Mikrobiologisches Praktikum: Versuche und Theorie

Springer-Lehrbuch

Springer Berlin Heidelberg New York Hongkong London Mailand Paris Tokio

A. Steinbüchel • F. B. Oppermann-Sanio

Mikrobiologisches Praktikum Versuche und Theorie unter der Mitarbeit von Christian Ewering, Markus Pötter und Frank Reinecke

Mit 207 Abbildungen und 106 Tabellen

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Professor Dr. ALEXANDER STEINBÜCHEL Dr. FRED BERND OPPERMANN-SANIO Universität Münster Institut für Mikrobiologie Corrensstraße 3 48149 Münster e-mail: [email protected] [email protected]

ISBN 978-3-642-17702-6 Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York Bibliografische Information Der Deutschen Bibliothek Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über abrufbar. Dieses Werk ist urheberrechtlich geschützt. Die dadurch begründeten Rechte, insbesondere die der Übersetzung, des Nachdrucks, des Vortrags, der Entnahme von Abbildungen und Tabellen, der Funksendung, der Mikroverfilmung oder der Vervielfältigung auf anderen Wegen und der Speicherung in Datenverarbeitungsanlagen, bleiben auch bei nur auszugsweiser Verwertung vorbehalten. Eine Vervielfältigung dieses Werkes oder von Teilen dieses Werkes ist auch im Einzelfall nur in den Grenzen der gesetzlichen Bestimmungen des Urheberrechtsgesetzes der Bundesrepublik Deutschland vom 9. September 1965 in der jeweils geltenden Fassung zulässig. Sie ist grundsätzlich vergütungspflichtig. Zuwiderhandlungen unterliegen den Strafbestimmungen des Urheberrechtsgesetzes. Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York ein Unternehmen der BertelsmannSpringer Science+Business Media GmbH http://www.springer.de © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2003, Nachdruck 2011

Die Wiedergabe von Gebrauchsnamen, Handelsnamen, Warenbezeichnungen usw. in diesem Werk berechtigt auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, daß solche Namen im Sinne der Warenzeichen- und MarkenschutzGesetzgebung als frei zu betrachten wären und daher von jedermann benutzt werden dürften. Produkthaftung: Für Angaben über Dosierungsanweisungen und Applikationsformen kann vom Verlag keine Gewähr übernommen werden. Derartige Angaben müssen vom jeweiligen Anwender im Einzelfall anhand anderer Literaturstellen auf ihre Richtigkeit überprüft werden. Satz: druckfertige Vorlagen der Autoren Einbandgestaltung: de´blik Graphische Gestaltung, Berlin (nach Vorlagen der Autoren) Umschlagabbildungen: Konidienträger des Schimmelpilzes Aspergillus niger (links); Kolonien vom Wildtyp und einer PHB-freien Mutante des Bakteriums Ralstonia eutropha (rechts) 29/3150 - 5 4 3 2 1 0 - Gedruckt auf säurefreiem Papier

Vorwort zur ersten Auflage Mikrobiologische Methoden haben in den letzten Jahrzehnten in einem immer stärker wachsenden Umfang Einzug in immer mehr Arbeitsgebiete erhalten. Die Beschäftigung mit Mikroorganismen und der Umgang mit ihnen hat dabei längst die traditionellen Gebiete der naturwissenschaftlichen und medizinischen Mikrobiologie verlassen. Mikrobiologische Methoden werden mittlerweile in den Naturwissenschaften nicht nur im Bereich der Mikrobiologie, sondern auch in der Zoologie und der Botanik, der Chemie und Biochemie sowie in den fachübergreifenden Gebieten wie Zellbiologie, Genetik, Molekularbiologie, Ökologie, Biotechnologie und vielen anderen Fachgebieten angewandt. Weite Bereiche der Landwirtschaft, die Pharmazeutische Industrie, Chemische Industrie und Lebensmittelindustrie, Umwelttechnik, Medizin wenden heute mikrobiologische Methoden und Verfahren an und nutzen die phantastische Stoffwechselvielfalt und -aktivität von Mikroorganismen. Entsprechend werden auch von den Angestellten und Beamten der Behörden, die öffentliche Fördermittel vergeben oder Aktivitäten überwachen und kontrollieren, umfassende mikrobiologische Kenntnisse erwartet, damit Nutzungs- und Gefährdungspotentiale beurteilt und gegebenenfalls gegeneinander abgewogen werden können. Ein Grundpraktikum Mikrobiologie muss heute also für viele Studierende Gegenstand der Ausbildung im Haupt- oder Nebenfach sein. In diesem Buch soll die Vielfalt der Mikroorganismen und vor allem die Vielfalt der Stoffwechselleistungen vermittelt werden. Einen Schwerpunkt bilden die Beiträge von Mikroorganismen zu den Stoffkreisläufen in der Natur, ohne die unsere Umwelt in dieser Form nicht existieren würde. Einen weiteren Schwerpunkt bilden Versuche, um Leistungen von Mikroorganismen für den Menschen und mikrobielle Stoffwechselprodukte, die von der Chemischen und Pharmazeutischen Industrie mit biotechnologischen Verfahren produziert werden, exemplarisch zu demonstrieren. Ein gutes Verständnis dieser Stoffwechselvorgänge setzt Kenntnisse der Stoffwechselphysiologie und der biochemischen Reaktionen voraus, die für die entsprechende Stoffwechselleistung verantwortlich sind. Wir betrachten es auch als Aufgabe, die Allgegenwart von Mikroorganismen und ihrer Produkte in unserem Alltag näher zu bringen. Eine Besonderheit dieses Buches ist es, die Grundlagen hierfür in jedem Versuch vorangestellt zu schildern. Es versteht sich von selbst, dass hier nur einige repräsentative Versuche dargestellt werden können, um diesen Einblick zu geben. Auch wird die Art der Versuche durch deren experimentellen Aufwand begrenzt. Wir haben bewusst solche Versuche aufgenommen, deren Durchführung ohne allzu großen technischen Aufwand möglich ist, dabei aber dennoch die Zielsetzung dieses Buches erreicht. Nach der Einführung wird zunächst ein kurzer theoretischer Überblick über die Mikroorganismen sowie deren Ansprüche und deren Beteiligung in globalen Stoffumsätzen und Kreisläufen gegeben. Es folgt der eigentliche Versuchsteil, in dem ausführlich Theorie und Praxis beschrieben werden. Kurzexkursionen und Demonstrationen werden im darauf folgenden Kapitel vorgeschlagen, durch die Mikroorganismen und deren Stoffwechselleistungen in verbreiteten Gewerbebetrieben sowie in der Natur „besichtigt“ werden können. Der Methodenteil, auf den in den Versuchen und Exkursionen Bezug genommen wird und in dem grundlegende Arbeitstechniken und häufig angewandte Nachweismethoden kurz beschrieben werden, schließt sich an.

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Vorwort

Dieses Buch versteht sich weniger als eine technische Methodensammlung zur Handhabung von Mikroorganismen. Hierfür gibt es andere hervorragende Bücher (Bast 2001). Die gebräuchlichen Methoden werden in diesem Buch natürlich detailliert beschrieben und können ohne zur Hilfenahme anderer Werke auf Grundlage dieser Informationen durchgeführt werden. Aus Gründen der Übersicht wird auf seltene und weniger verbreitete Methoden jedoch bewusst verzichtet oder auf diese nur kurz verwiesen. Das Buch MIKROBIOLOGISCHES PRAKTIKUM wendet sich an verschiedene Adressaten. Der angesprochene Kreis reicht von Studierenden an Hochschulen und Fachhochschulen, über Stätten der Ausbildung von technischem Personal bis hin zu Leistungskursen in der Sekundarstufe II an den Gymnasien einschließlich der Ausbilder, Gymnasiallehrer und Hochschullehrer. Darüber hinaus wird die mikrobiologische Ausbildung auf unterschiedlichem Niveau und in unterschiedlicher Intensität durchgeführt werden, und es stehen unterschiedlich lange Zeiträume für die Durchführung eines mikrobiologischen Praktikums zur Verfügung. Die Autoren tragen diesem Umstand Rechnung, indem sie am Ende des Buches Gestaltungsvorschläge für den Inhalt eines Praktikums in den verschiedenen Bereichen machen und hierfür geeignete Module zusammenstellen. Mit Modulen sind für die jeweilige Zielgruppe geeignete „Päckchen“ von Versuchen gemeint. Auch werden dort Empfehlungen gegeben, welche Versuche zur Durchführung in einem Biologie-Leistungskurs an Gymnasien geeignet sind. Wie nahezu alle anderen Praktika an Hochschulen und anderen Lehreinrichtungen werden auch mikrobiologische Praktika in der Regel mit einer Erfolgskontrolle abgeschlossen. Um den Studierenden und Praktikanten, die nach diesem Buch Versuche durchführen und lernen, eine Orientierungshilfe in dem schier undurchdringlichen Dschungel der Mikrobiologie zu geben, schließen wir jeden Versuchskomplex mit einem Katalog von 20 Fragen ab. Diese zielen auf besonders wichtige Aspekte von Theorie und Praxis des vorangegangen Versuchs ab. Dies ermöglicht es den Teilnehmern, Wichtiges von weniger Wichtigem zu unterscheiden. Zur Beantwortung der Fragen sollten auch einschlägige Lehrbücher der Mikrobiologie konsultiert werden. Eine intensive Auseinandersetzung mit diesen Fragen wird erheblich zu einem Bestehen der Erfolgskontrolle beitragen. Darüber hinaus sollen die Fragen die Leser anregen, sich weiterführend mit der Thematik zu beschäftigen. Auf eine Aufführung der Antworten wurde daher bewusst verzichtet. Die beigefügte Compact Disk (CD) enthält alle Abbildungen, Grafiken und Tabellen des Buchs und bietet zusätzliches Anschauungsmaterial, unter anderem Videosequenzen, für das Praktikum. Einerseits kann die CD von den Lehrenden über ihnen zur Verfügung stehende Medien im Praktikum eingesetzt werden, um dort Handlungsabläufe zu demonstrieren oder biologisches Material, wie z. B. Bakterienzellen, Kolonien, Strukturen chemischer Verbindungen oder Nachweisreaktionen zu zeigen. Andererseits hilft die CD den Studierenden bei der Nacharbeitung des im Praktikum Gebotenen, die erwarteten Ergebnisse werden gezeigt und Handlungsabläufe von wichtigen Methoden bleiben dokumentiert.* Die Autoren möchten Herrn Dr. Dieter Czeschlik sowie Frau Iris Lasch-Petersmann vom Springer Verlag für die Ermutigungen und Ermunterungen, dieses Buch zu schreiben, herzlich danken. Unser besonderer Dank gilt Frau Lasch-Petersmann sowie Frau Stefanie Wolf für die Betreuung und die vielen hilfreichen Ratschläge und für die Unterstützung, die wir in der Entstehungsphase dieses Buches erhalten haben. Die Autoren danken ferner Herrn Dr. Ingomar Reiff, dem langjährigen Akademischen Direktor des Instituts, der viele Versuche mit großem Engagement entwickelt und über Studentengenerationen optimiert hat; viele Abbildungen im M IKROBIOLOGISCHEN

Vorwort

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PRAKTIKUM stammen aus seiner Sammlung. Die Autoren danken auch Andrea Ockenfels, die viele Versuche auf ihre Durchführbarkeit überprüfte. Ein besonderer Dank gilt Karsten Rose, der die Versuchsvorschrift zur Herstellung von Insektentoxinen mit Bacillus thuringiensis entwickelte. Allen jetzigen und ehemaligen Mitarbeitern des Instituts sei gedankt, da ein wenig von jedem Einzelnen – sei es durch Betreuung von Praktika oder Forschungsarbeiten – in dem ein oder anderen Experiment steckt. Die Autoren und deren Mitarbeiter wünschen allen Lehrenden und Lernenden, die dieses Buch in der mikrobiologischen Grundausbildung verwenden und einsetzen, viel Erfolg bei der Durchführung der Versuche und viel Spaß und Freude an der Mikrobiologie. Für konstruktive Kritik und Vorschläge zur Abänderung oder Ergänzung einzelner Versuche oder Vorschläge zur Aufnahme weiterer Versuche sind wir jederzeit offen. Wir würden uns sehr freuen, wenn hierdurch die Qualität des Buches verbessert und der angesprochene Personenkreis erweitert werden könnte. Münster, im Januar 2003

Alexander Steinbüchel Fred Bernd Oppermann-Sanio Christian Ewering Markus Pötter Frank Reinecke

* Die Inhalte der CD finden Sie jetzt unter http://www.springer.com/978-3-642-17702-6.

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Inhaltsübersicht Vorwort zur ersten Auflage Inhaltsverzeichnis 1 Überblick über die Mikroorganismen 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8

2

Vorschriften und Gesetze im Zusammenhang mit mikrobiologischen Arbeiten 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7

3

3.4 3.5 3.6

5

5.4 5.5 5.6 5.7

8

Kultivierung von Mikroorganismen Mikroskopische Methoden Einfache taxonomische Verfahren zur Charakterisierung von Mikroorganismen Molekulargenetische Methoden Photometrische Methoden Quantifizierung von Zellen und Medienbestandteilen Chromatographische und elektrophoretische Methoden

Chemikalien, Nachweisreagenzien und Medien 6.1 6.2

7

Quantitative Bestimmungen Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen Abbauleistungen von Mikroorganismen Bakteriophagen und Viren Auslösung von Mutationen, Anreicherung von Mutanten und Übertragung von DNA

Exkursionen und Demonstrationen von Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie Methoden 5.1 5.2 5.3

6

Pathogene Mikroorganismen Gentechnisch veränderte Mikroorganismen Mikrobiologische Arbeiten im Produktionsmaßstab Biostoffverordnung (BioStoffV) Biologische Arbeitsstoffe und Risikogruppen Risikobewertung und Einstufung der Arbeiten Sicherheitsmaßnahmen und räumliche Voraussetzungen

Versuche 3.1 3.2 3.3

4

Prokaryonten und Eukaryonten Wachstums- und Nährstoffansprüche Die natürlichen Standorte der Mikroorganismen Stoffkreisläufe und Nahrungsketten Biotechnologie Kultivierbare und nichtkultivierbare Mikroorganismen Eingesetzte Mikroorganismen Weiterführende Literatur

Herstellung von Medien, Puffern und Lösungen Medien- und Chemikalienliste

Modulare Zusammenstellung von Versuchen für unterschiedliche Zielgruppen Stichwortverzeichnis

v

ix 1 1 6 8 10 15 16 18 20 22 22 23 23 24 24 26 27 29 29 42 112 201 239 249 295 355 355 373 377 385 390 403 404 409 409 409 430 434

ix

Inhaltsverzeichnis Vorwort zur ersten Auflage Inhaltsübersicht 1 Überblick über die Mikroorganismen 1.1 Prokaryonten und Eukaryonten 1.2 Wachstums- und Nährstoffansprüche 1.3 Die natürlichen Standorte der Mikroorganismen 1.4 Stoffkreisläufe und Nahrungsketten 1.5 Biotechnologie 1.6 Kultivierbare und nichtkultivierbare Mikroorganismen 1.7 Eingesetzte Mikroorganismen 1.8 Weiterführende Literatur 2 Vorschriften und Gesetze im Zusammenhang mit mikrobiologischen Arbeiten 2.1 Pathogene Mikroorganismen 2.2 Gentechnisch veränderte Mikroorganismen 2.3 Mikrobiologische Arbeiten im Produktionsmaßstab 2.4 Biostoffverordnung (BioStoffV) 2.5 Biologische Arbeitsstoffe und Risikogruppen 2.6 Risikobewertung und Einstufung der Arbeiten 2.7 Sicherheitsmaßnahmen und räumliche Voraussetzungen 3 Versuche 3.1 Quantitative Bestimmungen Versuch 1 Versuch 2

Bestimmung der Anzahl von Hefezellen in 1 g Bäckerhefe Aufnahme einer Wachstumskurve mit Ralstonia eutropha

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen Versuch Versuch Versuch Versuch

3 4 5 6

Versuch 7 Versuch 8 Versuch 9 Versuch 10 Versuch 11 Versuch 12

Anreicherung von Luftkeimen Anreicherung von Leuchtbakterien Anreicherung von Myxobakterien Anreicherung und Isolierung von Violacein-produzierenden Stämmen der Gattungen Chromobacterium und Janthinobacterium Direktisolierung von aeroben Endosporenbildnern (Bacillus megaterium) Anreicherung und Isolierung von saccharolytischen Clostridien Direktisolierung und taxonomische Bestimmung von fluoreszierenden Pseudomonaden Direktisolierung von Streptococcus salivarius Anreicherung und Isolierung von Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum Anreicherung und Isolierung von Propionibacterium sp.

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viii 1 1 6 8 10 15 16 18 20 22 22 23 23 24 24 26 27 29 29 30 34 42 43 46 51 55 59 62 66 70 74 77

x

Inhaltsverzeichnis Versuch 13 Versuch 14 Versuch Versuch Versuch Versuch

15 16 17 18

Versuch 19 Versuch 20

Anreicherung und Isolierung von aeroben N2-Fixierern (Azotobacter sp.) Anreicherung und Isolierung von anaeroben N2-Fixierern (Clostridium pasteurianum) Anreicherung von Nitrifizierern Anreicherung von Denitrifizierern Anreicherung und Isolierung von Knallgasbakterien Winogradsky-Säulen zur Anreicherung von anoxygenen phototrophen Bakterien Anreicherung und Isolierung von Schwefel-Oxidierern (farblose Schwefelbakterien) Anreicherung von sulfatreduzierenden Bakterien

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen Versuch Versuch Versuch Versuch Versuch

21 22 23 24 25

Versuch Versuch Versuch Versuch

26 27 28 29

Versuch Versuch Versuch Versuch Versuch Versuch

30 31 32 33 34 35

Versuch Versuch Versuch Versuch

36 37 38 39

Herstellung von Ethanol mit Hefe Herstellung von Glycerin mit Hefe durch Abfangverfahren Herstellung von Citronensäure mit Aspergillus niger Herstellung von Dihydroxyaceton mit Essigsäurebakterien Herstellung des Farbstoffs Indigo mit einem rekombinanten Stamm von Escherichia coli Herstellung und Nachweis von Antibiotika Herstellung von Insektentoxinen mit Bacillus thuringiensis Herstellung von Xanthan mit Xanthomonas campestris Herstellung von Dextran mit Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum Herstellung mikrobieller Cellulose mit Essigsäurebakterien Herstellung von Alginat mit Azotobacter vinelandii Herstellung von Bioplastik, Poly(3HB), mit Ralstonia eutropha Herstellung eines Elastomers mit Pseudomonas oleovorans Herstellung von Poly(γ-D-glutamat) mit Bacillus licheniformis Herstellung und Isolierung von Cyanophycin mit einem rekombinanten Stamm von Escherichia coli Herstellung von Sauerkraut Umwandlung von Wein in Weinessig Herstellung von Natto Herstellung von Tempeh

3.4 Abbauleistungen von Mikroorganismen Versuch Versuch Versuch Versuch Versuch Versuch Versuch

40 41 42 43 44 45 46

Mikrobieller Abbau von Poly(3-hydroxybutyrat) Mikrobieller Abbau von Kautschuk Mikrobieller Abbau von Stärke Partieller mikrobieller Abbau einer Fotokopie Mikrobieller Abbau von Kohlenwasserstoffen Mikrobieller Abbau von Polyethylenglykol Mikrobieller Abbau von Roundup®

3.5 Bakteriophagen und Viren Versuch 47 Versuch 48

Nachweis von Coli-Phagen im Abwasser Nachweis des Tabak-Mosaik-Virus (TMV)

81 85 88 91 95 99 105 108 112 114 119 124 127 131 136 140 145 150 153 157 161 167 174 178 183 188 193 197 201 202 207 212 216 220 228 233 239 240 246

Inhaltsverzeichnis

xi

3.6 Auslösung von Mutationen, Anreicherung von Mutanten und Übertragung von DNA Versuch 49 Versuch 50 Versuch Versuch Versuch Versuch Versuch Versuch

4

Ames-Test Erweiterung des Spektrums verwertbarer Substrate bei Ralstonia eutropha durch Mutagenese Poly(3HB)-negative Mutanten von Ralstonia eutropha Transformation von Bacillus subtilis Transformation von Escherichia coli Konjugation von Ralstonia eutropha Transposon-induzierte Mutanten von Ralstonia eutropha Elektroporation von Mycobacterium smegmatis

51 52 53 54 55 56

Exkursionen und Demonstrationen von Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie Exkursion Exkursion Exkursion Exkursion Exkursion Exkursion Demo 1 Demo 2 Demo 3 Demo 4

1 2 3 4 5 6

Demo 5 Demo 6

5

Kommunale Abwasserkläranlagen Kompostwerke Biogasanlagen Bierbrauerei und Braustätten Weinherstellung in Winzereien Silage in der Landwirtschaft Symbiontische N2-fixierende Bakterien und Wurzelknöllchen Rhizobium radiobacter und induzierte Pflanzentumore Claviceps purpurea und Mutterkorn-Alkaloide aus infiziertem Getreide Flechten: Ektosymbiosen von Pilzen mit Grünalgen oder Cyanobakterien Anaerobe Süßwassersedimente und das Volta-Experiment Farbstreifen-Sandwatt und Nordseeküste

Methoden 5.1 Kultivierung von Mikroorganismen Methode

1

Methode Methode Methode Methode Methode Methode

2 3 4 5 6 7

Herstellung von Nährmedien und Verwendung von Kulturgefäßen Sterilisation Herstellung einer Verdünnungsreihe von Zellsuspensionen Vereinzelung Kultivierung anaerober Mikroorganismen Verwendung einer Gasstation Dichtegradientenzentrifugation

5.2 Mikroskopische Methoden Methode 8 Methode 9 Methode 10 Methode 11

Lichtmikroskopie Messokular Zählkammer Tusche-Präparat

5.3 Einfache taxonomische Verfahren zur Charakterisierung von Mikroorganismen Methode 12 Methode 13 Methode 14 Methode 15 Methode 16

Bestimmung des Gram-Verhaltens Sporenfärbung Biochemische Charakterisierung von Anreicherungsund Reinkulturen Färbung von Poly(3HB) mit Sudanschwarz und Nilrot Färbung von Poly(glucose) mit Lugolscher Lösung

249 251 257 262 269 273 277 282 290 295 297 302 310 313 318 325 327 333 338 343 347 350 355 355 355 358 363 363 367 369 371 373 373 375 375 376 377 377 379 380 383 384

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Inhaltsverzeichnis

5.4 Molekulargenetische Methoden Methode Methode Methode Methode

17 18 19 20

Isolierung von Plasmid DNA aus Escherichia coli Transformation von Escherichia coli Isolierung von Gesamt DNA aus Bacillus subtilis Auslösung von Mutationen

5.5 Photometrische Methoden Methode Methode Methode Methode

21 22 23 24

Lambert-Beersches Gesetz Messung der Trübung von Zellsuspensionen Proteinbestimmung ganzer Zellen Einfacher und gekoppelter optisch-enzymatischer Test

5.6 Quantifizierung von Zellen und Medienbestandteilen Methode 25 Methode 26

Bestimmung der Trockenmasse einer Zellsuspension Bestimmung des Ammoniumgehalts

5.7 Chromatographische und elektrophoretische Methoden Methode 27 Methode 28 Methode 29

6

7 8

Bestimmung des Polyhydroxyalkanoat-Gehalts Trennung und Nachweis von Proteinen und Cyanophycin Gelpermeationschromatographie (GPC)

Chemikalien, Nachweisreagenzien und Medien 6.1 Herstellung von Medien, Puffern und Lösungen 6.2 Medien- und Chemikalienliste Modulare Zusammenstellung von Versuchen für unterschiedliche Zielgruppen Stichwortverzeichnis

385 385 386 387 388 390 390 391 392 393 403 403 404 404 404 405 408 409 409 409 430 434

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Überblick über die Mikroorganismen

Zu Beginn des MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUMS sollen einige einführende Anmerkungen gemacht werden, welche die in jeglicher Hinsicht außerordentlich große Diversität der Mikroorganismen verdeutlichen und einen Überblick über die verschiedenen Gruppen der Mikroorganismen und ihre Lebensweisen geben. Zurzeit sind ungefähr 5.000 Bakterienarten offiziell anerkannt. Bakterien zeichnen sich durch eine ungewöhnlich große Vielfalt aus. Entgegen häufig getätigten Äußerungen betrifft dies sogar die Zellmorphologie und die Zellgröße. Besonders vielseitig ist der Stoffwechsel der Bakterien. Hier gibt es zahlreiche Stoffwechselleistungen, die ausschließlich von Prokaryonten katalysiert werden können (Monopole der Prokaryonten) und ohne die ein Leben auf unserem Planeten auf lange Sicht nicht möglich wäre. Diese kurzen Ausführungen können die Lektüre von Lehrbüchern der Mikrobiologie nicht ersetzen; sie sollen jedoch auf das MIKROBIOLOGISCHE PRAKTIKUM einstimmen und einige besondere Aspekte beim Umgang mit Mikroorganismen hervorheben.

1.1

Prokaryonten und Eukaryonten

Prokaryonten

Eukaryonten

Organismen können auf Grund von Unterschieden ihrer Zellstrukturen und der Bausteine ihrer Zellen in die drei großen Domänen Eukarya, Bacteria und Tiere Pflanzen Archaea eingeteilt werden. Die Bacteria und Euglena Archaea werden auch als Prokaryonten Pilze Protozoen Mikroalgen zusammengefasst und den Eukaryonten gegenübergestellt, zu denen die Pflanzen und Tiere zählen ( Abb. 1.1). Versteht man Mikroorganismen unter Mikroorganismen einzellige OrganisBacteria Archaea men, dann umfasst diese Gruppe nicht nur die Prokaryonten, sondern auch etliche eukaryontische Organismen aus den BereiAbb. 1.1. Die großen Gruppen der chen der Pflanzen und Tiere. Die MikrobioOrganismen logie beschäftigt sich vornehmlich mit den prokaryontischen Mikroorganismen sowie mit Hefen und anderen Pilzen, die traditionell dem Bereich der Pflanzen zugerechnet werden, sowie mit Viren. 1.1.1

Das taxonomische und phylogenetische System der Mikroorganismen Die Taxonomie ist die Wissenschaft von der Identifizierung, Klassifizierung und Nomenklatur von Organismen und bedient sich eines hierarchischen Systems zur Einordnung in verschiedene Taxa. Dieses hierarchische System umfasst insgesamt acht Ebenen und reicht von den Domänen als oberste Ebene bis hinunter zu den Subspezies als unterster Ebene ( Abb. 1.2). Prokaryontische Mikroorganismen umfassen dabei mit den Bacteria und Archaea gleich zwei der drei Domänen des Lebens. Als nächste

A. Steinbüchel, F. B. Oppermann-Sanio, Mikrobiologisches Praktikum, DOI 10.1007/978-3-642-17703-3_1, © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2003, Nachdruck 2011

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1 Überblick über die Mikroorganismen

Ebenen folgen Phyla, Klassen, Ordnungen, Familien, Gattungen, Arten und schließlich die Subspezies. Hieran kann sich noch eine weitere unterhalb der Subspezies-Ebene angesiedelte Ebene anschließen. Die Phylogenie beschäftigt sich dagegen mit der evolutionären Stammesgeschichte von Organismen und versucht, den evolutionären Verwandtschaftsgrad von Organismen in Erfahrung zu bringen. Die phylogenetischen Beziehungen zwischen Bakterien werden heute zunehmend durch Vergleiche der 16S rRNA Sequenzen von Bakterienstämmen und darauf basierenden Stammbäumen dargestellt. Diese lassen in der Regel bereits weitreichende Rückschlüsse auf den Verwandtschaftsgrad von zwei Bakterien zu, reichen jedoch alleine nicht für eine vollständige Beschreibung aus. Die polyphasische Taxonomie versucht möglichst viele Zellkomponenten für eine umfassende Beschreibung und Bewertung einzubringen. Die Analyse umfasst phänotypische Eigenschaften (Morphologie, Gram-Verhalten, Physiologie, Enzymologie, Serologie), chemotaxonomische Marker (Fettsäurezusammensetzung, Mykolsäuren, polare Lipide, Chinone, Polyamine, Zellwandzusammensetzung, Exopolysaccharide usw.) sowie Daten von der Gesamt-DNA (Genomgröße, Verhältnis von G+C zu A+T, Restriktionsmuster, DNA-DNA-Hybridisierung), DNA-Fragmenten (PCR-basierte Fingerabdrucksmethoden, Hybridisierung mit spezifischen Sonden, Sequenzierung), RNA (16S rRNA Sequenzen, Profile kleiner RNA Moleküle) und Proteinen (Elektropherogramme von Gesamtprotein oder subzellulären Fraktionen, Enzymmuster). Für die Benennung eines Bakteriums wird das binominale System angewandt, und der Name eines Bakteriums (z. B. Escherichia coli) setzt sich aus einem Gattungsnamen (hier: Escherichia) und einem Artnamen (hier: coli) zusammen. Art- und Gattungsname werden wie die Bezeichnungen aller anderen Taxa immer kursiv geschrieben. Der Gattungsname wird, nachdem er einmal eingeführt worden ist, nachfolgend meist mit dem ersten Buchstaben abgekürzt verwendet (hier: E. coli).

Abb. 1.2.

Das hierarchische System der Taxonomie

1.1 Prokaryonten und Eukaryonten

In der Mikrobiologie wird üblicherweise mit Bakterienstämmen umgegangen. Wird im Labor ein Wachstumsexperiment durchgeführt, soll im Labor in einem Bakterium ein bestimmter Zellinhaltsstoff nachgewiesen werden oder wird in der Industrie ein biotechnologisches Produkt mit einem Bakterium hergestellt, dann wird hierfür immer ein bestimmter Bakterienstamm eingesetzt. Unter einem Stamm wird in der Mikrobiologie eine Reinkultur von Nachfahren eines aus der Natur isolierten Bakteriums mit bekannter Herkunft verstanden. Es handelt sich dabei z. B. um das Bakterium, welches Sie im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM in einem bestimmten Versuch einsetzen oder welches Sie aus der Natur anreichern. Die wichtigste taxonomische Einheit ist die Art oder Spezies. Hierunter versteht man eine distinkte Gruppe von Stämmen, die sich in wichtigen phänotypischen Eigenschaften sehr ähnlich sind, aber durchaus geringfügige Unterschiede in anderen, als weniger wichtig eingestuften Merkmalen aufweisen können. Auf molekularer Ebene (s. u.) sollten die 16S rRNA Sequenzen von Stämmen einer Art mindestens 97 % Ähnlichkeit zueinander aufweisen und die DNA Sequenzen der Genome sollten zu mindestens 70 % identisch sein. Sind die Ähnlichkeiten von 16S rRNA bzw. Gesamt-DNA geringer, dann gehört der Stamm einer anderen, bereits existierenden oder noch zu beschreibenden Spezies an. Einer der Stämme einer Spezies wird immer als Typstamm bezeichnet. Zurzeit sind ca. 5.000 verschiedene Bakterienarten bekannt. Die nächst höhere Ebene in der taxonomischen Hierarchie ist die Gattung, in der verschiedene Spezies zum nächst höheren Taxon zusammengefasst werden. Wichtige phänotypische Eigenschaften sollten hier übereinstimmen, und auch die 16S rRNA muss eine deutliche Ähnlichkeit aufweisen. Als Grenze zu einer anderen Gattung wird hier eine Ähnlichkeit der 16S rRNA Sequenzen von verschiedenen Spezies einer Gattung von ca. 93 bis 95 % angesehen. Sind die Ähnlichkeiten geringer, dann gehört die Spezies mit großer Wahrscheinlichkeit zu einer anderen bereits existierenden oder noch zu beschreibenden Gattung. In der neuesten Ausgabe von Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology aus dem Jahr 2001 werden insgesamt 942 unterschiedliche Gattungen aufgeführt. Die dort genannten Gattungen werden dann zu insgesamt 167 Familien, diese zu 83 Ordnungen, diese zu insgesamt 39 Klassen und diese wiederum zu 25 Phyla der beiden Domänen der Prokaryonten zusammengefasst, wobei zwei Phyla von Archaea und 23 Phyla von Bacteria belegt sind ( Tabelle 1.1). Innerhalb einer Spezies können einzelne Stämme auf Grund von phänotypischen Merkmalen, der 16S rRNA Sequenzen oder der Ergebnisse von DNA-DNA-Hybridierungsexperimenten in Subspezies unterteilt werden, wenn die Merkmale bzw. Sequenzen keine homogene Variation und Verteilung sondern eine deutliche Bildung von Clustern erkennen lassen. Subspezies stellen die unterste offizielle Hierarchiestufe bei Bakterien dar. Werden von einer Art Subspezies unterschieden, dann wird dem Bakteriennamen die Bezeichnung „subsp“. mit dem Namen der Subspezies angehängt (z. B. Amycolatopsis orientalis subsp. lurida). Aus praktischen Gesichtspunkten wird häufig noch eine weitere Hierarchieebene unter der Subspezies verwendet. Diese in der Taxonomie nicht offizielle Ebene beschreibt besondere Eigenschaften des betreffenden Bakterienstammes, wie besondere biochemische oder stoffwechselphysiologische Eigenschaften (Biovar), besondere morphologische Eigenschaften (Morphovar), den bevorzugten Wirt bei pathogenen Bakterien (Pathovar), welche Bakteriophagen dieses Bakterium infizieren und lysieren können (Phagovar) oder die Reaktion mit bestimmten stammspezifischen Antikörpern (Serovar). Diese Bezeichnungen sind sehr häufig von großem praktischen Nutzen und kennzeichnen manchmal die einzige Eigenschaft, mit der sich dieser Bakterienstamm von anderen unterscheiden lässt. Hinter Rhizobium leguminosarum biovar trifolii verbirgt sich z. B. ein Stamm, welcher die Wurzelhaare von Klee infiziert und dort die Bildung von Wurzelknöllchen induziert, während Rhizobum leguminosarum biovar phaseoli die Bildung von Wurzelknöllchen bei der Bohne verursacht.

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1 Überblick über die Mikroorganismen

Pseudomonas syringae pathovar tomato verursacht bei Tomatenpflanzen eine Erkrankung, während Pseudomonas syringae pathovar tabaci bei Tabakpflanzen die entsprechende Krankheit hervorruft. Die 25 Phyla sind sowohl die Anzahl der Organismen als auch die Anzahl der Taxa betreffend sehr unterschiedlich und heterogen. Nur acht Phyla enthalten mehr als zehn Gattungen, fünf Phyla bestehen aus jeweils nur einer einzigen Gattung. Das mit Abstand umfangreichste Phylum sind die Proteobacteria; dieses Phylum umfasst mit den Alpha-, Beta-, Gamma-, Delta- und Epsilonproteobacteria insgesamt fünf der 39 Klassen. Zu den Proteobacteria gehören 33 der 83 Ordnungen, 69 der 167 Familien sowie 404 aller beschriebenen 942 Gattungen. Weitere sehr umfangreiche Phyla stellen die Firmicutes, Actinobacteria, Bacteriodetes und die Cyanobacteria dar. Das Phylum Cyanobacteria enthält wahrscheinlich die meisten Spezies. Umfassende klärende Untersuchungen werden in diesem Phylum jedoch durch das langsame Wachstum, die z. T. schwierige Kultivierbarkeit dieser phototrophen Bakterien und die große Anzahl von nicht in Reinkultur vorliegenden Bakterien stark erschwert.

Tabelle 1.1. Die 25 Phyla der Prokaryonten mit Angabe der Anzahl der jeweils untergeordneten Gattungen Archaea Crenarchaeota Euryarchaeota Eubacteria Aquificae Thermotogae Thermodesulfobacteria Deinococcus-Thermus Chrysiogenetes Chloroflexi Thermomicrobia Nitrospirae Deferribacteres Cyanobacteria Chlorobi Proteobacteria Firmicutes Actinobacteria Planctomycetes Chlamydiae Spirochaetes Fibrobacteres Acidobacteria Bacteriodetes Fusobacteria Verrucomicrobia Dictyoglomi

22 47 5 5 1 3 1 5 1 4 4 56 5 404 164 130 4 5 13 1 3 49 7 2 1

Die im Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology aufgeführte und gerade aktualisierte Einteilung der Mikroorganismen ist seit Drucklegung des Buches bereits wieder in vielen Taxa überarbeitet und ergänzt worden, und viele neue Arten und Gattungen sind hinzugekommen. Sehr hilfreich bei der taxonomischen Zuordnung von Bakterien sind Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology sowie das Standardwerk The Prokaryotes, welche ausführliche Beschreibungen der Arten und Genera sowie sehr viele dichotome Schlüssel für die Bestimmung enthalten. In der Taxonomie steckt zurzeit sehr viel Dynamik. Will der Mikrobiologe auf dem Stand der Zeit sein, muss unbedingt die aktuelle Literatur verfolgt werden. Hier kommt der Zeitschrift International Journal of Evolutionary and Systematic Bacteriology eine zentrale Bedeutung zu. Auch sollten Listen, in denen die anerkannten Namen von Bakterien aufgeführt sind, aufmerksam verfolgt werden. Eine sehr gute und aktuelle Liste mit Verweisen auf alte, nicht mehr gültige Bakteriennamen sowie auf die Literatur, welche zur Zuordnung eines bekannten Bakteriums zu einem neuen Taxon oder zur Beschreibung von neuen Bakterienarten und -gattungen geführt hat, wird regelmäßig von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in Braunschweig veröffentlicht. Die jeweils aktuelle Liste ist auch auf der Homepage der DSMZ unter http://www.dsmz.de verfügbar.

1.1 Prokaryonten und Eukaryonten

1.1.2

Diversität bezüglich Form und Größe

Viele Bakterien zeichnen sich durch eine einfache, eher langweilige Zellform und durch eine geringe Größe aus. Die meisten im Labor kultivierbaren Bakterien haben entweder eine gerade oder gewundene stäbchenförmige Zellform (Stäbchen, Vibrionen, Spirillen) oder sind kugelrund (Kokken). Die Zelldimensionen der meisten Bakterien betragen 0,5 bis 3 μm. Nun gibt es aber auch bei den Bakterien häufig mehr oder weniger starke Abweichungen von den genannten Zellformen: gestielte oder mit Fortsätzen versehene Bakterien, dreieckige oder quadratische Bakterien, hyphen- oder scheidenbildende Bakterien sowie endosporen-, cysten- oder exosporenbildende Bakterien wurden beschrieben. Auch gibt es viele Bakterien, die sehr unterschiedlich beschaffene Zellaggregate, wie Zellfäden, Zellpakete, Zellflocken usw., ausbilden können oder Fruchtkörper ausbilden. Auch hier würde es zu weit führen, alle Besonderheiten aufzuführen. Der Leser sei auf die Konsultation von Lehrbüchern der Mikrobiologie oder Handbüchern über Prokaryonten verwiesen. Auffällig ist, dass offensichtlich eine gewisse Parallele zwischen der Komplexizität von Zellform und -struktur und dem Aufwand, der für die Kultivierung dieser Bakterien erforderlich ist, besteht. Auch von daher mag die Beschäftigung mit nicht kultivierbaren Mikroorganismen (s. u.) noch etliche Überraschungen zu Tage fördern. Auch bezüglich der Zellgröße können sich Prokaryonten gewaltig unterscheiden. Während die Zelldimensionen des von den Mikrobiologen am besten und häufigsten untersuchten Bakteriums Escherichia coli ungefähr 0,6 × 1,4 μm betragen, gibt es auch um mehrere Größenordnungen größere Bakterien. Relativ große Bakterien wurden in der Vergangenheit auffällig häufig unter den anoxygenen phototrophen Bakterien (z. B. Thiospirillum jenense und Chromatium okenii) sowie unter den farblosen Schwefelbakterien (z. B. Beggiatoa alba und Achromatium oxaliferum) gefunden. Bis vor kurzem galt das im Intestinalrakt einiger Fische lebende Bakterium Epulopiscium fishelsonii als größtes Bakterium, dessen stäbchenförmige Zellen ungefähr 600 μm lang sind und einen Durchmesser von ca. 80 μm haben. Alleine wegen dieser riesigen Ausmaße war das Bakterium lange Zeit nicht als Prokaryont angesehen worden. Erst die Analyse der 16S rRNA Sequenz ordnete diesen Organismus eindeutig der Domäne der Bacteria zu. Vor kurzem wurde vor der Küste Südafrikas ein noch größeres Bakterium isoliert. Thiomargarita namibiensis besitzt kugelförmige Zellen, die einen Durchmesser von bis zu 800 μm besitzen können. Im Zentrum der Zelle befindet sich eine große Vakuole, die eine wässrige Lösung mit bis zu 800 mM Nitrat enthalten kann. Das viele Schwefelgrana enthaltende Cytoplasma dieses Bakterium ist auf eine dünne Schicht zwischen Vakuole und Cytoplasmamembran beschränkt und macht lediglich ca. 2 % des Zellinhaltes aus. Auch der Stoffwechsel dieses Bakteriums ist sehr interessant: T. namibiensis nutzt reduzierte Schwefelverbindungen als Elektronendonator für die Reduktion von Nitrat. Aber es gibt auch sehr kleine Bakterien. Häufig handelt es sich dabei um pathogene oder parasitische Bakterien. So zeichnen sich z. B. die pathogenen Vertreter der Gattung Mycoplasma und die obligat endosymbiontisch in Bakterien lebenden Vertreter der Gattung Bdellovibrio durch geringe Zelldimensionen aus. Das Bakterium Dehalococcoides ethenogenes weist Zelldimensionen von ca. 0,15 × 0,45 μm auf. Noch kleiner sind die so genannten Nanobakterien. Die Zellen dieses als Vertreter eines neuen Phylums zur Domäne der Archaea gehörenden Bakteriums Nanoarchaeum equitans sitzen auf der Oberfläche von Zellen der Gattung Ignicoccus, die N. equitans als Wirt dienen. Dieses Bakterium besitzt mit ca. 500 kbp zugleich das kleinste, bisher bekannte bakterielle Genom. Berechnet man aus den unterschiedlichen Zelldurchmesser und -längen die Zellvolumina, dann erscheinen die Größenunterschiede noch dramatischer: Während in einer Zelle von E. coli rein rechnerisch ca. 100 bis 200 Zellen von D. ethenogenes oder

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6

1 Überblick über die Mikroorganismen

N. equitans Plätz fänden, würden in eine Zelle von E. fishelsonii ca. 2 Millionen Zellen von E. coli Platz finden; in einer einzigen Zelle von T. namibiensis wäre sogar Platz für ca. 300 Millionen E. coli-Zellen. 1.1.3

Diversität bezüglich des Stoffwechsels

Die größte Vielfalt bietet jedoch der Stoffwechsel (Metabolismus); hier sind Prokaryonten in ihrer Gesamtheit unübertroffen. Dies betrifft nicht nur die Syntheseleistungen (Anabolismus) sondern auch die Abbauleistungen (Katabolismus) sowie den Intermediärstoffwechsel (Amphibolismus). Viele sehr wichtige Stoffumsetzungen können ausschließlich von prokaryontischen Mikroorganismen katalysiert werden und sind in Eukaryonten nicht oder nur in sehr seltenen Ausnahmefällen anzutreffen. Aus Platzgründen kann darauf hier nicht im Detail eingegangen werden. Hierzu müssen Lehrbücher der Mikrobiologie konsultiert werden. Auch sollte die Originalliteratur aufmerksam verfolgt werden, da immer noch ständig neue Stoffwechselleistungen von Bakterien entdeckt werden. Einige der Besonderheiten des Stoffwechsels werden wir in den Versuchen im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM kennen lernen. Wichtige Monopole der Prokaryonten, ohne die bestimmte Stoffkreisläufe nicht möglich sind, werden weiter unten erwähnt.

1.2

Wachstums- und Nährstoffansprüche

Wenn Mikroorganismen einen aktiven Stoffwechsel besitzen und sich vermehren sollen, müssen zwei Voraussetzungen erfüllt sein: Es müssen geeignete physikalische und chemische Rahmenbedingungen und gegebenenfalls weitere abiotische Faktoren gegeben sein, und diese müssen nach dem von Shelford aufgestellten Gesetz im Toleranzbereich der Organismen liegen ( Kasten). Ferner müssen alle Nährstoffe vorhanden sein, die von den Mikroorganismen zum Aufbau der Zellsubstanz sowie zur Erzeugung von genügend Energie benötigt werden. Diese müssen in einer Konzentration vorliegen, in der sie von den Mikroorganismen verwertet werden können (minimale Konzentration) und die von den Mikroorganismen noch toleriert werden kann (maximale Konzentration). Soll ausgedehntes Wachstum erfolgen, um z. B. in einem biotechnologischen Prozess möglichst viel Biomasse zu produzieren, darf nicht frühzeitig ein Nährstoff das Wachstum limitieren. Hierbei muss dem von dem Agrikulturchemiker Justus von Liebig aufgestellten Gesetz des Minimums ( Kasten) Rechnung getragen werden. Diese ursprünglich bei der Untersuchung landwirtschaftlicher Produktivität gefundene Gesetzmäßigkeit muss nicht nur bei der Konzeption von Nährböden und Nährmedien zur Kultivierung von Mikroorganismen Beachtung finden, sondern sollte auch bei der Betrachtung der natürlichen Habitate von Mikroorganismen berücksichtigt werden. Hierdurch wird letztlich die Anzahl bzw. die Zelldichte festgelegt, in der ein bestimmter Mikroorganismus an einem natürlichen Standort vorkommen kann. Betrachtet man zwei verschiedene Organismen in einem Ökosystem, so können diese natürlich durch verschiedene Nährstoffe begrenzt sein. Die Anwesenheit und der Erfolg eines Organismus in einem Ökosystem ist also abhängig von der Erfüllung der Nährstoffansprüche sowie von einer Überschneidung von Toleranzbereich und den gegebenen Bedingungen. Gesetz des Minimums (Liebig, 1840)

Gesetz der Toleranz (Shelford, 1913)

Der Gehalt an Biomasse eines jeden Organismus wird begrenzt durch denjenigen Nährstoff, der im Vergleich zu den Nährstoffansprüchen am Standort in der niedrigsten Konzentration vorhanden ist.

Jeder Organismus benötigt in einem gegebenen Ökosystem einen kompletten Satz von Bedingungen zum Überleben und zum Wachstum. Jede Bedingung muss im Toleranzbereich des jeweiligen Organismus liegen.

1.2 Wachstums- und Nährstoffansprüche

Alle in den Zellbestandteilen vorkommenden Elemente müssen im Nährmedium in Makroelemente Spurenelemente der einen oder anderen Form enthalten sein. Man unterscheidet dabei die Makroelemente C Kohlenstoff Ag Silber von den Mikroelementen bzw. SpureneleCa Calcium B Bor Fe Eisen Cd Cadmium menten ( Tabelle 1.2). Die elf MakroH Wasserstoff Cl Chlor elemente werden von allen Organismen K Kalium Co Kobalt benötigt und sind essentielle Bestandteile der Mg Magnesium Cr Chrom Biomoleküle, oder sie werden in ionischer N Stickstoff Cu Kupfer Form als Cofaktoren essentieller Enzyme Na Natrium Hg Quecksilber benötigt oder kommen als Bestandteile von O Sauerstoff Mn Mangan Coenzymen bzw. prosthetischen Gruppen P Phosphor Mo Molybdän vor. Die Spurenelemente werden dagegen S Schwefel Ni Nickel nicht von allen, sondern nur von bestimmSe Selen ten Mikroorganismen benötigt. Es handelt V Vanadium W Wolfram sich fast immer um Bestandteile von EnzyZn Zink men, Coenzymen oder prosthetischen Gruppen, oder sie werden in Form von Ionen direkt als Cofaktoren von bestimmten EnzyTabelle 1.3. Typische Elementarmen für besondere Stoffwechselleistungen zusammensetzung von Mikroorganismen benötigt. So benötigen z. B. die meisten (außer Wasserstoff und Sauerstoff; in % der Nitrogenasen Molybdän-Ionen als Cofaktor. Zelltrockenmasse) Wenn diese Mikroorganismen eine aktive Element Bakterien Pilze Nitrogenase synthetisieren sollen, muss im C Kohlenstoff 48,0 48,0 Medium Molybdän in Form eines anorgaN Stickstoff 12,5 7,5 nischen Salzes als Spurenelement vorhanden P Phosphor 2,5 0,4 sein. Die Knallgasbakterien benötigen zum K Kalium 2,3 1,4 chemolithoautotrophen Wachstum Nickel, Na Natrium 0,8 0,3 da Nickel-Ionen unter anderem Bestandteile Ca Calcium 0,6 0,8 der aktiven Hydrogenase sind. Bei heteroS Schwefel 0,6 0,3 trophem Wachstum wird Nickel normalerMg Magnesium 0,3 0,2 weise nicht benötigt, es sei denn den Zellen Cu Kupfer 0,02 Fe Eisen 0,01 0,15 wird Harnstoff als alleinige Stickstoffquelle Mn Mangan 0,01 angeboten. Das Enzym Urease, welches Harnstoff in CO2 und NH3 spaltet, benötigt Nickel als Cofaktor. Es hängt also vom Stoffwechseltyp der Mikroorganismen und ihrer Lebensweise ab, ob und welche Spurenelemente das Medium enthalten muss. Diesem Umstand ist bei der Kultivierung von Mikroorganismen unbedingt Rechnung zu tragen; er ist auch zu berücksichtigen, wenn bestimmte Mikroorganismen aus der Natur angereichert werden sollen. Tabelle 1.2.

Makro- und Spurenelemente

Die durchschnittliche Zusammensetzung von Bakterienzellen wurde verschiedentlich ermittelt und gibt gute Anhaltspunkte dafür, wie eine Nährlösung zusammengesetzt sein muss. Ein Beispiel ist in Tabelle 1.3 aufgeführt. Dabei ist jedoch zu berücksichtigen, dass diese Zusammensetzung von Bakterienstamm zu Bakterienstamm und sogar innerhalb eines Bakterienstammes je nach physiologischem Zustand sehr stark variieren kann. Eine Zelle, die große Mengen des Speicherstoffs Poly(3-hydroxybutyrat) akkumuliert hat, wird einen wesentlich niedrigeren Stickstoffgehalt aufweisen als eine Zelle, welche diesen Speicherstoff nicht gebildet hat. Auch wenn der Aufwand für eine Analyse der Elementarzusammensetzung relativ groß ist, kann sich diese lohnen, wenn das Bakterium in einem biotechnologischen Prozess zur Produktion von Zellen oder Zellinhaltsstoffen eingesetzt wird. Anhand der Elementarzusammensetzung kann

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8

1 Überblick über die Mikroorganismen Universell anwendbares Beispiel zur Berechnung des Nährstoff-Bedarfs Aufgabe Ein Bakterium, welches keine Speicherstoffe synthetisieren kann, soll in einem Bioreaktor bis zu einer Zelldichte von 50 g Zelltrockenmasse (ZTM) pro Liter kultiviert werden. Hierzu wird ein Mineralsalzmedium mit NH4Cl als Stickstoffquelle eingesetzt. Frage Wie viel NH4Cl (=X) in g/l muss den Zellen im Medium angeboten werden, damit diese Zelldichte erreicht werden kann?

Lösung Es werden insgesamt1) 23,85 g NH4Cl pro Liter Nährlösung benötigt, um eine Zelldichte von 50 g ZTM/l zu erreichen.

Rechenweg 2)

ZTM (g/l) × Anteil N an ZTM (g/g) × M W ( NH 4 Cl ) ( g/mol ) X = ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Anteil N an NH 4 Cl (g/mol) 50,0 g/l × 0,125 g/g × 53,46 g/mol X = -----------------------------------------------------------------------------------14,007 g/mol X = 23,85 g/l Abkürzungen und Symbole: MW, Molekulargewicht; ZTM, Zelltrockenmasse; 1) in dieser Konzentration ist Ammonium für die meisten Bakterien toxisch; NH4Cl muss deshalb in mehreren kleinen Portionen während des Wachstums zugegeben werden; 2) N = Stickstoff ( Tabelle 1.3)

dann berechnet werden, welche Menge eines bestimmten Nährstoffs in einem Medium mindestens vorhanden sein muss, damit die gewünschte Zellmasse bzw. die gewünschte Menge des Zellinhaltsstoffes überhaupt erreicht werden kann. Zur Kultivierung von Mikroorganismen können mineralische oder komplexe Nährmedien verwendet werden. Bei mineralischen Nährmedien werden sämtliche Makro- und Spurenelemente in Form anorganischer Salze verabreicht. Handelt es sich um autotrophe Mikroorganismen, wird CO2 oder Bicarbonat als Kohlenstoffquelle verabreicht. Lediglich bei heterotrophen Mikroorganismen wird die Kohlenstoffquelle als organische Verbindungen, z. B. als Glucose oder als Fettsäure, verabreicht. Prototrophe Mikroorganismen können dann alle Zellbestandteile aus diesen Komponenten selbst synthetisieren. Lediglich auxotrophe Mikroorganismen oder eine auxotrophe Mutante von einem ehemals prototrophen Wildtyp benötigen dann einzelne zusätzliche chemische Verbindungen, wie z. B. Aminosäuren oder Vitamine als Supplin im Medium, da sie bedingt durch fehlende oder defekte Biosynthesewege nicht mehr alle Zellbestandteile selbst synthetisieren können. Komplexe Nährmedien bestehen häufig nur aus wenigen Komponenten, die dann bereits alle Makroelemente enthalten. Hefeextrakt, Fischmehl, Peptone und Melasse sind einige Beispiele hierfür. I. d. R. sind die Spurenelemente in diesen Komponenten bereits enthalten.

1.3

Die natürlichen Standorte der Mikroorganismen

Die Biosphäre umspannt die Geosphäre, Hydrosphäre und Atmosphäre ( Abb. 1.3). In allen drei Sphären kommen Mikroorganismen in unterschiedlichsten Ökosystemen vor. Dabei ist die Atmosphäre der unwirtlichste Bereich; in ihr können sich Mikroorganismen nicht wirklich vermehren und sind dauerhaft der zellschädigenden UV-Strahlung ausgesetzt. Über die Atmosphäre können Mikroorganismen jedoch z. T. über große Entfernungen verteilt werden. Die Hydrosphäre bildet ca. 70 % der Oberfläche unseres Planeten und ist ein sehr wichtiger Teil der Biosphäre. Hier sind zwei bezüglich der Salzkonzentration sehr unterschiedliche Bereiche zu unterscheiden.

1.3 Die natürlichen Standorte der Mikroorganismen

Wir kennen Süßwasserstandorte und marine Standorte. Beide gehen häufig durch Ästuarien bzw. Brackwasserzonen ineinander über. Die vielfältigste Sphäre ist sicherlich die Geosphäre, zu der z. B. Erdböden und Felsoberflächen gehören. Ökosysteme stellen die Grundeinheiten in der Ökologie dar. Ein Ökosystem besteht aus der biotischen Komponente, der Biozönose – also der Lebensgemeinschaft aller dort vorhandenen Organismen, und den abiotischen Faktoren ( Tabelle 1.4), d. h. den physikalischen und chemischen Bedingungen. Beispiele für Ökosysteme sind ein Teich, das Wattenmeer, die Mundhöhle, der Pansen der Wiederkäuer, die Blattoberfläche einer Pflanze. Unter einem ökologischen Standort oder Habitat versteht man die Lokalität innerhalb eines Ökosystems, an dem ein bestimmter Mikroorganismus normalerweise anzutreffen ist. Jeder Mikroorganismus besitzt mindestens einen Standort, kann Abb. 1.3. Die Biosphäre aber auch in mehreren Ökosystemen vorkommen. In einem Ökosystem besitzt ein Mikroorganismus meist nur einen Standort. Ein Bakterium kommt also im Ökosystem Teich z. B. entweder im oberen Teil des Wasserkörpers vor, weil er z. B. Sauerstoff oder Licht benötigt, oder er kommt im Schlamm vor, weil er strikt anaerob ist und z. B. Sulfat als Elektronenakzeptor benötigt. Unter der ökologischen Nische wird die Funktion eines Mikroorganismus in der Biozönose verstanden, nicht dessen räumliche Lokalität. Welche ökologische Nische ein Mikroorganismus einnimmt, ist abhängig von seinen ernährungsphysiologischen Ansprüchen, seinen kinetischen Eigenschaften und biochemischen Fertigkeiten sowie von strukturellen Besonderheiten und der Toleranz gegenüber den gegebenen abiotischen Rahmenbedingungen. Tabelle 1.4.

Abiotische Faktoren

• Bewegungen und Strömungen • Chemische Verbindungen • Druck (atmosphärischer Druck, hydrostatischer Druck, osmotischer Druck) • Magnetfelder • Nährstoffe (anorganische und organische Verbindungen) • Oberflächen • Redoxpotential • Salinität • Sauerstoff • Strahlung (sichtbares Licht, UV-Strahlung, ionisierende Strahlung) • Temperatur • Wassergehalt • Wasserstoffionenkonzentration (pH)

Bezüglich der Mikroorganismen, die in einem Ökosystem anzutreffen sind, wird die autochthone Flora von der allochthonen bzw. zymogenen Flora unterschieden. Vertreter der autochthonen Flora gelten als die wahren Bewohner eines Ökosystems, weil sie dort stets anzutreffen und dessen fester Bestandteil sind. Häufig handelt es sich um hochspezialiserte Mikroorganismen, deren Vorkommen auf einer normalerweise konstanten Zufuhr von Nährstoffen basiert, die für das betreffende Ökosystem typisch ist. Vertreter der allochthonen Flora sind dagegen keine typischen Bewohner eines Ökosystems und werden dorthin aus einem anderen Standort eingetragen. Ihre Anzahl variiert sehr stark in Abhängigkeit von für das Ökosystem untypischen exogenen Substraten, die in das Ökosystem gelangen und auf denen sie schnell wachsen können. Viele ubiquitär verbreitete Boden- und Wasserbakterien gehören hierzu. Diesem Aspekt ist

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10

1 Überblick über die Mikroorganismen

bei der Anreicherung und Isolierung von Mikroorganismen aus der Natur Rechnung zu tragen. Meist beinhaltet die autochthone Flora die interessanteren Vertreter, und meist zielen die Anreicherung auf eine Isolierung dieser Mikroorganismen ab. Häufig setzen sich bei Anreicherungen jedoch Vertreter der allochthonen Flora durch.

1.4

Stoffkreisläufe und Nahrungsketten

Mikroorganismen leisten wesentliche Beiträge zur Umsetzung nahezu sämtlicher Elemente. Da alle Elemente auf lange Sicht betrachtet nur in endlicher Menge zur Verfügung stehen, müssen deren Umsetzungen in Kreisläufen erfolgen. Würde dies nicht der Fall sein, dann würde sich ein Elemente in einer bestimmten Form akkumulieren, und es wäre für die Biosphäre nicht mehr verfügbar. Mikroorganismen sind an diesen Kreisläufen wesentlich beteiligt und katalysieren an verschiedenen Stellen Stoffwechselreaktionen, die von keinen anderen Organismen katalysiert werden können. Auf diese Weise tragen Mikroorganismen wesentlich zu diesen Kreisläufen bei bzw. ermöglichen diese erst überhaupt.

Abb. 1.4.

Kohlenstoffkreislauf

1.4 Stoffkreisläufe und Nahrungsketten

Abb. 1.5.

1.4.1

Anaerobe Nahrungsketten

Kohlenstoffkreislauf

Im Kohlenstoffkreislauf sind zwei wichtige Stoffwechselvorgänge zu betrachten ( Abb. 1.4). Neben den Pflanzen sind die anoxygenen und oxygenen phototrophen Prokaryonten sowie die chemolithotrophen Prokaryonten zu einer autotrophen Lebensweise befähigt. Durch diese Organismen wird CO2 zunächst in niedermolekulare organische Verbindungen überführt. Während die CO2-Fixierung in Pflanzen ausschließlich über den Calvin-Cyclus erfolgt, haben Prokaryonten noch mindestens drei weitere Wege der CO2-Fixierung entwickelt. Global betrachtet sind die Pflanzen mit Abstand die wichtigsten Primärproduzenten. Der Beitrag der Prokaryonten ist dazu im Vergleich eher bescheiden. Wohl aber sind in einzelnen Ökosystemen photoautotrophe und chemolithoautotrophe Prokaryonten maßgeblich oder sogar ausschließlich für die Primärproduktion von Biomasse verantwortlich. Als Beispiele hierfür seien die Hydrothermalquellen der Tiefsee genannt, wo nahezu die gesamte Biomasse auf die CO2Fixierung von chemolithoautotrophen schwefeloxidierenden Bakterien zurückzuführen ist, und die Flechten, eine Symbiose von Pilzen und Grünalgen oder Cyanobakterien, wo Letztere als Phycobionten für die Fixierung von CO2 verantwortlich sind. Die niedermolekularen CO2-Fixierungsprodukte werden von den fixierenden Organismen selbst oder von anderen mit diesen in Symbiose lebenden Organismen in Biomasse überführt, und sämtliche kohlenstoffhaltigen Bestandteile der Zelle leiten sich von diesen ab. Dies bedeutet zugleich, dass am Ende der weit überwiegende Anteil der primären CO2-Fixierungsprodukte in Form von Biopolymeren vorliegt ( Abb. 1.4), da die Zellen überwiegend aus Biopolymeren bestehen (Nukleinsäuren,

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12

1 Überblick über die Mikroorganismen

Proteine, Zellwand- und Speicherpolysaccharide, andere polymere Speicherstoffe, Lignin, usw.). Eine Zelle von Escherichia coli besteht im Durchschnitt zu ca. 95 % aus Biopolymeren. 1.4.2

Aerobe und anaerobe Nahrungsketten

Viele dieser Biopolymere können durch die sie synthetisierenden Zellen selbst wieder abgebaut werden ( Abb. 1.5). Das dies der Fall sein muss, ist eine mit der Funktion inhärent verbundene Eigenschaft von Speicherstoffen. Darüber hinaus wird die Biomasse abgestorbener Zellen bzw. Organismen wieder zu CO2 mineralisiert. Hieran sind überwiegend frei lebende oder in den Verdauungstrakten von Tieren lebende Mikroorganismen beteiligt ( Abb. 1.5). Diese verfügen über die Fähigkeit, eine Vielzahl von extrazellulären Enzymen zu bilden, mit denen die Biopolymere zunächst in niedermolekulare Verbindungen gespalten werden. Die entstehenden Oligomere, Dimere und Monomere werden dann in die Zellen aufgenommen und dort weiter verstoffwechselt. Unter aeroben Bedingungen entsteht aus dem von den Organismen nicht selbst assimilierten Anteil dann in der Regel CO2, wodurch der Kohlenstoffkreislauf geschlossen wird. Unter anaeroben Bedingungen sind am Abbau in der Regel mehrere Organismen beteiligt. Dies schließt die anaeroben Atmer sowie die primären und die sekundären Gärer ein. Am Ende solcher anaerober Nahrungsketten stehen die methanogenen Bakterien. Neben CO2 entsteht Methan als Hauptprodukt des anaeroben Abbaus von organischen Molekülen. Methan können dann aerobe, methanotrophe Bakterien wieder zu CO2 oxidieren. Auch auf diese Weise kann der Kohlenstoffkreislauf geschlossen werden. 1.4.3

Stickstoffkreislauf

Beginnen wir mit Ammonium, welchem im Stickstoffkreislauf eine zentrale Bedeutung zukommt ( Abb. 1.6). Ammonium ist die einzige Form anorganischer Stickstoffverbindungen, die in Biomoleküle eingebaut werden kann (Assimilation) bzw. in der es aus Biomolekülen freigesetzt werden kann (Mineralisation). Alle Organismen sind darauf angewiesen, dass ihnen Ammonium zur Verfügung steht oder dass sie selbst Ammonium aus anderen chemischen Verbindungen herstellen können. Ohne Ammonium wäre Leben nicht möglich. Exklusiv bei Prokaryonten finden wir die Möglichkeit, Ammonium als Elektronendonator nutzen zu können. Durch die Nitrosifizierer wird Ammonium zunächst zu Nitrit oxidiert, welches anschließend durch die Nitritoxidierer weiter zu Nitrat oxidiert wird. Diese als Nitrifikation bezeichneten Stoffwechselvorgänge gehören zur großen Gruppe der chemolithotrophen Lebensweisen, die bei Bakterien noch mit zahlreichen anderen anorganischen Elektronendonatoren verwirklicht ist. Diese Bakterien oxidieren dabei die anorganischen Verbindungen, übertragen die Reduktionsäquivalente über Atmungsketten auf Sauerstoff und gewinnen dabei Energie durch Elektronentransportkettenphosphorylierung. Diese Lebensweise ist fast immer mit Autotrophie verbunden. Nitrat ist Ausgangsverbindung für eine Reihe weiterer interessanter Stoffwechselreaktionen, an denen wiederum Bakterien maßgeblich beteiligt sind. Viele Bakterien können Nitrat und Nitrit als Elektronenakzeptor bei einer anaeroben Atmung nutzen. Bei der Oxidation von organischen und auch anorganischen Verbindungen anfallende Reduktionsäquivalente werden dabei über eine Atmungskette auf Nitrat bzw. Nitrit und nachfolgende reduzierte Produkte des Nitrits übertragen; auch hierbei wird Energie durch Elektronentransportkettenphosphorylierung gewonnen. Als Endprodukt dieses als Denitrifikation bezeichneten Stoffwechselvorgangs entsteht molekularer Stickstoff (N2). Für den globalen Stickstoffkreislauf ist die Denitrifikation von großer Bedeutung. Würde es keine Denitrifikation geben und würde die Stickstofffixierung

1.4 Stoffkreisläufe und Nahrungsketten

13

(siehe unten) mit unverminderter Rate weitergehen, dann würde der N2-Gehalt der Atmosphäre unseres Planeten innerhalb von einigen Millionen Jahren nahezu vollständig aufgebraucht werden, und Stickstoffverbindungen würden sich in der Geosphäre bzw. Hydrosphäre akkumulieren. In diesem Zusammenhang ist der so genannte Anammox-Prozess zu erwähnen. Dieser erst vor kurzem entdeckte Prozess wird durch so genannte Anammox-Bakterien katalysiert, die bisher noch nicht in Reinkultur vorliegen und daher bisher noch nicht im Detail untersucht werden konnten. Die Anammox-Bakterien überführen Nitrit und Ammonium in N2. Neben der Denitrifikation und dem Anammox-Prozess gibt es noch zwei weitere wichtige Stoffwechselvorgänge, bei denen Nitrat reduziert wird. Die sowohl bei Prokaryonten als auch bei Eukaryonten vorkommende assimilatorische Nitrat- bzw. Nitritreduktion hat die Aufgabe, Nitrat bzw. Nitrit in Ammonium als assimilierbare Stickstoffverbindung zu überführen. Hier entsteht als Reduktionsprodukt von Nitrat also nicht N2 sondern Ammonium. Nicht nur hinsichtlich der Funktion, sondern auch bezüglich der Enzyme und deren Regulation unterscheiden sich assimilatorische und dissimilatorische Nitratreduktion deutlich voneinander. Darüber hinaus kann Nitrit auch durch einige gärende Mikroorganismen zu Ammonium reduziert werden. Bei diesem als Ammonifikation bezeichneten Stoffwechselvorgang können Reduktionsäquivalente auf Nitrat bzw. Nitrit statt auf z. B. von Glucose abgeleitete Intermediate übertragen werden. Hierdurch steht ein größerer Anteil dieser Intermediate für die Energiegewinnung mittels Substratkettenphosphorylierung ausgehend von Acetyl-Phosphat zur Verfügung. Die Stickstofffixierung ist eine weiteres Monopol der Prokaryonten. Das Enzym Nitrogenase, welches molekularen Stickstoff (N2) zu Ammonium reduziert, kommt ausschließlich bei Prokaryonten vor. Diese werden dadurch in die Lage versetzt, Stickstoff entweder frei lebend oder in verschiedenen Symbiosen mit Pflanzen oder Pilzen zu fixieren. 0

N2

g un er

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Ass imi lato risc he Nit rit re

d

Denitrifikat ion

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NO

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+I

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HNO

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Mineralisation

A m m on i f i

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NH2OH + III

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NO3Abb. 1.6.

Stickstoffkreislauf

Nitrifik at

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aerob anaerob

1 Überblick über die Mikroorganismen ion ukt red t a lf Su

+ IV

SO32r i s c he

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Abb. 1.7.

1.4.4

Sc

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Sorg Mineralisation

aerob

p

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H 2S en e

SO4

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ox yg

Dispr opor tion ieru ng

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14

hw

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Schwefelkreislauf

Schwefelkreislauf

Wie im Stickstoffkreislauf gibt es auch im Kreislauf der anorganischen Schwefelverbindungen Reaktionen, die exklusiv von Prokaryonten katalysiert werden können ( Abb. 1.7). Wir beginnen mit H2S wieder mit der einzigen anorganischen Schwefelverbindung, die durch Assimilation in organische Verbindungen überführt bzw. durch Mineralisation aus organischen Molekülen freigesetzt werden kann. Auch hier gibt es Bakterien, die H2S oder dessen Oxidationsprodukt Schwefel als Elektronendonator nutzen können und diese dabei in anorganische Schwefelverbindungen mit höherer Oxidationszahl umwandeln. Neben elementarem Schwefel treten bei der Oxidation eine Reihe weiterer anorganischer Schwefelverbindungen als Intermediate oder auch zwischenzeitlich abgelagerte Verbindungen auf. Der höchste Oxidationszustand des Schwefels, der hierdurch erreicht werden kann, ist Sulfat (SO42-). Hier sind zwei große Gruppen von Bakterien zu unterscheiden. Zum einen sind hierzu anoxygene phototrophe Bakterien in der Lage, die H2S oder Schwefel als Elektronendonator nutzen. Diese Bakterien besitzen nur das Photosystem I und können im Gegensatz zu den oxygenen phototrophen Cyanobakterien und den Pflanzen, welche die Photosysteme I und II besitzen, Wasser nicht als Elektronendonator nutzen. Zum anderen gibt es die farblosen Schwefelbakterien, die H2S und Schwefel ebenfalls als Elektronendonator nutzen können, aber über eine rein chemolithoautotrophe Lebensweise verfügen und Licht nicht nutzen können. Die Reduktion von Sulfat zu H2S wird von vielen Prokaryonten und Eukaryonten bewerkstelligt. Wie bei der Nitratreduktion ist hier die assimilatorische SulfatReduktion von der dissimilatorischen Sulfat-Reduktion zu unterscheiden. Zur dissimilatorischen Sulfatreduktion sind wiederum nur Prokaryonten in der Lage. Hier wird Sulfat als Elektronenakzeptor für die bei der anaeroben Oxidation von organischen Verbindungen oder Wasserstoff anfallenden Reduktionsäquivalente verwendet

1.5 Biotechnologie

und hierdurch eine Gewinnung von Energie durch Substratketten- bzw. Elektronentransportkettenphosphorylierung ermöglicht. Dieser Vorgang wird deshalb auch als Sulfatatmung bezeichnet. Auch durch andere Vorgänge wie die Schwefelatmung und eine Reihe von Disproportionierungsreaktionen wird Prokaryonten eine anaerobe Lebensweise ermöglicht, die genügend Energie bereitstellt und das Erreichen von ausgeglichenen Redoxbilanzen ermöglicht. Die assimilatorische Sulfatreduktion kommt dagegen sowohl bei Prokaryonten als auch bei Eukaryonten vor und dient der Bereitstellung von assimilierbarem H2S ausgehend von Sulfat. Nicht nur die Funktion dieses Stoffwechselvorganges ist eine andere als die der dissimilatorischen Sulfatreduktion, auch sind hieran andere Enzyme beteiligt, und es treten zumindest teilweise andere Intermediate auf.

1.5

Biotechnologie

Die Biotechnologie hat sich zu einer der Schlüsseltechnologien entwickelt, die in den Biotechnologische Prozesse nutzen die kommenden Jahren die Entwicklung der Fähigkeiten von Organismen (Mikromenschlichen Gesellschaft entscheidend verorganismen, Pflanzen und Tieren), pflanzändern und prägen wird. Aus einer der lichen und tierischen Zellkulturen und von zahleichen Definitionen des Begriffs Bioderen Inhaltstoffen (z. B. Enzyme) zur technologie ( Kasten) ergibt sich der gezielten Synthese bzw. Umwandlung starke Anwendungsbezug und die ausgebestimmter Stoffe sowie zum Abbau von prägte Interdisziplinarität der BiotechnoSchadstoffen in Boden, Wasser und Luft. logie. Die Biologie und hier besonders die Mikrobiologie, Zellbiologie und Molekularbiologie, die Bioinformatik, die Biochemie und hier besonders die Enzymologie, die Chemie, die chemische Verfahrenstechnik sowie zahlreiche andere Teildisziplinen der Verfahrenstechnik sind wichtige Komponenten der Biotechnologie. Bedingt durch die enormen Fortschritte bei der Entwicklung molekularbiologischer Methoden bei der Zellkultur- und Hybridomatechnik sowie der Informatik hat sich für die moderne Biotechnologie ein weites und kaum noch überschaubares Anwendungsfeld ergeben. Dabei verschwinden die Grenzen zu benachbarten Disziplinen immer weiter. Definition: Biotechnologie

Bei klassischen, traditionellen Verfahren der Biotechnologie kommt der Mikrobiologie eine besondere Bedeutung zu. Diese so genannte weiße Biotechnologie hatte über viele Jahrzehnte eine dominierende Rolle. In den letzten Jahrzehnten haben auch die so genannte grüne Biotechnologie und die rote Biotechnologie an Bedeutung gewonnen, und Pflanzen und Tiere bzw. entsprechende Zellkulturen werden heute ebenfalls in zunehmenden Maße zur Stoffproduktion eingesetzt. Aber auch hier sind die Übergänge fließend. Durch die Verfügbarkeit von gentechnischen Methoden können heute Gene aus Pflanzen und Tieren in Mikroorganismen exprimiert werden und die rekombinanten Mikroorganismen z. B. zur Produktion von Enzym- oder Hormonproteinen angeregt werden. Auf der anderen Seite mag es manchmal sinnvoll sein, vormals nur in Bakterien vorhandene Synthesewege in Pflanzen zu exprimieren und entsprechende Stoffe dann mit Hilfe transgener Pflanzen zu produzieren. Die Mikrobiologie wird innerhalb der Biotechnologie ihre große Bedeutung behalten. Insgesamt werden Produktionsprozesse und andere biotechnische Verfahren, die mit Mikroorganismen durchgeführt werden, mit dem weiteren zu erwartenden Aufschwung der Biotechnologie an Umfang noch deutlich zunehmen. Dies betrifft auch die so genannte Umweltmikrobiologie, bei der Mikroorganismen zur Beseitigung von Schadstoffen eingesetzt werden. Zudem kann erwartet werden, dass die Genom-

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1 Überblick über die Mikroorganismen

sequenzierungsprojekte und die Beschäftigung mit den nicht kultivierbaren Mikroorganismen (s. u.) noch zahlreiche neue Stoffwechselwege und interessante Enzyme liefern werden.

1.6

Kultivierbare und nichtkultivierbare Mikroorganismen

Von den in der Natur vorkommenden prokaryontischen Mikroorganismen kann bisher nur ein geringer Teil im Labor kultiviert werden. Man schätzt diesen Anteil auf insgesamt ca. 1 bis 2 %. Dies bedeutet umgekehrt, dass ca. 98 bis 99 % der existierenden Prokaryonten bisher nicht kultivierbar werden konnten. Die Ursachen für die bisher eher bescheidenen Erfolge der Mikrobiologen bei der Erfassung der in der Natur vorkommenden Mikroorganismen sind sehr vielfältig. Das Labor und der natürliche Standort sind offensichtlich zwei sehr unterschiedliche Welten, und es muss der Schluss gezogen werden, dass wir im Labor die an den natürlichen Standort der Bakterien gegebenen abiotischen und biotischen Rahmenbedingungen bisher nur unzureichend simulieren können. Erklärungen können bereits in den biotischen Rahmenbedingungen liegen. In der Natur liegen nie Reinkulturen, sondern mehr oder weniger komplexe Mischkulturen vor. Zwischen ihnen gibt es eine Vielzahl unterschiedlichster Interaktionen, zu denen auch symbiontische und parasitische Beziehungen gehören, die durchaus auch obligat sein können ( Tabelle 1.5). Im Labor und bei den meisten biotechnologischen Prozessen bemühen wir uns meist, die Bakterien in suspendierter Form zu kultivieren. An ihren natürlichen Standorten bilden viele Bakterien dagegen Kolonien und Fruchtkörper aus oder kommen in Flocken, Matten oder Biofilmen vor. Häufig liegen Bakterien auch adsorbiert an Oberflächen vor. Die Anheftung kann z. B. durch Polysaccharidschleime oder besondere Haftorgane erfolgen. An den meisten natürlichen Standorten liegen Nährstoffe nur in relativ niedriger Konzentration vor, die meist viel niedriger als die in den Labormedien sind. Sehr viele Mikroorganismen sind an diese niedrigen Konzentrationen besonders angepasst. Zudem gibt es fast immer Konkurrenten um Nährstoffe. Im Gegensatz zu den meisten Labormedien liegt in der Natur selten nur eine einzige Kohlenstoffquelle vor. Außerdem liegen in der Natur häufig Gradienten von Nährstoffen vor. Mikroorganismen sind an ihren natürlichen Standorten verschiedensten Stresssituationen ausgesetzt, und viele biotische und abiotische Faktoren sind in einem Ökosystem selten konstant. Führt man sich die Stoffwechselvielfalt und die Vielzahl der biotechnischen Produkte vor Augen, welche die bereits kultivierbaren Mikroorganismen bieten, dann mag man erahnen, was für ein großes Potential in der Natur noch vorhanden sein muss. Die Erschließung dieser Möglichkeiten stellt eine der großen Herausforderungen für die Mikrobiologen dar und wird sicherlich einer der Schwerpunkte der mikrobiologischen Forschung in den nächsten Jahrzehnten sein. Zwei Vorgehensweisen sind geeignet, des Potentials der bisher nichtkultivierbaren Mikroorganismen habhaft zu werden. Beide Vorgehensweisen setzen sehr gute mikrobiologische Kenntnisse, vor allem der Stoffwechselphysiologie, voraus. Ferner sind umfassende Erfahrungen in mikrobiologischen Arbeitstechniken, Fingerspitzengefühl, Hartnäckigkeit und Ausdauer erforderlich. Die klassische Vorgehensweise setzt auf Anreicherungstechniken. Die Beschreibung der abiotischen und biotischen Faktoren eines Habitats in Verbindung mit dem dort vorhandenen Fluss von Nährstoffen wird Rückschlüsse darauf zulassen, welche Stoffwechseltypen in dem jeweiligen Habitat vorhanden sein müssen. Dadurch werden die Rahmenbedingungen vorgegeben, die dann eine selektive Anreicherung der in diesem Habitat zu fordernden Mikroorganismen ermöglichen sollten. Höchstwahrscheinlich wird es so sein, dass in einem Habitat mehrere Arten von Mikroorganismen vorkommen, die über diese Stoffwechselleistungen verfügen, aber aus einer Reihe von Gründen

1.6 Kultivierbare und nichtkultivierbare Mikroorganismen Tabelle 1.5. Definitionen zu Begriffen, die Wechselwirkungen zwischen Mikroorganismen untereinander bzw. zwischen Mikroorganismen und anderen Organismen beschreiben Amensalismus: Eine interaktive Assoziation zwischen zwei Populationen verschiedener Mikroorganismen, durch die eine geschädigt wird, während die andere weder positiv noch negativ beeinflusst wird. Antagonismus: Eine interaktive Assoziation zwischen zwei Populationen verschiedener Mikroorganismen, in der eine einen negativen Effekt (Hemmung, Schädigung, Abtötung) auf die andere ausübt. Kommensalismus: Eine interaktive Assoziation zwischen zwei Populationen verschiedener Mikroorganismen, bei welcher eine Population von der Assoziation profitiert, während die andere weder positiv noch negativ beeinflusst wird. Kompetition: Eine interaktive Assoziation zwischen zwei Populationen verschiedener Mikroorganismen, die beide einen limitierenden abiotischen Faktor (z. B. Nährstoff, Licht) benötigen. Teilen sich beide diesen Faktor, wachsen beide mit suboptimaler Rate; wird der Faktor nur von einer Population genutzt/verwertet, wächst nur diese. Mutualismus: Eine interaktive Assoziation zwischen zwei Populationen verschiedener Mikroorganismen, aus der beide einen geringen Vorteil ziehen. Neutralismus: Das Vorkommen von zwei Populationen verschiedener Mikroorganismen, die keinerlei erkennbare Interaktionen aufweisen. Parasitismus: Eine interaktive Assoziation zwischen zwei Organismen, von welchen der kleinere (Parasit) profitiert und durch welche der größere (Wirt) geschädigt wird. Symbiose: Eine obligatorische interaktive Assoziation zwischen Angehörigen von zwei Populationen. Es handelt sich dabei um einen stabilen Zustand, in dem beide Organismen zu ihrem gegenseitigen Vorteil in unmittelbarer Nachbarschaft (Ektosymbiose) bzw. in direktem Kontakt (Endosymbiose) leben. Synergismus: Eine nicht obligatorische interaktive Assoziation zwischen Angehörigen von zwei Populationen oder einer Population, von der beide Populationen oder alle Angehörigen der einen Population profitieren. Syntrophismus: Zwei Organismen ergänzen sich gegenseitig mit Nährstoffen oder mit katabolischen Enzymen, die für die Verwertung eines Substrates erforderlich sind.

in unterschiedlichem Maße hierzu beitragen. Es wird wahrscheinlich auch so sein, dass sich die hierfür wirklich relevanten Mikroorganismen nicht so leicht anreichern lassen, sondern sich vielmehr zunächst die weniger bedeutsamen Vertreter in Anreicherungskulturen durchsetzen. Liegen von solchen Mikroorganismen Reinkulturen vor, kann durch in situ DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung geprüft werden, in welcher Anzahl diese Bakterien in einem Habitat tatsächlich vorliegen. Hieraus können dann Rückschlüsse auf das Vorhandensein weiterer Bakterien mit gleichem Stoffwechseltyp gezogen werden. Der nächste Schritt müsste dann darin bestehen, diese Bakterien zu selektieren und dabei ein Durchsetzen der leichter anzureichernden Bakterien zu unterdrücken. Neuere Strategien verzichten zunächst auf die Anreicherung der Bakterien selbst, sondern zielen darauf ab, die DNA sämtlicher Organismen eines Habitats zu isolieren, hiervon Genbänke anzulegen und diese Genbänke nach Genen mit bestimmten Eigenschaften zu durchsuchen. Bei dieser Vorgehensweise werden also die in einem Habitat vorkommenden Genome in ihrer Gesamtheit betrachtet, und man bezeichnet solche Vorhaben deshalb auch als Metagenomprojekte. Häufig zielt das Durchmustern der Genbänke (screening) auf die Entdeckung bestimmter Stoffwechselwege ab, oder es wird nach bestimmten Stoffwechselprodukten gesucht, für die ein Interesse besteht und die nachgewiesen und erkannt werden können. Meist sind es also Stoffwechsel-

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1 Überblick über die Mikroorganismen

leistungen, nach denen gesucht wird. Während die Isolierung der Gesamt-DNA aus einem Habitat mittlerweile technisch nahezu gelöst ist, werden die Erfolge solcher Projekte vielmehr durch die Verfügbarkeit geeigneter selektiver Screeningverfahren limitiert, um Klone mit den gesuchten Genen zu identifizieren. Diese Vorgehensweise wird sicherlich in vielen Fällen zu Erfolgen führen, und hierduch werden neue Gene gefunden werden. Die Mikroorganismen selbst, aus denen diese Gene ursprünglich stammten, werden auf diese Weise jedoch nicht als Laborkulturen verfügbar.

1.7

Eingesetzte Mikroorganismen

Angegeben ist der jeweils gültige Name, falls vorhanden eine Stammbezeichnung. Plasmide sind in Klammern angegeben. Die Bezugsquellen (DSM, ATCC usw.) sind unter der Liste aufgeführt. • Aspergillus niger DSM 823 • Aspergillus oryzae DSM 1863 • Azotobacter vinelandii DSM 576 • Bacillus licheniformis ATCC 9945 • Bacillus licheniformis DSM 13 • Bacillus subtilis 168 DSM 402 • Bacillus subtilis DSM 10 • Bacillus subtilis DSM 1088 • Bacillus subtilis DSM 1092 • Bacillus subtilis DSM 4449 • Bacillus subtilis W23 DSM 6395 • Bacillus thuringiensis subsp. israelensis DSM 5724 • Cellulomonas fimi DSM 20113 • Comamonas testosteroni DSM 6781 • Escherichia coli (pAS300) DSM 1) • Escherichia coli (pBHR68) DSM 15372 • Escherichia coli (pBluescript SK-) (Stratagene) • Escherichia coli (pMa/c 5-914::cphA) DSM 15373 • Escherichia coli (pSKBEC/PP:3,3) DSM 15371 • Escherichia coli (pSUP5011) DSM 5167 • Escherichia coli DH5 DSM 10235 • Escherichia coli JM109 DSM 3423 • Escherichia coli S17-1 DSM 9079 • Gluconacetobacter xylinus DSM 2004 • Gluconobacter oxydans DSM 50049 • Gordonia polyisoprenivorans DSM 44302 • Gordonia westfalica DSM 44215 • Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum DSM 20484 • Micrococcus luteus DSM 20030 • Mycobacterium phlei DSM 43239 • Mycobacterium smegmatis mc2155 ATCC 700084

1.7 Eingesetzte Mikroorganismen

• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1)

Paucimonas lemoignei DSM 7445 Pseudomonas aeruginosa DSM 50071 (Risikogruppe 2) Pseudomonas fluorescens DSM 50090 Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 Pseudomonas putida KT2440 DSM 6125 Pseudomonas putida mt-2 DSM 3931 Pseudomonas stutzeri DSM 5190 Ralstonia eutropha C145 DSM 1) Ralstonia eutropha H16 DSM 428 Ralstonia eutropha HF39 DSM 1) Ralstonia eutropha PHB-4 DSM 541 Rhizopus microsporus var. chinensis DSM 1834 Rhizopus microsporus var. oligosporus DSM 1964 Saccharomyces cerevisiae DSM 1334 Saccharomyces ellipsoideus DSM 70471 Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis TA1535 (pSK1002) DSM 9274 Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis TA98 (Discovery Partners International) Sphingopyxis macrogoltabida DSM 8826 Sphingopyxis terrae DSM 8831 Streptomyces griseus subsp. griseus DSM 40236 Streptomyces hachijoensis DSM 40114 Xanthomonas campestris DSM 3586 Der Stamm ist bei der DSMZ hinterlegt, die Vergabe der DSM-Nummer fand allerdings erst nach Drucklegung statt.

1.7.1 Bezugsquellen für Mikroorganismen • DSM – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Deutschland, Telefon:+49 (0) 531-2616-0, Fax:+49 (0) 531-2616-418, http://www.dsmz.de • ATCC – American Type Culture Collection, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Vereinigte Staaten von Amerika (USA), Telefon: +1 (703) 365-2700, Fax: +1 (703) 365-2701, http://www.atcc.org • Discovery Partners International, 9640 Towne Centre Drive, San Diego, CA 92121, Vereinigte Staaten von Amerika (USA), Telefon: +1 (858) 455-8600, Fax: +1 (858) 546-3081, http://www.discoverypartners.com • Stratagene Europe, P.O. Box 12085, 1100 AB Amsterdam, Niederlande, Telefon: aus Deutschland 0800 182 8232; aus der Schweiz 0800 563 080; aus Österreich 0800 292 499, http://www.stratagene.com

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1 Überblick über die Mikroorganismen

1.8

Weiterführende Literatur

Mikrobiologie • • • •

Cypionka H (2002) Grundlagen der Mikrobiologie. 2. Aufl, Springer, Berlin Fritsche W, Laplace F (2002) Mikrobiologie. 3. Aufl, Spektrum, Heidelberg Gottschalk G (1986) Bacterial metabolism. 2nd Edition, Springer, New York Lengeler J, Drews G, Schlegel HG (Hrsg) (1999) Biology of the Prokaryotes. Thieme, Stuttgart • Madigan MT, Martinko JM, Parker J (eds) (2002) Brock Biology of Microorganisms. 10th Edition, Prentice Hall, New Jersey • Madigan MT, Martinko JM, Parker J; Goebel W (Hrsg) (2000) Brock Mikrobiologie. 8. Aufl, Spektrum, Berlin • Schlegel HG (1992) Allgemeine Mikrobiologie. 7. Aufl, Thieme, Stuttgart Geschichte(n) • Dixon B (1998) Der Pilz, der John F. Kennedy zum Präsidenten machte. Und andere Geschichten aus der Welt der Mikroorganismen. Spektrum, Heidelberg • Schlegel HG (1999) Geschichte der Mikrobiologie. Deutsche Akademie der Naturforscher Leopoldina, Halle (Saale); Barth, Heidelberg Ökologie • Atlas RM, Bartha R (1997) Microbial ecology – Fundamentals and Applications. 4th Edition, Addison Wesley Longman, London Allgemeine Biologie • Campbell NA (1998) Biologie. Spektrum, Heidelberg Biotechnologie • Deckwer WD, Pühler A, Schmid RD (Hrsg) (1999) Römpp Lexikon, Biotechnologie und Gentechnik. 2. Aufl, Thieme, Stuttgart • Fritsche W (1998) Umwelt-Mikrobiologie. Grundlagen und Anwendungen. Gustav Fischer, Jena • Rehm HJ, Reed G, Pühler A, Stadler P (eds) (1993-2001) Biotechnology: a multivolume comprehensive treatise, 2nd Edition, Wiley-VCH, Weinheim • Schmid RD (2001) Taschenatlas Biotechnologie und Gentechnik. Wiley-VCH, Weinheim • Sprenger B (1996) Umweltmikrobiologische Praxis: mikrobiologische und biotechnische Methoden und Versuche, Springer, Berlin Methoden • Bast E (2001) Mikrobiologische Methoden. Eine Einführung in grundlegende Arbeitstechniken. 2. Aufl, Spektrum, Heidelberg • Gerhardt P, Murray RGE, Wood WA, Kreig NR (eds) (1994) Methods for General and Molecular Bacteriology. American Society for Microbiology, Washington D.C. • Lottspeich F, Zorbas H (Hrsg) (1998) Bioanalytik. Spektrum, Heidelberg

1.8 Weiterführende Literatur

• Süßmuth R (1999) Mikrobiologisch-biochemisches Praktikum. 2. Aufl. Thieme, Stuttgart Taxonomie und Systematik • Dworkin M (ed) (1999-2002) The Prokaryotes. An Evolving Electronic Database for the Microbiological Community. 3rd Edition Online. Springer, New York http:// link.springer.de/link/service/books/10125 • Garrity G, Boone DR, Castenholz RW (eds) (2001) Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol 1: The Archaea and the Deeply Branching and Phototropic Bacteria, 2nd Edition, Springer, New York • Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, Staley JT, Williams ST (eds) (1993) Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 9th Edition. Williams & Wilkins, Baltimore Mykologie • Esser K (2000) Kryptogamen. Bd 1: Cyanobakterien, Algen, Pilze, Flechten. 3. Aufl, Springer, Berlin • Müller E, Loeffler W (1992) Mykologie. Grundriß für Naturwissenschaftler und Mediziner. Thieme, Stuttgart Botanik • Heldt HW, Heldt F (1999) Pflanzenbiochemie. 2. Aufl, Spektrum, Heidelberg • Sitte P, Weiler EW, Kadereit JW, Bresinsky A, Körner C (2002) Strasburger Lehrbuch der Botanik. 35. Aufl, Spektrum, Heidelberg Genetik • Knippers R (2001) Molekulare Genetik. 8. Aufl, Thieme, Stuttgart Chemie • Falbe J, Regitz M (Hrsg) (1995) Römpp-Chemie-Lexikon. Thieme, Stuttgart Anorganische Chemie • Holleman A, Wiberg E (1995) Lehrbuch der anorganischen Chemie. 101. Aufl, de Gruyter, Berlin Biochemie • Nelson D, Cox M (2001) Lehninger Biochemie. 3. Aufl, Springer Berlin Heidelberg • Stryer L (1996) Biochemie. 4. Aufl, Spektrum, Heidelberg • Voet D, Voet JG, Pratt CW; Beck-Sickinger AG, Hahn U (Hrsg) (2002) Lehrbuch der Biochemie. Wiley-VCH, Weinheim Organische Chemie • Vollhardt KPC, Schore NE; Butenschön H (Hrsg) (2000) Organische Chemie. 3. Aufl, Wiley-VCH, Weinheim

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2

Vorschriften und Gesetze im Zusammenhang mit mikrobiologischen Arbeiten

Der Umgang mit Mikroorganismen ist in Deutschland durch ein dichtes Netzwerk von Gesetzen und Verordnungen geregelt. Die für das MIKROBIOLOGISCHE PRAKTIKUM relevanten Bestimmungen werden im Folgenden erläutert. In anderen Staaten (z. B. Österreich oder Schweiz) gelten andere Gesetze und Vorschriften, die entsprechend zu befolgen sind.

2.1

Pathogene Mikroorganismen

Obwohl die meisten Mikroorganismen völlig harmlos sind, gibt es einige, die bei Menschen, Tieren oder Pflanzen Krankheiten oder andere Störungen hervorrufen können. Man bezeichnet diese nach ihrem entsprechenden Wirt als human-, tier- bzw. pflanzenpathogene Mikroorganismen. Einige wenige Mikroorganismen können sogar schwerste, zum Tode führende Erkrankungen oder Vergiftungen hervorrufen. Versuche mit pathogen Bakterien dürfen daher nur unter Beachtung besonderer Gesetze und Verordnungen durchgeführt werden. Auch der Umgang mit nicht pathogenen Bakterien erfordert Umsicht und Vorsicht, um Unfälle und Schäden zu vermeiden. Bei Anreicherungen von Mikroorganismen aus der Umwelt können sich unter unglücklichen Umständen unter den angereicherten Bakterien, die zunächst für eine Übergangsphase ja immer als Mischkulturen vorliegen, auch pathogene oder toxinproduzierende Bakterien befinden. Beim Anlegen von Anreicherungskulturen und beim Grundregeln für das Arbeiten im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM • • • • • • • • •

• • • • •

Es sind ein Schutzkittel und eine Schutzbrille zu tragen. Essen, Trinken und Rauchen sind in Laboratorien verboten. Nahrungsmittel und Rauchutensilien dürfen nicht in Laboratorien gelagert werden. Kosmetika dürfen nicht im Kursraum benutzt oder dort aufbewahrt werden. Vor Beginn eines Versuches sollten alle Handlungsabläufe absehbar und das Warum und Wie verstanden sein. Benötigte Geräte, Chemikalien und sonstige Utensilien sollten bereitliegen. Beim Pipettieren sind Pipettierhilfen zu benutzen. Gebrauchte Glaspipetten werden nach Gebrauch sofort abgeflammt und mit der Spitze nach unten in Sammelbehälter gestellt. Bunsenbrenner werden nur zum Gebrauch (z. B. Abflammen) mit nichtleuchtender Flamme betrieben; nach Gebrauch ist sofort wieder auf Sparflamme zu schalten. Die Arbeitsflächen sind frei und sauber zu halten. Sie sind nach Beendigung der Tätigkeiten täglich mit Desinfektionsmittel abzuwischen. Ethanol (70 %, vol/vol) darf hierzu nur für Flächen bis zu 1 m2 verwendet werden. Bioaerosolbildung ist zu vermeiden. Bioaerosole können bei Labortätigkeiten wie Arbeiten mit der Impföse, Pipettieren und Schütteln von offenen Kulturen entstehen. Während des Arbeitens sollen Fenster und Türen geschlossen sein. Alle beimpften Kulturgefäße müssen eindeutig beschriftet werden, um Verwechselungen zu vermeiden. Mikroorganismen müssen vor ihrer Entsorgung durch Autoklavieren inaktiviert werden. Bei Tätigkeitsende sind die Hände zu waschen.

A. Steinbüchel, F. B. Oppermann-Sanio, Mikrobiologisches Praktikum, DOI 10.1007/978-3-642-17703-3_2, © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2003, Nachdruck 2011

2.2 Gentechnisch veränderte Mikroorganismen

Umgang mit ihnen muss man daher besondere Umsicht walten lassen. Darüber hinaus kann nie ganz ausgeschlossen werden, dass die Kultur eines zuverlässig beschriebenen, harmlosen Laborstamms mit einem pathogenen Keim kontaminiert ist. Diesen Gefährdungen tragen die Grundregeln der guten mikrobiologischen Laborpraxis (GMP-Regeln) Rechnung ( Kasten S. 22). Werden diese Regeln befolgt, so sind die von den im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM verwendeten Kulturen ausgehenden Gefährdungen gebannt.

2.2

Gentechnisch veränderte Mikroorganismen

Sollen Versuche oder wissenschaftliche Untersuchungen mit gentechnisch veränderten Mikroorganismen durchgeführt werden, gelten besondere Vorschriften und Gesetze ( Tabelle 2.1). Ein gentechnisch Gentechnisch veränderte Bakterien veränderter Organismus (GVO) wird mit Gentechnik-Sicherheitsverordnung Hilfe von DNA-Rekombinationstechniken erzeugt, bei denen Vektoren (z. B. Plasmide, Humanpathogene Bakterien Cosmide, Bacteriophagen usw.) eingesetzt Biostoffverordnung werden. Dies ist in der mikrobiologischen Infektionsschutzgesetz Forschung die häufigste Vorgehensweise zur Gesetz über die Kontrolle von Kriegswaffen Erzeugung gentechnisch veränderter MikroTierpathogene Bakterien organismen. Gentechnisch veränderte OrgaTierseuchengesetz nismen entstehen auch durch die direkte Gesetz über die Kontrolle von Kriegswaffen Einführung von in vitro zubereitetem Erbgut Pflanzenpathogene Bakterien sowie durch Zellfusionen und HybridisiePflanzenschutzgesetz rungstechniken. Gentechnische Arbeiten Pflanzenbeschauverordnung umfassen nicht nur die Erzeugung von Gesetz über die Kontrolle von Kriegswaffen GVOs, sondern auch deren Handhabung, Nutzung von Bakterien für gewerbliche Transport, Lagerung und Inaktivierung. Zwecke Gentechnische Arbeiten dürfen grundsätzBundes-Immissionsschutzgesetz lich nur in behördlich gemeldeten Laboratorien, die besonders gekennzeichnet werden müssen, durchgeführt werden, und es muss ein Projektleiter benannt werden. Werden gentechnische Arbeiten der Sicherheitsstufe 1 durchgeführt, reicht es aus, wenn diese Arbeiten dann angezeigt werden. Werden dagegen Arbeiten der Sicherheitsstufen 2, 3 und 4 durchgeführt, muss bei den Behörden eine Genehmigung dieser Arbeiten beantragt werden. Die durchgeführten gentechnischen Arbeiten müssen protokolliert und die Aufzeichnungen mindestens zehn Jahre aufbewahrt werden. Tabelle 2.1. Die wichtigsten Verordnungen und Gesetze, die bei Tätigkeiten mit den jeweils aufgeführten Bakterien Anwendung finden

2.3

Mikrobiologische Arbeiten im Produktionsmaßstab

Auch die Nutzung von Bakterien für gewerbliche Zwecke unterliegt besonderen Gesetzen ( Tabelle 2.1). Dies ist einsichtig, da die Bakterien hierbei i. d. R. in großen Mengen und in einem großen Maßstab eingesetzt werden und das Gefährdungspotenzial für die Mitarbeiter bei Unfällen wesentlich größer ist. Darüber hinaus besteht die Gefahr, dass bei Unfällen oder unsachgemäßer Handhabung entsprechend große Mengen an Bakterien oder Stoffwechselprodukte in die Umwelt gelangen.

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2 Vorschriften und Gesetze im Zusammenhang mit mikrobiologischen Arbeiten

2.4

Biostoffverordnung (BioStoffV)

Den Arbeitsschutz beim Umgang mit Biologische Arbeitsstoffe im Sinne der Mikroorganismen regelt seit dem Jahr 1999 Biostoffverordnung (BioStoffV) die Verordnung über Sicherheit und Arbeitsstoffe sind MikroGesundheitsschutz bei Tätigkeiten mit bio- Biologische organismen einschließlich gentechnisch logischen Arbeitsstoffen (Biostoffverord- veränderter Mikroorganismen, Zellkulturen nung, kurz BioStoffV). Durch diese und humanpathogener Endoparasiten, die Verordnung soll der Schutz der Beschäftig- beim Menschen Infektionen, sensibiliten vor der Gefährdung ihrer Sicherheit und sierende oder toxische Wirkungen hervorruGesundheit bei diesen Tätigkeiten gewährlei- fen können. stet werden. Biologische Arbeitsstoffe ( Kasten) können Bakterien, Pilze, Parasiten, Zellkulturen und Viren sein. Biologische Arbeitsstoffe werden entsprechend dem von ihnen ausgehenden Infektionsrisiko in vier Risikogruppen eingestuft. Diesen Risikogruppen sind Schutzstufen zugeordnet, die technische, organisatorische und persönliche Sicherheitsmaßnahmen umfassen. Die Mikroorganismen, mit denen im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM umgegangen wird, gehören in der Regel der Risikogruppe 1 an. In seltenen Fällen ist es erforderlich, Vertreter der Risikogruppe 2 zu bearbeiten; dies und die notwendigen Umgangsvorschriften werden vorher bekannt gegeben.

2.5

Biologische Arbeitsstoffe und Risikogruppen

Die Zentrale Kommission für die Biologische Sicherheit (ZKBS) am Robert Koch Institut (RKI, Nordufer 20, D-13353 Berlin) veröffentlicht eine Liste risikobewerteter Spender- und Empfängerorganismen für gentechnische Arbeiten. Diese Bakterien, Pilze, Parasiten und Viren umfassende Liste ordnet jeden in der Liste aufgeführtem Organismus bzw. jedes Virus in eine der vier Risikogruppen ein und gilt verbindlich. Die Liste kann von der Homepage des RKI (http://www.rki.de) bezogen werden. Umfassendere und zurzeit aktuellere Listen werden von der Berufsgenossenschaft Chemie (BG Chemie, Postfach 101480, D-69004 Heidelberg) beim Jedermann-Verlag (Postfach 101340, D-69021 Heidelberg) veröffentlicht. Hier sind vier Merkblätter zum Thema „Sichere Biotechnologie – Einstufung biologischer Arbeitstoffe“ über Bakterien (Merkblatt 006), Pilze (Merkblatt 007), Parasiten (Merkblatt 005) und Viren (Merkblatt 004) erschienen. Alle Merkblätter enthalten über die Listen hinaus weitere wichtige und nützliche Informationen über die biologischen Arbeitsstoffe sowie über zu beachtende Vorschriften und Gesetze. Die Merkblätter sollten in keiner Institution fehlen, in der entsprechende Arbeiten durchgeführt werden. Biologische Arbeitsstoffe der Risikogruppe 1: Viele von der Industrie für biotechnologische Produktionsprozesse genutzte Mikroorganismen sind in Risikogruppe 1 zu finden ( Kasten). Auch nachfolgend aufgeführte Bakteriengruppen haben keine Bedeutung als Krankheitserreger und werden daher der Risikogruppe Definition: Risikogruppe 1 1 zugeordnet: Biologische Arbeitsstoffe, bei denen es • Obligat psychrophile Bakterien unwahrscheinlich ist, dass sie beim Menschen eine Krankheit verursachen. (Wachstumsoptimum < 15 °C) Beispiele • Obligat thermophile Bakterien Corynebacterium glutamicum (Wachstumsoptimum > 45 °C) Escherichia coli K12 • Obligat acidophile Bakterien Gordonia polyisoprenivorans (Wachstum nur bei pH < 4,5) Ralstonia eutropha Rhodococcus opacus • Obligat alkalophile Bakterien Xanthomonas campestris (Wachstum nur bei pH > 8,0)

2.5 Biologische Arbeitsstoffe und Risikogruppen Definiton: Risikogruppe 2 Biologische Arbeitsstoffe, die eine Krankheit beim Menschen hervorrufen können und eine Gefahr für Beschäftigte darstellen können; eine Verbreitung des Stoffes in der Bevölkerung ist unwahrscheinlich; eine wirksame Vorbeugung oder Behandlung ist normalerweise möglich. Beispiele Burkholderia cepacia Clostridium botulinum Clostridium tetani Escherichia coli WT Neisseria gonorrhoeae Pseudomonas aeruginosa Streptococcus mutans Vibrio cholerae Definiton: Risikogruppe 3 Biologische Arbeitsstoffe, die eine schwere Krankheit beim Menschen hervorrufen können und eine ernste Gefahr für Beschäftigte darstellen können; die Gefahr einer Verbreitung in der Bevölkerung kann bestehen, doch ist normalerweise eine wirksame Vorbeugung oder Behandlung möglich. Alle Bakterien der Risiogruppe 3 Bacillus anthracis Burkholderia mallei Burkholderia pseudomallei Chlamydophila psittaci Coxiella burnetii Escherichia coli EHEC-Stämme Orientia tsutsugamushi Mycobacterium africanum Mycobacterium bovis Mycobacterium leprae Mycobacterium microti Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium ulcerans Rickettsia africae Rickettsia akari Rickettsia australis Rickettsia bellii Rickettsia canadensis Rickettsia conorii Rickettsia japonica Rickettsia montanensis Rickettsia prowazekii Rickettsia rickettsii Rickettsia sibirica Rickettsia typhi Salmonella typhi Shigella dysenteriae Yersinia pestis

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• Obligat chemolithotrophe Bakterien • Obligat phototrophe, anoxygene Bakterien • Obligat phototrophe, oxygene Bakterien (Cyanobakterien) • Archaea, die in der Einstufungsliste der BG Chemie in Kursivschrift hervorgehoben sind • Bakterien, die seit langem im Produktionsbereich und auch bei produktionstypischen Arbeiten in Laborbereichen angewendet werden, ohne dass beim Menschen Erkrankungen beschrieben wurden • Als Saprophyten vorkommende Bakterien, die aufgrund ihrer ökologischen Stellung kein Infektionspotenzial gegenüber dem Menschen besitzen und die demzufolge bisher nie als Krankheitserreger dokumentiert wurden • Stämme von Erregern der Risikogruppe 2 und 3, die ihre Virulenz dauerhaft verloren haben, von denen also experimentell erwiesen oder aufgrund langjähriger Erfahrungen bekannt ist, dass sie genau so sicher sind wie Organismen der Risikogruppe 1 Biologische Arbeitsstoffe der Risikogruppe 2: Die Risikogruppe 2 enthält eine Vielzahl von Bakterien, Pilzen, Parasiten und Viren. Einige Vertreter der Bakterien sind beispielhaft im Kasten aufgeführt. Darüber hinaus werden Umweltisolate, die noch nicht eingehend charakterisiert sind, in die Risikogruppe 2 eingestuft. Bei den Pilzen gehören z. B. Aspergillus fumigatus, Candida tropicalis, Fusarium oxysporum und Paecilomyces variotii in diese Risikogruppe, bei den Parasiten sind es z. B. Entamoeba histolytica und Fasciola hepatica und bei den Viren das Hepatitis A-Virus und das HerpesSimplex-Virus 1. Arbeiten mit biologischen Arbeitsstoffen der Risikogruppe 2 sind genehmigungspflichtig. Gentechnische Arbeiten mit Vertretern dieser Risikogruppe dürfen nur in registrierten und überwachten Laboratorien durchgeführt werden. Die Anforderungen, die an

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2 Vorschriften und Gesetze im Zusammenhang mit mikrobiologischen Arbeiten

Räume, apparative Ausstattung und organisatorische Maßnahmen gestellt werden, um eine entsprechende Genehmigung zu erhalten, sind in Universitätsinstituten i. d. R. erfüllbar. Es würde jedoch den Rahmen sprengen, hier ins Detail zu gehen. Anmeldern wird dringend empfohlen, bereits rechtzeitig vor der Antragstellung mit Vertretern der Aufsichts- und Genehmigungsbehörden Kontakt aufzunehmen und sich beraten zu lassen. Biologische Arbeitsstoffe der Risikogruppe 3: In der Risikogruppe 3 sind sowohl Bakterien als auch Pilze, Parasiten und Viren zu finden. Eine vollständige Liste aller zurzeit von der BG Chemie in die Risikogruppe 3 eingestuften Bakterien ist im Kasten auf Seite 25 enthalten. Auch einige Pilze wie z. B. Cladosporium bantianum oder Histoplasma capsulatum wurden in diese Risikogruppe eingestuft. Von den Parasiten gehören z. B. Trypanosoma cruzi und Leishmania brasiliensis zur Risikogruppe 3. Bei den Viren sind es z. B. das Dengue-Virus, das Hepatitis B-Virus und das Rabies-Virus. Arbeiten mit biologischen Arbeitsstoffen der Risikogruppe 3 sind genehmigungspflichtig und setzen sehr umfangreiche Sicherheitsmaßnahmen voraus. Gentechnische Arbeiten mit Vertretern dieser Risikogruppe dürfen nur in registrierten und überwachten Laboratorien durchgeführt werden. Da Arbeiten mit biologischen Arbeitsstoffen der Risikogruppen 3 und 4 (s. u.) im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM weder beabsichtigt sind noch realisiert werden könnten, wird auf weitere Ausführungen zum Umgang mit diesen verzichtet. Biologische Arbeitsstoffe der Risiko- Definition: Risikogruppe 4 gruppe 4: In der Risikogruppe 4 sind weder Bakterien noch Pilze oder Parasiten zu Biologische Arbeitsstoffe, die eine schwere finden ( Kasten). Diese Gruppe enthält Krankheit beim Menschen hervorrufen und ernste Gefahr für Beschäftigte darstelzurzeit ausschließlich 14 human- und eine len; die Gefahr einer Verbreitung in der tierpathogene Viren (z. B. Ebola-Virus, Bevölkerung ist unter Umständen groß; norLassa-Virus, Maul- und Klauenseuche- malerweise ist eine wirksame Vorbeugung Virus, Weißpocken-Virus). Arbeiten mit oder Behandlung nicht möglich. biologischen Arbeitsstoffen der Risikogruppe 4 sind genehmigungspflichtig und setzen sehr umfangreiche Sicherheitsmaßnahmen voraus. Gentechnische Arbeiten mit Vertretern dieser Risikogruppe dürfen nur in registrierten und überwachten Laboratorien durchgeführt werden.

2.6

Risikobewertung und Einstufung der Arbeiten

Sollen Versuche mit biologischen Arbeitsstoffen durchgeführt werden, hängen die bezüglich der Sicherheit einzuleitenden Maßnahmen und die mögliche Einleitung eines Genehmigungsverfahrens davon ab, ob dieser Arbeitsstoff taxonomisch eindeutig klassifiziert ist und sich in den oben genannten Listen wiederfindet. Dies soll an drei möglichen Konstellationen erläutert werden: 1. Handelt es sich z. B. um einen Bakterienstamm, der taxonomisch sicher einer Art zugeordnet ist, und stammt dieser aus einer der offiziellen Stammsammlungen (z. B. DSMZ), ist die Situation eindeutig, wenn sich dieser Stamm in der von der ZKBS veröffentlichten Liste wiederfindet: Der Stamm kann dadurch eindeutig einer Risikogruppe zugeordnet werden, und die sich hieraus ergebenden Konsequenzen sind zu beachten. 2. Handelt es sich z. B. um einen Bakterienstamm, der taxonomisch sicher einer Art zugeordnet ist, und stammt dieser aus einer der offiziellen Stammsammlungen (z. B. DSMZ), ist aber nicht in der von der ZKBS veröffentlichten Liste aufgeführt, ist eine Risikobewertung durchzuführen. Ist diese erfolgt, so ist wie bei (1) zu verfahren.

2.7 Sicherheitsmaßnahmen und räumliche Voraussetzungen

3. Handelt es sich um das Neuisolat eines Bakterienstammes (ein Umweltisolat), so muss durch Einsatz moderner biochemischer und molekularbiologischer Methoden zunächst eine eindeutige taxonomische Zuordnung möglichst bis zur Spezies-Ebene erfolgen. Ist diese erfolgt, so ist – abhängig davon, ob sich die Spezies in der Liste wiederfindet – wie bei (1) oder (2) zu verfahren. Ergeben die taxonomischen Methoden einschließlich der Bestimmung der 16S rRNA-Sequenz jedoch keine eindeutige Zuordnung zu einer bereits bekannten Bakterienspezies, so sind weitere Untersuchungen anzuschließen. Die Vorgehensweise ist in der „Stellungnahme der ZKBS zur Risikobewertung von bakteriellen Umweltisolaten bei gentechnischen Arbeiten“ ( http://www.rki.de) detailliert ausgeführt. Hierbei sind zunächst Herkunft, Wachstumsbedingungen und Nährstoffansprüche des Isolates zu bewerten. Dadurch kann sich möglicherweise eine Einstufung in die Risikogruppe 1 ergeben. Ist dies nicht möglich, müssen Tierversuche (Ermittlung der LD50 im Mausmodell nach intravenöser, intraperitonealer oder oraler Applikation von Bakterienzellen), Cytotoxizitäts-Untersuchungen (eukaryontische Zelllinien mit bakteriellem Kulturüberstand bzw. -filtrat), Adhäsionsversuche (Prüfung auf spezifische Adhäsion der Bakterienzellen an Zellen einer eukaryontischen Zellkultur) und weitere sinnvolle Untersuchungen durchgeführt werden. Die ZKBS betrachtet die Einstufung eines Isolates, welches keiner bekannten Spezies zugeordnet werden kann, in eine Risikogruppe als Einzelfallentscheidung, die bei einer beabsichtigten Verwendung dieses Isolates für gentechnische Arbeiten von ihr selbst vorgenommen wird!

2.7

Sicherheitsmaßnahmen und räumliche Voraussetzungen

In Tabelle 2.2 sind einige Sicherheitsmaßnahmen aufgeführt, die in Genlaboratorien der Sicherheitsstufen 1 und 2 erfüllt sein müssen, damit diese für die Durchführung entsprechender gentechnischer Arbeiten zugelassen werden können. Diese Sicherheitsmaßnahmen umfassen organisatorische Maßnahmen und betreffen die apparative Ausstattung der Räume sowie deren Beschaffenheit. Zusätzlich gelten natürlich die im Kasten auf Seite 22 aufgeführten Regeln guter mikrobiologischer Laborpraxis! Die Sicherheitsmaßnahmen sind dem geringen Gefährdungspotential von gentechnischen Arbeiten in diesen Sicherheitsstufen entsprechend nicht sehr weitgehend und dürften ohnehin dem Standard der meisten Kursräume bzw. Labors an Universitätsinstituten entsprechen. Es sollte daher kein Problem darstellen, gentechnische Anlagen der Sicherheitsstufen 1 oder 2 anmelden zu können und auch genehmigt zu bekommen. Die Sicherheitsmaßnahmen für Genlaboratorien der Sicherheitsstufen 3 und 4 dürften an Universitätsinstituten nur schwerlich realisierbar sein. Deshalb, und weil entsprechende Arbeiten in der Ausbildung auch nicht erforderlich sind, wird hier auf eine nähere Betrachtung verzichtet.

27

28

2 Vorschriften und Gesetze im Zusammenhang mit mikrobiologischen Arbeiten Tabelle 2.2. Sicherheitsmaßnahmen in Genlaboratorien der Stufen 1 und 2, die über die im Kasten auf Seite 22 genannten Maßnahmen hinausgehen. Genlaboratorien der Sicherheitsstufe 2 haben zugleich die entsprechenden Mindestanforderungen an Genlaboratorien der Sicherheitsstufe 1 zu erfüllen Maßnahme

Sicherheitsstufe 1

Sicherheitsstufe 2

Kennzeichnung

• „Genlabor S1“

• „Genlabor S2“, • Warnzeichen „Biogefährdung“

Zutrittsbeschränkung

• Personen, die gem §12 Gentechnik Sicherheitsverordnung (GenTSV) belehrt wurden

• Personen, die vom Projektleiter dazu ermächtigt wurden

Beschaffenheit des Arbeitsplatzes

• Abgegrenzte und ausreichend große Räume • Aufgeräumt und sauber • Lagerung von Geräten, Materialien und Vorräten nur in dafür vorgesehenen Bereichen

• Keine Bodenabläufe • Ablaufbecken in Arbeitsflächen mit Aufkantung

Abgeschlossenheit des Arbeitsbereiches

• Türen sollen während der Arbeiten geschlossen sein • Nach außen öffnende Labortüren mit Sichtfenster

• Fenster und Türen müssen während der Arbeiten geschlossen sein

Oberflächenbeschaffenheit

• Arbeitsflächen und angrenzende Wandflächen müssen beständig gegen die verwendeten Stoffe und Reinigungsmittel sein

• Oberflächen müssen leicht zu reinigen und beständig gegen die eingesetzten Desinfektionsmittel sein

Aerosolbildung

• Es dürfen keine vermeidbaren Aerosole auftreten • Exposition der Beschäftigten minimieren, z. B. Sicherheitswerkbank, Atemschutz, biologische Sicherheitsmaßnahmen

• Es dürfen keine Aerosole in den Arbeitsbereich gelangen: Arbeiten mit aerosoldichten Geräten oder unter Sicherheitswerkbank, die regelmäßig zu warten ist • Prozessluft aus Autoklaven, Pumpen, Bioreaktoren u. ä. filtern oder thermisch inaktivieren

Kontamination / Desinfektion

• Wirksame Desinfektionsmittel und -verfahren müssen verfügbar sein

• Alle Arbeitsflächen müssen nach Beendigung der Tätigkeit desinfiziert werden

Autoklav

• Muss innerhalb des Betriebsgeländes verfügbar sein

• Muss im Labor oder im Gebäude verfügbar sein

Hygiene

• Ungeziefer ist in geeigneter Weise zu bekämpfen

• Ungeziefer und Überträger von GVO sind in geeigneter Weise zu bekämpfen • Ein Hygieneplan ist zu erstellen

Innerbetrieblicher Transport

-

• GVO nur in verschlossenen und gegen Bruch geschützten und von außen desinfizierbaren Behältern transportieren

3 3.1

Versuche Quantitative Bestimmungen

Die meisten Mikroorganismen zeichnen sich durch eine Eigenschaft aus, die sie von fast allen anderen Organismen unterscheidet: Ihre geringen Dimensionen. Darüber hinaus können viele Mikroorganismen außerordentlich schnell wachsen. Mit diesen wichtigen und konsequenzenreichen Gegebenheiten sollen die Teilnehmer/innen am MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM in diesem ersten praktischen Abschnitt vertraut gemacht werden. Im ersten Versuch soll mit verschiedenen Methoden ermittelt werden, wie viele Zellen der Hefe Saccharomyces cerevisiae sich in 1 g Backhefe befinden. Das Ergebnis wird beeindruckend sein. Es befinden sich dort ca. 1 × 1010 Zellen! Dies sind mehr Zellen als Menschen auf unserem Globus leben. An dieser Zahl wird deutlich, wie viele individuelle Zellen eines Klons in sehr kleinen Versuchsansätzen untersucht werden können. Es ist möglich, Populationen zu untersuchen, die Mitglieder mit äußerst selten auftretenden Veränderungen im Genom, also Mutanten, enthalten. Für diesen ersten Versuch wurden aus gutem Grund Hefezellen gewählt. Sie sind als Backhefe überall und jederzeit verfügbar; die Zellen sind unbeweglich und lassen sich im Gegensatz zu beweglichen Zellen viel einfacher z. B. in einer Zählkammer unter dem Lichtmikroskop untersuchen. Außerdem sind die Zellen relativ groß und daher auch für die noch wenig geübten Praktikumsanfänger/innen leicht im Mikroskop zu beobachten. Wenn wir an Stelle der Hefezellen nun Bakterienzellen betrachten, so müssen wir uns vor Augen halten, dass die meisten Bakterien noch viel kleiner als Hefezellen sind. Die Ausmaße einer durchschnittlichen Hefezelle betragen 5,5 × 7,0 μm und das Volumen entspricht ungefähr 100 μm3. Viele Bakterienzellen besitzen lediglich ein Volumen von ungefähr 1 μm3. Dies bedeutet, dass in einer Hefezelle ungefähr 100 von diesen Bakterienzellen Platz hätten und dass 1 cm3 Zellpaste dieses Bakteriums aus ungefähr 1,0 × 1012 Zellen besteht. Noch ein letztes Beispiel soll die geringen Dimensionen veranschaulichen: Zellen von Escherichia coli haben Ausmaße von ca. 1,0 × 3,0 μm, und eine einzelne Zelle hat im feuchten Zustand ein Gewicht von ca. 9,5 × 10-13 g. Eine wichtige Konsequenz dieser geringen Dimensionen von Mikroorganismen sind die im Vergleich zu höheren Organismen riesigen Zell-Oberflächen. Diese sind in etwa identisch mit den Flächen der Cytoplasmamembran, und da diese die Proteine enthält, mit denen Substrate und Nährstoffe in die Zelle aufgenommen und Stoffwechselprodukte in das Medium abgegeben werden, ist diese Fläche zugleich auch die Transportfläche. Gleichzeitig sind in der Cytoplasmamembran die Enzyme und Proteine der Atmung lokalisiert. Die großen Flächen ermöglichen wesentlich höhere Raten des Stoffwechsels und des Wachstums; dies erklärt, weshalb sich die Wachstumsraten ungefähr umgekehrt proportional zur Zellgröße verhalten. Im zweiten Versuch aus diesem Abschnitt soll an Hand des Wachstum von Ralstonia eutropha (früher: Alcaligenes eutrophus) gezeigt werden, dass Bakterien sehr schnell zu wachsen vermögen. Wenn der Versuche hierzu optimal verläuft, wird sich bei diesem Bakterium in dem vorgegebenen Medium eine Verdopplungszeit von ungefähr zwei Stunden ergeben. Innerhalb von 24 Stunden sollten sich somit aus einer Zelle bei ungehindertem Wachstum 4096 Nachkommen ergeben! Dabei ist R. eutropha kein besonders

A. Steinbüchel, F. B. Oppermann-Sanio, Mikrobiologisches Praktikum, DOI 10.1007/978-3-642-17703-3_3, © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2003, Nachdruck 2011

30

3 Versuche

schnell wachsendes Bakterium. Zellen von E. coli können sich z. B. alle 20 Minuten verdoppeln. Um einen Lastkraftwagen mit einem Fassungsvermögen von 20 Tonnen mit der Biomasse dieses Bakteriums füllen zu können, müssten Sie die Zellen lediglich etwas länger als acht Stunden kultivieren, wenn Sie die Kultur mit einem Inokulum von 1 g Zellmasse beimpfen. Jeder Landwirt wäre froh, wenn er über einen Zeitraum von Monaten nur Bruchteile von dieser Biomasse- und Proteinzunahme erreichen könnte. Aber auch die Wachstumsgeschwindigkeit von E. coli ist noch nicht der Rekord. Die am schnellsten wachsenden Bakterien können sich alle zehn Minuten verdoppeln! Mikroorganismen sind auf Grund ihrer geringen Zelldimensionen in Flüssigkeiten mit bloßem Auge nur dann wahrnehmbar, wenn eine bestimmte Zelldichte überschritten wird. Wenn Sie 1 g Hefezellen aus dem Backhefewürfel in einem Liter Wasser oder Puffer suspendieren, beträgt der Zelltiter in der Suspension ungefähr 1 × 107 Zellen pro Milliliter. Dies ist die Grenze, bei der gerade noch eine Trübung wahrnehmbar ist. In einer klar erscheinenden Lösung können also u. U. bereits beträchtliche Zelldichten vorliegen. Werden dann durch Zugabe von Nährstoffen Wachstumsbedingungen geschaffen, kommt es deshalb nur scheinbar zu einer plötzlichen und unerwarteten explosionsartigen Vermehrung der Zellen. Diesen Sachverhalt sollte man sich beim Umgang mit Lösungen und Puffern vor Augen halten, wenn es nicht möglich ist, diese steril zu handhaben oder aufzubewahren, wie dies z. B. bei vielen biochemischen und molekulargenetischen Untersuchungsmethoden der Fall ist. Proteine und Nukleinsäuren sind begehrte Nährstoffe, und auch im Kühlraum oder Kühlschrank ist das Wachstum der meisten mesophilen Mikroorganismen nicht vollkommen unterbunden.

Versuch 1

Bestimmung der Anzahl von Hefezellen in 1 g Bäckerhefe Theoretischer Hintergrund

E4 - S. 313

E5 - S. 318

Vermehrung

Im ersten Versuch wenden wir uns einem „Riesen“ unter den Mikroorganismen zu: Saccharomyces cerevisiae, weitläufig als Bäcker-, Bier- oder Weinhefe bekannt. Aufgrund der Größe der Zellen (ca. 7 μm lange Ellipsoide, ein Vergleich mit Bakterienzellen ist in Abb. 3.3 dargestellt) und der Unbeweglichkeit eignet sich dieser Mikroorganismus ganz besonders, um zwei grundlegende Techniken der Mikrobiologie kennen zu lernen: das Kochsche Plattengussverfahren zur Ermittlung der Lebendzellzahl und die Auszählung der Gesamtzellzahl mit Hilfe einer mikroskopischen Zählkammer. Zwei Exkursionen werden sich mit dem wirtschaftlich wichtigsten Betätigungsfeld von S. cerevisiae bewegen, der Bier- und Weinherstellung, beschäftigen.

Abb. 3.1. Sexuelle Fortpflanzung von Saccharomyces cerevisiae: Ascusbildung

Obwohl zu den Ascomyceten (Schlauchpilzen,  Abb. 3.1) gehörend, entwickelt die Bäckerhefe kein Mycel, sondern lebt dem Wortsinn „Hefe“ entsprechend einzellig. Die Vermehrung geschieht in der asexuellen Phase durch Sprossung ( Abb. 3.2), wobei an den Zellen nacheinander bis zu 30 Knospen gebildet werden, die nach Abschnürung an der Mutterzelle deutlich sichtbare Narben hinterlassen.

3.1 Quantitative Bestimmungen

Abb. 3.2. Asexuelle Vermehrung bei Saccharomyces cerevisiae durch Sprossung

31

Das Genom von S. cerevisiae ist auf einen haploiden Satz von 16 Chromosomen verteilt; es ist mit einer Gesamtgröße von 12 Mbp nur knapp 3-mal so groß wie das von Escherichia coli und damit für einen Eukaryonten relativ klein ( Abb. 3.3). Diesem Umstand ist es zu verdanken, dass bereits im April 1996 die Gesamtsequenz veröffentlicht werden konnte (http:// genome-www.stanford.edu/Saccharomyces).

Das Genom

Aufgrund der seit Jahrtausenden genutzten Eigenschaften der Bäckerhefe im Lebensmittelbereich und bei der Herstellung von alkoholischen Getränken sowie wegen der leichten Kultivierbarkeit, des schnellen und unizellulären Wachstums (Verdopplungszeit ca. 90 min in Komplexmedium) und der guten gentechnischen Zugänglichkeit (z. B. durch Transformation) ist die Bäckerhefe zum Modellorganismus für die Untersuchung unterschiedlichster Fragestellungen bei Eukaryonten geworden. Herkömmliche Bäckerhefe ist in jedem Supermarkt erhältlich und stellt daher eine preiswerte Quelle für biochemische Studien dar. Zudem ist der Umgang mit diesem Mikroorganismus aus sicherheitstechnischer Sicht völlig unproblematisch.

Modellorganismus

Versuchsziel Abb. 3.3. Größenvergleich zwischen Zellen einer Hefe und Escherichia coli

Aufgabe des im Folgenden beschriebenen Versuches ist es, die Gesamtzellzahl und Lebendzellzahl in einem Gramm Bäckerhefe zu bestimmen. Versuchsdurchführung

Abb. 3.4. Hefezellen in einer Thoma-Zählkammer im Mikroskop

Für den Versuch wird zunächst 1 g handelsüblicher Bäckerhefe mit Hilfe eines sterilisierten (abgeflammten) Spatels in eine sterilisierte (autoklavierte) Schraubdeckelglasflasche überführt. Durch Zugabe von 100 ml steriler Saline wird möglichst genau eine Hefe-Konzentration von 10 g/l eingestellt. Von dieser Suspension wird eine 10-1 verdünnte Lösung mit einem Gehalt von 1 g pro l Bäckerhefen hergestellt; dazu werden 10 ml mit einer sterilen Pipette entnommen und mit 90 ml Saline versetzt. Diese Lösung wird erneut 10-1 verdünnt, so dass eine Konzentration von 0,1 g/l Bäckerhefe vorliegt. Diese kleine Verdünnungsreihe soll zeigen, ab welcher Zellkonzentration eine Trübung

Vorbereitungen

32

3 Versuche

mit dem bloßen Auge gut wahrzunehmen ist. Hierbei sollte jedem klar werden, dass die Konzentration von Mikroorganismen sehr hoch sein kann, ohne dass deren Anwesenheit ins Auge fällt. Für den eigentlichen Hauptversuch wird die mittlere (1 g/l) Bäckerhefesuspension verwendet; sie gilt im Weiteren als Ausgangssuspension. Vor Entnahme von Proben aus dieser Ausgangssuspension müssen die sich relativ schnell absetzenden Zellen durch Umschwenken homogen verteilt werden. Ermittlung der Lebendzellzahl: Dazu werden die Hefezellen so weit verdünnt, bis aus den Nachkommen jeweils einer Zelle distinkte Kolonien heranwachsen können. Die Ausgangssuspension wird dazu unter sterilen Bedingungen zunächst schrittweise 10-6 verdünnt. Aus den Verdünnungen 10-4, 10-5 und 10-6 werden mit Hilfe des Kochschen Plattenguss-Verfahrens Vereinzelungen durchgeführt (M4, S. 364,  Abb. 3.5). Als Nährboden hierfür dient Hefe-Festmedium. Nach Erstarren des Agars werden die Platten bei 30 °C bebrütet.

benötigtes Material Geräte          

1 l Schraubdeckelglasflasche, steril Spatel Bunsenbrenner Kulturröhrchen mit Aluminiumkappe Brutschrank (30 °C) Objektträger und Deckgläser Lichtmikroskop Thoma-Zählkammer ( M10, S. 375) Objektmikrometer ( M9, S. 375) Messokular ( M9, S. 375)

Chemikalien und Medien  Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril  Hefe-Festmedium ( S. 416)

Sonstiges  Bäckerhefe aus dem Kühlregal  Taschenrechner

Ermittlung der Gesamtzellzahl mit einer Zählkammer: Bei dieser Bestimmung wird mit Hilfe einer mikroskopischen Zählkammer (M10, S. 375,  Abb. 3.4) die Zellzahl pro ml in der unverdünnten Ausgangssuspension bestimmt. Ermittlung der Gesamtzellzahl über das Volumen einer Hefezelle: Die im Folgenden beschriebene Verfahrensweise stellt kein übliches Verfahren zur Zellzahlbestimmung dar. Die damit verbundene Rechenübung soll vielmehr mit den Dimensionen der Mikroorganismen vertraut machen. Die Gesamtzellzahl (Z) in 1 g Bäckerhefe (Dichte = 1,07 g ml-1) wird hierzu auf folgende Weise über das Volumen einer Zelle (V) berechnet. Für das Volumen einer Zelle ist die Dimension ml ungeeignet, da die Zellen nur wenige μm klein sind. Dem Volumen von 1 μm3 entspricht die Wassermasse 1 pg (1 g = 1 × 1012 pg), Formel 1:

a b

Z=

1 [g] = Gewicht [g]

1 [g] × 1 [ml] V [ml] × 1,07 [g]

=

1 × 1012 [pg] [μm3] V [μm3] × 1,07 [pg]

(1)

Da die Form einer Hefezelle die eines Ellipsoids sehr nahe kommt, kann das Volumen einer Zelle näherungsweise durch Formel (2) bestimmt werden: V [μm3] =

4 π × a [μm] × b2 [μm] 3

(2)

3.1 Quantitative Bestimmungen

33

Die Messung der Radien a und b erfolgt mikroskopisch mit Hilfe eines Messokulars (M9, S. 375). Mit dem geeichten Messokular werden die Längen (= 2a) und Breiten (= 2b) von verschiedenen Hefezellen bestimmt, daraus die Mittelwerte gebildet und das Volumen einer Hefezelle bestimmt. Durch Einsetzen in die obige Formel (1) wird die Zellzahl pro einem Gramm Bäckerhefe errechnet. Ermittlung der Lebendzellzahl: Die Anzahl der Kolonien pro Platte wird durch Auszählen bestimmt. Eine gute Zählbarkeit ist gegeben, wenn auf bzw. im Festmedium Abb. 3.5. Kochscher Plattenguss von drei nicht mehr als ca. 100 Kolonien (bei Bakteunterschiedlichen Verdünnungsstufen eirien ca. 300) vorhanden sind. Hierbei sollten ner Suspension von Hefezellen die Kolonieformen Beachtung finden, die sich je nach dem Wuchsort (unter, in und auf dem Agar) stark von einander unterscheiden. Unter Berücksichtigung des eingesetzten Volumens, der verdünnten Zellsuspension und des Verdünnungsfaktors der Suspension wird die Lebendzellzahl pro ml in der Ausgangssuspension bestimmt. Nachgefragt 1. Welche mit Saccharomyces cerevisiae und ähnlichen Hefen hergestellten Produkte begegnen uns im Alltag? 2. Zu welcher Gruppe der Pilze gehört Saccharomyces cerevisiae? 3. Beschreiben Sie den Vermehrungscyclus (Kernphasenwechsel) bei Saccharomyces cerevisiae! 4. Wie viele Hefezellen befinden sich ungefähr in 1 g aus einem handelsüblichen, in jedem Lebensmittelmarkt zu kaufenden Backhefewürfel? 5. Welche Zellkonzentration muss in einer Lösung in etwa vorliegen, damit Sie deren Anwesenheit mit bloßem Auge wahrnehmen können? 6. Mit welchen Verfahren können Sie in einer Probe die Gesamtzellzahl und mit welchen die Lebendzellzahl eines Mikroorganismus bestimmen? 7. Beschreiben Sie, wie Sie bei der Bestimmung der Lebendzellzahl von Hefe nach dem Kochschen Plattengussverfahren vorgegangen sind? 8. Skizzieren und beschreiben Sie die verschiedenen Felder, die Sie bei der Betrachtung einer ThomaZählkammer im Mikroskop sehen! 9. Wie viele c-Felder enthält ein b-Feld der ThomaZählkammer? 10. Für welche Mikroorganismen eignet sich die Auszählung in der Thoma-Zählkammer, für welche nicht? 11. Wie hoch ist die Gesamtvergrößerung eines Lichtmikroskops, wenn die Okularvergrößerung 12,5× und die Objektivvergrößerung 40× beträgt? 12. Ist die Lebendzellzahl oder die Gesamtzellzahl größer? Warum?

13. Sie bestimmen den Bakterientiter einer Probe. Von der Probe fertigen Sie eine Verdünnungsreihe an und plattieren von einer 10-3-Verdünnung 100 μl auf ein Medium, welches zur Vermehrung des nachzuweisenden Mikroorganismus geeignet ist. Nachdem Sie die Platte zwei Tage inkubiert haben, zählen Sie auf ihr 45 Kolonien. Wie hoch ist der Titer (Zellen pro ml)? 14. Sie erwarten in einer Gewässerprobe ein bestimmtes Bakterium in einer Zelldichte von ca. 2 × 108 Zellen pro ml. Welche Verdünnung müssen Sie herstellen, damit nach Ausstrich von 100 μl auf einem Nährboden zum spezifischen Nachweis dieses Bakteriums die leicht auszählbare Anzahl von 100 ± 20 Kolonien heranwächst? 15. Wie lauten die mathematischen Formeln zur Berechnung des Umfangs, der Oberfläche und des Volumens einer Kugel? 16. Berechnen Sie das Volumen eines ellipsoiden Mikroorganismus, wenn der kurze Radius (a) 1,5 μm und der lange Radius (b) 3 μm beträgt! 17. Wie viele kokkenförmige Zellen eines anderen Mikroorganismus mit einem Durchmesser von 0,9 μm würden in dem unter Frage #16 beschriebenen ellipsoiden Mikroorganismus maximal Platz finden? 18. Berechnen Sie das Gewicht einer einzelnen Hefezelle, von der das Volumen (100 μm3) und die spezifische Dichte (1,07 g/ml) bekannt sind! 19. Um wieviel nimmt die Oberfläche einer Zelle in Form eines Kokkus zu, wenn sich dessen Radius verdoppelt? 20. Um wieviel nimmt das Volumen einer kokkenförmigen Zelle zu, wenn sich dessen Radius verdoppelt?

34

3 Versuche

Versuch 2

Aufnahme einer Wachstumskurve mit Ralstonia eutropha Theoretischer Hintergrund Unter Wachstum von Mikroorganismen wird die Zunahme der Zellzahl verstanden. Von wenigen Ausnahmen abgesehen vermehren sich Prokaryonten durch Zweiteilung einer Mutterzelle in zwei Tochterzellen. Zunächst erfolgt dabei die Vermehrung sämtlicher Bestandteile der Zelle einschließlich des Genoms, dies führt auch zu einer vorübergehenden Vergrößerung der Zelle. Liegen alle Bestandteile in ausreichender Menge und Anzahl vor und hat die Zelle eine bestimmte Größe erreicht, wachsen Cytoplasmamembran und Zellwand in der Mitte der Zelle nach innen, wodurch es zur Ausbildung einer Trennwand kommt. Ist die Trennwand vollständig und der Inhalt der Zellen in zwei gleich große Portionen aufgeteilt, trennen sich die Zellwände und zwei Tochterzellen sind entstanden. Werden bei der Kultivierung exakt konstante Bedingungen eingehalten, dann wiederholt sich dieser Vorgang in gleichen Zeitabständen. Für ein bestimmtes Bakterium und bestimmte Kulturbedingungen ist diese Generationszeit eine charakteristische Größe. Für die am schnellsten wachsenden Bakterien wie z. B. Geobacillus stearothermophilus (früher: Bacillus stearothermophilus) wurden Generationszeiten von 11 Minuten ermittelt. Bei Escherichia coli kann die Generationszeit 20 Minuten betragen. Viele andere im Labor untersuchte Bakterien wie z. B. Ralstonia eutropha besitzen Generationszeiten von einer bis wenigen Stunden. Es gibt aber auch sehr langsam wachsende Bakterien wie z. B. die Anammox Bakterien, bei denen die Generationszeit mehrere Tage betragen kann. Die Generationszeiten können also sehr unterschiedlich sein. Für ein bestimmtes Bakterium ist die Generationszeit abhängig von der Kohlenstoffquelle, dem Grundmedium und den physikalischen und sonstigen Bedingungen (Temperatur, pH, Versorgung mit Sauerstoff usw.), die den Zellen während der Kultivierung auferlegt werden.

Anlauf(lag)-Phase

Logarithmus der Bakterienzalhl

Vermehrung durch Zellteilung

exponentielle (lg)-Phase

Trophophase

stationäre Phase

AbsterbePhase

Idiophase ln X max. ln X t2 μ=

ln X t1 - ln X t2

t2 - t1

ν

ln X t1 ln X 0

t1 Abb. 3.6.

t2

Wachstumskurve einer Bakterienkultur

Zeit

3.1 Quantitative Bestimmungen

35

Bei der Kultivierung von Mikroorganismen liegt in der Regel kein synchronisiertes Wachstum vor und verschiedene Zellen teilen sich zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Nur für wenige Bakterien und bei Anwendung besonderer Techniken ist es möglich, für eine kurze Zeit ein synchronisiertes Wachstum zu erhalten, was dann in regelmäßigen Abständen zu einer sprunghaften Verdoppelung der Zellzahl führt. Für die meisten Bakterien und unter den üblicherweise im Labor angewandten Bedingungen ist dies nicht möglich. Da die Anzahl der Zellen in einem Medium sehr hoch ist, finden somit ständig Zellteilungen statt, und die Zellzahl steigt kontinuierlich an.

Wachstum von Zellpopulationen

Wird ein Medium in einem geschlossenen Gefäß mit Zellen einer Vorkultur angeimpft und damit ein Wachstumsexperiment gestartet, können in der Regel vier Phasen des Wachstums unterschieden werden ( Abb. 3.6). Zunächst benötigen die Zellen in einer Anlaufphase (lag-Phase) eine gewisse Zeit, um sich auf die neuen Bedingungen einzustellen, bevor sie beginnen, sich in regelmäßigen Zeitabständen zu teilen, und die Kultur die exponentielle Wachstumsphase erreicht. Später, wenn kein Wachstum mehr möglich ist, geht die Kultur in die stationäre Phase über. Die Zellzahl bleibt konstant. Später beginnen die Zellen abzusterben. Die letzte Phase wird als Absterbephase bezeichnet ( Tabelle 3.1).

Phasen einer Wachstumskurve

Werden einem Mikroorganismus in einem Medium zwei verschiedene chemische Verbindungen bzw. Nährstoffe mit dem gleichen Makroelement angeboten, wird zunächst meist nur eine dieser Verbindungen zum Wachstum verwertet und diese mehr oder weniger vollständig aufgebraucht, bevor die zweite Verbindung verwertet wird. Diese Situation ist zum Beispiel gegeben, wenn Escherichia coli gleichzeitig Glucose und Sorbit als Kohlenstoffquelle angeboten wird oder wenn Paracoccus denitrificans unter aeroben Bedingungen gleichzeitig Ammonium und Nitrat als Stickstoffquellen vorfindet. Die Mikroorganismen verbrauchen dann zunächst Glucose bzw. Ammonium, bevor mit der Verwertung von Sorbit bzw. Nitrat begonnen wird. Beim Übergang vom Verbrauch des ersten Nährstoffs zum Verbrauch des zweiten Nährstoffs ist dann häufig erneut eine Anlaufphase erforderlich, in der die Enzyme für die Verwertung des zweiten Nährstoff induziert werden. Dieses Verhalten wird als diauxisches Wachstum bezeichnet und resultiert in zweiphasigen Wachstumskurven. Das Phänomen der Diauxie wurde von Jacques Monod bei E. coli entdeckt. Tabelle 3.1. Die vier Wachstumsphasen und deren Ursachen Wachstumsphase Ursachen Anlaufphase

• Anpassung an neue Bedingungen • Induktion von Enzymen zur Verwertung der Kohlenstoffquelle und/oder anderer Nährstoffe • Reparatur von Zellschäden

Exponentielle Phase

• die Zellen nutzen die angebotenen Nährstoffe und die gegebenen physikalischen Bedingungen optimal

Stationäre Phase

• • • •

Absterbephase

• fehlende Energie durch Verbrauch der Energiequelle • Anwesenheit eines toxischen Stoffwechselprodukts • Induktion lytischer Enzyme

die Kohlenstoffquelle ist verbraucht ein anderer Nährstoff ist verbraucht Anhäufung eines hemmenden Stoffwechselprodukts durch Verbrauch eines Nährstoffs (meist Kohlen- oder Stickstoffquelle) oder durch Bildung eines Stoffwechselprodukts wurde der pH-Wert aus des Toleranzbereichs des Organismus bewegt

36

3 Versuche Bakterienzahl und Bakterienmasse

Beim Wachstum eines Bakteriums ist strikt zwischen der Zunahme der Zellzahl und der Zellmasse zu unterscheiden. Während wie oben angegeben die Zunahme der Zellzahl durch die Generationszeit (g) charakterisiert wird, bezieht sich die Verdopplungszeit (td) auf die Zunahme der Zellmasse. In der exponentiellen Wachstumsphase besteht zwischen beiden meist eine feste Beziehung. In der stationären Phase ist diese Beziehung dann jedoch häufig nicht mehr gültig. Dies trifft z. B. auf Bakterien zu, die in der Lage sind, intrazellulär Speicherstoffe zu akkumulieren. Ein einfaches Rechenbeispiel soll den möglichen Unterschied eindrucksvoll belegen: Wird z. B. die stationäre Phase bei dem Poly(3-hydroxybutyrat), Poly(3HB), synthetisierenden Bakterium Ralstonia eutropha durch Mangel einer verwertbaren Stickstoffquelle eingeleitet und ist noch genügend überschüssige Kohlenstoffquelle vorhanden, dann nimmt die Zellzahl zwar nicht mehr zu, aber die Zellmasse. Da R. eutropha Poly(3HB) bis zu einem Anteil von ca. 90 % (wt/wt) an der Zelltrockenmasse akkumulieren kann, könnte die Zellmasse bei konstanter Zellzahl theoretisch noch um den Faktor 10 zunehmen, wenn die Zellen am Ende der exponentiellen Wachstumsphase noch keinen Speicherstoff enthielten. Da Poly(3HB) eine andere Elementarzusammensetzung als die Durchschnittszelle aufweist, verschiebt sich auch die chemische Zusammensetzung der Zellen während der Speicherung. Auch die optischen Eigenschaften einer Kultur von R. eutropha verändern sich durch die Akkumulation des Speicherstoffs beträchtlich. Was hier am Beispiel des Speicherstoffs Poly(3HB) erläutert wurde, trifft im Prinzip auch auf alle anderen bakteriellen Speicherstoffe (Glycogen, Cyanophycin, Polyphosphat, Triglyceride, Wachsester usw.) und die diese akkumulierenden Bakterien zu. Die strikte Beziehung zwischen der Zunahme von Zellmasse und Zellzahl wird auch aufgehoben, wenn die Zellen Dauerformen (z. B. Endosporen, Cysten usw.) ausbilden oder während des Wachstums ihre Zellform und Zellgröße verändern (z. B. Arthrobacter globiformis).

Definition: Generationszeit Die Generationszeit (g) ist als das Zeitintervall definiert, das für eine Verdopplung der Zellzahl benötigt wird. Die Angabe erfolgt meist in den Einheiten Minuten oder Stunden. Definition: Verdopplungszeit Die Verdopplungszeit (td) ist als das Zeitintervall definiert, das für eine Verdopplung der Zellmasse benötigt wird. Die Angabe erfolgt meist in den Einheiten Minuten oder Stunden. Definition: Teilungsrate Die Teilungsrate (ν) ist definiert als die Anzahl der Zellteilungen pro Stunde:

ln N – ln N 0 n ν = --- = --------------------------t ln 2 ( t – t 0 ) Teilungsrate (ν) und Generationszeit (g) stehen in folgender Beziehung:

1 g = --ν Wachstumsrate (μ) und Teilungsrate (ν) stehen in folgender Beziehung zueinander:

μ μ ν = -------- = -----------ln 2 0,693

Definition: Wachstumsrate Das exponentielle Wachstum von Bakterien entspricht einer Reaktion 1. Ordnung. Die Wachstumsrate (μ) ist die Ratenkonstante für die Geschwindigkeit der Veränderung der Zellmasse X oder einer ihr proportionalen Größe.

ΔX μX = ------dt

X = X0 × e

μ×t

ln 2 0,693 μ = -------- = -----------td td Die Angabe der Wachstumsrate erfolgt meist in der Einheit 1/Stunde (h-1). Definition: Ertrag Der Ertrag (X) ist definiert als Differenz zwischen der Bakterienmasse zu Beginn des Wachstums und der maximalen Bakterienmasse in der stationären Phase. Die Angabe erfolgt in der Einheit „Gramm Trockenmasse“

3.1 Quantitative Bestimmungen Tabelle 3.2.

37

Bestimmung der Bakterienzahl

Gesamtzellzahl

• Mikroskopische Auszählung in Zählkammern (z. B. Thoma-Zählkammer) • Relativzählung (nach Zugabe einer Referenzsuspension von Partikeln mit bekannter Konzentration) • Elektronische Zählgeräte (z. B. Coulter Counter) • Membranfiltermethoden (mit nachfolgender Anfärbung und mikroskopischer Auszählung)

Lebendzellzahl

• Ausplattieren auf Nährböden • Kochsches Plattengussverfahren • Membranfiltermethoden (mit nachfolgender Inkubation der Filter auf Nährkartonscheiben oder Agarnährböden)

Darüber hinaus ist das Verhältnis von Zellmasse zu Zellzahl eine für ein bestimmtes Bakterium individuelle Größe und gilt hier streng genommen auch immer nur für eine definierte Wachstumsbedingung. Die Beziehung darf also grundsätzlich nicht von einem Bakterium auf ein anderes übertragen werden. Bei der Wachstumskurve wird die Zellzahl oder die Zellmasse auf der Ordinate bzw. YAchse gegen die Zeit auf der Abzisse bzw. X-Achse aufgetragen. Bevorzugt wird dabei eine halblogarithmische Auftragung des Logarithmus der Zellzahl bzw. -masse gegen die Zeit. Es kann dann sofort erkannt werden, ob tatsächlich ein exponentielles Wachstum vorliegt; diese Phase des Wachstums gibt sich dann durch eine Gerade zu erkennen. Aus der Steigung der Geraden können dann rechnerisch die Teilungsrate (ν) und auch die spezifische Wachstumsrate (μ) in der exponentiellen Wachstumsphase ermittelt werden.

Parameter des Wachstums

Eine weitere wichtige Größe ist der Ertrag (X). Bei Kenntnis des Verbrauchs von Nährstoffen und hier besonders der Kohlenstoffquelle können hieraus Rückschlüsse auf die Effizienz eines biotechnologischen Produktionsprozesses gezogen werden. Besonders bei anaeroben Stoffwechselvorgängen kann auch auf die Anzahl der Reaktionen geschlossen werden, die Energie in Form von ATP liefern. Bei der Bestimmung der Bakterienzahl ist zwischen der Gesamtzellzahl und der Lebendzellzahl zu unterscheiden ( Tabelle 3.2). Dabei kann die Lebendzellzahl höchstens so groß wie die Gesamtzellzahl sein. Sie kann nie größer sein; in der Regel ist sie niedriger, da nicht alle in einer Kultur vorhandenen Zellen lebens- bzw. vermehrungsfähig sind. Auch hier gibt es während des Wachstums meist Veränderungen des Verhältnisses von Gesamtzellzahl zu Lebendzellzahl. Während der Anlaufphase ist möglicherweise noch ein hoher Anteil abgestorbener oder nicht mehr vermehrungsfähiger Zellen aus der Vorkultur vorhanden. Das Verhältnis kommt dem Idealwert 1 meist in der exponentiellen Wachstumsphase am nächsten. In der stationären Phase und in der Absterbephase nimmt das Verhältnis dann zu Ungunsten der Lebendzellzahl wieder deutlich ab. Da die Zellzahlen bei Laborkulturen i. d. R. hoch sind, sind zuvor Verdünnungsreihen anzulegen, bevor eine der Methoden zur Bestimmung der Lebendzellzahl angewandt werden kann. Proben, die wenig Bakterien enthalten, wie sie z. B. bei der Keimzahlbestimmung von Trinkwasser oder von Raumluft anfallen, müssen zunächst durch Passage der Probe durch einen für Bakterien nicht passierbaren Membranfilter konzentriert werden, damit die Bakterien überhaupt in einer erfassbaren Konzentration zur Ermittlung der Gesamt- oder Lebendzellzahl vorliegen. Nur auf diese Weise ist es möglich, die Keimzahl in mehreren Litern Wasser oder mehreren Kubikmetern Luft zu ermitteln.

Bestimmung der Bakterienzahl

38

3 Versuche Tabelle 3.3.

Bestimmung der Bakterienmasse

Bestimmung der Bakterienmasse

Direkte Methoden

• • • •

Bestimmung der Trockenmasse Bestimmung des Gesamt-Stickstoffgehaltes (nach Kjeldahl) Bestimmung des Proteingehaltes Bestimmung eines anderen typischen essentiellen Zellbestandteils (z. B. DNA, Bacteriochlorophyll, Phospholipide usw.)

Indirekte Methoden

• Ermittlung der Trübung einer Zellsuspension (Turbidimetrie, Nephelometrie) • Ermittlung von mit dem Wachstum korrelierten Stoffwechselgrößen (O2Aufnahme, CO2-Freisetzung, ATP-Gehalt, typisches Stoffwechselprodukt)

Bei der Bestimmung der Bakterienmasse sind direkte Methoden von indirekten Methoden zu unterscheiden ( Tabelle 3.3). Streng genommen liefert nur die Ermittlung der Trockenmasse direkte Werte, auch wenn diese i. d. R. nichts über den physiologischen Zustand der Zellen aussagen. Werte über den Gesamtstickstoffgehalt, den Proteingehalt oder den Gehalt eines anderen essentiellen Zellbestandteils stehen wie oben erläutert nicht notwendigerweise in einer festen Beziehung zur Gesamtmasse und können sich z. B. durch Akkumulation von Speicherstoffen beträchtlich verschieben. Von den indirekten Methoden ist die Ermittlung der Trübung einer Zellsuspension i. d. R. am einfachsten und schnellsten durchzuführen. Deshalb wird diese Methode auch am häufigsten angewandt. Um aussagekräftige Werten zu erhalten, muss zuvor die Beziehung der Trübung zu anderen Parametern (z.B. Trockenmasse, Proteingehalt) ermittelt werden, und es muss der physiologische Zustand der Zellen bekannt sein. Die Ermittlung von Stoffwechselgrößen, die mit dem Wachstum korreliert sind, erfordert ebenfalls Vorexperimente, in denen die Beziehungen zu anderen Größen ermittelt wurden, sowie genaue Kenntnisse und Erfahrungen über den zu untersuchenden Organismus. Meist werden diese Methoden daher weniger zur Bestimmung der Bakterienmasse, sondern vielmehr zur Bestimmung des physiologischen Zustands einer Kultur, des Verbrauchs einer Kohlenstoffquelle und vieler anderer nützlicher Werte ermittelt, die z. B. Auskunft über den Stand einer Fermentation in einem biotechnologischen Produktionsprozess geben. Versuchsziel Dieser Versuch soll dazu dienen, das Wachstum bei zwei Stämmen des Gram-negativen, nicht Sporen-bildenden Bakteriums Ralstonia eutropha (früher: Alcaligenes eutrophus) durch das zeitliche Bestimmen der Parameter Gesamtzellzahl, Lebendzellzahl, Trübung, Trockenmasse und Proteingehalt zu verfolgen. Aus den erhaltenen Kurven werden Wachstumsrate, Verdopplungszeit, Generationszeit und Teilungsrate bestimmt. Hierbei gilt es auch, durch Vergleich der Wachstumskurven der beiden unterschiedlichen Stämme den Einfluss der Bildung des Speicherstoffs Poly(3-hydroxybutyrat), Poly(3HB), in Form lichtbrechender Einschlusskörper auf die Messungen zu erfassen. Versuchsdurchführung

Vorbereitungen

Nach Erhalt der beiden Stämme werden diese in jeweils wenig steriler Saline suspendiert und per Drei-Strich-Ausstrich (M4, S. 365) auf NB-Festmedium ausgestrichen. Die Platten werden bei 30 °C bebrütet. Die bewachsenen Platten können bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank (4 °C) gelagert werden.

3.1 Quantitative Bestimmungen

benötigtes Material Geräte     

       

100 ml-Erlenmeyerkolben 2 l-Erlenmeyerkolben 5 ml- und 10 ml-Glaspipetten, steril Kulturröhrchen mit Aluminiumkappe, steril Photometer zur Bestimmung der Optischen Dichte im Bereich von 540 bis 600 nm und für die Proteinbestimmung bei 750 nm Trockenschrank (70 bis 80 °C) Absaugvorrichtung für Membranfiltration mit Vakuumpumpe Membranfilter aus Cellulosenitrat (Porengröße 0,45 μm) Feinwaage Glasgeräteschüttler 1,5 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäße („E-Cups“) Zentrifuge für E-Cups Gefrierschrank (-20 °C)

Chemikalien und Medien  Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril  NB-Festmedium ( S. 422)  Mineralsalzmedium ( S. 421)

Mikroorganismen  R. eutropha H16 DSM 428  R. eutropha PHB-4 DSM 541

39

Vorkulturen: Mit Material von jeweils einer Einzelkolonie werden zweimal jeweils 10 ml Mineralsalzmedium mit 1 % (wt/vol) Na-Gluconat und normalem Stickstoffgehalt (0,1 %, wt/vol, NH4Cl) beimpft, die sich in zwei 100 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen befinden. Die Kulturen werden 18 bis 24 Stunden bei 30 °C unter Schütteln inkubiert. Für die Trockenmassebestimmung (M25, S. 403) wird die benötigte Anzahl von Membranfiltern über Nacht bei 70 bis 80 °C getrocknet. Hauptkulturen: Als Kulturgefäße für die Hauptkulturen dienen zwei 2 l-Erlenmeyerkolben mit Schikanen, in denen sich jeweils 200 ml Mineralsalzmedium mit 1 % (wt/vol) Na-Gluconat und reduziertem Stickstoffgehalt (0,05 %, wt/vol, NH4Cl) befinden. Vor dem Beimpfen der Ansätze werden unter sterilen Bedingungen je ca. 5 ml entnommen und steril verwahrt; sie dienen der Leerwertbestimmung bei der Messung der Optischen Dichte. Die Ansätze werden mit jeweils dem kompletten Volumen der Vorkulturen beimpft. Die Hauptkulturen werden unter Schütteln bei 30 °C inkubiert. Mit dem Beimpfen ist der Zeitpunkt t = 0 des Wachstumsversuchs festgelegt.

Direkt nach dem Beimpfen erfolgt zur Bestimmung der Parameter zum Zeitpunkt t = 0 eine Probennahme ( Tabelle 3.4). In den folgenden 48 Stunden werden zu den in der Tabelle 3.4 empfohlenen Zeitpunkten mit sterilen Glaspipetten Proben entnommen und in vorgekühlte, sterile Kulturröhrchen überführt. Letzteres ist notwendig, um ein weiteres Wachstum der Zellen in den Proben zwischen dem Zeitpunkt der Entnahme und der Messung der einzelnen Parameter zu unterbinden. Die Kulturgefäße sollten nicht länger als unbedingt notwendig von der Schüttelmaschine genommen werden, um die Unterbrechungen bei der Versorgung mit Sauerstoff so kurz wie möglich zu halten. Nach der Entnahme der Proben sollten zuerst die Arbeitsschritte für die Lebendzellzahlbestimmung, d. h. Verdünnungen herstellen ( M3, S. 363) und ausplattieren mit dem Drigalski-Spatel ( M4, S. 366), durchgeführt werden. Hierbei ist unbedingt kontaminationsfrei zu arbeiten, während bei der Bestimmung der anderen Messgrößen (Trübung, Gesamtzellzahl, Trockenmasse, Proteingehalt) die gänzliche Abwesenheit von Fremdkeimen nicht zwingend notwendig ist. In Tabelle 3.5 sind empfohlene Verdünnungen für die Lebendzellzahlbestimmung angegeben; zur Verdünnung wird sterile Saline verwendet. Aus den Verdünnungsstufen wird jeweils ein Volumen von 100 μl ausgespatelt. Die Platten werden bei 30 °C bebrütet. Für die Gesamtzellzahlbestimmung mit Hilfe einer mikroskopischen Zählkammer ( M10, S. 375) können neben der Originalprobe auch die verdünnten Proben aus der

3 Versuche

Lebendzellzahlbestimmung verwendet werden. Es werden Verdünnungen eingesetzt, die ca. 50 bis 80 Zellen pro Großquadrat (b-Feld bei der Thoma-Kammer) ergeben. Für die Proteinbestimmung werden je 1,0 ml der unverdünnten Proben in Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt und für 2 min bei Raumtemperatur in einer entsprechenden Zentrifuge bei 15.000 × g zentrifugiert. Die Zellen werden einmal in ca. 1 ml Saline resuspendiert und erneut zentrifugiert. Die auf diese Weise gewaschenen Zellen werden bis zur eigentlichen Proteinbestimmung (Tag 5) bei -20 °C gelagert. Die Trübungsmessung erfolgt mit monochromatischem Licht einer Wellenlänge zwischen 540 und 600 nm in 3 ml Glas- oder Plastikküvetten mit einer Schichtdicke von 1 cm gegen Saline (Nullabgleich). Der Leerwert des Mediums (unbeimpftes Medium) sollte bei dem für diesen Versuch verwendeten Medium kaum von Null abweichen, da es im gemessenen Wellenlängenbereich keine stark von Wasser bzw. Saline abweichende Absorption besitzt. Der Leerwert gefärbter Medien (z. B. Komplexmedien) kann jedoch durchaus recht beträchtlich sein. Der Leerwert des unbeimpften Mediums ist in jedem Fall von den Werten der Proben abzuziehen. Linearität zwischen Trübungwerten und Zellgehalt gilt nur im Bereich von ≤ 0,3. Fallen die Trübungswerte der Proben größer aus, so sind entsprechend verdünnte Proben (aus der Lebendzellzahlbestimmung) einzusetzen. Empfohlene Zeitpunkte für die Probenentnahme und Probevolumen

Probenvolumen [ml]

Lebendzellzahl

Gesamtzellzahl

Trübung

Proteingehalt

Trockenmasse

Messungen

ProbenentnahmeZeitpunkt [Stunden]

Tabelle 3.4.

Probennummer

40

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

0 4 8 10 12 14 16 18 20 24 26 28 32 38 48

15 5 15 5 15 5 15 5 15 5 15 5 15 5 15

+ + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + + + + +

+ + + + + + + +

+ + + + + + + +

Tabelle 3.5.

Empfohlene Verdünnungen für die Lebendzellzahlbestimmung

Probennummer 1 3 5 7 9 11 13 15

ProbenentnahmeZeitpunkt [Stunden] 0 8 12 16 20 26 32 48

Anzulegende Verdünnungen

Verdünnungsstufen, aus denen jeweils 100 μl ausplattiert werden

10-1 bis 10-5 10-1 bis 10-5 10-1 bis 10-5 10-1 bis 10-6 10-1 bis 10-6 10-1 bis 10-8 10-1 bis 10-9 10-1 bis 10-9

10-2 bis 10-5 10-2 bis 10-5 10-2 bis 10-5 10-3 bis 10-6 10-3 bis 10-6 10-5 bis 10-8 10-8 bis 10-9 10-8 bis 10-9

3.1 Quantitative Bestimmungen

41

Die Trockenmassebestimmung erfolgt nach den Angaben im Methodenkapitel ( M25, S. 403). Je 10 ml unverdünnte Probe werden mittels einer Absaugvorrichtung über die getrockneten Membranfilter (Porengröße 0,45 μm) gesaugt. Vor ihrem Einsatz müssen die Membranen zur Bestimmung des Leergewichts auf einer Feinwaage gewogen werden. Die Filter werden nach Gebrauch bei 70 bis 80 °C bis zur Gewichtskonstanz (über Nacht) getrocknet. Zur Ermittlung der Trockenmassewerte werden die getrockneten Membranfilter erneut gewogen; das Leergewicht der unbenutzten Membranfilter wird subtrahiert. Zur Bestimmung des Proteingehalts der Zellen während des Wachstums wird die Methode nach Lowry et al. (1951) angewandt (M23, S. 392). Hierzu werden die während des Versuchs eingefrorenen Zellpellets verwendet. Die eingefrorenen Zellen werden in jeweils genau 1,0 ml Saline resuspendiert. Jeweils 0,5 ml dieser Suspensionen werden für die Proteinbestimmung eingesetzt. Zur Ermittlung der Lebendzellzahl werden die Kolonien pro Platte gezählt. Zur Ermittlung der Zellkonzentration in den Kulturen zum Zeitpunkt der Probennahme müssen ausplattiertes Volumen (100 μl) und Verdünnungsstufe berücksichtigt werden ( Tabelle 3.5). Weiterführende Literatur Lengeler JW, Drews G, Schlegel HG (1999) Biology of the prokaryotes. Thieme, Stuttgart Madigan MT, Martinko JM, Parker J; Goebel W (2001) Brock – Mikrobiologie, Spektrum, Heidelberg Schlegel HG (1992) Allgemeine Mikrobiologie. 7. Aufl. Thieme, Stuttgart

Nachgefragt 1. Nennen Sie die vier Wachstumsphasen einer typischen Bakterienkultur! 2. Was versteht man unter „Trophophase“ und „Idiophase“? 3. Was versteht man unter diauxischem Wachstum? 4. Erläutern Sie die Begriffe „statische Kultur“ und „kontinuierliche Kultur“! 5. Nennen Sie Ursachen und Faktoren, die das weitere Wachstum einer Bakterienkultur unmöglich machen können! 6. Nennen Sie die Gleichungen zur Berechnung der Wachstumsrate (μ) und der Verdopplungszeit (td)! 7. Wie können Sie aus der Teilungsrate (ν) rechnerisch die Generationszeit (g) ermitteln? 8. Ein exponentiell wachsendes Bakterium mit einer Generationszeit von 60 min wird 10 Stunden unter optimalen Bedingungen kultiviert. Zum Zeitpunkt t0 hatte die Kultur eine Zelldichte von 5 × 106 Zellen/ml. Wie hoch ist die Zelldichte am Ende des Experiments? 9. Nennen Sie verschiedene Methoden zur Bestimmung der Lebendzellzahl und der Gesamtzellzahl in einer Bakterienkultur! 10. Beschreiben Sie, wie Sie die Gesamtzahl vorhandener Endosporen in einer Kultur von Bacillus megaterium bestimmen können! 11. Nennen Sie verschiedene direkte und indirekte Methoden zur Bestimmung der Bakterienmasse! 12. Warum nehmen die Trübungswerte mit steigender Wellenlänge des verwendeten Lichts leicht ab?

13. Erklären Sie den Unterschied zwischen der Verdopplungszeit und der Generationszeit eines Bakteriums! 14. Warum muss bei der Bestimmung der Trübung einer Bakterienkultur verdünnt werden, wenn ein bestimmter Extinktionswert überschritten wird? 15. Sie kultivieren ein Bakterium, dessen Zellen durch Carotinoide orange sind. Verwenden Sie zur Trübungsmessung eher Licht längerer oder kürzerer Wellenlänge? 16. Beschreiben Sie das Prinzip der im Versuch eingesetzten Methode zur Bestimmung des Proteingehaltes der Zellen! 17. Die Kultur eines Mikroorganismus enthält noch genügend Kohlenstoffquelle, befindet sich aber in der stationären Phase, weil ein anderer Nährstoff verbraucht wurde. Trotzdem nimmt die Konzentration der Kohlenstoffquelle weiter ab. Wie erklären Sie dies? 18. Die Kultur eines Bakteriums befindet sich in der stationären Phase. Obwohl die Gesamtzellzahl pro Volumeneinheit konstant bleibt, nimmt die Bakteriendichte weiter zu. Wie erklären Sie dies? 19. Durch welche Maßnahmen können Sie zur Verkürzung der Anlaufphase bei der Kultivierung eines Mikroorganismus beitragen? 20. Informieren Sie sich in Lehrbüchern der Mikrobiologie, wie hoch in etwa der prozentuale Anteil von Protein, Murein, Nukleinsäuren, Phospolipiden und nicht polymeren Zellbestandteilen an der Trockensubstanz einer Bakterienzelle ist, die keine Speicherstoffe akkumuliert hat!

42

3 Versuche

3.2

Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

Die Entwicklung selektiver Kulturmethoden zur gezielten Anreicherung von Bakterien mit bestimmten wachstumsphysiologischen Eigenschaften ist eines der klassischen Aufgaben und Gebiete der Mikrobiologie. Durch die erfolgreichen Arbeiten von sehr vielen Mikrobiologen in den letzten beiden Jahrhunderten ist es gelungen, eine Vielzahl sehr verschiedener Bakterien von natürlichen Standorten anzureichern und in Reinkultur zu bringen. Hierdurch wurden zahlreiche neue Stoffwechselwege entdeckt, die für den Kohlenstoffkreislauf und die geochemischen Kreisläufe von außerordentlicher Wichtigkeit sind und von denen viele ausschließlich in Mikroorganismen vorkommen. Häufig hat gerade die genaue Analyse einzelner Habitate oder die nicht beobachtete Akkumulation natürlicher oder synthetischer Verbindungen in einem Habitat dazu geführt, die Existenz bestimmter Stoffwechselleistungen zu fordern. Hierdurch wurden die Mikrobiologen ermuntert, ja herausgefordert, Mikroorganismen mit entsprechenden Stoffwechselleistungen durch die Auferlegung selektiver Kultivierungsmethoden anzureichern. Diese Anreicherungen förderten auch zu Tage, dass Mikroorganismen, und hier besonders Bakterien, einen kaum vorstellbaren Toleranzbereich gegenüber den physikalischen Rahmenbedingungen des Wachstums aufweisen und dass unter den Prokaryonten auch viele extremophile Vertreter vorkommen. Selbst Temperaturen von über 100 °C und pH-Werte unter 1 oder über 12 werden von einigen Bakterien nicht nur toleriert, sondern sogar zum Wachstum benötigt. Trotz der intensiven Bemühungen und der vielen Erfolge konnten bisher wahrscheinlich lediglich ca. 1 bis 2 % der in der Natur vorkommenden Bakterienarten im Labor in Reinkultur zum Wachstum gebracht werden; 98 bis 99 % der Bakterien haben sich dem bisher verschlossen. Die Aufgabe, einen Großteil dieser als nicht kultivierbar bezeichneten Bakterien in das Labor zu holen, wird eine der großen Herausforderungen für die Mikrobiologen in den nächsten Jahrzehnten darstellen. Die steigende Anzahl von Erstbeschreibungen neuer Spezies oder neuer Gattungen für neu isolierte Bakterien zeigt, dass die Mikrobiologen auf dem richtigen Weg dorthin sind. Mit der Anreicherung werden mit Sicherheit auch Bakterien entdeckt werden, die über neue Syntheseoder Abbauleistungen verfügen, die unter bisher nicht vorstellbaren Bedingungen wachsen können oder die auf bisher nicht bekannte symbiontische Beziehungen mit anderen Organismen obligat angewiesen sind. In diesem Abschnitt des MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUMS werden insgesamt 18 Versuche angeboten, die sich mit der Anreicherung von Mikroorganismen beschäftigen. Die Versuche sollen an wenigen Beispielen zeigen, wie bei Anreicherungen selektive Bedingungen genutzt werden können und was dabei zu beachten ist. Im ersten Versuch hierzu soll demonstriert werden, dass Mikroorganismen auch über die Luft transportiert werden können und dass unter den sogenannten Luftkeimen pigmentierte Bakterien und Sporenbildner vorherrschen werden. Es folgen Versuche zur Anreicherung von Leuchtbakterien, Myxobakterien und Bakterien, die das violette Pigment Violacein produzieren. Bei Letzteren ist zwischen Vertretern der Gattungen Chromobacterium und Janthinobacterium zu differenzieren. Anschließend sollen in zwei Versuchen endosporenbildende Vertreter der Gattungen Bacillus bzw. Clostridium angereichert werden. Nach der Isolierung von fluoreszierenden Vertretern der Gattung Pseudomonas stehen die Anreicherungen von drei gärenden Bakterien auf dem Programm: Streptococcus salivarius, Leuconostoc mesenteroides und Propionibacterium sp. Die nächsten vier Versuche beschäftigen sich mit Bakterien, die wichtige Beiträge zum Stickstoff-Kreislauf leisten. Es soll zunächst gezeigt werden, wie aerobe N2-fixierenden Bakterien der Gattung Azotobacter bzw. anaerobe N2-fixierende Bakterien der Gattung Clostridium angereichert werden können. Danach sollen chemoli-

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

43

thoautotrophe Nitrifizierer angereichert werden und im letzten Versuch aus diesem Teilblock Denitrifizierer. Die Isolierung von chemolithoautotrophen Knallgasbakterien leitet den nächsten Teilbereich ein. Dieser Abschnitt wird abgeschlossen durch drei Versuche, in denen Bakterien angereichert werden sollen, die wichtige Beiträge zum Schwefelkreislauf leisten. Nachdem der Versuch zur Anreicherung von Mischkulturen mit photolithoautotrophen anoxygenen phototrophen Bakterien in sogenannten Winogradsky-Säulen gelungen ist, sollen erst chemolithoautotrophe schwefeloxidierende Bakterien und dann anaerobe sulfatreduzierende Bakterien angereichert werden.

Anreicherung von Luftkeimen

Versuch 3

Theoretischer Hintergrund Die Atmosphäre ist der einzige Bereich unseres Planeten, in dem sich Mikroorganismen nicht dauerhaft aufhalten und auch nicht vermehren können. Fehlende Nährstoffe, ein i. d. R. nie hinreichend konstant hoher Wassergehalt und ein hoher Anteil von zellschädigender kurzwelliger Ultraviolettstrahlung (UV-Strahlung) des Sonnenlichts sind hierfür verantwortlich. Dennoch können Mikroorganismen z. B. durch Wind oder Ausscheidungen von Vögeln passiv in Aerosolen, an Staubpartikel gebunden oder auch in freier Form in die Atmosphäre gelangen, oder sie werden aktiv als Sporen zwecks Verbreitung in die Atmosphäre geschleudert. Dort halten sie sich dann „zwangsweise“ für eine begrenzte Zeit auf, bevor sie wieder einen aquatischen oder terrestrischen Standort besiedeln.

Die Atmosphäre – ein unwirtlicher Lebensraum

Mikroorganismen können wie andere Organismen natürlich durchaus UV-Strahlung tolerieren. Man braucht hier nur an die Zellen im Luftmyzel von Pilzen oder Bakterien zu denken. Auch ist ein weites Spektrum des sichtbaren Lichts von vielen Mikroorganismen nutzbar, und dessen Verfügbarkeit ist sogar für verschiedene Lebensformen essentiell bzw. hilfreich. Beispiele hierfür sind die anoxygenen und die oxygenen photosynthetischen Bakterien sowie die aeroben phototrophen Bakterien und die Halobakterien. Diese Bakterien nehmen jedoch in der Regel aquatische Standorte ein, oder sie leben an terrestrischen Standorten alleine oder in Symbiose mit anderen Organismen Abb. 3.7. Thymin-Dimer an Oberflächen. Dadurch scheiden Wasserund Nährstoffmangel als das Wachstum dauerhaft begrenzende Faktoren meist aus. Außerdem besitzen alle phototrophen Mikroorganismen neben den Bacteriochlorophyllen bzw. Chlorophyllen noch Carotenoide oder andere Pigmente, die neben ihrer akzessorischen Funktion für die Photosynthese auch eine Schutzfunktion (s. u.) für die Zelle haben. Mikroorganismen, die Licht nutzen können, suchen meist sogar gezielt durch Bewegung das Licht. Die Phototaxis gibt ihnen hierzu die Möglichkeit.

Nutzung von Licht

V18 - S. 99

44

3 Versuche

O

CH3

H3C

HO

CH3

CH3

H3C

CH3

CH3

CH3

H3C

OH

CH3

O Abb. 3.8. Schädigung durch Licht: Thymin-Dimere und Photooxidation

Strukturformel eines typischen Carotinoids (Astaxanthin)

Kurzwelliges UV-Licht kann DNA schädigen, indem es z. B. die photochemische Dimerisierung zweier auf einem Strang benachbart liegender Pyrimidinbasen (z. B. Thymin) induziert. Diese Thymin-Dimere ( Abb. 3.7) verursachen dann Fehler bei der Replikation, die sich dauerhaft in Mutationen manifestieren können. Sichtbares Licht wiederum kann auch dazu beitragen, dass diese Dimere durch einen von mehreren möglichen Reparaturmechanismen rechtzeitig wieder aufgelöst werden. Eine zweite verbreitete Form der Schädigung durch Licht ist sauerstoffabhängig und wird als Photooxidation bezeichnet. Bestimmte lichtabsorbierende Chromophore der Zelle dienen als Photosensibilisatoren, die Sauerstoffmoleküle in einen angeregten Zustand, den Singulett-Sauerstoff überführen. Von diesem Singulett-Sauerstoff geht nun eine Reihe von unkontrollierten, chemischen Reaktionen nicht nur mit Nukleinsäuren, sondern mit verschiedensten Bestandteilen der Zelle aus, die der normale Triplett-Sauerstoff nicht ausführen kann. Dies kann zu massiven Schädigungen der betroffenen Zellen führen, die daraufhin absterben. Carotinoide wirken nicht nur als Radikalfänger, sie reagieren auch mit dem Singulett-Sauerstoff und neutralisieren ihn. Dies erklärt deren wichtige Schutzfunktion für die Zelle und warum unter Luftkeimen besonders häufig durch Carotinoide pigmentierte Bakterien anzutreffen sind. Neben Carotinoiden ( Abb. 3.8) sind noch andere Schutzmoleküle wie z. B. α-Tocopherol (Vitamin E) vorhanden.

Photosensibilisierung

Die Photosensibilisierung kann auch gezielt zur Reduzierung der Keimzahl in Trinkwasser in der Tierzucht und -mast genutzt werden. Hier werden dann Methylenblau oder andere Farbstoffe als Photosensibilisatoren gezielt zugesetzt.

Natürliche Anreicherungskultur

Exponiert man eine Petrischale mit einem sterilen festen Komplexnährboden für einige Minuten ohne Deckel an der Luft und inkubiert diese dann im Dunkeln in einem Brutschrank, werden auf dieser „Fangplatte“ bald Kolonien von Mikroorganismen sichtbar ( Abb. 3.9). Die Kolonien auf diesem Nährboden bieten jedoch ein ganz anderes Abb. 3.9. Petrischalen mit Komplexohne Deckel für 10, 30 und 60 Erscheinungsbild als Kolonien, die nach dem medium, Minuten (von links) an der Luft exponiert Ausstrich aus der Suspension einer Bodenprobe heranwachsen. Es entsteht der Eindruck, als ob die Atmosphäre eine „Anreicherungskultur“ für bestimmte Mikroorganismen darstelle. Je nachdem ob das eingesetzte Nährmedium Bakterien oder Pilzen ein besseres Wachstum ermöglicht, sieht das Erscheinungsbild der Kolonien unterschiedlich aus. Auf Nährböden, die für Bakterien selektiver sind, finden sich auffällig viele bunte Kolonien von pigmentierten Bakterien, die gelb, orange oder rot gefärbt sind. Dies zeigt, dass sich unter den lebensfähigen Keimen überproportional viele Keime befinden, die in starkem Umfang Pigmente bilden können. Meist handelt es sich

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

dabei um Vertreter der Gattungen Corynebacterium, Micrococcus, Mycobacterium, Nocardia und Rhodococcus. Besonders häufig sind gelbe Kolonien von Micrococcus luteus; dieses Bakterium ist im Lichtmikroskop leicht an den in Paketen zusammenhängenden Zellen zu erkennen. In diesen Bakterien ist die Fähigkeit zur Synthese von Carotinoiden verbreitet. Auch werden in der Regel überdurchschnittlich viele aerobe Endosporenbildner der Gattung Bacillus auf diesen Platten zu finden sein. Von Endosporen ist bekannt, dass diese austrocknungs- und strahlungsresistent sind. Ein Vertreter dieser Gattung ist leicht an Hand der Koloniemorphologie zu identifizieren: Bacillus cereus subsp. mycoides bildet Zellfäden, die auf Agarnährböden Pilzkolonien ähneln und rasch den gesamten Nährboden überziehen können ( Abb. 3.10). Auf für Pilze selektiveren Nährböden keimen dann über die Luft verteilte Pilzsporen aus und wachsen zu Kolonien heran. Versuchsziel

Abb. 3.10. Zellfäden von Bacillus cereus subsp. mycoides

Mit diesem sehr einfachen Versuch soll ein Eindruck von der Anzahl und Vielfalt der Mikroorganismen vermittelt werden, die sich in der umgebenden Raumluft befinden. Er demonstriert zudem sehr eindrucksvoll, wie groß die Kontaminationsgefahr durch diese „Luftkeime“ beim Hantieren mit offenen Kulturgefäßen ist, wenn nicht an einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank gearbeitet wird. Als Medium für den Nachweis dient ein Komplexmedium mit Hefeextrakt und Pepton, das zusätzlich als leicht verwertbare Kohlenstoffquelle Glucose enthält.

Versuchsdurchführung benötigtes Material Geräte  Phasenkontrastmikroskop  Objektträger und Deckgläschen

Chemikalien und Medien  PHG-Festmedium ( S. 416)

An einer nicht-zugigen Stelle im Kursraum (wahlweise zu Hause) werden sechs Platten mit PHG-Festmedium platziert. Die Deckel werden entfernt. Nach 1, 2, 5, 10, 20 und 40 min wird jeweils eine Platte wieder mit einem Deckel versehen. Die Platten werden bei 30 °C bebrütet.

Die Anzahl der Kolonien auf den einzelnen Platten wird bestimmt. Die Verschiedenartigkeit der Kolonien (Form, Farbe) wird protokolliert. Material repräsentativer Kolonien wird im Hellfeld und Phasenkontrast mikroskopiert. Weiterführende Literatur Armstrong GA (1997) Genetics of eubacterial carotenoid biosynthesis: A colorful tale. Annual Review of Microbiology 51:629-659 Fraser NJ, Hashimoto H, Cogdell RJ (2001) Carotenoids and bacterial photosynthesis: the story so far…. Photosynthesis Research 70:249-256 Tuite EM, Kelly JM (1993) Photochemical interactions of methylen-blue and analogs with DNA and other biological substrates. Journal of Photochemistry and Photobiology B – Biology. 21:103-124

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V7 - S. 59

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3 Versuche

Nachgefragt 1. Weshalb ist die Atmosphäre nicht als dauerhaftes Habitat für Mikroorganismen geeignet? 2. Wie können Mikroorganismen in die Atmosphäre gelangen? 3. Was versteht man unter „Luftplatten“? 4. Was versteht man unter einer natürlichen Anreicherungskultur? Nennen Sie einige Beispiele! 5. Warum wachsen auf einem Nährboden, der vorübergehend offen an der Luft inkubiert wurde, sehr viele gelb, orange und rot gefärbte Kolonien von Bakterien heran? 6. Welche Pigmente können solche Färbungen hervorrufen? 7. In welchen Bakteriengruppen kommen Pigmente vor, und welche wichtigen Funktionen üben diese Pigmente aus? 8. Zeichnen Sie die chemische Strukturformel von β-Carotin! 9. Nennen Sie zwei Mechanismen mit denen UV-Licht Zellen schädigen kann! 10. Welcher dieser schädigenden Mechanismen ist abhängig von der Anwesenheit von Sauerstoff? 11. Erläutern Sie den Begriff Photooxidation! 12. Was versteht man unter Photosensibilisierung?

Versuch 4

13. In welchen Bereichen nutzt der Mensch die Photosensibilisierung? 14. Welches Bakterium bildet auf festen komplexen Nährböden „gekräuselte“, sich schnell über die gesamte Platte ausbreitende und wie Pilzkolonien aussehende Kolonien? 15. Welche Mikroorganismen überleben den Transport durch die Luft ebenfalls gut und werden dadurch angereichert? 16. Wie erkennen Sie anhand der Zellmorphologie, dass es sich bei einem Mikroorganismus, der auf Luftplatten zu gelben Kolonien herangewachsen ist, wahrscheinlich um einen Stamm von Micrococcus luteus handelt? 17. Nennen Sie möglichst viele positive und negative Wechselwirkungen zwischen Mikroorganismen und Licht! 18. Welche Bakteriengruppen sind essentiell auf das Vorhandensein von Licht zum Wachstum angewiesen? 19. Welche pigmentierten Bakterien können Licht zur Synthese von ATP nutzen, aber nicht autotroph wachsen? 20. Welche Verfahren müssen eingesetzt werden, um die Anzahl der Keime in einer Luftprobe quantitativ ermitteln zu können?

Anreicherung von Leuchtbakterien Theoretischer Hintergrund

Vorkommen von Biolumineszenz

Unter Biolumineszenz wird die Erzeugzung und Entsendung von Licht durch Organismen verstanden, wobei die Aussendung der Lichtquanten durch eine enzymatische Oxidation zustande kommt. Biolumineszenz ist in der Natur weit verbreitet und kommt bei Bakterien, Flagellaten, Pilzen, Schwämmen, Quallen, Würmern, Krebsen, Fischen und Insekten vor. Einige biolumineszierende eukaryontische Organismen sind in Tabelle 3.6 aufgeführt. In einigen Meerestieren ist die Biolumineszenz auf Bakterien zurückzuführen, mit denen diese in einer symbiontischen Beziehung leben. Man spricht von Leuchtorganen, die dem Wirt als Lichtfalle für Beutetiere dienen oder bei der Attraktion von Sexualpartnern eine Rolle spielen. Im Taschenlampenfisch Photoblepharon palpebratus leben die Bakterien unter den Augen in zwei Leuchtorganen extrazellulär in Hauteinstülpungen des Fisches.

Biolumineszenz bei Bakterien

Bei Bakterien ist Biolumineszenz im Wesentlichen auf einige Vertreter aus den Gramnegativen Gattungen Photobacterium und Vibrio beschränkt. Es fällt auf, dass diese Bakterien häufig in marinen Habitaten anzutreffen sind. Alle Vertreter sind fakultativ aerob und zur Gärung ähnlich wie die Enterobakterien fähig. Mit Vibrio cholerae (Erreger der Cholera) sowie Vibrio parahaemolyticus (Erreger von Gastroenteritis) befinden sich in der zuletzt genannten Gattung auch einige bedeutende humanpathogene Bakterien, die selbst aber – abgesehen von sehr wenigen Stämmen von V. cholerae – keine Biolumineszenz aufweisen. Darüber hinaus wurde Biolumineszenz lediglich noch in Photorhabdus luminescens nachgewiesen. In Tabelle 3.6 sind die wichtigsten zur Biolumineszenz befähigten Bakterienspezies aufgelistet.

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen Tabelle 3.6.

Biolumineszenz bei Eukaryonten und Prokaryonten

Eukaryonten Systematischer Name

deutscher Name

Prokaryonten

Aequorea aequorea Cypridina sp. Lampyris noctiluca Latia neritoides Luciola cruciata Oplophorus gracilorostris Phausis splendidula Photinus pyralis Photoblepharon palpebratus Renilla reniformis

Leuchtqualle Muschelkrebs Glühwürmchen Wasserschnecke japanischer Leuchtkäfer (Tiefsee-Garnele) Glühwürmchen Leuchtkäfer Taschenlampenfisch Meeresstiefmütterchen

Photobacterium phosphoreum Photobacterium leiognathi Photorhabdus luminescens Vibrio fischeri Vibrio harveyi Vibrio logei Vibrio orientalis Vibrio splendidus

Biolumineszenz ist ein komplizierter aerober Prozess und beruht auf mehreren Komponenten. In Vibrio fischeri sind die Produkte von insgesamt acht lux Genen involviert ( Tabelle 3.7). Luciferine sind die lichtgebenden Komponenten. Es handelt sich hierbei um Naturstoffe aus unterschiedlichen chemischen Klassen. Luciferine werden durch enzymatische Oxidation in eine aktivierte Form überführt, die unter Lichtabgabe und Einbeziehung zusätzlicher enzymatischer Schritte wieder in ihre ursprüngliche Form zurückkehren. Dabei ist die Quantenausbeute sehr hoch (~90%). Luciferine sind bei Bakterien häufig Aldehyde wie z. B. das Dodecanal. In Vibrio fischeri wird die Oxidation des Luciferins durch das Enzym Luciferase luxAB Untereinheiten der Luciferase katalysiert. Es handelt sich hierbei um eine luxCDE Komponenten des FettsäureMonooxygenase, die Flavinmononucleotid Reduktase-Komplexes (FMN) als Cofaktor enthält. FMN wird luxGH Enzym für Reduktion von Flavin zunächst durch NAD(P)H zu FMNH2 reduluxR Regulatorgen ziert, welches mit Sauerstoff zu einem Peroxiflavin reagiert. Diese Peroxiform oxidiert das Luciferin Dodecanal zu Dodecansäure, wobei wieder die oxidierte Form von FMN entsteht. Durch drei enzymatische Reaktionen des Fettsäure-Reduktase Enzymkomplexes wird aus der Dodecansäure wieder das Dodecanal regeneriert. Der erste Teilschritt, bei dem Dodecansäure in Dodecanyl-CoA überführt wird, benötigt ATP und macht deshalb die Biolumineszenz zu einem strikt ATP-abhängigen Vorgang. Außerdem ist die Biolumineszenz strikt NAD(P)H- und Sauerstoff-abhängig ( Abb. 3.11). Die Wellenlänge und damit Farbe des emittierten Lichts hängt von der chemischen Struktur des Luciferins, der Struktur der Luciferase und möglicherweise weiterer, am Leuchtvorgang beteiligter sekundärer Proteine ab. Tabelle 3.7.

47

lux Gene in Vibrio fischeri

Biolumineszenz wird auch durch andere Systeme ermöglicht. In der Leuchtqualle Aequorea aequorea ist die Biolumineszenz auf das Protein Aequorin und dessen Chromophor 2-Amino-3-benzyl-5-(4-methoxyphenyl)-pyrazin zurückzuführen, welches in Gegenwart von Calcium-Ionen intensiv blau luminesziert. Hier ist darüber hinaus noch das grün fluoreszierende Protein (GFP) an dem Leuchtprozess beteiligt. Da die in den verschiedenen Organismen an der Biolumineszenz beteiligten Gene nur geringe Ähnlichkeiten aufweisen, wird angenommen, dass sich die Biolumineszenz im Laufe der Evolution mehrmals unabhängig voneinander entwickelt hat.

Das LuciferinLuciferaseSystem

O H

C CH2

H2C CH2 H2C CH2 H2C CH2 H2C CH2 H2C CH3 Dodecanal

48

3 Versuche

AMP + PPi

Licht

NADP+

R-CHO

E-FMNH 2

LuxCDE

COOH R-COOH Lux AB

NAD(P)H + H+

LuxAB

O2

ATP E = Luciferase R = Undecylrest

E-FMNH 2

E-FMN LuxGH

NADP+ Abb. 3.11. quorum sensing

CH3 CH2 CH2 C

O

CH2 C O NH O O β-Ketocaprylhomoserinlacton

Anwendungen der Biolumineszenz

NAD(P)H + H+

Reaktionen des Luciferin /Luciferase-Systems in Vibrio fischeri

Eine intensive bakterielle Biolumineszenz ist meist nur dann zu beobachten, wenn die Bakterien in hoher Zelldichte vorkommen. Bei freilebenden Bakterien ist dies selten der Fall. Hohe Zelldichten sind jedoch leicht zu erreichen, wenn die Bakterien dicht gedrängt symbiontisch in den Leuchtorganen höherer Organismen vorhanden sind oder auf einem totem Fisch zu Kolonien heranwachsen. Dieses Phänomen hängt mit der Regulation der Expression der Luciferase durch Autoinduktion zusammen. Vibrio fischeri synthetisiert den Autoinduktor β-Ketocaprylhomoserinlacton und scheidet diesen aus. Dieser Autoinduktor vermag an das Regulatorgen luxR zu binden, welches erst dann die Transkription der lux Gene einschalten kann. Die Konzentration des Autoinduktors muss jedoch einen bestimmten Schwellenwert überschreiten bevor er wirksam werden kann. Da die Konzentration des Autoinduktors im Medium in etwa zur Zelldichte proportional ist, tritt Biolumineszenz erst dann auf, wenn eine bestimmte Zelldichte erreicht ist. Dadurch wird erreicht, dass die energieaufwendige Biolumineszenz nur dann betrieben wird, wenn überhaupt genügend wahrnehmbares Licht produziert werden kann; die von einer Einzelzelle ausgeführte Biolumineszenz würde wahrscheinlich unsichtbar bleiben. Das dieser Regulation zu Grunde liegende Prinzip wird als quorum sensing bezeichnet und wurde im Zusammenhang mit der Biolumineszenz entdeckt. Mittlerweile gibt es zahlreiche weitere Beispiele für quorum sensing. Die lux-Gene, das Enzym Luciferase, und andere an Leuchtvorgängen beteiligte Proteine haben der Biolumineszenz zu zahlreichen praktischen Anwendungen verholfen. Da die Reaktion der Luciferase strikt ATP-abhängig ist und die emittierten Lichtquanten leicht messtechnisch erfasst werden können, bietet dieses System die Möglichkeit für einen empfindlichen quantitativen Nachweis von ATP. Weiterhin wurden Verfahren entwickelt, um über den sehr empfindlichen Nachweis von ATP in komplexen Umweltproben die vorhandene Biomasse quantitativ zu bestimmen. Dies geschieht unter der Annahme, dass der Gehalt von ATP proportional zur Biomasse ist.

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

49

Darüber hinaus werden die lux Gene aus Glühwürmchen und Bakterien als Reportergene zum Nachweis der Expression von Genen in Regulationsstudien eingesetzt. Noch verbreiteter ist mittlerweile der Einsatz eines grün fluoreszierenden Proteins (GFP) aus der Leuchtqualle und ähnlicher Proteine aus anderen Quellen im biochemisch- und molekularbiologisch-analytischen Bereich. Versuchsziel Ausgehend von einer natürlich angereicherten Gemeinschaft von Leuchtbakterien, die sich nach einigen Tagen gut sichtbar auf Frischfisch entwickelt, sollen Vertreter dieser auffälligen Bakteriengruppe auf Festmedium isoliert werden. Versuchsdurchführung benötigtes Material Geräte      

Kühlschrank, -raum (4 °C) Große Glaspetrischale Impföse Alufolie o. ä. Phasenkontrastmikroskop Objektträger und Deckgläschen

Chemikalien und Medien  Seewasser oder 5 % (wt/vol) NaCl  Seesalz-Festmedium ( S. 414)

Sonstiges  Möglichst fangfrischer Seefisch (Knurrhahn o. ä.)

Beim Kauf des Fischs sollte auf Frische geachtet werden (wenn möglich, direkt am Fischkutter kaufen). Der Transport des Fischs und die Lagerung bis zur Verwendung sollten unter Kühlung (Eisbeutel, Kühlakku) erfolgen. Die Hautoberfläche des Fischs sollte wenig berührt werden, um Kontaminationen zu minimieren. Ansetzen der Anreicherungskultur: Ein möglichst frischer Fisch wird mit der Hautoberfläche nach oben in eine große Glaspetrischale gelegt. Die Petrischale wird so weit mit Seewasser oder 5 % (wt/vol) NaCl gefüllt, bis die Haut etwa zur Hälfte bedeckt ist. Die Schale wird mit Aluminiumfolie (o. ä.) abgedeckt und im Kühlschrank (4 °C) (wenn vorhanden Kühlraum) ruhig stehend inkubiert. Im Dunkeln wird die Hautoberfläche des Fischs nach grünlich leuchtenden Bereichen abgesucht. Damit das Leuchten erkennbar wird, müssen die Augen vorher für einige Minuten an die Dunkelheit adaptiert werden. Mit Hilfe einer vorher abgeflammten Impföse (alternativ: sterilisiertes Wattestäbchen) wird im Dunkeln etwas Material von den leuchtenden Stellen entnommen und per Kreuzausstrich (M4, S. 365) auf SeesalzFestmedium vereinzelt. Die Platten werden im Kühlschrank inkubiert.

Die Platten werden im Dunkeln inspiziert. Material leuchtender Kolonien wird per Drei-Strich-Ausstrich ( M4, S. 365) auf Seesalz-Festmedium ausgestrichen. Die Platten werden im Kühlschrank inkubiert. Tipp: Statt eines herkömmlichen Reinigungsausstrichs lassen sich mit der Impföse auch andere Motive (Bildchen, Redewendungen, Grußadressen, Gute Wünsche; eine Anregung ist in Abb. 3.12 dargestellt) auf das FestAbb. 3.12. Weihnachtsgrüße, wie sie Prof. Hans-Günter Schlegel mit Hilfe von Vibrio fischeri verschickt

Vorbereitungen

50

3 Versuche

medium bringen; hierzu sollte man unbedingt von in Saline suspendierten Zellen ausgehen. Durch Bewuchs entstehen auf diese Weise sehr schöne lebende „Kunstobjekte“, die jeden unvorbereiteten Betrachter in Begeisterung versetzen. Die erhaltenen Reinkulturen werden im Dunkeln betrachtet. Eine abschließende Mikroskopie unter Phasenkontrast rundet diesen Versuch wissenschaftlich ab. Weiterführende Literatur Dunlap PV, Kita-Tsukamoto K (2001) Luminous Bacteria. In: Dworkin M (ed) The Prokaryotes (elektronische Version: http://link.springer.de/link/service/books/10125, Release 3.6 vom 22.6.2001) Springer, New York Kricka LJ, Voyta, JC, Bronstein I (2000) Chemiluminescent methods for detecting and quantitating enzyme activity. Methods in Enzymology 305:370-390 Wilson T, Hastings JW (1998) Bioluminescence. Annual Review of Cell and Developmental Biology 14:197230

Nachgefragt 1. In welchen eukaryontischen Organismen kommt Biolumineszenz vor? 2. Was sind „Leuchtorgane“ (z. B. in Fischen), und welche Funktion haben diese? 3. Nennen Sie die beiden wichtigsten Bakteriengattungen, in denen zur Biolumineszenz befähigte Vertreter vorkommen! 4. Welche stoffwechselphysiologischen Eigenschaften zeichnen diese Bakterien aus? 5. Definieren Sie den Begriff „Luciferin“! 6. Zeichnen Sie die chemische Strukturformel des Luciferins von Vibrio fischeri! 7. Konsultieren Sie wissenschaftliche Übersichtsartikel und das Internet und stellen Sie eine Übersicht über die bekannten Luciferine zusammen! 8. Welche biochemischen Reaktionen katalysiert das Enzyme Luciferase in Vibrio fischeri? Schreiben Sie die Reaktionsgleichung des Enzyms auf! 9. Wie wird bei der Biolumineszenz in Vibrio fischeri das freigesetzte Licht erzeugt? 10. Durch welche enzymatische Reaktion wird bei der Biolumineszenz in Vibrio fischeri ATP verbraucht?

11. Wie wird die Expression der lux Gene in Vibrio fischeri reguliert? 12. Zeichnen Sie die chemische Strukturformel des Autoinduktors, der in Vibrio fischeri an der Regulation der Biolumineszenz beteiligt ist! 13. Welche Faktoren haben einen Einfluss auf die Farbe (also die Wellenlänge) des bei der Biolumineszenz freigesetzten Lichts? 14. Warum ist Biolumineszenz durch freilebende Bakterien kaum wahrnehmbar? 15. Was versteht man unter quorum sensing? 16. Wie kann die Luciferase zur Bestimmung der Zellzahl eingesetzt werden? 17. Nennen Sie andere Anwendungen des Enzyms Luciferase bzw. der lux Gene! 18. Machen Sie sich klar, wie Reportergene in der molekularbiologischen Forschung eingesetzt werden! 19. Welches in der Molekularbiologie und Zellbiologie häufig eingesetzte Protein wurde aus der Leuchtqualle Aequorea aequorea isoliert? 20. Welche Befunde sprechen dafür, dass sich Biolumineszenz im Verlauf der Evolution mehrfach unabhängig voneinander entwickelt hat?

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

Anreicherung von Myxobakterien

51

Versuch 5

Theoretischer Hintergrund

Abb. 3.13. Typische Fruchtkörper eines Myxobakteriums Tabelle 3.8. Besondere Eigenschaften der Myxobakterien • • • • • • • • •

Einzellig Gram-negativ den δ-Proteobakterien zugehörig Stäbchenförmige, vegetative Zellen Keine Geißeln Durch Gleiten beweglich Ausbildung von Fruchtkörpern Bildung von Myxosporen Durch Carotinoide gelb bis rot gefärbt

O S

H

Myxobakterien sind einzellige, stäbchenförmige und Gram-negative zu den δ-Proteobakterien gehörende Bakterien, die über einen komplizierten einzigartigen Lebenscyclus verfügen und sogenannte Fruchtkörper mit Myxosporen ausbilden können ( Abb. 3.13). Die Zellen ernähren sich bevorzugt von abgestorbenem organischem Material oder von anderen Bakterienzellen. In Kontakt mit Oberflächen sind sie beweglich, allerdings nicht durch Geißelbewegung, sondern durch Gleiten. Myxobakterien sind meist gelb bis rot gefärbt. Diese Färbung ist meist auf glycolisierte Carotinoide zurückzuführen, welche die Zellen vor schädlicher Lichteinwirkung schützen ( Tabelle 3.8). Bisher sind keine human-, tier- oder pflanzenpathogenen Myxobakterien bekannt. Obwohl zur Zeit noch kein Myxobakterium in einem biotechnologischen Prozess eingesetzt wird, ist das biotechnologische Potential dieser Bakteriengruppe als sehr hoch einzustufen. Sie verfügen über einen sehr ausgeprägten Sekundärstoffwechsel ( Abb. 3.14) und synthetisieren viele auch antibiotisch wirksame Substanzen sowie Verbindungen, die zur Tumortherapie oder zur Virusbekämpfung eingesetzt werden könnten. Darüber hinaus scheiden diese Bakterien bedingt durch Ihre Lebensweise viele Polymere spaltende Enzyme aus, von denen einige möglicherweise für technische Anwendungen interessant sind.

Myxobakterien kommen in den obersten Schichten von Böden, auf den Ausscheidungen von pflanzenfressenden Tieren H3C CH3 O (z. B. Hasenköttel, Pferdeäpfel, Kuhfladen), CH3 sich zersetzendem Pflanzenmaterial OH O O sowie auf der Borke von lebenden oder Abb. 3.14. Strukturformel des Sekundärabgestorbenen Bäumen vor. Myxobakterien metaboliten Epothilon aus einem bauen dort u. a. vorhandene Polysaccharide Myxobakterium wie z. B. Cellulose oder Stärke durch extrazelluläre Enzyme ab und haben in ihren natürlichen Habitaten eine große Bedeutung für den Kohlenstoffkreislauf (1.4.1, S. 11). Auch Bakterienrasen dient als Nahrungsquelle und werden von Myxobakterien „abgeweidet“. Myxobakterien sind obligat aerobe, chemoorganotrophe Bakterien und kommen an anaeroben Standorten nicht vor. Bei erhöhter Salzkonzentration oder bei einem pH unter 5,5 können Myxobakterien grundsätzlich nicht wachsen. H3C

N

CH3

H3C

OH

Eigenschaften der Myxobakterien

Vorkommen und Stoffwechsel

52

3 Versuche Fruchtkörperbildung

Myxobakterien sind durch einen einzig- Tabelle 3.9. Gattungen der artigen Lebenscyclus gekennzeichnet. Sind Myxobakterien genügend Nährstoffe vorhanden und herrschen auch sonst Bedingungen, die ein • Angiococcus • Melittangium Wachstum ermöglichen, vermehren sich die • Archangium • Myxococcus • Chondromyces • Nannocystis stäbchenförmige Zellen in einem vegetati• Corallococcus (frü• Polyangium ven Cyclus durch Querteilung, wie dies für her Chondrococcus) • Sorangium Prokaryonten typisch ist. Bei Nährstoffman• Cystobacter • Stigmatella gel setzen jedoch Veränderungen ein, und • Haploangium durch gleitende Bewegung beginnen Tausende von vegetative Zellen aufeinander zuzuwandern und einen Zellhaufen zu bilden. In dem immer größer werdenden Zellhaufen beginnt nun eine Differenzierung der Zellen, und es kommt zur Ausbildung eines Fruchtkörpers. Bei diesen Vorgängen spielen von den Zellen ausgeschiedene Signalsubstanzen eine große Rolle. Diese Fruchtkörper bestehen bei einigen Gattungen (z. B. Melittangium, Stigmatella) aus einem Stiel und einem Kopf, bei anderen lediglich aus einem Kopf (z. B. Archangium, Cystobacter). Der Stiel enthält im Wesentlichen Schleim und auch einige vegetative Zellen. Die meisten Zellen befinden sich jedoch im Kopf des Fruchtkörpers und wandeln sich in Myxosporen um. Die Myxosporen können dabei in einem einzigen oder in mehreren Sporangien vorkommen. Ein Fruchtkörper kann ca. 1 Milliarde Zellen enthalten und einen Durchmesser von bis zu 0,5 mm besitzen. Durch den Stiel kann der gesamte Fruchtkörper eine Größe von ca. 1 mm erreichen. Damit sind Fruchtkörper häufig mit bloßem Auge erkennbar. Es gibt aber auch Myxobakterien, die wesentlich kleinere Fruchtkörper bilden. Durch die gelbe bis rote Pigmentierung sind diese bei aufmerksamer Suche auf den Substraten eigentlich nicht zu übersehen. Besonders eindrucksvoll erscheinen die Fruchtkörper bei der Betrachtung mit einer Stereolupe.

Klassifizierung

Die Form der Fruchtkörper ist ebenso wie Form und Anzahl der Sporangien ein wichtiges Kennzeichen zur Klassifizierung der Myxobakterien. Die zur Zeit gültige taxonomische Klassifizierung der ca. 40 Spezies in zwölf Gattungen basiert immer noch nahezu ausschließlich auf morphologischen Eigenschaften ( Tabelle 3.9).

Myxosporen

Myxosporen gehen durch einen Zelldifferenzierungsprozess direkt aus den vegetativen Zellen hervor und sind von einer mehr oder weniger dicken Kapsel umgeben. Da die Fruchtkörperbildung meist erst bei Nährstoffmangel induziert wird, dienen die Myxosporen wahrscheinlich auch dazu, längere Zeiten ohne Wachstum zu überdauern und insbesondere Trockenperioden zu überstehen. Aus getrockneten Proben konnten selbst nach 15 Jahren noch vermehrungsfähige Myxobakterien isoliert werden. Myxosporen sind auch deutlich resistenter gegenüber UV-Strahlung und Hitze als die entsprechenden vegetativen Zellen. Dipicolinsäure ist in den Myxosporen nicht nachweisbar, und das Ausmaß der Hitzeresistenz ist nicht mit dem der Endosporen der Gattung Bacillus zu vergleichen. Unter Wachstum und Vermehrung ermöglichenden Bedingungen keimen die Myxosporen zu vegetativen Zellen aus und vermehren sich im vegetativen Zellcyclus, bis die nächste Fruchtkörperbildung induziert wird.

Gleitende Bewegung

Nicht bei allen beweglichen Bakterien beruht die Mobilität auf Geißeln. Viele, phylogenetisch nicht verwandte Bakterien können sich durch Gleiten fortbewegen; lediglich bei den Archaea wurde diese Art der Fortbewegung bisher nicht beobachtet. Unter Gleiten versteht man das Fortbewegen von Zellen entlang der Längsachse der Zellen auf einer Oberfläche. Offensichtlich gibt es unterschiedliche Mechanismen, die diese Art der Fortbewegung ermöglichen. Allerdings beginnt man erst, diese Mechanismen zu verstehen. In Myxococcus xanthus ist das Gleiten auf zwei völlig verschiedene Mechanismen zurückzuführen. Bereits frühzeitig wurde angenommen, dass die gleitende

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

Bewegung auf eine gerichtete Schleimausscheidung zurückzuführen ist. Einer der bei M. xanthus vorkommenden Mechanismen scheint tatsächlich auf der Ausscheidung von enormen Mengen eines Exopolysaccharides zu beruhen und ist für die Fortbewegung von Einzelzellen auf Oberflächen verantwortlich. Der zweite Mechanismus ist dagegen abhängig von den Typ IV Pili und erlaubt eine gemeinschaftliche Bewegung von Zellen in Schwärmen, wie dies vor der Ausbildung der Fruchtkörper beim Sammeln in den Zellhaufen und der Differenzierung der Zellhaufen zu Fruchtkörpern der Fall ist. Die Pili interagieren an ihren Enden mit spezifischen Bindungsstellen an der Oberfläche benachbarter Zellen. Durch Verkürzung und Ausdehnung der Pili kann es zu einer Veränderung der relativen Lage und damit zur Bewegung der Zelle kommen. Versuchsziel Die Anreicherung von Myxobakterien geht von Standortmaterial aus, dem man sich natürlicherweise nicht gern nähert (Kaninchenköttel, Kuhfladen, Pferdeäpfel), dessen Verwendung aber nach Überwinden des anfänglichen Ekels am Ende des Versuchs mit der Entwicklung von wunderschönen Kolonieformen (Fruchtkörper) belohnt wird. Ziel des Versuchs ist es daher in erster Linie, einen ersten Eindruck von der Formenvielfalt unter den Bakterien zu vermitteln und die Begeisterung für die Morphologie der Mikroorganismen zu wecken. Versuchsdurchführung benötigtes Material Geräte  Binokular / Stereolupe  Stereomikroskop  „Feuchte Kammer“ (z. B. großes, verschließbares Becherglas mit Wassergetränktem Fließpapier o. ä.)  Impföse  Bunsenbrenner

Chemikalien und Medien  Myxobakterien-Festmedium ( S. 422)  Wasser-Festmedium ( S. 428)  Cycloheximid

Sonstiges  Kaninchenköttel, Kuhfladen oder Pferdemist (möglichst einige Tage alt)

Ansetzen der Anreicherungskultur: Auf die Mitte von Platten mit MyxobakterienFestmedium werden kleine Stückchen (ca. 0,5 cm Kantenlänge) des Standortmaterials ausgelegt. Empfehlenswert ist die Verwendung eines Fungizids zur Unterdrückung von störendem Pilzwachstum. Dazu streut man etwas (kleine Spatelspitze) Cycloheximid über die Probe. Die Platten werden in einer „feuchten Kammer“ bei Raumtemperatur inkubiert. In der folgenden Zeit sollte in regelmäßigen Abständen (etwa alle drei Tage) mit dem Binokular oder der Stereolupe die Oberfläche des an das Standortmaterial angrenzenden Festmediums auf die Ausbildung von Bakterienschwärmen, „Schleimspuren“, Abbau der im Festmedium eingebetteten Hefezellen (Klärungszonen) und vor allem auf die Ausbildung von ersten Fruchtkörperchen abgesucht werden.

Die Entwicklung der Myxobakterien auf dem Festmedium dauert erfahrungsgemäß unterschiedlich lange. Die im Folgenden angegebenen Versuchszeiträume sind daher nur als vage Anhaltspunkte für die zeitliche Planung anzusehen. Aus Randbereichen von Schleimspuren oder Bakterienschwärmen, die oft gelb, braun oder rot gefärbt sind und sich meist fächer- oder ringförmig ausbreiten, wird mit der Impföse etwas Material abgenommen und per Kreuzausstrich (M4, S. 365) auf Myxobakterien-Festmedium vereinzelt. Die Platten werden bei Raumtemperatur inkubiert.

53

54

3 Versuche

Es wird ein Reinigungsausstrich auf Myxobakterien-Festmedium durchgeführt (DreiStrich-Ausstrich, M4, S. 365). Die Platten werden bei Raumtemperatur inkubiert. Induktion der Fruchtkörperbildung: Von Reinkulturen wird viel Koloniematerial mit der Impföse abgenommen und auf Wasser-Festmedium ausgestrichen. Unter diesen Mangelbedingungen kommt es bei den Isolaten nach einigen Tagen Inkubation bei Raumtemperatur zur Entwicklung von Fruchtkörperchen, deren Dokumentation im Versuchsprotokoll die zeichnerischen Fähigkeiten des Experimentators auf das Angenehmste herausfordern wird. Weiterführende Literatur Dawid W (2000) Biology and global distribution of myxobacteria in soils. FEMS Microbiology Reviews 24:403-427 Kaiser D (1998) How and why myxobacteria talk to each other. Current Opinion in Microbiology 1:663-668 Mattick JS (2002) Type IV pili and twitching motiliy. Annual Review of Microbiology 56:289-314 Merz AJ, Forest KT (2002) Bacterial surface motility: slime trails, grappling hooks and nozzles. Current Biology 12:R297-R303 Reichenbach H (1999) The ecology of the myxobacteria. Environmental Microbiology 1:15-21 Reichenbach H, Dworkin M (1999) The Myxobacteria. In: Dworkin M (ed) The Prokaryotes (elektronische Version: http://link.springer.de/link/service/books/10125, Release 3.0 vom 21.5.1999) Springer, New York

Nachgefragt 1. Nennen Sie besondere Eigenschaften der Myxobakterien! 2. Wo kommen Myxobakterien in der Natur vor? 3. Nach welchen Kriterien werden Myxobakterien taxonomisch klassifiziert? 4. Welche Gattungen gehören zu den Myxobakterien? 5. Was versteht man unter den Fruchtkörpern der Myxobakterien? 6. Suchen Sie im Internet nach farbigen Abbildungen von Fruchtkörpern verschiedener Myxobakterien! 7. Beschreiben Sie, wie die Bildung der Fruchtkörper ausgelöst wird und wie sie erfolgt! 8. Wie vermehren sich die Myxobakterien im vegetativen Cyclus? 9. Berechnen Sie, wie viele Myxosporen mit einem Durchmesser von ca. 2 μm in einem nur aus einem Sporangium bestehenden Fruchtkörper mit einem Durchmesser von 0,5 mm ungefähr Platz haben! 10. Wie unterscheidet sich eine Myxospore von einer vegetativen Zelle?

11. Wie unterscheiden sich Myxosporen von Endosporen? 12. Welche anderen interessanten Dauerformen sind bei Bakterien bekannt? 13. Durch welche Pigmente sind Myxobakterien gelb bis rot gefärbt? 14. Erklären Sie die beiden für die gleitende Bewegung vorgeschlagenen Mechanismen! 15. Konsultieren Sie Lehrbücher der Mikrobiologie und erstellen Sie eine Liste derjenigen Bakterien, die sich ebenfalls noch durch Gleiten fortbewegen können! 16. Was ist Cycloheximid und welche Wirkung geht von dieser Verbindung aus? 17. Weshalb setzt man Cycloheximid gerade bei der Anreicherung von Myxobakterien ein? 18. Erläutern Sie den Beitrag der Myxobakterien zum Kohlenstoffkreislauf! 19. Welche Enzyme müssen Myxobakterien besitzen, um ihrer besonderen Lebensweise nachkommen zu können? 20. Welche interessanten anderen Produkte synthetisieren Myxobakterien?

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

55

Anreicherung und Isolierung von Violacein-produzierenden Stämmen der Gattungen Chromobacterium und Janthinobacterium

Versuch 6

Theoretischer Hintergrund Auf sterilisierten Reiskörnern können aus Bodenproben relativ leicht Bakterien angereichert werden, die violett und manchmal auch rot gefärbte Kolonien bilden. Es handelt sich hierbei meist um Vertreter der Chromobacterium und Gattungen Janthinobacterium. In diesem Versuch sollen Vertreter dieser Gattungen angereichert werden, die in Gegenwart von Tryptophan violett bis dunkelblau erscheinende Kolonien bilden. Die Färbung ist auf das Pigment Violacein zurückzuführen. Es handelt Abb. 3.15. Typische, lederartige Koloniesich um Gram-negative, der Gruppe der struktur von Janthinobacterium sp. β-Proteobakterien zugehörige Bakterien. Bei der taxonomischen Zuordnung von Stämmen zu den Gattungen Chromobacterium und Janthinobacterium hatte es in der Vergangenheit immer wieder Probleme und Konfusionen gegeben, die auch durch das Vorkommen des Pigments verursacht wurden. Die moderne polyphasische Taxonomie einschließlich der 16S rRNA-Gensequenzierung hat jedoch gezeigt, dass beide Gattungen weniger verwandt sind als zunächst angenommen, und nur aus historischen Gründen werden heute beide noch meist zusammen behandelt. Mittlerweile kann mit relativ einfachen Tests eindeutig zwischen den Vertretern beider Gattungen unterschieden werden ( Tabelle 3.10). Zudem kann durch die Wahl der Temperatur bei der Anreicherung vorbestimmt werden, Vertreter welcher Gattungen sich in der Anreicherung durchsetzen sollen. Stämme der Spezies Chromobacterium violaceum wurden bisher am detailliertesten untersucht. Obwohl die Bildung von Violacein kein obligates Kriterium für diese Spezies ist und es auch einige Stämme dieser Art gibt, die dieses Pigment nicht synthetisieren können, ist es bei den meisten Vertretern vorhanden. C. violaceum kommt im Boden und im Wasser vor, und in tropischen und subtropischen Regionen sind einige opportunistisch pathogene Stämme bekannt, die bei Mensch und Tier durchaus sehr virulent sein können. C. violaceum bildet auf Glucose-Tryptophan-Mineral-AgarplatTabelle 3.10. Wichtige Unterschiede zwischen Vertretern der Gattungen Chromobacterium und Janthinobacterium Eigenschaften Wachstum bei 4 °C Wachstum bei 37 °C Strikt aerob Fakultativ aerob Produktion von Cyanid Hydrolyse von Aesculin Hydrolyse von Casein Säurebildung aus Trehalose Säurebildung aus Arabinose

Chromobacterium

Janthinobacterium

+ + + + + -

+ + + +

Blaue Kolonien

56

3 Versuche

ten schöne Kolonien, die intensiv violett gefärbt sind und mit zunehmendem Alter eine immer stärker gekräuselte Oberfläche bilden. Alte Kolonien weisen fast eine lederartige Konsistenz auf, und es ist schwierig, von diesen eine homogene Zellsuspension herzustellen ( Abb. 3.15). Dies ist auf das Vorkommen eines Exopolysaccharides zurückzuführen, dessen genaue chemische Struktur noch nicht aufgeklärt wurde. Violacein ( Abb. 3.16) wird nur von sehr H wenigen Bakterien synthetisiert und ist bei N O einigen für die violette Koloniefarbe verantwortlich. Hierzu gehören vor allem Chromobacterium violaceum und Janthinob- HO acterium lividum und andere Vertreter dieser Gattungen. Daneben wird Violacein ledigO N N lich noch von einem Vertreter der Gattung H H Iodobacter sowie einigen Stämmen aus der Gattung Alteromonas gebildet. C. violaceum Abb. 3.16. Strukturformel von Violacein synthetisiert Violacein ausschließlich dann, aus Chromobacterium violaceum wenn das Medium Tryptophan enthält. Wie anhand der chemischen Struktur Tabelle 3.11. Absorptionsmaxima von unschwer zu erkennen ist, handelt es sich bei Violacein in verschiedenen Lösungsmitteln diesem Farbstoff um ein Indolderivat, welWellenlänge ches sich von Tryptophan ableitet. Ein Lösungsmittel anderes Indolderivat (Indigo) wird im 575 nm; 375 nm MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM ebenfalls Ethanol Schwefelsäure 690 nm; 645 nm; 405 nm noch vorgestellt werden. Violacein ist wasserunlöslich und kann mit Ethanol aus den Zellen extrahiert werden. Es weist Absorptionsmaxima bei 579 und 430 nm auf. Nach Zugabe von 10 % (vol/vol) Schwefelsäure verändert sich die Farbe des Pigments nach grün mit einem Absorptionsmaximum bei 690 nm, während die Zugabe von 10 % (wt/vol) NaOH die Farbe des Pigments über grün nach rotbraun verändert ( Tabelle 3.11).

Violacein

V25 - S. 131

Violacein hat antibiotische Eigenschaften, und es geht auch eine Antitumor-Wirkung von diesem Pigment aus. Neben der Synthese von Violacein ist C. violaceum noch in vielerlei Hinsicht biotechnologisch interessant: Es produziert Antibiotika wie Aerocyanidin und Aerocavin sowie ein Monobactam-Antibiotikum und weitere antibiotisch wirksame Substanzen. Dem aufmerksamen Experimentator wird nicht entgehen, dass den Petrischalen, in denen dieses Bakterium kultiviert wird, beim Abheben des Deckels der Geruch nach Bittermandeln entweicht. Es handelt sich um Blausäure, welche von diesen Bakterien in großen Mengen produziert werden kann und Grundlage für ein Verfahren zur biotechnologischen Laugung von Gold ist. Außerdem kann der Homopolyester Poly(3-hydroxyvalerat) leicht und in großen Mengen mit C. violaceum aus Valeriansäure hergestellt werden. Biologisch abbaubare Polyester auf der Basis von Hydroxyfettsäuren werden im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM in mehreren Versuchen behandelt.

Biotechnologische Bedeutung

V32 - S. 161 V33 - S. 167

V40 - S. 202

O O n

P oly 3 H ( V)

Versuchsziel Im ersten Teil des Versuchs wird die Anreicherung und Isolierung von pigmentierten Isolaten beschrieben; Ausgangsmaterial ist frische Gartenerde. Als zu besiedelnder Mikrostandort werden den Zellen zu Beginn der Anreicherung Reiskörner angeboten, auf denen sich die charakteristisch gefärbten Kolonien entwickeln. Der abschließende Teil der Anreicherung beschäftigt sich mit der Charakterisierung der isolierten Stämme inklusive der Zuordnung zu den Gattungen Chromobacterium und Janthinobacterium

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

57

sowie mit der Isolierung und Charakterisierung des von den Isolaten produzierten wasserunlöslichen Farbstoffs Violacein. Versuchsdurchführung benötigtes Material Geräte       

Petrischalen Stereomikroskop Phasenkontrastmikroskop Impföse Bunsenbrenner Reagenzglasschüttler Laborzentrifuge für Glaszentrifugenröhrchen (3.000 bis 4.000 × g)

Chemikalien und Medien  GYT-Festmedium ( S. 415)  Cycloheximid  Ethanol (96 %, wt/vol)

Sonstiges  Reiskörner, poliert  Frische Gartenerde

Ansetzen der Anreicherungskultur: Der Boden einer Petrischale wird mit frischer Gartenerde bedeckt. Darauf werden zehn bis 20 Reiskörner verteilt. Empfehlenswert ist hier wie auch im vorhergehenden Versuch ( V5, S. 51) die Verwendung eines Fungizids zur Unterdrückung von Pilzen: Etwas Cycloheximid wird über die Erde und die Reiskörner gestreut. Die Erde wird nun mit so viel Leitungswasser benetzt, bis diese gut angefeuchtet ist. Die mit Deckel versehene Petrischale wird bei Raumtemperatur inkubiert. In der folgenden Zeit wird täglich die Oberfläche der Reiskörner auf violette Verfärbung untersucht. Die Entwicklung von violetten Zonen, die auf die Anwesenheit der gesuchten Bakterien deutet, braucht erfahrungsgemäß unterschiedlich lange Zeit. Die im Folgenden angegebenen Versuchstage können daher um mehrere Tage abweichen.

Aus den deutlich violett gefärbten Bereichen von Reiskörnern wird unter dem Stereomikroskop mit der Impföse vorsichtig etwas Material entnommen und per Kreuzausstrich (M4, S. 365) auf GYT-Festmedium ausgestrichen. Die Platten werden bei Raumtemperatur inkubiert. Ausgehend von deutlich gefärbten Kolonien werden jeweils aus Saline-Suspensionen Reinigungsausstriche parallel auf drei Platten mit GYT-Festmedium durchgeführt (Drei-Strich-Ausstrich, M4, S. 365). Die Platten werden bei Raumtemperatur, bei 4 °C und bei 37 °C inkubiert. Beim Vorliegen von Reinkulturen wird zunächst etwas Koloniematerial im Phasenkontrast mikroskopiert (M8, S. 373). Zur Bestimmung der Zugehörigkeit der Isolate zu den Gattungen Chromobacterium und Janthinobacterium kann zunächst das Wachstum auf den unter den unterschiedlichen Temperaturen inkubierten Festmedien herangezogen werden: Während Angehörige beider Gattungen bei Raumtemperatur (20 °C) gut wachsen, gedeihen bei 4 °C bzw. 37 °C nur jeweils Vertreter einer der beiden Gattungen ( Tabelle 3.10). Zur Absicherung dieses Ergebnisses eignet sich das in Methode 14 beschriebene Identifizierungssystem API20NE. Hierbei sind insbesondere die Ergebnisse der Fermentation von Glucose, der Verwertung von Arabinose und Maltose sowie der Hydrolyse von Aesculin zur Differenzierung geeignet ( Tabelle 3.10).

Charakterisierung der Isolate

Dazu wird das Zellmaterial von einer großen, gut gefärbten Kolonie in ca. 3 ml Ethanol suspendiert und dabei kräftig geschüttelt. Die Zellen werden durch eine 15 min Zentrifugation (3.500 × g) vom gefärbten Überstand abgetrennt. Mit dem Überstand kann das erste Absorptionsspektrum aufgenommen werden. Ein bis zwei Tropfen des ethanolischen Überstands werden in 2 ml 25 % (vol/vol) Schwefelsäure gegeben; von dieser

Isolierung von Violacein und Aufnahme eines Absorptionsspektrums

58

3 Versuche

grün gefärbten Lösung wird das zweite Spektrum aufgenommen. Beide Absorptionsspektren werden in Glasküvetten im Bereich zwischen 300 und 700 nm gegen Ethanol bzw. verdünnter Schwefelsäure aufgenommen. Dabei sollten sich charakteristische Peaks ergeben ( Tabelle 3.11). Aktuelle Übersichtsliteratur Duran N, Menck CFM (2001) Chromobacterium violaceum: A review of pharmacological and industrial perspectives. Critical Reviews in Microbiology 27:201-222 Gillis M, De Ley J (1999) The genera Chromobacterium and Janthinobacterium. In: Dworkin M (ed) The Prokaryotes (elektronische Version: http://link.springer.de/link/service/books/10125, Release 3.0 vom 21.5.2001) Springer, New York Rettori D, Duran N (1998) Production, extraction and purification of violacein: an antibiotic pigment produced by Chromobacterium violaceum. World Journal of Microbiology & Biotechnology 14:685-688

Nachgefragt 1. Beschreiben Sie, wie Sie im Versuch Vertreter der Gattungen Chromobacterium und Janthinobacterium angereichert haben! 2. Welche Bakterien synthetisieren das Pigment Violacein? 3. Beschreiben Sie Struktur und Eigenschaften von Violacein und wie Sie das Pigment eindeutig identifizieren können! 4. Was ist Cycloheximid und wie entfaltet es seine Wirkung? 5. Von welchem Intermediat des Stoffwechsels leitet sich die Biosynthese von Violacein ab? 6. Nennen Sie ein anderes Stoffwechselprodukt, das sich von diesem Intermediat ableitet und das auch im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM behandelt wird! 7. Worin muss die Ursache dafür liegen, dass Violacein ausschließlich dann gebildet wird, wenn dem Medium Tryptophan zugegeben wird? 8. Durch welche natürlich vorkommenden Substanzen könnten Sie Tryptophan ersetzen, um Kolonien von Chromobacterium violaceum mit Violacein zu erhalten? 9. Welche anderen Pigmente kommen in Mikroorganismen vor? 10. Beschreiben Sie, wie Sie mit einfachen physiologischen Tests zwischen Stämmen der Spezies Chromobacterium violaceum und solchen der Spezies Janthinobacterium lividum diskriminieren können!

11. Wie unterscheiden sich Vertreter der Gattungen Chromobacterium und Janthinobacterium bezüglich des Verhältnisses zum Sauerstoff? 12. Welche Temperatur wählen Sie, um bevorzugt Vertreter der Gattung Chromobacterium anzureichern und welche, um bevorzugt Vertreter der Gattung Janthinobacterium anzureichern? 13. Informieren Sie sich in Lehrbüchern der Mikrobiologie und Biochemie darüber, wie Blausäure biochemisch entstehen kann! 14. Informieren Sie sich in Lehrbüchern der Chemie, welche Rolle Blausäure bei der Gewinnung von Gold spielt! 15. Was ist Casein, und auf die Anwesenheit welches Enzyms deutet die Fähigkeit zur Hydrolyse von Casein hin? 16. Beschreiben Sie, wie im Versuch die Hydrolyse von Aesculin gezeigt wurde! 17. Auf welche Substanz ist die lederartige Konsistenz älterer Kolonien von Chromobacterium violaceum zurückzuführen? 18. Informieren Sie sich in anderen Versuchen aus dem MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM über Polyhydroxyalkanoate! 19. Haben Sie eine Idee, warum zur Herstellung von Poly(3-hydroxyvalerat) mit Chromobacterium violaceum Valeriansäure als Kohlenstoffquelle eingesetzt werden muss? 20. Wo liegen potentielle biotechnologische Anwendungen von Chromobacterium violaceum?

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

Direktisolierung von aeroben Endosporenbildnern (Bacillus megaterium)

59

Versuch 7

Theoretischer Hintergrund Die Bildung von Endosporen ist ein im Vergleich zu Eukaryonten eher seltener Vorgang der Zelldifferenzierung bei Prokaryonten. Endosporen gehen aus einer Mutterzelle durch eine inäquale Teilung hervor. Die Cytoplasmamembran schnürt sich dabei ein, trennt einen Teil des Protoplasten der Mutterzelle mit dem Genom ab und umwächst diesen. In einem komplizierten Prozess synthetisieren die beiden dann die den Sporenprotoplasten umgebende Cytoplasmembranen, die Zellwand, eine Sporenrinde, eine äußere Sporenhülle und ein Exosporium. Diese Hüllen tragen ca. 50 % der Trockenmasse der Endosporen bei. Dipicolinsäure ist eine für Endosporen charakteristische Substanz und kommt zusammen mit Calcium-Ionen nur dort vor. Am Ende dieses Differenzierungsprozesses ist eine von mehreren dicken Hüllschichten umgebene Endospore entstanden, die nicht nur hitzeresistent ist, sondern auch unempfindlicher gegenüber energiereicher Strahlung und chemischen Agenzien. Eine Besonderheit stellen Bakterien der Gattung Anaerobacter dar, in deren Sporenmutterzelle bis zu fünf Endosporen entstehen können. Sonst kommt in einer Sporenmutterzelle grundsätzlich immer nur eine Endospore vor. Die Sporulation ist ein strikt regulierter Vorgang – bei Bacillus ist sogar ein eigener Sigmafaktor beteiligt – und wird meist bei Nährstoffmangel induziert. Sind wieder ausreichend Nährstoffe vorhanden und herrschen Bedingungen, die ein Wachstum ermöglichen, keimt die Endospore aus und wächst zu einer normalen, teilungsfähigen vegetativen Zelle heran.

Entstehung und Aufbau von Endosporen

Neben den Endosporen gibt es noch einige weitere besonders widerstandsfähige Dauerformen, die Bakterien durch Zelldifferenzierung hervorbringen können. Methylosinus trichosporium ist eines der wenigen Bakterien, welche zur Bildung von hitzeresistenten Exosporen in der Lage sind. Die Exosporen der Streptomyceten sind nur unempfindlicher gegenüber Austrocknung, nicht aber gegenüber Hitze. Vertreter der Gattungen Azotobacter und Methylocystis bilden Cysten und Vertreter der Gattungen Myxococcus sowie Sporocytophaga Myxosporen; beide verleihen Resistenz gegenüber Austrocknung und Strahlung, nicht aber gegenüber Hitze. Stämme der Gattung Arthrobacter können sich in kleine kokkenförmige Zellen umwandeln, die eine Austrocknung besser als andere Zellen überstehen.

Andere Dauerformen

Die Fähigkeit zur Bildung hitzeresistenter Endosporen ist ein Charakteristikum verschiedener Bakteriengattungen. Endosporenbildende Bakterien sind besonders im Amphibacillus Heliophilum Anaerobacter Paenibacillus Boden weit verbreitet. In Vertretern der Bacillus Sporohalobacter Archaea wurden bisher keine Endosporen Clostridium Sporolactobacillus nachgewiesen. Von Vertretern der GattunDesulfitobacterium Sporomusa gen Sporomusa und Sporohalobacter Desulfotomaculum Sporosarcina abgesehen, sind alle Endosporenbildner Geobacillus Syntrophospora Gram-positiv. Stoffwechselphysiologisch Heliobacterium Thermoanaerobacter unterscheiden sich die Gattungen beträchtlich: Das Spektrum umfasst nicht nur aerobe, fakultativ aerobe und strikt anaerobe heterotrophe Bakterien sondern mit den Gattungen Heliobacterium und Heliophilum sogar phototrophe Bakterien. Auch thermophile, azidophile und alkaliphile sowie Xenobiotika-abbauende Bakterien sind bekannt. Viele der in Tabelle 3.12 aufgeführten Gattungen waren bis vor kurzem nicht bekannt und wurden nach der Isolierung neuer Bakterien oder nach detaillierten taxo-

Verbreitung

Tabelle 3.12. Endosporen

Bakteriengattungen mit

HOOC

N

COOH

Dipicolinsäure

V31 - S. 157

V13 - S. 81

60

3 Versuche Tabelle 3.13.

Bedeutung der Gattungen Bacillus und Paenibacillus

Humanpathogene Vertreter

Bacillus anthracis

Milzbrand

Insektenpathogene Vertreter

Bacillus thuringiensis Paenibacillus popilliae

Zerstörung des Darmepithels

Produktion von Antibiotika

Bacillus licheniformis Paenibacillus polymyxa

Bacitracin Polymyxin

Produktion von Enzymen

Bacillus licheniformis Bacillus subtilis

Protease Amylase

Fermentation von Lebensmitteln

Bacillus subtilis

Natto

Produktion von Biopolymeren

Bacillus licheniformis

Poly-γ-glutamat

nomischen Untersuchungen bereits bekannter Bakterien neu begründet. Dabei sind die Gattungen Bacillus und Clostridium am umfangreichsten und stellen mit Abstand die meisten Spezies. Auch in medizinischer Hinsicht und durch zahlreiche biotechnologische Produkte haben diese beiden Gattungen ein besonderes Gewicht. Bedeutung der Gattung Bacillus

Einige Spezies der Gattung Bacillus haben eine große medizinische und biotechnologische Bedeutung ( Tabelle 3.13). Bacillus anthracis ist Erreger des Milzbrandes.

V26 - S. 136

Ansonsten werden Spezies der Gattung Bacillus zur Produktion verschiedener Antibiotika, von technischen Enzymen und des Biopolymers Poly(γ-D-glutamat) sowie zur Fermentation von Sojabohnen bei der Herstellung des Lebensmittels Natto herangezogen.

V34 - S. 174 V38 - S. 193 V27 - S. 140 V8 - S. 62 Anreicherung von endosporenbildenden Bakterien

Selbst Stechmücken können wirkungsvoll mit Bacillus bekämpft werden. Bacillus thuringiensis produziert das BT-Toxin welches ein Insektenlarvizid darstellt. Das BTToxin ist in Zellen dieses Bakteriums als Proteinkristall neben der Endospore lichtmikroskopisch sichtbar. Die Anreicherung anaerober Endosporenbildner der Gattung Clostridium ist Gegenstand eines anderen Versuchs. Die Anreicherung von endosporenbildenden Bakterien ist recht einfach und wird durch Pasteurisieren eingeleitet. Dabei wird das Probenmaterial in wässriger Lösung für 10 min auf eine Temperatur von 80 °C erhitzt. Hierdurch werden alle vegetativen Zellen abgetötet, während die Endosporen überleben. Danach entscheiden Wahl des Anreicherungsmediums und Kultivierungsbedingungen darüber, welche endosporenbildende Bakterien weiter angereichert und in Reinkultur gebracht werden können. Versuchsziel In diesem Versuch sollen aerobe endosporenbildende Bakterien der Gattung Bacillus angereichert werden. Durch Ermittlung des Gram-Typs soll die Anreicherung überprüft werden. Durch besonders große Zellen geben sich Vertreter der Spezies Bacillus megaterium bei lichtmikroskopischer Betrachtung zu erkennen. Dieser Versuch führt auch in die Technik des Pasteurisierens ein.

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

Versuchsdurchführung benötigtes Material Geräte     

Reagenzglas Impföse Brutschrank (30 °C) Objektträger und Deckgläser Phasenkontrastmikroskop

Chemikalien und Medien  Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril  Bmeg-Festmedium ( S. 411)  FPMn-Festmedium ( S. 414)

Sonstiges  getrocknete Gartenerde

In ca. 5 ml Leitungswasser wird eine Spatelspitze getrocknete Erde suspendiert. (Man erhält diese durch zweiwöchige Lagerung von fein zerbröselter Gartenerde in flacher Schicht bei Raumtemperatur. In ihr sind lebensfähige Mikroorganismen im Wesentlichen nur als Dauerformen – Endosporen, Cysten – enthalten). Zur Abtötung aller verbliebenen vegetativen Zellen und nicht Hitze-resistenten Dauerformen wird die Suspension für 10 min in einem auf 80 °C geheiztem Wasserbad inkubiert (Pasteurisieren). Von der pasteurisierten Suspension wird mit der Impföse etwas Material entnommen und auf Bmeg-Festmedium ausgestrichen (Kreuzausstrich,  M4, S. 365). Die Platte wird bei 30 °C inkubiert.

Material von ungefärbten Kolonien wird mit einer sterilisierten Impföse entnommen und jeweils in einem Tropfen steriler Saline suspendiert. Entspricht das mikroskopische Bild den Erwartungen (große stäbchenförmige Zellen), erfolgt ausgehend von der Suspension ein Drei-Strich-Ausstrich ( M4, S. 365) auf Bmeg-Agar. Die Platte wird bei 30 °C inkubiert. Nach mikroskopischer Betrachtung von Koloniematerial erfolgt ein Drei-Strich-Ausstrich auf einer FPMn-Agar-Platte. Die Zusammensetzung dieses Festmediums (Mangan!) dient der Stimulierung der Endosporenbildung. Die Platte wird bei 30 °C inkubiert. Koloniematerial wird in steriler Saline suspendiert und im Phasenkontrast mikroskopiert: Es sollten deutlich Endosporen zu sehen sein. Es erfolgt ein weiterer Reinigungsausstrich auf Bmeg-Agar. Mit Hilfe der Gram-Färbung ( M12, S. 377), des KOH-Tests (M12, S. 379) und des LAAP-Tests ( M12, S. 378) wird der Gram-Typ der Reinkultur bestimmt. Weiterführende Literatur Levin PA, Grossmann AD (1998) Cell cycle and sporulation in Bacillus subtilis. Current Opinion in Microbiology 1:630-635 Nicholson WL, Munakata N, Horneck G, Melosh HJ, Setlow P (2000) Resistance of Bacillus endospores to extreme terrestrial and extraterrestrial environments. Microbiology and Molecular Biology Reviews 64:548572 Schnepf E., Crickmore N, Van Rie J, Lereclus D, Baum J, Feitelson J, Zeigler DR, Dean DH (1998) Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews 62:775-806 Stragier P, Losick R (1996) Molecular genetics of sporulation in Bacillus subtilis. Annual Review of Genetics 30:297-341

61

62

3 Versuche

Nachgefragt 1. Nennen Sie alle Bakteriengattungen, in denen hitzeresistente Endosporen vorkommen! 2. Wie müssen Sie vorgehen, um sicher zu stellen, dass Sie bei einer Anreicherung ausschließlich mit Endosporen bildenden Bakterien starten? 3. Welche Dauerformen kommen bei Mikroorganismen außer Endosporen noch vor? Wie unterscheiden sich diese von den Endosporen? 4. Wie erkennt man Endosporen bei Betrachtung von Zellsuspensionen im Phasenkontrastmikroskop, und wie können Sie diese von Poly(3-hydroxybutyrat)-Einschlüssen unterscheiden? 5. Welches Bakterium bildet parallel zur Endospore zusätzlich einen im Lichtmikroskop auffälligen Proteinkristall? 6. Nennen Sie die wichtigsten Unterschiede zwischen einer Endospore und einer vegetativen Zelle! 7. Konsultieren Sie Lehrbücher der Mikrobiologie und zeichnen Sie schematisch den Aufbau einer Endospore! Beschreiben und zeichnen Sie die Vorgänge bei der Entstehung von Endosporen! 8. Unter welchen Bedingungen wird die Bildung von Endosporen meist induziert? 9. Warum wäre die Sporenmutterzelle, selbst wenn Sie bei der Sporulation nicht zerstört würde, nicht mehr vermehrungsfähig? 10. Wo kommt Dipicolinsäure vor? Zeichnen Sie die Strukturformel!

Versuch 8

11. Nennen Sie andere wichtige Bestandteile von Endosporen und Proteinen, die bei der Bildung von Endosporen eine Rolle spielen! 12. Erklären Sie Hitzestabilität, UV-Resistenz und lange Lagerfähigkeit von auskeimungsfähigen Endosporen! 13. Warum kann man endosporenbildende Bakterien nicht als thermotolerant oder gar thermophil bezeichnen? 14. Warum kann Marmelade durch Erhitzen bei 100 °C haltbar gemacht werden, während Fleisch- und Gemüsekonserven bei 121 °C erhitzt werden müssen? 15. Was versteht man unter Pasteurisieren? 16. Bringen Sie in Erfahrung, was man unter Tyndallisation versteht und wie mit dieser Methode die Abtötung von Endosporen erreicht wird! 17. Nennen Sie jeweils eine humanpathogene und eine insektenpathogene Spezies der Gattung Bacillus! Welche Bedeutung haben diese beiden Bakterien für den Menschen? 18. Nennen Sie biotechnologische Produkte, die mit Vertretern der Gattung Bacillus produziert werden! 19. Welche Bacillus-Art spielt in der Lebensmitteltechnologie eine Rolle? 20. Beschreiben Sie die Vorgänge bei der Keimung einer Endospore!

Anreicherung und Isolierung von saccharolytischen Clostridien Theoretischer Hintergrund

Die Gattung Clostridium

Die Gattung Clostridium ist nahezu ubiqui- Tabelle 3.14. Beispiele für saccharotär verbreitet und mit ungefähr einhundert lytische Clostridien Spezies eine der umfangreichsten Gattungen der Prokaryonten. Dies ist nicht verwunder- Clostridium acetobutylicum lich, da für die Zugehörigkeit zu dieser Gat- Clostridium aceticum tung nur vier Kriterien erfüllt sein müssen. Clostridium butyricum Spezies der Gattung Clostridium bilden ther- Clostridium cellobiopaum moresistente Endosporen, verfügen über Clostridium formicoaceticum pasteurianum einen anaeroben Energiestoffwechsel, Clostridium Clostridium thermocellum können keine dissimilatorische Sulfatreduktion durchführen und müssen eine Gram-positive Zellwandstruktur besitzen. Damit sind die Clostridien von den ebenfalls anaeroben Sporenbildnern der Gattungen Sporomusa und Sporohalobacter mit einer Gram-negativen Zellwandstruktur klar abgetrennt. Die Unfähigkeit zur dissimilatorischen Sulfatreduktion unterscheidet Clostridien von Vertretern der Gattung Desulfotomaculum.

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen Tabelle 3.15.

63

Typische Substrate der vier physiologischen Gruppen der Gattung Clostridium

Stoffwechseltyp

Substrate (Beispiele)

Saccharolytisch

Fructose, Glucose, Lactose, Mannitol, Raffinose, Xylose, Cellulose, Chitin, Pektin, Stärke

Proteolytisch

Proteine, Peptide, freie Aminosäuren

Saccharolytisch und Proteolytisch

s. o.

Spezialisten

Acetoin, Adenin, Harnsäure, einzelne Aminosäuren

Der Stoffwechsel der Clostridien ist sehr heterogen. Dies bezieht sich nicht nur auf das Verhältnis zum nicht nutzbaren Sauerstoff, das von moderat tolerant bis strikt anaerob reicht, oder auf den zum Wachstum optimalen Temperaturbereich, sondern vor allem auf die Stoffwechselvielfalt. Es gibt keine andere Bakteriengruppe, die so viele verschiedene Substrate wie die Clostridien vergären kann. Üblicherweise werden innerhalb der Gattung Clostridium vier stoffwechselphysiologische Gruppen unterschieden ( Tabelle 3.15). Zur ersten und umgfangreichsten Gruppe gehören die saccharolytischen Clostridien ( Tabelle 3.14). Diese können ausschließlich Kohlenhydrate vergären, und es gehören hierzu praktisch keine pathogenen Vertreter. Die zweite Gruppe sind die proteolytischen Clostridien. Diese Bakterien scheiden Proteasen aus, hydrolysieren Proteine und vergären anschließend die freigesetzten Aminosäuren. Sehr viele pathogene Vertreter gehören zu dieser Gruppe. In einer dritten Gruppe sind Vertreter zusammengefasst, die sowohl saccharolytisch als auch proteolytisch sind. Die vierte Gruppe umfaßt sogenannte Spezialisten, die jeweils nur einige wenige Substrate als Kohlenstoffquellen nutzen können. Auch zu dieser Gruppe gehören wieder viele pathogene Vertreter.

Stoffwechselvielfalt

Typische Gärungsprodukte nahezu aller saccharolytischer Clostridien sind CO2, H2, Acetat und Buttersäure. Polysaccharid-abbauende Vertreter scheiden natürlich entsprechende Enzyme aus, um die Polysaccharide zunächst zu Zuckern zu hydrolysieren. Die Zucker werden dann über den Fructose-1,6-bisphosphat-Weg zu Pyruvat abgebaut. Wie fast alle strikt anaeroben, gärenden Bakterien besitzen auch die Clostridien das Enzym Pyruvat:Ferredoxin-Oxidoreduktase, welches Pyruvat oxidativ zu Acetyl-CoA und CO2 decarboxyliert. Dabei wird Ferredoxin reduziert, welches die Reduktionsäquivalente an eine Hydrogenase weitergeben kann, die dann H2 freisetzt. Ausgehend von Acetyl-CoA können dann verschiedene Gärungsprodukte gebildet werden. Hierzu gehört auch Acetat, dessen Synthese mit einer durch das Enzym AcetatKinase katalysierten Phosphorylierung von ADP zu ATP verbunden ist. Der überwiegende Anteil von Acetyl-CoA wird jedoch durch eine β-Ketothiolase zunächst in Acetoacetyl-CoA umgewandelt. Das meiste Acetoacetyl-CoA wird nun durch die Enzyme 3-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydrogenase, Crotonase und Butyryl-CoA-Dehydogenase in Butyryl-CoA umgewandelt. Aus Butyryl-CoA kann entweder Butyrat oder 1-Butanol entstehen. Aus dem verbleibenden Teil von Acetoacetyl-CoA entsteht freies Acetoacetat, welches durch Decarboxylierung zunächst in Aceton und anschließend durch Reduktion auch in 2-Propanol (Isopropanol) umgewandelt werden kann.

Aceton-Butanol Gärung

Clostridium acetobutylicum bildet besonders große Mengen Aceton, 1-Butanol und auch 2-Propanol. Diese Stoffwechselleistung wurde bereits vor fast 150 Jahren von Louis Pasteur entdeckt. C. acetobutylicum kann damit mehrere wichtige und von der chemischen Industrie dringend und in großen Mengen benötigte Rohstoffe produzie-

H3C

H2 C

O C H2

C

OH

Buttersäure O H3 C

C Aceton

CH3

64

3 Versuche

H3C

C H2

H2 C

CH2 OH

Butanol OH H3C

C

CH3

H 2-P rop anol

Anreicherungsverfahren

ren. 1-Butanol, Aceton und 2-Propanol sind wichtige Lösungsmittel für die Lackindustrie, 1-Butanol ein wichtiger Ausgangsstoff für die Produktion von Synthesekautschuk; Aceton wurde früher zur Herstellung von rauchfreiem Schießpulver (Cordit) benötigt. Der Erste Weltkrieg und die durch Fließbandmontage gesteigerte Produktion von Automobilen führten in den ersten drei Jahrzehnten des 20. Jahrhunderts zu einem gesteigerten Bedarf an Aceton und 1-Butanol. Darüber hinaus entfiel durch die Prohibition und mit dem Verbot der Alkoholgärung durch Saccharomyces cerevisiae in den USA in dieser Zeit eine Quelle für 2-Propanol. Chaim Weizmann, dem späteren Präsidenten von Israel, ist es zu verdanken, dass zu Beginn des 20. Jahrhunderts an der Universität von Manchester ein biotechnologisches Verfahren zur Produktion der Lösungsmittel mit Clostridium acetobutylicum bis zur Industriereife entwickelt wurde. Diese Verfahren wurden immer nur in Notzeiten oder in wirtschaftlich oder politisch isolierten Staaten betrieben; sie waren sonst nie konkurrenzfähig gegenüber synthetischen Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen. Die Ursachen dafür sind in den relativ geringen Konzentrationen von Aceton und Butanol und dem damit einhergehenden Aufwand für deren Abtrennung sowie in der geringen Toleranz von C. acetobutylicum gegenüber den Lösungsmitteln und Buttersäure zu suchen. Sehr viele unterschiedliche Medien mit verschiedenen Kohlenhydraten als Kohlenstoffquellen sind zur Anreicherung von saccharolytischen Clostridien beschrieben worden. Ein sehr einfaches Verfahren soll hier vorgestellt werden; es erlaubt die Anreicherung saccharolytischer Clostridien in drei Abschnitten. Für den ersten Abschnitt wird eine ungeschälte Kartoffel eingesetzt, in die ein- oder zweimal mit einem Messer hineingestochen wurde. Diese Kartoffel wird in einem mit Deckel verschlossenen Wasserglas bei 37 °C so lange inkubiert bis sie an die Wasseroberfläche aufschwimmt ( Abb. 3.17). Das Kartoffelgewebe selbst Abb. 3.17. Anreicherung von saccharobaut dabei den Sauerstoff durch Atmung ab. lytischen Clostridien in einer Kartoffel, vor Das Aufschwimmen der Kartoffel ist eine (links) und nach (rechts) Inkubation Folge der Anreicherung anaerober, gärender Bakterien, die in den Stichkanal eingedrungen sind und dort die Stärke oder das Pektin abgebaut und vergoren haben. Dadurch und durch die Bildung von CO2 erniedrigt sich die spezifische Dichte der Kartoffel. Im zweiten Schritt erfolgt nun eine Überführung von Probenmaterial aus dem bewachsenen Stichkanal in Hefeextrakt-Glucose-Medium mit anschließender Pasteurisierung, um die vorhandenen Endosporenbildner zu selektieren. Im dritten Schritt wird anschließend das Hefeextrakt-Glucose-Medium weiter eingesetzt, um beliebige nach dem Pasteurisieren vorhandene anaerobe Endosporenbildner in Reinkultur zu bringen. Alternativ ist es möglich, mit mehr oder weniger spezifischen Medien einzelne saccharolytische Clostridien in Reinkultur zu bringen. Leider gibt es keine Medien, die eine selektive Anreicherung von C. acetobutylicum erlauben. Zur Identifizierung von Stämmen dieser Spezies ist man letztlich darauf angewiesen, die typischen Gärungsprodukte nachzuweisen, z. B. durch Gaschromatographie. Versuchsziel Ein saccharolytisches Clostridium in einer „Kartoffel-Kultur“ angereichert und daraus isoliert werden.

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

Versuchsdurchführung benötigtes Material Geräte     

1.000 ml-Becherglas (schlank) Impföse Bunsenbrenner Autoklav Brutschrank (37 °C)

Chemikalien und Medien  HG-Nährlösung ( S. 416)  HG-Festmedium ( S. 416)

Sonstiges  eine rohe Kartoffel mit Schale

In eine Kartoffel werden mit einem Messer ein bis zwei Löcher gestochen. Die Kartoffel wird danach in ein Becherglas gelegt, und dieses wird mit Leitungswasser versehen, bis die Kartoffel einige cm hoch mit Wasser bedeckt ist. Das Becherglas wird mit einem Petrischalen-Deckel oder Aluminiumfolie bedeckt und bei 37 °C inkubiert. In dieser Zeit wird der anfangs enthaltene Sauerstoff zum großen Teil vom Kartoffelgewebe selbst, aber auch von aeroben und fakultativ anaeroben Bakterien verbraucht und auf diese Weise ein anaerobes Milieu geschaffen, das den Clostridien Wachstum erlaubt.

Hauptsächlich aufgrund der durch die Gärung verursachten Gasbildung schwimmt die Kartoffel an der Wasseroberfläche. Das Becherglas wird geöffnet und – nach vorsichtiger sensorischer Prüfung – die Kartoffel entnommen und seziert. Das Gewebe im Bereich der Einschnitte ist in Auflösung begriffen. Aus diesen macerierten Bereichen wird eine Probe entnommen und im Phasenkontrast mikroskopiert. Welche Zellformen sind zu erkennen, treten Endosporen auf? Um zu einer Reinkultur eines saccharolytischen Clostridiums zu kommen, wird eine Probe des macerierten Kartoffelgewebes in ein Reagenzglas mit wenigen Millilitern Hefeextrakt-Glucose-Nährlösung überführt. Zur Abtötung aller vegetativen Zellen wird das Röhrchen für 10 min bei 80 °C im Wasserbad inkubiert (pasteurisiert). Ausgehend von dem pasteurisierten Ansatz werden Kreuzausstriche ( M4, S. 365) auf Hefeextrakt-Glucose-Festmedium angefertigt. Die Platten werden zur anaeroben Bebrütung in einen Anaerobentopf überführt (M5, S. 368), der nach Schließen bei 37 °C inkubiert wird. Der Anaerobentopf wird geöffnet, und nach (zwangsläufiger) sensorischer Prüfung werden repräsentative Kolonieformen (Farbe?) im Phasenkontrast mikroskopiert (Endosporen? Lage der Endosporen?). Zur weiteren Aufreinigung erfolgen Drei-StrichAusstriche und erneute Inkubation unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C. Zur Charakterisierung der Isolate erfolgt eine Sporenfärbung (M13, S. 379). Mikroskopische Präparate ungefärbter und gefärbter Zellen werden sorgfältig betrachtet (Größenbestimmung, V1, S. 30) und dokumentiert (Zeichnung, Photographie). Weiterführende Literatur Dürre P (1998) New insights and novel developments in clostridial acetone/butanol/isopropanol fermentation. Applied Microbiology and Biotechnology 49:639-648 Hippe H, Andreesen JR, Gottschalk G (1999) The Genus Clostridium – Nonmediacal. In: Dworkin M (ed) The Prokaryotes (elektronische Version: http://link.springer.de/link/service/books/10125, Release 3.0 vom 21.5.1999) Springer, New York

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66

3 Versuche

Nachgefragt 1. Nennen Sie die vier typische Eigenschaften, die ein Bakterium aufweisen muss, um zur Gattung Clostridium zu gehören! 2. Nennen Sie andere strikt anaerobe Bakterien, die jeweils eines dieser vier für Clostridien typischen Eigenschaften nicht besitzen! 3. Was versteht man unter saccharolytischen und proteolytischen Clostridien, und wie unterscheiden sich beide Gruppen stoffwechselphysiologisch? 4. Nennen Sie mindestens fünf saccharolytische Spezies der Gattung Clostridium! 5. Konsultieren Sie Lehrbücher der Mikrobiologie, und erstellen Sie eine Liste mit pathogenen Vertretern der Gattung Clostridium! 6. Zeichnen Sie die Strukturformeln von Buttersäure, 1-Butanol, Aceton und Isopropanol! 7. Wozu werden 1-Butanol, Aceton und Isopropanol benötigt? 8. Informieren Sie sich in Lehrbüchern der Organischen Chemie über den Prozess zur Herstellung von Synthesekautschuk (Buna)! 9. Welche geschichtlichen Ereignisse haben den Bedarf an den Lösungsmitteln gesteigert? 10. Durch welche technischen Errungenschaften wurde der Bedarf an den Lösungsmitteln gesteigert? 11. Welches Enzym katalysiert in Clostridien die Umwandlung von Pyruvat in Acetyl-CoA?

Versuch 9

12. Nennen Sie zwei bedeutende Persönlichkeiten, die an der Entdeckung der Aceton-Butanol-Gärung und deren technischer Nutzbarmachung maßgeblich beteiligt waren! 13. Weshalb schwimmt die im Versuch eingesetzte Kartoffel zur Anreicherung von saccharolytischen Clostridien nach einigen Tagen auf? 14. Beschreiben Sie die einleitenden Schritte des Abbaus von Glucose zu Pyruvat in saccharolytischen Clostridien! 15. Nennen Sie weitere in Bakterien vorkommende Enzyme, die Pyruvat in eine aus zwei Kohlenstoffatomen bestehende Verbindung umwandeln! 16. Wie entsteht in Clostridien Buttersäure aus Acetyl-CoA? 17. Wie entstehen in Clostridium acetobutylicum Aceton und 2-Propanol? 18. Bei welchen Schritten der Vergärung von Glucose gewinnt Clostridium acetobutylicum Energie durch Substratkettenphosphorylierung? 19. Clostridium acetobutylicum bildet 1-Butanol und Aceton ungefähr in einem Verhältnis von 3 zu 1. In welchen Mengen müssen diese und die anderen bei diesem Bakterium möglichen Gärungsprodukte ausgehend von 100 g Glucose entstehen, damit die Redox-Bilanz ausgeglichen ist? 20. Was schränkt die Eignung von Clostridium acetobutylicum zur biotechnologischen Produktion von Lösungsmitteln ein?

Direktisolierung und taxonomische Bestimmung von fluoreszierenden Pseudomonaden Theoretischer Hintergrund Unter Pseudomonaden fasst man heute eine Gruppe von Bakterien mit den fünf Hauptgattungen Burkholderia, Comamonas, Pseudomonas, Zymomonas und Xanthomonas sowie weiteren Gattungen (Gluconobacter, Ralstonia, Zoogloea, u. a.) zusammen. Spezies der Gattung Pseudomonas sind in der Natur sehr weit verbreitet und kommen vor allem im Boden, im Wasser und auf Pflanzen in relativ großer Zellzahl vor. Sie gehören meist zur Gruppe der γ-Proteobakterien, seltener zur Gruppe der α-Proteobakterien. Die stäbchenförmigen Zellen sind durch eine oder mehrere polar angeordnete Geißeln beweglich und besitzen die typische Gram-negative Zellwandstruktur. Sie zeichnen sich durch einen obligat respiratorischen, nie gärenden Stoffwechsel aus und besitzen häufig die Fähigkeit, viele

Abb. 3.18. Fluoreszierende Pseudomonaden bei Beleuchtung mit Licht der Wellenlänge 366 nm

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

normalerweise schwer abbaubare Verbindungen – darunter auch Xenobiotika – verwerten zu können. Zucker werden immer über den Entner-Doudoroff-Weg verstoffwechselt; statt Poly(3-hydroxybutyrat) werden Polyhydroxyalkanoate aus Hydroxyfettsäuren mittlerer Kettenlänge, z. B. Poly(3-hydroxyoctanoat), als Speicherstoffe akkumuliert. Einige Vertreter sind tier- und humanpathogen (Burkholderia mallei, Pseudomonas aeruginosa) oder pflanzenpathogen (Burkholderia gladioli, Burkholderia caryophylli, Burkholderia solanacearum, Pseudomonas marginalis, Pseudomonas syringae, Pseudomonas viridiflava).

67

V33 - S. 167

An kaum einer anderen Gruppe der Bakterien wird die „ordnende Kraft“ der modernen polyphasischen Taxonomie so deutlich wie bei den Pseudomonaden. Vertreter der Gattung Pseudomonas wurden in den letzten Jahren umfassend neu taxonomisch eingeordnet. Viele der oben beschriebenen Bakterien, die früher einfach der Gattung Pseudomonas zugeordnet worden waren, wurden in andere, häufig neu geschaffene Gattungen überführt (Acidovorax, Aminobacter, Brevibacterium, Brevundimonas, Burkholderia, Comamonas, Delftia, Halomonas, Herbaspirillum, Hydrogenophaga, Methylobacterium, Oligotropha, Ralstonia, Shewanella, Sphingomonas, Stenotrophomonas, Telluria, Vogesella und Zavarzinia). Zudem wurden innerhalb der Gattung Pseudomonas verbliebene Mitglieder z. T. anderen Spezies zugeordnet. Leider werden die Bezeichnungen heute in der Literatur z. T. immer noch ungenau verwendet. Da zudem alte und neue Lehrbücher sowie Originalarbeiten und damit auch alte und neue Gattungsnamen nebeneinander existieren, stellt sich bei einem mit der Taxonomie der Pseudomonaden nicht vertrauten Leser beim Studium der Literatur über diese Bakterien häufig Verwirrung und manchmal sogar Hilflosigkeit ein.

polyphasische Taxonomie

Spezies der Gattung Pseudomonas scheiden häufig Pigmente ins Medium aus, von denen einige fluoreszieren. Aus Wasser- und Bodenproben lassen sich diese Bakterien regelmäßig und sicher anreichern, wenn man auf einem Nährboden ausstreicht, in dem Eisenmangel herrscht. Fluoreszierende Pseudomonaden geben sich unter UV-Licht durch gelb oder grün fluoreszierende, wasserlösliche Pigmente zu erkennen

Pyoverdine

Abb. 3.19. Struktur eines Pyoverdins (Succinyl isoform), synthetisiert von Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Die Abbildung zeigt den Komplex mit Fe3+

68

3 Versuche

( Abb. 3.18). Es handelt sich um Eisenchelatbildner mit einer hohen Affinität zu Fe3+-Ionen, die der Eisenaufnahme in die Zelle dienen und hier als Pyoverdine bezeichnet werden. Sie gehören zu den Siderophoren. Von mehr als 40 Pyoverdinen wurden bereits die chemischen Strukturen aufgeklärt. Farbgebende und fluoreszierende Struktur ist ein in allen Pyoverdinen identisches Chinolin als Chromophor, das an eine lineare oder cyclische aus sechs bis elf Aminosäuren bestehende Peptidkette gebunden ist ( Abb. 3.19). Die Pyoverdine von P. aeruginosa, P. chlororaphis, P. cichorii, P. fluorescens, P. jessenii, P. mandelii, P. monteilii, P. putida, P. rhodesiae, P. syringae, P. tolaasii, P. veronii und P. viridiflava sind bekannt. Aufnahmemechanismen für Eisen

Eisen ist ein essentielles Makroelement für nahezu alle Organismen. Eisenmangel im Medium oder im natürlichen Biotop eines Organismus, durch Fehlen oder Entzug hervorgerufen, limitiert i. d. R. das Wachstum. Zudem ist Eisen unter physiologischen Bedingungen sehr schlecht löslich. Bakterien haben deshalb z. T. sehr komplexe Mechanismen entwickelt, um Eisen effizient aufnehmen zu können. Dies geschieht häufig durch Siderophore, die eine sehr hohe Affinität zu Fe3+-Ionen besitzen und mit diesen Komplexe ausbilden, die dann in die Zelle transportiert werden, wo diese aufgelöst und damit das Eisen freigegeben werden. Zu diesen Eisenchelatbildnern gehören die Pyoverdine, durch die Eisen in Form eines Eisenpyoverdin-Komplexes in die Zelle transportiert wird. Pyoverdine können wie alle Siderophore in der Kompetition um Eisen wichtige Virulenzfaktoren darstellen. Auf der anderen Seite basieren verschiedene Schutzmechanismen von Eukaryonten gegenüber Infektionen und Schädigungen durch Bakterien auf der Bildung hoch affiner Moleküle, mit denen sie Bakterien Eisen entziehen. Versuchsziel Die Inkubation eines Ausstrichs von Bodenproben auf „King-Agar“ führt erfahrungsgemäß zur Anreicherung von fluoreszierenden Pseudomonaden, die sich bei Exposition kurzwelliger Strahlung zu erkennen geben. Nach Erhalt einer Reinkultur eines fluoreszierenden Stammes, wird mit Hilfe eines biochemischen Bestimmungssystems die Art bestimmt. Versuchsdurchführung Eine Spatelspitze frische Gartenerde wird in ca. 5 ml Wasser suspendiert und ein Tropfen mit dem Drigalski-Spatel als Flächen-Ausstrich (M4, S. 366) auf einer King-AgarPlatte ausgespatelt. Die Bebrütung erfolgt im Dunkeln bei 30 °C. Auf den bewachsenen Platten wird mit einer geeigneten Beleuchtungsquelle (UV-Lampe) bei einer Wellenlänge von 366 nm nach grünlich fluoreszierenden Bereichen gesucht. Diese Zonen werden auf der Plattenrückseite mit einem Filzschreiber markiert. Zellmaterial aus dem Zentrum der markierten Bereiche wird mit der ausgeglühten Impföse per Drei-Strich-Ausstrich

benötigtes Material Geräte        

Reagenzglas Drigalski-Spatel Pasteurpipette Platinimpföse UV-Lampe mit 366 nm Leuchtquelle Brutschrank (30 °C) Objektträger und Deckgläser Phasenkontrastmikroskop

Chemikalien und Medien  Reagenzien für die Gram-Färbung ( S. 377)  3 % (wt/vol) KOH  Bactident-Oxidase-Teststäbchen (Fa. Merck) ( S. 380)  Reagenzien und Material für den LAAPTest ( S. 378)  API20NE-Teststreifen und Zubehör (Fa. bioMérieux) ( S. 381)  Kings Festmedium ( S. 416)

Sonstiges  frische Gartenerde

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

( M4, S. 365) auf einer King-Agar-Platte ausgestrichen. Die Bebrütung erfolgt im Dunkeln bei 30 °C. Die Ausstriche werden erneut bei 366 nm beleuchtet. Zellmaterial aus einer fluoreszierenden Einzelkolonie wird per Drei-Strich-Ausstrich (M4, S. 365) auf eine KingAgar-Platte gebracht (Erster Reinigungsausstrich) und bei 30 °C im Dunkeln inkubiert. Es erfolgt ein zweiter Reinigungsausstrich auf King-Agar. Die Bebrütung erfolgt wieder bei 30 °C im Dunkeln. Es wird ein mikroskopisches Präparat angefertigt (M8, S. 373) und im Phasenkontrast betrachtet. Als einleitender Schritt zur taxonomischen Bestimmung wird der Gram-Typ mit Hilfe der Gram-Färbung, des KOH-Tests und des LAAP-Tests (M12, S. 377) bestimmt. Die bewachsenen King-Agar-Platte wird bis zum nächsten Tag im Kühlschrank aufbewahrt. Die taxonomische Bestimmung wird zunächst mit dem Oxidase-Test (M14, S. 380) und danach mit Hilfe des kommerziell erhältlichen biochemischen Bestimmungssystems API20NE (Fa. bioMérieux) (M14, S. 381) weitergeführt. Die beimpften API20NE-Teststreifen werden für ein bis zwei Tage bei 30 °C inkubiert. Mit der Auswertung der API20NE-Streifen nach 24 bzw. 48 Stunden Inkubationszeit ist der Versuch abgeschlossen. Weiterführende Literatur Braun V (2001) Iron uptake mechanisms and their regulation in pathogenic bacteria. International Journal of Medical Microbiology 291:67-79 Kessler B, Palleroni NJ (2000) Taxonomic implications of synthesis of poly-β-hydroxybutyrate and other poly-β-hydroxyalkanoates by aerobic pseudomonads. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 50:711-713 Meyer JM (2000) Pyoverdines: pigments, siderophores and potential taxonomic markers of fluorescent Pseudomonas species. Archives of Microbiology 174:135-142

Nachgefragt 1. Warum ist die Versorgung von Mikroorganismen mit Eisen schwierig? 2. Wie bezeichnet man von Bakterien synthetisierte Eisenchelatbildner mit einer hohen Affinität zu Eisenionen? 3. Wie und in welchen Teilschritten erfolgt die Aufnahme von Eisen durch die bakteriellen Eisenchelatbildner? 4. Beschreiben Sie die grundsätzliche chemische Struktur von Pyoverdinen! 5. Kann es aus der Sicht eines Bakteriums sinnvoll sein, nicht das gleiche Pyoverdin wie andere Pseudomonaden zu synthetisieren? 6. Nennen Sie Spezies der Gattung Pseudomonas, die Pyoverdine synthetisieren! 7. Welche ungewöhnlichen Aminosäuren kommen in Pyoverdinen vor? 8. Durch welche Enzyme wird der Peptidanteil der Pyoverdine synthetisiert? 9. Ist es für P. aeruginosa sinnvoll, die Synthese des Pyoverdins zu regulieren? Welches Medium wählen Sie, um Pyoverdinsynthese zu unterbinden? 10. Was versteht man unter polyphasischer Taxonomie?

11. Wo kommen Vertreter der Gattung Pseudomonas vor? 12. Was versteht man unter Virulenzfaktoren? 13. Nennen Sie human- und tierpathogene Vertreter der Gattung Pseudomonas und Krankheiten, die diese hervorrufen! 14. Nennen Sie pflanzenpathogene Vertreter der Gattung Pseudomonas und Krankheiten, die diese hervorrufen! 15. Wieso stellen Pyoverdine Virulenzfaktoren dar? 16. Welcher Speicherstoff ist in Vertretern der Gattung Pseudomonas verbreitet? 17. Nennen Sie Gattungen, denen ehemals der Gattung Pseudomonas zugeordnete Bakterien heute zugeordnet sind! 18. Beschreiben und skizzieren Sie den Abbauweg von Glucose durch Vertreter der Gattung Pseudomonas! 19. Welche Eigenschaften muss ein Medium erfüllen, um fluoreszierende Pseudomonaden anreichern zu können, und welche Kultivierungsbedingungen müssen angewandt werden? 20. Erstellen Sie eine Liste mit Eigenschaften, die für Spezies der Gattung Pseudomonas typisch sind!

69

70

3 Versuche

Versuch 10

Direktisolierung von Streptococcus salivarius Theoretischer Hintergrund

Eigenschaften und Standorte von Milchsäurebakterien

OH H3C

C H

O C OH

Milchsäure

V12 - S. 77 V20 - S. 108 Drei Formen der Milchsäuregärung

V11 - S. 74 Streptococcus salivarius

V11 - S. 74 V29 - S. 150

Milchsäurebakterien vergären Kohlen- Tabelle 3.16. Typische Eigenschaften von hydrate, und Milchsäure tritt als charakter- Milchsäurebakterien istisches Gärungsprodukt allein oder neben anderen auf. Diese obligat gärenden Bakte- Zelle rien kommen an nährstoffreichen Standorten • Gram-positiv vor und können aus Milch und Milchproduk- • Kokken, Stäbchen, unregelmäßige Zellformen ten, sich zersetzenden Pflanzenteilen, aus dem Darm und von Schleimhäuten sowie von • unbeweglich der Haut isoliert werden. Offenbar ist ihre Stoffwechsel • Milchsäure als Gärungsprodukt Anpassung an diese nährstoffreichen natürli- • Lactat-Dehydrogenase vorhanden chen Standorte so weit fortgeschritten, dass • obligate Gärer sie „verlernt“ haben, alle Zellbestandteile • auf Kohlenhydrate angewiesen selbst zu synthetisieren. Milchsäurebakterien • aerotolerant (Wachstum in Gegenwart von Luftsauerstoff ) sind deshalb grundsätzlich auf Aminosäuren und Vitamine als Suppline im Medium • Wachstum in Gegenwart von (NaN3) angewiesen – sie sind also auxotroph. Es • Natriumazid keine Katalase (nur Pseudokatalase) handelt sich immer um Gram-positive Bak- • säuretolerant terien, die unbeweglich sind. Die typischen • mehrfach auxotroph (supplinbedürftig) Eigenschaften von Milchsäurebakterien sind in Tabelle 3.16 aufgeführt. Bei den Milchsäuregärungen handelt es sich um primäre Gärungen. Die Gärungsprodukte können von anderen Bakterien weiter verstoffwechselt werden. Hierzu gehören die Propionsäurebakterien, aber auch Sulfat-reduzierenden Bakterien sowie die Methanbakterien (E1, S. 297; E3, S. 310), die entstehendes Acetat als Substrat nutzen können. Man unterscheidet mehrere Formen der G luco se 2L actat Milchsäuregärung ( Tabelle 3.17). Die von Streptococcus salivarius durchgeführte 2A P+2P D 2A P T i homofermentative Milchsäuregärung liefert Milchsäure als alleiniges Gärungs- Abb. 3.20. Homofermentative Vergärung produkt ( Abb. 3.20). Homofermentative von Glucose durch Streptococcus salivarius Milchsäurebakterien bauen Glucose über den Fructose-1,6-bisphosphat-Weg zunächst zu Pyruvat ab, welches durch eine LactatDehydrogenase mit den durch Oxidation von Glycerinaldehyd-3-phosphat entstandenen Reduktionsäquivalenten zu Milchsäure reduziert wird. Bei den heterofermentativen Milchsäuregärung entstehen neben Milchsäure noch weitere Gärungsprodukte. Diese Gärungen werden im nächsten Versuch besprochen. Die meisten Stämme von Streptococcus salivarius bilden das L-Isomer der Milchsäure. Die kokkenförmigen Zellen hängen meist in langen Ketten aneinander. S. salivarius synthetisiert ausgehend von Saccharose durch die Hexosyltransferase Lävansaccharase das Exopolysaccharid Lävan ( Abb. 3.21), ein Fructan, bei dem die Fructosereste im Hauptstrang β-2,6-glycosidisch verknüpft sind. An den Hauptstrang können weitere Stränge β-1,2-glycosidisch als Verzweigungen gebunden sein. Die freigesetzte Glucose dient als Kohlenstoffquelle für die Synthese der Zellbausteine und wird zu Milchsäure vergoren. Eine andere Hexosyltransferase, die Dextransaccharase, werden wir in anderen Versuchen kennenlernen. S. salivarius ist regelmäßig aus der Mundhöhle isolierbar. Dort bildet es kleine Kolonien aus, die durch das Exopolysaccharid an der Oberfläche von Zähnen relativ fest anhaften. Die Anheftung ist bei mangelnder Mundhygiene und einer guten Versorgung der Zellen mit Saccharose bedingt durch die

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen Tabelle 3.17.

71

Typen von Milchsäuregärungen

Gärungstyp / Produkte

vorhandene Enzyme

Vertreter

Homofermentative Milchsäuregärung

Fructose-1,6-bisphosphatAldolase

Enterococcus faecalis Lactococcus lactis Streptococcus mutans Streptococcus salivarius

Glucose-6-P-Dehydrogenase Phosphoketolase (Xylulose-5-P-abhängig) Phosphotransacetylase Acetaldehyd-Dehydrogenase Alkohol-Dehydrogenase (Acetat-Kinase)

Lactobacillus brevis Leuconostoc mesenteroides

Phosphoketolase (Fructose-6-P-abhängig) Phosphoketolase (Xylulose-5-P-abhängig) Transaldolase, Transketolase Acetat Kinase

Bifidobacterium bifidum

nur Lactat Heterofementative Milchsäuregärung

Lactat, CO2, Ethanol, Acetat BifidobacteriumGärung

Lactat und Acetat

Glucose Saccharose + Poly(β-2,6-Fructose)n

Poly(β-2,6-Fructose)n+1

Lävansaccharase CH2

O

O

CH2

O

O

HO

O

O

OH CH2

O

O

OH CH2

O

O CH2OH

OH

n

O HO

CH2OH OH

O HO

C H2

HO CH2OH

CH2

HO CH2OH

HO OH

O

O

HO CH2OH

OH CH2

CH2

CH2OH OH

Abb. 3.21. Reaktionsgleichung der Lävansaccharase und Strukturformel des Produktes Lävan (β2,6-glycosidische Fructose, β-1,2-verzweigt)

dann stärkere Schleimbildung besonders gut; andererseits wird dann auch besonders viel Milchsäure gebildet, welche den Zahnschmelz zerstört. S. salivarius und andere Milchsäurebakterien sind auf diese Weise maßgeblich an der Entstehung von Karies beteiligt. S. salivarius und eng verwandte Stämme spielen auch bei der Herstellung von Joghurt und Sauerkraut eine Rolle. Versuchsziel In diesem Versuch soll Streptococcus salivarius isoliert werden. Es zeichnet sich durch die für Milchsäurebakterien typischen Eigenschaften aus und kann auf kohlenhydrathaltigen Nährmedien, welche die notwendigen Suppline enthalten, leicht angereichert werden. Kolonien von S. salivarius geben sich auf saccharosehaltigen Nährböden durch Schleimbildung zu erkennen.

V36 - S. 183

72

3 Versuche

Versuchsdurchführung Mit Hilfe eines Wattestäbchens wird etwas Zahn- oder Zungenbelag aus dem Mund entnommen und per Wattestäbchen-Ausstrich ( M4, S. 366) flächig auf SaccharoseAgar ausgestrichen. Die Platte wird bei 37 °C inkubiert. Material von einer schleimenden Kolonie wird mit einer sterilisierten Impföse entnommen und in einem Tropfen steriler Saline suspendiert. Entspricht das mikroskopische Bild den Erwartungen (kugelförmige Zellen in Reihen, Streptococcen), erfolgt ausgehend von der Suspension ein DreiStrich-Ausstrich (M4, S. 365) auf einer Glucose-Carbonat-Platte. Die Platte wird bei 37 °C inkubiert.

benötigtes Material Geräte    

Wattestäbchen, Impföse Brutschrank (37 °C) Objektträger und Deckgläser Phasenkontrastmikroskop

Chemikalien und Medien  Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril  Wasserstoffperoxid-Lösung für den Katalasetest ( M14, S. 381)  Saccharose-Festmedium ( S. 425)  Glucose-Carbonat-Festmedium ( S. 415)  Glucose-Carbonat-StichkulturRöhrchen

Nach mikroskopischer Überprüfung erfolgt eine erneute Vereinzelung per Drei-StrichAusstrich (M4, S. 365) auf einer Glucose-Carbonat-Platte. Aufgehellte Bereiche im Bereich der bewachsenen Impfstriche deuten auf Säurebildung (Milchsäure!) hin. Ausgehend von einer Einzelkolonie wird eine Stichkultur (M5, S. 367) in Glucose-Carbonat-Agar angesetzt. Mit dem auf der Platte verbliebenen Bewuchs wird ein Katalasetest durchgeführt (M14, S. 381), der bei erfolgreicher Isolierung eines Milchsäurebakteriums negativ ausfallen sollte. Es sollte eine Positivkontrolle mit Kolonien eines Katalase-positiven Bakteriums durchgeführt werden, z. B. mit einer Spezies der Gattungen Bacillus, Pseudomonas oder mit Micrococcus luteus. Der Bewuchs des Stichkanals dient als Kriterium für die Bewertung des Verhältnisses der Reinkultur zum Luftsauerstoff; es sollte bei erfolgreicher Isolierung des (aerotoleranten!) Milchsäurebakteriums gleichmäßiges Wachstum auftreten. Weiterführende Literatur Hugenholtz J, Kleerebezem M (1999) Metabolic engineering of lactic acid bacteria: overview of the approaches and results of pathway rerouting involved in food fermentations. Current Opinion in Biotechnology 10:492-497 Rhee SK, Song KB, Kim CH, Park BS, Jang EK, Jang KH (2002) Levan. In: Vandamme EJ, De Baets S, Steinbüchel A (eds) Biopolymers – Polysaccharides I. vol 5. Wiley-VCH, Weinheim, pp 351-377 Reed G, Nagodawithana TW In: Rehm HJ, Reed G, Pühler A, Stadler P (eds) (1995) Biotechnology-Enzymes, Biomass, Food and Feed. vol 9, 2nd edn. Wiley-VCH, Weinheim (verschiedene Kapitel),

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

Nachgefragt 1. Zeichnen Sie die Struktur von Milchsäure! 2. Nennen Sie die wichtigsten Gattungen von Milchsäurebakterien! 3. Nennen Sie Eigenschaften, die allen Milchsäurebakterien gemeinsam sind und an denen Sie sofort erkennen können, ob es sich um ein Milchsäurebakterium handelt! 4. Nennen Sie die beiden stoffwechselphysiologischen Gruppen von Milchsäurebakterien und deren Unterschiede bezüglich der Vergärung von Glucose! 5. An welchen Standorten findet man Milchsäurebakterien bevorzugt? 6. Wo kommt Streptococcus salivarius in der Natur vor, und welcher Standort liefert geeignetes Ausgangsmaterial für dessen Anreicherung? 7. Nennen Sie die Zusammensetzung des Mediums, welches Sie zur Anreicherung von Streptococcus salivarius verwendet haben, und beschreiben Sie die Funktion der einzelnen Mediumskomponenten! Erläutern Sie die Begriffe „auxotroph“ und „Supplin“! 8. Fertigen Sie eine Zeichnung von dem typischen Erscheinungsbild einer Suspension von Zellen von Streptococcus salivarius unter dem Lichtmikroskop an! 9. Welches Polysaccharid synthetisiert Streptococcus salivarius, und ausgehend von welcher Kohlenstoffquelle wird es gebildet? 10. Nennen Sie die Stoffwechselprodukte, die in einer Kultur von Streptococcus salivarius in einem Komplexmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle entstehen! Stellen Sie eine stöchiometrische Beziehung von Glucose und den Stoffwechselprodukten her! 11. Welche Lebensmittel werden mit Hilfe von Milchsäurebakterien hergestellt?

12. Nennen Sie die Stoffwechselprodukte, die in einer Kultur von Streptococcus salivarius in einem Komplexmedium mit Saccharose als Kohlenstoffquelle entstehen! Stellen Sie eine stöchiometrische Beziehung von Saccharose und den Stoffwechselprodukten her! 13. Wie ist das Verhältnis von Milchsäurebakterien zum Luftsauerstoff, und wie schützen sich Milchsäurebakterien vor der Einwirkung von Luftsauerstoff? 14. Beschreiben Sie die von der Katalase katalysierte Reaktion! Wie weisen Sie die Anwesenheit dieses Enzyms einfach qualitativ nach? 15. Berechnen Sie, wie viel Milliliter Sauerstoff (O2) aus 1 ml einer 3 % (wt/vol) Lösung von H2O2 durch das Enzym Katalase maximal gebildet werden können! 16. Wie viel Gramm Milchsäure können in einer Kultur von Streptococcus salivarius ausgehend von 10 g Glucose maximal gebildet werden? 17. Warum bilden sich auf einer Glucose-Carbonat Agarplatte um Kolonien von Streptococcus salivarius klare Höfe aus? 18. Sind diese Höfe auf einer Glucose-Carbonat Agarplatte größer um Kolonien von Streptococcus salivarius oder Leuconostoc mesenteroides unter der Annahme, dass beide Bakterien zu gleich großen Kolonien heranwachsen? 19. Welchen Einfluss hat der Einsatz von Milchsäurebakterien auf Qualität, Zusammensetzung und Haltbarkeit von Lebensmitteln? 20. Beschreiben Sie die Beteiligung von Milchsäurebakterien bei der Entstehung von Karies! Wie kann Karies aus mikrobiologischer Sicht vorgebeugt werden?

73

74

3 Versuche

Versuch 11

Anreicherung und Isolierung von Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum Theoretischer Hintergrund

Heterofermentative Milchsäuregärungen V10 - S. 70

OH H3C

C H

O C OH

ilchsäure M

Nachdem wir im vorangegangenen Versuch ein homofermentatives Milchsäurebakterium kennengelernt haben, beschäftigt sich dieser Versuch mit dem heterofermentativen Milchsäurebakterium Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum. Zur heterofermentativen Milchsäuregärung befähigten Bakterien fehlt das Schlüsselenzym des Fructose-1,6-bisphosphat Weges. Anstelle des Enzyms Fructose-1,6-bisphosphat Aldolase sind dort u. a. eine Glucose-6-phosphatDehydrogenase und eine Phosphoketolase vorhanden, und es entstehen zunächst Acetylphosphat und Glycerinaldehyd-3-phosphat. Während Glycerinaldehyd-3-phosphat über Pyruvat durch die bekannten Enzyme zu Milchsäure abgebaut wird, entsteht Ethanol aus Acetylphosphat über Acetyl-CoA und Acetaldehyd ( Abb. 3.23). Einige heterofermentative Milchsäurebakterien können aus Acetylphosphat mit Hilfe einer Acetat-Kinase auch Acetat bilden, wenn es ihnen gelingt, mittels anderer Stoffwechselreaktionen eine ausgeglichene Redoxbilanz zu erreichen. Eine besondere Form der heterofermentativen Milchsäuregärung stellt die von Bifidobacterium bifidum durchgeführte Gärung dar, die energetisch sehr effizient verläuft. Neben Lactat entsteht Acetat ( Abb. 3.24).

Biotechnologische Bedeutung von Milchsäurebakterien

V36 - S. 183

Den Milchsäurebakterien kommt eine außerordentlich große wirtschaftliche Bedeutung zu. In Tabelle 3.18 sind einige wichtige Anwendungsgebiete und und mit diesen Bakterien hergestellte Produkte aufgeführt. Die ohne Zweifel größte Bedeutung haben Milchsäurebakterien im Bereich der Lebensmittelindustrie bei der Konservierung und Veredelung von landwirtschaftlichen Produkten wie Milch, Gemüse, Brot und Fleisch. In der Anfangsphase der Sauerkrautfermentation spielt Leuconostoc mesenteroides eine dominante Rolle. Während die Absenkung des pH Wertes durch Produktion von Milchsäure zur längeren Haltbar-

Abb. 3.22. Schleimbildung durch Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum

Lactat Ethanol CO2

Glucose ADP + 1 Pi

ATP

Abb. 3.23. Heterofermentative Vergärung von Glucose durch Leuconostoc mesenteroides

2 Lactat 3Acetat

2 Glucose 5ADP + 5P

i

5ATP

Abb. 3.24. Vergärung von Glucose durch Bifidobacterium bifidum Tabelle 3.18. bakterien

Bedeutung der Milchsäure-

Konservierung und Veredlung Lebensmitteln • Buttermilch • Joghurt • Käse • Kefir • Kimchi • Salami • Sauerkraut • Sauerteig Weinherstellung • Malo-Lactat-Fermentation Futtermittel • Silage Chemikalien • Milchsäure • Dextran

von

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

75

Fructose S acch ao se r +o lPy(

α-1,6-Glucose)n

Poly(α-1,6-Glucose)n+1

Dextransaccharase Abb. 3.25.

Reaktionsgleichung der Dextran-Saccharase

keit von entsprechend fermentierten Lebensmitteln beiträgt, werden auch Aroma und Geschmack dieser Lebensmittel ganz wesentlich von anderen Stoffwechselleistungen der Milchsäurebakterien beeinflusst. Als Beispiel soll hier lediglich die Fähigkeit vieler Milchsäurebakterien erwähnt werden, das Butteraroma Diacetyl (2,3-Butandion) zu bilden. Die Haltbarmachung landwirtschaftlicher Erzeugnisse betrifft auch Futtermittel wie im Falle der Herstellung von Silage. Selbst bei der Herstellung von Wein spielen Milchsäurebakterien eine Rolle. Im Reifungsprozess wandeln sie bei der spontan einsetzenden oder durch Zugabe von Starterkulturen von Oenococcus oeni initiierten sogenannten Malo-Lactat-Fermentation Äpfelsäure in Milchsäure um. Durch Umwandlung einer stärkeren in eine schwächere Säure wird in diesen Weinen ein überaus saurer Geschmack reduziert. Außerdem wird mit Milchsäurebakterien in großen Mengen Milchsäure produziert. Dieser Prozess gewinnt zunehmend Bedeutung, da mittlerweile effektive Prozesse zur chemischen Polymerisation von Milchsäure zu biologisch abbaubaren Polyestern (Polylactid) für Verpackungsmaterialien zum Einsatz kommen. Das seit vielen Jahren für verschiedene Anwendungen genutzte Polysaccharid Dextran ( Abb. 3.26) wird biotechnologisch mit Leuconostoc mesenteroides produziert. L. mesenteroides bildet kokkenförmige Zellen, die paarweise oder in langen Ketten aneinander gereiht vorliegen. Das Bakterium C H 2 synthetisiert ausgehend von Saccharose O durch die Hexosyltransferase DextransacO H charase ( Abb. 3.25) das ExopolyHO saccharid Dextran; ein Glucan, bei dem die O Glucosereste im Hauptstrang α-1,6-glycosiO H C H 2 disch verknüpft sind. An den Hauptstrang O sind selten weitere Stränge α-1,3-glycosidisch als Verzweigungen gebunden. Die Herstellung von Dextran ist Gegenstand eines HO HO C H 2 O anderen Versuchs im MIKROBIOLOGISCHEN O H PRAKTIKUM. L. mesenteroides kann Dextran O O C H 2 nicht ausgehend von Glucose, sondern nur O H O mit Saccharose synthetisieren. Ist aber genüHO gend Saccharose vorhanden, dann werden so O H große Mengen dieses Polysaccharids als O H HO O Schleim gebildet, dass die Zellen bei lichtmiO H kroskopischer Betrachtung kaum noch zu n finden sind ( Abb. 3.22). In ZuckerfabriAbb. 3.26. Strukturformel von Dextran ken kann dieses auch als „Froschlaichbakterium“ bezeichnete Mikroorganismus durchaus zu Problemen führen, wenn es sich in Saccharose-haltigen Lösungen anreichert, und diese durch Produktion von Dextran in hochviskose Lösungen überführt. Die durch die Dextransaccharase aus Saccharose freigesetzte Fructose dient als Kohlenstoffquelle für die Synthese der Zellbausteine und wird zu Milchsäure, Ethanol und CO2 vergoren. Eine weitere Hexosyltransferase, die Lävansaccharase, hatten wir bereits in einem anderen Versuch kennenlernen.

O O H3C

C

C

Diacetyl E6 - S. 325

V40 - S. 202

Dextran – ein wichtiges Biopolymer

V29 - S. 150

V10 - S. 70

CH3

76

3 Versuche

Versuchsziel Ausgehend von einem kleinen „Sauerkrautansatz“ soll das heterofermentative Milchsäurebakterium Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum angereichert und in Reinkultur gebracht werden. Dieses Bakterium gibt sich auf saccharosehaltigen komplexen Nährboden durch Schleimbildung zu erkennen ( Abb. 3.22). Bei dem Schleim handelt es sich um das Exopolysaccharid Dextran. Versuchsdurchführung Ein kleines Schraubdeckelröhrchen (10 ml Volumen) wird zur Hälfte mit geraspeltem Weißkohl gestopft. Der fest gedrückte Weißkohl wird mit Saccharaose-NaCl-Lösung überschichtet. Das Röhrchen wird mit Deckel versehen (nicht ganz zudrehen) und bei Raumtemperatur inkubiert. Der Sauerkrautansatz wird sensorisch geprüft (typischer Sauerkrautgeruch). Mit der Impföse wird etwas Kulturflüssigkeit per Kreuzausstrich (M4, S. 365) auf FructoseCarbonat-Agar ausgestrichen und bei 30 °C inkubiert. Material von ungefärbten Kolonien wird mit einer sterilisierten Impföse entnommen und jeweils in einem Tropfen steriler Saline suspendiert. Entspricht das mikroskopische Bild den Erwartungen (kugelförmige Zellen in Reihe, Streptococcen), erfolgt ausgehend von der Suspension ein Drei-Strich-Ausstrich (M4, S. 365) auf Saccharose-Agar. Die Platte wird bei 30 °C inkubiert. Reichlich vorhandener Schleim auf dem Bewuchs deutet auf die für L. mesenteroides typische Dextranbildung bei Wachstum auf Saccharose hin. Ein abschließender Katalasetest ( M14, S. 381) sollte erwartungsgemäß negativ ausfallen (Positivkontrolle durchführen, V10, S. 70).

benötigtes Material Geräte     

Impföse Schraubdeckelröhrchen Brutschrank (30 °C) Objektträger und Deckgläser Phasenkontrastmikroskop

Chemikalien und Medien  Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril  Wasserstoffperoxid-Lösung für den Katalasetest ( M14, S. 381)  Saccharose-NaCl-Nährlösung ( S. 425)  Fructose-Carbonat-Festmedium ( S. 414)  Saccharose-Festmedium ( S. 425)

Sonstiges  frischer Weißkohl, geraspelt

Weiterführende Literatur Leathers TD (2002) Dextran. In: Vandamme EJ, De Baets S, Steinbüchel A (eds) Biopolymers – Polysaccharides I. vol 5. Wiley-VCH, Weinheim, pp 299-321 Reed G, Nagodawithana TW (1995) Biotechnology-Enzymes, Biomass, Food and Feed. Vol 9, 2nd edn, Wiley-VCH, Weinheim (verschiedene Kapitel in dieser von Rehm HJ, Reed G, Pühler A und Stadler P herausgegebenen Buchreihe) Stiles ME, Holzapfel WH (1997) Lactic acid bacteria and their current taxonomy. International Journal of Food Microbiology 36:1-29 Maicas S (2001) The use of alternative technologies to develop malolactic fermentation in wine. Applied Microbiology and Biotechnology 56:35-39

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

77

Nachgefragt 1. Zeichnen Sie die Strukturformel von Milchsäure! 2. Nennen Sie die wichtigsten Gattungen von Milchsäurebakterien! 3. An welchen Eigenschaften eines Bakterienisolates erkennen Sie sofort, ob es sich um ein Milchsäurebakterium handelt? 4. Wie unterscheiden sich homofermentative und heterofermentative Milchsäurebakterien hinsichtlich der Gärungsprodukte und der für den Abbau von Glucose vorhandenen Stoffwechselwege? 5. An welchen Standorten findet man Milchsäurebakterien bevorzugt? 6. Wo kommt Leuconostoc mesenteroides in der Natur vor, und welcher Standort liefert geeignetes Ausgangsmaterial für dessen Anreicherung? 7. Nennen Sie Zusammensetzung des Mediums, welches Sie zur Anreicherung von Leuconostoc mesenteroides verwendet haben, und beschreiben Sie die Funktion der einzelnen Mediumskomponenten! 8. Fertigen Sie eine Zeichnung von dem typischen Erscheinungsbild einer Suspension von Zellen von Leuconostoc mesenteroides unter dem Lichtmikroskop an! 9. Konnten Sie Katalase in Leuconostoc mesenteroides nachweisen? 10. Welches Polysaccharid synthetisiert Leuconostoc mesenteroides, und ausgehend von welcher Kohlenstoffquelle wird es gebildet? Nennen Sie Methoden zum einfachen Nachweis dieses Polysaccharids! 11. Warum produziert die Industrie dieses Polysaccharid? Nennen Sie Anwendungen und Produkte! 12. Nennen Sie die Stoffwechselprodukte, die in einer Kultur von Leuconostoc mesenteroides in einem Komplexmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle entstehen! Stellen Sie eine stöchiometrische Beziehung von Glucose und den Stoffwechselprodukten her!

13. Nennen Sie die Stoffwechselprodukte, die in einer Kultur von Leuconostoc mesenteroides in einem Komplexmedium mit Saccharose als Kohlenstoffquelle entstehen! Stellen Sie eine stöchiometrische Beziehung von Saccharose und den Stoffwechselprodukten her! 14. Beschreiben Sie die biochemische Reaktion der von dem Enzym Katalase katalysierten Reaktion und wie Sie die Anwesenheit dieses Enzyms einfach qualitativ nachweisen können! 15. Versuchen Sie einen Stoffwechselweg zur Umwandlung von Äpfelsäure in Milchsäure mit ausgeglichener Redoxbilanz aufzuzeigen, wie er in Oenococcus oeni ablaufen könnte! 16. Wie viel Gramm Milchsäure können in einer Kultur von Leuconostoc mesenteroides ausgehend von 10 g Glucose maximal gebildet werden? 17. Sie haben Leuconostoc mesenteroides in 1 l Komplexmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle kultiviert und weisen am Ende des Experiments Milchsäure in einer Konzentration von 100 mM nach. Wie viel Gramm Glucose müssen zu Beginn mindestens vorgelegen haben? 18. Sind die klaren Höfe, die sich auf einer GlucoseCarbonat Agarplatte um Kolonien von Milchsäurebakterien herum ausbilden, mit Streptococcus salivarius oder mit Leuconostoc mesenteroides größer? 19. Erstellen Sie eine Liste von Lebensmitteln, die durch die Fermentation von Agrarprodukten mit Milchsäurebakterien hervorgegangen sind oder an deren Entstehung Milchsäurebakterien beteiligt waren! 20. Neben der Konservierung von Lebensmitteln durch Absenkung des pH Wertes verändern andere Stoffwechselprodukte von Milchsäurebakterien zusätzlich die Qualität von fermentierten Lebensmitteln! Welche?

Anreicherung und Isolierung von Propionibacterium sp.

Versuch 12

Theoretischer Hintergrund Tabelle 3.19. Typische Eigenschaften von Propionsäurebakterien • Gram-positiv • unbeweglich • charakteristisches Gärungsprodukt: Propionsäure • charakteristische Substrate: Milchsäure, Glucose, Alanin, Bernsteinsäure • häufig mikroaerotolerant • Standorte: Intestinaltrakt von Wiederkäuern, Haut, Schweizer Käse

Propionsäure entsteht durch Gärung, und zur Propionsäuregärung befähigte Bakterien bezeichnet man als Propionibakterien ( Tabelle 3.19). Alle Vertreter der Gattung Propionibacterium bilden Propionsäure; daneben kommt Propionsäure in einer Reihe anderer ausschließlich Gram-positiver Bakterien als Gärungsprodukt vor ( Tabelle 3.20). Die Propionsäuregärung bezeichnet man als sekundäre Gärung, da hierbei die aus primären Gärungen entstandene Milchsäure als Substrat verwendet und weiter verstoff-

Eigenschaften und Verbreitung

H H H

C

C

H H

O C OH

Propionsäure V10 - S. 70 V11 - S. 74

78

3 Versuche

wechselt wird. Einige Propionsäurebakterien können auch das z. B. bei der FumaratAtmung entstandene Succinat als Substrat verwenden. Typische Standorte von Propionsäuebakterien sind deshalb anaerob: Diese Bakterien kommen z. B. im Pansen und Darm von Wiederkäuern, auf der Haut in den Haarfollikeln und im Schweizer Käse vor. Drei Wege der Propionsäuregärung

Propionsäure kann durch drei unterschiedli- Tabelle 3.20. Drei Wege der Propionche Stoffwechselwege gebildet werden. Der säuregärung verbreitetste Weg ist der MethylmalonylCoA Weg und kommt bei allen Vertretern Methylmalonyl-CoA Weg der Gattung Propionibacterium sowie in Propionibacterium freudenreichii Veillonella parvula (früher: Veillonella alcale- Propionibacterium acnes parvula scens) und Selenomonas ruminantium vor. Veillonella Selenomonas ruminatium Viele dieser Propionsäurebakterien können Weg auch Kohlenhydrate über den Fructose- Acrylyl-CoA Clostridium propionicum 1,6-bisphosphat-Weg zu Pyruvat vergären. Prevotella ruminicola Aus der Glycolyse oder durch eine Lactat- Megasphaera elsdenii Dehydrogenase aus Milchsäure entstandenes Decarboxylierung von Succinat Pyruvat wird dabei zunächst durch eine Bio- Propionigenium modestum tin-abhängige Transcarboxylase zu Oxalessigsäure carboxyliert. Oxalessigsäure wird dann in Succinyl-CoA umgewandelt. Die Reaktionen hierfür sind z. T. aus dem Citronensäurezylus bekannt mit der Ausnahme, dass die nahezu irreversible Succinat-Dehydrogenase durch eine Fumarat-Reduktase und die Succinat Thiokinase durch eine Propionat CoA-Transferase ersetzt sind. Succinyl-CoA wird dann über die (R)- und (S)-Stereoisomere von Methylmalonyl-CoA in Propionyl-CoA umgewandelt. Eine Vitamin B12-abhängige Methylmalonyl-CoA Mutase und eine Methylmalonyl-CoA Epimerase katalysieren die ersten beiden Schritte. Im letzten Schritt wird dann die Carboxylgruppe von Methylmalonyl-CoA auf die oben bereits erwähnte Transcarboxylase und hiervon auf Pyruvat übertragen. Im allerletzten Schritt entsteht schließlich aus Propionyl-CoA freie Propionsäure, wobei CoA durch die Propionat-CoATransferase auf Succinat übertragen wird. Um ausgehend von Milchsäure eine ausgeglichene Redoxbilanz erreichen zu können, ist es erforderlich, dass ein Teil des Pyruvats durch die in diesen Bakterien immer vorhandene Pyruvat:Ferredoxin-Oxidoreductase zu Acetyl-CoA und CO2 oxidiert wird. Aus Acetyl-CoA entsteht durch die Phosphotransacetylase und die Acetat-Kinase über Acetyl-Phosphat Acetat; hierdurch ist die Möglichkeit zur Synthese von zusätzlichem ATP durch Substratketten-Phosphorylierung gegeben. Durch Decarboxylierung von Pyruvat entstandenes CO2 ist für die Ausbildung der großen Löcher im Emmentaler Käse verantwortlich. Weit weniger verbreitet ist der Acrylyl-CoA 2 Propionat Weg, der in Clostridium propionicum, Prevo- 3 Alanin CO2 + 3 NH4+ O 2 H 2 tella ruminicola (früher: Bacteroides ruminiAcetat cola) und Megasphaera elsdenii nachgewiesen Abb. 3.27. Vergärung von Alanin durch wurde. Auch hier geht die Synthese von Pro- Clostridium propionicum pionsäure von Milchsäure aus, welche zunächst durch das Enzym Lactat-CoATansferase zu Lactyl-CoA aktiviert wird. Durch Abspaltung von H2O entsteht mittels einer Lactyl-CoA Dehydratase zunächst Acrylyl-CoA, welches durch das Enzym Propionyl-CoA Dehydrogenase zu Propionyl-CoA reduziert wird und aus dem dann Propionsäure freigesetzt wird. C. propionicum kann auf dieses Weise auch die Aminosäure Alanin über Pyruvat und Lactat zu Propionsäure vergären ( Abb. 3.27). Darüber hinaus entsteht Propionsäure durch Decarboxylierung von Succinat in Propionigenium modestum. Dabei wird ein Natrium-Ion aus dem Cytoplasma über die Cytoplasma-

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

79

membran nach außen transportiert und hierdurch ein Natriumgradient aufgebaut. Dieser Natriumgradient wird von einer Na+-abhängigen, in der Cytoplasmamembran lokalisierten ATP-Synthase zur Synthese von ATP genutzt. Neben Protonengradienten, die während aerober oder anaerober Atmungen oder durch die lichtgetriebene Protonenpumpe der Purpurmembran extrem halophiler Archaea aufgebaut werden, können also auch Na+-Gradienten zur Synthese von ATP aus ADP und Pi genutzt werden. Propionibakterien haben auch eine biotechnologische Bedeutung. Schweizer Käse (Emmentaler,  Abb. 3.28) und anderen ähnlichen Käsetypen (Maasdamer, Jarlsberger) verleihen sie ihren typischen Geschmack und sind dort für die Bildung der großen Löcher verantwortlich. Auch bei der Herstellung von Gouda sind Propionsäurebakterien beteiligt. Sie gelangen durch Zugabe von „Labferment“ aus Kälbermägen oder durch Abb. 3.28. Emmentaler Käse Starterkulturen in die Käserohmasse. Von Propionsäure geht eine antimikrobielle Wirkung aus. Sie wurde daher früher als Konservierungsstoff für Lebensmittel verwendet und war als Zusatzstoff E280 zugelassen. Cyanocobalamin (Vitamin B12) ist neben Riboflavin (Vitamin B2) und Ascorbinsäure (Vitamin C) eines von drei Vitaminen, die bereits biotechnologisch produziert werden. Zur Produktion der ca. 20 Jahrestonnen Vitamin B12 wird entweder Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii oder Pseudomonas denitrificans herangezogen. Darüber hinaus gibt es unter den Propionibakterien auch pathogene Vertreter; Propionibacterium acnes ist als Erreger der Akne bekannt. Versuchsziel In diesem Versuch sollen ausgehend von Emmentaler-Käse Propionsäure-Bakterien mit Milchsäure als Kohlenstoffquelle angereichert und in Reinkultur gebracht werden. Versuchsdurchführung benötigtes Material Geräte       

50 ml Schraubdeckelflasche Messer oder Skalpell Eisbad Brutschrank (30 °C) lange Pasteurpipette Objektträger und Deckgläser Phasenkontrastmikroskop

Chemikalien und Medien  Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril  Propionibakterien-Nährlösung  Lactat-Festmedium ( S. 417)

Sonstiges  frischer Emmentaler Käse

In eine 50 ml-Schraubdeckelflasche wird ein Krümel Emmentaler Käse (ca. 3 mm Kantenlänge) als Impfgut gegeben. Die Flasche wird komplett mit Propionibakterien-Nährlösung gefüllt und mit locker aufliegendem Deckel bei 30 °C als Standkultur inkubiert. Die Anreicherungskultur wird sensorisch geprüft und auf Trübung und Gasbildung untersucht. Zur Vereinzelung wird eine Verdünnungsreihe in Lactat-Agar als AgarSchüttelkultur (M4, S. 364) angesetzt. Die ausgehärteten Röhrchen werden bei 30 °C inkubiert. Die Kolonien werden bezüglich Lage, Farbe, Form und Gasbildung makroskopisch bewertet. Zur Herstellung eines mikroskopischen Präparats einer Einzelkolonie muss zunächst die Agarsäule aus dem Röhrchen

Biotechnologische und medizinische Bedeutung

80

3 Versuche

herausgeholt werden. Dazu eignet sich eine lange Pasteurpipette, über die – angeschlossen an eine Druckluftquelle – ein mäßig starker Luftstrom auf den Grund des Röhrchens gebracht wird; die Agarsäule lässt sich auf diese Weise recht elegant in eine bereitliegende Petrischale befördern (Vorsicht, nicht zu viel Druck vorgeben!). Mit Hilfe eines Skalpells wird eine separat liegende Kolonie herauspräpariert und in wenig Saline suspendiert. Form, Beweglichkeit und Größe der Zellen werden im Phasenkontrast bewertet. Weiterführende Literatur Buckel W (2001) Sodium ion-translocating decarboxylases. Biochimica et Biophysica Acta – Bioenergetics 1505:15-27 Chamba JF (2000) Emmental cheese; a complex microbial ecosystem. Consequences on selection and use of starters. Sciences des Aliments 20:37-54 Martens JH, Barg H, Warren MJ, Jahn D (2002) Microbial production of vitamin B12. Applied Microbiology and Biotechnology 58:275-285 Piveteau P (1999) Metabolism of lactate and sugars by dairy propionibacteria: a review. Lait 79:23-41

Nachgefragt 1. Zeichnen Sie die Strukturformel von Propionsäure! 2. Welche Eigenschaften besitzt Propionsäure, und wozu wird sie in der Lebensmitteltechnologie eingesetzt? 3. Welche Kohlenstoffquelle verwenden Propionsäurebakterien bevorzugt und woher stammt diese? 4. Beschreiben Sie die Zellformen von Propionsäurebakterien! 5. Nennen Sie typische Eigenschaften von Propionsäurebakterien! 6. Nennen Sie drei natürliche Standorte von Propionsäurebakterien, aus denen Sie diese auch leicht anreichern können! 7. Was versteht man unter primären und sekundären Gärungen? Zu welcher Gruppe gehört die Propionsäuregärung? 8. Nennen Sie die drei Stoffwechselwege, durch die Propionsäure gebildet wird, und nennen Sie typische Vertreter von Propionsäurebakterien, die über die entsprechenden Stoffwechselwege verfügen! 9. Auf welche Stoffwechselaktivität der Propionsäurebakterien sind die großen Löcher im Schweizer Käse zurückzuführen? 10. Welches Enzym besitzen Propionsäurebakterien für die oxidative Decarboxylierung von Pyruvat? In welchen anderen Bakterien kommt dieses Enzym ebenfalls vor?

11. Warum kann es keine „Homopropionatgärung“ ausgehend von Milchsäure geben? 12. Welche anderen Gärungsprodukte entstehen meist zusätzlich zur Propionsäure? 13. Beschreiben Sie die Umsatzgleichung der Vergärung von Lactat in Propionsäurebakterien, die über den Methylmalonyl-CoA-Weg verfügen, und berechnen Sie, wie viel Gramm Propionsäure aus 100 g Milchsäure dabei maximal entstehen können! 14. Welche Coenzyme sind an der Propionsäuregärung beteiligt? 15. Nennen Sie die Substratkettenphosphorylierungen, mit denen Propionibacterium freudenreichii Energie in Form von ATP gewinnen kann! 16. Wie erzeugt Propionigenium modestum Energie in Form von ATP? 17. Nennen Sie andere Bakterien und Gärungen, bei denen ein ähnlicher Mechanismus der ATP-Synthese vorkommt! 18. Beschreiben Sie das Verhältnis von Propionibacterium sp. zum Luftsauerstoff! 19. Nennen Sie ein pathogenes Propionsäurebakterium! Für welche Erkrankung ist es maßgeblich verantwortlich? 20. Welches biotechnologische Produkt wird mit Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii hergestellt?

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

Anreicherung und Isolierung von aeroben N2-Fixierern (Azotobacter sp.)

81

Versuch 13

Theoretischer Hintergrund Die biologische Stickstofffixierung ( Abb. 3.29) ist nicht nur von wissenschaftlichem Interesse, sondern sie hat auch eine große ökologische und ökonomische Bedeutung. Es wird geschätzt, dass jedes Jahr global ca. 140 Millionen Tonnen Stickstoff in terrestrischen Ökosystemen und weitere ca. 40 Millionen Tonnen in marinen Ökosystemen fixiert werden. Damit liefert die biologische Stickstofffixierung ungefähr doppelt so viel fixierten Stickstoff wie die chemische Industrie mit dem Haber-Bosch-Verfahren.

Bedeutung der N2-Fixierung

Zur biologischen Stickstofffixierung sind ausschließlich Prokaryonten befähigt; dort ist sie allerdings weit verbreitet und kommt in unterschiedlichen physiologischen und phylogenetischen Bakteriengruppen vor ( Tabelle 3.21). Die Stickstofffixierung kann durch freilebende Bakterien sowie durch endosymbiontisch oder ektosymbiontisch mit höheren Organismen lebenden Bakterien erfolgen. In diesem Versuch soll ein aerobes, freilebendes zur N2Fixierung befähigtes Bakterium angereichert werden. Mit einem anaeroben freilebenden sowie mit symbiontisch N2-fixierenden Bakterien beschäftigen wir uns an anderen Stellen im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM.

Verbreitung

Das Schlüsselenzym der biologischen Stickstofffixierung ist die Nitrogenase. + Diese katalysiert die Reduktion von N2 zu N2 +8H +8e 2NH +H NH4+ und benötigt hierfür und für die Auf1 4T -2 6 PA hebung der in der Dreifachbindung von N2 steckenden Dissoziationsenergie von 940 kJ/ Abb. 3.30. Nettoumsatz der Nitrogenasemol ca. 16 bis 24 mol ATP ( Abb. 3.30). Reaktion Durch Reduktion von Protonen tritt als Nebenprodukt stets molekularer Wasserstoff (H2) auf. Auch Acetylen wird durch Nitrogenasen reduziert, wobei Ethylen entsteht. Diese Nebenreaktion wird zur Bestimmung der Enzymaktivität von Nitrogenasen genutzt. Nitrogenasen sind sehr kompliziert aufgebaute Enzyme. Die Nitrogenase ist in Wahrheit ein sich aus den Enzymen „Dinitrogenase“ und „Dinitrogenase Reduktase“ zusammensetzender Enzymkomplex ( Abb. 3.31). Die Dinitrogenase enthält Eisen, während die Dinitrogenase-Reduktase bei den meisten Nitrogenassen einen Eisen-Molybdän-Cofaktor enthält. Es gibt aber auch Nitrogenasen, bei denen nur

Nitrogenase

0

N2

Stic kst of xie ffi g run

N2O

Assimilation

NH2OH - III

- III

NH4

Norg

+

NO HNO

NH2OH

NO2NO2NO3-

aerob anaerob

Abb. 3.29. Die Stickstofffixierung im Kontext des Stickstoffkreislaufs.

Tabelle 3.21. Beispiele für freilebende, aerobe und fakultativ anaerobe N2-Fixierer Alcaligenes latus Anabaena variabilis Azotobacter chroococcum Azotobacter vinelandii Citrobacter freundii Derxia gummosa Gluconacetobacter diazotrophicus Klebsiella pneumoniae Mycobacterium flavescens Nostoc punctiforme Paenibacillus polymyxa Streptomyces thermoautotrophicus Xanthobacter autotrophicus

4A -2 6 1 P+1 D 4P -2 6

i

3

2

N N Stickstoff

D1 - S. 327

V14 - S. 85

82

3 Versuche O N2

S CoA + CO2

H3C

FlavodoxinRed

Acetyl-CoA

Dinitrogenase ReduktaseOx

DinitrogenaseRed

Dinitrogenase ReduktaseRed

DinitrogenaseOx

Pyruvat-Flavodoxin Oxidoreduktase O

H3C

COOH + HS-CoA Pyruvat

Abb. 3.31.

FlavodoxinOx

2 NH3

Reaktionen des Nitrogenase Enzymkomplexes

Eisen oder statt Molybdän Vanadium vorhanden sind. Darüber hinaus sind weitere Proteine, Cofaktoren und Coenzyme an komplizierten Reaktionen und der Übertragung der Elektronen auf N2 beteiligt. Sauerstoffempfindlichkeit der Nitrogenase V14 - S. 85

V31 - S. 157

D1 - S. 327

Bis auf das Enzym von Streptomyces thermoautotrophicus sind alle Nitrogenasen extrem sauerstoffempfindlich, da deren aktive Zentren durch Oxidation mit O2 inaktiviert werden. Für anaerobe Bakterien stellt die Sauerstoffempfindlichkeit kein Problem dar. Aerobe Bakterien, die Sauerstoff für die Atmung benötigen, stehen jedoch vor einem Dilemma. Als Ausweg hieraus haben aerobe Bakterien unterschiedliche Strategien entwickelt, um in Gegenwart von Sauerstoff Stickstoff fixieren zu können ( Tabelle 3.22). Ein Schutzmechanismus besteht in der Ausbildung dicker Zellwände mit Kapseln. Bei Azotobacter sp. ist die Zelle von einer dicken, überwiegend aus dem Polysaccharid Alginat bestehenden Kapsel umgeben; diese stellt einen Diffusionsbarriere für Sauerstoff dar und bewirkt, dass im Cytoplasma ein deutlich niedrigerer Sauerstoffpartialdruck als außerhalb der Zelle herrscht. Für Azotobacter sp. und einige andere Bakterien wurde eine erhöhte Atmungsrate nachgewiesen; hierdurch soll der Sauerstoffpartialdruck in der Zelle ebenfalls erniedrigt werden.

Tabelle 3.22. Mechanismen zum Schutz der Nitrogenase vor Sauerstoff Diffusionsbarrieren Schleimkapseln oder besondere Zellwände behindern die Diffusion von O2 Respirationssschutz Erniedrigung des O2-Partialdrucks durch erhöhte Atmung Zelldifferenzierung Trennung von oxygener Photosynthese und N2-Fixierung Sauerstofftransportproteine Proteine stellen eine niedrige, aber ausreichende Versorgung mit O2 sicher Schutzproteine Stabilisierung der Nitrogenase Ausbildung von Zellaggregaten Lokale Verringerung des O2-Partialdrucks Negative Aerotaxis Bewegliche Bakterien entfernen sich von Orten hohen O2-Partialdrucks

In fädigen Cyanobakterien findet die Stickstofffixierung in besonders differenzierten Zellen, den Heterocysten statt. Heterocysten besitzen im Gegensatz zu den anderen Zellen nur das Photosystem I und betreiben deshalb keine oxygene Photosynthee; außerdem sind die Zellwände der Hete3.32. Das Cyanobacterium Anabaerocysten von einer dicken, aus Glycolipiden Abb. na cylindrica mit Heterocyste bestehenden Schicht umgeben ( Abb. 3.32). Ein weiterer Schutzmechanismus ist bei den in Leguminosen endosymbiontisch lebenden Arten der Rhizobien realisiert: Zum einen behindert der Cortex der Wurzelknöllchen die Diffusion von Sau-

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

83

erstoff zu den als Bacteroide bezeichneten Endosymbionten, zum anderen werden die Bacteroide durch das gemeinsam von Bakterium und Pflanze synthetisierte Sauerstofftransportprotein „Leghämoglobin“ wohldosiert mit Sauerstoff versorgt. Darüber hinaus bieten die Ausbildung von Zellaggregaten oder negative Aerotaxis Möglichkeiten eines Schutzes vor zu hohen Sauerstoffkonzentrationen. Es sollte betont werden, dass nicht an allen natürlichen Standorten 20 % O2 in der Gasphase vorhanden sind. Vertreter der Gattung Azotobacter sind aerobe, meist chemoorganotrophe Bakterien; einige von ihnen sind zur frei lebenden Stickstoff-Fixierung befähigt. Diese können aus Bodenproben leicht angereichert werden, wenn man geringe Mengen Erde in einem mineralischen Medium, welches Stickstoff nicht in gebundener Form enthalten darf, in einen Erlenmeyerkolben gibt, und diesen aerob, aber ruhig stehend inkubiert. Mit Mannit als Kohlenstoffquelle reichern sich dann nach wenigen Tagen an der Oberfläche des Mediums in einem Film Bakterien an. Wird hieraus ein Ausstrich auf Agarmedium durchgeführt, bilden sich Abb. 3.33. Tusche-Kontrastierung der Alschleimige Kolonien, an denen man bei ginat-Kapsel von Azotobacter chroococcum mikroskopischer Betrachtung dann fast immer paarweise zusammen liegende kurze stäbchenförmige Zellen findet, die von einer relativ dicken, aus Polysacchariden bestehenden Schleimkapsel umgeben sind. Meist findet man in Zellen von Azotobacter sp. Einschlüsse von Poly(3HB). Versuchsziel benötigtes Material Geräte  100 ml Erlenmeyerkolben mit passender Alukappe oder Aluminiumfolie  Brutschrank (30 °C)  Objektträger und Deckgläser  Phasenkontrastmikroskop

Chemikalien und Medien  Mannit-Nährlösung ( S. 419)  Mannit-Festmedium ( S. 419)  Benzoat-Festmedium ( S. 411)

Sonstiges  getrocknete Gartenerde

In diesem Versuch sollen stickstofffixierende Vertreter der Gattung Azotobacter angereichert werden. Dabei gibt sich Azotobacter chroococcum auf Benzoat-Agar durch die Ausbildung eines dunklen Pigments und auf Mannit-Agar durch die Bildung einer ausgeprägten, aus Alginat bestehenden Schleimkapsel zu erkennen. Versuchsdurchführung Ein 100 ml-Erlenmeyerkolben wird mit 15 ml Mannit-Nährlösung versetzt. Die Beimpfung geschieht durch Zugabe einer Spatelspitze getrockneter Gartenerde. Der mit einer Alukappe bedeckte Kolben wird bei 30 °C im Dunklen inkubiert (nicht schütteln!).

Die Oberfläche der Kultur wird zunächst auf Kahmhautbildung untersucht (heftige Bewegungen vermeiden). Von der Kahmhaut wird mit der Impföse etwas Material entnommen und per Kreuzausstrich ( M4, S. 365) jeweils auf Mannit- und Benzoat-Agar gebracht. Inkubation wie oben.

Azotobacter sp.

V32 - S. 161 V53 - S. 273

84

3 Versuche

Abschließend wird eine makroskopische und mikroskopische Betrachtung des Plattenbewuchses durchgeführt. In Abhängigkeit von der Zusammensetzung der Nährmedien bilden ältere Kolonien von einigen Stämmen aus jeder Azotobacter-Spezies wasserlösliche und -unlösliche dunkel gefärbte Pigmente (braun bis schwarz). Die Bildung eines diffusiblen braun-schwarzen Pigments auf Benzoat-Agar ist typisch für Vertreter der Spezies A. chroococcum. Zur Sichtbarmachung der Schleimkapseln werden mikroskopische Tuschepräparate angefertigt (M11, S. 376;  Abb. 3.33). Weiterführende Literatur Marchal K, Vanderleyden J (2000) The „oxygen paradox“ of dinitrogen-fixing bacteria. Biology and Fertility of Soils 30:363-373 Martinez-Romero, E (2000) Dinitrogen-Fixing Prokaryotes. In: Dworkin M (ed) The Prokaryotes (elektronische Version: http://link.springer.de/link/service/books/10125, Release 3.3 vom 8.9.2000) Springer, New York Ribbe M, Gadkari D, Meyer O (1997) N2 fixation by Streptomyces thermoautotrophicus involves a molybdenum dinitrogenase and a manganese-superoxide oxidoreductase that couple N2 reduction to the oxidation of superoxide produced from O2 by a molybdenum CO dehydrogenase. Journal of Biological Chemistry 272:26627-26633 Tamagnini P, Axelsson R, Lindberg P, Oxelfelt, Wunschiers R, Lindblad P (2002) Hydrogenases and hydrogen metabolism of cyanobacteria. Microbiology and Molecular Biology Reviews 66:1-20

Nachgefragt 1. Zeichnen Sie die typische Zellform von Azotobacter sp., wie sie bei der Betrachtung im Lichtmikroskop sichtbar ist! 2. Beschreiben Sie die Methode, mit der im Versuch die Schleimkapsel von Azotobacter sichtbar gemacht wurde! Wie dick ist diese Schleimkapsel im Vergleich zum Durchmesser der Zellen? 3. Warum unterscheiden sich auf Benzoat-Agar gewachsene Zellen von auf Mannit-Agar gewachsenen Zellen hinsichtlich der Schleimkapsel? 4. Aus welcher Substanz besteht die Schleimkapsel von Azotobacter sp. hauptsächlich? 5. Konsultieren Sie Lehrbücher der organischen Chemie und beschreiben Sie die chemische Struktur von Melanin! 6. Welchen intrazellulären Speicherstoff akkumulieren Vertreter der Gattung Azotobacter häufig? 7. Nennen Sie mindestens sechs weitere Bakterienspezies aus verschiedenen Gattungen, die frei lebend zur Fixierung von molekularem Stickstoff befähigt sind! 8. Nennen Sie Bakterien, die in Symbiose mit höheren Organismen Stickstoff fixieren! 9. Wie müssen Sie bei einer Anreicherung vorgehen, um Bakterien anzureichern, die Stickstoff fixieren können? 10. Nennen Sie möglichst viele unterschiedliche Verbindungen, die in Nährmedien als Stickstoffquelle dienen können!

11. Zeichnen Sie die Strukturformel von N2, aus der auch die Art der Bindung hervorgeht! 12. Schreiben Sie die Umsatzgleichung der von der Nitrogenase katalysierten Reaktion auf! Welche anderen Reaktionen kann die Nitrogenase noch katalysieren? 13. Wieviel Energie in Form von ATP wird pro Mol fixiertem N2 in etwa benötigt? 14. Vergleichen Sie die Reaktionsbedingungen, welche die Nitrogenasen aus Bakterien üblicherweise benötigen, mit denen der chemischen Stickstofffixierung nach dem Haber-Bosch Verfahren! 15. Aus welchen Untereinheiten ist die Nitrogenase aufgebaut? 16. Warum ist die Stickstofffixierung sauerstoffempfindlich? 17. Welche Strategien haben aerobe Stickstofffixierende Bakterien entwickelt, um dennoch Stickstoff fixieren zu können? 18. Beschreiben Sie, was mit dem aus N2 entstandenem NH4+ weiter geschieht! 19. Wie nutzt man die biologische Stickstofffixierung in der Landwirtschaft? 20. Wie müssen die Kultivierungsbedingungen beschaffen sein, damit für die Kultivierung von Azotobacter sp. Benzoat als Kohlenstoffquelle eingesetzt werden kann?

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

Anreicherung und Isolierung von anaeroben N2-Fixierern (Clostridium pasteurianum)

85

Versuch 14

Theoretischer Hintergrund 0

N2

Stic kst of g run x ie ffi

N2O

Assimilation

NH2OH NO

- III

- III

NH4+

Norg.

HNO

NH2OH

NO2NO2-

aerob anaerob

NO3-

Abb. 3.34. Die Stickstofffixierung im Kontext des Stickstoffkreislaufs.

Tabelle 3.23. N2-Fixierer innerhalb der Gattung Clostridium C. aceticum C. acetobutylicum C. acidisoli

C. akagii C. beijerinckii C. pasteurianum

Tabelle 3.24. Strikt anaerobe N2-fixierende Bakterien außerhalb der Gattung Clostridium Desulfonema limicola Desulfovibrio gigas Desulfobacter curvatus Chlorobium tepidum Marichromatium purpuratum (früher: Chromatium purpuratum) Rhodospirillum rubrum Rhodobacter capsulatus Rhodobacter sphaeroides Methanococcus maripaludis Methanosarcina mazei Heliobacterium gestii Heliobacterium chlorum Heliobacillus mobilis Heliophilum fasciatum

Trotz des enorm hohen Energieverbrauchs der Nitrogenase und des relativ geringen Energiegewinns, der unter anaeroben Bedingungen durch Vergärung von Kohlenhydraten zu erzielen ist, erfolgt auch unter anaeroben Bedingungen eine Fixierung von Stickstoff ( Abb. 3.34). Dies soll mit diesem Versuch demonstriert werden, welcher fast immer sicher zur Anreicherung von Clostridium pasteurianum führt. Sergej Winogradsky wies mit diesem Bakterium 1895 erstmals die Fixierung von Stickstoff in einem frei lebenden Bakterium nach, und L.E. Mortenson entdeckte dort 1972 Ferredoxin. Heute geht man davon aus, dass C. pasteurianum im Boden im Hinblick auf die anaerobe Stickstofffixierung die größte Bedeutung zukommt.

Anaerobe N2-Fixierung

C. pasteurianum ist nicht der einzige Vertreter der Gattung Clostridium, der zur Fixierung von Stickstoff befähigt ist. In Tabelle 3.23 sind einige weitere Spezies aufgeführt. Auch außerhalb der Gattung Clostridium kommt Stickstofffixierung in frei lebenden anaeroben Bakterien vor ( Tabelle 3.24). Fixierung von Stickstoff wurde nachgewiesen in Desulfurikanten, in allen Gruppen der anoxygenen phototrophen Bakterien außer in Chloroflexus, methanogenen Bakterien und Archaea. Eine symbiontische Fixierung von Stickstoff durch strikt anaerobe Bakterien erfolgt wahrscheinlich durch methanogene Bakterien im Verdauungstrakt von Termiten.

Organismen

Vertreter der Gattung Clostridium sind obligat anaerobe und gärende, Gram-positive, durch peritriche Begeißelung bewegliche stäbchenförmige Bakterien, die thermoresistente Endosporen bilden. Man unterscheidet saccharolytische Clostridien, die Kohlenhydrate vergären, peptolytische oder proteolytische Clostridien, die Proteine bzw. deren Spaltprodukte vergären, und Spezialisten, die spezielle Substrate vergären können. Daneben gibt es eine Gruppe, die sowohl saccharolytisch als auch proteoly-

Eigenschaften der Clostridien

1.4.3, S. 12

V8 - S. 62

86

3 Versuche

tisch ist. Das mesophile Bakterium C. pasteurianum gehört zur großen Gruppe der saccharolytischen Clostridien. C. pasteurianum vermag eine Vielzahl von Kohlenhydraten, nicht jedoch Stärke zu vergären. Glucose wird dabei über den Embden-MeyerhofWeg zu Pyruvat abgebaut, welches durch eine Pyruvat:Ferredoxin-Oxidoreduktase in Acetyl-CoA und CO2 mit einhergehender Reduktion von Ferredoxin gespalten wird. Ausgehend von Acetyl-CoA werden dann die Gärungsprodukte gebildet. Als Gärungsprodukte entstehen dabei Butyrat, Acetat, Aceton, Butanol, CO2 und H2. Die in C. pasteurianum an der Stickstofffixierung beteiligten Proteine werden auch heute noch intensiv untersucht, und C. pasteurianum ist gewissermaßen der Modellorganismus für die anaerobe Stickstofffixierung. Granulose

V42 - S. 212

Anreicherungs bedingungen

C. pasteurianum bildet relativ große stäbchenförmige Zellen mit einer terminal liegenden Endospore. Charakteristisch ist die Akkumulation eines als „Granulose“ bezeichneten, stärkeähnlichen Glucans als Speicherpolysaccharid in den Zellen. Diese Granulose lässt sich mit Lugolscher Lösung anfärben. Besonders nach dieser Anfärbung sehen die Zellen wie brennende Zigarren aus, mit der Endospore als „Glut“ ( Abb. 3.35).

Abb. 3.35. Clostridium pasteurianum im Phasenkontrast mit Endosporen

Die Selektionsbedingungen, die hauptsächlich zur Anreicherung und Isolierung von Stämmen dieser Spezies führen, sind die folgenden: • Getrocknete Erde als Impfmaterial • Pasteurisierung • anaerobe Bebrütung • Nährmedium ohne gebundenen Stickstoff • hohe Saccharose-Konzentration (15 %, wt/vol) Versuchsziel In diesem Versuch soll das anaerobe sporenbildende Bakterium Clostridium pasteurianum in einem speziellen Medium und durch Pasteurisieren angereichert werden. In einer homogenen Suspension von Zellen dieses Bakteriums wird der Speicherstoff „Granulose“ durch Färbung mit Lugolscher Lösung sichtbar gemacht. Versuchsdurchführung In einem Reagenzglas mit ca. 5 ml Clostridium pasteurianum-Anreicherungsmedium wird mit einer Spatelspitze getrockneter Erde eine Suspension hergestellt. Diese Suspension wird 10 min bei 80 °C inkubiert (pasteurisiert). Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wird das Reagenzglas in abgestützter Schräglage (ca. 45 °) bei 30 °C im Dunkeln bebrütet. Mit einer sterilen Pasteurpipette wird eine Probe aus der bewachsenen Zone im unteren Bereich des Reagenzglases entnommen. Jeweils ein Tropfen wird sowohl per Kreuzaustrich ( M4, S. 365) als auch mit Hilfe eines Drigalski-Spatels als Flächenausstrich (M4, S. 366) auf Clostridium pasteurianum-Agar ausgestrichen. Die Agar-Platten werden in einen Anaerobentopf überführt (M5, S. 368) und in einer O2-freien Atmosphäre bei 30 °C bebrütet.

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

benötigtes Material Geräte     

Reagenzgläser sterile Pasteurpipetten Wasserbad mit 80 °C 30 °C Brutraum Anaerobentopf

Chemikalien und Medien  Clostridium pasteurianumAnreicherungslösung ( S. 412)

Sonstiges  getrocknete Gartenerde

Die Agar-Platten werden aus dem Anaerobentopf genommen. Die Koloniemorphologie wird beurteilt und mikroskopische Präparate angefertigt (M8, S. 373); bei der Mikroskopie im Phasenkontrast sollte insbesondere auf das Vorkommen und die Lage von Endosporen (stark lichtbrechend) geachtet werden. Zellmaterial von Kolonien, die dem erwarteten mikroskopischen Bild entsprechen, wird per Drei-Strich-Ausstrich ( M4, S. 365) auf Clostridium-pasteurianum-Agar ausgestrichen (Reinigungsausstrich). Die Agar-Platten werden erneut in den Anaerobentopf überführt und O2-frei bei 30 °C bebrütet.

Mit Zellmaterial der erhaltenen Reinkultur wird abschließend ein Nachweis intrazellulär akkumulierter Stärke (Granulose) geführt ( M16, S. 384). Weiterführende Literatur Hippe H, Andreesen JR, Gottschalk G (1999) The Genus Clostridium – Nonmedical. In: Dworkin M (ed) The Prokaryotes (elektronische Version: http://link.springer.de/link/service/books/10125, Release 3.0 vom 21.5.1999) Springer, New York Martinez-Romero E (2000) Dinitrogen-Fixing Prokaryotes. In: Dworkin M (ed) The Prokaryotes (elektronische Version: http://link.springer.de/link/service/books/10125, Release 3.3 vom 8.9.2000) Springer, New York

Nachgefragt 1. Warum geht man bei der Anreicherung von Clostridium pasteurianum von getrockneter Erde als Impfgut aus? 2. Was versteht man unter Pasteurisieren und wie führt man diesen Vorgang durch? 3. Warum wurde die Erde pasteurisier,t bevor sie als Impfgut verwendet wurde? 4. Warum überlebt Clostridium pasteurianum als mesophiles Bakterium das Erhitzen auf 80 °C? 5. Erklären Sie die Begriffe thermophil und thermotolerant! 6. Welche anderen selektiven Maßnahmen mussten Sie zur selektiven Anreicherung von Clostridium pasteurianum ergreifen? 7. Warum enthält das Anreicherungsmedium CaCO3? 8. Wie weisen Sie die Endosporen in Clostridium pasteurianum nach? 9. Enthalten die Zellen 1, 2 oder 4 Endosporen? 10. Warum war es unwahrscheinlich, dass in diesem Versuch peptolytische Clostridien angereichert wurden? Wie müssten Sie hierzu vorgehen? 11. Nennen Sie die charakteristischen Eigenschaften von Vertretern der Gattung Clostridium! 12. Welchen Speicherstoff synthetisiert Clostridium pasteurianum? 13. Wie haben Sie diesen Speicherstoff nachgewiesen?

14. Nennen Sie zwei weitere einfache Untersuchungen ohne chemische Nachweisreagenzien, mit denen Sie sehr schnell zeigen können, dass in der Anreicherungskultur ein Vertreter der Gattung Clostridium vorhanden sein muss? 15. Nennen Sie weitere Spezies der Gattung Clostridium, die zur Fixierung von Stickstoff befähigt sind? 16. Nennen Sie weitere anaerobe Bakterien außerhalb der Gattung Clostridium, die zur Fixierung von Stickstoff befähigt sind? 17. Das Enzym Nitrogenase ist normalerweise extrem empfindlich gegenüber Sauerstoff, und Bakterien haben viele unterschiedliche Strategien entwickelt, damit auch in Gegenwart von Sauerstoff ein Stickstofffixierung möglich ist. Warum benötigt Clostridium pasteurianum diese Schutzmechanismen nicht? Welches Nebenprodukt entsteht bei der Nitrogenasereaktion? 18. Nennen Sie die anderen Bakteriengattungen, deren Vertreter Endosporen bilden können! 19. Wo wird die Pasteurisierung im Haushalt und in der Industrie eingesetzt? 20. Welche zusätzlichen Maßnahmen sind erforderlich, damit es nach dem Pasteurisieren von Lebensmitteln nicht zum Auskeimen von Endosporen kommen kann und diese einen Verderb oder gar Vergiftung des Lebensmittels hervorrufen?

87

88

3 Versuche

Versuch 15

Anreicherung von Nitrifizierern Theoretischer Hintergrund

Nitrifikation

Unter Nitrifikation versteht man die bioloN gische Oxidation von reduzierten anorganischen Stickstoffverbindungen zu Nitrat ( Abb. 3.36 und Abb. 3.37). Dieser Vorgang stellt ein weiteres Monopol der Prokaryonten dar. Nitrifizierende BakteNH N rien nutzen Ammonium oder Nitrit als Elektronendonatoren und reduzieren damit NO Sauerstoff, wobei sie durch AtmungskettenNO f phosphorylierung die Energie für alle weitet ri Ni NO ren Stoffwechselvorgänge erzeugen müssen. Die meisten Nitrifizierer fixieren dabei Koh- Abb. 3.36. Die Nitrifikation im Kontext des lendioxid; dazu wird grundsätzlich der Stickstoffkreislaufs Calvincyclus genutzt. Einige nutzen auch organische Verbindungen als Kohlenstoffquelle. Die Nitrifikation ist somit ein aerober Prozess, und die Lebensweise dieser Bakterien ist chemolithoautotroph bzw. chemolithoheterotroph. 2

N2O

1.4.3, S. 12

NH2OH

- III

+

NO

4

org.

HNO

-I

at ion

NH2OH

2

-

+ III

2

+V

aerob

anaerob

ik

-

-

3

Zwei Bakteriengruppen

Energetik der Nitrifikation

Nitrifikanten gehören zu den Gram-negativen Bakterien (meist α- und β-Proteobakterien). Bisher wurden keine Bakterien beschrieben, die Ammoniak direkt zu Nitrat oxidieren können; es gibt vielmehr zwei Gruppen von nitrifizierenden Bakterien: Vertreter der ersten Gruppe oxidieren Ammoniak über Hydroxylamin lediglich zu Nitrit. Hieran sind eine in der Cytoplasmamenbran verankerte Ammonium-Monooxygenase und eine im periplasmatischen Raum lokalisierte Hydroxylamin-Oxidoreduktase beteiligt. Man bezeichnet diese Gruppe auch als Nitrosifizierer ( Tabelle 3.25). Ein typischer Vertreter ist Nitrosomonas europaea. Vertreter der zweiten Gruppe ( Tabelle 3.26) oxidieren Nitrit dann zu Nitrat. Eine in der Cytoplasmamembran verankerte NitritOxidase katalysiert diese Reaktion. Nitrobacter winogradskyi ist ein typischer Vertreter dieser Gruppe.

Tabelle 3.25.

Beispiele für Nitrosifizierer

Nitrosomonas europaea Nitrosococcus oceani Nitrosospira briensis Nitrosospira multiformis (früher: Nitrosolobus multiformis)

Tabelle 3.26.

Beispiele für Nitritoxidierer

Nitrobacter winogradskyi Nitrococcus mobilis Nitrospina gracilis Nitrospira marina

Tabelle 3.27. NAD+/NADH NO2-/NH4+ NO3-/NO2O2/H2O

Relevante Redoxpotentiale E0' = E0' = E0' = E0' =

- 320 mV + 334 mV + 433 mV + 818 mV

Sowohl die Oxidation von Ammoniak als auch von Nitrit und die nachfolgende Übertragung der Reduktionsäquivalente auf Sauerstoff sind nur mit einem sehr niedrigen Energiegewinn verbunden. Zudem muss ein Großteil der hierbei gewonnenen Energie verwendet werden, um durch rückläufigen Elektronentransport NAD+ zu NADH + H+ zu reduzieren, welches für die Fixierung von Kohlendioxid und andere anabolische Prozesse benötigt wird. Als Konsequenz wachsen diese Bakterien nur sehr langsam. Sie bilden aber meist intracytoplasmatische Membranstapel aus, die aus Einstülpungen der Cytoplasmamembran hervorgehen, um zusätzlichen Platz für die

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

2 HNO3- + 2 H2O

2 NH3 + 4 O2 NH3 + O2 + NAD(P)H2 NH2OH + H2O HNO2 + H2O

89

Ammonium-Monooxygenase Hydroxylamin-Oxidoreduktase Nitrit-Oxidase

NH2OH + H2O + NAD(P)+ HNO2 + 4 [H] HNO3 + 2 H+ + 2 e-

Abb. 3.37. Umsatzgleichungen der Nitrifikation. Die obere Gleichung stellt die Gesamtgleichung dar, die darunter folgenden zwei Gleichungen die Umsätze der „Nitrosofizierer“, die untere die der „Nitrifizierer“

Proteine des Elektronentransports zu schaffen. Besonders der niedrige für die Nitritoxidierer zu erzielende Energiegewinn ist wahrscheinlich die Ursache dafür, dass gerade bei Vertretern dieser Gruppe die Nutzung organischer Verbindungen verbreitet ist. Die Nitrifikation ist in vielerlei Hinsicht ein interessanter und wichtiger mikrobiologischer Prozess. An nitrifizierenden Bakterien entwickelte der russische Mikrobiologe Sergej N. Winogradsky im 19. Jahrhundert das Konzept der Chemolithoautotrophie. Der Vorgang der Nitrifikation ist ein wichtiges Element im Stickstoffkreislauf. Ohne Nitrifikation würde es auf der Erde wahrscheinlich zu einer massiven Anhäufung von Ammoniak kommen. Trotz ihres langsamen Wachstums haben Nitrifizierer eine enorme wirtschaftliche Bedeutung. Napoleon nutzte nitrifizierende Bakterien bereits vor ca. 200 Jahren, als er in den besetzten Ländern „Siegesgärten“ anlegen ließ, die seine Armeen mit Nitrat zur Herstellung von Schwarzpulver versorgten. Bei der Abwasserreinigung nutzt man die Nitrifizierer, um das aus dem organischen Material durch Mineralisation freigesetzte Ammonium zunächst in Nitrat bzw. Nitrit zu überführen; Denitrifikanten reduzieren diese Verbindungen dann zu elementarem Stickstoff, welcher dann in die Atmosphäre gelangt. Die Nitrifikation läuft auch in Böden ab und ruft Stickstoffverluste hervor. Der Landwirt versucht diesen Prozess zu unterdrücken, da hierdurch positiv geladene Ammoniumionen in Anionen überführt werden, die im Boden nicht durch die negativ geladenen Huminsäuren gebunden werden können und auch durch andere Bodenbestandteile weniger gut festgehalten werden. Zudem liefert die Nitrifikation den ebenfalls im Boden vorkommenden Denitrifikanten „ihr“ Substrat an, wodurch die Gefahr des Verlusts von gebundenem Stickstoff weiter erhöht wird. Man setzt hier Nitrifikationshemmer wie Cyanoguanidin, Etridiazol oder Nitrapyrin ein, welche spezifisch die Ammonium-Monooxygenase hemmen, um die Nitrifikation zu unterbinden. Darüber hinaus richten nitrifizierende Bakterien große Schäden an Bauwerken und unterirdischen Abwasserkanälen an, besonders wenn diese aus Sandstein oder Beton bestehen. Wenn das in der Luft bzw. im Abwasser vorkommende Ammonium durch die z. T. in die Poren der Baumaterialien eingedrungenen Nitrifikanten zu Nitrat oxidiert wird, entsteht Salpetersäure (HNO3). Eine besonders extreme Erscheinungsform stellt der Mauersalpeter dar, der an feuchten Steinmauern bei überdurchschnittlich starker Zuführung von Ammonium durch Urin und Tierexkremente auch sehr schnell entstehen kann. Die Säure zerstört die Oberfläche der Bauwerke zwar langsam, aber in Relation zur Nutzungsdauer der Bauwerke dann doch in einem kurzen Zeitraum. Nitrifikanten verursachen daher eine besondere Form der mikrobiellen Korrosion, die durch Verunreinigungen mit Ammonium gefördert wird.

Bedeutung der Nitrifikation 1.4.3, S. 12

E1 - S. 297

V16 - S. 91

C l

N

Nitrap yrin

lC

3

90

3 Versuche

Versuchsziel Ziel dieses Veruches ist es, chemolithoautotrophe ammoniumoxdierende Bakterien anzureichern. Das Auftreten von Nitrit bzw. Nitrat sowie die Verringerung des pHWertes der Nährlösung deuten auf das Vorhandensein von Nitrifizierern hin. Außerdem soll die Wirkung des Nitrifikationshemmers Nitrapyrin demonstriert werden. Versuchsdurchführung In zwei 300 ml-Erlenmeyerkolben werden jeweils 30 ml Nitrifizierer-Nährlösung gegeben und diese mit einer Spatelspitze Gartenerde versetzt. Einer der Suspensionen wird Nitrapyrin (Endkonzentration 200 mg/l) zugeben; beide Kolben werden bei 30 °C im Dunkeln bebrütet. Die Kultur sollte im Folgenden möglichst nicht bewegt werden. Alle zwei bis drei Tage wird der pH-Wert der Kulturen visuell überprüft und ggf. eingestellt: Wenn die durch den in der Nährlösung enthaltenden pH-Indikator verursachte Rotfärbung nach Gelb umgeschlagen ist, wird den Kulturen mit Hilfe einer Pasteurpipette so lange Natriumcarbonat-Lösung zugesetzt, bis die ursprüngliche Farbe wieder erreicht ist. Dabei die Kulturflüssigkeit nur sehr vorsichtig schwenken, um die Bildung und den Erhalt einer Kahmhaut nicht zu gefährden.

benötigtes Material Geräte     

Spatel Zwei 300 ml-Erlenmeyerkolben Pasteurpipetten Brutschrank (30 °C) Phasenkontrastmikroskop

Chemikalien und Medien  Reagenzien zum Nitritnachweis ( M14, S. 383)  Nitrifizierer-Nährlösung ( S. 422)  Natriumcarbonat-Lösung (Na2CO3, 5 %, wt/vol)  Nitrapyrin (2-Chloro-6-(trichloromethyl)pyridin, Fa. Sigma)

Sonstiges  frische Gartenerde

Die Kultur wird im Phasenkontrast mikroskopiert. Zur qualitativen Bestimmung der Oxidationsprodukte des Ammoniums wird ein kombinierter Nitrit/Nitratnachweis (M14, S. 383) geführt. Die Ergebnisse des Nitrit/Nitrat-Nachweises der Kulturen mit und ohne Nitrapyrin werden verglichen. Weiterführende Literatur Aakra A, Utaker JB, Pommerening-Röser A, Koops HP, Nes IF (2001) Detailed phylogeny of ammoniumoxizing bacteria determined by rDNA sequences and DNA homology values. International Journal of Systematik and Evolutionary Microbiology 51:2021-2030 Bothe HG, Jost M, Schloter BB, Ward K, Witzel P (2000) Molecular analysis of ammonia oxidation and denitrification in natural environments. FEMS Microbiological Reviews 24:673-690 Ye RW, Thomas SM (2001) Microbial nitrogen cycles: physiology, genomics and applications. Current Oppinion in Microbiology 4:307-312

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

91

Nachgefragt 1. Welche Funktion haben die Nitrifizierer im Stickstoffkreislauf? 2. Welches grundlegende Konzept entwickelte S. Winogradsky an den Nitrifizierern? 3. Wo ist die Aktivität von Nitrifizierern unerwünscht, und wie kann diese unterdrückt oder vermindert werden? 4. Wo wurde oder wird die Aktivität von Nitrifizierern biotechnologisch genutzt? 5. Erklären Sie die Begriffe „Mauersalpeter“ und „Napoleonsche Siegesgärten“! 6. Beschreiben Sie die Lebensweise der Nitrifizierer bezüglich der Verwendung von Kohlenstoff- und Energiequellen sowie der Nutzung von Elektronendonatoren und -akzeptoren! 7. Wie können Sie am Gattungsnamen erkennen, ob es sich bei dem Nitrifizierer um einen Nitrosofizierer oder einen Nitritoxidierer handelt? 8. Welche selektiven Kriterien verwenden Sie, um Nitrifizierer aus der Natur anzureichern? Warum sollte die Anreicherung im Dunkeln durchgeführt werden? 9. Wie verändert sich der pH Wert eines Mediums, in dem Nitrifizierer kultiviert werden? 10. Ist in der Anreicherungskultur eine Trübung sichtbar? Warum? 11. Mit welchem Schnelltest können Sie sich von der Anreicherung von Nitrifizierern überzeugen?

12. Welche Kohlenstoffquelle(n) nutzen Nitrifizierer, und wie überführen Sie diese in Zellbestandteile? 13. Warum müssen Nitrifizierer einen rückläufigen Elektronentransport betreiben? 14. Für welche Stoffwechselleistungen wird das Produkt des rückläufigen Elektronentransports verwendet? 15. Berechnen Sie an Hand der in Tabelle 3.27 (S. 88) angegebenen Elektronenpotentiale die freie Energie Δ G0', die bei der Übertragung der Reduktionsäquivalente von Nitrit auf Sauerstoff freigesetzt wird! 16. Welchen anorganischen Elektrondonator verwendet Nitrobacter winogradskyi, und wieviel Energie Δ G0' muss dieses Bakterium aufbringen, um damit NAD+ zu NADH + H+ zu reduzieren? (Verwenden Sie zur Berechnung die im Kasten Seite 88 angegebenen Redoxpotentiale) 17. Geben Sie an Hand der Oxidationszustände des Stickstoffs an, wie viele Elektronen bei der Oxidation von Ammonium zu Nitrat insgesamt freigesetzt werden! 18. Ist eine Nitrifizierung unter anaeroben Bedingungen mit Nitrat als Elektronenakzeptor denkbar? 19. Erklären Sie das langsame Wachstum und die niedrigen Zellerträge der Nitrifizierer! 20. Warum und wo werden Nitrifikationshemmer eingesetzt? Wie wirkt Nitrapyrin?

Anreicherung von Denitrifizierern

Versuch 16

Theoretischer Hintergrund 0

N2 +I

Denitrifika

tion

N2O

NH2OH

+ II

NH4+

NO

Norg.

HNO

NH2OH

+ III

NO2+V

NO2-

aerob anaerob

NO3-

Abb. 3.38. Die Denitrifikation im Kontext des Stickstoffkreislaufs.

Unter Denitrifikation versteht man die Reduktion von Nitrat zu elementarem Stickstoff (N2). Dieser Vorgang stellte lange Zeit ein weiteres Monopol der Prokaryonten dar und ist ein sehr wichtiger Abschnitt des Stickstoffkreislaufs ( Abb. 3.38). Denitrifikanten nutzen dabei alternativ zu Sauerstoff Nitrat und dessen Reduktionsprodukte als terminale Akzeptoren für die über die Atmungskette angelieferten Reduktionsäquivalente.

Die Denitrifikation ist bei Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien weit verbreitet und ist dort nicht auf spezialisierte Organismengruppen oder gar Gattungen beschränkt ( Tabelle 3.28). Bisher wurden keine Bakterien beschrieben, die obligat auf Nitrat als terminalen Elektronenakzeptor angewiesen sind; alle können auch Sauerstoff als Akzeptor nutzen. Denitrifizierer sind deshalb fakultativ anaerob. Die Denitrifikation wird durch an die Cytoplasmamembran gebundene oder im Periplasma lokalisierte Enzyme katalysiert. In Pseudomonas stutzeri wurden vier Enzyme identifiziert: Nitrat-Reduktase, Nitrit-Reduktase, NO-Reduktase und N2O-Reduktase

Denitrifikation

1.4.3, S. 12

Verbreitung

92

3 Versuche

-

-

+

Nitrat-Reduktase

-

-

+

Nitrit-Reduktase

NO3 + 2 e + 2 H NO2 + 2 e + 2 H -

+

NO + 2 e + 2 H -

+

N2O + 2 e + 2 H

Stickstoffoxid-Reduktase Distickstoffoxid-Reduktase

-

NO2 + H2O NO + H2O N2O + H2O N2 + H2O

Abb. 3.39. Umsatzgleichung der Denitrifikation (Dissimilatorische Nitratreduktion; „Nitrat-Atmung“). Nitratreduktase: membrangebunden; enthält Cytochrom b; wird durch O2 reprimiert! Nitritreduktase: wird durch O2 reprimiert

( Abb. 3.39). Sauerstoff reprimiert in der Regel die Expression dieser Enzyme und hemmt sie auch. Dies ist sinnvoll, da durch Sauerstoffatmung mehr Energie als durch Nitratatmung gewonnen werden kann ( Tabelle 3.29). Auch bei den Archaea wurde Denitrifikation nachgewiesen. Mittlerweile ist auch sicher, dass einige Eukaryonten (Hefen, filamentöse Pilze und Fungi Imperfecti) Nitrat und Nitrit zu NO und N2O und wahrscheinlich sogar zu N2 reduzieren können. Andere Wege der Nitratreduktion

Die Denitrifikation, die auch als dissimila- Tabelle 3.28. Beispiele für Denitrifizierer torische Nitratreduktion bezeichnet wird, stellt jedoch nur eine von drei Möglichkeiten Bacillus halodenitrificans der Natur dar, Nitrat zu reduzieren. Sowohl Bacillus licheniformis bei Prokaryonten als auch bei Eukaryonten Geobacillus stearothermophilus verbreitet ist die assimilatorische Nitrat- Haloarcula denitrificans Paracoccus denitrificans reduktion. Durch diese wird Nitrat über Pseudomonas stutzeri Nitrit zu Ammonium reduziert. Dieser Vorgang ist immer dann erforderlich, wenn Ralstonia eutropha Nitrat oder Nitrit als alleinige N-Quellen vorliegen und diese für die Synthese stick- Tabelle 3.29. Relevante Redoxpotentiale stoffhaltiger Zellbestandteile in Ammonium E0' = - 320 mV überführt werden müssen. An dieser Umset- NAD+/NADH NO2-/NO E0' = + 350 mV zung sind die Enzyme Nitrat-Reduktase und NO3-/NO2E0' = + 433 mV Nitrit-Reduktase beteiligt ( Abb. 3.39). NO/N E0' = + 1175 mV 2O Diese sind hier nicht an die CytoplasmaN2O/N2 E0' = + 1355 mV membran gebunden und werden meist O E0' = + 818 mV 2/H2O durch Ammonium gehemmt oder reprimiert. Sauerstoff hat meist keinen Einfluss auf die Expression dieser Enzyme. Bei der Ammonifikation wird Nitrat ebenfalls über Nitrit zu Ammonium reduziert. Einige fakultative anaerobe Bakterien nutzen dies unter anaeroben Bedingungen als eine zusätzliche Möglichkeit der Entledigung von Reduktionsäquivalenten. Energie wird durch diesen Vorgang meist nur indirekt gewonnen, da ein größerer Anteil des bei der Gärung entstehenden Acetyl-CoA nun über Acetyl-Phosphat der Acetat-Kinase zugeführt werden kann und somit durch Substratkettenphosphorylierung zusätzliches ATP gebildet werden kann. Sonst wäre der Anteil von Acetyl-CoA, der zwecks Ausgleichs der Redoxbilanz ohne Energiegewinn z. B. zu Ethanol reduziert werden müsste, höher. In Escherichia coli ist nur die Nitrat-Reduktase membrangebunden, und hier kann wie bei der dissimilatorischen Nitratreduktion sogar Energie durch Elektronentransportkettenphosphorylierung gewonnen werden, die nachfolgenden Enzyme sind dann löslich und deren Umsetzungen nicht mit einem direkten Energiegewinn verbunden.

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

Die Denitrifikation stellt für den globalen Stickstoffhaushalt einen sehr wichtigen Vorgang dar und ist daher ein bedeutendes Segment im Stickstoffkreislauf ( Abb. 3.38). Denitrifikation wird auch großtechnisch genutzt. Nur durch Denitrifkation kann der Stickstoffkreislauf geschlossen werden und gebundener Stickstoff wieder in elementarer Form freigesetzt werden. Ohne Denitrifikation würde es auf der Erde wahrscheinlich zu einer massiven Anhäufung von Ammoniak oder Nitrat kommen. Bei der Abwasserreinigung und der Trinkwasseraufbereitung nutzt man die Denitrifizierer, um das von Nitrifikanten aus Ammonium gebildete Nitrat bzw. Nitrit aus dem zu reinigendem Wasser in elementaren Stickstoff zu überführen und es in dieser Form an die Atmosphäre abzugeben. Dies ist die einzige Möglichkeit, den in organischen Material gebundene Stickstoff in N2 zu überführen. Die Denitrifikation läuft auch in Böden ab. Auf landwirtschaftlich genutzten Böden muss dieser Prozess unterdrückt werden, soll sich teuer eingekaufter und eingebrachter Dünger nicht in „Luft“ auflösen. Eine gute Bodenauflockerung durch Pflügen und Verhinderung von Staunässe durch Drainage verbessert die Sauerstoffversorgung im Boden und vermindert die durch Denitrifikation hervorgerufenen Stickstoffverluste. Noch nicht abschließend beurteilt werden kann die ökologische Bedeutung der „unvollständigen Denitrifikation“, bei der Nitrat bzw. Nitrit nicht vollständig zu N2 reduziert werden, sondern mehr oder weniger große Mengen der Treibhausgase NO und N2O freigesetzt werden. Versuchsziel In diesem Versuch soll eine Anreicherungskultur für denitrifizierende Bakterien angesetzt werden. Das bei der Denitrifikation entstehende Gas N2 soll aufgefangen werden. Außerdem soll ein Zwischenprodukt der Nitratreduktion, Nitrit, in dem Ansatz nachgewiesen werden. Versuchsdurchführung benötigtes Material Geräte      

Spatel Großes Reagenzglas Kleines Reagenzglas Aluminium-Folie / Parafilm Brutschrank (30 °C) Phasenkontrastmikroskop

Chemikalien und Medien  Reagenzien zum Nitritnachweis (Seite 383)  Denitrifizierer-Nährlösung ( S. 413)

Sonstiges  frische Gartenerde

Ein großes Reagenzglas (25 bis 50 ml Volumen) wird mit einer Spatelspitze frischer Gartenerde versetzt und vollständig mit Denitrifizierer-Nährlösung gefüllt. Um die durch die Denitrifizierung verursachte Gasbildung visuell zu verdeutlichen, wird das große Reagenzglas mit einem sogenannten Durham-Röhrchen versehen. Dazu wird in das große Reagenzglas ein möglichst kleines Reagenzglas, das Durham-Röhrchen, mit der Öffnung nach unten eingeführt. Die Öffnung des großen Reagenzglases wird mit Parafilm, Aluminiumfolie o. ä. verschlossen. Durch Umschwenken des großen Reagenzglases wird das kleine Reagenzglas entlüftet und befindet sich danach auf dem Boden des großen Reagenzglases. Die Bebrütung geschieht bei 30 °C im Dunkeln.

Wird der Einsatz eines Durham-Röhrchens unter sterilen Bedingungen gewünscht, so wird das Röhrchen vor dem Autoklavieren einfach mit der Öffnung nach unten in die Nährlösung gebracht. Während des Autoklavierens wird das Röhrchen dann „automatisch“ entlüftet und sinkt nach unten.

93 Bedeutung der Denitrifikation 1.4.3, S. 12 E1 - S. 297 V15 - S. 88

94

3 Versuche

Nach mikroskopischer Sichtung der Anreicherungskultur im Phasenkontrast wird die Nährlösung abschließend mit Hilfe des Nitritnachweises (M14, S. 383) auf Nitrat und Nitrit untersucht. Die Kultur wird dann auf Gasbildung überprüft. Im mittlerweile oben schwimmenden Durham-Röhrchen hat sich Gas gesammelt. Mikroorganismen können eine begrenzte Zahl von unterschiedlichen Gasen bilden, im wesentlichen sind es CO2, CH4, H2, H2S und N2. Von diesen wiederum sollten sich N2 (aus den Denitrifizierungsreaktionen) und CO2 (aus dem Katabolismus der Kohlenstoffquellen) im Röhrchen angesammelt haben. Um die Gegenwart von H2S auszuschließen, reicht die sensorische Kontrolle. Mit einer Glimmspanprobe lässt sich die Abwesenheit von CH4 und H2 verifizieren. Weiterführende Literatur Bothe H, Jost G, Schloter M, Ward BB, Witzel KP (2000) Molecular analysis of ammonia oxidation and denitrification in natural environments. FEMS Microbiological Reviews 24:673-690 Zumft WG (1997) Cell biology and molecular basis of denitrification. Microbiology and Molecular Biology Reviews 61:533-616 Ye RW, Thomas SM (2001) Microbial nitrogen cycles: physiology, genomics and applications. Current Oppinion in Microbiology 4:307-312

Nachgefragt 1. Welche wichtige Funktion kommt den Denitrifizierern in der Natur im Stickstoffkreislauf zu? Was würde geschehen, wenn es keine Denitrifikation gäbe? 2. Warum ist die bei der Denitrifikation ebefalls zu beobachtende Freisetzung von NO und N2O problematisch? 3. Warum spielen Denitrifizierer bei der Abwasserbehandlung in Kläranlagen eine essentielle Rolle? 4. Weshalb ist die Denitrifikation in der Landwirtschaft unerwünscht, und durch welche Maßnahmen verhindert der Landwirt dies? 5. Warum darf der Nitratgehalt von Trinkwasser vorgeschriebene Grenzwerte nicht überschreiten, und wie können Denitrifizierer eingesetzt werden, um diese Grenzwerte einhalten zu können? 6. Was versteht man unter Methämoglobin, und weshalb ist dessen Bildung besonders bei Säuglingen ein Problem? 7. Welche selektiven Kriterien wenden Sie an, um Denitrifizierer aus der Natur anzureichern? 8. Nennen Sie mindestens fünf Denitrifizierer mit vollständigem Namen, deren Speziesname nicht „denitrificans“ lautet! 9. Welche strikt anaeroben Denitrifizierer kennen Sie? 10. Wie unterscheiden sich assimilatorische und dissimilatorische Nitratreduktion hinsichtlich Funktion sowie Lokalisation der Enzyme und Regulation? 11. Welche physiologische Bedeutung hat die NitratAmmonifikation als dritter Weg der biologischen Nitratreduktion, und in welchen Bakterien spielt dieser Vorgang eine Rolle?

12. Erklären Sie, weshalb fakultativ anaerobe Bakterien durch Nitrat-Ammonifikation mehr Energie durch Substratkettenphosphorylierung gewinnen können! 13. Sie kultivieren Paracoccus denitrificans unter aeroben Bedingungen und bieten im Medium KNO3 als alleinige stickstoffhaltige Verbindung an. In einem Parallelversuch geben Sie zusätzlich NH4Cl hinzu. Was geschieht mit dem Nitrat in den beiden Versuchen? 14. Ist eher die assimilatorische oder die dissimilatorische Nitratreduktion ein Monopol der Prokaryonten? 15. Nennen Sie mindestens eine anorganische Stickstoffverbindung, welche Denitrifizierer außer Nitrat meist ebenfalls als Elektronenakzeptor verwenden können! 16. Welche Gase können bei der Denitrifikation freigesetzt werden? 17. Berechnen Sie anhand der in Tabelle 3.27 ( S. 88) angegebenen Redoxpotentiale die freie Energien Δ G0', die bei der Übertragung der Reduktionsäquivalente von NADH + H+ auf Sauerstoff bzw. Nitrat freigesetzt werden! 18. Wie viele Mole CO2 setzt Paracoccus denitrificans aus einem Mol Glucose bei der aeroben Atmung und wie viele bei der anaeroben Atmung mit Nitrat frei? 19. Wie viel N2 (in l) wird durch Denitrifizierer durch Reduktion von 1 mol Nitrat gebildet? 20. Mit welchen Reagenzien weisen Sie im Kurs Nitrit nach? Formulieren Sie die dabei ablaufenden chemischen Reaktionen

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

Anreicherung und Isolierung von Knallgasbakterien

95

Versuch 17

Theoretischer Hintergrund Knallgas ist ein Gemisch aus zwei Volumen Wasserstoff (H2) und einem Volumen Sauerstoff (O2), welches beim Erhitzen auf 0' G = - 485 kJ pro Reaktion 500-600 °C oder in Gegenwart von KatalyAbb. 3.40. Knallgasreaktion satoren (z. B. Platin) heftig explodiert und dabei in Wasser umgewandelt wird. Diese chemische Knallgasreaktion ist jedem aus Tabelle 3.30. Relevante Redoxpotentiale dem Chemieunterricht wohl bekannt ( Abb. 3.40). So genannte KnallgasH+/H2 E0' = - 414 mV bakterien katalysieren eine biochemische E0' = - 320 mV NAD/NADH + H+ Knallgasreaktion, nutzen dabei WasserO2/H2O E0' = + 818 mV stoff als Energiequelle und Elektronendonator und übertragen Elektronen und Protonen über eine Atmungskette auf Sauerstoff als Akzeptor, der an deren Ende steht ( Tabelle 3.30). Bei der biochemischen Knallgasreaktion wird natürlich genauso viel Energie frei, wie bei der chemischen, die Reaktion nimmt hier allerdings keinen explosionsartigen Verlauf, sondern ein großer Teil der freigesetzten Energie wird zur Synthese von ATP aus ADP und anorganischem Phosphat (Pi) genutzt.

Die Knallgasreaktion

Molekularer Wasserstoff wird von vielen Mikroorganismen in ganz unterschiedlicher Weise verwertet. Knallgasbakterien nutzen H2 als anorganischen Elektronendonator. Sie gehören damit wie nitrifizierende Bakterien und schwefeloxidierende Bakterien, die wir an anderer Stelle im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM behandeln, zu den lithotrophen Mikroorganismen. Da Knallgasbakterien meist auch noch Kohlendioxid (CO2) fixieren können, handelt es sich bei ihnen um chemolithotoautotrophe Bakterien.

H2-Verwertung

2 H2 + O2

2 H2O

Darüber hinaus wird Wasserstoff von vielen photosynthetischen Bakterien anstelle von H2S als Elektronendonator für die anoxygene Photosynthese genutzt. Vielen sulfatreduzierenden Bakterien, den meisten methanogenen Bakterien und vielen acetogenen Bakterien dient Wasserstoff als Elektronendonator für die Reduktion von organischen Verbindungen oder CO2. Auch einige Bakterien, die über eine FumaratAtmung verfügen wie z. B. Wolinella succinogenes, beziehen die Reduktionsäquivalente zur Reduktion von Fumarat häufig von Wasserstoff. Bei den in diesem Absatz genannten Bakterien handelt es sich jedoch um anaerobe Bakterien, und Wasserstoff wird anders als bei den Knallgasbakterien nie zur Reduktion von Sauerstoff verwendet. Knallgasbakterien sind unter den Gram-negativen Bakterien weit verbreitet, sie kommen aber auch bei den Gram-positiven Bakterien und den Archaea vor. Auch ist das Vorkommen von Knallgasbakterien weder auf bestimmte Gattungen beschränkt, noch sind alle Vertreter einer Gattung grundsätzlich Knallgasbakterien. Besonders häufig sind Knallgasbakterien unter den aeroben, stickstofffixierenden Bakterien (z. B. Alcaligenes latus) und auch unter den Kohlenmonoxid oxidierenden Bakterien (z. B. Seliberia carboxydohydrogena) anzutreffen. In Tabelle 3.31 sind einige wichtige und gut untersuchte Vertreter aufgeführt.

V15 - S. 88 V19 - S. 105

V20 - S. 108 E3 - S. 310

Gruppen von Knallgasbakterien

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3 Versuche

Nahezu alle Knallgasbakterien sind fakultativ chemolithoautotroph, d. h. sie können alternativ auch heterotroph mit organischen Kohlenstoff-Verbindungen als Energie- und Kohlenstoffquelle wachsen. Lediglich einige wenige Knallgasbakerien sind obligat chemolithoautotroph (z. B. Hydrogenobacter thermophilus). Die meisten Knallgasbakterien fixieren CO2 über den Calvin-Cyclus. nur die obligat chemolithoautotrophen bevorzugen den reduktiven Citrat-Cyclus. Hydrogenasen

Tabelle 3.31.

Knallgasbakterien

Gram-negative Bakterien • Alcaligenes latus • Bradyrhizobium japonicum • Derxia gummosa • Hydrogenobacter thermophilus • Paracoccus denitrificans • Pseudomonas saccharophila • Ralstonia eutropha • Ralstonia metallidurans • Seliberia carboxydohydrogena • Xanthobacter autotrophicus Gram-positive Bakterien • Arthrobacter Stamm 11/X • Bacillus schlegelii • Pseudonocardia autotrophica (früher: Nocardia autotrophica) • Rhodococcus opacus Archaea • Aquifex pyrophilus

Die Verwertung von Wasserstoff wird grundsätzlich durch Hydrogenasen eingeleitet. Diese Hydrogenasen aktivieren das H2-Molekül und übertragen die Reduktionsäquivalente meist über Coenzyme bzw. Cofaktoren auf einen Akzeptor. Solche Aufnahme-Hydrogenasen enthalten fast immer Nickel. Bei den Knallgasbakterien sind zwei Typen von Hydrogenasen zu unterscheiden, die beide in Ralstonia eutropha vorkommen. Die membrangebundene Hydrogenase besteht aus zwei verschiedenen Untereinheiten und befindet sich auf der Außenseite der Cytoplasmamembran dem periplasmatischen Raum zugewandt. Diese Hydrogenase überträgt die Elektronen auf ein Cytochrom b, von hier werden diese durch eine Elektronentransportkette zum Sauerstoff transportiert. Dabei wird Energie durch Elektronentransportkettenphosphorylierung erzeugt. Da dieses Enzym NAD nicht direkt zu reduzieren vermag, muss dies durch einen kurzen rückläufigen Elektronentransport geschehen. Die lösliche Hydrogenase besteht aus vier verschiedenen Untereinheiten und befindet sich im Cytoplasma. Diese Hydrogenase reduziert NAD+ zu NADH + H+. Von NADH werden die Reduktionsäquivalente dann an die Atmungskette abgegeben und letztlich auf Sauerstoff übertragen. Die Strukturgene für die sechs Untereinheiten der beiden Hydrogenasen sowie weitere Gene, die für die Synthese von prosthetischen Gruppen und den Einbau von Nickel in die Hydrogenasen benötigt werden, Gene für die Regulation der Expression der Hydrogenasen, Strukturgene für einen vollständigen Enzymsatz zur Synthese der Enzyme des Calvin-Cyclus und zahlreiche weitere Gene befinden sich auf dem 452.156 bp großen Megaplasmid pHG1, welches in R. eutropha schon vor längerer Zeit entdeckt wurde und die dritte Replikonseinheit des Bakteriums darstellt. Die meisten anderen Knallgasbakterien besitzen nur eine membrangebundene Hydrogenase; selten ist wie z. B. in Rhodococcus opacus nur eine lösliche, NAD+-abhängige Hydrogenase vorhanden.

Herkunft von H2 V13 - S. 81 V14 - S. 85

V8 - S. 62

Für molekularen Wasserstoff gibt es mehrere biogene Quellen, und er kann sowohl in aeroben wie anaeroben Habitaten gebildet werden. Wasserstoff entsteht grundsätzlich als Nebenprodukt der Nitrogenase bei der biologischen Stickstofffixierung durch aerobe oder anaerobe Bakterien. Außerdem entsteht Wasserstoff in anaeroben Habitaten durch Gärungsprozesse. Aus reduziertem Ferredoxin, welches bei den Reaktionen der Enzyme Pyruvat:Ferredoxin-Oxidoreduktase und NAD(P)H-Ferredoxin-Oxidoreduktase entsteht, kann in strikt anaeroben Bakterien durch Hydrogenasen Wasserstoff freigesetzt werden, wodurch auch wieder oxidiertes Ferredoxin entsteht. Als dritte Möglichkeit wird Wasserstoff durch das Enzym Formiat-H2-Lyase aus Formiat frei-

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

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gesetzt, welches in allen Bakterien anfällt, die wie die fakultativ anaeroben Enterobakterien Pyruvat unter anaeroben Bedingungen mittels einer Pyruvat-Formiat-Lyase verstoffwechseln. Andere Wasserstoff-bildende Enzyme gibt es nicht. Es sollte betont werden, dass molekularer Wasserstoff nicht nur in Bakterien entsteht. H2 wird auch von einigen eukaryontischen Mikroorganismen gebildet. So besitzen einige Protisten wie z. B. Trichomonas vaginalis spezielle Organellen, die dort als Hydrogenosomen bezeichnet werden und durch die Pyruvat zu Acetat, CO2 und H2 vergoren wird. In diesen Hydrogenosomen sind wie bei Clostridien die Enzyme Pyruvat:Ferredoxin-Oxidoreduktase und Hydrogenase für die Entstehung von H2 verantwortlich. Entstandener Wasserstoff muss nicht in dem Habitat verbleiben, in dem er gebildet wurde; er kann z. B. durch Diffusion von einem anaeroben Habitat in ein darüber liegendes aerobes Habitat gelangen. Auch sollte hier festgehalten werden, dass die messbaren Konzentrationen von freiem Wasserstoff in den natürlichen Habitaten meist recht gering sind und deutlich unter den Konzentrationen liegen, mit denen im Labor die Anreicherung wasserstoffverwertender Bakterien durchgeführt wird. Die gemessenen Konzentrationen resultieren jedoch nur aus dem Gleichgewicht von zwei gegenläufigen, sehr dynamischen Prozessen, nämlich der H2-Freisetzung und des H2-Verbrauchs; sie sagen nichts über die Mengen des tatsächlich gebildeten Wasserstoffs aus. Versuchsziel Es sollen zunächst in Flüssigkultur ohne organische Kohlenstoffquelle unter einer Atmosphäre aus Wasserstoff, Sauerstoff und Kohlendioxid Knallgasbakterien in zwei Stufen angereichert werden, die dann auf Festmedium unter Wechsel von Komplexund Mineralsalzmedium in Reinkultur gebracht werden. Die Warnhinweise zu wasserstoffhaltigen Gasgemischen und zum Evakuieren von Glasgefäßen, beschrieben in M6 S. 369, sind unbedingt zu beachten! Versuchsdurchführung Um die Wirkung der Knallgasexplosion zu demonstrieren, kann zunächst der folgende eindrucksvolle Teilversuch durchgeführt werden: Ein Luftballon wird mit ca. 5 Litern eines Gemisches von ca. 40 % (vol/vol) Wasserstoff und 60 % (vol/vol) Luft gefüllt und mit einem Knoten verschlossen. Dieser Luftballon wird im Freien mit einem Bindfaden benötigtes Material befestigt (z. B. an einer Mauer oder an einem Geräte Pfahl). Im Umkreis von ca. 10 m vom Befestigungsort sollten sich keine Fenster und  50 ml-Erlenmeyerkolben andere zerbrechliche Gegenstände befinden.  Exsikkator oder Wittscher Topf (druckDer mit Schutzbrille, Gehörschutz, Schutzfest) helm und Laborkittel ausgerüstete Experi Gasstation ( M6, S. 369) mentator entzündet nun das Gasgemisch im  Phasenkontrastmikroskop  Impföse (nicht aus Platin!) Luftballon in dem er eine brennende Fackel  Bunsenbrenner am ausgestreckten Arm an den Luftballon hält. Spätestens nach der erfolgten KnallgasChemikalien und Medien explosion wird Gemischen aus Wasserstoff  Autotrophen-Medium ( S. 411) und Sauerstoff mit dem nötigen Respekt  Standard I-Festmedium ( S. 427) begegnet werden. Sonstiges Wenden wir uns nun dem eigentlichen mikrobiologischen Versuch zur Anreiche frische Gartenerde rung von Knallgasbakterien zu.

Demonstration der Knallgasreaktion

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3 Versuche

Ansetzen der Anreicherungskultur: Eine kleine Spatelspitze Gartenerde (wenige Milligramm genügen) wird in ca. 5 ml Autotrophenmedium suspendiert, das sich in einem 50 ml-Erlenmeyerkolben befindet. Der Kolben wird unverschlossen in einen Wittschen Topf (bzw. Exsikkator) überführt. Mit Hilfe der Gasstation (M6, S. 369;  Abb. 5.13, S. 370) wird die Luftatmosphäre im Wittschen Topf gegen ein Gasgemisch aus 85 % (vol/vol) H2, 10 % (vol/vol) CO2 und 5 % (vol/vol) O2 ausgetauscht. Der Topf wird ruhig stehend bei 30 °C im Dunkeln inkubiert. Die Anreicherungskultur wird aus dem Wittschen Topf entnommen und auf Kahmhautbildung bzw. Trübung untersucht. Von der bewachsenen Kultur werden 0,2 ml in 5 ml Autotrophenmedium überführt. Diese zweite Anreicherungskultur wird unter den gleichen Bedingungen wie die erste (siehe Tag 1) inkubiert. Ausgehend von der deutlich getrübten zweiten Anreicherungskultur wird etwas Material mit einer Impföse (Sicherheitshinweise beachten, Kasten S. 369) per Kreuzausstrich ( M4, S. 365) auf mehrere Agarplatten mit Autotrophen-Festmedium ausgestrichen. Die Petrischalen werden mit dem Deckel nach oben und dem Agarboden nach unten in den Wittschen Topf eingebracht. Das Gefäß wird mit dem oben angegebenen Gasgemisch befüllt. Die Inkubation erfolgt bei 30 °C im Dunkeln. Hinweis: Zur Inkubation von Festmedien im Wittschen Topf (wie auch im Anaerobentopf) sollten Petrischalen mit Nocken im Deckel verwendet werden, die gewährleisten, dass der Gasaustausch zwischen Umgebung und Petrischale unbehindert erfolgen kann und beim Evakuieren des Topfs nicht die Deckel an die Petrischalenböden „festgesaugt“ werden. Der Wittsche Topf wird geöffnet, und ausgehend von separat liegenden Kolonien erfolgen Reinigungsausstriche (Drei-Strich-Ausstrich, M4, S. 365) auf Standard I-Festmedium. Diese Platten werden normal (aerob) bei 30 °C bebrütet. Ausgehend von separat liegenden Kolonien der erhaltenen Reinkulturen werden Ausstriche nach der Drei-Strich-Methode (M4, S. 365) auf Autotrophen-Festmedium angefertigt. Diese Platten werden wieder im Wittschen Topf unter dem Knallgas enthaltenden Gasgemisch bei 30 °C im Dunkeln inkubiert. Koloniematerial deutlich bewachsener Platten wird abschließend im Phasenkontrast mikroskopiert. Zur weiteren Charakterisierung der Isolate bieten sich optional Oxidase-Test (M14, S. 380) und Gram-Bestimmung (M12, S. 377) an. Weiterführende Literatur Aragno M, Schlegel, HG (1999) The Mesophilic Hydrogen-Oxidising (Knallgas) Bacteria. In: Dworkin M (ed) The Prokaryotes (elektronische Version: http://link.springer.de/link/service/books/10125, Release 3.0 vom 21.5.1999) Springer, New York Aragno M (1999) Thermophilic, Aerobic, Hydrogen-Oxidizing (Knallgas) Bacteria. In: Dworkin M (ed) The Prokaryotes (elektronische Version: http://link.springer.de/link/service/books/10125, Release 3.0 vom 21.5.1999) Springer, New York Bowien B, Kusian B (2002) Genetics and control of CO2 assimilation in the chemotroph Ralstonia eutropha. Archives of Microbiology 178:85-93 Conrad R (1999) Contribution of hydrogen to methane production and control of hydrogen concentrations in methanogenic soils and sediments. FEMS Microbiology Ecology 28:193-202 Frey M (2002) Hydrogenases: hydrogen-activating enzymes. Chembiochem 3:153-160 Friedrich B, Schwartz E (1993) Molecular-biology of hydrogen utilization in aerobic chemolithotrophes. Annual Review of Microbiology 47:351-383

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

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Rotte C, Henze K, Müller M, Martin W (2000) Origins of hydrogenosomes and mitochondria – Commentary. Current Opinion in Microbiology 3:481-486

Nachgefragt 1. Welche Sicherheitshinweise sind bei Gasgemischen, die Wasserstoff enthalten, unbedingt zu beachten? 2. Weshalb dürfen Sie in einem Glasgefäß, das Wasserstoff enthält, nicht mit einer Impföse aus Platin hantieren? 3. Warum dürfen Wittsche Töpfe nie ohne einen übergestülpten Drahtkorb evakuiert werden? 4. Berechnen Sie, in welchen Volumenanteilen Sie reinen Wasserstoff und Luft mischen müssen, damit Wasserstoff und Luft bei der Knallgasreaktion ohne Rückstände vollständig in Wasser umgewandelt werden! 5. Nennen Sie die drei Enzyme, die für die biologische Entstehung von molekularem Wasserstoff verantwortlich sind! 6. Welche Mikroorganismen bilden molekularen Wasserstoff, und in welchen Habitaten kommen diese vor? 7. Warum ist es für stickstofffixierende Bakterien sinnvoll, eine Aufnahme-Hydrogenase zu besitzen? 8. Warum sagt die in einem Habitat messbare Wasserstoffkonzentration nichts über die Menge des dort tatsächlich gebildeten Wasserstoffs aus? 9. Informieren Sie sich in der angegebenen Literatur über Vorkommen, Struktur und Stoffwechsel von Hydrogenosomen! 10. Wo kommt Wasserstoffbildung bei Eukaryonten vor?

11. Beschreiben Sie verschiedene physiologische Gruppen von Mikroorganismen, die Wasserstoff verwerten können! 12. Welches Enzym müssen alle Wasserstoff-verwertenden Mikroorganismen besitzen? 13. Warum wird den bei der Anreicherung von Knallgasbakterien eingesetzten Medien in der Regel NiCl2 zugesetzt? 14. Nennen Sie hinsichtlich Struktur und Lokalisation wichtige Unterschiede zwischen den beiden in Knallgasbakterien vorkommenden Typen von Hydrogenasen! 15. Wie reduzieren Bakterien, die lediglich eine membrangebundene Hydrogenase besitzen, NAD+? 16. Berechnen Sie an Hand der angegebenen Redoxpotentiale, wie viel Energie bei der Reduktion von Sauerstoff mit Wasserstoff frei wird. Wie viel Energie ist es mit NADH + H+ als Reduktionsmittel? 17. Welche Knallgasbakterien fixieren CO2 über den Calvin-Cyclus und welche über den reduktiven Citrat-Cyclus? 18. Nennen Sie obligat chemolithoautrophe Knallgasbakterien! 19. Nennen Sie weitere chemolithotrophe Bakterien! 20. Konsultieren Sie Lehrbücher der Mikrobiologie oder Physikalischen Chemie und erstellen Sie eine möglichst vollständige Liste mit anorganischen Verbindungen, die von Mikroorganismen als Elektronendonator genutzt werden können!

Winogradsky-Säulen zur Anreicherung von anoxygenen phototrophen Bakterien

Versuch 18

Theoretischer Hintergrund Nicht nur bei den Pflanzen und eukaryontischen Algen sondern auch bei den Bakterien APS ist die Photosynthese in verschiedenen taxoPAPS nomischen Gruppen weit verbreitet. Hierbei sind die oxygene Photosynthese und die SO HS S anoxygene Photosynthese zu unterscheiden. In beiden Fällen handelt es sich um lithotrophe Prozesse, da anorganische ElekS SO tronendonatoren verwendet werden. Ist Wasser bei der oxygenen Photosynthese der Elektronendonator, so sind es bei der anoxyAbb. 3.41. Relevante Reaktion des Schwefelkreislaufs genen Photosynthese häufig – aber nicht ausschließlich – reduzierte anorganische H2S Schwefelverbindungen wie ( Abb. 3.41). Phototrophe Bakterien sind darüber hinaus praktisch immer auch autotrophe Organismen, da CO2 über unterschiedliche Fixierungswege (CalvinCyclus, reduktiver Citrat-Cyclus, Hydroxypropionat-Weg) assimiliert werden SO32-

Photosynthetische Bakterien

- II

2-

4

2

0

2-

an ox yge ne

PS

org

3

aerob

anaerob

1.4.4, S. 14

100

3 Versuche

kann. Tabelle 3.32 gibt einen Überblick über die zur Nutzung von Licht befähigten Prokaryonten und nennt einige charakteristische Eigenschaften. Kaum eine Bakteriengruppe enthält so viele besonders große Bakterien wie die der phototrophen Bakterien. Außerdem kommen hier häufig besonders interessante Zellformen vor. Einige phototrophe Bakterien und auch Licht nutzende Archaea können an ihren natürlichen Standorten zu einer Massenvermehrung gelangen und dann Seen oder Teiche rot oder dunkelgrün färben. Oxygene Photosynthese D4 - S. 343

V13 - S. 81

Die oxygene Photosynthese kommt grundsätzlich bei den Cyanobakterien vor. Der Photosyntheseapparat der Cyanobakterien besteht wie bei den Pflanzen und eukaryontischen Algen aus dem Photosystem I und dem Photosystem II. Damit dient Wasser als Elektronendonator, und durch ein Mangan-abhängiges Enzym erfolgt die Aufspaltung von Wasser in Sauerstoff und in Reduktionsäquivalente für die Fixierung von CO2 sowie die Synthese von ATP. Lediglich in für die Stickstofffixierung spezialisierten Zellen, den Heterocysten, fehlt das Photosystem I und damit die Fähigkeit zur Freisetzung von Sauerstoff. Cyanobakterien fixieren CO2 grundsätzlich über den CalvinCyclus. In eutrophierten Seen kann es im Sommer zur Massenvermehrung von Cyanobakterien kommen. Dies ist sehr problematisch, da Cyanobakterien viele sehr toxische Substanzen (Nervengifte, karzinogene Verbindungen) bilden können; das Baden und Tränken von Weidevieh mit diesem Wasser sollte vermieden werden. Eine oxygene Photosynthese kommt bei den Prokaryonten sonst nur noch bei Vertretern der Prochlorophyten vor ( Tabelle 3.32). Diese Prokaryonten besitzen wie die Pflanzen Chlorophyll a und b, während die Cyanobakterien nur Chlorophyll a und zusätzlich Phycobiline besitzen. Auf Grund dieser Befunde wurde lange Zeit angenommen, mit den Prochlorophyten die unmittelbaren Vorläufer der Chloroplasten entdeckt zu haben.

Anoxygene Photosynthese

Bakterien, die eine anoxygene Photosynthese betreiben ( Abb. 3.42), fehlt das Photosystem II. Daher ist es diesen Bakterien nicht möglich, Wasser zu spalten und dessen Reduktionsäquivalente für die Erzeugung von Energie und die Fixierung von CO2 zu verwenden. Sie verwenden fast immer H2S oder andere reduzierte anorganische Schwefelverbindungen, aber z. T. auch molekularen Wasserstoff oder organische Säuren als Elektronendonatoren. Eine wichtige und sehr heterogene Gruppe von anoxygenen phototrophen Bakterien sind die Purpurbakterien; sie fixieren CO2 über den Calvin-Cyclus. Hierzu gehören die Schwefelpurpurbakterien, die aus H2S gebildeten Schwefel vorübergehend intra- oder extrazellulär ablagern können, bevor dieser weiter

Abb. 3.42. jenense (C)

Hellfeldaufnahmen von Rhodospirillum sp. (A), Chromatium okenii (B) und Thiospirillum

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen Tabelle 3.32.

Lichtnutzung bei Prokaryonten

Bakteriengruppe

Gattungen

CO2-Fixierung

Besondere Eigenschaften

Purpurbakterien Schwefelpurpurbakterien

Allochromatium Calvin-Cyclus Ectothiorhodospira Lamprocystis Thiocapsa Thiospirillum

Bacteriochlorophylle a und b Schwefel wird intra- oder extrazellulär abgelagert

NichtschwefelPurpurbakterien

Rhodobacter Calvin-Cyclus Rhodomicrobium Rhodospirillum Rhodopseudomonas Rubrivivax

Bacteriochlorophylle a und b keine Ablagerung von Schwefel

Grüne Schwefelbakterien

Chlorobium Chloronema Pelodictyon

reduktiver Citrat-Cyclus

Bacteriochlorophylle a, c, d und e Photosynthesepigmente in Chlorosomen lokalisiert. Schwefel wird extrazellulär abgelagert.

Grüne Nichtschwefelbakterien

Chloroflexus

Hydroxypropionat-Weg

Bacteriochlorophylle a und c keine Ablagerung von Schwefel

Heliobakterien

Heliobacillus Heliobacterium Heliophilum Heliorestis

Calvin-Cyclus

Bacteriochlorophyll g Gram-positiv keine intrazellulären Membranen

Aerobe anoxygene phototrophe Bakterien

Erythrobacter heterotroph Erythromicrobium Roseococcus Sandaracinobacter

typische Photosynthesepigmente (Bacteriochlorophylle und Carotinoide) sind vorhanden. Licht wird zur Synthese von ATP genutzt.

Cyanobakterien

Anabaena Dermocarpa Fischerella Gloeothece Nostoc Oscillatoria Synechococcus

Calvin-Cyclus

nur Chlorophyll a Phycobiline (Phycocyanine und Phycoerythrin)

Prochlorophyten

Prochloron Prochlorothrix

Calvin-Cyclus

Chlorophylle a und b keine Phycobiline

Halobakterien

Halobacterium heterotroph Haloferax Halorubrum Natrialba Natronobacterium

Grüne Bakterien

keine Bacteriochlorophylle oder Chlorophylle Purpurmembran mit Bacteriorhodopsin, lichtgetriebene Protonenpumpe

101

102

3 Versuche

zu Sulfat oxidiert wird. Hierzu gehören auch die Nichtschwefel-Purpurbakterien, die Schwefel selten ablagern und von denen manche in einigen Metern Tiefe von Teichen und Seen zur Massenvermehrung gelangen können. Eine zweite wichtige Gruppe der anoxygenen phototrophen Bakterien sind die grünen Bakterien, zu denen die grünen Schwefelbakterien und die grünen Nichtschwefelbakterien gehören. Vertreter der ersten Gruppe lagern Schwefel vorübergehend extrazellulär ab und fixieren CO2 über den reduktiven Citrat-Cyclus. Bei den Vertretern der zweiten Gruppe wird die Ablagerung von Schwefel nicht beobachtet, und die Fixierung von CO2 erfolgt über den Hydroxypropionat-Weg. Eine dritte wichtige Gruppe sind die Heliobakterien. Während alle bisher genannten anoxygenen phototrophen Bakterien Gram-negativ sind und zu den Proteobakterien gehören, sind Heliobakterien Gram-positiv. Heliobakterien besitzen als einzige Bacteriochlorophyll g; sie assimilieren CO2 über den Calvin-Cyclus. Aerobe anoxygene phototrophe Bakterien

Neben den oben beschriebenen anoxygenen phototrophen Bakterien hat man Bacteriochlorophylle und für die Photosynthese typische akzessorische Pigmente auch noch in einigen aeroben anoxygenen phototrophen Bakterien entdeckt. Diese Bakterien erzeugen durch die anoxygene Photosynthese Energie in Form von ATP, sind aber nicht zu einer autotrophen Fixierung von CO2 in der Lage. Ein weiterer wichtiger Unterschied zu den oben aufgeführten Bakterien ist, dass sie obligat aerob sind.

Lichtnutzung bei Archaea

Photosynthese wurde bisher noch nicht bei Archaea nachgewiesen. Die extrem halophilen Archaea können Licht zwar zur Energiegewinnung nutzen, sie absorbieren Licht jedoch nicht mit Chlorophyllen oder den anderen aus photosynthetischen Bakterien bekannten akzessorischen Pigmenten, sondern mit Hilfe ihrer Purpurmembran. Außerdem können diese Archaea grundsätzlich kein CO2 fixieren. In der Purpurmembran der Halobakterien kommt Bacteriorhodopsin vor, welches durch eine lichtinduzierte Konformationsänderung Protonen über die Cytoplasmamembran transloziert und so einen Protonengradienten aufbaut. Man spricht von einer lichtgetriebenen Protonenpumpe. Der Protonengradient ermöglicht der ATP-Synthase die Bildung von ATP aus ADP und anorganischem Phosphat (Pi). Halobakterien gelangen in Meerwasser-Salzgewinnungsanlagen bei entsprechenden Temperaturen zur Massenvermehrung und färben den Wasserkörper charakteristisch purpur.

WinogradskySäulen

In nach dem russischen Mikrobiologen Sergej N. Winogradsky benannten Säulen ( Abb. 3.43) kann das den anoxygenen phototrophen Bakterien als Elektronendonator dienende H2S kontrolliert erzeugt werden. Winogradsky setzte diese Säulen ursprünglich zur Anreicherung farbloser Schwefelbakterien ein, an denen er das Konzept der Lithotrophie entwickelte. Inkubiert man diese Säulen jedoch in Gegenwart von Licht, kommt es zur Anreicherung von anoxygenen phototrophen Bakterien. Durch Wahl der Quelle für H2S, die sich am Boden der Säulen befindet, und durch Applikation von Licht bestimmter Wellenlängenbereiche ist es möglich, unterschiedliche phototrophe Bakterien gezielt anzureichern. H2S kann aus zugegebenem proteinhaltigem Material (gekochtes Eiweiß, Fleisch) durch Desulfuration langsam freigesetzt werden. Es kann auch aus zugegebenem Gips (CaSO4) durch sulfatreduzierende Bakterien in stärkerem Umfang gebildet werden. Die Wahl der Quelle für H2S hat also Einfluss auf dessen Konzentration im Wasserkörper der Säule und damit darauf, welche anoxygenen phototrophen Bakterien sich in der Anreicherung durchsetzen. NichtschwefelPurpurbakterien setzen sich besonders leicht bei Verabreichung von proteinhaltigem Material und Licht der Wellenlänge zwischen 800 und 1100 nm durch. Schwefelpurpurbakterien und Grüne Schwefelbakterien setzen sich dagegen bei der Verabreichung von Gips sowie Licht einer Wellenlänge zwischen 800 und 900 nm bzw. 720 bis 770 nm durch.

V20 - S. 108

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

Versuchsziel Dieser Versuch soll am Beispiel der Winogradsky-Säulen in die Technik der Anreicherung von anoxygenen phototrophen Bakterien einführen. Außerdem sollen die Wechselwirkungen zwischen diesen Bakterien und sulfatreduzierenden Bakterien verdeutlicht werden. Versuchsdurchführung benötigtes Material Geräte  100 ml-Messzylinder aus Glas (oder ein ähnliches Gefäß)  Lampe mit 60 W Birne  Zeitschaltuhr  Bunsenbrenner  Objektträger  Phasenkontrastmikroskop

Chemikalien und Medien  Gips (CaSO4)

Sonstiges    

Teichschlamm Teichwasser Sand Hackfleisch

Abb. 3.43. Beispiel für den Aufbau einer Winogradsky-Säule

Der Boden eines 100 ml-Messzylinders aus Glas (oder eines ähnlich dimensionierten Gefäßes) wird mit Hackfleisch belegt ( Abb. 3.43). Darüber wird eine ca. 4 cm hohe Schicht modelliert, die aus etwa gleichen Anteilen Gips (CaSO4) und Schlamm besteht. Den Abschluss nach oben bildet eine dünne Schicht aus Sand. Die Schichten im Sediment haben hierbei folgende Funktion: Das Mett liefert die Kohlenstoffquelle für eine anaerobe Nahrungskette, an deren Anfang primäre Gärer (z. B. proteolytische Clostridien) stehen, deren Gärungsprodukte (Butyrat, Acetat, H2 etc.) in der darüber liegenden Schicht von den im Teichschlamm vorhandenen Desulfurikanten zur Reduktion des Sulfats (aus dem Gips) verwendet werden. Der hierbei entstehende Schwefelwasserstoff diffundiert durch die als permeable Abdeckung fungierende Sandschicht in den Wasserkörper, in dem schließlich bevorzugt die Schwefelpurpur- und die grünen Schwefelbakterien zur Blüte gelangen. Die Glassäule wird vorsichtig komplett mit Teichwasser gefüllt und mit einem Petrischalendeckel bedeckt. Die Bestrahlung mit Licht erfolgt aus ca. 30 bis 40 cm Entfernung für täglich 10 Stunden. Die Anreicherung phototropher Bakterien wird zunächst bezüglich Farbe und Verteilung bewertet. Die Mikroskopie von Proben aus unterschiedlichen Zonen der Wassersäule dient vor allem der Sichtbarmachung der teilweise äußerst prächtigen Schwefelpurpurbakerien ( Abb. 3.42). Dem überaus starken Bewegungsdrang einiger Vertreter dieser Gruppe kann durch Hitzefixierung auf dem Objektträger Einhalt geboten werden. Dazu wird der Objektträger mit der Probe ohne Deckgläschen mit der Probenseite nach oben mehrmals durch eine entleuchtete Bunsenbrennerflamme gezo-

103

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3 Versuche

gen, bis das Material gut eingetrocknet ist (ohne dabei zu „verbrutzeln“!). Die Betrachtung eines solchen Präparats erfolgt ohne Deckgläschen im Phasenkontrast mit Ölimmersion. Weiterführende Literatur Haupts U, Tittor J, Oesterhelt D (1999) Closing in on bacteriorhodopsin: progress in understanding the molecule. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure 28:367-399 Madigan MT (2001) The Family Heliobacteriaceae. In: Dworkin M (ed) The Prokaryotes (elektronische Version: http://link.springer.de/link/service/books/10125, Release 3.5 vom 13.3.2001) Springer, New York Mur LR, Burger-Wiersma T (1999) The Order Prochlorales. In: Dworkin M (ed) The Prokaryotes (elektronische Version: http://link.springer.de/link/service/books/10125, Release 3.5 vom 21.5.1999) Springer, New York Overmann J, Garcia-Pichel F (2000) The Phototrophic Way of Life. In: Dworkin M (ed) The Prokaryotes (elektronische Version: http://link.springer.de/link/service/books/10125, Release 3.2 vom 25.7.2000) Springer, New York Stackebrandt E, Rainey FA, Ward-Rainey N (1996) Anoxygenic phototrophy across phylogenetic spectrum: current understanding and future perspectives. Archives of Microbiology 166:211-223 Stal LJ (1995) Physiological ecology of cyanobacteria in microbial mats and other communities. New Phytologist 131:1-32 Yurkov VV, Beatty JT (1998) Aerobic anoxygenic phototrophic bacteria. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62:695-724

Nachgefragt 1. Warum ist die Photosynthese ein lithotropher Prozess? 2. Welche Wege der CO2-Fixierung kommen in phototrophen Bakterien vor und erlauben diesen Bakterien eine autotrophe Lebensweise? 3. Kommen diese Wege der CO2-Fixierung auch in heterotrophen Bakterien vor? Sind dies die einzigen Wege der CO2-Fixierung? 4. Wie unterscheidet sich die Photosynthese der Cyanobakterien von denen aller anderen prokaryontischen phototrophen Organismen? 5. Welche Elektronendonatoren können photoautotrophe Bakterien nutzen? 6. Welche photosynthetischen Bakterien lagern Schwefel intra- oder extrazellulär ab? 7. Warum gibt es in Cyanobakterien spezialisierte Zellen, denen das Photosystem II fehlt, und wie werden diese Zellen genannt? 8. Welche Pigmente sind an der bakteriellen Photosynthese in den verschiedenen Gruppen beteiligt? 9. Wie werden die besonderen Membranstrukturen der grünen Schwefelbakterien bezeichnet, in denen die Photosynthesepigmente lokalisiert sind? 10. Beschreiben Sie den Aufbau von WinogradskySäulen und mit welchen Variablen Sie unterschiedliche anoxyge phototrophe Bakterien anreichern können! 11. Warum ist bei einigen Winogradsky-Säulen die Anwesenheit von sulfatreduzierenden Bakterien unabdingbar?

12. Wie erklären Sie sich die sehr unterschiedliche Farben der Kulturen von anoxygenen phototrophen Bakterien und dass von einzelnen Gruppen Licht sehr unterschiedlicher Wellenlänge für die Photosynthese genutzt wird? 13. Welches Konzept entwickelte Winogradsky, und für welche Untersuchungen setzte er Winogradsky-Säulen ein? 14. Was ist Ihnen bei der Betrachtung der Anreicherungskulturen aus den Winogradsky-Säulen bei den phototrophen Bakterien aufgefallen? 15. Welche Besonderheiten zeichnen die aeroben anoxygenen phototrophen Bakterien aus? 16. Beschreiben Sie, welche Archaea ebenfalls Licht zur Erzeugung von Energie nutzen können und wie dies geschieht! 17. Warum kann die Lebensweise von Allochromatium vinosum als photolithoautotroph bezeichnet werden, die von Halobacterium halobium jedoch nur als photoorganoheterotroph? 18. Konsultieren Sie Lehrbücher der Mikrobiologie und beschreiben Sie die chemische Struktur von Bacteriorhodopsin und wie das Bacteriorhodopsin Protonen über eine Membran translozieren kann! 19. Welche Besonderheiten zeichnen Vertreter der Heliobakterien aus? 20. Welche besondere Zusammensetzung der Photosynthesepigmente zeichnet Vertreter der Prochlorophyten aus und was wurde hieraus geschlossen?

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

Anreicherung und Isolierung von Schwefel-Oxidierern (farblose Schwefelbakterien)

105

Versuch 19

Theoretischer Hintergrund Schwefel oxidierende Bakterien oxidieren verschiedene anorganische reduzierte Schwefelverbindungen, wobei Sulfid (S2-), PAPS elementarer Schwefel (S0) und Thiosulfat (S2O32-) die bevorzugten Substrate darstelSO HS S len. Die Oxidation dieser als Elektronendonatoren dienenden Verbindungen erfolgt schrittweise bis zum Sulfat (SO42-). Dient S SO Sulfid als Ausgangsverbindung, wird oft (vorübergehend) elementarer Schwefel abgelagert ( Abb. 3.44). Diese Bakterien Abb. 3.44. Relevante Reaktionen des spielen im Schwefelkreislauf eine sehr wichSchwefelkreislaufs tige Rolle; einige sind auch biotechnologisch bedeutend. Schwefel oxidierende Bakterien gehören zur großen und heterogenen Gruppe der lithotrophen Bakterien, weil sie anorganische Verbindungen als Elektronendonatoren verwenden. Das Konzept der Lithotrophie wurde im 19. Jahrhundert von dem russischen Mikrobiologe Sergej N. Winogradsky an farblosen Schwefelbakterien der Gattung Beggiatoa entwickelt.

Mikrobiell oxidierbare anorganische Schwefelverbindungen

Lithotrophe, schwefeloxidierende Bakterien sind ernährungsphysiologisch einer von zwei großen Gruppen zuzuordnen. Die eine Gruppe stellen die anoxygen phototrophen Bakterien dar, welche H2S und nicht H2O wie oxygen phototrophe Organismen (Pflanzen und Cyanobakterien) als Elektronendonator für die Photosynthese nutzen. Da diese Bakterien Kohlendioxid fixieren und hieraus ihre Zellbausteine synthetisieren, bezeichnet man diese als photolithoautotroph. Diese Bakterien sind Gegenstand des vorhergehenden Versuchs im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM. Für die Vertreter der zweiten Gruppe hat sich die Bezeichnung farblose Schwefelbakterien etabliert. Diese Mikroorganismen verwenden H2S und andere reduzierte anorganische Schwefelverbindungen als Elektronendonatoren, übertragen die Reduktionsäquivalente über Atmungsketten auf Sauerstoff und gewinnen dabei durch Elektronentransportkettenphosphorylierung Energie in Form von ATP; einige nutzen auch Nitrat als Elektronenakzeptor. Diese farblosen Schwefelbakterien werden deshalb als chemolithotroph bezeichnet. Sie können Licht nicht nutzen und wachsen im Dunkeln. Viele, aber nicht alle, können aber auch Kohlendioxid fixieren, diese bezeichnet man dann als chemolithoautotroph. Andere chemolithotrophe Bakterien wie die nitrifizierenden Bakterien oder die Knallgasbakterien sind ebenfalls Gegenstand des MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUMS.

Formen der Lithotrophie

Die farblosen Schwefelbakterien sind von ihrer phylogenetischen Stellung, vom Stoffwechsel und von ihrem Toleranzbereich gegenüber abiotischen Faktoren her sehr heterogen. Sie stellen eine sehr große Gruppe dar, und in den letzten Jahren hat es hier wie bei den meisten anderen großen Gruppen besonders viele Neubewertungen der taxonomischen Zuordnung gegeben. Als Ergebnis sind zahlreiche neue Gattungen hervorgegangen und viele Umbenennungen vorgenommen worden. Zur Unübersichtlichkeit trägt weiter die große Anzahl neu isolierter Vertreter bei. Die vier wichtigsten stoffwechselphysiologischen Gruppen, in welche die farblosen Schwefelbakterien üblicherweise eingeteilt werden, verdeutlichen diese großen Unterschiede ( Tabelle 3.33).

Physiologische Gruppen der farblosen Schwefelbakterien

SO32-

APS

+ VI

2-

4

Dispr opor tion ieru ng

- II

2

org

Mineralisation

1.4.4, S. 14

che

mo

+ IV

0

lito

2-

tro

3

aerob

p

he Sc hw efe lox id

anaerob

atio n

V18 - S. 99

V15 - S. 88 V17 - S. 95

106

3 Versuche Tabelle 3.33.

Stoffwechselphysiologische Gruppen der farblosen Schwefelbakterien Kohlenstoffquelle

Energiequelle

Stoffwechseltyp CO2

organisch

anorganisch

organisch

obligat chemolithoautotroph

+

-

+

-

fakultativ chemolithotroph

+

+

+

+

chemolithoheterotroph

-

+

+

+

chemoorganoheterotroph

-

+

-

+

Obligat chemolithotrophe Vertreter fixieren CO2 durchweg über den CalvinCyclus. Die Mehrheit der Gattung Acidithiobacillus, alle Species der Gattung Thiomicrospira und Sulfolobus gehören hierzu. Fakultativ chemolithotrophe Vertreter können im Gegensatz zu den obligaten Vertretern zusätzlich auch organische Verbindungen als Kohlenstoff- und Energiequelle nutzen und zeichnen sich deshalb durch eine mixotrophe Ernährungsweise aus. Einige Spezies der Gattung Acidithiobacillus gehören hierzu. Paracoccus pantotrophus (früher: Thiosphaera pantotropha), Beggiatoa und auch Paracoccus denitrificans sind weitere typische Beispiele. Chemolithoheterotrophe Schwefelbakterien wie Thiomonas perometabolis (früher: Thiobacillus perometabolis) stellen eine Minderheit der farblosen Schwefelbakterien dar; sie können durch die Oxidation reduzierter Schwefelverbindungen Energie erzeugen, aber nicht CO2 fixieren. Chemoorganoheterotrophe Schwefel oxidierende Bakterien können zwar reduzierte Schwefelverbindungen oxidieren, hieraus aber keine Energie gewinnen. Hier ist die Oxidation der Schwefelverbindungen möglicherweise bei der Beseitigung toxischer Stoffwechselprodukte von Bedeutung. Morphologische Besonderheiten

In Tabelle 3.34 sind einige Vertreter von farblosen Schwefelbakterien aufgeführt, von denen auch einige zu den Archaea gehören. Hierzu gehören auch auffällig viele sehr große Bakterien. Thiomargarita namibiensis ist der größte zur Zeit bekannte prokaryontische Organismus (1.1.2, S. 5). Weitere Besonderheiten sind das Vorkommen von Vakuolen, Einschlüssen aus Calciumcarbonat und Carboxysomen (Zelleinschlüsse aus dem Enzym Ribulose-1,5-bisphosphat Carboxylase).

Natürliche Habitate

Die große stoffwechselphysiologische Vielfalt ermöglicht den farblosen Schwefelbakterien ein Vorkommen in vielen natürlichen Habitaten. Sie kommen praktisch überall dort vor, wo reduzierte Schwefelverbindungen biologisch oder geologisch bereit gestellt werden. Dies trifft besonders zu auf die Übergangsbereiche von anaeroben zu aeroben Zonen in oder über den Sedimenten aquatischer Ökosysteme an marinen und Süßwasserstandorten, wo H2S in großen Mengen durch die sulfatreduzierenden Bakterien entsteht. Besondere Bedeutung kommt den farblosen Schwefelbakterien in den Hydrothermalquellen der Tiefsee zu, wo H2S aus geologischen Quellen eingespeist wird. Hier erfolgt durch die farblosen Schwefelbakterien im großen Umfang Primärproduktion von Biomasse, die einer großen Vielfalt und Vielzahl von Organismen ein Leben in Abwesenheit von Licht ermöglicht. Ein sehr hoher Anteil der farblosen Schwefelbakterien ist dort endo- oder ektosymbiontisch mit höheren Organismen, z. B. in dem Röhrenwurm Riftia pachyptila oder den Muscheln Calyptogena magnifica und Thyasira flexuosa, vergesellschaftet.

Mikrobielle Erzlaugung

Unlösliche Mineralien wie z. B. Pyrit (FeS2) und Chalcocit (Cu2S) stellen eine weitere Quelle für reduzierte Schwefelverbindungen dar. Viele Thiobacilli wie z. B. Acidithiobacillus ferrooxidans (früher: Thiobacillus ferrooxidans) nutzen neben H2S auch oxidierte Metallionen als Elektronendonatoren. Dies macht man sich bei der mikrobiellen Erz-

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen Tabelle 3.34.

Morphologische Besonderheiten farbloser Schwefelbakterien

Farbloses Schwefelbakterium Bacteria Achromatium oxaliferum Beggiatoa alba Thiobacillus ferrooxidans Acidithiobacillus thiooxidans (früher: Thiobacillus thiooxidans) Halothiobacillus neapolitanus (früher: Thiobacillus neapolitanus) Thiomargarita namibiensis Thiomicrospira thyasirae (früher: Thiobacillus thyasiris) Thioploca chileae Thiovulum majus Archaea Acidianus infernus Sulfolobus acidocaldarius

Besonderheit Calciumcarbonat-Einschlüsse großes fädiges Bakterium oxidiert aus Eisen, bakterielle Erzlaugung toleriert 1 N Schwefelsäure Carboxysomen größtes Bakterium (Ø bis 750 μm), besitzt Vakuole Endosymbiont in Thyasira flexuosa Fäden bis einige cm Länge, besitzt Vakuole schnellster prokaryontischer „Schwimmer“ thermoacidophil thermoacidophil

laugung zunutze, mit der an einigen Standorten in Amerika, Südafrika und Asien Kupfer und Uran aus minderwertigen Erzen gewonnen werden. Im Fall der Kupferlaugung oxidiert Acidithiobacillus ferrooxidans Cu+ im Cu2S zunächst Cu2+, und es entsteht CuS. Gleichzeitig wird in Pyrit vorkommendes Fe2+ zu Fe3+ oxidiert. Fe3+-Ionen sind ein starkes Oxidationsmittel, welches den in CuS vorkommenden Schwefel chemisch oxidiert. Als Folge geht Kupfer als Cu2+ in Lösung. An diesem Schritt der Schwefeloxidation sind die Bakterien im Fall der Erzlaugug wahrscheinlich nicht in einem nennenswerten Umfang beteiligt; die Bakterien sind hier für die Reoxidation des im letzten Schritt entstandenen Fe2+ zu Fe3+ wichtig. Versuchsziel benötigtes Material Geräte    

100 ml-Erlenmeyerkolben Impföse Brutschrank (30 °C) Phasenkontrastmikroskop

Chemikalien und Medien  Thiosulfat-Nährlösung ( S. 428)  Thiosulfat-Festmedium ( S. 428)

Sonstiges

In diesem Versuch sollen farblose Schwefelbakterien angereichert werden. Bei der Verwendung von Thiosulfat und unter aeroben Bedingungen kommen hierbei Vertreter der Thiobacilli zur Anreicherung. Versuchsdurchführung Ein 100 ml-Erlenmeyerkolben wird mit 15 ml Thiosulfat-Nährlösung und 1 ml Teichwasser versetzt. Der mit Alukappe bedeckte Kolben wird bei 30 °C im Dunkeln inkubiert (nicht schütteln!).

 Teichwasser

Die Oberfläche der Kultur wird zunächst auf Kahmhautbildung untersucht (heftige Bewegungen vermeiden!). Es wird der pH-Wert des Mediums bestimmt. Von der Kahmhaut wird mit der Impföse etwas Material entnommen und per Kreuzausstrich (M4, S. 365) auf Thiosulfat-Agar gebracht. Die Platte wird bei 30 °C im Dunkeln bebrütet. Material der farblosen Kolonien wird im Phasenkontrast mikroskopiert. Kleine bewegliche stäbchenförmige Zellen deuten auf Acidithiobacillus sp. hin.

107

108

3 Versuche

Weiterführende Literatur Friedrich CG (1998) Physiology and genetics of sulfur-oxidizing bacteria. Advances in Microbial Physiology 39:235-289 Jorgensen BB, Galardo VA (1999) Thioploca spp: filamentous sulfur bacteria with nitrate vacuoles. FEMS Microbiology Ecology 28:301-313 Robertson LA, Kuenen JG (2000) The Colorless Sulfur Bacteria. In: Dworkin M (ed) The Prokaryotes (elektronische Version: http://link.springer.de/link/service/books/10125, Release 3.0 vom 21.5.1999) Springer, New York Suzuki I (2001) Microbial leaching of metals from sulfide minerals. Biotechnology Advances 19:119-132

Nachgefragt 1. Was versteht man unter Lithotrophie, und an welchen Bakterien wurde dieses Konzept von wem entwickelt? 2. Nennen Sie die Oxidationszahlen des Schwefels in Sulfid, elementarem Schwefel, Thiosulfat, Sulfit und Sulfat! 3. Beschreiben sie die chemischen Wechselwirkungen zwischen H2S und Sauerstoff! 4. Wo kommen in der Natur reduzierte Schwefelverbindungen vor, die als Elektronendonatoren für farblose Schwefelbakterien geeignet sind? 5. Welche nicht Schwefel enthaltenden Verbindungen können Vertreter der Gattung Acidithiobacillus häufig auch als Elektronendonatoren verwenden? 6. Nennen Sie Standorte, an denen eine Primärproduktion von Biomasse erfolgen kann und welche Organismen hierfür verantwortlich sind! 7. Welche anorganischen Verbindungen können von chemolithotrophen Bakterien als Elektronendonatoren genutzt werden? Stellen Sie die verschiedenen stoffwechselphysiologischen Gruppen zusammen! 8. Warum müssen die Kulturen zur Anreicherung von farblosen Schwefelbakterien in Abwesenheit von Licht inkubiert werden? 9. Über welchen Stoffwechselweg zur Fixierung von CO2 verfügen die zur autotrophen Lebensweise befähigten farblosen Schwefelbakterien?

Versuch 20

10. Wie unterscheidet sich die photolithoautotrophe von der chemolithoautotrophen Lebensweise? 11. Wie unterscheidet sich die chemolithoautotrophe von der chemolithoheterotrophen Lebensweise? 12. Nennen Sie bei farblosen Schwefelbakterien beobachtete Besonderheiten? 13. Nennen Sie den größten zur Zeit bekannten prokaryontischen Organismus! 14. Berechnen Sie, wie viele Zellen von Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae bzw. wie viele Mitochondrien in dem größten Prokaryonten Platz finden könnten! 15. Suchen Sie in Lehrbüchern der Mikrobiologie nach weiteren Riesen und gleichzeitig nach den kleinsten Bakterien unter den Prokaryonten! 16. Welche farblosen Schwefelbakterien gehören zu den Archaea? 17. Wo kommen endosymbiontisch lebende farblose Schwefelbakterien vor? 18. Welche Metalle werden durch mikrobielle Erzlaugung gewonnen? Beschreiben Sie die biochemischen und chemischen Vorgänge bei der mikrobiellen Erzlaugung! 19. Konsultieren Sie Lehrbücher der Mikrobiologie und besorgen Sie sich im Internet Informationen über die Hydrothermalquellen der Tiefsee! Welche wichtigen biologischen Prozesse laufen dort ab? 20. Zeichnen Sie die Strukturformel von Thiosulfat!

Anreicherung von sulfatreduzierenden Bakterien Theoretischer Hintergrund

Bedeutung und Vorkommen von Sulfat

Schwefel hat an der Biomasse einen Anteil von ca. 1 % und kommt dort u. a. in den Aminosäuren Methionin und Cystein, in einigen Coenzymen wie z. B. Coenzym A, Liponsäure und Coenzym M sowie in Eisenschwefelzentren von Proteinen vor ( Tabelle 1.3, Seite 7). Sulfat ist ein wichtiges Intermediat im Schwefelkreislauf ( Abb. 3.45) und für die Biosphäre die wichtigste Schwefelquelle. Die Bedeutung von Sulfat erklärt sich aus seiner hohen Konzentration an marinen Standorten. Die Ozeane, die ungefähr zwei Drittel des Erdballs bedecken, enthalten Sulfat in einer Konzentration von ca. 2,7 g/l. Aber auch im Süßwasser und an terrestrischen Standorten und in den Intestinaltrakten höherer Organismen kommt Sulfat vor.

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

ulf

e atr

t duk

ion

SO32-

im ss

Diss im

PAPS

a

Su lfa t

re

on k ti du

ilato risc

APS

ilat

Es entsteht hier vor allem durch aerobe chemolithoautotrophe Mikroorganismen stetig aus Sulfid (H2S), Schwefel (S) oder anderen reduzierten Schwefelverbindungen. Obwohl die für Sulfat nachweisbaren Konzentrationen dort wesentlich niedriger als an marinen Standorten sind, stehen letztlich auch hier sehr große Mengen Sulfat zur Verfügung.

+ IV

he

or is

ch

eS

+ VI

- II

2-

SO4

- II

H2S

SO32-

109

Sorg

S

V19 - S. 105

1.4.4, S. 14

aerob anaerob

Vorhandenes Sulfat kann von Organismen auf zweierlei Art und Weise genutzt werden. Durch den Versuch zur Anreicherung von denitrifizierenden Bakterien ist bereits bekannt, dass Bakterien, die bei der Oxidation von Kohlenstoff- und Energiequellen NH2 anfallenden Reduktionsäquivalente nicht N nur auf Sauerstoff, sondern auch auf andere N anorganische oder organische ElektronenakO O zeptoren übertragen können, um Coenzyme N N HC O P O S O zu regenerieren. Sulfat wird von anaeroben O 2 Bakterien durch dissimilatorische SulfatO O reduktion nach Überführung in Adenosin5’-phosphosulfat (APS,  Abb. 3.46) HO R schrittweise durch die Enzyme APS-Reduktase und Sulfit-Reduktase zu Sulfid oxiAPS R : OH diert. Da sich der Oxidationszustand vom O Schwefel dabei von +VI zu -II verändert, PAPS R : O P O werden hierfür acht Elektronen benötigt. Die O Zwischenstufen sind in Abb. 3.47 aufgeführt. Diese Vorgänge dienen der Erzeugung von Abb. 3.46. Strukturformel von AdenosinEnergie in Form von ATP durch Elektronen5’-Phosphosulfat (APS) bzw. Phosphotransportkettenphosphorylierung unter adenosin-5’-Phosphosulfat (PAPS) Nutzung des dabei aufgebauten Protonengradienten. Sulfatreduzierende Bakterien und andere schwefelreduzierende Bakterien können neben oder statt Sulfat einige weitere Schwefelverbindungen nutzen und oxidieren oder disproportionieren. Sogar eine Vergärung von Thiosulfat wurde nachgewiesen. Zur dissimilatorischen Sulfatreduktion befähigte Bakterien fixieren CO2 entweder über den reduktiven Citrat-Cyclus oder über den reduktiven Acetyl-CoA-Weg. Abb. 3.45. Die Sulfatreduktion im Kontext des Schwefelkreislaufes

Von der dissmilatorischen Sulfatreduktion ist die assimilatorische Sulfatreduktion zu unterscheiden. Hierbei wird das aus Sulfat gebildete APS zunächst in Phosphoadenosin-5’-phosphosulfat (PAPS,  Abb. 3.46, ) überführt, bis auch hier der Schwefel AT P +V I

2H []

PPi

2-

+IV

APS

SO4

Su lfit AT PSu se ra d y lfh

APSRe se ta k u d

Dissimilatorische Sulfatreduktion

a n o rith T

2H []

2H []

2-

2-

SO3

Su t lfa

Abb. 3.47.

2H []

AM P

S3O6 t lfa su io h T

Su lfid Su lfitRe se ta k u d

S2O3

2-

-II

H2S

Zwei Formen der Sulfatreduktion O O

S O O Su t lfa

V16 - S. 91

110

3 Versuche

schrittweise zu Sulfid reduziert wird. Dieser Vorgang dient der Überführung von Sulfat in eine Form des Schwefels, die in organische Moleküle einbaubar ist. Die assimilatorische Sulfatreduktion kann auch unter aeroben Bedingungen erfolgen und muss in allen Organismen ablaufen, die Sulfat als alleinige Schwefelquelle nutzen. Sie erfolgt deshalb auch in aeroben Bakterien und in höheren Organismen wie z. B. den Pflanzen. Vier Phylogenetische Gruppen

V7 - S. 59 V8 - S. 62 V14 - S. 85

Verwerter von Acetat

Nichtverwerter von Acetat

Sulfatreduzierende Bakterien sind eine große, phylogenetisch und auch stoffwechselphysiologisch sehr heterogene Gruppe von anaeroben Bakterien. Viele von ihnen sind strikt anaerob; einige überleben jedoch eine Exposition gegenüber Sauerstoff, und wenige können Sauerstoff sogar nutzen! Basierend auf Analysen der 16S rRNA-Gensequenz werden sulfatreduzierende Bakterien in vier phylogenetische Gruppen eingeteilt. Sulfatreduzierende Bakterien finden sich sowohl unter den Gram-negativen wie auch Gram-positiven Bakterien, und einige von ihnen gehören zu den Archaea. Sogar endosporenbildende Vertreter sind bekannt. In Tabelle 3.35 sind diese Gruppen mit einigen Vertretern aufgeführt. Stoffwechselphysiologisch unterscheidet man zwei Gruppen. Vertreter der einen Gruppe, wie z. B. Desulfobacter postgatei, sind in der Lage, Acetat zu verwerten. Es findet dabei eine vollständige Oxidation zu CO2 statt. Die Umwandlung erfolgt durch Enzyme, die vom reduktiven AcetylCoA Weg der CO2-Fixierung bekannt sind. In solchen Bakterien sind damit auch die Voraussetzungen gegeben, um Acetyl-CoA, welches aus dem Abbau langkettiger Fettsäuren durch β-Oxidation resultiert, zu CO2 abbauen zu können.

Tabelle 3.35. Phylogentische Gruppen der sulfatreduzierenden Bakterien Gram-negative, mesophile (δ-Proteobakterien) Desulfobacter postgatei Desulfovibrio desulfuricans Gram-positive Endosporenbildner Desulfotomaculum acetoxidans Desulfosporosinus orientis thermophile Bakterien Thermodesulfobacterium commune Thermodesulforhabdus norvegica thermophile Archaea Archaeoglobus fulgidus Archaeoglobus veneficus

2 Lactat SO42-

2 Acetat 2 CO2 + H2S

Abb. 3.48. Reduktion von Sulfat durch Lactat in Desulfovibrio desulfuricans

Vertreter der anderen Gruppe können Acetat nicht oxidieren. Diese Bakterien nutzen fast immer Lactat, Pyruvat und molekularen Wasserstoff (H2) als Elektronendonator, einige können auch primäre Alkohole wie z. B. Ethanol oder sogar Benzoat nutzen. Häufig ist dann Acetat eines der Endprodukte. Wie eben erwähnt, ist Lactat ein verbreitetes Substrat der sulfatreduzierenden Bakterien. In Desulfovibrio desulfuricans wird Abb. 3.49. Korrosion eines Eisennagels durch Stoffwechselaktivität Lactat durch eine Lactat-Dehydrogenase (Schwärzung) von sulfatreduzierende Bakterien zu Pyruvat oxidiert ( Abb. 3.48). Aus diesem entsteht durch das Enzym Pyruvat:Ferredoxin-Oxidoreduktase CO2 und Acetyl-CoA, welches dann durch die Enzyme Phosphotransacetylase und Acetat-Kinase über Acetyl-Phosphat in Acetat umgewandelt wird. Beim letzten Schritt wird Energie durch Substratkettenphosphory-

3.2 Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen

111

lierung gewonnen. Insgesamt werden hierbei vier Reduktionsäquivalente pro Molekül Lactat frei; es ist also die Oxidation von zwei Molekülen Lactat erforderlich, um ein Molekül Sulfat zu Sulfid reduzieren zu können. Zur Anreicherung von sulfatreduzierenden Bakterien wird ein anaerobes Medium benötigt, welches einen geeigneten Elektronendonator und eine assimilierbare Kohlenstoffquelle enthält. Man beimpft diese Kultur z. B. mit Material aus Faulschlamm, aus anaeroben Sedimenten aquatischer Ökosysteme oder aus Intestinaltrakten höherer Organismen. Üblicherweise fügt man dem Ansatz einen Eisennagel bei. Schon nach kurzer Zeit färbt sich der zuvor blanke Nagel schwarz ( Abb. 3.49). Dies ist auf Ablagerungen von Eisensulfid (FeS) zurückzuführen. An dieser Stelle soll erwähnt werden, dass sulfatreduzierende Bakterien durch eine anaerobe Korrosion von Eisen beträchtliche wirtschaftliche Schäden hervorrufen. Metallisches Eisen ist normalerweile von einem hauchdünnen Film aus Wasserstoff umgeben. Dieser entsteht in sehr geringen Mengen spontan durch Oxidation von Fe zu Fe2+ und der Vereinigung der freigesetzten Elektronen mit Protonen aus der Umgebung. Wird dieses Gleichgewicht durch Entfernung des Wasserstoffs durch sulfatreduzierende Bakterien gestört, die diesen als Elektronendonator für die Sulfatreduktion nutzen, und wird auch noch Fe2+ durch Präzipitation als FeS entfernt, wird das Gleichgewicht noch weiter gestört. Als Ergebnis wird die Rate der chemischen Oxidation von Fe zu Fe2+ erhöht, und es erfolgt dann eine rasch fortschreitende Korrosion von Eisen in Abwesenheit von Sauerstoff. Versuchsziel benötigtes Material Geräte     

Großes Reagenzglas Brutschrank (30 °C) Eisennagel Anaerobiertopf samt Zubehör Phasenkontrastmikroskop

Chemikalien und Medien  Desulfurikanten-Nährlösung ( S. 413)

Sonstiges

In diesem Versuch soll eine Anreicherungskultur für anaerobe, sulfatreduzierende Bakterien angesetzt werden und die anaerobe Korrosion von Eisen demonstriert werden. Versuchsdurchführung Ein großes Reagenzglas wird mit einem Eisennagel versehen, mit etwas Teichschlamm versetzt und komplett mit Desulfurikanten-Nährlösung gefüllt. Das mit Alufolie bedeckte Reagenzglas wird bei 30 °C im Anaerobiertopf ( M5, S. 368) in Abwesenheit von Sauerstoff inkubiert.

 Teichsediment (Schlamm)

Nach sensorischer Prüfung (H2S!) und sorgfältiger Betrachtung des Eisennagels (anaerobe Eisenkorrosion!) erfolgt die Betrachtung der unterschiedlichen Zellformen der angereicherten Desulfurikanten im Phasenkontrast. Weiterführende Literatur Castro HF, Williams NH, Ogram A (2000) Phylogeny of sulfate-reducing bacteria. FEMS Microbiology Ecology 31:1-9 Cypionka H (2000) Oxygen respiration by Desulfovibrio species. Annual Review of Microbiology 54:827-848 Hansen TA (1994) Metabolism of sulfate-reducing prokaryotes. Antonie van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology 66:165-185 Lee W, Lewandowski Z, Nielsen PH, Hamilton WA (1995) Role of sulfate-reducing bacteria in corrosion of mild-steel – A Review. Biofouling 8:165-174

Anreicherung und anaerobe Eisenkorrosion

112

3 Versuche

Nachgefragt 1. In welchen Bestandteilen von Zellen kommen schwefelhaltige organische Verbindungen vor? 2. Wo kommen sulfatreduzierende Bakterien in der Natur vor? 3. Welche Erscheinungen an der Nordsee werden als schwarze Flecken bezeichnet? Welche Voraussetzungen müssen zu ihrer Entstehung gegeben sein? 4. Nennen Sie Standorte, an denen die Aktivitäten von sulfatreduzierenden Bakterien mit bloßem Auge sichtbar sind! 5. Warum entsteht pro Flächeneinheit an Süßwasserstandorten sehr viel mehr Methan als an marinen Standorten? 6. Zeichnen Sie den Schwefelkreislauf und erläutern Sie die Beiträge der sulfatreduzierenden Bakterien hierzu! 7. Welche Organismen liefern den sulfatreduzierenden Bakterien an Süßwasserstandorten das Sulfat an? 8. In welche vier großen Gruppen werden die sulfatreduzierenden Bakterien nach phylogenetischen Gesichtspunkten eingeteilt? 9. Nennen Sie zwei endosporenbildende Arten von sulfatreduzierenden Bakterien! 10. Nennen Sie Archaea, die zur Reduktion von Sulfat oder anderen oxidierten Schwefelverbindungen in der Lage sind! 11. In welche zwei großen Gruppen werden sulfatreduzierende Bakterien eingeteilt?

3.3

12. Welche Verbindungen werden von sulfatreduzierenden Bakterien besonders häufig als Elektronendonator verwendet? 13. Beschreiben Sie die Enzyme, die in Desulfovibrio desulfuricans am Abbau von Lactat zu Acetat beteiligt sind! 14. Beschreiben Sie die anorganischen Schwefelverbindungen, die bei der Reduktion von Sulfat zu Sulfid als Intermediate entstehen, und benennen Sie jeweils die Oxidationsstufen des Schwefels! 15. Beschreiben Sie, wie Desulfobacter postgatei Acetat vollständig zu CO2 oxidiert! 16. Welchen Stoffwechselweg verwenden sulfatreduzierende Bakterien zur Fixierung von CO2? 17. Erläutern Sie, wie sulfatreduzierende Bakterien Eisen korrodieren können und welche chemischen und biochemischen Reaktionen sich hinter diesem bedeutenden Korrosionsprozess verbergen! 18. Erklären Sie am Beispiel von Desulfovibrio sulfodismutans die Vergärung von Thiosulfat! 19. Auch aerobe Bakterien und Pflanzen müssen Sulfat reduzieren können. Erklären Sie, warum und wie sich die dort ablaufenden Vorgänge von denen in sulfatreduzierenden Bakterien unterscheiden! 20. Beschreiben Sie, wo die sulfatreduzierenden Bakterien in der anaeroben Nahrungskette stehen!

Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

Mikroorganismen werden, durch Dokumente belegbar, seit mindestens 6000 Jahren zur Herstellung, Veredlung und Konservierung von Lebensmitteln, Genussmitteln und Getränken eingesetzt. Dieser Bereich der angewandten Mikrobiologie wird als Lebensmittelmikrobiologie bezeichnet und nimmt an Bedeutung immer noch stetig zu. Definierte chemische Verbindungen werden mit Reinkulturen von Bakterien oder Pilzen seit ungefähr einhundert Jahren produziert. Die meisten niedermolekularen Verbindungen werden mit anaeroben oder fakultativ anaeroben Mikroorganismen durch Gärungen oder mit aeroben Mikroorganismen durch unvollständige Oxidationen und Biotransformationen hergestellt. Organische Säuren und Aminosäuren, Alkohole und Ketone, Farbstoffe und Pigmente, Aromastoffe, Vitamine sowie antibiotisch wirkende Substanzen haben eine außerordentlich große Bedeutung in unserem Alltagsleben und für unsere Gesundheit. Die Herstellung dieser Verbindungen stellt mittlerweile einen wichtigen Wirtschaftsfaktor dar. Alleine mit der Herstellung von Antibiotika werden jährlich global ca. 40 Milliarden Euro umgesetzt. Andere wichtige biotechnologische Produkte sind Biopolymere. Hier haben zurzeit sicherlich die Proteine für technische Einsatzgebiete, wie z. B. in Waschmitteln oder für enzymkatalysierte Synthesen sowie therapeutisch wirksame Proteine, die größte Bedeutung. Zu den mit biotechnologischen Verfahren bereits produzierten Biopolymeren gehören auch einige Polysaccharide sowie in der Zukunft möglicherweise auch Polyester und Polyamide. Die Perspektiven für neue und verbesserte biotechnologische Produktionsverfahren sind hervorragend. Die von den Genomsequenzen bereits gewonnenen Erkenntnisse werden in naher Zukunft auch biotechnologisch verwertet werden. Darüber hinaus

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

eröffnen verbesserte molekularbiologische Methoden und neue Analyseverfahren weitere Möglichkeiten. Auch durch das Bestreben, in stärkerem Umfang als bisher nachwachsende Rohstoffe für Produktionsprozesse zu nutzen, werden biotechnologische Produktionsverfahren in der Zukunft deutlich an Bedeutung gewinnen. Auf dem Einsatz von Bakterien und Pilzen beruhende Produktionsverfahren werden auch in der Zukunft einen sehr hohen Stellenwert besitzen, möglicherweise sogar noch an Bedeutung gewinnen. In diesem Abschnitt vom MIKROBIOLGISCHEN PRAKTIKUM werden insgesamt 19 Versuche angeboten, um Mikroorganismen vorzustellen, die biotechnologisch relevante Stoffwechselprodukte synthetisieren oder an der Herstellung von Lebensmitteln beteiligt sind. Es handelt sich ausnahmslos um Verfahren, die entweder von der Industrie bereits seit langer Zeit angewandt oder möglicherweise in naher Zukunft zum Tragen kommen werden. In den ersten sechs Versuchen sollen niedermolekulare Stoffwechselprodukte hergestellt werden. Mit den eukaryontischen Mikroorganismen Saccharomyces cerevisiae und Aspergillus niger wird die biotechnologische Produktion von Ethanol, Glycerin und Citronensäure vorgestellt. Synthese und Herstellung des Hautbräunungsmittel Dihydroxyaceton, des Farbstoffes Indigo und eines Antibiotikums sollen mit drei prokaryontischen Mikroorganismen gezeigt werden; hierzu kommen Gluconobacter oxydans, ein rekombinanter Stamm von Escherichia coli bzw. Streptomyceten zum Einsatz. Die nächsten neun Versuche beschäftigen sich mit der biotechnologischen Herstellung verschiedener Biopolymere. Die Spanne reicht von einem Protein aus Bacillus thuringiensis, welches als Insektentoxin eingesetzt wird, über die Polysaccharide Xanthan, Dextran, Cellulose und Alginat die mit Xanthomonas campestris, Leuconostoc mesenteroides, Gluconacetobacter xylinus bzw. Azotobacter vinelandii hergestellt werden, sowie Poly(3-hydroxybutyrat) und Poly(3-hydroxyoctanoat) und ähnlichen Polyestern, die von Ralstonia eutropha bzw. Pseudomonas putida produziert werden, bis hin zu den Polyamiden Poly(γ-D-glutamat) und Cyanophycin, die von Bacillus licheniformis bzw. einem rekombinanten Stamm von Escherichia coli, der hierzu ein Gen aus einem Cyanobacterium exprimiert, synthetisiert werden. Der Abschnitt wird abgeschlossen mit vier Versuchen zur Herstellung traditioneller Lebensmittel mit Mikroorganismen. Mit zwei Produkten ist auch die deutsche Küche vertraut: Sauerkraut wird aus Weißkohl durch Fermentation mit Milchsäurebakterien hergestellt, während Essigsäurebakterien zur Umwandlung von Wein in Weinessig eingesetzt werden. Zwei andere Produkte stammen aus der traditionellen asiatischen Küche: Sojabohnen werden mit Bacillus subtilis zu Natto und mit Rhizopus microsporus zu Tempeh fermentiert.

113

114

3 Versuche

Versuch 21

Herstellung von Ethanol mit Hefe Theoretischer Hintergrund

Saccharomyces cerevisiae

V1 - S. 30

V22 - S. 119

E4 - S. 313

E5 - S. 318

Die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist ein in der Industrie vielseitig verwendeter eukaryontischer Mikroorganismus. Er ist uns im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM bereits begegnet, als mit verschiedenen Methoden die Anzahl der Hefezellen in einem „Hefewürfel“ ( Abb. 3.50) bestimmt wurde. Hefe wird uns noch in einigen anderen Versuchen, so bei der Herstellung von Glycerin, und bei Exkursionen zu Bierbrauereien und Winzereien begegnen. Damit lernen wir einige bedeutende Produkte der Biotechnologie und Lebensmittelmikrobiologie ken- Abb. 3.50. Ein „Hefewürfel“ nen. Dies sind nicht die einzigen Produkte, die mit oder aus Hefe gewonnen werden. Tabelle 3.36 gibt einen Überblick über die vielfältige Verwendung von Hefe und über deren Produkte in der Industrie.

Verhältnis von Hefe zum Sauerstoff

Saccharomyces cerevisiae ist fakultativ aerob. In Gegenwart von Sauerstoff wird Glucose, abgesehen von dem Teil, aus dem Zellbestandteile synthetisiert werden, vollständig zu CO2 veratmet. Unter anaeroben Bedingungen wird die Glucose dagegen nahezu vollständig zu Ethanol und CO2 vergoren. Da bezogen auf Glucose durch die Atmung wesentlich mehr ATP synthetisiert werden kann als bei Gärung, ist es für die Hefe sinnvoll, dass Sauerstoff die Gärung unterdrückt. Diese Regulation wird als Pasteureffekt bezeichnet. Saccharose wird durch Hefe mit einer Invertase in Glucose und Fructose gespalten.

Biochemie der Synthese von Ethanol

Die Hefe Saccharomyces cerevisiae und das Bakterium Zymomonas mobilis bauen Glucose über den Fructose-1,6-bisphosphat-Weg bzw. über den 2-Keto-3-desoxy6-phosphogluconat-Weg zu Pyruvat ab. In beiden Mikroorganismen wird Pyruvat anschließend durch das Enzym Pyruvat-Decarboxylase zu Acetaldehyd und CO2 decarboxyliert. Acetaldehyd wird durch eine Alkohol-Dehydrogenase zu Ethanol reduTabelle 3.36.

Verwendung von Hefe und deren Stoffwechselprodukte in der Industrie

Lebende Hefezellen

• Bäckerhefe zur Herstellung von Teigwaren • Gärhefen zur Herstellung von Wein und Bier • Gärhefen zur Vergärung von Mosten oder Stärkehydrolysaten zur Herstellung von Spirituosen (Branntwein, Whiskey, Wodka, Rum usw.)

Sonstige Hefezellen

• Bäckerhefe für die Kosmetik • Einzellerprotein für die Tierernährung

Hefeextrakt

• für Nährmedien

Gärungsprodukte

• Ethanol, Glycerin

Biochemikalien

• ATP, NAD+

Technische Enzyme

• Invertase, Galactosidase

Pharmazeutische Proteine

• Humaninsulin

Vitamine

• Vitamin B1, Vitamin D

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

Pyruvat

PyruvatDecarboxylase CO2

HCOOH

Xylulose-5-Pi Fd

PyruvatFormiatLyase

Pi Phosphoketolase

Pyruvat:FerredoxinOxidoreduktase H2O

CO2 FdH2

Phosphotransacetylase

GAP Acetyl-Pi

Acetyl-CoA +

NADH + H

CoA

115

AcetaldehydDehydrogenase (acylierend)

Pi

CoA

NAD+ Acetaldehyd NADH + H

+

Alkohol-Dehydrogenase NAD+ Ethanol

Abb. 3.51.

Wege der Biosynthese von Ethanol

ziert ( Abb. 3.51). In nahezu allen anderen gärenden Bakterien entsteht Acetaldehyd nicht aus Pyruvat sondern aus Acetyl-CoA. Diese Reaktion wird von einer Acetaldehyd-Dehydrogenase (acylierend) katalysiert. Acetyl-CoA kann aus Pyruvat mit Hilfe der Pyruvat:Ferredoxin-Oxidoreduktase (Clostridien und die meisten anderen strikt anaeeroben Bakterien) oder der Pyruvat-Formiat-Lyase (z. B. Enterobakterien) gebildet werden, oder es entsteht aus Acetylphosphat durch eine Phosphotransacetylase (z. B. heterofermentative Milchsäurebakterien). Obwohl intensiv nach besseren Verfahren zur biotechnologischen Produktion von Ethanol aus nachwachsenden Rohstoffen gesucht wird, basieren zurzeit die meisten etablierten Verfahren nach wie vor auf der Vergärung von zuckerhaltigen Reststoffen durch die Hefe Saccharomyces cerevisiae. In der Regel werden dabei Zuckerrübenoder Rohrzuckermelasse als Kohlenstoffquelle eingesetzt, welche als Reststoffe bei der Gewinnung von Saccharose aus Zuckerrüben oder Zuckerrohr zurück bleiben. Mögliche und in ersten Ansätzen erkennbare Alternativen sind Verfahren auf der Grundlage von Melasse mit dem Bakterium Zymomonas mobilis oder von cellulosehaltigen Rohstoffen mit cellulolytischen, thermophilen Bakterien. Die Vergärung von lignocellulosehaltigen Reststoffen aus der Landwirtschaft wie z. B. Stroh bietet das größte Potential für eine umfassende und ökonomische biotechnologische Produktion von Ethanol. Es wird daher intensiv an der Entwicklung von Verfahren zum physikalischen oder enzymatischen Aufschluss lignocellulosehaltiger Substrate geforscht. Die durch Verknappung und Verteuerung von Energie hervorgerufenen weltweiten Probleme bedürfen in absehbarer Zukunft einer Lösung. In der Biotechnologie richten sich die Hoffnungen der Menschheit auf drei Produkte: Ethanol, Methan und molekularen Wasserstoff (H2). Während eine wirtschaftliche biotechnologische Produktion von Wasserstoff noch in weiter Ferne ist, werden Ethanol und Methan bereits in großen Mengen produziert. Die Produktion von Methan enthaltendem Biogas an natürlichen Standorten und in Kläranlagen bzw. speziellen Biogasanlagen sind im

Biotechnologische Produktion von Ethanol

H H H

C

C

OH

H H Ethanol

Verwendung von Ethanol

D5 - S. 347

116

3 Versuche

E1 - S. 297 E3 - S. 310

CH 3 H 3C

C

O

CH 3

CH 3

Methyltert-Butylether Derzeitige Bioethanolproduktion

Perspektive

MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM Gegenstand einer Demonstration und von zwei Exkursionen und demonstrieren eindrucksvoll das Potential anaerober Mikroorganismen zur Produktion dieses Energieträgers. Gegenstand dieses Versuchs ist die Herstellung von Bioethanol mit Hefe. Bioethanol wird in Vergaserkraftstoffen mit zwei unterschiedlichen Zielen eingesetzt. Enthält der Kraftstoff nur wenig Bioethanol (6 bis 20 %) dient er als Ersatz für Methyl-tert-Butylether (MTBE). MTBE ist ein Zusatz, der die Octanzahl erhöht, und dem Kraftstoff mittlerweile statt Bleitetramethyl Pb(CH3)4 oder Bleitetraethyl Pb(C2H5)4 als Antiklopfmittel zugesetzt wird. MTBE ist jedoch sehr flüchtig und wird in der Natur nur sehr langsam abgebaut. In Kraftstoffen, die einen höheren Anteil von Bioethanol enthalten (80 bis 85 %), dient der Alkohol selbst als Brennstoff und liefert bei der Verbrennung mit Sauerstoff die zum Antrieb des Motors notwendige Energie. Im Jahr 2001 wurden weltweit ca. 31,4 Milliarden Liter Bioethanol produziert. Davon entfielen 65,5 % auf den amerikanischen Kontinent mit Brasilien und den USA als bedeutendsten Produktionsländern, 19,6 % auf Asien und lediglich 13,2 % auf Europa. Insgesamt wurden nahezu 90 % der Weltjahresproduktion in lediglich 10 Ländern produziert ( Tabelle 3.37).

Tabelle 3.37. Die zehn wichtigsten Produktionsländer von Bioethanol (2001) Land Brasilien USA China Indien Russland Frankreich Großbritannien Saudi-Arabien Südafrika Deutschland

Milliarden Liter 11,90 7,58 3,09 1,78 1,17 0,80 0,43 0,39 0,39 0,30

Schätzungen zufolge könnten pro Jahr ohne weiteres ca. 600 Milliarden Liter Bioethanol alleine aus zuckerhaltigem Pflanzenmaterial produziert werden. Bei Verwendung von lignocellulosehaltigem Pflanzenmaterial kämen noch einmal ca. 1.800 Milliarden Liter Bioethanol hinzu. In der Summe wären dies ca. 2.400 Milliarden Liter Bioethanol und entspräche ungefähr einem Drittel des derzeitigen Erdölverbrauchs. Versuchsziel In diesem Versuch wird mit Hilfe der Weinhefe Saccharomyces cerevisiae subsp. ellipsoideus (DSM 70471) in einem 15 l-Ansatz innerhalb von zwei Wochen Ethanol hergestellt. Im Anschluss an die Produktionsphase wird der Alkohol aus dem Kulturüberstand durch Destillation gewonnen.

Rechtlicher Hinweis

Der Betrieb von Brenngeräten unterliegt der Brennereiordnung und damit der amtlichen Überwachung durch die Zollverwaltung. Auch ist die Anzahl der Brennrechte, die von den Zollverwaltungen vergeben werden, begrenzt. Bereits die Anschaffung eines Brenngerätes mit einer Brennblase von mehr als 500 ml muss bei der Zollverwaltung angemeldet und von der Behörde genehmigt werden. Nach § 232 der Brennereiordnung sind jedoch Brenngeräte, die in öffentlichen Lehr- und Forschungsbetrieben zu wissenschaftlichen Zwecken genutzt werden, von der Anmeldung und amtlichen Überwachung befreit, sofern das Gerät nicht zur Erzeugung von Branntwein genutzt wird.

Versuchsdurchführung Vorbereitungen

Nach Erhalt des Stamms wird dieser – wenn nicht anders von der Bezugsquelle (DSMZ) angegeben – in wenig steriler Saline suspendiert und per Drei-Strich-Ausstrich ( M4, S. 365) auf Malz-Festmedium ausgestrichen. Die Platte wird bei 30 °C bebrütet. Das bewachsene Festmedium kann bis zur Verwendung im Kühlschrank (4 °C) gelagert werden.

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

benötigtes Material Geräte      

200 ml-Erlenmeyerkolben 2 l-Erlenmeyerkolben 20 l-Steilbrustflasche Gärverschluss Autoklav Wasserbad-Brennerei mit Kolonne und Röhrenkühler (z. B. von den Firmen Axel Hedrich, Hattendorfer Straße 12, D-73035 Göppingen; Arnold Holstein, Kupferschmiede, Apparatebau, Brennerei-Einrichtungen, Am Stadtgraben 15, D-88677 Markdorf)

Mikroorganismen  Saccharomyces ellipsoideus (S. cerevisiae DSM 70471)

Chemikalien und Medien    

Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril Malz-Medium ( S. 418) Malz-Festmedium ( S. 418) (NH4)2SO4

Sonstiges  15 l Traubensaft aus dem Supermarkt  Haushaltszucker

Abb. 3.52.

Destillationsapparatur

117

Erste Vorkultur: Ausgehend von einer Einzelkolonie auf Malz-Festmedium werden 20 ml Malz-Flüssigmedium in einem 200 ml-Erlenmeyerkolben beimpft. Die Kultur wird für 12 bis 24 Stunden unter Schütteln bei 30 °C bebrütet. Zweite Vorkultur: Mit der gesamten ersten Vorkultur werden 300 ml Malz-Flüssigmedium versetzt, die sich in einem 2 l-Erlenmeyerkolben mit Schikanen befinden. Die zweite Vorkultur wird unter den gleichen Bedingungen wie die erste inkubiert. Hauptkultur, Ethanol-Produktionsphase: Mit dem gesamten Volumen der zweiten Vorkultur wird eine 20 l-Steilbrustflasche versehen, in der sich 15 l roter Traubensaft befinden, die vor dem Autoklavieren zusätzlich mit 150 g Saccharose (Haushaltszucker) und 15 g Ammoniumsulfat versetzt worden sind. Das Gefäß wird mit einem mit Wasser befüllten Gärverschluss versehen und für ca. zwei Wochen bei Raumtemperatur (20 bis 25 °C) inkubiert. Die Gärung ist abgeschlossen, wenn sicht- und hörbar (Gärverschluss) kein CO2 mehr entweicht. Mit einen Schlauch wird der Überstand von den abgesetzten Zellen abgesaugt. Von dem Überstand wird eine Probe für die optischenzymatische Ethanolbestimmung (M24, S. 393) abgenommen. Die nachfolgend beschriebene Vorgehensweise ist für die im Institut der Autoren vorhandene Wasserbad-Brennerei der Firma Arnold Holstein, Kupferschmiede, Apparatebau, Brennerei-Einrichtungen ausgearbeitet worden ( Abb. 3.52); sie lässt sich problemlos auf Anlagen anderer Hersteller übertragen. Vor der Inbetriebnahme ist der Wasserstand des Wasserbades zu überprüfen und ggf. nachzufüllen. Dabei ist darauf zu achten, dass die Absperrhähne des Wasserstandsglases geöffnet sind. Die Wasserzuleitung des Kühlsystems ist zu öffnen. Der möglichst klare Gärüberstand wird durch die Einfüllöffnung in die Brennblase eingefüllt. Die Destillation sollte man langsam anlaufen lassen, d. h. mit niedrigem Überdruck im Wasserbad (200 bis 300 hPa). Dadurch tritt der Vorlauf der Destillation (ca. 0,2 l) langsam aus und kann sorgfältig vom qualitativ hochwertigeren Mittellauf abgetrennt wer-

Destillation

118

3 Versuche

den. Der genaue Zeitpunkt für das Wechseln der Vorlagen wird durch laufende Verkostung (Geschmacksprobe) festgestellt; der Vorlauf besitzt einen ausgesprochenen scharfen, stechenden Geschmack. Wenn der Alkoholgehalt des Mittellaufs auf ca. 60 % Vol. absinkt, sollte wiederum die Vorlage gewechselt werden; der jetzt folgende Nachlauf besitzt einen leicht schmeckbaren „fuseligen“ Charakter und sollte daher nicht mit dem Mittellauf vermischt werden. Abschließend wird durch optisch-enzymatische Ethanolbestimmung (M24, S. 393) der genaue Gehalt an Ethanol in den unterschiedlichen Fraktionen der Destillation bestimmt. Weiterführende Literatur Kosaric N, Velikonja J (1995) Liquid and gaseous fuels from biotechnology – challenge and opportunities. FEMS Microbiology Reviews 16:111-142 Kosaric N (1996) Ethanol – Potential source of energy and chemical products. In: Rehm HJ, Reed G, Pühler A, Stadler P (eds) Biotechnology. vol 6, 2nd edn. Wiley-VCH, Weinheim, pp 121-203 Ostergaard S, Olsson L, Nielsen J (2000) Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews 64:34-50. Senn T, Pieper HJ (1996) Ethanol – Classical methods. In: Rehm HJ, Reed G, Pühler A, Stadler P (eds) Biotechnology. vol 6, 2nd edn. Wiley-VCH, Weinheim, pp 59-120 Ward OP, Singh A (2002) Bioethanol technology: Developments and perspectives. Advances in Applied Microbiology 51:53-80

Nachgefragt 1. Nennen Sie biotechnologische Produkte, die mit Hilfe von Hefe produziert werden! 2. Für welche Anwendungen sind die Hefezellen selbst interessant? 3. Nennen Sie die drei Energieträger, die mit Hilfe biotechnologischer Verfahren produziert werden können! 4. Mit welchem Enzym wird der Abbau von Saccharose durch Saccharomyces cerevisiae eingeleitet? 5. Beschreiben Sie, wie Saccharomyces cerevisiae Glucose zunächst zu Pyruvat und anschließend zu Ethanol abbaut! Nennen Sie die wichtigsten Enzyme! 6. Beschreiben Sie Gemeinsamkeiten und Unterschiede bezüglich der Vergärung von Glucose zu Ethanol bei Saccharomyces cerevisiae und Zymomonas mobilis! 7. Was unterscheidet Zymomonas mobilis bezüglich der Synthese von Ethanol von den meisten anderen Bakterien? 8. Nennen Sie die unterschiedlichen Vorstufen, aus denen Ethanol biochemisch entstehen kann und ordnen Sie diesen Organismengruppen zu! 9. Beschreiben Sie die Gärgleichung, mit der Hefe Saccharose anaerob zu Ethanol umsetzt! 10. Konsultieren Sie Lehrbücher der Mikrobiologie und der Biochemie und ermitteln Sie, wie viel mol ATP Saccharomyces cerevisiae während der aeroben und während der anaeroben Verstoffwechselung aus 1 mol Glucose erzeugen kann! 11. Mit welchem Verfahren haben Sie die Konzentration von Ethanol ermittelt? Wie wurde dabei das ungünstig auf der Seite von Ethanol liegende Gleichgewicht in Richtung Acetaldehyd verschoben?

12. Wie heißt das Gesetz, welches die Absorption von Licht durch eine chemische Verbindung beschreibt? Formulieren Sie es! 13. Eine Verbindung X wird durch ein NAD+-abhängiges Enzym oxidiert. In einem optisch-enzymatischen Test zum Nachweis dieser Verbindung messen Sie nach deren vollständigen Umsatz bei 366 nm eine Extinktionsänderung ΔE von 0,8. Sie hatten eine Küvette mit einer Schichtdicke von 1,0 cm eingesetzt und die Probe um den Faktor 10 mit Puffer und Messreagenzien verdünnt. Der Extinktionskoeffizient ε von NADH beträgt bei 366 nm 3,4 mM-1 cm-1. Wie hoch war die Konzentration der Verbindung X in der Probe? 14. Welche Reststoffe der Landwirtschaft sind für die biotechnologische Produktion von Ethanol besonders interessant? 15. Ihr PKW ist für den Betrieb mit einem Kraftstoffgemisch aus 85 % (vol/vol) Bioethanol und 15 % (vol/vol) Benzin ausgerüstet und verbraucht im Durchschnitt 6 Liter dieses Kraftstoffgemisches pro 100 km. Wie viele km können Sie mit 50 kg vergorener Saccharose bei durchschnittlicher Fahrweise fahren? 16. Berechnen Sie, wie viel Liter CO2 bei der Vergärung von 1 Tonne Saccharose durch Hefe freigesetzt werden! 17. Beschreiben Sie Aufbau und Funktionsweise eines Destilliergerätes! 18. Beschreiben Sie chemische Struktur und Funktion von MTBE! 19. Warum wird Ethanol in Treibstoffen für Verbrennungsmotoren in zwei sehr unterschiedlichen Konzentrationsbereichen eingesetzt? 20. Was wird unter dem Pasteureffekt verstanden, welche biochemische Grundlagen hat dieser Effekt?

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

Herstellung von Glycerin mit Hefe durch Abfangverfahren

119

Versuch 22

Theoretischer Hintergrund In Versuch 21 des MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUMS wurde bereits ausführlich die + + biotechnologische Produktion von Ethanol 2 NAD 2 NADH + H mit der Hefe Saccharomyces cerevisiae 2 CO2 besprochen. Ethanol ist bei Hefe das typische Abb. 3.53. Nettoreaktion der Produkt des anaeroben Gärungsstoffwech1. Neubergschen Vergärungsform sels und damit ein Produkt des Primärstoffwechsels. Es entsteht nach der im Kasten angegebenen Gärgleichung, die auch als 1. Neubergsche Vergärungsform bezeichnet wird. Glucose wird dabei über den Fructose-1,6-bisphosphat-Weg zunächst zu Pyruvat abgebaut. Durch das Enzym Glycerinaldehyd-phosphat-Dehydrogenase werden bei der Oxidation von Glycerinaldehyd-3-phosphat Reduktonsäquivalente auf NAD+ übertragen, wodurch dieses Coenzym zu NADH reduziert wird. Anschließend decarboxyliert das Enzym Pyruvat-Decarboxylase Pyruvat zu Acetaldehyd und CO2. Acetaldehyd ist bei der alkoholischen Gärung der notwendige Akzeptor für die zuvor abgetrennten Reduktionsäquivalente, und durch die Alkohol-Dehydrogenase wird bei der Reduktion von Acetaldehyd zu Ethanol NADH wieder zu NAD+ oxidiert. Diese Regeneration von NAD+ ist unbedingt erforderlich, da Coenzyme ebenso wie Enzyme in der Zelle stets nur in katalytischen Mengen zur Verfügung stehen und nicht in stöchiometrischen Mengen eingesetzt werden können. Wenn dieses Coenzym nicht fortlaufend regeneriert würden, käme der Stoffwechsel der Hefe praktisch sofort zum Erliegen, da als Folge kein Glycerinaldehyd-3-phosphat mehr oxidiert werden könnte ( Abb. 3.53).

1. Neubergsche Vergärungsform

Wie verhält sich Hefe, wenn den Zellen bei der Alkoholgärung unter anaeroben Bedingungen Acetaldehyd als Akzeptor der Reduktionsäquivalente von NADH entzogen wird? Kommt der Stoffwechsel tatsächlich zum Erliegen oder finden die Zellen einen alternativen Akzeptor zur Regeneration von NAD+? Der deutsche Biochemiker Carl Neuberg entdeckte, dass Hefe dieses Problem durch die Bildung von Glycerin löst. Später wurde der modifizierte Gärungsstoffwechsel sogar zur biotechnologischen Produktion von Glycerin genutzt. Hiervon wurde in Deutschland besonders im ersten und zweiten Weltkrieg intensiv Gebrauch gemacht, als Glycerin in großen Mengen zur Herstellung von Nitroglycerin (Glycerintrinitrat) benötigt wurde.

Glycerin statt Ethanol

In begrenztem Umfang entsteht Glycerin auch stets natürlicherweise bei der Hefegärung z. B. bei der Herstellung von Wein. Die Gärgleichung nach der 1. Neubergschen Vergärungsform gilt natürlich nur für reine Saccharoselösungen und für nichtwachsende Hefezellen. Beides trifft jedoch für Traubenmost und die darin gärende Hefe nicht zu.

Glycerin

Glucose

2 Ethanol

Das von der Hefe während der alkoholischen Gärung gebildete Intermediat Acetaldehyd kann durch Zugabe von Sulfit zum Medium abgefangen werden. Es bildet sich Hydroxyethansulfonat, welches von der Alkohol-Dehydrogenase nicht als Substrat genutzt und zu Ethanol reduziert werden kann. Die aus Glycerinaldehyd-3-phosphat stammenden Reduktionsäquivalente werden nun durch das Enzym Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase auf Dihydroxyacetonphosphat übertragen, und es entsteht Glycerin-3-phosphat. Eine Phosphatase spaltet Glycerin-3-phosphat anschließend in Glycerin und anorganisches Phosphat ( Abb. 3.54). Dieses Abfangverfahren wurde früher zur biotechnologischen Produktion von Glycerin genutzt. Dieser so genannte „Protol-Prozess“ wurde in Gegenwart von 3 % (wt/vol) Na2SO3 durchgeführt, und

V21 - S. 114

H H

C

OH

H

C

OH

C

OH

H

H

E5 - S. 318 2. Neubergsche Vergärungsform

120

3 Versuche

Saccharose konnte dabei mit einer Ausbeute von ca. 20 % in Glycerin überführt werden. Die stöchiometrische Beziehung der anaeroben Vergärung in Gegenwart von Sulfit wird durch die 2. Neubergsche Vergärungsform in Abb. 3.55 wiedergegeben. 3. Neubergsche Vergärungsform

Eine weitere Möglichkeit zur biotechnologischen Produktion von Glycerin mit Hefen bietet die anaerobe Vergärung unter alkalischen Bedingungen in Gegenwart von Na2CO3, NaHCO3 oder NaHPO4. Die Ursache hierfür ist die unter diesen Bedingungen erfolgende Disproportionierung von Acetaldehyd zu Ethanol und Acetat. Diese von dem italienischen Chemiker Stanislao Cannizzaro entdeckte chemische Reaktion ist typisch für Aldehyde unter alkalischen Bedingungen. Die Disproportionierung von Acetaldehyd kann aber auch auf das enge Zusammenwirken einer NAD+-abhängigen Acetaldehyd-Dehydrogenase mit der Alkohol-Dehydrogenase zurückgeführt werden ( Abb. 3.56). Während die Acetaldehyd-Dehydrogenase Acetaldehyd zu Acetat oxidiert, überträgt die Alkohol-Dehydrogenase die Reduktionsäquivalente des dabei entstehenden NADH sofort auf Acetaldehyd, wodurch Ethanol entsteht. Durch diesen kleinen Cyclus werden fortlaufend große Mengen Acetaldehyd mit katalytischen Mengen von NAD+/NADH disproportioniert. Als Folge steht Acetaldehyd nicht mehr als Akzeptor für die aus der Oxidation von Glycerinaldehyd-3-phosphat stammenden Reduktionsäquivalente zur Verfügung. Die stöchiometrische Beziehung dieser modifizierten Gärung wird durch die 3. Neubergsche Vergärungsform ( Abb. 3.57) wiedergegeben. Wie bei der 2. Neubergschen Vergärungsform werden die Reduktionsäquivalente statt auf Acetaldehyd auf Dihydroxyacetonphosphat übertragen. Im Gegensatz zum Abfangverfahren mit Sulfit wurde dieser Prozess in der Vergangenheit nicht zur biotechnologischen Produktion von Glycerin genutzt.

Metabolic engineering

Methoden und Strategien des metabolic engineering bieten heute neue Möglichkeiten zur Entwicklung biotechnologischer Prozesse zur Produktion von Glycerin mit gentechnisch veränderten Stämme von Saccharomyces cerevisiae. Wurde bei den Neubergschen Gärverfahren früher der

Glucose

Fructose1,6-bisphosphat DihydroxyAcetonphosphat

Glycerinaldehyd3-phosphat 2 [H]

Pyruvat

2 [H]

2 [H]

2 [H] Aldehyd

Ethanol

Sulfit

Glycerin3-phosphat

Hydroxyethansulfonat

Glycerin

Abb. 3.54. Physiologische Grundlagen der 2. Neubergschen Vergärungsform

Glucose

Glycerin HydroxyethanO 2 C sulfonat

H2O aHSO 3 N Abb. 3.55. Nettoreaktion der 2. Neubergschen Vergärungsform

Acetaldehyd-Dehydrog enase Acetaldehyd

Acetat H2O AD + N

ADH +H N

Acetaldehyd

+

Ethanol

Alk ohol-Dehydrog enase

Abb. 3.56. Physiologische Grundlagen der 3. Neubergschen Vergärungsform

2 Glucose H2O

2O C

2

2 Glycerin Ethanol Actetat

Abb. 3.57. Nettoreaktion der 3. Neubergschen Vergärungsform

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

121

Stoffwechselfluss durch das Abfangen von Acetaldehyd in eine andere Richtung gelenkt, so ist es jetzt möglich, gezielt Mutanten zu erzeugen, die Acetaldehyd oder Ethanol nicht mehr synthetisieren können oder bei denen durch andere Maßnahmen verstärkt NADH gebildet wird. Glycerin wurde früher in großen Mengen zur Herstellung von Nitroglycerin (Glycerintrinitrat) benötigt. Dieser Absatzmarkt hat heute keine große Bedeutung mehr. Es gibt heute vielmehr eine Vielzahl von technischen Anwendungen in ganz unterschiedlichen Bereichen sowie bei der Herstellung von Nahrungsmitteln und Kosmetika. Heute ist Glycerin auch Ausgangsverbindung bei der fermentativen Herstellung von Dihydroxyaceton mit Essigsäurebakterien. Außerdem kann Glycerin als Kohlenstoffquelle zur fermentativen Produktion von 1,3-Propandiol eingesetzt werden, welches für die chemische Synthese bestimmter biologisch abbaubarer Polyester benötigt wird.

Verwendung von Glycerin

Glycerin fällt in großen Mengen als Nebenprodukt bei der Herstellung von Seifen und Waschmitteln an, wenn Triglyceride aus Fetten und Ölen zur Gewinnung der freien Fettsäuren verseift werden. In noch größeren und steigenden Mengen fällt Glycerin heute besonders bei der Herstellung von Biodiesel aus Rapsöl als Reststoff an. Darüber hinaus gibt es chemische Verfahren zur Synthese von Glycerin aus Propen oder Allylalkohol. Das klassische Verfahren zur Herstellung von Glycerin mit dem Protol-Prozess hat deshalb heute kaum noch eine Bedeutung, zumal die Extraktion und Reinigung von Glycerin ausgehend von Fermentationsbrühen sehr aufwendig ist.

Andere Quellen für Glycerin

V24 - S. 127

Versuchsziel Die Bildung der Gärungsprodukte Ethanol und Glycerin und der Verbrauch des Substrats Glucose durch Saccharomyces cerevisiae wird unter drei unterschiedlichen Bedingungen verfolgt. Dabei soll neben dem Einfluss von Sauerstoff (1. Neubergsche Vergärung) insbesondere die Wirkung von Hydrogensulfit (2. Neubergsche Vergärung) auf die Bildung der genannten Gärprodukte untersucht werden. Die Bestimmung der Konzentrationen des Substrats Glucose und der Gärungsprodukte Ethanol und Glycerin erfolgt durch optisch-enzymatische Tests mit Hilfe spezifischer Enzyme. Versuchsdurchführung Nach Erhalt der Hefe wird diese – wenn nicht anders von der Bezugsquelle (DSMZ) angegeben – in wenig steriler Saline suspendiert und per Drei-Strich-Ausstrich ( M4, S. 365) auf Malz-Festmedium ausgestrichen. Die Platte wird bei 30 °C bebrütet. Das bewachsene Festmedium kann bis zur Verwendung im Kühlschrank (4 °C) gelagert werden. Zellanzucht: Mit einer Impföse Zellmaterial von S. cerevisiae werden 200 ml Malzmedium in einem 2 l-Erlenmeyerkolben angeimpft und für 24 Stunden bei 30 °C unter Schütteln inkubiert. Die Kultur wird 10 min bei 3.500 × g und 4 °C in sterilen Zentrifugenbechern zentrifugiert. Das Zellpellet wird in 100 ml 1:2 verdünnten, autoklavierten Basalmedium resuspendiert, erneut zentrifugiert und schließlich in 6 ml 1:2 verdünnten, autoklavierten Basalmedium resuspendiert. Diese Zellsuspension dient als Impfgut für die drei Versuchsansätze. Die drei unten angegebenen Versuchsansätze werden mit jeweils 1,5 ml Zellsuspension beimpft. Mit dem Zeitpunkt des Animpfens ist der Startpunkt (t = 0 h) definiert. Es werden drei unterschiedliche Versuchsansätze zusammengestellt ( Tabelle 3.38).

Vorbereitungen

122

3 Versuche

Unmittelbar nach Animpfen (t = 0 h) und 8 Stunden danach werden aus allen drei Ansätzen kontaminationsfrei Proben à ca. 5 ml entnommen und in Schraubdeckelröhrchen überführt. Nach Zentrifugation bei 3.500 × g (15 min) werden die Überstände in frische Schraubdeckelröhrchen überführt und bis zur optisch-enzymatischen Bestimmung der Metabolite (siehe Tag 5) bei -20 °C gelagert. Zwei weitere Proben werden ca. 24 Stunden und ca. 30 Stunden nach Beimpfen aus jedem Ansatz entnommen; die Überstände werden bei -20 °C eingefroren. Ca. 48 Stunden nach Beimpfen erfolgt eine weitere Probenentnahme. Die letzte Probe wird ca. 72 Stunden nach Beimpfen genommen. Die bei -20 °C gelagerten Überstände werden bei Raumtemperatur aufgetaut. Mit allen Proben werden optische-enzymatische Bestimmungen der Konzentrationen von Glucose ( M24, S. 399), Ethanol ( M24, S. 397) und Glycerin ( M24, S. 400) durchgeführt. Die Proben müssen vor den Messungen z. T. mit Wasser verdünnt werden, um in die bei den einzelnen Messmethoden angegebenen Konzentrationsbereiche zu kommen. Die Ergebnisse der Konzentrationsbestimmungen werden vergleichend in einer Grafik [Ordinate: Konzentration von Glucose und der Metabolite (mM); Abszisse: Inkubationszeit (Stunden)] dargestellt.

benötigtes Material Geräte  2 l-Erlenmeyerkolben  500 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen  Zwei 50 ml-Schraubdeckelflaschen  Kühlzentrifuge für die Zellernte (3.500 × g)  Glaspipetten (steril)  Impföse  Bunsenbrenner  Schüttler (30 °C)  Brutschrank (30 °C)  Autoklav  Gefrierschrank (-20 °C)  Schraubdeckelröhrchen  Photometer zur optisch-enzymatischen Bestimmung von Glucose ( M24, S. 399), Ethanol ( M24, S. 397) und Glycerin ( M24, S. 400) bei 340 nm

Mikroorganismen  Saccharomyces cerevisiae, z. B. DSM 1334

Chemikalien und Medien      

Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril Basalmedium ( S. 411) Malz-Medium ( S. 418) Malz-Festmedium ( S. 418) Glucose (1 M), sterilfiltriert Natriumhydrogensulfit (16 %, wt/vol), (sterilfiltriert)  Reagenzien für die optisch-enzymatische Bestimmung von Glucose ( M24, S. 399), Ethanol ( M24, S. 397) und Glycerin ( M24, S. 400)

Weiterführende Literatur Bakker BM, Overkamp KM, van Maris AJA, Kotter P, Luttik MAH, van Dijken JP, Pronk JT (2001) Stoichiometry and compartmentation of NADH metabolism in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiology Reviews 325:15-37 Rehm HJ (1996) Microbial production of glycerol and other polyols. In: Rehm HJ, Reed G, Pühler A, Stadler P (eds) Biotechnology. vol 6, 2nd edn. Wiley-VCH, Weinheim, pp 205-227 Taherzadeh MJ, Adler L, Liden G (2002) Strategies for enhancing fermentative production of glycerol – A review. Enzyme and Microbial Technology 31:53-66 Wang ZX, Zhuge, J, Fang HY, Prior BA (2001) Glycerol production by microbial fermentation: a review. Biotechnology Advances 19:201-223

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen Tabelle 3.38.

Versuchsansätze zur Ethanol- und Glycerin-Produktion durch Hefe

Ansatz

1. Neubergsche Gärung

aerob

Basalmedium H2Odem.

25 12,5

ml ml

25 12,5

ml ml

12,5 -

ml

2. Neubergsche Gärung 25 -

ml

autoklavieren, vor dem Beimpfen zugeben Glucose (1 M) (NH4)2SO3 (16 %, wt/vol) Kulturgefäß

1,2 -

ml

500 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen

Inokulum

1,5

ml

Inkubation

unter Schütteln bei 30 °C

50 ml Schraubdeckelflasche mit Deckel 1,5

ml

12,5 ml 6,25 ml (sofort) 6,25 ml (nach 3 h) 50 ml Schraubdeckelflasche mit Deckel 1,5

ml

ruhig stehend bei 30 °C ruhig stehend bei 30 °C

Nachgefragt 1. Erläutern Sie die Begriffe Oxidation, Reduktion und Disproportionierung! 2. Beschreiben Sie die 1. Neubergsche Vergärungsform bei Saccharomyces cerevisiae! 3. Berechnen Sie, wie viele Liter CO2 eine anaerobe Kultur der Hefe nach der 1. Neubergschen Vergärungsform ausgehend von 180 g Glucose maximal bilden kann! 4. Zeichnen Sie die Strukturformel von Glycerin! 5. In welchen Bestandteilen von Zellen kommt Glycerin vor? 6. Unter welchen Bedingungen kann die Hefe unter anaeroben Bedingungen ausgehend von Zuckern Glycerin bilden? 7. Weshalb war man früher an einer biotechnologischen Produktion von Glycerin interessiert? 8. Beschreiben Sie die 2. Neubergsche Vergärungsform bei Saccharomyces cerevisiae! 9. Zeichnen Sie die Strukturformel der Verbindung, die aus der Reaktion von Acetaldehyd mit Sulfit entsteht! 10. Beschreiben Sie die 3. Neubergsche Vergärungsform bei Saccharomyces cerevisiae! 11. Durch welche Reaktion kann bei der Hefegärung Acetat entstehen? Welche anderen biochemischen Wege der Entstehung von Acetat sind Ihnen bei Mikroorganismen bekannt?

12. Berechnen Sie, wie viel Gramm Glycerin Sie mit einer Hefekultur erhalten, wenn Sie 100 g Glucose vorgeben und diese (i) aerob oder (ii) anaerob ohne weitere Zusätze bzw. anaerob mit (iii) Hydrogensulfit oder (iv) Natriumhydrogencarbonat als Zusatz kultivieren! 13. Wie viel Gramm Glucose müssen Sie mindestens vorgeben, um unter Bedingungen, bei denen die 2. Neubergsche Vergärungsform anzuwenden ist, 100 g Glycerin zu produzieren? 14. Wie viel mol ATP gewinnt die Hefe beim Umsatz von 1 mol Glucose nach der 1., 2. und 3. Neubergschen Vergärungsform? 15. Sind die 2. und die 3. Neubergsche Vergärungsform auch auf die alkoholische Gärung von Zymomonas mobilis anwendbar? 16. Welche biotechnologischen Produkte können mit Hefe außer Ethanol und Glycerin noch produziert bzw. aus ihr gewonnen werden? 17. Was versteht man unter einem optischen Enzymtest, und welches Gesetz findet bei der Auswertung der Messergebnisse Anwendung? 18. Wozu können optische Enzymtests eingesetzt werden? 19. Beschreiben Sie, wie im Versuch die Konzentrationen von Glucose, Glycerin und Ethanol bestimmt wurden! 20. Erläutern Sie, was man unter einer „CannizzaroReaktion“ versteht!

123

124

3 Versuche

Versuch 23

Herstellung von Citronensäure mit Aspergillus niger Theoretischer Hintergrund

Bedeutung und Produktion

H2C HO

COOH

C

COOH

H2C

COOH

Citronensäure

Mengenmäßig gehört Citronensäure zu den bedeutensten biotechnologisch hergestellten Produkten. Im Jahr 2000 wurden weltweit ca. 900.000 Jahrestonnen mit einem Marktwert von ca. 1 Mrd € durch Fermentation überwiegend mit Aspergillus niger produziert. Dieser filamentöse Pilz kann auch noch andere Intermediate das Tricarbonsäure-Cyclus und von diesen abgeleitete Verbindungen ausscheiden. Es gibt daneben zahlreiche weitere eukaryontische Mikroorganismen, die ebenfalls z. T. beträchtliche Mengen Citronensäure produzieren können. Verfahren, die auf der Verwendung dieser Mikroorganismen beruhen, haben sich aber gegenüber den Verfahren mit A. niger bisher nicht durchgesetzt; lediglich geringe Mengen werden mit der Hefe Yarrowia lipolytica hergestellt.

Abb. 3.58. Konidienträger von Aspergillus niger ( Umschlagseite)

Verwendung

Anwendungen von Citronensäure basieren auf geschmacksbeeinflussenden Eigenschaften, als Säuerungsmittel, als Antioxidans und einem sehr guten Komplexbildungsvermögen mit divalenten Kationen. Ca. 50 % der biotechnologisch produzierten Citronensäure wird zur Herstellung von Limonaden und 20 % zur Herstellung anderer Nahrungsmittel (Milchprodukte, Konserven, Marmeladen, Süssigkeiten, Puddings) eingesetzt. Jeweils ca. 15 % finden Verwendungen in pharmazeutischen oder kosmetischen Präparaten (Eisen- und Calciumpräparate, Säuerungsmittel zur CO2-Freisetzung) bzw. technischen Anwendungen (Metallreinigung und -behandlung, Ersatz von Phosphaten in Wasch- und Reinigungsmitteln) in der Industrie. In Nährböden für die Mikrobiologie werden häufig Eisensalze von Citrat eingesetzt, um die Entstehung unlöslicher Eisenhydroxide zu verhindern.

Isolierung aus Citronen

Bis vor ca. hundert Jahren wurden lediglich geringe Mengen Citronensäure ausschließlich aus Citrusfrüchten, und hier besonders aus dem Saft von Citronen, durch Ausfällung der Citronensäure als Calciumsalz gewonnen. 1920 wurden auf diese Weise ca. 10.000 Tonnen vorwiegend in Italien (Marktanteil: ca. 80 %) hergestellt. Basierend auf einem Gehalt von 2,5 % Citronensäure am Frischgewicht von Citronen müssten zur Deckung des heutigen Bedarfs ca. 36 Mio Tonnen Citronen geerntet und diese ausschließlich der Herstellung von Citronensäure zugeführt werden. Hierzu wäre eine Anbaufläche von ca. 3 Mio ha notwendig. Bedenkt man, dass in den fünf wichtigsten Anbauländern von Citrusfrüchten (Südafrika, USA, Argentinien, Türkei und Spanien) zusammen lediglich ca. 3,8 Mio Tonnen Citronen geerntet werden, wird deutlich, dass der heutige Bedarf mit dem alten Verfahren nicht gedeckt werden könnte. Hinzu kommt, dass die geographischen Anbauregionen von Citronenbäumen durch klimatische Ansprüche wesentlich stärker eingeschränkt sind als die von Stärke oder Zucker enthaltenden Pflanzen. Zudem enthalten letztere Kohlenhydrate in wesentlich höheren Anteilen am Pflanzengewicht als Citrusfrüchte Citronensäure. Ein wichtiges weiteres Moment kommt noch hinzu: Die Isolierung von Citronensäure aus Früchten hinter-

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

125

lässt einen schlecht weiter verwertbaren Reststoff, während die biotechnologische Produktion von Citronensäure Reststoffe nutzt, die aus der Verarbeitung von landwirtschaftlichen Produkten stammen. Ein erstes Patent zur fermentativen Produktion mit A. niger ( Abb. 3.58) wurde bereits 1917 erteilt. Melasse, ein Reststoff der Rüben- bzw. Rohrzuckerherstellung, wird dabei meist als Kohlenstoffquelle verwendet. Nach sorgfältiger Abtrennung des Myzels bzw. der Zellen durch Filtration wird Citronensäure durch Zugabe von Ca(OH)2 oder CaO als Ca3Citrat ausgefällt. Hieraus kann freie Citronensäure durch Zugabe von Schwefelsäure hergestellt werden; dabei entsteht CaSO4 als Nebenprodukt. Weitere Reinigungsschritte schließen sich an. Extraktionen der zellfreien Kulturbrühe mit Lösungsmitteln oder die Abtrennung der Citronensäure mittels Ionenaustauschchromatographie stellen alternative Verfahren dar.

Biotechnologische Produktion

Drei grundlegend unterschiedliche Verfahren werden zur biotechnologischen Produktion von Citronensäure mit A. niger angewandt: Im Koji-Prozess werden stärkehaltige Reststoffe oder aus der Verarbeitung landwirtschaftlicher Produkte stammende Abfälle in einer Art Feststoff-Fermentation in großen flachen Schalen nach Beimpfung mit Sporen von A. niger inkubiert. Dieses Verfahren spielt jedoch eine untergeordnete Rolle. Der Oberflächen-Prozess hatte lange Zeit die größte Bedeutung. Hierbei wird mit Kaliumhexacyanoferrat vorbehandelte Melasse in großen, flachen Schalen (2,5 × 4,0 × 0,25 m, L × B × H) aus Aluminium oder besonderen Stahllegierungen gegeben und mit Sporen des Pilzes beimpft. An der Oberfläche bildet sich eine dicke „Schwimmdecke“ des A. niger-Myzels aus. Das am Ende citronensäurehaltige Medium unterhalb der Schwimmdecke kann dabei sogar mehrfach abgelassen und durch frisches Medium ersetzt werden. Heute setzen sich Submersverfahren immer mehr durch. In riesigen, mehrere hunderttausend Liter Medium fassenden Bioreaktoren wird A. niger in Melasse bei sehr intensiver Belüftung und Rührung kultiviert.

Drei Prozesse

Ziel der biotechnologischen Produktion ist es, möglichst wenig Zellen bzw. Myzel zu produzieren, die Zellen dafür aber zu einer langanhaltenden und irreversiblen Synthese und Ausscheidung von Citronensäure ausgehend von Glucose anzuregen. Glucose wird in A. niger durch den Embden-Meyerhof-Weg zu Pyruvat abgebaut. Durch den Pyruvat-Dehydrogenase Komplex entstehen Acetyl-CoA und CO2; das Enzym Citrat-Synthase kondensiert dann Acetyl-CoA unter Abspaltung von CoA mit Oxalessigsäure zu Citronensäure, die ausgeschieden wird. Dabei wird ein Teil des CO2 durch das Enzym Pyruvat-Carboxylase wieder fixiert, womit auch sichergestellt wird, dass genügend Oxalessigsäure zur Verfügung steht. Diese unvollständige Oxidation von Glucose erfolgt nur bei intensiver Belüftung und bei niedrigem pH (pH 2). Zudem müssen die Komponenten des Mediums genau eingestellt werden. Wichtig ist ein sehr niedriger Gehalt an Eisenionen. Während Manganionen die Citronensäureproduktion bereits ab einer Konzentration von 3 mg/L hemmen, steigern Kupferionen (Cu2+) die Citronensäureproduktion deutlich, wenn deren Konzentration im Medium mindestens 150 mg/L beträgt. Beides ist auf das Enzym cis-Aconitase zurück zu führen, welches normalerweise im Tricarbonsäure-Cyclus den nächsten Schritt katalysiert. Dieses Enzym ist eisenabhängig und wird durch Kupfer als Antagonist von Eisen gehemmt.

Biochemische Grundlagen

Versuchsziel Mit diesem Versuch soll demonstriert werden, dass Aspergillus niger Saccharose in Abhängigkeit von der Belüftung unvollständig zu Citronensäure oxidieren kann.

126

3 Versuche

Versuchsdurchführung Zwei 450 ml-Fernbachkolben mit je 150 ml Malz-Saccharose-Nährlösung werden unter sterilen Bedingungen mit je 1 ml Aspergillusniger-Konidiensuspension versetzt. Nach dem Beimpfen werden jeweils unter sterilen Bedingungen mit Hilfe einer Glaspipette ca. 5 ml Probe entnommen und in Reagenzgläser überführt. Jeweils ca. 1 ml hiervon werden in geeignete Gefäße (z. B. ein Eppendorf-Reaktionsgefäß) transferiert und im verschlossenen Zustand bei -20 °C aufbewahrt. In der restlichen Probe wird mit Hilfe eines pH-Meters der pH-Wert der Kulturen bestimmt. Beide Kulturen werden bei 30 °C bebrütet. Eine der beiden Kulturen wird ruhig stehend, die andere auf einem Rotationsschüttler inkubiert.

benötigtes Material Geräte           

Zwei 450 ml-Fernbachkolben Reagenzgläser 5 ml-Glaspipetten (steril) 1 ml-Glaspipetten 20 μl-Pipette Eppendorf-Reaktionsgefäße und geeignete Zentrifuge pH-Meter Brutschrank (30 °C) Rotationsschüttler (30 °C) Photometer (334, 340 oder 365 nm) 3 ml-Küvetten

Chemikalien und Medien  Reagenzien zum optisch-enzymatischen Nachweis von Citronensäure (Seite 396)  Malz-Saccharose-Medium ( S. 418)

Alle fünf Tage werden auf die oben beschriebene Weise kontaminationsfrei Proben Mikroorganismen genommen. Am 15. Tag wird abschließend mit Hilfe eines optisch-enzymatischen Tests  Geeigneter Stamm von Aspergillus niger in allen Proben der Verlauf der Citronen(z. B. DSM 823 = ATCC 10577) säure-Bildung in den Kulturen bestimmt. Dazu werden die aufgetauten 1 ml-Proben zur Abtrennung der Zellen 5 min bei 14.000 × g zentrifugiert (entspricht 13.000 Umdrehungen pro min in einer herkömmlichen „Eppendorf-Zentrifuge“). Von den Überständen werden mit H2Odem. 10-1 und 10-2-verdünnte Proben hergestellt. Die verdünnten Proben werden im optisch-enzymatischen Nachweis zur Bestimmung von Citronensäure ( M24, S. 396) eingesetzt. Weiterführende Literatur Roehr M, Kubicek CP, Kominek J (1996) Citric acid. In: Rehm HJ, Reed G, Pühler A, Stadler P (eds) Biotechnology. vol 6, 2nd edn. Wiley-VCH, Weinheim, pp 307-345 Ruijter GJG, Kubicek CP, Visser J (2002) Production of organic acids by fungi. In: Osiewacz HD (ed) The Mycota, vol X, Springer, Berlin, pp 213-230

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

127

Nachgefragt 1. Zeichnen Sie die Strukturformel von Citronensäure! 2. Nennen Sie mindestens fünf unterschiedliche Produkte, in denen Sie biotechnologisch hergestellte Citronensäure vorfinden! 3. Welche Eigenschaften der Citronensäure sind für deren Einsatz ausschlaggebend? 4. Welcher Mikroorganismus wird hauptsächlich zur biotechnologischen Produktion von Citronensäure eingesetzt? Mit welchem anderen Mikroorganismus wurden ebenfalls vielversprechende Verfahren ausgearbeitet? 5. Wie viel Citronensäure wird pro Kopf der Weltbevölkerung jährlich produziert? 6. Berechnen Sie die Höhe und Durchmesser einer Halde aus Citronensäure unter den Annahmen, dass das hergestellte Salz eine Schüttdichte von 1 g/ cm3 besitzt und dass eine gesamte Weltjahresproduktion in Form eines Kegels mit einem Neigungswinkel von 45 ° aufgeschüttet wird! 7. Was versteht man unter einem Reststoff? Erstellen Sie eine Liste von Reststoffen, die bei der Verarbeitung von Produkten der Landwirtschaft anfallen! 8. Sind Reststoffe mit Abfällen gleichzusetzen? 9. Nennen und Beschreiben Sie die drei grundlegenden Verfahren, die zur biotechnologischen Produktion von Citronensäure eingesetzt werden können. 10. Welches Enzym katalysiert die Synthese von Citronensäure? Schreiben Sie die Reaktionsgleichung der von diesem Enzym katalysierten Reaktion! 11. Wodurch wird in A. niger am „Ende“ des CitratCyclus eine ausreichende Bereitstellung von Oxalessigsäure gewährleistet, obwohl das erste Intermediat des Cyclus nahezu quantitativ ausgeschieden wird?

12. Welche Reaktion katalysiert das Enzym PyruvatCarboxylase? Schreiben Sie die Reaktionsgleichung der von diesem Enzym katalysierten Reaktion! 13. Warum erfolgt die Ausscheidung von Citronensäure durch A. niger besonders bei sehr niedrigen Konzentrationen von Eisenionen im Medium? Warum muss aber dennoch ein Minimum an Eisenionen vorhanden sein? 14. Weshalb bewirkt der Zusatz von Cu2+-Salzen eine deutliche Steigerung der Ausscheidung von Citronensäure? 15. Welche Eigenschaften der Citronensäure nutzt man für dessen Abtrennung von den übrigen Bestandteilen des Mediums und dessen Reinigung aus? 16. Aus 100 g Glucose sollten theoretisch nur 71 g Citronensäure entstehen können. In der Realität werden jedoch bis zu 87 g erhalten. Wie viel mol % der eingesetzten Glucose entsprechen 71 bzw. 87 g Citronensäure? (MW Glucose: 180,16 g mol-1; MW Citronensäure: 192,12 g mol-1). Erklären Sie die größere Menge entstehender Citronensäure stoffwechselphysiologisch! 17. Beschreiben Sie den optisch-enzymatischen Test, mit dem im Praktikum Citronensäure quantitativ bestimmt wurde, und nennen Sie Edukte und Produkte sämtlicher zum Nachweis eingesetzter Enzyme! 18. Wie könnte die Refixierung von CO2 durch A. niger während der Citronensäureproduktion experimentell nachgewiesen werden? 19. Erläutern Sie die Begriffe „overflow Produkt“ und „unvollständige Oxidation“! 20. Warum muss die Kultur von A. niger zur Produktion von Citronensäure gut belüftet werden? Ließe sich Citronensäure auch durch Gärung herstellen?

Herstellung von Dihydroxyaceton mit Essigsäurebakterien

Versuch 24

Theoretischer Hintergrund Die Ketotriose Dihydroxyaceton (DHA, 1,3-Dihydroxypropan-2-on) ist eine wasserlösliche, hygroskopische und süß schmeckende Verbindung. Sie stellt ein wertvolles Ausgangsprodukt für die chemische und pharmazeutische Industrie dar und dient als Zwischenprodukt zur Herstellung von Gerbmitteln, Emulgatoren, Weichmachern, Kunststoffen, Fungiziden und Katalysatoren. Ein weiteres wichtiges Hauptanwendungsgebiet sind sogenannte Selbstbräunungscremes, die praktisch immer DHA als aktive Komponente enthalten ( Abb. 3.59). Die Bräunung resultiert aus der Reaktion des DHA mit freien Aminogruppen von Proteinen abgestorbener Zellen der Hornschicht. Auf diese Weise lässt sich auch ohne Sonnenlicht gebräunte Haut erhalten. Die entstandene Braunfärbung hält einige Tage an. Dabei ist allerdings zu berücksichtigen, dass mit DHA gebräunte Haut nicht vor einem Sonnenbrand geschützt ist!

Bedeutung und Verwendung

128

3 Versuche Eigenschaften der Essigsäurebakterien

H H

H

C

OH

C

O

C

OH

H Dihydroxyaceton (DHA)

DHA wird biotechnologisch ausgehend von Glycerin mit Hilfe eines Essigsäurebakteriums produziert. Essigsäurebakterien sind strikt aerobe Bakterien und gehören zur Gruppe der α-Proteobakterien mit Acetobacter, Gluconobacter und Gluconacetobacter als Hauptgattungen. Essigsäurebakterien zeichnen sich durch die Fähigkeit aus, zahlreiche unterschiedliche Zuckeralkohole und Zukker sowie primäre und sekundäre Alkohole unvollständig oxidieren zu können. Möglich werden diese Umsetzungen durch eine Vielzahl von Dehydrogenasen, die häufig in der Cytoplasmamembran lokalisiert sind und nicht von NAD(P) sondern von Pyrrolochinolinchinon (PQQ) abhängig sind. Auf Abb. 3.59. Wirkung von DHA (links) und Produkt (rechts). Auf dem Undiese Weise entstehen aus Zuckeralkoholen DHA-haltiges terarm sind die durch die Selbstbräunungsje nach Position der zu oxidierenden Hydro- creme hervorgerufenen Buchstaben „DHA“ xylgruppe entweder Aldosen oder Ketosen zu erkennen und aus Ketosen die entsprechenden Zuckersäuren, während aus primären und sekundären Alkoholen die entsprechenden Aldehyde bzw. Ketone entstehen; entstandene Aldehyde können dann zu den entsprechenden Säuren aufoxidiert werden. Je nach eingesetztem Stamm werden die entstandenen Oxidationsprodukte dann weiter oxidiert und in Intermediate des zentralen Stoffwechsels überführt, oder sie bleiben als Ausscheidungsprodukte im Medium erhalten. Hier unterscheiden sich Vertreter der Gattung Acetobacter von denen der Gattung Gluconobacter. Gluconobacter sp. besitzen im Gegensatz zu Acetobacter sp. keinen vollständigen Citronensäure-Cyclus und können zum Beispiel entstandene Essigsäure deshalb nicht weiter abbauen. Da die angebotenen Substrate trotz eines aeroben Stoffwechsels nicht vollständig zu CO2 oxidiert werden, spricht man von unvollständigen Oxidationen. Die Umwandlungen können auch als Biotransformationen bezeichnet werden, da die betreffenden Verbindungen in andere umgewandelt werden, ohne dass die Ausgangsverbindung als Kohlenstoffquelle genutzt wird. Lediglich die bei den Oxidationen gewonnenen Reduktionsäquivalente können zur Energiegewinnung mittels Atmungskettenphosphorylierung genutzt werden.

Biotechnologische Verfahren mit Essigsäurebakterien V37 - S. 188

Unvollständige Oxidationen bilden die Grundlage vieler bedeutender biotechnologischer Produktionsprozesse. Ein Beispiel, die biotechnologische Produktion von Citronensäure mit Aspergillus niger, haben wir bereits kennen gelernt. Andere wichtige biotechnologische Verfahren nutzen für unvollständige Oxidationen Essigsäurebakterien. Ein bekanntes Beispiel ist die Herstellung von Essig aus Wein bzw. Ethanol. Dies sind Verfahren, welche schon seit Jahrtausenden gezielt angewandt werden, um Weinessig zu produzieren. Auch hierzu ist im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM ein Versuch beschrieben. Ein anderes sehr wichtiges Verfahren ist die Oxidation von D-Sorbit zu L-Sorbose. Dies ist der zweite Schritt beim 1934 entwickelten und bis heute praktiziertem Reichstein-Grüssner-Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure (Vitamin C) aus Glucose und wird durch Acetobacter suboxydans katalysiert. Es ist der einzige biochemische Schritt in dem ansonsten von chemischen Reaktionen dominierten Verfahren zur Herstellung von Vitamin C. Nach dem Reichstein-Grüssner-Verfahren wurden im Jahr 2000 ca. 80.000 Tonnen L-Ascorbinsäure mit einem Wert von über 600 Millionen € produziert. Davon finden ca. 50 % in Vitaminpräparaten Verwendung, sowie 25 % als Nahrungsmittelzusatzstoffe, 15 % in alkoholfreien Getränken und 15 %

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

als Futtermittelzusatz in der Tierernährung. Zur Zeit setzen sich verbesserte und umfassendere biotechnologische Verfahren durch, die mit Hilfe von gentechnisch veränderten Bakterien eine nahezu vollständige Umwandlung von Glucose in L-Ascorbinsäure ermöglichen. Darüber hinaus wurden biotechnologische Verfahren entwickelt, um mit Gluconacetobacter xylinus (früher: Acetobacter xylinum) Cellulose für Spezialanwendungen zu produzieren. Bei dem hier durchzuführenden Versuch wird Glycerin mit Gluconobacter oxydans unvollständig zu DHA oxidiert. Hierzu wird HC OH C O ein zweistufiges Verfahren angewandt: in der H2C OH H2C OH ersten Stufe wird mit Sorbit als Kohlenstoff2 [H] quelle zunächst Zellmasse produziert und in Abb. 3.60. Oxidation von Glycerin zu der zweiten Stufe dann Glycerin zu DHA Dihydroxyaceton (DHA) durch oxidiert ( Abb. 3.60). Glycerin ist eine Gluconobacter oxydans preiswerte Kohlenstoffquelle, die entweder synthetisch aus Propen oder Allylalkohol hergestellt werden kann oder während der Methanolyse von Triglyceriden bei der Produktion von Biodiesel aus Rapsöl in großen Mengen anfällt. Außerdem kann Glycerin auch biotechnologisch durch Vergärung von Glucose mit Hefen nach der 2. und 3. Neubergschen Vergärungsform hergestellt werden, wie wir in einem Versuch gesehen haben. H2C

OH

H 2C

OH

129

V30 - S. 153

Biotransformation von Glycerin zu DHA

V22 - S. 119

Versuchsziel benötigtes Material Geräte  Drei 250 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen  Rotationsschüttler (30 °C)

Chemikalien und Medien      

Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril 50 % (wt/vol) Glycerin, autoklaviert Gluconobacter-Festmedium ( S. 415) Sorbit-Medium ( S. 426) DHA-Kontrollmedium ( S. 413) DHA-Produktionsmedium ( S. 413)

Mikroorganismen  Gluconobacter oxydans DSM 50049

Sonstiges  Dihydroxyaceton-Kontroll-Lösung (10 %, wt/vol DHA); alternativ: Eine beliebige Selbstbräunungscreme als Vergleichssubstanz

In diesem Versuch soll demonstriert werden, dass Essigsäurebakterien Glycerin unvollständig zu Dihydroxyaceton oxidieren können und das Oxidationsprodukt ins Medium ausscheiden. Der Nachweis des Selbstbräunungsmittels erfolgt durch einen Selbstversuch auf der Haut. Versuchsdurchführung Nach Erhalt des Stamms wird dieser (wenn nicht anders von der Bezugsquelle angegeben) in wenig steriler Saline suspendiert und per Drei-Strich-Ausstrich ( M4, S. 365) auf Gluconobacter-Festmedium ausgestrichen. Die Platte wird bei 30 °C bebrütet. Die bewachsene Platte kann bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank (4 °C) gelagert werden. Mit Material einer Einzelkolonie werden 25 ml Sorbit-Medium in einem 250 mlErlenmeyerkolben mit Schikanen beimpft. Die Kultur wird bei 30 °C unter Schütteln bebrütet.

Jeweils 7,5 ml des bewachsenen Sorbit-Mediums werden in zwei 250 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen, der eine gefüllt mit 25 ml DHA-Produktionsmedium, der andere mit 25 ml DHA-Kontrollmedium, überführt. Beide Kolben werden bei 30 °C geschüttelt.

Vorbereitungen

130

3 Versuche

Zum Produktionsansatz werden erneut 2,5 ml 50 % (wt/vol) Glycerin zugesetzt. Die Überprüfung der DHA-Herstellung erfolgt visuell durch Ermittlung des zu erzielenden Bräunungsgrades auf der eigenen Haut. Hierzu wird jeweils etwas Flüssigkeit der beiden Ansätze und einer Dihydroxyaceton-Kontroll-Lösung (bzw. der Bräunungscreme) mit Hilfe von Wattestäbchen (o. ä.) auf drei vorher markierte Bereiche der Haut aufgetragen. Eine sichtbare Bräunung der Hautpartien tritt frühestens nach zwei Stunden auf. Weiterführende Literatur Deppenmeier U, Hoffmeister M, Prust C (2002) Biochemistry and biotechnological applications of Gluconobacter strains. Applied Microbiology and Biotechnology 60:233-242 Hancock RD, Viola R (2001) The use of microorganisms for L-ascorbic acid production: current status and future perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology 56:567-576 Macauley S, McNeil B, Harvey LM (2001) The genus Gluconobacter and its applications in biotechnology. Critical Reviews in Biotechnology 21:1-25 Stiftung Warentest (2002) Selbstbräuner – Ein blasses Ergebnis. Test-Heft 5, S. 25-27 Wethmar M, Deckwer WD (1999) Semisynthetic culture medium for growth and dihydroxyacetone production by Gluconobacter oxydans. Biotechnology Techniques 13:283-287

Nachgefragt 1. Wieso führt DHA zur Braunfärbung der Haut? Beschreiben Sie Komponenten und deren funktionelle Gruppen, mit denen DHA reagiert, und die dabei ablaufende chemische Reaktion! 2. Welcher Mikroorganismus wird bei der biotechnologischen Produktion von DHA aus Glycerin eingesetzt? 3. Beschreiben Sie die taxonomischen Charakteristika und die phylogenetische Stellung von Essigsäurebakterien! Welche Gattungen und Species kennen Sie? 4. Was versteht man unter Biotransformation? Nennen Sie Beispiele! 5. Was versteht man unter unvollständiger Oxidation? Nennen Sie Beispiele! 6. Stellen Gärungen unvollständige Oxidationen dar? In welchem Sinne? 7. Beschreiben Sie die Enzyme, welche die für Essigsäurebakterien typischen Reaktionen katalysieren! 8. Wie heißt das Coenzym, welches in Essigsäurebakterien häufig an der enzymatischen Oxidation von Verbindungen beteiligt ist? 9. Nennen Sie weitere Coenzyme oder prosthetische Gruppen, die bei enzymatischen Oxidationen bzw. Reduktionen anstelle von NAD+ bzw. NADH beteiligt sein können!

10. Welche Verbindungen entstehen bei der Oxidation von n-Propanol, 2-Propanol und D-Glucose durch Essigsäurebakterien? 11. Welche Ausgangsverbindungen müssen gewählt werden, um durch Essigsäurebakterien D-Fructose, L-Sorbose oder Glycolsäure zu erhalten? 12. Welche anderen biotechnologischen Verfahren beruhen auf dem Einsatz von Essigsäurebakterien? 13. Zeichnen Sie die Strukturformel von DHA und der Verbindung auf, aus der es in dem beschriebenen biotechnologischen Prozess entsteht! 14. Wie viel Gramm Glycerin müssen Sie unter der Annahme einer 100 %igen Ausbeute einsetzen, um daraus 100 g DHA zu produzieren? 15. Wie gewinnt Gluconobacter oxydans bei der Oxidation von Glycerin zu DHA Energie? 16. Nennen Sie mögliche Quellen für Glycerin! 17. Wie haben Sie im Versuch DHA nachgewiesen? 18. Zeichnen Sie die Strukturformel von Vitamin C! 19. Zählen Sie allgemein zugängliche Produkte auf, in denen Vitamin C vorkommt! 20. Suchen Sie in Lehrbüchern und Lexika nach einer Beschreibung des Reichstein-Grüssner-Verfahren zur Produktion von L-Ascorbinsäure!

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

Herstellung des Farbstoffs Indigo mit einem rekombinanten Stamm von Escherichia coli

131

Versuch 25

Theoretischer Hintergrund Indigo ( Abb. 3.61) ist einer der ältesten organischen Farbstoffe und wurde nachweislich bereits vor ca. 4.000 Jahren in Ägypten zum Färben von Stoffen und zum Zeichnen N eingesetzt. Er eignet sich hervorragend zum H Färben von Pflanzen- und Tierfasern und O Indigoblau hat heute eine sehr große Bedeutung, da er z. B. zum Färben von Baumwollstoffen einO H gesetzt wird. Indigo ist lediglich einer von Br N mehreren verfügbaren indigoiden Farbstoffen, die sehr ähnliche chemische Strukturen N aufweisen. Ebenfalls sehr bekannt und nachBr H O weislich seit mindestens 4.300 Jahren im Purpur Mittelmeerraum genutzt ist 6,6’-DibromAbb. 3.61. Chemische Strukturen von indigo, besser bekannt als Purpur Indigo (Indigoblau) und Purpur ( Abb. 3.61). Präparate von Purpur stellen meist ein Gemisch verschiedener Farbstoffe dar und hatten früher eine sehr große Bedeutung. Heute gibt es nur noch Relikte der Nutzung dieses außerordentlich teuren Farbstoffs.

Bedeutung und Verwendung

Purpur kommt als Leucobase (Indigoweiß) im Saft der Drüsen von marinen Purpurschnecken (Muricidae) vor und wird durch Extraktion aus den Tieren gewonnen. So lieferte z. B. Thais lapillus im Nordseeraum den sogenannten violetten Purpur, während Trunculariopsis trunculus im Mittelmeerraum den roten Purpur lieferte, um lediglich zwei Quellen zu nennen. Durch Einwirkung von Luftsauerstoff und Licht (Photooxidation,  Abb. 3.62) wandelt sich das farblose Indigoweiß dann in Purpur um. Da die Extraktion aus ca. 12.000 Schnecken lediglich 1,4 g reinen Farbstoff liefert, ist Purpur außerordentlich wertvoll (ca. 2.000 €/g).

Traditionelle Gewinnung und Herstellung

O

H N

Indigo ist leichter zugänglich. Bis ca. 1900 wurde Indigo ausschließlich als Naturstoff aus bestimmten Pflanzen isoliert. Färberwaid (Isatis tinctoria), auch Deutscher Indigo, wurde besonders zwischen 1400 und 1700 in Europa sehr umfangreich angebaut und lieferte hier den Farbstoff. Hauptlieferant wurde danach jedoch Java, wo der Farbstoff zu geringeren Kosten hauptsächlich aus der Indigopflanze (Indigofera tinctoria) gewonnen und dann nach Europa exportiert wurde. In den 70er Jahren des 19. Jahrhunderts entwickelte Adolph von Baeyer ein chemisches Verfahren zur Synthese von Indigo und klärte die chemische Struktur des natürlichen Indigo auf. Hierfür wurde der deut-

Ox idation duk e R tion

Abb. 3.62.

Photooxidation von Indigoweiß (Leukobase, links) zu Purpur (rechts)

132

3 Versuche

sche Chemiker 1905 mit dem Nobelpreis ausgezeichnet. Chemische Produktionsverfahren begannen sich ab ca. 1900 durchzusetzen und sind auch heute noch vorherrschend. Zur Zeit werden jährlich ca. 17.000 t Indigo hergestellt; der Großhandelspreis beträgt ca. 65 €/kg. Biotechnologie und blue genes

Es bahnt sich jedoch auch hier eine grundlegende Veränderung an, da mittlerweile biotechnologische Verfahren zur Produktion von Indigo entwickelt wurden. Die Firma Genencor produziert Indigo mit Hilfe eines gentechnisch veränderten Stammes von Escherichia coli. Durch metabolic engineering ist es gelungen Tryptophan bzw. Indol überproduzierende Stämme von E. coli zu konstruieren, die mit einer einklonierten Naphthalin-Dioxygenase bzw. XylenOxidase Indol in Indoxyl umwandeln; aus dieser Verbindung entsteht dann spontan durch Luftoxidation der Farbstoff Indigoblau ( Abb. 3.64).

Abb. 3.63. EM-Aufnahme eines rekombinanten Stammes von Escherichia coli mit Indigo-Einschlüssen (Maßstab: 0.2 μm)

Beim Anlegen einer Genbank des Genoms von Ralstonia eutropha Stamm H16 in Escherichia coli Stamm S17-1 fielen einige Klone auf, deren Kolonien auf LB-Agarplatten dunkelblau, ja fast schwarz gefärbt waren. Aus einem ursprünglich 11-kbp großen genomischen Fragment wurde durch Behandlung mit der Restriktionsendonuklease PstI zwei Fragmente (2,4 kbp und 0,9 kbp) erhalten, welche in den Vektor pBluescript SK- kloniert wurden. Das resultierende Hybridplasmid pSK-BEC/PP:3,3 vermittelt die Entstehung von Indigo in E. coli ( Abb. 3.63) und wird in diesem Versuch verwendet. Versuchsziel Mit diesem Versuch soll demonstriert werden, dass ein rekombinanter Stamm von Escherichia coli zur Synthese des Farbstoffs Indigo in der Lage ist. Indigo soll partiell gereinigt werden. Von dem Präparat soll ein Absorptionsspektrum aufgenommen werden. Außerdem kann das Präparat zur Färbung von Baumwolle eingesetzt werden. C OOH

Pyruvat + NH 3

NH2 N H Indol Naphtalin Dioxygenase

Tryptophanase

N H Tryptophan

Xylen Oxidase O2

OH spontan

N H

Abb. 3.64.

H N

spontan

OH

cis-Indol-2,3-dihydrodiol

O

OH

H2O

N H

O2

Indoxyl

Syntheseweg von Indigoblau ausgehend von Tryptophan

N H

O

Indigoblau

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen Dieser Versuch stellt nach dem geltenden Gentechnik-Gesetz eine gentechnische Arbeit der Sicherheitsstufe 1 (Kultivierung eines gentechnisch veränderten Organismus) dar. Der Versuch darf daher nur in behördlich genehmigten gentechnischen Anlagen der Sicherheitsstufe 1 unter Beachtung der entsprechenden Vorschriften der Gentechnik-Sicherheitsverordnung und Gentechnik-Aufzeichnungsverordnung erfolgen.

133 Sicherheitshinweis

Versuchsdurchführung Nach Erhalt des Stamms wird dieser in wenig steriler Saline suspendiert und per DreiStrich-Ausstrich (M4, S. 365) auf LB-Amp-Agar ausgestrichen. Die Platte wird bei 30 °C bebrütet. Die bewachsene Platte kann bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank (4 °C) gelagert werden. benötigtes Material Geräte  1.000 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen  Schraubdeckelglas  Schüttler (37 °C)  Laborzentrifuge (100 ml, 3.500 × g)  Gefrierschrank (-20 °C)  Spektrophotometer zur Aufnahme eines Absorptionsspektrums im sichtbaren Wellenlängenbereich  Reibschale mit Pistill  Gefriertrocknungsanlage  auf 150 °C heizbarer Thermoblock mit passenden Bohrungen für Schraubdeckelgläser oder Ölheizbad  Eisbad  Papierfilter und Trichter

Chemikalien und Medien  Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril  LB-Festmedium ( S. 417) + Amp ( S. 429)  LB-Nährlösung ( S. 417) + Amp ( S. 429)  TB-Nährlösung ( S. 427) + Amp + IPTG ( S. 429)  70 % (vol/vol) Ethanol  96 % (wt/vol) Ethanol  Anilin  N,N-Dimethylformamid  Natrium-Dithionit  NaOH (1,5 M)

Mit Material einer Einzelkolonie werden nachmittags 10 ml LB-Amp-Nährlösung in einem 100 ml-Erlenmeyerkolben beimpft. Die Kultur wird bei 37 °C unter Schütteln bebrütet. Mit 1 ml der Vorkultur werden vormittags 200 ml TB-Amp-IPTG-Nährlösung in einem 1.000 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen beimpft. Die Suspension wird unter Schütteln bei 37 °C inkubiert. Zunächst werden die Zellen im Phasenkontrast mikroskopiert; deutlich sollten die dunkel gefärbten Einschlusskörper an den Zellpolen zu sehen sein. Aus der tief dunkelblau gefärbten Kultur werden die Zellen durch Zentrifugation (3.500 × g, 10 min) geerntet. Die Zellen werden zunächst in 50 ml H2Odem. resuspendiert und erneut zentrifugiert. Nach Resuspendierung der Zellen in 50 ml 70 % (vol/vol) Ethanol und Zentrifugation werden die Zellen in 50 ml 96 % (wt/vol) Ethanol aufgenommen und zentrifugiert. Das auf diese Weise gewaschene Zellmaterial wird bei -20 °C eingefroren. Die eingefrorenen Zellen werden in eine Gefriertrocknungsanlage überführt und dort getrocknet.

Die getrockneten Zellen werden in einer Reibschale gemörsert. Das zerkleinerte Material wird in ein Schraubdeckelglas überMikroorganismen führt und mit ca. 5 ml Anilin versetzt. Es folgt eine ca. einstündige Inkubation des ver Escherichia coli pSKBEC/PP:3,3 schlossenen Röhrchens bei 150 °C im Ther(DSM 15371) moblock oder in einem Ölbad. In dieser Zeit  Escherichia coli S17-1 (plasmidfrei, wird das Röhrchen mit Hilfe einer HolzFa. Stratagene) zange mehrmals geschwenkt. Während einer anschließenden 24-stündigen Inkubation im Eisbad kommt es zur Präzipitation der Farbpigmente.

Vorbereitungen

134

3 Versuche

Die Farbkristalle werden schließlich durch Filtration über ein Papierfilter mit nachfolgendem Spülen mit 96 % (wt/vol) Ethanol und H2Odem. aus der Flüssigkeit gewonnen. Charakterisierung des Farbstoffs: Zur Charakterisierung des isolierten Farbstoffs bieten sich in Abhängigkeit von der erzielten Farbstoffmenge folgende Vorgehensweisen an: Aufnahme eines Absorptionsspektrums im sichtbaren Wellenlängenbereich (400 bis 800 nm): Dazu wird der Farbstoff in wenig N,N-Dimethylformamid gelöst. Indigo zeigt einen Absorptionspeak im Bereich zwischen 500 und 660 nm mit einem Maximum bei 610 nm. Färbung von Baumwolltextilien: Dazu wird zunächst etwas isolierter Farbstoff in 1 M NaOH aufgenommen. Nach Zusatz einer Spatelspitze Natrium-Dithionit wird Indigo in das lösliche Indigoweiß überführt (Verküpung). In dieser Form wird der Farbstoff von Textilfasern aufgenommen. Zur Färbung eines Stückchens Baumwolle (z. B. Teil eines weißen T-Shirts) oder Papier wird die Lösung einfach aufgetropft. Der mit der Lösung versehene Stoff erscheint an der Luft zunächst gelb. Durch Autoxidation kehrt nach einigen Minuten über grüne Zwischentöne die blaue Farbe zurück; sie verleiht der vormals weißen Baumwolltextilie einen typischen „Jeansfarbton“. Ist ein Kleidungsstück gefärbt worden, muss es vor dem Tragen gründlich gewaschen werden, um NaOH und Dithionit zu entfernen. Weiterführende Literatur Berry A, Dodge TC, Pepsin M, Weyler W (2002) Application of metabolic engineering to improve both the production and use of biotech indigo. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 28:127-133 Drewlo S, Brämer CO, Madkour M, Mayer F, Steinbüchel A (2001) Cloning and expression of a Ralstonia eutropha HF39 gene mediating indigo formation in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology 67:1964-1969 Seefelder M (1994) Indigo in Kultur, Wissenschaft und Technik. Ecomed, Landsberg Melzer RR, Brandhuber P, Zimmermann T, Smola U (2001) Der Purpur – Farben aus dem Meer. Biologie in unserer Zeit 31:30-39

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

Nachgefragt 1. Wie unterscheiden sich Indigo und Purpur hinsichtlich ihrer chemischen Struktur? Wie lautet die chemische Bezeichnung von Purpur? 2. Stellen Sie aus Lehrbüchern eine Übersicht von gefärbten Verbindungen zusammen, die von Mikroorganismen synthetisiert werden! Welche dieser Verbindungen sind biotechnologisch relevant? 3. Wo kommt Purpur in der Natur vor? Nennen Sie Quellen für die Gewinnung von Purpur! 4. In welcher chemischen Form liegt Purpur in der Natur vor, und wie entsteht hieraus der eigentliche Farbstoff? 5. Nennen Sie Pflanzen, aus denen Indigo gewonnen werden kann! 6. Zur Herstellung welcher Produkte wird Indigo heute hauptsächlich verwendet? 7. Beschreiben Sie den Stoffwechselweg über den Indigo aus Tryptophan entsteht! 8. Welche Schritte werden bei der Überführung von Tryptophan in Indigo durch Enzyme katalysiert? 9. Welche Schritte laufen bei der Überführung von Tryptophan in Indigo spontan ab, und um welche Reaktionen handelt es sich? 10. Wie erkennen Sie die Bildung von Indigo bei dem im Praktikum durchgeführten Versuch makroskopisch und lichtmikroskopisch? 11. Was versteht man unter dem Begriff metabolic engineering?

12. Wie erklären Sie sich, dass Indigo in dem eingesetzten Stamm überwiegend in den Zellen abgelagert und kaum ins Medium ausgeschieden wird? 13. Welche Voraussetzungen außer den Besitz von Genen zur Überführung von Tryptophan in Indigo muss ein gentechnisch veränderter Stamm von Escherichia coli noch erfüllen, damit der Farbstoff in großer Menge produziert werden kann? 14. Beschreiben Sie, wie Sie bei der Isolierung von Indigo aus den Zellen des rekombinanten Stammes von Escherichia coli vorgegangen sind! 15. Wie sind Sie im Versuch vorgegangen, um einen Baumwollstoff mit Indigo zu färben? 16. Informieren Sie sich in einem Lehrbuch der Organischen Chemie, was Küpenfarbstoffe sind und wie diese zum Färben eingesetzt werden! 17. Erinnern Sie sich an einen Versuch zur Charakterisierung von Bakterien, bei dem der Nachweis von Tryptophan bzw. Indol angewandt wurde? 18. Welche Faktoren waren dafür ausschlaggebend, dass sich die Gewinnung von Indigo von der Isolierung aus Pflanzen hin zur Produktion durch chemische Synthese verlagerte? 19. Welche Faktoren sind dafür ausschlaggebend, dass sich die Herstellung von Indigo nun wahrscheinlich von der chemischen Synthese zur biotechnologischen Produktion verlagern wird? 20. Warum darf dieser Versuch nicht ohne weiteres in jedem Laboratorium durchgeführt werden?

135

136

3 Versuche

Versuch 26

Herstellung und Nachweis von Antibiotika Theoretischer Hintergrund

Entdeckung und Bedeutung

Nachdem der englische Mikrobiologe Alexander Fleming 1928 beobachtet hatte, dass von der Kolonie eines Pilzes, die als Kontamination auf den Nährboden zur Kultivierung von Bakterien gelangt war, eine Hemmung des Wachstums dieser Bakterien ausging, wurde eine neue Ära der Biotechnologie eingeleitet. Bei dem Pilz handelte es sich um Penicillium notatum, und einige Jahre später war die chemische Struktur dieser hemmenden Substanz, dem Penicillin, von Howard Florey aufgeklärt worden. Die Antibiotika waren entdeckt worden. Beide wurden hierfür 1945 mit dem Nobelpreis geehrt. Die Verfügbarkeit von wirkungsvol- Abb. 3.65. Hemmung von Testbakterien len Antibiotika hat maßgeblich dazu durch das Antibiotikum von Streptomyces beigetragen, dass Infektionskrankheiten und hachijoensis auftretende Epidemien wirkungsvoll bekämpft werden konnten. Mit zur Zeit fast 40 Milliarden Euro Umsatz sind die Antibiotika die bedeutendste Produktgruppe der Biotechnologie.

Definition

Von der im Kasten angegebenen Definition Definition: Antibiotika für Antibiotika gibt es zahlreiche durchaus sinnvolle Modifikationen und Erweiterun- Antibiotika sind natürliche, von Mikrogen. Häufig sind die Übergänge zu anderen organismen synthetisierte StoffwechselStoffgruppen fließend. So sind antibiotisch produkte mit einem niedrigen Molekularwirksame Substanzen wie z. B. die Sulfon- gewicht, die in niedriger Konzentration das amide und das Chloramphenicol natürlich Wachstum von anderen Mikroorganismen auch durch chemische Synthese darstellbar. hemmen oder diese abtöten. Auch gibt es andere natürliche Quellen für antibiotisch wirksame Substanzen als Mikroorganismen. Darüber hinaus werden viele Substanzen, die ursprünglich als Antibiotika entdeckt wurden, nicht in der Therapie von Infektionskrankheiten sondern in anderen Anwendungsgebieten wie z. B. in der Tumortherapie eingesetzt.

Wirkungsweise von Antibiotika

Beim Einsatz von Antibiotika werden grundlegende Unterschiede der Zellstrukturen und des Stoffwechsels zwischen dem zu schützenden Wirt und dem zu bekämpfenden infektiösen Agenz genutzt ( Tabelle 3.39). Diese „Archillesversen“ können selektiv gehemmt oder inaktiviert werden, um dadurch das Wachstum von Bakterien und Pilzen gezielt zu hemmen (bakteriostatisch, fungistatisch) oder um diese gar abzutöten (bakterizid, fungizid).

Produzenten

Antibiotika werden nicht in gleichem Umfang von allen Organismengruppen gebildet ( Tabelle 3.40). Pilze stellen ein sehr wichtiges Reservoir für Antibiotika dar, und die zur Klasse der β-Lactam-Antibiotika gehörenden Penicilline und Cephalosporine haben zurzeit den größten Anteil am Umsatz. Während Gram-negative Bakterien praktisch kaum Antibiotika produzieren, bieten Gram-positive Bakterien mit Abstand das umfangreichste Spektrum. Hier sind es besonders Vertreter der Gattung Bacillus und die Actinomyceten. Spezies der Gattung Streptomyces treten als Produzenten von Antibiotika besonders häufig in Erscheinung ( Abb. 3.65).

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen Tabelle 3.39.

Selektive Wirkorte und -ziele wichtiger Antibiotika

Wirkort

Beispiele

Zellwandsynthese

Murein

Penicilline, Cephalosporine, Cycloserin Vancomycine, Bacitracine

Transkription

DNA-Gyrase RNA-Polymerase

Nalidixinsäure, Novobiocin Rifamycin

Proteinsynthese

30S Untereinheit 50S Untereinheit tRNA

Kanamycin, Tetracyclin, Streptomycin Chloramphenicol, Erythromycin Puromycin

Cytoplasmamembran Stoffwechsel Tabelle 3.40. zenten

Polymyxin, Cycloheximid Folsäuressynthese

Sulfanilamid, Trimethoprim

Einige wichtige Klassen von Antibiotika nach chemischer Struktur und deren Produ-

Chemische Struktur

Beispiele

Produzenten

β-Lactam-Antibiotika

Cephalosporin C1953 Penicillin G

Acremonium chrysogenum Penicillium notatum

Peptid-Antibiotika und Derivate

Bacitracin A Bleomycin Cycloserin Cyclosporin A Gramicidin S Polymyxin Valinomycin

Bacillus licheniformis Streptomyces verticillus Streptomyces orchidaceus Tolypocladium inflatum Brevibacillus brevis Paenibacillus polymyxa Streptomyces fulvissimus

Aminoglycosid- und andere Kohlenhydrathaltige Antibiotika

Gentamycin C1 Kanamycin Neomycin Streptomycin Vancomycin

Micromonospora echinospora Streptomyces kanamyceticus Streptomyces fradiae Streptomyces griseus Amycolatopsis orientalis

Polyketid-Antibiotika

Erythromycin A Nystatin Rifamycin

Saccharopolyspora erythraea Streptomyces noursei Amycolatopsis mediterranei

Chinoide und aromatische Antibiotika

Chloramphenicol Chlortetracyclin Doxorubicin Griseofulvin Oxytetracyclin

chemische Synthese Streptomyces aureofaciens Streptomyces peucetius Penicillium griseofulvum Streptomyces rimosus

Cycloalkane

Cycloheximid

Streptomyces griseus

Polyether-Antibiotika

Monesin

Streptomyces cinnamonensis

137

138

3 Versuche Ausbreitung von Resistenzen und Infektionskrankheiten

Mittlerweile haben Infektionskrankheiten wieder eine zunehmende Bedeutung erlangt. Hierfür gibt es verschiedene Ursachen: Ein sehr großes Problem sind die sich momentan rasant ausbreitenden Antibiotikaresistenzen. Sie bewirken, dass einige vormals hervorragende Waffen drohen, stumpf zu werden. Resistenzen gegenüber Antibiotika werden häufig durch Gene auf extrachromosomalen Elementen codiert, die als Plasmide bezeichnet werden. Diese tragen zur raschen Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen bei. In diesem Zusammenhang sind auch die Krankenhausinfektionen, auch Nosokomialinfektionen, zu erwähnen, die ein zunehmendes Problem darstellen. Zunehmende Schwächungen der Immunabwehr durch sich ausbreitende HIVInfektionen sowie die starke Zunahme globaler Reiseaktivitäten bedingt durch Tourismus und Geschäftsreisen tragen hierzu ebenfalls bei.

Resistenzmechanismen

Bakterien haben eine Vielzahl von Strategien entwickelt, um gegenüber Antibiotika resistent zu werden. Hierzu gehören die Inaktivierung des Antibiotikums durch Spaltung und Abbau, wie z. B. bei der durch das Enzym β-Lactamase vermittelten Resistenz gegenüber Penicillinen, die enzymatische Modifizierung des Antibiotikums durch Anhängen von Acetat- oder Phosphatresten, wie im Falle von Resistenzen gegenüber Chloramphenicol und Kanamycin, ein erschwerter Transport in die Zelle oder gesteigerter Hinaustransport, wie im Fall von Tetracyclin, und die Veränderung des Wirkortes, wie die Methylierung der 23S rRNA im Falle der Resistenz gegenüber Erythromycin.

Streptomycin

Streptomyces griseus bildet eine antibiotisch wirksame Substanz. Bei dieser Substanz handelt es sich um das Antibiotikum Streptomycin ( Abb. 3.66). Dieses Aminoglycosid-Antibiotikum wurde 1943 von dem Amerikaner Selmon Waksman entdeckt. Streptomycin entfaltet seine Wirkung durch Bindung an die 30S Untereinheit der Ribosomen. Streptomycin ist ein Breitbandantibiotikum und wurde früher zur Therapie von Mycobacterium tuberculosis-Infektionen eingesetzt. Heute ist es ein wichtiges Reserveantibiotikum, welches häufig dann eingesetzt wird, wenn andere Antibiotika z. B. aufgrund von Resistenzen nicht mehr wirksam sind.

NH NH H2N

HN

NH2

NH OH

HO

OH

O O

CHO H3C OH O HO

O CH2OH H3C HN

Versuchsziel OH In diesem Versuch soll gezeigt werden, dass Stämme der Gattung Streptomyces anti- Abb. 3.66. Strukturformel von biotisch wirksame Substanzen syntheti- Streptomycin sieren. Durch den Versuch soll auch deutlich werden, dass Antibiotika das Wachstum verschiedener Bakterien durchaus unterschiedlich stark beeinträchtigen.

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

139

Versuchsdurchführung benötigtes Material Geräte  Impföse  Reagenzgläser mit ca. 2 ml Saline, autoklaviert  Brutschrank (30 °C)

Chemikalien und Medien  Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril  Suspensionsgel (0,2%, wt/vol, Agar und 0,05%, vol/vol, Tween 80), autoklaviert  Standard I-Festmedium ( S. 427)

Mikroorganismen  Antibiotika-bildende StreptomycesStämme, beispielsweise S. griseus subsp. griseus DSM40236 oder S. hachijoensis DSM40114  Als Indikatorkeime: Escherichia coli K12 DSM9037, Micrococcus luteus DSM20030, Pseudomonas fluorescens DSM50090, Mycobacterium phlei DSM43239 und Bacillus subtilis DSM10.

Nach Erhalt der notwendigen Stämme werden diese (wenn nicht anders von der Bezugsquelle angegeben) in wenig steriler Saline suspendiert und getrennt per DreiStrich-Ausstrich ( M4, S. 365) auf Standard I-Agar ausgestrichen. Die sechs Platten werden bei 30 °C bebrütet. Die bewachsenen Platten können bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank (4 °C) gelagert werden. Mit Hilfe von Suspensionsgel wird durch Rreiben auf den Kolonien des StreptomycesStammes mit der Impföse etwas Zellsuspension gewonnen. Etwas Material hiervon wird in Form einer Bogensehne auf den Randbereich einer Standard I-Agarplatte ausgestrichen ( Abb. 3.65, S. 136). Diese Testplatte wird zur Antibiotika-Bildung für zwei Wochen bei 30 °C bebrütet.

Etwas Koloniematerial der im Kühlschrank gelagerten fünf Indikatorstämme wird jeweils mit Hilfe einer Impföse in ca. 1 ml steriler Saline suspendiert. Ausgehend von diesen Suspensionen werden die Indikatorstämme nebeneinander in Form eines Impfstrichs im rechten Winkel zum Streptomyces-Bewuchs auf die Testplatte gestrichen ( Abb. 3.65, S. 136). Die Testplatte wird erneut bei 30 °C inkubiert. Die bei den Indikatorstämmen aufgetretene unterschiedliche Wuchshemmung wird bewertet. Weiterführende Literatur Demain AL (1999) Pharmaceutically active secondary metabolites of microorganisms. Applied Microbiology and Biotechnology 52:455-463 Nosek J, Radzio R, Kück U (1997) Produktion von β-Lactamantibiotika durch Mikroorganismen – Einsatzmöglichkeiten der Gentechnik bei der biotechnologischen Produktion neuer Antibiotika-Derivate. Chemie in unserer Zeit 27:172-182 Von Döhren H, Gräfe U (1997) General aspects of secondary metabolism. In: Rehm HJ, Reed G, Pühler A, Stadler P (eds) Biotechnology, vol 7, 2nd edn. Wiley-VCH, pp 1-55

Vorbereitungen

140

3 Versuche

Nachgefragt 1. Definieren Sie den Begriff Antibiotikum! 2. Welches war das erste Antibiotikum, das entdeckt wurde? Skizzieren Sie, was Alexander Fleming beobachtet hat! 3. In welche Klassen kann man Antibiotika nach Ihrer chemischen Struktur einteilen? 4. Nennen Sie Wirkorte von Antibiotika in der Zelle bzw. im Stoffwechsel! 5. Welche Organismen produzieren besonders viele Antibiotika? 6. Nennen Sie sechs wichtige Antibiotikaproduzierende Mikroorganismen und die Substanzen, die von ihnen produziert werden! 7. Was versteht man unter einem fungiziden Antibiotikum? 8. Wann ist ein Antibiotikum bakterizid und wann bakteriostatisch? 9. Erläutern Sie, weshalb einige Antibiotika nur auf wachsende Zellen, andere auch auf ruhende Zellen wirken! Nennen Sie Beispiele! 10. In welchen Anwendungsgebieten und Bereichen werden Antibiotika eingesetzt? 11. Welches wichtige Antibiotikum produziert Streptomyces griseus? 12. Beschreiben Sie Wirkort und Wirkungsweise des von Streptomyces griseus produzierten Antibiotikums! 13. Beschreiben Sie die chemische Struktur des von Streptomyces griseus produzierten Antibiotikums!

Versuch 27

14. Beschreiben Sie wichtige Unterschiede der fünf im Versuch eingesetzten Testkeime! 15. Beschreiben Sie, wie Sie im Versuch geprüft haben, ob Streptomyces griseus ein Antibiotikum bildet und gegen welche Testkeime dieses Antibiotikum besonders wirkungsvoll ist. 16. Warum gibt es bei einem Agar-Diffusionstest keine lineare Beziehung zwischen der Menge des vorhandenem Antibiotikums und der Entfernung zwischen Entstehungsort und dem Ort, an dem es seine Wirkung noch entfalten kann. Welche andere Beziehung schlagen Sie vor? 17. Viele Antibiotika hemmen die Proteinbiosynthese der Prokaryonten, weil sie mit Komponenten der 70S Ribosomen interagieren. Warum hat dies i. d. R. keine Auswirkungen auf den Menschen bei der Therapie mit einem entsprechenden Antibiotikum, obwohl bei uns u. a. auch 70S Ribosomen vorkommen? 18. Welche Strategien sind bei Bakterien realisiert, um Resistenzen gegenüber Antibiotika zu entwickeln? Beschreiben Sie die unterschiedlichen Resistenzmechanismen! 19. Informieren Sie sich in Lehrbüchern über bakterielle Resistenzmechanismen gegenüber Tetracyclin und Ampicillin. Welches Antibiotikum kann seine Wirkung in Gegenwart eines resistenten Bakteriums gegenüber einem sensiblen Bakterium in der gleichen Kultur wohl länger entfalten? 20. Warum können sich vorhandene AntibiotikaResistenzen u. U. relativ schnell verbreiten?

Herstellung von Insektentoxinen mit Bacillus thuringiensis Theoretischer Hintergrund

Biologische Insektenbekämpfung

Bakterien können auch zur Bekämpfung von Insekten und damit zur biologischen Schädlingsbekämpfung in der Landwirtschaft eingesetzt werden. Das Gram-positive Bodenbakterium Bacillus thuringiensis wurde 1911 in Thüringen als Pathogen der Mehlmotte entdeckt. Es produziert während der Sporulation einen parasporalen Proteinkristall ( Abb. 3.67), der zusammen mit der Endospore im selben Sporangium im Cytoplasma abgelagert wird. Dieser Abb. 3.67. EM-Aufnahme einer Zelle von Proteinkristall besteht aus einem Protoxin, Bacillus thuringiensis mit Parasporalkristall aus dem im Darm von Insektenlarven ein toxisches Insektenlarvizid entsteht. Als Zielorganismen kommen die Larven von Schmetterlingen, Käfern, Fliegen und Mücken in Frage. Bacillus thuringiensis ist nicht das einzige Bakterium, welches Toxine produziert, die als Schädlingsbekämpfungsmittel eingesetzt werden ( Tabelle 3.41). Einige Stämme von Bacillus sphaericus besitzen ebenfalls einen parasporalen Proteinkristall, der aus zwei Proteinen besteht (41,9 und 51,5 kDa), welche keine Sequenzhomologien zum

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

141

BT-Toxin aufweisen. Das Toxin tötet Larven von Moskitos innerhalb weniger Stunden ab. Auch verschiedene Stämme von Paenibacillus popilliae (früher: Bacillus popilliae) und Paenibacillus lentimorbus (früher: Bacillus lentimorbus) sind insektenpathogen und produzieren Insektenlarvizide. Beide sind obligat insektenpathogen und verursachen beim Japanischen Käfer (Popillia japonica) die milky disease. Die Larven des Japanischen Käfers rufen durch Wurzelfraß bei Gräsern bedeutende wirtschaftliche Schäden hervor. Die Krankheit wurde nach dem milchigen Aussehens der Hämolymphe benannt, die durch die hohe Konzentration von Endosporen (2 bis 5 × 1010 Sporen pro ml) hervorgerufen wird. In Stämmen von P. popilliae wurden parasporale Proteinkristalle nachgewiesen, in P. lentimorbus dagegen nicht. Der Mechanismus, durch den es ausgehend vom Intestinaltrakt zur Sepsis kommt, ist noch nicht klar. Es gibt weitere insektenpathogene Bakterien, wie z. B. Paenibacillus larvae (früher: Bacillus larvae); dieses Bakterium ist bei Honigbienen (Apis mellifera) für die „Amerikanische Faulbrut“ verantwortlich und ruft beträchtliche wirtschaftliche Schäden bei der Herstellung von Honig und Bienenwachs, aber auch in der Landwirtschaft durch als Folge ausbleibender Bestäubung von Kulturpflanzen hervor. Parasporale Proteinkristalle wurden bei P. larvae nicht beobachtet. Das krankheitsverursachende Prinzip ist hier noch unbekannt; wahrscheinlich wird die Abtötung der Bienenlarven durch eine Sepsis von über das Darmepithel eingedrungenen Endosporen verursacht. P. larvae ist sehr wirtsspezifisch für Honigbienen und wird deshalb natürlich nicht eingesetzt. Darüber hinaus gibt es Mikroorganismen, die antibiotisch wirksame und für den Pflanzenschutz geeignete Substanzen produzieren. Lediglich zwei sollen hier erwähnt werden. Einige Stämme von Bacillus subtilis produzieren das cyclische Lipopeptid Iturin A, welches in der Landwirtschaft gegen den Befall von Pflanzen mit den Pilzen Botrytis cinerea und Rhizoctonia solani eingesetzt wird. Rhizobium radiobacter produziert ein Nucleotid (Agrocin 84), welches zum Kettenabbruch bei der DNA Synthese führt und zur Bekämpfung virulenter Stämme von Rhizobium radiobacter eingesetzt werden kann, die Wurzelhalsgallen induzieren. Die Wirkstoffforschung wird sicherlich hier in der Zukunft weitere Substanzen hervorbringen und finden, die sich zur Schädlingsbekämpfung einsetzen lassen. Das in den Zellen als parasporaler Kristall vorliegende BT-Toxin wird auch als δ-Toxin bezeichnet, weil B. thuringiensis noch einige weitere insektenpathogene Toxine produziert, die aber nicht im Kristall vorkommen. Mittlerweile sind eine Vielzahl von δ-Toxinen, die aus parasporalen Proteinkristallen von B. thuringiensis stammen und die sich z. T. beträchtlich in ihrer Wirtsspezifität unterscheiden, bekannt. Die Tabelle 3.41. Bakterium

Insektenpathogene Spezies der Gattungen Bacillus und Paenibacillus Kristalle Empfängliche Organismen

Bacillus sphaericus

ja

Mücken (Larven)

Bacillus thuringiensis

ja

Coleoptera (z. B. Larven des Kartoffelkäfers) Diptera (Larven von Mücken) Lepidoptera (Schmetterlingsraupen)

Paenibacillus larvae

nein

Honigbienen (Larven)

Paenibacillus lentimorbus

nein

Japanischer Käfer (Larven)

Paenibacillus popilliae

ja

Japanischer Käfer (Larven)

D2 - S. 333

BT-Toxin und δ-Toxin

142

3 Versuche

im Literaturverzeichnis angegebene Homepage listet weit mehr als einhundert unterschiedliche δ-Toxine auf, von denen die Sequenz bereits bekannt ist.

Aus zahlreichen Stämmen von Tabelle 3.42. Anteil der GesamtanbauB. thuringiensis wurden die Gene für BT- fläche der jeweiligen Kulturpflanze in den Toxine kloniert und molekulargenetisch USA, die mit transgenen, das B. thuringiensischarakterisiert. Diese Gene und vor allem Toxin exprimierenden Pflanzen, bebaut Gene für modifizierte BT-Toxine wurden wurde (in Prozent) bereits vor einigen Jahren in verschiedene Kulturpflanzen übertragen und haben zu Pflanze transgenen Pflanzen geführt, die gegen Insektenfraß resistent sind. Die Firma Mais 1 6 18 26 19 Monsanto (St. Louis, USA) ist hier sehr erfolgreich gewesen. Besonders große Kartoffel 1 3 ~4 ~4 ~3 Bedeutung hat in den USA die Züchtung transgener Mais-, Kartoffel- und Baum- Baumwolle 12 18 23 32 39 wollsorten erlangt, die das BT-Toxin exprimieren ( Tabelle 3.42). Hierdurch stehen z. B. Mais- und Kartoffelsorten zur Verfügung, die gegen die Raupe des Maiszünslers oder des Kartoffelkäfers resistent sind. 2000

Transgene Pflanzen mit BT-Toxin

1999

B. thuringiensis eignet sich hervorragend zur biotechnologischen Produktion des Toxins, da das Bakterium im großen Maßstab (bis 50 m3) und in preiswerten Medien zu hohen Zelldichten kultiviert werden kann. Das BT-Toxin wurde erstmals 1938 in Frankreich als Insektizid eingesetzt, in den 50er Jahren dann auch in den USA. Mittlerweile hat es am Weltmarkt für Agrarchemikalien (Fungizide, Herbizide und Insektizide) einen Anteil von ca. 1 %. Dabei entfallen zur Zeit ungefähr 90 % des Weltmarktes von biologischen Schädlingsbekämpfungsmitteln auf das BT-Toxin. Hauptanwendungsgebiet ist die Bekämpfung von Stechmücken in Feuchtgebieten. Hierdurch soll die Übertragung von Infektionskrankheiten (z. B. Malaria) vermindert oder auch nur die Stechmückenplage reduziert werden. Auch in Deutschland wird hierzu das BT-Toxin eingesetzt, wie z. B. in bestimmten Regionen am Rhein. Hierzu werden meist Formulierungen von ganzen Zellen von B. thuringiensis eingesetzt, da eine Isolierung und Reinigung des BT-Toxins viel zu aufwendig wäre und auch kaum Vorteile mit sich brächte. Der Einsatz dieser sehr wirtspezifischen Toxine ist sinnvoll und ökologisch wesentlich unbedenklicher als der Einsatz von nicht selektiven Chemikalien, die auch die Populationen vieler anderer Tiere in Mitleidenschaft ziehen. Lediglich das Auftreten von resistenten Zielorganismen könnte den Erfolg dieses biologischen Schädlingsbekämpfungsmittels in Frage stellen und wie bei Antibiotika, die in der Therapie von Infektionskrankheiten eingesetzt werden, die Entwicklung von neuen BT-Toxinen in rascher Folge erforderlich machen.

1998

Anwendungen

1997

Diese BT-Toxine besitzen in der Regel Molekulargewichte zwischen 120 und 140 kDa und werden meist von einem der zahlreichen konjugativen Plasmide codiert, die in B. thuringiensis, vorkommen. Das im Kristall vorliegende BT-Toxin stellt lediglich ein Protoxin dar und ist in Wasser normalerweise unlöslich. Erst im sehr alkalischen Milieu des Darms (pH 10 bis 12) von Insekten löst es sich auf. Dadurch wird es dort auch zugänglich für eine von den Tieren gebildete Protease und erst durch die proteolytische Spaltung entsteht das eigentliche Toxin. Dieses ca. 60 kDa große Protein induziert in den Darmepithelzellen die Bildung von Poren. Dadurch kommt es zunächst zum Auslaufen der Wirtszellen, einem Anstieg des pH Wertes der Hämolymphe und anschließend zur Lyse der Zellen. Schon nach wenigen Stunden ist der Darm der Larven massiv zerstört. Das Toxin enthält getrennte Bereiche, die dessen Toxizität bzw. dessen Wirtsbereich bestimmen.

1996

Wirkungsweise des Toxins

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

143

Versuchsziel Im Versuch soll zunächst Bacillus thuringiensis subsp. israelensis angezogen werden. Nach eingetretener Sporulation wird das Endotoxin geerntet und exemplarisch gegen Larven der Fruchtfliege Drosophila melanogaster eingesetzt. Versuchsdurchführung Nach Erhalt des Bakterienstamms wird dieser (wenn nicht anders von der Bezugsquelle angegeben) in wenig steriler Saline suspendiert und als Drei-Strich-Ausstrich ( M4, S. 365) auf Standard I-Festmedium ausgestrichen. Die Platte wird bei 30 °C inkubiert. Die bewachsene Platte kann bis zum Versuchsbeginn im Kühlschrank (4 °C) aufbewahrt werden. Da das zu testende Toxin auf die Test-Tiere nur wirken kann, wenn diese im Larvenstadium sind, müssen zunächst Fruchtfliegen-Larven erzeugt werden. Dazu werden einige Fruchtfliegen (beider Geschlechter!) ca. eine Woche vor dem eigentlichen Versuch auf Drosophila-Festmedium in einem mit Watte verschlossenen Falcon®-Röhrchen bei Raumtemperatur inkubiert. Alternativ kann man die Fruchtfliegen auch in einem geschlossenen jedoch luftdurchlässigen Gefäß mit einem Stückchen Apfel versorgen. Innerhalb weniger Tage bis zu einer Woche sind in der Regel genügend Larven entstanden. benötigtes Material Geräte  500 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen  Impföse  Autoklav  Brutschrank (30 °C)  Schüttler (30 °C)  Kühlzentrifuge mit Einsätzen zur Zellernte (100 ml, 3.500 × g, 4 °C)  Falcon®-Röhrchen (50 ml), steril

Chemikalien und Medien  Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril  Standard I-Festmedium ( S. 427)  NB-Sporulationsnährlösung ( S. 422)  Drosophila-Festmedium ( S. 414)

Mikroorganismen  Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (z. B. DSM 5724)

Sonstiges  Drosophila melanogaster (Fruchtfliegen; Bezugsquelle: Zoohandlungen bzw. verderbendes Obst)

Ausgehend von dem Zellmaterial einer Einzelkolonie von B. thuringiensis subsp. israelensis werden 100 ml NB-Sporulationsnährlösung in einem 500 ml-Erlenmeyerkolben beimpft. Die Kultur wird unter Schütteln bei 30 °C inkubiert. Von der Kultur wird eine Probe entnommen und ein mikroskopisches Präparat hiervon im Phasenkontrast auf Sporulation und Vorhandensein von Toxinkristallen untersucht. Fällt die Bewertung des mikroskopischen Bildes positiv aus, wird die Kultur auf zwei Zentrifugen-Röhrchen (z. B. Falcon®-Röhrchen) verteilt, und diese werden 15 min bei 3.500 × g und 4 °C zentrifugiert. Das Sediment wird in 0,5 ml Saline aufgenommen. Diese Suspension wird auf 10 ml Drosophila-Festmedium verteilt; ein KontrollRöhrchen erhält 0,5 ml Saline. Nachdem die Flüssigkeit in das Medium eingedrungen ist, werden jeweils zehn Drosophila-Larven vorsichtig mit Hilfe einer Pinzette in beide Falcon®-Röhrchen auf das Medium gesetzt. Die Röhrchen werden mit Watte verschlossen und bei Raumtemperatur aufrecht stehend inkubiert. In beiden Röhrchen wird täglich die Anzahl von lebenden bzw. toten Larven bestimmt.

Vorbereitungen

144

3 Versuche

Weiterführende Literatur Crickmore N, Zeigler DR, Feitelson J, Schnepf E, Van Rie J, Lereclus D, Baum J, Dean DH (1998) Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews 62:807-813. Knowles BH (1994) Mechanism of action of Bacillus thuringiensis insecticidal delta-endotoxins. In: Evans PD (ed) Advances in Insect Physiology, vol 24, pp 275-308 Niepold F, Rudolph K (2001) Biotechnology in plant protection. In: H. J. Rehm, G. Reed, A. Pühler & P. Stadler (eds) Biotechnology. vol 10. 2nd edn. Wiley-VCH, Weinheim, pp 485-506 Stahly DP, Andrews RE, Yousten AA (1999) The Genus Bacillus – Insect Pathogens. In: Dworkin M (ed) The Prokaryotes (elektronische Version: http://link.springer.de/link/service/books/10125, Release 3.0 vom 21.5.1999) Springer, New York Zhang JB, Hodgman TC, Krieger L, Schnetter W, Schairer HU (1997) Cloning and analysis of the first cry gene from Bacillus popilliae. Journal of Bacteriology 179:4336-4341 Internet

Crickmore N, Zeigler DR, Schnepf E, Van Rie J, Lereclus D, Baum J, Bravo A, Dean DH (2002) Bacillus thuringiensis toxin nomenclature. http://www.biols.susx.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.html Van Frankenhuyzen K, Nystrom C (2002) The Bacillus thuringiensis toxin specificity database. http://www.glfc.cfs.nrcan.gc.ca/bacillus

Nachgefragt 1. Welche Mikroorganismen eignen sich zur biologischen Schädlingsbekämpfung? 2. Welche Vorteile bietet die biologische Schädlingsbekämpfung mit dem BT-Toxin im Vergleich zur Verwendung von synthetischen Chemikalien? 3. Um was handelt es sich bei dem parasporalen Kristall, der im Cytoplasma von Bacillus thuringiensis bei der Sporulation auftritt? 4. Auf welche Organismen wirkt die im parasporalen Kristall enthaltene Substanz? 5. Wie wirkt diese Substanz? 6. Was versteht man unter Protoxinen, und wie entsteht aus dem von Bacillus thuringiensis gebildeten Protoxin das eigentlich wirksame Toxin? 7. Erläutern Sie, wie Bacillus thuringiensis zur Schädlingsbekämpfung eingesetzt wird! 8. Konsultieren Sie Lehrbücher der Zoologie und Medizinischen Mikrobiologie, und erstellen Sie eine Liste von Krankheitsüberträgern, die mit dem BT-Toxin bekämpft werden können. 9. Warum ist es nicht erforderlich, die Kristalle aus den Zellen zu isolieren und in reiner Form einzusetzen und statt dessen möglich, ganze Zellen von Bacillus thuringiensis zu verwenden?

10. Warum ist das BT-Toxin für Menschen ungefährlich? Wo könnte bei einigen Menschen ein Problem auftreten, wenn sie Produkte verzehren, die dieses Toxin enthalten? 11. Welche Veränderungen bei den Zielorganismen könnten beim Einsatz des BT-Toxins zu Problemen führen? 12. Beschreiben Sie, wie und gegen welche Insekten Paenibacillus popilliae toxisch ist! 13. Wo tritt die milky disease auf, und welcher Befund gab dieser Krankheit den Namen? 14. Welches Toxin produzieren Stämme von Bacillus subtilis, und zur Bekämpfung welcher Erkrankungen wird es eingesetzt? 15. Welche Krankheit ruft Paenibacillus larvae hervor? 16. Warum eignet sich Paenibacillus larvae nicht zur biologischen Schädlingsbekämpfung? 17. Welches Toxin produziert Rhizobium radiobacter und zum Schutz vor welchen Erkrankungen wird es eingesetzt? 18. Von welchem Teil des Genoms wird das BT-Toxin codiert? 19. Weshalb hat man das BT-Toxin aus Bacillus thuringiensis in Pflanzen exprimiert? 20. Was versteht man unter BT-Mais?

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

Herstellung von Xanthan mit Xanthomonas campestris

145

Versuch 28

Theoretischer Hintergrund Polysaccharide stellen eine sehr wichtige und umfangreiche Gruppe natürlicher Polymere dar, bei denen unterschiedlichste Zucker und Zuckerderivate über verschiedene glycosidische Bindungen miteinander verknüpft sind. Polysaccharide haben für die sie synthetisierenden Organismen wichtige Funktionen: als Speicherstoffe sind sie wichtig für den Stoffwechsel der Organismen, und als Bestandteile von Zellwänden und Kapseln sind sie für die Struktur der Zelle und Organismen von großer Bedeutung. Darüber hinaus können Polysaccharide bei der Anheftung von Organismen an Oberflächen beteiligt sein und die Erkennung von Zellen vermitteln, um nur einige weitere Funktionen zu nennen. Polysaccharide haben viele wichtige Anwendungen in zahlreichen Gebieten gefunden. Tabelle 3.43 gibt einen kleinen Einblick in die Vielfalt allein der technisch bedeutsamen Polysaccharide aus den verschiedenen Gruppen von Organismen. Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, dass auch Mikroorganismen Polysaccharide synthetisieren, die für technische Anwendungen genutzt werden. Anwendungen in der Lebensmitteltechnik sowie in der Kosmetik, Pharmazie und Medizin sind hier besonders hervorzuheben. Zu den wichtigsten mikrobiellen Polymeren, die technisch genutzt werden, gehören besonders Cellulose, Curdlan, Dextran, Hyaluronsäure und Xanthan. Das zuletzt genannte Polysaccharid wird Gegenstand dieses Versuches sein. Tabelle 3.43.

Technisch bedeutende Polysaccharide und Beispiele für deren Herkunft

Pflanzen

nahezu alle Cyamopsis tetragonolobus Acacia arabica Helianthus tuberosus alle höheren Pflanzen Solanum tuberosum

Cellulose Guar-Mehl, Guar Gum Gummi arabicum Inulin Pectin Stärke

Mensch / Tier

Krabben Nabelschnur

Chitin/Chitosan Hyaluronsäure

Marine Algen

Braunalgen Rotalgen Laminaria sp. Schizophyllum commune

Alginat Carrageenan Laminaran Schizophyllan

Pilze

Aspergillus niger Aureobasidium pullulans Sclerotium glucanicum

Chitin/Chitosan Pullullan Scleroglucan

Bakterien

Azotobacter vinelandii Gluconacetobacter xylinus Alcaligenes faecalis Leuconostoc mesenteroides Sphingomonas sp. Streptococcus zooepidemicus Zymomonas mobilis Xanthomonas campestris

Alginat Cellulose Curdlan Dextran Gellan Hyaluronsäure Lävan Xanthan

Bedeutung von Polysacchariden

V29 - S. 150 V30 - S. 153 V31 - S. 157

146

3 Versuche

CH2OH

CH2OH

O

O

M+ = Na+, K+, Ca2+

Hauptkette: β-1,4-Glucan

OH

O

O OH

OH

n

O H2C OC CH3

O

O OH

M

+ -

-

O CH2

OOC

COO M O

C

OH HO

H3C

D-Mannose-Acetylester

HO

D-Mannose-Pyruvat-Ketal

+

O

O

O

OH

D-Glucuronsäure

O OH Abb. 3.68.

Struktur von Xanthan

Chemische Struktur

Xanthan ist zurzeit in der Anwendung das bedeutendste mikrobielle Polysaccharid. Es wird biotechnologisch mit dem phytopathogenen Gram-negativen Bakterium Xanthomonas campestris produziert. Die chemische Struktur von Xanthan ist sehr komplex: Das Rückgrat von Xanthan besteht aus Cellulose, also aus β-1,4-glycosidisch verknüpfter Glucose. Jede zweite Glucoseeinheit ist dann kovalent mit einem aus D-Mannose, D-Glucuronsäure und D-Mannose bestehendem Trisaccharid verknüpft, wobei die beiden Mannosereste wiederum mit Acetat bzw. Pyruvat verknüpft sind ( Abb. 3.68).

Eigenschaften und Anwendungen

Xanthan ist ein saures, anionisches und gut wasserlösliches Heteropolysaccharid ( Tabelle 3.44). Es wird in der Praxis immer nur als Zusatzstoff eingesetzt und findet Verwendung als Emulgator, Stabilisator, Verdickungs- und Geliermittel ( Tabelle 3.45). Ca. 65 % des produzierten Xanthan findet als Zusatz bei Nahrungsund Körperpflegemitteln Verwendung. Ca. 15 % werden in der Erdölförderung eingesetzt und ca. 20 % für andere technische Anwendungen. Die sehr hohe Viskosität, die Xanthan in wässrigen Lösungen bereits bei sehr niedrigen Konzentrationen verursacht, verleiht Produkten, denen es zugesetzt wird, eine ganz andere Konsistenz. Zudem bewirkt diese Viskositätszunahme indirekt eine Stabilisierung von dispersen Systemen und hier besonders von Emulsionen und verhindert somit eine Entmischung der Phasen. Hierauf sowie auf seiner Pseudoplastizität und einiger weiterer vorteilhafter Eigenschaften beruhen letztlich alle Anwendungen von Xanthan. In der Liste der Inhaltsstoffe von entsprechenden Produkten wird es häufig als Xanthan Gum aufgeführt. Als Lebensmittelzusatzstoff wird es seit 1980 unter der Nummer E415 ausgewiesen.

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen Tabelle 3.44. • • • • • • • • •

Eigenschaften von Xanthan

weißes Pulver sehr gut wasserlöslich hoch viskose wässrige Lösungen stabil bei hohen Salzkonzentrationen, extremen pH Werten, hohen Temperaturen und beim Einfrieren geschmacksneutral vermittelt Vollmundigkeit pseudoplastisch MW: 4 bis 12 × 106 g/mol biologisch abbaubar

Tabelle 3.45. Anwendungen von Xanthan (als Zusatzstoff ) Nahrungsmittel • Salatdressings • Sirup und Schokoladensaucen • Desserts • Getränke • Schlagsahne • Mehlteige und Backmischungen • kalorienreduzierte Nahrungsmittel Kosmetika • Zahnpasta • Salben Andere technische Anwendungen • Erdölförderung • Reinigungsmittel • Farben und Druckertinten • Klebstoffe

Xanthan kommt als Exopolysaccharid bei Xanthomonas campestris vor. Wahrscheinlich hat es eine mehrfache Schutzfunktion für die produzierende Zelle: sein starkes Wasserbindevermögen trägt zum Schutz vor Austrocknung bei; außerdem wird ein Schutz vor der Wirkung von Licht diskutiert, und als physikalische Barriere erschwert es eine Infektion der Zellen durch Bakteriophagen. Höchstwahrscheinlich stellt es auch einen Pathogenitätsfaktor bei Erkrankungen dar, die X. campestris bei einigen Pflanzenarten hervorrufen kann. Interessanterweise sind die produzierenden Zellen selbst nicht in der Lage, Xanthan wieder abzubauen; es kann sich also nicht um einen Speicherstoff handeln.

Natürliche Funktion

Xanthan wird ausschließlich biotechnologisch durch Fermentation von X. campestris ausgehend von Glucose produziert. Eine Herausforderung stellt dabei die Überwindung der Schwierigkeiten beim Rühren und bei der Sauerstoffversorgung dar, welche durch die vom Polymer selbst hervorgerufene starke Viskosität des Mediums bedingt sind. Diese Viskosität erschwert auch die Abtrennung des Xanthans von der restlichen Biomasse. Xanthan wird dabei meist durch Ausfällen mit Isopropanol isoliert. Zur Abtrennung der Zellen sind dann zusätzliche, meist aufwendige Schritte erforderlich. Pro Jahr werden auf diese Weise ca. 30.000 t Xanthan produziert. Beim einem Preis von ca. 10 bis 14 €/kg bedeutet dies immerhin einen Produktionswert von ca. 500 Millionen €.

Biotechnologische Produktion

Versuchsziel Das Polysaccharid Xanthan soll durch Fermentation mit einer Kultur von Xanthomonas campestris hergestellt und anschließend isoliert werden. Mit einem einfachen Versuch soll dann die Viskosität von Xanthan-haltigen Lösungen sowie die Eignung von Xanthan als Stabilisator von Dispersionen und Emulsionen demonstriert werden. Abb. 3.69. Demonstration der stabilisierenden Wirkung von Xanthan (rechts) gegenüber reinem Wasser (links)

147

148

3 Versuche

Versuchsdurchführung Vorbereitungen

Nach Erhalt des Stamms wird dieser (wenn nicht anders von der Bezugsquelle angegeben) in wenig steriler Saline suspendiert und per Drei-Strich-Ausstrich (M4, S. 365) auf Pepton-FE-Agar ausgestrichen. Die Platte wird bei 30 °C bebrütet. Die bewachsene Platte kann bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank (4 °C) gelagert werden. Den Dialyseschlauch zunächst in 2 % (wt/vol) NaHCO3 aufkochen, dann in 1 mM EDTA aufkochen, abschließend in H2Odem. waschen. Der Dialyseschlauch kann in H2Odem. autoklaviert und bei 4 °C im Kühlschrank aufbewahrt werden. Vorkultur: Mit dem Zellmaterial einer Einzelkolonie von Xanthomonas campestris werden 20 ml Pepton-FE-Nährlösung in einem 100 ml Erlenmeyerkolben beimpft und 15 Stunden (über Nacht) bei 30 °C geschüttelt. Hauptkultur: Mit der gesamten Vorkultur werden 200 ml Xanthan-Produktionsmedium in einem 1000 ml-Erlenmeyerkolben beimpft und bei 30 °C unter Schütteln inkubiert. Isolierung des Polymers: Durch eine 15 min Zentrifugation bei 3.500 × g werden die Zellen abgetrennt. Der Xanthan-haltige Überstand wird zur Bestimmung des Volumens in einen Messzylinder überführt. Pro ml Überstand werden 10 mg KCl und 4 ml 95 % (vol/vol) Ethanol zugesetzt. Die Lösung wird durchmischt und ruhig stehend über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. In dieser Zeit fällt das Xanthan als Präzipitat aus. Das durch Dekantieren der flüssigen Phase gewonnene Präzipitat wird in möglichst wenig H2Odem. gelöst und in einen Dialyseschlauch überführt. Die Lösung wird für 15 bis 18 Stunden gegen ca. 2,5 l H2Odem. dialysiert.

benötigtes Material Geräte        

100 ml-Erlenmeyerkolben Zwei 500 ml-Schraubdeckelflaschen Schüttler (30 °C) Impföse Brutschrank (30 °C) 500 ml Messzylinder 1 und 5 l-Bechergläser Zentrifuge mit Rotor und Bechern zur Zentrifugation von ca. 1 l Volumen bei 3.500 × g  vorbereitete Dialyseschläuche  Gefrierschrank (-20 bis -30 °C)  Gefriertrocknungsanlage

Chemikalien und Medien     

Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril Pepton-FE-Agar Pepton-FE-Nährlösung KCl 95 % (vol/vol) Ethanol

Mikroorganismen  Xanthomonas campestris (z. B. DSM 3586)

Sonstiges  Aluminiumfolie  Schere

Das Wasser für die Dialyse wird gegen frisches H2Odem. ausgetauscht, und die Dialyse wird weitere 3 bis 4 Stunden fortgeführt. (Nach dem ersten Dialyseschritt ist der Dialyseschlauch prall gefüllt und steht unter Druck; bitte daher vorsichtig beim Wasserwechsel agieren, um ein Platzen zu vermeiden.) Der Inhalt wird danach in ein Becherglas (o. ä.) überführt und bei -20 °C bis -30 °C eingefroren. Um zur Festsubstanz zu kommen, wird das gefrorene Präparat abschließend gefriergetrocknet. Die Masse des getrockneten Polymers wird zur Bestimmung der Ausbeute (g/l Kultur) bestimmt.

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

Von dem isolierten pulverförmigen Xanthan werden 2 g vollständig in 400 ml Wasser in einer 500 ml Schraubdeckelflasche gelöst. Anschließend werden in diese Flasche ca. 50 kleine quadratische Plättchen (Kantenlänge ca. 1 cm) gegeben, die zuvor aus handelsüblicher Aluminiumfolie geschnitten wurden. Die Flasche wird fest verschlossen. In eine zweite Flasche werden ebenfalls 50 Aluminiumplättchen und 400 ml reines Wasser (ohne Xanthan) gegeben. Beobachten und protokollieren Sie das unterschiedliche Verhalten der Aluminiumplättchen in beiden Flaschen, nachdem kräftig geschüttelt wurde und die Flaschen danach ruhig stehen gelassen werden ( Abb. 3.69).

149 Demonstration der Eignung von Xanthan als Stabilisator

Weiterführende Literatur Becker A, Katzen F, Pühler A, Ielpi L (1998) Xanthan gum biosynthesis and application: a biochemical/genetic perspective. Applied Microbiology and Biotechnology 50:145-152 Born K, Langendorff V, Boulenguer P (2002) Xanthan. In: Vandamme EJ, De Baets S, Steinbüchel A (eds) Biopolymers, vol 5, Polysaccharides I. Wiley-VCH, Weinheim, pp 259-297 Divjak H (1991) Xanthan – der multifunktionelle Stabilisator. Eigenschaften und Einsatzmöglichkeiten in Salatdressings. Ernährung/Nutrition 15:587-589 Klepp R (1989) Xanthan – Die moderne Lösung für Stabilitätsprobleme. Eigenschaften und Einsatzmöglichkeiten in der Lebensmittelindustrie. Ernährung/Nutrition 13:746-751 Auf der Homepage von Xanthan-Herstellern finden sich detailierte Beschreibungen der Eigenschaften von Xanthan und seinen Anwendungen (zwei wichtige Produzenten in Europa sind z. B.: Fa. Degussa Texturant Systems France SAS http://www.texturant-systems.com und Fa. Jungbunzlauer http://www.jungbunzlauer.com).

Nachgefragt 1. Aus welchen Bausteinen besteht Xanthan? Skizzieren Sie die chemische Zusammensetzung von Xanthan! 2. Zeichnen Sie die chemische Struktur des Rückgrats von Xanthan! 3. Mit welchem Mikroorganismus wird Xanthan biotechnologisch produziert? 4. Wo kommt Xanthan bei dem Produzenten vor? 5. Welche natürlichen Funktionen übt Xanthan für die Zellen aus? 6. Warum hat Xanthan für die Zellen nicht die Funktion eines Speicherstoffs (z. B. für Kohlenstoff und Energie)? 7. Nennen Sie andere bedeutende Polysaccharide, die aus biologischem Material isoliert oder biotechnologisch produziert werden können! Ordnen Sie den jeweiligen Polysacchariden Organismen zu, die diese bilden können! 8. Nennen Sie Polysaccharide, die sowohl in Eukaryonten als auch Prokaryonten vorkommen! 9. Welche Eigenschaften besitzt Xanthan? 10. Was bedeutet Pseudoplastizität? 11. Auf welcher Eigenschaft beruhen letztlich die meisten Anwendungen von Xanthan?

12. Welche Probleme bringt diese Eigenschaft bei der fermentativen Produktion mit sich? 13. Warum fällt Xanthan nach Zugabe von Ethanol als Präzipitat aus? 14. Warum eignet sich die Dialyse zum Reinigen von Xanthan? 15. Warum steht der Dialyseschlauch nach erfolgter Dialyse unter Druck? 16. Nennen Sie möglichst viele Anwendungen von Xanthan und gruppieren Sie diese nach Einsatzgebieten! 17. In welchen Produkten des Alltags finden Sie Xanthan? 18. Konsultieren Sie das Internet und bringen Sie in Erfahrung, wie man sich den Einsatz von Xanthan bei der Erdölförderung vorzustellen hat! 19. Konsultieren Sie das Internet und bringen Sie in Erfahrung, welche Unternehmen Xanthan produzieren! Welche biotechnologischen Produkte stellen diese Unternehmen außerdem noch her? 20. Mit welchen anderen Bezeichnungen wird auf die Anwesenheit von Xanthan in Produkten häufig hingewiesen?

Internet

150

3 Versuche

Versuch 29

Herstellung von Dextran mit Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum Theoretischer Hintergrund

Vorkommen und Funktion V11 - S. 74

V10 - S. 70

Bereits 1861 erhielt der französische Mikrobiologe Louis Pasteur erste Hinweise auf die mikrobielle Bildung dieses Polysaccharids, und 1878 identifizierte PhilippeÉdouard-Léon van Tieghem das dextranbildende Bakterium Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum, welches zu den heterofermentativen Milchsäurebakterien gehört. Dextran besteht aus α-1,6-glycosidisch verknüpften Glucoseresten ( Abb. 3.26, S. 75). Relativ selten sind in gleicher Weise verknüpfte Glucose-Oligomere unterschiedlichen Polymerisationsgrads als Verzweigungen an die Hauptkette gebunden. Häufig erfolgt die Anbindung α-1,3-glycosidisch; es sind aber auch andere Verknüpfungen der Seitenketten bekannt. Länge und Art der Anknüpfung der Seitenketten sind stammspezifisch und haben einen großen Einfluss auf die Eigenschaften des Polysaccharids. Dextran ist ein Exopolysaccharid. Es vermittelt vermutlich Schutz gegenüber Austrocknung und ermöglicht die Anheftung der Zellen an Oberflächen. Dextran kann von L. mesenteroides selbst nicht wieder abgebaut werden; es ist deshalb kein Speicherstoff. Daneben wird Dextran nur noch von sehr wenigen anderen Bakterien gebildet.

Biosynthese

Dextran wird außerhalb der Zellen durch eine ausgeschiedene Hexosyltransferase, die Dextransaccharase ( Abb. 3.25, S. 75), synthetisiert. Dieses Enzym verwendet Saccharose als Substrat und überträgt den Glucoserest auf die wachsende Polysaccharidkette. Auf diese Weise entstehen Dextranmoleküle, die Molekulargewichte von mehreren Millionen Da aufweisen können. Die Verzweigungen werden ebenfalls durch das Enzym eingeführt. Die Dextransaccharase ist lediglich von Ca2+-Ionen abhängig und benötigt keine weiteren Cofaktoren; unter leicht sauren Bedingungen (pH 5 - 6) katalysiert das Enzym die Reaktion mit optimaler Rate. Die von der Saccharose abgetrennten Fructosereste werden für die Biosynthese von Dextran nicht benötigt; sie werden in die Zelle aufgenommen und zu Milchsäure vergoren. Deshalb synthetisiert L. mesenteroides Dextran auch nur dann, wenn das Medium Saccharose als Kohlenstoffquelle enthält; mit Glucose als alleiniger Kohlenstoffquelle kann kein Dextran gebildet werden!

Eigenschaften und Anwendungen

Dextran ist ein weißes, geschmackloses Pul- Tabelle 3.46. Anwendungen von Dextran ver und gut in Wasser löslich. Wässrige • Blutplasma-Ersatzmittel Lösungen von Dextran sind hochviskos. • Trennmedien für die Biochemie Bereits kurz nach dem 2. Weltkrieg wurden • Erdölbohrungen erste medizinische Anwendungen für • Filme für die Photographie Dextran entdeckt. Danach wurden weitere • Kosmetika wichtige Anwendungsgebiete erschlossen • Nahrungsmittelzusatzstoff ( Tabelle 3.46). Die bekanntesten Anwendungen sind sicherlich der Einsatz von Dextranen als Blutplasma-Ersatzmittel und als Adsorbenzien für chromatographische Trennverfahren von Proteinen in der Biochemie. Bekannt ist das Produkt Sephadex® ( Abb. 3.70), welches von dem schwedischen Unternehmen Pharmacia bereits ab 1960 entwickelt wurde. Hierbei handelt es sich um ein Dextran, das durch chemische Reaktionen quervernetzt wurde und in Form wasserunlöslicher Mikropartikel mit unterschiedlicher Porengröße zur Gelfiltration von Proteinen eingesetzt wird. An diese Dextrane können auch positiv oder negativ geladene Verbindungen oder andere funktionelle Gruppen als Liganden kovalent geknüpft werden. Dadurch werden Anionen- bzw. Kationenaustauscher oder

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

151

Medien für die Affinitätschromatographie hergestellt, die ebenfalls sehr häufig zur Proteinreinigung eingesetzt werden.

Abb. 3.70.

Sephadex®

benötigtes Material Geräte       

100 ml-Erlenmeyerkolben Schüttler (30 °C) Impföse Brutschrank (30 °C) 500 ml Messzylinder 1 bis 2 l-Becherglas Zentrifuge mit Rotor und Bechern zur Zentrifugation von ca. 1 l Volumen bei 3.500 × g  vorbereitete Dialyseschläuche ( V28, S. 145)  Gefrierschrank (-20 bis -30 °C)  Gefriertrocknungsanlage

Chemikalien und Medien  Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril  Saccharose-NaCl-Nährlösung ( S. 425)  Saccharose-Festmedium ( S. 425)  Glucose-Carbonat-Festmedium ( S. 415)  96 % (vol/vol) Ethanol

Dextran wird schon seit mehr als 50 Jahren durch Fermentation von L. mesenteroides in Saccharose-haltigen Nährmedien produziert. Dabei wird die theoretisch erreichbare Ausbeute bezogen auf Saccharose nahezu erreicht. Da das Molekulargewicht des entstehenden Dextrans viel höher ist, als für die Anwendungen erforderlich, wird Dextran durch Behandlung mit Säure zunächst partiell hydrolysiert. Anschließend wird das Polysaccharid mit organischen Lösungsmitteln gefällt; hierzu können Aceton, Ethanol oder Methanol eingesetzt werden. Zur Zeit ist Dextran neben Xanthan das bedeutendste technisch genutzte Biopolymer aus Mikroorganismen. Firmen wie Dextran Products Ltd. (Toronto), Pfeiffer und Langen (Deutschland), Pharmachem Corp. (USA) und Pharmacia (Schweden) produzieren pro Jahr weltweit ca. 2.000 t Dextran. Zusätzlich werden noch einige hundert Tonnen chemisch modifizierte Dextrane hergestellt. Der Großhandelspreis liegt bei ungefähr 7 €/kg. Mittlerweile wurde auch damit begonnen, enzymatische Produktionsverfahren mit gereinigter Dextransaccharase einzusetzen. Versuchsziel In diesem Versuch soll auf festen Nährböden demonstriert werden, dass Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum Dextran nur ausgehend von Saccharose und nicht ausgehend von Glucose synthetisiert. Außerdem soll Dextran durch Kultivierung des heterofermentativen Milchsäurebakteriums L. mesenteroides subsp. dextranicum in einer Saccharose-haltigen Nährlösung produziert und anschließend isoliert werden.

Versuchsdurchführung Nach Erhalt des Stamms wird dieser (wenn  Leuconostoc mesenteroides subsp. nicht anders von der Bezugsquelle angedextranicum (z. B. DSM 20484) geben) in wenig steriler Saline suspendiert und per Drei-Strich-Ausstrich (M4, S. 365) auf Glucose-Carbonat-Agar ausgestrichen. Die Platte wird bei 30 °C bebrütet und anschließend im Kühlschrank (4 °C) gelagert.

Biotechnologische Produktion

V28 - S. 145

V11 - S. 74

Mikroorganismen

Zur Demonstration der Dextranbildung ist darüber hinaus ein Ausstrich auf Saccharose-Festmedium zu empfehlen. Nach ein bis zwei Tagen Inkubation ist die Menge des

Vorbereitungen

152

3 Versuche

Exopolysaccharids so groß, dass es in dicken schleimigen Fäden von der Agaroberfläche in den Deckel der Petrischale tropft ( Abb. 3.22, S. 74). Der Vergleich von Kulturen auf Saccharose-Festmedium und Glucose-Carbonat-Agar macht zudem deutlich, dass Dextran ausgehend von Saccharose, aber nicht ausgehend von Glucose produziert werden kann, obwohl es sich um ein Glucan handelt, da das polymerisierende Enzym (Dextran-Saccharase) nur Saccharose aber nicht Glucose als Substrat verwendet. Vorkultur: Mit dem Zellmaterial einer Einzelkolonie von einer Glucose-CarbonatPlatte werden 20 ml Saccharose-Nährlösung in einem 250 ml Erlenmeyerkolben beimpft und ruhig stehend über Nacht bei 30 °C inkubiert. Hauptkultur: Mit der gesamten Vorkultur werden 500 ml Saccharose-Nährlösung in einem 1000 ml-Erlenmeyerkolben beimpft und bei 30 °C bei einer niedrigen Schüttelfrequenz (ca. 25 min-1) inkubiert. Isolierung des Polymers: Diese erfolgt auf gleiche Weise wie die Isolierung von Xanthan (V28, S. 145), allerdings kann beim ersten Schritt, der Ausfällung mit Ethanol, auf den Zusatz von KCl verzichtet werden. Weiterführende Literatur De Belder AN (1990) Dextran. Umfangreiche Broschüre der Fa. Pharmacia LEO Therapeutics, Uppsala, Schweden Leathers TD (2002) Dextran. In: Vandamme EJ, De Baets S, Steinbüchel A (eds) Biopolymers – Polysaccharides I. vol 5. Wiley-VCH, Weinheim, pp 299-321

Nachgefragt 1. Nennen Sie wichtige Eigenschaften von Dextran! 2. Beschreiben Sie die Grundstruktur von Dextran und zeichnen Sie die chemische Strukturformel! 3. Wo gibt es bei Dextranen Variationsmöglichkeiten bezüglich der chemischen Struktur? 4. Welches Bakterium synthetisiert Dextran und wird zur biotechnologischen Produktion von Dextran verwendet? 5. Welche alternativen biotechnologischen Produktionsverfahren gibt es zur Fermentation von Leuconostoc mesenteroides? 6. Wo kommt Dextran bei Leuconostoc mesenteroides vor? 7. Nennen Sie weitere wichtige Polysaccharide, die von Mikroorganismen synthetisiert werden! 8. Nennen Sie mögliche physiologische Funktionen von Dextran! 9. Nennen Sie das Enzym, welches Dextran synthetisiert und schreiben Sie die Umsatzgleichung des Enzyms nieder! 10. Warum erfolgt die Synthese von Dextran nur ausgehend von Saccharose? Wie hoch ist die maximal mögliche theoretische Produktausbeute in Gewichtsprozent bezogen auf Saccharose? 11. Ist die Synthese von Dextran außer von Saccharose noch von anderen Verbindungen oder Cofaktoren abhängig? Nennen Sie diese! 12. Zu welchen Verbindungen vergärt Leuconostoc mesenteroides Fructose? 13. Nennen und beschreiben Sie wichtige Anwendungen von Dextranen!

14. Sie kultivieren Leuconostoc mesenteroides in einem Medium, welches 100 g Saccharose pro l enthält, unter anaeroben Bedingungen. Berechnen Sie, in welchen Konzentrationen welche Produkte entstehen! 15. Sie kultivieren Leuconostoc mesenteroides unter anaeroben Bedingungen in einem Medium, welches 100 g Glucose pro l enthält. Berechnen Sie, in welchen Konzentrationen welche Produkte entstehen! 16. Nennen Sie typische Eigenschaften von Milchsäurebakterien! Was ist bei der Kultivierung von Milchsäurebakterien zu beachten? 17. Wie unterscheiden sich die Vorgehensweisen bei der Isolierung von Dextran und Xanthan (V28 S. 145)? 18. Warum wird die Vorkultur als Standkultur inkubiert und warum ist eine niedrige Schüttelfrequenz bei der Inkubation der Hauptkultur ausreichend (vergleichen Sie hierzu die Kulturbedingungen zur Xanthan-Herstellung in V28 S. 145)? 19. Warum werden zur Herstellung von biochemischen Trennmedien eingesetzte Dextrane zuvor chemisch quervernetzt? 20. Suchen Sie im Internet die Homepage bekannter Hersteller von biochemischen Trennmedien, die auf Dextran basieren, und erstellen Sie eine Liste von Liganden, die kovalent mit Dextran verknüpft werden. Zeichnen Sie die Strukturformeln dieser Liganden und nennen Sie die Einsatzgebiete dieser so modifizierten Dextrane!

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

Herstellung mikrobieller Cellulose mit Essigsäurebakterien

153

Versuch 30

Theoretischer Hintergrund HO CH2

HOCH2

O

O OH

O OH

Abb. 3.71.

OH

O OH

Struktur von Cellulose

Tabelle 3.47. Funktion und Vorkommen von Cellulose bei Bakterien Bildung von Zellaggregaten Gluconacetobacter xylinus Sarcina ventriculi Zoogloea ramigera Erleichterung des Anheftens an Oberflächen (z. B. bei Pflanzen) Rhizobium radiobacter Rhizobium sp.

Abb. 3.72. Cellulose

Kahmhaut aus bakterieller

Abb. 3.73. Unterschiedliches Wachstum von Gluconacetobacter xylinus in ruhender und in geschüttelter Kultur

n

Cellulose ( Abb. 3.71) ist neben Lignin das mengenmäßig bedeutendste in der Natur vorkommende Biopolymer. Dieses Glucan, bei dem die Glucosereste β-1,4-glycosidisch miteinander verknüpft sind, wird allein in terrestrischen Ökosystemen in einer Größenordnung von ca. 30 Milliarden Tonnen jährlich von Pflanzen produziert. Mikroorganismen und insbesondere Bakterien tragen hierzu kaum bei, und es ist nur von wenigen Bakterien bekannt, dass sie Cellulose synthetisieren können. Die wenigen Bakterien, die überhaupt zur Synthese von Cellulose befähigt sind, produzieren darüber hinaus nur recht geringe Mengen dieses Polysaccharids als Exopolymer. In Tabelle 3.47 sind einige Bakterien aufgeführt, bei denen die Bildung von Cellulose nachgewiesen wurde. Darüber hinaus gibt es noch einige weitere Vertreter, und die Analyse der Sequenzdaten von bakteriellen Genomen ergab Hinweise auf das Vorkommen von Genen für Cellulose-Biosynthese auch noch in einigen weiteren Bakterien.

Vorkommen von Cellulose bei Bakterien

Cellulose scheint bei Bakterien wesentlich an der Ausbildung von Zellaggregaten beteiligt zu sein. So wird der in der Kahmhaut von Essigsäurebakterien vorliegende feste Zellverband der Zellen durch Cellulose zusammengehalten ( Abb. 3.72). In stehenden, nicht geschüttelten Kulturen von Gluconacetobacter xylinus (früherer: Acetobacter xylinum) wachsen diese strikt aeroben Bakterien deshalb in einem Häutchen direkt an der Grenzschicht zwischen Medium und umgebender Luft. Auf diese Weise wird eine bestmögliche Versorgung mit Sauerstoff gewährleistet. Werden entsprechende Kulturen im gleichen Medium geschüttelt, kommt es zur Ausbildung kleiner „Kügelchen“ von einigen Millimetern Durchmesser, in denen die Zellen durch Cellulose zusammengehalten werden ( Abb. 3.73). Auch die Ausbildung der Zellpakkete bei Sarcina ventriculi und der Zellflocken von Zoogloea ramigera wäre ohne Beteiligung von Cellulose wahrscheinlich nicht möglich. Bei einigen anderen Bak-

Funktion von Cellulose bei Bakterien

V43 - S. 216

154

3 Versuche

terien ermöglicht Cellulose die Anheftung an Oberflächen. So scheint die bei Rhizobium radiobacter (früher: Agrobacterium tumefaciens) durch Cellulose vermittelte Anheftung an Pflanzen wichtige Voraussetzung für die anschließend erfolgende Infektion zu sein. Bei Knöllchenbildung induzierenden Vertretern dieser Gattung ist Cellulose wahrscheinlich an der Ausbildung eines ersten festen Kontakts mit den Wurzelhärchen mitbeteiligt. Biosynthese

Die Biosynthese von Cellulose verläuft in Bakterien ähnlich wie in Pflanzen und wurde bei G. xylinus am detailliertesten untersucht. Die Synthese nimmt hier ihren Ausgang von Glucose-6-Phosphat, welches durch eine Phosphoglucomutase in Glucose1-Phosphat umgewandelt wird. Der Glucoserest wird dann durch das Enzym Glucose1-phosphat-Uridylyltransferase durch Reaktion mit Uridintriphosphat (UTP) auf Uridindiphosphat (UDP) übertragen, wodurch UDP-Glucose und Pyrophosphat entstehen. Durch das Enzym Pyrophosphatase wird Pyrophosphat anschließend in zwei Moleküle Phosphat gespalten und damit das Gleichgewicht der Reaktion auf die Produktseite verschoben. UDP-Glucose ist das Substrat der Cellulose-Synthase, und unter Abspaltung von UDP wird der Glucoserest nun kovalent mit dem wachsenden Cellulosemolekül verknüpft. Der Cellulose-Synthase-Komplex ist in der Cytoplasmamembran lokalisiert. G. xylinus besitzt in der äußeren Membran zahlreiche in einer Reihe angeordnete so genannte Extrusionsporen, durch welche die Cellulosemoleküle die Zelle verlassen können. Die Cellulosemoleküle aus mehreren Extrusionsporen vereinigen sich dabei zu Mikrofibrillen und später auch noch zu höher geordneten Strukturen. Gerade diese durch die Extrusion entstehenden Strukturen scheinen für die besonderen Eigenschaften bakterieller Cellulose verantwortlich zu sein.

Biotechnologische Produktion

Angesichts der riesigen Mengen von Cellulose, die von Pflanzen produziert werden, muss natürlich kritisch hinterfragt werden, weshalb überhaupt Anstrengungen unternommen werden, um Cellulose auch biotechnologisch durch Fermentation von Bakterien zu produzieren. Hierfür gibt es mehrere Gründe. Bakterien bieten die Möglichkeit besonders reine Cellulose zu Abb. 3.74. Folien aus mikrobieller Cellulobilden, die im Gegensatz zur pflanzlichen se Cellulose nicht mit anderen Polymeren wie Hemicellulose, Pectin oder Lignin fest asso- Tabelle 3.48. Mögliche Anwendungen ziiert ist. Darüber hinaus hat die mit Hilfe bakterieller Cellulose von Bakterien produzierte Cellulose auf • Wundabdeckung: „künstlicher“, Grund der typischen übergeordneten Strukvorübergehender Hautersatz turen der Cellulosefibrillen besondere phy• Künstliche Blutgefäße sikalische Eigenschaften, die aus Pflanzen • Diaphragma für Kopfhörer isolierte Cellulose nicht aufweist. Bakterielle • Erhöhung der Viskosität in Nahrungsmitteln, Kosmetika, Farben usw. Cellulose besitzt deshalb u. a. eine besonders • Stabilisator für Emulsionen hohe Kristallinität und Zugfestigkeit bei • Verstärkung und Oberflächengleichzeitig hoher Elastizität. Die Firmen behandlung von Spezialpapieren Imperial Chemical Industries (ICI) in Eng• Verbesserung des Geschmacksland sowie Cetus und Weyershäuser haben empfindens (mouth feeling) in der Vergangenheit sehr große Anstren• Nata de Coco gungen unternommen, biotechnologische Prozesse zur Produktion von bakterieller Cellulose zu entwickeln. Besonders intensiv wird momentan daran gearbeitet, Folien aus Cellulose ( Abb. 3.74) zu entwickeln, die bei großflächigen Verbrennungen als

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

155

vorübergehende Abdeckung der zerstörten Haut eingesetzt werden können, bis in Gewebekultur die Züchtung von Ersatzhaut aus körpereigenen Zellen gelungen ist. Auch wurde von der Fa. Sony ein Kopfhörer angeboten, dessen Diaphragma aus einem mit G. xylinus hergestellten Cellulosefilm bestand. Einige weitere Anwendungen sind in Tabelle 3.48 aufgeführt. Das Feld der Anwendungen wäre sicherlich noch sehr viel umfassender, wenn die biotechnologische Herstellung von Cellulose nicht mit sehr hohen Kosten verbunden wäre. Eine Besonderheit ist das Vorkommen in Nata de Coco. Es handelt sich hierbei um ein Nahrungsmittel, welches besonders auf den Philipinen verbreitet ist und durch Fermentation von Kokosnussmilch, Saccharose und Essigsäure mit Essigsäurebakterien hergestellt wird. Durch die Fermentation wird die Flüssigkeit in eine gummiartige, glasige und fruchtig schmeckende Substanz umgewandelt, die in kleine Würfel geschnitten wird, bevor sie als Dessert verzehrt wird. Die von G. xylinus während der Fermentation gebildete Cellulose trägt maßgeblich zur Konsistenz von Nata de Coco bei. Dieses Nahrungsmittel wird mittlerweile in großen Mengen von den Philipinen nach Japan und andere asiatische Länder exportiert.

Mögliche Anwendungen

Versuchsziel benötigtes Material Geräte     

450 ml-Fernbachkolben Brutschrank (30 °C) Wasserbad (95 °C) Schere und Pinzette Zentrifuge mit Rotor und Bechern zur Zentrifugation von ca. 0,5 l Volumen bei 3.500 × g  vorbereiteter Dialyseschlauch ( V28, S. 145)  Gefrierschrank (-20 bis -30 °C)  Gefriertrocknungsanlage

Chemikalien und Medien      

Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril GHC-Nährlösung ( S. 414) GHC-Festmedium ( S. 414) Natronlauge (1 %, wt/vol, NaOH) Cross & Beaver Reagenz ( S. 413) 96 % (vol/vol) Ethanol

Mikroorganismen  Gluconacetobacter xylinus (z. B. DSM 2004)

Ziel dieses Versuches ist die Herstellung von Cellulose mit Hilfe des Gram-negativen Bakterium Gluconacetobacter xylinus. Dabei soll auch die Auswirkung der Kultivierungsbedingungen auf die Form der Zellaggregate demonstriert werden. Anschließend wird die bakterielle Cellulose ausgehend von Kulturen, bei denen die Cellulose in Form einer an der Oberfläche des Mediums schwimmenden und die Zellen von G. xylinus zusammenhaltenden Kahmhaut vorkommt, mit speziellen Reagenzien präparativ dargestellt. Versuchsdurchführung Nach Erhalt des Stammes wird dieser (wenn nicht anders von der Bezugsquelle angegeben) in wenig steriler Saline suspendiert und per Drei-Strich-Ausstrich ( M4, S. 365) auf GHC-Agar ausgestrichen. Die Platte wird bei 30 °C bebrütet (einige Tage). Die bewachsene Platte kann bis zum Beginn des Versuches im Kühlschrank (4 °C) aufbewahrt werden.

Ausgehend von Zellmaterial der bewachsenen Platte werden 200 ml GHC-Nährlösung in einem 450 ml-Fernbachkolben beimpft. Die Kultur wird ruhig stehend bei 30 °C inkubiert ( Abb. 3.73). Die nun langsam einsetzende Entwicklung einer Kahmhaut kann zwei Wochen dauern ( Abb. 3.72). Hiernach kann die Kultur mit Kahmhaut bei Raumtemperatur über Monate aufbewahrt werden und in dieser Form als Stammkultur für eine Vielzahl von weiteren Versuchen dienen; als Inokulum dient dann ein Stückchen der Kahmhaut.

Vorbereitungen

156

3 Versuche

Die Kahmhaut wird mit Hilfe einer Pinzette von der Kultur abgehoben und gründlich mit H2Odem. abgespült. Mit einer Schere wird die Kahmhaut in Stücke (ca. 1 bis 2 cm2) geschnitten und bei -20 °C eingefroren. Die eingefrorene Kahmhaut wird zur Trocknung lyophilisiert. Isolierung der Cellulose: Zunächst wird die Masse der getrockneten Kahmhaut bestimmt. Die Kahmhaut wird mit 200 ml Natronlauge versetzt und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Eine Zentrifugation (3.500 × g, 15 min) dient der Sedimentation der Cellulose-haltigen Zellmasse. Das Zellsediment wird in 200 ml Natronlauge aufgenommen, und die Suspension wird in eine Schraubdeckelflasche überführt. Die fest verschlossene Flasche wird für 30 min in ein kochendes Wasserbad gestellt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird die Cellulose-haltige Masse durch Zentrifugation sedimentiert; der Überstand kann verworfen werden. Das Sediment wird in 20 ml H2Odem. resuspendiert und erneut zentrifugiert. Die auf diese Weise gewaschene Masse wird für ca. 15 Stunden (über Nacht) mit 200 ml Reagenz nach Cross und Beaver versetzt. In dieser Zeit geht die Cellulose-haltige Biomasse in Lösung. Die Lösung wird mit vier Volumen 96 % (wt/vol) Ethanol versetzt und für ca. 15 min unter gelegentlichem Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Hierbei präzipitiert die Cellulose. Durch Zentrifugation wird das Präzipitat sedimentiert. Das Sediment wird in möglichst wenig H2Odem. gelöst und über Nacht in einem vorbereiteten Dialyseschlauch (zur Vorbereitung von Dialyseschläuchen V28, S. 145) gegen 2,5 l H2Odem. dialysiert. Der Inhalt des Dialyseschlauchs wird entnommen und bei -20 °C eingefroren. Die gereinigte Cellulose wird zur Trocknung lyophilisiert. Nach Bestimmung der Masse des getrockneten Präparates kann eine Berechnung der Ausbeute in Gewichtsprozent bezogen auf die Kahmhaut erfolgen. Weiterführende Literatur Bielecki S, Krystynowicz A, Turkiewicz M, Kalinowska H (2001) Bacterial Cellulose. In: Vandamme EJ, De Baets S, Steinbüchel A (eds) Biopolymers – Polysaccharides I (Polysaccharides from Prokaryotes), vol 5. Wiley-VCH, Weinheim, pp 37-90 Iguchi M, Yamanaka S, Budhiono A (2000) Bacterial cellulose – a masterpiece of nature's art. Journal of Material Science 35:261-270 Sutherland IA (1996) Extracellular Polysaccharides. In: Rehm HJ, Reed G, Pühler A, Stadler P (eds) Biotechnology, vol 6, 2nd edn. Wiley-VCH, Weinheim, pp 613-657

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

157

Nachgefragt 1. Zeichnen Sie die Struktur von Cellulose! 2. Wie sind die Zuckerbausteine in der Cellulose miteinander verknüpft? 3. Cellulose besitzt ein mittleres Molekulargewicht von 100 kDa. Wie viele Bausteine sind im Durchschnitt miteinander verknüpft? 4. Warum besitzen nicht alle Cellulosemoleküle, die von einer Bakterienspezies synthetisiert werden, exakt das gleiche Molekulargewicht wie z. B. ein bestimmtes Enzym, welches von der gleichen Bakterienspezies gebildet wird? 5. Was versteht man unter monodispers, polydispers und Polymerisationsgrad? 6. Nennen Sie Polysaccharide, die aus den gleichen Zuckerbausteinen bestehen, bei denen diese jedoch anders verknüpft sind! 7. Nennen Sie drei Derivate der Cellulose, die als Zellwandbestandteile oder biotechnologische Produkte eine große Bedeutung haben! 8. Nennen Sie die Bakterienart, die zur Produktion mikrobieller Cellulose eingesetzt wird! 9. Wieviel Gramm Cellulose erhalten Sie ausgehend von 100 mol Glucose unter der Annahme einer Ausbeute von 100 %? 10. Essigsäurebakterien können auch ausgehend von Ethanol Cellulose synthetisieren. Beschreiben Sie die hierbei beteiligten Stoffwechselwege!

11. Wieviel Gramm Cellulose erhalten Sie maximal ausgehend von 100 mol Ethanol? 12. Sie haben 1 Gramm reine Cellulose mit einem mittleren Molekulargewicht von 1 Million Da isoliert. Wie viele einzelne Cellulosemoleküle liegen in Ihrer Probe vor? 13. Weshalb besteht ein Interesse, mikrobielle Cellulose herzustellen, obwohl Cellulose von Pflanzen in ungeheuer großen Mengen produziert wird? 14. Nennen Sie mögliche Anwendungen von mikrobieller Cellulose! 15. Welche Probleme treten bei der biotechnologischen Produktion mikrobieller Cellulose auf? 16. Nennen Sie das Schlüsselenzym und weitere an der Biosynthese von Cellulose beteiligte Enzyme und beschreiben Sie die von diesen Enzymen katalysierten Reaktionen! 17. Wo ist das Schlüsselenzym lokalisiert? 18. Beschreiben Sie die weiteren Vorgänge, die nach der Synthese der Cellulose in der Cytoplasmamembran zur Entstehung von Cellulosefibrillen führen! 19. Nennen Sie andere Bakterien, die Cellulose synthetisieren können? 20. Nennen Sie alle Ihnen bekannten biotechnologischen Verfahren, bei denen Essigsäurebakterien beteiligt sind! Um welche Produkte handelt es sich?

Herstellung von Alginat mit Azotobacter vinelandii

Versuch 31

Theoretischer Hintergrund Tabelle 3.49.

Vorkommen von Alginat

Bakterien Azotobacter chroococcum Azotobacter vinelandii Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens Pseudomonas mendocina Pseudomonas putida Pseudomonas syringae Braunalgen Ascophyllum nodosum Durvillea antarctica Eclonia maxima Laminaria digitata Laminaria hyperborea Laminaria japonica Lessonia nigrescens Macrocystis pyrifera Sargassum sp.

Alginate sind saure Polysaccharide, die vorwiegend in Braunalgen, Pseudomonaden der rRNA-Homologie-Gruppe I und der Gattung Azotobacter vorkommen ( Tabelle 3.49). Es handelt sich um lineare Polyuronsäuren, die aus 1,4-glycosidisch verknüpfter β-D-Mannuronsäure und α-L-Guluronsäure zusammengesetzt sind ( Abb. 3.75). Die Bausteine treten dabei meist in kurzen aus jeweils einem Baustein bestehenden Blöcken auf, die durch ebenfalls kurze Abschnitte getrennt sind, in denen beide Bausteine in alternierender Abfolge auftreten. Nur bei den Alginaten aus Bakterien können die Hydroxylgruppen an den Kohlenstoffatomen Nr. 2 und 3 der Mannuronsäure noch zusätzlich mit Essigsäure verestert sein.

Vorkommen und Struktur

In Braunalgen kommen Alginate in den Zellwänden vor und können dort bis zu 40 % zur Trockenmasse beitragen. Die Alginate verlei-

Funktion

158

3 Versuche

V33 - S. 167

V13 - S. 81 Biosynthese

hen dem Gewebe zugleich mechanische Festigkeit und Elastizität und haben dort eine ähnliche strukturelle Funktion wie die Cellulose bei den höheren Pflanzen. In Bakterien kommen Alginate als Exopolysaccharide in den Kapseln bzw. in dem die Zellen umgebenden Schleim vor. Für Patienten, die an der Erbkrankheit Cystische Fibriose erkrankt und deren Lungen mit Pseudomonas aeruginosa infiziert sind, ist der aus Alginat bestehende Schleim maßgeblich für den tödlichen Verlauf der Erkrankung verantwortlich. Der Alginatschleim stellt eine massive Diffusionsbarriere dar und schirmt die Zellen von P. aeruginosa so gut ab, dass Antibiotika nicht wirkungsvoll zur Therapie eingesetzt werden können. Außerdem wird so viel Schleim gebildet, dass die Versorgung der Lungenbläschen mit Sauerstoff stark eingeschränkt wird. Entsprechend intensiv wird deshalb die Biosynthese von Alginat in P. aeruginosa und dessen Regulation untersucht. P. aeruginosa synthetisiert neben Alginat auch noch Polyhydroxyalkanoate als Speicherstoff und begegnet uns im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM bei einem Versuch zur Herstellung dieses elastischen Polyesters. Bei Azotobacter vinelandii ist Alginat ein wesentlicher Bestandteil der Cysten. A. vinelandii synthetisiert neben Alginat auch noch den Speicherstoff Poly(3-hydroxybutyrat) und vermag molekularen Stickstoff zu fixieren. Dieses Bakterium begegnet uns im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM bei einem Anreicherungsversuch. Die Biosynthese der Alginate weist einige Besonderheiten auf und wurde besonders detailliert in P. aeruginosa und A. vinelandii untersucht. Sie geht von Fructose-6-Phosphat aus und verläuft über Mannose-6-phosphat zu Mannose-1-phosphat. Diese Umsetzungen werden durch die Enzyme Phosphomannose-Isomerase und Phosphomannose-Mutase katalysiert. Der Mannoserest wird dann durch eine Pyrophosphorylase auf GDP übertragen und dort durch eine GDP-MannoseDehydrogenase zu GDP-Mannuronsäure oxidiert. Damit ist einer der beiden Grundbausteine des Polymers synthetisiert, und eine wahrscheinlich in der Cytoplasmamembran lokalisierte Alginat-Polymerase synthetisiert nun zunächst Poly(mannuronsäure), welche in den periplasmatischen Raum abgegeben wird. Dort erfolgen nun Modifizierungen am Poly(mannuronsäure)-Molekül. Die Hydroxylgruppen einiger Mannuronsäurereste werden durch eine Transacetylase acetyliert. Nur die nicht modifizierten Mannuronsäurereste können im letzten Schritt durch eine Epimerase in Guluronsäure umgewandelt werden. Anschließend wird das fertige Alginatmolekül durch ein porenbildendes Protein durch die äußere Membran geschleust ( Abb. 3.76). COO

-

O OH

O

COO

HO O

O

O OH O

OH O HO COO Poly(mannuronsäure)

n

-

HO

COO

-

COO

OH O

OH

-

n

O O

O

O O OH

OH

OH

O

Abb. 3.75.

-

OH OH COOPoly(guluronsäure)

O

OH COO-

Strukturformeln von Poly(mannuronsäure) und Poly(guluronsäure)

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

Fructose-6-phosphat PhosphomannoseIsomerase (PMI) Mannose-6-phosphat PhosphomannoseMutase (PMM) Mannose-1-phosphat Pyrophosphorylase GDP-Mannose GDP-MannoseDehydrogenase GDP-Mannuronsäure

159

Die Eigenschaften von Alginat werden im Wesentlichen durch die negativen Ladungen der Bausteine sowie die Verteilung der beiden Bausteine im Polymer bestimmt. In kaltem Wasser und in Ethanol sind Alginate unlöslich. In Anwesenheit von mono- und divalenten Kationen bilden Alginate viskose Lösungen oder Gele.

Eigenschaften

Zur Zeit werden jährlich ca. 30.000 Tonnen Alginate fast ausschließlich aus Braunalgen gewonnen. Hierzu werden die Braunalgen z. B. vor den Küsten der Nordsee und des atlantischen Ozean geerntet und das Polymer dann unter alkalischen Bedingungen aus der Biomasse extrahiert. Aus der gewonnen Lösung wird es als Calciumalginat ausgefällt, abgetrennt und schließlich durch Ansäuerung freigesetzt.

Produktion

Polymerisation Modifikation Export

In verschiedenen Lebensmitteln werden Alginate als Emulsions-, Schaum- und Suspensionsstabilisator, als Gelbildner und Verdickungsmittel sowie zur Herstellung von Alginat essbaren Wursthüllen eingesetzt. Alginate Abb. 3.76. Biosyntheseweg von Alginat können auch in der Medizin zur Herstellung von chirurgischem Nahtmaterial, saugfähigen Wundverschlüssen und Retardmaterialien sowie als Arzneimittelzusatzstoff eingesetzt werden. Darüber hinaus finden Alginate als Zusatzstoffe bei der Herstellung von Leim, Appreturmitteln, Seifen, Cremes und anderen Kosmetika Verwendung. In der biochemischen Forschung und Biotechnologie wird Calciumalginat zur Immobilisierung von Zellen eingesetzt.

Anwendungen

Versuchsziel Im praktischen Teil wird zunächst unter nahezu optimalen Bedingungen (pH-Pufferung, Phosphat-Limitierung, hohe Glucosemenge, gute O2-Versorgung) die Produktion von Alginat durch Azotobacter vinelandii erreicht. Im weiteren Verlauf des Versuchs wird das Polymer isoliert und mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) und Uronsäure-Bestimmung charakterisiert. Versuchsdurchführung Nach Erhalt des Stamms wird dieser in wenig steriler Saline suspendiert und per DreiStrich-Ausstrich (M4, S. 365) auf Standard I-Festmedium ausgestrichen. Die Platte wird bei 30 °C bebrütet. Die bewachsene Platte kann bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank (4 °C) gelagert werden.

Vorbereitungen

160

3 Versuche

Vorkultur: Mit Material von jeweils einer Einzelkolonie werden viermal jeweils 20 ml Standard I-Nährlösung beimpft, die sich in vier 200 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen befinden. Die Kulturen werden 18 bis 24 Stunden bei 30 °C unter Schütteln inkubiert. Hauptkultur: Mit jeweils dem kompletten Volumen einer Vorkultur werden vier 2 lErlenmeyerkolben mit Schikanen beimpft, in denen sich jeweils 200 ml AP-Medium befinden. Diese vier Hauptkulturen werden unter möglichst starkem Schütteln (empfohlene Umdrehungsgeschwindigkeit: 250 min-1) für 48 Stunden bei 30 °C inkubiert. Eine gute Sauerstoff-Versorgung reduziert die mit der Alginatbildung um die Kohlenstoff-Quelle konkurrierende Akkumulation von Poly(3-hydroxybutyrat).

benötigtes Material Geräte  200 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen  2 l-Erlenmeyerkolben mit Schikanen  Schüttler (30 °C)  Gefrierschrank (-30 bis -70 °C)  Kühlzentrifuge (1 l, 50.000 × g, 4 °C)  Trockenschrank (80 °C)  Membranfilter (Porengröße 1,2 μm)

Chemikalien und Medien     

Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril Standard I-Festmedium ( S. 427) AP-Medium ( S. 410) Isopropanol (2-Propanol) Alginat als Referenz für Analysen (Bezug: Fa. Sigma, Aldrich oder Fluka)

Mikroorganismen

 Azotobacter vinelandii DSM 576 Isolierung des Polymers: Die Zellen werden durch Zentrifugation (30 min, 50.000 × g, 20 °C) sedimentiert. Der vereinigte Kulturüberstand wird für ca. 15 min bei -30 bis -70 °C vorgekühlt und danach unter Rühren mit drei Volumen ebenfalls vorgekühltem Isopropanol versetzt. Durch Zentrifugation (s. o.) wird das Präzipitat sedimentiert. Das Sediment wird in H2Odem. resuspendiert, erneut zentrifugiert und schließlich zur Trocknung für 24 Stunden bei 80 °C inkubiert

Charakterisierung des Polymers: Das gewonnene Material wird zur Ermittlung des Molekulargewichts einer GPC ( M29, S. 408) unterzogen. Dazu wird eine Probe des Produkts in GPC-Laufpuffer (0,1 M Phosphat-Puffer, pH 6,9) gelöst (0,5 g/l) und zur Entfernung von störenden Partikeln durch ein Membranfilter gegeben. Zusätzlich erfolgt die Bestimmung des Uronsäuregehalts des Polymers (M24, S. 402). Weiterführende Literatur Draget KI, Smidsrod O, Skjak-Braek G (2002) Alginates from algae. In: De Baets S, Vandamme EJ, Steinbüchel A (eds) Biopolymers – Polysaccharides II – Polysaccharides from eukaryotes, vol 6. Wiley-VCH, Weinheim, pp 215-244 Rehm BHA, Valla S (1997) Bacterial alginates: biosynthesis and applications. Applied Microbiology and Biotechnology 48:281-288 Rehm BHA (2002) Alginates from bacteria. In: Vandamme EJ, De Baets S, Steinbüchel A (eds) Biopolymers – Polysaccharides I – Polysaccharides from prokaryotes, vol 5. Wiley-VCH, Weinheim, pp 179-212

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

161

Nachgefragt 1. Zeichnen Sie die chemische Strukturformel von Alginat aus Bakterien! 2. Wie sind die beiden Bausteine von Alginat im Polymer angeordnet? 3. Warum haben der pH-Wert und die Salzkonzentration einer Lösung großen Einfluss auf das Verhalten von Alginat in der Lösung? 4. Wie unterscheidet sich das Alginat aus Bakterien von dem Alginat aus eukaryontischen Organismen? 5. Welche Bakterien synthetisieren Alginat? 6. Wo kommt Alginat bei Bakterien vor, und welche Funktion hat es dort? 7. In welchen Eukaryonten kommt Alginat vor? 8. Welche Funktion hat Alginat in Braunalgen? 9. Informieren Sie sich in Lehrbüchern der Mikrobiologie über Struktur, Eigenschaften und Funktion der von Azotobacter vinelandii gebildeten Cysten! 10. Welche anderen wichtigen Biopolymere synthetisieren Azotobacter vinelandii und Pseudomonas aeruginosa neben Alginaten noch? 11. Weshalb vermindert Alginat die Wirkung von Antibiotika auf Zellen von Pseudomonas aeruginosa? 12. Nennen Sie technische Anwendungen von Alginat!

13. Wie wird Alginat technisch gewonnen? 14. Konsultieren Sie Lehrbücher der Biochemie und Mikrobiologie sowie andere Kapitel im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM und versuchen Sie Gemeinsamkeiten bei der Biosynthese von Polymeren, insbesondere bei Art und Reihenfolge der zwischenzeitlich entstehenden Intermediate, herauszufinden! 15. Welche anderen Biopolymere werden wie Poly(mannuronsäure) ebenfalls nach ihrer Biosynthese biochemisch modifiziert? 16. Welche Verbindung ist das Substrat der für die Bildung des Bausteins Guluronsäure verantwortlichen Epimerase? 17. Welche Mutante von Azotobacter vinelandii müsste man erzeugen, um biotechnologisch Poly(mannuronsäure) produzieren zu können? 18. Erläutern Sie, wie die beiden Membranen der Gram-negativen Bakterien Azotobacter vinelandii und Pseudomonas aeruginosa bei der Synthese des Exopolymers überwunden werden! 19. Bei welcher Erkrankung hat die Bildung von Alginat eine große Bedeutung und bestimmt wesentlich den Verlauf der Erkrankung? 20. Weshalb ist die Verwendung von Alginaten auch für biotechnologische Produktionsprozesse interessant?

Herstellung von Bioplastik, Poly(3HB), mit Ralstonia eutropha

Versuch 32

Theoretischer Hintergrund Bereits 1926 wurde Poly(3-hydroxybutyrat), Poly(3HB), von dem französischen Wissenschaftler Maurice Lemoigne als Zellinhaltsstoff in Bacillus megaterium entdeckt. In den Jahren danach wurde gezeigt, dass Poly(3HB) auch noch in vielen anderen Prokaryonten vorkommt. Außerdem wurden neben Poly(3HB) noch zahlreiche weitere Polyester mit anderen Bausteinen nachgewiesen. Für diese natürlichen Polyester hat sich die Bezeichnung Abb. 3.77. Elektronenmikroskopische Polyhydroxyalkanoate (PHA) durchAufnahme einer Zelle von Ralstonia gesetzt. Es handelt sich hierbei um in Bacteeutropha mit Poly(3HB)-Einschlüssen ria und Archaea weit verbreitete Speicherstoffe für Kohlenstoff und Energie, die als unlösliche Einschlüsse im Cytoplasma der Zellen erscheinen. Gegenstand dieses Versuchs ist die Synthese und Herstellung von Poly(3HB). Im nächsten Versuch wird ein weiterer mikrobieller Polyester mit anderen Eigenschaften hergestellt.

Entdeckung und Verbreitung

V33 - S. 167

162

3 Versuche Biosynthese

V51 - S. 262

V53 - S. 273

In den meisten Bakterien setzt die Synthese von Poly(3HB) dann ein, wenn die Zellen in Gegenwart eines Überschusses einer Kohlenstoffquelle kultiviert werden. Es muss aber gleichzeitig ein anderes Makroelement (z. B. N, P, S, Mg oder Fe) im Medium in Mangel geraten sein oder die Zellen nicht mehr ausreichend mit Sauerstoff versorgt werden, so dass kein oder nur noch ein verlangsamtes Wachstum möglich ist. Durch eine β-Ketothiolase und eine meist NADPH-abhängige Acetoacetyl-CoA Reduktase wird hierbei ausgehend von Acetyl-CoA über Acetoacetyl-CoA zunächst (R)-3-hydroxybutyrylCoA synthetisiert und dieses Intermediat dann unter Abspaltung von Coenzym A zu Poly(3HB) polymerisiert. Die letzte Reaktion wird durch das Schlüsselenzym der Poly(3HB) Biosynthese, einer PHA-Synthase, katalysiert ( Abb. 3.78). Da dieses Enzym während der Synthese kovalent mit dem wachsenden Polyestermolekül verbunden bleibt, ist es an der Oberfläche der stetig größer werdenden PHA Grana nachweisbar. Bei ausreichender Versorgung der Zellen mit Kohlenstoffquelle und bei geeigneten Kultivierungsbedingungen können die PHA Grana nahezu das gesamte Cytoplasma füllen, und Poly(3HB) kann bis zu 95 % zur Zelltrokkenmasse beitragen. Die Gene für diese drei Enzyme sind in Ralstonia eutropha im phaCAB Operon organisiert, welches in Escherichia coli exprimiert werden kann und die Zellen des rekombinanten Stammes dann zur Poly(3HB) Synthese befähigt.

O

O H3C

S CoA

H3C

S CoA

Acetyl-CoA

Acetyl-CoA

β-Ketothiolase (PhaA)

HS CoA

O

O S CoA

H3C

Acetoacetyl-CoA NADPH + H+ Acetoacetyl-CoA Reduktase (PhaB)

NADP+ OH

O S CoA

H3C

(R)-3-Hydroxybutyryl-CoA O O n

PHA-Synthase (PhaC)

HS CoA O O n+1 Poly(3HB)

Abb. 3.78.

Biosyntheseweg für Poly(3HB)

Tabelle 3.50. Poly(3HB)

Eigenschaften von

Intrazellulärer Abbau

Stehen später wieder alle für das Wachstum benötigten Makroelemente zur Verfügung und fehlt gar eine extrazelluläre Kohlenstoffquelle, können die Zellen auf ihren Speicherstoff Poly(3HB) zurückgreifen und bauen ihn intrazellulär mittels PHA Depolymerasen hydrolytisch zu (R)-3-Hydroxybutyrat oder Dimeren hiervon ab. Die niedermolekularen Spaltprodukte werden anschließend in den zentralen Stoffwechsel überführt.

Eigenschaften und Verwendung

Poly(3HB) ist ein wasserunlöslicher Polyester mit vielen interessanten Eigenschaften ( Tabelle 3.50). Er ist ein biologisch vollständig abbaubarer Thermoplast und kann mit in der kunststoffverarbeitenden Industrie etablierten Verfahren wie Spritzgießen, Schmelzspinnen, Extrusionsblasformen, Spritzblasformen oder Filmblasen verarbeitet werden. Poly(3HB) könnte als biologisch abbaubares und kompostierbares Verpakkungsmaterial Verwendung finden ( Abb. 3.79), wenn es gelänge, ihn preiswert zu produzieren. Poly(3HB) wäre somit eine Alternative zu herkömmlichen, persistenten

V40 - S. 202

E2 - S. 302

• wasserunlöslich • hoher Polymerisationsgrad (MW: bis zu 3 Millionen Da) • thermoplastisch verformbar • biologisch abbaubar • nicht toxisch • enantiomerenrein • Schmelzpunkt: 178 °C • Bruchdehnung: 3 %

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

163

und nicht biologisch abbaubaren synthetischen Polymeren wie Polyethylen, Polypropylen oder Polystyrol. Zudem kann Poly(3HB) aus nachwachsenden Rohstoffen oder gar CO2 produziert werden, während zur Synthese synthetischer Polymere fossile Rohstoffe herangezogen werden. Daneben gibt es noch weitere Anwendungen, z. B. in der Medizin (resorbierbare Nahtmaterialien und Knochenplatten), Pharmazie (Depotund Retardpräparate), Landwirtschaft (Mulchfolien). Das aerobe Bakterium Ralstonia eutropha synthetisiert Poly(3HB) sehr gut, und es kann hiervon besonders große Mengen in der Zelle akkumulieren ( Abb. 3.77). Eine wirtschaftlich tragbare biotechnologische Produktion von Zellinhaltsstoffen ist im Gegensatz zur Produktion ausgeschiedener Stoffwechselprodukte in besonderem Maße von der Erzeugung von viel Biomasse und dem Erreichen hoher Zelldichten abhängig, da die Menge eines Zellinhaltstoffes durch das von den Zellen zur Verfügung gestellte Zellvolumen limitiert ist. Da R. eutropha ein chemolithoautotrophes Knallgasbakterium ist, und in den 60er und 70er Jahren des 20. Jahrhunderts große Anstrengungen unternommen worden waren, EinzellerAbb. 3.79. Pappbecher, mit einer protein für die Tiermast und die menschliBeschichtung aus Biopol che Ernährung auch mit diesem Bakterium zu produzieren, standen geeignete Verfahren zur Massenkultivierung von R. eutropha mittels Hochzelldichteverfahren bereits zur Verfügung, als mit der Entwicklung von Verfahren zur biotechnologischen Produktion von Poly(3HB) und anderer PHAs begonnen wurde. R. eutropha war also in mehrfacher Hinsicht ein sehr geeigneter Kandidat für die biotechnologische Produktion dieser biologisch abbaubaren Polyester. Fermentative Verfahren zur biotechnologischen Produktion von Poly(3HB) und Poly(3HB-co-3HV) mit Alcaligenes latus und R. eutropha wurden von den Unternehmen Chemie Linz in Österreich bzw. Imperial Chemical Industries (ICI) in Großbritannien entwickelt. Nachdem die Arbeiten vorübergehend von dem Unternehmen Monsanto in den USA aufgegriffen worden waren, werden diese heute von der Firma Metabolix, ebenfalls USA, fortgeführt. Es wird auch intensiv daran gearbeitet, transgene, Poly(3HB)-produzierende Pflanzen zu erzeugen. Die Gewinnung PHA-haltiger Biomasse stellt jedoch nur den ersten Schritt in der Produktion dar. Die biotechnologische Produktion dieser Polyester erfordert auch die Isolierung der Polyester aus den Zellen und deren Abtrennung von der restlichen Biomasse. Hierzu werden sowohl Extraktionen mit organischen Lösungsmitteln als auch enzymatische Verfahren angewandt. Versuchsziel In diesem Versuch soll der biologisch abbaubare Thermoplast Poly(3HB) durch Fermentation von Ralstonia eutropha ausgehend von Gluconat als Kohlenstoffquelle hergestellt werden. Anschließend soll Poly(3HB) aus den Zellen extrahiert und in reiner Form dargestellt werden.

Biotechnologische Produktion

164

3 Versuche

Versuchsdurchführung Vorbereitungen

Nach Erhalt des Stamms wird dieser in wenig steriler Saline suspendiert und per DreiStrich-Ausstrich (M4, S. 365) auf NB-Agar ausgestrichen. Die Platte wird bei 30 °C bebrütet. Die bewachsene Platte kann bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank (4 °C) gelagert werden. Im Folgenden wird zunächst die Kultivierung von R. eutropha H16 im 30 l-Maßstab beschrieben. Hierbei gelangt man zu einer relativ großen Zellmenge, aus der entsprechend viel Polymer gewonnen werden kann. Alternativ hierzu kann die Produktion von Poly(3HB) auch in herkömmlichen Erlenmeyerkolben durchgeführt werden. Eine vereinfachte Vorschrift hierzu ist im zweiten Teil aufgeführt. Anzucht der Zellen im 30 l-Maßstab im Fermenter Die folgende Vorschrift ist exemplarisch für Fermentertypen beschrieben, die im Institut der Autoren Verwendung finden (Biostat DU oder Biostat DL der Fa. Braun-Melsungen). Geeignet ist aber jeder andere Rührkessel, der sich auf 30 °C temperieren und sich mit einer Rate von 1 l Luft pro l Kultur und Minute (1 vvm) belüften lässt sowie eine Rührgeschwindigkeit von 500 Umdrehungen pro Minute erreichen kann. Erste Vorkultur: Mit Material von jeweils einer Einzelkolonie werden zweimal jeweils 10 ml NB-Nährlösung beimpft, die sich in zwei 100 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen befinden. Die Kulturen werden 18 bis 24 Stunden bei 30 °C unter Schütteln inkubiert. Zweite Vorkultur: Mit dem kompletten Volumen der beiden Vorkulturen werden jeweils 100 ml NB-Nährlösung in 1 l-Erlenmeyerkolben mit Schikanen beimpft und für 18 bis 24 Stunden bei 30 °C unter Schütteln inkubiert. Dritte Vorkultur: Die beiden Suspensionen aus der zweiten Vorkultur werden zunächst vereinigt und dann in vier gleich großen Portionen (ca. 50 ml) als Impfgut für vier 2 l-Erlenmeyerkolben mit Schikanen verwendet, in denen sich jeweils 500 ml Mineralmedium mit 1 % (wt/vol) Na-Gluconat befinden. Diese Vorkultur wird für 24 Stunden bei 30 °C geschüttelt.

benötigtes Material Geräte  Erlenmeyerkolben mit Schikanen: ein Kolben in der Größe 50 ml, jeweils zwei in den Größen 100 ml und 1 l sowie vier in der Größe 2 l  Schüttler (30 °C)  30 l-Fermenter (z. B. Biostat DU oder Biostat DL der Fa. Braun-Melsungen)  Durchlaufzentrifuge (z. B. CEPA Z 41, Fa. Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH, Lahr)  Gefrierschrank (-20 °C)  Gefriertrocknungsanlage  Elektrode zur Ammoniumbestimmung ( M26, S. 404)  Gaschromatograph zur Polyhydroxyalkanoat-Bestimmung ( M27, S. 404)  Soxhlet-Apparatur zur Extraktion gefriergetrockneter Zellen (z. B. von Ochs GmbH, Bovenden)  Rotationsverdampfer  Trichter und passender Papierfilter

Chemikalien und Medien        

Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril NB-Nährlösung ( S. 422) NB-Festmedium ( S. 422) Mineralsalzmedium ( S. 421) Na-Gluconat Silikonentschäumer (50 %, wt/vol) Ethanol (96 %, wt/vol) Chemikalien für die Polyhydroxyalkanoat-Bestimmung ( M27, S. 404)

Mikroorganismen  Ralstonia eutropha H16 DSM 428

Sonstiges  Wasserstoff für die gaschromatographische PolyhydroxyalkanoatBestimmung ( M27, S. 404)  Druckluft zum Trocknen des Polymers

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

Hauptkultur: Für die Hauptkultur wird ein 30 l Fermenter mit Mineralmedium befüllt, das unter anderem 0,05 % (wt/vol) NH4Cl und 2 % (wt/vol) Na-Gluconat enthält. Da beim Autoklavieren ca. 2 l Wasser verdampfen, wird dieses Volumen vorher zugesetzt, so dass sich im Rührkessel vor der Sterilisation 32 l befinden mit den Zutaten für 30 l. Der Rührkessel wird entsprechend den Herstellerangaben vorbereitet: Einbau der Schaumelektroden und der Durchstechsepten für die Beimpfung, Eichung der pHElektrode etc. Nach der in situ-Sterilisation des Fermenters wird die Sauerstoff-Elektrode kalibriert, und es werden folgende Parameter eingestellt: • Temperatur, 30 °C • Belüftung, 1 vvm (entspricht 1 l Luft pro Minute und l Kultur; hier 30 l/min) • Umdrehungsgeschwindigkeit des Rührers, 100 min-1

165

FermentationsParameter

Die dritte Vorkultur wird komplett über einen sterilen Schlauch in den Fermenter überführt. Die Rührgeschwindigkeit sollte nun bis maximal 500 min-1 erhöht werden.

Video

Zur Schaumbekämpfung dient sterilisierter Silikonentschäumer, der bei Bedarf automatisch zudosiert wird. Hin und wieder kann die Schaumentwicklung trotz Entschäumerzugabe „außer Kontrolle“ geraten; in diesem Fall sollte die Belüftung und die Umdrehungsgeschwindigkeit des Rührers vorübergehend geringfügig herabgesetzt werden.

Abb. 3.80. Soxhlet-Apparatur zur Chloroform-Exktraktion von Polyestern mit Heizpilz

Um den Verlauf der Fermentation zu verfolgen, werden in regelmäßigen Abständen Proben entnommen, die wie folgt bearbeitet werden: • mikroskopische Kontrolle der Zellen (Bildung von Poly(3HB)-Grana) • Bestimmung der Optischen Dichte bei 600 nm (M22, S. 391) • Bestimmung des Trockengewichts (M25, S. 403) • Bestimmung des Ammoniumgehalts im Kulturüberstand (M26, S. 404) • Bestimmung des Poly(3HB)-Gehalts der Zellen (M27, S. 404)

Proben

166

3 Versuche

Zur Bestimmung des Poly(3HB)-Gehalts werden die in Saline gewaschenen Zellen eines Teils der Probe zunächst bei -20 °C eingefroren und danach gefriergetrocknet. Dies geschieht parallel zu Fermentation. Im Anschluss an die Fermentation erfolgt die quantitative Poly(3HB)-Bestimmung (M27, S. 404). Nach einer Fermentationsdauer von ca. 30 bis 36 Stunden nach Beimpfen des Fermenters werden die Zellen mittels einer Durchlaufzentrifuge geerntet. Die Zellen werden bei -20 °C (oder tiefer) eingefroren. Die gefrorene Zellpaste wird in eine Gefriertrocknungsanlage überführt und lyophilisiert. Anschließend wird das Gewicht der trockenen Zellen bestimmt. Extraktion des Polyesters: Die getrocknete Zellmasse wird in Cellulose-Extraktionshülsen überführt und danach in einer Soxhlet-Apparatur unter Rückflusskühlung mit Chloroform für 48 bis 96 Stunden extrahiert ( Abb. 3.80). Reinigung des Polymers: Mit Hilfe eines Rotationsverdampfers wird das Volumen der Polyester-enthaltenden Chloroform-Phase reduziert. Durch langsame Zugabe der konzentrierten Lösung in eine Vorlage mit dem zehnfachen Volumen an Ethanol fällt Poly(3HB) als Präzipitat aus. Nach Dekantieren des Überstands wird der Rest über einen Papierfilter gegeben und mit Druckluft getrocknet. Der Anteil von Poly(3HB) an der Zelltrockenmasse in Prozent wird durch Vergleich der Gewichte des isolierten Polyesters und der Zellmasse ermittelt. Anzucht der Zellen im Labormaßstab im Erlenmeyerkolben Erste Vorkultur: Mit einer Einzelkolonie werden 5 ml NB-Nährlösung in einem 50 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen beimpft. Die Kultur wird über Nacht bei 30 °C geschüttelt. Zweite Vorkultur: Mit der Vorkultur werden 50 ml NB-Nährlösung in einem 500 mlErlenmeyerkolben mit Schikanen beimpft und für 18 bis 24 Stunden bei 30 °C geschüttelt. Hauptkultur: Die Zellsuspension der zweiten Vorkultur dient als Impfgut für einen 2 l-Erlenmeyerkolben mit Schikanen, in dem sich 500 ml Mineralmedium mit 0,05 % (wt/vol) NH4Cl und 2 % (wt/vol) Na-Gluconat befinden. Diese Kultur wird bei 30 °C für ca. 48 Stunden geschüttelt. Die Zellen werden durch Zentrifugation (15 min 3.500 × g) geerntet. Nach dem Einfrieren der Zellmasse bei -20 °C folgt die Gefriertrocknung und die Extraktion und Reinigung des Polyesters, wie oben für den 30 l-Maßstab beschrieben (siehe Tag 7 bis Tag 11 im ersten Teil dieser Durchführung). Weiterführende Literatur Babel W, Steinbüchel A (2001) Biopolyesters. Advances in Biochemical Engineering Biotechnology, vol 71, Springer, Berlin, Heidelberg, New York Jung C, Steinbüchel A (2001) Palette der nachwachsenden Rohstoffe erweitert: Bioplastik aus Nutzpflanzen. Biologie in unserer Zeit 31:250-258 Steinbüchel A (1995) Mikrobielle und chemische Synthese von biologisch abbaubaren Polyestern. Chemie in unserer Zeit 29:260-271 Internet

Homepage der Fa. Metabolix (Cambridge / MA, USA) im Internet: www.metabolix.com

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

167

Nachgefragt 1. In welchem Bakterium wurde Poly(3HB) entdeckt? 2. Zeichnen Sie die Strukturformel von Poly(3HB)! 3. Wie sind die Bausteine in einem Poly(3HB) Molekül miteinander verknüpft? 4. Welches Stereoisomer von 3-Hydroxybuttersäure ist Bestandteil des Polyesters? 5. Zeichnen Sie den aus Ralstonia eutropha bekannten Biosyntheseweg von Poly(3HB) ausgehend von Acetyl-CoA! Benennen Sie die an der Synthese beteiligten (Co-)Enzyme! 6. Welches sind die natürlichen Funktionen von Poly(3HB)? 7. Wie muss das Medium beschaffen sein und welche Kultivierungsbedingungen müssen gewählt werden, um in Ralstonia eutropha Akkumulation von Poly(3HB) auszulösen? 8. Warum könnte Poly(3HB) auch als Gärungsprodukt bezeichnet werden? In welcher Hinsicht unterscheidet sich der Polyester von klassischen Gärungsprodukten? 9. Angenommen Ralstonia eutropha könnte auch in Abwesenheit von Sauerstoff oder Nitrat anaerob wachsen: Die Befähigung zur Synthese welcher Gärungsprodukte, neben der bereits vorhandenen für Poly(3HB), müsste man in diesem Bakterium etablieren, damit die Zellen eine ausgeglichene Redox- und Kohlenstoffbilanz erreichen können? 10. Wie viel Gramm Poly(3HB) können Sie mit Ralstonia eutropha ausgehend von 100 g Fructose maximal produzieren? (Es wird angenommen, dass Ralstonia eutropha die angebotene Fructose ausschließlich zur Synthese von Poly(3HB) verwendet. Das Bakterium baut Fructose über den KDPG-Weg zu Pyruvat ab, aus dem dann durch den PDH-Multienzymkomplex u. a. Acetyl-CoA entsteht).

11. Warum kann bei der Kultivierung von Ralstonia eutropha die Trübung des Mediums deutlich weiter zunehmen, obwohl die Anzahl der Zellen und der Proteingehalt konstant bleiben? 12. Berechnen Sie überschlagsmäßig an Hand von Bindungslängen für C-C und C-O Bindungen, die aus Lehrbüchern für Organische Chemie verfügbar sind, die Länge eines ausgestreckten Poly(3HB) Moleküls mit einem Molekulargewicht von 3 Mio Da! Setzen Sie diese Länge in Relation zum Durchmesser eines typischen Poly(3HB) Granulums! 13. Die Synthese eines Poly(3HB) Moleküls mit einem Molekulargewicht von 3 Millionen Da dauert ungefähr 3 Stunden. Wie viele Esterbindungen werden von der PHA Synthase pro Sekunde geknüft? 14. Berechnen Sie das molare Verhältnis von 3-Hydroxybuttersäure (3HB) und 3-Hydroxyvaleriansäure (3HV) in dem Copolyester Poly(3HB-co-3HV), wenn beide Comonomere in einem Anteil von jeweils exakt 50 Gewichtsprozent vorliegen! 15. Nennen Sie andere Polyhydroxyalkanoate, die in Bakterien nachgewiesen wurden! 16. Welche natürlichen Polyester kennen Sie aus eukaryontischen Organismen? Wie unterscheiden sich diese von Polyhydroxyalkanoaten aus Bakterien? 17. Warum ist Poly(3HB) sowohl durch intrazelluläre als auch durch extrazelluläre Enzyme abbaubar? 18. Wie bezeichnet man die Enzyme, die den Abbau von Poly(3HB) katalysieren, und wie bauen diese Enzyme den Polyester ab? 19. Nennen Sie mindestens acht wichtige Eigenschaften von Poly(3HB)! 20. Welche (möglichen) Anwendungen für Poly(3HB) sind Ihnen bekannt?

Herstellung eines Elastomers mit Pseudomonas oleovorans

Versuch 33

Theoretischer Hintergrund Der Polyester Poly(3-hydroxybutyrat), Poly(3HB), war Gegenstand des vorangegangen Versuchs. Dort wurde bereits darauf hin gewiesen, dass Bakterien neben Poly(3HB) noch eine Vielzahl weiterer Polyhydroxyalkanoate, PHA, synthetisieren können, und dass bereits ca. 150 verschiedene Hydroxyfettsäuren als Bausteine von PHAs nachgewiesen wurden. Eine Untergruppe von PHAs sind Polyester mit Hydroxyfettsäuren aus einem Kohlenstoffgerüst kurzer Kettenlänge, die als PHASCL (SCL im wissenschaftlichen englischen Sprachgebrauch short chain length) bezeichnet werden. Poly(3HB) ist deren wichtigster Vertreter. Polyester, die z. B. 3-Hydroxypropionat, 3-Hydroxyvalerat, 4-Hydroxybutyrat oder 4-Hydroxyvalerat enthalten, gehören ebenfalls dazu und werden von den PHA Synthasen aus Ralstonia eutropha und vielen anderen Bakterien synthetisiert. Eine andere Untergruppe von PHAs stellen die als PHAMCL bezeichneten Polyester mit 3-Hydroxyfettsäuren aus einem Kohlenstoffgerüst mittlerer Kettenlänge dar (MCL von medium chain length). PHAMCL werden praktisch ausschließlich von Vertretern der Gattung Pseudomonas synthetisiert und stellen für diese Bakterien,

Zwei Gruppen von PHAs V32 - S. 161

168

3 Versuche

Fettsäuren Glucose Acetyl-CoA accABC fabD

CO2/ACP

Malonyl-ACP fa b

fab I

A ad

2 [H]

Acyl-CoA

CoA

trans-Δ2Fettsäure Enoyl-ACP de novo Synthese

3-Ketoacyl-ACP

3-Ketoacyl-CoA

2 [H]

Fettsäure β-Oxidation

H2O

fa

dB

/f

fa

bA

bG

fa

f ad

2 [H]

Z

2

trans-Δ Enoyl-CoA B

H2O

ab

fa

dE

B

f

H ab

f

Acyl-ACP

R-(-)-3-Hydroxyacyl-ACP

S-(+)-3-Hydroxyacyl-CoA

phaG

R-(-)-3-Hydroxyacyl-CoA CoA

phaC ACP

CoA

Poly(3HAMKL) Abb. 3.81.

Biosynthesewege für Polyhydroxyalkanoate mittlerer Kettenlänge Poly(3HAMCL)

wie Poly(3HB), ebenfalls Speicherstoffe für Kohlenstoff und Energie dar, die in Form unlöslicher Einschlüsse im Cytoplasma abgelagert werden. Die Herstellung von PHAMCL ist Gegenstand dieses Versuches. PHAMCL Biosynthese ausgehend von Fettsäuren

V44 - S. 220

Im Jahr 1983 wurde im Labor von Bernhard Witholt entdeckt, dass Pseudomonas oleovorans einen überwiegend aus 3-Hydroxyoctanoat bestehenden Polyester, Poly(3HO), synthetisiert und akkumuliert, wenn die Zellen mit Octan als Kohlenstoffquelle angezogen werden. P. oleovorans überführt Octan mit Hilfe der vom OCT Plasmid codierten Enzyme in Octansäure, welche dann durch eine Thiokinase zu OctylCoA aktiviert und anschließend durch die Fettsäure β-Oxidation sukzessive zu AcetylCoA abgebaut wird. Acetyl-CoA wird dann z. T. vollständig zu CO2 abgebaut, kann gleichzeitig auch als Ausgangsverbindung zur Synthese aller essentiellen Zellbestandteile dienen. Bei der β-Oxidation entstehende Intermediate werden dem Cyclus jedoch auch teilweise entzogen und in (R)-3-Hydroxyoctyl-CoA überführt, welches die beiden in P. oleovorans vorhandenen PHA-Synthasen als Substrat verwenden können und unter Abspaltung von Coenzym A zu Poly(3HO) polymerisieren ( Abb. 3.81). Dieser Polyester enthält stets auch geringe Anteile von 3-Hydroxyhexanoat (3 bis 5 mol %,  Abb. 3.82), da auch das entsprechende Intermediat aus dem nächsten Cyclus der β-Oxidation den PHA Synthasen zugeführt und von ihnen als Substrat genutzt werden kann. Später wurde gefunden, dass P. oleovorans auch Octansäure und andere Fettsäuren ebenfalls als Kohlenstoffquellen zur Synthese von PHAMCL verwenden kann. Hierzu

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

169

sind praktisch auch alle anderen Vertreter der Gattung Pseudomonas in der Lage, die nicht über das OCT Plasmid verfügen. P. oleovorans stellt eine Ausnahme dar, weil es einer der wenigen Vertreter der Gattung Pseudomonas ist, der PHAMCL ausschließlich ausgehend von Fettsäuren und anderen in Fettsäuren überführbare Kohlenstoffquellen O O synthetisieren kann. Nahezu alle anderen Vertreter dieser Gruppe sind zur Synthese O O von PHAMCL auch ausgehend von Kohlenn hydraten bzw. beliebigen anderen KohlenAbb. 3.82. Poly(3HO-co-3HHx) stoffquellen in der Lage ( Abb. 3.81). Wird z. B. Pseudomonas putida in einem Mineralsalzmedium mit einem Überschuss der Kohlenstoffquelle Gluconsäure kultiviert, lassen sich in den Zellen Einschlüsse aus PHAMCL nachweisen. Dieser Polyester besteht dann überwiegend aus 3-Hydroxydecanoat; 3-Hydroxyoctanoat und 3-Hydroxydodecanoat sind als die wichtigsten Nebenkomponenten ebenfalls vorhanden ( Abb. 3.83). Die PHAMCL entstehen hier O O O überwiegend ausgehend von Acetyl-CoA über die Fettsäure de novo Synthese, O O O wobei das Enzym 3-Hydroxyacyln Carrierprotein:Coenzym A Transferase den Abb. 3.83. Poly(3HO-co-3HD-co-3HDD) Hydroxyacylrest vom Acyl-Carrierprotein auf Coenzym A überträgt. Dabei entsteht überwiegend (R)-3-Hydroxydecanyl-CoA, welches von beiden PHA Synthasen aus P. putida unter Abspaltung von Coenzym A polymerisiert wird. Diese Acyltransferase (PhaG) stellt daher ein wichtiges Bindeglied zwischen Fettsäurebiosynthese und PHA Biosynthese dar ( Abb. 3.81).

PHAMCL Biosynthese ausgehend von Kohlenhydraten

Die physikalischen Eigenschaften von PHAMCL unterscheiden sich deutlich von denen der PHASCL ( Tabelle 3.51). Durch Pseudomonaden synthetisierte PHAMCL sind • wasserunlöslich weicher als PHASCL und ähneln Gummi und • hoher Polymerisationsgrad (MW: maxianderen Elastomeren. Andere PHAMCL mit mal 400.000 Da) einer sehr heterogenen Zusammensetzung • biegsam und elastisch sind sogar flüssig und erinnern an Klebstoffe. • biologisch abbaubar Im allgemeinen sind PHAMCL wesentlich • nicht toxisch weniger kristallin und dafür mehr amorph • enantiomerenrein als PHASCL. Der Schmelzpunkt von • Schmelzpunkt: 58,5 °C Poly(3HO) ist sehr viel niedriger als der von • Bruchdehnung ca. 450 % Poly(3HB). Außerdem liegen die Molekulargewichte von PHAMCL deutlich unter denen von Poly(3HB). Noch deutlicher sind die Unterschiede im Polymerisationsgrad, welcher die Anzahl der kovalent verknüpften Bausteine eines Polymers angibt. Wie alle anderen PHAs sind auch die PHAMCL biologisch abbaubar.

Eigenschaften

Tabelle 3.51. Poly(3HO)

Eigenschaften von

170

3 Versuche

Abb. 3.84. Konventionelles Papier (links) im Vergleich zu hydrophiertem (rechts) nach direktem Auftropfen von Wasser (oben) bzw. nach 5 Minuten (unten) Anwendungen

Es gibt vielseitige Anwendungen von PHAMCL, die zur Zeit getestet werden. Zur Herstellung von Flaschen, Folien und Trinkbechern ist das Material ungeeignet, da es zu weich ist. Es eignet sich jedoch zur Hydrophierung von wasserempfindlichen Materialien, wie z. B. Einschlagpapiere ( Abb. 3.84) im Lebensmittelbereich. Darüber hinaus wurde bereits gezeigt, dass PHAMCL zur Herstellung von Latexfarben und als Alternative zu Wachs für die Umhüllung von Käselaiben geeignet ist. Außerdem kann durch Quervernetzung von Poly(3HO) ein gummiartiges Material mit enormer Reißfestigkeit hergestellt werden. Versuchsziel In diesem Versuch soll das biologisch abbaubare Elastomer Poly(3HO) durch Fermentation von Pseudomonas oleovorans ausgehend von Gluconat als Kohlenstoffquelle hergestellt werden. Anschließend soll dieser PHAMCL aus den Zellen extrahiert und in reiner Form dargestellt werden. Zusätzlich soll mit einem einführenden Versuch die wasserabweisende Eigenschaft des Polymers demonstriert werden. Versuchsdurchführung Die vorgeschlagene Vorgehensweise bei diesem Versuch lehnt sich eng an die für Versuch 32 (S. 161) beschriebene an. Wesentliche Unterschiede treten durch die Nutzung von Octanoat als Kohlenstoffquelle für die Hauptkultur im Fermenter (Tag 4 und 5) und bei den letzten Schritten der Isolierung des Polymers (Tag 11) sowie bei der Charakterisierung des Polymers im Anschluss an die Isolierung (Tag 12) auf. Wie in Versuch 32 werden zwei Produktions-Maßstäbe vorgeschlagen, die sich lediglich in ihren Anforderungen an die Kultivierungstechnik unterscheiden. Einzelheiten insbesondere zu den Bedingungen der Anzucht im Rührkessel können den Ausführungen zu Versuch 32 entnommen werden.

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

Nach Erhalt des Stamms wird dieser in wenig steriler Saline suspendiert und per DreiStrich-Ausstrich (M4, S. 365) auf NB-Agar ausgestrichen. Die Platte wird bei 30 °C bebrütet. Die bewachsene Platte kann bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank (4 °C) gelagert werden.

171 Vorbereitungen

Anzucht der Zellen im 30 l-Maßstab benötigtes Material Geräte   V32, S. 161  Glasschale, Ø 5 bis 10 cm  Glasschale, Ø ca. 20 cm

Chemikalien und Medien   V32, S. 161  Octansäure (20 %, wt/vol, durch langsame Zugabe von NaOH neutralisiert)

Mikroorganismen  Pseudomonas putida Stamm KT2440 (DSM 6125)

Sonstiges   V32, S. 161  Löschblätter

Erste Vorkultur: Mit dem Material von jeweils einer Einzelkolonie werden zweimal 10 ml NB-Nährlösung in zwei 100 ml-Erlenmeyerkolben beimpft. Die Ansätze werden über Nacht bei 30 °C geschüttelt. Zweite Vorkultur: Mit jeweils dem kompletten Volumen einer 10 ml-Vorkultur werden zwei 1 l-Erlenmeyerkolben mit Schikanen versetzt, in denen sich jeweils 100 ml NB-Nährlösung befinden. Wiederum wird über Nacht unter Schütteln bei 30 °C inkubiert. Dritte Vorkultur: Die beiden zweiten Vorkulturen werden zunächst vereinigt. Mit jeweils ca. 50 ml dieser Suspension werden vier 2 l-Erlenmeyerkolben mit Schikanen beimpft, in denen sich jeweils 500 ml Mineralmedium mit 1 % (wt/vol) Na-Gluconat befinden. Diese Ansätze werden für 24 Stunden bei 30 °C geschüttelt.

Hauptkultur: Für die Hauptkultur im 30 l-Maßstab im Fermenter kann zwischen zwei Fütterungsregimen gewählt werden. In beiden Fällen dient Mineralmedium mit 0,05 % (wt/vol) NH4Cl als Grundlage. Der Unterschied ergibt sich aus der Art und der Zugabe der Kohlenstoffquelle. Wird die Kultur auf Gluconat angezogen, so kann eine Konzentration von 1,5 % (wt/vol) vorgelegt werden; sollen die Zellen auf Octansäure wachsen, so muss diese Kohlenstoffquelle in Portionen à 0,2 % (vol/vol) zugesetzt werden, da sonst toxische Effekte während der Fermentation durch das Substrat auftreten. Das Medium enthält zu Beginn 0,2 % (vol/vol) Octansäure. Ungefähr 10, 15, 20, 25, 28 und 30 Stunden nach Beginn der Fermentation werden jeweils 0,2 % (vol/vol) Octansäure nachgefüttert. In beiden Fällen wird der Fermenter mit der kompletten dritten Vorkultur (ca. 1,5 l) beimpft. Folgende Parameter werden vorgegeben: • Temperatur, 30 °C • Belüftung, 1 vvm • Rührerumdrehungen, 100 bis 500 min-1 (siehe hierzu Versuch 32).

FermentationsParameter

Während der Fermentation werden verfolgt:

Proben

• • • •

Optische Dichte bei 600 nm (M22, S. 391) Trockengewicht (M25, S. 403) Ammoniumgehalt im Kulturüberstand (M26, S. 404) PHA-Gehalt der Zellen (M27, S. 404).

172

3 Versuche

Nach Erreichen der stationären Phase werden die Zellen mittels einer Durchlaufzentrifuge geerntet. Die Zellen werden eingefroren. Die gefrorene Zellpaste wird lyophilisiert. Anschließend wird das Gewicht der trockenen Zellen bestimmt. Extraktion des Polyesters mit Chloroform in einer Soxhlet-Apparatur ( M27, S. 404,  Abb. 3.80). Reinigung des Polymers: Im Rotationsverdampfer wird die PHA-enthaltende Chloroform-Phase eingeengt. Nach Präzipitieren des Polymers im zehnfachen Volumen Ethanol wird der Überstand vorsichtig dekantiert. Aufgrund der klebrigen Konsistenz des Polyesters sollte sich hiernach keine Filtration über ein Papierfilter anschließen (vergleiche Versuch 32), an dem das Polymer fest haften bliebe. Durch entsprechend zeitlich verlängertes Überströmen mit Druckluft wird schließlich auch hier ein lösungsmittelfreies Produkt erreicht. Das Gewicht des trockenen Polyesters wird durch Wiegen ermittelt. Dieser Wert wird mit dem Gewicht der Zellen verglichen und daraus der Anteil von PHAMCL an der Zelltrockenmasse berechnet. Anzucht der Zellen im Labormaßstab Erste Vorkultur: Mit dem Material einer Einzelkolonie werden 5 ml NB-Nährlösung in einem 50 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen beimpft. Die Kultur wird über Nacht bei 30 °C geschüttelt. Zweite Vorkultur: Mit der Vorkultur werden 50 ml NB-Nährlösung in einem 500 mlErlenmeyerkolben mit Schikanen beimpft. Es folgt wiederum eine Bebrütung über Nacht bei 30 °C unter Schütteln. Hauptkultur: Die Zellsuspension der zweiten Vorkultur dient als Impfgut für einen 2 l-Erlenmeyerkolben mit Schikanen, in dem sich 500 ml Mineralmedium mit 0,05 % (wt/vol) NH4Cl befinden. Als Kohlenstoffquelle dient 1,5 % (wt/vol) Na-Gluconat. Der Ansatz wird bei 30 °C für ca. 48 Stunden geschüttelt. Die Zellen werden durch Zentrifugation (15 min 3.500 × g) geerntet, danach eingefroren und gefriergetrocknet. Die Extraktion und Reinigung des Polyesters erfolgt, wie oben für den 30 l-Maßstab beschrieben (siehe Angaben zu Tag 7 bis Tag 11). Löschblatt-Versuch zur Demonstration der Eigenschaften von PHAMCL: Ein Löschblatt wird in einer Glasschale mit einer Lösung von ca. 2 bis 5 % (wt/vol) PHA getränkt und danach luftgetrocknet. Das auf diese Weise behandelte Blatt wird nochmals getränkt und getrocknet. Die wasserabweisende Wirkung der PHA-Beschichtung kann sehr anschaulich durch Auftropfen von Wasser aus einer Pasteurpipette demonstriert werden (zum Vergleich ein unbehandeltes Löschblatt beträufeln,  Abb. 3.84, S. 170). Herstellung eines Films aus PHAMCL: Das isolierte Polymer wird in möglichst wenig Chloroform gelöst und anschließend in eine exakt waagerecht positionierte Glasschale gegossen. Die Größe der Grundfläche dieser Glasschale sollte der Polymermenge entsprechend gewählt werden. Für den Polyester aus dem „kleinen Ansatz“ wird eine Glasschale mit einem Durchmesser von 5 bis 10 cm empfohlen, während für den „großen Ansatz“ eine Glasschale von ca. 20 cm Durchmesser verwendet werden sollte. Unter einem Abzug gibt man dem Lösungsmittel Gelegenheit zu verdunsten. Nach 5 bis 7 Tagen hat sich ein elastischer, nicht mehr klebriger Film gebildet, der vom Boden der Glasschale abgezogen werden kann

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

Weiterführende Literatur De Smet MJ, Eggink G, Witholt B, Kingma J, Wynberg H (1983) Characterization of intracellular inclusions formed by Pseudomonas oleovorans during growth on octane. Journal of Bacteriology 154:870-878 Steinbüchel A, Valentin HE (1995) Diversity of bacterial polyhydroxyalkanoic acids. FEMS Microbiology Letters 128:219-228 Westhuis RA, Kessler B, Dielissen MPM, Witholt B, Eggink G (2001) Fermentative production of mediumchain-length poly(3-hydroxyalkanoate). In: Doi Y, Steinbüchel A (eds) Biopolymers – Polyesters I. vol 3a, Wiley-VCH, Weinheim, pp 291-316

Nachgefragt 1. In welchem Bakterium wurde Poly(3HO) entdeckt? 2. Zeichnen Sie die Strukturformel von Poly(3HO)! 3. Wie sind die Bausteine in einem Poly(3HO) Molekül miteinander verknüpft? 4. Wie unterscheiden sich Poly(3HB) und Poly(3HO) hinsichtlich ihrer chemischen Struktur im Polymerrückgrat und in den Seitenketten, die aus dem Rückgrat herausragen? 5. Wie unterscheiden sich Poly(3HB) und Poly(3HO) hinsichtlich Ihrer physikalischen Eigenschaften und Materialeigenschaften? 6. Beschreiben Sie Abbau und Verwertung von Octan durch Pseudomonas oleovorans und benennen Sie die an den ersten Schritten beteiligten Enzyme! 7. Skizzieren Sie die Biosynthesewege mit denen Pseudomonas putida PHAMCL ausgehend von Kohlenhydraten bzw. Lipiden synthetisiert! 8. Wie unterscheiden sich Fettsäure de novo Biosynthese und Fettsäure β-Oxidation bezüglich der von den beteiligten Enzymen verwendeten Coenzyme und der optischen Aktivität der Isomere der Isomere? 9. Wie unterscheiden sich Pseudomonas oleovorans und Pseudomonas putida hinsichtlich der Biosynthese von PHAMCL? 10. Wie unterscheiden sich die PHA Synthasen aus Pseudomonas putida von den PHA Synthasen aus Ralstonia eutropha und anderen Poly(3HB) synthetisierenden Bakterien? 11. Warum enthält der von Pseudomonas oleovorans während der Kultivierung mit Octansäure akkumulierte Polyester neben 3-Hydroxyoctanoat als Hauptbestandteil auch stets geringe Anteile an 3-Hydroxyhexanoat?

12. Welches Schlüsselenzym vermittelt in Pseudomonas putida zwischen der Biosynthese von Fettsäuren und der Biosynthese von PHAMCL? 13. Versuchen Sie Erklärungen dafür zu finden, dass Poly(3HB) ein wesentlich härteres Material als Poly(3HO) darstellt und wesentlich kristalliner ist, obwohl die Rückgrate beider Polyester vollkommen identisch sind! 14. Welches Molekulargewicht besitzt ein Poly(3HO) mit einem Polymerisationsgrad von 3.000? 15. Berechnen Sie die Polymerisationsgrade von Poly(3HB) und Poly(3HO) wenn die Molekulargewichte dieser Polyester 3 Millionen bzw. 300.000 betragen! 16. Wie viele Gramm Poly(3HO) können Sie mit Pseudomonas oleovorans ausgehend von 100 g Octansäure maximal produzieren? (Es soll angenommen werden, dass Pseudomonas oleovorans die angebotene Octansäure ausschließlich zur Synthese von Poly(3HO) verwendet). 17. Wie viele Gramm PHAMCL können Sie mit Pseudomonas putida ausgehend von 100 g Glucose maximal produzieren? (Es soll angenommen werden, dass Pseudomonas putida die angebotene Glucose ausschließlich zur Synthese von PHAMCL verwendet und dass der Polyester ausschließlich aus 3-hydroxydecansäure besteht). 18. Beschreiben Sie die im Versuch angewandte Methode zur Gewinnung von reiner Poly(3HO) ausgehend von ganzen Zellen! 19. Welche (möglichen) Anwendungen für Poly(3HO) sind Ihnen bekannt? 20. Wie gehen Sie experimentell vor, um Papier mit PHAMCL wasserabstoßend zu machen?

173

174

3 Versuche

Versuch 34

Herstellung von Poly(γ-D-glutamat) mit Bacillus licheniformis Theoretischer Hintergrund

Zwei Klassen von Polyamiden O

O

N H

O

n

Po ly lutamat g (PGA)

V35 - S. 178

Die Natur synthetisiert in einem großen Umfang zwei unterschiedliche Gruppen von Polyamiden. Eine Gruppe stellen die in jedem Organismus vorkommenden Proteine dar. Sie werden an den Ribosomen in einem komplexen Prozess unter Beteiligung sehr vieler unterschiedlicher Moleküle synthetisiert. Die ribosomale Proteinbiosynthese ist ein matrizenabhängiger Synthesevorgang, wobei messenger-RNA als Matrize dient. Deshalb besitzen alle Moleküle eines Proteins exakt das gleiche Molekulargewicht. Man sagt, sie sind monodispers. Eine weitere Folge der matrizenabhängigen Biosynthese ist eine definierte Abfolge der 22 möglichen Aminosäuren in dem Proteinmolekül. Die zweite Gruppe der Polyamide wird durch vergleichsweise einfach aufgebaute Enzyme synthetisiert, die als Polyamid-Synthetasen bezeichnet werden. Diese Polyamide werden also unabhängig von den Ribosomen und auch unabhängig von einer Matrize synthetisiert und besitzen deshalb kein einheitliches Molekulargewicht. Vertreter dieser Polyamide sind daher polydispers. Für diese Polyamidgruppe sind bisher lediglich drei Vertreter bekannt: Poly(γ-D-glutamat), Poly(ε-L-lysin) und Cyanophycin.

Vorkommen und Verbreitung

In Poly(γ-D-glutamat), PGA, kommt das Tabelle 3.52. Verbreitung der PGA Biosynnicht in Proteinen vorkommende D-Stereoi- these somer von Glutaminsäure als Baustein vor. Ein weiterer Unterschied zu Proteinen ist die Bacillus amyloliquefaciens Art der Verknüpfung der Bausteine: wäh- Bacillus anthracis rend in Proteinen die α-Carboxylgruppe mit Bacillus halodurans der Aminogruppe des nächsten Bausteins die Bacillus licheniformis Amidbindung ausbildet, ist es hier die Bacillus megaterium subtilis β-Carboxylgruppe. Neben dem D-Stereo- Bacillus Halobacillus halophilus isomer wurden in einigen Stämmen auch Marinococcus halophilus PGAs nachgewiesen, die entweder nur das Natrialba aegyptia L-Stereoisomer oder beide Stereoisomere Hydra (in den Nematocysten) enthalten. In Tabelle 3.52 sind Organismen angegeben, die zur Synthese von PGA befähigt sind. PGA wird von sehr vielen Spezies der Gattung Bacillus synthetisiert und wurde zuerst in dem humanpathogen Bakterium Bacillus anthracis (Erreger des Milzbrandes) entdeckt. Es kommt dort in der Kapsel vor. In den meisten anderen Vertretern der Gattung Bacillus kommt es ebenfalls außerhalb der Zelle als Kapsel oder Schleim vor. Außerhalb der Gattung Bacillus wurde PGA bisher lediglich in einigen halophilen Bakterien und Archaea nachgewiesen. Drei Vertreter sind in der nebenstehenden Tabelle aufgeführt. Darüber hinaus wurde PGA auch in den Nematocysten von Hydra nachgewiesen.

Biosynthese

Die Biosynthese von PGA wurde bisher ausschließlich bei einigen Vertretern der Gattung Bacillus untersucht. Die Synthese von PGA erfolgt dort durch das in der Cytoplasmamembran lokalisierte Enzym PGA-Synthethase ( Abb. 3.85). Es handelt sich O

O

PGA n C OH ATP Abb. 3.85.

PGA n C O ADP

Reaktionsmechanismus der PGA-Synthethase

2-

PGA n + 1

PO3

Glutamat

3-

PO4

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

175

um einen aus drei verschiedenen Untereinheiten bestehenden Proteinkomplex. Wie andere Polyamid-Synthetasen benötigt auch die PGA-Synthetase für jede zu knüpfende Amidbindung ein Molekül ATP und ist abhängig von Mg2+-Ionen. Der genaue Mechanismus der Reaktion ist noch nicht aufgeklärt. Es gibt jedoch Hinweise, dass ein phosphoryliertes Intermediat entsteht. Die physiologischen Funktionen von PGA sind nicht mit Sicherheit bekannt. Bei B. anthracis trägt es wahrscheinlich zur Virulenz des Bakteriums bei, da die geringe Immunität von PGA und sein Vorkommen in der äußersten Zellhülle die Bildung von Antikörpern gegen den Krankheitserreger erschweren. Bei halophilen Bakterien könnte das Polymer bedingt durch seine hohe Wasserbindekapazität (s. u.) die Verfügbarkeit von Wasser für die Zellen erhöhen.

Funktion

PGA ist ein polyanionisches Polymer, welches unbegrenzt in Wasser löslich ist. Molekulargewichte zwischen 0,1 und 1,0 Millionen Da wurden beschrieben. Es verleiht wässrigen Lösungen eine hohe Viskosität. Die Amidbindungen können durch PGAHydrolasen gespalten werden; PGA ist deshalb vollkommen biologisch abbaubar. Im trockenen Zustand ist es ein nahezu weißes Pulver, welches jedoch sehr hygroskopisch ist. Wird PGA-Pulver nicht abgeschlossen aufbewahrt, absorbiert es bereitwillig in der Luft enthaltendes Wasser in großen Mengen und wandelt sich schnell in einen zähen Brei um.

Eigenschaften

Als Verdickungsmittel ist PGA möglicherweise ein interessanter Lebensmittelzusatzstoff. PGA kommt in dem asiatischen Lebensmittel Natto vor, welches durch Fermentation von Sojabohnen mit Bacillus subtilis entsteht. Durch die vielen negativen Ladungen eignet sich PGA auch für medizinische Retardsysteme, die eine langanhaltende und kontinuierliche Freisetzung von Wirkstoffen im Körper ermöglichen. Ähnliche Präparate sind auch für Kosmetika und Lebensmittel denkbar. In Kosmetika kann es darüber hinaus als Feuchthaltemittel dienen. Durch chemische Agenzien oder durch Exposition gegenüber γ-Strahlung können die linearen PGA-Moleküle quervernetzt werden. Es entstehen Hydrogele, die enorme Mengen Wasser aufnehmen können (bis zu 3.500 g H2O pro Gramm Polymer) und die als Superabsorber für Hygieneartikel oder Einwegbabywindeln Verwendung finden könnten.

Anwendungen V38 - S. 193

Versuchsziel In diesem Versuch soll PGA durch Kultivierung von Bacillus licheniformis produziert und anschließend ausgehend vom zellfreien Kulturüberstand isoliert werden. Versuchsdurchführung Nach Erhalt des Stamms wird dieser (wenn nicht anders von der Bezugsquelle angegeben) in wenig steriler Saline suspendiert und per Drei-Strich-Ausstrich (M4, S. 365) auf PY-Agar ausgestrichen. Die Platte wird bei 37 °C bebrütet. Für die Herstellung von Poly(γ-D-glutamat) wird zunächst nach dem im Folgenden beschriebenen Verfahren ein stark Polymer-bildender Stamm selektiert. Ausgehend von einer Einzelkolonie von der bewachsenen PY-Agarplatte wird per Drei-Strich-Austrich auf Medium E-Agar ausgestrichen. Die Platte wird bei 37 °C inkubiert. Von der bewachsenen Platte wird Zellmaterial einer sichtbar stark schleimenden Kolonie erneut auf Medium E-Agar ausgestrichen. Diese Selektion wird nochmals wiederholt. Mit dem Material einer schleimenden Kolonie werden dann 20 ml PY-Medium in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben beimpft. Die Kultur wird 15 Stunden (über Nacht) bei 37 °C geschüttelt. Danach wird die Kultur mit 1,5 ml Dimethylsulfoxid versetzt, durchmischt und in Portionen à 1,0 ml eingefroren (möglichst bei -70 °C).

Vorbereitungen

176

3 Versuche

Hauptkultur: Mit dem gesamten Inhalt eines im Gefrierschrank gelagerten Aliquots der Vorkultur werden 200 ml Medium E in einem 1000 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen beimpft und bei 30 °C unter Schütteln inkubiert. Das Wachstum wird anhand der Optischen Dichte verfolgt ( V2, S. 34). Die Produktion von Poly(γ-D-glutamat) erlangt nach Erreichen der stationären Wachstumsphase ihr Maximum. Man die Kultur dann (ca. 50 bis 60 Stunden nach Beimpfen) noch weitere 10 Stunden schütteln. Isolierung des Polymers: Die Kultur wird zunächst, zur Bestimmung des Volumens, in einen Messzylinder überführt und dann in ein 1 l-Becherglas. Die Kulturflüssigkeit wird mit ca. 0,5 Volumen Eis versetzt und für 3 bis 5 min mit einem handelsüblichen Stabmixer intensiv bewegt. Zur Abtrennung der Zellen schließt sich eine Zentrifugation für 1 Stunde bei 3.500 × g und 4 °C an. Der Überstand wird unter Rühren langsam mit vier Volumen bei -20 °C vorgekühltem Ethanol (96 %, vol/vol) versetzt. Der Ansatz wird für 24 (bis 48) Stunden bei -20 °C inkubiert. In dieser Zeit fällt das Polymer als Präzipitat aus.

benötigtes Material Geräte          

Schüttler (30 °C) Impföse Brutschrank (37 °C) 500 ml Messzylinder 1 bis 2 l-Becherglas Zentrifuge mit Rotor und Bechern zur Zentrifugation von ca. 1 l Volumen bei 3.500 × g Zentrifuge mit Rotor und Bechern zur Zentrifugation von ca. 200 ml Volumen bei 100.000 × g vorbereitete Dialyseschläuche ( V28, S. 145) Gefrierschrank (-20 bis -70 °C) Gefriertrocknungsanlage

Chemikalien und Medien      

Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl) PY-Medium ( S. 424) Medium E ( S. 419) Medium E-Festmedium ( S. 419) Dimethylsulfoxid (autoklaviert) 96 % (wt/vol) Ethanol

Mikroorganismen  Bacillus licheniformis ATCC 9945

Das nach vorsichtigem Dekantieren des Überstands gewonnene Präparat wird durch Inkubation bei 37 °C unter mäßigem Unterdruck (ca. 20 hPa; z. B. im Vakuumschrank) getrocknet. Das Präparat wird in 50 bis 100 ml H2Odem. gelöst und in vorbereiteten Dialyseschläuchen bei 4 °C gegen 2 l H2Odem. dialysiert (Vorbereitung der Dialyseschläuche V28, S. 145). Das Wasser für die Dialyse wird gegen frisches H2Odem. gewechselt. Vorsicht beim Wasserwechsel hantieren: Der Schlauch ist prall gefüllt und steht unter Druck. Der Inhalt des Dialyseschlauchs wird hochtourig zentrifugiert (100.000 × g, 1 Stunde, 4 °C). Der klare Überstand wird eingefroren. Der eingefrorene Überstand wird lyophilisiert. Die Masse des getrockneten Polymers wird zur Bestimmung der Ausbeute (g/l Kultur) bestimmt und unverzüglich zur weiteren Aufbewahrung luftdicht verpackt (z. B. in Folie einschweißen).

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

Weiterführende Literatur Ashiuchi M, Risono H (2002) Biochemistry and molecular genetics of poly-γ-glutamate synthesis. Applied Microbiology and Biotechnology 59:9-14 Kunioka M (1997) Biosynthesis and chemical reactions of poly(amino acid)s from microorganisms. Applied Microbiology and Biotechnology 47:469-475 Oppermann-Sanio FB, Steinbüchel A (2002) Occurrence, functions and biosynthesis of polyamides in microorganisms and biotechnological production. Naturwissenschaften 89:11-22

Nachgefragt 1. Zeichnen Sie die chemische Strukturformel von Poly(γ-D-glutamat)! 2. Welche Organismen sind in der Lage, Poly(γ-D-glutamat) zu synthetisieren? 3. Wo kommt Poly(γ-D-glutamat) in diesen Organismen vor? 4. Wie macht sich die Bildung von Poly(γ-D-glutamat) bei der Kultivierung von Bakterien auf festen Nährmedien oder in flüssigen Medien bemerkbar? 5. Welche Funktionen hat Poly(γ-D-glutamat) vermutlich für Organismen, welche dieses Polyamid bilden? 6. Nennen Sie andere Polyamide, die von Bakterien ebenfalls synthetisiert werden können! Nennen Sie jeweils einige Bakterien, die zur biotechnologischen Produktion dieser anderen Polyamide herangezogen werden können! 7. Nennen Sie zwei wesentliche Unterschiede in den Strukturen von Poly(γ-D-glutamat) und Proteinen! 8. Welche Unterschiede bestehen zwischen der Biosynthese von Poly(γ-D-glutamat) und der von Proteinen? 9. Wie heißt das Schlüsselenzym der Poly(γ-D-glutamat) Biosynthese, und wo ist es in den Zellen lokalisiert? 10. Beschreiben Sie die vom Schlüsselenzym der Poly(γ-D-glutamat)-Biosynthese katalysierte Reaktion und nennen Sie alle benötigten Cofaktoren und Coenzyme!

11. Man unterscheidet monodisperse und polydisperse Polymere. Erläutern Sie diese Begriffe! 12. Warum ist Poly(γ-D-glutamat) im Gegensatz zu einem Enzymprotein grundsätzlich polydispers? 13. Nennen Sie möglichst viele Beispiele für monodisperse und polydisperse Biopolymere! 14. Beschreiben Sie, wie Sie bei der Isolierung von Poly(γ-D-glutamat) vorgegangen sind! 15. Ihnen stehen 100 g Glutaminsäure zur enzymatischen Synthese von Poly(γ-D-glutamat) zur Verfügung. Wie viel Gramm Poly(γ-D-glutamat) erhalten Sie bei vollständiger Umsetzung? 16. Von Ihnen isoliertes Poly(γ-D-glutamat) besitzt ein durchschnittliches Molekulargewicht von 100.000 Da. Welchen Polymerisationsgrad besitzt das Polymer? 17. Nennen Sie Eigenschaften von Poly(γ-D-glutamat)! 18. Welche Anwendungen sind für Poly(γ-D-glutamat) vorstellbar? Welche zusätzlichen Anwendungen gibt es für quervernetztes Poly(γ-D-glutamat)? 19. In welchem Lebensmittel kommt Poly(γ-D-glutamat) vor? 20. Bacillus anthracis bildet ebenfalls Poly(γ-D-glutamat). Warum dürfen Sie die Biosynthese von Poly(γ-D-glutamat) in diesem Bakterium nur dann untersuchen, wenn Sie hierfür eine besondere, nicht einfach zu erhaltene Genehmigung vorweisen können?

177

178

3 Versuche

Versuch 35

Herstellung und Isolierung von Cyanophycin mit einem rekombinanten Stamm von Escherichia coli Theoretischer Hintergrund

Struktur V34 - S. 174

Vorkommen und Verbreitung NH 2

HN NH

O

HN

OH

O N

O

n

Cyanophycin

Funktion

V32 - S. 161

Biosynthese

Cyanophycin wurde bereits 1887 von dem italienischen Biologen Antonio Borzi in Cyanobakterien entdeckt. Cyanophycin ist neben Poly(γ-D-glutamat) und Poly(ε-L-lysin) das dritte mikrobielle Polyamid, welches unabhängig vom ribosomalen Proteinbiosynthese-Apparat synthetisiert werden kann. Es ist ein Copolymer aus den Aminosäuren Asparaginsäure (Aspartat, Asp) und Arginin (Arg). Die Aspartatreste bilden dabei das Polymerrückgrat, wobei die α-Carboxylgruppen mit der Aminogruppe des benachbarten Aspartatrestes Amidbindungen ausbilden. Die β-Carboxylgruppen sind jeweils mit der α-Aminogruppe eines Argininrestes kovalent über Amidbindungen verknüpft. Cyanophycin ist in Cyanobakterien weit verbreitet und kommt dort in allen Gruppen vor. In den Zellen lässt sich Cyanophycin in Form unlöslicher cytoplasmatischer Einschlüsse mikroskopisch nachweisen ( Abb. 3.86). Bis vor kurzem wurde angenommen, dass das Schlüsselenzym der Cyanophycin-Biosynthese, die Cyanophycin-Synthetase (CphA), ausschließlich in Cyanobakterien vorkommt. Eine Datenbanksuche nach cphA-homologen Abb. 3.86. EM-Aufnahme von CyanobakGenen ergab jedoch Hinweise darauf, dass terien mit Cyanophycin (dunkle Einschlüsse) auch andere Bakterien Cyanophycin-Synthetasen besitzen. Nachfolgende physiologische Untersuchungen zeigten dann, dass ein Stamm von Acinetobacter sp. sowie Desulfitobacterium hafniense ebenfalls Cyanophycin synthetisieren und akkumulieren können. Die Fähigkeit zur Biosynthese ist also in der Natur weiter verbreitet als ursprünglich angenommen, sie ist allerdings nach wie vor auf Prokaryonten beschränkt. Cyanophycin ist ein in Cyanobakterien weit verbreiteter Speicherstoff und wird dort beim Übergang von der exponentiellen in die stationäre Wachstumsphase synthetisiert und im Cytoplasma akkumuliert. Durch fünf Stickstoffatome pro β-Asp-Arg-Dimer ist Cyanophycin ein idealer Speicherstoff für Stickstoff. Da der Abbau von Arginin relativ viel Energie liefert, kann er auch als Speicherstoff für Energie dienen. Als Kohlenstoffspeicher spielt Cyanophycin wahrscheinlich eine eher untergeordnete Rolle; hierfür sind in den meisten Cyanobakterien andere Speicherstoffe wie Glycogen und Poly(3-hydroxybutyrat) vorhanden. Bei einem wieder ausgewogenen und Wachstum ermöglichendem Nährstoffangebot wird Cyanophycin durch intrazelluläre Cyanophycinasen in β-Asp-Arg-Dimere hydrolysiert, die anschließend gespalten und weiter verstoffwechselt werden. Die Aminosäuren Asparaginsäure und Arginin werden durch das Enzym Cyanophycin-Synthetase in der in Abb. 3.87 angegebenen Weise miteinander verknüpft. Dieses Enzym besteht aus lediglich einem Typ Untereinheit und benötigt 1 Molekül ATP für jede zu knüpfende Amidbindung. Die Enzymreaktion verläuft wahrscheinlich über phosphorylierte Zwischenstufen. Die Reaktion ist auch abhängig von der Anwesenheit von Mg2+ und K+-Ionen sowie von einem SH-Reagenz. Darüber hinaus benötigt die Cyanophycin-Synthetase als Startermolekül Cyanophycin-Oligomere, die aus mindestens drei Bausteinen bestehen müssen [(β-Asp-Arg)3]. In vitro und in vivo Ver-

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

179

O Arg R

O

Arg

1. Aktivierung

Aspα C

OH

Aspα C

R

Arg

O O

2PO3

R

C

OH

β

Aspα Aspα C

OH

O ATP

Arg R

Abb. 3.87.

Pi

O

2. Aktivierung

ATP

L-Aspartat

ADP

ADP

C

β

2-

Arg

PO3

O

Aspα Aspα C O

R

OH

Arg

β

Aspα Aspα C OH O

L-Arginin

Pi

Vermuteter Mechanismus der Cyanophycin-Synthetase, R = Cyanophycin-Strang

suche haben gezeigt, dass Cyanophycin-Synthetasen wie viele Enzyme nicht strikt spezifisch sind: Sie können z. B. statt Arginin auch Lysin und andere Aminosäuren als Substrate verwenden und an das Polymerrückgrat anknüpfen. Reines Cyanophycin ist ein nahezu weißes Pulver und ist über einen weiten pHBereich wasserunlöslich. Lediglich unter sehr sauren (pH < 2) oder alkalischen Bedingungen (pH > 9) geht Cyanophycin in Lösung. Dieses Löslichkeitsverhalten wird bei der Isolierung und Reinigung von Cyanophycin ausgenutzt. Das Molekulargewicht des stets polydispersen Cyanophycins ist abhängig vom Produktionsstamm und kann zwischen 25 und 100 kDa liegen. Cyanophycin wird durch Protein-spaltende Enzyme nicht angegriffen. Neben den intrazellulären Cyanophycinasen (s. o.) scheiden einige Bakterien extrazelluläre Cyanophycinasen aus, die dieses Polyamid hydrolytisch spalten und so die Verwertung von Cyanophycin als alleinige Kohlenstoffquelle zum Wachstum ermöglichen.

Eigenschaften

Cyanophycin ist bis vor kurzem nie in großen Mengen verfügbar gewesen. Die Ursachen hierfür liegen in dem äußerst langsamen Wachstum der Cyanobakterien und in den sehr niedrigen Zelldichten, die selbst nach langanhaltender Kultivierung nur erreicht werden. Daher sind weder die physikalischen Eigenschaften noch mögliche Anwendungsfelder bekannt. Dabei weist Cyanophycin eine sehr interessante chemische Struktur auf und enthält Polyasparaginsäure als Grundstruktur. Die chemische Industrie produziert bereits biologisch abbaubare Polyasparaginsäure als Ersatz für die persistente Polyacrylsäure durch chemische Synthese. Mittlerweile sind jedoch die Gene für mehrere Cyanophycin-Synthetasen (cphA) kloniert und in funktionell aktiver Form in Escherichia coli und einigen anderen Bakterien exprimiert worden. Cyanophycin kann heute durch neue Verfahren mit wesentlich geeigneteren rekombinanten Mikroorganismen biotechnologisch produziert werden. Dies soll in diesem Versuch demonstriert werden.

Biotechnologische Produktion und Anwendungen

Dieser Versuch stellt nach dem geltenden Gentechnik-Gesetz eine gentechnische Arbeit der Sicherheitsstufe 1 dar. Der Versuch darf daher nur in behördlich genehmigten gentechnischen Anlagen der Sicherheitsstufe 1 unter Beachtung der entsprechenden Vorschriften der Gentechnik-Sicherheitsverordnung und Gentechnik-Aufzeichnungsverordnung erfolgen.

Sicherheitshinweis

180

3 Versuche

Versuchsziel In diesem Versuch soll Cyanophycin mit einem rekombinanten Stamm von Escherichia coli produziert werden, der die Cyanophycin-Synthetase von Synechocystis sp. Stamm PCC6803 exprimiert. Durch ein neu entwickeltes Verfahren soll Cyanophycin anschließend aus den Zellen freigesetzt und gereinigt werden. Eine Analyse des Molekulargewichts und der chemischen Zusammensetzung schließen sich an. Versuchsdurchführung Vorbereitungen

Nach Erhalt des Stamms wird dieser in wenig steriler Saline suspendiert und per DreiStrich-Ausstrich ( M4, S. 365) auf LBAmp-Cm-Agar ausgestrichen. Die Platte wird bei 30 °C bebrütet. Die bewachsene Platte kann bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank (4 °C) gelagert werden. Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die relativ einfache Produktion von Cyanophycin im Fermenter im 25 l-Maßstab. Erste Vorkultur: Mit dem Zellmaterial einer Einzelkolonie werden 20 ml LB-AmpCm-Flüssigmedium beimpft, die sich in einem 100 ml-Erlenmeyerkolben befinden. Die Kultur wird ca. 15 bis 18 Stunden bei 30 °C unter Schütteln inkubiert. Zweite Vorkultur: Mit je 5 ml der Vorkultur werden dreimal 500 ml LB-Amp-CmFlüssigmedium in 2 l-Erlenmeyerkolben mit Schikanen beimpft. Diese zweite Vorkultur wird ebenfalls für 15 bis 18 Stunden bei 30 °C geschüttelt.

benötigtes Material Geräte          

100 ml-Erlenmeyerkolben 2 l-Erlenmeyerkolben mit Schikanen Schüttler (30 °C) 30 l-Fermenter (z. B. Biostat DU oder Biostat DL der Fa. Braun-Melsungen) Durchlaufzentrifuge (z. B. CEPA Z 41, Fa. Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH, Lahr) Spektrophotometer zur Bestimmung der Optischen Dichte bei 650 nm Phasenkontrastmikroskop Kühl-Zentrifuge für den Mehr-LiterVolumenbereich (3.500 × g) Gefrierschrank (-20 °C) Gefriertrocknungsanlage

Chemikalien und Medien  Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril  LB-Amp-Cm-Medium  Silikonentschäumer (50 %, wt/vol)

Mikroorganismen  Escherichia coli (pMa/c 5-914::cphA)

Hauptkultur: Die Bedingungen für die DSM 15373 Hauptkultur sind im Folgenden beschrieben für den im Institut der Autoren eingesetzten Fermentertyp; die Angaben hierzu lassen sich jedoch auf die meisten anderen Rührkessel übertragen. FermentationsParameter

Folgende Parameter werden vor der Beimpfung eingestellt: • Temperatur, 30 °C • Belüftung, 1 vvm (entspricht 1 l Luft pro Minute und l Kulturvolumen; hier 30 l/ min) • Umdrehungsgeschwindigkeit des Rührers, 100 min-1. Mit der gesamten Vorkultur (1,5 l) werden 25 l LB-Amp-Cm-Flüssigmedium beimpft, die sich in einem entsprechend den Herstellerangaben vorbereiteten 30 l-Fermenter befinden. Die Rührgeschwindigkeit wird auf maximal 500 min-1 erhöht. Für die Schaumbekämpfung wird Silikonentschäumer bei Bedarf automatisch zudosiert. Um den Verlauf der Fermentation zu verfolgen, werden in regelmäßigen Abständen Proben entnommen, die wie folgt bearbeitet werden:

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

• • • •

mikroskopische Kontrolle der Zellen (Auftreten von Cyanophycin-Granula) Bestimmung der Optischen Dichte (OD) bei 650 nm (V2, S. 34) Bestimmung des Trockengewichts (V2, S. 34) gelelektrophoretischer Nachweis von Cyanophycin (erfolgt erst später)

Die Hauptkultur wird bis zum Erreichen einer OD von ca. 1 bei einer Temperatur von 30 °C gehalten. Dann (ca. 3 Stunden nach Beimpfen) folgt ein möglichst schneller Temperaturwechsel auf 37 °C. Diese Erhöhung führt durch Inaktivierung eines temperatursensitiven Repressors zum „Anschalten“ der Transkription von cphA. Bis zum Ende der Kultivierung, d. h. für weitere ca. 15 Stunden wird diese Temperatur beibehalten. Die Zellen werden mit Hilfe einer Durchlaufzentrifuge geerntet und bei -20 °C eingefroren. Die gefrorene Zellpaste wird in eine Gefriertrocknungsanlage überführt und lyophilisiert. Die erhaltene Masse wird protokolliert. Isolierung von Cyanophycin: Die hier beschriebene Methode wurde für die Isolierung von Cyanophycin im technischen Maßstab konzipiert. Das Verfahren basiert auf dem pH-abhängigen Löslichkeitsverhalten von Cyanophycin. Die Aufreinigung wird an zwei aufeinander folgenden Tagen durchgeführt; eine nächtliche Unterbrechung kann erfolgen, wenn sich die Präparation im pH-neutralen Bereich befindet. Die lyophilisierten Zellen werden in Leitungswasser suspendiert, wobei sich eine Konzentration von 0,1 g Zelltrockenmasse pro ml ergeben soll. Durch Zugabe von konzentrierter HCl wird unter Rühren der pH-Wert auf 1,0 eingestellt. Bei diesem pH-Wert werden die Zellen für sechs Stunden bei Raumtemperatur gerührt. In dieser Zeit wird das unter diesen Bedingungen lösliche Cyanophycin aus den Zellen freigesetzt, ohne diese dabei vollständig zu lysieren (mikroskopische Kontrolle). Es folgt eine Abtrennung der Zellen durch Zentrifugation für 20 min bei 3.500 × g. Der Überstand wird aufbewahrt. Die Zellen werden in 0,1 N HCl aufgenommen und für ca. eine Stunde gerührt. In dieser Zeit wird weiteres, noch in den Zellen verbliebenes Cyanophycin freigesetzt. Nach erneuter Zentrifugation werden beide Überstände vereinigt. Durch Zugabe von NaOH (anfangs in fester Form, später als 1 N Lösung) wird ein pH-Wert von 7 bis 7,5 eingestellt. Bei dieser Neutralisierung fällt das Cyanophycin als weißliches Präzipitat aus. An dieser Stelle kann die Aufarbeitung unterbrochen werden; die Suspension wird dann bis zur weiteren Bearbeitung über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt. Durch eine einstündige Zentrifugation bei 3.500 × g und 4 °C wird das Rohcyanophycin sedimentiert und durch zweimaliges Aufnehmen in H2Odem. und Zentrifugation gewaschen. Das gewaschene Präzipitat wird in 0,1 N HCl aufgenommen und für eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das hierbei in Lösung gegangene Cyanophycin wird durch Zentrifugation von unlöslichen Verunreinigungen befreit. Der Überstand wird durch NaOH-Zugabe neutralisiert (s. o.). Das präzipitierte Cyanophycin wird durch Zentrifugation gesammelt und abschließend zweimal mit H2Odem. gewaschen (s. o.). Das auf diese Weise gereinigte Cyanophycin wird bei -20 °C eingefroren. Das eingefrorene Cyanophycin wird in einer Gefriertrocknungsanlage lyophilisiert. Charakterisierung des gereinigten Polymers: Zunächst wird zum Zwecke der Bilanzierung die Masse des getrockneten Cyanophycins bestimmt. Zur Bestimmung der Größe der Polymerstränge werden Proben des Materials einer diskontinuierlichen SDS-Gelelektrophorese (M28, S. 405) unterworfen.

181 Proben

182

3 Versuche

Weiterführende Literatur Frey KM, Oppermann-Sanio FB, Schmidt H, Steinbüchel A (2002) Technical-scale production of cyanophycin with recombinant strains of Escherichia coli. Applied Environmental Microbiology 68:3377-84 Krehenbrink M, Oppermann-Sanio FB, Steinbüchel A (2002) Evaluation of non-cyanobacterial genome sequences for occurrence of genes encoding proteins homologous to cyanophycin synthetase and cloning of an active cyanophycin synthetase from Acinetobacter sp. strain DSM 587. Archives of Microbiology 177:371380 Lang NJ (1968) The fine structure of blue-green algae. Annual Reviews in Microbiology 22:15-46 Oppermann-Sanio FB, Steinbüchel A (2002) Occurrence, functions and biosynthesis of polyamides in microorganisms and biotechnological production. Naturwissenschaften 89:11-22 Ziegler K, Deutzmann R, Lockau W (2002) Cyanophycin synthetase-like enzymes of non-cyanobacterial eubacteria: characterization of the polymer produced by a recombinant synthetase of Desulfitobacterium hafniense. Zeitschrift für Naturforschung – A Journal of Biosciences 57:522-529

Nachgefragt 1. Wie setzt sich Cyanophycin zusammen? Zeichnen Sie die chemische Strukturformel! 2. Welche anderen Polyamide können von Bakterien noch synthetisiert werden? Nennen Sie jeweils einige Bakterien, die zur biotechnologischen Produktion dieser anderen Polyamide herangezogen werden könnten! 3. Welche Bakterien sind in der Lage, Cyanophycin zu synthetisieren? 4. Welche Funktionen hat Cyanophycin für die dieses Polyamid natürlicherweise bildenden Mikroorganismen? Auf welchen Befunden stützt sich diese Annahme? 5. Beschreiben Sie die Reaktion, die von der Cyanophycin-Synthetase, dem Schlüsselenzym der Cyanophycin-Biosynthese, katalysiert wird! 6. Welche Cofaktoren benötigt die CyanophycinSynthetase? 7. In welcher Hinsicht unterscheiden sich die Biosynthesen von Cyanophycin und Proteinen? Warum ist Cyanophycin polydispers, ein Protein dagegen grundsätzlich monodispers? 8. Welche Funktion hat das Enzym Cyanophycinase? Welche Reaktion katalysiert dieses Enzym und welche Produkte entstehen? 9. Welche Voraussetzungen müssen erfüllt sein, damit ein Bakterium während der Kultivierung Cyanophycin bildet? Durch welche Maßnahmen kann die Bildung von Cyanophycin bei einem Bakterium gesteigert werden? 10. Warum bietet ein rekombinanter Stamm von Escherichia coli bezüglich der biotechnologischen Produktion von Cyanophycin Vorteile gegenüber der Produktion mit Cyanobakterien?

11. Warum wird bei der Kultivierung von Cyanobakterien zur Steigerung des Cyanophycingehalts Chloramphenicol zugesetzt? Welchem Zweck dient die Zugabe von Chloramphenicol bei der Kultivierung des rekombinanten Stammes von Escherichia coli im Versuch? 12. Wie unterscheidet sich von einem rekombinanten Stamm von Escherichia coli synthetisiertes Cyanophycin von dem aus Cyanobakterien hinsichtlich der chemischen Zusammensetzung? 13. Unter welchen Bedingungen liegt Cyanophycin in löslicher Form und unter welchen in unlöslicher Form vor? 14. Beschreiben Sie, wie Sie bei der Isolierung von Cyanophycin vorgegangen sind! 15. Sie haben Cyanophycin, in dem Asparaginsäure und Arginin in äquimolaren Anteilen vorliegen, in hoch gereinigter Form isoliert. Nach Totalhydrolyse ermitteln Sie eine Menge von 50 g Arginin. Wie viel Gramm Cyanophycin müssten Sie vorliegen haben? 16. Wie viel Gramm Stickstoff enthalten 100 g reines Cyanophycin? 17. Sie hydrolysieren 100 g isoliertes Cyanophycin vollständig. Wie viel Gramm Asparaginsäure und Arginin erhalten Sie jeweils? 18. Warum ist die Verfügbarkeit von biosynthetischem Cyanophycin interessant? 19. Weshalb kommen in der Natur Bakterien vor, die Cyanophycin z. B. als Kohlenstoffquelle verwerten können, wenn es diesen im Medium angeboten wird? 20. In welcher Form kommt Cyanophycin in der Natur vor?

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

Herstellung von Sauerkraut

183

Versuch 36

Theoretischer Hintergrund Fermentierte Lebensmittel bildeten in nahezu allen Kulturkreisen traditionelle und früher essentielle Bestandteile der täglichen Nahrung. Auch in Deutschland gibt es solche Nahrungsmittel. Sauerkraut ( Abb. 3.88) ist ein wichtiges Beispiel. Hierbei handelt es sich um fermentiertes Weißkraut, welches durch Milchsäuregärung angesäuert wird. Sauerkraut wird immer wieder mit Deutschland in Verbindung gebracht. Dabei stammt Abb. 3.88. Sauerkraut Sauerkraut ursprünglich gar von hier. Vermutlich ist es vor mindestens ca. 2.200 Jahren in China „erfunden“ worden. Es gibt Berichte über chinesische Arbeiter und Handwerke, die beim Bau der Großen Mauer tätig waren und die ihre einfachen und kargen Reismahlzeiten mit saurem Kraut würzten. Dschingis Khan und den Mongolen ist es zu verdanken, dass das know how zur Herstellung von Sauerkraut dann nach Europa gelangte und dort anscheinend bei den Deutschen auf besondere Gegenliebe stieß. Durch Kolonialismus und Emigration hat es sich von Mitteleuropa aus dann in der gesamten Welt ausgebreitet. Dies hatte sicherlich nicht nur geschmackliche, sondern auch ganz praktische Gründe. Sauerkraut ist im Gegensatz zu frischem Kohl sehr lange haltbar sowie reich an Nährstoffen und Vitaminen und bot daher besonders bei langen Seereisen eine ideale Nahrung, die dem Auftreten von Mangelkrankeiten wie Skorbut entgegenwirkte. Besonders reich an fermentierten Lebensmittel ist die asiatische Küche. Zwei traditionelle fermentierte Lebensmittel aus Asien, Natto durch Fermentation von Sojabohnen mit dem Gram-positiven Bakterium Bacillus subtilis und Tempeh durch Fermentation von Sojabohnen mit dem Pilz Rhizopus microsporus hergestellt, sind ebenfalls Gegenstand von Versuchen im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM.

Geschichte

Bei der Herstellung von Sauerkraut wird von Weißkohl (Brassica oleracea) ausgegangen. Nachdem die Kohlköpfe gesäubert und von den großen äußeren Hüllblättern befreit wurden, wird das Material entweder mit dem Messer, einem Hobel oder mit speziellen Maschinen in ca. 1 mm schmale Streifen zerschnitten, gesalzen und in ein Gefäß gefüllt. Die Zugabe von i. d. R. 2,5 % (wt/wt) Kochsalz (NaCl) ist nicht nur für den späteren Geschmack wichtig, sondern auch für den Verlauf der Gärung (s. u.). Im häuslichen Bereich für die Eigenversorgung werden Tontöpfe mit einem Fassungsvermögen von 5 bis 10 Litern verwendet. Im gewerblichen Bereich wurden früher und teilweise noch heute große Holzfässer verwendet. Bei der industriellen Produktion von Sauerkraut werden häufig Betonwannen eingesetzt, die durchaus 20 bis 180 Tonnen Weißkohl aufnehmen können. Nach dem Befüllen der Gefäße müssen diese abgedeckt werden, um Sauerstoffzufuhr auszuschließen. Beim industriellen Fertigungsprozess geschieht dies durch große Plastikfolien, die über die Betonwannen gezogen werden. Die Ansätze werden meist bei Temperaturen zwischen 18 und 20 °C inkubiert.

Herstellung

Das zugegebene Kochsalz trägt durch den osmotischen Effekt zur Freisetzung von Wasser und Nährstoffen aus den Zellen der Blätter bei. Diese Salzlake stellt ein ideales Medium für das Wachstum von Milchsäurebakterien dar. In der Regel erfolgt ein spontan einsetzende Milchsäuregärung durch Bakterien, die mit dem Pflanzenmaterial eingeschleppt werden. Starterkulturen werden i. d. R. nicht verwendet. Einige industrielle Hersteller von Sauerkraut (besonders in Deutschland) verwenden die beim Abfüllen

V38 - S. 193 V39 - S. 197

OH H3C

C H

O C OH

Milchsäure

184

3 Versuche

des fertigen Sauerkrauts überschüssige Salzlake als Inokulum für die nächste Fermentation. Die Abführung des bei der Milchsäuregärung entstehenden CO2 und der durch Gasblasen vermittelte Auftrieb des Krautes können besonders in der Anfangsphase Probleme bereiten, wenn die heterofermentativen Milchsäurebakterien dominieren (s. u.). Diese Probleme müssen unbedingt behoben werden. Wenn ein Milchsäuregehalt von ungefähr 1 bis maximal 2 % erreicht ist, wofür ungefähr fünf Wochen benötigt werden, wird die Fermentation beendet. Bei der Herstellung von Sauerkraut im industriellen Maßstab gibt es teilweise beträchtliche Unterschiede, besonders zwischen deutschen und amerikanischen Herstellern in Bezug auf Prozessführung, Verwendung von Impfmaterial und Lagerung. Hierauf kann hier jedoch nicht im Detail eingegangen werden. Verarbeitung und Lagerung

Das fertige Produkt wird zum Verkauf in Dosen, Gläser oder Plastikbeutel abgefüllt. In Dosen abgefülltes Sauerkraut wird für 3 min bei 74 bis 82 °C pasteurisiert und ist dann 18 bis 30 Monate haltbar. In Gläser oder Plastikbeutel abgefülltes Sauerkraut wird dagegen nicht erhitzt, sondern mit Konservierungsstoffe (z. B. 0,1 %, wt/wt, NatriumBenzoat) versetzt und anschließend kühl (5 °C) gelagert, wo es für acht bis zwölf Monate haltbar ist.

Mikrobiologie des Sauerkrauts

Neben der Freisetzung von Wasser und Nährstoffen aus den Kohlzellen hat die Zugabe von Kochsalz noch eine anderen wichtigen Effekt. Es unterdrückt die Vermehrung von peptolytischen Bakterien, die hier sicherlich sonst genügend Substrat fänden, die sich im weiteren Verlauf der Umsetzungen nicht vermehren dürfen, weil sie unerwünschte Produkte aus Aminosäuren synthetisieren. Glucose

Xylulose-5-Phosphat

ATP ADP

2 [H] 2 [H]

CO2 Acetyl-Pi

Acetat CH2OH

CH2OH

C

O

HO

C

H

HO

C

H

HO

C

H

H

C

OH

H

C

OH

H

C

OH

H

C

OH

CH2OH Fructose

2 [H]

CH2OH Mannit

CoA

Glycerinaldehyd3-phosphat

Pi

2 [H]

Acetyl-CoA 2 [H]

ATP ADP

Acetaldehyd 2 [H]

ATP Ethanol ADP Pyruvat

2 [H] Lactat Abb. 3.89. Bildung von Mannit bei der heterofermentativen Milchsäuregärung und Auswirkung auf andere Fermentationsprodukte

Ansonsten lassen sich in Sauerkraut verschiedene Mikroorganismen in hoher Anzahl nachweisen. Hefen kommen praktisch nicht vor. Obwohl die Milchsäuregärung der entscheidende Vorgang bei der Herstellung von Sauerkraut ist, stellen Milchsäurebak-

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen Tabelle 3.53.

185

Unterschiede in der Herstellung und Verwendung von Sauerkraut und Silage

Kriterium

Sauerkraut

Silage

Ausgangsmaterial

nur Weißkohl

Gras, Rübenblätter, Mais

Zerkleinerung des Ausgangsmaterials

immer

selten

Zusatz von NaCl

immer

nie

weitere Hilfsmittel

keine

Siliermittel (Melasse, Säuren)

Starterkultur

selten

häufig

Funktion und Verwendung

Lebensmittel

Futtermittel

terien nicht den höchsten Anteil an der Gesamtpopulation. Zumindest in der Anfangsphase sind auch noch zahlreiche Enterobakterien vorhanden. Auch halten sich obligat aerobe Bakterien. Eine genaue Analyse der im Sauerkraut vorkommenden Milchsäurebakterien über den gesamten Fermentationsverlauf zeigt deutlich, dass sich die dort vorkommende Population von Milchsäurebakterien verändert und dass es Sukzessionen gibt. In der entscheidenden Anfangsphase von ca. 8 Tagen dominieren heterofermentative Milchsäurebakterien mit Leuconostoc mesenteroides als wichtigstem Vertreter. L. mesenteroides wird in der Industrie auch zur Produktion des Biopolymers Dextran herangezogen. Erst später setzen sich dann homofermentative Milchsäurebakterien durch; Lactobacillus plantarum ist in dieser Phase der dominierende Vertreter. Neben den genannten Bakterien werden sonst noch hauptsächlich Streptococcus faecalis, Lactobacillus brevis und Pediococcus pentosaceus nachgewiesen. Die Zusammensetzung der Population kann durch Variation der Salzkonzentration und der Temperatur beeinflusst werden. Geringe Salzkonzentrationen (z. B. 1 %, wt/vol, NaCl) und niedrigere Temperaturen (z. B. 18 °C) fördern die heterofermentativen Milchsäurebakterien, während höhere Salzkonzentrationen (z. B. 3,5 %) und höhere Temperaturen (z. B. 32 °C) die homofermentativen Milchsäurebakterien fördern. Hauptkohlenstoffquelle der Milchsäurebakterien sind Saccharose sowie Fructose und Glucose. Während der Fermentation werden diese drei Zucker praktisch vollständig verstoffwechselt. In der von heterofermentativen Milchsäurebakterien dominierten Anfangsphase werden Milchsäure und Mannit in nahezu äquimolaren Mengen (je ca. 100 mM) und CO2 als Hauptprodukte sowie Essigsäure (ca. 80 mM) und Ethanol (ca. 40 mM) in etwas niedrigerer Konzentration gebildet ( Abb. 3.89, unten). Mannit entsteht dabei durch Reduktion von Fructose ( Abb. 3.89, oben). Können bei der Gärung Reduktionsäquivalente auf Fructose übertragen werden, dann können die Zellen in stärkerem Umfang von der über Acetat-Kinase mit zusätzlichem Energiegewinn verbundenen Essigsäurebildung Gebrauch machen. Die relativ umfangreiche Bildung von Mannit erklärt daher die relativ hohen Konzentrationen von Essigsäure. Im weiteren, von homofermentativen Milchsäurebakterien dominierten Verlauf bleiben die Konzentrationen von Mannit, Essigsäure und Ethanol weitgehend konstant, es wird kaum noch CO2 gebildet, und lediglich die Konzentration von Milchsäure steigt weiter an. Eine besondere Bedeutung kommt der noch aus dem Kohl stammenden Ascorbinsäure (Vitamin C) zu. Hiervon liegen ca. 200 mg pro kg Sauerkraut vor. Neben seiner ernährungsphysiologischen Bedeutung als Vitamin zur Vorbeugung gegen Scorbut wirkt es im Sauerkraut als Antioxidans und trägt auch zum Erhalt der Farbe des Sauerkrauts bei.

V29 - S. 150

Veränderung der chemischen Zusammensetzung

H H

C

OH

H

C

OH

HO

HO

O O

L-Ascorbinsäure (Vitamin C)

186

3 Versuche Verwandte Produkte

E6 - S. 325

Neben Weißkohl werden noch zahlreiche weitere landwirtschaftliche Produkte mit Hilfe von Milchsäurebakterien fermentiert, dadurch über einen langen Zeitraum haltbar gemacht sowie positiv im Geschmack verändert und im Nährwert gesteigert. Es würde den Rahmen dieses Buches sprengen, hier alle aufzuführen. Auch in der Tierernährung gibt es ähnliche Produkte. Hier ist an erster Stelle die Silage zu erwähnen, deren Herstellung wir im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM im Rahmen einer Exkursion besichtigen. Hierbei handelt es sich um durch Milchsäuregärung konservierte Futterpflanzen, die als hochwertiges Futtermittel zur Tierernährung in den Monaten beitragen, in denen frisches Gras nicht zur Verfügung steht. Die Herstellung von Silage und Sauerkraut unterscheidet sich aber auch in anderer Hinsicht ( Tabelle 3.53). Versuchsziel In diesem Versuch soll ohne den Einsatz einer Starterkultur verzehrbares Sauerkraut hergestellt und damit demonstriert werden, dass die nötigen Mikroorganismen auf dem Weißkohl selbst zu finden sind. Der Gehalt an gebildeter Milchsäure wird mit einem optisch enzymatischen Test bestimmt. Versuchsdurchführung Von den Weißkohlköpfen werden zunächst die äußeren Blätter entfernt (aufbewahren), die Köpfe werden halbiert, die Knollen herausgestochen. Die Hälften werden in möglichst kleine Stückchen zerteilt (mit einer Küchenmaschine oder Küchenhobel); die Stückchen werden mit 80 bis 100 g Kochsalz bestreut. Ein geeignetes Gefäß (traditionell ein Holzfass oder ein Steintopf) wird am Boden mit einem Teil der anfangs abgestreiften Krautblätter ausgelegt. Darauf wird der zerkleinerte Weißkohl in Lagen von 20 bis 30 cm gelegt und fest eingestampft (Küchenstampfer). Von der heraustretenden Flüssigkeit wird eine Probe (ca. 1 ml) entnommen, um den Gehalt an Milchsäure vor Beginn der Fermentation zu bestimmen (M24, S. 401). Die Probenflüssigkeit wird für 5 min bei 12.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wird bei -20 °C gelagert; die Messung findet am Ende des Versuchs statt.

benötigtes Material Geräte  Steintopf, Holzfass oder ähnliches mit passendem Holzdeckel  Baumwoll- oder Leinentuch  Stein zur Beschwerung  Hobel oder Küchenmaschine zum zerkleinern des Kohls  Photometer zur Bestimmung der Milchsäure ( M24, S. 401)  1,5 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäße (E-Cups)  Zentrifuge für E-Cups

Chemikalien und Medien  Kochsalz (NaCl)  Reagenzien zur Bestimmung von Milchsäure ( M24, S. 401)

Sonstiges  Weißkohl (ganze Köpfe, 10 kg)

Auf den Sauerkrautansatz werden Kohlblätter aufgelegt, darauf gibt man ein weißes Tuch (traditionell aus Leinen) und einen Holzdeckel, den man mit einem schweren sauberen Stein beschwert. Der Ansatz wird bei Raumtemperatur inkubiert. Es wird erneut eine Probe zur späteren Milchsäurebestimmung aus dem Ansatz genommen. Es erfolgt eine weitere Probenentnahme.

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

Nach einer erneuten Probennahme wird der Sauerkraut-Ansatz zum Durchreifen an einen kühlen Ort (Kühlschrank oder Keller) gestellt. Das Sauerkraut ist nun zum Verzehr geeignet. Vorher wird eine letzte Probe entnommen, um den Endgehalt an gebildeter Milchsäure zu bestimmen. Diese Probe und die bei -20 °C gesammelten werden sowohl unverdünnt als auch 10-1 und 10-2 verdünnt in den optisch-enzymatischen Test zur Quantifizierung der Milchsäure eingesetzt (M24, S. 401). Weiterführende Literatur Fleming HP, Kyung KH, Breidt F (1995) Vegetable fermentations. In: Rehm HJ, Reed G, Pühler A, Stadler P (eds) Biotechnology. vol 9, 2nd edn. Wiley-VCH, Weinheim, pp 629-661 Halasz A, Barath A, Holzapfel WH (1999) The influence of starter culture selection on sauerkraut fermentation. Zeitschrift für Lebensmitteluntersuchung und -forschung, A – Food Research and Technology. 208:434-438

Nachgefragt 1. Beschreiben Sie, was Sauerkraut ist und welche Komponenten es enthält! 2. Konsultieren Sie Lehrbücher der Mikrobiologie und Lebensmittelmikrobiologie und erstellen Sie eine möglichst umfangreiche Liste der verschiedenen fermentierten Lebensmitteln aus den unterschiedlichen Kulturkreisen! 3. Beschreiben Sie, wie sich die Herstellung von Sauerkraut ausgebreitet hat, und weshalb es früher ein wichtiges Lebensmittel gewesen ist! 4. Weshalb ist Sauerkraut relativ lange haltbar? 5. Gegen welche Erkrankung beugt Sauerkraut vor? Weshalb? 6. Weshalb wird bei der Herstellung von Sauerkraut zu Beginn Kochsalz zugegeben? 7. Nennen Sie die drei Auswirkungen des Zusatzes von Kochsalz bei der Herstellung von Sauerkraut! 8. Zeichnen Sie die Strukturformel von Milchsäure! 9. Durch welche besonderen stoffwechselphysiologischen Eigenschaften zeichnen sich Milchsäurebakterien aus? 10. Welches wichtige Biopolymer synthetisiert Leuconostoc mesenteroides? 11. Schreiben Sie jeweils die Umsatzgleichungen der homo- und der heterofermentativen Milchsäuregärung auf.

12. Über welche verschiedenen Stoffwechselwege bauen homo- bzw. heterofermentative Milchsäurebakterien Zucker ab? 13. Zeichnen Sie die Strukturformel von Mannit und vergleichen Sie diese mit denen von Fructose und Glucose! 14. Wie entsteht bei der Herstellung von Sauerkraut Mannit? 15. Warum ist die Bildung von Mannit für das Bakterium, welches es synthetisiert, energetisch vorteilhaft? Beschreiben Sie die Umsätze bei der heterofermentativen Milchsäuregärung mit und ohne Bildung von Mannit! 16. Welche Sukzession von Mikroorganismen ist im Sauerkraut während der Fermentation zu beobachten? 17. Welches Gas entsteht bei der Milchsäuregärung, und weshalb wird es besonders während der ersten Tage der Fermentation gebildet und danach kaum noch? 18. Welche Spezies der Milchsäurebakterien kommen im Sauerkraut besonders häufig vor? 19. In welcher Weise wird Sauerkraut, welches in Gläser oder Plastikfolien abgefüllt wird, anders als in Dosen abgefülltes Sauerkraut behandelt? 20. Sauerkraut und Silage unterscheiden sich hinsichtlich mehrerer Aspekte. Stellen Sie die Unterschiede zwischen Sauerkraut und Silage zusammen!

187

188

3 Versuche

Versuch 37

Umwandlung von Wein in Weinessig Theoretischer Hintergrund

Geschichte

H H H

C

C

OH

H H tha E nol O H3C

C OH

sig E säu re

Begriffsbestimmungen

E5 - S. 318

Biochemie der Essigsäurebildung

Erste Berichte über die Verwendung von Weinessig als Würz-, Säuerungs- und Konservierungsmittel datieren ungefähr 6000 Jahre zurück. Damit ist die Weinessigherstellung so alt wie die Herstellung von Wein. Dieser direkte Bezug ist nicht zufällig. Jedem ist bekannt, dass zu lange und falsch gelagerter Wein „umkippt“ und nach Essig schmeckt. Dies liegt dann an einer Kontamination des Weins mit Essigsäurebakterien und dem Zutritt von Luftsauerstoff. Die Bakterien oxidieren den im Wein enthaltenen Ethanol unvollständig zu Essigsäure. Die Abhängigkeit dieses Vorganges von Luftsauerstoff wurde von dem französischen Gelehrten Antoine Laurent de Lavoisier bereits in der zweiten Hälfte des 18. Jahrhunderts erkannt. Im Weinkeller ist dieser Vorgang natürlich unerwünscht, da Wein hierdurch ungenießbar wird. Hersteller von Weinessig nutzen diese Stoffwechselleistung der Essigsäurebakterien jedoch gezielt zur Produktion von Essigsäure bzw. Weinessig. Die Bezeichnung „Essig“ ist innerhalb der Europäischen Union für Produkte vorbehal3.90. Wein und Essig sind verwandte ten, welche durch eine doppelte Fermenta- Abb. und doch sehr unterschiedliche Produkte tion (alkoholische Gärung mit Hefen und unvollständige Oxidation mit EssigsäureCOOH bakterien) aus landwirtschaftlichen ErzeugH nissen hervorgegangen sind. Hierzu gehören HOOC N z. B. Weinessig (Wein,  Abb. 3.90), Apfelessig (Äpfel), Obstessig (Früchte), Malzessig (Gerstenmalz) und Spritessig (Branntwein). Essigsäurehaltige Lösungen, HOOC N O die durch Fermentation von synthetischem O Alkohol mit Essigsäurebakterien erhalten wurden, dürfen demnach die Bezeichnung Abb. 3.91. Pyrrolochinolinchinon (PQQ) Essig nicht führen. In anderen Wirtschaftsregionen bzw. Ländern gelten andere Vorschriften. So ist in den USA diese Definition (für vinegar) durch Einbeziehung synthetischen Alkohols erweitert worden. Die Sequenzierung des Genoms von Gluconobacter oxydans hat Hinweise auf das Vorkommen von mehr als 100 Genen für Dehydrogenasen und Oxidoreduktasen ergeben; unter ihnen sind wahrscheinlich mindestens 20 Alkohol-Dehydrogenasen und mindestens 30 Enzyme, die Zucker oxidieren können. Viele dieser Dehydrogenasen sind in Essigsäurebakterien abhängig von dem Coenzym Pyrrolochinolinchinon (PQQ) ( Abb. 3.91). PQQ-abhängige Dehydrogenasen sind wie flavinabhängige Dehydrogenasen meist in der Cytoplasmamembran lokalisiert und nicht wie NAD(P)+-

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

AlkoholDehydrogenase H3C

C H2

OH

H3C 2 [H]

Ethanol Abb. 3.92.

O

AcetaldehydDehydrogenase

C

O H3C

H Acetaldehyd

H2O

2 [H]

189

C OH

Essigsäure

Enzymatische Oxidation von Ethanol zu Essigsäure

abhängige Dehydrogenasen im Cytoplasma gelöst. Ethanol wird in Essigsäurebakterien über Acetaldehyd in zwei Stufen zu Essigsäure oxidiert. Hieran sind Alkohol-Dehydrogenasen und Acetaldehyd-Dehydrogenasen beteiligt ( Abb. 3.92). Die Essigsäurebakterien verfügen hierzu sowohl über NADP+- als auch PQQ-abhängige Dehydrogenasen. Wahrscheinlich leisten die PQQ-abhängigen Enzyme den Hauptanteil des Umsatzes von Ethanol zu Essigsäure. Die dabei anfallenden Reduktionsäquivalente werden zur Energiegewinnung durch die Atmungskette genutzt. Die biotechnologische Herstellung von Essig ist ein bedeutender industrieller Prozess. Die Weltjahresproduktion von Essig lag 1992 bei über 2 Milliarden Litern, was einer Menge von mehr als 200.000 Tonnen reiner Essigsäure entspricht. Alleine in der Europäischen Union wurden in dem gleichen Jahr 513 Millionen Liter Essig produziert. Wahrscheinlich spielen bei den biotechnologischen Umsetzungen in der Industrie Vertreter der Gattungen Gluconacetobacter und Acetobacter eine größere Rolle als die von Gluconobacter. Drei Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Weinessig sind bekannt. Das Oberflächenverfahren (Orleans-Verfahren) ähnelt dem klassischen Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Citronensäure; hierbei wird Wein in flache Wannen gefüllt und mit Essigsäurebakterien angeimpft. Die Essigsäurebakterien wachsen an der Oberfläche der Flüssigkeit, d. h. an der Grenzfläche zum Luftsauerstoff zu einer dichten, festen Schicht heran und sind nur dort ausreichend mit Sauerstoff versorgt. Für lange Zeit dominierten sogenannte Fesselverfahren, bei denen der Wein über in Bottiche gefüllte Trägermaterialien geleitet wurde, an deren Oberflächen immobilisierte Zellen von Essigsäurebakterien vorlagen. Von diesen Rieselbettverfahren hat es zahlreiche Varianten gegeben. Verbreitet war das Schnellessigverfahren: Dabei werden bevorzugt Buchenholzspäne in einen Standreaktor gefüllt und Wein fortlaufend von oben über das Trägermaterial perkoliert. Zusätzlich wird von unten mit einem Luftstrom belüftet. Auf diese Weise werden die als Biofilm auf der Oberfläche der Buchenholzspäne vorliegenden Essigsäurebakterien optimal mit Sauerstoff versorgt. Heute werden zunehmend Submersverfahren (Frings Acetator) in gerührten und belüfteten Bioreaktoren zur Herstellung von Weinessig angewandt. Durch diese Verfahren gelingt es, 90 bis 98 % des im Wein enthaltenen Ethanols in Essigsäure mit einer Konzentration von 12 bis 17 % umzuwandeln. In der Regel wird als Inokulum ein Teil der Kultur aus dem vorherigen Ansatz verwendet. Diese Kulturen sind wahrscheinlich keine Reinkulturen sondern Mischkulturen, die an die extremen Bedingungen (hohe Konzentrationen von Ethanol und Essigsäure, niedriger pH) besonders gut angepasst sind. Die Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Essigsäure bzw. Weinessig werden häufig durch Bakteriophagen gestört, die spezifisch Essigsäurebakterien infizieren.

Biotechnologische Herstellung

Der in Italien in der Region Emilia bei Modena hergestellte Aceto Balsamico ist eine Spezialität unter den Weinessigen, für dessen Herstellung die Verwendung bestimmter Traubensorten aus der Region vorgeschrieben ist. Der durch Hefe vergorene Traubenmost muss zunächst auf einem offenen Feuer eingekocht werden. Durch den Wasserverlust steigt die Konzentration der Inhalts- und Aromastoffe an. Erst danach erfolgt die Umsetzung des Alkohols durch die Essigsäurebakterien. Die Fermentation wird in

Aceto Balsamico

V23 - S. 124

V47 - S. 240

190

3 Versuche

Fässern aus Eichen-, Kastanien-, Maulbeer-, Kirsch-, Wacholder- oder Eschenholz durchgeführt. Anschließend muss das Produkt für mindestens zwölf Jahre in verschiedenen Holzfässern gelagert werden bevor es als Aceto Balsamico verkauft werden darf. Biotechnologische Bedeutung der Essigsäurebakterien

H H

C

OH

H

C

OH

HO

O

HO

O

L-Ascorbinsäure (Vitamin C) V24 - S. 127 V30 - S. 153

Neben der Herstellung von Essigsäure und Weinessig werden Essigsäurebakterien in weiteren biotechnologischen Prozessen eingesetzt. Die Eignung dieser Bakterien hierzu beruht meist auf den zahlreichen regio- und stereoselektiven Dehydrogenasen, die den Essigsäurebakterien die Möglichkeit geben, primäre und sekundäre Alkohole sowie Zucker zu oxidieren und die Oxidationsprodukte (Aldehyde, Ketone, organische Säuren, Aldosen, Ketosen) in das Medium auszuscheiden und nicht weiter zu oxidieren. Neben der Herstellung von Essig und Essigsäure aus alkoholhaltigen Flüssigkeiten hat zur Zeit das Reichstein-Grüssner-Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure (Vitamin C) aus Glucose die größte Bedeutung. Essigsäurebakterien katalysieren dabei einen Schritt, die Oxidation von D-Sorbit zu L-Sorbitose. Auch können Essigsäurebakterien möglicherweise zur Herstellung von Gluconsäure, 2-Ketogluconsäure, 5-Ketogluconsäure und 2,5-Diketogluconsäure aus Glucose eingesetzt werden. Weitere Derivate von Glucose wie 1-Deoxynoijrimycin und Miglitol können ebenfalls unter Beteiligung von Essigsäurebakterien ausgehend von Glucose hergestellt werden. Darüber hinaus sind uns Essigsäurebakterien im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM bei der Herstellung von Dihydroxyaceton und von mikrobieller Cellulose bereits an zwei Stellen begegnet. Dihydroxyaceton entsteht durch unvollständige Oxidation von Glycerin und ist die in allen Selbstbräunungsmitteln enthaltene wirksame Substanz. Mikrobielle Cellulose kann mit Hilfe von Essigsäurebakterien ausgehend von Glucose produziert werden; der Einsatz für spezielle Nischenanwendungen wird diskutiert. Versuchsziel In diesem Versuch soll Weinessig mit Hilfe von Essigsäurebakterien aus Wein hergestellt werden. Dabei soll die Abnahme der Konzentration von Ethanol und die Zunahme der Konzentration von Essigsäure über die Zeit verfolgt und eine stöchiometrische Beziehung zwischen beiden Verbindungen aufgestellt werden. Versuchsdurchführung

Vorbereitungen

Weinquelle: Ein gut schmeckender Weiß- oder Rotwein wird besorgt. Schlechte Weine, die z. B. bereits nach Kork schmecken, sind ungeeignet, da der Fehlgeschmack im späteren Essig erhalten bleibt. Aus schlechtem Wein kann kein guter Essig hergestellt werden! Der Wein sollte nach Möglichkeit ungeschwefelt oder zumindest nur in geringem Maße geschwefelt sein, da das Wachstum der Essigsäurebakterien durch höhere Schwefelkonzentrationen gehemmt wird. Der Wein wird deshalb am besten direkt bei einem Winzer besorgt, der Auskunft über die Behandlung mit Schwefel geben kann. Starterkulturen: In Gegenwart von genügend Luftsauerstoff setzt meist durch entweder bereits im Wein vorhandene oder aus der Luft in den Wein gelangte Essigsäurebakterien die Oxidation des Ethanols ein. Um den Vorgang jedoch zu beschleunigen und reproduzierbar durchführen zu können, sollte mit einer Starterkultur inokuliert werden. Hierzu werden entweder Reinzuchtbakterienstämme oder die so genannte „Essigmutter“ eingesetzt. Bei letzterer handelt es sich um nichts anderes als einen Teil der aus Essigsäurebakterien bestehenden Kahmhaut, die sich bei der Umsetzung von Wein in Weinessig in ruhenden Kulturgefäßen an der Grenzschicht zwischen Wein und Luft stets ausbildet. Fällt diese bei vorangegangenen Umsetzungen, wie sie auch in diesem Versuch durchgeführt werden sollen, an, dann kann hiervon ohne weiteres ebenfalls ein Teil als Inokulum für die nächste Umsetzung verwendet werden.

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

Quellen für Starterkulturen sind mehrere auf die Versorgung von kleinen Winzereien oder „Hobbywinzern“ spezialisierte Unternehmen, die auch Zubehör für einfache Laboranalysen anbieten. Bei der Suche im Internet findet man diese Firmen bei Verwendung entsprechender Suchwörter relativ leicht. Zwei Beispiele aus Deutschland sind die Fa. VIERKA-Friedrich Sauer GmbH & Co (http://www.vierka.de) sowie die Fa. Paul Arauner GmbH & Co KG (http://www.arauner.de). Auch bieten einzelne Drogerien und manchmal sogar Apotheken Hilfe bei der Beschaffung an. Weitere Bezugsquellen für Starterkulturen sind möglicherweise Winzer, von denen mittlerweile einige auch mit der Herstellung von Weinessig aus ihren eigenen Weinen experimentieren. Reinkulturen von Essigsäurebakterien können natürlich auch von allen größeren Stammsammlungen (z. B. bei der DSMZ) bezogen werden. benötigtes Material Geräte  Rundkolben (2 bis 10 l)  10 ml Glaspipetten  ca. 300 bis 500 ml Flaschen aus braunem Glas  Brutraum (30 °C) oder warmer, dunkler Raum (Heizungskeller)  Trichter mit Faltenfilter  Gerät zur Bestimmung des pH-Wertes; alternativ: pH-Indikatorpapier  Photometer zur Bestimmung von Ethanol und Essigsäure

Chemikalien und Medien  Reagenzien zur Bestimmung von Acetat ( M24, S. 394)  Reagenzien zur Bestimmung von Ethanol ( M24, S. 397)

Mikroorganismen  Starterkultur bzw. „Essigmutter“

Sonstiges

Ein Rundkolben (2 bis 10 l) mit abgeflachtem Boden soll zur Hälfte mit dem ausgesuchten Wein gefüllt werden. Zuvor ist der Alkoholgehalt des Weines auf 6 % (vol/vol) einzustellen. Der Alkoholgehalt ist grundsätzlich auf dem Etikett der Flasche angegeben. Die Verdünnung wird mit sterilem oder abgekochtem Wasser durchgeführt. Das Gefäß wird an einem möglichst temperaturkonstanten und dunklen Bereich (ca. 30 °C) aufgestellt. Die Starterkultur bzw. Essigmutter wird ebenfalls zugegeben. Unmittelbar danach wird eine erste Probe von 10 ml entnommen. Anschließend wird die Öffnung des Gefäßes mit Watte locker verschlossen und für ca. 4 Wochen inkubiert. Ab dem dritten Tag werden alle zwei Tage Proben von jeweils 10 ml entnommen. Außerdem sollte die Entstehung und das Wachsen der Kahmhaut fotografisch dokumentiert werden.

 Weiß- oder Rotwein

Es wird die letzte Probe entnommen. Über einen mit einem Faltenfilter bestückten Trichter wird der Inhalt des Kulturgefäßes in saubere und sterilisierte oder ausgekochte dunkle Flaschen (z. B. Bierflaschen) gegeben und diese anschließend mit einem Korken verschlossen. Die im Filter verbleibende Essigmutter wird entweder verworfen, als Inokulum für einen neuen Ansatz verwendet oder dient als Ausgangsmaterial für die Isolierung von bakterieller Cellulose (V30, S. 153). Unmittelbar nach Probenentnahme wird der pH-Wert in der Probe bestimmt. In den Proben werden mit optischen Tests außerdem die Konzentrationen von Essigsäure ( M24, S. 394) und Ethanol (M24, S. 397) bestimmt. Die Veränderungen von pH-Wert sowie von Ethanol- und Essigsäurekonzentration werden fortlaufend gegen die Zeit aufgetragen. Außerdem wird die Ausbeute von Essigsäure bezogen auf Ethanol berechnet und ebenfalls in die Graphik eingetragen.

191

192

3 Versuche

Weiterführende Literatur Deppenmeier U, Hoffmeister M, Prust C (2002) Biochemistry and biotechnological applications of Gluconobacter strains. Applied Microbiology and Biotechnology 60:233-242 Duine JA (1999) The PQQ Story. Journal of Bioscience and Bioengineering 88:231-236 Ebner H, Follmann H, Sellmer S (1995) Vinegar. In: Rehm HJ, Reed G, Pühler A, Stadler P (eds) Biotechnology. Enzymes, Biomass, Food and Feed. vol 9, 2nd edn. Wiley-VCH, Weinheim, pp 579-591 Ebner H, Follmann H, Sellmer S (1996) Acetic acid. In: Rehm HJ, Reed G, Pühler A, Stadler P (eds) Biotechnology. Enzymes, Products of primary metabolism, vol 6, 2nd edn. Wiley-VCH, Weinheim, pp 381-401 Pütz J, Norten E, Werner K (1998) Hobbythek. Essig und Öl. VGS Tesfaye W, Morales ML, Garcia-Parilla MC, Troncoso AM (2002) Wine vinegar: technology, authenticity and quality evaluation. Trends in Food Science & Technology 13:12-21.

Nachgefragt 1. Zeichnen Sie die Strukturformeln von Ethanol und Essigsäure! 2. Erklären Sie den Unterschied zwischen Essigsäure und Essig! 3. Aus welchen Ausgangsstoffen darf Essig in der Europäischen Union ausschließlich hergestellt werden? 4. Nennen Sie verschiedene Essigsorten und deren Ausgangsstoffe! 5. Welche Bakterien werden zur Produktion von Essigsäure bzw. Weinessig eingesetzt? 6. Welche Enzyme sind an der biochemischen Umsetzung von Ethanol zu Essigsäure durch Essigsäurebakterien beteiligt? 7. Von welchen Coenzymen sind diese beiden Enzyme abhängig? 8. Wo sind die verschiedenen Enzyme, die Ethanol in Essigsäure umwandeln, in der Zelle eines Essigsäurebakteriums lokalisiert? 9. Wie gewinnen Essigsäurebakterien Energie? 10. Nennen Sie die drei grundlegenden Verfahren zur biotechnologischen Produktion von Essigsäure bzw. Weinessig! 11. Welche extremen Toleranzen werden von effektiv umsetzenden Essigsäurebakterien erwartet? 12. Welche Verfahren für die biotechnologische Produktion von Citronensäure und Essigsäure ähneln sich? 13. Welches Problem tritt bei der biotechnologischen Herstellung von Essigsäure häufig auf und führt zu Fehlfermentationen?

14. In welcher Form liegen die Essigsäurebakterien beim Schnellessigverfahren vor? 15. Wie unterscheiden sich Weinessig und Aceto Balsamico? 16. Welche Vorsorgemaßnahmen treffen Sie, damit der Wein in Ihrem Weinkeller nicht durch Essigsäurebakterien zu einer (als Wein) ungenießbaren Lösung umgesetzt wird? 17. Berechnen Sie, in welcher Konzentration (in g/l) Essigsäure in Essig maximal vorliegen kann, wenn Sie für dessen Herstellung von einem Wein mit einem Alkoholgehalt von 120 g/l ausgehen und Ethanol durch die Essigsäurebakterien vollständig umgesetzt wird! 18. Sie möchten Weinessig mit einer Essigsäurekonzentration von 10 % (wt/wt) herstellen. Wie hoch muss die Konzentration von Ethanol im Wein sein (in wt/wt), wenn Sie eine 90 %ige Umsetzung von Ethanol in Essigsäure durch Essigsäurebakterien erwarten? 19. Berechnen Sie, in welcher Konzentration Essigsäure in Essig maximal vorliegen kann (in g/l), wenn Sie für dessen Herstellung von unvergorenem Traubenmost mit einer Saccharosekonzentration von 15 g/l ausgehen und die Saccharose zunächst durch Hefe vergoren wird und die Gärungsprodukte dann durch Essigsäurebakterien vollständig umgesetzt werden! 20. Nennen Sie andere biotechnologische Produkte, die mit Essigsäurebakterien produziert werden!

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

Herstellung von Natto

193

Versuch 38

Theoretischer Hintergrund In allen Kulturkreisen existieren einheimische, auf Pflanzen oder Tieren basierende, fermentierte Lebensmittel, und es ließen sich mühelos Hunderte ganz unterschiedliche Lebensmittel aufführen, die durch Fermentation von Gemüse, Früchten, Samen, Tieren usw. mit Bakterien und/oder Pilzen entstehen. In der asiatischen Küche ist diese Vielfalt besonders groß und bemerkenswert. Was für Deutsche das Sauerkraut ist, sind für Asiaten z. B. Kimchi, Koji, Miso, Natto, Sojasauce, Tapé oder Tempeh, um nur einige wenige in Europa noch am ehesten bekannte Produkte zu nennen. Die unterschiedlichen Produkte sind meist regional begrenzt, und die Verfahren zu ihrer Herstellung werden häufig nach wie vor als Erfahrungswerte von Generation zu Generation überliefert. Die Herstellung dieAbb. 3.93. Handelsübliches Natto ser Lebensmittel hat meistens einen niedrigen verfahrenstechnischen Stand, nur sehr wenige von ihnen werden heute kommerziell im industriellen Maßstab hergestellt.

Fermentierte Lebensmittel

Fermentierte Lebensmittel bildeten besonders in der Vergangenheit eine wichtige Grundlage der Ernährung. Im Zeitalter der globalen Ausbreitung weniger Ernährungsformen und Lebensmittel durch die industrialisierte Lebensmitteltechnik haben die traditionellen Lebensmittel jedoch nicht mehr die Bedeutung für das Überleben wie früher. Traditionelle Lebensmittel tragen jedoch entscheidend zur Vielfalt und damit zur Lebensqualität bei. Die Ursachen für die Entwicklung und in der Vergangenheit beherrschende Dominanz traditioneller Verfahren zur Fermentation von Lebensmitteln sind vielfältig. Sie werden besonders dann deutlich, wenn die chemische Zusammensetzung dieser Lebensmittel vor und nach der Fermentation verglichen wird ( Tabelle 3.54). Darüber hinaus spielt die Konservierung häufig eine sehr wichtige Rolle.

Auswirkungen der Fermentation

Natto und andere fermentierte Lebensmittel sind unverzichtbare Elemente der traditionellen japanischen Küche, und sie sind dort seit mindestens eintausend Jahren bekannt. Bei Natto handelt es sich um ein als Fleischersatz dienendes fermentiertes Lebensmittel, welches in Japan besonders gerne zum Frühstück verzehrt wird. Natto-Produkte sind Lebensmittel, die durch Fermentation von ganzen Sojabohnen hervorgehen ( Abb. 3.93). Beim Itohiki-Natto, dem Natto im eigentlichen Sinne, werden Sojabohnen mit Bacillus subtilis fermentiert. Zu den Natto-Produkten gehören auch das Yukiwari-Natto und das Hama-Natto. Beim Yukiwari-Natto werden Itohiki-Natto mit Reis-Koji, welches durch Fermentation mit Aspergillus oryzae gewonnen wurde, sowie Kochsalz gemischt und für ca. zwei Wochen bei Temperaturen zwischen 25 und 30 °C nachfermentiert. Beim Hama-Natto werden gequollene und pasteurisierte Sojabohnen mit geröstetem Gerstenmehl gemischt und mit A. oryzae fermentiert. Das resultierende Koji wird anschließend partiell getrocknet, mit einer Salzlake versehen und dann für ca. 6 bis 12 Monate einem Reifeprozess überlassen.

Verschiedene Natto-Produkte

V36 - S. 183

V39 - S. 197

194

3 Versuche Tabelle 3.54.

Beispiele für den positiven Einfluss mikrobieller Fermentationen auf Lebensmittel

Konservierung

Bildung von organischen Säuren und dadurch Absenkung des pH, aber auch durch Maßnahmen, die zur Vorbereitung der Fermentation dienen

Erhöhung des Nährwertes

Bildung von Vitaminen, Aminosäuren und ungesättigten Fettsäuren

Erhöhung des Kaloriengehaltes

bessere Verfügbarkeit von Inhaltsstoffen z. B. durch partiellen Abbau von Biopolymeren

Beseitigung von Toxinen

Abbau

Verbesserung des Geschmacks bzw. des Geruchs

Bildung von Aromastoffen oder Abbau unangenehm schmeckender bzw. riechender Substanzen

Verbesserung des Aussehens

Bildung von Pigmenten

Verbesserung der Konsistenz

Bildung von Biopolymeren

Vorgänge bei der Herstellung von Itohiki-Natto

In diesem Versuch werden wir uns ausschließlich mit dem Itohiki-Natto beschäftigen, welches besonders im Nordosten Japans verbreitet ist und welches man mittlerweile auch bei uns in „Asialäden“ kaufen kann. Zur Herstellung von Natto wird von speziellen Soja-Sorten ausgegangen, die sich durch besonders kleine Sojabohnen und einen höheren Kohlenhydrat-Gehalt auszeichnen. Diese Varitäten wurden speziell für die Herstellung von Natto gezüchtet. Zunächst erfolgt ein Aufquellen der Sojabohnen über Nacht in Wasser. Dabei nimmt das Gewicht um ca. 100 bis 150 % zu. Ohne das Quellen wäre der Wassergehalt für eine Vermehrung und Stoffwechselaktivität der später an der Fermentation beteiligten Bakterien viel zu gering. Anschließend werden die auf diese Weise vorbehandelten Sojabohnen für ca. 15 min gekocht. Vorteilhafter im Hinblick auf den späteren Geschmack ist jedoch eine Behandlung mit heißem Wasserdampf. Durch diese Pasteurisierung soll die vorhandene mikrobielle Begleitflora reduziert werden. Anschließend wird mit einer Starterkultur von Bacillus subtilis beimpft, und der Ansatz wird bei 42 °C inkubiert. Bei der häuslichen, nicht kommerziellen Herstellung von Natto werden die vorbehandelten Sojabohnen mit Stroh eingewickelt, und geeignete B. subtilis Stämme gelangen hierüber als Inokulum hinzu. Bereits nach weniger als einem Tag ist die Fermentation so weit fortgeschritten, dass diese abgebrochen werden kann.

Mikrobiologie des Natto

Bezüglich der Bezeichnung der verwendeten Tabelle 3.55. Zusammensetzung von Bacillus-Spezies gibt es in der Literatur Natto (%, wt/wt) unterschiedliche Angaben. Die häufig verwendete Bezeichnung Bacillus natto ist taxo- Wasser 55-61 17-23 nomisch nicht richtig und damit ungültig. Es Protein 1-9 handelt sich hierbei stets um Stämme von Fett 5-7 Bacillus subtilis. Eine wichtige Eigenschaft Kohlenhydrate 2-3 dieser Stämme ist deren Vermögen, während Asche der Fermentation Poly(γ-D-glutamat), PGA, zu bilden. Dieses mikrobielle Polyamid und dessen Gewinnung hatten wir bereits in einem vorangegangenen Kapitel behandelt. Wir hatten gesehen, dass es u. a. von sehr vielen Vertretern der Gattung Bacillus als Kapsel oder Schleim gebildet wird. Das während der Fermentation in großen Mengen gebildete schleimige PGA verleiht dem Natto seine typische viskose Textur. Auch der Nährwert der Sojabohnen wird durch die mikrobiellen Umsetzungen gesteigert

O N H

O

O

Polyglutamat (PGA)

V34 - S. 174

n

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

195

( Tabelle 3.55). Am Ende der Fermentation sind die Gehalte an Thiamin und Riboflavin in der Regel um den Faktor 3 höher, und der Gehalt an Vitamin B12 kann sogar um den Faktor 5 gesteigert werden. Darüber hinaus wird durch die Fermentation ein Teil des ursprünglich vorhandenen Proteins in leichter abbaubare Peptide und Aminosäuren umgewandelt. Anfänglich vorhandene, Flatulenzen verursachende Zucker werden dagegen durch B. subtilis abgebaut. Natto wird auch im großen Umfang kommerziell produziert. Alleine in Japan werden von ungefähr 500 kommerziellen Herstellern jährlich ca. 220.000 t Natto produziert. Dabei wird die Fermentation meist bereits in kleinen Behältern aus Styropor oder Pappe durchgeführt, in denen es dann auch direkt vertrieben wird. Die produzierte Menge ergibt ca. 2,3 Millionen Kleinpackungen, die in Supermärkten angeboten werden. In solchen Behältern kann Natto auch in Deutschland z. B. in sogenannten „Asialäden“ erworben werden. So bedeutend Natto ist, verbraucht es jedoch lediglich ca. 0,1 bis 0,2 % des weltweit angebauten Soja. Japan ist damit jedoch bereits auf SojaImporte aus anderen Ländern (z. Zt. besonders USA) angewiesen.

Industrielle Produktion

Natto muss nach der Fermentation im Kühlschrank gelagert werden, und es sollte innerhalb einer Woche verzehrt werden. Danach ist es zwar immer noch für eine gewisse Zeit essbar, jedoch nimmt die Konzentration von Ammonium zu, was das Geschmacksempfinden stört. Zum Verzehr wird Natto häufig mit Reis gemischt. Auch die Zugabe von Sojasauce oder Senf ist verbreitet. Natto kann auch zusammen mit anderen Speisen gekocht, gebraten und frittiert werden.

Verzehr

Versuchsziel In diesem Versuch sollen Sojabohnen mit Bacillus subtilis zu Natto fermentiert werden. Das auf diese Weise hergestellte Natto kann verzehrt werden. Außerdem soll Poly(γ-D-glutamat) als Fermentationsprodukt nachgewiesen werden. Versuchsdurchführung benötigtes Material Geräte     

Kochtopf Sieb flache Schale Brutschrank (40 °C) Phasenkontrastmikroskop

Chemikalien und Medien  Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril  Standard I-Festmedium ( S. 427)  500 g getrocknete Sojabohnen

Mikroorganismen  Geeignete Stämme von Bacillus subtilis, z. B. DSM 1088, DSM 1092 sowie DSM 4449 oder spezielle Trockenkulturen von B. subtilis zur Herstellung von Natto, sog. Natto Kin-Kulturen

Wenn Sie nicht von den Natto Kin-Trockenpräparaten als Starterkultur ausgehen können oder wollen, müssen Sie zunächst einen der geeigneten B. subtilis-Stämme auf Standard I-Festmedium ausstreichen und diese Platte über Nacht bei 30 °C inkubieren. Ausgehend von dem Zellmaterial einer Einzelkolonie werden dann 10 ml Standard INährlösung in einem 100 ml-ErlenmeyerKolben beimpft und diese Kultur für ca. 15 Stunden (über Nacht) bei 30 °C geschüttelt. Die Zellen werden durch Zentrifugation (3.500 × g, 15 min) geerntet, im gleichen Volumen 0,9 % (wt/vol) NaCl (Saline) resuspendiert und erneut zentrifugiert. Die auf diese Weise gewaschenen Zellen werden noch ein weiteres Mal gewaschen, um eventuell den Geschmack beeinträchtigende Bestandteile der Kulturbrühe zu entfernen. Die Zellen werden letztlich in 50 ml Saline resuspendiert und bis zu ihrer Verwendung bei 4 °C aufbewahrt.

Vorbereitungen

196

3 Versuche

Die getrockneten Sojabohnen werden gewaschen und anschließend in einen Topf mit ausreichend Leitungswasser gegeben, damit diese aufquellen können. Pro 1 g Sojabohnen werden ca. 1 bis 1,5 ml Wasser aufgenommen. Je nach Raumtemperatur ist hierfür eine Inkubationszeit von ca. 12 bis maximal 24 Stunden erforderlich. Die gequollenen Sojabohnen werden für ca. 3 Stunden gekocht. Danach sollten die Bohnen durch leichten Druck zwischen den Fingern zerquetscht werden können. Entfernen Sie das Wasser mit einem Sieb oder durch Abkippen und überführen Sie die Sojabohnen in eine flache Schale aus Glas, Porzellan oder Kunststoff. Die Schichthöhe der Sojabohnen sollte etwa 3 bis 4 cm betragen. Der Gesamtansatz kann dabei auch auf mehrere Gefäße verteilt werden. Nachdem die Sojabohnen auf eine Temperatur von ca. 50 °C abgekühlt sind, geben Sie B. subtilis als Inokulum hinzu. Wenn Sie auf ein Natto Kin Präparat zurückgreifen, verwenden Sie von diesem 0,3 g, welches Sie zuvor in ca. 50 ml Wasser gelöst haben. Achten Sie in jedem Fall darauf, dass das Inokulum möglichst gleichmäßig über die Sojabohnen verteilt wird. Der Ansatz wird für 24 h in einem Brutschrank bei 40 °C inkubiert. Das Natto ist fertig zum Verzehr ( Abb. 3.94). Es kann in einem geschlossenen Behälter für maximal eine Woche im Kühlschrank bei Temperaturen zwischen 4 bis 10 °C gelagert werden. Betrachten Sie die im Natto vorhandenen Mikroorganismen im Phasenkontrast. Verwenden Sie hierzu den Schleim sowohl direkt als auch nach Herstellung einer Suspension von viel Schleim in wenig Wasser. Isolierung von PGA

Suspendieren Sie das entstandene PGA indem Sie zu 50 g des fertigen Natto 50 ml H2O geben und einige Minuten kräftig schütteln. Das PGA sollte dabei in Lösung gehen. Sie lassen die Suspension einige Minuten ruhig stehen und dekantieren dann den Überstand von den Feststoffen. Gegebenenfalls muss der Überstand anschließend noch einmal zentrifugiert werden (3.500 × g, 15 min). Mit dem klaren Überstand verfahren Sie wie beschrieben (V34 - S. 174), um PGA in reiner Form zu isolieren und später zu analysieren. Ermitteln Sie, wie viel PGA in den 50 g Natto vorhanden war.

Abb. 3.94.

Selbstfermentiertes Natto

Weiterführende Literatur Beuchat LR (1995) Indigenous Fermented Food. In: Rehm HJ, Reed G, Pühler A, Stadler P (eds) Biotechnology. vol 9, 2nd edn. Wiley-VCH, pp 505-559 Cober E, Reid JF, Pietrzak L, Voldeng H (2001) The Natto story: a niche market in Japan for Canadian small-seeded Soybean. Ag-Infotec, Heft 2 (Januar) Wang J, Fung DYC (1996) Alkaline-fermented Food: A review with emphasis on pidan fermentation. Critical Reviews in Microbiology 22:101-138

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

197

Nachgefragt 1. Nennen Sie fermentierte Agrarprodukte aus dem europäischen und asiatischen Raum! 2. Warum werden Agarprodukte häufig fermentiert, bevor Sie als Lebensmittel genutzt werden? Welche vorteilhaften Veränderungen können bei oder durch die Fermentation erfolgen? 3. Nennen Sie die drei verschiedenen Natto Produkte! 4. Welche signifikanten Unterschiede gibt es bei den drei Natto-Produkten bezüglich ihrer Herstellung? 5. Warum ist es vor ca. eintausend Jahren in Deutschland im Gegensatz zu Japan nicht zu einer Entwicklung von Verfahren zur Herstellung von Natto gekommen? 6. Warum müssen die Sojabohnen vor der Fermentation zur Herstellung von Natto quellen? 7. Weshalb werden die Sojabohnen vor der Fermentation gekocht oder gedämpft? 8. Welchem in der Mikrobiologie verbreiteten Verfahren kommt der Vorgang des Kochens bzw. Dämpfens gleich? 9. Warum werden bei der Fermentation zunächst bevorzugt die gelösten Kohlenhydrate und nicht die Stärke abgebaut? 10. Nennen Sie die korrekte und unkorrekte wissenschaftliche Bezeichnung des Mikroorganismus, der für die Fermentation von Sojabohnen zu Natto verantwortlich ist!

11. Beschreiben sie wichtige Eigenschaften dieses Mikroorganismus! 12. Warum würde die Fermentation der Sojabohnen auch erfolgen, wenn Sie mit dem Animpfen bereits beginnen, bevor die Temperatur auf 50 °C abgekühlt ist? 13. Erörtern Sie, wie früher und lange bevor kommerzielle Starterkulturen zur Verfügung standen, sichergestellt wurde, dass sich auf den vorbehandelten Sojabohnen geeignete Mikroorganismen ansiedeln und durchsetzen konnten! 14. Welche Organismen sind in der Lage, Poly(γ-D-glutamat) zu bilden? 15. Zeichnen Sie die chemische Strukturformel von Poly(γ-D-glutamat)! 16. Wie entsteht Poly(γ-D-glutamat) bei der Fermentation? Woher könnten die Bausteine stammen? 17. Beschreiben Sie, wie Sie in diesem Versuch ausgehend von Natto Poly(γ-D-glutamat) in reiner Form isoliert haben! 18. Woraus entsteht in reiferem Natto der Ammoniak? 19. Informieren Sie sich in Lehrbüchern, Lexika oder im Internet über die Herstellung von Kimchi! 20. Informieren Sie sich in Lehrbüchern, Lexika oder im Internet über die Herstellung von Sojasauce!

Herstellung von Tempeh

Versuch 39

Theoretischer Hintergrund Tempeh ( Abb. 3.95) ist ein weiteres Beispiel für ein traditionelles fermentiertes Lebensmittel aus Asien. Es ist dort besonders in Indonesien, Neuguinea und Surinam verbreitet. Tempeh erfreut sich aber auch zunehmender Beliebtheit in westlichen Ländern als Fleischersatz für Vegetarier. Bezüglich der Bedeutung fermentierter Lebensmittel für die Ernährung sei auf das vorangegangene Kapitel mit der Herstellung von Natto verwiesen. Auch bei der Herstellung von Tempeh handelt es sich um eine Abb. 3.95. Tempeh Festsubstratfermentation. Es gibt verschiedene Tempeh Produkte. Am verbreitetsten und beliebtesten ist Tempeh Kedelee, welches durch Fermentation von Sojabohnen mit verschiedenen Spezies der Gattung Rhizopus hergestellt wird. Daneben gibt es noch Tempeh Bongrek, welches durch Fermentation von Kokosnusspresskuchen entsteht. Auch andere Bohnen, Erbsen und sogar Getreide können zu Tempeh-Produkten fermentiert werden.

Verschiedene Tempeh Produkte

V38 - S. 193

198

3 Versuche Vorgänge bei der Herstellung von Tempeh

In diesem Versuch werden wir uns mit der Herstellung von Tempeh Kedelee, kurz Tempeh, beschäftigen. Beim traditionellen Herstellungsverfahren werden die Sojabohnen zunächst in Wasser gekocht und dann in frisches kaltes Wasser überführt. Wie bei der Herstellung von Natto erfolgt dann ein Aufquellen der Sojabohnen über Nacht in Wasser bei Raumtemperatur damit bei der später folgenden Fermentation der Wassergehalt für die Mikroorganismen ausreichend ist. Im Gegensatz zur Herstellung von Natto werden anschließend jedoch die Hülsen der Samen entfernt. Die Hülsen würden sonst das Eindringen des Pilzes in die Kotyledonen behindern. Es wird erneut kurz gekocht oder gedämpft. Durch diese einem Pasteurisieren gleich kommenden Vorgang soll die mikrobielle Begleitflora reduziert werden. Anschließend werden die vorbehandelten Sojabohnen mit der Starterkultur versetzt. Dabei handelt es sich entweder um Impfgut einer vorausgegangenen Tempeh Fermentation oder um Ragi Tempeh, einer kommerziellen Starterkultur. Anschließend werden die beimpften Sojabohnen sofort auf Kästen aus Bambusholz verteilt und dabei mit Blättern vom Bananenbaum eingehüllt. Bei einer Temperatur zwischen 30 und 38 °C wird dann für 1 bis 2 Tage inkubiert. Dabei muss für eine ausreichende Versorgung mit Sauerstoff gesorgt werden. Von dem hier beschriebenen Verfahren gibt es mehrere Varianten. Tempeh wird auch in großem Umfang kommerziell durch darauf spezialisierte Unternehmen produziert. Es werden dann meist weitere Modifikationen vorgenommen, um die Herstellung im industriellen Maßstab durchführen zu können.

Mikrobiologie von Tempeh

An der Fermentation sind eine Reihe von Mikroorganismen beteiligt. Die einzelnen Vorgänge und die Rolle der verschiedenen hieran beteiligten Mikroorganismen wurden noch nicht bis in alle Einzelheiten aufgeklärt. Es steht fest, dass ausschließlich Kulturen von Rhizopus Tempeh produzieren können. Rhizopus-Arten sind dafür bekannt, dass sie extrazelluläre Enzyme wie Lipasen, Proteasen, Phytasen, Carbohydrasen und andere ausscheiden. Rhizopus microsporus var. oligosporus ist in Indonesien der Hauptorganismus. Bei nicht industriellen Prozessen gibt es stets eine mehr oder weniger bedeutsame mikrobielle Begleitflora. Dies schließt Milchsäurebakterien (Lactobacillus casei, Enterococcus faecium und Staphylococcus epidermidis) sowie Hefen und andere Pilze (Pichia burtonii, Candida diddensiae und Rhodotorula rubra) ein. Verwunderlich ist dies nicht, wenn z. B. bekannt ist, dass die Enthüllung der Sojabohnen mit Füßen (barfuß!) in großen Fässern erfolgt. Während der Fermentation ändert sich das Verhältnis von gelösten zu unlöslichen Kohlenhydraten, der Gehalt an Lipiden ändert sich quantitativ und qualitativ und die Konzentrationen einiger Vitamine wie z. B. Riboflavin, Niacin und Vitamin B12 nehmen deutlich zu.

Verzehr

Tempeh ist ein leicht verderbliches Lebensmittel und sollte innerhalb eines Tages nach Fertigstellung verzehrt werden. Die Lagerzeit kann durch Trocknung von Scheiben in der Sonne verlängert werden. Andere Verfahren der Trocknung oder Einfrieren sind ebenfalls möglich, um fertiges Tempeh länger haltbar zu machen. Tempeh kann auf verschiedene Weise verzehrt und weiter zubereitet werden. Es wird entweder in dünne Scheiben geschnitten und dann direkt gegessen, in Kochsalzlösung eingetaucht oder in Kokosnussöl frittiert oder in kleine Stücke geschnitten und Suppen zugesetzt. Fritiertes Tempeh kann zum Verzehr mit Salz oder Sojasauce versetzt werden. Versuchsziel Mit diesem Versuch soll die Fermentation von Sojabohnen mit dem Pilz Rhizopus microsporus zu Tempeh demonstiert und ein verzehrbares Produkt hergestellt werden.

3.3 Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen

199

Versuchsdurchführung Die Stammhaltung und Anzucht der Stämme erfolgt auf Malzextrakt-Agar, auf dem der Pilz bei 28 °C inkubiert wird. Um Kontaminationen mit Bakterien vorzubeugen, sollte in Abständen von ca. einem Monat auf Rhizopus-Festmedium kultiviert werden. Fünf Tage vor Beginn der Tempeh-Fermentation sollten die Rhizopus-Stämme auf Sojabohnen-Agar angezogen werden, um eine optimale Adaption an das Substrat zu erreichen. benötigtes Material Geräte    

Kochtopf Sieb Trockenschrank (60 °C) autoklavenfeste Plastikbeutel (ca. 13 × 13 cm)  Brutschrank (32 °C)  Phasenkontrastmikroskop

Chemikalien und Medien      

Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril Malzextrakt-Festmedium ( S. 418) Rhizopus-Festmedium ( S. 425) Sojabohnen-Festmedium ( S. 426) Milchsäure-Lösung (90 %, wt/vol) Tween-Saline (Saline, zusätzlich mit 0,001%, vol/vol, Tween 80)

Mikroorganismen  Geeignete Rhizopus-Stämme, z. B. Rhizopus microsporus var. oligosporus (DSM 1964) oder Rhizopus microsporus var. chinensis (DSM 1834)

Ca. 500 g getrocknete Sojabohnen werden gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen. Sie werden dann in Leitungswasser für 30 min gekocht nachdem der pH-Wert durch Zugabe von Milchsäurelösung auf 5,0 eingestellt wurde. Von den gekochten Sojabohnen werden die Schalen gründlich mit den Fingern entfernt. Anschließend werden die Bohnen gewaschen, erneut für 30 min gekocht und dann zum Quellen für 15 min in dem Kochwasser stehengelassen. Pro 1 g Sojabohnen sollten insgesamt ca. 1 bis 1,5 g Wasser aufgenommen worden sein. Die vorbehandelten Sojabohnen werden für ca. 60 min bei 60 °C im Trockenschrank getrocknet bis sie oberflächlich trocken erscheinen. Die oberflächlich trockenen Sojabohnen werden zu je ca. 300 g in Plastikbeutel (ca. 13 × 13 cm) gefüllt und eingeschweißt und diese anschließend für ca. 20 min bei 121 °C autoklaviert. Die Schichthöhe der Sojabohnen in den Beuteln sollte ca. 2 cm betragen.

Sonstiges

Nach dem Abkühlen der autoklavierten Sojabohnen auf ca. 30 °C werden die Plastikbeutel auf beiden Seiten mehrfach mit einer sterilen Einmalpipettenspitze perforiert, so dass Löcher von ca. 2 mm Durchmesser entstehen. Von einer ca. 5 Tage alten Sojabohnen-Agarplatte werden die Pilzsporen mit 5 ml Tween-Saline abgeschwemmt und in der Suspension ein Titer von ca. 3 × 106 Sporen pro ml eingestellt. Ca. 2 ml dieser Sporensuspension werden in 100 μl Portionen als Inokulum durch verschiedene Löcher des Plastikbeutels auf die Sojabohnen gegeben. Anschließend wird in einem Brutschrank für 34 Stunden bei 32 °C inkubiert. In dem Brutschrank sollte eine relative Luftfeuchtigkeit von ca. 90 % eingestellt werden.  500 g getrocknete Sojabohnen

Nach ca. 34 Stunden Inkubation ist die Fermentation abgeschlossen. Die Sojabohnen sind danach vollständig von einem weißen Myzel durchwachsen und bilden eine feste Masse. Der Plastikbeutel wird nun vorsichtig entfernt, und das Tempeh ist zum Verzehr bereit. Es sollte innerhalb eines Tages verzehrt oder weiter verarbeitet werden. Betrachten Sie die in Tempeh vorhandenen Mikroorganismen unter dem Lichtmikroskop. Stellen Sie hierzu eine Aufschwemmung des Pilzmyzels in wenig Wasser her.

Vorbereitungen

200

3 Versuche

Weiterführende Literatur Beuchat, LR (1995) Indigenous fermented food. In: Rehm HJ, Reed G, Pühler A, Stadler P (eds) Biotechnology. vol 9, 2nd edn. Wiley-VCH, Weinheim, pp 505-559 Hachmeister KA, Fung DYC (1993) Tempeh – A mold-modified indigenous fermented food made from soybeans and or cereal-grains. Critical Reviews in Microbiology 19:137-188 Hering L, Bisping B, Rehm HJ (1991) Patterns and formation of fatty acids at tempe-fermentation by several strains of Rhizopus sp. Fat Science and Technology 93:303-308

Nachgefragt 1. Um was handelt es sich bei Tempeh? 2. Nennen Sie die verschiedenen Varianten von Tempeh! 3. Wo wird Tempeh hauptsächlich hergestellt? 4. Warum gewinnt Tempeh auch in westlichen Ländern eine zunehmend größere Bedeutung? 5. Erstellen Sie sich an Hand von Angaben in Lehrbüchern und Lexika sowie den Informationen, die Ihnen im Internet zugänglich sind, eine möglichst umfassende Liste fermentierter Lebensmittel und ordnen Sie diese geographischen Regionen zu! 6. Suchen Sie nach Gründen, weshalb sich in Europa Verfahren zur Fermentation von Hülsenfrüchten nicht entwickelt und durchgesetzt haben! 7. Warum müssen die Sojabohnen vor der Fermentation zur Herstellung von Tempeh aufquellen? 8. Weshalb müssen die Hülsen der Sojabohnen vor der Fermentation entfernt werden? 9. Weshalb werden die Sojabohnen vor der Fermentation gekocht oder gedämpft? 10. Weshalb müssen die vorbehandelten Sojabohnen vor der Fermentation in relativ flacher Schicht verteilt werden? Was würde geschehen, wenn die Sojabohnen eine sehr hohe Schicht bilden würden? 11. Was versteht man unter einer Starterkultur?

12. Warum sind die Sojabohnen nach der Fermentation in ein weißes, watteähnliches Geflecht eingebunden? 13. Erklären Sie, weshalb der Nährwert von Tempeh höher als der von lediglich gekochten Sojabohnen ist! 14. Welchem Mikroorganismus kommt bei der Herstellung von Tempeh eine zentrale Bedeutung zu? 15. Welche Mikroorganismen sind bei Tempeh häufig als Begleitorganismen zu finden? 16. Wie unterscheiden sich Tempeh und Natto voneinander hinsichtlich der Produkte selbst und hinsichtlich der eingesetzten Mikroorganismen? 17. Mit Natto und Tempeh haben Sie zwei Beispiele für fermentierte Sojabohnen kennen gelernt. Vervollständigen Sie die Liste mit anderen Beispielen für Fermentationen von Sojabohnen und den daran jeweils beteiligten Mikroorganismen. 18. Konsultieren Sie Lehrbücher der Mikrobiologie und beschreiben Sie Lebenscyclus und Zellformen von Rhizopus sp.! 19. Verschiedene Spezies der Gattung Rhizopus sind biotechnologisch interessant. Warum? Welche biotechnologischen Produkte werden mit ihnen hergestellt? 20. Nennen Sie Möglichkeiten der Aufarbeitung von Tempeh zum Verzehr!

3.4 Abbauleistungen von Mikroorganismen

3.4

Abbauleistungen von Mikroorganismen

Ein weiterer Aspekt, der Mikroorganismen interessant macht, ist deren Fähigkeit, eine Vielzahl von organischen Verbindungen abbauen zu können. Dies umfasst praktisch alle natürlichen Stoffe und auch einen großen Teil der von der Industrie produzierten Chemikalien. Die Suche nach Bakterien oder Pilzen, die eine bestimmte Verbindung abbauen können, ist meist erfolgreich. Diese Mikroorganismen verfügen häufig über Enzyme zum Abbau solcher Verbindungen, die auch für technische Anwendungen von großem Interesse sind. Organismen synthetisieren selbst keine Verbindungen, die prinzipiell nicht abbaubar wären und sich in der Biosphäre akkumulieren könnten. Sollte dennoch eine Akkumulation erfolgen, so liegen diese Verbindungen entweder in einem Habitat vor, in dem Mikroorganismen nicht wachsen und stoffwechselaktiv sein können, oder die chemische Struktur dieser Verbindungen wurde durch chemische Reaktionen bzw. Einwirkung physikalischer Kräfte so stark verändert, dass diese keiner natürlichen Verbindung mehr hinreichend ähnlich sind. Ob eine chemische Verbindung abbaubar ist oder nicht, hängt ausschließlich von ihrer chemischen Struktur und nicht von ihrer Herkunft ab. Allein die Tatsache, dass es sich nicht um eine natürliche Verbindung handelt, muss nicht besagen, dass sie persistent wäre und nicht abgebaut werden kann. Durch den Abbau werden die Bestandteile wieder in den Kreislauf der Elemente zurückgeführt, und viele toxische Verbindungen werden aus der Biosphäre entfernt. Natürlich sind auch den Mikroorganismen Grenzen gesetzt, was deren Abbaupotential angeht, und es gibt einige synthetische Verbindungen, die gar nicht oder nur sehr langsam abgebaut werden können – glücklicherweise, denn wir hätten sonst Schwierigkeiten, Materialien für Produkte mit einer langen Lebenszeit zu finden – leider, denn unter den nicht abbaubaren Verbindungen befinden sich einige, die große Probleme bereiten. Man denke an nicht abbaubare und Mülldeponien füllende Verpackungsmaterialien (z. B. Polyethylen) oder an toxische Insektizide (z. B. Dichlordiphenyltrichlorethan, DDT). In den letzten Jahren hat das Interesse der chemischen Industrie deutlich zugenommen, Verbindungen zu synthetisieren, die biologisch abbaubar sind und die dennoch die ihnen zugedachten Funktionen erfüllen können. Biologisch abbaubare Polyester wie z. B. Polymilchsäure oder Poly(3-hydroxybutyrat) sowie die Totalherbizide Glyphosat und Phosphinotricin sind hierfür Beispiele. In diesem Abschnitt des MIKROBIOLGISCHEN PRAKTIKUMS werden sieben Versuche angeboten, um Abbauleistungen von Mikroorganismen zu demonstrieren. Den Anfang bilden drei Versuche zum Abbau der Biopolymere Poly(3-hydroxybutyrat), Naturkautschuk und Stärke, die von Mikroorganismen bzw. Pflanzen synthetisiert werden. Im vierten Versuch soll demonstriert werden, dass eine Fotokopie, die aus zwei verschiedenen Komponenten besteht, zumindest partiell von Mikroorganismen abgebaut werden kann. Das aus Cellulose bestehende Papier wird abgebaut, während die aufgedruckten Buchstaben, die aus einer Mischung von Ruß und synthetischem Polymer bestehen, erhalten bleiben. Ein nachfolgender Versuch demonstriert, dass aliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe durch Mikroorganismen durchaus abgebaut und als Kohlenstoff- und Energiequelle zum Wachstum verwendet werden können. Die beiden letzten Versuche beschäftigen sich mit dem Abbau von Verbindungen synthetischen Ursprungs. Das in großen Mengen produzierte und verbreitete synthetische Polymer Polyethylenglykol wird ebenfalls von Mikroorganismen abgebaut. Das Gleiche gilt für das Totalherbizid Glyphosat, dessen Verwendung seit einigen Jahren in der öffentlichen Diskussion die Gemüter erregt. Im Gegensatz zu vielen relativ persistenten Herbiziden wird diese Verbindung, die nur auf Pflanzen wachstumshemmend wirkt, im Boden innerhalb kurzer Zeit durch Mikroorganismen abgebaut.

201

202

3 Versuche

Versuch 40

Mikrobieller Abbau von Poly(3-hydroxybutyrat) Theoretischer Hintergrund

Vorkommen von Polyestern in der Natur

HO HO

O HO Hyd rox ycin am säu in re

O

O

O

O n

Polym alat

Polyhydroxyalkanoate

V32 - S. 161

Einige wenige eukaryontische Mikroorganismen und die Riesenzellen des Myxomyceten Physarum polycephalum synthetisieren einen wasserlöslichen, aus Äpfelsäure bestehenden Polyester. Die Funktion dieses Polymalats wurde noch nicht vollständig aufgeklärt. Bakterien synthetisieren wasserunlösliche Polyester aus Hydroxyfettsäuren und Polyhydroxyakkumulieren diese alkanoate (PHA) als Speicherstoff für Energie und Kohlenstoff im Cytoplasma ( Tabelle 3.56).

Tabelle 3.56. Beispiele für PHA speichernde Bakterien Poly(3HB) und PHASCL Alcaligenes latus Allochromatium vinosum Bacillus megaterium Bradyrhizobium japonicum Haloferax mediterranei Ralstonia eutropha Rhodospirillum rubrum PHAMCL Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas mendocina Pseudomonas oleovorans Pseudomonas putida 2 Acetyl-CoA CoA

O O n

CoA

Acetoacetyl-CoA 2 [H]

CoA

Acetoacetat 3HB-CoA

2 [H]

Auf PHAs stoßen wir im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM in mehreren Versuchen. 3HB Der bekannteste mikrobielle Polyester ist Poly(3-hydroxybutyrat), Poly(3HB) und CoA Poly(3HB) wird von dem Gram-negativen Bakterium HO Ralstonia eutropha und sehr vielen anderen Bakterien synthetisiert. Daneben gibt es Abb. 3.96. Intrazellulärer Kreislauf von noch ca. 150 weitere Hydroxyfettsäuren, die Poly(3HB) in Ralstonia eutropha bereits als Bestandteile mikrobieller Polyester nachgewiesen wurden. Die Synthese einer so großen Anzahl von PHAs wird möglich durch sehr unspezifische PHA-Synthasen, welche die Coenzym A-Thioester verschiedenster Hydroxyfettsäuren unter Abspaltung von Coenzym A als Substrate nutzen können und dabei die Hydroxyfettsäurereste zu Polyesterketten verknüpfen. R. eutropha synthetisiert ausgehend von Fructose und Propionsäure als Kohlenstoffquellen den aus 3-Hydroxybutyrat und 3-Hydroxyvalerat bestehenden Copolyester Poly(3HB-co-3HV). Dieser und Poly(3HB) werden von der chemischen Industrie bereits seit einigen Jahren biotechnologisch mit R. eutropha produziert und unter dem Handelsnamen Biopol® vertrieben. R. eutropha und andere Poly(3HB) synthetisierende Bakterien produzieren i. d. R. auch Poly(4-hydroxybutyrat), Poly(4HB), wenn diese in Gegenwart geeigneter Kohlenstoffquellen kultiviert werden. Die bisher genannten PHAs bestehen aus Hydroxyfettsäuren kurzer Kettenlänge (englisch: short chain length) und werden auch als PHASCL 2

V53 - S. 273

Poly(3HB)

Polyester kommen in der belebten Natur in Pflanzen und Bakterien vor. Gemeinsam sind diesen Biopolymeren Oxoesterbindungen, mit denen die Bausteine kovalent verknüpft sind. Pflanzen synthetisieren Cutin ( Abb. 3.97) und Suberin (ein Polymer, welches Hydroxycinnaminsäure enthält), die den Zellen der oberirdischen Gewebe aufgelagert sind und dort vor allem vor einer übermäßigen Verdunstung von Wasser schützen sollen, aber auch einen gewissen mechanischen Schutz vor der Infektion mit Mikroorganismen und der Schädigung durch Insekten bilden.

3.4 Abbauleistungen von Mikroorganismen

O

C

O

O (CH2) 8 C

CH2 (CH2)5 CH

O

O

(CH2)8 HC

203

C

OH

(CH2)5 O O

HC

HC

OH

C

(CH2)5 C O H2

O

C

H (CH2)8 C

O

C

C

(CH2) 14 CH3

O

(CH2)14 CH2 O

O

(CH2)5 CH2 O

O H C (CH2) 8 C (CH2)5 CH2

O C CH

O

(CH2) 8

(CH2)8

(CH2)5

CH2

O

O CH

OH

O Abb. 3.97.

Struktur von Cutin

bezeichnet. Vertreter der Gattung Pseudomonas synthetisieren Polyester, die aus 3-Hydroxyfettsäuren mittlerer Kettenlänge (medium chain length) bestehen und als PHAMCL bezeichnet werden. Poly(3-hydroxyoctanoat), Poly(3HO), ist ein Beispiel hierfür. Mögliche Anwendungen von PHAs sind biologisch abbaubare und kompostierbare Verpakkungsmaterialien; aber auch medizinische und pharmazeutische Anwendungen werden erforscht. Oben wurde erwähnt, dass PHAs den Bakterien als intrazelluläre Speicherstoffe ( Abb. 3.96) dienen. Sie werden i. d. R. O dann synthetisiert und im Cytoplasma akkun muliert, wenn eine verwertbare Kohlenstoffquelle im Überschuss zur Verfügung steht, in H 2O Ermangelung eines anderen Nährstoffs, z. B. HB P der Stickstoffquelle, aber kein Wachstum s ra m ly o p e D mehr möglich ist. Sind dann jedoch wieder 3HB für das Wachstum förderliche Bedingungen vorhanden, weil z. B. wieder eine StickstoffO quelle vorhanden ist, dann können die PHAs wieder abgebaut werden und dienen als O Kohlenstoffquelle, besonders wenn keine - 1 n andere verwertbare extrazelluläre KohlenAbb. 3.98. Reaktion der PHA-Depolystoffquelle vorhanden ist. Der Abbau erfolgt merase. Gezeigt ist hier lediglich die Abspalin diesem Fall durch intrazelluläre PHA tung eines randständigen 3HB Moleküls von Poly(3HB). Hydrolysen an den Esterbindung Depolymerasen ( Abb. 3.98), welche die können auch mitten im Polyester erfolgen Oxoesterbindungen durch Anlagerung von Wasser hydrolytisch spalten. Hierdurch entstehen Oligomere und schließlich Monomere der zuvor in den PHAs vorhandenen Hydroxyfettsäuren. Im Falle des intrazellulären Abbaus von Poly(3HB) würde also freies 3-Hydroxybutyrat entstehen, die über Acetoacetat und Acetoacetyl-CoA in Acetyl-CoA überführt wird. Dadurch entsteht dann ein Intermediat des zentralen StoffO

V33 - S. 167

Intrazellulärer Abbau von PHAs

204

3 Versuche

wechsels, welches für den Anabolismus bereitsteht oder dem weiteren Abbau zwecks Energiegewinnung unterliegt. Extrazellulärer Abbau von PHAs

Zellen von Mikroorganismen, die PHAs als Speicherstoff akkumuliert haben, sterben in der Natur natürlich ab und lysieren. Dann steht anderen Mikroorganismen eine energiereiche Verbindung als Kohlenstoffquelle zur Verfügung. Da Polymere, abgesehen von DNA bei der Transformation und Konjugation, wegen ihrer Größe jedoch grundsätzlich nicht in eine Bakterienzelle Abb. 3.99. Abbau von PHAs durch Mikrotransportiert werden können, müssen die organismen im Boden. Eine Flasche aus PoPHA Moleküle zunächst außerhalb der ly(3HB-co-3HV) wurde für ca. 6 Wochen zur Zellen hydrolysiert werden. Dies geschieht Hälfte in Gartenerde eingegraben. Der von hier durch extrazelluläre PHA Depoly- Erde bedeckte Bereich der Flasche wurde merasen, die zunächst in der Zelle als Vor- vollkommen abgebaut läuferprotein synthetisiert werden und dann über ein Signalpeptid und unter Abspaltung desselben aus der Zelle hinaustransportiert werden. Die PHA-Depolymerasen hydrolysieren die Polyester in Oligomere, Dimere und Monomere, überführen damit den wasserunlöslichen Polyester in wasserlösliche niedermolekulare Spaltprodukte, die in die Zelle transportiert werden können und dann dort in Intermediate des zentralen Stoffwechsels überführt werden ( Abb. 3.99). Besonders detailliert wurde der Abbau von PHAs in dem darauf spezialisiertem Bakterium Paucimonas lemoignei (früher: Pseudomonas lemoignei) untersucht. P. lemoignei besitzt mindestens sieben verschiedene (!) PHA Depolymerasen.

Verbreitung des extrazellulären Abbaus

Relativ viele Bakterien und Pilze sind in der Lage, Poly(3HB) oder andere PHAs durch PHA Depolymerasen abzubauen. Bei der weiten Verbreitung dieser Polyester in der Natur überrascht dies nicht. Darüber hinaus sind Enzyme, die Esterbindungen des verbreiteten Cutins der Pflanzen ( Abb. 3.97) hydrolysieren können und als Cutinasen bezeichnet werden, häufig in der Lage, auch lineare aliphatische Polyester wie Poly(ε-caprolacton) oder PHAs zu hydrolysieren. Esterasen und Lipasen stellen eine weitere Enzymgruppe dar, die potentiell zur Hydrolyse von PHAs in der Lage sind. Auch die natürlichen, ebenfalls Oxoesterbindungen enthaltende Substrate dieser Enzyme sind hydrophob; lediglich die Substituenten an den Oxoesterbindungen sind verschieden. Es wurde wiederholt gezeigt, dass PHAs, die aus ω-Hydroxyfettsäuren aufgebaut sind, durch Lipasen hydrolysiert werden. Die Polymerketten dieser PHAs enthalten keine Alkylreste als Substituenten am Polymerrückgrat, während hier beim Poly(3HB) ein Methylrest und beim Poly(3HO) sogar ein Pentylrest stehen. Poly(4HB) ist ein Beispiel für einen durch Esterasen und Lipasen hydrolysierbaren Polyester. Vorhandene Alkylreste scheinen die zu hydrolysierende Esterbindungen vor einem Zugriff der Lipasen abzuschirmen. Poly(3HB) wird daher durch Lipasen nicht hydrolysiert. Dieser Befund ist im Hinblick auf die Auswahl von biologisch abbaubaren PHAs für medizinische Anwendungen wichtig. Denn bei diesen Anwendungen darf ein Abbau nur durch körpereigene Enzyme erfolgen; PHA abbauende Mikroorganismen dürfen im Körper nicht vorkommen!

3.4 Abbauleistungen von Mikroorganismen

Abb. 3.100. Klär- bzw. Fresshöfe um Kolonien eines PHA abbauenden Bakteriums auf einem festen Nährboden, der Poly(3HB) als alleinige Kohlenstoffquelle enthielt

205

Mikroorganismen, die Polymere extrazellulär abbauen, um diese als Kohlenstoffquelle zu erschließen, werden daran erkannt, dass sie Fresshöfe ( Abb. 3.100) um ihre Kolonie herum ausbilden. Diese Fresshöfe werden als Klärhöfe direkt sichtbar, wenn es sich wie im Fall von PHAs um ein wasserunlösliches Substrat handelt und wenn dieses als feinstes Pulver im Nährboden verteilt ist. Dann erscheint der Nährboden zunächst trüb. Im Klärhof wurde das Polymer abgebaut und in wasserlösliche Monomere überführt, und der Nährboden erscheint nun klar. Diese Methode ist auch auf einige Kautschuk abbauende Bakterien anwendbar. Es ist nicht anwendbar auf Bakterien, die extrazelluläre Polymere nur durch direkten Zellkontakt abbauen können. Ist das zu untersuchende Polymer wasserlöslich, können die Fresshöfe unter Umständen durch Anfärben der nicht abgebauten Polymere sichtbar gemacht werden.

Nachweis des Abbaus durch Klärhöfe

V41 - S. 207

V42 - S. 212

Versuchsziel Bei diesem Versuch werden gut charakterisierte bakterielle Isolate (Comamonas testosteroni und Paucimonas lemoignei, früher: Pseudomonas lemoignei) zur Demonstration des extrazellulären Poly(3HB)-Abbaus eingesetzt. Da die Poly(3HB)-Depolymerasen in das Medium ausgeschieden werden, kann man die sie ausscheidenden Bakterienkolonien auf Poly(3HB)-haltigem Festmedien aufgrund des Löslichkeitsunterschiedes von Polymer und Monomer anhand von direkt sichtbaren Fress- oder Klärhöfen erkennen. Das Substrat, Poly(3HB), ist unter dem Handelsnamen Biopol® kommerziell verfügbar. benötigtes Material Geräte    

Glaspipetten (steril) Impföse Bunsenbrenner Autoklav

Chemikalien und Medien  Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl)  Standard I-Festmedium ( S. 427)  Poly(3HB)-haltiges Doppelschichtmedium ( S. 423)  Poly(3HB) aus Versuch 32 bzw. von der Fa. Sigma

Mikroorganismen  Comamonas testosteroni DSM 6781  Paucimonas lemoignei DSM 7445

Während der eigentliche Abbauversuch keine besonderen mikrobiologischen Arbeitsweisen beinhaltet, so führt die vorbereitende Herstellung des Poly(3HB)-haltigen Festmediums in die Technik der so genannten Doppelschicht-Agarplatten (overlay agar plates,  Abb. 5.2, S. 356) ein, die häufig zum Nachweis Polymer abbauender Mikroorganismen eingesetzt werden, die extrazelluläre Enzyme ausscheiden. Versuchsdurchführung Nach Erhalt der Stämme werden diese – wenn nicht anders von der Bezugsquelle (DSMZ) angegeben – in wenig steriler Saline suspendiert und per Drei-Strich-Ausstrich ( M4, S. 365) auf Standard I-Festmedium ausgestrichen. Die Platten werden bei 30 °C

Vorbereitungen

206

3 Versuche

bebrütet. Das bewachsene Festmedium kann bis zur Verwendung im Kühlschrank (4 °C) gelagert werden. Ausgehend von dem Material einer Einzelkolonie wird ein Drei-Strich-Ausstrich (M4, S. 365) auf Doppelschicht-Festmedium mit Poly(3HB) durchgeführt. Die Platten werden bei 30 °C inkubiert und täglich auf die Bildung von Fresshöfen kontrolliert. Doppelschichtmedien bieten bei der Untersuchung von Mikroorganismen, die Kohlenstoffquellen vor der Verwertung zunächst durch extrazelluläre Enzyme spalten müssen, zwei Vorteile: Zum einen wird Substrat gespart, da es nur im oberen Teil der Platte eingesetzt wird; zum anderen werden auftretende Fresshöfe deutlicher sichtbar, da sie sich schärfer von dem Teil des Nährboden abgrenzen, in dem noch kein Abbau erfolgt ist ( Abb. 5.2, S. 356). Weiterführende Literatur Abe H, Doi Y (2002) Molecular and material design of biodegradable poly(hydroxyalkanoate)s. In: Doi Y, Steinbüchel A (eds) Biopolymers – Polyesters II, vol 3b. Wiley-VCH, Weinheim, pp 105-132 Jendrossek D, Schirmer A, Schlegel HG (1995) Biodegradation of polyhydroxyalkanoic acids. Applied Microbiology and Biotechnology 46:451-463 Jendrossek D (2002) Extracellular polyhydroxyalkanoate depolymerases: the key enzymes of PHA degradation. In: Doi Y, Steinbüchel A (eds) Biopolymers – Polyesters II, vol 3b. Wiley-VCH, Weinheim, pp 41-83 Mukai K, Doi Y, Sema Y, Tomita K (1993) Substrate specificities in hydrolysis of polyhydroxyalkanoates by microbial esterases. Biotechnology Letters 15:601-604 Steinbüchel A, Valentin HE (1995) Diversity of bacterial polyhydroxyalkanoic acids. FEMS Microbiology Letters 128:219-228

Nachgefragt 1. Nennen Sie drei unterschiedliche Polyester, die in der Natur vorkommen, und Beispiele für Organismen, die diese synthetisieren! 2. Zeichnen Sie die Strukturformeln von Poly(3HB), Poly(4HB) und Poly(3HO)! 3. Was versteht man unter ω-Hydroxyfettsäuren? Nennen Sie Beispiele hierfür! 4. Welche Funktion haben PHAs in Bakterien? 5. Nennen Sie mindestens jeweils drei Bakterienspezies, die Poly(3HB) bzw. Poly(3HAMCL) synthetisieren können! 6. Warum müssen Bakterien, die PHAs synthetisieren, auch in der Lage sein, diesen Polyester wieder abzubauen? 7. Welche biochemische Reaktion katalysieren PHA Depolymerasen? 8. Wie kann man sich die hohe Anzahl von Mikroorganismen im Boden erklären, die extrazelluläre PHAs abbauen und als alleinige Kohlenstoffquelle zum Wachstum verwerten können? 9. Weshalb ist die biologische Abbaubarkeit von Poly(3HB) und anderer PHAs für die Industrie von Interesse? 10. Nennen Sie den Namen eines im Hinblick auf den Abbau von PHAs besonders gut untersuchen Bakteriums! 11. Wie unterscheiden sich intrazelluläre von extrazellulären PHA Depolymerasen?

12. Informieren Sie sich in Lehrbüchern der Biochemie, wie Proteine aus einer Bakterienzelle herausgeschleust werden! 13. Für die Verwertung welcher Verbindungen außer von PHAs muss es noch extrazelluläre Enzyme geben? 14. Warum kann eine Lipase unter Umständen Poly(4HB) hydrolysieren, Poly(3HB) jedoch nicht? 15. Was versteht man unter Klär- bzw. Fresshöfen? 16. Welche Eigenschaften müssen Polymere oder auch andere Substanzen aufweisen, damit deren Abbau an Hand von Klärhöfen erkannt werden kann. 17. Erstellen Sie eine möglichst umfangreiche Liste von Biopolymeren und anderen Substanzen, bei denen man den biologischen Abbau durch Klärhofe sichtbar machen kann! 18. Weshalb können PHAs auch weit entfernt von der Zelle abgebaut werden? 19. Wie muss der Abbau einer polymeren Verbindung bei einem Bakterium erfolgen, das keine Fresshöfe ausbildet? 20. Welche chemische Struktur sollte ein Polyester besitzen, der nach einem Knochenbruch bei einem chirurgischen Eingriff als Stützmaterial implantiert werden und dann langsam resorbiert werden soll, um die Stütze nicht durch eine erneute Operation entfernen zu müssen?

3.4 Abbauleistungen von Mikroorganismen

Mikrobieller Abbau von Kautschuk

207

Versuch 41

Theoretischer Hintergrund Kautschuk ist ein Sammelbegriff für unvernetzte, aber durch Vulkanisation vernetzbare Polymere, die bei Raumtemperatur gummielastische Eigenschaften besitzen. Kautschuke werden in Naturkautschuke und Synthese-Kautschuke unterteilt. Naturkautschuk ist ein weit verbreitetes Polyisoprenoid und besteht aus kovalent verknüpften Isopreneinheiten in der cis-1,4-Konfiguration. Er ist Bestandteil des weißen Milchsafts zahlreicher DikotyleAbb. 3.101. Mikrobieller Abbau eines donen und kommt in ca. 2.500 verschieKondoms nach zweiwöchiger Inkubation denen Pflanzenarten vor. Naturkautschuk mit Gordonia polyisoprenivorans wird praktisch ausschließlich mit dem Kautschukbaum Hevea brasiliensis produziert. Dieser Baum liefert jährlich ca. 6,4 Millionen Tonnen dieses wichtigen Rohstoffs. Neben Naturkautschuk gibt es in der Natur noch einige weitere Polyisoprenoide von denen Guttapercha am bekanntesten ist. In Guttapercha liegen die Isopreneinheiten jedoch in der trans-1,4-Konfiguration vor, was diesem Polymer ganz andere Eigenschaften als Naturkautschuk verleiht. Synthesekautschuke können sich in ihrer chemischen Struktur beträchtlich unterscheiden; wie oben erwähnt, sind grundlegende Materialeigenschaften und weniger die chemische Struktur kennzeichnend für Kautschuke. Die chemische Industrie produziert weltweit jährlich ca. 10,9 Millionen Tonnen synthetische Kautschuke.

Polyisoprenoide

Naturkautschuk ist ein wichtiger Rohstoff für die Industrie, der bisher nicht vollständig durch synthetische Kautschuke der chemischen Industrie ersetzt werden kann. Naturkautschuk wird unmodifiziert, derivatisiert oder vulkanisiert verwendet. Laborhandschuhe aus Latex, Gummihandschuhe, Transportbänder und Transmissionsriemen, Dichtungen, Schläuche, Kondome, Babynuckel, Luftballons, Gummistiefel und Schuhsohlen, bestimmte Farben und Isoliermäntel von elektrischen Leitungen bestehen ganz oder teilweise aus Naturkautschuk, um nur einige Beispiele zu nennen. Eines der Haupteinsatzgebiete sowohl für Naturkautschuk als auch Synthesekautschuk sind jedoch Autoreifen. Jeweils mehr als die Hälfte der produzierten Kautschuke gehen in diesen Markt. In Deutschland fallen jährlich ca. 650.000 Tonnen Altreifen an. Von den abgefahrenen Autoreifen wird nur ein geringer Anteil des verbliebenen Kautschukmaterials recyclisiert oder in anderer Weise wieder verwertet. Ca. 50 % der Altreifen werden thermisch entsorgt bzw. genutzt, d. h. in Zement- oder Kraftwerken verbrannt. In den USA schätzt man die Anzahl der Altreifen, die auf speziellen Deponien gelagert werden, auf ca. 3 Milliarden Stück. Die Verwendung von Kautschuken erzeugt also auch ein großes Abfallproblem! Könnte man diesen Abfall nutzen, dann wären Altreifen nicht länger Abfälle sondern Reststoffe.

Naturkautschuk: Rohstoff und Reststoff

Das verbreitete Vorkommen großer Mengen von Naturkautschuk in der Biosphäre und die nicht beobachtete Akkumulation von Polyisoprenoiden in der Natur sowie Berichte über die Zerstörung kautschukhaltiger Materialien durch mikrobiellen Bewuchs geben klare Hinweise darauf, dass auch Naturkautschuk wie alle anderen von Organismen synthetisierten Verbindungen biologisch abbaubar ist. In der Tat sind seit längerer Zeit Mikroorganismen bekannt, die Naturkautschuk abbauen und als alleinige Kohlenstoff- und Energiequelle zum Wachstum verwerten können. Der Abbau erfolgt jedoch

Mikrobieller Abbau

n

Kautschuk

n

Guttapercha

208

3 Versuche

V40 - S. 202

sehr langsam und nur durch ein sehr eingeschränktes Spektrum fast ausschließlich Gram-positiver Bakterien und einiger Pilze. Die Schwierigkeit des Abbaus hat mehrere Ursachen. Zum einen enthält das Rückgrat des Polymers ausschließlich Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindungen. Anders als bei Polyestern oder Proteinen sind keine hydrolysierbaren Ester- oder Amidbindungen vorhanden. Zum anderen ist das Substrat vollkommen wasserunlöslich und ausgesprochen hydrophob; dadurch steht immer nur die Oberfläche und damit ein geringer Prozentsatz des Materials für einen enzymatischen Angriff zur Verfügung. Die Untersuchungen von Abbauprodukten deuten darauf hin, dass die Spaltung des Polyisoprenmoleküls nach Anlagerung von Sauerstoff an die Doppelbindung erfolgt und durch eine Oxygenase katalysiert wird CH3

CH3

CH3

O2

CH3

CH3

CH3

CH3 O

O R

R

Oxidative Spaltung

n

n

Oxidation

CoA CH3

CH3

CH3O

CH3 S-CoA

O

n

[H] H2O

Acetyl-CoA CH3

CH3

CH3O OH

CoA

n

CH3

CH3

O

CH3

CH3

O

CH3

O S-CoA n

OH n

CoA

O

O

Oxidation

H 2O CH3O

CH3

CO2 CH3O

CH3

CH3

O

CH3

O S-CoA O

n

n

Subterminale Oxidation

ω-Oxidation

CoA O

CH3

CH3O

CH3

S-CoA

O

S-CoA

CH3O

CH3

O

n

n

CoA

Propionyl-CoA

CoA

O S-CoA H3C Acetyl-CoA

H3C

CH2 OH

Ethanol CH3O

CH3

S-CoA

O

S-CoA

CH3O

-

COO

O

Pyruvat

Abb. 3.102.

O

n

CH3 O

Hypothetischer Abbauweg von Kautschuk

S-CoA

CH3 O

O

H3C Acetyl-CoA

3.4 Abbauleistungen von Mikroorganismen

209

( Abb. 3.102). Bisher wurde der Abbau von Naturkautschuk auch nur unter aeroben Bedingungen nachgewiesen. Sicherlich muss in der Natur auch an anaeroben Standorten ein Abbau erfolgen; dieser konnte bisher jedoch noch nicht gezeigt werden. Tabelle 3.57. terien

Kautschuk abbauende Bak-

Klärhof-bildende Bakterien Actinoplanes missouriensis Micromonospora aurantiaca Streptomyces cinnamonensis Adhäsiv wachsende Bakterien Gordonia polyisoprenivorans Gordonia westfalica Mycabacterium fortuitum Nocardia sp.

Kautschuk abbauende Bakterien werden in Bezug auf ihr Wachstum in zwei Gruppen unterteilt ( Tabelle 3.57): Mitglieder der ersten Gruppe bilden auf Latex-haltigen Festmedien Klärhöfe. Diese Bakterien scheiden offensichtlich Enzyme oder Agenzien aus, die Naturkautschuk auch in einer gewissen Entfernung von der Zelle spalten können. Zu dieser Gruppe gehören meist Mycel-bildende Actinomyceten wie Vertreter der Gattungen Actinoplanes, Micromonospora und Streptomyces. Mitglieder der zweiten Gruppe bilden keine Klärhöfe und sind auf den direkten Kontakt zum Substrat angewiesen, auf dem sie adhäsiv wachsen und einen Biofilm bilden. In dieser Gruppe findet man die potenteren KautschukAbbauer. Diese Art des Abbaus von Kautschuk scheint verbreiteter als ursprünglich angenommen zu sein und kommt bei Vertretern der Gattungen Gordonia, Mycobacterium und Nocardia vor. Gordonia polyisoprenivorans ist ein diesbezüglich besonders gut untersuchtes Bakterium. Versuchsziel

Abb. 3.103. Versuchsanordnung zur Bestimmung der Mineralisation von Kautschuk durch Mikroorganismen

In diesem Versuch soll gezeigt werden, dass Gordonia polyisoprenivorans und Gordonia westfalica kommerziell erhältliche Latex-haltige Materialien (Handschuhe, Kondome usw.) und flüssiges Latex-Konzentrat als alleinige Kohlenstoffquelle zum Wachstum verwerten können. Hierzu wird das zu untersuchende Material in Mineralsalzmedium unter aeroben Bedingungen mit einer Reinkultur von G. polyisoprenivorans bzw. G. westfalica kultiviert. Der Abbau wird anhand der CO2-Entwicklung als Maß für die Polymerzersetzung und der Lebendkeimzahl als Wachstumsparameter verfolgt.

Kautschuk verwertende Mikroorganismen

210

3 Versuche

Versuchsdurchführung Vorbereitungen

Nach Erhalt der Stämme werden diese – wenn nicht anders von der Bezugsquelle (DSMZ) angegeben – in wenig steriler Saline suspendiert und per Drei-Strich-Ausstrich (M4, S. 365) auf Standard I-Festmedium ausgestrichen. Die Platte wird bei 30 °C bebrütet. Das bewachsene Festmedium kann bis zur Verwendung im Kühlschrank (4 °C) gelagert werden. Vorkultur: Mit dem Zellmaterial einer Einzelkolonie von G. westfalica und G. polyisoprenivorans werden jeweils 20 ml Standard I-Flüssigmedium in einem 200 mlErlenmeyerkolben angeimpft und für 48 Stunden bei 30 °C unter Schütteln inkubiert. Die Vorkulturen werden 15 min bei 3.500 × g und 4 °C in sterilen Schraubdeckelröhrchen zentrifugiert. Die Zellpellets werden jeweils in ca. 20 ml steriler Saline resuspendiert, erneut zentrifugiert und schließlich in 3 ml Saline aufgenommen. Mit jeweils 1 ml der Zellsuspension werden die beiden im Folgenden angegebenen drei Hauptkulturen angeimpft; mit dem Zeitpunkt des Animpfens ist der Startpunkt (t = 0 h) definiert.

benötigtes Material Geräte  200 ml-Erlenmeyerkolben  Sechs 500 ml-Erlenmeyerkolben mit Gewinde und Deckel  Schraubdeckelröhrchen, steril  Kühlzentrifuge für die Zellernte (3.500 × g)  Glaspipetten (steril)  Impföse  Bunsenbrenner  Schüttler (30 °C)  Bürette  Autoklav

Chemikalien und Medien     

Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril Standard I-Festmedium ( S. 427) Standard I-Nährlösung ( S. 427) Mineralsalzmedium ( S. 421) Latex-Konzentrat (Bezugsquelle: Fa. Weber & Schäfer, Postfach 106503, 20044 Hamburg)  Bariumhydroxid-Lösung (0,25 M Ba(OH)2) in einem Reagenzglas, autoklaviert  Phenolphthalein-Lösung (1 %, wt/vol, in Isopropanol)  Salzsäure (0,25 M HCl)

Mikroorganismen Das Medium für die Hauptkulturen besteht aus jeweils 50 ml Mineralsalzmedium. Ein  Gordonia westfalica DSM 44215 Kolben wird mit zerkleinerten Latex Gordonia polyisoprenivorans DSM 44302 Gebrauchsartikeln versetzt. Die beiden Sonstiges anderen werden durch Zugabe von flüssigem Latex-Konzentrat auf 0,5 % (wt/vol) Kau Gebrauchsartikel aus Latex (Einmaltschuk eingestellt. In einen dieser beiden handschuhe, Kondome) Kolben wird zusätzlich ein Reagenzglas mit 15 ml einer Bariumhydroxid-Lösung gegeben; als Kulturgefäße dienen 500 mlErlenmeyerkolben mit gasdicht schließendem Deckel (mit Gewinde,  Abb. 3.103). Neben diesen beimpften Ansätzen werden drei weitere Ansätze mit gleichem Inhalt, jedoch unbeimpft als Kontrollen auf nicht-biologischen Abbau mitgeführt. Es werden unmittelbar nach Animpfen (t = 0 h) kontaminationsfrei Proben für die Lebendzellzahlbestimmung entnommen. Dazu wird mit steriler Saline eine Verdünnungsreihe bis 10-5 angesetzt (M3, S. 363); bei späteren Kultivierungszeiträumen sollte der Bereich bis maximal 10-10 ausgedehnt werden. Je 0,1 ml der einzelnen Verdünnungen werden mit dem Drigalski-Spatel (M4, S. 366) flächig auf Standard IFestmedium ausplattiert. Diese Platten werden bei 37 °C bebrütet und können nach ein bis zwei Tagen Inkubation ausgezählt werden. Die sechs Versuchsansätze zum Latexabbau werden bei 30 °C geschüttelt.

3.4 Abbauleistungen von Mikroorganismen

211

Benötigte Differenz-Menge HCl [ml] × 0,25 M Mineralisation (% CO2) =

C-Gehalt der eingesetzten Substratmenge [mmol] × 2 a

Abb. 3.104. Berechnung der Mineralisation a Die Bildung eines Mols BaCO benötigt 1 Mol CO , die Titration jedoch 2 Mol HCl 3 2

Alle drei Tage wird eine weitere Probe für die Lebendzellzahlbestimmung gezogen. Alle fünf Tage erfolgt die Bestimmung des bei der Mineralisierung entstandenen CO2: Mit der im Folgenden beschriebenen Vorgehensweise kann die Mineralisation der Isoprenoidbestandteile im eingesetzten Latex-Konzentrat bestimmt werden; der Anteil dieser Fraktion beträgt in der Regel ca. 90 bis 95 %, während der verbleibende Rest aus Nicht-Isoprenoiden besteht, deren Mineralisation hier nicht von Interesse ist. Dies bedeutet, dass erst Mineralisationsgrade von mehr als 5 bis 10 % tatsächlich auf den Abbau von Isoprenoiden hinweisen. Für die Berechnung der Mineralisation wird vorausgesetzt, dass die eingesetzte Menge an Latex-Substrat vollständig als Kohlenstoff vorliegt, d. h. dass ein Mol CO2 aus einem Mol Kohlenstoff des Latex-Substrats und einem Mol O2 entsteht. Der Menge Sauerstoffs im verwendeten gasdichten Erlenmeyerkolben (500 ml mit Gewinde,  Abb. 3.103) beträgt 4,2 mmol und ist ausreichend, um den aeroben Abbau zwischen zwei Messpunkten mit Sauerstoff zu versorgen; bei jeder Messung werden durch Öffnen des Kolbens erneut 4,2 mmol zugeführt. Für die Messung werden zunächst die Kolben geöffnet, die Reagenzgläser mit Ba(OH)2Lösung werden entnommen und durch frische ersetzt. Aus den entnommenen Reagenzgläsern werden zunächst 10 ml des Überstandes entnommen. Diese Lösung wird mit 20 μl Phenolphthalein-Lösung (pH-Indikator) versetzt. Aus einer Bürette gibt man vorsichtig Salzsäure bis zum Farbumschlag zu; das Volumen wird protokolliert. Die Differenz der dabei benötigten Menge HCl zu der für die Lösung aus dem nichtbeimpften Ansatz benötigten ist ein Maß für die während der Kultivierung gebildete CO2-Menge, welche durch die Mineralisierung entsteht und als BaCO3 ausfällt ( Abb. 3.104). Es werden die letzten Proben genommen. Die Ergebnisse der Lebendzellzahlbestimmung und der Mineralsiation werden tabellarisch und in einer Graphik gegen die Zeit dargestellt. Weiterführende Literatur Arenskötter M, Baumeister D, Bröker D, Ibrahim EMA, Rose K, Steinbüchel A (2002) Mikrobieller Abbau von Natur- und Synthesekautschuk. BIOforum 3:124-126 Linos A, Steinbüchel A, Spröer C, Kroppenstedt RM (1999) Gordonia polyisoprenivorans sp. nov., a rubber degrading actinomycete isolated from automobile tire. International Journal of Systematic Bacteriology 49:1785-1791 Linos A, Steinbüchel A (2001) Biodegradation of natural and synthetic rubbers. In: Koyama T, Steinbüchel A (eds) Biopolymers – Polyisoprenoides, vol 2. Wiley-VCH, Weinheim, pp 321-359

Bestimmung der Mineralisation

212

3 Versuche

Nachgefragt 1. Was versteht man unter dem Sammelbegriff Kautschuk? 2. Zeichnen Sie die chemische Strukturformel von Naturkautschuk! 3. Wie unterscheiden sich die chemischen Strukturen von Naturkautschuk und Guttapercha? 4. Nennen Sie andere wichtige Bestandteile von Zellen, die Isopren als Baustein enthalten! 5. Konsultieren Sie ein Lehrbuch der Organischen Chemie und erstellen Sie eine Übersicht der wichtigsten synthetischen Kautschuke und ihrer chemischen Strukturen! 6. Wie viel Naturkautschuk und wie viel Synthesekautschuk werden weltweit jährlich etwa produziert? 7. Erstellen Sie eine Liste von Gegenständen aus dem Alltag, die Naturkautschuk enthalten! 8. Was versteht man unter Vulkanisation? 9. Machen Sie an Hand der Anzahl der in Deutschland zugelassenen Kraftfahrzeuge, der durchschnittlichen Fahrleistung und der durchschnittlichen Lebensdauer von Autoreifen (in km) eine Abschätzung, wie viele Altreifen in Deutschland jährlich anfallen! 10. Berechnen Sie, wie viel Reifenabrieb jährlich an unseren Straßen anfällt, wenn während der Nutzung aller Reifen die Profiltiefe von 8 auf 2 mm „heruntergefahren“ wird!

Versuch 42

11. Wie werden Altreifen heute hauptsächlich entsorgt? 12. Welche Pflanze ist die Hauptquelle für den von der Industrie genutzten Naturkautschuk? Orientieren Sie sich in Lehrbüchern der Botanik über die Herkunft dieser Pflanze und wo diese jetzt überwiegend angebaut wird! 13. Orientieren Sie sich in Lehrbüchern der Biochemie über die unterschiedlichen Bindungstypen von Bausteinen in Biopolymeren! 14. Nennen Sie Gründe für den langsamen und schweren Abbau von Kautschuken! 15. Beschreiben Sie den vermuteten Mechanismus des enzymatischen Abbaus von Naturkautschuk! 16. Warum kann Naturkautschuk nicht hydrolytisch gespalten werden? 17. In welche zwei Klassen lassen sich Kautschuk abbauende Mikroorganismen bezüglich der Abbaustrategie einteilen? 18. Nennen Sie beispielhaft Bakterien, die der einen bzw. anderen Gruppe angehören! 19. Was fällt Ihnen auf, wenn Sie die taxonomische Stellung der in diesem Kapitel genannten Kautschuk abbauenden Bakterien betrachten? 20. Warum sollten die beim Abbau untersuchten Kautschukmaterialien vor ihrem Einsatz als Kohlenstoff- und Energiequelle zerkleinert werden?

Mikrobieller Abbau von Stärke Theoretischer Hintergrund

Ein bedeutender nachwachsender Rohstoff

Stärke ist ein bedeutender nachwachsender Rohstoff, der überwiegend aus Pflanzen gewonnen wird. Stärke liegt dort in den Zellen verschiedener Organe unlöslich in Form von Stärkekörnchen vor. Diese Stärkekörnchen haben eine für die jeweilige Pflanze typische Form, Struktur und Größe. Die mit Abstand bedeutendste Quelle für Stärke ist Getreide mit einer globalen Weltproduktion von ca. 2 Milliarden Tonnen und einem Gehalt von ca. 1,23 Milliarden Tonnen Stärke, wobei bis zu 87 % aus nur drei Pflanzen (Reis, Mais und Weizen) stammen. Knollen und Wurzeln bildende Pflanzen sind mit 0,68 Milliarden Tonnen und einem Stärkegehalt von 140 Millionen Tonnen die zweitwichtigste Quelle, wobei wiederum 92 % aus nur drei Pflanzen (Kartoffeln, Cassava und süßen Kartoffeln) stammen. Die drittwichtigste Quelle, die Hülsenfrüchte (Erbsen, Bohnen und Linsen), liefern bereits nur noch 60 Millionen Tonnen Früchte mit insgesamt lediglich 20 Millionen Tonnen Stärke. Von der durch Pflanzen produzierten Stärke wird ein kleiner Teil außerhalb des Nahrungsmittelbereichs für unterschiedlichste Anwendungen genutzt. In der Europäischen Union sind dies jährlich ca. 3,4 Millionen Tonnen Stärke.

Zusammensetzung und chemische Struktur

In den meisten Pflanzen setzt sich Stärke aus Amylose und Amylopektin zusammen. Amylose besteht aus linearen, nahezu unverzweigten Ketten α-1,4-glycosidisch verknüpfter Glucosemoleküle ( Abb. 3.105). Polymerisationsgrad und Molekulargewichtsverteilung variieren in Abhängigkeit von der Pflanze; es wurden Molekulargewichte zwischen 1 × 105 und 1 × 106 nachgewiesen. Die Amylosemoleküle

3.4 Abbauleistungen von Mikroorganismen HO CH2

213

HO CH2 O

HO CH2 O

OH

O

OH

OH

O OH

HO CH2

OH

HOCH2

O

O OH

OH

O

O OH

CH2

O

OH OH

OH

HOCH2

O

OH

Abb. 3.105.

O

O

O OH

O OH

Struktur von Amylose (Hauptstrang) bzw. Amylopektin (häufig verzweigt)

liegen gewunden in einer Art Doppelhelix mit einer Ganghöhe von 2,1 nm vor. Amylopektin ( Abb. 3.105) hat die gleiche Grundstruktur, besitzt jedoch Molekulargewichte zwischen 1 × 107 und 1 × 109 Da. Zudem ist es wesentlich stärker verzweigt, wobei relativ kurze Ketten α-1,4-glycosidisch verknüpfter Glucosemoleküle (Anzahl 20 bis 120) im Durchschnitt an jedem 20. Glucoserest α-1,6-glycosidisch an die Hauptkette angeknüpft sind. Stärke ist also aus exakt den gleichen Bausteinen wie Cellulose aufgebaut. Da die Bausteine jedoch anders verknüpft sind und das Polymer verzweigt ist, haben beide Glucane sehr unterschiedliche Eigenschaften. Glycogen ist mit Amylopektin die Art der Bindungen und Verzweigungen betreffend vollkommen identisch. Es ist lediglich wesentlich stärker verzweigt. Glycogen ist der typische Speicherstoff tierischer Zellen und kommt dort besonders in der Leber vor. Der Vollständigkeit halber sei hier das ebenfalls ausschließlich aus Glucose aufgebaute Polysaccharid Pullulan erwähnt, welches in der Hefe Aureobasidium pullulans entdeckt wurde. Die Glucosemoleküle sind hier regelmäßig alternierend sowohl α-1,4 als auch α-1,6-glycosidisch miteinander verknüpft. Formal ist Pullulan aus MaltotrioseEinheiten (die drei Glucosemoleküle sind hier α-1,4 glycosidisch verknüpft) aufgebaut, die α-1,6-glycosidisch miteinander verbunden sind. Dextran, ein von Leuconostoc mesenteroides sups. dextranicum extrazellulär synthetisiertes Glucan, besteht aus α-1,6-glycosidisch verknüpfter Glucose und ist auch Gegenstand eines Versuches im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM. Tabelle 3.58. nismen

Amylolytische Mikroorga-

Bakterien Bacillus amyloliquefaciens Bacillus licheniformis Bacillus subtilis Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes Geobacillus stearothermophilus Klebsiella pneumoniae Paenibacillus polymyxa Pilze Aspergillus oryzae Aspergillus niger Rhizopus niveus

Die Fähigkeit zum Abbau von Stärke und deren Verwertung als alleinige Kohlenstoffquelle kommt sowohl in Bakterien als auch in Pilzen vor. Die amylolytischen Aktivitäten sind nicht auf bestimmte Organismengruppen beschränkt. Bei Bakterien findet man jedoch besonders viele Vertreter in der Gattung Bacillus und bei den saccharolytischen Clostridien ( Tabelle 3.58).

Mikroorganismen, die Stärke abbauen, um sie als Kohlenstoffquelle zum Wachstum verwerten, müssen stärkeabbauende Enzyme aus der Zelle ausscheiden, welche die Stärke zunächst außerhalb der Zelle in Glucose oder Oligomere von Glucose hydrolysieren. Erst diese Spaltprodukte können dann in die Zelle transportiert und dort weiter verstoffwechselt werden. Kultiviert man stärke-

V43 - S. 216

Weitere Glucane

V29 - S. 150

Stärkeabbauende Mikroorganismen

Nachweis des Abbaus

214

3 Versuche

HO CH2

OH

V40 - S. 202

OH

O OH

HO CH2 O

O

OH

OH

HO

HO CH2 O

O

OH

Abb. 3.106.

HOCH2

HO CH2 O

OH

OH O

O

HO OH

OH

OH OH

Strukturformeln von Maltose (links) und Maltotriose (rechts)

abbauende Mikroorganismen auf festen Nährmedien, die Stärke fein verteilt als Kohlenstoffquelle enthalten, so bilden sich um die Kolonien herum sogenannte Fresshöfe oder Klärhöfe in denen die Stärke abgebaut wurde ( Abb. 3.107). Da Stärke wasserlöslich ist, ist das Verschwinden der Stärke in diesen Fresshöfen im Gegensatz zur Situation beim Abbau der wasserunlöslichen Polyhydroxyalkanoate nicht direkt sichtbar. Die Klärhöfe können jedoch durch Anfärbung mit Lugolscher Lösung sichtbar gemacht werden. Lugolsche Lösung ist eine Lösung von Jod (I2) und Kaliumjodid (KI) in Wasser. Jod bildet mit der Amylose der Stärke eine charakteristische Einschlussverbindung, woraus ein intensiv blau gefärbter Jodstärke-Komplex entsteht. Dieser sehr empfindliche und spezifische Nachweis sowohl für Stärke als auch für Iod wird als JodstärkeReaktion bezeichnet ( M16, S. 384). Nach Anfärbung entsprechender Festmedien geben sich Fresshöfe als helle Areale um die Kolonien herum zu erkennen, wohingegen der Agar außerhalb der Fresshöfe dunkelblau gefärbt ist.

Beteiligte Enzyme

Am Abbau von Stärke bzw. ihrer Komponenten sind mindestens drei unterschiedliche Enzyme beteiligt. α-Amylasen spalten die α-1,4-Bindungen, wobei entweder das Disaccharid Maltose oder das Trisaccharid Maltotriose entsteht ( Abb. 3.106). β-Amylasen spalten sukzessive Maltose vom nichtreduzierenden Ende durch Angriff an den α-1,4-Bindungen ab. Glucoamylasen, die auch als γ-Amylasen oder Pullulanasen bezeichnet werden, spalten α-1,6-Bindungen, wodurch die Verzweigungen im Amylopektin aufgehoben werden bzw. Pullulan in Maltotriose gespalten wird.

Biotechnologische Prozesse

Stärke-hydrolysierende Enzyme haben eine enorme wirtschaftliche Bedeutung. Im Zusammenhang mit der Bespechung des Brauprozesses im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM sehen wir, wie wichtig die Induktion der gersteeigenen Amylasen ist, damit die von der Hefe nicht verwertbare Stärke zunächst in die verwertbare Kohlenstoffquelle Maltose überführt wird. Leider sind viele für biotechnologische Produktionsprozesse verwendete Mikroorganismen nicht in der Lage, Stärke als Kohlenstoffquelle zu verwerten. Möchte man Stärke als Kohlenstoffquelle einsetzen, muss diese daher zunächst in Glucose oder Maltose überführt werden. Dies erfolgt heute Abb. 3.107. Fresshöfe um Kolonien von zunehmend in großem Umfang durch Aspergillus niger (oben) auf Stärkeagar nach enzymatische Verfahren, wodurch chemi- Anfärbung mit Lugolscher Lösung, sche Verfahren (saure Hydrolyse) zurück- Saccharomyces cerevisiae (unten) bildet keigedrängt werden. Diese auch als ne Amylase „Stärkeverflüssigung“ bezeichneten Verfahren werden vor allem mit den α-Amylasen aus Bacillus licheniformis und Aspergillus oryzae sowie der β-Amylase aus Geobacillus stearothermophilus (früher:

E4 - S. 313

3.4 Abbauleistungen von Mikroorganismen

215

Bacillus stearothermophilus) durchgeführt. Die Stärkeverflüssigung gehört vom Umfang her zu den bedeutendsten biotechnologischen Prozessen und schlägt lediglich mit Kosten von ca. 0,2 Cent pro Kilogramm Stärke zu Buche. Viele weitere biotechnologische Prozesse, wie die Produktion von Glucose- oder Maltosesirup oder Cyclodextrinen, werden ebenfalls mit mikrobiellen Enzymen durchgeführt und haben eine große Bedeutung erlangt. Versuchsziel Hier soll in einem recht einfachen, aber eindrucksvollen Versuch der Abbau von Stärke durch extrazelluläre Enzyme von Pilzen und Bakterien gezeigt werden. Zwei wichtige biotechnologische Produzenten von Amylase (Aspergillus oryzae und Bacillus licheniformis) sollen hierbei zum Einsatz kommen. Der Vergleich mit der Bierhefe (Saccharomyces cerevisiae), die in diesem Versuch als Negativkontrolle mitgeführt wird, macht deutlich, wieso die Bierherstellung in Deutschland nach den derzeit gültigen Vorschriften nicht direkt von (Getreide)-Stärke ausgehen kann. Versuchsdurchführung benötigtes Material Geräte    

Impföse Bunsenbrenner Autoklav Brutschrank (30 °C)

Chemikalien und Medien    

Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril Malz-Festmedium ( S. 418) Stärke-Festmedium ( S. 427) Standard I-Festmedium ( S. 427)

Mikroorganismen  Saccharomyces cerevisiae (z. B. DSM 1334; geeignet ist auch Saccharomyces ellipsoideus = S. cerevisiae DSM 70471 aus V21 - S. 114)  Aspergillus oryzae (z. B. DSM 1863; geeignet ist auch A. niger DSM 823 aus V23 - S. 124)  Bacillus licheniformis (z. B. DSM 13)

Nach Erhalt der Pilz-Stämme werden diese – wenn nicht anders von der Bezugsquelle (DSMZ) angegeben – per Drei-Strich-Ausstrich (M4, S. 365) auf Malz-Festmedium ausgestrichen; B. licheniformis kann zunächst auf Standard I-Festmedium ausplattiert werden. Die Platten werden bei 30 °C bebrütet. Die bewachsenen Festmedien können bis zur Verwendung im Kühlschrank (4 °C) gelagert werden. Ausgehend von dem in wenig steriler Saline suspendierten Material von jeweils einer separaten Einzelkolonie der drei Mikroorganismen werden Sektorenausstriche auf einer Platte mit Stärke-Festmedium angefertigt. Die Platte wird bei 30 °C inkubiert.

Zur Sichtbarmachung der Fresshöfe wird die gesamte Plattenoberfläche mit Lugolscher Lösung ( M16, S. 384) überschichtet. Durch die Jod-Stärke-Reaktion färben sich die stärkehaltigen Zonen im Festmedium schwarzblau. Als farblos durchsichtig sind deutlich die Bereiche zu erkennen, in denen die ausgeschiedenen Amylasen die Stärke depolymerisiert haben ( Abb. 3.107). Hefe sollte auf diesem Medium kaum wachsen und keine Fresshöfe bilden. Weiterführende Literatur Röper H (2002) Renewable raw materials in Europe – Industrial utilisation of starch and sugar. Starch Stärke 54:89-98 Tester RF, Karkalas J (2002) Starch. In: De Baets S, Vandamme EJ, Steinbüchel A (eds) Biopolymers – Polysaccharides II, vol 6. Wiley-VCH, Weinheim, pp 381-438 Van der Maarel MJEC, van der Veen B, Uitdehaag JCM, Leemhuis H, Dijkhuizen L (2002) Properties and applications of starch-converting enzymes of the alpha-amylase family. Journal of Biotechnology 94:137155

Vorbereitungen

216

3 Versuche

Nachgefragt 1. Nennen Sie wichtige Glucane und die Organismen in denen diese vorkommen! 2. Wo kommt Stärke in der Natur vor? 3. Aus welchen Glucanen setzt sich Stärke zusammen? 4. Wie unterscheiden sich die Glucane der Stärke hinsichtlich ihrer chemischen Struktur? 5. Wie unterscheiden sich Stärke und Cellulose hinsichtlich ihrer chemischen Struktur und Eigenschaften? 6. Zeichnen Sie schematisch den Aufbau von Pullulan! 7. Weshalb sind die Glucoamylasen für den vollständigen Abbau von Stärke von außerordentlicher Bedeutung? 8. Was versteht man unter Fresshöfen bzw. Klärhöfen? 9. Wie haben Sie die Fresshöfe um Kolonien von Stärke-verwertenden Mikroorganismen sichtbar gemacht? 10. Wie setzt sich Lugolsche Lösung zusammen?

Versuch 43

11. Nennen Sie Unterschiede zwischen α- und β-Amylasen! 12. Welches bedeutende Getränk könnte ohne Amylasen nicht hergestellt werden? 13. Wie unterscheidet sich Amylopektin von Glycogen? 14. Wie sind die Glucosemoleküle im Dextran verknüpft? 15. Was versteht man unter Stärkeverflüssigung? 16. Welche Enzyme werden bei der Stärkeverflüssigung eingesetzt? 17. Warum führt man die Stärkeverflüssigung in diesem großen Maßstab durch und setzt bei biotechnologischen Produktionsprozessen nicht direkt Stärke als Kohlenstoffquelle ein? 18. Sie benötigen 1 Tonne Glucose. Wieviel Stärke müssen Sie verflüssigen? 19. In welchen Bakterien kommen Amylasen vor? Nennen Sie einige Beispiele! 20. Aus welchem Pilz wird Amylase für biotechnologische Prozesse gewonnen?

Partieller mikrobieller Abbau einer Fotokopie Theoretischer Hintergrund

Cellulose der bedeutendste nachwachsende Rohstoff

V30 - S. 153

HO CH2 O OH

O OH

Cellulose

n

Zusammen mit Lignin ist Cellulose der bedeutendste nachwachsende Rohstoff. Cellulose wird vorwiegend von Pflanzen synthetisiert und bildet zusammen mit Lignin, Hemicellulosen und Pektinen den Hauptbestandteil der Gerüstsubstanz pflanzlicher Zellwände. Man schätzt die Jahresproduktion von Cellulose in den terrestrischen Ökosystemen auf ca. 30 Milliarden Tonnen; dies sind dort dann ca. 50 % der Gesamtproduktion der Biomasse. Einige Bakterien sind zwar auch in der Lage, Cellulose zu synthetisieren, deren Beitrag ist mengenmäßig jedoch zu vernachlässigen. Cellulose besteht 3.108. Partieller mikrobieller Abbau aus linearen, unverzweigten Ketten Abb. einer Fotokopie durch ein Kultur von β-1,4-glycosidisch verknüpfter Glucose- Cellulomonas fimi moleküle. Durch intra- und intermolekulare Wasserstoffbrücken nehmen die Cellulosemoleküle eine Konformation an, welche die Aneinanderlagerung von Einzelketten zu Fibrillen und die Ausbildung kristalliner Bereiche ermöglicht. In den Cellulosefasern wechseln Bereiche hoher Kristallinität mit amorphen Bereichen ab. Bedingt durch die β-1,4-Verknüpfung besitzt Cellulose ganz andere strukturelle, chemische und physikalische Eigenschaften als Stärke, bei der Glucosemoleküle α-1,4-glycosidisch miteinander verknüpft sind. Cellulose ist im Gegensatz zu Stärke auch wasserunlöslich.

3.4 Abbauleistungen von Mikroorganismen

217

Besonders im Holz der Pflanzen liegt Cellulose meist nicht in reiner Form sondern in Kombination mit anderen Polysacchariden und Lignin vor. Bei den Polysacchariden handelt es sich vorwiegend um Polyosen, die früher auch als Hemicellulosen bezeichnet wurden. Dies sind verzweigte Heteropolysaccharide, die aus Galactose, Glucose und Mannose (Hexosen), Arabinose und Xylose (Pentosen) sowie Galacturonsäure und Glucuronsäure (Uronsäuren) aufgebaut sein können und über Wasserstoffbrückenbindungen mit Cellulose verbunden sind. Lignin ist ein unregelmäßig aufgebautes, verzweigtes und quervernetztes Polymer aus Phenylpropan-Bausteinen, die sich von den aromatischen Aminosäuren L-Phenylalanin und L-Tyrosin ableiten, und durch radikalische Polymerisation entstanden. Es bildet mit Cellulose eine feste, schwer aufzulösende Assoziation, die auch als Lignocellulose bezeichnet wird. Tabelle 3.59. organismen

Cellulolytische Mikro-

Bakterien • Bacteroides cellulosolvens • Butyrivibrio fibrisolvens • Cellulomonas fimi • Clostridium thermocellum • Pectobacterium carotovorum • Ruminococcus albus • Sorangium cellulosum • Streptomyces lividans • Thermobifida fusca Pilze • Aspergillus fumigatus • Aspergillus nidulans • Botrytis cinerea • Myrothecium verrucaria • Neocallimastix frontalis • Trichoderma reesei • Trichoderma viridis

Bei den großen Vorkommen von Cellulose in der Natur ist es nicht verwunderlich, dass Cellulose durch viele prokaryontische und eukaryontische Mikroorganismen und auch höhere Pilze abgebaut werden kann ( Tabelle 3.59). Die Organismen werden als cellulolytisch bezeichnet. Ein Abbau erfolgt sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen. In einem großen Umfang erfolgt der Abbau von Cellulose auch in den Intestinaltrakten aller Tiere, die cellulosehaltige Nahrung aufnehmen; da die Verweilzeit der Nahrung dort relativ kurz ist, muss der Abbau rasch erfolgen. Viele Pilze, deren Hyphen in Holz eindringen können, sind ebenfalls gute Celluloseverwerter. Diejenigen Pilze, die im Holz bevorzugt Cellulose abbauen, werden auch als Braunfäulepilze bezeichnet, da mit Lignin angereichertes Holz übrig bleibt; Weißfäulepilze bauen entsprechend bevorzugt Lignin ab und lassen mit Cellulose angereichertes Material zurück.

Der Abbau von Cellulose wird durch Cellulasen eingeleitet, welche die β-1,4-glycosidischen Bindungen zwischen den Glucoseeinheiten der Cellulose hydrolytisch spalten. Diese Enzyme bestehen aus mindestens drei Domänen: einer katalytischen Domäne, einer Cellulose-Bindedomäne und einem Verbindungsstück. Die meisten cellulolytischen Mikroorganismen besitzen mehrere Cellulasen, die häufig synergistisch arbeiten und als Multienzymkomplexe in sogenannten Cellulosomen vorliegen. Dies macht Sinn, denn Cellulose liegt in unterschiedlichen Konformationen vor, und es gibt kristalline und amorphe Regionen. Offensichtlich bevorzugen einzelne Enzyme die amorphen Regionen, während andere die kristallinen Regionen hydrolysieren können. Darüber hinaus müssen die oligomeren Spaltprodukte weiter abgebaut werden. Es ist deshalb nicht verwunderlich, dass in einem Organismus Endoglucanasen und Exoglucanasen sowie Cellobiasen und Cellodextrinasen nebeneinander vorliegen.

Weitere Bestandteile von Holz

Cellulolytische Mikroorganismen

Cellulasen

Cellulasen haben eine große Bedeutung in vielen Anwendungsgebieten. Sie werden deshalb in großen Mengen mit Hilfe von Mikroorganismen produziert ( Tabelle 3.60). Wichtige aus Cellulose bestehende Produkte sind Papier und Pappe. Zur Zeit werden hiervon jährlich weltweit ca. 300 Millionen Tonnen hergestellt. Ein steigender Anteil wird durch Photokopierer oder an Rechner angeschlossene Drucker beschriftet. Hieran

Xerographie

218

3 Versuche Tabelle 3.60. Waschmittel

Verwendung von Cellulasen • Reinigung • Beseitigung zerstörter Fasern • Aufhellung und Farbauffrischung • „stone-washing“

Cellulose-Verflüssigung

• Glucose für Fermentationsprozesse

Papierherstellung

• „de-inking“ von Papier • Fasermodifizierung • Herstellung weicher Papiere

hat die Xerographie einen hohen Anteil. Die Xerographie ist ein 1942 von dem amerikanischen Physiker und Patentanwalt Chester F. Carlson erfundenes Elektrokopierverfahren. Es ist eines der bedeutendsten Reproduktionsverfahren und aus unserem Alltag mittlerweile nicht mehr wegzudenken. Die Xerographie ermöglicht unter Nutzung von photoelektrischen und elektrostatischen Effekten die Anfertigung von hochauflösenden und exakten Kopien nahezu beliebiger Vorlagen auf normalem Papier und auf Kunststoffolien. Mit der „Zerox-914“ wurde 1960 von der Firma Xerox der erste kommerzielle Fotokopierer auf den Markt gebracht; 1988 wurde bereits der zweimillionste Fotokopierer verkauft. Beim xerographischen Prozess wird die Oberfläche einer zylindrischen Selentrommel (Fotokonduktor) durch den Ionenstrom einer Corona-Entladung positiv aufgeladen. Diese positive Ladung wird durch Licht aufgehoben und bleibt nur im Dunkeln erhalten. Durch Licht wird nun von der Vorlage über Linsen ein latentes, elektrostatisches Bild auf die positiv aufgeladene Schicht projiziert. Dadurch bleiben nur die nicht belichteten Areale positiv geladen. Es entsteht ein elektrostatisches Spiegelbild von der Vorlage, auf das nun negativ geladene Tonerpartikel appliziert werden. Diese werden vom positiv geladenen elektrostatischen Bild angezogen und bleiben dort haften. Das auf der Selentrommel in Form der Tonerpartikel haftende Bild wird auf ein Blatt Papier oder eine Folie übertragen und dort dauerhaft durch Hitze fixiert. Bei den eingesetzten Tonern handelt es sich um staubförmige Pulver aus feinsten globulären Partikeln. Diese bestehen aus einem synthetischen, thermoplastischen Polymer, welches bereits bei einer niedrigen Temperatur schmilzt, und sind bei Schwarz/Weiß-Kopierern mit Rußpartikeln schwarz eingefärbt sowie durch weitere Zusätze negativ aufladbar. Versuchsziel In diesem kurzen Versuch soll demonstriert werden, dass beim Fotokopierprozess Komponenten auf Papier gebracht werden, die im Gegensatz zu Cellulose nicht abbaubar sind. Eine zerschnittene Papierfotokopie wird mit einem cellulolytischen Bakterium in Flüssigmedium inkubiert; nach einigen Tagen ist zwar das Papier abgebaut, die Buchstaben sind jedoch nahezu intakt erhalten geblieben.

3.4 Abbauleistungen von Mikroorganismen

219

Versuchsdurchführung benötigtes Material Geräte  Zwei 300 ml Erlenmeyerkolben, ohne Schikanen  Impföse  Brutschrank (30 °C)  Schüttler (30 °C)  Autoklav  Lichtmikroskop  Stereolupe

Chemikalien und Medien     

Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril Hefeextrakt Glucose Standard I-Festmedium ( S. 427) Mineralsalzmedium ( S. 421)

Mikroorganismen  Cellulomonas fimi DSM 20113

Sonstiges

Nach Erhalt des Stamms wird dieser – wenn nicht anders von der Bezugsquelle vorgesehen – in wenig steriler Saline suspendiert und per Drei-Strich-Ausstrich (M4, S. 365) auf Standard I-Festmedium ausgestrichen. Die Platte wird bei 30 °C inkubiert. Die bewachsene Platte kann bis zum Versuchsbeginn im Kühlschrank (4 °C) gelagert werden. Die Kolben zum Abbau der Fotokopie sollten gemeinsam mit den Papierstückchen autoklaviert werden. Ausgehend vom Material einer Einzelkolonie wird einer von zwei 300 ml Erlenmeyerkolben ohne Schikanen beimpft, in dem sich 30 ml Mineralmedium mit 0,05 % (wt/ vol) Hefeextrakt und die Hälfte einer in Stückchen geschnittenen, bedruckten DIN A4-Kopie befinden. Ein zweiter Kolben gleichen Inhalts bleibt steril. Die Ansätze werden bei 30 °C langsam geschüttelt (maximal 25 Umdrehungen pro Minute).

Die beiden Ansätze werden verglichen. Wie stark ist die Trübung? Was ist aus dem Papier geworden? Wie ist es den aufgedruckten Zeichen ergangen? Die vom Papier abgelösten und erhalten gebliebenen Buchstaben oder Zeichen sollten mit einer Stereolupe und bei niedriger Vergrößerung auch im Lichtmikroskop betrachtet werden ( Abb. 3.108).  Eine DIN A4 Fotokopie mit großen Buchstaben bzw. Zeichen (möglichst im Fettdruck formatiert)

Weiterführende Literatur Bayer EA, Shoham Y, Lamed R (2001) Cellulose-decomposing Bacteria and Their Enzyme Systems. In: Dworkin M (ed) The Prokaryotes (elektronische Version: http://link.springer.de/link/service/books/10125, Release 3.7 vom 2.11.2001) Springer, New York Cox PM, Betts RA, Jones CD, Spall SA, Totterdell IJ (2000) Acceleration of global warming due to carboncycle feedbacks in a coupled climate model. Nature 408:184-187 Klemm D, Schmauder HP, Heinze T (2002) Cellulose. In: De Baets S, Vandamme EJ, Steinbüchel A (eds) Biopolymers – Polysaccharides II, vol 6. Wiley-VCH, Weinheim, pp 275-319 Schwarz WH (2001) The cellulosome and cellulose degradation by anaerobic bacteria. Applied Microbiology and Biotechnology 56:634-649

Vorbereitungen

220

3 Versuche

Nachgefragt 1. Besorgen Sie sich aus Büchern und aus dem Internet Informationen darüber, wie viel fossile Rohstoffe jährlich weltweit (im wesentlichen zur Erzeugung von Energie) verbraucht werden! Ermitteln Sie, um welchen Faktor alleine die jährliche Neusynthese von Cellulose diese Menge übersteigt! 2. Zeichnen Sie die chemische Strukturformel von Cellulose! 3. Wie unterscheiden sich Cellulose und Stärke hinsichtlich der chemischen Struktur und ihrer Eigenschaften? 4. Erläutern Sie wie Polyosen, Lignin und Lignocellulosen chemisch aufgebaut sind! 5. Wie unterscheiden sich Lignin und Cellulose hinsichtlich der Anordnung ihrer Bausteine? 6. Nennen Sie einige bedeutende cellulolytische Bakterien! 7. Wie bezeichnet man cellulolytische Pilze auch noch? 8. Warum besitzt Holz, welches durch einen cellulolytischen Pilz verrottet wurde, eine braune Färbung? 9. Wie erfolgt der Abbau von Cellulose durch cellulolytische Bakterien, und welches Enzym initiiert den Abbau?

Versuch 44

10. Nennen Sie mindestens vier unterschiedliche, am Abbau von Cellulose beteiligte Enzyme! 11. Was versteht man unter Cellulosomen? 12. Warum ist Cellulose in der Regel schwerer abbaubar als Stärke? 13. Wie machen Sie einem Nichtbiologen klar, dass es einen anaeroben Abbau von Cellulose geben muss? 14. Welche Funktion haben cellulolytische Bakterien im Intestinaltrakt von Termiten? 15. Beschreiben Sie Prinzip und wesentliche Teilschritte der Xerographie! 16. Aus welchen Komponenten bestehen Toner für die Xerographie? 17. Wie wird das Bild bei der Xerographie auf dem Papier fixiert? 18. Erklären Sie, weshalb die Buchstaben und andere Zeichen von fotokopiertem Papier durch die cellulolytischen Bakterien nicht zerstört werden! 19. Welcher biotechnologisch hergestellte Thermoplast könnte möglicherweise verwendet werden, um biologisch vollständig abbaubares bedrucktes Photokopierpapier zu erhalten? 20. Was zeichnet Weißfäulepilze aus?

Mikrobieller Abbau von Kohlenwasserstoffen Theoretischer Hintergrund

Kohlenwasserstoffe

Kohlenwasserstoffe ist ein Sammelbegriff für organische Verbindungen, die sich ausschließlich aus Kohlenstoff und Wasserstoff zusammensetzen. Es werden dabei lineare und ringförmige aliphatische von aromatischen Kohlenwasserstoffen unterschieden, die immer aus mindestens einem Ring bestehen ( Abb. 3.109).

Abbau von Kohlenwasserstoffen

Es gibt relativ wenige biochemische Vorgänge neben der aeroben Atmung, für die Organismen Sauerstoff benötigen. Der Abbau von Kohlenwasserstoffen gehört (fast immer) hierzu. An aeroben Standorten sind am Abbau dieser Verbindungen OxygeH2 C

H3C

C H2

H2 C

C H2

H2 C

C H2

CH3

H2 C

H3C

C H2

H2 C

C H2

H2 C

Octan

H

C C

C C

C C

H H

H H

C C

C C

C C

H

H

Toluol

Benzol

Abb. 3.109.

C H2

H2 C

C H2

H2 C

C H2

H2 C

C H2

CH3

Hexadecan H

CH3 H

C H2

H2 C

H

H H H C C C H

H C

H

C

H

H

H

H H

H

C

C H H H

Cyclohexan

Beispiele verschiedener Strukturen von Kohlenwasserstoffen

H H

Methan

3.4 Abbauleistungen von Mikroorganismen

R

221

CH3

O2

+

RuDoxred

NAD

Alkan-Hydrolase H2O

R

Rubredoxin-Reduktase NADH + H+

RuDoxox CH2OH + NAD Alkohol-Dehydrogenase +

NADH + H R

CHO NAD+ Aldehyd-Dehydrogenase +

NADH + H R

COOH

CoA

ATP Acyl-CoA-Synthetase O

AMP + PPi

R S-CoA 3 CoA 3 H2O

3 FAD 3 NAD+

β-Oxidation + 3 NADH + H 3 FADH2 R = -(CH2)6-CH3

4 Acetyl-CoA Abb. 3.110.

RuDox = Rubredoxin

Oxidation von Octan durch Pseudomonas putida und Abbau zu Acetyl-CoA

nasen beteiligt. Je nachdem, ob dabei nur ein oder beide Sauerstoffatome in den Kohlenwasserstoff eingebaut werden, unterscheidet man zwischen Monooxygenasen und Dioxygenasen. Pseudomonas putida besitzt das OCT Plasmid. Dieses Plasmid codiert für alle Enzyme, die für die Umwandlung von Alkanen zu den entsprechenden Fettsäuren benötigt werden. Das OCT Plasmid ist eines jener katabolischen Plasmide, die besondere Abbauleistungen ermöglichen. Die einleitende Oxidation von Octan erfolgt durch das aus drei Komponenten bestehende Alkan-Hydroxylase System ( Abb. 3.110). Eine in der Cytoplasmamembran lokalisierte Alkan-Hydroxylase (AlkB) oxidiert n-Octan mit Hilfe von reduziertem Rubredoxin (AlkF und AlkG) zu 1-Octanol. Durch eine NADH-abhängige Rubredoxin-Reduktase (AlkT) wird aus der oxidierten Form von Rubredoxin wieder die reduzierte Form regeneriert. 1-Octanol wird anschließend durch eine ebenfalls membrangebundene Alkohol-Dehydrogenase (AlkJ) weiter zu 1-Octaldehyd oxidiert. Durch eine im Cytoplasma lösliche Aldehyd-Dehydrogenase (AlkH) wird der Aldehyd anschließend zur Octansäure oxidiert. Diese wird dann durch eine Acyl-CoA Synthetase (AlkK) zu Octyl-CoA aktiviert und anschließend schrittweise durch vier Cyclen der β-Oxidation zu vier Molekülen Acetyl-CoA oxidiert und abgebaut. Auf dem OCT-Plasmid sind zwei Operons (alkBFGHJKL und alkST) lokalisiert, deren Gene die oben genannten Proteine codieren. Das bisher noch nicht

Aerober Abbau von Octan

222

3 Versuche

erwähnte von alkL codierte Protein ist ein in der äußeren Membran dieses Gram-negativen Bakteriums lokalisiertes Protein, welches möglicherweise für die Aufnahme von Octan wichtig ist. Das ebenfalls oben noch nicht erwähnte alkS codiert für ein Regulatorprotein, welches die Expression beider Operons positiv reguliert. Dieser Weg der terminalen Oxidation von Alkanen ist sehr weit verbreitet, und über ähnliche Reaktionen verläuft auch der Abbau anderer Alkane in den meisten anderen Mikroorganismen. Auf andere ebenfalls vorkommende Wege kann hier aus Platzgründen nicht eingegangen werden. Aerobe Verwertung von Methan

Eine Sonderstellung nimmt die Verwertung CH4 O2 von Methan ein. Der einleitende Schritt wird 2 [H] wieder durch eine Monooxygenase, die MethanMethan-Monooxygenase, katalysiert, Monooxygenase H 2O wodurch Methanol entsteht. Es schließt sich, CH3OH katalysiert durch Methanol-DehydroMethanolgenase und Formaldehyd-DehydroDehydrogenase genase, die Oxidation von Methanol zur 2 [H] Ameisensäure an, die durch eine FormiatDehydrogenase sogar noch zu CO2 oxidiert Assimilation HCHO wird. Damit wird Methan zwar formal wie Formaldehydoben für Octan beschrieben oxidiert, aber Dehydrogenase die Assimilation des Kohlenstoffs bereitet 2 [H] Probleme. Mit Ausnahme von Methan münHCOOH det der Abbau aller anderen Kohlenwasserstoffe, ob linear oder ringförmig, ob Formiataliphatisch oder aromatisch, in der Bildung Dehydrogenase 2 [H] von Intermediaten des zentralen Stoffwechsels oder in der Bildung von Verbindungen, Assimilation CO2 die leicht in diese überführt werden können. Es entstehen Acetyl-CoA, Succinyl-CoA und Abb. 3.111. Oxidation von Methan zu CO2 andere Intermediate. Beim Abbau von Methan ist dies anders. Wie wir gesehen Tabelle 3.61. Assimilation von C1-Verbinhaben, wird Methan schrittweise über ver- dungen durch methanotrophe und methyschiedene C1-Verbindungen zu CO2 oxidiert lotrophe Mikroorganismen ( Abb. 3.111). Die methanotrophen Bak- Ausgehend von Formaldehyd terien müssen also wie die autotrophen Bak• Ribulosemonophosphat-Cyclus (auch terien über Stoffwechselwege verfügen, die Hexulosephosphat-Weg) eine Assimilation einer dieser C1-Verbin• Serin-Weg dungen ermöglichen. Gleiches gilt übrigens • Xylulosemonophosphat-Cyclus (nur für die methylotrophen Mikroorganismen, Hefen) die Methanol als alleinige Kohlenstoff- und Ausgehend von CO2 Energiequelle verwerten können. Aus Platz• Ribulose-1,5-bisphosphat-Cyclus (auch gründen kann im MIKROBIOLOGISCHEN Calvin Cyclus) PRAKTIKUM nicht auf diese Wege eingegangen werden. Aber man sollte sich einprägen, dass diese Assimilation entweder von dem Intermediat Formaldehyd oder von CO2 ausgeht und dass verschiedene Wege möglich sind ( Tabelle 3.61). Aerober Abbau von aromatischen Kohlenwasserstoffen Die Fähigkeit zum Abbau von aromatischen Verbindungen ist nicht überraschend, da aromatische Verbindungen von der Natur selbst synthetisiert werden. Man denke nur an die drei aromatischen Aminosäuren Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin sowie an das Lignin, um nur einige wenige Beispiele zu nennen. Der Abbau von aromatischen

3.4 Abbauleistungen von Mikroorganismen

223

Kohlenwasserstoffen kann in drei Abschnitte eingeteilt werden. Im ersten Abschnitt erfolgt eine Modifizierung und Umwandlung der vielen verschiedenen Kohlenwasserstoffe in sehr wenige zentrale aromatische Intermediate. Hierbei sind häufig bereits Oxygenasen eingeschaltet. Bei den zentralen aromatischen Intermediaten handelt es sich um Brenzkatechin, Protocatechuat und Homogentisat. Im zweiten Abschnitt erfolgt die Ringspaltung dieser zentralen aromatischen Intermediate durch Dioxygenasen. Weit verbreitet ist hier die ortho-Spaltung, d. h. die Ringöffnung zwischen zwei mit Hydroxylgruppen substituierten Kohlenstoffatomen. Seltener ist die meta-Spaltung, bei der die Spaltung zwischen einem mit einer Hydroxylgruppe substituierten und einem nicht substituiertem Kohlenstoffatom erfolgt. Durch diese Ringspaltungen entstehen erstmals lineare Moleküle, wie cis,cis-Muconsäure und 3-Carboxycis,cis-Muconsäure im Falle einer ortho-Spaltung von Brenzkatechin bzw. Protocatechuat. Im dritten Abschnitt werden diese Spaltprodukte nun in zentrale Intermediate des Stoffwechsels wie Succinyl-CoA, Acetyl-CoA, Fumarat, Acetoacetat, Pyruvat und Acetaldehyd überführt ( Abb. 3.112). Aromatische Verbindungen

Zentrale aromatische Verbindungen OH

OH

OH

HOOC

O2

O2

O2

OH

OH

O2

HO

CH2-COOH

O2

Brenzkatechin

Protokatechuat ortho-Spaltung ( meta-Spaltung (

Homogentisat O2) O2 )

Erste lineare Intermediate cis-cis-Muconat

β-Carboxy-cis-cis-Muconat Maleylacetoacetat

2-Hydroxymuconat- 2-Hydroxy-4-Carboxysemialdehyd muconat-semialdehyd

Intermediate des zentralen Stoffwechsels Succinat + Acetyl-CoA Pyruvat + Acetaldehyd Abb. 3.112.

Fumarat + Acetoacetat

Pyruvat

Abbauwege aromatischer Verbindungen unter aeroben Bedingungen

224

3 Versuche

V16 - S. 91 V20 - S. 108

E3 - S. 310

D5 - S. 347

Anaerober Abbau von Kohlenwasserstoffen Es gibt schon lange Hinweise darauf, dass Tabelle 3.62. Zum anaeroben Abbau von Kohlenwasserstoffe auch in Abwesenheit Kohlenwasserstoffen befähigte Mikroorgavon molekularem Sauerstoff abgebaut wer- nismen den können. So werden diese Verbindungen an anaeroben Standorten nicht akkumuliert. Denitrifizierende Bakterien Seit wenigen Jahren sind Reinkulturen sol- Azoarcus tolulyticus cher Bakterien verfügbar. Die Fähigkeit zum Stamm HxN1 anaeroben Abbau von aliphatischen und Thauera aromatica aromatischen Kohlenwasserstoffen scheint Eisen reduzierende Bakterien besonders unter denitrifizierenden Bakte- Geobacter metallireducens rien, Eisen reduzierenden Bakterien und Sulfat reduzierende Bakterien Sulfat reduzierenden Bakterien verbreitet cetonicum zu sein. Außerdem wurden Wasserstoff frei- Desulfobacterium Desulfobacula toluolica setzende Bakterien gefunden; diese sind allerdings nur in einer Mischkultur mit COOH methanogenen Bakterien zum Abbau von Kohlenwasserstoffen in der Lage COOH ( Tabelle 3.62). Auch eine anaerobe, von Sulfatreduktion abhängige Oxidation von Fumarat Methan wurde nachgewiesen. Die Aufklärung der biochemischen Reaktionen, die eine anaerobe „Aktivierung“ der Kohlenwasserstoffe ermöglichen, befindet sich noch in den Anfängen. Es zeichnet sich jedoch ab, dass der anaerobe Abbau von aliphatischen und aromatischen Kohlenwasserstoffen häufig durch Anlagerung von Fumarat eingeleitet wird ( Abb. 3.113). Auf diese Weise wird Sauerstoff gewissermaßen in organisch gebundener Form auf die abzubauende Verbindung übertragen.

Hexan

1-Methylpentyl-Succinat COOH COOH

CH3 Fumarat Toluol

Benzylsuccinat

Abb. 3.113. Anaerobe Aktivierung von Kohlenwasserstoffen durch Anlagerung von Fumarat

Anaerober Abbau von Hexan

In einem denitrifizierenden Bakterium (Stamm HxN1) wird Fumarat an n-Hexan angelagert, wodurch 1-Methylpentyl-Succinat entsteht. Die nachfolgenden Schritte wurden noch nicht eindeutig aufgeklärt; es scheint jedoch klar, dass hier eine Vielzahl neuer, interessanter Enzyme beteiligt ist, die letztlich den Abbau von 1-Methylpentyl-Succinat zu 3 Molekülen Acetyl-CoA und die Regeneration von Fumarat ermöglichen. Neben Hexan ist auch der anaerobe Abbau zahlreicher weiterer n-Alkane möglich. Hieran sind u. a. auch Sulfat reduzierende Bakterien beteiligt, die sich insgesamt durch eine enorme Stoffwechselvielfalt auszeichnen.

Anaerober Abbau von Toluol

Der anaerobe Abbau von Toluol wird bei Thauera aromatica und Azoarcus tolulyticus ebenfalls durch Anlagerung von Fumarat eingeleitet. Durch diese von dem Enzym Benzylsuccinat-Synthase katalysierte Reaktion entsteht Benzylsuccinat, welches anschließend durch fünf weitere Enzyme in Benzyl-CoA umgewandelt wird. Benzyl-CoA ist ein verbreitetes zentrales aromatisches Intermediat beim anaeroben Abbau aromatischer Kohlenwasserstoffe und anderer aromatischer Verbindungen, ähnlich wie Brenzkatechin und Protokatechuat beim aeroben Abbau die zentralen aromatischen Intermediate sind. Die Spaltung des aromatischen Ringes und Überführung von Benzyl-CoA in eine lineare Verbindung wird durch schrittweise Reduktion und Anlagerung von Wasser eingeleitet. Dabei ist die erste Reduktion, also die Überführung

3.4 Abbauleistungen von Mikroorganismen

225

Abb. 3.114. Versorgung von Zellen mit flüchtigen Kohlenwasserstoffen in Flüssig- (links) und Festmedien (rechts) durch Depots

von Benzyl-CoA in das 1,5-Dien ATP-abhängig. Als erstes lineares Produkt entsteht 3-Hydroxypimelyl-CoA, welches anschließend in ein Molekül CO2 und drei Moleküle Acetyl-CoA überführt wird. Versuchsziel Der technisch wenig anspruchslose aber dennoch eindrucksvolle Versuch verfolgt zwei Ziele: Zum einen soll gezeigt werden, dass im normalen Erdboden zahlreiche aerobe Kohlenwasserstoff verwertende Mikroorganismen vorhanden sind, die sich direkt auf Festmedium isolieren lassen. Als repräsentative Substrate werden ein Alkan (Octan) und ein aromatischer Kohlenwasserstoff (Toluol) eingesetzt. Hierbei soll gezeigt werden, wie heterogen das Spektrum der Mikroorganismen ist, die zum Wachstum auf diesen Kohlenwasserstoffen befähigt sind. Zum anderen soll parallel dazu die Fähigkeit zum Abbau von Kohlenwasserstoffen bei drei Stämmen der Gattung Pseudomonas gezeigt werden. Hierbei wird deutlich werden, dass die Information zum Abbau der Kohlenwasserstoffe Plasmid-gebunden ist. Die drei Stämme und ihre für diesen Versuch relevanten Eigenschaften sind im Folgenden aufgeführt: • Pseudomonas putida mt-2 besitzt das Plasmid pTOL (= pWWO), das den Abbau aromatischer Kohlenwasserstoffe wie Toluol und Xylol vermittelt. • Pseudomonas putida KT2440 ist ein Plasmid-freier Abkömmling von Stamm mt-2. • Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 besitzt das Plasmid pOCT, das die Information zum Abbau von Alkanen (C6 bis C12, z. B. C8 = Octan) trägt.

CH3

Toluol H3C CH2 H2C CH2 H2C CH2 H2C CH3 n cta O

Beim Einsatz der Substrate ist folgender Sicherheitshinweis zu beachten: In diesem Versuch wird mit leicht entzündlichen Substanzen (Toluol, Octan) umgegangen, die zudem gesundheitsschädlich sind. Das Hantieren mit diesen Substanzen muss daher unter einem Abzug (Digestorium) erfolgen.

Sicherheitshinweis

226

3 Versuche

Versuchsdurchführung Vorbereitungen

Nach Erhalt der drei Stämme werden diese in jeweils wenig steriler Saline suspendiert und per Drei-Strich-Ausstrich (M4, S. 365) auf Standard I-Festmedium ausgestrichen. Die Platten werden bei 30 °C bebrütet. Die bewachsenen Platten können bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank (4 °C) gelagert werden. Jeweils eine kleine Spatelspitze feinkörniger (oder gesiebter) Erde wird auf zwei MineralFestmedien verteilt, die keine zugesetzte Kohlenstoffquelle enthalten. Auf zwei weiteren Platten werden als Sektorenausstriche nebeneinander die drei PseudomonasStämme ausplattiert.

benötigtes Material Geräte        

Impföse Pinzette Bunsenbrenner Autoklav Brutschrank (30 °C) Digestorium (Abzug) Phasenkontrastmikroskop Geeignete Kleingefäße zur Applikation von Toluol (z. B. PCR-Gefäße oder Dekkel von 1,5 ml Eppendorfgefäßen)  Papierrundfilter zur Applikation von Octan (Ø 55 mm, z. B. von Fa. Schleicher & Schüll GmbH, D-37582 Dassel) oder Glaspetrischalen  Parafilm®

Es folgt das Applizieren der Kohlenwasserstoff-Substrate: Diese können und dürfen Chemikalien und Medien nicht direkt mit dem Medium in Berührung  Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril kommen, da sie zum einen nicht wasser Mineralsalz-Festmedium ( S. 421), löslich sind, und zum anderen beim direkten dünn gegossen Kontakt mit den Mikroorganismen toxisch  Standard I-Festmedium ( S. 427) wirken. Die Versorgung der Zellen mit den  Octan (Gefahrenhinweis: leicht entKohlenwasserstoffen erfolgt über die Gaszündlich) phase. Hierzu werden beide Substanzen als  Toluol (Gefahrenhinweis: leicht entverdampfende Depots im Deckel der Petrizündlich und gesundheitsschädlich) schalen platziert. Eine geeignete Depotform Mikroorganismen für Octan stellt ein Papierrundfilter dar, der in den Deckel gelegt wird und direkt mit  Pseudomonas putida mt-2 (DSM 3931) Octan benetzt wird. Für Toluol ist eine  Pseudomonas putida KT2440 andere Verfahrensweise geboten, da diese (DSM 6125)  Pseudomonas oleovorans (ATCC 29347) Substanz das Plastikmaterial herkömmlicher Petrischalen (Polystyrol) angreift. Für Toluol Sonstiges werden daher kleine, möglichst flache Lösungsmittel-beständige Gefäße aus Glas  Frische Gartenerde (feinkörnig) (kurze, dünne Reagenzgläser, flach gelegt) bzw. Polyethylen (z. B. PCR-Gefäße, flach gelegt; abgeschnittene Deckel von Eppendorf-Reaktionsgefäßen) mit Toluol versetzt und in den Deckel der Petrischale gelegt; es können natürlich auch Glaspetrischalen verwendet werden, die dann zur Aufnahme von Toluol mit einem Papierrundfilter belegt werden können. Der beimpfte Plattenboden wird dann in allen Fällen auf den Deckel gestülpt. Um ein Verflüchtigen der Kohlenwasserstoffe aus den Petrischalen zu verhindern, empfiehlt es sich, die Petrischalen an der Seite rundherum mit Parafilm® zu versiegeln. Dieser Verschluss verhindert zudem, dass die Platten sich gegenseitig während der Inkubation in einem gemeinsamen Brutschrank mit den flüchtigen Substanzen kontaminieren. Auf die eine oder andere der oben beschriebenen Weisen werden jeweils 0,2 ml Octan bzw. 0,2 ml Toluol in den Deckel je einer Platte mit Gartenerde und einer Platte mit den drei Pseudomonas-Stämmen gebracht. Die verschlossenen Platten werden bei 30 °C ruhig auf dem Kopf stehend inkubiert ( Abb. 3.114).

3.4 Abbauleistungen von Mikroorganismen

Die Platten zur Direktisolierung von Kohlenwasserstoff-Verwertern werden täglich auf Wachstum der Mikroorganismen kontrolliert. Nach eingetretenem Wachstum wird die Morphologie der auftretenden Kolonien dokumentiert; repräsentative Formen werden mikroskopiert. Das Wachstum auf den beiden Platten mit den drei Pseudomonas-Stämmen wird unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Ausstattung mit Plasmiden vergleichend bewertet. Weiterführende Literatur Boll M, Fuchs G, Heider J (2002) Anaerobic oxidation of aromatic compounds and hydrocarbons. Current Opinion in Chemical Biology 6:604-611 Heider J, Spormann AM, Beller HR, Widdel F (1999) Anaerobic bacterial metabolism of hydrocarbons. FEMS Microbiology Reviews 22:459-473 Nauhaus K, Boetius A, Krüger M, Widdel F (2002) In vitro demonstration of anaerobic oxidation of methane coupled to sulphate reduction in sediment from a marine gas hydrate area. Environmental Microbiology 4:296-305 Schink B (2000) Principles of anaerobic degradation of organic compounds. In: Rehm HJ, Reed G, Pühler A, Stadler P (eds) Biotechnology. Vol 11b, 2nd edn. Wiley-VCH, Weinheim, pp 169-192 Swannell RPJ, Lee K, McDonagh M (1996) Field evaluations of marine oil spill bioremediation. Microbiological Reviews 60:342-365 Van Beilen JB, Panke S, Lucchini S, Franchini AG, Rothlisberger M, Witholt B (2001) Analysis of Pseudomonas putida alkane-degradation gene clusters and flanking insertion sequences: evolution and regulation of the alk genes. Microbiology-SGM 147:1621-1630 Van Hylckam Vlieg JET, Janssen DB (2000) Principles of anaerobic degradation of organic compounds. In: Rehm HJ, Reed G, Pühler A, Stadler P (eds) Biotechnology. Vol 11b, 2nd edn. Wiley-VCH, Weinheim, pp 193-209 Wilkes H, Rabus R, Fischer T, Armstroff A, Behrends A, Widdel F (2002) Anaerobic degradation of nhexane in a denitrifying bacterium: further degradation of the initial intermediate (1-methylpentyl)succinate via C-skeleton rearrangement. Archives of Microbiology 177:235-243

227

228

3 Versuche

Nachgefragt 1. Nennen Sie einige aliphatische Kohlenwasserstoffe und zeichnen Sie die chemischen Strukturformeln dieser Verbindungen! 2. Nennen Sie einige aromatische Kohlenwasserstoffe und zeichnen Sie die chemischen Strukturformeln dieser Verbindungen! 3. Konsultieren Sie Lehrbücher und Lexika und stellen Sie eine Liste von aliphatischen und aromatischen Kohlenwasserstoffen und verwandten Verbindungen zusammen, die in der Biosphäre gebildet werden! Beziehen Sie alle Organismen, nicht nur Mikroorganismen, in die Nachforschungen ein! 4. Beschreiben Sie den Unterschied zwischen Monooxygenasen und Dioxygenasen! 5. Nennen Sie weitere Stoffwechselleistungen, die molekularen Sauerstoff benötigen! 6. Wie kann experimentell nachgewiesen werden, ob es sich bei einer Reaktion, die durch eine Oxygenase katalysiert wird, um eine Monooxygenase oder eine Dioxygenase handelt? 7. Beschreiben Sie die einleitenden Reaktionen beim Abbau von Octan, bis eine Verbindung entsteht, die leicht durch einen verbreiteten Stoffwechselweg abgebaut werden kann! 8. Welches Intermediat des Zentralstoffwechsels entsteht beim Abbau von Octan, und welche zusätzlichen Stoffwechselwege sind für die Assimilierung und weitere Verstoffwechselung dieses Intermediates erforderlich? 9. Versuchen Sie sämtliche Stoffwechselreaktionen zu betrachten, die in einem aeroben Bakterium wie z. B. Pseudomonas putida erforderlich sind, um Octan vollständig zu CO2 zu oxidieren und dabei durch Atmung Energie zu gewinnen. Wie viel Energie (in Form von ATP) und wie viel Wasser werden hierbei ausgehend von einem Mol Octan insgesamt gebildet?

Versuch 45

10. Welche Funktionen und Stoffwechselleistungen werden von dem OCT-Plasmid codiert? 11. Nennen Sie die Verbindungen, bei denen der Abbau verschiedenster aromatischer Kohlenwasserstoffe meist mündet, bevor es zu der Spaltung des aromatischen Rings kommt! 12. Warum muss man erwarten, dass die Spaltung des aromatischen Rings per se nicht unmöglich ist, sondern im Gegenteil weit verbreitet ist? 13. Durch welchen Enzymtyp wird die Spaltung eines aromatischen Ringes unter aeroben Verhältnissen grundsätzlich katalysiert, und welche Arten der Ringspaltung gibt es? 14. Beschreiben Sie die Reaktionen und benennen Sie die Enzyme, welche die vollständige Oxidation von Methan katalysieren! 15. Warum benötigen methanotrophe Bakterien bei der Verwertung des Kohlenwasserstoffs Methan zusätzlich zu den Enzymen, die dessen Oxidation katalysieren, noch Stoffwechselwege zur Assimilation von Kohlenstoff? 16. Benennen Sie die vier Stoffwechselwege, die bei methanotrophen Bakterien für die Assimilation von C1-Verbindungen vorkommen! 17. Konsultieren Sie Lehrbücher der Mikrobiologie und informieren Sie sich, welche Reaktionen bei den Stoffwechselwegen zur Fixierung von Formaldehyd beteiligt sind! 18. In welchen Bakteriengruppen wurden Vertreter gefunden, die Kohlenwasserstoffe anaerob abbauen können? 19. Beschreiben Sie, wie z. B. Thauera aromatica anaerob Toluol abbaut! 20. Beschreiben Sie, wie das denitrifizierende Bakterium HxN1 anaerob Hexan abbaut!

Mikrobieller Abbau von Polyethylenglykol Theoretischer Hintergrund

Polyether H

H

C O C H

H

n

Polyether

Technische Bedeutung und Anwendungen

Polyethylenglykol (PEG) gehört zur Gruppe der Polyether, unter der man Polymere zusammenfasst, bei denen in regelmäßigen Abständen Etherbindungen vorkommen. Neben PEG sind Polypropylenglykol (PPG), Polytetramethylenglykol (PTMG) und Polybutylenglykol (PBG) weitere wichtige Vertreter dieser Gruppe. PEG ist der einfachste und zugleich mengenmäßig bedeutendste Vertreter der Polyether und wird wie alle anderen Polyether ausschließlich durch chemische Synthese produziert. Die natürliche Synthese von PEG oder ähnlichen Polymeren ist nicht bekannt. Von PEG werden weltweit ca. 1 Millionen Tonnen mit sehr unterschiedlichen Molekulargewichten und für verschiedene Einsatzgebiete produziert. PEGs finden u. a. als Bindemittel, Dispergatoren. Emulgatoren, Flockungsmittel, Konsistenzgeber, Lösungsvermittler, Trennmittel und Weichmacher Verwendung. Sie dienen auch als Komponenten für Klebstoffe und sind Zwischenprodukt bei der Synthese von Polyurethanen. Das Molekulargewicht von PEG bestimmt entscheidend dessen Löslichkeit und physi-

3.4 Abbauleistungen von Mikroorganismen

229

kalische Eigenschaften. PEGs mit Molekulargewichten bis zu ca. 25.000 Da sind flüssig und gut wasserlöslich. Mit zunehmenden Molekulargewicht werden die PEGs fester und beginnen eine wachsartige Konsistenz zu besitzen; auch deren Löslichkeit in Wasser nimmt stark ab. Für alle von der Natur synthetisierten Verbindungen lassen sich (meist) Mikroorganismen finden, die diese auch wieder Aerobe Bakterien Organismen abbauen können. synthetisieren keine Verbindungen, die Achromobacter xylosoxidans subsp. denitrificans prinzipiell nicht abbaubar wären und Pseudomonas aeruginosa sich in der Biosphäre akkumulieren Pseudomonas stutzeri könnten. Die Evolution von Synthesewegen Sphingomonas macrogoltabidus und der daran beteiligten Enzyme hat sich Sphingomonas terrae über große Zeiträume erstreckt und ist sehr Rhodoblastus acidophilus (früher: Rhodolangsam vorangegangen. Diese Zeiträume pseudomonas acidophila) haben natürlich auch zur Verfügung gestanAnaerobe Bakterien den, um gegenläufige katabolische Prozesse Bacteroides sp. Stamm PG1 zu entwickeln, wodurch diese Organismen Pelobacter venetianus dann von den Syntheseprodukten als KohPilze lenstoff- oder Stickstoffquelle profitieren konnten. Es wäre sicherlich sehr interessant, Gloeophyllum trabeum aus nachwachsenden Rohstoffen Biopolymere produzieren zu können, die wie Polyethylen oder Polypropylen biologisch nicht abbaubar – also persistent sind und als langfristig haltbare Konstruktionsmaterialien im Haus- oder Automobilbau einsetzbar wären. Leider sind solche biotechnologischen Prozesse, die sich wirklich für den Einsatz in der Industrie eignen würden, bisher nicht bekannt. Es ist lediglich möglich, dass biologisches Material vorübergehend an Orten und unter Bedingungen abgelagert wird, an denen ein Abbau nicht möglich ist. Beispiele hierfür sind die Lagerstätten für fossile Rohstoffe. Hier ist zudem zu berücksichtigen, dass häufig auch noch physikochemische Prozesse zur Umwandlung der ehemals aus Biomasse hervorgegangenen Verbindungen beigetragen haben.

Biologische Abbaubarkeit und Persistenz chemischer Verbindungen

Mit PEG begegnen wir einer Verbindung, die von der Natur nicht synthetisiert aber dennoch von einigen Mikroorganismen abgebaut und als alleinige Kohlenstoffquelle zum Wachstum verwertet werden kann. Dies belegt, dass nicht alle Syntheseprodukte der chemischen Industrie persistent. Nicht die Herkunft, sondern die chemische Struktur entscheidet darüber, ob eine Verbindung durch Enzyme abgebaut werden kann. Meist gibt es natürliche Verbindungen mit einer verwandten chemischen Struktur oder zumindest Teilstruktur. Enzyme, welche die entsprechenden „natürlichen“ Moleküle angreifen, sind u. U. auch in der Lage, Verbindungen synthetischen Ursprungs zu attackieren, oder können die Fähigkeit hierzu durch wenige Mutationen erwerben.

Mikrobieller Abbau von PEG

Mikroorganismen, die PEG abbauen können, lassen sich aus der Natur relativ leicht von unterschiedlichen Standorten isolieren, auch wenn sie dort nicht in sehr hoher Anzahl vorkommen. Eingehender wurde der Abbau von PEG an aeroben Bakterien untersucht. Es sind aber auch Pilze und strikt anaerobe Bakterien bekannt, die PEG als alleinige Kohlenstoffquelle zum Wachstum verwerten können ( Tabelle 3.63).

PEG-abbauende Mikroorganismen

Enzyme, die den mikrobiellen Abbau von PEG einleiten, wurden bisher noch nicht sehr ausführlich untersucht. Außerdem scheint es hier mehrere sehr unterschiedliche Strategien der Mikroorganismen für den Abbau zu geben. Der aerobe Abbau wird in Sphingomonas terrae durch eine Oxidation der endständigen Hydroxylgruppe des

Biochemie des PEG Abbaus

Tabelle 3.63. nismen

PEG abbauende Mikroorga-

O

CH2 CH2 n

Polyethylenglykol

230

3 Versuche

Abb. 3.115.

Aerober und anaerober Abbau von Polyethylenglykol

PEG eingeleitet. Die Oxidation von PEG zum PEG-Aldehyd wird von einer membrangebundenen PEG-Dehydrogenase katalysiert, die FAD als prosthetische Gruppe enthält. Eine zweite Dehydrogenase oxidiert PEG-Aldehyd dann zu PEG-Säure. Im dritten Schritt kommt es zur Spaltung der Etherbindung and Abspaltung von Glyoxylsäure, die weiter verstoffwechselt wird. Auf diese Weise verkürzt sich das PEG Molekül sukzessive um jeweils zwei Kohlenstoffatome ( Abb. 3.115). Für den anaeroben Abbau wurde ein anderer, experimentell jedoch noch nicht abgesicherter Mechanismus vorgeschlagen. Danach soll in Pelobacter venetianus ein Coenyzm B12-abhängiges Enyzm die Hydroxylgruppe des endständigen Glykolrestes von Kohlenstoffatom C1 auf C2 verschieben, wodurch ein instabiles Hemiacetal entsteht. Nachfolgend wird dann durch eine PEG-Acetaldehyd-Lyase die Etherbindung aufgelöst und Acetaldehyd abgespalten; ein um zwei Kohlenstoffatome verkürztes PEG-Molekül bleibt zurück ( Abb. 3.115). Versuchsziel In diesem Versuch wird der Abbau von PEG durch ein aerobes Bakterium demonstriert. Das Wachstum der Zellen wird durch die Messung der Trübung in einem Mineralmedium mit PEG als einziger Kohlenstoffquelle verfolgt. Der Abbau des wasserlöslichen Polymers wird mit der in der Polymeranalytik wichtigen Methode der Gelpermeationschromatographie (GPC) erfasst. Bei diesem Abbauversuch werden zwei PEG-Varianten (PEG 6.000 und PEG 20.000) eingesetzt, die sich in ihrem Polymerisationsgrad und ihrer biologischer Abbaubarkeit unterscheiden.

3.4 Abbauleistungen von Mikroorganismen

231

Versuchsdurchführung benötigtes Material Geräte            

Impföse Bunsenbrenner Autoklav 200 ml-Erlenmeyerkolben Vier 1 l-Erlenmeyerkolben Schüttler (30 °C) 5 ml-Glaspipetten, steril 1,5 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäße (E-Cups) Zentrifuge für E-Cups Gefrierschrank (-20 °C) Photometer zur Bestimmung der Optischen Dichte (Trübung) bei 600 nm Gelpermeationsanlage mit Zubehör ( M29, S. 408)

Chemikalien und Medien      

Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril Standard I-Festmedium ( S. 427) Mineralsalzmedium ( S. 421) PEG 6.000 PEG 20.000 Reagenzien zur Gelpermeationschromatographie ( M29, S. 408)

Mikroorganismen Folgende Stämme sind bei der DSMZ verfügbar, die PEG unterschiedlichen Polymerisationsgrades abbauen können:  Pseudomonas aeruginosa DSM 50071, gehört jedoch der Risikogruppe 2 an,  S. 24  Pseudomonas stutzeri DSM 5190  Sphingopyxis macrogoltabida DSM 8826  Sphingopyxis terrae DSM 8831  Es lassen sich jedoch auch recht einfach innerhalb weniger Wochen (in einem Vorversuch) unter den unten angegebenen Bedingungen Bakterien aus Erde oder Belebtschlamm (Kläranlage) anreichern und auf Festmedium isolieren, die dann in den unten beschriebenen Versuch als Reinkultur eingesetzt werden können.

Nach Erhalt des Stamms wird dieser – wenn nicht anders von der Bezugsquelle (DSMZ) angegeben – per Drei-Strich-Ausstrich (M4, S. 365) auf Standard I-Festmedium ausgestrichen. Die Platte wird bei 30 °C bebrütet. Das bewachsene Festmedium kann bis zur Verwendung im Kühlschrank (4 °C) gelagert werden. Vorkultur: Ausgehend von einer separat liegenden Einzelkolonie wird ein 200 mlErlenmeyerkolben mit 20 ml Mineralmedium und 0,5 % (wt/vol) PEG 6.000 beimpft. Die Kultur wird ca. 15 h bei 30 °C geschüttelt. Hauptkultur: Mit 5 ml der Vorkultur werden zwei 1 l-Erlenmeyerkolben mit jeweils 100 ml Mineralmedium und 0,5 % (wt/vol) PEG 6.000 bzw. 0,5 % (wt/vol) PEG 20.000 beimpft und bei 30 °C unter Schütteln inkubiert. Parallel zu den beiden beimpften Kulturen werden zwei sterile Ansätze gleichen Inhalts als Kontrollen auf nicht-biologische PEG-Zersetzung mitgeführt. Zum Zeitpunkt des Beimpfens (t = 0) werden kontaminationsfrei jeweils Proben à 5 ml aus den vier Ansätzen entnommen. Im Abstand von zwei Stunden werden aus dem beimpften Ansatz mit PEG 6.000 weitere fünf Proben entnommen. Die Proben dienen zunächst zur Bestimmung der Trübung bei 600 nm (M22, S. 391). Danach werden jeweils ca. 1 ml der Proben in E-Cups überführt, und diese werden für 10 min bei 12.000 × g zentrifugiert. Die Überstände werden in frische E-Cups überführt. Bis zur Messung des PEGAbbaus mittels Gelepermeationschromatographie (M29, S. 408) am Ende des Versuchs (Tag 7) werden die Überstände gesammelt und bei -20 °C gelagert. Es werden abschließend Proben aus beiden Ansätzen mit PEG 6.000 genommen. Eine Probe wird aus dem beimpften Ansatz mit PEG 20.000 gezogen. Die Proben werden wiederum der Trübungsbestimmung und der Gelpermeationschromatographie (GPC) zugeführt.

Vorbereitungen

232

3 Versuche

Täglich erfolgt eine Probennahme aus dem beimpften Ansatz mit PEG 20.000. Es werden abschließend Proben aus beiden Ansätzen mit PEG 20.000 entnommen. Die gesammelten Überstände der Proben werden in einer gemeinsamen GPC-Messreihe eingesetzt (M29, S. 408). Weiterführende Literatur Frings J, Schramm E, Schink B (1992) Enzymes involved in anaerobic polyethylene glycol degradation by Pelobacter venetianus and Bacteroides strain PG1. Applied and Environmental Microbiology 58:2164-2167 Kawai F (2002) Biodegradation of polyethers (Polyethylene glycol, polypropylene glycol, Polytetramethylene glycol, and other). In: Matsumura S, Steinbüchel A (eds) Biopolymers – Miscellaneous biopolymers and biodegradation of polymers, vol 9. Wiley-VCH, Weinheim, pp 267-298 White GF, Rusell NJ, Tidswell EC (1996) Bacterial scission of ether bonds. Microbiological Reviews 60:216232 Yasuda M, Cheepanov A, Duine JA (1996) Polyethylene glycol dehydrogenase activity of Rhodopseudomonas acidophila derives from a type I quinohaemoprotein alcohol dehydrogenase. FEMS Microbiology Letters 138:23-28

Nachgefragt 1. Welcher charakteristische Bindungstyp kommt in Polyethern vor? 2. Zeichnen Sie die chemische Strukturformel von Polyethylenglykol! 3. Nennen Sie weitere Polyether! 4. Wie verändern sich die Eigenschaften von Polyethylenglykol mit zunehmendem Molekulargewicht? 5. Wie unterscheiden sich Polyethylenglykol und Polyethylen hinsichtlich der chemischen Struktur? 6. Welche generelle Regel gilt bezüglich der biologischen Abbaubarkeit natürlicher Verbindungen? Begründen Sie diese Regel! 7. Warum gilt diese Regel nicht in umgekehrter Weise auch für alle Produkte der chemischen Industrie? 8. Suchen Sie in Lehrbüchern der Biochemie, Mikrobiologie und Biotechnologie nach natürlichen Verbindungen, die eine möglichst ähnliche chemische Struktur wie Polyethylenglykol oder zumindest eine Etherbindung besitzen! Es ist dabei von untergeordneter Bedeutung, aus welchem Organismen diese Verbindungen stammen! 9. Nennen Sie Bakterien, die Polyethylenglykol unter aeroben Bedingungen abbauen können! 10. Beschreiben Sie den für den Abbau von PEG in aeroben Mikroorganismen vorgeschlagenen Mechanismus! 11. Wo entsteht im Stoffwechsel von Bakterien ebenfalls Glyoxylsäure?

12. Informieren Sie sich in Lehrbüchern der Mikrobiologie und Biochemie, wie Glyoxylsäure weiter verstoffwechselt werden kann! 13. Nennen Sie Bakterien, die Polyethylenglykol unter anaeroben Bedingungen abbauen können! 14. Beschreiben Sie den für den Abbau von PEG in anaeroben Mikroorganismen vorgeschlagenen Mechanismus! 15. Wie könnten anaerobe Bakterien den beim Abbau von PEG freigesetzten Acetaldehyd weiter verstoffwechseln, um nicht nur eine ausgeglichene Redoxbilanz, sondern auch genügend Energie zu erhalten? 16. Ist der für den aeroben Abbau von PEG vorgeschlagene Mechanismus auch auf strikt anaerobe Bakterien übertragbar? 17. Konsultieren Sie Lehrbücher der Biochemie und Mikrobiologie und erstellen Sie eine Übersicht über Enzyme, die Coenzym B12 als Cofaktor nutzen, und über die Reaktionen, die diese Enzyme katalysieren! 18. Wie verändert sich das Molekulargewicht von PEG während des mikrobiellen Abbaus nach den hierfür vorgeschlagenen Abbaumechanismen? 19. Sind die hier für den aeroben und anaeroben Abbau von PEG vorgeschlagenen Mechanismen auch auf den Abbau von Polypropylenglykol übertragbar? 20. Warum können Mikroorganismen, die Polyethylenglykol abbauen, nicht auch Polyethylen abbauen?

3.4 Abbauleistungen von Mikroorganismen

Mikrobieller Abbau von Roundup®

233

Versuch 46

Theoretischer Hintergrund Roundup® ist der bekannteste Vertreter einer Gruppe von UnkrautO P CH2 NH CH2 COO bekämpfungsmitteln (Herbiziden), die den Glyphosat enthalten Wirkstoff O ( Abb. 3.116). Glyphosat (N-PhosphonoGlyphosat methyl-Glycin) selbst gehört mit einem weiO O teren wichtigen Wirkstoff, dem Glufosinat ( Abb. 3.116), zur Gruppe der OrganoH3C P O C O Glyphosat wurde phosphorherbiziden. CH2 CH2 von der Fa. Monsanto (St. Louis, USA) entCH2 CH2 O O wickelt und 1971 der Öffentlichkeit vorge+ stellt. Bereits drei Jahre später erfolgte die C C NH3 C C NH3+ Zulassung für die USA durch die EnvironO O H H mental Protection Agency und für DeutschGlufosinat Glutamat land durch die Biologische Bundesanstalt (BBA). Seit dieser Zeit wird die Substanz Abb. 3.116. Strukturformeln von Glyphounter zahlreichen unterschiedlichen Hansat, Glufosinat und Glutamat delsnamen (in Deutschland allein 54 Präparate) vertrieben und im großen Umfang eingesetzt ( Tabelle 3.64); allein in den USA wurden 1998 rund 13.000 t von der Substanz eingesetzt. Bei Monsanto beliefen sich die Umsatzerlöse für Roundup® und andere Glyphosat-Produkte im Jahr 2001 auf ca. 2,5 Mrd. US$.

Glyphosat

Die Wirkungsweise von Glyphosat beruht auf der Hemmung eines Enzyms im Biosyntheseweg der aromatischen Aminosäuren (Shikimat-Weg), der 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSP-Synthase,  Abb. 3.117). Der Wirkstoff bindet fest im aktiven Zentrum des Enzyms und verhindert so die Anlagerung eines der beiden Reaktanden der Reaktion, des Phosphoenolpyruvats (PEP). Die Wirkung ist sehr spezifisch: Andere Enzyme, insbesondere andere PEP-umsetzende Enzyme werden nicht gehemmt. Die EPSP-Synthase kommt vor in Pflanzen, in Bakterien und in Pilzen, nicht jedoch in Tieren. Letzteren fehlt der Shikimat-Weg inklusive EPSP-Synthase. Tryptophan und Phenylalanin sind daher für Tiere (einschließlich des Menschen) essentielle Aminosäuren, die mit der Nahrung aufgenommen werden müssen (Tyrosin zählt nicht dazu, da es in Tieren durch Umwandlung von Phenylalanin entsteht). In Pflanzen ist die EPSP-Synthase in den Chloroplasten lokalisiert, in denen die Synthese der aromatischen Aminosäuren abläuft. Glyphosat wird von den Pflanzen durch die oberirdisch liegenden Teile, insbesondere durch die Blattoberfläche aufgenommen. Von dort wird es im ganzen Pflanzenkörper verteilt; beeinträchtigt werden alle Pflanzenteile (systemische Wirkung). Viele Glyphosat-haltige Formulierungen enthalten Oberflächen-aktive Substanzen (Netzmittel, Tenside), welche die Passage des Herbizids durch die Wachsschicht der Blätter erleichtern. Die Wirkung über den Boden ist gering, da die ionische Substanz sehr gut von den Bodenpartikeln gebunden wird. Pflanzen, die mit Glyphosat behandelt wurden, zeigen nach drei bis sieben Tagen erste sichtbare Zeichen der Wirkung (die Blätter welken, werden gelb, dann braun), bevor der gesamte Pflanzenkörper in der Folge eingeht.

Wirkung bei Pflanzen

Der Umgang bzw. Kontakt mit Glyphosat ist für Mensch und Tier relativ unproblematisch. Der speziellen Wirkung auf die EPSP-Synthase ist es zu verdanken, dass Glyphosat für höhere Tiere ungiftig ist. Wie oben bereits erwähnt, enthalten viele Glyphosathaltige Präparate Tenside, die dem Eindringen des Herbizids in die Pflanze dienen. Auf

Wirkung auf Mensch und Tier

O

234

3 Versuche Tabelle 3.64.

Breitbandherbizide

Wirkstoff

Wirkort

chemische Gruppe

Produkte

Hersteller

Glyphosat

EPSP-Synthase

Organophosphorherbizid

Roundup Accord, Durano, Clinic, Taifun, Touchdown u. a.

Monsanto

Glufosinat

GlutaminSynthetase

Organophosphorherbizid

Basta Liberty

Bayer AG

Atrazin

Photosynthese

Triazin

Aatrex, Gisaprim, Primatol u. a.

Ciba-Geigy

Paraquat

Photosynthese

Bipyridyl-Verbindung

Gramoxone u. a.

Zeneca

Amitrol

ChlorophyllSynthese

Triazol

Cumatol u. a.

RhônePoulenc

Diuron

Photosynthese

Harnstoffverbindung

Crisuron, Diater, Dion u. a

DuPont

die hautschädigende Wirkung der Tenside konnte es zurückgeführt werden, dass viele ältere Glyphosat-Formulierungen als „reizend für Schleimhäute“ und „Fisch-schädigend“ eingestuft wurden. Seit 1994 sind Glyphosat-Präparate mit harmlosen Zusatzstoffen auf dem Markt, die keiner Giftklasse mehr zugeordnet werden. Diese neuen Präparate (z. B. Roundup Ultra®) gelten als Bienen-ungefährlich und nicht-schädigend für andere Indikator-Tiere (Wolfsspinne, Laufkäfer, Brackwespe) und nur schwachschädigend für Florfliegen. Glyphosat ist weder mutagen noch karzinogen oder fruchtschädigend. Aufgrund der guten Bindung an Erdpartikel, dringt es nicht tiefer als 15 cm in den Boden ein und gelangt daher nicht ins Grundwasser. Wirkungsweise von Glufonisat

Die Wirkung von Glyphosat und der verwandten Substanz Glufosinat gegenüber Pflanzen ist nicht selektiv, d. h. die Substanzen sind für fast alle Pflanzenarten toxisch. Die Wirkstoffe zählen damit zu den Breitband- oder Totalherbiziden ( Tabelle 3.64). Glufosinat, das 1984 auf Betreiben der Fa. Hoechst von der Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft (BBA) zugelassen wurde und das international unter dem Handelsnamen Liberty® verkauft wird und in Deutschland unter der Bezeichnung BASTA® für Furore sorgte, hemmt spezifisch die pflanzliche Glutamin-Synthetase. Die chemische Struktur von Glufosinat ist der des Glutamats sehr ähnlich ( Abb. 3.116) und im Unterschied zu Glyphosat in der Natur zu finden; sie ist in dem Peptid Phosphinothricin vorhanden, das von einigen Actinomyceten gebildet wird.

Einsatzgebiete

Typisches Einsatzgebiet für Breitband-Herbizide wie Glyphosat und Glufosinat ist die Unkrautbekämpfung auf Flächen, die vegetationsfrei gehalten werden sollen (Nichtkulturland), wie z. B. Bahndämme, Straßenränder, Plätze, Gehwege, Terrassen, Grundstückseinfahrten etc. Doch auch im Acker- und Gartenbau, im Weinanbau sowie in der Forstwirtschaft werden diese Substanzen eingesetzt. Hier jedoch waren der Einsatz von Glyphosat und Glufosinat wegen der nicht-selektiven Wirkung lange Zeit stark eingeschränkt (z. B. vor der Aussaat und nach der Ernte).

3.4 Abbauleistungen von Mikroorganismen

235

CH2 2-

O3P

C

O

COO-

COODAHP-Synthase

H 2-

O

O3P

C CH

CH2 CH HO

O

2-

O3P

O

OH

O

HO

OH

OH

COO-

2-

O3P

OH

OH OH

-

COO

COO + P i

2-

O3P

O

C

O

CH2

COO-

O

-

+

NH3

ChorismatMutase

CH2 O

C

COO

O

-

Anthranilat + NH3

-

CH2

THF O -

p-Aminobenzoat

OOC

COO

-

CH2

AminodehydrochorismatSynthase

COO-

COO

-

AnthranilatSynthase

COO- + NH3

Tryptophan

COO

Chorismat

Phosphoenolpyruvat COO

C

OH

OH 5-Enolpyruvylshikimat3-phosphat (EPSP)

COO

-

ChorismatSynthase

CH2

EPSP-Synthase

CH2

Shikimat-3-phosphat

Shikimat

Glyphosat

C

COO

OH Prephenat

-

+

NH3 Aminodehydrochorismat COO +

NH3

HO Tyrosin

Abb. 3.117.

O

OH

Dehydroshikimat

C

OH

COO-

DHQ- HO Synthase

ShikimatKinase

OH

O

HC CH

CH2 CH HO

ShikimatDehydrogenase

Dehydroquinase

O3P

CH2

COO-

COO-

H2O

C

O OH + NAD + OH NADH + H 3-Deoxy-D-arabinoheptuloDehydroquinat sonat-7-phosphat (DAHP) (DHQ)

H2O

D-Erythrose-4-phosphat

2-

O

+ Pi

Phosphoenolpyruvat

-

COO +

NH3

Phenylalanin

Shikimat-Syntheseweg aromatischer Aminosäuren und Wirkort von Glyphosat

-

236

3 Versuche HerbizidresistenzSysteme

Einen Ausweg in dieser zumindest für die Tabelle 3.65. Herbizidresistenz-Systeme Produzenten von Glyphosat und Glufosinat Nutzpflanzen misslichen Situation bot in den 90er Jahren System (Hersteller) die so genannte Grüne Gentechnik. In den Sojabohne vergangenen zehn Jahren wurden verschie- Roundup Ready® (Monsanto) Baumwolle dene Glyphosat-resistente KulturpflanMais zen entwickelt, die einen breiten Einsatz des Raps Totalherbizids auch hier ermöglichten. Glyphosat ist damit das Komplementärherbizid LibertyLink® Mais zu Glyphosat-resistenten Nutzpflanzen; (Bayer AG) Reis beide gemeinsam stellen ein so genanntes Zuckerrübe Herbizidresistenz-System dar. Die Fa. Monsanto bietet zurzeit vier so genannte Roundup Ready®-Pflanzen an ( Tabelle 3.65). Die Roundup Ready®-Sojabohne ist nach ihrer Zulassung in Nordamerika bei den Farmern zunächst auf gute Akzeptanz gestoßen: Von 500.000 ha im Jahr 1996 stieg die Anbaufläche innerhalb von drei Jahren auf knapp 17 Mio ha. Für Glufosinat werden von der Fa. Bayer CropScience, die jüngst die Hoechst-Nachfolgefirma Aventis CropScience erworben hat, ebenfalls Herbizidresistenz-Systeme angeboten, die so genannten LibertyLinks®.

Resistenzmechanismen

Die Resistenz gegenüber Glyphosat wird in Roundup Ready®-Pflanzen durch ein Gen aus dem Bodenbakterium Rhizobium radiobacter (früher: Agrobacterium tumefaciens) CP4 vermittelt, das für die CP4 EPSP-Synthase codiert, die im Unterschied zu den pflanzlichen Enzymen nicht durch Glyphosat gehemmt wird. Ein weiteres Gen, das in Kombination mit dem CP4-EPSP-Synthase-Gen bei der Erzeugung Glyphosat-resistenter Pflanzen eingesetzt wurde, stammt aus Achromobacter sp. LBAA und codiert für -

Arthrobacter artrocyaneus O Acinetobacter sp. O P Flavobacterium sp. O Pseudomonas sp. H O+O 2

2

CH2 NH

Arthrobacter sp. Pseudomonas sp. Streptomyces sp.

CH2 COOH

Glyphosat

H2O Pi

H2O2

O O3P CH2 NH2 H C COO Aminomethyl+ Glyoxylat phosphonat 2-

H3C

NH

CH2 COOH

Sarcosin

H2O

H2N

H2O O

Pi CH3

C H H Formaldehyd

Methylamin 2 [H]

NH3

2 [H] H2N

CH2 COOH Glycin

C1-Fixierung

Abb. 3.118. Abbauwege von Glyphosat. Die Bakterien, bei denen der jeweilige Weg gefunden wurde, sind angegeben

3.4 Abbauleistungen von Mikroorganismen

237

ein Enzym mit Glyphosat-Oxidase-Aktivität (GOX), das das Herbizid zum ungiftigen Aminomethylphosphonat oxidiert. Auch nach fast 30-jährigem Einsatz von Glyphosat sind bislang keine natürlichen Resistenzen bei Pflanzen bekannt geworden. Die Resistenz gegenüber Glufosinat wird bei den LibertyLink®-Pflanzen durch ein bakterielles Gen vermittelt, dessen Produkt, die Phosphinothricin-Transacetylase, das Herbizid in ein unschädliches Derivat überführt. Trotz des „Imageproblems“, das Pflanzen wie Roundup Ready®-Mais hierzulande haben, schreitet die Forschung und Entwicklung auf dem Gebiet der grünen Gentechnik international weiterhin ungebremst voran, und damit einhergehend vergrößert sich das Angebot gentechnisch veränderter Nutzpflanzen ständig. Glyphosat gilt als moderat bis gut biologisch abbaubar; die Halbwertszeit im Erdreich beträgt abhängig von Bodenzusammensetzung und Temperatur zwei bis 140 Tage (im Durchschnitt 60 Tage). Obwohl die im Glyphosat vorhandene Kohlenstoff-Phosphor-Bindung (Phosphonat) chemisch relativ stabil ist, kann sie von vielen Bodenbakterien hydrolytisch gespalten werden, was zur Freisetzung von Phosphat (Pi) führt. Glyphosat kann damit als Phosphorquelle zum Wachstum genutzt werden. Dies scheint auch die Hauptfunktion des Herbizids für die abbauenden Organismen zu sein: Die Gegenwart von Phosphat wirk hemmend auf den Abbau; Glyphosat als alleinige Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle wird nur langsam verstoffwechselt. In den vergangenen Jahrzehnten nach Markteinführung von Glufosinat ist eine Vielzahl von bakteriellen Gram-positiven und -negativen Glyphosat-Abbauern isoliert worden. Die bei den Abbauern bislang gefundenen Abbauwege sind in Abb. 3.118 dargestellt. Detaillierte Kenntnisse über die Biochemie der Abbaureaktionen insbesondere über die Phosphor-Kohlenstoff (CP)-Lyase liegen bislang nicht vor. Versuchsziel benötigtes Material Geräte      

Zwei 1000 ml-Erlenmeyerkolben Vier Blumentöpfe Gartenkresse-Saat Sprühflasche Gießkanne Schüttler (30 °C)

Chemikalien und Medien  Glyphosat-Lösung (4,2 g Glyphosat/l; entspricht 10 g Roundup®Gran/l), sterilfiltriert

Im praktischen Teil wollen wir die biologische Abbaubarkeit von Glyphosat überprüfen. Dazu wird Roundup® mit Gartenerde vermischt und über mehrere Wochen inkubiert. Als Kontrolle wird sterilisierte Gartenerde mitgeführt. Um den Abbau im relativ kurzen Versuchszeitraum zu beschleunigen, wird den Erdproben etwas Gluconat als leicht verwertbare Kohlenstoffquelle zugesetzt. Der Erfolg des Herbizid-Abbaus wird im Anschluss anhand der verbliebenen Wirkung des Herbizids auf Testpflanzen gemessen.

Versuchsdurchführung Ansetzen der Abbaukulturen: Zwei mit A Sonstiges und B gekennzeichnete 1000 ml-Erlenmey frische Gartenerde (ca. 160 g) erkolben werden jeweils mit 80 g frischer Gartenerde und 100 ml Leitungswasser versehen und anschließend mit Wattestopfen und Aluminiumfolie verschlossen. Kolben B wird autoklaviert, Kolben A jedoch nicht. Nach dem Autoklavieren und Abkühlen von Kolben B werden aus einer sterilen Glyphosat-Lösung jeweils 100 ml zu beiden Kolben zugesetzt. Die beiden Ansätze werden bei 30 °C geschüttelt.

Biologischer Abbau

238

3 Versuche

Einsäen der Testpflanzen: In vier mit A, B, C und D gekennzeichnete Blumentöpfe mit Blumenerde wird Gartenkresse-Saatgut dicht eingesät und mit Leitungswasser besprüht. Die Töpfe werden an einem normal hellen Ort platziert. In den folgenden Tagen wird bei Bedarf mit Leitungswasser gegossen. Ein Teil der beiden Ansätze A und B (jeweils ca. 50 ml) wird zunächst durch ein feinporiges Sieb (z. B. Teesieb) gegeben und dann mittels Filtration durch ein Papierfilter (z. B. Kaffeefilter) von Erdpartikeln befreit. Die beiden Filtrate aus den Ansätzen A und B werden mit Hilfe einer Sprühflasche auf die Pflänzchen der gleich gekennzeichneten Blumentöpfe gesprüht. Die Gartenkresse in den Blumentöpfen C und D wird zur Kontrolle mit normalen Leitungswasser (Topf C) bzw. mit 1:2 verdünnter GlyphosatLösung (Topf D) besprüht. Bitte in den folgenden Tagen die Erde weiterhin feucht halten. Mit einer abschließenden Bewertung des Erscheinungsbildes der Testpflanzen endet der Versuch. Weiterführende Literatur Dick RE, Quinn JP (1995) Glyphosate-degrading isolates from environmental samples: occurrence and pathways of degradation. Applied Microbiology and Biotechnology 443:545-550 Kertesz MA, Cook, AM, Leisinger T (1994) Microbial metabolism of sulfur- and phosphorus-containing xenobiotics. FEMS Microbiology Reviews 15:195-215 Mannerlöf, M, Tuvesson S, Steen P, Tenning P (1997) Transgenic sugar beet tolerant to glyphosate. Euphytica 94:83-91 Padgette SR, Kolacz KH, Delannay X, Re DB, LaVallee BJ, Tinius CN, Rhodes WK, Otero YI, Barry GF, Eichholtz DA, Peschke VM, Nida DL, Taylor NB, Kishore GM (1995) Development, identification, and characterization of a glyphosate-tolerant soybean line. Crop Science 35:1451-1461 Torstensson NTL, Aamisepp A (1977) Detoxification of glyphosate in soil. Weed Research 17:209-212

Nachgefragt 1. Erläutern Sie die Begriffe Biozid, Pestizid, Herbizid und Fungizid! 2. Was ist ein Xenobiotikum? 3. Zeichnen Sie die Strukturformeln von Glyphosat und Phosphoenolpyruvat! 4. Welche Organismen werden durch Glyphosat geschädigt? 5. Warum ist Glyphosat für Mensch und Tier ungiftig? 6. Welche Aminosäuren sind für den Menschen essentiell; warum ist Tyrosin für den Menschen keine essentielle Aminosäure? 7. Welche Aminosäuren zählen zu den sauren, den basischen und den aromatischen Aminosäuren? Informieren Sie sich über den Biosyntheseweg der aromatischen Aminosäuren (Shikimat-Weg)! 8. Zeichnen Sie die Struturformeln von Glufosinat, Glutamin und Glutamat! 9. Welches Enzym wird durch Glufosinat gehemmt? Wieso führt die Behandlung mit Glufosinat zu einer Vergiftung der Pflanze mit Ammoniak? 10. Wieso werden Glyphosat und Glufosinat als Totalherbizide bezeichnet? Nennen Sie andere Totalherbizide! 11. Wie funktioniert die gentechnisch erzeugte Resistenz gegenüber Glufosinat?

12. Wie sind Nutzpflanzen gentechnisch verändert worden, um sie gegen Glyphosat resistent zu machen? 13. Welche Voraussetzungen muss ein Herbizid haben, um Teil eines Herbizidresistenz-Systems zu werden? 14. Informieren Sie sich über die Persistenz von Herbiziden und Pestiziden im Boden! 15. Warum ist die Kohlenstoff-Phosphor-Bindung im Glyphosat relativ stabil? Informieren Sie sich über das unterschiedliche Phosphatgruppenübertragungspotential der drei Phosphatgruppen im ATP! Woher kommt der Unterschied? 16. Wie wird Glyphosat im Boden abgebaut; welche Mikroorganismen sind am Abbau beteiligt? 17. Warum wird den Ansätzen im Versuch Gluconat zugesetzt? 18. Warum wird im Versuch neben dem sterilisierten Ansatz noch eine Glyphosat-Lösung in Wasser als Kontrolle mitgeführt? 19. Warum wird die Mikroflora im Boden durch Glyphosat kaum geschädigt? 20. Beurteilen Sie die Abbaurate von Glyphosat in einem Boden, der mit Mineraldünger behandelt wurde!

3.5 Bakteriophagen und Viren

3.5

239

Bakteriophagen und Viren

Viren sind genetische Elemente, die sich nicht selbständig vermehren können und zwischen einer extrazellulären und einer intrazellulären Form wechseln. Die extrazelluläre Form dient der Verbreitung, während die intrazelluläre Form der Replikation und der Vermehrung des Virus dient. Viren sind für die Vermehrung auf eine lebende Zelle als Wirt angewiesen. Sie stellen deshalb keine Organismen dar. Ein Virus kann nur dann neue Zelle infizieren, wenn es von der Wirtszelle freigesetzt wird, was i. d. R. mit der Lyse der Wirtszelle verbunden ist. Für nahezu alle Organismen sind Viren bekannt. Je nach Wirtsorganismus – Bakterium, Pflanze, Tier oder Mensch – werden sie als Bakteriophagen, Pflanzenviren, bzw. Tier- und Humanviren bezeichnet. Die Freisetzung von Bakteriophagen führt, von wenigen Ausnahmen abgesehen, fast immer zum Absterben der infizierten Bakterienzelle. Durch die Freisetzung der Viren und die damit verbundene Zerstörung einzelner Zellen in einem Gewebe oder Organ eines mehrzelligen Wirtsorganismus wird i. d. R. auch der Gesamtorganismus in Mitleidenschaft gezogen. Der Wirtsorganismus erkrankt hierdurch und kann sogar so weit geschädigt werden, dass dies seinen Tod zur Folge hat. Im extrazellulären Zustand liegen Viren als Viruspartikel oder Virionen vor, die grundsätzlich nur aus einer Art von Nukleinsäure sowie aus Protein bestehen ( Tabelle 3.66). Als Nukleinsäure kommt entweder einzel- oder doppelsträngige DNA (DNA-Viren) oder einzel- oder doppelsträngige RNA (RNA-Viren) vor, wobei DNA sowohl ringförmig geschlossen als auch linear vorliegen kann. Die Proteine werden auch als Capsomere bezeichnet und umgeben stets die Nukleinsäure. Die Gesamtheit der Capsomere, welche die Nukleinsäuren umgeben, wird als Capsid bezeichnet. Capsid und Nukleinsäure zusammen bilden das Nucleocapsid. Die charakteristische Struktur eines Viruspartikels und die symmetrische Anordnung des Capsids wird durch die Struktur der Proteine selbst vorgegeben und geht aus dem Selbstzusammenbau (self assembly) des Nucleocapsids hervor. Neben der helicalen Symmetrie, wie sie die stäbchenförmigen Viren aufweisen (z. B. Tabak-Mosaik-Virus), ist die ikosaedrische Symmetrie, wie sie kugelförmige Viren (z. B. der Kopf des Bakteriophagen Lambda) aufzeigen, verbreitet. Häufig liegen die Nukleocapside nackt vor; bei einigen Viren ist das Nukleocapsid zusätzlich noch von einer Membranhülle umgeben, die meist aus einer Lipiddoppelschicht und spezifischen Proteinen besteht. Einige Viren können darüber hinaus auch noch Enzyme enthalten, die bei der Infektion oder bei der Freisetzung von Bedeutung sind. Tabelle 3.66.

Die Genome verschiedener Viruspartikel DNA-Viren

RNA-Viren

dsDNA

ssDNA

dsRNA

ssRNA

• Bakteriophage Lambda • Bakteriophage Mu • Bakteriophage T4 • Bakteriophage T7 • Herpes-Virus

• Bakteriophage ϕX174 • Bakteriophage M13

• Hepadna-Virus • Reo-Virus

• • • • • •

Bakteriophage MS2 Tabak-Mosaik-Virus Picorna-Virus Polio-Virus Retro-Virus (HIV) Tollwut-Virus

In der zweiten Zeile sind jeweils Art und Form der in dem Viruspartikel (extrazelluläre Form!) vorliegenden Nukleinsäure aufgeführt. Abkürzungen: ss, einzelsträngig (single stranded); ds, doppelsträngig (double stranded)

240

3 Versuche

Viruspartikel sind sehr viel kleiner als Bakterienzellen. Die kleinsten Viren haben lediglich eine Größe von 20 nm; die größten Viren haben eine Größe von bis zu 300 nm. Viren sind deshalb mit dem Lichtmikroskop nicht zu sehen; nur mit dem Elektronenmikroskop sind sie abbildbar. Viren passieren auch alle herkömmlichen Filter. Membranfilter, die z. B. zum Abtrennen von Bakterienzellen und Sterilisieren von hitzeempfindlichen Lösungen eingesetzt werden, halten Viruspartikel nicht zurück. In den Wirt gelangen Viren durch eine Infektion. Der Infektion geht eine Anheftung des Viruspartikels an die Oberfläche des Wirtes voraus, die durch spezifische, eine hohe Affinität zueinander aufweisende Proteine an der Oberfläche von Wirt und Virus vermittelt wird und daher ein sehr spezifischer Vorgang ist. Nachdem das Virus in die Wirtszelle eingedrungen ist, vermehrt sich dessen Genom unabhängig von dem Genom des Wirts. Außerdem werden in einem geregelten Prozess sämtliche andere Bestandteile des Virus sowie Enzyme, die für dessen Freisetzung benötigt werden, synthetisiert. Der Stoffwechsel der Wirtszelle wird diesem Vorgang mehr oder weniger stark untergeordnet und kann deshalb von der Anwesenheit eines Virus sehr stark beeinflusst werden. Innerhalb sehr kurzer Zeit können dann in der infizierten Wirtszelle aus ursprünglich einem Viruspartikel Dutzende oder gar Hunderte neue entstanden sein. Solche Viren werden als virulente Viren bezeichnet. Das Genom eines Virus kann aber auch zunächst in das Genom des Wirtes integrieren und wird dann zusammen mit diesem repliziert. Dieses Stadium wird als Lysogenie bezeichnet. Solche bei Bakterien und Tieren nachgewiesene Viren heißen temperente Viren. Erst zu einem späteren Zeitpunkt, der u. U. sehr viele Generationen nach der Infektion auftreten kann, wird dann die unabhängige Vermehrung des Virusgenoms und damit auch die Entstehung neuer Viruspartikel induziert. In diesem Abschnitt des MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUMS werden wir uns mit Bakteriophagen und mit dem Tabak-Mosaik-Virus beschäftigen. Im ersten Versuch soll das Vorkommen von Bakteriophagen, die Escherichia coli infizieren können, demonstriert werden, und wir lernen eine Methode für deren Nachweis. Im zweiten Versuch beschäftigen wir uns mit dem Tabak-Mosaik-Virus und dessen Nachweis.

Versuch 47

Nachweis von Coli-Phagen im Abwasser Theoretischer Hintergrund

Bakteriophagen

Viren, die Bakterien infizieren können, werden als Bakteriophagen bezeichnet. Neben pflanzen- sowie tier- und humanpathogenen Viren stellen Bakteriophagen damit eine weitere Gruppe von Viren dar. Die Entdeckung von Bakteriophagen erfolgte 1915 durch den englischen Bakteriologen Frederick William Twort und 1917 durch den französisch-kanadischen Wissenschaftler Félix Hubert d'Herelle ungefähr 20 Jahre nach der Entdeckung von Pflanzen- und Tierviren aufgrund von Plaquebildung in Kolonien von Micrococcen bzw. aufgrund von Zelllyse bei einer Spezies von Shigella. Wie andere Viren bestehen auch Bakteriophagen aus einem Nucleocapsid mit Nukleinsäuren und Proteinen.

Phagen in Escherichia coli

In Escherichia coli wurden sehr viele unterschiedliche Bakteriophagen entdeckt und z. T. sehr detailliert untersucht ( Tabelle 3.67). Es kommen sowohl DNA- als auch RNA-Phagen vor, und auch die Formenvietfalt der Nucleocapside ist sehr groß. Von einfachen, sehr kleinen sphärischen Vertretern wie MS2, der lediglich 20 nm im Durchmesser misst, über sehr lange filamentöse Formen wie z. B. der Bakteriophage

3.5 Bakteriophagen und Viren Tabelle 3.67.

241

Beispiele für Phagen von Escherichia coli

Phage

Nukleinsäure

Morphologie

Lambda

dsDNA

sphärisch mit langem, nicht kontraktierbarem Schwanz

Mu

dsDNA

sphärisch mit mittellangem, kontraktierbarem Schwanz und Basalplatte

P1

dsDNA

sphärisch mit langem, nicht kontraktierbarem Schwanz und Basalplatte

T4

dsDNA

sphärisch mit mittellangem, kontraktierbarem Schwanz und Basalplatte

T7

dsDNA

sphärisch mit kurzem, nicht kontraktierbarem Schwanz und Basalplatte

M13

ssDNA

filamentös

Fd

ssDNA

filamentös

MS2

ssRNA

sphärisch

Qβ

ssRNA

sphärisch

SP

ssRNA

sphärisch

M13, bis hin zu komplexen Formen mit einem sphärischen Kopf, einem langen, z. T. kontrahierbaren Schwanz mit einem Injektionsstift sowie einer Basalplatte mit Schwanzfasern, wie z. B. die T-Phagen, sind alle Formen vertreten ( Abb. 3.119). Die meisten Bakteriophagen sind virulent und durchlaufen einen lytischen Cyclus. Nach der Infektion vermehren sie sich in der Wirtszelle autonom unter Einbeziehung von Enzymen, die vom Phagengenom und vom Wirtsgenom kodiert werden. Es erfolgen zunächst wiederholte Replikationen der Phagen-DNA, mit nur kurzer Verzögerung werden dann auch die Phagenproteine synthetisiert. Phagen-DNA und Phagenproteine aggregieren anschließend selbst (self assembly) zu reifen Phagenpartikeln. Durch Enzyme, die eine vom Lysozym her bekannte Reaktion katalysieren, wird die Zellwand des Wirts zerstört und die Phagenpartikel werden freigesetzt. Die Zeit von der Infektion der Wirtszelle durch den Phagen bis zur Freisetzung der neuen Phagen wird als Latenzzeit bezeichnet. Die Anzahl der Phagen, die dabei von einer einzelnen Zelle freigesetzt wird, ist die Wurfgröße. Latenzzeit und Wurfgröße sind charakteristische Größen für einen Bakteriophagen in dem betrachteten System. Die freigesetzten Phagen können nun weitere Wirtszellen infizieren, wodurch ein neuer lytischer Cyclus eingeleitet wird. Zahlreiche Bakteriophagen vermehren sich in der Wirtszelle nach der Infektion zunächst nicht autonom, sondern die Phagen-DNA wird in das Genom der Wirtszelle, mit dem es dann zusammen repliziert wird, integriert. Bei einigen anderen Bakteriophagen erfolgt keine Integration und die Phagen-DNA wird weiter autonom repliziert, ohne dass es zu einer Massenvermehrung kommt. Solche Bakteriophagen werden als temperent bezeichnet. Der Bakteriophage hat dann den Status eines Prophagen, und die Bakterien sind lysogen. Nur in sehr seltenen Fällen und u. U. viele Generationen nach der Infektion erlangen die Prophagen wieder einen autonomen Status, wodurch ein lytischer Cyclus eingeleitet wird.

virulente und temperente Bakteriophagen

242

3 Versuche

Abb. 3.119. Skizze eines T4-Bakteriophagen bei der Injektion der DNA in eine Wirtszelle von Escherichia coli Phage Lambda

Der am besten untersuchte Bakteriophage ist sicherlich Lambda, für den Escherichia coli Stamm K12 ein geeigneter Wirt ist. Bei diesem Bakteriophagen handelt es sich um einen temperenten Phagen, dessen Genom eine Länge von 48.502 Basenpaaren besitzt. Der Bakteriophage Lambda bindet an ein Protein, welches bei E. coli an der Aufnahme von Maltose beteiligt ist und sich auf der Zelloberfläche befindet. Mutanten von E. coli, die dieses Protein nicht mehr bilden, können Maltose nicht mehr als Kohlenstoffquelle verwerten und sind auch gegen diesen Bakteriophagen resistent. Nach der Adsorption gelangt die lineare, doppelsträngige DNA des Phagen in die Bakterienzelle. Beide Enden des DNA Moleküls bestehen aus kurzen, 12 Nukleotide umfassenden, einzelsträngigen und zueinander komplementären Bereichen (kohäsive Enden), die sich aneinander lagern (hybridisieren) und durch eine Ligase kovalent verknüpft werden. Die nun ringförmige Lambda-DNA lagert sich jetzt an das Chromosom von E. coli an. Diese Anlagerung erfolgt nur zwischen jeweils einer bestimmten Region der Lambda-DNA (att-Region) und des E. coli Chromosoms (intergenischer Bereich zwischen gal und bio). Diese Region wird auch durch das Enzym Lambda-Integrase erkannt, welches dort die Integration katalysiert. Durch die Integration verliert der Phage Lambda seinen autonomen Status, und die Phagen-DNA wird fortan zusammen mit dem Chromosom repliziert und so von Generation zu Generation in dem lysogenen Bakterium als so genannter Prophage weiter gegeben. Nur in relativ seltenen Fällen erlangt der Phage durch Ausgliederung aus dem Genom wieder einen autonomen Status. Er vermehrt sich dann in der Wirtszelle wie ein virulenter Phage, was dann innerhalb weniger Minuten zur Bildung vollständiger Phagenpartikel und nach Lyse der Bakterienzelle zu deren Freisetzung führt.

3.5 Bakteriophagen und Viren

Die meisten virulenten Bakteriophagen lassen sich mit einer sehr einfachen Methode nachweisen. Hierzu wird ein für den nachzuweisenden Bacteriophagen sensitiver Bakterienstamm zusammen mit der phagenhaltigen Probe und noch flüssigem Agar gut vermischt und auf einen in einer Petrischale bereits vorhandenen festen Nähragar gegossen. Die Bakterien beziehen ihre Nährstoffe aus dem Agar und wachsen zu einem trüben, konfluenten „Bakterienrasen“ heran. Überall dort, wo eine Bakterienzelle durch einen virulenten Bakteriophagen infiziert wird, werden bereits wenige Minuten nach der Infektion eine Vielzahl von Nachkommen dieses Bakteriophagen freigesetzt, Abb. 3.120. Plaques in einem Rasen von die benachbarte Zellen infizieren, wieder Escherichia coli K12, hervorgerufen durch freigesetzt werden, neue Zellen infizieren Bakteriophagen aus Abwasser usw. Auf diese Weise breitet sich die Infektion immer weiter aus, und der Bereich mit lysierten Zellen des Wirtsbakteriums wird immer größer. Diese Bereiche sind an der nicht mehr vorhandenen Trübung zu erkennen. Dort, wo die Bakterienzellen lysiert sind, erscheint der Nährboden klar ( Abb. 3.120). Diese lytischen, durch die Bakteriophagen verursachten Höfe werden als Plaques bezeichnet und können einen Durchmesser von einigen Millimetern annehmen. Die Größe der Plaques hängt von den Inkubationsbedingungen, aber vor allem vom Typ des Bakteriophagen und vom Wirtsbakterium ab.

243 Nachweis von Bakteriophagen

Zum Nachweis von temperenten Bakteriophagen eignet sich diese Methode im Prinzip ebenfalls. Die Durchmesser der Plaques werden nur sehr viel kleiner sein, da die Prophagen nur selten in den lytischen Cyclus übergehen. Die Platten müssen dann entsprechend länger inkubiert werden, oder der Prophage muss mit geeigneten Methoden (UV-Strahlung, chemische Mittel) zur Bildung und Freisetzung infektiöser Phagen induziert werden. Eine andere Möglichkeit besteht darin, zum Gemisch aus phagenhaltiger Probe und Bakterienstamm, für die der Phage temperent ist, noch einen zweiten Bakterienstamm als Indikator hinzuzugeben, für den dieser Bakteriophage virulent ist. Bakteriophagen sind in der Natur sehr weit verbreitet, und sie lassen sich für die meisten Bakterien nachweisen, wenn nur intensiv genug nach ihnen gesucht wird. Damit stehen dann auch fast immer automatisch Vektoren zur Verfügung, die eine Einschleusung von DNA in die betreffenden Bakterienstämme ermöglichen. Die kohäsiven Enden (cos-site) des Bakteriophagen Lambda waren wichtige Elemente zur Konstruktion von Cosmiden, mit denen besonders effizient Genbänke angelegt und DNA kloniert werden kann. Eine häufig eingesetzte DNA-Ligase stammt aus dem Bakteriophagen T4. Weitere Einsatzgebiete von Viren sind in der Erzeugung einzelsträngiger DNA für die Sequenzierung zu sehen, und auch einige Methoden zur gerichteten Mutagenese beruhen auf der Verwendung modifizierter Bakteriophagen wie z. B. der Bacteriophage M13. Es können hier nur einige Beispiele genannt werden – das Feld ist groß! Auch andere Viren haben wichtige Werkzeuge geliefert: Die Klonierung eukaryontischer Gene wurde durch den Einsatz der reversen Transkriptase aus Retroviren wesentlich vereinfacht, und das Enzym ist auch bei vielen anderen molekulargenetischen Untersuchungsmethoden heute unersetzbar geworden.

Biotechnologische Bedeutung

244

3 Versuche

V37 - S. 188

„Leider“ gibt es auch Bakteriophagen, die bei biotechnologischen Produktionsprozessen eingesetzte Bakterien infizieren können. Eine besonders große Bedeutung hat dies bei lebensmikrobiologischen Prozessen zur Herstellung von Lebensmitteln. In der Milchwirtschaft bei der Käseherstellung und bei der Herstellung von Weinessig bereiten mit Phagen infizierte Kulturen von Milchsäurebakterien bzw. Essigsäurebakterien sehr große Probleme und führen nicht selten zu Betriebsstörungen. Versuchsziel In diesem Versuch soll demonstriert werden, dass in dem in Kläranlagen gesammelten Abwasser Escherichia coli-spezifische Bakteriophagen vorkommen. Da im Abwasser sehr viele verschiedene Zellen von E. coli vorkommen, ist hier auch mit einen großen Anzahl und Vielfalt von entsprechenden Bakteriophagen zu rechnen. Mit Hilfe einer einfachen, auch auf viele andere Bakteriophagen und Viren übertragbaren Methode sollen die Bakteriophagen nachgewiesen werden. Versuchsdurchführung

Vorbereitung

Nach Erhalt des Stamms wird dieser (wenn nicht anders von der Bezugsquelle angegeben) in wenig steriler Saline suspendiert und per Drei-Strich-Ausstrich (M4, S. 365) auf LB-Festmedium ausgestrichen. Die Platte wird bei 37 °C bebrütet. Die bewachsene Platte kann bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank (4 °C) gelagert werden. Mit einer Einzelkolonie von E. coli K12 werden abends 10 ml LB-Nährlösung beimpft und über Nacht bei 37 °C geschüttelt.

benötigtes Material Geräte       

Schraubdeckelröhrchen Einmalröhrchen aus Polystyrol Pasteurpipetten Wasserbad (45 °C) Petrischale, leer Schüttler (37 °C) Brutschrank (37 °C)

Chemikalien und Medien  Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl)

Von der Abwasserprobe werden ca. 2 ml in  Chloroform ein Schraubdeckelröhrchen überführt und  100 ml-Erlenmeyerkolben mit 10 ml mit fünf Tropfen Chloroform versetzt, um LB-Nährlösung ( S. 417) die im Abwasser vorhandenen Bakterien  LB-Festmedium ( S. 417)  LB-Weichagar ( S. 418), flüssig abzutöten. Nachdem das Röhrchen 5 min ruhig bei Raumtemperatur stehengelassen Mikroorganismen wurde, werden fünf Tropfen der behandelten Abwasserprobe in ein Polystyrol-Röhr Escherichia coli K12 (DSM 9037) chen überführt. Durch Rollen und Kippen Sonstiges des Röhrchens wird der Inhalt mehrmals über die Innenwände des Röhrchens geführt,  frische Abwasserprobe aus dem Zulauf so dass Chloroformspuren von dem einer kommunalen Kläranlage ( E1, S. 297) Kunststoffmaterial adsorbiert werden können. Nach Zugabe von fünf Tropfen aus der „Übernachtkultur“ von E. coli K12 und 5 min Inkubation bei Raumtemperatur werden 3 ml LB-Weichagar (bei 45 °C im Wasserbad flüssig gehalten) zugesetzt und der gesamte Inhalt flächendeckend über die Agar-Schicht einer LB-Festmedium-Agarplatte gegossen. Der erstarrte Agar wird bei 37 °C bebrütet. Im dicht bewachsenen Bakterienrasen sollten unterschiedlich große Plaques zu sehen sein.

3.5 Bakteriophagen und Viren

245

Weiterführende Literatur Dozois CM, Curtiss R (1999) Pathogenic diversity of Escherichia coli and the emergence of 'exotic' islands in the gene stream. Veterinary Research 30:157-179 Friedman DI, Court DL (2001) Bacteriophage lambda: alive and well and still doing its thing. Current Opinion in Microbiology 4:201-207 Marks T, Sharp R (2000) Bacteriophages and biotechnology: a review. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 75:6-17 Sandmeier H, Meyer J (1993) Bacteriophages. In: Rehm HJ, Reed G, Pühler A, Stadler P (eds) Biotechnology. vol 1, Biological Fundamentals, 2nd edn. Wiley-VCH, Weinheim, pp 543-575

Nachgefragt 1. Was sind Bakteriophagen? 2. Wie unterscheiden sich Phagen mit helicaler und ikosaedrischer Symmetrie in ihrem Aufbau? 3. Erläutern Sie den Begriff „Nucleocapsid“! 4. Kontaktieren Sie Lehrbücher der Mikrobiologie und verschaffen sich so einen Überblick über die Formenvielfalt bei Bakteriophagen. Skizzieren Sie die wichtigsten Formen! 5. Nennen Sie einige Bakteriophagen, die Escherichia coli infizieren können! 6. Wozu wird der Bakteriophage Mu eingesetzt? 7. Wie unterscheiden sich virulente von temperenten Bakteriophagen? 8. Beschreiben Sie den typischen Entwicklungscyclus eines virulenten Bakteriophagen! 9. Beschreiben Sie die Entwicklung des temperenten Bakteriophagen Lambda und erläutern Sie die Begriffe „Prophage“ und „Lysogenie“? 10. Was besagen die Begriffe „Latenzzeit“ und „Wurfgröße“? Erarbeiten Sie eine Versuchsvorschrift, um diese zu bestimmen! 11. Warum kann ein bestimmter Bakteriophage meist nur Zellen einer Bakterienspezies infizieren?

12. Wie haben Sie im Versuch Bakteriophagen experimentell nachgewiesen? Was bedeutet die Einheit „pfu“? 13. Warum wurde die Probe zuvor mit Chloroform behandelt? 14. Wie konnten Sie Plaques virulenter Bakteriophagen von denen temperenter Phagen unterscheiden? 15. Wie gehen Sie vor, um temperente Phagen empfindlich nachzuweisen? 16. Beschreiben Sie, wie ein Phagenplaque entsteht! 17. Was erwarten Sie zu sehen, wenn Sie Material aus dem Bereich eines Plaques unter dem Lichtmikroskop betrachten? 18. Weshalb sind Bakteriophagen für die molekulargenetische Forschung interessant? 19. Nennen Sie biotechnologische Produkte bzw. Produkte für molekulargenetische Arbeiten, zu deren Herstellung Elemente von Viren verwendet wurden! 20. Nennen Sie Gefahren, die von Bakteriophagen bei biotechnologischen Prozessen ausgehen können!

246

3 Versuche

Versuch 48

Nachweis des Tabak-Mosaik-Virus (TMV) Theoretischer Hintergrund

Vorkommen und Verbreitung

Mit dem Tabak-Mosaik-Virus wurde 1892 von Dimitri Iwanoski erstmals ein Virus als Krankheitserreger erkannt. Wie der Name andeutet, infiziert das Virus Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum) und verursacht dort eine Sprenkelung und Verfärbung der Blätter. Das Tabak-Mosaik-Virus kommt aber nicht nur in Tabakpflanzen, sondern auch in zahlreichen anderen Pflanzen vor. Das Tabak-Mosaik-Virus (TMV) gehört zu den helicalen Viren, bei denen die Proteine der Hülle als spiralförmiger Zylinder angeordnet sind und im Gegensatz zu den sphärischen Viren keinen geschlossenen Polyeder ausbilden. Das Tabak-MosaikVirus ist ein stäbchenförmiges, aus Protein und RNA bestehendes Virus. Auf dem langen, einzelsträngigen und schraubenförmig gewundenem RNA-Molekül sind 2.130 identische Proteinmoleküle aufgereiht. Dadurch ist das RNA Molekül von einem zylindrischen Proteinmantel umgeben. Das Virus hat einen Durchmesser von 18 nm und eine Länge von 300 nm. Das Protein besteht aus 158 Aminosäuren, dessen genetische Information auf dem aus ca. 6.400 Nukleotiden bestehenden RNA-Molekül selbst enthalten ist. Gereinigte Virusproteine und gereinigte Virus-RNA können im Reagenzglas (in vitro) in einem komplizierten und über mehrere Zwischenstufen verlaufenden Prozess von alleine zu voll infektiösen Viruspartikeln aggregieren.

Wissenschaftliche Bedeutung

Das Tabak-Mosaik-Virus ist eines der am intensivsten untersuchten Viren. Viele Jahrzehnte haben sich Wissenschaftler eingehend mit der Struktur und der Organisation dieses Virus beschäftigt. Das Virus diente auch als Modell zur Erforschung von Selbstaggregationen (self assembly) von Biomolekülen und der Faktoren, welche solche Prozesse steuern.

Kompost und Phytohygiene

Das Tabak-Mosaik-Virus wird heute gemäß der Bioabfallverordnung (BioAbfV) auch eingesetzt, um den ordnungsgemäßen Betrieb und die richtige Prozessführung von biologischen Abfallbehandlungsanlagen und damit die Sicherheit der Produkte zu überprüfen. Dies betrifft z. B. die Kompostwerke und die anaeroben Biogasanlagen, sofern der resultierende Kompost oder andere Produkte zur Bodenverbesserung oder Düngung z. B. in der Landwirtschaft ausgebracht werden sollen. Die Bioabfallverordnung soll sicherstellen, dass von dem ausgebrachten Kompost keine Gefährdung für die Umwelt ausgeht und dass diesem die phytohygienische Unbedenklichkeit bescheinigt werden kann. Dies ist nur der Fall, wenn während des Prozesses eine ausreichende Hygienisierung erfolgt.

E2 - S. 302 E3 - S. 310

Um die oben genannten Anlagen auf ordnungsmäße Prozessführung und Gewährleistung der Phytohygiene zu prüfen, werden die folgenden drei Leitorganismen bzw. Indikatororganismen in direkten Prozessprüfungen eingesetzt: Tabak-Mosaik-Virus, Erreger der Kohlhernie (Plasmodiophora brassicae) und Tomatensamen. Zur Überprüfung der Seuchenhygiene wird Salmonella senftenberg Stamm W775 als Indikatororganismus eingesetzt. Praktisch geht man so vor, dass man die drei Leitorganismen und das TMV in kleinen Kompartimenten in verschiedenen Phasen des Rotteprozesses zugibt und anschließend prüft, ob diese am Ende des Prozesse noch nachweisbar sind. Bei richtiger Prozessführung sollten diese in der Hygienisierungsphase abgetötet werden ( Tabelle 3.68).

3.5 Bakteriophagen und Viren

247

benötigtes Material Geräte  Ausreichende Anzahl von Blumentöpfen mit Pflanzerde  Mixer bzw. Reibschale mit Pistill  Gazebeutel  Pinsel oder Gazebausch

Chemikalien und Medien  KP-Puffer (50 mM, pH 7,0,  S. 416)  Karborund / Celite / Bentonit

Sonstiges  Zwei unterschiedliche Tabak-Arten (zu beziehen von Botanischen Gärten oder http://www.surrowseeds.com):  Nicotiana tabacum var. Samsun  Nicotiana glutinosa

Probenextrakt

Kontroll- Probenextrakt extrakt

vorher

Kontrollextrakt

nachher

Abb. 3.121. Halbblatt-Methode: Je eine Hälfte eines Blattes wird mit Proben- bzw. Kontrollextrakt bestrichen

Abb. 3.122. Blatt

Läsionen auf einem Tabak-

Versuchsziel Mit diesem Versuch soll eine einfache Versuchsanordnung zur Vermehrung eines pflanzenpathogenen Virus und eine einfache Methode für dessen Nachweis aufgezeigt werden. Dies geschieht an Hand des TabakMosaik-Virus, das heute auch zur Überprüfung der Prozessführung bei Anlagen zur biologischen Abfallbehandlung herangezogen wird. Versuchsdurchführung Pflanzenmaterial sollte rechtzeitig vor Versuchsbeginn besorgt und herangezogen werden. Herstellung des Pflanzenpresssaftes: Infizierte Blätter von Nicotiana tabacum (var. Samsun) werden mit wenig 50 mM Kalium Phosphat-Puffer (pH 7.0) versetzt und in einem Mixer zerkleinert. Es sollte ein nicht zu dünnflüssiger Brei entstehen, der in einen Gazebeutel gegeben wird und aus dem die überschüssige Flüssigkeit ausgepresst wird. Der so gewonnene Probenextrakt kann verwendet werden, um neue Pflanzen zu infizieren. Herstellung von infizierten Tabakblättern: Das Virus wird in Tabakpflanzen der Sorte Nicotiana tabacum (var. Samsun), in der sich das Virus systemisch ausbreitet, vermehrt. Zunächst werden die Tabakpflanzen in einem Gewächshaus herangezogen bis diese das sog. 5-Blatt-Stadium erreicht haben. Die unteren Blätter werden nun mit Karborund, Celite oder Bentonit dünn eingepudert. Auf diese Blätter wird dann ein TMV-haltiger Pflanzenpresssaft, der aus TMV infizierten Tabakpflanzen gewonnen wurde (s. o.), vorsichtig mit einem Pinsel, Glasspatel oder Gazebausch aufgetragen. Ein Kontrollextrakt wird entsprechend aus nicht infiziertem Pflanzenmaterial hergestellt. Ungefähr zwei bis drei Wochen nach der Infektion haben sich die Blätter mosaikartig verfärbt. Nachweis des Tabakmosaikvirus: Als Testpflanze dient Nicotiana glutinosa, die auf TMV mit sogenannten Lokalläsionen reagiert. Die Pflanzen werden im Gewächshaus bis zum 6- oder 8-Blattstadium angezogen. Die Vegetationsspitze und die unteren Blät-

Vorbereitungen

248

3 Versuche Tabelle 3.68. Richtwerte bei der Überprüfung der Phytohygiene und Seuchenhygiene von Komposten aus biologischen Abfallbehandlungsanlagen Tabak-Mosaik-Virus Kohlhernie-Erreger Tomatensamen Salmonella senftenberg

≤ 8 Läsionen pro Pflanze Befallsindex: ≤ 0,5 ≤ 2% keimfähige Samen pro Probe nicht nachweisbar

ter werden entfernt, bis sich an den Pflanzen nur noch vier voll ausgebildete Blätter befinden. Zum Nachweis wird die Technik der Halbblattmethode ( Abb. 3.121) angewandt. Das zweite und dritte Blatt werden hierzu je zur Hälfte mit dem Probenextrakt bzw. dem Kontrollextrakt abgerieben. Auf der mit Probenextrakt eingeriebenen Hälfte sollten kleine, runde Flecken entstehen, deren Zentren aus abgestorbenem, nekrotischem Gewebe bestehen ( Abb. 3.122). Parallel hierzu werden Proben von anderen intakten Pflanzen, aus sich zersetzendem Pflanzenmaterial und aus Kompost sowie weiteren Proben Ihrer Wahl zum Test auf das TMV eingesetzt. Die Anzahl der Lokalläsionen wird bestimmt. Weiterführende Literatur Bruns C, Gottschall R, Marchiniszyn E, Schüler C, Zeller W, Wolf G, Vogtmann H (1994) Phytohygiene der Kompostierung – Sachstand, Prüfmethoden, F.- und E.-Vorhaben. Tagungsband „BMBF-Statusseminar: Neue Techniken der Kompostierung“, Hamburg, S 191-206 Bundesgesetzblatt (1998) Verordnung über die Verwertung von Bioabfällen auf landwirtschaftlich, forstwirtschaftlich und gärtnerisch genutzten Böden (Bioabfallverordnung – BioAbfV) vom 21. September 1998 (BGBl. I, S. 2955), zuletzt geändert am 25. April 2002 (BGBl. I, S. 1488) Walkey DGA (1991) Applied plant virology. 2nd edn, Chapman & Hall, London

Nachgefragt 1. Definieren Sie den Begriff „Virus“! 2. Weshalb sind Viren keine Organismen? Was fehlt ihnen hierzu? 3. Über welche Wirte können sich Viren vermehren? 4. Wie können Viren auf Grund der Struktur bzw. des Aufbaus klassifiziert werden? 5. Wie können Viren auf Grund der chemischen Zusammensetzung klassifiziert werden? 6. Beschreiben Sie den Aufbau des Tabak-MosaikVirus! 7. In welchen Pflanzen kann das Tabak-Mosaik-Virus vorkommen? 8. Konsultieren Sie Lehrbücher der Biochemie und Molekularbiologie und informieren Sie sich über den Aggregationsprozess (self-assembly) beim Zusammenbau des Tabak-Mosaik-Virus aus den Bausteinen! 9. Welche anderen Komplexe in biologischen Systemen fügen sich ebenfalls durch self-assembly zusammen? 10. Informieren Sie sich in Lehrbüchern der Molekularbiologie, welche genetische Informationen in den ca. 6.400 Nukleotiden der TMV-RNA enthalten sind!

11. Stellen Sie möglichst viele phytopathogene Viren zusammen! Welche DNA enthalten diese meist? 12. Beschreiben Sie die wesentlichen Vorgänge bei der Kompostierung! 13. Was regelt die Bioabfallverordnung von 1998? 14. Was versteht man beim Kompost unter Phytohygiene und Seuchenhygiene? 15. Durch welchen Vorgang beim Prozess der biologischen Abfallbehandlung sollen Phytohygiene und Seuchenhygiene sichergestellt werden? 16. Welche Leit- und Indikatororganismen verwendet man zur Überprüfung der Phytohygiene? 17. Welcher Indikatororganismus wird zur Überprüfung der Seuchenhygiene eingesetzt? 18. Wie setzt man diese Leit- und Indikatororganismen bei der Überprüfung praktisch ein? 19. Beschreiben Sie, wie Sie einen Pflanzenpresssaft mit infektiösen TMV-Partikeln erhalten! 20. Beschreiben Sie, wie Sie in einer Probe prüfen, ob darin infektiöse TMV-Partikel enthalten sind!

3.6 Auslösung von Mutationen, Anreicherung von Mutanten und Übertragung von DNA

3.6

Auslösung von Mutationen, Anreicherung von Mutanten und Übertragung von DNA

Mutanten weisen gegenüber dem Wildtyp bzw. Ausgangsstamm mindestens eine Veränderung im Genom auf. Sie besitzen einen anderen Genotyp. Häufig, aber nicht notwendigerweise, bewirkt die Veränderung des Genotyps auch eine Veränderung des Phänotyps, d. h. des Erscheinungsbildes bezogen auf sämtliche erfassbaren Eigenschaften eines Organismus. Wie wichtig Mutanten sind, wird beim Lesen fast jeder wissenschaftlichen Veröffentlichung aus dem Bereich der mikrobiologischen Forschung deutlich. Man braucht lediglich den Methodenteil einer Publikation aufzuschlagen und wird meist feststellen, dass fast immer Mutanten in die Untersuchungen einbezogen wurden. Die Verfügbarkeit von Mutanten ermöglicht z. B. die Identifizierung neuer Stoffwechselwege oder hilft bei der Klärung der Frage, ob ein bestimmtes Enzym tatsächlich an einer Stoffwechselleistung beteiligt ist. Mutanten werden auch eingesetzt, um Stämme zu „markieren“, sie z. B. in Supplin-bedürftige auxotrophe Stämme umzuwandeln; solche Stämme sind u. a. bei Kreuzungsexperimenten hilfreich. Durch Mutationen kann die Aktivität von Enzymen des Anabolismus gesteigert werden oder es kann deren Regulation durch Inhibition oder Repression ausgeschaltet werden. Solche Mutanten werden heute häufig bei biotechnologischen Produktionsprozessen eingesetzt. Die außerordentlich hohen Produktivitäten vieler heute zur Produktion von Antibiotika eingesetzter Bakterien- oder Pilzstämme beruhen meist auf einer Vielzahl solcher sukzessiv eingeführten Mutationen. Die modernen Methoden der Molekularbiologie und die Verfügbarkeit der stetig wachsenden Zahl an vollständig sequenzierten mikrobiellen Genomen ermöglicht heute bei der Mutationsauslösung ganz andere und viel gezieltere Vorgehensweisen. Heute ist es möglich, nur ein bestimmtes Gen auszuschalten oder ein einzelnes Nukleotid zu verändern, um in dem untersuchten Protein eine bestimmte Aminosäure gegen eine andere auszutauschen. Dies sei nur der Vollständigkeit halber angeführt; da solche Versuche in vielerlei Hinsicht zu aufwendig sind, können diese im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM nicht angeboten werden. Die DNA-Replikation erfolgt mit einer sehr großen Genauigkeit. Im Fall von Fehlern stehen in der Zelle auch noch Reparaturenzyme bereit, die diese beseitigen. Deshalb treten spontane Mutationen in der Regel sehr selten auf. Um eine hinreichend hohe Mutationsrate zu erhalten, muss deshalb mit mutagenen Agenzien nachgeholfen werden. Hierzu eignen sich energiereiche Strahlung (UV-Licht, ionisierende Strahlung), chemische Agenzien (Basen-Analoga wie 5-Bromuracil, salpetrige Säure, Hydroxylamin, Nitrosoguanidin, Ethylmethansulfonat, Ethidiumbromid, Akridinorange) oder transponierbare Elemente (Transposons, Insertionselemente, Bacteriophage Mu). Die Mutationsauslösung hat die Mutationsausprägung zu folgen. Anschließend erfolgt meist der aufwendigste Abschnitt bei der Isolierung von Mutanten, da nach der Mutationsauslösung in dem Ansatz natürlich nicht nur die Mutanten mit dem gesuchten Phänotyp vorliegen, sondern auch alle anderweitig mutierten Stämme und auch Nachkommen von nicht mutierten Wildtypzellen. Zellen der gesuchten Mutante liegen immer deutlich in der Minderheit vor. Diese müssen deshalb zunächst angereichert werden, bevor eine überschaubare Anzahl von Kandidaten dann gezielt auf das Vorliegen der richtigen Mutation geprüft und tatsächlich identifiziert werden kann. Für die Ausarbeitung einer intelligenten und effizienten Methode zur Anreicherung von Mutanten und deren Umsetzung sind wieder Erfahrung, Phantasie und gute stoffwechselphysiologische Kenntnisse eines Mikrobiologen und natürlich auch dessen Ausdauer und Hartnäckigkeit gefordert.

249

250

3 Versuche

In diesem letzten Abschnitt vom MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM werden insgesamt acht Versuche angeboten, die Beispiele dafür liefern, wie Genome von Bakterien durch Mutationen verändert oder durch Übertragung von zusätzlicher DNA aus anderen Organismen erweitert werden können. Der Abschnitt beginnt mit der Vorstellung des Ames-Tests, der sich als einer der wichtigsten Standardverfahren für Mutagenitätsprüfungen in Forschung, Industrie und Untersuchungsämtern durchgesetzt hat. In den beiden nächsten Versuchen soll gezeigt werden, wie durch chemische Mutagenese das Spektrum der durch ein Bakterium verwertbaren Substrate (Glucose, Ethanol, 2,3-Butandiol) erweitert werden kann bzw. Syntheseleistungen (Polyester) eingeschränkt werden können. Es werden also Gewinn- und Verlustmutationen gesucht. In beiden Versuchen dient Ralstonia eutropha (früher: Alcaligenes eutrophus) als Modellorganismus. Während im ersten Fall eine einfache positive Selektion auf Nährböden mit den „neuen“ Substraten als alleinige Kohlenstoffquelle erfolgen kann, ist im zweiten Fall zunächst eine Anreicherung der Mutanten erforderlich; dies geschieht durch Ausnutzung der abweichenden spezifischen Dichte der gesuchten Mutanten gegenüber dem Wildtyp mittels Zentrifugation in einem Dichtegradienten. Die nächsten beiden Versuche beschäftigen sich mit der Übertragung von isolierter DNA durch Transformation von Bacillus subtilis mittels natürlicher Kompetenz und Escherichia coli mittels artifizieller Kompetenz. Im ersten Fall soll durch die Übertragung von chromosomaler DNA eine auxotrophe Mutante von B. subtilis wieder prototroph werden; in zweiten Fall wird E. coli durch Übertragung eines Plasmids mit den Genen für diePoly(3-hydroxybutyrat)-Biosynthese aus R. eutropha zur Biosynthese und Akkumulation dieses Polyesters befähigt. Der nächste Versuch demonstriert die Konjugation, eine andere Möglichkeit der Plasmidübertragung. Dieser Versuch wird kombiniert mit einer grundlegenden Veränderung des Grundstoffwechsels, indem der in R. eutropha für den Abbau von Fructose zuständige 2-Keto-3-desoxy-6-phosphogluconat-Weg durch den Fructose-1,6-bisphosphat-Weg ersetzt wird. Dieser Versuch ist ein Beispiel dafür, wie durch „metabolic engineering“ Stoffwechselwege in einem Organismus einschneidend verändert werden können. Die letzten beiden Versuche dieses Abschnittes demonstrieren, wie in zwei verschiedenen Bakterienstämmen mit ganz unterschiedlichen Strategien Mutationen durch Insertion eines Transposons induziert werden können. Im ersten Fall wird das Suizidplasmid pSUP5011 mit dem Transposon Tn5 durch Konjugation nach R. eutropha übertragen, und es sollen Tn5-induzierte Transkonjuganten mit unterschiedlichen Defekten im Anabolismus und Katabolismus isoliert werden. Im zweiten Fall wird das unter normalen Bedingungen stabil replizierbare Plasmid pCG79 mit dem Transposon Tn611 durch Elektroporation in das Gram-positive Bakterium Mycobacterium smegmatis übertragen; nach Erhöhung der Temperatur während der Inkubation wird dieses Plasmid ebenfalls zu einem Suizidplasmid. Transposon-induzierte Mutanten, welche die Transposonen im Genom integriert enthalten, geben sich in beiden Fällen durch die von den Transposonen codierten Antibiotika-Resistenzen zu erkennen.

3.6 Auslösung von Mutationen, Anreicherung von Mutanten und Übertragung von DNA

Ames-Test

251

Versuch 49

Theoretischer Hintergrund Bei dem sogenannten Ames-Test handelt es sich um eine von dem amerikanischen Mikrobiologen Bruce N. Ames vor ca. 30 Jahren entwickelte Testmethode zum Nachweis der mutagenen Wirkung von chemischen Verbindungen. Da die Durchführung dieses Tests experimentell nicht besonders aufwendig ist, hat sich der Ames-Test in der Industrie und bei Behörden zu einem Standardverfahren für Mutagenitätsprüfungen entwickelt. Für Zulassungsbehörden ist das Ergebnis des Ames-Tests mittlerweile ein wichtiges Entscheidungskriterium für die Zulassung einer Substanz. Der Test ist darüber hinaus schnell durchführbar, liefert reproduzierbare Ergebnisse und ist sehr sensitiv. Mit diesem einfachen Test ist es möglich, die Sicherheit beliebiger natürlicher und synthetischer Chemikalien zu prüfen und festzustellen, ob eine Chemikalie mutagen ist.

StandardMutagenitätstest

In einer umfangreichen Studie belegte Ames, dass eine hohe Korrelation zwischen Mutagenität und Karzinogenität einer chemischen Verbindung besteht. Damit erlaubt dieser bakterielle Test auch eine Beurteilung des karzinogenen Potentials einer Substanz. Von ca. 300 sehr verschiedenen chemischen Substanzen, deren Karzinogenität bereits bekannt war, zeigten ca. 90 % auch eine mutagene Wirkung. Umgekehrt zeigten 87 % der Verbindungen, die nicht karzinogen waren, auch keine mutagene Wirkung. Die fehlende Korrelation von ca. 10 % macht deutlich, dass im Einzelfall die Befunde durch Tierversuche abgesichert werden müssen. Ein positives Ergebnis im Ames-Test zeigt daher mit einer sehr hohen Wahrscheinlichkeit an, dass die betreffende Verbindung karzinogen ist.

Korrelation zwischen Mutagenität und Karzinogenität

Inzwischen wurden weltweit Tausende von Verbindungen mit dem Ames-Test auf Mutagenität bzw. potentielle Karzinogenität getestet. Die Kosten für den Ames-Test sind im Vergleich zu Tierversuchen sehr gering, und Ergebnisse können innerhalb weniger Tage erzielt werden. Demgegenüber dauern Tierversuche mit Ratten und Mäusen häufig mehrere Monate oder gar Jahre und sind entsprechend teuer. Der Ames-Test kann im Vorfeld zunächst viele der zeitraubenden und wirtschaftlich aufwendigen Tierversuche einsparen helfen. Für Substanzen, die den Ames-Test „überstehen“ und dann möglicherweise z. B. in Lebensmitteln, Kosmetika oder pharmazeutischen Präparaten eingesetzt werden sollen, bleiben Tierversuche aber trotzdem unersetzbar. Der Ames-Test beruht auf einem denkbar einfachen Prinzip. Es werden Histidinauxotrophe Mutanten von Salmonella typhimurium (z. B. TA1535) eingesetzt, bei denen ein Gen für den sehr langen Biosyntheseweg der Aminosäure Histidin durch eine Punktmutation defekt ist. Diese Mutanten können dadurch Histidin nicht mehr selbst synthetisieren und sind bei Wachstum in Mineralsalzmedien auf den Zusatz von Histidin als Supplin angewiesen. Da es sich bei der Primärmutation um eine Punktmutation handelt, kann diese durch eine von der zu testenden Substanz ausgelöste Sekundärmutation rückgängig gemacht werden. Durch diese Rückmutation wird der ursprüngliche Phänotyp des Wildtyps wieder hergestellt und die Stämme werden wieder prototroph, sind also nicht länger auf Histidin als Supplin im Medium angewiesen. Da die Rückmutanten bzw. Revertanten eine zusätzliche Eigenschaft erwerben, nämlich wieder selbst Histidin synthetisieren zu können, kann eine positive Selektion angewandt werden, und die Revertanten sind phänotypisch an der Bildung von Kolonien auf Histidin-freien Medien erkennbar. Auf diese Weise können unter einer großen Anzahl von Bakterienzellen, die der zu testenden Substanz ausgesetzt waren, selbst wenige Rückmutanten erkannt werden. Der Test ist also sehr empfindlich.

Das Grundprinzip

COOH H

C

NH2

CH2 N H H

N Histidin

H

252

3 Versuche

Im Prinzip würde die zu testende Substanz natürlich im Wildtyp auch eine Mutation zur Histidin-Auxotrophie auslösen können, man hätte jedoch kaum eine Chance, die relativ wenigen durch eine Mutation resultierenden Histidin-auxotrophen Mutanten unter den in einer Größenordnung von 106 bis 107 vorliegenden Überzahl von Zellen des Wildtyps zu erkennen. Der Ames-Test erlaubt die quantitative Erfassung der mutagenen Wirkung in Abhängigkeit von der Konzentration des Mutagens. Dabei ist das Verhältnis von der durch die Testsubstanz induzierten Rückmutationsrate zu der spontanen Rückmutationsrate ein Maß für die Mutagenität der Substanz. Der Test ermöglicht daher auch einen Vergleich der unterschiedlichen Wirksamkeit verschiedener Mutagene. Übertragung auf andere Systeme

Steigerung der Empfindlichkeit

Das Grundprinzip des Ames-Tests lässt sich natürlich auch auf andere Bakterien wie z. B. Escherichia coli übertragen. Auch können statt der Histidinbiosynthese die Biosynthesewege für andere Aminosäuren oder für Coenzyme herangezogen werden. Darüber hinaus wurden weitere sinnvolle Modifikationen der zum screening eingesetzten Teststämme vorgenommen, um die Empfindlichkeit des Ames-Tests zu steigern:

Benz(a)pyren

Prokarzinogen Oxigenasen O

CH3

OH N

N

+ HO

N

CH3

N

NH2

DNA

OH eigentliches Karzinogen O N N

NH N

NH

DNA HO HO OH Abb. 3.123. Aktivierte Form des Promutagen Benz(a)pyren und dessen Reaktion mit Adenin

1. Um hydrophoben Testsubstanzen einen leichteren Zugang in die Zelle zu ermöglichen, in der sie ihre mutagene Wirkung entfalten können, werden Mutanten (Defekt im rfa-Gen) eingesetzt, die in der Biosynthese der hydrophilen, in der Zellhülle vorkommenden Polysaccharidketten gestört sind. 2. Organismen sind mutagener Strahlung und mutagenen Substanzen seit jeher ausgesetzt. Auch arbeiten die Enzyme der DNA-Replikation nie völlig fehlerfrei. Um das Genom trotzdem möglichst unverändert von Generation zu Generation weitergeben zu können, haben Organismen im Verlauf der Evolution eine Reihe von Reparaturmechanismen entwickelt, welche die meist mit negativen Auswirkungen versehenen Veränderungen der DNA höchst effizient korrigieren. Die Empfindlichkeit des Ames-Tests wurde durch die Verwendung von Mutanten von S. typhimurium, deren Reparaturmechanismen für DNA Schäden gestört sind, gesteigert. So ist z. B. das uvrB-Gen, dessen Genprodukt an der Exzissionsreparatur beteiligt ist, deletiert. Durch die Verwendung solcher Stämme kann sich eine durch die zu testende Substanz ausgelöste Rückmutation mit höherer Rate manifestieren, weil sie nicht durch die zelleigenen Reparaturmechanismen korrigiert wird. 3. Zur weiteren Empfindlichkeitssteigerung wurden die Stämme mit dem Plasmid pKM101 ausgestattet. Dieses ein Ampicillin-Resistenzgen beherbergende Plasmid codiert zusätzlich für zwei Gene, welche zur Verstärkung der zu Fehlern neigenden mismatch-Reparatur beitragen.

3.6 Auslösung von Mutationen, Anreicherung von Mutanten und Übertragung von DNA

Auch wurde die Methode selbst ergänzt, um zusätzliche Aussagen über die Mutagenität bzw. Kanzerogenität einer Substanz zu erhalten. In Wirklichkeit beinhaltet der AmesTest heute einen ganzen Satz verschiedener Testsysteme, deren Ergebnisse auch differenzierende Aussagen über das mutagene Potential einer Substanz zulassen. Hiervon können hier nur einige beispielhaft beschrieben werden:

253 Steigerung der Aussagekraft

1. Statt einer Punktmutante des Histidin-Biosyntheseweges wie im Stamm TA1535 werden auch Rasterschubmutanten eingesetzt, die im Gen für die Aminotransferase ein zusätzliches Basenpaar enthalten (z. B. Mutanten TA1537 und TA1538). Diese Rasterschubmutanten werden nur durch solche mutagene Agenzien revertiert, die das zusätzliche Basenpaar wieder eliminieren. Aus dem Vergleich der Reversionsraten ausgehend von Punktmutanten und Rasterschubmutanten lassen sich Rückschlüsse auf die Wirkungsweise der mutagenen Agenzien ziehen. 2. Nicht alle mutagenen Substanzen sind in unserem Körper selbst bereits mutagen bzw. karzinogen. Einige von ihnen werden erst im Körper, z. B. in der Leber, durch den Stoffwechsel in gefährliche Substanzen umgewandelt. Zur Erfassung dieser so genannten Promutagene bzw. Prokarzinogene dient eine weitere Ergänzung des ursprünglichen Ames-Tests. Vor der Inkubation der zu testenden Substanzen mit den bakteriellen Teststämmen werden diese mit einem so genannten S9-Extrakt aus Rattenleber inkubiert. Dieser Extrakt enthält eine Cytochrom P450-abhängige Hydroxylase und katalysiert in der Leber die Hydroxylierung von Fremdstoffen. Zur Funktionsfähigkeit dieser Hydroxylase müssen zusätzlich NADP und Glucose-6-phosphat zugegeben werden. Die Zugabe von S9-Extrakt simuliert gewissermaßen die Situation im Körper ( Abb. 3.123). Auch hier gibt es Modifikationen: so ist es möglich, andere Promutagen- oder Prokarzinogen-aktivierende Enzymreaktionen im Körper durch Zugabe der Enzyme N-Acetyltransferase oder Nitroreduktase zu simulieren. Stahlkanüle mit Luer-Verschluss

Glasröhrchen mit Glaswolle

Plastikspritze (50 ml) mit Luer-Verschluss

Gummistopfen Rundkolben Aus Duranglas mit Normschliff

Bereits 1918 fanden zwei japanische Wissenschaftler heraus, dass mit Holzkohlenteer aus der „Trockenen Destillation“ bei Kaninchen Hautkrebs erzeugt werden kann. Einer der Stoffe, die sich im Holzkohlenteer befinden und Krebs erzeugen, ist Benz(a)pyren ( Abb. 3.123). Diese Substanz ist u. a. auch im Ruß von Verbrennungsanlagen, in geräuchertem Fisch und in Zigarettenrauch enthalten.

Versuchsziel Dieser Versuch soll die mutagene Wirkung Siedesteinchen von Zigarettenrauch demonstrieren. Die vorgegebene Reihe von Ansätzen beinhaltet Abb. 3.124. Absaugvorrichtung zur Geneben den eigentlichen Proben auf mutawinnung von Zigarettenrauchkondensat gene Wirkung des Zigarettenkondensats eine Kontrolle auf kontaminationsfreies Arbeiten, Ansätze zur Bestimmung der spontanen Reversionsrate und eine positive Kontrolle mit Benz(a)pyren. In dem Test werden direkt wirkende Stoffe und promutagene Stoffe erfasst, die erst durch die Umsetzung mit Rattenleber-Homogenisat (S9-Extrakt) wirksam werden. In gewissen Grenzen steigt die Mutationsrate mit der Konzentration in der Testlösung. Bei zu hoher Konzentration ist es allerdings häufig zu beobachten, dass die zu messende Reversionsrate von toxischen Effekten der Prüfsubstanz überlagert wird und dass deshalb die Kolonienzahl mit steigender Wirkstoffmenge wieder abnimmt.

Benz(a)pyren

254

3 Versuche

Versuchsdurchführung Vorbereitungen

Wegen der erhöhten Empfindlichkeit der einsetzbaren Teststämme in Bezug auf mutagene Einflüsse und wegen der erhöhten spontanen Mutationsrate erfordern Kultivierung und Konservierung ein hohes Maß an Sorgfalt. Nach Erhalt des ausgewählten Stamms muss dieser daher unbedingt vor seinem Einsatz im Versuch nach den Angaben der Bezugsquelle überprüft und gelagert werden (siehe ausführliche Angaben im Beipackzettel zur Stamm-Lieferung). Vorkultur des Teststamms: Mit einer Einzelkolonie von Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis (Salmonella typhimurium) TA1535 (pSK1002) oder Stamm TA98 wird ein 100 ml-Erlenmeyerkolben angeimpft, in dem sich 10 ml NB-NaCl-Medium, versetzt mit 75 μg/ml Ampicillin und 87,5 μM Histidin, befinden. Der Zusatz von Histidin soll während der Vorkultur eine Limitierung mit dieser Aminosäure verhindern, was sonst zwangsläufig zur Anreicherung von spontan auftretenden Revertanten führen würde. Die Kultur wird über Nacht (ca. 15 Stunden) bei 37 °C geschüttelt. Hauptkultur des Teststamms: Von der Vorkultur werden 0,2 ml in 10 ml NB-NaClMedium mit 75 μg/ml Ampicillin (ohne Zusatz von Histidin) überführt. Die Kultur wird ca. 3 Stunden bei 37 °C geschüttelt. Die Suspension wird danach direkt für den Test eingesetzt; sie wird nicht auf Eis gestellt, um einen Kälteschock zu vermeiden. Parallel zur Zellanzucht geschehen die Isolierung von Zigarettenrauchkondensat und das Vorbereiten der zwanzig Testansätze ( Tabelle 3.69).

benötigtes Material Geräte             

Schüttler (37 °C) Wasserbad 37 °C (für Vorinkubation) Wasserbad 42 °C (für Top-Agar) Brutschrank (37 °C) Eisbad Rotationsverdampfer Rundkolben 100 ml Glaswattefilter Absaugvorrichtung mit Glaswolle-Filter ( Abb. 3.124) 1,0 und 5,0 ml-Glaspipetten, steril Gelbe Mikroliter-Spitzen, steril Mikroliterpipette, verstellbar für den Bereich 2,5 bis 20 μl Kulturröhrchen mit Aluminium-Kappe, steril

Chemikalien und Medien        

Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril AT-Festmedium ( S. 410) Top-Agar ( S. 428) Histidin-Biotin-Lösung vom Top-Agar ( S. 428), sterilfiltriert NB-NaCl-Nährlösung ( S. 422) Dimethylsulfoxid (DMSO), autoklaviert Benz(a)pyren Metabolisierungspuffer (M-Puffer) ( S. 420)

Mikroorganismen  Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis (Salmonella typhimurium) TA1535 (pSK1002) DSM 9274; besser geeignet ist: TA98, Bezugsquelle: Bonnie Kuenstler, Discovery Partners International Inc., 9640 Towne Centre Drive, San Diego, CA 92121, USA

Sonstiges Isolierung des Zigarettenrauchkonden Leber-Homogenat (S9-Extrakt, Bezugssats: Die Gewinnung des Kondensats aus quelle: Fa. ICN-Pharma, Eschwege; ProRauch einer Zigarette geschieht mit einer duktname: S9-Aroclor-KCl, 5 ml; Apparatur, wie sie in Abb. 3.124 dargestellt Bestell-Nr: 50412) ist. Dazu wird die Glaswolle im Glasröhr Eine herkömmliche Zigarette mit Filter chen zunächst mit ca. 1 ml Aceton befeuchtet. Eine Zigarette wird angezündet und auf das Glasröhrchen gesteckt. Zugweise wird die Zigarette mit der angeschlossenen Spritze „geraucht“; nach jedem Zug wird der Rauch aus der abgeschraubten Spritze ausgeblasen. Das im Filter festgehaltene Kondensat wird durch Zugabe von ca. 10 ml Aceton aus dem Filter gespült (mit der Spritze lässt sich das Aceton nahezu vollständig aus dem Filter saugen). Das Lösungsmittel Aceton wird im Rotationsverdampfer bei Raumtemperatur und 270 hPa vollständig entfernt;

3.6 Auslösung von Mutationen, Anreicherung von Mutanten und Übertragung von DNA Tabelle 3.69.

255

Ansätze für den Ames-Test zur Prüfung von Zigarettenrauchkondensat

°C

Inhaltsstoff / Ansatz

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0

M-Puffer [ml]

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

S9-Extrakt [μl]

10

-

10

10

-

10

20

40

-

10

DMSO [μl]

20

-

20

-

-

-

-

-

-

-

Kondensat [μl]

20

-

-

-

2,5

2,5

2,5

2,5

5

5

Benz-(a)-pyren [μl]

20

-

-

20

-

-

-

-

-

-

Teststamm

-

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

37

Auswertung (Kolonien pro Platte)

°C

Inhaltsstoff / Ansatz

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

0

M-Puffer [ml]

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

S9-Extrakt [μl]

20

40

DMSO [μl]

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Kondensat [μl]

5

5

10

10

10

10

20

20

20

20

Benz-(a)-pyren [μl]

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Teststamm

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

37

Auswertung (Kolonien pro Platte)

die vorher zugesetzten Siedesteinchen sollen dabei einen Siedeverzug verhindern. Das im Kolben verbliebene Kondensat wird in 1,5 ml sterilem DMSO gelöst. In dieser Form kann das Kondensat direkt in den Test eingesetzt werden. Zusammenstellung der Testansätze: Entsprechend der Tabelle 3.69 werden nummerierte Kulturröhrchen mit Aluminiumkappe in ein Eisbad gestellt und unter sterilen Bedingungen mit den in Tabelle 3.69 angegebenen Lösungen versetzt. Im Abstand von jeweils genau einer Minute werden die Röhrchen der Reihe nach mit 0,1 ml der Zellsuspension des Teststamms versetzt und in ein 37 °C Wasserbad gestellt. Die Röhrchen werden genau 20 Minuten unter mehrmaligem Schütteln inkubiert. Danach werden 3 ml des bei 42 °C flüssig gehaltenen Top-Agars im Minutenabstand der Reihe nach in das jeweils fertig inkubierten Röhrchen pipettiert. Jedes Röhrchen wird außen mit einem Tuch trocken gewischt, und der gesamte Inhalt wird zügig auf eine mit der entsprechenden Nummer versehene Platte mit AT-Festmedium verteilt. Nach dem Härten des Agars im Dunklen (Karton überstülpen) werden die Platten bei 37 °C im Dunklen inkubiert.

256

3 Versuche

Auswertung: Unter den unterschiedlich großen weißlichen Kolonien der Revertanten sollte ein mehr oder weniger starker Hintergrundrasen gewachsen sein. Ohne diesen Hintergrund handelt es sich bei den Kolonien nicht um eigentliche Revertanten, sondern um Überlebende aus Ansätzen mit toxisch wirkender Kondensatmenge. Die Zahl der Revertanten-Kolonien pro Platte wird protokolliert und diskutiert ( Tabelle 3.69). Weiterführende Literatur Devoret R (1979) Bacterial tests for carcinogens. Scientific American 241:28-37 Friedrich U (1979) Der Ames-Test zum Aufspüren mutagener und cancerogener Stoffe. Biologie in unserer Zeit 9:97-102 Josephy PD, Gruz P, Nohmi T (1997) Recent advances in the construction of bacterial genotoxicity assays. Mutation Research – Reviews in Mutation Research 386:1-23 Mortenmans K, Zeiger E (2000) The Ames Salmonella/microsome mutagenicity assay. Mutation Research – Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis 455:29-60

Nachgefragt 1. Konsultieren Sie Lehrbücher der Biochemie und Mikrobiologie und zeichnen Sie den Biosyntheseweg für die Aminosäure Histidin! Führen Sie die an der Biosynthese beteiligten Enzyme auf! 2. Beschreiben Sie das Grundprinzip des Ames-Test! 3. Aus welchem Bereich der Grundlagenforschung hat sich die Entwicklung des Ames-Test in den 70er Jahren wohl entwickelt? 4. Erläutern Sie, weshalb der Ames-Test eine solch große Bedeutung erlangt hat und heute einer der verbreitetsten Untersuchungsmethoden zur Prüfung chemischer Substanzen ist! 5. Erklären Sie die Begriffe „auxotroph“ und „prototroph“. 6. Welche Funktion haben Suppline in einem Medium und um welche Substanzen kann es sich hierbei handeln? 7. Könnte man für den Ames-Test auch Mutanten von Biosynthesewege anderer Aminosäuren einsetzen? 8. Warum basiert der Ames-Test auf der Erfassung von Rückmutationen zur Histidin-Prototrophie und von Vorwärtsmutationen zur Histidin-Auxotrophie? 9. Welche experimentellen Befunde zeigen, dass der Ames-Test nicht nur zum Erkennen mutagener, sondern auch karzinogener Verbindungen geeignet ist?

10. Durch welche Modifikationen des Testorganismus kann der Ames-Test empfindlicher gestaltet werden? 11. Welche Aussagen können von unterschiedlichen Rückmutationsraten der Stämme TA1535 und TA1537 bezüglich der Testsubstanz abgeleitet werden? 12. Warum wird im Versuch das Kondensat in Dimethylsulfoxid (DMSO) aufgenommen? 13. Warum müssen die Platten, auf denen der Teststamm kultiviert wird, im Dunkeln inkubiert werden? 14. Was versteht man unter einem „Promutagen“ oder einem „Prokarzinogen“? 15. Durch welche Erweiterung des Ames-Tests können Promutagene bzw. Prokarzinogene erkannt werden? 16. Zeichnen Sie die Strukturformel von Benz(a)pyren! 17. Konsultieren Sie Lehrbücher der Biochemie und beschreiben Sie die Cytochrom P450-abhängige Hydroxylase! 18. Wie entsteht Benzpyren und wo kommt diese Verbindung vor? 19. Warum kann der Ames-Test die Anzahl von notwendigen Tierversuchen zwar deutlich verringern, diese aber nicht vollständig ersetzen? 20. Erklären Sie den Unterschied zwischen einer Punktmutation und einer Rasterschubmutation!

3.6 Auslösung von Mutationen, Anreicherung von Mutanten und Übertragung von DNA

Erweiterung des Spektrums verwertbarer Substrate bei Ralstonia eutropha durch Mutagenese

257

Versuch 50

Theoretischer Hintergrund Das Gram-negative, fakultativ chemolithoautotrophe Knallgasbakterium Ralstonia eutropha verfügt über einen strikt respiratorischen Energiestoffwechsel und kann nur durch Sauerstoff- oder Nitratatmung ausreichend Energie zum Wachstum gewinnen. Dieses Bakterium wird zur biotechnologischen Produktion von Poly(3-hydroxybutyrat), Poly(3HB), und anderer Polyhydroxyalkanoate herangezogen. Die Tatsache, dass der Wildtyp abgesehen von Fructose keine anderen Kohlenhydrate verwerten kann, schränkt den Einsatz von R. eutropha in der Biotechnologie jedoch stark ein, da man dort bestrebt ist, nach Möglichkeit nachwachsende Rohstoffe oder Reststoffe aus der Land- und Forstwirtschaft sowie anderer Wirtschaftszweige als Kohlenstoffquellen einzusetzen. Bei Kohlenhydraten handelt es sich hierbei vorwiegend um Stärke, Saccharose, Melasse, Molke, Cellulose und Hemicellulosen. R. eutropha kann jedoch keinen dieser Rohstoffe und der darin enthaltenden Kohlenhydrate wie z. B. Glucose, Lactose oder Saccharose verwerten. Auch kurzkettige Alkohole wie Methanol und Ethanol stellen preiswerte, von R. eutropha jedoch nicht verwertbare Kohlenstoffquellen dar.

Durch Ralstonia eutropha verwertbare Kohlenstoffquellen

Es besteht daher ein sehr großes Interesse, das Spektrum der durch R. eutropha verwertbaren Kohlenstoffquellen zu erweitern. Eine Möglichkeit, dies zu erreichen, besteht darin, durch Mutationen zu solchen Stäm• Erweiterung der Substratspezifität men zu gelangen. Dies kann natürlich nicht eines Transportproteins in allen Bakterien und für alle Substrate • Erweiterung der Substratspezifität gelingen. Da die Isolierung entsprechender eines Enzymproteins Mutanten durch positive Selektion auf • Expression kryptischer Gene Nährböden mit den entsprechenden Verbindungen sehr einfach ist, sollte dieser Weg • Veränderte Regulation jedoch nicht unversucht bleiben. Bei R. eutropha ist dies bereits für mehrere Kohlenstoffquellen gelungen. Die biochemischen Ursachen für einen Erfolg können vielfältig sein. Meist sind die Ursachen in veränderten Substratspezifitäten von Proteinen und Veränderungen in der Expression von Genen bzw. Regulation von Enzymen zu suchen ( Tabelle 3.70).

Erweiterung des Substratspektrums

Auf Glucose-haltigen Medien vermag R. eutropha nicht zu wachsen. Es werden jedoch relativ leicht Mutanten erhalten, die Glucose als alleinige Kohlenstoffquelle verwerten. Dabei wurde beobachtet, dass die Wachstumsgeschwindigkeit mit zunehmender Glucosekonzentration im Medium zunimmt und mit 2 bis 3 % (wt/vol) ein Maximum erreicht. Dies kann mit dem Aufnahmesystem für Glucose in Verbindung gebracht werden. Offensichtlich wird Glucose nicht durch aktiven Transport, sondern durch eine Permease vermittelte Diffusion in die Zelle aufgenommen. Da die erleicherte Diffusion im Gegensatz zum aktiven Transport nicht gegen einen Konzentrationsgradienten anarbeiten kann, tritt eine Sättigung erst bei sehr hohen Konzentrationen ein. Ob in der Mutante eine kryptische, im Wildtyp nicht exprimierte Permease aktiv ist oder ob die Substratspezifität einer anderen Permease auf Glucose ausgedehnt wurde, ist nicht bekannt. Außerdem wurde festgestellt, dass diese Mutanten Glucose-6-phosphatDehydrogenase konstitutiv exprimieren. Hierdurch wird aus Glucose durch Phos-

Glucose verwertende Mutanten

Tabelle 3.70. Biochemische Ursachen für das Auftreten von Mutanten mit erweitertem Spektrum verwertbarer Kohlenstoffquellen

V32 - S. 161

258

3 Versuche

phorylierung mittels Hexokinase hervorgegangenes Glucose-6-phosphat möglicherweise schneller zu 6-Phosphogluconat und weiter über den 2-Keto-3-desoxy6-phosphogluconat-Weg verstoffwechselt. Ethanol- und 2,3-Butandiolverwertende Mutanten

OH OH H3C

C

C

CH3

H H

Obwohl R. eutropha über einen strikt respiratorischen Energiestoffwechsel verfügt, exprimiert es bei Kultivierung unter Sauerstoffmangelbedingungen die NAD-abhängigen Gärungsenzyme Lactat-Dehydrogenase (LDH) und Alkohol-Dehydrogenase (ADH). Bei der ADH handelt es sich um ein sehr unspezifisches Enzym, welches sowohl Acetaldehyd zu Ethanol als auch Acetoin zu 2,3-Butandiol reduzieren kann. Diese Enzyme sind nur in Zellen nachweisbar, die unter Sauerstoffmangelbedingungen kultiviert wurden und dann auch Lactat, Ethanol und 2,3-Butandiol, also typische Gärungsprodukte, ausscheiden. Der Wildtyp von R. eutropha wächst zwar sehr gut auf Lactat und auch auf Acetoin, aber Ethanol oder 2,3-Butandiol kann dieses Bakterium nicht verwerten.

2,3-Butandiol

Es wurden jedoch mühelos zwei Klassen von Mutanten erhalten, welche die beiden Alkohole ebenfalls als jeweils alleinige Kohlenstoffquelle verwerten. Klasse-I Mutanten wachsen relativ schnell (Verdopplungszeiten: 3,5 bis 9 h) auf Ethanol und exprimieren offensichtlich eine substratspezifische NAD(P)-unabhängige EthanolDehydrogenase, mit der Ethanol zu Acetaldehyd oxidiert werden kann ( Abb. 3.125). Gleichzeitig wird von diesen Mutanten eine Acetaldehyd-Dehydrogenase (AcDH) sehr stark überexprimiert, die Acetaldehyd zu Acetat oxidiert, welches auch vom Wildtyp verwertet werden kann. Klasse-II Mutanten wachsen sehr langsam auf Ethanol (Verdopplungszeiten: 15 bis 30 h), können jedoch im Gegensatz zu Klasse-I Mutanten auch 2,3-Butandiol als Kohlenstoffquelle zum Wachstum (Verdopplungszeiten: 3,3 bis 4,4 h) verwerten ( Abb. 3.125). Durch jeweils eine Punktmutation im Bereich des Promoters der unspezifischen fermentativen ADH wird dieses Enzym nun auch unter aeroben Bedingungen exprimiert und ermöglich die Oxidation beider Alkohole. Ethanol wird zu Acetaldehyd und anschließend wie bei Klasse-I Mutanten durch die AcDH zu Acetat oxidiert. 2,3-Butandiol wird zunächst zu Acetoin oxidiert, welches anschließend durch eine aus drei Enzymen bestehende AcetoinDehydrogenase in Acetyl-CoA und Acetaldehyd gespalten wird. Die Oxidation von Acetaldehyd zu Acetat erfolgt wieder durch die AcDH.

Erschließung zusätzlicher Kohlenstoffquellen durch zusätzliche Gene

Eine weitere Möglichkeit zur Erschließung zusätzlicher Kohlenstoffquellen besteht in der Übertragung und Expression von Genen für entsprechende Abbauleistungen aus anderen Organismen. Mit der Übertragung des für ein lac-Operon codierenden Lactose-Transposons wurde in R. eutropha zunächst die Spaltung von Lactose in Glucose und Galactose und anschließende Verwertung der Glucose ermöglicht. Um auch noch die Verwertung der Galactose zu ermöglichen, wurden zusätzlich noch die Gene für den Leloir-Weg mit der Galactose-Kinase nach R. eutropha übertragen. Ähnliche molekulargenetische Ansätze wurden auch auf andere Substrate wie Saccharose und Stärke angewandt.

Übertragung in ein anderes Genom

Führen weder Mutationen noch zusätzliche Gene dazu, dass eine kostengünstige Kohlenstoffquelle zur biotechnologischen Produktion einer Verbindung mit diesem Bakterium erschlossen werden kann, ist eine andere Vorgehensweise in Erwägung zu ziehen. Ist der von einem Intermediat des Zentralstoffwechsels abzweigende Biosyntheseweg für die fragliche Verbindung überschaubar und benötigt die Biosynthese keine ungewöhnlichen Cofaktoren, dann eröffnet sich die Möglichkeit, die für die Biosynthese benötigten Gene zu klonieren und in einem geeigneteren Produktionsorganismus zu exprimieren. Dies wird heute z. B. mit den sehr gut untersuchten Biosynthesegenen für Poly(3HB) aus R. eutropha in Pflanzen versucht. Es wird davon ausgegangen, dass transgene Pflanzen ausgehend von CO2 und unter Nutzung von Licht Poly(3HB) unschlagbar preiswert produzieren könnten.

3.6 Auslösung von Mutationen, Anreicherung von Mutanten und Übertragung von DNA EthanolDehydrogenase H3C

CH2 OH

AcetaldehydDehydrogenase H3C

Klasse I - Mutanten

2 [H]

CHO

H3C NAD H2O

+

CH3 H H

C

OH

C

OH

CH3

NAD

+

+

H3C CH3 C

O

H

C

OH

+

CH3

NADH + H

COOH

NADH + H

Klasse II - Mutanten 2, 3 ButandiolDehydrogenase

259

Acetaldehyd- HO O C Dehydrogenase CHO CH3

AcetoinDehydrogenase

NAD+ NADH + H+ H3C CoA

NAD+ NADH + H+ H2O O C S-CoA

Abb. 3.125.

Verwertung von Ethanol und 2,3-Butandiol durch Mutanten von Ralstonia eutropha

Salpetrige Säure (HNO2) desaminiert die Basen Adenin, Cytosin und Guanin oxidativ, wodurch die Aminogruppe durch eine Hydroxylgruppe ersetzt wird. Hierdurch wird Adenin in Hypoxanthin überführt, welches nicht mit Thymin, sondern mit Cytosin paart. Auf diese Weise wird Adenin dann letztlich in Guanin überführt. Es wird also eine Punktutation ausgelöst. Die Desaminierung von Cytosin bewirkt eine Transition zu Thymin. Die Deaminierung von Guanin führt zu keiner Veränderung. Nitrit wirkt nur im leicht sauren Bereich, die Wirkung kann daher durch Anheben des pH Wertes auf ca. 8 aufgehoben werden.

Mutationsauslösung mit Nitrit

N-Methyl-N-nitro-N-nitroso-guanidin (MNNG) ist ein bifunktionelles alkylierendes und sehr wirkungsvolles Mutationen auslösendes Agens. Neben Alkylierungen bewirkt es auch Quervernetzungen der DNA-Stränge. Die modifizierten Regionen werden durch eine DNAse ausgeschnitten und anschließend durch die DNA-Polymerase I wieder aufgefüllt. Bei diesen Reparaturen kommt es häufig zu Fehlern, und es entstehen Punktmutationen oder auch kurze Deletionen.

Mutationsauslösung mit MNNG

Versuchsziel In diesem Versuch sollen Mutanten von Ralstonia eutropha erzeugt und isoliert werden, die Ethanol, 2,3-Butandiol oder Glucose als zusätzliche Kohlenstoffquelle zum Wachstum verwerten können. Zum einen sollen die Mutationen durch salpetrige Säure bzw. MNNG ausgelöst werden, zum anderen soll geprüft werden, ob diese Mutanten auch spontan auftreten. Der geringe Aufwand zur Isolierung solcher Mutanten wird dadurch möglich, dass eine positive Selektion angewandt werden kann. Beim Einsatz von MNNG (s. u.) und Natriumnitrit ist folgender Sicherheitshinweis zu beachten: In diesem Versuch wird mit mutagenen Substanzen (MNNG, Natriumnitrit) umgegangen. MNNG (N-Methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin) kann Krebs erzeugen, ist gesundheitsschädlich beim Einatmen, reizt die Augen und die Haut, ist giftig für Wasserorganismen, kann in Gewässern längerfristig schädliche Wirkungen haben; Sicherheitsratschläge: Exposition vermeiden, vor Gebrauch besondere Anweisungen einholen, nur für den berufsmäßigen Verwender, bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt hinzuziehen, Freisetzung in die Umwelt vermeiden; Beim Umgang mit MNNG daher unbedingt Einmal-Handschuhe tragen, die Arbeiten mit MNNG sind unbedingt unter einem Abzug durchzuführen

O NH

+

N O

N H

CH3

C N

O MNNG Sicherheitshinweis

260

3 Versuche

Versuchsdurchführung Vorbereitungen

Nach Erhalt des Stamms wird dieser in wenig steriler Saline suspendiert und per DreiStrich-Ausstrich ( M4, S. 365) auf NBFestmedium ausgestrichen. Die Platte wird bei 30 °C bebrütet. Die bewachsene Platte kann bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank (4 °C) gelagert werden. Zellanzucht für die Mutagenesen: Mit Material von einer Einzelkolonie von R. eutropha H16 werden 20 ml Mineralmedium mit 0,5 % (wt/vol) Fructose in einem 200 ml Erlenmeyerkolben beimpft. Die Kultur wird 48 Stunden bei 30 °C unter Schütteln inkubiert.

benötigtes Material Geräte       

Impföse Bunsenbrenner Autoklav 50 ml und 200 ml-Erlenmeyerkolben Schüttler (30 °C) Brutschrank (30 °C) Labor-Kühlzentrifuge für die Zellernte (20 ml, 3.500 × g, 4 °C)  Papierrundfilter zur Applikation von Ethanol (Ø 55 mm, z. B. von Fa. Schleicher & Schüll GmbH, D-37582 Dassel)  Parafilm®

Chemikalien und Medien  Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril

Mutagenesen und Ausprägung der  NB-Festmedium ( S. 422) Mutationen: Die Zellen werden durch  Mineralsalz-Festmedium ( S. 421)  Fructose Zentrifugation (15 min, 3.500 × g, 4 °C)  Glucose geerntet, zweimal mit 0,1 M Citrat-Puffer  Ethanol (96 %, vol/vol, unvergällt) gewaschen und in 7 ml Puffer resuspendiert.  2,3-Butandiol Diese Zellsuspension wird für die Muta 0,1 M KP-Puffer, herstellen aus KP-Puftionsauslösungen – Nitrit- und MNNGfer (1 M) ( S. 416) Mutagenese (M20, S. 388) – eingesetzt;  Citrat-Puffer (0,1 M) ( S. 412) 1 ml der Suspension wird zur Isolierung  Natriumnitrit spontan auftretender Mutanten unbehandelt  MNNG (N-Methyl-N-nitro-N-nitrosomitgeführt. Unmittelbar nach erfolgten guanidin; Bezug: Fa. Fluka, Nr. 68051, Fa. Aldrich, Nr. 12,994-1) Mutagenesen werden die Zellen getrennt voneinander durch Zentrifugation sedimenMikroorganismen tiert, zweimal mit 0,1 M Phosphat-Puffer gewaschen und in jeweils 5,5 ml Mineralme Ralstonia eutropha H16 DSM 428 dium mit 0,5 % (wt/vol) Fructose resuspendiert. Die Kulturen werden in sterilen 50 mlErlenmeyerkolben überführt und zur Ausprägung der Mutationen 24 Stunden bei 30 °C geschüttelt. Selektion der Mutanten: Die drei Kulturen werden schrittweise mit Saline bis 10-5 verdünnt. Aus den einzelnen Verdünnungsstufe werden je 0,1 ml mit dem DrigalskiSpatel ( M4, S. 366) auf Mineral-Festmedium ohne Kohlenstoffquelle, auf MineralFestmedium mit 1,0 % (wt/vol) Glucose und Mineral-Festmedium mit 0,5 % (vol/vol) 2,3-Butandiol ausplattiert. In den Deckel der Platte ohne Kohlenstoffquelle wird ein Papier-Rundfilter gelegt, auf den 0,2 ml Ethanol pipettiert werden. Letzteres wird auf diese Weise gehandhabt, da Ethanol im direkten Kontakt toxisch wirkt; die Versorgung mit der leicht flüchtigen Kohlenstoffquelle Ethanol erfolgt daher über die Gasphase (ähnlich erfolgt auch die Applikation der Substrate in Versuch 44 zum Abbau von Kohlenwasserstoffen,  S. 220). Diese Platte wird am Rand rundherum mit Parafilm® verschlossen. Alle Platten werden bei 30 °C inkubiert. Auswertung: Die Platten werden nach Kolonien durchmustert. Die Anzahl der Kolonien wird quantitativ erfasst in Abhängigkeit des eingesetzten mutagenen Agens und der Kohlenstoffquelle. Ausgehend von möglichst vielen repräsentativen Kolonien werden Reinigungsausstriche ( M4, S. 365) auf NB-Festmedium angefertigt. Die Platten werden bei 30 °C inkubiert.

3.6 Auslösung von Mutationen, Anreicherung von Mutanten und Übertragung von DNA

Es erfolgen weitere Reinigungsausstriche auf NB-Festmedium. Ausgehend von Salinesuspensionen separat liegender Kolonien der gereinigten potentiellen Mutanten werden Sektoren-Ausstriche auf den oben genannten Mineral-Festmedien (siehe Tag 4) und zusätzlich auf Mineral-Medium mit 0,5 % (wt/vol) Fructose angefertigt. Auf einer Platte sollten neben fünf potentiellen Mutanten auch Zellen des Ausgangsstamms R. eutropha H16 (zur Kontrolle) ausgestrichen werden. Es erfolgt täglich eine vergleichende qualitative Bewertung des Wachstums auf den Sektoren-Ausstrichen [z. B. anhand folgender Abstufung: -, kein (lediglich Hintergrund); +, schwaches; ++, gutes bis +++, starkes Wachstum]. Weiterführende Literatur Jendrossek D, Krüger N, Steinbüchel A (1990) Characterization of alcohol dehydrogenase genes of derepressible wild-type Alcaligenes eutrophus H16 and constitutive mutants. Journal of Bacteriology 172:4844-4851 König C, Sammler J, Wilde E, Schlegel HG (1969) Konstitutive Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase bei Glucose-verwertenden Mutanten von einem kryptischen Wildstamm. Archiv für Mikrobiologie 67:51-57 Schlegel HG, Gottschalk G (1965) Verwertung von Glucose durch eine Mutante von Hydrogenomonas H16. Biochemische Zeitschrift 341:249-259 Steinbüchel A, Fründ C, Jendrossek D, Schlegel HG (1987) Isolation of mutants of Alcaligenes eutrophus unable to derepress the fermentative alcohol dehydrogenase. Archives of Microbiology 148:178-186

Nachgefragt 1. Welche Zucker kann Ralstonia eutropha als Kohlenstoffquelle zum Wachstum verwerten? 2. Weshalb lässt sich der Wildtyp von Ralstonia eutropha nur eingeschränkt für biotechnologische Prozesse nutzen? 3. Nennen Sie die wichtigsten nachwachsenden Rohstoffe, die von der Landwirtschaft in großen Mengen bereitgestellt werden können! 4. Beschreiben Sie die chemische Zusammensetzung dieser Rohstoffe! 5. Nennen Sie mögliche Strategien, mit denen Sie die Anzahl der Kohlenstoffquellen, die durch ein Bakterium verwertet werden können, erhöhen können! 6. Welches biotechnologische Verfahren wird mit Hilfe von Ralstonia eutropha durchgeführt, und welches Produkt wird damit hergestellt? 7. Ein von ihnen untersuchtes Bakterium synthetisiert eine sehr interessante chemische Verbindung; der Biosyntheseweg für diese Verbindung ist sehr kurz. Leider verwertet dieses Bakterium nur sehr teure Kohlenstoffquellen zum Wachstum und zur Produktbildung, aber alle Versuche zur Erweiterung des Spektrums verwertbarer Kohlenstoffquellen dieses Bakteriums sind gescheitert. Wie könnten Sie weiter vorgehen, um die interessante Verbindung dennoch herzustellen? 8. Zeichnen Sie die chemischen Strukturformeln von Glucose und Fructose! 9. Über welchen Abbauweg wird Fructose von Ralstonia eutropha verwertet? 10. Nennen Sie die Intermediate des Abbaus von Fructose bis zum Pyruvat und nennen Sie die am Abbau beteiligten Enzyme!

11. Wie wird Glucose bei den Mutanten in den Fructose-Abbauweg eingeschleust? 12. Mit Hilfe welcher Enzyme ist es Mutanten von Ralstonia eutropha im Gegensatz zum Wildtyp möglich, 2,3-Butandiol zu verwerten? Beschreiben Sie die Überführung von 2,3-Butandiol in AcetylCoA! 13. Mit Hilfe welcher Enzyme ist es Mutanten von Ralstonia eutropha im Gegensatz zum Wildtyp möglich, Ethanol zu verwerten? Beschreiben Sie die Überführung von Ethanol in Acetyl-CoA! 14. Die Wachstumsgeschwindigkeit eines Bakteriums ist abhängig von der Konzentration der Kohlenstoffquelle, und mit zunehmender Konzentration der Kohlenstoffquelle beschleunigt sich das Wachstum. Auf was deutet dieser Befund hin? 15. Die Wachstumsgeschwindigkeit eines Bakteriums ist abhängig von der Konzentration der Kohlenstoffquelle, und mit zunehmender Konzentration der Kohlenstoffquelle verlangsamt sich das Wachstum, bis schließlich gar kein Wachstum mehr zu beobachten ist. Auf was deutet dieser Befund hin? 16. Was versteht man unter primären und sekundären Mutanten? Nennen Sie Beispiele! 17. Warum setzen Sie bei der Kultivierung Ethanolverwertender Stämme auf Festmedium Ethanol nicht direkt dem Medium zu, sondern in den Dekkel der Petrischale? 18. Beschreiben Sie, wie durch Nitrit Mutationen ausgelöst werden! 19. Zeichnen Sie die Strukturformel von N-Methyl-N-nitro-N-nitroso-guanidin! 20. Beschreiben Sie, wie durch N-Methyl-N-nitroN-nitroso-guanidin Mutationen ausgelöst werden!

261

262

3 Versuche

Versuch 51

Poly(3HB)-negative Mutanten von Ralstonia eutropha Theoretischer Hintergrund

Modellorganismus für den Stoffwechsel von Poly(3HB)

O O n

Poly(3HB) V32 - S. 161 V33 - S. 167

Das Gram-negative Bakterium Ralstonia eutropha (früher: Alcaligenes eutrophus) ist in der Lage, Poly(3-hydroxybutyrat), Poly(3HB) sowie einige andere Polyhydroxyalkanoate (PHA) zu synthetisieren und in z. T. beträchtlichen Mengen in der Zelle als Speicherstoff für Kohlenstoff und Energie zu akkumulieren. PHAs sind natürliche Thermoplaste und Elastomere, die nicht nur für die Herstellung biologisch abbaubarer und kompostierbarer Verpackungsmaterialien, sondern auch noch für andere Anwendungen eingesetzt werden können. Dies wird an anderer Stelle im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM besprochen. Da R. eutropha darüber hinaus auch noch sehr gut wächst und gut in einfachen Medien kultiviert werden kann, wurden verschiedene Stämme dieses Bakteriums von der Industrie zur biotechnologischen Produktion von PHAs mittels Fermentation herangezogen. Zusätzlich wird versucht, die Gene für die PHA Biosynthese aus diesem Bakterium in andere Bakterien sowie in Hefen und Pflanzen zu übertragen, um dort die Biosynthese von z. B. Poly(3HB) zu etablieren.

Biosynthese von Poly(3HB)

R. eutropha akkumuliert Poly(3HB), wenn den Zellen eine verwertbare Kohlenstoffquelle wie z. B. Fructose im Überschuss zur Verfügung steht, in Ermangelung eines anderen Nährstoffs wie z. B. einer Stickstoffquelle aber kein Wachstum möglich ist. Die Biosynthese von Poly(3HB) geht in diesem Bakterium von Acetyl-CoA aus und benötigt drei Enzyme. Durch eine β-Ketothiolase werden zwei Moleküle Acetyl-CoA unter Abspaltung eines Moleküls Coenzym A in einer Claisen-Kondensation in AcetoacetylCoA umgewandelt. Dieses Intermediat wird von einer NADPH-abhängigen Acetoacetyl-CoA Reduktase zu 3-Hydroxybutyryl-CoA reduziert. Im dritten und letzten Schritt wird der 3-Hydroxybutyrat-Rest durch das Schlüsselenzym PHA-Synthase auf ein während der gesamten Synthese kovalent an das Enzym gebundenes Poly(3HB) Molekül übertragen, wodurch das wachsende Polyestermolekül um eine Einheit verlängert wird ( Abb. 3.78, S. 162).

Mutationsauslösung mit Nitrit

Salpetrige Säure (HNO2) desaminiert die Basen Adenin, Cytosin und Guanin oxidativ, wodurch die Aminogruppe durch eine Hydroxylgruppe ersetzt wird. Hierdurch wird Adenin in Hypoxanthin überführt, welches nicht mit Thymin, sondern mit Cytosin paart. Auf diese Weise wird Adenin dann letztlich in Guanin überführt. Es wird also eine Punktmutation ausgelöst. Die Desaminierung von Cytosin bewirkt eine Transition zu Thymin. Die Desaminierung von Guanin führt zu keiner Veränderung. Nitrit wirkt nur im leicht sauren Bereich, die Wirkung kann daher durch Anheben des pH Wertes auf ca. 8 aufgehoben werden.

Größe und spezifische Dichte der Zellen

Jede Bakterienzelle besitzt eine bestimmte spezifische Dichte, die für die jeweilige Bakterienart und für ihren physiologischen Zustand charakteristisch ist. Gehen Zellen von R. eutropha von der exponentiellen Wachstumsphase, in der keine Speicherung von Poly(3HB) erfolgt, in die stationäre Phase über und beginnen mit der Akkumulation von Poly(3HB), fangen die Zellen an, sich zu vergrößern und deren spezifische Dichte nimmt geringfügig, aber signifikant zu. Das durchschnittliche Zellvolumen steigt dabei ungefähr um den Faktor 3 von 1,21 μm3 der speicherstofffreien Zellen auf 3,81 μm3 der Zellen am Ende der Speicherphase an. Die Volumenzunahme ist auf eine Zunahme des Durchmessers und nicht der Länge der Zellen zurückzuführen und folgt linear der Zunahme des Poly(3HB)-Gehaltes. Dabei steigt die spezifische Dichte der Zellen von 1,110 auf 1,145 pg μm-3 an. Diese Unterschiede in der Zelldichte können zur Anreicherung von Mutanten genutzt werden, die deutlich weniger oder sogar kein

3.6 Auslösung von Mutationen, Anreicherung von Mutanten und Übertragung von DNA

263

Poly(3HB) mehr akkumulieren können. Zellen von Poly(3HB)-negativen Mutanten besitzen in etwa die gleiche spezifische Dichte wie Zellen des Wildtyps, die kein Poly(3HB) gespeichert haben. Zentrifugation in Dichtegradienten

PHB PHB

+ -

SaccharoseDichtegradient

-

PHB

+

PHB PercollDichtegradient

Abb. 3.126. Unterschiedliches Sedimentationsverhalten des Wildtyps und der PHAnegativen Mutante PHB-4 von R. eutropha in Percoll- und Saccharose-Dichtegradienten

Abb. 3.127. Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation von Zellen des Wildtyps (oben) und der PHA-negativen Mutante PHB-4 von R. eutropha (unten)

Zellen höherer spezifischer Dichte können von Zellen niedrigerer spezifischer Dichte durch Ultrazentrifugation in kontinuierlichen oder diskontuinuierlichen Dichtegradienten voneinander getrennt werden. Solche Gradienten lassen sich aus Saccharose, Glycerin oder Percoll® herstellen und eignen sich auch zur Trennung und Reinigung von unlöslichen Zellbestandteilen, Organellen, cytoplasmatischen Einschlüssen sowie einiger Makromoleküle. Von der Firma Amersham Biosciences wird ein Produkt angeboten, welches sich hervorragend zur Dichtegradienten-Zentrifugation eignet. Mit Percoll® können gestufte oder lineare isoosmotische Dichtegradienten in beliebiger Form und in einem beliebigen Bereich zwischen 1,0 und 1,3 g/ml erzeugt werden und darin Zellen oder subzelluläre Partikel nach ihrer spezifischen Dichte aufgetrennt werden. Mit Hilfe von Standards (density marker beads) ist es sogar möglich, die spezifische Dichte der aufgetrennten Partikel zu bestimmen. Percoll besteht aus sehr kleinen Siliciumpartikeln mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 21-22 nm, die mit einer dünnen Schicht aus Polyvinylpyrrolidon überzogen sind, und wird als 23 %iges kolloidales Gel angeboten. Percoll® ist somit ein nichttoxisches und im Gegensatz zu Saccharose osmotisch nahezu inertes Material, welches die Zellmembran nicht durchdringt. Percollgradienten können einfach vorgeformt werden, indem Percoll in einer spezifischen Dichte, die der Mitte des zu untersuchenden Bereichs entspricht, durch Zentrifugation vorgeformt wird. Auf den vorgeformten Gradienten wird dann die Probe aufgetragen, bevor erneut zentrifugiert wird. Poly(3HB) enthaltende Zellen des Wildtyps besitzen eine höhere spezifische Dichte als Zellen einer PHA-negativen Mutante und sedimentieren im Percoll-Dichtegradienten daher weiter unten ( Abb. 3.126).

PercollDichtegradient

n

N

Poly iny v lrprolidon y

O

264

3 Versuche SaccharoseDichtegradienten

Am einfachsten und preiswertesten sind Dichtegradienten aus Saccharose herzustellen. Dabei kommen jedoch sehr hohe Konzentrationen des Zuckers zum Einsatz, und da Saccharose osmotisch nicht inert ist, können hierdurch die Zellen geschädigt oder gar abgetötet werden. Paradoxerweise weisen Poly(3HB) enthaltene Zellen des Wildtyps im Saccharose-Dichtegradienten scheinbar eine geringere spezifische Dichte als Zellen einer PHA-negativen Mutante auf. Dies erklärt sich aus der starken durch die hohe Saccharosekonzentration verursachten Schrumpfung der Zellen und stellt ein Artefakt dar ( Abb. 3.126). Identifizierung der Mutanten

Anfärben mit lipophilen Farbstoffen

Werden Zellen von R. eutropha auf „Speicherplatten“ ausgestrichen, wachsen die Kolonien des Wildtyps zu weißlichen, opaken Kolonien heran, während Kolonien einer PHA-negativen Mutante durchscheinend glasig aussehen. Den Zellen der Mutante fehlen die vielen stark lichtbrechenden Poly(3HB)-Grana ( Abb. auf der Umschlagseite). Es ist auch möglich die Kolonien mit einer ethanolischen Lösung von Sudanschwarz B ( Abb. 5.22, S. 383) anzufärben. Dann nehmen zunächst alle Kolonien den lipophilen Farbstoff an. Durch eine Nachbehandlung mit reinem Ethanol können dann beide Kolonietypen voneinander differenziert werden, da nur die Kolonien der PHA-negativen Mutante den Farbstoff wieder abgeben ( Abb. auf der Umschlagseite). Diese Methode hat jedoch den Nachteil, dass zuvor eine Kopie der anzufärbenden Platte angefertigt werden muss, da die Zellen durch die zweimalige Behandlung mit Ethanol abgetötet werden. Vorteilhafter ist es, den Speicherplatten von Beginn an den Fluoreszenzfarbstoff Nilrot ( Abb. 5.22, S. 383) zuzugeben. Dieser Farbstoff ist für die Zellen nicht toxisch und reichert sich in den Poly(3HB) Grana an. Unter UV-Licht fluoreszieren Kolonien des Wildtyps daher im Gegensatz zu Kolonien einer PHA-negativen Mutante. Diese Methode ist sehr empfindlich und gut auf andere Gram-negative Bakterien übertragbar. Es ist jedoch zu beachten, dass sich Nilrot auch in anderen lipophilen Einschlüssen wie z. B. denen aus Triglyceriden oder Wachsestern anreichert und daher, wie übrigens auch Sudanschwarz B, nicht spezifisch für PHAs ist. Mit den meisten Gram-positiven Bakterien liefert Nilrot jedoch leider nur unbefriedigende Ergebnisse.

Phänotypen „negativ“ und „leaky“

Mutanten von R. eutropha, die Poly(3HB) nicht mehr synthetisieren können, akkumulieren auch keine anderen PHAs mehr. Sie besitzen den Phänotyp „PHA-negativ“. In diesen Mutanten ist grundsätzlich keine Aktivität des Schlüsselenzyms PHA-Synthase mehr nachweisbar. Interessanterweise ist in keiner dieser PHA-negativen Mutanten ausschließlich die β-Ketothiolase oder die Acetoacetyl-CoA Reduktase defekt. Neben den PHA-negativen Mutanten treten in sehr viel höherer Anzahl Mutanten auf, die noch mehr oder weniger deutlich Poly(3HB) synthetisieren können, jedoch weniger als der Wildtyp akkumulieren. Sie besitzen den Phänotyp „PHA-leaky“. Für das Auftreten dieser Mutanten gibt es mehrere Erklärungen, die mit der Inaktivierung weiterer Gene für Strukturproteine der die PHA-Grana umgebenden Hüllmembran, mit der Regulation von Synthese und Wiederverwertung sowie wahrscheinlich mit der Bereitstellung von Acetyl-CoA für die β-Ketothiolase zu tun haben. Außerdem muss das Schlüsselenzym PHA-Synthase nicht durch jede Mutation vollständig inaktiviert werden. Es ist denkbar, dass z. B. nach einer Punktmutation noch ein partiell aktives Enzym gebildet wird, welches aber nicht mehr in dem Umfang wie das Enzym des Wildtyps zur Synthese von Poly(3HB) beitragen kann. Das Auftreten von Mutanten mit dem Phänotyp leaky ist verbreitet und kommt auch bei der Untersuchung vieler anderer Stoffwechselleistungen vor.

3.6 Auslösung von Mutationen, Anreicherung von Mutanten und Übertragung von DNA

265

Versuchsziel Zunächst soll das unterschiedliche Sedimentationsverhalten des Wildtyps und einer PHA-negativen Mutante von Ralstonia eutropha in Percoll- und in Saccharose-Dichtegradienten demonstriert werden. Dann sollen Nitrit-induzierte Mutanten von R. eutropha erzeugt werden, von denen Mutanten mit dem Phänotyp PHA-negativ auf Grund ihrer vom Wildtyp geringeren spezifischen Dichte in einem Percoll-Dichtegradienten angereichert und später an Hand der Koloniemorphologie auf festen Speichernährböden identifiziert werden. Versuchsdurchführung benötigtes Material Geräte              

Impföse Bunsenbrenner Autoklav 50 ml-Erlenmeyerkolben 100 ml-Erlenmeyerkolben Schüttler (30 °C) Brutschrank (30 °C) Peristaltik-Pumpe mit autoklavierbarem Schlauch Glaskanülen Glaspipetten, steril Photometer zur Messung der Optischen Dichte (Trübung) bei 650 nm Labor-Kühlzentrifuge für die Zellernte (10 ml, 3.500 × g, 4 °C) Zentrifuge für die DichtegradientenZentrifugationen und Zubehör ( M7, S. 371) Phasenkontrastmikroskop

Chemikalien und Medien  Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril  NB-Festmedium ( S. 422)  Mineralsalzmedium ( S. 421) mit Nilrot ( M15, S. 383)  Fructose  Saccharose  Percoll® (Bezugsquelle: Amersham Biosciences Europe GmbH, Munzinger Str. 9, D-79111 Freiburg)

Mikroorganismen  R. eutropha H16 DSM 428  R. eutropha PHB-4 DSM 541

Nach Erhalt der beiden Stämme werden diese in jeweils wenig steriler Saline suspendiert und per Drei-Strich-Ausstrich (M4, S. 365) auf NB-Festmedium ausgestrichen. Die Platten werden bei 30 °C bebrütet. Die bewachsenen Platten können bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank (4 °C) gelagert werden. Vorversuch (Zellanzucht unter Poly(3HB)Speicherbedingungen): Mit Material von jeweils einer Einzelkolonie der Stämme R. eutropha H16 (Wildtyp) und R. eutropha PHB-4 (Poly(3HB)-negativ) werden jeweils 10 ml Mineralmedium mit 0,5 % (wt/vol) Fructose und reduziertem Stickstoffgehalt (0,05 %, wt/vol, NH4Cl) beimpft, die sich in zwei 100 ml-Erlenmeyerkolben befinden. Die Kulturen werden 48 Stunden bei 30 °C unter Schütteln inkubiert. Vorversuch (Dichtegradienten-Zentrifugation): In den unten beschriebenen Dichtegradienten bilden die beiden Zelltypen nach Zentrifugation aufgrund des Unterschieds in der spezifischen Dichte an definierten Positionen recht scharfe Banden ( Abb. 3.127). Die relative Position der Zellen von R. eutropha PHB-4 muss eindeutig dokumentiert werden; hier sind im späteren Teil des Versuchs die Poly(3HB)negativen Mutanten zu suchen (siehe Tag 9). Die Verwendung zweier unterschiedlicher Gradientensysteme dient zur Demonstration der osmotischen Wirkung von Saccharose auf die relative Bandierungsposition im Gradienten.

Zunächst wird in beiden Kulturen die Trübung bei 650 nm bestimmt (M22, S. 391). Nach Ernte und Waschen der Zellen soll eine Zellsuspension in Saline hergestellt werden, die eine bestimmte Trübung besitzen soll. Dazu werden die Kulturen getrennt in sterilen Zentrifugenröhrchen (Schraubdeckelröhrchen) 15 min bei 3.500 × g und 4 °C zentrifugiert, zweimal mit Saline gewaschen und in einem Volumen Saline suspendiert,

Vorbereitungen

266

3 Versuche

dessen Trübung eine Optische Dichte von 2 besitzt. Ausgehend von diesen Suspensionen werden drei Saccharose-Gradienten (M7, S. 372) und drei Percoll®-Gradienten ( M7, S. 371) mit Zellen beladen. Dazu werden jeweils 0,2 ml der Zellsuspensionen getrennt auf zwei Saccharose-Gradienten und zwei Percoll®-Gradienten gegeben; die beiden verbliebenen Gradienten werden mit einer Mischung beider Zellsuspensionen versetzt (0,4 ml bestehend aus je 0,2 ml R. eutropha H16 und R. eutropha PHB-4-Suspension). Hauptversuch (Zellanzucht für die Mutagenese): Mit Material von einer Einzelkolonie von R. eutropha H16 (Wildtyp) werden 10 ml Mineralmedium mit 0,5 % (wt/vol) Fructose und normalen Stickstoffgehalt (0,1 %, wt/vol, NH4Cl) in einem 100 ml Erlenmeyerkolben beimpft. Die Kultur wird 48 Stunden bei 30 °C unter Schütteln inkubiert. Hauptversuch (Mutagenese und Ausprägung der Mutationen): Die Zellen werden durch Zentrifugation (15 min, 3.500 × g, 4 °C) geerntet, zweimal mit Saline gewaschen und in 2 ml Saline resuspendiert. Diese Zellsuspension wird zur Mutationsauslösung mit Nitrit behandelt ( M20, S. 390). Nach erfolgter Mutagenese werden die Zellen durch Zentrifugation sedimentiert, zweimal mit Saline gewaschen und in 5,5 ml Mineralmedium mit 0,5 % (wt/vol) Fructose und normalen Stickstoffgehalt (0,1 %, wt/vol, NH4Cl) resuspendiert. Die Kultur wird in einen sterilen 50 ml-Erlenmeyerkolben überführt und zur Ausprägung der Mutationen 48 Stunden bei 30 °C geschüttelt. Hauptversuch (Anzucht unter Poly(3HB)-Speicherbedingungen): Mit 0,5 ml der Kultur wird ein 100 ml-Erlenmeyerkolben, der 10 ml Mineralmedium mit 0,5 % (wt/ vol) Fructose ohne Stickstoffzusatz enthält, beimpft. Diese Kultur wird 24 Stunden bei 30 °C geschüttelt. Hauptversuch (Dichtegradienten-Zentrifugation): Wie bereits oben beschrieben (siehe Tag 3), wird zunächst die Optische Dichte der Kultur bestimmt, die Zellen werden geerntet und gewaschen. Es wird eine Zellsuspension in Saline hergestellt, die im Unterschied zum Vorversuch auf eine Optische Dichte von 3 eingestellt wird. Von dieser Suspension werden 0,2 ml auf einen Percoll-Dichtegradienten gegeben. Die im Gradienten abgetrennten Mutanten sollen aus dem Gradienten entnommen werden und sich phänotypisch mittels in vivo-Färbung mit Nilrot (M15, S. 383) zu erkennen geben. Zur Abschätzung des Bereichs im Gradienten, in dem sich die gesuchten Mutanten befinden, sollte die dokumentierte relative Position der Zellbande von R. eutropha PHB-4 aus dem Vorversuch dienen (siehe Tag 3). Nach erfolgter Dichtegradienten-Zentrifugation ( M7, S. 371) werden mit Hilfe des in Abb. 5.14 ( S. 372) skizzierten Aufbaus aus dem Bereich oberhalb der sichtbaren Wildtypzellbande vorsichtig Proben entnommen und direkt auf Nilrot-haltiges Mineral-Festmedium mit stark reduziertem Stickstoffgehalt (0,005 %, wt/vol, NH4Cl) und 0,5 % (wt/vol) Fructose getropft. Fraktionen von zwei bis fünf Tropfen werden dabei jeweils auf einer Platte gesammelt und mit Hilfe eines Drigalski-Spatels (M4, S. 366) flächig verteilt. Die Platten werden bei 30 °C bebrütet. Die Platten werden zunächst nach durchscheinenden Kolonien durchmustert. Danach werden die Platten zur Sichtbarmachung von akkumuliertem Nilrot unter UV-Licht (312 nm, M15, S. 383) betrachtet; hier sollten die gesuchten Kolonien nicht fluoreszieren ( Abb. 3.128). Potentielle Poly(3HB)-Defekt-Mutanten werden per DreiStrich-Ausstrich ( M4, S. 365) auf NB-Festmedium ausgestrichen.

3.6 Auslösung von Mutationen, Anreicherung von Mutanten und Übertragung von DNA

Abb. 3.128. Poly(3HB)-produzierende Zellen (oben) und eine negative Mutante (unten) nach Wachstum auf Speichermedium mit Nilrot unter UV-Licht betrachtet

267

Ausgehend von Salinesuspensionen separat liegender Kolonien der gereinigten potentiellen Mutanten werden Ausstriche auf Nilrot-haltigen Sektorenplatten mit MineralFestmedium mit 0,5 % (wt/vol) Fructose und stark reduziertem Stickstoffgehalt (0,005 %, wt/vol, NH4Cl) angefertigt. Auf einer Platte sollten neben vier potentiellen Mutanten immer auch die Positiv- und Negativ-Kontrollen (R. eutropha H16 und R. eutropha PHB-4) ausgestrichen werden. Zusätzlich wird auf Mineral-Festmedium gleicher Zusammensetzung jedoch ohne Nilrot ausgestrichen. Diese Platten werden anschließend mit Sudanschwarz angefärbt (M15, S. 383).

Es erfolgt zum Abschluss des Versuchs eine vergleichende makroskopische Betrachtung der Sektorenausstriche ( Abb. 3.128). Prüfen Sie, ob sich vermeintliche Mutanten in Gegenwart von Nilrot bzw. nach Anfärbung mit Sudanschwarz (M15, S. 383) gleichsinnig verhalten. Material der auf diese Weise verifizierten Mutanten wird im Hellfeld und Phasenkontrast mikroskopiert. Weiterführende Literatur Pedros-Alio C, Mas J, Guerrero R (1985) The influence of poly-β-hydroxybutyrate accumulation on cell volume and buoyant density in Alcaligenes eutrophus. Archives of Microbiology 143:178-184 Schlegel HG, Lafferty R, Krauss I (1970) The isolation of mutants not accumulating poly-β-hydroxybutyric acid. Archiv für Mikrobiologie 71:283-294 Spiekermann P, Rehm BHA, Kalscheuer R, Baumeister D, Steinbüchel A (1999) A sensitive, viable-colony staining method using Nile red for direct screening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and other lipid storage compounds. Archives of Microbiology 171:73-80 Steinbüchel, A (1995) Mikrobielle und chemische Synthese von biologisch abbaubaren Polyestern. Chemie in unserer Zeit 29:260-271 Amersham Biosciences (2002) Handbuch „Percoll – Methodology and Applications“. Dieses Handbuch ist auf der Homepage der Firma (http://www.apbiotech.com) kostenlos als PDF verfügbar, nachdem man sich dort registriert hat.

Internet

268

3 Versuche

Nachgefragt 1. Zeichnen Sie die Strukturformel von Poly(3HB)! 2. Orientieren Sie sich in der Literatur über weitere Polyhydroxyalkanate, die außer Poly(3HB) ebenfalls von Bakterien synthetisiert werden! 3. Beschreiben Sie den Biosyntheseweg für Poly(3HB) in Ralstonia eutropha! 4. Welches sind die natürlichen Funktionen von Poly(3HB) in Bakterien? 5. Warum ist die chemische Industrie an einer biotechnologischen Produktion von Poly(3HB) und anderer bakterieller Polyester interessiert? 6. Um was handelt es sich bei Percoll? 7. Vergleichen Sie die spezifischen Dichten von Poly(3HB)-freien und Poly(3HB)-haltigen Zellen von Ralstonia eutropha! 8. Warum sind die beobachtbaren spezifischen Dichten von Poly(3HB)-freien und Poly(3HB)-haltigen Zellen von Ralstonia eutropha in Percoll-Dichtegradienten anders als in Saccharose-Dichtegradienen? 9. Eine Einzelzelle von Ralstonia eutropha enthält am Ende der Speicherphase 1,70 pg Poly(3HB). Wieviele Poly(3HB) Moleküle liegen in dieser Zelle vor, wenn deren durchschnittliches Molekulargewicht 1 Million Da beträgt? 10. Das Zellvolumen einer Einzelzelle von Ralstonia eutropha nimmt während der Akkumulation von Poly(3HB) von durchschnittlich 1,21 auf 3,81 μm3 zu. Die Länge der Zellen bleibt dabei mit durchschnittlich ca. 1,5 μm konstant. Berechnen Sie die Durchmesser der Zellen zu Beginn und am Ende der Speicherphase! 11. Berechnen Sie, um wie viel der Durchmesser einer Kolonie des Wildtyps von Ralstonia eutropha größer ist als der Durchmesser einer Kolonie einer Poly(3HB)-freien Mutante, wenn die Zellen auf einem Nährboden kultiviert werden, der maximale Speicherung ermöglicht! Bei den Berechnungen soll von den folgenden Gegebenheiten ausgegangen werden: (1) Das Volumen der Zellen des Wildtyps ist ungefähr 3,15-mal größer als das Volumen der Mutante. (2) Die Kolonien auf der Agaroberfläche sind halbkreisförmig.

12. Warum erscheinen Kolonien des Wildtyps von Ralstonia eutropha auf festen Nährböden opak, wenn die Zellen Poly(3HB) gespeichert haben, während Kolonien von Poly(3HB)-negativen Mutanten auf dem gleichen Nährboden durchscheinend aussehen? 13. Beschreiben Sie, wie Sie mit Sudanschwarz und Nilrot die Speicherung von Poly(3HB) in Kolonien von Ralstonia eutropha sichtbar gemacht haben! Wie können Sie Kolonien des Wildtyps von Kolonien einer PHA-negativen Mutante auf Speicherplatten noch unterscheiden? 14. Welche Vorteile bietet die Methode mit Nilrot im Vergleich zur Methode mit Sudanschwarz? 15. Können Sie mit Sudanschwarz und Nilrot auch noch andere Verbindungen anfärben, oder interagieren diese beiden Farbstoffe spezifisch nur mit Poly(3HB)? 16. Warum können Sie die Wirkung von Nitrit durch Alkalisierung aufheben? 17. Wie löst Nitrit Mutationen aus, und welche Mutationen treten bevorzugt auf? 18. Nach der Mutationsauslösung und Ausprägung der Mutation trennen Sie die Wildtypzellen von den Zellen der gesuchten Poly(3HB)-freien Mutanten durch Zentrifugation in Dichtegradienten. Weshalb können Sie weder im Percoll-Dichtegradienten noch im Saccharose-Dichtegradienten erwarten, mit bloßem Auge eine „Bande“ zu sehen, in denen sich die Mutanten angereichert haben? 19. Was versteht man unter dem Phänotyp „Poly(3HB)-leaky“? 20. Weiterführende biochemische und molekulargenetische Charakterisierungen der von Ihnen in diesem Versuch isolierten PHA-negativen Mutanten werden aller Voraussicht nach ergeben, dass in diesen Mutanten die PHA-Synthase defekt ist, und Sie werden keine Mutante finden, die nicht mehr über β-Ketothiolase oder Acetoacetyl-CoA Reduktase Aktivität verfügt. Geben Sie mehrere mögliche Erklärungen hierfür an!

3.6 Auslösung von Mutationen, Anreicherung von Mutanten und Übertragung von DNA

Transformation von Bacillus subtilis

269

Versuch 52

Theoretischer Hintergrund

Abb. 3.129. Bacillus subtilis ist in der Lage, freie DNA – hier auf eine Pasteupipette gewickelt – aufzunehmen Tabelle 3.71. Verbreitung von natürlicher und artifizieller Kompetenz in Bakterien Natürliche Kompetenz Acinetobacter calcoaceticus Bacillus subtilis Haemophilus influenzae Neisseria gonorrhoeae Streptococcus pneumoniae Artifizielle Kompetenz Escherichia coli Pseudomonas putida Ralstonia eutropha

Unter Transformation versteht man in der Mikrobiologie die Aufnahme von freier DNA in eine Zelle und die dadurch hervorgerufene Veränderung des Genotyps. Hierdurch verändert sich häufig auch der Phänotyp eines Stammes. Die Transformation ist lediglich eine Möglichkeit für den horizontalen DNA Transfer. Daneben kann DNA noch durch Konjugation von Zelle zu Zelle und mittels Bacteriophagen durch Transduktion übertragen werden. Die Elektroporation und die Transfektion stellen gewissermassen Spezialfälle von Transformationen dar, bei denen nackte DNA aus beliebigen Quellen bzw. aus Bacteriophagen übertragen wird. Versuche hierzu werden wir im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM ebenfalls durchführen.

Horizontaler Gentransfer und Übertragung von DNA

Voraussetzung für eine Transformation ist die genetische Kompetenz der Empfängerzelle. Hierunter versteht man einen Zustand der Empfängerzelle, der diese befähigt, freie DNA aufnehmen und damit transformiert werden zu können. Einige Bakterien wie Bacillus subtilis und Acinetobacter calcoaceticus haben spezielle Mechanismen entwickelt, um freie DNA aufzunehmen. Man bezeichnet dies als natürliche Kompetenz. Kompetenz kann wie bei Escherichia coli und anderen Bakterien nur unter Laborbedingungen erreicht werden. Man bezeichnet dies daher als artifizielle Kompetenz ( Tabelle 3.71). Ein Beispiel hierfür wird im nächsten Versuch demonstriert.

Natürliche und artifizielle Kompetenz

Bacillus subtilis hat einen speziellen Mechanismus entwickelt, mit dem freie DNA in die Zelle aufgenommen werden kann. Die Entwicklung dieser Kompetenz ist strikt reguliert und wird bei B. subtilis nur unter bestimmten Bedingungen beim Übergang von der exponentiellen in die stationäre Wachstumsphase induziert. Dabei stimuliert Glucose die Entwicklung der Kompetenz, während Glutamat einen hemmenden Effekt ausübt. An der Ausbildung der Kompetenz sind in B. subtilis mehrere Gene beteiligt, von denen einige als com-Gene bezeichnet werden. Für die Transformation muss doppelsträngige DNA vorliegen. Diese wird durch ein an der Zelloberfläche von B. subtilis lokalisiertes Protein nicht kovalent gebunden. Pro Zelle sind ca. 50 dieser Proteine vorhanden. Die Bindung der DNA ist nicht sequenzabhängig und so stabil, dass die DNA auch durch Waschvorgänge nicht entfernt werden kann. Nach der Bindung erfolgt eine Spaltung des DNA-Doppelstrangs im Bereich dieser Proteine, wodurch doppelsträngige DNA Moleküle mit einer durchschnittlichen Größe von 19 kbp zurückblei-

V54 - S. 277 V47 - S. 240 V56 - S. 290

V53 - S. 273

Kompetenz und DNA-Aufnahme bei Bacillus subtilis

270

3 Versuche

ben. Nun wird vermutlich ein Strang durch eine Nuklease hydrolysiert, während der zweite, zurückbleibende Einzelstrang in die Zelle aufgenommen wird. Durch homologe Rekombination, die hier in B. subtilis durch ein vom recE-Gen codiertes Protein erfolgt, wird die aufgenommene DNA in das Genom integriert.

H2N

COOH

NH

Tryptophan

Versuchsziel In diesem Versuch soll aus Zellen eines prototrophen Wildtypstammes von B. subtilis zunächst Gesamt-DNA isoliert werden. Diese DNA wird dann in kompetente Zellen einer Tryptophan-bedürftigen Mutante (B. subtilis trp-) transformiert. Die Mutante ist in einem der Gene für die Biosynthese von Tryptophan defekt und kann diese Aminosäure deshalb nicht mehr selbst synthetisieren. Solche Mutanten werden als auxotroph bezeichnet, und Tryptophan muss im Medium als Supplin vorhanden sein, damit die Zellen wachsen können. Die übertragene DNA des Wildtyps integriert durch homologe Rekombination in das Genom der auxotrophen Mutante, wobei das defekte Gen durch das intakte Gen ausgetauscht wird. Der rekombinante Stamm ist dann wieder prototroph, d. h. er kann Tryptophan wieder selbst synthetisieren. Versuchsdurchführung

Vorbereitungen

Nach Erhalt der Stämme werden diese (wenn nicht anders von der Bezugsquelle angegeben) in wenig steriler Saline suspendiert und per Drei-Strich-Ausstrich ( M4, S. 365) auf Standard I-Agar ausgestrichen. Die Platten werden bei 37 °C bebrütet. Der für diesen Versuch relevante Phänotyp (trp+/-) wird durch Überprüfen des Wachstums beider Stämme auf Bsub-Minimal- und Bsub-TrpAgar geprüft.

benötigtes Material Geräte             

3 Schraubdeckelröhrchen, steril 9 Reagenzgläser, mit Alukappe, steril 100 ml-Erlenmeyerkolben 500 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen Pasteurpipetten Drigalski-Spatel Impföse Mikroliterpipette, verstellbar für den Volumenbereich 10 bis 100 μl Wasserbad (37 °C und 45 °C) Schüttler (30 °C und 37 °C) Brutschrank (30 °C und 37 °C) Gefrierschrank (-20 °C) Eppendorf-Reaktionsgefäße (E-Cups)

Chemikalien und Medien  Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril  Reagenzien zur Gesamt-DNA-Isolierung ( M19, S. 387)  SSC-Puffer ( S. 426) (1 × und 0,1 ×)  Standard I-Festmedium ( S. 427)  PY-Medium ( S. 424)  M I-Medium ( S. 418)  M II-Medium ( S. 418)  20 % (wt/vol) Glucose, autoklaviert  Glycerin, autoklaviert  Bsub-Minimal-Festmedium ( S. 412)  Bsub-Trp-Festmedium ( S. 412)

Mikroorganismen  Tryptophan-bedürftiger (trp-) Empfängerstamm: Bacillus subtilis Stamm 168, DSM 402  Prototropher Spenderstamm (trp+): Bacillus subtilis (z. B. W23, DSM 6395)

Anzucht des Spenderstamms: Mit dem Material einer Einzelkolonie des prototrophen B. subtilis trp+ werden morgens 10 ml PY-Medium in einem 100 ml-Erlenmeyerkolben angeimpft und bei 30 °C geschüttelt. Abends werden mit 10 μl dieser Vorkultur 50 ml PY-Medium in einem 500 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen beimpft. Der Ansatz wird bei 30 °C geschüttelt. Ernte der Spenderzellen: Nach genau 14 Stunden Wachstum werden die Zellen durch 15 min Zentrifugation bei 3.500 × g und 4 °C geerntet. Die Optische Dichte bei 420 nm der Kultur sollte zu diesem Zeitpunkt nicht größer als 4,5 sein. Die Zellen werden in ca. 20 ml SSC-Puffer resuspendiert, erneut zentrifugiert und schließlich in 5 ml

3.6 Auslösung von Mutationen, Anreicherung von Mutanten und Übertragung von DNA Tabelle 3.72.

Pipettierschema zur Transformation von Bacillus subtilis

Zeit (min)

Zusätze

271

Ansatz

0,2 ml DNA

1

2

+

+

0,2 ml 0,1fach SSC B. subtilis trp-

0

0,8 ml

0

0,8 ml Medium II

ab 30

Verdünnen und Ausspateln

3

+ +

+ +

SSC-Puffer aufgenommen. Die Zellen werden in ein Schraubdeckelröhrchen überführt und bis zu ihrer Verwendung bei -20 °C gelagert. Es ist nicht erforderlich, die Zellernte in sterilen Gefäßen durchzuführen. Anzucht des Empfängerstamms: Mit dem Material einer Einzelkolonie von B. subtilis trp- werden abends 10 ml MI Medium in einem 100 ml-Erlenmeyerkolben angeimpft und bei 37 °C geschüttelt. Isolierung der Spender-DNA: Die eingefrorene Zellsuspension wird bei Raumtemperatur aufgetaut. Zur Isolierung der DNA müssen unbedingt und genauestens die Angaben im Methodenteil befolgt werden ( M19, S. 387). Die Zellen werden bei dieser Methode durch den sukzessiven Einsatz der Enzyme Lysozym und Proteinase K sowie des Detergens Natriumlaurylsulfat (SDS = sodium dodecyl sulfat) lysiert. Die freigesetzte DNA wird durch Extraktion mit Chloroform-Octanol von Proteinen befreit und durch Zugabe von Ethanol aus dem Überstand gefällt. Durch Aufwickeln des DNA-Präzipitats auf einen Glasstab wird die DNA in beeindruckenden Mengen aus der Flüssigkeit gewonnen ( Abb. 3.129). Anzucht des Empfängerstamms: Mit 2 ml aus der bewachsenen Vorkultur werden 50 ml MI-Medium in einem 500 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen angeimpft. Nach fünf Stunden Schütteln bei 37 °C werden der Kultur 10 ml autoklaviertes Glycerin zugesetzt. Die Kultur wird in 1 ml-Portionen in E-Cups bei -20 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert. (Für das weitere Vorgehen wird eine Portion benötigt, die restlichen können für weitere Versuche bei -20 °C aufbewahrt werden). Herstellung kompetenter Zellen von B. subtilis trp-: Morgens werden zu 9 ml Medium II in einem 100 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen zunächst 0,25 ml einer 20 % (wt/vol) Glucose-Lösung zugesetzt. Das Medium wird mit dem kompletten, bei Raumtemperatur aufgetauten 1 ml-Portion Empfängerzellen (siehe Tag 3) beimpft. Nach genau 1,5 h Schütteln bei 37 °C wird der Ansatz in einem Eisbad abgekühlt. Die Zellen können nun und längstens für eine weitere Stunde als Rezipienten für die Transformation eingesetzt werden. Transformation: Die aufgewickelte DNA des Spenderstamms B. subtilis trp+ wird in 4 ml 0,1fach SSC-Puffer „abgewickelt“ und dabei gelöst. Dieser Vorgang wird durch Erwärmen auf 45 °C beschleunigt. Anhand der Angaben in Tabelle 3.72 werden in sterilen Schraubdeckelröhrchen ein Transformationsansatz und zwei Kontrollansätze zusammengemischt und bei 37 °C für 30 min im Wasserbad inkubiert. Danach werden mit Hilfe eines Drigalski-Spatels (M4, S. 366) je 100 μl der Ansätze 2 und 3 auf BsubMinimal-Agar ausgestrichen. Diese Platten dienen als Kontrolle auf Sporen im isolierten DNA-Material (Ansatz 2) und auf spontane Rückmutationen (Revertanten) der Empfängerzellen zur Tryptophan-Prototrophie (Ansatz 3). Von Ansatz 1, dem eigent-

272

3 Versuche

lichen Transformationsansatz, werden mit Medium II die Verdünnungsstufen 10-1 bis 10-6 hergestellt. Je 100 μl aus den Verdünnungen 10-1 bis 10-3 werden auf Bsub-Minimal-Agar und je 100 μl aus den Verdünnungen 10-4 bis 10-6 werden auf Bsub-Trp-Platten ausgespatelt. Die Platten werden bei 37 °C inkubiert. Die Anzahl der transformierten Zellen (T) pro Ansatz ergibt sich aus den Koloniebildenden Einheiten (KBE) des Ansatzes 1 auf Bsub-Minimal-Festmedium; die Gesamtzellzahl (N) pro Ansatz errechnet sich aus den KBE des Ansatz 1 auf Bsub-TrpAgarplatten. Die Transformationshäufigkeit H errechnet sich nach: H = T/N. Weiterführende Literatur Cvitkovitch DG (2001) Genetic competence and transformation in oral streptococci. Critical Reviews in Oral Biology and Medicine. 12:217-243 Dubnau D (1999) DNA uptake in bacteria. Annual Review of Microbiology 53:217-244 Saunders JR, Saunders VA (1999) Introduction of DNA into bacteria. Methods in Microbiology 29:3-49 Tortosa P, Dubnau D (1999) Competence for transformation: a matter of taste. Current Opinion in Microbiology 2:588-592

Nachgefragt 1. Was sind Suppline? 2. Definieren und beschreiben Sie die Begriffe „Prototrophie“ und „Auxotrophie“! 3. Was ist der Unterschied zwischen „Auxotrophie“ und „Autotrophie“? 4. Nennen Sie Bakteriengruppen, in denen Auxotrophie weit verbreitet ist! 5. Was versteht man in der Mikrobiologie unter „Transformation“? 6. Nennen Sie zwei andere Beispiele für natürliche Wege der DNA Übertragung bei Bakterien! 7. Können die Übertragungen von DNA-Molekülen durch Transfektion oder durch Elektroporation als Spezialfälle der Transformation angesehen werden? 8. Was versteht man im Zusammenhang mit der Transformation unter „genetischer Kompetenz“? 9. Was versteht man unter „natürlicher Kompetenz“ und was unter „artifizieller Kompetenz“? 10. Nennen Sie Bakterien, die natürliche bzw. artifizielle Kompetenz entwickeln können! 11. Wann und unter welchen Bedingungen werden Zellen von Bacillus subtilis kompetent? 12. Beschreiben Sie, welche Teilschritte bei der Transformation von Bacillus subtilis biochemisch ablaufen!

13. Beschreiben Sie, wie Sie die chromosomale DNA aus Bacillus subtilis isoliert haben! Welche Reaktion katalysiert Lysozym? 14. In welcher Form muss die in Bacillus subtilis durch Transformation zu übertragende DNA vorliegen? 15. Warum muss die übertragene chromosomale DNA aus dem Wildtyp von Bacillus subtilis durch homologe Rekombination in das Genom von Bacillus subtilis trp- integrieren? 16. Ist eine Integration in das Genom bei jeder Transformation von Bacillus subtilis erforderlich? 17. Wie haben Sie die aus der erfolgreichen Transformation hervorgegangenen rekombinanten Stämme von Bacillus subtilis selektiert, und wie konnten Sie dessen Zellen von denen des Ausgangsstamms Bacillus subtilis trp- unterscheiden? 18. Zeichnen Sie die chemische Strukturformel von Tryptophan! 19. Konsultieren Sie Lehrbücher der Mikrobiologie und der Biochemie und bringen Sie den Biosyntheseweg für Tryptophan in Erfahrung. 20. Wie wahrscheinlich ist es, dass die Tryptophanauxotrophe Mutante von Bacillus subtilis auch noch für andere Aminosäuren auxotroph ist. Um welche Aminosäuren wird es sich hierbei dann vermutlich handeln?

3.6 Auslösung von Mutationen, Anreicherung von Mutanten und Übertragung von DNA

Transformation von Escherichia coli

273

Versuch 53

Theoretischer Hintergrund DNA kann auf unterschiedliche Weise in Bakterienzellen gelangen, wie wir im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM zeigen. In den frühen 70er Jahren des letzten Jahrhunderts wurde gefunden, dass Zellen von Escherichia coli unter bestimmten Laborbedingungen die Befähigung zur Aufnahme von freier DNA erlangen. Da E. coli im Gegensatz zu Bacillus subtilis keine natürliche Kompetenz aufweist, gilt diese Entdeckung als einer der Meilensteine in der Gentechnologie: Ab diesem Zeitpunkt waren viele molekulargenetische Arbeiten mit dem „Haustier“ der Mikrobiologen möglich, und FremdDNA konnte in E. coli kloniert werden. Bei den künstlichen Bedingungen, unter denen Zellen von E. coli DNA bindet, ist insbesondere die Inkubation der Zellen in der Kälte in Gegenwart von divalenten Kationen hervorzuheben. Durch einen schnellen Temperaturwechsel wird dann die Aufnahme von DNA ermöglicht. Die Vorgänge, die bei E. coli zur Bindung und Aufnahme der DNA führen, sind nicht auf spezielle chromosomal codierte Zellfunktionen zurückzuführen, sondern eher physikalisch-chemischer Natur. Im Gegensatz zu B. subtilis nehmen Zellen von E. coli bei der hier vorgestellten Methode bevorzugt zirkulär geschlossene (cc) und doppelsträngige (ds) DNA-Moleküle, also Plasmide auf.

Aufnahme von DNA und Kompetenz

Aufbau, Größe und Struktur von Plasmiden variieren sehr stark. Die meisten Plasmide sind zirkuläre Moleküle; bisher wurden nur relativ wenige lineare Plasmide entdeckt. Die kleinsten Plasmide sind gerade ca. zwei Kilobasenpaare (kbp) groß; die größten Plasmide umfassen mehr als 1.000 kbp und sind kaum von Chromosomen zu unterscheiden. Auch gibt es mehrere Wege, auf denen ein Plasmid in eine Zelle gelangen kann. Natürliche Plasmide codieren meist für zusätzliche Stoffwechselleistungen, die für die Bakterienzelle normalerweise entbehrlich sind, ihnen aber einen Selektionsvorteil gegenüber anderen Zellen verleihen. Es gibt Resistenz-Plasmide, die für Antibiotika- oder Schwermetallresistenz codieren, Toxin-Plasmide und VirulenzPlasmide, die für die Synthese von Toxinen oder Virulenzfaktoren codieren, katabolische Plasmide, die zusätzliche Abbauleistungen vermitteln (wie für aliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe oder Lactose), anabolische Plasmide für zusätzliche Syntheseleistungen (wie Fixierung von CO2 mittels Calvin-Cyclus) sowie FertilitätsPlasmide. Plasmide sind wie Chromosomen autonome Replikationseineiten; sie stellen sogenannte Replikons dar.

Aufbau eines Plasmids

Abb. 3.130.

Karte des Plasmids pBHR68

Bei dem in diesem Versuch eingesetzten Plasmid pBHR68 ( Abb. 3.130) handelt es sich um ein Hybridplasmid, welches aus einem ursprünglich sehr kleinen zirkulären Plasmid hervorgegangen ist. Es codiert alle Informationen, die für eine stabile Replikation in E. coli notwendig sind. Die Replikation eines Plasmids wird immer an der gleichen, charakteristischen Stelle auf dem DNA-Molekül initiiert. An diesem als ori (origin of replication) bezeichneten essentiellen cis-Element erfolgt durch Proteine eine Destabilisierung und Entwindung der Doppelstrang DNA, und es kommt zur Synthese der ersten RNA-Startermoleküle, an denen dann die Synthese des DNA-Gegenstrangs erfolgt. Am ori startet somit die Replika-

V52 - S. 269

Aufbau von pBHR68

274

3 Versuche

tionsgabel. Dieser Typ der Replikation ist nicht der einzige bekannte, aber offensichtlich sehr verbreitet. Bedingt durch seinen Aufbau kann pBHR68 nur durch Transformation oder Elektroporation, nicht aber durch Konjugation überrtragen werden. Auch ist der Wirtsbereich eingeschränkt. Zusätzlich ist auf pBHR68 das Strukturgen bla lokalisiert, welches für das Enzym βLactamase codiert. Dieses Enzym hydrolysiert den β-Lactamring des Antibiotikums Ampicillin und macht es dadurch unwirksam. Wachsende Zellen eines rekombinanten Stammes von E. coli, welche dieses Plasmid besitzen, werden deshalb nicht durch Ampicillin abgetötet; sie sind Ampicillin-resistent. Darüber hinaus besitzt dieses Plasmid einen kleinen Bereich, der Schnittstellen für insgesamt 22 verschiedene Restriktionsendonukleasen enthält. Diese sogenannte multiple Klonierungsstelle (multiple cloning site, MCS) befindet sich unmittelbar stromabwärts vom Promotor (lacPO) des bekannten Lactose-Operons aus E. coli. Durch diese beiden zusätzlichen Elemente ist es möglich, Fremd-DNA durch Behandlung zahlreicher Restriktionsendonukleasen so in das Plasmid zu ligieren, dass auf dieser Fremd-DNA liegende Gene induziert werden können. Zudem kann die Anwesenheit des Plasmids in einem Klon phänotypisch erkannt werden. O O n

Poly(3HB)

Dem in diesem Versuch eingesetzten Hybridplasmid pBHR68 wurde das phb-Operon aus dem Gram-negativen aeroben Bakterium Ralstonia eutropha in die MCS kloniert. Das phb Operon aus R. eutropha codiert die drei Enzyme, die in diesem Bakterium für die Synthese von Poly(3-hydroxybutyrat), abgekürzt Poly(3HB), ausgehend von Acetyl-CoA notwendig sind. Diese Biosynthese umfasst drei enzymatische Schritte ( Abb. 3.78, S. 162), und die drei Enzyme β-Ketothiolase, Acetoacetyl-CoA Reduktase und PHA Synthase werden durch die Gene phaA, phaB und phaC codiert. Im Genom von R. eutropha liegen diese drei Gene als Operon, phaCAB, in einem lediglich ca. 4 kbp umfassenden Bereich vor.

V51 - S. 262

Die Expression dieser drei Gene in nicht zur Biosynthese von Poly(3HB) befähigten Bakterien und Hefen sowie in tierischen und pflanzlichen Zellen reicht aus, um dort die Poly(3HB) Biosynthese ausgehend von Acetyl-CoA zu etablieren. Die biotechnologische Bedeutung von Poly(3HB), deren Isolierung aus Bakterien und deren biologischer Abbau sowie die Isolierung von Mutanten von R. eutropha, welche die Fähigkeit zur Synthese von Poly(3HB) verloren haben, wird an anderer Stelle im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM noch ausführlich vorgestellt. Versuchsziel In diesem Versuch soll das Plasmid pBHR68 mit dem phaCAB Operon aus Ralstonia eutropha durch Transformation nach Escherichia coli übertragen und dort exprimiert werden. Dadurch wird in E. coli die Poly(3HB) Synthese etabliert. Durch visuelle Überprüfung der Kolonien und Anfärbung mit Sudanschwarz sowie durch lichtmikroskopisch wahrnehmbare Poly(3HB) Grana geben sich die erfolgreich transformierten Zellen zu erkennen. Da das Ergebnis dieses Versuches die Erschaffung eines gentechnisch veränderten Organismus (GVO) ist, muss folgender Sicherheitshinweis beachtet werden:

Sicherheitshinweis

Dieser Versuch stellt nach dem geltenden Gentechnik-Gesetz eine gentechnische Arbeit der Sicherheitsstufe 1 dar. Der Versuch darf daher nur in behördlich genehmigten gentechnischen Anlagen der Sicherheitsstufe 1 unter Beachtung der entsprechenden Vorschriften der Gentechnik-Sicherheitsverordnung und Gentechnik-Aufzeichnungsverordnung erfolgen.

3.6 Auslösung von Mutationen, Anreicherung von Mutanten und Übertragung von DNA

275

Versuchsdurchführung benötigtes Material Geräte          

      

Pinzette, Pasteurpipette Impföse, Zahnstocher 100 ml-Erlenmeyerkolben Schüttelinkubator (37 °C) Kühlzentrifuge (für 10 ml-Röhrchen) Schraubdeckelröhrchen, 10 ml (steril) 5 ml-Glaspipette (steril) Reagenzglasschüttler Drigalski-Spatel Zwei Mikroliterpipetten, verstellbar für den Volumenbereich 10 bis 100 μl bzw. 100 bis 1000 μl mit Pipettenspitzen, gelb für den Volumenbereich bis 200 μl (autoklaviert) bzw. blau für den Volumenbereich bis 1000 μl (autoklaviert) 1,5 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäße („E-Cups“), autoklaviert Zentrifuge für E-Cups „Schwimmer“ aus Schaumstoff oder Styropor zur Aufnahme und Inkubation von E-Cups im Eis- oder Wasserbad Wasserbad (42 °C) Brutschrank (37 °C) wärmeisoliertes und wasserdichtes Gefäß für ein „Eisbad“ (Eiswassergemisch) Phasenkontrastmikroskop

Chemikalien und Medien  Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril  Lösungen zur Plasmidpräparation ( M17, S. 385)  Transformationspuffer (0,1 M CaCl2)  LB-Nährlösung ( S. 417)  LB-Festmedium ( S. 417)  LB-Amp-Festmedium ( S. 417)  LB-IPTG-Amp-Festmedium ( S. 417)  Reagenzien zur Sudanschwarz-Färbung ( M15, S. 383)

Mikroorganismen  Zwei plasmidhaltige Stämme von E. coli als Quellen für die Plasmide: Stamm A enthält nur den Vektor pBluescript SK(Fa. Stratagene), Stamm B (DSM 15372) enthält das Plasmid pBHR68.  Geeigneter E. coli Empfänger-Stamm; gut geeignet sind die K12-Derivate JM109 (DSM 3423) oder DH5 (DSM 10235).

Nach Erhalt der drei notwendigen E. coliStämme werden diese (wenn nicht anders von der Bezugsquelle angegeben) in wenig steriler Saline suspendiert und per DreiStrich-Ausstrich ( M4, S. 365) auf LB-Agar (Rezipient) bzw. LB-Amp-Agar (Stämme A und B als Donorstämme für die Plasmide) ausgestrichen. Die Platten werden bei 37 °C bebrütet. Die bewachsenen Platten können bis zur weitern Verwendung im Kühlschrank (4 °C) gelagert werden. Der Versuch gliedert sich in zwei Bereiche, die zeitlich parallel durchgeführt werden können: 1. Plasmidpräparation. Die dargestellte Vorgehensweise zur Präparation der Plasmide ist die vereinfachte Version einer Labormethode; sie führt auch mit einfacher Ausstattung zum befriedigenden Ergebnis. 2. Anzucht der Empfängerzellen. Unter den angegebenen Bedingungen der Kultur und Ernte erreicht ein hinreichend großer Anteil der E. coli-Zellen genetische Kompetenz. Daran schließt sich die eigentliche Transformation an, die in Volumina von wenigen μl abläuft und technisch recht unspektakulär ist. Ausgehend von jeweils einer Einzelkolonie auf LB-Amp-Agar werden Kreuzausstriche (M4, S. 365) auf zwei LB-Amp-Agarplatten angefertigt und diese bei 37 °C über Nacht bebrütet. Plasmidpräparation: Zur Isolierung der in den Zellen enthaltenden Plasmide folgen Sie bitte den Anweisungen zur Plasmidpräparation ( M17, S. 385). Auf die Beschreibung der üblicherweise im Anschluss durchzuführenden Analyse durch AgaroseGelelektrophorese wird aufgrund des apparativen Aufwands verzichtet. Die Plasmidpräparationen können bis zu ihrer Verwendung bei der Transformation bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Anzucht der Empfängerzellen: Die im Methodenteil angegebenen Bedingungen zur Anzucht und Ernte der Zellen sind wichtig für das Erzielen einer ausreichenden Kompetenz und sollten daher ohne Abweichung eingehalten werden (M18, S. 386).

Vorbereitungen

276

3 Versuche

Da die Haltbarkeit der auf diese Weise behandelten Zellen gering ist, müssen sie am nächsten Tag zur Transformation eingesetzt werden. Die Aufbewahrung erfolgt bei 4 °C. Transformation ( M18, S. 386). Zur Transformation werden die beiden getrockneten Plasmid-Präparationen A und B sowie die Kontrollansätze K-P- und K-E- eingesetzt. Die Plasmid-Präparation A enthält nur den Vektor ohne das pha-Operon; die Präparation B enthält das Plasmid pBHR68 mit pha-Operon. Der Kontrollansatz K-Penthält während des Transformationsschritts keine Plasmid-DNA; der Kontrollansatz K-E- entspricht dem Ansatz B, enthält jedoch keine Empfängerzellen sondern 300 μl Transformationspuffer. Nach erfolgter Transformation werden je 10, 20, 40 und 80 μl der vier Ansätze A, B, K-P- und K-E- sowohl auf LB-Agar als auch auf LB-Amp-Agar aufgetropft und mit dem Drigalski-Spatel flächig verteilt (M4, S. 366). Die Platten werden bei 37 °C inkubiert. Auf LB-Agar ist ein dichter Bakterienrasen zu sehen; hier sind alle Zellen aus den Transformationsansätzen (transformierte und nicht-transformierte) gewachsen. Ausgespatelte Proben der Kontrollansätze K-P- bzw. K-E- sollten nur auf LB-Agar (K-P-) bzw. gar nicht (K-E-) zum Bewuchs führen. Einzelkolonien, die aus den Ansätzen A und B auf LB-Amp-Agar herangewachsen sind, werden als Drei-Strich-Ausstrich auf LB-IPTG-Amp-Agar ausgestrichen. In Gegenwart von IPTG erfolgt in den Transformanten aus dem Ansatz B die Induktion der pha-Gene und damit die Synthese des Speicherstoffs Poly(3HB). Die Platten werden bei 37 °C inkubiert. Auswertung: Auf LB-IPTG-Amp-Agar sind die Transformanten herangewachsen. Die Impfstriche und Kolonien, die aus pBHR68-enthaltenden Transformanten bestehen (Ansatz B), sind aufgrund der in diesen Zellen ablaufenden Poly(3HB)-Synthese im Unterschied zu den Vektor-haltigen Transformanten (Ansatz A) deutlich weißlich. Unter dem Mikroskop im Phasenkontrast sind die Poly(3HB)-Granula als helle (stark lichtbrechende) Einschlusskörper zu erkennen. Zur Verdeutlichung werden die Transformanten einer Behandlung mit dem lipophilen Farbstoff Sudanschwarz B unterzogen ( M15, S. 383). Kolonien Poly(3HB)-haltiger Transformanten werden danach dunkelblau erscheinen. Weiterführende Literatur Jung C, Steinbüchel A (2001) Palette der nachwachsenden Rohstoffe erweitert: Bioplastik aus Nutzpflanzen. Biologie in unserer Zeit 31:250-258 Schubert P, Steinbüchel A, Schlegel HG (1988) Cloning of the Alcaligenes eutrophus genes for synthesis of poly-β-hydroxybutyric acid (PHB) and synthesis of PHB in Escherichia coli. Journal of Bacteriology 170:5837-5847 Winnacker EL (1987) From genes to clones. Introduction to gene technology. VCH, Weinheim

3.6 Auslösung von Mutationen, Anreicherung von Mutanten und Übertragung von DNA

277

Nachgefragt 1. Was versteht man unter natürlicher und artifizieller genetischer Kompetenz? 2. Welche Laborbedingungen führen bei Escherichia coli zur Kompetenz? 3. Was versteht man unter Transformation? 4. Was versteht man unter Transformationsrate? 5. In welcher Form muss DNA vorliegen, um bei Escherichia coli bzw. Bacillus subtilis zur Transformation zu führen? 6. Beschreiben Sie alle wichtigen Elemente und alle Gene des Plasmids pBHR68! 7. Was bewirken die bei der Isolierung von GesamtDNA eingesetzten Enzyme Lysozym und Proteinase K? 8. Zeichnen Sie die Strukturformel von Ampicillin! 9. Wie vermittelt das Gen bla die Resistenz gegenüber Ampicillin? 10. Zeichnen Sie die Strukturformel von Poly(3HB)! 11. Erstellen Sie eine Liste mit möglichst vielen Eigenschaften von Poly(3HB) und beurteilen Sie, welche Eigenschaften besonders wichtig oder interessant sind! 12. Nennen Sie die Enzyme, die in Ralstonia eutropha die Synthese von Poly(3HB) ausgehend von Acetyl-CoA katalysieren!

13. Warum sind die Gene des phb Operons aus Ralstonia eutropha biotechnologisch interessant? 14. Warum müssen Reihenfolge der Enzyme im Biosyntheseweg von Poly(3HB) und die Reihenfolge der diese Enzyme codierenden Gene im phb Operon von Ralstonia eutropha nicht übereinstimmen? 15. Unter welchen Bedingungen wird in Ralstonia eutropha und in den im Versuch erzeugten rekombinanten Zellen von Escherichia coli die Synthese von Poly(3HB) induziert? 16. Wie und warum verändert sich das Aussehen der Kolonien von Escherichia coli, wenn die Zellen Poly(3HB) akkumulieren? 17. Wie wurden die Transformanten von Escherichia coli in diesem Versuch selektiert? 18. Warum wurde bei der Kultivierung des rekombinanten Stammes von Escherichia coli IPTG zugegeben? 19. Nennen Sie vier einfache Untersuchungen/Merkmale, mit denen Sie schnell erkennen können, ob ein rekombinanter Stamm von Escherichia coli Poly(3HB) akkumuliert! 20. Warum liegt das von den Zellen des rekombinanten Stamms von Escherichia coli akkumulierte Poly(3HB) nicht gleichmäßig im Cytoplasma verteilt vor und findet sich stattdessen in Einschlüssen (Grana) wieder?

Konjugation von Ralstonia eutropha

Versuch 54

Theoretischer Hintergrund Die Konjugation stellt eine weitere Möglichkeit dar, DNA in Bakterienzellen zu übertragen. Unter Konjugation versteht man die Übertragung von DNA von einer Donorzelle in eine Empfängerzelle. Durch Konjugation übertragbare Plasmide kommen in Wildtypstämmen von Bakterien häufig vor. Konjugation ist in der Natur wahrscheinlich relativ weit verbreitet und bietet dort auch die Möglichkeit für einen horizontalen Gentransfer. Im Labor wird die Konjugation häufig dann eingesetzt, wenn eine Transformation oder andere Form der DNA Übertragung praktisch nicht möglich ist, wie dies bei dem in diesem Versuch verwendetem Gram-negativen Bakterium Ralstonia eutropha (früher: Alcaligenes eutrophus) der Fall ist.

Prinzip und Verfahren

Konjugativ übertragbare Plasmide sind meist deutlich größer als durch Transformation übertragbare Plasmide, weil an der Konjugation sehr viele Proteine essentiell beteiligt sind. Besonders viel Platz beanspruchen die Transfer-Gene (tra), die u. a. für die Ausbildung sogenannter Sex-Pili benötigt werden, mit denen ein direkter und stabiler Zellkontakt zwischen Donor- und Empfängerzelle hergestellt und die natürliche Abstoßung der Zellen überwunden wird. Produkte von mehr als 30 Genen können für die Konjugation erforderlich sein. Tra-Gene stellen trans-Elemente dar, da die Genprodukte an beliebiger Stelle in der Donorzelle synthetisiert werden können. Essentiell für eine Konjugation sind zudem das Vorhandensein des Transferstartpunktes (oriT = origin of transfer) und weitere mob-Funktionen. Im Bereich dieser cis-Elemente des Plasmids kommt es zu einem Strangbruch im DNA-Doppelstrang, und die Übertragung (Mobilisierung) eines DNA-Einzelstrangs nimmt hier ihren Ausgang. Daneben

Elemente konjugativ übertragbarer Plasmide

278

3 Versuche

muss wie grundsätzlich bei allen Plasmiden noch ein Replikationsstartpunkt (ori = origin of replication) vorliegen. Alle weiteren Bausteine konjugativ übertragbarer Plasmide können praktisch nach Belieben zusammengestellt werden. Für die Laborarbeiten sind natürlich singulär auftretende Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen erforderlich, um die Klonierung von Fremd-DNA in das Plasmid zu ermöglichen; dabei erleichtert das Vorhandensein einer multiplen Klonierungsstelle die Ligation von Fremd-DNA. Sehr hilfreich sind zusätzliche Strukturgene, die einen Phänotyp vermitteln und so Rückschlüsse auf die An- oder Abwesenheit des Plasmids bzw. auf die erfolgreiche Ligation von Fremd-DNA zulassen. Auch können weitere Elemente in diese Plasmide eingebaut werden, um diesen zusätzliche Funktionen zu verleihen. Dabei kann es sich um kohäsive Enden handeln, um diese Plasmide auch als Cosmide verwenden zu können, oder um Transposons, wodurch diese Plasmide dann für eine Transposonmutagenese eingesetzt werden können. In diesem Versuch soll ein Plasmid mit weitem Wirtsbereich (pVK101) eingesetzt werden, welches durch mehrfache Veränderungen aus dem bekannten Plasmid RP4 hervorgegangen ist. Das Plasmid pVK101 ist zur Übertragung von genetischen Informationen aus einem speziellen Stamm von Escherichia coli in viele Gram-negative Bakterien geeignet. Die an der Konjugation essentiell beteiligten tra-Gene müssen nicht auf dem konjugativ übertragbaren Plasmid selbst vorliegen, sondern sie können in das Chromosom integriert werden, da es sich hierbei um so genannte trans-Elemente und nicht um cis-Elemente handelt. Hierdurch kann die Größe dieser Plasmide deutlich reduziert werden, wodurch die molekulargenetischen Arbeiten erleichtert werden. Ein Stamm von Escherichia coli, der die tra-Gene ins Chromosom integriert enthält, ist E. coli S17-1. Ausgehend von E. coli S17-1 als Donor können nun eine Vielzahl unterschiedlicher Plasmide durch Konjugation in andere Bakterien übertragen werden, die nicht mit ausreichend hohen Raten transformierbar sind. Dieses System wurde erfolgreich zur konjugativen Plasmidübertragung besonders bei Vertretern der α-, β- und γ-Proteobakterien (z. B. Spezies der Gattungen Ralstonia, Pseudomonas, Bradyrhizobium) angewandt. Helferplasmide und Drei-ElternKreuzung

Nur der Vollständigkeit halber soll ergänzt werden, dass die tra-Gene auch auf einem separaten Helferplasmid vorliegen können, welches dann zunächst in den Stamm von E. coli übertragen werden muss; der resultierende rekombinante Stamm von E. coli dient dann als Donor für das eigentlich zu übertragende Plasmid. Der gesamte Vorgang wird als Drei-Eltern-Kreuzung bezeichnet und macht die konjugative Plasmidübertragung von einem speziellen E. coli Stamm wie S17-1 unabhängig.

Kohlenhydratstoffwechsel in Ralstonia eutropha

Ralstonia eutropha vermag Fructose und Gluconsäure als jeweils alleinige Kohlenstoffquellen zum Wachstum zu verwerten. Glucose kann der Wildtyp nicht verwerten. Es baut diese über den 2-Keto-3-desoxy-6-phosphogluconat-Weg (KDPG-Weg) zu Pyruvat ab. Dieser Weg ist auch unter der Bezeichnung Entner-Doudoroff-Weg bekannt. Schlüsselenzym dieses in Bakterien verbreiteten Weges ist die KDPG-Aldolase, welche KDPG in Glycerinaldehyd-3-phosphat und Pyruvat spaltet. Wird dieses Enzym durch Mutation des Gens ausgeschaltet, vermag R. eutropha nicht mehr auf Fructose oder Gluconat zu wachsen. Viele andere Mikroorganismen wie E. coli oder die Hefe bauen Glucose über den Fructose-1,6-bisphosphat-Weg (FBP-Weg) ab. Dieser Weg ist auch unter der Bezeichnung Embden-Meyerhoff-Parnass-Weg oder Glycolyse bekannt. Das Schlüsselenzym für diesen verbreiteten Weg, die Fructose-1,6-bisphosphat-Aldolase, fehlt R. europha. Alle anderen Enzyme dieses Weges sind in diesem Bakterium jedoch vorhanden und werden in umgekehrter Richtung für die Gluconeogenese benö-

3.6 Auslösung von Mutationen, Anreicherung von Mutanten und Übertragung von DNA

279

tigt, wenn R. eutropha auf Gluconat, Fettsäuren (z. B. Acetat) oder Dicarbonsäuren (z. B. Succinat) wächst. Die Gluconeogenese ist bei Wachstum auf diesen Kohlenstoffquellen erforderlich, um Glucose-6-phosphat für die Biosynthese von essentiellen Zellbestandteilen wie z. B. für das Peptidoglycan bereitzustellen. Versuchsziel Am Beispiel von R. eutropha soll gezeigt werden, wie ein Bakterium, welches Fructose über den KDPG-Weg abbaut, dazu gebracht werden kann, Fructose über den FBP-Weg abzubauen. Hierzu wird in eine KDPG-Aldolase negative Mutante von R. europha das Strukturgen der Phosphofructokinase (pfkA) von E. coli mit Hilfe des Plasmids pAS300 konjugativ übertragen und exprimiert. Bei dem in diesem Versuch eingesetzten Plasmid pAS300 handelt es sich um ein Hybridplasmid, welches aus dem Plasmid pVK101 durch Einklonieren des aus dem Plasmid pGE42 stammenden pfkA-Gens aus E. coli hervorgegangen ist. Die Wiederherstellung der Fähigkeit zur Verwertung von Fructose als alleiniger Kohlenstoffquelle zeigt dabei einen vollständigen und funktionell aktiven FBP-Weg an; dagegen wird die Fähigkeit zur Verwertung von Gluconat dadurch nicht wieder hergestellt. Dieses einfache Beispiel für metabolic engineering zeigt, wie ein wichtiger Abschnitt des Zentralstoffwechsels grundlegend verändert werden kann. Bei diesem Versuch wird ein gentechnisch veränderten Organismus (GVO) erzeugt. Aus diesem Grund ist folgender Sicherheitshinweis zu beachten: Dieser Versuch stellt nach dem geltenden Gentechnik-Gesetz eine gentechnische Arbeit der Sicherheitsstufe 1 dar. Der Versuch darf daher nur in behördlich genehmigten gentechnischen Anlagen der Sicherheitsstufe 1 unter Beachtung der entsprechenden Vorschriften der Gentechnik-Sicherheitsverordnung und Gentechnik-Aufzeichnungsverordnung erfolgen.

Sicherheitshinweis

Versuchsdurchführung Nach Erhalt der drei Stämme werden diese jeweils in steriler Saline suspendiert und per Drei-Strich-Ausstrich (M4, S. 365) auf NB-Festmedium (R. eutropha) bzw. LB-Festmedium mit 12,5 μg/ml Tetracyclin (E. coli) ausgestrichen. Die Platten werden bei 30 °C (R. eutropha) bzw. 37 °C (E. coli) bebrütet. Die bewachsenen Platten können bis zum Versuchsbeginn im Kühlschrank (4 °C) gelagert werden. Zellanzucht des Empfängers: Ausgehend von dem Zellmaterial einer Einzelkolonie von R. eutropha C145 werden 10 ml NB-Medium in einem 100 ml-Erlenmeyerkolben beimpft. Die Kultur wird unter Schütteln für ca. 20 h bei 30 °C inkubiert. Zellanzucht des Donors: Ausgehend von einer Einzelkolonien von E. coli S17-1 (pAS300) werden 10 ml LB-Medium mit 12,5 μg/ml Tetracyclin in einem 100 ml-Erlenmeyerkolben beimpft. Die Kultur wird ca. 15 Stunden bei 30 °C geschüttelt. Zellernte: Die Zellen von Donor und Akzeptor werden durch Zentrifugation (15 min, 3.500 × g, 4 °C) in sterilen Schraubdeckelröhrchen geerntet und in jeweils 0,5 ml Saline resuspendiert. Konjugation: Zum konjugativen Plasmidtransfer werden jeweils 0,2 ml Donorsuspension und 0,2 ml Akzeptorsuspension nacheinander durch Auftropfen auf die Mitte einer dick gegossenen Platte mit NB-Festmedium vereinigt. Die Platten werden ca. 20 Stunden bei 30 °C inkubiert. Kontrollplatten, auf denen nur 0,2 ml Donorsuspension bzw. nur 0,2 ml Akzeptorsuspension aufgetropft wurden, sind ebenfalls mitzuführen.

Vorbereitungen

280

3 Versuche

Selektion der Transkonjuganten: Um die pAS300-haltigen Transkonjuganten von R. eutropha gegenüber den Donorzellen und den nicht konjugierten Akzeptorzellen zu selektieren, werden die Zellen von der Konjugationsplatte auf Mineralmedium mit dem Antibiotikum Tetracyclin übertragen. Auf diesen Platten können die Transkonjuganten wachsen, da sie im Gegensatz zu den Akzeptorzellen über die Plasmid-codierte Resistenz gegenüber Tetracyclin verfügen. Die Donorzellen hingegen sind – obwohl resistent gegenüber Tetracyclin – nicht in der Lage, auf dem Mineralmedium zu wachsen, da sie Prolin und Thiamin-bedürftig (auxotroph) sind. Dazu wird der aus Transkonjuganten sowie aus Donor- und Akzeptorzellen bestehende Plattenbewuchs in 3 ml steriler Saline suspendiert (zur Vorgehensweise siehe Versuch 55, Tag 3, Seite 286). Diese Zellsuspension wird schrittweise mit Saline bis 10-5 verdünnt (M3, S. 363). Jeweils 0,1 ml aus den einzelnen Verdünnungsstufen werden mit Hilfe eines Drigalski-Spatels (M4, S. 366) auf Platten mit Mineral-Festmedium mit 0,5 % (wt/vol) Na-Succinat und Tetracyclin (12,5 μg/ml) verteilt. Reinigung der Transkonjuganten: Ausgehend von dem Zellmaterial von mindestens acht isoliert liegenden Transkonjuganten-Kolonien werden Reinigungsausstriche (Drei-Strich-Ausstriche, M4, S. 365) auf NB-Festmedium mit Tetracyclin (12,5 μg/ml) angefertigt. Die Platten werden bei 30 °C inkubiert.

benötigtes Material Geräte         

100 ml-Erlenmeyerkolben Impföse 5 ml-Glaspipetten (steril) Bunsenbrenner Autoklav Brutschrank (30 °C) Brutschrank (37 °C) Schüttler (30 °C) Kühlzentrifuge zur Zellernte (10 ml, 3.500× g, 4 °C)  Schraubdeckelröhrchen (steril)

Chemikalien und Medien        

Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril NB-Festmedium ( S. 422) LB-Festmedium ( S. 417) Mineralsalz-Festmedium ( S. 421) Fructose Na-Gluconat Na-Succinat Tetracyclin-Stammlösung ( S. 429)

Mikroorganismen  Ralstonia eutropha H16 DSM428 (Wildtyp, wächst auf Fructose und Gluconat)  Ralstonia eutropha C145 1) (KDPG-Aldolase-Defektmutante von H16, wächst nicht auf Fructose oder Gluconat)  Escherichia coli S17-1 (pAS300) 1) (Prolin- und Thiamin-auxotroph, enthält das Plasmid pAS300) 1) Der Stamm ist bei der DSMZ hinterlegt, die Vergabe der DSM-Nummer fand allerdings erst nach Drucklegung statt.

Es erfolgen nochmals Reinigungsausstriche. Die gereinigten Transkonjuganten werden zur abschließenden Charakterisierung auf Mineral-Festmedien mit 0,5 % (wt/vol) Na-Gluconat, 0,5 % (wt/vol) Fructose bzw. 0,5 % (wt/vol) Na-Succinat ausgestrichen. Auf den Platten werden der Ausgangsstamm C145 und der Wildtyp-Stamm H16 als Kontrollen mitgeführt. Die Platten werden bei 30 °C bebrütet. Das Wachstum auf den Sektorenausstrichen wird täglich beobachtet und vergleichend bewertet. Einen besseren Vergleich der unterschiedlichen Fähigkeiten der Wildtyp-Zellen (H16), des Akzeptors (C145) und der Transkonjuganten bringt allerdings das Verfolgen des Wachstums in Flüssigmedium; hierbei sollte die Optische Dichte (Trübung) bei der Kultivierung der genannten Stämme auf 0,5 % (wt/vol) Fructose, 0,5 % (wt/vol) Na-Gluconat bzw. 0,5 % (wt/vol) Na-Succinat über 48 Stunden gemessen werden (V2 S. 34).

3.6 Auslösung von Mutationen, Anreicherung von Mutanten und Übertragung von DNA

Weiterführende Literatur Bowien B, Schlegel HG (1972) Isolierung und Charakterisierung katabolischer Defektmutanten von Hydrogenomonas eutropha Stamm H16. II. Mutanten mit einem Defekt in der 2-Keto-3-deoxy-6-phosphogluconat-Aldolase. Archiv für Mikrobiologie 87:221-234 Simon R, Priefer U, Pühler A (1983) A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in Gram-negative bacteria. Biotechnology 1:784-791 Steinbüchel A (1986) Expression of the Escherichia coli pfkA gene in Alcaligenes eutrophus and in other Gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology 166:319-327

Nachgefragt 1. Nennen Sie besondere Eigenschaften des Stoffwechsels von Ralstonia eutropha und beschreiben Sie sein biotechnologisches Potential! 2. Nennen Sie die Stoffwechselwege, mit denen Escherichia coli, Ralstonia eutropha und Saccharomyces cerevisiae Fructose zu Pyruvat abbauen! 3. Schreiben Sie die Strukturformeln von 2-Keto-3desoxy-6-phosphogluconat und Fructose-1,6-bisphosphat sowie von Pyruvat auf! 4. Skizzieren Sie den KDPG-Weg und schreiben Sie die stöchiometrische Umsatzgleichung von Fructose zu Pyruvat! 5. Skizzieren Sie den FBP-Weg und schreiben Sie die stöchiometrische Umsatzgleichung von Fructose zu Pyruvat! 6. Nennen Sie die Schlüsselenzyme des KDPG-Wegs und des FBP-Wegs! 7. Unterscheidet sich der Abbau von Fructose zu Pyruvat über den KDPG-Weg bzw. über den FBPWeg hinsichtlich der Ausbeute an ATP? 8. Welche Enzymreaktionen verlaufen im KDPGWeg bzw. im FBP-Weg praktisch irreversible, und welche Schritte sind in beiden Wegen identisch? 9. Wozu benötigt Ralstonia eutropha im FBP-Weg vorkommende Enzyme obwohl das Bakterium Fructose und Gluconat über den KDPG-Weg abbaut? 10. Beschreiben Sie den Phänotyp einer KDPG-Aldolase negativen Mutante von Ralstonia eutropha bezüglich der Verwertung von Fructose bzw. Gluconat! 11. Welche natürlichen und unnatürlichen Formen der DNA-Übertragung in Bakterien kennen Sie?

12. Beschreiben Sie den Aufbau des Plasmids pAS300 und seine relevanten Elemente! 13. Beschreiben Sie die genetischen Elemente von Escherichia coli S17-1, die für die konjugative Übertragung des Plasmids pAS300 in Ralstonia eutropha wichtig sind! 14. Beschreiben Sie Wirkorte und Wirkungsweisen der Antibiotika Streptomycin, Ampicillin, Tetracyclin und Kanamycin! 15. Weshalb tötet das Antibiotikum Ampicillin Zellen von Ralstonia eutropha nicht ab? 16. Warum ist die konjugative Übertragung des Plasmids pAS1 in Ralstonia eutropha HF33 nur mit Escherichia coli Stamm S17-1 als Donor und nicht mit jedem beliebigen Stamm von Escherichia coli möglich? 17. Wie könnten Sie vorgehen, um die Übertragung von pAS1 in Ralstonia eutropha dennoch auch ausgehend von anderen Stämmen von Escherichia coli zu erreichen? 18. Warum wurde die Kreuzung von Ralstonia eutropha HF33 und Escherichia coli S17-1 (pAS1) auf Agar und nicht in Flüssigmedium durchgeführt? Wie könnten Sie das damit verfolgte Ziel experimentell ebenfalls erreichen? 19. Wie selektierten Sie nach der Kreuzung von Ralstonia eutropha HF33 mit Escherichia coli S17-1 (pAS1) die Transkonjuganten von Ralstonia eutropha HF33, die pAS1 enthalten? 20. Warum erwirbt die KDPG-Aldolase negative Mutante von Ralstonia eutropha nach heterologer Expression der PFK-Aldolase aus Escherichia coli nicht auch die Fähigkeit, wieder auf Gluconat zu wachsen?

281

282

3 Versuche

Versuch 55

Transposon-induzierte Mutanten von Ralstonia eutropha Theoretischer Hintergrund

Transponierbare Elemente

Transponierbare Elemente sind nicht zur autonomen Replikation befähigte Elemente, die ihre Lokalisation in einem Genom verändern können. Die Ortsveränderung eines transponierbaren Elements wird als Transposition bezeichnet und löst eine Mutation aus. Da hierdurch Fremd-DNA in ein intaktes Gen insertiert, wird entweder die Transkription des Gens oder die Translation der messenger-RNA unterbrochen, und es kann kein intaktes Protein mehr synthetisiert werden. Entdeckt wurde die Transposition zuerst im Mais von Barbara McClintok, die hierfür posthum den Nobelpreis zuerkannt bekam. Die Transposition ist grundsätzlich unabhängig von der durch das recA-Gen codierten allgemeinen homologen Rekombination. Es handelt sich vielmehr um eine illegitime Rekombination, die durch die von den transponierbaren Elementen selbst codierten Transposasen (tnp) ermöglicht wird. In Prokaryonten sind Insertionselemente, Transposons und der Bakteriophage Mu als transponierbare Elemente bekannt.

Transposons

Transposons codieren im Gegensatz zu Insertionselementen immer für phänotypisch erkennbare Marker bzw. Stoffwechselleistungen. Häufig handelt es sich hierbei um Antibiotika-Resistenzgene. Es gibt aber auch Transposons, die für SchwermetallResistenz vermittelnde Proteine codieren. Auch sogenannte katabolische Transposons sind bekannt; diese codieren wie das Lactose-Transposon für das Lactose-Operon oder sogar für vollständige Abbauwege.

Transposon Tn5

In diesem Versuch soll das Transposon Tn5 eingesetzt werden, um in Ralstonia eutropha Mutationen auszulösen. Tn5 ist eines der am besten untersuchten Transposons und wurde 1975 entdeckt. Es besteht aus drei Abschnitten. Ein zentraler 2.748 Baasenpaare (bp) umfassender Abschnitt enthält die Gene kan, str und bleo, die für Resistenzen gegen die Antibiotika Kanamycin, Streptomycin und Bleomycin codieren. Der zentrale Abschnitt wird von zwei nahezu identischen und jeweils 1.535 bp langen Insertionssequenzen IS50L und IS50R flankiert. Bestandteile der Insertionssequenzen sind umgekehrte Sequenzwiederholungen (inverted repeats) von jeweils 9 bp Länge, welche an beiden Enden der Insertionssequenzen anzutreffen sind. Die Gesamtlänge dieses Transposons beträgt somit 5818 bp. IS50R codiert für das Enzym Transposase und einen Transpositions-Inhibitor. Der Inhibitor ist mit der Transposase identisch mit dem Unterschied, dass die ersten 55 Aminosäuren der aminoterminalen Region fehlen. Die Bildung des Inhibitors resultiert aus einem weiteren Transkritionsstart ausgehend von einem zweiten Promotor, der stromabwärts vom Transkriptionsstart der Transposase lokalisiert ist. Das Verhältnis der Proteinmengen von Transposase zu Inhibitor bestimmt die Transpositionsrate. Offensichtlich ist die Konzentration des Inhibitors nur in gerade transformierten Zellen so gering, dass eine Transposition erfolgen kann. In IS50L ist das Gen für die Transposase bzw. den Inhibitor durch eine A/T-Transition an Position 1443 defekt; diese Punktmutation stellt den einzigen Unterschied zwischen IS50R und IS50L dar.

Stoffwechsel von Ralstonia eutropha

Ralstonia eutropha gehört zu den Gram-negativen Bakterien und verfügt über einen strikt respiratorischen Energiestoffwechsel. Es kann daher nur in Gegenwart von Sauerstoff oder Nitrat als Elektronenakzeptor wachsen. Das Bakterium ist in der Vergangenheit vornehmlich wegen seiner autotrophen Lebensweise und der Fähigkeit, technisch relevante Biopolymere zu produzieren, intensiv untersucht worden. R. eutropha ist prototroph und fakultativ chemolithoautotroph. Das Bakterium kann von Zuckern lediglich Fructose als Kohlenstoffquelle verwenden. Daneben vermag es auf Gluconat sowie auf zahlreichen anderen organischen Säuren wie z. B. Acetat, Propionat, Succinat

3.6 Auslösung von Mutationen, Anreicherung von Mutanten und Übertragung von DNA

(3)

Tn5-Mob tra-Gene

283

Tn5-Mob (4)

(1) (2)

pHG1 Escherichia coli

Ralstonia eutropha

Abb. 3.131. Das System zur Transposonmutagenese von Ralstonia eutropha. Ablauf: 1) Synthese der für die Konjugation nötigen Proteine; 2) Transfer des Plasmids, welches im Rezipientenstamm nicht repliziert werden kann (3) und daher bei Zellteilungen verloren geht; 4) Integration des Transposons ins Genom, in diesem Fall in das Megaplasmid pHG1

und Octanoat sowie einigen anderen Kohlenstoffquellen zu wachsen Fructose und Gluconsäure werden über den 2-Keto-3-desoxy-6-phosphogluconat-Weg abgebaut. Ein Abbau über den Fructose-1,6-bisphosphat-Weg ist nicht möglich, da das Schlüsselenzym Phosphofructokinase in R. eutropha nicht vorhanden ist. Die Gluconeogenese ist intakt und muss während der Verwertung sämticher organischer Säuren (einschließlich von Gluconat!) betrieben werden. R. eutropha ist ein Knallgasbakterium und kann mit molekularem Wasserstoff als Energiequelle und Elektronendonator wachsen und dabei Kohlendioxid über den Calvin-Cyclus fixieren. In den 70er Jahren wurde auch dieses Bakterium als Kandidat zur biotechnologischen Produktion von Einzellerprotein für die Tierernährung in Erwägung gezogen. In dieser Zeit wurden auch die ersten Poly(3-hydroxybutyrat), Poly(3HB), negativen Mutanten isoliert, da die Anwesenheit dieses Polyesters im Einzellerprotein unerwünscht war. Zur Zeit hat sich das Interesse umgekehrt und R. eutropha wird zur biotechnologischen Produktion von Poly(3HB) und anderen Polyhydroxyalkanoaten (PHA) herangezogen. Diese Polyester werden unter dem Handelsnamen Biopol vertrieben und finden als biologisch abbaubare Thermoplaste Anwendungen in verschiedenen Bereichen. Darüber hinaus wurden die Gene für PHA Biosynthese aus R. eutropha in zahlreiche andere Organismen übertragen, um kostengünstigere Produktionsprozesse für Biopol zu etablieren.

V54 - S. 277 V17 - S. 95

V32 - S. 161 V53 - S. 273

R. eutropha Stamm H16 besitzt eine natürliche Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Ampicillin. Für andere Antibiotika wie z. B. Chloramphenicol, Kanamycin, Streptomycin und Tetracyclin ist es dagegen empfindlich. Für die Durchführung von Kreuzungsexperimenten und zur Selektion der Transkonjuganten wurde vom Stamm H16 die Mutante HF39 isoliert, die gegenüber sehr hohen Konzentrationen von Streptomycin resistent ist.

Streptomycinresistente Mutante HF39

Da Transposons nicht autonom repliziert werden können, benötigen sie einen Vektor. In diesem Versuch ist Tn5 Bestandteil von Plasmid pSUP5011. Dieses Plasmid leitet sich ursprünglich vom Plasmid pBR325 ab, und war einer der ersten Klonierungsvektoren, als sich molekulargenetische Arbeitstechniken in den 70er Jahren zu entwickeln begannen. Durch in vivo-Rekombination wurden Tn5 und Plasmid-DNA vereinigt. Um das Plasmid konjugativ von Escherichia coli in andere Bakterien übertragen zu können, wurde ein ca. 1,7 kbp großes genomisches Fragment mit der mob-Stelle eines anderen konjugativ übertragbaren Plasmids in den zentralen Abschnitt des Transposons kloniert. Das modifizierte Transposon Tn5::mob besitzt daher eine Länge von ca. 7,5 kbp. Insgesamt ist das Plasmid, nun als pSUP5011 bezeichnet, ca. 10 kbp lang ( Abb. 3.132).

Plasmid pSUP5011

V26 - S. 136

284

3 Versuche Das Gesamtsystem

R. eutropha kann im Gegensatz zu E. coli ( V53, S. 273), Bacillus subtilis ( V52, S. 269) praktisch nicht mit freier DNA transformiert werden. Durch Konjugation (V54, S. 277) kann Fremd-DNA jedoch sehr effizient in Zellen der streptomycinresistenten Mutante von R. eutropha HF39 übertragen werden. In dem hier eingesetzten System zur Transposon-Mutagenese von R. eutropha wird das Plasmid konjugativ von einem speziellen Donorstamm von E. coli nach R. eutropha übertragen. Der E. coli Stamm S17-1 enthält hierzu die für eine konjugative Übertragung erforderlichen traGene im Chromosom integriert. Dies ist möglich, da es sich bei diesen Genen um transElemente handelt, die nicht selbst auf dem Vektor lokalisiert sein müssen. Auf diese Weise kann das Plasmid pSUP5011 konjugativ nach R. eutropha übertragen werden, wo es aber nicht repliziert werden kann. Deshalb dünnt das Plasmid in wachsenden Zellen aus und wird durch Nukleasen abgebaut. Lediglich das an seiner Kanamycin-Resistenz leicht erkennbare Transposon kann in R. eutropha „überleben“ – aber nur dann, wenn es von pSUP5011 in das Genom von R. eutropha transponiert. Diese Vorgehensweise wird als Suizidplasmid-Technik bezeichnet ( Abb. 3.131).

Vorteile der TransposonMutagenese

Ein wesentlicher Vorteil der Mutagenese mit dem Transposon Tn5 und den meisten anderen Transposons ist, dass lediglich Einfachmutationen auftreten. Bei Mutanten, die durch chemische Agenzien oder Strahlung erzeugt wurden, liegen meist mehrere Mutationen im Genom vor. Es ist dann u. U. sehr aufwendig oder gar unmöglich aufzuklären, welchen Beitrag die zusätzlichen Mutationen zum Phänotyp der Mutante beitragen. Bei den durch Transposition von Tn5 in das Genom von R. eutropha erzeugten Mutationen handelt es sich um sehr stabile Mutationen, d. h. es kommt sehr selten wieder zu einer Ausgliederung des Transposons oder dessen Transposition an eine andere Stelle im Genom ( Tabelle 3.73).

Ap

r

Cm

Δ pBR325

r

r

Km

Mob

Die Verfügbarkeit von Transposon-indu- Abb. 3.132. Aufbau von Plasmid zierten Mutanten ermöglicht weiterführende pSUP5011 Untersuchungen, die zu weitreichenden Erkenntnissen führen können. Wird isolierte Tabelle 3.73. Vorteile von TransposonGesamt-DNA einer solchen Mutante mit induzierten Mutanten einem Restriktionsenzym restringiert, welches selbst nicht in Tn5 schneidet wie z. B. • Einfachmutationen • Stabile Mutationen EcoRI und erzeugt man von dieser DNA eine • „Markierung“ aller zu einer StoffwechselGenbank, so kann ein Klon mit dem Tn5 leistung beitragenden Gene enthaltenden Fragment unter den zahlrei• Quelle für spezifische DNA-Sonden chen anderen Klonen auf Grund der vorhan• Exakte und rasche Identifizierung des denen Resistenz gegenüber Kanamycin auf Insertionsortes Kanamycin-haltigen Nährböden selektiert • Hinweise auf Organisation von Genen werden. Das so klonierte Fragment enthält das vollständige Transposon mit genomischer DNA welche die Tn5-DNA an beiden Seiten flankieren. Somit kann dieses Fragment bzw. Teile hiervon verwendet werden, um in einer anderen Genbank, die mit Gesamt-DNA vom Wildtyp angelegt wurde, das intakte Fragment z. B. durch DNADNA Hybridisierung zu identifizieren. Isoliert man von diesem Fragment nach Restriktion mit dem Enzym SalI Subklone, die nur den Kanamycinresistenz vermittelnden

3.6 Auslösung von Mutationen, Anreicherung von Mutanten und Übertragung von DNA

285

Abschnitt von Tn5 mit einer Insertionssequenz und der angrenzenden genomischen DNA enthalten, und sequenziert dieses Fragment unter Verwendung eines Primers, der an das Ende von IS50L hybridisiert, kann von der genomischen DNA die Nucleotidsequenz der Insertionsstelle ermittelt werden. Vergleiche mit den in Datenbanken vorhandenen Sequenzen von Proteinen oder gar mit der Genomsequenz des Bakteriums geben dann mit großer Wahrscheinlichkeit sofort Anhaltspunkte über die Funktion des getroffenen Gens. Auf diese Weise kann dann dem bereits bekannten Phänotyp ein Genotyp zugeordnet werden. Darüber hinaus können Hinweise auf die Anordnung von Genen gewonnen werden. Es könnte z. B. erste Hinweise darauf geben, ob Gene in einer Transkriptionseinheit vorliegen und in welcher Reihenfolge diese angeordnet sind. Von der Insertion eines Transposons können nämlich polare Effekte ausgehen. So wird durch die Insertion eines Transposons in ein Gen einer Transkriptionseinheit i. d. R. auch die Expression stromabwärts liegender Gene verhindert. Versuchsziel Das Transposon Tn5 soll mit einem Suizidplasmid als Vektor konjugativ von Escherichia coli S17-1 nach Ralstonia eutropha HF39 übertragen werden, um in das Genom des Empfängers zu transponieren und dort Transposon-induzierte Mutationen auszulösen. Anschließend sollen unter den Transkonjuganten solche mit Defekten in der Poly(3HB)-Biosynthese, dem zentralen Kohlenstoff-Stoffwechsel und im Aminosäure Biosynthesestoffwechsel identifiziert werden. Dieser Versuch stellt nach dem geltenden Gentechnik-Gesetz eine gentechnische Arbeit der Sicherheitsstufe 1 dar. Der Versuch darf daher nur in behördlich genehmigten gentechnischen Anlagen der Sicherheitsstufe 1 unter Beachtung der entsprechenden Vorschriften der Gentechnik-Sicherheitsverordnung und Gentechnik-Aufzeichnungsverordnung erfolgen.

Sicherheitshinweis

Versuchsdurchführung Nach Erhalt der beiden Stämme werden diese in jeweils wenig steriler Saline suspendiert und per Drei-Strich-Ausstrich (M4, S. 365) auf NB-Festmedium mit 500 μg/ml Streptomycin (R. eutropha) bzw. LB-Festmedium mit 160 μg/ml Kanamycin (E. coli) ausgestrichen. Die Platten werden bei 30 °C (R. eutropha) bzw. 37 °C (E. coli) bebrütet. Die bewachsenen Platten werden bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank (4 °C) gelagert. Zellanzucht des Akzeptors: Mit Einzelkolonien von R. eutropha HF39 werden vier 100 ml-Erlenmeyerkolben mit jeweils 10 ml NB-Nährlösung (500 μg/ml Streptomycin) beimpft. Die Kulturen werden ca. 20 h bei 30 °C geschüttelt. Zellanzucht des Donors: Ausgehend von Einzelkolonien von E. coli S17-1 (pSUP5011) werden vier mal 10 ml LB-Nährlösung (160 μg/ml Kanamycin) in 100 ml Erlenmeyerkolben beimpft. Diese Kulturen werden ca. 15 Stunden bei 30 °C geschüttelt. Zellernte: Die Zellen von Donor und Akzeptor werden jeweils getrennt durch Zentrifugation (15 min, 3.500 × g, 4 °C) in sterilen Falcon®-Röhrchen geerntet und in jeweils 1 ml Saline resuspendiert. Dabei können die vier Ansätze für den Donor und Akzeptor vorher in jeweils einem Röhrchen vereinigt werden. Konjugation (Mating): Zum konjugativen Plasmidtransfer werden fünf mal jeweils 0,2 ml Donorsuspension und 0,2 ml Akzeptorsuspension nacheinander durch Auftrop-

Vorbereitungen

286

3 Versuche

fen auf die Mitte von fünf relativ dick gegossenen Platten mit NB-Festmedium vereinigt (Matingplatten). Die Platten werden vorsichtig in den Brutschrank transportiert (um ein Auseinanderlaufen der Suspension zu verhindern) und dort bei 30 °C inkubiert. Kontrollplatten, auf denen nur 0,2 ml Donorsuspension bzw. nur 0,2 ml Akzeptorsuspension aufgetropft wurden, sind ebenfalls mitzuführen. Selektion der Transkonjuganten: Um die Transkonjuganten von R. eutropha, die von E. coli S17-1 über pSUP5011 das Transposon Tn5 erhalten haben, gegenüber den Donorzellen und den nicht konjugierten Akzeptorzellen zu selektieren, müssen die Zellen von den Matingplatten auf NB-Festmedium übertragen werden, das sowohl Kanamycin als auch Streptomycin enthält. Auf diesen Platten können nur transkonjugierte Zellen wachsen, da nur sie über ausreichend hohe Resistenzen gegenüber beiden Antibiotika verfügen. Dies gilt auch für die Donorzellen, obwohl Tn5 über ein Gen für StreptomycinResistenz verfügt. Das Gen wird jedoch in E. coli nur sehr schwach expremiert, so dass die Tn5-haltigen Donorzellen bei der eingesetzten hohen Streptomycin-Konzentration (500 μg/ml) abgetötet werden. Für die Übertragung auf die Selektivplatten wird der aus Donor- und Akzeptorzellen bestehende Plattenbewuchs in 3 ml steriler Saline suspendiert. Dies geschieht am besten direkt auf der Platte mit Hilfe der Glaspipette, mit der man die Saline zuführt. Die suspendierten Zellen von jeweils einer Platte werden mit der Pipette aufgesaugt und in ein steriles Schraubdeckelröhrchen überführt. Jeweils 0,1 ml der so erhaltenen Zellsuspensionen werden mit Hilfe eines Drigalski-Spatels ( M4, S. 366) auf einer Platte mit NBFestmedium verteilt, welches Kanamycin (160 μg/ml) und Streptomycin (500 μg/ml) enthält. Von den Mutationsansätzen werden so viele Platten wie möglich angelegt; von den Kontrollansätzen reicht die Beimpfung jeweils einer Platte. Die Platten werden für zwei (bis drei) Tage bei 30 °C inkubiert. Die Platten müssen nach spätestens drei Tagen aus dem Brutschrank genommen werden; eine anschließende Lagerung bis zum nächsten Versuchsschritt kann bei 4 °C (im Kühlschrank) erfolgen.

benötigtes Material Geräte         

100 ml-Erlenmeyerkolben Impföse 5 ml-Glaspipetten (steril) Bunsenbrenner Autoklav Brutschrank (30 °C) Brutschrank (37 °C) Schüttler (30 °C) Kühlzentrifuge zur Zellernte (10 ml, 3.500 × g, 4 °C)  Falcon®-Röhrchen (50 ml, steril)  Schraubdeckelröhrchen (steril)  Phasenkontrastmikroskop

Chemikalien und Medien            

Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril NB-Nährlösung ( S. 422) NB-Festmedium ( S. 422) Mineralsalz-Festmedium ( S. 421) Mineralsalz-Festmedium ( S. 421) mit Nilrot ( M15, S. 383) LB-Nährlösung ( S. 417) Fructose Na-Gluconat Na-Succinat Casaminosäuren Kanamycin-Stammlösung  S. 429 Streptomycin-Stammlösung  S. 429

Mikroorganismen  Ralstonia eutropha HF39 1)  Escherichia coli S17-1 (pSUP5011) DSM 5167

Sonstiges  Zahnstocher (autoklaviert) 1) Der Stamm ist bei der DSMZ hinterlegt, die Vergabe der DSM-Nummer fand allerdings erst nach Drucklegung statt.

3.6 Auslösung von Mutationen, Anreicherung von Mutanten und Übertragung von DNA

Identifizierung der gesuchten Mutanten: Die Platten werden betrachtet. Auf ihnen sollten nur Transkonjuganten gewachsen sein, die pSUP5011 konjugativ empfangen haben und fortan das Transposon Tn5 im Genom integiert haben; die Kontroll-Platten sollten keinen Bewuchs aufweisen. Um die Mutanten mit den gesuchten Defekten in der Poly(3HB)-Synthese, dem zentralen Kohlenstoff-Stoffwechsel oder im Aminosäure-Biosynthesestoffwechsel zu identifizieren, werden möglichst viele Transkonjuganten in einem geordneten Muster mit sterilen Zahnstochern auf folgende Festmedien übertragen. Dabei dient die Verwendung von Nilrot unter Stickstoff-Mangelbedingungen der in vivo-Färbung von Poly(3HB) (M15, S. 383). 1. Nilrot-haltiges Mineral-Festmedium mit 0,5 % (wt/vol) Fructose und stark reduziertem Stickstoffgehalt (0,02 %, wt/vol, NH4Cl) 2. Mineralmedium mit 0,5 % (wt/vol) Na-Gluconat und normalem Stickstoffgehalt (0,1 %) 3. Mineralmedium mit 0,5 % (wt/vol) Na-Succinat und normalem Stickstoffgehalt (0,1 %) 4. NB-Medium mit Streptomycin (500 μg/ml) und Kanamycin (160 μg/ml) Dabei sollte man folgendermaßen vorgehen: Mit dem sterilen Zahnstocher etwas Zellmaterial einer Kolonie abnehmen und nachein4 5 6 7 8 ander in der oben angegebenen Reihenfolge 9 10 11 12 13 14 15 als ca. 5 mm lange Striche auf die Festmedien streichen. An dem Zahnstocher ist genug 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Zellmaterial vorhanden, um alle Platten 25 26 27 28 29 30 31 32 33 nacheinander zu beimpfen, ohne nochmals Koloniematerial aufnehmen zu müssen. Ein 34 35 36 37 38 39 40 41 42 geordnetes Muster von Impfstrichen erhält man auf den vier Festmedien, indem man 43 44 45 46 47 48 49 unter die Platten ein DIN A4-Blatt mit 50 51 52 53 54 einem so genannten Pickschema legt ( Abb. 3.133, auf der CD befindet sich eine 55 56 maßstabsgerechte Version, die ausgedruckt Abb. 3.133. Pickschema zur Erzeugung werden kann) und die Platten an einer geordneter Muster von Mutanten auf bestimmten Stelle relativ zum Schema am Selektionsplatten Rand markiert. Auf diese Weise erhält man letztlich vier Platten, auf denen jede Transkonjugante an gleicher Position gewachsen ist. Dies ist eine wichtige Voraussetzung, um später die Mutanten sicher vergleichen und von dem als Masterplatte dienenden Komplexmedium (NB plus Kanamycin, Streptomycin) ausgehend reinigen zu können. 1

2

3

Die Platten werden für 2 (bis 3 Tage) bei 30 °C inkubiert. Beurteilung der Mutanten: Die Platten werden zunächst nach potentiellen Mutanten durchmustert, die in der Poly(3HB)-Synthese defekt sind. Diese sollten auf Nilrothaltigem Mineral-Festmedium mit stark reduziertem Stickstoffgehalt durchscheinend wirken. Die Nilrot-Platten werden zusätzlich zur Sichtbarmachung von akkumuliertem Nilrot unter UV-Licht (312 nm) betrachtet; hier sollten nur Poly(3HB)-akkumulierende Kolonien fluoreszieren ( M15, S. 383; V51, S. 262). Mutanten mit Defekten im Kohlenstoff-Metabolismus sollten auf einer oder mehreren MineralmediumPlatten kein Wachstum zeigen. Mutanten im Aminosäure-Anabolismus schließlich sollten nur auf NB-Medium zum Wachstum gelangt sein.

287

288

3 Versuche

Ausgehend von den NB-Festmedien (Masterplatten) werden von den fraglichen Mutanten Reinigungsausstriche (Drei-Strich-Ausstriche  M4, S. 365) auf NB-Festmedium mit Kanamycin und Streptomycin angefertigt. Die Platten werden bei 30 °C inkubiert. Es erfolgen nochmals Reinigungsausstriche. Die gereinigten potentiellen Mutanten werden zur abschließenden phänotypischen Charakterisierung als Sektorenausstriche auf den drei oben genannten Mineral-Festmedien und auf entsprechende drei weitere Platten ausgestrichen, die zusätzlich 0,2 % (wt/vol) Casaminosäuren enthalten. Letzteres dient zur Erkennung von Mutanten mit Defekten in der Aminosäure-Biosynthese, die nur hierauf wachsen sollten. Auf allen Platten wird der Ausgangsstamm HF39 als Kontrolle mitgeführt. Die Platten werden bei 30 °C bebrütet. Es erfolgt eine ausführliche vergleichende Auswertung der erhaltenen Mutanten und ihrer unterschiedlichen Phänotypen in tabellarischer Form. Mutanten mit Defekten in der Poly(3HB)-Synthese werden im Vergleich zur Kontrolle im Phasenkontrast mikroskopiert (Poly(3HB)-Grana?). Das Versuchsprotokoll sollte mit einer auf den jeweiligen Gendefekt hinweisenden Interpretation der unterschiedlichen Phänotypen abschließen. Weiterführende Literatur Bowien B, Schlegel HG (1981) Physiology and biochemistry of aerobic hydrogen-oxidizing bacteria. Annual Reviews in Microbiology 35:405-452 Friedrich B, Hogrefe C, Schlegel HG (1981) Naturally occurring genetic transfer of hydrogen-oxidizing ability between strains of Alcaligenes eutrophus. Journal of Bacteriology 147:198-205 Reznikoff WS (1993) The Tn5 transposon. Annual Review of Microbiology 47:945-963 Schlegel HG (1990) Alcaligenes eutrophus and its scientific and industrial career. In: Dawes EA (ed) Novel Biodegradable Microbial Polymers, Kluwer, Dordrecht, pp 133-141 Simon R (1984) High frequency mobilization of gram-negative bacterial replicons by the in vitro constructed Tn5-mob transposon. Molecular and General Genetics 196:413-420 Simon R, Priefer U, Pühler A (1983) A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: Transposon mutagenesis in Gram negative bacteria. BioTechnology 1;784-791 Tan HM (1999) Bacterial catabolic transposons. Applied Microbiology and Biotechnology 51:1-12

3.6 Auslösung von Mutationen, Anreicherung von Mutanten und Übertragung von DNA

Nachgefragt 1. Charakterisieren Sie Ralstonia eutropha hinsichtlich der wichtigsten Elemente seines Grundstoffwechsels! 2. Nennen Sie die drei Gruppen von transponierbaren Elementen und beschreiben Sie deren Unterschiede! 3. Skizzieren Sie den Aufbau des Transposons Tn5! 4. Welche Vorteile bietet die Transposonmutagenese im Vergleich zu Mutagenesen mit anderen Agenzien? 5. Das Genom eines Bakteriums, mit dem Sie eine Transposonmutagenese durchführen, ist 5,6 Mbp groß. Die vermutete Größe des Gens, welches Sie durch Insertion eines Transposons inaktivieren möchten, beträgt 1,4 kbp. Wie hoch ist der Anteil der Mutanten mit Insertion in diesem Gen an allen Transposonmutanten? 6. Wie ist das Plasmid pSUP5011 aufgebaut? 7. Was versteht man unter der Suizidplasmidtechnik, und wie sind Suizidplasmide aufgebaut. 8. Wo finden Suizidplasmide noch Anwendung? 9. Für welche Proteine codieren die tra Gene? Weshalb wurden diese Gene im Genom von Escherichia coli Stamm S17-1 integriert und müssen nicht Bestandteil von Plasmid pSUP5011 sein? 10. Was versteht man unter dem Phänotyp, was unter dem Genotyp einer Mutante? 11. Nach dem spot agar mating haben Sie ein Gemisch von drei unterschiedlichen Bakterien vorliegen. Um welche handelt es sich, und welche Phänotypen besitzen diese? 12. Warum müssen in dem hier durchgeführten Versuch alle Kanamycin-resistenten Transkonjuganten gleichzeitig auch Tn5-induzierte Mutanten sein? 13. Warum sind die meisten Transposon-induzierten Mutanten auf den im Versuch eingesetzten Medien überlebensfähig und sterben nicht ab? 14. Was versteht man unter pleiotropen Mutanten? Nennen Sie einige mögliche Beispiele!

15. In dem Versuch haben Sie von Ralstonia eutropha u. a. auch Transposon-induzierte Aminosäureauxotrophe Mutanten isoliert. Für welche Aminosäuren werden diese Mutanten besonders häufig auxotroph sein? Begründen Sie Ihre Antwort! 16. Was versteht man im Zusammenhang mit der Insertion eines Transposons unter einem polaren Effekt? 17. Sie haben von Ralstonia eutropha eine Transposon-induzierte Mutante isoliert, die Tryptophanauxotroph ist. Für welche anderen Aminosäuren könnte diese Mutante mit großer Wahrscheinlichkeit noch auxotroph sein, für welche Aminosäuren eher nicht? 18. Sie haben vier Transposon-induzierte Mutanten von Ralstonia eutropha mit den unten angegebenen Phänotypen isoliert. Der Wildtyp ist bezüglich der Verwertung von Fructose (F), Gluconat (G) und Succinat (S) positiv. Welcher Stoffwechselweg oder welches Protein ist diesen Mutanten defekt? • Mutante 1: F: positiv; G: negativ; S: negativ • Mutante 2: F: negativ; G: negativ; S: positiv • Mutante 3; F: negativ; G: negativ; S: negativ • Mutante 4: F: positiv; G: negativ; S: positiv 19. Beschreiben Sie den Weg der Biosynthese von Poly(3HB) in Ralstonia eutropha ausgehend von Acetyl-CoA! 20. Bevor Sie mit der Isolierung von Transposoninduzierten Poly(3HB)-negativen Mutanten von Ralstonia eutropha begannen, hatten Sie bereits Hinweise darauf, dass die drei Gene für Poly(3HB) Biosynthese im Genom dieses Bakteriums eine Transkriptionseinheit bilden. Sie haben nun insgesamt 12 voneinander unabhängige Mutanten mit dem Phänotyp Poly(3HB)-negativ isoliert und stellen fest, dass alle Mutanten keine PHA-Synthase Aktivität mehr aufweisen, während Aktivitäten von β-Ketothiolase und Acetoacetyl-CoA Reduktase noch messbar sind. Welche zwei naheliegenden Schlussfolgerungen ziehen Sie hieraus?

289

290

3 Versuche

Versuch 56

Elektroporation von Mycobacterium smegmatis Theoretischer Hintergrund

Methoden der DNAÜbertragung

V54 - S. 277

V47 - S. 240

V52 - S. 269

V53 - S. 273 Elektroporation

DNA Moleküle können auf verschiedene Weise in eine Bakterienzelle gelangen. Nicht frei vorliegende DNA wird entweder durch Konjugation durch direkten Zellkontakt von einer Donorzelle oder mittels Transduktion durch Infektion mit einem Bacteriophagen übertragen. Darüber hinaus gibt es die Möglichkeit, auch freie, isolierte DNA in eine Empfängerzelle einzuschleusen. In Bakterien mit natürlicher oder artifizieller Kompetenz kann dies durch Transformation geschehen. Auch hiermit beschäftigen sich im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM einige Versuche. Einen Sonderfall der Transformation stellt die so genannte Transfektion dar, bei der aus einem Bacteriophagen isolierte Phagen-DNA in eine Empfängerzelle eingeschleust wird.

Netzgerät

Abb. 3.134.

Elektroporationszelle

H C (

) H C -

2 32 3 Isolierte DNA kann auch durch so genannte H C ( 2)32 H C - 3 H O C Elektroporation in Zellen übertragen werH O C H O den. Durch kurzzeitiges Anlegen eines starHO H C ( 2)71 ken elektrischen Feldes können in H C ( 2)11 biologischen Membranen in Bruchteilen von cis Sekunden Poren erzeugt werden, die sich cis ebenso schnell wieder schließen. Das elektriH C ( 2)51 sche Feld geht dabei von Pulsen eines sich H C ( 2)41 entladenden Kondensators aus, zwischen O dessen Polen sich die Zellen in einem Puffer cis oder Medium mit geringer Leitfähigkeit H3C befinden. Ist dabei isolierte DNA zugegen, H C 3H C ( 2)71 C ( 2)71 H C 3H kann diese durch die Poren in die Zelle l A ph a o c y m lsäure e K tom o c y lsäure gelangen. Auch für eine effiziente Elektroporationsrate müssen die Zellen in einem Abb. 3.135. Strukturformeln zweier Mybestimmten Zustand vorliegen; sie müssen colsäuren aus Mycobacterien „elektrokompetent“ sein. Die Elektroporation wurde bereits auf sehr viele Bakterien erfolgreich angewandt. Durch diese Methode können jedoch nicht nur Bakterienzellen, sondern auch Hefe- und Pilzzellen sowie Pflanzen-, Insekten- und Säugetierzellen transformiert werden. Diese Methode erlangt zunehmende Bedeutung, weil sie die Möglichkeit zur Einschleusung von Fremd-DNA auch in solche Zellen gibt, bei denen die anderen oben genannten Methoden versagen oder aus anderen Gründen nicht anwendbar sind. I. d. R. muss den Zellen nach der Elektroporation für kurze Zeit Gelegenheit zur Regeneration gegeben werden, da sie durch die Behandlung geschädigt werden.

Diese relativ neue Methode ist allerdings apparativ sehr aufwendig und benötigt ein Spezialgerät, den Elektroporator, sowie spezielle Elektroporations-Küvetten ( Abb. 3.134). Da diese Methode jedoch zunehmend wichtiger wird, sind entsprechende Geräte heute in nahezu jedem mikrobiologischen Institut vorhanden.

3.6 Auslösung von Mutationen, Anreicherung von Mutanten und Übertragung von DNA

291

In diesem Versuch wird das Gram-positive Bakterium Mycobacterium smegmatis als Empfängerorganismus für die zu übertragende DNA verwendet. Die Gattung Mycobacterium bildet zusammen mit den Gattungen Corynebacterium und Nocardia den sogenannten CNM-Komplex, und Vertreter dieser Gattungen sind nahe verwandt. Zur Gattung Mycobacterium gehören viele äußerst pathogene Mikroorganismen wie z. B. M. tuberculosis (Erreger der Tuberkulose) oder M. leprae (Erreger von Lepra). M. smegmatis ist nicht pathogen (Sicherheitsstufe 1), gehört zu den schnellwachsenden Vertretern der Gattung und ist relativ gut untersucht. Neben den für Mycobakterien typischen Mycolsäuren stellen Glycopeptidolipide eine der Hauptkomponenten der Zellwände vieler Mycobakterien dar ( Abb. 3.135). Diese Glycopeptidolipide sind für die Lebensfähigkeit der Bakterien nicht essentiell, haben aber einen großen Einfluss auf die Koloniemorphologie: Mutanten, die keine Glycopeptidolipide mehr synthetisieren können, bilden raue Kolonien. Entsprechende Mutanten sind an diesem Phänotyp leicht zu erkennen.

Mycobacterium smegmatis Stamm mc2155

In diesem Versuch soll das Plasmid pCG79 ( Abb. 3.136) durch Elektroporation nach M. smegmatis übertragen werden. Dieser Vektor ist in vielerlei Hinsicht interessant. Das Plasmid hat eine Größe von 17,9 kbp und besitzt ein Streptomycinresistenz vermittelndes Resistenzgen. Es verfügt über pCG79 einen temperatursensitiven Replikati17,9 kbp onsursprung, der in M. smegmatis mc2155 bei einer Temperatur von 30 °C eine stabile Replikation ermöglicht, jedoch nicht mehr bei 41 °C. Die Temperatursensitivität wird durch eine Mutation im Replikations1 ursprung des bekannten mycobakteriellen IS6 Km Plasmids pAL5000 bewirkt. Wird das BakAbb. 3.136. Karte des Plasmids pCG79. terium bei einer Temperatur von 30 °C kultiori, Replikationsursprung in Mycobacterium viert, ist das Plasmid in den Zellen stabil. smegmatis (1) und in Escherichia coli (2) Wird die Temperatur dann auf 41 °C erhöht, erfolgt keine Replikation mehr, und das Plasmid wird während der weiteren Zellteilungen ausverdünnt und wahrscheinlich zusätzlich auch noch durch Nukleasen abgebaut. Solche Vektoren werden als konditional replikative Vektoren bezeichnet. Bei höherer Temperatur verhält sich dieser Vektor also wie das Plasmid pSUP5011 ( S. 284), welches im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM bei der Suizidplasmid-Technik zur Erzeugung von Transposon-induzierten Mutanten von dem Gram-negativen Bakterium Ralstonia eutropha eingesetzt wird.

Ein konditional replikativer Vektor

Das Plasmid pCG79 enthält ein weiteres interessantes Element: es besitzt das Transposon Tn611, dessen zentraler Abschnitt für eine Kanamycin-Resistenz codiert und an beiden Enden von jeweils einer Kopie der Insertionssequenz IS6100 flankiert wird. Das Gen für eine Transposase, welche die Transposition und damit eine recA-unabhängige Rekombination des Transposons ermöglicht, wird von IS6100 codiert. Insgesamt hat das Transposon eine Größe von ca. 4 kbp. Tn611 ist selbst kein natürliches Transposon; es ist aus einem anderen natürlichen Transposon in vitro durch Austausch einer vorhandenen Antibiotikaresistenz gegen das Kanamycin-Resistenzgen hervorgegangen.

Transposon Tn611

orf5

ori1

or f2

o rf

ori 2

4 orf

Str

3

10

0

00

IS 6

V55 - S. 282

292

3 Versuche Auslösung der Mutation und Selektion der Mutanten

Werden rekombinante Stämme von M. smegmatis mc2155, die durch Elektroporation das Plasmid pCG79 erhalten haben, bei 41 °C inkubiert, kann Tn611 in diesem Bakterium nur „überleben“, d. h. stabil weitervererbt werden, wenn es aus pCG79 in das Genom von M. smegmatis mc2155 transponiert. Auftretende Tn611-induzierte Mutanten können also durch einen Temperatursprung von 30 auf 41 °C und Kultivierung in Gegenwart von Kanamycin selektiert und identifiziert werden. Bedingt durch den replikativen Mechanismus der Transposition in M. smegmatis mc2155, kommt es jedoch unter Verdopplung eines der beiden IS6100-Elemente von Tn611 zur Transposition des gesamten Plasmids pCG79, so dass sich Tn611-induzierte Mutanten zusätzlich zur Kanamycinresistenz auch noch durch eine Streptomycinresistenz auszeichnen. Versuchsziel Ziel dieses Versuches ist die Übertragung des Plasmids pCG79 in das Gram-positive Bakterium Mycobacterium smegmatis Stamm mc2155 durch die Methode der Elektroporation. An diesen Teilversuch schließt sich eine Transposon-Mutagenese an, wobei die Transposon-induzierten Mutanten nach Transposition des Transposons Tn611 vom übertragenen Plasmid in das Genom des Empfängerbakteriums durch Kanamycinresistenz selektiert werden. Unter den Transposon-induzierten Mutanten werden solche mit veränderter, rauer Kolonieform identifiziert.

Sicherheitshinweis

Dieser Versuch stellt nach dem geltenden Gentechnik-Gesetz eine gentechnische Arbeit der Sicherheitsstufe 1 (Herstellung eines gentechnisch-veränderten Organismus) dar. Der Versuch darf daher nur in behördlich genehmigten gentechnischen Anlagen der Sicherheitsstufe 1 unter Beachtung der entsprechenden Vorschriften der Gentechnik-Sicherheitsverordnung und GentechnikAufzeichnungsverordnung erfolgen.

Versuchsdurchführung Vorbereitungen

Nach Erhalt des Stammes wird dieser – wenn im Begleitmatierial der Bezugsquelle nicht anders angegeben – in wenig steriler Saline suspendiert und per Drei-Strich-Ausstrich (M4, S. 365) auf Middlebrook 7H9-Festmedium ausgestrichen. Die Platten werden bei 30 °C bebrütet. Die bewachsenen Platten werden bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank (4 °C) gelagert. Vorkultur für Elektroporation: Mit dem Material einer Einzelkolonie werden 10 ml Middlebrook 7H9-Nährlösung in einem 100 ml-Erlenmeyerkolben beimpft. Der Kolben wird über Nacht bei 30 °C geschüttelt. Hauptkultur für Elektroporation: Mit 2 ml Vorkultur werden 50 ml Middlebrook 7H9-Nährlösung beimpft. Der Ansatz wird bei 30 °C kultiviert, bis eine OD600 nm (M22, S. 391) von 0,5 erreicht ist. Herstellung elektrokompetenter Zellen: Die Kultur wird anschließend für 10 min auf Eis inkubiert, bevor die Zellen durch Zentrifugation bei 4000 Upm für 20 min bei 4 °C geerntet werden. Das Sediment wird zweimal mit eiskalter Glycerin-Lösung gewaschen und danach in 2,5 ml Glycerin-Lösung 20 × konzentriert. Die elektrokompetenten Zellen wurden in 400 μl Aliquots in E-Cups verteilt und bei -70 °C eingefroren und können bei dieser Temperatur über mehrere Wochen gelagert werden, ohne dass eine signifikante Beeinträchtigung der Transformationseffizienz zu beobachten ist.

3.6 Auslösung von Mutationen, Anreicherung von Mutanten und Übertragung von DNA

benötigtes Material Geräte  Elektroporator mit der Möglichkeit, folgende Parameter einzustellen: Feldstärke 10.000 V cm-1 Widerstand600 Ω Kapazität25 μF Zeitkonstante3 bis 4,5 ms  Elektroporationsküvetten, 400 μl mit 2 mm Elektrodenspalt  Brutschrank (30 °C)  Brutschrank (41 °C)  Gefäß zur Aufbewahrung eines Eis-Wasser-Gemisches („Eisbad“)  Falcon®-Röhrchen, 50 ml, steril  Kühlzentrifuge für Falcon®-Röhrchen (4.000 Upm bei 4 °C), z. B. Megafuge 1.0R (Fa. Heraeus Sepatech GmbH, Osterode)  Eppendorf-Reaktionsgefäße, 1,5 ml („E-Cups“), steril

Chemikalien und Medien  Middlebrook 7H9-Festmedium ( S. 420)  Middlebrook 7H9-Nährlösung ( S. 420)  LB-Nährlösung ( S. 417)  Mycobacterium-Selektionsnährlösung ( S. 421)  Mycobacterium-Selektionsfestmedium ( S. 422)  Mycobacterium-Mineralfestmedium ( S. 421)  Glycerin-Lösung (10 %, vol/vol)  Tween 80, autoklaviert

Mikroorganismen  Mycobacterium smegmatis mc2155 (ATCC 700084)

Sonstiges  Plasmid pCG79 (Bezugsquelle:  Literaturangabe Guilhot C et al), dialysierte Lösung bekannter Konzentration ( M17, S. 385)

Elektroporation: 400 μl kompetente Zellen werden mit einer zuvor dialysierten Plasmid DNA-Lösung versetzt, so dass die Konzentration der DNA zwischen 0,1 und 1 μg ml-1 beträgt. Anschließend wird die Suspension in eine Elektroporationsküvette gegeben und bei folgenden elektrischen Parametern elektroporiert: Sofort werden 600 μl LB-Nährlösung zugegeben und der Ansatz wird zur Regeneration der Zellen und zur Ausprägung plasmidcodierter Antibiotikaresistenzen für 2 h bei 30 °C inkubiert. Selektion der elektroporierten Stämme: Aliquots von 100 bis 250 μl werden auf Mycobacterium-Selektionsfestmedium ausplattiert und bei 30 °C inkubiert. Nach drei bis vier Tagen sind die Transformanten zu Kolonien herangewachsen und können nun weiter untersucht werden. Vorkultur und Transposonmutagenese: 10 ml Mycobacterium-Selektionsnährlösung werden mit einer Transformante inokuliert und 24 h bei 30 °C inkubiert. Diese Kultivierung dient nicht nur der Zellvermehrung. Während des Wachstums erfolgen auch laufend Transpositionen, die im nachfolgenden Schritt selektiert werden. Selektion der Mutanten: Die Kultur wird steril durch Zentrifugation (4.500 × g, 15 min, 4 °C) geerntet, einmal mit LB-Nährlösung mit 0,05 % (wt/vol) Tween 80 gewaschen und anschließend in 500 μl des gleichen Mediums resuspendiert. Aliquots dieser Zellsuspension oder einer geeigneten Verdünnung werden nun auf Mineralfestmedium mit 1 % (wt/vol) Glucose, je 30 μg ml-1 Kanamycin und Streptomycin und 0,05 % (wt/vol) Tween 80 ausplattiert und für ca. vier Tage bei 41 °C inkubiert. Identifizierung der Mutanten: Nach vier Tagen können Mutanten mit dem Phänotyp „raue Kolonien“ anhand ihrer Koloniemorphologie deutlich von den Kolonien unterschieden werden, die noch WildtypMorphologie zeigen.

293

294

3 Versuche

Weiterführende Literatur Guilhot C, Otal I, van Rompaey I, Martìn C, Gicquel B (1994) Efficient transposition in mycobacteria: construction of Mycobacterium smegmatis insertional mutant libraries. Journal of Bacteriology 176:535-539. Von dieser Arbeitsgruppe kann das verwendete Plasmid pCG79 bezogen werden. Anschrift: Dr. Brigitte Gicquel, Unité de Génétique Mycobactérienne, Institut Pasteur, 25 rue du Dr. Roux, 75724 Paris Cedex 15, Frankreich Hartmans S, De Bont JAM (1999) The genus Mycobacterium – Nonmedical. In: Dworkin M (ed) The Prokaryotes (elektronische Version: http://link.springer.de/link/service/books/10125, Release 3.0 vom 21.5.1999) Springer, New York Patterson JH, McConville MJ, Haites RE, Coppel RL, Bilman-Jacobe H (2000) Identification of a methyltransferase from Mycobacterium smegmatis involved in glycopeptidolipid synthesis. The Journal of Biological Chemistry 275:24900-24906 Snapper SB, Melton RE, Mustafa S, Kieser T, Jacobs WR (1990) Isolation and characterization of efficient plasmid transformation mutants of Mycobacterium smegmatis. Molecular Microbiology 4:1911-1919

Nachgefragt 1. Nennen Sie einige pathogene Vertreter der Gattung Mycobacterium! 2. Konsultieren Sie Lehr- und Handbücher der Mikrobiologie und bringen Sie Zusammensetzung und Aufbau der Zellwand und -hülle bei Mycobakterien in Erfahrung! 3. Welche weiteren charakteristischen Verbindungen befinden sich in den Zellwänden von Mycobakterien? 4. Erklären Sie die antibiotischen Wirkungen von Kanamycin und Streptomycin! 5. Durch welche Vorgänge kann zusätzliche DNA in eine Bakterienzelle gelangen? 6. Welche dieser DNA-Übertragungen bzw. -aufnahmen sind natürlich, welche nur im Labor möglich? 7. Was versteht man unter Elektroporation, und auf welche Organismen ist diese Methode anwendbar? 8. Beschreiben Sie, wie Sie im Versuch die Elektroporation praktisch durchgeführt haben! 9. Wie unterscheiden sich Transformation, Transfektion und Elektroporation? Was haben alle drei Methoden gemeinsam? 10. Welcher Zustand der Zellen ist Voraussetzung für die Durchführung von Transformation, Transfektion und Elektroporation? 11. Bei welchen Bakterien ist die Elektroporation eine besonders häufig angewandte Methode zur Einschleusung von Fremd-DNA?

12. Beschreiben Sie Aufbau und Struktur des Plasmids pCG79! Welche für den Versuch relevanten Gene sind auf diesem Plasmid vorhanden? 13. Beschreiben Sie Aufbau und Struktur des Transposons Tn611! 14. Welche Eigenschaften des Plasmids pCG79 ermöglichen die Transposon-Mutagenese in Mycobacterium smegmatis? 15. Für welche Antibiotika-Resistenz codiert Tn611, für welche der Vektoranteil von pCG79? 16. Wie ist es zu erklären, dass die Transposon-induzierten Mutanten von Mycobacterium smegmatis im Gegensatz zum Ausgangsstamm auch resistent gegenüber Streptomycin wurden, obwohl das Transposon selbst kein Streptomycinresistenzgen besitzt? 17. Wie haben Sie die rekombinanten elektroporierten Stämme und wie die Transposon-induzierten Mutanten von Mycobacterium smegmatis in diesem Versuch selektiert? 18. Von welchen anderen Zellen galt es, die Zellen der Transposon-induzierten Mutanten von Mycobacterium smegmatis durch Selektion zu trennen? 19. Welche Verbindung können Transposon-induzierte Mutanten von Mycobacterium smegmatis mit dem Phänotyp „raue Kolonien“ nicht mehr synthetisieren? 20. Zeichnen Sie die Strukturformel für eine typische Mycolsäure!

4

Exkursionen und Demonstrationen von Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie

Botaniker und Zoologen können eine große Vielzahl unterschiedlichster Pflanzen und Tiere direkt vor der „Haustür“ einsammeln und dann im Praktikum demonstrieren und in vielfältiger Art und Weise untersuchen lassen. Auch sind Zoologische und Botanische Gärten relativ verbreitet. Dagegen scheint es auf den ersten Blick schwierig zu sein, Mikroorganismen an ihren natürlichen Standorten ausfindig zu machen und deren Leistungen zu demonstrieren. In diesem Abschnitt des Buches stellen wir gewerbliche und kommunale Einrichtungen sowie natürliche Standorte vor, an denen Mikroorganismen „besichtigt“ werden können. Es gibt zwei interessante Einrichtungen, die in Deutschland mittlerweile in nahezu jeder größeren Kommune vorhanden sind und in denen wichtige und komplexe mikrobiologische Umsetzungen in einem sehr großen Maßstab erfolgen. Es handelt sich um kommunale Kläranlagen und Kompostwerke, in denen die größten Bioreaktoren betrieben werden, welche die Menschheit kennt. In diesen offenen Systemen werden mikrobiologische Umsetzungen mit dem Ziel durchgeführt, Abwässer zu reinigen bzw. Bioabfälle durch aerobe Rotte in ein nutzbares Produkt, den Kompost, umzuwandeln, um gleichzeitig den der Müllverbrennung oder -deponierung zuzuführenden tatsächlichen Abfall zu vermindern. An den Umsetzungen sind nahezu alle wichtigen Mikroorganismengruppen beteiligt, und es fällt daher leicht, die komplexen Umsetzungen von organischen und anorganischen Verbindungen in der Umwelt zu zeigen und auf die Bedeutung von Stoffkreisläufen hinzuweisen. Nach unseren Erfahrungen in Göttingen und Münster sind die Betreiber solcher Anlagen stets gerne bereit, Besuchergruppen in den Betrieben herumzuführen und deren Funktionsweise zu erläutern. Auch müssen solche Besuchstermine in der Regel nicht langfristig im Voraus vereinbart werden. Wir machen hiervon steten Gebrauch, und Besichtigungen einer Kläranlage und eines Kompostwerks sind in Münster ein obligatorischer Bestandteil des mikrobiologischen Grundpraktikums. In Deutschland liegen die mittlerweile ca. 500 Kompostierungsanlagen und mehr als 10.000 kommunalen Kläranlagen meist in unmittelbarer Nähe von Universitäten und sind entweder mit dem Fahrrad oder mit öffentlichen Verkehrsmitteln unter Benutzung des Studententickets problemlos zu erreichen. Mit ähnlichem Ziel wie in Kompostwerken und zur Erzeugung von Biogas, jedoch (noch) nicht so verbreitet, wird die anaerobe Nassvergärung kommunaler oder landwirtschaftlicher Bioabfälle und Reststoffe in spezialisierten Betrieben oder in der Landwirtschaft praktiziert. Auch diese lohnen einen Besuch. Zwei weitere mikrobielle Verfahren werden in Deutschland ebenfalls weit verbreitet angewandt. Während Bierbrauereien noch flächendeckend in ganz Deutschland anzutreffen sind, findet man Winzereien in Deutschland, von wenigen Ausnahmen, bedingt durch die klimatischen Rahmenbedingungen für den Gedeih gut tragender Weinreben abgesehen, fast nur im Süden und Südwesten unseres Landes. Es lohnt sich, solche Betriebe zu besichtigen und in der Regel sind Besuchergruppen dort willkommen. Hierbei werden die sehr unterschiedlichen Verfahren zur Vergärung kohlenhydrathaltiger pflanzlicher Rohstoffe durch Hefe, die Gewinnung dieser Rohstoffe sowie

A. Steinbüchel, F. B. Oppermann-Sanio, Mikrobiologisches Praktikum, DOI 10.1007/978-3-642-17703-3_4, © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2003, Nachdruck 2011

296

4 Kurzexkursionen und Demonstrationen

die Aufarbeitung und Konservierung der Produkte anschaulich vermittelt. Außerdem können bei den Fermentationen auftretende Probleme und Fehlgärungen diskutiert werden. Ein weiterer, weit verbreiteter Ort gezielter mikrobieller Umsetzungen sind Silageanlagen in der Landwirtschaft. Auch hieran lassen sich mikrobielle Umsetzungen anschaulich erläutern. Darüber hinaus lassen sich in der Natur andere Standorte finden, an denen das Vorkommen und / oder Stoffwechselaktivitäten von Mikroorganismen demonstriert werden können und Probenmaterial für weiterführende Untersuchungen im Praktikum eingesammelt werden kann. Beispiele hierfür sind Symbiosen von Mikroorganismen mit verschiedenen höheren Pflanzen, wie sie z. B. von Rhizobien und anderen N2fixierenden Bakterien mit Leguminosen oder der Erle ausgebildet werden. Pilze und andere Mikroorganismen sind Bestandteile der Flechten. Mit Rhizobium radiobacter (früher: Agrobacterium tumefaciens) oder Claviceps purpurea infizierte Pflanzen zeigen parasitische Beziehungen zwischen Mikroorganismen und Pflanzen auf. Es kann den Praktikumsteilnehmern auch die Aufgabe gestellt werden, anhand dieses Buchs entsprechende Objekte selbst aus der Natur zu besorgen, die dann im Rahmen des Praktikums mikroskopiert werden oder als Impfgut für gezielte Anreicherungskulturen dienen. Ein weiterer jederzeit zu erreichender Standort mikrobieller Umsätze sind die anaeroben Sedimente von Süßwasserstandorten; die mikrobiellen Umsätze sollen hier durch eine Nachstellung des Volta-Experiments demonstriert werden. Regional wieder eingeschränkt und in Deutschland nur an der Nordseeküste anzutreffen ist das Farbstreifen-Sandwatt. An der Demonstration und Untersuchung dieser „Mikrobenmatte“ kann nahezu der gesamte Stoffwechsel anoxygener und oxygener phototropher Mikroorganismen und der Desulfurikanten aufgehängt werden. Ansonsten ist es in Deutschland schwer, besondere Standorte zu finden, an denen man Vorkommen und Stoffwechselaktivitäten von Mikroorganismen veranschaulichen kann. Unternehmen der chemischen, pharmazeutischen und Lebensmittelindustrie sowie der Umwelttechnik nutzen Mikroorganismen in vielfältiger Weise. Hier gibt es bedeutende biotechnologische Prozesse und mikrobielle Stoffwechselprodukte, und es lohnt sich, solche Anlagen zu besichtigen. Von Ausnahmen angesehen, liegen interessante Betriebe jedoch nicht in unmittelbarer Nähe einer Universität, so dass diese meist nur im Rahmen mehrtägiger Exkursionen aufgesucht werden können. Dies erfordert eine umfassende Organisation und langfristige Planung, und die Durchführung solcher Exkursionen ist für die Studierenden in der Regel mit einem größeren finanziellen Aufwand verbunden. Solche Exkursionen sollten im Rahmen des Hauptstudiums unbedingt durchgeführt werden, denn sie vermitteln den Studierenden auch einen Einblick in die Berufswelt des Mikrobiologen in der Industrie. Andere, früher sichere Orte der Massenvermehrung von Mikroorganismen sind durch die strengeren Umweltauflagen aus den Einleitungsorten von Abwässern der Industrie mittlerweile nahezu verschwunden und ebenso wie Massenvermehrungen phototropher Bakterien in eutrophierten Seen kaum noch anzutreffen. Der nachfolgende Teil stellt einige Ziele zusammen, die – von wenigen Ausnahmen abgesehen – im Rahmen sehr kurzer Exkursionen in einem Grundpraktikum oder im Rahmen eines Klassenausflugs aufgesucht werden können. Er verschafft einen Überblick über in Frage kommende Einrichtungen und natürliche Standorte und vermittelt die theoretischen Hintergründe der dort vorkommenden relevanten Mikroorganismen und deren Stoffwechselleistungen.

Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie

Kommunale Abwasserkläranlagen

Abb. 4.1. Belebtschlammbecken der Hauptkläranlage Münster Tabelle 4.1. mg O2/l)

Beispiele für BSB5-Werte (in

Reines Flusswasser Ungereinigtes Abwasser Gereinigtes Abwasser Molkereiabwässer Brauereiabwässer Gülle

1-3 ~300.000 15-40 500-2.000 500-2.000 10.000-25.000

Weil in Europa mit einer geordneten Abwassersammlung und -reinigung erst gegen Ende des 19. Jahrhunderts begonnen wurde, bereiteten Seuchen und Epidemien früher größere Probleme. Diese treten heute praktisch nur noch dann auf, wenn durch Katastrophen (z. B. Überschwemmungen) oder in eilig errichteten Flüchtlingslagern die Abwasserentsorgung und -reinigung gestört bzw. vorübergehend nicht möglich ist. Eine geordnete Abwasserreinigung ist heute Voraussetzung für das Zusammenleben in dicht besiedelten Gebieten, und auch die Verfügbarkeit von Antibiotika und Impfstoffen hat Epidemien in entwickelten Staaten nahezu beseitigt. Bei zunehmender Bevölkerungsdichte und Industrialisierung kommt der Abwasserreinigung heute auch eine essentielle Bedeutung im Gewässerschutz zu.

297

Exkursion 1 Bedeutung

Video

Abwassermengen und Zusammensetzung von Abwasser Jeder Bürger gibt im Durchschnitt pro Tag ca. 200 l Abwasser in die Kanalisation ein. Durch die summarischen Wirkungsparameter „Biologischer Sauerstoff-Bedarf“ (BSB) und „Chemischer SauerstoffBedarf“ (CSB) wird die Wasserqualität beschrieben. Der Verhältnis von BSB zu CSB, welches immer kleiner als eins sein muss, ist ein Maß für die biologische Abbaubarkeit der Inhaltsstoffe im Abwasser ( Tabelle 4.1). Der BSB5 für die tägliche Abwassermenge eines Bürgers beträgt durchschnittlich 60 g O2 und entspricht dem so genannten Einwohnergleichwert (EGW). Die Schmutzfracht industrieller und gewerblicher Abwässer wird durch Zuordnung eines EGW charakterisiert ( Tabelle 4.2).

Charakterisierung von Abwässern

Nahezu sämtliche Abwässer aus Haushalten, Gewerbe und Industrie werden heute in Deutschland gereinigt. Hierzu waren im Jahr 2000 insgesamt 10.383 kommunale Abwasserbehandlungsanlagen in Betrieb, die vier Größenklassen zugeordnet werden können: GK I (272 Anlagen für > 100.000 EW), GK II (1.817 Anlagen für > 10.000 bis 100.000 EW), GK III (2.617 Anlagen für 2.000 bis 10.000 EW) und GK IV (5.677 Anla-

Verbreitung

Definition: Biologischer Sauerstoff-Bedarf (BSB) Menge an Sauerstoff, die Mikroorganismen für den aeroben Abbau der in einer Probe vorhandenen organischen Substanzen bei 20 °C benötigen. In der Regel werden Inkubationszeiten von 5 oder 10 Tagen angesetzt, und man spricht dann von dem BSB5 bzw. BSB10 (Angabe in mg O2/l). Definition: Chemischer Sauerstoff-Bedarf (CSB) Menge an Sauerstoff, die zur chemischen Oxidation durch Kaliumdichromat bei 148 °C der in einer Probe enthaltenden organischen Verbindungen erforderlich ist. Durch die Messung werden auch oxidierbare anorganische Verbindungen erfasst. (Angabe in mg O2/l)

298

4 Kurzexkursionen und Demonstrationen

gen für > 50 bis < 2.000 EW). Neben den zahlenmäßig überwiegenden kommunalen Kläranlagen betreiben nur wenige größere Industrieunternehmen eigene Anlagen zur Reinigung ihrer spezifischen Abwässer. Ansonsten werden die meisten gewerblichen und industriellen Abwässer ebenfalls den kommunalen Kläranlagen zugeführt. In Deutschland waren im Jahr 2000 ca. 95 % der Bevölkerung der alten Bundesländer und ca. 73 % der Bevölkerung der neuen Bundesländer an das 400.000 km lange Kanalnetz der öffentlichen Abwasserentsorgung angeschlossen. Gesetzliche Vorschriften und Verordnungen Grenzwerte

Beseitigung von Nährstoffen

Biogas und Klärschlamm 11.4 - S. 11 E3 - S. 310 D5 - S. 347

Für die Behandlung von kommunalem Abwasser ist die Richtlinie 98/15/EG vom 27. Februar 1998 der Europäischen Kommission maßgeblich, die in Deutschland durch Kommunalabwasserverordnungen der Bundesländer umgesetzt wird. Die Richtlinie setzt die Anforderungen an Einleitungen aus kommunalen Abwasserbehandlungsanlagen in empfindlichen Gebieten fest, in denen es zur Eutrophierung kommt und die ca. 85 % des Gebiets der Bundesrepublik umfassen. Man unterscheidet dabei zwischen den Anlagen GK I und GK II. Wahlweise sind für den Gesamtphosphor- und -stickstoffgehalt entweder die vorgeschriebenen Konzentrationswerte oder die minimalen prozentualen Verringerungen einzuhalten ( Tabelle 4.3).

Tabelle 4.2.

Belastung von Abwässern

Herkunft Belastung in EGW Haushalt (pro EW und Tag) 1 Molkerei (pro 1.000 l Milch) 100-200 Brauerei (pro 1.000 l Bier) 150-350 Papierfabrik (pro 1 t Papier) 200-900 Stärkefabrik (pro 1 t Stärke) 500-900 Zuckerfabrik (pro 1 t Zucker) 1.000-2.000 Schlachthof (pro 100 Schweine) 3000

Tabelle 4.3. Anforderungen an Einleitungen aus Kläranlagen (gemäß Richtlinie 98/15/EG vom 27. Februar 1998) Element

Belastung in EGW

Phosphor (gesamt) 10.000 bis 100.000 EW 2 mg / l > 100.000 EW 1 mg / l oder 80 % Verringerung 1)

Prinzip der Abwasserreinigung und Produkte einer Kläranlage Mit Hilfe komplexer mikrobieller Zönosen Stickstoff (gesamt) soll das Abwasser durch aerobe und anaebis 100.000 EW 15 mg / l robe mikrobielle und zusätzliche chemische 10.000 > 100.000 EW 10 mg / l Verfahren gereinigt werden, um bestimmte oder 70 bis 80 % Verringerung 1) Nährstoffe unter die vorgeschriebenen Grenzwerte zu bringen. Wesentliche Ziele 1) gegenüber dem Wert im zugeführten Absind die Reduzierung des gelösten organi- wasser; EW: Einwohner. schen Kohlenstoffs sowie von Stickstoff und Phosphat und schließlich die Abtrennung der dabei entstandenen Biomasse. Als Hauptprodukt entsteht also gereinigtes Abwasser, welches anschließend wieder den natürlichen Ökosystemen oder speziellen Trinkwasseraufbereitungsanlagen zugeführt werden kann. Bei diesen Prozessen werden organischer Kohlenstoff und gebundener Stickstoff hauptsächlich als CO2 bzw. N2 freigesetzt. Die im ersten Abschnitt entstandene Biomasse und sonstige feste, nicht gleich nach dem Eintritt des Abwassers in die Kläranlage abgetrennte Stoffe werden dann in Faultürmen weiter unter anaeroben Bedingungen mikrobiell behandelt. Ziel ist die weitere Reduzierung des organischen Kohlenstoffs; dabei entsteht Biogas als zweites wichtiges Produkt. Biogas besteht zu 50-70 % aus CH4 und 30-45 % aus CO2 als Hauptkomponenten und kann daneben noch ca. 0,1 % H2S und bis zu 5 % H2 enthalten. Es besitzt einen durchschnittlichen Brennwert von 21,5 MJ/m3 und wird energetisch durch Erzeugung von Elektrizität und Wärme genutzt. Daneben entsteht im Faulturm Klär-

Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie

299

schlamm. In Deutschland sind dies pro Jahr ca. 2,3 Mio Tonnen (Trockensubstanz); pro Bürger also ca. 25 kg. Mit sehr starken regionalen Schwankungen werden davon bundesweit zurzeit ca. 40 % in der Landwirtschaft zur Bodenverbesserung und Düngung verwertet, 20 % werden thermisch entsorgt (Verbrennung), 10 % deponiert, 10 % im Landschaftsbau verwendet und 20 % werden kompostiert oder anderweitig entsorgt. Aufbau und Arbeitsweise von Kläranlagen

Abb. 4.2. Münster

Faulturm der Hauptkläranlage

Tabelle 4.4. Einige Zahlen zur Hauptkläranlage der Stadt Münster (ca. 300.000 Einwohner) Wassermenge pro Tag Bei Trockenheit Bei Regen

ca. 100.000 m3 ca. 200.000 m3

Eintrag pro Tag BSB5 Stickstoff Phosphat

ca. 18.000 kg ca. 4.500 kg ca. 1.000 kg

Austrag pro Tag Klärschlamm

74.000 kg

Aufbau 2 Sandfänge 8 Vorklärbecken 2 Belebungsbecken 2 Selektorbecken 2 Dephosphatierungsbecken 2 Nitrifikations-/ Denitrifikationsbecken 5 Nachklärbecken 2 Faulbehälter 2 Nacheindicker 1 Schlammwasserspeicher 1 Gasbehälter

1.440 m3 7.760 m3 7.660 m3 1.280 m3 6.220 m3 45.000 m3 39.000 m3 12.660 m3 1.700 m3 650 m3 500 m3

Bei der Abwasserreinigung handelt es sich um technisch z. T. sehr aufwendiges Verfahren. Dies hat seinen Preis; 1999 zahlte jeder Bundesbürger im Durchschnitt immerhin 2,28 € pro m3 Abwasser an Gebühren. Dies ist mehr, als für den Bezug von Trinkwasser zu zahlen ist! Abwasserreinigung beginnt mit der möglichst vollständigen Erfassung, Sammlung und Zuführung der zu reinigenden Abwässer zu den Abwasserbehandlungsanlagen. Bereits hier gibt es große Unterschiede. Bei einer Trennkanalisation werden Schmutzwasser und Niederschlagswasser in zwei unabhängigen Kanalsystemen gesammelt. Das Schmutzwasser wird zur Kläranlage abgeführt, während das Niederschlagswasser direkt oder nach Behandlung in so genannten Regenklärbecken den natürlichen Gewässern zugeführt wird. Dagegen werden bei einer Mischkanalisation Schmutz- und Niederschlagswasser in einem Kanalsystem gesammelt und gemeinsam der Kläranlage zugeführt. Die Mischkanalisation dominiert in Deutschland mit einem Anteil von ca. 65 %. Die Trennkanalisation bietet den Vorteil, dass das angelieferte Schmutzwasser nur geringfügig hinsichtlich der Menge und der Zusammensetzung variiert; die Realisierung erfordert jedoch höhere Investitionskosten ( Tabelle 4.4).

Kanalisation

Man unterscheidet drei Stufen der Abwasserreinigung: Die erste Reinigungsstufe (Verbreitung: 100 %) umfasst mechanische Verfahren zur Abtrennung grober Verunreinigungen sowie sich absetzender oder an der Oberfläche schwimmender Stoffe. Rechenanlage, Sandfang und Vorklärbecken gehören hierzu. Die zweite Reinigungsstufe (Verbreitung: 97 %) umfasst biologische Verfahren, wobei im Abwasser gelöste organische Stoffe durch Mikroorganismen biologisch abgebaut werden. Hierzu gehören die dritten Belebungsbecken. In der Reinigungsstufe (Verbreitung: 82 %)

Drei Stufen der Abwasserreinigung

300

4 Kurzexkursionen und Demonstrationen

V15 - S. 88 V16 - S. 91

erfolgt die weitergehende Behandlung, um Stickstoff und Phosphor zu entfernen. Dabei kommt der Nitrifikation und der Denitrifikation sowie dem Anammox-Prozess eine zentrale Bedeutung bei der Reduzierung des Stickstoffgehaltes zu. Zur Phosphatentfernung kommen sowohl biologische als auch chemische Verfahren oder eine Kombination von beiden zum Einsatz. Module einer Kläranlage Während der prinzipielle Aufbau in nahezu allen Kläranlagen gleich ist, gibt es große Unterschiede bezüglich der einzelnen Module die dort tatsächlich vorhanden sind. Hierauf hat auch das Einzugsgebiet und damit die Größe der Kläranlage großen Einfluss. Im Folgenden sind daher alle bekannten und wichtigen Elemente aufgeführt. Vor Ort muss dann geklärt werden, welche hiervon in der betreffenden Anlage tatsächlich vorhanden sind. Mikrobiologische Prozesse Es gibt wohl kaum ein natürliches System, in dem mikrobiologische Umsetzungen dieses Umfangs ablaufen wie in Kläranlagen. Immerhin fallen in Deutschland jeden Tag ca. 27 Mio m3 Abwasser in den Kläranlagen an. Komplexe mikrobiologische Lebensgemeinschaften mit den für die jeweilige Organismengruppe typischen Stoffwechselleistungen sorgen dafür, dass innerhalb der relativ kurzen Verweilzeit des Abwassers in einer Kläranlage (ca. 48 Std.) in der Regel deutlich mehr als 95 % des Kohlenstoffs, der zu einem großen Teil in polymerer Form vorliegt, und des Stickstoffs in Form gasförmiger Produkte (CO2, CH4, N2) entweichen oder in mechanisch abtrennbare Biomasse umgewandelt werden. Auch Phosphat wird heute in der 3. Reinigungsstufe biologisch durch Überführung in Biomasse und/oder Fällung mit FeCl3 weitgehend aus dem Abwasser entfernt.

Sukzessiver Abbau

1.1.4 - S. 12 V20 - S. 108 1.1.4 - S. 12 V15 - S. 88 V16 - S. 91

Komplexe mikrobielle Nahrungsketten, bei denen besonders die Makroelemente C und N in Form verschiedener organischer bzw. anorganischer Verbindungen von einer zur anderen Organismengruppe weitergereicht werden, sind für die Reinigungsleistung Voraussetzung. Organische Kohlenstoffverbindungen werden zunächst durch aerobe Bakterien zu CO2 abgebaut. Die bei diesem aeroben Prozess zwangsläufig entstehende Biomasse wird mechanisch abgetrennt und als Überschussschlamm dann anaerob weiter behandelt. Am Ende einer komplexen anaeroben Nahrungskette aus primären und sekundären Gärern stehen die Methanbakterien, die entstandenes Acetat, CO2 und H2 in Methan umwandeln. Desulfurikanten sind im Faulschlamm sicherlich auch vorhanden. Jedoch durch die relativ geringen Konzentrationen von schwefelhaltigen Verbindungen und damit auch von Sulfat ist deren Beitrag zu den Umsätzen als gering einzustufen. Auch wichtige am Stickstoffkreislauf Beteiligte greifen bei der Abwasserreinigung ins Geschehen ein, um Stickstoff zu entfernen. Durch Verknüpfung von Nitrifikanten und Denitrifikanten ist eine Umwandlung von dem aus der Biomasse freigesetztem Ammonium über Nitrat in N2 möglich. Wahrscheinlich leisten die anaeroben ammoniumoxidierenden Anammox-Bakterien aber auch einen wichtigen Beitrag zur Entfernung von Stickstoff. Bei der Bindung von gelöstem Phosphat in Form von Polyphosphat in der Zelle spielen offensichtlich Spezies der Gattung Acinetobacter eine große Rolle. Mit fast allen genannten Bakteriengruppen werden im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM Versuche durchgeführt. Da die betreffenden Bakterien dort ausführlich vorgestellt werden, sei auf diese Kapitel verwiesen.

Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie Rechenanlage Im Abwasser vorhandene, grobe Verunreinigungen wie Plastik- und Holzteile, Textilien, Papier usw. werden mechanisch abgetrennt. Die abgetrennten Feststoffe werden entweder deponiert oder verbrannt. Sandfang Sand, Kies und Steine setzen sich ab. Die abgetrennten Feststoffe werden entweder deponiert oder im Bauwesen verwendet. Vorklärbecken Hier setzen sich die im Abwasser enthaltenen organischen Schlammstoffe ab. Bodenräumer schieben die sedimentierten Stoffe zu Schlammtrichtern, von wo sie in die Faulbehälter gepumpt werden. Selektorbecken Das Abwasser aus dem Vorklärbecken und der im Nachklärbecken abgetrennte Schlamm werden hier vermischt, bevor sie in das Dephosphatierungsbekken gelangen. Dephosphatierungsbecken Hier wird das im Abwasser gelöste Phosphat biologisch gebunden, indem es in den Bakterienzellen in Form von Polyphosphat gespeichert wird. Belebungsbecken Hier erfolgt der aerobe Abbau organischen Kohlenstoffs zu CO2. Dieser Prozess wird durch intensive Belüftung oder Rührung unterstützt. Auch die Nitrifikation setzt hier bereits ein ( Abb. 4.1). Tropfkörper Es handelt sich um turmförmige Stahl- oder Betonbehälter, die mit einer Füllung aus Lavaschlacke versehen sind und auf die das Abwasser aus dem Vorklärbecken über Drehsprenger aufgegeben wird. Die für den Reinigungsprozess verantwortlichen Mikroorganismen sind auf der Oberfläche des Trägers in großflächigen Biofilmen vergesellschaftet, entnehmen dem Abwasser die abzubauenden Verbindungen und bauen diese wie im Belebungsbecken aerob zu CO2 ab. Tropfkörper spielen heute in großen Kläranlagen kaum noch eine Rolle, da das Belebungsverfahren wesentlich effizienter und schneller ist. Zudem kann die beim Abbauprozess zwangsläufig entstehende Biomasse bei den heutigen Verfahren wesentlich besser abgetrennt werden, während Tropfkörper häufig verstopfen. Man findet Tropfkörper heute meist nur noch in sehr kleinen Anlagen. Nitrifikations- und Denitrifikationsbecken Hier erfolgt der weitere Abbau organischer Verbindungen zu CO2 und gleichzeitig die Nitrifikation

von Ammonium zu Nitrat. In sich anschließenden anaeroben Zonen erfolgt die Denitrifikation von Nitrat zu N2. Es ist noch unklar, welchen Beitrag die Anammox-Bakterien hier zur Entfernung von N2 leisten. Absetzbecken Hierbei handelt es sich in der Regel um das letzte Modul bei der Behandlung der flüssigen Phase des Abwassers, bevor das gereinigte Abwasser über einen Vorfluter wieder dem natürlichen Kreislauf zugeführt wird. Die während der vorangegangenen Prozesse gebildete Biomasse setzt sich am Boden des Gefäßes ab und wird durch Bodenräumer in Schlammtrichtern zusammengeschoben. Der größte Teil des abgetrennten Schlamms wird wieder über das Selektorbecken dem Belebungsbecken zugeführt. Dadurch wird sichergestellt, dass zu Beginn des Reinigungsprozesses genügend Biomasse als Katalysator vorhanden ist, und der anfängliche Abbau der organischen Substanz wird beschleunigt. Lediglich ein geringer Teil, der auch als Überschussschlamm bezeichnet wird, wird in die Faulbehälter gepumpt. Faulbehälter Es handelt sich um große kugelförmige Konstruktionen aus Stahlbeton, in die der Klärschlamm aus den Vorklärbecken und der Überschussschlamm aus den Absatzbecken gepumpt wird. Unter den hier herrschenden anaeroben Bedingungen wird die entstandene Biomasse durch anaerobe Mikroorganismen in Biogas und Faulschlamm verwandelt ( Abb. 4.2). Nacheindicker Der aus den Faulbehältern abgezogene Klärschlamm wird mit Flockungsmitteln (z. B. Kalk, Eisensalze) vermischt. Schlammentwässerung Hier werden häufig Kammerfilterpressen eingesetzt, um die ungelöste organische Substanz vom Schlammwasser zu entfernen. Schlammwasserspeicher Dient der Aufnahme und Lagerung des abgetrennten Schlammwassers bis zur weiteren Behandlung oder Entsorgung. Gasbehälter Dient der Aufnahme und Lagerung des im Faulbehälter entstandenen Biogases bis zur energetischen Nutzung.

301

302

4 Kurzexkursionen und Demonstrationen

Weiterführende Literatur Fritsche W (1998) Umwelt-Mikrobiologie: Grundlagen und Anwendungen. Gustav Fischer, Jena Kuenen JG, Jetten MSM (2001) Extraordinary anaerobic ammonium-oxidizing bacteria. ASM News 67: 456-63

Nachgefragt 1. Erstellen Sie eine Liste der mengenmäßig überwiegenden chemischen Verbindungen, die wir täglich in das Abwasser abgeben und die in der Kläranlage durch Mikroorganismen abgebaut werden müssen! 2. Beschreiben Sie die Folgen der Einleitung ungereinigter Abwässer in natürliche Gewässer! 3. Warum ist meist Phosphor und nicht Stickstoff der limitierende Nährstoff in aquatischen Ökosystemen? 4. Erläutern Sie die einzelnen Stufen und Abschnitte einer kommunalen Kläranlage und ordnen Sie diesen die jeweils relevanten mikrobiologischen Umsetzungen zu! 5. Welche aeroben und welche anaeroben mikrobiellen Prozesse spielen bei der Abwasserreinigung eine wichtige Rolle, und welche gasförmigen Produkte entstehen hierbei? 6. Weshalb sind anaerobe mikrobielle Prozesse bei der Abwasserreinigung unabdingbar? 7. Weshalb müssen bei der Abwasserreinigung sowohl die bei aeroben als auch bei anaeroben Prozessen beteiligten Mikroorganismen mit extrazellulären Enzymen ausgestattet sein? 8. Warum wird der im Absetzbecken abgesetzte und gesammelte Schlamm nur zum Teil der anaeroben Zersetzung im Faulturm zugeführt und der Rest in das Belebungsbecken zurückgeführt? 9. Berechnen Sie unter Berücksichtigung der täglichen Pro-Kopf-Abwassermenge und des durchschnittlichen BSB hierfür die Gesamtmenge an Sauerstoff, die pro Tag in der Bundesrepublik zur Beseitigung der organischen Verbindungen benötigt wird! In wie viel m3 Wasser ist diese Sauerstoffmenge gelöst?

10. Wie unterscheiden sich BSB5 und BSB10? 11. Warum ist der CSB eines Abwassers stets höher als der BSB? 12. Was versteht man unter Belebtschlammflocken, und weshalb sind diese im Hinblick auf die Reduzierung von BSB und CSB wichtig? 13. Skizzieren Sie, wie Belebtschlammflocken unter dem Lichtmikroskop aussehen! Welches Material hält die Zellen zusammen? 14. Wo finden Sie in einer Kläranlage Biofilme, und was versteht man hierunter? 15. Nennen Sie die ungefähre Zusammensetzung von Biogas, wie es im Faulturm entsteht! 16. Nennen Sie mindestens fünf Verbindungen, aus denen das im Biogas vorhandene H2S stammt! Wie entsteht H2S? 17. Weshalb erlauben Trennkanalisationen eher einen reibungslosen Betrieb von Kläranlagen als Mischkanalisationen? 18. Weshalb kann die Zuführung kommunaler Abwässer zur Kläranlage eines Chemieunternehmens einen positiven Beitrag zur mikrobiellen Reinigung der Abwässer eines chemischen Produktionsprozesses leisten? 19. Durch die Galvanisierungsbetriebe und metallurgische Industrieunternehmen werden den Abwässern häufig Cyanide und Schwermetallionen zugeführt. Weshalb ist es ratsam, diese Verbindungen zunächst durch Vorbehandlung zu entfernen, bevor diese Abwässer in die Kläranlagen gelangen? Durch welche Maßnahmen kann dies geschehen? 20. Warum kann ausreichend behandeltes Abwasser noch nicht als Trinkwasser verwendet werden?

Exkursion 2 Kompostwerke Bedeutung und Verbreitung

Video

Pro Einwohner und Jahr wird ein Aufkommen von 90 kg Bio- und Grünabfall veranschlagt. In Deutschland gab es 1998 bereits 535 gewerblich betriebene große Kompostwerke, in denen die organischen Abfälle von Privathaushalten und z. T. auch von Gewerbebetrieben behandelt werden. Nahezu jede größere Kommune oder jeder Landkreis verfügt über diese professionell betriebenen Anlagen. Die Anlagen verfügen über eine Kapazität von 7,2 Mio Tonnen, und ca. 15 % der Siedlungsabfälle werden in Deutschland mittlerweile in solchen Anlagen behandelt. Bei einem durchschnittlichen Rotteverlust von ca. 50 % (wt/wt) bedeutet dies in Deutschland die Produktion von 3,6 Mio Tonnen Kompost! Das Potential für Bioabfälle wird in Deutschland auf ca. 20 Mio Tonnen oder ca. 50 % der Siedlungsabfälle geschätzt. Die Anzahl der Kompostierungsanlagen ist daher seit 1998 immer noch ansteigend.

Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie

303

Die mittlere Größe von Kompostwerken lag 1998 in Deutschland bei ca. 13.000 Tonnen Jahresdurchsatz. Daneben gibt es noch ca. 500 bis 1.000 Kleinanlagen mit einer Kapazi< 6.500 ca. 52 % tät von zusammen lediglich ca. 1 Mio Ton6.500 bis 20.000 ca. 28 % nen ( Tabelle 4.5). Hinzukommen dürften 20.000 bis 50.000 ca. 17 % noch mehrere Millionen in Haus- und Klein> 50.000 ca. 3 % gärten betriebene Komposthaufen und -tonnen, in denen die Bürger Garten- und Küchenabfälle selbst zu Kompost umwandeln; deren Kapazitäten betragen jedoch i. d. R. weniger als eine Tonne. Tabelle 4.5. Größenordnungen der Kompostwerke in Deutschland nach Kapazität in Jahrestonnen

Die Kompostierung ist im Prinzip auf alle biologisch abbaubaren Anteile im Siedlungsund Gewerbeabfall anwendbar. Ziele der Kompostierung sind: 1. 2. 3. 4. 5.

eine Verringerung des Abfallvolumens die Mineralisierung der organischen Komponenten die Humifizierung der organischen Komponenten eine Hygienisierung des Abfalls und aus allem resultierend die Herstellung eines wirtschaftlich verwertbaren Produkts, des Komposts.

Die Kompostierung stellt eine unter aeroben Bedingungen durchgeführte Rotte dar. An Mineralisierung, Humifizierung und Hygienisierung sind ganz wesentlich Mikroorganismen beteiligt. Aufbau von Kompostwerken Auch wenn kein gewerbliches Kompostwerk dem anderen vollkommen gleicht, sind alle Abschnitte dieser Anlagen aus ähnlichen Modulen aufgebaut, wobei der Technisierungsgrad sehr unterschiedlich sein kann. Die Module sind in Reihe geschaltet und meist durch Förderbänder miteinander verbunden. Die Verfahren verlaufen nach ähnlichen Prinzipien; lediglich bei der Vor- und Nachrotte gibt es wesentliche Unterschiede und Variationen.

Abb. 4.3. Verschiedene Arten der Kompostierung: Mieten- (links), Brikollare- (Mitte) und Container-Verfahren (rechts)

Ziele

304

4 Kurzexkursionen und Demonstrationen Anlieferung Abfallsammelfahrzeuge, Gewerbebetriebe und Bürger transportieren organische Abfälle zur Annahmestelle. Während Bürger ihren „Bioabfall“ meist noch kostenlos abgeben können, werden auf den durch Fahrzeuge der Gewerbebetriebe und Abfallsammelfahrzeuge angelieferten „Bioabfall“ i. d. R. gewichtsabhängige Gebühren erhoben. Hierzu erfolgt ein Wiegen der Fahrzeuge vor und nach Abgabe des „Bioabfalls“ auf dem Sammelplatz. Vorsortierung und Vermischung Vom Sammelplatz wird der „Bioabfall“ dann meist in eine Halle transportiert um Geruchsbelästigungen durch die i. d. R. bereits eingesetzten mikrobiellen Abbauprozesse zu vermeiden. Dabei wird der „Bioabfall“ bereits grob vorsortiert, indem grobes Strauch- und Baumschnittmaterial beiseite gelegt wird. Dieses im Frühjahr und Herbst mit einem besonders hohen Anteil anfallende Strukturmaterial soll dem restlichen „Bioabfall“ möglichst gleichmäßig untergemischt werden, da es zur Auflockerung beiträgt und später eine bessere Sauerstoffversorgung in den Mieten gewährleistet. Grobe Störstoffe, die später eine Schädigung der Zerkleinerungsgeräte verursachen könnten, werden bereits jetzt entfernt. Bagger oder Radlader führen die Vorsortierung und Vermischung durch und geben den zu behandelnden Bioabfall auf ein Förderband. Optische Sichtung und Entfernung von Metallen Der „Bioabfall“ wird auf einem Förderband an einer Sortierstelle vorbei geleitet. Hier werden grobe Störstoffe wie Baumscheiben, Plastiktüten, Pflanzenkübel, Batterien und große Metallteile entfernt. Die Sammlung an Gartenscheren und anderen z. T. skurrilen Fundstücken, die fälschlicherweise unter den „Bioabfall“ geraten waren, ist beeindruckend! Das Förderband führt den gesichteten „Bioabfall“ dann der Zerkleinerung zu. Zerkleinerung Die mechanische Zerkleinerung kann durch unterschiedliche Apparaturen bewerkstelligt werden. Im Einsatz sind Mühlen unterschiedlichen Typs. In der Regel schließt sich eine Siebung des zerkleinerten Materials in einer Siebtrommel mit einer Maschenweite von bis zu 80 mm an. Größeres Material wird entweder anders entsorgt (Müllverbrennung, Deponierung) oder zurück zum Sammelplatz gebracht. Entfernung von Störstoffen Der zerkleinerte und gesiebte „Bioabfall“ wird i. d. R. noch an einem Magnetabscheider vorbeige-

führt. Hier werden kleine Metallteile entfernt, bevor das Rottegut der Rotte zugeführt wird. Vor- und Hauptrotte Diese Prozesse werden in unterschiedlicher Weise in Mieten oder in besonderen Behältnissen durchgeführt. Während der Rotte erfolgen Mineralisierung, Humifizierung und Hygienisierung. Auch die hier ablaufenden mikrobiellen Prozesse werden gesondert behandelt. Sickerwässer werden aufgefangen und getrennt entsorgt oder zur Befeuchtung des Rotteguts eingesetzt. Nachrotte Meist ist der aus der Rotte hervorgegangene Kompost noch zu frisch, und es muss eine Nachrotte erfolgen, um einen höheren Rottegrad zu erreichen. Diese wird in den meisten Anlagen in Mieten durchgeführt. Siebung Im Anschluss an die Nachrotte wird der Kompost gesiebt, bevor er weiter verarbeitet werden kann. Die Siebe besitzen meist eine Maschenweite von 1020 mm. Das Sieben dient – möglicherweise in Kombination mit einem Gebläse – dazu, kleinere verbliebene Plastikfolienstücke zu entfernen. Verarbeitung Der gesiebte Kompost kann nun direkt in Plastiktüten abgefüllt werden. Einige Kompostwerke stellen durch Vermischung mit Sand, Erde und anderen Zuschlagstoffen Spezialerden her, die dann ebenfalls in Plastiktüten abgefüllt werden. Von den hergestellten Komposten werden 25-30 % zu Blumenerde verarbeitet, der Rest fließt in den Garten- (1030 %), Landschafts- (10-30 %), Land- (10 %) oder Weinbau (1 %). Qualitätskontrolle Man unterscheidet Frischkompost, Fertigkompost, Substratkompost und Mulchkompost. Diese Produkte unterliegen einer umfassenden Qualitätskontrolle. Kompost, welcher das Gütesiegel Kompost erhalten will, muss die in Tabelle 4.6. angegebenen Grenzwerte einhalten. Verkauf und Abtransport Der in Plastiktüten abgefüllte Kompost bzw. die Spezialerden werden dann direkt an Kleinkunden ab Werk verkauft. Großabnehmer holen Kompost oder Spezialerden auch selbst mit Fahrzeugen ab.

Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie

305

Technische Durchführung der Rotte Hier haben sich sehr unterschiedliche Verfahren durchgesetzt ( Abb. 4.3). Am wenigsten aufwendig und technisch am einfachsten ist die Durchführung in offenen Mieten, die entweder im Freien oder in offenen Hallen aufgeschichtet werden. Das Rottegut wird in so genannten Dreiecks- oder Trapezmieten in einer Höhe von bis zu 2 m auf Betonplatten aufgeschichtet, die ein Durchdringen von Sickerwasser in den Bodenkörper verhindern. Über Schlitze in den Böden kann entweder durch in die Miete einströmende Luft oder durch Zwangsbelüftung mittels über die Mieten von außen in die Belüftungsschlitze gesaugte Luft die Versorgung mit Sauerstoff verbessert werden. Regelmäßiges Umschichten mit Radladern oder automatischen Umsatzgeräten sorgt für eine Auflockerung und damit ebenfalls für eine Verbesserung der Sauerstoffversorgung des Materials. Insgesamt werden in Deutschland 327 der 535 Anlagen nach diesem Verfahren betrieben. Die Kompostierung in geschlossenen Mieten in Form von Tafelmieten verläuft ähnlich wie das Verfahren in offenen Mieten, nur dass die Mieten hier in vollständig abgeschlossenen Hallen aufgesetzt werden. Insgesamt 78 Anlagen arbeiten nach diesem Verfahren. Ein weiteres Verfahren ist die Zeilen- und Tunnelkompostierung. Hierbei wird das Rottegut in langen Zeilen aufgeschichtet, die seitlich z. B. durch Betonwände begrenzt sind. Bei der Zeilenkompostierung sind die Zeilen nach oben offen, während sie bei der Tunnelkompostierung verschlossen sind. Belüftung und Umsetzung des Rotteguts sind erforderlich. Insgesamt arbeiten 23 Anlagen nach diesem Verfahren.

Abb. 4.4.

Verlauf der Rotte

Viele Wege führen zum Ziel

306

4 Kurzexkursionen und Demonstrationen

Relativ aufwendig ist das Intensivverfahren in geschlossenen Containern. Dafür laufen Vor- und Nachrotte hier etwas schneller ab, und der Prozess kann besser kontrolliert werden. Das Rottegut wird hierzu in Container abgefüllt, die über Lochböden belüftet werden. Messungen von Sauerstoffverbrauch und CO2-Entwicklung geben Hinweise auf den Stand der Rotte. Nach 3 bis 4 Wochen sind Vor- und Nachrotte abgeschlossen; die Nachrotte wird dann in Mieten durchgeführt. Insgesamt arbeiten 58 Anlagen nach diesem Verfahren. Noch schneller ist ein weiteres Intensivverfahren, welches in Rottetrommeln durchgeführt wird. Es handelt sich hierbei um thermisch isolierte Drehtrommeln, die bis zu 50 m lang sein können und meist einen Durchmesser von 3 m besitzen. Dieses Verfahren erlaubt einen kontinuierlichen Betrieb, und die für die Vor- und Hauptrotte benötigte Zeit wird auf 1 bis 2 Tage verkürzt. Die Nachrotte wird dann in Mieten durchgeführt. Zurzeit arbeiten 15 Anlagen nach diesem Verfahren. Ein weitere Möglichkeit bietet das so genannte Brikollare-Verfahren. Das Rottegut wird hierbei zunächst zu ziegelförmigen Presslingen von ca. 30 kg Gewicht verarbeitet. Diese werden auf Paletten gestapelt, wo dann Vor- und Hauptrotte erfolgen. In diesen Briketts sorgen Kapillarkräfte für einen guten Stoffaustausch. Nach Abschluss der Hauptrotte werden die Presslinge wieder zerkleinert, die Nachrotte erfolgt in Mieten. Lediglich 6 Anlagen arbeiten z. Zt. nach diesem Verfahren. Die mikrobiellen Vorgänge bei der Kompostierung Drei Abschnitte

Insbesondere bei den drei Abschnitten der Rotte laufen komplexe mikrobielle Abbauprozesse ab, an denen Bakterien und Pilze beteiligt sind. Es kommt zu Sukzessionen von Mikroorganismen. COOH HOOC

O (CH3)0-3

COOH

O HOOC

OH O

OH

OH

COOH

OH

O COOH

(CH3)0-2

R

COOH

HOOC

R

R

COOH R

N H

HO OH COOH

COOH

COOH

O

COOH

COOH

(CH3)0-2

HO COOH

COOH HOOC

OH

N

(CH3)0-4 COOH OH

O OH R

COOH

COOH

OH

(CH3)0-2

(CH3)0-3

(CH3)0-4

COOH

COOH COOH

O

(CH3)0-2 O OH

HOOC

O R

HO

CH3

R

O OH

COOH

C

O OH

N

OH

O

(CH3)0-5

Abb. 4.5.

R

N N H

OH HOOC

O

COOH

R

C

O COOH

Ausschnitt aus der chemischen Struktur des Makromoleküls Huminsäure

CH2OH R (CH3)0-5

Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie

307

Bei der in Mieten nur ca. 1 bis 2 Wochen währenden Vorrotte kommt es durch Mineralisierung leicht abbaubarer, meist niedermolekularer chemischer Verbindungen im „Bioabfall“ zu einer Massenvermehrung besonders von Bakterien. Durch die enormen Stoffwechselumsätze wird sehr viel Energie frei, und die Temperatur steigt von anfänglich 20 bis 40 °C auf bis zu 75 °C an. Es erfolgt also ein Übergang von der mesophilen zur thermophilen Phase. Eine unzureichende Versorgung mit Sauerstoff führt hier zur Bildung von Gärungsprodukten wie Alkoholen und organischen Säuren und kann damit zu unerwünschten Geruchsbelästigungen führen. Die Säurebildung führt zu einem Absenken des pH und würde die weiteren aeroben Umsetzungen hemmen. Durch Belüftung z. B. über Belüftungsschlitze im Boden der Mieten und durch aufgelockerte Lagerung des Materials muss deshalb für eine ausreichende Versorgung mit Sauerstoff gesorgt werden. Die Hauptrotte stellt die eigentliche thermophile Phase der Kompostierung dar und dauert ca. 2 Wochen. Durch Anstieg der Temperatur auf bis zu 75 °C kommt es zu der wichtigen Hygienisierung des Komposts. Bei diesen hohen Temperaturen werden bakterielle Krankheitserreger, tier- und pflanzenpathogene Viren, andere Erreger von Pflanzenkrankheiten und Pflanzensamen abgetötet. Eine erfolgreich ablaufende Hygienisierung ist daher wichtige Voraussetzung für die Entstehung eines einwandfreien Komposts, von dem keine Gefährdung für Menschen und Pflanzen ausgehen kann und der auch keine keimungsfähigen Samen von „Unkräutern“ enthält. In dieser Phase der Kompostierung sind thermophile Vertreter der Gattungen Bacillus und Geobacillus besonders aktiv. G. stearothermophilus kann regelmäßig aus sich in der Hauptrotte befindendem Rottegut isoliert werden. Besonders wichtig ist der nun hier erfolgende Abbau von polymeren Verbindungen durch Bakterien und Pilze, die hierfür geeignete Exoenzyme ausscheiden. In der Nachrotte wird wieder eine mesophile Phase erreicht und die Temperaturen erreichen Werte zwischen 20 und 40 °C. Actinomyceten und Pilze vermehren sich in dieser Phase besonders. Vertreter der Gattungen Streptomyces, Aspergillus, Mucor und Geotrichum sind besonders stark vertreten. Es erfolgt nun durch diese Mikroorganismen besonders der Abbau von Lignocellulose, und die Humifizierung setzt ein. Beim Abbau entstehen aus den aromatischen Verbindungen durch enzymatische Reaktionen Radikale, die spontan zu Huminsäuren ( Abb. 4.5) polymerisieren. Die Nachrotte erstreckt sich i. d. R. über einen Zeitraum von bis zu 12 Wochen ( Abb. 4.4). Abluftreinigung über Biofilter

Abb. 4.6. Biofilter aus Wurzelholz in einem Kompostwerk

Mikroorganismen sind in Kompostierungsanlagen nicht nur an der Rotte beteiligt, sie spielen auch bei der Abluftreinigung eine wichtige Rolle. In der Regel wird die Abluft sämtlicher Gebäudeabschnitte und der Mieten gesammelt und einem Biofilter zugeführt. Die Biofilter bestehen hier meist aus schwer abbaubarem ligninhaltigem geschreddertem Pflanzenmaterial (z. B. Wurzelholz, Baumrinde, Äste) als Matrix, welches in nach oben offenen Betonkästen in Lagen mit unterschiedlicher Korngröße geschichtet ist. Die zu reinigende Abluft wird dem Biofilter dann von unten zugeleitet und durchströmt den ca. 2 m hohen Korpus ( Abb. 4.6). Auf dem geschredderten

Reduzierung der Geruchsemission

308

4 Kurzexkursionen und Demonstrationen Tabelle 4.6.

Einige Qualitätskriterien für Fertigkompost gemäß BGK

Rottegrad IV oder V Dunkelbraune Farbe

Geruch nach Waldboden Neutraler bis leicht alkalischer pH

Ausgewogenes Verhältnis von Nährstoffen (C/N-Verhältnis)

Keine Hemmung von Pflanzenwachstum

Zusammensetzung (Gewichtsprozent) Wassergehalt max. 35 Organische Substanz min. 15 Anteil von Steinen (> 5 mm ∅) max. 5 Anteil von Fremdstoffen max. 0,5 (Glas, Plastik, Metalle) Grenzwerte für Schwermetalle: Blei Cadmium Chrom Kupfer Nickel Quecksilber Zink a)

% (wt/wt) bei Sackware % (wt/wt TS a)) % (wt/wt TS) % (wt/wt TS)

150 1,5 100 100 50 1 400

mg/kg TS mg/kg TS mg/kg TS mg/kg TS mg/kg TS mg/kg TS mg/kg TS

TS = Trockensubstanz

Pflanzenmaterial haben sich Mikroorganismen in Form von Biofilmen angesiedelt, und die vorbeiströmenden organischen und auch anorganischen Substanzen werden von diesen Mikroorganismen als willkommene Kohlenstoffquellen (z. B. Methan, flüchtige organische Säuren und Alkohole) oder als Elektronendonatoren (z. B. NH4+, H2S) zur Energiegewinnung und zum Wachstum genutzt. Anlagenprüfung und Qualitätskontrollen Grenzwerte

Die dem RAL Deutsches Institut für Gütesicherung und Kennzeichnung e. V. angeschlossene Bundesgütegemeinschaft Kompost e. V. (BGK) in Köln hat Qualitätskriterien für Kompost ( Abb. 4.7) und andere Produkte der biologischen Abfallbehandlung aufgestellt, deren Einhaltung von beauftragten Prüflabors regelmäßig kontrolliert wird. Einige dieser Qualitätskriterien sind hier aufgeführt ( Tabelle 4.6). Die BGK prüft nicht nur den Kompost selbst, sondern auch die seuchenhygienische Wirksamkeit des Rotteverfahrens. Hierdurch wird sichergestellt, dass die Anlage so konzipiert ist und betrieben wird, dass eine ausreichende Hygienisierung erfolgt.

Abb. 4.7.

Fertiger Kompost

Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie

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Bei dieser regelmäßig stattfindenden Prüfung werden dem Rottegut vor der Kompostierung unten stehende Erreger, Samen und Viren zugesetzt, die sich nach erfolgter Hygienisierung nicht mehr nachweisen lassen dürfen: 1. Salmonella sp. 2. Tabakmosaikvirus 3. Kohlhernie-Erreger Plasmodiophora brassicae

V48 - S. 246

4. Tomatensamen Weiterführende Literatur Fritsche W (1997) Umwelt-Mikrobiologie. Grundlagen und Anwendungen. Spektrum, Heidelberg Kämpfer P, Weißenfels WD (2001) Biologische Behandlung organischer Abfälle. Springer, Berlin, Heidelberg, New York Kutzner HJ (2000) Microbiology of composting. In: Rehm HJ, Reed G, Pühler A, Stadler P (eds) Biotechnology. vol 11c, 2nd edn., Wiley-VCH, Weinheim, pp 35-100 Seitz P (1994) Kompost und Boden. Franck-Kosmos, Stuttgart (Kosmos-Garten-Bibliothek) Wiemer K, Kern M (1998) Bio- und Restabfallbehandlung. II. Biologisch – mechanisch – thermisch. MIC Baeza, Witzenhausen Homepage der Bundesgütegemeinschaft Kompost e. V. (BGK) (http://www.bgkev.de)

Nachgefragt 1. Schildern Sie den prinzipiellen Aufbau eines Kompostwerks! 2. Welche drei Phasen der Rotte gibt es bei der Kompostierung? Unterscheiden Sie diese hinsichtlich Zeitdauer und der dort herrschenden Temperaturen! 3. Warum müssen die Innenkabinen der Fahrzeuge, die in der Sammelhalle den Kompost in das System einschleusen, mit Klimaanlagen und Mikrofiltern ausgestattet sein? 4. Beschreiben Sie die verschiedenen Verfahren, mit denen die Hauptrotte bei der Kompostierung durchgeführt werden kann! 5. Was versteht man unter Hygienisierung bei der Entstehung von Kompost und warum ist dieser Vorgang außerordentlich wichtig? 6. Was sollte sich nach einer erfolgreichen Hygienisierung im Kompost nicht mehr nachweisen lassen? 7. Nennen Sie die wichtigsten mikrobiellen Vorgänge, die in den drei Phasen der Rotte ablaufen! 8. Welche Mikroorganismen tragen wesentlich zur Rotte bei und was leisten sie im einzelnen? 9. Berechnen Sie, wie viel Prozent der in Glucose steckenden Energie von eukaryontischen Mikroorganismen in ATP umgewandelt werden kann, wenn durch aerobe Verstoffwechselung von Glucose zu CO2 pro 1 mol Glucose 38 mol ATP gewonnen werden können! Wo bleibt die restliche Energie?

10. Warum werden Verbindungen, die ein niedriges Molekulargewicht besitzen, besonders schnell abgebaut? 11. Was versteht man unter Humifizierung, und welche mikrobiologischen, enzymatischen und chemischen Vorgänge sind daran beteiligt? 12. Welche Substanzen sind für die dunkle Färbung von Kompost verantwortlich? 13. Beschreiben Sie die chemischen Struktur von Huminsäuren! Auf was für eine Art von Synthese deutet die unregelmäßige Struktur von Huminsäuren hin? 14. Nennen Sie mehrere Gründe dafür, weshalb eine Kompostierung nur bei ausreichender Sauerstoffversorgung erfolgen kann! 15. Was würde mit dem Rottegut unter anaeroben Bedingungen geschehen? Schildern Sie die dann ablaufenden mikrobiologischen Vorgänge! 16. Warum wird der „Bioabfall“ geschreddert, bevor er der Rotte zugeführt wird? 17. Warum ist es sinnvoll Strauch- und Baumschnittmaterial immer zu einem gewissen Anteil dem „Bioabfall“ unterzumischen? 18. Warum sollte vermieden werden, dass zuviel Rasenschnitt gleichzeitig in eine Miete oder Rottecontainer gelangt? 19. Beschreiben Sie Aufbau und Funktionsweise von Biofiltern! 20. Was versteht man unter Biofilmen?

Internet

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4 Kurzexkursionen und Demonstrationen

Exkursion 3 Biogasanlagen Ziele

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In Biogasanlagen ( Abb. 4.8) werden Gülle und andere biologisch abbaubare Abfallund Reststoffe der Landwirtschaft sowie die biologisch abbaubare Fraktion von Siedlungsabfällen und zugelassene gewerbliche Abfälle anaerob mit dem Ziel der Umwandlung der Biomasse in Biogas und Kompost oder Klärschlamm vergoren. Das Biogas aus diesen Anlagen besitzt ungefähr die gleiche Zusammensetzung wie das in den Faulbehältern von Kläranlagen entstehende Biogas und wird energetisch verwertet. Hierzu wird es meist in Blockkraftwerken in elektrische und thermische Energie umgewandelt. Der entstandene Kompost bzw. Klärschlamm Abb. 4.8. Biogasanlage für Gülle aus der kann im Gegensatz zu den ursprünglichen Landwirtschaft Abfall- und Reststoffen genutzt werden; dies geschieht auf ähnlichen Wegen wie beim Kompost aus Kompostwerken bzw. Klärschlamm aus Faulbehältern von Kläranlagen. Hierbei sind Qualitätskriterien einzuhalten, damit eine bedenkenlose Abgabe an die Umwelt erfolgen kann. Nassvergärung und Trockenvergärung

Verfahren

Für die Erzeugung von Biogas in Biogasanlagen wurden zwei unterschiedliche Verfahren entwickelt. Man unterscheidet die Nassvergärung und die Trockenvergärung. Bei der Nassvergärung beträgt die Trockensubstanz des Substrats maximal 15 % (wt/wt), während diese bei der Trockenvergärung einen Anteil von ca. 25 bis 50 % (wt/ wt) besitzt. Wie bei den Kompostierungsanlagen gibt es für jedes der Verfahren eine Vielzahl unterschiedlicher Anlagen. In Deutschland arbeiten die meisten Biogasanlagen nach dem Verfahren der Nassvergärung. Nutzung von Biogas

Zusammensetzung

In Biogasanlagen gebildetes Biogas besteht zu 55 bis 75 % (vol/vol) aus Methan, 23 bis 43 % (vol/vol) Kohlendioxid und kann daneben noch ca. 2 % (vol/vol) Wasserstoff, Schwefelwasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff enthalten. Biogas besitzt einen Heizwert von ca. 21,5 MJ/m3. Damit entspricht 1 m3 Biogas ca. 0,6 l Heizöl oder 1,8 kg Buchenholz. Durch die Haltung einer „Großvieheinheit“ (z. B. ein Rind) können pro Tag ca. 1,3 m3 Biogas produziert werden. Biogas ist also ein interessanter und auch volkswirtschaftlich sinnvoller Energieträger, da Siedlungsabfälle der Kommunen sowie Abfallund Reststoffe aus der Landwirtschaft und von Gewerbebetrieben durch mikrobiologische Prozesse in Energie umgewandelt und somit noch genutzt werden können.

Treibhausgase

Die Verbrennung von Biogas zur Wärme- und Stromerzeugung ist zudem CO2-neutral und trägt nicht zum Treibhauseffekt bei. Wahrscheinlich reduziert gewerblich betriebene Biogaserzeugung sogar die Freisetzung von Treibhausgasen, da Abfälle und Reststoffe gezielt zur Erzeugung von Biogas genutzt werden. Ohne diese Anlagen würde Methan – selbst ein Treibhausgas – unkontrolliert entstehen und ohne Verbrennung zu CO2 in die Atmosphäre gelangen.

Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie

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Bedeutung von Biogasanlagen In Deutschland gab es 2001 insgesamt 51 kommunale Anlagen mit einer Kapazität von jeweils mehr als 2.500 Jahrestonnen. Durch Nassvergärung werden bereits mehr als 1 Mio Tonnen kommunale Siedlungsabfälle behandelt. Damit kommt der Kompostierung zurzeit jedoch noch eine etwa zehnfach größere Bedeutung zu. In der Landwirtschaft gibt es zudem mittlerweile ca. 1.000 Biogasanlagen zur Vergärung von Gülle ( Abb. 4.8). Diese sind mit einem Anteil von ca. 0,07 % an der Gesamtstromproduktion beteiligt. Die Tendenz ist steigend, und gerade in den letzten Jahren sind zahlreiche neue Anlagen in Betrieb genommen worden. Die größte Biogasanlage Europas für Gülle mit zwei 8.000 m3 fassenden Reaktoren wurde 1998 in Nordhausen in Betrieb genommen. Durch das 1996 in Kraft getretene Kreislaufwirtschaftsgesetz und die 2001 in Kraft getretene Biomasse-Verordnung sowie verschiedene Fördermaßnahmen soll das Potential von Biomasse zur Energieerzeugung zukünftig besser ausgeschöpft werden. Es wird geschätzt, dass in Deutschland mit ca. 135.000 dezentralen Biogasanlagen insgesamt 11 % der Stromversorgung (60 Milliarden kWh) sichergestellt werden könnten, wobei zusätzlich ungefähr die gleiche Energiemenge als Wärme erzeugt würde.

Deutschland

Andere Länder sind hier schon weiter. In Dänemark gab es in 2001 mit Abstand die meisten Biogasanlagen pro Einwohner. Spitzenreiter auf diesem Gebiet ist jedoch Indien. Hier gibt es ca. 2,5 Mio kleine Biogasanlagen mit einem durchschnittlichen Faulraumvolumen von drei bis zehn m3, die durchschnittlich jeweils drei bis zehn m3 Biogas pro Tag erzeugen.

Andere Länder

Funktionsweise und Aufbau von Nassvergärungsanlagen Tabelle 4.7. Kenndaten und Leistungen der Bioenergieanlage Bottrop (SOTEC GmbH) Kapazität (pro Jahr) Siedlungsabfälle Kompost Biogas

6.500 t 2.800 t 740.000 m3

Dimensionen Aufbereitungsbehälter Prozesswasserbehälter Reaktor Hygienisierungsbehälter Zwischenspeichertank Verweilzeit des Bioabfalls

60 m3 40 m3 950 m3 60 m3 110 m3 ca. 20 Tage

Biofilter Querschnitt 120 m2 Zu reinigende Abluftmenge ca. 11.000 m3/h Beaufschlagung mit Abluft 87 m3 / m2 × h Überschüssige Energie (pro t Bioabfall) Wärme Elektrizität

ca. 280 kWh ca. 160 kWh

Wie bei Kompostierungsanlagen gibt es auch bei Biogasanlagen keine einheitliche Bauweise. Einige Module von Biogasanlagen haben wir bereits bei den ersten beiden Exkursionen zu den kommunalen Abwasserbehandlungsanlagen und den Kompostierungsanlagen kennen gelernt. Auf diese brauchen wir deshalb nicht mehr im Detail eingehen. Da es den Rahmen dieses Buches sprengen würde, einen vollständigen Überblick über die Technik von Biogasanlagen zu geben, stellen wir deshalb stellvertretend eine Nassvergärungsanlage (Bioenergieanlage Bottrop der SOTEC GmbH,  Tabelle 4.7) im Detail vor. In dieser Anlage erfolgt zunächst eine trokken-mechanische Vorbehandlung: Ähnlich wie das Rottegut bei der Kompostierung wird das zu vergärende Substrat gesammelt, von Störstoffen (Holz, Plastik, Glas, Metall) befreit, in einer Schneckenmühle zerkleinert und in einer Siebtrommel mit einem Lochdurchmesser von 50 mm gesiebt. Es folgt die Herstellung einer Maische, indem das aus der Vorbehandlung hervorgegangene Substrat in einem Aufbereitungsbehälter mit temperiertem Wasser (36 bis 37 °C) ver-

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312

4 Kurzexkursionen und Demonstrationen

mischt und dabei ein Trockensubstanzanteil von 15 % (wt/vol) eingestellt wird. Dieser Vorgang ist mit der erneuten Abtrennung von Störstoffen verbunden: Während des Rührens sinken schwere Störstoffe (Steine, Glas, Metall) auf den Boden, während leichte Störstoffe (Kunststoffe, Holz, Kork) aufschwimmen; beide werden abgezogen. Die Maische wird nun in den temperierbaren Gärbehälter gepumpt und ersetzt dabei ca. 5 % des Gärrückstands, der zuvor abgezogen wurde. Dieser Reaktor ist Kernstück der Biogasanlage und besteht in dieser aus Stahl; in anderen Biogasanlagen sind auch Gärbehälter aus Beton vorhanden. Im Gärbehälter finden die anaeroben Umsetzungen statt, durch die letztlich Biogas entsteht. Der in den Hygienisierungsbehälter überführte Gärrückstand, der nur noch einen Trockensubstanzgehalt von 9 bis 10 % (wt/ vol) besitzt, wird für mindestens 30 min auf 70 °C erhitzt und anschließend in den Zwischenspeichertank überführt. Nach Abkühlung wird der hygienisierte Gärrückstand zu einer Schneckenpresse gepumpt und entwässert und dabei ein Trockensubstanzgehalt zwischen 40 und 45 % (wt/wt) eingestellt. Das hierbei abgetrennte Wasser wird zum Teil über den Prozesswasserbehälter in den Aufbereitungsbehälter zur Herstellung neuer Maische geleitet. Zum weiteren Abbau organischer Verbindungen wird der Gärrückstand mit Grün- und Strauchschnitt vermischt und einer Nachrotte zugeführt. Aus 1.000 kg Siedlungsabfall werden ca. 80 kg Störstoffe und 350 Liter Wasser abgetrennt, und es entstehen ca. 420 kg Kompost sowie 120 m3 Biogas. Qualitätssicherung

E1 - S. 297 D5 - S. 347 1.1.4 - S. 12

Auch bei der Nassvergärung muss das Substrat bzw. der Klärschlamm einer Hygienisierung unterzogen werden, um pathogene Mikroorganismen und Viren, sonstige Krankheitserreger und Pflanzensamen abzutöten bzw. zu inaktivieren. Die seuchenhygienische Wirksamkeit der Anlage und ihres Betriebs wird in gleicher Weise wie bei der Kompostierung geprüft. Die Bundesgütegemeinschaft Kompost e. V. (BGK) hat wie für Kompost auch für flüssige und feste Gärprodukte Qualitätskriterien aufgestellt. Werden diese erfüllt, dürfen die Produkte das „Gütezeichen Gärprodukt“ führen. Mikrobiologische Prozesse bei der Nassvergärung Die mikrobiologischen Prozesse, die in Biogasanlagen ablaufen, ähneln denen in den Faulbehältern der kommunalen Abwasserbehandlungsanlagen und in anaeroben Süßwassersedimenten. Durch komplexe Biozönosen werden die organischen Moleküle über anaerobe Nahrungsketten, an deren Ende die methanogenen Bakterien stehen, letztlich zu Methan und CO2 abgebaut. Es sei hierzu auf die entsprechenden Kapitel verwiesen. Weiterführende Literatur Fritsche W (1997) Umwelt-Mikrobiologie. Grundlagen und Anwendungen. Spektrum, Heidelberg Kämpfer P, Weißenfels WD (2001) Biologische Behandlung organischer Abfälle. Springer, Berlin, Heidelberg, New York

Internet

Bundesgütegemeinschaft Kompost e. V. (BGK) Homepage (http://www.bgkev.de)

Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie

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Nachgefragt 1. Zeichnen Sie die Strukturformel von Methan! 2. Nennen Sie wirtschaftlich relevante Substrate, die in Biogasanlagen zur Erzeugung von Biogas eingesetzt werden können! 3. Wo fallen diese Substrate an? 4. Erstellen Sie eine Liste der relevanten Substrate und besorgen Sie sich von Verbänden und aus dem Internet Angaben über die Mengen, in denen diese Substrate pro Jahr in Deutschland anfallen! 5. Nennen Sie einen wesentlichen Unterschied zwischen der Nassvergärung und der Trockenvergärung! 6. Welches der in (5) genannten Verfahren wird man auf Gülle anwenden? Warum? 7. Schildern Sie den prinzipiellen Aufbau einer Vergärungsanlage für Gülle! 8. Welche Module müssen bei einer Nassvergärungsanlage für Siedlungsabfälle zusätzlich zu denen bei einer Anlage für Gülle hinzu kommen? 9. Schätzen Sie ab, wie viel Biogas durch Vergärung von einer Tonne Siedlungsabfall etwa entsteht! Wie viel Liter Heizöl entspricht dies vom Energiegehalt ungefähr? 10. Nennen sie so genannte „Treibhausgase“! Was versteht man hierunter?

11. Warum muss grobes Material (z. B. Holz) vor dem Einbringen in den Reaktor einer Biogasanlage zunächst zerkleinert werden, obwohl Mikroorganismen auch diese Materialien vollständig abbauen können? 12. Welche Gruppen von Mikroorganismen sind an den mikrobiologischen Umsetzungen bei der anaeroben Nassvergärung beteiligt? 13. Welche biochemischen Vorgänge sind bei der Biogasherstellung wahrscheinlich limitierend? 14. Worin unterscheiden sich die methanogenen Mikroorganismen von den meisten anderen Mikroorganismen, die an den Umsetzungen bei der Nassvergärung beteiligt sind? 15. Welche Substrate verwenden die Methanogenen zur Bildung ihres Stoffwechselendprodukts? 16. Wie setzt sich Biogas zusammen? 17. Warum enthält Biogas immer auch H2S? Woher stammt es, und wie wird es gebildet? 18. Warum werden in Anlagen zur anaeroben Nassvergärung Biofilter eingesetzt? 19. Beschreiben Sie Aufbau und Funktion von Biofiltern! 20. Wo verbleibt in Biogasanlagen der organisch gebundene Stickstoff?

Bierbrauerei und Braustätten

Exkursion 4 Bier ( Abb. 4.9) wird durch Vergärung von Stärke mit Hefen hergestellt und gehört wie Wein zu den ältesten biotechnologischen Produkten aus dem Bereich der Lebensmitteltechnik. Das Bierbrauen geht wahrscheinlich wie auch die Herstellung von Wein ebenfalls auf die Sumerer zurück und ist durch erhaltene Darstellungen aus der Zeit um 4.000 v. Chr. dokumentiert. Die Kunst des Brauens hat sich dann von hier aus weiter ausgebreitet. Heute liegt die Weltjahresproduktion von Bier bei ca. 130 Milliarden Litern.

Geschichte: Ein Jahrtausende altes Verfahren

Der älteste Nachweis des Bierbraues in Deutschland datiert auf die Zeit um 800 v. Chr. zurück und beruht auf dem Fund Abb. 4.9. Ein Glas Bier von Bieramphoren in der Nähe von Kulmbach. Auf 764 n. Chr. datiert der älteste Nachweis von Hopfenanbau in Deutschland in der Hallertau, dem heute größten zusammenhängenden Hopfenanbaugebiet der Welt. Nachdem Kaiser Barbarossa bereits im 12. Jahrhundert erste Qualitätsvorschriften für Bier erlassen hatte, erließ der Rat der Stadt München 1447 bereits ein Gebot, dass zur Herstellung von Bier lediglich Gersten, Hopfen und Wasser verwendet werden dürfen. 1516 wurde dann von den Herzögen Wilhelm IV und Ludwig X das berühmte Reinheitsgebot für ganz Bayern

Bierherstellung in Deutschland

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4 Kurzexkursionen und Demonstrationen

erlassen ( Kasten). Das Deutsche Reinheitsgebot ist die älteste heute noch geltende lebensmittelrechtliche Bestimmung der Welt und rechtliche Grundlage dafür, dass in Deutschland zur Herstellung von Bier nur Malz, Hopfen, Hefe und Wasser eingesetzt werden dürfen. In Deutschland werden in ca. 1.300 Braustätten über 5.000 verschiedene Biere hergestellt. Es sind 24 Biersorten bekannt, die sich nach Geschmack, Aroma, Farbe und Herstellungsverfahren unterscheiden ( Tabelle 4.8) und den vier Biergattungen Einfachbiere, Schankbiere, Vollbiere und Starkbiere zugeordnet werden können ( Tabelle 4.9). Insgesamt wurden 1994 in Deutschland 11,8 Milliarden Liter Bier mit einem Produktionswert von ca. 7,3 Milliarden € hergestellt. Das Bierbrauen ist somit ein bedeutender Wirtschaftszweig.

Tabelle 4.8.

Deutsche Biersorten

Obergärige Biere • Altbier • Berliner Weisse • Broyhan • Dampfbier • Gosebier • Kölsch • Roggenbier • Weizenbier • Weizenbock

Untergärige Biere • Bockbier • Doppelbockbier • Eisbockbier • Exportbier • Lager • Märzen • Pilsener

Biochemische Vorgänge bei der Vergärung von Stärke zu Ethanol V42 - S. 212

Die enzymatische Spaltung von Stärke stellt den ersten biochemischen Schritt bei der Umwandlung in Ethanol und CO2 dar. Dieser Schritt kann nicht durch die Hefe selbst katalysiert werden, da diese keine stärkespaltenden Enzyme besitzt. Die Spaltung der Stärke vorwiegend in Maltose erfolgt bereits nach der Herstellung des Malzes durch Amylasen, die von der Gerste bei der Keimung gebildet werden, bevor die Hefe Saccharomyces cerevisiae zugesetzt wird. Maltose wird durch die Hefe mit dem Enzym Maltase in Glucose gespalten, welches durch die Enzyme des Fructose-1,6-bisphosphat-Wegs in Pyruvat umgewandelt wird. Pyruvat wird durch das Enzym PyruvatDecarboxylase in Acetaldehyd und CO 2 gespalten und Acetaldehyd anschließend mit der Alkohol-Dehydrogenase zu Ethanol reduziert. Auf diese Weise ist es der Hefe möglich, zu einer ausgeglichenen Gärungsbilanz zu gelangen. Aus jedem Molekül Maltose entstehen je vier Moleküle Ethanol und CO2 ( Abb. 4.10).

Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie

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Der Brauprozess

in Gerste

Stärke Amylase

in Hefe

1 Maltose Maltase 2 Glucose Fructose-1,6bisphosphatWeg 4 Pyruvat PyruvatDecarboxylase 8 ]H]

4 CO2 4 Acetaldehyd AlkoholDehydrogenase 4 Ethanol

Abb. 4.10. Umwandlung von Stärke in Ethanol während der Bierherstellung

An dieser Stelle muss betont werden, dass in anderen Ländern und in Brauereien, die Bier nicht nach Deutschland exportieren, der Brauprozess und seine Ingredienzien weitgehend von dem unten geschildertem Prozess in deutschen Brauereien abweichen können. So werden statt Gerste häufig andere Stärkequellen wie Mais oder Reis verwendet, und die Verzuckerung der Stärke wird auch häufig durch zugesetzte Enzyme herbeigeführt. Außerdem gibt es eine Vielzahl von Zusätzen, die den Geschmack verändern. Solche Biere können durchaus interessant schmecken und auch bekömmlich sein. Es sind jedoch keine Biere, die dem Deutschen Reinheitsgebot genügen. Auch gibt es Experimente mit immobilisierten oder gentechnisch veränderten Hefen. Für das Bierbrauen wird keine normale Futtergerste verwendet. Es kommen vielmehr besondere Braugersten zum Einsatz, die sich durch einen niedrigen Proteingehalt auszeichnen. Der Abbau von Proteinen und besonders der darin enthaltenen verzweigten Aminosäuren führt nämlich zur Bildung von Fuselölen, die der Bekömmlichkeit von Bier abträglich sind. Es handelt sich fast immer um Sommergersten.

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Der Prozess des Bierbrauens wird heute zumindest in den großen überregionalen Brauereien nicht mehr in Gänze in einem Betrieb durchgeführt. Es erfolgt meist eine Arbeitsteilung zwischen Mälzereien einerseits und Brauereien andererseits. Nach einer eingehenden Qualitätskontrolle werden die Gerstenkörner der Braugerste maschinell sortiert und gereinigt. Anschließend ist eine Lagerung in Silos möglich.

Reinigung und Vorsortierung

Die Gerstenkörner werden in großen Trögen mit Wasser eingeweicht und dann in Keimkästen bei guter Belüftung ca. 3 Tage bei Temperaturen zwischen 10 und 18 °C inkubiert. Während dieser Zeit beginnen die Körner zu keimen sowie Amylasen und Proteasen zu bilden. Die Amylasen wandeln die unlösliche Stärke in lösliche Maltose um. Dieser Vorgang liefert das Grünmalz.

Herstellung von Grünmalz

Unter Darren versteht man das Trocknen der gekeimten Gerstenkörner durch erhitzte Luft und deren Überführung in ein lagerfähiges Malz. Hierzu wird der Wassergehalt des Malzes schrittweise auf ca. 3 % reduziert und die Temperatur auf 80 °C (helles Bier) oder 100 °C (dunkles Bier) erhöht, ohne dass dabei die zuvor gebildeten Enzyme inaktiviert werden. Die beim Darren eingestellte Temperatur entscheidet über die Farbe des Malzes und damit auch über die Farbe des später daraus hergestellten Bieres. Anschließend müssen noch die Keimblätter abgeschält und diese zusammen mit Staub durch ein Sieb entfernt werden; sie können als Tierfutter verwendet werden. Dieses Darrmalz kann vorübergehend in Silos gelagert werden, bevor es dann von den Mälzereien an die Brauereien ausgeliefert wird.

Darren und Herstellung von Darrmalz

316

4 Kurzexkursionen und Demonstrationen Schroten

Nach der Anlieferung des Darrmalzes bei der Brauerei kann es dort zunächst in Silos gelagert werden. Vor der Weiterverarbeitung wird das Darrmalz in einer Schrotmühle gemahlen.

Herstellen der Maische

In einer Maischpfanne wird das Darrmalz mit Wasser vermischt und bei unterschiedlichen Temperaturen unter Rühren inkubiert. In dieser Maische werden die Enzyme reaktiviert, und die im Malz vorhandenen Amylasen bauen die Stärke überwiegend zu Maltose und anderen von der Hefe verwertbaren Oligosacchariden ab. Weitere wichtige Inhaltsstoffe des Darrmalzes gehen dabei in Lösung.

Läuterung

Aus der Maischpfanne wird die Maische in den Läuterbottich überführt. In ihm werden mechanisch die festen Bestandteile von der Flüssigkeit getrennt. Die abgetrennten festen Bestandteile werden als Malztreber bezeichnet, der als Tierfutter oder Dünger Verwendung findet. Die abgetrennte Flüssigkeit wird als Würze bezeichnet.

Sudprozess

Die Würze wird nun in die Sudpfanne über- Definition: Stammwürzegehalt führt. Im nächsten Schritt wird Hopfen (Humulus lupulus) der Würze zugesetzt. Je Unter dem Stammwürzegehalt wird der nach Biersorte enthält jeder Liter Bier letzt- Extraktgehalt der Würze (Gesamtmenge aller lich zwischen 1 bis 4 g Hopfen. Die Inhalts- in der Würze gelöster Substanzen wie stoffe des Hopfens geben dem Bier seinen Zucker, Eiweiß, Bitterstoffe usw.) verstanden. typischen Geschmack und haben auch eine Ungefähr je ein Drittel der Stammwürze konservierende Wirkung. Zum Brauen wer- werden durch den Gärprozess in Ethanol den nur die Blütendolden der weiblichen oder CO2 überführt oder verbleiben im Bier. Pflanzen verwendet. Mittlerweile werden nur noch selten die intakten Dolden selbst, Tabelle 4.9. Vorgeschriebene Stammsondern Hopfenpulver oder Extrakte zuge- würzegehalte der vier Biergattungen setzt. Dies vereinfacht den Transport und ist 2,0 - 5,5 % im Einklang mit dem Deutschen Reinheits- Einfachbiere 7,0 - 8,0 % gebot. Anschließend wird der Sud für ca. Schankbiere 11,0 - 14,0 % zwei Stunden gekocht, um die fertige Würze Vollbiere Starkbiere über 16,0 % herzustellen. Diese ist durch ihren Stammwürzegehalt charakterisiert ( Kasten). Beim Kochen werden die Bitter- und Gerbstoffe aus dem Hopfen gelöst. Außerdem werden die malzeigenen Enzyme dabei inaktiviert und ausgefällt und können durch nachfolgende Klärschritte entfernt werden. Darüber hinaus wird die Würze bei diesem Vorgang auf den gewünschten Stammwürzegehalt eingestellt und sterilisiert ( Tabelle 4.9).

Hauptgärung

Die fertige Würze wird heruntergekühlt, in den Gärbottich gegeben und dann mit einer Starterkultur ausgewählter Stämme von Saccharomyces cerevisiae als Anstellkultur beimpft. Bei untergärigen Hefen benötigt die Hauptgärung bei Temperaturen zwischen 4 und 10 °C ca. 8 bis 10 Tage; dabei setzen sich die Hefezellen am Boden des Gärgefäßes ab. Bei obergärigen Hefen werden bei Temperaturen zwischen 10 und 25 °C für die Gärung lediglich 2 bis 3 Tage benötigt; dabei reichern sich die Hefezellen an der Oberfläche der flüssigen Phase an. Die Hefezellen werden anschließend entweder durch Dekantieren oder Abschöpfen entfernt.

Reifung

Mit der Hauptgärung ist der Brauprozess noch nicht abgeschlossen. Es ist lediglich ein Jungbier entstanden, welches noch reifen muss. Die Reife benötigt in der Regel mehrere Wochen und erfolgt in Lagertanks bei niedrigen Temperaturen (~ 0 °C). Hierbei fallen Trübstoffe aus, die abgetrennt werden können, und unerwünschte Nebenstoffe werden abgebaut. Von besonderer Bedeutung ist hier Diacetyl, welches dem Bier bereits bei relativ niedrigen Konzentrationen einen unangenehmen Geschmack verleiht. Es entsteht biochemisch oder chemisch während der Hitzebehandlung aus

O O H3C

C

C

Diacetyl

CH3

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α-Acetolactat. Insgesamt wird durch die Reifung erreicht, dass die Aromastoffe, die dem Bier seinen typischen Geschmack und sein typisches Bukett verleihen, am Ende in ausgewogenen Konzentrationen vorhanden sind. Um die Lagerfähigkeit des Bieres zu erhöhen, erfolgt in der Regel eine Reduzierung der Keimzahl durch Pasteurisierung oder Filtration. Als Filtrationshilfsmittel sind dabei in Deutschland Kieselgur und Bentonite zugelassen. In riesigen und schnell arbeitenden Abfüllanlagen wird das fertige Bier dann entweder in Flaschen oder kleine Fässer gefüllt.

Nachbehandlung und Abfüllung

Biere mit einem deutlich verminderten Alkoholgehalt erfreuen sich zunehmender Beliebtheit, und ihr Anteil steigt stetig. Hierzu wird in der Regel zunächst nach dem üblichen Verfahren ganz normales Bier hergestellt. Anschließend wird der Alkohol durch Vakuumverdampfung oder selektive Membranen mehr oder weniger effektiv entfernt. Alkoholarme Biere enthalten dann in der Regel ca. 2,4 % (vol/vol) Ethanol, während so genannte alkoholfreie Biere maximal 0,5 % (vol/vol) Ethanol enthalten dürfen. Aber auch über den Stammwürzegehalt und die Gärführung ist ein niedriger Alkoholgehalt einstellbar.

Alkoholarme und alkoholfreie Biere

Auch in Deutschland werden einige Biere mit anderen Stärkequellen als Gerste hergestellt. Bei der Herstellung von Weizenbier wird von bis zu 70 % Weizenmalz ausgegangen. Zudem wird sogenanntes Hefeweizen nach der Hauptgärung ohne Abtrennung der Hefezellen direkt in Flaschen abgefüllt; die Reifung findet in der Flasche statt. Gosebier ist ein Weizenbier aus Sachsen. Bei Dinkelbier wird Dinkelmalz verwendet, beim Roggenbier Roggenmalz. Beim Rauchbier, welches im Bamberger Raum bekannt ist, wird das Grünmalz über einem Holzfeuer gedarrt. Bei der Herstellung von Steinbier werden über einem offenen Feuer erhitzte Natursteine in die Maische getaucht. Berliner Weiße ist ein säuerliches Bier bei dem neben der Hefegärung zusätzlich auch eine Milchsäuregärung durch zugesetzte Milchsäurebakterien erfolgt. Zur Abschwächung der Säure wird beim Trinken meist ein Schuss Himbeer- oder Waldmeistersirup zugegeben. Malzbier ist ein obergäriges, braunschwarzes Bier mit einem Alkoholgehalt von lediglich 1 %. Es ist sehr kalorienreich, da die niedrige Malzwürze von nur 7 % durch Zugabe von Zucker auf bis zu 13 % gebracht wurde. Bockbier und Maibock haben einen Stammwürzegehalt von mindestens 16 %; beim Doppelbock beträgt dieser mindestens 18 %. Beim Eisbock wird Bockbier durch Gefrieren Wasser entzogen. Eisbockbier zeichnet sich deshalb durch einen höheren Alkoholgehalt aus.

Besonderheiten einiger deutscher Biersorten

Weiterführende Literatur Bamforth VW (2000) Brewing and brewing research: past, present and future. Journal of the Science of Food and Agriculture 80:1371-1378 Evans DE, Sheehan MC (2002) Don't be fobbed off: The substance of beer foam – A review. Journal of the American Society of Brewing Chemists 60:47-57 Gesellschaft für Öffentlichkeitsarbeit der Deutschen Brauwirtschaft eV (2001) Vom Halm zum Glas – Wie unser Bier gebraut wird. Anschrift: Annaberger Straße 28, D-53175 Bonn Moir M (2000) Hops – A millenium review. Journal of the American Society of Brewing Chemists 58:131146 Russell I, Stewart GG (1995) Brewing. In: Rehm HJ, Reed G, Pühler A, Stadler P (eds) Biotechnology. vol 9, 2nd edn., Wiley-VCH, Weinheim, pp 419-462 Brau Ring Kooperationsgesellschaft Privater Brauereien (Wetzlar): Sehr ausführliche Homepage mit vielen wichtigen Information rund ums Bier und mit einer Liste von Links zu allen angeschlossenen Brauereien (http://www.brauring-kooperation.de)

Internet

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4 Kurzexkursionen und Demonstrationen Deutscher Brauer-Bund eV (Bonn): Sehr ausführliche Homepage mit vielen wichtigen Information rund ums Bier und mit einer Liste von Links zu angeschlossenen Brauereien (http://www.brauer-bund.de)

Nachgefragt 1. Wann und in welcher geographischen Region sind vermutlich sowohl das Bierbrauen als auch die Herstellung von Wein erfunden worden? 2. Nennen Sie einen grundlegenden Unterschied zwischen der Herstellung von Wein und Bier! 3. Was besagt das Deutsche Reinheitsgebot? 4. Beschreiben Sie, was unter Grünmalz, Darrmalz und Würze verstanden wird und wie diese hergestellt werden! 5. Was versteht man unter Starterkulturen oder im Falle des Bierbrauens unter Anstellhefe? 6. Nennen Sie die beiden Enzyme, die bei der Bierherstellung für die Überführung von Stärke in Glucose verantwortlich sind und wo diese Enzyme vorkommen! 7. Informieren Sie sich in Lehrbüchern der Mikrobiologie und Biochemie über die Stoffwechselwege, durch die Diacetyl entstehen kann! 8. Weshalb geht man bei der Bierherstellung nicht von ganz normaler Gerste, sondern von Braugerste aus? 9. Beschreiben Sie den Stoffwechselweg, mit dem Hefe Glucose zu Ethanol vergärt, und nennen Sie die hieran beteiligten Schlüsselenzyme! 10. Nach welcher Umsatzgleichung vergärt die Hefe Glucose zu Ethanol und CO2?

11. Welcher Stammwürzegehalt muss im Brauansatz mindestens vorliegen, damit am Ende ein Bier mit einem Ethanolgehalt von 4,8 % (vol/vol) entstehen soll? 12. Wieviel Liter CO2 sind in einem Gärtank mit 100 m3 Inhalt bei der Hauptgärung mindestens entstanden, wenn dabei ein Bier mit einem Ethanolgehalt von 4,8 % (vol/vol) hergestellt wurde? 13. Wie ist der Stammwürzegehalt definiert? 14. Welche Faktoren bestimmen Alkoholgehalt und Farbe eines Bieres? 15. Welche Funktionen hat Hopfen bei der Bierherstellung? 16. Nennen Sie die Ursachen dafür, weshalb beim Bierbrauen nicht nur einfach eine Vergärung von Stärke bzw. deren Abbauprodukte nach der in jedem Lehrbuch beschriebenen Umsatzgleichung erfolgt! 17. Was ist der Unterschied zwischen untergärigen und obergärigen Hefen? Welche Auswirkungen hat dies auf den Brauprozess? 18. Nennen Sie mindestens drei untergärige und drei obergärige Biersorten! 19. Warum wird das Jungbier nicht sofort abgefüllt und verkauft, sondern noch einer langwierigen Reifung unterzogen? 20. Wie werden alkoholfreie Biere bzw. Biere mit einem erniedrigten Alkoholgehalt hergestellt?

Exkursion 5 Weinherstellung in Winzereien Geschichte: Ein Blick 6.000 Jahre zurück E4 - S. 313

Wein wird durch Vergärung der im Traubenmost von Weinreben vorhandenen Saccharose mit Hefen hergestellt. Wie auch das Brauen von Bier gehört das Herstellen von Wein zu den ältesten biotechnologischen Prozessen. Die heute angebauten Kulturreben von Vitis vinifera ( Abb. 4.11) wurden durch Selektion und Züchtung von der Wildrebe Vitis silvestris abgeleitet. Vermutlich wurde der erste Wein bereits vor ca. 6.000 Jahren in Mesopotamien von den Sumerern angebaut. Für die Zeit seit 3.500 v. Chr. ist Weinherstellung auch in Ägypten belegt. Von hier aus gelangte das Wissen zur Weinherstellung in den Mittelmeerraum zunächst nach Griechenland und später nach Italien und Spanien. Die Ausbreitung von Weinanbau und -herstellung war stets auch mit der Ausbreitung von Herrschaftsreichen, kolonialen Aktivitäten und neuen Besiedlungen verbunden. Auf diese Weise gelangte diese Technologie dann auch nach Nord- und Südamerika, Südafrika, Neuseeland und Australien. Heute werden Weinreben in nahezu allen Regionen der Erde angebaut, in denen die klimatischen Voraussetzungen hierfür gegeben sind. Jährlich werden weltweit ca. 30 Milliarden Liter Wein produziert.

Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie

Die Etablierung des Weinanbaus in Deutschland verdanken wir den Römern. Als die Römer vor ca. 2.100 Jahren auch die Gebiete im heutigen Deutschland eroberten, führten sie besonders an Rhein und Mosel den Anbau der Weinrebe ein. Nach dem Niedergang des römischen Reiches verlor die Weinherstellung in den damaligen germanischen Gebieten zunächst an Bedeutung. Das hauptsächlich in Klöstern bewahrte know how des Weinanbaus und der Weinherstellung wurde im 8. Jahrhundert n. Chr. besonders durch Karl den Großen wiederbelebt. In Deutschland gibt es 13 Weinanbaugebiete, in denen Winzer und Genossenschaften Wein aus dem Saft der Weinrebe herstellen ( Tabelle 4.10). Zurzeit werden in Deutschland auf ca. 100.000 ha in ca. 2.400 Einzellagen Weinreben angebaut, und es werden jährlich ungefähr 900 Mio l Wein produziert. Biochemie der Ethanolbildung Die enzymatische Spaltung von Saccharose ( Abb. 4.15) ist der erste biochemische Schritt bei der Zuckervergärung. Hefen Tabelle 4.10. Die 13 Weinanbaugebiete besitzen hierfür das Enzym Invertase, Deutschlands welches das Disaccharid Saccharose in die • Ahr • Nahe Monosaccharide Fructose und Glucose spaltet. Beide Monosaccharide werden • Baden • Pfalz anschließend über den Fructose-1,6-bis• Franken • Rheingau phosphat-Weg in Pyruvat umgewandelt. • Hessische • Rheinhessen Pyruvat wird dann durch das Enzym Bergstrasse • Saale-Unstrut Pyruvat-Decarboxylase in Acetaldehyd • Mittelrhein • Sachsen und CO2 gespalten. Die bei der Glycolyse in • Mosel-Saar-Ruwer • Württemberg Form von reduzierten Pyridinnukleotiden (NADH + H+) anfallenden Reduktionsäquivalente werden im letzten Schritt von der Alkohol-Dehydrogenase auf Acetaldehyd übertragen, wodurch Ethanol entsteht. Hierdurch wird der Cofaktor NAD+ regeneriert und steht für die Oxidation weiterer Monosaccharidmoleküle zur Verfügung. Auf diese Weise entstehen aus jedem Molekül Saccharose je vier Moleküle Ethanol und CO2. Auf diese Vorgänge wurde im Versuch 21 bereits ausführlich eingegangen ( Abb. 3.51, Seite 115). Abb. 4.11.

319 Weinherstellung in Deutschland

Weinrebe

Ethanol ist zwar das Hauptprodukt, welches bei der Vergärung von Traubenmost durch Hefe entsteht, aber es werden von der Hefe auch noch zahlreiche andere Verbindungen meist in sehr niedriger Konzentration gebildet, die für Bukett und Geschmack von Wein von entscheidender Bedeutung sind und deren An- oder Abwesenheit letztlich die Qualität eines Weines bestimmt. Die Ursache für die Entstehung der Nebenprodukte ist darin zu sehen, dass wir es beim Traubenmost nicht mit einer reinen Saccharoselösung zu tun haben, auf welche die Gärgleichung anzuwenden ist. Neben Saccharose liegen im Traubenmost noch viele andere chemische Verbindungen vor. Außerdem gilt die Gärgleichung nur für nichtwachsende Hefezellen. Wachsen Hefe-

H H H

C

C

OH

H H Ethanol

V21 - S. 114

Die Entstehung von Nebenprodukten

320

4 Kurzexkursionen und Demonstrationen

zellen, so entstehen natürlich während der Umwandlung von Saccharose zu Ethanol Intermediate, die teilweise für anabolische Zwecke benötigt und nicht in Ethanol umgewandelt werden. Aus Platzgründen kann hier nur auf einige wenige Verbindungen eingegangen werden. Entstehung von Glycerin V22 - S. 119

Organische Säuren als Nebenprodukte

In geringen Mengen wird durch die Hefe auch Glycerin als Nebenprodukt gebildet. An anderer Stelle im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM wird gezeigt, dass der Stoffwechsel der Hefe zur gezielten Produktion von Glycerin genutzt werden kann, wenn dafür gesorgt wird, dass Acetaldehyd nicht mehr als Elektronenakzeptor zur Verfügung steht. In einem geringen Umfang tritt dies hier auch bei der Vergärung der Saccharose durch Hefe auf, da die Hefezellen im Traubenmost jedoch auch wachsen und sich vermehren und Intermediate der Glykolyse und Acetyl-CoA für die Synthese von Zellbestandteilen benötigt. Dadurch steht letztlich zu wenig Acetaldehyd zur Verfügung, und Dihydroxyacetonphosphat muss als Elektronenakzeptor aushelfen. In beträchtlicher Menge kann Weinsäure ( Abb. 4.12) im Wein auftreten. Diese organische Säure kann nicht wieder abgebaut werden und kristallisiert häufig als sogenannter Weinstein aus. Dies kann auch noch nach der Abfüllung in den Flaschen geschehen und ist kein Grund zur Beunruhigung. Früher war Weinstein ein wichtiger Ausgangsstoff zur Herstellung von Pyruvat (Brenztraubensäure). Pyruvat wurde durch „Brenzen“ aus Weinsäure hergestellt.

H H

C

COOH

OH

H

C

OH

H

C

OH

H Glycerin

H HO

C

OH

C

H

H

C

H H

COOH

Weinsäure

Äpfelsäure

OH

OH

COOH HO C

COOH

H H

C

H3C

C

O C

O H3C

C

Daneben können bei der Weinherstellung OH OH H H auch noch biochemische Vorgänge anderer Milchsäure Essigsäure Mikroorganismen von Bedeutung sein. Von Methanol einigen Winzern wird der Hefegärung häufig Abb. 4.12. Organische Säuren, die als Nedie sogenannte Malo-Lactat-Fermenta- benprodukte im Wein zu finden sind tion nachgeschaltet. Bei dieser durch Milchsäurebakterien – besonders von der Gattung Oenococcus – durchgeführten Gärung wird Äpfelsäure zu Milchsäure und CO2 vergoren. Da durch diese Malo-Lactat-Fermentation eine stärkere Säure in eine schwächere umgewandelt wird, wird der saure Charakter eines Weins gemindert, der Wein milder. Weitere Nebenprodukte

V37 - S. 188

In geringen Mengen entsteht durch den Abbau von Pektinen auch Methanol. Längerkettige Alkohole (Propanol, 2-Butanol, 2-Methylpropanol, 3-Methylpentanol und verschiedene Pentanole) entstehen besonders beim Abbau der Aminosäuren Isoleucin, Leucin, Threonin und Valin und werden als Fuselöle bezeichnet. Lässt sich im Wein Essigsäure nachweisen, muss eine Kontamination mit Essigsäurebakterien vorgelegen haben, die Ethanol mit Sauerstoff unvollständig zu Essigsäure oxidiert haben. Dieser Vorgang muss unterbunden werden, da Wein dadurch ungenießbar wird. Essigsäurebakterien werden in einem kontrollierten Prozess eingesetzt, um aus Wein Weinessig herzustellen. Hierauf wird an anderer Stelle im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM eingegangen. Auch 2,3-Butandiol und andere Diole treten im Wein in der Regel in nennenswerten Konzentrationen auf. Problematisch ist das Auftreten von Diacetyl und Acetoin, da besonders Diacetyl den Geschmack von Wein negativ beeinflusst. Die Biosynthese beider Verbindungen leitet sich von 2,3-Butandiol ab. Die Auflistung von Nebenprodukten ließe sich noch fortführen und umfasst auch anorganische (H2S und SO32-) und organische Schwefelverbindungen (z. B. Dimethylsulfid).

Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie

Der Befall der Weintrauben mit dem Pilz Botrytis cinerea führt zur sogenannten Edelfäule und ist ein durchaus erwünschter Vorgang. Edelfäule ist Voraussetzung für die Herstellung der deutschen Qualitätsweine mit den Prädikaten „Auslese“, „Beerenauslese“ und „Trockenbeerenauslese“ (s. u.) und auch zahlreicher bekannter ausländischer Weine. Durch die von Botrytis cinerea ausgelöste Schrumpfung der Beeren und Edelfäule kommt es nicht nur zu einer relativen Konzentrierung des Zuckers und wichtiger Aromastoffe in den Trauben, die Inhaltsstoffe verändern sich auch qualitativ. Galactose, Arabinose, Galactarsäure, Polysaccharide wie Mannane und Glucane, das Maillardprodukt 4,5-Dimethyl-3-hydroxy-2(5)-furanon sowie Ethyl-9-hydroxynonanoat sind nur einige Beispiele. Hierauf kann aus Platzgründen nicht im Detail eingegangen werden.

321 Edelfäule

Vorgänge bei der Weinherstellung Die Herstellung von Wein umfasst eine Vielzahl von einzelnen Schritten, die nicht bei allen Weinen in der gleichen Reihenfolge durchgeführt werden. Auch gibt es für einzelne Teilschritte mehr oder weniger große Variationen, die z. T. für bestimmte Weine spezifisch sind oder da der Winzer seine besondere Note einfließen lassen möchte. Die Ernte der Trauben vom Rebstock wird entweder maschinell oder mit der Hand durchgeführt. Die Trauben werden „gelesen“. Art, Ort und Zeitpunkt der Lese sind für die Qualität des Weines von großer Bedeutung. Anschließend werden die Trauben zum Hof des Winzers oder zur Genossenschaft transportiert. Auf der Oberfläche der Beeren befinden sich bereits natürlicherweise eine große Anzahl von Hefen wobei Zellen von Saccharomyces cerevisiae in der Regel in deutlich geringerer Anzahl als Vertreter anderer Hefen wie besonders Hanseniaspora uvarum vorhanden sind. Daneben können noch Vertreter der Gattungen Candida, Metschnikowia und Pichia sowie andere unerwünschte Hefen, aber auch Essigsäure- und Milchsäurebakterien vorhanden sein. Auf edelfaulen Beeren hat sich der oben besprochene Pilz Botrytis cinerea angesiedelt. Um einen kontrollierten und sicheren Verlauf der Fermentation sicherzustellen, wird heute fast immer eine Reinzuchthefe von Saccharomyces cerevisiae als Starterkultur zugegeben.

Ernte der Trauben

Die Trauben werden entrappt, d. h. die Beeren werden von den Stielen und Stängeln abgetrennt. Anschließend werden die Trauben gemahlen, wodurch die Maische entsteht. Mit Ausnahme von Qualitätsweinen mit Prädikat darf der Traubenmost in diesem Stadium mit Rübenzucker angereichert werden, um bei der Gärung auf einen höheren Alkoholgehalt kommen zu können. Diese Anreicherung wird als Chaptalisation bezeichnet. In der Regel erfolgt in der Maische auch eine Schwefelung mit SO2 oder Kaliumpyrosulfit, um vorhandene Mikroorganismen abzutöten.

Herstellung der Maische

In einer Presse werden die festen Bestandteile (Beerenhäute, Stiele, Stängel) als Trester abgetrennt. Zurück bleibt der Traubenmost. Dieser Vorgang wird als Kelterung bezeichnet und wird bei der Herstellung von Rotweinen erst im Anschluss an die Gärung durchgeführt. Der Traubenmost kann u. U. weiter behandelt werden, um die spätere Qualität des Weines zu steigern. So sind Vorbehandlungen mit Bentonit zur Abtrennung von Trübstoffen oder Zugabe von Kalk zur Reduzierung von Säure erlaubt. Auch hier ist eine Chaptalisation erlaubt, sofern es sich nicht um die Herstellung von Qualitätsweinen mit Prädikat handelt.

Herstellung von Traubenmost

Die Vergärung der Maische (Rotwein) bzw. des Traubenmostes (Weißwein und Roséwein) erfolgt durch Hefen. Früher erfolgte dies spontan durch dort bereits vorhandene Hefen. Heute werden meist Reinzuchthefen als Starterkulturen zugesetzt, um die Gärung kontrolliert durchführen zu können. Auch wenn einzelne Winzer die Gärung durchaus noch in Holzfässern durchführen, so werden für das Gros der Weine die Gärungen heute in riesigen Stahltanks durchgeführt. Bei Temperaturen um 20 °C kann

Gärung

322

4 Kurzexkursionen und Demonstrationen

die Gärung bereits nach 10 Tagen abgeschlossen sein, und der Jungwein ist fertig. Hier gibt es jedoch bezüglich der Temperatur und der Dauer sehr große Unterschiede, welche die Winzer nutzen und hier ihre Erfahrung einfließen lassen. In Abhängigkeit vom Zuckergehalt und der Gärführung werden in der Regel Ethanolgehalte zwischen 7 und 15 % (vol/vol) erreicht. Ausbau und Reifung des Weins

Zunächst werden die Hefezellen vom Jungwein abgetrennt. Bei Rotwein wird hier die Kelterung nachgeholt. In der Regel wird der Jungwein zunächst noch einige Zeit gelagert, um ihn reifen zu lassen. Dies kann z. B. in frischen Eichenholzfässern geschehen. Aus dem Holz herausgelöste Stoffe geben diesen Barriqueweinen ihre besondere Note; außerdem werden u. a. Gerbstoffe vom Holz absorbiert. Häufig (besonders außerhalb Deutschlands und bei Rotweinen) wird auch Gelegenheit zur bereits oben erwähnten Malo-Lactat-Fermentation gegeben.

Schönen

Es können sich eine Reihe von weiteren Maßnahmen anschließen, um Qualität und Lagerfähigkeit des Weins zu verbessern. Mit Hilfe von Schwefel werden Aldehyde abgefangen und Mikroorganismen abgetötet. Durch Zugabe von konzentriertem Traubenmost (Süßreserve) kann die Restsüße erhöht werden.

Abfüllung

Der fertige Wein wird in sterilisierte Flaschen abgefüllt, verkorkt oder mit einem Schraubverschluss versehen und etikettiert. Rebsorten und Weinsorten Von Vitis vinifera sind etwa 8.000 Rebsorten bekannt, von denen heute ungefähr 800 als anbauwürdig gelten. In Deutschland werden insgesamt ca. 50 Rebsorten als Keltertrauben angebaut. Bekannte und verbreitete weiße Rebsorten sind in Deutschland Bacchus, Grauburgunder, Gutedel, Kerner, Müller-Thurgau, Riesling, Ruhländer, Scheurebe, Silvaner und Weißburgunder; rote Rebsorten sind in Deutschland vor allem Dornfelder, Portugieser, Spätburgunder und Trollinger. Weißwein wird ausschließlich aus weißen Rebsorten hergestellt. Der Traubensaft wird in der Maische von Stielen und Beerenhäuten abgetrennt, bevor die Gärung einsetzt. Rotwein wird aus roten Rebsorten gewonnen. Die entrappten und zerquetschten Beeren werden in Gegenwart der Beerenhäute

Tabelle 4.11. Prädikatsstufen bei deutschen Weinen a) Kabinett • Wein aus reifen Trauben • Mostgewicht: 73 Grad Öchsle Spätlese • Wein aus vollreifen Trauben, die 7 Tage später als Kabinett geerntet werden • Mostgewicht: 85 Grad Öchsle Auslese • nur aus vollreifen und edelfaulen Trauben • Kranke und unreife Beeren müssen ausgesondert werden • Mostgewicht: 95 Grad Öchsle Beerenauslese • nur aus überreifen und edelfaulen Beeren • Handlese • Mostgewicht: 125 Grad Öchsle Trockenbeerenauslese • nur aus durch Edelfäule eingeschrumpften Beeren • Handlese • Mostgewicht: 150 Grad Öchsle Eiswein • Trauben müssen bei Lese und Kelterung gefroren (min. -8 °C) sein. Das Eis bleibt beim Pressen der Beeren zurück, dadurch Konzentrierung von Zucker und anderen Inhaltsstoffen. • Mostgewicht: 125 Grad Öchsle a) Das vorgeschriebene Mostgewicht ist abhängig von Rebsorte und Anbaugebiet; angegeben sind hier die Mindestwerte für die Rebsorte „Riesling“ und für das Anbaugebiet „Rheingau“

Tabelle 4.12. Bezeichnungen für den Süßegrad bei deutschen Weinen Trocken Halbtrocken Lieblich Süß

maximal 9 g/l Restzucker 9 bis 18 g/l Restzucker 18 bis 45 g/l Restzucker mindestens 45 g/l Restzucker

Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie Tabelle 4.13. Tafelwein

323

Weinqualitäten • einfacher Wein, Verschnitt

Qualitätswein (Q.b.A)

• • • • •

aus einem der 13 Anbaugebiete aus einer empfohlenen Rebsorte Mindestmostgewicht: 50 bis 70 Grad Öchsle Anreicherung durch Zuckerung vor der Gärung erlaubt Prüfnummer muss angegeben werden

Qualitätswein mit Prädikat

• • • •

aus einer einzelnen der ca. 2.400 Lagen nur aus einer Rebsorte Mindestmostgewicht: 67 bis 154 Grad Öchsle Anreicherung durch Zuckerung vor der Gärung nicht erlaubt, jedoch darf nach der Gärung Traubensaftkonzentrat (Süßreserve) zugegeben werden

vergoren. Der entstehende Alkohol löst die in der Beerenhaut und nicht im Fruchtfleisch enthaltenen Farb- und Gerbstoffe heraus. Durch Erhitzen der Maische kann die Herauslösung der Farbstoffe noch gesteigert werden. Wichtige Farbstoffe sind die Anthocyane ( Abb. 4.13). Roséwein wird ebenfalls aus roten Rebsorten hergestellt. Die Beeren werden entrappt, feste Bestandteile wie Stiele und Beerenhäute werden jedoch vor der Gärung von der Maische abgetrennt. Rebsorte, Beschaffenheit des Bodens, Klima und Gärungsführung sowie Erfahrung und Experimentierfreude des Winzers sind die OH entscheidenden Faktoren für Qualität und + O - Geschmacksbild des Weines. In Deutschland HO R2 Cl werden nach dem gültigen Weingesetz drei Klassen von Weinqualitäten unterschieden ( Tabelle 4.13). Tafelwein ist ein VerR3 schnitt aus verschiedenen deutschen AnbauOH gebieten. Die nächst höhere Stufe ist Anthocyanidin Qualitätswein bestimmter Anbaugebiete (Q.b.A.). Wein dieser Qualität stellt Pelargonidin: R1= H, R2 = H, R3 = OH ebenfalls einen Verschnitt verschiedener Cyanidin: R1 = OH, R2 = H, R3 = OH Weine dar, die aber aus einem einzigen Delphinidin: R1 = OH, R2 = OH, R3 = OH Anbaugebiet stammen müssen. Die höchste Päonidin: R1= OCH3, R2 = H, R3 = OH Stufe ist der Qualitätswein mit Prädikat Petunidin: R1 = OH, R2 =OCH3, R3= OH (Q.m.P.). Hierbei handelt es sich um Wein, R1 = OCH3, R2 = OCH3, R3 =OH Malvidin: der aus den Trauben eines eng definierten Bereichs, einer Einzellage, hergestellt wurde. Abb. 4.13. Strukturformel von AnthoEs werden sechs verschiedene Prädikate cyanidin, dem Grundgerüst der Anthocyane unterschieden ( Tabelle 4.11). Meist angeund einige Beispiele geben ist die Geschmacksrichtung eines Weines bezogen auf die Süße. Nach dem Deutschen Weinrecht sind vier Bezeichnungen gebräuchlich ( Tabelle 4.12). Es sei bemerkt, dass die für Schaumwein und Sekt gleicher Bezeichnungen zugelassenen Restzuckerwerte hiervon abweichen und dass es hier auch zusätzliche Stufen gibt.

Weinqualitäten

Federweißer (auch Sauser, Bitzler oder Sturm) ist Traubenmost, der sich noch in der Gärung befindet und bei dem die Hauptgärung noch nicht abgeschlossen ist. Tafel- und Qualitätsweine können nach Zusatz von 2,5 % (wt/vol) Saccharose und Hefekulturen

Neben- und Folgeprodukte

R1

324

4 Kurzexkursionen und Demonstrationen

weiter zu Schaumweinen (Champagner, Sekt) vergoren werden. Diese Gärung erfolgt entweder direkt in den Flaschen oder in Tanks. Oben wurde bereits erwähnt, dass aus Wein mit Hilfe von Essigsäurebakterien Weinessig hergestellt werden kann. Trester wird zu Tresterbränden wie z. B. Grappa verarbeitet. Wein selbst dient als Vorlage zum Brennen von Branntweinen (Armagnac, Cognac, Weinbrand). Weiterführende Literatur Dittrich HH (1995) Wine and Brandy. In: Rehm HJ, Reed G, Pühler A, Stadler P (eds) Biotechnology. vol 9, 2nd edn., Wiley-VCH, pp 463-504 Fleet GH (1993) Wine – Microbiology and biotechnology. Harwood Academic Publishers, Chur Johnson H (1985) Der große Weinatlas. Die Weine und Spirituosen der Welt. 18. Aufl., Hallwag, Bern

Nachgefragt 1. Schildern Sie die Ausbreitung des Weinbaus von seinen Anfängen bis zum heutigen Stand! 2. Beschreiben Sie die qualitative und quantitative Zusammensetzung der Mikroorganismenflora auf Weinbeeren! 3. Was versteht man unter „Starterkulturen“? 4. Welches Enzym ist bei Saccharomyces cerevisiae für die Spaltung von Saccharose verantwortlich? 5. Beschreiben Sie den Stoffwechselweg, mit dem Hefe Saccharose zu Ethanol vergärt und welche Schlüsselenzyme hieran beteiligt sind! 6. Wie unterscheidet sich die Herstellung von Weiß-, Rot- und Roséweinen? 7. Woher stammen die Pigmente, die dem Rotwein seine typische Farbe geben, und wie heißen diese? 8. Welche Rolle spielt Botrytis cinerea bei der Weinherstellung? 9. Wann und in welcher Form darf bei der Weinherstellung nach dem deutschen Weingesetz zusätzlicher Zucker eingesetzt werden? 10. Welche anderen chemischen Verbindungen entstehen neben Ethanol bei der Vergärung von Traubenmost durch Hefe? Aus welchen Bestandteilen der Biomasse entstehen diese Verbindungen?

11. Nennen Sie die Ursachen dafür, dass bei der Herstellung von Wein nicht nur einfach eine Vergärung von Saccharose nach der in jedem Lehrbuch beschriebenen Umsatzgleichung erfolgt! 12. Was versteht man unter Fuselölen? Zeichnen Sie deren chemische Strukturformeln! Woraus entstehen diese? 13. Nennen Sie zwei Voraussetzungen, die gegeben sein müssen, damit im Wein Essigsäure entsteht! 14. Wie entsteht im Wein biochemisch Glycerin? 15. Was ist Weinstein und welche chemische Substanz kann hieraus hergestellt werden? 16. Was versteht man unter der „Malo-Lactat-Fermentation“ und welche Mikroorganismen führen diese durch? 17. Durch welche Vorgänge können die Konzentrationen von Zucker und anderer Inhaltsstoffe in den Beeren bzw. im Traubenmost erhöht werden? 18. Zählen Sie die sechs Prädikatsstufen bei deutschen Weinen auf! 19. Was ist bei der Herstellung von Eiswein zu beachten? 20. Wie werden Schaumweine, Branntweine und Grappa aus Wein bzw. bei der Weinherstellung anfallenden Reststoffen hergestellt?

Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie

Silage in der Landwirtschaft

Abb. 4.14.

Silageverfahren

325

Exkursion 6 Unter Silage, auch Silofutter, versteht man durch Milchsäuregärung konservierte Futterpflanzen. Silage spielt als Futtermittel in der Rinder- und Schweinemast eine bedeutende Rolle. Es wird entweder ganzjährig oder bei Weidevieh überwiegend im Winter verfüttert. Als Siliergut geeignete Futterpflanzen (z. B. Rübenblätter, Gräser, Mais, kleeartige Futterpflanzen, Hafer) werden hierzu in Silos eingelagert (einsiliert) und luftdicht abgeschlossen. Drei Silotypen sind bekannt und etabliert. Relativ selten werden Hochsilos ( Abb. 4.14, oben) aus Metall, Beton oder Kunststoff eingesetzt. Verbreiteter und technisch weniger aufFlachsilos wendig sind befahrbare ( Abb. 4.14, Mitte), die nach unten und meist auch zu den Seiten mit Betonplatten begrenzt sind. Auf der Bodenplatte wird das Siliergut in mehreren Schichten übereinander aufgebracht, welche jeweils durch Überfahren mit Fahrzeugen verdichtet werden. Hat das Silo die endgültige Füllhöhe erreicht, wird es mit einer UV-Licht beständigen Folie luftdicht abgedeckt. Eine Beschwerung durch Altreifen oder Sandsäcke sorgt für ein festes Aufliegen der Abdeckfolie auf dem Siliergut und auch für dessen weitere Komprimierung. Zunehmend häufiger werden Silageballen Silierungen auch in ( Abb. 4.14, unten) durchgeführt: Gemähtes Gras wird kurz nach der Ernte durch Ballenpressen zu ca. 1 m3 Material umfassenden Rund- oder Quaderballen komprimiert, und diese fest mit einer gegen UV-Licht resistenten Stretchfolie umhüllt. Entsprechend genutzte Grünflächen sind dann meist für einige Wochen mit weißen oder grünen Ballen „verziert“.

Prinzip und Verfahren

Beim Silageprozess vergären Milchsäurebakterien den Zuckeranteil der Pflanzenbiomasse, wobei u. a. Milchsäure entsteht. Nachdem das Siliergut einsiliert wurde, laufen in den ersten Stunden zunächst noch aerobe mikrobielle Umsetzungen ab. Es vermehren sich dann zunächst heterofermentative Milchsäurebakterien und nachfolgend besonders homofermentative Milchsäurebakterien, wodurch immer mehr Milchsäure entsteht. Dadurch kom-

Verlauf der Silierung

OH H3C

C

O C

H

OH

Milchsäure

V11 - S. 74

V10 - S. 70

326

4 Kurzexkursionen und Demonstrationen

V36 - S. 183

V12 - S. 77

men die aeroben Prozesse jedoch zum Erliegen. Durch die entstehende Milchsäure (ca. 10 bis 20 g/kg Siliergut) wird der pH-Wert stark abgesenkt. Bei einem optimalen Verlauf der Silierung werden pH-Werte zwischen 4,0 und 4,5 erreicht. Dies führt – ähnlich wie beim Sauerkraut – zu einer lang anhaltenden Konservierung und verhindert das Wachstum von Fäulnisbakterien bzw. Schadkeimen. Der niedrige pH-Wert unterdrückt auch weitgehend die Milchsäure-verwertenden Propionsäurebakterien.

Schadkeime

Coliforme Bakterien, Clostridien, Listeria monocytogenes, Hefen und Schimmelpilze werden in Silage als Schadkeime angesehen. Durch erhöhte Bildung von Essigsäure, Buttersäure und Ammoniak sowie durch unerwünschter Nährstoff- und Trockenmasseverluste vermindert sich die Qualität der Silage. Einige Schadkeime infizieren Tiere, die mit Silage gefüttert werden, was im Falle von Kühen zu Mastitis und sogar zur Kontamination der Milch sowie aus dieser hergestellten Folgeprodukte mit pathogenen Mikroorganismen führen kann.

Bedeutung des Sauerstoffausschlusses

Sauerstoff muss während der Silierung, aber auch beim Öffnen eines reifen Silos möglichst ausgeschlossen bleiben. Deshalb sind für Silierungen geschlossene Systeme zu verwenden. Auch muss der Anteil der in einem Silo zu Beginn der Silierung eingeschlossenen Luft möglichst gering sein. Je mehr Sauerstoff enthalten ist, desto länger dauern die energetisch günstigeren aeroben mikrobiellen Abbauvorgänge an, die jedoch mit einer für die Silierung ungünstigen Erwärmung verbunden sind. Sogar durch Zugabe von Trockeneis wird vereinzelt versucht, diese aeroben Vorgänge zu verlangsamen, um Nährstoffverluste zu vermindern. Diese aeroben Prozesse hören erst auf, wenn der Sauerstoff durch die aeroben Mikroorganismen selbst aufgezehrt ist oder wenn diese durch die starke Säurebildung der Milchsäurebakterien gehemmt werden. Deshalb ist auf eine hohe Verdichtung des Silierguts zu achten. Art und Feuchtigkeitsgehalt des Silierguts, Zeitpunkt der Ernte und Aufarbeitung des Silierguts sowie Verfahren beim Einsilieren haben einen großen Einfluss auf die Verdichtung des Silierguts und damit auch auf den Verlauf der Silierung sowie später auf die Stabilität der Silage. Wird Weidegras für die Silierung zu spät geschnitten, ist dessen Faseranteil höher und der Anteil niedermolekularer Kohlenhydrate entsprechend geringer; es kann schlechter verdichtet werden und es wird weniger Milchsäure gebildet. Ist das Siliergut zu stark angewelkt, dann ist der Trockenmasseanteil höher, und die Verdichtung wird erschwert.

Siliermittel

Häufig werden dem Siliergut zu Beginn CH2OH Siliermittel zugesetzt. Siliermittel sollen die HO CH2 O O Entstehung von Milchsäure unterstützen und beschleunigen. Durch Zusatz von OH HO O CH2OH Melasse, welche einen hohen Anteil SacchaHO rose ( Abb. 4.15) besitzt, wird das C/NOH OH Verhältnis erhöht. Abhängig von Art und Abb. 4.15. Saccharose Zustand des Silierguts wird ein Zusatz von 2 bis 8 % (wt/wt) Melasse empfohlen. Dadurch stehen den Milchsäurebakterien mehr Kohlenhydrate für die Milchsäuregärung zur Verfügung. Darüber hinaus kann durch den Klebeeffekt der Melasse auch eine bessere Verdichtung des Silierguts erreicht werden. Beide Einflüsse der Melasse sorgen nicht nur für eine schnellere, sondern auch für eine stärkere Absenkung des pH-Wertes. Organische Säuren (z. B. Ameisensäure, Propionsäure), aber auch Mineralsäuren werden dem Siliergut in Konzentrationen von ca. 0,5 % (wt/wt) zugesetzt, um gleich zu Beginn der Silierung einen niedrigeren pH-Wert einzustellen. Unternehmen, die sich auf die Herstellung von Starterkulturen spezialisiert haben, vertreiben Kulturen von homofermentativen Milchsäurebakterien (z. B. Lactobacillus plantarum DSM 4744 und Pediococcus pentosaceus DSM 4745), die in einer Impfdichte von ca. 106 bis 107 Lebend-

O H

C OH

eisen m A säu re H H H

C

C

H H rop P ion säu re

O C OH

Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie

327

zellen pro Gramm Siliergut zugesetzt werden. Hierdurch soll die Milchsäuregärung schnell und wirkungsvoll einsetzen. Die für eine ausreichende Absenkung des pH benötigte Zeit soll möglichst kurz sein. Bei einigen Siliergütern und bei einer gut laufenden Silierung kann der Prozess bereits innerhalb weniger Tage abgeschlossen sein. Weiterführende Literatur Es fällt schwer, dem Leserkreis dieses Buches geeignete Fachbücher über Silierung zu empfehlen. Die mikrobiologischen Grundlagen werden in Lehrbüchern für das Fach Mikrobiologie behandelt. Der Interessierte findet umfassende, meist praktische Informationen auf den Homepages von Firmen, die Siliermittel, Starterkulturen oder Geräte für die Silierung anbieten, oder von Organisationen, die Landwirte beraten.

Nachgefragt 1. Nennen Sie Beispiele von Grünfutter und Futterpflanzen, die häufig zur Herstellung von Silage verwendet werden! 2. Warum macht sich der Landwirt die Mühe der Silageherstellung und verfüttert das Grünfutter nicht direkt? 3. Warum muss bei der Herstellung von Silage in einem Flachsilo dieses unbedingt mit einer Folie abgedeckt werden? 4. Nennen Sie andere Formen, die neben Flachsilos zur Herstellung von Silage verwendet werden! 5. Warum und wie wirkt sich bei der Verwendung von Weidegras eine frühe Maht positiv auf die Durchführung der Silierung aus? 6. Nennen Sie Unterschiede in der Herstellung von Sauerkraut und Silage! 7. Beschreiben Sie die sukzessiven mikrobiellen Prozesse, die bei der Herstellung von Silage ablaufen! 8. Welche Gruppen von Mikroorganismen kommen hauptsächlich in Silage vor? 9. Warum setzt man bei der Herstellung von Silage häufig zusätzlich Melasse zu? 10. Was ist Melasse, und welche Hauptkomponenten enthält es? 11. Warum wird dem Siliergut zu Beginn des Silageprozesses häufig Säure (z. B. Ameisensäure) zugesetzt? 12. Zeichnen Sie die Strukturformelen von Ameisensäure, Propionsäure und Milchsäure!

13. Aus welcher Verbindung entsteht Milchsäure, und welches Enzym katalysiert den letzten Schritt ihrer Entstehung? Schreiben Sie die Reaktionsgleichung auf! 14. Wie unterscheiden sich heterofermentative und homofermentative Milchsäurebakterien hinsichtlich der Gärungsprodukte und der Wege für den Abbau von Glucose? 15. Wie viel Milchsäure (in Gramm) könnte theoretisch durch ein homofermentatives Milchsäurebakterium aus 180 g Glucose gebildet werden? 16. In Silage kommen neben Milchsäure häufig auch noch Essigsäure, Ethanol, Propionsäure und Buttersäure vor. Können diese Gärprodukte auch durch Milchsäurebakterien gebildet werden? Nennen Sie andere gärende Bakterien, welche diese Gärprodukte bilden! 17. Das zur Herstellung von Silage verwendete Grünfutter enthält auch viel Protein. Weshalb setzen sich bei einem gut geführten Silageprozess keine anaeroben, peptolytischen Bakterien (z. B. Vertreter der Gattung Clostridium) durch? 18. Weshalb spielen Propionsäurebakterien in Silage eher eine untergeordnete Rolle, obwohl viele von ihnen Milchsäure als bevorzugtes Substrat verwenden? 19. Was versteht man unter Siliermitteln? Nennen Sie Beispiele und begründen Sie deren Einsatz im Einzelnen! 20. Was versteht man unter Starterkulturen?

Symbiontische N2-fixierende Bakterien und Wurzelknöllchen

Demo 1

Unter der Fixierung von Stickstoff wird die enzymatische Reduktion von N2 zu NH4+ verstanden, die durch das Enzym Nitrogenase katalysiert wird. Es handelt sich wie die chemische Reduktion von Stickstoff beim Haber-Bosch-Verfahren um eine sehr stark endergone Reaktion, die pro mol reduziertem N2 ca. 16 bis 24 mol ATP verbraucht. Als Nebenprodukt tritt durch Reduktion von Protonen stets molekularer Wasserstoff (H2) auf. Die Nitrogenase ist ein sehr sauerstoffempfindliches Enzym, und die Natur hat eine Reihe von Strategien und Schutzmechanismen entwickelt ( Tabelle 3.22, Seite 82), damit auch aerobe Zellen Stickstoff fixieren können. Das Enzym kommt ausschließlich in Prokaryonten vor, und die biologische Stickstofffixierung ist eine – wenn auch verbreitete – exklusive Stoffwechselleistung der Prokaryonten ( Abb. 3.30, Seite 81).

Stickstofffixierung und Nitrogenase N N Stickstoff

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4 Kurzexkursionen und Demonstrationen

Abb. 4.16. Symbiosen zur Fixierung von N2 V13 - S. 81 V14 - S. 85

D4 - S. 343

Wurzelknöllchen bei Leguminosen (links) und Erle (rechts)

Neben der Stickstofffixierung durch freilebende Bakterien, die uns im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM bereits in zwei Versuchen begegnet ist, haben sich in der Natur eine Vielzahl von mutualistischen Symbiosen zwischen höheren Organismen und stickstofffixierenden Prokaryonten ausgebildet, die besonders effektive Formen der Fixierung von N2 darstellen. Während bei freilebenden Prokaryonten die Fixierung von Stickstoff in vielen Gattungen verbreitet ist und sogar bei den Archaea vorkommt, ist die endosymbiontische Fixierung von Stickstoff auf vier Bakteriengruppen bzw. Gattungen beschränkt. Es handelt sich hierbei um Bakterien, die zur Gruppe der Rhizobiaceae gehören, um zahlreiche Vertreter der sehr großen Gruppe von Cyanobakterien, um Vertreter der Gattung Frankia sowie um Gluconacetobacter diazotrophicus. Die ektosymbiontischen Beziehungen zwischen Pilzen und Cyanobakterien bei einem Teil der Flechten ist Gegenstand einer anderen Demonstration im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM. Besonders verbreitet und für die Landwirtschaft wichtig sind Symbiosen zwischen höheren Pflanzen und N2-fixierenden Bakterien. Zwischen diesen Organismengruppen haben sich vielseitige endo- und ektosymbiontische Beziehungen ausgebildet, die hier besprochen werden sollen.

Ektosymbiosen

Ektosymbiontische Beziehungen zwischen Pflanzen und Bakterien zur Fixierung von N2 sind zumindest in der Rhizosphäre, wo auch immer freilebende N2-fixierende Bakterien vorkommen, häufig nicht klar zu erkennen und zu bewerten. Ektosymbiosen mit klaren Strukturen an oberirdischen Pflanzenteilen werden vorwiegend von Cyanobakterien ausgebildet. Beispiele sind die Symbiosen von Anabaena azollae ( Abb. 4.17) und Vertretern der Gattung Nostoc in den Gewebehohlräumen vom Wasserfarn bzw. verschiedener Lebermoose. Nostoc punctiforme bildet Symbiosen an den Drüsen der Blattstielansätze der tropischen Staude Gunnera macrophylla aus.

Endosymbiosen

Im Gegensatz zu Ektosymbiosen sind endo- von Anabaena azollae symbiontische Beziehungen immer klar zu erkennen und zu definieren, da der Endosymbiont in einer Wirtszelle vorliegt und dort eindeutig nachgewiesen werden kann.

Abb. 4.17.

Lichtmikroskopisches Präparat

Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie

Wurzelknöllchen sind eine Form in der sich die Endosymbiose zwischen Pflanzen und N2-fixierenden Bakterien äußert. Durch N2-fixierende Rhizobien hervorgerufene Wurzelknöllchen sind bei fast allen Leguminosen verbreitet. Die taxonomische Zuordnung der Rhizobien und verwandter Bakterien wird zur Zeit umfassend überprüft. Dies hat in den letzten Jahren zur Einführung vieler neuer Gattungen und zu zahlreichen Umbenennungen geführt. Selbst die Gattung Agrobacterium existiert nicht mehr. Viele ehemalige Angehörige dieser Gattung finden sich nun in der Gattung Rhizobium wieder wie z. B. auch Agrobacterium tumefaciens (jetzt: Rhizobium radiobacter). Momentan werden die Vertreter der Rhizobien sechs Gattungen zugeordnet: Allorhizobium, Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium, Sinorhizobium. Auch bei Bäumen kommen Wurzelknöllchen häufig vor. Von einer Ausnahme abgesehen handelt es sich hier immer N2-fixierende Vertreter der zu den Actinomyceten gehörenden Gattung Frankia. Die meisten der in den Wurzelknöllchen von Holzpflanzen nachgewiesenen Vertreter der Gattung Frankia wurden noch nicht detailliert im Hinblick auf ihre taxonomische Zuordnung untersucht, und bisher liegt mit Frankia alni erst eine anerkannte Art vor. Lediglich eine kleine Auswahl von Wirten für die Besiedlung mit Rhizobien oder Frankia ist in Tabelle 4.14. aufgeführt. Die einzigen Wurzelköllchen, die bei Holzgewächsen nicht von Frankia sondern von Vertretern der Rhizobiaceae ausgebildet werden, treten bei Parasponia andersonii, einem Vertreter der Ulmengewächse, auf.

329

D2 - S. 333

Es gibt noch zwei andere interessante Formen der endosymbiontischen N2-Fixierung: Azorhizobium caulinodans bildet bei Sesbania rostrata Stängelknöllchen. Im Leitgewebe von Zuckerrohr-Pflanzen (Saccharum officinarum) wurde Gluconacetobacter diazotrophicus als N2-fixierender Endosymbiont identifiziert. Die Ausbildung von Wurzelknöllchen bei Leguminosen und die Ausbildung einer aktiven Nitrogenase sind komplizierte Vorgänge, an denen ein Vielzahl von Proteinen, Polysaccharid-ähnlichen Molekülen und andere Verbindungen beteiligt sind. Diese Moleküle initiieren und regulieren alle Vorgänge von der Anlockung der Rhizobien über die Bildung der Nitrogenase bis hin zur Schaffung optimaler Bedingungen für dieses Enzym. Hieran sind mehrere Dutzend Gene (z. B. nod, nif, fix, dct) beteiligt, von denen die meisten auf großen in den Rhizobien vorhandenen Plasmiden lokalisiert sind. Nicht jeder Vertreter der Rhizobien kann jede Leguminose infizieren. Selbst innerhalb einer Spezies der verschiedenen Gattungen der Rhizobiaceae ist die Spezifität für eine bestimmte Leguminose auf bestimmte Stämme (Biovare) beschränkt (s. u.). Die Ausbildung der Wurzelknöllchen kann in fünf Abschnitte unterteilt werden. Im ersten Abschnitt erfolgt die Anlockung und Vermehrung der Rhizobien in der Rhizosphäre der Leguminosen. Hierzu scheiden die Wurzelhaarzellen eine Vielzahl von Substanzen aus, zu denen auch Flavonoide und Isoflavonoide gehören. Im zweiten Abschnitt erfolgt die spezifische Erkennung zwischen den Wurzelhaarzellen der Leguminose und eines passenden Biovars der Rhizobien sowie die Anheftung der Bakterienzelle an die Oberfläche der Wurzelhaare. Hieran sind von beiden Seiten Adhäsionsproteine wie z. B. Lektine und polysaccharidähnliche Moleküle beteiligt. Von besonderer Bedeutung sind die von der Bakterienzelle synthetisierten Nodulationsfaktoren. Diese Nodulationsfaktoren stellen modifizierte Chitinmoleküle dar, bei denen das Chitinmolekül mit verschiedenen Verbindungen (langkettigen Fettsäuren, Sulfatresten) substituiert ist. Durch unterschiedliche Substitutionen bildet jeder Stamm der Rhizobien Nodulationsfaktoren mit einer individuellen Struktur, wodurch eine wirtsspezifische Anheftung der Bakterienzelle an die Oberfläche der Wurzelhaare vermittelt wird. Im dritten Schritt erfolgt dann die Invasion der Rhizobienzelle in das Wurzelhaar. Ausgelöst durch weitere Nodulationsfaktoren erfolgt zunächst meist ein charakteristisches Kräuseln der Spitze des Wurzelhaares, bevor die Bakterienzellen dort

Von der Infektion bis zum Wurzelknöllchen

330

4 Kurzexkursionen und Demonstrationen Tabelle 4.14. Symbiosen von Pflanzen mit N2-fixierenden Bakterien Wirtspflanze N2-fixierendes Bakterium Wurzelknöllchen bei Leguminosen Bohne (Phaseolus sp.) Erbse (Pisum sp.) Klee (Trifolium sp.) Luzerne (Medicago sp.) Sojabohne (Glycine max)

Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli Rhizobium tropici Rhizobium leguminosarum biovar viciae Rhizobium leguminosarum biovar trifolii Sinorhizobium meliloti Bradyrhizobium elkanii Bradyrhizobium japonicum Sinorhizobium fredii

Wurzelknöllchen bei Ulmengewächsen Parasponia andersonii

Rhizobium sp.

Wurzelknöllchen bei Bäumen Schwarzerle (Alnus glutinosa) Büffelbeere (Shepherdia argenta) Gagelstrauch (Myrica gale) Ölweide (Elaeagnus angustifolia) Rutenstrauch (Casuarina cunninghamiana) Sanddorn (Hippophae rhamnoides) Seckelblume (Seanothus americanus) Silberwurz (Dryas octopetala)

Frankia alni Frankia sp. Frankia sp. Frankia sp. Frankia sp. Frankia sp. Frankia sp. Frankia sp.

Stängelknöllchen bei Leguminosen Sesbania rostrata

Azorhizobium caulinodans

Leitgewebe Zuckerrohr (Saccharum officinarum)

Gluconacetobacter diazotrophicus

eindringen. Im vierten Abschnitt wachsen die Rhizobien zu einem überwiegend aus Cellulose bestehenden und immer größer werdenden so genannten Infektionsschlauch aus, durch den die Bakterienzellen bis zur Hauptwurzel wandern und benachbarte Wurzelzellen infizieren können. Im fünften Abschnitt wird nun, wieder durch Nodulationsfaktoren ausgelöst, das Wachstum der Wurzelzellen stark angeregt, wodurch ein zunehmend größer werdendes Wurzelknöllchen entsteht. Gleichzeitig vermehren sich die Zellen der Rhizobien, werden größer und nehmen immer unregelmäßigere und auch verzweigte Formen an. Dabei wird auch die Synthese des Enzyms Nitrogenase induziert. Zum Schluss sind in jeder Wurzelzelle der Pflanze mehrere Dutzend dieser jetzt als Bacteroide bezeichneten Bakterienzellen vorhanden, und das reife Wurzelknöllchen besitzt einen Durchmesser von einigen wenigen Millimetern. Leghämoglobin: ein gemeinsames Produkt

Leghämoglobin ist ein rotes, eisenhaltiges Protein, welches den Wurzelknöllchen ihre typische rosa Farbe verleiht. Es ist ein Sauerstoff bindendes Protein mit einer dem Myoglobin ähnelnden Struktur und besteht aus zwei Komponenten: dem Apoprotein und dem Protohäm als prosthetischer Gruppe. Leghämoglobin wird gemeinschaftlich von beiden Partnern der Endosymbiose synthetisiert. Während die Bacteroide das Protohäm synthetisieren, stellen die Pflanzenzellen das Apoprotein bereit. Da Leghämoglobin Sauerstoff sehr effizient bindet, bleibt die Konzentration von freiem Sauerstoff relativ niedrig. Auf diese Weise trägt Leghämoglobin dazu bei, dass die Bacteroide mit ihrem strikt aeroben Stoffwechsel mit einer konstant niedrigen aber ausreichenden

Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie

331

Menge Sauerstoff versorgt werden, um die energieliefernden Atmungsprozesse ablaufen lassen zu können. Gleichzeitig wird die Konzentration von freiem Sauerstoff im Hinblick auf eine optimale Aktivität der sauerstoffempfindlichen Nitrogenase niedrig genug gehalten. Dadurch wird eine insgesamt optimale Stoffwechselaktivität der Bacteroide sichergestellt. Dies ist in Übereinstimmung mit der Beobachtung, dass die meisten endosymbiontisch N2-fixierenden Rhizobien auch freilebend N2 fixieren können, allerdings meist nur unter mikroaerophilen Bedingungen. Messungen haben ergeben, dass pro Hektar Land, auf dem Leguminosen angebaut werden, pro Jahr zwischen 100 und 200 kg N2 fixiert werden. Da Leguminosen weltweit auf ca. 300 Millionen Hektar landwirtschaftlicher Nutzfläche angebaut werden, ergibt sich alleine hieraus eine Fixierung von jährlich 30 bis 60 Millionen Tonnen N2. Der Gesamtbetrag der globalen endosymbiontischen N2-Fixierung ist natürlich noch viel höher, da auch noch die endosymbiontische N2-Fixierung durch Rhizobien auf nicht landwirtschaftlich genutzten Flächen sowie die der Holzpflanzen addiert werden muss. Hieraus ergibt sich, dass der Hauptanteil des in allen terrestrischen Ökosystemen biologisch fixierten N2, welcher auf 140 Millionen Tonnen Stickstoff geschätzt wird, durch endosymbiontisch lebende Bakterien erfolgen muss. Nach diesen Abschätzungen und nach anderen Untersuchungen ist die endosymbiontische N2-Fixierung pro Hektar etwa 20- bis 100-mal höher als die N2-Fixierung durch freilebende Bakterien. Die Auswirkungen der endosymbiontischen N2-Fixierung auf das Pflanzenwachstum und die Erträge werden offensichtlich, wenn Leguminosen, die nicht mehr mit Rhizobien infiziert werden können, und Wildtyp-Pflanzen auf einem Feld nebeneinander angebaut werden. Andere Versuche haben ergeben, dass die Anzahl der in einem Boden vorhandenen Rhizobien viel zu gering ist, um zu einer optimalen Besiedlung und Infektion der Pflanzen zu führen, wenn auf diesen Böden Leguminosen erstmals angebaut werden. Auf diesen Böden können die Pflanzenerträge um 50 % und mehr gesteigert werden, wenn auf sie Präparate mit Kulturen eines geeigneten und zur entsprechenden Leguminose passenden Biovars von Rhizobien ausgetragen wurden. Erst in den nachfolgenden Jahren ist dann für einen erneuten Anbau von Leguminosen die Keimzahl der Rhizobien ausreichend hoch. Hierauf haben sich zahlreiche Firmen spezialisiert, die Rhizobienpräparate zur Inokulation von Böden kommerziell vertreiben. Die Firma Liphatec in Milwaukee (Wisconsin, USA) vertreibt Präparate von mehr als einhundert Rhizobienstämmen alleine zur Vorbereitung von Böden, auf denen Sojabohnen angebaut werden sollen. Aufgabe Ab dem Spätfrühling beginnen die Wurzelknöllchen der Leguminosen eine Größe zu erreichen, die für weitere Untersuchungen geeignet ist. Mit den Teilnehmern am MIKROBIOLGISCHEN PRAKTIKUM wird ein kurzer Ausflug in die Natur veranstaltet, und die Teilnehmer bekommen die Aufgabe gestellt, möglichst viele verschiedene Leguminosen zu identifizieren und Pflanzenmaterial zur Betrachtung der durch Rhizobien induzierten Wurzelknöllchen zu sammeln. Hierbei sollte sowohl auf wildlebende Leguminosen als auch auf solche aus dem landwirtschaftliche Anbau zurückgegriffen werden. Bei den Gehölzpflanzen sollten die Wurzelbereiche von Erlen bevorzugte Ziele sein. Pflanzenmaterial mit gut ausgebildeten Wurzelknöllchen wird zunächst vor Ort betrachtet. Die Pflanzen werden an Hand eines botanischen Bestimmungsbuches eindeutig identifiziert, und die Herkunft des Materials wird dokumentiert. Das Material wird anschließend mit ins Labor genommen und soll dort weiter untersucht werden. Die Proben sollten für den Transport in einer feuchten Kammer (z. B. mit feuchter Watte ausgelegter und mit Parafilm verschlossener Standzylinder) aufbewahrt werden

Wirtschaftliche und biotechnologische Bedeutung

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4 Kurzexkursionen und Demonstrationen

um sie besonders an heißen Tagen und wenn der zeitliche Abstand zwischen Probenentnahme und den weiteren Laborarbeiten sehr groß wird vor dem Austrocknen zu schützen. Im Labor werden die Wurzelknöllchen dann zunächst mit einer Stereolupe betrachtet. Dabei wird auch deren Größe ermittelt. Von den Wurzelbereichen mit den Knöllchen sind zur Dokumentation Skizzen anzufertigen. Mit einem scharfen Skalpell oder einer Rasierklinge werden die Wurzelknöllchen anschließend angeschnitten. Es wird geprüft, ob das Innere der Wurzelknöllchen rosa bis rötlich gefärbt ist. Möglichst feine Dünnschnitte und Quetschpräparate der angeschnittenen Wurzelknöllchen werden anschließend mikroskopiert. Ziel ist es, die Bacteroide zu identifizieren. Die unterschiedlichen Formen dieser Bacteroide werden durch Zeichnen protokolliert. Dabei soll auch auf das Vorhandensein von lichtbrechenden Einschlüssen von Poly(3-hydroxybutyrat) geachtet werden. Weiterführende Literatur Dakora FD, Phillips DA (2002) Root exudates as mediators of mineral acquisition in low-nutrient environments. Plant and Soil 25:35-47 Normand P (2002) The Families Frankiaceae, Geodermatophilaceae, Acidothermaceae, and Sporchtyaceae. In: Dworkin M (ed) The Prokaryotes (elektronische Version: http://link.springer.de/link/service/books/10125, Release 3.11 vom 22.11.2002) Springer, New York Patriarca EJ, Tate R, Iaccarino M (2002) Key role of bacterial NH4+ metabolism in rhizobium-plant symbiosis. Microbiology and Molecular Biology Reviews 66:203 Sadowsky MJ, Graham PH (2000) Root and Stem Nodule Bacteria of Legumes. In: Dworkin M (ed) The Prokaryotes (elektronische Version: http://link.springer.de/link/service/books/10125, Release 3.3 vom 8.9.2000) Springer, New York

Nachgefragt 1. Beschreiben Sie die vom Enzym Nitrogenase katalysierte Hauptreaktion und eine Nebenreaktion! 2. Konsultieren Sie Lehrbücher der Mikrobiologie und Versuch 13 ( S. 81) im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM und erstellen Sie eine Liste mit Maßnahmen und Strategien zum Schutz der sauerstoffempfindlichen Nitrogenase in aeroben Bakterien! 3. Welchen Beitrag leistet die Stickstofffixierung durch endosymbiontische Bakterien in der Landwirtschaft? Wie umfangreich ist die Stickstofffixierung durch freilebende und endosymbiontische Bakterien pro Hektar in etwa? 4. Konsultieren Sie Lehrbücher der Mikrobiologie und nennen Sie Symbiosen, die nicht im Zusammenhang mit der Stickstofffixierung stehen! 5. Nennen und beschreiben Sie Ektosymbiosen, die Cyanobakterien mit Pflanzen ausbilden können! 6. Wie bezeichnet man Ektosymbiosen zwischen Pilzen und Cyanobakterien? 7. Nennen Sie Bäume, bei denen Wurzelknöllchen auftreten können! 8. Nennen Sie die sechs Gattungen, die zur Familie der Rhizobiaceae gehören! 9. Mit welcher Pflanzenfamilie bilden Mitglieder der Rhizobiaceae hauptsächlich Endosymbiosen zur Fixierung von Stickstoff?

10. Bei welchen Pflanzen außerhalb dieser Familie kommen durch Mitglieder der Familie Rhizobiaceae induzierte Wurzelknöllchen vor? 11. Wo und durch welches Bakterium erfolgt im Zukkerrohr die Fixierung von Stickstoff? 12. Ihnen wurden Wurzelknöllchen übergeben, und Sie weisen darin Zellen einer Spezies der Gattung Frankia nach. Von welchen Pflanzen müssen diese Wurzelknöllchen stammen? 13. Welche Zellen werden als Bacteroide bezeichnet? 14. Schilden Sie die Vorgänge, die zur Ausbildung von Wurzelknöllchen bei Leguminosen führen! 15. Schildern Sie die unterschiedlichen Funktionen von Nodulationsfaktoren bei der Bildung von Wurzelknöllchen! 16. Wie ist Leghämoglobin aufgebaut und welche Funktion hat es? 17. Durch welche Zellen wird Leghämoglobin synthetisiert? 18. Was versteht man unter dem Biovar einer Spezies von z. B. Rhizobium leguminosarum? 19. Durch was wird die Wirtsspezifität eines Vertreters der Rhizobien für eine bestimmte Leguminose bestimmt? 20. Wie ist das Verhältnis der Nitrogenase zum Sauerstoff?

Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie

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Rhizobium radiobacter und induzierte Pflanzentumore

Demo 2

Zwischen Pflanzen und Mikroorganismen existieren eine Vielzahl von Wechselwirkungen und unterschiedlichen Symbiosen. Wichtige ekto- und endosymbiontische Beziehungen sind die bisher noch nicht in ihrer ganzen Komplexizität verstandene Mykorrhiza und die besser verstandenen Wechselwirkungen von Pflanzen mit stickstofffixierenden Bakterien. Besonders die Endosymbiosen von Rhizobien mit Leguminosen wurden in der Vergangenheit detailliert untersucht. Einige Bakterien können bei Pflanzen auch Krankheiten verursachen. Diese pflanzen- bzw. phytopathogenen Abb. 4.18. Wurzelhalsgallen, ausgelöst Bakterien rufen bei den infizierten Pflanzen durch Rhizobium radiobacter (früher: mehr oder weniger umfangreiche Schäden Agrobacterium tumefaciens) hervor, die von geringen Beeinträchtigungen des Wachstums über unansehnliche Veränderungen des Aussehens bis hin zu einem völligen Verlust der Pflanzen reichen. Die durch Bakterien in Kulturpflanzen hervorgerufenen Schäden sind dabei ähnlich umfangreich wie die von Pilzen hervorgerufenen Schäden und verursachen in der Landwirtschaft sowie im Zierpflanzen- und Gemüseanbau beträchtliche wirtschaftliche Schäden.

Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Mikroorganismen

Phytopathogene Bakterien sind in lediglich sechs Familien bzw. Gruppen anzutreffen ( Tabelle 4.15): Bei den Vertretern der Enterobacteriaceae, Pseudomonaceae, Rhizobiaceae und coryneformen Bakterien handelt es sich um stäbchenförmige, obligat aerobe oder fakultativ anaerobe Bakterien, die nicht zur Bildung von Endosporen in der Lage sind. Daneben kommen phytopathogene Bakterien nur noch bei den Mycoplasmen (zellwandlose Bakterien) und bei Xylella fastidiosa (Gram-negativ) vor. Weitere Bakterien wurden in der Literatur anfänglich als phytopathogen beschrieben; nähere Untersuchungen zeigten später jedoch, dass es sich hierbei lediglich um opportunistisch pathogene Bakterien handelt.

Phytopathogene Bakterien

Sehr viele verschiedene Krankheiten können durch phytopathogene Bakterien hervorgerufen werden. Diesen Krankheiten liegen auch eine Reihe von sehr unterschiedlichen Mechanismen vor, mit denen die Bakterien die Pflanzen schädigen. Verbreitet sind sogenannte Weichfäuleerkrankungen, die meist durch die Zersetzung von Pflanzengewebe durch von Bakterien ausgeschiedene polymerabbauende Enzyme verursacht werden. Pectobacterium carotovorum (früher: Erwinia carotovora) scheidet neben Pektinasen auch Cellulasen, Xylanasen und Proteasen aus, welche die Zellwände in Pflanzengeweben auflösen, und ruft bei Karotten Weichfäule hervor. Einige Bakterien vermehren sich z. T. massiv im Xylem oder Phloem von Gefäßpflanzen und rufen bei einer Vielzahl von Pflanzen Erkrankungen unterschiedlichster Art hervor. Meist führt dies zu Nekrosen in den angrenzenden Geweben und als Folge hiervon zu einem Welken der Blätter. Diese bezüglich der Wachstumsbedingungen sehr anspruchsvollen Bakterien kommen in der Natur nur im Xylem oder Phloem von Gefäßpflanzen vor und werden vornehmlich durch Insekten verbreitet. Nur sehr wenige von ihnen konnten bisher im Labor kultiviert werden. Als Bewohner des Xylems wurden Vertreter der Gattung Clavibacter und Xylella fastidiosa identifiziert. Als Bewohner des Phloems wurden zellwandlose, zur Gattung Spiroplasma gehörende Bakterien wie z. B. Spiro-

D1 - S. 327

D3 - S. 338

334

4 Kurzexkursionen und Demonstrationen Tabelle 4.15. Hauptgruppen der phytopathogenen Bakterien (Einige, nicht alle Spezies der Gruppen sind als Beispiele aufgeführt) Rhizobiaceae Rhizobium radiobacter Rhizobium rhizogenes Rhizobium rubi Rhizobium vitis Pseudomonaceae Burkholderia caryophyllii Burkholderia cepacia Pseudomonas cichorii Pseudomonas marginalis Pseudomonas syringae Pseudomonas viridiflava Ralstonia solanacearum Xanthomonas albilineans Xanthomonas axonopodis Xanthomonas campestris Xanthomonas fragariae Xanthomonas populi Xylophilus ampelinus

Corynebacteria Arthrobacter ilicis Clavibacter agropyri Clavibacter humiferum Clavibacter humuli Clavibacter hypertrophicans Clavibacter insidiosum Clavibacter iranicum Clavibacter michiganense Clavibacter nebraskense Clavibacter rathayi Clavibacter sepedonicum Clavibacter tritici Curtobacterium betae Curtobacterium beticola Curtobacterium flacumfaciens Curtobacterium poinsettiae Curtobacterium oortii Rhodococcus fascians

Enterobactericeae Brenneria rubrifaciens Erwinia amylovora Erwinia tracheiphila Pantoea stewartii Pectobacterium carotovorum Pectobacterium chrysanthemi Mycoplasmen-ähnliche Spiroplasma citri Spiroplasma kunkelii Weitere Bakterien Xylella fastidiosa

plasma citri in Citruspflanzen isoliert. Eine dritte Gruppe von Bakterien induziert abnormales Wachstum pflanzlicher Zellen und verursacht so zur Bildung von Tumoren, Knöllchen und ähnlichen Erscheinungen führende Gewebewucherungen. Die von mehreren Vertretern der Gattung Rhizobium (früher: Agrobacterium) hervorgerufenen Wurzelhalsgallen ( Abb. 4.18) und Wucherungen von Wurzeln sind hierfür Beispiele. Andere Bakterien führen zum direkten Absterben von infizierten Pflanzenzellen und -geweben. Dies ist meist mit dem Auftreten von Nekrosen und Chlorosen der angrenzenden Gewebe verbunden. Phytopathogene Spezies der Gattung Rhizobium

Die Gattung Rhizobium umfasst mehrere phytopathogene Spezies, von denen vier z. T. sehr intensiv untersucht wurden. Von allen phytopathogenen Bakterien haben Vertreter der Gattung Rhizobium die einzigartigste Strategie entwickelt, um durch natürliche, auf Plasmiden beruhende Gentransfersysteme die infizierten Pflanzen für sich nutzbar zu machen. Diese Strategie wurde durch sehr raffinierte Mechanismen umgesetzt. Am bekanntesten ist Rhizobium radiobacter (früher: Agrobacterium tumefaciens), welches bei ca. 400 verschiedenen Dikotyledonen als Wurzelhalsgallen bezeichnete Tumore induziert. Das Ti-Plasmid (tumor inducing) aus diesem Bakterium ist an der Tumorentstehung maßgeblich beteiligt (siehe unten). Rhizobium rubi (früher Agrobacterium rubi) und Rhizobium vitis (früher: Agrobacterium vitis) besitzen ebenfalls ein Ti-Plasmid und rufen bei Pflanzen der Gattung Rubus bzw. bei der Weinrebe (Vitis vinifera) die Bildung von Wurzelhalsgallen hervor. Rhizobium rhizogenes (früher: Agrobacterium rhizogenes) induziert offensichtlich nahezu wirtsunspezifisch bei vielen Pflanzen massive Vergrößerungen des Wurzelgewebes (hairy root disease); hieran sind vom Ri-Plasmid (root inducing) codierte Proteine beteiligt.

Ti-Plasmide

Ti-Plasmide aus verschiedenen Stämmen von R. radiobacter ähneln sich in ihrem prinzipiellen Aufbau. Es handelt sich um konjugativ übertragbare Plasmide, die mit ca. 200 kbp relativ groß sind. Auf Gene und Elemente, die als Grundelemente für die unterschiedlichen Plasmidtypen wichtig sind, soll hier nicht eingegangen werden. Hierzu sei auf andere Kapitel im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM verwiesen (V52 S. 269, V53 - S. 273, V54 - S. 277, V56 - S. 290).

Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie

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Zwei größere Regionen sind für die Virulenz von R. radiobacter und den Pathogenitätsmechanismus wichtig und in allen Ti-PlasC N (CH2)3 C COOH miden vorhanden. Die eine Region HN H N H repräsentiert die ca. 15 bis 30 kbp umfassende T-DNA, welche nach der Infektion in HOOC (CH2)2 C COOH die Pflanze transportiert und in das pflanzliche Genom integriert wird. Bei der anderen H Region handelt es sich um ein großes Cluster Abb. 4.19. Strukturformel von Nopalin von Virulenzgenen (vir-Gene). Ein besonders detailliert untersuchtes Ti-Plasmid ist das Plasmid pTiC58 aus R. radiobacter Stamm C58. H2N

H

Der Ablauf der Infektion einer Pflanze mit virulenten Stämmen von R. radiobacter und die Entstehung der Wurzelhalsgallen führenden Vorgänge können hier aus Platzgründen nicht in allen Einzelheiten geschildert werden. Auch ist es unmöglich, hier alle an diesem sehr komplizierten Prozess beteiligten Proteine aufzuführen. Die Infektion von Pflanzengewebe mit R. radiobacter erfolgt meist im erdnahen Bereich der Pflanze und grundsätzlich immer an einer Verwundung. Hierbei kann es sich um eine natürliche oder beim Umgang mit den Pflanzen in einer Baumschule erfolgte Verwundung handeln. Aus der Wunde treten Monosaccharide und phenolische Verbindungen wie z. B. Acetosyringon aus, durch welche in der Rhizosphäre aufhaltende Zellen von R. radiobacter spezifisch chemotaktisch angelockt werden. Die genetische Information für die hierfür notwendigen Rezeptoren und Sensoren sind auf dem Ti-Plasmid vorhanden. Acetosyringon aktiviert dann zusätzlich die ebenfalls auf dem Ti-Plasmid vorhandenen Virulenzgene. Diese Virulenzgene codieren u. a. für eine Topoisomerase und ein Restriktionsenzym, welche den als T-DNA bezeichneten Bereich aus dem Ti-Plasmid ausschneiden. Diese T-DNA wird anschließend aus der Bakterienzelle in die Pflanzenzelle transportiert. Hierzu codieren die Virulenzgene für weitere in der Cytoplasmamembran und der äußeren Membran lokalisierte Proteine, welche eine Pore bilden, durch welche die T-DNA aus der Bakterienzelle in die Pflanzenzelle transportiert werden kann. Das restliche Plasmid verbleibt in der Bakterienzelle. Anschließend wird die T-DNA mit Hilfe weiterer vir-Genprodukte an einer zufälligen Stelle in das Genom der Pflanze integriert. Die T-DNA codiert für drei Stoffwechselleistungen, die nun von der Pflanzenzelle ausgeführt werden. Darunter befinden sich Gene für die Synthese von Cytokin und Indolessigsäure, die zu einer ungeordneten Vermehrung der Zellen, zu einer Vergrößerung des Gewebes um die Infektionsstelle herum und letztlich zur Bildung der Wurzelhalsgallen führen. Die Gene des Ti-Plasmids besitzen bereits pflanzenspezifische Promotoren und können deshalb in der Bakterienzelle selbst nicht transkribiert werden. Weitere auf der T-DNA lokalisierte Gene codieren für Enzyme zur Synthese von Opinen, welche die infizierte Pflanzenzelle nun als neue Metabolite synthetisiert. Ein verbreitetes Opin ist Nopalin ( Abb. 4.19). Bei diesen neuen Metaboliten handelt es sich um Derivate von Aminosäuren, welche nur R. radiobacter als Kohlenstoff-, Energie- und Stickstoffquelle, nicht aber die Pflanze selbst nutzen kann. Das Ti-Plasmid codiert für Transportproteine und Enzyme zum Abbau dieser Opine, weshalb diese Verbindungen nur von R. radiobacter, nicht aber auch von anderen Bodenbakterien verwertet werden können. Mit diesem raffinierten System versklavt R. radiobacter die Pflanze und bringt diese dazu, aus den Primärprodukten der pflanzlichen Photosynthese Metabolite für die Bakterienzellen zu synthetisieren, die exklusiv vom Bakterium verwertet werden können.

Infektion einer Pflanze durch R. radiobacter

COCH3

O CH3

O OH

tosy ce A ring on

CH3

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4 Kurzexkursionen und Demonstrationen Ein erfolgreicher biotechnologischer Ansatz zur Kontrolle von Wurzelhalsgallen

Ein zunächst als Agrobacterium radiobacter Stamm K84 beschriebenes Bakterium, welches mittlerweile von den Taxonomen der Spezies Rhizobium radiobacter zugeordnet wurde, bildete die Grundlage für die Entwicklung einer biotechnologischen Strategie zur vorbeugenden Bekämpfung der verbreiteten Wurzelhalsgallen. Stamm K84 besitzt kein Ti-Plasmid und ist deshalb selbst nicht virulent; er kann aber durch Übertragung eines Ti-Plasmids in einen virulenten Stamm transformiert werden.

CH2OH HO

CH

O

O

O P

OH

N

O OH

N

N O Pentose

N

P

N

N O

CH2

O

O

HO Zellen von Stamm K84 produzieren ein als Agrocin 84 ( Abb. 4.20) bezeichnetes Nukleosid-Analogon, welches die DNA- Abb. 4.20. Strukturformel von Agrocin 84 Replikation hemmt. Biosynthese von Agrocin und Resistenz gegenüber dieser Verbindung werden in Stamm K84 von dem Plasmid pAgK84 codiert. Agrocin 84 wird durch die vom Ti-Plasmid codierte Opin-Permease in die Zellen virulenter Stämme von R. radiobacter transportiert und unterbindet dort die Synthese von DNA. Stamm K84 besitzt darüber hinaus noch das Plasmid pNOC, welches für Proteine zur Aufnahme von Nopalin in die Zelle und für dessen Abbau codiert. Damit wird Stamm K84 in die Lage versetzt, die von der Pflanze produzierten neuen Metabolite ebenfalls wie ein virulenter Stamm von R. radiobacter nutzen zu können. Ein virulenter Stamm von R. radiobacter wird somit durch R. radiobacter Stamm K84 in mehrfacher Hinsicht mit seinen eigenen „Waffen“ geschlagen! Zur Vorbeugung gegen eine Infektion von virulenten R. radiobacter Stämmen müssen die Pflanzen oder die Schnittstellen, die beim Pfropfen entstehen, nur mit einer Zellsuspension von R. radiobacter Stamm K84 behandelt werden.

Da es sich bei pAgK84 um ein konjugativ übertragbares Plasmid handelt, welches auch in virulente Stämme von R. radiobacter übertragen werden kann und dort dann Resistenz gegenüber Agrocin 84 bewirkt, wurde Stamm K84 weiter optimiert, um einen noch effektiveren vorbeugenden Schutz vor der Entstehung von Wurzelhalsgallen zu gewährleisten. Hierzu wurde mit genetischen Methoden die Mutante K1026 hergestellt, die das Plasmid pAgK84 nicht mehr konjugativ übertragen und damit R. radiobacter auch nicht mehr mit einer Resistenz gegenüber Agrocin ausstatten kann.

V27 - S. 140 Biotechnologische Bedeutung

Diese biologische Bekämpfungsmaßnahme wurde vor ca. 30 Jahren von Alan Kerr in Australien entdeckt und entwickelt. Es war die erste kommerzielle Maßnahme dieser Art zur Bekämpfung einer Pflanzenkrankheit. Entsprechende Präparate werden seit vielen Jahren von mehreren Firmen unter verschiedenen Handelsnamen (z. B. Galltrol® basierend auf Stamm K84, Nogall® basierend auf Stamm K1026) angeboten. Dieses vorbeugende System ist damit ähnlich gut auf dem Markt etabliert wie das Bt-Toxin zur biologischen Insektenbekämpfung. Für Pflanzenzüchter stellen die Ti-Plasmide hervorragend geeignete Werkzeuge zur Übertragung von Fremdgenen in dikotyledone Pflanzen dar. Viele Fortschritte der molekularen Pflanzenzüchtung wären ohne die Verwendung dieser Plasmide nicht möglich gewesen. Es werden hierzu einschneidend modifizierte Ti-Plasmide verwendet, welche das in die Pflanze zu übertragende und dort zu exprimierende Gen enthalten und noch infektiös, aber nicht mehr virulent sind. Weitere Modifikationen beinhalten meist die Hinzufügung eines Replikationsursprung (ori) für Escherichia coli, damit die Herstellung geeigneter Plasmidkonstrukte in diesem Bakterium erfolgen

Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie

kann. Auch wird das zu übertragende Gen mit einem spezifischen Promotor und gegebenenfalls auch mit einer geeigneten leader-Sequenz ausgestattet, damit es später von der transgenen Pflanze auch unter den gewünschten Bedingungen, in einem geeigneten Organ und in einem geeigneten Kompartiment der Zelle exprimiert wird. Weitere interessante Systeme zur Herstellung transgener Pflanzen beruhen auf dem Einsatz von Elementen des Ri-Plasmides. Demonstrationen Um Wurzelhalsgallen und andere durch phytopathogene Bakterien verursachte Krankheiten zu demonstrieren, sollte ein Ausflug in die nahe Umgebung durchgeführt werden. Wälder, Weinhänge, Klein- und Vorgärten, öffentliche Parkanlagen usw. sind als Ziel geeignet. Wurzelhalsgallen und an anderer Stelle von Pflanzen induzierte Tumore fallen sofort auf, und bei aufmerksamer Suche trifft man häufig auf entsprechend geschädigte Pflanzen. Meist befindet sich auch nicht weit entfernt eine größere Baumschule. Es empfiehlt sich dort mit dem technischen Leiter einen Besichtigungstermin zu vereinbaren. Diese(r) wird der Besuchergruppe sicherlich zahlreiche Objekte demonstrieren und sie (er) wird auch erläutern können, was in diesem Betrieb vorbeugend zur Verhinderung des Auftretens von Wurzelhalsgallen und anderer durch Bakterien, Pilze und Viren hervorgerufene Pflanzenkrankheiten unternommen wird. Es empfiehlt sich ferner, gefundene Objekte mit ins Labor zu nehmen, dort genauer mit der Stereolupe zu betrachten und Skizzen anzufertigen. Eindrucksvoll ist auch die mikroskopische Betrachtung von Dünnschnitten, die aus dem Material angefertigt wurden. Fortgeschrittene Studierende sollten versuchen, nach Literaturangaben aus solchen Proben die Bakterien zu isolieren und in Reinkultur zu bringen. Dieses Kapitel sollte engagierten Schülern und Schülerinnen sowie Studierenden ferner das erforderliche Rüstzeug und Anregungen vermittelt haben, damit diese selbst einfache Experimente mit virulenten Stämmen von Rhizobium radiobacter oder Rhizobium rhizogenes durchführen können. Es könnten z. B. Reinkulturen dieser Bakterienstämme von Stammsammlungen besorgt werden und diese Stämme auf den von den Stammsammlungen Medien kultiviert werden, um mit diesen dann anschließend Gefäßpflanzen an gesetzten Verwundungen zu infizieren. Auch auf dünnen Scheiben von frisch geschnittenen Karotten, die möglichst kontaminationsfrei feucht in einer geschlossenen Perischale inkubiert werden, lassen sich nach Infektion mit einem virulenten Stamm von Rhizobium radiobacter nach ca. 10 bis 14 Tagen Gewebewucherungen beobachten. Bei allen Versuchen sollten immer unbedingt Kontrollen mitgeführt werden! Hierzu sollten avirulente, plasmidfreie Stämme sowie sterile Lösungen eingesetzt werden. Weiterführende Literatur Christie PJ (1997) Agrobacterium tumefaciens T-complex transport apparatus: a paradigm for a new family of multifunctional transporters in eubacteria. Journal of Bacteriology 179:3085-3094 Kado CI (1999) Plant pathogenic bacteria. In: Dworkin M (ed) The Prokaryotes (elektronische Version: http://link.springer.de/link/service/books/10125, Release 3.0 vom 21.5.1999) Springer, New York Penyalver R, Vicedo B, Lopez MM (2000) Use of the genetically engineered Agrobacterium strain K1026 for biological control of grown gall. European Journal of Plant Physiology 106:801-810 Zhu J, Oger PM, Schrammeijer B, Hooykaas PJJ, Frrand SK, Winans SC (2000) The Bases of crown gall tumorigenesis. Journal of Bacteriology 182:3885-3895 Zupan J, Muth TR, Draper O, Zambryski P (2000) The transfer of DNA from Agrobacterium tumefaciens into plants: a feast of fundamental insights. Plant Journal 23:11-28

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4 Kurzexkursionen und Demonstrationen

Nachgefragt 1. In welchen Bakterienfamilien und -gruppen kommen phytogene Vertreter vor? 2. Beschreiben Sie von phytopathogenen Bakterien hervorgerufene Krankheiten! 3. Beschreiben Sie Habitat und Aufbau der Zelle von Spiroplasma citri! 4. Welche Krankheit ruft Pectobacterium carotovorum hervor, und welche Enzyme sind hieran beteiligt? 5. Mit welchen allgemeinen Mechanismen werden diese Krankheiten verursacht? 6. Stellen Sie die wichtigsten Eigenschaften der Zellen und des Stoffwechsels von Rhizobium radiobacter zusammen! 7. Welche Krankheiten rufen Vertreter der Gattung Rhizobium bei Pflanzen hervor? 8. Erläutern Sie die Abfolge von Ereignissen, die zur Entstehung von Wurzelhalsgallen führen! 9. Zeichnen Sie die chemische Strukturformel von Acetosyringon! 10. Erläutern Sie die beiden durch Acetosyringon bewirkten bzw. ausgelösten Ereignisse und Vorgänge! 11. Welche physiologische Funktion hat Indolessigsäure und welche Rolle spielt diese Verbindung bei der Entstehung von Wurzelhalsgallen?

12. Beschreiben Sie den grundsätzlichen Aufbau des Plasmids pTiC58, und welche Rolle es bei der durch Rhizobium radiobacter hervorgerufenen Pflanzenkrankheit spielt! 13. Zeichnen Sie die chemische Strukturformel von Nopalin! 14. Zu welcher funktionellen Klasse von Verbindungen gehört Nopalin? 15. Was versteht man im Zusammenhang mit dem TiPlasmid unter T-DNA? 16. Erläutern Sie, weshalb das Ti-Plasmid und die TDNA für molekulare Pflanzenzüchter von besonderem Interesse sind! 17. Um was für eine Verbindung handelt es sich bei Agrocin 84? Beschreiben Sie Struktur und Wirkungsweise dieser Verbindung! 18. Beschreiben Sie, wie der Entstehung von Wurzelhalsgallen bei Pflanzen mit einem biologischen Ansatz vorgebeugt werden kann! 19. Wie können Sie aus einem avirulenten Stamm von Rhizobium radiobacter einen virulenten Stamm erzeugen, und wie erzeugen Sie gegen Agrocin 84 resistente Stämme von Rhizobium radiobacter? 20. Wie unterscheiden sich die Stämme K84 und K1026 von Rhizobium radiobacter?

Demo 3

Claviceps purpurea und Mutterkorn-Alkaloide aus infiziertem Getreide

Mykotoxine im Getreide

Mykotoxine sind von Pilzen synthetisierte Gifte und spielen hinsichtlich der Sicherheit von Lebensmitteln eine sehr große Rolle. Sie entstehen entweder schon bei der Erzeugung oder später bei unsachgemäßer Lagerung der Lebensmittel. Im Bereich der Getreide haben drei Stoffgruppen die größte Bedeutung: Trichothecene und Zearalenone werden von Fusarium culmorum und Fusarium graminearum auf Getreide und Mais gebildet. In dieser Demonstration beschäftigen wir uns mit den MutterkornAlkaloiden, die in den Sklerotien von Claviceps purpurea, die auch als Mutterkörner bezeichnet werden, enthalten sind und eine wichtige Gruppe von in Getreiden auftretenden Mykotoxinen darstellen.

Entstehung von Mutterkorn durch Claviceps purpurea

Vertreter der Gattung Claviceps infizieren verschiedene Gramineen. Bei C. purpurea ist dies besonders Roggen (Secale cereale); aber auch Infektionen von Dinkel (Triticum spelta) und Gerste (Hordeum vulgare) werden beobachtet ( Abb. 4.21). Der Name „Mutterkorn“ bedeutet soviel wie „verändertes Korn“ (lateinisch: mutare). Biologisch stellt das Mutterkorn das Sklerotium von C. purpurea dar. Die im wissenschaftlichen Sprachgebrauch übliche Bezeichnung „Ergot-Alkaloide“ für MutterkornAlkaloide leitet sich wahrscheinlich von der Ähnlichkeit des Mutterkorns mit einem Hahnensporn (ergot) ab.

Entwickungscyclus von Claviceps purpurea

Wir beginnen den Entwicklungscyclus mit einer im Frühjahr durch Wind verbreiteten Acsospore. Bei C. purpurea sind diese Ascosporen fädig und besitzen eine Länge von 50 bis 100 μm. 1. Ist eine Ascospore auf die Narbe in der Blüte einer Graminee gelangt, keimt diese aus, und es folgt das Eindringen der Hyphen in den Fruchtknoten. Dadurch

Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie

Abb. 4.21.

Verschiedene mit Claviceps purpurea infizierte Gräser

ist die Pflanze infiziert, und Pollen können diesen Fruchtknoten nicht mehr befruchten. Hieraus wird ersichtlich, wie wichtig u. a. das Verhältnis von Pollen zu Ascosporen im Hinblick auf eine Infektion der Pflanze ist. 2. Auf der Oberfläche des zerstörten Fruchtknotengewebes entsteht ein weißes Myzel mit vielen Konidien, die durch Insekten auf nicht infizierte Blüten übertragen werden können, wodurch diese ebenfalls infiziert werden. Dabei werden die Insekten durch einen nektarähnlichen Stoff angelockt, der während der Konidienbildung entsteht. 3. Das anfänglich weiße Myzel verfestigt sich, wird größer und wächst zu einem zunächst roten und in der Endphase schwarzen Sklerotium heran. Dies geschieht parallel zur Bildung des Getreidekorns. Auf der Ähre nimmt das Sklerotium dabei dessen Platz ein, ist aber um ein Vielfaches größer und fällt zusätzlich durch die schwarze Farbe auf. 4. Die Sklerotien fallen im Herbst aus der Ähre heraus oder gelangen zusammen mit der Ähre auf den Boden, wo diese überwintern. Diese Überwinterung im Boden ist für die weitere Entwicklung wichtig, weil die Sklerotien nur nach einem Kälteschock auskeimen können. 5. Das Auskeimen der Sklerotien erfolgt im Frühjahr und resultiert in der Bildung von ein bis zwei Zentimeter langen gestielten, köpfchenartigen Fruchtkörpern. 6. In diesen Köpfchen bilden sich nun die geschlechtsreifen Gametangien, die bei der Befruchtung miteinander Verschmelzen (Anisogametangiogamie); aus ihnen entstehen anschließend die Perithezien, welche in großer Zahl direkt unter der Oberfläche der Köpfchen in Stromata eingesenkt angeordnet sind. 7. In den Perithezien entstehen die Asci, die im reifen Zustand aktiv durch eine vorgeformte Öffnung herausgeschleudert werden.

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4 Kurzexkursionen und Demonstrationen

Mutterkorn-Alkaloide Das Mutterkorn enthält eine Mischung verschiedener Alkaloide, die als MutterkornAlkaloide oder Ergot-Alkaloide bezeichnet werden. Es handelt sich dabei um Produkte des Sekundärmetabolismus, die im Fall der Ergot-Alkaloide aus Tryptophan und 2,3-Dimethylallyl-Pyrophosphat sowie weiteren von Aminosäuren abgeleiteten Substituenten entstehen. Eine Zwischenstufe der Biosynthese ist Lysergsäure. Allen Ergot-Alkaloiden ist ein tetracyclisches Ergolinmolekül als Grundgerüst gemeinsam. Je nach Substitution am Kohlenstoffatom Nr. 8 des Ergolin-Ringsystems werden Lysergsäure-Alkaloide und Clavin-Alkaloide unterschieden. Ein bekanntes Ergotalkaloid ist das Ergotamin ( Abb. 4.22), welches gefäßverengend und uteruskontrahierend wirkt. Es wird als Analgetikum zur Behandlung von Migräne eingesetzt. Die letale Dosis (LD50) bei intravenöser Gabe beträgt bei Kaninchen 100 mg/kg. Ein andere bekannte Verbindung, die sich von Ergotalkaloiden ableitet ist LSD (Lysergsäurediethylamid,  Abb. 4.22). Es handelt sich um ein süchtig machendes Halluzinogen, welches seine Wirkung bereits nach einer oralen Dosis von 30 bis 100 μg entfaltet. LSD wird chemisch aus Lysergsäure synthetisiert. Bedeutung als Getreideschädling

Der Befall von Getreide mit C. purpurea und das Auftreten von Mutterkorn hatten über Jahrhunderte eine außerordentlich große Bedeutung. Vom Mittelalter bis in das 20. Jahrhundert hinein war der Befall von Roggen mit C. purpurea in Europa recht häufig. In schlechten Jahren konnte das Roggengetreide bis zu 50 % aus Mutterkörnern bestehen. Da Roggen im Mittelalter das vorherrschende Brotgetreide war, kam es hierdurch häufig zu Massenvergiftungen (Ergotismus, St. Antonius-Feuer), an denen im Mittelalter Hunderttausende von Menschen starben. Der ersten geschichtlich dokumentierten Massenvergiftung fielen 945 n. Chr. in Paris ca. 40.000 Menschen zum Opfer.

Bedeutung als Biowaffe

Neben den humanpathogenen Mikroorganismen stellen natürlich auch phytopathogene Bakterien und Pilze potentielle Biowaffen dar. Durch erntevernichtende Biowaffen wird die Bevölkerung zwar nicht sofort geschädigt, es können aber u. U. mittelfristig immense Schäden hervorgerufen werden, da in den betroffenen Gebieten die Grundlage der Ernährung zumindest teilweise entzogen wird. C. purpurea gehört zu den 16 Erregern von Pflanzenkrankheiten in einer Liste von Pflanzenpathogenen mit Waffenpotential, die von einer „Ad hoc-Gruppe“, welche Maßnahmen zur Kontrolle des B-Waffen-Übereinkommens erarbeiten soll, aufgestellt wurde. Hierunter fallen ein Virus, fünf Bakterien und zehn Pilze als Erreger. Die anderen 15 Erreger sind: Colletotrichum coffeanum var virulus (Brennfleckenkrankheit bei Kaffee), Erwinia amylovora (Feuerbrand bei Kernobst), Mycospharaella pini (Nadelschütte bei Kiefer), Peronospora tabacina (Blauschimmel bei Tabak), Puccinia graminis (Schwarzrost bei Getreide), Puccinia striiformis (Gelbrost bei Getreide), Pyricularia oryzae (Blattbrand bei Reis), Ralstonia solanacearum (Schleimkrankheit bei Kartoffel), Sclerotinia sclerotiorum (Sklerotienfäule bei Salat), Tilletia indica (Indischer Weizenbrand bei Weizen), Ustilago maydis (Beulenbrand bei Mais), Zuckerrohr-Fidschi-Krankheits-Virus (FidschiKrankheit bei Zuckerrohr), Xanthomonas albilineans (Blattstreifigkeit bei Zuckerrohr), Xanthomonas campestris pathovar citri (Citruskrebs bei Citrusfrüchten), Xanthomonas campestris pathovar oryzae (Weißblättrigkeit bei Reis).

Biotechnologische Bedeutung

Mutterkorn-Alkaloide werden in der einen oder anderen Form seit Jahrhunderten in verschiedenen Bereichen genutzt. Vor allem in der Medizin werden sie als Migräneund Wehenmittel eingesetzt. Außerdem wird es zur Therapie von Hypertonie, verschiedenen Krebserkrankungen und zur Verbesserung der Symptomatik bei der Parkinson-Krankheit verabreicht. Das Mutterkorn war lange Zeit ein verbreitetes

Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie

O

H R1 O N H N H

N H

O

OH H

N

O

H H3C O N H

O

R2 N

CH3

H

Ergot-Alkaloide (Mutterkorn)

OH H

CH3 CH3 CH2

H O

OH

O

N

N

H

H

Ergolin

H

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CH3

N H

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H

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CH3

LSD

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OH

N

CH3

N

CH3

D-Lysergsäure

H

N H

H N

N

CH2

Ergotamin

N

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NH2

CH3 OH

N H Abb. 4.22.

Agroclavin

N H

Elymoclavin

OH

Dopamin (Neurotransmitter)

Strukturformeln einiger Mutterkorn-Alkaloide und verwandter Substanzen

Abtreibungsmittel da es Gebärmutterkontraktionen mit einem Abgang der Frucht auslösen kann. Auf die chemische Verwandtschaft einiger Inhaltsstoffe des Mutterkorns mit dem bekannten Rauschgift LSD war bereits oben hingewiesen worden. Die Produktion der Ergot-Alkaloide erfolgte früher ausschließlich durch parasitäre Kultivierung von C. purpurea auf Getreide, welches gezielt mit dem Pilz infiziert wurde. Die Mutterkörner wurden dann geerntet und die entsprechenden Ergot-Alkaloide isoliert. Auf diese Weise ließen sich ca. 1.000 bis 2.000 kg Sklerotien pro Hektar ernten. Da der Gehalt der Sklerotien an Ergotalkaloiden bei ca. 1 % (wt/wt) liegt, ergibt ein Hektar nach Extraktion und Reinigung ca. 8 bis 10 kg Ergot-Alkaloide. Heute werden die Ergot-Alkaloide in immer stärkerem Umfang fermentativ durch Kultivierung von C. purpurea in geeigneten Nährlösungen in großen Bioreaktoren produziert.

Produktion

Die Belastung von Erntegut mit Mutterkorn hängt von Witterungsfaktoren sowie standort- und anbautechnischen Einflüssen ab. Eine Verhinderung der Infektion mit C. purpurea ist ebenso wie eine gezielte Bekämpfung durch Pflanzenschutzmittel zurzeit nur eingeschränkt möglich. Es kann deshalb nur durch pflanzenbauliche Maßnahmen (Fruchtfolge, Wahl der Anbaufläche, Saatgut) einer Infektion vorgebeugt werden.

Bekämpfung von Mutterkorn

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4 Kurzexkursionen und Demonstrationen

Durch pflanzenzüchterische Maßnahmen ist es gelungen, die Anzahl der zur Befruchtung der Nachbarähren ausgeschütteten Pollenkörner deutlich zu erhöhen. Dadurch erfolgt eine schnellere Befruchtung und die Wahrscheinlichkeit einer Besiedlung der Narbe mit C. purpurea wird vermindert. Dennoch im Erntegut vorhandene Mutterkörner müssen in der Mühle vor dem Mahlen des Getreides durch Wind- oder Siebreinigung entfernt werden. Durch moderne Mühlentechnologie ist eine sichere Entfernung von Mutterkorn gewährleistet. Die Interventionsrichtlinien und das geltende Futtermittelrecht schreiben zulässige Höchstgrenzen von 0,05 % (wt/wt) Mutterkorn für Konsumgetreide und 0,1 % (wt/wt) für Futtergetreide vor. Aufgaben Rechtzeitig vor Beginn der Erntzeit werden mit den Teilnehmern des MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUMS Roggenfelder aufgesucht. Am Feldrand stehende Halme werden intensiv nach Sklerotien von Claviceps purpurea tragenden Ähren durchsucht. Die Suche kann sich recht mühsam gestalten, da die Mutterkornbildung mittlerweile recht selten geworden ist. Entdecktes Material wird vom Halm getrennt und für den Transport ins Labor vorsichtig in ein Glas gelegt. Die Wahrscheinlichkeit, auf Sklerotien von Claviceps Arten zu treffen, ist bei wildlebenden Gräsern meist höher. Deshalb sollten auch Gräser am Wegesrand und auf nicht landwirtschaftlich genutzten Wiesen nach Sklerotien durchsucht werden. Auch das hier entdeckte Material wird wieder für den Transport vorbereitet. Die Herkunft des Materials wird dokumentiert. In beiden Fällen sollte auch eine Abschätzung vorgenommen werden, wie viel Prozent der Ähren einer Pflanzenart Mutterkörner enthalten und wie hoch der Anteil der Mutterkörner an den Getreidekörnern einer einzelnen Ähre ist. Für den Finder/die Finderin der Ähre mit der größten Anzahl von Mutterkörnern kann ein kleiner Preis ausgelobt werden, um die Suchenden zu motivieren. Im Labor werden mit Sklerotien besiedelte Ähren zunächst mit der Stereolupe betrachtet. Dabei sollten Länge und Durchmesser sowie Gewicht einzelner Mutterkörner ermittelt und diese Daten mit denen von regulären Getreidekörnern verglichen werden. Diese Ergebnisse werden tabellarisch für die verschiedenen Pflanzen zusammengestellt. Mit einem Skalpell oder einer Rasierklinge werden nun möglichst dünne Längs- und Querschnitte von abgetrennten Sklerotien angefertigt und unter dem Lichtmikroskop betrachtet. Bei auskeimenden Sklerotien sollen in den Köpfchen die Perithezien mit den reifen Asci identifiziert und gezeichnet werden. Auch die Anordnung der Perithezien zueinander im Stroma der Köpfchen sind auf Zeichnungen zu dokumentieren. Hierzu müssen jedoch im Vorjahr eingesammelte und in Erde „überwinterte“ Sklerotien verwendet werden, denen Gelegenheit zum Auskeimen gegeben wurde. Weiterführende Literatur Esser K (2000) Kryptogamen – Praktikum und Lehrbuch. Band 1. Cyanobakterien, Algen, Pilze, Flechten. 3. Aufl., Springer, Berlin, Heidelberg, New York Meinhardt F, Esser K (1993) Filamentous fungi. In: Rehm HJ, Reed G, Pühler A, Stadler P (eds) Biotechnology. vol 1, 2nd edn., Wiley-VCH, Weinheim, pp 515-542 Rogers P, Whitby S, Dando M (1999) Erntevernichtende Bio-Waffen. Spektrum der Wissenschaften, Oktoberheft, S. 72-77 Tudzynski P, Correia T, Keller U (2001) Biotechnology and genetics of ergot alkaloids. Applied Microbiology and Biotechnology 57:593-605

Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie

343

Nachgefragt 1. Was versteht man unter Mykotoxinen? 2. Wo und wie können Mykotoxine entstehen? 3. Welche Mykotoxine produzieren Vertreter der Gattung Fusarium? 4. Bei welchen Pflanzen treten Mutterkörner in der Natur auf? 5. Welcher Mikroorganismus ist für die Entstehung des Mutterkorns bei Roggen verantwortlich? 6. Weshalb stellte der Befall von Roggen mit Claviceps purpurea besonders im Mittelalter ein Problem dar? 7. Was stellt das Mutterkorn biologisch dar? 8. Woher leiten sich die Bezeichnungen „Mutterkorn“ und „Ergot-Alkaloide“ sprachlich ab? 9. Beschreiben Sie den Entwicklungscyclus von Claviceps purpurea! 10. Warum können Sklerotien von Claviceps purpurea nicht direkt nach ihrer Entstehung zum Auskeimen gebracht werden? 11. Was sind Perithezien?

12. Welche Größe und Form haben die Ascosporen von Claviceps purpurea? 13. Um was konkurrieren Ascosporen von Claviceps purpurea und Pollen von Gerste? 14. Was versteht man unter Produkten des Sekundärstoffwechsels? 15. Von welchen Verbindungen leitet sich die Biosynthese von Ergot-Alkaloiden ab? 16. Welches tetracyclische Ringsystem stellt das Grundgerüst der Ergot-Alkaloide dar? Zeichnen Sie die chemische Strukturformel! 17. Wie wurden Mutterkorn-Alkaloide früher ausschließlich gewonnen? Wie produziert man diese heute vorwiegend? 18. Nennen Sie Wirkungen und Anwendungen von Mutterkorn-Alkaloiden in der Medizin! 19. Zeichnen Sie die Strukturformel eines verbotenen Rauschgifts, welchen strukturell den MutterkornAlkaloiden ähnlich ist! 20. Nennen Sie mögliche phytopathogene Mikroorganismen, die als Biowaffen eingesetzt werden könnten!

Flechten: Ektosymbiosen von Pilzen mit Grünalgen oder Cyanobakterien

Abb. 4.23.

Apothezien einer Flechte

Flechten bestehen immer aus mindestens zwei verschiedenen Organismen und stellen eine Ektosymbiose aus einem Pilz sowie einer Grünalge oder einem Cyanobakterium in einem einheitlichen Vegetationskörper, dem Thallus, dar. Der Pilz wird als Mycobiont bezeichnet, während die Grünalge bzw. das Cyanobakterium als Phycobiont oder auch Photobiont bezeichnet wird. Flechten wachsen meist sehr langsam. Es sind ca. 20.000 verschiedene Flechtenspezies bekannt, und obwohl Flechten nicht aus einer Organismenart bestehen, also kein Individuum im eigentlichen Sinne darstellen, werden sie dennoch wie andere Individuen mit einem Spezies- und einem Gattungsnamen versehen.

Wir hatten zuvor im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM bereits die Endosymbiose von Leguminosen und Rhizobien kennen gelernt. Auch bei den Flechten handelt es sich meist um mutualistische Symbiosen, denn von dieser Ektosymbiose profitieren sowohl der Mycobiont als auch der Phycobiont. Die Lebensgemeinschaft stellt nicht nur eine morphologische, sondern auch eine physiologische Einheit dar. Während der Phycobiont grundsätzlich für die Fixierung con CO2 und im Falle von Cyanobakterien auch für die Fixierung von N2 und die Abgabe eines Teils der Fixierungsprodukte an den Mycobionten zuständig ist, versorgt der Mycobiont den Phycobiont mit ande-

Demo 4 Definition

Struktur und Aufbau D1 - S. 327

344

4 Kurzexkursionen und Demonstrationen

ren Nährstoffen und Wasser und bietet Schutz vor Austrocknung, intensivem Sonnenlicht und Erosion ( Tabelle 4.16). Beim Vegetationskörper (Thallus) unterscheidet man zwischen homöomeren und heteromeren Thalli. Meist werden die Zellen des Phycobionten von den Hyphen des Pilzes eng umhüllt. Die Hyphen können aber auch in Form von Haustorien in die Zellen des Phycobionten eindringen (bei Grünalgen) oder diesen in Form von Appressorien fest aufliegen (bei Cyanobakterien). Diese engen Kontakte sind wichtig für den Austausch bzw. Transport der Nährstoffe zwischen den Zellen des Mycobionten und Phycobionten. Bei den häufiger vorkommenden heteromeren Thalli liegt eine Schichtung vor, und der Phycobiont (meist eine Grünalge) liegt in bestimmten, meist dem Licht zugewandten Zonen vor. Der Habitus des Thallus wird dabei fast immer durch den Mycobionten bestimmt. Es werden Krustenflechten, Blatt- oder Laubflechten und Strauchflechten unterschieden. Bei den selteneren homöomeren Thalli liegt keine Schichtung vor, und der Phycobiont (meist ein Cyanobakterium) ist nicht in bestimmten Zonen konzentriert. Hier bestimmt der Phycobiont meist den Habitus des Thallus. Es werden Gallertflechten sowie Faden- oder Haarflechten unterschieden. Beteiligte Organismen

Bei dem Mycobionten handelt es sich fast immer im einen Ascomyceten. Fast 50 % aller Ascomyceten, welche die zahlenmäßig größte Gruppe der Pilze darstellen, kommen übrigens als Flechten vor. Freilebend, also außerhalb von Flechten ohne phycobiontischen Partner, scheinen die in Flechten vorkommenden Ascomyceten keine große Rolle zu spielen, da sie in der Regel nur sehr langsam wachsen und ihnen Enzymsysteme zum Abbau von komplexen Polymeren fehlen. Es sind lediglich ungefähr 20 Flechten bekannt, bei denen der Mycobiont von einem Basidiomyceten gestellt wird.

Tabelle 4.16. Beiträge der Partner zur Symbiose und Funktionsfähigkeit der Flechten Mycobiont • Meist formgebender Organismus • Feste Verankerung auf Untergrund • Schutz vor Erosion durch Wind und Regen • Absorption von Mineralstoffen aus dem Untergrund oder der Atmosphäre • Versorgung mit Wasser • Schutz vor Austrocknung • Schutz vor Sonnenlicht Phycobiont • Versorgung mit organischen Nährstoffen • Fixierung von CO2 • Fixierung von N2 (nur bei Cyanobakterien)

Die Anzahl der in Flechten vorkommenden Phycobionten ist wahrscheinlich auf nur ca. 100 Spezies begrenzt. Zu einem größeren Anteil (90 %) handelt es sich hierbei um Grünalgen. Die einzellige Alge Trebouxia kommt hier besonders häufig vor und ist ebenfalls auf die Symbiose mit dem Pilz spezialisiert, da sie freilebend keine große Bedeutung hat. Verbreitet ist darüber hinaus die filamentöse Grünalge Trentepohlia. Vertreter dieser Gattung und andere als Photobionten in Flechten vorkommende Grünalgen kommen auch freilebend vor. Nur ca. 10 % der Flechten haben ein Cyanobakterium als phycobiontischen Partner. Spezies der Gattung Nostoc sind hier besonders häufig vertreten. In 3 bis 4 % aller Flechten kommt sowohl eine Grünalge als Primärphycobiont als auch ein Cyanobakterium als Sekundärphycobiont vor. Dabei sind die Cyanobakterien dann häufig in speziellen Strukturen, den Cephalodien, an der Oberfläche des Thallus (externe Cephalodien) oder innerhalb des Thallus (interne Cephalodien) lokalisiert und haben dort wahrscheinlich die Funktion, Stickstoff zu fixieren.

Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie

Die meisten Flechten verbreiten sich durch vegetative Vermehrung von Thallusbruchstücken; eine sexuelle Fortpflanzung ist den meisten Phycobionten ohnehin nicht möglich. Um die Verbreitung durch Wind und Tiere zu unterstützen, bilden einige Flechten durch Wucherungen in der Rinde des Thallus Ausstülpungen (Isidien) oder besondere Zellpakete im Inneren des Thallus (Soredien), die nach dem Austrocknen des Thallus leicht abgerissen bzw. freigesetzt und dann verbreitet werden. Aus diesen Thallusbruchstücken können dann am neuen Standort nach Befeuchtung neue Flechtenthalli heranwachsen.

345 Verbreitung und Fortpflanzung

Bei vielen Mycobionten kommt natürlich auch eine sexuelle Vermehrung vor. Der Mycobiont bildet hierzu Apothezien ( Abb. 4.23), die besonders häufig bei Tabelle 4.17. Habitate von Flechten Strauchflechten an einer stiel- oder trichterförmigen Differenzierung, dem Podetium, • Baumrinde • Gestein zu finden sind. Diese ein bis mehrere Milli• Dächer • Lavagestein meter großen Podetien sind meist mit blo• Felsen • Pflanzenblätter • Gehwegplatten • Wüstensand ßem Auge zu erkennen und fallen häufig durch eine orange bis rote Färbung der Apothezien auf. Auskeimende Sporen müssen am neuen Standort natürlich zunächst wieder auf den Phycobioten treffen, damit hieraus eine Flechte entstehen kann. Abb. 4.24. Eine Flechte auf der Borke eines Baumes

Flechten begegnen uns in der Natur in allen Klimazonen in sehr vielen unwirtlichen Habitaten, an denen sonst keine anderen Organismen vorkommen. Es handelt sich hierbei teilweise um extreme Ökosysteme, in denen keiner der Partner aus der Symbiose alleine existieren könnte. Nur die morphologische und physiologische Einheit beider zur Lebensgemeinschaft beitragenden Organismen ermöglicht den Flechten dort Wachstum und Überleben. Deshalb sind Flechten auch häufig Erstbesiedler von Standorten. Auch die Teilnehmer am MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM brauchen nur wenige Meter vor die Tür zu gehen, um Flechten anzutreffen. Ein einziger Blick auf alte Hausdächer, Gehwegplatten, Beton- oder Steinmauern oder große Bäume ( Abb. 4.24) führt meist sofort zur Entdeckung von Flechten ( Tabelle 4.17). Probenmaterial verschiedener Flechten kann einfach von den oben angegebenen Habitaten gesammelt werden. Es empfiehlt sich ein scharfes Messer oder Skalpell mitzunehmen, da viele Flechten fest auf dem Untergrund anheften und nur schwierig abzutrennen sind. Im Rahmen des MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUMS sollten die Flechten zunächst an ihren natürlichen Standorten und später im Labor photographiert werden. Es lohnt sich dann, die meist sehr schön aussehenden Flechten im Labor mit einer Stereolupe zu betrachten und die Wuchsform zu skizzieren. Als drittes sollte das eingesammelte Material dann mikroskopiert werden. Zur Vorbereitung sollten die eingesammelten Flechten zunächst für einige Minuten in Wasser eingeweicht werden, bevor von Hand oder mit einem Mikrotom Schnitte angefertigt werden. Das Flechtenmaterial kann auch zunächst durch Einlegen (je nach Größe eine Stunde bis zu einem Tag) in das sogenannte Pfeiffersche Gemisch ( S. 423) fixiert und konserviert werden, bevor Dünnschnitte für die mikroskopische Betrachtung angefertigt werden. Die Praktikums-

Vorkommen

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4 Kurzexkursionen und Demonstrationen

teilnehmer sollten dann in den mikroskopischen Präparaten die verschiedenen Organismen und Zellformen identifizieren und versuchen, hierbei vor allem die besonderen Strukturen (Haustorien, Appressorien, Cephalodien, Isidien, Soedien, Apothezien usw.) zu finden. Es empfiehlt sich zur Dokumentation Skizzen von den mikroskopischen Präparaten anzufertigen. Auch sollten Dauerpräparate mit Angaben zur Herkunft des Materials und zum Zeitpunkt der Probennahme hinterlegt werden. Biotechnologische Bedeutung

D6 - S. 350

In vegetationsarmen Gegenden haben Flechten eine gewisse Bedeutung für die Ernährung. Das bekannteste Beispiel ist wahrscheinlich die Rentierflechte (Cladonia rangiferina), die in den Tundren besonders im Winter die Hauptfutterquelle der Rentiere und einiger anderer Tiere (z. B. Karibus) darstellt. Früher wurden auch die kohlenhydratreiche Mannaflechte (Lecanora esculenta) und das Isländische Moos (Cetraria islandica) zur Herstellung von Flechtenbrot für die menschliche Ernährung und zur Herstellung von Alkohol verwendet. Gärtner verwenden Cladonia stellaris bei der Herstellung von Blumenarrangements. Flechten dienten auch als Ausgangsmaterial zur Herstellung von Textil- und anderen Farbstoffen (z. B. Lackmus). Im Umweltschutz dienen Flechten aufgrund ihrer starken Empfindlichkeit gegenüber dem in Abgasen von Kraftwerken enthaltenen SO2 und anderen Luftverunreinigungen als Indikatororganismen. Eine gewisse Bedeutung ist den Flechten auch bei der Bodenbefestigung besonders von Sandböden und damit dem Erosionsschutz zuzuschreiben. Wir werden im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM hierzu noch ein weiteres Beispiel kennenlernen. Als Ergebnis der physiologischen Einheit der OH OH Ektosymbiose werden von den Flechten auch H3C H C CO CH3 typische sekundäre, als „Flechtenstoffe“ 3 bezeichnete Stoffwechselprodukte gebildet. Obwohl Flechten in der traditionellen MediHO O O zin durchaus Berücksichtigung fanden, wurCO CH3 den sie von der modernen pharmazeutischen Industrie bisher weitgehend ignoriert. Lediglich die in der Mannaflechte und im Isländi- Abb. 4.25. Strukturformel von Usninsäure schen Moos vorkommende Usninsäure ( Abb. 4.25) findet als Antibiotikum zur Therapie von Hautkrankheiten Verwendung. Dabei befinden sich unter den Flechtenstoffen viele weitere antibiotisch bzw. therapeutisch wirksame Substanzen, die für medizinische und pharmazeutische Anwendungen interessant sein könnten. Hier bietet sich noch ein weites Feld für die Suche nach aktiven Substanzen und Genen für Biosynthesewege mittels moderner molekularbiologischer Methoden. Weiterführende Literatur Eldridge DJ, Greene RSB (1994) Microbiotic soil crusts – A review of their roles in soil and ecological processes in the rangelands of Australia. Australian Journal of Soil Research 32:389-415 Esser K (2000) Kryptogamen – Praktikum und Lehrbuch. Band 1. Cyanobakterien, Algen, Pilze, Flechten. 3. Aufl., Springer, Berlin, Heidelberg, New York Miao V, Coeffet-Legal MF, Brown D, Sinnemann S, Donaldson G, Davies J (2001) Genetic approaches to harvesting lichen products. Trends in Biotechnology 19:349-355 Müller K (2001) Pharmaceutically relevant metabolites from lichens. Applied Microbiology and Biotechnology 56:9-16 Nash TH (1996) Lichen biology. Cambridge Univ Press, Cambridge Nash TH, Gries C (2002) Lichens as bioindicators of sulfur dioxide. Symbiosis 33:1-21

Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie

347

Nachgefragt 1. Nennen Sie eine Lebengemeinschaft von mindestens zwei verschiedenen Organismen, die kein Individuum im eigenschaftlichen Sinn dargestellt, aber trotzdem mit einem Spezies und Gattungsnamen bezeichnet wird! 2. Aus welchen Organismengruppen bestehen Flechten, und was stellen Flechten dar? 3. Nennen Sie Mycobionten und Phycobionten, die in Flechten vorkommen! 4. Was versteht man unter Primärphycobionten und Sekundärphycobionten? 5. Nennen Sie die Funktionen von Mycobiont und Phycobiont in den Flechten und deren Beiträge zu dieser Lebensgemeinschaft und erläutern Sie, weshalb Mycobiont und Phycobiont eine anatomischmorphologische und auch eine physiologische Einheit darstellen! 6. Wo kommen Flechten in der Natur vor? 7. Warum sind Flechten anderen Organismen an extremen Standorten in der Regel überlegen, können dort sehr lange Zeiträume überdauern und sogar wachsen? 8. Bei welchen Flechten bestimmt eher der Mycobiont und bei welchen eher der Phycobiont den Habitus des Thallus?

9. Wie unterscheidet sich ein homöomerer Thallus von einem heteromeren Thallus? 10. Nennen Sie die verbreitetsten Typen von Flechten und beschreiben Sie deren Aufbau! 11. Was versteht man unter Haustorien? Fertigen Sie eine Skizze zur Erläuterung an! 12. Was versteht man unter Appressorien? Fertigen Sie eine Skizze zur Erläuterung an! 13. Was sind Cephalodien, und welche Organismen kommen in ihnen vor? 14. Welche besonderen Bestandteile des Flechtenthallus dienen der vegetativen Vermehrung? 15. Was versteht man unter einem Podetium, bei welchem Flechtentyp kommt dies vor und woran kann man es erkennen? 16. Welche Bedeutung hat die Rentierflechte? 17. Was versteht man unter Flechtenstoffen? 18. Welche Flechte wird in der Medizin genutzt? Wie heißt der Wirkstoff? 19. Nennen Sie weitere Beispiele für die Nutzung von Flechten durch den Menschen! 20. Nennen Sie weitere Beispiele für Symbiosen zwischen prokaryontischen und eukaryontischen Organismen!

Anaerobe Süßwassersedimente und das Volta-Experiment

Demo 5

Methan ist ein wichtiges Produkt des Stoffwechsels von Prokaryonten. Es wird geschätzt, dass jährlich ca. 1 Mio Tonnen Methan entstehen. Dies entspricht immerhin ungefähr der dreifachen Menge sämtlicher von der Chemischen Industrie synthetisierter Chemikalien. Der überwiegende Teil des Methans entsteht durch anthropogene Einflüsse und wird biologisch durch methanogene Prokaryonten gebildet. Diese kommen frei lebend an zahlreichen aquatischen Standorten, als Bewohner der Intestinaltrakte höherer Organismen (z. B. Rinder) und von Insekten (z. B. Termiten) Abb. 4.26. Brennendes Sumpfgas. sowie als Symbionten von vielen Protozoen vor. Nur vergleichsweise geringe Mengen Methan entstehen abiogen. In Tabelle 4.18. sind die bedeutendsten Standorte der biogenen und abiogenen Methanogenese mit einer Abschätzung der dort freigesetzten Methanmengen aufgelistet. Diese Mengen sind auch vor dem Hintergrund zu beurteilen, dass Methan ein bedeutendes Treibhausgas darstellt.

Vorkommen von Methan

H H

C

H

H Methan

348

4 Kurzexkursionen und Demonstrationen Anaerobe Nahrungsketten

V10 - S. 70

V11 - S. 74 V12 - S. 77

Standorte der Methanogenen E1 - S. 297 E3 - S. 310 V20 - S. 108

Methan und CO2 sind die Endprodukte Tabelle 4.18. Orte von Methan-Emissiodes anaeroben Abbaus von Biomasse. nen (in 106 Tonnen pro Jahr) Unter anaeroben Bedingungen wird die überwiegend aus Polymeren bestehende Bio- Biogen 120 - 200 masse jedoch praktisch nie direkt zu Methan Natürlichea)Feuchtgebiete Reisfelder 70 - 120 abgebaut. Es sind unter diesen Bedingungen a) 80 - 100 vielmehr stets mehrere Gruppen von Mikro- Rinder Termiten 25 - 150 organismen funktionell hintereinander Freisetzung aus Faultürmen a) 10 - 30 geschaltet und an der Umwandlung der Bio- Mülldeponien a) 5 - 70 masse zu Methan beteiligt. Am Anfang ste- Ozeane 1 - 20 hen primäre Gärer, die Kohlenhydrate zu Tundren 1- 5 Lactat, Acetat, Butyrat, Ethanol, Succinat, Formiat, H2 und CO2 vergären; viele von Abiogen 10 - 35 ihnen sind in der Lage, die mehr oder weni- Kohlebergbau a) a) 15 - 45 ger komplexen Polymere zunächst in mono- Lecks in Pipelines usw. von Biomasse a) 10 - 40 mere oder oligomere Verbindungen zu Verbrennung 0,5 Autos a) spalten. Es folgen sekundäre Gärer, welche Vulkane 0,5 die primären Gärungsprodukte weiter vergären; hierzu gehören z. B. die Milchsäure ver- a) anthropogen wertenden Propionsäurebakterien. Auch anaerobe Carbonatatmer wie z. B. homoacetogene Bakterien tragen dazu bei, dass weitere Gärungsprodukte in Acetat überführt werden. Methanogene Bakterien sorgen nun ebenfalls durch anaerobe Carbonatatmung dafür, dass entstandenes Acetat, H2 und CO2 in Methan umgewandelt wird. Dabei entstehen ca. 60 % des Methans aus Acetat und ca. 40 % aus H2 und CO2 (1.4.2, S. 12). Aus den oben genannten Verbindungen erfolgt die Methanogenese durch frei lebende methanogene Bakterien überwiegend an Süßwasserstandorten ( Tabelle 4.18). Sie ist in den anaeroben Sedimenten entsprechender Gewässer besonders dann ausgeprägt, wenn sich in den Gewässern durch Primärproduktion phototropher Organismen oder durch Eintrag von außen (z. B. Laubfall) viel organisches Material akkumuliert hat. Natürliche Feuchtgebiete und Reisfelder sind hier die bedeutendsten Quellen von Methan. Das hier gebildete Sumpfgas hat eine ähnliche Zusammensetzung wie das Biogas, welches in den Faultürmen der Kläranlagen oder in Biogasanlagen entsteht. Marine Standorte, die sich durch einen hohen Sulfatgehalt auszeichnen, entlassen ausgehend von den oben genannten Substraten nur geringe Mengen Methan. Hier dominieren die Desulfurikanten als „Endabnehmer“ von H2 und organischen Säuren, da diese energetisch und kinetisch gegenüber den methanogenen Bakterien im Vorteil sind. Trotzdem werden auch an marinen Standorten geringe Mengen Methan freigesetzt, wo es jedoch vorwiegend aus Methylamin entsteht, welches bei der anaeroben Vergärung von Betain, Cholin und Trimethylaminoxid durch anaerobe Bakterien gebildet wird.

Die Entdeckung

Als der italienische Physiker Alessandro Volta 1776 auf dem Lago Maggiore ruderte und dabei mit einem Paddel den Grund berührte, beobachtete er das Aufsteigen von Gasblasen. Er fing die Gasblasen in einem großem Glasgefäß auf und konnte das Gas mit einer brennenden Kerze entzünden, welches mit einer bläulichen Flamme abfakkelte ( Abb. 4.26). Am Boden des Glasgefäßes erlosch die Kerze, während das Gas in einer Mischung mit acht bis zehn Teilen Luft besonders heftig verbrannte. Volta sprach fortan von „brennender Luft“.

Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie

349

Versuchsdurchführung Das Experiment kann im Binnenland an nahezu jedem stehenden Gewässer, auf dessen Grund sich ein schlammiges Sediment befindet, durchgeführt werden. Je mehr or Trichter aus durchsichtigem Kunststoff  passender Stopfen ganisches Material durch Laubfall eingetragen wurde bzw. je mehr Nährstoffe aus Sonstiges gedüngten angrenzenden landwirtschaftlichen Nutzflächen so einem Teich, Tümpel,  Spaten oder Stock  Feuerzeug oder Streichholz See oder Graben zugeführt wurden, desto mehr Methan entsteht an einem solchen Süßwasserstandort erfahrungsgemäß. Von der Eignung des Gewässers kann man sich schnell überzeugen, indem man mit einem Stock kurz im Sediment stochert: steigen Gasblasen, die durchaus einen Durchmesser von einigen Zentimetern besitzen können, auf, handelt es sich i. d. R. um brennbares Sumpfgas. benötigtes Material Geräte

Beim Entzünden des Sumpfgases sollte sich oberhalb des Trichters nichts Brennbares wie z. B. die Äste eines Baumes oder Strauches befinden. Auch sollten die Experimentatoren ihre Köpfe zur Seite und nicht über den Trichter halten.

Der Experimentator hat sich am besten in die Randzone des Gewässers zu begeben. Dort drückt er einen großen, möglichst durchsichtigen Kunststofftrichter mit der großen Öffnung nach unten in das Wasser, bis die Luft über die kleine Öffnung vollkommen aus dem Trichter entwichen ist. Danach wird die kleine Öffnung mit einem Stopfen verschlossen. Mit einem Spaten, Stock oder Ähnlichem wird nun vorsichtig im Schlamm unterhalb des Trichters gestochert und gerührt. Die aufsteigenden Gasblasen werden im Trichter gesammelt und verdrängen in zunehmenden Maße das im Trichter enthaltende Wasser. Auf diese Weise können an einem „ertragsreichen“ Standort innerhalb von wenigen Minuten ohne Probleme einige Liter Sumpfgas gesammelt werden. Ist genug Sumpfgas vorhanden (mindestens 0,5 l), wird der Stopfen entfernt und das austretende Gas mit einem Feuerzeug oder Streichholz entzündet. Erfahrungsgemäß kann die auftretende Stichflamme beim Brennen durch langsames Hinunterdrücken des Trichters noch vergrößert bzw. länger „am Leben“ erhalten werden ( Abb. 4.26). Am besten beginnt man das Experiment mit einer kleinen Wanderung in der Abenddämmerung und inspiziert den Standort noch bei Tageslicht. Der Eindruck vom Experiment ist besonders nachhaltig, wenn es dann nach Eintreten der Dunkelheit durchgeführt wird. Die anfängliche Skepsis über den Ausgang des Experiments und Zweifel, ob sich denn dieser Ausflug überhaupt lohne, verfliegen dann in der Regel sehr schnell. Weiterführende Literatur Tyler SC (1991) The global methane budget. In: Rogers JE, Whitman KWB (eds) Microbial Production and Consumption of Greenhouse Gases: Methane, Nitrogen Oxides, and Halomethanes. American Society for Microbiology, Washington. pp 7-38 Wolfe RS (1996) 1776-1996: Alessandro Volta’s combustible air. ASM News 62:529-534

Sicherheitshinweis

350

4 Kurzexkursionen und Demonstrationen

Nachgefragt 1. Schreiben Sie die Strukturformel von Methan! 2. Nennen Sie die beiden Hauptbestandteile von Sumpfgas und deren ungefähren prozentualen Anteile! 3. Welche Gase können in geringerer Konzentration im Sumpfgas außerdem noch enthalten sein? 4. Warum erlischt eine brennende Kerze am Boden eines mit Sumpfgas gefüllten Gefäßes? 5. Wo und wie kann durch Methanogenese entstehendes Methan genutzt werden? 6. Sumpfgas hat einen Brennwert von ca. 21 kJ/L. Wieviel Liter Sumpfgas benötigen Sie, um 1 Liter Wasser mit einer Temperatur von 20 °C zum Sieden zu bringen? 7. Schreiben Sie die Reaktionsgleichung auf, nach der Methan an der Luft verbrennt! 8. Warum sollte das Volta-Experiment an einem Süßwasserbiotop durchgeführt werden? 9. Aus welchen Verbindungen entsteht Methan an marinen Standorten überwiegend? 10. Was versteht man unter einer anaeroben Nahrungskette? 11. Welches sind die wichtigsten Substrate für die Methanogenese? 12. Warum kann Methan biogen nicht unter aeroben Bedingungen entstehen?

13. Warum ist die Methanogenese auch im Hinblick auf einen hohen Stoffdurchsatz in anaeroben Nahrungsketten bedeutsam? 14. Wieviel Liter Methan entstehen aus 100 Gramm Glucose bei einer für anaerobe Süßwassersedimente typischen Nahrungskette ungefähr? 15. Zu welcher Gruppe der Prokaryonten gehören die methanogenen Bakterien? 16. Nennen Sie die wichtigsten Habitate von methanogenen Bakterien! 17. In welcher Hinsicht unterscheiden sich methanogene Bakterien als Archaea von den Bacteria? 18. Stellen Sie an Hand von mikrobiologischen Lehrbüchern die für Methanogenese einzigartigen Coenzyme und Cofaktoren zusammen! 19. Welche Stoffwechselwege und Enzyme sind in methanogenen Bakterien vorhanden, um ausgehend von ihren typischen Substraten nicht nur Methan, sondern auch Zellbestandteile synthetisieren und damit wachsen zu können? 20. Protozoen, Termiten, Rinder und andere eukaryontische Organismen bilden ebenfalls Methan. Wie entsteht Methan in diesen Organismen?

Demo 6

Farbstreifen-Sandwatt und Nordseeküste

Vorkommen

Das Farbstreifen-Sandwatt ist in Deutschland an der Nordseeküste im Wattenmeer an den Südseiten der Ostfriesischen Inseln, aber auch in Schleswig-Holstein im Sommer zu bestaunen. Besonders ausgeprägt ist es bei der unbewohnten und unter Naturschutz stehenden Insel Mellum, aber auch bei Spiekeroog und Amrum tritt es auf. Es kommt auch an der Ostseeküste und einigen anderen Stränden der Welt vor. Das FarbstreifenSandwatt besteht aus deutlichen gelblich, Abb. 4.27. Farbstreifen-Sandwatt grün, rot, schwarz und grau gefärbten Schichten im Sand, in denen unterschiedliche prokaryontische und eukaryontische Mikroorganismen miteinander vergesellschaftet sind und die von aufsteigendem Kapillarwasser feucht gehalten werden ( Abb. 4.27). Erstmals beschrieben wurde das Farbstreifen-Sandwatt vor ca. 200 Jahren von dänischen Botanikern in der „Flora Danica“; die Bezeichnung „Farbstreifen-Sandwatt“ wurde 1936 durch den deutschen Biologen E. Schulz geprägt.

Laminierte Gesteine und Sedimente

Das Farbstreifen-Sandwatt ist ein Beispiel für eine Mikrobenmatte. Aus Mikrobenmatten sind im Lauf der Erdgeschichte die Stromatolithe hervorgegangen, fossile Zeugnisse der bedeutendsten Ökosysteme, die jemals auf der Erde existierten. Sie haben die Bildung riesiger Lagerstätten vieler Rohstoffe bewirkt und datieren bis auf 3,5 Milliarden Jahre zurück. Es handelt sich dabei um laminierte Gesteine, deren Ursprünge

Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie

351

im Zusammenhang mit der Aktivität mikrobieller Lebensgemeinschaften stehen und die zusammen mit anderen Faktoren ein Muster erzeugt haben, das im konsolidierten Gestein erhalten geblieben ist. Mikrobenmatten können daher als potentielle Stromatolithe angesehen und auch als rezente oder lebende Stromatolithe bezeichnet werden. Das Farbstreifen-Sandwatt besteht aus mehreren unterschiedlich gefärbten Schichten ( Abb. 4.30). Die oberste Schicht ist sehr dünn und graugelb gefärbt und besteht überwiegend aus Sand, der durch Wind und Gezeiten ständig neu heran- und abgetragen wird. Diese Schicht kann auch fehlen. Die vier folgenden Schichten sind aus mikrobiologischer Sicht besonders interessant. Die obere, blaugrüne bis grüne Schicht enthält hauptsächlich Cyanobakterien und Diatomeen. Vertreter beider Organismengruppen verfügen über eine oxygene Photosynthese. Die grüne Farbe dieser Schicht ist daher auf die Chlorophylle zurückzuführen. In dieser Schicht ist auch das CyanobakteAbb. 4.28. Fäden aus Microcoleus chthorium Microcoleus chthonoplastes anzutreffen noplastes (siehe unten); Merismopedia punctuata ist ein weiterer wichtiger Vertreter. Die mittlere, purpurrote bis rosa Schicht enthält Purpurschwefelbakterien, welche eine anoxygene Photosynthese betreiben. Thiopedia rosea und Allochromatium vinosum sind häufig vorkommende Verteter. Die rote Farbe dieser Schicht ist auf Carotinoide, die Hauptpigmente dieser Bakterien, zurückzuführen. Die untere, schwarze Schicht enthält vorwiegend Desulfurikanten. Desulfovibrio desulfuricans ist ein häufiger Vertreter. Das von diesen Bakterien gebildete Abb. 4.29. Watt mit Polder Sulfid präzipitiert mit Eisenionen zu amorphem Eisensulfid und ist für die Schwarzfärbung verantwortlich. Es schließt sich dann nach unten noch eine graue Zone an. Die Graufärbung ist auf die chemische Bildung von Pyrit durch Reaktion von Eisensulfid mit Schwefel zurückzuführen. Manchmal kann weiter unten eine Wiederholung dieser Schichten beobachtet werden; es handelt sich dabei um im Vorjahr entstandene Zonen, die nicht durch Wind- oder Wassererosion zerstört wurden. Die Dicke eines Farbstreifen-Sandwatts kann zwischen zwei und 20 mm betragen.

Aufbau

Das Farbstreifen-Sandwatt stellt eine komplexe syntrophe Biozönose dar. Die Cyanobakterien betreiben eine oxygene Photosynthese und nutzen hierzu das in die oberen Schichten noch eindringende Sonnenlicht. Das durch die Pigmente der Cyanobakterien gefilterte Licht ermöglicht den Schwefelpurpurbakterien noch eine anoxygene Photosynthese mit Sulfid als Elektronendonor. Hierdurch entsteht über Schwefel Sulfat. Die strikt anaeroben Desulfurikanten leben von den in den darüber gelegenen Schichten synthetisierten organischen Verbindungen und reduzieren damit Sulfat zu Sulfid, welches dann wieder den darüber liegenden Schwefelpurpurbakterien zur Verfügung steht.

Synthrophien

V18 - S. 99

V20 - S. 108

V18 - S. 99

352

4 Kurzexkursionen und Demonstrationen

Abb. 4.30.

Schemazeichnung der Schichtung des Farbstreifensandwatts

Mikroorganismen an natürlichen Standorten, in Umweltproben und in der Industrie

353

Das Cyanobakterium Microcoleus chthonoplastes ist ein charakteristischer Bewohner des Farbstreifen-Sandwatts und kommt in der obersten Schicht vor. Es ist unter dem Mikroskop an den langen Zellfäden (Durchmesser ca. 0,7 bis 1,0 μm,  Abb. 4.28) aus zylindrischen Einzelzellen (ca. 0,7-1,0 × 3-5 μm) und den spitz zulaufenden terminalen Zellen gut zu erkennen. Bis zu 100 dieser Zellfäden sind zu charakteristischen Bündeln zusammengefasst, die von einer dicken, aus Polysacchariden bestehenden Schleimhülle umgeben sind. Diese Zellverbände ähneln einem Kabel. Der Durchmesser dieser Bündel kann bis zu 40 μm und deren Länge sogar einige Millimeter betragen. Die einzelnen Zellfäden können im Bündel hin und her gleiten und auch die Hülle verlassen. Die Schleimhülle gewährt den Zellen einen Schutz vor Austrocknung und wird offensichtlich nur am natürlichen Standort ausgebildet, denn in Laborkulturen ist sie nicht zu finden.

Zellfäden und Bündel von Fäden

Schleimhülle und Länge der Bündel sind für das Verkleben der Sandkörner verantwortlich. Wie mit einem Netz werden die Sandkörner durch die kreuz und quer übereinander liegenden Microcoleus-Bündel bedeckt und damit festgehalten. Die Auswirkungen hiervon sind zu spüren, wenn Sand aus dem Bereich des Farbstreifen-Sandwatts entnommen wird: die Probe zerbröselt nicht in einzelne Sandkörner sondern ist relativ stabil. Zerbricht man die Probe vorsichtig, können beim Auseinanderweichen der Klumpen an der Bruchstelle sogar mit bloßem Auge feinste Fäden erkannt werden. Dadurch trägt M. chthonoplastes maßgeblich zur Verfestigung von Sandböden bei. Es sorgt dadurch auch dafür, dass die Sandschichten langsam, aber stetig in die Höhe wachsen, bis diese durch Salzpflanzen besiedelt werden können und später erste Dünen entstehen ( Abb. 4.29). Im Speziesnamen ist diese Eigenschaft bereits 1813 bei der Erstbeschreibung dieser Spezies unter dem früheren Namen Conferva chthonoplastes durch den Botaniker Hofmann Bang dokumentiert worden („Chthon“: griechisch „Erdboden“; „plastes“: griechisch „Bildner“). Erst später erhielt dieses Cyanobakterium den heute gültigen Gattungsnamen Microcoleus. M. chthonoplastes ist an dieses Ökosystem optimal angepasst: Es fixiert Stickstoff und kann neben der für Cyanobakterien typischen oxygenen Photosynthese auch eine anoxygene Photosynthese mit Sulfid als Elektronendonor durchführen, welches dabei zu Thiosulfat oxidiert wird.

Verkleben von Sand

Um das Farbstreifen-Sandwatt sehen zu können, muss zunächst mit einem Spaten in den festen Sand einer Salzmarsch gestochen und der Querschnitt offengelegt werden. Mit einem scharfen Messer wird dann am besten eine Scheibe herausgetrennt und zunächst mit bloßem Auge betrachtet. Durch Biegen und vorsichtiges Brechen kann man sich von der Festigkeit des Materials überzeugen und auch die Fäden von Microcoleus sichtbar machen. Die Sandscheiben können dann in einer Petrischale aufbewahrt und später im Labor mikroskopisch untersucht werden. Weiterführende Literatur Krumbein WE (1987) Die Entdeckung inselbildender Mikroorganismen. In: Gerdes G, Krumbeim WE, Reinecke HE (Hrsg) Mellum – Portrait einer Insel, Waldemar Kramer, Frankfurt, S. 62-76 Krumbein WE (1987) Das Farbstreifen-Sandwatt. Bau, Funktion und Erdgeschichte von Mikrobenmatten. In: Gerdes G, Krumbeim WE, Reinecke HE (Hrsg) Mellum – Portrait einer Insel, Waldemar Kramer, Frankfurt, S. 170-187 Waterbury JE (1999) The Cyanobacteria – Isolation, Purification, and Identification. In: Dworkin M (ed) The Prokaryotes (elektronische Version: http://link.springer.de/link/service/books/10125, Release 3.0 vom 21.5.1999) Springer, New York

354

4 Kurzexkursionen und Demonstrationen

Nachgefragt 1. Was versteht man unter einem FarbstreifenSandwatt? 2. Skizzieren Sie den typischen Aufbau eines Farbstreifen-Sandwatts. 3. Weshalb befindet sich im Farbstreifen-Sandwatt die rote Schicht nicht oberhalb der grünen Schicht? 4. Nennen Sie jeweils zwei Bakterien, die in den einzelnen Schichten des Farbstreifen-Sandwatts mit großer Wahrscheinlichkeit vorkommen! 5. Beschreiben Sie die stoffwechselphysiologischen Besonderheiten der Bakterien, die hauptsächlich in der grünen, roten und schwarzen Schicht vorkommen! 6. Warum ist es unwahrscheinlich, ein FarbstreifenSandwatt auch an aquatischen Süßwasserstandorten zu finden? 7. Die Färbungen der grünen und roten Schichten des Farbstreifen-Sandwatts sind auf Pigmente zurückzuführen. Worauf beruhen die schwarzen und grauen Verfärbungen in den beiden unteren Schichten? 8. Welche chemische Reaktion ist für den Übergang der schwarzen Schicht in eine graue Schicht verantwortlich? 9. Warum ist die Sauerstoffkonzentration im Bereich der grünen Schicht tagsüber besonders hoch, und warum ist in der roten Schicht kein Sauerstoff mehr nachweisbar? 10. Wie verändert sich die Sauerstoffkonzentration im Bereich der grünen Schicht im Tag/Nacht-Rhythmus?

11. Beschreiben Sie den Kreislauf anorganischer Schwefelverbindungen im Farbstreifen-Sandwatt und ordnen Sie die Umsetzungen den einzelnen Schichten zu! 12. Skizzieren Sie den Aufbau der typischen von Microcoleus chthonoplastes gebildeten Zellverbände! 13. Aus welcher Substanz besteht die Schleimhülle, welche die Zellfäden von Microcoleus chthonoplastes bündelt? 14. Welche Funktion hat die Schleimhülle für die Zellen von Microcoleus chthonoplastes? 15. Warum zerbricht ein Sandsediment aus dem Bereich des Farbstreifen-Sandwatts nicht unverzüglich nach der Entnahme? 16. Beschreiben Sie die einzelnen Stufen der Landentstehung an sandigen Meeresküsten bis hin zur Bildung erster Dünen! 17. Suchen Sie in Lehrbüchern und im Internet nach anderen Beispielen für Mikrobenmatten! 18. Was versteht man unter Stromatolithen? 19. Welche geologischen Lagerstätten sind auf Mikrobenmatten zurückzuführen? 20. Erklären Sie, wie es dazu gekommen sein kann, dass sich in der in diesem Kapitel gezeigten Abbildung eines Farbstreifen-Sandwatts die farbigen Schichten wiederholen!

5

Methoden

Grundlegende Methoden, auf die in den Versuchskapiteln verwiesen wird, sind im folgenden Abschnitt des MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUMS aufgeführt. Wo es uns sinnvoll erschien, wurden den eigentlichen „Kochvorschriften“ kurze Erläuterungen zum Prinzip der verwendeten Technik vorangestellt. Neben den in den Versuchen ausdrücklich erwähnten Methoden sind im einleitenden Kapitel 5.1 Verfahrensweisen behandelt, die Grundlage jeder mikrobiologischen Praxis sind, wie z. B. die Kultivierung von Mikroorganismen und die Herstellung und Sterilisation von Nährmedien. Rezepturen für bestimmte Lösungen sind der Übersichtlichkeit halber im Kapitel 5.3 (ab Seite 409) aufgelistet.

5.1

Kultivierung von Mikroorganismen

Herstellung von Nährmedien und Verwendung von Kulturgefäßen Ein Nähr- oder Kulturmedium muss alle Makroelemente oder Mineralstoffe (C, O, H, N, S, P, K, Mg, Na, Ca, Fe), aus denen sich im Wesentlichen die Biomasse zusammensetzt, und alle Spurenelemente oder Mikroelemente (Mn, Mo, Zn, Cu, Co, Ni, V, B, Cl, Se, Si, W u. a.), die hauptsächlich als Bestandteile von Cofaktoren und in freier Form an katalytischen Prozessen beteiligt sind, in einer für den betreffenden Mikroorganismus verwertbaren Form anbieten ( Tabelle 1.2, S. 7). Man unterscheidet synthetische oder definierte Medien, die eine chemisch definierte Zusammensetzung aufweisen (als Beispiel “Mineralsalzmedium” auf Seite 421), von Komplexmedien, die gänzlich oder z. T. aus chemisch undefinierten Bestandteilen wie Hefeextrakt, Fleischextrakt oder Pepton (als Beispiel “LB-Nährlösung” auf Seite 417) bestehen. Ein Minimalmedium enthält nur Verbindungen, die für einen bestimmten Mikroorganismus unbedingt notwendig sind, um seine minimalen Nährstoffansprüche zu decken. Ein Nährmedium kann in flüssiger Form als Flüssigmedium (Nährlösung) oder in verfestigter Form als Festmedium geboten werden. Während erstere hauptsächlich aufgrund der weitgehend homogenen Verteilung von Nährstoffen und Zellen für physiologische Untersuchungen und zur Gewinnung von Zellmasse verwendet werden, dienen letztere hauptsächlich zur Vereinzelung von Zellen und zur morphologischen Kontrolle von Kulturen. Als Verfestigungsmittel hat sich in der Praxis Agar (korrekt Agar-Agar,  Tabelle Abbildung 6.1, S. 409) durchgesetzt. Agar ist ein im Wesentlichen aus Agarose und Agaropektin zusammengesetztes Polysaccharidgemisch, das aus Rotalgen extrahiert wird. Agar ist in getrockneter Form ein weißlich bis grau-beiges Pulver, das je nach Reinigungsgrad in einer Konzentration von 1,5 bis 2 % (wt/vol) zur Verfestigung von Medien eingesetzt wird. Agar ist in kalten wässrigen Flüssigkeiten unlöslich und setzt sich als trüber Belag schnell am Boden ab ( S. 359). Erst ab einer Temperatur von 80 bis 90 °C schmilzt der Agar in der Lösung klar auf; beim Abkühlen bleibt der Agar bis zu einer Temperatur von 40 °C flüssig. Beim weiteren Abkühlen bildet sich ein klares, recht stabiles Gel, in dessen weitmaschiger Matrix Wasser, Nährstoffe und Proteine frei diffundieren können. Agar kann nur von einigen wenigen, vorwiegend marinen Mikroorganismen als Kohlenstoffquelle verwendet werden.

A. Steinbüchel, F. B. Oppermann-Sanio, Mikrobiologisches Praktikum, DOI 10.1007/978-3-642-17703-3_5, © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2003, Nachdruck 2011

Methode 1

ra

Festmedien werden meist in sterile (Plastik-)Petrischalen gegossen, bei speziellen Fragestellungen kann dies auch in verschiedenen Schichten erfolgen, z. B. bei overlay agar plates ( Abb. 5.2) zum Nachweis des extrazellulären Abbaus von Polymeren. In dieser Form gehören die Festmedien und die darauf kultivierten Mikroorganismen zum typischen Erscheinungsbild eines mikrobiologischen Laboratoriums. Zum Gießen von Festmedien wird das Agar-haltige Medium nach dem Autoklavieren ( S. 359) im Wasserbad auf eine Temperatur von ca. 50 bis 60 °C abgekühlt. Diese Temperatur ist zum einen niedrig genug, um mit dem das Medium umschließenden Gefäß ohne Handschuhe hantieren zu können, und zum anderen hoch genug, um ein vorzeitiges Erstarren des Agars zu verhindern. Das Gießen selbst geschieht am besten an einer sterilen Werkbank in keimfreier oder keimreduzierter Luft, da hierbei notwendigerweise die Petrischalen geöffnet werden müssen. Gegossen wird im Stapel von ca. 10 bis 15 Platten, einzeln Platte für Platte von unten beginnend ( Abb. 5.1). Dies ist zum einen aufgrund der Enge einer sterilen Werkbank notwendig, zum anderen führt ein fertig gegossener Plattenstapel aufgrund der kompakten Anordnung und der damit einhergehenden langsamen Abkühlung des Mediums zu einer verminderten Kondenswasserbildung an den Innenseiten der Petrischalen-Deckel.

n

5 Methoden

Du

356

Abb. 5.1. pel

Gießen von Agarplatten im Sta-

uersch Q nitt

Aufsitch

Abb. 5.2. Vergleich von Doppelschicht(overlay agar plates) und „Voll“-Medium bei der Sichtbarmachung von Fresshöfen

Die Art des Gefäßes, in dem ein Flüssigmedium Mikroorganismen angeboten wird, hängt im Wesentlichen von deren Verhältnis zum Luftsauerstoff ab. Allen aerob zu kultivierenden Mikroorganismen muss Sauerstoff für die Aufrechterhaltung des Energiestoffwechsels in ausreichender Menge geboten werden. Da die Löslichkeit von Sauerstoff in wässrigen Medien jedoch extrem gering ist, muss Sauerstoff permanent in das Medium nachgeliefert werden. Zum Vergleich: Während die übliche Menge von Glucose in einem Liter Medium 28 mmol beträgt, befindet sich bei einem normalen Luftdruck von 0,1 MPa (1 bar) lediglich der hundertste Teil dieser Stoffmenge an Sauerstoff in gelöster Form im Medium; dies bedeutet, dass zur vollständigen Verbrennung der vorhandenen Glucosemenge die sechshundertfache Stoffmenge Sauerstoff in das Medium eingebracht werden muss. Zur aeroben Kultivierung von Mikroorganismen im Labor- oder Praktikumsmaßstab wird diesem Umstand dadurch Rechnung getragen, dass man Gefäße wählt, die aufgrund ihrer Geometrie ein möglichst großes Oberflächen/Volumen-Verhältnis des Mediums erlauben. Eine möglichst große Oberfläche ist Voraussetzung für das rasche Nachdiffundieren von Sauerstoff aus der Luftatmosphäre in das Medium. Erlenmeyerkolben, deren Nutzvolumen nur zu einem Zehntel genutzt wird (d. h. 10 ml Medium in einem 100 ml-Erlenmeyerkolben), sind für diesen Zweck nahezu ideal ( Abb. 5.3).

5.1 Kultivierung von Mikroorganismen

Abb. 5.3.

Kolben, Flaschen und andere Kulturgefäße

Durch kreisende Bewegung des Erlenmeyerkolbens auf einem so genannten Schüttler (mit Umdrehungsgeschwindigkeiten von 100 bis 200 min-1) wird die effektive Oberfläche für den Gasaustausch um ein Vielfaches erhöht. Noch mehr erhöhen lässt sich die Gas-Flüssigkeitsgrenzfläche in Erlenmeyerkolben, die so genannte Schikanen enthalten. Schikanen sind in den Innenraum des Erlenmeyerkolben ragende eckenförmige Einbuchtungen, an denen sich die Flüssigkeit bei rotierender Bewegung bricht. Auf diese Weise kann man unter aeroben Bedingungen bis zu einem Kulturvolumen von ca. 200 ml verfahren. Will man darüber hinausgehen, so muss man entweder die Kultur auf mehrere Erlenmeyerkolben verteilen oder einen Rührkessel (Fermenter) verwenden. In einem Fermenter wird eine im Vergleich zu einem Erlemeyerkolben wesentlich verbesserte Sauerstoffversorgung dadurch erreicht, dass Luft (oder sogar reiner Sauerstoff) unter hohem Druck durch feine Düsen eingeblasen und durch die sich schnell drehenden Rührblätter rasch verteilt wird. In ihnen können aufgrund der besseren Sauerstoffzufuhr wesentlich höhere Zelldichten erzielt werden als in Erlenmeyerkolben. Zur aeroben Kultivierung mycelbildender Mikroorganismen sind kurzhalsige Gefäße wie z. B. Fernbach- oder Penicillinkolben gebräuchlich ( Abb. 5.3), die entweder gar nicht oder nur mit langsamer Schüttelfrequenz bewegt werden. Zur Kultivierung anaerober Mikroorganismen kehrt sich das benötigte Oberflächen/ Volumen-Verhältnis um: Zur Luftatmosphäre geöffnete Oberflächen müssen minimiert sein, um das Eindringen von Luftsauerstoff zu verhindern. Kultivierung unter anaeroben Bedingungen findet daher in der Regel in nahezu randvoll gefüllten Gefäßen statt, die sorgsam verschlossen sind. Eine Inkubation auf einem Schüttler verbietet sich von selbst; aerobe Kulturen sind in der Regel Standkulturen (eine schwache Bewegung kann gelegentlich notwendig sein, um ein Absetzen der Zellen zu vermeiden). Typische Gefäße zur anaeroben Kultivierung sind Rundkolben und Steilbrustflaschen. Näheres zur Kultivierung anaerober Mikroorganismen ist in Methode 5 ( S. 367) aufgeführt.

357

358

5 Methoden

Methode 2 Sterilisation

V7 - S. 59

V8 - S. 62

Sterilität ist ein absoluter Begriff und bedeutet absolute Keimfreiheit; Ausdrücke wie „semisteril“ sind so unsinnig wie „teilweise schwanger“. Desinfektion bedeutet die Beseitigung von pathogenen Mikroorganismen. Eine sterile Lösung oder ein steriles Gerät ist also auch automatisch desinfiziert, wohingegen eine Desinfektion noch keine Sterilität bedeutet. Werden unerwünschte Mikroorganismen in eine Lösung oder ein Medium eingeschleppt, so spricht man von Kontamination. Unter Pasteurisieren versteht man die Abtötung aller vegetativen Zellen; sie wird durch Erhitzen auf einer Flüssigkeit auf 80 °C (10 min) erzielt. Diese Prozedur „überleben“ die hitzeresistenten Endosporen (Bacillus, Clostridium u. a.), weshalb eine Pasteurisierung zur Anreicherung von Endosporenbildnern genutzt werden kann.

Definition: Sterilisation Beim Vorgang der Sterilisation werden sämtliche Mikroorganismen einschließlich aller Dauerformen, wie z. B. Endosporen, abgetötet oder entfernt. Definition: Desinfektion Bei einer Desinfektion werden lediglich alle pathogenen Mikroorganismen abgetötet oder entfernt, so dass vom desinfizierten Material keine Infektion ausgehen kann. Definition: Pasteurisation Bei der Pasteurisation werden lediglich vegetative Zellen abgetöt. Dauerformen wie hitzeresistente Endosporen werden nicht abgetötet.

Im Folgenden sind die im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM verwendeten Verfahren zur Sterilisation von Lösungen, Medien und Gerätschaften erläutert. Bei den zunächst behandelten Verfahren des Ausglühens ( S. 358), der Nutzung von trockener Hitze (Sterilisationsschrank,  S. 359) und feuchter Hitze (Autoklavieren,  S. 359) stellt die erheblich erhöhte Temperatur das sterilisierende Biozid dar; die Wirkung wird durch die Denaturierung (Koagulation) der Zellproteine erreicht. Die nötige Intensität der Hitzebehandlung ist abhängig von der Hitzeresistenz der Endosporen. Zur Sterilisation hitzeempfindlicher Lösungen hat sich die Methode der Sterilfiltration ( S. 362) bewährt.

Ausglühen Das Ausglühen einer Impföse oder einer Impfnadel in einer entleuchteten Bunsenbrennerflamme ist ein sichtbares Zeichen für das Erreichen einer Temperatur, die zur Sterilität der genannten Überimpfungs-Gerätschaften führt. Dazu wird der Halter der Impföse (Kollehalter) am äußersten Ende angefasst. Der Draht der Impföse bzw. Impfnadel wird möglichst im steilen Winkel ( Abb. 5.4) in den oberen (heißen) Teil der Flamme gehalten, bis er hell aufglüht.

Abb. 5.4.

Ausglühen einer Impföse

benötigtes Material Geräte  Impföse oder -nadel  Bunsenbrenner

5.1 Kultivierung von Mikroorganismen

Danach sollte auch der nicht isolierte Bereich des Halters zweimal längs durch die Flamme gezogen werden, um auch diesen Teil zu sterilisieren (Vorsicht: nicht den Plastikgriff des Kollehalters verschmoren).

Sterilisieren durch trockene Hitze Ein Sterilisationsschrank entspricht in seiner Funktionsweise einem herkömmlichen Geräte Backofen. In ihm können hitzeunempfindliche Gerätschaften aus Metall oder Glas  Sterilisationsschrank (z. B. Glaspipetten) sterilisiert werden. Hier wird durch trockene Hitze Keimfreiheit erzeugt. Dafür ist es notwendig, dass das Sterilisiergut für mindestens 45 min bei 250 °C bzw. zwei Stunden bei einer Temperatur von 160 °C (oder 60 Stunden bei 120 °C) verbleibt. Ein Sterilisationsschrank ist denkbar einfach zu bedienen; eine Zeitschaltuhr und ein Temperaturwähler ermöglichen die Einstellung der genannten Parameter. Bei der Zeitvorwahl ist die Aufwärmzeit des Schranks zu berücksichtigen. benötigtes Material

Autoklavieren Ein Autoklav ( Abb. 5.5) ähnelt in seiner Funktionsweise einem Küchen-SchnellkochGeräte topf. Das Autoklavieren eignet sich zum Sterilisieren von hitzeunempfindlichen  Autoklav Lösungen, Medien und Gerätschaften. Wasser kann thermische Energie ca. 250-mal besser an den Zielort bringen als trockene Luft; daher werden zum Sterilisieren in reiner Wasserdampfatmosphäre bei gleicher Temperatur entsprechend verkürzte Verweilzeiten benötigt, um Endosporen abzutöten: So sind 15 min bei 121 °C bzw. 1 min Aufenthalt bei 150 °C in reiner Wasserdampfatmosphäre ausreichend. Wasser mit einer Temperatur von 121 °C besitzt einen Druck von 0,102 MPa (ca. 2 bar, entspricht ca. 1 bar „Überdruck“ im Vergleich zur Umgebung); dementsprechend druckfest muss ein Autoklav sein. benötigtes Material

Zum Autoklavieren darf kein Gefäß mehr als halb mit Flüssigkeit gefüllt sein, sonst ist bei eventuellem Siedeverzug die Gefahr zu groß, dass ein Teil des Inhalts überkocht und in den Autoklaven fließt. Das gilt insbesondere für Agar-haltige Medien. Zur Herstellung von 1 l Festmedium verfährt man daher mit zwei 1 l-Flaschen: Dazu kann man die löslichen Zutaten (Pepton, Salze etc.) zunächst in eine Flasche einwiegen, H2Odem. zugeben, lösen und mischen; dann wird auf beide Flaschen verteilt. Den Agar muss man aber stets direkt in das einzelne Gefäß einwiegen, da ungeschmolzener Agar unlöslich ist und sich sehr rasch absetzt. Die Vorgehensweisen zum Sterilisieren von Flüssig- und Festmedien ist schematisch in Abb. 5.6 dargesetllt. Agar-haltige Lösungen sollten nicht bei pH-Werten unterhalb von 6 autoklaviert werden, um eine Hydrolyse des Polymers zu vermeiden. In solchen Fällen kann man entweder erheblich mehr Agar einwiegen (20 g/l statt der üblichen 15); oder man senkt den pH-Wert erst nach Autoklavieren durch Zugabe von Säure ab. Generell empfiehlt es sich, Agar- und Nährlösung getrennt zu autoklavieren. Die beiden getrennt autoklavierten Komponenten werden im Wasserbad auf 50 bis 60 °C abgekühlt und dann in einem der beiden Gefäße vereinigt. Wenn man in dieser Flasche ein Magnetrührstäbchen mitgeführt hat, kann man die Lösungen bequem und gründlich mischen. Auf diese Weise lassen sich auch Nährböden mit hoher Salzkonzentration ohne Schwierigkeit zubereiten.

359

360

5 Methoden

Thermometer Manometer 121°

Druckventil

C

C 100°

-1

Temperaturfühler im Referenzgefäß

00

50 -1

0 -5

0° C

0

00 -2 50 -2

r mba 02 20 CE

Deckel mit Druckverschluss

Wasserdampfatmosphäre Druckfester Mantel 300 ml

300 ml

200 ml

200 ml

100 ml

100 ml

Sterilisationsgut Einlegeboden Wasser zum Verdampfen (feuchte Hitze) Heizstäbe Abb. 5.5.

Aufbau eines Autoklaven im Querschnitt mit Bezeichnung der Komponenten

Beim Sterilisieren von komplexen Medien ist zu beachten, dass Glucose und Aminosäuren (in Pepton u. ä.) nicht gemeinsam autoklaviert werden dürfen. Glucose kann separat in konzentrierter (z. B. 20 % wt/vol) Lösung autoklaviert, besser sterilfiltriert werden und dem Medium nach dem Autoklavieren steril zugesetzt werden. Wenn man dies nicht beachtet, gehen bei hohen Temperaturen die Aminosäuren mit allen reduzierenden Zuckern so genannte Amadori-Umlagerungen (Osazonbildung; MaillardReaktionen) ein; danach sind beide Komponenten für die Mikroorganismen nicht mehr oder nur noch bedingt verwertbar. Generell sollten empfindliche Substratkomponenten wie Vitamine, Antibiotika, Aminosäuren dem Medium nach dem Autoklavieren und Abkühlen aus sterilfiltrierten Stammlösungen ( S. 362) zugesetzt werden. Im Autoklaven befindet sich unter einem Einlegeboden eine ausreichend große Menge Wasser. Auf dem Einlegeboden wird das Sterilisiergut platziert. Neben einem Druckventil sind ein Temperaturfühler für Flüssigkeiten, ein Kontroll-Thermometer für den Innenraum und ein Manometer als weitere wichtige Funktionsteile vorhanden. Die im Folgenden aufgeführten Schritte bei der Handhabung eines Autoklaven sind im Detail abhängig vom jeweiligen Typus des Autoklaven.

5.1 Kultivierung von Mikroorganismen

Abb. 5.6.

Sterilisieren von flüssigen oder verfestigten Komplex- bzw. definierten Medien

361

362

5 Methoden

•

Zunächst wird der Wasserstand im Autoklaven überprüft; das Wasser sollte bis dicht unter den Einlegeboden reichen.

•

Die zu sterilisierenden Gefäße und Gerätschaften werden auf dem Einlegeboden platziert. Alle Gefäße, deren Innenraum nebst evtl. vorhandener Lösung sterilisiert werden soll, dürfen nicht fest verschlossen sein; Schraubdeckelverschlüsse werden nur aufgelegt bzw. lediglich mit ein bis zwei Umdrehungen fixiert.

•

Der Temperaturfühler wird in ein Referenzgefäß gehängt, dessen Wasserinhalt dem größten einzelnen Flüssigkeitsvolumen des Sterilisiergutes entspricht.

•

Tür des Autoklaven schließen. Zeit (15 min) und Temperatur (121 °C) einstellen. Gerät einschalten. Nach einiger Zeit kocht das Wasser im Gefäß, und Dampf beginnt zischend aus dem Ventil zu entweichen. Nach ca. 10 bis 15 min ist die vormals präsente Luftatmosphäre durch reinen Wasserdampf ausgetauscht. Das Ventil schließt sich, und der Druck und die Temperatur im Innenraum steigen an, bis die eingestellte Temperatur (121 °C) am Temperaturfühler erreicht ist.

•

Nach Ablauf der Steriliserzeit (15 min) schaltet sich die Heizung aus und der Autoklaven-Innenraum kühlt langsam ab. Dabei wird der Druck im Innenraum sehr langsam abgebaut, um Siedeverzüge zu vermeiden.

•

Wenn kein Überdruck mehr herrscht und die Temperatur des Fühlers unter 80 °C gesunken ist, wird in der Regel die Tür des Autoklaven frei gegeben. Die Tür wird vorsichtig geöffnet (Vorsicht: heißer Dampf tritt aus) und die Gefäße werden entnommen (Vorsicht: heiß, Arbeitshandschuhe aus Leder tragen!). Agar-haltige Nährmedien werden im Wasserbad (50 bis 60 °C) weiter abgekühlt.

Sterilfiltration Durch Sterilfiltration lassen sich hitzeempbenötigtes Material findliche Medien und Gase sterilisieren. Geräte Dabei kann zwischen Tiefen- und Membranfiltern unterschieden werden. Während  Membranfilter (Porengröße 0,2 μm, erstere aus Baumwolle oder Glaswolle bestez. B. von Schleicher und Schüll) hen und im Labor vornehmlich zur Filtra Glas- oder Kunststoffspritzkörper mit Luer-Verschluss tion von Gasen verwendet werden, sind Membranfilter zur Filtration von Flüssigkeiten gut geeignet und aus Cellulosenitrat, Celluloseacetat, Polycarbonat u. ä. gefertigt. Membranfilter sollten eine Porengröße von 0,2 μm aufweisen. Hierbei sind Einwegsterilfilter mit einem so genannten LuerVerschluss (Luer-Lock) besonders hervorzuheben, welche für die benötigten Volumina an sterilisierten Flüssigkeiten in den Versuchen zum MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM völlig ausreichend sind. Diese Membranfilter können fest auf Glas- oder PlastikSpritzenkörper, die ihrerseits einen Luer-Verschluss besitzen, geschraubt werden. Nach dem Befüllen des Spritzenkörpers mit der zu sterilisierenden Flüssigkeit wird der Spritzenkolben in den Spritzenkörper eingeführt. Mit leichtem Händedruck wird die Lösung durch den Filter in ein sterilisiertes Vorlagengefäß (z. B. Schraubdeckelflasche) getrieben. Im Laborhandel sind darüberhinaus Einwegfiltrationsvorrichtungen für Volumenbereiche bis ca. 150 ml erhältlich.

5.1 Kultivierung von Mikroorganismen

363

Herstellung einer Verdünnungsreihe von Zellsuspensionen jeweils 0,5 ml Suspension

jeweils 4,5 ml Saline 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 Abb. 5.7. Herstellung einer Verdünnungsreihe in Stufen von 10-1

Methode 3

Da die Zelldichte in bewachsenen Kulturen in der Regel viel zu hoch für viele Analysen ist (z. B. für die Lebendzellzahlbestimmung), muss die Ausgangssuspension zunächst über eine Verdünnungsreihe unter sterilen Bedingungen verdünnt werden. Sehr gebräuchlich ist das Verdünnen in Dezimalschritten, d. h. das Anlegen einer Verdünnungsreihe im Verhältnis 1:10 (0,1 bzw. 10-1), 1:100 (0,01 bzw. 10-2), 1:1000 (0,001 bzw. 10-3) usw. Der in Klammern angegebene Wert wird als Verdünnungsfaktor bezeichnet. Als Verdünnungsmittel ist hierfür Saline geeignet.

Die gesamte Verdünnungsreihe sollte zügig angelegt werden, um weitere Zellteilungen und die Sedimentation der Zellen in den Röhrchen zu vermeiden. Unter der Annahme, dass die Gesamtzellzahlbestimmung eine Zelldichte von 1 × 107 ml-1 ergeben hat, führt ein Verdünnungsfaktor von 10-5 zu einer Zelldichte von 1 × 102 bzw. 100 ml-1. Wenn von dieser verdünnten Suspension 0,5 ml in eine Petrischale überführt werden, kommt es zur Entwicklung einer gut auszählbaren Anzahl von 50 Kolonien. Durchführung Man pipettiert zunächst jeweils 4,5 ml Saline mit einer 5 ml-Glaspipette in die benötigten Geräte Reagenzgläser (bei einer Dezimal-Verdünnungsreihe bis zu einem Verdünnungsfaktor  Kulturröhrchen mit Aluminiumkappe, von 10-6 sind es 6 Reagenzgläser). Dies kann steril mit derselben Pipette erfolgen. Danach wer Glaspipetten (1 ml, 5 ml), steril den exakt 0,5 ml von der Ausgangssuspen Reagenzglasschüttler sion mit einer 0,5 oder 1,0 ml-Glaspipette in Chemikalien das erste Reagenzglas pipettiert. Eine homogene Verteilung der Zellen wird durch ca.  Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl), steril 10 sec Durchmischung mit einem Reagenzglasschüttler erreicht (dabei soll die Suspension bis ca. 2 cm unter den Rand drehend aufsteigen). Damit ist die Verdünnungsstufe 10-1 eingestellt. Aus dieser Verdünnungsstufe werden wiederum exakt 0,5 ml mit einer neuen Pipette entnommen und in das zweite Röhrchen pipettiert und durchmischt (Verdünnungsstufe 10-2). Dieses Verfahren wird bis zum Erreichen der gewünschten Endverdünnungsstufe fortgeführt. benötigtes Material

Vereinzelung Bei der Vereinzelung sollen die Zellen so weit voneinander zu trennen, dass sie im oder auf dem Nährmedium einzeln zu liegen kommen. Die Nachkommenschaft einer Zelle wächst dann zu einer makroskopisch sichtbaren Kolonie heran. Nach wenigen Reinigungspassagen können Reinkulturen erhalten werden. Die Vereinzelung gelingt auf diese Weise nur in oder auf Festmedien.

Methode 4

5 Methoden

Kochsches Plattengussverfahren Dieses Verfahren wird genutzt, um die Lebendzellzahl in einer Mikroorganismen-Suspension von Saccharomyces cerevisiae zu bestimmen. Für strikt aerobe Mikroorganismen eignet sich besser das oberflächige Ausbringen der Suspension (“Flächenausstrich” auf Seite 366). Durchführung Nach Erstellen einer Verdünnungsreihe benötigtes Material (M3, S. 363) werden aus den in der VerGeräte suchsvorschrift angegebenen Verdünnungsstufen nach gründlicher Resuspendierung  Petrischalen, steril 0,5 ml Suspension entnommen und in leere  Glaspipetten (1 ml), steril Petrischalen gegeben. Danach werden aus Chemikalien einer Flasche 20 bis 30 ml Agar zugesetzt, der bei 42 °C flüssig gehalten wurde. Durch kur Festmedium, autoklaviert aber noch in zes und vorsichtiges Bewegen in Form einer flüssigem Zustand (ca. 50 °C) Acht auf dem Arbeitstisch wird der Inhalt jeder Petrischale unmittelbar nach Agarzugabe durchmischt. Danach werden die Platten bis zum Erstarren des Agars nicht mehr bewegt.

Agar-Schüttelkultur Diese Kultur in „hoher Schicht“, die auch als agar-shake bekannt ist, stellt eine einfache Methode dar, um mäßig anaerobe Bakterien zu vereinzeln.

Das erste Röhrchen wird danach zur Beschleunigung des Gelierens kurz in ein Eisbad getaucht. Aus dem zweiten Röhrchen werden wiederum ca. 0,5 ml entnommen und in ein drittes Röhrchen überführt und so fort, bis am Ende insgesamt sieben Röhrchen mit erstarrtem Agar präpariert sind.

Geräte  Pasteurpipetten (1 ml), steril

Chemikalien  Reagenzgläser mit autoklaviertem Festmedium, noch im flüssigen Zustand (ca. 50 °C)

Wattestopfen

we sch nk

en

Durchführung Der in kurzen Reagenzgläsern mit Wattestopfen autoklavierte Nährboden wird im Wasserbad bei 45 °C im flüssigen Zustand gehalten. In das erste Röhrchen kommen mit einer sterilen Pasteurpipette 1 bis 3 Tropfen Zellsuspension (aus der Anreicherungskultur). Das Röhrchen wird mit dem Wattestopfen verschlossen und der Inhalt einmal durch Umdrehen gemischt. Von diesem Röhrchen werden zügig ca. 0,5 ml in ein zweites Röhrchen überführt, dieses mit dem Wattestopfen verschlossen und einmal geschwenkt ( Abb. 5.8).

benötigtes Material

um

364

Tropfen einer Zellsuspension

flüssiger Agar (45 °C) Abb. 5.8.

Herstellung von agar-shakes

5.1 Kultivierung von Mikroorganismen

365

Vereinzelung durch fraktionierten Ausstrich Mit den unten dargestellten Ausstrich-Varianten gelingt es auf einfache Weise, aus einer Geräte Zellsuspension durch Ausstrich auf einer Agaroberfläche zur Vereinzelung der Zellen  Impföse zu kommen, die dann zu makroskopisch  Bunsenbrenner sichtbaren Nachkommen (Kolonien) heran Petrischalen mit Festmedium wachsen. Hierzu werden zwei AusstrichVarianten vorgestellt, von denen der DreiStrich-Ausstrich die häufigere ist. Beim Ausstreichen sollte Folgendes beachtet werden: benötigtes Material

• Der Deckel der Petrischale wird beim Ausstrich schützend über die Platte gehalten, während die beiden äußeren Finger den Boden der Platte halten. • Ein „Pflügen“ durch den Agar läßt sich vermeiden, wenn man die Impföse in einem möglichst flachen Winkel und ohne Druck über den Agar bewegt.

Kreuzausstrich Diese Methode eignet sich, Mikroorganismen als Einzelkolonie zu erhalten, die in der Probensuspension nur vereinzelt vorkommen. Daher wird diese AusstrichVariante häufig am Anfang einer Anreicherung von Mikroorganismen verwendet.

B

A

Durchführung Die mit der Impföse aufgenommene Suspension wird mit einem Strich ( Abb. 5.9, A) über die Platte verteilt. Die ausgeglühte und abgekühlte Impföse wird bei (B,  Abb. 5.9) angesetzt und, wie dargestellt, über die Platte bewegt.

Abb. 5.9. Vereinzelung durch den Kreuzausstrich (Erklärung im Text)

Drei-Strich-Ausstrich B

A 1 2 3

32

1

3 C 2 1

D 2

3

Der Drei-Strich-Ausstrich, auch Reinigungsausstrich genannt, ist eine weit verbreitete und sehr häufig angewandte Methode, Einzelkolonien einer Mischpopulation verschiedener Mikroorganismen zu erhalten. Auch Reinkulturen werden mit dem Drei-StrichAusstrich überimpft, da möglicherweise auftretende Kontaminationen rasch erkannt werden können.

Durchführung Mit einer abgeflammten und abgekühlten Impföse wird etwas Material von einer KoloAbb. 5.10. Vereinzelung durch die Dreinie abgenommen und dieses in einem TropStrich-Technik (Erklärung im Text) fen sterilem Wasser oder steriler Saline (zweckmäßigerweise im Deckel oder Boden einer sterilen Petrischale) verrieben und möglichst gleichmäßig suspendiert. Die Zelldichte sollte so hoch sein, dass eine deutliche Trübung des Wassertropfens erkennbar wird. Die Vorgehensweise ist in Abb. 5.10 dargestellt. Wichtig: Die Impföse wird 1

o e id V

366

5 Methoden

tte ipe urp ste Pa ge lan

C

B

Sparflamme A

Abb. 5.11.

Biegen eines Drigalski-Spatels aus einer langen Pasteurpipette aus Glas

jeweils nach den drei A-Strichen, nach den drei B-Strichen und nach den drei C-Strichen ausgeglüht und durch Aufdrücken auf einen freien Randbereich der Agaroberfläche abgekühlt; zwischen den jeweiligen Strich-Triaden wird keine neue Suspension aufgenommen.

Flächenausstrich Beim Flächenausstrich (auch: Spatelplattenverfahren) pipettiert man eine kleine Menge (meist 50 oder 100 μl) einer verdünnten Zellsuspension auf die Oberfläche einer Agarplatte und verteilt diese mit einem Drigalski-Spatel.

benötigtes Material Geräte  Drigalski-Spatel oder lange Pasteurpipetten  Bunsenbrenner  Petrischalen mit Festmedium  Drehtisch für Petrischalen

Durchführung Biegen von einfachen Drigalski-Spateln Chemikalien aus Pasteur-Pipetten: Bunsenbrenner auf  Ethanol (70 %, vol/vol) Sparflamme stellen. Wie in Abb. 5.11 dargestellt, erhitzt man die Kapillare zuerst etwa 2 Fingerbreit unterhalb der Verjüngung der Pipette und biegt in leichtem Winkel (ca. 30 °) ab (Abb. 5.11, A). Dann wieder 2 Fingerbreit weiter zum Ende so abknicken, dass die Spitze quer zum Griff steht (Abb. 5.11, B). Schließlich die Spitze der Pipette am Ende zum Griff hin abbiegen und zuschmelzen, damit keine Flüssigkeit ins Röhrchen eintreten kann (Abb. 5.11, C). Plattieren von Suspensionen: Spatel zur Sterilisation in Ethanol (70 %, vol/vol) stellen, dann durch die Bunsenflamme ziehen und den Alkohol abbrennen lassen. Auf dem Rand des Becherglases ablegen. Agarplatte auf den Drehtisch legen. Die Zellen werden im Röhrchen gründlich resuspendiert (z. B. mit einem Reagenzglasschüttler). Mit einer sterilen Glaspipette möglichst genau 0,1 ml Suspension auf die Agarfläche auftropfen. Mit der linken Hand das Drehtischchen langsam rotieren lassen und mit der rechten Hand den Spatel locker auf die Agarfläche aufsetzen. Spatel ohne Druck über die gesamte Fläche hin- und herschieben, bis die Flüssigkeit in den Agar eingezogen ist.

5.1 Kultivierung von Mikroorganismen

367

Wattestäbchen-Ausstrich Diese Vereinzelungstechnik wird häufig in der medizinischen Mikrobiologie angewenGeräte det. Man taucht ein zuvor autoklaviertes Wattestäbchen („Q-Tip“) in das biologische  Wattestäbchen, autoklaviert oder medizinische Material (z. B. infiziertes  Petrischalen mit Festmedium Gewebe) und wischt dann in Wellenlinien über die gesamte Plattenoberfläche. Dann dreht man die Platte um 60 °, wischt erneut mit demselben Wattestäbchen über die ganze Fläche und wiederholt das ganze nochmals bei 120 °, um letztlich die gesamte Plattenoberfläche auszunutzen. benötigtes Material

Kultivierung anaerober Mikroorganismen Im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM werden nur „mäßig“ anaerobe Bakterien kultiviert, die man beim Transfer von Kulturgefäß zu Kulturgefäß vorübergehend der normalen Luftatmosphäre aussetzen kann. Dennoch sollte man beim Überimpfen und Vereinzeln an der Luft möglichst zügig arbeiten.

Stichkultur benötigtes Material Geräte  Impfnadel  Bunsenbrenner  Reagenzgläser mit Festmedium

Viele anaerobe Bakterien können sehr einfach in hoch mit Nährmedien gefüllten Enghalsgefäßen oder Röhrchen kultiviert werden („Kultur in hoher Schicht“).

Das nur geringe Luftvolumen über der Nährlösung, die im Verhältnis zum Nährmedium kleine Phasengrenze zwischen Medium und Luft sowie die schlechte Löslichkeit von O2 in wässrigen Lösungen führen in der Tiefe des Nährmediums meist zu ausreichend anaeroben Bedingungen, insbesondere in Anreicherungskulturen, in denen aerobe und fakultativ anaerobe Mikroorganismen den nachdiffundierenden Sauerstoff verbrauchen. Häufig wird durch den Zusatz von 0,5 bis 1 g/l Agar die Viskosität des flüssigen Nährmediums erhöht und damit der Gastransport (durch Konvektion) noch weiter reduziert. Daher sind feste Nährböden in hoher Schicht besser zur Kultivierung geeignet als Flüssigmedien. Eine Art der Kultur in hoher Schicht stellen die agar-shakes (“Agar-Schüttelkultur” auf Seite 364) dar. Die hier beschriebene Stichkultur dient nicht der Vereinzelung; vielmehr gibt sie in sehr einfacher und anschaulicher Weise Auskunft über das Verhältnis des betreffenden Mikroorganismus zum Luftsauerstoff. Durchführung Mit der Impfnadel wird etwas Zellmaterial von einer Kolonie entnommen und diese in der Mitte des Hochschicht-Röhrchens der Länge nach durch die Agarsäule bis fast auf den Boden gestochen. Danach wird die Nadel vorsichtig wieder aus dem Stichkanal herausgezogen, so dass ein glatter Einstich entsteht, der sich wieder schließt und keine zerrissenen Bereiche hinterlässt.

Methode 5

368

5 Methoden

Kultivierung im Anaerobentopf Zur Kultivierung mäßig anaerober Bakterien auf Festmedien oder in offenen Systemen und Gefäßen (z. B. Petrischalen oder Erlenmeyerkolben) eignet sich der Anaerobentopf. Die Schaffung einer O2-freien Gasatmosphäre wird durch unterschiedliche kommerzielle Systeme erreicht. Die im Handel erhältlichen Anaerobentöpfe mit gasdichtem Verschluss bestehen meist aus klarem Polycarbonat mit einem Nutzvolumen von 2,5 bis 10 l. Zur Bebrütung einzelner Petrischalen sind entsprechende Minisysteme in verschweißbaren Plastikbeuteln verfügbar. Zur Entfernung des Luftsauerstoffs sind zwei Systeme gebräuchlich. Entfernung des Luft-Sauerstoffs

benötigtes Material Geräte  Anaerobentopf

Chemikalien  System zur Schaffung einer O2-freien Gsatmosphäre (z. B. Anerocult der Fa. Merck)

Bei den Katalysator-abhängigen Systemen (u. a. Oxoid Gas Generating Kit der Fa. Becton Dickenson) wird der O2 im geschlossenen Anaerobentopf durch Reaktion an der Oberfläche eines Palladiumkatalysators durch eine kalte Knallgasreaktion mit H2 zu H2O umgesetzt. Der Wasserstoff entwickelt sich aus festem Natriumborhydrid nach Zusatz von Wasser: NaBH4 + 2 H2O → NaBO2 + 4 H2 Bei den Katalysator-unabhängigen Systemen (u. a. Anaerocult der Fa. Merck) wird der im geschlossenen Anaerobentopf befindliche Sauerstoff durch Reaktion mit Eisenspänen zu braungefärbten Eisenhydroxiden gebunden.

1

2

3

4

Abb. 5.12. Das Anaerocult®-System der Fa. Merck. 1 Befüllen mit Kulturgefäßen; 2 Fixieren des Anaerocult®-Behälter; 3 Befeuchten des Anaerocult®-Behälters; 4 geschlossener Anaerobentopf

Beide Systeme enthalten zusätzlich Natriumcarbonat, das durch Säureeinwirkung CO2 freisetzt; hierdurch wird der chemisch gebundene Volumenanteil O2 durch CO2 ersetzt. Als Säure wird Weinsäure (Oxoid) bzw. Citronensäure (Merck) eingesetzt. Im Prinzip läuft die Reaktion wie folgt ab: CO32- + 2 H+ → HCO3- + H+ → CO2 + H2O Exemplarisch sei hier das Verfahren mit dem Katalysator-unabhängigen System der Fa. Merck vorgestellt. Der Anaerobentopf wird zunächst mit den Kulturgefäßen (Platten, offene Röhrchen etc.) befüllt ( Abb. 5.12). Zur Kontrolle der Anaerobiose wird ein mit Wasser befeuchteter Indikator-Teststreifen im Gefäß fixiert, der Methylenblau enthält. Methylenblau schlägt bei einem erniedrigten Redoxpotential (E0’ = +0,01 V) von blau nach farblos um. Der Anaerocult®-Behälter, der die notwendigen Reagenzien zur Generierung der anaeroben Gasatmosphäre enthält, wird mit 35 ml Leitungswasser benetzt und in den Anaerobentopf eingesetzt. Das Gefäß wird danach umgehend geschlossen.

5.1 Kultivierung von Mikroorganismen

Verwendung einer Gasstation

369

Methode 6

Unter strikter Einhaltung der Sicherheitsvorschriften ( Kasten unten und Kasten auf Seite 371) ist die Vorgehensweise bei der Nutzung einer Gasstation, wie sie in Abb. 5.13 dargestellt ist, folgendermaßen: Das mit einem Gasgemisch zu befüllende Gefäß (z. B. Wittscher Topf) wird mit geöffGeräte netem Hahn an den Schlauch („Verbraucher“) angeschlossen. Die Manometerhähne,  Gasstation ( Abb. 5.13) die Absperrhähne und das Drehventil der  Wittscher Topf oder evakuierbarer Gasstation sind geschlossen. Die VakuumAnaerobentopf  Pumpe zum Evakuieren pumpe wird gestartet und der Absperrhahn zur Vakuumpumpe geöffnet. Das Gefäß Chemikalien wird evakuiert. Danach wird der Absperr Gase in Stahlgasflaschen, passendes hahn zur Vakuumpumpe geschlossen. Nun Zubehör (Ventile etc.) wird zunächst die Gasleitung der Gasstation über die Spülleitung mit dem zur Verwendung vorgesehenen Gas gespült. Dazu wird die Spülleitung geöffnet (linker Absperrhahn der Spülleitung) und etwas Gas nach Öffnen des entsprechenden Manometerventils in die Atmosphäre entlassen. Die Spülleitung wird geschlossen. Nach Öffnen des Absperrhahns zum „Verbraucher“ wird durch vorsichtiges Drehen an der Regulierschraube des Nadelventils unter Beachtung des Drucks im Gefäß (Manometer) so lange Gas zugesetzt, bis noch ein messbarer Unterdruck im Gefäß herrscht. benötigtes Material

Soll das Gefäß zunächst gespült werden, so geschieht dies mit der Komponente des Gasgemisches, das den größten Volumenteil ausmacht. Danach wird das Gefäß erneut evakuiert und evtl. nochmals gespült. Das Gemisch wird dann in der Reihenfolge der Volumenteile der Gase sukzessiv in das Gefäß eingebracht. Dabei dient die Skala des Manometers als Dosierungshilfe. Umgang mit Gasgemischen, die Wasserstoff (H2) enthalten • Wasserstoff ist ein entzündbares, brennbares Gas. Gemische von Wasserstoff mit Sauerstoff oder Luft können hochexplosiv sein. Die Entzündungsgrenzen eines Gemisches von Wasserstoff und Luft liegen bei einem Gasanteil (vol/vol) von 4 % (untere Grenze) bzw. 74,5 % (obere Grenze) H2. Bei einem Gemisch von Wasserstoff und reinem Sauerstoff liegen diese Grenzen bei 4 bzw. 94 %. • Es dürfen keine offenen Flammen oder funkenerzeugende Geräte in die Nähe von Gasgemischen gelangen, die Wasserstoff enthalten! • Gefäße, in denen sich Wasserstoff befindet, dürfen nicht in einem Kühlschrank oder Brutschrank gelagert bzw. inkubiert werden, die nicht explosionsgeschützt sind und in denen Funken entstehen können! • In Gefäßen, die Wasserstoff enthalten, darf nicht mit einer Platinöse hantiert werden! • Beachten Sie, dass Wasserstoff, obwohl es leichter als Luft ist, aus geöffneten Gefäßen nicht sofort in die Umgebung entweicht. In einem geöffneten Wittschen Topf kann ein explosives Wasserstoff/Sauerstoff-Gemisch durchaus lange Zeit (über Tage!) erhalten bleiben! Entfernen Sie das explosive Gasgemisch aus dem Gefäß aktiv durch Spülen, z. B. mit Stickstoff oder Luft! • Tragen Sie grundsätzlich eine Schutzbrille! • Kennzeichnen Sie Gefäße, Arbeitsplatz und Labor mit einem Hinweis darauf, dass hier mit Wasserstoff umgegangen wird, damit sich andere entsprechend verhalten!

Sicherheitshinweis

370

5 Methoden

Abb. 5.13.

Schematischer Aufbau einer Gasstation

Soll z. B. ein Gasgemisch bestehend aus 85 % (vol/vol) H2, 10 % (vol/vol) CO2 und 5 % (vol/vol) O2 im Gefäß geschaffen werden, so lässt man in das zweimal mit Wasserstoff gespülte und danach wieder evakuierte Gefäß (Druckanzeige am Manometer ca. -1 bar) zunächst Wasserstoff einströmen, bis das Manometer -0,5 bar anzeigt. Dann spült man die Gasleitung mit CO2 und lässt danach so viel dieses Gases in das Gefäß ein, bis das Manometer -0,4 bar anzeigt (Druckdifferenz von 0,1 bar entspricht bei einem Gesamtdruck von 1 bar 10 % vol/vol). Man spült dann mit Sauerstoff und lässt dann so viel O2 in das Gefäß ein, bis das Manometer -0,35 bar angibt. Die Leitung wird mit Wasserstoff gespült, und das Gefäß wird dann mit diesem Gas so weit gefüllt, bis noch ein gut messbarer Unterdruck (ca. -0,05 bar) im Gefäß herrscht. Die Pumpe wird abgestellt, der Hahn des Gefäßes geschlossen, und das Gefäß vom Schlauch abgenommen. Abschließend sollten die Gasleitungen der Station mit einem unbrennbaren Gas (Stickstoff) gespült werden.

5.1 Kultivierung von Mikroorganismen

371

Evakuieren von Glasgefäßen Wenn Sie Glasgefäße, wie z. B. einen Wittschen Topf evakuieren, um diesen hinterher mit einem von Luft abweichenden Gasgemisch zu füllen, kann es bedingt durch den Unterdruck zu einer Implosion des Glasgefäßes kommen. Das Ergebnis der Implosion kommt dem einer Explosion nahe, und herumfliegende Glassplitter können schwerste Verletzungen hervorrufen. Es sind daher die folgenden Sicherheitsmaßnahmen zu ergreifen: • • • • •

Sicherheitshinweis

Verwenden Sie keine Glasgefäße, die durch Kratzer oder gar Sprünge bereits beschädigt sind! Bekleben Sie das Glasgefäß mit einer durchsichtigen Folie aus Kunststoff! Stülpen Sie einen Drahtkäfig mit einer Maschenweite von ca. 3-5 mm über das Gefäß! Tragen Sie grundsätzlich eine Schutzbrille! Füllen Sie die evakuierten Gefäße nicht wieder vollständig, sondern belassen Sie einen geringfügigen Unterdruck! Dadurch wird sichergestellt, dass bei der anschließenden Inkubation, die meist bei einen höheren Temperatur als der Temperatur beim Füllen erfolgt, das Gas sich nicht zu einem Überdruck ausdehnen kann und sich so das Gefäß öffnet und das möglicherweise explosive Gasgemisch dadurch unkontrolliert entweichen kann.

Dichtegradientenzentrifugation Die im Folgenden beschriebenen Dichtegradientenzentrifugationen mit Saccharose und Percoll® dienen zur Isolierung von Mutanten von Ralstonia eutropha mit Defekten in der Synthese von Poly(3-hydroxybutyrat), Poly(3HB). Wildtyp-Zellen und Mutanten zeichnen sich durch einen signifikanten Unterschied in ihrer spezifischen Dichte aus, der bei diesem Verfahren ausgenutzt wird.

Percoll®-Dichtegradientenzentrifugation Durchführung benötigtes Material Geräte  Kühlzentrifuge mit Ausschwingrotor und passenden Röhrchen (z. B. Rotor Kontron TST 41.14 mit PolyallomerRöhrchen)  Aufbau zur Entnahme von Probematerial ( Abb. 5.14)  Einmal-Mikropipetten aus Glas (steril, z. B. von Fa. Brand, Art.-Nr. 708733)

Chemikalien  Percoll® (autoklaviert) (Bezugsquelle: Amersham Biosciences Europe GmbH, Munzinger Str. 9, D-79111 Freiburg)  1,5 M NaCl (autoklaviert)  H2Odem. (autoklaviert)  Ethanol (70 %, vol/vol)

Zunächst werden Percoll®, 1,5 M NaCl und H2Odem. im Volumenverhältnis 7,5 : 1 : 1,5 zusammengegeben. Diese Lösung wird in mit Ethanol desinfizierte und getrocknete Zentrifugenröhrchen gegeben. Durch 10 min Zentrifugation bei 30.000 × g und 4 °C wird ein Gradient „vorgeformt“. Auf diesen Gradienten werden 0,2 ml Zellsuspension aufgetragen. Die Trennung der Zellen im Gradienten erfolgt durch 30 min Zentrifugation bei 30.000 × g und 4 °C. Die anschließende Probenentnahme aus dem Gradienten erfolgt mit dem in Abb. 5.14 skizzierten Aufbau. Dazu wird eine sterile Einmal-Mikropipette in das Zentrifugenröhrchen eingeführt. Der Gradient wird langsam mit Hilfe der Peristaltik-Pumpe zu Fraktionen à zwei bis fünf Tropfen entnommen. Die Fraktionen werden direkt auf geöffnete Petrischalen mit geeignetem Festmedium getropft und dort mit Hilfe eines Drigalski-Spatels verteilt.

Methode 7

372

5 Methoden

Abb. 5.14. Versuchsaufbau zur Entnahme von Proben aus dem Percoll-Dichtegradienten. Alle Komponenten des Probeentnahmesystems (Kapillare, Schlauch der Peristaltik-Pumpe) müssen vor Gebrauch sterilisiert werden.

Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation Durchführung Zunächst werden die Zentrifugenröhrchen durch Spülen mit Ethanol desinfiziert. Die hiernach getrockneten Röhrchen werden durch sukzessives Überschichten mit • • • •

1,8 ml 80 % (wt/vol) Saccharose 3,6 ml 70 % (wt/vol) Saccharose 3,6 ml 55 % (wt/vol) Saccharose und 1,8 ml 40 % (wt/vol) Saccharose

mit einem Saccharose-Stufengradienten versehen. Der Gradient wird mit 0,2 ml Zellsuspension überschichtet. Die Röhrchen wurden 2 Stunden bei 12.500 × g und 4 °C zentrifugiert.

benötigtes Material Geräte  Kühlzentrifuge mit Ausschwingrotor und passenden Röhrchen (z. B. Rotor Kontron TST 41.14 mit PolyallomerRöhrchen)

Chemikalien  Saccharoselösungen folgender Konzentrationen (pasteurisiert durch 10 min Inkubation im kochenden Wasserbad): 40 % (wt/vol), 55 % (wt/vol), 70 % (wt/vol) und 80 % (wt/vol)  Ethanol (70 %, vol/vol)

5.2 Mikroskopische Methoden

5.2

373

Mikroskopische Methoden

Dieser Abschnitt behandelt Herstellung und Auswertung mikroskopischer Präparate.

Lichtmikroskopie

Methode 8 Das optische System eines herkömmlichen Lichtmikroskops setzt sich im Wesentlichen aus dem Objektiv, das ein vergrößertes, seitenverkehrtes, reales Zwischenbild erzeugt, und dem Okular, welches das Zwischenbild zum virtuellen Endbild vergrößert, zusammen.

Abb. 5.15. Lichtmikroskop Leitz Laborlux D. 1 Binokularer Tubus mit Okularen, 2 Objektivrevolver mit Objektiven, 3 Kondensor, 4 Kondensorblende, 5 Zentrierschrauben zur Zentrierung des Leuchtfeldblendenbildes, 6 PhasenkontrastZentrierschrauben, 7 Leuchtfeldblende

Abb. 5.15 zeigt ein Mikroskop der Fa. Leitz für die Durchlichtmikroskopie und seine wesentlichen Bauteile. Die im Folgenden angegebenen Hinweise beziehen sich auf das in Abb. 5.15 gezeigte Modell; sie sind jedoch auf alle anderen herkömmlichen Fabrikate übertragbar. Ein Mikroskop sollte stets mit äußerster Sorgfalt behandelt werden.

Verwendung des Mikroskops

Mit einer abgeflammten und abgekühlten Impföse wird etwas Material von einer Kolonie abgenommen und dieses in einem Tropfen Wasser (in einem Röhrchen oder – zweckmäßiger noch – im Deckel einer Petrischale) verrieben und möglichst gleichmäßig suspendiert. Die Zelldichte sollte so hoch sein, dass eine deutliche Trübung des Wassertropfens erkennbar wird. Aus dieser Suspension werden mit der Impföse ein oder mehrere Tröpfchen auf den Objektträger gebracht und mit einem Deckglas bedeckt. Überschüssige Flüssigkeit wird mit einem Stück Papier weggesaugt, so dass das Deckglas fest aufliegt.

Präparieren von Zellmaterial

Gefärbte Präparate lassen sich sehr schön im Hellfeld betrachten. Zunächst wird das 10 ×-Objektiv und die Kondensorstellung H (Hellfeld) gewählt. Ein mikroskopisches Präparat (s. o.) wird auf dem Objekttisch fixiert. Nach dem Einschalten der Beleuchtung wird die Beleuchtungsstärke auf mittlere Stärke eingestellt. Danach Kondensor mit Anschlagschraube bis zum Anschlag hochdrehen, Kondensorblende schließen. Mit Grob- und Feintrieb Objekt scharf stellen; Leuchtfeldblende schließen. Mit Zentrierschrauben Leuchtfeldblendenbild zentrieren. Danach Leuchtfeldblende so weit öffnen, dass der Rand gerade aus dem Sehfeld verschwindet. Ggf. Bildkontrast durch Öffnen der Kondensorblende verbessern: dazu Okular aus dem Tubus nehmen und Kondensorblende so weit öffnen, bis die sichtbare Objektivöffnung zu ¾ ausgeleuchtet ist.

Hellfeldbeleuchtung

Zunächst das Mikroskop für Hellfeldbeleuchtung wie oben beschrieben einstellen Leuchtfeldblende vollständig öffnen. Kondensorblende vollständig öffnen (Stellung Ph). Okular gegen Einstellfernrohr austauschen. Mit Phasenkontrast-Zentrierschrauben Lichtring mit Phasenring des Objektivs zur Deckung bringen. Für jedes Objektiv getrennt einstellen:

PhasenkontrastBeleuchtung

374

5 Methoden

α

α

t Luf 1

1

Öl

2 3

Objektivfrontlinse Luft Deckglas Objekt Objektträger

2

Immersionsöl

3

Abb. 5.16. Steigerung des Öffnungswinkels (α) durch Verwendung von Immersionsöl. Gezeigt sind die Strahlengänge dreier eng benachbart liegender Punkte eines Objektes (1, 2 und 3), die bei Verwendung von Immersionsöl aufgelöst werden (rechts). Ohne Immersionsöl (links) werden die Strahlen 2 und 3 an der Grenzfläche zwischen Deckglas und Luft gebrochen

• Objektiv 10 ×: Kondensor-Stellung 1 (Phasenscheibe 1) oder • Objektiv 40 ×: Kondensor-Stellung 2 (Phasenscheibe 2) oder • Objektiv 100 ×: Kondensor-Stellung 3 (Phasenscheibe 3) Ölimmersion

Die Qualität des mikroskopischen Bildes ist im Wesentlichen abhängig von dem Auflösungsvermögen des Mikroskops (Objektiv und Kondensor). Zur mikroskopischen Betrachtung von Bakterienzellen ist ein besonders hohes Auflösungsvermögen notwendig. Unter dem Auflösungsvermögen versteht man den kleinsten Abstand d, den zwei Punkte des Objekts haben dürfen, um gerade noch voneinander getrennt wahrgenommen zu werden. Für das Auflösungsvermögen ist die Wellenlänge λ des Lichtes, das zur Beobachtung verwendet wird, und die numerischen Aperturen (A) des Objektivs AObj und des Kondensors AKond entscheidend (Formel 1). λ d = (1) AObj + AKond AObj ist wiederum bestimmt durch den Brechungsindex n des Mediums, das sich zwischen Deckglas und Objektiv befindet, und den halben Öffnungswinkel des Objektivs α (Formel 2). AObj = n × sin(α) (2) Eine Steigerung der numerischen Apertur und damit des Auflösungsvermögens gelingt mit einem Immersionsobjektiv, bei dem sich zwischen Präparat bzw. Deckglas und Objektivfrontlinse ein höherbrechendes Medium als Luft (n = 1,0;  Abb. 5.16, links) befindet. In der Regel wird hierzu Immersionsöl verwendet, welches den selben Brechungsindex wie Glas besitzt (n = 1,5), so dass die vom Objekt ausgehenden Lichtstrahlen bis zum Objektiv ein optisch homogenes Medium durchdringen. Dadurch wird eines signifikanten Vergrößerung des Öffnungswinkels erreicht ( Abb. 5.16, rechts). Durchführung Das Präparat zunächst, wie oben beschrieben, mit Objektiv 40 × und Kondensorstellung 2 scharf stellen. Objektiv 40 × wegschwenken und den beleuchteten Bereich des Objekts mit einem Tropfen Immersionsöl beträufeln. Objektiv 100 × (Oel) vorsich-

5.2 Mikroskopische Methoden

375

tig einschwenken. Mit dem Feintrieb Objekt scharf stellen. Nach Beendigung der Untersuchung Ölreste am Objektiv mit Linsenpapier entfernen.

Messokular

Methode 9 Für die genaue Bestimmung von Längen beim Mikroskopieren wird ein Messokular verwendet, welches vor der Längenbestimmung mit Hilfe eines Objektmikrometers für jedes Objektiv (4 ×, 10 ×, 40 × und eventuell 100 ×) geeicht werden muss.

benötigtes Material Geräte  Mikroskop  Objektmikrometer  Messokular

Objektmikrometer ( 1 mm / 100 )

10

9

8

7

5

0,2

6

4

3

2

0,1

1

0

0

Skala des Messokulars ( 12,5 × ) Abb. 5.17. Kalibrierung des Messokulars mit der Skala des Objektmikrometers

Bei einer gewählten Objektivvergrößerung wird die Skala des Objektmikrometers mit der Skala des Messokulars zur Deckung gebracht ( Abb. 5.17) und die Zahl der Teilstriche für eine gegebene Länge des Objektmikrometers ermittelt. Nach der Kalibrierung wird das Objektmikrometer gegen ein mikroskopisches Präparat getauscht. Die Kalibrierung ist nur einmal zu Beginn des Kurses notwendig.

Zählkammer Für die Zählung von Bakterien verwendet man Zählkammern mit einer Tiefe von 0,02 mm, für die Zählung von Hefen Kammern mit einer Tiefe von 0,1 mm. In der Mikrobiologie ist die Zählkammer mit einer Netzteilung nach Thoma (Thomakammer) am gebräuchlichsten ( Abb. 5.18). Durchführung Zählkammer und Deckglas reinigen: Mit alkoholgetränktem Tuch abwischen und trocknen lassen. Zählkammer und Deckglas nur seitlich an den Kanten anfassen. Deckglas anhauchen, in Längsrichtung auf die drei Stege legen und mit einem Linsenpapier an den Rändern fest auf die Seitenstege pressen; den korrekten Sitz des Deckglases zeigen „Newtonsche Ringe“ an. Die Füllung der Kammer erfolgt mit Hilfe einer Pasteurpipette: Ein kleiner Tropfen Zellsuspension wird dicht am Deckglasrand so auf den mittleren Steg gesetzt, dass die Flüssigkeit kapillar unter das Deckglas gesaugt wird. Nach dem Füllen der Kammer wartet man ca. 2 min (Beendigung der Kapillar- und Konvektionsströmung, Sedimentation der Bakterien). Man legt die Kammer auf den Objekttisch des Mikroskops und sucht bei schwacher Vergrößerung (Objektiv 4 ×, Kondensor H) das eingeätzte Netzgitter. Nach Einstellen der Objektebene wird auf ein stärkeres Objektiv (40 ×) und Phasenkontrast (Stellung 2) umgeschaltet. Auf dem speziellen Objektträger sind Quadrate definierter Fläche (Zählfelder) eingeätzt. Der Abstand zwischen Deckglas und Objektträger über den Zählfeldern ist bekannt und auf der Zählkammer angegeben. Man unterscheidet c- und b-Felder. Die Größe eines c-Feldes beträgt 0,0025 mm2, der Abstand zwischen Objektträger und Deckglas beträgt 0,1 mm ( Abb. 5.18). Das Volumen eines c-Feldes lässt sich so bestimmen:

Kalibrierung

Methode 10

5 Methoden

1 mm2 = 25 b-Felder

Zählfeld

Aufsicht c-Feld = 0,0025 mm2

376

Ansicht

Abstand = 0,1 mm

Abb. 5.18.

Vc

b-Feld = 16 c-Felder Aufbau und relevante Abmessungen einer Thomazählkammer

= 0,0025 mm2 × 0,1 mm = 0,00025 mm3 = 0,00025 μl = 0,25 nl = 0,25 × 10-6 ml

Es werden Zellen über drei b-Feldern gezählt und daraus der Durchschnittswert für ein c-Feld ermittelt. Die Zellzahl pro 1 ml Suspension berechnet sich aus Formel 3: c Zellzahl = ml-1 (3) 0,25 × 10-6

Methode 11 Tusche-Präparat Mit dieser Negativ-Kontrastierung lassen sich zellumgebende Schleime und Kapseln darstellen, die aufgrund des zu geringen Unterschieds im Brechungsindex zum umgebenden Wasser im Phasenkontrast nicht sichtbar sind. Da die Farbpartikel aus Ruß aufgrund ihrer Größe nicht in die Schleim- bzw. Kapselhülle eindringen können, heben sich letztere im mikroskopischen Bild hell gegen einen dunklen Hintergrund ab ( Abb. 3.33, S. 83).

benötigtes Material Geräte     

Objektträger Deckgläschen Impföse Phasenkontrastmikroskop Pasteurpipette

Chemikalien  Chinatusche

Durchführung Ein kleiner Tropfen Chinatusche wird auf die Mitte eines Objektträgers gegeben. Mit der Impföse wird ein kleiner Tropfen Zellsuspension bzw. eine winzige Menge Koloniematerial mit der Tusche verrieben. Deckglas auflegen und fest andrücken (mit dem umgedrehten Impfösenhalter). Überschüssige Flüssigkeit mit Fließpapier absaugen. Das Präparat wird im Phasenkontrast mikroskopiert.

5.3 Einfache taxonomische Verfahren zur Charakterisierung von Mikroorganismen

5.3

377

Einfache taxonomische Verfahren zur Charakterisierung von Mikroorganismen

Bestimmung des Gram-Verhaltens

Methode 12

Eine sichere Aussage über das Gram-Verhalten einer bakteriellen Reinkultur kann nur erfolgen, wenn zwei der drei im Folgenden aufgeführten Methoden (Gram-Färbung, KOH-Test, LAAP-Test) durchgeführt wurden und diese zum gleichen Ergebnis gekommen sind.

Gram-Färbung Die Gram-Färbung bringt reproduzierbare Ergebnisse, wenn die folgende Vorschrift exakt befolgt wird; der Differenzierungsschritt ist besonders kritisch. Durchführung benötigtes Material Geräte      

Objektträger Färbewanne mit Färbebank Stoppuhr Spülmittel, Bürste Impföse Bunsenbrenner und eine Holzklammer zum Halten eines Objektträgers  10 ml-Pipetten  Spritzflasche mit Wasser  Phasenkontrastmikroskop

Chemikalien  Lösung A = Karbol-Gentianavioloett  Lösung B = Lugolsche Lösung (IodKaliumiodid-Lösung, KJ·J2)  Lösung C = 96 % (vol/vol Ethanol)  Lösung D = Safranin-Lösung Alle Lösungen sind gebrauchsfertig zu beziehen, z. B. bei der Fa. Merck

Mikroorganismen  Agarplatten mit frisch gewachsenem Koloniematerial des zu bestimmenden Bakterienstamms und zweier Kontrollkeime, z. B. der folgenden:  Pseudomonas fluorescens DSM 50090 als Gram-negativer Kontrollkeim  Micrococcus luteus DSM20030 als Gram-positiver Kontrollkeim

Mit Spülmittel und einer Bürste einen Objektträger gründlich bearbeiten, mit heißem Wasser nachspülen. Den Objektträger mit Fließpapier abtrocknen oder an der Luft trocknen lassen, ohne die Oberfläche nochmals mit den Fingern zu berühren.

Vorbereiten des Objektträgers

Auf den Objektträger streicht man auf dem linken Drittel den Gram-positiven Kontrollkeim und auf dem rechten Drittel den Gram-negativen Kontrollkeim aus; in der Mitte wird Material des zu bestimmenden Bakterienstamms ausgestrichen. Dazu setzt man jeweils einen kleinen Tropfen Wasser auf den Objektträger, nimmt dann mit der Impföse eine kleine Menge Koloniematerial von der Platte und suspendiert darin flokkenfrei. Die Suspensionen sollten gleichmäßig schwach milchig trüb sein.

Keime auftragen

Zur Erleichterung der späteren Zuordnung sollten die Ausstriche optisch eindeutig unterscheidbar gestaltet werden, da eine Beschriftung des Objektträgers i. d. R. durch die später folgende Differenzierungsprozedur abhanden kommt (z. B. den Grampositiven Kontrollkeim als runden Ausstrich, den Gram-negativen als quadratischen). Den Objektträger horizontal an der Luft liegen lassen, bis die Suspensionen getrocknet sind.

Das getrocknete Präparat mit der bestrichenen Seite nach oben mit Hilfe einer Holzklammer dreimal kurz durch die leuchtende Bunsenbrennerflamme ziehen; auf der anderen Seite fassen und nochmals dreimal durch die Flamme ziehen. Die Präparate sollen dabei kräftig erwärmt werden, ohne zu „verbrutzeln“.

Trocknung

Hitzefixerung

378

5 Methoden Färbung

Der Objektträger mit den hitzefixierten Ausstrichen wird auf die Färbebank der Färbewanne gelegt. Die Präparate werden vollständig mit Lösung A bedeckt; 3 min einwirken lassen.

Beizen

Lösung A abgießen, mit Lösung B bedecken und sofort wieder abgießen. Erneut mit Lösung B bedecken und 1 min einwirken lassen.

Differenzieren

Lösung C aus einer 10 ml-Pipette langsam über den Objektträger fließen lassen. Dabei hält man den Objektträger in einer Weise Abb. 5.19. Gram-Färbung von Bacillus sp. schräg über die Färbewanne, bei der die (dunkel) und Pseudomonas sp. (hell) Lösung C zunächst auf den Ausstrich des Gram-positiven Kontrollkeims tropft und dann von dort über das Material des zu bestimmenden Stamms weg zum Gram-negativen Kontrollkeim fließt. Diese Differenzierung dauert weniger als eine Minute; sie muss sofort durch gründliches Spülen mit Wasser beendet werden, wenn keine dicken Farbwolken mehr abgehen und der Ausstrich des Gram-negativen Kontrollkeims hell bläulich ausbleicht, der mit der Grampositiven Kontrolle jedoch noch tief schwarzblau erscheint. Hält man nach dieser Differenzierung das Präparat gegen einen weißen Hintergrund (Laborkittel), so muss der Ausstrich der Gram-negativen Kontrolle sehr zart hellblau, der der Gram-positiven dagegen schwarzblau aussehen.

Gegenfärben

Zur Kontrastierung der entfärbten Gram-negativen Bakterien wird der Objektträger kurz (30 bis 60 sec) mit Lösung D überschichtet. Färbelösung abgießen, mit Wasser spülen. Das Präparat an der Luft trocknen lassen; die Unterseite des Objektträgers mit Papier sauber wischen.

Mikroskopieren

Auf die drei Ausstriche direkt, ohne Verwendung eines Deckgläschens, je einen Tropfen Immersionsöl aufsetzen. Im Hellfeld die Färbung der Zellen beurteilen: Bei einer guten Färbung sind die Gram-positiven Zellen tief violettblau, die Gram-negativen hellrot ( Abb. 5.19). Auch im Phasenkontrast betrachten (Vorsicht: hier können die Farben verfälscht sein!).

LAAP-Test L-Alanyl-Aminopeptidase (LAAP) ist ein Enzym, das als „Autolysin“ die Spaltung der Interpeptid-Brücken von Zellwand-Bausteinen katalysiert; ein Vorgang, der beim Zellwachstum wichtig ist. Das Enzym wurde (mit wenigen Ausnahmen) nur bei Gramnegativen Bakterien gefunden. Dem Nachweis liegt die in Abb. 5.20 dargestellte, durch die LAAP katalysierte Farbreaktion zugrunde. H O H2N

C

C

CH3

N

NO2

H2N

H

L-Alanyl-Nitroanilidfarblos

L-Alanyl-Aminopeptidase

Nitroanilingelb

H H2O

H2N

C

COOH

CH3 Abb. 5.20.

NO2

L-Alanin

Gleichung der Nachweisreaktion des Enzyms L-Alanyl-Aminopeptidase (LAAP)

5.3 Einfache taxonomische Verfahren zur Charakterisierung von Mikroorganismen

379

Durchführung In drei kleine Reagenzgläser werden jeweils ca. 0,2 ml Wasser gegeben. Mit der Impföse Geräte wird etwas Koloniematerial des zu untersuchenden Stamms und der Kontrollkeime  Bactident®-LAAP-Teststreifen (Merck) darin suspendiert; es soll eine deutliche Trü kleine Reagenzgläser bung zu erkennen sein. Man fügt nun die  Impföse Teststreifen zu; die Reaktionsfläche muss mit  Pasteurpipette  Brutschrank (37 °C) der Flüssigkeit bedeckt sein. Nach 10 min Inkubation bei 37 °C wird die Färbung der Sonstiges Teststreifen bewertet; eine Gelbfärbung bedeutet einen positiven LAAP-Test und  siehe Gram-Färbung somit Gram-negatives Verhalten. Ist die Testzone des Stäbchens weiterhin ungefärbt, wird noch weitere 20 min bei 37 °C inkubiert und danach nochmals abgelesen. benötigtes Material

KOH-Test Obwohl der folgende KOH-Test im Vergleich zur Gram-Färbung außerordentlich einfach ist, kann das Ergebnis gleichberechtigt neben dem der Gram-Färbung bestehen. Die Zellwand der Gram-negativen Bakterien wird durch Einwirken von 3 % (wt/vol) KOH aufgelöst, so dass die DNA austritt, wodurch die Viskosität fühl- und sichtbar zunimmt. Die Zellwand Gram-positiver Bakterien dagegen widersteht dieser Behandlung mit Lauge. Durchführung benötigtes Material Geräte  Objektträger  Impföse  Pasteurpipette

Chemikalien  Kaliumhydroxid-Lösung (3 %, wt/vol, KOH)

Ein Tropfen Kaliumhydroxid-Lösung wird auf einen Objektträger gegeben. In diesen Tropfen suspendiert man eine Impföse Zellmaterial. Nach ca. 2 min legt man die Impföse flach in die Bakteriensuspension und hebt sie dann langsam in die Höhe: Bei Gram-negativen Bakterien zieht die viskose Lösung einen zähen Faden, wohingegen bei Gram-positiven keine Viskositätszunahme eintritt und somit kein Faden sichtbar wird.

Sporenfärbung Die Bakterien werden in dichter homogener Suspension auf dem Objektträger ausgestrichen, getrocknet und fixiert, indem man das Präparat vier- bis sechsmal durch die Bunsenbrennerflamme zieht. Dann stellt man eine Färbeküvette auf die Glasperlen im Becherglas, füllt sie mit Malachitgrün-Lösung bis etwa 2 cm unter den Rand und setzt einen Deckel auf. Mit H2Odem. wird dann das Becherglas so weit gefüllt, dass die Färbeküvette etwa zu ¾ im Wasser steht. Dann erhitzt man das Wasser auf dem Dreibein über dem Bunsenbrenner bis zum Kochen. Wenn die Malachitgrün-Lösung ebenfalls heiß geworden ist, werden die Präparate wie folgt behandelt:

Methode 13

380

5 Methoden

Färbung: Das hitzefixierte Ausstrichpräparat (markieren, auf welcher Seite der Ausstrich ist!) wird in die fast kochend heiße Malachitgrün-Lösung gestellt. Nach 10 bis 15 min Inkubation wird der Ausstrich mit der Pinzette herausgenommen. Spülen: Mit fließendem Wasser den ganzen Objektträger abspülen, bis keine grünen Farbwolken mehr abgehen. Gegenfärben: Auf der Färbebank mit Safranin-Lösung überschichten, 1 bis 2 min einwirken lassen. Farblösung abschütten, nur kurz mit H2Odem. abspülen und an der Luft trocknen lassen. Die Unterseite des Präparats und evtl. seine Ränder sauber wischen. Mikroskopische Betrachtung: Einen Tropfen Immersionsöl direkt auf den gefärbten Ausstrich aufsetzen. Hellfeldbeleuchtung einstellen; mit dem 100 × Ölimmersionsobjektiv bei weit geöffneter Kondensorblende betrachten. Die Endosporen sind hell bis kräftig bläulichgrün gefärbt; die vegetativen Zellen bzw. die Sporenmutterzellen sind rot kontrastiert.

benötigtes Material Geräte          

Objektträger Färbewanne Stoppuhr Dreibein mit Keramiknetz 400 ml-Becherglas (Boden mit großen Glasperlen bedeckt) Färbeküvette Bunsenbrenner Impföse Glaspipetten (10 ml) Pinzette

Chemikalien  Malachitgrün-Gebrauchslösung: Gesättigte Lösung von MalachitgrünOxalat (> 50 g/l Farbstoff); entspricht Fertiglösung Fa. Merck, Artikel-Nr. 1398  Safranin-Lösung: 5 g/l Safranin O; entspricht Fertiglösung Fa. Merck, Artikel-Nr. 1382

Methode 14 Biochemische Charakterisierung von Anreicherungs- und Reinkulturen Oxidase-Test Der Test beruht auf der Cytochrom c-abhängigen Oxidation des farblosen Nachweisreagenzes zu einem blauen Farbstoff. Damit lassen sich sehr einfach Vertreter der Enterobacteriaceae, deren Atmungskette kein Cytochrom c besitzt, von anderen aeroben und fakultativ anaeroben Bakterien abgrenzen, die i. d. R. über Cytochrom c verfügen. Durchführung Auf den Bactident®-Oxidase-Teststäbchen (Fa. Merck) ist am ein Ende ein Filterblättchen, das mit N,N-Dimethyl-para-phenylendiammoniumdichlorid und α-Naphthol getränkt ist. Auf dieser Reaktionsfläche verreibt man mit einer Platin-Impföse Bakterienmaterial und wartet 20 bis 40 sec (nicht länger!) ab. Blaufärbung bedeutet Oxidasepositiv. Alternativ kann frisch angesetztes Oxidasereagenz auf Koloniematerial eines Festmediums geträufelt werden.

benötigtes Material Geräte  Platin(!)-Impföse

Chemikalien  Bactident®-Oxidase-Teststreifen (Merck); alternativ: Oxidasereagenz ( S. 423)

5.3 Einfache taxonomische Verfahren zur Charakterisierung von Mikroorganismen

Katalase-Test Katalase zählt zu den Enzymen, die eine Schutzwirkung gegenüber dem Sauerstoff ausüben. Es setzt das aggressive Sauerstoff-Derivat Wasserstoffperoxid (H2O2) zu H2O und O2 um. Mit Ausnahme der Milchsäurebakterien verfügen alle anderen in Gegenwart von Luftsauerstoff wachsenden Mikroorganismen i. d. R. über Katalase. Durchführung benötigtes Material Geräte  Pasteurpipetten  Pipettensauger

Chemikalien  Wasserstoffperoxid-Lösung (3 %, vol/ vol, H2O2), frisch

Ein bis zwei Tropfen WasserstoffperoxidLösung werden mit einer Pasteurpipette auf eine Kolonie oder den Impfstrich einer Reinkultur aufgetropft. Bei Katalase-positiven Mikroorganismen schäumt die aufgetropfte Lösung aufgrund der O2-Bildung nach wenigen Sekunden kräftig auf. Bei Katalase-negativen Mikroorganismen ist auch nach längerem Warten keinerlei Aufschäumen zu beobachten.

API20NE® benötigtes Material Geräte  Pasteurpipetten, steril Aus dem API20NE-System (bioMérieux):  API20NE-Teststreifen

Chemikalien Aus dem API20NE-System (bioMérieux):  2 Ampullen mit Suspensionsmedium (5 ml und 2 ml 0,85 %, wt/vol, NaCl)  1 Ampulle AUX-Medium  Paraffinöl, steril  McFarland-Standard 0,5  Satz mit Nachweisreagenzien (Nit1, Nit2, Zn, James-Reagenz)  Auswertekatalog bzw. -software

Das im Folgenden besprochene Bestimmungssystem der Fa. bioMérieux wurde aus einer Vielzahl von derzeit verfügbaren Hilfsmitteln zur taxonomischen Einordnung von Bakterien ausgewählt, weil es keinen besonderen apparativen Aufwand benötigt und somit im Rahmen des MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUMS gut bewältigt werden kann. Man kommt mit diesem System dennoch zu vergleichsweise verlässlichen Aussagen über die taxonomische Einordnung von Isolaten aus dem großen Spektrum der Gram-negativen Nicht-Enterobacteriaceae.

Es handelt sich um einen Teststreifen, auf den eine Folie mit kleinen Plastiktaschen aufgeschweißt ist; diese Taschen enthalten sterile lyophilisierte Nährlösungskomponenten, die sich beim Befüllen mit Bakteriensuspension lösen und den Bakterien die entsprechenden charakteristischen Stoffwechselleistungen ermöglichen. Teilweise werden durch Auftropfen von Paraffinöl anaerobe Bedingungen geschaffen. Sichtbar gemacht werden diese Reaktionen z. T. durch pH-Indikatoren; in einzelnen Fällen werden nach Bebrütung Nachweisreagenzien zuzugeben. Die Teststreifen werden nach Beschickung in einer Plastikhülle (feuchte Kammer) 48 h bebrütet und anschließend nach einem numerischen System ausgewertet. Zur Handhabung der Teststreifen und der feuchten Kammer sei auf die ausführlichen Arbeitsanleitung der Firma bioMérieux verwiesen, die zusammen mit einer Farbkarte als Informationsmaterial den Teststreifen beiliegt.

381

382

5 Methoden

Durchführung Eine Ampulle mit Suspensionsmedium durch kräftigen Daumendruck auf die Schrägfläche der Plastikkappe aufbrechen. Mit der Impföse zwei bis drei Einzelkolonien von der Platte abnehmen und im Medium homogen suspendieren, bis eine sehr leichte Trübung erreicht ist (zur Abschätzung der geeigneten Trübung den MacFarlandStandard 0,5 verwenden). In das Unterteil der Plastikwanne ca. 5 ml Wasser verteilen, dann die Teststreifen in die Wanne legen. Es empfiehlt sich, zum Einpipettieren der Bakteriensuspension die Wanne schräg gegen einen festen Gegenstand zu stellen, damit die Suspension leicht in die Röhrchen einfließen kann. Mit einer sterilen Pasteurpipette Bakteriensuspension aufnehmen und zunächst nur in die Taschen „NO3“ bis „PNPG“ des Teststreifens geben, bis diese gefüllt sind. Nicht auf- und abpipettieren. Nach dem Befüllen der Taschen „NO3“ bis „PNPG“ werden 0,2 ml der Bakteriensuspension in die Ampulle mit dem AUX-Medium übertragen und gründlich durchmischt. Aus dieser Ampulle werden dann die restlichen Röhrchen („GLU“ bis „PAC“, braune Querstreifen) gefüllt. Wenn alle Röhrchen gefüllt sind, die Kammer flachlegen. Anschließend bei den Tests, die durch eine U-förmige Umrandung gekennzeichnet sind, die Taschen völlig mit Suspension auffüllen; in die Taschen der unterstrichenen Tests reichlich Paraffinöl eintropfen (konvexer Meniskus), damit der Luftzutritt unterbrochen ist (anaerobe Bebrütung). Inkubation

Deckel auflegen, beschriften und 24 h bei 30 °C inkubieren.

Auswertung

An Hand der Vergleichstafeln zunächst die positiv ausgefallenen Reaktionen markieren. Erst wenn alle pH-abhängigen Reaktionen beurteilt sind, werden die Testreagenzien (Nit1, Nit2, Zn; James-Reagenz) zu den Röhrchen zugetropft: Test auf Nitratreduktion und Tryptophan-Desaminase (jeweils ein Tropfen). Nach einigen Minuten diese Tests ebenfalls beurteilen.

Identifikation anhand des Codes

Anhand der Protokollzettel werden die Codenummern ermittelt: Es sind jeweils drei Reaktionen zu einer Gruppe zusammengefasst. Bei der Auswertung werden nur die positiven Tests (Zahlenwerte 1, 2 oder 4) innerhalb jeder Gruppe addiert, die Summe zwischen 0 (kein positiver Test) und 7 (alle positiv) eingetragen. Man erhält eine 7stellige Schlüsselzahl, die man im Code-Buch nachsieht bzw. in die APILAB-Software eingibt. Nach vollständiger Auswertung werden die Testansätze autoklaviert. O HO

S

NH2

O Sulfanilsäure

HNO2 (NO+) Essigsäure

O HO

+

S

N N

O Azosulfanilsäure = Diazoniumkation NH2

O HO

S

N

+

NH2

N

O Kirschroter Azofarbstoff Abb. 5.21.

α-Naphthylamin

Nachweis von Nitrit mit Sulfanilsäure nach Gries-Ilosvay

5.3 Einfache taxonomische Verfahren zur Charakterisierung von Mikroorganismen

383

Nitritnachweis Der Nachweis der Nitritbildung erfolgt mittels Nitrit-Reagenz nach Griess-Ilosvay: Das zunächst im Sauren aus Nitrit entstehende Nitrosylkation reagiert mit Sulfanilsäure zu einem Diazoniumkation, das mit α-Naphthylamin zu einem kirschroten Azofarbstoff kuppelt ( Abb. 5.21). Durch Zusatz von Zink lässt sich der Test auch zum Nachweis von Nitrat verwenden. Durchführung benötigtes Material Geräte  Reagenzgläser  Glaspipetten (5 ml)  Spatel

Chemikalien  Nitrit-Reagenz nach Griess-Ilosvay ( S. 423)  Zink-Pulver

Etwas (ca. 1 ml) von der zu bestimmenden Lösung (z. B. Kulturmedium, Anreicherungslösung) in ein leeres Reagenzglas pipettieren und 2 ml Nitrit-Reagenz zusetzen. Eine nach kurzer Zeit auftretende Rotfärbung zeigt Nitrit an. Ist der Nitrit-Nachweis negativ, so wird zu dem Gemisch im Reagenzglas eine kleine Spatelspitze Zinkpulver zugefügt. In der sauren Lösung entwickelt sich Wasserstoff in statu nascendi, wodurch evtl. vorhandenes Nitrat zu Nitrit reduziert wird. Tritt also erst nach Zink-Zugabe eine Rotfärbung auf, so war nicht Nitrit sondern

Nitrat vorhanden.

Färbung von Poly(3HB) mit Sudanschwarz und Nilrot Zur Färbung von Polyhydroxyalkanoaten (PHA), wie z. B. Poly(3HB), werden hier drei Methoden beschrieben. Mit der N ethanolischen Sudanschwarz B-Lösung und mit der Nilrot-Aceton-Lösung (Strukturen Nilrot  Abb. 5.22) können Kolonien nach Wachstum auf herkömmlichen Agarplatten HO direkt gefärbt werden. Erstere Methode (Sudanschwarz) verbindet den Vorteil der N N N N unmittelbaren Sichtbarmachung der Kolonien ohne Heranziehung weiterer Hilfsmittel mit dem Nachteil der relativen UnempfindSudanschwarz B lichkeit, wohingegen letztere (Nilrot-Aceton) den Vorteil der höheren Sensitivität mit Abb. 5.22. Strukturformeln der verwendedem Nachteil eines etwas erhöhten techniten Farbstoffe Nilrot und Sudanscharz B. schen Aufwandes (UV-Strahlenquelle) kombiniert. Beiden gemeinsam ist, dass das Zellmaterial die Färbung nicht überlebt. Ein Nachteil, der das Screening nach PHAakkumulierenden Stämmen bzw. PHA-negativen Mutanten PHA-speichernder Stämme wesentlich erschwert und der sich bei Verwendung dieser Methoden nur durch die Anfertigung von Masterplatten umgehen lässt. Dieser Aufwand lässt sich durch die dritte unten beschriebene Methode, die in vivo-Färbung von PHA mit Nilrot, vermeiden, die das gefärbte Material im vitalen Zustand belässt. (C2H5)N

O

O

Methode 15

384

5 Methoden

Durchführungen Färbung mit Sudanschwarz B: Bewachsenes Festmedium wird mit Sudanschwarz BLösung überschichtet. Nach 15 min Einwirkzeit wird die Lösung abgegossen. Zur Differenzierung wird die Plattenoberfläche mit Ethanol überschichtet. Nach ca. 2 min wird die Flüssigkeit verworfen. PHA-haltiges Zellmaterial ist im Unterschied zu PHA-freiem dunkelblau bis schwarz gefärbt. Dunkel gefärbtes Koloniematerial wird in Saline suspendiert und sowohl im Hellfeld als auch im Phasenkontrast mikroskopiert. Färbung mit Nilrot-Aceton: Die Oberfläche bewachsener Agarplatten wird mit Nilrot-Aceton-Lösung benetzt. Nach Verdampfen des Acetons gibt sich PHA-haltiges Zellmaterial durch intensive Fluoreszenz bei Bestrahlung mit UV-Licht (312 nm) zu erkennen. In vivo-Färbung mit Nilrot: Hierzu wird dem Festmedium 0,5 μg/ml Nilrot ausgehend von einer 0,25 mg/ml Stammlösung in DMSO zugesetzt. Die Zellen nehmen beim Wachstum den anwesenden Farbstoff auf, ohne dabei nennenswert geschädigt zu werden. Der sich in vorhandenen PHA-Granula akkumulierende Farbstoff führt zu einer intensiven Fluoreszenz unter UV-Licht (312 nm). Eine auf diese Weise detektierte Kolonie kann problemlos weiter kultiviert werden.

benötigtes Material Geräte  Phasenkontrastmikroskop  Pasteurpipetten  UV-Lampe (312 nm)

Chemikalien  Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl)  Sudanschwarz B-Lösung (0,05 %, wt/ vol, in 96 %, wt/vol, Ethanol)  Ethanol (96 %, vol/vol)  Nilrot-Aceton-Lösung (0,01 %, wt/vol, in Aceton)  Nilrot-DMSO-Lösung (0,025 %, wt/vol, in Dimethylsulfoxid)  Festmedium mit 0,5 μg/ml Nilrot

Methode 16 Färbung von Poly(glucose) mit Lugolscher Lösung Mit dieser Färbung lassen sich Granula aus Poly(glucose) wie z. B. Stärkekörnchen darstellen. Die Färbung ist darauf zurückzuführen, dass die Iodatome in die Hohlräume der Stärkeketten eindringen und als tiefblaue Einlagerungsverbindung sichtbar werden. Durchführung Ein Tropfen Lugolsche Lösung wird auf den Objektträger neben das mit Deckgläschen abgedeckte mikroskopische Präparat gesetzt und mit Hilfe eines Stückchens Fließpapier unter dem Deckglas hindurchgesaugt, bis keine Flüssigkeit mehr hervortritt und das Deckglas fest aufliegt. Das gefärbte Präparat wird im Hellfeld und im Phasenkontrast mikroskopiert. Die Färbung eignet sich auch zur direkten Anwendung auf bewachsenen Agarplatten. Dazu tropft man die Lugolsche Lösung mit Hilfe einer Pasteurpipette direkt auf die fraglichen Kolonien, die sich bei Anwesenheit

benötigtes Material Geräte     

Objektträger Deckgläschen Phasenkontrastmikroskop Pasteurpipette Fließpapier

Chemikalien  Lugolsche Lösung (Iod-KaliumiodidLösung entspricht Lösung B der Gramfärbung  M12, S. 377)  Ethanol (96 %, vol/vol)

5.4 Molekulargenetische Methoden

385

von Stärke sofort violett färben. In Versuch 42 ist eine Abbildung enthalten, die sowohl den positiven wie auch den negativen Ausgang dieser Färbung zeigt ( Abb. 3.107, S. 214).

5.4

Molekulargenetische Methoden

Im folgenden Abschnitt werden Vorgehensweisen zur Isolierung von DNA und zur ungerichteten, klassischen Mutagenisierung behandelt.

Isolierung von Plasmid DNA aus Escherichia coli Durchführung Von einer mit dem Plasmid-tragenden E. coli-Stamm bewachsenen Agarplatte wird Geräte mittels Impföse Koloniematerial entnommen und in ein E-Cup überführt, in dem  Reagenzglasschüttler 150 μl TELT-Lösung vorgelegt wurde (die  Zahnstocher Zellmenge sollte ca. zwei gut gefüllten Imp Mikroliterpipette, verstellbar für den fösen entsprechen). Die Zellklumpen werVolumenbereich 100 bis 1000 μl  Pipettenspitzen, blau für den Volumenden mit Hilfe des Reagenzglasschüttlers bereich bis 1000 μl (autoklaviert) vollständig suspendiert. Nach 5 min Inkuba 1,5 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäße („Etion bei Raumtemperatur wird das E-Cup in Cups“), autoklaviert einen „Schwimmer“ gesteckt und für 2 min  „Schwimmer“ aus Schaumstoff oder in einem auf 95 °C vorgeheiztem Wasserbad Styropor mit Bohrungen zur Aufnahme inkubiert. Danach wird das E-Cup zur und Inkubation von E-Cups im EisAbkühlung für 5 min in ein Eisbad gestellt. oder Wasserbad Es folgt eine 8 min Zentrifugation bei  Wasserbad (95 °C) 15.000 × g. Das im E-Cup befindliche „glibb Wärme-isoliertes und wasserdichtes Gefäß zur Aufbewahrung eines Eiswasrig-schleimige“ Sediment wird mit Hilfe sergemisches („Eisbad“) eines Zahnstochers aufgenommen und entfernt; der verbliebene klare Überstand entChemikalien hält die DNA. Zur Aufreinigung der  TELT-Lösung: Folgende Komponenten Plasmide wird der Überstand mit 100 μl Isowerden vor Gebrauch zusammengepropanol versetzt und für 10 min in einem mischt: Eisbad inkubiert. Die präzipitierte DNA wird  0,25 ml 1 M Tris/HCl (pH 7,5) durch 15 min Zentrifugation bei 15.000 × g  0,625 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) sedimentiert. Der Überstand wird verwor 3,9 ml 3,2 M LiCl fen, und das Plasmid-haltige Sediment wird  0,2 ml 10 % (vol/vol) Triton X-100 mit 200 μl 70 % (vol/vol) Ethanol versetzt.  Danach 5 mg Lysozym zusetzen und Nach erneuter Zentrifugation wird der ethaunter langsamen Schwenken lösen. nolische Überstand mit Hilfe einer Mikroli Isopropanol terpipette möglichst vollständig  Ethanol 70 % (vol/vol) abgenommen. Das Entfernen von restlichem Ethanol aus dem Plasmid-haltigen Sediment erfolgt am einfachsten durch Verdampfen aus dem geöffneten E-Cup während einer ein- bis mehrstündigen Inkubation in einer sterilen Werkbank. benötigtes Material

Methode 17

386

5 Methoden

Methode 18 Transformation von Escherichia coli Durchführung 1. Anzucht der Empfängerzellen

Mit einer Einzelkolonie des zu transformierenden E. coli-Stammes werden 10 ml LBMedium in einem 100 ml-Erlenmeyerkolben angeimpft. Unter Schütteln wird die Kultur bei 37 °C inkubiert bis eine deutliche Trübung erreicht ist (ca. 3 h). Die Kultur wird in ein steriles 10 ml-Schraubdeckelröhrchen überführt. Durch 15 min Zentrifugation bei 3.500 × g und 4 °C werden die Zellen geerntet; der Überstand wird verworfen. Die Zellen werden mit 5 ml eisgekühltem, sterilem Transformationspuffer versetzt und mit Hilfe eines Reagenzglasschüttlers resuspendiert. Nach einer 15 min Inkubation in einem Eisbad erfolgt eine weitere Zentrifugation unter den o. a. Bedingungen. Danach werden die Zellen in 1 ml eiskaltem Transformationspuffer resuspendiert und in drei Portionen zu je 330 μl auf vorgekühlte 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße („E-Cups“) verteilt. Die Zellen verbleiben bis zur Transformation im Eisbad. Die Zellen sind frühestens nach 4 h Inkubation zur Transformation verwendbar. Da die Haltbarkeit der Zellen gering ist, müssen die Zellen spätestens am nächsten Tag verwendet werden.

2. Transformation

benötigtes Material Geräte          

 

  

Impföse 100 ml Erlenmeyerkolben Schüttelinkubator 37 °C Kühlzentrifuge (für 10 ml-Röhrchen) Schraubdeckelröhrchen, 10 ml (autoklaviert) 5 ml-Glaspipette (steril) Reagenzglasschüttler Drigalski-Spatel Mikroliterpipetten, verstellbar für die Volumenbereiche 10 bis 100 μl, und 100 bis 1000 μl Pipettenspitzen, gelb für den Volumenbereich bis 200 μl (autoklaviert) und blau für den Volumenbereich bis 1000 μl (autoklaviert) 1,5 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäße („ECups“), autoklaviert „Schwimmer“ aus Schaumstoff oder Styropor mit Bohrungen zur Aufnahme und Inkubation von E-Cups im Eisoder Wasserbad Wasserbad (42 °C) Brutschrank (37 °C) Wärmeisoliertes und wasserdichtes Gefäß zur Aufbewahrung eines Eiswassergemisches („Eisbad“)

Chemikalien und Medien Die getrockneten Plasmidpräparationen (M17, S. 385) werden mit je 300 μl Sus Transformationspuffer (0,1 M CaCl2) pension der Rezipientenzellen versetzt. Zur  LB-Nährlösung ( S. 417)  LB-Festmedium ( S. 417) Kontrolle wird ein Ansatz ohne Plasmid LB-Amp-Festmedium ( S. 417) DNA (K-P-) und ein Ansatz, bei dem zwar Plasmid-DNA, jedoch keine Empfängerzellen eingesetzt werden (K-E-), mitgeführt. Die Ansätze werden kurz durchmischt und danach für 30 min im Eisbad inkubiert. Die E-Cups werden in Schwimmern für genau 1,5 min bei 42 °C in einem Wasserbad inkubiert, dann sofort in das Eisbad zurückgestellt und mit je 600 μl LB-Flüssigmedium versetzt. Nach 10 min im Eisbad werden die Ansätze für 30 min bei 37 °C im Brutschrank inkubiert. Danach werden unterschiedliche Volumina (10 bis 100 μl) der Ansätze mit Hilfe eines Drigalski-Spatels auf nicht-selektivem und selektivem Medium ausgespatelt.

5.4 Molekulargenetische Methoden

387

Isolierung von Gesamt DNA aus Bacillus subtilis

Methode 19

Durchführung benötigtes Material Geräte  Glaspipetten, 5 ml  Mikroliterpipette, verstellbar für den Volumenbereich 100 bis 1000 μl  Pipettenspitzen, blau für den Volumenbereich bis 1000 μl  Pasteurpipette, lang  Reagenzgläser  Wasserbad (37 °C)

Chemikalien        

Zu der Zellsuspension werden 200 μl Lysozym-Lösung und 200 μl EDTA-Lösung zugesetzt und gemischt. Unter gelegentlichem Umschwenken wird der Ansatz für ca. 20 bis 30 min bei 37 °C im Wasserbad inkubiert. Danach erfolgt der Zusatz von 200 μl Proteinase K-Lösung und 200 μl SDS-Lösung. Unter Umschwenken wird 30 bis 40 min bei 37 °C inkubiert, bis der Ansatz sich vollständig klärt. Dann werden 500 μl 5 M NaCl zugesetzt.

0,2 ml Lysozym (1 × 106 U/ml), frisch 0,2 ml EDTA (0,25 M, pH 8,0) 0,2 ml Proteinase K (2,5 mg/ml), frisch 0,2 ml SDS-Lösung (12,5 %, wt/vol) 0,5 ml NaCl-Lösung (5 M) Ethanol (70 %, vol/vol) Ethanol, reinst Chloroform-Octanol (5 vol Chloroform + 1 vol Octanol)

Unter einem Abzug werden 4 ml Chloroform-Octanol-Gemisch zugegeben. Das Schraubdeckelglas wird sorgfältig verschlossen und bis zum Einsetzen einer feinen Emulsion geschwenkt (ca. 10 min). Durch 45 min Zentrifugation bei 3.500 × g und 4 °C erfolgt die Phasentrennung. Die obere wässrige Phase wird mit einer umgedrehten (!) 5 ml-Glaspipette vorsichtig abgehoben und in ein Reagenzglas überführt, wobei die weißliche Schicht zwischen den Phasen zurückbleiben soll. (Eine starke Viskosität der wässrigen Phase macht diesen Transfer nicht einfach; sie ist auf DNA zurückzuführen und somit ein gutes Zeichen. DNA-haltige Lösungen sollten vorsichtig und langsam pipettiert werden, um ein allzu starkes Fragmentieren der DNA-Stränge durch Scherkräfte zu vermeiden.) Am Reagenzglas wird die Höhe des Flüssigkeitsspiegels markiert und danach vorsichtig zwei Volumenteile eisgekühlter Ethanol auf die Lösung geschichtet. Im Phasengrenzbereich fällt nun DNA gespinstartig aus. Diese DNA-Ausflockungen können mit Hilfe eines Glasstabs (bzw. einer unten zugeschmolzenen Pasteurpipette) aufgespult werden. Durch die hierbei eintretende Vermischung der Phasen präzipitiert sukzessiv aus der Lösung immer mehr DNA, die somit fortlaufend auf den Glasstab aufgewickelt werden kann. Der Glasstab mit dem gut sichtbaren DNA-Knäuel wird bis zur weiteren Verwendung in einem Reagenzglas mit 70 % (vol/vol) Ethanol im Kühlschrank (4 °C) aufbewahrt.

+

Na O O

S

O

O CH2 H2C CH2 H2C CH2 H2C CH2 H2C CH2 H2C CH2 H3C Natriumlaurylsulfat (SDS)

388

5 Methoden

Methode 20 Auslösung von Mutationen Im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM werden repräsentativ zwei Methoden der konventionellen Mutagenese vorgestellt. In der Vergangenheit wurden diese ungerichteten Mutagenesen vielfach und erfolgreich zur Erzeugung wertvoller Mutanten eingesetzt, mit deren Hilfe viele Fragen zum bakteriellen Stoffwechsel beantwortet werden konnten. Die Bedeutung dieser Methoden ist in heutiger Zeit dank neuerer Techniken im Bereich der Molekulargenetik zurückgegangen. Für Stämme, für die noch keine genetischen Werkzeuge verfügbar sind (z. B. NeuIsolate), bieten sie jedoch auch heute noch wertvolle Hilfen, um wichtige physiologische Fragestellungen zu bearbeiten.

OH

+

N

N

N

N H2N

N

N

R 7

N -MeG

R 6

O -MeG

Abb. 5.23. Guinin-Derivate, die durch Reaktion mit MNNG entstehen können

NH2

O

N

MNNG-Mutagenese, Aufnahme einer Abtötungskurve N-Methyl-N´-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) ist ein überaus starkes mutagenes Agenz. Seine Wirkung erzielt die Substanz durch Alkylierung von Basen; in Abb. 5.23 sind zwei methylierte Derivate des Guanins, das N7-Methylguanin und das O6-Methylguanin dargestellt.

N

N H2N

O CH3

CH3

N O

N

U ra cil O

NH2 N N

O

N

Cy to n is

H

N N

N N

N

H

N

Bevor MNNG zur erfolgreichen Generierung A d en i Hy i th n a x o p von Mutanten bei einem Bakterium eingeO setzt werden kann, muss zunächst eine so O H N genannte Abtötungs- bzw. Überlebenskurve N H N aufgenommen werden. Hierbei wird die N Inaktivierung der Zellen mit steigender N O N Dosis des Mutagens oder steigender EinN NH2 N H wirkzeit gemessen. Ziel ist hierbei zunächst, a n tX h i Gu n a i die Bedingungen der Mutagenese für ein bestimmtes Bakterium zu finden, bei dem bevorzugt Einzel-Mutationen in den Zellen Abb. 5.24. Desaminierung von Basen bei ausgelöst werden. Bei MNNG ist dies erfah- der Mutagenese mit Nitrit rungsgemäß der Fall, wenn 50 % der Zellen inaktiviert (getötet) werden. Im unten beschriebenen Verfahren wird bei konstanter Konzentration der Wirksubstanz die Einwirkzeit variiert. Die ermittelte Einwirkzeit, die zu einer Abtötung von 50 % der Zellen führt, wird dann unter sonst gleichen Bedingungen bei der eigentlichen Mutationsauslösung zur Isolierung von Mutanten eingesetzt. Durchführung Ausgehend von einer gut gewachsenen Kultur des betreffenden Bakteriums werden 30 ml Medium in einem 300 ml Erlenmeyerkolben beimpft. Die Kultur wird geschüttelt, bis eine Zelldichte von 3 bis 5 × 108 Zellen/ml erreicht ist ( V2, S. 34); die hierbei

5.4 Molekulargenetische Methoden

389

N-Methyl-N´-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) kann Krebs erzeugen, ist gesundheitsschädlich beim Einatmen, reizt die Augen und die Haut, ist giftig für Wasserorganismen und kann in Gewässern längerfristig schädliche Wirkungen haben. Sicherheitsratschläge: • Exposition vermeiden, vor Gebrauch besondere Anweisungen einholen, nur für den berufsmäßigen Verwender, bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt hinzuziehen! • Freisetzung in die Umwelt vermeiden. Beim Umgang mit MNNG sind außerdem unbedingt Einmal-Handschuhe zu tragen! • Die Arbeiten mit MNNG sind unbedingt unter einem Abzug durchzuführen! • MNNG ist im Alkalischen nicht stabil und kann mit verdünnter Ammoniaklösung inaktiviert werden!

zu wählenden Kulturbedingungen (Medium, Temperatur) hängen vom Bakterienstamm ab. Durch Zentrifugation (15 min, 3.500 × g, 4 °C) in sterilisierten Zentrifugenbechern werden die Zellen geerntet, in 30 ml Citrat-Puffer resuspendiert, erneut zentrifugiert, wiederum in Citrat-Puffer aufgenommen, nochmals zentrifugiert und schließlich in 32 ml Citrat-Puffer resuspendiert. Diese Suspension wird zu gleichen Portionen (4 ml) auf acht sterile Schraubdeckelröhrchen verteilt. Die Röhrchen werden in ein auf 37 °C temperiertes Wasserbad gestellt. benötigtes Material Geräte      

300 ml-Erlenmeyerkolben mikroskopische Zählkammer Lichtmikroskop Schraubdeckelröhrchen (steril) Glaspipetten Kühlzentrifuge für die Zellernte (30 ml, 3.500× g, 4 °C)  Wasserbad (37 °C)

Chemikalien  Citrat-Puffer (0,1 M) ( S. 412)  Phosphat-Puffer (0,1 M) ( S. 423)  MNNG (N-Methyl-N´-nitro-N-nitrosoguanidin, Bezug: Fa. Fluka, Nr. 68051, Aldrich, Nr. 12,994-1)

Zu jedem Röhrchen werden 0,2 ml der MNNG-Lösung gegeben; dies ist der Zeitpunkt t0. Die Konzentration von MNNG im Ansatz beträgt 50 μg/ml. Zu den Zeitpunkten t0 und 5, 10, 20, 30, 45, 60 und 90 min danach wird jeweils ein Röhrchen aus dem Wasserbad genommen und sofort 10 min zentrifugiert (3.500 × g, 4 °C). Das Zellsediment wird unmittelbar danach in 5 ml Phosphat-Puffer aufgenommen, erneut zentrifugiert und schließlich in 5 ml Puffer resuspendiert. Damit ist die Wirkung des Agens abgestoppt. Bei der Zugabe von MNNG zu den ersten Röhrchen muss genügend Zeit für diese Zentrifugationen einkalkuliert werden.

Von den Zellsuspensionen werden Verdünnungen in Phosphat-Puffer hergestellt (10-1 bis 10-5, M3, S. 363), und jeweils 0,1 ml aus diesen Verdünnungen werden mit Hilfe eines Drigalski-Spatels (M4, S. 366) auf Festmedium ausgespatelt. Die Platten werden bebrütet, bis die Kolonien eine auszählbare Größe erreicht haben. Unter der Berücksichtigung des ausplattierten Volumens (0,1 ml) und der jeweiligen Verdünnungsstufe wird die Anzahl der lebenden Zellen pro ml in den AusgangsSuspensionen bestimmt. Diese Lebendzellzahl wird gegen die Einwirkzeit von MNNG aufgetragen. Aus der Auftragung wird die Einwirkzeit graphisch ermittelt, bei der 50 % Inaktivierung (Abtötung) erzielt wurde. Diese Zeit wird unter sonst gleichen Bedingungen im Hauptversuch eingesetzt.

Gefahrenhinweis

390

5 Methoden

Nitrit-Mutagenese Die Mutagenese mit Nitrit ist ein im Verbenötigtes Material gleich zur MNNG-Mutagense ( S. 388) Geräte leicht durchführbares und für den Anwender relativ unproblematisches Verfahren, das  Schraubdeckelröhrchen dennoch zu guten Ergebnissen (Mutanten)  Wasserbad (30 °C) führt. Hierbei sind es die im Sauren aus der  Glaspipetten (2 ml) Salpetrigen Säure entstehenden überaus Chemikalien reaktive Nitrosyl-Kationen (NO+), die mit den Aminogruppen von Adenin, Guanin  Acetat-Puffer (0,6 N, pH 4,5) oder Cytosin zu instabilen Diazomium-Ver Nitrit-Lösung (0,05 M Na2NO2)  Phosphat-Puffer (0,067 M, pH 8,1) bindungen reagieren, was letztlich zur Desaminierung der genannten Basen führt ( Abb. 5.24). Cytosin kann bei der Mutagenese in Uracil überführt werden, was zur Falschpaarung mit Adenin führt; Adenin selbst kann zu Hypoxanthin umgesetzt werden, das mit Cytosin paart. Guanin schließlich wird in Xanthin umgewandelt; eine Änderung, die jedoch folgenlos bleibt, da Xanthin weiterhin mit Cytosin paart. Auch hier sollte für jede Bakterien-Spezies zunächst eine Abtötungskurve aufgenommen werden (M20, S. 388). Im Folgenden sind die Bedingungen aufgeführt, die bei Ralstonia eutropha zum Erfolg führen. Zu 2 ml Zellsuspension werden 2 ml Acetat-Puffer und 2 ml Nitrit-Lösung zugefügt. Nach 9 min Inkubation bei 30 °C wird die Einwirkung des mutagenen Agenz durch eine 10-1-Verdünnung des Ansatzes in Phophatpuffer gestoppt.

5.5

Photometrische Methoden

Das Photometer wird in der klassischen Mikrobiologie hauptsächlich zur Bestimmung von Extinktionen (Absorptionen und Lichtstreuungen) verwendet.

Methode 21 Lambert-Beersches Gesetz Die Strahlenmenge I, die eine absorbierende Flüssigkeitsschicht durchdringt, verringert sich exponentiell nach dem Lambert-Beerschen Gesetz (Formel 6): Iaus Iaus = Iein × e-c × d × k (4) = e-c × d × k (5) Iein • • • • •

Iaus Iein c d k

austretende Lichtmenge eintretende Lichtmenge Konzentration der absorbierenden Verbindung Schichtdicke der Flüssigkeit Korrelationskoeffizient

Der Quotient Iaus/Iein wird auch als Transmission bezeichnet; sie verändert sich exponentiell mit der Schichtdicke und der Konzentration der absorbierenden Substanz. Durch Logarithmieren des Kehrwerts der Transmission kann ein linearer Bezug hergestellt werden; gebräuchlich ist jedoch nicht der natürliche (ln) sondern der dekadische Logarithmus (lg), wobei der Korrelationskoeffizient k zum Absorptionskoeffizient ε = k/2,303 wird (E = Extinktion):

5.5 Photometrische Methoden

391

lg (

Iaus Iein

)=c×d×ε=E

(6)

Berechnung von Konzentrationen Die Konzentration (c) von Acetat ( S. 394), Citrat ( S. 396), Ethanol ( S. 397), Glucose ( S. 399), Glycerin ( S. 400), und Milchsäure ( S. 401) in der jeweiligen Probe des Kulturüberstandes in mM errechnet sich mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes (Formel 6). Zur Konzentrationsbestimmung umgeformt, ergibt sich hieraus Formel 7: ΔE Vges 1 c= × × (7) ε×d VProbe VF • • • • • •

ΔE Änderung der Extinktion ε Absorptionskoeffizient von NAD(P)H (bei 340 nm = 6,3 mM-1 cm-1) d Schichtdicke (je nach verwendeter Küvette, meist 1 cm) Vges Gesamtvolumen des Tests VProbe Volumen der in den Test eingesetzten Probe VF Verdünnungsfaktor des Kulturüberstandes (falls nötig)

Messung der Trübung von Zellsuspensionen Eine sehr häufig angewendete indirekte Methode zur Bestimmung des Zellgehalts Geräte von Mikroorganismenkulturen stellt die Trübungsmessung dar. Partikel, die in Was Photometer ser suspendiert sind und sich in ihrem Bre Küvetten chungsindex von dem umgebenden Medium unterscheiden, verursachen eine Trübung bzw. Optische Dichte (OD). Die OD ist durch eine Streuung der durchfallenden Lichtstrahlen an der Grenzfläche Wasser-Partikel bedingt. In der Regel wird die Intensitätsschwächung des eingestrahlten Lichtes durch die Streuung in der Suspension (scheinbare Extinktion) gemessen. Die Trübungsmessung ist zur relativen Bestimmung des Zellgehaltes eine einfach zu handhabende Bestimmungsmethode. Sie ist aber nur für homogene Suspensionen verwendbar. Proportionalität zwischen Trübung und Zellmasse besteht nur, wenn „dünne“ Suspensionen (bis zu einer Extinktion von ca. 0.3) verwendet werden. Bei höherer Zelldichte führt insbesondere die verstärkt eintretende Rückstreuung zu fälschlich niedrigeren Werten. benötigtes Material

Die Trübung ist außer von der Konzentration auch von der Größe und der Form der Zellen abhängig. Deswegen dürfen Verdünnungen der Zellsuspensionen nicht zu Änderungen der Zellvolumina führen. Die Trübung hängt darüber hinaus von der Wellenlänge der Messstrahlung ab. Je kürzer die Wellenlänge, desto stärker ist die Streuung und desto empfindlicher ist die Messung. Andererseits darf die Absorption neben der Streuung des Lichtes keine Bedeutung haben. Die OD ungefärbter Mikroorganismen wird daher vorzugsweise mit monochromatischer Strahlung aus dem Bereich von 540 bis 600 nm gemessen.

Methode 22

392

5 Methoden

Durchführung Die Trübungsmessung erfolgt in 3 ml Glas- oder Plastikküvetten mit einer Schichtdicke von 1 cm gegen Saline oder H2Odem. (Nullabgleich). Der Leerwert des Mediums stellt die Optische Dichte unbeimpften Mediums dar. Der Leerwert gefärbter Medien (z. B. Komplexmedien) kann durchaus recht beträchtlich sein. Der Leerwert des unbeimpften Mediums ist in jedem Fall von den Werten der Zell-haltigen Proben abzuziehen. Alternativ kann natürlich auch das unbeimpfte Medium zum Nullabgleich herangezogen werden. Fallen die Trübungswerte der Proben größer als 0,3 aus, so sind mit Hilfe des unbeimpften Mediums entsprechend verdünnte Proben einzusetzen.

Methode 23 Proteinbestimmung ganzer Zellen Die am häufigsten angewendete Methode zur Proteinbestimmung ist die nach Lowry et al. (1951). Mit ihr werden sowohl nach dem Prinzip der Biuret-Reaktion die Peptidbindungen als auch aromatische Aminosäuren (Tryptophan, Phenylalanin, Tyrosin) erfasst. Im ersten Schritt wird ein Kupfer-ProteinKomplex in alkalischer Lösung gebildet ( Abb. 5.25). Das im zweiten Schritt zugesetzte Folin-Ciocalteus-Phenol-Reagenz ist nur im sauren Milieu beständig; die Farbreaktion erfolgt jedoch bei pH 10. Deshalb muss man, sobald das Folin-CiocalteusPhenol-Reagenz zur alkalischen KupferProtein-Lösung zufügt, sofort kräftig mischen, damit die Farbreaktion vor der Zersetzung des Reagenzes stattfindet. Zudem muss das Zeitintervall zwischen FolinCiocalteus-Phenol-Reagenz-Zugabe und Messung (20 min) strikt eingehalten werden. Die im Folgenden angegebene Variante eignet sich zur Bestimmung des Proteingehalts ganzer Zellen. Durchführung

benötigtes Material Geräte  Photometer zur Bestimmung der Absorption bei 750 nm  Pipette für die Volumina 250 bis 1.000 μl mit passenden Spitzen  Glaspipette für das Volumen 5 ml  Glas- oder Plastikküvetten  Reagenzgläser  Wasserbad (100 °C)

Chemikalien  Saline (0,9 %, wt/vol, NaCl)  Lösungen zur Proteinbestimmung nach Lowry ( S. 424)

Tabelle 5.1. Kalibrierung der Proteinbestimmung mit RSA-Stammlösung RSA-Lösung [ml] 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0

H2 O [ml] 5,0 4,5 4,0 3,0 2,0 1,0 -

Protein [μg/μl] 0 20 40 80 120 160 200

Die sedimentierten Zellen werden in genau 1 ml Saline resuspendiert. Je 500 μl dieser Suspensionen bzw. 500 μl der Rinderserum (RSA)-Standardlösungen werden mit je 500 μl Lösung A in Reagenzgläser pipettiert und für 1 min im kochenden Wasser inkubiert. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur werden 5,0 ml Lösung B zugesetzt, gemischt und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Im Abstand von 30 sec werden 250 μl Lösung C zugesetzt, sofort gemischt und genau 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Bei 750 nm wird die Absorption der Ansätze gegen den Leerwert (500 μl H2O statt Probe bzw. RSA,  Tabelle 5.1) ermittelt. Eine Kalibrierung muss stets mit den zu messenden Proben mitgeführt werden; hierzu kann das in Tabelle 5.1 angegebene Schema verwendet werden.

5.5 Photometrische Methoden

O H2N

393

O

C

N

R

NH2

C

O

H Biuret

H O H2N

C R

C

R N

C

H

C

OH

H

H

C H N R C H H N O

C

R

C

R

C O N H H C R N H

2+

Cu

H

C

H

C

O

C

R

O

Peptidbindung im Protein Abb. 5.25. Cu2+

C

Kupferkomplex der Biuretverbindung

Prinzip der Biuret-Reaktion. Gezeigt ist die Komplexierung von Peptid-Bindungen mit

Weiterführende Literatur Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry 193:265-275

Einfacher und gekoppelter optisch-enzymatischer Test Im Folgenden sind drei unterschiedliche gekoppelte optisch-enzymatische Testsysteme beschrieben, die zur Quantifizierung von Acetat ( S. 394), Citrat ( S. 396), Ethanol ( S. 397), Glucose ( S. 399), Glycerin ( S. 400) und Milchsäure ( S. 401) dienen. Bei diesen Bestimmungen wird letztlich mit dem Photometer die Änderung der Konzentration von NAD(P)H gemessen, welches im Gegensatz zu seinem oxidierten Derivat NAD(P)+ im Wellenlängenbereich zwischen 300 und 400 nm absorbiert ( Abb. 5.26). Über den durch die Enzymreaktionen gegebenen stöchiometrischen Zusammenhang von NAD(P)H und zu bestimmendem Metabolit kann dessen Konzentration mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetz ( S. 390) berechnet werden. Die Messungen sollten bei einer Wellenlänge von 340 nm durchgeführt werden; hier besitzt NAD(P)H im oben genannten Bereich sein Absorptionsmaximum (ε = 6,3 mM-1 cm-1). Erfolgen mehrere Messungen unterschiedlicher Personen an einem Photometer, so ist es durchaus zweckmäßig, gegen Luft zu messen: Dazu wird das Photometer vor den Messungen mit leerer Messposition (ohne Küvette) auf E = 0 abgeglichen. Ein auf diese Weise „neutral“ abgeglichenes Photometer kann problemlos auch von anderen für Messungen verwendet werden.

Methode 24

394

5 Methoden

H

O C

O O

P

O

O

HO

NH2

N O

CH2 H

NH2

N

N

H H

O

O

OH

Oxidation

N N

+ H+ H

HO

O

N O

P

O

CH2

N

H

O

O H

H

H

H NAD+ NADH + H+ HO OH HO OH Abb. 5.26. Redox-Reaktionen von Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD+ bzw. NADH) H

H

NH2

H

H

OH

C

N

CH2

H

Reduktion

N

P

O

O

H

H O

P

H

H H

O

O

+ 2 [H]

O

O

NH2

+ N

CH2

H

H

H

Nachweis von Acetat In diesem gekoppelten optisch-enzymatischen Test kommen gleich drei Enzyme zum Einsatz ( Abb. 5.27). Acetyl-CoA-Ligase (bekannter unter Acetyl-CoA-Synthetase, AS, EC 6.2.1.1) setzt das nachzuweisende Acetat zunächst in Acetyl-CoA um, das dann durch die Wirkung der Citrat-Synthase (CS, EC 4.1.3.7) mit Oxalacetat zu Citrat kondensiert. Der optische Nachweis geschieht mit der durch die Malat-Dehydrogenase (MDH, EC 1.1.1.37) katalysierten Nachlieferung von Oxalacetat durch die NAD-abhängige Oxidation von Malat in einer so genannten vorgeschalteten Indikatorreaktion.

benötigtes Material Geräte  Photometer zur Bestimmung der Absorption bei 340 nm  Mikroliterpipette für Volumina bis 1.000 μl mit passenden Spitzen  Glaspipetten  Glas- oder Plastikküvetten  Reagenzgläser  Eisbad  Wasserbad (30 °C)

Chemikalien  Acetat-Nachweis-Reagenzien ( S. 410)

Durchführung Tabelle 5.2 enthält die Zusammensetzung des Messansatzes zur Bestimmung von Acetat. Zur Kontrolle wird ein Ansatz mit 1,15 ml H2Odem. statt Probe mitgeführt.

5.5 Photometrische Methoden

O H3C

395

CO O

Acetyl-CoASynthetase

C O

Acetat

COO

O H3C

+

C S-CoA

ATP CoA

AMP + PPi

COO HO

C

Acetyl-CoA

C

H2O

COO

MalatDehydrogenase

COO

CO O

CoA

Citrat

COO C

O

CH2 COO

+

NAD

Malat

Tabelle 5.2.

C

CH2

Oxalacetat

CH2

Abb. 5.27.

HO

CH2

H

COO

CH2

Citrat-Synthase

O

+

NADH + H

Oxalacetat

Reaktionen bei der enzymatischen Bestimmung von Acetat Zusammensetzung eines Messansatzes zur Acetatbestimmung

Nacheinander in Küvette pipettieren [ml]

Endkonzentration

TEA/Malat-Puffer

1,50

150,0 mM Triethanolamin 10,0 mM Malat 3,0 mM Mg2+

NAD/CoA-Lösung

0,20

ATP-Lösung

0,10

Probe

1,15

bis ca. 0,15 mM Acetat

MDH

0,01

5,0 U/ml

CS

0,02

4,0 U/ml

1,0 mM NAD 17,0 μM Coenzym A 2,7 mM ATP

Extinktion E1 ablesen, anschließend Folgendes zusetzen: AS

0,02

5,0 U/ml

Mischen und bei 30 °C Extinktionsänderung bis zur Konstanz verfolgen (ca.1 Stunde). Extinktion E2 bestimmen. E2 - E1 = ΔE geht in die Berechnung ein (Formel 7, Seite 391)

396

5 Methoden

Nachweis von Citrat Bei diesem Test wird Citronensäure (Citrat) durch die Reaktionen der Citrat-Lyase (CL, EC 4.1.3.6) zunächst in Oxalacetat überführt. Malat-Dehydrogenase (MDH, EC 1.1.1.37) wandelt unter Oxidation von NADH (und damit einhergehender Absorptionsabnahme) das Oxalacetat in Malat um. Da Oxalacetat mit niedriger Rate spontan (chemisch) zu Pyruvat decarboxylieren kann, wird in einer zusätzlichen durch die Lactat-Dehydrogenase (LDH, EC 1.1.1.27 oder 1.1.1.28) katalysierten Reaktion auch diese Menge photometrisch erfassbar ( Abb. 5.28). Durchführung Der Messansatz zur Citratbestimmung ist in Tabelle 5.3 angegeben. Zur Kontrolle wird ein Ansatz mit 0,5 ml H2Odem. statt Probe mitgeführt.

Tabelle 5.3.

benötigtes Material Geräte  Photometer zur Bestimmung der Absorption bei 340 nm  Mikroliterpipette für Volumina bis 1.000 μl mit passenden Spitzen  Glaspipetten  Glas- oder Plastikküvetten  Reagenzgläser  Eisbad

Chemikalien  Glycylglycin-Puffer (0,51 M Glycylglycin; 0,6 mM ZnCl2; pH 7,8)  MDH/LDH-Lösung (Malat-Dehydrogenase 24 U/ml; Lactat-Dehydrogenase 55 U/ml; gelöst in AmmoniumsulfatPuffer ( S. 415)  NADH-Lösung (NADH 1,2 mM)  CL-Lösung (Citrat-Lyase 42 U/ml)

Zusammensetzung eines Messansatzes zur Citratbestimmung

Nacheinander in Küvette pipettieren [ml]

Endkonzentrationen

Glycylglycin-Puffer

1,00

NADH-Lösung

0,50

0,20 mM

H2Odem.

0,50

-

-1

Probe (10 verdünnt)

0,50

bis ca. 0,15 mM Citrat

MDH/LDH-Lösung

0,50

4,0 U/ml MDH 9,0 U/ml LDH

Nach 10 Minuten Extinktion E1 ablesen. Anschließend Folgendes zusetzen: CL-Lösung

0,02

0,28 U/ml CL

Dann 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend Extinktion E2 ablesen. E2 - E1 = ΔE geht in die Berechnung ein (Formel 7, Seite 391)

5.5 Photometrische Methoden

397

CO O CH2 HO

C

C

COO

CH2 CO O

O

+

O H3C

CH2

C

O

Oxalacetat Abb. 5.28.

LactatDehydrogenase

Pyruvat

OH H3C

O CO2

Malat

C

COO

H

COO

+

NAD

Oxalacetat

spontan

C

CH2

NADH + H

COO C

COO HO

CO O

C

O Acetat

Citrat

O

CH2

O H3C

MalatDehydrogenase

COO

Citrat-Lyase

C

O C O

+

NADH + H

+

NAD

Lactat

Reaktion bei der enzymatischen Bestimmung von Citrat

Nachweis von Ethanol benötigtes Material Geräte  Photometer zur Bestimmung der Absorption bei 340 nm  Mikroliterpipette für Volumina bis 1.000 μl mit passenden Spitzen  Glaspipetten  Glas- oder Plastikküvetten  Reagenzgläser  Eisbad  Wasserbad (37 °C)

Chemikalien  Pyrophosphat/Semicarbazid/GlycinPuffer ( S. 425)  NAD-Lösung 24 mM (in Puffer, im Eisbad aufbewahren)  Alkohol-Dehydrogenase-Lösung mit 6.000 U/ml (in Puffer, im Eisbad aufbewahren)

Ethanol wird unter Reduktion von NAD durch die Alkohol-Dehydrogenase (Alkohol:NAD-Oxidoreductase, EC 1.1.1.1, ADH) zu Acetaldehyd oxidiert ( Abb. 5.29, oben). Die Bildung von NADH, gemessen an der Extinktionszunahme bei 340 nm, ist der Ethanolmenge proportional. Das Gleichgewicht der Enzymreaktion hängt stark vom pH-Wert ab. Im alkalischen und durch Abfangen des gebildeten Acetaldehyds mit Semicarbazid kann das Gleichgewicht auf die rechte Seite verschoben werden ( Abb. 5.29, unten). Spezifität der Methode: Alkohol-Dehydrogenase (ADH) setzt neben Ethanol die primären n-Alkohole von n-Propanol bis zum n-Decanol mit abnehmender Aktivität um. Verzweigte und sekundäre Alkohole werden nur mit sehr geringer Rate umgesetzt.

398

5 Methoden

O

H

C H3C

CH2 OH +

NH2

O H3C

+

C

H3C

+

R

NAD

O

O

C

C

+

H

H2N N

C

NH2

N R

Acetaldehyd

NADH + H

+

O H3C NH2

C

Semicarbazid

C

N N

H

H Acetaldehyd

O

+ H

N Ethanol

H

H

AlkoholDehydrogenase

NH2 + H 2O

H Semicarbazon

Abb. 5.29. Reaktionen bei der enzymatischen Bestimmung von Ethanol (oben) mit nachgeschalteter Abfangreaktion des Acetaldehyds mit Semicarbazid zu Semicarbazon (unten)

Durchführung Der Messansatz für die Ethanolbestimmung ist in Tabelle 5.4 angegeben. Zur Kontrolle wird ein Ansatz mit 0,20 ml H2Odem. statt Probe mitgeführt. Tabelle 5.4.

Zusammensetzung eines Messansatzes zur Ethanolbestimmung

Nacheinander in Reagenzglas pipettieren [ml]

Endkonzentration

Puffer

3,00

-

NAD-Lösung

0,10

0,73 mM

Probe

0,20

bis ca. 0,15 mM Ethanol

Diesen Ansatz im Reagenzglas mischen, in eine Küvette überführen und dann Extinktion E1ablesen. Anschließend ins Reagenzglas zurückgießen und Folgendes zusetzen: ADH-Lösung

0,02

36,0 U/ml

Dann 25 min im Wasserbad bei 37 °C stehenlassen. Nach der Inkubation in die Küvette zurückgießen und Extinktion E2 ablesen. E2 - E1 = ΔE geht in die Berechnung ein (Formel 7, Seite 391)

H

C

O

H

C

OH

HO

C

H

H

C

OH

H

C

OH

CH2OH

H Hex okinase

AT P ADP

C

O

O

H

C

OH

HO

C

H

H

C

OH

H

C

OH

O

H

C

O

P

H D-G lu cose Abb. 5.30.

lu G cose-6 -P hosp hatDehydrogenase

+

O

NADP H2O

NADP H+H

O

D-G lu cose-6 -P hosp hat Reaktionen bei der enzymatischen Bestimmung von Glucose

+

C

O

H

C

OH

HO

C

H

H

C

OH

H

C

OH

O

H

C

O

P

H

O

-P 6 hosp hoglu conat

O

5.5 Photometrische Methoden

399

Nachweis von Glucose Glucose wird in diesem gekoppelten Test zunächst mit der Hexokinase (EC 2.7.1.1) zu Glucose-6-Phosphat umgesetzt. In der nachgeschalteten Indikatorreaktion wird Glucose-6-Phosphat unter Reduktion von NADP+ durch die Glucose-6-PhosphatDehydrogenase (EC 1.1.1.4) zu 6-Phosphogluconat oxidiert ( Abb. 5.30).

benötigtes Material Geräte  Photometer zur Bestimmung der Absorption bei 340 nm  Mikroliterpipette für Volumina bis 1.000 μl mit passenden Spitzen  Glaspipetten  Glas- oder Plastikküvetten  Reagenzgläser  Eisbad  Wasserbad (37 °C)

Chemikalien  Triethanolamin-Puffer ( S. 428)  Ammoniumsulfat-Puffer (3,4 M)  ATP/NADP-Lösung: 150 mM ATP, 12 mM NADP in Triethanolamin-Puffer ( S. 428) lösen  Glucose-6-phosphat-DehydrogenaseLösung: 150 U/ml (in Ammoniumsulfat-Puffer lösen  Hexokinase-Lösung: 150 U/ml in Ammoniumsulfat-Puffer lösen

Das Gleichgewicht der Glucose-6-PhosphatOxidation liegt weit auf der rechten Seite. Das Gleichgewicht der vorgeschalteten Nachweisreaktion ist bedeutungslos, da Glucose-6-Phosphat sofort weiterreagiert. Die Bildung von NADPH ist somit der Glucosemenge proportional. Spezifität der Methode: Hexokinase katalysiert die Übertragung der γ-Phosphorylgruppe von ATP auf D-Glucose, D-Fructose und D-Mannose. Spezifisch für Glucose wird der Test durch die Glucose-6-PhosphatDehydrogenase, die ausschließlich Glucose6-Phosphat umsetzt.

Durchführung Der Messansatz für die Glucosebestimmung ist in Tabelle 5.5 angegeben. Zur Kontrolle wird ein Ansatz mit 0,20 ml H2Odem. statt Probe mitgeführt. Tabelle 5.5.

Zusammensetzung eines Messansatzes zur Glucosebestimmung

Nacheinander in Küvette pipettieren [ml] Glycerin-NachweisReagenzienmix

2,50

ATP/NADP-Lösung

0,20

Probe

0,20

Endkonzentration 10,0 mM ATP 0,8 mM NADP bis ca. 0,15 mM Glucose

Extinktion E1 ablesen. anschließend Folgendes zusetzen: Hexokinase-Lösung

0,02

1,0 U/ml

Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase-Lösung

0,02

1,0 U/ml

Dann 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend Extinktion E2 ablesen. E2 - E1 = ΔE geht in die Berechnung ein (Formel 7, Seite 391)

400

5 Methoden

Nachweis von Glycerin Glycerin wird durch ATP und GlycerinKinase (ATP:Glycerin-Phosphotransferase; EC 2.7.1.30) in Glycerin-3-Phosphat und ADP überführt. ADP lässt mit PyruvatKinase (ATP:Pyruvat-Phosphotransferase; EC 2.7.1.40) aus zugesetztem Phosphoenolpyruvat (PEP) Pyruvat entstehen, welches mit Lactat-Dehydrogenase (LDH, L-Lactat:NAD-Oxidoreductase, EC 1.1.1.27) und NADH zu Lactat reduziert wird ( Abb. 5.31). Die Phosphorylierung von Glycerin mit ATP ist ein exergoner, zu Ende laufender Prozess. Für die von der Pyruvat-Kinase katalysierte Reaktion liegt das Gleichgewicht mit K = 2 × 103 bei 30 °C zwar auf der Seite von ATP, für die LDH-katalysierte Nachweisreaktion mit K = 1 × 104 l/mol (pH 7,6) jedoch weit auf der Produktseite.

benötigtes Material Geräte  Photometer zur Bestimmung der Absorption bei 340 nm  Mikroliterpipette für Volumina bis 1.000 μl mit passenden Spitzen  Glaspipetten  Glas- oder Plastikküvetten  Reagenzgläser  Eisbad  Wasserbad (37 °C)

Chemikalien  Glycerin-Nachweis-Reagenzienmix ( S. 415)  GK-Lösung ( S. 415)

Spezifität der Methode: Glycerin-Kinase setzt außer Glycerin auch Dihydroxyaceton und L-(-)-Glycerinaldehyd zu Dihydroxyacetonphosphat bzw. Glycerinaldehyd-phosphat um; die anderen Enzyme sind sehr spezifisch. Durchführung Der Messansatz zur Glycerinbestimmung ist in Tabelle 5.6 angegeben. Tabelle 5.6.

Zusammensetzung eines Messansatzes zur Glycerinbestimmung

Nacheinander in Küvette pipettieren [ml] Reagenzienmix

0,90

Probe

0,10

Endkonzentrationen 8,5 mM Mg2+ 1,0 mM PEP 0,4 mM NADH 2,0 mM ATP 2,9 U/ml PK 3,5 U/ml LDH bis ca. 0,15 mM Glycerin

Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur Extinktion E1 ablesen, anschließend Folgendes zusetzen: GK-Lösung

0,02

0,4 U/ml

Dann 20 min bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend Extinktion E2 ablesen. E2 - E1 = ΔE geht in die Berechnung ein (Formel 7, Seite 391)

5.5 Photometrische Methoden

401

H

H H

C

OH

H

C

OH

H

C

OH ATP

H

P C

PyruvatKinase

O C

O PhosphoenolPyruvat Abb. 5.31.

OH

C

OH O

H

C

O

H

P

O

O

Glycerin-3-Phosphat

O H3C

O

C

C

LactatDehydrogenase

OH H3C

C

O C

O ADP

O +

Pyruvat

ATP

NADH + H

+

NAD

Lactat

Reaktionen bei der enzymatischen Bestimmung von Glycerin

O H3C

C

O

COO

Lactat-Dehydrogenase

C

H O

Pyruvat

C

OH

CH3

+

NADH + H Abb. 5.32.

C

O

O H2C

H H

ADP

Glycerin

O O

GlycerinKinase

+

NAD

Lactat (D-Isom er)

COO HO

C

H

CH3 Lactat (L-Isom er)

Reaktion bei der enzymatischen Bestimmung von D- bzw. L-Milchsäure (Lactat)

Nachweis von Milchsäure benötigtes Material Geräte  Photometer zur Bestimmung der Absorption bei 340 nm  Mikroliterpipette für Volumina bis 1.000 μl mit passenden Spitzen  Glaspipetten  Glas- oder Plastikküvetten  Reagenzgläser  Eisbad

Chemikalien  Glycylglycin-Puffer (300 mM Glycin; 400 mM Hydrazin; pH 9,0)  NAD-Lösung (40 mM), auf Eis  L-(+)-LDH (aus Kaninchenmuskel, Fa Sigma, Produkt-Nr. L2500): 5 mg/ml in 3 M Ammoniumsulfat, auf Eis  D-(-)-LDH (aus Leuconostoc mesenteroides, Fa Sigma, Produkt-Nr. L2395) 5 mg/ml in 3 M Ammoniumsulfat, auf Eis

In biologischen Proben, z. B. Sauerkraut aus den Versuchen 11 (S. 74) oder 36 (S. 183), kann sowohl D-Lactat (bzw. (S)-Lactat) als auch das Enantiomer L-Lactat (bzw. (R)-Lactat) vorhanden sein ( Abb. 5.32). Eine bestimmte Lactat-Dehydrogenase (LDH) ist stets nur für eines der beiden Enantiomere spezifisch. Um beide Isomere erfassen zu können, setzen wir im Test eine D-LDH (EC 1.1.1.28) und eine L-LDH (EC 1.1.1.27) ein; das sukzessive Zusetzen erlaubt darüber hinaus ein Berechnen des Enantiomeren-Verhältnisses. Die enzymatische Reaktion ist relativ einfach. Obwohl das Gleichgewicht der Reaktion unter physiologischen Bedingungen auf Seiten des Lactats liegt ( Abb. 5.31), erreicht man durch Abfangen des Reaktionsprodukts Pyruvat durch Hydrazin, das Einstellen eines alkalischem pH-Werts (9,0) und durch eine relativ hohe Konzentration von NAD, dass die Reaktion quantitativ in die gewünschte Richtung läuft.

402

5 Methoden

Durchführung Tabelle 5.7 enthält die Zusammensetzung des Messansatzes zur Bestimmung von Lactat. Tabelle 5.7.

Zusammensetzung eines Messansatzes zur Lactatbestimmung

Nacheinander in Küvette pipettieren [ml]

Endkonzentrationen

Glycin-Puffer

3,00

450,0 mM Glycin 360,0 mM Hydrazin

NAD-Lösung

0,20

2,4 mM

Probe

0,10

bis ca. 0,02 mM Lactat

Extinktion E1 ablesen. Anschließend Folgendes zusetzen: L-LDH

0,01

15,0 μg/ml

Bei 30 °C Extinktionsänderung bis zur Konstanz verfolgen (ca. 1 Stunde). Extinktion E2 ablesen. D-LDH

0,01

15,0 μg/ml

Bei 30 °C Extinktionsänderung bis zur Konstanz verfolgen (ca. 1 Stunde). Extinktion E3 ablesen. E2 - E1 = ΔE [L-Lactat] dient der Berechnung der L-Lactat-Konzentration, während E3 - E2 = ΔE [D-Lactat] zur Bestimmung der D-Lactat-Konzentration dient (Formel 7, Seite 391)

Bestimmung des Uronsäuregehaltes von Alginat Durchführung Von der Alginat-haltigen Probe werden 0,2 ml mit 1,2 ml H2SO4-Tetraborat-Lösung versetzt; die Mischung wird 10 min im Eisbad gekühlt. Der Ansatz wird 5 min im kochenden Wasserbad inkubiert und danach für weitere 5 min zur Abkühlung im Eisbad. Nach Zugabe von 20 μl m-Hydroxybiphenyl-Lösung wird 45 sec intensiv durchmischt. Nach einer Wartezeit von 10 min wird bei 520 nm die Extinktion gegen Wasser (Leerwert) bestimmt. Anhand einer Eichkurve (10 bis 200 μg/ml Alginat) wird die Alginatkonzentration in der Probe bestimmt. Bei Proben aus Kulturüberständen wird ein Ansatz mit 20 μl einer 0,5 % (wt/vol) Natronlauge anstelle der m-Hydroxybiphenyl-Lösung mitgeführt, um unspezifische Reaktionen mit Komponenten des Mediums zu erfassen.

benötigtes Material Geräte       

Wasserbad (95 °C) Photometer Küvette (Glas oder Plastik, 1 cm) 1,5 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäße Reagenzglasschüttler Glaspipetten (1 ml, 2 ml) Mikroliterpipette (20 μl)

Chemikalien  H2SO4-Tetraborat-Lösung: 12,5 mM Dinatriumtetraborat in konz. H2SO4  m-Hydroxybiphenyl-Lösung: 0,15 % (wt/vol) in 0,5 % (wt/vol) NaOH

5.6 Quantifizierung von Zellen und Medienbestandteilen

5.6

403

Quantifizierung von Zellen und Medienbestandteilen

Die beiden folgenden Methoden zur Bestimmung der Zelltrockenmasse und des Ammoniumgehalts in Kultuüberständen sind wegen ihrer technischen Robustheit ausgesprochen Praktikums-tauglich.

Bestimmung der Trockenmasse einer Zellsuspension Durchführung Die benötigte Anzahl von Membranfiltern wird in einer Glaspetrischale mehrere StunGeräte den (z. B. über Nacht) bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Ein derart vorbehandelter  Membranfilter (Porengröße 0,45 μm) Membranfilter wird mit einer Pinzette der  10 ml Glaspipette Glaspetrischale entnommen; und mit einer  Trockenschrank (105 °C)  Glaspetrischale Feinwaage wird die Masse des Filters  Pinzette bestimmt (Tara-Masse). Das Membranfilter  Feinwaage wird mit der Pinzette auf die Fritte der  Mehrfach-Filtrationsgerät Absaufvorrichtung gelegt und mit dem ( Abb. 5.33) mit Absaugpumpe Zylinderaufsatz festgeklemmt. Die Absaugpumpe wird angestellt, der Absaughahn langsam geöffnet, und die angegebene Menge Probeflüssigkeit wird in den Zylinderaufsatz pipettiert ( Abb. 5.33). Nach einigen Minuten sieht man die Zellmasse als festen Filterkuchen auf der Filtermembran liegen und kann den Absaughahn schließen. Das Membranfilter wird mit der Pinzette abgenommen und in eine Glaspetrischale gelegt (beschriften). Die in den Glaspetrischalen gesammelten Filter werden über Nacht bei 105 °C im Trockenschrank getrocknet und danach erneut gewogen (Brutto-Masse). Die Differenz der Massen (BruttoMasse minus Tara-Masse) entspricht der Trockenmasse der Zellen im abgesaugten Probevolumen. benötigtes Material

Abb. 5.33.

Vorrichtung zur Filtration von Zellsuspensionen

Methode 25

404

5 Methoden

Methode 26 Bestimmung des Ammoniumgehalts Zur Bestimmung des Gehaltes an Ammonium (NH4+) wird eine Gas-sensitive NH3-Elektrode verwendet. Bei dieser Art der Messung verursacht das durch starke Alkalisierung der Probe mit Natronlauge entstehende Ammoniak eine messbare Spannungsänderung. Die Elektrode wird nach Herstellerangaben äquilibriert und geeicht.

5.7

benötigtes Material Geräte  Gas-sensitive NH3-Elektrode (z. B. Typ 15230300 der Fa. Mettler Toledo GmbH, Greifensee, Schweiz)

Chemikalien  10 N Natronlauge (4 %, wt/vol, NaOH)

Chromatographische und elektrophoretische Methoden

Die in diesem Abschnitt behandelten Verfahren fassen technisch recht anspruchsvolle chromatographische bzw. elektrophoretische Methoden zum Nachweis von Polyhydroxyalkanoaten, Polyethylenglykol und Alginaten bzw. Proteinen und Cyanophycin zusammen.

Methode 27 Bestimmung des Polyhydroxyalkanoat-Gehalts Das hier beschriebene Analyseverfahren ist auf die im Institut der Autoren befindliche Gerätekonfiguration (Gaschromatograph mit Autosampler) abgestimmt; es lässt sich jedoch auch auf andere Gerätetypen übertragen. In Schraubdeckelröhrchen mit Teflondichtung werden jeweils 3 bis 5 mg lyophilisierte Zellen eingewogen und mit 1 ml wasserfreiem Chloroform sowie 1 ml Methanol/ Schwefelsäure versetzt; diese Mischung wird in den fest verschlossenen Röhrchen für 5 Stunden bei 100 °C in einem Ölheizbad inkubiert. Dadurch wird das Polymer in die entsprechenden Hydroxyfettsäuremethylester überführt. Nach Abkühlen der Proben auf Raumtemperatur werden die Ansätze mit jeweils 0,5 ml H2Odem. versetzt. Es folgt ein kräftiges Durchmischen der Proben für ca. 0,5 min mit Hilfe eines Reagenzglasschüttlers. Nach Phasentrennung wird die untere Chloroformphase zur gaschromatographischen Bestimmung des Anteils an Hydroxyfettsäuren eingesetzt. Bei einem Split-Verhältnis von 1:40 werden 3 μl der Chloroformphase mit Hilfe einer automatisierten Probenauftragung in den Injektor (Injektionstemperatur: 230 °C) des

benötigtes Material Geräte  Gaschromatograph zur Identifizierung und Quantifizierung von Hydroxyfettsäuremethylester (z. B. Gaschromatograph: Typ 820 mit Autosamplers AS 8300 und Flammenionisationsdetektor FID 8420 von Perkin Elmer, Überlingen; Säule: Permaphase PEG Säule (60 m; 0,32 mm Innendurchmesser; 0,5 μm) der Fa. Restek GmbH, Bad Soden; Autosampler-Gefäße: Typ 08-CV mit PTFE-beschichteten Butylgummisepten Typ 8-AC4 der Fa. Chromacol LTD, United Kingdom)  Ölheizbad (100 °C)  Schraubdeckelröhrchen mit Teflondichtung

Chemikalien  Chloroform (wasserfrei)  Schwefelsäure (15 %, vol/vol) in getrocknetem Methanol

Sonstiges  Wasserstoff als Träger- und Brenngas für den Gaschromatographen  Methylester von Hydroxyfettsäuren zur Kalibrierung des Gaschromatographen

5.7 Chromatographische und elektrophoretische Methoden

405

Gaschromatographen injiziert. Die Trennung der Methylester erfolgt mit Hilfe eines Temperaturprogramms (5 min 120 °C, danach Erhöhung mit einer Rate von 3 °C/min auf 180 °C, darauf folgt eine weitere Erhitzung mit einer Rate von 10 °C/min auf eine Temperatur von 220 °C, die 31 min gehalten wird) an einer PEG Säule mit dem Trägergas Helium (Durchströmgeschwindigkeit: 32 ml/min). Die Detektion erfolgt mit Hilfe eines Flammenionisationsdetektors bei einer Temperatur von 275 °C. Zur Identifizierung und Quantifizierung der auftretenden Signale erfolgt eine Kalibrierung mit definierten Mengen bekannter Hydroxyfettsäuremethylester.

Trennung und Nachweis von Proteinen und Cyanophycin Die im Folgenden dargestellte elektrophoretische Methode ist eine Kombination von Disk- und Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) und findet zur Darstellung von Proteinen und zu deren Größenbestimmung breiteste Verwendung. Ein gebräuchliches Puffersystem für die diskontinuierliche SDS-PAGE wurde von Laemmli (1970) entwickelt. Einige praktische Aspekte sind hierbei zu beachten: Kaliumionen (z. B. aus PhosphatPuffern) sollten in den Proben nicht vorhanden sein, da Kalium-Dodecylsulfat schwer löslich ist; es sind daher entsprechende Na-Salze zu verwenden. Ferner ist bei der Verwendung einer Pufferumwälzung auf Schaumbildung zu achten (eine Pufferumwälzung ist bei dem hier verwendeten Mini-System nicht notwendig,  Abb. 5.34). Es ist eine geringere Spannung als in Abwesenheit von SDS anzulegen, da die durch SDS eingebrachten Ionen den Stromfluss stark erhöhen. Durchführung benötigtes Material Geräte  Netzgerät, Glasplatten, Halterung, Dichtung, Klammern (z. B. von Fa. BIOMETRA, Göttingen,  Abb. 5.34)  Mikroliterpipette (2 bis 20 μl)  Wasserbad (95 °C)  50 ml-Erlenmeyerkolben  25 ml-Erlenmeyerkolben  Glaspipetten (5 ml, 10 ml)  Färbeschale (aus Metall, Glas oder Kunststoff)  Magnetrührer und Rührkern

Chemikalien  Sämtliche Lösungen für Proteintrennung und Nachweis ( S. 424)  APS-Lösung (40 %, wt/vol, Ammoniumpersulfat)  TEMED (N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin)  Natriumsulfit  1-Butanol

Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgele bestehen aus einem Trenngel (11,5 %, wt/ vol, Acrylamid, pH 8,9) und einem Sammelgel (4 %, wt/vol, Acrylamid, pH 6,8), die in dieser Reihenfolge in vertikal ausgerichtete und mit Dichtung und Klammern fixierte Glasplatten-Paare gegossen werden. Zuerst wird die Trenngellösung in einem 50 ml-Erlenmeyerkolben zusammengestellt; sie besteht aus 10,5 ml Trenngelpuffer, 16,0 ml Acrylamidlösung und 15,2 ml H2Odem.. Diese Lösung wird mit ca. 20 mg Natriumsulfit versetzt und langsam mit Hilfe eines Magnetrührers bewegt, bis das Sulfit vollständig gelöst ist. Mit Hilfe des Sulfits wird der in der Lösung befindliche Sauerstoff beseitigt; dies muss geschehen, da O2 ein potenter Polymerisations-Inhibitor ist. Nach Zugabe von 20 μl TEMED und 40 μl 40 % (wt/vol) Ammoniumpersulfat (APS) wird noch genau eine Minute langsam weiter gerührt; dann werden zügig ca. 8,0 ml der Gellösung in das ausgerichtete und fixierte Glasplatten-Paar pipettiert (es sollten noch ca. 1,5 bis 2 cm bis zum oberen Rand für das Sammelgel frei bleiben) und mit 1-Butanol

Methode 28

406

5 Methoden

Abb. 5.34.

Aufbau einer Gelkammer zur elektrophoretischen Trennung von Proteinen

überschichtet. Die Zugabe von APS startet die Polymerisation; daher sollte die Gelkammer spätestens vor der APS-Zugabe komplett vorbereitet sein ( Abb. 5.34). Nach einer Stunde Polymerisationszeit werden 1-Butanol und überschüssiger Gelpuffer mit Hilfe einer Plastikspritze und Kanüle abgesaugt und der Bereich gründlich mit H2Odem. gespült. Danach wird auf das Trenngel das Sammelgel gegossen. Dazu werden in einem 25 mlErlenmeyerkolben nacheinander folgende Lösungen pipettiert: 1,6 ml Sammelgelpuffer, 1,0 ml Acrylamidlösung und 3,75 ml H2Odem.. Die Lösung wird mit ca. 5 mg Natriumsulfit versetzt und schwach gerührt. Nachdem das Sulfit vollständig gelöst ist, werden unter langsamem Rühren 4,5 μl TEMED und 2,2 μl 40 % (wt/vol) APS zugesetzt. Nach einer weiteren Minute Rühren wird mit dieser Lösung das Sammelgel auf das Trenngel gegossen. Danach wird zügig der Probenkamm eingeführt. Das Gel kann nach ca. 0,5 bis 1 Stunde verwendet werden. Das Glasplatten-Paar wird von Klammern und Dichtung befreit und in die Elektrophorese-Halterung eingepannt. Dabei sollte das unten befindliche Pufferreservoir (Anode) vorher mit Elektrodenpuffer gefüllt worden sein, um ein Luftblasen-freies Einbringen der Glasplatten zu erleichtern. Nach dem Fixieren der Glasplatten wird das obere Pufferreservoir (Kathode) mit Gelpuffer befüllt. Nun kann vorsichtig der Probenkamm aus dem Sammelgel gezogen werden. Die sichtbaren Probentaschen werden mit Hilfe einer Spritze mit aufgesteckter Kanüle gespült, um Gelreste zu entfernen. Die Vorbereitung (Denaturierung) der Proben (die in diesem Fall neben Proteinen auch das Polyamid Cyanophycin enthalten können, V35, S. 178) erfolgt durch Zugabe von einem Drittel Volumen Denaturierungspuffer und anschließender Inkubation bei 95 °C; im Falle der Cyanophycin-haltigen Proben sollte die Inkubationszeit 10 min betragen (sonst reichen 3 min). Das Denaturieren sollte in fest verschlossenen Gefäßen (Schraubdeckelröhrchen, 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße mit Schraubdeckel) erfolgen. Die pro Tasche aufzutragende Proteinmenge sollte bei der im Folgen-

5.7 Chromatographische und elektrophoretische Methoden

den vorgeschlagenen Färbemethode 25 μg betragen; bei gereinigtem Cyanophycin sollte die Menge 50 μg betragen. Das Auftragen der auf Raumtemperatur abgekühlten Proben in die Probetaschen geschieht zweckmäßigerweise mit einer Mikroliterspritze. Zur Bestimmung von Molekulargewichten von Proteinen bzw. Cyanophycin muss ein Gemisch von Proteinen in einer separaten Probentasche aufgetragen werden, deren Untereinheitengewicht bekannt ist. Ein Fertiggemisch bietet z. B. die Fa. SIGMA an; es besteht aus den Proteinen Phosphorylase b, (Gewicht der Untereinheiten 94.000 Da), Rinderserumalbumin (67.000 Da), Ovalbumin (43.000 Da), Carboanhydrase (30.000 Da), Trypsininhibitor (20.100 Da) und Lactalbumin (14.400 Da). Die Elektrophorese-Apparatur wird mit dem Netzgerät verbunden und die Elektrophorese sollte bei einer konstanten Stromstärke von 20 bis 30 mA so lange laufen, bis die Farbfront (Bromphenolblau) ca. 1 cm vor dem unteren Ende der Glasplatten angekommen ist (Dauer ca. 2 Stunden). Nach der Elektrophorese wird das Gel vorsichtig dem Glasplatten-Paar entnommen. Zur Kenntlichmachung der im Gel bandierten Proteine wird eine so genannte „Coomassie-Färbung“ durchgeführt (benannt nach dem ursprünglich hierfür eingesetzten Farbstoff). Dazu wird das Gel vorsichtig in eine Färbeschale überführt und für ca. 0,5 Stunden gefärbt (hierbei sollte die Färbeschale ab und zu – besser noch permanent – bewegt werden, ohne das Gel dabei zu beschädigen). Zur Differenzierung wird das Gel so lange in Entfärbelösung geschwenkt, bis die Protein- bzw. Cyanophycinbanden deutlich dunkelblau vor dem vollständig entfärbten Hintergrund erscheinen. Das Gel kann in 7,5 % (vol/vol) Essigsäure in einem verschlossenen Gefäß (oder eingeschweißt in Folie) aufbewahrt werden. Weiterführende Literatur Laemmli (1970) Cleavage of structural proteins during the asembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685

407

408

5 Methoden

Methode 29 Gelpermeationschromatographie (GPC) Durchführung

O

CH2 CH2 n

Polyethylenglykol

Wie bei allen chromatographischen Methoden erfolgt bei der GPC die Trennung dadurch, dass die durch die Trennsäule wandernden Substanzen unterschiedlich verzögert werden. Voraussetzung hierfür ist die unterschiedliche Verteilung zwischen flüssiger Phase und fester Phase. Im Fall der GPC besteht die feste Phase aus porösem Material. Substanzen können je nach ihrem hydrodynamischem Durchmesser, der innerhalb einer Stoffklasse mit dem Molekulargewicht korreliert, unterschiedlich tief in die Poren eindringen. So werden kleine Moleküle bei der Wanderung durch die Säule stärker verzögert als große.

benötigtes Material Geräte  Apparatur zur Gelpermeationschromatographie (z. B. von Fa. Waters GmbH, Hauptstrasse 87, 65760 Eschborn)  Trennsäule (z. B. Hema Bio 100, Fa. JASCO GmbH, Robert-Bosch-Straße 11, 64823 Groß-Umstadt)

Chemikalien Laufpuffer:  Zur Analyse von Polyethylenglykol und Abbauprodukten: 0,02 % (wt/vol) in filtriertem (0,2 μm Porengröße) H2Odem.  Zur Analyse von Alginat: 0,1 M Phosphat-Puffer, pH 6,9 ( S. 416)

Eine GPC-Analge besteht aus einer Pumpe, einer Säule, einem Detektor und einem Integrator; zusätzlich ist i. d. R. ein Säulenofen und ein Autosampler vorhanden. Mit der Pumpe wird ein pulsationsfreier, laminarer Flüssigkeitsstrom erzeugt. Im Gegensatz zur Hochauflösenden Flüssigchromatographie (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) werden aufgrund der andersartigen Säulenmatrix allerdings geringere Drücke aufgebaut. Bei der GPC-Analyse von Polyethylenglykol und dessen Abbauprodukten bzw. Alginaten wird bei einer Flussrate von 0,9 ml min-1 ein Druck von ca. 2 MPa erreicht. Höhere Flussraten mit Drücken über 5 MPa sind zu vermeiden, da dadurch das Säulenmaterial komprimiert wird und sich die Trennleistung verschlechtert. Das Säulenmaterial besteht aus einem hochgradig vernetzten Polystyrol ohne zusätzliche funktionelle Gruppen und erlaubt die Verwendung von wässrigen Elutionsmitteln. Das Trennvermögen liegt mit der vorgeschlagenen Säule zwischen 100 und 80.000 Da (bezogen auf Polyethylenglykol). Die Detektion erfolgt über die Änderung des Brechungsindex gegenüber dem Laufmittel. Im Gegensatz zu selektiven Detektoren wie UV- oder Fluoreszenzdetektoren können hier alle Substanzen erfasst werden, deren Brechungsindex sich hinreichend groß vom Laufmittel unterscheidet.

6

Chemikalien, Nachweisreagenzien und Medien

6.1 Herstellung von Medien, Puffern und Lösungen Die unten aufgeführte Liste der Medien, die im Mikrobiologischen Praktikum Verwendung finden ( 6.2), verzichtet zugunsten der Übersichtlichkeit auf das detaillierte Beschreiben der Zubereitungsweisen. Für Ungeübte und Anfänger auf dem Gebiet sei auf die Methoden 1 ( S. 355) und 2 ( S. 358) im Kapitel 5.1 verwiesen; dort sind allgemeingültige Ratschläge hierzu aufgeführt. O

OH CH2OH

O

O O

O

OH O

OH

n

D-Galactose Abb. 6.1.

3,6-Anhydro-L-galactose

Strukturformel von Agar-Agar

6.2 Medien- und Chemikalienliste Für die im Folgenden aufgeführten Medien, Nährlösungen etc. wurden die in den Texten zu den Versuchen verwendeten Bezeichnungen gewählt. In der rechten Spalte wird auf den Versuch verwiesen, in dem diese benötigt werden. Außerdem sind in der rechten Spalte spezielle Hinweise für die Herstellung (z. B. getrenntes Autoklavieren von Mineralsalz- und Agar-haltigen Lösungen,  Abb. 6.1.) und auf mögliche Zusätze gegeben. Bei Lösungen, die gebrauchsfertig im Handel erhältlich sind und üblicherweise nicht selbst im Labor hergestellt werden, ist eine Bezugsquelle angegeben.

A. Steinbüchel, F. B. Oppermann-Sanio, Mikrobiologisches Praktikum, DOI 10.1007/978-3-642-17703-3_6, © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2003, Nachdruck 2011

410

6 Chemikalien, Nachweisreagenzien und Medien

Acetat-Nachweis-Reagenzien TEA/Malat-Puffer Triethanolamin Malat MgCl2

Herstellung 300 mM 20 mM 6 mM pH 8,4

Alle Lösungen und Enzyme werden auf Eis gelagert.

NAD/CoA-Lösung NAD Coenzym A

15 mM 2,5 mM

ATP-Lösung ATP

80

mM

MDH Malat-Dehydrogenase (z. B. MDH aus Schweineherz, Fa. Sigma, Produkt-Nr. M7383; 1.500 U/ml in 3,2 M Ammoniumsulfat) CS Citrat-Sythase (z. B. CS aus Schweineherz, Fa. Sigma, Produkt-Nr. C3260; 600 U/ml in 2,2 M Ammoniumsulfat) AS Acetyl-CoA-Synthase (Ligase) (z. B. AS aus Bäckerhefe, Fa. Sigma, Produkt-Nr. A1765; 750 U/ml in 3,2 M Ammoniumsulfat)

AT-Festmedium Salzkomponente

Herstellung

7,5 K2HPO4 NaNH4HPO4 × 4 H2O 2,63 Citronensäure-Monohydrat 1,5 75 SL 6 ( S. 425) H2Odem. ad 300 pH 7,4

g g g μl ml

Salz- und Agar-Agar-Komponenten sowie Magnesium-Lösung autoklavieren, die Glucose-Lösung sterilfiltrieren und anschließend (nach dem Abkühlen auf ca. 50 °C) vereinigen. Glucose-Lösung Glucose H2Odem.

Agar-Agar-Komponente Agar-Agar H2Odem.

11,25 ad 350

g ml

0,15 ad 37,5

g ml

g ml

75

mg/l

Zusätze Ampicillin ( S. 429)

Magnesium-Lösung MgSO4 × 7 H2O H2Odem.

15 ad 75

Verwendung V49 - S. 251

AP-Medium Glucose MOPSa) (Na-Salz) Hefeextrakt Na2HPO4 (NH4)2SO4 MgSO4 × 7 H2O H2Odem.

15 11,6 6 1 0,6 0,3 ad 1.000 pH 7,2

g g g g g g ml

a)

3-Morpholinopropansulfonsäure

Verwendung V31 - S. 157

6.2 Medien- und Chemikalienliste

411

Autotrophen-Medium Salzkomponente Na2HPO4 × 12 H2O NH4Cl KH2PO4 SL 7 ( S. 425) MgSO4 × 7 H2O H2Odem.

Herstellung 9 2 1,5 1 0,2 ad 980

g g g ml g ml

0,5 ad 10

g ml

11 2 0,4 ad 1.000 pH 5,0

g g g ml

0,75 1 0,5 0,5 0,05 1 ad 1.000 pH 7,2

g g g g g ml ml

0,75 1 0,5 0,5 0,05 1 20 ad 1.000 pH 7,2

g g g g g ml g ml

Carbonat-Lösung NaHCO3 H2Odem.

Basalmedium K2HPO4 NaCl MgSO4 × 7 H2O H2Odem.

Verwendung V17 - S. 95

V22 - S. 119

V13 - S. 81

Verwendung

Bmeg-Festmedium Glucose NH4Cl K2HPO4 MgSO4 × 7 H2O CaCl2 × 2 H2O SL 10 ( S. 426) Agar-Agar H2Odem.

CaCl2 × 2 H2O Fe(NH4)-Citrat H2Odem.

Verwendung

Benzoat-Festmedium Benzoat KH2PO4 MgSO4 × 7 H2O NaCl CaCl2 × 2 H2O SL 10 ( S. 426) Agar-Agar H2Odem.

Eisen-Calcium-Lösung

Verwendung

Benzoat-Nährlösung Benzoat KH2PO4 MgSO4 × 7 H2O NaCl CaCl2 × 2 H2O SL 10 ( S. 426) H2Odem.

Alle drei Komponenten getrennt autoklavieren und anschließend vereinigen.

V13 - S. 81

Verwendung 10 1 1 0,5 0,05 1 15 ad 1.000 pH 7,2

g g g g g ml g ml

V7 - S. 59

0,01 g 0,005 g ad 10 ml

412

6 Chemikalien, Nachweisreagenzien und Medien

Bsub-Minimal-Festmedium Agar-Agar-Komponente Agar-Agar H2Odem.

Herstellung 15 ad 500

g ml

5 ad 300

g ml

14 6 ad 100 pH 7,2

g g ml

Glucose-Lösung Glucose H2Odem. Phosphat-Komponente K2HPO4 KH2PO4 H2Odem.

Alle vier Komponenten getrennt autoklavieren und anschließend (nach Abkühlen auf ca. 50 °C) vereinigen. Ammonium-Komponente (NH4)2SO4 MgSO4 × 7 H2O Na3-Citrat × 2 H2O H2Odem.

2 0,2 0,1 ad 100

g g g ml

Verwendung V52 - S. 269

Bsub-Trp-Festmedium

Herstellung

Agar-Agar-Komponente

Alle vier Komponenten ( Bsub-MinimalFestmedium) getrennt autoklavieren und anschließend (nach Abkühlen auf ca. 50 °C) vereinigen. Die Tryptophan Lösung sterilfiltrieren und ebenfalls zugeben.

 Bsub-Minimal-Festmedium Glucose-Lösung

 Bsub-Minimal-Festmedium

Verwendung

Phosphat-Komponente

V52 - S. 269

 Bsub-Minimal-Festmedium Ammonium-Komponente

 Bsub-Minimal-Festmedium Tryptophan-Lösung L-Tryptophan 25 Phosphat-Komponente (s. o.) 1 H2Odem. ad 10

mg ml ml

Citrat-Puffer (0,1 M) Citronensäure NaOH H2Odem.

Herstellung 21 8,8 ad 1.000 pH 5,5

g g ml

150 5 1 0,5 0,05 1 ad 1.000 pH 7,2

Verwendung V50 - S. 257 (M20 - S. 388)

Clostridium pasteurianumAnreicherungslösung Saccharose CaCO3 KH2PO4 MgSO4 × 7 H2O CaCl2 × 2 H2O SL 10 ( S. 426) H2Odem.

Der pH-Wert wird mit 2 N NaOH eingestellt.

Verwendung g g g g g ml ml

V14 - S. 85

6.2 Medien- und Chemikalienliste

413

Clostridium pasteurianum-Festmedium Glucose Hefeextrakt Na-Ascorbat KH2PO4 MgSO4 × 7 H2O NaCl CaCl2 × 2 H2O SL 10 ( S. 426) Agar-Agar H2Odem.

20 3 1 1 0,5 0,5 0,05 1 20 ad 1.000 pH 6,8

g g g g g g g ml g ml

Cross & Beaver Reagenz ZnCl2 HCl (12,1 M)

g ml

10 5 5 2 1 ad 1.000 pH 7,4

g g g g g ml

g ml g g g g g g ml ml

5 4 2 ad 1.000 pH 6,0

g g g ml

V20 - S. 108

Verwendung

DHA-Produktionsmedium Glycerin Hefeextrakt CaCl2 × 2 H2O (NH4)2SO4 H2Odem.

V16 - S. 91

Verwendung

4 1 0,5 1,5 1,5 0,1 1 0,1 1 ad 1.000 pH 7,5

DHA-Kontrollmedium Hefeextrakt CaCl2 × 2 H2O (NH4)2SO4 H2Odem.

V30 - S. 153 Verwendung

Desulfurikanten-Nährlösung Na-Lactat Ethanol Hefeextrakt MgSO4 × 7 H2O Na2SO4 (NH4)2Fe(SO4)2 × 6 H2O NH4Cl CaCl2 × 2 H2O SL 10 ( S. 426) H2Odem.

V14 - S. 85

Verwendung 100 200

Denitrifizierer-Nährlösung KNO3 NaCl Pepton Hefeextrakt Fleischextrakt H2Odem.

Verwendung

50 5 4 2 ad 1.000 pH 6,0

V24 - S. 127

Verwendung g g g g ml

V24 - S. 127

414

6 Chemikalien, Nachweisreagenzien und Medien

Drosophila-Festmedium Soja-Pepton Saccharose Hefeextrakt Agar-Agar H2Odem.

56 48 24 12 ad 600

Herstellung g g g g ml

Kurz bevor die Drosophila-Maden auf das Medium gesetzt werden, wird die Hefe-Paste auf die Oberfläche des Mediums gestrichen. Verwendung V27 - S. 140

Hefe-Paste Frische Bäckerhefe mit wenig Wasser

Seesalz-Festmedium Seesalz Pepton Glycerin CaCO3 Hefeextrakt Agar-Agar H2Odem.

Verwendung 30 5 5 1 0,5 15 ad 1.000

g g g g g g ml

FPMn-Festmedium Pepton Fleischextrakt MnCl2 × 4 H2O SL 10 ( S. 426) Agar-Agar H2Odem.

Verwendung 5 3 10 1 15 ad 1.000

g g mg ml g ml

Fructose-Carbonat-Festmedium Fructose CaCO3 Hefeextrakt Trypton Agar-Agar H2Odem.

5 10 10 5 15 ad 1.000 pH 6,8

g g g g g ml

100 10 20 ad 1.000 pH 6,8

g g g ml

V11 - S. 74

Verwendung

GHC-Festmedium Glucose Hefeextrakt CaCO3 Agar-Agar H2Odem.

V7 - S. 59

Verwendung

GHC-Nährlösung Glucose Hefeextrakt CaCO3 H2Odem.

V4 - S. 46

V30 - S. 153

Verwendung 100 10 20 15 ad 1.000 pH 6,8

g g g g ml

V30 - S. 153

6.2 Medien- und Chemikalienliste

415

Gluconobacter-Festmedium Sorbit Hefeextrakt (NH4)2SO4 Agar-Agar H2Odem.

Verwendung

15 5 2 15 ad 1.000 pH 7,0

g g g g ml

Glucose-Carbonat-Festmedium Glucose CaCO3 Hefeextrakt Trypton Agar-Agar H2Odem.

5 10 10 5 15 ad 1.000 pH 6,8

Verwendung g g g g g ml

Glycerin-Nachweis-Reagenzienmix Triethanolamin-Puffer MgCl2-Lösung PEP-Lösung NADH-Lösung ATP-Lösung PK-Lösung LDH-Lösung Summe

V24 - S. 127

36,81 ml 0,45 ml 0,90 ml 0,90 ml 0,90 ml 0,45 ml 0,09 ml 40,50 ml

V10 - S. 70, V29 - S. 150

Herstellung Der pH-Wert des Triethanolamin-Puffers wird mit 4 N NaOH eingestellt. Die angebenen Lösungen sind bei 4 °C mindestens eine Woche haltbar. Erst kurz vor dem Gebrauch werden die Lösungen zum „Reagenzienmix“ vereinigt; dieser wird im Eisbad aufbewahrt.

ATP-Lösung

Ammoniumsulfat-Puffer Ammoniumsulfat

3,4

M

ATP

100

mM

Pyruvat-Kinase 300 in Ammoniumsulfat-Puffer lösen

U/ml

PK-Lösung

Triethanolamin-Puffer Triethanolamin

100 mM pH 7,6

PEP-Lösung

MgCl2-Lösung 850

MgCl2

mM

NADH-Lösung

Phosphoenolpyruvat

50

mM

Lactat-Dehydrogenase 1800 in Ammoniumsulfat-Puffer lösen

U/ml

LDH-Lösung

NaHCO3 NADH

1 20

% mM

21

U/ml

GK-Lösung Glycerokinase in Triethanolamin-Puffer lösen

GYT-Festmedium Glucose Hefeextrakt Pepton L-Tryptophan Agar-Agar H2Odem.

Verwendung 5 5 5 1 15 ad 1.000

g g g g g ml

V6 - S. 55

416

6 Chemikalien, Nachweisreagenzien und Medien

HG-Nährlösung Pepton Glucose NaCl Na-Acetat Hefeextrakt Lösliche Stärke L-Cystein H2Odem.

Verwendung 10 5 5 3 3 1 0,5 ad 1.000

g g g g g g g ml

10 5 5 3 3 1 0,5 15 ad 1.000

g g g g g g g g ml

30 10 15 ad 1.000 pH 6,0

g g g ml

HG-Festmedium Pepton Glucose NaCl Na-Acetat Hefeextrakt Lösliche Stärke L-Cystein Agar-Agar H2Odem.

Verwendung

Hefe-Festmedium Saccharose Hefeextrakt Agar-Agar H2Odem.

V1 - S. 30

Verwendung 5 3 1 ad 1.000 pH 7,2

g g g ml

20 10 1,8 1,5 15 ad 1.000 pH 7,2

g g g g g ml

68 ad 500

g ml

87 ad 500

g ml

Kings Festmedium Proteose-Pepton Glycerin K3PO4 × 3 H2O MgSO4 × 7 H2O Agar-Agar H2Odem.

V8 - S. 62

Verwendung

PHG-Festmedium Pepton Hefeextrakt Glucose H2Odem.

V8 - S. 62

V3 - S. 43

Verwendung V9 - S. 66

KP-Puffer (1 M) Basische Komponente K2HPO4 H2Odem.

Herstellung

Saure Komponente KH2PO4 H2Odem.

Beide Komponenten getrennt herstellen und durch Mischen den gewünschten pH-Wert einstellen. Bei Bedarf den Puffer (eventuell nach Zusatz von weiteren Salzen) auf die benötigte Endkonzentration mit H2Odem. verdünnen.

6.2 Medien- und Chemikalienliste

417

Lactat-Festmedium Na-Lactat Hefeextrakt Trypton K2HPO4 Na-Ascorbat Agar-Agar H2Odem.

Verwendung 10 10 10 5 0,2 15 ad 1.000 pH 6,8

g g g g g g ml

15 5 1 ad 1.000 pH 6,8

g g mg ml

Lactat-Nährlösung Na-Lactat Hefeextrakt Vitamin B12 H2Odem.

Verwendung

LB-Nährlösung Trypton Hefeextrakt NaCl H2Odem.

10 5 10 ad 1.000 pH 7,5

g g g ml

10 5 10 15 ad 1.000 pH 7,5

g g g g ml

10 5 10 15 ad 1.000 pH 7,5

g g g g ml

Ampicillin ( S. 429)

75

mg/l

Verwendung V25 - S. 131, V53 - S. 273

Zusätze

10 5 10 15 ad 1.000 pH 7,5

g g g g ml

10 5 10 15 ad 1.000 pH 7,5

g g g g ml

LB-Km-Festmedium Trypton Hefeextrakt NaCl Agar-Agar H2Odem.

V47 - S. 240, V53 - S. 273, V54 - S. 277, V55 - S. 282

Zusätze

LB-IPTG-Amp-Festmedium Trypton Hefeextrakt NaCl Agar-Agar H2Odem.

V25 - S. 131, V47 - S. 240, V53 - S. 273

Verwendung

LB-Amp-Festmedium Trypton Hefeextrakt NaCl Agar-Agar H2Odem.

V12 - S. 77

Verwendung

LB-Festmedium Trypton Hefeextrakt NaCl Agar-Agar H2Odem.

V12 - S. 77

IPTG ( S. 429) Ampicillin ( S. 429)

0,1 mM 75 mg/l

Verwendung V53 - S. 273 Zusätze Kanamycin ( S. 429) Verwendung V55 - S. 282

160

mg/l

418

6 Chemikalien, Nachweisreagenzien und Medien

LB-Weichagar Trypton Hefeextrakt NaCl Agar-Agar H2Odem.

Herstellung 10 5 10 5 ad 1.000 pH 7,5

g g g g ml

Nach dem Autoklavieren wird der Weichagar im Wasserbad bei ca. 45 °C flüssig gehalten.

14 6 2 1 0,2 0,3 0,1 ad 1.000 pH 7,2

g g g ml g g g ml

Hauptkomponente und Glucose-Lösung getrennt autoklavieren; die TryptophanLösung sterilfiltrieren; alle Komponenten danach vereinigen.

Verwendung V47 - S. 240

M I-Medium Hauptkomponente K2HPO4 KH2PO4 (NH4)2SO4 SL 8 ( S. 426) MgSO4 × 7 H2O Hefeextrakt Na3-Citrat × 2 H2O H2Odem.

Herstellung

L-Tryptophan 25 1 KP-Puffer ( S. 416, pH 7,2) ad 10 H2Odem.

mg ml ml

Verwendung

Glucose-Lösung Glucose H2Odem.

Tryptophan-Lösung

5 ad 25

g ml

V52 - S. 269

M II-Medium

Herstellung

Hauptkomponente (s. o.)

Hauptkomponente und Glucose-Lösung getrennt autoklavieren, danach vereinigen.

Glucose-Lösung (s. o.)

Verwendung V52 - S. 269

Malzextrakt-Festmedium Malzextrakt 40 Sojapepton aus Sojamehl 3 Agar-Agar 20 ad 1.000 H2Odem. pH 5,5

Verwendung g g g ml

Malz-Medium Malzextrakt H2Odem.

Verwendung 30 ad 1.000 pH 5,5

g ml

Malz-Festmedium Malzextrakt Agar-Agar H2Odem.

V21 - S. 114

Verwendung 30 20 ad 1.000 pH 5,5

g g ml

Malz-Saccharose-Medium Malzextrakt Saccharose H2Odem.

V39 - S. 197

50 100 ad 1.000

V21 - S. 114, V42 - S. 212

Verwendung g g ml

V23 - S. 124

6.2 Medien- und Chemikalienliste

419

Mannit-Nährlösung Mannit KH2PO4 MgSO4 × 7 H2O NaCl CaCl2 × 2 H2O SL 10 ( S. 426) H2Odem.

Verwendung 10 1 0,5 0,5 0,05 1 ad 1.000 pH 7,2

g g g g g ml ml

10 1 0,5 0,5 0,05 1 20 ad 1.000 pH 7,2

g g g g g ml g ml

Mannit-Festmedium Mannit KH2PO4 MgSO4 × 7 H2O NaCl CaCl2 × 2 H2O SL 10 ( S. 426) Agar-Agar H2Odem.

V13 - S. 81

Verwendung

Medium E Na-L-Glutamat 25,6 18,7 Na3-Citrat × 2 H2O Glycerin 80 NH4Cl 7 K2HPO4 0,5 0,5 MgSO4 × 7 H2O Eisen-Calcium-Lösung (s. u.) 2,5 Mangan-Zink-Lösung (s. u.) 1 100 SL 6 ( S. 425) H2Odem. ad 1.000 pH 7,4

Eisen-Calcium-Lösung g g g g g g ml ml μl ml

FeCl3 × 6 H2O CaCl2 × 6 H2O H2Odem. MnSO4 × H2O ZnSO4 × 7 H2O H2Odem. Verwendung

Verwendung g g g g g g ml ml μl g ml

4 15 ad 250

g g ml

104 1 ad 1.000

g g ml

Mangan-Zink-Lösung

V34 - S. 174

Medium E-Festmedium Na-L-Glutamat 25,6 Na3-Citrat × 2 H2O 18,7 Glycerin 80 NH4Cl 7 0,5 K2HPO4 MgSO4 × 7 H2O 0,5 Eisen-Calcium-Lösung (s. o.) 2,5 Mangan-Zink-Lösung (s. o.) 1 100 SL 6 ( S. 425) Agar-Agar 15 H2Odem. ad 1.000 pH 7,4

V13 - S. 81

V34 - S. 174

420

6 Chemikalien, Nachweisreagenzien und Medien

Metabolisierungspuffer (M-Puffer) Pufferkomponente

Herstellung

200 KP-Puffer, pH 7,4 ( S. 416) KCl 4,1 MgCl2 × 6 H2O 2,65 H2Odem. ad 1.000

ml g g ml

Substrat- und Cofaktor-Konzentrationen Glucose-6-phosphat NADP+

8 6

mM mM

Zunächst 200 ml KP-Puffer (1 M, pH 7,4) vorlegen, Salze einwiegen und auf 1.000 ml mit H2Odem. auffüllen. Anschließend die Substrate bzw. Cofaktoren im benötigten Endvolumen dieser Pufferkomponente lösen. Verwendung V49 - S. 251

Middlebrook 7H9-Nährlösung Salzlösung NaCl Na2HPO4 KH2PO4 (NH4)2SO4 Na3-Citrat MgSO4 Eisen-Ammonium-Citrat ZnSO4 CuSO4 CaCl2 H2Odem.

Herstellung 8,5 g 2,5 g 1 g 0,5 g 0,1 g 0,05 g 0,04 g 0,001 g 0,001 g 0,0005 g ad 950 ml

Die Salzlösung kann nach dem Ansetzen autoklaviert werden. Die Supplement-Lösung wird vor der Zugabe in die abgekühlte Salzlösung durch Filtration sterilisiert. Verwendung V56 - S. 290

Supplement-Lösung Rinderserumalbumin Glucose L-Glutaminsäure Tween 80 Pyridoxin Biotin H2Odem.

5 g 2 g 0,5 g 0,5 g 0,001 g 0,0005 g ad 50 ml

Middlebrook 7H9-Festmedium Salzlösung NaCl Na2HPO4 KH2PO4 (NH4)2SO4 Na3-Citrat MgSO4 Eisen-Ammonium-Citrat ZnSO4 CuSO4 CaCl2 H2Odem.

Herstellung 8,5 g 2,5 g 1 g 0,5 g 0,1 g 0,05 g 0,04 g 0,001 g 0,001 g 0,0005 g ad 450 ml

Supplement-Lösung (wie oben) Agar-Agar-Komponente Agar-Agar H2Odem.

15 ad 500

g ml

Die Salzlösung und die Agar-Agar-Komponente können nach dem Ansetzen getrennt autoklaviert und nach Abkühlen auf ca. 50 °C vereinigt werden. Die Supplement-Lösung (s. o.) wird durch Filtration sterilisiert und ebenfalls zugegeben. Verwendung V56 - S. 290

6.2 Medien- und Chemikalienliste

421

Mineralsalzmedium Na2HPO4 × 12 H2O KH2PO4 NH4Cl MgSO4 × 7 H2O CaCl2 × 2 H2O Fe(III)NH4-Citrat SL 6 ( S. 425) H2Odem.

Kohlenstoffquellen 9 g 1,5 g 1 g 0,2 g 0,02 g 1,2 mg 100 μl ad 1.000 ml pH 6,9

Die Art und Konzentration der Kohlenstoffquelle wird im jeweiligen Versuch genau angegeben. Verwendung V32 - S. 161, V33 - S. 167, V41 - S. 207, V43 - S. 216, V45 - S. 228, V51 - S. 262

Mineralsalz-Festmedium Mineralsalzkomponente Na2HPO4 × 12 H2O KH2PO4 NH4Cl MgSO4 × 7 H2O CaCl2 × 2 H2O Fe(III)NH4-Citrat SL 6 ( S. 425) H2Odem.

Herstellung 9 g 1,5 g 0,5 g 0,2 g 0,02 g 1,2 mg 100 μl ad 500 ml pH 6,9

Agar-Agar-Komponente Agar-Agar H2Odem.

15 ad 500

g ml

Beide Komponenten getrennt autoklavieren und, nach Abkühlen auf ca. 50 °C, steril vereinigen, Kohlenstoffquelle zugeben (s. u.) und Platten gießen. Kohlenstoffquellen Die Art und Konzentration der Kohlenstoffquelle wird im jeweiligen Versuch genau angegeben. Die Kohlenstoffquelle wird separat sterilisiert. Verwendung V32 - S. 161, V33 - S. 167, V44 - S. 220, V50 - S. 257, V54 - S. 277, V55 - S. 282

Mycobacterium-Mineralfestmedium Mineralsalzkomponente

Herstellung

siehe Mineralsalz-Festmedium ( S. 421) Agar-Agar-Komponente Agar-Agar Tween 80 H2Odem.

15 0,5 ad 400

g g ml

10 ad 100

g ml

Glucose-Lösung Glucose H2Odem.

Wie Mineralsalz-Festmedium ( S. 421), aber mit geänderter Agar-Agar-Komponente. Die Glucose-Lösung wird sterilfiltriert. Zusätze Kanamycin ( S. 429) Streptomycin ( S. 429)

30 30

mg/l mg/l

30 30

mg/l mg/l

Verwendung V56 - S. 290

Mycobacterium-Selektionsnährlösung Trypton Hefeextrakt NaCl Tween 80 H2Odem.

10 5 10 0,5 ad 1.000 pH 7,5

g g g g ml

Zusätze Kanamycin ( S. 429) Streptomycin ( S. 429) Verwendung V56 - S. 290

422

6 Chemikalien, Nachweisreagenzien und Medien

Mycobacterium-Selektionsfestmedium Trypton Hefeextrakt NaCl Agar-Agar Tween 80 H2Odem.

10 5 10 15 0,5 ad 1.000 pH 7,5

g g g g g ml

Myxobakterien-Festmedium Bäckerhefe (frisch) 5 1 CaCl2 × 2 H2O Cyanocobalamin (Vitamin B12) 0,5 Agar-Agar 15 Leitungswasser ad 1.000 pH 7,2

5 3 ad 1.000

g g ml

5 5 3 ad 1.000

g g g ml

5 3 15 ad 1.000

g g g ml

5 3 10 ad 1.000

V56 - S. 290

V5 - S. 51

V13 - S. 81, V32 - S. 161, V55 - S. 282

Ampicillin ( S. 429)

75

mg/l

Verwendung V49 - S. 251

500 70 50 50 1 1,5 ad 1.000

V27 - S. 140, V32 - S. 161, V50 - S. 257, V51 - S. 262, V54 - S. 277, V55 - S. 282

Verwendung g g mg ml

Nitrifizierer-Nährlösung (NH4)2SO4 KH2PO4 MgSO4 × 7 H2O CaCl2 × 2 H2O SL 10 ( S. 426) Phenolrot H2Odem.

Verwendung

Verwendung

NB-Sporulationsnährlösung Pepton Fleischextrakt MnSO4 H2Odem.

mg/l mg/l

Zusätze

NB-Festmedium Pepton Fleischextrakt Agar-Agar H2Odem.

30 30

Verwendung

NB-NaCl-Nährlösung Pepton NaCl Fleischextrakt H2Odem.

Kanamycin ( S. 429) Streptomycin ( S. 429)

Verwendung g g mg g ml

NB-Nährlösung Pepton Fleischextrakt H2Odem.

Zusätze

V27 - S. 140

Herstellung mg mg mg mg ml mg ml

Nach dem Ansetzen wird der pH-Wert mit Natriumcarbonat (Na2CO3, 5 %, wt/vol) auf ca. 8 eingestellt (pH-Indikator schlägt nach rosa um). Verwendung V15 - S. 88

6.2 Medien- und Chemikalienliste

423

Nitrit-Reagenz nach Griess-Ilosvay Sulfanilsäure-Lösung:

Herstellung

Sulfanilsäure 5 N Essigsäure

0,8 100

g ml

0,5 100

g ml

α-Naphthylamin-Lösung: α-Naphthylamin 5 N Essigsäure

Sulfanilsäure- und α-Naphtylamin-Lösungen im gleichen Volumenverhältnis mischen ergibt die Gebrauchslösung. Im Handel angebotenes Reagenz (Merck) ist bereits gebrauchsfertig und längere Zeit haltbar.

5 N Essigsäure Essigsäure H2Odem.

60 ad 200

g ml

30 20

ml ml

0,3 ad 30

g ml

0,2 ad 20

g ml

Oxidasereagenz

Herstellung

NNDP-Lösung α-Naphthol-Lösung NNDP-Lösung

Die NNDP-Lösung und die α-Naphthol-Lösung erst kurz vor Gebrauch mischen. a)

NNDP a) H2Odem.

N,N-Dimethyl-para-phenylendiammoniumdichlorid

α-Naphtol-Lösung α-Naphthol Ethanol (96 %, vol/vol)

Pfeiffersches Gemisch

Anmerkung

Methanol, absolut Formol / Formalin (37 %, vol/vol, Formaldehyd) Holzessig, roh (75 bis 80 %, vol/vol)

100

ml

100

ml

100

ml

Dieses Universalfixativ kann auch gebrauchsfertig vom Fachhandel (z. B. Schmid GmbH & Co, Küferstraße 2, Postfach 1110, D-73257 Köngen) bezogen werden.

Poly(3HB)-haltiges Doppelschichtmedium Mineralsalz-Festmedium

Herstellung

( S. 421) Poly(3HB)-Top-Agar Mineralsalzkomponente 50 ml (vom Mineralsalz-Festmedium,  S. 421) Agar-Agar-Komponente 50 ml (vom Mineralsalz-Festmedium,  S. 421) Poly(3HB)-Suspension (s. u.) 10 ml Poly(3HB)-Suspension Poly(3HB) H2Odem.

0,3 ad 10

g ml

Phosphat-Puffer (0,1 M) KH2PO4 NaOH H2Odem.

13,6 2,32 ad 1.000 pH 7,0

Ca. 7 ml Poly(3HB)-Top-Agar werden jeweils über eine Platte mit Mineralsalz-Festmedium ( S. 421, ohne Kohlenstoffquelle) gegossen. Herstellung der Poly(3HB)-Suspension Extrahiertes, trockenes Polymer ( V33, S. 172) wird durch kräftiges Schütteln oderRühren (über Nacht) und mit Hilfe von Ultraschall in H2Odem. suspendiert u. autoklaviert. Verwendung V40 - S. 202 Herstellung

g g ml

Der pH-Wert wird mit 2 N NaOH eingestellt.

424

6 Chemikalien, Nachweisreagenzien und Medien

Proteinbestimmung nach Lowry Lösung A NaOH H2Odem.

Herstellung 8 ad 100

g ml

7,5 ad 250 5 5

g ml ml ml

Lösung B Na2CO3 H2Odem. Tartrat-Lösung (s. u.) Kupfer-Lösung (s. u.) Lösung C

Die RSA-Standardlösung kann in einem geeigneten Kunststoff-Gefäß (z. B. Falcon®-Röhrchen) bei -20 °C gelagert werden. Kupfer-Lösung

entspricht Folin-Ciocalteus-Phenol-Reagenz (Fertigreagenz, z. B. von Merck) Tartrat-Lösung Na2-Tartrat H2Odem.

Beim Ansetzen von Lösung B die Komponenten unbedingt in der angegebenen Reihenfolge zusammengeben und immer frisch ansetzen (Haltbarkeit ca. ein Tag).

CuSO4 × 5 H2O H2Odem.

0,5 ad 50

g ml

RSA-Standardlösung 1 ad 50

g ml

Rinderserumalbumin (RSA) 20 H2Odem. ad 100

mg ml

Proteintrennung und Nachweis Denaturierungspuffer

Herstellung

Natriumdodecylsulfat (SDS) 2,5 2-Mercaptoethanol 5,0 Ethylendiamintetraacetat (EDTA) 37,2 TRIS-HCl (50 mM, pH 8.0) 50 H2Odem. 10 Glycerin, ca. 10 Bromphenolblau] ca. 5

g ml mg ml ml ml mg

Trenngelpuffer

Sammelgelpuffer Tris 30,23 g Natriumdodecylsulfat (SDS) 2,0 g H2Odem. ad 500 ml pH 6,8 (HCl) 3,0 14,4 1,0 ad 1000

g g g ml

146,0 4,0 ad 500

g g ml

PY-Medium Pepton Hefeextrakt H2Odem.

Serva Blau G Methanol Esssigsäure H2Odem. Methanol Essigsäure H2Odem. Verwendung

10 10 ad 1000 pH 7,8

4 908 908 92

g ml ml ml

660 200 ad 2.000

ml ml ml

Entfärbelösung

Acrylamidlösung 30 % (37,5:1)) Acrylamid Bisacrylamid H2Odem.

Tris 90,75 g Natriumdodecylsulfat (SDS) 2,0 g H2Odem. ad 500 ml pH 8,9 (HCl) Färbelösung

Elektrodenpuffer Tris Glycin SDS H2Odem.

Alle Lösungen sind haltbar. Die Acrylamid- und die Färbelösung sollten nach dem Ansetzen einmal filtriert werden; bei dennoch unbefriedigenden Ergebnissen (Streifenbildung) kann eine zusätzliche Filtration der Puffer Abhilfe schaffen.

g g ml

V13 - S. 81, V52 - S. 269

6.2 Medien- und Chemikalienliste

425

Pyrophosphat/Semicarbazid/GlycinPuffer Na4P2O7 Semicarbazid Glycin

75 mM 75 mM 21 mM pH 8,7

Rhizopus-Festmedium D(+)-Glucose Hefeextrakt Agar-Agar H2Odem.

20 5 15 ad 1.000 pH 6,6

g g g ml

50 10 10 5 3 20 ad 1.000 pH 7,2

1 5 ad 1.000

Chloramphenicol ( S. 429)

100

mg/l

Verwendung V39 - S. 197 Verwendung

g g g g g g ml

Saccharose-NaCl-Nährlösung Saccharose NaCl H2Odem.

Der pH-Wert wird mit 4 N NaOH-Lösung (16 %, wt/vol, NaOH) eingestellt.

Zusätze

Saccharose-Festmedium Saccharose Trypton Gelatine Hefeextrakt K2HPO4 Agar-Agar H2Odem.

Herstellung

V10 - S. 70, V11 - S. 74, V29 - S. 150

Verwendung g g ml

V11 - S. 74, V29 - S. 150

SL 6 (Spurenelement-Lösung 6) H3BO3 CoCl2 × 6 H2O ZnSO4 × 7 H2O NaMoO4 MnCl2 × 4 H2O NiCl2 × 6 H2O CuCl2 × 6 H2O H2Odem.

30 20 10 3 3 2 1 ad 1.000

mg mg mg mg mg mg mg ml

SL 7 (Spurenelement-Lösung 7) HCl (konz.) FeCl2 × 4 H2O CoCl2 × 6 H2O MnCl2 × 4 H2O ZnCl2 H3BO3 Na2MoO4 × 2 H2O NiCl2 × 6 H2O CuCl2 × 2 H2O H2Odem.

10 1,5 190 100 70 62 36 24 17 ad 1.000

Herstellung ml g mg mg mg mg mg mg mg ml

Wasser vorlegen und mit Salzsäure (HCl) beginnen, da sich das Eisensalz sonst schwer löst.

426

6 Chemikalien, Nachweisreagenzien und Medien

SL 8 (Spurenelement-Lösung 8) EDTAa) (Dinatriumsalz) FeCl2 × 4 H2O CoCl2 × 6 H2O MnCl2 × 4 H2O ZnCl2 H3BO3 Na2MoO4 × 2 H2O NiCl2 × 6 H2O CuCl2 × 2 H2O H2Odem.

5,2 1,5 190 100 70 62 36 24 17 ad 1.000 pH 6,5

Herstellung g g mg mg mg mg mg mg mg ml

SL 10 (Spurenelement-Lösung 10) HCl (konz.) FeCl2 × 4 H2O CoCl2 × 6 H2O MnCl2 × 4 H2O ZnCl2 Na2MoO4 × 2 H2O NiCl2 × 6 H2O H3BO3 CuCl2 × 2 H2O H2Odem.

10 1,5 190 100 70 36 24 6 2 ad 1.000

ml g mg mg mg mg mg mg mg ml

Sojabohnen-Festmedium Sojabohnen-Filtrat (s. u.) Agar-Agar H2Odem.

4 ad 250 pH 5,5

g ml

400 ad 1.000

g ml

150 5 2 ad 1.000 pH 7,0

g g g ml

8,6 4,4 ad 1.000 pH 7,2

g g ml

Sorbit-Medium Sorbit Hefeextrakt (NH4)2SO4 H2Odem.

Ethylendiamintetraacetat

Herstellung Wasser vorlegen und mit Salzsäure (HCl) beginnen, da sich dasEisensalz sonst schwer löst.

Die Sojabohnen werden 60 Minuten gekocht, anschließend von ihren Schalen befreit und mit einem Küchenmixer zerkleinert. Der Brei wird dann durch ein Küchensieb (Maschenweite ca. 1 mm) passiert. Verwendung V39 - S. 197 Verwendung

SSC-Puffer NaCl Na3-Citrat × 2 H2O H2Odem.

a)

Herstellung des Sojabohnen-Filtrats

Sojabohnen-Filtrat Sojabohnen H2Odem.

Wasser vorlegen und mit EDTAa) beginnen, da sich das Eisensalz sonst nicht löst. Den pH-Wert mit NaOH auf pH 6,5 einstellen.

V24 - S. 127

6.2 Medien- und Chemikalienliste

427

Stärke-Festmedium Lösliche Stärke KH2PO4 Pepton MgSO4 × 7 H2O Hefeextrakt Agar-Agar H2Odem.

Verwendung 3,0 0,5 0,3 0,2 0,2 15 ad 1.000 pH 6,6

g g g g g g ml

Standard I-Nährlösung Pepton Hefeextrakt NaCl Glucose H2Odem.

Verwendung

15 3 6 1 ad 1.000 pH 7,5

g g g g ml

Standard I-Festmedium Pepton Hefeextrakt NaCl Glucose Agar-Agar H2Odem.

V42 - S. 212

V38 - S. 193, V41 - S. 207

Verwendung

15 3 6 1 15 ad 1.000 pH 7,5

g g g g g ml

24 12 4 ad 900

g g ml ml

2,31 12,54 ad 100

g g ml

V17 - S. 95, V26 - S. 136, V27 - S. 140, V31 - S. 157, V40 - S. 202, V41 - S. 207, V42 - S. 212, V43 - S. 216, V44 - S. 220, V45 - S. 228

TB-Nährlösung Komplex-Komponente Hefeextrakt Trypton Glycerin H2Odem.

Herstellung

Puffer-Komponente KH2PO4 K2HPO4 H2Odem.

Beide Komponenten getrennt autoklavieren und nach Abkühlen auf ca. 50 °C steril vereinigen. Verwendung V25 - S. 131, V35 - S. 178

TB-Festmedium Komplex-Komponente mit Agar Hefeextrakt Trypton Glycerin Agar-Agar H2Odem.

24 12 4 15 ad 900

Herstellung g g ml g ml

Verwendung V35 - S. 178

Puffer-Komponente KH2PO4 K2HPO4 H2Odem.

Beide Komponenten getrennt autoklavieren und nach Abkühlen auf ca. 50 °C steril vereinigen, anschließend die Platten gießen.

2,31 12,54 ad 100

g g ml

428

6 Chemikalien, Nachweisreagenzien und Medien

Thiosulfat-Nährlösung Na2S2O3 × 5 H2O K2HPO4 MgCl2 NH4Cl SL 10 ( S. 426) H2Odem.

Verwendung 10 4 0,7 0,05 1 ad 1.000 pH 6,8

g g g g ml ml

Thiosulfat-Festmedium Na2S2O3 × 5 H2O K2HPO4 MgCl2 NH4Cl SL 10 ( S. 426) Agar-Agar H2Odem.

V19 - S. 105

Verwendung

10 4 0,7 0,05 1 15 ad 1.000 pH 6,8

g g g g ml g ml

0,45 0,59 ad. 90

g g ml

V19 - S. 105

Top-Agar NaCl-Agar NaCl Agar-Agar H2Odem.

Herstellung

Histidin-Biotin-Lösung Histidin Biotin

Verwendung 7 5

mM mM

Triethanolamin-Puffer Triethanolamin MgSO4

V49 - S. 251 Herstellung

300 mM 3 mM pH 7,5

Wasser-Festmedium CaCl2 × 2 H2O Agar-Agar Leitungswasser

NaCl-Agar autoklavieren und im Wasserbad auf 42 °C abkühlen lassen. Dann 0,75 ml sterilfiltrierte Histidin-Biotin-Lösung zusetzen.

Der pH-Wert wird mit 4 N NaOH-Lösung (16 %, wt/vol, NaOH) eingestellt. Verwendung

1 12 ad 1.000 pH 7,2

g g ml

V5 - S. 51

6.2 Medien- und Chemikalienliste

429

Zusätze Medien werden häufig mit speziellen Zusätzen wie z. B. Antibiotika benötigt. Diese Zusätze werden nach dem Autoklavieren der Nährlösung bzw. des Festmediums und nach dessen Abkühlen auf ca. 45 °C aus sterilen Stammlösungen zugegeben. Die Endkonzentration eines Zusatzstoffes ist beim jeweiligen Medium angegeben, die Stammlösungen sind hier angegeben.

Ampicillin (Amp) 100 mg/ml H2Odem.

Chloramphenicol (Cm) 34 mg/ml Ethanol (96 %, vol/vol)

Isopropylthiogalactopyranosid (IPTG) 238,3 mg/ml H2Odem. (entspricht 1 M)

Kanamycin(-Sulfat) (Km) 50 mg/ml H2Odem.

Streptomycin-Sulfat (Str) 500 mg/ml H2Odem.

Tetracyclin (Tc) 25 mg/ml Ethanol (96 %, vol/vol)

Sterilisationsmethode Filtration Sterilisationsmethode nicht erforderlich Sterilisationsmethode Filtration Sterilisationsmethode Filtration Sterilisationsmethode Filtration Sterilisationsmethode nicht erforderlich

7

Modulare Zusammenstellung von Versuchen für unterschiedliche Zielgruppen

In der nachfolgenden Tabelle (Tabelle 7.1) sind sämtliche im MIKROBIOLOGISCHEN PRAKTIKUM beschriebenen Versuche, Exkursionen und Demonstrationen aufgeführt. Daneben sind acht Zielgruppen bzw. Ausbildungsrichtungen aufgeführt, und Versuche, die uns für die jeweilige Zielgruppe bzw. Ausbildungsrichtung besonders geeignet erscheinen, sind zugeordnet (). Die Abschätzung der Durchführbarkeit basiert auf Erfahrungswerten und berücksichtigt die für die Versuche notwendigen Gerätschaften sowie den Kenntnisstand der Teilnehmer. • Mikrobiologisches Anfängerpraktikum im Grundstudium der Naturwissenschaften und Studium der Landwirtschaft (Spalte 1) • Weiterführende mikrobiologische Praktika (Spalten 2 bis 6) • für Biologen mit Hauptfach Mikrobiologie (Spalte 2) • für Biologen und andere Naturwissenschaftler mit Nebenfach Mikrobiologie (Spalte 3) • für Biotechnologen (Spalte 4) • für stoffwechselphysiologisch orientierte Naturwissenschaftler (Spalte 5) • für molekulargenetisch orientierte Naturwissenschaftler (Spalte 6) • Mikrobiologische Ausbildung von technischen Assistenten und Ingenieuren (Spalte 7) • Biologieausbildung an Gymnasien in Leistungskursen in der Sekundarstufe II (Spalte 8) Spalte 1 umfasst dabei die mikrobiologische Grundausbildung im Hochschulstudium der Biologie und verschiedener anderer Studienfächer, in der mikrobiologische Lehrinhalte vorgesehen sind, wie z. B. Biotechnologie, Landwirtschaft, Chemie und Biochemie. In den Spalten 2 bis 6 sind dann Versuche aufgeführt, die Gegenstand der weiterführenden mikrobiologischen Ausbildung in den angegebenen Fächern bzw. Schwerpunkten an der Hochschule sein sollten. Bei der Zusammenstellung wurde davon ausgegangen, dass die Teilnahme an einem weiterführenden Praktikum erst nach einem erfolgreichen Abschluss des Grundpraktikums erfolgt. In Spalte 7 sind mikrobiologische Versuche zusammengestellt, die sich für die Ausbildung von technischem Personal und Ingenieuren eignen. Sie vermitteln praktische Fähigkeiten und theoretische Grundkenntnisse in Mikrobiologie, die später im Beruf wichtig sind, und machen Zusammenhänge in der Natur deutlich. Die in Spalte 8 aufgeführten Versuche können in der Sekundarstufe II in BiologieLeistungskursen herangezogen werden, um interessierten Schülern die Biologie von Seiten der Mikrobiologie her näher zu bringen. Die hierzu ausgewählten Versuche sind apparativ nicht sehr aufwendig und sollten an Gymnasien, die sich einer modernen Ausbildung in Biologie verschrieben haben, durchgeführt werden können. Uns sind viele engagierte Lehrer bekannt, die bereit sind mit ihren Schülern entsprechende Versuche oder Demonstrationen durchzuführen bzw. die Schüler bei Exkursionen zu den angegebenen Zielen zu führen.

A. Steinbüchel, F. B. Oppermann-Sanio, Mikrobiologisches Praktikum DOI 10.1007/978-3-642-17703-3_7, © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2003, Nachdruck 2011

7 Modulare Zusammenstellung von Versuchen für unterschiedliche Zielgruppen

431

Tabelle 7.1.

Für die einzelnen Zielgruppen geeignete Veranstaltungen (Abschnitt 1 von 2) Zielgruppe 1 2 3 4 5 6 7 Quantitative Bestimmungen V1

Bestimmung der Anzahl von Hefezellen in 1 g Bäckerhefe



V2

Aufnahme einer Wachstumskurve mit Ralstonia eutropha

 

8

































































 

 

Anreicherung, Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen V3 V4

Anreicherung von Luftkeimen Anreicherung von Leuchtbakterien

V5 V6

V15

Anreicherung von Myxobakterien Anreicherung und Isolierung von Violacein-produzierenden Stämmen der Gattungen Chromobacterium und Janthinobacterium Direktisolierung von aeroben Endosporenbildnern (Bacillus megaterium) Anreicherung und Isolierung von saccharolytischen Clostridien Direktisolierung und taxonomische Bestimmung von fluoreszierenden Pseudomonaden Direktisolierung von Streptococcus salivarius Anreicherung und Isolierung von Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum Anreicherung und Isolierung von Propionibacterium sp. Anreicherung und Isolierung von aeroben N2-Fixierern (Azotobacter sp.) Anreicherung und Isolierung von anaeroben N2-Fixierern (Clostridium pasteurianum) Anreicherung von Nitrifizierern

V16

Anreicherung von Denitrifizierern

V17 V18

Anreicherung und Isolierung von Knallgasbakterien Winogradsky-Säulen zur Anreicherung von anoxygenen phototrophen Bakterien Anreicherung und Isolierung von Schwefel-Oxidierern (farblose Schwefelbakterien) Anreicherung von sulfatreduzierenden Bakterien

V7 V8 V9 V10 V11 V12 V13 V14

V19 V20

 

 





 

 



 

 





 



 

 



 





 

 





 























Herstellung von biotechnologisch relevanten Produkten und Lebensmitteln mit Mikroorganismen V21 V22

Herstellung von Ethanol mit Hefe Herstellung von Glycerin mit Hefe durch Abfangverfahren

V23 V24 V25 V26

Herstellung von Citronensäure mit Aspergillus niger Herstellung von Dihydroxyaceton mit Essigsäurebakterien Herstellung des Farbstoffs Indigo mit einem rekombinanten Stamm von Escherichia coli Herstellung und Nachweis von Antibiotika



 





V27

Herstellung von Insektentoxinen mit Bacillus thuringiensis



 

 



V28 V29







 

V30

Herstellung von Xanthan mit Xanthomonas campestris Herstellung von Dextran mit Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum Herstellung mikrobieller Cellulose mit Essigsäurebakterien



 

V31

Herstellung von Alginat mit Azotobacter vinelandii







V32

Herstellung von Bioplastik, Poly(3HB), mit Ralstonia eutropha Herstellung eines Elastomers mit Pseudomonas oleovorans

   



V33

 

V34

Herstellung von Poly(γ-D-glutamat) mit Bacillus licheniformis





   





432

7 Modulare Zusammenstellung von Versuchen für unterschiedliche Zielgruppen Tabelle 7.1.

V35

Für die einzelnen Zielgruppen geeignete Veranstaltungen (Abschnitt 2 von 2) Zielgruppe 1 2 3 4 5 6 7 



8



V36

Herstellung und Isolierung von Cyanophycin mit einem rekombinanten Stamm von Escherichia coli Herstellung von Sauerkraut

 

 







V37

Umwandlung von Wein in Weinessig



 







V38

Herstellung von Natto











V39

Herstellung von Tempeh















Abbauleistungen von Mikroorganismen V40

Mikrobieller Abbau von Poly(3-hydroxybutyrat)



 



V41

Mikrobieller Abbau von Kautschuk

V42

Mikrobieller Abbau von Stärke

 

  

  

V43

Partieller mikrobieller Abbau einer Fotokopie

 

 



V44

Mikrobieller Abbau von Kohlenwasserstoffen

 

 



V45

Mikrobieller Abbau von Polyethylenglykol



V46

Mikrobieller Abbau von Roundup®



 

  



Bakteriophagen und Viren V47

Nachweis von Coli-Phagen im Abwasser

 

 

 

V48

Nachweis des Tabak-Mosaik-Virus (TMV)





 



 

  





V51

Ames-Test Erweiterung des Spektrums verwertbarer Substrate bei Ralstonia eutropha durch Mutagenese Poly(3HB)-negative Mutanten von Ralstonia eutropha

V52 V53

Transformation von Bacillus subtilis Transformation von Escherichia coli



 

  



 

 

 



V54

Konjugation von Ralstonia eutropha





V55

Transposon-induzierte Mutanten von Ralstonia eutropha



 

V56

Elektroporation von Mycobacterium smegmatis



  

Auslösung von Mutationen, Anreicherung von Mutanten und Übertragung von DNA V49 V50





   

 

Exkursionen E1

Kommunale Abwasserkläranlagen

 

 







E2

Kompostwerke

 

 







E3

Biogasanlagen



 







E4

Bierbrauerei und Braustätten



 







E5

Weinherstellung in Winzereien



 







E6

Silage in der Landwirtschaft



 







 

 

  





 

 





 



 





D5

Symbiontische N2-fixierende Bakterien und Wurzelknöllchen Rhizobium radiobacter und induzierte Pflanzentumore Claviceps purpurea und Mutterkorn-Alkaloide aus infiziertem Getreide Flechten: Ektosymbiosen von Pilzen mit Grünalgen oder Cyanobakterien Anaerobe Süßwassersedimente und das Volta-Experiment

 

 



D6

Farbstreifen-Sandwatt und Nordseeküste

 





Demonstrationen D1 D2 D3 D4



 



 

434

8 Stichwortverzeichnis

8

Stichwortverzeichnis

A Abbau chemischer Verbindungen 229 Abfallvolumen 303 Abiotische Faktoren 9 Abluftreinigung 307 Absetzbecken 301 Absterbephase 35 Abtötungskurve 388-389 Abtreibungsmittel 341 Abwasser 297 Grenzwerte 298 Kommunalverordnung 298 Reinigung 89, 93, 298 Acetaldehyd 115, 223 Disproportionierung 120 Acetaldehyd-Dehydrogenase 71, 120, 189 acylierend 115 Acetat 185, 300 Nachweis 395  auch Essig(säure) Acetat-Kinase 63, 71, 74, 78, 92, 110, 185 Aceto Balsamico 189 Acetoacetyl-CoA Reduktase 162, 262 Acetobacter suboxydans 128 Acetobacter xylinum  Gluconacetobacter xylinus Acetobacter sp. 128 Acetoin 258 Aceton 64 Acetosyringon 335 Acetyl-CoA 115 Acetyl-CoA-Weg, reduktiver 109 Acetylphosphat 74 N-Acetyltransferase 253 Achromatium oxaliferum 5, 107 Achromobacter xylosoxidans subsp. denitrificans 229 Achromobacter sp. 236 Acidianus infernus 107 Acidithiobacillus ferrooxidans 106-107 Acidithiobacillus thiooxidans 107 Acinetobacter calcoaceticus 269 Acinetobacter sp. 178, 300 cis-Aconitase 125 Acremonium chrysogenum 137 Acrylyl-CoA Weg 78

Actinobacteria 4 Actinomyceten 136 Actinoplanes missouriensis 209 Acyl-CoA Synthetase 221 Acyltransferase 169 Adenin 262, 388 Adenosin-5’-phosphosulfat 109 Adenosintriphosphat Nachweis von 48 Synthese 79, 101 Adenosintriphosphat-Synthase Na+-abhängig 79 Adsorbenz 150 Aequorea aequorea 47 Aequorin 47 Aerocavin 56 Aerocyanidin 56 Aerotaxis 83 Affinitätschromatographie 151 Agar-Agar 355 Agar-Schüttelkultur 364 agar-shake 364 Agrobacterium tumefaciens  Rhizobium radiobacter Agrocin 84: 141, 336 Agroclavin 341 Akne 79 Alanin 78 L-Alanyl-Aminopeptidase 378 Alcaligenes eutrophus  Ralstonia eutropha Alcaligenes latus 81, 95-96, 163, 202 Aldehyd-Dehydrogenase 221 Alginat 82, 145, 157-160 Weltjahresproduktion 159 Alginat-Polymerase 158 Alkan-Hydroxylase System 221 Alkohol-Dehydrogenase 71, 114, 119-120, 188, 221, 258, 314, 319 Allochromatium vinosum 202, 351 Allochromatium sp. 101 Allochthone Flora 9 Allorhizobium sp. 329 Alnus glutinosa 330 Alphamycolsäure 290 Alteromonas sp. 56 Amadori-Umlagerung 360 Ameisensäure 326

A. Steinbüchel, F. B. Oppermann-Sanio, Mikrobiologisches Praktikum, DOI 10.1007/978-3-642-17703-3, © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2003, Nachdruck 2011

Amensalismus 17 American Type Culture Collection 19 Amersham Biosciences 263 Ames, Bruce N. 251 Ames-Test 251 Aminoglykosid-Antibiotika 137 Amitrol 234 Ammoniak 88-89, 326 Ammonifikation 13, 92 Ammonium-Bestimmung 404 Ammonium-Monooxygenase 88-89 Ammoniumpersulfat 405 Amphibolismus 6 Ampicillin 283 Amycolatopsis mediterranei 137 Amycolatopsis orientalis 137 Amylase 60, 314-315 Typen (α, β, γ) 214 Amylopektin 213-214 Amylose 212-213 Anabaena azollae 328 Anabaena variabilis 81 Anabaena sp. 101 Anabolische Plasmide 273 Anabolismus 6 Anaerobacter sp. 59 Anaerobe Atmung 12 Anammox Bakterien 34 Anammox-Prozess 13, 300-301 Angiococcus sp. 52 Anisogametangiogamie 339 Anlaufphase  lag-Phase Anoxygene Photosynthese 14 Anreicherung von Mutanten 262 Anreicherungstechniken 16 Antagonismus 17 Anthocyane 323 Anthocyanidin 323 Antibiotika 56, 60, 136-139 chemische Klassen 137 Produzenten 137 Resistenzen 138, 282 Wirkorte 137 Antitumor-Wirkung 56 Apfelessig 188 Äpfelsäure 320  Malat API20NE 381-382 Apoprotein 330

8 Stichwortverzeichnis Apothezium 345 Appressorien 344 APS  Adenosin-5’-phosphosulfat APS-Reduktase 109 Aquifex pyrophilus 96 Arabinose 217 Archaea 1, 107 halophile 102 Archaeoglobus fulgidus 110 Archaeoglobus veneficus 110 Archangium sp. 52 Art 2-3 Arthrobacter globiformis 36 Arthrobacter ilicis 334 Arthrobacter Stamm 11/X 96 Arthrobacter sp. 59 Ascomyceten 30, 344 L-Ascorbinsäure 79, 128, 185, 190 Weltjahresproduktion 128 Ascosporen 338 Aspergillus fumigatus 25, 217 Aspergillus nidulans 217 Aspergillus niger 124-126, 213-214 Aspergillus oryzae 193, 213-215 Aspergillus sp. 307 Assimilation 12, 14 Astaxanthin 44 Atmosphäre 8-9 Atmung 114 ATP  Adenosintriphosphat ATP-Sulfhydrase 109 ATP-Synthase 79 Atrazin 234 att-Region 242 Auflösungsvermögen 374 Aureobasidium pullulans 213 Auslese 322 Autochthone Flora 9 Autoinduktor 48 Autolysin 378 Autoreifen 207 Auxotrophie 8, 70, 270 Azoarcus tolulyticus 224 Azorhizobium caulinodans 329-330 Azorhizobium sp. 329 Azotobacter chroococcum 81, 84 Azotobacter vinelandii 81, 157-160 Azotobacter sp. 59, 81-83

B

Bacillus amyloliquefaciens 174, 213 Bacillus anthracis 60, 174-175 Bacillus halodenitrificans 92

435 Bacillus halodurans 174 Bacillus licheniformis 60, 92, 137, 174-176, 213-215 Bacillus megaterium 59, 161, 174, 202 Bacillus mycoides 45 Bacillus natto 194 Bacillus schlegelii 96 Bacillus stearothermophilus  Geobacillus stearothermophilus Bacillus subtilis 60, 174-175, 183, 193-195, 213, 269-271, 273 Bacillus thuringiensis 60, 140-144 Bacitracin 60, 137 Bacteria 1 Bacteriochlorophyll 101 Bacteriodetes 4 Bacteriorhodopsin 101-102 Bacteroide 330 Bacteroides cellulosolvens 217 Bacteroides ruminicola  Prevotella ruminicola Bacteroides sp. Stamm PG1 229 von Baeyer, Adolph 131 Bakterienrasen 243 Bakterienstämme 3 Liste der eingesetzten 18 Bakteriophagen 239-245 Fd 241 ϕX174Mu 239 Lambda 239, 241 lytischer Cyclus 241 M13 239, 241 MS2 241 Mu 239, 241, 282 P1 241 Qβ 241 SP 241 T4 239, 241-242 T7 239, 241 temperente 241, 243 virulente 241, 243 Bang, Hofmann 353 Barriquewein 322 Basen 262 Basidiomyceten 344 Bayer AG 234 Bdellovibrio 5 Beerenauslese 322 Befruchtung 339 Beggiatoa alba 5, 107 Beggiatoa sp. 105-106 Belebtschlammbecken 297 Belebungsbecken 301 Benz(a)pyren 253 Benzyl-CoA 224 Benzylsuccinat 224 Synthase 224

Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology 4 Systematic Bacteriology 4 Berliner Weiße 317 Berufsgenossenschaft Chemie 24 Bier 313-317 alkoholreduziert 317 Gattungen 316 obergärig 316 Sorten 314, 317 untergärig 316 Weltjahresproduktion 313 Bifidobacterium bifidum 71, 74 Bifidobacterium-Gärung 71 Binominales System 2 Bioabfallverordnung 246 Biodiesel 121, 129 Bioenergieanlage der SOTEC in Bottrop 311 Bioethanol  Ethanol Biofilme 301 Biofilter 307 Biogas 115, 298, 310-312, 348 Anlage 246, 310-312 Zusammensetzung 310 Biologische Arbeitsstoffe 24 Biologischer Sauerstoff-Bedarf 297 Biolumineszenz 46-48 Biomasse Zusammensetzung 355 Biomasse-Verordnung 311 bioMérieux 381 Bioplastik  Polyhydroxyalkanoate Biopol™  Poly(3-hydroxybutyrat-co-3-hydroxyvalerat) Biopolymere 11  Exopolysaccharide  Polyhydroxyalkanoate Biosphäre 8-9 Biostoffverordnung (BioStoffV) 24 Biotechnologie 15 grüne 15 rote 15 weiße 15 Biotransformation 128 Biovar 3 Biowaffen 340 Biozönose 9, 351 Blattflechte 344 Bleomycin 137, 282 Blutplasma-Ersatzmittel 150 Bockbier 317 Bodenbefestigung 346 Bohne 330 Borzi, Antonio 178 Botrytis cinerea 217, 321

436

8 Stichwortverzeichnis Bradyrhizobium elkanii 330 Bradyrhizobium japonicum 96, 202, 330 Bradyrhizobium sp. 329 Branntwein 324 Brassica oleracea 183 Brauerei 313-317 Abwässer 297 Braugerste 315 Braunalgen 157 Braunfäule 217 Brauprozess 315 Brenneria rubrifaciens 334 Brenzkatechin 223 Brenztraubensäure  Pyruvat Brevibacillus brevis 137 Brikollare-Verfahren 306 BSB  Biologischer SauerstoffBedarf BT-Toxin 60, 140-144 Büffelbeere 330 Burkholderia caryophyllii 334 Burkholderia cepacia 334 2,3-Butandiol 258, 320 2,3-Butandion  Diacetyl Butteraroma  Diacetyl Buttermilch 74 Buttersäure 326 Butyrivibrio fibrisolvens 217 Butyryl-CoA-Dehydogenase 63

C Calciumcarbonat-Einschlüsse 106-107 Calciumsulfat 102-103 Calvin-Cyclus  Ribulose-1,5-bisphosphatWeg Calyptogena magnifica 106 Candida diddensiae 198 Candida tropicalis 25 Candida sp. 321 Cannizzaro, Stanislao 120 Capsid 239 Capsomer 239 Carbonatatmer 348 Carboxysomen 106 Carlson, Chester F. 218 Carotinoide 44, 51, 351 akzessorische Funktion 44 Schutzfunktion 44 Carrageenan 145 Casuarina cunninghamiana 330 Cellobiasen 217 Cellodextrinase 217 Cellulasen 217, 333 Cellulomonas fimi 216-219 Cellulose 145, 330 Abbau 115, 216-219

Herstellung 129, 153 mikrobielle 190 Cellulose-Synthase 154 Cellulose-Verflüssigung 218 Cellulosomen 217 Cephalodien 344 Cephalosporin 137 Cetraria islandica 346 CH4  Methan Chalcocit 106 Chaptalisation 321 Chemie Linz 163 Chemischer Sauerstoff-Bedarf 297 Chemolithoautotrophie 11, 89, 95 Chemotaxonomische Marker 2 Chinoide 137 Chinolin 68 Chitin 145, 329 Chitosan 145 Chloramphenicol 136-138, 283 Chlorobium tepidum 85 Chlorobium sp. 101 Chloroflexus sp. 85, 101 Chloronema sp. 101 Chlorophyll 101 Chlorosen 334 Chlortetracyclin 137 Cholecalciferol 114 Chondrococcus  Corallococcus Chondromyces sp. 52 Chromatium okenii 5 Chromatium purpuratum  Marichromatium purpuratum Chromatographie 151 Chromobacterium violaceum 55-58 Citrat  Citronensäure Citrat-Cyclus 125 reduktiv 96, 99, 101-102, 109 Citrobacter freundii 81 Citronensäure 124-126, 128 Anwendungen 124 Nachweis 396-397 Synthase 125 Weltjahresproduktion 124 Cladonia rangiferina 346 Cladonia stellaris 346 Cladosporium bantianum 26 Clavibacter agropyri 334 Clavibacter humiferum 334 Clavibacter humuli 334 Clavibacter hypertrophicans 334 Clavibacter insidiosum 334 Clavibacter iranicum 334 Clavibacter michiganense 334

Clavibacter nebraskense 334 Clavibacter rathayi 334 Clavibacter sepedonicum 334 Clavibacter tritici 334 Claviceps purpurea 338-342 Clavin-Alkaloid 340 Clostridien proteolytische 85 saccharolytische 85 Clostridium aceticum 62, 85 Clostridium acetobutylicum 62-63, 85 Clostridium acidisoli 85 Clostridium akagii 85 Clostridium beijerinckii 85 Clostridium butyricum 62 Clostridium cellobiopaum 62 Clostridium formicoaceticum 62 Clostridium pasteurianum 62, 85 Clostridium propionicum 78 Clostridium thermocellum 62, 217 CO2  Kohlendioxid Cofaktoren 355 Colletotrichum coffeanum var virulus 340 Comamonas testosteroni 205 com-Gene 269 Conferva chthonoplastes  Microcoleus chthonolastes Container-Verfahren 303, 306 Corallococcus sp. 52 Cordit 64 Coryneforme Bakterien 333 CphA  CyanophycinSynthetase Crotonase 63 CSB  Chemischer SauerstoffBedarf Curdlan 145 Curtobacterium betae 334 Curtobacterium beticola 334 Curtobacterium flacumfaciens 334 Curtobacterium oortii 334 Curtobacterium poinsettiae 334 Cutin 202-203 Cutinasen 204 Cyanidin 323 Cyanobacteria 4 Cyanobakterien 100-101, 178, 328, 343, 351 Cyanocobalamin 79, 195 Weltjahresproduktion 79 Cyanoguanidin 89 Cyanophycin 174, 178-181 Anwendungen 179 Biosynthese 178 Eigenschaften 179 Einschlüsse 178 Cyanophycinase 179

8 Stichwortverzeichnis Cyanophycin-Synthetase 178 Cycloalkane 137 Cyclodextrine 215 Cycloheximid 53, 57, 137 Cycloserin 137 Cyclosporin 137 Cypridina sp. 47 Cysten 36, 59 Cystobacter sp. 52 Cytochrom c 380 Cytochrom P450 253 Cytokin 335 Cytosin 262, 388

D Darren 315 Darrmalz 315 Dauerformen 36, 59 Decarboxylierung von Succinat 78 Dehalococcoides ethenogenes 5 Delphinidin 323 Dengue-Virus 26 Denitrifikanten 300 Denitrifikation 12, 91, 300-301 1-Deoxynoijrimycin 190 Dephosphatierungsbecken 301 Dermocarpa sp. 101 Derxia gummosa 81, 96 Desaminierung 262 Desoxyribonucleinsäure Desaminierung 388 Isolierung 385, 387 Mutation 388, 390 Reparaturmechanismus 252 Übertragung 386 Destillation 117 Desulfitobacterium hafniense 178 Desulfobacter curvatus 85 Desulfobacter postgatei 110 Desulfobacterium cetonicum 224 Desulfobacula toluolica 224 Desulfonema limicola 85 Desulfosporosinus orientis 110 Desulfotomaculum acetoxidans 110 Desulfotomaculum sp. 62 Desulfovibrio desulfuricans 110, 351 Desulfovibrio gigas 85 Desulfurikanten 85, 348, 351 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH 4, 19 Dextran 75-76, 145, 150-152, 213 Weltjahresproduktion 151 Dextransaccharase 75, 150 DHA  Dihydroxyaceton

437 Diacetyl 75, 316, 320 Diatomeen 351 Diauxie 35 6,6’-Dibromindigo  Purpur Dichte von Zellen 262 Dichtegradienten 263 Percoll 371 Saccharose 372 Zentrifugation 371-372 Dihydroxyaceton 121, 127-130, 190 Dihydroxyacetonphosphat 119 1,3-Dihydroxypropan-2-on  Dihydroxyaceton 2,5-Diketogluconsäure 190 Dimethylsulfid 320 Dinitrogenase 81 Dinitrogenase Reduktase 81 Dinkel 338 Dinkelbier 317 Dioxygenasen 221 Dipicolinsäure 52, 59 Dispersität 174 Disproportionierung 15 Diuron 234 Diversität von Mikroorganismen 1 Zellform 5 Zellgröße 5 DNA-Fragmente 2 DNA-Ligase 243 DNA-Rekombinationstechnik 23 Dodecanal 47 Domänen 1 Dopamin 341 Doppelbock 317 Doxorubicin 137 Drei-Eltern-Kreuzung 278 Drei-Strich-Ausstrich 365 Drigalski-Spatel 366 Dryas octopetala 330 Dschingis Khan 183

E

E280  Propionsäure E415  Xanthan Ebola-Virus 26 Ectothiorhodospira sp. 101 Edelfäule 321 Einzellerprotein 114, 163 Eisbock 317 Eisen Aufnahmemechanismen 68 Chelator 68 Oxidation 107 oxidierende Bakterien 224 Eisenchelatbildner 68 Eisen-Molybdän Cofaktor 81 Eiswein 322

Ektosymbiose 328, 343 Elaeagnus angustifolia 330 Elastomer 167, 262 Elektronentransport Phosphorylierung 96 rückläufig 88 Elektroporation 269, 290, 294 Küvetten 290 Elektroporator 290 Elementarzusammensetzung 7 Elemente, genetische 239 Elymoclavin 341 Embden-Meyerhof-Weg  Fructose-1,6-bisphosphatWeg Emmentaler  Schweizer Käse Endoglucanase 217 Endosporen 36, 52, 85-86, 358 Anzahl pro Zelle 59 bildende Bakterien 45, 59 Endosymbiose 328, 333 Energieerzeugung 311 5-Enolpyruvylshikimat-3-Phosphat-Synthase 233 Entamoeba histolytica 25 Enterobacteriaceae 333 Enterococcus faecalis 71 Enterococcus faecium 198 Entwicklungscyclus 338 Enzyme extrazelluläre 12 Epimerase 158 Epothilon 51 Epulopiscium fishelsonii 5-6 Erbse 330 Ergolin 340-341 Ergot-Alkaloid 338, 340-341 Ergotamin 341 Ergotismus 340 Erstbesiedler 345 Ertrag 36-37 Erwinia amylovora 334, 340 Erwinia carotovora  Pectobacterium carotovorum Erwinia tracheiphila 334 Erythrobacter sp. 101 Erythromicrobium sp. 101 Erythromycin 137-138 Escherichia coli 5-6, 12, 31, 34-35, 92, 131-134, 162, 178-179, 244, 269, 274, 278 Stamm K12 242 Essig 128, 188 Weltjahresproduktion 189 Essigsäure 185, 188, 320, 326 Essigsäurebakterien 127-130, 153, 244 biotechnologische Bedeutung 128

438

8 Stichwortverzeichnis Esterasen 204 Ethanol 114-116, 185, 188, 314, 319, 348 Biosynthese 115 Nachweis 397-398 Produktionsländer 116 Verwendung 115 Weltjahresproduktion 116 Etridiazol 89 Eukarya 1 Eukaryonten 1 Exoglucanase 217 Exopolysaccharide 53, 145  Alginat,  Cellulose,  Dextran,  Lävan,  Xanthan Exosporen 59 Exponentielles Wachstum  log-Phase Extrusionsporen 154 Exzissionsreparatur 252

Frankia sp. 328-330 Fresshöfe 205, 209, 214 Frings Acetator 189 Froschlaichbakterium 75  Leuconostoc mesenteriodes Fruchtknoten 338 Fruchtkörper 51-52, 339 Fructose-1,6-bisphosphat-Aldolase 71, 74, 278 Fructose-1,6-bisphosphat-Weg 63, 70, 74, 86, 114, 119, 125, 278, 314, 319 Fumarat 223 Atmung 95 beim anaeroben Aromatenabbau 224 Fumarat-Reduktase 78 Fusarium culmorum 338 Fusarium graminearum 338 Fusarium oxysporum 25 Fuselöle 315, 320 Futtermittel 75

F Fadenflechte 344 Familie 3 Färberwaid 131 Farblose Schwefelbakterien 14 Farbstreifen-Sandwatt 350 Fasciola hepatica 25 Faulbehälter 301 Faulturm 299, 301 Federweißer 323 Fermentation von Lebensmitteln 194 Ferredoxin 85 Fertilitäts-Plasmide 273 FeS2  Pyrit Fesselverfahren 189 Festsubstratfermentation 197 Fettsäure de novo Synthese 169 Fettsäure-Reduktase 47 Feuchthaltemittel 175 Firmicutes 4 Fischerella sp. 101 Flächenausstrich 366 Flachsilos 325 Flavinmononucleotid 47 Flechten 328, 343-346 Flechtenstoffe 346 Fleming, Alexander 136 Flockungsmittel 301 Florey, Howard 136 FMN/H2  Flavinmononucleotid Formaldehyd-Dehydrogenase 222 Formiat-Dehydrogenase 222 Formiat-H2-Lyase 96 Frankia alni 330

G Gagelstrauch 330 Galactose 217 Galactosidase 114 Gallertflechte 344 Galltrol™ 336 Gärbehälter 312 Gärung 12, 114 primär 12, 70, 114, 300, 348 sekundär 12, 300, 348 Gasbehälter 301 Gasstation 369-370 Gattung 2-3 GDP-Mannose-Dehydrogenase 158 Gefäßpflanzen 333 Geißeln 51-52 Gelfiltration 150 Gellan 145 Gelpermeationschromatographie 408 Generationszeit 36 Gentamycin 137 Gentechnische Arbeiten 23 Risikogruppe 1: 24 Risikogruppe 2: 25 Risikogruppe 3: 25-26 Risikogruppe 4: 26 Geobacillus stearothermophilus 34, 92, 213-214, 307 Geobacter metallireducens 224 Geosphäre 9 Geotrichum sp. 307 Gerste 315, 338 Gesamt-DNA 2 Gesamtzellzahl 31, 37

Gesetz der Toleranz 6 Gesetz des Minimums 6 Getreide 212 GFP  Grün Fluoreszierendes Protein Gips  Calciumsulfat Gleiten 51-52 Gloeophyllum trabeum 229 Gloeothece sp. 101 Glucoamylase 214 Gluconacetobacter diazotrophicus 81, 328-330 Gluconacetobacter xylinus 129, 153 Gluconacetobacter sp. 128 Gluconobacter oxydans 129, 188 Gluconobacter sp. 128 Gluconsäure 190 Glucose 217 Nachweis 398-399 Glucose-1-phosphat-Uridylyltransferase 154 Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase 71, 74, 257 Glucosesirup 215 Glufosinat 233-234 Glühwürmchen 47 Glutamin-Synthetase 234 Glycerin 114, 119, 121, 128-129, 263, 320 Nachweis 400-401 Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase 119 Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase 119 Glycine max 330 Glycogen 178, 213 Glycopeptidolipide 291 Glyphosat 233 Aufnahme in die Pflanze 233 resistente Kulturpflanzen 236 GMP-Regeln 22-23 Gordonia polyisoprenivorans 209 Gordonia westfalica 209-210 Gosebier 317 Gouda 79 GPC  Gelpermeationschromatographie Gradienten 263 Gram-Färbung 377-378 Gramicidin 137 Granulose 86 Grappa 324 Griess-Ilosvay 382-383 Griseofulvin 137 Größe von Bakterien 31, 37 von Hefezellen 31

8 Stichwortverzeichnis Grün Fluoreszierendes Protein 47, 49 Grünalgen 343 Grüne Bakterien 101 Grüne Nichtschwefelbakterien 101 Grüne Schwefelbakterien 101 Grünmalz 315 Guanin 262, 388 Guar 145 Gülle 297 Guttapercha 207

H

H2S  Schwefelwasserstoff Haarflechte 344 Haber-Bosch-Verfahren 81 Habitat 9 Haloarcula denitrificans 92 Halobacillus halophilus 174 Halobacterium sp. 101 Halobakterien 43, 101 Haloferax mediterranei 202 Haloferax sp. 101 Halorubrum sp. 101 Halothiobacillus neapolitanus 107 Haltbarmachung  Konservierung Hama-Natto 193 Hanseniaspora uvarum 321 Haploangium sp. 52 Harnstoff 7 Hauptrotte 304, 307 Haustorien 344 Hefe  Saccharomyces cerevisiae Hefeweizen 317 Helferplasmid 278 Heliobacillus mobilis 85 Heliobacillus sp. 101 Heliobacterium chlorum 85 Heliobacterium gestii 85 Heliobacterium sp. 59, 101 Heliobakterien 101-102 Heliophilum fasciatum 85 Heliophilum sp. 59, 101 Heliorestis sp. 101 Hemicellulosen  Polyosen Hepatitis A-Virus 25 Hepatitis B-Virus 26 d’Herelle, Félix Hubert 240 Herpes-Simplex-Virus 25 Heterocysten 82, 100 Hevea brasiliensis 207 Hexan 224 anaerober Abbau 224 Hexosyltransferase 70, 75, 150 Hierarchieebene 3 Hierarchisches System 1-2 Hippophae rhamnoides 330

439 Histidin auxotrophe Mutanten 251-252 Histoplasma capsulatum 26 HNO2  Salpetrige Säure HNO3  Salpetersäure Hochsilos 325 Holz Zusammensetzung 217 Holzgewächse 329 Homoacetogene Bakterien 348 Homogentisat 223 Hopfen 314, 316 Hordeum vulgare 338 Hülsenfrüchte 212 Humaninsulin 114 Humanviren 239 Humifizierung 303 Huminsäure 306-307 Humulus lupulus 316 Hyaluronsäure 145 Hydra sp. 174 Hydrogele 175 Hydrogenase 7, 63, 96 löslich 96 membrangebunden 96 Hydrogenobacter thermophilus 96 Hydrogenosom 97 Hydrosphäre 8-9 Hydrothermalquellen 11, 106 3-Hydroxyacyl ACP:CoA Transferase 169 3-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydrogenase 63 Hydroxycinnaminsäure 202 Hydroxyethansulfonat 119 Hydroxylamin 88 Hydroxylamin-Oxidoreduktase 88 Hydroxypropionat-Weg 99, 101 Hygienisierung 303, 307, 312 Hygienisierungsbehälter 312 Hygienisierungsphase 246 Hypoxanthin 262, 388

I

Ignicoccus 5 Immunabwehr 138 Imperial Chemical Industries 163 in situ Hybridisierung 17 Indigo 131-134 Indigofera tinctoria 131 Indigoweiß 131 Indikatororganismen 246 Indol 132 Derivate 56 Indolessigsäure 335 Infektionen Schutzmechanismen 68 Infektionsschlauch 330

Insektentoxine  BT-Toxin Insertionselement 282 Insertionssequenzen IS50 282 IS6100 291 Insulin 114 International Journal of Evolutionary and Systematic Bacteriology 4 Inulin 145 Invasion 329 Invertase 114, 319 Iodobacter sp. 56 Ionenaustauscher 150 Isatis tinctoria 131 Isidien 345 Isländisches Moos 346 Isopren 207 Itohiki-Natto 193-194 Iturin A 141 Iwanoski, Dimitri 246

J

Janthinobacterium lividum 55-58 Jarlsberger 79 Jodstärke-Reaktion 214 Joghurt 74 Jungbier 316 Jungwein 322

K

Kabinett 322 Kaiser Barbarossa 313 Kaliumdichromat 297 Kaliumhexacyanoferrat 125 Kaliumpyrosulfit 321 Kälteschock 339 Kanamycin 137-138, 282-283 Kapseln 82-83 Karies 71 Karl der Große 319 Karotten 333 Karzinogenität 251 Käse 74 Herstellung 244 Katabolische Plasmide 273 Katabolismus 6 Katalase 70 Katalase-Test 381 Kautschuk 207 Abbau 207 Weltjahresproduktion 207 KDPG-Aldolase 278 KDPG-Weg  2-Keto-3-desoxy6-phosphogluconat-Weg Kefir 74 Kerr, Alan 336 2-Keto-3-desoxy-6-phosphogluconat-Weg 114, 258, 278, 283

440

8 Stichwortverzeichnis β-Ketocaprylhomoserinlacton 48 2-Ketogluconsäure 190 5-Ketogluconsäure 190 Ketomycolsäure 290 β-Ketothiolase 63, 162, 262 Kimchi 74, 193 Kläranlage 297 Aufbau 299, 301 der Stadt Münster 299 Klärhöfe 205, 209, 214 Klärschlamm 298, 310 Klasse 3 Klebsiella pneumoniae 81, 213 Klee 330 Klonierung in Plasmide 278 Knallgasbakterien 7, 95 Knallgasreaktion 95 Knollen 212 Kochsalz 183 Kochsches Plattengussverfahren 364 Kohäsive Enden 242-243 Kohlendioxid 114, 298, 300, 310, 314, 348 Fixierung 11, 99-102, 222, 344 Kohlenmonoxid oxidierende Bakterien 95 Kohlenstoffkreislauf 10-11 Kohlenwasserstoffe 220-227 Abbau 220 Kohlhernie 246 KOH-Test 379 Koji 193 Koji-Prozess 125 Koloniefarbe 56 Kommensalismus 17 Kompetenz, genetische 269, 290 Kompetition 17 Komplexe Nährmedien 8 Kompost 302-310 Grenzwerte 308 Qualitätskriterien 308 Werk 246-309 Werk, Aufbau 303-304 Konidienbildung 339 Konjugation 269, 277, 290 Konservierung 75, 79 Kontamination 358 Korrosion, mikrobielle 89 von Eisen 110-111 Kreislaufwirtschaftsgesetz 311 Kreuz-Ausstrich 365 Krustenflechte 344 Kultivierung von Mikroorganismen aerob 356-357 anaerob 367-368

L

LAAP  L-Alanyl-Aminopeptidase Labferment 79 Lackmus 346 β-Lactam 137 Lactat  Milchsäure Lactat-CoA-Tansferase 78 Lactat-Dehydrogenase 70, 110, 258 Lactobacillus brevis 71, 185 Lactobacillus casei 198 Lactobacillus plantarum 185, 326 Lactococcus lactis 71 lag-Phase 35 Lambda 242 Lambda-Integrase 242 Lambert-Beersches Gesetz 390 Laminaran 145 Lamprocystis sp. 101 Lampyris noctiluca 47 Lassa-Virus 26 Latenzzeit 241 Latex  Kautschuk Latia neritoides 47 Laubflechte 344 Laugung, mikrobielle 56, 106 Läuterbottich 316 Läuterung 316 Lävan 70, 145 Lävansaccharase 70 de Lavoisier, Antoine Laurent 188 Lebendzellzahl 31, 37 Lebensmittelindustrie 74 Lebensmittelzusatzstoff 175 Lecanora esculenta 346 Leghämoglobin 83, 330 Leguminose 328, 330-331, 333 Leishmania brasiliensis 26 Leitgewebe 329-330 Lektine 329 Lemoigne, Maurice 161 Leuchtbakterien 46-50 Leuchtkäfer 47 Leuchtorgane 46 Leuchtqualle 47 Leucobase 131 Leuconostoc mesenteroides 71, 74, 150-152, 185, 213 LibertyLink® 236 Lichtnutzung 102 von Liebig, Justus 6 Lignin 153, 216-217, 222 Lignocellulose 217 Vergärung 115 Limonaden 124 Lipasen 204 Liphatec 331 Listeria monocytogenes 326

Lithotrophie 105 log-Phase 35 LSD  Lysergsäurediethylamid Luciferase 47 Luciferin 47 Luciola cruciata 47 Luftkeime 43-45 Lugolsche Lösung 86, 214, 384 lux-Gene 47-48 Luzerne 330 Lysergsäure 340-341 Lysergsäurediethylamid 340-341 Lysogenie 240-241

M Maasdamer 79 Maibock 317 Maillard-Reaktionen 360 Maische 316, 321 Makroelemente 7, 355 Malat 320 Malo-Lactat-Fermentation 75, 320, 322 Maltase 314 Maltose 214, 242 Maltosesirup 215 Maltose-Verwertung 242 Maltotriose 214 Malvidin 323 Malz 314 Malzbier 317 Mälzerei 315 Malzessig 188 Malztreber 316 Mannaflechte 346 Mannit 185 Mannose 217 Marichromatium purpuratum 85 Marine Standorte 348 Marinococcus halophilus 174 Massenvergiftung 340 Massenvermehrung von Bakterien 100 Mastitis 326 Mauersalpeter 89 Maul- und Klauenseuche-Virus 26 McClintok, Barbara 282 Medicago sp. 330 Megaplasmid pHG1 96 Megasphaera elsdenii 78 Melasse 115, 125, 326 Melittangium sp. 52 Merismopedia punctuata 351 Mesorhizobium sp. 329 Messokular 375 metabolic engineering 120, 132 Metabolismus 6 Metabolix 163

8 Stichwortverzeichnis Metagenomprojekte 17 meta-Spaltung 223 Methan 115, 298, 300, 310, 312, 347 Emissionen 348 Heizwert 310 Oxidation 222 Methan-Monooxygenase 222 Methanococcus maripaludis 85 Methanogene Bakterien 348 Methanol 222, 320 Methanol-Dehydrogenase 222 Methanosarcina mazei 85 Methylenblau 44 Methylmalonyl-CoA Epimerase 78 Methylmalonyl-CoA Mutase 78 Methylmalonyl-CoA Weg 78 N-Methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin 259 Methylocystis sp. 59 Methylosinus trichosporium 59 1-Methylpentyl-Succinat 224 Methyl-tert-Butylether 116 Metschnikowia sp. 321 Micrococcus luteus 45 Microcoleus chthonoplastes 351-353 Micromonospora aurantiaca 209 Micromonospora echinospora 137 Miete 303, 305 Mietenkompostierung 305 Miglitol 190 Migränemittel 340 Mikrobenmatte 350 Mikroelemente 7, 355 Mikrofibrillen 154 Milchsäure 70-71, 74-75, 77-78, 183, 185, 320, 325, 348 Nachweis 401 Milchsäurebakterien 70, 74, 198, 244, 317, 320, 325 Eigenschaften 70 wirtschaftliche Bedeutung 74 Milchsäuregärung 71, 183, 317, 325 Bifidobacterium-Typ 74 heterofermentativ 70, 74 homofermentativ 70 Milzbrand 60, 174 Mineralisation 12, 14 Mineralische Nährmedien 8 Mineralisierung 303 mismatch-Reparatur 252 Miso 193 MNNG  N-Methyl-N-nitro-Nnitroso-guanidin mob Funktion 277 Molekulargewicht

441 von Polymeren 174 Molkereiabwässer 297 Molybdän 7 Monesin 137 Monod, Jacques 35 Monooxygenase 47, 221 Monopole der Prokaryonten 1 Monsanto 142, 163, 233 Morphovar 3 Mortenson, L.E. 85 Mostgewicht 322-323 MTBE  Methyl-tert-Butylether Muconsäure 223 Mucor sp. 307 Mundhöhle 70 Mundhygiene 70 Mutagen  N-Methyl-N-nitro-N-nitroso-guanidin  Salpetrige Säure quantitative Erfassung 252 Mutagenese gerichtet 243 Mutagenität 251 Mutagenitätsprüfung 251 Mutante 262 Mutation 262 Mutterkorn-Alkaloide 338-342 Mutualismus 17 Mycabacterium fortuitum 209 Mycobacterium flavescens 81 Mycobacterium leprae 291 Mycobacterium smegmatis 290-294 Mycobacterium tuberculosis 138, 291 Mycobiont 343-344 Mycolsäuren 291 Mycoplasma 5 Mycoplasmen 333 Mycospharaella pini 340 Mykorrhiza 333 Mykotoxine 338 Myrica gale 330 Myrothecium verrucaria 217 Myxobakterien 51 Eigenschaften 51 Lebenscyclus 51 Vorkommen 51 Myxococcus xanthus 52 Myxococcus sp. 52, 59 Myxosporen 51-52, 59

N N2O-Reduktase 91 Nacheindicker 301 Nachrotte 304 Nachwachsende Rohstoffe 163

NAD(P)H-Ferredoxin-Oxidoreduktase 96 NAD/H  NicotinsäureamidDinucleotid Nährstoffe 6 Nahrungsketten 10, 12, 300 Nalidixinsäure 137 Nannocystis sp. 52 Nanoarchaeum equitans 5-6 Nanobakterien 5 Naphthalin-Dioxygenase 132 Napoleon 89 Nassvergärung 310 Natrialba aegyptia 174 Natrialba sp. 101 Natriumazid 70 Natriumgradient 79 Natriumlaurylsulfat 271 Natronobacterium sp. 101 Natto 60, 175, 183, 193, 195, 198 Herstellung 195 Weltjahresproduktion 195 Zusammensetzung 194 Naturkautschuk  Kautschuk Nekrosen 334 Nematocysten 174 Neocallimastix frontalis 217 Neomycin 137 Neuberg, Carl 119 Neubergsche Vergärungsformen 119-120, 129 Neutralismus 17 NH3  Ammoniak Nickel 7, 96 Nicotiana glutinosa 247-248 Nicotiana tabacum 246-248 Nicotinsäureamid-Dinucleotid 47, 119 Redoxpotential 88 Nilrot 264, 383-384 Nitrapyrin 89 Nitrat 88-89 reduzierende Bakterien 224 Nitrat-Reduktase 91 Nitratreduktion 13 assimilatorisch 92 dissimilatorisch 92 Nitrifikation 12, 88-89, 300-301 Nitrifikationshemmer 89  Cyanoguanidin  Etridiazol  Nitrapyrin Nitrit 88-89, 390 Nachweis 382-383 Nitrit-Oxidase 88 Nitrit-Reduktase 91 Nitritreduktion 13 Nitrobacter winogradsky 88

442

8 Stichwortverzeichnis Nitrococcus mobilis 88 Nitrogenase 7, 13, 81, 96, 327 Enzymaktivität 81 Nitroglycerin 119, 121 Nitroreduktase 253 Nitrosococcus oceani 88 Nitrosolobus multiformis  Nitrosospira multiformis Nitrosomonas europaea 88 Nitrosospira briensis 88 Nitrosospira multiformis 88 Nitrospina gracilis 88 Nitrospira marina 88 Nocardia autotrophica  Pseudonocardia autotrophica Nocardia sp. 209 Nodulationsfaktoren 329 Nogall™ 336 Nopalin 335 Nordseeküste 350 NO-Reduktase 91 Nosokomialinfektionen 138 Nostoc punctiforme 81, 328 Nostoc sp. 101, 344 Novobiocin 137 Nucleocapsid 239-240 Nystatin 137

O Oberflächen-Prozess 125 Objektmikrometer 375 Obstessig 188 Öchslegrad 322-323 Octan 221 Octanzahl 116 Oenococcus oeni 75 Oenococcus sp. 320 Öffnungswinkel 374 Ökologische Nische 9 Ökologischer Standort 9 Ökosystem 9 Ölweide 330 Opine 335 Opin-Permease 336 Oplophorus gracilorostris 47 Optische Dichte 391 Optisch-Enzymatischer Test 393 Ordnung 3 Organophosphorherbizide 233 origin of transfer 277 ortho-Spaltung 223 Oscillatoria sp. 101 overlay agar plates 205 Oxidase-Test 380 β-Oxidation 221 Oxidoreduktase 188 Oxoesterbindungen 202 Oxygenase 208, 220, 223 Oxytetracyclin 137

P Paecilomyces variotii 25 Paenibacillus polymyxa 60, 81, 137, 213 Paenibacillus popilliae 60 Pantoea stewartii 334 Päonidin 323 Papier und Pappe 217-218 Herstellung 218 Weltjahresproduktion 217 PAPS  Phosphoadenosin-5’phosphosulfat Paracoccus denitrificans 35, 92, 96, 106 Paracoccus pantotrophus 106 Paraquat 234 Parasitäre Kultivierung 341 Parasitismus 17 Parasponia andersonii 329-330 Parasporalkristall 140 Pasteur, Louis 63, 150 Pasteureffekt 114 Pasteurisierung 60, 317, 358 Pathogene Mikroorganismen 22-23 Pathovar 3 Paucimonas lemoignei 204-205 Pectin 145 Pectobacterium carotovorum 217, 333-334 Pectobacterium chrysanthemi 334 Pediococcus pentosaceus 185, 326 PEG  Polyethylenglycol PEG-Acetaldehyd-Lyase 230 PEG-Dehydrogenase 230 Pektinasen 333 Pelargonidin 323 Pelobacter venetianus 229-230 Pelodictyon sp. 101 Penicillin 136-138 Penicillium griseofulvum 137 Penicillium notatum 136-137 Peptid-Antibiotika 137 Peptolytischen Bakterien 184 Percoll™ 263 Perithezien 339 Permease 257 Peronospora tabacina 340 Persistenz 229 Petunidin 323 Pfeiffersches Gemisch 345 Pflanzenpathogen 340 Pflanzenviren 239 PGA  Poly(γ-D-glutamat) PGA-Hydrolasen 175 PGA-Synthethase 174 phaCAB Operon 162 PHA-Depolymerase 203 extrazellulär 204

intrazellulär 203 PhaG  3-Hydroxyacyl ACP:CoA-Transferase Phagovar 3 Phänotyp 2 Pharmacia 150 Phaseolus sp. 330 PHA-Synthase 162, 168, 202, 262 Phausis splendidula 47 PHB  Poly(3-hydroxybutyrat) Phenylalanin 217, 222 Phloem 333 Phosphinothricin 234 Phosphinothricin-Transacetylase 237 Phosphoadenosin-5’-phosphosulfat 109 Phosphofructokinase 279 Phosphoglucomutase 154 Phosphoketolase 71, 74 Phosphomannose-Isomerase 158 Phosphomannose-Mutase 158 Phosphor Entfernung aus Abwasser 300 Phosphor-Kohlenstoff-Lyase 237 Phosphotransacetylase 71, 78, 110, 115 Photinus pyralis 47 Photoautotrophie 11 Photobacterium leiognathi 47 Photobacterium phosphoreum 47 Photoblepharon palpebratus 46-47 Photooxidation 131 Photorhabdus luminescens 46-47 Photosensibilisierung 44 Photosynthese 99-104 anoxygen 99-100, 105, 351 oxygen 99-100, 351 Phototaxis 43 Phycobilin 101 Phycobiont 343-344 Phycocyanin 101 Phycoerythrin 101 Phylogenie 2 Phylum 4 Physarum polycephalum 202 Phytohygiene 246, 248 Pichia burtonii 198 Pichia sp. 321 Pigmente 44, 67 Pili 53 Pilze 136 Pilzsporen 45 Pisum sp. 330 Plaques 243 Plasmide Isolierung 385 pAgK84 336

8 Stichwortverzeichnis pAL5000 291 pAS300 279 pBHR68 273 pBluescript SK- 132, 275 pBR325 283 pCG79 291-294 pMa/c5-914 180 pNOC 336 pOCT 168-169, 221, 225 pRP4 278 pSUP5011 250, 283-284, 291 pTiC58 335 pTOL 225 pVK101 278 pWWO 225 Replikation 273, 278 root inducing 334 Transfer 277 tumor inducing 334-335 Typen 273 Plasmodiophora brassicae 246, 309 Podetium 345 Poly(3-hydroxybutyrat) 7, 36, 83, 161-166, 178, 262, 274 Abbau 202 Kreislauf 202 Syntheseweg 162 Poly(3-hydroxybutyrat-co-3-hydroxyvalerat) 202 Poly(3-hydroxyoctanoat) 67, 203 Poly(3-hydroxyvalerat) 56 Poly(4-hydroxybutyrat) 202 Poly(ε-L-lysin) 174 Poly(γ-D-glutamat) 60, 174, 176, 194 Biosynthese 174 Verbreitung 174 Polyacrylsäure 179 Polyamid-Synthetasen 174 Polyangium sp. 52 Polyasparaginsäure 179 Polyester 75 Polyether 228 Polyether-Antibiotika 137 Polyethylenglykol 228-232 Abbau 228 Eigenschaften und Anwendungen 229 Weltjahresproduktion 228 Polyhydroxyalkanoate 161, 167-172, 202, 257 Abbau 202-205 Anwendungen 163, 170, 204 aus nachwachsenden Rohstoffen 163 Bestimmung 404 Biosynthese 169 Eigenschaften 169

443 Färbung 383 Grana 161-162, 264 in transgenen Pflanzen 163 kurzer Kettenlänge 167 mittlerer Kettenlänge 67, 167 Mutanten 264 Verbreitung 202 Polyhydroxyfettsäuren  Polyhydroxyalkanoate Polyketid-Antibiotika 137 Polylactid 75 Polymalat 202 Polymere  Exopolysaccharide,  Polyhydroxyalkanoate Polymerisationsgrad 169 Polymyxin 60, 137 Polyosen 216-217 Polyphasische Taxonomie 67 Polypropylenglykol 228 Polysaccharide in Pflanzen 145 Vorkommen 145  Alginat,  Cellulose,  Dextran,  Lävan,  Pullulan,  Xanthan Polytetramethylenglykol 228 Polyvinylpyrrolidon 263 PQQ  Pyrrolochinolinchinon Prevotella ruminicola 78 Primärproduzenten 11 Primärstoffwechsel 119 Prochloron sp. 101 Prochlorophyten 100-101 Prochlorothrix sp. 101 Prokaryonten 1 Prokarzinogen 253 Promutagen 253 1,3-Propandiol 121 Prophagen 241 Propionat CoA-Transferase 78 Propionibacterium acnes 78-79 Propionibacterium freudenreichii 78 subsp. shermanii 79 Propionibacterium sp. 77 Propionibakterien biotechnologische Bedeutung 79 Propionigenium modestum 78 Propionsäure 77-78, 326 Propionsäuregärung 77-78 Proteinbestimmung 392 Proteinbiosynthese 174 Proteine 2, 174 Trennung und Nachweis 405 Proteobacteria 4 Protocatechuat 223 Protohäm 330 Protol-Prozess 119

Protonenpumpe 101 lichtgetrieben 102 Prototrophie 8, 251, 270 Pseudokatalase 70 Pseudomonaceae 333 Pseudomonaden 67 fluoreszierende 66 Gattungen 67 Pseudomonas aeruginosa 67, 202, 229 Pseudomonas cichorii 334 Pseudomonas denitrificans 79 Pseudomonas lemoignei  Paucimonas lemoignei Pseudomonas marginalis 334 Pseudomonas mendocina 202 Pseudomonas oleovorans 167-172, 202, 226-227 Pseudomonas putida 169, 202, 221, 226-227 Pseudomonas saccharophila 96 Pseudomonas stutzeri 92, 229 Pseudomonas syringae 334 pathovar tabaci 4 pathovar tomato 4 Pseudomonas viridiflava 334 Pseudonocardia autotrophica 96 Pseudoplastizität 146 Puccinia graminis 340 Puccinia striiformis 340 Pullulan 145, 213 Pullulanase 214 Punktmutation 262 Puromycin 137 Purpur 131 Purpurbakterien 100-101 Purpurmembran 79, 101 Purpurschnecken 131 Purpurschwefelbakterien 351 Pyoverdine 68 Pyricularia oryzae 340 Pyrit 106, 351 Pyrophosphatase 154 Pyrophosphorylase 158 Pyrrolochinolinchinon 128, 188 Pyruvat 78, 115, 223, 320 Pyruvat:Ferredoxin-Oxidoreduktase 63, 78, 86, 96, 110, 115 Pyruvat-Carboxylase 125 Pyruvat-Decarboxylase 114, 119, 314, 319 Pyruvat-Dehydrogenase Komplex 125 Pyruvat-Formiat-Lyase 97, 115

Q Qualitätswein 323 quorum sensing 48

444

8 Stichwortverzeichnis

R Rabies-Virus 26 Ralstonia eutropha 34, 36, 92, 96, 132, 161-163, 167, 202, 257, 262-267, 274, 277-278 Klasse-I Mutanten 258 Klasse-II Mutanten 258 Ralstonia metallidurans 96 Ralstonia solanacearum 334, 340 Rasterschubmutation 253 Rattenleber 253 Rauchbier 317 Raumluft 37 Rebsorten 322 recE-Gen 270 Rechenanlage 301 Reichstein-Grüssner-Verfahren 128, 190 Reinheitsgebot 314 Reinzuchthefen 321 Reis-Koji 193 Renilla reniformis 47 Rentierflechte 346 Replikationsursprung 278, 291 Reportergene 49 Reserveantibiotikum 138 Resistenzmechanismen 138 Resistenz-Plasmide 138, 273 Reststoffe 207 Retardsysteme 175 Retroviren 244 Reverse Transkriptase 244 rfa-Gen 252 Rhizobiaceae 328, 333 Rhizobienpräparat 331 Rhizobium leguminosarum 330 biovar phaseoli 3 biovar trifolii 3 Rhizobium radiobacter 154, 236, 329, 333-337 Rhizobium rhizogenes 334 Rhizobium rubi 334 Rhizobium tropici 330 Rhizobium vitis 334 Rhizobium sp. 329-330 Rhizopus microsporus 183, 197, 199 Rhizopus niveus 213 Rhodobacter capsulatus 85 Rhodobacter sphaeroides 85 Rhodobacter sp. 101 Rhodoblastus acidophilus 229 Rhodococcus fascians 334 Rhodococcus opacus 96 Rhodomicrobium sp. 101 Rhodopseudomonas acidophila  Rhodoblastus acidophilus Rhodopseudomonas sp. 101 Rhodospirillum rubrum 85, 202

Rhodospirillum sp. 101 Rhodotorula rubra 198 Riboflavin 79 Ribulose-1,5-bisphosphat-Weg 11, 88, 96, 99-101, 222 Ribulosemonophosphat-Cyclus 222 Rifamycin 137 Riftia pachyptila 106 Risikobewertung 26 RKI  Robert Koch Institut RNA-Profile 2 Robert Koch Institut 24 Roggen 338 Roggenbier 317 Rohrzucker 115 Rohstoffe, nachwachsende 163 Roseococcus sp. 101 Rotte 305-309 Verlauf 305 Rottetrommeln 306 Roundup®  Glyphosat Roundup Ready® 236 16S rRNA 2-3 Rubredoxin 221 Rubredoxin-Reduktase 221 Rubrivivax sp. 101 Ruminococcus albus 217 Rutenstrauch 330

S

S9-Extrakt 253 Saccharomyces cerevisiae 30, 33, 64, 114-119, 214-215, 314, 316, 319, 321-324 industrielle Verwendung 114 Saccharopolyspora erythraea 137 Saccharose 150, 263, 326 Saccharum officinarum 329-330 Salami 74 Salmonella senftenberg 246 Salmonella typhimurium 251 Salmonella sp. 309 Salpetersäure 89 Salpetrige Säure 259, 262 Salzlake 183 Sandaracinobacter sp. 101 Sanddorn 330 Sandfang 301 Sarcina ventriculi 153 Sauerkraut 74, 183-187, 193 Unterschiede zu Silage 185 Sauerstoff 114, 297 Schutz vor 327 Sauerteig 74 Säure Toleranz 107 Schaumwein 324 Schlammentwässerung 301

Schlammwasserspeicher 301 Schleimausscheidung zur Bewegung 53 Schleimhülle 353 Schroten 316 Schulz, E. 350 Schwarzerle 330 Schwefel elementarer 105 oxidierende Bakterien 105 Schwefelatmung 15 Schwefelbakterien, farblose 105 Schwefeldioxid 321 Schwefelfreie-Purpurbakterien 102 Schwefelpurpurbakterien 100 Schwefelsäure Toleranz 107 Schwefelwasserstoff 14-15, 99-100, 102, 105-106, 300, 310 Schweizer Käse 77, 79 Sclerotinia sclerotiorum 340 Scorbut 186 SDS  Natriumlaurylsulfat Seanothus americanus 330 Secale cereale 338 Seckelblume 330 Seife 121 Sekundäre Gärung 77 Sekundärmetabolismus 51, 340 Selbstaggregation 246 Selbstbräuner 127 Selektorbecken 301 Selenomonas ruminantium 78 self assembly 239, 241, 246 Seliberia carboxydohydrogena 95-96 Sephadex®  Dextran Serin-Weg 222 Serovar 3 Sesbania rostrata 330 Sex-Pili 277 Shelford 6 Shepherdia argenta 330 Shigella sp. 240 Shikimat-Weg 233 Sicherheitsmaßnahmen 27-28 Sicherheitsstufen 23 Siderophore 68 Siegesgärten 89 Signalsubstanz 52 Silage 75, 186, 325-327 Unterschiede zu Sauerkraut 185 Silberwurz 330 Siliciumpartikeln 263 Siliergut 325 Siliermittel 326

8 Stichwortverzeichnis Singulett-Sauerstoff 44 Sinorhizobium fredii 330 Sinorhizobium meliloti 330 Sinorhizobium sp. 329 Sklerotium 338-339 SO2  Schwefeldioxid Sojabohne 330 Sojasauce 193 Sorangium cellulosum 217 Sorangium sp. 52 Soredien 345 Spatelplattenverfahren 366 Spätlese 322 Speicherstoff 161, 168, 203 für Energie 178, 202 für Kohlenstoff 36, 168, 202, 262 für Stickstoff 178 Spezies 3 Sphingomonas macrogoltabidus 229 Sphingomonas terrae 229 Spiroplasma citri 334 Spiroplasma kunkelii 334 Sporenfärbung 379 Sporocytophaga sp. 59 Sporohalobacter 59 Sporohalobacter 62 Sporomusa sp. 59, 62 Sporulation 59 Spritessig 188 Spurenelemente 7  Mikroelemente St. Antonius-Feuer 340 Stammwürze 316-317 Stängelknöllchen 329-330 Staphylococcus epidermidis 198 Stärke 145 Abbau 212, 214 Färbung 384 Verflüssigung 214 Starterkulturen 194, 198, 321, 326 Startermolekül 178 Stationäre Phase 35 Steinbier 317 Sterilität 358 Stickstoff Entfernung aus Abwasser 300 Fixierung 13, 81, 328, 344 Fixierung, aerob 82 Fixierung, anaerob 85 Fixierung, symbiontisch 327, 331 Stickstoffkreislauf 12-14 Stickstoffverluste 89, 93 Stigmatella sp. 52 Stoffkreisläufe 10 Stratagene 19

445 Strauchflechte 344 Streptococcus faecalis 185 Streptococcus mutans 71 Streptococcus salivarius 70-71 Streptomyces aureofaciens 137 Streptomyces cinnamonensis 137, 209 Streptomyces fradiae 137 Streptomyces fulvissimus 137 Streptomyces griseus 137-139 Streptomyces hachijoensis 139 Streptomyces kanamyceticus 137 Streptomyces lividans 217 Streptomyces noursei 137 Streptomyces orchidaceus 137 Streptomyces peucetius 137 Streptomyces rimosus 137 Streptomyces thermoautotrophicus 81-82 Streptomyces verticillus 137 Streptomycin 137-138, 282-283 Stresssituationen 16 Stromatolithe 350 Suberin 202 Submersverfahren 125, 189 Subspezies 3 Substratkettenphosphorylierung 78, 92 Substratspektrum 257 Succinat Decarboxylierung 78 Sudanschwarz 264, 383 Sudprozess 316 Suizidplasmid-Technik 284, 291 Sukzession 185 Sulfanilamid 137 Sulfat 14-15, 108-109 Reduktion, assimilatorisch 109 Reduktion, Bakterien 102, 108-111, 224 Reduktion, dissimilatorisch 109 Sulfat-Reduktion assimilatorisch 14 dissimilatorisch 14 Sulfid 105, 109 Sulfit 109 Sulfit-Reduktase 109 Sulfolobus acidocaldarius 107 Sulfolobus sp. 106 Sulfonamide 136 Sumerer 318 Sumpfgas 347-348 Superabsorber 175 Suppline 70, 251, 270 Süßreserve 322 Süßwasserstandort 348 Symbiose 17 mutualistisch 343

Synchronisiertes Wachstum 35 Synechococcus sp. 101 Synergismus 17 Synthesekautschuk 64 Weltjahresproduktion 207 Syntrophismus 17

T

Tabak-Mosaik-Virus 239-240, 246-248, 309 Tabakpflanzen 246 Tafelwein 323 Tapé 193 Taschenlampenfisch 46 Taxonomie 1, 67 polyphasisch 2 Taxonomische Zuordnung 27 TCC  Citrat-Cyclus T-DNA 335 Teilungsrate 36-37 Tempeh 183, 193, 197-199 Termiten 85 Tetracyclin 137-138, 283 Textilfärbestoff 346 Thais lapillus 131 Thallus 344-345 Thauera aromatica 224 The Prokaryotes 4 Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes 213 Thermobifida fusca 217 Thermodesulfobacterium commune 110 Thermodesulforhabdus norvegica 110 Thermoplaste 262 Thiamin 114, 195 Thiobacillus ferrooxidans  Acidithiobacillus ferrooxidans Thiobacillus neapolitanus  Halothiobacillus neapolitanus Thiobacillus perometabolis  Thiomonas perometabolis Thiobacillus thiooxidans  Acidithiobacillus thiooxidans Thiobacillus thyasiris  Thiomicrospira thyasirae Thiocapsa sp. 101 Thiomargarita namibiensis 5-6, 106-107 Thiomicrospira sp. 106 Thiomicrospira thyasirae 107 Thiomonas perometabolis 106 Thiopedia rosea 351 Thioploca chileae 107 Thiosphaera pantotropha  Paracoccus pantotrophus

446

8 Stichwortverzeichnis Thiospirillum jenense 5 Thiospirillum sp. 101 Thiosulfat 105, 109 Thiovulum majus 107 Thomazählkammer 375-376 Thyasira flexuosa 106-107 Thymin 262 Dimere 44 van Tieghem, Philippe-ÉdouardLéon 150 Tierversuche 251 Tierviren 239 Tilletia indica 340 Ti-Plasmid 334 TMV  Tabak-Mosaik-Virus α-Tocopherol 44 Toluol anaerober Abbau 224 Tolypocladium inflatum 137 Tomatensamen 246, 309 Toner 218 Topoisomerase 335 Toxin-Plasmide 273 tra-Gene 278 Transacetylase 158 Transaldolase 71 Transduktion 269, 290 Transfektion 269, 290 Transfer-(tra-)Gene 277 Transferstartpunkt 277 Transformation 269, 290, 386 Transition 262 Transketolase 71 Transposase 282, 291 Transposition 282 Transposon Tn5 250, 282-284 Transposon Tn611 291 Traubenmost 321 Trebouxia sp. 344 Treibhauseffekt 310 Treibhausgase 93, 347 Trennverfahren Chromatographie 150 Trentepohlia sp. 344 Trester 321 Trichoderma reesei 217 Trichoderma viridis 217 Trichomonas vaginalis 97 Trichothecen 338 Trifolium sp. 330 Triglyceride 264 Trimethoprim 137 Trinkwasser 37 Aufbereitung 93 Trithionat 109 Triticum spelta 338 Trockenbeerenauslese 322 Trockenmasse Bestimmung 403

Trockenvergärung 310 Tropfkörper 301 Trübungsmessung 391 Trunculariopsis trunculus 131 Trypanosoma cruzi 26 Tryptophan 56, 132, 222, 270 Auxotrophie 270 Tunnelkompostierung 305 Tusche-Kontrastierung 83, 376 Twort, Frederick William 240 Typstamm 3 Tyrosin 217, 222

U

Umweltisolat 27 Umweltmikrobiologie 15 unvollständige Oxidation 125, 128 Uracil 388 Urease 7 Uronsäure Bestimmung 402 Usninsäure 346 Ustilago maydis 340 uvrB-Gen 252 UV-Strahlung 8

V

Vakuole 106-107 Vakuumverdampfung 317 Valinomycin 137 Vancomycin 137 Vegetativer Cyclus 52 Veillonella alcalescens  Veillonella parvula Veillonella parvula 78 Verdickungsmittel 175 Verdopplungszeit 36 Verdünnungsreihe 363 Vereinzelungstechniken 363 Vermehrung sexuell 345 vegetativ 345 Verpackungsmaterial 162 Vibrio cholerae 46 Vibrio fischeri 47-48 Vibrio harveyi 47 Vibrio logei 47 Vibrio orientalis 47 Vibrio parahaemolyticus 46 Vibrio splendidus 47 Violacein 55-58 Struktur 56 Viren helicale 246 Nukleinsäure-Typ 239-240 sphärische 246 Symmetrie 239 temperente 240

virulente 240 Virionen 239 Virulenzfaktoren 68 Virulenzgene 335 Virulenz-Plasmide 273 Viruspartikel 239 Vitamin B1  Thiamin Vitamin B2  Riboflavin Vitamin B12  Cyancobalamin Vitamin C  Ascorbinsäure Vitamin D  Cholecalziferol Vitamin E  α-Tocopherol Vitis silvestris 318 Vitis vinifera 318, 322, 334 Volta, Alessandro 348 Volta-Experiment 347 Vorklärbecken 301 Vorrotte 304, 307

W Wachsester 264 Wachstum diauxisches 35 Phasen 35 Wachstumsrate 36-37 Waksman, Selmon 138 Waschmittel 121, 218 Wasserstoff 81, 115, 224, 300, 310, 348 Herkunft 96 Verwertung 95 Watt 350 Wattestäbchen-Ausstrich 367 Wehenmittel 340 Weichfäule 333 Wein 318-324 Anbaugebiete 319 Herstellung 319, 321 Prädikatsstufen 322 Qualitäten 323 Roséwein 323 Rotwein 322 Schwefelung 321 Süßegrad 322 Weißwein 322 Weltjahresproduktion 318 Weinessig 188, 244, 324 Weinsäure 320 Weinstein 320 Weißfäule 217 Weißkohl 183 Weißpocken-Virus 26 Weizenbier 317 Weizmann, Chaim 64 Weltjahresproduktion Alginat 159 L-Ascorbinsäure 128 Citronensäure 124 Cyanocobalamin 79

8 Stichwortverzeichnis Dextran 151 Essig 189 Ethanol 116 Kautschuk 207 Natto 195 Papier und Pappe 217 Polyethylenglykol 228 Synthesekautschuk 207 Xanthan 147 Wiederkäuer 77 Winogradsky, Sergej 85, 89, 102, 105 Winogradsky-Säulen 102 Winzereien 318-324 Witholt, Bernhard 168 Wolinella succinogenes 95 Wurfgröße 241 Würze 316 Wurzelhalsgallen 334-335 Wurzelknöllchen 82, 329-331 Bildung 329 Wurzeln 212

447 chemische Struktur 146 Weltjahresproduktion 147 Xanthan Gum 146 Xanthin 388 Xanthobacter autotrophicus 81, 96 Xanthomonas albilineans 334, 340 Xanthomonas axonopodis 334 Xanthomonas campestris 145-148, 334, 340 Xanthomonas fragariae 334 Xanthomonas populi 334 Xenobiotika 229 Xerographie 218 Xylanasen 333 Xylella fastidiosa 333-334 Xylem 333 Xylen-Oxidase 132 Xylophiluss ampelinus 334 Xylose 217 Xylulosemonophosphat-Cyclus 222

Y X

Xanthan 145-148

Z

Zählkammer 375-376 Zearalenon 338 Zeilenkompostierung 305 Zellaggregate 83, 153 Zelldifferenzierung 52, 59 Zellgröße 5 Zellteilung 34 Zellzahl Methoden zur Bestimmung 30, 37 Zentrale Kommission für die Biologische Sicherheit 24 ZKBS  Zentrale Kommission für die Biologische Sicherheit ZKBS-Stellungnahme 27 Zönose 298 Zoogloea ramigera 153 Zuckerrohr 329-330 Zuckerrübenmelasse 115 Zweiteilung 34 Zymomonas mobilis 114-115

Yarrowia lipolytica 124 Yukiwari-Natto 193

Quellenverzeichnis Alle Fotographien wurden am Institut für Mikrobiologie der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster aufgenommen. Folgende Aufnahmen wurden mit freundlicher Genehmigung gedruckt: Abb. 3.12 (S. 49): Maria Meyer, Institut für Mikrobiologie und Genetik der Georg August-Universität, Göttingen; Abb. 3.28 (S. 79): Käshütt'n Garmisch, Harald Wandelnig, Garmisch-Partenkirchen; Abb. 3.63 (S. 132): aus Drewlo S et al. (2001) Applied and Environmental Microbiology 67: 1964-1969; Abb. 3.77 (S. 161): aus Pötter M et al. (2002) Microbiology 148: 2413-2426; Abb. 3.101 (S. 207): aus Arenskötter M et al. (2002) BIOforum 3: 124126; Abb. 3.128 (S. 267) aus Spiekermann P et al (1999) Archieves of Microbiology 171:73-80; Abb. 4.3 (S. 303): Mitte und rechts, Fa. Rethmann, Lünen; Abb. 4.8 (S. 310): Kurt Frunzke, bioteg GmbH; Abb. 4.14 (S. 325): Günter Kortmann, Landwirtschaftskammer Westfalen-Lippe, Münster; Abb. 4.28 (S. 351): www.rz.uni-frankfurt.de/~schauder/mats/microbial-mats.html