: Methoden bzw. Wissenschaftszweige, die zur Arzneimittelentwicklung beitragen, und Zeitpunkte ihrer ersten Auswirkung für die praktische Therapie Beginn der Auswirkung

Wissenschaftszweig/Methodik Phytochemie: Isolierung von Alkaloiden und Digitalisglykosiden

Seit 1805 (Morphin) bzw. seit 1867 („Digitalin“)

Synthetische organische Chemie

Seit 1880

Mikrobiologie: Fermentationstechnik

Seit 1942

Biochemie, biochemische Pharmakologie

Seit 1950 (Mehrzahl der heute verwendeten Arzneimittel)

Molekularbiologie, Gentechnologie

Seit 1978 (Humaninsulin)

Proteindomänen als Zielstrukturen

Bisher ohne

. Tabelle 7.2 Isolierte Reinsubstanzen phytogener Herkunft, die arzneilich verwendet werden Pflanzenteil

Inhaltsstoff

Anwendung

Artemisia annua

Kraut

Artemisinin (Qinghaosu)

Antimalariamittel (bei multiresistenter Malaria tropica)

Catharanthus roseus

Kraut

Vincristin und Vinblastin

Zytostatika, insbes. bei Leukämien

Cephaelis ipecacuanha

Wurzel

Emetin

Expektorans und bei Amöbenruhr (Protoplasmagift)

Cinchona-Arten

Rinde

Chinin, Chinidin

Malariamittel, Antiarrhythmikum

Coffea arabica und Coffea robusta

Samen

Coffein

Analeptikum, zentrales Stimulans

Colchicum autumnale

Samen, Knolle

Colchicin

Beim akuten Gichtanfall

Digitalis lanata

Blatt

Digoxin und Digitoxin

Herzinsuffizienz

Duboisia myoporoides u. D. leichhardtii

Blatt

Scopolamin

Als Antiemetikum

Erythroxylon coca

Blatt

Cocain

Lokales Anästhetikum

Galanthus nivalis

Kraut

Galanthamin

Bei Alzheimer-Erkrankung

Hyoscyamus muticus

Blätter

Hyoscyamin

Krämpfe im Verdauungstrakt

Papaver somniferum

Milchsaft (Opium)

Morphin, Codein

Analgetikum, Antitussivum

Physostigma venenosa

Samen

Physostigmin

Als Miotikum, als Antidot (Atropin, trizyklische Antidepressiva u. a. m.)

Silybum marianum

Früchte

Silybin (ein Isomerengemisch)

Lebertherapeutikum

Taxus brevifolia

Rinde

Taxol A (Paclitaxel)

Als Zytostatikum bei Ovarialkarzinom

Artname

153

154

7

Das medizinische Potential von Pflanzenstoffen

können. Im Abschnitt 7.2 wird diese Rolle von Planzenstofen als Rohstofquelle skizziert. Während der jahrzehntelangen Erforschung von Mikroorganismen auf der Suche nach immer neuen Antibiotika hatte eine Zeit lang das Interesse der Arzneimittelforschung an den Planzeninhaltsstofen stark nachgelassen. Mit dem Wandel des Krankheitsverständnisses unter dem Einluss der Molekularbiologie hat jedoch die Phytochemie in jüngster Zeit in Verbindung mit der neuen Forschungsrichtung der Proteomik neue Bedeutung erlangt. Ausgangspunkt ist die Schätzung, dass 98% aller Krankheiten von Proteinen beeinlusst werden, die fehlerhat, in zu geringen oder in zu großen Mengen oder aber auch am falschen Ort produziert werden. Die Aufgabe der Arzneimittelforschung innerhalb der Proteomikforschung besteht darin, Liganden für Proteine zu inden und damit Eingrifmöglichkeiten in ein pathologisches Geschehen auf Proteomebene. Nun ist allerdings die Zahl an menschlichen Proteinen viel zu groß, um quasi für jedes dieser Proteine einen passenden „Schlüssel“, d. h. einen niedermolekularen Liganden zu inden. Viele Proteine weisen jedoch in Form von Proteindomänen häuig wiederkehrende Bauelemente auf, d. h. die Zahl an Proteindomänen ist wesentlich kleiner als die Gesamtzahl der Proteine, die das menschliche Proteom ausmachen. Die bisherigen Forschungen haben gezeigt, dass gerade Planzenstofe ot hochspeziisch an bestimmte Proteindomänen binden. Auf den Unterschied von Planzenstofen und synthetischen Stofen wird in Abschnitt 7.5 eingegangen. Ein Stof, der an eine Proteindomäne andockt, zeigt in aller Regel eine biologische Wirkung, doch handelt es sich natürlich noch lange nicht um einen therapeutisch brauchbaren Wirkstof, d. h. über die Wirksamkeit ist damit noch lange nichts ausgesagt: Es fehlen Informationen über die Bioverfügbarkeit, über die Toxizität und über die therapeutische Wirksamkeit, die letztlich nur mittels klinischer Studien nachgewiesen werden können. Zwischen biologischen bzw. experimentell-pharmakologischen Wirkungen eines Stofes und seiner therapeutischen Wirksamkeit gilt es, streng zu diferenzieren. Diese wichtige Unterscheidung kommt im Abschnitt 7.4 zur Sprache.

7.1 In unveränderter Form genutzte Pflanzenstoffe Weltweit gesehen werden zwar einige tausend planzliche Arzneidrogen in Form von Extrakten und anderen planz-

lichen Arzneizubereitungen verwendet, allerdings außerhalb der naturwissenschatlichen Medizin. Demgegenüber ist die Zahl der in der wissenschatlichen Medizin aus planzlichen Arzneidrogen isolierten und als Arzneistofe verwendeten Substanzen sehr klein. > Tabelle 7.2 listet diejenigen Planzenstofe auf, die als aus Planzen isolierte Reinsubstanzen therapeutisch verwendet werden. Lassen sich genuine Pflanzenstoffe durch naturidentische Stoffe ersetzen? Planzenstofe können durch Ex-

traktion aus Drogen oder synthetisch hergestellt werden. Die Vorgeschichte eines Arzneistofes, ob Synthese- oder Naturprodukt, ist für dessen therapeutische Anwendung ohne Bedeutung. Zum Beispiel kann das für arzneiliche Zwecke verwendete Papaverin aus dem Opium stammen, es kann aber auch rein synthetischer Herkunt sein. Rein wirtschatliche Überlegungen bestimmen die Wahl. Im Allgemeinen können total synthetisch hergestellte Naturstofe nicht mit den durch Extraktion aus natürlichen Materialien hergestellte