Brock Mikroorganizmaların Biyolojisi (Unit 4)

MİKROBİYAL ÜREMENİN KONTROLÜ

I

20.1 20.2 20.3

II 20.4 20.5

III

20.6 20.7 20.8

Mikrobiyal üremeyi kontrol etmek amacıyla çeşitli fiziksel, kimyasal ve biyolojik yöntemler kullanılır. Şekilde, filtre üzerinde tutulan bir mikroorganizma popülasyonu görülmekte olup, filtreler genelde sıvı ortamdan mikroorganizmaları ayırmak veya sıvıları sterilize etmek amacıyla kullanılır.

20.9

IV

FİZİKSEL ANTIMIKROBIYAL KONTROL Isıyla Sterilizasyon Radyasyonla Sterilizasyon Filtre ile Sterilizasyon KİMYASAL ANTİMİKROBİYAL KONTROL Üremenin Kimyasal Kontrolü Harici Olarak Kullanılan Kimyasal Antimikrobiyal Maddeler İN VIVO OLARAK KULLANILAN ANTİMİKROBİYAL ETKENLER Sentetik Antimikrobiyal İlaçlar Doğal Antimikrobiyal İlaçlar: Antibiyotikler /3-Laktam Antibiyotikleri: Penisillinler ve Sefalosporinler Prokaryotlardan Elde Edilen Antibiyotikler VİRÜSLER VE ÖKARYOTİK PATOJENLERİN KONTROLÜ

20.10 Antiviral İlaçlar 20.11 Antifungal ilaçlar V

ANTİMİKROBİYAL İLAÇ DİRENCİ VE İLAÇ KEŞFİ

20.12 Antimikrobiyal ilaç Direnci 20.13 Yeni Antimikrobiyal ilaçların

Araştırılması

671 671 673 675

677 677 679

681 681 685 686 687

688 688 691

692 692 697

669

670 • Bölüm 20 • Mikrobiyal Üremenin Kontrolü

BOLÜMLE İLGİLİ SOZLUK Aminoglikozit streptomisin gibi, birbirine glikosidik bağlarla bağlanmış amino şekerleri içeren antibiyotik Antibiyotik bir mikroorganizma tarafından üretilen veya diğer mikroorganizmayı öldüren veya gelişmesini engelleyen kimyasal madde Antımikrobiyal ilaç direnci bir mikroorganizmanın genelde duyarlı olduğu bir antimikrobiyal ilaç mevcudiyetinde kazanılmış gelişme yeteneği Antimikrobiyal madde mikroorganizmaları öldüren veya gelişimlerini engelleyen kimyasal bileşik Antiseptik (germisit) mikroorganizmaları öldüren veya gelişmelerini engelleyen ve canlı dokular üzerinde uygulanabilecek seviyede nontoksik olan kimyasal etken /3-laktam antibiyotiği penisilini de dahil olmak üzere dört-üyeli heterosiklik /3-laktam halkası içeren antibiyotik Bakteriyosidal etken bakterileri öldüren etken Bakteriyostatik etken bakteriyal gelişime engel olan etken Dekontaminasyon objeleri ve cansız yüzeyleri kullanıma güvenli hale getiren işlem Dezenfeksiyon cansız objelerden veya yüzeylerden mikroorganizmaların elimine edilmesi Dezenfektan sadece cansız objeler üzerinde kullanılan antimikrobiyal etken Fungisidal etken funguslan öldüren etken Fungistatik etken fungal gelişime engel olan etken

Füzyon inhibitörü viral ve hedef hücre zarlarının füzyonunu bloke eden peptit Geniş-spektrumlu antibiyotik hem gram-pozitif hem de gram-negatif bakteriler üzerine etki eden antibiyotik Germisit (antiseptik) mikroorganizmaları öldüren veya gelişmelerini engelleyen ve canlı dokulara uygulanabilecek düzeyde nontoksik kimyasal etken HEPA filtre laboratuvarlarda ve endüstride mikroplar da dahil olmak üzere hava akışının giriş veya çıkışından partikülleri uzaklaştırmak için kullanılan yüksek etkinlikte partikül hava fütesi (Mgh efficiency particulate «ir filter) tnhıbisyon mevcut organizmaların sayısındaki azalma veya mikrobiyal çevredeki değişikliklerden dolayı mikrobiyal _ gelişimde azalma tnterferon virüs ile enfekte olmuş hücreler tarafından üretilen sitokin proteinleridir. Yakın hücrelerde sinyal transdüksiyonuna neden olarak antiviral genlerin transkripsiyonu ve antiviral proteinlerin ifadesini sağlar. Kemoterapötik madde dahili olarak kullanılabilen antimikrobiyal etken Liziz sitoplazmik bileşenlerin serbest kalmasıyla hücresel bütünlüğün yok olması MIC minimum inhibitör konsantrasyonumikrobiyal gelişmenin engellenmesi için gerekli minimum madde konsantrasyonu NNRTI non-nükleozit ters transkriptaz inhibitörü NRTI nükleozit ters transkriptaz inhibitörü

u bölümle, mikroorganizmalar ve insanlar arasındaki ilişkiye ilk adımı atıyoruz ve mikrobiyal üremeyi kontrol etmek için kullanılan madde ve yöntemler ile başlıyoruz. Bazı durumlarda, besi yerindeki tüm canlı organizmaların öldürülmesi veya ortadan kaldırılması olarak tanımlanan sterilizasyon işlemi ile mikrobiyal üremeyi tamamen ortadan kaldırabiliriz. Örneğin bakterileri öldüren veya yok eden maddeler bakteriyosidal olarak isimlendirilir. Bununla beraber, sterilizasyon çoğu zaman uygulanamaz, ancak inhibisyon adı verilen bir işlem ile üremelerini engelleyerek yine de etkili bir şekilde mikroorganizmaları kontrol edebiliriz. Bakteriyal üremeyi inhibe eden maddelere bakteriyostatik maddeler denir. Mikrobiyal gelişimi hızlı bir şekilde inhibe eden metotlar arasında dekontaminasyon ve dezenfeksiyon yer almaktadır. Dekontaminasyon, yüzeyin veya objelerin kullanımlarını güvenli olması için yapılan uygulamadır. Örneğin, yemekten sonra masanın basitçe silinmesi kontaminasyona sebep olan mikroorganizmaları ve bunların potansiyel besinlerini ortadan kaldırır. Bunun aksine, dezenfeksiyon, her ne kadar tüm mikroorganizmaları ortadan kaldırmasa da direkt olarak patojenleri hedef alır. Dezenfektan olarak isimlendirilen özel

B

Otoklav basınç altında sıcaklık ve buharla mikroorganizmaları yok eden bir sterilizatör Pastörizasyon hastalığa neden olan mikroorganizmaları öldürmek ve bozulmalara neden olan mikroorganizmaların sayısını azaltmak amacıyla ısıya duyarlı sıvılardaki mikrobiyal yükün azaltılması Penisillin /6-laktam halkası ile karakterize edilen ve bakteriyal hücre duvar sentezini engelleyen bir antibiyotik sınıfı PI proteaz inhibitörü Quinolon DNA giraz enzimi üzerinden bakteriyal DNA'nm süpersarmal oluşturmasına engel olan sentetik bir antibakteriyal madde Sanitizer mikrobiyal sayıyı güvenli kabul edilen bir seviyeye kadar indiren ancak tamamen yok etmeyen etken Sterilant (sterilizer)(sporicide) tüm mikrobiyal yaşam formlarını yok eden kimyasal etken Sterilizasyon üreme ortamından tüm canlı organizmaları ve virüslerim uzaklaştırma veya öldürme Tetrasiklin dört-halkalı naftasen yapı ile ..karakterize edilen bir antibiyotik Üreme faktörü analoğu üreme faktörü ile ilgili olan ve üreme faktörünün alımını bloke eden kimyasal etken Virisidal etken viral replikasyonu ve aktivitesini durduran etken Viristatik etken viral replikasyonu engelleyen etken Yan-sentetik penisillin kimyasal olarak değiştirilmiş doğal penisillin

bir takım kimyasal veya fiziksel maddeler mikroorganizmaları öldürebilir veya mikrobiyal üremeyi engeleyebilirler. Örneğin, seyreltilmiş beyazlatıcı (sodyum hipoklorit) solüsyonları gıdaların hazırlandığı alanları temizlemek için rutin bir şekilde kullanılmaktadır. Zaman zaman, tüm mikroorganizmaların ortadan kaldırılması gerekebilir. Her ne kadar başarı zor da olsa, sterilizasyon, kontaminasyona ve mikroorganizmaların üremesine tamamen engel olur. Örneğin mikrobiyolojik besiyerlerini hazırlarken veya ameliyat ekipmanlarını hazırlarken bu tür tedbirler gereklidir. Tüm dekontaminasyon ve sterilizasyon işlemlerinin amacı mikrobiyal yükü veya canlı mikroorganizmaların sayısını azaltmak veya tamamen ortadan kaldırmaktır. in vivo sistemde mikrobiyal kontrol çok daha zordur. Klinik olarak faydalı olan bakteriyosidal veya bakteriyostatik maddeler konukçu hücreye zarar vermeden mikrobiyal üremeyi azaltmak veya engellemek durumundadır. Çeşitli seçici doğal ve sentetik kemoterapötik maddelerle bu hedefe ulaşılabilir. Bu bölümde, ilk olarak in vitro sistemlerde kullanılan mikrobiyal kontrol yöntemlerini inceleyeceğiz. Daha sonra insanlarda in vivo kullanılan antimikrobiyal ilaçlardan sözedeceğiz.

20 1 • Isıyla Sterilizasyon • 671

I

FİZİKSEL ANTIMIKROBIYAL KONTROL

Fiziksel metotlar çoğu kez mikrobiyal dekontaminasyon, dezenfeksiyon ve sterilizasyonu sağlamak için kullanılır. Isı, radyasyon ve filtrasyon istenmeyen mikroorganizmaları ortadan kaldırabilir veya öldürebilir. Bu yöntemler mikrobiyal üremeye engel olur veya mikropları bulunduran maddeleri veya alanları dekontamine eder. Burada, bu yöntemlerin nasıl çalıştığını ve bazı pratik örnekleri tartışacağız.

Isıyla Sterilizasyon Mikrobiyal üremeyi kontrol etmek için kullanılan belki de en yaygın yöntem ısı uygulamasıdır ve bu kısımda ısı ile sterilizasyon işlemim inceleyeceğiz. Isı ile Sterilizasyonun Ölçümü

Tüm mikroorganizmalar için, daha üstünde canlılığın azaldığı bir maksimum üreme sıcaklığı bulunmaktadır. Oldukça yüksek sıcaklıklarda, neredeyse tüm makromoleküller denatürasyon olarak bilinen bir işlemle yapılarını ve işlevsel yeteneklerini kaybederler. Şekil 20.1 «'de gösterildiği gibi, ısıdan kaynaklanan ölüm logaritmik (birinci-sıra) bir fonksiyondur ve sıcaklık arttıkça daha hızlı bir şekilde meydana gelmektedir. Bu da her hangi bir zaman dilimindeki ölüm hızının, organizmaların o zaman dilimindeki konsantrasyonuna orantılı olduğu yani canlı hücrelerin belirli bir bölümünü (örneğin, % 90) öldürmek için gerekli olan zamanın, başlangıç hücre konsantrasyonuna bağımlı olmadığı anlamına gelmektedir. Dolayısıyla, eğer mikrobiyal popülasyonu sterilize etmek istiyorsak, yüksek sıcaklık İle kıyaslandığında bu işlemin düşük sıcaklıklarda gerçekleşmesi uzun zaman alacaktır. Spesifik her bir koşulda sterilizasyonu başarmak için zamanı ve sıcaklığı ayarlamak gerekmektedir.

m

S 100

Onda bire düşme zamanı (D)

100 ^

10

-

0.1

1 \ a O

Isının niteliği de oldukça önemlidir: Kuru ısı ile kıyaslandığında, nemli ısı daha iyi nüfuz edebilen bir güce sahiptir ve uygulanan sıcaklıkta yaşayan organizmaların sayısında hızlı bir şekilde azalmaya sebep olur. Uygulanan sıcaklıkta popülasyon yoğunluğunda 10-kat azalma için gerekli olan zaman onda bire düşme zamanı veya D olarak isimlendirilir ve ısı ile sterilizasyonu karakterize etmenin en kesin yoludur. Gıda hazırlanmasında {yani pişirme ve konserveleme) genelde kullanılan sıcaklık aralığının üzerinde, D ve sıcaklık arasındaki ilişki esas olarak logaritmiktir. Bu nedenle, D'nin logaritması sıcaklığa karşı çizildiğinde, düz bir çizgi elde edilir (Şekil 20.2*). Çizginin eğimi uygulanan koşullar altında organizmanın ısıya karşı hassasiyetini gösterir ve grafik, örneğin konserveleme operasyonlarında olduğu gibi sterilizasyonu başarmak için gerekli olan işlem zamanını hesaplamak için kullanılır («»öKısım 29.2). Onda bire düşme zamanının belirlenmesi çok fazla sayıda canlı hücre sayım ölçümlerini gerektirmektedir (öOoKısım 6.5). Organizmanın ısıya hassasiyetini karakterize etmenin en kolay yolu belirli sıcaklıkta hücrelerin tamamını öldürmek için gerekli olan zaman olarak tanımlanan termal ölüm zamanını ölçmektir. Termal ölüm zamanını belirlemek için hücre süspansiyon numuneleri farklı zamanlarda ısıtılır, kültür besiyeri ile karıştırılır ve inkübe edilir. Eğer hücrelerin tamamı ölmüş ise, inkübe edilmiş numunelerde üreme gözlemlenmez. Termal ölüm zamanı popülasyonun büyüklüğüne bağlıdır, çünkü küçük popülasyonlara kıyasla büyük olanlarda hücrelerin tamamını öldürmek için daha uzun zaman gereklidir. Hücrelerin sayısı standardize edildiğinde organizmaların belirli sıcaklıktaki termal ölüm zamanlarını karşılaştırmak suretiyle farklı organizmaların ısıya hassasiyetlerini kıyaslamak mümkündür.

0.1 10

20

\ 30

105 40

50

Zaman (dak)

• Şekil 20.1 Mezofilik bir bakterinin canlılığı üzerinde sıcaklığın etkisi. Onda bire düşme zamanı, D, üç farklı sıcaklıkta aynı mezofilik organizmadan elde edilir. D, orijinal organizma popülasyonunun sadece %10'unun verilen sıcaklıkta canlılığını koruduğu zamandır. 70°C için, D=3 dak; 60°C için, D=12 dak; 50°C için, D=42 dak.

110 115 120

125 130

Sıcaklık (°C)

• Şekil 20.2 İki farklı organizma için onda bire düşme ile gösterilen sıcaklık ve ölüm hızı arasındaki ilişki. Onda bire düşme zamanlan, D, için veriler Şekil 20.1 de olduğu gibi çeşitli farklı sıcaklıklarda elde edilmiştir. Tipik bir mezofil olan (a) organizmasını 110°C de 20 saniyeden daha az tutmak onda bire düşüşe sebep olurken termofil olan (b) organizmasında onda bire düşüşe ulaşmak için 10 dak gerekmektedir.

672 • Bölüm 20 • Mikrobiyal Üremenin Kontrolü

Endosporlar ve Isı ile Sterilizasyon Aynı organizmanın vejetatif hücrelerinin ve bakteriyal endosporlarınm ısıya direnci oldukça değişmektedir. Örneğin, otoklavda (aşağıya bakınız) normal olarak 121 °C sıcaklığa ulaşılabilir. Bu koşullar altında, endosporlar onda bire düşüş için 4-5 dakikaya ihtiyaç duyarlarken vejetatif hücreler 65°C de sadece 0.1-0.5 dakikaya ihtiyaç duyarlar. Bu varyasyondan dolayı, endosporları ortadan kaldırmak için etkili ısı sterilizasyon işlemlerinin tasarlanması gerekmektedir. Bakteriyal endosporlar, aynı türün vejetatif hücrelerini hızlı bir şekilde öldüren ısıda yaşayabilirler. Isıya dirençte en büyük faktör endospor içerisindeki suyun miktarı ve durumudur. Endospor oluşumu esnasında, Ca2+-dipikolinik asit kompleksi ve küçük, asitte çözünen spor proteinlerinin (SASP) birikmesinin sonucu olarak protoplazma minimum hacme kadar iner (öocsKısım 4.13). Bu karışım sitoplazmada bir jel oluşturur ve protoplast özün etrafında daha sonra kaim korteks tabakası meydana gelir. Korteksin büzülmesi vejetatif hücrenin sadece %10-30'u kadar su içeriğine sahip olan dehidre protoplastın oluşumuna sebep olur. Protoplastın su içeriği ile birlikte SASP'lerin konsantrasyonu endosporun ısıya direncini belirler. Eğer endospor düşük SASP konsantrasyonuna ve yüksek su içeriğine sahipse, düşük ısı direncine sahiptir. Eğer protoplast yüksek SASP konsantrasyonuna ve düşük su içeriğine sahipse yüksek ısı direncine sahip olacaktır. Su endosporun içine ve dışına serbestçe hareket edebilir, dolayısıyla suyu dışarıda tutan endospor kılıfının su geçirmezliği değil, endospor protoplastı içerisindeki jel-benzeri materyaldir. Isıtılan besiyerinin niteliği de aynı zamanda hem vejetatif hücrelerin hem de endosporların ölümüne etki eder. Mikrobiyal ölüm asidik pH'da daha hızlıdır ve domates, meyve ve turşu gibi asidik gıdaları sterilize etmek mısır ve fasulye gibi bazik gıdaları sterilize etmekten daha kolaydır. Yüksek şeker, protein ve yağ konsantrasyonları ısının nüfuz etmesini azaltarak genelde organizmanın ısıya direncini arttırırken yüksek tuz konsantrasyonları organizmaya bağlı olarak ısıya direnci arttırabilir veya azaltabilir. Kuru hücreler (ve endosporlar) nemli olanlara göre ısıya daha dirençlidir; bu nedenle nemli objelerin sterilizasyonuna kıyasla kuru objelerin ısı ile sterilizasyonu her zaman yüksek sıcaklık ve daha uzun zamanı gerektirir. Otoklav Otoklav, basınç altında buhar girişine izin veren kapalı bir ısıtma cihazıdır (Şekil 20.3»). Isıyadirençli endosporları öldürmek için basınç altında buhar kullanımı ile kaynama noktasının üstündeki sıcaklıklarda ısıtma gereklidir (Şekil 20.3a). Rutin işlem, 121 °C sıcaklığı sağlayan 1.1 kilogram / santimetre kare (kg/cm2) [15 pound/ inç kare (lb/in2)] buhar basıncında ısıtmaktır. 121°Ç'de sterilizasyonu gerçekleştirmek için gerekli olan zaman genelde 10-15 dakikadır (Şekil 20.3b).

Eğer büyük hacimli objeler sterilize ediliyorsa, objenin iç bölgesine ısı transferi gecikecek ve objenin tamamının 121°C delO-15 dakika muamelesini sağlamak için toplam ısıtma süresi uzun tutulmalıdır. Zamanın uzatılması aynı zamanda büyük hacimdeki sıvıların otoklavlanması söz konusu olduğunda gereklidir, çünkü büyük hacimlerin sterilizasyon sıcaklığına ulaşması zaman alır. Bu işlemde, mikroorganizmaları öldürenin otoklav içerisindeki basınç yerine basınçlı buhar uygulandığında ulaşılan yüksek sıcaklık olduğuna dikkat ediniz. Pastörizasyon Pastörizasyon, süt ve ısıya-hassas diğer sıvılardaki mikrobiyal popülasyonu {mikrobiyal yük) azaltmak için kesin bir şekilde kontrol altında tutulan ısıyı kullanır. İşlem, şaraptaki bozulmayı kontrol etmek için ısıyı ilk kullanan Louis Pasteur'ün ismi ile anılmaktadır. Pastörizasyon tüm organizmaları öldürmez ve dolayısıyla da sterilizasyon ile sinonim değildir. Başlangıçta, sütün pastörizasyonu patojenik bakterileri, özellikle tübeküloz, bruselloz, Q humması ve tifo hummasına sebep olan organizmaları öldürmek için kullanıldı. Bu patojenler gelişmiş ülkelerdeki gıdalarda artık yaygın olmasa da; pastörizasyon, süt ürünleri ve meyve suları gibi yaygın kaynaklardan Listeria monocytogenes, Campylobacter türleri, Salmonella türleri ve Escherichia coli O157:H7 gibi («aoaKısım 29.7-29.10) patojenlerin yayılmasına engel olmaktadır. Buna ilaveten pastörizasyon, bozulmaya sebep olan organizmaların gelişimlerini geciktirir ve dayanıksız, kolay bozulabilir sıvıların raf ömrünü önemli ölçüde uzatır (Kısım 29.1 ve 29.2). Sütün pastörizasyonu genelde sütün ısıtıcıdan geçirilmesi ile sağlanır. Süt, ısı kaynağı ile temas halinde olan boruların içinden pompalanır. Süt akış hızı ile ısı kaynağı büyüklüğünün ve sıcaklığının dikkatli bir şekilde kontrolü, sütün sıcaklığını 15 saniyede 71 °C ye yükseltir. Süt daha sonra hızlı bir şekilde soğutulur. İşlemin tamamı flaş pastörizasyon olarak isimlendirilir. Süt aynı zamanda büyük teknelerde 30 dakika 63-66°C ye kadar ısıtılabilir. Bununla beraber, bulk pastörizasyon olarak adlandırılan bu işlem pek yeterli değildir, çünkü süt yavaş bir şekilde ısıtılıp soğutulmakta ve yüksek sıcaklıklarda uzun süre tutulmak durumundadır. Bazen oldukça yüksek sıcaklıklarda ve kısa zaman dilimlerinde yapılan flaş pastörizasyon işlemi, lezzette çok az değişikliğe sebep olmakta, ısıya-dirençli organizmaları daha etkili bir biçimde öldürmekte ve sürekli-akış temelinde gerçekleşerek büyük modern süt ve süt ürünleri uygulamalarında kolaylıkla uygulanabilen bir sistemdir. 20.1 Kavramların Gözden Geçirilmesi Sterilizasyon, virüsler de dahil olmak üzere tüm organizmaların öldürülmesidir. Isı, sterilizasyonda en yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Sıcaklık, başta bakteriyal endosporlar olmak üzere ısıya-dirençli organizmaların çoğunu genelde ortadan kaldırır. Otoklav, suyun kaynama noktasının üzerindeki sıcaklıkta basınç altında buharlı ısı uygulamalarına izin verir, endosporlan öldürür. Pastörizasyon sıvıları sterilize etmez, ancak patojenlerin çoğunu öldürerek ve bozulmaya sebep olan mikroorganizmaların üremesini engelleyerek mikrobiyal yükü azaltır.

20.2 • Radyasyonla Sterilizasyon • 673

Kabin basınç ölçeri

T^r*- Buhar çıkışı

Buhar çıkış vanası

Kapı

Ceket kabini

Termometre ve vana

Hava borudan çıkar

Buhar destek vanası

fa; Otoklav süresi I

130

Buhar durur

I

120

a o

110

Basınç

başlar Buhar

100

akışı

J

/

/ f

\j X

/

S

f

ı

Sterilizayon süresi

— Sterilize edilen objenin sıcaklığı 10

20

Otoklav - ^ sıcaklığı 30

40

^^^^V». ^^^""•»•»^ 50

60

Toplam döngü zamanı (dak) (b)

• Şekil 20.3 Sterilizasyon için otoklavın kullanılışı, (a) Otoklav içinden buhar akışı, (b) Tipik bir otoklav döngüsü. Oldukça büyük hacimli bir nesnenin sterilizasyonu gösterilmektedir. Nesnenin sıcaklığı otoklavın sıcaklığına göre daha yavaş yükselmektedir, (c) Modern araştırma otoklavı. Kilitli-basınç kapağı ve otomatik devir kontrollerinin sağ taraftaki panelde bulunduğuna dikkat ediniz. Buhar giriş ve çıkış ayarlan otoklavın sağ tarafında.

• •

Isı, niçin etkili bir sterilizasyon ajanıdır? Bakteriyal endosporlar ile kontamine ihtimali olan materyallerin sterilitesini sağlamak için hangi basamaklar gereklidir? • Mikrobiyolojik besiyerlerini sterilize etme ve elma suyunu pastörize etme gereksinimi arasındaki farkları belirti-

Radyasyonla Sterilizasyon Isı, sterilize eden veya mikrobiyal yükü azaltan elektromanyetik radyasyondan sadece bir tanesidir. Mikrodalga, ultraviyole (UV) radyasyon, X-ışınları, gama ışınları (-y) ve elektronlar elektromanyetik radyasyonun tüm formlarıdır (
mekanizmasına sahiptir. Örneğin, mikrodalganın antimikrobiyal etkisi kısmen termal etkiden kaynaklanır. 220 ve 300 nm dalga boyları arasındaki UV radyasyon DNA üzerinde modifikasyonlara veya kırılmalara sebep olabilen yeterli enerjiye sahiptir ve zaman zaman genetik materyalin bozulmasına ve maruz kalan organizmanın ölümüne yol açar (ÖODKısım 10.4). "Görünüre-yakın" UV ışığı yüzeylerin, havanın ve UV dalgalarını soğurmayan su gibi materyallerin dezenfeksiyonu için uygundur. Örneğin, kullanım sonrası yüzeyleri dekontamine etmek için laboratuvardaki biyolojik kabinler "jermisidal" UV ışığı ile desteklenir (Şekil 20.4»). UV radyasyonu katı, opak veya ışığı soğuran yüzeylerden geçemediğinden, kullanım alanı sadece maruz kalmış yüzeylerin dezenfeksiyonu olarak sınırlanmaktadır.

674 • Bölüm 20 • Mikrobiyal Üremenin Kontrolü

v c

T bl 20 1 Mikroorganizmaların biyolojik Tablo 20. işlevlerin radyasyona duyarlılıkları

• Şekil 20.4 Biyolojik güvenlik kabini. İç yüzeylerin dekontaminasyonu için kullanılan ultraviyole (UV) radyasyon kaynağına sahip (civa gaz lambası) kabin gösterimiştir.

Tür veya işlev

Mikroorganizma tipi

Clostridium botulinum Clostridium tetani Bacillus subtüis

Gram-pozitif anaerobik spor oluşturan Bakteri Gram-pozitif anaerobik spor oluşturan Bakteri Gram-pozitif aerobik spor oluşturan Bakteri Gram-negatif Bakteri

Salmonella typhimurium Lactobacillus brevis Deinococcus radiodurans Aspergillus niger Saccharomyces cerevisiae Ayak-ve-ağız Coxsackie Enzim inaktivasyonu

13,000 4500 20,00050,000 1000-5000

İyonize radyasyon, radyasyon partiküllerinin çarptığı moleküllerden iyon veya diğer reaktif moleküler türler meydana getirmek için yeterli enerjiye sahip elektromanyetik radyasyondur. İyonize radyasyon elektronları, e", hidroksil radikallerini, OH»; ve hidrit radikallerini, H> oluşturur (Kısım 6.16). Oldukça reaktif olan bu moleküllerin her biri deoksiribonükleik asit (DNA) ve protein gibi biyopolimerleri değiştirip bozabilme yeteneğine sahiptirler. DNA ve proteinler gibi biyolojik açıdan önemli moleküllerin iyonizasyonu ve bunu izleyen yıkımı, iyonize radyasyona maruz kalmış hücrelerin ölümüne sebep olmaktadır. Çeşitli radyasyon kaynakları sterilizasyon için kullanım potansiyeline sahiptir. Radyasyon birimi, kaynaktan çıkan radyasyon enerjisinin ölçümü olan röntgen'dir. Sterilizasyon gibi biyolojik uygulamalardaki standart rad (100 erg/g) veya gray (lGy=100 rad) birimi ile ölçülen

dart öldürücü doz 12 D}0'dur. Clostridium botuli-

num susunun radyodirençli endosporlarmı yok etmek için, örneğin 39,600 Gy gereklidir (Tablo 20.1). Salmonella typhimurium için öldürme dozu

200

Virüs Virüs

Böcek deenfestasyonu —

Bazı mikroorga-

600

1200 2200

a

nizmaların radyasyona direnci diğerlerinden çok daha fazladır. Tablo 20.1, biyolojik fonksiyonlarda veya seçilen mikroorganizmaların sayılarında 10-kat azalma için gerekli olan radyasyon dozunu göstermektedir. Örneğin, Salmonella typhimuriutn gibi radyasyona hassas Gram negatif bakterilerde desimal (10-kat) azalmayı veya DlO'u sağlamak için gerekli olan enerji miktarı 200 Gy'dir. Tablo 20.1'deki veriler ısı ile sterilizasyondaki onda bire düşme zamanı değerine benzer bilgiler vermektedir (bakınız Kısım 20.1): yarı logaritmik skalada canlı kalan fraksiyona karşı gray biriminden radyasyon dozu çizildiğinde elde edilen ilişki esas itibarıyla doğrusal'dır (Şekil 20.5»). Radyasyon ile sterilizasyonda kullanılan stan-

2400

Gram-pozitif Bakteri Gram-negatif radyasyonadirençli Bakteri Küf Maya

İyonize Radyasyon

absorbe olan radyasyon dozu'dur.

DlO'(Gy) 3300

500 500

D10, başlangıç popülasyonu veya aktivite seviyesini 10-kat 0 azaltmak için gerekli olan radyasyon miktarıdır. Gy= gray, 1 gray= 100 rad..

2400 Gy'dir. Çok hücreli organizmalar ile karşılaştırıldıklarında, mikroorganizmalar iyonize radyasyona genelde çok daha fazla dirençlidir. Örneğin, insanlar için öldürücü radyasyon dozu sadece lOGy'dir! Radyasyon Uygulaması

İyonize radyasyonun yaygın kaynakları arasında X-ışını makinaları, katot ışın tüpleri ve radyoaktif nüklitler yer almaktadır. Bu kaynaklar X-ışınları veya y-ışınları meydana getirerek her ikisi de yeterli enerjiye ve katı ve sıvı ortamlardaki mikrobiyal gelişimi etkili bir şekilde engelleyebilen nüfuz edici güce sahiptirler. Ticari yönden kullanışlı olan radyasyonun temel kaynakları, y-ışını yayan radyoaktif nüklitlerdir.

IE 10"1

. %10 canlı

İ 10-2

Radyasyon (Gray) • Şekil 20.5 Canlılığına devam eden bölüm ile radyasyon dozu arasında ilişki. D10, veya onda bire düşme dozu verilen verilerden elde edilir. Gray biriminden doz, her bir organizma için önemli ölçüde değişir.

20.3 • Filtre ile Sterilizasyon • 675 En yaygın bir şekilde kullanılan iki radyoizotop Co ve 137Cs'dir ve her ikisi de nükleer bölünmenin ucuz yan ürünleridir. Radyasyon halen medikal malzemelerin sterilizasyonu ve gıda endüstrisinde sterilizasyon ve dekontaminasyon amacıyla kullanılmaktadır. Birleşik Devletler'de, Gıda ve İlaç Kurumu (FDA), cerrahi malzemeler, tek kullanımlık laboratuvar malzemeleri, ilaçlar ve hatta tissue grafts gibi muhtelif malzemelerin sterilizasyonu için radyasyonun kullanımını onaylamıştır (Tablo 20.2). Bununla beraber, radyasyon ekipmanlarının maliyeti ve tehlikeleri nedeniyle, bu sterilizasyonun kullanımı büyük endüstriyel uygulamalar veya oldukça uzmanlaşmış hizmetlerle sınırlandırılmıştır. Aynı zamanda gıda ve gıda ürünleri de rutin olarak ışınlanmaktadır (ecçsKısım 29.2). Sterilizasyonun yanı sıra, bu yöntem, uygulanan radyasyonun dozu ayarlanarak pastörizasyon ve böcek deenfestasyonu amacıyla kullanılabilir. Radyasyon, başta mikrobiyal kontaminasyona hassas gıdaların, özellikle hamburger ve tavuk gibi baharatlı ve taze et ürünlerinin dekontaminasyonu amacıyla Dünya Sağlık Örgütünce ve kıymanın dekontaminasyonu için kullanımı ise yine Birleşmiş Milletlerce onaylandı (cooKısım 29.2). Radyasyonun belirtilen tüm amaçlar için kullanımı pek çok ülkede ispatlanmış ve kabul görmüş bir teknolojidir. Bununla beraber, olası radyoaktif kontaminasyon, besinsel değerlerde değişim, toksik veya kanserojenik ürünlerin oluşumu ve ışınlanmış gıdalarda "anormal" koku oluşumunun sezinlenmesi çekincesinden dolayı bu uygulama diğer ülkelerde kolayca kabul görmemiştir.

Filtre ile Sterilizasyon

60

Görmüş olduğumuz gibi, pek çok sıvının sterilizasyonu için ısı oldukça etkili bir yoldur. Bununla beraber, ısıya-hassas sıvılar fütmsyon ile steril edilebilir. Bir filtre, mikroorganizmaların geçemeyeceği kadar küçük ancak sıvı veya gazın geçişine olanak sağlayacak kadar büyük gözeneklere sahip bir aygıttır. Sterilizasyon için kullanılacak filtrelerin seçiminde, engellenecek kontaminant boyutlarının sınırları dikkate alınmalıdır. Çok büyük mikrobiyal hücrelerden bazıları lOum çapından daha büyük, buna karşılık çok küçük olan bakterilerin çapı 0.3um den daha küçüktür. Tarihsel olarak, seçici filtrasyon yöntemleri, çapı 25 nm'den 200 nm ye kadar değişen virüsleri tanımlamak ve izole etmek için kullanılırdı (£«»Kısım 9.2). Şekil 20.6» başlıca üç filtre tipini göstermektedir. Derîn Filtreler En basit filtre tiplerinden biri derin filtredir. Derin filtre, üst üste yığılmış kağıt, asbest veya borosilikat (cam) ipliklerin rastgele diziliminden oluşmuş

— (jHp 20.2 Kavramların Gözden Geçirilmesi Elektromanyetik radyasyonun kontrollü dozları mikrobiyal üremeyi etkin bir biçimde engeller. Ultraviyole radyasyon, hava ve su gibi ışığı soğurmayan materyallerin ve yüzeylerin dekontaminasyonunda kullanılır. Katı veya ışığı-soğuran materyallerden geçmesi gereken iyonize radyasyon, medikal ve gıda endüstrilerinde sterilizasyon ve dekontaminasyon amacıyla yaygın olarak kullanılmaktadır. • Mikroorganizmaların radyasyonla kontrolü açısından onda bire düşme dozu ve letal dozu tanımlayınız. • Gıda ürünlerinin sterilizasyonunda iyonize radyasyon UV radyasyonuna göre niçin daha fazla etkilidir?

Radyasyonla sterilize edilen medikal ve Tablo 20.2 laboratuvar ürünleri Tissue grafts

İlaçlar

Kıkırdak

Kloramfenikol

Tendon Deri Kalp kapakçığı

Ampisilin Tetrasiklin Atropin Aşılar Merhemler

Medikal ve laboratuvar sarfları Tek kullanımlık lab eşyaları Kültür besiyerleri Şırıngalar Cerrahi ekipman Sürürler

(c)

• Şekil 20.6 Mikrobiyolojik filtreler, (a) derin filtre, (b) geleneksel membran filtre ve (c) nükleopor bir filtre yapısı. Derin filtreler önfiltre amacıyla ve fazla miktarlarda süspanse partikül içeren sıvıların filtrasyonu için kullanılır. Membran filtreler laboratuvar ve endüstrideki pek çok uygulamalarda kullanılır, çünkü çeşitli ebatlarda ve gözeneklerde kolayca temin edilebilir, ekonomiktir ve neredeyse filtrenin ihtiyaç duyulduğu tüm alanlarda uygulanabilir. Nükleopor, veya nükleasyon tract filtreleri mikroskopik çalışmalarda numunelerin izolasyonunda kullanılır, çünkü filtre edilmiş materyal filtre yüzeyinde tek bir düzlemde yakalanır.

676 • Bölüm 20 • Mikrobiyal Üremenin Kontrolü

fibröz tabaka veya mat yapıdır (Şekil 20.6a). Derin filtre, yapının derinliği boyunca biçim alan fiber ağında partikülleri yakalar. Derin filtreler oldukça büyük gözenekli oldukları için, sterilizasyon işleminde, en son filtrenin tıkanması için büyük partikülleri sıvı süspansiyonlardan uzaklaştırmak amacıyla çoğunlukla ön filtre olarak kullanılır. Derin filtreler aynı zamanda endüstriyel işlemlerde havanın filtrasyonla sterilizasyonunda kullanılmaktadır (<£>°&Kısım 30.4). Ev ortamında, üflemeli hava ısıtma ve soğutma sistemleri toz, spor ve alerjen gibi partiküler maddeleri yakalamak için basit derin filtre kullanmaktadır. Derin filtreler çeşitli biyogüvenlik uygulamalarında oldukça önem taşır. Örneğin, hücre kültürleri, mikrobiyal kültürler ve üreme ortamlarının manipülasyonu, hem uygulayıcı hem de deneysel materyal kontaminasyonlarınm minimize edilmesini gerekli kılmaktadır. Bu uygulamalar, hem içerden hem de dışarıdan high-efficiency particulate air, veya HEPA filtre aracılığı ile hava akışının sağlandığı biyolojik güvenlik kabinleriyle verimli bir şeklide gerçekleştirilebilir (Şekil 20.4). Büyük ölçekte, hava kaynaklı partiküler materyallerin HEPA filtreleri ile kontrolü, "temiz odaların" ve karantina amaçlı izolasyon odalarının yanı sıra uzmanlaşmış biyolojik güvenlik laboratuvarlarının yapımına olanak sağlamaktadır (öo^Kısım 24.4). HEPA filtreleri genelde 0.3-um test partiküllerini en az %99.97 verimle uzaklaştırmaktadır; filtreler hava akımından hem küçük hem de büyük partikülleri etkili bir şeklide uzaklaştırır. Tipik bir HEPA filtresi su-itici binder ile muamele edilmiş tek bir borosilikat fiber tabakasından oluşur. Toplam yüzey alanını arttırmak için filtre kıvrılır ve çöküntüden kaynaklanan kıvrımlara engel olmak için sert, bükülmez çerçevenin içerisine monte edilir. HEPA filtreler birkaç santimetre kareden (vakum temizleyicileri için) birkaç metre kareye (biological containment hood (Şekil 20.4) ve oda hava sistemleri için) kadar değişik şekil ve büyüklüklerde olabilir. Membran Filtreleri

Mikrobiyoloji laboratuvarında, sıvı sterilizasyonu için en yaygın filtre tipi membran filtre'dir (Şekil 20.6b). Membran filtreleri, çok fazla sayıda minik gözenekler içerecek şekilde üretilen selüloz asetat, selüloz nitrat veya polisülfon gibi yüksek gerilme kuvvetine sahip polimerlerden oluşmuştur. Üretim esnasında polimerizasyon koşullarını ayarlamak suretiyle membrandaki gözeneklerin büyüklüğü (dolayısıyla da gözeneklerden geçecek moleküllerin büyüklüğü) kesin olarak kontrol edilebilir. Membran filtre derin filtreden farklılık gösterir, çünkü membran filtre daha çok bir elek görevi görmekte ve filtrenin yüzeyinde partikülleri yakalamaktadır. Membran yüzey alanının yaklaşık %80-85'i açık gözenek içerir. Gözenek yapısıyla, oldukça yüksek sıvı akış hızı sağlanır.

Steril olmayan besiyeri

Tutma mengenesi

Membran filtre •L—- Cam platform

• Şekil 20.7 Membran filtreler, (a) tekrar kullanılabilir membran filtre aparatının montajı, (b) tek kullanımlık, önceden steril edilmiş ve bir araya getirilmiş membran filtre üniteleri. Sol: küçük hacimler için tasarlanmış filtre sistemi. Sağ: büyük hacimler için tasarlanmış filtre sistemi.

Sıvıların sterilizasyonu için kullanılan membran filtreler Şekil 20.7»'de görülmektedir. Filtre aparatları genelde filtreden ayrı bir şekilde sterilize edilir ve filtrasyon zamanında aparatlar aseptik koşullar altında bir araya getirilir. Şekil 20.7a'da gösterilen düzenleme, küçük hacimli sıvılar için uygundur. Büyük hacimli steril filtrasyon için, membran filtre bir kaset içine takılır ve paslanmaz çelikten bir muhafaza içerisine yerleştirilir. Büyük hacimli ısıya-hassas sıvılar, eczacılık endüstrisinde yaygın olarak filtrasyon ile sterilize edilmektedir. Araştırma ve klinik laboratuvarlarmda, küçük ve orta düzeydeki hacimlerin sterilizasyonu için daha önceden sterilize edilmiş membran filtre takımları rutin olarak kullanılmaktadır (Şekil 20.7b). Filtrasyon, sıvının filtrasyon aparatından steril toplama kabına geçişini kolaylaştıran şırınga, pompa veya vakum kullanımı ile başarılır. Yaygın kullanıma sahip bir diğer membran tipi nükleasyon tract (Nükleopor) filtre'dir. Bu filtreler oldukça kalın polikarbonat filmlerin (10 um) nükleer radyasyon ile muameleleri ve daha sonra filmin kimyasal ile aşındırılmasıyla yapılır. Radyasyon, filmde belirli bir hasara neden olur ve kimyasal ile aşındırma ise hasar görmüş bu bölgeleri büyüterek gözenek haline getirir. Tipik bir nükleasyon tract filtrede ince film boyunca neredeyse dikey olarak sıralanmış tek tip gözenekler bulunur (Şekil 20.6c). Nükleopor filtreler yaygın olarak taramalı elektron

20.4 • Üremenin Kimyasal Kontrolü • 677

KİMYASAL ANTIMIKROBİYAL KONTROL Kimyasal maddeler evde, iş yerinde ve laboratuvarda rutin bir şekilde mikrobiyal üremeyi kontrol etmek için kullanılır. Antimikrobiyal madde, mikroorganizmaların üremesini engelleyen veya öldüren doğal veya sentetik kimyasaldır. Organizmaları öldüren maddeler sidal maddeler olarak isimlendirilir ve aldığı ön ek öldürülen organizmanın tipini işaret etmektedir. Dolayısıyla bakteriler, funguslar ve virüsleri öldüren maddeler sırayla bakteriyosidal, fungisidal ve virisidal maddeler olarak isimlendirilir. Organizmayı öldürmeyen, buna karşılık sadece üremesini engelleyen maddeler statik maddeler olarak isimlendirilir ve bunlar bakteriyostatik, fungistatik ve viristatik maddeleri ihtiva ederler.

Üremenin Kimyasal Kontrolü Antimikrobiyal maddeler seçici toksisiteleri bakımından değişiklik gösterirler. Bazıları seçici değildir ve tüm hücreler üzerinde benzer etkilere sahiptirler. Diğerleri ise oldukça seçicidir ve hayvan dokularına kıyasla mikroorganizmalara karşı oldukça toksiktirler. Seçici toksisiteye sahip antimikrobiyal maddeler özellikle bulaşıcı hastalıkların tedavisinde kullanışlıdır, çünkü in vivo sistemde konukçuya zarar vermeden sadece hedeflenen mikroorganizmaları öldürür. Bu maddeler, bu bölümün ilerleyen bölümlerinde tanımlanacaklardır. Burada, oldukça geniş toksisiteye sahip olan ancak in vitro sistemde mikrobiyal gelişimi sınırlayan kimyasal maddeleri inceliyoruz. Üreme Üzerine Antimikrobiyal Maddelerin Etkisi

• Şekil 20.8 Nühleopor membran filtreler üzerinde tutulan bakterilerin taramalı elektron mikrograflan. (a) akuatik bakteri ve algler. Gözenek büyüklüğü 5 /un. (b) Leptospira interrogans. Bakteri yaklaşık 0.1 fim çapında ve 20 fim'ye varan uzunlukta. Filtrenin gözenek büyüklüğü 0.2 /un. mikroskopisinde kullanılır. Organizma sıvıdan uzaklaştırılır ve mikrospkopla gözlemlenebilen filtrenin üstünde tek düzlemde konsantre edilir (Şekil 20.8»).

m

20.3 Kavramların Gözden Geçirilmesi

Filtreler hava veya sıvılardan mikroorganizmaları uzaklaştırır. HEPA filtreler de dahil olmak üzere derin filtreler hava veya sıvılardan mikroorganizmaları veya diğer kontaminantları uzaklaştırmak için kullanılır. Membran filtreler ısıya-duyarlı sıvıların sterilizasyonunda, nükleasyon filtreler ise elektron mikroskopisi için örneklerin izolasyonunda kullanılırlar. • Hastanelerde temiz havanın muhafazasında HEPA filtrelerinin potansiyel kullanımını tanımlayınız. • Isıya-duyarlı sıvıların sterilizasyonunda neden membran filtreler kullanılır?

Üssel olarak üremekte olan bakteriyal kültüre antimikrobiyal madde eklendiğinde üç farklı etki gözlenir: bakteriyostatik, bakteriyosidal ve bakteriyolitik (Şekil 20.9»). Bakteriyostatik maddeler çoğunlukla protein sentezi inhibitörleridir ve ribozomlara bağlanarak etki ederler. Eğer maddenin konsantrasyonu azaltılırsa, madde ribozomdan ayrılır ve üreme tekrar başlar (Şekil 20.9a). Pek çok antibiyotik bu mekanizma ile etki eder ve Kısım 20.6-20.9 da tartışılacaktır. Bakteriyosidal maddeler hücresel hedeflerine güçlü bir şekilde bağlanır ve seyreltme ile giderilemezler, ancak hücre bütünlüğünün ve hücresel içeriğin kaybı olarak ifade edilen liziz olayı meydana gelmez (Şekil 20.9i>). Bakteriyolitik maddeler madde eklendikten sonra bulanıklık veya hücre sayısındaki azalma şeklinde gözlemlenen hücre lizizi sonucu ölüme sebep olurlar (Şekil 20.9c). Bakteriyolitik maddeler penisillin gibi («ao&Kısım 4.8 ve bakınız Kısım 20.8) hücre duvarı sentezini engelleyen maddelere ek olarak sitoplazmik zarı parçalayan deterjanlar gibi kimyasallar bu grupta yer alır. Antimikrobiyal Aktivitenin Ölçümü Antimikrobiyal aktivite, test organizmanın üremesini engellemeye yeterli en düşük madde miktarının, yani minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC)

678 • Bölüm 20 • Mikrobiyal Üremenin Kontrolü

Log r ucre sa\ /ısı

Bakteriyostatik

/

/T

Toplam hücre sayısı / \ Canlı hücre sayısı

Zaman

(a)

Bakteriyosidal

Zaman

• Şekil 20.10 Seyreltme yöntemleri ile antibiyotik hassasiyet ayarlaması. Deney minimum inhibitör konsantrasyonunu (MIC) tespit etmeye olanak sağlamaktadır. Kültür ortamında artan konsantrasyonlarda antibiyotik serileri hazırlanan. Her bir tüpe inokülsyon yapılır ve inkübasyonun devamı sağlanır. MIC değerinin altında antibiyotik konsantrasyonlarına sahip tiplerde üreme (bulanıklık) meydana gelir.

(b)

maddesinin MİC'sinin fenolün MİC'sine oranı olarak bilinen fenol katsayı yöntemidir.

Bakteriyolitik

Zaman (c)

• Şekil 20.9 Vç tip antimikrobiyal madde etkisi. Ok ile gösterilen zamanda, üremeyi inhibe eden konsantrasyon üssel olarak ûremekte olan kültüre eklendi. Canlı hücre ve toplam hücre sayılan arasındaki ilişkiye dikkat ediniz.

Antimikrobiyal aktivitenin belirlenmesinde kullanılan bir diğer yaygın çalışma ağar difüzyonu'dur (Şekil 20.11»). Test organizmayı içeren kültür ile kaplanmış katı besi yeri (ağar) içeren petri plaka hazırlanır. Bilinen miktarlardaki antimikrobiyal madde filtre kağıdı disklerine eklenir ve daha sonra katı besi yerinin (ağar) yüzeyine yerleştirilir. İnkübasyon esnasında, madde filtre kağıdından ağara doğru dağılır; filtre kağıdından en uzağa giden, en

•••-..

.

• • .-ŞS!*"*

Nutrient agarlı plaka

değerinin belirlenmesi ile ölçülür. Söz konusu mad5 mi erimiş ağardaki kültür j yüzeye yayılarak inoküle denin MIC değerini belirlemek için, her biri farklı edilir madde konsantrasyonuna sahip besi yeri içeren bir seri kültür tüpü hazırlanır ve inoküle edilir. İnkübasyondan sonra, tüplerde gözle görülür üremenin olup olmadığı (bulanıklık) kontrol edilir. MIC, test organizmanın üremesini tamamen engelleyen en düşük madde konsantrasyonudur (Şekil 20.10*). Bu basit ve etkin işlem, çoğunlukla tüp dilüsyon tekniği olarak da adlandırılmaktadır. MIC bahsi geçen madde için sabit bir değer değildir, çünkü kullanılan test organizmasının niteliği, inokulum miktarı, kültür besiyerinin komAntibiyotik diskleri yüzeye yerleştirilir pozisyonu, inkübasyon zamanı ve sıcaklık, pH ve 24-48 saat inkübe edilir havalandırma gibi inkübasyon koşullarından etkilenmektedir. Bununla beraber, tüm koşullar çok Test organizma bazı antibiyotiklere dikkatli bir şekilde standardize edildiğinde farkkarşı inkübasyon sonrasında disklerin lı antimikrobiyal maddeler karşılaştırılarak bahsi etrafında bakteriyal gelişmenin geçen organizmaya karşı en etkili olan antimikroengellenmesi şeklinde gözlemlenen bir hassasiyet gösterir biyal madde belirlenebilir. Antimikrobiyal maddeleri karşılaştırmak için kullanılan standart yöntem, • Şekil 20.11 Antibiyotik aktivitesinin ölçümü. Antibiyotik aynı organizma, besi yeri ve üreme koşullarında test hassasiyetinin belirlenmesi için ağar difüzyon yöntemi

20.5 • Harici Olarak Kullanılan Kimyasal Antimikrobiyal Maddeler • 679

düşük madde konsantrasyonuna sahiptir. Diskten epeyce bir mesafe uzaklıkta elverişli MIC değerine ulaşılır. Bu noktanın uç kısmında üreme meydana gelir ancak diske yakın yerde üreme yoktur. Diske eklenen antimikrobiyal maddenin miktarı, difüzyon katsayısı ve maddenin toplam etkisi ile doğru orantılı olan bir çapta inhibisyon zonu oluşur. Bu metot rutin bir şekilde patojenlerde antibiyotik hassasiyetini test etmek için kullanılmaktadır (««sKısıin 24.3). 20A Kavramların Gözden Geçirilmesi Kimyasallar, mikrobiyal gelişimi kontrol etmek için sıklıkla kullanılır. Organizmaları öldüren kimyasallar sidal, gelişimlerim engelleyenler ise statik ajanlar olarak adlandırılır. Antibakteriyal kimyasal ajanın etkisi bakteriyal gelişimi tamamen engellemek için gerekli olan minimum konsantrasyonun belirlenmesi ile tayin edilir. • Antibakteriyal ajanlarla ilgili olarak, statik, sidal ve litik ajanlar arasındaki farkı açıklayınız. •

Antimikrobiyal bir maddeye ait minimum inhibitör konsantrasyonunun nasıl hesaplandığım tanımlayınız.

Harici Olarak Kullanılan Kimyasal Antimikrobiyal Maddeler Kimyasal antimikrobiyal maddeler iki kategoriye ayrılırlar. İlk kategoride insanlarda patojenik olmayan mikroorganizmaları kontrol etmek amacıyla kullanılan antimikrobiyal ürünler yer almaktadır. Bu maddeler insan sağlığını etkileyen mikroorganizmaları kontrol etmek için kullanılabilir, bununla beraber gıdalarda, klima soğutucu kulelerinde, tekstil ve kağıt ürünlerinde ve hatta yakıt depolarındaki! mikrobiyal kontaminasyonu kontrol etmek amacıyla kullanılan endüstriyel ürünleri de içermektedir. Tablo 20.3 de mikrobiyal gelişimi kontrol etmek için kullanılan kimyasallara ait bazı endüstriyel uygulama örnekleri yer almaktadır.

Kimyasal antimikrobiyal maddelerin ikinci kategorisinde cansız ortamlarda insan patojenlerinin gelişimini engellemek için tasarlanan ürünler yer almaktadır. Bu kategori sterilantlar, dezenfektanlar, sanitizatörler ve antiseptikler şeklinde kendi içinde tekrar alt gruplara bölünmüştür. Sterilantlar Sterilizer veya sporicide olarak da isimlendirilen kimyasal sterilantlar, endosporlar da dahil olmak üzere tüm mikrobiyal yaşam formlarını yok ederler. Kimyasal sterilantlar dekontaminasyon veya sterilizasyon için ısı (bakınız Kısım 20.1) veya radyasyon (bakınız Kısım 20.2) kullanımının elverişsiz olduğu durumlarda yaygın kullanım alanlarına sahiptir. Hastaneler ve laboratuvarlar; termometre, mercekli araçlar, polietilen borular, kateterler ve respirometre gibi yeniden kullanılabilir medikal ekipman tarzındaki ısıya-hassas materyalleri steril edebilmek durumundadır. Bu amaçlar için genelde soğuk sterilizasyon kullanılır. Soğuk sterilizasyon otoklava benzer kapalı bir sistem içinde uygulanır ancak bu işlemde etilen oksit, formaldehit, peroksiasetik asit veya hidrojen peroksit gibi gaz halindeki kimyasal maddeler kullanılır. Sodyum klorit solüsyonu veya amilfenol gibi sıvı sterilantlar yüksek sıcaklıklara veya gazlara dayanamayan hassas cihazlar için kullanılır (Tablo 20.4). Dezenfektanlar, Sanitizatör ve Antiseptikler Dezenfektanlar mikroorganizmaları öldüren ancak endosporları yok etmeyen kimyasallar olup cansız objeler üzerinde de kullanılırlar. Örneğin, enfeksiyon kontrolünde kritik olan etanol ve katyonik deterjanlar gibi hastane-tipi dezenfektanlar yerleri, masaları, laboratuvar çalışma tezgahlarını, duvarları ve medikal alanlardaki benzeri alanları dekontamine etmek için kullanılır. Evde, yüzme havuzlarında ve su artıcılarında genel dezenfektanlar kullanılır (Tablo 20.4).

Tablo 20.3 Antimikrobiyal kimyasalların endüstriyel kullanımları Endüstri

Kimyasallar

Kullanımı

Kağıt

İmalat esnasında mikrobiyal gelişmeye engel olmak

Deri Plastik

Organik civa bileşikleri, fenoller", metilizotiyazolinon Ağır metaller, fenoller1 Katyonik deterjanlar

Tekstil

Ağır metaller, fenoller"

Kereste Metal işleri

Ağır metaller, fenoller" Katyonik deterjanlar

Petrol

Civalı bileşikler, fenoller, katyonik deterjanlar, metilizotiyazolinon Klor, fenoller"

Havalandırma

Elektrik kaynaklan Klor Nükleer

Klor

Son üründe antimikrobiyal ajanlar mevcuttur Plastiklerin sulu dispersiyonlarmdaki bakteri gelişimine engel olmak için Güneşlik, çadır, tente gibi dış ortamlara maruz bırakılan dokulardaki mikrobiyal bozulmalara engel olmak için Tahta yapıların bozulmasına engel olmak için Sulu kesim emilsiyonlarda bakterilerin gelişimine engel olmak için Petrol ve petrol ürünlerinin elde edilmesi ve depolanması sırasında bakterilerin gelişimine engel olmak için Soğutma kulelerinde bakterilerin (örneğin Legionelk) gelişimine engel olmak için Kondansatörlerde ve soğutma kulelerinde bakterilerin gelişimine engel olmak için Nükleer reaktörlerde radyasyon-dirençli bakterilerin gelişimine engel olmak için

"Ağır metaller (civa ve arsenik) ve fenolik maddeler çevreye zararlı atık ürünler meydana getirir ve sağlık açısından tehlikeler yaratabilir

• Bölüm 20 • Mikrobiyal Üremenin Kontrolü

Tablo 20.4 Antiseptikler, sterilantlar, dezenfektanlar ve sanitizerler Ajan Antiseptikler Alkol (su içerisinde % 60-85 etanol veya izopropanol)" Fenol-içeren maddeler (hexachlorophene, Triclosan, chloroxylenol, chlorhexidine)1' Katyonik deterjanlar, özellikle dörtlü amonyum maddeleri (benzalkonium chloride) Hidrojen peroksit" (% 3 solüsyon) Solüsyonda iyot-içeren iodophor maddeleri iyodine" (Betadine9) Octenidine Gümüş nitrat

Sterilantlar, Dezenfektanlar ve Sanitizatör Alkol (su içerisinde % 60-85 etanol veya izopropanol)" Katyonik deterjanlar (dörtlü amonyum maddeleri) Klor gazı Klorlu maddeler (kloramin, sodyum hipoklorit, sodyum klorit klor dioksit) Bakır sülfat Etilen oksit (gaz) Formaldehit Gluteraldehit Hidrojen peroksita* Solüsyonda iyot içeren iodophor maddeleria in solution" (VVescodyne®) Merkürik diklorit6 OPA (orthophalaldehyde) Ozon Peroksiasetik asit Fenolik maddeler*

Kullanıl

Etki Mekanizması

Topikal antiseptik Sabunlar, losyonlar, kozmetikler, vücut deodorantları, topikal dezenfektanlar Sabunlar, losyonlar, topikal dezenfektanlar Topikal antiseptik Topikal antiseptik

Lipit çözücü ve protein denaturantı Hücre zarını bozar

Topikal antiseptik Neisseria gonorrhoeae enfeksiyondan dolayı ortaya çıkan körlüğü engellemek için yeni doğanların gözlerine Medikal araçlar ve laboratuvar yüzeyleri için dezenfektan Medikal araçlar, gıda ve süt endüstrisi ekipmanları için dezenfektan ve sanitizatör Su malzemelerini saflaştırılması için dezenfektan Gıda ve süt endüstrisi ekipmanları ve su malzemeleri için dezenfektan ve sanitizatör Yüzme havuzlarında ve su malzemelerinde aljisit dezenfektan Plastik ve mecekli ekipmanlar gibi sıcaklığa-duyarh materyaller için sterilant %3-%8 solüsyon yüzeyler için dezenfektan %37 (formalin) veya buhar sterilant olarak kullanılır Yüksek-seviyede dezenfektan veya sterilant %2 solüsyon kullanılır Sterilant olarak buhar kullanılır Medikal araçlar ve laboratuvar yüzeyleri için dezenfektan Laboratuvar yüzeyleri için dezenfektan Medikal araçlar için yüksek-seviyede dezenfektan içme suları için dezenfektan Solüsyon yüksek-seviyede dezenfektan veya sterilant olarak kullanılır Laboratuvar yüzeyleri için dezenfektan

Hücre zarmdaki fosfolipitlerle etkileşime girer Oksitleyici ajan Proteinlerdeki tirozin rezidüsünü eder, oksitleyici ajan Hücre zarını bozar Protein presipitantı

Lipit çözücü ve protein denaturantı Interact with phospholipids

Oksitleyici ajan Oksitleyici ajan aljisit dezenfektan Alkilasyona sebep olan ajan Alkilasyona sebep olan ajan Alkilasyona sebep olan ajan Oksitleyici ajan Tirosin rezidülerini şyodine eder -SH grupları ile birleşir Alkilasyona sebep olan ajan Güçlü oksitleyici ajan Güçlü oksitleyici ajan Protein denaturantı

"Alkoller, hidrojen peroksit ve iyodin-içeren iyodofor maddeler konsantrasyona, maruz kalma süresine ve uygulama şekline bağlı olarak antiseptik, dezenfektan, sanitizatör veya sterilant olarak işlev gösterebilirler. h Ağır metaller (civa) ve fenolik maddelerin kullanımı çevreye zararlı atık ürünler meydana getirebilir ve sağlık açısından tehlikeler yaratabilir 'Ağır metalleri içerenler dışında suda çözülür antimikrobiyal maddelerin çoğu gıda ve süt ürünleri ekipmanları ve bunların preparasyon alanlarında sanitizatör olarak kullanılabilir, ancak gıda ile temas etmeden önce uygun şekilde kurulanmaları gerekmektedir.

Sanitizerler, mikrobiyal sayıyı güvenli kabul edilebilir bir seviyeye kadar azaltan ancak tamamı ile ortadan kaldıramayan maddelerdir. Gıda kontakt sanitizerler gıda endüstrisinde karma ve yemek yapma ekipmanları, tabaklar ve çanak çömlek gibi yüzeylere muamele için yaygın olarak kullanılır. Ayrı bir kategoride yer alan gıda harici kontakt sanitizerler ise tezgah, yerler, duvarlar, halılar, hava, ve çamaşırhane gibi alanlarda kullanılır (Tablo 20.4). Antiseptikler ve jermisidler mikroorganizmaları öldüren veya gelişimlerine engel olan kimyasal maddelerdir ve canlı dokulara uygulanabilecek düzeyde nontoksiktir. Bu kategoride yer alan maddelerin çoğu ellerin yıkanmasında ve yüzey yara-

larının tedavisinde kullanılır (Tablo 20.4). Bazı durumlarda belirli antiseptikler etkili birer dezenfektanlardır. Bu ürünler ilaç olarak düşünülür ve Amerikan Gıda ve İlaç Kurumunun regülasyonuna dahildir. Antimikrobiyal Etkinlik

Bu kimyasal antimikrobiyal maddelerin etkinliği çeşitli faktörler tarafından etkilenmektedir. Örneğin, pek çok dezenfektan organik materyallerle nötralize edilmektedir, böylece dezenfektan konsantrasyonları ve mikrobiyal öldürme kapasitesi azalmaktadır. Buna ilaveten, patojenler çoğu kez partiküllerle kaplanmıştır veya biyofilm şeklinde

1

20.6 • Sentetik Antimikrobiyal İlaçlar • 681

çok fazla sayılarda üreyerek dokunun yüzeyini mikrobiyal hücrelerden oluşmuş tabakalarla çevirirler (Kısım 19.3). Sadece sterilantlar bakteriyal endosporlara karşı etkilidir. Endosporlar sahip oldukları düşük su mevcudiyetinden ve azaltılmış metabolizmalarından dolayı vejetatif hücrelerle kıyaslandığında diğer maddelere karşı oldukça dirençlidir (bakınız Kısım 20.1 ve £«ûKısım 4.13). Tüberküloz hastalığının etken maddesi olan Mycobacterium tuberculosis susunda olduğu gibi bazı vejetatif hücreler hücre duvarlarının balmumu şeklindeki (waxy nature) yapılarından dolayı yaygın olarak kullanılan dezenfektanların etkilerine karşı dirençlidirler (ö°oKısım 12.23 ve 26.5). Dolayısıyla, antimikrobiyal muamelenin etkinliği gerçek kullanım koşulları altında tespit edilmesi gereken deneysel bir işlemdir. 20.5 Kavramların Gözden Geçirilmesi Sterilantlar, dezenfektanlar ve sanitizatörler cansız materyalleri dekontamine etmek için kullanılan maddelerdir. Antiseptik ve jermisitler yaşayan canlı dokularda mikrobiyal gelişimi azaltmak için kullanılır. Antimikrobiyal maddeler ticari, sağlık ve endüstriyel uygulamalara sahiplerdir. • Sterilizer, dezenfektan ve sanitizatör ifadelerini birbirinden ayırt ediniz • Hangi dezenfektanlar suyun sterilizasyommda rutin olarak kullanılmaktadır? Bu dezenfektanlar neden insanlara zararlı değildir? İN VIVO OLARAK KULLANILAN ANTİMİKROBİYAL ETKENLER Hem sentetik hem de kendiliğinden vuku bulan pek çok antimikrobiyal madde in vivo sistemlerdeki mikrobiyal enfeksiyonları tedavi etmek için kullanılmaktadır. Bu maddeler enfeksiyonel hastalıkların tedavisini tamamıyla değiştirmiştir.

Sentetik Antimikrobiyal İlaçlar Önceki bölümde, insan vücudunun dışındaki mikrobiyal üremeyi engellemek için kullanılan kimyasal maddelere değinildi. Her ne kadar bazı antiseptikler sadece deri yüzeyinde kullanılabilseler de bahsedilen kimyasalların çoğu vücudun içinde kullanılamayacak kadar toksiktir. Enfeksiyonel hastalığı kontrol etmek için, dahili olarak kullanılabilecek olan kimyasal maddeler gereklidir. Kemoterapötik madde olarak adlandırılan bu tür maddeler klinik ve veterinerlik alanlarının yanı sıra tarım alanında da önemli rollere sahiptir. Antimikrobiyal kemoterapötik maddeler üzerindeki çalışmalar Alman bilim adamı Paul Ehrlich ile başlamıştır. 1900 lerin başında; Ehrlich, konukçuyu olumsuz bir şekilde etkilemeden patojenik mikroorganizmaları öldürme veya gelişimlerini

engelleme şeklinde ifade edilen seçici toksisite kavramını oluşturdu. Sadece patojenleri öldürmeye yönelik olan "sihirli mermi" arayışında, Ehrlich seçici toksisite için çok fazla sayıda kimyasal boyayı test etti ve bunların arasında en başarılı olan ilk antimikrobiyal ilacı, yani frengi tedavisinde kullanılan ve arsenik içeren bir madde olan Salvarsan'ı keşfetti (Şekil 20.12*). Kemoterapötik maddeler yapılarına (Şekil 20.13 •), etki mekanizmalarına (Şekil 20.14 •) ve antimikrobiyal aktivite spektrumlarına (Şekil 20.15») göre sınıflandırılırlar. Tüm dünyada, her yıl 500 metrik tondan fazla çeşitli kemoterapötik madde üretilmektedir (Şekil 20.16»). Antimikrobiyal maddeler sentetik maddeler ve antibiyotikler olmak üzere iki geniş kategoriye ayrılırlar. Bu kısımda sentetik maddeler üzerinde yoğunlaşacağız. Antibiyotikleri ise sonraki üç kısımda tartışacağız. Üreme Faktörü Analogları Üreme faktörünü, kısım 5.1 de organizmanın kendisi sentezleyemediği için besi yerinde bulunması gerekli olan spesifik kimyasal maddeler olarak tanımladık. Üreme faktörü analogları üreme faktörüne yapısal olarak benzerlik gösteren sentetik maddelerdir, fakat analoglar ve özgün üreme faktörleri arasındaki ince yapısal farklar analogların hücre içerisinde fonksiyon göstermesine engel olmaktadır. Vitaminler, amino asitler, pürinler, pirimidinler ve diğer maddeler için analoglar bilinmektedir. İlk olarak bakteriyal üreme faktörü analoglarmı tartışacağız. Viral ve fungal enfeksiyonların tedavisinde etkili olan üreme faktörü analoglarını ise Kısım 20.10 ve 20.11 de tartışacağız. Sülfa İlaçlar 1930 larda Gerhard Domagk tarafından keşfedilen sülfa ilaçları bakteriyal üremenin engellenmesinde spesifik olarak etkili olduğu gösterilen ve geniş çapta ilk kullanım alanına sahip olan üreme faktörü analoglarıdır. İlk sülfa ilacın keşfi deneysel hayvanlarda streptokokal hastalıkların tedavisinde kimyasalların aktivite bakımından geniş skalada taranması sonucunda ortaya çıkmıştır.

H,N

• Şekil 20.12 Salvarsan. Arsenik içeren bu madde ilk faydalı antimikrobiyal kemoterapötik ilaçlardan bir tanesiydi. 1900 lerin başında frengi hastalığını tedavi etmek için kullanıldı.

682 • Bölüm 20 • Mikrobiyal Üremenin Kontrolü

Antibiyotik Sınıflandırması I.

II.

Karbohidrat-içeren bileşikler

Makrosiklik laktonlar

III. Ouinonlar ve ilgili bileşikler

Alt Sınıflandırma Saf şekerler Aminoglikozitler Ortosomisinler N-glikozitler C-glikozitler Glikolipitler

Örnek

Temsili yapı

Nojirimisin Streptomisin Everninomisin Streptotirisin Vankomisin Menomisin

Makrolit antibiyotikleri Poliyen antibiyotikleri Ansamisinler Makrotetrolitler

Eritromisin Kandisidin Rifampin Tetranaktin

Tetrasiklinler Antrasiklinler Naftoquinonlar Benzoquinonlar

Tetrasiklin Adriyamisin Aktinorhodin Mitomisin

NH

WH H II

NHCNH, 2

i

1

H 2 NCNH|

k u

\H HO/İ

H ^^^^^OH

°

H/°\I

?

r 1

c°"

CH3COO ^:j

oin

OH

OH T

Amino asit türevleri p-laktam antibiyotikleri Peptit antibiyotikleri Kromopeptitler Depsipeptitler Şelat-oluşturan peptitler

V.

Nitrojen içeren heterosiklik bileşikler

Nükleozit antibiyotikleri

Sikloserin Penisilin, seftriakson Basitrasin Aktinomisin Valinomisin Bleomisin

C H

3

-

CH

\-CH

° Rifampin

C H

3

Streptomisin Q

H2N

IV. Amino asit ve peptit analogları

i

3

o—f

V H NH

OH0

C

/ o-•^V^^CH =N-N^

o »vb^oA

HNI

CH 3 CH 3

H

ı

ll_>COGONH

C

| ı

0

NH2

f

\

K "S

h

3C-^ ^N^^OH

^L

1 ^1

ıı

0 C H

a

h
1U

Mitomisin C

HH

^C-CONHH

COOH

0

J^

H2S

HN-^YCH!ı0H

°

1

Seftriakson

Poliyoksinler

2

T JQOCH3

COHNCH

|] 1

Q

H2NCH VS \ J HCOH H N ^ a j / H

VI. Oksijen içeren heterosiklik bileşikler

Polieter antibiyotikleri

HOCH OH | CH2OCONH2

Monensin

OH

Poliyoksin B VII. Alisiklik türevler

Sikloalkan türevleri Steroit antibiyotikleri

Siklohekzimid Fusidik asit

HO sC )

H

CH3O /

VIII.Aromatik bileşikler

Benzen türevleri Kondense aromatikler Aromatik eter

Kloramfenikol Griseofulvin Novobiosin

\ ,

V o ^

M

H

C H

H3C /— A C H 2 C H 3 )

v

3

CHfCHjicooH

H

V "O

H

H3C y

H)—\

/V VHV VcH b - ^ - C H O3H 2

OH

Monensin

H3C

IX. Alifatik bileşikler

Fosfor içeren bileşikler

CH3O

Fosfomisin

Cl

X.

Ouinolon bileşikleri

4-Quinolon Floro-4-quinolon

Nalidiksik asit Siprofloksasin

3

CH 3

Griseofulvin

Siklohekzimid

Ç;,H,

C X V XPO3 Fosfomisin O NH

Nalidiksik asit

J XI. Oksazolidinon

Siklik lakton

2-Oksazolidinon

2-Oksazolidinon

• Şekil 20.13 Antibahteriyal kemoterapötik maddeler. Ajanlar kimyasal yapılarına göre sınıflandırılmıştır. Her bir grup için temsili bir örnek verilmiştir.

20,6 • Sentetik Antimikrobiyal ilaçlar • 683 Hücre duvarı sentezi Sikloserin Vankomisin Basitrasin Penisilinler Sefalosporinler Monobaktamlar Karbapenemler

DNA-gudumlü RNA polimeraz Quinolon!ar4~Nalidiksikasit L Sıprofloksasın Novobiyosin

Rifampin Streptovarisinler Protein sentezi (50S inhibitörleri) Eritromisin (makrolidler) Kloramfenikol Klindamisin Linkomisin

IfflIlüHlIİlfiflfHlMlir-HI Trimethroprim Sülfonamidler

Protein sentezi (30S inhibitörleri) Tetrasiklinler Spektinomisin Streptomisin Gentamisin Kanam isin Amikasin Nitrofuranlar

Sitoplazmik zar yapısı Polimiksinler Daptomisin PABA

Sitoplazmik zar

Hücre duvarı

Mupirosin Puromisin

• Şekil 20.14 Başlıca antimikrobiyal kemoterapötik maddelerin etki mekanizması. THF, tetrahidrofolat; DHF, dihidrofolat; mRNA, elçi RNA; tRNA, transfer RNA

En basit sülfa ilaç olan Sülfanilamit, folik asit vitamininin (nükleik asit öncüsü) bir parçası olan p-aminobenzoik asit analoğudur (Şekil 20.17*). Sülfanilamit, nükleik asit sentezini engelleyerek folik asit sentezini bloke eder. Sülfanilamit sadece Bacteria da aktiftir çünkü Bacteria kendi folik asitlerini sentezlerler, oysa hayvanların çoğu folik asiti diyetlerinden sağlarlar. Streptokokal enfeksiyonların tedavisinde yaygın olarak kullanılmasına rağmen (bakınız öo^Kısım 26.2) klinik olarak faydalı sülfanamitlere karşı yaygın bir şekilde ilaç direnci geliştirilmiştir, çünkü genelde dirençli mikroorganizmalar önceden oluşmuş folik asiti harici kaynak olarak kullanabilme yeteneği geliştirmişlerdir (bakınız Kısım 20.12). Bununla beraber, sulfamethaxazole (klinik olarak faydalı sülfa ilacı) ile bera-

Ökaryotlar

Funguslar

İzoniazid İzoniazid (s^Şekil 26.9), dar aktivite spektrumuna sahip önemli bir üreme faktörü analoğudur (Şekil 20.15). Sadece Mycobacteriumtuberculosis'e karşı etkili

olan izoniazid mikobakteriyal hücre duvarı bileşeni olan mikolik asit sentezine müdahale eder. İzoniazid nikotinamit (vitamin) analoğudur ve tüberküloz hastalığının kontrolü ve tedavisinde kullanılan en etkili tek ilaçtır (Şekil 20.15, öo&Kısım 26.5).

Zorunlu parazitik bakteriler

Bacteria

Mikobakter

Gram-negatlf Bakteriler Tobromisin

Azoller Alilaminler Sikloheksimit Poliyenler Polioksinler Nükleik asit analogları Ekinokandinler

ber trimethoprim (ilintili folik asit sentez rakibi) tedavisi halen etkilidir çünkü ilaç kombinasyonu folik asit sentez yolunun ardışık bloklanmasma sebep olur; bu kombinasyona direnç aynı organizmada iki mutasyonu gerektirmektedir.

, Streptomisin

l

Gram-pozitif Bakteriler

Chlamydia

Penisilinler I Sülfonamitler Sefalosporinler ûuinolonlar Tetrasiklin

İzoniazid

Polimiksinler

Vankomisin Daptomisin

Rickettsia

Virüsler RNA virüsleri

DNA virüsleri

Non-nükleosit ters transkriptaz inhibitörleri Proteaz inhibitörleri Füzyon inhibitörleri I ı Nükleozit analogları Interferon

• Şekil 20.15 Antibakteriyal etki spektrumu. Antimikrobiyal kamoterapötik ajanların her biri sınırlı mikroorganizmalar grubunu etkilemektedir.

684 • Bölüm 20 • Mihrobiyal Üremenin Kontrolü

3%

3 %

15%

Üreme faktörü

Analog

Fenilalanin (amino asit)

p-Florofenilalanin

Sefalosporinler 17%

Makrolitler Quinolonlar Penisilinler Aminoglikozitler

14%

Tetrasiklinler

37%

Diğerleri O

11%

• Şekil 20.16 Dünyada yıllık antibiyotik üretimi ve kullanımı. Antimikrobiyal kemoterapötik ajanlar her yıl 500 metrik tondan daha fazla üretilmektedir.

Urasil (RNA bazı)

5-florourasil (urasil analoğu)

Nükleik Asit Analogları

Şekil 20.18«'de gösterilen örneklerde, flor veya brom atomunun eklenmesi ile nükleik asit baz analogları oluşmaktadır. Flor oldukça küçük bir atomdur ve bazların genel şeklini etkilemez ancak kimyasal özelliklerini öyle bir değiştirir ki madde hücre metabolizmasında fonksiyon gösteremez. Florourasil bir nükleik asit bazı olan urasil'e; bromourasil ise bir diğer baza, timin bazına benzemektedir. Nükleik asitlere benzeyen üreme faktörü analogları viral ve fungal enfeksiyonların tedavisinde ve aynı zamanda da mutajen olarak kullanılmaktadır (bakınız Kısım 20.10 ve 20.11, sosKısım 10.4). Quinolonlar

Quinolon'lar, bakteriyal DNA giraz enzimine müdahale ederek bakteriyal DNA nın süperhalkasal yapıyı kazanmasını engelleyen sentetik antibakteriyal bileşenlerin ayrı bir sınıfıdır («3°oKısım 7.3). Bakteriyal DNA nın süperhalkasal yapıyı kazanması bakteriyal hücrede DNA nın paketlen-

H,N (a) Sulfanilamit

SO 2 NH 2 (b) p-Aminobenzoik asit

H_/^

O

I I ^ HN-C-H I CH 2 CH 2

(c) Folik asit

COOH

• Şekil 20.17 Sülfa ilaçlar, (a) en basit sülfa ilaç, sulfanilamit. Sulfanilamit, folik asitin (c) (üreme faktörü) öncüsü olan p-aminobenzoik asitin (b) analoğudur («S^Kısım S.l).

H Timin (DNA bazı)

»V

H 5-bromourasil (timin analoğu)

• Şekil 20.18 Üreme Faktörleri. Mukayese için, yapısal olarak benzer olan analoglar gösterilmiştir. Üreme faktörlerinden Kısım 5.1 ve Tablo 5.3 de bahsedilmiştir.

mesi için gerekli bir basamaktır. Nalidiksit asit bir quinolon prototipidir (Şekil 20.13 ve Şekil 20.14). Nalidiksit asitin siproflaksasin gibi (Şekil 20.19 •) fluoroquinolene türevleri insanlarda idrar yollan enfeksiyonlarının tedavisinde rutin bir şekilde kullanılmaktadır. Siproflaksasin, şarbon hastalığının sebebi olan Bacülus anthracis'un penisillin dirençli suşlarmdan kaynaklanan enfeksiyonların tedavisinde tercih edilen bir ilaçtır (ö°öKısım 25.13). DNA giraz enzimi tüm bakterilerde bulunduğundan fluoroquinolene'lar hem Gram-pozitif hem de Gram-negatif bakteriyal enfeksiyonların tedavisinde etkilidir (Şekil 20.15). Fluoroquinolene'lar aynı zamanda sığır eti ve kümes hayvanları endüstrisinde solunumla ilgili hastalıkların engellenmesinde ve tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır.

m

20.6 Kavramların Gözden Geçirilmesi

Sentetik antimikrobiyal ajanlar Bacteria, virüsler ve funguslar için selektif'dir. Sülfa ilaçlar, izoniazid ve nükleik asit analogları gibi üreme faktörü analogları sentetik metabolik inhibitörlerdir. Quinolonlar bakterilerde DNA giraz enzim aktivitesine engel olurlar. •

Seçici toksisite nedir?

•

Sentetik kemoterapötik ajanları antiseptik ve dezenfektanlardan ayırt ediniz?

•

Üreme faktörü analoglarından her hangi birisinin etkisini tanımlayınız.

20 7 • Doğal Antimikrobiyal İlaçlar: Antibiyotikler • 685

COOH

• Şekil 20.19 Bir quinolon antibiyotiği olan siproflaksasin. Siproflaksasin, nalidiksik asitin florlu bir türevidir (Şekil 20.13). Türevleri nalidiksik asitle kıyaslandığında daha fazla çözünür ve kan ve dokularda klinik olarak tedavi edici seviyelere ulaşır. Siproflaksasin, idrar yollan enfeksiyonlarım ve penisillindirençli BaciIIus anthracis suşlannın neden olduğu şarbon hastalığının tedavisinde kullanılır, treat urinary tract infections and anthrax caused by penicülin-resistant Bacillus anthracis.

Doğal Antimikrobiyal İlaçlar: Antibiyotikler Sentetik antimikrobiyal maddelere kıyasla antibiyotikler doğallardır. Geniş çeşitlilikteki funguslar ve bakteriler tarafından üretilir ve diğer mikroorganizmaları öldürür veya gelişimlerini engeller. Doğada çok fazla sayıda antibiyotik tanımlanmış ancak bunların %1 den de azı klinik olarak faydalı bulunmuştur. Bununla beraber, faydalı antibiyotiklerin enfeksiyonel hastalıkların tedavisi üzerinde oldukça dramatik etkileri bulunmaktadır. Etkinliklerini geliştirmek adına, pek çok doğal antibiyotik laboratuvar ortamında yapısal olarak modifiye edilmiştir. Bunlar yan-sentetik antibiyotikler olarak isimlendirilir. Antibiyotiklerin büyük-ölçek endüstriyel üretimleri Bölüm 30 da tartışılacaktır.

etkili araştırma gereçleridir çünkü protein sentezinde bazı basamakları bloke ederler (soaKısım 7.16). Mesela, streptomisin protein sentezinde başlama basamağını engellerken puromisin, kloromfenikol, sikloheksimit ve tetrasiklin antibiyotiklerin uzama basamağını engellemektedir. İki antibiyotik protein sentezinde aynı basamağı engellese bile bunların inhibisyon mekanizmaları oldukça farklı olabilir. Örneğin, puromisin ribozomun A bölgesine bağlanır ve büyümekte olan polipeptit zinciri aminoaçil-transfer RNA kompleksi yerine puromisin'e transfer edilir (s^Şekil 7.37 ve 7.38). Puromisin-peptit kompleksi daha sonra ribozomdan ayrılarak uzuma işlemini durdurur. Kloromfenikol ise, bunun aksine peptit bağ oluşumunu engellemek suretiyle uzama işlemine engel olur. Pek çok antibiyotik, organizmaların ribozomlarını spesifik bir şekilde sadece bir veya iki filogenetik domainden inhibe eder. Örneğin, kloromfenikol ve streptomisin Bacteria ribozomları için spesifik iken sikloheksimit sadece Eukarya'nm ribozomlarmı etkilemektedir. Mitokondri ve kloroplast prokaryotik tip ribozomlara sahip olduklarından bakterilerde protein sentezini engelleyen antibiyotikler bu organellerdeki protein sentezini de engellerler (£O& Kısım 14.4). Bu antibiyotiklerin bir kaçı, tetrasiklin gibi, medikal olarak faydalıdır çünkü ökaryotik mitokondriler antimikrobiyal terapide kullanılan konsantrasyonlardan etkilenmemektedir.

Antibiyotikler ve Seçici Antimikrobiyal Toksisite Transkripsiyonu Etkileyen Antibiyotikler Mikroorganizmaların antibiyotiklere ve diğer Antibiyotiklerden bir kaçı RNA sentezini engellekemoterapötik maddelere hassasiyeti önemli ölçümek suretiyle spesifik bir şekilde transkripsiyonu de değişiklik göstermektedir (Şekil 20.15). Örneğin, engellemektedir (oeoKısım 7.10 ve Şekil 20.14). her ne kadar bazı genis-spektrumlu antibiyotikler Örneğin, rifampin ve streptovaricin antibiyotikleri gram-pozitif ve gram-negatif Bacteria üzerinde etkili RNA polimeraz enziminin /3-alt ünitesine bağlaolsalar da farklı antibiyotiklere hassasiyetleri bakınarak RNA sentezine engel olurlar. Bu antibiyomından bu iki grup birbirinden farklılık gösterebiltikler Bacteria, kloroplastlar ve mitokondriler için mektedir. Genelde, dar-spektrumlu antibiyotikler ile spesifiktir. Aktinomisin, DNA ile bir araya gelip kıyaslandığında, geniş-spektrumlu antibiyotikler RNA elongasyonunu bloke etmek suretiyle RNA daha geniş alanlarda medikal kullanımlara sahipsentezini engeller. Aktinomisin, DNA molekülüne tir. Bununla beraber, sınırlı aktivite spektrumuna guanin-sitozin baz ciflerinden oldukça güçlü bir sahip bir antibiyotik, diğer antibiyotiklere yanıt şekilde bağlanarak çift-zincirde RNA molekülüveremeyen mikroorganizmaların kontrolünde nün sentezlendiği büyük oluğa oturur. oldukça değerli olabilir. Buna bir örnek olarak darSon derece faydalı olan antibiyotiklerden bazıspektrumlu bir glikolipit olan vankomisin'ı verebiları hücre duvarı gibi Bacteria' nın emsalsiz yapısal liriz. Bakteriyosidal bir madde olan bu antibiyotik Staphylococcus, Bacillus ve Clostridium generasından özelliklerini hedef almaktadır. Bu antibiyotiklerin penisillin-dirençli gram-pozitif Bacteria için olduk- bir kaçından ve hedeflerinden bir sonraki kısımda bahsedeceğiz. ça etkilidir (Şekil 20.13, 20.14 ve 20.15). Antibiyotiklerin bakterilerdeki önemli hedefleri arasında ribozomlar (translasyon), hücre duvarı, sitoplazmik zar, DNA replikasyonu ve transkripsiyon yer almaktadır (Şekil 20.14). Burada protein sentezi ve transkripsiyonu engelleyen antibiyotik mekanizmalarından bahsediyoruz. Protein Sentezini Etkileyen Antibiyotikler Pek çok antibiyotik ribozomlarla etkileşime girmek suretiyle protein sentezini engellerler (Şekil 20.14). Bu etkileşimler oldukça spesifiktir ve çoğu rRNA molekülünü gerektirmektedir. Bu antibiyotiklerin bir kaçı medikal olarak faydalıdır ve bir kaçı da

20.7 Kavramların Gözden Geçirilmesi Antibiyotikler, çeşitli mikroorganizmalar tarafından üretilen antimikrobiyal bileşenlerin kimyasal olarak farklılık gösteren bir grubudur. Pek çok antibiyotik bilinmesine rağmen, zayıf alınım ve toksisiteden dolayı çoğu insanlarda ve hayvanlarda faydalı değillerdir. Pek çok antibiyotik hedef organizmalarda transkripsiyonu veya translasyonu engellemek suretiyle fonksiyon göstermektedir. • Antibiyotikleri, üreme faktörü analoglanndan ayırt ediniz. • Geniş-spektrumlu antibiyotik nedir? • Protein sentezini ve transkripsiyonu engelleyen antibiyotikler için hedeflenmiş potansiyel bölgeleri tanımlayınız.

• Bölüm 20 • Mikrobiyal Üremenin Kontrolü

/ -LalUam Antibiyotikleri: Penisillinler ve Sefalosporinler Antibiyotiklerin hem tarihsel hem de medikal anlamda en önemli gruplarından birisi /3-laktam grubudur. /3-laktam antibiyotikleri arasında medikal anlamda önemli olan penisillin, sefalosporin ve sefa-

misin antibiyotikleriyer almaktadır. Bu antibiyotikler karakteristik bir yapısal bileşen olan /3-laktam halkasına sahiplerdir (Şekil 20.20*). Penisillinler ve sefalosporinler bir araya geldiklerinde dünyada üretilen ve tüketilen antibiyotiklerin tamamının yarısından fazlasını oluşturmaktadırlar (Şekil 20.16).

CH 3 + ;-COO"(Na , I

W-açil grup

Tiyazolidin halkası 6-Aminopenisilanik asit

il grup

İsim DOĞAL PENİSİLİN Benzilpenisilin (Penisilin G) Gram-pozitif aktivite p-laktamaz duyarlı

/

^CH2—CO—

Penisillinler 1929 yılında, İngiliz Bilim Adamı Alexander FleYARI-SENTETİK PENİSİLİNLER ming bir fungus olan Penicillium chrysogenum tarafından üretilen antimikrobiyal ürünü /3-laktam Metisilin antibiyotik penisillin G olarak tanımlamıştır (Şekil asit-dayanıklı, p-laktamaz dirençli 20.20). Penisillin G, keşfedilen ve klinik olarak etkili olan ilk antibiyotiktir. Sülfa ilaçlan kullanılsa bile enfeksiyonel hastalıkların çoğu 1930 larda Oksasilin asit-dayanıklı, kontrol altına alınamamıştır. Bununla beraber, p-laktamaz dirençli 1939 yılında, Howard Florey ve meslektaşları II. Dünya Savaşının başlamasının tahrikiyle penisillin Amfisilin antibiyotiğinin büyük ölçeklerde üretimi için özel Genişletilmiş aktivite spektrumu
20,9 • Prokaryotlardan Elde Edilen Antibiyotikler • 687

Hücre duvarı ve hücre duvarının sentez mekanizması Bacteria'lara özgü olduğundan, /3-laktam antibiyotikleri oldukça yüksek hassasiyete sahiptirler ve konukçu hücrelere toksik değillerdir. Bununla beraber, bu antibiyotiklerin kompleks yapılarından dolayı, bazı bireyler ardı ardına tekrarlanan antibiyotik terapilerinden sonra bazı /3-laktam maddelerine karşı allerji geliştirebilirler («»aKısım 22.15). Sefalosporinler Sefalosporinler /3-laktam halkası içeren ve klinik olarak önemli olan antibiyotiklerin bir diğer grubudur. Sefalosporin, fungus Cephalosporium sp. tarafından üretilir («naKısım 30.6). Sefalosporinler yapısal olarak penisillinlerden farklılık gösterirler. Yapılarında /3-laktam halkası mevcuttur ancak beş-üyeli tiyazolidin halkası yerine altı-üyeli dihidrotiyazin halkasına sahiplerdir. Sefalosporinler tıpkı penisillinler gibi etki mekanizmasına sahiplerdir; yani geri dönüşümü olmayan bir şekilde PBP'lere bağlanır ve peptidoglikanm çapraz-bağlanmasına engel olurlar. Klinik olarak önemli olan sefalosporinler penisillinlerden daha geniş antibiyotik aktivite spektrumuna sahip olan yarı-sentetik antibiyotiklerdir. Buna ek olarak, /3-laktam halkasını yıkan /3-laktamaz enzimine karşı genelde daha dirençlidirler. Örneğin, seftriakson (Şekil 20.13) /3-laktamaz enzimine karşı oldukça dirençlidir ve Neisseria gonorrhoeae'dan kaynaklanan enfeksiyonların (bakınız Kısım 20.12, <2°oKısım 26.12) tedavisinde penisillin antibiyotiğinin yerini almıştır, çünkü pek çok N. gonorrhoeae susu artık penislin dirençlidir. 20.8 Kavramların Çözden Geçirilmesi Penisillinler ve safalosporinleri de içine alan /3-laktam bileşikleri klinik olarak oldukça önemli antibiyotiklerdir. Bu antibiyotikler Bacfen'a'lardaki hücre duvarı sentezini hedef alırlar. Düşük konukçu toksisitesine ve geniş aktivite spektrumuna sahiplerdir. • /3-laktam halkasının yapısını çiziniz ve /3-laktamaz aktivite bölgesini gösteriniz. • /3-laktam antibiyotikleri nasıl işlev gösterir? • Gram-negatif Bacteria'lardan kaynaklanan enfeksiyonların tedavisinde penisillinlere kıyasla sefalosporinler ne tür avantajlara sahiplerdir.

Prokaryotlardan Elde Edilen Antibiyotikler

A/-Asetiltransferaz

I

H 2 C—NH 2 -O

NH 2

A

o--A?H

KNH 2

1/

• Şekil 20.21 Kanamisin, aminoglikozit antibiyotiği. Amino şekerler san renkte. Direnç pilazmiti tarafından kodlanan JV-asetiltransferaz tarafından yapılan modifikasyon bölgesi gösterilmiştir (bakınız Kısım 20.12). Asetilasyonu takiben, antibiyotik inaktiftir.

tomyces griseus tarafından üretilen) (Şekil 20.13) ve kanamisin (Şekil 20.21*), neomisin, gentamisin, tobramisin, netilmisin, spektinomisin ve arnikasın gibi türevleri yer almaktadır. Aminoglikozitler protein sentezine ribozomun 30S alt ünitesinden engel olurlar (Şekil 20.14) ve gram-negatif Bacteria'lara karşı klinik olarak kullanışlıdırlar (Şekil 20.15). Streptomisin, tüberküloz tedavisinde kullanılan etkili ilk antibiyotiktir. Bununla beraber, aminoglikozit antibiyotiklerinin hiç biri günümüzde yaygın olarak kullanılmamaktadır ve aminoglikozitlerin hepsi bir arada üretilen ve tüketilen tüm antibiyotiklerin tamamının sadece %3 ünü oluşturmaktadır (Şekil 20.16). Tüberküloz tedavisinde nörotoksisite ve nefrotoksisite (böbrek toksisite) gibi ciddi yan etkilerden dolayı streptomisin'in yerini çeşitli sentetik antimikrobiyaller almaktadır. Bakteriyal direnç de kolayca oluşmaktadır. Gram-negatiflerin tedavisinde aminoglikozitlerin kullanımı yarı-sentetik penisillinlerin (bakınız Kısım 20.8) ve tetrasiklinlerin (bakınız bu bölümün daha ilerisi) keşfinden bu yana azalmaktadır. Aminoglikozit antibiyotiklerin diğer antibiyotiklerin başarısız olduğu durumlarda öncelikli olarak kullanılan depo antibiyotikler olduğu düşünülmektedir. Makrolit Antibiyotikler Eritromisin gibi makrolit antibiyotikler şeker moleküllerine bağlı büyük lakton halkaları içer-

Bakteria'lava karşı aktif olan çoğu antibiyotik aynı zamanda Bacteria'lar tarafından üretilmektedir. Bunların arasında aminoglikozüler, makrolitler ve tetrasiklinler bulunmaktadır. Bu antibiyotiklerin çoğu oldukça önemli klinik uygulamalara sahiptirler, ve bu bölümde bu antibiyotiklere ait genel özelliklerden bahsedilmektedir. Aminoglikozit Antibiyotikler Aminoglikozit antibiyotikleri diğer amino şekerlere glikosidik bağlarla bağlanmış (c^Kısım 3.3) amino şekerlerini içermektedir. Klinik olarak faydalı aminoglikozitler arasında streptomisin (Strep-

• Şekil 20.22 Eritromisin, makrolit antibiyotiği. Eritromisin oldukça yaygın olarak kullanılan geniş-spektrumlu bir antibiyotiktir.

h

• Bölüm 20 • Mikrobiyal Üremenin Kontrolü

mektedir (Şekil 20.22*). Hem makrolit halkasında hem de mevcut şekerlerdeki varyasyonlar oldukça büyük çeşitlilikteki makrolitleri oluşturmaktadır. En iyi bilinen makrolit antibiyotiği eritro-misin'dir (Streptomyces erythreus tarafından üretilen). Klinik olarak faydalı olan diğer makrolitler arasında dirithromycin, clarithromycin ve azithromycin yer almaktadır. Makrolitler dünya üzerinde üretilen ve kullanılan toplam antibiyotiklerin % 11 'ini oluşturmaktadır (Şekil 20.16). Eritromisin, ribozomun 50S alt ünitesinde işlev gösteren protein sentez inhibitörüdür (Şekil 20.14). Eritromisin, penisillin ve diğer /3-laktam antibiyotiklerine karşı allerjisi olan hastalarda penisillin yerine yaygın bir şekilde kullanılmakta olup bununla beraber lejyonelloz tedavisinde de oldukça faydalıdır (o°öKısım 28.7). Tetrasiklinler Streptomyces cinsinin (s^Kısım 30.6) çeşitli üyeleri tarafından üretilen tetrasiklinler insanlarda medikal anlamda geniş çapta kullanım alanı bulan antibiyotiklerin önemli bir grubudur. Neredeyse tüm gram-pozitif ve gram-negatif Bacteria'lan inhibe eden ilk geniş-spektrumlu antibiyotiklerdendir. Tetrasiklin'lerin temel yapısı naphthacene halka sistemini içermektedir (Şekil 20.23*). Yeni tetrasiklin analoglarını meydana getirmek için naphthacene halka sistemi çeşitli pozisyonlarda değiştirilebilir. Örneğin, klorotetmsiklin klor atomuna sahipken oksitetmsiklin ilave bir hidroksil gruba (OH) sahiptir ve klor yoktur. Bu üç tetrasiklin doğal yollarla üretilmekle beraber naphthacene halka sisteminde değişikliklere sahip yarı-sentetik tetrasiklinler de geliştirilmektedir. Eritromisin ve aminoglikozit antibiyotikleri gibi, tetrasiklin de protein sentez inhibitörüdür ve ribozomun 30S alt ünite fonksiyonuna engel olur (bakınız Şekil 20.14). Tetrasiklinler, /3-laktam antibiyotikleri ile birlikte, medikal alanda antibiyotiklere ait en önemli iki grubu oluşturmaktadır. Tetrasiklinler aynı zamanda veterinerlik alanında ve bazı ülkelerde de kümes hayvanları ve domuz için besinsel destek olarak yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Medikal R 2 R3

OH

1

V 0

OH

0

OH

Ico

NH 2

Daptomisin Daptomisin, Streptomyces cinsinin bir üyesi tarafından üretilen bir diğer antibiyotiktir. Bu yeni antibiyotik eşsiz etki mekanizmasına sahip siklik bir lipopeptit'dir (Şekil 20.14). Çoğunlukla patojen olan stafilokok ve streptokok gibi gram-pozitif Bacteria'lann sebep olduğu enfeksiyonların tedavisinde kullanılan daptomisin, bakteriyal hücre zarına bağlanır ve zar potansiyelinin hızlı bir şekilde depolarizasyonuna sebep olur. Depolarize olmuş hücre, nükleik asitler ve proteinler gibi makromolekülleri sentezleme yeteneğini kaybeder ve neticede hücre ölür. Bu eşsiz zara bağlanma mekanizmasından dolayı, tanınabilir ve transfer edilebilir bir direnç mekanizması mevcut değildir. 20.9 Kavramların Gözden Geçirilmesi Aminoglikozitler, makrolitler ve tetrasiklin antibiyotikleri bakteriler tarafından üretilen ve diğer Bacteria'lara karşı aktif olan yapısal olarak kompleks moleküllerdir. Bunların tamamı protein sentezine müdahale etmek suretiyle fonksiyon gösterirler. Yeni bir antibiyotik olan daptomisin hücre zarını depolarize eder. • Aminoglikozit, tetrasiklin, makrolit ve daptomisin antibiyotiklerinin biyolojik kaynaklan nelerdir? • Her bir antibiyotik sınıfının aktivitesi etkilenen hücrenin ölümüne ne şekilde sebep olmaktadır?

tiIV

VİRÜSLER VE OKARYOTIK PATOJENLERİN KONTROLÜ Virüslerin ve funguslar gibi ökaryotik patojenlerin gelişimini kontrol eden ilaçlar genellikle ökaryotik konukçu hücreyi de etkiler. Sonuç olarak, ökaryotik patojenlerde seçici toksisiteye ulaşmak oldukça zordur; sadece öncelikli olarak patojen-spesifik metabolik yolları veya yapısal bileşenleri etkileyen kemoterapötik ajanlar faydalıdır. Bu ilaçlardan sınırlı sayıda mevcuttur, ve burada bunlardan bazılarının etki mekanizmalarından bahsedece iz.

Antiviral İlaçlar

Rı

R2

R3

R4

Tetrasiklin

H

OH

CH 3

H

7-Klorotetrasiklin (aureomisin)

H

OH

CH 3

Cl

5-Oksitetrasiklin (terramisin)

OH

OH

CH 3

H

Tetrasiklin analoğu

alanda önemli antibiyotiklerin medikal olmayan alanlarda kapsamlı bir şekilde kullanımları yaygın antibiyotik direncine katkıda bulunduğundan, bu alandaki kullanımı artık uygun görülmemektedir (bakınız Kısım 20.12).

Şekil 20.23 Tetrasiklin. Tetrasiklinin yan-sentetik analoglan önemli antibiyotiklerdir

Bakterilere karşı seçici antibakteriyal ajanların kullanımı ile kazanılan terapötik başarılar antiviral ajanların kullanımı ile sağlanan kazançlara denk değildir çünkü virüsler üremek ve metabolik fonksiyonlarını gerçekleştirmek için kendi ökaryotik konukçularını kullanırlar (^»oBölüm 9). Virüsleri kontrol eden ilaçların çoğu konukçu yapılarını hedef alır ve dolayısıyla da konukçu için toksiktir. Bununla beraber, çeşitli ajanlar konukçuya kıyasla

20 10 • Antiviral ilaçlar •

1

Tablo 20.5 Antiviral kemoterapötih bileşikler Kategori/İlaç Füzyon inhibitörü Enfuvirtid İnterferonlar

înterferon a Interferon fi înterferon y Nöraminidaz inhibitörleri Oseltamivir Zanamivir Non-Nükleozit ters transkriptaz inhibitörü (NNRTI) Nevirapine Nükleozit analoglan Asiklovir Gansiklovir Trifluridin Valasiklovir Vidarabin Abakavir (ABC) Didanozin (dideoksiinozin veya ddl) Emtrisitabin (FTC) Lamivudin (3TC) Stavudin (d4T) Zalsitabin (ddC) Zidovudin (AZT) (0°öŞekil 26.38) Ribavirin Nükleotit analoglan Sidofovir Tenofovir (TDF) Proteaz tnhibitörleri Amprenavir Indinavir (Şekil 20.28) Lopinavir Nelfinavir Saquinavir (Şekil 20.28) Pirof osfat analoğu Fosfonoformik asit (Foscarnet) RNA polimeraz inhibitörü Rifamisin Sentetik aminler Amantadin Rimantadin

Etki Mekanizması

Etkilenen virüs

HlV-lenfosit zar füzyonunu bloke eder

HIV

Viral replikasyonu engelleyen proteinleri uyarır

Geniş-spektrum (konukçu spesifik)

Influenza nöraminidaz enziminin aktif bölgesini bloke eder

influenza A ve B influenza A ve B

Ters transkriptaz inhibitörü

HIV

Viral polimeraz inhibitörleri

Herpes virüsleri, Varicella zoster Cytomegalovirüs Herpes virüs Herpesvirüs Herpesvirüs, vaccinia, hepatit B virüsü

Ters transkriptaz inhibitörleri

HIV HIV HIV

HIV, hepatit B virüsü

HIV HIV HIV

Viral RNA'ya başlık takılmasını bloke eder influenza A ve B Lassa ateşi

Solunumla ilgili sinsityal virüs,

Viral polimeraz inhibitörü Ters transkriptaz inhibitörü

Sitomegalovirüs, herpes virüsleri

Viral proteaz inhibitörü

HIV HIV HIV HIV HIV

Viral polimeraz inhibitörü

Herpesvirüs, HIV, hepatit B virüsü

RNA polimeraz inhibitörü

Vaccinia, poks virüsü

Viral uncoating engelleyicisi

influenza A influenza A

HIV

"Human immunodeficiency virüs

virüsler için çok daha toksiktir ve sadece birkaç ajan spesifik olarak virüsleri hedef alır. AİDS hastalığının (-»»Kısım 26.14) etken ajanı olan insan immun yetmezlik virüsünü (HIV) kontrol etmek için etkin önlemleri bulma çabalarından dolayı kimyasal maddelerle virüsleri kontrolde önemli başarılar sağlanmıştır Antiviral Kemoterapötik Ajanlar

Antiviral kemoterapide en başarılı ve yaygın olarak kullanılan ajanlar nükleozit analoglandır (Tablo 20.5). Bu kategoride dünya çapında kabul gören ilk bileşik zidovudin, veya azidotimidin (AZT) dir. AZT, KIV gibi retrovirüsleri inhibe eder (cooŞekil 26.38). Azidotimin kimyasal olarak timin bazına

benzerdir ancak dideoksi türevidir ve 3'-hidroksil grubu yoktur. AZT, ters transkripsiyonu ve viralkodlu DNA ara ürün üretimini bloke ederek retrovirüslerin çoğalmasına engel olur. Bu işlem HIV in çoğalmasını imhibe eder. HIV ve diğer virüslerin tedavisi için Tablo 20.5 de de gösterildiği üzere benzer mekanizmalara sahip diğer birkaç nükleozit analoglan geliştirilmiştir. Nükleozit analoglarmm, veya nükleozit ters transkriptaz inhibitörlerinin (NRTI) neredeyse tamamı aynı mekanizma ile çalışır ve nükleik asit polimeraz enzimi tarafından gerçekleştirilen viral nükleik asit zincirinin uzamasını inhibe ederler. Bir nükleotit analogu olan cidofovir aynı şekilde fonksiyon gösterir (Tablo 20.5). Normal bir hücre fonksiyonu olan nükleik asit replikasyonu hedef alındığı

690 • Bölüm 20 • Mikrobiyal Üremenin Kontrolü

için, bu ilaçlar genelde belirli bir seviyede konukçu toksisitesi yaratır. Pek çok NRTI, ilaç-dirençli virüslerin ortaya çıkmasından dolayı zamanla antiviral güçlerini kaybederler (ö°oKısım 26.14). Birkaç başka antiviral ajan ters transkripaz enzimini hedef alır. Non-nükleozit ters transkriptaz inhibitörü (NNRTI) olan Nevirapin direkt olarak ters transkriptaz enzimine bağlanır ve ters transkripsiyonu inhibe eder. Fosfonoformik asit, normal internükleotit bağlarını engelleyerek viral nükleotitlerin sentezine engel olan inorganik pirofosfatın analoğudur. NRTI larda olduğu gibi, NNRTI lar da genelde bir seviyeye kadar konukçu toksisitesine sebep olur çünkü bunlar da normal konukçu hücre nükleik asit sentezini etkilerler. Antiviral ilaçlara ait yepyeni bir sınıf protez inhibitörleridir (PI) (Tablo 20.5 ve bakınız Şekil 20.28). Bu ilaçlar özellikle HIV tedavisinde etkilidir. HIV proteaz enziminin aktif bölgesine bağlanıp viral polipeptitlerin işlemini ve virüs olgunlaşmasını engellemek suretiyle viral replikasyonunu önlemektedir (oaûKısım 26.15 ve Kısım 20.13). Anti-HIV ilaçlara ait son kategori enfuvirtid olarak bilinen tek bir ilaç ile temsil edilmektedir. Bu ilaç, HIV in gp41 zar proteinine bağlanan 36 amino asitlik sentetik peptitden ibaret olan bir füzyon inhibitörüdür (Tablo 20.5 ve d^sKısım 26.14). Proteinin bağlanması viral ve hedef T lemfosit hücre zarlarının füzyonu için gerekli olan konformasyonal değişiklikleri durdurmaktadır. Influenza Antiviral Ajanlar İlaçlara ait iki kategori influenze enfeksiyonlarını etkili bir şekilde sınırlamaktadır. Adamantan türevleri olan amantadin ve rimantadin, influenza A iyon transport proteinlerine müdahale ederek virüs kılıfının açılmasına ve bunu izleyen replikasyon işlemine engel olan sentetik aminlerdir. Nörominidaz inhibitörleri olan oseltamivir ve zanamivir, influenza A ve B virüslerinde nöraminidaz enziminin aktif bölgesini bloke ederek enfekte olmuş hücrelerden virüsün çıkışma engel olur. Her iki kategoride yer alan ilaçlar influenza enfeksiyonunun tedavisinde ve kemoprofilaksisinde kullanılır (c«2,Kısım 26.8). Interferon Interferonlar, normal hücrelerde antiviral proteinlerin üretimini harekete geçirerek viral multiplikasyonuna engel olan düşük moleküler ağırlığa sahip proteinlerdir (17,000MW). Virüs ile enfekte olmuş hücelerdeki interferonlar enfekte olmamış hücrelerin yüzeyindeki reseptörlerle etkileşime girerek daha fazla virüs enfeksiyonuna engel olmak için görev yapan antiviral proteinlerinin sentezini teşvik ederler. İnterferonlar sitokinlerdir ve üç moleküler formda üretilirler: IFN-a lökositler, IFN-fi fibroblastlar ve IFN-y ise immun lemfositler tarafından üretilir (s°öKısım 23.11). Bu üç formun hepsi de etkili birer viral inhibitörüdür. Bir virüs ile enfeksiyonun bunu izleyen bir başka virüs ile enfeksiyonu engellemesi olarak

ifade edilen virüs interferansı ile ilgili çalışmalarda interferansın sebebi olan birkaç küçük protein tanımlanmıştır. Daha sonra interferonlar olarak isimlendirilen bu proteinler canlı virüs, viral nükleik asitleri ve radyasyon ile inaktive olmuş virüse karşılık oluşmaktadır. İnterferonlar, düşük virülensli virüsler ile enfekte olmuş hücreler tarafından çok miktarlarda üretilirler. Bununla beraber yüksek virülense sahip virüslere karşı ise oldukça az miktarlarda üretilmektedirler, interferonlar, aynı zamanda doğal veya sentetik olan çeşitli çiftzincir RNA (dsRNA) molekülleri tarafından da uyarılmaktadır. dsRNA'lar, doğada sadece rhinovirüs (soğuk virüs) gibi belli bazı RNA virüsleri ile enfekte olmuş hücrelerde replikatif form şeklinde mevcutlardır (ö^Kısım 16.10 ve 26.8). Çift-zincir RNA görünüşte hayvan hücrelerinde virüs enfeksiyonunun sinyalini vermekte ve interferon üretimini teşvik etmektedir. İnterferon aktivitesi, virüs-spesifik olmaktan ziyade konukçu hücreye spesifiktir. Bir türe ait üyeler tarafından üretilen interferon sadece aynı türün hücrelerindeki spesifik reseptörleri tanır. Sonuç olarak, örneğin rhinovirüse karşı hayvan hücreleri tarafından üretilen interferon aynı tür içerisindeki hücrelerde influenza virüslerinin çoğalmasına engel olabilir ancak diğer hayvan türlerine ait hücrelerdeki herhangi bir virüsün multiplikasyonu üzerinde herhangi bir etkiye sahip değildir. înterferonlar, antiviral ve antikanser ajanları olarak potansiyele sahiplerdir. Piyasada onaylanmış çeşitli rekombinant interferon preparasyonları mevcuttur. Bununla beraber, interferonlarm genel kemoterapötik ajan olarak kullanımları yaygın değildir çünkü enfekte olmamış konukçu hücrelerde antiviral proteinlerin üretimini teşvik etmek için interferonlarm lokal olarak yüksek konsantrasyonlarda verilmesi gerekmektedir. Bu nedenle, bu antiviral ajanların klinik faydaları interferonu konukçu hücredeki lokal alanlara enjektör veya püskürtü yolu ile verebilme kabiliyetimize bağlıdır. Alternatif olarak, interferonu teşvik eden sinyallerin (yani, viral nükleotitler, virülent olmayan virüsler, veya sentetik nükleotitler) viral enfeksiyondan önce konukçu hücreye layıkıyla verilmesiylede aynı amaç gerçekleştirilebilir. 20.10 Kavramların Gözden Geçirilmesi Etkili antiviral ajanlar virüs-spesifik enzimleri ve bunların işlemlerini hedef alır. Klinik olarak etkili olan antiviral ajanlar arasında nükleozit analogları ve nükleik asit polimeraz ve viral genom replikasyonunu engelleyen diğer ilaçlar yer almaktadır. Proteaz inhibitörleri gibi ajanlar viral olgunlaşma basamaklarım etkiler. Konukçu hücrelerde, aynı zamanda viral replikasyonunu durduran antiviral interferon proteinlerini üretir. • Neden etkili antiviral kemoterapötik ajanların sayısı oldukça azdır? Bu tür ajanlar neden nezle gibi yaygın viral hastalıkların tedavisinde kullanılmazlar? • Viral olgunlaşma işleminin hangi basamakları nükleozit analogları tarafından engellenmektedir? Proteaz inhibitörleri tarafından engellenmektedir? İnterferonlar tarafından engellenmektedir?

20.11 • Antifungal İlaçlar • 691

20.11

•

Antifungal Haçlar

Virüsler gibi, funguslar ile ilgili kemoterapi çalışmalarında da problemler bulunmaktadır. Funguslar, Eukarya oldukları için, hücresel mekanizmalarının çoğu hayvanlar ve insanlardaki ile aynıdır. Bu yüzden, funguslarda metabolik yolları etkileyen kemoterapötik ajanlar aynı zamanda konukçu hücrelerde buna denk yolları etkileyerek ilaç toksisitesine sebep olmaktadır. Sonuç olarak, pek çok antifungal ilaç sadece topikal (yüzey) uygulamalarda kullanılabilmektedir. Bununla beraber, sadece birkaç ilaç, eşsiz fungal yapısını veya metabolik işlemleri hedef aldıklarından, funguslar için seçici toksisiteye sahiptir. İmmun sistemi baskılanmış olan bireylerde fungal enfeksiyonlar oldukça yaygın olduğundan, fungal tedavisinde ilaç arayışları artan bir şekilde önem kazanmaktadır (^c^Kısım 26.14 ve 27.8). Funguslara karşı etkili olan çeşitli kimyasal sınıfların seçici toksisitelerinden detaylı olarak bahsedeces az.

Ergosterol inhibitörleri Yüksek ökaryotik hücrelerin sitoplazmik zarlarmdaki kolestrolün yerine fungal hücre zarlarında ergosterol bulunmaktadır (öooKısım 4.5). İki grup antifungal bileşik ergosterol ile etkileşime girerek veya onun sentezini engelleyerek fonksiyon gösterir (Tablo 20.6). İlk grup içerisinde Streptomyces cinsinin üyeleri tarafından üretilen ve antibiyotiklere ait bir diğer grubu oluşturan poliyenler bulunmaktadır. Poliyenler ergosterole bağlanıp zar fonksiyonunu bozarak zar geçirgenliğine ve hücrenin ölümüne sebep olurlar (Şekil 20.24*). Antifungal bileşiklerin ikinci majör grubu arasında azoller ve alilaminler olarak isimlendirilen ve seçici olarak ergosterol biyosentezini engelleyen sentetik ajanlar bulunmaktadır ve dolayısıyla da daha geniş antifungal aktiviteye sahiplerdir. Funguslar, azollerle muamele edidiğinde normal zar oluşturma özelli-

Zar fonksiyonları: Poliyenler, ergosterole bağlanarak zarın bütünlüğünü bozarlar

Hücre duvarı sentezi: Polioksinler kitin sentezini, ekinokandinler ise glukan sentezini inhibe ederler Ergosterol sentezi: Azoller ve alilaminler sentezi inhibe ederler

Nükleik asit sentezi: 5-florositozin, nükleik asit sentezini inhibe eden bir nükleotit analoğudur

Mikrotübül oluşumu: Griseofulvin mitoz esnasında mikrotübüllerin kümeleşmesini bozar

• Şekil 20.24 Bazı antifungal kemoterapötik ajanların etki bölgeleri. Funguslar ökaryotik hücre oldukları için antibiyotikler genelde etkisizdir.

ğini kaybederek zar hasarına ve kritik zar transport aktivitelerinde değişikliğe sebep olurlar. Alilaminler de ergosterol biyosentezini engeller ancak kullanımları sadece topikal uygulamalarla sınırlıdır çünkü hayvan hücreleri veya dokuları tarafından kolaylıkla kabul edilmemektedir. Ekinokandinler Ekinokandinler antifungal ilaçlara ait yeni bir sınıftır (Tablo 20.6). Fungal hücre duvarında glukan polimerlerini oluşturan 1,3 /3-D-glukan sentetaz enzimini inhibe ederek etki gösterirler (Şekil 20.24).

Tablo 20.6 Antifungal ajanlar

Kategori

Hedef

Örnekler

Kullanımı

Alilaminler Aromatik Antibiyotik Azoller

Ergosterol sentezi Mitoz inhibitörü Ergosterol sentezi

Kitin sentez inhibitörü Ekinokandinler Nükleik asit analogları Polyenler

Kitin sentezi Hücre duvarı sentezi DNA sentezi Ergosterol sentezi

Polioksinler

Kitin sentezi

Terbenafin Griseofulvin Klortrimazol Flukonazol Itrakonazol Ketokonazol Mikonazol Posoconazol Ravukonazol Varikonazol Nikomisin Z Kaspofungin 5-florositozin Amfoterisin B Nistatin Polioksin A Polioksin B

Ağızdan, topikal Ağızdan Topikal Ağızdan Ağızdan Ağızdan Topikal Deneysel Deneysel Ağızdan Deneysel Damar içi Ağızdan Ağızdan, damar içi Ağızdan, topikal Tarımsal Tarımsal

692 • Bölüm 20 • Mikrobiyal Üremenin Kontrolü

Memeli hücreleri 1,3 j3-D-glukan sentetaz enzimine sahip olmadıklarından bu ajanların etkisi spesifiktir ve hücrenin hızlı bir şekilde ölümüne sebep olur. Bu ajanlar Candida gibi fungusların sebep olduğu enfeksiyonları tedavi etmede kullanılır ve diğer ajanlara karşı direnç gösteren bazı funguslara karşı etkilidir («sKısım 26.14 ve 27.8). Diğer antifungal ajanlar Diğer antifungal ilaçlar fungus-spesifik yapılar ve fonksiyonlarla etkileşime girer (Tablo 20.6). Örneğin, fungal hücre duvarı sadece funguslar ve böceklerde bulunan ve kitin olarak isimlendirilen N-asetilglukozamin polimerini içermektedir (e*^> Tablo 17.9). Birkaç polioksin kitin biyosentezini etkilemek suretiyle hücre duvarı sentezini engeller. Yaygın bir şekilde tarımsal fungisit olarak kullanılan Polioksinler klinik kullanıma sahip değillerdir. Diğer ilaçlar replikasyon sırasında DNA topolojisini etkileyerek veya grisefulvin gibi mitoz sırasında mikrotubül kümeleşmesini bozmak suretiyle folat biyosentezine engel olurlar (o°GKısım 14.7). Nükleik asit analoğu olan 5-florositozin funguslarda etkili bir nükleik asit sentez inhibitörüdür. Oldukça etkili bazı antifungal ilaçlar diğer bazı biyolojik uygulamalara da sahiplerdir. Örneğin, vinkristin, vinblastin ve toksol etkili birer antifungal ajandır ve antikanser özelliklerine sahip oldukları bilinmektedir. Antifungal ilaçların kullanımı maalesef ki funguslara ait dirençli popülasyonunun ve "yeni" fungal patojenlerinin ortaya çıkmasına sebep olmaktadır. Örneğin, normalde patojenik olmayan Candida türleri antifungal ilaçlarla tedavi görmüş ve immun sistemi baskılanmış bireylerde hastalığa sebep olmaktadır.Bununla beraber, çeşitli patojenik Candida suşları halen kullanılan antifungal ajanların çoğuna karşı artık direnç geliştirmiştir. 20.11 Kavramların Gözden Geçirilmesi Antifungal ajanlar geniş çeşitlilikteki kimyasal kategorilerde yer almaktadır. Funguslar Eukarya olduğu için, seçici toksisiteye ulaşmak oldukça zordur ancak bazı etkili kemoterapötik ajanlar mevcuttur. Fungal enfeksiyonların tedavisi yeni yeni ortaya çıkmakta olan bir sağlık problemidir. • Neden klinik olarak etkili olan antifungal antibiyotikler çok azdır? • Hangi faktörler fungal enfeksiyonların görünüşteki artışına katkıda bulunmaktadır?

ANTİMİKROBİYAL İLAÇ DİRENCİ VE İLAÇ KEŞFİ Antimikrobiyal ilaç direnci çok sayıda patojenik mikroorganizma, özelliklede sağlık ile ilgili olanlar söz konusu olduğunda ciddi bir problemdir. Burada, mikroorganizmalarda ilaç direncinin birkaç sebebini ve yeni antimikrobiyal ajanların geliştirilmesindeki mevcut stratejileri araştırıyoruz. Halen

kullanılmakta olan antimikrobiyal ilaçların faydasını koruyan ve geliştiren pratik yöntemler "Antibiyotik direncini engelleme" isimli mikrobiyal ek bilgi'de tartışılmıştır.

Antimikrobiyal İlaç Direnci Antimikrobiyal ilaç direnci mikroorganizmanın normalde hassas olduğu kemoterapötik ajanların etkilerine karşı kazanmış olduğu direnç yeteneğidir. Antimikrobiyal ilaç direnci konukçuyu gerektirmez ancak konukçuda bulunan mikroorganizmaların bir işlevidir. Bahsettiğimiz gibi, antibiyotik üreticileri mikroorganizmalardır ve yaşayabilmek için antibiyotik üreten mikroorganizmalar kendi antibiyotiklerini nötralize eden veya yok eden direnç mekanizmaları geliştirmiştir. Ayrıca, bu direnç mekanizmalarını kodlayan genler diğerine, genelde yakın ilişkide olduğu organizmalara transfer edilir. Sonuç olarak, çoğu antimikrobiyal ilaç direnci genetik değişim ile aralarında transfer edilen direnç genlerini gerektirmektedir. Direnç Mekanizmaları Tüm mikroorganizmaları inhibe eden bir antibiyotik yoktur ve bazı mikroorganizmalar belli antibiyotiklere karşı doğal dirençlidir. Mikroorganizmaların antibiyotiklere karşı bu içsel yaradılışlarında var olan doğal dirence sahip olmalarının çeşitli sebepleri vardır. (1) Organizma antibiyotiğin inhibe ettiği yapıya sahip değildir. Örneğin, mikoplazmalar gibi bazı bakteriler tipik bakteriyal hücre duvarına sahip olmadıklarından penisillinlere karşı dirençlidir. (2) Organizma antibiyotiğe karşı geçirgen olmayabilir. Örneğin, çoğu gram-negatif Bacteria Penisillin G antibiyotiğine karşı geçirgen değildir. (3) Organizma antibiyotiği inaktif forma dönüştürme yeteneğine sahip olabilir. Birçok stafilokok çoğu penisillindeki /3-laktam halkasını kesen /3-laktamaz enzimine sahiptir (Şekil 20.25»). (4) Organizma antibiyotiğin hedefini modifiye edebilir. (5) Organizma dirençli biyokimyasal yol geliştirebilir. Örneğin, birçok patojen Bacteria''da folik asit üretimini engelleyen sulfonamit ilaçlarına karşı direnç geliştirmiştir (bakınız Kısım 20.6 ve Şekil 20.17). Direnç kazanan bakteri kendisini saran çevreden önceden oluşmuş olan folik asiti alacak metabolizmasını modifiye eder, böylece sulfonamit tarafından bloke konulan yola ihtiyaç duymaz. (6) Organizma hücreye giren antibiyotiği geri dışarı pompalayabilme yeteneğine sahip olabilir (dışarıya akış). Antibiyotiklere karşı bakteriyal dirence ait bazı spesifik örnekler Tablo 20.7 de verilmiştir. Kısım 10.9 ve 10.10'da sözedildiği gibi, mikroorganizmalarda antibiyotik direnci genetik olarak ya kromozomal DNA'da ya da direnç pilazmüleri (R faktör) olarak adlandırılan pilazmitlerde kodlanmıştır. Özgül dirençler, bir lokasyonda veya diğerinde tipik tarzda genetik temellere sahiptir (Tablo 20.7). Antibiyotik direnç kazanımından dolayı, klinik numunelerden izole edilen bakteriler MIC yöntemi veya ağar difüzyon yönteminin kullanımı

20 12 • Antimikrobiyal ilaç Direnci • 693

Tablo 20.7 Mechanisms of bacterial resistance to antibiotics Direnç mekanizması

Antibiyotik örnek

Direncin genetik temeli

Mekanizmanın mevcut olduğu organizma

Geçirgenliğin azaltılması

Penisihinler

Krorrtozomal

Antibiyotik inaktivasyonu (örneğin penisillinaz; metilaz, asetilaz, fosforilaz ve diğerleri, modifiye eder)

Penisillinler

Pilazmit ve kromozomal

Kloromfenikol

Pilazmit ve kromozomal

Aminoglikozitler Eritromisin Rifamisin Streptomisin Norfloksasin

Pilazmit Kromozomal

Sülfonamidler

Kromozomal

Tetrasiklinler Kloromfenikol

Pilazmit Kromozomal

Pseudomonas aeruginosa Enterik Bacteria Staphylococcus aureus Enterik Bacteria Neisseria gonorrhoeae Staphylococcus aureus Enterik Bacteria Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Enterik Bacteria Enterik Bacteria Enterik Bacteria Staphylococcus aureus Enterik Bacteria Staphylococcus aureus Enterik Bacteria Staphylococcus aureus

Eritromisin

Kromozomal

Hedef bölgenin değiştirilmesi (örneğin; RNA polimeraz, Rifamisin; ribozom eritromisin ve streptomisin; DNA giraz quinolonlar) Dirençli biyokimyasal yolun geliştirilmesi Atma (hücrenin dışına

pompalama)

ile antibiyotik hassasiyetleri bakımından test edilmelidir (bakınız Kısım 20.4 ve Şekil 20.10 ve 20.11). Klinik izolatların antibiyotik hassasiyet testlerine ait detaylar Kısım 24.3 de verilmiştir.

T%n/~"ilİT to o-ı ıVıt-il-I c DULlllUb blA-ULltlb

Staphylococcus spp.

Labomtuvarda, antibiyotiğe hassas olan kültürlerden genelde antibiyotik-dirençli hücreler izole edilebilmektedir. Bu izolatların direnci genelde kromozomal genlerdeki mutasyonlardan dolayıdır. Pek çok durumda, antibiyotik aktivitesinin hedefindeki modifikasyondan dolayı (örneğin ribozom) kromozomal genlerin aracılık yaptığı antibiyotik direnci ortaya çıkmaktadır. R pilazmitleritıin aracılık yaptığı Direnç Mekanizması

H,C

HO

Fosforilasyon Adenilasyon

CH 3 COOH (3-Laktamaz

Kloramfenikol

Penisilin

Hastalardan izole edilen ilaç-dirençli bakterilerin çoğu kromozomlarından ziyade R (direnç) pilazmitlerinde bulunan ilaç-direnç genlerine sahiptir («cnsKısım 10.10). R pilazmit direnci genelde ilacı inaktif'hale getiren yeni enzimleri kodlayan R pilazmit genlerinin varlığından (Şekil 20.25) veya ya ilaç alımını engelleyen ya da aktif bir şekilde hücrenin dışına pompalayan enzimleri kodlayan genlerden dolayıdır. Örneğin, aminoglikozit antibiyotikleri olan streptomisin, neomisin, kanamisin ve spektinomisin benzer kimyasal yapılara sahiplerdir. Bu ilaçlar için R pilazmitlerini taşıyan suşlar, antibiyotikleri ya fosforilasyon, ya asetilasyon ya da adenilasyon ile kimyasal olarak modifiye eden enzimleri yapabilir. Modifiye olmuş ilaç artık antibiyotik aktivitesine sahip değildir. Penisillinler söz konusu olduğunda, R pilazmitler, /3-laktam halkasını parçalayarak antibiyotiği inaktif hale getiren penisillinaz (/3-laktamaz) enzimini kodlarlar. Kloromfenikol direnci antibiyotiği asetile eden R-pilazmit tarafından kodlanmış enzimden dolayıdır. Tek bir R pilazmiti, her biri farklı antibiyotik-inaktivasyonuna sebep enzimi kodlayan çeşitli farklı genlere sahip olabileceğin* Şekil 20.25 R pilazmit genlerince kodlanan enzimler tarafından antibiyotiklerin etkilenen bölgeleri. Antibiyotikler, kimyasal modifikasyon veya kesim ile seçici bir şekilde inaktif hale getirilebilir (aym zamanda bakınız Şekil 20.20).

694 • Bölüm 20 • Mikrobiyal Üremenin Kontrolü

Mİkrobİyal Ek Bİlgİ

• Antimikrobiyal İlaç Direncinin Engellenmesi

ntimikrobiyal ilaç dirençliliği, bulaşıcı hastalıkların engellenmesi ve tedavi edilmesinde kullanılan bileşenlere karşı kazanılmış bir dirençtir. Antimikrobiyal ilaçlar, az sayıda mikroorganizmada, tek bir metabolik yolu engellemek suretiyle etki gösterirler. Mikroorganizmalar genellikle tek bir genin modifikasyonu veya kazanımı ile çok hızlı bir şekilde ilaç dirençliliği geliştirir veya kazamrlar. Örneğin; 1930'larda (surfanilamid) ve 1940'larda (penisillin) kullanılan antimikrobiyal maddelere karşı 1950'lerde pek çok mikroorganizma direnç sergilemiştir. Atlanta'daM (Georgia, USA) Hastalık Kontrol ve Engelleme Merkezi (CDC; Disease control and prevention) dirençliliğin geniş yayılım göstereceğini ve herkesin bu durumdan ya hasta ya da sağlık personeli olarak etkilenebileceğini öne sürmektedir. Birleşik Devletlerde her yıl yaklaşık 2 milyon hastada hastane kaynaklı (nozokomiyal) enfeksiyon geliştirmektedir. Nazokomiyal enfeksiyonların tedavisi oldukça zordur çünkü enfeksiyona sebep olan mikroorganizmaların %70 kadarı antimikrobiyal ilaçlara karşı dirençlidir. Yoğun bakım ünitelerinde bu tür enfeksiyonların %10'dan fazlasına neden olan Staphlococcus aureus için aşağıda verilen şekil metisilin ve en yeni penisillin türevi olan oksasilin (13 yıldan fazla) antibiyotiklerine karşı ilaç direncinde iki kat artışı göstermektedir. S. aureus izolatlan diğer birçok ilaca karşıda dirençli olabileceğinden metisilin/okzasilin dirençli S.aureus (MRSA) suşlannın ortaya çıkması tedavi edici etkili ilaçların seçimini kısıtlamaktadır. Mycobacteri-

IV tüpleri ve kateterler gibi parenteral ekipmanın gereksiz kullanımından kaçınma: Bahsi geçen bu ekipmanların tümü, enfeksiyöz ajanların vücuda girişi bakımından risk oluşturur. Eğer bu ekipmanların kullanımı gerekliyse, mümkün olduğu kadar kısa sürede çıkarınız.

2.

Enfeksiyonun etkili tanı ve tedavisi 3. Patojeni hedefleme: Mümkün olan her zaman patojeni yeniden elde etmek için enfeksiyon kültüre edilmelidir. Sadece en olası patojen için antimikrobiyal ilaç tedavisi sağlanmalıdır. Pozitif kültür sonucundan sonra, bilinen patojene karşı belirli bir terapi düzenlenmelidir. Terapiye yamt izlenmeli ve gerektiğinde tedavi düzenlenebilmelidir. Terapinin tüm aşamaları tamamlanmalıdır. 4. Uzmanlara ulaşma: Ciddi enfeksiyonlar için, sağlık hizmetleri uzmanı aranmalı ve eğer koşullar tedaviye başladıktan sonra hızlıca düzelmezse ikinci bir fikir edinilmelidir.

Antimikrobiyal ajanları bilinçli kullanma 5. Antimikrobiyal kontrol uygulaması. Uygun antimikrobiyal ilaçlara ve kullanımlarına ait güncel bilgilerinin farkında olun. Önerilen tedavinin geçerli ve patojen için önerildiğinden emin olun. 6. Bölgesel veriyi kullanın. Bölgesel sağlık hizmetlerine ait kaynaklarından hastalık yapıcı ajanlar için antibiyogram profil verilerini elde edin ve anlayın. 7. Kontaminasyonu değil, enfeksium tuberculosis ve Enterococcus faecium yonu tedavi edin. Enfekte olmuş bakterilerinin her birine ait en az bir suş dokulardan uygun örnekleri elde kullanımda olan en gelişmiş antibiyotikedebilmek için antiseptik teknikler lere bile direnç göstermektedir. Bununla uygulanmalıdır. Kontaminasyona beraber, bazı patojenler artık antibiyotik sebep olan organizmalar kateterler tedavisiyle bile kontrol edilememektedir. ya da IV hatlannda mevcut olabilirAntimikrobiyal direncin engellenmeler. Kültürleri yalnızca enfeksiyon si için 12 aşamalı CDC yönergesi aşağıda bölgesinden elde edin. Şüphe içinözetlenmiştir(/ı«p;//ıvTVW.cdc.goi'/drugredeyseniz enfeksiyon bölgesini yenisistance/healthcare/ha/12steps_HA.htm). den kültüre alm. Antimikrobiyal Direncin Engellenmesinde Kullanılan 12 basamak: Enfeksiyonu Engelleme 1. Yaygın hastalıklara engel olmak için bağışıklık kazanma: İmmünizasyonlan güncelleştirin, özellikle maruz kahnabilecek olası hastalıklar için. Gerekli aşılamalara ilave olarak (Kısım 22.12), neredeyse herkes yıllık grip (influenza) aşısını ve menenjit aşılarım yaptırmalı, bununla beraber sağlık görevlileri için veya okul, kolej ve askeriye gibi çok fazla kişi ile karşılaşılan ortamlarda olanlar için pnömokokkal immünizasyonlar yapılmalıdır.

60 50 N

>- 30 o §5 5

20 10

1989 1991 1993 1995 1997 1999 2001 Yıl 1989-2001 yıllan arasında yoğun bakım ünitesindeki hastalar arasında Metisilin-dirençli Staphylococcus aureus nazokomiyal enfeksiyonları. Veriler Atlanta'daki (Georgia, USA) Hastalık Kontrol ve Engelleme Merkezinin (CDC) Ulusal Nazokomiyal Enfeksiyonları Gözetim (NNIS) Sistemlerinden elde edilmiştir.

Kolonizasyonu değil, enfeksiyonu tedavi edin. Patojen üzerinde işlem yapın, hastalığa sebep olmayan diğer kolonize olmuş mikroorganizmalar üzerinde değil. Örneğin normal deri ve boğazdan elde edilen kültürler genellikle Stapylococcus türleri gibi mevcut enfeksiyon ile hiçbir ilgisi olmayan potansiyel patojenlerle kolonize olmaktadır. 9. Patojeni elimine edebilecek en az egzotik olan antimikrobiyal madde ile muamele edin. En yeni çıkan geniş-spektrumlu antibiyotikler, her ne kadar etkili olsa da, diğer ilaçların halen etken olduğu durumda garantili olmayabilirler. Ne kadar çok ilaç kullanılırsa, dirençli mikroorganizmaların gelişme şansı o kadar fazla olur. Örneğin, bazı Enterococcus izolatlan oldukça yeni sayılan ve geniş spektrumlu bir antibiyotik olan vankomisine karşı zaten dirençlidirler. Bunun sebebi ise kullanım için ilk lisansı aldığında MRSA enfeksiyonlarım tedavi etmek için öngörülenin dışında kullanılmasıdır. Gerekli olmadığı durumlarda antimikrobiyal tedaviyi durdurun 10. Tanısı konulmuş enfeksiyonların antimikrobiyal tedavisi, tedavinin önerilen dozu tamamlanır tamamlanmaz bırakılmalıdır. Eğer enfeksiyona tanı konmamış ise, tedavi yanda bırakılmalıdır. Örneğin, faranjit (boğaz ağnsı) söz konusu olduğunda, henüz boğaz kültür sonuçlan tam olarak kesinleşmeden önce genellikle Streptococcus pyogenes enfeksiyonu (strep kökenli boğaz ağnsı) için antibiyotik tedavisi başlanmaktadır. Eğer boğaz kültürü S. pyogenes için negatif ise, antibiyotik tedavisi durdurulmalıdır. Antibiyotikler çoğunlukla faranjitin olası sebebi olan virüsler için etkili değillerdir. Patojen geçişinin engellenmesi 11. Patojeni izole edin. Enfekte olmuş kişilerin çevresini kontaminasyondan uzak tutun. Vücut sıvılanm uygun şekilde temizleyin ve muhafaza edin. İç çamaşm, giyecek, yatak takımı ve diğer potansiyel kontaminasyon kaynaklanın dekontamine edin. Hastane ortamında, enfeksiyon kontrol uzmanlanndan görüş alınmalıdır. 12. Bulaşma zincirini kınn. İş veya okul ortamında hasta olanlar ile temastan kaçının. Hasta iseniz veya hasta birine bakıyorsanız özellikle el yıkama suretiyle temizliğinizi muhafaza ediniz. 8.

Bu basamaklar antimikrobiyal ilaçlann akıllı kullanımına ait kılavuzdur. Bu tür önlemler direnç gelişimini yavaşlatır ve pek çok ilacın kullanım ömrünü uzatır. •

20.12 • Antintikrobiyal İlaç Direnci • 695

den çoğu R pilazmiti çoklu antibiyotik direncine sahiptir (ooaKısım 10.10).

1

Direnç Pilazmitlerinin Kaynağı

Her ne kadar çoklu ilaç-dirençli R pilazmitlerinin kaynağına ait spesifik veriler elde edilemese de deliller R pilazmitlerin antibiyotik döneminden önce mevcut olduklarını önermektedir. Örneğin, 1946 yılında dondurulan Escherichia coli susu hem tetrasiklin hem de streptomisine karşı direnç genlerine sahip pilazmit içermekteydi, her ne kadar bu antibiyotiklerin hiç biri birkaç yıl sonrasına kadar klinik olarak kullanılmasa da. Bununla beraber,

|

60

s

40

20

i

I

20

yan-sentetik penisillinlere direnç için R pilazmit gen-

lerini taşıyan suşların yan-sentetik penisillinlerin sentezinden önce mevcut olduğu gösterilmiştir. Muhtemelen, sahip oldukları ekolojik önemlerinden dolayı, antibiyotik direnç genlerine sahip pilazmitler bazı patojen olmayan gram-negatif toprak Bacteria' larında fark edilmiştir. R pilazmitler toprakta, selektif avantajlara sahip olabilirler çünkü antibiyotik-üreten organizmaların (Sterptomyces ve Penicillium) büyük bir çoğunluğu aynı zamanda normal toprak organizmalarıdır. Bu yüzden, görünüşe göre R pilazmitler, antibiyotikler keşfedilmeden ve ilaç veya tarımda kullanılmadan önce doğal mikrobiyal popülasyonda mevcutlardır.

80

80

100

125

150

Antibiyotik kullanımı (ton) (a)

Antimikrobiyal İlaç Direncinin Dağılımı

Medikal, veterinerlik ve tarımsal antibiyotiklerin yaygın kullanımları antibiyotik direnç genlerine sahip R pilazmitlerin dağılımı için seçici koşullar sağlamaya devam etmekte ve böylece R pilazmitlerine sahip bakteriler için seçici avantaj sağlamaktadır. R pilazmitlerinden kaynaklanan antibiyotik direnci bu yüzden doğal seleksiyonun tahmin edilebilir bir sonucudur. R pilazmitleri ve direnç genlerinin diğer kaynakları etkili birer kemoterapötik ajan olarak tek bir antibiyotiğin uzun süreli kullanımına önemli limitler teşkil etmektedir. Antimikrobiyal ilaçların uygunsuz ve kapsamlı kullanımları hastalığa sebep olan mikroorganizmalarda hızlı bir şekilde gelişen ilaç-spesifik direncin temel sebebidir. Bilindik antibiyotiklerin çoğunun keşfi ve klinik kullanımları bunlara direnç gösteren bakterilerin ortaya çıkmasıyla paralel olmuştur. Şekil 20.26a» kullanılan tonlarca antibiyotik sayısı ve her bir antibiyotiğe karşı direnç gösteren bakterilerin yüzdesi arasındaki korelasyonu göstermektedir. Direnç gelişimine sebep olan antibiyotiklerin aşırı kullanımına ait bir takım örnekler bulunmaktadır. Belirli bir enfeksiyonun tedavisinde öngörülen antimikrobiyal ajan hastalığa sebep olan mikroorganizmanın artan direncinden dolayı değiştirilmelidir. Klasik bir örnek, bel soğukluğu hastalığına sebep olan Neisseria gonorrhoeae bakterisinde penisilline karşı direnç gelişimidir (Şekil 20.26b). 1980 lerden önce, penisillin bel soğukluğu için kabul görmüş bir tedaviydi ve 194O'lı yıllarda yani mevcut olduğu andan itibaren penisillin bu amaçla sürekli olarak kullanımdaydı. Bununla beraber, penisillin artık bel soğukluğu hastalı-

1981 1983 1985 1987 1989 1980 1982 1984 1986 1988 1990 Yıl

(b) • Şekil 20.26 Antimikrobiyal ilaca dirençli bakterilerin ortaya çıkışı, (a) antibiyotik kullanımı ve diyare hastalarından izole edilen antibiyotik-dirençli bakterilerin yüzdesi arasındaki ilişki. Ticari olarak üretilen miktarlarla da gösterildiği üzere, oldukça fazla miktarlarda kullanılmakta olan bu ajanlar, ilaç dirençli-suşlann oldukça yaygın olduğu ajanlardır, (b) İlaç-dirençli suşlann sebep olduğu bel soğukluğu (gonore) hastalığının bildirilmiş vak'a yüzdesi. Bildirilmiş ilaç-dirençli vak'alann gerçek sayısı 1985 yılında 9000 di. Bu sayı 1990 lar da 59000 e yükseldi. Bildirilmiş ilaç-dirençli vak'alann % 95'inden daha fazlası Neisseria gonorrhoeae'nm penisillinaz-üreten suşlanndan kaynaklanmaktadır. 1990 yılından bu yana, ortaya çıkan ilaç direncinden dolayı bel soğukluğu hastalığının tedavisinde penisillin önerilmemektedir (KAYNAK: Hasatlık kontrol ve önleme merkezleri, Atlanta, GA).

ğının tedavisi için faydalı bir antibiyotik değildir çünkü klinik N. gonorrhoeae izolatlarmın büyük bir çoğunluğu artık /3-laktamaz üretmekte ve penisilline direnç sağlamaktadır. Dirençli suşlann hemen hemen tamamı 1980 den bu yana meydana çıkmaktadır. Tercih edilen güncel ilaç seftriakson'dır ancak tedavi kılavuzu ilaç-dirençli JV. gonorrhoeae suşlarıran ortaya çıkmasını kontrol etmek için neredeyse her yıl güncellemnektedir (
696 • Bölüm 20 • Mikrobiyal Üremenin Kontrolü

yotikler %80 uygulanmaktadır. Bunun yanı sıra, %50 ye kadar ki vaka örneklerinde önerilen doz veya tedavinin süresi doğru değil. Bu durum hastanın riayetsizliği ile birleştirildi: Pek çok hasta ilaç kullanımlarına, özellikle de antibiyotik kullanımlarına kendilerini "iyi hissetmeye" başladıkları anda son vermektedir. Örneğin, isoniazid-dirençli tüberkülozun ortaya çıkışı hastanın kendisine önerildiği şekilde altı aydan dokuz aya kadar günlük kullanması gereken ilaç alımındaki başarısızlığı ile ilişkilidir (£*fc>Kısım 26.5). Dolayısıyla, virülent patojenler sıklıkla kısa bir süreliğine ölümcül dozun altında antibiyotiklere maruz kalmaktadır ve böylece dirençli suşlar ortaya çıkmaktadır. Bununla beraber, son zamanlarda yapılan diğer çalışmalar, bu trendin Birleşmiş Milletlerde değişmekte olduğunu göstermektedir. Doktorlar, çocukluk çağı enfeksiyonlarının tedavisinde bundan on yıl önce kullanmış oldukları antibiyotiklerin üçte birinden de azını öngörüyorlar. Antibiyotik kullanımındaki bu azalma, büyük bir ölçüde doktorları, sağlık kuruluşlarını ve hatta hastalan eğitmek için harcadıkları çabaların neticesinde sağlanmıştır (bakınız antibiyotik terapisinin uygun kullanımını ile ilişkili olan "Antibiyotik direncini engelleme" isimli mikrobiyal kenar çubuğu). Antibiyotiklerin rastgele, medikal olmayan kullanımları da dirençli suşlarm ortaya çıkmasına katkıda bulunmuşlardır. Tarım alanında ise antibiyotikler hayvan yemlerinde bütünleyici (supplement) olarak kullanılmaktadır. Bütünleyici olarak kullanılan bu antibiyotikler hem üremeyi-destekleyen maddeler olarak hem de var olan hastalığı tedavi etmekten ziyade hastalığın meydana gelmesini engellemek amacıyla profilaktik (hastalıktan koruyan) katkı maddesi olarak görev yapmaktadır. Sonuç olarak, son zamanlarda çeşitli gıda enfeksiyon salgınları hayvan yemlerinde antibiyotiklerin kullanımını işaret etmektedir. Örneğin, fluoroquinolonlar 20 yıldan daha az bir süredir tarım alanında hem gelişimidestekleyen hem de profilaktik ajan olarak kapsamlı bir şekilde kullanılmaktadır. Bununla beraber, muhtemelen solunumla ilgili hastalıkları engellemek için sürüler halindeki kümes hayvanlarının fluoroquinolon ile rutin muamelelerinden dolayı fluoroquinolon-dirençli Camplobacter jejuni gıda kökenli patojen olarak ortaya çıkmıştır (öOaKısım 29.9). Fluoroquinolonlarm tarımda kullanımlarını izlemek ve yeni fluoroquinolonlara direncin hızlı bir şekilde ortaya çıkmasını engellemek için kümes hayvanları ve ilaç üreticileri tarafından gönüllü kılavuzlar kullanılmaya başlamıştır. Antibiyotik-dirençli patojenler

Büyük ölçüde antibiyotiklerin uygun şekilde kullanımları ve direncin izlenmesindeki başarısızlıkların sonucu olarak neredeyse tüm patojenik mikroorganizmalar antimikrobiyal kemoterapinin 1950 lerde başlayan yaygın kullanımlarından beri bazı kemoterapötik ajanlara karşı direnç geliştirmiştir (Şekil 20.27*).Yaygın olarak kullanılan ilk kemoterapötik ajanlardan olan penisillin ve sülfa ilaçlan günü-

Acinetobacter sp. • • *-

Anahtar: Gram-negatif Gram-pozitif Gram-negatif/ Aside dirençli

Enterococcus faecalis* Streptococcus pneumoniae

**-

Mycobacterium tuberculosis'

*-

Haemophilus ducreyi

*-

Salmonella typhi

*-

Haemophilus influenzae

— *-

Neisseria gonorrhoeae

*-

Pseudomonas aeruginosa*Salmonella sp.

--.....

Shigella dysenteriae -------Shigella s p . Diğer gram-negatif çubuklar Staphylococcus aureus 1950

1960

1970

1980

1990

i 2000

2010

• Şekil 20.27 Bazı insan patojenlerinde antimikrobiyal ilaç direncinin görünümü. * işareti bu organizmaların bazı çoklu-ilaç dirençli suşlannın bilinen antimikrobiyal ilaçlarla artık tedavi edilemediğini göstermektedir.

müzde yaygın olarak kullanılmamaktadır çünkü patojenlerin çoğu direnç kazanmıştır. Streptococcus pyogenes (boğaz ağrısı, kızıl hastalığı ve ateşli romatizmaya sebep olan bakteri «**sKısım 26.2) gibi halen penisilline karşı hassas olan organizmalar bile başarılı bir tedavi için tipik olarak bundan on yıl öncesi ile kıyaslandığında gerekli olandan çok daha fazla dozlarda penisillin gerektirmektedir. Birkaç patojen bilindik tüm antimikrobiyal ajanlara karşı direnç geliştirmiştir (Şekil 20.27). Bunların arasında çeşitli metisilin-dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) (e»feKısım 26.9), vankomisin dirençli Enterococcus tuberculosis ve Mycobacterium tuberculosis izolatları yer almaktadır (öOöKısım 26.5). Ayrı ayrı türetilmiş MRSA suşlarmdaki sayı artışı vankomisine azalmış hassasiyeti geliştirmektedir ve "vankomisin ara Staphylococcus aureus" (VISA) suşları olarak ifade edilmektedir. Antibiyotik direnci, dirençli mutanlann ortaya çıkma şansı olmadan önce mikrobiyal popülasyonu azaltacak şekilde sadece ve sadece ilaçların hassas hastalıkların tedavisinde kullanıldığı durumlarda, yeterince yüksek dozlarda ve yeterli zaman uzunluklarında verildiğinde asgariye indirilebilir. Birbirinden alakasız iki kemoterapötik ajanı bir araya getirmek de direnci azaltabilir; yani bir antibiyotiğe dirençli olan mutant susun ikinci bir antibiyotiğe de aynı zamanda dirençli olması pek olası değildir. Bununla beraber, çoklu ilaç direnci taşıyan R pilazmitlerinin yaygınlığı çoklu antibiyotik terapisini klinik tedavi stratejisi olarak daha az faydalı kılmaktadır. Sınırlı sayıdaki bazı çalışmalarda, belirli bir antibiyotiğin kullanımı durdurulduğunda, yıllar sonra bu antibiyotiğe direncin eski haline döneceği ifade edilmektedir. Diğer taraftan, antibiyotikdirençli organizmalar sindirim sisteminde belirli bir süre kalmaktadır. Bu bilgi, bazı antibiyotiklerin faydalarının antibiyotiğin kullanımdan çekilmesi suretiyle tekrardan kazanılabileceğini ifade etmek-

20.13 • Yeni Antimikrobiyal İlaçların Araştırılması • 697

tedir. Bununla beraber, yeniden kullanıma sunulmadan önce ilacın temkinli kullanımına ait dikkatli bir şekilde hazırlanmış olan bir planının takip edilmesi gerekmektedir. Son olarak, aşağıda bahsettiğimiz gibi, yeni ilaçların keşfi ve dizaynı için çeşitli yöntemlerin kullanımı ile yeni kemoterapötik ajanlar devamlı olarak üretilmektedir. H 8 B Ö 20.12 Kavramların Gözden Geçirilmesi Antimikrobiyal ilaçların kullanımı hedef mikroorganizmalarda direnç gelişimini teşvik etmektedir. Direnç, direnç genlerinin seçiminden kaynaklanmaktadır ve antimikrobiyal ilaçların gelişigüzel kullanımıyla da hız kazanmaktadır. Sadece birkaç organizma bilindik tüm antimikrobiyal ilaçlara karşı direnç geliştirmiştir. • Antibiyotik direnç genlerinin birincil kaynağını belirtiniz? • Ne tür uygulamalar antibiyotik-dirençli patojenlerin gelişimini teşvik etmektedir?

Yeni Antimikrobiyal İlaçların 20.13 Araştırılması Henüz bahsetmiş olduğumuz gibi, yeterli ilaç dozu ve yeterli zaman verildiğinde, bilinen tüm antimikrobiyal ilaçlara karşı direnç gelişir. Sonuç olarak, antibiyotiklerin dikkatli ve yerinde kullanımları bu ilaçların faydalı klinik ömürlerini uzatmak için kesinlikle gereklidir. Bununla beraber, mikrobiyal ilaç direnci için uzun süreli çözüm yeni antimikrobiyal ilaçların türemesidir. Mevcut bileşiklerin faydalı analoglarını tanımlamak ve üretmek veya yeni antimikrobiyal bileşikler keşfetmek ve/veya dizayn etmek için çeşitli stratejiler kullanılmaktadır. Mevcut Antimikrobiyal BileşliklerinYeni Analoglan

Mevcut antimikrobiyal bileşiklere ait yeni analogların üretimi, büyük ölçüde eskilerin yapısal taklitleri olan yeni bileşikler tahmin edilebilir etki mekanizmasına sahip olduklarından dolayı, genelde basit ve çoğu kezde verimlidir. Çoğu durumda, çözülebilirlik ve afinite gibi parametreler ilacın etkisi için kritik olan yapılar değiştirilmeden ilacın kimyasal yapısında küçük modifikasyonlar yapmak suretiyle optimize edilebilir. Yeni bileşik aslında atasal bileşikten daha güçlü olabilir ve direnç, yapısal tanınmaya dayandığı için yeni bileşik direnç faktörleri tarafından tanınmayabilir. Örneğin, Şekil 20.23 tetrasiklinin temel yapısını ve iki biyoaktif türevini göstermektedir. Tetrasiklini öncü bileşik (modifikasyonların yapılacağı biyolojik olarak aktif olan bileşik) olarak kullanarak ve dördüncü R grup bölgesinde sistematik kimyasal değiştirmeler yapmak suretiyle neredeyse sonsuz tetrasiklin analog serileri oluşturulabilir. Bu temel strateji kullanılarak, bazıları atasal (parent) bileşiklerinden neredeyse 100 kat daha güçlü olan yeni /3-laktam antibiyotikleri (bakınız Kısım 20.8), yeni tetrasiklinübenzeri bileşikler (bakınız Kısım 20.9) ve yeni vankomisin analogları (Şekil 20.13) rutin bir şekilde sentezlenir ve test edilir.

İlaç keşfi için otomotize robotic kimya yöntemlerinin uygulaması potansiyel yeni antimikrobiyal bileşikleri hızlı bir şekilde üretme yeteneğimizi önemli ölçüde artırmaktadır. Combinatorial kimya olarak ifade edilen otomotize robotic kimya yöntemleri yeni analoglardan fazla sayılarda üretmek için bilinen antimikrobiyal ürünlerin sistematik modifikasyonlarını uygulamaktadır. Örneğin, otomotize combinatorial kimya yöntemlerini kullanarak ve tetrasiklin kılavuz bileşiği ile başlayarak, 4 farklı tetrasiklin R grubunda değiştirmeler yapmak için 5 farklı reaktif kullanılabilir. Değiştirilmiş bölgeler sadece altı farklı reaktiften 5 X 5 x 5 X 5 (dört bölgenin her birinde beş türev), veya 625 farklı tetrasiklin türevini sadece birkaç saat içinde oluşturabilir! Bu bileşikler daha sonra in vitro biyolojik aktiviteleri için farklı mikroorganizmalar üzerinde antibiyotik hassasiyetlerinde otomotize test yöntemlerinin kullanımı ile denenirler (bakınız Kısım 20.4). Otomotize sentez ve tarama işlemleri ilaç teslim (delivery) süresini önemli ölçüde kısaltmakta ve her yıl yeni aday ilaçların sayısını 10 kat veya daha fazla arttırmaktadır. Farmasötikal endüstrisinin tahminlerine göre, faydalı tek bir ilacın eldesi için yaklaşık 7 milyon aday bileşik taranmak durumundadır. Laboratuvarda etkili olan ilaçlar daha sonra etkinlik ve toksisite için hayvanlarda ve son olarak da klinik denemeler için insanlarda test edilmek durumundadır. Aday ilacın etkili ve güvenilir olduğundan emin olmak için hayvan denemeleri genelde birkaç yıl kadar süren çoklu denemeleri gerekli kılmaktadır. Farmasötikal endüstrisi yeni antimikrobiyal ilaçların keşfi için her yıl 4 milyar $ kadar para harcamaktadır. Her bir ilacın keşfi ve geliştirilmesi için harcanan toplam zaman klinik kullanımı için onaylanmadan önce 10-25 yılı almaktadır. Laboratuvar çalışmalarından klinik denemelere kadar süren keşif ve geliştirilme aşamaları için tutarın, insanlarda kullanımı onaylanan her bir yeni antibiyotik için en azından 500 milyon $ olduğu tahmin edilmektedir. Bilgisayara Bağlı İlaç Tasarımı

Mevcut olan ilaçların analogları ile karşılaştırıldığı zaman yeni antimikrobiyal bileşiklerin tanımlanması oldukça zordur çünkü yeni antimikrobiyal bileşikler metabolizma ve biyosentezde eşi olmayan bölgelerde çalışmak veya bilindik direnç mekanizmalarına sebep olmalarını engellemek için mevcut bileşiklerden yapısal olarak farklı olmak durumundadır. Geçmişte, aday ilaçlar Streptomyces veya Penicillium gibi doğal kaynaklardan izole edilmiş ve yeni antimikrobiyal bileşikleri bulmak için sistematik bir şekilde antimikrobiyal aktiviteleri için taranmıştır. Bununla beraber, bilgisayar ve yapısal grafik teknolojisindeki son gelişmeler günümüzde spesifik mikrobiyal yapılar ile etkileşime giren ilaçlan tasarlamayı mümkün kılmaktadır. İlaç keşfi artık yeni ilaçların bilgisayar ortamında bağlanma ve etkinlik bakımından oldukça düşük maliyet ile hızlı bir şekilde "yaratılıp-test edildiği" bilgisayarda başlayabilir (€3Qe>Kısım 30.5 ve 26.8).

• Bölüm 20 • Mikrobiyal Üremenin Kontrolü

Bilgisayar-güdümlü ilaç tasarımındaki son zamanlarda en çarpıcı başarılardan birisi enfekte olmuş bireylerde HIV (insanimmun yetmezlik virüsü) gelişimini yavaşlatmak için kullanılan ve bir proteaz inhibitörü olan saa.uina.vir'in keşfidir (Şekil 20.28»). Saquinavir, HIV proteaz enziminin aktif bölgesine bağlanması için bilgisayar tarafından proteaz-substrat kompleksinin bilindik üç boyutlu yapısı temel alınarak tasarlanmıştır. Normalde, HIV proteaz enzimi olgun (mature) öz oluşturmak ve replikasyon için ters transkriptaz enzimini aktive etmek için virüs tarafından kodlanmış öncü proteini keser (ös&Kısım 16.15). Saquinavir, HIV öncü proteininin yerini değiştiren, ve virüsün olgunlaşmasına engel olarak konukçu insanda gelişimini yavaşlatan bir peptit analoğudur. Saquinavir gibi bilgisayar tarafından tasarlanmış diğer proteaz inhibitörlerinden bir kaçı AİDS hastalığının tedavisi için kemoterapötik ilaçlar olarak kullanımdadır (Tablo 20.5, Şekil 20.28 ve öo^Şekil 26.38). Yapısal ve biyokimyasal modellemeye göre bilgisayar güdümlü tasarım ve deneme antimikrobiyal ilaçların tasarlanmasında pratik, hızlı ve maliyeti düşük yöntemlerdir. Bu ilaçlarında tedavi amaçlı kullanımlarından önce hayvansal testlere ve klinik denemelere tabi tutulması kesinlikle gerekmektedir.

O

NHC(CH3)2

Saquinavir

Yeni Antimikrobiyal Ajanlar

Bakteriyofajlar, tek bir bakteri türünü kendisine hedef alan virüslerdir (aosKısım 16.1-16.6). Bakteriyofaj terapisi 80 yıldan fazla bir süredir hayvanlarda ve sadece birkaç durumda insanlarda enfeksiyonları tedavi etmek için sınırlı kaynaklarda kullanılmaktadır. Fajlar, spesifik bakteriyal hücre yüzeyi bileşenleri ile etkileşime girerek bakterilere bağlanır. Bağlanma oldukça spesifiktir ve genelde tek bir bakteriyal türü hedef almaktadır. Bağlı faj bakteriyal hücreye girer, replike olur ve işlem sürecinde konukçu bakteriyi öldürür. Bu ajanların insanların tedavisindeki etkinliği ve verimliliği büyük ölçüde test edilmemiş ve her ne kadar çeşitli ürünlerin klinik denemeleri devam etse de bir şekilde tartışmaya açıktır. Reseptörleri değiştiren veya hücre duvarının faj enzimlerine olan hassasiyetini azaltan mutasyonlar aracılığı ile bakteriler faja dirençli hale geldikleri için, bu terapi muhtemelen direnç problemine bağışık olmayacak.

•m20.13

Kavramların Çözden Geçirilmesi

İlaç-dirençli patojenlerin üstesinden gelebilmek ve enfeksiyonel hastalıkları tedavi etmedeki yeteneklerimizi arttırmak için yeni antimikrobiyal bileşikler devamlı olarak keşfedilmekte ve geliştirilmektedir. Mevcut ilaçların analogları bir sonraki antimikrobiyal bileşik jenerasyonu olarak kullanılabilecek şekilde sıklıkla geliştirilmektedir. Bilgisayar güdümlü ilaç tasarımı ilaç keşfinde önemli yeni bir araçtır. •

Mevcut ilaç analoglarına dayalı yeni ilaçların geliştirilmesinin avantajları ve dezavantajlarını açıklayınız. • Bilgisayar güdülü ilaç tasarımı yeni ilaçların arayışında nasıl zaman ve para kazandırır?

Indinavir

(b) • Şekil 20.28 Bilgisayar ile oluşturulan antiviral ilaçlar. (a) HIV proteaz homodimer. Bireysel polipeptit zincirleri yeşil ve mavi ile gösterilmiştir. Peptit (san) katalitik bölgeden bağlanmıştır. Bu proteaz HIV öncü proteinini keser ki bu da virüs olgunlaşmasında önemli bir basamaktır (ö^sKısım 16.15 ve Şekil 16.26). Proteaz bölgesinin bu peptit ile bloklanması öncü işlemini ve HIV olgunlaşmasını engeller. Bu yapı Protein Veri Bankasındaki bilgilerden türetilmiştir, (b) Bu anti-HIV ilaçlan HIV proteaz enziminin aktif bölgesini bloke etmek için bilgisayar tarafından tasarlanan peptit analoglandır. Turuncu renk ile gösterilen bölge peptit bağlarına benzer alanları göstermektedir. Bu bileşiklere HIV proteaz enziminin bağlanması HIV öncü işlemlerini ve virüs olgunlaşmasını engeller. Bu bileşikler proteaz inhibitörleri olarak isimlendirilen terapötik ilaçlann bir sınıfı temsil etmektedir. Bu bileşiklerin HIV ile enfekte olmuş hücrelerdeki konsantrasyonu ve HIV proteaz için yüksek afiniteleri kendilerini proteaz enziminin aktif bölgesi için oldukça güçlü rekabetçi inhibitörler haline getirmekte ve virüs olgunlaşmasını engellemektedir. Bu proteaz inhibitörleri yaygın bir şekilde HIV enfeksiyonunun tedavisinde kullanılmaktadır (bakınız Tablo 20.5 ve Kısım 26.14).

Uygulama Sorulan •

DEĞERLENDİRME SORULARI 1. Onda bire düşme zamanı (D) ısı ile sterilizasyonda neden önemlidir? Bakteriyal endosporlarm varlığı D değerini nasıl etkiler (<^^Kısım 20.1)? 2. Ölümcül dozdaki iyonize radyasyonun moleküler seviyede etkilerim tanımlayınız (ö^Kısım 20.2). 3. Derin filtre yerine membran filtre kullanımının temel avantajları nelerdir (c**5Kısım 20.3)? 4. Nükleopor filtreleri neden özellikle mikroskop çalışmaları için numune izolasyonunda kullanışlıdır (<3tfe Kısım 20.4)? 5. Escherichia coli için bakteriyosidal olan bir kimyasal için minimum inhibisyon konsantrasyonunu (MIC) nasıl belirlersiniz, tanımlayınız (öOöKısım 20.5)? 6. Dezenfektan ve antiseptiklerin etkilerini karşılaştırınız. Dezenfektanlar normalde neden canlı dokular üzerinde kullanılmazlar (<3>°»Kısım 20.6). 7. Üreme faktörü analogları genelde önemli tek bir kriter ile antibiyotiklerden ayırt edilirler. Açıklayınız

Kısım 20.7). /3-laktam antibiyotiklerini karakterize eden c etki mekanizmasını tanımlayınız (ö *3Kısım 20.8). 8. Protein sentezini engelleyen antibiyotiklerden en az üç tanesinin etki mekanizmaları arasındaki farkları belir9. Antiviral ilaçlar neden genelde konukçu toksisitesi sergilerler (ö°0>Kısım 20.10). 10. Kemoterapötik ajanların funguslarda seçici toksisitesine olanak sağlayan hedefleri tanımlayınız (ö^Kısım 20.11). 11. Antibiyotik direncinden sorumlu altı mekanizma tanımlayınız (O°oKısım 20.12). 12. Öncü bleşlikten başlayarak yeni ilaç analoglarının üretimi için kullanılan combinatorial kimya yöntemlerini tanımlayınız (öOKısım 20.13).

UYGULAMA SORULARI 1. Gıda muhafazasında radyasyon kullanımının potansiyel bazı sakıncaları nelerdir? Bu sakıncalar sağlığı tehdit eden koşullar olarak gösterilebilir mi? Neden veya neden değil? Radyasyon ile hasar görmüş ve radyasyon ile kontamine olmuş gıdalar arasındaki ayrımı nasıl sağlarsınız? 2. Filtrasyon, bazı sıvıların pastörizasyonunda kullanılır. Isıya duyarlı bir sıvının pastörizasyonu için bir filtrasyon sistemi tasarlayınız. Neden filtrasyon sistemi, ısı ile filtrasyon sistemine kıyasla daha tercih sebebidir? 3. Her ne kadar üreme faktörü analogları mikrobiyal metabolizmayı inhibe edebilseler de, bu ajanlardan sadece birkaç tanesi pratikte faydalıdır. Pek çok potansiyel ajan ve azidothymidine gibi (bakınız Tablo 20.5) bazı yaygın kullanım alanlarına sahip olanlar önemli derecede konukçu hücre toksisitesi sergilerler. Konukçu hücre için etkili olan ve düşük toksisiteye sahip bir üreme faktör analoğu tanımlayınız. Seçtiğiniz ajan için toksisite neden düşük? Aynı zamanda enfeksiyonel bir hastalığa karşı etkili olan ancak konukçu hücrelerde toksisite sergileyen bir üreme faktör analoğu tanımlayınız. Neden AZT gibi toksik ajanlar enfeksiyonel hastalıkları tedavi etmek için belirli durumlarda halen kullanılmaktadır? Bu tür bir ilacın toksik etkisini kısıtlamak, terapötik aktiviteyi arttırmak için ne tür önlemler alırsınız? Cevabınızı açıklayınız. 4. Yeni antibiyotiklerin üretimi için mikroorganizmaları incelemek adına bir deney tasarlayınız. Antibiyotik üretimini taramak için hangi mikroorganizma grubu veya gruplarını seçersiniz? Bu organizmaları doğal çevrede nereden bulup izole edersiniz? Antibiyotiğin

5.

6.

7.

8.

üretimi bu organizmalara doğada ne tür avantajlar sağlamaktadır? Potansiyel yeni antibiyotiklerinizin verimliliğini test etmek için hangi in vitro yöntemlerini kullanırsınız? /3-laktam antibiyotikleri bakteriler için temiz, seçici bir toksisite göstermelerine rağmen pek çok bakteri grubu bunların etkilerine doğal olarak dirençlidir. Gram-negatif bakterilerin /3-laktam antibiyotiklerinin tamamının değil ancak çoğunun etkilerine karşı neden dirençli olduğunu belirtiniz. Ayrıca, neden bazı /3-laktam antibiyotiklerinin bu organizmalara karşı faydalı olduğunu açıklayınız. İdeal bir antiviral ilacın, özellikle seçici toksisite ile ilgili, özelliklerini listeleyiniz. Bu tür ilaçlar mevcut mu? Hangi faktörler bu tür ilaçların kullanımını kısıtlamaktadır? Virüsler gibi, funguslar da özel kemoterapötik problemler sergilemektedir. Her iki grubun kemoterapisinde yaradılışlarında var olan problemleri ve önceki ifadeyi kabul edip etmediğinizi açıklayınız. Spesifik bir örnek veriniz ve her iki tipteki bulaşıcı hastalık ajanlarını hedef alabilen en az bir grup kemoterapötik ajan öneriniz. Staphylococcus aureus'da /3-laktam antibiyotiklerine karşı kazanılmış direncin genetik temelini açıklayınız. /3-laktam antibiyotiklerine direnci tersine çevirmek için deneyler tasarlayınız. Bunun laboratuvarda yapılabileceğini düşünür müsünüz? Antibiyotik dirençli organizmaların seçimini teşvik etmek için deneyiniz "alan çalışmalarında" uygulanabilir mi?

MİKROORGANİZMALARIN İNSANLARLA ETKİLEŞİMLERİ

MİKROORGANİZMALARIN İNSANLARLA YARARLI ETKİLEŞİMLERİ 21.1 21.2 21.3 21.4 21.5

11.

Însan-Mikroorganizma Etkileşimlerine Genel Bakış Derinin Normal Mikrobiyal Florası Ağız Boşluğunun Normal Mikrobiyal Florası Sindirim Sisteminin Normal Mikrobiyal Florası Diğer Vücut Bölgelerinin Normal Mikrobiyal Florası MİKROORGANİZMALARIN İNSANLARLA ZARARLI ETKİLEŞİMLERİ

21.6 Patojenin Konakçıya Girişi 21.7 Kolonizasyon ve Gelişme 21.8 Virülens III

VİRÜLENS FAKTÖRLERİ VE TOKSİNLER

701 701 703 704 706 708

710 710 712 713

716

21.9 21.10 21.11 21.12

Virülens Faktörler Ekzotoksinler Enterotoksinler Endotoksinler

IV

E N F E K S İ Y O N D A KONAKÇI FAKTÖRLERİ

722

21.13 Enfeksiyon Yönünden Konakçı Risk Faktörleri 21.14 Enfeksiyonlara Karşı Kalıtsal Direnç

722 723

700

716 716 719 721

Şarbon etmeni Bacillus anthracis, fotoğrafta yeşil olarak boyanmış kalın bir polisakkarit kapsül üretir. Bu kapsül, konakçı savunma mekanizmalarını engelleyerek patojenin ölmesini önler. •

21.1 • İnsan-Mikroorganizma Etkileşimlerine Genel Bakış • 701

BOLÜMLE İLGİLİ SOZLUK Alt solunum sistemi soluk borusu, bronşlar ve akciğer Bakteremi kanda mikroorganizmaların bulunması Dental çürüme bakteriyal enfeksiyon sonucu oluşan diş çürümesi Dental plak dişler üzerinde bulunan hücre dışı polimerlerin ve tükürük ürünlerinin oluşturduğu matriks ile örtülü bakteriyal hücreler Ekzotoksin bir mikroorganizmanın geliştiği sürece hücre dışına salgıladığı, konakçı hücrede derhal hasara neden olan protein Endotoksin gram-negatif Bakterilerde bulunan ve çözündüğünde toksin olan hücre zarfının lipopolisakkarit kısmı Enfeksiyon organizmaların konakçıda gelişimi Enterotoksin bir mikroorganizmanın geliştiği sürece hücre dışına salgıladığı, konakçının ince bağırsağında derhal hasara neden olan protein Fırsatçı patojen normal konakçı direncinin olmadığı durumlarda hastalık yapan organizma

Hastalık konakçı fonksiyonlarım bozan konakçı hasarı Hemolisinler kırmızı kan hücrelerinin lizizi olan hemoliz yapma yeteneğindeki bakteriyal toksinler Kapsül hücreyi sıkıca saran yoğun, iyi tanımlanmış polisakkarit ya da protein tabakası Kolonizasyon bir patojenin konakçı dokusuna girişinden sonra çoğalması Konakçı parazit barındıran organizma Mukoz membran dış çevre ile etkileşimde bulunan epitel hücre tabakası Mukus mukoz membranları saran epitel hücreler tarafından salgılanan çözünür glikoproteinler Normal mikrobiyal flora sağlıklı vücut dokusuyla ilişkide bulunan mikroorganizmalar Nozokomiyal enfeksiyon (hastane enfeksiyonu) bir hastane ya da sağlık hizmeti ortamında yakalanılan enfeksiyon

nsan vücudu deri üzeri ile ağzı, sindirim, salgı ve üreme sistemlerini kaplayan mukoz membranlarda yaygın bir mikroorganizma popülasyonuna sahiptir. Bu mikroorganizmalar sağlıklı olmayı sürdürmek için çoğunlukla yararlı ve bazen de zaruridirler. Bununla beraber, diğer bir grup mikroorganizma ise "enfeksiyon hastalığı" olarak adlandırılan süreçte insan vücudunu doğrudan ya da dolaylı olarak kolonize olmak, yayılmak ve zarar vermek için kullanılırlar. Patojen olarak adlandırılan bu mikroorganizmalar konakçıda besin kaynaklarına ulaşmak için çeşitli stratejiler kullanırlar. Bu stratejiler, özelleşmiş tutunma yapılarının, özgün büyüme faktörlerinin, yayılımcı enzimlerin ve kuvvetli biyolojik toksinlerin üretimini kapsar. Bu faktörler sıklıkla konakçıda zarar ve ara sıra da konakçının ölümüne yol açar. Bölüm 20'de, mikroorganizmaların gelişimini ortadan kaldırmak ya da engellmek için mikrobiyologların karşı tedbirleri nasıl geliştirdiklerini gördük. Ek olarak, vücudumuz da çoğu mikrobiyal saldırganı baskılamak ya da ortadan kaldırmak üzere etkili karşı tedbirler geliştirmiştir. Spesifik olmayan fiziksel, anatomik ve biyokimyasal süreçler, mikrobiyal enfeksiyon hastalığını oldukça seyrek görülen bir olay haline getirir.

İ

MİKROORGANİZMALARIN İNSANLARLA YARARLI ETKİLEŞİMLERİ Normal koşullar altında sağlıklı insan vücudunda bulunan ve sağlıklı yaşam katkısı olan mikroorganizmalarla başlayacağız.

Parazit bir konakçı içinde ya da üzerinde gelişen ve hastalığa neden olan organizma Patojen hastalık yapan, genelde mikroorganizma olan, bir organzima Patojenite bir patojenin hastalık oluşturabilme yeteneği Toksisite bir patojen tarafından üretilen toksinlerin neden olduğu patojenite Üst solunum sistemi nazofarenks, ağız boşluğu ve boğaz Virülens bir patojen tarafından gösterilen patojenite derecesi Yapışkan tabaka hücre dış yüzeyinde tabaka oluşturan, tipik olarak polisakkarit, dağınık polimer lifi tabakası Yayılmacılık bir patojenin vücuda girme ve yayılma kabiliyetinin yol açtığı patojenite Zayıflatma (attenuasyon) virülensm azalması ya da kaybı

İnsan-Mikroorganizma Etkileşimlerine Genel Bakış însan vücudu sürekli olarak mikroorganizmalara maruz kalır. Günlük normal aktiviteler süresince, çevremizde bulunan sayısız mikroorganizmaya maruz kalırız. Bununla birlikte, normal mikrobiyal flora olarak adlandırılan yüzlerce tür ve milyarlarca ayrı mikroorganizma insan vücudu üzerinde ya da içinde gelişir. Tamamı olmasa da, çoğu mikroorganizma tehlikesizdir ve birkaçı da sağlığımıza doğrudan katkıda bulunur. Patojenler Konakçı bir organizma üzerinde ya da içinde yaşayan , konakçıya zarar veren organizmalara parazit adı verilir. Mikrobiyal parazitlere genellikle patojen denir. Konakçi-patojen ilişkisinin sonucu parazitin patojenitesine bağlıdır. Konakçının parazite dirençliliği ya da duyarlılığı değiştiği gibi, parazitin konakçıyı zarara uğratma kabiliyeti de değişir. Oportünist patojen, normal konakçı direncinin olmadığı durumlarda hastalığa yol açar. Patojenite, her bir ayrı patojen için belirgin şekilde farklılık gösterir. Patojenitenin nicel ölçütü virülenshr. Virülens, belirli bir sürede konakçıda patojenik yanıtı sağlayacak hücre sayısı olarak ifade edilir. Ne patojenin virülenslığı ne de konakçının bağıl dirençliliği sabit bir faktördür. Konakçıparazit ilişkisi, hem patojen hem de konakçıda

702 • Bölüm 21 • Mikroorganizmaların İnsanlarla Etkileşimleri

değişkenlik gösteren koşullardan etkilenen iki organizma arasındaki dinamik olan bir ilişkidir. Enfeksiyon ve Hastalık

Enfeksiyon terimi, konakçıya zarar versin veya vermesin, bir organizmanın konakçıda gelişmesi ve yerleşmesi durumunu anlatır. Hastalık, konakçı fonksiyonlarını bozarak konakçının zarar ya da hasar görmesidir. Enfeksiyon ile hastalık eşanlamlı

değildir. Çünkü bir mikroorganizmanın konakçıda gelişmesi her zaman hasara yol açmaz. Bu nedenle, normal floranın üyeleri enfeksiyona neden olabilirler, ama nadiren hastalığa yol açarlar. Bununla birlikte bazen, kanser ve AİDS gibi hastalıklarda olduğu üzere, eğer konakçının bağışıklığı baskılanmış ise normal floraya ait mikroorganizmalar hastalığa neden olurlar (öOöKısım 26.14). Konakçı-Parazit Etkileşimleri

Hayvan vücudu konakçı gibi davranır ve pek çok mikroorganizmanın gelişimi için uygun bir ortam sağlar. Organik besinler ve kemoorganotroflarca gereksinim duyulan gelişme faktörlerince zengindir ve lokal olarak kontrol edilen pH, ozmotik basınç ve sıcaklık sağlarlar. Öte yandan, hayvan vücudu tekdüze mikrobiyal bir ortam değildir. Her bir bölge ya da organ birbirinden farklılık gösterir ve bu nedenle de belirli mikroorganizmaların gelişimine ayrıcalık tanıyan seçici bir ortam oluşturur. Örneğin, deri, solunum sistemi ve sindirim sistemi farklı mikroorganizmaların seçici olarak geliştiği çok çeşitli kimyasal ve fiziksel ortamları sağlar. Derinin oldukça kuru koşullan gram pozitif Staphylococcus aureus gibi dehidrasyona karşı dayanıklı bariyerleri olan organizmaların gelişimine olanak sağlar (Ö°O Kısım 26.9); akciğerlerin yüksek düzeyde oksijen içeren ortamı mutlak aerobik Mycobacterium tuberculosis 'in gelişimini sağlar («3055 Kısım 26.5); kalın bağırsaktaki anaerobik ortam ise mutlak anaerobik Clostridium cinsi üyelerinin gelişimini destekler (o»s Kısım 12.20). Hayvanlar aynı zamanda toplu olarak mikrobiyal yayılmayı ya da gelişmeyi engelleyici savunma mekanizmalarına sahiptir. Sonuçta başarılı şekilde kolonize olan mikroorganizmalar bu savunma mekanizmalarından kurtulma yollarını geliştirmiş olanlardır. Enfeksiyonlar, çoğunlukla hayvanların mukoz membranlarında başlar. Mukoz membranlar dış ortamla ara yüzey oluşturacak şekilde sıkıca paketlenmiş tekli ya da çoklu tabaka halinde bulunan epitel hücrelerden oluşur. Vücudun her yerinde bulunurlar ve ağız, yutak, yemek borusu ile ürogenital, solunum ve sindirim sistemlerini kapsar. Mukoz membranlar çoğunlukla mukus adı verilen yapışkan çözülebilir glikoproteinlerden oluşan koruyucu bir tabaka ile kaplıdır. Bakteriler, konakçı dokuları ile mukoz membranlardan temas ettiklerinde gevşek ya da sıkıca bağlanırlar. Eğer muko-

zal yüzeye gevşek bağlanırlarsa genellikle fiziksel süreçler sonucunda süpürülerek uzaklaştırılırlar, ama aynı zamanda patojen ve konakçı arasındaki belirli hücre-hücre tanınması sonucu epitel yüzeye tutunabilirler. Mukozal engelin kırılması ve patojenin daha derin dokulara (submukozal) yayılmasını doku enfeksiyonu takip eder (Şekil 21.1 •). Mikroorganizmalar hemen her zaman deri, ağız boşluğu, solunum sistemi ve ürogenital sistem gibi çevre ile temasta olan vücut yüzeylerinde bulunurlar. Normalde iç organlarda ya da kanda, lenf ya da sinir sisteminde bulunmazlar. Genellikle steril olan bu ortamlarda mikroorganizmaların gelişimi, ciddi enfeksiyon hastalığa işaret eder. Tablo 21.1, genelde vücut yüzeyleri ile ilişkide bulunan mikroorganzimalarm başlıca tiplerini göstermektedir. Mukozal yüzeyler çok çeşitli ilşkili mikroorganizmalar içerir, çünkü korunaklı nemli bir ortam ve yaklaşık 400m2 büyüklüğünde muazzam bir yüzey sunar. Örneğin, ince bağırsak gibi özelleşmiş fonksiyona sahip mukozal bir organ besin maddelerinin taşınması için geniş bir yüzeyi gerektirir ve bu yüzey aynı zamanda mikrobiyal İnsanların normal florasını temsil Tablo 21.1 eden mikroorganizma cinsleri Anatomik bölge

Cins"

Deri

Acinetobacter, Corynebacterium, Enterobacter, Klebsiella, Malassezia (f), Micrococcus, Pityrosporum (f), Propionibacterium, Proteus, Pseudomonas, Staphylococcus Streptococcus, Lactobacillus, Fusobacterium, Veillonella, Corynebacterium, Neisseria, Actinomyces, Geotrichum (f), Candida (f), Capnocytophaga, Eikenella, Prevotella,

Ağız

spiroketler (pek çok cinsi)

Solunum sistemi

Sindirim sistemi

Ürogenital sistem

Streptococcus, Staphylococcus, Corynebacterium, Neisseria, Haemophilus Lactobacillus, Streptococcus, Bacteroides, Bifidobacterium, Eubacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus, Ruminococcus, Clostridium, Escherkhia, Klebsiella, Proteus, Enterococcus, Staphylococcus Escherkhia, Klebsiella, Proteus, Neisseria, Lactobacillus, Corynebacterium, Staphylococcus, Candida f/j, Prevotella, Clostridium, Peptostreptococcus, Ureaplasma, Mycoplasma, Mycobacterium, Streptococcus, Torulopsis (f)

"Bu liste geniş kapsamlı anlamına gelmemekte ve her bireyde bu organizmaların tümü bulunmamaktadır. Bazı organizmalar belirli yaşlarda (yetişkine karşı çocuklar) daha yaygındır. Dağılım aynı zamanda cinsiyete göre de değişebilir. Bu organizmaların çoğunluğu belirli koşullar altında Oportünist patojen olabilir. Birkaç cins, vücudun birden fazla bölgesinde bulunabilir, (f)-funguslar.

21.2 • Derinin Normal Mikrobiyal Florası • 703 Mikrobiyel hücreler

Mukus

Epitel hücresi

(c)

• Şekil 21.1 Mukoz membranlarla bakteriyal etkileşimler, (a) Zayıf ilişki (b) Tutunma (c) Yanmukozal epitel hücrelere doğru yayılma.

gelişim için bir alandır. Burada biz, mukozal yüzeylerdeki normal bazı mikroorganizma-konakçı etkileşimlerini incelemekteyiz. 21.1

Kavramların Gözden Geçirilmesi

Hayvan vücudu, çoğunluğu zararsız olan mikroorganizmaların gelişimi için uygun ortamlardır. Zarara yol açan mikroorganizmalara patojen denir. Konakçı yüzeyinde sıklıkla mukoz membranlarm üzerinde olan patojen gelişimi, enfeksiyon ve hastalıkla sonuçlanabilir. Bir mikroorganizmanın hastalığı oluşturma ya da engelleme yeteneği karmaşık konakçı-parazit etkileşimlerinin etkisi altındadır. • •

Enfeksiyon ve hastalık arasındaki farkları tanımlayınız. Vücudun bir bölgesi diğerine göre mikrobiyal gelişim için neden daha elverişli olabilir?

Derinin Normal Mikrobiyal Florası Ortalama yetişkin bir insan kimyasal bileşimi ve nem oranı oldukça değişen yaklaşık 2m2 deriye sahiptir. Şekil 21.2» derinin anatomisini ve mikroorganizmaların yaşayabileceği bölgeleri göstermektedir. Deri yüzeyi (epidermis) periyodik kurumaya bağlı olarak geniş çaplı mikroorganizma gelişimine uygun bir alan değildir.

-Epidermis

Kıl folikülü

• Şekil 21.2 İnsan derisi. Mikroorganizmalar temel olarak ter kanalları ve kıl folikülleri ile ilişki halindedir.

Deri mikroorganizmalarının büyük çoğunluğu doğrudan ya da dolaylı olarak apokrin bezleri (ter bezleri) ile ilişkilidir. Bunlar, çoğunlukla koltukaltı ve genital bölgede bulunan salgı bezleri meme başı ve göbek deliğidir. Çocuklukta aktif olmayan bu bezler, yalnız ergenlikte tamamen aktif hale geçerler. Derinin bu sıcak ve nemli yüzey bölgelerinde bulunan bakteriyal popülasyonlar, yumuşak ve kuru olan bölgelerine kıyasla oldukça fazladır. Apokrin salgılarında bulunan bakteriyal aktiviteler sonucunda koltukaltı kokuları oluşur; aseptik olarak toplanan apokrin salgısı kokusuzken, bakteri inokülasyonu ile koku oluşturur. Benzer şekilde, herbir kıl folikülü yağlayıcı sıvı salgılayan yağ bezi ile ilişkilidir. Kıl folikülleri hemen derinin altında mikroorganizmalar için cazip bir habitat sağlar. Deri bezlerinin salgısı üre, amino asitler, tuzlar, laktik asit ve lipidler gibi mikrobiyal besin kaynaklarmca zengindir. İnsan salgılarının pH'sı hemen her zaman asidik olup, genellikle pH 4 ile 6 arasındadır. Derinin normal florası geçici ya da kalıcı mikroorganizma popülasyonlarım kapsar. Deri devamlı olarak geçici mikroorganizmalarla inoküle edilir, bunların neredeyse tamamı çoğalamaz ve ölürler. Kalıcı mikroorganizmalar yalnız hayatta kalmayıp, deride çoğalabilirler. Derinin normal florası, temel olarak birkaç grupla sınırlı gram-pozitif Bakterilerdir (Tablo 21.1). Bunlara çeşitli Staphylococcus türleri ve hem aerobik hem de anaerobik çeşitli korinebakteriler dahildir. Bir tür anaerobik korinebakteri olan Propionibacterium acnes, akne olarak adlandırı-

lan duruma neden olmaktadır. Gram-negatif Bakteriler nadiren derinin normal florasının bileşenidir. Çünkü Escherichia coli gibi bağırsakta bulunan organizmalar, devamlı olarak fekal kontaminasyonlar ile deri yüzeyine bulaşırlar. Su aktivitesinin düşük olduğu koşullara daha iyi adapte olabilmiş gram-pozitif organizmlar ile yarışma kabiliyetleri olmadığından, bu gram-negatif Bakterilerden çok azı aslında deride gelişebilir. Bununla birlikte, istisnalar da vardır ve gram-negatif çubuk olan Acinetobacter genellikle deride bulunur. Lipofilik maya olan Pityrosporum ovalis nadiren kafa derisinde bulunmasına rağmen mayalar deri yüzeyi ve mukoz membranlarda fazla sayıda bulunmazlar. Kazanılmış bağışıklık sistemi yetersizliği sendromu (AİDS) (OÖS Kısım 26.14) hastalarında olduğu gibi, konakçı direncinin ya da normal bakteriyal floranın olmadığı durumlarda Candida gibi mayalar ile diğer mantarlar deri yüzeyinde gelişebilir ve ciddi enfeksiyonlara neden olabilirler. Kalıcı mikroflora bir bakıma değişmez olmasına rağmen, normal kompozisyonunu pek çok faktör etkiler. (1) Hava koşulları deri sıcaklığı ve nemini artırarak deri mikroflorasınm yoğunluğunda artışa neden olabilir. (2) Konakçı yaşının da etkisi vardır ve küçük çocuklar yetişkinlerden daha çeşitli mikrofloraya sahiptir ve daha fazla potansiyel patojenik gram-negatif Bakteri taşırlar. (3) Kişisel hijyen kalıcı mikrofloraya etki eder ve temiz olmayan

704 • Bölüm 21 • Mikroorganizmaların insanlarla Etkileşimleri

bireyler genelde deri yüzeylerine daha fazla mikrobiyal popülasyon yoğunluğuna sahiptir. Deri yüzeyinde hayatta kalamayan organizmalar genellikle derinin ya düşük nemi ya da düşük pH'sına (organik asit içeriğine bağlı olarak) yenilirler.

Dış minesi Dentin Taç

21.2 Kavramların Gönden Geçirilmesi Deri, çoğu mikroorganizmanın gelişimini desteklemeyen genellikle kuru, asidik bir ortamdır. Bununla birlikte nemli bölgeler, özellikle ter bezleri, gram-pozitif Bakteriler ve derinin diğer normal florası tarafından kolonize edilir. Çevresel faktörler ve konakçı faktörleri normal deri mikroflorasmı nicel ve nitel olarak etkiler. • •

— Kök

Deri yüzey alanını mukozal dokularla karşılaştırınız. Deride iyi gelişen mikroorganizmaların özelliklerini anlatınız.

Ağız Boşluğunun Normal IVÎikrobiyal Florası Ağız boşluğu oldukça karmaşık ve heterojen bir mikrobiyal habitattır. Bir taraftan tükrük çeşitli mikrobiyal besinleri içermesine rağmen, bu besinler düşük konsantrasyonlarda olduğundan mikrobiyal gelişim için uygun bir ortam değildir. Tükrük salgısı aynı zamanda bir takım antimikrobiyal bileşenlere de sahiptir. Örneğin tükrük, bakteriyal hücre duvarında bulunan peptidoglikanın glikozidik bağları kırarak duvarı zayıflatan ve hücre lizizizne yol açan bir enzim olan lizozim içerir (ÖPÛ Kısım 4.8). Hem tükrük salgısında hem de sütte bulunan laktoperoksidaz enzimi, bir oksijenin açığa çıktığı bir reaksiyon ile bakterileri öldürür (o^ö Kısım 6.15 ve 22.2). Bu antibakteriyal bileşenlerin aktivitesi yanında, gıda parçaları ve epitel tortu bulunuşu, diş ve diş eti gibi oral yüzeyler ve çevresinde geniş kapsamlı lokal mikrobiyal gelişim, doku hasarı ve hastalık için uygun koşulları yaratan yüksek konsantrasyonlarda besin kaynağı sağlar. Dişler ve Dental Plak

Piş, canlı diş dokusunu (dentin ve pulp) çevreleyen kalsiyum fosfat kristallerinden oluşan mineral bir matriksten (enamel, diş minesi) meydana gelir ($ekiı21.3«). Yaşamın ilk yılında (dişler yokken) ağızda bulunan bakterilerin çoğu streptokoklar ve laktobasiller gibi aerotolerant bakterilerdir. Fakat bazı anaerobları da içine alan çeşitli diğer bakteriler de az sayıda bulunur. Dişler çıkmaya başladığında, mikroflora dengesinde spesifik olarak diş yüzeylerine ve diş eti oluğuna adapte olmuş anaeroblara doğru belirgin bir kayma olur. Diş yüzeyinde, bakteriyal kolonizasyon, tek bir bakteri hücresinin tutunması ile başlar. Yeni temizlenmiş diş yüzeyinde bile tükrükteki asidik glikoproteinlerin bağlanması sonucu hızlı bir şekilde bir-

• Şekil 21.3 Bir dişin kesiti. Şekil dişin yapısı ve dişin dişetine gömüldüğü dokuları göstermektedir.

kaç mikrometre kalınlığında ince bir organik film oluşur. Bu film bakteriyal mikrokoloniler için sağlam bir tutunma yeri oluşturur (Şekil 21.4»). Glikoprotein filminde kolonizasyon birkaç Streptococcus türünü (esasen S. sangius, S. sobrinus, S. mutans

ve S. mitis) içerir. Bu organizmaların yaygın gelişimi dental plak adı verilen kaim bakteriyal tabaka oluşumu ile sonuçlanır (Şekil 21.5» ve 21.6»). Eğer plak oluşumu devam ederse filamentli Fusobacterium türleri gelişmeye başlar. Filamentli bakteriler streptokoklar tarafından oluşan matrikse gömülür ve daha da kalmlaşan bakteriyal tabaka oluşturarak dikey olarak yayılır. Streptokoklara ek olarak, filamentli bakterilerle ilişki halinde olan Borellia türleri gibi spiroketler, gram-pozitif çubuklar ve gram-negatif koklar vardır (
21,3 • Ağız Boşluğunun Normal Mikrobiyal Florası • 705 1. Gün 1436 mm 2

IV V

x

W V

^

10. Gün 22,522 mm 2

* Şekil 21.5 Dental plağın dağılımı. Fırçalanmış (üstte) ve fırçalanmamış (altta) dişlerde plak, belirginleştirici ajan kullanılarak ortaya çıkarılmıştır. Rakamlar dental plağın toplam alanını vermektedir. Mor alanlar plağa işaret etmektedir. Plağın öncelikle doğrudan dişetinin mukoz memranlanna bitişik bulunup, seçici olarak dişeti sınırına yakın yerlerde oluştuğuna dikkat ediniz.

* Şekil 21.4 Bakteri mikrokolonileri. (a) 6 saatliğine ağıza takılan model diş yüzeyinde kolonilerin gelişimi, (b) (a)'daki preparatın daha yüksek büyütmesi. Bulunan organizmaların farklı morfolojisine ve organizmaları bir arada tutan yapışkan dokuya (oklar) dikkat edin.

dental çürüme (diş çürümesi) oluşur. Bu yüzden, diş çürümesi mikroorganizmaların neden olduğu enfeksiyon bir hastalıktır. Dişlerin yumuşak yüzeyleri dil, yanak, tükrük salgısı ya da diş fırçası ile sık sık tekrarlanan temizliğe tabii olduğundan, ya da gıda çiğnemenin aşındırıcı etkisi ile çürümeye karşı oldukça dirençlidir. Gıda parçalarının tutulduğu diş eti oluğu içinde ve yakınında olan diş yüzeyleri diş çürümesinin genellikle meydana geldiği yerlerdir. Sakkarozca (sofra şekeri) zengin beslenme biçimleri özellikle çürük etmeni'dir. Çünkü laktik asit bakterileri, şekerleri laktik asite fermente ederler. Sert dokunun (diş minesi) bozulması bir kez başlamışsa artık bakteriyal proteolitik enzimler aracılığıyla diş minesinin proteolizi meydana gelir. Mikroorganizmlar çürüyen matrikse ileri derecede nüfuz eder, ancak bu sürecin daha sonraki aşamaları son derece yavaş ve karmaşıktır. Kalsifiye

(a)

• Şekil 21.6 Dental plağın ince kesitine ait elektron mikrografı. Alt taraf plağın tabanıdır; üst taraf ise, ağız boşluğuna açılan parçadır, (a) Düşük-güç elektron mikrografı. Hakim olan organizmalar streptokoklardır. Streptococcus sobrinus türü antibadi-mikrokimyasal teknik ile boyanmıştır ve bu hücreler diğerlerinden daha koyu gözürmektedir. İki farklı zincir (oklar) halinde görülmektedirler. Gösterilen plak tabakasının toplam kalınlığı 50 |jm'dir. (b) Streptococcus sobrinus hücrelerinin (koyu, ok) olduğu bölgeyi gösteren yüksek-güç elektron mikrografı. Streptococcus sobrinus hücrelerini çevreleyen yapışkan tabakaya (Bölüm 21.6) dikkat ediniz. Her bir hücre yaklaşık 1 (jm çapındadır.

706 • Bölüm 21 • Mikroorganizmaların İnsanlarla Etkileşimleri

olmuş dokunun yapısı aynı zamanda dental çürümenin boyutunda da rol oynar. Örneğin, floridin kalsiyum fosfat kristal matriksine katılması asit dekalsifikasyonuna direnci artırır. Bu yüzden, içme suyunda ve diş macunlarında bulunan floridler diş çürümesini engeller. Dental çürümeden, her ikisi de laktik asit üreten bakteri olan Streptococcus sobrinus ve Streptococcus mutans adlı iki organizma sorumludur. S. sobrinus yumuşak diş dokusu yüzeyleri üzerindeki tükrüğe ait glikoproteinlere tutunma yatkınlığı olması sebebiyle yumuşak doku yüzeylerindeki çürümeye neden olan birincil organizmadır (Şekil 21.6). S. mutans çoğunlukla yarık ve ince çatlaklarda bulunur ve diş yüzeylerine tutunabilme kabiliyeti yüksek düzeyde adhesiv bir polisakkarit olan dekstran üretiminden kaynaklanır (Şekil 21.7»). S. mutans, yalnızca sakkaroz (sofra şekeri) varlığında dekstransukraz enzimi aracılığı ile dekstran üretir: n Sakkaroz

Dekstransukraz

Dekstran (M Glukoz) + n Fruktoz

Diş çürümesinin duyarlılığı değişkendir ve bireyin kalıtsal özelliklerinin yanı sıra beslenme alışkanlığı ve diğer dış faktörlerden etkilenir. Örneğin sakkaroz, gelişmiş ülkelerdeki pek çok bireyin beslenme alışkanlıklarında yer alır ve dekstransukrazın substratı olması sebebiyle yüksek düzeyde karyojeniktir. Karyojenik oral streptokokların dağılımı üzerine yapılan çalışmalar, S. mutans ve S. sobrinus'un bulunması ile dental çürümenin boyutu arasındaki doğrudan ilişkiyi göstermiştir. Amerika Birleşik Devletleri ve Doğu Avrupa'da örneğin, toplumun %80-90'mın dişlerinde S. mutans kolonize olmuştur ve dental çürüme hemen hemen evsenseldir. Buna karşılık, tahminen beslenme alışkanlıklarında sakkaroz olmaması nedeniyle, Tanzanyalı çocukların diş plaklarında S. mutans bulunmamakta ve dental çürüme görülmemektedir. Ağızda bulunan mikroorganizmalar aynı zamanda başka enfeksiyonlara da yol açarlar. Diş eti oluğunda ya da altında bulunan periodontal

membranlar (periodontal paketler) boyunca bulunan alanlar, doku ve kemiklere hasar veren periodontal hastalıklara yol açan dişeti dokusu (gingivitis) iltihabına neden olan çok çeşitli mikroorganizmalarca enfekte olabilir. Fakültatif aerob Capnocytophaga gibi fusiform bakteriler (uzun, ince, sivri uçlu gram-negatif çubuklar) buna neden olan bazı cinslerden biridir. Aynı zamanda aerobik Rothia ve bir anaerobik metanojen Archea olan Methanobrevibacter üyeleri de bulunabilir (c«3 Kısım 13.4). 21.3 Kavramların Gözden Geçirilmesi •

•

>

Bakteriler diş yüzeylerinde plak adı verilen kalın tabaka halinde gelişebilir. Plak mikroorganizmaları yapışkan maddeler üretir. Plakta bulunan mikroorganizmaların ürettiği asit diş yüzeylerine zarar verir ve dental çürüme ile oluşur. Çürük ve perodontal hastalıklara çeşitli mikroorganizmalar katkıda bulunur. • Anaerobik mikroorganzimalar ağıza nasıl yerleşirler? • Dental çürüme, enfeksiyon hastalığı mıdır? Cevabınız için en az bir sebep veriniz. • Laktik asit bakterilerinin diş çürümesine katkısını tanımlayınız.

Sindirim Sisteminin Normal Mikrobiyal Florası Gıda sindiriminin gerçekleştiği yer olan insan sindirim sistemi (Şekil 21.8») mide, ince bağırsak, ve kalın bağırsağı kapsar. Mide sıvılarının yüksek asitliği (yaklaşık pH 2) nedeniyle mide mikroorganizmaların bağırsak sistemine girişini engelleyen kimyasal bir bariyerdir. Bu nedenle, mide içeriğinin bakteriyal sayısı genellikle çok düşüktür. Bunun yanında, Helicobacter pylori gibi mikroorganizmalar normal bireylerde mide duvarında kolonize olabilir, ancak duyarlı bireylerde ülsere yol açabilirler (Ö°Ö Kısım 26.10). Mide haricinde, bağırsak sistemi her biri farklı anatomik bölgelere ayrılan ince bağırsak ve kalın bağırsaktan oluşur. İnsanlarda bağırsak florası kompozisyonu oldukça değişkendir ve beslenme düzenine bağlıdır. Örneğin, fazla miktarda kırmızı et tüketen kimselerde vejeteryan beslenme düzenina sahip bireylerden daha fazla sayıda yüksek proteolitik aktivite gösteren Bacteriodes ve daha az sayıda koliform ve laktik asit bakterileri bulunur. Bağırsaklarda bulunan mikroorganizmaları temsil eden cinsler Şekil 21.8'de verilmiştir. İnce Bağırsak

• Şekil 21.7 Çürük etkeni Streptococcus mufans'ın taramalı elektronmikrografı. Yapışkan dekstran materyali, hücreleri filamentler halinde bir arada tutar. Her bir hücre yaklaşık 1 ^ım çapındadır.

İnce bağırsak, duodenum ile ileum ve bunları birbirine bağlayan jejunum olarak iki parçaya ayrılmıştır. Mideye bitişik duodenum oldukça asidik olması ve mikrobiyal floranın eksikliği ile mideye benzer-

21.4 • Sindirim Sisteminin Normal Mikrobiyal Florası • 707

Bulunan başlıca bakteriler

Başlıca fizyolojik süreçler

Prevotella Streptococcus Veillonella Asit (HCI) salgılanması Makromoleküllerin sindirimi pH2

Helicobacter

Enterokoklar Loktobasiller Bacteroides Bifidobacterium Clostridium Enterobacteria Enterococcus Escherichia Eubacterium Klebsiella Lactobacillus Peptococcus Peptostreptococcus Proteus Ruminococcus Staphylococcus Streptococcus

Sindirimin devamı Monosakkaritlerin, amino asitlerin, yağ asitlerinin ve suyun emilimi

pH4-5

Kalın bağırsak

Safra asitlerinin ve B12 vitaminin emilimi pH7

* Şekil 21.8 İnsan sindirim sistemi. Normal (sağlıklı) bireylerde bulunan patojenik olmayan mikroorganizmaların işlev ve dağılımı gösterilmektedir.

dir. Duodenumdan ileuma kadar pH gittikçe daha az asidik hale gelir ve bakteri sayısı artar. İleumun aşağısında, bağırsak lümeninde sindirim materyali ile karışmış halde bakteriler bulunur. Yaygın hücre sayısı 105-107/gram bağırsak içeriği düzeyindedir.

Bacteriodes türlerinin oluşturduğu 10ı0-10nhücre/ gram bağırsak içeriği sayısı normaldir. Genellikle Enterococcus faecalis de yüksek oranda yer alır.

Kalın Bağırsak İleum kalın bağırsakların bağlantı parçası olan çekuma boşalır. Kalın bağırsakların geri kalan kısmını kolon oluşturur. Kolonda çok yüksek oranda bakteri bulunur. Kolon, özelleşmiş fermentasyon tankı gibi davranır. Bağırsak lümeni içinde muhtemelen gıda sindirimi sonucu oluşan besin kaynaklarını kullanan pek çok bakteri yaşar (Tablo 21.1). Diğer bakterilerden daha az sayıda Escherichia coli gibi fakültatif aeroblar mevcuttur; fakültatif aerobların sayısı genellikle 107 / gram bağırsak içeriği kadardır. Fakültatif aeroblar kalan oksijenin tamamını kullanarak kalın bağırsak ortamını tam olarak anoksik yapar. Bu koşullar zorunlu anaerobların fazla miktarda gelişimini destekler. Bunların pek çoğu fusiform anaeroblarıdır ve bağırsak duvarına tutunmuş halde bulunurlar (Şekil 21.9»). Diğer zorunlu anaeroblar Clostridium ve Bacteriodes türlerini içerir. Kolonda bulunan toplam zorunlu anaerobların sayısı çok yüksektir. Çoğunluğunu

(b)

• Şekil 21.9 Fare ileumundaki silindir biçimli cpitelin yüzeyinde bulunan mikrobiyal topluluğun tarama alan elektron mikrografı. (a) Düşük büyütmede genel görünümü. Yüzeyde bulunan uzun, filamentli fusioform bakterilere dikkat ediniz, (b) Yüksek büyütme, tek bir girintiye bağlanan bazı filamentleri göstermektedir. Bağlantının sadece filamentin uç kısımlarında olduğuna dikkat ediniz. Her bir hücre 10-15 um uzunluğundadır.

708 • Bölüm 21 • Mikroorganizmaların İnsanlarla Etkileşimleri

Bağırsak Florasının Fonksiyonları ve Ürünleri Bağırsak florası türlü ürünlerle sonuçlanan çok çeşitli temel metabolik reaksiyonları yürütür (Tablo 21.2). Bütün bu metabolik ürünler için, bağırsak florasının kompozisyonu ve beslenme alışkanlığı üretilen ürünün tipini ve miktarını etkiler. B12 ve K vitaminleri bu ürünler arasındadır. Bu gerekli vitaminler insanlar tarafından üretilemez, ancak endojen mikrobiyal flora tarafından üretilip bağırsak tarafından emilir. Karaciğer tarafından üretilerek safra kesesinden safra asidiyle bağırsaklara salınan steroidler bağırsakta bulunan mikrobiyal flora tarafından düzenlenir. Düzenlenen aktif steroid bileşenleri de aynı zamanda bağırsaklar tarafından emilir. Fermentatif ve metanojenik mikroorganizmaların aktiviteleri sonucu oluşan diğer ürünler Tablo 21.2'de verilen gaz (flatus) ve koku üreten madderleri kapsar. Gaz fermentatif ve metanojenik mikroorganizmların metabolizması sonucu oluşur. Normal yetişkin bireyler hergün yarısı yutulan havadan kaynaklı N 2 olan yüzlerce mililitre gazı bağırsaklardan dışarı atarlar. Bağırsaklarda fermentatif mikroorganizmaların bazı gıdaları metabolize etmesi hidrojen (H2) ve karbondioksit (CO2) üretimi ile sonuçlanır. Normal yetişkinlerin üçte birinden fazlasının bağırsaklarında bulunan metanojenler 13.4) diğer bağırsak mikroorganzimaları tarafından üretilen H 2 ve CO2'i metana (CH4) dönüştürür. Sığır rumeninde bulunan metanojenler tüm dünyada üretilenin çeyreğine yakın çok önemli miktarda metan üretir (cas Kısım 19.10). Gıdaların sindirim sisteminden geçişleri sırasında su emilir, sindirilen materyal gittikçe yoğunlaşarak dışkıya dönüştürülür. Bakteriler fekal maddenin ağırlığının üçte birini oluştururlar. Kalın bağısak lümeninde yaşayan organizmalar materyal akışıyla aşağı doğru devamlı olarak yer değiştirir ve kaybolan mikroorganizmalar devamlı olarak yeni gelişim ile yenilenir. Bu şekilde kalın bağırsak kemostata benzerdir (
Tablo 21.2

Bağırsak mikroorganizmalarının _. . . .. »-•»•_•_*»_• bıyokımyasal/metabolık katkıları

Vitamin sentezi

Gaz üretimi Koku üretimi

Organik asit üretimi Glikozidaz reaksiyonları Steroid metabolizması (safra asitleri)

Ürün: tiyamin, riboflavin, piridoksin, B12,K Ürün: CO2, CH 4 , H 2 Ürün: H2S, NH 3 , aminler, indol, skatol, bütirik asit Ürün: asetik, propiyonik, bütirik asit Enzim: /3-glukuronidaz Süreç: esterifikasyon, dehidroksilasyon, oksidasyon, redüksiyon, inversiyon

da 24 saattir. Lümendeki bakterilerin gelişme hızı ise, hergün 1-2 kez ikiye ikiye katlanma şeklinde gerçekleşir. Oral olarak antibiyotik verilirse, patojenlerin yanı sıra normal floranın gelişimi de engellenerek bağırsak sistemindeki antibiyotiğe duyarlı bakterilerin kaybına yol açar. Normal floranın tamamının yokluğunda antibiyotiğe dirençli Staphylococcus, Proteus, Clostridium difficile, ya da maya Candida albicans gibi oportünist mikroorganizmalar bazen yerleşir. Oportünist patojenlerin yerleşmesi sindirim fonksiyonunda zararlı değişikliklere ve hatta hastalığa yol açarlar. Örneğin antibiyotik tedavisi, C. difficile gibi enfeksiyon ve kolite neden olan antibiyotiğe daha az duyarlı mikroorganizmaların gelişmesini sağlar. Antibiyotik tedavisi durduktan çoğunlukla uzun bir süre sonra tekrar yerleşir. 21.4 Kavramların Gözden Geçirilmesi Mide oldukça asidiktir ve çoğu kez mikrobiyal gelişim için bir bariyer oluşturur. Bağırsak sistemi az asidikten nötre doğru değişken olup, değişik besinsel ve çevresel koşullar altında çeşitli mikroorganizma popülasy onlarının gelişimini destekler. • İnce bağırsak fakültatif aerobların gelişimi için neden kaim bağırsaktan daha uygun olabilir? • Endojen bağırsak mikroorganizmaları tarafından üretilen birkaç temel bileşiği tanımlayınız. Antibiyotiklerin kullanımına bağlı olarak vücuttan mikroorganizmaların tamamen yok edilmesi halinde ne meydana gelebilir?

Diğer Vücut Bölgelerinin Normal Mikrobiyal Florası Herbir ayrı mukoz membran, belirli bir grup mikroorganizmanın gelişimini destekler. Bu organizmalar lokal çevrenin bir parçasıdır ve sağlıklı dokunun karakteristiğidir. Pek çok durumda, normal kalıcı mikroorganizma popülasyonunun bulunması nedeniyle patojenik mikroorganizmalar mukoz membranlarda kolonize olamazlar. Burada iki mukozal membranı ve onların kalıcı mikroorganizmalarını tartışacağız. Solunum Sistemi Şekil 21.10»'da solunum sisteminin anatomisi gösterilmektedir. Üst solunum sisteminde (nazofarinks, ağız boşluğu ve gırtlak) mikroorganizmalar mukoz membranların salgıları ile ıslanmış alanlarda yaşarlar. Bakteriler üst solunum sistemine nefes alırken hava yolu ile girerler, fakat çoğu nazal yolda tutulur ve yine nazal salgılama ile dışarı atılırlar. Genel olarak bulunan kalıcı organizmalar stafilakoklar, sptreptokoklar, difteroid basiller ve gram negatif koklardır. Potansiyel olarak zararlı

21.5 • Vücudun Diğer Bölgelerinde Bulunan Normal Mikrobiyal Flora • 709

Üst solunum yolu Alt solunum yolu

Nazofarinks

—

Ağız boşluğu -—' Boğaz " Soluk borusu

-—"

Akciğerler-—

^____—~~ ı

* Şekil 21.10 Solunum sistemi. Üst solunum sisteminde çok çeşitli ve fazla sayıda mikroorganizma bulunur. Ancak devam eden etkin bir enfeksiyon yoksa, alt solunum sistemi oldukça az mikrobiyal yüke sahiptir (Şekil 26.2).

Staphylococcus aureus ve Streptococcus pneumoniae

gibi bakteriler sıklıkla sağlıklı bireylerde nazofarenksin normal florasının bir parçasıdır (21.1). Bu bireyler patojenlerin taşıytasıdırlar, ancak muhtemelen diğer kalıcı mikroorganizmaların kaynaklar için yarışmada başarı kazanmaları ve patojen gelişimini sınırlandırmaları nedeniyle normalde

hastalığa yakalanmazlar. Kalıtsal bağışıklık sistemi (Kısım 22.2 ve Kısım 23.1) ve IgA gibi sonradan kazanılan bağışıklık sisteminin bileşenleri (aco Kısım 22.9) özellikle mukozal yüzeylerde aktiftir ve aynı zamanda patojenlerin gelişimini engeleyebilir. Normal alt solunum sistemi (soluk borusu, bronşlar ve akciğer) nefesle bu bölgeye ulaşan yüksek sayıda organizmaya rağmen kalıcı mikrofloraya sahip değildir. Oldukça büyük olan toz parçaları üst solunum sistemine yerleşir. Hava alt solunum sisteminden geçtikçe, akış hızı belirgin bir şekilde düşer ve organizmalar geçtikleri yerlerdeki duvarlara yerleşir. Solunum sisteminin bütününün duvarları yukarı doğru çarpma hareketi yapan, bakterileri ve diğer partikül maddeleri tükrük ve nazal salgılarla dışarı atan üst solunum yoluna doğru iten, silli epitelyum ve siller ile kaplıdır. Yalnız, büyüklüğü 10/zm çapından daha küçük olan parçacıklar akciğere ulaşır. Ürogenital Sistem

Erkek ve kadın ürogenital sistemlerinde (Şekil 21.11a»), genellikle mesanenin kendisi sterildir, ancak üretrayı saran epitel hücreler fakültatif anaerob gram negatif basil ve koklar tarafından koloni-

• Şekil 21.11 Genitoüriner sistemde mikrobiyal gelişme. (a) Mikroorganizmaların genellikle geliştiği bölgeleri (kırmızı) gösteren erkek ve kadın insanlarda genitoüriner sistem. Normal bireylerde hem erkek hem de kadınların genitoüriner sistemlerinin üst bölgelerinin steril olduğuna dikkat ediniz, (b) Ergenliğin başlangıcından menopozun bitimine kadar kadınların vajinasında hakim olan organizma Lactobacullus acidophilus'un gram boyaması. Her bir çomak 3-4 um uzunluğundadır. Genç ve yaşlı kadınların genitoüriner sistemi daha az asidiktir ve nötür veya az alkali pH'da gelişen heterojen bir mikroorganizma grubu içerir.

710 • Bölüm 21 • Mikroorganizmaların insanlarla Etkileşimleri

ze edilmiştir (Tablo 21.1). Escherichia coli ve Proteus mirabilis gibi mikroorganizmalar ile normalde vücutta ve pH değişiklikleri gibi lokal faktörlerden etkilenen, lokal çevrede bulunan diğerleri çoğalabilir ve patojenik hale gelebilir. Bu gibi organizmalar, özellikle kadınlarda sıklıkla idrar sistemi enfeksiyonlarına neden olurlar. Yetişkin bir kadının vajinası zayıf asidiktir ve bir polisakkarit olan glikojeni önemli miktarda içerir. Vajinada yerleşik bir organizma olan Lactobacillus acidophilus glikojeni fermente ederek laktik asit oluşturur ve asit koşulları sağlar (Şekil 21.1£>) (c**2> Kısım 12.19). Aynı zamanda mayalar {Torulopsis ve Candida türleri), streptokoklar, ve E. coli gibi diğer organizmalar da bulunur. Ergenlik çağından önce kadın vajinası alkalidir ve glikojen üretmez, L. acidophilus bulunmaz ve flora esas olarak stafilokoklar, streptokoklar, difteroidler, ve E. coli'den ibarettir. Menapozdan sonra glikojen üretimi kesilir, pH yükselir ve flora ergenlik öncesinde bulunan floraya benzer.

•m21.5 Kavramların Gözden Geçirilmesi

Patojenik olmayan Normal bir mikroorganizma popülasyonunun solunum ve ürogenital sistemde bulunması, normal organ işlevleri için gereklidir ve genellikle patojenlerin kolonizasyonunu engeller. •

Potansiyel patojenler sıklıkla üst solunum sisteminin normal florasında mevcuttur. Birçok durumda neden hastalık oluşturmazlar? • Normal yetişkin bir kadının ürogenital sisteminde neden Lactobacillus bulunur? Neden menopoz sonrası kadınlarda bulunmaz?

Patojenlere MARUZ KALMA

Deri ya da mukozaya TUTUNMA Lokal bölgelerde ileri düzeyde maruz kalma

Epitel yolu ite YAYILMA

İleri düzeyde maruz kalma

Vîrütens faktörlerin üretimi KOLONİZASYON ve YAYILMA

TOKSİSİTE: Toksinin lokal veya sistemik etkileri

YAYILMA: Orijin ve uzak bölgelerde ileri düzeyde gelişme

\ DOKU HASARI, HASTALIK

• Şekil 21.12 Mikroorganizmalar ve patojcnitc. Konakçıda mikroorganizmaların bulunuşu ve hatta gelişimi, mutlaka bir enfeksiyonun oluşacağı anlamına gelmez.

bağırsak epitelyumu gibi mikrobiyal bariyer oluşturan yüzeylere nüfuz etmeleri gerekir. Spesifik Bağlanma

MİKROORGANİZMALARIN İNSANLARLA ZARARLI ETKİLEŞİMLERİ Mikrobiyal etkileşimler konakçıya zarar verebilir ve hastalığa neden olabilir. Burada mikroorganizmaların hastalığa neden olma kabiliyetlerinin yani patojenesisin mekanizmasını inceleyeceğiz. Mikrobiyal patojenesis mikroorganizmaların konakçı hücrelere maruz kalması ve bağlanması ile başlayıp yayılma, kolonizasyon ve çoğalma devam eder. Kontrolsüz patojen gelişimi daha sonra konakçı hasarı ile sonuçlanır. Hastalık üreten mikroorganizmalar bir patojenin bağıl yeteneği olan virülens oluşturmak için çok farklı stratejiler kullanırlar (Şekil 21.12*). Burada virülens oluşturmadan sorumlu faktörleri sırasıyla gözden geçireceğiz.

Patojenin Konakçıya Girişi Herhangi bir patojen zarar vermeden önce genellikle konakçı dokulara geçişi sağlamak ve çoğalmak zorundadır. Çoğu durumda, bunu gerçekleştirmek için organizmaların deri, mukoz membranlar ya da

Çoğu mikrobiyal enfeksiyonlar deride veya solunum, sindirim ya da genitoüriner sistemlerin mukoz membranlarmda bulunan çatlak ya da yaralarda başlar. Enfeksiyon başlatan bakteriler ya da virüsler çoğu kez epitel hücrelere, spesifik olarak patojen ve konakçı hücre yüzeylerindeki makromoleküllerin etkileşimi aracılığıyla tutunur (Şekil 21.13»). Enfeksiyon yapan bir mikroorganizma her epitel hüreye eşit olarak bağlanmaz, ancak vücudun belirli bölgesindeki hücrelere seçici olarak bağlanır. Örneğin, cinsel yolla bulaşan belsoğukluğu etkeni olan Neisseria gonorrhoeae (cfs, Kısım 26.12) ürogenital epitellere Opa (opak yapı oluşturan proteinler) adı verilen yüzey proteinleri vasıtasıyla diğer dokulara bağlandığından daha kuvvetli bir şekilde bağlanır. Konakçı hücreler Opa proteinlerine sadece insan epitel hücrelerinde bulunan CD66 adı verilen protein ile bağlanır. Bu şekilde, N. gonnorhoeae hedef hücrelerle, yalnız hücre yüzeyi reseptörü-ligand çifti yolu ile bağlanır. Aynı zamanda konakçı türü de bu spesifikliğe etki eder. Pek çok durumda, normalde insanları enfekte eden herhangi bir bakteriyal suş uygun insan hücrelerine, hayvanlarda (örneğin fareler) bulunan

* •>

/

,

..'

•

Sİ

'

21.6 • Patojenin Konakçıya Girişi • 711

IP

ft) * Şekil 21.13 Patojenlerin hayvan dokusuna tutunması. (a) Tavşan vililerinin fırça kenanna tutunan Vibrio cholera'nın geçirindi elektron mikrografı. Kapsülün bulunmadığına dikkate ediniz, (b) Yeni doğmuş bir buzağıda öldürücü enfeksiyon modelinde enteropatojenik Escherichia coli. Bakteriyal hücreler buzağı vililerinin fırça kenanna iyi-tanımlanmış kapsül ile bağlıdır. Her bir çomak 0.5 |jm uzunluğundadır.

aynı hücrelerden daha kuvvetli bağlanır ya da tam tersi olur. Bakteriyal tutunmadan sorumlu bazı makromoleküller bakterilere kovalent bağ ile bağlı değildir. Bunlar genellikle bakteriler tarafından sentezlenen ve salgılanan polisakkaritler, proteinler ya da protein-karbonhidrat karışımlarıdır (c»a Kısım 4.10). Polimer liflerinin oluşturduğu hücre dışına uzanan gevşek ağ yapışkan tabaka olarak bilinir (Şekil 21 Ab). Hücreyi çevreleyen, yoğun, iyi tanımlanmış tabakadan oluşan polimer kılıfa kapsül adı verilir (Şekil 21.13 ve 21.14»). Bu yapılar yalnız konakçı dokulara değil aynı zamanda diğer bakterilere tutunma için de önemli olabilir. Ek olarak, bu yapılar bakterileri fagositoz (<3°Ö Kısım 22.2) gibi konakçı savunma mekanizmalarına karşı korur. Fimbriya ve piluslar (o°o Kısım 4.10) bakteriyal hücre yüzeyi proteini yapıları olup aynı zamanda tutunma sürecinde görev alırlar. Mesela, Neisseria gonorrhoeae''da piluslar bu organizmaların ürogenital epitelyuma bağlanmalarında kilit rol oynar ve Escherichia coli'nin fimbriya oluşturan suşları (Şekil 21.15 •) fimbriyaları olmayan suşlara kıyasla daha sık idrar sistemi enfeksiyonuna neden olurlar. En iyi karakterize edilmiş fimbriyalar arasında enterik bakterilere (Escherichia, Klebsiella, Salmonella, Shigel-

la) ait tip I fimbriyalar olarak adlandırılan fimbriyalar yer alır. Tip I fimbriyalar hücrelerin yüzeyine düzenli şekilde dağılmıştır. Piluslar genellikle fimbriyalardan uzun olup hücre yüzeyinde az sayıda bulunurlar. Hem piluslar hem de fimbriyalar konakçı hücrenin glikoproteinlerine bağlanarak tutunma olayını başlatırlar. Aynı zamanda flagellalar (Kısım 4.14) da konakçı hücrelere tutunmayı arttırır ve gelişmiş virülensa yol açar (Şekil 21.17).

• Şekil 21.14 Bacillus anthracis kapsülleri, (a) Bikarbonat ağar ortamında B. anthracis kapsülleri. Kasül içine alınmış koloniler tipik olarak çok geniş ve mukoid görünümündedir. Her bir kapsül içine alınmış koloni 0.5 cm çapındadır, (b) B. anthracis kapsüllerinin doğrudan immunofloresan boyaması. Flörosein izosiyanat (FITC) (ö°ö Kısım 24.9) ile birleşen antikorlar kapsülü açık yeşile boyar. Burada boyama sonucu, kapsülün yaklaşık 0.5 (jm çapındaki hücreden dışarıya doğru 1 |jmgenişlediği görülmektedir. Şarbon etmeni B. Anthracis hakkında daha fazla bilgi ve B. anthracis'in biyolojik silah olarak kullanımı Bölüm 25.12 ve 25.13'de bulunabilir.

712 • Bölüm 21 • Mikroorganizmaların İnsanlarla Etkileşimleri

üretir. Bundan sonra, kolonize olarak ve enteretoksin (bkz. Kısım 21.11) üreterek diyare ve başka hastalıklara (o°e> Kısım 29.8) neden olurlar. E. coli'nin patojenik olmayan diğer suşları nadiren CFA proteinlerine sahiptir. Mikrobiyal tutunma için önemli olan bazı temel faktörler Tablo 21.3'de verilmiştir. Yayılma

• Şekil 21.15 Fimbriyalar. Tip P fimbriyalan gösteren bakteri Escherichia coli'nin karanlık alan elektron mikrografı. Tip P fimbriyalar, tip I fimbriyalara benzerler, ancak oldukça uzundur. Gösterilen hücre yaklaşık 0.5 ^jrn genişliğindedir.

Mukozal epitelyum ve patojenler arasındaki spesifik etkileşimin kanıtı Escherichia coli 'nin neden olduğu diyaredir. E. coli'nin çoğu susu patojenik değildirler ve cecum (kör bağırsak) ile kolonda yerleşik normal floranın parçasıdır (Şekil 21.8). E. coli'nin pek çok susu aynı anda vücutta bulunur ve bu patojen olmayan suşlar çok fazla sayıda rutin olarak vücuttan geçerek dışkı ile atılırlar. Bununla birlikte, E. coli'nin enterotoksik suşları ince bağırsak hücrelerine spesifik olarak tutunan CFA (kolonizasyon faktör antijenleri) olarak adlandırılan fimbriyal proteinleri

Tablo 21.3

Mihrobiyal patojenlerin konakçı dokularına bağlanmalarını sağlayan temel tutunma faktörleri

Faktör

Örnek

Kapsül/ yapışkan tabaka (Kısım 4.10, Şekil 21.4, Şekil 21.13, Şekil 21.14)

Patojenik Escherichia coli - kapsül bağırsak mikrovilluslarma tutunmayı sağlar

Tutunma proteinleri

Streptococcus pyogenes -

Streptococcus nıutans- dekstran yapışkan tabaka, dişlerin yüzeylerine tutunmayı sağlar

hücredeki M proteini solunum mukozasındaki reseptörlere tutunur Neisseria gonorrhoeae - hücredeki Opa

proteini ürogenital epitelyumdaki reseptörlere tutunur Lipoteikoik asit (<»& Kısım 4.8 ve Şekil 4.31)

Streptococcus pyogenes - solunum yolu

mukozal reseptöre bağlanmaya yardımcı olur (M proteini ile birlikte)

Fimbriyalar (piluslar) Neisseriaggonorrhoeae p- piluslar ürogenital g Kısım 4.10 epitele bağlanmaya yardımcı olur ve Şekil 21.15) Salmonella türleri - tip I fimbriyalar ince bağırsak epiteline bağlanmaya yardımcı olur Patojenik Escherichia coli - kolonizasyon faktör antijenleri (CFA'lar) ince bağırsak epiteline bağlanmaya yardımcı olur " Konakçı dokularındaki çoğu reseptör bölge gangliozidler ya da globozidler gibi glikoprotein, ya da kompleks lipid yapısındadır.

Yalnız toksin üreten çok az sayıda mikroorganizma patojeniktir. Bu organizmalar konakçı dokularına geçişe sahip olmaya ihtiyaç duymazlar ve biz bunları ayrı ayrı tartışacağız (bkz. Bölüm 21.10 ve 21.11). Bununla birlikte, çoğu patojen, patojeniteyi başlatmak için yayılma adı verilen bir süreç ile epitelyuma nüfuz eder. Genellikle deri ya da mukozal yüzeylerdeki küçük yarık ya da lezyonlarda, giriş noktasında gelişme başlar. Gelişme aynı zamanda bozulmamış mukozal yüzeylerde özellikle normal flora örneğin antimikrobiyal kemoterapi ile değiştirilmiş ya da yok edilmiş ise başlayabilir. Patojenler bundan sonra kolayca dokularda kolonize olabilir ve yayılma sürecine başlayabilirler. Aynı zamanda, patojen gelişimi orijinal giriş noktasından uzak bir yerde de başlayabilir. Uzak, genellikle iç kısımlara ulaşım, kan ya da lemfatik dolaşım sistemi yolu ile olur (<s«5 Kısım 22.1). 21.6 Kavramların Gözden Geçirilmesi Patojenler konakçı dokularına, patojen ve konakçı makromoleküllerinin etkileşimi ve mukozal yüzeylere tutunarak giriş sağlarlar. Tutunma bölgesinde patojen yayılmaya başlar ve dolaşım sistemi ile konakçının her yerine dağılabilir. •

•

Escherichia coli'deki CFA molekülleri ve Neisseria gonorrhoeae''daki Opa proteinleri mukozal dokulara tutunmaya nasıl etki ederler? Tutunma yayılmayı nasıl başlatır?

Kolonizasyon ve Gelişme Eğer bir patojen dokulara geçerse çoğalır. Bu sürece kolonizasyon adı verilir. Bir patojenin başlangıç sayısı zarara yol açacak kadar yüksek olmadığından, konakçıda gelişmek için uygun besin kaynağı ve çevre koşullarını bulmak zorundadır. Sıcaklık, pH, ile oksijen varlığı ve yokluğu patojen gelişimini etkiler, ancak mikrobiyal besin kaynaklarının varlığı, bunlar arasında en önemli olanıdır. Omurgalı bir konakçı, mikroorganizmalar için besinsel bir cennet gibi görünse de bütün besin kaynakları bol bulunmaz. Şekerler, amino asitler, ve organik asitler gibi çözünebilir besinler kısıtlıdır ve bu nedenle glikojen gibi kompleks besinleri kullanabilen organizmalar tercih edilir. Vitaminler ve büyüme faktörlerinin hepsi her zaman her dokuda yeteri kadar bulunmamaktadır. Brucella abortus örneğin, enfekte olmuş sığırlarda pek çok dokuda çok yavaş gelişirken, düşüğe neden olduğu plasen-

21.8 • Virülens • 713

tada çok hızlı gelişir. Bunun nedeni, B. abortus'un plasentayı enfekte ettiğinde gelişimini destekleyen besin kaynağı olan eritrolün değişen konsantrasyonlarıdır (bkz. Tablo 21.6). Aynı zamanda iz elementler de az bulunabilir ve patojen yerleşimine etki edebilirler. Örneğin, demir konsantrasyonu mikrobiyal gelişime önemli ölçüde etki eder (oocs Kısım 5.1). Hayvanlarda bulunan transferrin ve laktoferrin adı verilen spesifik protein demire sıkıca bağlanır ve demiri vücutta taşırlar. Bu proteinler mikrobiyal demir yetersizliğinin yaygın olabileceği kadar yüksek demir ilgisine sahiptir. Enfekte hayvanlara verilen bir demir tuzu patojenlerin virülenslığmı büyük oranda artırır. Bölüm 5.1'de belirttiğimiz gibi, birçok bakteri çevrede bulunan gelişimi-sınırlayan bir mikrobesin kaynağı olan demiri elde etmeye yardımcı demir-bağlayıcı bileşikler (siderofor) üretir. Bakterilerden izole edilen bazı demir bağlayıcılar o kadar etkindir ki hayvansal demir-bağlayan proteinlerden demiri ayırabilirler. Örneğin, belirli Escherichia coli suşları tarafından üretilen ve Col V plazmitinde (ef^ Kısım 10.9) kodlanan aerobactin adlı bir siderofor transferrine bağlı bulunan demiri kolaylıkla ayırabilmektedir. Benzer şekilde, Neisseria türleri de transferrine-özgül reseptör proteinler üretir ve demiri bağlı bulunduğu tranferrinden ayırır. Vücutta Lokalizasyon

İlk girişten sonra organizma, Staphylococcus'un neden olduğu deri enfeksiyonlarında oluşan iltihapta olduğu gibi küçük bir enfeksiyon toplanmasıyla ortaya çıkıp çoğunlukla yerleşerek kalır ve çoğalır (c«5 Kısım 26.9). Başka bir şeklinde ise, organizmalar lenfatik damarlara girebilir ve lenf bezlerinde biriktirilirler. Eğer bir organizma kana ulaşırsa, genellikle karaciğer ya da dalakta yoğunlaşır. Patojenin kan ve lenf sistemi yoluyla dağılması organizmanın çeşitli dokularda gelişmesi, vücutta genelleşmiş (sistemik) enfeksiyona yol açar. Eğer dokularda geniş kapsamlı bakteriyal gelişme meydana gelirse bazı organizmalar fazla sayıda kana karışır ve bakteremi denilen durum ortaya çıkar. Bu tip yaygın enfeksiyonlar hemen her zaman böbrek, bağırsaklar ya da akciğer gibi belirli bir organda yerleşmiş bir enfeksiyon olarak başlar.

Virülens Virülens bir parazitin hastalığa neden olma yeteneğidir ve burada virülensı ölçmek için kullanılan bazı basit yöntemleri ele alacağız. Virülens Ölçümü

Bir patojenin virülensı, test edilen hayvan grubunun %50'sini öldüren etmenin dozu olan LD50 (letal doz50)'nin deneysel çalışmalarından tahmin edilebilir. Yüksek ölçüde virülant patojenler popülasyonun %50'si ile %100'ünü öldürmek için gereken hücre sayısı karşılaştırıldığında, genellikle çok az farklılık gösterir. Bu durum Şekil 21.16»'da farelerle yapılan deneysel Streptococcus ve Salmonella enfeksiyonları ile örneklenmiştir. Ölümcül bir enfeksiyonun gerçekleşmesi için yalnız birkaç Streptococcus pneumoniae hücresi gerekir ve belirli bir susun virülensı yerleştiğinde, test edilen fare popülasyonunun bütün üyelerini öldürür. Aslında S. Pneumoniae'da LD50'nin belirlenmesi, letal enfeksiyon için çok az organizmaya gerek olduğundan zordur. Buna karşılık, biraz daha az virülant olan Salmonella typhimurium için LD 5 0 S. pneumoniae''dan

daha yüksektir. Popülasyonun %100'ünü öldürmek için gerekli Salmonella typhimurium hücre sayısı, LD50'ye ulaşmak için gereken hücre sayısının 100 katından daha fazlasıdır. Patojenler laboratuvar kültürü olarak saklandığında ve hayvanlar yoluyla taşınmadığında virülens özellikleri düşmekte ve hatta tamamen kaybolmaktadır. Bu organizmalar zayıflatılmış olarak adlandırılır. Zayıflatma muhtemelen taze besiyerine ardışık aktarımlardan sonra virülant olmayan mutantlarm daha hızlı gelişebilmesi nedeniyle oluşur ve bu tür mutanatlar seçilimde tercih edilir. Zayıflatma sıklıkla kültür koşulları tür için optimal olmadığında daha kolay meydana gelir. Eğer zayıflatılmış bir kültür bir hayvana tekrar inuküle edi-

100

•ffi

Bir patojen kolonize olmadan ve konakçı dokusunda fazla gelişmeden önce, besinleri ve uygun gelişme koşullarını sağlamalıdır. Organizmalar yayılma bölgesinde lokal olarak gelişir ya da vücudun her yerine yayılabilirler. •

Çoğu patojenin başarılı olabilmesi için neden kolonizasyon ve gelişim gereklidir? • Bir mikroorganizmanın lokal bir bölgede kolonizasyonu ve gelişimini sınırlayan ya da arttıran konakçı faktörleri nelerdir?

80

•a N

a) a

21.7 Kavramların Gözden Geçirilmesi

Orta düzeyde virülent organizma (Salmonella typhimurium)

Yüksek virülense sahip (Streptococcus pneumoniae)

60

I O

40 20

101

10 2

10 3

10 4

10 5

10 6

10 7

Her bir fareye enjekte edilen hücre sayısı

• Şekil 21.16 Mikrobiyal virülens. Fareleri öldürmek için gereken Streptococcus pneumoniae ve Salmonella typhimurium hücrelerinin sayısına bağlı olarak mikrobiyal virülanttaki farklılıkların karşılaştırılması.

714 • Bölüm 21 • Mikroorganizmaların İnsanlarla Etkileşimleri

lirse, organizmalar bazen virülensı tekrar kazanır, ancak pek çok durumda virülens kaybı kalıcıdır. Zayıflatılmış suşlar çoğunlukla aşıların, özellikle de viral aşıların üretiminde kullanılır (<*Xa Kısım 22.13). Örneğin; kızamık, kabakulak ve kızamıkçık aşıları, zayıflatılmış canlı virüsleri içerir. Toksisite ve Yayılmacılık

Salmonella'nın Virülensı

Virülens özellik, bir patojenin toksisite ve yayılmacılık yoluyla konakçı hasarına neden olma kabiliyetinden ileri gelir. Her patojen bu özellikleri hastalık oluşturmak için kullanır. Toksisite bir organizmanın konakçı hücre fonksiyonlarını engelleyen ya da konakçı hücrelerin ölmesine neden olan, önceden oluşturulmuş toksinler yoluyla hastalık yapma kabiliyetidir. Örneğin, tetanoz hastalığına Clostridium tetani tarafından üretilen kuvvetli bir ekzotoksin neden olur (bkz. Bölüm 21.10). C. tetani hücreleri nadiren ilk girdikleri yaradan ayrılır ve yara bölgesinde oldukça yavaş gelişir. Fakat C. tetani hastalık oluşturma yeteneğindedir, çünkü vücudun uzak bölgelerine taşınan ve geridönüşsüz kas kasılması ve sıklıkla konakçının ölümüne yol açan tetanoz toksinini üretir. Yayılmacılık bir organizmanın konakçı dokusunda, konakçı fonksiyonlarını engelleyecek kadar fazla sayıda gelişme yeteneğidir. Bir mikroorganizma hiç toksin üretmese bile yayılma özelliği sayesinde hastalık oluşturabilir. Örneğin, Streptococcus pneumoniae için virülens faktör, konakçı tarafından yayılmayı engelleyici temel savunma mekanizması olan patojenik suşlarm fagositozunu (bkz. Kısım 21.6, ÖOQ Kısım 26.2, ve Şekil 26.3) yenmesini sağlayarak, bu bakteriyi koruyan polisakkarit kapsüldür. S. pneumoniae'nm kapsül oluşturan suşları ileri düzeyde konakçı hasarına neden olabilmektedir, çünkü yüksek seviyede yayılmacıdırlar. Akciğer dokularında yüksek oranda gelişerek konakçı tepkisini başlatır ve zatürreye yol açarlar (Kısım 26.2). • Şekil 21.17 Salmonella patojenitesindeki virülens faktörleri. Patojenite için bilinen önemli yapısal elemeanlar gösterilmiştir, pho gen sisteminin protein ürünleri tanımlanamamıştır, ancak makrofajlann ürettiği defensinlerin etkilerini nötralize ettikleri bilinmektedir.

Kapsül oluşturmayan suşlar, hızla ve etkin bir şekilde fagositozla tutularak yok edilirler. Clostridium tetani ve Streptococcus pneumoniae, sırasıyla toksisite ve yayılma özelliğinin uç örnekleridir. Pek çok patojen bu uç noktalar arasında yer alır ve hastalık oluşturmak için toksin üretme ve yayılma özelliklerinin kombinasyonlarını kullanır.

Salmonella türleri patojeniteyi arttırmak için toksin oluşturma, yayılmacılık ve diğer virülens faktörlerin karışımını kullanırlar (Şekil 21.17»). Öncelikle, Salmonella'nın virülensma çeşitli toksinler yardım eder ve en az üç toksin üretilir: enterotoksin (Tablo 21A), endotoksin («**a Kısım 4.9 ve Şekil 4.35) ve sitotoksin. Sitotoksin konakçı hücre protein sentezini engelleyerek ve konakçı hücrelerden Ca+2 iyonlarının kaçışını sağlayarak hareket eder. Salmonella'nın yayılmasında görev alan birtakım virülens faktörler vardır. Hücre yüzey polisakkariti O antijeni (ÖOQ Şekil 4.35), flagellar H antijeni ve fimbriyalar tutunmayı arttırır. Kapsül yapısına ait Vi polisakkariti komplement (kanda bulunan ve mikroorganizmaların tahribine yol açan madde) bağlanmasını ve antikor-aracılığıyla bakterinin öldürülmesini (OQÖ Kısım 22.11) engeller. Salmonella'nın inv (yayılma) genleri yayılmada yer alan en az 10 farklı protein kodlar. Örneğin, invC, invG, invl ve inv] konakçı hücreye-bağlanmak için kullanılan özel yüzey uzantılarnın montajında görev alırken, invH yüzey adhezin proteinini kodlar. Salmonella hücre içi parazitizm yoluyla kolaylıkla enfeksiyon oluşturur ve bağırsakları kaplayan hücrelerin yanısıra, normalde bakterileri sindirip öldüren beyaz kan hücreleri olan makrofajlar içinde gelişir («sas Kısım 22.2). Makrofajlarm toksik oksijen ürünleri Salmonella oxyR geni tarafından oluşturulan proteinler tarafından nötralize edilir. Makrofajlar tarafından üretilen ve defensinler olarak adlandırılan antibakteriyal moleküller, phoP ve phoQ genleriSideroforlar Tip 1 fimbriya (tutunma)

LPS tabakasındaki endotoksin (ateş)

oxyR tarafından indüklenen antifagositik proteinler

O antijeni Fagositik etkiyi engeller

inv tarafından kodlanan yüzey elemanları; tutunma

Sitotoksin (konakçıdaki hücre protein sentezini engeller; konakçıya kalsiyum akışı; tutunma) Vi kapsül antijeni; kompleman bağlanmasını engeller Flagellum (hareket) H antijeni (tutunma; fagositik etkiyi engeller)

21.8 • Virülens • 715

Tablo 21.4

İnsan patojenleri tarafından üretilen ekzotoksinler

dışı virülens faktörler

Organizma

Hastalık

Toksin ya da faktör

Etki

Bacillus anthracis

Şarbon

Letal faktör (LF) Edema factor (EF) Koruyucu antijen (PA) (AB)

Bacillus cereus

Gıda zehirlenmesi

Enterotoksin kompleksi

PA hücre tutunma B bileşenidir, EF ödeme neden olur, LF hücre ölümüne neden olur Bağırsak hücrelerinden

Bordetella pertussis

Boğmaca

Pertussis toksini (AB)

Clostridium botulinum

Botulizm

Nörotoksin (AB)

Clostridium tetani

Tetanoz

Nörotoksin (AB)

Clostridium perfringens

Gazlı gangren, gıda zehirlenmesi

a-Toksin (CT) (3-Toksin (CT) •y-Toksin (CT) 5-Toksin (CT) «-Toksin (E) A-Toksin (E) Enterotoksin (CT)

Corynebacterium diphtheriae

Difteri

Difteri toksini (AB)

Escherichia coli

Gastroenterit

Enterotoksin (AB)

Haemophilus ducreyi

Kankroid

Sitoletal toksin6 (CDT) (AB)

Pseudomonas aeruginosa

P.aeruginosa enfeksiyonları

Ekzotoksin A (AB)

Salmonella sp.

Salmonellosis, tifo ateşi,

Enterotoksin (AB)

Sitotoksin (CT) Shigella dysenteriae

Bakteriyal dizanteri

Şiga toksin (AB)

Staphylococcus aureus

Piyojenik (irin oluşturan) enfeksiyonlar (deri ve diğer apseler), solunum yolu enfeksiyonları, gıda zehirlenmesi, toksik şok sendromu, yanık deri sendromu

a-Toksin (CT) Toksik şok sendromu toksini (SA) Deride pullar halinde dökülmeye yol açan toksin A ve B (SA) Lökosidin (CT) (8-Toksin (CT) y-Toksin (CT) 5-Toksin (CT) Enterotoksin A, B, C, D ve E (SA) Koagülaz (E)

Piyojenik enfeksiyonlar, bademcik iltihabı, kızıl ateşi

Streptolisin O (CT) StreptolişinS(CT) Eritrojenik toksin (SA)

Streptococcus pyogenes

Streptokinaz (E) Hiyaluronidaz (E) Vibrio cholera

Kolera

Enterotoksin (AB)

G proteini sinyal transdüksıyonunu engeller, hücreleri öldürür Gevşek paraliz (bkz. Spiril 91 90}

Spastik paraliz (bkz. Sekil 21 21) Hemoliz (lesitinaz, bkz. Şekil 21.18b) Hemoliz Hemoliz Hemoliz (kardiyotoksin) Kollajenaz Proteaz Bağırsak epitelyumunun geçirgenliğini değiştirir

Ökaryotlarda protein sentezim inhibe eder (Şekil 21.19) Bağırsak hücrelerinden sıvı kaybını tetikler (yalnızca enterotoksijenik suşları) Genotoksin (DNA lezyonları konakçı hücrede apoptosise neden olur) Protein sentezini inhibe eder Protein sentezini inhibe eder ve konakçı hücreleri lize eder paratifo ateşi Bağırsak hücrelerinden sıvı kaybını tetikler Protein sentezini inhibe eder Hemoliz Sistemik şok Deri soyulması, şok Lökositleri parçalar Hemoliz Hücreleri öldürür Hemoliz, lökoliz Mide bulantısı, diyare ve şoku tetikler Fibrin topaklanmasını tetikler Hemolisin Hemolisin (Şekil 21.18a) Kızıl ateşi döküntüsüne neden olur Fibrin topaklarını çözer Bağ dokudaki hiyaluronik asidi çözer Bağırsak hücrelerinden sıvı kaybını tetikler (Şekil 21.22)

" AB, A-B toksini; CT, sitolitik toksin; E, enzimatik virülens faktör; SA, süperantijen toksini. * Sitoletal toksin Actinobacülus actinomycetemcomitans, Campylobader sp., Escherichia coli, Helicobacter sp., Salmonella typhi, ve Shigella dysenteriae'yi kapsayan diğer gram-negatif patojenlerde de bulunur.

nin ürünleri tarafından nötralize edilir. Bu şekilde, Salmonella'nm oxy ve pho gen ürünleri hücre içi yayılma yöntemlerini genişleterek ve normal koşullarda hücre içi bakteriyal gelişimi engelleyen konakçı savunma sistemlerini nötralize ederek patojeniteyi artırır.

Plazmit kaynaklı çeşitli virülens faktörleri aynı zamanda çoğu Salmonella türünde kalıcılık ve yayılmada da görev alır. Örneğin, antibiyotik dirençlilik, bir plazmit üzerinde kodludur. Son olarak, Salmonella aynı zamanda bakteriyal demirbağlanma proteinleri olan sideroforları üretir

716 • Bölüm 21 • Mikroorganizmaların insanlarla Etkileşimleri

Kısım 5.1 ve bakınız Kısım 21.7). Bu şekilde, Salmonella ve muhtemelen diğer patojenlerin de çoğu virülens oluşturmak için çeşitli faktörleri kullanır ve hastalık oluşturur. Bu virülens faktörler çeşitli enterik bakteri üyeleri arasında ve içinde paylaşılır Kısım 12.11). — I^H 21.8 Kavramların Gözden Geçirilmesi Virülens, bir patojenin yayılmacılığı, toksijenitesi ve ürettiği diğer faktörlere göre belirlenir. Çoğu patojende, virülensa birkaç faktör katkıda bulunur. Zayıflatma virülensm kaybıdır. Salmonella virülensı geliştiren çok çeşitli özellikler gösterir. •

Toksisite ve yayılmacılık arasındaki farkları belirtin. Virülens özelliği neredeyse tamamen toksisite ya da yayılmacılığa bağlı olan organizmalara örnekler veriniz. • Bir organizmanın nasıl zayıflatıldığmı açıklayın. Aşı üretiminde zayıflatılmış organizmaların rolünü tartışınız.

VİRÜLENS FAKTÖRLER VE TOKSİNLER Mikroorganizmalar tarafından üretilip hücre dışına salgılanan virülens faktörler ve toksinler patojeniteyi ilerletirler. Bu proteinlerin birçok çeşidi farklı patojenler tarafından üretilirler, ancak bunların çoğu ortak moleküler karakteristikler ve etki şekline sahiptir. Burada çeşitli virülens faktörler ve toksinleri temsil eden örnekleri, ortak mekanizmaları göz önünde tutarak inceleyeceğiz.

Virülens Faktörler Patojenler tarafından üretilip hücre dışına salgılanarak hastalık oluşumuna ve hastalığın devam etmesine yardımcı olan proteinler virülens faktörler olarak adlandırılır. Virülens faktörlerin çoğu patojen kolonizasyonunu ve gelişimini artıran enzimlerdir. Örneğin, streptokoklar, stafilokoklar ve belirli klostridler (clostridia) hücreler arası yapıştırıcı olarak görev gören bir polisakkarit olan hiyaluronik asiti parçalayarak organizmanın dokularında yayılmayı ilerleten hiyaluronidaz (Tablo 21.4) enzimi üretir. Hücreler arası ağm hiyoluronidaz ile parçalanması, bu organizmaların başlangıç bölgesinden yayılmasına imkan verir. Streptokoklar ve stafilokoklar aynı zamanda konakçı proteinleri, nükleik asitleri, ve lipidlerini depolimerize eden proteazlar, nükleazlar ve lipazlardan oluşan bir sistem üretirler. Benzer şekilde, gazlı kangren yapan klostridler (clostridia) kollajenaz ya da K-toksin (Tablo 21.4) üreterek doku-destekleyici kollajen ağını parçalar ve vücutta sayılmaları sağlanır.

nizması, enfeksiyonu lokal bir bölgeyle sınırlar. Bazı organizmalar pıhtıyı çözen ve ileri yayılmayı mümkün kılan fibrinolitik enzimler üretir. Streptococcus pyogenes tarafından üretilen bir fibrinolitik madde streptokinaz olarak bilinir (Tablo 21.4). Buna karşın, başka organizmalar fibrin pıhtılarının oluşumunu ilerleten enzimler üreterek lokalizasyonu sağlar. Bu yolla organizmanın yayılması değil korunması gerçekleşir. En iyi çalışılmış fibrin-pıhtılaşma enzimi patojenik Staphylococcus aureus tarafından üretilen koagülazdır (Tablo 21.4). Koagülaz, fibrinin S. aureus hücreleri üzerinde birikmesine neden olur ve kaplanmış bakterileri konakçı hücrelerin saldırısından korur. Koagülaz aktivitesi sonucunda oluşan fibrin ağı, iltihap ve sivilcelerde olduğu gibi çoğu stafilokokkal enfeksiyonların aşırı derecede lokalize olmuş doğası ile açıklanır (<^ö Şekil 26.21). Koagülaz pozitif Staphylococcus aureus, koagülaz-negatif suşlara nazaran daha az virülant olarak bilinir.

•m21.9 Kavramların Gözden Geçirilmesi Patojenler, konakçı dokusunu bozarak ya da değiştirerek girişi elde etmek ve besinleri sağlamak için çeşitli enzimler üretirler. Dahası patojen tarafından üretilen diğer virülens faktörler normal konakçı savunma mekanizmalarını engelleyerek patojenin korunmasını sağlar. Bu faktörler, patojenin kolonizasyonu ve gelişimini arttırırlar. •

Konakçı dokularındaki yapısal bileşenleri parçalayan enzimler patojene ne tür avantaj sağlar? • Staphlococcus aureus'un gelişimini desteklemek için koagülaz aktivitesi nasıl çalışır?

F i Ekzotoksinler Ekzotoksinler organizma geliştikçe hücre dışına salgılanan toksik proteinlerdir. Bu toksinler enfeksiyonun sınırlı odağından ayrılarak uzak bölgelerde hasara neden olabilir. Tablo 21.4 en iyi bilinen bazı ekzotoksinler ile hücre dışına salgılanan diğer virülens faktörlerin özelliklerini ve etkilerini özetlemektedir. Ekzotoksinlerin çoğu üç kategoriden birine dahildir; sitolitik toksinler; A-B toksinleri, ya da süperantijen toksinler. Sitolitik toksinler hücre bileşenlerine enzimatik olarak saldırmak suretiyle çalışır ve lizize neden olur. A-B toksinleri kovalent olarak bağlı iki alt üniteden oluşur (A ve B). B parçası genel olarak hücre yüzey reseptörlerine bağlanıp, A alt ünitesinin hücre hasarı oluşturduğu hedef hücre membranmdan geçişini sağlar. Süperantijenler fazla sayıda bağışıklık yanıt hücresini uyararak çalışır ve geniş çaplı iltihaplanma reaksiyonuna neden olur (öCfc Kısım 22.16).

Fibrin, Pıhtı ve Virülens

Fibrin pıhtıları konakçı tarafından sıklıkla mikrobiyal yayılmanın meydana geldiği yerde oluşturulur. Doku zedelenmesi ile tetiklenen pıhtılaşma meka-

Sitolitik Toksinler

Çeşitli patojenler, konakçının sitoplazmik zarına zarar veren proteinler üreterek hücre lizizine ve

21.10 • Ekzotoksinler • 717

• Şekil 21.18 Hemoliz. (a) Kanlı ağarda gelişen Streptococcus pyogenes kolonilerinin çevresindeki hemoliz zonlan. (b) Lesitin kaynağı olan yumurta sarısı içeren ağar ortamında gelişen Closthdium perfringens kolonilerin etrafında bir fosfolipaz olan lesitinazm aktivitesi. Lesitinaz kırmızı kan hücrelerinin membranlannı çözerek, gösterilen zonlann berraklaşmasına yol açar. (b)

ölümüne neden olurlar. Bu toksinlerin aktivitesi, kırmızı kan hücreleri (eritrositler) kullanılarak ko layca tespit edilmelebilir. Bu nedenle söz konusu toksinler hemolisinler olarak adlandırılır (Tablo 21.4). Bununla birlikte, eritrositlerden başka hüc relere de etki ederler. Hemolisinlerin üretimi la boratuvarda kanlı ağar ortamına yayma ekim yapı larak kanıtlanabilir. Kolonilerin gelişimi sırasında hemolisin salgılanır ve koloni etrafındaki kırmızı kan hücrelerini lize ederek tipik hemoliz zonunu oluşturur (Şekil 21.18a»). Bazı hemolisinler, konakçı sitoplazmik za rındaki fosfolipitlere saldırır. Substrat olarak ge nellikle fosfolipit lesitin (fosfatidilkolin)'in kulla nılmasından dolayı, bu enzimler lesitinaz ya da fosfolipaz olarak adlandırılır. Membran lipidlerini çözerek hücrenin lizizine yol açan bir lesitinaz (Şe kil 21.18b) (Tablo 21.4) olan Clostridium perfringens

a-toksini buna örnektir. Bütün organizmaların si toplazmik zarlarının fosfolipit içermesi nedeniyle, fosfolipazlar bazen hem hayvansal hem de bakteri yal sitoplazmik zarları yıkarlar.

Fakat bazı hemolisinler fosfolipaz değildir. Streptokoklar tarafından üretilen bir hemolisin olan streptolisin O, konakçı hücre membranındaki sterollere etki eder. Lökosidinler (Tablo 21.4) beyaz kan hücrelerini lize edebilen litik ajanlardır ve ko nakçı direncini düşürürler (ena Kısım 22.2). Difteri Toksini Corynebacterium diphtheriae tarafından üretilen dif

teri toksini difterinin patojenliğinde önemli bir vi rülens faktördür (Ö°B> Kısım 26.3). Sıçan ve fareler difteri toksinine oldukça dirençlidir. Ancak insan, tavşan, kobay fare ve kuş hücreleri difteri toksi nine çok hassastır ve her bir hücreyi yalnız tek bir toksin molekülü öldürebilir. Difteri toksini C. diphtheriae tarafından tek bir polipeptid olarak sal gılanan A-B toksinidir. B parçası toksinin konakçı hücre reseptörlerine spesifik bağlanmasını sağlar (Şekil 21.19»). Bağlanmadan sonra A ve B parçaları arasındaki proteolitik kesim, A parçasının konak çı stoplazmasma girişine izin verir. Daha sonra A parçası protein sentezini, tRNA (transfer ribonük A - B

Dış

Anahtar A — B Difteri toksini

EF—2

Amino asit

Ribozom

(a)

Normal protein sentezi

(b)

Protein sentezi durur

• Şekil 21.19 Corynebacterium dîphlhcriae'nın ürettiği difteri toksininin etkisi, (a) Uzama faktörü 2 (EF-2) normalde ribozoma bağlanır ve amino asit bağlı tENA'yı ribozoma taşıyarak protein sentezinin devamını sağlar, (b) Difteri toksini hücre membranına bağlanarak kesilir ve A peptidi içeri alınır. A peptidi uzama faktörü 2 (EF-2*)'nin ADP-ribozilasyonunu katalize eder. Modifiye edilen uzama faktörü, uzayan polipeptid zincirine amino asit transferini gerçekleştiremediğinden protein sentezi durur ve hücre ölümü meydana gelir.

718 • Bölüm 21 • Mikroorganizmaların İnsanlarla Etkileşimleri

leik asit)'dan ilerleyen polipeptid zincirine amino asit transferini engelleyerek, durdurur (coa Kısım 7.15). Bu toksin spesifik olarak ökaryot hücrelerde polipeptit zincirinin gelişmesinden sorumlu bir protein olan uzama faktörü 2'yi NAD+'dan adenozin difosfat (ADP)'a riboz bağlanmasını katalizleyerek inaktive eder. ADP-ribozilasyonunu takiben, düzenlenmiş uzama faktörü 2'nin aktivitesi çarpıcı bir şekilde düşer ve protein sentezi durur. Difteri toksini yalnızca toksin-kodlayan tox genini taşıyan ve fi fajı olarak adlandırılan bakteriyofaj tarafından lizogen hale gelmiş C. diphtheriae suşları tarafından üretilir. Toksin üretmeyen, patojen olmayan C. dvphiheriae suşları /3 fajı ile enfekte olarak patojen hale dönüştürülebilir (fa) ile dönüşüm süreci) (öQa Kısım 10.8).

lu anaerob iki tür Clostridium tetani ve Clostridium

solunum bozukluğu nedeniyle meydana gelir. C. tetani anoksik hale gelen derin vücut yaralarında gelişir. C. tetani enfeksiyonun başlangıç yerinden vücuda yayılmaz. Bunun yerine, toksin nöral hücreler yoluyla yayılır ve tetanozun en temel özelliği olan ve genellikle ölümle sonuçlanan spastik paraliziye neden olur (<£«2» Kısım 27.9). Botulinum toksini bilinen en kuvvetli biyolojik toksin olan yedi tane benzer A-B toksinini içerir. Botulinum toksininin 1 miligramı 1 milyondan fazla kobay fareyi öldürmek için yeterlidir. Bilinen yedi ayrı botulinum toksininden en az ikisi Clostridium botulinum'a spesifik lizogen bakteriyofajlar tarafından kodlanır. Temel toksin, toksik olmayan botulinum proteinlerininheteromerik bir molekül oluşturacak şekilde bir araya geldiği kompleks bir proteindir. Biyoaktif toksin kompleksi sinir ve kaslara ait birleşme yerlerindeki stimulatör motor nöronların sonunda bulunan presinaptik membranlara bağlanarak asetilkolinin açığa çıkmasını engeller. Kaslardaki sinir sinyali iletimi, asetilkolinin kas reseptörü ile etkileşimi sonucu meydana geldiği için botulinumla zehirlenen kaslar uyarıcı sinyali alamaz; kasılma engellenerek flask kas paralizine yol açar ve botulizmin karakteri olan boğulma sonucu ölüme neden olur (Şekil 21.20«).

botulinum tarafından üretilir. Bu türlerden hiç biri yayılmacı değildir ve hemen hemen hepsi toksisite nedeniyle patojenik etki gösterir. C. botulinum bazen vücutta doğrudan gelişerek bebek ya da yara botulizmine neden olur. Bu bakteri aynı zamanda uygun olmayan şekilde saklanan gıdalarda gelişir ve toksin üretir (aas, Kısım 29.6). Botulizm sebebiyle ölüm flask kas paralizinden kaynaklanan

Tetanoz toksini de aynı zamanda bir A-B protein toksinidir. Bu toksin merkezi sinir sistemi ile temas ettiğinde, motor nöronlar yoluyla omuriliğe taşınarak inhibitör internöron uçlarındaki ganglosit lipitlere özgül bir şekilde bağlanır. İnhibitör internöronlar, normalde reseptör motor nöronlara bağlanan ve genellikle glisin olan inhibitör bir nörotransmitter salgılayarak çalışır. Normalde inhibitör

Pseudomonas aeruginosa'ya

ait ekzotoksin A

(Tablo 21.4) da, difteri toksini ile benzer şekilde, uzama faktörü 2'nin ADP-ribozilasyonu sonucu değiştirilmesi yolu ile işlev görür. Tetanoz ve Botulinum Toksinleri

Bu toksinler, normal toprak kökenli organizmalar olan ara sıra hayvanlarda hastalığa yol açan zorun-

Merkezi sinir sistemine ait kas uyarı sinyalleri

ir m >

A A

A

|Aj l£j lAj |Aj [Aj [AJ'|AJ [Aj |Aj [Aj [Aj |Aj [Aj

1 I

Kas

LJ

LJ \

Normal Asetilkolin (A) kas liflerinin kasılmasını teşvik eder (a)

LJ

Botulizm Botulinum toksini, 4 A'nın açığa çıkmasını bloke eder, kasılmayı engeller (b)

• Şekil 21.20 Clostridium botulinum'un ürettiği botulinum toksininin etkisi, (a) Periferal ve kraniyal sinirlerin uyarılmasına bağlı olarak motor son plağının nöral tarafında bulunan keseciklerden asetilkolin (A) salgılanır. Daha sonra asetilkolin kastaki spesifik reseptörlere bağlanarak kasılmaya neden olur. (b) Botulinum toksini motor son plağına etki ederek asetilkolin (A)'nın keseciklerden salgılanmasım engelleyerek kas liflerine uyarının oluşmamasına, kaslann geri dönüşsüz şekilde gevşemesine ve flasid paralize yol açar Kısım 29.6).

21.11 • Enterotoksinler • 719

internöronlara ait glisin, motor nöronlar tarafından asetilkolinin salgılanmasını durdurur ve kas kasılmasını engeleyip kas liflerinin gevşemesine izin verir. Bununla birlikte, eğer tetanoz toksini glisin salgısını bloke ederse, motor nöronlar engellenemez ve sürekli salgılanan asetilkolin tarafından zehirlenen kasın kontrolsüz kasılması, tetanoz ile sonuçlanır (Şekil 21.21 •). Sonuç spastik, seğirme paralizidir ve etkilenen kaslar sürekli olarak kasılırlar. Eğer ağızdaki kaslar dahil olursa uzun süren kasılmalar ağızın hareketini sınırlayarak trismus ya da kazıklıhumma olarak bilinen durumla sonuçlanır. Eğer solunum kasları dahil olursa, uzun süren kasılmalar oksijensiz kalma nedeniyle ölümle sonuçlanır. Tetanoz ve botulinum toksinlerinin her ikisi de kas kontrolünde görev alan nörotransmitterlerin salgısını bloke eder. Ancak semptomlar, görev alan belirli nörotransmittere bağlı olarak, oldukça farklıdır.

21.10

Kavramların Gözden Geçirilmesi

En kuvvetli biyolojik toksinler mikroorganizmalar tarafından üretilen ekzotoksinlerdir. Her bir ekzotoksin özgül konakçı hücrelerine etki ederek, bunların işlevlerinde belirgin bozulmaya yol açar. •

Bütün ekzotoksinler tarfından paylaşılan anahtar özellikler nelerdir? Hangi özellikler A-B toksinlerine özgüdür?

• Toksin üretimi için konakçıda bakteriyal gelişim ve enfeksiyon gerekli midir? Cevabınızı açıklayınız.

21.11

Enterotoksinler

Enterotoksinler, aktivitesi ince bağırsağı etkileyen ekzotoksinlerdir ve genel olarak bağırsak lümenine büyük çapta sıvının salgılanmasına neden olarak kusma ve diyareye neden olur. Enterotoksinler, Satphylococcus aureus, Clostridium perfiringens,

ve Bacülus cereus dahil gıda zehirlenmesine neden olan organizmalar, bağırsak patojenleri Vibrio cholerae, Escherichia coli, ve Salmonella enteritidis gibi

çeşitli bakteriler tarafından üretilir. Kolera Toksini Koleraya etmeni (Ö°Ö Kısım 28.5), Vibrio cholera tarafından üretilen enterotoksin en iyi anlaşılan enterotoksindir. Kolera toksini A-B toksinidir (bkz. Kısım 21.10) ve bir A alt ünitesi ve beş B alt ünitesinden oluşur. B alt ünitesi kolera toksininin gangliozit GM1 (kompleks bir glikolipit) ile epitel hücrelerin stoplazmik membranına spesifik olarak bağlandığı bölgeyi içerir (Şekil 21.22»). Ancak B alt ünitesi kendi basma membran geçirgenliğinde değişikliğe neden olmaz. Bunun yerine, toksik etki hücre membranını geçerek adenozin trifosfat

Inhibitör internöron inhibisyon Merkezi sinir sistemine ait kas uyarı sinyalleri

Kas

Normal Internöronlardan salınan glisin (G) asetilkolinin (A) salınımıdurdurur ve kasın gevşemesini sağlar

Tetanus Tetanoz toksini inhibitör internöronlara bağlanır, glisin'in (G) salimini ve kasın gevşemesini engeller.

(a)

(b)

• Şekil 21.21 Clostridium tetanPnin ürettiği tetanoz toksininin etkisi, (a) Kas gevşemesi normalde inhibitör internöronlardan salgılanan glisin (G) tarafından teşvik edilir. Glisin, asetilkoklin (A)'nın uyanmım ve motor son plağından salgılanmasını durdurmak için, motor nöronlara etki eder. (b) Tetanoz toksini internöronlara bağlanarak keseciklerden glisinin salgılanmasını engelleyerek; motor nöronlar için inhibisyon sinyallerinin oluşmamasına, asetilkolinin kas liflerine devamlı salgılanmasına, kaslann geri dönüşsüz şekilde kasılmasına ve spastik paralize yol açar (Of^s Kısım 27.9 ve Şekil 27.19).

720 • Bölüm 21 • Mikroorganizmaların İnsanlarla Etkileşimleri +

1. Normal iyon akışı, lümenden kana Na akışı olur, net Cl hareketi olmaz Kan

İnce bağırsak epitel hücreleri

+

I

Na *#«

mm mm*

İnce bağırsak Ittmeni

ZK " ~ femm 1*»-Na

+

ÜE wm

2. Kolonizasyon ve toksin üretimi Vibrio cholerae toksini A-B formu - Vibrio cholerae hücresi 3. Epitelyal adenil siklazın kolera toksini aracılığı ile aktivasyonu A alt üniteleri

-Kolera toksini B alt ünitesi

4. Bloke edilmiş Na + hareketi, lümene net Cl" hareketi

5. Lümene aşırı su hareketi

(ATP)'ı çevrimsel adenozin monofosfat (cAMP)'a dönüştüren adenil siklaz enzimini aktive eden A zincirinin görevidir. Bölüm 8.7'de ele alındığı gibi çevrimsel AMP, iyon dengesini de kapsayan pek çok regülatör sistemin aracısıdır. Kolera enterotoksini nedeniyle artan çevrimsel AMP düzeyleri klor ve bikarbonat iyonlarının bağırsak lümeni mukozal hücrelerinden salınmasına neden olur. îyon konsantrasyolarındaki bu değişiklik aşırı miktarda suyun lümene salgılanmasına yol açar (Şekil 21.22). Koleranın akut fazında, ince bağırsaktaki su kaybı oranı, suyun kaim bağırsaklardan mümkün olan geri emiliminden çok fazladır ve böylece büyük çapta kesintisiz su kaybı meydana gelir. Kolera kurbanları genel olarak dehidrasyon sebebiyle ölür. Hastalığın en iyi tedavi yöntemi elektrolit ve diğer çözünürleri içeren solüsyonlarla sıvı değişimidir. Kolera enterotoksini çeşitli hücre ve dokularda adenil siklazı aktive ettiği için, söz konusu toksininin patolojik belirtileri; adenil siklazm toksinle aktivasyonundan çok, ince bağırsak epitel hücrelerinde bulunan özgül bağlanma bölgeleri ile ilgilidir. Gerçekten de adenil siklaz aktivitesinden yoksun saflaştırılmış B alt ünitesi, önceden verilmesi halinde, kolera enterotoksininin aktivitesini önler. B alt üniteleri mukozal hücrelerdeki spesifik kolera reseptörüne bağlanır ve sitotoksik A alt ünitesini de içeren tam toksinin bağlanmasını bloke eder. Kolera enterotoksin genleri ctxA ve ctxB 'nin ifadesi, toxR geni tarafından kodlanan bir pozitif regülatör protein tarafından kontrol edilir. toxR gen ürünü membranlar arası bir protein olup kolera toksininin ve Vibrio cholera'mn ince bağırsaklara başarılı şekilde bağlanması ve kolonizasyonunu sağlayan membran proteinleri ve pilusları gibi diğer önemli virülens faktörlerin üretimini kontrol eder. Diğer Enterotoksinler Enterotoksijenik Escherichia coli ve Saltnonella tara-

• Şekil 21.22 Kolera enterotoksininin etkisi. (1) Bağırsaklarda normal iyon akışı süreci. (2) Vibrio cholera'mn bağırsak mikrovililerine tutunması ve kolonizasyonunu takiben, A-B enterotoksinin konakçı hücredeki GM1 gangliozitlere özgül etkileşimle bağlanması ve üretimi. A-B toksinin B alt ünitesi (yeşil) GMl'e bağlanır ve A alt ünitesinin (kırmızı) membrandan geçişini sağlar. Hücre içine giren A alt ünitesi adenil siklaz aktivitesini teşvik eder. (3) normal sodyum (Na+) akışını bozar. (4) lümen içinde su kaybı ve diyare. Kolera tedavisi, iyon ve su kaybının ikamesi suretiyle yapılır. Antibiyotik tedavisi, üretilen toksin üzerinde etkili değildir. Ancak, V. cholera'mn gelişiminin kısıtlanması yolu ile hastalık süresini kısaltabilir.

fından üretilen enterotoksinler fonksiyonel, yapısal ve evrimsel olarak kolera toksini ile benzerdir. Bu toksinler aynı zamanda bağırsaklarda kolonize olmuş bakteriler tarafından da üretilir. Bununla birlikte, bazı gıda zehirlenmesine neden olan bakteriler (Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens,

Bacillus cereus) tarafından üretilen enterotoksinler oldukça farklı etki şekillerine sahiptir. Örneğin, Clostridium perfringens enterotoksini bir sitotoksindir ve Staphylococcus aureus enterotoksini bir süperantijendir (Tablo 21.4). Süperantijenler tamamen farklı bir etki şekline sahip olup, yüksek sayıda immun lenfositi uyararak bağırsak iltihabının yanı sıra, sistemik yanıtlara da yol açar («**> Kısım 22.16). Bütün gıda zehirlenmesi toksinleri önceden oluşturulan toksinlerin vücuda alınması ile kazanılır ve bakterilerin vücutta gelişmesi gerekmez.

21.12 • Endotohsinler • 721

21.11 Kavramların Gözden Geçirilmesi Enterotoksinler, ekzotoksinler olup, ince bağırsağa etki ederek bağırsak geçirgenliğini değiştirir ve diyareye yol açar. İnce bağırsakta pek çok enterik bakteri kolonize olur ve A-B türü enterotksinleri üretir. Gıda zehirlenmesine neden olan bakteriler genellikle sitotoksinler ya da süperantijenler üretir. •

Bütün enterotoksinler tarafından paylaşılan anahtar özellikler hangileridir? A-B enterotoksinleri tarafından paylaşılan anahtar özellikler hangileridir? • İnce bağırsakta Vibrio cholera toksininin etkisini açılayınız. Bu neden büyük çapta sıvı kaybına yol açar?

Endotoksinler Pek çok gram-negatif Bakteri hücre zarfının dış tabakasının bir parçası halinde, potansiyel olarak toksik lipopolisakkaritler üretirler (0°a Kısım 4.9). Bu polisakkaritler endotoksinler olarak adlanırılır. Bunlar hücreye-bağlıdır ve yalnız hücreler lize olduğunda yüksek seviyede açığa çıkarlar. Buna karşın, bütün endotoksinler yaşayan hücreler tarafından salgılanırlar. Endotoksinler esas olarak Escherichia, Shigella ve özellikle Salmonella'da çalışılmıştır.

Ekzotonlerin ve endotoksinlerin özellikleri Tablo 21.5'de karşılaştırılmıştır. Endotoksinin Yapısı ve Görevi

Lipopolisakkarit (LPS) yapısı Şekil 4.34 ve 4.35'de diyagram ile gösterilmiştir. Lipopolisakkarit; lipid A, merkez bir polisakkarit, ve O-polisakkariti adını

alan ve birbirine kovalent bağlarla ilişkilenen üç alt ünite içerir. Endotoksinler, çeşitli fizyolojik etkilere neden olur. Ateş neredeyse genel bir semptomdur. Çünkü endotoksin konakçı hücrelerden, endojen pirojenler olarak adlandırılan beynin sıcaklık-kontrol merkezini etkileyen proteinlerin salmımmı teşvik eder. Ek olarak, endotoksinler diyareye, lenfosit, lökosit ve trombositlerde hızlı düşüşe, sitokinlerin salmımma ve genel iltihaplanmaya neden olabilir Kısım 22.3). Endotoksinin yüksek dozları ka> Tablo 21.5

namaya bağlı şok (hemorajik şok) ve doku nekrozundan dolayı ölüme yol açabilir. Bununla birlikte endotoksinlerin toksisitesi, ekzotoksinlerinkinden çok daha düşüktür. Mesela, farelerde endotoksinler için LD50 değeri hayvan başına 200^00 /itg iken botulinum toksini için LD50 değeri yaklaşık 25 pikogramdır (pg). Yani botulinumun LD50 değeri yaklaşık 10 milyon kat daha azdır. Çalışmalar göstermiştir ki, LPS'nin A kısmı toksisiteden sorumlu iken (e°o Şekil 4.35) polisakkarit kısmı bu kompleksi suda çözünür ve immunojenik hale getirir (c*t> Kısım 22.5). Hayvan denemeleri, hem lipid hem de polisakkarit kısımların in vivo toksik etki için gerekli olduğunu göstermiştir. Endotoksin İçin Limulus Amebosit Lizat Analizi

Endotoksinler pirojen oldukları için antibiyotikler ve damar içi solüsyonlar gibi farmasötikler endotoksinlerden arındırılmış olmalıdır. Yüksek hassasiyetteki bir endotoksin analizi atnalı yengeci Limulus polyphemus'a ait amebosit lizatları kullanılarak geliştirilmiştir. Endotoksin spesifik olarak amebositlerin lizizine neden olur (Şekil 21.23»). Standart Limulus amebosit lizat (LAL) analizinde, Limulus amebosit ekstraktları test edilecek solüsyonla karıştırılır. Eğer endotoksin varsa, amebosit ekstraktı jel oluşturur ve çökerek bulanıklılıkta değişikliğe neden olur. Bu reaksiyonun spektrofotometrede, 10 pg/ml polisakkarit gibi düşük düzeye kadar, nicel olarak ölçülebilir. Limulus analizi serumda, serebral sıvıda, içme suyunda, enjeksiyon ve ilaç formülasyonlarmda kullanılan sıvılarda endotoksin belirlemek için kullanılır. Limulus testi o kadar hassastır ki donanımın, solüsyonların ve ayraçların laboratuvarda ve klinik çevrede bulunan gram negatif Bakterüerce, örneğin destile sudaki kontaminantlar gibi, kontaminasyonunu engellemek için çok fazla özen gösterilmelidir. Serumda ve serebral sıvıda endotoksinlerin Limulus analizi ile tespiti gram-negatif enfeksiyonlarının muhtemel kanıtıdır.

Ekzotoksin ve endotoksinlerin özellikleri

Özellik

Ekzotoksinler

Kimyasal özellikler

Bazı gram-negatif ya da gram-pozitif Bacteria tarafından salgılanan proteinler; genellikle ısıya-duyarlı

Etki şekli; semptomlar

Spesifik; genellikle spesifik hücre reseptörleri ya da yapılarına bağlanır; hücre ya da dokularda belirli spesifik etkiye sahip hem sitotoksin, hem enterotoksin, hem de nörotoksin Sıklıkla yüksek düzeyde toksik, bazen de ölümcül Yüksek derecede immunojenik; nötralize eden antibadilerin (antitoksin) üretimim teşvik eder Toksinin formaldehit ile muamelesi toksisiteyi ortadan kaldırır, ancak muamele görmüş toksin (toksoid) immunojenik olarak kalır Konakçıda ateş yapmaz

Toksisite Immünojenite cevabı Toksoid potansiyeli

Ateş potansiyeli

Endotoksinler

1

Lipopolisakkarit-lipoprotein kompleksleri (Şekil (<%^> Şekil 4.34 ve 4.35); hücre lizizi sırasında gram-negatif Bacteria hücre dış membramnın bir parçası olarak salınır; son derece ısıya-dayamklıdır Genel; ateş, diyare, mide bulantısı i Hafif düzeyde toksik, nadiren ölümcül Kısmen zayıf immunojen; immün cevap toksini nötralize etmek için yeterli değil Yok

Pirojenik, sıklıkla konakçıda ateş yapar

722 • Bölüm 21 • Mikroorganizmaların İnsanlarla Etkileşimleri

21.13

Enfeksiyon Yönünden Konakçı Risk Faktörleri

Konakçının enfeksiyon ve hastalığa karşı duyarlılığına birtakım faktörler katkıda bulunur. Burada bu faktörlerden bazılarını tartışacağız ve bunları enfeksiyon hastalık süreci ile bağdaştıracağız. Yaş, Stres ve Diyet

Yaş enfeksiyon hastalıklarda duyarlılığı belirleyen önemli bir faktördür. Enfeksiyonlara çok gençlerde ve çok yaşlılarda sıkça rastlanır. Örneğin; bebeklerde bağırsak mikroflorasmm gelişimi çok hızlı bir şekilde olur, ancak bir bebeğin normal florası bir yetişkininki ile aynı değildir. Yetişkin florası gelişmeden önce ve özellikle doğumu takip eden günlerde, yerleşmek ve hastalık oluşturmak için patojenler büyük bir imkana sahiptir. Bu nedenle, • Şekil 21,23 Limulus amebositleri. (a) Atnalı yengeci Limulus polyphemus'un normal amebositleri. (b) Bakteriyal lipopolisakkaritlere maruz kalmış amebositler. Lipopolisakkarit uygulaması hücrelerin degranülasyonuna neden olur ve bu tepki lipopolisakkarit içeriği için analiz olarak kullanılabilir.

21.12 Kavramların Gözden Geçirilmesi Endotoksinler gram-negatif Bakterilerin dış membranlarmdan türeyen lipopolisakkaritlerdir. Endotoksinler genellikle ekzotoksinlerden daha az toksiktir. Limulus amebosit lizat analizi ile ortaya çıkan endotoksin varlığı, o maddenin gram-negatif Bakteriler tarafından kontamine olduğunu gösterir. •

Gram-pozitif bakteriler neden endotoksin üretmezler? • İlaç preparatlarınm neden endotoksinler için test edilmesi gereklidir?

ENFEKSİYONDA KONAKÇI FAKTÖRLERİ Konakçı faktörleri mikroorganizmanın patojenliğini ya sınırlar ya da buna katkıda bulunurlar. Burada öncelikle enfeksiyona katkıda bulunan bazı önemli risk faktörlerini sunacağız. Yaş, genetik yapı, ya da doku spesifitesi gibi risk faktörleri konakçı tarafından kontrol edilemez. Bununla birlikte, beslenme alışkanlığı ve stres gibi faktörler potansiyel olarak kontrol edilir. Bu bölümü, enfeksiyonları ve kolonizasyonu sınırlamak için çalışan ve insan anatomisinde yer alan fiziksel ve kimyasal bariyerleri tartışarak bitireceğiz. Takip eden bölümde, patojen teması halinde geliştirilen bağışıklık yanıtından (konakçı yanıtı) söz edeceğiz.

Escherichia coli (Ö°O Kısım 29.8) ya da Pseudomonas

aeruginosa gibi patojenik bakterilerin sebep olduğu diyare sık sık 1 yaş altı bebeklerde rastlanır. Bebek botulizmi, Clostridium botulinum (oosKısım 29.6) kaynaklı bağırsak enfeksiyonu sonucu olur. Patojen kolonize olup geliştikçe, botulinum toksini salgılayarak flasid kas paralizine neden olur (bkz. Bölüm 21.10). Toprak, hava ve ham bal kaynaklı C. botulinum'un vücuda alınmasından sonra oluşan bu hastalık neredeyse yalnızca 1 yaş altı bebeklerde görülür. Çünkü muhtemelen daha büyük bebeklerde ve yetişkinlerde normal bağırsak florasının yerleşmesi C. botulinum'un kolonizasyonunu önler. 65 yaş üstü bireylerde enfeksiyon hastalıklar daha genç yetişkinlere kıyasla çok yaygındır. Örneğin, yaşlılar özellikle grip gibi solunum yolu enfeksiyonlarına çok daha duyarlıdır (cf%s Kısım 26.8). Bu durum, muhtemelen solunum yolu patojenlerine karşı etkili bir bağışıklık yanıtı oluşturma kabiliyetindeki düşme nedeniyle meydana gelir. Yaşla gelen anatomik değişiklikler, aynı zamanda enfeksiyonları teşvik eder. 50 yaş üstü erkeklerde yaygın bir durum olan prostat bezinin büyümesi, çoğunlukla idrar akış hızını düşürür ve patojenlerin erkek idrar sisteminde (bkz. Şekil 21.11) daha kolay kolonize olmasına izin vererek idrar sistemi enfeksiyonlarında artışa yol açar. Stres normalde sağlıklı olan bireyleri hastalıklara yatkmlaştırabilir. Sıçan ve farelerle yapılan çalışmalarda yorgunluk, efor, kötü beslenme, susuzluk, ya da ani hava değişikliği enfeksiyon hastalıkların sıklığını ve şiddetini arttırmıştır. Örneğin, uzun süreli yoğun fiziksel aktiviteye maruz bırakılan sıçanlar, iyi dinlenmiş kontrol hayvanlara kıyasla deneysel Salmonella enfeksiyonlarında daha yüksek ölüm oranı göstermiştir. Stres durumunda hormonlar bağışıklık sistemini etkiler ve stresle ortaya çıkan hastalıkta rol oynayabilir. Örneğin, kortizon hormonu stres anlarında normal dönemlerden daha yüksek seviyede üretilen etkili bir iltihaplanma-karşıtı ajandır. Bununla birlikte

21.14 • Enfeksiyonlara Karşı Kalıtsal Direnç • 723

iltihaplanmanın baskılanması bağışıklık yanıtının aktif hale geçmesini engelleyerek, hastalıklara karşı normal savunmayı ortadan kaldırır (Kısım 22.2). Diyet konakçının enfeksiyona duyarlılığında rol oynar. Açlık ve enfeksiyon hastalıklar arasındaki ilişki yüzyıllardır bilinmektedir. Protein ve kalorisi düşük beslenme düzeni normal florayı değiştirerek Oportünist patojenlerin çoğalması için daha iyi bir fırsat sağlar ve konakçının bilinen patojenlere duyarlılığını artırır. Örneğin, bir bireyde kolera oluşturmak için gereken Vibrio cholerae sayısı, eğer birey yetersiz beslenmişse belirgin bir biçimde düşer. Hastalığa neden olmak için gereken organizma sayısı V. cholerae gıdalarla vücuda alındığında da azalır. Zira muhtemelen gıdalar, normalde patojenleri yok eden mide asitlerini nötralize eder (cs^Kısım 28.5). Belirli bir besin maddesinin eksikliği, bazı durumlarda patojeni kritik besin maddesinden mahrum bırakarak, hastalıktan koruma işlevi görür. Buna en iyi örnek, sakkarozun dental cürümlerin gelişimindeki etkisidir. Bölüm 21.3'de açıklandığı gibi, iyi bir oral hijyen ile birlikte sakkarozun diyetle kısıtlanması, hemen hemen diş çürümesini gidermektedir. Diyette sakkaroz olmadan, yüksek düzeyde çürük yapan bakteriler olan Streptococcus mutans ve S. sobrinus bakteriyal hücrelerin dişlere tutunmasını sağlayan polisakkarit yapışkan tabakayı sentezleyemez. Bağışıklığı Baskılanmış Konakçı Bağışıklığı baskılanmış konakçı terimi, bir ya da daha fazla direnç mekanizması inaktif hale gelmiş ve bu yüzden enfeksiyon olasılığı artmış konakçıları kapsamaktadır. Hastanede yatan, ancak enfeksiyon hastalığı olmayan pek çok hastada (örneğin, kanser ve kalp hastalığı) mikrobiyal enfeksiyon ortaya çıkar. Çünkü bunlar bağışıklılğı baskılanmış konakçılardır (c«s Kısım 25.7). Bu gibi hastane-kaynaklı enfeksiyonlar nazokomiyal enfeksiyonlar olarak adlandırılır. Nozokomiyal hastalıklar Birleşik Devletler'de her yıl 2 milyon civarında bireyi etkilemekte ve bunların 100,000'e yakını ölümle sonuçlanmaktadır. Kateterizasyon, hipodermik enjeksiyon, belkemiği zedelenmesi, biyopsi ve ameliyat gibi hastane uygulamaları, istem dışı mikroorganizma bulaşmasına yol açar. Aynı zamanda ameliyat stresi hastanın direncini düşürebilir. Ağrıyı ve şişkinliği azaltmak için verilen iltihap-engelleyici ilaçlar da hastanın direncini azaltır («öç» Kısım 22.2 ve 22.3). Organ nakli yapılan hastalar bağışıklık sistemini baskılayan ilaçlarla tedavi edilirler. Bu ilaçlar nakledilen organın reddedilmesini baskılar, ancak aynı zamanda hastanın enfeksiyona karşı direnç kabiliyetini de düşürür. Bağışıklığı baskılanmış konakçılar hastane dışında bile bulunur. Sigara içme, aşırı alkol tüketimi, damar içi uyuşturucu kullanımı, uykusuzluk, yetersiz beslenme, ve diğer bir ajanla akut ya da kronik enfeksiyon, konakçı direncini baskılanyan

koşullardır. Örneğin, HIV (insan bağışıklık yetersizliği virüsü) enfeksiyonu, enfekte olmamış bireyler için patojen olmayan pek çok mikroorganizmanın neden olduğu enfeksiyonlara karşı hastayı yatkın hale getirir. HIV, bağışıklık yanıtında yer alan CD4 T lenf ositleri (0°^ Kısım 22.7) olan tek tip bağışıklık hücresini yok ederek kazanılmış bağışıklık yetersizliği sendromu (AIDS)'na neden olur. HIV enfeksiyonu sonucu oluşan vücut hasarından ötürü, AIDS'li hastalar enfeksiyona etkili bir tepki koyamazlar. Ölüm genellikle, kompromised olmayan kişilerde normalde hastalığa neden olmayan bir fırsatçı patojen'in neden olduğu bir enfeksiyon sonucunda gerçeleşir (ö=fe Kısım 25.6 ve 26.14). Son olarak, belirli genetik koşullar konakçıyı yetersiz kılar. Örneğin, bağışıklık sisteminin önemli parçalarının ortadan kalkmasına neden olan genetik hastalıklar, bireyleri enfeksiyonlara karşı yatkmlaştırır. Bu koşullara sahip bireyler, genetik hastalıktan dolayı değil mikrobiyal enfeksiyon nedeniyle, çoğunlukla erken yaşta ölür. 21.13 Kavramların Gözden Geçirilmesi Yaş, stres, diyet, genel sağlık, yaşam şekli, önceden geçirilmiş ya da eşzamanlı hastalıklar ve genetik donanım, konakçının enfeksiyonlara karşı direncini baskılayabilir. •

Enfeksiyonlara duyarlılığı kontrol eden ve konakçı tarafından kontrol edilemeyen önemli faktörleri listeleyiniz. • Enfeksiyonlara duyarlılığı kontrol eden ve konakçı tarafından kontrol edilebilen önemli faktörleri listeleyiniz.

21.14

Enfeksiyonlara Karşı Kalıtsal Direnç

Pek çok hayvan patojenlere karşı kalıtsal bir ilk savunma hattına sahiptir. Doku spesifikliğini de içeren bu fiziksel ve kimyasal engeller patojenlerin yayılmasını spesifik olmaksızın engelleyerek hastalıktan korur (Şekil 21.24» ve Tablo 21.6). Doğal Konakçı Dirençliliği Belirli şartlar altında, yakın ilişkili türler ve hatta aynı türün üyeleri belirli bir patojene karşı farklı duyarlılıklar gösterebilir. Belirli bir patojenin tek bir hayvan türünde hastalık oluşturma yeteneği son derece değişkendir. Örneğin Kuduz hastalığında, bir kez hastalığın semptomları görülmeye başladıktan sonra, bütün memeli türlerinde genellikle ölüm meydana gelir. Yine de, bazı hayvan türleri kuduz hastalığına karşı diğerlerinden daha duyarlıdır. Örneğin rakunlar ve kokarcalar, bu hastalığa nadiren yakalanan keseli sıçanlarla karşılaştırıldıklarında, kuduz enfeksiyonlarına karşı aşırı derecede duyarlıdır. Şarbon çeşitli hayvanları enfekte eder ve insanlarda görülen hafif kabartılardan, sığırlarda görülen ölümcül kan zehirlenmesine kadar değişen şekilde hastalık semptomlarına

724 • Bölüm 21 • Mikroorganizmaların İnsanlarla Etkileşimleri

Gözyaşı ve diğer salgılarda bulunan ve hücre duvarını çözen lizozim

NazoTarınKsteKi sıılerin çevresinde hızlı hava geçişi vasıtası ile mikroorganizmaları içeren partiküllerin ortamdan ayrılması

Patojenlerle yarışan normal flora

Mukus ve soluk borusundaki siller, mikroorganizmaları askıya alır ve vücuttan dışarı atar

Antimikrobiyel yağ asitleri üreten ve normal florası patojen kolonizasyonunu engelleyen deri, fiziksel bir bariyerdir

Kan proteinleri mikrobiyal gelişimi engeller Akciğerlerdeki mukus ve fagositler kolonizasyonu engeller

Hızlı pH değişimi mikrobiyal gelişimi engeler

Mide asitliği (pH 2) mikrobiyal gelişimi engeller

Üriner sistemde svı hareketi, mikrobiyal gelişimi engeller

Normal flora patojenlerle yarışır

• Şekil 21.24 Fiziksel, kimyasal ve anatomik enfeksiyon bariyerleri. Bu bariyerler mikrobiyal enfeksiyonlara karşı kalıtsal dirençliliği sağlarlar.

neden olur. Bununla birlikte, akciğeri etkileyen ya da hava yolu ile bulaşan, örneğin biyoterörizmde kullanılan silah haline getirilmiş suşlarm neden olduğu şarbon, genellikle insanlar için öldürücüdür (<XKS Kısım 25.13). Buna karşın, kuşlar şarbona karşı tamamen dirençlidir. Diğer yandan, sıcak kanlı ve soğuk kanlı hayvanlara özgü hastalıklar nadiren bu hayvan grupları arasında bulaşıya neden olur. Son bir örnek olarak, konakçılar ve patojenler spesifik ve sadece birbirlerini etkileyecek şekilde bazen yavaş yavaş evrimleşir. Örneğin HIV enfeksiyonları, yalnız büyük maymunları ve insanları da içeren yüksek primatlarda meydana gelir. Bunun nedeni, insan T hücrelerindeki CXCR4 proteini ve insan makrofajlarmdaki CCR5 proteininin sadece primatlarda ifade edilmesidir. Zira bu proteinler HIV için bilinen yegane hücre yüzey proteinleri olup, HlV'in gpl20 proteini ile etkileşerek bağlanmayı gerçekleştirirler. Diğer hayvanlarda bu HIV reseptörleri bulunmaz ve bu nedenle HIV enfeksiyonlarından bu nedenle korunurlar (ö=fc Kısım 26.14). Tablo 21.6

Fiziksel ve Kimyasal Savunmalar

Doku yüzeylerinin yapısal bütünlüğü mikroorganizmaların nüfuz etmelerine karşı bir bariyer oluşturur. Potansiyel patojenler deride ve mukozal dokularda, yalnız doku yüzeyine tutunmak zorunda değildir. Aynı zamanda, vücudun başka yerlerine geçmeden önce bu bölgelerde gelişmek zorundadırlar. Bozulmamış yüzeyler genellikle kolonizasyonu önler. Ancak hasar görmüş yüzeyler (örneğin, derin yara) kolaylıkla kolonize edilir ve bu yolla yayılmaya katkıda bulunur. Kolonizasyon ve yayılmaya karşı dirençlilik konakçı savunma maddelerinin üretimi ve çeşitli anatomik mekanizmalardan ileri gelir. Temel anatomik savunmalar Şekil 21.24'de gösterilmiştir. Deri mikroorganizmaların nüfuz etmelerine karşı etkili bir engeldir. Deride bulunan yağ bezleri (Şekil 21.2) yağ asitleri ve laktik asit salgılayarak deri pH'sını yaklaşık pH 5'e düşürür ve pek çok patojenik bakterinin kolonizasyonunu engeller (kan ve iç organların pH'sı yaklaşık 7.4'dür). Burun ve ağız yolu ile içeri alınan mikroorganizmalar, nazofarenks ve soluk borusunda bulunan silli epitel hücreler tarafından dışarı atılır. Siller bakteriyal hücreleri oral salgılar tarafından yakalanana kadar yukarı doğru iter ve ya balgamla atılır ya da yutularak midede öldürülürler. Mideye giren potansiyel patojenler asiditeden (yaklaşık pH 2) sağ kurtulmalı ve sonra ince bağırsakta (yaklaşık pH 5) ve son olarak kalın bağırsakta (pH 6-7) bulunan yoğun yerleşik mikroflora ile başarılı bir şekilde rekabet etmelidir. Kalın bağırsak, normal bir yetişkinde her gram bağırsak içeriği başına 1010 ya da daha fazla bakteri sayısını içerir (bkz. Bölüm 21.4) ve bu durum, yeni mikroorganizmaların yerleşmesini oldukça zorlaştırır. Böbrek lümeni ve göz yüzeyi mikrobiyal popülasyonları belirgin şekilde azaltan bir enzim olan lizozim içeren salgılarla sürekli olarak kaplı durumdadır (<3°Ö Kısım 4.8). Aynı zamanda kan plazması gibi hücre dışı sıvılar bakterisidal maddeler içerir. Örneğin, fl-lisinler olarak adlandırılan kan proteinleri bakteriyal stoplazmaya bağlanan ve bozan bir işlev görerek sitoplazmik bileşenlerin dışarı akmasına ve hücre ölümüne yol açar.

1

Enfeksiyon hastalıklarında doku özgüllüğü

Hastalık

Enfekte doku

Organizma

Kazanılmış bağışıklık yetersizliği sendromu (AİDS) Botulizm Kolera Dental çürüme

T yardımcı lenfositler Motor son plak İnce bağırsak epiteli Oral epitelyum

Diphtheria Gonorrhea Malana Pyelonephritis Spontaneous abortion (cattle) Tetanus

Boğaz epiteli Ürogenital epiteli Kan (eritrositler) Böbrek medulası Plasenta İnhibitör internöron

İnsan bağışıklık yetersizliği virüsü (HIV) Clostridium botulinum Vibrio cholerae Streptococcus mutam, S. sobrinus, S. sanguis, S. mitis Corynebaderium diphtheriae Neisseria gonorrhoeae Plasmodium sp. Proteus sp. Brucella abortus Clostridium tetani

• Değerlendirme Soruları • 725

Doku Özgüllüğü

Çoğu patojen öncelikle temas bölgesine yapışmak ve kolonize olmalıdır. Patojenler, temas bölgesine yapışsa bile, besinsel ve metabolik ihtiyaçları karşılanmadıkça kolonize olamaz. Bundan dolayı, Clostridium tetani yutulursa tetanoz oluşmaz. Çünkü patojen mide asitliği ile öldürülür. Öte yandan, eğer C. tetani hücreleri ya da endosporları derin bir yara ile temas ederse, organizma gelişebilir ve lokal ölü dokunun yarattığı oksijensiz bölgelerde tetanoz toksinini üretir (bkz. Bölüm 21.10 ve 27.9). Buna karşılık, Salmonella ve Shigeüa gibi enterik bakteriler yara enfeksiyonlarına yol açmazlar. Ancak bağırsak sisteminde etkin bir şekilde kolonize olurlar. Tablo 21.6'da doku özgüllüğüne ait örnekeler bulunmaktadır.

Burada pasif konakçı direçlilik mekanizmalarını tanımladık. Bir sonraki bölümde, bağışıklık kavramlarını sunacak ve konakçı tarafından patojeni tanıma ve hedef almada kullanılan patojen-spesifik olan ve olmayan yöntemleri ele alacağız. 21.14 Kavramların Gözden Geçirilmesi Spesifik olmayan fiziksel, anatomik ve kimyasal engeller, konakçıyı patojenler tarafından kolonize edilmekten korur. Bu savunmaların olmaması, enfeksiyona duyarlılık ve patojen tarafından kolonize olma ile sonuçlanır. •

Patojenlere karşı fiziksel ve kimyasal engelleri tanımlayınız. Bu bariyerler nasıl yetersiz hale gelir? • Diğer yönlerden sağlıklı olan bir konakçının bağışıklık sistemi, önceden var olan bir enfeksiyonla nasıl yetersiz hale getirilir?

DEĞERLENDİRME SORULARI 1. Parazit ve patojen arasındaki farkları anlatınız. Enfeksiyon ve hastalık arasındaki farkları anlatınız (ooo Kısım 21.1). 2. İnsan vücudundaki hangi organlar normal olarak mikroorganzimalar tarafından kolonize olmuştur? Bu organlarda ortak olan nedir? Hangi organlar genel olarak mikroorganizmalardan yoksundur? Bu organlarda ortak olan nedir (ÖBÇS Kısım 21.1)? 3. Vücudun bir bölgesindeki yerleşik ve geçici mikroorganzimlar arasındaki farkları anlatın. Deneysel olarak yerleşik ve geçici mikroorganizmalar arasındaki farkları nasıl tanımlayabilirsiniz ( c * ^ Kısım 21.3)? 4. Streptococcus cinsi üyeleri neden dental çürüklerin oluşumunda aracı olur? Neden çürüğün oluşumunda diğer organizmalardan daha yeteneklidirler (COû Kısım 21.4)? 5. Sindirim sisteminin her bir farklı bölümünde gelişen mikroorganizmaların tipini pH nasıl etkiler? Sindirim sisteminin her bir tanımlanabilir bölgesinde gelişen mikroorganizma tiplerini oksijen konsantrasyonu nasıl etkiler (£»ö Kısım 21.5)? 6. Vajinal sistemde Lactococcus acidophilus ve glikojen arasındaki ilişkiyi açıklayınız. Neden yetişkin kadınlar, kız çocuklardan farklı olarak, normal vajinal floraya sahiptir (£«5 Kısım 21.6)? 7. Glikokaliks, kapsül, ve yapışkan tabaka arasındaki farkları belirtiniz. Bu özgün yapılar mikrobiyal tutunmaya nasıl katkıda bulunurlar (OOo Kısım 21.7)? 8. Sadece toksin-üretme yeteneğiyle patojenik olan bir mikroorganizma örneği veriniz. Toksini ve etki şeklini

9.

10.

11.

12.

13.

14.

tanımlayınız. Sadece yayılma karakteristiği ile patojenik olan bir mikroorganizma örneği veriniz. Bu mikroorganizmanın yayılma niteliklerine katkıda bulunan faktörler nelerdir (ö°ö Kısım 21.8)? A-B toksinleri, sitotoksinler ve süper antijenler arasındaki farkları belirtiniz. Her bir toksin sınıfına birer örnek veriniz. Bu toksin sınıfları hastalığı nasıl etkiler (C*Xs Kısım 21.9)? Tetanoz ve botulinum toksinlerinin etki mekanizmalarını tanımlayınız. Etki mekanizmlarına göre bu toksinler neden çok tehlikelidir ( f l * Kısım 21.10)? Kolera enterotoksininin etki şeklini açıklayınız (Şekil 21.22). Bu hastalık için uygun tedavi nedir ve antibiyotik tedavisi genellikle neden etkili değildir? Stafilokokal enterotoksinin etki şeklini açıklayınız. Bu hastalık için uygun tedavi nedir ve antibiyotik tedavisi genellikle neden etkili değildir (£«s Kısım 21.11)7 Tipik endotoksin yapısını açıklayınız. Endotoksin ateşin yükselmesine nasıl neden olur? Hangi mikroorganizmalar endotoksin üretir (osaa Kısım 21.12)? Baskılanmış konakçıya yol açan genel faktörleri tanımlayınız. Hangi faktörlerin konakçı tarafından kontrol edilebildiğini ve hangi faktörlerin kontrol edilemediğini belirtiniz (
726 • Bölüm 21 • Mikroorganizmaların İnsanlarla Etkileşimleri

UYGULAMA SORULARI 1.

2.

Mukoz membranlar nikroorganizmaların gelişmesi ve kolonizasyonuna karşı etkin bariyerlerdir. Ancak, örneğin boğaz gibi bölgelerde yer alan mukoz membranlar, bazı durumlarda hastalığa yol açan mikroorganizmaların kolonizasyonuna izin verir. Patojen olmayan bir mikroorganizma belirli koşullar altında nasıl patojen hale dönüşür? Açıklayınız. Bu durumda patojeniteyi güçlendiren koşulların en az bir dizisini belirtin. Antibiyotik terapisi, mide-bağırsak sisteminde bulunan mikroorganizmaların sayısında önemli ölçüde düşmeye yol açar. Konakçıda bulunan normal floranın bu sayısal azalması hangi fizyolojik septomlann ortaya çıkmasına yol açar? Genellikle uzun süreli antimikrobiyal terapiyi; birçoğu AIDS'li (BakmızonoKısım 26.14) hastalarda oportünistik enfeksiyonlara yol açan, oportünüstik patojenlerin meydana getirdiği enfeksiyonlar takip eder. Bu sürece hangi patojenler katılır? Antibiyotik terapisi altındaki bireyler bu patojenlere neden duyarlıdır?

3.

4.

5.

Streptococcus penumoniae ve Clostridium tetani'nin virülensı ve patojenitesinde artışa yol açan potansiyel seçici baskıları, ayrı ayrı tanımlayınız. Bu organizmaların virülensmdaki artışlar, organizma için seçici avantaj oluşturur mu? Soruyu yanıtlarken, her iki organizma için de doğal habitatları dikkate alınız. Koagülaz, gelişme bölgesinde Staphylococcus aureus'un kümeleşmesine yol açan bir virülens faktördür. Streptokinaz ise, gelişme bölgesindeki Streptococcus pyogens kümelerini çözen bir virülens faktördür. Bu zıt stratejilerin patojenitenin gücünü artırma yönünde aynı etkinliği göstermesini nasıl açıklarsınız? Endotoksin üretme yeteneğini kaybetmiş mutantların izolasyonu, ekzotoksin üretme yeteneğini kaybetmiş mutantların izolasyonundan çok daha zordur. Bu tip toksinlerin yapısı ve fonksiyonu hakkındaki bilgilerinize dayanarak geri mutasyon farklılıklarını (mutasyonun geri dönüşümü) açıklayınız.

İMMÜNOLOJİNİN

TEMELLERİ

IMMUN SİSTEME GENEL BAKIŞ 22.1 22.2 22.3 22.4 II 22.5 22.6 22.7 22.8

III

Şekilde, immünitenin fagositlerin doğal yanıtı ile başladığını Neisseria gonoırhoeae hücrelerini içine alan insan dokusunda görmekteyiz. Doğal veya adaptif immün mekanizmalar yangısal reaksiyonları başlatmakta ve bu da patojenin yayılmasını kısıtlamaktadır.

İmmün Sisteminin Hücre ve Organları Doğal İmmün Yanıt Yangı, Ateş ve Septik Şok Adaptif İmmün Yanıt ANTİJENLER, T HÜCRELERİ VE HÜCRESEL İMMÜNİTE İmmünojenler ve Antijenler Antijenin T Lenfositlere Sunulması T-Sitotoksik Hücreler ve Doğal Katil Hücreler T-Yardımcı Hücreler: İmmün Yanıtın Aktive Edilmesi ANTİKORLAR VE İMMÜNİTE

22.9 Antikorlar (İmmünoglobulinler) 22.10 Antikor Üretimi 22.11 Kompleman, Antikorlar ve Patojenin Yıkımı IV

729 729 732 735 736

738 738 739 742 743 743

744 747 749

İMMÜNİTE VE ENFEKSİYÖZ HASTALIĞIN ÖNLENMESİ 751^

22.12 Doğal İmmünite 22.13 Yapay İmmünite 22.14 Yeni İmmünizasyon Stratejileri

751 752 754

V İ M M Ü N YANIT H A S T A L I K L A R I

755

22.15 Allerji, Aşırı Duyarlılık ve Otoimmünite 22.16 Süper Antijenler

755 758

727

728 • Bölüm 22 • İmmünolojinin Temelleri

BOLÜMLE İLGİLİ SOZLUK Adaptif immünite veya antijene-özgü immünite, bir patojeni tanımak ve yok etmek için kazanılmış bir yetenektir ve patojenin kendisine ya da ürünlerine daha önceden maruz kalmaya dayanır. Antijen immün sisteme özgü elemanlar ile etkileşebilen bir molekül. Antijen-Sunucu hücre (APC) bir makrofaj, dentritik hücre veya B hücresi olup, işlenmiş peptit antijenleri bir T hücresine sunar. Antijenik determinant (epitop) antijenin, özgül antikoru veya T-Hücre reseptörü ile tepkimeye giren bölümü. Antikor çözünür bir proteindir. B hücrelerince üretilir, antijen ile etkileşir; immünoglobulin olarak da adlandırılır. Antikor-aracılığıyla immünite (humoral immünite) immünite antikorlar ile doğrudan etkileşme sonucu oluşur. Aşı koruyucu immüniteyi uyarmak için kullanılan inaktif veya zayıflatılmış patojenler, ya da zararsız patojen ürünü. Aşılama (immünizasyon) koruyucu immüniteyi uyarmak için, bir konukçunun inaktif veya zayıflatılmış patojenler ya da patojen ürünleri ile inokulasyonu. Aşırı duyarlılık konukçu dokularda hasara neden olan bir immün yanıt. B hücresi immünologlobulin yüzey reseptörlerine sahip bir lenfosittir, immünoglobulin üretir ve T hücrelerine antijenleri sunabilir. Başlıca Doku-Uygunluk Kompleksi (MHC) antijen sunmada önemli olan çeşitli hücre yüzey proteinlerinin kodlanmasından sorumlu olan genetik bir kompleks. Bellek (immünolojik bellek) önceden karşılaştığı bir antijene maruz kaldıktan sonra spesifik immün hücreleri veya antikorları büyük miktarda hızla üretme yeteneği. Bellekli B hücreleri her bir antijene yanıt verebilen uzun-ömürlü hücreler. Birincil antikor yanıtı antijene ilk maruz kaldığında yapılan antikorlar; çoğunlukla IgM sınıfı. Dentritik hücre lenf düğümleri ve dalakta bulunan, fagositoz yapma ve antijen-sunma özelliğinde olan bir tip lökosit. Doğal immünite veya spesifikimmünite, her bir patojen veya ürünlerini tanımak ve yok etmek için indüklenebilir-olmayan bir yetenek. Doğal katil (NK) hücre özelleşmiş bir lenfosit olup, yabancı hücreleri veya en-

Ç

fekte olmuş konukçu hücreleri spesifikolmayan bir şekilde tanır ve yok eder. Domain proteinin belirli bir yapı ve işleve sahip bir bölgesi. Fagosit Patojenleri ve patojen ürünlerini tanıyan, sindiren ve yok eden hücre grubundan birisi. Hapten düşük molekül-ağırlığmda olup, antikorlar ile birleşen fakat kendisi bir immün yanıt oluşturma yeteneğinde olmayan bir molekül. Hücre-aracılığıyla immünite (CMI) antijene özgü T hücreleriyle doğrudan etkileşim sonucu oluşan immünite. İkincil antikor yanıtı antijene sonradan maruz kalındığında yapılan antikor; çoğunlukla IgG sınıfı. İmmünoglobulin (Ig) B hücreleri ve plazma hücrelerince üretilen çözünür bir protein olup, antijenler ile reaksiyona girer; antikor olarak da isimlendirilir. İmmünite bir organizmanın enfeksiyona karşı koyma yeteneği. tmmünizasyon (aşılama) koruyucu immüniteyi uyanmak için, bir konukçunun inaktif veya zayıflatılmış patojenler ile inokulasyonu. İmmünojen immün yanıt oluşturma yeteneğindeki bir molekül. İnterlökin (ÎL) lökositlerce salgılanan çözünür bir sitokin veya kemokin. Kompleman antikor aktivitesini arttırmak veya güçlendirmek amacıyla, antijen-antikor kompleksleri ile ardışık bir şekilde reaksiyona giren bir seri protein. Kök hücre sonunda çok sayıda farklı hücre tipine dönüşebiln bir hücre. Lenf kana benzer bir sıvı olup, kırmızı kan hücrelerinden yoksundur ve lenf düğümlerini içeren ayrı bir dolaşım sistemi (lenfatik sistem) içinde dolaşırlar. Lenfosit immün yanıtla bağlantılı, kanda bulunan çekirdekli hücrelerin bir alt grubu. Lökosit kanda bulunan nükleuslu bir hücre (beyaz kan hücreleri). Makrofaj dokularda bulunan büyük lökositlerin bir tipi olup, fagositoz yapma ve antijen-sunma özelliklerine sahiptir. Nötrofil (polimorfonükleer lökosit) (PMN) fagositik özellikler, granüler bir sitoplazma (granülosit) ve çok parçalı bir nükleus özelliği gösteren bir tip lökosit. Otoantikor kendi antijenleri ile reaksiyona giren antikor.

ok hücreli tüm organizmalar, patojenlerin saldırısı ve enfeksiyonuna karşı korunmak için, çeşitli hücrelerinin ve bunların ürünlerinin etkileşimlerine gereksinim duymaktadır. Bu süreç immünite olarak bilinmektedir. 21. Bölüm'de, patojen saldırısı ve hastalığa karşı pasif fiziksel ve kimyasal koruma tartışılmıştır. Burada, patojenlere karşı aktif direnç incelenecektir, tik önce doğal immünite veya

Patern tanıma molekülü (PRM) zara bağlı bir protein olup, mikrobiyal hücre yüzey yapısının özgül bir üyesi olarak, patojene özgü bir moleküler paterni tanır. Patojenle-Bağlantılı moleküler patern (PAMP) bir patern tanıma molekülünce tanınan bir mikrop veya virüsün özgün-yapısal bölümleri. Plazma uzaklaştırılmış ve pıhtılaştırıcı proteinleri etkisiz hale getirilmiş kanın sıvı kısmı. Plazma hücresi büyük miktarda antikor üreten farklılaşmış bir B hücresi. Seroloji antijen-antikor reaksiyonlarının in vitro çalışılması. Serum kanın, pıhtılaştırıcı proteinleri ve hücreleri uzaklaştırıldıktan sonraki sıvı kısmı. Sınıf I MHC Proteini çekirdekli tüm omurgalı hücrelerinde bulunan antijen sunucu molekül. Sınıf II MHC Proteini özellikle makrofajlar, B hücreleri ve dentritik hücrelerde bulunan antijen-sunucu molekül. Sitokin lökositlerce üretilen, çözünür bir immün yanıt düzenleyicisi. Spesifite her bir antijenle etkileşmede immün yanıtın yeteneği. Süper antijen T hücrelerini normalden çok daha fazla uyararak, uygun olmayan şekilde güçlü immün yanıt oluşturan bir patojen ürünü. T hücresi antijene özgü hücresel etkileşimlerden sorumlu bir lenfosit; T hücreleri işlevlerine göre Tc sitotoksik T hücrelerine ve TH yardımcı T hücreleri alt gruplarına ayrılır. TH hücreleri ayrıca antikor oluşumunda B hücrelerine yardım eden TH1 yangısal hücreler ve TH2 yardımcı hücreler şeklinde alt gruplara ayrılırlar. T-hücre reseptörü (TCR) T hücreleri yüzeyindeki antijene-özgü reseptör protein. Toksoid immünojenliği korunan, buna karşın toksisitesini kaybetmiş bir toksinin zayıflatılmış formu. Tolerans spesifik antijenlere bir immün yanıt oluşturmadaki yetersizlik. Toll-Benzeri reseptör (TLR) patojenle ilgili moleküler bir paterni (PAMP) tanıyan, fagositlerin üzerinde bulunan patern tanıma moleküllerinin bir sınıfı. Yangı oluşumu genellikle enfeksiyonun bulunduğu bölgede, kızarma, ödem, ağrı, ateş oluşumları ile kendini gösteren, toksinler ve patojenler gibi zararlı uyanlara karşı gösterilen spesifikolmayan bir reaksiyon.

spesifik-olmayan immüniteden söz edilecek olup, vücudun patojen veya ürünlerini tanıma ve yok etme yeteneği ortaya konulacaktır. Doğal immünite, bir patojene veya'ürünlerine dalıa önce maruz kalmakla bağlantılı olmayıp, daha çok çoğu patojeni tanıyan, yutan, öldüren ve sindiren hücreler olan fagositlerin bir işlevidir. Ne yazık ki, doğal immünite her zaman etkili değildir ve zaman zaman tehlikeli en-

22,1 • İmmün Sisteminin Hücre ve Organları • 729

feksiyonlar hala ortaya çıkar. Buna karşın, fagositler bu hastalıklar ile bağlantılı olan, adaptif immünite veya spesifik immünite denilen, başka bir savunma mekanizmasını da aktive edebilir. Adaptif immünite, bir patojeni veya ürünlerini tanımak ve yok etmek amacıyla edinilmiş bir yetenektir ve immün sisteminin patojene maruz kalmasına gerek duymaktadır. Fagositler, spesifik immüniteden sorumlu özelleşmiş hücreler olan lenfositleri aktive etmek için, patojenlerin kısmen parçalanmış moleküllerini kullanır. Her bir lenfosit, patojen üzerinde antijen denilen tek bir molekülü tanımak için genetiksel olarak programlanmıştır. Antijen, lenfositler üzerindeki özel reseptörleriyle etkileşen herhangi bir moleküldür (bakınız Bölüm 22.4). Lenfositler antijen ile etkileştiğinde, gelişir ve hızla bölünüp kendi kopyalarını oluşturur. Antijenle-etkileşmiş lenfositlerin kopyaları veya klonlan ya özgün antijenini doğrudan yok eder veya antijenleri hedef seçen antikorlar denilen antijene-özgü çözünür proteinleri üretir. Tek bir antijeni tanımadaki bu yeteneğe immün özgünlük adı verilmektedir. Antijenle-etkileşmiş lenfositlerin bazısı yıllarca yaşar. Eğer bir süre sonra ayni patojenle karşı karşıya kalırsak, özgün lenfosit sayısı hızla artar, hızlı ve etkin bir immün yanıt oluşur. Antijene sonradan maruz kalındığında özgün bir şekilde ve daha kuvvetli reaksiyon gösterme yeteneği, immün bellek olarak adlandırılır. İmmün sistem, patojenlerin antijenleri ile çok kuvvetli bir şekilde reaksiyona girer, fakat ayni şekilde kendi hücrelerimizin yıkımını engelleyen bir korunma mekanizmasına da sahiptir. İmmün sistemin tehlikeli kendinden-olmayan patojen antijenlerini yok etmek, buna karşın zararsız kendi antijenlerine kayıtsız kalma yeteneği immün tolerans olarak adlandırılır. Ne yazık ki, tolerans bazen başarısız olur ve immün sistem konukçu dokulara zarar vererek ve otoimmün hastalık oluşturarak, uygun olmayan bir şekilde yanıt vermektedir. Bu bölümde ilk olarak, çoğu patojen ile bağlantılı olarak spesifik-olmayan fagositlerce doğal immünitenin nasıl tetiklendiğine bakılacaktır. Daha sonra da aynı fagositlerin antijen sunarak ve lenfositleri aktive ederek, adaptif immün yanıtı nasıl indüklediğine bakılacaktır. Aktive edilen immün lenfositler özgül antijeni tanır (spesifite), antijene yeniden-maruz kaldığında etkin biçimde yanıt verir (bellek) ve konukçu hücrelere zarar vermez (tolerans). Doğal ve adaptif immünite, hayvanları tehlikeli, kendine ait olmayan patojenlerden korunmak için geliştirilmiştir ve patojenden korunma sisteminin kritik unsurlarıdır.

*jgj 1 mm 1

İMMÜN SİSTEME GENEL BAKıŞ

İmmün yanıt, özellikle patojenlerden türevlenen antijen molekülleri olmak üzere, herhangi bir yabancı molekülü tanımak için geliştirilmiştir.

Antijene-özgü yanıt, yıkım için reaktif molekülleri hedef alır. Burada patojenler ve diğer yabancı maddere karşı doğal ve adaptif konukçu yanıtının bazı önemli özellikleri anlatılacaktır. Doğal yanıtlar tüm yabancı molekülleri ve patojenleri tanır, buna karşın adaptif yanıtlar patojenler üzerindeki farklı moleküllere yönelir. İlk önce immün sisteminin hücreleri ve organları ile başlanacak ve daha sonra da doğal immünitede yer alan hücreler ve mekanizmalar göz önüne alınacaktır. Bölümün geri kalan kısmında odaklanıldığı gibi, spesifik veya adaptif immüniteye genel bir bakış ile bitirilecektir.

İmmün Sisteminin Hücre ve Organları Doğal ve adaptif immünite, doğrudan veya dolaylı olarak her büyük organ sistemiyle etkileşen vücut sıvıları olan, kan ve lenf içinde dolaşan hücrelerin faaliyeti sonucu oluşur. İmmünitede yer alan tüm hücreler, kemik iliğinde bulunan, kök hücreler adı verilen ortak öncüllerden gelişir. Kan ve Lenfin Bileşenleri

Kan, hücresel ve hücresel-olmayan bileşenlerden oluşur ve immün yanıtla ilgili bazı hücreleri ve molekülleri içerir. Kan, hastalardan kolayca ve güvenle alınabildiği için, immün yanıt testleri için değerli bir kaynaktır. İnsan kanında en fazla sayıda bulunan hücreler, akciğerlerden dokulara oksijen taşıma işini yapan, nükleuslu olmayan hücreler olan eritrositler (kırmızı kan hücreleri) dir (Tablo 22.1). Buna karşın, kandaki hücrelerin yaklaşık % 0,1'i nükleuslu beyaz kan hücreleri veya lökositlerdir. Lökositler, monositler gibi fagositik hücrelerin bir grubunu, bunun yanısıra lenfositler de denilen ve antikor üretimi ve hücre-aracılığıyla immüniteyle ilişkili hücreleri içerir. Lenf, kana benzer bir sıvıdır, fakat kırmızı kan hücreleri yoktur. Şekil 22.1 • 'de gösterildiği gibi, kemik iliğindeki bilinen kök hücreleri, kan hücrelerinin ve lökositlerin atalarıdır. Kök hücreleri, sitokinler denilen bir grup çözünür hücre proteinlerinin etkisi altında olgun hücreleri üretmek için farklılaşmaktadır (ÖOÖ Kısım 23.11). Tüm kan, proteinleri ve çeşitli diğer çözünmüş maddeleri içeren bir sıvı olan plazmadan ve süspande hücrelerden oluşmaktadır. Vücut dışında, Tablo 22.1 Normal insan kanında bulunan başlıca hücreler Hücre tipi

Mililitredeki hücre sayısı

Eritrositler Lökositler" Lenfositler Miyeloid hücreler

4.2-6.2 X 10" 4.5-11 X 106 1.0-4.8 X 10' 7.0 X 10 6 'ya kadar

• Lökositler, nükleuslu tüm kan hücrelerini içerir ve lenfositler ile miyeloit hücreler (monositîer ve granülositler) olarak ayrılır Kaynak: Henry, J.B 1996 Clinical Diagnostic and Management by Laboratory Method, 19th adition .W. B. Saunder, Philadelphia

730 • Bölüm 22 • İmmünolojinin Temelleri

Kemik iliği kök hücresi

M iye lo id öncül

Lenfoid öncül

Timusta olgunlaşma/

k Ke, Kemik iliğinde % \ olgunlaşma olg

/

Mast hücresi

Dendritik hücreler

Monositler

Polimorfonükleer lokositler (PMN)

Makrofajlar

T hücreleri

Plazma hücreleri

B hücreleri

Bellekli hücreler

• Şekil 22.1 Immün yanıtta iş gören temel hücrelerin orijini. İmmünitede yer alan hücreler iki ana öncülden gelişir. Miyeloid öncül fagositleri üretip, bu hücreler doğal immünitede ve antijen sunmada görev alır. Lenfoid öncül T ve B lenfositlerini üretir ve bu hücreler doğrudan antijene-özgü immün yanıta katılır.

tüm kan veya plazma, çözünür bir plazma proteini olan fibrinojenin çözünmez bir protein olan fibrine dönüşmesi nedeniyle, hızla çözünmez bir pıhtı oluşturur. Plazma veya tüm kan sıvı halde sadece bir antikoagülant eklendiğinde kalır. Potasyum okzalat, potasyum sitrat veya heparin gibi antikoagülant kimyasalların ilavesi, pıhtılaşma işlemini durdurarak, fibrinojenin fibrine dönüşümünü engeller. Pıhtılaşma olduğu takdirde, çözünmez proteinler kan hücrelerini büyük, çözünmez bir kütlede tutarlar. Pıhtılaşmadan sonra, geri kalan sıvıya serum adı verilir ve serum hiçbir şekilde hücreleri ve pıhtılaştırıcı proteinleri içermez. Bununla birlikte, serum çözünür antikor proteinlerini içerecek şekilde diğer proteinleri yüksek bir konsantrasyonda içerir ve immünolojik araştırmalarda geniş çapta kullanılır (oc^Bölüm 24.7). Serum antikorlarının in vitro olarak antijen aramak için kullanılması seroloji olarak adlandırılır. Kan ve Lenf Dolaşımı

Kan kalp tarafından atardamarlar ve kılcal damarlar yoluyla tüm vücuda pompalanır ve toplam damarlar yoluyla da geri döner (Şekil 22.2a, b»). Şekil

22.2b ve c de lökositlerin kandan içinden lenf dolaşan, ayrı bir sistem olan lenfatik sisteme giriş çıkışı gösterilmektedir. Lenf sıvısı, damar dışı dokulardan lenf kılcal damarlarına ve sonrada tüm lenf sistemi boyunca bulunan (Şekil 22.2ıi) lenf nodüllerine doğru akar. Lenf nodülleri yüksek konsantrasyonlarda lökositleri ve fagositleri içerip, lenf kanalları yoluyla nodüllere giren mikroorganizma ve antijenleri karşılayabilecek bir şekilde düzenlenmişlerdir. Kan dolaşım sistemi içinde ayni işi dalak görmektedir. Lenf nodülleri ve dalak adaptif immün yanıtın en çok görüldüğü yerlerdir. Lenf, antikorları ve immün hücreleri taşıyarak, torasik lenf kanalı yoluyla sonunda dolaşım sistemine geri döner. Lokositler Lokositler, kan ve lenfte bulunan nükleuslu beyaz kan hücreleridir, lökositlerin birçok farklı tipi bulunmaktadır (Tablo 22.1 ve Şekil 22.1) ve tümü doğal ve adaptif immün yanıta katılmaktadır. Lemfositler spesifik immün yanıta katılmak üzere lokositler şeklinde özelleşirler. Olgun lenfositler, antijenler ile etkileşim gösterdikleri lenf nodülleri

22.1 • İmmiin Sisteminin Hücre ve Organları • 731 Akciğerle ilgili dolaşım Akciğerler Lenf düğümleri Timus

Toplardamarlar! atardamarlar Kan ^kılcalları

Mukozalarla bağlantılı lenfoid doku (MALT)

Torasik kanal

Vücut boyunca sistemik dolaşım

Dalak Lenf düğümleri

Lifler ve lif yığınları

Hücreler kan kılcalları içine ve dışına geçer

Lenf kılcalı

Kan kılcalı

Hücreler lenf kılcalı içine ve dışına geçer Sıvı lenf kılcalına girer (c) İçeri getiren kanal, hücreler, antijenler

Medulla plazma hücreleri

Parakorteks T hücreleri Korteks APC ve B hücreleri Dışarı götüren kanal, hücreler, antikorlar

(a)

• Şekil 22.2 Kan ve Lenf Sistemleri, (a) Lenf sistemi. Başlıca organların yerleri gösterilmektedir, (b) Lenf ve kan sistemleri arasındaki bağlantılar. Kan toplar damarlardan kalbe akıp, sonrada oksijenli hale geldiği akciğere gider, buradan da atardamarlar yoluyla dokulara gider. Lenf, torasik kanaldan kan dolaşımı sisteminin sol subklavyen toplar damara akar. (c) Kan ve lenf sistemleri arasındaki bağlantı, mikroskobik olarak görülmektedir. Hem kan ve hem de lenf kılcalları kapalı kanallardır, fakat hücreler ve sıvılar bir damardan diğerine ekstravazasyon denilen bir işlemle geçebilir, (d) Bir lenf nodülü. Şekil başlıca anatomik bölgeleri göstermekte ve bu alanlarda bulunan immün hücreleri belirtmektedir.

ve dalakta yoğun halde bulunurlar. Lenfositler ayrıca B hücreleri ve T hücreleri şeklinde ayrılmaktadır (Şekil 22.1). B hücreleri kemik iliğinden orijinlenip burada olgunlaşır ve antikor üreten plazma hücrelerinin öncülleridir. T hücreleri de kemik iliği orijinlidir, fakat olgunlaşmak için timusa giderler. Miyeloid hücreler miyeloid bir öncülden türevlenir (Şekil 22.1) ve işlevsel farklılıklarına göre iki büyük kategoriye ayrılır. Monositler, dokularda, dalakta ve lenf nodüllerinde (Şekil 22.1) bulunan, makrofajlar ve dentritik hücreler adı verilen özelleşmiş hücrelerin öncülleridir (Şekil 22.1). Bunlara antijen-

sunucu hücreler veya APC'ler denir, çünkü bunların yutma, işlemden geçirme ve lenfositlere antijen sunmada özelleşmiş yetenekleri vardır (bakınız Kısım 22.5). Granülositler, sitoplazmik inklüzyonlar veya granüller içeren hücreler olup, boyama teknikleri kullanılarak görülmektedir. Nötrofiller veya PMN'ler olarak da adlandırılan Polimorfonükleer lökositler fagositik granülositlerdir (bakınız Kısım 22.2). Bazofiller toksik kimyasallar içeren granüllü granülositlerdir. Degmnülasyon denilen, bu granüllerin salmımı, allerji-benzeri semptomlara neden olabilir (bakınız Kısım 22.15).

732 • Bölüm 22 • immünolojinin Temelleri

Lökositler vücut boyunca dolaşabilir ve kandan dokular arası boşluklara, lenfe geçip, tekrar kan dolaşım sistemine geri dönmesi ekstravazasyon (damardan akıtma) denilen bir süreçtir (Şekil 22.2c). 22.1 Kavramların Gözden Geçirilmesi

kalar ve patojeni içine alır. Patojeni çevreleyen zar kuşatılıp, bir fagozom oluşur ve hücrenin iç kısmına doğru hareket eder. Burada bir fagolizozom oluşturarak, bir lizozom ile eritilir. Fagolizozomun içindeki toksik maddeler ve enzimler, genellikle yutulan mikrobiyal hücreyi öldürür ve parçalar (Şekil 22.3»).

îmmünitede yer alan tüm hücreler, kemik iliğindeki ortak kök hücrelerden türevlenmektedir. Kan ve lenf sistemleri, işlevsel bir immum sistem için önemli olan hücre ve proteinlerin dolaşımım sağlar. Çeşitli tipte lökositler immün yanıt olaylarına katılmaktadır. •

Bir lökositin kandan lenfe ve tekrar kana dolaşımını tanımlayınız. • Ortak kök hücresinden B hücreleri, T hücreleri ve makrofajların gelişimini çizerek gösteriniz.

Doğal İmmün Yanıt Bazen, patojenler konukçunun 21. bölümde anlatılan fiziksel ve kimyasal savunma mekanizmalarını kırar (o«a»Kısım 21.14). Bu noktada, immün sistem harekete geçirilmelidir; doğal veya spesifik-olmayan immün yanıt savunmanın ilk hattını oluşturur. Doğal immünite için başlama noktası bir patojen veya bir patojen ürünü gibi yabancı bir maddenin bir fagosit ile temasıdır. Bir fagosit, yabancı maddeleri yutma ve parçalama yeteneğine sahip çeşitli lökositlerden biridir. Böyle bir etkileşimin bilinen sonucu yangısal reaksiyon adı verilen konukçuaracılığıyla oluşan kompleks bir işlemdir. Burada, patojenleri tanımada ve yangısal yanıtı başlatmada yer alan hücre ve moleküllerden söz edilecektir. Ayni şekilde, patojenlerin fagositleri yenmede kullandıkları mekanizmalar da incelenecektir. Bundan sonraki kısımda, yangısal yanıt ayrıntı olarak incelenecektir. Fagositler

Yangısal yanıtın başlangıcında yer alan hücre tipi genellikle bir fagosittir (gerçekten, yiyici bir hücre). Bir fagositin birincil işlevi patojenleri içine almak ve yok etmektir. Bu işlemde, bazı fagositler antijen-sunucu hücreler (APC'ler) olarak da iş görür ve adaptif immün yanıtı aktive eden peptit antijenleri ortaya çıkarır. Fagositler makrofajları, monositleri, nötrofilleri ve dendritik hücreleri içermektedir. Bu hücreler, tüm vücut boyunca dokular ve sıvılarda bulunur. Fagositler, ameboid tarzda hareket eden, genellikle hareketli hücrelerdir. Fagositlerin çoğu lizozomlar adı verilen granüler inklüzyonlara sahip olup, bu inklüzyonlar hidrojen peroksid, lizozim, proteazlar, fosfatazlar, nükleazlar, ve lipazlar gibi bakterisidal maddeler içerir. Fagositler patojeni bir kan damarı çeperi veya bir fibrin pıhtısı üzerinde ya-

• Şekil 22.3 Fagositoz. Bacillus megaterium' un bir zincirinin bir insan makrofajı tarafından yutulması ve parçalanmasının hızlandırmış foto mikrograflan olup, faz kontrast mikroskopta gözlenmiştir. Bakteri zinciri yaklaşık 18-20 jtım uzunluktadır. Makrofaj, patojen ve patojen ürünlerini yutan ve parçalayan hücre gruplanndan birisidir.

22 2 • Doğal İmimin Yanıt • 733

Fagositlerin bir grubu olan nötrofiller veya polimorfonükleer lökositler (PMN'ler), çok sayıda lizozom içeren aktif olarak hareketli granülositlerdir (Şekil 22.4a*). Miyeloid kök hücreden türevlenen nötrofiller, daha çok kan akımı ve kemik iliğinde bulunup, buradan dokulardaki aktif enfeksiyon bölgesine giderler. Kanda çok sayıda nötrofil olması veya bir yerde yangısal tepkime ortaya çıkması, genellikle aktif bir enfeksiyon olduğunun gösterir. Monositler, başlıca fagositik hücre tipleri olan makrofajların ve dentritik hücrelerin dolaşan öncüleridir (Şekil 22.4a ve 22.3). Makrofajlar, lenf nodülleri ve dalak gibi dokularda bulunan büyük hücrelerdir ve çoğu patojeni yutma ve parçalama yeteneğinde oldukları gibi ayni zamanda adaptif immün yanıtları başlatmak için lenfositler ile de etkileşirler. APC'ler, adaptif bir immün yanıtı aktive etmenin ilk adımı olarak, peptid antijenleri T hücrelerine sunar. Dentritik hücreler (dendrositler) de immün yanıtta yer alan fagositlerdir. Makrofajlar gibi ayni monosit atadan türevlenen dendritik

•e£© O

i

• Şekil 22.4 Temel immün hücre tipleri (a) Fagositik hücreler. Altta merkezin solundaki nükleuslu hücre, parçalı nükleusa ve granüler sitoplazmayla karakterize edilen, bir nötrofil (PMN)'dir. Sağa doğru ve PMN'nin hafif yukarısında olan nükleuslu hücre, bir monosittir. Fagositler 12-15 /xm çapındadır.Nüldeussuz kırmızı kan hücreleri yaklaşık 6/I çapındadır, (b) Nükleuslu hücre dolaşımdaki bir lenfosittir. Lenfositin görülür bir sitoplazması hemen hemen yoktur ve yaklaşık 10 fj.m çapında olduğu için fagositlerden daha küçüktür.

hücreler, aynı şekilde lenf nodülleri ve dalakta da bulunup, buralarda etkin APC'lerdir. Makrofaj ve dentritik hücrelerin özelleşmiş antijen-sunma özellikleri, onları adaptif immünitenin başlatılmasında oldukça önemli hale getirmektedir. Bunların rolü daha ayrıntılı olarak Kısım 22.5'de incelenecektir. Fagositler ve Patojen Tanıma

Fagositler, süresi gelince uygun bir yangısal yanıt, tetikleyecek genel bir patojen-tanıma sistemine sahiptir. Bu sistem evrimsel olarak korunmuş birçok patern-tanıma molekülleri (PRM'ler) kullanır. PRM'ler membrana bağlı fagosit proteinleri olup, mikrobiyal bir hücre veya virüs üzerindeki tek bir yapısal bileşen olan, patojenle-bağıntılı moleküler pattern'i (PAMP) tanımaktadır (Şekil 22.5»). PRM'ler ilk olarak meyve sineği olan Drosophüa'da gözlenmiş olup, burada Toll reseptörleri adını almıştır. Bir insan fagositi üzerindeki her Toll-benzeri reseptör (TLR), spesifik bir PAMP'i tanır. Örneğin, TLR-4 gram-negatif bakterilerin hücre çeperinde bulunan lipopolisakkarid (LPS)'i (<3OöKısım 4.9 ve Kısım 23.1) tanıyıp, tüm gram negatif patojenlere karış immüniteyi belirli ölçüde indüklemekdedir. Diğer TLR'ler mayaların hücre-yüzey bileşenleri (zimosan), bakterilerdeki peptidoglukan, metillenmemiş CpG oligonükleotitleri ve bakteriyal peptidoglukan gibi PAMP'ları tanır (««sKısım 23.1). Bir PAMP'in fagosit PRM ile etkileşimi, sinyal iletim olaylarını (era&Kısım 8.12) başlatarak, sonuçta fagositin aktivasyonuna yol açan, membrandan geçen bir sinyali tetikler. Patojen tarafından indüklenen bu sinyaller, fagositin fagositik ve yıkıcı özelliklerini arttırmakta ve burada patojen ölümüne yol açabilen toksik oksijen ürünlerinin oluşumu üzerinde yoğunlaşılacaktır. Oksijene-Bağlı Fagosit Aktivasyonu

Bir patojenin yutulması, fagositlerin fagositik ve yıkıcı özelliklerini arttırarak, fagositleri aktive eder. Kısım 6.15 de tartışıldığı gibi, hidrojen peroksid (H2O2), süperoksid anyonları (O2), hidroksil radikallare (OH.), singlet oksijen QO2), hipoklorik asit (HOCİ) ve nitrik oksiti (NO) kapsayan toksik oksijen-içeren bileşiklerin oluşumu çeşitli reaksiyonlar ile olmaktadır. Fagolizozomdaki asidik koşullar, toksik oksijen bileşiklerinin üretimi ve reaksiyon kabiliyetine katkı sağlamaktadır. Fagositik hücreler oksijenin toksik formlarını, yutulan bakteriyal hücreleri öldürmek amacıyla kullanır. Oksijene bağlı fagositlerin bu enzimlerinin birlikte aktivite göstermesi, anahtar hücresel yapı taşlarını oksitleyerek yutulan hücreleri öldürmek için yeterli düzeyde toksik oksijen bileşiği oluşturur. Fagositik hücrenin kendi içinde oluşan bu reaksiyonlardan kendisi, toksik oksijen ürünlerinden zarar görmez. Oksijen aracılığıyla öldürmede fagositik hücrelerin

734 • Bölüm 22 • immünolojinin Temelleri PAMP'lı patojenler ve antijenler

Kompleman, opsonizasyonu

Antijen bağlama

( D Antijene-özgü antikor-aracılı immünite

Sitokin üretimi

• Şekil 22.5 İmmün yanıtın genel görünüşü. Patoenler üç mekanizma ile yok edilir. (1) Doğal immünite, patojenlerin hücre-yüzey bileşenleri olarak bulunan, patojenle bağıntılı moleküler pattern (PAMP'ler) ile pattern tanıma molekülleri (PRM'ler) arasındaki etkileşimlerden oluşur. Adaptif immünite, antijene-özgü T hücreleri tarafından yönetilip, iki ayn etkili yola ayrılır. (2) Antikor aracılı immünite, antijence-uyanlan B lenfositlerin ürünleri olan, çözünür antijene-özgü antikor proteinlerinden ileri gelmektedir, (3) Hücrearacıh immünite, antijene-özgü etkin T hücreleri aracılığıyladır.

aktivitesi Şekil 22.6» 'da özetlenmiştir. Aktive edilen fagositler, bu toksik oksijen bileşikleri üretmek için, kısa zaman dilimi içinde normalden daha fazla O2 almak zorundadır. Aktive edilen fagositlerce artan orandaki bu O2 alınımı, solunum patlaması olarak bilinir. Engelliyici Fagositler

Bazı patojenler, fagositi öldürmek veya fagositozdan korunmak amacıyla, toksik fagosit ürünlerini nötralize edici mekanizmalar geliştirmişlerdir. Örneğin, Staphylococcus aureus (««sKısım 26.9), singlet oksijeni nötralize eden ve ölümü engelleyen, karotenoidler denilen pigmentli bileşikleri üretir (c«5Kısım 6.15). Mycobacterium tuberculosis gibi hücre-içi

patojenler (tükerkulozisin etmeni) fagositik hücrelerin içinde gelişir ve kalırlar. Bunlar toksik oksijen

bileşiklerini ortadan kaldırmak için- hücre çeperi glikolipidlerini kullanır. Bu glikolipidler, fagositik hücrelerce üretilen en letal toksik oksijen türleri olan hidroksil radikallerini ve süperoksit anyonlarını ortadan kaldırır. Bazı hücre-içi patojenler, lökosidinler denilen fagosit öldürücü proteinleri üretir. Bu gibi durumlarda, patojen bilinen şekilde yutulur, fakat fagositi öldürür ve daha sonra salınır. Streptococcus pyogenes ve Staphylococcus aureus başlıca lökosidin üre-

ticileridir. Ölü fagositler daha fazla irinli materyal oluşturur; bu yüzden lökosidin üreten organizmalar genellikle piyojenik (irin-oluşturan) dir. Piyojenik bakterilerce oluşturulan lokalize enfeksiyonlar çoğu kez çıban veya abselerle sonuçlanır (<«sKısım 26.9). Fagositoza karşı önemli diğer bir mikrobiyal savunma bakteriyal kapsül (Ö°G Kısım 4.10) dür.

22 3 • Yangı, Ateş ve Septik Şok • 735 Fagositin sitoplazmik membranı

PAMP'ler ve PRM'lerin hücredeki yerini ve moleküler spesifitesini tanımlayınız. Toksik oksijen ürünlerini tanımlayınız ve aktive edilen fagositlerde oluşan solunum patlamasını açıklayınız. Patojenlerin fagositozu engellemede kullandığı mekanizmalardan en azından birini tanımlayınız.

Yangı, Ateş ve Septik Şok Yangı, toksinler ve patojenler gibi zararlı uyarılara karşı spesifik-olmayan bir reaksiyondur. Yangı, genellikle enfeksiyonun olduğu bölgede kızarıklık (eritem), şişme (ödem), ağrı ve sıcaklık (ateş)

Fagolizozom

Fagosite edilen bakteriler

• Şekil 22.6 Fagositik enzimlerin toksik oksijen tiplerini oluşturma şekli. Bunlar, hidrojen peroksit (H2O2), hidroksil radikali (OH.), hipokloröz asit (HOCİ), süperoksit anyonu (O2~), Singlet oksijen ('O2) ve nitrik oksit (NO) dir. Bu toksik bileşiklerin oluşumu, moleküler oksijenin (O2) alınımı ve kullanımında önemli bir artışa gereksinir. Aktive edilen fagositlerce oksijenin alınımı ve harcanmasmdaki bu artış, solunumsal yanma olarak bilinir. Toksik oksijen türlerinin ayrıntılı tartışılması için Kısım 6.15'e bakınız.

oluşturur. Yangının moleküler aracıları sitokinler ve kemokinler denilen bir grup proteinini içerir (öOöŞekil 23.11), bunlar da çeşitli hücrelerce fakat özellikle de fagositlerce üretilirler (Kısım 22.1). Yangı genellikle ya doğal veya adaptif bir immün yanıtın sonucudur; immünitenin her iki dalı ayni yangısal aracıları indükleyip aynı etkileyici hücre ve molekülleri toplar ve aktive eder. Etkin bir yangısal yanıt, belirli bir bölgedeki hücrelere zarar verdikleri gibi istilacı patojenleri de yok ederek, doku hasarını sınırlar ve kısıtlar. Bununla birlikte, bazen de yangı oldukça önemli sistemik konukçu hücre haşarıyla sonuçlanabilir. Yangı Oluşturan Hücreler ve Lokal Yangı

Bir enfeksiyon veya doku hasarının olduğu yere ulaşan ilk yangı oluşturan hücre nötrofü (Şekil 22.7a «)'dir. Bu fagositik hücreler, aktif enfeksiyon Kapsüllü bakteriler çoğu kez fagositoza oldukça veya doku hasarı olan bölgeye, kemokinler (Kıdayanıklıdır, bunun açık nedeni kapsülün fagosisım 23.11) denilen çözünür kimyasal-çekici madtin bakteri yüzeyine tutunmasını engellemesidir. deler ile çekilirler (ao&Kısım 23.11). Örneğin, IL-8 Bir kapsülün fagositozu önlemede önemini ortaya (interleukin-8), kemokin türünde küçük bir protein koyan en net durumu, Streptococcus pneumoniae'de olup, hasarlı konukçu hücrelerce üretilir. Nötrofilgörebiliriz. S. pneumoniae'nin kapsüllü 10 kadar ler IL-8 salgılayan hücrelere doğru giderler ve IL-8 hücresi, enjekte edildiğinde, bir fareyi birkaç günde etkileşimiyle aktive edilirler. Aktive olan nötrofilöldürebilir. Buna karşın, kapsülsüz mutant bireyler önemli fagositlerdir ve bunlar MIP-a ve MIP-/3 ler tümüyle avirulandır (öo^Şekil 21.16). Kapsülün (makrofaj yangısal proteinler) gibi kemokinleri salgılayarak makrofajları da olay yerine çekerler. Bu dışında diğer yüzey yapı taşlarıda fagositozu engelleyebilir. Örneğin, patojenik Streptococcus pyoge- kemokinler makrofajlar için kimyasal olarak çekici olup, zaten enfeksiyon veya hasar olan bölgede nes spesifik bir madde olan M-proteini üretir, bu olan nötrofillerin kemokin gradientine dek çıkarlar. madde de bakteriyal hücre yüzeyini değiştirir ve Makrofajlar aktive edildikçe, fagositik yetenekleri fagositozu engeller. artmakta (bakınız Kısım 22.2) ve diğer hücre tipleKapsüllere veya diğer hücre yüzey molekülleririni aktive eden çözünür aracı maddeler olan bazı ne karşı olan antikorların bakterilerin bu savunma sitokinleri salgılar (ö°öKısım 23.11). Yangıda yer mekanizmalarının koruyucu etkisini tersine çeviralan başlıca sitokinler IL-1, IL-6 ve TNF-a (tömür mesi ve fagositozu arttırması, opsonizasyon olarak nekrozis faktör-alfa) dır. Bunlar ve diğer çözünür bilinen bir işlemdir (bakınız Kısım 22.11). aracı maddeler hasar gören hücrelerce salınmakta ve fagositler yangıya katkıda bulunmaktadır. Örne22.2 Kavram/arın Gözden Geçirilmesi ğin, IL-1, IL-6 ve TNF-a gibi tüm aracıların damar geçirgenliğini arttırması hacmi arttırması (ödem) ve Doğal immün yanıt fagositler aracılığıyla olur. Fagokızarma (eritem) ile lokal ısınmaya yol açması faalisitler patojenle-bağıntılı moleküler paternleri (PAMP) , yetleri yangıyla bağıntılıdır. Ödem, lokal nöronları membrana bağlı patern tanıma molekülleri veya PRM'ler uyararak ağrıya neden olur. yoluyla tanır. PAMP'larm PRM'ler ile etkileşmesi fagositleri aktive ederek metabolik ürünler oluşturur. Bunlar da patojeni öldürür veya etkilerini kısıtlar. Bazı patojenler fagositleri engelleyici mekanizmalar geliştirmiştir.

Yangı oluşumunun bilinen özeti hızlı bir lokalizasyon ve nötrofiller ile makrofajlar tarafından

736 • Bölüm 22 • İmmünolojinin Temelleri

8 (b)

o

• Şekil 22.7 Aktive olmuş fagositler, (a) Nötrofiller Neisseria gonorrhoeae yi aktif olarak içine alır ve öldürür. Nötrofiller yaklaşık 12-15 /im çapındadır. Her hücrede çok loplu nükleus dikkati çekmektedir. Hücrelerin tümü bakterileri yutmamıştır. (b) Çok sayıda Leishmania'nm alındığı bir deri makrofajı (oklarla gösterilmiştir) Aktive edilen makrofajlar, bu hücre-içi protozoan parazitini öldürme yeteneğindedir.

patojenlerin parçalanmasıdır. Patojen yok edildiği için, yangı oluşturan hücreler daha fazla uyarılmaz, bunların sayısı bulundukları yerde azalır, sitokin üretimi azalır ve yangı hafiflemeye başlar. Makrofajlar doğal immünitedeki rollerinin yanısıra, adaptif bir immün yanıtta başlatabilirler. Makrofajların, T hücrelerini çekmek için sitokinleri salgılayarak ve daha sonrada antijenleri T hücrelerine sunarak, antijen sunucu hücreler olarak davranma yetenekleri de vardır (bakınız Kısım 22.5). Sistemik Yangı ve Septik Şok

Bazen, yangı oluşumu patojeni belirli bir yerde tutmayı başaramaz ve reaksiyon yangı oluşturan hücreler ve aracı maddelerin büyük ölçüde aktive edilmesiyle giderek yayılır. Yangısal hücreler ve aracı maddelerin dolaşım ve lenf sistemleri boyunca yayılmasıyla, sistemik bir yangısal yanıt, hayatı-tehdit eden bir durum olan, septik şoka yol açabilir (Kısım 22.1) Septik şokun en bilinen nedeni, sistemik enfeksiyona neden olan Salmonella veya Escherichia gibi enterik Bacteria olup, çoğu kez gram negatif bakterileri periton-içi boşluğa veya kan dolaşımına salan hasarlı veya sızıntılı bağırsaklarca oluşturulur. Primer enfeksiyon çoğu kez fagositlerce temizlenir veya antibiyotikler ile başarıyla tedavi edilir. Buna karşın, bu organizmalardaki endotoksik dış membran olan lipopolisakkarit (LPS), (e»e»Kısım 4.9) fagositler üzerindeki TLR-4 (Kısım 22.2 ve on» Kısım 23.1) ile etkileşmekte ve sistemik dolaşıma

salman IL-1, IL-6, IL-8 ve TNF-a yangısal sitokinlerin üretimini teşvik etmektedir. Sitokinler daha sonra çeşitli sistemik antipatojen yanıtları indükler. Örneğin, IL-1, IL-6 ve TNF-a endojenik pirojenler olup, beyinde prostaglandinlerin salımmını uyararak ateş oluşumuna yol açar. Karaciğerde, yangısal sitokinler akut faz proteinlerinin üretimini uyarır. Bunlarda C-reaktif protein, kompleman proteinleri, serum amiloid protein, mannan-bağlayıcı lektin ve fibrinojeni indükler. Bu proteinler, genellikle patojen parçalanmasına aracılık ederek, fagositozu arttırır. Bununla birlikte, sistemik yangısal reaksiyonların, çok ciddi sonuçları olabilir. Endojenik pirojenlerin büyük miktarda sistemik salmımı, lokalize sıcaklık üretmek yerine, kontrol-edilemeyen yüksek ateşe neden olur. Damar genişlemesi ve damar geçirgenliğinin artmasıyla lokal ödem oluşturan ayni mekanizma şimdi çevredeki dokularda ödem ve kan basıncında ciddi bir düşmeye yol açarak, merkezi damar dokusundan sıvıların etkin biçimde dışarı çıkmasına neden olmaktadır. Sonuçta, yüksek ateş ile birlikte kan miktarındaki azalmayla da tanımlanan septik şok, fecidir ve etkilediği bireylerin % 30'una yakınında ölüme yol açar. Kontrolsüz sistemik yangı orijinal enfeksiyondan daha tehlikeli olabilir. 22.3

Kavramların Gözden Geçirilmesi

Yangı ağrı, şişme (ödem), kızarma (eritem) ve ateşle tanımlanır. Yangısal yanıt, bir immün yanıtın normal ve genellikle arzu edilen bir sonucudur. Kontrolsüz sistemik yangı, septik şok olarak isimlendirilip, ciddi hastalık ve ölüme yol açabilir. • •

Yangı oluşumunda yer alan hücreleri tanımlayınız. Moleküler aracı maddelerin ve bunların her birinin yangıdaki rolünü tanımlayınız.

Adaptif İmmün Yanıt Adaptif veya spesifik immün yanıt ayrıntılı olarak Şekil 22.5'de özetlenmiştir. Makrofajlar ve dendritik hücreler gibi fagositler, aynen B lenfositleri gibi, patojenleri alır ve parçalarlar. Bu hücreler antijensunucu hücreler (APC)'dir ve bunlar parçalanan peptid antijenleri, T hücreleri adı verilen lenfositlere sunma işlevi gösterirler. T hücreleri peptid antijenleri yüzeylerinde yer alan antijene-özgü T-hücre reseptörleri (TCR) vasıtasıyla tanır. Her T hücresi üzerinde TCR'ler, tek bir peptid antijen ile spesifik olarak etkileşir. T hücrelerinden birisi olan Tc (T-sitotoksik) hücreleri, antijen-taşıyan hücrelere doğrudan saldırır ve yok eder. Antijence-aktive edilen diğer T hücreleri olan TH1 veya T-yardımcı 1 hücreleri, antijen-taşıyan hücreleri yok etmek için makrofajlar gibi diğer hücreleri aktive eden sitokinler denilen proteinleri salgılayarak dolaylı olarak iş görür. Hücre-aracılığıyla oluşan bu immünite, enfekte konukçu hücreleri üzerinde bulunan patojen

22.4 • Adaptif İmmün Yanıt • 737

antijenlerin tanınmasından dolayı patojenin enfekte ettiği hücrelerin ölmesine neden olur. T hücrelerinin diğer bir alt grubu olan TH2 hücreleri, antijene spesifik B lenfositleri veya B hücreleriyle etkileşir ve B hücrelerini antikor (veya immünoglobulin de denir) yapımı için uyarır. B hücrelerinin her biri ve onların antikor ürünü tek bir antijene spesifiktir. Antikorlar çözünür proteinler olup, antikorların antijenleri nötralize ettiği veya parçalanması için hedef seçtiği dolaşım sisteminde veya vücut sıvılarında antijenler ile spesifik olarak etkileşir. Antikor-aracılı immünite özellikle kanda ve lenfte virüsler ve bakteriler gibi patojenlere karşı ve ayni şekilde toksinler gibi çözünür patojen ürünlerine karşı etkilidir. Doğal immünite patojenlerin bilinen özelliklerine karış olmasına rağmen, spesifik immünite belirli makromoleküller ile etkileşmeye yönlendirilir. Spesifik immünite özgüllük, bellek ve tolerans özellikleriyle tanımlanır.

Spesifik antijenle reaksiyon

\

Spesifik reseptör

4 Immun yanıt

Antijenler Ö z g ü l l ü k : İmmün hücreler direkt moleküler etkileşimlerle her molekülü (antijeni) tanır ve reaksiyon gösterir.

Antijen

İmmün bellekti hücreler

Birlikte immün yanıt Bellek: Spesifik bir antijene immün yanıt, sonradan maruz kalındığında daha hızlı ve daha kuvvetlidir, çünkü antijenle ilk karşılaşma antijene-reaktif hücrelerin gelişimi ve bölünmesini indükleyip, antijene-reaktif hücrelerin çoklu kopyalarını oluşturur.

Özgüllük

Antijen-antikor veya antijen-T-hücre etkileşiminin özgüllüğü, daha önce tartışılan doğal konukçu dayanıklılık mekanizmalarından farklıdır. Doğal konukçu yanıtı, patojenler ile konukçu daha önce hiç karşılaşmamış bile olsa, saldıran bir organizmaya açıkça meydan okumaktadır. Adaptif immün yanıtta, immünite patojenle ilk temastan sonraki birkaç gün içinde belirlenemeyebilir. Buna karşın, adaptif immün yanıt birkez tetiklendiğinde, özgün moleküler antijen özelliklerinin (Şekil 22.8a •) tanınması sayesinde özellikle ve özgül olarak patojeni bulmaya yönelir. Bellek İmmün sistem bir kez antijene-spesifik antikor veya T hücresi üretince, ayni organizmaya sonradan tekrar maruz kalındığında, hızla ve bol miktarda antijenle-reaksiyona girebilen T hücreleri veya antikorların üretimini uyarır. Daha sonra maruz kalındığında hızlı ve etkin yanıt vermedeki veya ortaya çıkarılan antijenlere meydan okumadaki bu kapasite immünolojik bellek olarak bilinir (Şekil 22.8b). Bellek, önceden karşılaşılmış patojenler tarafından oluşturulan hastalığa karşı konukçuya spesifik olarak dayanıklılık sağlamaktadır. Bazı tehlikeli patojenlere karşı suni olarak uyarmak ve immünite artışı sağlamak için, duyarlı bireylerin ölü veya zayıflatılmış patojenler (veya bunların ürünleri) ile immünizasyonu (inokule ederek, aşılama yaparak) ile immünolojik belleğin avantajlarına sahip olabiliriz (bakınız Kısım 22.11). Tolerans

Tolerans, bir bireyin kendi antijenlerine karış adaptif bir immün yanıt oluşturmada kazanılmış yetersizliktir. Tolerans gereklidir, çünkü konukçudaki

Kendi antijeni

immün hücreler kendinden olmayan antijenlere spesifik H o ş g ö r ü : İmmün hücreler kendi antijenleri ile reaksiyon veremez. Kendine-reaktif hücreler immün yanıtın gelişimi esnasında yok edilir.

• Şekil 22.8 Adaptif immün yanıt. Antikor ve hücre aracılı immürütenin anahtar özellikleri görülmektedir.

tüm makromoleküller potansiyel antijendir. Bu yüzden, immün sistem konukçu maİcrorholekülleri tanımamayı "öğrenmeli" dir çünkü antikorlar veya T hücreler tarafından konukçu hücreler tanınmış olsalardı, hasar görebilirlerdi (Şekil 22.8c). Adaptif immün yanıtın, yabancı (kendinden olmayan ve tehlikeli) antijenler ve konukçu (kendinden ve tehlikeli olmayan) antijenlerini ayırt etme ve uygun biçimde reaksiyona girme yeteneği vardır. 22.4 Kavramların Gözden Geçirilmesi Spesifik-olmayan fagositler antijeni spesifik T hücrelerine sunmakta, etkin T hücreleri ve antikorların üretimini tetiklemektedir. İmmün T hücreleri ve antikorlar antijeni nötralize etmek veya yok etmek için doğrudan veya dolaylı olarak reaksiyon gösterir. Adaptif immün yanıt, antijene özgüllük, ayni antijene yeniden-maruz kalınca daha etkin yanıt verme (bellek) ve kendi antijenlerini kendinden olmayan antijenlerden ayırma yeteneği (tolerans) ile tanımlandırılır. •

Hücre-aracılığıyla ve antikor-aracılığıyla oluşan immün yanıtta yer alan antijene-spesifik hücreleri tanımlayınız.

738 • Bölüm 22 • İmmünolojinin Temelleri • Bir patojene yanıt verme yeteneğinde sahip olunan spesifiklik, bellek veya hoşgörüyü hangi etkiler bozabilir?

mu

ANTİJENLER, T HÜCRELERİ VE HÜCRESEL İMMÜNİTE

Adaptif ünmün yanıt, patojenden türevlenen molekül ve yapıların geniş bir aralığını tanıyacak şekilde gelişmiştir. Adaptif immün yanıt tarafından tanınan moleküller olan antijenler, ilk önce antijene-spesifik T hücrelerince tanınır. Burada ilk önce antijenler tartışılacak, daha sonra da T hücreleri üzerinde odaklanılacaktır. Bunlar hücre-aracılığıyla ölüm, yangısal yanıtlar ve antikor üreten B hücreleri için "yardım" sağlama gibi antijene-spesifik reaksiyonları içerir. T hücrelerinin yokluğunda, etkin bir antijene-spesifik adaptif immünite yoktur.

İmmünojenler ve Antijenler Antijenler antikorlar veya T-Hücre reseptörleri (TCR'ler) ile reaksiyona giren maddelerdir. Her zaman değil ama çoğunlukla immünojen olup, bir immün yanıtı uyarır. Burada etkin immünojenlerin özellikleri incelenecek ve daha sonra da antikorlar ve TCR'ler ile etkileşen antijenlerin özellikleri belirtilecektir. İmmünojenlerin Asıl Özellikleri Tüm immünojenler, antikorlar veya TCR'ler tarafından etkin biçimde tanınmak için çeşitli moleküler kriterlere sahip olması gerekir, immünojenler asıl özelliklerden olan boyut, komplekslik ve formun minimum değerlerini karşılamalıdır. Molekül boyutu, immünojenliğin önemli unsurlarından birisidir. Örneğin, düşük molekül ağırlıklı bileşikler hapten adını alırlar ve immün yanıtı uyaramazlar fakat antikorlara bağlanabilirler. Haptenler antikorları bağladığından dolayı, immünojenik olmasalar da antijendirler. Haptenler şekerleri, amino asitleri ve çeşitli düşük-molekül ağırlıklı organik bileşikleri içerir. Taşıyıcı büyük bir molekülle birleştiğinde, haptenler etkili immünojenler haline gelir, immünojenlerin çoğunun molekül ağırlıkları 10.000 veya daha fazlasıdır. Bu yüzden, yeterli molekül boyutu, potansiyel immünojenlik için bir göstergedir. Proteinler gibi tekrarlamayan, kompleks polimerler, genellikle etkin immünojenlerdir. Kompleks karbohidratlar da oldukça etkin immünojenler olabilirler. Buna karşın, nükleik asitler, basit polisakkaritler ve lipidler, tekrarlayan monomerlerden oluştuğu için, zayıf immünojen olma eğilimindedirler. Bu yüzden, bir maddenin moleküler kompleksisitesi, immünojenlik için başka bir öngörüdür. Çözünmez veya kümeleşmiş formdaki (örneğin, ısıyla presipite edilen proteinler) kompleks makromoleküller, genellikle mükemmel immünojendir. Çözünmez materyal fagositlerce kolaylık-

la alınıp, bir immün yanıta yol açmaktadır. Buna karşın, ayni molekülün çözünür formu, çoğu kez oldukça zayıf immünojendir, çünkü çözünür molekül fagositlerce alınmaz. Bu yüzden, fiziksel durumu immünojenliğin diğer bir koşuludur. İmmünojenlerin Dışsal Özellikleri Bazı maddeler esas olarak immünojenik olmasına rağmen, çeşitli dış faktörler de immünojenliği etkiler. Bunlar, immünojenin dozu, veriliş şekli, konukçuya göre immünojenin yabancı yapısını içerir. Bir konukçuya verilen immünojenin dozu, etkin bir immün yanıt için önemli olabilir, fakat genellikle geniş aralıktaki bir dozun yeterli immünite sağladığı görülür. Genelde, çoğu memeliler için lOug-lg arasındaki dozlar etkindir, lg'dan daha yüksek veya lOug'dan daha düşük olan dozların immün yanıtı uyaramadığı görülüp, son derece yüksek veya düşük dozlar aslında spesifik bir immün yanıtı baskılar ve hoşgörüye neden olur. Bir immünojenin veriliş şekli de önemlidir. Parenteral olarak (bağırsak dışı), genellikle enjeksiyonla yapılan immünizasyonlar, normal olarak yüzeyden veya ağızdan verilenlere göre daha etkilidir. Oral veya topik yol kullanıldığında, fagositle temas etmeden önce antijende belirli bir parçalanma oluşabilir. Bir immünojenin son ve en önemli dış özelliği, etkin bir immünojenin konukçu için mutlaka yabancı olmasıdır. Adaptif immün sistem sadece yabancı (kendinden olmayan) antijenleri tanır ve elemine eder. Kendinden olan antijenler tanınmaz ve bu yüzden bireyler kendilerine ait moleküllere hoşgörülüdür, hatta bu moleküllerin ayni türün diğer bireylerinde immünojen kapasitesi olduğu düşünülse bile böyledir. Antikorlar ve T-Hucre Reseptörleriyle Antijen Bağlama Antikor ve TCR antijenik bir makromolekülün tamamıyla değil, sadece antijenik determinant veya epitop denilen belirli bir kısmıyla etkileşir (Şekil Antijenik determinant

Protein (antijen)

Antijenik determinant Antikorlar

• Şekil 22.9 Antikorlar için antijenler ve antijenik determinantlar. Antijenler, her biri spesifik bir antikorla reaksiyon verme yeteneğinde, bir çok farklı antijenik determinatlar içerebilir. ABj tarafından tanınan antijenik determinant, aynı polipeptit zincirinin iki farklı kısmından oluşan kontormasyonel bir determinanttır. Polipeptit zinciri, tek bir determinat oluşturmak için proteinin iki uzak kısmını biraraya getirmek için katlanır.

22 6 • Antijenin T Lenfositlere Sunulması • 739

22.9»). Antijenik determinantlar şekerleri, amino asitleri ve diğer organik molekülleri içerirler. Antikorlar antijenler üzerinde bulunan yüzey epitopları ile etkileşir. 4-6 amino asitlik bir dizi, bir protein üzerindeki antijenik determinant için optimum büyüklüktür. Bu yüzden, genellikle yüzlerce veya hatta binlerce amino asitten oluşan proteinler, örtüşen antijenik epitopların dizisi olarak düşünülür. Bazen, antikorlar primer yapıdan uzak olan fakat makromolekülün ikincil, üçüncül veya dördüncül yapısıyla biraraya getirilen, molekülün iki kısmındaki amino asitlerden oluşan epitopları bile tanıyabilir (Şekil 22.9, öOaKısım 3.7 ve 3.8). Bu konformasyonel determinantlar makromoleküllerin

antijenik kompleksliğini arttırır. Bir bakteri hücresi veya virüsün yüzeyi, proteinlerin, polisakkaritlerinin ve diğer makromoleküllerin bir mozayiği olup, herbiri farklı epitoplar içerir. Bu yüzden, tipik bir mikroorganizmanın, hatta tek bir makromolekülün bile antijenik yapısı son derece kompleksdir. Antikorlar genellikle makromolekül yüzeylerinde sunulan epitopları tanırken, TCR'ler sadece immünojenler kısmen parçalandıktan sonra epitopları tanır. Bu parçalanmış veya işlemden geçmiş antijen, özelleşmiş APC'ler veya hedef hücre yüzeyinde T hücrelerine sunulur (bakınız Kısım 22.5 ve bakınız Şekil 22.12). Antijenin işlenmesi normalde bir antijenin konformasyonel yapısını parçalar, çünkü antijenler normal olarak 20 amino asitten daha küçük peptitlere işlenir. Sonuç olarak, konformasyonel determinantlardan çok ardışık lineer determinantlar dan oluşan T-hücre epitopları antikorlarca tanınır. Antikor ve TCR spesifitesi, oldukça yakın epitoplar arasındaki farkı ayırt etmede yeterince duyarlıdır. Örneğin, antikorlar tek bir hidroksil grubunun yönü sadece farklı olan glukoz ve galaktoz şekerlerini ayırt edebilir. Bunun birlikte, özgüllük kesin değildir ve her bir antikor veya TCR, bir ölçüde birçok farklı fakat yapısal olarak benzer epitoplar ile reaksiyon verebilir. Antikor ve TCR'yi indükleyen antijen homolog antijen olarak adlandırılır ve antikorlar ile reaksiyona giren homolog olmayan antijenlere heterolog antijenler denir. Bir antikor veya TCR ve bir heterolog antijen arasındaki etkileşim çapraz-reaksiyon olarak adlandırılır.

Antijenin T Lenfositlere Sunulması T lenfositleri hücre yüzeylerindeki T-hücre reseptörü aracılığıyla antijenle spesifik olarak etkileşir. Moleküler düzeyde, TCR'ler enfekte hedef hücrelerdeki veya antijen sunucu fagosit hücrelerdeki başlıca doku uygunluk kompleksi (MHC) proteinleri sayesinde

bağlanan antijenler ile etkileşirler. T-hücre Reseptörü

TCR, membrana-bağlı bir protein olup, T-hücre yüzeyinden hücre dışına uzanmaktadır. Her T hücresi, kendi yüzeyinde ayni TCR'nin binlerce kopyasına sahiptir. Fonksiyonal bir TCR, bir a zinciri ve bir /3 zinciri olmak üzere iki proteinden oluşur. Bu zincirlerin her birinde de bir değişken (V) bölgesi ve bir sabit (C) bölgesi vardır. (Şekil 22.10 •). Va ve V/3 bölgeleri, tam bir antijen-bağlama yeri oluşturmak için birlikte etkileşir. Daha ileride görüleceği gibi (£«aKısım 23.7), adaptif immün yanıt hemen hemen bilinen bir peptit antijenle bağlanacak TCRTeri üretir. Kompleks polisakkaritler gibi, diğer antijenler, TCR'lerce tanınmaz, fakat B hücrelerindeki immünoglobulin reseptörleriyle bağlanabilir (bakınız Kısım 22.10). TCR'ler bir peptit antijeni, sadece peptit ilk önce başlıca doku uygunluk kompleksi (MHC) pro-

teini olarak bilinen kendine ait bir proteinle bağlı olduğunda ancak tanıyabilir. Başlıca Doku Uygunluk Kompleksi (MHC) Proteinleri

MHC proteinleri, tüm omurgalılarda bulunan ve başlıca doku uygunluk kompleksi (MHC) denilen genetik bir bölge tarafından kodlanır. MHC proteinleri bu kompleks içinde yer alan birçok gen tarafından üretilir ve genelde de insan lökosit antijeni veya HLA'lar olarak adlandırılır. MHC proteinleri ilk kez transplantasyon reddi için başlıca hedef molekülleri olarak kendini göstermiştir. Verici bir

22.5 Kavramların Gözden Geçirilmesi İmmünojenler, immün yanıtı indükleyen yabancı makro moleküllerdir. Molekül boyu, komplekslik ve fiziksel formu, immünojenlerin esas özellikleridir. Yabancı immünojenler uygun bir doz ve yolla konukçuya verilirse, immün bir yanıtı başlatırlar. Antijenler, antikorlar veya TCR'ler tarafından tanınan moleküllerdir. Antikorlar konformasyonel determinantları; TCR'ler lineer peptit determinantları tanır. • İmmünojenler ile antijenler arasındaki farkı belirtiniz. • Bir immünojenin içsel ve dışsal özelliklerini tanımlayın. • Bir antikor epitopunu tanımlayın ve onu bir TCR epitopu ile karşılaştırın.

• Şekil 22.10 T-hücre reseptörünün (TCR) yapısı, a zincirinin ve /3 zincirinin V kısımları, peptit antijen-bağlanma bölgesini oluşturmak için birleşir.

740 • Bölüm 22 • İmmünolojinin Temelleri

hayvanın dokuları alıcı bir hayvana aktarıldığında immünolojik olarak reddedildiğinde, sonradan bunların MHC proteinlerinin farklı olduğu görülür. MHC proteinlerinin şimdi esas olarak hem antijen ve hem de TCR ile etkileşen antijen-sunucu moleküller olarak fonksiyon gösterdiği bilinmektedir. MHC genleri hem sınıf ive hem de sınıf II MHC proteinlerini kodlar. Sınıf I MHC proteinleri çekirdekli tüm hücrelerin yüzeyinde bulunur. Sınıf II MHC proteinleri sadece tümüyle antijen sunucu hücreler (APC'ler) olan, B lenfositleri, makrofajlar ve dendritik hücrelerin yüzeyinde bulunur. Bu moleküllerin farklı hücresel dağılımı her birinin fonksiyonlarıyla bağıntılıdır. Sınıf I MHC proteinleri birisi MHC gen bölgesinde kodlanan membrana-gömülü olan bir (a) zincirinden ve diğeri de MHC olmayan bir genle kodlanan beta-2 nıikroglobulin (j82m) denilen küçük bir protein olmak üzere 2 polipeptitden oluşur (Şekil 22.11a»). Sınıf II MHC proteinleri ave/3 denilen kovalent olmayan şekilde bağlanmış iki polipeptitden oluşur. Sınıf I a zincirleri gibi, bu polipeptidler sitoplazmik zara gömülüdür ve hücre yüzeyinden dışa doğru çıkarılırlar (Şekil 22.10b) MHC proteinleri, belirli bir tür içinde bile özdeş değildir Farklı bireyler çoğu kez MHC proteinlerinin amino asit dizisinde küçük farklılıklar gösterir. Sekanslardaki bu sınırlı değişikliklere polimorfizm denilir. İnsanlarda yüzlerce farklı MHC geni bulunur. MHC genlerindeki bu polimorfizm, bir bireyden diğerine doku aktarımı için başlıca antijenik engeldir. Sonuç olarak MHC,özdeşliği uyuşmayan doku aktarımlarını kendinden-olmayan olarak tanır ve bu yüzden de reddeder. MHC genleri ve Antijen

a1

cx2

Değişken Sabit

• Şekil 22.11 MHC proteinlerinin yapılan, (a) Sınıf I MHC proteini. Peptit antijen bağlanma bölgesini oluşturmak için, al ve a2 kısımları etkileşirler, (b) Sınıf II MHC proteini. Peptit antijen-bağlanma bölgesini oluşturmak için a İve a2 kısımları birleşir.

proteinlerinin ayrıntılı moleküler yapısı ve genetik düzenlenmesi 23. Bölümde verilmiştir. Antijen Sunma

MHC proteinleri, T hücrelerinin yabancı antijenleri tanıması için moleküler referans noktaları olarak iş görür. T hücreleri, kendinden-olmayan antijenleri taşıyan hücreleri tanımak için diğer hücrelerin yüzeyindeki moleküler yapıyı sürekli örnekler. Belirli bir T hücresindeki TCR sadece MHC yapısında gömülü bulunan yabancı antijenlere sahip MHC moleküllerini bağlar; T hücresi, yabancı bir antijeni bir MHC proteininin içinde sunulmadıkça tanımaz. Bu nasıl olmaktadır? Çeşitli konukçu hücreler kendinden olmayan antijenleri enfeksiyon veya fagositoz yoluyla ele geçirir. Konukçu hücreler daha sonra antijenleri parçalar (işlemden geçirir) ve işlenmiş antijen peptitleri MHC proteinlerinin içine yükler. MHC-peptit kompleksi sitoplazmik zardan geçirilir ve T hücrelerince tanınabilmek için hücre yüzeyinden sunulur. İki farklı antijen-işleme şekli bilinmektedir. Bunlardan birisi MHC I antijen sunma ve diğeri de MHC II antijen sunmadır (Şekil 22.12*). MHC I proteinleri, fagositik olmayan hücrelerin sitoplazmasında bulunan patojen proteinlerinden türevlenen peptit antijenleri sunar (Şekil 22.12a). Yabancı patojen proteinleri, virüs ve diğer hücreiçi patojenlerce hücre-içi enfeksiyonundan ortaya çıkar. Örneğin, virüslerin enfekte etmesiyle üretilen proteinler, sitoplazmada proteozom denilen bir yapı içine alınır ve parçalanır. Yaklaşık 10 amino asit büyüklüğündeki peptit antijenler, taşıyıcılarla bağıntılı antijen işleme (TAP) denilen işlemle, enerji

gerektiren bir reaksiyonla iki proteince oluşturulan bir delikten geçirilerek endoplazmik retikuluma (ER) taşınır. Peptitler bir kez ER'a girdiğinde, MHC I proteini tarafından bağlanır, bir grup şaperon proteinince TAP bölgesine yakın bir yerde tutulur. Bu şaperon proteinleri MHC I molekülünü, bir peptit bağlanıncaya dek onu yerinde tutarak, TAP bölgesine yöneltir. MHC I-peptit kompleksi daha sonra şaperondan ayrılır ve hücre yüzeyine gider ve orada membrana entegre olur ve Tc hücrelerince tanınabilir. Bu yüzden, MHC proteinleri yabancı viral antijenlerin bağlanacağı bir platform olarak iş görür. Daha sonra, bir T hücresi yüzeyindeki TCR, hedef hücre yüzeyindeki hem antijen ve hemde MHC proteini (kendinden) ile etkileşir. Bu T hücre- hedef hücre etkileşimi özelleşmiş T-sitotoksik (T.) hücrelerini, virüsle enfekteli hedef hücreyi öldüren, perforinler denilen sitotoksik proteinleri üretmeye teşvik eder (bakınız Kısım 22.6). İkinci bir antijen sunma şekli MHC Sınıf II proteinlerini içerir (Şekil 22.12b). MHC II proteinleri sadece fagositik APC'lerde ifade edilip, burada bakteriler gibi yutulan hücre-dışı patojenlerdeki peptitleri sunma işi görürler. MHC sınıf II proteinleri, MHC I proteinlerine benzer şekilde, başlangıç-

22 6 • Antijenin T Lenfositlere Sunulması • 741

Proteozom

Hedef hücre

(a) • Şekil 22.12 MHC I ve MHC II proteinleri tarafından antijen sunulması, (a) MHC I antijen sunma yolunda membrana-bağlı MHC I proteinleri, endoplazmik retikulumda yapılır ve monte edilir. Şaperon proteinleri antijen gelinceye dek MHC I'i stabil halde tutar. (1) Protein antijenler, örneğin virüslerden, hücre içinde yapılıp, sitoplazmadaki proteozomlarda parçalamr ve TAP proteinlerince oluşturulan bir delik yoluyla endoplazmik retikulum boyunca taşımr (2) Sonradan MHC I'e bağlanan peptitler, hücre yüzeyine taşımr ve (3) Tc hücrelerinin yüzeyindeki T-hücresi reseptörleri (TCR'ler) ile etkileşir. (4) Tc hücresindeki CD8 koreseptör, sımf I MHC'ye tutturulup, güçlü bir kompleks oluşturulur. Tc hücreleri daha sonra sitokinleri salıp, hedef hücreyi öldürür. Nukleuslu herhangi bir hücre, peptit-MHC I komplekslerim tanıyan T hücreler için hedef olarak iş görebilir (b) MHC II antijen sunma yolunda, (1) MHC II proteinleri endoplazmik retikulumda üretilir ve MHC H'yi endoplazmik retikulumda bulunan peptitlerle komplek oluşturmasından koruyan, bloke edici bir protein olan li (sabit zincir) ile birleşir. (2) MHC'yi içeren lizozimler fagozomlar ile birleşip, fagolizozomlan oluşturmaktadır. Burada, endositoz ile hücre dışından gelen, li ve yabancı proteinler parçalanırlar. MHC II proteini daha sonra parçalanmış yabancı peptitlere bağlamr ve kompleks hücre yüzeyine taşımr (4) Kompleks burada TCR'ler ile etkileşir. (5) TH hücrelerindeki CD4 korepresörü. TH hücreleri daha sonra sitokin salar ve bu sitokinler de bir immün yamt aktive etmek için diğer hücreleri hareket geçirir. Peptit-MHC II kompleksini tanıyan T hücreleri için hedef, sadece APC'ler olabilmektedir. APC'ler makrofajlar, dendritik hücreler ve B hücreleridir.

ta ER'da toplanır. Bununla birlikte, MHC I proteinlerinden farklı olarak, li veya sabit zincir denilen bir şaperon proteini, MHC II proteini bağlar, MHC-II peptit-bağlama bölgesini bloke etmekte ve ER'un içinde MHC II proteinlerinin peptitlere bağlanmasını engellemektedir. Bu MHC II-Ii kompleksleri ER'dan hücre vakuollerine (lizozom) (bakınız Kısım 22.2) taşınır. Yabancı antijeni içeren fagosom, bir fagolizozom oluşturmak için lizozom ile birleşir ve li peptitlerinde olduğu gibi yabancı antijenler lizozomal enzimlerce parçalanır. Genellikle yaklaşık 11-15 amino asit uzunluğundaki (MHC I-bağlayan peptitlerden biraz daha büyük) yabancı peptitler, daha sonra yeni açılan MHC II antijen-bağlama bölgesine bağlanır. Kompleks daha sonra sitoplazmik zara taşınıp, burada özelleşmiş T-yardımcı (TH) hücrelerine sunulur. TH hücreleri, TCR sayesinde MHC II-peptit kompleksini tanır. Bu etkileşim TH hücrelerini sitokin salgılamaya aktive ederek, ya spesifik B-hücre klonları ile antikor üretimi teşvik

edilir veya yangı oluşumuna neden olunur (bakınız Kısım 22.8 ve 22.10). CD4 ve CD8 Koreseptörleri TCR'ye ilaveten, her T hücresi koreseptör olarak iş gören özgün bir hücre yüzey proteini oluşturur. TH hücreleri bir CD4 protein koreseptörü oluştururken, Tc hücreleri bir CD8 koreseptörü oluşturur (Şekil 22.12). TCR peptit-MHC kompleksine bağlandığında, T hücresi üzerindeki koreseptörün de MHC proteinine bağlanması, moleküler etkileşimi güçlendirmekte ve T hücresinin aktivasyonunu arttırmaktadır. CD4 sadece sınıf II proteini ile bağlanıp, MHC II proteini taşıyan APC'ler ile TH hücre etkileşimini arttırır. Buna karşın, CD8'in sadece MHC I proteini ile bağlanması, MHC-I oluşturan hedef hücreyle Tc hücrelerinin bağlanmasını arttırır. CD4 ve CD8 proteinleri in vitro olarak TH hücrelerini Tc hücrelerinden ayırmada markır olarak kullanılır C(£Oo,Kısmı 24.9).

742 • Bölüm 22 • İmmünolojinin Temelleri

22.6 Kavramların Gözden Geçirilmesi Tc sitotoksik hücre

T hücreleri APC'ler veya patojence enfekte edilen hücreler tarafından sunulan antijenleri tanır. Moleküler düzeyde, TCR'ler MHC proteinlerince sunulan peptit antijenleri bağlarlar. Bu moleküler etkileşimler, T hücrelerini antijen-oluşturan hücreleri öldürmeye veya sitokinler olarak bilinen hücre-teşvikleyici proteinleri üretmeye teşvik eder. • Yüzey unsuru olarak MHC I ve MHC II proteinlerini gösteren hücreleri tanımlayınız. • Hücre-içi ve hücre-dışı patojenler için antijen sunma işleminin nasıl olduğunu belirtiniz.

Perforin ve granzimli granüller

Apoptozis ile hücre ölümü

T-Sitotoksik Hücreler ve Doğal Katil Hücreler Önceki kısımda, T lenfositlerinin T-sitotoksik hücreler T-yardımcı hücreler olarak iki gruptan oluştuğundan bahsedilmiştir. Burada T-sitotoksik hücrelerin,hücre öldürme işlevini nasıl yaptığı ayrıntısıyla incelenecektir. Ayni şekilde, hücre-içi patojenlerce enfekte edilen hücreleri tanıyan ve öldüren bir hücre olan doğal katil hücreden de söz edilecektir.

T H 1 yangısal T hücresi

TNF-a GM-CSF IFN-y sitokinlerin salınması

T-Sitotoksik Hücreler

T-Sitotoksik hücreler, sitotoksik T lenfositleri (CTL'ler) olarak da bilinip, yüzeyinde yabancı antijenleri gösteren hücrelerin parçalanmasında doğrudan aracılık yaparlar. Önceden tartışıldığı gibi, Tc hücreleri MHC I proteinlerinin içinde gömülü olan yabancı antijenleri tanır. Virüsle enfekte edilen hücrelerin yüzeyinde bulunan viral peptitlerde olduğu gibi, bir hücre MHC I ile birlikte bulunan yabancı bir antijen taşıyorsa, Tc hücrelerince öldürülebilir (bakınız Kısım 22.6) Hücre ölümü için bir Tc hücresi ve bir hedef hücre arasında bir bağlantı gereklidir. Bu bağlantı TCR: peptit-MHC I kompleksi ile başlatılır (Şekil 22.12a). Hedef hücreyle temas sağlanınca, Tc hücresindeki granüller bağlantı kurulan yere doğru gidip, burada granüllerin içeriği boşaltılır (degranülasyon). Granüller perforin içerip, bu madde sayesinde hedef hücrenin membranından girer ve delik oluştururlar. Perforinlere ilaveten, Tc granülleri granzimler içermekter ve bu proteinler de apoptoziz veya kontrollü ölüme neden olmaktadır. Granzimler perforinlerin açtığı porlardan hedef hücreye girdiğinde, hedef hücre hücrenin ölümü ve içerden parçalanmasıyla karakterize edilen, apoptosise uğrar (Şekil 22.13a«). Buna karşın, Tchücreleri, etkilenmeden kalır; bunların membranları perforinden hasar görmez. Tc hücreleri sadece yabancı antijen taşıyan hücreleri öldürür çünkü degranülasyon sadece T c ve antijeni taşıyan hücre arasında temas yüzeyinde oluşur. Tc hücrelerince tanınan antijenden yoksun hücreler bağlantı kuramazlar ve öldürülemezler. Doğal Katil Hücreler

Doğal katil hücreler (NK hücreleri) lenfositlerin bir çeşitli olup, sitotoksik T hücrelerinden farklıdır.

Sınıfll MHC Makrofaj

Sitokin aktivasyonu Tüm patojenlerde fagositozisin artması, yangı (b)

• Şekil 22.13 Etkin T hücreleri, (a) T-sitotoksik hücreler veya Tc hücreleri, herhangi bir hücrenin MHC I protein ile birlikte sunulan antijenler tarafından aktive edilir. Tc hücreleri perforin ve granzimlerini salgılayarak yanıt verir. Salgılanan bu sitotoksinler hedefi delmekte ve apoptozise neden olmaktadır, (b) T-yangısal hücreler veya TH1 hücreleri, MHC II proteini ile birlikte makrofajlar üzerinden sunulan antijenlerce aktive edilir. TH1 hücreleri de, makrofajlann fagosit aktivitesinin artmasını ve yangının ilerlemesini teşvik eden sitokinleri üreterek yanıt verir.

Buna karşın, hücre-içi parazitlerce enfekte edilen hücrelerin yok edilmesinde ayni şekilde bir rol oynarlar. NK hücreleri ne T hücresi nede B değildir. Bunların sayıları artmadığı gibi, uyarıldıktan sonra bir bellek de göstermezler. Yine de NK hücreleri enfekte hücreleri yok etme yeteneği bakımından Tc hücrelerine benzemektedir. Örneğin, NK hücreleri de hedeflerini öldürmede perforin ve granzimleri kullanır. Buna karşın, NK hücreleri spesifik bir antijenin yokluğunda hedef hücreleri öldürmeleriyle T hücrelerinden ayrılmaktadır. NK hücreleri, önceden maruz kalınmadan veya yabancı antijenle temas kurmadan in vitro olarak malign ve virüsenfekteli hücreleri yok etme yeteneğindedir.

22 8 • T-Yardımcı Hücreler: Immün Sistemin Aktive Edilmesi • 743

NK hücrelerinin moleküler hedefinin, uygun MHC sınıf I proteinlerinin eksikliği olduğu görülür. NK hücreleri, bir dizi özgün MHC I reseptörleri yoluyla, normal hücreleri ve bunların MHC I reseptörleri yoluyla, proteinlerini tanır. Reseptörlerin MHC I'e bağlanması, öldürme mekanizmasını etkinsizleştirip, bağlanma olmayınca NK hücreleri tanınmayan hedefi öldürür. NK hücrelerinin ana hedefi olan tümör hücreleri ve virüsle enfekteli hücrele, çoğu kez MHC I protein ifadesini redükler veya değiştirir. 22.7

Kavramların Gözden Geçirilmesi

T-sitotoksik (Tc) hücreleri, antijene spesifik olan TCRTeri vasıtasıyla, virüsle-enfekteli konukçu hücreleri ve tümör hücrelerindeki antijenleri tanır. Antijene-spesifik tanıma, perforin ve granzimler aracılığıyla ölümü tetikler. Doğal katil hücreler virüsle-enfekteli hücreler ve tümörleri öldermek için aynı etkileyicileri kullanır. Buna karşın, NK hücreleri ne uyarıya gerek duyar, ne de bellek özelliği gösterir. NK hücreleri, MHC proteinlerinin yokluğunda yanıt verir. • Tc ve NK hücrelerinin kullandığı hedef tanıma mekanizmalarını tanımlayınız. • Tc ve NK hücrelerince kullanılan genel etkileyici sistemi tanımlayınız (hücre-öldürme sistemi).

T-Yardımcı Hücreler: Immün Sistemin Aktive Edilmesi Bu kısımda, T-yardımcı hücrelerinin fonksiyonları ve etkin bir immün yanıtı teşvik etmede sitokinleri üretmedeki önemli rolleri belirtilecektir. T-Yardımcı hücreleri, TY.1 hücreleri ve T.,2 hücreri

rl

leri olmak üzere iki alt gruba ayrılır. TH1 hücreleri makrofaj aktivasyonu ve yangıda önemli rol oynarken, TH2 hücreleri de B lenfositleriyle etkileşir ve antikor üretimini teşvik eder. TH1 Hücreleri ve Makrofaj Aktivasyonu

Makrofajlar, APC'ler olarak hem antikor-aracılığıyla ve hem de hücre-aracılığmda olan immünitede önemli rol oynarlar. Şekil 22.12b'de gösterildiği gibi, makrofajlar antijeni bağlar, işlemden geçirir TH hücrelerine sunar. Bununla birlikte, makrofajlar fagositik hücreler olduğu için, bazı yabancı hücreleri yakalayıp öldürmeleri, TH1 hücrelerince teşvik edilen bir yetenektir. THl-aktivasyonlu makrofajlar, aktive edilmeyen makrofajlar veya diğer hücre tiplerinde normal olarak çoğalan hücre-içi bakterileri öldürebilir. Daha önce belirtildiği gibi (bakınız Kısım 22.2), bazı bakteriler makrofajlar içinde canlı kalabilir ve çoğalabilir, oysa makrofaj içine alman çoğu bakteriler öldürülür ve parçalanır. Makrofajlar içinde çoğalan bakteriler Mycobacterium tuberculosis,

(interferan gamma) GM-CSF (granülosit-monosit koloni-uyarıcı faktör) ve TNF-a (Şekil 22.13b) içeren bazı sitokinler salgılayarak makrofajlar ve diğer spesifik-olmayan fagositleri aktive ederler. Bu şekilde immünize edilen hayvanların Listeria gibi ilişkisiz organizmaları da fagosite eder ve öldürürler çünkü immünize edilen hayvanlardaki makrofajlar, herhangi bir sekonder istilacıyı daha kolay bir şeklide öldürecek kadar çok aktive edilmiştir. THl-aktivasyonlu makrofajlar sadece yabancı patojenleri öldürmekle kalmaz, ayni şekilde yabancı memeli hücrelerinin parçalanmasında da yer alır. Örneğin, çoğu kez spesifik antijenlere sahip olan tümör hücreleri, normal hücrelerde bulunmaz. Çoğu tümör hücreleri yabancı olarak tanınır ve esas olarak tümöre-spesifik TH1 hücrelerince üretilen sitokinler tarafından aktive edilen makrofajlarca yok edilirler. TH1 hücrelerince aktive edilen makrofajlarca gerçekleştirilen doku aktarımının reddi, bir kişiden diğerine organları ve dokular aktarıldığında, karşılaşılan asıl sorundur. Bu durumda TH1 hücreleri aktarılan dokunun MHC proteinlerini tanıyıp, makrofaj aktivasyonu ve aktarılan dokunun parçalanmasını tetiklemektedir. TH2 Hücreleri ve B Hücre Aktivasyonu

TH2 hücreleri, B hücre aktivasyonunda ve antikor üretiminde önemli bir rol oynar. Kısım 22.3'de tartışıldığı gibi, B hücreleri antikor yapar. TH2 hücrelerinin bu işlemle ilgisi nedir? Olgun B hücreleri, antijen reseptörü gibi iş gören antikorlarla kaplanır. Buna karşın, antijen B hücre reseptörlerine bağlandığında, B hücreleri hemen çözünür antikorları üretmez. Bunun yerine, B hücreleri bir APC gibi iş görür ve TH2 hücreleriyle etkileşir. Daha spesifik olarak, bağlı antijen ilk önce endositoza uğratılır ve B hücresi içinde parçalanır. Parçalanan antijendeki peptitler MHC II proteini üzerinden bir TH2 hücresine sunulur (Şekil 22.12b ve 22.14»). TH2 hücresinin sonradan IL-4 (Interleukin-4) ve IL-5 üreterek yanıt vermesi, Kısım 22.10'da tartışıldığı gibi, bu sitokinlerin B hücrelerinin çözünür antikorları üretmesi ve salgılamasını teşvik etmektedir. 22.8

Kavramların Gözden Geçirilmesi

TH1 ve TH2 hücreleri, hücre-aracılı ve antikor-aracılı immün yanıtlarda önemli rol oynamaktadır. TH1 yangısal ve TH2 yardımcı hücrelerin her biri, sitokinleri faaliyete geçirerek etkin hücreleri uyarırlar. • TH1 hücrelerinin makrofajların aktivasyonundaki rolünü anlatınız. • TH2 hücrelerinin B hücrelerinin aktivasyonunundaki rolünü anlatınız.

M. leprae (sırasıyla tüberkulosis ve cüzzamm etmenidirler) ve Listeria monocytogenes (listeriozisin etmeANTİKORLAR VE nidir, öo^Kısım 29.10)'i içerir. Orta dozda M. tuberİMMÜNİTE culosis verilen hayvanlar enfeksiyonun üstesinden Bu kısımda B hücrelerinin ve antikorların immügelir ve T-hücre aracılığıyla immün yanıt nedeniyle nitedeki rolü üzerinde ayrıntılı durulacaktır. Andayanıklılık geliştirir. İçerilen hücreler, TH1 alt grutikorlar, etkin bir immün yanıtın önemli yapı taşbundaki T-yangısal hücrelerdir. Bu hücreler, IFN-y

744 • Bölüm 22 • immünolojinin Temelleri

T- yardımcı hücre (TH2)

T-hücre reseptörü İşlenmiş antijen

T H 2 hücresince IL-4 ve IL-5 sitokinlerinin salınması

Sınıf II MHC B hücreleriyle antijen işleme

Birincil immun yanıt

Antijenle bağlı antikor

Plazme hücresi (kısa ömürlü)

Bellekli hücre (uzun ömürlü)

özelliklerine göre 5 ana sınıfa ayrılabilir: Ig G, Ig A, Ig M, IgD ve IgE (Tablo 22.2). Bireylerin çoğunda, serum immünogbulinlerinin yaklaşık % 80'i Ig G olup, bunlar oldukça yoğun çalışılmıştır. İmmünoglobulin G Yapısı

IgG en çok dolaşan antikordur. IgG'nin yaklaşık 150.000'lik bir molekül ağırlığı vardır ve dört poliptet zincirinden oluşur (Şekil 22.15»). Her bir zincir, zincirler arası disülfit köprüleri (S-S bağları) ile bağlıdır. Her IgG proteininde, 25.000 molekül ağırlığındaki iki identik hafif zincir, 50.000 molekül ağırlığındaki iki identik ağır zincirle eşleşir. Her hafif zincirde yaklaşık 220 amino asit ve her ağır zincirde de yaklaşık 440 amino asit vardır. Fonksiyonal bir Ig G antikoru, her biri bir ağır ve bir hafif zincirden oluşan, iki antijen-bağlama biriminden oluşur. Bu yüzden, antikorlar bivalentdir ve iki identik epitop bağlayabilir. Hafif Zincirler

Antikor salgılama

Her Ig hafif zinciri eşit boyda iki protein kısmından oluşur (Şekil 22.15). Amino-terminal bölge değişken bir domain olup, bu yapısal bölgedeki amino asit sekansı her farklı antikorda farklıdır. Buna karşın,

Antijene ikinci maruz kalma bellekli hücreleri plazma hücresine dönüştürür.

İkinci immun yanıt

Antijen Değişken Sabit

• Şekil 22.14 T hücre - B hücre etkileşimi ve antikor üretimi. B hücreleri, bir antijen sunucu hücre (APC) gibi fonksiyon gösterip, ilk önce antijene özgü immünoglobulin reseptörleri kullanarak antijeni taramaktadır. İşlendikten sonra, antijen bir sınıf II MHC molekülüyle TH2 hücresine sunulur TH2 hücresi daha sonra ayni B hücresine çoğalması ve plazma hücresine (antikor üreticiler) dönüşmesi için sinyal gönderir. Sonradan tekrar antijene maruz kalınırsa, bellekli hücreler hızla plazma hücrelerine dönüşür.

larıdır ve hücre-dışı patojenlere ve toksinler gibi tehlikeli çözünür proteinlere karşı antijene spesifik immünite sağlarlar. Antikorların moleküler yapısı gözden geçirildikten sonra, B hücreleri tarafından antikor üretimine bakılacaktır. Antikorların in vivo olarak antijenleri nötralize etmesi veya yok etmesi tartışılacaktır.

Antikorlar (İmmiinoglobulinler) Antikorlar veya immünoglobulinler (Ig), antijenik determinantlar ile birleşebilen protein molekülleridir. Bunlar serum ve mide salgıları ve süt gibi diğer vücut sıvılarında bulunurlar. Antijene spesifik antikorları içeren seruma antiserum denilmektedir. Antikorlar fiziksel, kimyasal ve immünolojik

CH3

• Şekil 22.15 İmmünoglobulin G yapısı. Ig G iki ağır zincir (50.000 moleküler ağırlığında) ve iki hafif zincir (25.000 moleküler ağırlığında) den oluşup, toplam molekül ağırlığı 150.000'dir. Bir ağır zincir ve bir hafif zincir, bir antijen-bağlama birimi oluşturmak için etkileşir. Ağır ve hafif zincirlerin değişken kısımları (VH ve VL) antijeni bağlar ve her farklı antikorda sekans farklılıkları gösterir. Sabit kısımlar (CH1, CH2, CH3) tüm Ig G proteinlerinde özdeştir. Zincirler, disülfit bağlarıyla kovalent olarak bağlanırlar.

22,9 • Antikorlar (Immünoglobulinler) • 745

1

Tablo 22.2 İnsan immünoglobulinlerinin özellikleri Molekül ağırlığı/1 formülü '

Sınıf/ H zinciri 3 IgG y

150.000 2(H+L)

IgM

Serum (mg/ml)

AntijenBağlanma Bölgesi

Özellikleri

Dağılımı

13,5

2

970.000 (pentamer) 5[2(H + L)+J

1,5

10

175.000 (monomer) 2 (H + D

0

2

IgA a

150.000 2 (H + L)

3,5

2

0,05

4

IgD S

385.000 (salgılanan dimer) 2[2(H + L)] + J + SC 180.000 2(H + L)

0,03

2

Dolaşımdaki en az antikor

Kan ve lenf; B lenfosit yüzeyi

190.000 2(H + L)

0,00005

2

Allerjik reaksiyonlarda yer alır; C.,4 mast hücresini bağlayıcı kısım içerir.

Kan ve lenf; mast hücresi yüzeyine bağlanır.

IgE e

Hücre-dışı sıvılar, kan ve Dolaşımdaki başlıca antilenf; plasentadan geçer. kor; dört alt sınıf: IgGI, IgG2, IgG3, IgG4; IgGI ve IgG3 komplemam aktive eder. tmmünizasyondan sonra Kan ve lenf; monomeri B görülen ilk antikor; güçlü hücresi yüzey reseptörü kompleman aktivatörü

Dolaşımdaki önemli antikor Başlıca salgılanan antikor

Salgılar (tükrük, süt, hücresel ve kan sıvıları); kanda monomer ve salgılarda dimer

" Tüm antikorlar ya \ veya K zincir tipi olabilir. Her ikisi birden olmaz. k Her fonksiyonal moleküldeki ağır (H) ve hafif (L) zincirlerin sayısı ve düzenlenmesine bağlı olarak. J, serumdaki IgM ve salgısal IgA'da bulunan birleştirici bir protein. SC, salgılanan IgA'da bulunan salgısal bir yapıtaşı. Her antikorun şekli için Şekil 22.15, 22.17, 22.18 ve 22.19'a bakınız.

karboksi terminal kısım ise sabit bir domaindir. Bu kısımdaki amino asit sekansı ayni tipteki hafif zincirler arasında farklı değildir. Ağır Zincirler Her Ig G ağır zinciri, bir amino-terminal değişken kısımdan ve herbiri yaklaşık 110 amino asitlik üç sabit kısımdan oluşur. Hafif zincirlerde olduğu gibi, her ağır zincirin üç sabit kısmı, ayni sınıftan antikorlarda identik olmasına karşın, değişken bölgeler her antikorda değişir. Antijen Bağlama Yeri Ig G ve tüm diğer Ig'lerde antijen-bağlanma yeri hem ağır ve hem de hafif zincirlerin değişken bölgeleri arasındaki birlikte yapılan etkileşimle oluşur (Şekil 22.16»). Her iki zincirin değişken bölgeleri, antijenle kuvvetli fakat kovalent-olmayan şekilde bağlanacak moleküler bir yer oluşturacak şekilde etkileşirler. Bu bağlanmanın kuvveti antijen-bağlama afinitesi olarak isimlendirilir. Eğer antijen kuvvetli bir şekilde etkileşir ve antikor tarafından sıkı bir şekilde tutulursa, bir antikor için yüksek afiniteden söz edilir. Her bireyin immün sistemininin sayısız

antijeni tanıma veya bağlanma kapasitesi vardır ve her antijen özgün bir antijen-bağlanma bölgesiyle tanınır. Olası tüm antijenlere uyum sağlamak için, her birey antikor formlarında milyarlarca farklı antijen-bağlanma bölgesi üretebilir. Antijen bağlanma bölgesindeki bu farklılık nasıl oluşturulur? Kısım 22.10'da ve gelecek bölümde anlatıldığı gibi, yeni antikorlar hafif ve ağır kısımları kodlayan 300 veya daha fazla genin tesadüfi rekombinasyonu ve mutasyonu ile sürekli oluşturulur. Her yapılan Ig geni, bir B hücresinde ifade edilen özgün bir antijen-bağlayan Ig'i kodlar. Antijenin bu özgün B-hücresi Ig'i ile etkileşimi, çözünür antikorlar olarak salgılanan, Ig'in kopyalarını üretmek için B hücresini uyarır (co^Kısım 23.5). İmmünoglobulinlerin Diğer Sınıfları İmmünoglobulinlerin diğer sınıfları Ig G'den farklıdır. Belirli bir Ig molekülünün sınıfını onun ağır zincirinin sabit domaini belirler ve aşağıdaki beş amino asit sekansından birine sahiptir: gamma (y), alfa (a) mü(yu,), delta (<5) veya epsilon (e). Sabit kısım sekansları Ig G, Ig A ve Ig D'nin ağır zincirlerinin karboksi terminal kısmının 3/4'ünü, Ig M ve Ig E'nin ağır zincirlerinin ise, 4/5'ini oluşturur (Şekil

746 • Bölüm 22 • immünolojinin Temelleri

• B Antijen h,,ıü,;l Değişken r~1 Sabit

• Şekil 22.17 İmmünoglobulin sınıflan. Tüm immünoglobulin sınıflarında, antijeni (kahverengi) bağlayan VH ve VL kısımları (kırmızı) vardır, (a) Ig G, Ig A ve Ig D'nin üç sabit kısmı (mavi) bulunur, (b) Ig M ve Ig E ise dördüncü bir sabit kısma daha sahiptir.

Ig M'nin yapısı Şekil 22.18*'de gösterilmiştir. Ig M genellikle en azından bir / zinciriyle tutturulmuş beş immünoglobulin molekülünün bir araya gelmesiyle oluşur. Ig M'nin her ağır zinciri dördüncü bir sabit kısım daha içermektedir (CH4). Ig M, bir bakteriyal enfeksiyona tipik bir immün yanıt oluşturmadaki ilk sınıftır, fakat genellikle Ig M'lerin afinitesi düşüktür. Bunu karşın, pentamerik Ig M • Şekil 22.16 İmmünoglobulin yapısı ve antijen-bağlama bölgesi (a) bir Ig G molekülünün üç-boyutlu görünüşü. Ağır zincirler kırmızı ve koyu mavi görülmektedir. Hafif zincirler yeşil ve açık mavidir, (b) Bir antijen ve Ig G'nin birleşme bölgesinin yapısı. Antijen (lizozim) yeşil renktedir. Ig ağır zincirinin değişken bölgesi mavi, hafif zincirde ise sandır. Kırmızı olarak görülen amino asit lizozozimin bir glutamin köküdür. Glutamin residusu, Ig molekülü üzerindeki bir çukura yerleştirilir, fakat tüm antijen antikor tanımaları Ig ve antijenin her ikisinin de diğer birçok amino asitleri arasındaki temasla sağlanır.

22.17»). Örneğin Ig M sınıfı her antikor, ağır zincir sabit kısımlarında mü sekansını oluşturacak amino asitler içerir. Tipik bir immün yanıtta, farklı sınıftan iki Ig, çoğu kez de Ig M ve Ig G, ayni epitopu bağlayabilir. Bu durumda, hem Ig M ve hem de Ig G'nin ağır ve hafif zincirlerindeki değişken (antijen-bağlayan) kısımları özdeş olabilir, fakat ağır zincirlerin sınıfbelirleyici sabit kısımları farklı olup, Ig M bir mü (/x) ağır zincirini, Ig G ise bir gamma (y) ağır zincirini ifade eder.

• Şekil 22.18 İmmünoglobulin M. Ig M serumda pentamerik bir proteinden ibaret olup, yapıda beş Ig M proteini bir diğerine disülfit bağlan ve bir J zincir proteini ile kovalent olarak bağlıdır. Bir pentamer olması nedeniyle, Ig M, şekilde görüldüğü gibi, 10 taneye kadar antijen bağlayabilir.

22.10 • Antikor Üretimi • 747

molekülünün yüksek valansı nedeniyle, antijenbağlama kuvveti bir ölçüde arttırılır; antijenle etkileşimi için 10 bağlanma bölgesi vardır (Tablo 22.2 ve Şekil 22.18). Avidite terimi, multivalan antijenbağlayıcı moleküller tarafından bağlanma kuvveti'ni tanımlamak için kullanılır.Bu yüzden, Ig M'nin antijen için afinitesi düşüktür fakat aviditesi yüksektir. Serum antikorlarının yaklaşık % 10'u Ig M'dir. Ig M monomerleri ayrıca bunların antijen bağladıkları, B hücre yüzeyinde de bulunur. Dimerik formdaki Ig A (Şekil 22.19»), tükrük, göz yaşı, ağız sütü gibi vücut sıvıları ve mide bağırsak, solunum ve ürogenital sistemlerinin mukozal salgılarında bulunur. Bu mukozal yüzeylerin tümü, mukozalarla-bağlantılı lenfoid doku (MALT) ile bağlantılı (Şekil 22.2) olup, Ig A üretmektedirler. Bu mukozal yüzeyler yaklaşık 400 m2 dir ve günde yaklaşık lOg olacak şekilde, salgılarla ilgili üretilen Ig A'nm büyük bir kısmını üretirler. Buna karşın, bir bireyde serumda üretilen Ig G ise günde yaklaşık 5 g dir. Bu yüzden, vücudun ürettiği salgısal Ig A miktarı, serum Ig G miktarından daha çoktur. Salgısal form, bir J (bağlanma) zincir peptidi ve Ig A'nın membrandan geçmesine yardımcı olan bir protein sekretör kısmının iki Ig A molekülünü kovalent bağlamasından oluşur (Şekil 22.19). Ig A monomer olarak serumda da bulunur (Tablo 22.2). IgE serumda son derece düşük miktarlarda (serumdaki her 50.000 Ig molekülünden l'i Ig E'dir) bulunur. Düşük konsantrasyonda olmasına rağmen, Ig E önemlidir çünkü erken-tip aşırı duyarlılıklar (allerjiler) Ig E ile gerçekleştirilir (bakınız 22.15). Ig E'nin molekül ağırlığı diğer Ig'lerin çoğundan fazladır, çünkü aynen IgM de olduğu gibi, Ig E'nin de dördüncü bir sabit kısmı bulunmaktadır (Tablo 22.2), (Şekil 22.17). Bu ilave sabit bölge IgE'yi mast hücresinin yüzeylerine bağlama işlevi görmesini sağladığından, allerjik reaksiyonlar için önemli bir ön koşuldur (bakınız Şekil 22.25). Ig D, serumda düşük konsantrasyonda bulunup, fonksiyonu bilinmemektedir. Bununla birlikte, Ig D ile Ig M, B hücrelerinin yüzeyinde boldur, Ig D ise özellikle bellekli B hücrelerinde boldur. Bu yüzden, Ig D yüzey- Ig'leri, ikincil antikor yanıtında önemli olabilir. ü i Antijen Sül Değişken F~1 Sabit

• Şekil 22.19 Immünoglobulin A. Sekretör Ig A (slg A) birbirleriyle bir J zincir proteini ile kovalent olarak bağlanan iki Ig A proteininden oluşan bir dimer olarak çoğu kez vücut salgılarında görülür. Şekilde görülmeyen, salgısal bir protein yapı taşı, Ig A'nın membranlar boyunca taşmımına yardımcı olur.

22.9 Kavramların Gözden Geçirilmesi Ig (antikor) proteinleri iki ağır ve iki hafif, dört zincirden oluşur. Antijen-bağlama bölgeleri ağır ve hafif zincirlerin değişken kısımlarının etkileşimiyle oluşur. Her antikor sınıfının farklı yapısal ve işlevsel özellikleri vardır. • Antijen bağlanmayla ilgili Ig kısımlarını belirtiniz. • İşlevsel ve yapısal özellikleri kullanarak Ig sınıflarını ayırt ediniz.

Antikor Üretimi Bu kısımda, tipik bir antikor yanıtı incelenecek, ilk olarak etkili antijene-spesifik immünite oluşturmak için gerekli kompleks hücre etkileşimleri gözden geçirilecektir. T Hücre • B Hücre etkileşimleri

Antijene yanıt vermek amacıyla immünoglobulinleri üretmek, T hücreleri ve B hücrelerin kendi antijene-spesifik hücre yüzey molekülleri olan, T hücrelerinde TCR ve B hücrelerinde yüzey Ig'i vasıtasıyla, etkileşimlerini kapsamaktadır (Şekil 22.14). Antikor üretim mekanizmasındaki her adım oldukça spesifiktir. Antijene ilk maruz kaldıktan sonra, antijen antijene-spesifik yüzey Ig'i ile bir B hücresiyle bağlanır. Antijen- Ig kompleksi içselleştirilir ve antijen işlenerek MHC II proteinlerine yüklenir. Bu yüzden, B hücresi antijeni yakalamak için kendi yüzey Ig'ini kullanarak, başlangıçta bir antijen-sunucu hücre gibi iş görür. MHC antijen kompleksinin daha sonra hücre yüzeyine gitmesi, yüzeyinde antijenespesifik TCR'si bulunan bir TH2 hücresiyle etkileşmesi için antijeni açığa çıkarmaktadır (bakınız Şekil 22.12b). B hücresinin MHC-antijen kompleksi ile bağlanması, antijene spesifik TH2 hücresini aktive etmekte ve sitokin üretimini uyarmaktadır. Salman sitokinler yakındaki antijene-spesifik B hücrelerini uyarıp, antijene spesifik antikor üretimi ve salgılanmasını aktive etmektedir. Antikor ve TCR Farklılığının Genetik Mekanizması

Her bireyin milyarlarca farklı antikor üretme yeteneği vardır, immün sistem her antijenin doğru antikoru seçmesini nasıl sağlamaktadır? Önceki teoriler her antikoru kodlayan birer gen olduğu yönündeydi, fakat şimdi bu yoğun antikor farklılığını kodlayan genlerin oldukça az sayıda olduğunu biliyoruz. Antikor üretimi, bir Ig üretmek için gerekli genlerin aşamalı olarak yeniden düzenlenmesiyle başlar. Kemik iliğinde lenfositlerin gelişimi esnasında, B hücrelerinde hem ağır ve hem de hafif zincir geni yeniden düzenlenir. Genler olgunlaşan lenfositlerde gen splaysı ve yeniden düzenlenmesiyle (her gen parçası çeşitli kombinasyonlarda karıştırılır ve eşlenir) yeniden çeşitlendirilir. Bu işleme somatik rekombinasyon adı verilmektedir. Şekil 22.20 •,

748 • Bölüm 22 • İmmünolojinin Temelleri

insan K hafif zinciri için tipik bir yeniden düzenlenme ve ifade şeklini göstermektedir. Ağır zincir genleri buna benzer bir şekilde, fakat daha kompleks olarak yeniden düzenlenir. Her olgun B hücresinde final sonuç, tek bir işlevsel ağır zincir geni ve tek bir işlevsel hafif zincir genidir. Yeniden düzenlenen bu genlerin her biri, B hücrelerinin yüzeyinde bir antijen reseptör proteini olarak transkripte edilir ve ifade edilir. Bunlara ilave olarak antijenin Ig genlerindeki genetik hipermutasyonu indüklemesi, ifade edilen antikorların daha çok modifiye olmasını ve farklılaşmasını sağlamaktadır. Çok sayıda olası gen yeniden-düzenlenmesinin, antijene maruz kalındıktan sonra somatik mutasyonları ile birlikte yürümesi, Ig'lerin farklılığında hemen hemen sınırsız açılım sağlar (<3«*sKısım 23.6). Benzer yeniden-düzenlemeler T-hücre gelişiminde de oluşur ve sonuçta T-hücre reseptörlerinde oldukça farklılık oluşturulur. Bununla birlikte, T hücreleri farklılığın boyutunu arttırmak için hipermutasyon mekanizmasını kullanmaz (ötfcKısım 23.8). Antikor Üretimi ve İmmün Bellek

Bir yüzey Ig'ni ifade eden bir B hücresi ile başlandığında, antikor üretimi antijene maruz kalma ile başlar ve aşağıdaki sıraya göre antijene-spesifik antikorun üretimi ve salgılanmasıyla da biter. 1. Antijenler, lenfatik ve kan dolaşım sistemleri vasıtasıyla lenf düğümleri, dalak veya mukozalarla bağıntılı lenfoid doku (MALT) gibi komşu sekonder lenfoid organlara yayılır (Kısmı 22.1 ve Şekli 22.2) Antijene maruz kalma şekli üretilen antikorların yapısını etkiler. Damar içine enjektede edilen antijenler kan yoluyla dalağa giderler, burada çoğunlukla Ig M ve IgG ile serum IgA antikorları oluşur. Eğer antijen derialtı, deri-içi, topik veya periton-içine verilecek olursa lenfatik sistem antijeni en yakın lenf düDeğişken bölge genleri

Sabit-bölge geni

Birleşme genleri 1

J 2 -y- J

S

K

ırıRNA Translasyon Kappa zincir proteini

ğümüne taşıyıp, yine çoğunlukla IgM, Ig G ve serum IgA üretimini uyarır. Mukozal yüzeylerden giren antijen en yakın MALT'a ulaşır. Örneğin, ağız yoluyla alınan antijen MALT'a sindirim sisteminde ulaşarak, primer IgM yanıtı ve sekonder antijene spesifik salgısal IgA yanıtıyla, tercihen spesifik antikor üretimini barsakta uyarmaktadır. 2. İlk antijene maruz kalındıktan sonra, her antijenle uyarılan B hücresi, hem antikor-salgılayan plazma hücreleri ve hem de bellekli hücreler oluşturmak üzere çoğalır ve farklılaşır (Şekil 22.14). Plazma hücreleri nispeten kısa-ömürlüdür (1 haftadan az), fakat bu primer antikor yanıtında bol miktarda IgM üretir ve salgılar (Şekil 22.21*). Kanda görülen spesifik antikor yanıtından önce bir latent dönemi vardır, bunu antikor titresindeki giderek artan bir dönem izleyip, daha sonrada primer antikor yanıtında yavaş bir düşüş izler. 3. Antijene ilk maruz kalmayla üretilen bellekli B hücreleri yıllarca yaşayabilir. Daha sonra, immünize-edici antijene yeniden maruz kalınırsa, bellekli hücreler T-hücre aktivasyonuna gerek duymaksızın, hızla plazma hücrelerine dönüşür ve Ig G üretmeye başlar. Yeniden maruz kalma sonrası, antikor fitresi hızla ilk maruz kalmadaki titrenin 10-100 kat fazlasına çıkar. Antikor titresindeki bu artış ikincil antikor yanıtı olarak gösterilir (Şekil 22.21) Sekonder yanıt immünolojik belleğin sonucu olup, primer yanıta göre daha hızlı ve daha bol antikor üretilir. Sekonder yanıt Ig M'den Ig G'ye geçişle de karakterize edilir ve sınıf değişimi denilen bir olaydır (Şekil 22.2). 4. Süre boyunca titre yavaşça azalır, fakat ayni antijene sonradan maruz kalınırsa, başka bir sekonder yanıta neden olabilir. Sekonder yanıt "ek aşı" olarak bilinen immünizasyon işleminin temelidir (örneğin, evcil hayvanlara verilen yıllık

• Şekil 22.20 insan B hücrelerinde immünoglobulin kappa zinciri genlerinin yeniden düzenlenmesi. Gen segmentleri 2. kromozomdaki kappa Germ-line DNA (K) hafif zincirde ardışık olarak düzenlenmiştir. DNA yeni-düzenlenmesi, olgunlaşan B hücrelerinde tamamlanır. 150 V (değişken) sekanstan herhangi biri 5 J DUA {aktif gen) sekansından birisiyle birleşebilir. Bu yüzden, 750 (150V x 5) rekombinasyon olasıdır ve 750 farklı kappa Primer RNA transkripti zinciri kodlar, fakat gerçekte her hücrede sadece bir yeniden-düzenlenme oluşur. B hücrelerin her birinde, ağır zincir genlerinde de benzer bir işlem oluşur. Ağır zincir gen kompleksinin daha da fazla gen segmentine sahip olması, daha fazla sayıda rekombinasyona ve potansiyel ağır zincirlerin oluşumuna olanak sağlar, fakat yine sadece bir ağır zincir yeniden düzenlenmesi her olgun B hücresinde gerçekleşir. Olgun Ig proteini, translasyondan sonra, iki hafif zincir proteini ile iki ağır zincir proteininin birleştirilmesiyle gerçekleştirilir (<3O&Kısım 23.6).

22.11 • Kompleman, Antikorlar ve Patojenin Yıkımı • 749

İkincil yanıt

Birincil yanıt

Çoğunlukla IgG Yeniden antijen enjeksiyonu Antijen enjeksiyonu

100

200

Gün (gün)

• Şekil 22.21 Serumdaki birincil ve ikincil antikor yanıtı. O. ve 100. günde enjekte edilen antijen, ikincil yanıtı indüklemek için özdeş olmalıdır. Güçlendirici bir yanıt olarak bilinen, ikincil yanıt, birincil yanıttan 10 kattan daha fazla olabilmelidir. Birincil yanıttaki Ig M üretiminden ikincil yanıttaki Ig G üretimine olan sınıf değişikliği kayda değerdir.

kuduz aşısı). Peryodik tekrarlanan immünizasyonlar belirli bir antijene özgü dolaşan antikor düzeylerini korur ve her enfeksiyon hastalığına karşı uzun-süreli aktif koruma sağlar (bakınız Kısım 22.12). 22.10 Kavramların Gözden Geçirilmesi Antikor üretimi, antijenin antijeni işleyen ve onu antijene spesifik TH2 hücresine sunan antijene-özgü bir B hücresiyle temasıyla başlamaktadır. Aktive olan TH2 hücresi, antijene spesifik B hücresine antikor üretmesi için sinyal gönderir. Aktive edilen B hücrelere bellekli hücreler olarak uzun yıllar yaşar ve antijene yeniden maruz kaldıkça hızla bol miktarda antikor üretebilir. • •

B hücreleri APC'ler olarak nasıl iş görür? TH2 hücreleri antijene spesifik B hücrelerini nasıl aktive eder? • "Booster" immünizasyonun mantığını açıklayınız.

22.11

Kompleman, Antikorlar ve Patojenin Yıkımı

Ardışık olarak etkileşen ilişkili bir protein grubu olan kompleman hem doğal ve hem de adaptif immünitede etkin bir unsur olarak önemli rol oynar. Kompleman proteinleri çoğu kez antijen antikor kompleksleriyle etkileşimler sonucu aktive edilir, fakat spesifik antikorların yokluğunda doğal mekanizmalarla da aktive edilebilirler. Kompleman proteinleri ardışık olarak reaksiyona girerek, bakteriyal hücrelerin Hzizine neden olabilir veya fagositler tarafından tanınmayı arttırmak için antijen-sunucu hücreleri işaretleyerek, antijenlerin yıkımının hızlanmasına yol açabilir.

Klasik Kompleman Aktivasyontı ve Hücre Hasan

Kompleman, bazısı enzimatik aktiviteye sahip, çeşitli proteinlerden oluşur. Bu proteinler, bakteri hücrelerindeki antijen-antikor kompleksleriyle ard arda, düzenli bir şekilde aktive edilir. Sonuçta hücre membranı hasar görür, içerikleri sızar, bakteri hücresi olasılıkla erir. Kompleman proteinleri tüm bireylerin serumunda karşılaştırılabilir düzeylerde bulunur. Antikorun asıl görevi, istilacı hücreleri tanımak ve saldırı için kompleman sistemini aktive etmektir. Bu yüzden, her biri tek bir antijene özgü olan bazı antikorlar, mevcut kompleman proteinlerini destekleyebilir, immün sistem istilacı her ajana saldırmak için ayrı enzimlere gereksinmez. Komplemanın özgün proteinleri Cl, C2, C3 v.d şeklinde isimlendirilir. Komplemanın klasik aktivasyonu sadece Ig G ve IgM sınıfı antikorlarla oluşur (bakınız Tablo 22.2). Özellikle hücre yüzeylerinde, Ig G ve Ig M antikoları antijeni bağladığında, antikorlar daima-mevcut kompleman proteinlerini bağlar (Şekil 22.22•). Kompleman proteinleri kademeli bir şekilde ard arda reaksiyona girer. Komplemanın bileşenlerinden birinin aktivasyonuyla diğeri ve sonra da geri kalan ötekileri aktive olurlar. Anahtar adımlar (1) antijenin antikoru bağlanması ile başlar; (2) Cl bileşenlerinin (CIq, Clr ve Cls) antijen-antikor kompleksine bağlanması, bitişik membran bölgesinde C4-C2 bağlanmasma; C3'ün aktivasyonuna ve bağlanmasına yol açar; (3) membrana bağlı C3 ikinci bir membran bölgesinde C5-C6-C7 kompleksinin oluşumunu katalizler; daha sonrada C8 ve C9'un C5-C6-C7 kompleksiyle bir araya gelmesi, membranda hasara ve hücrenin erimesine yal açmaktadır (Şekil 22.23»). C5-9 bileşenleri membran atak kompleksi (MAC) olarak bilinir çünkü bir por oluşturmak için tek bir membranda etkileşirler. Komplemanın aktivasyonunun yan ürünleri anafilatoksinler denilen kimyasal-cezbedicilerdir. Bu maddeler komplemanın döküntü yaptığı bölgede yangısal reaksiyonlara neden olurlar (bakınız Kısım 22.15). C3'ün yer aldığı reaksiyonlar, fagositlerin aktivasyonunu ve kemotaktik çekimi içerdiğinden, sonuçta fagositozun artmasına yol açarlar. C5'in yer aldığı reaksiyonlar T-hücrelerini çekmeye ve sitokin salınımına neden olurlar. Kompleman, özgün antikorlarla bağlantılı olarak kullanıldığında, bazı gram-negatif Bacteria için bakterisidal ve litik bir ajandır. Buna karşın, grampozitif bakteriler, özgün antikorlarının varlığında bile, kompleman ile öldürülmez. Bununla birlikte, gram-pozitif Bacteria, opsonizasyon ile yok edilebilirler. Opsonizasyon

Antikor bir hücrenin yüzeyindeki antijene bağlandığında, hücre çok daha kolay bir şekilde fagosite edilecektir. Bunun nedeni, makrofajlar ve B hücrelerini içeren çoğu fagositin, C3 reseptörleri (C3R) ya-

750 • Bölüm 22 • İmmünolojinin Temelleri

Membran hasarı ve hücre lizizi

Fagositoz Anafilaksis

C1q

(a) Klasik kompleman aktivasyonu

Hücre yüzeyi

C3 C4

-C3 MBL

(b) Properdin (P) ile aktive edilen alternatif yol (P)

C6 C5 \

C7 ,C8

C9

(d)

MBL

(c) Mannan-bağlayıcı lektin (MBL) yoluyla aktivasyon

• Şekil 22.22 Kompleman aktivasyonu. (a) Bir hücreyi yok etmek için etkileşen, klasik kompleman yolu bileşenlerinin dizilimi, düzenlenmesi ve aktivitesi. Panel 1: Antikor ve Cl protein kompleksi (Clq, Clr ve Cls)'nin antikora bağlanması, Panel: 2 C42 kompleksinin C3 ile etkileşimi, Panel 3: C423 kompleksinin komşu bir membran bölgesine bağlanan C5'i aktive etmesi, Panel: 4 C6, C7, C8 ve C9'un ard arda C5'e bağlanması, membranda bir delik açmaktadır. C5-9, membran atak kompleksi (MAC) dir. (b) Alternatif yol. Properdin (P) membrana bağlanır, bunu C3B kompleksi izler. Kompleks, yukarıda panel 3 de olduğu gibi, C5'i aktive eder ve MAC oluşumunu başlatır (yukarıda panel 4). (c) Mannan-bağlayıcı lektin (MBL) yolu. MBL, bakteri membranmdaki mannoza bağlanır ve bir C423 kompleksi buna bağlanır. Kompleks, yukarıdaki panel 3'de olduğu gibi CS'i aktive eder ve MAC oluşumunu başlatır (Yukarıda panel 4) (d) C5-C9 kompleman bileşenlerince oluşturulan membran porunun şematik bir görünüşü.

nısıra antikor reseptörleri (FcR)'ne sahip olmasıdır. Bu reseptörler sırasıyla antikorun sabit kısmını ve C3 kompleman proteinini bağlar. Normal fagositik işlemler antikor bağlama ile yaklaşık 10-kat arttırılır ve C3 fiksasyonu (bağlama) ile de bir 10-kat daha arttırılır. Fagositozun antikor veya kompleman tarafından bu artışına opsonizasyon adı verilir. Gram-pozitif Bacteria de bu şekilde opsonize edilebilmesi, fagositozun artmanısa ve patojenin parçalanmasına yol açar. Fakat, gram-negatif bakteriler de olduğu gibi antikorların klasik kompleman yol izini aktive etmesi ve opsonizasyonu gerçekleştirebilmesi ilk önce gram-pozitif hücredeki yüzey antijenlerine bağlanmayı gerektirir. Antikora Bağımlı-Olmayan Kompleman Aktivasyonu

Alternatif yol, opsonizasyonu uyarmak ve C5-9 MAC'ı aktive etmek için klasik kompleman yolu

bileşenlerinden bazılarını kullanan, kompleman aktivasyonunun spesifik-olmayan bir yöntemidir. Alternatif yol-izi,komplemanı klasik kompleman yoluyla bağlantılı olmayan bazı serum proteinlerinin faaliyetleriyle aktive eder (Şekli 22.22b) Alternatif yol, antikorların yerine, özgün alternatif yol proteinlerini kullanarak, hem gram-pozitif ve hem de gram-negatif Bacteria yüzeyindeki molekülleri hedef olarak seçer. Alternatif yol aktivasyonunda ilk adım, bir serum proteini olan properdin (P)'in bakteri hücre yüzeyine bağlanmasıdır. Membranabağlı P, C3B (kompleman proteini C3 ve alternatif yol serum proteini faktör B'yi içeren çözünür bir kompleks)'yi bağlar. Hücre yüzeyine fikse edilen C3BP kompleksi, klasik kompleman yolundaki membrana bağlı C423 kompleksi gibi hareket etmesi ve C5-9 MAC oluşumunu katalizlemesi, hücrenin parçalanmasına yol açmaktadır. Alternatif yolla hücre yüzeyine C3'ün tutunması, fagositin C3

22,12 • Doğal İmmünite • 751 • Spesifik-olmayan şekilde komplemam aktive eden iki mekanizma tanımlayınız.

Delikler

• Şekil 22.23 Bakteri hücrelerinde kompleman aktivitesi. Şekil, Salmonella paratyphi'mn bir elektron mikrografıdır. Negatif boyanmış preparat, hücre zan antijenleri, spesifik antikor ve kompleman içeren bir reaksiyon sonucunda bakteri hücre zarında oluşturulan delikleri göstermektedir.

reseptörleriyle opsanizasyon yapılmasını sağladığından fagositozun artmasına neden olmaktadır. Kompleman sistemini aktive etmenin bir diğer yolu, mannan-bağlayıcı lektin (MBL) yoludur, bu

yol, bakteri hücre yüzeylerinde bulunan, özgün mannoz-içeren polisakkaritlere bağlanan, bir serum MBL proteininin aktivitesine bağlıdır (Şekil 22.22c). MBL-polisakkarit kompleksi klasik kompleman sisteminin Cl kompleksine benzer ve C4, C2 ve C3 bileşenlerini hücre yüzeyine bağlar, ayrıca yine C5-9 MAC oluşumunu katalizleyip, bakteri hücresinin erimesine veya opsonizasyonuna yol açar. Hem alternatif yol ve hem de MBL yolu, istilacı bakterileri spesifik-olmayan şekilde hedef alır ve membran atak kompleksinin aktivasyonuna yol açıp, opsonizasyonu arttırır. Toll-benzeri reseptörlerde olduğu gibi, properdin ve MBL her ikisi de patern tanıma molekülü PRM) oldukları için, patojenle-bağmtılı moleküler patterni hedef alırlar (bakınız Kısım 22.2 ve a°öKısım 23.1). Ayrıca, her ikisi de doğal immün sisteminin bir parçası olduğu için, ne properdin yolu ve ne de MBL yolu önceden antijene maruz kalmaya veya antikorların olmasına gerek duymaz. Klasik kompleman yolunda olduğu gibi, alternatif ve MBL yolların C3'ü aktive etmesi, C5-9 MAC oluşumunu tetikler ve C3 membran kompleksinin birikimine yol açıp opsonizasyonu attırır. 22.11 Kavramların Gözden Geçirilmesi Kompleman sistemi bakteri hücre yıkımını ve opsonizasyonu katalizler. Kompleman antikor etkileşimleriyle veya spesifik-olmayan aktivatörlerin etkileşimleriyle tetiklenir. Kompleman, hem doğal ve hem de adaptif konukçu savunmasının kritik bir unsurudur. •

Komplemam bağlayan immünoglobulinleri belirtiniz.

•

Opsonizasyonu gerçekleştiren ve hücrenin erimesini teşvik eden kompleman bileşenlerini belirtiniz.

IMMUNITE VE ENFEKSIYOZ HASTALIĞIN ÖNLENMESİ Şu ana dek doğal immünitenin temel özellikleri anlatılmıştır. Şimdi, yapay yollarla kazanılan immüniteye geçilecektir. Burada, immünojenlerin hazırlanmasında kullanılan standart ve deneysel tekniklerin her ikisi de tartışılacaktır. Bu yöntemlerin uygulanması, çeşitli patojen ve ürünlerine karış adaptif immün yanıtları güvenli bir şekilde indükleme yeteneğini geliştirmiştir. Yapay immünizasyon, bazı enfeksiyon hastalıklarına karşı en iyi silah olarak durmaktadır.

Doğal immünite Doğal ve adaptif immün yanıtın her ikisininde vücuttaki rolü, enfeksiyonun sonuçlarından konukçuyu korumaktır. Hem doğal ve hem de adaptif immünite yaşamımızı sürdürmek için gereklidir. Örneğin, doğal immün genetik kusurlu bireylerin nötrofil veya makrofaj gelişimi engellediğinden, bunlar patojenleri yutma ve parçalama fonksiyonu olmayan fagositler üretmektedir. Sonuçta, bu bireyler örneğin, maruz kalınan tüm çevreden izole edilme gibi, tıbbi müdahale olmadan yaşamazlar. Normal bir çevrede çeşitli bakteriler, virüsler ve funguslardan sürekli enfeksiyon kaparlar ve genellikle genç bir yaşta ölürler. Adaptif immünitenin rolü gerekenden hiç de az değildir. Adaptif İmmünite ve Enfeksiyon Hastalığının Önlenmesi

Hayvanlar, adaptif bir immün yanıta yol açan doğal bir enfeksiyon sayesinde, çeşitli hastalıklara karşı normalde doğal aktif immünite geliştirir. Doğal aktif immünite, enfeksiyonlar yoluyla antijenlere maruz kalmanın sonucu olup, genelde T hücreleriyle olduğu kadar antikorlara da dayanan koruyucu immünitenin sonucudur. Hastalık dayanıklığmda aktif immünitenin önemi, genetik bozukluklar gösteren bazı bireylerde çarpıcı bir şekilde görülür. Örneğin, agammaglobulinemia B hücrelerindeki genetik bozukluk nedeniyle hastalarının antikor üretemediği bir hastalıktır. Böyle kişiler, tekrarlayan, yaşamı-tehdit edici bakteriydi enfeksiyonlardan çok sıkıntı çekerler, fakat virüslere karşı normal immün yanıtlarını geliştirirler. Bu yüzden, antikor-aracılığıyla oluşan immünite, özellikle bakteriler olmak üzere, hücre-dışı patojenlerden korumak için gereklidir. DiGeorge sendromlu bireylerde, timusun olgunlaşması engellenen bir gelişim kusuru olduğu için, olgun T hücrelerinin üretimi, virüsler ve diğer hücre-içi patojenlerle tekrarlayan ciddi enfeksiyonlar nedeniyle sıkıntı yaratmaktadır. Bu yüzden Di-

752 • Bölüm 22 • İmmünolojinin Temelleri George Sendromunda görülen T-hücresi immün yetersizlik sorunları, T-Hücre immünitesi için esas koruyucu rolü olan hücre-içi patojenlerden korunmayı belirler. Adaptif immün yanıtın genel eksikliği kazanılmış immün yetmezlik sendrom'lu (AİDS) hastalarda da gözlenmiştir. AİDS hastalarında, insan immün yetmezlik virüsü (HTV) ile olan enfeksiyon, eğer kontrol edilmezse, CD4 (TH) hücrelerinin hemen hemen tümüyle tükenmesine neden olabildiği için, etkin antikor aracılı ve hücresel (T hücre aracılı) immünitenin kaybına neden olur. Böyle bireyler tekrarlayan, şiddetli viral, bakteriyal ve fungal patojenler yoluyla oluşan enfeksiyonlardan sıkıntı çekerler. AİDS'den ölüm, özellikle bu enfeksiyonların biri veya birkaçıyla oluşur (««sKısım 26.14). 22.12 Kavramların Gözden Geçirilmesi Doğal ve adaptif immün yanıtlar canlılığı sürdürebilmek için gereklidir. Doğal immünitenin eksikliği tekrarlayan, kontrol-edilemeyen enfeksiyonlar yoluyla ölüme neden olur. Adaptif immün yanıtın eksikliğinde de kontroledilemeyen enfeksiyon hastalıkları oluşur. • Doğal immünitenin yokluğu nasıl etkiler? • T veya B hücre immünitesi yokluğunun etkileri nelerdir?

22.13

Yapay İmmünite

Spesifik immünitenin enfeksiyöz hastalıklarıyla amaçlı yapay indüklenmesi, enfeksiyöz hastalıkların tedavisi ve önlenmesi için büyük bir silahtır. Bu çeşitli şekillerde oluşabilir. (1) Bir birey antikor oluşumunu indüklemek için bir antijene maruz kalabilirse, bireylerin antikorları üretmeleri nedeniyle yapay aktif immünite olarak bilinen bir immünite tipi oluşur. Bu immünizasyon işlemi genellikle aşılama olarak bilinir (2) Alternatif olarak, bir kimse söz konusu antijene karşı önceden oluşmuş antikorları taşıyan başka birisinden türevlenen bir saf immünoglobulini (gamma globulin) veya bir antiserumu enjeksiyonla alabilir. Bu, yapay pasif immünite olarak adlandırılır, çünkü alınan her antikor, antikor-üretim işleminde aktif bir rol oynamaz. (3) Bazı durumlarda, doğal pasif immünite oluşabilir. Doğduktan birkaç ay sonra, yeni doğanların kanlarında anneden gelen Ig antikorlara sahiptirler. Bu

antikorlar, doğumdan önce plasenta yoluyla geçip, yeni doğanın immün sistemi olgunlaşıncaya kadar hastalıklara karşı koruma sağlar. Aktif ve pasif, immünite Tablo 22.3'de karşılaştırılmıştır. Aktif immünitede, antijen alındıktan sonra konukçuda temel değişiklikler oluşur: immün hücreler bol miktarda antijene-özgü immün efektör molekülleri (Ig'ler) ve hücreleri üretir. Ayni antijenin ikinci bir ("booster") dozu, hızlı ve yüksek titrede ikincil bir yanıta neden olur (bakınız Şekil 22.21). Aktif immünite çoğu kez yaşam boyu kalır. Pasif olarak immünize edilen bir kişi, başlangıç enjeksiyonunda aldığından daha fazla antikora asla sahip olamaz. Bu antikorlar vücuttan giderek kaybolur. Ayrıca, antijene daha sonra maruz kalındığında, antijen ikincil bir yanıta yol açmaz. Pasif yapay immünite genellikle terapötik olup, halen hastalıktan zarar gören bir kimseyi tedavi amacıyla oluşturulur. Örneğin, tetanoz toksoidi (bakınız aşağıdaki kısım) bir kimseyi gelecekte Clostridium tetani ekzotoksini ile karşılaşmasına karşı aktif olarak immünize eder, oysa tetanoz antiserumu C. tetani'ye maruz kalındığından şüphelenilen bir kişiyi pasif olarak immünize etmek için verilir. Buna karşın, aktif yapay immünite, bir kimseyi bir patojenin saldırısına karşı korumak için, genellikle profilaktik olarak kullanılır. İmmünizasyon Yapay aktif immüniteyi indüklemede kullanılan materyal olan antijen veya antijenlerin karışımı, bir aşı veya bir immünojen olarak bilinir ve böyle bir immün yanıt üreten işlem immünizasyondur. Aktif immünite oluşumu için tasarlanan bir aşı ile immünizasyon, enfeksiyon için ve diğer çapraz reaksiyonlar için risk taşıyabilir. Riski azaltmak için, patojenler ve ürünleri çoğu kez inaktif hale getirilir. Örneğin, patojenik bakterilerden oluşan bazı immünojenler fenol veya formaldehit gibi kimyasal maddeler veya sıcaklık gibi fiziksel ajanlarla öldürülür. Formaldehit saik polio aşısında olduğu gibi, aşılardaki virüsleri inaktif hale getirmek için de kullanılır. Buna karşın, ekzotoksinle oluşan hastalıklardan dolayı, ekzotoksinin aktif formu immünojen olarak kullanılmaz. Bazı ekzotoksinler kimyasal olarak modifiye edilebilir, böylece bunların antijenlikleri kalmakla birlikte, artık toksik olmamaktadırlar. Böyle modifiye

Tablo 22.3 Aktif ve pasif immünite Aktif immünite

Pasif immünite

Antijene maruz kalma; immünite antijeni enjekte ederek elde edilir. Spesifik yanıt bireysel elde edilen immüniteyle yapılır. İmmün sistem antijenle aktive edilir; immünolojik bellek çalışmaktadır. tmmün yanıt, bellekli hücrelerin uyarılması ile sürdürülebilir (yani destek immünizasyon) îmmün durum haftalar sonraki bir dönemde gelişir.

Antijene maruz kalma yok; immünite antikorları veya antijence-reaktif T hücrelerini enjekte ederek sağlanır. Spesifik immün yanıt ikincil bir konukçuda yapılır. İmmün sistem aktivasyonu yoktur immünolojik bellek yoktur. İmmünite korunamayabilir ve hızla azalır. İmmünite hemen gelişir.

22.13 • Yapay Immünite • 753

bir ekzotoksine toksoid denilmektedir. Toksoidler genellikle immünite oluşturmada orjinal ekzotoksin kadar etkili değildir, fakat bunlar güvenle ve yüksek dozda verilebilir. Canlı hücreler veya virüsle yapılan immünizasyon, genellikle ölü veya inaktif materyalle olandan daha etkilidir. Virülensini kaybetmiş fakat hala immünize edici antijenler olarak kalan bir patojenin, mutant bir susunu izole etmek çoğu kez olasıdır; bu tip suşlar zayıflatılmış suşlar olarak adlandırılır ( cooKısım 21.8) Bununla birlikte, patojenlerin zayıflatılmış suşları hala canlı olduğundan, özellikle immünolojik olarak riske atılan bazı bireyler, bazen immünize edici patojen tarafından aktif hastalığa yakalanırlar. Örneğin, zayıflatılmış poliovirüs aşıları ve smallpox virüs aşılarında olduğu gibi, aşıyla edinilen enfeksiyon hastalıklarıyla bazı ciddi vakalar oluşmuştur (cG&Kısım 25.11). İnsanların kullanımına sunulmuş aşıların özeti Tablo 22.4'de verilmiştir. En etkin viral aşılar zayıflatılmış formda olanlardır. Zayıflatılmış aşılar, yeniden yapılan immünizasyonlardan sonra güçlü bir Tablo 22 4 ' n s a n Enfeksiyöz Hastalıkları İçin Aşılar Hastalık Bakteriyal hastalık Şarbon Difteri Tetanoz Boğmaca

Kullanılan aşı tipi Toksoid Toksoid Toksoid Ölü bakteriler (Bordetella pertussis) veya hücresel olmayan protein-

ikincil yanıt ve yoğun bir antikor yanıtın yanısıra, uzun-süreli T-Hücre aracılı immünite sağlama eğilimindedir. Buna karşın, zayıflatılmış suşların seçimi, standardizasyonu ve korunması zordur. Canlı aşıların ise sınırlı bir raf ömrü vardır ve genellikle yeterli depolama için soğutulmaya gerek duyar. Diğer taraftan, ölü virüs aşıları uzun-süreli bir bellek yanıtı geliştirmeden, kısa-süreli immün yanıt sağlama eğilimdedir. Bakteriyal aşılar neredeyse daima inaktif bir formda verilir, inaktif bakteriyal aşılar, alıcıya enfeksiyon riskine maruz bırakmadan, uzun, süreli antikor-aracılı koruma sağlar. İmmünizasyon Uygulamaları

Bebekler, plasentadan veya emdikleri sütten geçen anneye ait antikorlar şeklinde doğal pasif immünite sahiptir. Sonuç olarak, bebekler yaşamlarının ilk 6 ayı esnasında enfeksiyon hastalıklarına nispeten immündürler. Bununla birlikte, bebekler temel enfeksiyon hastalıklarını önlemek için olabildiğince çabuk immünize edilmelidir, böylece kendi aktif immüniteleri anneye ait pasif immüniteyle yer değiştirebilir. Kısım 22.10'da tartışıldığı gibi, antijene sadece bir kez maruz kalma, yüksek bir antikor fitresine yol açmaz. İlk immünizasyon sonrası, bir dizi "booster" immünizasyonlar yapılarak sekonder bir yanıt ve yüksek bir antikor titresi sağlanmaya çalışır. A.B.D'de çocuklar ve yetişkinler için önerilen aşı programı Şekil 22.24«'de gösterilmiştir. En

ler

Tifo Paratifo Kolera

Ölü bakteri (Salmonella typhi) Ölü bakteri (Salmonella paratyphi) Ölü bakteri veya hücre ekstraktı (Vibrio cholerae) Veba Ölü hücreler veya hücre eksraktı (Yersinia pestis) Tüberküloz Mycobacterium tuberculosis'in zayıflatılmış susu (BÇG) Menenjit Neisseria meningitidis'den saf polisakkarit. Bakteriyal pnömoni Streptococcus pneumoniae'den saf polisakkerit Tifüs Ölü bakteri (Rickettsia prozuazekü) Haemophilus influenzae Konjuge aşı (Haemophilus menenjiti influenzae'nin polisakkariti) Viral hastalıklar Sarı humma Kızamık Kabakulak Kızamıkçık Çocuk felci Grip Kuduz Çiçek Hepatit A Hepatit B Su çiçeği

2004, ABD'de yaşa göre immünizasyon için öneriler Aşı

Doğum-18yaş

>65

> m

Hepatit B Difteri Tetanoz, Boğmaca Haemophilus influenzae tip B İnaktif Poliovirüs Kızamık, kabakulak, kızamıkçık Varicella Pnömokokkal

Zayıflatılmış virüs Zayıflatılmış virüs Zayıflatılmış virüs Zayıflatılmış virüs Zayıflatılmış virüs (sabin veya inaktif virüs (saik) İnaktif virüs İnaktif virüs (insan) veya zayıflatılmış virüs (köpekler ve diğer hayvanlar) Çapraz reaksiyonlu virüs (çiçek) (ötfeKısım 16.13) Rekombinant DNA aşısı Rekombinant DNA aşısı veya inaktif virüs Zayıflatılmış aşı

50-64

19-49

•

•

Hepatit A Grip

m> m

m* •

•

Tümü için önerilen İÜ Riski önceden bilinen bireyler için önerilen (medikal, davranışsal, mesleki veya yüksek riskli diğer indikatörler)

• Şekil 22.24 Amerika Birleşik Devleti'nde çocuklar ve yetişkinler için önerilen immünizasyonlar. Bu immünizasyon kursu, 2004 yılında, Atlanta, GA, Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezi tarafından belirlenmiştir. Herhangi bir yaş grubu, için daha spesifik öneriler için (turistler için önerileri içerecek şekilde), http://www.cdc.gov'deki CDC website'sine başvurunuz.

754 • Bölüm 22 • İmmünolojinin Temelleri

çok önerilen aşılarda, etkin immüniteyi sürdürmek için, peryodik yeniden-immünizasyon gereklidir. Enfeksiyon hastalıklarının kontrolünde immünizasyonım önemi oldukça iyi anlaşılmıştır. Etkin bir aşının bir popülasyona verilmesi, çoğu kez hastalığa yakalanma oranını belirgin olarak azaltır («»öŞekil 26.13 ve 26.23). Bununla birlikte, aşılarla elde edilen immünite derecesi, aşının kalitesi ve miktarıyla olduğu gibi bireylerle de oldukça değişir. Yaşam-boyu immünite tek bir enjeksiyon veya bir seri enjeksiyonla bile nadiren elde edilir ve immünizasyonla indüklenen immün hücreler giderek vücuttan kaybolur. Diğer taraftan, antijenik uyarım, çoğu kez doğal enfeksiyonlar aracılığıyla yapay immünizasyonun yokluğunda bile oluşur. Doğal bir enfeksiyon sekonder bir yanıtı indükleyip, antikor üretiminde bir artışa neden olur. Antijenik uyarımın tümüyle olmadığı durumda, etkin immünitenin süresi, farklı antijenlerle oldukça değişir. Örneğin, tetanoz toksoidine etkin immünite birkaç yıl sürebilir, fakat özel bir influenza virüs aşısınca indüklenen immünite, ikincil bir uyarının yokluğunda, bir veya iki yıl içinde ortadan kaybolabilir. İmmünizasyonlar sadece bireylere yarar sağlamakla kalmaz, ayrıca etkin halk sağlığı önlemleridir, çünkü hastalık immün bireylerin büyük çoğunluğunu oluşturduğu bir popülasyon sayesinde zayıf bir şekilde yayılır (ot*3Kısım 25.5). Pasif İmmünite Pasif immünite, önceden oluşan antikorların enjeksiyonuyla gerçekleştirilir. Antikor-içeren preparat bir serum, bir antiserum veya bir antitoksin (bir toksine karşı yönlendirilen antikorlar) olarak bilinir. Antiserumlar, atlar gibi immünize edilen hayvanlardan veya yüksek antikor titreli insanlardan elde edilir. Bu bireylere hiperimmün denilir. Antiserum veya antoksin, bilinen bir antikor titresi içeriğiyle standardize edilip, antiserumdan yeterli sayıda birim vücutta bulunabilecek herhangi bir antijeni nötralize etmek için enjekte edilmelidir. Pasif immünizasyon için, çeşitli bireylerden toplanan serumdan ayrılan immünoglobulin kısımları da kullanılabilir. Toplanan serumlar, çeşitli antijenlere yapay veya doğal olarak maruz kalmayla indüklenen çeşitli antikorları içerir. — (jHy 22.13 Kavramların Çözden Geçirilmesi Enfeksiyon hastalıklarına karşı immünite ya pasif veya aktif, ya da doğal veya yapay olabilir. Yapay aktif immünite şeklindeki immünizasyon, enfeksiyon hastalıklarım önlemede geniş çapta kullanılır. İmmünizasyon için kullanılan çoğu ajan, ya zayıflatılmış veya inaktif patojenlerdir ya da doğal mikrobiyal ürünlerin inaktif formlarıdır. • Doğal pasif immünite sağlayacak bir örnek veriniz. Doğal pasif immünite, immünize bireylere nasıl yarar sağlar? • Yapay aktif immünite sağlayan bir örnek veriniz. Yapay aktif immünite, immünize bireylere nasıl yarar sağlar?

Yeni İmmünizasyon Stratejileri îmmünizasyon preparatlarmm çoğu, önceki kısım da belirtildiği gibi, tümüyle organizmalardan veya toksoidlerden üretilir. Buna karşın, immünizasyon için uygun antijenleri üretecek başka birçok yöntem vardır. Sentetik ve Genetik Olarak Tasarlanmış İmmünize Edici Ajanlar

Aşı geliştirmek için en basit alternatif yaklaşım, sentetik peptitlerin kullanılmasıdır. Bir aşı yapmak için, bir enfeksiyon ajanındaki bilinen bir epitopla bağlantılı olan bir peptit sentezlenebilir. Örneğin önemli bir hayvan patojeni olan şap virüsüne immüniteden sorumlu protein antijenin yapısı bilinmektedir. Proteininin önemli antijenik determinantını oluşturan 20 amino asitlik sentetik bir peptit yapılmış ve uygun taşıyıcı moleküllere tutturulmuştur. Bu sentetik aşı, şap virüsünü nötralize edici antikor yanıtını oldukça iyi bir şekilde uyarır. Buna karşın, genel bir yöntem olarak, bu yaklaşımın büyük bir sorunu vardır: proteininin tam antijenik profilini gösteren, tüm sekansın, etkin bir aşı yapımı için bilinmesine gerek vardır Bu koşul şap virüsü ve baz dizilimi henüz belirlenmiş diğer bazı patojenler için karşılanmış olup, etkin bir aşı tasarımı için gerekli spesifik antijenik profilin belirlenmesine olanak sağlamaktadır («»sKısım 15.3). Patojenlerin genom biliminden elde edilen bilgileri kullanarak, moleküler biyolojik teknikler aşı yapımında kullanılabilir. Örneğin, herhangi bir virüsteki antijenleri kodlayan genler çiçek virüsüne klonlanabilir ve ifade edilebilir. Genetik olarak tasarlanmış çiçek virüsüyle yapılan inokulasyon, daha sonra klonlanmış genin ürünüyle immüniteyi indüklemek için kullanılabilir. Böyle bir perparat bir rekombinant-vektör aşısıdır. Bu yöntem, antijeni

kodlayan genin tanımlanması ve klonlanmasına ve ayni şekilde antijenik bir protein olarak klonlanmış genin ifade edilmesi için şap virüsünün yeteneğine dayanır. Etkin rekombinant bir çiçek-kuduz aşısı, hayvanlarda kullanılmak üzere geliştirilmiştir. Aşı geliştirmede rekombinant DNA yöntemleri Kısım 31.6'da tartışılacaktır. Başka bir immünizasyon stratejisi, immünojenler olarak rekombinant DNA proteinlerinin üretimini içerir. îlk önce, bir patojen geni uygun bir mikrobiyal konukçuda klonlanmalıdır. Konukçu, klonlanan gen tarafından kodlanan proteini ifade etme yeteneği bakımından seçilmiş olup, daha sonra patojen proteinini ifade edecektir. Patojen proteini de daha sonra alınır ve aşı olarak kullanılır. Bu, bir rekombinant antijen aşısı olarak bilinir. Örneğin, günümüzdeki hepatit B virüsü aşısı, maya hücrelerince ifade edilen temel bir hepatit yüzey protein antijenidir (HbsAg). DNA aşılan

İmmünizasyonun yeni bir yöntemi, konukçu hücrelerinde klonlanan genlerin ifade edilmesine da-

22.15 • Allerji, Aşın Duyarlılık ve Otoimmünite • 755 yanır. Klonlanmış DNA içeren bakteriyal plazmitler, konukçu bir hayvana kas-içine enjekte edilir. Birkaç hafta sonra konukçu, klonlanan DNA tarafından kodlanan proteine karşı Tc hücreleri, TH1 hücreleri ve antikorlar ile yanıt verir. Konukçu hücrelerince alman DNA, immünojenik proteinler üretmek için transkripsiyonu ve translasyonu sağlanıp, klasik bir immün yanıtı tetikler. Bu plazmitlere DNA aşıları denilmektedir. DNA aşıları, bazı klasik immünizasyon stratejileri ötesinde önemli avantajlar sağlar. Örneğin, normalde sadece tek bir yabancı patojen geni klonlanıp enjekte edildiği için, zayıflatılmış bir aşıyla olduğu gibi bir enfeksiyon riski bulunmamaktadır, ikinci olarak, tümöre-spesifik bir antijende olduğu gibi, her antijenin genleri, veya tek bir antijenik determinant bile klonlanabilmekte ve belirli bir hücre yapı taşma immün yanıt oluşumunu yönlendirilmektedir. Yanıt, gen yapısında bir MHC sınıf II promotoru içeriliyorsa, doğrudan APC'leride hedef alabilir. Promotor, MHC II proteinini ifade eden hücreler olan dendritik hücreler, B hücreleri, makrofajlarda sadece seçici ifade sağlar. İfade edilen ve işlenmiş antijen daha sonra hem MHC I ve hem de MHC II proteinlerine sunulabilir. Bu yüzden, biyolojik olarak tasarlanmış bir plazmit, immün T hücrelerini ve antikorları indükleyerek, bir antijeni kodlar ve komple bir immün yanıta neden olur. 22.14 Kavramların Gözden Geçirilmesi Alternatif immünizasyon stratejileri, mikroorganizmalara ve hatta bazı durumlarda protein antijene maruz kalmayı elemine etmek için, biyolojik olarak tasarlanmış molekülleri kullanmaktadır. Bu stratejilerin uygulanması, daha güvenilir ve daha amaçlı aşılar sağlayabilir. • Alternatif immünizasyon stratejilerine iki örnek veriniz. • Her alternatif immünizasyon stratejisinin şimdiki immünizasyon işlemlerine göre avantajı nedir?

IMMUN YANIT HASTALIKLARI immün reaksiyonlar, konukçuda hücre hasarı ve hastalığa neden olabilir. Aşırı-duyarlılık yanıtları

konukçuda hasara yol açan uygun olmayan immün yanıtlardır. Aşırı-duyarlılık hastalıkları, hastalığı üreten antjenlere ve etki mekanizmalarına göre sınıflandırılır (Tablo 22.5). Süper-antij enler bazı bakteri ve virüslerce üretilen proteinler olup, immün hücrelerin yaygın uyarımına neden olmakta ve sonuçta yoğun bir yangısal yanıt aktivasyonuyla konukçuda hasar oluşturmaktadır.

22.15

Allerji, Aşırı Duyarlılık ve Otoimmünite

Antikor-aracılı erken aşırı-duyarlılık genelikle allerji olarak adlandırılır. Hücre-aracılı reaksiyonlar ise geciken-tip aşın duyarlılık şeklinde hastalık oluşturur. Otoimmün hastalıklar kendi antijenlerine karşı oluşturulur. Erken-tip Aşırı-duyarlılık (Tip I Aşırı-duyarlılık) Erken aşırı-duyarlılık veya Tip I aşırı-duyarlılık, Ig E antikoruyla-kaplı mast hücrelerinden vazoaktif ürünlerin salınımı aracılığıyla olur (Tablo 22.5). Genellikle allerji denilen, erken aşırı-duyarlılık reaksiyonları, antijene maruz kaldıktan sonraki dakikalar içinde oluşur. Kişiye ve antijene bağlı olarak, erken aşırı-duyarlılık reaksiyonları çok hafif olabilir ya da anafilaksi olarak bilinen bir durum olan, son derece şiddetli, yaşamı-tehdit eden reaksiyonlara da yol açabilir. Tip I aşırı-duyarhlığa neden olan antijenler allerjen olarak adlandırılır. Popülasyonun yaklaşık %20'si polenler, hayvansal danderler, bazı gıdalar ve çeşitli diğer ajanlar gibi spesifik allerjenlere karış allerjik (anafilaktik) reaksiyonları içeren erken aşırı-duyarlılıklardan etkilenmektedir (Tablo 22.6). Hemen hemen tüm allerjenler, akciğerler ve barsakta olduğu gibi mukoz membranların yüzeyinden alınırlar. Allerjenler, tercihen IgE antikorlarını yapmak için B hücrelerini indükleyen sitokinleri üretmek amacıyla, TH2 hücrelerini uyarır. Dolaşan Ig G veya Ig M gibi antikorlardan çok, mast hücrelerindeki Ig E reseptörlerine, hücre membranını-bağlayıcı sabit kısımmdan bağlanan allerjene spesifik Ig E antikorlarıdır (bakınız Kısım 22.8), (Şekil 22.25*). Mast hücreleri, tüm vücut

Tablo 22.5 Aşın Duyarlılık Sınıflandırma,

Tanımı

Tipi

Erken

Tipli

Sitotoksik"

Tip III

tmmün kompleks

Tip IV

Geciken tip

Immiin mekanizması

Oluşum süresi

Mast hücrelerinin IgE duyarlılaşmasıyla IgG'nin hücre yüzey antijeni ile etkileşimiyle IgG'nin çözünür veya dolaşımdaki antijenleri ile etkileşimiyle TH1 yangısal hücrelerle

Dakikalar

"Otoimmün hastalıklar Tip II, Tip III veya Tip IV reaksiyonlarıyla oluşabilir.

Saatler

Örnekler Arı zehirine reaksiyon (Arı sokması) saman nezlesi İlaç reaksiyonları (penisillin)

Saatler

Sistemik lupus eritematozis (SLE)

Günler

Zehirli sarmaşık Tüberkülin testi

756 • Bölüm 22 • İmmünolojinin Temelleri

Tablo 22.6 Erken Aşın duyarlılık allerjenlcri Polenler ve fungal sporlar (saman nezlesi) Böcek zehirleri (an sokması) Bazı gıdalar HAyvan kepeği Ev tozundaki akarlar

boyunca kılcal damarlara komşu olan bağ dokuyla bağıntılı hareketsiz granülositlerdir (bakınız Kısım 22.2). İmmünize edici allerjene sonradan maruz kalındığında, hücreye bağlı olan Ig E molekülleri antijeni bağlar. İki veya daha fazla Ig E antikorunun bir antijenle çapraz bağlanması, mast hücrelerinden çeşitli çözünür allerjik aracı madde salmımmı tetikler. Bu işleme degranülasyon adı verilmektedir. Bu aracı maddeler, antijene maruz kalındıktan sonraki dakikalar içinde, allerjik semptomlara neden olmaktadır. Genelde, bu semptomlar nispeten kısaömürlüdür, fakat bir allerjen tarafından başlangıçta bir kez duyarlılaştırıldığında, bir kişi sonradan antijene her maruz kalmaya yanıt verebilir. Mast hücrelerinden salınan primer kimyasal aracı moleküller, modifiye amino asitler olan histamin ve serotonin olup, kan damarlarının hızla genişlemesine ve düz kasların kasılmasına neden olarak, sistemik anafilaksi semptomlarının başlamasına yol açmaktadırlar. Bu semptomlar damar genişlemesi (kan basıncında ani bir düşmeye neden olur), bronşiyal ödemle oluşan şiddetli solunum güçlüğü, kızarmış deri, mukus üretimi, hapşırma ve kaşıntılı, sulu gözlerdir. Eğer şiddetli anafilaksi vakaları, düz kas kasılmasını önlemek için adrenalin ile hemen tedavi edilmez ise, kan basıncının artması ve solunumunun hızlanmasıyla, anafilaktik şoktan ölüme yol açabilir. Ne yazıkki, çoğu al-

lerjik reaksiyonun boyutu kaşıntılı, sulu gözler gibi semptomları içeren hafif lokal anafilaksi ile sınırlıdır. Pek ciddi olmayan semptomlar, histamin aracı maddelerini nötralize eden ve antihistaminler denilen ilaçlar ile tedavi edilir. Daha ciddi semptomların tedavisi, steroidler gibi genel yangı giderci ilaçları da içerebilir. Sonuç olarak, artan dozlarda allerjenle immünizasyonla, antikor üretiminde Ig E'den Ig G'ye bir dönüşüm yapılabilir. Antijenle etkileşen Ig G, nispeten az olan Ig E ile etkileşimleri önler, allerjik semptomları durdurur ve daha fazla Ig E üretimini engeller. Bu işleme de duyarsızlaştırma denilir. Geciken-Tip Aşırı-Duyarlılık (Tip IV AşınDuyarlılık

Tip IV aşırı-duyarlılık veya geciken-tip aşırıduyarlılık, (DTH) hücre-aracılı aşırı-duyarlılık olup, TH1 yangısal hücrelerce üretilen yangı oluşumuyla doku hasarına yol açma özelliğindedir. (Tablo 22.5). Semptomlar, temin edilen antijene ikincil maruz kalmadan birkaç saat sonra görülmeye başlar. Maksimal bir yanıt genellikle 24-48 saat içinde oluşur. Tipik antijenler bazı mikroorganizmaları, birkaç kendi-antijenlerini (Tablo 22.7) ve deriye kovalent bağlanıp, yeni antijenler ortaya çıkaran çeşitli kimyasalları içerir. Bu yeni oluşturulan antijenlere karşı aşırı-duyarlılığa, kontakt dermatiti denilir ve zehirli sarmaşık (Şekil 22.26»), mücevherat, kozmetikler, lateks ve diğer kimyasallara karşı deride reaksiyonlar oluşturmaktadır. Etkene maruz kaldıktan sonraki birkaç saat içinde, temas noktasında deride kaşınma hissi oluşur, kızarma ve şişme görülür. Bu belirtiler genel bir yangısal yanıtın göstergeleridir. Çoğu kez kabarcık şeklinde, loAntijen iki antikor molekülünü çapraz bağlar

Antijen

\

B hücresi ' antijene karşı IgE Mast hücresinin yapar bağlanma kısmı Yardımcı fonksiyon

Antijene karşı T-hücre reseptörlü T-hücresi

Antijene sonradan maruz kalma

IgE, dokudaki mast hücrelerini, yüzeydeki IgE reseptör bölgelerine bağlanarak duyarlı hale getirir

Allerjik aracı moleküllerin salınması (histaminler, serotonin ve diğerleri)

i Allerjiler Saman nezlesi, astım

• Şekil 22.2S Erken Aşın-Duyarlılık. Ig E, CH4 kısmı için yüksek-afiniteli yüzey reseptörleri aracılığıyla, mast hücrelerine bağlanır. Bağlanma mast hücrelerini silahlandırır. Antijenin Ig E ile teması ve çapraz bağlanması, vazoaktif aracı-moleküllerin salımmım başlatır ve basit allerjilerden yaşamı-tehdit eden anafilaksiye dek değişen sistemik semptomların oluşmasına neden olur.

22.15 • Allerji, Aşın Duyarlılık ve Otoimmünite • 757 r

.

Tablo 22.7 Otoimmün İnsan Hastalıkları Hastalık Organ veya etkilenen bölge

Mekanizma (aşırı duyarlılık tipi)

Juvenil diyabet (insüline bağlı diabetes mellitus)

Pankreas

Myasthenia gravis

İskelet kası

Goodpasture sendromu

Böbrek

Rhomatoid artrit

Kıkırdak

Hashimoto hastalığı (hipotiroidizm) Erkek kısırlığı (bazı vakalar) Persiniyöz anemi

Tiroid

Hücre, aracılı immünite ve oto antikorlar langerhans adacıklarının yüzey ve sitoplazmik antijenlerine karşı oluşur (II ve IV) İskelet kasındaki asetilkolin reseptörlerine karşı otoantikorlar (II) Böbrek glomerulus temel membramna karşı oto antikorlar (11) Kendi Ig G antikorlarına karşı oto antikorlar; bunlar eklemlerde toplanan komplekslerden oluşup, yangıya ve kıkırdak yıkımına yol açar (III). Tiroid yüzey antijenlerine karşı oto antikorlar (II)

Sperm hücreleri içsel faktör

Oto antikorlar konukçu sperm hücrelerini aglütine eder (II) Oto antikorlar vitamin B]2'nin absorbsiyonunu önler (III).

Sistemik lupus eritematoziz Addison hastalığı

DNA, kardiolipin, nükleoprotein, kam pıhtılaştmcı proteinler Böbrek üstü bezleri

Immün kompleks oluşumu sonucu oluşan çeşitli hücre yapı taşlarına karşı yoğun oto antikor yanıtı (III) Böbrek üstü hücre antijenlerine oto antikorlar (II

Allerjik ensefalit

Beyin

Beyin dokusuna karış hücre aracılı yanıt (IV)

Multipli skleroz

Beyin

Merkezi sinir sistemine karşı hücre-aracılı ve oto antikor yanıtı (II ve IV)

i

/TT\

kalize doku yıkımı, immün hücrelerinin aktivitesi sonucu oluşup, yaklaşık 24-48 saatlik maksimal bir reaksiyonla yinelenir. Gedken-tip aşırı-duyarlılığın bir örneği, tüberküloza yol açan etmen olan Mycobacterium tuberculosis'e karşı immünite gelişimidir (Şekil 22.24). Bu koruyucu hücresel yanıt, tüberküloz üzerine yaptığı çalışmaları esnasında Robert Koch tarafından bulunmuş (c^oKısım 1.6) ve oldukça ayrıntılı çalışılmıştır. Bakteriden türevlenen antijenler, önceden M. tuberculosis enfekte edilmiş bir hayvana deri-altma enjekte edildiğinde, sadece 24-48 saatlik bir dönemden sonra tümüyle gelişen karakteristik bir deri reaksiyonu oluşturur. Buna karşın, Ig E aracılı erken aşırı-duyarlılık yanıtına karşı deri reaksiyonları, antijen enjeksiyonundan sonraki dakikalarda gelişir. Antijenlerin verildiği bölgede, TH1 hücreleri antijenle uyarılmış olup, sitokin salarak çok sayıda makrofajı, çekmekte ve aktive etmektedir. Bu makrofajlarda enjeksiyon bölgesinde belirli bir süre sonra bir deri reaksiyonu oluşturur. Reaksiyon, yangısal bir yanıtın genel semptomları olan, sertleşme, ödem (şişme), eritem (kızarma), ağrı ve lokalize ısınmayla karakterize edilir, (bakınız Kısım 22.3). Aktive edilen makrofajlar istilacı antijeni içine alır ve yok eder. Bu deri yanıtı, M. tuberculosis'e maruz kalmadan önce belirleme yapmada kullanılan tüberkülin testinin temelidir (Şekil 22.26). Bazı mikrobiyal enfeksiyonlar, geciken-tip aşırıduyarlılığa neden olur. Tüberküloz dışında, bunlar leprozis, brusellozis, psittakiyoz (tümü Bacteria türlerince oluşturulur), kabakulak (bir virüs tarafından oluşturulur) ve koksidiyomikozis, histoplazmozis ve blastomikozis (funguslarca oluşturulur) dir. Tüm bu hücresel immün reaksiyonlarda, patojenlerden türevlenen antijenlerin enjeksiyonundan sonra tüberkülin reaksiyonuna benzer şekilde gö-

rülebilen antijene spesifik deri yanıtları oluşması, patojene önceden maruz kalındığını gösterir. Ayrıca TH1 aracılı geciken aşırı-duyarlılık, kendi-antijenlerine karış yönelen oto-immün tepkimelerde de yer alır. Örneğin, TH1 hücreleri allerjik ensefalitis ve Tip I (juvenil) diabetes mellitus (Tablo 22.6)'un patogenezinde yer alır. Buna karşın, şimdi tartışılacağı gibi, bazı oto-immün hastalıklar antikorlar aracılığıyla olur. Otoimmün Hastalıklar (Tip II ve Tip III AşırıDuyarlılık)

Kendi-antijenleri ile reaksiyona eğilimli T ve B hücreleri, normalde lenfosit olgunlaşması işlemi esnasında elemine edilir. Buna karşın, bazı bireylerde T ve B lenfositleri kendi-proteinlerine karşı immün reaksiyonları üretmek için aktive edilmekte ve otoimmün hastalıklara yol açmaktadır (Tablo 22.7). Spesifik bozukluğa bağlı olarak, otoimmün hastalık kendi-antijenleriyle etkileşen antikorlar olan otoantikorları veya kendi yapı taşlarına karşı hücresel bir immün yanıtı içerebilir. Bazı oto-immün hastalıklar oldukça organa spesifiktir. Örneğin, Hashimoto hastalığında, oto-antikorlar tiroglobulin gibi tiroid bezi ürünlerine karşı yapılır. Hastalık tiroid fonksiyonunu etkiler ve Tip II aşırı duyarlılık olarak sınıflandırılır: Antikorlar, konukçu hücrelerin yüzeyinde bulunan antijenlerle etkileşir ve dokunun yıkımına neden olur (Tablo 22.5). Bu durumda, tiroglobulin için olan antikorlar komplemanı bağlar ve tiroid bezi hücrelerinin yıkımına neden olur. Juvenil diyabette (insuline-bağlı şeker hastalığı), pankreasta insülin üreten hücrelere karşı oto-antikorlar görülür, fakat doku yıkımı esas olarak TH1 hücreleri aracılığıyla yangısal reaksiyonlar yoluyla oluşur.

758 • Bölüm 22 • İmmünolojinin Temelleri Organa-spesifik oto-immün hastalıklar bazen klinik olarak daha kolay kontrol edilir çünkü otoimmün hipotiroidismde tiroksin veya juvenil diabette insulinde olduğu gibi, organ fonksiyonunun ürünü çoğu kez başka bir kaynaktan saf olarak sağlanabilir. SLE ve benzeri birçok organı etkileyen hastalıklar, steroid ilaçlarının kullanımında olduğu gibi, sadece immün sistemi baskılayıcı tedaviyle kontrol edilebilir. Buna karşın, steroid tedavinin taşıdığı riskler de vardır. Genel olarak immün sistemin baskılanması, fırsatçı enfeksiyonların şansını belirgin olarak arttırır. Kalıtımın, oto-immün hastalıkların tipi, yakalanma oranı ve şiddeti üzerinde önemli etkisi vardır. Bazı oto-immün hastalıkların bazı başlıca doku-uygunluk kompleksi (MHC) antijenlerinin bulunuşuyla sıkı bağlantısı vardır (bakınız Kısım 22.6; «söaKısım 23.3). Farelerde yapılan model otoimmün hastalık çalışmaları, böyle genetik bir bağlantıyı destekler, fakat oto-immünitenin gelişimi için gerekli tüm koşullar, cinsiyet gibi diğer faktörlere de bağlı olabilir. Örneğin, kadınlarda erkeklere göre SLE gelişimi 20 kata kadar daha fazla olabilir. 22.15 Kavramların Çözden Geçirilmesi Aşırı-duyarlılık, yabancı antijenler hücresel veya antikor immün yanıtlarını indüklediğinde oluşur ve konukçuda doku hasarına yol açar. Oto-immünite, immün yanıt kendi-antijenlerine karşı yöneldiğinde oluşur ve konukçuda doku hasarı yapar. • Antijenleri ve etkenlerini dikkate alarak erken aşırıduyarlılık ve geciken aşırı-duyarlılık arasındaki farkı belirtiniz. • Antijenleri ve immün etkenlerini dikkate alarak otoimmün hastalığının iki ana sınıfını tanımlayınız. • Şekil 22.26 Hücre aracılı immünite (a) Bir kol üzerinde zehirli sarmaşık kabarcıkları. Kabaran lekeler en büyük şekilde, Rhus cinsi bitkilere maruz kalındıktan yaklaşık 24-48 saat sonra, duyarlı kişilerde görülür, (b) Geciken-aşın duyarlılık için tipik olarak, pozitif bir tüberkülin testi. Önkolda yangının oluşturduğu kızarık bölge 1,5 cm çapındadır. Her iki reaksiyonda, antijeneözgüTHl hücrelerinin faaliyeti sunucudur.

Sistemik lupus eritematoziz (SLE), Tip III aşırı duyarlılığın açık bir örneğidir: Antikorların çözünür proteinlere bağlanarak, ürettikleri çözünmez immün kompleksler, komplemanın birikmesine ve yangıya neden olmaktadır. Tip III aşırı-duyarlılık, bir immün kompleks bozukluğudur (Tablo 22.5). Bu ve buna benzer diğer hastalıklar, çözünür, dolaşan kendi antijenlerine karşı büyük çapta oto-antikor üretimini içerir. SLE'de olduğu gibi, antijenler nukleoproteinleri ve DNA'yi içerir. Hastalık semptomları, böbrek, akciğer ve dalak gibi farklı vücut dokularında biriken kan dolaşımındaki antijen antikor komplekslerince indüklenir. Kompleman fiksasyonu ve sonuçtaki litik ve yangısal yanıtlar, kompleksin birikim bölgelerinde, lokal, çoğu kez şiddetli hücre hasarına yol açar.

22.16

Süper Antijenler

Bakteriyal toksinlerin birçok farklı sınıfının etki mekanizmaları 21. Bölümde tartışılmıştır. Çoğu toksinler, konukçu hücreyle doğrudan etkileşerek doku hasarına neden olurlar. Örneğin, endotoksinler çeşitli hücre tipleriyle doğrudan etkileşip, endojen pirojenlerin ve diğer çözünür aracı moleküllerin salınımma ve ateş ile genel yangıya yal açmaktadır (bakınız Kısım 22.2). Çoğu ekzotoksinler de hücre hasarına neden olmak için hücreler ile doğrudan etkileşir (aoöKısım 22.10 ve 22.11). Buna karşın, bazı ekzotoksinler, süper antijenler, yoğun konukçu doku hasarı oluşturmak için yeni bir immün mekanizmayı kullanarak, konukçu hücrelerde dolaylı-olarak etki eder. T Hücrelerinin Süper antijen Aktivasyonu Süper antijenler çok kuvvetli yanıta neden olma yeteneğinde olan proteinlerdir çünkü bunlar normal bir immün yanıta göre daha çok T hücrelerini aktive etmektedirler. Süper antijenler, TÇR'ye bağlanma şekliyle klasik antijenlerden ayrılırlar. Çoğu

• Değerlendirme Sorulan • 759

süper antijen virüsler ve bakterilerce üretilir. Özellikle streptokoklar ve stafilokoklor, farklı ve çok güçlü birçok süper antijen üretir (ooç>Tablo 21.4). Klasik yabancı antijenler TCR'ye, antijenbağlanma bölgesinin değişken (V) kısmından bağlanır. Tipik bir immün yanıtta, normalde mevcut tüm T hücrelerinin % 0.01'inden daha azı, klasik yabancı bir antijenle etkileşir (bakınız Kısım 22.5). Buna karşın, süper antijenler TCR'ye antijenespesifik TCR bağlanma bölgesinin dışında olan TCR'nin V/3 kısmından bağlanır. Süper antijenler tüm TCR'lere paylaşımlı bir yapıyla bağlanır ve bazı farklı TCR'ler ayni yapıyı antijen-bağlanma bölgesinin dışında paylaşır. Bazı durumlarda, maruz kalınan süper antijen, tüm T hücrelerinin % 5-%25'inin bağlanmasına ve aktivasyonuna yal açabilir. Süper antijenler ayni şekilde, sınıf IIMHC moleküllerini de, yine normal peptit bağlanma bölgesinin dışındaki spesifik bir yerinden bağlamaktadır (Şekil 22.27»). Bu hücre yüzey etkileşimleri, klasik antijen sunmayı taklit ederek (bakınız Kısım 22.7), çok sayıda T hücresini aktive eder. Aktive edilen T hücreleri, buna karşılık sitokinleri üretir. Sitokinler, özellikle makrofajlar ve diğer fagositler olmak üzere, daha sonra diğer hücreleri uyarır. Yoğun sitokin üretimi nedeniyle, bu hücre-aracılı yanıt, çoğu kez ateş, diyare, kusma, mukus üretimi ve sistemik şokla sonuçlanan, sistemik yangısal reaksiyonlarla karakterize edilir. Ekstrem durumlarda, süper antijenlere maruz kalma öldürücü olabilir. Süper antijen şoku, Kısım 22.3'de tartışılan septik şoktan pek ayırt edilemez. Bazı hastalıklar süper antijenlere dayandırılabilir ve önceden belirtilmiştir («3°oKısmı 21.10 ve Tablo 21.4) Kayda diğer süper antijen hastalıkları, Staphylococcus aureus gıda zehirlenmesinin içermekte ve ateş, kusma, diyareyle karakterize edilen, stafilokokkal enteroktoksinleri, gibi etki eden çeşitli süper antijenlerden birisiyle oluşturulmaktadır.

Antijen-sunucu hücre

• Şekil 22.22 Bakleriyal süper antijenler. Süper antijenler, hem MHC ve hemde TCR'ye normal bağlanma bölgesinin dışında bağlanarak iş görmektedir. Süper antijenler MHC ve TCR proteinlerinin korunmuş bölgelerine bağlandıkları için, süper antijenler çok sayıda hücreyle etkileşip, etkin T-hücre aktivasyonunu, sitokin salınımını ve hatta sistemik yangıyı uyanr.

Staphylococcus aureus, toksik şok sendromundan so-

rumlu süper antijeni de üretir. Streptococcus pyogenes, kızıldan sorumlu süper antijen olan, eritrojenik toksini üretir (co&Şekil 26.25). 22.16 Kavramların Gözden Geçirilmesi Süper antijenler çok sayıda T hücresini farklı bir şekilde bağlar ve aktive eder. Süper antijenlerce-aktive edilen T hücreleri, etkin yangısal reaksiyonlarla sistemik hastalıkları üretebilirler. •

Normal ve süper antijenlerin T hücrelerini aktive etmesini ayırt ediniz. • Süper antijenlerin T hücreleri ve APC'lere bağlanma bölgelerini belirtiniz.

DEĞERLENDİRME SORULARI 1.

İmmün yanıtta yer alan fagositik ve antijene-spesifik hücrelerin orijini nedir? B hücreleri ve T hücrelerinin olgunlaşmasını izleyiniz (CS^Kısım 22.1). 2. Pattern tanıma molekülleri (PRM'leri) tarafından tanınan bir patojenle-bağıntılı moleküler pattern nedir? Bu moleküller arasındaki etkileşimin önemi nedir? (0G3 Kısım 22.2) 3. Özellikle oksijene-bağlı mekanizmaları dikkate alarak, fagositlerin mikroorganizmaları nasıl yuttuğunu ve öldürdüğünü açıklayınız (oOsKısım 22.3). 4. Adaptif immün yanıtın en önemli özelliklerini belirtiniz (öOaKısım 22.4).

5. İmmün yanıtları indükleyen moleküller nelerdir? Bir molekülün bir immün yanıtı indüklemesi için gerekli özellikler nelerdir? (ö^oKısım 22.5) 6. Sınıf I ve Sınıf II başlıca doku uygunluk kompleksi (MHC) proteinlerinin temel yapısını tanımlayınız. Fonksiyonal bakımdan aralarındaki farklar nelerdir (oe&Kısım 22.7)? 7. Tc hücreleri ve NK hücreleri arasındaki fark nedir? Her bir hücre tipi için aktivasyon sinyali nedir (ö^a Kısım 22.7)? 8. TH hücreleri Tc hücrelerinden nasıl ayrılır? TH1 ve TH2 hücrelerinin fonksiyonal rolleri arasındaki farkları belirtiniz (oe^Kısım 22.8).

I

760 • Bölüm 22 • İmmünolojinin Temelleri

9. Beş ana antikor sınıfı arasındaki yapısal ve fonksiyonal farkları belirtiniz (Cö&Kısım 22.9). 10. B hücrelerince antikor üretiminde iş gören hücre etkileşimlerini belirtiniz (öC^Kısım 22.10). 11. Komplemamn basamaklarını belirtiniz. Protein etkileşimlerinin sırası önemli midir? Önemliyse neden, değilse neden? Kompleman aktivasyonunun alternatif yolunun bileşenlerini tanımlayınız. Kompleman aktivasyonu için mannan-bağlayıcı lektin yolunun bileşenlerini tanımlayınız (ö°sKısım 22.11). 12. İmmünize edilmiş olduğunuz hastalıkları sıralayınız. Doğal yolla edinilen immüniteyle ilgili hastalıkları sıralayınız (öOOKısım 22.12 ve Kısım 22.13)

t

raiı«13. Tanımlanmış olan, biyoteknoloji-bazlı immünizasyon stratejilerinden en azından birini tanımlayınız. Bu strateji, klasik bir immünizasyon stratejisinden nasıl ayrılır (C»aKısım 22.14). 14. Erken ve geciken tip aşırı duyarlılıkları, immün etkenleri, hedef dokuları, antijenleri ve klinik sonuçlarıyla ilgili olarak, farklarını belirtiniz (fi°&Kısım 22.15). 15. Süper antijenlerin T hücrelerini aktive etmesindeki genel mekanizmayı belirtiniz. Süper antijen aktivasyonu klasik antijenlerle T-hücre aktivasyonundan nasıl farkhlaşır (C«aKısım 22.16).

UYGULAMA SORULARI 1. Bir kişinin patojenleri fagosite etmede edindiği yetersizlikten kaynaklanabilecek olası sorunları belirtiniz. Kişi bir üniversite kampusu gibi normal bir çevrede canlılığını sürdürebilir mi? Fagositteki hangi kusurlar, fagositozun kaybolmasına yal açabilir? Açıklayınız. 2. Adaptif bir immün yanıt için spesifite ve hoşgörü gerekli özelliklerdir. Bununla birlikte, belleğin en azından ilk bakışta, pek kritik olmadığı görülür, immün belleğin rolünü belirtiniz ve bellekli hücrelerin üretimi ve korunmasının uzun vadede konukçuya ne yarar sağladığını açıklayınız. 3. Kalıtsal bir kusurundan dolayı T c hücrelerine antijen sunamayan bir kişiden kaynaklanabilecek olası sorunları belirtiniz. Ayni soruyu TH hücreleri için; T c ve T H hücrelerinin her ikisi için yanıtlayınız? Her kişi için hangi moleküller eksik olabilir? Bu kişilerden herhan-

gi biri normal bir çevrede yaşamını sürdürebilir mi? Açıklayınız. 4. Ig A sınıfı antikorlar, olasılıkla Ig G'den daha yaygındır. Bunun neden doğru olduğunu ve konukçuya ne avantaj sağladığını açıklayınız. 5. Kompleman, kritik bir sıvısal savunma mekanizması olarak bilinir. Siz bu saptamayla ayni görüştemisiniz? Yanıtınızı açıklayınız. Kompleman bileşenlerinden C3, C5, properdin (alternatif yol), MBL'den yoksun olan bireylere neler olabilir? 6. Birçok enfeksiyöz hastalığın etkin aşıları yoktur. Bu hastalıklardan bazılarını seçiniz (örneğin, AİDS- sıtma, nezle) ve geçerli aşı stratejilerinin neden etkin olmadığını açıklayınız. Seçtiğiniz hastalıklara karşı immünizasyon için bazı alternatif stratejiler hazırlayınız.

MOLEKULER İMMÜNOLOJİ

1 RESEPTÖRLER VE İMMÜNİTE 23.1 23.2

II 23.3 23.4

Doğal İmmünite ve Patern Tanıma Adaptif İmmünite ve Immünoglobulin Süperfamilyası

IV 23.7 23.8

İmmün tanıma, hücrelerin yüzeyindeki moleküler etkileşimlerdir. Tüm hücrelerde bulunan başlıca doku uygunluk proteinleri, peptitleri şekilde gösterildiği şekilde bağlar. Bu kompleks bir süre sonra T-hücre reseptörlerince bağlanıp, antijene spesifik olan bir immün yanıtı tetikler.

V

762 763

BAŞLICA DOKU UYGUNLUK KOMPLEKSİ (MHC)

765

MHC Protein Yapısı MHC Genleri ve Polimorfizm

765 767

111 ANTİKORLAR 23.5 23.6

762

767

Antikor Proteinleri ve Antijen Bağlama Antikor Genleri ve Çeşitlilik

767 768

T-HÜCRE RESEPTÖRLERİ

770

TCR Proteinleri ve Antijen Bağlama TCR Genleri ve Farklılaşma

770 771

İMMÜNİTEDE MOLEKÜLER SİNYALLER

771

23.9 Klonal Seçim ve Tolerans 23.10 İkincil Sinyaller 23.11 Sitokinler ve Kemokinler

772 773 775

761

762 • Bölüm 23 • Moleküler İmmünoloji

BOLÜMLE İLGİLİ SOZLUK Agretop MHC protinlerince tanınan, işlenmiş bir antijen kısmı. Anerji etkin hücrelerin nötralizasyonuyla spesifik antijenlere bir immün yanıt üretememe. Antikor B hücrelerince üretilen, çözünür bir protein olup antijenle etkileşir; immünoglobin de denir. Apoptoziz programlı hücre ölümü. Aşın değişken bölge immünoglobulin veya TCR'lerin değişken domainlerinin amino ait sekansmdaki değişme olup, antijenle moleküler temasların çoğunda etkilidir. (Komplementerliği belirleyen bölge olarak da bilinir). Başlıca Doku Uygunluk Kompleksi (MHC) antijen işleme ve sunmada önemli çeşitli hücre-yüzey proteinlerin kodlanmasından sorumlu genetik bir bölge. Domain bir proteinin belirli bir yapı ve fonksiyonu sahip bir bölgesi. Epitop bir antijenin, bir immünoglobulin veya bir T-hücre reseptörü tarafından tanınan kısmı HLA insan lökosit antijeni, insanların MHC'si. tmmünoglobulin (İg) B hücrelerince üretilen çözünür bir protein olup, antijenle etkileşir: antikor olarak da bilinir. tmmünoglobulin gen süper ailesi immünoglobulinler ile evrimsel, yapısal ve fonksiyonel olarak akraba olan bir gen ailesi.

Kemokin çeşitli hücrelerce üretilen küçük bir çözünür protein olup, hedef hücrelerde immüniteyi ve yangısal reaksiyonları ayarlar. Klonal delesyon yararsız veya kendine reaktif klonlann öldürülmesiyle, timusta T-hücre seçimi için klonal delesyon. Klonal seçim her B veya T hücresi, antijenle uyarıldığında kendi kopyalarını üretir. Komplementerliği-belirleyici bölge (CDR) immünoglobulinlerin veya TCR'lerin değişken bölgeleri içinde amino asit sekansında bir değişme olup, antijenle moleküler temasların çoğunu sağlar (aşırı değişken bölge olarak da bilinir). Motif belirli bir MHC proteinine bağlanan tüm peptit antijenlerinde bulunan korunmuş bir amino asit sekansı. Negatif Seçim timusta kendi antijenleriyle etkileşen T-hücrelerinde yapılan T-hücre seçimi (klonal delesyon). Patern tanıma molekülü (PRM) patojenle-bağıntılı moleküler bir paterni tanıyan bir protein. Örneğin, bir mikrobiyal hücre yüzey proteninin bir bileşeni. Patojenle-bağıntılı moleküler patern (PAMP) bir patojen veya patojen ürününün yapısal bir bileşeni olup, bir patern tanıma molekülünce tanınır.

mmün yanıtın hedef patojenlere karşı bazı proteinleri kullandığı görülmüştür. Bu bölümde bu proteinler ve bunların kompleks moleküler etkileşimleri tartışılacaktır. fjk olarak, doğal immün yanıtta antijenle etkileşen proteinler olan, patern tanıma moleküllerini (PRM) inceleyeceğiz. Daha sonra, adaptif immün yanıt üzerine odaklanılacak ve tümü antijenle doğrudan etkileşen proteinler olan başlıca doku uygunluk (MHC) proteinleri, T-hücre reseptörleri (TCR) ve Irnmünoglobulinler (İg) üzerinde ypğunlaşılacaktır. Son kısımda ise, hücre sinyalleşmesini kontrol eden ve immün yanıtı aktive eden moleküler etkileşimler üzerinde durulacaktır.

I

RESEPTÖRLER VE İ M M ÜN İTE Doğal İmmünite ve Patern Tanıma Makrofajlar ve nötrofiller gibi fagositler, doğal immüniteyi başlatan hücreler olup, genellikle patojenin yutulması ve parçalanması olan fagositoza yol açmaktadır. Fagositler, patojenlerin belli başlı gruplarınca paylaşılan moleküllerle etkileşir.

Polimorfizm bir lokusta sık olarak çoklu allellerin oluşmasıdır; yeni oluşan tesadüfi mutasyonlarla açıklanamaz. Pozitif seçim timusta kendi MHC proteiniyle etkileşen T hücrelerinin çoğalması ve gelişimi için T-Hücre seçimidir. Sınıf I MHC Proteini tüm çekirdekli omurgalı hücrelerinde bulunan, antijen, sunucu protein. Sınıf II MHC Proteini makrofajlar, B hücreleri ve dentritik hücrelerde (antijen-sunucu hücreler) bulunan antijen sunucu protein. Sitokin lökositler tarafından üretilen küçük, çözünür bir protein olup, hedef hücrelerde yangısal reaksiyonları ve immüniteyi ayarlar. Somatik hipermutasyon immünoglobulin genlerinde, diğer genlerde gözlenenden daha yüksek oranda mutasyona rastlanması. T-hücre reseptörü (TCR) T hücreleri yüzeyinde antijene-spesifik reseptör proteini. Tolerans spesifik bir antijene bir immün yanıt oluşturmadaki yetersizlik. Toll-benzeri reseptör (TLR) fagositler üzerinde bulanan bir patern tanıma molekülü olup, yapısal ve fonksiyonel olarak Drosophila'da bulanan Toll reseptörleriyle ilişkilidir.

Patojenle-Bağıntıh Moleküler Paternler (PAMP), Patern Tanıma Molekülleri (PRM) ve Toll-Benzeri Reseptörler (TLR) Fagositler, patojenleri tanımlamak için patern tanıma molekülleri (PRM) denilen, evrimsel olarak korunmuş bazı membrana-bağh proteinler geliştirmişlerdir. PRM, patojenle-bağıntılı moleküller paterni tanıyan bir proteindir, yani mikrobiyal hücre yüzey yapısının bir bileşenini tanımaktadır. Kompleman sistemiyle ilgili olarak zaten iki PRM'den bahsedilmiştir. Bu iki çözünür proteinden birisi mannan-bağlayıct lektin (MBL) ve diğeri de properdin (faktör P) dir («saaKısım 22.11). Bu PRM'lerin kompleman sistemini aktive etmesi, hedef hücre lizisini veya opsonizasyonunu indükler. MBL ve properdin çoğu zaman ayni şekilde iş görüp, mikroplar üzerindeki hücre yüzey bileşenlerine bağlanmakta ve MBL veya alternatif yolla komplemanı aktive etmektedir (öBöKısım 22.11) (Tablo 23.1). Bu proteinlerin hedefleri, organizmaların özel grupları veya enfeksiyöz ajanlarda bulunan Ö2gün yapısal bileşenler olan patojenle-bağlantılı moleküler pattern (PAMP) lerdir. MBL tarafından tanınan mannoz şekeri olup, çoğu zaman bakteriyal polisakkaritlerde sadece tekrarlayan bir alt birim olarak bulunur. Properdin, bazı maya (fungal) patojenlerinin hücre

23.2 • Adaptif İmmünite ve İmmünoglobulin Siiperfamilyası • 763

1

Tablo 23.1 Doğal immün yanıtta reseptörler ve hedefleri Patern Tanıma Molekülleri (PRM

Patojenle-Bağıntılı Moleküler Paternler (PAMP)

Etkileşimlerin Sonucu

Patern Tanıma Molekülleri (PRM)

Patojenle-Bağıntılı Moleküler Paternler (PAMP)

Etkileşimlerin Sonucu

MBL (Mannan-bağlayıcı lektin) (Çözünür) Properdin (çözünür)

Mannoz içeren hücre yüzeyindeki mikrobiyal yapı MBL yoluyla kompleman aktivasyotaşlan nufö^Kısım 22.11) Zimozan ve diğer mikrobiyal hücre-yüzeyi molekü- Alternatif yolla kompleman aktivasler kompleksleri yonu (öOöKısım 22.11) Gram-pozitif bakterilerde peptidoglikan, Maya Tüm TLR'ler için, patojenle-smırlı hücre çeperinde zimozan makro molekülerle etkileşim sinyal Çift zincirli RNA (viral replikasyon) iletimiyle sonuçlanabilir ve fagosit aktivasyonu, yangı ve patojeninin LPS (Lipopolisakkarit) Bakterilerdeki flajellin yıkımına yol açar. Bakterilerdeki metilenmemiş CpG oligonükleotitleri

a

TLR-2 (Toll-benzeri reseptör-2) (Membrana bağlı) TLR-3 (membrana bağlı) TLR-4 (membrana bağlı) TLR-5 (membrana bağlı) TLR-9 (membrana bağlı)

' Toll-benzeri reseptörler hemen hemen sadece fagositlerde bulunur.

çeperinin tümünü oluşturan protein-polisakkarit kompleksi olan zimozanı tanır. Diğer PRM'ler çoğu zaman sadece fagositlerde bulunan membrana-entegre olan proteinlerdir. İlk olarak Drosophila (mevye sineği)da Toll reseptörleri olarak bulunmuş olup, evrimsel ve fonksiyonel olarak ilişkili transmembran proteinlere, memelilerde Toll-benzeri reseptörler (TLR) denilmektedir, (bakınız "Toll Reseptörleri ve Drosophila enfeksiyonlara Atasal Bir Yanıt"). Halen insanlarda bilinen 10 TLR vardır. Bunlar, patojenin hücre-yüzey moleküllerini ve patojen metabolizmasının çeşitli çözünür ürünlerini içerecek şekilde, virüsler, bakteriler ve funguslardaki PAMPTarı tanımaktadır. Tablo 23.1 TLR'ler ve diğer PRM'lerin çeşitli PAMP'ler ile bilinen etkileşimlerinin bazılarını özetlemektedir. Çeşitli TLR'leri birden fazla PAMP'e karşı yanıt vermede içerilir. Örneğin TLR-4 gram-negatif LPS'ye doğal immün yanıtla ve aynı şekilde ısı şok proteini (HSP) denilen bir konukçu-yanıt molekülünün bulunmasıyla ilgilidir. Ne LPS ve ne de HSP doğrudan TLR-4 ile etkileşemez, fakat daha çok bir reseptör protein ile etkileşip bu ise daha sonra TLR-4 ile etkileşir. Diğer durumlarda, flagellin ve TLR-5 de olduğu gibi, TLR doğrudan PAMP'a bağlanır. Bir PAMP'm fagosit TLR'si ile doğrudan veya dolaylı etkileşimi, zar aracılığıyla sinyal iletim olayını tetikleyip, çeşitli proteinlerin translasyonunu başlatmakta ve sonuçta fagositte aktivasyonuna yol açmaktadır. Aktivasyon, fagositozta artışa ve patojenlerin ölümüne neden olabilir veya yangın oluşumuna katkı sağlayabilir (po&Kısım 22.2 ve 22.3).

-m

23.1 Kavram/arın Çözden Geçirilmesi

PAMP'lar ve konukçu PRM'leri, doğal immün sisteminin ayrılmaz parçalarıdır. PRM'lerin çeşitli patojenlerce paylaşılan PAMP'ları ile etkileşmesi, kompleman ve fagosit etkin mekanizmalarını hedefe yöneltmekte ve patojenlerin yok edilmesini sağlamaktadır.

•

MBL yol-izinin hedefini ve hedeflenen patojenin sonucunu belirtiniz. • TLR-4 taşıyan hücreyi ve TLR-4 oluşturan hücre tarafından tanınan bakteriyal PAMP'ı tanımlayınız.

Adaptif İmmünîte ve İmmünoglobulin Siiperfamilyası İmmünoglobulin gen süperf amilyası, yapısal, evrimsel ve/veya fonksiyonel özelliklerini immünoglobulin genleri ve proteinleriyle paylaşan genler ve bunların ürünlerinden oluşmaktadır. Adaptif immün yanıtla ilişkili antijen bağlayıcı proteinler, bu büyük gen familyasının üyeleridir. Bölüm 22 de tartışıldığı gibi, adaptif immün yanıt esnasında antijenle spesifik-olarak üç farklı hücre-yüzey proteini etkileşir. Bunlar İmmünoglobulinler (Ig veya antikorlar), T-hücre reseptörleri (TCR) ve MHC proteinleridir. Antijen-bağlayıcı bu proteinlerinin her birinin farklı bir yeri, yapısı ve fonksiyonu vardır. MHC proteinleri antijensunucu hücrelerin (APC) ve hedef hücrelerin yüzeyinde bulunup, antijenleri sadece T hücrelerinde bulunan TCRTere sunarlar (öOçaKısım 22.6). Ig, B lenfositlerin üzerinde bulunup, ekstrasellüer antijenler ile doğrudan etkileşir. (oe&Kısım 22.9) Antijen-Bağlayıcı Proteinlerinin Yapısı ve Evrimi

Ig, TCR ve MHC proteinlerin yapısal özellikleri birbirine benzerdir ve ilksel antijen-reseptör genlerinin duplikasyonu ve seleksiyonuyla gelişmiştir. Seçilen Ig süper aile proteinleri Şekil 23.1 «'de gösterilmiştir. Proteinler bazı farklı domainlerden oluşup, bu kısımlar belirli yapı ve fonksiyona sahip protein bölgeleridir. Her proteinin oldukça korunmuş amino asit sekanslı en azından bir bölgesi vardır. Sabit (C) domain denilen bu bölge yaklaşık 100 amino asitlik olup, 50-70 amino asit zincir-içi disülfit bağlarıyla köprü oluşturur. Sınıf I MHC protein

764 • Bölüm 23 • Moleküler İmmünoloji

Ek BİIgİ

•

eyve sineği olan Drosophıla melanogaster biyologlara yaklaşık yüz yıldır deneysel bir model olmuştur. Bir omurgasız olan Drosophıla'mn immün sisteminin ayrıntıları şimdi omurgalılar, diğer omurgasızlar ve hatta bitkilerdeki doğal immün mekanizmaların anlaşılmasını sağlamıştır. Meyve sineği gelişimi ile ilgili birçok protein, patern-tamma molekülleri (PRM) olarak iş görüp, istilacı bakteriler için önemli reseptör olarak da görev yapar. En iyi örnek Drosophıla Toll olup, sineğin doğal immün yamtında olduğu gibi, dorso-ventral eksen oluşumunun gelişimiyle ilişkili bir hücre-yüzey reseptörüdür. Toll immün sinyalleşmesi, bir patojenin veya onun yapı taşlannın Toll proteini ile etkileşimiyle başlatılır. Toll proteini fagositler üzerinde bir hücre-yüzey re-

Toll Reseptörleri ve Drosophıla Enfeksiyonlarına Atasal Bir Yanıt septörü olarak bulunur. Bununla birlikte, Drosophıla Toll'un kendisi patojenle doğrudan etkileşemez. Sinyal iletim olayları, gram-negatif bakterilerin lipopolisakkariti (LPS) benzeri, patojen- türevli bir molekülün bir veya daha fazla yardımcı proteinle bağlanmasıyla başlar (Kısım 4.9) (bakınız insanlardaki analog TLR-4 sisteminin şekli), LPS- yardımcı protein kompleksi daha sonra Toll'a bağlanır. Membrana entegre olan Toll proteini sitoplazmaya bir sinyal ileterek, nükleusa ait bir kripsiyon faktörünü aktive etmekte ve çeşitli antimikrobiyal peptit genlerinin transkripsiyonunu indüklemektedir. Tollbağıntıh transkripsiyon faktörleri antifungal bir peptit olan drosominisini içeren antimikrobiyal peptitlerin, gram-negatif bakterilere karşı aktif olan dipterisinin ve gram-pozitif bakterilere karşı aktif defen-

Gram-negatif bakteriler A Lipopolisakkarit (LPS) M LPS-bağlayıcı protein

TLR-4

sinin ifade edilmesini indüklemektedir. Peptitler karaciğer benzeri yağ cisimciğinde üretilip, sineğin dolaşımına salınır, buradan hedef organizmaya girer ve lizizine neden olur. Yapısal olarak Toll proteinleri, omurgalılar ve bitkileri içeren hemen hemen tüm çok hücreli organizmalarda bulunan bir protein grubu olan lektinler ile ilişkilidir. Lektinler bazı oligosakkarit monomerler ile oldukça spesifik olarak etkileşir. Toll-benzeri reseptörler (TLR), Tablo 23.1'de belirtildiği gibi, patojenlebağmtıh moleküler patern (PAMP)'lei birçoğuyla reaksiyona girer. Örneğin, insan TLR-4'ü, LPS ile girdiği reaksiyonlar sayesinde gram-negatif bakterilere karşı doğal bağışıklık sağlar. Drosophüa'da olduğu gibi, TLR-4'ün doğrudan patojen veya LPS ile etkileşmediği şekilden görülmektedir. Bunun yerine, çözünür bir konukçu-savunma proteini olan LPS bağlayıcı protein (LBP), dolaşımda LPS ile etkileşir. Bu kompleks, fagositin yüzeyindeki bir protein olan CD14'ü bağlar. LPS-CD14 kompleksi de daha sonra TLR4'ü bağlar. Membrandan geçebilen TLR-4 proteini, nükleusa ait transkiripsiyon faktörü olan NF^'i aktive ederek bir sinyal oluşumu başlatır. NFKB konukçu yanıtıyla ilgili sitokinlerin ve diğer fagosit proteinlerinin transkripsiyonunu aktive eder. Aktive edilen fagosit, yangısal proteinlerinin şahmında olduğu gibi, daha sonra patojenleri yok edebilir. Drosophila Toll, insanları da içeren yüksek omurgalılardaki analog olan Tollbenzeri reseptörün fonksiyonal, evrimsel ve yapısal bir atasıdır. Toll proteinleri ve bunların benzerleri evrimsel olarak oldukça eski olup, çeşitli hayvanlarda ve hatta bitkilerde bile görülebilen doğal immün sistemin oldukça korunmuş yapılardır. •

Şekil 1 insanlarda makrofajlann TLR-4 aktivasyonu. Vücut sıvılarında gram-

Yangı

IL-1, IL-6, IL-8, TNFa aktivasyon

negatif bakterilerden salman lipopolisakkarit (LPS), LPS-bağlayıcı protein (LBP) tarafından bağlanır) LPS-LBP kompleksi daha sonra CD14'e bağlanır. LBP serbest bırakılır ve LPS-CD14 TLR-4 ile kompleks oluşturur. Yeni TLR-4 -LPS-CD14 kompleksi, TLR-4 sayesinde sinyal iletimini indükler, NFJ3 (transkripsiyon faktörü) nü aktive eder, İL-Î, IL-6, IL-8 ve TNF-a gibi yangısal sitokinleri ve kemokinleri kodlayan genlerin transkripsiyonuna ve translasyonuna yol açar. Bu aracı moleküller daha sonra diğer hücreleri aktive eder ve yangı oluşumunu, patojen alımı ve yıkımını gerçekleştirir (Kısım 22.2 ve 22.3).

kısmı olan beta-2 mikroglobulin (/32m), tek bir C domaininden oluşur. TCR, Ig ve MHC proteinlerinin değişken (V) domainleri, sabit domainler ile aynı boydadır, fakat V domain yapıları birbirlerinden ve C domainlerinden oldukça farklıdır. C domainleri antijen-

bağlayan moleküller için yapısal bütünlüğü sağlar, V domainleri membrana tutturur ve her proteine karakteristik yapısını verir. C domainleri yardımcı moleküller için hedef olarak da iş görür. Örneğin, Ig M ve Ig G'nin sabit domainleri komplemanı bağlar (cOöKısım 22.11), MHC sınıf I sabit domaini

23 3 • MHC Protein Yapısı • 765

Antijen -

immunoglobulin

Sınıf I MHC

• Şekil 23.1 immunoglobulin gen süper ailesi proteinleri. Sabit bölgeler (C), homolog amino asit sekansına ve daha fazla sıralı yapıya sahiptir. Ig-benzeri C bölgesi proteinlerinin, Ig gen süper ailesinin üyeleri olarak tanımlaması, evrimsel akrabalığı göstermektedir. Ig ve TCR'lerin değişken bölgelerinin (V) ve MHC sımf I ve sımf II proteinlerinin antijen-bağlayıcı bölgeleri korunmuş yapılar olmamaları nedeniyle Ig süper ailesinin üyeleri olarak tanımlanmaz. Olasılıkla, antijen bağlayıcı bu bölgeler Ig-benzeri bölgelerden gelişmiştir, fakat antijenin belirli formlarını bağlayıcı evrimsel seçim, yapısal homolojiyi ortadan kaldırmıştır. İmmünite ile ilgili diğer bazı proteinler, bazı sitokinleri ve kompleman proteinlerini içerip, ayni şekilde Ig geni süper ailesinin de üyeleridir, fakat burada sadece antijenle doğrudan etküeşen proteinler gösterilmiştir.

T-Sitotoksik (Tc) hücreler üzerindeki yardımcı CD8 proteinine bağlanır, homolog MHC sınıf II sabit domainleri TH hücrelerindeki CD4'e bağlanır (ctta Kısım 22.6). Buna karşın, V domainleri çok çeşitli antijenler ile etkileşmek üzere geliştirilmiştir. TCR, Ig ve MHC proteinlerinin her birisi iki özdeş olmayan polipeptitden oluşur. Bu heterodimerler, hücre yüzeyinde bir antijen reseptörü olarak ifade edilen, fonksiyonel bir protein oluşturmak için bir araya gelir. Buna karşın bu moleküllerin spesifik fonksiyonları oldukça farklıdır. Ig'ler veya antikorlar B-hücrelerinin yüzeyine tutturulup burada patojenlere veya bunların toksinleri gibi ürünlerine bağlanırlar. Ig'ler ayni şekilde çözünür serum proteinleri olarak bol miktarda üretilirler. TCR'ler özellikle T lenfositleri üzerinde bulunup, MHC proteinleriyle bağlantılı olarak hedef hücreler veya APC'ler tarafından sunulan antijenik peptitlerle etkileşirler. Antijene-reaktif T hücreleri daha sonra etkileştiği hücreyi öldürür veya immün yanıtı aktive eden proteinler üretir (öe^Kısım 22.7 ve 22.8).

23.2 Kavramların Gözden Geçirilmesi Ig geni süper ailesi, evrimsel, yapısal ve fonksiyonel olarak Ig'ler ile ilişkili olan proteinleri kodlar. Antijen-bağlayıcı Ig'ler, TCR'ler ve MHC proteinleri, immün yanıtla ilgili diğer proteinler oldukları için, bu ailenin üyeleridirler. • •

Ig sabit domaininin yapısal özelliklerini belirtiniz. V domainlerinin sahip olduğu yapılar neden C domainlerden farklıdır? • Antijenin Ig'ler, TCR'ler ve MHC proteinleriyle bağlanmasını tanımlayınız.

•#11

BAŞLICA DOKU UYGUNLUK KOMPLEKSİ (MHC)

Başlıca doku uygunluk kompleksi (MHC), tüm omurgalılarda bulunan bir grup gendir. MHC, insanın 6. kromozomu üzerinde yaklaşık 4 milyon baz çiftlik yer kaplar ve HLA (insan lökosit antijeni) kompleksi olarak bilinir (Şekil 23.2») MHC proteinleri antijen işleme ve sunmayla ilgilidir.

MHC Protein Yapısı MHC proteinleri, doku aktarımları için başlıca antijen engelleri olarak rol oynamaları yüzünden bulunmuşlar ve bu ismi almışlardır. Buna karşın, MHC proteinlerinin gerçek biyolojik fonksiyonu, peptit antijenleri bağlamak ve T hücrelerine sunmaktır (oooKısım 22.6). MHC proteinleri iki yapısal sınıfa ayrılır. Sınıf I MHC proteinleri, nükleuslu tüm hücre yüzeylerinde bulunur. Kural olarak, sınıf I proteinleri peptit antijenleri T-Sitotoksik hücrelere (Tc) sunar. Eğer sınıf I'e yerleşik antijen varsa, yabancı olarak tanınıp, antijen içeren hücre hedef olmakta ve Tc hücresince doğrudan yok edilmektedir (ö°aKısım 22.7) Sınıf II MHC proteinleri sadece B lenfositleri, APC olarak ad-

landırılan makrofajlar ve dendritik hücrelerin üzerinde bulunmaktadır (c«sKısım 22.6). Sınıf II proteinleri sayesinde, APC'ler antijenlerin T-yardımcı hücrelere sunulmasıyla ilişkilenip ya yangısal reaksiyonları ya da antikor yanıtını uyarırlar 22.8).

766 • Bölüm 23 • Moleküler İmmünoloji

r />

DPA Gen kompleksi

II

Bölge Boyut (Mbp)

III Sınıf II

11 Sınıf III

Sınıf I

* Şekil 23.2 İnsanın başlıca doku uygunluk kompleksi (MHC) gen haritası. İnsan MHC'si HLA (İnsan lökosit antijeni) olarak adlandırılır. HLA kompleksi 6. kromozom üzerinde bulunur ve uzunluk olarak 4 milyon bazdan daha fazladır. Sınıf II genleri DPA ve DPB, sımf II proteinleri DPa ve DPb'yı kodlar; DQA ve DQB DQa DOb'yı ve DRA ve DRB ise DRa ve DRb'yı kodlar. Sınıf III genleri, diğer ilişkisiz proteinlerde oduğu gibi, immün tanıma fonksiyonlarıyla bağıntılı çeşitli protenileri kodlar. C4 ve C2 kompleman proteinleri olan C4 ve C2 proteinlerini kodlar (OO^Kısım 22.11). TNF geni, tümör nekrozis faktörü olan, bir sitokini kodlar (bakınız Kısım 23.10). Sımf I MHC proteinleri olan HLA-B, HLA-C ve HLA-A B, C ve A genlerince kodlanır. Çoğu antijen tanıma, işleme ve sunmayla ilgili olan 200'den fazla gen HLA kompleksinde yer almaktadır.

Sınıf I MHC Proteinleri

Sınıf I MHC proteinleri iki polipeptitten oluşur. (Şekil 23.1 ve 23.3») Membrana entegre olan alfa (a) zinciri 6. kromozomda bulanan MHC gen bölgesinde kodlanır. Diğer sınıf I polipeptidi kovanet olarak bağlanan beta-2 mikroglobulin (/32m) dir. MHC sınıf I proteininin üç boyutlu yapısı, bu proteinin antijen peptit ve TCR ile aynı anda nasıl etkileştiğini gösteren farklı bir şekli olduğunu ortaya çıkarmıştır (Şekil 23.3). Sınıf I a zinciri al ve al domainleri arasında büyük bir oyuk oluşturmak için katlanır ve bu oyuktan, MHC moleküllerinin peptit antijenleri bağlarlar. Oyuğun her iki ucunun açık olması, bağlanacak peptitlerin boyutunu 8-10 amino asitlik olacak şekilde kısıtlamaktadır. Katlanan MHC I proteini, bir /3-katmanı üzerine oturan iki a-heliksten oluşur. Daha sonra tartışılacağı gibi, bu yapı peptidi bağlar ve TCR ile etkileşecek olan

r

bir peptit MHC kompleksi oluşturur (bakınız Kısım 23.7) Sınıf II MHC Proteinleri

Sınıf II MHC proteinleri, ave/3 denilen, kovalent olmayan şekilde bağlı, membrana entegre iki polipeptitden oluşur (Şekil 23.1 ve 23.3). Sınıf II proteinleri çoğu kez çift olarak düzenlenip, TCR'lere bağlanma yeteneklerini arttırmaktadır. Sınıf II proteinin a\ ve /32 domainleri, sınıf I peptit bağlama bölgesine benzer şekilde, bir peptit bağlama bölgesi oluşturacak şekilde etkileşir. Buna karşın, oyuğun uçlarının açık olması, belirgin olarak 10 amino asitten daha büyük olabilen peptitleri bağlamasına ve göstermesine olanak sağlar (Şekil 23.3). Sınıf II tarafından bağlanmış peptitler genellikle APC'lerde işlenmiş ekzojenik patojen proteinlerinden türevle-

Peptit-bağlayıcı bölge

«1

• Şekil 23.3 MHC proteinlerinin üç-boyutlu yapısı, (a) Sımf I proteini (b) Sınıf II proteini dimerik formunda görülmektedir. San oklar peptiti ve bağlanma bölgesindeki pozisyonunu gösterir. [Nature 364:33 (1993), ©Macmillan magazines'in izniyle basılmıştır.] (c) Yukandan görüldüğü şekliyle, bir sımf I proteiniyle bağlı bir peptitin uzamsal modeli. 9 amino asitlik bir peptit, fare sımf I proteinine gömülü olarak, yapışık bir yapı olarak gösterilmiştir. Sınıf I proteinlerinin açık uçlan vardır ve yaklaşık 8-10 amino asit uzunluğunda peptitleri bağlar. Açık-sonlanan sımf II proteinleri yaklaşık 20 amino asit uzunluğa kadar olan peptitleri bağlayabilir.

23,5 • Antikor Proteinleri ve Antijen Bağlama • 767

nen fragmentlerdir ve uzunluk olarak 10-20 amino asitlik veya daha fazladır (öooKısım 22.6). 23.3 Kavramların Çözden Geçirilmesi MHC I proteinleri tüm hücrelerde ifade edilir ve sitosoltürevli antijenik peptitleri Tc hücreler üzerindeki TCR'lere sunma işlevi görür. Sınıf II MHC proteinleri sadece APC'lerde ifade edilir. Bunlar, ekzojenik orijinli peptit antijenleri, TH hücrelerdeki TCR'lere sunma işlevi görürler. • Sınıf I ve sınıf II MHC protein yapılarını karşılaştırınız. Farklılıkları nelerdir? Benzerlikleri nelerdir? • Sınıf I ve Sınıf II MHC proteinlerinin peptit bağlama bölgelerini karşılaştırınız. Bunların farklılığı nedir? Benzerliği nedir?

MHC Genleri ve Polimorfîzm En azından üç farklı MHC sınıf I geni vardır: HLA-A, B ve C ve tümü yüksek derecede polimorfizm gösterir. Polimorfizm, son zamanlardaki tesadüfi mutasyonlarmın oluşumuyla açıklanamayacak sıklıkta, bir lokusta (kromozom üzerindeki gen bölgesi) multipli allellerin ortaya çıkmasıdır. Örneğin, HLA-A, HLA-B ve HLA-C lokuslarında, belirtilen sırayla, 95,207 ve 50 farklı allel vardır. Bu yüzden, insan türünde, her lokusta çoklu polimorfizmler vardır. Buna karşın, her birey her lokusta bu allellerden sadece ikisine sahiptir (bir allel baba orijinli ve biri de anne orijinli). İki allellik değişik protein eş baskın olarak {aynı derecede) ifade edilir.

Benzer şekilde, yüksek sayıda polimorfik lokus sınıf II proteinleri olan HLA-DR, -DP ve -DQ'yu kodlar. Yine ayni şekilde, sınıf II gen ürünleri eşbaskm olarak ifade edilir. Bu yüzden, bir birey genellikle altı genetik olarak ve yapısal olarak farklı sınıf I proteini ve altı farklı sınıf II proteini gösterir. MHC proteinlerindeki bu polimorfik değişiklikler, başarılı doku aktarımları için başlıca engeldir. Çünkü verici doku (greft) üzerindeki MHC proteinleri, alıcının immün sistemi tarafından yabancı antijen olarak tanınır. Greftin MHC proteinlerine karşı yönelen bir immün yanıt, hücre ölümü ve greftin reddine neden olabilir. Her MHC geni tek bir protein kodlar. Buna karşın, insan popülasyonu içinde, MHC genlerin po-

limorfik yapısı sayesinde, antijen sunulması için mevcut çok sayıda MHC proteini bulunmakta ve her MHC alleli farklı bir amino asit sekansıyla kodlanmaktadır. MHC proteinlerindeki amino asit sekans varyasyonları, peptit-bağlayıcı oyukta odaklanmasına karşın (Şekil 23.3), MHC proteininin her polimorfik varyasyonu, peptit antijenlerinin farklı bir setini bağlar. Tek bir MHC proteiniyle bağlanan peptitler, ortak yapısal bir paterni veya motifi paylaşır ve her farklı MHC proteini farklı bir motifi bağlar. Örneğin, belirli bir sınıf proteiniyle bağlanan tüm 8 amino asitlik peptitler, 5 pozisyonunda bir fenilalanine ve 8 pozisyonunda bir lösine sa-

hiptir. Bu yüzden, X-X-X-X- fenilalenin -X-X- lösin sekanslı tüm peptitler (buradaki X herhangi bir amino asittir), MHC proteiniyle bağlanır ve sunulur. Polimorfik bir allel tarafından kodlanan başka bir MHC sınıf I proteini tercihen 4 pozisyonundaki bir valin ve 8 pozisyonundaki bir prolin ile (X-X-X- valin -x-x-x-prolin) bağlanır. Her motifteki değişmez amino asitler sabit kökler olarak bilinir çünkü bunlar her bireyin MHC peptit-bağlayıcı oyuğu içinde doğrudan ve spesifik olarak bağlanır. Bu yüzden, her MHC proteini, uygun sabit kökleri içeren peptitler kadar çok sayıda farklı peptitleri bağlar ve sunar. Her MHC I proteini farklı bir motifi ve bu yüzden de farklı sabit kökleri bağlar. Bu açıdan, bir bireyde altı olası MHC I proteini, çok sayıdaki farklı peptit antijenlerini bağlar ve sunar. Analog bir durum MHC II proteinleri ve antijen sunmada oluşur. Buna karşın özellikle Ig'ler ve TCR'ler olmak üzere, diğer antijen-bağlayıcı proteinler, hemen hemen sınırsız sayıda antijenle oldukça spesifik olarak etkileşir ve bu yüzden daha fazla reseptör farklılığı üretmek için farklı bir genetik mekanizma kullanır (bakınız Kısım 23.5 ve 23.7). 23.4 Kavramların Gözden Geçirilmesi MHC, antijen işleme ve sunmayla ilgili proteinleri kodlayan bir grup gendir. Sınıf I ve sınıf II MHC genleri, bilinen en polimorfik genlerdir. MHC sınıf I ve sınıf II allelleri; korunmuş yapısal motifli peptitleri bağlayan ve sunan proteinleri kodlar. • MHC genlerindeki polimorfiztni belirtiniz ve açıklayınız. • Polimorfik MHC proteinleri, çok sayıdaki peptitin T-hücre reseptörlerine sunulmasını nasıl kolaylaştırmaktadır?

ANTİKORLAR Antikorlar veya immünoglobulinler (Ig), B hücreleri üzerinde hücre-yüzey antijen reseptör proteinleri olarak veya serum ve diğer vücut sıvılarında çözünür proteinler olarak bulunup, buralarda Ig yabancı antijenleri nötralize etme ve opsonize etme işlevi görür (öOsKısım 22.11 ve 24.6). Bu kısımda, sınırsız değişkenlik gösteren Ig'lerin yapısı, antijen bağlama işlevi ve genetik organizasyonu üzerinde durulacaktır.

Antikor Proteinleri ve Antijen Bağlama 22. Bölümde ve yukarıda tartışıldığı gibi (bakınız Kısım 23.1), fonksiyonel Ig'ler ikisi ağır zincir ve ikisi hafif zincir olmak üzere, dört polipeptitten oluşmaktadır. Fonksiyonal antijen-bağlama birimi bir ağır-zincir heterodimerinden oluşur. Ağır ve hafif zincirler ayrıca C (sabit) ve V (değişken) bölgelere ayrılmış olup, bunlardan C bölgeleri kompleman

768 • Bölüm 23 • Moleküler İmmünoloji

bağlama gibi genel fonksiyonlardan sorumludur, buna karşılık H ve L zincirlerin V bölgeleri antijenbağlama bölgesini oluşturmak için etkileşir (Şekil 23.4*). Burada V bölgelerinin ve antijen-bağlama bölgesinin yapısal özellikleri incelenecektir. Değişken Domainler

Amino asit sekansmdaki farklılıklar, değişik Ig'lerin değişken domainlerinde (V domainleri) oluşur (Şekil 23.4). Amino asit değişkenliği özellikle aşırı değişken veya komplementerliği belirleyici bölgeler (CDR) olarak adlandırılan bölgelerde VH(CDR1)

Değişken domain, ağır zincir Antijen

Antijen-Bağlama

Değişken domain, hafif zinir

Bir Ig'nün üç-boyutlu yapısı Şekil 22.16'da gösterilmiştir. Tüm antikor reaksiyonlarının prensibi, antijenler üzerindeki determinantların değişken bölge ile spesifik birleşmesine dayanmaktadır. Bir antikor molekülünün antijen-bağlama bölgesi, hafif ve ağır zincirlerin birlikteliğiyle oluşturulur ve yaklaşık 2 X 3 nm olarak ölçülür. Bu bölge, yaklaşık 10-15 amino asitlik bir peptit olan bir epitopu bağlayabilir. Antijen bağlama, sonuçta ağır ve hafif zincir polipeptit zincirlerinin Ig katlanma modelinin bir fonksiyonudur. Ig'nin V bölgesi, tüm altı CDR'sini (CDR1, 2 ve 3'ü hem ağır hem de hafif zincirde) Ig proteininin son kısmında biraraya getirecek şekilde katlanır. Sonuç, özgün ve spesifik antijen-bağlama bölgesidir (oooŞekil 22.16 ve Şekil 23.4b). Bundan sonraki kısımda, Ig proteinlerinde görülen müthiş farklılığı oluşturan genetik mekanizmalar incelenecektir.

V H (CDR3 Çeşitlilik bölgesiBağlayıcı bölgeleı

belirgindir. CDR'ler antijenle moleküler temasın çoğunu sağlar. Ağır ve hafif zincirlerdeki her V domaininin üç CDR'si vardır. CDR1 ve CDR2 domainleri farklı imnunoglobulinler arasında bir ölçüde farklıdır, fakat CDR 3'ler birinden diğerine çok çarpıcı şekilde değişir. Ağır zincirin CDR3'ünün özellikle kompleks bir yapısı vardır. Protein sekans karşılaştırmaları CDR3'ün V domaininin karboksi terminal kısmı, bunu izleyen 3 amino asitlik kısa bir "farklılık" (D) kısmı ve yaklaşık 13-15 amino asit uzunluğunda daha uzun bir "birleştirici" kısmından oluştuğunu gösterir. Hafif zincirin kendi CDR3'ü için benzer bir düzenlemesi vardır, fakat D bölgesi yoktur. Tüm CDR'ler antijen-bağlamayla ilgilidir.

VL(CDR1) V L (CDR2) V L (CDR3)

(a)

Antijen

•m23.5

Kavramların Gönden Geçirilmesi

Bir Ig'nin antijen -bağlama bölgesi, bir ağır zincir ve bir hafif zincirin V değişken bölgelerinden oluşur. Her ağır ve hafif zincir üç komplementerliği belirleyen bölge veya CDR içerip, bunlar antijen-bağlama bölgesini oluşturmak için birlikte katlanırlar. •

• Şekil 23.4 Hafif ve ağır immünoglobulin zincirlerinin değişken bölgeleri, (a) Tipik bir Ig'in yansı şematik olarak gösterilmiştir. CH ve CL, ağır ve hafif zincirinin sabit domainleridir. (b) (a)'daki hem ağır ve hafif zincirin komplementerliği-belirleyici bölgeleri (CDR'ler) antikor üzerinde tek bir antijen-bağlama bölgesi veya cep oluşturmak için uygunluk sağlarlar. Bölge yukarıdan görülmektedir. Kırmızı bağlanma bölgeleri ağır zincirden, mavi-bağlanma bölgeleri hafif zincirdendir. Bağlanma bölgeleri CDR ve ziitÜir-İag6sİe1:rA'ek için numaralanmıştır. Örneğin, Ll hafif zincirdeki CDRl'dir. Hem hafif ve hem de ağır zincirlerdeki oldukça değişken CDR3'ler, bölgenin merkezinde bir araya gelmektedir. Antijen gri renkte gösterilmiş olup, bölgeyi kaplamakta ve tüm CDR4'ler ile temas kurmaktadır. Bölgenin gerçek şekli, seçilen antikor-antijen çiftine bağlı olarak, sığ bir oyuk ve derin bir cep olabilir.

Ağır zincirde V, D ve J bölgelerinin ve hafif zincirde V ve J bölgelerinin CDR'lere olan katkısını belirtiniz. • Tam bir Ig molekülü çiziniz ve antijen bağlama bölgelerini gösteriniz.

Antikor Genleri ve Çeşitlilik Proteinlerin çoğu için, bir gen bir proteini kodlar. Bu yüzden, eğer bir B lenfositi bir Ig üretiyorsa, bir gen hafif zinciri ve bir gen de ağır zinciri kodlaması mümkün görülebilir. Buna karşın, durum böyle değildir. Antikorların sınırsız sayıda moleküler yapı çeşitini spesifik olarak tanıması ve bağlaması

23 6 • Antikor Genleri ve Çeşitlilik • 769

gerekliliğinden dolayı, immün sistem sınırlı sayıda geni kullanarak hemen hemen sınırsız antikor çeşitliliği oluşturacak şekilde gelişmiştir. Somatik rekombinasyon, tesadüfi olarak ağır ve hafif zincir yeniçeşitlenmesi ve hipermutasyon, nispeten az, sınırlı

sayıdaki Ig geniyle üretilen neredeyse sınırsız çeşitliliğe katkı sağlayan mekanizmalardır. Parçalı Immünoglobulin Genleri Tek bir hafif veya ağır zincir, çeşitli gen segmentlerince kodlanır, bunlarda B hücreleri geliştikçe bir dizi somatik yeni-düzenlemelere (rekombinasyonu aradaki sekansların çıkması izler) uğrarlar. Ig genleri için, somatik yeni düzenlemeler, yaklaşık 400 farklı gen parçası arasındaki rekombinasyonlarla çok sayıda antikorun üretimine olanak sağlamaktadır. Moleküler çalışmalar, V, D, J ve C bölgelerinin genomda birbirlerinden ayrı olduklarını, fakat her gelişen B hücresinde tek olgun bir Ig geni oluşturmak için Değişken-bölge genleri

Çeşitlilik genleri

bir araya getirildiğini ortaya koyan "parçalardaki genler" hipotezini kanıtlamıştır (Şekil 23.5»). Ağır zincir için, V geni CDR1 ve CDR2'yi kodlar. Buna karşın CDR3 V geninin 3' ucunun bir mozaiki ile kodlanıp, tüm D ve J genleri bunları izler. Son olarak, Ig molekülünün sınıfını belirleyen sabit bölge, C geni tarafından kodlanır. Bu yüzden, fonksiyonal bir ağır zincir geni oluşturmak için, dört farklı gen V, D, J ve C rekombine olmaktadır. Benzer şekilde, hafif zincirlerde, hafif zincir genleri V, J ve C genlerinin rekombinasyonuyla kodlanır. Tüm Ig'ler için gerekli olan genler, her gelişen B lenfositinde bulunmaktadır. Şekil 23.5 de gösterildiği gibi, her B hücresi ardarda dizilmiş yaklaşık 150 hafif zincir V geni ve 5 farklı J geni içerir. Ağır zincirler içinde ardarda dizilmiş yaklaşık 200 V geni, 50 D geni ve 4 J geni vardır. Ayrıca, ağır zincir sabit bölge (CH) genleri ve hafif zincir sabit bölge genleri (CL) de bulunur. V, D, J ve C genleri, ökaryotlardaki gen düzenlemeleri için tipik olan Bağlayıcı genler —-|

•)

Sabit-bölge genleri Germ-line DNA

Lenfosit gelişimi esnasında ^ aktif gen oluşumu V 3 D-, J 2 (somatik rekombinasyon)

/

n

j Transkripsiyon / I RNA

DNA (aktif gen)

M Primer RNA transkrip

)f3 D-, J 2 H mRNA i Translasyon

(a) IgM ağır zinciri Değişken-bölge genleri

Sabit-bölge geni

Bağlayıcı genler

şJ,.

/

I

Germ-line DNA

V

DNA (aktif gen)

K

Primer RNA transkripti

I Transkripsiyon j

.

Ii RNA •f splaysı V z J-, K mRNA I Translasyon (b) Kappa hafif zincir

(c) A ve B'nin özeti

\

• Şekil 23.5 İnsan B hücrelerinde immünoglobulin geninin yeniden düzenlenmesi. Ig genleri üç farklı kromozomda ard arda dizilmiştir, (a) 14. Kromozomda ağır zincir (H) gen kompleksi. İşaretlenmiş kutular Ig kodlayıcı genleri gösterir. Kesik çizgiler araya giren sekansları gösterir ve ölçeği gösterilmez, (b) 2. kromozomdaki kappa (K) hafif-zincir kompleksi. Lambda (A) hafif zincir genleri 22. kromozomdaki benzer bir komplekstedir, (c) Bir antikor molekülünün yansının bir araya gelişi.

770 • Bölüm 23 • Moleküler İmmünoloji

kodlayıcı olmayan sekanslar (intronlar) ile ayrılır (csoöKısım 7.1 ve 14.8) B lenfositlerinin olgunlaşması esnasında, her B hücresinde genetik rekombinasyon oluşur. Tesadüfi olarak seçilen V, D ve J segmentleri birleştirilip, aktif bir ağır zincir geni ve aktif bir hafif zincir geni oluşturulur. Aktif gen (VDJ gen segmentleri ve C gen segmenti arasında ara sekansları içeren) transkiripte edilir ve sonuçta oluşan primer RNA transkiripti sonuçta haberci mRNA'yı oluşturmak için kaynaştırılır. mRNA daha sonra Ig molekülünün ağır ve hafif zincirlerini yapmak için translasyona uğrar. Yeni-Çeşitlenme ve VDJ (VJ) Bağlanması

Bu noktaya kadar, tüm Ig farklılığı mevcut genlerin rekombinasyonuyla üretilmiştir. Belirli bir B hücresi tarafından ifade edilen son hafif zincir ve ağır zincir, yeniden düzenlenmiş bu ağır zincirler ve hafif zincir ve ağır zincirlerin tesadüfi bir araya gelmesiyle oluşur. Örneğin, kappa (K) hafif-zincir lokusundaki genlerin sayısına dayanarak, 150V X 5J olası yeni-düzenleme veya 750 olası hafif zincir mevcuttur (««sKısım 22.10 ve Şekli 22.20). Ağırzincir (H zinciri) lokusunda yaklaşık olarak 200V X 50 D X 4J veya 40 000 olası ağır zincir mevcuttur. Her ağır zincir ve hafif zincirin, her hücrede ifade edilmesinde eşit şansa sahip olduğu varsayılarak, 750 X 40 000 veya 3 000 000 olası antikor ifade edilebilir (Şekil 23.5). Farklılık yaratan diğer bir mekanizma da, DNAbirleşme mekanizmasında yatmaktadır. V-D-J veya V-J genlerinin DNA birleşmesi belirsizdir ve VDJ füzyonlarınm yeri çoğu kez bir kaç nükleotitle değişmektedir. Bu genetik belirsizlik, bir veya iki amino asitlik bir değişiklik için yeterlidir ve antikor çeşitliliğine daha büyük bir boyut kazandırır. Her B hücresinde, ağır ve hafif zincir genlerinde, protein-üreten sadece tek bir yeni-düzenleme oluşur. Allelik dışlama adı verilen bu mekanizma, her B hücresinin

sadece bir Ig üretmesini

sağlar.

Hipermutasyon

ilave antikor çeşitliliği, B hücrelerinde somatik hipermutasyon ile oluşturulup, Ig genlerinde diğer genlerde izlenenden daha yüksek oranlarda mutasyona uğramasıdır. Ig genlerinin somatik hipermutasyonu, immünize edici antijene ikinci kez maruz kaldıktan sonra genellikle daha belirgindir. Görüldüğü gibi, antijene ikinci bir maruz kalma, üretilen baskın antikor sınıfında Ig M'den Ig G üretimine bir dönüşümle, bir değişikliğe neden olur (öooıKısım 22.10). Ayrıca sınıf değişimi antijenbağlama kuvveti (afinite) ile bağlantılıdır. Bu afinite yetkinliği, immünitede oldukça güçlü ikincil yanıttan sorumlu faktörlerden birisidir. («ao^Kısım 22.10 ve Şekil 22.21). Afinite yetkinliği, Ig çeşitliliği oluşumuna gerçekten sınırsız olasılıklar katmakta ve en azından 1012 olası Ig üretmektedir.

23.6 Kavramların Gözden Geçirilmesi Rekombinasyon, son Ig genlerinin çeşitli parçalarmmın karılmasına olanak sağlar. Ağır ve hafif zincir genlerinin tesadüfi yeni-çeşitlenmesi genetik olarak kodlanmış farklılığı maksimuma ulaştırır. Hipermutasyon ve afinite yetkinliği gibi VDJ ve VJ'nin belirsiz birleşmesi de sınırsız immünoglobulin çeşitliliğine gerçekten katkı sağlar. • Olgun bir ağır-zincir geni üreten rekombinasyon olaylarını belirtiniz. • Antikor farklılığını daha da fazla arttıran somatik mutasyonu anlatınız. • Kaç tane olası Ig-bağlanma bölgesi üretilebilir?

T-HUCRE RESEPTÖRLERİ TCR'ler lenfositler üzerindeki hücre-yüzey antijen reseptörleri olup, MHC proteinlerine gömülü peptit antijenleri tanırlar (oo&Kısım 22.6). Bu kısımda, TCR'lerin yapısı, antijen-bağlama işlevi ve genetik organizasyonu gözden geçirilecektir.

TCR Proteinleri ve Antijen Bağlama TCR, sadece T hücrelerinin yüzeyinde bulunan membrana-entegre bir proteindir. TCR iki polipeptitten oluşur: (a) alfa ve beta (/3).a:/3 TCR hedef hücrelerinin veya APC'lerin yüzeyindeki MHC moleküllerinde gömülü olan yabancı peptitleri spesifik olarak bağlar (<s«oKısım 22.6). Bu yüzden TCR hem kendinden olan bir MHC proteinini ve hem de yabancı bir

peptiti bağlar. TCR'ler bu ikili bağlama işlevini, a zinciri ve /3 zincirin V bölgelerinden oluşan bir bağlanma bölgesi sayesinde başarmaktadır. Ig'lerde olduğu gibi, TCR'lerin a-zinciri ve /3-zinciri V bölgelerinden oluşan bir bağlanma bölgesi sayesinde başarmaktadır. Ig'lerde olduğu gibi, TCR'lerin /3-zinciri V bölgeleri a-zinciri ve antijeni bağlayan CDR1, CDR2 ve CDR3 segmentlerini içerir. TCR-peptiti-MHC protein kompleksinin üç boyutlu yapısı, Şekli 23.6 «'da gösterilmiştir. Hem TCR ve hem de MHC proteinleri peptit antijene doğrudan bağlanır. MHC proteini peptitin bir yüzünü agretop bağlar, oysa TCR diğer peptit yüzü epitop ile etkileşir. CDR bölgeleri MHC-peptit kompleksinin bağlanmasıyla doğrudan ilişkilidir ve her CDR'nin spesifik bir bağlanma işlevi vardır. TCR a ve /3 zincirinin CDR3 bölgeleri, peptit epitopla temas sağlar. TCR a ve /3 zincirlerinin CDR1 ve CDR2 bölgeleri de MHC proteinlerinin peptitbağlayıcı a heliksleriyle teması sağlar. 23.7 Kavramların Gözden Geçirilmesi TCR, MHC proteinlerince sunulan peptit antijenleri bağlayan bir proteindir. Hem a zinciri ve hem de /3 zincirinin CDR3 bölgeleri, peptit epitopu bağlamaktadır, oysa CDR1 ve CDR2 bölgeleri MHC proteinine bağlanmaktadır.

23 8 • TCR Genleri ve Çeşitlilik • 771 T hücresi TCRCP

TCRV(3

- T-hücre reseptörü TCRVa

Peptit antijen Başlıca doku uygunluk kompleksi proteini

MHCal MHCa2

Zar

MHCa3

Antijen-sunucu hücre

(b)

• Şekil 23.6 TCR-peptit-MHC I protein kompleksi, (a) üç boyutlu yapı, TCR, peptit (kahverengi) ve MHC uyumunu göstermektedir. Bu yapı Protein Data Bank'ta saklanan bulgulardan türevlenmiştir. (b) MHCpeptit-TCR yapısının diagramatik bir gösterimi.

•

TCR CDR1, CDR2 ve CDR3 segmentlerinin işlevleri arasındaki farkları ayrımlaymız.

•

Agretop ve epitop arasındaki farklılık nedir?

TCR Genleri ve Çeşitlilik TCR a ve /3 zincirlerinin, sabit ve değişken domainleri farklı gen segmentlerince kodlanır. Ig genlerine oldukça benzer şekilde, TCR V bölgesi genleri ardışık düzenlenmiş belirli sayıdaki genler olarak düzenlenmektedir, a zincirde yaklaşık 80 değişken (V) geni ve 61 birleştirici (J) segment vardır, oysa j3 zincirin 50 değişken (V) geni, 2 çeşitlilik (D) geni ve 13 birleştirici (J) segmenti vardır (Şekil 23.7»). /3 zincir V, D ve J genler ve a zincir V ve J genleri, fonksiyonal V-bölgesi genlerini oluşturmak için rekombinasyona uğrar. N-bölgesi çeşitliliği denilen ilave farklılık 1-6 nükleotitin V ve D gen segmentleri arasına ve D ve J gen segmentleri arasına tesadüfi ilavesiyle oluşturulur. Son olarak, /3 zincirin D bölgesi üç okuma çerçevesi şeklinde tümüyle transkripte edilerek, her D-bölgesinden üç ayrı transkript oluşumuna yol açmakta ve D gen segmentlerinin tek başına beklenenden daha fazla çeşitlilik yaratmaktadır. Ig H ve L zincirlerinin yeni kombinasyonunda tartışıldığı gibi, her a ve (3 zinciri, tam bir a:f3 heteodimeri oluşturmak için her T hücresinde tesadüfi olarak üretilir ve birleştirilir. Somatik hipermutasyon mekanizmaları TCR farklılığı oluşturmayla ilişkilidir. Buna karşın, potansiyel farklılık halen anormaldir ve teorik olarak 1015 düzeyinde TCR üretilebilir.

23.8 Kavramların Çözden Geçirilmesi TCR'nin fi zincirinin V domaini, V, D ve J gen segmentlerince kodlanır. TCR'nin a zincirinin V domaini, V ve J gen segmentlerince kodlanır. Rekombinasyon, gen ürünlerinin yeni çeşitlenmesi, D bölgelerinin üç okuma çerçevesi şeklinde transkiripsiyonu ve tesadüfi N nükleotit ilavesiyle üretilen çeşitlilik, pratikte sınırsız antijen-bağlayıcı TCR üretimini sağlamaktadır. •

D bölgesinin üç okuma çerçevesi şeklinde ifade edilmesinin, çeşitliliğe katkısı nedir, açıklayınız. • N bölge ilavelerinin TCR farklılığına katkılarını açıklayınız.

IMMUNITEDE MOLEKÜLER SİNYALLER Ig'ler ve TCR'ler sayesinde antijen tanıma ilk sinyaldir ve antijene-spesifik T ve B lenfositlerini aktive etmede en önemli moleküler etkileşimdir. Buna karşın, diğer moleküler sinyallerin, antijenlere yanıt vermeden önce lenfositlere aktarılmış olması gerekmektedir. Burada, immün yanıtı aktive etmek için gerekli diğer moleküler sinyallerden bazıları incelenecektir. İlk olarak, yabancı antijenlere reaksiyon gösterecek ve kendi proteinlerine duyarsız kalacak immün hücreleri seçen mekanizmaları göreceğiz. Daha sonra da, immün T hücrelerinin aktivasyonundan sorumlu olan moleküler ikinci sinyalleri inceleyeceğiz. Son olarak, immün yanıttaki diğer hücreleri aktive edebilen çözünür proteinler olan sitokinler ve kemokinler ile tanışacağız.

772 • Bölüm 23 • Molehüler İmmünoloji a-zincir genleri V,,1

Va2

• Şekil 23.7 insan TCRa -ve fi- zincir genlerinin organizasyonu, a -zincir genleri 14. kromozomda ve /3- zincir genleri 6. kromozomda bulunmaktadır. Boş alanlar a-olmayan zinciri veya -/} olmayan zinciri kodlayan büyük bir segmenti göstermekte olup, şekilde görülmemektedir.

V.,80

[S-zincir genleri Vp50

Jp1(1-6)

lannnnnı ••••••i

Jp2(1-7)

HHHHHHMı

mustaki MHC proteinlerine bağlanmak için yeni geliştirdikleri TCR'lerini kullanarak timik epitelyumla Etkin bir immün yanıt için, T hücrelerinin kendinden- etkileşmektedir. MHC proteinleriyle bağlanmayan olmayan tehlikeli antijenler ile vücut dokumuzu oluş- T hücreleri apoptoziz denilen, bir işlemle ölmeye programlanır; timik MHC proteinlerini bağlayan T turan tehlikesiz kendi antijenleri arasından ayrım hücreleri çoğalmaya devam eder. Bu yüzden, pozitif yapması gerekir. Bu yüzden, T hücrelerin kendi seçim kendi-MHC proteinlerini tanıyan T hücreleriantijenlerine karşı tolerans veya spesifik yanıtsızlık ni korumakta ve kendi-MHC proteinlerini tanımakazanmış olması gerekir. Tolerans kazandıktan sonyan T hücrelerini ise dışlamaktadır. ra sadece tehlikeli kendinden olmayan antijenlerle T-hücre olgunlaşmasının ikinci evresi negatif etkileşen immün hücreleri seçebiliriz. seçim olup, pozitif olarak seçilen T-hücrelerinin, antijenlerle kompleks oluşturmuş timik MHC proKlonal Seçim teinlerle etkileşmek için etkileşimlerini sürdürmesidir. Timustaki antijenler çoğunlukla kendine aitKlonal seçim, her antijene reaksiyon gösteren B tir. Timik kendi antijenleriyle etkileşen T hücreleri veya T hücresinin, tek bir antijen için bir hücre yüpotansiyel olarak tehlikelidir. Çünkü bunlar kendi zey reseptörü olduğunu belirten bir hipotezdir. Bu doku antijenleriyle reaksiyona girebilir (Otoimmüantijenle etkileşerek uyarıldığında, her hücre çoğanite). Bu yüzden, bu kendine reaksiyona gösteren T labilir ve antijenle-uyarılan B ve T hücreleri çoğalır hücreleri elemine edilmelidir. Kendine-reaktif olan ve farklılaşır. Sonuç olarak, antijenle-uyarılan hücT hücreleri timusa sıkıca bağlanır ve sonuçta ölür. reler bölünür ve ayni antijene-spesifik reseptörleri Buna karşılık, kendinden olmayan antijenler ile ifade eden bir hücre havuzu oluşturur. Antijeneetkileşmek amacının güden T hücreleri, olasılıkla reaksiyona gösteren orjinal hücrenin bu kopyaları kendinden-olmayan antijenler timusta bulunmadıklonlar olarak bilinir (Şekil 23.8«). Antijenle etkileşğı için, sıkı bir şekilde bağlanmaz. Bu T hücreleri meyen hücreler çoğalmaz. ölmez, fakat timusu terketip, B lenfositleri ve diğer Görünürdeki sınırsız antijen çeşitliliğine yanıt APC'lerle sunulan yabancı antijenlerle temas kuravermek için, vücutta çok sayıda antijene reaksibilecekleri dalak ve lenf nodüllerine göç ederler. yon gösterecek hücre gerekmektedir. Buna karşın Tolerans indüklemekle birlikte antijene reakantijene-reaksiyon gösteren hücreler, konukçuda tif T-hücrelerinin seçimindeki bu iki-evreli mekakendi antijenlerine karşı immün rekasiyonları uyannizmaya klonal delesyon denilmektedir. T-hücre dırmamalıdır. Bu özel gereksinimleri karşılamak klonlarının öncülleri ya yararsızdır ya da zararlı, için, immün sistem kendinden-olmayan antijenlere ölümcüldür ve timusa giren tüm T hücrelerinin % karşı yararlı olabilen klonları seçip, kendine reaksi99'dan fazlası seçim işlemlerinde canlılığını sürdüyon gösteren klonları elemine eder ya da baskılar. remez. Pozitif ve negatif seçimde canlı kalabilen T hücreleri, daha sonra timusu terk ederek, yabancı T-hücre Seçimi ve Tolerans antijenlere immün yanıtta yer alabilecekleri sekonT hücreleri, antijene-reaksiyon gösteren T hücreler der lenfoit organlara giderler. için ve kendi antijenlerine reaksiyon gösteren klonlara karşı seçimden geçirilir. Kendine-reaksiyon gösB-Hiicre Toleransı teren klonlara karşı seçim, kendi antijenlere karşı tolerans gelişimi veya spesifik immün yanıtsızlık- B hücrelerinde immün toleransın edinilmesi, la sonuçlanır. Öncelikle, toleransın yetersizliği ve kendine-reaktif B hücreleri tarafından üretilen antibuna bağlı olarak otoimmünite gelişimi tartışılakorların (otoantikorlar) konukçu dokuya hasar vecaktır (öOcsKısım 22.15). rebilmesi nedeniyle de gereklidir (<2£*>Kısım 22.15). T hücresi haline gelecek lenfositler, kemik iliğini B hücreleri de klonal delesyona uğrar. Bazı kendineterkederek, lenf kanalları yoluyla, primer bir lenfoit reaktif B hücreleri, insanlardaki B-hücre gelişiminorgan olan timusa girerler (Şekil 23.9, «^»Şekil 22.2). den sorumlu primer lenfoit organ olan, kemik iliğiTimustaki ilk T-hücre olgunlaşma evresine pozitif nin gelişimi esnasında elenir (««sKısım 22.1). seçim adı verilip, olgunlaşmamış T hücrelerinin ti-

Klonal Seçim ve Tolerans

23.10 • ikincil Sinyaller • 773

Kemik iliği kök hücresi

sağlayacak antijene-reaktif hiçbir T hücre yoksa, B hücreleri anerji durumunda kalır. 23.9 Kavramların Gözden Geçirilmesi Timus, antijene-reaksiyon gösteren T hücrelerin olgunlaşması için bir ortam yaratan primer bir lenfoit organdır. MHC proteiniyle etkileşmeyen (pozitif seçim) veya kendi antijenleriyle güçlü bir reaksiyona giren (negatif seçim) T hücreleri, timusta klonal delesyon ile elenir. Pozitif ve negatif seçimde canlılığını sürdüren T hücreleri timusu terkeder ve etkin bir immün yanıta katılabilir. Kendi antijenlerine B hücre reaktivitesi, klonal seçim, delesyon ve anerji sayesinde kontrol edilir. •

T hücreleriyle etkileşim

Bir klon oluşturmak için bir tip hücre seçimi

Kendinize ait bir protein olup toleranslı kalabileceğiniz ve başkasına ait bir protein olup toleranslı olamayacağınız bir örnek gösteriniz. • Pozitif ve negatif T-hücre seçimi arasındaki farklılığı belirtiniz. • B hücreler için, klonal delesyon ile klonal anerji arasındaki farklılık nedir?

İkincil Sinyaller Çoğalma ve plazma ve hafıza hücrelerine farklılaşma

• Şekil 23.8 Klonal seçim. Tek bir antijene özgü olan her B hücresi, spesifik antijeniyle etkileştikten sonra, çoğalır ve bir klon oluşturmak üzere genişler. Antijen, seçici ajan olarak iş görüp, antijene-özgü her B hücresinin seçilmesi ve çoğalmasını yönlendirmektedir. Antijen-reaktif hücrelerin klonal kopyalarının tümü, antijene-özgü ayni yüzey antikoruna sahiptir. Antijene sürekli maruz kalma, klonun sürekli büyümesine yol açar. Benzer bir durum T hücreleri için mevcuttur.

Klonal delesyon olaylarına ilaveten, son seçimde klonal anerji (yanıtsızlık) de rol oynar. Kendine-reaksiyon gösteren olgunlaşmamış B hücreleri, kemik iliğinde kendi antijenlerine yüksek konsantrasyonlarda maruz kalsa bile, gelişmez. Kendi antijenleri bazı B-Hücre Ig reseptölerini kaplayabilmesine rağmen, ileride görüleceği gibi (bakınız Kısım 23.10), B hücresi ikinci bir aktivasyon sinyali için T hücrelerine bağımlıdır. T-hücre seçimi esnasındaki eleminasyon nedeniyle yardım

Daha önce görüldüğü gibi, timusta kendinden olmayan tehlikeli antijenlere karşı reaksiyon göstermek üzere seçilen T hücreleri, kendi antijenlerine tolerans ya da yanıtsızlık için de seçilir ve kendi antijenleriyle reaksiyon veren T hücreleri timusta yok edilir. Buna karşın kendine ait bazı antijenler timusta ifade edilmez. Timusa ait olmayan bu antijenlere yanıt veren T-hücre klonları klonal delesyondan kaçınmış olabilir, fakat klonal anerji geliştirerek, sekonder lenfoit organlardaki etkileşimler sayesinde kendi antijenlerine yanıtsız hale gelebilir. Yukarıda B hücreleri için tartışılan duruma benzer şekilde, T hücrelerinde klonal anerji indüklemenin anahtarı, T hücrelerini aktive etmek için iki-sinyalli mekanizmanın kullanılmasıdır. T-Hiicre Aktivasyonu ve İkinci Sinyal

Seçilmiş olgun T hücreleri timusu terkedince, yerleşip kalacakları ikincil lenfoit organlara (lenf nodülleri, dalak, mukozalarla-bağmtılı lenfoit doku veya MALT) gitmektedir. Bu T hücreleri henüz antijene maruz kalmamıştır ve bu yüzden saf ve genç T hücreleri olarak adlandırılır. Genç T hücreleri, etkin hücreler olarak tümüyle yetkin olmadan önce APC tarafından aktive edilmelidir (co^Kısım 22.6). Genç T hücrelerinin aktivasyonundaki ilk adım peptitin bağlanmasıdır: APC üzerindeki MHC protein kompleksinin TCR ile bağlanmasıdır(Şekil 23.10»). Bu sinyal 2'dir ve aktivasyon için kesinlikle gereklidir. Sinyal 1 olmaksızın, bir T hücresi aktive edilemez. T hücrelerinin aktivasyonundaki sonraki adım, biri APC üzerinde bulunan ve B7 denilen, ve biri

774 • Bölüm 23 • Moleküler İmmünoloji

Kemik-iliğinden ön-T hücreleri

TCR gelişimi: T-hücre reseptörleri (TCR'ler mavi renkli) timustaki T hücrelerinde gelişir

Pozitif seçim: Timusta MHC proteinleriyle (kırmızı) etkileşen T hücreleri bölünür ve çoğalır MHC proteinleriyle etkileşmeyen hücrelerin büyümesi durur ve sonuçta ölür Negatif seçim: Kendi antijeni (mor) ve MHC ile etkileşen T hücreleri ölür. Kendi antijeniyle etkileşmeyen hücreler çoğalmayı sürdürür.

Timus

© * Ş e k i l 2 3 . 9 T-hücre Seçimi ve klonal eksilme. T hücreleri timusta aşamalı bir seçim süreci geçirir 1 Ön-T hücreleri timusa girer ve T-Hücre reseptörlerim (TCR'ler) ifade eder. 2 T hücreleri timusta MHC proteinlerini bağlama yetenekleri bakımından seçilir. MHC'lere bağlanamayan hücreler sonunda ölür, bu olay pozitif seçim olarak bilinir. 3 Pozitif olarak seçilen T hücrelerinden bazıları daha sonra timusta kendi-antijenleri ile etkileşir. Kendi-antijenleriyle etkileşenT hücreleri, negatif seçim adı verilen bir işlemle, timusta eksiltilir. MHC'ye bağlanmayan hücreler sonuçta ölür, bu olay pozitif seleksiyon olarak bilinir. 4 Pozitif ve negatif seçimde canlı kalabilen T hücreleri timustan ayrılır. Seçilen hücreler üzerindeki TCR'ler, timus dışındaki yabancı antijenlerle etkileşebilme yeteneğindedir.

de T hücreleri üzerinde bulunan ve CD28 denilen, iki ilave proteinin etkilemesini içerir. B7'nin CD28 ile etkileşmesi ve bağlanması sinyal 2'dir ve T hücresini aktive eder. Sinyal 2'nin yokluğunda, T hücresi aktive edilemez (Şekil 23.11*). Aktive edilen T hücreleri daha sonra etkin bir hücre haline dönüşür. Aktive edilen bir Tc hücresi, antijeni taşıyan bir hedef hücreyi hatta CD28 taşımayan hedef hücreleri bile öldürecektir. Aktive edilen etkin hücreler, etkili aktiviteyi indüklemek için sadece Sinyal 1 (peptit-MHC)'e gereksinir (Şekil 23.10). ikinci bir sinyale olan bu gereklilik esas olarak klonal anerjiyi yerleştirme ve koruma gibi gizli anlamlar taşır. Örneğin, sunucu olmayan bir hücre üzerindeki kendi antijeniyle etkileşen bağımsız bir Tc hücresi, sadece sinyal l'i alır, çünkü sunucu olmayan hücreler sinyal 2 için gerekli B7 proteinini taşımazlar. Bu sinyalin yokluğunda, bu Tc yanıtsız

Periferik: Yabancı antijenlerle etkileşen antijenler timusu terkeder ve yeniden lenf dolaşımına döner.

i

Lenf nodlarına

kalır ve aktive edilemez (Şekil 23.10). Bu yüzden B7: CD28 ikinci sinyali, aktivasyon için kesinlikle gereklidir. Sinyal l'in varlığında sinyal 2 yoksa, kalıcı anerji indüklenir. Bağımsız TH1 ve TH2 lenfositleri ayni şekilde B7-CD28 koreseptör ikinci sinyalini kullanarak aktive edilir. Sonraki kısımda göreceğimiz gibi, farklı bir ikinci sinyal, B hücrelerini ve diğer immün yanıt etkileyicilerini aktive etmede kullanılır. 23.10 Kavramların Gözden Geçirilmesi Bazı kendine-reaktif T hücreleri, timustaki gelişim ve olgunlaşma esnasında yok edilir. Bağımsız T hücreleri ilk olarak kendi TCR'leriyle peptit: MHC bağlanmasıyla sekonder organlarda aktive edilir (Sinyal 1), bunu B7 APC proteininin CD28 T-hücre proteinine bağlanması izler (Sinyal 2). Bağımsız kendine reaktif T hücreleri eğer sinyal 2 yokluğunda sinyal 1 ile etkileşiyorsa, sekonder lenfoit organlarda yanıtsız hale gelirler.

23.11 • Sitokinler ve Kemokinler • 775

Etkin

Genç Tc hücresi»

Makrofaj

Tc hücnıp'

CD4

Aktivasyon CD28

TCR IL-1 reseptör T H hücre IL-2 < "

Sinyal 1 \

Sinyal 2 Klonal büyüme, hafıza •*»

MHC APC

Hedef hücre

IL-2 reseptör

Zar hasarı apoptoziz, ölüm

(b)

(a)

Farklılaşma

Sinyal 1

Etkileyici fonksiyon yok

Herhangi hücre (c)

Herhangi! hücre

A A

9999 antikor

%f üretimi

(d)

• Şekil 23.10 Genç T hücrelerini aktive etmek için gerekli Sinyal 1 ve Sinyal 2. (a) Genç bir Tc hücresi, APC üzerindeki peptit MHC kompleksi ile TCR aracılığıyla etkileşir. Bu, sinyal 1 'dir. Tc hücresi ayni şekilde, APC üzerindeki bir B7 proteini ile etkileşen bir CD28 proteinine de sahiptir. Bu, sinyal 2'dir.Tc hücresi ve APC'nin sinyal 1 ve sinyal 2 aracılığıyla aynı anda etkileşmesi, genç T hücresini aktive eder. (b) Sürekli aktive edilen bu Tc hücresi sonradan, sinyal 1 etkileşimleri olduğu sürece bir hedef hücreyi öldürme yeteneğindedir. (c) Genç bir Tc hücresi bir hücredeki peptit-MHC kompleksiyle TCR aracılığıyla etkileşir. Sinyal 1 için koşullar karşılansa bile, sinyal 2 üretilmeyebilir, çünkü sadece APC'ler B7 proteinini taşımaktadır (d) Sinyal 2 yokluğunda, Tc hücresi sürekli yanıtsız veya ergsiz hale gelir.

• Bağımsız bir T hücresi için sinyal 1 ve sinyal 2'yi açıklayınız. • Aktive edilen bir T hücresinde etkinlik fonksiyonunu indüklemek için gerekli sinyal (ler)i belirtiniz.

Sitokinler ve Kemokinler İmmün sistemin aktivasyonu için gerekli olan hücreler arası iletişim, sitokinler denilen çözünür bir protein ailesi sayesinde gerçekleştirilir. Sitokinler lökositler tarafından üretilip, immün sistemde çeşitli hücresel fonksiyonları düzenler. Bazı sitokinler, çeşitli hücre tiplerini aktive ettiği için, çok geniş etkilidir. Buna karşın, bu heterojen proteinlerin ortak özelliği, lökositler tarafından üretiliyor olmasıdır. Lenfositler tarafından üretilen sitokinlere çoğu

• Şekil 23.11 Sitokinler ve antikor üretimi. Antikor yanıtında IL-1, IL-2 ve IL-4 sitokinlerinin bazı ana etkileri ve etkileşimleri. Sitokinler makrofajlar, T hücreleri ve B hücreleri için sinyal sağlamaktadır. Sitokinler, T ve B lenfositlerin aktivasyonu, farklılaşması ve büyümesinde olduğu gibi, makrofajlann artan antijen alımını da uyarmaktadır.

kez lenfokinler denilmektedir. İnterlökinler (İL) denilen sitokinler lökositler arasındaki etkileşimlere aracılık eder. Genel olarak, sitokinler bir hücre tarafından salgılanır ve bir hedef hücre üzerindeki spesifik reseptörlere bağlanır. Bazı sitokinler kendisini üreten hücrenin üzerindeki reseptörlere bağlanır. Bu yüzden, bu sitokinlerin otokrin (kendini uyarıcı) yeteneği vardır. Sitokin reseptörlerinin bağlanması, protein sentezi ve hücre bölünmesi gibi aktiviteleri kontrol etmek için hücre membranı üzerindeki bilgiye dayanarak, genellikle bir sinyal iletim yolunu aktive eder (ötsaKısım 8.12). Bu sinyaller sonuçta hücre çoğalması, farklılaşma ve klonal çoğalmaya neden olabilir. Tablo 23.2, bazı önemli sitokinleri, bunları üreten başlıca hücreleri, bunların en genel hedef hücrelerini ve bunların biyolojik etkilerini göstermektedir. Toplam olarak, bilinen 40'a yakın sitokin bulunmakta olup, bunların çoğu ya T f[ hücreleri veya monositler ve makrofajlar tarafından üretilir. Şimdi, antijene-spesifik antikor-aracılı bir immün yanıtın indüklenmesiyle ilgili üç sitokin aktivitesi incelenecektir.

776 • Bölüm 23 • Moleküler İmmünoloji

IL-l,IL-2veIL-4 Daha önce görüldüğü gibi, makrofajlar antijen alımı, işlenmesi ve sunumundan sorumludur (öet> Kısım 22.16). Ayrıca, bunlar birçok farklı hücre tipini etkileyen, IL-1 olarak bilinen bir sitokin salgılar (Tablo 23.2 ve Şekil 23.11). IL-1, immün sisteminin anahtar bir unsurudur çünkü TH hücreleri IL-1 tarafından aktive edilir. Lenf nodüllerinde T u hücreleri ve makrofajlarm yakın olmaları nedeniyle, yakındaki TH2 hücreleri de olasılıkla aktive edilmektedir. TH2 hücresi üzerindeki IL-1 reseptörleri (IL-IR) tarafından IL-1 bağlanması, bir aktivasyon sinyali olarak iş görür. Aktive edilen TH2 hücresi, daha sonra IL-2 üreterek buna yanıt verir, IL-2 salgılanır ve TH2 hücrelerinin yüzeyindeki IL-2R ile bağlanır. Bu yüzden, IL-2 kendisini salgılayan ayni hücreyi aktive eder. IL-2'nin etkisiyle hücreler bölünür, klonal kopyalar yapar. Süreç içinde, TH2 hücresi diğer sitokinleri de oluşturur, bu durumda, sözü edilen IL-4 olup, daha sonra B hücreleri üzerindeki IL-4R'ne bağlanır. IL-4: IL-4R kompleksi B hücrelerini sonradan antikorları üretecek olan plazma hücrelerine farklılaşmak için uyarır (c«2.Kısım 22.10). Bu yüzden, IL-1, IL-2 ve IL-4 sitokinleri, antikor-aracılı immün yanıtı oluşturmak için etkileşen hücreler olan T lenfositleri, makrofajlar ve B hücreleri için çözünür aracılar ve aktivatörlerdir. Diğer Sitokinler

Tablo 23.2 de diğer birçok sitokinin aktivitesi görülmektedir. Bu proteinlerin bazıları spesifik immüniteyle ilişkilidir. Örneğin, IL-4 esas olarak B Tablo 23.2 Sitokin

hücrelerini etkiler. Bununla birlikte, birçok sitokin T veya B lenfositleri etkilemez, fakat diğer hücreler üzerinde faaliyet gösterir; sitokin ile aktive edilen hücreler buna karşılık doğal konukçu yanıtlarının önemli ayarlayıcıları olarak iş görür. Örneğin, interferonlar (IFN-a ve IFN-y) lökositlerce üretilir ve vücuttaki bir hücrede ortaya çıkan viral çoğalmayı engeller. Tümör nekrozis faktörler olan TNF-a ve TNF-/3 , TNF-üreten hücreler tümöre ulaştıkları takdirde, çeşitli tümörleri öldürebilirler. TNF-a, ayni zamanda yangının kritik bir aktivatörüdür (önçsKısım 22.3). İnterferonlar ve TNF'lerin hedef hücre spesifitesi olmadığı görülür, fakat fagositlerin yanısıra T hücrelerince de üretilir ve immün hücrelerin etkilerini arttırabilirler. Kemokinler

Kemokinler küçük proteinlerin bir grubu olup, fagositik hücreler ve T hücreler için kimyasal cezbediciler olarak işlev görür. Bunlar, konukçu hücrelerde hasara yol açan bakteriyal ürünler, virüsler ve diğer ajanlara yanıt vermek amacıyla lenfositler ve çeşitli diğer hücrelerce üretilir. Kemokinler, hasar olan bölgeye fagositleri ve T hücrelerini çekip, spesifik bir immün yanıt potansiyeli oluşturduğu gibi ,yangısal bir yanıtı da teşvik etmektedir. Yaklaşık 40 farklı kemokin bilinmektedir. Olasılıkla en iyi çalışılan kemokinler IL-8 ve makrofaj cezbedici protein-1 (MCP-1) (Tablo 23.2) dir. IL-8, doku hasarına yanıt vermek veya patojenlerle temas kurmak amacıyla, monositler, makrofajlar, fibroblastlar (konnektif doku hücreleri) ve kerati-

Bazı Önemli Sitokinler ve Kemokinlerin Özellikleri Üreticiler

Asıl Hedefler

Etkisi

Monositler Aktif T hücreleri

TH

IL-1» IL-2 IL-3 IL-4 IL-5 IL-10 IL-12 IEN-a b IFN-y 2 GM-CSP

TH1

TH1, NK hücreleri Normal hücreler Makrofajlar Miyeloit kök hücreleri

TGF-/3d TNF-a e TNF-/3

T H lveT H 2 TH1, makrofajlar NK hücreleri T l

Makrofajlar Makrofajlar Makrofajlar

Aktivasyon Gelişme, farklılaşma Gelişme faktörü Ig Gl ve Ig E sentezi Ig A sentezi TH1 inhibisyonu Farklılaşma, aktivasyon Anti-viral Aktivasyon Granülositlere, monositlere farklılaşma Aktivasyonu engelleme Aktivasyon Aktivasyon

Makrofajlar, fibroblastlar, keratinositler Makrofajlar, fibroblastlar, keratinositler

Nötrofiller, T hücreleri

Cezbedici ve aktivatör

Makrofajlar, T hücreleri

Cezbedici ve aktivatör

Kemokinler IL-8 MCP-1'

TH1 TH2 TH2 TH2

Makrofajlar, dentritik hücreler Lökositler

V

T hücreleri Hematopoetik kök hücreleri B hücreleri B hücreleri

"İL, interlökin;bIFN, interferon; CGM-CSF, granülosit, monosit koloni uyarıcı faktör; dTGF, T-hücresi büyüme faktörü; TNF, tümör nekroz faktörü; f MCF, makrofaj cezbedici protein

• Uygulama Soruları • 777

nositleri (deri hücreleri) içeren oldukça çeşitli hücre tipince üretilir. IL-8, etkilenen hücrelerce salgılanır ve çevre dokuya bağlanıp, burada T hücreleri ve nötrofiller için bir kimyasal cezbedicidir (Ö°ÖKIsım 22.1) Bu durum nötrofil-aracılı yangısal yanıta yol açıp, bunu olay yerine çekilen T hücrelerince oluşturulan spesifik bir immün yanıt izler. Sitokin reseptörlerinde olduğu gibi, hedef hücre üzerindeki ilgili kemokin reseptörleri, hedef fagositler veya T hücrelerin aktivasyonunu indüklemek için sinyal iletişim yolları boyunca iş görür (««sKısım 8.12). MCP-1, çeşitli hücre tiplerince de üretilir ve makrofajlar ile T hücrelerini cezbeder; yine yangısal aracıların üretimini teşvik edici ve antijenespesifik bir immün yanıtın olası düzenleyicisidir. Bu yüzden kemokinler, T hücrelerinin olaya katılmasına ve antijene-spesifik immün reaksiyonlara yol açan, spesifik olmayan yangısal reaksiyonların güçlü başlatıcılarıdır.

23.11 Kavramların Gözden Geçirilmesi Sitokinler lökositlerce üretilen aracılar olup, hücreler arası etkileşimleri düzenler. IL-1, IL-2 ve IL-4 gibi bazı sitokinler lökositlere etkir ve spesifik immün yanıtın oluşumunda kritik yapı taşlarmdandır. IFN ve TNF gibi diğer sitokinler çeşitli hücre tiplerine etkir. Kemokinler hasara yanıt vermek amacıyla çeşitli hücre tiplerince üretilir ve spesifik-olmayan yangı hücreleri ve T hücreleri için güçlü cezbedecilerdir. • IL-1, IL-4, IL-12, IL-y, IL-)3 için hedef hücreleri karşılaştırınız. • Sitokin ve kemokinler hücre kaynaklarına göre nasıl ayrılmaktadır? • Sitokin üretimini hangi olaylar uyarır? Kemokin üretimini hangi olaylar uyarır?

DEĞERLENDİRME SORULARI 1. Patern tanıma moleküllerini (PRM) tanımlayınız ve patojenle-bağıntılı moleküler paternleri (PAMP) ile etkileşimlerini belirtiniz (<^*»Kısım 23.1). 2. Ig gen süper ailesine ait bir gen ve onun kodladığı proteini göstermek için kullanılan kriterleri belirtiniz (<**>Kısım 23.2). 3. Sınıf I ve Sınıf II MHC proteinlerinin başlıca yapısal özelliklerini belirtiniz (ö°öKısım 23.3). 4. Polimorfizmin anlamı, her farklı MHC proteininin farklı bir peptit motifi bağlamasıdır. HLA sınıf I polimorfizmi için, bir kişide kaç farklı HLA proteini ifade edilir? Tüm insan popülasyonunda durum nedir? (€53&Kısım 23.4) 5. Tam bir antijen-bağlama bölgesi yapmak için hangi Ig zincirleri kullanılır? Hangi bölgeleridir? Hangi CDR'lerdir? (ö^SKısım 23.5). 6. Mevcut Ig genlerinden yapılabilecek VH ve VL bölgelerinin toplam sayısını hesaplayınız. Tüm olası ağır zincirler ve hafif zincirlerin yeni çeşitlenmesiyle, tümüyle kaç tane Ig proteini üretilebilir? («33aKısım 23.6).

7. TCR ile peptit antijen ve MHC proteininin etkileşimini tanımlayınız. TCR de CDR'lerin rolünü tanımlamayı unutmayınız. (CKfeKısım 23.7). 8. TCR'lerdeki farklılık, Ig'lerde olduğu gibi rekombinasyon ve yeni-çeşitlenmeyle üretilebilir. Buna karşın, ilave farklılık N-bölgesi nükleotit ilaveleri ve üç okuma çerçevesinin tümünde D (farklılık) segmentinin okunması ile sağlanmaktadır. Bu farklılık üreten mekanizmaların nasıl çalıştığının belirtiniz («^SKısım 23.8). 9. T hücrelerinin pozitif ve negatif seçimini açıklayınız 10. Genç T hücrelerin aktivasyonu için hangi moleküler etkileşimler gereklidir? Etkin hücrelerin aktivasyonu için hangileri gereklidir (^^sKısım 23.10)? 11. Sitokinlerin ve kemokinlerin başlıca etkileri nelerdir? Sitokinler ve kemokinler arasındaki ana farklılıklar nelerdir (öasKısım 23.11)?

UYGULAMA SORULARI 1.

2.

3.

Konukçu için sonucunu tahmin ederek bir PRM'yi elemine eden genetik bir mutasyonun sonuçlarını belirtiniz. Bunu her PRM için yapınız. Ig gen süper ailesi üyelerince kodlanan proteinlerin ortak özelliklerini gösteren bir tablo yapınız. Ig'ler, TCRTer ve MHC proteinleri için bu ortak özelliklere uyan yapısal bileşenleri tanımlayınız. Polimorfizmin anlamı, her farklı MHC proteininin farklı bir peptit motifi bağlamasıdır. Buna karşın, sımf I proteinleri için, sadece 6 peptit motif bir kişide tanınabilir, oysa tüm insan popülasyonuyla 350'den fazla motif tanınabilir. Popülasyon için bu ne avantaj sağlar? Bireyler için ne avantaj sağlar?

4.

5. 6.

Genetik rekombinasyon olayları, Ig'lerin antijenbağlama bölgesinde belirgin farklılık oluşturmada önemli olmasına karşın, rekombinasyon-sonrası somatik olaylar toplam Ig farklılığı oluşturmada daha önemli bile olabilir. Bu saptamayla ayni düşüncede misiniz, yoksa karşı düşüncede misiniz? Açıklayınız. Pozitif seçimin yokluğunda T-hücre repertuarında ne oluşabilir? Negatif seçimin yokluğunda ne oluşabilir? Tüm periferal T hücrelerinin aktivasyonu sonucu ne olabilir? ikinci sinyal sistemi bunun oluşmasını nasıl engeller?

TANISAL MİKROBİYOLOJİ VE İMMÜNOLOJİ

1 GELİŞMEYE BAĞLI TANI

24.1 24.2 24.3 24.4 II

24.5 24.6 24.7 24.8 24.9 24.10 24.11 III

YÖNTEMLERİ Klinik Örneklerden Patojenlerin İzolasyonu Gelimeye Bağlı Tanı Yöntemleri Antimikrobiyal İlaç Duyarlılık Testi Mikrobiyoloji Laboratuvannda Güvenlik İMMÜNOLOJİ VE KLİNİK TANI YÖNTEMLERİ Enfeksiyöz Hastalıklar İçin İmmünoassayler Poliklonal ve Monoklonal Antikorlar İn vitro Antijen-Antikor Reaksiyonları: Seroloji Aglütinasyon Floresan Antikorlar Enzim Bağlı İmmünosorbent Assay ve Radyoimmünassay İmmünoblot Yöntemleri MOLEKÜLER VE GÖRSEL TANI YÖNTEMLERİ

24.12 Nükleik Asit Yöntemleri 24.13 Tanısal Viroloji

778

779 779 785 788 789

792 792 795 797 799 801 804 808

810 810 812

Laboratuvar personelini laboratuvar enfeksiyonlarından korumak için mutlaka önlemler alınmalıdır. Şekil, maksimum kontrollü biyogüvenlik seviye-4 (BSL-4) tesisinde ölümcül bir insan patojeni ile çalışan bir kişiyi göstermektedir.

24.1 • Klinik Örneklerden Patojenlerin İzolasyonu • 779

BOLÜMLE İLGİLİ SQZL.UK Aglütinasyon antikor ve partiküle bağlı antijen arasındaki, partiküllerin görünür şekilde kümeleşmesiyle sonuçlanan reaksiyon. Antibiyogram klinik mikroorganizma izolatlarınm kullanımda olan antibiyotiklere karşı duyarlılıklarını gösteren bir rapor. Bakteremi kanda bakterilerin bulunması. Ayırt edici besiyeri mikroorganizmaların fenotopik özellikleri sayesinde tanılarına izin veren besiyeri. ELISA enzim-bağlı immunosorbent assay Zenginleştirilmiş besiyeri özel büyüme faktörlerinin ilavesi sayesinde, metabolik olarak zor büyüyen organizmaların büyümesine izin veren besiyeri. Zenginleştirme kültürü doğal örneklerden mikroorganizmaları izole etmek için, seçilmiş besiyeri ve inkübasyon

koşullarının kullanılması. Floresan antikor bir antikor molekülünün floresan bir boya ile kovalent modifikasyonu; boya antikoru floresan ışık altında görünür yapar. Genel Amaçlı Besiyeri çoğu aerobik ve fakültatif anaerobik organizmanın büyümesini destekleyen besiyerleri. îmmünoblot (VVestern blot) proteinlerin elektroferezi takiben bir membrana aktarılmaları ve spesifik antikorların ilave edilmesiyle saptanmaları. Monoklonal antikor tek bir B hücre klonu tarafından yapılan antikor. Nötralizasyon antijenin biyolojik aktivitesini azaltan ya da bloke eden antijenantikor etkileşimi. Nukleik Asit Probu spesifik genlerin tanısı için bir hibridizasyon probu olarak kullanılan eşsiz sekanslı bir oligonükleotit. Poliklonal antikorlar birçok farklı B

ikrobiyolog, enfeksiyon hastalıklarına neden olan ajanların tanısında kritik bir rol oynar. Mikrobiyolojinin bu alanına tanısal veya klinik-mikrobiyoloji denilir. Klinik laboratuvarlar rutinde en sık karşılaşılan patojenik bakterileri örneklemeden sonra 48 saat içinde geliştirir, izole ve identifiye edebilirler. İmmünolojik ve moleküler yöntemler de, organizmanın kültürünü yapmadan birçok patojenin tanısında kullanılabilirler. Bu yöntemler, etkenin kültüre alınmasındaki güçlükler nedeniyle tanıda zorluk çıkartan viral ve protozoal enfeksiyonların teşhisinde özellikle önemlidir.

M

GELİŞMEYE BAĞLI TANI YÖNTEMLERİ Patojenlerin konukçu dokularından izolasyonu ve geliştirilmeleri ile ilgili prensiplerin tartışılması ile başlıyoruz. Gelişmeye bağlı yöntemler birçok patojenin tanısında için önemlidir.

Jflinik Örneklerden Patojenlerin izolasyonu Doktor, bir hastanın muayenesini takiben enfeksiyöz bir hastalığın mevcudiyetinden şüphelenebilir. Daha sonra enfekte doku veya sıvı örnekleri mikrobiyolojik, immünolojik ve moleküler biyolojik analizler için toplanır (Şekil 24.1 •). Toplanan materyaller, kan, idrar, dışkı, tükürük, beyin-omurilik sıvısı veya bir yaradan alınan cerahat olabilir. Şüpheli enfekte bir bölgeyi örneklemek için steril bir eküvyon kullanılabilir (Şekil 24.2»). Eküvyon daha sonra sıvı besiyeri tüpünü veya bir katı besiyerinin

hücre klonu tarafından yapılan antikorlar. Presipitasyon antikor ve çözünmüş antijen arasında, çözünmeyen görünür bir kompleks oluşumuyla sonuçlanan reaksiyon. RIA radioimmünassay Seçici besiyeri eklenen bir besiyeri bileşeni nedeniyle, bazı organizmaların büyümesini geciktirirken bazılarınınkini arttıran besiyerleri. Duyarlılık tayin edilebilen en düşük antijen miktarı Septisemi kan enfeksiyonu Seroloji in vitro antijen-antikor reaksiyon çalışmaları Spesifite bir antikorun tek bir antijeni tanıma yeteneği Titre immünolojik anlamda, bir solüsyondaki mevcut antikor miktarı.

yüzeyini inoküle etmek için kullanılır. Bazı durumlarda, küçük canlı doku parçaları da kültür için örneklenebilir. Tablo 24.1'de tipik klinik örneklerden izole edilen organizmaların ilk kültürü için gerekli olan tavsiyeler özetlenmektedir. Eğer klinikle ilişkili organizmalar izole ve identifiye edilecekse, örnek mutlaka uygun bir şekilde alınmalıdır. Klinisyen, örneğin gerçek enfeksiyon bölgesinden alındığına emin olmalıdır. Ayrıca, eğer yetersiz inokulüm alınmışsa, patojenlerin geri kazanılması mümkün olmayabilir. Örnek mutlaka aseptik koşullarda da alınmalıdır ki kontaminasyondan kaçınılabilsin. Bazı organizmaların metabolik gereksinimlerinin sağlanması için dikkat edilmelidir, örneğin anoksik koşulların korunması. Örnek bir kere alındıktan sonra, en kısa zamanda analiz edilmelidir. Besiyerleri ve Kültür Zenginleştirme kültürü, örneklerden mikroorganizmaların izolasyonu için seçilmiş besiyeri ve inkübasyon koşullarının kullanılmasıdır (o°öKısım 18.1) ve klinik mikrobiyolojinin önemli bir parçasıdır. Çeşitli özelleşmiş besiyerlerinin kullanılmasıyla klinik öneme sahip çoğu organizma geliştirilebilir, izole edilebilir ve identifiye edilebilir. Çoğu klinik örnek önce kan ağar gibi çoğu aerobik ve fakültatif anaerobik organizmanın gelişmesini destekleyen genel amaçlı besiyelerinde çoğaltılır (^%sŞekil 21.18 ve Tablo 24.1). Zenginleştirilmiş besiyerleri, gonoreye (bel soğukluğu) neden olan Neisseria gonorrhoeae gibi bazı patojenlerin gelişmesinin arttırılması için çoğu kez gerekli olan spesifik gelişme faktörlerinin ilavesinden dolayı, metabolik olarak zor

780 • Bölüm 24 • Tanısal Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Hasta (şüpheli enfeksiyöz hastalık)

İmmünolojik yol

I

Mikrobiyolojik yol

Kan örneği Şüpheli antijene karşı antikor aranması (a)

Kan Gaita İdrar Doku biyopsisi Mukozal svap Konvansiyonel mikrobiyoloji

Antikor assay (aglütinasyon, RIA, ELISA, vb.)

(b)

(c)

• Şekil 24.2 Üst solunum yollarından örnek alma yöntemleri, (a) Boğaz eküvyonu. (b) Burundan geçen nazofaringeal eküvyon. (c) Burun içi eküvyon.

Moleküler mikrobiyoloji

Septisemi, bir enfeksiyon noktasından kana giren, çoğalan ve çeşitli vücut dokularına giderek Zenginleştirme kültürü, yeni enfeksiyonlar başlatan virülent bir organizmazenginleştirilmiş, seçici nın gelişmesi sonucu oluşan bir kan enfeksiyonuveya ayırt edici besiyeri İmmünolojik Moleküler (Patojen aranması: (patojen dur. Septisemi; ateş ve titremeyi takip eden halsizmikrobiyal hücreler genomu lik gibi şiddetli sistemik semptomlarla sonuçlanır. veya virüs aranması) partikülleri) Nükleik asit Şiddetli septisemi vakaları kalp, böbrekler ve akciFloresan antikor hibridizasyonu ğerlerin dahil olduğu çoklu organ bozuklukları ve ELİSA PCR şiddetli kan basıncı düşmesi ile karakterize edilen Saf kültür izolasyonu yaşamı tehdit eden sistemik bir durum olan septik şok ile sonuçlanabilir. Kan kültürleri etken amilin izolasyonu ve tanısı için doğrudan tek yolu sağlar ve bu nedenle tanı, dikkatli ve uygun yapılan kan kültürüne bağlıdır. Identifikasyon (Tanılama) Antibiyotik duyarlılığı Standart kan kültürü prosedürü bir damardan Büyümeye bağlı assayler (kemoterapi etkinliğinin aseptik olarak 20 mi kanın alınması ve bunun bir İmmünolojik identifikasyon kararı) Moleküler identifikasyon anti koagülant ile genel amaçlı bir besiyeri içeren iki kan kültürü şişesine enjekte edilmesidir. Bir şişe aerobik, bir şişe anaerobik olarak inkübe edilir. Kan * Şekil 24.1 Patojenlerin izolasyonu ve tanısı. Enfeksiyöz kültürü şişeleri 35°C'ta inkübe edilirler ve otomatik patojenlerin izolasyon ve tanısı için kullanılan klinik ve tanı yönsistemlerin çoğunda 5 güne kadar her saat birçok temleri. kere kontrol edilirler. Çoğu klinik olarak önemli bakteriler iki gün içinde geri kazanılırken, daha gelişen organizmaların çoğalmasına izin verirler zor gelişen organizmalar üç-beş gün içinde geri (Tablo 24.1). Bazı besiyerleri seçici besiyerleridir, kazamlabilirler. Bazı kan kültür sistemleri kırmızı ve beyaz kan hücrelerini lizise uğratarak hücre içi bazı organizmaların gelişmesini arttırırken, diğerlepatojenlerin serbest kalmasını sağlayan bir kimyarinin gelişmelerini ilave edilen bir bileşen nedeniyle sal kullanırlar. Kan kültürlerindeki organizmalar geciktirirler. (Tablo 24.1). Son olarak ayırt edici begenellikle otomatik sistemlerdeki mikrobiyal gelişsiyerleri, organizmaların besiyerindeki gelişme ve me indikatörleri, mikroskobik inceleme ve alt külgörünüşlerine göre tanılarına izin veren özelleşmiş tür ile saptanırlar. Otomatik kan kültür sistemleri besiyerleridir (bkz. Şekil 24.7). gelişmeyi her 10 dakika sıklıkta bir karbondioksit üretimini ve bulanıklılığı izleyerek saptarlar. Kan Kültürleri Kan alınırken derinin normal florasından belBakteremi, kanda bakterilerin bulunmasıdır, (c^s li bir miktar kontaminasyon kaçınılmazdır ve Kısım 21.7). Bakteremi sağlıklı bireylerde fevkala%2-3'lük bir kontaminasyon oranı beklenebilir. Dede nadirdir, normalde sadece dental işlemler veya ride yaygın olarak bulunan Staphylococcus epidermitravma gibi invaziv işlemlere karşı olan yanıtta dis, korineform bakteriler veya propionibakterler geçici şekilde bulunur. Kandaki bakterilerin uzun gibi bazı bakteriler yaygın kontaminantlardır. Buna süreli mevcudiyetleri genellikle sistemik enfeksirağmen, bu organizmalar bazen kalp enfeksiyonuyonun göstergesidir. Kanda en yaygın bulunan pana (subakut bakteriyal endokarditis) veya yapay tojenler Pseudomanas aeruginosa, enterik bakteriler, kalp kapakları gibi damar içi cihazlarda koloniözellikle Escherichia coli ve Klebsiella pneumoniae ve zasyona neden olabilirler. Bu nedenle, kan kültürü sonuçları yorumlanırken epeyce mikrobiyolojik ve gram-pozitif koklar, Staphylococous aureus ve Strepklinik deneyim gerekmektedir. tococcus pyogenes'ı içerir.

I

i

4

24.1 • Klinik Örneklerden Patojenlerin İzolasyonu • 781

Tablo 24.1

Patojenlerin ilk izolasyonu için önerilen seçici ve zenginleştirilmiş besiyerleri. Besiyerleri

Örnek Göğüs, abdomen, perikardiyum, eklem sıvıları 1 Dışkı: rektal veya enterik taşıma eküvyonları ' Cerrahi doku biyopsileri Boğaz, tükürük, tonsil, nazofarinks, akciğer, lenf nodülleri idrar yollan, vajina, serviks idrar Kan» Yaralar, apseler, eksüdatlar

Kan ağar + + + + + + + + +

Enterik ağar + + + + + + + + +

CA

MTM

ANA

+ +

+ +

+ +

+

+ +

-

+ +

KAYNAK: Murray, P. R., E. J. Baron, J. H. Jorgenson, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken. 2003. Manual of Clinical Mkrdbiölogy, 8th edidtion. American Society for Microbiology, Washington D. O.'den adapte edilmiştir. " Kanlı ağar, triptik soy agar'a %5 koyun kanı ilave edilir; enterik ağar, eozin metilen mavisi (EMB) ağar veya Mac Conkey ağar; CA, çukulotalı (ısıtılmış kan) ağar; MTM, modifiye Thayer-Martin ağar; ANA, anaerobik ağar, tiyoglikolat içeren kanlı ağar veya anaerobik olarak inkübe edilen destekli tiyoglikolat ağar. * Özel enterik patojen besiyerleri, SMAC (sorbitoUü MacConkey ağar) fekal vce enterik örneklerin kültüründe de kullanılır. SMAC, enteropatojenik Escherichia coli gibi sorbitolnegatif enterik patojenlerin izolasyonu ve tanısında kullanılan seçici ve ayirtedici bir besiyeridir. ' Kan ilk olarak sıvı besiyerinde kültüre edilir. Izolatlarm Gram boyanma karakteristiklerine bağlı olarak, alt kültür MacConkey agar'da (gram negatif) veya chocolate agar'da (gram pozitif) yapılır.

idrar Kültürleri

rarda önemli derecede nitrit üretimi sadece yüksek sayıdaki (>105ml) enterik organizmaların mevcuİdrar yolu enfeksiyonları özellikle kadınlarda oldiyetinde gerçekleştiği için, bu yöntem idrar yolu dukça yaygındır. Etken amiller genellikle normal enfeksiyonları için çok hızlı bir kontroldür. İdrar flora üyeleri olduğu için (örneğin, Escherichia coli) yolu enfeksiyonu için olan diğer dipstik testleri, idrarın bakteriyolojik analizinde oldukça dikkatli genellikle nitrat indirgenmesiyle bağlantılı olarak olunmalıdır. Çoğu vakada, idrar yolu enfeksiyonu kullanılır, esteraz (lökositler tarafından üretilir, <^> bir organizmanın idrar yolundan dışarıya çıkarak, Kısım 22.1) ve peroksidaz (birçok çeşit bakteri tamesaneyi enfekte etmesi sonucu oluşur. İdrar yolu rafından üretilir, (aaaKısım 6.15 ve 17-22) saptanır. enfeksiyonları aynı zamanda nozokomiyal enfeksiPozitif dipstik testini idrar kültürü takip eder. yonların (hastane kökenli enfeksiyonların) en yayPotansiyel idrar yolu patojenlerinin karaktegın tipidir (fiMoKısım 25.7). ristik morfotiplerini identifiye etmek için, bakteÖnemli idrar yolu enfeksiyonları genellikle riüri gösteren idrar örneklerinde direkt olarak bir temiz orta akım idrarı örneğinin mi'sinde 105 ya gram boyama da («**sKısım 4.1) yapılabilir. Bunda daha fazla organizmaya ulaşan bakteri sayılar gram-negatif çubuklar (enterik bakteriler, (efs, sıyla sonuçlanır. Bir enfeksiyonun yokluğunda Kısım 12.11), gram-negatif koklar (Neisseria, o"^» dış genitallerden gelen idrarın kontaminasyonu Kısım 12.10) ve gram-pozitif koklardır (Enterococ(belli bir dereceye kadar neredeyse kaçınılmazdır) cus, Bölüm 12.19). Gram boyama ve diğer doğruml'de lCFten daha az organizma ile sonuçlanır. En dan boyama yöntemleri, tükürük gibi diğer vücut yaygın idrar yolu patojenleri enterik bakterilerin sıvılarındaki bakterilerin direkt saptanmasında da üyeleridir, vakaların yakaşık % 90'ından Eschericyararlıdır («3°c»Kısım 26.5). hia coli sorumludur. Diğer idrar yolu patojenleri Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Pseudomonas Streptococcus saphrophyticus ve Enterecoccus faecalis'tii.

Gonore'nin nedeni olan Neisseria gonorrhoeae idrarda bizzat çoğalmaz, ancak üretra epitelyumunda gelişebilir ve farklı yöntemlerle teşhis edilir (ileriye bakınız). İdrarın direkt mikroskobik tetkiki, idrarda anormal sayıda bakterinin bulunması olan bakteriüri'nin göstergesi olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, yaklaşık olarak bütün idrarlar belli seviyede bakteriyal üreme taşıdıklarından, bakteriüri genellikle ticari olarak bulunan dipstik (daldırma) testlerinin kullanılmasıyla izlenir. Örneğin bir dipstik testi nitratın indirgenmesini, indirgenme ürünü olan nitriti saptayarak takip eder. Pozitif bir test, dipstikteki bir renk değişikliği ile belirlenir (Şekil 24.3»). İd-

• Şekil 24.3 Dipstik testi ile ürinanaliz. Test çubuğunun altında bir kontrol çubuğu gösterilmektedir. Test çubuğu soldan sağa doğru bir idrar örneğindeki glukoz, bilirübin, ketonlar, spesifik gravite, kan, pH, protein, urobilinogen, nitrit ve lökosiuerin (esteraz) anormal seviyelerini ölçer. Esteraz (zayıf pozitif, sağ uç) ve nitrit (kuvvetli pozitif, sağdan ikinci) için anormal ölçümler bakteriüriyi gösterir. Bu örneğin sonraki kültürü Escherichia coi/'nin varlığım göstermiştir.

782 • Bölüm 24 • Tanısal Mikrobiyoloji ve İmmünoloji

Potansiyel idrar yolları patojenlerini kültüre etmek için normalde iki besiyeri kullanılır: (1) seçici olmayan genel bir besiyeri olarak kan ağar ve (2) enterik bakteriler için seçici olan Mc Conkey veya eozin metilen mavisi ağar gibi bir besiyeri (bkz. Kısım 24.2 ve Şekil 24.4»). Bu özelleşmiş enterik besiyerleri Staphylococcus spp. gibi (yaygın deri kontaminantı) gram pozitif organizmaların büyümesini inhibe ederken, laktoz fermentörlerinin, non fermentörlerden ilk ayrımının yapılmasına izin verir. Deneyimli klinik mikrobiyologlar, Tablo 24.2'de tanımlanan çeşitli besiyerlerinde büyüyen şüpheli patojenlerin koloni morfoloji ve renklerini gözleyerek, bir izolatm tecrübeye dayalı tanısını yapabilirler. Böyle bir tanı mutlaka daha detaylı testlerle takip edilmelidir, ama klinik mikrobiyologlar bu bilgiyi pozitif bir tanı yapmak için, bu bölümün sonundaki kısımda de tartışılacak olan daha ileri test sonuçlarıyla birleştirirler.

ve işlemler arasındaki gecikmeden kaçınılmalıdır. Bu özellikle her ikisi de asit pH'a duyarı olan Salnıonella ve Shigella türlerinin izolasyonunda kritiktir. Yeni toplanan fekal örnekler laboratuvara taşınırken fosfat tamponu içeren bir şişeye konulur. Şüpheli gıda veya su kaynaklı emfeksiyonu olan hastalardan alman dışkı örneklerinin yanı sıra, kanlı veya cerahatli dışkılar da bireysel bakterilerin izolasyonu için birçok seçici ortama inoküle edilir. İntestinal parazitler (bkz. Kısım 24.2) kültürel yöntemlerden ziyade kistlerin dışkı örneğinde mikroskobik olarak gözlenmesiyle ya da antijen tayin testleri (bkz. Kısım 24.5'den 24.11'e) ile identifiye edilirler. Birçok laboratuvar genellikle kontamine gıda ya da sulardan kazanılan iki önemli intestinal patojen olan Esherichia coli 0157:H7 ve Campylobacter'i identifiye etmek için, çeşitli seçici ve ayırtedici besiyerleri ve inhübasyon koşullarını da kullanırlar (öO&Kısım 29.8 ve 29.9).

İdrar kültürleri, bir petri için inokulüm olarak genellikle 1 ul gibi ayarlanmış miktarda idrar kulYaralar ve Abseler landırarak, kan ağar ya da seçici bir katı besiyerinHayvan ya da insan ısırıkları, yanıklar, kesikler ya deki kolonilerin sayılmasıyla kantitatif olarak da da yabancı obje girişi gibi travmatik yaralanmalaryapılabilir. la ilgili enfeksiyonlar, ilgili patojenin kazanılması Son olarak, ısrarlı idrar yolları enfeksiyonu için dikkatlice örneklenmeli ve sonuçlar mutlaka semptomlarına rağmen bakteriyal gelişme elde edidikkatlice yorumlanmalıdır. Yara enfeksiyonları lemiyorsa klinisyen, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydiave abseler genellikle normal flora ile kontamine trachomatis, Branhemella türleri mycoplasmalor gibi durumdadır ve böyle lezyonlardan alınan eküvyon zor gelişen organizmalar ya da birçok anaerobik orörnekleri genellikle yanıltıcı olur. Abseler ve diğer ganizma için direkt kültür talebinde bulunabilir. cerahatli lezyonlar için en iyi örnek alma yöntemi, Fekal Kültürler İntestinal patojenlerin izolasyonunda dışkının uygun şekilde alınması ve korunması önemlidir. Saklama sırasında fekal asidite arttığından, örnekleme

deri yüzeyinin dezenfeksiyonundan sonra cerahatin steril bir enjektör veya iğne ile çekilmesidir. Dahili cerahat lezyonları, biyopsi veya ameliyatla ile alınan dokulardan örneklenir. Birçok patojen yara enfeksiyonları ile ilişkilidir. Bu patojenlerin bir kısmı anaerobik olduğundan, anaerobik koşullarda alınacak, taşınacak ve kültürü yapılacak örneklerin aerobik koşullardaki gibi uygun şekilde değerlendirilmesi gerekir. Örneğin, yara enfeksiyonlarmdaki cerahatli akıntılarla çoğunlukla ilişkili olan potansiyel patojenler Staphylococcus aureus, enterik bakteriler, Pseudomonas aeruginosa ile Bacteroides ve Clostridium cinslerinden olan anaerobardır. Başlıca izolasyon besiyerleri kan ağar, enterik bakteriler için birçok seçici besiyeri (Tablo 24.1 ve 24.2) ve zorunlu anaeroblar için indirgeyici ajanlar ve ilave destekleyiciler içeren kan ağardır. Böyle örneklerden yapılan gram boyamalar direkt olarak mikroskopta incelenirler. Genital Örnekler ve Gonore'nin Laboratuvar Tanısı

• Şekil 24.4 Bir eozin metilen mavisi (E1HB) ağar petrisi. Petride bir laktoz fermentörü Eschehchia coli (solda) ve bir mektedir. E. coli kolonilerinin metalik yeşil parlaklığına dikkat ediniz.

Erkeklerde cerahatli bir idrar boşaltımı, cinsel yola bulaşan gonore hastalığının («ne»Kısım 26.12) klasik belirtisidir. Eğer akıntı yoksa, ön idrar yoluna sokulan, herhangi bir sızıntıyı emmesi için birkaç saniye tutulan ve daha sonra gonorenin etken amili Neisseria gonorrhoeae'nin tanısı için çıkartılan steril dar çaplı bir pamuk eküvyon kullanılarak bir ör-

24.1 • Klinik Örneklerden Patojenlerin İzolasyonu • 783

Tablo 24.2

Klinikte yararlanılan çeşitli besiyerlerinde kültüre edilen sıklıkla izole edilen gram negatif çubukların gelişme özellikleri Ağar Besiyerleri

Organizma

EMB

MC

Escherichia coli

Koyu merkezli yeşilimsi metalik parlak (bkz Şekil 24.4) E. coli'ye benzer ancak kloniler daha büyüktür Büyük, mukoid, kahverengimsi Yarı şeffaf, renksiz

Kırmızı veya

Yarı şeffaf, renksizden altın rengine değişir (bkz Şekil 24.4) Yarı şeffaf, renksizden altın rengine değişir

Şeffaf, renksiz

Şeffaf, renksiz

Yarı şeffaf, renksizden altın rengine değişir

Şeffaf, renksiz

Enterobacter Klebsiella Proteus

Pseudomonas

SalmoneUa

Shigella

pempe Kırmızı veya pembe Pembe Şeffaf, renksiz

ss

BS

HE

Kırmızıdan pembeye değişir

Çoğunlukla inhibe olur

Sarı-pembe

Beyaz veya bej

Gümüşümsü parlak mukoid koloniler Çoğunlukla inhibe olur Yeşil

Sarı-pembe

Büyüme yok

Saydam

Opak

Siyahtan koyu yeşile değişir

Yeşil veya siyah merkezli

Opak

Kahverengi ya da inhibe

Kırmızıdan pembeye değişir Siyah merkezli, saydam kenarlı Çoğunlukla inhibe olur

Sarı-pembe Saydam

şeffaf Yeşil veya şeffaf

. A. Pfaller, and R. -i. 1 Yolken. 2003. Manual of CHnical Microbiology, 8th edidtion. American KAYNAK: Murray, P. R., E. J. Baron, J. H. Jorgenson, M Society for Microbiology, Washington D. C.'den adapte edilmiştir. fl BS, Bizmut Sülfit ağar; EMB, eozin metilen mavisi ağar;MC, MacConkey ağar; SS, Salmonella-Shigdla ağar; HE, Hektoen enterik ağar.

nek elde edilebilir. Alternatif olarak, enfekte bir bireyin ilk sabah idrarı genellikle canlı N. gonorrhoeae hücrelerini içerir. Gonore veya diğer genital enfeksiyonları olduğundan şüphelenilen kadınlarda örnekler genellikle serviks veya idrar yolundan eküvyon ile elde edilir. Gonore'nin tanısında klinik mikrobiyoloji işlemleri esastır. N. gonorrhoeae (klinikte gonococcus olarak bilinir) idrar yolunun, rahim ağzının, anal kanalın, boğazın ve konjonktivanm mukazal yüzeylerini kolanize eder. Organizma, kurumaya karşı duyarlıdır ve bu nedenle hemen her zaman sadece direkt kişiden kişiye temasla, genellikle de cinsel ilişki ile bulaşır. Gonore'nin kontrolü için olan halk sağlığı tedbirleri, asemptomatik taşıyıcıların tanısını içerir ve bunun içinde mikrobiyolojik analiz gereklidir.

Neisseria gonorrhoeae genellikle gram-negatif diplokok halinde bulunur ancak oldukça pleomorfik de olabilir. Ürogenital yolların normal florasında benzer mikroorganizmalar gözlenmemiştir. Bu nedenle, gram boyanmış vajinal ya da servikal sürüntülerin direkt mikroskopisinde gram negatif diplokoklarm gözlenmesi, gonore'nin muhtemel bir göstergesidir. Akut gonorede, cerahatli akıntıların mikroskobik incelenmesi genellikle nötrofillerdeki fagosite edilmiş gram negatif diplokokları açığa çıkartır. (aosKısım 22.2) (Şekil 24.5a •). Üregenital örneklerin N. gonorrhoeae için (ve genellikle Chamidia trachomatis'le ilişkili, ooöKısım 26.3) çoğu laboratuvar testi, nükleik asit probu veya amplifikasyon prosedürleri (bkz. Kısım 24.12) kullanılarak yapılır. Bununla beraber, göz ve rektum

N. gonorrhoeae hücreleri

• Şekil 24.5 Neisseria gonorrhoeae'nin tanısı, (a) Neisseria gonorrhoeae''nin bir idrar yolu sızıntısından alman insan polimorfonükleer lökositleri içindeki fotomikrografı. Eşleşmiş diplokoklara dikkat ediniz (baştaki). (b).Thayer-Martin agar'da büyüyen Af. gonorrhoeae. Petri ortadan, eğer hücreler sitokrom c taşıyorsa kolonileri maviye çeviren bir ayraç ile boyanmıştır (oksidaz testi). Af. gonorrhoeae hücreleri oksidaz pozitiftir.

784 • Bölüm 24 • Tanısal Mikrobiyoloji ve İmmünoloji

gibi üregenital kaynaklardan olmayan örnekler de baskın toprak organizmaları olan endospor oluşaynı zamanda kültüre edilmelidirler. turan bakterilerdir. Anaerobik kültür yöntemleri örnek kontamiN. gonorrhoeae'nin izolasyonu için seçici olmayan zenginleştirilmiş besiyerleri ısıyla lizize uğra- nasyonunun olağan problemlerine ilave olarak anoksik bir büyüme ortamının sürdürülmesi güçtılmış kan içerir ve koyu kahverengi görünümlerinden dolayı chocalate ağar olarak adlandırılırlar. lüğünü de içerirler. Biyopsi veya enjektör ile alınan örnekler acilen, genellikle redoks indikatör boyası Isıtılmış kan besiyeri bileşenleriyle etkileşerek, normalde N. gonorrhoeae için toksik olan bileşikle- rezazürin ve tiyoglikollat gibi indirgeyici bir ajan içeren seyreltik bir tuz solüsyonuyla birlikte okri absorbe eder. İlk izolasyon için kulanılan birçok sijensiz gaz içeren bir tüpe konulmalıdırlar. Boya seçici besiyerinden birisi modifiye Thayer-Martin indirgendiğinde renksiz ve oksitlendiğinde pembe (MTM) ağardır (Şekil 24.5). Bu besiyeri normal olarak örneğin oksijen kontaminasyonunu gösterir. floranın gelişmesini baskılayan vankomisin, nistaEğer anaerobik bir transport tüpü bulunmuyorsa, tin, trimetoprim ve kolistin antibiyotiklerini içerir, enjektörün kendisi örneğin taşınmasında kullanılaancak bu antibiyotikler bakteriyal menenjit etkeni olan ne N. gonorrhoeae''yi ne de N. meningüidis'i et- bilir; iğne kısmı atılır ve şırınga kauçuk bir tıpa ile kapatılır ve böylece enjektöre hava giremez. kilerler (ööa-Kısım 26.6). Anaerobik inkübasyon için ağar petrileri sızdırİnoküle edilen petriler nemli bir ortamda ve maz bir kaba konulur ki bu kap ya içindeki atmosgonokokların gelişmesi için gerekli olan %3-7 ferin oksijensiz bir gaz karışımıyla değiştirilesi ile CO2 içeren nemli bir atmosferde inkübe edilirler. (genellikle N 2 ve CO2 karışımı) ya da oksijeni uzakPetriler 24 ve 48 saat sonra incelenirler ve bütün laştıran bazı bileşiklerin kapalı kaba konmasıyla Neisseria'ler oksidaz pozitif olduklarından oksidaz anoksik hale getirilir. Örneğin, Şekil 24.6«'da göstesti ile incelenirler (Şekil 24.5b; bkz. Kısım 24.2). terildiği gibi, H2 üretilir ve genellikle palladium gibi Eğer inokülum genitoüriner kaynaklardan türevuygun bir katalist mevcudiyetinde H2 serbest O2 ile lenmişse, chocolate ağarda ya da seçici besiyerleH2Ö oluşturmak üzere birleşir, böylece kontamine rinde gelişen oksidaz-pozitif gram-negatif diplooksijen uzaklaştırılır. Anaerobik koşulların sağlankoklar gonoccoci olarak farzedilirler, ancak kesin ması için alternatif yollar indirgeyici ajanlar içeren tanı için karbonhidrat kullanım yollarının belirlenbesiyerlerin kullanılması veya azot veya hidrojen mesi ve immünolojik veya nükleik asit prob testlegibi oksijensiz bir gazla doldurulmuş anoksik "glorine de (bkz. Kısım 24.5-24.12) gerek vardır. ve boxes" larm (steril kabinlerin) (öeoŞekil 6.26b) Anaeroblann Kültürü kullanılmasıdır. Zorunlu anaerobik bakteriler yaygın enfeksiyon nedenleridirler. Anaerobik patojenlerin izolasyon ve tanıları, özel izolasyon ve kültür metodlarını gerektirir. Genelde, anaeroblar için olan besiyerleri, (1) çoğu zaman organik içerik bakımından daha zengin olmaları, (2) indirgeyici ajanlar içermeleri, genellikle sistein veya glikollat ve (3) bir redoks indikatörü (cnaKısım 6.15) içermeleri dışında aeroblar için kullanılanlardan çok fazla farklılaşmazlar. Örnek toplanması, muamelesi ve işleme tabi tutulması muhtemel oksijen kontaminasyonunu önleyecek şekilde tasarlanır, çünkü oksijen zorunlu anaerobik organizmalara toksiktir. Vücutta genellikle anoksik olan ve zorunlu anaerobik organizmaların normal floranın bir parçası oldukları birçok habitat vardır (örn., ağız boşluğu kısımları ve alt intestinal yollar) (Kısım 21.3 ve 21.4). Bununla birlikte, vücudun diğer kısımları da doku yaralanması veya travma sonrası hasar gören bölgeye kan desteğinin ve oksijen geçişinin azalması ile anoksik hale gelebilirler. Bu anaerobik bölgeler daha sonra zorunlu anaeroblarla kolonize olabilir. Genellikle patojenik anaerobik bakteriler normal floranın parçasıdırlar ve oportünistik (fırsatçı) patojendirler. İki önemli istisna, patojenik anaeroblar olan Clostridium tetani (tetanoz nedeni) (cnç,Kısım 27.9) ve Clostridium perfringens'in (gazlı kangren ve bir tip gıda zehirlenmesi nedeni) (öOöKısım 29.6) her ikisi de

•m24.1

Kavramların Gözden Geçirilmesi

Şüpheli bir patojenin uygun örneklenmesi ve kültürü bir hastalığa neden olan bir organizmanın tanısı için en güvenilir yoldur. Uygun örnekleme ve kültür koşullarının seçilebilmesi, bakteriyal ekoloji, fizyoloji ve beslenme bilgisi gerektirir.

Kimyasal katalizör

Anoksik kap

Hidrojen üreticisi

..

^

_

•*

• Petrilerdeki besiyeri

* Şekil 24.6 Kültürlerin anoksik koşullarda inkübasyonu için kapalı kap. Katalizör ve hidrojen üretici paket indirgeyici (anoksik) bir çevre oluşturur ve devam ettirir.

24 2 • Gelişmeye Bağlı Tanı Yöntemleri • 785

• Neden İdrar kültürleri neredeyse her zaman bakteriyal büyüme için pozitiftir. • Anaerobik patojenlerin başarılı izolasyonları için gerekli olan önlemleri anlatınız.

Gelişmeye Bağlı Tanı Yöntemleri Eğer primer bir besiyerinin inokülasyonu bakteriyal büyüme ile sonuçlanırsa, klinik mikrobiyolog mevcut organizma ya da organizmaları mutlaka identifiye etmelidir. Klinik bir izolatm tanısı çoğu kez çeşitli büyümeye bağlı testler kullanılarak yapılabilir. Burada bu yöntemlerden bazıları tartışılacaktır. Seçici ve Ayırtedici Besiyerlerinde Büyüme Bilinmeyen bir patojen ilk izolasyon besiyerindeki büyüme karakteristiklerine dayanarak genellikle, birçok farklı biyokimyasal reaksiyonlardan birisini ölçmek için tasarlanmış besiyerlerine alt kültürü yapılır. En önemli biyokimyasal testlerden bazıları Tablo 24.3'te listelenmiştir. Özelleşmiş besiyerlerinin çoğu, her birisi ayrı kuyularda bulunan ve çok sayıdaki besiyerini içeren ve hepsi bir kerede inoküle edilebilen minyatür kitler halinde bulunmaktadır (Şekil 24.7 •). r

Tablo 24.3

Kullanılan besiyerleri seçici, ayırt edici veya her ikisi birden olabilir. Seçici bir besiyeri bazı mikroorganizmaların büyümelerini inhibe eden bileşikler içerir. Ayırt edici bir besiyeri, büyüme sırasında gerçekleştirilen reaksiyonlar arasında ayrım yapmaya izin veren ve genellikle bir boya olan bir indikatör içerir. Örneğin, eozin metilen mavisi (EMB) ağar, yaygın olarak kullanılan seçici ve ayırt edici bir besiyeridir. EMB ağar gram-negatif enterik Bacteria izolasyonu için kullanılır. Metilen mavisi boyası çoğu gram-pozitif bakterinin büyümesini inhibe eder. Eosin pH'daki değişikliklere cevap vreen bir boyadır ve asidik koşullarda renksizden siyaha döner. EMB ağarda enerji kaynağı olarak laktoz ve sukroz vardır ama glukoz yoktur. Escherichia coli, Klebsiella ve Enterobacter gibi laktoz fermente eden bakteriler besiyerini asitleştirir ve koloniler parlak yeşille birlikte siyah olarak görünürler. Salmonella, Shigella ve Pseudomonas gibi laktoz fermente etmeyenlerin kolonileri yarı saydam veya pembe görünürler (Şekil 24.4). Böylece EMB gram-negatif Bacteria büyümelerini tercihli olarak seçer ve seçilen gram-negatif Bacteria birçok cinsi arasında da ayırım yapar. Bu münferit biyokimyasal testler, ayırd edici besiyerlerindeki substrat ya da substratlarm katabolizmasmdaki enzymes bulunup bulunmadığını ölçer. Şekerlerin fermentasyonu, asidifikasyonda renk değiştiren pH indikatörü boyaların besiyeri-

i

Bakteriler için önemli klinik tanısal testler (devamı diğer sayfada) Prensip

İşlem

Karbohidrat fermantasyonu

Şeker veya alkol şekerleriyle fermantatif büyüme sırasında asit ve/veya gaz üretilir.

Katalaz

Enzim, hidrojen peroksiti parçalar,

Karbohidratlı broth besiyeri ve pH indikatörü olarak fenol kırmızısı; gaz için ters döndürülmüş tüp. Yoğun kültüre H2O2 damlası ileve edilir ve baloncuklara (O2) bakılır (Şekil 6.29)

Test

HA Sitrat kullanımı

Tek karbon kaynağı olarak sitratın kullanımı, besiyerinin alkalileşmesiyle sonuçlanır.

pH indikatörü olarak bromtimol mavili sitrat besiyeri. Yoğun bir mavi renk bakılır (bazik pH)

Koagülaz

Enzim kan plazmasının pıhtılaşmasına neden olur

Yoğun sıvı bakteri kültürü plazma ile karıştırılır.

Dekarboksilaz dizin, ornitin, arjinin)

Amino asidin dekarboksilasyonu amin ve CO2 serbest bırakır

/8-Galaktosidaz (ONPG) testi

Ortonitrofenil-j8-galaktosidaz (ONPG) enzim için yapay bir subs-

Amino asitlerle zenginleştirilmiş besiyerleri. Bromkresol moru pH indikatörü eğer enzim aktivitesi varsa mora (bazik) döner. Lizis olmuş yoğun kültür ONPG ile inkübe edilir. Sarı renk olu-

fenol (sarı) oluşur. Jelatin sıvılaştırılması

Bir çok proteaz jelatini hidroliz eder ve jeli parçalar.

%12 jelatinli broth'ta inkübasyon yapılır. Jel oluşumunun kontrolü için soğutulur. Eğer jelatin hidrolize edilmişse soğutmada tüp sıvı kalır.

En yaygın kullanımı Enterik bakterilerin ayırt edilmesi . Clostridium'dan(~) Bacillus (+) ayrımı; MicrococcusStaphylococcus''tan (+) Streptococcus (-) ayrımı. Escherichia''dan (-) Klebsiella-Enterobacter'in (+) ayrımı; Salmonella'dan (+) Edwardsiella'mn (-) ayrımı (Şekil 24. 7) Staphylococcus epidermidis'den (-) S. aureus'un (+) ayrımı. Enterik bakteriler arasında bakteri grubunun saptanmasına yardım. Salmonella'dan (-) Citrobacter'm (+) ayrımı. Bazı. Sfıigeffa ve Pseudomonas türlerinin tanısı Serratia, Pseudomonas, Flavobacterium ve Clostridium' un tanısına yardım etmek için

î

786 • Bölüm 24 • Tanısal Mikrobiyoloji ve İmmünoloji

Tablo 24.3

Bakteriler için önemli klinik tanısal testler

Test

Prensip

İşlem

En yaygın kullanımı

Hidrojen sülfür (H2S) üretimi

H 2 S kükürtlü amino asitlerin parçalanmasıyla veya tiyosülfatın indirgenmesiyle üretüir

Enterik bakterilerde, Salmonella, Edzvardsiella ve Proteus'un tanısına yardımcı olmak için (Şekil 24. 7)

Indol testi

Proteinlerdeki triptofan indole dönüştürülür.

Demirce zengin bir besiyerinde siyah ferro sülfit oluşumundan H2S saptanması (birçok çeşidi: Kligler's iron ağar ve triple sugar iron ağar aynı anda karbonhidrat fermantasyonunu da saptar İndol kültür besiyerinde dimetil aminobenzaldehit ile (kırmızı renk) veya dimetilaminosinamaldehit içeren kağıda koloninin sürülmesiyle (spot test; mavi renk) saptanır.

Metil kırmızısı testi

Karışık asit fermentörleri pH'ı 4,3'ün altına düşürecek yeterli asit üretirler.

Glukoz- sıvı besiyeri. tnkübasyondan sonra bir örneğe metil kırmızısı indikatörü eklenir

Nitrat (NO3-) alternatif bir elektron alıcısı olarak NO2~ veya N 2 'ye indirgenir.

Nitratlı sıvı besiyeri. Inkübasyondan sonra a-naftilamin sülfanilik asitle nitrit saptanır (kırmızı renk). Eğer negatifse, NO,~'ı NO2~'e indirgemek için çinko tozu ilave ederek NO,"'m hala bulunduğu doğrulanır.

Nitrat indirgenmesi

Escherichia'yı (+), çoğu Klebsiella (-) ve Enterobacter'den (-); Edzvardsiella'yi (+) Salmonella'dan (-); Proteus vulgaris'i (+), Proteus mirabilis'ten (-) ayırt etmek için. Escherichia'yı (+, kültürü kırmızı) Enterobacter ve Klebsiella'dan (genellikle -,

kültürleri sarı) ayırt etmek için Enterik bakterilerin tanısına yardımcı olmak için (genellikle +) ,'

Oksidaz testi

Sitokrom c yapay elektron alıcısını oksitler: tetrametil p-fenilendiamin (Kovac's ayracı), veya dimetil p-fenilendiamin (Gordon ve McLeod'un ayracı)

Koloniler ayraçla doyurulmuş kâğıda sürülürler. Oksidaz pozitif koloniler kovac's ayracı ile 10 -15 saniye içinde koyu mor-siyah renk ve Gordon and McLeod'un ayracı ile 30 dakikada mavi renk oluştururlar.

Neisseria ve Moraxella'yı (+), Acinetobactef den; Pseudomonas ve Vibrionaceae'yi (+) Enterobacteriaceaea'den (-) ay Aeromonas ırt etmek için.'ın tanısına yardım etmek için

Oksidasyon -fermantasyon (O/F) testi

Bazı organizmalar aerobik olarak büyürken sadece asit üretirler.

Şeker içeren kültür tüpünün üst kısmında asit üretimi; inkübasyon sırasında karışmayı kısıtlamak için yumuşak ağar kullanılır.

Micrococcus'u (sadece aerobik olarak asit üretir) Staphylococcus'ten (asit anaero-

bik olarak üretilir) ayırt etmek için. Pseudomonas'ı (aerobik asit

üretimi) enterik bakterilerden (asit anaerobik olarak üretilir) karakterize etmek için.

Fenilalanin deaminaz testi

Deaminasyon sonucu kolorimetrik bir testle saptanan fenil pirüvik asit üretilir.

Fenilalanince zengin besiyeri. Büyümeden sonra, ferik klorit ilave edilir ve yeşil renk oluşumuna bakılır.

Proteus ve Providencia cinslerinin karakterizasyonu için.

Nişasta hidrolizi

Iyot-Iyodür nişasta ile mavi renk verir

Bacittus spp. Gibi tipik nişasta hidroliz edicilerini identifiye etmek için.

Üreaz testi

Üre, H 2 N-CO-NH 2 , 2NH, + CO 2 'ye ayrilır

Organizma nişasta içeren besiyerinde büyütülür. Petri Gram iyodürle kaplanır ve kolonilerin etrafındaki şeffaf bölgelere bakılır. % 2 üre ve fenol kırmızısı indikatörlü besiyeri. Amonyak salınımı pH'ı arttırır, yoğun pembe renk oluşur

Klebsiella'yı (+), Escherichia'dan (-) ve Proteus'u (+) Providencia'dan (-) ayırt etmek ıçm. Helicobacter pylori'yi (+) identifiye etmek için.

Voges-Proskauer testi

Şeker fermantasyonundan asetoin üretilir

a-naftol kullanarak asetoin için kimyasal test

Klebsiella ve Enterobacter'i (+) Escherichia'dan (-) ayırt etmek için. Bacillus cinsi üyelerini karakterize etmek için

24 2 • Gelişmeye Bağlı Tanı Yöntemleri • 787

I

(c)

.

ili 0

*0"

IOÇ

OOÇ

JCIIj

HJS

A U(«

IOA

lî_! _•_•*.

i A

A

A

i A

g»

I feü

im

m

(yi)

)İ

pıij «U M*N ıNO

• Şekil 24.7 Çeşitli diyagnostik besiyerlerindeki renk değişimleri ile klinik izolatlann tanısı için kullanılan gelişmeye bağımlı tanı yöntemleri, (a) Şeker fermantasyonunu tayin etmek için ayırt edici bir besiyerinin kullanılması. Asit üretimi, sıvı ortama eklenen pH indikatörü boyanın renk değiştirmesiyle belirlenir. Eğer gaz üretimi oluşursa, her tüpteki ters döndürülmüş küçük şişede, bir baloncuk görülür. Soldan sağa: asit, asit ve gaz, negatif, inoküle edilmemiş, (b) Enterik bakteriler için triple sugar iron (TSİ) ağar olarak adlandırılan bir besiyerindeki geleneksel bir tam testi. Besiyeri hem agann yüzeyinden hem de katı ağara batırarak dipten inoküle edilmiştir. Besiyeri küçük bir miktar glukoz ve çok miktarda da laktoz ve sukroz içerir. Sadece glukozu fermente edebilen organizmalar sadece dipte asit oluşumuna neden olurken, laktoz veya sukrozu fermente eden organizmalar aynı anda tüm besiyeri boyunca asit oluşmasına neden olurlar. Gaz oluşumu agann dipte yırtılmasıyla belirlenir. Hidrojen sülfür oluşumu (ya protein degredasyonundan ya da besiyerindeki tiyosülfatm indirgenmesinden oluşan) H2S'in besiyerindeki ferro demir ile reaksiyonu nedeniyle oluşan bir siyahlaşma ile belirlenir. Soldan sağa: sadece glukozun fermantasyonu, reaksiyon yok, hidrojen sülfür oluşumu, glukoz ve diğer bir şekerin fermantasyonu, (c) Simmons sitrat ağarda Salmonella tarafından sitrat kullanımının ölçülmesi. pH'taki değişme indikatör boyanın renginde bir değişmeye neden olur. Soldan sağa: pozitif, negatif ve inoküle edilmemiş, (d) Klinik izolatlann hızlı tanısında kullanılan besiyeri kitleri. Prensip (a)'dakinin aynısıdır ama ancak düzenlemeler küçültülmüştür ve böylece birçok test aynı anda yapılabilir. Her birisi dört ayn kültürle birlikte dört farklı strip gösterilmiştir, (d) Küçültülmüş test kitlerinin diğer bir düzenlemesi. Nonfermantatif organizmalardaki şeker kullanımını göstermektedir.

• Bölüm 24 • Tanısal Mikrobiyoloji ve İmmünoloji

ne katılmasıyla ölçülür (Şekil 24.7a). Şeker fermentasyonu sırasında hidrojen ve/veya karbondioksit üretimi, gaz üretiminin ağarda ya da gaz toplama şişelerinde gözenmesiyle test edilir (Şekil 24.7a,b). Hidrojen sülfür (H2S) üretimi, ferrik demir içeren bir besiyerindeki gelişmeyi takiben belirlenir. Eğer sülfür üretilmişse, ferrik demir H2S'le reaksiyona girerek siyah bir demir sülfit presipitatı oluşturur (Şekil 24.7b). Üç karboksilik asit gruplu bir organik asit olan sitrik asit kullanımı, bir pH artışıyla ve sitrik asit test ortamındaki spesifik bir boyanın koşullar bazik olduğunda renk değiştirmesiyle birlikte tayin edilir (Şekil 24.7c). Klinik kullanım için yüzlerce ayırt edici test geliştirilmiştir ancak, sadece 20 kadarı rutin olarak kullanılmaktadır (Şekil 24.7d). Birçok patojenin biyokimyasal paternleri (modelleri) bir bilgisayar veritabanında depolanır. Bilinmeyen bir patojenin ayırt edici test sonuçları girilir ve bilgisayar bilinmeyenin karakteristiklerini, patojen veritabanındaki metabolik paternlerle karşılaştırarak en iyi tanı yapar. Birçok organizma için, üç ya da dört kadar az sayıdaki anahtar test, kesin bir tanı yapmak için yeterlidir. Ancak, şüpheli eşleşmeler durumunda daha sofistike tanı işlemlerine gerek olabilir. Klinik Tanı

Gelişmeye bağlı hızlı tanı sistemleri genellikle enterik bakterileri teşhis etmede kullanılır, çünkü bu organizmalar çoğu kez rutin idrar yolu ve intestinal enfeksiyonlara karışırlar (Şekil 24.7) (bkz. Kısım 24.1). Diğer bakteri grupları ve hatta tek bir bakteriyal tür için bile diğer gelişmeye bağlı hızlı tanı kitleri bulunmaktadır. Örneğin, Staphylococcus aureus, Streptecoccus pyogenes, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzaeveMycobacteriutn tuberculosis

için bir seri test içeren kitler geliştirilmiştir. Patojenik funguslar olan Candida albicans ve Cryptococcus

neofermans'm tanısı için başka kitler de bulunmaktadır (coaKısım 27.8). Spesifik bir tanı testini kullanılmak için karar genellikle, klinik örneğin doğasını, elde edilen saf kültürlerin özeliklerini, temel karakteristikerini (morfoloji ve Gram boyama) değerlendirmek zorunda olan ve benzer vakalarda deneyimi olan klinik mikrobiyologlarca verilir. 24.2 Kavramların Göxden Geçirilmesi Patojenlerin tamsmdaki geleneksel metodlar, gelişmenin bir sonucu indüklenen metabolik değişikliklerin gözlenmesine bağlıdır. Gelişmeye bağlı bu metotlar patojenin hızlı ve doğru tanısını sağlarlar. •

Seçici ve ayırt edici besiyerlerini birbirinden ayırm. Her bir amaç için kullanılan bir besiyeri örneği verin. • (1) Bir idrar kültürü, (2) bir kan kültüründen patojenlerin ilk izolasyonu için uygun birer genel, seçici ve ayırt edici besiyeri önerin.

Antimikrobiyal İlaç Duyarlılık Testi Klinik örneklerden izole edilen mikrobiyal patojenlerin tanıları, tıbbi teşhisi doğrulamada ve antimikrobiyal tedaviyi yönlendirmede kullanılır. Mikrobiyal izolatarm antimikrobiyal ajanlara karşı duyarlılıkarınm belirlenmesi kritik bir sağlık hizmeti konusudur. Antimikrobiyal aktivitenin ölçülmesindeki bazı prensipleri Bölüm 20'de tartışmıştık. Bir kültürün duyarlılığı en kolay olarak ağar difüzyon yöntemi veya bir ajanın gelişmeyi inhibe etmesi için gerekli olan minimum inhibitör konsantrasyonunun (MIC) saptanması için bir yöntem olan tüp dilüsyon tekniği kullanılarak tayin edilebilir (Kısım 20.4). Amerika'daki duyarlılık testinde kullanılan otomatik cihazları Gıda ve İlaç Dairesi (Food and Drug Administration, FDA) yönetmelikleri kontrol eder. Her organizma ve antibiyotik için olan deneysel son noktaları da içeren standartlar ve prosedürler, diğer sağlık alanı teknolojilerinde olduğu gibi antibiyotik testleri için de gönüllü mutabakat standartlarının belirlendiği, kar amacı gütmeyen ve standartlar geliştiren bir organizasyon olan Klinik Laboratuvar Standartları Ulusal Komitesi (National Committee for Clinical Laboratory Standarts, NCCLS) tarafından sürekli olarak güncellenmektedir. (http:// www.nccls.org). Antibiyotik duyarlılık testi için olan MIC prosedürü, ya kültür tüplerindeki («»»Şekil 20.10) ya da bir mikrotitrasyon plağı kuyularındaki (Şekil 24.8e •) bir antibiyotik dilüsyon testini içerir. Antibiyotiklerin seri dilüsyonlarını içeren kuyular test organizmasının standart bir miktarı ile inoküle edilirler. Çeşitli antibiyotiklerin mevcudiyetindeki gelişme bulanıkhlık ölçülerek gözlenir. Antibiyotik duyarlılığı genellikle, gelişmeyi tamamen inhibe eden antibiyotiğin en yüksek seyreltmesi (en düşük konsantrasyon) olarak ifade edilir. Bu MIC değerini tanımlar. Antimikrobiyal aktiviteyi belirleyen standart prosedüre Kirby-Bauer metodu denilir (Şekil 24.8). Katı besiyerleri belirli bir yoğunluktaki saf kültür süspansiyonunun besiyeri yüzeyine eşit miktarda yayılmasıyla inoküle edilirler. Daha sonra belli bir miktarda (ug/disk) antimikrobiyal ajan içeren filtre kâğıdı diskleri inoküle edilmiş besiyeri üzerine konulur. Belirli bir inkübasyon periyodundan sonra, her diskin etrafındaki inhibisyon zonunun çapı ölçülür. Tablo 24.4'de bir çok antibiyotiğin zon boyutları gösterilmektedir. Daha sonra inhibisyon zon çapları, zon büyüklüğüne göre duyarlılık kategorileri halinde yorumlanırlar. Çeşitli ajanların farklı bakteriler için yorumlama kriterleri ya FDA ya da NCCLS tarafından sağlanır. Etest®(AB BIODISK, Solna, Sweden) plastik bir çubuğa immobilize edilmiş bir antimikrobiyal ajanın önceden hazırlanmış ve önceden belirlenmiş bir gradientini kullanan, difüzyon temelli olmayan bir tekniktir. Konsantrasyon gradientinde, konvansiyo-

24.4 • Anlimihrobiyal İlaç Duyarlılık Testi • 789 1

Tablo 24.4 Bazı antimikrobiyal disk difüzyon duyarlılık testleri için dîlüsyon standartlar

1

Inhibition zone diameter (mm) Antibiyotik c

Ampisilin Ampisilin'' Seftriakson Kloramfenikol Klindamisin Eritromisin Gentamisin Metisilin' Nitrofuranton Penisillin G1r Penisillin G Streptomisin Sülfonamid Tetrasiklin Trimetoprim-sülfametoksazol Tobramisin Vankomisin»' Vankomisin*

Diskteki mü; ar 10 (iıg 10/xg 30 Mg 30 M g

2fj.g

15 M g 10 Mg

5 (U,g

300

M

g

10 ünite 10 ünite 10 Mg 10

M

g

30 jııg

1,25/23,75 jttg 10 ^g 10 M g 10 M g

Dirençli

Orta derece Dirençli

13 veya daha az 28 veya daha az 13 veya daha az 12 veya daha az 14 veya daha az 13 veya daha az 12 veya daha az 9 veya daha az 14 veya daha az 28 veya daha az 14 veya daha az 6 veya daha az 12 veya daha az 14 veya daha az 10 veya daha az 12 veya daha az 14 veya daha az 14 veya daha az (MIC için test)

14-16 —

14-20 13-17 15-20 14-22 13-14 10-13 15-16

— — 7-9

13-16 15-18 11-15 13-14 15-16 —

Duyarlı

17 veya daha fazla 29 veya daha fazla 21 veya daha fazla 18 veya daha fazla 21 veya daha fazla 23 veya daha fazla 15 veya daha fazla 14 veya daha fazla 17 veya daha fazla 29 veya daha fazla 15 veya daha fazla 10 veya daha fazla 17 veya daha fazla 19 veya daha fazla 16 veya daha fazla 15 veya daha fazla 17 veya daha fazla 15 veya daha fazla

1

Standartlar, antibiyotik testleri ve diğer sağlık teknolojileri için gönüllü uzlaşma standartları geliştiren kar amacı gütmeyen uluslararası bir kuruluş olan NCCLS tarafından tanımlanır ve güncellenir. (http://www.nccls.org) 1 h Standart duyarlılık test yöntemlerinin tarifi için Şekil 24.8'e bakınız. «I

' Enterobacteriaceae için

.-I

' Staphylococd ve yüksek derecede penisillin duyarlı organizmalar için ' Yüksek dozda penisillin G ile muamele edilebilen bazı sistemik enfeksiyonlara neden olabilen enterococci gibi organizmalar için > Enterococci için h Staphylococci için

nel yöntemin iki katlı seyreltmeleri yapılarak baştan sona 15 MIC aralığı elde edilir. Gradient inoküle ediliş bir ağar yüzeyine uygulandığında çubuktan ağara transfer olur ve farklı mikroorganizmaların gelişme karakteristikleriyle ilgili çok çeşitli kritik süreleri de kapsayacak kadar bir süre kararlı olarak kalır. Bir gece veya daha uzun süre inkübasyondan sonra, çubuğun eksenini merkez alan eliptik bir inhibisyon zonu gelişir. Elips kenarının önceden kalibre edilmilş E test çubuğunu kestiği noktada ug/ml cinsinden bir MIC değeri okunurak kesin bir MIC değeri sağlanır. Bu değer daha sonra FDA veya NCCLS'in MIC verileri kullanılarak yorumlanır (Şekil 24.8/). Antimikrobiyal ilaç dirençliğinin çok yaygın olmasından dolayı (««»Kısım 20.12) klinik örneklerden izole edilen çoğu patojen için bir antibiyotik duyarlılık testi yapılması önerilir. Mesela Tablo 24.4'deki gibi veriler, spesifik bir bakteriyal enfeksiyon için en uygun antibiyotiğin seçilmesinde yararlıdır. Toplum kökenli patojenlerin çoğu birçok farklı antibiyotiğe karşı duyarlı olmasına rağmen, Pseudomonas aeruginosa gibi bazı patojenler çok az antimikrobiyal ilaca karşı duyarlıdırlar. Nozokomiyal patojenler hastanelerden kazanılan patojenlerdir. Birçok nozokomiyal patojen antibiyotik direnci geliştirmiştir ve bunlardan birkaçı bilinen bütün antibiyotiklere karşı dirençlidir (Kısım 20.12). Bu nedenle, hastaneden kazanılmış patojenlerin antibiyotik duyarlılık testleri, etkili bir kemoterapi için esastır. Hastane enfeksiyon kontrol mikrobiyologları bu şekilde toplanmış ilaç duyarlılık bilgilerini kullanarak, klinik olarak izole edilen organizmaların güncel yöresel kullanımdaki antibiyotiklere

karşı duyarlılıklarını gösteren, antibiyogram olarak adlandırılan periyodik raporlar oluştururlar. Antibiyogramlar bilinen patojenlerin kontrolünün izlenmesinde ve özellikle yöresel seviyede yeni antibiyotik dirençli patojen suşlarmm ortaya çıkmasının takibinde oldukça yararlıdırlar. 24.3 Kavramların Gözden Geçirilmesi Antimikrobiyal ilaçlar enfeksiyöz hastalıkların tedavisinde yaygm şekilde kullanılırlar. Patojener, uygun kemoterapiden emin olmak için bireysel antibiyotiklere duyarlılıkları bakımından test edilmelidirler. Antimikrobiyal ilaç tedavisindeki bu özenli yaklaşım genellikle sadece sağlık kuruluşlarında uygulanmaktadır. • Kirby-Bauer tekniğini tanımlayın. Her bir organizma ve antimikrobiyal ajan için sonuçlar ne gösterir? • Antimikrobiyal ilaç duyarlılık testlerinin hem toplum kökenli hem de nozokomiyal enfeksiyonlarda mikrobiyolog, hekim ve hasta açısından değeri nedir?

Mikrobiyoloji Laboratuvarında Güvenlik Mikrobiyoloji laboratuvarları ve özellikle de klinik laboratuvarlar, çalışanlara ve çalışanlarla temas edenlere karşı enfeksiyöz biyolojik riskler için önemli bir potansiyel oluştururlar. Bu nedenle, klinik örneklerin muamelesinde laboratuvar kazalarından kaçınmak için tanımlanmış bir standart laboratuvar kuralları protokolü belirlenmiştir. Birleşik devletlerde, insan veya primat dokularıyla çalışan her bir klinik veya araştırma enstitüsünün, bütün kan kökenli

790 • Bölüm 24 • Tanisal Mikrobiyoloji ve İmmünoloji

küllin,

ı,ı,ıı ı,t ı a iıı

'''İlil.jl'll,!/ ) (a)

(b)

(O

(f)

• Şeltil 24.8 Antibiyotik duyarlılık testi, (a-e) Bir organizmanın antibiyotiklere kaşı duyarlılığının belirlenmesi için Kirby-Bauer prosedürü, (a) İzole edilen saf koloniler, bir turbidite standardı ile karşılaştırarak karar verilen belli bir yoğunluğa ulaşabilmek için bir tüpte uygun bir sıvı besiyeri ile homojenize edilirler, (b) Steril bir pamuk eküvyon bakteri süspansiyonuna batınlır ve fazla sıvı eküvyon tüpün yanlarına bastırılarak uzaklaştırılır, (c) Eküvyon uygun bir ağar besiyerinin yüzeyine eşit olarak sürülür, (d) Sıvı dilüsyon yöntemiyle saptanan antibiyotik duyarlılığı. Organizma Pseudomonas aeruginosa'dır. Her sırada farklı bir antibiyotik vardır. Mikrotitrasyon plağı bu testlerin otomasyonunu sağlar. Son nokta, görünür bakteriyal büyüme göstermeyen en düşük antibiyotik konsantrasyonunun olduğu ilk kuyudur. Kuyudaki en yüksek antibiyotik konsantrasyonu soldaki kuyudadır; sağdaki kuyularda iki katlı seyreltmeler yapılmıştır. Örneğin, 1. ve 2. sıralarda son nokta 3. kuyudur. 3. sırada bütün kuyularda bakteriyal üreme olduğundan, antibiyotik test edilen konsantrasyonlarda etkisizdir. 4. sırada son nokta ilk kuyudadır, (e) Farklı antibiyotiklerin bilinen miktarlarını taşıyan diskler ağarın yüzeyine konulur. İnkübasyondan sonra inhibisyon zonlan görülür. Organizmanın duyarlılık kategorisi zon büyüklüklerini yorumlayan bir çizelge referans alınarak belirlenir (tablo 24. 4). (f) Farklı antibiyotikler için (saat 8 yönünden, PTc-piperacillin/tazobactam; AT-aztreonam, CT; cefotaxime; CI-ciprofloxacin; GM-gentamicin, IP-imipenem) E-test®'le (AB BIODISK, Sonla, Sweeden) belirlenen antibiyotik duyarlılığı. Her strip, en düşük konsantrasyon petrinin merkezinden başlayarak ^g/ml cinsinden minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) olacak şekilde kalibre edilmiştir. Bakteriyal gelişmeyi inhibe eden en düşük antibiyotik konsantrasyonu, o özel ajan için MIC değeridir Bölüm 20. 4). Örneğin; cefotaxime (CT) için MIC 16 /^g/ml'dir. Bu organizma imipenem'e (İP) dirençlidir; MIC > 32 /j,g/vnl.

patojenlerin manipulasyonu için mesleki bir maruzat kontrol planına sahip olması kanunen gerekmektedir. Bu kanun çalışanları, hepatit B virüsü (HBV) (ooöKısım 26.14) ve insan immün yetmezlik virüsüne (HIV) (ö°GKısım 26.14) karşı korumak için özel olarak tasarlanmıştır ancak, laboratuvardaki sıkı enfeksiyon kontrol uygulamaları nedeniyle bütün patojenlerle enfeksiyonu etkili bir şekilde kısıtlar. Laboratuvar kazalarının en yaygın iki nedeni bilgisizlik ve dikkatsizliktir. Bununla birlikte uygun eğitim ve belirlenen güvenlik kurallarının uygulanması çoğu kazayı önleyebilir. Ne yazıkki laboratuvardan kazanılan enfeksiyonların çoğu tanılanabilir maruz kalma veya kazalardan ziyade hasta örneklerinin rutin işlenmesinden kaynaklanmaktadır. Örneğin işlenmesi sırasında oluşturulan enfeksiyöz aeresoller laboratuvar enfeksiyonlarının en yaygın nedenidir. Klinik laboratuvarlar sağlık alanı çalışan-

larının enfeksiyöz ajanara maruz kalmasını en aza indirmek ve böylece kaza dışı laboratuvar enfeksiyonlarının sayısını azaltmak için, burada ana hatları belirtilen (Birleşik Devletlerde kanunla istenen) güvenlik kurallarını takip ederler. 1. Tehlikeli materyallerle çalışan laboratuvarlar girişi mutlaka sadece laboratuvar ve destek personelini içerecek şekilde smırlamalıdır. Bu bireyler mutlaka laboratuvarda bulunan biyolojik risk hakkında bilgi sahibi olmalı ve ona göre hareket etmelidirler. 2. Örnekler, enjektörler ve iğneler, inoküle edimiş besiyerleri, bakteriyal kültürler, doku kültürleri, deney hayvanları, cam malzemeler, aletler ve yüzeyleri içeren enfeksiyöz materyal veya atıkların dekontaminasyonu için etkili prosedürler mutlaka yerine konulmalı ve ödün vermeden uygulanmalıdır. Kazara dökülmüş enfeksiyöz

24 4 • Antimihrobiyal ilaç Duyarlılık Testi • 791

Biyolojik Sınırlama ve Laboratuvar Biyogüvenlik materyalin dekontaminasyonu için % 5,25'lik Seviyeleri (tam kuvvet) bir klorin solüsyonu veya onaylanmış diğer bir dezenfektan tavsiye edilmektedir. Klinik, araştırma ve eğitim laboratuvarlarındaBütün potansiyel enfeksiyöz atıklar sertifikalı ki kazayla olan çevresel kontaminasyonu (kaçağı) bir çöp yakma fırınında yakılmak veya lisanslı veya kazayla olan enfeksiyonları önlemek için kulbir atık işlemcisi tarafından işlem görmelidir. lanılan sınırlama seviyesi, mutlaka laboratuvarda 3. Tehlikeli enfeksiyöz ajanlar veya aşılarla (örn., işlem gören organizmaların biyotehlike potansiyelkuduz, polio (çiçek) veya difteri-boğmaca-tetalerine göre ayarlanmalıdır. Laboratuvarlar sınırlama noz aşıları) çalışan personel mutlaka ajana karşı potansiyellerine veya biyogüvenlik seviyelerine (BSL) uygun bir şekilde aşılanmalıdır. İnsan veya prigöre sınıflandırırlar ve BSL-1, BSL-2, BSL-3 veya mat dokularıyla çalışan kişiler mutlaka HBV'ye BSL-4 olarak adlandırılırlar. Bütün biyogüvenik sekarşı aşılanmalıdırlar. viyelerinde çalışan laboratuvarlar temel temizliği ve 4. Bütün klinik örnekler enfeksiyöz olarak değer- kontaminasyon sınırlamasını temin edecek laboralendirilmeli ve uygun bir şekilde işlem görmeli- tuvar uygulamalarını takip etmelidirler. Örneğin; laboratuvarda yiyecek veya içecek tüketilmemeli dir. Bu özellikle kan örneklerinde bulunan heve laboratuvar yüzeyleri her çalışma vardiyasınpatit virüslerinin göreceli sıklığı nedeniyle labodan sonra veya bir dökülme olduğunda mutlaka ratuvardan kazanılan hepatitin önlenmesinde dekontamine edilmelidir. Personel laboratuvardan önemlidir (Kısım 26.11). 5. Bütün pipetleme mutlaka mekanik pipetleme ci- çıkarken ellerini yıkamalı ve laboratuvara girişler kısıtlanmakdır. hazlarıyla yapılmalıdır (ağızla değil). BSL-1 laboratuvarları en düşük sınırlama sınıfı6. Hayvanlar sadece deneyimli laboratuvar persodır. Çalışma, açık bankolarda düşük bir enfeksiyon risneli tarafından işleme tabi tutulmalı ve anestetik ki taşıyan organizmalarla yapılabilir; bu organizmave/veya yatıştırıcılar hem personelde hem de lar normal bireylerde patojen değildirler ve Bacillus hayvanlarda yaralanmalardan kaçınılacak şekilsubtilis gibi organizmaları kapsarlar. Bir BSL-1 tesisi de kullanılmalıdır. örneği, patojenleri kullanılmayan bir temel mikrobi7. Laboratuvar personeli, laboratuvar önlüğü, kayoloji öğrenci eğitim laboratuvarı olabilir. palı ayakkabılar, lastik eldivenler, maske, göz BSL-2 laboratuvarları, kazayla yutma, deri altına koruyucusu, gerekirse solunum cihazları ve poenjeksiyon veya mukoz membranların aeresolere tansiyel enfeksiyonun şiddetine ve maruz kalma maruz kalması nedeniyle orta derecede bir enfeksiyon seviyesine uygun olacak şekilde diğer uygun riski gösteren organizmaları kontrol altında tutmak görülen bariyer korumalarını mutlaka giymeiçin tasarlanmıştır. Escherichia coli veya Streptococcus lidir. Bu bariyer aletleri mutlaka uygun şekilde pyogenes gibi patojenlerle yapılan çalışmalar BSL-2 depolanmalı ve kullanımdan sonra dekontamilaboratuvarlarmda veya daha yüksek sınırlama sene edilmelidir. Laboratuvar personeli mutlaka viyelerinde gerçekleştirilir. Banko üstlerinde noriyi bir şekilde el yıkayarak, iyi bir kişisel hijyen uygulanmalıdır. Klinik bir laboratuvarda yemeye mal prosedürler gerçekleştirilebilir ancak, uygun olduğunda el ve yüz koruyucusu, eldivenler ve laiçmeye, kozmetik veya dudak kremi uygulamaya veya boratuvar örtüleri ve önlükleri gibi (bariyer koruma kontakt lens takmaya asla izin verilmez. aygıtları) kullanılır. Mikrobiyolojik araştırmaların 8. AiDS'le ilgili özel risker yüzünden bütün kliçoğu, klinik ve endüstriyel laboratuvarlar BSL-2 konik insan örnekleri sanki HIV taşıyorlarmış gibi ruma standardını sağlarlar. muamele edilmelidir. Her çeşit örneğin muameleBSL-3 laboratuvarları, özellikle aerosollerden, ensinde mutlaka koruyucu eldivenler giyilmelidir. feksiyona neden olmak için çok yüksek bir potansiyele Örnek hazırlama sırasında herhangi bir aerosol sahip olan patojenleri sınırlamak için tasarlanmıştır. oluşması ihtimali varsa mutlaka maske ve/veya Öreğin, eğer laboratuvar personeli tüberküloz netam yüz koruyucuları giyilmelidir. İğnelerin deni Mycobaderium tuberculosis gibi aşırı enfeksiyöz asla kılıfları tekrar takılmamak, eğrilmiş veya hava kökenli patojenlerle çalışıyorsa, laboratuvar kırılmış olanlar, mühürlenebilen ve imha etmepatojenin laboratuvardan kazayla çıkmasını engelden önce dekontamine edilebilen, bu amaç için lemek için hava filtreleri ve negatif basınçlı odalar tasarlanmış işaretli bir taşıyıcıya konulmalıdır. gibi özelliklerle donatılmalıdır. Manipülasyonlar için biyolojik güvenlik kabinleri (Şekil 20.4) gerekBu güvenlik kuralları potansiyel enfeksiyöz lidir; çalışmalar asla açık bankolarda yapılmamaajanlarla işlem yapan bütün laboratuvarlarda yürürlıdır. Bazı özel durumlarda, normalde BSL-2 labolükte olmalıdır. Uzmanlaşmış klinik laboratuvarları ratuvarlarmda çalışılabilen organizmalar mutlaka güvenli bir çalışma ortamının sağlanması için aşaBSL-3 laboratuvarlarmda çalışılmalıdır. Örneğin, ğıda değineceğimiz ilave kurallara sahip olabilirler. Staphylococcus aureus BSL-2'de besiyeri petrilerinde Son analizde laboratuvarda güvenliğin sağlanması, çalışılabilir. Ancak, büyük miktarlarda büyütüldüpersonelin sorumluluğundadır. Herhangi bir kliğünde ve özellikle büyük miktarlarda sartrifüjlendinik laboratuvar, eğitimsiz personel veya laboratuğinde, potansiyel enfeksiyöz aerosolleri sınırlamak vardan kazanılan enfeksiyonlardan korunmak için için çalışmalar mutlaka bir BSL-3 tesisinde yapılgerekli adımların atılmasında gönülsüz olan kişiler malıdır. Uzmanlaşmış araştırma ve öğretim tesisleri için potansiyel olarak tehlikeli bir yerdir. genellikle bir BSL-3 laboratuvarına sahiptir.

792 • Bölüm 24 • Tanısal Mikrobiyoloji ve İmmünoloji

laboratuvarlan, aerosollerle yüksek bulaşma ihtimali olan ve etkili bir bağışıklık veya tedavisi bulunmayan ölümcül patojenlerin maksimum sınırlanması için tasarlanmışlardır. BSL^l tesislerindeki fiziksel kontrol mutlaka, kapalı bir biyogüvenlik kabininin içinde eldivenler yoluyla manipulasyon yapılması veya tüm vücudu kaplayan hava destekli pozitif basınçlı elbiseler giyen personelin çalışması gibi, organizmanın bir şekilde tam izolasyonunu içermelidir (Şekil 24.9). Bir BSL-4 tesisinde çalışılması gereken bazı patojen örnekleri, hemorajik ateş virüs'leri (Lassa, Marburg, Ebola, co&Kısım 25.11), çiçek virüsü (çiçek, ^oöKısım 25.12) ve ilaç-dirençli Mycobacterium tuberculosis'i (««sKısım 26.5) içerir. BSL-4 laboratuvarları sadece en tehlikeli patojenlerle çalışmak için özel olarak tasarlanmış ve donatılmış olan araştırma ve geliştirme tesislerinde bulunurlar.

ili 11

24.4 Havramlarm Gözden Geçirilmesi Klinik laboratuvarlarındaki güvenlik için etkili eğitim, planlama ve laboratuvar çalışanlarının patojenlerle enfeksiyondan korunmaları için tedbir alınmasına gerek vardır. Canlı kültürler, inoküle edilmiş besiyerleri, kullanılmış hipodermik iğneler ve hasta örnekleri gibi materyallerin güvenli bir şekilde muamelesi için özel önlemlere gerek vardır. •

Kan kökenli bir patojenin laboratuvar personeline yayılmaması için alınması gereken temel önlemler nelerdir? • Laboratuvar enfeksiyonlarının asıl sebepleri nelerdir? • BSL-1'den BSL-4'e kadar olan BSL sınırlama laboratuvarlarmm temel özelliklerini tanımlayınız.

411

İMMÜNOLOJİ VE KLİNİK TANI YÖNTEMLERİ İmünoassay'ler klinik, referans ve araştırma laboratuvarlarında spesifik patojenlerin veya patojen ürünlerinin tesbitinde yaygın olarak kullanılırlar. Ajanın bulunmadığı veya kültüre edilemediği durumlarda enfeksiyonların doğrulanması için kullanılırlar. İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) ile enfeksiyonu da içeren çoğu viral enfeksiyonda olduğu gibi, patojen kültür yöntemleri rutin olarak kullanışlı olmadığında veya yapılmaları engelleyici şekilde zor olduğunda, immünassayler çoğu kez spesifik bir patojenin tanısında etkili ve nispeten basit bir yol sağlarlar.

Enfeksiyöz Hastalıkar için İmmünassayler Patojenere karşı olan spesifik immün antikorlar enfeksiyöz hastalıkların belirlenmesinde in vitro olarak kullanılırlar. Bazı durumlarda, bir hastanın antikor veya hücresel immün yanıtı bir patojenle enfeksiyonun gösterilmesinde kullanılır. Diğer bazı durumlarda ise antikorlar, patojenleri in vitro identifiye etmek için yapılan testlerde kulanılırlar. Doğal İmmünite İmmün yanıt Kısım 22'de tartışılmıştı. İmmünitenin başlıca yönleri Şekil 24.10»'da özetlenmek-

• Şekil 24.9 BSL-4 (biyolojik güvenlik seviyesM) laboratuvanndaki bir çalışan. BSL-4 maksimum çalışan korumasını ve patojen kontrolünü gerektiren en yüksek biyolojik kontrol seviyesidir. Çalışanda harici hava destekli ve havalandırmalı, tüm vücudu kaplayan bir elbise bulunmaktadır. Hava kilitleri laboratuvara olan tüm girişleri kontrol eder. Laboratuvan terk eden tüm materyal otoklavlanır veya kimyasal olarak dekontamine edilir.

tedir. Vücudun daha önce hiç karşılaşmadığı bir patojen için, patojen mutlaka önce çoğunlukla fagosit denilen hücreler tarafından tanınmalıdır (öo&Kısım 22.1). Fagositlerdeki özelleşmiş bir grup reseptör, hücre çeperindeki sakkarit grupların tekrarlayan zincirleri gibi bir veya daha fazla sayıdaki takrarlayan makromoleküler paternleri (şablonları) tanırlar (oooKısım 22.2). Birçok patojen tipi ya da türü tarafından paylaşılan paternlerin tanınması fagositi, hedeflenen patojenleri yutmak ve tahrip etmek için aktive eder, fagositoz denilen bir işlem. Patern tanınması takiben patojenlerin tahrip edilmesine doğal immünite veya non spesifik immünite denilir ve bu invazif patojenlere direnme yeteneği için bir temel taşıdır. Antijen Spesifik İmmünite ve Antikorlar îmmünitenin ikinci safhasında fagositer patojentürevli antijenleri (imha edilen patojenlerden elde edilmiş proteinler) T hücresi olarak bilinen antijenspesifik lenfositlere sunarlar (Şekil 24.10 ve
24.5 • Enfehsiyöz Hastalıkar için İmmunassayler • 793 Antijenler

( T ) Nonspesifik immünite MHC Antijen sunumu TCR

ılV

Antijen bağlanması ve tahrip

( 2 ) Antijen spesifik, antikor bağımlı immünite

Inflamasyon (Yangı)

Hedef hücre lizizi

• Şekil 24.10 Immün yanıt. Patojenlere maruz kalma, nonspesifik fagosit hücreleri ve antijen-spesifik immünite aracılı doğal immüniteyi (T) stimüle eder. Spesifik immünite, bireysel patojen antijenlerini tanımak için donanır ve antijen-reaktif antikorlar (2) veya T enflamatuar hücreleriyle (TH1) T sitotoksik hücrelerini de (Tc) içeren antijen-reaktif T hücreleri (f) aracılığıyla yapılır.

miktarlarına haftalar boyunca ulaşmazlar. Antikor proteinleri patojene özgüdürler, sadece belli patojenlerdeki bireysel antijenleri tanırlar. Spesifik antikorlar hedef hücrelerdeki antijenle etkileşirler, ama hücreyi öldüremezler. Toplu olarak komplement (öH>Kısım 22.11) olarak bilinen bir grup protein, patojene bağlanmış antikorlara tutunabilir ve antikor bağlanmış bütün hücreleri lizise uğratabilirler. Komplement-antikor etkileşimi, sadece antikorlar tarafından hedef alınan hücreleri etkiler. Örneğin, Salmonella sp. hücre yüzey proteineri için spesifik olan antikorlar sadece Salmonella ile etkileşirler: Komplement, antikorladuyarlılaştırılmış Salmonella hücrelerinin izisine neden olurken, antikorla-duyarlılaştırılmamış komşu E. coli hücresinde lizis yapamaz. Bu nedenle immün-yanıt spesifik antikorlar nedeniyle bireysel antijenler için spesifiktir, ama son etki komplement gibi spesifik olmayan mekanizmalar yoluyla olur.

Hücresel İmmünite ve İmmün Bellek Birçok durumda, antikor aracılı immünite enfeksiyortun yayılmasını kontrol etmek ıçm etkili bir mekanizma değildir. Bazı enfeksiyöz ajanlar vücudu hücrelerin içerisinden parazitize ederler. Örneğin, hayvan virüsleri konukçu hücre sistemlerini kullanarak çoğalırlar ve bu nedenle yaşam döngülerinin büyük bir bölümünü konukçu hücrelerinin içinde geçirirler (öo©Kısım 9.12). Aynı şekilde, tüberküloz etkeni olan Mycobacterium tuberculosis gibi bakteriler de fagositlerin içinde yaşarlar (a°K>Kısım 22.2 ve 26.5) Antikorlar kan veya mukozal hücre yüzeylerindeki patojenleri tanımak için donatıldıklarından, enfekte konukçu hücreleri genellikle hücresel immünitenin hücreden hücreye etkileşimlerini içeren diğer yollarla tanınmalı ve tahrip edilmelidirler. TH hücre tiplerinden bir tanesi olan antijen-spesifik TH1 hücresi, makrofajlar ve nötrofiller gibi fagosit-

794 • Bölüm 24 • Tanısal Mikrobiyoloji ve İmmünoloji

leri çekerek ve aktive ederek, enflamatuvar reaksiyonlara neden olurlar ve enfeksiyonu sınırlarlar (ceoKısım 22.8). İlave olarak hücre içi patojenler, enfekte hücrelerin yüzeylerinde sunulan antijenler üretirler. Tsitotoksik hücreleri (Tc) antijeni tanırlar ve enfekte hücreyi lizise uğratan perferin denilen sitolitik proteinleri salgılayarak direkt olarak enfekte hücre üzerinde etki ederler (Şekil 24.10 ve CRÛKIsım 22.7). Antijene maruz kalmadan önce antijen-spesifik immünite mevcut değildir ama antijene ilk maruz kalmadan sonra antijen-reaktif immün T ve B hücreleri üretilir ve bunlar uzun yıllar dayanarak uzun-süreli spesifik immüniteyi oluştururlar. Daha da önemli olarak, bu antijen-reaktif hücrelerin ikinci bir antijen stimülasyonu birkaç gün içinde pik yapan çok güçlü ve hızlı bir immün yanıt oluşturur (
(csaaKısım 26.14) vakasında olduğu gibi yeni olmuş veya devam etmekte olan bir enfeksiyonu gösterir. HIV antikor seviyelerini saptamak için olan yöntemleri Kısım 24.11 ve 24.12'de tartışacağız. Ne yazık ki, bütün enfeksiyonlar sistemik immünite oluşumuyla sonuçlanmaz. Eğer bir patojen aşırı şekilde lokalize olmuşsa, immünolojik bir yanıtın indüksyonu çok az olabilir veya patojen enfeksiyon bölgesinde bol bol çoğalıyor olsa bile antikor titresinde bir artış görülmeyebilir. İyi bir örnek gonore hastalığıdır. Gonore'nin etken amili Neisseria gonorrhoeae ile enfeksiyon sistemik veya koruyucu bir immün yanıta neden olmaz ve bu nedenle iyileşmiş bir bireyin tekrar enfeksiyonu oldukça yaygındır (bkz. Kısım 24.1, ««sKısım 26.12). Bazı durumlarda, serumdaki antikorların mevcudiyeti yeni bir immünizasyon nedeniyle olabilir. Aslında, immünizasyonu takiben antikor titresindeki artışın ölçülmesi, immünizasyonun etkili olduğunu belirlemenin en iyi yollarından birisidir. Deri testi bir patojene maruz kalmanın belirlenmesi için diğer bir yöntemdir. En yaygın kullanılan

Antikor litreleri, Deri Testleri ve Enfehsiyöz Hastalık Tanısı

çözünür bir ekstraktının deri altına enjeksiyonundan meydana gelen tuberculin testidir. Enjeksiyon bölgesinde 48 saat içindeki pozitif bir enflamatuvar reaksiyon halihazırdaki bir enfeksiyonu veya önce-

Enfeksiyöz bir hastalığın tanısını doğrulamak için bir patojenin izolasyonu her zaman mümkün ya da pratik değildir. Bir alternatif, şüpheli bir patojen için antikor titresinin (miktarının) ölçülmesidir. Önceden belirttiğimiz gibi, eğer bir birey şüphelenilen bir patojenle enfekte ise bu patojen için olan immün yanıt - bu durumda antikor titresi - yüksek olmalıdır. Antikor titresi presipitasyon, aglütinasyon veya Kısım 24.7-24.12'de anlatılan yöntemlerden herhangi birisi ile ölçülebilir. Genel prosedür hasta serumundan bir seri seyreltme hazırlamak ve antijen antikor reaksiyonunun oluştuğu en yüksek seyreltmeyi belirlemektir (Şekil 24.11 •). Bu yöntemlerin hepsi serolojik testler olarak isimlendirilir çünkü bunlar antikor içeren hasta serumundan faydalanırlar. Tek bir antikor titresi ölçümü aktif enfeksiyonun bir göstergesi olarak kullanılamaz çünkü, bir çok antikor önceki bir enfeksiyon halledildikten sonra uzun periyotlar için yüksek titrede kalırlar. Akut bir hastalığın belli bir patojen yüzünden olduğunu ispatlamak için, bir hastadan akut hastalık sırasında ve hastalığın nekahat (iyileşme) dönemi sırasında alman serum örneklerindeki antikor titresinde bir artış görülmesi gereklidir. Çoğunlukla antikor titresi akut enfeksiyon sırasında düşüktür ve nekahat sırasında artar (Şekil 24.11). Antikor titresindeki bir artış, hastalığın şüphelenilen ajan nedeniyle olduğunun en iyi göstergesidir. Bazı durumlarda buna rağmen antikorun önemsiz miktarlarda bulunuşu enfeksiyonu göstermek için yeterli olabilir. Bu, bir popülasyonda nadir bulunan patojenler için gerçektir. Böyle bir patojene karşı antikorların bulunması kazanılmış immün yetmezlik sendromu (AİDS)

deri testi, Mycobacterium tııberculosis hücrelerinin

Normal sıcaklık

idrar kültürleri Fekal kültürler

±±±±±±+±±

Kan kültürleri

2048 512 128 32

Ilı ı

3 Hafta

• Şekil 24.11 Tipik bir tedavi edilmemiş tifo hastasında enfeksiyonun seyri. Vücut sıcaklığının ölçülmesi, klinik semptomların gidişatının ölçümünü sağlar. Antikor titresi bir Salmonella typhi test susunun aglütünasyonuna sebep olan en yüksek serum dilüsyonunun (iki katlı seriler) tayin edilmesiyle ölçülmüştür. Titre bir aglütünasyon reaksiyonu gösteren en yüksek dilüsyonun karşılığı olarak gösterilmiştir. Kanda, dışkıda ve idrarda canlı bakterilerin bulunması periyodik kültürlerden belirlenmiştir. Antikor titresi arttıkça patojenin kandan temizlendiğine ve dışkı ile idrarın temizlenmesi için daha uzun bir süre gerektiğine dikkat ediniz. Vücut sıcaklığı antikor titresi arttıkça kademeli olarak normale düşer. Bu veriler tek bir hastanın göstergesi değil, ancak çok sayıdaki hastada görülen modelin bir birleşimidir.

24 6 • Poliklonal ve Monoklonal Antikorlar • 795

den M. tuberculosis'e maruz kalmış olmayı gösterir. Bu test, patojene spesifik TH1 hücrelerinin neden olduğu gecikmiş tipteki aşırı duyarlılık yanıtlarını identifiye eder («»»Kısım 22.15). Deri testleri tüberkülozun, cüzzamm (öOûKısım 26.5), bir çok fungal hastalığın (<»>Kısım 27.8) ve antikor yanıtının bulunmadığı veya çok az olduğu diğer hastalıkların tanısında rutin olarak kullanılır. Patojenler için olan yaygın immün tanılama testleri Tablo 24.5'te gösterilmektedir. 24.5

Kavramların Gözden Geçirilmesi

İmmün yanıt enfeksiyonun doğal bir sonucudur. Spesifik immün yanıtlar, özellikle de antikor fitreleri deri testleri, geçmiş hastalıklar, devam eden hastalıklar ve nekahat dönemi hakkında bilgi sağlamak için takip izlenebilirler. •

Enfeksiyöz bir ajana karşı olan antikor titresindeki değişiklikleri enfeksiyonun akut fazından nekahat dönemine kadar tanımlayın. • TB deri testinin yöntem, zaman aralığı ve mantığını tanımlayın. Bu testin saptamasını immün yanıtın hangi bileşeni yapar?

Tablo 24.S

Poliklonal ve Monoklonal Antikorlar Bir antijene karşı olan immün yanıt genellikle, antijende bulunan bir çok determinanta (ooaKısım 22.5) yönlendirilen immünoglobulün (Ig) moleküllerinin üretimiyle sonuçlanır (ceç>Kısım 22.9 ve 22.10). Birçok Ig'in sadece bir kaçı her bir antijen determinantına karşı yönlendirilmiştir. Sonuçta oluşan antiserum farklı antikorların bir karışımıdır ve poliklonal bir antiserum olarak bilinir. Poliklonal antiserumlar, konukçuya yeterli immün koruma sağlayan antikorlardan oluşurlar, ancak genellikle birçok çeşit determinant için spesifiktirler. Bu antiserumlar tam olarak tekrar üretilemezler çünkü, bunlar bir hayvan tarafından belli bir anda üretilen antikor yanıtının bir toplamıdırlar. Bununla birlikte, her Ig tek bir B hücresi tarafından üretilir (öo^Kısım 22.10) ve in vitro klonlanmış B hücreleri tek bir monospesifik immünoglabülini sınırsız miktarda üretebilirler. Klonlanmış tek bir B hücresi tarafından üretilen antikorlara monoklonal antikorlar denilir. Uzun ömürlü B

Enfeksiyöz ajanların tanısı için immünolojik yöntemler

Patojen/hastalık

Antijen

Yöntem

HIV (AİDS) Borrelia burgdorferi

İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) Flajellin Yüzey proteinleri

Brucella (brusellozis) Candida albicans (maya enfeksiyonları) Corynebacterium diphteriae (difteri) Influenza virüs (grip)

Hücre çeperi antijenleri Çözünür fungal proteinler ekstraktı Toksin Influenza virüs süspansiyonları. Influenza içeren nazofarinks hücreleri Lepromin (çözünür bakteriyal proteinler ekstraktı) Tüberkülin (saflaştırılmış protein türevi, PPD) Kapsüler polisakkarit

ELISA ELISA İmmünoblot Bakterisidal test (««»Kısım 27. 4) Aglütinasyon Deri testi Deri testi (Schick testi) Komplement temelli assay İmmünofloresans Deri testi

Mycobacterium leprae (cüzam) Mycobacterium tuberculosis (tüberküloz) Neisseria meningitidis (menenjit) Pneumocystis carini (akciğer enfeksiyonu) Riketsiyal hastalıklar (Q fever, tifüs, Rocky Mountain spotted fever)

P. carinii hücreleri Ölü Riketsiyal hücreler

Salmonella (gastroenteritis)

O ve H antijenleri

Streptococcus (grupA) (boğaz ağrısı, kızıl) Treponema pallidium (frengi)

Streptolizin O (ekzotoksin), DNase (ekstraselüler protein) Kardiolipin-lesitin-kolesterol

Vibrio cholerae (kolera)

O antijeni

Deri testi Pasif hemaglütinasyon (N. Meningitidis polisakkariti kırmızı kan hücrelerine adsorbe edilir) İmmünofloresans Komplement temelli assay veya hücre aglütinasyon testleri ELISA Aglütinasyon (VVidal testi) ELISA Hemolizisin nötralizasyonu Enzimin nötralizasyonu Flokülasyon [Veneral Disease Research Laboratory (VDRL) testi] Aglütinasyon Bakterisidal test komplement varlığında) ELISA

" İmmünofloresans testleri, bir hasta örneğindeki belirtilen patojenin mevcudiyetini saptamak için önceden oluşturulmuş antikorları kullanırlar. C. albicans, M. tuberculosis ve M. leprae için olan deri testleri TH1 bağımlı gecikmiş tipte aşırı duyarlılığı belirtirler. C. diphteriae Schick testi bir toksinnötralizasyon deri testi ile serum antikorlarını saptar. Diğer bütün testler serum antikor seviyelerini saptarlar.

796 • Bölüm 24 • Tanısal Mikrobiyoloji ve İmmünoloji

hücre klonları donmuş hücreler halinde saklanabilir ve daha sonra tekrar canlandırılabilirler, böylece yenilenebilir bir spesifik antikor kaynağı sağlarlar. Sonuç olarak, monoklonal antikor teknolojisi birçok immünodiyagnostik uygulamada standart poliklonal tekniklerin yerini almıştır. Tablo 24.6'da poliklonal antikorlar ile monoklonal antikorların özellikleri karşılaştırılmaktadır.

Miyeloma hücreleri

Hibridomaları yapmak için hücreleri birleştir

Monoklonal Antikorlar ve Hibridomalar

Antikor üreten B lenfositleri normalde hücre kültüründe (in vitro) birkaç hafta sonra ölürler. Bu nedenle, antikor üreten B lenfositleri myeloma denilen B hücre tümörleri ile birleştirilirler. Bu myeloma'lar süresiz olarak bölünebilme yeteneğindedirler ve bu nedenle bazen ölümsüz hücre hatları olarak adlandırılırlar. B hücresi-myeloma birleşmesi sonucu oluşan ölümsüz hücre hatları, hibridoma denilen hibrit hücre hatlarıdır. Hibridoma hücre hatları her iki füzyon partnerinin özelliklerini paylaşırlar. İn vitro da süresiz olarak büyür ve antikorları üretirler (Şekil 24.12»). Monoklonal bir antikor üretmek için, bir fare istenilen bir antijenle immünize edilir. Sonraki birkaç hafta boyunca, antijen-spesifik B hücreleri çoğalırlar büyürler ve farede antikor üretmeye başlarlar (£*35Kısım 22.10). Daha sonra fareden B-lenfositlerce zengin olan dalak dokusu alınır ve B-hücreleri miyeloma hücreleri ile birleştirilir (Şekil 24.12). Her ne kadar kültürdeki birçok hücre birleşse ve büyümeye başlasa bile, sadece küçük bir kısım antikor üreten canlı hibridomalardır. Hibridomalar önce diğer hücrelerden in vitro hücre kültürü ortamına (HAT besiyeri) hipoksantin, aminopterin ve timidin ilavesiyle seçilirler. HAT besiyeri birleşmemiş miyeloma hücrelerinin büyümesini durdurur. Çünkü miyeloma hücreleri ne kadar hücre kültüründe sınırsız olarak büyüyebilseler de, bir hücre zehiri olan aminopterinin neden olduğu metabolik bir engellemeyi by-pass etmek için hipoksantin ve timidin metaboliterini kullanamazlar. Bunun aksine, birleşmiş hibridoma hücreleri hipoksantin ve timidini, aminopterinin bloğunu aşmak için kullanabilirler ve HAT besiyerinde normal olarak Tablo 24.6

Monoklonal ve poliklonal antikor üretiminin özellikleri

Poliklonal Bir antijendeki birçok determinantı tanıyan birçok antikoru içerir Birçok antikor sınıfı mevcuttur (IgM, IgG vb.) Sadece yüksek oranda saflaştırılmış bir antijen kullanarak spesifik bir antikor yapılabilir Tekrar üretilebilirlik ve standardizasyon zordur

Monoklonal Sadece tek bir determinantı tanıyan tek bir antikor içerir Tek bir antikor sınıfı üretilir Saf olmayan bir antijen kullanarak spesifik bir antikor yapılabilir Yüksek oranda tekrar üretilebilirdir

Dalaktan izole edilen antikor üreten B hücreleri

Hücreleri in viitro kültür sistemindee büyüt

I

Bireysel hibridomaları mikrotitre plakalarında büyüt

nılen antikor bakımından test et

T

¥

İki yoldan biriyle devam et Fare hibridoma tümörü

\ Hücre kültürü

Monoklonal antikorlar

* Şekil 24.12 Hibridoma tekniği ve monoklonal antikorların üretimi. Hibridoma süresiz olarak kültüre edilebilir veya bir tümör olarak hayvanlara geçirilebilir. Hibridoma hücreleri aynı zamanda donmuş tümör hücreleri olarak da saklanabilirler ve gerektiğinde doku kültüründe ya da uygun bir konukçu hayvanda tekrar canlandırılırlar.

büyüyebilirler; hipoksantin ve timidinin kullanılması için gerekli olan genetik bilgiyi B-hücresi füzyon ortağından alırlar. Birleşmemiş herhangi bir B-hücresi kültürde büyüyemediğinden birkaç gün içinde ölür. Füzyonu takiben, antikor üreten hibridoma klonları mutlaka tanılanmalıdır. Monoklonal antikorları üreten hibridomaları tanılamak için bir ELISA (enzim-bağlı immünoassay) testi (bkz. Kısım 24.10) kullanılabilir. Tipik bir birleşmeden her birisi bir monoklonal antikor yapan birçok farklı klon izole edilir. İstenilen klonlar bir kere identifiye edildiklerinde, in vivo'da antikor

24 7 • la Vitro Antijen-Antikor Reaksiyonları: Seroloji • 797 Tablo 24.7

Antijen- antikor reaksiyon tipleri

Antijenin lokasyonu Çözünür Hücrede veya inert partikülde Flajel Bakteri hücresinde Bakteri hücresinde Eritrositte Toksin Virüs Bakteri hücresinde

Gerekli yardımcı faktörler Yok Yok Yok

Komplement Komplement Komplement Yok Yok

Fagosit, komplement

üreten tümörler olarak veya hücre kültüründe büyütülebilirler. Hibridomalar süresiz olarak büyüyebilir veya donmuş hücreler olarak saklanabilirler. Tanı ve Tedavide Kullanılmaları Monoklonal antikorlar sayısız uygulamayla birlikte, yüksek spesifitedeki biyolojik ayraçların sınırsız bir kaynağını sağlarlar. Monoklonal antikorlar klinik tanı testlerinde, bakterilerin immünolojik tiplendirilmesinde ve yabancı yüzey antijenleri taşıyan hücrelerin tanısında (örn, virüs enfekteli bir hücre) yaygın şekilde kullanılırlar. Monoklonal antikorlar genetik mühendisliğinde diğer metodlarla saptanamayan gen ürün seviyelerinin ölçülmesinde de kullanılmakta ve aynı zamanda mevcut kan ve doku tiplendirmesini de içeren klinik testlerin spesifitelerinin arttırılmasında da büyük ümit vadetmektedirler. Spesifitelerinden ötürü monoklanal antikorlar insan kanserlerinin tespitinde ve tedavisinde kullanılırlar. Malignant hücreleri, normal hücreler tarafından ifade edilmeyen birçok yüzey antijeni taşırlar. Bu tümör antijenleri benzersiz, tümör-spesifik hücre proteinleridir. Bu tümör antijenlerine karşı hazırlanan monoklonal antikorlar, spesifik olarak malignant hücrelerini hedef alırlar ve toksinlerin direkt ve spesifik olarak malignant hücrelerine ulaştırılmasında kullanılırlar. Toksinlere kovalent olarak bağlanmış tümöre spesifik monoklanal antikorların klinik denemeleri devam etmektedir. Monoklanal antikor tedavilerinin spesifitesi, kanser hücrelerine olduğu kadar normal konukçu hücrelerine de zarar veren kimyasal ve radyasyon tedavilerine bir alternatif oluşturarak, kanser kemoterapisini büyük ölçüde kıymetlendirebilir. —|Hf| 24.6 Kavramların Gözden Geçirilmesi Poliklonal ve monoklonal antikorlar araştırma ve klinik uygulamalar için kullanılırlar. Hibridama teknolojisi, geniş bir aralıktaki klinik, tanı ve araştırma amacı için yenilenebilir monoklonal antikorları sağlar. • Poliklonal bir antikor preparasyonu, birçok çeşit determinantı nasıl tanıyabilir?

Gözlenen reaksiyon Presipitasyon (Kısım 24. 7) Aglütinasyon (Kısım24. 8) Immobilizasyon veya aglütinasyon (Kısım 24.8) Lizis (<£>«SKısım 22. 11) Öldürme (0°OKısım 22. 11) Hemoliz (<3°öKısım 22.11) Nötralizasyon (Kısım 24. 7) Nötralizasyon (Kısım 24. 7) Fagositoz (opsonizasyon; ^öKısım 22.11)

• Monoklonal antikorların, poliklonal antikorlarla karşılaştırıldıklarında ne gibi avantajları vardır? Poliklonal antikorlar ne gibi avantajlar sunarlar?

in Vitro Antijen-Antikor Reaksiyonları: Seroloji in vitro antijen-antikor reaksiyon çalışmaları seroloji olarak adlandırılır. Serolojik reaksiyonlar bütün tanısal immünoloji testlerinin temelidir. Antijen-antikor reaksiyonlarının prensipleri, antijendeki determinantların antikor molekülünün değişken bölgesi ile spesifik etkileşiminde yatar. Antijenlerin tanısında, antijenin özelliklerine ve reaksiyon için seçilen koşullara bağlı olarak birçok çeşit serolojik test kullanılır. Spesifîte ve Sensitivite Serolojik bir testin tanısal amaçlar için yararlılığı, testin spesifitesine ve duyarlılığına bağlıdır. Spesif ite, bir antikor preparasyonunun tek bir antijeni tanıyabilme yeteneğidir. Optimal spesifite, antikorun tek bir antijen için spesifik olduğunu, diğer hiçbir antijenle çapraz reaksiyon vermeyeceğini ve bu nedenle de yanlış pozitif sonuçlara neden olmayacağını ifade eder. Spesifite mutlaka pozitif ve negatif kontrol antijenleri ile reaksiyonlara dayanarak tanımlanmalıdır. Spesifite her test için mutlaka deneysel olarak tanımlanmalı ve test her kullanıldığında doğrulanmalıdır. Sensitivite, bir antijenin tayin edilebilir en düşük miktarını tanımlar. En yüksek duyarlılık seviyesi için bir testteki antikorun tek bir antijen molekülünü tanılayabilme kapasitesinde olmasına gerek vardır. Yüksek duyarlılık yanlış negatif reaksiyonları engeller. Bazı yaygın testlerin duyarlılıkları, antijeni tayin etmek için gerekli olan antikor miktarı cinsinden Tablo 24.8'de gösterilmiştir. Her test sistemiyle saptanan antijen miktarı, kullanılan antikor miktarına orantılıdır. Örneğin, immün presipitasyon reaksiyonları, büyük bir miktarda antikora gerek duyar ve genellikle 0,1-1,0 mg miktardaki antijenleri saptar. Bu nedenle, presipitasyon testleri en az duyarlı olan serolojik testlerdir. Bunun aksine, enzim-bağlı

798 • Bölüm 24 • Tanısal Mikrobiyoloji ve İmmünoloji r

Tablo 24.8 Test

İmmünodiyagnostik testlerin duyarlılıkları Duyarlılık 3 (lig natikor'ml)

Presipitin reaksiyonu Sıvılarda Jellerde (çifte immünodifüzyon) Aglütinasyon reaksiyonları Direkt Pasif Radyoimmünassay (RIA) Enzim bağlı immunsorbent assay (ELISA) İmmünofloresans

1

24-160 24-160 0,4 0,8

0,0008-0,008 0,0008-0,008 8,0

"Antijen mevcudiyetinde pozitif bir reaksiyon vermek için gerekli olan en küçük antikor miktarı

immunosorbent assayleri veya ELISA testleri (bkz. Kısım 24.10) 100.000 kere daha az antikora gere duyarlar ve antijenlerin presipitasyonunda olduğundan 1 milyon kere daha az antijeni (0,1-1,0 ng miktarlardaki) tayin edebilirler. Nitekim ELISA testleri serolojik testler arasında en duyarlı olanlarıdır. Nötralizasyon Nötralizasyon, antijenin biyolojik aktivitesinin elimine edilmesi veya yeterli şekilde azaltılması için onu bloke eden veya bozan antikor ile antijen etkileşimidir. Nötrolizasyon reaksiyonları in vitro veya in vivo olabilir. Örneğin, mikrobiyal toksinlerin spesifik antikorlarla nötralizasyonu, toksin ve spesifik antikor, toksinin aktif kısmı bloke olacak bir şekilde kombine olduğunda gerçekleşir (Şekil 24.13«). Bu tip nötralizasyon reaksiyonları, Tablo 21.4'te üstelenenlerin bir çoğunu da içeren çoğu bakteriyal ekzotoksin için oluşur. Bir toksini nötralize eden bir antikor içeren bir antiserum bir antitoksin olarak tanımlanır. Antitoksin tedavisi botulizm (öeç>Kısım 29.6), tetanoz (^«aKısım 27.9) ve difteriyi (Kısım 26.3) tedavi etmede kullanılır ki bütün bu hastalıklar bakteriyal ekzotoksin üretimi sonucu oluşur. Virüsler spesifik antikorlarla bağlandıklarında da nötralizasyon reaksiyonları oluşabilir. Örneğin, influenza virüslerinin nöraminidaz ve hemaglütinin proteinlerine karşı yönlendirilmiş olan antikorlar, virüslerin konukçu hücrelerindeki spesifik reseptörlere adsorpsiyonunu engellerler (<3°oKısım 26.8). Nötralizasyon reaksiyonları hasta serumu kullanılarak in vitro test yapmak için kullanılabilirler ama nötralizasyon testleri için biyolojik olarak aktif sistemler gerekli olduğu için rutin tanı laboratuvarlarında kullanılamazlar. Presipitasyon Presipitasyon çözünür bir antikor ile çözünür bir anti^etvm. çözünmeyen bir kompleks oluşturmak vçirv etküeşmeleri sonucu oluşur. Antikor moleküllerinin geneYrMe iki antijen bağ\ama Vöigeieri vardır Vyani

bivalenttirler) (ö°öKısım 22.9). Bu nedenle, her bölgenin farklı bir antijen molekülü ile kombine olması mümkündür. Aynı zamanda antijen de birden fazla uygun determinanta sahip olsa bile, antijen ve antikor moleküllerinin agregatlarmdan bir presipitat oluşabilir (Şekil 24.14a»). Presipitasyon reaksiyonları in vitroda kolaylıkla gözlenebildiklerinden, özellikle antikor konsantrasyonlarının kantitatif ölçümü için çok bilgilendirici serolojik testlerdir. Presipitasyon maksimum olarak sadece, reaksiyona giren iki maddenin optimum oranları bulunduğunda oluşur. Antijen veya antikorun ikisinden birinin fazla miktarda bulunması küçük, çözünür immün komplekslerin oluşumuyla sonuçlanır. immünodifüzyon testleri olarak bilinen ağar jellerde yapılan presipitasyon reaksiyonları, antijenantikor reaksiyonlarının spesifitesini çalışmada kullanılır. Hem antijen hemde antikor, bir ağar jelden kesilen ayrı kuyulardan dışarıya difüze olurlar ve antijen ile antikorun optimal oranlarda etkileştikleri bölgelerde presipitasyon bantları oluşur (Şekil 14.14i>). Presipitasyon bantları reaksiyona giren maddeler için karakteristiktir; antiserum kuyusunun bitişiğindeki kuyulara iki antijen konulduğunda, oluşan bantların gözlenmesiyle bir antiserumla reaksiyona giren iki antijen moleküler ilişkileri bakımından test edilebilirler. Örneğin; bitişik kuyulardaki iki antijen identik ise tek bir birleşmiş presipitin bantı oluşturacaklardır. Bu bir tanılama hattı olarak tanımlanır. Diğer taraftan, eğer bitişik kuyulardan biri yaygın bir antijen içeriyor ama diğer kuyuda ikinci bir antijen bulunuyorsa, bir kısmi tanılama hattı oluşacaktır (Şekil 24.24b). Presipitin hattının uzaması (antiserum ile ikinci antijen arasındaki bir reaksiyonu gösteren) bir çıkıntı olarak tanımlanır. İmmünodifüzyon, biyokimyasal araştırmalarda farklı kaynaklardan elde edilen proteinlerin benzerliğini değerlendirmede bir araç olarak kullanılır. Toksin + antitoksin

fi;

Hücre ~

g

Toksin molekülleri

Hücre hasarı Hücre hasar görmez (a)

* Şekil 24.13 Bir ekzotoksinin antikorla nötralizasyonu. Antitoksinler difteri (Kısım 26. 3), tetanoz (Kısım 27. 9) ve (a) Muamele edilmemiş toksin hücre tahribiyle sonuçlanır, (b) Antitoksin toksini riörralize eûer ve "mıcre taiuÎDmi engeller

24.8 • Aglütinasyon • 799 • Bir presipitasyon reaksiyonu için minimum antijen ve antikor gereksinimleri nelerdir?

Aglütinasyon Presipitat miktarı

Antijen konsantrasyonu (a) Çıkıntı

Aglütinasyon, partikülat antijenler için spesifik olan antikorlar ile karıştırıldığında partikülat bir antijenin görünür şekildeki kümeleşmesidir. Diğer bazı serolojik testler kadar duyarlı olmamakla birlikte, aglütinasyon testleri prensipitasyon testlerinden 1000 kat daha fazla duyarlıdırlar (Tablo 24.8). Aglütinasyon testleri kinik ve tanı laboratuvarlarmda yaygın olarak kullanılırlar çünkü, yapılmaları kolay, yüksek oranda spesifik, ucuz, hızlı ve makul ölçüde duyarlıdırlar. Birçok patojen ve patojen ürünlerinde olduğu gibi kan grup antijenlerinin tanısı için de standardize edilmiş testler bulunmaktadır. Direkt Aglütinasyon

• Şekil 24.14 Çözünür antijen ve antikor arasındaki presipitasyon reaksiyonları. Grafik (a) antijen ve antikor konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak presipitasyonun derecesini göstermektedir, (b) Ağar jeldeki presipitasyon, immünodifüzyon denilen bir işlem. S ile işaretli kuyular Proteus mirabilis'e karşı antikorlar içermektedir. A, B ve C işaretli kuyularda Proteus mirabilis'in çözünür ektraktlan bulunmaktadır. Soldaki kuyularda bir tanılama hattı görülmektedir. Sağda, E antijeni reaksiyon vermemiştir ve A antijeni F antijeni ile kısmi benzerlik göstermektedir (öndeki çıkıntıya bakınız).

Ne yazık ki, kolaylıkla görülebilen presipitasyon reaksiyonları çok fazla duyarlı değillerdir. Bir presipitatın görülebilmesi için spesifik bir antikorun mikrogram miktarları gereklidir (Tablo 24.8) ve en faydalı tanılama testleri için nanogram seviyesinde duyarlılığa gerek vardır. Sonuç olarak, presipitasyon reaksiyonları normal olarak sadece araştırma ve referans laboratuvarlarmda kullanılırlar. 24.7 Kavramların Gözden Geçirilmesi Antijen-antikor reaksiyonları antikorun antijene bağlanmasına gerek duyarlar. Spesifite ve sensitivite bireysel serolojik testlerin doğruluğunu tanımlar. Nötralizasyon ve prensipitasyon reaksiyonları, antijen-antikor etkileşimlerini içeren görünür sonuçlar üreten antijen-bağlama testlerinin örnekleridir. •

Serolojik reaksiyonlarda, yüksek spesifite yanlış pozitif reaksiyonları engeller. Yüksek duyarlılık yanlış negatif reaksiyonları engeller. Açıklayınız. • Bir nötralizasyon reaksiyonunun prensiplerini açıklayınız.

Bir hücre veya çözünmeyen başka bir partikülün bir parçası olan bir antijenle etkileşimden dolayı çözünür antikor kümeleştiğinde, direkt aglütinasyon oluşur. Direkt aglütinasyon işlemleri, kırmızı kan hücrelerinin (eritrositlerin) yüzeylerinde bulunan antijenlerin sınıflandırılmasında kullanılırlar. Kırmızı kan hücrelerinin aglütinasyonu hemaglütinasyon olarak bilinir ve kan tiplendirmesinin temelini oluşturur. Kırmızı kan hücreleri birçok çeşit hücre yüzey antijeni sergilerler ve kişiler kırmızı kan hücrelerinde bulunan antijenler nedeniyle oldukça çeşitlenirler. Esas insan kırmızı hücre antijenlerine A, B, ve D (Rh olarak ta bilinir) denilir. A ve B antijenleri ve antikorları, ABO kan tiplendirme testinin temelidirler. Belli eritrosit yüzey antijenleri için spesifik olan antikorlar, küçük bir damla kan bir mikroskop lamının üzerinde insan eritrositlerinin A veya B antijenlerine karşı reaktif antiserumla karıştırıldığında, kırmızı kan hücrelerinin görünür şekilde kümeleşmesine neden olurlar (Şekil 24.15»). Antiserumlar, A ve B antijenlerine karşı doğal veya yapay yollarla immünize edilen insan donörlerden ede edilir. A, B ve O kan grupları için, bireyler kodominant A ve B allellerini aşağıdaki antijen fenotiplerinden birisi olarak ifade ederler: A, B, AB (bir allelin A antijenini ve birinin B antijenini ifade etmesi) veya O (her iki A veya B antijeninin de bulunmaması). İlave olarak, bireyler çoğu kendinden olmayan kan grup antijenlerine karşı antikor yaparlar. Tip A bireyleri grup B antijenlerine karşı antikor yaparken, tip B bireyleri de grup A antijenlerine karşı antikorlar yaparlar. Tip AB bireylerde ne A ne de B-antikorları bulunmazken, tip O bireylerinde hem A hem de B antijenlerine karşı antikorlar bulunur (Şekil 24.15). A ve B antijenlerine karşı olan antikorlara doğal antikorlar denilir, çünkü bunlar çoğu birey tarafından, enterik bakteriler gibi her yerde bulunan antijen kaynaklarına yanıt olarak üretiliyor gibi görülmektedir. Kan naklinde, alıcının kanındaki antikorlar aktarılan kandaki kırmızı kan hücreleriyle reaksiyo-

800 • Bölüm 24 • Tanisal Mikrobiyoloji ve İmmünoloji

I

Kan tipi TipO Tip A TipB Tip AB

ABD populasyonun yüzdesi 47 42 8 3

smda da kullanılır. Örneğin; sadece Staphylococcus aureus'un yüzeyinde bulunan iki molekül olan protein A ve kümeleşme faktörüne karşı antikorlarla kaplı lateks boncuklarının ticari olarak bulunan bir süspansiyonu, S. aureus'un klinik izolatlarının tanısında hemen hemen % 100 spesifiktir. S. aureus için olan geleneksel büyümeye bağlı testlerin aksine, S. aureus'un lateks tanecik testi ile tanısı sadece 30 sn sürer (Şekil 24.16»). Lancefield grup A (Streptecoccus pyogenes) B, C, D, F ve G'yi de (eesKısım 12.19) içeren çeşitli patojenik /3-hemalitik streptokoklaSerum

AntiA Aglütinasyon yok Aglütinasyon Aglütinasyon yok Aglütinasyon

AntiB Aglütinasyon yok Aglütinasyon yok Aglütinasyon Aglütinasyon

(b)

* Şekil 24.15 İnsan kırmızı kan hücrelerinin ABO kan tiplendirmesinde direkt aglütinasyonu. (a) Soldaki reaksiyonda aglütinasyon yoktur. Ortadaki reaksiyon B kan grubu için pozitif bir reaksiyonu belirten yaygın aglütinasyon modelini göstermektedir. Sağdaki reaksiyon A kan grubu için tipik olan büyük, kümeleşmiş aglütinatlarla birlikte güçlü bir aglütinasyon modelini göstermektedir, (b) U.S. popülasyonu için beklenen kan grubu sonuçlan tablosu.

na girerse veya bunun aksi durumda oluşabilecek olan kırmızı kan hücrelerinin tahribini engellemek için, kan naklinden önce mutlaka kan tiplendirmesi yapılmalıdır. Antikor kaplı kırmızı kan hücreleri komplementin etkisi sayesinde («*^>Kısım 22.11) hemolize (kırmızı kan hücrelerinin lizisi) uğrarlar, bu da şiddetli anemi ile sonuçlanır. Pasif Aglütinasyon Pasif aglütinasyon, lateks tanecikleri veya kömür partikülleri gibi çözünmeyen partiküllere veya hücrelere adsorbe edilen ya da kimyasal olarak bağlanan, çözünür antijen veya antikorların aglütinasyonudur. Çözünmez hale gelen antijen veya antikor daha sonra aglütinasyon reaksiyonlarıyla saptanabilir. Hücre veya partikül inert bir taşıyıcı olarak iş görür. Pasif aglütinasyon reaksiyonları, direkt aglütinasyon testlerinden beş kat fazlaya kadar daha duyarlılığa sahip olup (Tablo 24.8) duyarlılığı önemli derecede arttırırlar. Antijen-kaplı veya antikor-kaplı lateks taneciklerinin bir hastadan gelen komplementer antikor veya antijenle aglütinasyonu, tipik bir hızlı tanı yöntemidir. Spesifik bir antijenle kaplanmış küçük (0,8 fim) lateks tanecikleri, bir mikroskop lamında hasta serumu ile karıştırılır ve kısa bir süre inkübe edilir. Eğer hasta antikoru taneciğin yüzeyindeki antijene bağlanırsa, sütümsü beyaz lateks süspansiyonu görünür şekilde kümeleşerek, pozitif bir aglütinasyon reaksiyonunu gösterir. Lateks aglütinasyonu aynı zamanda küçük bir miktar bakteri kolonisi antikor kaplanış lateks tanecikleriyle karıştırılarak, bakteri yüzey antijenlerinin saptanma-

rı, Neisseria genorrhoeae ve Neisseria meningüidis'i, Haemephilus influenza, Escherichia coli 0157:H7 ve Cryptococcus neofor'.nans ile Candida albicans fungus-

larını identifiye etmek için diğer lateks tanecik aglütinasyon testleri de geliştirilmiştir. Yaygın şekilde kullanıma konmuş bir lateks aglütinasyon testi, otoimmün bir hastalık olan romatoid artrit ile ilgili olan ve vücudun kendi Ig'lerine karşı yönlenmiş bir antikor olan romatiod faktör için spesifik serum antikorlarının saptanmasında kullanılır (oooKısım 22.15). İnsan Ig'leriyle kaplanmış lateks tanecikleri bütün kan veya serumla karıştırılır ve aglütinasyon pozitif ve negatif kontrolle karşılaştırılır. Pasif aglütinasyon testleri özel uzmanlığa veya pahalı ekipmana gerek duymaz ve yüksek oranda spesifik ve duyarlı olabilirler. İlave olarak bu testlerin pahalı olmayan tabiatı bunları büyük ölçekli tarama programları içinde uygun hale getirir. Bu testler klinik ve araştırma laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılırlar. (jSy 24.8 Kavramların Gözden Geçirilmesi Direkt aglütinasyon testleri kan gruplarının tayininde yaygın olarak kullanılırlar. Çok sayıda pasif aglütinasyon testi birçok çeşit patojenin ve patojene ilişkili ürünlerin tanısı için piyasada bulunmaktadır. Aglütinasyon testleri hızlı, göreceli olarak duyarlı, oldukça spesifik yapılması kolay ve ucuzdur. •

Direkt ve pasif aglütinasyonu birbirinden ayırt edin. Hangi testler daha duyarlıdır?

• Şekil 24.16 Staphylococcus aureus için lateks tanecik aglütinasyon testi. Panel 1 negatif bir kontrolü göstermektedir. Yalnız S. aureus hücrelerinin yüzeyinde bulunan iki antijen olan protein A ve kümeleşme faktörüne karşı antikorlarla kaplanmış süspanse lateks taneciklerinin muntazam pembe rengine dikkat ediniz. Panel 2 aynı süspansiyonu, bakteri kolonisinden bir öze dolusu materyal süspansiyona karıştırıldıktan sonra göstermektedir. Parlak kırmızı kümeler pozitif bir aglütinasyon reaksiyonunun yer aldığını ve koloninin S. aureus olduğunu belirtir.

24 9 • Floresan Antikorlar • 801

• Aglütinasyon testlerinin diğer immüneassayle göre ne gibi avantajları vardır? Dezavantajları nelerdir?

Floresan Antikorlar Antikorlar floresan boyalarla kimyasal olarak modifiye edilebilirler. Bu modifiye antikorlar tam hücrelerdeki antijenleri saptamada kullanırlar. Floresan antikorlar tanı ve araştırma uygulamalarında yaygın olarak kullanılırlar. Floresan Yöntemler

Antikorlar, kırmızı floresan veren rodamin B veya sarı-yeşil floresan veren floresan izotiyosiyanat gibi floresan boyalarla kovalent olarak modifiye edilebilirler. Bu antikorun spesifitesini değiştirmez ama floresan bir mikroskop kullanılmasıyla hücre veya doku yüzey antijenlerine bağlanmış olan antikorun saptanmasını mümkün hale getirir (Şekil 24.17»). Hücreye bağlı floresan antikorlar, belirli dalga boylarındaki ışıkla uyarıldıklarında parlak bir floresan renk yayarlar. Yayılan floresan ışık kullanılan boyaya bağlı olarak genellikle kırmızıturuncu veya sarı-yeşildir. Floresan antikorlar tanısal mikrobiyolojide kullanılırlar çünkü organizmanın izolasyonu ve kültürü için olan gereksinimi atlayarak, bir mikroorganizmanın direkt olarak bir hasta örneğinden (in situ) tanısına izin verirler. Floresan antikor tekniği mikrobiyal ekolojide de mikrobiyal hücrelerin izolasyonu ve kültürüne ihtiyaç olmadan, direkt olarak gözlenmeleri ve tanılanmaları için bir yöntem olarak oldukça yararlıdır («^as Kısım 18.3).

Uygulamalar

Floresan antikorları kullanan tipik bir testte, şüpheli bir patojen içeren bir örneğin spesifik bir floresan antikor ile reaksiyonuna izin verilir ve floresan bir mikroskop ile gözlenir. Eğer patojen antikor ile reaktif yüzey antijenlerini taşıyorsa, hücreler floresan yayacaktır (Şekil 24.19»). Floresan antikorlar direk olarak enfekte konukçu dokularına uygulanabilirler ki bu da primer izolasyon tekniklerinin şüpheli bir patojen üretmelerinden çok daha önce tanıya izin verir. Örneğin lejyonellozisin teşhisinde (ooöKısım 28.7)

Antijen Bakteriyal hücre

Antibakteriyal antikor, floresan boyayla işaretlenmiş

(a) Antijen /

Bakteriyal hücre

Tavşanda yapılmış (işaretsiz) antibakteriyal antikor

Farklı direkt ve indirekt floresan boyama yöntemleri kullanılmaktadır. Direkt yöntemde yüzey antijenine yöneltilmiş antikor, floresan boya ile kovalent olarak bağlıdır. İndirekt metotta, bir hücrenin yüzeyindeki floresan olmayan bir antikorun mevcudiyeti, bu fluaresan olmayan antikora karşı yöneltilmiş olan floresan bir antikorun kullanılmasıyla saptanır (Şekil 24.18»).

Anti-tavşan Ig, floresan boyayla işaretlenmiş

• Şekil 24.17 Floresan antikor reaksiyonları. Clostridium septicum hücreleri san-yeşil floresan veren floresan izotiyosiyanat ile bağlı antikorlarla boyanmıştır. Clostridium chauvoei hücreleri kırmızı-turuncu floresan veren rodamin B ile konjuge antikorlar ile boyanmıştır.

(b)

• Şekil 24.18 Mikrobiyal yüzey antijenlerinin saptanmasında floresan antikor yöntemleri, (a) Direkt boyama yöntemi, (b) İndirekt boyama yöntemi.

802 • Bölüm 24 • Tanisal Mikrobiyoloji ve İmmünoloji

• Şekil 24.19 Floresan antikorların klinik mikrobiyolojide kullanımına ait örnekler, (a) Legionellosis'e neden olan Legionella pneumophila'nın immünfloresan boyanmış hücreleri. Örnek biyopsi yapılmış akciğer dokusundan alınmıştır. Bireysel organizmalar 2-5 /jm uzunluğundadırlar. (b) Virüs enfekteli hücrelerin immünfloresansla saptanması. Human B lymphotrophic virüs (HBLV) enfekteli dalak hücreleri, lenfoproliferatif bozukluğu olan bir hastadan alınan HBLV'ye karşı antikorları içeren serumla inkübe edilmişlerdir. Daha sonra hücreler floresan izotiyosiyanat ile bağlı anti-insan IgG antikorları ile muamele edilmişlerdir. HBLV enfekteli hücreler parlak san floresans verirler. Arka plandaki hücreler hastanın serumu ile reaksiyon vermemişlerdir. Bireysel hücreler yaklaşık 10 jım çapındadır.

biyopsi yapılmış akciğer dokusunun, Legionella pneumophila'nm hücre çeper antijenleri için spesifik olan floresan antikorlarla boyanmasıyla pozitif bir tanı yapılabilir (Şekil 24.19fl). Keza direkt bir floresan antikor testi, antraksın teşhisinin doğrulanması için Bacillus anthracis''in kapsülüne karşı kullanılabilir (öOsŞekil 21.14). Bu metodoloji aynı zamanda boğmaca etkeni Bordatella pertussis ile enfeksiyonun saptanmasında da kullanılmaktadır (o^Kısım 26.4). Direkt floresan antikor testleri viral enfeksiyonların teşhisine yardımda da kullanılmaktadır (Şekil 24.19b). Yaygın solunum yolları patojenleri olan influenza A ve B, parainfluenza, respiratory syncytial virüs (RSV) ve adenovirüs'lar solunum yolu örneklerinden direkt floresan antikor yöntemleri ile identifiy eedilirler. Floresan antikor yöntemleri doku veya organ tanılanırlar. Floresan antikor yöntemleri doku veya organ kültüründe büyüyen virüsleri identifiye etmek için de kullanılırlar (bkz. Kısım 24.12). Birçok çeşit floresan antikor testi aynı zamanda bazı enfeksiyöz olmayan hastalıların tanısına yardım etmek için de kullanılırlar. Belirli bir antijen ile etkileşen floresan antikorlar o antijeni ifade eden hücre tiplerinin tanısında kullanılabilirler. Örneğin, malignant hücrelerde bulunan tümör-spesifik antijenlere karşı yönlendirilmiş floresan antikorlar, malignant hücrelerin tanısında ve hastalığın gidişatının izlenmesinde kullanılabilirler (Şekil 24.20«). Floresan antikorlar nispeten saf popülasyonlar içindeki hücre karışımlarını ayırmada veya kan gibi komleks karışımlardaki belirli hücre tiplerinin sayılarını tanımlamada da kullanılabilirler. T-lenfositlerin CD4 ve CD8 yüzey antijenerine karşı yönlendirilmiş monoklonal antikorlar

• Şekil 24.20 Floresan antikorların enfeksiyöz olmayan hastalıkların teşhisinde kullanılması, (a) Bazıları toksik bir antikanser ilaca karşı duyarlı, bazıları duyarsız olan insan kan kanseri hücreleri ayırt edilemez görünmektedirler, (b) (a)'daki hücreler, sadece ilaca dirençli hücrelerin yüzeyinde bulunan bir proteine spesifik olarak bağlanan floresan bir monoklonal antikor ile muamele edildiklerinde, ilaca duyarlı hücreler floresan vermezlerken, diğerleri floresan verirler. Bireysel hücreler yaklaşık 10-12 /j.m çapındadır.

22.6) kan lökosit popülasyonundaki bu hücreleri tanılamak ve saymak için rutin olarak kullanılırlar (Şekil 24.21). Örneğin, kazanılmış immün yetmezlik sendromunun (AİDS) tanımlanması CD4 hücre sayısında bir düşüşü de kapsar. Ek olarak, CD4 T hücre sayısı AiDS'in ilerlemesi boyunca değişir ve bu durum hastalık için tanısaldır. Böylece, CD4 sayısının tanımlanmasıyla doktor, normal değerlerle karşılaştırarak CD4 hücrelerindeki azalmayı belirleyebilir ve zaman içindeki başarılı testlerle hastalığın ilerlemesini takip edebilir (o^Kısım 26.14). Floresan antikor işaretli hücreler, floresan sitometre denilen bir enstrümanla görüntülenebilir, sayılabilir ve ayrılabilirler, bazen floresan aktivasyonlu hücre ayırıcısı (fluorescent activated celi sorter, FACS) olarak tanımlanır. FACS hücrelere bağlı olan floresan antikoru aktive etmek için bir lazer ışını kullanarak, işaretli hücrelere bir yük verir. Daha sonra hücre karışımına bir elektrik alanı uygulanır. Sonra floresan yayan ve yaymayan hücreler her hücre popülasyonunun sayıldığı ve bir tüpte toplandığı elektrik alanının karşıt kutuplarına döndürülürler. Her birisi farklı bir floresan boyayla işaretlenmiş birçok antikorun kullanılması

24 9 • Floresan Antikorlar • 803

* Şekil 24.21 Spesifik yüzey markırlanna karşı floresan etiketli monoklonal antikorlarla boyanmış T lenfositleri. San-yeşil hücreler Tc (CD8) hücreleri; kırmızı-turuncu hücreler TH (CD4) hücreleridir. Farklı renkte olan hücreler birbirlerinden floresan aktivasyonlu bir hücre ayırıcısı ile farklı hücre tiplerinin zenginleştirilmiş popülasyonlannı üretmek için ayrılabilirler. Bireysel hücreler 10-12 ju,m çapındadır. Science 239: Cover (Feb. 12,1988) izniyle tekrar basılmıştır, ©AAAS.

birçok hücre markörünün eş zamanlı tanısıyla sonuçlanabilir. Normal bireyler ve AİDS hastalarmdaki T hücrelerinin CD3 ve CD4 yüzey proteinlerinin tanısında kullanılan tipik bir uygulama Şekil 24.22«'de gösterilmektedir. FACS analizi araştırma uygulamaları için de yararlıdır. Örneğin, immünologlar FACS metodu1000 q

©

nu kompleks immün hücre karışımlarını ayırmada rutin olarak kullanılırlar. Daha sonra yüksek oranda zenginleştirilmiş hücre popülasyonlarınm özelliklerini çalışabilirler. Uygun koşullar altında, floresan antikorlar birçok klinik durum hakkında hızlı ve oldukça spesifik bilgi üretirler. Buna rağmen, floresan antikor teknikleri tuzaklardan arınmış değildir. Non spesifik boyanma, bazıları normal floranın üyesi olabilen çeşitli bakteri türleri arasında çapraz reaksiyon yapabilen yüzey antijenleri nedeniyle bir problem olabilir. Bu, floresan probun birçok farklı organizmayla bağlanmasına neden olmak için, lipopolisakkarit antijenlerin («s^Kısım 4.9) türler arasında yeterince benzer olduğu enterik bakteriler arasında büyük bir problemdir. Bu nedenle klinik mikrobiyolog mutlaka nonspesifik serumlar kullanarak kontrolleri yapmalı ve bütün pozitif immünofloresan bulguları diğer immünolojik veya mikrobiyolojik testlerle doğrulamalıdır. 24.9 Kavramların Gözden Geçirilmesi Floresan antikorlar, doku örnekleri ve diğer kompleks çevrelerdeki patojenlerin veya diğer antijenik maddelerin hızlı ve doğru tanısında kullanılırlar. Floresan antikor temelli yöntemler tanı, kantitatif sayım ve birçok çeşit hücre tipinin ayrılmasında kullanılabilirler. •

Direkt ve indirekt floresan antikor testlerinin prensiplerini, avantajlarını ve dezavantajlarını açıklayın ve karşılaştırın.

• FITCAPE -

1000 3

100 :

©

-FİTCAPE-

100 : I

%56.3

• •••• % 2 . 7

'•&:

CD4-PE

CD4-PE

•• %

1 0 ;

1000 (a)

(b)

• Şekil 24.22 CD3 ve CD4 hücre sayımı. Örnekler, floresan aktivasyonlu hücre ayırıcısı (FACS) kullanılarak (a) sağlıklı bir insandan, (b) kazanılmış immün yetmezlik sendromlu (AİDS) bir insandan alınmıştır. Her nokta bir hücreyi temsil eder. Periferal kan hücreleri aym anda CD4'e karşı olan fikoeritrın (PE) konjugeli monoklonal antikorlarla ve CD3'e karşı olan floresan izotiyosiyanat (FITC) konjugeli monoklonal antikorlarla işaretlenmiştir. CD3 bütün T hücrelerinde bulunur. CD4 sadece T-helper (TH) hücrelerinde bulunur. Bölme 3 hiçbir antikorla boyanmayan hücreleri göstermektedir. Bölme 1 sadece anti CD4 ile boyanan hücreleri göstermektedir. Bölme 4 sadece antı CD3 ile boyanan hücreleri göstermektedir. Bölme 2 hem antiCD3 hem de antiCD4 ile boyanan hücreleri göstermektedir, (a) Sağlıklı bir insanın sonuçlan. Bu vakada, T hücrelerinin % 56,3'ü TH hücreleridir. Bu nedenle bölme 2'de koyu bir boyama paterni görülmektedir. (b) Klinik AIDS'li bir hastamn sonuçlan. Bu vakada, toplam T hücrelerinin sadece %2,7'si TH hücresidir. Bu bölme 2'deki çok hafif olan boyama paterni ile belirlenmektedir. Orijinal veriler Peter McConnachie'den izinle kullanılmıştır.

• Bölüm 24 • Tanısal Mikrobiyoloji ve İmmünoloji

• Floresan antikorlar kan gibi kompleks karışımlardaki spesifik hücrelerin tanısında nasıl kullanılırlar?

24.10

Enzim Bağlı İmmünosorbent Assay ve Radyoimmünassay

Çok düşük miktarlardaki antijen-antikor komplekslerini saptama yeteneğindeki yüksek duyarlılığa sahip immünoassayleri kullanmak arzulanır (bkz. Kısım 24.5 ve Tablo 24.8). Yüksek duyarlılıklarından ötürü enzim bağlı immünosorbent assay (ELISA) ve radyoimmünassay (RIA) yöntemleri yaygın olarak kullanılırlar. ELISA ve RIA, antijen tayininde kullanılan antikor moleküllerini işaretlemek için sırasıyla enzimleri ve radyoizotopları kullanırlar. Radyoaktif moleküllerin veya enzimlerin antikor moleküllerine kovalent bağlanmaları, bir reaksiyonu saptamak için gerekli antijen-antikor kompleksi miktarını azaltır. Bu artan duyarlılık klinik tanı ve araştırmalarda kullanılmakta ve birçok çeşit yeni immünolojik testin geliştirilmesine izin vermektedir. ELISA

Enzimlerin antikor moleküllerine kovalent bağlanmaları hem yüksek spesifiteye hem de yüksek duyarlılığa sahip bir immünolojik araç oluşturur. ELISA denilen teknik, enzimin katalitik özelliklerinin ve antikorun spesifitesinin değişmeyeceği şekilde, enzimlerin kovalent olarak bağlandığı antikorları kullanr. Tipik olarak bağlanan enzimler, hepsi bir spektrofetometre ile çok küçük miktarları dahi tayin edilebilen renkli ürünler oluşturan reaksiyonları katalizleyen, peroksidaz, alkalin fosfataz ve /3-galaktosidaz gibi enzimleri içerir. İki temel ELISA metodolojisi geliştirilmiştir, birisi antijeni saptamak için (direkt ELISA) diğeri ise antikorları saptamak içindir (indirekt ELISA). Bir kan örneğinden ya da fekal örnekten virüs partikülleri gibi antijenlerin saptanmasında, direkt ELISA metodu kullanılır. Bu prosedürde antijen iki tabaka antikor arasında "tuzağa" düşürülür (Şekil 24.23»). Bu nedenle bu yönteme bazen sandviç ELİSA'da denilir. Örnek, saptanacak antijen için spesifik olan antikorlarla önceden kaplanmış bir mikrotitrasyon plakasının kuyularına eklenir. Eğer bir örnekte bir antijen (virüs partikülü) varsa bu, antikorların antijen bağlayan bölgeleri tarafından yakalanır. Bağlanmayan materyalin yıkanıp uzaklaştırılmasından sonra, konjuge bir enzim taşıyan ikinci bir antikor ilave edilir. İkinci antikor da antijen için spesifiktir: Açıktaki diğer determinantlara bağlanır. Bir yıkamayı takiben, her mikrotitrasyon kuyusundaki bağlı materyalin enzim aktivitesi, enzimin substratınm ilave edilmesiyle saptanır. Üretilen renk mevcut olan antijen miktarıyla orantılıdır (Şekil 24.23). İnsan serumundaki antikorları saptamak için indirekt bir ELISA kullanılır. İndirekt bir ELISA, insan vücut sıvılarındaki insan immün yetersizlik

virüsüne (HIV) karşı ola" antikoıların saptanmasında yaygın olarak kullanılır ve biz içerdiği prensipler bütün indirekt ELISA testlerine uygulandığından dolayı bu testi detaylı olarak ele alacağız (Şekil 24.24»). Modifiye hızlı ELISA prosedürleri, kağıt stripler, nitroselüloz veya plastik membranlar veya plastik "dipstikler" gibi sabit bir destek materyaline adsorbe edilmiş ayraçları kullanırlar. Bu testler stripte veya çubukta çok kısa bir sürede bir renk değişimine neden olurlar. Bu hızlı "yerinde yapılan" testler HIV-AİDS (
HIV-AIDS'e neden olan virüs, insan immün yetmezlik virüsü (HIV) (öOaKısım 26.24) kanın da dahil olduğu vücut sıvılarıyla bulaşır. HlV'e maruz kalan bireylerden alınan kan örneklerinin test edilmesi için ve HlV'in kan nakilleri sırasında veya kan ürünlerinin transferinde yanlışlıkla bulaşmadığından emin olmak için duyarlı, spesifik, hızlı ve uygun maliyetli tarama araçlarına gerek vardır. HlV'le enfeksiyonu test etmek için yapılan rutin kan taramalarında bir ELISA testi kullanılır. HIV-ELISA testi serumdaki bulunan HlV'e karşı antikorları ölçmek için tasarlanmış bir indirekt ELISA'dır. HIV ile ilk enfeksiyon birçok HIV antijenine, özellikle de HIV zarfında bulunanlara karşı antikorların üretimine yol açar. Bu antikorlar HIV ELISA testi ile saptanabilirler (Şekil 24.24)..Bir HIV ELIŞA testi yapmak için mikrotitrasyon plakaları önce bozulmuş bir HIV partikül preparasyonu ile kaplanır; her bir kuyuda yaklaşık 200 ng kadar parçalanmış HIV gereklidir. Daha sonra seyreltilmiş bir hasta serum örneği ilave edilir ve karışım HlV-spesifik antikorların HIV antijenlerine bağlanmasına izin vermek için inkübe edilir. Antijen-antikor komplekslerinin mevcudi-

24.10 • Enzim Bağlı İmmünosorbent Assay ve Radyoimmünassay • 805

İşlem 1. Virüse ( * ) karşı olan antikorlar (Y) mikrotitrasyon plakasının kuyularına bağlanır

Negatif test

Pozitif test

TTTT Mikrotitrasyon kuyusunun yüzeyi

TTTT

2. Virüs partikülü veya virüs antijeni taşıdığından şüphelenilen hasta örneğini (salgılar, serum vb) ilave et ve kuyuları tamponla yıka

E4-E

3. Konjuge enzim taşıyan virüs antikorunu ilave et

E-(-E E-|-E E4-E E+E 4. Tampon ile yıka

.AA,

\y \y \y \y

5. Enzimin substratını ilave et ve renkli ürünün miktarını ölç(#).

\s

\s

\s

\y

TTTT

Sonuçlar Renkli ürün

Ölçüm Üretilen renkli ürün antijen miktarıyla orantılıdır

Antijen

• Şekil 24,23 Direkt CLISA testi. Direkt bir ELISA testi, kan, idrar ve diğer vücut sıvılanndaki antijenik metabolitlerin veya antijenik patojen bileşenlerinin saptanmasında kullanılır.

yetini saptamak için ikinci bir antikor eklenir. Bu ikinci antikor enzim bağlanmış bir anti-insan IgG preparasyonudur. Anti-insan IgG antikorları, artık HIV antijen preparasyonuna bağlanmış olan her bir HlV-spesifik IgG antikoruna bağlanırlar. İkinci antikorun eklenmesini takiben, enzim substratı da ilave edilir ve enzim aktivitesi test edilir. Enzim testinde elde edilen renk, bağlanan anti-insan IgG antikor miktarına orantılıdır (Şekil 24.24). İkinci antikorun bağlanması, hastanın serumundaki antikorların HIV antijenleri tarafından tanındığının ve hastanın HIV antikorlarına sahip olduğunun bu nedenle HlV'le enfekte olduğunun bir göstergesidir. Spesifitenin kanıtlanması (pozitif kontrol) ve assaydeki arkaplan absorbansımn büyüklüğünü ölçmek için (negatif kontrol) kontrol serumları

(HlV-pozitif veya HIV negatif olduğu bilinen) hasta örnekleriyle birlikte denenir. HIV-ELISA testi HlV'e maruz kalmanın saptanması için hızlı, yüksek ölçüde duyarlı ve spesifik bir metoddur. ELISA'lar genelikle kütle tarama ve otomasyona çok iyi adapte edilebildiklerinden, HIV-ELISA testi kan için standart bir tarama metodu olarak kullanılır. Buna rağmen, bu cest yöntemi bazı şartlar altında hatalı sonuçlar verebilir. Örneğin, test bazen yanlış-pozitif sonuçlar verir. Bu sonuçlara, hiçbiri HlV'e maruz kalmakla ilgili olmayan birçok faktör karıştığı için, bütün pozitif HIV-ELISA testleri mutlaka başka bir bağımsız testle, genellikle de VVestern blot (immünoblot) testi (bkz. Kısım 24.11) ile doğrulanmalıdır. Pozitif HIV-ELISA testinden sonraki bir pozitif HIV-Wes-

806 • Bölüm 24 • Tanısal Mikrobiyoloji ve İmmünoloji

İşlem 1. Parçalanmış HIV partiküllerinden (*) hazırlanmış antijenlerle mikrotitrasyon kuyularını kapla

Pozitif test

Negatif test

* * * * * * *

* * * * * * *

Mikrotitrasyon kuyusunun yüzeyi

2. Hasta serum örneğini ilave et. HlV-spesifik antikorlar HIV antijenlerine bağlanır. Diğer antijenler bağlanmaz.

* * * * * * *

* * * * * * *

3. Tampon ile yıka *

*

*

*

*

*

*

*

*

*

4. Enzimle konjuge (E+E) insan anti IgG antikorlarını ilave et *

*

*

*

*

-f

E* E*

*

*

*

*

5. Tampon ile yıka *

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

6. Enzimin substratını ilave et ve renkli ürünün miktarını ölç (•) *

*

*

*

*

*

*

Sonuçlar Renkli ürün

Ölçüm Üretilen renkli ürün antikor konsantrasyonuyla orantılıdır

Antikor

• Şekil 24.24 Indirekt ELISA testi. İndirekt bir test, kazanılmış immün yetmezlik sendromu (AİDS)'in nedeni olan insan immün yetmezlik virüsü (HlV)'e karşı antikorlann saptanması için kullanılır.

tern blot testi, HIV enfeksiyonun kanıtı olarak değerlendirilir. HIV-ELISA testinin diğer bir dezavantajı, yanlış-negatif sonuçların elde edilmesi olasılığıdır. İmmün sistem antijene maruz kaldıktan ancak birkaç hafta sonra tayin edilebilir bir antikor yanıtı

titresi geliştirebilir (bkz. Kısım 24.5). HIV enfeksiyonu durumunda bu lag zamanının altı haftadan bir yıla kadar olduğu tahmin edilmektedir. Bu nedenle, HIV ile yeni enfekte olmuş kişiler test edildiklerinde henüz tayin edilebilir seviyede antikor üretmeye başlamamış olabilirler. HIV ELISA tes-

24 10 • Enzim Bağlı İmmünosorbent Assay ve Radyoimmünassay • 807

Vibrio cholerae (kolera), Mycobacterium tuberculosis (tüberküloz), Legionella pneumophüa (lejyonellozis), Borrelia burgdorferi (Lyme hastalığı) ve Treponema

pallidium (sifilis)'e karşı olan serum antikorlarını saptamak için ELISA'lar geliştirilmiştir. Candida (maya) ve amebiazis, Chagas hastalığı, şistostomiazis, toksoplazmozis ve sıtma'ya neden olan birçok parazit içinde ELISA'lar geliştirilmiştir. Hız, düşük maliyet, radyoaktif atığın olmaması ve uzun raf ömrü birçok laboratuvar için ELISA testlerini özellikle cazip hale getirmektedir. Ancak ELISA'yı çok önemli bir immüntanılayıcı araç yapan şey yüksek duyarlılığıdır. Radyoimmünassay

• Şekil 24.25 Rapid-ELISA temelli test kitleri. Hamilelik test kitleri (a) ve uyuşturucu test kiti (b) bu uygulamaların yerinde yapılan testleri için bulunmaktadır. Diğer kitler streptokokkal boğaz ağnsı ve HIV-AIDS'in de dahil olduğu enfeksiyöz hastalıkların tanısında kullanılır.

tindeki diğer bir yanlış-negatif sonuç nedeni, ileri AİDS vakalarında görülen tüm immün sistemin tahrip olmasıdır; eğer vücutta immün hücreler kalmamışsa, antikorda yapılamaz ve ELISA faydasız olur. Buna rağmen, hastalığın bu safhasında AİDS teşhisi klinik bilgilere dayanarak yapılabilir (ÖÖS Kısım 26.14) ve ELISA testi sadece doğrulayıcı bir gösterge olarak faydalıdır. Klinik Öneme Sahip Diğer ELISA Testleri

HIV için olan ELISA testlerinin yanı sıra gerçekte klinik olarak faydalı yüzlerce ELISA testi geliştirilmektedir. Bunlardan bazıları, kolera toksini, enteropatojenik Escherichia coli toksini ve Staphylococcus aureus enterotoksini gibi bakteriyal toksinleri içeren antijenlerin saptanması için olan direkt ELISA'lardır. Direkt ELISA tekniği kullanılarak halihazırda saptanabilen virüsler; rotavirüs, hepatit virüsleri, kızamıkçık virüsü, bunyavirüs, kızamık virüsü, kabakulak virüsü ve parainfluenza virüsüdür. Klinik olarak önemli birçok bakteriye karşı olan antikorların saptanması için indirekt ELISA'lar geliştirilmektedir. Her ne kadar tam bir liste olmasa da, Salmonella (gastrointestinal hastalıklar), Yersinia (veba), Brucella (brusellozis), birçok ricketsia (Rocky mountain spotted fever, tifüs, Q fever),

Radyoimmünssay (RIA), ELISA'da kullanılan enzimlerin aksine, antikor veya antijen konjugatı olarak radyoizotopları kullanılır. İyodin-125 (125I) izotopu konjugat olarak yaygın şekilde kullanılır çünkü antikorlar veya antijenler immün spesifiteleri bozulmaksızın, kolaylıkla iyodinlenebilirler. RIA klinik olarak insanlarla aşırı derecede küçük miktarlarda bulunan insan büyüme hormonu, glucagon, vasopressin, testosterone ve insülin gibi nadir serum proteinlerinin ölçümünde kullanılır (Şekil 24.26»). RIA'lar aynı zamanda bazı yasa dışı uyuşturucu testlerinde de kullanılırlar. Çoğu durumda direkt bir RIA kullanılır. Direkt test iki adımlı bir işlemdir. Öncelikle, saf antijenin (örn. Hormon) bilinen konsantrasyonlarını içeren bir seri mikrotitrasyon kuyusu hazırlanır. Kuyulara antijene spesifik radyoaktif işaretli antikorlar eklenir ve bu standart kuyuların her birinde bağlanan radyoaktivite ölçülür. Bu verilerle antijen konsantrasyonları için bir standart eğri yapılır. Sonra, bir hastadan alınan antijen örneğinin başka bir kuyuya bağlanmasına izin verilir ve daha önce olduğu gibi radyoaktif antikorlar eklenerek ölçüm yapılır. Daha sonra hasta örneği tarafından bağlanan radyoaktivite miktarı, saf antijenin kullanılmasıyla elde edilen bağlanma verilerinden oluşturulan bir standart çizim ile karşılaştırılır ve hasta serumundaki antijen konsantrasyonu standart eğri değerlerinden çıkartılır (Şekil 24.26•). RIA, ELISA ile aynı duyarlılık aralığına sahiptir (Tablo 24.8) ve aynı zamanda çok hızlı bir şekilde yapılabilir. Bununla birlikte, radyoaktivitenin saptanmasında kullanılan cihazlar oldukça özelleşmiş ve pahalıdır. RIA hatırı sayılır miktarda bir radyoaktif atık oluşturur ve tayinde kullanılan radyoizotopların radyoaktif bozulma süreleri (yaıî ömürleri) bir test kitinin yararlı ömrünü sınırlayabilmektedir. Sonuç olarak, RIA sadece ELISA yeteri kadar doğru ve duyarlı olmadığında kullanılır. Örneğin; serum bileşenleri bazı ELISA enzim-substrat veya antijen-antikor etkileşimlerini inhibe ettiğinden, serum protein seviyelerinin saptanmasında (önceden tanımlandığı gibi) RIA çoğu kez ELISA'dan daha

• Bölüm 24 • Tanısal Mikrobiyoloji ve İmmünoloji

1. Insülini mikrotitrasyon plakası kuyularına bağla İnsülin

Mikrotitrasyon kuyuları

9 1 Konsantrasyon artışı

0

<» m m • • m %

2

4

Serum örneği

2. Fazla miktarda 125l'le işaretlenmiş anti insülin antikorlarını ekle; bağlanmayan antikorları uzaklaştırmak için yıka Radyoaktif antikor 1

2

Örnek

4

Serum örneğindeki insülin 1

Serum örneği

3. Radyoaktiviteyi gamma radyasyon sayacında say. 1, 2 ve 4 ile işaretli kuyular bilinen miktardaki antijenle (insülin) standart bir eğri oluşturur. Son kuyudaki radyoaktivite, standart eğri ile karşılaştırılarak belirli bir miktar serumda ne kadar insülin bulunduğunu gösterir.

• Şekil 24.26 Radyoimmunassay (RIA). İnsan serumundaki insülin seviyesinin tespit edilmesi için RIA'mn kuUamlması. Standart eğrinin yapılmasını takiben bir serum örneğindeki insülin konsantrasyonu hesap edilebilir.

yararlıdır. Bu nedenle, belirli uygulamalar için her test sisteminin açık avantajları bulunmaktadır.

•m24.10

Kavramların Çözden Geçirilmesi

ELISA ve RIA metotları en duyarlı immünassay teknikleridir. Her ikisi de duyarlılığı önemli derecede attıran bir antikor veya antijene bağlanan ya bir enzim ya da radyoaktif molekül gibi bir tayin sistemiyle bağlantı içerirler. ELISA ve RIA klinik ve araştırma işlerinde kullanılır; testler birçok uygulamada ya antikoru ya da antijeni saptamak için tasarlanmışlardır. •

ELISA ve RIA teknikleri, presipitasyon ve aglütinasyon gibi immünassaylerden neden daha duyarlıdır.

•

ELISA ve RIA'mn nispi kullanımlarına göre avantaj ve dezavantajlarını karşılaştırın.

lmmunoblot Yöntemleri Antikorlar immunoblot yönteminde, hücre lizatı ya da kan gibi kompleks karışımlarda olsalar bile spesifik patojenlerle ilişkili spesifik bireysel proteinlerin tanısında da kullanılabilirler. İmmunoblot yöntemi daha önce bahsedilen 3 tekniği kullanır: (1) proteinlerin poliakrilamid jellerde ayrımı, (2) proteinlerin jelden nitroselüloz veya naylon bir membrana aktarılması (blotlama) ve (3) proteinlerin spesifik antikorlarla tanısı. Protein blotlama ve sonra proteinlerin spesifik antikorlarla tanısına onu (DNA) Southern blot tekniğinden ayırmak için Western blot tekniği de denilir (c**>Kısım 7.7). Bir immunoblotun ilk adımında, bir protein karışımı poliakrilamid bir jelde elektrofreze tabi tutulur. Bu, proteinleri her birisi spesifik moleküler ağırlıktaki tek bir proteini temsil eden birçok farklı bantlara ayırır (Şekil 24.27»). Proteinler daha son-

ra, proteinleri jelden membrana aktaran elektroforetik bir transfer işlemi ile membrana aktarılırlar. Bu noktada, patojen bileşenlerine karşı oluşturulan antikorlar blot'a eklenirler. Antikorların bağlanmasına izin veren kısa bir inhübasyon periyodunu takiben, antijen-antikor kompleksine bağlanan radyoaktif bir marker ilave edilir. Yaygın olan bir radyoaktif marker, radyoaktif iyodinle (125I) iyotlanmış Staphylococcus protein A' sidir. Protein A antikor için güçlü bir afiniteye sahiptir ve sıkıca bağlanır. Radyoaktif marker bir kere bağlanınca, blottaki yeri membran X-ray filmine maruz bırakılarak saptanabilir; 125I tarafından yayılan gamma ışınları, filmi sadece radyoaktif antikorun antijen-antikor kompleksine bağlandığı yerde etkiler (Şekil 24.27). Birçok klinik uygulama için immunoblotlar, bağlanmış antijen-antikor komplekslerinin saptanması için enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) teknolojisini (bkz. Kısım 24.10) kullanırlar. Blotlanmış proteinlerin spesifik antikorlarla muamelesini takiben, membran yıkanır ve daha sonra birinciye bağlanan ikinci bir antikor ile muamele edilir. Bu ikinci antikora kovalent olarak bağlı olan, bir enzimdir. Enzim, subsratma maruz bırakıldığında, orijinal antijen-antikor kompleksleri görünür hale gelir: Enzim reaksiyonunun ürünü, enzim-işaretli sekonder antikorların antijen-reaktif antikorlara bağlandığı her bir noktada, membranm üzerinde renkli bir ürün bırakırlar. Blot'taki renk bantlarının yerlerinin kontrol örneklerindeki renkli bantların pozisyonu ile karşılaştırılmasıylâ, belli bir patojenle ilişkili bir protein pozitif olarak idendifiye edilebilir. İmmunoblot işlemi hem antijeni (patojen varlığının direkt kanıtı) hem de antikoru (patojene maruz kalmanın indirekt kanıtı) saptamak için kullanılabilir.

24.11 • Immunoblot Prosedürleri •

1. Proteinleri deterjanda kaynatarak denatüre et ve elektroforeze tabi tut; proteinler molekül ağırlıklarına göre ayrılır

3. Blotlanmış proteinleri taşıyan membranı antikorlarla muamele et; her antikor spesifik bir proteini tanır ve bağlanır

2. Ayrılan proteinleri jelden membrana blotla

y Poliakrilamid iel - Proteine bağlı antikorlar

— Membran

4. Bağlanmış antijen-antikor komplekslerine marker ekle, ya (solda) radyoakif Staphylococcus protein A- 1 2 5 I veya (sağda) antikor taşıyan konjuge enzim

125,

m

5. Filme (125I) veya enzim substratına maruz bırak ve antikorla işaretli proteinleri açığa çıkarmak için işlem yap

125,

X-ray film

Enzimin renkli leke oluşturduğu membran

(a)

GP41-45

P24

5 4 3 2 1 (b)

ti 11

|

|

ıı •

1

HIV İmmunoblotu

İmmunoblot'lar HlV'e maruz kalmanın teşhisinde ve doğrulanmasında önemli bir klinik etkiye sahiptir. Bir immunblot, ELISA testinden daha zahmetli, daha zaman alıcı, daha az duyarlı ve daha pahalı olduğu için, HIV-ELISA testleri tarama amacı için geniş ölçüde kullanılmaktadır. Bununla birlikte, HIV-ELISA testi bazen yanlış-pozitif sonuçlar verir. Bu nedenle, oldukça spesifik olan immunblot, pozitif ELISA sonuçlarının doğrulanması için kullanılır. HIV ELISA gibi, HIV immunoblot da bir serum örneğindeki HlV'e karşı olan antikorların varlığını saptamak için tasarlanmıştır. İmmunblot'u yapmak için, saflaştırılmış bir HIV preparasyonu, HIV proteinlerinin çözünmesini sağlayan ve aynı zamanda virüsü de inaktive eden bir deterjan olan sodyum dodesil sülfat (SDS) ile muamele edilir. HIV proteinleri daha sonra poliakrilamid jel elektroferezi ile ayrılırlar ve jelden membranlara blot'lanırlar (Şekil 24.26). En az yedi ana HIV proteini elektroforezle ayrılır ve P24 ve GP41-45 olarak isimlendirilen iki

• Şekil 24.27 V/estern blot (immunoblot) ve insan immünyetmezlik virüsü (HIV) enfeksiyonunun tanısında kullanımı, (a) Bir immunoblot protokolü, (b) Banyo edilmiş HIV immunoblot'u. P24 ve GP41-45 proteinleri virüsün zarf proteinleridir ve HIV için tamda kullanılır. Hat 1, pozitif kontrol serumu (bilinen AİDS hastalarından); hat 2, negatif kontrol serumu (sağlıklı gönüllüden); hat 3, hasta örneğinden kuvvetli pozitif; hat 4, hasta örneğinden zayıf pozitif; hat 5, arka plan bağlanması kontrolü için kör ayraç.

tanesi HIV immunoblot'undaki spesifik tanı proteinleri olarak kullanılırlar. Protein P24 HIV core proteini ve GP41-45 proteineri de HIV zarf proteinleridir (öOaKısım 16.15). Proteinlerin blot'lanmasım takiben, membran stripleri test serum örneği ile inkübe edilir. Eğer örnek HIV pozitif ise HIV proteinlerine karşı antikorlar mevcut olacak ve membrandaki HIV proteinlerine bağlanacaklardır (Şekil 24.27). Serum örneğindeki antikorların HIV antijenlerine bağlanıp bağlanmadığını saptamak için, bir sensör antikor olan peroksidaz enzimine bağlanmış anti-insan IgG'i, striplere ilave edilir. Eğer sensör antikoru bağlanırsa, konjuge enzimin aktivitesi, rubstratın ilavesinden sonra, stripte antikor bağlanma bölgesinde kahverengi bir bant oluşturacaktır. Eğer hasta serumu ve pozitif bir kontrol serumundaki bantların pozisyonu identik ise hasta HIV pozitif olarak doğrulanır; negatif kontrol serumu da parelel olarak analiz edilir ve bant göstermemesi gerekir (Şekil 24.27).

810 • Bölüm 24 • Tanısal Mikrobiyoloji ve İmmünoloji

Her ne kadar HIV immunblot'da elde edilen bantların yoğunlukları örnekten örneğe bir parça değişse de (Şekil 24.27b), bir immunoblot'un yorumlanması genellikle şüpheye yer bırakmaz ve bu nedenle bu test HIV-ELISA pozitiflerin doğrulanması ve yanlış negatiflerin eliminasyonunda değerlidir. HlV-İmmunoblot'u klinik olarak erişilebilir yapmak için, inaktive edilmiş HIV antijenlerini (önceden elektroferezle ayrılmış) taşıyan membran stripler ticari olarak bulunmaktadır. Farklı stripler direkt olarak hasta ve kontrol serum örnekleriyle inkabe edilebilir ve sonra sensör antikoru ile muamele edilirler. Immunoblot tekniği Lyme hastalığı antikor testlerinin spesifitesinin doğrulanması için de kullanılır (bkz. Tablo 24.5). Bununla birlikte, pahalılık, teknik gereksinimler, düşük duyarlılık (ama daha yüksek spesifite) ve gereken zaman nedeniyle immunoblot testleri genel tarama araçları için, hızlı ve ucuz ELISA metodlarından daha az yararlıdırlar. 24.11 Kavramların Gözden Geçirilmesi Immunoblot işlemleri spesifik antijenlere karşı olan antikorları veya antijenlerin kendi mevcudiyetini saptamak için kullanılırlar. Antijenler elektroferez ile ayrılırlar, bir membrana transfer (blotlama) edilirler ve antikora maruz bırakılırlar. İmmün kompleksler, enzim işaretli veya radyoaktif sekonder antikorlar ile görüntülenirler. İmmünoblotlar aşırı derecede spesifiktir ama işlemler kompleks ve zaman alıcıdır. •

İmmunoblot'un ELISA ve RİA gibi immünassaylere göre ne avantajları vardır? • HlV'e maruz kalma için yapılan genel taramalarda niçin immunoblot kullanılmaz?

MOLEKULER VE GÖRSEL TANI YÖNTEMLERİ Patojenlerin saptanması için moleküler veya elektron mikroskobu metodlarını kullanan aşırı duyarlı yöntemler bulunmaktadır. Bu yöntemler patojenin izolasyonuna ya da büyütülmesine veya patojene karşı geliştirilen bir immun yanıtın saptanmasına bağımlı değillerdir. Patojenlerin kültürde büyütülmeleri ve tanıları çoğu kez zor ve bazen de imkansız olduğundan, moleküler veya fiziksel yöntemlere dayalı büyümeden-bağımsız olan tanı yöntemleri yaygın olarak kullanılmaktadır.

Nükleik Asit Yöntemleri Moleküler yöntemler tanısal mikrobiyolojide yaygın olarak kullanılırlar. Bu yöntemler spesifik patojenlerin tanısında fenotipik karakteristiklerden ziyade genotipik karakteristikleri kullanırlar. Genetik ya da DNA temelli tanı prosedürlerinin başarısı çeşitli prensiplere dayanır: (1) Nükleik asitler enfekte dokulardan kolaylıkla izole edilebilirler; (2) nükleik asitler kolaylıkla görüntülenebilir ve ölçülebilirler; (3) bireysel bir patojen genomunun nükleik asit

dizisi eşsizdir ve böylece nükleik asit analizi şüpheye yer bırakmayacak şekilde tanıda kulanılabilir ve (4) nükleik asit dizileri, analiz için elde bulunan materyal miktarını arttırmak için çoğaltılabilirler. Tanıda Nükleik Asit Probları

Klinik mikrobiyolgların elinde bulunan en güçlü analitik araçlardan birisi nükleik asit hibridizasyonu-

dur. Hibridizasyon, bütün bir organizmanın ya da onun ürünlerinin saptanması yerine, spesifik bir organizma ile ilişkili spesifik DNA dizilerinin mevcudiyetini saptar. Klinik mikrobiyolog bir mikroorganizmayı DNA analizi ile identifiye etmek için, mutlaka o mikroorganizma için hazır olan bir nükleik asit probuna sahip olmalıdır. Nükleik asit probları, normalde ilgilenilen gen için eşsiz olan bir sekansa sahip tek zincirli DNA'dan ibarettirler. Tipik bir prob birkaç kilobaz uzunluğunda olabilir. Klinik bir örnekteki bir mikroorganizma proba komplementer DNA veya RNA dizileri taşıyorsa, prob dizisi (mikroorganizmadan tek zincirli DNA üretmek için uygun örnek hazırlanmasını takiben) hibridize olarak çift zincirli bir molekül oluşturabilir (Şekil 24.28»). Bir reaksiyonu saptamak için prob, hibridizasyonu takiben saptanabilecek bir radyoizotop, bir enzim veya floresan bir bileşik olan bir reporter (bildirici) molekülle işaretlenir.

Reporter'a bağlı olarak (radyoizotoplar en duyarlı olanlarıdır) örnek başına 0,25 ug kadar az bir DNA tanı için kullanılabilir. Nükleik asit probları, immünolojik assaylere karşı birçok avantaj sunarlar. Nükleik asitler yüksek sıcaklık ve yüksek pH'da proteinlerden çok daha fazla kararlıdır ve organik çözgenlere ve diğer kimyasallara karşı da daha dirençlidirler. Hedef nükleik asitlerin görece kimyasal kararlılıklarından dolayı, nükleik asit teknolojisi, artık hayatta olmayan organizmaların pozitif tanısında bile kullanılabilir. İlave olarak, bazı nükleik asit probları antikorlardan daha spesifik olabilirler ve DNA dizileri arasındaki tek bir nükleotit farklılıklarını saptayabilirler. Klinik Laboratuvar Probları

Çoğu klinik prob testinde, petrilerdeki koloniler veya enfekte doku parçaları hücreleri lizise uğratmak ve DNA'yı kısmen denatüre ederek tek zincirli moleküller oluşturmak için, kuvvetli alkali ile, genellikle NaOH, muamele edilirler (Şekil 24.28a). Bu karışım daha sonra bir matrikse bağlanır (filtre veya dipstik) veya solüsyonda bırakılır ve işaretli prob ilave edilir. Hedef DNA ve prob DNA dizi homolojisi arasında kararlı bir dubleks oluşması için gerekli olan sıcaklıkta, hibridizasyonun oluşmasına izin verilir (belli bir prob testinde kullanılan gerçek sıcaklık, probun ve hedef DNA'nın nükleik asit kompozisyonu ve uzunluğu tarafından belirlenir). Hibridize olmamış prob DNA'yı uzaklaştırmak için yapılan yıkamayı takiben, hibridizasyonun de-

24.12 • Nükleik Asit Yöntemleri • 811

recesi proba tutunmuş olan reporter molekül kullanılarak ölçülür. Bu, probun nasıl işaretlendiğine bağlı olarak radyoaktivitenin, enzim aktivitesinin veya floresansın ölçümüyle yapılır. Nükleik asit probları birçok temel mikrobiyal patojenin tanısı için pazarlanmakta ve Neisseria gonorrhoeae ve Chlamydia trachomatis'm

saptanmasında

yaygın

olarak kullanılmaktadır. (Tablo 24.9 ve cs^Kısım 26.12 ve 26.13). Moleküler problar klinik teşhisteki kullanımlarına ilave olarak, gıda endüstrisi ve gıda ruhsatlandırma birimlerinde yaygın uygulama alanı bulmaktadırlar. Probe tayin sistemleri, gıdaların Salmonella ve Staphylococcus gibi önemli patojen

içeriklerinin izlenmesinde kullanılabilir. Gıdaların prob testlerinde genellikle, gıdadaki düşük sayıdaki hücrelerin prob tarafından saptanabilecek yeterli bir sayıya çoğaltılmaları için bir zenginleştirme periyodu kullanılır. Gıda endüstrisinde kullanılmak için tasarlanmış problar, solüsyondaki patojen DNA'siy la hibridize olması için, patojen-spesifik DNA ile kaplı dipstkleri kullanır. Burada iki bileşenli problar kullanılır, bir tanesi reporter prob olarak, diğeri bir capture (tutucu) prob olarak görev yapar (Şekil 24.28b). Reporter veya capture probun hedef DNA'yla hibridizasyonunu takiben, capture prob'a bir dizi komplementerliği olan dipstik (genellikle capture için poli dT, probda poli dA,) hibri-

(a)

Örnekten elde edilen hücreler filtreye bağlanır

Reporter prob

(b) Örnekten hücreler filtreye bağlanır

Hücreleri parçala ve tek iplikli hedef DNA oluştur

dizasyon salüsyonuna sokulur ve hibridize olmuş DNA'yı uzaklaştırmak ve ölçmek için yakalar. Bakteriyal filogenetikteki 16S ribozomal RNA (rRNA) dizilerine dayanan ilerlemeler (<3°c,Kısırn 11.6), türe özgü ve hatta suşa-özgü nükleik asit problarının yapılmasına izin vermektedir. rRNA dizilerindeki farklılıklara dayanan tiplendirmeye, ribotiplendirme denilir. Ribotiplendirme, belli bir organizmanın DNA'sı restriksiyon endonükleazları ile kesildiğinde oluşan rRNA genlerinin eşsiz DNA restriksiyon paternlerini görüntüler (<3Qç>Kısım 7.7). Kesilen DNA bir agaroz jelde ayrılır ve işaretli bir rRNA probu, rRNA'yı kodlayan genlerin eşsiz restriksiyon paternlerini göstermede kullanılır (««»Kısım 11.11 ve Şekil 11.23). Bir türde ve özellikle bir susta restriksiyon paterni oldukça korunmuştur ve organizma için moleküler bir parmak izidir. Bütün organizmalarda ribozomal RNA genleri olduğundan ribotiplendirme, filogenetik çalışmalarda olduğu gibi çok çeşitteki klinik çalışmalarda da uygulanmaktadır. Nükleik asit probları örnek başına 1 ug'dan daha az nükleik asiti saptayarak, yaklaşık 106 bakteri hücresi veya 108 virüs partikülünden ekstrakte edilen DNA'yı identifiye edebilirler. Her ne kadar moleküler problar direkt kültür kadar (örnek başına 1-10 kadar az hücre saptanabilmektedir) duyarlı değillerse de organizmanın kültürünün zor veya

Reporter işaretli prob ilave et; hedefle tekrar birleşmesine izin ver

Eğer reporter radyoaktif veya fluoresan ise hibridizasyonu doğrudan ölç. Eğer reporter enzim ise enzim substratını ilave et

Saptama

Yakalanan prob

Hedef DNA'ya komplementer olan bölge

Örnek DNA'yı sıvıda problarla hibridize et. Nükleazlar hibridize olmamış probu yok eder.

Reporter'ı ölç

• Şekil 24.28 Klinik tanıda nükleik asit prob yöntemi, (a) Membran filtre assay. Tayin sistemi (reporter) bir radyoizotop, floresan bir boya veya bir enzim olabilir, (b) Dipstik testi. Dipstik testinde ikili bir reporter veya capture probu kullanılır. Capture prob dipstick'e takılmış bir poly-dT oligonükleotitiyle hibridize olan bir poly-dA kuyruğu taşır, oligonükleotit-hedef-reporter kompleksine bağlamr. Kompleks yukarıda (a)'daki gibi tayin edilebilir.

812 • Bölüm 24 • Tanısal Mikrobiyoloji ve İmmünoloji

hatta imkânsız olduğu durumlarda prob yöntemleri yararlıdır. Bununla birlikte, DNA teknolojisinin diğer uygulamaları kültür yönteminin duyarlılığı ile rekabet ederler.

1

2

3

4

b

6

7

8

9 1Ü 11 12 13 14 15

Tanıda Polimeraz Zincir Reaksiyonu Aşırı derecede kısa diziye spesifik nükleik asit oligonükleotitleri (genellikle 15-24 nükleotit uzunluğunda) spesifik patojenlerin DNA'sının polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile çoğaltılması için primerler olarak görev yapabilirler. PCR biyolojik araştırmalarda yaygın şekilde kullanılır ve aynı zamanda da temel bir klinik tanı aracıdır (oe^Kısım 7.9). Tipik bir PCR prosedürü DNA'yı yaklaşık 1 milyon kat çoğaltmak için tasarlanmıştır. Teorik olarak bu, tek bir bakteri hücresinden elde edilen tek bir DNA molekülünün görüntülenmesine izin verir. Örneğin, patojene özgü bir gen için olan diziye-spesifik olan primerler, kültüre edilebilir bir patojenin yokluğunda bile şüpheli enfekte bir dokudan elde edilen DNA'yı çalışmak için kullanılabilir. Bu yöntemler özellikle viral ve hücre içi enfeksiyonların tanısında yararlıdır. Uygun bir çoğaltılmış gen seğmen tinin mevcudiyeti (Şekil 24.29»), patojenin mevcudiyetini doğrular. Ya hibridizasyon ya da PCR tanı yöntemleri kullanımda olan çeşitli spesifik organizmalar Tablo 24.9'da listelenmişlerdir. Klinik laboratuvarlarda çeşitli PCR uygulamaları kullanılır. Halen, birçok PCR testi real time PCR'ı kullanmaktadır. Real-time PCR, floresan-işaretli PCR primerlerinin kullanımını içerir. Kusursuz optikli PCR makineleri, PCR ürünlerine işaretli PCR primerlerinin her döngüde girmelerini takip ederler. Bir amplifikasyon eğrisi, çoğaltılan ürüne işaretli primerlerin katılmasını izler. Bir amplifikasyon ürünü hedeflenen organizmanın varlığını gösterir. Real-time PCR, elektroferez gibi sonraki tayin yöntemlerine olan gereksinimi bertaraf ederek, hızlı bir görsel sonuç üretir. PCR teknolojisinin diğer bir uygulaması, RTPCR (reverse-transcriptase PCR), HIV-AIDS'm ilerlemesini takip etmek için kullanılır ve Kısım 26.24'te tartışılmıştır. Bu yöntem, HIV gibi RNA retrovirüsler («s^Kısım 9.13) durumunda olduğu gibi patojen spesifik RNA içeren örneklerden direkt olarak cDNA'nm üretimini içerir.

•m24.12 Kavramların Gözden Geçirilmesi

Nükleik asit hibridizasyonu, mikroorganizmamın tanısında kullanılan güçlü bir laboratuvar aracıdır. Bir prob tasarlamak için ilgilenilen mikroorganizma için spesifik olan bir nükleik asit sekansı mutlaka bulunmalıdır. Prob-temelli teknolojinin en yaygın kullanımı muhtemelen gen amplifikasyon (PCR) yöntemlerinin uygulamasmdadır. Çeşitli DNA temelli yöntemler halen klinik, gıda ve araştırma laboratuvarlarında kullanılmaktadır.

• Mikroorganizmaların tanısında nükleik asit hibridizasyonunun standart yöntemler e göre avantajları nelerdir? Dezavantajları nelerdir?

-«-439bp

* Şekil 24.29 Tüberkülozun tanısında, hasta tükürüğünün Mycobacterium tubcrculosis yönünden Polimeraz Zincir Reaksiyon (PCR) analizi. Hastalardan alman tükürük örnekleri DNA kaynağı olarak kullanılmıştır. Amplifikasyon, M. tuberculosis saf kültürü DNA kaynağı olarak kullanıldığında (hat 15) belirtilen 439 baz çiftlik ürünü oluşturan bir primer çifti ile başlatılmıştır. 2-9, 11 ve 12. hatlar M. tuberculosis için pozitif olan tükürüklerdendir (12. hat zayıf pozitiftir). 13 ve 14. hatlar M. tuberculosis negatif tükürük örneklerindendir. 1 ve 10. hatlar moleküler ağırlık referans marker'landır. PCR teknolojisinin bir tanımı için, bkz Kısım 10.17.

• Standart büyüme bağımlı testlerin yokluğunda, bir organizma hakkında bir nükleik asit prob veya PCR assay ile nereden bilgi edinilebileceğine dair bir örnek

Tanısal Viroloji Patojenik hayvan virüsleriyle enfeksiyonların tanısı ve teşhisi, bakteriyal patojenlerle karşılaştırıldığında önemli ölçüde farklı problemler sunar. Virüslerin hepsi zorunlu hücre içi parazitlerdir (ö«aKısım 9). Virüsler hücre dışında replike olamadıklarından, yapay ortamlarda doğrudan kültüre edilemezler, ancak mutlaka memeli hücrelerinde büyütülmelidirler. Bununla birlikte, virüsler veya onların sitopatik etkileri doğrudan gözlenebilir ve viral patojenlerin tanısı için birçok direkt ve indirekt in vitro test prosedürü bulunmaktadır. in Vitro Virüs Çoğalması Klinik materyallerden hayvan virüslerinin laboratuvar kültivasyonu, çoğu bakteriyal patojenin kültivasyonundan daha zor, zaman alıcı ve özelleşmiştir. Bu, virüslerin sadece canlı hücrelerde çoğalmaları yüzündendir. Virüslerin çoğaltılması için hücre kültürleri kullanılmasını Kısım 9.3'te tartışmıştık, ki bu tip kültürler yaygın olarak tanısal virolojide kullanılırlar. Virüslerin çoğaltılması için birçok uzun ömürlü insan hücre hatları bulunmaktadır. Bazen ölümsüz hücre hatları da denilen bu hücre hatları, hızlı şekilde gelişir ve hücre kültür ortamlarında sınırsız şekilde bölünürler ve bazıları memeli virüsleriyle kolaylıkla enfekte olabilirler.

24.13 • Tanısal Viroloji • 813

r

Tablo 24.9

Nükleik asit probları ve PCR yöntemleriyle teşhis edilen patojenler

Patojen

Hastalık

Bakteriler Campylobacter sp. Chlamydia trachomatis Enterococcus sp. Escherichia coli (enteropatojenik suşları) Haemophilus influenzae Legionella pneumophila Listeria monocytogenes Mycobacterium avium Mycobacterium tuberculosis Mycoplasma hominis Mycoplasma pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Namem meningitidis Ricketsia sp. Salınonella sp. Shigella sp. Staphylococcus aureus

Gıda enfeksiyonları Cinsel sendromlar; trahoma Nozokomiyal enfeksiyonlar Gastrointestinal hastalıklar Enfeksiyöz menenjit Pnömoni Listeriyozis Tüberküloz Tüberküloz idrar yolları enfeksiyonu; pelvik inflamatuar hastalığı Pnömoni Belsoğukluğu Menenjit Tifüs, hemorajik ateş, vb. Gastrointestinal hastalıklar Gastrointestinal hastalıklar Cerahatli ifrazatlar (çıbanlar, kabarcıklar, irin oluşturan deri enfeksiyonları)

Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae Treponema pallidium

Kızıl, ateşli romatizma, boğaz ağrısı Pnömoni Frengi

Funguslar Blastomyces dermatidis Candida sp. Coccidioides immitis Histoplasma capsulatum

Blastomikozis Kandidiazis, pamukçuk Kokkidiodomikozis Histoplasmosis

Virüsler Cytomegalovirüs Epstein-Barr virüs Hepatit virüsleri A, B, C, D, E Herpes virüsleri (tip I ve tip II) insan immünyetmezlik virüsü (HIV) İnsan papilloma virüsü İnfluenza Polioma virüs Rotavirüs

Konjenital viral enfeksiyonlar Burkitt's lenf oma; mononükleozis Hepatit Uçuk, Genital herpes Kazanılmış immünyetmezlik sendromu (AİDS) Genital siğiller, rahim ağzı kanseri Solunum hastalıkları Nörolojik hastalıklar Gastrointestinal hastalıklar

Protozoonlar Leishmania danovani Plasmodium sp. Pneumocystis carimi Trichomonas vaginalis Trypanosoma sp.

Leişmaniazis Sıtma Pnömoni Trikomoniazis Tripanosomiazis

Bu ölümsüz hücre hatlarına ilave olarak, virüsler Rhesus maymunu böbrek hücre hatlarında da büyütülebilirler. Maymun böbrek hücre hatlarına primer hücre hatları denir çünkü sınırlı bir sayıdaki hücre bölünmesinden sonra ölürler ve laboratuvarda süresiz olarak devam ettirilemezler. Primer maymun böbrek hücreleri birçok sayıdaki patojenik virüsün büyümesini destekler ve bilinmeyen virüslerin ilk izolasyonu için kıymetlidirler. Elektron Mikroskopisi

Tanısal viroloji elektron mikroskopisiyle de yapılabilir. Birçok virüs ayırt edici morfolojiye sahip olduğu için (öö^Bölüm 9) bazen klinik örneklerde,

örneğin bir elektron mikroskobunda gözlenmesiyle saptanabilirler (Şekil 24.30•). Çoğu örnekte, virüs partikülleri önce mutlaka konsantre edilmeli ve insan dokularından ayrılmalıdır ve genellikle santrifüjleme ve filtrasyon metodlarını kullanan birçok teknik, virüsçe zenginleştirilmiş bir örnek elde etmede kullanılır. İmmünolojik veya nükleik asit prob yöntemleri kadar gerçekçi olmasa da, spesifik bir morfolojideki virüs partiküllerinin belli bir tipteki insan dokusunda gözlenmesi enfeksiyon için muhtemel bir kanıttır. Belli virüslere karşı yönlendirilmiş antikorlar bu yöntemin duyarlılığının ve özgüllüğünün arttırılmasında kullanılabilirler. Aglütinasyon yapan antikorlar viral partiküllerin agregasyonuna neden

814 • Bölüm 24 • Tanısal Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Diğer Virüs Tanı Testleri Tanısal viroojide kullanılan bir çok laboratuvar prosedürü Tablo 24.10'da gösterilmiştir. Birçok durumda viral tanı için immunodiagnostik yöntemler (bkz. Kısım 24.5-24.12) ve nükleik asit hibridizasyon yöntemleri (bkz. Kısım 24.13) kullanılır. Virüs taşıyan hücrelerin saptanması için, ya viral partikülleri saptayan direkt enzim-bağlı immunosorbent assay'lar (ELISA'lar) (bkz. Kısım 2411 ve Şekil 24.24) ya da viral antijenlere karşı antikorların yapıldığı fluaresan antikor yöntemeri (bkz. Kısım 24.10 ve Şekil 24.20b) olan birçok immünolojik test kullanılır. İndirekt testlerde, virüsün kendisi saptanmaz ama virüse karşı olan antikorlar viral enfeksiyon için muhtemel bir kanıt olarak kabu edilirler. Örneğin; insan immün yetmezlik virüsü (HIV) enfeksiyonu için olan rutin testler, ELISA testi ve immunblot testini (bkz. Kısım 24.10 ve Kısım 24.11) içerir. ELISA ve İmmunblot'un her ikisi de HlV'm kendisini değil, HlV'e karşı olan antikorları saptar. Bununla beraber, Kısım 26.15'te tartışılan viral yük testi HIV varlığının saptanmasında kullanılır. Aglütinasyon testleri de virüsü doğrudan saptayabilirler. Lateks taneciklerine veya aktif kömüre (bkz. Kısım 24.8) konjuge edilmiş antiviral antikorlar, lizise uğramış doku örneklerinden serbest kalan viral partiküllerin aglütinasyonu için kullanılabilirler.

(b) • Şekil 24.30 Virüslerin tespitinde Minik örneklerin elektron mikroskobik olarak gözlenmesi, (a) Fekal bir örnekten insan rotavirüs' u. Virüsün ayırt edici küresel yapısı fekal materyalde bulunduğunda oldukça diyagnostik bir kriterdir. Her rotavirüs partikülü yaklaşık 75 nm çapındadır, (b) Diareli bir hastadan izole edilen insan Norwalk-like virüs. Bireysel virüs partikülleri belirsiz pürüzlü dış kenarları ve yaklaşık 17 nm çapındaki küçük boyutuyla Norwalk-like virüslerin üyeleri olarak karakterize edilmişlerdir.

olarak, onları elektron mikroskobu altında hücresel debristen ayırt etmeyi kolaylaştırır. Virüsler aynı zamanda, örneklerin ağır metallerle birleştirilmiş antiviral antikorlarla muamele edilmesiyle de görülebilirler (bkz. Kısım 24.9). Negatif boyama tekniklerinin kullanılmasıyla (Şekil 24.30) elektron mikroskobu analiz sonuçları, örneğin alınmasından 20 dakika sonra elde edilebilir. Bununla birlikte, bu yöntem analiz için pahalı ve kompleks bir alete -elektron mikroskobuna- gerek duyar.

Klinik olarak önemli virüslerin saptanması ve tanısı için olan nükleik asit probları ve PCR assayleri aynı zamanda klinik virolojideki önemli tanı araçlarıdır (bkz. Kısım 24.11 ve Tablo 24.9). Birçok viral tanı prosedürü ancak belli özel koşullar altında kullanılırlar. Rutin virüs enfeksiyonları için teşhis, klinik semptomlar değerlendirilerek yapılır. Birçok viral tanı prosedüründe gereken teknik uzmanlık ve maliyet nedeniyle (örneğin, primer kültür yapacak laboratuvarlar mutlaka Rhesus maymunlarını üretmeli ya da satın almalı ve hücre kültür yöntemlerinde uzmanlığa sahip olmalıdır), çoğu tanısal viroloji laboratuvarları, uzmanlaşmış referans devlet laboratuvarlarmda veya büyük klinik araştırma enstitülerinde bulunurlar.

•m 24.13

Kavramların Gözden Geçirilmesi

in vitro virüs üretimi sadece doku kültüründe başarılabilir. Bu nedenle, viral tanısı için olan çoğu tanı tekniği büyümeye bağlı değildir, ama rutin olarak nükleik asit tekniklerine ve immunoassay'lere dayanır. Elektron mikroskopi teknikleri, konukçu örneklerindeki virüslerin direkt gözenmeleri için faydalıdır. • Neden virüsler mutlaka doku kültüründe çoğaltılmalıdır? • Patojenik virüsler bireysel olarak laboratuvarda nasıl teşhis edilebilirler?

• Değerlendirme Soruları • 815

Tablo 24.10

Tanısal virolojide kullanılan laboratuvar yöntemleri"

Sağlık durumu

Muhtemel viral neden

Örnek kaynağı

Hücre hatları/gözlem teknikleri

Üst solunum yollatı enfeksiyonu

Nazofaringeal veya trakeal sıvı (aspirat)

insan fibroblast kültürü

Pnömoni

Rhinovirüs Corona virüs Adenovirüs Influenza

Kızamık

Kızamık virüsü

insan fibroblast kültürleri veya emriyolu yumurtalar Maymun böbrek hücreleri

Kabarcıklı isilik

Herpes simpleks

ishal

Rotavirüs (Bebekler) Norwalk benzeri virüses

Nazofaringeal sıvı ya da eküvyon Nazofaringeal sıvı ya da sürüntü Aspirasyonla kabarcık içi sıvı Dışkı veya rektal sürüntü

Bakteriyal olmayan menenjit

Enterovirüs Kabakulak virüsü Herpes simpleks

Omurilik sıvısı

insan fibroblast kültürü Elektron mikroskobu ile karakteristik virüs partiküllerinin gözlenmesi (Şekil 24. 30) insan fibroblast veya Maymun böbrek kültürleri

"immünolojik yöntemler ve nükleik asit prob yöntemleri viral enfeksiyonların tanısında yaygın olarak kullanılmaktadır (bkz Bölüm 24. 5-24.12). Burada sıralanan yöntemler araştırma ve referans laboratuvarlarında virüslerin ilk izolasyonu ve karakterizasyonu için kullanılmaktadır.

DEĞERLENDİRME SORULARI 1. Bir boğaz kültürü ve bir kan örneğinin alınması ve kültürü için olan standart prosedürü tanımlayın. Kan kültürü alınırken, ne gibi özel önlemler alınmalıdır (GOöKısım 24.1)? 2. Neden bakteriler bir idrar örneğinden neredeyse her zaman kültüre edilebilir? idrardaki bakteri hücrelerinin sayısı niçin önemlidir? Çoğu idrar yolu enfeksiyonundan hangi organizma sorumudur? Neden (£^s Kısım 24.1)? 3. Anaerobik mikroorganizmaların kültüründe kullanılan yöntemleri tanımlayınız. Bütün klinik örneklerin hızlı işlem görmesi niçin önemlidir? Anaerobların izolasyonu ve kültürü için ne gibi özel işlemer ve önlemler gereklidir (<s«sKısım 24.1)? 4. Seçici ve ayırt edici besiyerlerini birbirinden ayırt edin. Eozin metilen mavisi (EMB) ağar seçici bir besiyeri mi yoksa ayırt edici bir besiyeri midir? Klinik bir laboratuvarda nasıl ve neden kullanılır (öC^sKısım 24.2)? 5. Antibiyotik duyarlılığı için Kirby-Bauer testini tanımlayın. Hasta izolatlarmdan potansiyal patojenler niçin bu yönteme test edilmelidirler (ö^Kısım 24.3)? 6. Çoğu laboratuvar kaynaklı enfeksiyona nasıl yakalanılır? Laboratuvar enfeksiyonlarından korunmak için nasıl önlemler alınılabilinir (<3»5>Kısım 24.4)? 7. Enfeksiyondan sonra antikor fitresi niçin artar? Yüksek bir antikor fitresi, devam etmekte olan bir enfeksiyonun göstergesi midir? Açıklayın. Enfeksiyonları izlemek için bir akut ve bir konvalesan kan örneği almak niçin önemlidir (ö°öKısım 24.5)?

8. Monoklonal antikorların, poliklonal antikor hazırlamaya göre, özellikle antikor hazırlamanın standardizasyonu bakımından hangi avantajları vardır (Kısım 24.6)? 9. Mikrobiyal toksinleri ve antiserumları referans alarak, bir nötralizasyon reaksiyonunu tanımlayın («^^»Kısım 24.7). 10. Aglütinasyon testleri klinik tanı amacıyla presipitasyon testlerinden daha yaygın olarak kullanılırlar. Niçin bu tip bir durum sözkonusudur («s^SKısım 24.8)? 11. Floresan antikorlar viral hastalıkların teşhisinde nasıl kullanılırlar? Floresan antikorların, işaretlenmemiş antikorlara göre ne gibi avantajları vardır (ö^Kısım 24.9)? 12. Radyoimmün assay (RIA) ve enzim bağlı immünosorbent assay (ELISA) testleri, aglütinasyonla karşılaştırıldıklarında aşırı derecede duyarlıdırlar. Niçin bu tip bir durum söz konusudur (€f^Kısım 24.10)? 13. Pozitif insan immün yetmezlik virüs (HIV)-ELISA sonuçlarının doğrulanması için niçin immunoblot (western blot) işlemi kullanılır (oBöKısım 24.11)? 14. Patojene spesifik bir nükleotit probun tasarlanması için ne tip bilgi gereklidir? Böyle bir bilgi nereden elde edilebilir? Bütün patojenler için bu bilgi bulunabilir mi (öO&Kısım 24.12)? 15. Primer hücre hattı nedir? Hayvan virüsleri niçin sadece doku kültüründe çoğalırlar (C«sKısım 24.13)?

816 • Bölüm 24 • Tanısal Mikrobiyoloji ve İmmünoloji

UYGULAMA SORULARI 1.

2.

3.

Bir kan kültürü Staphylococcus epidermidis için pozitiftir. Bulguları yorumlayın ve açıklayın. Hastada S. epidermidis bakteremisi mi var gibidir? Sorumlu doktor ile bir görüşme için bir olasılıklar ve sorular listesi hazırlayın. Baktereminin doğrulanması veya olasılıklardan çıkartılması için hangi ilave bilgilere gerek duyulacaktır? Hem kısa süreli hem de uzun süreli sonuçlan nedeniyle, enfeksiyöz bir hastalığı şüpheli patojenin izolasyonundan önce antibiyotiklerle muamele etmek neden yaygın bir tıbbi uygulamadır. Bir patojen izole ve teşhis edildikten sonra uygun antibiyotik duyarlılığının doğrulanması için hangi adımlar atılmalıdır? Bu ölçümler bir hastane ortamından uzakta neden nadiren kullanılır? Hastalardan akut bir enfeksiyon sırasında ve yaklaşık iki hafta sonra serum örnekleri alınmasının mantığım açıklayın (Kısım 24.5). iyileşmekte olan bir hastanın serumundan hangi bilgiyi elde etmeyi beklersiniz?

4. Aglütinasyon testleri gibi hızlı tanı sistemlerinin ve ELISA gibi immün temelli tayin sistemlerinin, gelişmeye dayalı tanı yöntemleriyle karşılaştırıldıklarında, avantajları nelerdir? Kültüre dayanmayan testlerin potansiyel dezavantajları nelerdir? 5. Tanısal mikrobiyolojide DNA probları kullanmanın temel avantajları nelerdir? Bir mikroorganizma için diziye spesifik polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) test probu tasarlamak için hangi bilgi gereklidir? Bu bilgiyi nereden bulabilirsiniz? 6. Yeni bir viral patojeni izole ve teşhis etmek için kullanacağınız işlemleri tanımlayın. Hem gelişmeye bağlı testleri, moleküler testleri hem de elektron mikroskopisi gibi görsel yöntemlerin bulunduğundan emin olun. Bulgularınızı nereye rapor edersiniz? Testlerden hangisi, hızlı klinik tanı için yüksek etkinlikli, rutin olarak kullanılan bir test olarak adapte edilebilir?