MIKROBIYAL EVRİM VE SİSTEMATİK İLKEL DUN YA, YAŞAMIN KÖKENİ VE MİKROBİYAL ÇEŞİTLENME
V
t! T 1 t 1 il
n
İr
11.1 11.2 11.3
f:.1
1
•r 4
•jy
11.4
i
mPffm a
tii 1
II
11.5 11.6 11.7
Prokaryotların evrimsel tarihi dünyanın kendi evrimsel tarihinin aynadaki görüntüsüdür. Dünyanın var olduğu 4.5 milyar yıllık zamanın 4/5'inden fazlasında prokaryotlar hakimdi. Okside demir gibi yeryüzünde yaygın olarak bulunan pek çok oluşumda prokaryotların bulunuşu, eski tarihlerde de var olduklarına dair delildir.
III 11.8 11.9
IV 11.10 11.11 11.12 11.13
Dünyanın ve İlk Yaşam Formlarının Evrimi İlkel Yaşam: RNA Dünyası ve Moleküler Kodlama İlkel Yaşam: Enerji ve Karbon Metabolizması Eukaryalar ve Organeller: Endosimbiyoz
EVRİMSEL İLİŞKİLERİ BELİRLEMEDE KULLANILAN YÖNTEMLER Evrimsel Kronometreler Moleküler Evrim Aracı Olarak Ribozomal RNA Dizileri Sinyal Diziler, Filogenetik Problar ve Mikrobiyal Topluluk Analizleri
MIKROBIYAL EVRİM Ribozomal RNA Dizilerinden Elde Edilen Mikrobiyal Filogeni Canlı Domainlerinin Özellikleri
MIKROBIYAL TAKSONOMI VE FİLOGENİ İLE İLİŞKİSİ Klasik Taksonomi Kemotaksonomi Mikrobiyolojide Tür Kavramı Adlandırma ve Bergey's Manual
300 300 303 304 307
309 309 309 312
314^ 314 316
318 318 320 324 326
300 • Bölüm 11 • Mikrobiyal Evrim ve Sistematik
BOLÜMLE İLGİLİ SOZLUK 16S ribozomal RNA prokaryotlarda ribozomların küçük alt birimi olarak görev yapan büyük polinükleotitler (-1500 baz) olup, dizilimi evrimsel bilgi edinilmesinde kullanılır. Eukaryatik karşılığı 18S rDNA'dır. Allel herhangi bir genin bir formu (tipi) Archaea Bacteria'dan farklı ancak filogenetik olarak akraba prokaryotlardan oluşan bir grup Bacteria Archaea'dan farklı, ancak filogenetik olarak akraba prokaryotlardan oluşan bir grup Binomiyal sistem canlıların adlandırılmasında bir organizmaya cins adının ve bir tür epitetinin verildiği, Linnaeus tarafından önerilen sistem Cins bir veya daha çok sayıda temel özelliği paylaşan farklı türler topluluğu Çok lokuslu dizi yazılımı yaşamsal faaliyetleri kodlayan (housekeeping) 6-7 adet genin gen dizilimlerini karşılaştırılmasını temel alarak, organizmaların sınıflandırılmasında kullanılan taksonomik bir yöntem Domain taksonomik yönden biyolojik sınıflandırmanın en üst seviyesi Ekotip bir ekolojik niş içerisinde belirli bir kaynağı paylaşan, genetik olarak benzer hücrelerden oluşan bir popülasyon Endosimbiyoz serbest olarak yaşayan bacteria hücrelerinden köken alan mitokondri ve kloroplastm ilkel eukaryatik hücrelere daimi olarak yerleşmesi sonucunda modern eukaryatik hücrelerin oluşum işlemi Evrensel f ilogenetik ağaç tüm domainlerdeki yaşayan organizmaların temsilcilerinin konumunu gösteren ağaç
Evrimsel kronometre moleküler dizilimi evrimsel farklılığın karşılaştırmalı ölçüsü olarak kullanılabilen molekül, örneğin ribozomal RNA Evrimsel uzaklık filogenetik ağaçlarda organizmaları ayıran fiziksel mesafelerin toplamı olup, bu uzaklık evrimsel ilişkisizlikle ters orantılıdır FAME yağ asiti metil esteri Familya biyolojik sınıflandırmada bir veya daha çok türden oluşan ve bir veya daha çok sayıdaki cinsi içine alan taksonomik hiyerarşinin orta düzeyi Filogenetik prob bazı ribozomal RNA sinyal dizileri ile komplementer (tamamlayıcı) dizilime sahip olan ve çoğunlukla bir boyaya tutunarak floresan ışıma yapan oligonükleotit Filogeni organizmaların evrimsel geçmişi FISH floresan in-situ hibridizasyon GC oranı herhangi bir organizmanın, DNA (veya RNA)'sındaki guanin ve sitozin bazlarını içeren toplam nükleik asit yüzdesi Genomik hibridizasyon bir organizmanın genomunun bir diğeri ile çaprazlanarak DNA hibridizasyon derecesinin ölçülmesi sonucu genomik benzerliklerinin deneysel olarak belirlenmesi Metazoa çok hücreli organizmalar Organel Eukaryatik hücrelerde bulunan, birim zarla çevrili, metabolik işlev için özelleşmiş bacterial boyutlardaki yapılar Eukarya tüm eukaryatik hücreler: algler, protozoa, funguslar, sıvaşıcı küfler, bitki ve hayvan hücreleri Proteobacterialar Gram negatif Bacterialer ile filogenetik olarak ilişkili geniş bir grup
İLKEL DÜNYA, YAŞAMIN KÖKENİ VE MİKROBİYAL ÇEŞİTLENME Tüm biyolojinin bütünleştirici konusu evrimdir. Bu kısımda şu an bildiğimiz kadarıyla yaklaşık 4 milyar yıllık bir evrimin sonucu olan mikrobiyal çeşitlilik konusuna başlayacağız. Bu bölüm, mikrobiyal evrim ile prokaryotlarm filogenetik resimlerine göre taksonomisinin ve sınıflandırılmasının nasıl yapıldığı üzerine yoğunlaşmıştır. Mikroorganizmaların evrimsel ilişkilerinin araştırılmasında moleküler biyolojiden nasıl yararlanıldığı ve "bacterial türlerin" nasıl açığa çıktığını göreceğiz. Bu bölüm, önümüzdeki dört bölümde inceleyeceğimiz organizmaları ve genetik yapılarını anlayabilmemiz için temel oluşturacaktır.
Ribotiplendirme 16S rDNA dizilerini kodlayan genlerin restriksiyon enzimleriyle kesilmesi sonucu oluşturulan DNA parçalarının analizi yoluyla mikroorganizmaların tanımlanması Ribozomal Veritabanı Projesi (RDP) elektronik ortamda depolanabilen ve karşılaştırmalı ribozomal RNA dizileme çalışmalarında kullanılabilen, ribozomal RNA küçük alt birim dizilerine ait geniş bir veritabanı RNA küçük alt birimi (SSU) prokaryotlarda 30S eukaryalarda ise 40S olan ribozomal RNA alt birimi RNA yaşamı DNA'nm ve proteinin olmadığı, RNA'nm hem genetik kodlamada hem de katalitik olaylarda görev aldığı, ilkel dünyada var olmuş olabilen bir yaşam şekli Sinyal dizisi belirli canlılarda veya filogenetik olarak ilişkili bir grup canlıda karakteristik olarak bulunan ve prob yapımında kullanılan, 16S veya 18S ribozomal RNA'nın tanımlanmış dizilerindeki kısa oligonükleotitler Stromatolit tipik olarak filamentöz prokaryotlar ve diğer mikroorganizma katmanlarından oluşmuş, fosilleşebilen tabakalı mikrobiyal kaya Şube yaşamın her üç domaininden birindeki hücre nesillerinin ana dalı Taksonomi tanımlama, sınıflandırma ve adlandırma bilimi Tür mikrobiyolojide, başlıca ortak özelliklere sahip ancak bir veya daha fazla önemli özelliği ile diğer suşlardan ayrılan suş topluluğu Yatay gen transferi bir mikrobiyal toplulukta hücreler arasındaki gen alışverişi
Dünyanın ve İlk Yaşam Formlarının Evrimi İlk bölümlerde, dünya üzerindeki hücre oluşumlarından öncesi zamandan modern eukaryatik hücrelere kadar uzanan bir zaman diliminde yolculuk yaptık. Bu bölümde yaşamın kökeni için gerekli bilgileri sağlayan prebiyotik kimyayı, kendini eşleyen "ilkel yaşam şekillerinin" hücresel olmayabileceğini, ilk enerji kaynaklarının inorganik olabileceğini ve eukaryatik hücrenin en az iki farklı organizmadan oluşan genetik bir kimera olduğunu öğreneceğiz. Dünyanın Kökeni
Dünya yaklaşık 4.6 milyar yaşındadır. Büyük ve çok sıcak bir yıldız patladığında Güneş sistemimiz oluştu. Bu patlama yeni bir yıldızı (güneş) ve güneş
11.1 • Dünyanın ve İlk Yaşara Formlarının Evrimi • 301
sistemimizin diğer bileşenlerini meydana getirdi. Muhtemelen aşınmış olabileceklerinden, gezegenimizin kökenini tarihleyecek kaya parçalan henüz keşfedilmemesine rağmen, yeryüzünün değişik bölgelerinde tahminen 4 milyar yıllık (4 gigayıllık, GY) kayalar bulunmuştur. Şu ana kadar bulunan en eski kaya yaklaşık 3.86 milyar yaşında olup, Greenland'ın güney batısındaki Itsaq bölgesinde keşfedilmiştir. Eski zamanlara ait diğer kayalar Avusturalya'nın batısındaki Warrawoona, Kule oluşumları ve Pilbara bölgesi ile Afrika'nın güneyindeki Svvaziland ve Barberton bölgelerinde bulunmuştur. Bu kaya oluşumlarının tümü yaklaşık 3.5 milyar yaşındadır (Bkz Şekil 11.1). Eski kayalar üç çeşittir: sedimenter, volkanik ve karbonlu. En eski sedimenter kayalar evrimsel olarak özel öneme sahiptir; çünkü bildiğimiz kadarıyla oluşumları için sıvı haldeki su gereklidir. Sedimenter kayaların neredeyse 4 milyar yıldır yeryüzünde bulunması, bizi aynı zamanda suyun muhtemelen okyanus veya geniş göller şeklinde o zamanda da var olduğu sonucuna götürür. Bilindiği gibi sıvı haldeki suyun varlığı, yaşam döngüsü için uygun koşulların olduğunu gösterir. İlkel Dünyada Mikrobiyal Yaşamın Kanıtı
Eskiye ait kayalarda mikrobiyal yaşama dair kanıt, fosilleşmiş hücre kalıntılarına ve bu kayalardaki izotopik hafif karbon bolluğuna dayanır (Canlılık sürecinin belirleyicisi olarak karbon ve kükürt izotopik analizlerinin kullanılışını Bölüm 18.8'de inceleyeceğiz). Bazı ilkel kayalar, tipik olarak basit yapılı çubuk ve kok şeklindeki bacterialara çok benzeyen mikrofosiller içerirler (Şekil 11.1 •). 3.5 milyar yıllık veya daha genç kayalarda, stromatolit olarak adlandırılan oluşumlar oldukça bol bulunur. Stromatolitler, fosilleşmiş mikrobiyal yapılar olup filamentli prokaryotik tabakalar ve
• Şekil 11.1 Antik mikrobiyal yaşam. Güney Afrika'd akı 3.45 milyar yıllık Barberton Greenstone Belt kayalanndaki prokaryot mikrofosillerinin taramalı elektron mikrografı. Çubuk şeklindeki bacteriamn (okla gösterilmiştir) mineral madde partiküllerine yapıştığına dikkat ediniz. Hücreler yaklaşık 0.7 /Ltm çapındadır.
1383*
• Şekil 11.2 Antik ve modern stromatolitler. (a) Batı Avusturalya'daki Warrawoona grubundaki 3.5 milyar yıllık bir kayada bulunan, bildiğimiz en eski stromatolit. Tabakalar halinde korunmuş yapının kaya içerisindeki dikey kesiti görülmektedir, (b) Kuzey Avusturalya'daki McArthur havzasında bulunan 1.6 milyar yıllık beyaz mermerli kayalardaki konik şekilli stromatolitler. (c) Batı Avustralya'nın ılık bir suya sahip Shark Bay koyunda bulunan modern sromatolitler. (d) Yellowstone Doğal Parkı'daki termal bir havuzda gelişen termofilik siyanobacterialann oluşturduğu modern stromatolitler. Her yapı yaklaşık olarak 2 cm yüksekliğindedir. (e) Shark Bay'deki diğer modern ve çok büyük stromatolitlerin görüntüsü. Yapıların her biri 0.5-1 m çapındadır.
sıkıştırılmış sedimentlerden oluşur (Şekil 11.2»). Mikrobiyal yapıların bazı özelliklerini. Bölüm 18.7'de inceleyeceğiz. Bu eski stromatolit Jbacterialar ne çeşit canlılardır? Eski stromatolitler, derin deniz çukurları (Şekil 11.2c ve e) veya sıcak su kaynaklarındaki (Şekil 11.2d; oo&Şekil 18.18a) modern . stromatolitler ile karşılaştırdığında, eski stromatolitlerin muhtemelen Chloroflexus adı verilen yeşil. kükürtsüz bacteriaların bir akrabası olaniilamentli fototrofik bacterialardan oluştuğu sonucuna varılmıştır (oo^Bölüm 12.35). Şekil 11.3 »'de modern filamentli bacterialar ve yeşil algleri andıran, hücre benzeri yapılar içeren daha genç kayaların ince kesit fotomikrögrafları görülmektedir (<*öBölüm 14.13). Daha eski stromatolitlerde bu organizmalar modern stromatolitlerde yaygın olarak bulunan ve oksijen açığa çıkaran siyanobaeterialardan (cwaBölüm 12.25 ve 12.26) çok, anoksijenik (oksijensiz) fototrofik bacterialara (ao&Bölüm 12.2, 12.21, 12.32 ve 12.35) benzerlik gösterirler (Şekil 11.2c, e). Bununla birlikte, dünya tarihinin çok erken dönemlerinden beri prokaryotik mikroorganizmaların etkileyici bir morfolojik çeşitlilikle evrimleştikleri kaçınılmaz bir sonuçtur.
302 • Bölüm 11 • Mihrobiyal Evrim ve Sistematik
tarafından sık sık bombardımana uğruyordu. Bu koşullar altında su serbest halde bulunamazdı. Su ancak dünya soğuduğunda birikti. Dünyanın hangi hızda soğuduğu bilinmiyor ama kendini eşleyen ilkel oluşumların ilk kez dünyanın hâlâ sıcak olduğu zamanlarda ortaya çıktığı varsayılmaktadır. İlkel yaşam formları muhtemelen ısıya oldukça dirençli olduklarından, bu bağlamda hipertermofilik prokaryotları (cotsKısım 6.12 ve Bölüm 13) andırmaktadırlar. Bu hipotezin kanıtlarını Kısım 11.8, 11.9 ve 13.13'de inceleyeceğiz. Yaşamın Kökeni
• Şekil 11.3 Şekil 11.1 "de gösterilenlere göre daha genç hayalardan elde edilen prokaryot ve eukaryatik fosiller. İki fotoğraftan (a) Avustralya'nın merkezindeki bir kaya oluşumu olan yaklaşık 1 milyar yıllık Bitter Springs Oluşumlanndaki prokaryotik mikroorganizmalara ait fosilleri gösterir. Bu oluşumlar, modern füamentli siyanobacterialara, anoksijenik fototroflara veya filamentli kükürt kemolitotroflanna çok büyük bir benzerlik göstermektedir (<2£^>Bölüm 12). Hücre çaplan, 5-7 ,ıtm. (b) Aynı kaya oluşumlarında bulunan eukaryatik hücrelere ait mikrofosiller. Hücresel yapılar dikkate değer şekilde Chlorella türleri gibi bazı modern yeşil alglere benzemektedir (£*^>Kısım 14.13). Hücre çaplan, yaklaşık 15 fim.
İlkel Dünya Koşulları: Sıcak ve Oksijensiz
İlkel Dünya atmosferi oksijenden yoksundu. Suyun yanında bazı gazlar, çoğunlukla da metan, karbon dioksit, azot ve amonyak bulunuyordu. Bunun dışında eser miktarda karbon monoksit ve hidrojenin yanısıra bir H2S ve FeS karışımı şeklinde bulunan büyük kükürt depoları vardı. Ayrıca ilkel dünyada NH 3 ve CH4'ün reaksiyona girmesiyle oluşmuş çok miktarda hidrojen siyanürün de (HCN) bulunması muhtemeldi. İlkel dünyanın bugünden daha sıcak olduğuna dair pek çok kanıt ileri sürülmüştür. İlk 200 milyon yıl kadar dünya yüzeyi 100°C'nin üzerindeki sıcaklıklarda idi. Bunun yanısıra gezegen meteorlar
Yukarıda adı geçen gazları içeren indirgeyici atmosfer yoğun enerji kaynaklarına maruz bırakılırsa, biyomoleküllerin sentezi kendiliğinden gerçekleşebilir. O zamanlar ultraviyole ışınları (UV) tutan ozon tabakası olmadığı için, ilkel dünyada mevcut enerji kaynaklarından belki de en önemlisi güneşten gelen UV ışınlarıydı. Bununla beraber şimşek çakması, radyoaktivite, meteor etkisi sonucu oluşan sıcaklık ve volkanik aktiviteler sonucu ortaya çıkan termal enerji de mevcuttu. İlkel yeryüzünde bulunduğu düşünülen gaz karışımları bugünkü laboratuvar koşullarında UV'ye veya elektrik boşalmalarına maruz bırakılırsa, çeşitli biyomoleküller oluşur. Bunlar şekerler, amino asitler, pürinler, pirimidinler, çeşitli nükleotitler, tiyoesterler ve yağ asitleridir. Bunun da ötesinde bu ön biyolojik koşullarda, biyokimyasal yapı taşlarından bazılarının polimerize olarak polipeptitlerin, polinükleotitlerin ve diğer önemli makromoleküllerin oluşumuna sebep olduğu laboratuvar ortamında gösterilmiştir. Sonuç olarak organik bileşiklerin bir karışımının ilkel dünyada biriktiği ve bunun da yaşamın başlangıcı için bir aşama olduğunu var sayılabilir iz. O zamanki dünyanın steril oluşu da bu organik bileşiklerin kararlı olduğu ve günümüzde olduğu gibi biyolojik parçalanmaya maruz kalmadığı anlamına gelir. Kataliz ve Montmorillonit Kilinin Önemi
İlkel dünyada makromoleküllerin kendiliğinden sentezini sağlamak için bir katalizörün varlığı gerekiyordu. Olası katalizörler kil yüzeyleri veya piritti (FeS2). Bu tür yüzeyler, makromoleküllerin sentezi ve organik tabakalar içinde birikmesi için nispeten kararlı ve kuru ortamlar sağlıyordu. Uzun zaman sonra bu tabakalardan kendi kendine çoğalabilen, ilkel yapılar ortaya çıktı. Montmorillonit kili ile yapılan deneyler bu kilin mükemmel bir katalitik yüzey olduğunu göstermektedir. Örneğin yağ asitleri varlığında, Montmorillonit kil parçaları hücre benzeri küçük yağ keseciklerinin oluşumunu tetikler (Şekil 11.4»). Bu kesecikler, daha çok yağ asitinin katılımıyla kendi kendine genişleme ve küçük çaplı bir filtreden geçirildiğinde "bölünme" özelliği gösterirler. Bu tür
11.2 • İlkel Yaşam: RNA Dünyası ve Moleküler Kodlama • 303
• Şekil 11.4 Yağ asiti olan miristik asit ve RNA'dan (Laboratuvar koşullannda) üretilen lipit kesecikleri. Keseciğin kendisi yeşile boyanırken, kesecik içerisinde kompleks oluşturmuş RNA kırmızıya boyanır. Kesecik sentezini, MontmoriUonite kil partiküllerinin yüzeyi katalizler.
özelliği. Ancak bu özellikler hücresel bir yapıya gerek duyacak mıydı? Günümüzden geçmiş zamanlara doğru baktığımızda, ilkel organizmaların modern hücrelere benzediklerini fakat sadece birkaç gene ve kısıtlı traskripsiyonel ve translasyonel yeteneğe sahip olmaları açısından ayrıldıklarını kabul edebiliriz. Böyle bir yapı bile muhtemelen ilk kendini eşleyen oluşumlardan çok daha kompleksti. Peki daha sonraki yapı nasıl olacaktı? Ribonükleik asitlerin (RNA) belirli tiplerinin katalitik özellikleri keşfedildikten sonra (««aKısım 14.8), bugün pek çok bilim insanı ilk yaşam formlarının hücreler değil ama bunun yerine çıplak RNA'lar olduğuna inanmaktadırlar. Eğer doğru ise, bu RNA'nın hem katalitik hem de genetik kodlamada aracı olduğu bir "RNA yaşam" devri olabilir. RNA Dünyası
kil partikülleri aynı zamanda RNA'ya da bağlanarak onları lipit kesecikleri içine hapsederler (Şekil 11.4). Montmorillonit kil partiküllerine ribonükleotitler eklenirse, bu partiküller RNA oligonükleotitlerinin kendiliğinden oluşumunu katalize ederler. Her ne kadar kil katalizli kesecikler günümüz modern hücrelerinde, RNA oligonükleotitleri ise modern genlerde (birçok virüsün RNA genomuna sahip olması bunu anımsatsa da, cssaBölüm 9 ve 16) var olmasa da, RNA içeren kesecikler (Şekil 11.4) pek çok hücresel özellik gösterirler. İlkel dünyanın belirtilen jeolojik zamanlarında bu tür kendini eşleyen keseciklerin oluşması, diğer makromolekülleri içeren gelişmiş versiyonların ve sonuçta daha karmaşık bir modelin ortaya çıkmasına neden olmuş olabilirdi. Bu tür yapılar ilk hücresel organizmaların öncüleri olarak görülebilirdi. 1-1 Kavramların Gözden Geçirilmesi Dünya gezegeni yaklaşık olarak 4.6 milyar yaşındadır. Mikrobiyal yaşama ait ilk kanıtlar, 3.86 milyar yıllık olduğu tahmin edilen kayalarda bulunabilmiştir. ilkel dünya oksijensizdi ve şu ankinden çok daha sıcaktı. Abiyotik sentez yoluyla meydana gelen ilk biyokimyasal bileşikler, yaşamın kökeni için bir basamak oluşturdu. •
ilkel dünya atmosferi bugünkü dünya atmosferi ile karşılaştırıldığında nasıldı?
•
İlkel biyokimyasallar nasıl oluştu?
•
Montmorillonit kili yaşamın kökeninde nasıl rol oynayabilirdi?
İlkel Yaşam: RNA Dünyası ve Moleküler Kodlama İlk kendini eşleyen oluşum neye benziyordu? Bugün yaşam hakkındaki bilgilerimize dayanarak ilkel yaşam formlarının modern hücrelerden daha basit olduğunu ve en basit kendini eşleyen oluşumun en azından iki özelliğe sahip olduğunu tahmin edebiliriz: (1) enerji elde etmesi ve (2) kalıtım
Var olduğu farzedilen bir RNA dünyasında kendini eşleyebilen çeşitli RNA'lar kendi replikasyonları için gerekli katalitik reaksiyon yürütmüş olabilirler (Şekil 11.5*). Bu fikir için çok uzağa gidilmemelidir; çünkü RNA'ların bu işi yaptığı günümüzde artık bilinmektedir. Çeşitli katalitik RNA'ların (ÖQQ ribozimler, Kısım 14.8) kendini eşlemeyi de içeren çok sayıda değişik reaksiyonu katalizleyebildikleri gösterilmiştir. Dahası bazı ribozimler bir şeker ve bir azot bazından nükleotit sentezleyebilir ve amino asitleri, polipeptitlere polimerize edebilirler. Kendini eşleyen RNA yaşam formları, montmorillonit kil keseciklerine benzeyen lipoprotein keseleri içerisine hapsedildiğinde, ilk hücresel yaşam oluşumlarına evrimleşmiş olabilirler (Şekil 11.4) Bu süreç ilkel dünyada çok uzun zamanlar içerisinde oluşmuş olabilir ama sonuç olarak uygun bileşenler ve ortam biraraya geldiğinde, kendini eşleyebilen ilkel bir zarlı yapı ortaya çıkmış olabilir (Şekil 11.4 ve 11.5). Henüz DNA ve proteinlerden yoksun olsa da, bu ilkel hücresel yaşam formları farklı bir bakış açısıyla modern bir hücreye de benzetilebilir. Bu yapılar eşlendikçe, doğal seleksiyon onları evrimsel gelişim için zorlamış olabilir. Bu seleksiyon daha etkili bir kataliz için olası bir seçilimi ve daha kararlı bir genetik kodlama işlemini içermiş olabilir. Günümüzde proteinlerin RNA'dan daha yüksek katalitik özgüllük gösterdiği bilinmektedir, ilkel organizmalar daha kompleks hale geldikçe ve biyokimyasal olarak katalitik reaksiyonlara daha fazla gereksinim duyuldukça, proteinler hücrelerin primer katalizörleri olarak RNA'larla yer değiştirmiş olabilirler. Ancak bu bir gecede oluşabilecek bir olay değildir. Proteinlerin hücrede dereceli olarak görünmeye başladığı ve muhtemelen başlangıçta RNA ile kompleks oluşturduğu söylenebilir (günümüz hücrelerinde iyi bilinen ribonükleoprotein kompleksleri gibi). Evrim çok daha kusursuz biyokimyasal katalizörleri seçtikçe, RNA hücresel enzimler olarak yerini neredeyse tamamen proteinlere bırakmıştır (Şekil 11.5). Bu noktadan sonra modern hücre açıkça ufukta görünmüştür.
304 • Bölüm 11 • Mikrobiyal Evrim ve Sistematik
Steril Yeryüzü Prebiyotik sentez Proteinler ve RNA abiyotik olarak oluştu -RNA
RNA Dünyası
Kendini eşleyen RNA
Lipit veya lipoprotein keseciği
İlk hücresel yaşam Kodlama ve katalitik molekül olarak RNA
, Protein
Hücresel yaşam
Proteinler katalitik fonksiyonları üstlendi (RNA sadece kodlayan molekül)
ça karışık metabolik düzenlemelere sebep olabilirler (Bölüm 8). Genetik materyal olarak düşünüldüğünde RNA'nın kararsız bir yapıya sahip olması da yine DNA temelli sistemlerin oluşumuna neden olmuş olabilir. Hücrelerin evrimleşmesi için sistemin çok yüksek bir genetik stabiliteye sahip olması gerekir. Aksi takdirde istenilen genetik özelliklerin bir nesilden diğerine başarılı bir şekilde aktarılması mümkün olmaz. İlkel hücrelerdeki genetik kararlılıkla ilgili bu gereksinimler, büyük olasılıkla ilk hücrelerdeki temel genetik molekülünün RNA'dan DNA'ya dönüşümü için evrimsel olarak onları zorlamış olabilir. Substratları ile olan kimyasal ilişkilerine bakıldığında, DNA polimerazlar doğal olarak RNA polimerazlardan daha az hata yaparlar. Neticede genetik bilginin nesilden nesile doğru bir şekilde aktarılabilmesi için evrimleşmiş bir DNA genomu seçilmiştir. RNA'larm ise işlevlerinin çok büyük bir kısmı katalitik özellikte olup (modern hücreler de buna dahildir), hücredeki protein sentezini üstlenmişlerdir (e^*s>Kısım 7.16). Mikrobiyal evrimin erken dönemlerinde bir şekilde üç kısımlı sistem-DNA, RNA, ve proteinbiyolojik bilginin işlenmesi için en iyi çözüm olarak görüldüğünden, hücrelerde değişmez hale gelmiştir. Bu sistemin evrimsel başarı hikayesi o kadar açıktır ki, modern hücrelerin hepsi de bu üç tip makromolekülü de istisnasız olarak içermektedir. 11.2 Kavramların Gözden Geçirilmesi
DNA
RNA'dan DNA'nın evrimi Modern hücresel yaşam (DNA— RNA —Protein oluşumunda DNA kodlayıcı molekül olarak RNA'nın yerini aldı)
• Şekil 11.5 Hücresel yaşam formlarının RNA yaşam formlarından evrimleştiğini gösteren muhtemel senaryo. Kendini eşleyen RNA'lar, lipoprotein kesecikleri içerisine daimi olarak yerleşip hücresel yapılar haline gelebilirler. Zamanla RNA'nın katalitik işlevini proteinler devralmış ve RNA'nın kodlama fonksiyonu DNA ile yer değiştirmiştir.
İlk yaşam formları kendi kendini eşleyen RNA'lar olabilir. Bunlar hem katalitikdir hem de bilgi içermekteydi. Sonuç olarak DNA hücrelerin genetik deposu haline gelmiştir ve üç kısımlı sistem, DNA, RNA ve protein hücreler arasında evrenselleşmiştir. •
Bir RNA yaşam sürecinin varlığını hangi delil destekler ve RNA yaşam formları neden günümüze kadar yaşamım sürdürememiştir?
İlkel Yaşam: Enerji ve Karbon Metabolizması
Yaşam oldukça düzenli bir süreçtir. Çeşitli moleküllerin karmaşık bir biyolojik makina içinde-hücredebir araya getirilebilmesi için enerjiye ihtiyaç vardır. Kendini eşleyen ilkel oluşumlar enerji ihtiyaçlarını Modern Hücre: DNA -» RNA •-> Protein nasıl karşılıyordu? Katalitik RNA'lar için ihtiyaç DNA temelli hücre neden ortaya çıktı? Bu pek çok duyulan enerji, yürüttükleri pek çok egzotermik sebepten dolayı ortaya çıkmış olabilir. Hücre genoreaksiyonun doğasından ileri gelmiş olabilir. Ama munda DNA'nın varlığı, genetik bilgiyi hücrenin hücreler için enerji korunumu önemli bir konudur. bir bölgesinde saklama ve onu orada kararlı bir Siyanobacteriaların evrimleşmesine kadar, yerşekilde tutabilme gereksiniminden kaynaklanmış yüzünde yok denecek kadar az miktarda moleküolabilir. Genler buradan proteinleri oluşturmak ler oksijen mevcuttu (Bkz Şekil 11.7). Bu nedenle üzere ifade edilebilirler. Daha çok evrimsel girdi ilkel hücreler enerji gereksinimlerini karşılamak ile, hücrenin daha sonraki enerji birikimlerini etkiiçin sadece oksijensiz koşullarda oluşabilecek enerji leyebilecek seçici ekspresyonlar ortaya çıkabilir. Bu üreten mekanizmaları kullanabiliyordu. Bununalandaki devam eden evrimsel değişimler, bugün la birlikte, Bölüm 17'de de göreceğimiz gibi okprokaryotlarda gördüğümüz gibi yoğun ve olduksijensiz koşullar mikrobiyal metabolik çeşitliliğe
11.3 • İlkel Yaşam: Enerji ve Karbon Metabolizması • 305
birtakım kısıtlamalar getirir. Oksijen yokluğunda, çeşitli kemoorganotrofik ve kemolitotrofik enerji üreten mekanizmalarda olduğu kadar fotosentezde de çok sayıda değişiklikler meydana gelir. Bu mekanizmaların hepsi oldukça kompleks olduklarından, muhtemelen daha basit mekanizmalarla bu sorunun üstesinden gelinmiştir. İlkel organizmaların, ferro demir içeren reaksiyonları (ilkel dünyada bol miktarda olduğu biliniyordu) enerji üreten reaksiyonlar olarak kullandıkları ileri sürülmektedir. Örneğin, aşağıdaki reaksiyon: FeS 2 +H 2 AG°'=-42 kj / reaksiyon enerjinin serbest bırakılmasıyla egzergonik olarak ilerler. Bu reaksiyon H 2 ürününü verir. İlkel hücreler bu güçlü elektron vericisini bir proton itim gücü olarak kullanmış olabilirler. ATP oluşturmak için ilkel bir ATPaz'a enerji kaynağı olmuş olabilir (Şekil 11.6*). Diğer H 2 kaynakları ilkel dünyada ferro demirden temin edilmiş olabilir. Örneğin, enerji kaynağı olarak ultraviyole ışınların varlığında Fe+2 hidrojene proton üretebilir (Şekil 11.6). İlk okyanusların ferro demirle yüklü olduğu düşünülmektedir ve yüzey suları yoğun bir UV radyasyona maruz kalmıştır. Elektron vericisi olarak H2 ile redoks çifti oluşturmak için aynı zamanda bir elektron alıcısına da ihtiyaç vardı (<=c^Kısım 5.6); bu da elementer kükürt (S°) olabilirdi. Şekil 11.6'da da gösterildiği gibi, H2O2'nin üretimi ile H2'nin oksidasyonu için birkaç enzime ihtiyaç duyulabilirdi. Bunun da ötesinde ilkel dünyadaki H2 ve kükürt bileşiklerinin bolluFeS + H,S-
ğu sebebiyle, hücreler neredeyse sınırsız bir enerji kaynağına sahip olabilirlerdi. İlgi çekici olan şey, pek çok hipertemofilik Archaea'nm. (hipertemofilik Bacteria ile birlikte daha sonra işleyeceğimiz bu canlılar, dünyanın en eski organizmalarına en yakın akrabalık derecesine sahiptirler) S°'ı elektron alıcısı olarak kullanarak H2'yi okside edebilmesidir. İlkel organizmalar, abiyotik biyosentez veya ilkel dünyada bol bir gaz olan CO2 gibi çeşitli kaynaklardan karbon ihtiyaçlarını karşılamış olabilirler. Karbon dioksitin kullanılmasını takiben, hücrede CO2'in tüm organik bileşenlere dönüştürülebilirle işlemi olarak bilinen ototrofi evrimleşmiştir (ÖOOKIsım 17.6 ve 17.7). Her ne kadar başta öyle olmadığı düşünülse de, Aquifex gibi ototrofik prokaryotların keşfedilmesi ile ototrofinin ilk fizyolojik oluşum olduğu hipotezi önem kazanmıştır. Bacteria'nm bir üyesi olan bu grup hipertermofil olup, çok küçük bir genom içerir ve yaşamın evrimsel ağacının neredeyse köklerine doğru branşlaşır (Bkz Şekil 11.16). Tüm bu özellikler "ilkel" bir durumla ilişkilendirilebilir. Bu sebeplerden ötürü ilkel prokaryotların gelişmek için CO2'i temel veya tek karbon kaynağı olarak kullanması oldukça muhtemeldir. Moleküler Oksijen: Şerit Halindeki Demir Oluşumları Siyanobacterialarda oksijenli fotosentezin evrimleşmesi, dünya tarihi için önemli bir dönüm noktasıdır (Şekil 11.7»). Siyanobacterialar dünyada ilk defa yaklaşık 2.8 milyar yıl önce görülmüşlerdir ama ürettikleri O2, okyanuslarda bolca bulunan tüm in-
Alternatif hidrojen kaynağı H 2
ilkel ATPaz
2 H2O
• Şekil 11.6 ilkel hücreler için olası bir enerji üretim şeması. Piritin oluşumu, ilkel bir ATPaza enerji kaynağı olacak H2 üretimine ve S° redüksiyonuna yol açar. H2S'in nasıl bir katalitik role sahip olduğuna dikkat ediniz, net substratlar FeS ve S°'dır. Bunun yamsıra sadece bir kaç farklı proteine gereksinim duyulduğunu da göz önünde bulundurunuz. Reaksiyonun AG°'si FeS + H2S —> FeSz + H2 = -42 kj'dur. Alternatif H2 kaynaklarından biri de UV kataliziyle gösterildiği gibi H+'nin Fe+2 ile redüksiyonu olabilir.
• Şekil 11.7 Şerit halindeki demir oluşumları. Yaklaşık 10 m yüksekliğindeki demir oksit katmanlarının arasına serpiştirilmiş demir silikatlar ve diğer silika minerallerinden oluşan bir kaya. Brockman Demir Oluşumları, Hammersly Basin, Batı Avusturalya. Demir oksitler, temel olarak siyanobacterial fotosentez sonucu serbest kalan oksijen ile ferro demirden (Fe+Z) ortaya çıkan ferrik (Fe+3) demir formu içerir.
306 • Bölüm 11 • Mikrobiyal Evrim ve Sistematik
dirgeyici maddelerden dolayı (FeS gibi) atmosferde birikmemiştir; bu materyaller H2O'yu oluşturmak için O2 ile kendiliğinden reaksiyona girmiştir. Pirit oksidasyonu durumunda üretilen Fe+3 jeolojik kayıtlarda belirgin bir işaretleyici olmuştur. Siyanobacteriaların, fotosentetik CO2 indirgenmesi için H2O'nun elektron vericisi olarak kullanabildiği ve oksijenin yan ürün olarak serbest bırakıldığı bir fotosistem geliştiren anoksijenik fototroflardan evrimleştikleri oldukça yüksek bir ihtimaldir. Fotosentezin biyokimyasını Bölüm 17'de tartışacağız. Prekambriyan (>0.5 milyar yıl öncesi, Bkz. Şekil 11.8) kökenli kayalarda bulunan demirin çoğu
• Dinazorlann çağı Kambriyan Prekambriyan ayırım zamanı 0.5 milyar yıldır -Çok hücreli bitkiler ve hayvanlar - Modern ökaryotların kökeni Endosimbiyoz Ozon tabakasının oluşumu
%0.1 t o
Oksijenli
O
şerit halindeki demir oluşumları (BIF) şeklindedir (Şe-
kil 11.7). Bunlar demirce ve silikaca zengin içerik değişiklikleri ile ince tabakalar halinde üst üste gelerek, sedimenter kayaları oluştururlar. BIF'in yaşı 2.7 ila 1.9 GY arasındadır. Oksijenik fotosentezin evriminin (Siyanobacteria) yaklaşık 2.75-3 GY önce olduğu düşünülmektedir. Siyanobacteriaların metabolizması O2 üretmiştir ki bu da Fe+2 olarak bulunan demiri (örneğin FeS2'de) Fe+3'e okside etmiştir. Ferrrik demir, BIF olarak biriktirilen çeşitli demir oksitler oluşturmuştur (Şekil 11.7). Fe+2'nin bol olduğu düşünüldüğünde, atmosferde O2 birikimi için gerekli ortam oluşturulmuş, hem prokaryotik hem de eukaryatik dünya için önemli bir evrimsel olay gerçekleşmiştir (Şekil 11.8»). Atmosferin Oksijenlenmesi:Yeni Metabolizmalar ve Ozon Tabakası
Oksijenik fotosentezin oluşumu dünya için çok büyük sonuçlar doğurdu, çünkü O2 biriktikçe atmosferde dereceli olarak oksijensiz ortamdan oksijenli ortama doğru geçiş oldu (Şekil 11.8). Aerobik organizmalar O2 ortamda bir elektron alıcısı olarak mevcut olduğunda, evrimleşebildi. Bu organizmalar organik bileşikleri okside ederek anaeroblardan daha çok enerji elde edebildiler (ooöBölüm 17). Bu da sayıca artmak için daha büyük popülasyonların oluşumuna ve yeni tip organizmalar ile metabolik şemaların evrimleşmesi için gerekli olasılıkların artışına neden oldu. Fosil kayıtlarındaki güvenilir delillere bakıldığında, dünya atmosferinin oksijenli hale geldiği zamanlarda evrimleşme oranında çok büyük bir patlama olduğu görülmüştür. Bu da organel içeren eukaryatik mikroorganizmaların oluşumunu ve onlardan da çok hücreli organizmaların hızlıca çeşitlenmesini tetiklemiştir. Sonuç olarak evrim süreci ilerledikçe, hayvanlar ve bitkiler oluşmuştur (Bkz Şekil 11.6 ve Kısım 11.9). O2'nin atmosferde var olmasının en önemli sonucu, güneşten dünyaya gelen yoğun ultraviyole radyasyonu bariyer kurarak engelleyen ozonun oluşumudur. O2 kısa dalga boylu UV radyasyona maruz kaldığında, 300 nm'ye kadarki dalga boylarını kuvvetlice soğuran O3'a dönüştürülür. Bir ozon tabakası oluşana kadar, evrim ancak kaya altları veya okyanuslar gibi güneşten gelen direk radyasyondan korunmuş bölgelerde gerçekleşebilmiştir, çünkü yo-
%20 N
3
- Oksijenik fototrof ların(siyonabakterilerin) kökeni
- İlk hücresel yaşam belirtileri Kimyasal Biyomoleküllerin Oksijensiz evrimleşme prebiyotik biyosentezi Dünya'nın oluşumu (Günümüzden - 4.6 X10» yıl öncesi)
• Şekil 11.8 Biyolojik evrimleşmedeki ve dünya'nın değişen jeokimyasındaki başlıca dönüm noktalan. Bir gigayıl (GY) bir milyar yıldır. Siyanobacterial metabolizma sonucu atmosferin oksijenizasyonunun kademeli bir işlem olduğunu ve bu olayın 2 milyar yılldan daha uzun bir süre zarfında gerçekleştiğini hatırlayın. Her ne kadar hayvanlar ve diğer pek çok gelişmiş organizma doymuş (%20) oksijen seviyesine ihtiyaç duysa da, pek çoğu fakültatif aerob veya mikroaerofilik olan prokaryotlar için bu geçerli değildir (
ğun UV radyasyonu DNA'da ölümcül hasarlara sebep olabilirdi. Ö2 fotosentetik olarak üretilidikten ve bunun sonucunda da ozon tabakası oluştuktan sonra, organizmaların dünya yüzeyindeki dağılımları artmış, yaşayan organizmaların evrimleşerek daha çok sayıda çeşitlenmesine ortam sağlanmıştır. Şekil 11.8, biyolojik evrimleşmedeki bazı temel olaylar ile dünyanın yüksek bir indirgeyiciyken güçlü bir yükseltgeyici gezegen olmasına kadar ki jeokimyasal değişimleri özetler. 11.3 Kavramların Gözden Geçirilmesi İlkel metabolizma anaerobikti ve kemolitotroflara benzer şekilde yeryüzünde bolca mevcut olan FeS ve H2S kaynaklarını kullandı. Karbon metabolizması ototrofiyi içermiş olabilir. Oksijenik fotosentez, şerit halindeki demir oluşumlarına, oksijenli bir ortamın ortaya çıkmasına ve biyolojik evrimleşmede görülen büyük bir patlamaya sebep oldu. •
ilkel hücreler FeS + H2S'den nasıl enerji elde edebiliyordu? • Neden Siyanobacteriaların evrimleşmede kritik bir basamak olduğu düşünülür? • BIF'da demirin hangi formu bulunur? • Biyolojik evrimleşmede ozonun görevi neydi ve siyanobacterialar ozon oluşumuna nasıl olanak sağladı?
11.4 • Euharyalar ve Organeller: Endosimbiyoz • 307
Eukaryalar ve Organeller: Endosimbiyoz Bölüm 2'de eukaryatik mikrobiyal çeşitlilik özetlenmiştir (<3°c>Kısım 2.6). Bölüm 14'de eukaryatik mikroorganizmaları daha detaylı inceleyeceğiz. Burada ise modern eukaryatik hücrelerin kendilerine özgü şu anki içsel yapılarına doğru nasıl evrimleştikleri dikkate alınacaktır: membranla çevrili çekirdek ve organeller.
Hayvanlar
\ Protozoa X
Çekirdeğin Kökeni
İlkel eukaryatik hücreler yapısal olarak basit hücrelerden oluşmuştu. Günümüzdeki modern prokaryotik hücrelerdeki gibi mitokondri, kloroplast ve membranla çevrili bir çekirdekten yoksunlardı. Daha sonra çekirdek nasıl oluştu? Eukaryatik hücre soyları geliştikçe, DNA'yı farklı birimler içinde bölen (kromozomlar) çekirdek ve mitotik aygıt evrimleşti. Replikasyonun düzenli olması ve DNA'nın ayrılmasını sağlamak için kromozomlar ortaya çıktı. Sonuçta öyle bir noktaya gelindi ki, ilkel genomlar büyüdükçe DNA'nın tek bir molekül olarak replikasyonu (prokaryotlardaki gibi) daha fazla mümkün olamadı. Çekirdeğin gelişimi aynı zamanda daha büyük genoma ihtiyaç duyan kompleks eukaryatik hücrelerin oluşumuna aracılık ederek seksüel üreme yoluyla genomların rekombinasyonuna imkan sağladı (cOöKısım 2.2 ve 14.7). Dünya hâlâ oksijensiz zamanlarını sürdürüken, özellikle ilkel eukaryaların neden çekirdeğin dışındaki diğer organellere ihtiyaç duyduğuna dair açık bir neden yoktur. Bu nedenle muhtemelen diğer temel organeller daha sonra evrimleşmiştir. Şimdi, kökenleri ilginç olan bu sürece değineceğiz. Endosimbiyoz
Modern (organel içeren) eukaryatik hücreler, hücresel fonksiyonlarını zarla çevrili yapılar olan organeller içerisine dereceli olarak bölüştürmediler. Bunun yerine organeller Bacteria domaini içerisindeki kemoorganotrofik ve fototrofik simbiyontlarla kararlı bir birleşme sonucu oluştular (Şekil 11.9»). Bu işlem endosimbiyoz olarak adlandırıldı (endo "iç" anlamındadır) ve muhtemelen aerobik bir bacterianın ilkel bir eukaryaun stoplazmasına kalıcı olarak yerleşmesiyle başladı. Bu da hücreye, korunmuş bir ortamda enerji değiş tokuşu ve hazır bir besin kaynağı sağladı (Şekil 11.9). Bu simbiyont, modern mitokondrinin öncüsü oldu. Benzer şekilde ilkel bir eukarya içerisine oksijenik bir fototrofun endosimbiyotik alımı, hücreye fotosentetik özellikler kazandırarak, organik bileşikler kullanılarak elde edilen enerji ihtiyacım ortadan kaldırıp hücreyi fototrofik hale getirdi. Fototrofik endosimbiyont günümüzdeki modern kloroplastın öncüsü oldu (Şekil 11.9). Bir kaç eukaryatik hücre ise ya hiç hücre endosimbiyont ortaklığı yapmadı veya bir şekilde
v s
Mitokondriden yoksun modern ökaryotlar
\ t
Fototrofik hücrenin simbiyotik birleşmesi (ilkel kloroplast) \ \
l Solunum hücresinin simbiyotik birleşmesi (ilkel mitokondri)
Bakteriler Arkeler
Evrensel ata
• Şekil 11.9 Endosimbiyotik olaylar sonucu modern eukaryatik hücrelerin oluşumu. Organellerin Archaea 'dan ziyade Bacteria 'dan köken aldığım anımsayınız. Bazı ilkel eukaryatlar, eukaryatik hücrelere özgü temel özelliklerini koruyarak, ya hiçbir zaman endosimbiyotik olaylara maruz kalmadı ya da kendi simbiyontlannı daimi olarak kaybetti. Organellerin kökenini oluşturan Bacteria soylarını gösteren Şekil 11.16 ile bu şekli karşılaştırınız.
onları içerisine aldıktan sonra geri serbest bıraktı, çünkü büyük bir ihtimalle nişleri daimi olarak anoksikti. Böyle organelden yoksun eukaryatlar günümüzde bilinmektedir (c«3Kısım 14.2 ve 14.9). Oluşan pek çok endosimbiyotik birliktelik konak hücrenin formunu koruma olasılığını arttırdı ve bu sebeple günümüzde organel içeren eukaryatik hücreler hakim oldu. Mikrofosil kayıtları (Bkz Şekil 11.3) endosimbiyotik olayların yaklaşık olarak 2 GY gibi bir zamandan sonra olmaya başladığını göstermektedir (Bkz Şekil 11.10). Endosimbiyoz zamanla ilişkili bir olay olmaktan çok, çoklu ve muhtemelen de prokaryotik hücreler ve ilkel eukaryatik hücreler arasında yaygın olarak gelişen bir olaydı. Kararlı olmayan ve zararlı birliktelikler yaşayamazken, yararlı birliktelikler devamlılık gösterdi. Seleksiyon yararlı birlikteliklerin seçilmesine yardımcı oldu. Bu seçim, endosim-
308 • Bölüm 11 • Mikrobiyal Evrim ve Sistematik
biyontun yapısındaki değişiklikleri (örneğin, hücre duvarı kaybı), genomik değişiklikleri ve endosimbiyonttan konak hücre çekirdeğine gen transferini de kapsadı (c^Kısım 14.9 ve 15.7). Modern eukaryatik hücre bu birliktelikten köken aldı.
t
0 Fonerozoik
Kambriyan Prekambriyan
0.5
1
1
Endosimbiyozun Kanıtı
Bitkiler ve hayvanlar — Modern ökaryotlar
_ -
bı
Gigayı1
Endosimbiyoz hipotezini pek çok kanıt destekler. 1.5 Örneğin, hem kloroplast hem de mitokondri proProterozoik karyotik tipte ribozoma sahiptir (ö°öTablo 7.4) ve Bacteria y& özgü 16S ribozomal RNA dizileri (Bkz 2 Kısım 11.6) içerirler. Üstelik bu organellerin ribozom fonksiyonu, serbest yaşayan Bacteria'yı etki-Prokaryotlar leyen aynı antibiyotikler tarafından inhibe olur çağı (öOöKısım 14.5). Mitokondri ve kloroplast aynı za(Dünya üzerindeki manda, prokaryotlara özgü az miktardaki kovalent 3 yaşam tarihinin şekilde kapalı, halkasal formda düzenlenmiş DNA üçte ikisi) içerirler (a«aKısım 2.2). Gerçekte bugünkü modern Arkean hücrelerin organellerinde prokaryotik bir geçmişe 3.5 sahip olduklarına dair pek çok işaret vardır («**s Kısım 14.4). 4 Endosimbiyotik olaylar bugün bile hâlâ oluşmaktadır. Özellikle anaerobik protozoalar gibi bazı - RNA dünyası^ Hadean protozoalarm simbiyotik prokaryotlar içermesi 4.5 buna örnek olarak verilebilir (ö^Şekil 19.25). Bu Dünya'nın balangıcı simbiyontlar, mitokondri ve kloroplastlarda olduğu gibi oldukça özelleşmiş hücrelerden çok tama• Şekil 11.10 Kendini eşleyebilcn oluşumların yeryüzündemamen fonksiyonelleşmiş hücrelere benzeseler de, ki devirleri. Soldaki ölçek, jeolojideki temel zaman süreçleri ile tercihen her iki ortağa da avantaj sağlaması sebe- yaşam formlarım ilişkilendirmektedir. biyle eukaryatik hücrelerin prokaryotik hücreleri içine alabildiğini göstermektedirler. tazoadan günümüze kadar süregelen biyolojik evEndosimbiyoz, eukaryatik hücre nesilleri için rimleşme hakkında oldukça fazla bilgiye sahibiz. önemli bir itici güçtür. Solunum ve fotosentetik Mikroorganizmaların hikayesi tam olarak tamamenerji fabrikalarının varlığı eukaryatik hücrelere lanmasa da, özellikle prokaryotlarla ilişkilidir. Geryeni ve önemli özellikler kazandırarak, biyolojik çekte prokaryotların evrimsel hikayesi ta ki çeyrek çeşitliliğin patlama göstermesi için zemin oluşturyüzyıl öncesine kadar gizemini koruyordu. Evrimmuştur. Endosimbiyoz, 1.5 milyar yıl öncesinden sel ilişkilendirmelerin belirlenmesinde kullanılan bugüne kadar yükseliş göstermiş ve tek hücreli moleküler yöntemlerin keşfi, başta mikrobiyal eveukaryatik mikroorganizmalar ile metazoanın çerim olmak üzere evrimsel bilime yeni bakış açıları şitlenmesi sonucu yapısal olarak daha kompleks kazandırmıştır. Şimdi bu konuyu inceleyeceğiz ve bitkiler ve hayvanlar ortaya çıkmıştır (Şekil 11.8, bu yöntemlerin tüm hücreleri bir filogenetik soy 11.9 ve 11.16). ağacına yerleştirmemize nasıl yardımcı olduklarını göreceğiz. Biyolojik Evrimleşme ve Jeolojik Zaman Cetveli
îlk protozoadan (tek hücreliler) bugünkü temsilcisinin oluşumuna kadar geçen süreç, yeryüzünde yaşamın var olduğu toplam zamanın yaklaşık olarak altıda biri kadardır. Başka bir açıdan bakacak olursak, dünyanın biyolojik tarihinin altıda beşi sadece prokaryotlan kapsayan mikrobiyal bir yaşam süreci ile kısıtlanmıştır. Eğer gerçekte bu tip yapılar var olmuşsa, bu sürecin öncesi hücresel olmayan, eşlenebilir yaşam formlarının-RNA dünyası-devri olmuş olabilir. RNA dünyasının da öncesinde dünya gezegeni tamamen sterildi. Yaşamın evrimleşmesindeki bu devirler, jeologların zaman çizelgesi kullanılarak Şekil 11.10«'da özetlenmiştir. Metazoa (çok hücreliler) geride çok çeşitli ve önemli fosil kayıtları bırakmıştır. Bu nedenle me-
11.1 Kavramların Gözden Geçirilmesi Eukaryatik çekirdek ve mitotik aygıt muhtemelen büyük genomlu organizmalarda DNA'nın düzenli şekilde paylaştırılmasına ihtiyaç duyulduğu için ortaya çıkmıştır. Eukaryalarm temel enerji üreten organelleri olan mitokondri ve kloroplast, endosimbiyoz adı verilen işlem ile Bacteria domainine ait prokaryotların eukaryatik hücreler içerisine simbiyotik birleşmeleri sonucu ortaya çıkmıştır. Bir RNA dünyasının var olduğu farz edildiğinde, kendi kendini eşleyen yapıların yeryüzünde 4 milyar yıl önce oluştuğu kabul edilmektedir. •
Eukaryalar jeolojik devirler içerisinde ilk olarak ne zaman görülmüştür? Peki Metazoa?
•
Organellerin bir zamanlar Bacteria domainine ait serbest yaşayan türler olduğu fikrini hangi kanıt destekler?
11 6 • Moleküler Evrim Aracı Olarak Ribozomal RNA Dizileri • 309
I
W EVRİMSEL. İLİŞKİLERİ 1 BELİRLEMEDE KULLANILAN YÖNTEMLER
Evrimsel Kronometreler Olarak Ribozomal RNA'lar
Ribozomal RNA'lar, onların mükemmel evrimsel kronometreler olmasını sağlayacak çeşitli özelliklere sahiptirler. Ribozomal RNA'lar, oldukça büyük, işBundan sonraki bir kaç bölümde mikroorganizmalevsel olarak sabit, evrensel olarak yaygın moleküller ların filogenisini yani evrimsel ilişkilerini işleyeceolup, tüm hücrelerde nükleotit dizisinin korunduğu ğiz. Burada odaklanacağımız temel konu ribozomçok sayıda bölge içerirler. Prokaryotlarda büyüklüklardaki yapısal RNA'ların karşılaştırmalı dizilemesi leri 5S, 16S ve 23S ("S", "Svedberg"'i simgeler ve bir olacaktır. Mikrobiyal filogeninin ilk resmi bu tip partikülün santrifüj edildiğinde çökmesini esas alan çalışmalardan açığa çıkmıştır. Ayrıca geliştirilen bir kütle ölçüsüdür) olan üç çeşit ribozomal RNA bu teknikler, mikrobiyal ekoloji ve klinik tanı için molekülü vardır. Eukaryatlarda ise dizileme çalışde yeni araştırma imkanları doğurmuştur. maları, işlevsel olarak benzer fakat biraz daha büyük olan 18S molekülü üzerine odaklanmıştır. 16S ve 18S rRNA'ları ribozomun küçük alt biriminin (30S veya 40S) (Şekil 11.11b) bir parçası olduklarından, SSU Evrimsel Kronometreler (küçük alt birim) dizilemesi kısaltması, 16S veya 18S dizilemesi ile eş anlama gelmektedir. Belirli genler ve proteinler evrimsel kronometreler olup, evrimsel değişimi ölçerler. Diğer bir değişle rRNA dizilerine ait çok geniş bir veri tabanı işlevsel olarak benzer (homolog) makromoleküllemevcuttur. Örneğin Ribozomal Veri Tabanı Prorin nükleotit ve amino asit dizisindeki farklılıklar, jesi (RDP) şu an sayısı 100,000'i aşan bu tür dizilere evrimsel uzaklıklarının bir sonucudur. Moleküler di- ait çok büyük bir kolleksiyonuna sahiptir. RDP'ye internet üzerinden erişilebilmekte (http://rdp. zileme ile evrimsel uzaklıkların ölçülmesi amacıyla cme.msu.edu/html) ve dizilerin yanısıra filogeneyapılacak dizileme çalışmalarında doğru molekültik eğitimler, referans kaynaklar, yeni oluşturulan lerin seçilmesi şarttır. dizilerin gösterimi ve diğer birtakım özelliklere ev sahipliği yapmaktadır. Moleküler Kronometre Kriterleri SSU rRNA'ların filogenetik bir araç olarak kullanımına, 1970'lerde Illinois Üniversitesi'nden Cari Kusursuz bir moleküler kronometreyi tanımlayan Woese öncülük etmiştir ve bu yöntem günümüzbazı kriterler vardır. Moleküler bir kronometre, çalışmak için seçilen grup içerisinde evrensel olarak de tüm biyolojide yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu başarısından dolayı 2003 yılında İsveç Kraliyet yaygın olmalıdır. Bu tüm organizmaların karşılaşBilim Akademisi tarafından, biyolojide bilimsel batırılmasına yardım eder. İkinci olarak, molekül her şarının en yüksek ölçütü olarak görülen Crafoord organizma için işlevsel olarak homolog olmalıdır zira ödülüne layık görülmüştür. işlevselliği farklı olan moleküllerin dizi benzerliği göstermesi beklenmez. Üçüncü olarak, analizler 11.5 Kavramların Gözden Geçirilmesi için dizileri sıralamak amacıyla molekülün korunmuş dizi bölgeleri içermesi çok önemlidir. Son Ribozomal RNA dizilerinin karşılaştırılması, organizmaolarak seçilen molekül dizisinin organizmadaki lar arasındaki evrimsel ilişkinin belirlenmesinde kullanılabilir. rRNA'lara dayalı filogenetik ağaçlar günümüz evrimsel değişimi bir bütün olarak yansıtması geprokaryot ve eukaryalara ait tüm ana gruplar için hazırrekir. Aslında ölçülecek filogenetik uzaklık artıkça, lanabilmektedir. dizilerdeki değişim oranının yavaşlaması gerekir • Ribozomal RNA'lar neden iyi birer evrimsel kronometki, çok uzun bir zaman sürecinde meydana gelen redir? değişimler bize evrimsel sinyalleri işaret eder. • RDP nedir? Pek çok gen ve proteinin moleküler kronomet• Cari VVoese kimdir? reler olduğu ileri sürülmektedir. Ancak bunlar arasından ribozomal RNA'ları kodlayan genler, transMoleküler Evrim Aracı Olarak lasyonel sistemdeki temel bileşenler (c«ûKısım Ribozomal RNA Dizileri 7.14-7.16), ATPaz proteinleri, ATP sentezleyen veya hidrolizini yapan enzim kompleksleri (<3o&Kısım Ribozomal RNA dizilerinin elde edilmesi ve filo5.12), genetik rekombinasyona yardımcı olan RecA genetik ağaçların oluşturulması, moleküler biyoloji enzimi (öc^Kısım 10.6) ve belirli translasyonel prove bilgisayar analizlerinin beraber yürütülmesi soteinler mikroorganizmalar hakkında en çok kabul nucu şu an oldukça rutin hale gelmiştir. Yeni buedilebilir filogenetik bilgiyi edinmemizi sağlamışlunan diziler, RDP'deki veya GenBank (Amerika), lardır. Bu moleküllerin hepsi, ilkel hücrelerde bile DDBS (Japonya) ve EMBL (Almanya) gibi diğer gereklidir ve bu sebeple onların gen dizilerindeki genetik veri tabanlarındaki mevcut dizilerle karvaryasyonlar, evrimsel geçmişlerini daha derinleşılaştırılabilir. Daha sonra ağaç oluşturan bir algomesine incelememize olanak sağlar. Bu kısımda, ritma kullanarak dizilerin tabiatında olan evrimsel bu kronometreler arasında en yaygın olarak kulbilgiyi en iyi şekilde ifade eden filogenetik bir ağaç lanılan ribozomal RNA üzerinde duracağız (Şekil çizilebilir. 11.11»).
<
310 • Bölüm 11 • Mikrobiyal Evrim ve Sistematik
30S alt birim
(-120) (-2900)
fcj
• Şekil 11.11 Ribozomal RNA. (a) Escherichia coii'nin 70S ribozomunu gösteren elektron mikrograf (b) Ribozomun kısımları; 5S, 16S ve 23S ribozomun küçük alt birimindeki farklı RNA formlanm ifade eder. (c) 16S ribozomal RNA'nın (rRNA) primer ve sekonder yapısı. Bu Escherichia coli'ye (Bacteria) ait 16S rRNA'dır; Archaea'mn 16S rRNA'lan bütün sekonder yapıya (katlanma) benzerlik gösterir, ama primer yapılannda (dizi) çok sayıda farklılık vardır. 16S rRNA'run eukaryatlardaki benzeri stoplazmada bulunan 18S rRNA'dır.
Dizileme Metodolojisi
SSU rRNA dizilerinin karşılaştırılmasında, saf bir mikroorganizma kültürü ile çalışılabileceği gibi mutlaka saf kültürle çalışmak da şart değildir. İşleme başlamak için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR, cttsKısım 7.9) kullanılarak genomik DNA'dan 16S ribozomal RNA'yı kodlayan gen çoğaltılır. Daha sonra PCR ürünü dideoksi DNA dizileme metodu (Sanger dizilemesi; cssiKısım 7.8) ile dizilenir (Şekil 11.12»). Bu prosedür hızlı ve spesifiktir. SSU ribozomal RNA'lardaki korunmuş dizilere komplementer PCR primerleri kullanarak, dizileme amacı ile sadece çok az miktardaki hücre materyalinden çok yüksek miktarda DNA ürünü elde edilebilir
(Şekil 11.12). Dizileme tamamlandıktan sonra dizi verileri bilgisayar analizi için hazırdır. RNA Dizilerinden Filogenetik Ağaçların Oluşturulması
Karşılaştırmalı ribozomal RNA dizilemesinde kullanmak amacıyla dizi analizleri için çok çeşitli algoritmalar ve filogenetik ağaç oluşumları geliştirilmiştir. Hangi programın kullanılacağına bakılmaksızın ilk yapılması gereken ham dizi verilerinin, daha önce sıralanmış dizilerle bir dizi editörü yardımı ile sıralanmasıdır. rRNA'ların hepsi tamamen aynı uzunlukta değildir. Bu sebeple sıralama esnasında
11.6 • Moleküler Evrim Aracı Olarak Ribozomal RNA Dizileri • 311
1. DNA izolasyonu
urgan ızma
uızı
A
CJ&UAGAJCJCUGJAIC
B
C'CMAGAjGİCUGİGJC
C
CCAAGACGUGGC
D
GCUAGAUGUGCC
""•'
Analız A — * - B , için oniki bazdan üçünden farklılık vardır; bu nedenle A = 0.25
(a) Dizi sıralaması ve analizi 2. İplikçikleri ayırmak için ısıtma; özgün primerlerin eklenmesi
Evrimsel uzaklık
3. DNA polimeraz ile primerin uzaması
4. 16S rRNA geninin çok sayıda kopyasını elde etmek için yukarıdaki basamakların tekrarı 5. Agaroz jel yapılarak ürünün doğru büyüklükte olduğunun kontrolü
Düzeltilmiş evrimsel uzaklık
ED
A
—
B 0.25
0.30
ED
A
—
C 0.33
0.44
ED
A
—
D 0.42
0.61
ED
B —
C 0.25
0.30
ED
B -
D 0.33
0.44
ED
C —
D 0.33
0.44
(b) Evrimsel uzaklığın hesaplanması
6. PCR ürününün saflaştırılması ve dizisinin çıkarılması
• Şekil 11.12 Bir mikroorganizmaya ait saf bir kültürün polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanılarak yapılan ribozomal RNA dizilemesi. 16S rRNA geni çoğaltılır ve Sanger yöntemiyle dizisi çıkarılır (Kısım 7.8). Eklenen primerler, 16S rRNA'nın korunmuş dizilerine komplementerdir (Bkz Şekil 11.11c).
bir dizinin diğerinden daha kısa olduğu bölgelerdeki gerekli boşluklar doldurulmalıdır. Sıralanmış diziler daha sonra bir ağaç oluşturma programına taşınarak karşılaştırmalı analizleri yapılır. En çok kullanılan ağaç oluşturma algoritmaları uzaklık ve parsinomidir. Uzaklık metodu kullanıldığında, diziler sıralanır ve sonra bilgisayar kayıtlarında dizi verilerinin her bir pozisyonundaki farklılıklar belirlenerek evrimsel uzaklık (ED) hesaplanır (Şekil 11.13»). Bu verilerden, veri setinde bulunan herhangi iki dizi arasındaki ED'yi gösteren bir uzaklık matriksi oluşturulabilir. Daha sonra belirtilen herhangi bir bölgede birden fazla değişiklik olma ihtimali düşünülerek ED'ye istatistiksel bir düzeltme faktörü verilir (Şekil 11.13). Bu hesaplar yapıldığında, ağaçtaki çizgi uzunluklarının evrimsel uzaklıkla doğru orantılı olduğu bir filogenetik ağaç oluşturulur (Şekil 11.13c,d). Filogenetik analizlerde kullanılan diğer popüler yöntem ise parsinomidir. Parsinomi, evrimsel yayılış esnasında ortak bir atadan iki farklı nesle ayrılmak için meydana gelmesi gereken minimum miktardaki dizi değişikliklerinin hesaplanması temeline dayanan evrimsel ağaçlar oluşturur. Uzaklık programları gibi bu yöntem de belirli bir veri setindeki dizi farklılıklarının sayılarının toplanma-
Yelpaze şeklinde
—ız ı
0.29
(c) Filogenetik ağaç
İki parçaya ayrılmış (d) Ağaç topolojileri
• Şekil 11.13 16S rRNA dizileri kullanılarak filogenetik uzaklık ağaçlarının hazırlanışı. Örneklemek amacıyla sadece kısa diziler gösterilmiştir. Evrimsel uzaklık ED (b) herhangi iki organizmadaki benzer olmayan dizilerin yüzdesi şeklinde hesaplanır. Düzeltilmiş ED, orjinal genotipte oluşabilecek geri mutasyonlan veya aym bölgede oluşabilecek ileri mutasyonlan hesaba katmak için gerekli istatistiksel bir düzeltmedir. Ağaç (c) veriye en çok uygunluk gösteren bilgisayar analizi ile oluşturulmuştur, (d) Yelpaze şeklinde veya iki parçaya aynlmış şekilde olan farklı biçimdeki filogenetik ağaçlar. Her iki biçimde de herhangi iki organizmayı ayıran dallann toplam uzunluğu, evrimsel uzaklıklan ile doğru orantılıdır.
sını gerektirir, ancak algoritma analizleri oldukça farklı yorumlar. Parsinomi ile oluşturulan filogenetik ağaçlar uzaklık ağaçlarına benzerlik gösterse de, bazen parsinomik bir ağaçtaki branşlaşma sırası, tamamen aynı verilerle oluşturulan uzaklık ağaçlarına göre farklılıklar sergileyebilir. Organizmaların evrimsel ilişkisini cevaplandırmak için sonuç olarak tek bir filogenetik ağaç yeterli değildir. Oluşturulan herhangi bir ağaç, bir grubun doğru olarak filogenisine sadece yakın bir tahmin olarak düşünülebilir.
312 • Bölüm 11 • Mikrobiyal Evrim ve Sistematik
11.6 Kavramların Çözden Geçirilmesi Karşılaştırmalı ribozomal RNA dizilemesi günümüzde rutin olarak uygulanan bir yöntemdir. 16S rRNA'yı kodlayan genin çoğaltılması, dizilemesi ve dizinin diğer referans dizilerle analizini kapsar. Uzaklık ve parsinomi, ağaç oluşturmaya yarayan iki önemli algoritmadır.
prob adı verilen spesifik nükleik ait problarmın dizayn edilmesinde kullanılmaktadır. Filogenetik Problar ve FISH
Probun bir karışımdaki komplementer nükleik asite hibridize olmakta kullanılan ve etiketlenebilen bir nükleik asit zinciri olduğunu yeniden hatırlaya• Evrimsel uzaklık nedir? lım (Kısım 7.7). Problar genel veya spesifik olabilir. • Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) karşılaştırmalı ribozoMesela domaini ne olursa olsun tüm organizmamal RNA dizilemesinde nasıl kullanılır? lardaki ribozomal RNA'ların korunmuş dizilerine bağlanan evrensel ribozomal RNA probları sentezlenebilir. Bunun aksine sadece Bacteria domainine Sinyal Dizileri, Filogenetik Problar ait türlerin hücrelerinde bulunan RNA'lara özgü ve Mikrobiyal Topluluk Analizleri sinyallerle reaksiyona girebilecek özel problar da dizayn edilebilir (Tablo 11.1). Benzer şekilde arcSSU rRNA dizilemesi, bu tekniğin kullanıldığı pek haealara ve eukaryatlara özgü problar da sadece çok yeni araştırmanın gelişmesine öncülük etmişArchaea ve Eukarya türleri ile reaksiyona girecektir. tir. Buna sinyal dizileri ve ribozomal RNA probCins veya familya (Bkz Kısım 11.10) gibi bir domalarmın, mikrobiyal ekoloji ve tıpta kullanılması in içerisindeki belirli temel gruplar bile özel probörnek verilebilir. lar ile hedeflenebilmektedir. Prob floresan bir boya ile işaretlendiğinde, probun hücresel ribozomlara bağlandığı mikroskobik Sinyal Dizileri olarak görülebilir (Şekil 11.14*). Hücreleri uygun Ribozomal RNA dizilerinin bilgisayar analizleri, reaktiflerle muamele ettiğimizde, membran gebelirli grup organizmalara özgü kısa oligonükleotitçirgen hale gelir ve prob/boya karışımının hücre ler olarak bilinen sinyal dizilerini ortaya çıkarmışiçine girişine izin verir. Probun direk olarak ribotır. Mesela hücresel yaşamın her bir domaini için zomlardaki ribozomal RNA ile hibridizasyonunspesifik sinyal dizileri olduğu bilinmektedir (Tablo dan sonra, hücreler benzer şekilde floresan özellik 11.1). Bunun yanısıra, bir domain içerisindeki spekazanır ve bir floresan mikroskobu altında incelesifik bir grubu veya bazı durumlarda belirli bir cinnebilir (Şekil 11.14, Bkz Şekil 11.15» ve 11.7). Kısa si ve hatta tek bir türü tanımlayan sinyaller olduadı FISH olarak bilinen bu tekniğe floresan m-situ ğu bilinmekte olup, bu sinyaler sıralanmış dizileri Mbridizasyon denilip, kültüre edilmiş veya doğal bilgisayarda denetleyerek de belirlenebilir. Sadece ortamlarındaki hücrelere direk olarak uygulanabibulundukları canlıya özgü olmaları sebebiyle sinlir ("in situ" terimi "ortamın içerisinde" anlamına yal dizileri oldukça kullanışlıdır. Buna örnek olagelir). Kısacası FISH filogenetik bir boyadır. rak, sinyal dizilerinin yeni izole edilmiş veya daha FISH teknolojisi mikrobiyal ekoloji ve klinik önce yanlış sınıflandırılmış organizmaları doğru tanıda sıkça kullanılmaktadır. FISH ekolojide mikfilogenetik gruplara yerleştirmeye yardımcı olması roskobik teşhisde ve organizmaları yaşam ortamverilebilir. Ancak sinyal dizileri en çok filogenetik larında direk olarak izlemek amacıyla kullanılabi-
I
Tablo 11.1 Yaşamın üç do m a ininii tanımlayan 16S veya 18S rRNA'daki sinyal dizileri Yer alma oranlan
0
Oligonükleotit sinyalleri*
Tahmini pozisyonu
Archaea
Bacteria
CACYYG
315
0
>95
Eukarya o>
AAACUCAAA
910
3
100
0
AAACUUAAAG
910
100
0
100
YUYAAUUG
960
100
<1
100
CAACCYYCR
1110
0
>95
0
UCCCUG
1380
>95
0
100
UACACACCG
1400
0
>99
100
CACACACCG
1400
100
0
o
1 h c
Y, herhangi bir pirimidin; R, herhangi bir pürin. 16S rRNA numaralama şeması için Şekil ll.lıc'yebakınız. Yer alma oranlan, her bir domainde incelenmiş organizmalar arasında o diziyi içeren organizmaların oranlarını ifade eder.
11.7 • Sinyal Dizileri, niogenetik Problar ve Mikrobiyal Topluluk Analizleri • 313
• Şekil 11.14 Floresan etiketli ribozomal RNA problari: Filogenetik boyalar, (a) Bacillus megaterium hücreleri ile (çubuk şeklindeki Bacteria üyesi) bir maya olan Saccharomyces cerevisiae'iun (oval şekilli bir Eukaryatik hücre) faz-kontrast fotomikrografı (prob kullanılmamışır). (b) Aynı alanda hücreler san-yeşil bir evrensel rRNA probu ile boyanmıştır (bu prob herhangi bir domaindeki bir türle reaksiyona girer), (c) Aynı alan eukaryatik bir prob ile boyanmıştır (sadece S. cerevisiae hücreleri reaksiyona girer). B. megaterium hücreleri yaklaşık 1.5 /im ve S. cerevisiae hücreleri ise yaklaşık 6 /JLTC\ çapındadır. Genetik boyalar, Kısım 18.4'de rRNA dizilerini hedef almayanlar da dahil edilerek daha detaylı olarak anlatılmıştır.
lir. FISH aynı zamanda mikrobiyal toplulukların komposizyonunu direk olarak mikroskopta belirlemede kullanılan bir yöntemdir (Şekil 11.15 ve ooo Kısım 18.4). Klinik tanıda, hasta numunelerinden spesifik patojenlerin hızlı teşhisi amacıyla kullanılmaktadır. Bu teknik, kültüre edilmiş bir organizmaya ihtiyaç duyar. Bunun yanısıra bir numunenin mikroskobik olarak incelenmesi ile tehlikeli bir patojenin varlığı doğrulanabilir. Klinik tanıda bu daha hızlı bir teşhise ve mikrobiyal enfeksiyondan yakınan bir hastanın tedavisine olanak sağlar. Bunun aksine tipik izolasyon ve teşhis yöntemlerinin tamamlanması en az 24 saat alır ve bu süre daha da uzayabilir. Mikrobiyal Topluluk Analizleri
PCR ile çoğaltılacak ribozomal RNA genlerini, mutlaka laboratuvarda geliştirilmiş saf bir kültürden elde edilmek zorunluluğu yoktur. Doğal bir mikrobiyal topluluğun filogenetik görüntüsü, Bölüm 18'de daha detaylı bir şekilde anlatılacak olan
• Şekil 11.15 Aktive edilmiş bir atık su granülünde, nitrifikasyon yapan bacterialan görünür hale getirmek için filogenetik boyaların kullanımı. (Sol) Faz-kontrast fotomikrografı. (Sağ) Aynı alanın filogenetik boyalar uygulandıktan sonraki renkli fotomikrografı. Kırmızı floreasan ışık yayan prob, amonyak okside eden bacterialann 16S rRNA'sındaki bir sinyal diziye (Bkz. Tablo 11.1) özgü iken, yeşil floresan ışık yayan prob ise sadece nitriti okside eden bacterialarda bulunan bir diziye özgüdür. Amonyak ve nitrit oksidasyonu yapıp, filogenetik olarak birbirleriyle yakın akraba olan bu bacterialar, Bacterialann iki farklı üyesidir («fi^öKısım 12.3 ve 17.12) ve birbirine bağlı bir seri kemolitotrofik reaksiyonu gerçekleştirirler (öO&Kısım 19.12).
yöntemleri kullanarak, o toplulukta bulunan tüm üyelerin SSU ribozomal RNA'larmı kodlayan genleri PCR ile çoğaltarak da elde edilebilir. Bu genler kolaylıkla düzenlenebilir, dizilebilir ve sıralanabilir. Bu verilerden, topluluktaki farklı ribozomal RNA'ların varlığını gösteren ve "çevresel" dizilerden oluşturulan filogenetik bir ağaç geliştirilebilir. Hiç kültüre edilmemiş veya tanımlanmamış olsalar bile, bu ağaç ile yeni ve özel organizmalar tanımlanabilir. Bu tür mikrobiyal topluluk analizleri bugün mikrobiyal ekolojiye önemli bilgiler kazandırmış ve mikrobiyal topluluk yapıları ile mikrobiyal ilişkiler hakkında pek çok anahtar özelliği ortaya çıkarmıştır (bu konunun daha detaylı tartışıldığı aoe»Börüm 18'e bakınız). 11.7 Kavramların Gözden Geçirilmesi Sinyal dizileri bir ribozomal RNA molekülü içerisinde bulunan kısa oligonükleotitlerdir ve belirli biii'organizmamn veya ilişkili organizma grubunun teşhisi için çok seçicidir. Sinyal dizileri özel filogenetik probların oluşturulmasında kullanılabildiği gibi, FISH veya mikrobiyal topluluk analizleri için de kullanışlıdır. •
Tablo 11.1'deki dizi verilerini kullanarak bir Archaea hücresini bir Bacteria hücresinden ayırabilecek spesifik bir filogenetik prob seçiniz.
•
Olignükleotit problar, mikroskop altında nasıl görünür hale getirilir? Bu tekniğin adı nedir?
j
314 • Bölüm 11 • Mikrobiyal Evrim ve Sistematik
MİKROBİYAL EVRİM
Ribozomal RNA Dizilerinden Elde Edilen Mikrobiyal Filogeni Daha önceleri biyologlar canlılar dünyasını beş alem içerisinde gruplandırıyordu: bitkiler, hayvanlar, funguslar, protistalar ve monera (prokaryotlar).
Moleküler filogeni, beş alem sisteminin beş temel evrimsel soyu temsil etmediğini ortaya çıkarmıştır. Bunun yerine, daha önce 2. Bölüm'de de belirtildiği üzere yeryüzündeki hücresel yaşam, ikisi kendine has şekilde mikrobiyal ve sadece prokaryotik hücrelerden oluşan domain adı verilen üç temel soy üzerinden evrimleşti. Üçüncü soy ise eukaryatları içerip (Şekil 11.6) monera hariç özgün beş alem sistemininin hepsini kapsar. Prokaryotik gruplar Bacteria ve Archaea'dir; ökaryotik domain Eukaryatlar olarak adlandırılır (Şekil 11.16»). Bu terimler yaşamın üç domainini temsil eder ki domain biyolojik taksonların en üst seviyesidir. Bu sebeple bitkiler, hayvanlar, funguslar ve protistaların hepsi Eukarya domaini içerisindeki alemler olarak kabul edilir. Evrensel Yaşam Ağacı
Evrensel yaşam ağacı (Şekil 11.16) yaşamın bir haritasıdır. Tüm organizmalara ait hücrelerin evrimsel tarihlerini resmeder ve üç domaini açıkça ortaya çıkarır. Evrimsel ağacın kökü, yeryüzünde mevcut tüm yaşam formlarının ortak bir atayı yani
evrensel atayı paylaştığı evrimsel tarihteki bir noktayı temsil eder. Yapılam tüm genom analizleri, Bacteria veya Eukarya'larda karşılığı olmayan ve çok miktarda tamamlayıcı gene sahip Archaea kavramını olduğu kadar üç domain kavramını da genel olarak doğrulamıştır. Ancak eşdeğer öneme sahip diğer bir veri ise Bacteria, Archaea ve Eukarya türleri arasında pek çok genin paylaşıldığıdır. Peki evrensel ata kavramı ışığı altında, karmaşık görünen bu bulgular arasında nasıl uzlaşı sağlanabilir? Bu bulgulara cevap verebilmek için ortaya atılmış varsayımlardan birisi, ilk domainler gelişmeden önce yatay (horizontal) gen transferinin yaygın olduğu fikrini benimser (ö°ö>Börüm 10). Bu zaman zarfında, transkripsiyon ve translasyon gibi temel hücresel fonksiyonlarda görev alarak hücreye olağanüstü imkanlar sağlayan proteinleri kodlayan genler, ortak bir atadan gelen ilkel bir hücre popülasyonu arasında rastgele aktarılmıştır. Bu hipotezin doğru olduğu farzedildiğinde, genom analizlerinde domainine bakılmaksızın tüm hücrelerin neden temel işlevsel genleri müşterek olarak paylaştığını ve beklendiği üzere tüm hücrelerin ortak bir ataya sahip olduğu fikrini açıklamaktadır (Şekil 11.16).
Peki tüm genom dizilerinde gözlenen genetik farklılıklar neydi? Daha sonra ortaya atılan varsayıma göre muhtemelen zamanla habitatların seçici kolonizasyonlarından dolayı (üreme izolasyonları oluşturmak suretiyle) kısıtlanmamış yatay aktarıma karşı sınırlamalar veya serbest genetik değişimi bir şekilde önleyen yapısal veya enzimatik (restrikÖKARYOTLAR
PROKARYOTLAR
Bacteria
Eukarya
Archaea Kükürtsüz yeşil bakteriler
Mitokondri
Entamoebae Euryarchaeota Methanosarcina
Crenarchaeota---m\ Proteobacteria Kloroplast Flavobacteria
Cyanobacteria
Thermoproteus
M e t h g
Hayvanlar
Ekstrem
\
Pyrodictium \ coccus \ \. Thermococcus \ Denizel «\\ Pyrolobus Crenarchaeota
Akışkan küfler
\ \
/ /^Jbe\ Thermoplasma Flagellatlar
Methanopyrus
Trichomonadlar
Thermotoga Nanoarchaeota Thermodesulfobacterium Aquifex
Microsporidia Diplomonadlar (Giardia)
• Şekil 11.16 Karşılaştırmalı ribozomal RNA dizilemelerinden elde edilen evrensel iilogenetik ağaç. Her domainde sadece birkaç anahtar organizma veya nesil gösterilmiştir. Daha detaylı domain ağaçlan için Şekil 12.1, 13.1 ve 14.20'yi inceleyiniz. Üç domainden sadece ikisi (Bacterialarve Archaealar) prokaryotik temsilcileri kapsar.
11.8 • Ribozomal RNA Dizilerinden Elde Edilen Mikrobiyal Filogeni • 315
siyon endonükleazlar gibi) kısıtlamalar getirilmiştir. Bunun sonucunda, daha önceleri genetik olarak rastgele çoğalan popülasyonlar, ilk evrimsel soylarından yavaşça seçilip ayrılmaya başlamışlardır (Şekil 11.16). Nesiller evrimleşmeye devam ettikçe, her bir grup içerisindeki kendine özgü biyolojik karakterler de sabit hale gelmeye başlamıştır. Mikrobiyal evrimleşmeden yaklaşık 3.8 GY (Şekil 11.10) sonra bugün, hücresel evrimleşmenin muhteşem sonuçlarını görüyoruz: bir taraftan pek çok ortak özelliği paylaşırken, diğer taraftan kendilerine ait farklı evrimsel hikayeler sergileyen hücresel yaşamın üç domainini.
çıkmıştır. İlgi çekici olan diğer bir konu da, bu organizmaların mitokonriler gibi yaşamak için bitki («»»Kısım 19.21 ve 19.22) ve hayvan («»aKısım 12.13 ve 27.3) hücrelerine ait hücre içi bir ortama ihtiyaç duymalarıdır. Kloroplast ise hem siyanobacterialar hem de kloroplastın oksijenik fotozentez (Kısım 17.5) yapabilmesinden de tahmin edilebileceği gibi, siyanobacterial şubeden köken almıştır (Şekil 11.16). Archaea
Flogenetik açıdan bakıldığında Archaea domaini dört şubeden oluşur: Crenarchaeota, Euryarchaeota, Korarchaeota ve Nanoarchaeota (Şekil 11.16). Thermoproteus, Pyrolobus ve Pyrodictium gibi cinsleİlkellere Karşı Modern Organizmalar ri içeren Crenacrhaeotlar, evrensel ağacın köküne Bugün yaşayan ve evrensel ağaçta belirtilen orgadoğru en yakın branşlaşan şubedir (Şekil 11.16). nizmaların (Şekil 11.16) hiç biri ilkel organizmalar Onları metan üreticisi (metanogenik) prokaryotlar değildir. Hâlâ var olan tüm yaşam formları, ekove ekstrem halofilleri içine alan Euryarchaeota talojik nişlerinde başarılı ve iyi adapte olmuş modern kip eder ki asidofilik, termofilik, hücre duvarından organizmalardır. Bu organizmalardan hipertermoyoksun bir prokaryot olan Thermoplastna bu son filik prokaryotlar (optimal gelişme sıcaklığı >80°C) grupla uzaktan ilişkilidir (Şekil 11.16). gibi bazıları gerçekten de fenotipik olarak ilkel orgaSadece çevresel örneklerden alman ribozomal nizmalara benzeyebilmektedir. Örneğin Aquifex ve genlerin topluluk analizleri ile ortaya çıkarılabilmiş Metanopyrus sırasıyla Bacteria ve Archaea domainleri Crenarchaeota soyunda (Şekil 11.6 ve GOÖI3.I) bazı içerisindeki ağacın köklerine oldukça yakın branşlabranşlaşmalar vardır (Bkz Kısım 11.7,18.5 ve 18.6). şır (Şekil 11.16). Bu organizmaların her ikisi de, ilkel Bu dizilerin, sadece sıcak su kaynakları ve derin dünyada çok daha sıcak koşullarla karşı karşıya kalan denizlerdeki hidrotermal bacalar gibi Crenarchaeakrabaları gibi çok yüksek sıcaklıklarda gelişebilirler otlarm bilinen habitatlarından değil, aynı zamanda (c«aKısım 12.38 ve 13.6). Bununla birlikte bu erken sıcaklığı buralardan oldukça düşük olan Güney Kutbranşlaşan organizmalar da ilkel değildir. Sadece bu deniz sularına ait okyanuslarda yaşayan organizProteobacterialar (Bacteria) veya ekstrem halofiller malardan da elde edilmiş olması ilginçtir (««»Kısım (Archaea) gibi yaşam ağacında daha sonra branşlaş- 13.8). Diğer Crenarchaeota dizileri ise toprak ve göl mış organizmalara göre fenotipik olarak daha basit suyu örneklerinin topluluk analizlerinden elde edilyapıda olan modern hücrelerdir (Şekil 11.16). miştir. Soğuğa adaptasyon göstermiş bu Crenacrhaeotanın, Kısım 13.8'de daha detaylı inceleyeceğiz. Bacteria Soğuğa adapte olmuş Crenarchaeotlara benzer şekilde Archaea'mn diğer bir şubesi olan KorarchaBacteria arasında bugüne kadar en az 40 adet eota da, Yellowstone Doğal Parkı'nda (VVyoming, şube (çoğulu şubeler) ortaya çıkarılmış ve Şekil ABD) bulunan ve nadir görülen bir sıcak su kay11.16'daki evrensel ağaçta önemli olan birkaçı gösnağına (Obsidian Havuzu) ait mikrobiyal topluluk terilmiştir. Pek çok şube sadece evrimsel dizilerinden tanımlanabilmiştir (Bkz Kısım 11.7 ve &*s> analizlerinden teşhis edilmiştir. Korarchaeota'ların Şekil 12.1). Bacteria domaini içerisindeki bu soylar- da (filogenetik boyama yoluyla teşhis edilebilir, Şekil 11.17*) içinde bulunduğu karışık kültürler dan bazıları daha önceleri morfolojik ve fizyolojik karakterler gibi bazı fenotipik özellikleri ile ayırt edilebiliyordu ki, sırasıyla spiroketler ve siyanobacterialar buna iyi birer örnektir. Ancak türlerden oluşan şubelerin çoğu filogenetik açıdan bakıldığında spesifik olarak oldukça ilişkili görünseler de, güçlü fenotipik benzerliklerden yoksundurlar. Proteobacterialar buna iyi bir örnek olup, şu anki mikrobiyal fizyoloji ile ilgili bilgilerimizin tamamı, bu grup içerisindeki bilinen mevcut fizyolojik özelliklerin bir karışımıdır (<**»Bölüm 17). Bu da bize fizyoloji ve filogeninin birbiriyle çok ilişkili olma* Şekil 11.17 Korarchaeota hücrelerinin filogenetik bir dığını göstermektedir. boya ile teşhis edilmesi, (a) Aktiileştirilnüş korarkot hücrelerim Eukaryatik organellerin Bacteria domaininden gösteren faz-kontrast mikrografı (oklar), (b) (a)'da görülen aynı alaköken aldığı açıktır. Evrensel ağaç üzerinde göstenın, Korarchaeota 16S rRNA'sına özgü bir sinyal diziye (Bkz Kısım rildiği üzere mitokondriler, Bacteria'mn temel bir 11.7) göre dizayn edilmiş filogenetik bir boyayla boyandığı floregrubu olup (Şekil 11.16), Rhizobium ve riketsialarla san fotomikrogran. Bu bölgede çubuk şeklindeki iki uzun hücre kırmızıya boyandığından dolayı korarkottur. akrabalık gösteren Proteobacterialar'dan ortaya
316 • Bölüm 11 • Mikrobiyal Evrim ve Sistematik
laboratuvarda sürekli olarak geliştirilebilmektedir. Laboratuvar kültürlerinden de anlaşılmıştır ki, Korarchaeota hipertermofiliktir. Bu nedenle diğer hipertermofilik Crenacrhaeota benzer şekilde metabolik özellikler gösterebilmektedirler (c^Kısım 13.8-13.10). Korarchaeotaların altında uzanan Nanoarchaeota, Nanoarchaeum adlı tek bir organizma ile temsil edilen küçük bir grubu kapsar. Bu küçük bacteria Ignicoccus adlı diğer bir archaeanın paraziti olup, prokaryotlar arasında bilinen en küçük genoma sahiptir (ooöKısım 13.11 ve 15.4). Nanoarkot'ları ve tüm Archaea şubelerini 13. Bölüm'de daha detaylı göreceğiz. Eukarya
Eukaryatik domaini türlerinin filogenetik ağacı, fonksiyonel olarak 16S rRNA'ya eşdeğer olan eukaryatik stoplazmik ribozomlardaki 18S rRNA'sının karşılaştırmalı analizlerinden geliştirilmiştir. İlk eukaryatlar günümüz mikrosporidia ve diplomonadlarına benzerlik gösterebilir. Bu organizmaların hepsi mikroorganizmalardan insanlara kadar çeşitli eukaryatik grupların temsilcileri ile beraber yaşayan zorunlu parazitlerdir (örneğin Giardia patojeni (öOöKısım 28.6) diplomonad grubunun bir üyesidir). İlginç olan mikrosporidia ve diplomonadlarda olmamasına karşın, bu organizmaların zarla çevrili bir çekirdeğe sahip olmasıdır. Bu bağlamda ilk kararlı endosimbiyontlar olarak kabul edilen hücre tipine benzerler (Bkz Şekil 11.9 ile ö°öKısım 14.5 ve 14.9). (Mikrosporidiaları filogenetik açıdan doğru bir yere yerleştirmede pek çok sorun ortaya çıkmıştır ve bunlar Kısım 14.9'da tartışılacaktır). Filogenetik olarak çok hücreli organizmalardan türemiş Eukarya' dan en geniş ve yapısal olarak en karmaşık olanları bitkiler ve hayvanlardır (Şekil 11.16). Fosil kayıtları ile Eukarya'lavın filogenetik ağaçları karşılaştırıldığında, hızlı evrimsel yayılımın 1.5 milyar yıl öncesine dayandığı gözlenmiştir. Jeokimyasal kanıtlar, Dünya tarihindeki bu sürecin atmosferdeki oksijen seviyesinin belirgin miktarda biriktirildiği dönemde olduğunu işaret eder (Şekil 11.8). Oksijenik koşulların ve bunun sonucunda bir ozon tabakasının oluşması [kolonizasyon için yüzeydeki habitat sayısının çok arttığı], büyük bir ihtimalle Eukarya'larm hızla yayılımını tetikleyen en önemli olaydır. Mikrobiyal Eukarya'nın temel gruplarını ve biyolojilerini 14. Bölüm'de inceleyeceğiz.
•m11.8
Kavramların Gözden Geçirilmesi
Yeryüzündeki yaşam, domain adı verilen ve ortak bir atadan gelen üç ana nesil üzerinden evrimleşti. Her domain çok sayıda şube içerir. Bacteria ve Archaea'yı içine alan iki domain prokaryotik olarak kalırken, üçüncü nesil olan Eukarya modern eukaryatik hücreleri oluşturdu. • İlkel Dünya'nın sıcak olduğu düşüncesini evrensel ağaç nasıl destekler? •
Endosimbiyoz hipotezini evrensel ağaç nasıl destekler (Bkz Şekil 11.9)?
Canlı Domainlerinin Özellikleri Ana domainler (Bacteria, Archaea ve Eukarya) kar-
şılaştırmalı ribozomal RNA dizilemesine bağlı olarak (genetik ölçütle) belirlenmiş olsa da, her domain belirli fenotipik özellikleri ile de karakterize edilebilir. Bu karakterlerin bazıları bir domaine özgü iken, diğerleri üç domainden ikisinde bulunur. Bu kısımda filogenetik öneme sahip bazı temel fenotipik özellikleri inceleyeceğiz. Hücre Duvan
Hemen hemen tüm Bacteria peptidoglikandan oluşan hücre duvarına sahiptirler (a°CtKısım 4.8). Bilinen istisnalar sadece hücre duvarı proteinden oluşan Planctomyces-Pirella grubu üyeleri («^»Kısım 12.28) ile hücre duvarından yoksun MycoplasmaChlamydia grubudur («»oKısım 12.21 ve 12.27). Bu nedenle peptidoglikan Bacteria türleri için "anahtar" bir molekül olarak düşünülebilir (peptidoglikandan varlığı araştırılırken tespit edilen aslında muramik asittir çünkü, peptidoglikana özgü olan odur; Bkz Tablo 11.13). Eukaryat ve Archaea hücreleri peptidoglikandan yoksundur. Hücre duvarı içeren Eukaryatlar'da ise duvar tipik olarak selüloz veya kitinden oluşur (cK^sBölüm 14). Archaea da ise hücre duvarı kimyasında bir peptidoglikan analoğu olan yalancı peptidoglikandan, polisakkarit, protein veya glikoproteinden oluşan duvarlara kadar çeşitli tipte duvarlar olduğu bilinmektedir (<3°t>Kısım 4.8). Mikrobiyal hücre duvarlarının kimyasal yapısında büyük çeşitlilikler bulunur ama sonuçta Bacterialar'i Archaealar'dan ayırmakta kullanılan en uygun yol peptidoglikanın varlığı veya yokluğudur. Lipitler
Membran lipitlerinin kimyasal yapısı, Archaea'yı Bacteria'dan ayırt etmede kullanılan belirleyici bir niteliktir. Bacteria ve Eukarya gliserol molekülüne ester bağıyla bağlı yağ asitlerinden oluşan membran lipitleri sentezlerler (Şekil 11.18•). Yağ asitlerinin yapısı değişkenlik gösterse de, ester bağlı gliserol, niteliği belirleyen anahtar moleküldür. Bunun aksine archaeal lipitler eter bağlı moleküllerden oluşur (Şekil 11.18). Ester bağlı lipitlerde yağ asitleri genellikle düz zincirli (doğrusal) moleküllerken, Archaea 'da yağ asitleri yerine ya fitanil ya da bifitanil tipindeki uzun zincirli, dallanmış hidrokarbonlar eter bağıyla gliserole bağlanır. Lipitlerin filogenetik desenleri ile ilgili bir kaç istisnai durum bilinmektedir. Örneğin sülfat indirgeyen termofilik bacteria Thermodesulfobacterium (cK^Kısım 12.36), diğer bazı sülfat redükleyen bacterialar O^&Kısım 12.18) ve Propionibacterium türleri eter bağlı lipitler içerirler. Ancak bunun tersi doğru değildir. Hiç bir Archaea türünün ester bağlı lipitler içerdiği görülmemiştir. Özellikle hipertemofilik türleri kapsayan bazı Archaea üyelerinin tüm membran yapısı düşünül-
11.9 • Canlı Domainlerinin Özellikleri • 317 Ester CH OH O
ı
2
5
aslc
ıı r~
Ec
" yan zinciri
!
HC-O-C-CH 2 -(CH 2 ) 1 3 -CH 3 CH2OH Bacteria, Eukarya Eter
Fitanil yan zinciri
H
CH,OH I
H ı
H I
CH 2 OH
CH 3
CH 3
Hs
I Sa
Sc
H
,
HC-O-C-CH2-C-(CH2)3-C-(CH2)3-C-(CH2)3-C-CH3 CH 3
CH 3
Archaea
• Şekil 11.18 Bacteria, Eukarya ve Archaea'daki lipitler. Bacteria ve Eukaryat'da lipitler glıserolün ester bağıyla bağlandığı yağ asitleri (palmitik asit gösterilmiştir) içerirler. Archaealar'daki yan zincirler, gliserolün eter bağıyla bağlandığı dallanmış hidrokarbonlardır (fitanil, C20, gösterilmiştir). Fitanil izoprenden sentezlenir (f^Şekil 4.18c).
düğünde, çift tabakalı lipit yerine tek tabaklı bir lipit yapısı görülür (ö°e>Kısım 4.5 ve Şekil 4.20). Bu organizmaların geliştiği yüksek sıcaklıklarda, tek tabakalı bir lipitin denatürasyonu çift tabakalıya göre daha az olur. Gliserol ve hidrokarbon zincirleri arasındaki eter bağları (Şekil 11.18) tek tabaka ile inşaa edilen membranla birleştiğinde, bu ekstremofilik Archaealar'm kendi habitatlarındaki olumsuz koşullardan korunmaları membranları ile sağlanır.
• Şekil 11.19 RNA polimeraz ve filogeni. Üç domainin, temsilcilerine ait RNA polimerazlar: Ec, Escherichia coli (Bacteria), Hs, Halobacterium salinarum (Euryarchaeota, Archaea), Sa, Sulfolobus acidocaldarius (Crenarchaeota, Archaea), ve Sc, Saccharomyces cerevisiae (Eukarya). Saflaştınlan RNA polimeraz billeşenleri poliakrilamid jel elektroforezinde ayrılmıştır. En büyük polipeptit alt birimleri üstte, en küçük alt birimler ise alttadır. Sadece Bacteria üyesi basit RNA polimeraza (dört polipeptitli) sahiptir.
RNA Polimeraz
DNA'nın kalıp, RNA'mn ürün olarak ortaya çıktığı transkripsiyon tüm organizmalarda DNA'ya bağımlı RNA polimeraz ile yürütülür. Bacteria hücreleri, oldukça basit dört boyutlu yapıya sahip tek tip RNA polimeraz içerirler. Bu polimeraz, a, /3, (3\ a adlı dört polipeptidin sırasıyla 2:1:1:1 oranında birleşmesiyle aktive olan klasik bir RNA polimerazdır (Şekil 11.19»), (c^Kısım 7.10). Archaeal RNA polimerazları yapısal olarak Bacteria polimerazlarından çok daha komplekstir. Archaea türlerinin RNA polimerazları sekiz veya daha çok polipeptit içerip, biçim olarak Eukarya polimerazlarına daha çok benzerlik gösterirler (Şekil 11.19). Eukarya tik RNA polimerazlar (üç adetttir) 10-12 polipeptid içerir ve peptidlerin boyutları çoğunlukla hipertermofilik Archaea türleri ile uyum gösterir (Şekil 11.19). Filogenetik sinyaller açısından bakıldığında, a2/3/3V polimerazı Bacteria için tanımlayıcı olup, dört alt birimden daha fazla alt birim içeren RNA polimerazlar filogenetik olarak kesin bir belirleyici değildir; sadece Bacteria'ya ait olmadığı söylenebilir. Protein Sentezinin Özellikleri Ribozomal RNA dizilerindeki farklılıklar ve çok çeşitli protein sentezi faktörlerinin varlığı nedeniyle, üç domainin temsilcilerindeki protein sentezleme ünitelerinin de değişiklik göstermesi şaşırtıcı değildir.
Archaea ve Bacteria ribozomları aynı büyüklükte olsalar da (70S, eukaryatların stoplazmalarındaki 80S ribozomları ile karşılaştırıldığında), archaeal protein sentezinin pek çok basamağı Bactera'dakinden çok Eukaryatlar'mkine benzerlik gösterir. Translasyonun her zaman başlangıç kodonu adlı tek bir kodonla başladığını hatırlayalım. Bacteria'da bu başlangıç kodonu (AUG), modifiye bir metiyonin kökü olan /orm//-metiyonin adlı öncü bir tRNA ile birleşmeye gereksinim duyar (c^Kısım 7.16). Bunun aksine eukaryatlarda ve Archaea'da öncü tRNA modifiye olmamış bir metiyonin taşır. Corynebacterium diphtheriae tarafından üretilen egzotoksin, eukaryatik protein sentezinin potansiyel bir inhibitörüdür; çünkü ribozomun mRNA üzerinde yer değiştirmesi esnasında ihtiyaç duyulan bir uzama faktörüne ADP-riboz ekler ve modifiye olmuş uzama faktörü inaktive olur (<3°öKısım 21.10). Difteri toksini ise Bacteria türlerinde etkili değilken Archaea türlerinin protein sentezini inhibe eder. Bacteria'da protein sentezini spesifik olarak etkileyen pek çok antibiyotik, archaeal ve ökaryal protein sentezini etkilemez. Üç domaine ait temsilcilerin, çeşitli protein sentezi inhibitörlerine karşı duyarlılıkları Tablo 11.1'de gösterilmiş (o°csKısım 7.16) olup, antibiyotikler farklı domaine ait organizmalardaki protein sentezini hangi yolla engellediğine bağlı olarak gruplandırılmıştır.
318 • Bölüm 11 • Mikrobiyal Evrim ve Sistematik
Tablo 11.2 Uç domaîne ait temsilcilerin çeşitli protein sentezi inhibîtÖrlerine karşı duyarlılıkları Archaea Euryarchaeotalar Antibiyotikler Fusidik asit, sparsomisin Anisomisin, narsiklasin Siklohegzamit Eritromisin, streptomisin, kloramfenikol Virjiniyamisin, pulvomisin Neomisin, puromisin Rifampisin
Etki şekli
3
Bacteria
Eukarya
Escherichia coli
Saccharomyces cerevisiae
Crenarchaeota
Mcthanobacterium Sullolobus thermoautotrophicum acidocaldarius +
Uzama basamaklarım engeller Peptidil transferini + engeller Başlamayı bloke eder Hata sıklıklarını ve diğer etkileri arttırır Uzama basamakları+ nı engeller Erken sonlanmaya + neden olur RNA polimerazm /3 alt birimini inhibe eder a + protein sentezinin (ve büyümenin) engellendiğini gösterir.
Bu sonuçlar göstermiştir ki, Archaea ve Eukarya hücrelerinin ribozomal proteinleri işlevsel olarak birbirlerine Bacteria'ya ait ribozomal proteinlerden çok daha benzerdir. Bu da domainlerin evrensel yaşam ağacındaki pozisyonlarını birbirlerine yakınlık derecelerine bağlı olarak destekler (Şekil 11.16). Domaini Tanımlayan Diğer Özellikler
Tablo 11.3'de özetlendiği gibi fizyolojik veya diğer bazı fenotipik özellikler, organizmaları domain seviyesinde ayırt etmede kullanılabilir. Bu tabloyu incelerken, belirtilen domainde tüm özelliklerin evrensel olarak bulunmadığı göz önünde tutulmalıdır. Mesela klorofil temelli fotosentez sadece bazı Bacteria ve Eukarya (ve fotosentetik endosimbiyotik Bacteria'da, Bkz Şekil 11.9) temsilcilerine özgüdür. Bunun aksine Bacterialafin hücre duvarındaki peptidoglikan varlığı gibi diğer ayırıcı özellikler evrensel olabilir.
•
Hangi prokaryotik domaine ait organizmalar, Eukarya'nınkine çok benzer şekilde RNA polimeraz sentezlerler? Bu görüşü hangi filogenetik kanıt destekler?
MİKROBİYAL TAKŞONOMİ VE FİLOGENİ İLE İLİŞKİSİ Mikrobiyolojideki temel disiplinlerden biri mikrobiyal sınıflandırma veya taksonomidir. Sınıflandırma, mikrobiyologların farklı mikroorganizmalar arasındaki ilişkileri karşılaştırmalarına ve adlandırmaları için sistematik kurallar geliştirmelerine olanak sağlar. Bacterial taksonominin temel fikrini daha sonraki dört kısımda inceleyeceğiz.
Klasik Taksonomi
Taksonomi, sınıflandırma bilimi olup teşhis ve adlandırma olmak üzere iki alt disiplin içerir. Taksono11.9 Kavramların Gözden Geçirilmesi miyi ve bu bölümün şimdiye kadar ki ana konusu olan filogeniyi birbirinden ayırt etmek önemlidir Üç domaindeki canlı organizmalar her ne kadar riboçünkü bu iki terim aslında farklı anlamlara gelzomal RNA dizilerine göre tanımlansa da, son yapılan mektedir. çalışmalar diğer pek çok açıdan farklılıklar gösterdikleBacterial taksonomi, klasik anlamda fenotipik rini ortaya çıkarmıştır. Bacteria ve Archaea özellikle hücre analizlere dayanır. Bunlar bir organizmanın neye duvarı ve lipit kimyaları ile transkripsiyon ve protein sentezinin özellikleri bakımından büyük ölçüde farklılık benzediği, enerji metabolizması, enzimleri ve digösterirler. ğer özelliklerini kapsar. Her ne kadar prokaryotların filogenisi daha önceki kısımda belirtildiği gibi • Bacteria ve Eukarya lipitlerinin Archaeal lipitlerden farkı genotipik analizlerden ortaya çıksa da, fenotipik nedir? analizler bacterial teşhis ve sınıflandırmada önemli
11.10 • Klasik Taksonomi • 319
Tablo 11.3 Bacteria, Archaea ve Eukarya arasındaki ayırıcı temel özelliklerin özeti' Özellikler Morfolojik ve Genetik Prokaryotik hücre yapısı Kovalent şekilde kapalı ve halkasal DNA'nın varlığı Histon proteinlerinin varlığı Membranla çevrili çekirdek Hücre duvarı
Bacterialar
Archaealar
Eukaryatlar
Evet Evet Hayır
Evet Evet Evet
Hayır Hayır Evet
Yok
Yok
Var
Muramik asit mevcut
Muramik asit yok
Muramik asit
Ester bağlı
Eter bağlı
Ester bağlı
70S
70S
80S
Formilmetiyonin Hayır Evet Hayır Evet Hayır Bir adet (4 alt birimli)
Metiyonin Hayır Evet Hayır Evet Evet Birkaç adet (Herbiri 8-12 alt birimli) Evet TATA kutusu
Metiyonin Evet Hayır Evet Nadir Evet Üç adet (Herbiri 12-14 alt birimli) Evet TATA kutusu
Hayır
Hayır
Hayır Evet
Evet Evet
Hayır Hayır
Evet Evet Evet Evet
Hayır" Evet Evet Hayır
Hayır
Evet Evet Evet Evet
Evet Evet Evet Evet
Hayır Hayır Evet (kloroplastlarda) Hayır Hayır Hayır Hayır
Evet Hayır
Evet Evet
Hayır Hayır
î
yok
Membran lipitleri Ribozomlar (kütlesi) Başlangıç tRNA'sı Pek çok gendeki intronlar Operonlar mRNA'daki Kep ve poli-A kuyruğu Plazmitler Ribozomun difteri toksinine duyarlılığı RNA polimerazlar (Bkz Şekil 11.19) Gerekli transkripsiyon faktörleri (cn^,Kısım 11.19) Promotor yapısı (öOöKısım 7.10 ve 7.11) Kloramfenikol, streptomisin ve kanamisine duyarlılık Fizyolojik/Özel Yapılar Metanogenez S" veya SO42'nin H2S'e veya Fe*3'ün Fe+2'ye indirgenmesi Nitrifikasyon Denitrifikasyon Azot fiksasyonu Klorofilli fotosentez Rodopsinli enerji metabolizması Kemolitotrofi (Fe, S, H2) Gaz kesecikleri Poly-/3-hidroksialkanoatlardan oluşan depo karbon granüllerinin sentezi 80°C'nin üzerinde gelişebilme 100°C'nin üzerinde gelişebilme
Hayır -10 ve -35 dizileri (Pribnov kutusu) Evet
" Pek çok özelliği bir domain içerisindeki sadece belirli bir kısım üyeninin gösterdiğine dikkat ediniz. * Deniz sularındaki çevresel genomik çalışmalar, nitrifikasyon yapan Archaea'nm var olduğunu öne sürmektedir ( t ^ S K ı s ı m 18.6).
bir rol oynamaya devam etmektedir. Bu özellikle klinik mikrobiyal tanı gibi teşhisin kendisinin bir amaç olduğu uygulamalı durumlar için geçerlidir. Bu kısımda klasik bacterial taksonomiyi tartışacağız ve daha sonraki bölümde ise bacteria sınıflandırmasında kullanılan bazı moleküler yöntemleri özetleyeceğiz. Klasik bacterial taksonomide pek çok fenotipik karakter değerlendirilir ve elde edilen veriler, organizmaları türden domaine kadar olan taksonomik basamaklarda gruplandırmak için kullanılır (Tablo 11.5 ve 11.6). Bu amaçla kullanılan taksonomik değere sahip karakterler morfoloji, beslenme ile fizyoloji ve habitatdır. Tablo 11.4'de bu temel kategoriler, taksonomik değere sahip belirli konulara ayırılmıştır. Bir organizmayı tanımlamak için araştırıcı, genelden özele kadar pek çok fenotipik özelliği değer-
lendirmelidir. Buna örnek olarak Şekil 11.20«'deki morfolojik ve fizyolojik testleri verebiliriz (Tablo 11.5'e de bakınız). Bireysel karaktere özgü çok sayıda verinin toplanmasıyla, muhtemel organizmaların listesi kesin bir teşhis yapılana kadar sınırlandırılmış olur (Şekil 11.20). CC Oranları
Bir organizmanın genomik DNA'sındaki GC oranı, taksonomik sonuçları yorumlarken kullanılan aydınlatıcı özelliklerden biridir. GC oranı bir organizmanın, DNA'sındaki guanin ve sitozin bazlarını içeren toplam nükleik asit yüzdesi olarak tanımlanır. Bu oran, DNA'nın erime sıcaklığının ölçümü (anöKısım 7.2) veya kromatografi yöntemleri gibi çeşitli yöntemlerle belirlenebilir. GC oranı oldukça çeşitlilik gösterip, prokaryotlar arasında bilinen en düşük değeri %20 iken en
ı
•
320 • Bölüm 11 • Mikrobiyal Evrim ve Sistematik
Tablo 11.4 Tahsonomik değere sahip bazı fenotipik karakterler Temel kategori
içerikleri
I. Morfoloji II. Hareket III. Beslenme ve Fizyoloji
Şekil; büyüklük; Gram reaksiyonu; eğer mevcutsa flagellamn düzenlenişi Flagella ile hareketlilik; kayarak hareketlilik; gaz kesecikleri ile hareketlilik; hareketsizlik Enerji korunum mekanizması (fototrof, kemoorganotrof, kemolitotrof); oksijenle ilişkileri; sıcaklık, pH ve tuz gereksinimleri/toleransları; çeşitli karbon, azot ve kükürt kaynaklarını kullanma yetenekleri; büyüme faktörü gereksinimleri Pigmentler; hücre inkulüzyonları veya yüzey tabakaları; patojeniteleri; antibiyotik duyarlılıkları
IV. Diğer faktörler
yüksek değeri yaklaşık %80 kadardır. Bu oranlar eukaryatlarda biraz daha dar bir aralıktadır (Şekil 11.21*). Çok çeşitli organizmaların DNA baz içerikleri belirlenmiş olup, bir organizmanın GC oranı bilgisi duruma bağlı olarak önemli bir veri olabilir. Mesela iki organizmaya ait GC oranları benzer olabilir, ancak hem taksonomik hem de filogenetik açıdan birbirlerinden oldukça farklılık gösterebilirler, çünkü DNA'daki tek bir baz içeriği ile baz dizisinde çeşitlilik görülmesi mümkündür. Bu durumda benzer GC oranları taksonomik açıdan bir anlam ifade etmez. Bu durumun aksine, iki organizmanın GC oranlarının yaklaşık olarak %5'den fazla farklılık göstermesi, sadece bir kaç ortak DNA dizisi paylaşabilecekleri anlamına gelir ve bu nedenle birbirleriyle yakın ilişkide olma ihtimalleri de düşer. 11.10 Kavramların Çözden Geçirilmesi Klasik bacterial taksonomi analizleri, organizmanın fenotipik özellikleri üzerinde yoğunlaşır. Bir organizmadaki guanin ve sitozin (GC) baz oranlarını belirlemek bu işlemin bir parçası olarak görülür. •
Bacteriaları ayırt etmede kullanılan üç fenotipik özelliği sıralayınız.
I. İzolasyon ve mikroskobi İzolasyon
Saf kültür
Gram reaksiyonu/ morfoloji
Fakültatif
Laktozu asit/gaza fermente eder
•
İki organizmanın çok benzer DNA GC oranlarına sahip iken, sadece bir kaç ortak geni paylaşması nasıl mümkün olur?
Kemotaksonomi Kemotaksonomi olarak da adlandırılan moleküler taksonomi, hücredeki bir veya da daha çok yapı taşının moleküler analizini kapsar. Rutin olarak kullanılan kemotaksonomik yöntemlerin başında genonıik DNA:DNA hibridizasyonu, ribotiplendirme, çok lokuslu dizilerin tiplendirilmesi ve lipit profillerinin çıkarılması gelir. DNA: DNA Hibridizasyonu GC baz yüzdesi bir türün genomik DNA'smda mevcut olan her bir nükletotidin yüzdesini verir ama o nükleotitlerin dizisi hakkında kesin bir bilgi vermez. Diziler önemlidir, çünkü iki organizmanın DNA'smda çok sayıda benzer nükleotit dizisinin olması, muhtemelen oldukça benzer (eğer aynı değilse) genler içerdikleri anlamına gelir. Bu iki DNA birbiri ile hibridize edildiğinde, gen dizilerinde büyük oranda benzerlik olması beklenir. Genomik hibridizasyon, iki DNA arasındaki dizi benzerliğinin derecesini ölçer ve rRNA dizilemesinin ayırım sağlayamadığı durumlarda çok yakın ilişkiye sahip organizmaların ayırt edilmesinde kullanılır.
II. Genel fizyoloji Gram-negatif çubuk III. Detaylı fizyoloji Laktozu fakültatif olarak fermente eden
IV. Sonuç
Bir seri ..••»» biyokimyasal testin yapılması
Pozitifi: indol, metil kırmızısı; mukoit Negatif: Sitrat, Voges-Proskaver, H2S
<•• Escherichia coli
• Şekil 11.20 Yeni izole edilen enteritik bir bacterianın teşhisinde kullanılabilecek örnek yöntemler. Bu şema klasik mikrobiyolojik yöntemleri kullanır (verilen örnek Escherichia coli'mn teşhis edilmesinde kullanılan basamakları göstermektedir). Buradaki analizlerin çoğunda organizmanın saf kültürüne itiyaç duyulduğuna ve teşhiste sadece fenotipik kriterlerin kullanıldığına dikkat ediniz. Biyokimyasal testler 24. Bölüm'de daha detaylı olarak anlatılmıştır (OO&Kısım 24.2, Tablo 24.3 ve Şekil 24.7).
Prokaryotlar Bacteria Archaea Okaryotlar Hayvanlar Bitkiler Algler Küfler Protozoalar 0
10 20 30 40 50
70 80 90 100
GC (mol '
• Şekil 11.21 Çeşitli organizmalara ait genomik DNA baz içeriklerinin oranlan. En geniş aralıktaki GC oranlarının Bacteria 'da görüldüğüne dikkat ediniz.
1111 • Kemotaksonomi • 321
Nükleik asit hibridizasyonunun teorisini ve yöntemini Kısım 7.7'de inceleyeceğiz. Bir hibridizasyon deneyinde, organizmadan izole edilen 32 3 DNA P veya H ile radyoaktif hale getirilir, nispeten daha küçük boyutlarda olacak şekilde kesilir, denatüre etmek için ısıtılır ve aynı yöntemle hazırlanan ikinci bir organizmaya ait işaretlenmemiş fazla miktardaki DNA'yla karıştırılır (Şekil 11.12). Daha sonra karışım tekrar birleşmeleri için soğutulur ve çift zincirli DNA, geriye kalan hibridize olmamış DNA'dan ayrılır. Bunu takiben hibridize olmuş DNA'daki radyoaktivitenin miktarı belirlenir Karşılaştırılacak Organizma 1 organizmalar
Organizma 2
4
•DNA
DNA
4
Kesim ve etiketleme (-@)
DNA kesimi
4
Denatürasyon için ısıtma
4
(a)
Hibridizasyon deneyi
İki organizmanın DNA'sı karıştınlır-etiketlenmemiş DNA fazla miktarda eklenir:
Hibridize DNA — L Hibridize olmamış DNA
(b)
Sonuçlar ve yorumlaması Aynı cins ve farklı türler
Aynı türler
100
75
50
Farklı cinsler
25
Hibridizasyon yüzdesi
1x1
1x2
%100
%25
i
Aynı suş (kontrol)
1
1 ve 2 muhtemelen farklı cinsler
(c)
• Şekil 11.22 Taksonomik bir araç olarak genomik hibridizasyon. (a) Test edilen organizmanın DNA'sı izole edilir. DNA'lardan biri etiketlenmiştir (Organizma l'in DNA'sında radyoaktif fosfat olarak gösterilmiştir), (b) Hibridizasyon deneyi. Etiketlenmiş DNA'mn kendi kendine tekrar birleşmemesi için ortama fazla miktarda etiketlenmemiş DNA eklenir. Hibridizasyonu takiben, sadece hibridize olmuş DNA'daki radyoaktiviteyi ölçmek için, hibridize olmamış DNA ortamdan uzaklaştırılır, (c) Sonuçlar. Kontroldeki radyoaktivite (Organizma 1 'in DNA'sı kendisi ile hibridize edilir) %100 hibridizasyon değeri olarak kabul edilir.
ve %100 olarak kabul edilen kontrol DNA ile karşılaştırılır (Şekil 11.22»). Radyoaktivitenin yanında, radyoaktif olmayan bazı DNA'lar da ortamda bulunur. Bu da hibridizasyon deneyinin istenmeyen radyoaktif atıklar oluşturmadığını gösterir. İki organizmanın aynı taksonomik dereceye sahip olduğunu göstermek için, iki DNA arasındaki hibridizasyon miktarının ne kadar olması gerektiği hakkında kesin bir kural yoktur. Yine de iki organizmanın aynı tür olduğunu söylemek için %70 veya üzerindeki hibridizasyon değerlerine sahip olunması önerilir. Bunun aksine iki organizmayı aynı cinse dahil etmek için, en azından %25 hibridizasyon değeri gereklidir (bacterial cins ve tür tanımlarını çalışmak için Kısım 11.12'ye bakınız). Birbiriyle ilişkili olmayan Clostridium (grampozitif) ve Salmonella (gram negatif) gibi farklı organizmalara ait DNA'larm hibridizasyonu ise sadece %10 veya daha az bir hibridizasyon seviyesi gösterecektir (Şekil 11.22). DNA:DNA hibridizasyonu, iki organizmanın genlerindeki küçük farklılıkları ortaya çıkarmakta kullanılan hassas bir yöntemdir ve bu sebeple yakın akraba olan organizmaları ayırt etmede kullanılır. Taksonomik çalışmalarda kullanılan genomik hibridizasyon aslında SSU ribozomal RNA dizilemesi ve fenotipik analizlerin, iki farklı tür olduğundan şüphelenilen organizmalar arasında belirgin bir farklılık ortaya koyamadığı durumlarda kullanılır. Tüm genom dizilemesi yapılabilirse, hibridizasyon analizlerine gerek duyulmaz. Bir bacteria genomu dizilendiğinde, dizilemesi yapılmış diğer bir bacteria ile mevcut olan tüm genleri karşılaştırılabilir (os»Bölüm 15). Şimdiye kadar sadece bir kaç yüz prokaryotik genom tamamen dizilenmiş olduğunda, pek çok durumda bu tür karşılaştırmaları yapmak mümkün değildir. Mikrobiyologlar, gelecek yıllarda moleküler taksonomi çalışmaları için tüm genom analizlerinde kullanılacak uygun yöntemlere sahip olacaklardır. Ancak taksonomi tüm genom karşılaştırmaları üzerine oturtulana kadar, (hibridizasyon) yakın taksonomik ilişkileri ayırmada kullanılmaya devam edecektir. Ribotiplendirme
Ribotiplendirme, daha önce ribozomal RNA temelli filogenetik karakterizasyonda konu edilen bazı yöntemleri bacterial sınıflandırmada kullanan bir tekniktir (Bkz. Kısım 11.6). Ancak ribotiplendirmede, karşılaştırmalı dizi analizi yöntemlerinden farklı olarak dizileme yapılmaz. Bunun yerine bir organizmanın DNA'sının restriksiyon enzimleri ile kesilmesi sonucu oluşan kendine özgü deseni ölçer ve bu parçalar ayrılıp bir ribozomal RNA probu ile incelenir (Şekil 11.23««). İki organizmanın ribozomal RNA'ları arasındaki farklılıklar, özel restriksiyon enzimi kesim bölgelerinin varlığını veya yokluğunu belirlediğinden (restriksiyon enzimlerini incelemek için
322 • Bölüm 11 • Mikrobiyal Evrim ve Sistematik
Lactococcus lactis Laçtobaçillus acidophilus Laçtobaçillus brevis Laçtobaçillus kefir
ve içeceklerin mikrobiyal analizi gibi pek çok uygulama alanına sahiptir.
I. l
Çok Lokuslu Dizi Tiplendirmesi
(a) Yeni izolat veya klinik numune
Bağlılık uzaklığı 0.6 0.4 0.2 0 Suşlar
1-5
I
Yeni suş Suş6
DNA izolasyonu
•Suş 7 ; PCR ile 6-7 adet hedef genin çoğaltılması
Dizileme
I
Aynı türe ait diğer suşlarla karşılaştırma
^ ^ . ^
î
Allellerin belirlenmesi
(b)
• Şekil 11.23 Ribotiplendirme ve çok lokuslu dizi tiplendirmesi (MLST). (a) Dört farklı laktik asit bacteriasının ribotiplendirme sonucu. Her bir bacterianın tek kolonisinden izole edilen DNA'ya ait restriksiyon enzim kesimlerinin bir türe hatta bir tür içerisindeki suşlara özgü 16S rRNA genleri ile problanması sonucu oluşan DNA fragmetlerinin deseni. Bilinen organizmalarla beraber jelde görüntülenen desenler numaralandırılır ve çevresel veya klinik izolatlann teşhisinde karşılaştırmak amacıyla bir veri tabamnda saklanır. Bantların yerlerindeki değişiklikler ve bant yoğunluğu teşhiste önemlidir (b) Çok lokuslu dizi tiplemesindeki (MLST) basamaklar.
Kısım 7.7'ye bakınız), belirli bir bacteria türünün restriksiyon deseni de sadece o türe özgüdür (Şekil 11.23a). Aslında ribotiplendirme çok tanımlayıcı olduğundan "moleküler ayak izi" olarak da adlandırılır, çünkü neredeyse tüm organizmalar için eşsiz bir seri bant ortaya çıkar. Pratikte ribotiplendirmeye bir koloninin veya sıvı kültürün DNA'sı ile başlanır. PCR kullanılarak 16S rRNA ve onunla ilgili moleküllerin genleri çoğaltılır, bir veya daha fazla restriksiyon enzimi ile muamele edilir, elektroforezle ayrılır ve sonra problanır (bu yöntemleri incelemek için cw&Bölüm 7'ye bakınız). Jelde görülen DNA parçalarının oluşturduğu desenler sayısallaştırılıp, bir veri tabanında mevcut referans organizmaların desenleri ile karşılaştırma yapmak için bilgisayar ortamı kullanılır (Şekil 11.23a). Ribotiplendirme, hem hızlı (olası bir dizilemeyi, dizi sıralamasını ve ribozomal RNA dizileme yöntemlerinin gerektirdiği analizleri gerektirmediğinden) hem de spesifik bir yöntem olduğundan bacterial teşhiste kullanılır. Bu sebeplerden ötürü, ribotiplendirme klinik tanı, gıda, su
Hem ribozomal RNA dizilemesi hem de ribotiplendirmedeki kısıtlamalardan biri de, analizlerin sadece tek bir gen üzerine odaklanmasıdır. Çok lokuslu dizi tiplendirmesi (MLST), bu sorunun üstesinden gelir ve bir tür içerisindeki suşların karakterizasyonunda kullanılan yararlı bir tekniktir. MLTS, bir organizmadaki "yaşamsal faaliyetleri kodlayan" (housekeeping) altı yedi adet gene ait parçaların dizilimleri ile aynı organizmanın farklı suşlarındaki özdeş gen gruplarını karşılaştırılmasını içerir. Bu genlerin, hücrenin temel fonksiyonlarını kodladığmı ve plazmitlerden ziyade kromozomlar üzerinde yerleştiklerini tekrar hatırlayalım (<£»ÖKIsım 7.4). Her bir gen için yaklaşık olarak 450-bç'lik dizi PCR ile çoğaltılır ve dizilenir. Daha sonra karşılaştırmalı dizileme verileri bir dendogram ile ifade edilir (Şekil 11.23b). MLST'de bir gen için benzer dizilere sahip suşların, o gende aynı allele sahip olduğu söylenir ve o gen için aynı sayı tayin edilir. Bir gen pek çok farklı allele sahip olabilir ve aynı tür içerisindeki bir grup susa ait bir gende genelde 10 ile 30 adet allel bulunabilir. Her türe, o türe özgü bir seri sayı -çok lokuslu dizi tipi- verilerek sonuçlandırılır. Daha sonra her dizi tipi arasındaki benzersizlik, 0'dan (suşlar benzerdir) l'e (suşlar sadece uzaktan ilişkilidir) kadar olan bağlılık uzaklığı bir dendogramı çizilerek ifade edilir (Şekil 11.23fr). MLST çok yakın akraba suşları bile ayırt edebilme gücüne sahiptir. Bu nedenle organizmaları tür seviyesine kadar tanımlamada, rRNA dizilemesine göre çok daha iyi bir yöntemdir. MLST analizlerinde incelenen yedi genle ve gen başına 20 allele, birkaç milyar farklı genotipin ayırımının yapılabildiği hesaplanmıştır. Bunun aksine MLST organizmaları tür seviyesinin üzerinde karşılaştırmak için uygun değildir, çünkü çözünürlüğü daha yüksek seviyedeki bir taksonun anlamlı bir filogenisini oluşturamayacak kadar duyarlıdır. MLST şimdiye kadar belirli bir patojenin suşlarını ayırt etmek için klinik mikrobiyolojiye önemli bir katkıda bulunmuştur. Bu örneğin Escherichia coli türü için düşünüldüğünde -K-12 gibi bazı suşları zararsız iken, O157:H7 gibi bazı suşları çok ciddi ve hatta ölümcül enfeksiyonlara yol açabilirciddi bir iştir (ooöKısım 29.8). MLST aynı zamanda epidemiyolojik çalışmalarda da oldukça yararlıdır. Mesela MLST bir bacterial patojenin popülasyondan uzaklaşan virülent bir susunu takip edebilir ve popülasyonda yakından akraba pek çok organizma olsa bile, susu kesin şekilde teşhis edebilir. Bunun yanısıra teknik PCR temelli olduğundan, klinik numuneleri laboratuvar kültüründen izole etmeden de test edebilme imkânı sağlar. Bunun anlamı ise klinik bir numuneden, özel bir patojenik
1111 • Kemotaksonomi • 323
susun DNA'sı izole edilebilirse MLST analizlerinin yapılabileceğidir. MLST analizleri bacterialarda bazı ilginç genetik desenler ortaya çıkarır. Örneğin bazı prokaryotlar esasen çok küçük MLST değişiklikleri gösteren klonlardır. Buna tipik olarak Staphylococcus aureus suşları örnek verilebilir. Neisseria meningititis gibi diğer organizmalar ise sadece zayıf klonlardır ve MLST analizlerinde büyük çeşitlilik gösterirler. Her ne sebeple olursa olsun bu sonuçlar göstermiştir ki, N. meningitidis gibi organizmalar geçmişte S. aureus'tan çok daha fazla yatay gen akışına uğramışlardır. Bu farklılıklar, bu organizmaların ekolojisindeki farklılıkları ve onları rekabette başarılı kılan faktörleri kesin olarak yansıtır. Bu tür bilgiler, bir patojenin genetik kararlılığına veya kararsızlığına dayanan ilaç ve aşı geliştirme stratejilerine de katkıda bulunabilir.
Bakteriler''deki Yağ Asiti Sınıfları Örneğin Yapısı
Sınıf/Omek
o I. Doymuş: tetradekanoik asit II. Doymamış: omega-7-cis hegzadekanoik asit III. Siklopropan: c/s 7,8 metilen hegzadekanoik asit IV. Dallanmış: 13-metiltetradekanoik asit V. Hidroksi: 3-hidroksitetradekanoik asit (a)
II C—(CH 2 ) 1 2 —CH 3 O
u
u
C
{CH 2 ) 1 0 —Ç C H 3
II T I C-(CH 2 ) 6 -C=C-(CH 2 ) 6 -CH 3 HO H H O w II / \ C-(CH 2 ) 7 -C-C-(CH 2 ) 6 -CH 3 X HO H H ÇH 3 HO
H O H II (_. C_«rİ2~~'C' '
HO
OH
ORGANİZMANIN TEŞHİSİ
t
Yağ Asiti Analizleri: FAME
Bacterial sınıflandırmadaki diğer popüler yöntemlerden biri de, hücrelerin stoplazmik membranlarmdaki ve dış membranlarmdaki (gram-negatif bacterialar, o°oKısım 4.9) lipitlerde bulunan yağ asiti tiplerinin ve oranlarının karakterizasyonudur. Bu teknik yağ asiti metil esterin FAME şeklinde kısaltılması ile adlandırılr ve patojenlerin veya diğer zararlı bacterialarm rutin olarak teşhisinin yapıldığı klinik tanı, halk sağlığı, gıda ve suları inceleyen laboratuvarlarda geniş bir kullanım alanına sahiptir. Prokaryotlardaki yağ asiti içerikleri oldukça çeşitlilik gösterip, bu değişiklikler yağ asitinin zincir uzunluğu, çift bağ, halka yapısı, dallanmış zincirler veya hidroksil gruplar içerip içermemesi gibi farklılıkları kapsar (Şekil 11.24a»). Bu nedenle yağ asiti profili genellikle belirli bir bacteria türünü teşhis edebilir. Rutin analizlerde, standart koşullar altında üretilmiş bir bacteria kültürünün hücre hidrolizatlarmdan ekstrakte edilen yağ asitleri, kendi metil esterlerini oluşturmak için kimyasal olarak türevlendirilir. Uçucu hale gelen bu türevler daha sonra gaz kromatografisi ile teşhis edilir. Tanımlanmamış bacteriadan elde edilen yağ asitlerinin tipini ve miktarını gösteren kromatogram daha sonra aynı koşullar altında geliştirilmiş referans bacterialara ait binlerce yağ asiti profilini içeren bir veri tabanı ile karşılaştırılır. Bilinmeyen bacteriaya en çok uygunluk gösterenler seçilir (Şekil 11.24b). Taksonomik bir araç olarak FAME bazı dezavantajlara sahiptir. Bir organizmanın yağ asiti profilli sıcaklık, büyüme fazı (üssel veya duraklama) ve daha büyük oranda da geliştirilen besiyerine göre değişiklik gösterdiğinden, FAME analizleri özellikle sıkı standardizasyonlar gerektirir. Bu sebeple tutarlı sonuçlar almak için, veri tabanında aynı koşullarda geliştirilmiş organizmaların yağ asiti profilleri ile karşılaştırmak istenilen bilinmeyen organizmayı belirli bir besiyerinde ve sıcaklıkta geliştirmek şarttır. Pek çok mikroorganizma için
HO
Pik desenlerini, veri tabanındaki desenlerle karşılaştırma
Bakteri kültürü
î
Yağ asitlerinin ekstraksiyonu
1
Metil esterlerini 3rini oluşturmak için türevlendirme evleı
Çeşitli yağ asiti metil esterlerinin pikleri
Gaz kromatografisi
(b) • Şekil 11.24 Bacterial tanımlamada kullanılan yağ asiti metil ester analizleri (FAME). (a) Bactehalardaki yağ asiti sınıflan. Her bir sınıf için tek bir örnek verilmiştir, ancak bacterial bir kaynakta normalde 200'den fazla yağ asiti bulunmaktadır. Metil esterinde, yağ asitinin karboksilik asit grubu (COOH) üzerinde bulunan proton ile bir metil grubu (CH3) yer değiştirir, (b) Yöntem. Gaz kromatogtafisinden elde edilen her pik farklı bir yağ asiti metil esteridir ve pikin uzunluğu miktarı ile orantılıdır.
bu mümkün olmadığından, FAME analizleri sadece belirli koşullarda geliştirilebilen organizmalar ile sınırlıdır. 11.11
Kavramların Gözden Geçirilmesi
Moleküler taksonomi, belirli hücre bileşenlerinin moleküler analizlerini kapsar. Bunlar arasında DNA:DNA hibridizasyonu, ribotiplendirme, çok lokuslu dizi tiplendirmesi ve yağ asiti analizleri gelir. •
İki organizmanın DNA'sı arasındaki %10'dan az bir hibridizasyon, onların olduğunu gösterir.
•
Ribotiplendirme, löSribozomalRNAgendizilemesinden ve MLST'den nasıl farklılık gösterir?
•
FAME analizi nedir?
324 • Bölüm 11 • Mikrobiyal Evrim ve Sistematik
Mikrobiyolojide Tür Kavramı Bitkiler ve hayvanlar dünyasında tür (1) doğal olarak melezleşip, verimli döller üretebilen ve (2) çoğalma yönünden diğer türlerden ayırt edilebilen bir popülasyon olarak tanımlanır. Ancak bu tanım prokaryotlar için uygun değildir. Prokaryotlar haploittir ve aseksüel olarak ürerler. "Verimli döller üretmek" kavramı prokaryotlar için anlamsızdır. Mikrobiyologlar yine de bu terimi geleneksel olarak bacteria "türü" olarak kullanırlar ve yeni bacteria izolatlarına usulüne uygun olarak cins ve tür adları verirler, ki tür bu bağlamda epitet olarak adlandırılır. Peki bacteria türü nedir? Prokaryotik tür kavramı hâlâ evrimleşme sürecine devam etse de, mikrobiyologlar prokaryotik türleri ayırt etmek için günümüzde SSU ribozomal RNA dizilemesi, genomik hibridizasyon ve Kısım 11.11'de incelediğimiz fenotipik araçları kullanmaktadırlar. Bacterial Türler ve Daha Ust Taksonlar
16S ribozomal RNA dizisinde, diğer tüm organizmalardan %3'den fazla farklılık gösteren bir prokaryotun (diğer bir deyişle veri tabanındaki diğer tüm dizilere %97'den az benzerlik gösteren) yeni bir tür olduğu düşünülebilir. Bu rastgele seçilmiş bir rakam değildir. Bu öneriyi destekleyen en önemli gözlem, 16S rRNA dizisinde %97'den az benzerlik gösteren iki prokaryotun genomik DNA'larmın genelde %70'den az hibridize olduğudur. Minimal bir değer bulunduğunda ise iki mikroorganizmanın aynı tür oldukları düşünülür (Bkz Kısım 11.11 ve Şekil 11.22). Bu Şekil 11.25«'de gösterilmiştir. Şekil 11.25'deki veriler aynı zamanda 16S dizilemesinin bazı durumlarda genomik DNA hibridizasyonuna göre organizmaları tür seviyesinde ayırt ederkenki ayırma gücünün yetersizliğini göstermektedir. 16S dizisi diğer tüm organizmalardan %3'den fazla farklılılık gösteren bir organizma, DNA hibridizasyon kriterine göre yeni bir tür olarak kabul edilse de, ribozomal RNA dizisi çok benzer (ve hatta birebir) olan bazı organizmalar da oldukça alakasız bir genoma sahip olabilirler (Şekil 11.25). Bu nedenle, SSU dizilemesi sonunda %97'den fazla dizi benzerliği görülen durumlarda, genomik hibridizasyon yeni türlerin tanımlanması için önemli bir taksonomik araçtır. Yeni bir tür genellikle pek çok susun karakterizasyonu yapılarak tanımlanır. Mikrobiyolojide tür kavramı önemlidir, çünkü izole edilmiş suşlara resmi bir taksonomik kimlik verir. Tür gruplar daha sonra cinsler (tekili cins) altında toplanır. Moleküler kriterlere göre yeni bir cins oluşturmak, tür kavramını değerlendirmekten daha zordur ama bir organizmanun 16S dizisinin diğer organizmalardan %5 farklılık göstermesi (diğer bir deyişle %95'den az dizi benzerliği), onun yeni bir cins olduğunu gösterir. Cins grupları familyalar, familyalar
(D
100
o
98
İra o N
96
n < z
92
C 0)
co (O
".V
«••.;
94
4
90 20
40
60
80
100
Genomik DNA-DNA benzerliği (yüzde) • Şekil 11.25 Farklı organizma çiftleri ile yapılan 16S ribozomal RNA dizi benzerliğiyle genomik DNA:DNA hibridizasyonu arasındaki ilişki. Bu veriler Bacteria domaindeki çeşitli türlerle çok sayıda bağımsız deneyler yapılmasının bir sonucudur. Turuncu kutulardaki noktalar, 16S dizi benzerliği ve genomik hibridizasyon sonuçlarının kombinasyonlarının çok yüksek olduğunu gösterir, dolayısıyla böyle bir durumda test edilen iki organizmanın da aynı tür olduğu söylenir. Yeşil kutulardaki noktalar, farklı türlerin tespit edildiği kombinasyonları temsil eder ve her iki yöntem de aynı sonucu işaret eder. Mavi kutular, 16S rRNA dizilemesinin aksine, genomik DNA hibridizasyonu ile ölçüm yapıldığında farklı türlerin olduğu örnek organizmaları gösterir. %70'in üzerinde çıkan hibridizasyonlarda, %97'den az 16S rRNA benzerliğinin görülmediğine dikkat ediniz. Veriler Rossellö-Mora, R., ve R. Amann. 2001. FEMS Microbiol. Revs. 2S:39-67'den alınmıştır.
ordolar, ordolar sınıflar ve sınıflar da en yüksek taksonomik seviye olan domainler içerisinde toplanırlar (Tablo 11.4 ve 11.5). 2004 yılından bu yana hemen hemen 6500 Bacteria ve Archaea türü resmi olarak tanımlanmıştı (Tablo 11.5). Yeni izole edilmiş bir organizmayı tanımlayıp adlandırırken, organizmanın tür tanımının üzerindeki tüm taksonomik kategorilerin kriterlerini karşılaması gereklidir. Fototrofik bacteria Allochromatium loarmingii'nin taksonomik hiyerarşisinin örnek olarak verildiği Tablo 11.4'de de görüldüğü üzere, Allochromatium cinsine ait türlerin hepsi çubuk şeklindeki gram-negatif mor sülfür Bacteriası olmalıdır. Bu kritere uymayan organizma bir Allochromatium türü olarak kabul edilmez. Bunun da ötesinde Allochromatium cinsi Chromatiaceae familyasının ve taksonomik basamaktaki diğer üst seviyelerin tüm kriterlerini karşılamak zorundadır. Diğer bir deyişle, domain seviyesinden türe kadar inen taksonomik bir hiyerarşide, iki organizmayı ayırmak için kullanılan kriterler daha az genel fakat daha çok özgün hale gelir (Tablo 11.4). Bacterialann Türlendirilmesi Yeni bacteria türleri nasıl ortaya çıkar? Bu şu an mikrobiyologlar arasında oldukça tartışılan bir konudur. Yine de bacterialara ait bazı türleşme modelleri ileri sürülmüştür ve bu kısımda popüler olanlardan birini ele alacağız. Bir hücre popülasyonunun tek bir hücrenin üremesinden köken aldığını ve onun da belirli bir ekolojik nişi işgal ettiğini düşünün. Eğer bu popülasyondaki hücreler belirli bir kaynağı (mesela anahtar bir besin) paylaşırlar-
11.12 • Mikrobiyolojide Tür Kavramı • 325
Tablo 11.5 Mor sülfür bacteriası olan AHochromatium vvarmingiPdcUi taksonomik hiyerarşi
Taksonomik İsim bölüm Domain
Bacteria
Özellikler
Doğrulandığı yöntem
Prokaryotik hücreler; Bacterialara özgü tipik ribozomal RNA dizileri
Mikroskobi; 16S ribozomal RNA dizilemesi; eşsiz biyomarkerların varlığı, örneğin peptidoglikan
Proteobacterialara özgü ribozomal RNA dizileri
16S rRNA dizilemesi
Şube
Proteobacteria
Sınıf
Gammaproteobac- Gram-negatif bacteriateria lar; Gamaproteobacterialara özgü rRNA dizileri
Ordo
Chromatiales
Fototrofik mor bacterialar
Karakterize edici pigmentler («3O»Şekil 17.3)
Familya
Chromatiaceae
Mor kükürt bacteriaları
H2S'i oksitleme ve hücre içinde S° depolama yeteneği; S°'m varlığını gözlemlemek için kültürün mikroskobik incelemesi (resme bakınız)
Cins
AHochromatium
Çubuk şeklindeki mor sülfür bacteriaları
Mikroskobi (resme bakınız)
Tür
ıvarmingü
3.5-4.0 /un X 5-11 /nm'lik hücreler; çoğunlukla kutup kısımlarında kükürt depolayan hücreler
Mikrometre kullanarak mikroskopta hücrelerin ölçümü; hücredeki S° globüllerinin yerini belirlemek (resme bakınız)
u
Kükürt (S ) globülleri
t
Gram-boyama; mikroskobi
sa, popülasyondaki bu hücrelere ekotip denilir. Farklı ekotipler bir habitat içerisinde yaşayabilirler, ancak herbiri sadece habitatdaki kendi nişi içinde başarılı olur. DNA replikasyonundaki hatalar (mutasyonlar) seyrek ama düzgün bir frekansta gerçekleşir (öoçıKısım 10.3). Belirli bir ekotip içerisinde, ekotipi sağlıklı kılan bir mutasyonun (adapte edici bir mutasyon) oluşma sıklığı periyodik seçimi tetikler. Bu oluştuğunda, eski popülasyon tipi yeni bir ekotip popülasyonu haline gelir (Şekil 11.26»). Sonuçta popülasyondaki hücreler birbirlerinden genetik anlamda bu şekilde "uzaklaşırlar". Tekrarlanan mutasyon döngüleri ve seleksiyon, nihayetinde özgün ekotipten genetik olarak yeterince farklı ve yeni tür olarak kabul edilen bir ekotipin oluşumuna sebep olur (Şekil il.26). Farklı ekotipler bazı kaynaklar için birbirleriyle yarışmadığından dolayı, bir ekotip içerisindeki olaylar serisi diğer bir ekotipi etkilemez (Şekil 11.26). Şekil 11.26'da gösterilen türleşme modeli sadece dikey (anneden oğula) gen akışı üzerine kurulmuştur. Bunun yanısıra bacterial türleşmenin yatay (horizontal) gen transferinden de etkilendiğini biliyoruz. Yatay geçiş, genlerin türler arasında konjugasyon, transdüksiyon ve transformasyonla aktarımıdır (öo^Bölüm 10). Prokaryotlar seksüel
AHochromatium rvarmingii
hücrelerinin fotoğrafı
olarak seçici değildir ve gen değişimini geniş bir filogenetik hat üzerinde yapabilirler. Bu nedenle bir ekotipin kazandığı yeni bir genetik yetenek, mutasyondan ve seleksiyondan ziyade diğer ekotipteki hücrelerden gelen genlerden ortaya çıkabilir. Prokaryotlar arasındaki yatay gen akışı oldukça değişkendir. Genom dizilemesi, yatay gen akışının diğer aktarımlardan daha sık görüldüğünü göstermiştir (Kısım 15.8). Bunun yanında çok lokuslu dizi tiplendirmesi (Bkz Kısım 11.11), bazı türler içerisinde genetik değişimin yaygın olduğunu, buna karşın diğerlerinde neredeyse hiç gözlenmediğini ortaya çıkarmıştır. Yatay gen akışının etkisine rağmen, türleşmenin temelde yatay aktarımdan çok mutasyon ve periyodik seleksiyonla (Şekil 11.26) yönlendirildiği düşünülmektedir. Bu da yatay aktarımla kazanılan genlerin sayıca daha az olması, sadece geçici bir avantaj sağlaması ve eğer etkili bir zorlama olursa genellikle kaybedilebileceğinden kaynaklanır. Ne Kadar Prokaryotik Tür Var?
Yaklaşık 4 milyar yıllık bir bacterial evrimleşmenin (Bkz Şekil 11.8 ve 11.10) sonucunda bugün gördüğümüz prokaryotik dünya oluştu. Mikrobiyal taksonomistler şu an prokaryotik türlerin sayısı hak-
326 • Bölüm 11 • Mikrobiyal Evrim ve Sistematik Mikrobiyal bir habitat Ekotip III
Ekotip II
O ©° © ©o^o
oo°o
Ekotip I
Adapte edici mutasyonu uğramış hücre
Periyodik seleksiyon Adapte edici mutasyona uğramış mutantlar canlı kalır. Yaban tipteki özgün Ekotip I hücreleri rekabetten çekilir
Tablo 116 Taksonomik seviyeler ve bilinen prokaryotik tür sayısı" Seviye
Bacteria
Archaea
Domain Şubeler Sınıflar Ordolar Familyalar Cinsler Türler
1 25 34 78 230 1227 6740
1 4 9 13 23 79 289
Top] 2 29 43 91 243 1306 7029
• Rakamlar, 2005'den bu yana geçerli sayılan Bacteria ve Archaea'ya ait cins ve türleri temsil eder. Archaealar için şube kategorisi, şu an resmi olarak onaylanmamış Korarkot ve Nanoarkotları da içerir.
*
** ^ ^
Mutant Ekotip I popülasyonu
Kaynak: Garrity, G.M., Libum, T.G., ve Bell, J.A. 2005. Bergey's Manual of Systematk Bacteriology, 2. baskı, Cilt 2, Bölüm A, 159-220. SpringerVerlag, New York
11.12 Kavramların Gözden GeçirHm esi
Sürecin defalarca tekrarlanması
Yeni Ekotip I türleri
• Şekil 11.26 Bacterial türleşmeye bir model. Birkaç çeşit ekotip, tek bir mikrobiyal habitat içerisinde yaşayarak, kendi özel ekolojik nişlerini oluşturabilirler. Bir ekotipte faydalı bir mutasyon ortaya çıktığı zaman, o mutasyonu içeren hücre sonunda orjinal ekotipin yerine geçecek yeni bir popülasyon oluşturur. Bu olay belirli bir ekotip içerisinde tekrar ettikçe, yeni bir türü temsil eden ve genetik olarak farklı hücre poülasyonlan ortaya çıkar. Diğer ekotipler aynı kaynak için birbirleriyle yarışmayacağından, kendi ekotipleri veya habitatlan dışında gerçekleşen bu genetik ve seleksiyon olaylarından etkilenmezler.
kında kesin bir tahmin yapamamaktadırlar. Yine de yapılacak son analizlerde bu sayının oldukça yüksek olacağı konusunda hemfikirdirler. Günümüzde birkaç bin prokaryotik türün olduğu bilinmekle beraber (Tablo 11.6), birkaç binden fazlasının belki de toplamda 100,000-1,000,000 (veya bu tahminin 10 katı kadarı) kadarının ise hâlâ varlığı şüphelidir. Bir sayım yapılacak olursa toplam prokaryotik tür sayısı çok yüksek olacaktır. Mikrobiyal topluluk analizleri (Bkz Kısım 11.7 ve 18.5) doğadaki prokaryotik çeşitliliğin sadece yüzeysel bir kısmını kültüre edebildiğimizi göstermektedir. Prokaryotik çeşitliliği ortaya çıkarmak için daha gelişmiş kültürel ve moleküler araçlar kullanarak daha önce var olduğu bilinen çok sayıda türün mevcudiyeti aydmlatılabilecektir. Günümüzdeki gerçek, prokaryotik türleşmenin şu anki teknoloji ile doğru bir şekilde tahmin edilemeyeceğidir. Ancak diğer şeylerde olduğu gibi mikrobiyolojide de bu durum muhtemelen değişecektir. Prokaryotik çeşitlilikle ilgilenenler için daha yapılacak pek çok çalışamanm olduğu kesindir!
Tür kavramı eukaryalara olduğu kadar prokaryotlara da uygulanır ve domainin en yüksek takson olduğu benzer bir taksonomik hiyerarşi vardır. Bacterial türleşme, bir ekotip içerisinde tercih edilen bir özellik için tekrarlanan periyodik seleksiyon ile yatay gen akışının bir kombinasyonu sonucu ortaya çıkmış olabilir. •
Eğer belirli bir cins çok sayıda bir da pek çok cins içerir.
_ içeriyorsa,
• Ekotip nedir? • Şimdiye kadar bilinen kaç prokaryotik tür vardır? Bunlardan ne kadarı yaşamaktadır?
11.13
Adlandırma ve Bergey's Manual
Tüm biyolojide binomiyal adlandırma sistemi kullanıldığından, prokaryotlara da cins isimleri ve tür epitetleri verilmektedir. Kullanılan terimler, organizma için uygun tanımlamayı sağlayan Latince veya Yunancanm Latince bir türevidir ve italik yazılır. Örneğin Bacillus (B.) subtilis, B. cereus, ve B.
megaterium'u gibi 100'den fazla Bacillus cinsi tanımlanmıştır. Bu tür epitetleri sırasıyla "ince uzun", "mumsu" ve "iri dört ayaklı" anlamına gelir ve her organizma için karakteristik olan anahtar bir morfolojik, fizyolojik veya ekolojik özelliği ifade eder. Prokaryotların adlandırması, Bacterialarda olduğu kadar Archaea'da Bakteriyolojik kodlama kuralları ile yapıhr-Uluslaramsı Bacteria Adlandırma
Kodu. Kodlama, prokaryotların resmi olarak adlandırıldılması için yasal bir çerçeve oluşturur ve yeni verilerin taksonomik düzenlemeler gerektirdiği durumlarda kullanılmak üzere var olan isimlerin değiştirilmesi için gerekli talimatları ihtiva eder. Hatta özgün isimlendirme işleminde bir hata yapıldığında veya bir isim geçersiz hale geldiğinde, isimleri reddetmek için başvurulan kuralları dahi içerir. Kodlama tüm prokaryotik tür, cins, familya ve ordolarm adlandırılması için gerekli kuralları kapsar.
11.13 • Adlandırma ve Bergey's Manual • 327
Kültür Kolleksiyonları ve Yeni Bir Taksonun Yayınlanması
Yeni bir organizma izole edildiğinde ve eşsiz olduğu düşünüldüğünde, bu organizmanın yeni olarak tanımlanabilmesi için diğer türlerden yerince farklı olduğundan emin olunmalı veya yeni bir cinsin tanımlanması için ise daha önce tanımlanan cinslerden yeterince farklı olduğuna kesin olarak karar verilmelidir (böyle bir durumda otomatik olarak bir de tür atanır). Yeni bir cins veya türün resmi bir taksonomik adlandırmasını yapabilmek için, izolatm detaylı bir tanımlaması ile önerilen ismi yayınlanmalı ve organizmanın canlı kültürü, uluslararası iki kültür kolleksiyonuna gönderilmelidir. Kültür kolleksiyonlarına örnek olarak Amerikan Tür Kültür Kolleksiyonu (American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, Virginia, ABD) veya Alman Mikroorganizma ve Hücre Kültür Kolleksiyonu (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ, Braunschweig, Almanya) (e^> Kısım 30.1) verilebilir. Depozit edilen suş yeni türün tip susu ve ona benzer olduğu düşünülen diğer suşların karşılaştırılabildiği bir standart haline gelir. Kültür kolleksiyonları, depozit edilen kültürleri genelde çok düşük sıcaklıklarda dondurarak (-80 ile -196°C) veya dondurup kurutarak muhafaza eder. Bu uygulama taksonomik açıdan botanik veya zoolojik yaklaşımlardan farklıdır. Bu disiplinler yeni türler ile karşılaştırmada kullanmak için (ölü) numuneleri (ya kurutulmuş herbaryum materyali veya kimyasal olarak fikse edilmiş hayvan numuneleri) muhafaza ederler. Bunun aksine, mikrobiyologlar her zaman bilimsel araştırıcılara dağıtılabilecek, farklı laboratuvarlarda geliştirilebilecek ve çalışılıp karşılaştırılabilecek yaşayan tip suşları kullanırlar. Bu yaklaşım, organizmaların özelliklerinin özellikle moleküler seviyede daha detaylı ve verimli şekilde karşılaştırılmasına olanak sağlar. Eğer yeni bir türün tanımlaması International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology
(IJSEM) yerine başka bir dergide yaymlanmışsa, prokaryotların taksonomisi ve sınıflandırması için gereken resmi yayın belgesi ile yayınlanmış bir kopya makalenin bu dergiye sunulması ve ayrıca yeni bir prokaryotik takson olduğu kabul edilmeden önce isminin onaylanması gerekir. I)SEM her baskıda yeni oluşturulmuş isimlerin onaylanmış bir listesini yayınlar ve prokaryotik taksomide araştırmalar için kullanılan bir yayın kaynağı olarak iş görür. Yeni ve resmi prokaryotik isimler (www.bacterio. cict.fr) internet sitesi adresinden de takip edilebilir. Bergey's Manual ve Prokaryotes Yeni önerilen isimleri onaylayan IJSEM, bu isimlerin prokaryotların taksonomisinde temel bir kaynak olan Bergey's Manual of Systematic Baderiology adlı
kitaba dahil edilmesininin önünü açmış olur (Şekil 11.27»). Bergey's Manual, 1923'den bu yana mikrobiyologlar tarafından yaygın olarak kullanılmaktadır ve tüm bilinen prokaryotik türlere ait özet bilgiler içeren ciltlik bir ansiklopedi şeklindedir. Bir uzman
• Şekil 11.27 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology'tıin ikinci baskısı. Bu kaynağın toplam beş cildinde bilinen tüm prokaryotlann temel özellikleri tanımlanır, hem Bacterialar hem de Archaealar
tarafından yazılmış her bölüm tablolar, şekiller ve teşhis etmede kullanılabilecek diğer sistematik bilgileri içerir. Bergey's Manual'm I. Cildinin ikinci baskısı 2001 yılında, 2. Cildi 2005 yılında basılmış, üç yeni ilave cilt ise 2007 yılında basılmış olacaktır. Bergey's Manual'm ikinci baskısı, ribozomal RNA dizilemesi ve genomik çalışmaların bol miktarda fenotipik bilgi ile harmanlandığı pek çok kavramı içine alır. Prokaryotik çeşitlilikte kullanılan ikinci temel kaynak ise Prokaryotes'dur. Bu çalışmanın 4100'den fazla sayfa içeren (dört cilt) ikinci baskısına (1992), şu an online olan üçüncü bir baskısı ile (http://141.150.157.117:8080/prokPUB/index. htm) adresinden ulaşılabilmektedir. Elektronik baskı, prokaryotik taksonomi ve filogenide hızla ortaya çıkan yeni verilerin yansıtılabilmesi için sıklıkla güncelleştirilmektedir. Bergey's Manual ve Prokaryotes, mikrobiyologla-
ra bugün bilgimiz dahilindeki prokaryotik taksonomi ve filogeni hakkında detaylı bilgiler sağlayan hem bir kuruluş, hem de yeni izole ettikleri prokaryotları tanımlamalarında kullanacakları birer başucu" kaynağıdır. Bölüm 18'de de göreceğimiz gibi, doğada henüz kültüre edilememiş çok sayıda prokaryot vardır. Bunlar muhtemelen "kültüre edilemeyen" prokaryotlar değildir, ama şu anki kültüre etme bilgilerimiz bunun için yeterli olmamaktadır. Bu organizmalar bir gün kültüre edilip, karakterizasyonları ve isimlendirmeleri yapıldığında, Bergey's Manual ve Prokaryotes çok sayıda prokaryotik türe yer vermek için kapsamlarını inanılmaz şekilde genişletmek zorunda kalacaklardır. "(JHj) 11-13 Kavramların Gözden Geçirilmesi Prokaryotlara tanımlayıcı cins isimleri ve tür epitetleri verilir. Yeni bir prokaryotik türün resmi olarak tanınması için, organizmaya ait bir numunenin kültür kolleksiyonuna gönderilmesi ve yeni tür ismi ile tanımının resmi olarak yayınlanması gerekmektedir. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Bacteria ve Archaea'ya ait temel taksonomik bilgilerinin yer aldığı en önemli kaynaktır. •
I]SEM nedir ve yaptığı hangi taksonomik işlevler onu önemli kılar? • Taksonomide muhafaza edilmiş numuneler yerine neden canlı hücre materyalleri daha çok kullanılılıyor olabilir?
328 • Bölüm 11 • Mikrobiyal Evrim ve Sistematik
DEĞERLENDİRME SORULARI 1. 2.
3.
4. 5.
6.
7.
8.
9.
Dünya gezegeni kaç yaşındadır? Bilinen en eski mikrofosiller kaç yaşındadır (c*^3Kısım 11.1)? ilkel organizmaları kendilerini eşlemeye iten temel özellikler nelerdir ve niçin buna gereksinim duymuşlardır (oöaKısımll.2)? RNA'nın hangi özellikleri bir RNA yaşam çağının varlığını mümkün kılar? Eğer RNA yaşam formları var olmuşsa, günümüzde onlardan hâlâ hangi kalıntılar bulunabilir (<E«öKısım 12.2)? Ferrik demir, FeS ve H 2 'nin ilkel yaşam sürecinde nasıl rol oynayabileceğini tartışınız (ö^Kısım 11.3). Siyanobacteriamn evrimleşmesi, kendisinden sonra evrimleşen yeryüzündeki yaşamın üzerinde neden büyük bir etkiye sahiptir? Bugüne kadar hangi jeolojik kayıt, siyanobacterialarm evrimleşmesini göstermek için kullanılmıştır (ooaKısım 11.3)? Endosimbiyozun modern, organel içeren eukaryatik hücrelerin oluşumundan sorumlu olduğunu destekleyen kanıt nedir (^oaKısım 11.4)? (İpucu: öOûKısım 14.214.5'i gözden geçirebilirsiniz) Ribozomal RNA'lar filogenetik çalışmalar için neden sitokromlar gibi proteinlerden daha belirleyici moleküllerdir (C^öKısım 11.5)? (İpucu: Bu makromoleküllerin prokaryotlar arasındaki yayılımı üzerinde düşününüz). 16S rRNA dizilerini elde etmede kullanılan yöntemleri tarif ediniz. Polimeraz zincir reaksiyonunun (PCR) moleküler filogenideki rolü nedir (c^öKısım 11.6)? Sinyal dizileri nedir ve filogenetik değerleri nedir? Sinyal dizileri nasıl seçilir (c«*5Kısım 11.7)?
10. FISH teknolojisi nedir? Nasıl kullanıldığına dair bir örnek veriniz («»ûKısım 11.7). 11. Ribozomal RNA dizilerinin çalışılması ile hangi temel evrimsel bulgular ortaya çıkarılmıştır? Bu klasik evrimsel görüşü nasıl değiştirmiştir? Bu buluş, eukaryatik organizmaların kökeni hakkında daha önce ortaya atılan görüşleri nasıl desteklemiştir (C°o>Kısım 11.8)? 12. Archaea, Eukarya ve Bacteria ile hangi temel fizyolojik ve biyokimyasal özellikleri paylaşırlar (c°aKısım 11.9)? 13. Klasik bacterial taksonomide organizmaları gruplandırmak için hangi temel fenotipik özellikler kullanılır? Eğer kullanılıyorsa, bu özelliklerden hangisi filogenetik bir tahmin gücüne sahiptir (CKSsKısım 11.10)? 14. GC oranları filogenetik belirlemeler yapmak için neden uygun değildir? GC baz oranları taksonomik çalışmalarda hangi durumlarda kullanılır (i^^Kısım 11.10)? 15. Ribotiplendirme, bir teşhis aracı olarak 16S dizilemesinden nasıl farklılık gösterir? Ribotiplendirmenin çok lokuslu dizi tiplendirmesinden farkı nedir (<3C%>Kısım 11.11)? 16. FAME analizlerinde ne ölçülür («»öKısım 11.11)? 17. Yeni bacteria türlerinin nasıl ortaya çıktığı düşünülür? Ne kadar bacteria türü vardır? Bu sayıyı neden kesin olarak bilmiyoruz («»»Kısım 11.12)? 18. Verilen bacteria ismini inceleyiniz: Pseudomonas aeruginosa. Bunun hangi kısmı tür epitetidirl Taksonomik hiyerarşiye kaynak olarak görülen hangi iki isim, diğer pek çok isim listesini içinde barındırır (ö°öKısım 11.13)?
UYGULAMA SORULARI 1.
Yaşamın ilk ortaya çıktığı Dünya ile bugünkü yaşam koşullarını fiziksel ve kimyasal açıdan karşılaştırarak mukayese ediniz. Fiziksel bir açıdan bakarak, ilkel dünyada hayvanların neden var olmadığım en az iki sebeple tartışınız. 2. Yaşamın milyar yıl önce olduğu gibi günümüzde evrimleşmesi neden olanaksızdır? 3. Endosimbiyoz hipotezine karşı olan biri ile tartıştığınızı düşünün. Karşınızdaki kişiyi ikna etmek için endosimbiyozun olduğunu destekleyen hangi beş kanıtı kullanırsınız? (Cevabınızı yazmadan önce Kısım 14.4'ü gözden geçirebilirsiniz.) 4. Aşağıdaki dizileri temel alarak bu organzimalar arasındaki evrimsel uzaklığı hesaplayınız ve bu üçünden hangi ikisinin birbiri ile daha yakın akraba olduğunu tahmin ediniz. Organizma 1: AGGUACGUUA Organizma 2: UGCCACGGUU Organizma 3: AGGUACGGUA Bu üç organizmanın evrimsel ilişkilerinin yaklaşık olarak gösterildiği filogenetik bir ağaç çiziniz. 5. İki prokaryotun Şekil 11.24'de gösterildiği biçimde lipit analizlerini yaptığınızı farzedin. A kültüründeki sonuçlar kısa zincirli doymamış yağ asitlerinin fazla olduğunu gösteriyor. B kültüründeki hücrelerin ana-
lizi eter bağlı fitanil lipitlerin varlığım gösteriyor. Bu bilgilere dayanarak, A ve B organizmalarının hangi filogenetik domaine dahil olduğunu söylersiniz? Eğer bu iki organizmanın da ekstremofil olduğunu ve birinin sıcak su kaynağından ve diğerinin de kutuplardaki buzlanmış denizden izole edildiklerini söylüyorsanız (öODKısım 2.4), bunlardan hangisi nereden izole edilmiştir? Son olarak lipit analizi sonuçlarını ve lipitlerin hücrede en çok nerede bulunduğunu düşünerek (CSa Kısım 3.4 ve Şekil 3.3), bulduğunuz maddelerin her bir organizmanın kendi ekstrem koşullarında canlı kalbilmesi için nasıl fayda sağladığını açıklayınız. (Cevaplamadan önce Kısım 6.10-6.12'deki bilgileri gözden geçirebilirsiniz.) 6. Aşağıdaki uzunlukta olan DNA'daki GC oranını belirleyiniz: TAAGCCTGCAAGCTTAGCTA ATTCGGACGTTCGAATCGAT 7. Prokaryotlarm taksonomisi ve filogenisi ile zenginleştirilmeleri, izolasyonları ve kültürasyonları hakkında bilgi edinmek için hangi referans kaynakları kullanırsınız? Eğer kütüphanenizde bu kaynaklar mevcut ise içindekiler tablolarını karşılaştırınız. Bunlardan hangisi sınıflandırma ve adlandırma üzerinde daha çok durur?
PROKARYOTIK ÇEŞİTLİLİK: BACTERİA I 12.1 II 12.2 12.3 12.4 12.5 12.6 12.7 12.8 12.9 12.10 12.11 12.12 12.13 12.14 12.15
Bacteria türleri, morfolojileri, fizyolojileri ve filogenileri bakımından çok büyük çeşitlilik gösterir. Resimde, tomurcuklanan bir myxobacterium olan Chondromyces crocatus görülmektedir. Bu organizmanın tomurcuklanan gövdesi, karmaşık yaşam döngüsü boyunca üretilen miksosporları bulundurur. Miksosporlar çimlenerek yeni bir hücre popülasyonu oluşturabilir.
12.16 12.17 12.18
III
BAKTERİLERİN FİLOGENİSİ 331 Bacteria'nm Filogenisine Genel Bakış
331
ŞUBE 1: PROTEOBACTERIA
332
Mor Fototrofik Bacteria Nitrifiye Edici Bacteria Kükürt ve Demir Okside Eden Bacteria Hidrojen Okside Eden Bacteria Metanotroflar ve Metilotroflar Pseudomonas ve Pseudomonadlar Asetik Asit Oluşturan Bacteria Serbest Yaşayan Aerobik Azot Fiksasyonu Yapan Bacteria Neisseria, Chromobacterium ve Akraba Gruplar Enterik Bacteria Vibrio ve Photobacterium Rickettsia Spirilla Kılıflı Proteobacteria: Sphaerotilus ve Leptothrix Tomurcuklanan ve Prostekalı /Saplı Bacteria Kayan Myxobacteria Sülfat ve Kükürt-İndirgeyen Proteobacteria
332 337 340 342 345 348 348 350 351 355 357 359 362 363 367 371
Ş U B E 2 VE 3 : GRAM-POZİTİF BACTERİA VE 374 ACTINOBACTERIA
12.19 Sporlanmayan, Düşük GC'li, Gram Pozitif Bacteria: Laktik Asit Oluşturan Bacteria ve Akrabaları 12.20 Endospor-Oluşturan, Düşük GC'li, Gram-pozitif Bacteria: Bacillus, Clostridium ve Akraba Gruplar 12.21 Hücre Duvarı Olmayan, GC Oranı Düşük, Gram-Pozitif Bacteria: Mycoplasmalar 12.22
335
374
379
383
GC Oranı Yüksek Gram-Pozitif
Bacteria (Actinobacteria): Coryneform ve Propiyonik Asit Bakterileri 12.23 Actinobacteria: Mycobacterium 12.24 Filamentöz Actinobacteria: Streptomyces ve Diğer Actinomycetes
386 388 390 329
330 • Bölüm 12 • Proharyotik Çeşitlilik: Bacteria
IV ŞUBE 4: CYANOBACTERIA VE PROCHOLOROPHYTLER 394 12.25
Cyanobacteria
12.26
Procholorophytes (Proklorofitler) ve Kloroplastlar
V 12.27 VI 12.28
394
ŞUBE 5: CHLAMYDIA Chlamydia
399 399
ŞUBE 6: PLANCTOMYCES/ PIRELLULA 401^
401
ŞUBE 7: VERRUCOMİCROBIA
402
12.29
Verrucomicrobium ve Prosthecobacter
402
VIII
ŞUBE 8: FLAVOBACTERIA 403
12.30
Bacteroides ve Flavobacterium
IX 12.31
12.32
XI
XII
Cytophaga ve Akraba Gruplar
404
ŞUBE 1 1: SPIROCHETES
405 407 407
ŞUBE 1 2 : DEINOCOCCI
411
Deinococcus/Thermus
XIII
ŞUBE 13: YEŞİL KÜKÜRTSÜZ BAKTERİLER 412
12.35 Choloroflexus ve Akraba Gruplar
411
412
XIV
ŞUBE 14-16: AŞIRI DALLANMIŞ HİPERTERMOFİLİK BAKTERİLER 414^
12.36
Thermotoga ve Thermodesulfobacterium
414
Aquifex, Thermocrinis ve Akraba Gruplar
415
12.37
XV 404
Chlorobium ve Diğer Yeşil Kükürt Bakterileri
12.34
403
ŞUBE 9: CYTOPHAGA GRUBU
ŞUBE 1O: YEŞİL KÜKÜRT BAKTERİLERİ 405^
12.33 Spiroketler
Planctomyces: Filogenetik Olarak Kendine Özgü Saplı Bakteri
VII
397
X
12.38
ŞUBE 17 VE 18: NITROSPIRA VE DEFERRIBACTER 416 Nitrospira, Deferribacter ve Akraba Gruplar
416
BOLÜMLE İLGİLİ SOZLUK Asit-dirençlilik Mycobacterium türlerinin bir özelliği; bu türlerin asit fuksin ile boyanmış hücreleri asidik alkol ile yıkandığında boyayı kaybetmezler Cyanobacteria klorofil a ve fikobilinleri bulundurduğu halde klorofil b bulundurmayan prokaryotik oksijenik fototroflar Enterik bakteriler fakültatif aerobik metabolizmalarıyla karakterize edilen çubuk şeklindeki gram-negatif Bacteria Heliobacteria bakteriyoklorofil g içeren anoksijenik fototroflar Heterofermentatif birden fazla tipte fermentasyon ürünü oluşturabilen laktik asit bakterileri Heterosist azot fiksasyonu yaptığı halde oksijenli fotosentez yapamayan farklılaşmış siyanobakteri hücresi Hipertermofil 80°C'den daha yüksek sıcaklıklarda yaşayabilen organizma Homof ermentatif fermentasyon ürünü olarak sadece laktik asit üretebilen bakteriler Karboksizom Calvin döngüsünün anahtar enzimlerinden olan kristalize ribüloz bisfosfat karboksilaz (RubisCO)'ın oluşturduğu polihedral hücresel inklüzyon Kemolitotrof enerji kaynağı (elektron 2+ + vericisi) olarak H2, Fe , S° ya da NH 4
gibi inorganik bileşikleri okside edebilen organizma Klorozom yeşil bakterilerde ve Ch\oroflexus'da bulunan, ışık soğurucu bakteriyoklorofil (c, d ya da e) içeren ve ünit membran yapısında olmayan bir zarla çevrelenmiş olan çubuk şeklindeki yapı Konsorsiyum genellikle çok yakm simbiyotik ilişki içinde olan iki ya da daha fazla üyeden oluşmuş prokaryot birliği Metanotrof enerji metabolizmasında elektron vericisi olarak metan (CH4) kullanan organizma Metilotrof karbon-karbon bağı içermeyen organik bileşikleri okside edebilen organizma; eğer CH4 'ı okside edebilirse ayrıca bir metanotroftur Miksotrof inorganik bileşikleri okside ederek enerji edebildiği halde karbon kaynağı olarak organik bileşiklere de gereksinim duyan organizma Mor kükürt bakterileri bakteriyoklorofil a ve b bulunduran, H S'i okside ederek elementer kükürdü hücre içinde (ya da Ectothiorhodospira ve Halorhodospi-
ra cinslerinde olduğu gibi hücre dışında) depolayabilme özelliğine sahip fototrofik prokaryotlar Mor kükürtsüz bakteriler fotoheterotrof olarak çok iyi gelişen, H2S'e karşı
düşük toleransa sahip, bakteriyoklorofil a ve b bulunduran fototrofik prokaryot grubu Nitrifiye edici bakteriler NH3—> NO 2 ' ya da NO 2 —• NO3~ dönüşümlerini gerçekleştirebilen kemolitotroflar Proklorofit klorofil a ve b bulunduran ancak fikobilinlerden yoksun olan prokaryotik oksijenik fototrof Prosteka hücre duvarı ile çevrili belirgin bir çıkıntı oluşturan sitoplazma uzantısı Proteobacteria gram-negatif basil ve kokların büyük bölümünü içeren ana bakteri grubu Spiroket hareket amacıyla kullandığı bir hücre-içi kamçıya sahip olmasıyla karakterize edilen, sıkı şekilde bükülmüş biçimli gram-negatif prokaryot Stickland tepkimesi biri elektron alıcısı, diğeri elektron vericisi olarak görev yapan bir amino asit çiftinin fermentasyonu Sülfat-redükte edici bakteriler SO4 2 'yi elektron alıcısı olarak kullanarak anaerobik solunum yapan ve H2S üreten anaerobik bakteri grubu Yeşil kükürt bakterileri ışık soğurucu klorofil olarak klorozomları ve bakteriyoklorofil c, cs, d, ya da e içeren anoksijenik fototroflar
12.1 • Bacteria Filogenisine Cenel Bakış • 331 BAKTERİLERİN FİLOGENİSİ ikrorganizmalar arasındaki evrimsel ilişkiler 11. Bölüm'de incelenmişti. Bu ve bundan sonraki iki bölümde önemli mikrobiyal grupların özelliklerini tartışarak bu kavramları genişleteceğiz. Bu bölümde Bacteria türleri, diğer iki bölümde ise sırasıyla Archeae ve mikrobiyal Eukarya üzerinde odaklamlacaktır. Yaklaşık olarak 7000 kadar prokaryot türü bilinmekle birlikte, bunların hepsini incelememiz mümkün olmayacaktır. Bu nedenle, filogenetik ağaç üzerinde odaklanılacak ve kültürü yapılmış ve özellikle de fenotipik özellikleri bilinen türler ele alınacaktır. Prokaryotik çeşitlilik üzerinde daha ayrıntılı bilgi için Bergey's Manual of Systematic Bacteriology ve The Procaryotes adlı kaynaklara başvurmak gerekir (cooKısım 11.13).
M
Bacteria, Filogenisine Genel Bakış En az 18 temel Bacteria şubesi laboratuvar kültürü çalışmaları sonucunda, diğer birçoğu da doğal habita Harından izole edilerek ribozomal RNA genlerinin dizi analizleri ile tanımlanmıştır. Şekil 12.1 • Bacteria filogenetiğini özetlemektedir. Filogenetik olarak en eski (en az türemiş) şube, Aquifex cinsi ve bunların akrabalarını içerir. Bunların tümü H2-
okside eden hipertermofilik kemolitotroflardır. Thermodesulfobacterium, Thermotoga ve yeşil kükürtsüz bakteriler (Chloroflexus grubu) gibi İlkel' şubeler de termofilik türler içerir. Yeşil kükürtsüz bakterilerden daha eskiye doğru gittiğimizde, deinococci ve bunların akrabalarını, morfolojik olarak benzersiz spiroketleri, fototrofik yeşil kükürtsüz bakterileri, kemoorganotrofik Flavobacterium ve Cytophaga gruplarını, tomurcuklanan Planktomyces-Pirella ve Verrucomicrobium gruplarını, Chylamyda, Nitrospim ve Deferribacter cinslerini görürüz (Şekil 12.1). Bu grupların her biri bu bölümde tartışılacaktır. Kültürleri yapılan diğer Bacteria şubeleri bu bölümün büyük bir kısmını kapsamaktadır. Bunlar arasında gram-pozitif bakteriler, siyanobakteriler ve Proteobacteria bulunmaktadır. Bunların her biri birçok cins içeren büyük gruplar olup, fenotipik özellikleri en çok bilinen grup Bacteria'dır. Gram-pozitif bakteriler iki alt-gruba ayrılır ve bunlar düşük GC ve yüksek GC (Actinobacteria) olarak adlandırılırlar. Bu terimler DNA'daki GC baz oranını belirtir (Bkz. Kısım 11.10). DNA'daki GC oranı %50'nin altında olanlar düşük GC, %50'nin üstünde olanlar ise yüksek GC alt-grubundadır. Kemoorganotrofik Bacteria'mn büyük bir grubu olan gram-pozitif bakteriler Kısım 12.19-12.24'da ayrıntılı olarak ele alınacaktır. Oksijenik fototrof prokaryotlar olan siyanobakterilerin evrimsel kök-
Spiroketler
Yeşil kükürtsüz bakteriler Thermotoga Thermodesulfobacterium
• Şekil 12.1 Bakteri ana kollarının 16 S ribozomal RNA dizi karşılaştırmalarına dayanan detaylı filogenetik ağacı. İçerdiği çoğu şube topluluk örneklemelerinden bilinir (Kısım 11.7), gerçekte ise 40'dan fazla bakteri şubesini içerir.
332 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
leri gram-pozitif Bacteria'ya yakındır. Bu organizmalar Kısım 12.25 ve 12.26'da incelenecektir. Bacteria filogenetik ağacı üzerindeki son şube Proteobacteria'dır (Şekil 12.1). Bunlar en büyük Bacteria grubunu oluştururlar (Bkz. Kısım 12.212.18). Proteobacteria, birçok cinsi bulunduran beş kümeden (cluster) oluşur. Her bir grup alfa, beta, gama, delta ve epsilon gibi Yunan harfleri ile temsil edilir (Tablo 12.1). Proteobacteria, fizyolojik olarak fototrofik, kemolitotrofik ya da organotrofik olabilir. Bölüm 17' de bu gruptaki bakterilerin enerji üretim mekanizmalarındaki büyük çeşitliliği göreceğiz. Şimdi Bacteria'mn en büyük ve metabolik olarak en fazla çeşitliliğe sahip grubu olan Proteobacteria'yı incelemeye başlıyoruz.
Tablo 12.1 Proteobakterilerin başlıca cinsleri' Altdivisio Acetobacter Agrobacterium Akaligenes Azospirillum Beijerinckia Bradyrhizobium Brucella Caulobacter Ehrlichia Gluconobacter Hyphomicrobium Methylocystis
Nitrobacter Paracoccus Rhodospirillum Rhodopseudomonas Rhodobacter Rhodomicrobium Rhodovulum Rhodopila Rhizobium Rickettsia Sphingomonas Zymomonas
Beta
Aauaspirülum Bordetella Burkholderia Chromobacterium Dechloromonas Gallionella Leptothrix Methyîophüus Neisseria Nitrosomonas
Oxalobacter Polaromonas Ralstonia Rhodocyclus Rhodoferax Sphaerotilus Spirillum Thiobacillus Zoogloea
Gama
Acetobacter Acinetobacter Azotobacter Chromatium Escherichia Ectothiorhodospira Erıuinia Francisella Halomonas Halorhodospira Halothiobacillus Legionella Leucothrix Methylomonas Oceanospirillum
Photobacterium Pseudomonas Methylococcus Methylobacter Nitrosococcus Nitrococcus Thermochromatium Thiomicrospira Thiospirülum ve diğer mor kükürt bakterileri Salmonella ve diğer enterik bakteriler Vibrio Xanthomonas
Delta
Acinetobacter Aeromonas Bdellovibrio Desulfuromonas Desulfovibrio a n d most other sulfatereducing Bacteria Francisella
Epsilon
Campylobacter Helicobacter
ŞUBE 1: PROTEOBACTERİA Proteobacteria kapsamındaki önemli cinsler Tablo 12.1'de verilmiştir. Bu organizma grubunun tümü gram-negatif olup, büyük ölçüde metabolik çeşitlilik gösterir ve tıbbi, endüstriyel ve tarımsal açıdan önemli olduğu bilinen gram-negatif bakterilerin çoğunu içine alır. Tartışmamıza fototrofik Proteobacteria olan mor bakteriler ile başlıyoruz.
Mor Fototrofik Bacteria Anahtar Cinsler: Chromatium, Ectothiorhodospira, Rhodobacter, Rhodospirillum Mor fototrofik bakteriler oksijensiz fotosentez yaparlar. Ancak Cyanobacteria'dan farklı olarak (Bkz. Kısım 12.25) O2 oluşturmazlar. Morfolojik olarak çok çeşitlilik gösteren mor bakteriler, filogenetik, morfolojik ve fizyolojik özellikleri göz önünde bulundurularak sınıflandırılırlar. Alfa, beta ya da gama Proteobacteria içinde yer alan farklı cinsler vardır.
Cins
Alfa
Geobacter Halomonas Moraxella Myxococcus ve diğer miksobakteriler Pelobacter Syntrophobacter Thiovulum Wolinella
u
Mor bakteriler bakteriyoklorofil adı verilen klorofil
pigmentlerini ve çok çeşitlilik gösteren karotenoid pigmentlerden birini içerirler ( Şekil 17.4 ve 17.9). Bu pigmentler mor bakterilerin kendilerine özgü mor, kırmızı ya da kahverengi renklerinden sorumludur (Şekil 12.2«). Bu pigmentlerin yapıları ve ışık-aracılığı ile enerji üretiminde (bu süreç fotofosforilasyon adını alır) nasıl işlev yaptıkları Bölüm 17'de incelenecektir. Mor bakteriler sitoplazma içinde yer alan fotosentetik zar sistemlerini sentezlerler. Pigmentler bu zar sistemleri içine katılırlar. Bu zarlar değişik biçimlerde olmakla birlikte (Şekil 12.3»), her durumda sitoplazmik zarın içeriye doğru çökmesiyle oluşurlar. Bu iç zar sistemleri mor bakterilerin özgül pigment içeriğinin artmasını ve dolayısıyla mevcut ışınlardan daha iyi yararlanmasını sağlar.
Bu tablo tam anlamıyla kapsamlı olmayıp, sadece çok iyi tanımlanmış Proteobacteria cinslerini içermektedir. Proteobacteria'nın tüm cinsleri ve Bacteria cinsleri için Ek 2'ye bakınız
Yüksek ışık şiddeti altında üretilen hücreler daha az iç zar ve pigment içerir. Buna karşılık düşük ışık şiddeti altında gelişen hücreler zarlar ve fotopigmentlerle doludur. Mor Kükürt Bakterileri
Fotosentez sırasında CO2'i indirgemek için elektron vericisi olarak hidrojen sülfit (H2S) kullanan mor bakteriler mor kükürt bakterileri olarak bilinir (Tablo 12.2). Sülfit elementer kükürde (S°) yükseltgenir ve hücre içinde kürecikler halinde depolanır (Şekil 12.4»). Kükürt daha sonra sülfa-
12,2 • Mor Fototrofik Bacteria • 333
Mor kükürt bakterileriıtina cinsleri ve Tablo 12.2 özellikleri' Özellikleri Kükürtü dışta depolayanlar Spiral, polar kamçılı Spiral, aşırı alkalifil Spiral, aşrı halofil Kükürtü içte depolayanlar Gaz kürecikleri içermeyenler Oval veya basil, polar kamçılı
• Şekil 12.2 Sıvı kültürdeki fototrofik mor bakterilerin, çeşitli karotenoid pigmentler içeren türlerinin renklerini gösteren fotoğrafı. Mavi kültür, aslında bakteriofil a'nın gerçekte mavi olduğunu gösteren Rhodospirullum rubrum' un karetonoidsiz mutant türevidir. En sağ şişe ise (Rhodobacter sphaeroides G susu) doğal tipte olan karotenoidlerden birim içermediğinden daha yeşildir.
Küre, alkalifilik Küre, bakteriyofil b içeren Küre Küre, diplokok, tetrat, hareketsiz; hücreler 1,2-3 /un çapında Küre veya oval, polar kamçılı; hücreler 2,5-3 /xm çapında Küre; hücreler 1,5-2,5 /im çapında Küre; hücreler 1-2 (jm çapında Küre; hücreler 1,2-1,5 fnm çapında Büyük spiral, polar kamçı Küçük spiral Gaz kürecikleri içerenler 4-16 hücreli pulcuk oluşturan düzensiz küreler Basiller Küre, oval polar kamçılı Basil, hareketsiz; düzensiz ağ oluşturan Küre, hareketsiz; tetrat halinde yassı tabaka oluşturan
Cinsler/DNA(mol %GC) Ectothiorhodospira (62-67) Thiorhodospira (57) Halorhodospira (50-69)
Chromatium (48-70) Allochromatium Halochromatium Rhabdochromatium Thermochromatium lsochromatium Marichromatium Thioalkalicocus (64) Thioflavicoccus (66) Thiorhodococcus (67) Thiocapsa (63-70) Thiocystis (61-68) Thiohalocapsa (66) Thiorhodococcus (67) Thiococcus (69) Thiospirillum (45) Thiorhodovibrio (61-62) Thiolamprovum Lamprobacter (64) Lamprocystis (64) Thiodktyon (65-66) Thiopedia (62-64)
a
Filogenetik görüş açısına göre, bütün hepsi Proteobakterilerin gamma altdivisiosundadır.
• Şekil 12.3 Fototrofik mor bakterilerin elektron mikroskobu ile gösterilmiş zar sistemi, (a) Mor fototrofik bakteri Ectothiorhodospira mobilis'in yassı yapraklar (lamella) halindeki fotosentetik zarlarını gösterir, (b) Diğer bir fototrofik mor bakteri olan Allochromatium vinosum'un küresel şekilli kesecikler halindeki zarlarını gösterir.
ta (SO42)oksitlendiğinde ortadan kaybolur. Birçok mor kükürt bakterisi diğer indirgenmiş kükürt bileşiklerini fotosentetik elektron kaynağı olarak kullanabilir. Labaratuvar kültürleri için en çok kullanılan elektron vericisi tiyosülfat (S2O3~2)'tır. Bugüne kadar keşfedilmiş bütün mor kükürt bakterileri gama Proteobacteria içinde gruplamr. Mor kükürt bakterileri genellikle H2S'in biriktiği ışıklı oksijensiz göl ve diğer sucul habitat zonlamnda ve jeokimyasal ya da biyolojik olarak üretilen H2S'in bu bakterilerin üremesini tetiklediği "kükürtlü dereler"de bulunurlar (Şekil 12.5»). Mor bakterilerin gelişmesi için en uygun göller meromiktik (kalıcı olarak tabakalaşmış) olanlardır. Meromiktik göller dipte daha yoğun (genellikle tuzlu su), yüzeye yakın yerlerde ise daha az yoğun su (genelde tatlı sular) içerdikleri için tabakalaşma gösterirler. Ortamda indirgenmeye yetecek kadar sülfat varsa, katmanlarda üretilen sülfid oksijensiz olan daha üstteki dip katmanlara doğru yayılır ve burada mor kükürt bakterileri genellikle yeşil kükürtlü bakteri-
334 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
lerle birlikte çok miktarda üreyerek yoğun hücre kütleleri oluştururlar (Şekil 12.5c). Ectothiorhodospira ve Halorhodospira
özellikle
ilgi çeken cinslerdir. Diğer mor kükür bakterilerinden farklı olarak bu organizmalar H2S'i oksitleyerek oluşturdukları S°'ü hücre dışında biriktirirler (Şekil \2Ad). Bu cinslerin bir başka ilginç özelliği, bilinen tüm prokaryotlar arasında en aşırı halofilik (tuz seven) ve/veya alkalifilik (bazofilik) türleri içermeleridir. Bu organizmalar tipik olarak tuzlu, göllerde, sodalı göllerde ve tuzlalarda yaşarlar.
•m s »a
• Şekil 12.4 Mor kükürtlü bakterilerin açık-alan fotomikrograflan. (Aynca tablo 12.2'ye bakınız), (a) Chromatium okenii; hücreler yaklaşık 5 fim genişliğindedir. Hücrelerin içinde elementer kükürt görülmektedir, (b) Thiospirillum jenense, kutuplarında kamçılan olan çok büyük, spiral hücrelerdir ve yaklaşık 30 (im uzunluğundadır. İçinde kükürt kürecikleri görülmektedir. (c) Thiopedia rosea; hücreler yaklaşık 15 fim genişliğindedir. (d) Ectothiorhodospira mobilis'in faz mikroskobu görüntüsü. Hücreler yaklaşık 0,8 fim genişliğindedir. Dışarda kükürt kürecikleri görülmektedir (okun ucunda). Chromatium okenii'm'n fotoğrafını büyük Rus mikrobiyolog Sergei Winogradsky'nin en az 115 yıl önce yaptığı mor kükürt bakterilerinin çizimleriyle karşılaştırınız. (Kısım 1.7 ve Şekil 1.15)
Mor Kükürtsüz Bakteriler
Bazı mor bakteriler mor kükürtsüz bakteriler olarak adlandırılırlar. Bunun nedeni başlangıçta bunların CO2'i hücresel madde içeriğine indirgemek için elektron vericisi olarak sülfidi kullanamadıklarının düşünülmesidir. Oysa bu gruptaki türlerin birçoğu sülfidi kullanabilir. Ancak, mor kükürt bakterileri için ideal olan sülfid miktarı (1-3 mM), mor kükürtsüz bakterilerin pek çoğuna zehir etkisi gösterir. Bazı mor kükürtsüz bakteriler fermentasyon yani oksijensiz solunum yaparak karanlık oksijensiz koşullarda yaşar; birçoğu da karanlıkta oksijenli solunum yaparak gelişir. Bu ikinci durumda fotosentetik mekanizmanın sentezi baskılanmakta ve elektron vericisi olarak ya organik bir bileşik hatta bazı türlerde H 2 gibi inorganik bir bileşik kullanılmaktadır. Bu grup üyelerinin fotoheterorofik yeteneği (enerji kaynağı olarak ışık, karbon kaynağı olarak organik bir bileşik kullanmaları, öOaŞekil 17.1) onlara, doğal ortamlarında rakiplerine karşı üstünlük kazandırmaktadır. Mor kükürtsüz bakteriler karbon kaynağı olarak yağ asitlerini, organik asitleri, amino asitleri, şekerleri, alkolleri ve hatta benzoat gibi aromatik bileşikleri kullanabilirler ve dolayısıyla beslenme açısından çeşitlilik taşırlar. Birçok tür aynı zamanda CO2 + H 2 veya CO2 + az miktarda H2S ile fotoototrofik olarak üreyebilir. : .
• Şekil 12.5 Mor kükürtlü bakteri tabakaları (bloom). (a) Thiopedia roseopersicina, Madison, VVisconsin'deki sülfit kaynağında. Bakteriler kaynak havuzunun dibine yakın çoğalırlar; daha sonra rahatsız edildiklerinde (gaz küreciklerinin hareketiyle) (Gaz küreciklerinin hareketini incelemek için Kısım 4.12'ye bakımz) yüzeye çıkarlar. (Şekil 14.35 d) (b) British Columbia'daki Mahoney Gölü'nde 7m derinlikten alınan su örneği. Birincil organizma Amoebacter purpureus'tur. (c) Michigan'da küçük bir strafiye (tabakalanmış) göldeki mor kükürt bakteri tabakalarının faz kontrast fotomikrografı. Fotoğraftaki mor kükürt bakterileri Chromatium türleri (büyük basiller) ve Thiocystis (küçük koklar)'dir.
12.3 • Nitrifiye Edici Bacteria • 335
Mor nonkiikürt bakterilerinin cinsleri
Tablo 12.3 ve özellikleri" Özellikleri
CinslerfDNA(mol %GC)
Alfa Proteobacteria Spiral, polar kamçılı
Rhodospirullum (62-68) Phaespirillum; Rhrodovibrio; Rhodothalassium;(66) Roseospirillum (71)
Basil, polar kamçılı; tomurcuklanarak bölünen
Rhodopseıtdomonas (64-72) Rhodopknes (66-69) Rhodobium (61-65)
Basil; ikiye bölünen Oval, peritriş kamçılı; tomurcuklanarak ve hif formuyla üreyen Büyük küre, asidofilik (optimum pH 5) Küçük küre, asidofilik (optimum pH 9)
Rhodobacter (62-71) Rhodomicrobiutn (61-63) Rhodophila (66) Rhodobaca (59)
Beta Proteobacteria Halka şekilli ya da spiral Kıvrık basil Kıvrık basil
Rhodocydus (64-66) Rubivivax (70-72) Rhodoferaz (59-60)
Ctf
'Tamamı Proteobakterilerin üyesidir. (Şekil 12.1 ve Tablo 12.Te bakınız)
Mor kükürtsüz bakterilerin zenginleştirilmesi ve izolasyonu, karbon kaynağı olarak organik bir bileşik katılmış mineral tuz ortamı kullanarak kolayca yapılabilir. Çamur, göl suyu ya da lağım örneği ile inoküle edilmiş bu gibi ortamlar oksijensiz, ışıklı koşullarda tutulduğunda mor kükürtsüz bakteriler kolayca seçilebilir. Zenginleştirilmiş kültür ortamlarındaki inorganik (örneğin, NH4+) veya organik azot (örneğin maya özütü veya pepton) kaynağı çıkarılıp, bunların yerine sadece N o gazı kullanılırsa ortamlar daha seçici hale getirilebilir; çünkü mor kükürtsüz bakterilerin tümü N 2 fiksasyonu yapma yeteneğine sahiptir (£«öKısıml7.28). Mor kükürtsüz bakterilerin morfolojik çeşitliliği mor kükürt bakterilerinin tipik bir özelliği olup (Tablo 12.3 ve Şekil 12.6») bu açıdan bakıldığında bu grubun heterojenitesi açıkça görülür. Şimdiye kadar izole edilen tüm mor kükürtsüz bakteriler, alfa ya da beta Proteobacteria içindedir (Şekil 12.1).
m
12.2 Kavramların Gözden Geçirilmesi
Mor bakteriler karbonu CO2+H2S'den (mor kükürtlü bakteriler) veya organik birleşiklerden (mor kükürtsüz bakteriler) sağlayan anoksijenik fototroflardır. Mor kükürtsüz bakteriler fizyolojik olarak çeşitlilik gösterir ve çoğu karanlıkta kemoorganotrof olarak gelişir. Mor bakteriler Proteobacteria'nın alfa, beta ve gama alt-bölüirilerinde yer alırlar. •
Anoksijenik terimiyle anlatılmak istenen nedir?
'e) • Şekil 12.6 Mor kükürtlü bakterilerden birçok cins (Ayrıca Tablo 12.3'e bakınız), (a) Phaespirillum fulvu;, hücreleri yaklaşık 3 fim uzunluğundadır, (b) Rhodopseudomonas acidophila; hücreleri yaklaşık 4ju.ni uzunluğundadır, (c) Rhodobacter sphaeroides; hücreleri yaklaşık 1,5 fim genişliğindedir. (d) Rhodophila globiformis; hücreleri yaklaşık 1,6 fim genişliğindedir. (e) Rhodocydus purpureus; hücreleri yaklaşık 0,7 fim çapındadır, (f) Rhodomicrobium vanniecii; hücreleri yaklaşık 1-2 fim genişliğindedir. • Mor kükürtsüz bakterilerin aerobik koşullarda fotosentez yapamamasının başlıca sebebi nedir? •
Mor bakteriler ışık yokluğunda üreyebilir mi?
Nitrifiye Edici Bacteria Anahtar Cinsler: Nitrosomonas, Nitrobacter Bacteria türlerinin birçoğu kemolitotrofik olarak yaşayabilir. Kemolitotrofik bakteriler inorganik elektron vericilerini enerji kaynağı olarak kullanma yeteneği açısından fizyolojik benzerlik taşırlar (kemolitorofinin kavramsal temeli Bölüm 17'de tartışılacaktır). Kemolitotroflarm çoğu ototrofik olarak da üreme yeteneğine sahip olma açısından fototrofik bakteriler ve siyanobakteriler ile ortak fizyolojik birçok karakteri paylaşır. Bu kısımda üzerinde en çok çalışma yapılmış olan ve redükte kükürt ya da azot bileşiklerini veya H 2 'i okside etme yeteneğine sahip kemolitotroflar üzerinde yoğunlaşılacaktır.
336 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
Nitritleyici ve Nitratlayıcı Bakteriler
Ortamdaki indirgenmiş inorganik azot bileşiklerini kullanarak kemolitotrofik olarak üreyebilen bakterilere nitrifiye edici bakteriler denir. Morfoloji ve filogenileri ve özellikle de yürüttükleri oksidasyon dizilerindeki özgül basamak temel alınarak birçok cins tanımlanmıştır (Tablo 12.4). Nitrifiye edici bakteriler filogenetik olarak Proteobacteria'mn beş alt-bölümünün dördüne dağılmışlardır. Bunlar alfa, beta, gama ve delta alt-bölümleridir. Nitrospira cinsi Bacteria içinde ayrı bir şube oluşturur (Şekil 12.1 ve Kısım 12.38) ve diğer nitrifiye edici bakterilerle sadece metabolik açıdan benzerlik taşır. Amonyağı nitrata kadar tamamen okside eden hiçbir kemolitotrof yoktur. Bu nedenle doğadaki nitrifikasyon olayı iki ayrı organizma grubunun sırayla etki etmesi sonucunda başarılır. Bunlar amonyak-oksitleyici bakteriler yani nitritleyiciler (Şekil 12.7») ve nitrit-oksitleyici (nitrat-üreten) gerçek nitrifiye edici bakterilerdir (Şekil 12.8»). Nitritleyici bakterilerin cins isimleri "Nitroso" ile başlarken, nitratlayıcı bakterilerin cins isimleri genellikle "Nitro" ile başlar. Nitrosomonas ve Nitrobacter nitrifikasyon yapan bakterilerin en önemli cinsleridir (Tablo 12.4). Nitrifikasyon bakterileri, kemolitotrofik oldukları saptanan ilk organizmalardır. VVinogradsky, tek karbon kaynağı olarak CO2 kullanıldığında bu bakterilerin organik madde ve hücresel kütle oluşturulabildiğini göstermiştir (öo&Mikrobiyal Okuma Parçası, VVinogradsky Kuralları, Bölüm 17). Nitrifikasyon yapan bakterilerin pek çok türü karmaşık bir iç zar sistemine sahiptir. Bu zarları birçok açıdan nitrifikasyon yapan bakterilerin filogenetik olarak yakm akrabaları olan mor fototroflarda (Bkz. Kısım 12.2) ve metan okside eden (metanotrofik) bakterilerde (Bkz. Kısım 12.6) bulu-
• Şekil 12.7 Nitritleyici bakteri Nitrococcus oceani'nin faz-kontrast fotomikrografı (solda) ve elektron mikrografı (sağda). Tek bir hücre yaklaşık 2 jiım çapındadır.
• Şekil 12.8 Nitritleyici bakteri Nitrobacter mnogradsky'nin faz-kontrast fotomikrografı (solda) ve elektron mikrografı (sağda). Tek bir hücre yaklaşık 0,7/u.m çapındadır.
nan iç-zarlarla benzerlik gösterirler. Nitrifikasyon için anahtar enzimler durumunda olan amonyak monooksijenaz ve nitrit oksidaz bu zarlara yerleş-
miştir. Amonyak monooksijenaz NH 3 (amonyak) NH2OH (hidroksilamin)'e, nitrit oksidaz ise NO2~ 'i NO 3 'a oksitler (öOöKısım 17.12). Hidroksilamin nitritleyici bakteriler tarafından daha ileri bir oksidasyona uğrar ve NO2" (nitrit)'e oksitlenir. Nitrit ise gerçek nitrifikasyon bakterileri için substrat oluşturur (Şekil 12.9»).
Tablo 12.4 Nitrifiye edici bakterilerin özellikleri Filogenetik grupa
Özellikler
Cins
Amonyağı okside edenler Gram-negatif kısadan uzuna basiller, hareketli (polar kamçılı) veya hareketsiz, periferal zar sistemi
Nitrosomonas Beta
DNA (ntol % GC) Habitatlan
Büyük kok, hareketli; viziküler veya periferal zarlar Nitrosococcus Gamma Spiral, hareketli (peritriş kamçılı), belli bir zar sistemi yoktur Nitrospira Beta Pleomorfik, loblu yapıda, bölümlü hücreler; hareketli (peri- Nitrosolobus Beta tiriş kamçı)
54
Toprak, lağım, tatlısu, deniz Tatlısu, deniz Toprak
54
Toprak
45-53 49-50
r
Nitriti okside edenler Kısa basil, tomurcuklanarak çoğalır, genellikle hareketli (bir subterminal kamçı), zar sistemi polar bir başlık şeklinde düzenlenmiştir.
Nitrobacter
Alfa
Uzun ince basiller, hareketsiz; belirgin bir zar sistemi yok
Nitospina
58
Deniz
Büyük koklar, hareketli (bir veya iki subterminal kamçı); zar sistemi rastgele tüpler şeklinder düzünlenmiştir.
Nitrococcus
Delta Gamma
61
Deniz
Sarmal ya da virgül benzeri şekilde hücreler, hareketsiz; iç zar yoktur
Nitrospira
Nitrospira grubu
50
Deniz, toprak
59-62
Toprak, tatlısu deniz
12.4 • Nitrifiye Edici Bacterîa • 337
Nıtrosıfıye bakteriler +
1. NH 3 + O 2 + 2 e " + 2 H -»~ NH2OH + H 2 0 2. NH2OH + H 2 0 + \ O 2 -*• N
+
Toplam: NH 3 + 1 \ O 2 -*- NO2" + H2O AG° = -288 kJ/reaksiyon Nitrifiye bakteriler NO2" + \ O 2 -*- NO3~ AG° =-74.1 kJ/reaksiyon * Şekil 12.9 Nitrifikasyon. Reaksiyonlar inorganik nitrojen bileşiklerinin kemolitotrofik nitrifiye eden bakteriler tarafından okside edilmesini içerir.
tür ortamıdır. Bu organizmaların yetersiz üremesi nedeniyle ( "-c Kısım 17.12), aşırı nitrifikasyon gerçekleşse bile belirgin bir bulanıklık artışı olmayabilir. Bu nedenle üremeyi izlemenin en kolay yolu, nitrit üretimini (elektron vericisi olarak amonyak varlığında) ya da nitritin ortamdan kaybolmasını veya nitrat üretimini (elektron vericisi olarak nitrit varlığında) ölçmektir. Nitrifiye edici bakterilerin çoğu zorunlu kemolitotrof ve zorunlu aerobtur. Nitrobacter türleri ise, tek karbon ve enerji kaynağı olarak asetat veya piruvatı kullanarak kemoorganotrofik üreme yetenekleri açısından istisna oluştururlar. Bir başka grup olan anammoks organizmalar (cîBöKısım 17.12) filogenetik farklılık taşırlar ve anaerobik olarak amonyağı okside ederler.
Kükürt ve Demir Okside Eden Bacteria
Ekoloji, İzolasyon ve Kültür
Nitrifiye edici bakteriler toprak ve suda çok geniş bir dağılım gösterirler. Yoğun protein bozunması (amonifikasyon) gerçekleştiği için çok miktarda amonyak içeren habitatlarda ve atık arıtım tesislerinde çok yüksek sayılara ulaşırlar ( Kısım 28.2). Nitritleyici bakteriler, amonyak miktarı yüksek olan, özellikle lağım ve diğer kirli suların karıştığı göl ve akarsu ortamlarında çok iyi gelişirler («* Şekil 19.10a). Elektron vericisi olarak amonyak ya da nitrit, tek karbon kaynağı olarak da bikarbonat (HCO3~) kullanılarak hazırlanan zenginleştirilmiş mineral tuz ortamı nitratlayıcı bakteriler için iyi bir kül-
Anahtar Cinsler: ThiobacîHus,AcidithîobacilIus, Achromaüum, Beggiatoa Proteobacteria içindeki çok özel bir grup, indirgenmiş kükürt bileşikleri üzerinde kemolitotrofik olarak üreme yeteneğindedir (Tablo 12.5). Kükürt oksitleyen bakteriler iki büyük ekolojik gruba ayrılır. Nötral pH'da yaşayanlar ve asidik pH 'da yaşayanlar. Asidofilik olanların bazıları ferrus demir ( Fe2+)'i elektron vericisi olarak kullanarak kemolitotrofik üreme yeteneğindedir. Kükürt ve demir okside eden asidofilik bakterilerin biyojeokimyası Kısım 19.13-19.16'da, biyokimyası ise Kısım 17.10 ve 17.11'de tartışılmıştır.
ı H M iü.3 nuKun OHSioe enen Kemoıııan Cinsler ve türler Tamamen organik ortamda az üreyenler: Thiobacülus thioparus Thiobacillus denitrificans Halothiobacillus neapolitanus Acidothiobacillus thiooxidans Acidothiobacülus ferrooxidans Organik ortada iyi üreyenler: Starkeya novella Thiomonas intermedia Filamentöz, kükürt kemolitotroflar: Beggiatoa Thiothrix Thioploca Diğer cinsler: Achromatium Thiomicrospira Thiosphaera Thermothrix Thiovulum
nenen
İnorganik elektron Çeliştiği pH aralığı vericisi
Filogenetik grup
H 2 S,sülfidler / S 0 / S 2 O3 2H 2 S, S°, S 2 O 3 2 ~
S°, metal sulfidler, Fe2H
6-8 6-8 6-8 2-4 2-A
Beta Beta Gama Gama Gama
61-66 63-68 52-56 51-53 55-65
s 2 o 3 22 s2o3 -
6-8 3-7
Beta Beta
66-68 64
H 2 S, S 2 O 3 2 ~ H2S H2S,S°
6-8 6-8 —
Gama Gama Gama
37-51 52
H2S S 2 O 3 2 ", H 2 S H 2 S, S 2 O 3 2 ~, H 2 H 2 S, S 2 O 3 2 ^ S O 3 ' H2S, S°
— 6-8 6-8 6.5-7.5 6-8
Gama Gama Alpha Beta Epsilon
s0,s2o32S°
1
Tamamı Proteobakteridir. Fakültatif aeroblar; anerobik şekilde NO3~'ü elektron alıcısı olarak kullanırlar. " Saf kültürleri henüz yoktur.
b
d
Thisphaera pontotropha; paracoccus denitrificansla aynı 16SrRNA dizilimine sahiptir.
DNA (mol % CC)
36-44 66 — —
338 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
Thiobacillus ve Achromatium Thiobacillus cinsi ve yakın akrabaları, morfolojik olarak diğer gram-negatif basillerin birçoğundan ayırt edilemeyen, çubuk şekilli gram-negatif bakterilerdir (Şekill2.10a). Üzerinde çok çalışma yapılmış olan kükürt kemolitotrofları bunlardır. Thiobacillus türleri, filogenetik olarak Proteobacteria'nm alfa, beta ve gama alt-bölümlerinin üçünde de değişik türlerle temsil edilir (Tablo 12.5). Bu cins içindeki türler kemolitotrofik metabolizmalarında elektron vericisi olarak en çok H2S, SO ve S2O32 gibi kükürt bileşiklerini kullanırlar. Enerji-veren tepkimeler aşağıda verilmiştir: H2S + 2 O2
> SO42~ + 2 H+ AG0' = -798 kj/tepkime
S° + H2O + l | O 2
2 4
~ + 2 H+ AG0' = -587 kj/tepkime
H2O + 2 O ,
2 SO 4 2 ~ + 2 H + AG0' = -818 kj/tepkime
Bu tepkimelerden çok fazla enerji elde edileceği açıktır. Kısım 17.10'da görüleceği gibi bu enerjinin bir kısmı proton motive güç ortaya çıkaran elektron taşıma tepkimeleri aracılığı ile ATP şeklinde saklanır. Bundan başka bu tepkimeler çok miktarda sülfirik asit ürettiği için, birçok thiobacillus asidofiliktir. Asidofilik bir tür olan Acidithiobacillus ferrooxidans ferrus demiri okside ederek kemolitotrofik olarak gelişebilir ve bu metali okside eden en önemli biyolojik ajan olma özelliğini taşır (öQöKısıml9.14). Pirit formundaki demir (FeS2) sülfid kadar önemli bir Fe2+ kaynağıdır. FeS2'ün oksidasyonu özellikle maden işletmelerinde hem yararlı (cevherlerin filtrelenmesi sırasında sülfid mineralinden demir ayrılır) hem de ekolojik felakete neden olacak kadar Zaralıdır (pirit ile birlikte bulunan diğer ağır metallerin açığa çıkması ile çevrenin asitleşmesi) (öe?sKısım 19.14 ve 19.15). Achromatium çoğunlukla sülfid içeren tatlı sulardaki çökeltilerde bulunan ve kükürt okside eden, küresel biçimli bir kemolitotroftur. Achromatium hücreleri 10-100 /j,m arasında değişen çapa sahip koklardır (Şekil 12.10£>). Achromatium'un saf kültürü elde edilemediği halde, doğal popülasyonlarm filogenetik analizleri sonucunda (öCfeKısım 11.6 ve 18.5) her biri değişik büyüklükte birçok türünün bulunabileceği gösterilmiştir. Filogenetik olarak Achromatium gama Proteobacteria grubunda yer alır ve fototrofik benzeri olan Chromatium gibi fototrofik mor bakterilere dahildir (Bkz. Kısım 12.2). Chromatium gibi Achromatium da hücre içinde elementer kükürt depolar (Şekil 12.10b). Hücre içindeki kükürt sülfata okside olduğunda, bu granüller kaybolur. Achromatium hücreleri ayrıca, muhtemelen ototrofik üreme için karbon kaynağı olarak kullanılmak üzere, büyük kalsit (CaCO3) granülleri de depolar (Şekil 12.10b).
,-
'
(b)
• Şekil 12.10 Filamentöz olmayan kükürt kemolitotrofları. (a) Kemolitotrofik kükürt okside eden Halothiobacillus neapolitanus hücrelerinin transmisyon elektron mikrografı. Tek bir hücre yaklaşık 0,5 fim çapındadır. Hücre boyunca dağılan polihedral cisimcikler (Karboksizomlar) okla gösterilmektedir, (b) Achromatium. Hücreler Almanya'daki küçük bir gölden izole edilmiştir ve Nomarsky ışık mikroskobu ile fotoğrafı çekilmiştir. Hücre periferine yakın duran küçük küresel yapılar elemental kükürt, büyük granüller ise kalsiyum karbonat içerir. Tek bir Achromatium hücresi yaklaşık 25 fim çapındadır.
Kültür
Bazı kükürt kemolitotrofları zorunlu kemolitotrof olup, elektron vericisi olarak organik bileşikler yerine inorganik bileşikleri kullanırlar. Bu şekilde ürediklerinde aynı zamanda ototrof olarak davranır ve Calvin döngüsüyle CO2'i hücre materyaline dönüştürürler (so^KısımlZ.ö). Karboksizomlar çoğunlukla zorunlu kemolitotroflar içinde bulunur (Şekil 12.10a). Bu yapılar Calvin döngüsü enzimlerini çok miktarda içerir ve muhtemelen bu organizmaların CO2 fiksasyon hızını artırırlar. Diğer kükürt kemolitotrofları fakültatif kemolitotroflar olup, duruma göre ya kemolitotrofik (ve dolayısıyla ototrofik) olarak ya da kemoorganotrofik (Tablo 12.5) olarak gelişebilirler. Beggiatoa'ran birçok türü, Calvin döngüsü enzimlerinden yoksun olduğu halde inorganik kükürt bileşiklerinin oksidasyonu ile enerji elde eder. Bu nedenle bu türler, karbon kaynağı olarak organik bileşiklere gereksinim duyarlar. Bu tip yaşam biçimi miksotrofi olarak adlandırılır.
12.4 • Nitrifiye Edici Bactetia • 339
Beggiatoa Bu cins içinde yer alan organizmalar filamentöz, kayma hareketi yapan ve kükürt okside eden bakterileri içerirler. Beggiatoa hücreler' -ün çap ve boylan genellikle oldukça büyük olup bunlar birçok kısa hücrenin uç uca eklenmesiyle oluşurlar (Şekil 12.11»). Bu şekilde oluşan filamentler esneyip bükülür ve böylece birçok filament bir araya gelerek yumak şeklinde kompleks kümeler oluştururlar. Beggiatoa doğada, kükürt yatakları, çürümekte olan deniz yosunları, göllerin çamur tabakaları ve lağım atıkları ile kirlenmiş sular gibi özellikle H2S açısından zengin habitatlarda bulunur (Şekil 12.11b). Bu gibi ortamlarda Beggiatoa flamentleri tipik olarak kükürt granülleri ile doludur (Şekil 12.11a). Beggiatoa aynı zamanda sıcaksu kaynaklarının doğal sakinidir («**»Kısıml9.8). VVinogradsky bir canlı organizmanın H2S'i önce S°'e, daha sonra da SO42'a okside edebildiğini ilk olarak Beggiatoa üzerinde göstermiş ve kemolitotrofi kavramını formüle etmiştir (oe^Mikrobiyal Okuma Parçası, VVinogradsky Kuralları, Bölüm 17). Beggiatoa'nm az sayıda susu gerçek kemolitotrofik ototrof olup, çoğu redükte kükürt bileşiklerini elektron vericisi, organik bileşikleri de karbon kaynağı olarak kullanır ve miksotrofik olarak ürer.
Beggiatoa için bir başka ilginç habitat, bol miktarda su içeren ve bu nedenle oksijensiz olan topraklarda yetişen bitkilerin (pirinç, su kamışı ve diğer bataklık bitkileri) rizosferleridir. Bu gibi bitkiler oksijeni köklerine doğru pompalar. Böylece kök ile toprak arasında kesin olarak belirlenmiş bir oksijenli/oksijensiz sınır ortaya çıkar. Beggiatoa (belki de diğer kükürt bakterileri) bu sınırda gelişir ve buradaki H2S'i okside (ve dolayısıyla detoksifiye) ederek bitkiler için yararlı bir rol oynarlar. Beggiatoa ve Sphaerotilus gibi filamentöz bakteriler (Bkz. Kısım 12.15) atık arıtım tesisleri, konserve sanayii atıkları, kağıt hamuru atıkları, bira vs gibi fermente içki üretimi ve öğütme işlemleri sonucu oluşan endüstriyel atık havuzlarmdaki tortu probleminin temel nedenidir. Bu sorun yığılma (bulking) olarak adlandırılır ve Beggiatoa gibi filamentöz bakterilerin arıtım sisteminin normal florasından çok daha fazla üreyerek, Zoogloea ve buna benzer bakterileri içeren evsel atıkların kolayca tortulaşan sıkı yığınları yerine, daha gevşek yığınlar oluşturmasıyla ortaya çıkar (Kısım 28.2). Yığılma oluşması durumunda, evsel atık hâlâ yüksek oranda organik madde içerdiği için, yeterli oranda arıtılmamış olarak kalır (<**>Kısım 28.2). Thioploca ve Thiothrix Kükürt oksitleyen diğer filamentöz bakteriler arasında Thioploca ve Thiothrix bulunur. Thioploca, kükürt okside eden, büyük, filamentöz, kemolitotorof bir bakteridir. Hücrelerin oluşturduğu demetler bir km ile çevrelenmiştir (Şekil 12.12*). Yorgan şeklinde kalın bir tabaka oluşturan deniz Thioploca türleri, Şili ve Peru kıyılarındaki okyanus diplerinde bulunmuştur. Ekolojik çalışmalar bu organizmaların, oksijensiz H2S oksidasyonunu ve buna bağlı olarak nitrat (NO3)m amoyuma (NH4+)'a irdirgenmesini başardıklarını göstermiştir (csosKısım 17.14 ve 19.12). Thioploca hücrelerinin içlerinde çok büyük miktarlarda nitrat biriktirdikleri ve bu nitratın, H2S'in elektron vericisi olduğu anaerobik solunum sürecini uzattığı gösterilmiştir. Deniz Thioploca tabakalarının önemli miktarlarda CO2 fikse ettiği ve aynı zamanda kükürt ve azot
• Şekil 12.11 Filamantöz kükürt-okside eden bakteriler. (a) Bir lağım antma bitkisinden izole edilen Beggiota türlerinin faz-kontrast fotomikrografı. Bazı hücrelerde bol miktarda bulunan elementer kükürt granülleri dikkat çekmektedir. (b)Bazı sülfat kaynaklarının dışan akan kısımlarındaki kükürt okside eden bakteriler. Filamantöz hücreler kalın şeritler oluşturmak üzere birbiri üzerine kıvrılır ve beyaz renk hücrelerinin yoğun miktarda elementer kükürt içermesinden kaynaklanır.
# Şekil 12.12 Geniş bir deniz Thioploca türünün hücreleri. Hücreler kükürt granülleri içerir(san) ve yaklaşık 40-50 yu,m genişliğindedir.
340 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
döngülerinde önemli rol oynadığı kabul edilmektedir. Çoğunlukla Beggiatoa'dan oluşmuş buna benzer tabakalar, hidrotermal bacaların yakınlarında da bulunmakla birlikte (^^Kısım 19.8), bunların nitrat solunumu ile ilgileri tam olarak saptanamamıştır. Thiothrix de kükürt okside eden, filamentöz bir organizmadır. Bu filamentler uç kısımlarından bir araya gelerek, rozet denilen hücre birlikteliklerini oluştururlar (Şekil 12.13»). Fizyolojik olarak Thiothrix, zorunlu aerob miksotroftur. Bu ve birçok diğer özellikleri ile Beggiatoa'ya benzer.
Hidrojen Okside Eden Bacteria anahtar Cinsler: Ralstonia, Paracoccus Çeşitli bakteriler tek elektron vericisi olarak H 2 , tek elektron alıcısı olarak da O2 kullanırlar. Bu geniş bakteri grubu, "knallgas" tepkimeleri aracılığı ile H 2 kullanarak O2'i indirger. Enerji metabolizmaları:
H2
H2O
AGU = -237 kj
Bu organizmaların hepsi olmasa da çoğu aynı zamanda ototrofik olarak da yaşayabilir (CO2 fiksasyonunda Calvin döngüsü tepkimelerini kullanarak). Burada bunların hepsi kemolitotrofik hidrojen-okside eden bakteriler olarak gruplandırılmıştır. Hem gram-pozitif hem de gram-negatif hidrojen bakterileri tanımlanmış olup, üzerinde çok çalışma yapılmış olanlar Ralstonia (Şekil 12.14*), Pseudomonas ve Paracoccus (Tablo 12.6) cinsleri içinde sınıflandırılmıştır. Hidrojen okside-eden bakterilerin tümü bir veya daha çok hidrogenaz enzimi içerir. Bu enzimler H2'i bağlama ve bunu ya ATP üretiminde ya da ototrofik gelişme için gerekli indirgeyici güç olarak kullanma işlevi yapar (Tablo 12.6). Hidrojen bakterilerinin hemen hepsi fakültatif kemolitotroftur. Diğer bir deyişle bunlar, enerji kaynağı olarak organik bileşikleri de kullanabilen kemoorganotrofik organizmalardır. Kemolitotrof hidrojen bakterileri ile birçok kükürt kemolitotrofu ve nitritleyici bakteri arasındaki en belirgin fark budur; çünkü bu iki grubun üyeleri zorunlu kemolitotrof olup, ortamda enerji kaynağı olarak inorganik bir madde yoksa üreyemez, oysa hidrojen kemolitotrofları, ortamlarında bulunan besin çeşidine bağlı olarak hem kemolitotrofik hem de kemoorganotrofik olarak yaşayabilirler. Hidrojen Bakterilerinin Fizyoloji ve Ekolojisi
Hidrojen bakterilerinin çoğu kemolitotrofik olarak H2 varlığında gelişirken çok az oksijen bulunmasını tercih eder. Bunun nedeni hidrogenazların oksijene duyarlı enzimler olmalarıdır. En iyi gelişimi sağlayan oksijen düzeyleri %5-10 arasında olanlardır. Hemen hemen tüm hidrogenazlar Ni2+
• Şekil 12.13 Thiothrhc. (a) Florida(ABD)'da kükürt içeren bir artezyen su kaynağı. Kaynağın dışı Thiothrix tabakasıyla kaplıdır. Tabaka yaklaşık 1.5 m çapındadır, (b) Kaynaktan izole edilip saf kültürü elde edilmiş Thiothrix hücrelerinin oluşturduğu rozet yapısının faz-kontrast fotomikrografı. Sülfidin oksidasyonuyla oluşan iç kükürt kürecikleri dikkat çekmektedir. Her bir filament yaklaşık 4 fim çapındadır.
• Şekil 12.14 Hidrojen bakterileri. Hidrojen okside eden kemolitotrof Ralstonia eutropha'ran negatif boyanmış hücrelerinin transmisyon elektron mikrografı. Bir hücre yaklaşık 0,6 yum çapındadır ve bir çok kamçı taşır.
12.5 • Hidrojen Okside Eden Bacteria • 341
Tablo 12.6 Belli başlı birkaç hidrojen okside eden bakteri türünün ayırt edici özellikleri Denitrifikasyon
Cins ve türler
Fruktozda Filogenetik üreme Hareket Grup
DNA (mol % GC)
Diğer özellikleri
Gram-negatif Acidovorax
facilis
-
+
+
Beta
64
Zara bağlı hidrojenaz
Ralstonia
eutropha
+
+
+
Beta
66
Zara bağlı ve sitoplazmik hidrojenaz Zara bağlı ve sitoplazmik hidrojenaz Zara bağlı hidrojenaz
Achromobacter
xylosoxidans
-
+
+
Beta
—
AquaspiriUum
autotrophicum
-
-
+
Beta
61
-
-
+
Gama
60
Pseudomonos rans
carboxydovoflava
-
+
+
Beta
67
Paracoccus denitrificans
+
+
-
Alfa
66
Aquifex
+
-
+
Aquifex grubu'
65
.
Aquifex grubu'
37-46
Düşük GC gram-pozitifc
66
Actinobacteria<< Actinobacte-
70
Hydrogenophaga
pyrophilus
Hydrogenobacter
pyrophilus
.
.
Zara bağlı hidrojenaz; ayrıca CO'yu okside eder Koloniler açık sarıdır Zara bağlı hidrojenaz; güçlü denitrifiye edici Hipertermofil,mikroaeorofilik veya anaerobik (NO3- ile), zorunlu kemolitotroif, ayrıca SO'ı veya S2O3-2'yi elekton vericisi olarak kullanır Aquifex ile benzer özellikte fakat zorunlu aerob (nıicroaerofil)
Gram-pozitif Bacülus schlegelü
-
-
+
Arthrobacter sp.
-
+
-
Mycobacterium gordonae
-
?
-
u
işaret edilenin dışında aerobik hidrojen bakterileri Proteobacteria içindedir 1 Bkz. Kısım 12.37 ' Bkz. Kısım 12.20 " Bkz. Kısım 12.22 • Bkz. Kısım 12.23
elementini kofaktör olarak kullandıkları için, kemolitotrofik gelişim sırasında üreme ortamında mutlaka bu elementin bulunması gerekir. Hidrojen bakterilerinin çok azı moleküler azotu (N2) fikse edebilir. Ancak moleküler azotu indirgeyen nitrojenaz oksijene duyarlı bir enzim olduğundan (oo^Kısım 17.28), bu organizmalar N 2 varlığında gelişirken oksijene karşı oldukça duyarlıdır. Hidrojen okside eden bakterileri zenginleştirmek için, iz elementleri (özellikle Ni2+,Fe2+) içeren az miktardaki mineral tuz ortamı, toprak veya su ile inoküle edilip, içinde %5 O2, %10 CO2 ve %85 H 2 bulunan ağzı kapalı büyük kaplarda inkübasyona bırakmak gerekir. Sıvı ortam bulanıklaştığında buradan alınacak örnekler aynı besi yerinden hazırlanmış katı plaklara ekilir ve yine aynı gaz karışımını içeren cam kavanozlarda inkübasyona bırakılır (O2 ve H 2 karışımı patlayıcı olduğundan dikkatli olunmalıdır). CO Oksidasyonu Bazı hidrojen bakterileri elektron alıcısı olarak karbon monoksit (CO) kullanarak gelişebilir. CO'in
ria
i.
-
Endospor oluşturur; termofil; ayrıca CO ve S2O3-2'yi elektron vericisi olarak kullanır. Zara bağlı hidrojenaz Asit-fast; koloniler sarıturuncu 1
CO2'e oksidasyonu sırasında açığa çıkan elektronlar ATP sentezini gerçekleştirmek üzere elektron taşıma zincirine aktarılırlar. CO okside eden bakteriler, karboksidotrofik bakteriler olarak adlandırılır ve CO'in oksidasyonu ile ortaya çıkan CO2'i fikse eden Calvin döngüsü tepkimeleri (o^Kısım 17.6) aracılığı ile ototrofik olarak gelişirler. CO'i CO2'e oksitleyen enzim, molibden içeren karbon monoksit dehidrogenaz'dır. CO dehidrogenaz içindeki molibden, nitrat redüktaz enzimindeki (^t: Kısım 17.14) yapıya benzer şekilde, çok halkalı yapıda olan küçük bir kofaktöre bağlıdır. Bu kofaktöre pterin adı verilir. Doğadaki karboksidotrofik bakterilerin CO tüketmeleri önemli bir ekolojik süreçtir. Her ne kadar insan ve diğer kaynaklar çok miktarda CO oluştursalar da, havadaki CO düzeyinin yükselme nedeni bu değildir. Çünkü çok miktarda CO salınımı (özellikle otomobil ekzoslarından, fosil yakıtların tam yanmamasından ve lignin katabolizmasmdan) oksijenli koşullarda gerçekleşir ve muhtemelen doğadaki en önemli CO kaynağı toprağın üst katmanlarında bulunan karboksidotrofik bakterilerdir.
342 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
En iyi çalışılmış karboksidotrofik bakteriler Pseııdomonas cinsi içinde yer alır. Pseudomonas carboxy-
dovorans bunlardan biridir (Tablo 12.6). En azından bir karboksidobakter, elektron alıcısı olarak nitratı kullanarak CO üzerinde anaerobik olarak gelişebilirse de, bu özellik grup üyeleri arasında yaygın değildir. Karboksidotrofik bakteriler CO kullanarak üreyebildiği gibi, hidrojen bakterilerine benzer şekilde organik maddeleri kullanabilir ve kemoorganotrofik olarak da üreyebilirler. 12.2-12,5 Kavramların Çözden Geçirilmesi Kemolitotroflar inorganik elektron vericilerini okside edebilen prokaryotlar olup ve birçok durumda CO2'yi tek karbon kaynağı olarak kullanırlar. •
•
Nitrifiye edici bakterilerle kükürt, demir ve hidrojen bakterilerim, kullanılan inorganik elektron vericisi, karbon kaynağı, elektron vericilerinin E{l' değerleri («SS^Bölüm 17) ve habitatları açısından karşılaştırınız. Çoğu kemolitotrofta CO, asilmilasyonu için kullanılan başlıca metabolik yol nedir?
Metanotroflar ve Metilotroflar Anahtar Cinsler: Methylomonas, Methylobacter Metan (CH4), doğada bol miktarda bulunur. Oksijensiz ortamlarda metanojenik Archaea (oocsKısım 13.14 ve 17.17) tarafından oluşturulan metan, oksijensiz çamur ve bataklıklarda (<WsŞekil 13.5), göllerin oksijensiz zonlarmda, geviş getiren hayvanların rumeninde ve memelilerin sindirim sisteminde bulunan en önemli gazdır. Metan aynı zamanda doğalgazm temel bileşenidir ve pek çok kömürün yapısında bulunur. Metan kimyasal olarak kararlı bir molekül olduğu halde metanotroflar tarafından kolayca okside edilir. Bu bakteriler metanı ve bir kaç tek-karbonlu bileşiği enerji elde etmek için elektron vericisi ve tek karbon kaynağı olarak kullanırlar. Bu bakterilerin hepsi aerobik olup doğada toprak ve suda geniş bir yayılım gösterirler. Farklı morfolojilere sahip olan bu bakteriler hem filogenetik olarak hem de metan okside edebilme yetenekleri açısından benzerlik taşırlar. Metan, anaerobik solunum yapmak için metanojenezin değil sülfat indirgenmesinin kullanıldığı deniz sedimentlerinde çok az bulunur (ö°öKısım 19.10). C) Metabolizması
Metan dışında birçok tek-karbonlu bileşik mikroorganizmalar tarafından kullanılabilir. Bu bileşiklerin listesi Tablo 12.7'de verilmiştir. Biyokimyasal bakımdan bu bileşikler ortak bir özelliği paylaşırlar. Bu özellik karbon-karbon bağlan içermemeleridir.
Bu nedenle hücredeki tüm karbon-karbon bağları yeni baştan (de novo) sentezlenmek zorundadır. Sadece tek karbonlu organik bileşikler üzerinde üreyebilen organizmalara metilotroflar denir. Metilotrofların hepsi değilse de çoğu aynı zamanda metanotroftur. Ancak metanotroflar hem daha
Metilotrofik bakterilerce kullanılan Tablo 12.7 substratlar I. Üreme için kullanılan substratlar Metan, CH4", Metanol, CH3NH2 Metilanin, CH3NH, Dimetilamin, (CH,)ZNH Trimetilovin, (CH ) N Tetrometilamonyum (CH3),N+, Trimetilamin N-oksit, (CH,),NO Trimetilsulfonium,
Formate, HCOO Formamid, HCONH2 Karbon monoksit, CO Dimetil eter, (CH3)2O Dimetil karbonat, CH3OCOOCH3 Dimetil sülfoksit, (CH3)2SO Dimetil sülfid (CHJ,S
II. Üreme için kullanılmayan substratlar Amonyum, NHJ Etilen, H2C = CH, Klorometan, CH3C1
Bromometan, CH3Br Yüksek hidrokarbonlar (etan, propan)
"Tek bir izolat yukandakilerin tamamını kullanmaz ancak yukandaki üstede yer alan her bir birleşiğin bir metilotrofik bakteri tarafından kullanıldığı rapor edilmiştir. ''Metilotroflar metili okside edebildikleri için bu adı almışlardır.
okside bazı tek karbonlu bileşikler (Tablo 12.7) hem de metan üzerinde üreyebildikleri için bu konuda rakipsizdirler. Metanotroflar bir oksijen atomunu metan molekülüne dahil ederek metanol oluşturan metan monooksijenaz adı verilen özgül bir enzime sahiptir (<**s Kısım 17.24). Metan oksidasyonununbaşlaması için reaktant olarak O2'e gereksinim duyulması, metanotrofların neden zorunlu aerob olması gerektiğini de açıklamaktadır (Kısım 17.24'te metanın konsorsiyum oluşturan bazı özel organizmalar tarafından oksijensiz koşullarda da okside edilebildiği görülecektir). Tüm metanotrofların aynı zamanda zorunlu C, kullanıcısı olduğu ve karbon-karbon bağları içeren bileşikleri kullanamadıkları bilinmektedir. Buna karşılık, metanotrof olmayan (nonmetanotrofik) metilotroflar organik asitleri, etanolu ve şekerleri kullanabilme yeteneğindedirler. Metan-oksitleyen bakteriler tüm prokaryotlar içinde çok büyük miktarlarda sterol içermeleri ile de biriciktirler. Kısım 4.5'te belirtildiği gibi, steroller ökaryotlarm kompleks iç zarlarının işlevsel bir bileşeni olup, prokaryotlarm çoğunda bulunmaz. Metanotroflarda ise steroller, metan oksidasyonu ile ilişkili olan kompleks iç zar sisteminin esas bileşeni olabilirler. Sterollerin yaygın olarak bulunduğu diğer bir prokaryot grubu, hücre duvarından yoksun olan mycoplasmalar içinde yer alır (Bkz. Kısım 12.21). Metanotrofların Sınıflandırılması
Tablo 12.8'de metanotrof taksonomisinin genel çerçevesi verilmiştir. Bu bakteriler başlangıçta morfolojik ve dinlenme evrelerindeki oluşumlar temel alınarak ayırt edilmiş olmakla birlikte, günümüzde hücre-içi yapıları, filogenileri ve karbon özümseme (asimilasyon) yolları dikkate alınarak iki büyük gruba ayrılırlar. Tip I metanotroflar ribüloz monofosfat döngüsü aracılığı ile tek-karbonlu
12,6 4 Metanotroflar ve Metilotroflar
343
Tablo 12.8 Bazı metanotrofik bakterilerilerin özellikleri
Organizma
Morfoloji
Dinlen16SrRNA me iç grubu" evresi zarlar'
Methylomonas
Basil
Gama
Kist benzeri
I
yapı Yok
I
Methylomkrobium
Basil
Gama
Methylobacler
Gama
Methylococcus
Kokdon elipsoide Kokdon
Methylosinus hAethylocystis Methylocella
Basil-vibroid Basil Basil
Alfa Alfa Alfa
Gama
Kist benzeri yapı Kist benzeri yapı Ekzospor Ekzospor Ekzospor
I I 11 II II
Sitrik asit döngüsü
Karbon asimilasyon metabolik yolu
Tamamlanmamış Ribuloz monofosfat Tamamlanmamış Ribuloz monofosfat Tamamlanmamış Ribuloz monofosfat Tamamlanmamış Ribuloz monofosfat Tamamlanmış Serin Tamamlanmış Serin Tamamlanmış Serin
DNA fiksas- (mol % GC) yonu Hayır
50-54
Hayır
49-60
Hayır
50-54
Evet
62-64
Evet Evet Evet
63 63 61
"Tamamı proteobateri ''İç zarlar: Tip I, orgnazimanın içine dağılmı disk şekilli kesecikyığınlan; Tip II, hücre çeperi boyunca uzanan eşleşmiş zarlar. 'a-ketoglutarat dehidrogenaz enzimi eksikliği dolayısıyla sitrit asit döngüsü tamamlanmamış ve esetatı CO,'ye okside edemeyen organizmalar. •'Şekil 17.59 ve 17, bakanız. Diğer metilotrofların aksine methylococcus türleri calvin döngüsü enzimleri içerirler. ' Acidophilic, growth optimal at pH 5.
bileşikleri özümserler ve gama Proteobacteria içinde yer alırlar. Buna karşılık Tip II metanotroflar, serin metabolik yolu aracılığı ile C ] ara-ürünlerini özümserler ve alfa Proteobacteria içinde yer alırlar (Tablo 12.8). Bu metabolik yolların ayrıntısı Kısım 17.24'te tartışılacaktır. Metanotroflarm her iki grubu da, metan oksidasyonunda görev alan olan yaygın bir iç zar sistemi içerir. Tip I metanotroflardaki zarlar disk şeklindeki veziküllerin oluşturduğu demetler halinde hücre içine yayılmışlardır (Şekil 12.15b*). Tip II metanotroflarlarm zarları ise, hücre periferi boyunca uzanan zar çiftinden ibarettir (Şekil 12.15a). Anahtar enzim niteliğindeki metan monooksijenaz bu zar sistemlerinde yerleşmiştir. Tip I metanotroflarda tam bir sitrik asit döngüsü olmadığı (a-ketoglutarat dehidrogenaz enzimi bulunmadığından) halde, Tip II organizmalar bu döngünün tamamını içerirler. Tam bir sitrik
• Şekil 12.15 Methanotrofların elektron mikrografı. (a) Tip II zarlar sistemi taşıyan bir Methylosinus türü. Hücreler yaklaşık 0,6 jxm çapındadır, (b) Methylococcus capsulatus,Tip I zarlar sistemi taşır. Hücreler yaklaşık 1 fim çapındadır.
asit dögüsüne sahip olmayan (oe&Şekil 5.22) bir organizmanın kemoorganotrofik üreme yeteneği büyük ölçüde yok olur. Bu tepkimelerin bir döngü şeklinde yürütülememesi, döngü tepkimelerinden NADH elde edilememesine yol açar. Bu durum organik bileşiklerin sitrik asit döngüsü yoluyla metabolize edilmesini ve organizmanın gelişmesini engeller. Bu nedenle Tip I metanotroflar zorunlu olarak metilotrofdur. Ekoloji ve İzolasyon Metanotroflar kalıcı metan kaynaklarının bulunabildiği sucul ve karasal ortamlarda geniş bir dağılım gösterirler. Metan göllerin oksijensiz bölgesinde üretilip su içinde yükseldiği için metanotroflar genellikle, oksijensiz zondan gelen metanın oksijenle buluştuğu oksiklindeki dar bir bant içinde yoğunlaşırlar. Dolayısıyla metan-oksitleyen
344 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
bakteriler, oksijensiz bozunma ile ortaya çıkan metanı hücre materyaline (ve CO2'e) dönüştürmeleri nedeniyle karbon döngüsünde önemli bir rol oynarlar. Metanotrofların zenginleştirilmesi için gereken tek koşul %80 metan, %20 hava içeren atmosfer ve mineral tuzları içeren bir besi yeridir. İyi bir üreme sağlandığında, mineral tuz agarlı plaklara tekrarlanan ekimler yapılarak bu plaklar yukarıda belirtilen oranlarda metan-hava karışımı içeren özel cam kapta inkübe edilir. Plaklarda iki tip koloni ortaya çıkar: ortamdaki eser miktardaki organik madde üzerinde üreyen metanotrof olmayan kemoorganotrofların 1-2 gün içinde oluşturduğu koloniler ve yaklaşık bir haftadan sonra oluşan metanotrof kolonileri. Metanotrofların çoğu pembe renkli koloniler oluştururlar. İzolasyonda kolaylık sağlayan bu rengin nedeni bu organizmaların karotenoid pigmentler içermeleridir. Metanotroflar ve Nitritleyici Bakteriler
Metanotroflar amonyağı tek elektron vericisi olarak kullanarak kemolitotrofik olarak üreyemedikleri halde, amonyağı okside edebilme yeteneğine sahiptirler. Metan monooksijenaz metanı okside ettiği gibi, amonyağı da okside eder. Dolayısıyla bu iki substrat arasında bir rekabet söz konusudur. Amonyak genellikle metanotroflar üzerine toksik etkili olduğundan, azot kaynağı olarak nitrat tercih edilir. Metanotrofik bakterilerin, amonyak monooksigenaz'ı metan monooksijenaz'a dönüştüren mutasyonlar sonucunda nitritleyici bakterilerden evrimleştiği düşünülmektedir. Her iki bakteri grubunun çok özel iç zar sistemlerinin bulunması (Bkz. Kısım 12.3) ve filogenetik olarak da yakın akraba olmaları bu teoriyi desteklemektedir. Ayrıca, metanotrofik bakteriler, filogenetik olarak Archaea'ya bağlı olan metanojen (metan-üreten) prokaryotların bazı genlerinin aynılarını içermekte ve benzer proteinler sentezlemektedir ( - Kısım 13.4). Bu gibi sonuçlar, çok eski dönemlerde metan metabolizmasının biyokimyası evrimleşirken bu gruplar arasında yatay (lateral) gen aktarımı olduğu fikrini vermektedir (««»Kısım 15.8). Birbirine zıt süreçler olan metanojenez ile matanotrofi arasındaki ilişki Kısım 17.17 ve 17.24'te incelenecektir.
.Vır
• Şekil 12.16 Deniz midyelerinin metanotrofik simbiyontlan (a) Meksika körfezinde yaşayan bir deniz midyesinin solungaç dokusundan alınan kesitin düşük büyütmedeki elektron mikrografi. Dokular içindeki simbiyotik metanotro£lara(okun ucunda) dikkat ediniz, (b) Solungaç dokusunun yüksek büyütmedeki Tip I metanotroflan göstermektedir. Zarlar destelerine (okun ucunda) dikkat ediniz. Metanotroflar yaklaşık 1 fim çapındadır. Şekil 12.15b ile karşılaştırınız.
Tip I metanotroflara özgü sitoplazma-içi zar yığınları (Şekil 12.16İ0 içerirler. Simbiyontlar, deniz suyuyla etkin bir gaz alış verişinin yapıldığı solungaç yüzeyine yakın hücreler içindeki kofullarda (vakuol) bulunur. Ribozomal RNA dizi analizleri bu simbiyontlarm metanotroflar olduğunu göstermiştir. Midyenin içindeki metanotroflar tarafından özümsenen metan organik bileşiklere dönüştürüldükten sonra hayvanın vücuduna salınır ve burada dağılır. Dolayısıyla metanotrofik simbiyozis kavramsal olarak, sülfid okside eden kemolitotrofik bakterilerle sıcaksu bacalarında bulunan solucanlar ve dev deniztarakları arasındaki ilişkiye benzemektedir (öOöKısun 19.8). Dolayısıyla hayvan-bakteri simbiyozisinde, prokaryotik hücreler tek basamaklı besin zincirinin temelini oluşturur. — ((Hj) 12.6 Kavramların Gözden Geçirilmesi
Hayvanlardaki Metanotrofik Simbiyontlar
Metanotrofik bakterilerle bazı deniz midye ve süngerleri arasında simbiyotik bir ilişki gelişmiştir. Bazı deniz midyeleri, deniz tabanında bol miktarda metan salınan hidrokarbon kaynaklarının yakınında yaşarlar. Midyenin solungaçlarından izole edilen dokular, O2 varlığında hızla metan tüketirler. Bu dokularda çok sayıda kok şekilli prokaryot bulunur (Şekil 12.16ö«). Bakteriyal simbiyontlar,
Metilotoflar karbon-karbon bağları içermeyen karbon kaynakları üzerinde üreyebilen prokaryotlardır. Bazı metilotroflar aynı zamanda metanotroftur ve CH 4 üzerinde üreyebilirler. Metanotrofların iki sınıfı bilinmektedir. Bunlar ortak yapısal ve kimyasal özelliklere sahiptirler. Metanotroflar toprakta ve suda bulunmalarının yanı sıra deniz kabukluları ile simbiyont olarak da yaşarlar. • •
Metanotrof ile metilotrof arasındaki fark nedir? Tip I ve Tip II metanotroflar hangi özellikleri açısından birbirinden farklıdır?
12.7 • Pseudomonas ve Pseudomonadlar « 345 •
Hangi hayvanlar metanotrofik simbiyontları barındırır ve simbiyontun ihtiyaç duyduğu metan nereden gelir?
olarak pseudomonadlar Proteobacteria içinde yer alırlar (Bkz. Tablo 12.1). Pseudomonadlann Özellikleri
Pseudomonas ve Pseudomonadlar
Pseudomonadların ayırt edici özellikleri Tablo 12.9'da verilmiştir. Bu tabloda ayrıca bir organizAnahtar Cinsler: Pseudomonas, Burkholderia, mayı pseudomonad olarak adlandırabilmek için Zymomonas, Xanthomonas gerekli asgari özellikler de listelenmiştir. Pseudomonadlar en belirgin tanımlayacı özellikleri olan Bu gruptaki tüm cinsler düz ya da hafif kıvrık glukozdan gaz oluşturamama ve oksidaz testinin çubuk şeklinde, kemoorganotrof ik aerobik organizpozitif olması ile enterik bakterilerden ayırt edilir malar olup, polar kamçılar içerirler (Şekil 12.17b»). (Bkz. Kısım 12.11). Burada inceleyeceğimiz önemli cinsler PseudoPseudomonas cinsinin türleri ve diğer akraba monas, Commamonas, Ralstonia ve Burkholderia''dır. Gruptaki diğer cinsler, Xanthomonas, Zoogloea ve cinsler filogenetik ve çeşitli fizyolojik karakterGluconobacter'dir. Xanthomonas bitkilerdeki nekro- leri temel alınarak tanımlanırlar. Bu özellikler Tablo 12.10 ve Tablo 12.11'de gösterilmiştir. Besin tik yaralardan sorumlu olan bir bitki patojenidir ve sarı renkli pigmentleri ile tanınır. Zoogloea'nm gereksinmileri oldukça basit olan Pseudomonadlar nötral pH'da ve mezofilik sıcaklık aralığında karakteristik özelliği, hücre dışında ipliksi yapıda kemoorganotrofik olarak ürerler. bir polimer oluşturmasıdır. Bu polimer hücrelerin bir araya gelerek küçük yumaklar oluşturmasına Birçok Pseudomonad türünün en belirgin özelneden olur. Bu organizma aktif lağım çamurunun liği çok çeşitli organik bileşiği karbon ve enerji kayen temel bileşenidir ( Kısım 28.2). Gluconobac- nağı olarak kullanabilmesidir. Bazı türler 100'den ter ise şekerleri ya da alkolleri eksik oksidasyona fazla değişik bileşiği kullanabilirken, yalnızca çok uğratması ile karakterize edilir ve örneğin glukoaz sayıda tür 20'den az bileşiği kullanabilir. Burkholzu glukonik aside ya da etanolu asetik aside oksitderia cepacia'mn tek bir susu birçok değişik şekeri, ler (bu organizma diğer asetik asit bakterileriyle yağ asitlerini, dikarboksilik asitleri, trikarboksilik birlikte Kısım 12.8'de tartışılacaktır). Filogenetik asitleri, alkolleri, polialkolleri, glikolleri, aromatik
Glukoz ATP
• Şekil 12.17 Tipik pseudomonad kolonileri, hücre morfolojileri ve pseudomonadlarda görülen yaygın biyokimyasal metabolik yollar, (a) Ağar tabakası üzerinde Burkholderia cepacia kolonilerinin fotoğrafı, (b) Pseudomonas türlerinin Shadow-cast TEM preparatı. Hücreler yaklaşık 1 jLtrn çapındadır, (c) Entner-Doudoroff metabolik yolu. Pseudomonadlardaki Glukoz katabolizmasmm esas yolu.
Glukoz 6-fosfat
H-C-OH HO-C-H
6-Fosfoglukonik asit
H-C-OH H-C-OH H 2 C-OPO 3 2 -
2-Keto-3deoksiglukonik 6-fosfat (KDGP)
H-C-OH; I H-C-OH
•
H2C-0PO32
KDGP aldolaz
Piruvat
H-C=O H-C-OH
;Gliseraldehit 3-fosfat
H2C-OPO32-
+ 2ATP (b)
(c)
|
346 • Bolum 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
Tablo 12.9 Pseodomonadların özellikleri Genel özellikleri: Düz ya da kıvrık basil şeklinde ancak vibroid değil; 0,5-1.0 /Am'ye 1.5-4.0 /mı büyüklüğünde; sporsuz; gramnegatif; polar kamçılı; tek veya çok sayıda; kılıf, uzantı veya tomurcuk yok; solunum metabolizması var, asla fermentasyon yapmaz, ayrıca aerobik olarak glukozdan az miktarda asit üretir; düşük moleküler ağırlıklı organik bileşikleri kullanır, polimerleri kullanmaz; bazıları kemolitotrofiktir, H 2 veya CO'yu tek elektron vericisi olarak kullanırlar; bazıları anaerobik olarak nitratı elektron alıcısı olarak kullanırlar; bazıları anaerobik olarak arjinini enerji kaynağı olarak kullanır. Tanımlama için en basit özellikleri: Gram-negatif, düz veya hafif kıvrık; sporlanmayan; hareketli (daima); polar kamçılı (kamçı boyasıyla); glukozlu ortamda oksidatif-fermantatif: açık tüpte asit üretir; kapalı tüpte üretmez (bunları kolaylıkla enterik bakterilerden ve Aeromonas'tan ayırır); neredeyse daima oksidaz pozitif (enterikler oksidaz negatif); daima katalaz pozitif; fotosentetik pigmentler bulunmaz (bunları mor kükürtsüz bakterilerden ayırır); indol negatif; metil-red negatif; VogesProskauer negatif (bu biyokimyasal testlerin çoğunun açıklaması için Kısım 24.2'ye bakınız)
Tablo 12.10 Grup
bileşikleri, amino asitleri ve aminleri, ayrıca bu katogorilere girmeyen miselli organik bileşikleri kullanabilme yeteneği açısından çok yönlü beslenmeye bir örnek oluşturur. Diğer yandan pseudomonadlar, polimerleri monomerlerine yıkacak hidrolitik enzimlerden genel olarak yoksundurlar. Beslenme yönünden çok yönlü olan pseudomonadlar, olağan olmayan organik substratları yıkıma uğratabilmek için değişik enzim aktivitelerine gereksinim duyar bu nedenle de çok sayıda indüklenebilen operon içerirler (
Pseudomonadlann alt grupları ve özellikleri Filogenetik Grup Karakteristik özellikler
Florescent altgrup
Gama
Pseudomonas aeruginosa
DNA (mol % GC)
Çoğu suda çözülebilen, sarı-yeşil florasan pigmentler üretir; poli-/3hidroksibütirat oluşturmaz; tek DNA homoloji grubu var.
Pseudomonas fluorescens
Piyosiyanin üretimi; 43°C'de üreme; tek polar kamçı; denitrifikasyon yeteneği var Piyosiyanin üretmez veya 43°C'de üremez; püskül şeklinde polar kamçıları
Pseudomonas putida
P.fluorescensile aynı ancak jelatini sıvılaştırmaz ve benzilaminde üremez
60-63
Pseudomonas syringae
Arjinin dehidrolazı yok; oksidaz negatif; bitki patojeni
58-60
Pseudomonas stuzeri Acidorovans altgrubu
Toprak saprofiti; güçlü denitrifiye edici ve florasant değil Beta
Commamonas acidorovans Commamonas testosteroni Pseudomallei-cepacia altgrubu
Beta
67 59-61
62
Pigmentsiz; poli-/3-hidroksibütirat oluşturur; püskül şeklinde polar kamçıları var; karbonhidratları kullanmaz; tek DNA homoloji grubu var. Tek karbon kaynağı ve elektron alıcısı olarak mukonik asiti kullanır
67
Tek karbon kaynağı olarak testestoronu kullanır
62
Florasan pimentleri yok; poli-/3-hidroksibütirat oluşturur; püskül şeklinde polar kamçıları var; tek DNA homoloji grubu vardır.
Bıırkholderia cepacia
Aşırı derecede besin çeşitliliği var; bazı suşları patojenik
67
Burkholderia pseudomallei
Hayvanlarda melioidosis'e neden olur; besin çeşitliliği var
69
Burkholderia mallei
Hayvanlarda glanders'e neden olur; hareketsiz; kısıtlı besin
69
Diminuta-vesicularis
Alfa
altgrubu
Pigmentsiz; şeker kullanmaz
Brevindumonas diminuta
Karotenoid pigmentli; şeker kullanır
Brevindumonas vesicularis Ralstonia altgrubu Ralstonia solanacearum
Çok kısa dalga boylu tek kamçı; vitamine ihtiyaç duyar (pantoten, biyotin, B]2
Beta
Bitki patojeni H2 ile kemolitotrofik olarak ürer; nişastayı sindirir
Ralstonia saccaropkila Metiyonin'e ihtiyaç duyar; NO3- ve asla N kaynağı olarak kullanmaz; oksidaz Stenotrophomonas maltopnegatif hila "Tüm pseudomonadlar Proteobacteria üyeleridir (Tablo 12.1'e bakınız)
66-67 66 66-68 69 67
12.7 • Pseudomonas ve Pseudomonadlar • 347
bakterilerle yapılan araştırmalarla bu enzimlerin gram-pozitif bakterilerde bulunmadığı, buna kar-
Birçok durumda bitkinin iç ortamına o kadar iyi adapte olurlar ki, toprak dahil diğer habitatlardan şılık Pseudomonas, Rhizobium, Agrobacterium, Zymoçok ender izole edilebilirler. Fitopatojenler, sıklıkla monas ve diğer birçok gram-negatif Bacteria'da kendi konakçıları olmayan bitkileri (hastalık belirbulunduğu saptanmıştır. tileri göstermeyen) aracı olarak kullanır ve buradan kendi konakçı bitkilerine geçerek enfeksiyon başlatırlar. Hastalık belirtileri fitopatojenin tipine ve Patojenik Pseudomonadlar konakçı bitkiye göre değişir. Patojenin saldığı bitki toksinleri, litik enzimler, bitki büyüme faktörleri ve Pseudomonadlarm birçoğu patojeniktir diğer bazı maddeler bitki dokularını tahrip eder ya (Tablol2.11). Floresan özellik taşıyan pseudomonadlardan olan Pseudomonas aeruginosa türü insan- da onların biçimini bozar. Birçok durumda hastalık belirtileri fitopatojenin tanımlanmasına yardımlarda idrar ve solunum yolları enfeksiyonlarına neden olur. Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonları cı olur. Örneğin Pseudomonas syringae yapraklarda sarı renkli tipik lezyonlar oluşturur ve lezyonları yanık ya da deri yaralanmaları nedeniyle tedavi içeren yapraklardan izole edilir. P. marginalis ise gören kişilerde ve sistik fibrosis (ö°öKısım 31.7) hastalarında da görülür. Pseudomonas aeruginosa tipik olarak yumuşak-çürükçül bir patojendir ve bitkinin gövde ve sürgünlerini enfekte ettiği halde zorunlu bir parazit değildir. Fırsatçı bir organizyapraklarını çok seyrek olarak enfekte eder. ma olan bu bakteri vücut direnci düşük bireylerde enfeksiyonlara neden olur. Üriner enfeksiyonlara ek, olarak geniş çaplı deri yaralanması olan bireyZymomonas lerde sıklıkla sistemik enfeksiyonlara da neden olur. Zymomonas cinsi gram-negatif çubuk şeklinde P. aeruginosa yaygın olarak kullanılan birçok büyük hücrelere sahiptir. Bu cinsin üyeleri şekerleantibiyotiğe karşı dirençli olduğundan tedavisinri hızla etanole fermente ederler. Zymomonas zorunde sıklıkla zorlukla karşılaşılır. Bu doğal dirençlik lu fermentatif olmasına rağmen, filogenetik olarak direnç aktarım plazmiti (R plazmit)'inden kaynaklanır. pseudomonadlara akrabadır ve Entner-Doudoroff (oöaKısım 10.9 ve 20.12) Bu plazmit çeşitli antibiyometabolik yolunu kullanır (Şekil 12.17c). tikleri etkisiz hale getiren proteinleri kodlayan genZymomonas çeşitli bitki özsularının fermente leri taşımaktadır. Pseudomonas aeruginosa genellikle edilerek alkol üretilmesinde yaygın olarak kullahastane ortamında yaygın olarak bulunur ve diğer nılan bir organizmadır. Güney ve Orta Amerika, hastalıklardan tedavi gören hastaları kolayca enfekAfrika ve Asya'nın tropikal bölgelerinde fermente te eder (<3°oKısım 25.7). Toksik etkisinden dolayı içecek üretiminde bu organizma kullanılır. Kuzey insan tedavisinde normal koşullarda kullanılmaAmerika ve Avrupa'da ise fermentasyon endüstriyan polimiksin antibiyotiği P. aeruginosa üzerinde sinde bu amaçla kullanılan organizma Saccharomyetkilidir ve özel tibbi vak'alarda kullanılılır. ces cerevisiae'dır. Örneğin Meksika'da sabırotunun (agave) alkolik fermentasyonuyla pulque denilen Belirli bazı Pseudomonas, Ralstonia ve Burkholdebir içkinin yapımında, diğer tropikal bölgelerde ise ria türleri ile Xanthomonas cinsi üyeleri iyi bilinen palmiye özsuyunun fermentasyonunda Zymomobitki patojenleridir (fitopatojen) (Bkz. Tablo 12.11). Tablo 12.11
Patojenik pseudomonadlar
Türler Hayvan patojenleri Pseudomonas aeruginosa
Hastalıkla ilgisi
Fırsatçı patojen, özellikle hastanelerde; metabolik, hematolojik ve malignant hastalıkları olan hastalarda bulunabilir; hastanede olması zorunlu katater kullanımı, trakeotomi, belde delik açma ve damar içi iğneden bulaşabilir; uzun süre bağışıklık baskılayıcı ajan, kortikosteroid, antibiyotik ve radyasyon kullanılan hastalara bulaşabilir; ameliyat yaralarına, abselere, yanıklara,kulak enfeksiyonlarına, antibiyotikle tedavi gören akciğerlere bulaşabilir; kistik fibrosis; birincil olarak toprak organizmasıdır 37°C'de iyi üreyemediğinden nadiren patojenik, buzdolabında kanı ve kan ürünlerini kontamine Pseudomonas fluorescens edebilir. Stenotrophomonas maltophilia Her yerde bulunan, sıklıkla hastane patojeni olan serbest yaşayan bir organizmadır Burkholderia cepacia Soğan kökü çürümesine neden olur; ayrıca insanlardan ve tıbbi önemi olan çevresel kaynaklardan izole edilmiştir. Burkholderia pseudomallei Güneydoğu Asya'da insanlarda ve hayvanlarda endemik olan melioidosis hastalığına neden olur Burkholderia mallei Sıklıkla insanlara geçen bir at hastalığı olan glanders hastalığının etkenidir. Pseudomonas stutzeri Sıklıkla insanlardan ve çevreden izole edilir; insan vücudunda saprofitik olarak yaşayabilir Bitki patojenleri Ralstonia solanacearum Birçok kültür bitkisinde (örneğin; patates,domates, tütün, yerfıstığı) solmalara neden olur Pseudomonas syringae Yapraklara saldırır, yapraklarda klorosis ve nekrotik lezyonlara neden olur; nadiren toprakta serbest bulunur Birçok bitkinin yumuşayıp çürümesine neden olur aktif pektinolitik tür Pseudomonas marginalis Yaprakta, köklerde ve meyvelerde nekrotik lezyonlara ve ayrıca sararma ve doku çürümelerine Xantnmonas campestris neden olur; nadiren toprakta serbest bulunur
348 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
nas kullanılır. Ayrıca şekerpancarı özsuyu ve balın alkolik fermentasyonunda da kullanılır. Her ne kadar Zymomonas bu tip alkolik fermentasyonlarda iş gören tek organizma olmasa da, fermentasyon ortamının baskın organizmasıdır ve içki endüstrisinde üretilen alkolün çoğundan sorumludur. Zymomonas ayrıca meyve sularının bozulmasından sorumludur ve bozulmuş biranın bakteri florasında da bulunur. Zymomonas, fermentatif metabolizması, mikroaerofilden anaerobiğe değişen doğası, oksidaz negatif olması ve diğer moleküler taksonomik özellikleri ile Pseudomonas'dan ayrılır. Asetik asit bakterilerine benzer (Bkz. Kısıml2.8) ve doğada çoğunlukla bu bakterilerle birlikte bulunur. Bu ilginç bir durumdur, çünkü mayalar gibi Zymomonas da glukozu etanole fermente ederken, asetik asit bakterileri etanolu asetik aside oksitlerler. Dolayısıyla asetik asit bakterilerinin aktivitesi, substratları olan alkolü üreten mayalara ve Zymomonas'a bağlıdır.
Asetik Asit Oluşturan Bacteria Anahtar Cinsler: Acetobacter, Gluconobacter Asetik asit bakterileri alkol ve şekerleri eksik oksidasyona uğratarak son ürün olarak organik asitler oluşturan, gram-negatif, aerobik, hareketli basiller olarak tanımlanmıştır. Bu isimle adlandırılmalarının nedeni etanolu substrat olarak kullanarak asetik asit üretmeleridir. Asetik asit bakterileri asidik koşullara karşı çok toleranslıdır ve birçok suş 5'in altındaki pH'larda iyi gelişir. Bu asit toleransı çok miktarda asit üreten organizmalar için büyük önem taşır. Asetik asit bakterileri hem peritriş hem de polar kamçılı üyelerden oluşmuş heterojen bir gruptur. Polar kamçılı olanlar Gluconobacter cinsi içinde sınıflandırılırken, peritriş kamçılı olanlar Acetobacter cinsine dahil edilmiştir. Bilinen tüm asetik asit bakterileri filogenetik olarak alfa Proteobacteria içinde gruplandırıhr (Tablo 12.1) Kamçı yerleşimlerindeki farklılığa ek olarak, Acetobacter asetik asidi CO2'e kadar okside edebilme yeteneğiyle de Gluconobacter''den ayrılır. Acetobacter'in asetik asidi okside edebilme yeteneği sitrik asit döngüsü enzimlerinin tümünü içermesinden kaynaklanır. Gluconobacter ise sitrik asit döngüsü enzimlerinden yoksun olduğu için asetik asidi okside edemez. Ekolojileri ve Endüstriyel Kullanımları
Asetik asit bakterileri genellikle alkollü içeceklerde bulunur. Bu bakteriler elma veya üzüm şarapları gibi alkollü içeceklerden ve biradan izole edilebilirler. Asetik asit bakterilerinin kolonileri etanol içeren CaCO3'lı ağar plaklarında kolayca gözlenebilir; çünkü üretilen asetik asit normal koşullarda çözünmeyen CaCO3'ı çözerek şeffaf bir zon oluşmasına neden olur (Şekil 12.18»). Asetik asit
• Şekil 12.18 Enerji kaynağı olarak etanol içeren kalsiyum karbonat ağardaki Acetobacter aceti kolonilerinin fotoğrafı. Bakteriler tarafından oluşturulan asetik asitin kalsiyum karbonatı çözmesi sonucu kolonilerin etrafında oluşan parlak kısımlara dikkat ediniz.
bakteri kültürleri ticari sirke üretiminde kullanılır (öocJKısım 30.11). Bu organizmalar etanole ek olarak, yüksek alkolleri ve şekerleri de eksik oksidasyona uğratabilirler. Örneğin glukoz glukonik aside, galaktoz galaktonik aside, arabinoz arabonik aside vs oksitlenir. Bu eksik oksidasyon yapma özelliği, askorbik asit (C vitamini) üretiminde önemlidir. Askorbik asit sorboz'dan oluşturulabilir, ancak sorbozun kimyasal olarak sentezi zordur. Bu nedenle asetik asit bakterileri kullanılarak sorbitol (daha kolay sağlanan bir şeker alkol) sorboza okside edilir. Bu işlem biyotmnsformasyon olarak adlandırılır (oosKısım 30.8). Bazı asetik asit bakterilerinin bir başka ilginç özelliği selüloz sentezleyebilmeleridir. Oluşturulan bu selüloz kimyasal olarak bitki selülozundan çok farklı değildir. Ancak bitki selülozu gibi hemiselüloz, pektin ya da lignin gibi polimerlerle karışık olmaması nedeniyle daha saftır. Asetik asit bakterileri tarafından sentezlenen selüloz hücre duvarının dışında bir matriks oluşturur ve hücreler selüloz mikrofibrillerinden oluşmuş bu yapı içine gömülür. Asetik asit bakterilerinin bu türleri çalkalanmaksızın üretildiğinde, bakterilerin içinde gelişebileceği selüloz yapısında bir yüzey pelikülü oluştururlar. Bu bakterilerin zorunlu aerob oldukları göz önüne alındığında, böyle bir pelikül oluşturma yeteneği organizmanın sıvı yüzeyinde kalarak kolayca oksijen sağlamalasını olanaklı kılar.
Serbest Yaşayan Aerobik Azot Fiksasyonu Yapan Bacteria Önemli Cinsler: Azotobacter,Azomonas Toprakta yaşayan organizmaların çoğu aerobik (oksijenli) koşullarda N 2 fikse etme yeteneğindedir (Tablo 12.12). Azotobacter cinsi içinde yer alan bakteriler büyük, gram-negatif, zorunlu aerob, çubuk şeklinde organizmalar olup, simbiyotik olmayan bir yolla N 2 fiksasyonu yaparlar (Şekil 12.19*). Bu cinse ait ilk tür Hollandalı bir mikrobiyolog olan Martinus Beijerinck tarafından yirminci yüzyılın başlarında keşfedilmiştir («^ooKısım 1.7). Beijerinck,
12.9 • Serbest Yaşayan Aerobik Azot Fiksasyonu Yapan Bacteria • 349
Tablo 12.12
Serbest yaşayan aerobik azot fikse eden bakteri cinsleri
Cins/DNA (mol % GC) Özellikleri Gama Proteobacteria Azotobacter(63-67) Büyük basil; kist oluşturular; birincil olarak nötralden alkaline tüm topraklarda bulunabilrler Büyük basil; kist oluşturmazlar; Azotomonas(52-59) birincil olarak sucul Alfa Proteobacteria Mikroaerofilik basil; bitkilerle Azospirillum(69-71) ilişkilidir inci şekilli basil; her iki sonunda Beijerinckia(54-59) da lipid cisimcikler vardır; yaygın yapışkan madde üretir; asidik topraklarda yaşar Basiller; kalın, buruşuk koloniler Derxia(69-73) oluşturur Beta Proteobacteria Küçük kıvrık hücreler; kist oluşAzoarcus(65) turmaz Azovibrio (64-65) Çok ince kıvrık hücreler; kist oluşturmaz Çok ince basil ya da vibriolar; kist Azospira(65-66) oluşturmaz Azonexus(65-66) 50 (um uzunluğunda sarmal oluşturan hücreler;
N 2 (hava) içerdiği halde bağlı azot kaynağından yoksun olan, zenginleştirilmiş aerobik bir kültür ortamı kullanmıştır (ootsKısım 18.1 ve Şekil 18.1). Serbest-yaşayan azot-fikse eden bakteriler filogenetik olarak alfa, beta ya da gama Proteobacteria'ya bağlıdır (Tablo 12.12).
ket peritriş kamçılarla sağlanır. Serbest-yaşayan N 2 fikse eden bakteriler, karbohidrat içeren besi ortamlarda üretildiğinde büyük kapsüller ya da yapışkan tabakalar oluştururlar (Şekil 12.20*; «**a Şekil 17.71). Azotobacter zorunlu aerob olmasına karşın, bu organizmanın biyolojik N 2 fiksasyonu yapmasını katalizleyen nitrojenaz enzimi O2'e duyarlıdır («aoöKısım 17.28). Azotobacter'e özgü olan yüksek solunum hızı ve yapışkan kapsül oluşumunun, nitrojenazı O2'den koruduğu düşünülmektedir. Azotobacter çeşitli karbohidratlar, alkoller ve organik asitler üzerinde üreme yeteneğindedir. Karbon bileşiklerinin metabolizması kesinlikle oksidatif olup, asit ve diğer fermentasyon ürünleri nadir olarak üretilir. Tüm üyeleri azot fikse etmelerine rağmen, amonyak, üre ve nitrat gibi bağlı azot içeren basit bileşikler üzerinde de üreyebilirler. Azotobacter kist (cyst) denilen dinlenme hücreleri oluşturur. Bakteriyal endosporlarda olduğu gibi Azotobacter kistleri de (Şekil 12.19b) ihmal edilebilecek ölçüde içsel solunum yapar ve kurumaya, mekanik parçalanmaya, ultraviyole ışınlarına ve iyonizan radyasyona dirençlidir. Ancak endosporlarlarm aksine bu kistler sıcaklığa karşı özel bir direnç göstermez ve dışarıdaki enerji kaynaklarını hızla okside ettiklerinden tam olarak dormant değildirler. Serbest-yaşayan ve N 2 fikse eden diğer önemli bir cins olan Azomonas üyeleri Azotobacter'e benzeyen büyük çubuk şeklinde bakteriler olup, kist
Taksonomileri Azotobacter, AzospiriUum
ve Beijerinckia üzerinde
en fazla çalışılan serbest-yaşayan azot-fikse eden bakterilerdir. Azotobacter hücreleri çok büyük olup, birçok izolatm çapı 2-4/jum ya da daha fazladır. Bu hücreler maya hücreleri kadar büyüktür. Pleomorfizm yaygın olup, çok çeşitli şekil ve boyuta sahip hücreler tanımlanmıştır. Bazı suşlarında hare(a)
• Şekil 12.19 Azotobacter vinelandii. (a) Vejetatif hücreler ve (b) kistler faz-kontrast mikroskobu ile görüntülenmiştir. Bir hücre yaklaşık 2 /j,m, kist ise 3 /im çapındadır. Şekil 1.14b ile karşılaştırınız.
• Şekil 12.20 Serbest yaşayan Nz fikse eden bakteriler tarafından üretilen yapışkan tabaka örnekleri, (a) Derxia gummosa hücreleri yapışkan tabaka ile kaplanmıştır, (b) Beijerinchia türlerine ait koloniler karbonhidrat içeren ortamlarda büyürler. Kolonilerin parlak, kabank görüntüsü bolca bulunan kapsül yapısındaki yapışkan maddeden kaynaklanır.
350 • Bölüm 12 • Profcaryotik Çeşitlilik: Bacteria
oluşturmaz ve çoğunlukla sucul ortamlarda yaşar. Beijerinckia (Şekil 12.20b) ve Derxia (Şekil 12.21») cinslerinin her ikisi de asidik topraklarda iyi gelişir. Azot fikse eden bakterilerden Azospirillum, basilden spirale kadar değişen farklı şekillere sahip bir cins olup, özellikle mısır başta olmak üzere değişik bitkilerle (Tablo 12.12) özgül olmayan simbiyotik ilişki içinde olmasıyla bu gruba dahil olur.
12.10
Neisseria, Chromobacterîum ve Akraba Gruplar
Anahtar Cinsler: Neisseria, Chromobacterium Beta ve gama Proteobacteria'nın bu grubu, Gram boyanma, morfoloji, hareketten yoksun olma, aerobik metabolizma gibi özellikleri ve filogenetik akrabalıkları göz önüne alınarak bir araya getirilen geniş bir organizma topluluğunu kapsar. Tablo 12.13'te görülen Neisseria, Moraxella, Branhamella, Azotobacter ve Alternatif Nitrojenazlar Kingella ve Acinetobacter cinsleri en dikkat çeken grup üyeleridir. Önemli bir biyolojik süreç olan N 2 fiksasyonu Kısım Neisseria cinsinde hücreler daima kok biçimin17.28'de ele alınacak olup, molibden (Mo) ve demir de (Şekil 12.22««; ö^öŞekil 26.28) olduğu halde, (Fe) metallerinin nitrojenaz enzimi için çok önemli diğer cinslerde hücreler yalnızca üremenin durolduğu görülecektir. Azotobacter chroococcum molibden yokluğunda N 2 üzerinde üreme yeteneği olduğu gunluk fazında kokoid olup, normal koşullarda çubuk şeklindedir. Bu organizmalar kokobasiller ilk gösterilen azot-fikse eden bakteridir. Mo nitrojeolarak da adlandırılır. Neisseria, Kingella ve Moranaz yerine geçen iki "alternatif nitrojenaz" olduğu xella cinslerindeki organizmalar çoğunlukla ilk kez A. chroococcum'da gösterilmiştir. Bu nitrohayvanlardan izole edilir ve bunların bazıları patojenazlar üreme koşullarına bağlı olarak ya vanadjendir. Belsoğukluğu (gonore) etkeni olan Neisseria yum (V) ve Fe, ya da sadece Fe içerirler. Azot fikse gonorrhoeae'nin klinik mikrobiyolojisi Kısım 24.1'te, eden diğer bakteriler üzerinde yapılan daha sonraki belsoğukluğunun patogenezi ise Kısım 26.12'de araştırmalar bu gibi "yedek" nitrojenaz sistemlerinin bakteriler ve azot fikse edebilen bir kaç Archaea tartışılacaktır. Zaman zaman hayvan paraziti olarak bulunan türünde yagm olarak bulunduğunu göstermiştir. ve hastane-kaynaklı bazı enfeksiyonlarda saptanan Acinetobacter türleri ise genellikle toprak ve sularda yaygındır. Morexella ve Acinetobacter'in bazı türleri 12.7-12.9 Kavramların Gözden Geçirilmesi ilginç bir seğirme hareketi sergiler ve 1-5 /um kadar Pseudomonadlar arasında çok sayıda gram-negatif kekısa mesafelerde yer değiştirme ya da atlama haremoorganotrofik aerobik basil bulunur. N 2 fikse eden keti yaparlar. Seğirici bakteriler hareket etmelerini birçok tür filogenetik olarak yakın akrabadır. Pseudomosağlayan özel bir pili (öoaKısım 4.10) içerirler. nadlarla filogenetik olarak akraba olan asetik asit bakterileri etonolü asetata aerobik olarak okside edebilmeleriyle karakterize edilirler.
Pseudomonadları, Azotobactefi ve asetik asit bakterilerini, O ve azot gereksinimleri, elektron vericileri, patojeniteleri ve habitatları açısından karşılaştırınız. • Acetobacter ve Gluconobacter organizmalarını düşünebildiğiniz bütün özellikler açısından karşılaştırınız.
Chromobacterium filogenetik olarak Neisseria'ya
yakın olmakla birlikte, çubuk şeklinde olması
•
Bipolar lipid cisimcikler
(a)
• Şekil 12.21 Asidi tolere eden, serbest yaşayan N2 fikse eden bakterilerden iki cinsin faz-kontrast fotomikrografı. (a) Beijerinckia indica. Hücreler kabaca inci şeklinde ve yaklaşık 0,8 /j-m çapındadır. Her iki uçta bir poli-/3-hidroksibütirat küreciği içerir(ö°C»Kısım 4.11) (b) Dencia gummosa. Hücreler yaklaşık 1 fim çapındadır.
Gram-negatif kok cinslerinin Tablo 12.13 özellikleri 3 Özellikleri
Cins/DNA (mol % GC)
Özellikleri I. Oksidaz pozitif, penisillin duyarlı Kok; kompleks beslenme, karbonhidratlardan faydalanırlar, zorunlu aerob; Beta Proteobacteria veya Gama Proteobacteria Basil veya kok; genelde büyüme faktörlerine ihtiyaç duymazlar, genelde karbonhidratlardan faydalanamazlar; kamçılan yoktur, bazı türler seğirme hareketi gösterirler; çoğu kommensal veya hayvan patojeni; Beta Proteobacteria II.Oksidaz negatif, penisillin dirençli Bazı suşlar kısıtlı çeşitlilikte şekerleri kullanırlar ve bazıları seğirme hareketi gösterirler; toprak, su ve lağım saprofitidirler; Gama Proteobacteria
Cins/DNA (mol %GC)
" Hepsi Proteobacteria
Neisseria(49-55) Moraxella (40-46)
Branhamella (40-46) Kingella (47-55)
Acinetobacter (38-47)
12.11 » Enterik Bacteria • 351 • Şekil 12.22 JVeisseria ve Chromobacterium. (a) Neisseria gonorrhoeae'mn tipik diplokok hücre düzenlenmesini gösteren transmisyon elektron mikroskobu görüntüsü, (b) Choromobacterium violaceum'un büyük bir kolonisi. Mor pigment viyolasein (violacein) denen aromatik bir bileşiktir.
•
.
•
•
I I (a) O H,C-C-COCr
nedeniyle morfolojik olarak pseudomonadlara ya da enterik bakterilere benzer. En iyi bilinen Chromobacterium türü olan C. violaceum, mor bir pigmente sahip olan, toprak ve suda bulunan, ender olarak da insan ve diğer hayvanlarda cerahat (irin) oluşturan enfeksiyonlarda saptanan bir organizmadır. Chromobacterium violaceum ve az sayıda bazı kromobakterler suda çözünmeyen, antibiyotiğe benzer özellik gösteren ve sadece triptofan amino asidi içeren besi ortamlarında üretilebilen viyolasein (Şekil 12.22b) denilen mor renkli bir pigment sentezlerler. Enterik bakteriler gibi Chromobacterium da fakültatif aerobtur ve şekerler üzerinde fermentasyon ile, aerobik koşullarda ise çeşitli karbon kaynaklarını kullanarak gelişir.
Tiyamin pirofosfat (TPP)
CO. • H I
O II
H3C-C-TPP
+ H3C-C-COO-
Piruvat
OH
TPP
CH3 C=O
a-Asetolaktat
H3C-C-COOOH COo CH3 C=O
Enterik Bacteria Anahtar Cinsler: Escherichia, Salmonella, Proteus, Enterobacter Gama Proteobacteria içinde bulunan enterik bakteriler filogenetik olarak oldukça homojen bir grup olup, spor oluşturmayan, çubuk şeklinde, hareketsiz ya da peritriş kamçılar (Şekil 12.23Ö •) ile hareket eden, fakültatif aerob gram-negatif bakterileri kapsar. Enterik bakteriler oksidaz-negatif, oldukça basit beslenme gereksinimleri olan ve şekerleri çeşitli son ürünlere fermente eden bir gruptur. Entrerik bakterileri bunlara benzeyen morfoloji ve fizyolojiye sahip diğer bakterilerden ayırt etmede kullanılan fenotipik özellikler Tablo 12.14'te verilmiştir. Enterik bakteriler içinde insan, hayvan veya bitkiler için patojenik olan pek çok tür olduğu gibi, endüstriyel önemi olan suşlar da bulunur. Diğer bakterilere göre hakkında çok daha fazla bilgimiz olan tür Escherichia coli'dir («»»Kısım 10.19). Tıbbi açıdan önemli olmalarından dolayı çok sayıda enterik bakteri izolatı ile çalışılmış ve bunların özellikleri belirlenmiş olup, birçok farklı cins tanımlanmıştır. Enterik bakterilerin pek çoğu yüksek oranda genomik DNA homolojisi götermeleri («po&Kısım 11.11) ve yaygın olarak genetik rekombinasyon yapmaları nedeniyle belirgin genetik akrabalık taşırlar. Bu gerçeğe rağmen, klinik mik-
Piruvat
Asetoin
H3C-C-H OH
I
CH3 H-C-OH
2,3-Bütandiol
H3C-C-H OH (b) Stokiyometri: 2 piruvat +
2 COo
(c)
• Şekil 12.23 Biitandiyol üretimi, (a) Bütandiyol üreten enterik bakteri Envinia carofovora'mn (shadow-cast) preparatmm elektron mikrografı. Hücreler yaklaşık 0,8 /j,m genişliğindedir. Tüm hücre yüzeyinden çıkan kamçılara dikkat ediniz. (G°S Kısım 4.14) (b) Bütandiyol fermente edenler tarafından 2 molekül piruvattan bütandiyol oluşturulmasının metabolik yolu. (c) Toplam sitokiyometri. Bütandiyol yapmak için sadece 1 NADH değil aynca 2 piruvatm da gerektiğine dikkat ediniz.
352 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
Tablo 12.14
Enterik bakterilerin özelliklerini tanımlama
Genel özellikleri: Gram-negatif düz basiller; peritriş kamçlarla hareketli veya hareketsiz; sporlanmayan; fakültatif aerob, glukozdan asit üretimi; sodyum ne gerekli ne de baskılaycı; katalaz pozitif; oksidaz negatif; sıklıkla nitratı nitrite redükte eder (N2'ye değil); gamma Proteobacteria'dan 16S rRNA'lı (Tablo 12.1'e bakınız) Enterik bakterileri aynı morfolojideki diğer bakterilerden ayırmak için kullanılan anahtar testler Oksidaz testi, enterikler her zaman negatiftir-enterikleri, morfolojik olarak benzer olabilen oksidaz pozitif bakteri cinsleri Pseudomonas, Aeromonas, Vibrio, Akaligenes, Falavobacteri-
um, Cardiobacterium'dan ayırır; nitrat safdece nitrite redükte edilir, (üreme sonrası nitrit tahlili)— enterik bakterileri Pseudomonas gibi nitratı N2'ye (gaz oluşumu tespit edilen) redükte edebilenlerden ve diğer birçok oksidaz pozitif bakteriden ayırır; glukozu fermente etme yeteneği- enterikleri zorunlu aerobik bakterilerden ayrırır. " Kısım 24.2 ve Şekil 24.7'ye bakınız
robiyolojide tanımlama yapma gibi daha çok pratik nedenlerden dolayı ayrı cinsler oluşturulmuştur. Bu organizmalar genellikle hastalık durumu söz konusu olduğunda üretildiklerinden, tedavinin hızlandırılmasını sağlamak için bunların tanımlanması gerekir. Bu nedenle enterik bakteri cinslerini ayırt etmede geleneksel olarak fenotipik karakterler büyük önem kazanmıştır. Enterik Bakterilerde Görülen Fermentasyon Tipleri
Enterik bakteri cinslerini birbirinden ayırmak için kullanılan önemli taksonomik karakterlerin başında glukozun anaerobik fermentasyonunda kullanılan fermentasyon tipi ve üretilen fermentasyon • Şekil 12.24 Enterik fermantasyonlar. Enterik bakterilerde (a) Karışık asit ve (b) Butandiyol fermentasyonu arasındaki ayırım. Kalın oklar ana ürünleri çıkaran reaksiyonları göstermektedir. Üstteki fotoğraf E. coli kültüründe asit (san renk) ve gaz (ters çevrilmiş Durham tüpü içinde) üretimini göstermektedir(mor tüpe ekim yapılmamıştır). Alttaki fotoğraf VogesProskauer (VP) testinde Enterobacter aerogenes'in üremesiyle butandiyol üretimini belirten pembe-kırmızı renk oluşumunu göstermektedir. Soldaki tüpe(san) ekim yapılmamıştır. İki metabolik yolda CO2 üretimindeki temel farklılıklara dikkat ediniz.Butandiyol üretimi çok büyük ölçüde CO2 üretimine yol açar. Çünkü 2 molekül piruvattan 1 molekül butandiyol üretimi ile sadece 1 NADH oluşurken, (Şekil 12.23i, c'deki metabolik yola bakınız),üretilen her bir butandiyol için glikolizde üretilen ikinci NADH'ı harcamak amacıyla 0,5 molekül etanol yapılması zorunludur.
ürünlerinin oranı gelir. Kanşık-asit fermentasyonu ve 2,3-butandiyol fermentasyonu olmak üzere iki yaygın model tanımlanmıştır (Şekil 12.24»). Kanşık-asit fermentasyonunda önemli miktarda oluşan üç asit asetik, laktik ve süksinik asittir. Bu fermentasyonda etanol, CO2 ve H 2 de oluşur, ancak butandiyol oluşmaz. Butandiyol fermentasyonunda oluşan ana ürünler ise butandiyol, etanol, CO2 ve H 2 olup, üretilen asit miktarları çok daha azdır. Kanşık-asit fermentasyonu sonucunda eşit miktarlarda CO2 ve H 2 üretilirken, butandiyol fermentasyonunda oluşan CO2 miktarı H2'e göre oldukça fazladır. Bunun nedeni, karışık-asit fermentasyonu yapan organizlarm sadece formik asitten fortnat hidrojen liyaz enzimi aracılığı ile CO2 oluşturmasıdır: HCOOH
Yukarıdaki tepkime sonucunda eşit miktarlarda CO2 ve H 2 oluşur. Butandiyol fermentasyonu yapanlar da formik asitten CO2 ve H2 oluştururlar. Ancak bunun yanı sıra, oluşan her butandiyol molekülü için fazladan iki molekül CO2 daha üretirler (Şekil 12.23b). Enterik Bakterilerin Tanımlanması
İki büyük enterik bakteri grubunda yer alan cinsleri birbirinden ayırt etmek için çok çeşitli teşhis yöntemleri ve farklı besi ortamları kullanılır («MsTablo 24.2 ve 24.3). Bunlara ve diğer testlere dayanarak tanımlanan cinsler Tablo 12.15 ve 12.16'da verilmiştir. Enterik bakteriler genetiksel olarak birbirlerine çok yakın akraba olduklarından, doğru tanımlanmaları bir hayli zor olmakta-
(a) Karışık asit fermentasyonu (örneğin, Escherichia coli) Glukoz
• H, + CO,
Piruvat
Tipik ürünler (molar miktar)
Laktat CO 2 Süksinat
Asetil~CoA.
Etanol Asetat
Format .
(b) Butandiyol fermentasyonu (örneğin, Enterobacter) 2,3-Bütandiyol -
Glukoz
Piruvat
Tipik ürünler (molar miktarları) Asidik 1 CO 2 5
nötra 6 H2 1
12.11 • Enterik Bacteria « 353
Tablo 12.15 Cins Escherichia Enterobacter Shigella Edmardsiella Salmonella Klebsiella Citrobacter Proteus Providencia Yersinia Hafnia
3
Bazı önemli enterik bakteri cinslerinin aynmı için kullanılan belli başlı teşhis reaksiyonları H2S(TSI)
_ + + + ya da + ya da _
+ + +
İndol
Hareket
Glukozdan 1 gaz çıkışı '
/;-GalaUtozidaz
+
+ -
+ ya da +
+ +
+ +
+ + + + + ya da -
+ + + ya da + ya da + +
+ ya da -
+
KCN -
Sitrat
+ + + ya da + + _
+ + ya da + + + ya da + -
+
Vr*
_ -
-
Cins Escherichia Enterobacter Shigella Edmardsiella Salmonella Klebsiella Citrobacter Proteus Providencia Yersinia Hafnia
Üreaz -
+ ya da + + ya da + -
FenilMukat kullanımı ımetil kırmızı + +
+ ya da + + _
+
+ _ + + ya da + + + + +
+ + + +c +
+
+ + ya da -
Tartarat kullanımı
Alanin deaminaz
DNA (mol%GC)
+
-
+ ya da + ya da + + +
+ +
48^52 52-60 50 53-59 50-53 53-58 50-52 38-41 39^2 46-50 48-49
+
a
Bu tanımlama reaksiyonlarının prosedürleri çin Tablo 24,1'e bakınız. Bu reaksiyonun fotoğrafı için Şekil 12.24'e bakınız. •Oda sıcaklığında ürediğinde hareketli, 27°C'de hareketsiz /J
dır. Klinik laboratuvarlarda yapılan tanımlamada genellikle çok sayıda diagnostik testi temel alan bilgisayar analizleri kullanılır. Bu analizler için hızlı sonuç veren minyatür tanı vasatı kitleri ve immünolojik ve nükleik asit probları kullanılılır. Bu işlemler sırasında bazı istisnai suşlarm değişik tepkimeleri göz önünde bulundurulur (c»&Şekil 24.1). Alternatif olarak moleküler yöntemler de kullanılabilmektedir (oooKısım 24.5-24.12). Tablo 12.15 ve 12.16'da verilen cinslerin ayrımının yaklaşık bir sonuç olduğu göz önünde bulundurulmalıdır; çünkü bir cinste var olduğu bilinen herhangi bir özelliği taşımayan bir tür izole etme olasılığı her zaman vardır. Bu kısıtlamalar akılda tutularak, önemli cinslerin ayrımı Şekil 12.25«'te daha da basitleştirilmiş olarak verilmiştir. Bu anahtar yeni elde edilmiş enterik bir izolatm hangi cins içine yerleştirileceği konusunda çabuk bir karar verilmesini sağlar. Şimdi önemli cinslerin bazı özellikleri üzerinde durulacaktır.
tüketilmesine yardım ederek kalın bağırsağın oksijensiz hale gelmesini sağlar. Yaban-tip Escherichia suşları şekerler, amino asitler, organik asitler ve diğer çok çeşitli karbon ve enerji kaynakları üzerinde gelişebilir ve çok ender olarak herhangi bir büyüme fatörünü gereksinirler. Bazı Escherichia suşları patojendir. Bu suşlar bebeklik çağındaki çocuklarda ishale neden olur. Bu tip ishal vak'aları çocuk yuvalarında ve doğum koğuşlarında sıklıkla epidemik boyuta ulaşabilir. Escherichia, yaşlılarda ve cerrahi operasyon geçirdiği ya da iyonizan radyasyona maruz kaldığı için bağışıklığı baskılanmış bireylerde idrar yolu enfeksiyonlarına da neden olabilir. Enteropatojenik E. coli suşları sıklıkla dizanteri benzeri enfeksiyonlara ve ateşin yükselmesine neden olur. cOöKısım 21.6,21.11 ve 29.8'de belirtildiği gibi bu suşlar, ince bağırsağa yapışıp kolonize olmalarını sağlayan K antijeni ve ishal belirtilerinden sorumlu olan enterotoksin oluştururlar.
Escherichia Cinsi
Saltnonella ve Shigella
Escherichia cinsi üyeleri evrensel olarak insan ve sıcakkanlı hayvanların bağırsak kanalında bulunmakla birlikte bu habitatlardaki baskın organizmalar değildir. Bağırsak kanalında Escherichia tarafından sentezlenen vitaminler ve özellikle de K vitamini beslenmede önemli rol bir oynar. Fakültatif aerob olan bu organizma muhtemelen oksijenin
Salmonella ve Escherichia cinsleri birbirine oldukça yakın akrabadır ve DNA:DNA hibridizasyonunda %50 oranında genomik benzerlik gösterirler (so& Kısım 11.11). Ancak çoğu Escherichia' nın aksine, Salmonella cinsinin pek çok üyesi ya insanlar ya da diğer sıcakkanlı hayvanlar için patojendir. İnsanlarda salmonellaların neden olduğu en yaygın
354 • Bölüm 12 • Proharyotik Çeşitlilik: Bacteria
Tablo 12.16
2,3 butandiol üreten çeşitli cinsleri ayırmada kullanılan belli başlı teşhis reaksiyonları Uygun sıcaklık (°C)
Ornitin Jelatinin debarboksilaz hidrolizi
Cins Klebsiella Enterobacter Serratia b Erwinia Hafnia
37-40 37^0 37-^0 27-30 35
Yavaş + ya da -
Pigmentasyon
Hareket
Yok Sarı (yok) Kırmızı (yok) Sarı (yok) Yok
Laktoz
DNaz
Sorbitol
+ ya da -
DNA (mol % CC) 53-58 52-60 52-60 50-58 48^9
" Bu teşhis testlerinin tanımları için Tablo 24,3'e bakınız. 'Şekil 12.23ıi'ya bakınız.
hastalıklar tifo ve gastroenterit'tir (mide-bağırsak enfeksiyonu) («»aKısım 28.8 ve 29.7). Salmonellalar özellikle tifoya neden olan Salmonella suşlarmda bulunan üç tip hücre yüzeyi antijenine göre immünolojik olarak sınıflandırılırlar. Bunlar O veya hücre duvarı (somatik) antijeni, H veya flagellar (kamçıya ait) antijen ve Vi (dış polisakkarit tabaka) antijenidir. O antijenleri bu organizmalardaki dış zarın en dış tabakasını oluşturan lipopolisakkaritlerinin bir parçasıdır (oooKısım 4.9 ve 21.12). Lipopolisakkaritlerin kimyasal yapısı Kısım 4.9'da anlatılmıştır (öOöŞekil 4.35 ve 4.36). Salmonella cinsi O antijenleri üzerinde farklı antijenik özgüllüğe sahip 1000'den fazla serotip içermektedir. Flagellar (H) antijenlerin antijenik özgüllükleri temel alınarak tanımlanan bazı alt sınıflar da vardır. Salmonellanm antijenik tipleri ile hastalık belirtileri arasında çok az bağlantı olduğu veya hiç bağlantı olmadı-
Tanı testi 1 MR+;VP(karışık asit fermenterleri) MR -; VP + (butandiol üretenler)
Numaraya bak
2 Urease + Urease -
Proteus 3
3 H2S(TSI) + H2S (TSİ) -
4 6
4
Citrobacter 5
KCN + KCN-
2 7
5 Indol +; sitrot Indol - ; sitrot +
Edwardsiella Salmonella
6 Glukozdan gaz Glukozdan gaz yok
Escherichia Shigella
7 Hareketsiz; ornitin— Hareketli; ornitin + 8 Jelatin+; DNAaz -
Klebsiella 8 Serratia (kırmızı pigment)
Jelatin yavaş; DNAaz -
ğı ortaya çıkarılmış olmakla birlikte, immünolojik tipleme salgına neden olan bir susu takip etmeyi mümkün kılar. Shigellalar da genetik olarak Escherichia ile çok yakın akrabadır. DNA homoloji testleriyle, Shigella suşlarınm Escherichia coli ile %70 ve hatta daha yüksek oranda genomik benzerlik gösterdiği bulunmuştur. Escherichia' nm aksine Shigella insanlar için patojeniktir ve basilli dizanteri denilen oldukça ciddi bir gastroenterite neden olur. Shigella dysenteriae besin ve su aracılığıyla bulaşır ve bağırsak epitel hücrelerini istila eder (öOaKısım 29.11). Bağırsak hücrelerine yerleştiğinde hem bir endotoksin hem de bir nörotoksin üreterek, enterotoksik etkiler ortaya çıkarır. Proteus Proteus cinsi hızlı hareket etmesi (Şekil 12.26*) ve üreaz enzimi üretmesi ile tanımlanır. Genomik DNA homolojisi Escherichia coli ile sadece uzak akraba olduğunu göstermiştir. Proteus'un insanlarda sık görülen idrar yolu enfeksiyonlarından sorumlu olması muhtemelen hızla üreyi parçalama yeteneğinden ileri gelir. Proteus hücrelerinin hızlı hareket etmesi, ağar plakları üzerinde üreyen kolonilerin karakteristik olarak kümelenmesine neden olur (Şekil 12.26b). Büyüyen koloninin kenarındaki hücreler koloni ortasındaki hücrelerden daha hızlı hareket eder. Kenardaki hücreler koloniden kısa mesafeye kadar uzaklaşır ve daha sonra hareketi yavaşladığı için bulunduğu yerde kalarak, bölünür. Böylece hareketli hücrelerden oluşan ve kümeleşen yeni bir popülasyon oluşturur. Sonuçta ortaya çıkan olgun koloni iç içe geçmiş bir seri halka halinde görünür. Bu görüntünün nedeni, çok yoğun hücre içeren bir halkanın daha az yoğun hücre içeren bir diğerini izlemesidir (Şekil 12.26b).
Enterobacter
Anahtar Karışık asit fermentörlert Butandiol üreticileri
• Şekil 12.25 Enterik bakterilerin ana cinsleri için basit bir anahtar. Sadece en yaygın görülen cinsler verilmiştir.Artahtann kullanımındaki uyanlar için konuyu okuyunuz. Bu şekille birlikte kullanılan tanı testleri Tablo 24.3'te verilmiştir. Cinslerle ilgili diğer özellikler Tablo 12.14 ve 12.16'da verilmiştir.Renk kodlaması Şekil 12.24'deki gibidir.
Bütandiyol Fermentasyonu Yapanlar:
Enterobacter, Klebsiella ve Serratia
Bütandiyol fermentasyonu yapan organizmalar genetik olarak karışık-asit fermentasyonu yapanlara değil birbirlerine daha yakın akrabadır. Bu bulgu gözlenen fizyolojik farklılıklarla uygunluk taşır. Bunların DNA baz bileşimleri %53-58 gibi
12.12 • Vibrio ve Phofobacterium « 355
'^T%>* -:- •
,
;
y
f ''",
**'•'**•'• '$:h Y
m?
*
$
t
s.
•
*
/"
"
r
1
'
V
'
/
"
-
, * " " • ' •
'
•
•
• \ ' / '
%
$
- •
t
•*—
"•
>-
*-
V
"
;
_
•»
•
» -
t ^
• ,,
•
-
^
•
. •
V
•
.5 ^,
IL'
•
'a) i • Şekil 12.27 Serratia marcescens kolonileri. Turuncu kırmızı renklenme "prodigiosin" pigmentini içren pirol'den kaynaklanır.
Vibrio ve Photobacterium Anahtar Cinsler: Vibrio, Photobacterium
• Şekil 12.26 Proteus'iaki çoğalma, (a) Proteus mobilis hücreleri kamçı boyasıyla boyanmıştır; her bir grubun peritriş kamçılan tutam halindedir, (b) Proteus vulgaris kolonisinin fotoğrafı. Eş merkezli halkalara dikkat edin.
Vibrio grubu fermentatif metabolizmaya sahip, çubuk ve bükülmüş çubuk şeklinde, gram-negatif, fakültatif aerobik bakterileri içerir. Vibrio grubunun birçok üyesi polar kamçılı olduğu halde, bazı üyeler peritriş kamçılıdır. Vibrio grubu ile enterik bakteriler arasındaki en önemli fark, Vibrio' nun oksidaz-poz/h/ (öOöTablo 24.3), enterik bakterilerin ise oksidaz-negafff olmalarıdır. Pseudomonas da polar kamçılı ve oksidaz-pozitif olmasına karşın, fermentatif değildir. Dolayısıyla bu bakteri vibriolardan basit şeker fermentasyon testleriyle ayırt edilebilir. Vibrio grubunun en iyi bilinen cinsleri Vibrio ve Photobacterium'dur.
Vibrio ve benzer bakterilerin çoğu sucul olup, hem tatlı sularda hem de denizlerde bulunur. Vibyüksek bir oranda GC içerir. Bu grubun sınıflandırio cholera insanlara özgü bir hastalık olan kolera rılması Tablo 12.16'da verilmiştir. etkenidir (£»c>Kısım 21.11 ve Kısım 28.5). Bu orgaEnterobcıcter aerogenes su ve lağımlarda bulundu- nizma normal olarak başka konakçıları enfekte ğu gibi, sıcakkanlı hayvanların bağırsak kanalında etmez. Kolera az gelişmiş ülkelerdeki bulaşıcı hasda bulunur ve ara sıra da idrar yolu enfeksiyonlarıtalıkların en yaygınlarından biri olup, uzun bir na neden olur. Bir Klebsiella türü olan K. pneumoniae tarihi geçmişe sahiptir (ünlü tıbbi mikrobiyolog nadiren insanlarda zatürreye neden olur. Ancak Robert Koch Vibrio cholera'yi 1884'de ilk kez izole klebsiellaların en sık rastlandığı yerler toprak ve eden kişidir). Bu organizma hemen hemen yalnızsudur. Klebsiella suşlarmın çoğu diğer enterik bak- ca su ile bulaşır. On dokuzuncu yüzyılda koleranın terilerde bulunmayan bir özellik olan N, fikse etme nasıl bulaştığı üzerine yapılan araştırmalar kentsel yeteneğine sahiptir (o°öKısım 17.28). su arıtımının ne kadar önemli olduğunu göstermişSerratia cinsi üyeleri pirol içeren ve kırmızı renk- tir. V. cholera'nm patojenitesi Kısım 21.11'de tartıli pigmentler olan prodigiosinler'i sentezler (Şekil şılacaktır. 12.27»). Prodigiosin durgunluk evresinde ikincil Vibrio parahaemolyticus bir deniz organizmasımetabolit olarak üretilir («s^Kısım 30.2) ve enerdır. Çiğ balık tüketiminin çok olduğu Japonya'da ji aktarımında görev yapan porfirinler, klorofiller gasroenteritin başlıca etkeni olan bu organizma ve fikobilinler gibi pigmentlerde de bulunan pirol Dünya'nın diğer bölgeleri ile Amerika Birleşik halkası taşır («»ç>Kısım 17.2 ve Kısım 17.3). Ancak Devletleri'nde ortaya çıkan gatroenterit salgınlaprodigiosinin enerji aktarımında rol oynadığına ait rından da sorumludur. Bu organizma sıklıkla deniz kanıt yoktur ve işlevinin ne olduğu bilinmemektesuyundan ya da kabuklu deniz hayvanlarından dir. Serratia türleri su ve topraktan izole edilebildiği izole edilir. Bunun asıl habitatı muhtemelen deniz gibi, birçok böcek ve omurgalının midesinden, seyhayvanları olup, insanlardaki enfeksiyon ikincil rek olarak da insan bağırsağından izole edilebilir. olarak ortaya çıkmaktadır (öOöKısım 28.1).
356 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
Photobacterium ve Biyoluminesans Gram-negatif, polar kamçılı ve çubuk şeklindeki bazı bakteriler ilginç bir olay olan ışık-yayma özelliğine sahiptir. Bu olay biyoluminesans olarak adlandırılır. Bu bakterilerin çoğu Photobacterium cinsi içinde sınıflandırılmakla birlikte, az sayıda Vibrio izolatı da ışık-yayma özelliğine sahiptir (Şekil 12.28»). Biyoluminesan bakterilerin çoğunun deniz balıkları ile bir arada olduğu bulunmuştur. Bazı balıklar biyoluminesan bakterilerin üreyebileceği özel bir organa sahiptir (Şekil 12.28c-/). Denizlerde yaşayan diğer biyoluminesan bakteriler, ölü balıklar üzerinde saprofitik olarak bulunur ve ender olarak balık üzerinde gözle görülebilen koloniler oluşturur. (Biyoluminsansı görmek için, örneğimizi tamamen karanlık bir odada gözlerimiz karanlığa alıştıktan sonra incelememiz gerekir, Şekil 12.28a,b).
Photobacterium izolatları fakültatif aerob olmalarına rağmen ancak O2 varlığında ışık yayabilirler. Biyoluminesans için bir kaç bileşene gereksinim vardır. Bunlar, lusiferaz enzimi ve uzun-zincirli alifatik bir aldehit (örneğin dodekanaD'tir. İndirgenmiş flavin mononükleotit (FMNH,) ve O, de biyoluminesans için gereklidir. İlk elektron vericisi NADH olup, elektronlar lusiferazdan aşağıdaki yolla akar: FMNH2 + O2 + RCHO lusiferaz FMN + RCOOH + H 2 O + Işık
(d)
Işık-üretici sistem elektronların FMNH2 üzerinden O2'e akışını, kinon ve sitokromların yer almadığı yan bir yol üzerinden sağlar. Biyoluminesansın Denetlenmesi Lusiferaz enzimi, otoindüksiyon denilen kendine özgü bir sentez denetimine sahiptir. Bu tip ışıma gösteren bakteriler üreme sırasında, kültür ortamında birikmeye başlayan ve otoindükleyici denilen özgül bir organik molekül oluştururlar. Bu maddenin miktarı belirli bir düzeye eriştiğinde lusiferaz indüksiyonu ortaya çıkar. Vibrio fisheri'de bu otoindükleyicinin N-/3-ketokaproyil homoserin lakton olduğu gösterilmiştir. Işıma gösteren bakterilerde üreme yoğunluğu düşük iken ışıma olmaz. Işıma olabilmesi için, otoindükleyicinin birikerek işlevsel olmasını sağlayacak düzeyde üreme olması gerekir. Bu mekanizma, yoğunluk-bağımlı doğasından dolayı yeterli-çoğunluk algılaması (quorum sensing) olarak adlandırılır (
(e)
• Şekil 12.28 Biyoluminisan bakteriler ve ışık çıkaran balıklarda ışık organı olarak görevleri, (a) İki petri plağındaki ışık çıkaran bakterilerin kendi ürettikleri ışıkla fotoğraflan çekilmiştir. Farklı renklere dikkat ediniz.Soldaki, mavi ışıklı Vibrio fischeri MJ-1 susu; sağdaki yeşil ışıklı ise V. fischeri Y-l suşudur. (b) Kendi ışıklarıyla fotoğraflan çekilmiş Photobacterium kolonileri, (c) Işık yayan (flashlight) balık Photoblepharon palpebratus; parlak olan, biyoluminisan bakterilerin bulunduğu ışık organıdır, (d) Kendi çıkardığı ışık ile fotoğrafı çekilmiş aynı balık, (e) Eilat Körfezi'ndeki mercan resiflerinde P. palbebratus' un gece çekilmiş sualtı fotoğraflan. (f) P. palbebratus'ta ışık yayan organa ait ince kesitin elektron mikrografı; biyoluminisan bakterilerin yoğun dizilişlini göstermektedir, (oklar)
12.13 • Rikettsia • 357
ki bakteri popülasyonunun görülebilir bir ışıma oluşturacak yoğunluğa ulaşmasıyla mümkün olur. Biyoluminesansm deneysel bir model olarak kullanılmasıyla yeterli-çoğunluk algılamanın genetiği büyük ölçüde açıklık kazanmıştır. Bu denetim şekli sadece biyoluminesan bakterilerle sınırlı olmayıp, çok sayıda farklı bakterideki birçok olgunun düzenlenmesinde de belirli bir minimum hücre yoğunluğuna (yeterli sayı) gereksinim vardır (^«sKısım 8.10). r~MW 12.11-12.12 Kavramların Gözden Geçirilmesi Enterik bakteriler tıbbi ve moleküler biyolojik açıdan önemi olan, fakültatif aerobik basilleri içeren büyük bir gruptur. Vibrio ve Photolmcterium türleri sucul organizmalardır; bazı türler biyoluminesan iken bazı türler patojeniktir. • Escherichia coli fizyolojik olarak Enterobacter aerogenes'ten nasıl ayırt edilir? • Proteus türlerini diğer enterik bakterilerden ayıran iki önemli özelliğini belirtiniz. • Photobacterium gibi bir bakteri için görülebilir ışık yaymanın önemi nedir?
Rikettsia
• Şekil 12.29 Konak hücreler içinde gelişen Riccketsia. (a) Tarla faresi Microtus pennsylvanicus'un tunica vaginalis hücrelerindeki Riccketsia hckettsii. (b) Bir böcek olan konağı Melollontha meloloantha'nm kan hücreleri içindeki Rickettsiella popillia hücrelerinin elektron mikrografı. Bu bakteriler konak hücrenin vakuolü içinde çoğalırlar.
Anahtar Cinsler: Rickettsia, VVölbachia
Rikettsiyalar, eni 0.3-0.7 fim, boyu ise 1-2 fim arasında değişen, küçük, gram-negatif, küresel veya çubuk şeklinde Proteobacteria'dır. Bir istisna hariç tümü zorunlu hücre-içi paraziti (Şekil 12.29a •) olup, konakçı hücreleri olmadan üretilmeleri mümkün olmamıştır. Riketsiyalar insanlarda tifüs, Kayalık dağlar (Rocky Mountain) ateşi ve Q ateşi gibi değişik hastalıklarının etkenleridir (c^oKısım 27.3). Riketsiyaların ince kesit elektron mikrograflarında bu hücrelerin hücre duvarı ve hücre zarına sahip oldukları ve bu açıdan normal bakteri morfolojisi taşıdıkları açıkça gösterilmiştir (Şekil 12.2%). Hücre duvarı muramik asit ve diaminopimelik asit içermektedir. Riketsiyalarda hem RNA hem de DNA bulunur ve ikiye bölünerek ürerler. İkilenme zamanı yaklaşık 8 saattir. Bir riketsiya hücresinin konakçı hücreye girmesi aktif bir süreç olup, hem konakçının hem de parazitin canlı ve metabolik olarak aktif olmasını gerektirir. Fagositik konakçı hücre içine giren bakteri öncelikle sitoplazma içinde çoğalmaya başlar ve konakçı hücre iyice parazitle dolana kadar çoğalmasının sürdürür (Şekil 12.29 ve 27.3). Daha sonra konakçı hücre patlar ve içindeki bakteriler çevredeki sıvıya salınır. Riketsiyaların birçok cinsi bilinmektedir. Dört önemli reketsiya cinsinin özellikleri Tablo 12.17'de görülmektedir.
Metabolizma ve Patojenite Riketsiyaların neden zorunlu hücre-içi parazitleri olduklarını açıklamak üzere metabolik aktiviteleri ve biyokimyasal yolları üzerinde pek çok araştırma yapılmıştır. Riketsiyaların çoğu yüksek özgüllük taşıyan bir enerji metabolizmasına sahiptir. Şöyle ki, glukoz ya da organik asitleri oksitleyemezler; sadece glutamat ya da glutamini okside edebilirler. Ancak, Q ateşinin etkeni olan Coxiella burnetii hem glukozu hem de piruvatı elektron vericisi olarak kullanma yeteneğindedir. Riketsiyalar sitokromların tümünü içeren elektron taşıma zincirine sahiptir ve NADH'nın elektron vericisi olarak kullanılmasıyla, elektron taşınmasına bağlı fosforilasyon yaparlar. Makromolekül sentezi ve üreme için gerekli olan bazı küçük molekülleri sentezleyebilirler. Ancak diğer besinlerini konakçı hücreden sağlarlar. Dolayısıyla, parazit olmalarına rağmen birçok metabolik işlevi bağımsız olarak sürdürmektedirler. Riketsiyalar konaklarının dışında uzun süre canlı kalamazlar. Bu durum hayvandan hayvana neden artropod vektörler aracılığı ile geçtiklerini açıklar. Arthropod, hastalık taşıyan bir omurgalıdan kan emdiğinde kanda bulunan riketsiyalar doğrudan artropoda geçer ve onun mide-bağırsak kanalındaki epitel hücrelerin içine girerek çoğa-
358 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
Riketsiyaların Özellikleri
Tablo 12.17 Cins ve
Ara
Tür
Riketsiya grubu
Rickettsia R. rickettsii
Lekeli humma
Kene
R. proıvazekii' R. typhi
Tifüs Tifüs
Rochalimaea R. quintana R. vinsonn Coxiella C. bıırnetü Ehrlichia E. chaffensis E. equi Wolbachiad W. pipientis
konak
Hücresel
Yerleşim
DNA (mol % GC)
Filogenetik a grup
H. rickettsii DNA'sı ile hibridizasyonu
32-33
Bit Pire
Sitoplazma ve nükleus Sitoplazma Sitoplazma
Trenç humması —
Bit Tarla faresi
Hücre yüzeyi Hücre yüzeyi
39 39
Alfa
30 30
Q humması
Kene
Vakuoller
43
Gama
—
Erlikiyozis (insanlarda) Kene veya Potamak humma evcil (atlarda) hayvanlar
Tek çekirdekli lokositler
— —
Alfa Alfa
— —
—
Sitoplazma
30
Alfa
—
Eklem bacaklılar
Alfa
29-30 29-30
100 53 36
"Tamamı proteobacteria'dir. ''DNA: DNA hibridizasyonun açıklaması için Bölüm 11.4t' bakınız. ' Bu organizmanın genom dizisi çıkarılmıştır ve mitokondrial genomla çok sayıda benzerlikler göstermektedir. 11 İnsan veya diğer hayvanlar için patojen değildir.
lir, daha sonra dışkıda gözlenir. Artropod hasta olmayan bir birey üzerinde beslendiğinde, ya ağız parçaları ile ya da ısırdığı yeri dışkısıyla kontamine ederek riketsiyaları sağlıklı bireye bulaştırır. C. burnetii ise (öCfeKısım 27.3) solunum sistemi aracılığı ile de bulaşır. Spor benzeri dirençli bir yapı oluşturan C. burnetii, fiziksel tahribata en dirençli riketsiya üyesidir. C. burnetü'mn bu özelliği, havada nasıl canlı kalabildiğini açıklayabilir. Rochalimaea zorunlu hücre-içi paraziti olmayan ve bu nedenle de kültür ortamında üretilebilen atipik bir riketsiyadır. Ayrıca doku kültüründe üretildiğinde, ökaryotik hücrelerin sitoplazma ya da çekirdek içinde değil hücre yüzeyinde çoğalır. Rochalimaea quintana siper ateşi adı verilen hastalığa neden olur. Bu hastalık I. Dünya Savaşı sırasında askeri birliklerde çok sayıda ölüme neden olmuştur. Ehrlichia türleri insan ve hayvanlarda hastalığa neden olur. İnsanlardaki ehrlichiosis ve atlardaki potomac ateşi oldukça tahripkâr iki hastalıktır (o^s Kısım 27.3).
çoğalarak kolonize olur (Şekil 12.30). W. pipientis hücreleri, enfekte olmuş dişi yumurtaları aracılığıyla yavrulara aktarılır. Birçok yabanarısı türünde VVolbachia'nu\ uyardığı partenogenez gerçekleşir. Bu böceklerde, erkekler döllenmemiş yumurtalardan (kromozomların bir setini içeren) normal gelişim gösterirken, dişiler döllenmiş yumurtalardan (kromozomların iki setini içeren) oluşur. Ancak döllenmemiş bir yumurta VVolbachia ile enfekte olursa, bu organizma bir şekilde kromozom sayısının ikiye katlanmasını tetikleyerek sadece dişi bireylerin oluşmasına neden olur. Eğer dişi böcekler VVolbachia''yi öldüren antibiyotiklerle beslenirse partenogenezin sona ereceği tahmin edilebilir. Bir VVolbachia türü bazı tesbihböceklerinde (pillbugs) erkeklerin dişilere dönüşmesine neden
Wolbachia Wolbachia cinsi alfa Proteobacteria içinde yer alan ve böceklerde hücre-içi paraziti olan çubuk şekilli türleri içerir (Şekil 12.30*). Filogenetik olarak riketsiyalara çok yakın olan VVolbachia bunların böcek konakçılarını da çeşitli şekillerde etkileyebilir. Bu etkiler arasında partenogenez (döllenmemiş yumurtaların gelişimi) indüksiyonu, erkek bireyleri öldürme ve dişileştirme (erkek böceklerin dişilere dönüşümü) bulunur. Wolbachia pipientis bu cinsin en çok çalışılmış türüdür. Bu organizmanın hücreleri böcek yumurtası içindeki zarla çevrili kofullar (vakuol) içinde
• Şekil 12.30 Wolbachia. Parlenogeneze neden olan VVolbachia pipientis üe enfekte olmuş parazitoid Trichogramma kaykai'nin 4',6 diamine-2' fenilin doldihidroklorit ile boyanmış yumurtasının fotomikrografı.
12,14 • Spirilla • 359
olmaktadır. VVolbachia enfeksiyonu bu organizmaların erkeklik hormonu üreten bezlerini tahrip etmektedir. Uğurböcekği ve kelebekler gibi bazı böceklerde, Wolbachia enfeksiyonu her nasılsa sadece erkek yavruların ölümüne neden olduğu halde, dişi yavrulara bir şey olmaz. Bütün bu üreme bozukluklarına ek olarak, bazı böceklerdeki VVolbachia enfeksiyonları hayatta kalabilmek için hayati önem taşır. Örneğin, fil hastalığı (elefantiyazis) ve nehir körlüğü etkeni olan yuvarlak solucanları öldürmek için kullanılan antibiyotikler, bunların VVolbachia simbiyontlarım öldürdüğü için etkilidir. Genellikle bütün parazitik prokaryotlar gibi W. pipientis de dizilimi yakın zamanda ortaya çıkarılmış olan küçük bir genoma (yaklaşık 1.5 Mbp) sahiptir. Bu parazit ne omurgalılarda ne de omurgasız konakçılarında hastalığa neden olur. Bununla birlikte, üreme üzerindeki çeşitli etkileri nedeniyle büyük bir böcek sınıfının (bilinen böceklerin %70'ni arthropodlar oluşturur) evrimi ve türleşmesinde ne ölçüde etkili olduğuna ilişkin ilginç bir soruya yol açmaktadır. VVolbachia ile böcekler arasındaki ortaklık o kadar yaygındır ki, üreme üzerindeki etkiler gerçek bir VVolbachia -böcek simbiyozisi karşısında ikinci derecede önem taşır. Böcekleri enfekte eden VVolbachia hücreleri, kendilerine hem hazır besin kaynağı hem de korunmuş bir çevre sağlarlar. Üstelik, böceklerin de bu ortaklıktan henüz bilinmeyen bir yolla yarar sağlama ihtimali vardır.
•
Spirilla Anahtar Cinsler: Spirillum, Bdellovibrio, Campylobacter Spirilla gram-negatif, hareketli, spiral şekilli ve çeşitli fizyolojik özellikler gösteren Proteobacteria'dır. Hücre şekli, büyüklüğü, polar kamçının tipi (tek veya çok), oksijenle ilişkisi (zorunlu aerob, mikroaerofilik, fakültatif), bitkilerle ilişkisi (simbiyont veya bitki patojeni olarak), hayvanlarla ilişkisi (patojen olarak), fermentatif yetenekleri ve diğer fizyolojik (azot fikse etme yetenekleri, halofiîik ya da termofilik nitelikleri) özellikleri gibi bazı önemli taksonomik kriterler kullanılarak sınıflandırılırlar. Burada sözü edilen cinsler Tablo 12.18'de verilmiştir. Tabloda da görülebileceği gibi, spirilla cinsleri Proteobactera'nm beş altdiviziyosunun her birinde bulunmaktadır. Spirillum, Aquaspirillum, Oceanospiriüum ve Azospirillum Bunlar sarmal kıvrımlı basiller olup, her iki uçta kümelenen polar kamçılar ile hareket ederler (Şekil 12.31fr«). Sarmaldaki dönüş sayısı bir tam turdan az olabildiği gibi (bu durumda organizma bir vibrio'ya benzer) çok fazla da olabilir. Çok sayıda kıvrım içeren spirilla görünüşte spiroketlere benzer (Sekili 2.33), ancak filogenetik olarak kesinlikle onlardan farklıdır. Ayrıca spirillanm, spiroketlerdeki gibi bir dış kılıfı ve iç kamçısı yoktur; bunun yerine tipik bir bakteriyal kamçısı vardır. Bazı spirillalar çok büyük bakteriler olduklarından ilk mikroskobistler tarafından gözlenmiştir. Bu nedenle bir Spirillum türünün ilk kez gözlem-
12.13 Kavramların Çözden Geçirilmesi Riketsiyalar çoğu hastalık etkeni olan, zorunlu hücre içi parazitidirler. Riketsiyalar birçok metabolik özellikten yoksundurlar ve gerekli metabolitleri konaklarından alırlar. •
Bir Rickettsia türünün söyleyiniz.
•
"Zorunlu hücre içi paraziti" terimi ile ne anlatılmaktadır?
Tablo 12.18
Wolbachia'mn kendi böcek konakları üzerinde ne gibi etkileri olabilir?
neden olduğu bir hastalık adı
3
Spiral şekilli bakteri cinslerinin özellikleri
Cins
Filogenetik Grup
Özellikleri
Spirillum Aquaspirillum Munyetospirillıım
Beta Alfa veya beta Alfa
Ocetmospirillum
Gama
Azospirillum
Alfa
Herbaspirillum
Beta
Campylobacter
Epsilon
Helicobacler
Epsilon
Bdellovibrio
Delta
Ancyclobacter
Alfa
Hücre çapı 1,7 /um; mikroaerofilik; tatlısuda Hücre çapı 0,2-1,5 /un; aerobik; tatlısuda Vibrio'dan spirilluma çeşitli şekillerde; hücre çapı yaklaşık 0,3 /xm; magetosomları içerir; mikroaerofilik Hücre çapı 0,3-1,2 /un; aerobik; denizde (%3 NaCl'ye ihtiyaç duyar) Hücre çapı 1 /im; mikroaerofilik; toprak ve rizosferde; Nj fikse eder Hücre çapı 0,6-0,7 (im; mikroaerofilik; toprak ve rizosferde; N, fikse eder Hücre çapı 0,2-0,8 /um; mikroaerofilik veya anaerobik; insan ve hayvanlara patojenik veya kommensal; tek polar kamçılı Hücre çapı 0,5-1 /un; püskül şeklinde polar kamçı; insanlarda pilorik ülserle ilişkili Hücre çapı 0,25-0,4 /im; aerobik; diğer bakteriler üzeride predatör; tek, kılıflı polar kamçılı Hücre çapı 0,5 pm halka oluşturan kıvrık basiller; hareketsiz; aerobik; bazen gaz veziküllü
" Hepsi gram-negatif ve solunumsal ancak asla fermentatif değil
DNA (mol % GC) 36-38 49-66 65 42-51 68-70 66-67 30-38
36-38 33-52 66-69
360 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
Küçük çapa sahip spirilla (mikroaerofilik olmayan) Aquaspirillum ve Oceanospirillum olmak üzere
iki büyük cinse ayrılır. İlk grup tatlı suda yaşayan türleri içerirken, ikincisi deniz suyunda bulunan ve gelişmek için NaCl gereksinen türleri içerir (Tablo 12.18). Çok sayıda
Aquaspirillum ve Oceanospiril-
lum türü tanımlanmış olup, değişik türler birbirlerinden fizyolojik ve filogenetik kıstaslar temel alınarak ayrılmaktadır. Bu organizmaların sucul ortamlardaki organik madde döngüsünde önemli rol oynadıkları kuşkusuzdur. Manyetotaktik Spirilla
• Şekil 12.31 Spirilla. (a) Karanlık alan mikroskobuyla görüntülenmiş Spirillum volutans; kamçı tutamlan ve volutin(polifosfat) kürecikleri görülmektedir. Hücreler yaklaşık 1,5 X 25 /um boyutlanndadır. (b) Sindirim sistemi spirillumu. Hücrenin kutuplarındaki kamçı kümelerine ve hücrenin spiral yapısına dikkat ediniz, (c) Ancylobacter aquaticus hücrelerinin tarayıcı elektron mikroskobu görüntüsü. Hücreler yaklaşık 0,5 /um çapındadır.
lenmesi muhtemelen 1670'lerde Antoni van Leeuwenhoek (cösKısım 1.5), cins olarak tanımlanması ise 1832'de Alman protozoolog Ehrenberg tarafından gerçekleştirilmiştir. Bu araştırıcılar tarafından görülen bu organizma günümüzde Spirillum volutans adı verilen oldukça büyük bir bakteridir (Şekil 12.31a). Fototrofik bir organizma olan Thiospirillum (Şekil 12.4b) S. volutans'a benzer. Mikroaerofil olan S. volutans, O2'ne gereksinim duymakla beraber, normal O2 düzeyinde inhibe olur. S. volutans hücrelerinin bir diğer önemli özelliği polifosfat yapısında granüller (volutin granülleri) oluşturmalarıdır (Şekil 12.31a ve Kısım 4.11). Azospirillum lipoferum azot fikse eden bir organizma olup, ilk olarak Beijerinck tarafından 1922'de tanımlanmış ve Spirillum lipoferum olarak adlandırılmıştır. A. lipoferum tropikal otlar ve tarımı yapılan tahıllarla kurduğu simbiyotik ilişki nedeniyle oldukça ilgi çeker. Her ne kadar baklagiller ile bunların kök nodüllerindeki bakteriler (c^Kısım 19.22) arasındaki kadar çok yakın ilişkileri olmasa da, A. lipoferum/'mısır arasındaki ortaklıkta da mısırın azot fiksasyonundan yararlandığı açıktır.
Çok hareketli, mikroaerofilik manyetik spirilla tatlı su habitatlarından izole edilmiştir. Bu organizmalar manyetik alanda belirgin bir yönelme hareketi gösterirler. Bu olay manyetotaksis olarak adlandırılır. Yapay bir manyetik alana yerleştirilen manyetik spirilla uzun eksenini manyetik alanın kuzey-güney doğrultusunda yönlendirir. Hücre içinde zincir şeklinde yerleşmiş 5-40 adet manyetik partikülden oluşan ve manyetozom adı verilen bir yapı bulunur. Bu yapı manyetit (Fe3O4) ve greigit (Fe3S4) içerir (ö^öKısım 4.11 ve Şekil 4.42). Manyetozomlar hücreleri özel bir manyetik alanda konumlandıran iç mıknatıslar gibi işlev görür. Manyetik bakteriler manyetozomların hücre içindeki konumuna bağlı olarak, iki manyetik polariteden birine sahiptir. Kuzey Yarıküre'deki hücreler kuzeye-yönelen polariteye sahiptir ve bunlar kamçıları aracılığı ile kuzey yönünde hareket ederler. Güney Yarıküre'deki hücreler ise zıt polariteye sahip olduklarından, hareket yönü güneye doğrudur. Bakteriyal mıknatısların ekolojik rolleri tam olarak bilinmese de, manyetik alandaki yönelme yetenekleri, bu mikroaerofilik organizmaların O2 konsantrasyonun düşük olduğu oksijenli/oksijensiz ara yüzeye yakın zonlarda kalabilmeleri için seçici bir avantaj olabilir. Manyetospirillum manyetotacticum (Şekil 12.32* ve Tablo 12.18) bu gruptaki en önemli organizmalardan biridir. Bdeüovibrio Bu küçük vibroid organizmalar diğer bakterileri avlayarak, konak hücrenin sitoplazmik içeriğini besin olarak kullanmasıyla alışılmışın dışında bir özellik sergiler. Bu bakteriyal avcılar (predatörler) küçük ve çok hareketli hücreler olup, avlanacakları hücrelerin yüzeyine yapışır. Bundan dolayı bunlara Bdellovibrio ismi verilmiştir (bdello 'sülük' anlamına gelen bir önektir). Başka predatör bakteriler de izole edilmiş ve bunlara da örneğin Vampirococcus gibi cins isimleri verilmiştir. Ancak, Bdellovibrio kendine özgü saldırı şekli ve periplazma içinde gelişimi ile benzersizdir. Bdellovibrio hücresi avına tutunduktan sonra, avcı avının hücre duvarından içeriye girer ve periplazmik boşlukta çoğalmaya başlar. Sonuçta bdelloplast denilen küresel bir yapı oluşur. Tutun-
12.14 • Spirilla • 361
•
' -
-•»*
• Şekil 12.32 Manyetotafctik sprillum Manyetospirillum manyetotacticum'un negatif boyanmış elektron mikrografı. Bir hücre 0,3 X 2 ,u,m boyutlanndadır.Bu bakteri zincir şeklinde yerleşmiş manyetozom (<5^>Şekil 4.42) denilen Fe3O4 (manyetit) parçacıkları içerir; bu parçacıklar hücrelerin jeomanyetik çizgiler boyunca sıraya dizilmesini sağlar.
ma ve penetrasyon safhalarının elektron mikrografları Şekil 12.33*'te, şematik gösterimleri ise Şekil 12.34»'te görülmektedir. Birçok gram-negatif Bacteria bir tek Bdellovibrio türünün saldırısına uğrayabilir; gram-pozitif bakteriler ise saldırıya uğramaz. Bdellovibrio zorunlu aerob olup enerjisini amino asitlerin ve asetatın oksidasyonundan sağlamasının yanı sıra nükleotitleri, yağ asitlerini, peptidleri ve hatta bütün haldeki proteinleri parçalamaksızın doğrudan konakçıdan özümseyebilir. Bu avcılık şekli Bdellovibrio'da ilginç ve alışılmışın dışında biyokimyasal süreçlerin ortaya çıkmasıyla ilişkilidir. Avcı hayat şekline ek olarak, avcı olmayan
Bdellovibrio suşları da izole edilmiş ve avcılığın (predasyonun) zorunlu olmadığı gösterilmiştir. Avcı olmayan suşlar maya özütü ve pepton içeren kompleks besi ortamlarında üretilebilir. Bdellovibrio filogenetik olarak Proteobacteria'nm delta altdiviziyosunda yer alır (Şekil 12.1) ve E.coli genomunun yarısı kadar büyüklükte bir genoma sahiptir. Taksonomik olarak iki Bdellovibrio türü ve Bacteriovomx cinsine bağlı bir tür tanımlanmış olup, genomik DNA:DNA hibridizasyonu bu sonuçlan desteklemiştir («^^sKısım 11.11). Bdellovibrio cinsi üyeleri toprak ve suda (denizler dahil) yaygın olarak bulunur. Bunların araştırılması ve izolasyonu için bakteriyal virüs çalışmalarında kullanılan yöntemlere benzeyen yöntemler gereklidir (c»öKısım 9.4). Av olan bakteri ağar plakları üzerinde çayır oluşturacak şekilde yayılır ve yüzey membran filtreden geçirilmiş az bir miktar toprak süspansiyonu ile inoküle edilir. Membran filtre birçok bakteriyi alıkoyar ve sadece küçük Bdellovibrio hücrelerinin geçmesine izin verir. İnkübasyon sonucunda ağar plaklarının yüzeyinde Bdellovibrio hücrelerinin ürediği yerlerde bakteriyofaj plaklarına benzer plaklar oluşur. Ancak faj plaklarından farklı olarak, bakteriyal konakçı ürediği sürece, hatta avın üremesi sona erdikten sonra bile, Bdellovibrio plakları büyümeye devam eder. Bu durum ağar yüzeyinde sürekli büyüyen plaklarla sonuçlanır. Bdellovibrio'mın saf kültürü bu plaklardan elde edilebilir. Bdellovibrio kültürleri çok çeşitli tipteki toprak örneklerinden elde edilmiş olup, toprak popülasyonunun yaygın üyeleridir. Ancyclobacter Ancyclobacter cinsi üyeleri halka-şekilli, çok farklı besinleri kullanabilen, hareketsiz, kemoorganotrofik bakterilerdir (Şekil 12.31c). Çok sıkı kıvrımlar içeren vibriolara benzerler ve sucul ortamlarda yaygın olarak bulunurlar. Ancyclobacter'in fototrofik karşılığı mor kükürtsüz bakteri olan Rhodocyclus purpureu'dur (Şekil 12.6e).
• Şekil 12.33 Bdellovibrio tarafından yakalanan av hücrenin yapışma ve içeri alınma aşamaları. Bdellovibrio hücresi yaklaşık yaklaşık 0,3 fim çapındadır. (a,b) Echerichia coli'ye saldıran Bdellovibrio'ya ait ince kesitin elektron mikrografı. (a) Erken içeri girme (b) tam içeri girme. Bdellovibrio hücresi av hücrenin içinde oluşan zar bir kesenin içinde kapalıdır (bdelloblast) ve zar ile duvar arasındaki periplazmik boşlukta çoğalır.
362 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
Campylobacter türleri (çoğunlukla) kanlı ishale yol açan akut bağırsak iltihabına neden olur ve patojenite birçok etmene bağlı olarak gelişir. Bu etmenler arasında kolera toksinine benzeyen enterotoksin de vardır (0°öKısım 21.11). Helicobacter pylori, Campylobacter türleriyle yakın akraba olup, akut ve kronik mide iltihaplarına ve bunun ilerlemesiyle peptik ülserlere neden olur. Campylobacter
ve Helicobacter'in neden olduğu hastalıklar, bulaşma yollan ve klinik belirtileri Kısım 29.9'da daha ayrıntılı olarak tartışılacaktır. Projenin salınması
12.14 Avın parçalanması (2.5-4 saat tutunma sonrası)
r
Bdellovibrio
Sucul ortamlarda yaygın olarak bulunan spirillumlar, spiral şekilli kemoorganotrofik prokaryotlardır. Helicobacter ve Campylobacter cinsleri patojenik spirillumlardır. Spirillumlar Proteobakteria'nm beş alt bölümüne de yayılmış durumdadır. • Volutin granulü nedir? • Sadece Bdellovibrio ve Manyetospirullum'a ait olan özellik nedir?
' Bdellovibrio'nun bdelloplast içinde incelip uzanması
Tutunma
12.15
40-60 dk
(b)
Kavramların Gözden Geçirilmesi
5-20 dk
. . . İçine girme
• Av periplazmik boşluğu
• Şekil 12.34 Bakteri avcısı Bdellovibrio bacteriovorus'un gelişim döngüsü, (a) Bdellovibrio bacteriovorus hücrelerinin elektron mikrografı. Bu organizmalardaki oldukça kalın kamçıya dikkat ediniz («»SŞekil 4.54). (b) Avlanma sırasındaki olaylar. Çok hareketli Bdellovibrio hücresi ile gram-negatif bakterinin ilk temasından sonra yapışma ve avın periplazmik boşluğu içine girme gerçekleşir. İçeride ilk önce Bdellovibrio hücreleri uzar ve 4 saat içinde progeni hücreleri salınır. Salman progeni hücrelerinin sayısı av bakterinin büyüklüğüne göre değişir. Örneğin enfekte bir Echerichia coli hücresinden 5-6 Bdellovibrio salınırken, Aquaspihllum sp. gibi daha büyük bir hücreden 20-30 tane salınır.
Campylobacterve Hclicobactcr Bu iki cins Proteobacteria'nın epsilon altdiviziyosunun önemli temsilcileridir. Gram-negatif, hareketli spirilla olup, çoğu türleri insan ya da diğer hayvanlarda patojeniktir. Campylobacter ve Helicobacter'in
ikisi de mikroaerofilik olup, klinik örneklerin düşük O2(%3-15) ve yüksek CO2 (%3-10) varlığında inkübe edilmesiyle üretilirler.
Kılıflı Proteobacteria: Sphaerotüus ve Leptothrix
Anahtar Cinsler: Sphaerotilus, Leptothrhc Kılıflı bakteriler, kamçılı hücrelerin kümeler halinde uzun bir tüp ya da kılıf içinde dizilmesiyle kendilerine özgü hayat döngüleri olan filamentöz beta Proteobacteria'dır (Tablo 12.1). Belirli koşullar (genellikle istenmeyen) altında küme halindeki hücreler, arkalarında boş bir kılıf bırakarak dışarıya çıkar ve yeni çevreye yayılırlar. Uygun koşullar altında filament içinde vejetatif üreme gerçekleşir ve içleri hücre dolu uzun kılıflar oluşur. Kılıflı bakteriler, kirlenmiş akarsular gibi organik madde açısından zengin tatlısu habitatlarında yaygındır. Ayrıca, atıksu arıtım tesislerinin damla filtrelerinde ve aktif çamur tanklarında da bol miktarda bulunurlar (cö^Kısım 28.2). İndirgenmiş demir ya da manganez bileşiklerinin bulunduğu habitatlarda, kılıflar ferik hidroksit veya manganez oksitle kaplanabilir (ö«5Şekil 17.29). Demir çökelmesi muhtemelen kimyasal tepkimelere bağlıdır. Ancak bazı kılıflı bakterlerin, biyokimyasal olarak mangan iyonlarını manganez okside oksitleme yetenekleri vardır. Burada bu organizmaların önemli iki cinsi incelenecektir: manganez oksidasyonu yapmayan Sphaerotüus ve Mn2+ okside eden Leptothrix üyeleri. Sphaerotilus Sphaerotilus filamenti yuvarlak uçları uç uca eklenmiş çubuk şekilli hücrelerin oluşturduğu bir zincir şeklinde olup, bu zincir kılıf ile kaplanmıştır. İnce ve şeffaf yapıdaki bu kılıf hücrelerle dolu olduğunda zor görülür, ancak kısmen boş olduğunda faz kontrast mikroskop altında (Şekil 12.35a») ya
12.16 « Tomurliculanan ve Prostekalı/Saplı Bacteria da boyanarak rahatça görülebilir. Her bir hücre l-2/xm eninde, 3-8 /u.m boyunda olup gram-negatif boyanır. Kılıf içindeki hücreler ikiye bölünerek çoğalır (Şekil 12.35a) ve yeni oluşan hücreler yeni sentezlenen kılıf materyalinin son kısmına doğru itilirler. Böylece kılıf her zaman flamentin uç kısmında oluşturulur. Sonunda hücreler, muhtemelen besin azalması nedeniyle kılıftan dışarıya salınırlar. Bu serbest hücreler, lofotriş (bir kutupta demet halinde) düzenlenmiş kamçılar aracılığı ile aktif olarak hareket ederler (Şekil 12.35c). Kamçıların sentezi muhtemelen hücreler kılıfı terk etmeden önce gerçekleşir ve bu durum belki de hücrelerin dışarıya çıkmasına yardımcı olur, Bu hücre kümelerinin daha sonra göç edip katı bir yüzeye tutunduğu ve üremeye başlayarak her bir kümenin yeni bir filament için öncü olduğu düşünülmektedir. Peptidoglikan hücre duvarındaki muramik asit ve diğer bileşenlerden yoksun olan bu kılıf protein-
363
polisakkarit-lipid kompleksi halindedir. Bu kılıf doğrusal yapısı nedeniyle birçok gram-negatif bakteri tarafından oluşturulan kapsül yapısından da farklıdır (««»Kısım 4.10). Sphaerotilus kültürleri beslenme açısından çeşitlilik taşır ve inorganik azot bileşiklerini kullanmasının yanı sıra, çeşitli basit organik bileşikleri de karbon ve enerji kaynağı olarak kullanabilir. Habitatları olan akan sulara uygun olarak Sphaerotilus zorunlu aerobtur. Sonbaharda dökülen yaprakların, geçici olarak su içeriğindeki organik madde miktarını artırmasıyla, çoğu zaman nehir ve ırmaklarda Sphaerotilus patlaması gerçekleşir. Kanalizasyon pisliğinin alıcısı olan akarsulardaki kayalar üzerinde bulunan ve atıksu arıtımı ile ilgilenen mühendislerin "lağım fungusu" olarak adlandırdıkları cıvıksı filamentöz yapıdaki mikrobiyal kompleksin ana bileşeni Sphaerotilus filamentleridir. Atık arıtım tesislerindeki aktif çamur (<3»aKısım 28.2) içinde ortaya çıkan Sphaerotilus üremesi Beggiatoa üremesi (<^feKısım 12.4) gibi istenmeyen birikimlerin sorumlusudur. Aktif çamur içindeki Sphaerotilus filamentlerinden oluşan karmaşık kütleler çok arttığında çamurun çökelmesi mümkün olmaz ve bundan dolayı arıtımda zorluklar yaşanır.
Leptothrix Sphaerotilus ve Leptothrix'\n demir oksitleri kendi kılıflarına çöktürme yeteneğine sahip oldukları belirlenmiştir. Demir-kaplı kılıflara sahip bu tip bakteriler genellikle demirce-zengin sularda görülür (Şekil 12.36*). Demir çökelmesi hümik ya da tannik asit gibi organik maddelere kelatlanmış demirin metabolize edilmesiyle gerçekleşir. Demir kılıf üzerinde çökelirken, organik bileşenler karbon ya da enerji kaynağı olarak kullanılır. Leptothrix Fe2+'i okside edebildiği gibi, Mn2+/yi 4+ M 'e oksitleyebilir. i
•=w^*^^s ! ^Ş^i|j^4x>wa^^r-' 8 s (b)
(c)
• Şekil 12.35 Sphaeratilus natans. Tek bir hücre yaklaşık 2 /j.m genişiliğindedir. (a) Kirli bir akarsudan toplanan materyalin faz-kontrast fotomikrografı. Aktif büyüme fazı (üstteki) ve tabakadan ayrılmış çoğalan hücreler, (b) Bir filamente ait ince kesitin elektron mikrografı. (c) Çoğalan bir hücrenin negatif boyanmış elektron mikrografı.Polar kamçı demetine dikkat ediniz.
Mn2+ + 1/2O,
• MnO, + 2H+ AG°'= -68 kj
Mn2+ oksidasyonunun hücre içinde enerji-üreten tepkimelerle eşleştiğine, belki de elektron taşıma işine karıştığına ve proton motive güç oluşturduğuna dair kanıtlar vardır. Leptothrix'te manganez-okside eden proteini kodlayan gen izole edilmiş olup, biyokimyasal çalışmalarla bu proteinin hücre içinde değil, kılıfta yerleştiği gösterilmiştir. Bundan dolayı Leptothrix''in kılıfı bakterinin enerji metabolizmasında kritik bir rol oynar.
12.16
Tomurkculanan ve Prostekalı/ Saplı Bacteria
Anahtar Cinsler: Hyphomicrobium, Caulobacter Alfa Proteobacteria'nın bu büyük ve heterojen grubu saplar, hifler ya da uzantılar şeklinde çeşitli sitoplazmik çıkıntılar oluşturan organizmaları içe-
364 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
oluşur (Şekil 12.38»). Tomurcuklanan bakterilerin önemli cinsleri ve hücre bölünme süreci Şekil 12.38'de gösterilmiştir. Bu bakterilerle bilinen diğer bakteriler arasındaki en temel fark tomurcuk ya da sap oluşumu değil, yeni hücre duvarı materyalinin hücrenin tüm çevresinde (interkalar büyüme) oluşmayıp bir tek uçta (kutupsal büyüme) oluşmasıdır. Normalde tomurcuklanan bakteri olarak kabul edilmeyen birçok bakteri, hücre boyutunda herhangi bir değişiklik olmaksızın kutupsal gelişme gösterir (Şekil 12.38). Kutupsal gelişmenin en önemli sonucu zar kompleksleri gibi iç yapıların hücre bölünmesinde görev almaması ve dolayısıyla interkalar olarak gelişen hücrelere kıyasla daha kompleks iç yapıların oluşumuna izin vermesidir. Tomurcuklanan bakterilerin çoğu, özellikle de fototrofik olanlar, çok miktarda iç zar sistemi içerir. • Şekil 12.36 Lepthothrix ve demir çökelmesi. Ithaca, Newyork'ta bulunan bir bataklıktaki ferromanganez tabakasından alınmış Lepthothrix sp. Örneğine ait ince kesitin transmisyon elektron mikroskobu görüntüsü. Tek bir hücre yaklaşık 0,9 /im çapmdadır.Dış kılıfına dokunan hücre zanndaki kabarıklıklara dikkat ediniz, (ok)
rir (Tablo 12.19). Topluca prosteka olarak adlandırılan ve olgun hücrenin çapından daha küçük çapa sahip olan bu tip çıkıntıların etrafı hücre duvarı ile çevrelenmiş olup, iç kısımda sitoplazma içerirler (Şekil 12.37*). Tomucuklanan bakterilerde hücre bölünmesi eşit olmayan hücre büyümesi sonucunda gerçekleşir. Tipik bir bakteri hücresi ikiye bölündüğünde birbirinin özdeşi iki yavru hücre oluştuğu halde, saplı ve tomurcuklanan bakterilerdeki bölünme sonucunda ana hücre aynı kalır ve yeni bir yavru hücre Tablo 12.19
Tomurcuklanan Bakteriler: Hyphomicrobium Üzerinde çok fazla çalışılmış tomurcuklanan bakterilerden ikisi filogenetik olarak birbirine yakındır. Bunlar, kemoorganotrofik Hyphomicrobium ve fototrofik Rhodomicrobium''dur. Bu organizmalar ince uzun bir hifin son ucundan bir tomurcuk çıkarırlar. Ana hücre sitoplazmasmm doğrudan uzantısı olan hif (Şekil 12.39« ve 12A0b») hücre duvarı, sitoplazmik zar, ribozom ve bazen de DNA içerir. Şekil 12.39 Hyphomicrobium'un üreme sürecini göstermektedir. Çoğu zaman dip tarafından katı bir yüzeye tutunan ana hücre, ince bir çıkıntı oluşturur. Bu çıkıntı uzayarak hif halini alır. Hifin son ucunda bir tomurcuk oluşur. Bu tomurcuk genişleyerek bir kamçı oluşturur ve ana hücreden kopar, yüzerek uzaklaşır. Daha sonra yavru hücre kamçısını kaybeder, belirli bir olgunlaşma süresi sonun-
Saplı, uzantılı (prostekalı) ve tomurcuklanan bakterilerin özellikleri
Özellik Saplı bakteriler: Sap, bir sitoplazma uzantısıdır ve hücre bölünmesine dahil olur, mekik şeklinde hücreler Saplı, mekik şeklinde hücreler Saplı, ancak sap sitoplazma içermeyen dışta oluşan bir üründür; Sap demir depolar; hücre vibroid Lateral olarak oluşmuş dış sap demir depolamaz Uzatılı (prostekalı) bakteriler: Tek veya çift prosteka Çoklu prosteka Kısa prosteka, bölünerek çoğalır, bazılarında gaz kesecikleri var Yassı, yıldız şekilli hüreler, bazılarında gaz kesecikleri var Uzun prosteka, tomurcuklanarak çoğalır, bazılarında gaz kesecikleri var Tomurcuklanan bakteriler: Fototrofik, hif oluşturur Fototrofik, hifsiz tomurcuklanma Kemoorganotrofik, basil şekilli hücreler Kemoorganotrofik, ince uzun hiflerin ucunda tomurcuklar Ana hücreden tek bir hif Ana hücreden çok sayıda hif " Hepsi Proteobacteria'dır
Cins
Filogenetik grup a
DNA (mol% CC)
Caulobacter
Alfa
62-67
Prosthecobacter
Alfa
54-60
Gallionella Nevskia
Beta
Gama
55 60
Asticcacaulis
Alfa
55-61
Prosthecotnicrobium Stella Ancalomicrobium
Alfa Alfa Alfa
64-70 69-74 70-71
Rhodomicrobium Rhodopseudomonas Bhstobacter
Alfa Alfa Alfa
61-63 64-72 59-66
Hyphomicrobium Pedomicrobium
Alfa Alfa
59-65 62-67
12 16 • Tomurkculanan ve ProstekalıfSaplı Bacteria * 365
I. Hücre bölünmesinin eşit ürünleri: İkiye bölünme: normal bakteriler
• Tutunma aleti
II. Hücre bölünmesinin eşit olmayan ürünleri: 1. Basit tomukcuklanma: Pirella, Blastobacter
Prosteka Kamçı (Flajella) \ Çoğalan hücre
(a)
2. Hiften tomurcuklanma: Hyphomicrobium, Rhodomicrobium, Pedomicrobium
9 3. Saplı/prostekalı organizmada hücre bölünmesi: Caulobacter
4. Hücre büyüklüğünde değişiklik olmadan polar bölünme: Rhodopseudomonas, Nitrobacter, Methylosinus
• Şekil 12.38 Hücre bölünmesi. Normal bakteriler ile tomurcuklanan ve saplı bakterilerdeki hücre bölünmesi arasındaki farklılık.
(b)
(c)
• Şekil 12.37 Prostekalı bakteriler, (a) Prostekanın yerini ve yerleşimini gösteren Astıccocaulus biprosthecaum' a ait shadow cast preparatm elektron mikrografı. Hücreler yaklaşık 0,6 fim genişliğindedir. Aynca destek maddeye ve çoğalan hücrenin ayrılma sürecine dikkat ediniz, (b) Prostekalı bakteri Acalomicrobium adetum'a. ait negatif boyanmış preparatının elektron mikrografı. Uzantılar hücreseldir (prosteka); Çünkü hücre duvarıyla bağlıdırlar ve Sitoplazma içerirler. Aynca yaklaşık 0,2 /um çapındadırlar. (c) Yıldız şekilli bakteri Stella'mn elektron mikrografı. Hücreler 0,8 (im çapındadır.
da hif oluşturur ve tomurcuklanır. Ana hücrenin hif ucunda ilave tomurcuklar oluşabilir. Böylece hiflerle birbirine bağlı ışın görünümünde hücreler ortaya çıkar (Şekil 12.40a). Bazı durumlarda tomurcuk hif oluşumuna gerek olmadan doğrudan ana hücreden oluşurken, bazı hallerde tek bir hücre her ucundan hif oluşturur (Şekil 12.40a). Tomurcuklanma döngüsü sırasındaki nükleoid replikasyonu da ilginçtir (Şekil 12.39). Öncelikle ana hücredeki DNA kopyalanır. Daha sonra tomurcuk oluştuğunda halkasal kromozomun bir kopyası hif boyunca hareket ederek tomurcuk içine girer. Bunu takiben septum oluşur ve gelişmeye devam etmekte olan tomurcuğu hif ve ana hücreden ayırır. Hyphomicrobium metilotrofik bir bakteri olup, tatlı su, deniz ve kara habitatlarmda yaygındır (Kısım 12.6). Metanol, metilamin, formaldehit ve format gibi tek karbonlu karbon bileşiklerini tercih eder. Zenginleştirilmiş Hyphomicrobium kültürleri bu organizmanın çok sulandırılmış koşullarda bile üreyebilme yeteneğinden yararlanılarak hazırlanabilir. Yapılması gereken tek şey, organik karbon ve azot içermeyen bir mineral tuz ortamı hazırlamak ve bu ortama toprak, çamur ya da su örneklerinden ekim yapmaktır. Bir kaç haftalık inkübasyondan sonra yüzeyde bir film ortaya çıkar ve tek karbon kaynağı olarak metilamin ya da metanol içeren ağar besiyeri üzerinde yayılır. Oluşan kolonilerin mikroskobik incelemesi ile karakteristik Hyphomicrobium hücre morfolojisi araştırılır (Şekil 12.40). Hyphomicrobium için oldukça özgül olan zenginleştirme prosedürü metanolün elektron vericisi, nitratın da elektron alıcısı olduğu oksijensiz koşul-
366 • Bolüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria DNA Ana hücre
Hif
Hif uzar, DNA eplikasyonu olur
Kromozomunkopyası tomurcuğa girer Tomurcuk
Cross septum çapraz bölme oluşumu
• Şekil 12.40 Hypomicrobium'un morfolojisi, (a) Hypomicrobium hücrelerinin faz mikrografı. Hücreler yaklaşık 0,7 fim çapındadır. (b)Tek bir Hypomicrobium hücresine ait ince kesitin elektron mikrografı. Hif yaklaşık 0,2 fim genişliğindedir. Hareketli yavru olgunlaşır (uzar)
Ana hücredeki DNA tekrar replike olur
Tekrar lif
* Şekil 12.39 Hypomicrobium'un hücre döngüsündeki aşamalar. Hypomicrobium'un tek kromozomu halkasaldır.
lardır. Metanol kullanarak denitrifikasyon yapan (oooKısım 17.14) tek organizma Hyphomicrobium olduğu için bu prosedür çok çeşitli ortamlardan bu organizmanın seçilmesini mümkün kılar. Prostekah ve Saplı Bakteriler Prostekah ve saplı bakteriler (Şekil 12.37 ve 12.41 •) uzantıları olan kemoorganotrofik aeroblar olup, sucul habitatlardaki tanecikli maddelere, bitki materyallerine ya da diğer mikroorganizmalara tutunurlar. Bu uzantıların temel işlevi tutunmayı sağlamak olmakla birlikte, bunun yanı sıra hücrelerin yüzey-hacim oranının önemli ölçüde artmasına da yardımcı olurlar (prostekanm yüzey alanları geniş olmasına karşılık hemen hemen hiç hacmi
yoktur). Bölüm 4'ten hatırlanacağı gibi, bakteriler gibi küçük hücrelerin yüksek yüzey-hacim oranına sahip olması onların besin alma ve atıkları atma yeteneğini artırır. Uzantılara sahip bu bakterilerin alışılmadık morfolojisi (Şekil 12.37) evrimsel bir adaptasyon olabilir. Bu adaptasyon sayesinde yaygın olarak bulundukları oligotrofik (besince fakir) sularda yaşamaları mümkün olabilmiştir. Prostekanın bir başka işlevi sucul ortamlardaki çökme hızlarını azaltmak olabilir. Laboratuvarda prostekah bakterileri santrifüjde çöktürmek için, prostekah olmayanlara oranla daha fazla santrifügal güç gerektiği gösterilmiştir. Batmaya karşı koymak için olan bu doğal eğilim, muhtemelen prostekaya bağlı olup, prostekah hücrelere doğal ortamlarında avantaj sağlayabilir. Bu organizmalar genelde zorunlu aerob olduklarından, prosteka bu hücreleri sediment içine batmaktan ve solunum yapmanın olanaksız olduğu oksijensiz bölgeye girmekten korur. Prostekah /saplı bakterileri seçici olarak izole etmek için, inokulum çok sulandırılmış besin çözeltisi (örneğin %0.01'lik pepton gibi) ile karıştırılır ve sarsılmayacak şekilde bırakılır. Bir kaç gün içinde, prosteka ve saplı bakteri içeren bir yüzey film gelişmeye başlar. Aynı şekilde hazırlanmış çok seyreltilmiş besin içeren ağar plaklarına bu yüzey filminden ekim yapılarak izolasyon sağlanır. Caulobacterve Gallionclla Caulobacter (Şekil 12.41) ve Gallionella (Şekil 12.43) yaygın olarak bulunan saplı bakterilerdir. Caulobacter kemoorganotrof olup, içi sitoplazma ile dolu bir sap yani prosteka oluşturur. Gallionella ise
12.17 • Kayan Myxobacteria • 367
demir-oksitleyen kemolitotrofik bir bakteridir ve ferrik hidroksitten oluşmuş sapa sahiptir. Caulobacter hücreleri çoğunlukla sucul ortam yüzeylerinde bir kaç hücre sapının birbirine tutunarak oluşturdukları rozet şeklinde görünürler (Şekil 12.41a). Sapın ucunda onun yüzeye tutunmasını sağlayan ve tutunma aleti (holdfast) olarak adlandırılan bir yapı yer alır. Caulobacter''in hücre bölünme döngüsü (Şekil 12.42») özellikle eşit olmayan ikiye bölünme süreci ile gerçekleşmesi açısından ilgi çekicidir. Bu organizma hücre bölünmesi ve gelişimsel olaylar için model sistem olarak kullanılarak üzerinde çok sayıda moleküler araştırma yapılmıştır. Saplı Caulobacter hücresinin önce boyu uzar, bunu takiben sapın karşı kutbunda tek bir kamçı oluşur ve hücre ikiye bölünür. Bu şekilde oluşan kamçılı yeni hücre (svvarmer) kamçısız ana hücreden ayrılır ve yüzerek yeni bir yüzeye tutunur, kamçılı kutupta yeni bir sap oluşur; daha sonra kamçı kaybolur (Şekil 12.42). Sap oluşumu hücre bölünmesi için zorunlu bir ön koşuldur ve DNA sentezi ile eşgüdümlü gerçekleşir. Caulobacter'deki hücre bölünme döngüsü basit ikiye bölünme olayından daha karmaşıktır; çünkü saplı ve oğul hücreler yapısal olarak farklıdır ve üreme döngüsü her iki formu da içermek zorundadır.
Sap uzaması DNA sentezi DNA Kamçının sentezinin kaybı başlaması
Kamçı sentezi
Çapraz bant oluşumu
\ \
Hücre bölünmesi /
\l
1 If Saplı hücre
Ana hücre 0
10
20
30
40
Uzun saplı hücreler 50
60
Bölünme öncesi hücre 70
80
90
Zaman (dk)
• Şekil 12.42 Caulobacteı'in çoğalması. Caulaohacter'm oğul hücreye dönüşmesiyle başlayan hücre döngüsü.
Gallionella demir hidroksit [Fe (OH)3] içeren bükülmüş sap benzeri bir yapı oluşturur (Şekil 12.43»). Ancak bu sap hücrenin ayrılmaz parçası değildir. Hücre yüzeyinden salgılanarak oluşan bu yapı, üzerinde demir hidroksit birikmesiyle oluşan organik bir matriks içerir. Gallionella suyu kurutulmuş bataklıklarda, demir yataklarında ve ferrus demir (Fe2+) içeren diğer habitatlarda Sphaerotilus gibi kılıflı bakterilerle birlikte bulunur. Gallionella Calvin döngüsü (
Tutunma
Kılıflı bakteriler, kılıf denilen bir dış tabaka içinde tek tek hücrelerin zincir şeklinde sıralanmasıyla oluşan filamentöz Proteobacteria'dır. Tomurcuklanan ve prostekalı bakteriler saplar ve prosteka şeklindeki uzantılar oluşturlar. Sucul ortamda yaşayan bu organizmalar tutunmak ve besinleri absorblamak için bu uzantıları kullanırlar. •
(b)
Fizyolojik açıdan, sadece kılıflı bakteri Leptothrix'e ait olan özellik nedir? • Tomurcuklanarak bölünme ile basit ikiye bölünme arasında ne fark vardır? İkiye bölünme ile Caulobacter'deki bölünme süreci arasında ne fark vardır? •
Prostekalı bakterilerin besin açısından aşırı fakir ortamlarda ne gibi bir avantajı olabilir?
Kayan Myxobacteria
• Şekil 12.41 Saplı bakteriler, (a) Caulobacter rosette. Tek bir hücre yaklaşık 0,5 /im genişliğindedir. Beş hücre, saplan(prosteka) ile birbirlerine yapışmışlardır.Hücrelerin iki tanesi bölünmüştür ve yavru hücreler kamçı oluşturmuşlardır. (b,c) Caulobacter hücrelerinin elektron mikrografı (b) Hücre bölünmesini gösteren negatif boyanmış preparat. (c) İnce kesit. Sap bölgesindeki sitoplazmik köprülere dikkat ediniz.
Anahtar Cinsler: Myxococcus, Stigmatella Çeşitli prokaryotlar kayma denilen bir hareket biçimi sergiler (c^öBölüm 4.15). Genellikle çubuk ya da filamentöz şekilli olan kayan mikroorganizmalar kamçı içermedikleri halde, bir yüzeyle temas ettiklerinde hareket etme yeteneğine sahiptirler. Kayan bakterilerin bir grubu olan tomurcuklanan myxoBacteria, fruktifikasyon yapıları denilen çokhücreli yapılar oluşturur ve hücrelerarası iletişi-
368 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
Fruktifikasyon Yapılan
, , ,-5325" (a)
(b)
• Şekil 12.43 Nötrofilik ferrus okside eden Cattionella ferruginea. (a) Ithaca, Newyork yakinlanndaki demir kaynağından alınan hücrelerin fotomikrografı. Kıvrımlı sapın fasulye şekilli iki hücreye uzanmasına dikkat ediniz(ok). (b) Hücre ince kesitinin elektron mikrografı. Hücreler yaklaşık 0,6 fim genişliğindedir. Her iki fotoğrafta da hücre merkezinden çıkan ferrik hüdroksitin oluşturduğu kıvrımlı sapa dikkat ediniz.
Myxobacteria'nın fruktifikasyon yapıları, gevşek ve kaygan basit küresel miksospor topluluğu halinde olabildiği gibi, duvar ve sap içeren kompleks fruktifikasyon yapısı şeklinde de olabilir (Şekil 12.45»). Bu yapılar genellikle göz alıcı renklere ve karmaşık morfolojiye sahiptir (Şekil 12.45 ve 12.46*). Çürümekte olan nemli odun parçaları veya bitki materyalleri üzerinde basit bir mercek veya diseksiyon mikroskobu ile görülebilirler. Nemli bir bölmede bir kaç gün inkübe edilen gübre parçacıkları (örneğin tavşan dışkısı) üzerinde myxobakteria fruktifikasyon yapıları gelişir. Bu bakterileri izole etmenin bir başka yolu sadece ağar ve su ile hazırlanmış (besin eklenmemiş distile su içinde %1.5 ağar) Petri kaplarına herhangi bir bakterinin yoğun bir süspansiyonu yayılır. Petri kabının ortasına az miktarda toprak, çürümüş ağaç kabuğu ya da başka doğal materyaller yerleştirilir. İnokulum içindeki myxoBacteria diğer bakteri hücrelerini eriterek, parçalanma ürünlerini besin olarak kullanır ve üreme sırasında inoküle edildikleri alandan etrafa doğru yayılır. Bir kaç gün ya da bir hafta sonra Petri kapları diseksiyon mikroskobunda incelenir ve fruktifikasyon yapısından ya da kümenin kenarından alman hücrelerin organik besiyerine aktarımı ile saf kültürler elde edilir. Birçok myxoBacteria pepton ya da kazein hidrolizat
Tablo 12.20 Özellikleri
min olduğu karmaşık bir hayat döngüsü sergiler (Şekil 12.47). Kayan myxoBacteria filogenetik olarak Proteobacteria'ın delta altdiviziyosu üyeleridir (Tablo 12.20). Tomurcuklanan myxoBacteria bilinen prokaryotik organizmalar arasında, sergiledikleri davranış ve yaşam döngüleri açısından en karmaşık olanlarıdır. Bazı myxoBacteria'mn kromozomları çok büyüktür. Örneğin, Myxococcus xanthus'un 9.2 Mbç içeren ve halkasal yapılı olan tek kromozomu, Escherichia coli kromozomunun iki katı büyüklüktedir. (c**aKısım 15.4 ve 10.19). Gerçekten de bu kromozomun büyüklüğü, 16 kromozom üzerine yerleşmiş olan maya genomunun üçte ikisi kadardır (öOaKısım 15.6). Tomurcuklanan myxoBactera'nın vejetatif hücreleri kamçısız, gram-negatif çubuk şeklinde olup (Şekil 12.44a), kayarak hareket eder ve diğer bakterileri eriterek elde ettiği besinlerle beslenir. Uygun koşullar altında bir araya gelerek kümelenen vejetatif hücreler fruktifikasyon yapısı oluşturur. Bu yapı içindeki bazı hücreler miksospor (Şekil 12.44b) denilen dinlenme yapılarına dönüşür.
Fruktifikasyon Yapan (tomurcuklanan Myxobacteria'nın sınıflandırılması3 Cins/DNA (mol% CC)
Sivrilmiş vejetatif hücreler: Myxococcus (68-71) Küresel veya oval tomurcuklanan yapılar, genellikle yumuşak ve kaygan Archangium (67-68) Çubuk şekilli miksosporlar: Miksospolar sporangia içinde değil, sap oluşturmaz Miksosporlar kaygan bir zarf içinde gömülü: Sapsız tomurcuklanan yapı Cystobacter (68) Saplı tomurcuklanan yapılar, Melittangium (—) tek sporangium Saplı tomurcuklanan yapılar, Stigmatella (68-69) birçok sporongium Küçük küresel veya disk sekilinde Angiococcus (—) duvarla çevrili sporongium içeren, koyu kahverengi kümeler halinde tomurcuklanan yapılar Sivrilmemiş vejetatif hücreler (sivri olmayan yuvarlak sonlar); miksosporlar vejetatif hücrelere benzer; sporangium daima üretilir: Sapsız tomurcuklanan yapılar; Polyangium (69) miksosporlar basil şeklinde Sapsız tomurcuklanan yapılar; Sorangium (—) miksosporlar oval; yüksek derecede selülolitik Sapsız tomurcuklanan yapılar; Nannocystis (70-72) miksosporlar kokoid Saplı tomurcuklanan yapılar Chondromyces (69-70) "Rlogenetik olarak bu türler Proteobacteria'nın delta alt divizyosunda ele alınır. (Tablo 12.1'e bakınız)
12.17 • Kayan Myxobacteria • 369
• Şekil 12.44 Myxococcus. (a) Myxococcus xanthus vejetatif hücresine ait ince kesitin elektron mikrografı. Bir hücre yaklaşık 0.75 fim genişliğindedir. (b) M.xanthus'\m miksosporu; çok tabakalı duvar yapısı göstermektedir. Miksosporlar yaklaşık 2 ju.m çapındadır.
içeren besiyere kullanılarak laboratuvarda üretilebilir. Kazein hidrolizat organik besin maddelerini amino asitlere ya da küçük peptidlere yıkar. Tipik birer aerob olan bu organizmalar sitrik asit döngüsü (c°öŞekil 5.22) ve solunum zincirini eksiksiz olarak içerir. Bir Myxobacteriuıtt'un Hayat Döngüsü
Şekil 12.47» tipik bir myxobacterium'un hayat döngüsünü göstermektedir. Vejetatif hücre kaygan bir madde salgılar ve katı yüzey üzerinde hareket ederken gerisinde bu salgıyı bırakır (Şekil 12.48»). Kümedeki diğer hücreler bu salgıyı kullanmayı tercih eder. izler boyunca göç eden hücreler hızla yayılarak karakteristik bir şekil oluşturur (Şekil 12.48). Sonuçta, sap bölgesindeki ve miksosportaşıyan baş kısımdaki farklılaşan hücreler tarafından oluşturulan kompleks fruktifikasyon yapısı ortaya çıkar (Şekil 12.45 ve 12.46). Ortamda vejetatif üreme için uygun besin olduğu sürece fruktifikasyon yapısı ortaya çıkmaz. Ancak besinlerin tükenmesi durumunda, vejetatif kümeler fruktifikasyona başlar. Hücreler muhtemelen bir kemotaktik yanıt (o»oBölüm 4.16 ve 8.13) aracılığı ile birbirlerine doğru göç eder ve yığınlar veya kümeler halinde bir araya gelirler (Şekil 12.49»). Tek bir fruktifikasyon yapısında 109 ya da daha fazla sayıda hücre vardır. Hücre yığınları yükseldikçe fruktifikasyon yapısı sap ve baş oluşturacak şekilde farklılaşmaya başlar (Şekil 12.49b ve c). Şekil 12.49rf'de fruktifikasyon yapısının farklılaşması açıkça görülmektedir. Sap, birkaç hücrenin tutunabildiği kaygan bir salgıdan oluşmuştur. Hücrelerin çoğunluğu baş kısmında birikir ve değişikliğe uğrayarak miksosporlara dönüşürler (Şekil 12.44-12.47). Bazı cinslerde miksosporlar kist denilen geniş duvarlı yapılar içinde yer almıştır. Miksospor susuz kalmaya, ses dalgalarına, UV ışınlarına ve sıcaklığa karşı vejetatif hücreye oranla çok daha dayanıklıdır, ancak sıcaklığa dayanıklılık derecesi bakteriyal endospordan çok daha azdır 4.13). Dolayısıyla, kist haline gelmiş
• Şekil 12.45 Stigmateüa aurantiaca. (a) Tomurcuklanan bir yapının renklifotoğrafı.Buyapı yaklaşık 150 /im yüksekliğindedir. (b) Bir parça tahta üzerinde büyümüş tomurcuklanan yapımn taramalı elektron mikrografı. (a)' da gösterilen tomurcuklanan yapımn rengi karetenoid pigmentlerin üretiminden kaynaklanır. 17.3)
370 • Bölüm 12 • Prokaryotih Çeşitlilik: Bacteria
, * - • ' • • - . . ,
• Şekil 12.46 Tomurcuklanan Myxobacteria'dan üç türün tomurcuklanan yapılan, (a) Myxococcus fulvus (125 /um yüksekliğinde), (b) Myxococcusstipatatus (170 /iım yükseklğinde), (c) Chondromyces crocatus (560 /tun yüksekliğinde).
miksosporlarm asal işlevi, organizmanın yayılması sırasında karşılaşabileceği susuzlukta ya da habitatlarımn kuruması halinde hayatta kalmasını sağlamaktır. Uygun bir habitat bulduğunda ya da uygun üreme koşullarına dönüldüğünde kapsül bir noktadan yırtılır ve miksospor çimlenerek yeni bir vejetatif hücre ortaya çıkar.
lipid feromon olan 2,5,8-trimetil-8-hidroksi-nonae-
Tomurcuklanan yapı oluşumu
Hücre kümesi
Myxobacteria genellikle karotenoid pigmentlerle renklenir (Şekil 12.45a ve 12.46). Bu pigmentlerin en önemlileri karotenoid glikozidlerdir. Pigment oluşumu ışık tarafından başlatılır ve pigmentin fonksiyonlarından en az biri organizmayı ışıktan korumadır. Myxobacteria doğada genellikle ışıkta fruktifikasyon yaptığı için, ışıktan koruyan pigmentlerin bulunma nedeni anlaşılabilir. Stigmatelle cinsinde (Şekil 12.45) ışık fruktifikasyon yapısının oluşumunu büyük ölçüde hızlandırır ve 4-on üretimini katalizler. Bu madde kümelenme (agregasyon) basamağını başlatır. Tomurcuklanan myxoBacteria vejetatif hücrelerin, mikso-sporlarm ve fruktifikasyon yapılarının özellikleri temel alınarak morfolojik olarak sınıflandırılır (Tablo 12.20). Filogenetik sınıflandırma ise rRNA dizilerine dayanılarak yapılır.
Miksospor oluşumu Tomucuklanarî yapı
Salgı izleri
\
Çoğalma ve bir araya gelme ^
Kimyasal " indüksiyon
Gelişme
•
* Şekil 12.47 Myxococcus xanfus'un yaşam döngüsü. Vejetatif hücreler tomurcuklanan yapıyı oluşturmak üzere bir araya gelerek kümelenirler. Vejetatif hücreler morfogenez geçirerek mikrospor denen dinlenme hücrelerim oluşturular. Bu hücreler daha sonra uygun besin ve fiziksel şarlar altında gelişerek vejetatif hücreleri oluştururlar. Vejetatif hücreler bazı kimyasal indükleyicilerle, özellikle yüksek yoğunluktaki gliserolle tomurcuklanan yapı oluşumu olmadan direkt mikrospora dönüşebilirler. Şekil 12.45 ve 12.46'da Myxococcus' un tomurcuklanan yapı fotoğraflarına bakınız.
• Şekil 12.48 Çoğalan Myxococcus. (a) Ağar üzerinde çoğalan bir Myxococcus xantus kolonisinin fotomikrografı (5mm çapında), (b) Aktif olarak kayan bir kültürden alınmış tek bir Myxococcus fulvus hücresi. Ağar üzerinde karakteristik salgı izi görülmektedir. M. fulvus'un tek bir hücresi yaklaşık 0,8 /xm çapındadır.
12.18 • Sülfat ve Kükürt-İndirgeyen Proteobacteria • 371
• Şekil 12.49 Chondromyces crocatus' ta tomurcuklanan yapı oluşumunun tarayıcı elektron mikroskobu görüntüsü, (a) Erken evre, kümelenme ve tümsek oluşturmayı gösterir, (b) Sap oluşumunun başlangıç evresi. Baş kısmındaki yapışkan madde üretimi henüz başlamadığından baş kısmım oluşturan hücreler hala görülebilmektedir, (c) Baş oluşumundaki üç aşama. Aynca sap kalınlığının artığına da dikkat ediniz, (d) Olgun tomurcuklanan gövdeler. Tüm tomurcuklanan yapı yaklaşık 600 ^m yüksekliğindedir. (Şekil 12.46c'ye bakınız.)
12.17 Kavramların Gözden Geçirilmesi Tomurcuklanan myxobacteria bir araya gelerek "jruktifikasyon yapısı" adı verilen kompleks bir hücre kümesi oluşturan, basil şeklindeki kayan bakterilerdir. Bu organizmalar çürümüş organik madde veya diğer bakteriler üzerinde yaşayan kemoorganotrofik toprak bakterileridir. •
Hangi çevresel koşullar myxobacteria'mn fruktifikasyon yapısı oluşturmasını tetikler?
•
Miksospor nedir ve endosporla bunun arasında ne fark vardır?
•
Myxobacteria hangi özel filogenetik gruba dahildir?
12.18
Sülfat ve KükürMndirgeyen Proteobacteria
sal ortamlarda yaygındır. En iyi çalışılmış cins olan Desulfovibrio (Şekil 12.50a) yeterli düzeyde sülfat ve bol organik materyal içeren suya doymuş topraklar ya da sucul habitatlarda yaygındır. Filogenetik olarak gram-pozitif bakterilere dahil olan Desulfotomaculum, toprakta yaşayan ve endospor oluşturan çubuk şeklinde hücrelere sahiptir. Bazı konserve besinler içinde üreyen Desulfotomaculum'un sülfatı indirgemesi, kötü bir koku oluşumuna ve besinin bozulmasına yol açar. Sülfat-indirgeyen bakterilerin diğer cinsleri oksijensiz tatlı su (grup I) ya da denizlerde (grup I ve II) yaşar ve ender olarak da memelilerin bağırsağından izole edilebilir. Kükürt İndirgenmesi (Redüksiyonu)
Dissimilatif kükürt-indirgeyen bakteriler elementer kükürdü sülfide indirgeyebildiği halde, sülfatı sülfide indirgeyemezler. Desulfuromonas cinsi üyeleri Anahtar Cinsler: Desulfovibrio, Desulfobacter, (Şekil 12.50/) asetat ya da etanol gibi substratlarm Desulfurom onas oksidasyonunu elementer kükürdün hidrojen sülfide redüksiyonu ile eşleştirerek anaerobik olarak Elektron vericisi olarak organik bileşikleri ya da üreyebilir. Ancak, elementer kükürdü ve tiyosülH2'i kullanan delta Proteobacteria'nın büyük bir fat, sülfit ya da dimetil sülfoksit (DMSO) gibi diğer grubu oksijensiz koşullar altında elektron alıcı2 kükürtlü bileşikleri indirgeme yeteneği, fakültatif sı olarak sülfat (SO4 ) ve kükürt (S°) kullanabilir. aerob kemoorganotrof bakterilerde (örneğin ProteHem kükürtün hem de sülfatın indirgenme ürünü us, Campylobacter, Pseudomonas ve Salmonella) yayhidrojen sülfit (H2S)tir. Topluca dissimilatif sülfatgın olarak gözlenen bir özelliktir. Desulfuromonas indirgeyen bakteriler ve kükürt-indirgeyen bakzorunlu anaerob oluşu ve elektron alıcısı olarak teriler olarak bilinen bu organizmaların kırktan sadece kükürdü kullanması ile bunlardan ayrılır fazla cinsi vardır. Bunlara ait bazı önemli cinsler (Tablo 12.21). Dissimilatif kükürt-indirgeyen bakTablo 12.21 de gösterilmiştir. teriler (örneğin Desulfuromonas) sülfat indirgeSülfat-indirgeyen bakterilerin Grup I içindeki yen bakterilerle aynı habitatları paylaşır ve yeşil Desulfovibrio (Şekil 12.50a»), Desulfomonas, Desulkükürtlü bakteriler gibi H2S'i S°'e oksitleyen bakfotomaculum ve DesulfoJobus (Şekil 12.50c) cinsleri terilerle birlikte bulunur (Bkz. Kısım 12.32). Oluşelektron vericisi olarak laktat, piruvat, etanol ya da turulan kükürt, organizmanın kükürt-indirgeme bazı yağ asitlerini kullanır ve sülfatı hidrojen sülfite indirgerler. Grup II içindeki Desulfobacter (Şekil metabolizması sırasında tekrar H2S'e indirgenir ve 12.50d), Desulfococcus, Desulfosarcina (Şekil 12.50e) oksijensiz kükürt döngüsü bu şekilde tamamlanır 19.13). ve Desulfonema (Şekil 12.50b) gibi cinsler ise sülfatı hidrojen sülfite indirgerken, başta asetat olmak üzere yağ asitlerini okside ederler. Sülfat- indirSülfat-İndirgeyen Bakterilerin Fizyolojisi geyen bakterilerin önemli bir kısmı zorunlu aerob olduğu için kültürleri yapılırken kesinlikle oksijenSülfat-indirgeyen bakterilerin kullanabildiği siz koşullar sağlanmalıdır (Şekil 12.50g). elektron vericileri çok çeşitlidir. Hidrojen, laktat ve piruvat neredeyse evrensel olarak kullanılır. Sülfat-indirgeyen bakteriler, mikrobiyal bozunGrup I'deki cinslerin pek çoğu malat, sülfonat ve ma sonucu oksijensiz hale gelmiş sucul veya kara-
372 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
Tablo 12.21 Sülfat ve kükürt redükte eden bazı anahtar bakteri cinslerinin özellikleri" Cins
DNA (mol% CC)
Özellikler
I. Grup sülfat redükte edenler: Asetat okside etmeyenler Desulfovibrio Polar kamçılı, kıvrık basiller, spor yok; gram-negatif; desulfoviridin içerir; bir termofilik Desulfomicrobium Hareketli basiller, spor yok; gram-negatif; desulfoviridin içermez Vibriolar; gram-negatif; desulfoviridin içermez Desulfobotulus Desulfofustis Hareketli basiller; glikolat ve gliokzalat degradasyonu ile özelleşirler Düz veya kıvrık; peritriş veya polar kamçı ile hareketli; desulfoviridin içermez; endospor oluşDesulfotomaculum turur; asetatı enerji kaynağı olarak kullanabilir Desulfomonile Basil; 3-klorobenzoatın benzoata reduktif deklorinasyonunu yapabilir (°°Kısım 17.18) Desulfobacula Ovaldan koksu yapıya kadar değişir, denizde; araomatik hidrokarbon toluen de dahil birçok araomatik bileşiği CO2'ye okside eder Archaeoglobus Archaeon; hipertermofil, optimum sıcaklık 83 OC; metanojenik bakterilerin bazı kendine has koenzimlerini içerirler, üreme sırasında küçük miktarda metan oluştururlar; H2, format, glukoz, laktat ve piruvat elektron vericileri, SO 4 2 , S2O3'2 veya SCy2 elektron alıcılarıdır Desulfobulbus Ovalimsi veya limon şekilli hücreler; spor yok; gram-negatif; desulfoviridin içermez; eğer hareketliyse tek bir polar kamçı ile; propiyonatı asetat+CO2 ile birlikte elektron vericisi olarak kullanır. («»Kısım 13.7) Desulforhopalus Kıvrık basiller, gaz vakuolleri var, psikrofil; propiyonat, laktat veya alkolleri elektron vericisi olarak kullanır Thermodesulfobacterium Küçük, gram-negatif basiller; desulfoviridin bulunur; termofilik, optimum büyüme 700C'de; Bacteria'nm üyesidir ancak eter bağlı lipidleri içerir II. Grup sülfat siilfi redükte edenler: Asetat okside edenler Desulfobacter Basiller; spor yok; desulfoviridin bulunmaz; eğer hareketliyse tek bir polar kamçı ile; asetatı sadece elektron vericisi olarak kullanır ve sitrik asit döngüsü ile onu CO2'ye okside eder. Desulfobacterium Basiller, bazılarında gaz kürecikleri var, denizde; asetil CoA metabolik yoluyla ototrofik olarak üreyebilir. Desulfococcus Küresel hücreler; hareketsiz; gram-negatif; desulfoviridin bulunur, spor yok; C/den C ]4 'e yağ asitlerini CO2'nin tam oksidasyonuyla birlikte elektron vericisi olarak kullanırlar. Desulfonema Büyük filamentöz kayan bakteriler; gram-pozitif, spor yok; desulfoviridin bulunur veya bulunmaz; C 2 'den C ]2 'ye yağ asitlerini CO2'nin tam oksidasyonuyla birlikte elektron vericisi olarak kullanırlar; asetil CoA metabolik yoluyla ototrofik olarak üreyebilir (H2 elektron vericisi) Desulfosarcina Hücreler paketler halinde (sarsina düzenlenmesi); gram-negatif; spor yok; desulfoviridin bulunmaz; C2'den C ]4 'e yağ asitlerini CO2'nin tam oksidasyonuyla birlikte elektron vericisi olarak kullanırlar; asetil CoA metabolik yoluyla ototrofik olarak üreyebilir (H2 elektron vericisi) Desulfoarculus Vibriolar; gram-negatif; hareketli; desulfoviridin bulunmaz; C,'den C]8'e yağ asitlerini sadece elektron vericisi olarak kullanırlar Kok oval şekilli hücrelere; gram-negatif; C,'den C18'e yağ asitlerini kullanırlar; beslenmeleri çok Desulfacinum çeşitli; ototrofik olarak üreyebilir; termofilik Desulforhabdus Basiller; spor yok; gram-negatif; hareketsiz; CO2'nin tam oksidasyonuyla birlikte yağ asitlerini kullanırlar Thermodesulforhabdus Gram-negatif hareketli basiller; termofilik; C ]g 'e kadar yağ asitlerini kullanırlar Farklı kükürt redükte edenler Desulfuromonas Düz basiller, tek bir lateral kamçı; spor yok; gram-negatif; sülfat redükte etmezler; asetat süksinat, etanol veya propanolu elektron vericisi olarak kullanırlar; zorunlu anaerob; tek tür trikloroetilenin reduktif deklorinasyonunu yapabilir (°°Kısım 17.18) Desulfurella Hareketli kısa basiller; gram-negatif; asetata ihtiyaç duyar; termofilik n Sulfurospirillum Küçük vibriolar; S 'ı H 2 veya formatı elektron vericisi olarak kullanarak redükte eder Campylobacter Kıvrık, vibrio şekilli basiller; polar kamçılı; gram-negatif; spor yok; sülfatı redükte edemez ancak kükürtü, sülfiti, tiyosülfatı, nitratı veya fumaratı anaerobik olarak asetat veya çeşitli karbon ve elektron vericisi kaynaklarıyla birlikte redükte edebilir; fakültatif aerob
46-61 52-57 53 56 37-46 49 42 41-46
59-60 48 34 45-46 41-59 57 35-42 51 66 64 52 51
50-63 31 40-42
"Filogenetik olarak, çoğu delta Proteobacteria'dan sülfat ve kükürt redükte eden bakterilerdir.
bazı birincil alkolleri (örneğin etanol, propanol ve bütanol) kullanır. Bazı Desulfotomaculum suşları glukozu kullanmakla birlikte bu, sülfat indirgeyicileri tarafından nadiren tercih edilen bir durumdur. Grup I'deki sülfat-indirgeyicileri, elektron vericisini asetat seviyesine kadar okside eder ve bu yağ asidini son ürün olarak hücre dışına verir. Grup II'deki organizmalar yağ asitlerini (asetat dahil), laktatı, süksinatı ve hatta bazı türler benzoatı tamamen CO2'e oksitleyebilirle yetenekleri açısından grup I üyelerinden ayrılır. Desulfosarcina, Desulfonema, Desulfococcus, Desulfobacterium,
Desulfotomaculum ve Desulfovibrio''nun bazı türleri elektron vericisi olarak H2'i, elektron alıcısı olarak sülfatı ve tek karbon kaynağı olarak CO2'i kullanabilme ve kemolitotrofik ve ototrofik olarak üreme yetenekleriyle sülfat-indirgeyicileri arasında çok özel yere sahiptir. Az sayıdaki özelleşmiş bazı sülfat-indirgeyicileri hidrokarbonları ve hatta ham petrolü bile elektron vericisi olarak kullanabilir. Bu bulgu oldukça önemlidir; çünkü bu gibi organizmalar tanımlanıncaya kadar, hidrokarbonların sadece oksijenli koşullarda oksitlendiği düşünülüyordu 17.23).
12 18 • Sülfat ve Kükürt-İndirgeyen Proteobacteria • 373
Sülfat-indirgeyen birçok bakteri sülfatın yanı sıra nitratı da elektron alıcısı olarak kullanabilir ve NO 3 'ı NH3'a ya da örneğin izotiyonat (HO-CH2CH2-SO3") gibi sülfonatları sülfide indirgeyerek üreyebilir. Elementer kükürt de sülfat-mdirgeyen birçok bakteri tarafından sülfide indirgenebilir.
Sülfat-indirgeyen bakteriler bazı organik bileşikleri fermente edilebilir. Fermente edilebilen bileşiklerin en yaygın olanı fosforoklastik tepkimelerle asetat, CO2 ve H2'e çevrilen piruvathr (öOcsŞekil 17.51). Bunun da ötesinde, zorunlu anaerob oldukları düşünülen bazı sülfat-indirgeyen bakteri izolatları -özellikle de mikrobiyal ortamlarda O2-üreten siyanobakterilerle bir arada olanlaroksijeni oldukça iyi tolere ederler ve O2'i elektron alıcısı olarak kullanarak solunum yapabilirler. Desulfovibrio'nun
D. oxyclinae türü çok az oksijen-
li koşullarda elektron alıcısı olarak O2 kullanarak yaşar. İzolasyon
Desulfovibrio'mm. zenginleştirilmesi, ferrus demir eklenmiş laktat-sülfat besiortamının kullanıldığı oksijensiz koşullarda kolayca mümkün olur. Tiyoglikolat ya da askorbat gibi indirgeyici bir ajanın eklenmesiyle daha düşük bir Eo' sağlanır. Sülfat-indirgeyen bakteriler ürediğinde, sülfatın indirgenmesiyle oluşan sülfid, ferrus demir ile birleşerek siyah çözünmeyen ferrus sülfid oluşturur (Şekil 12.50g). Bu siyah renk sadece sülfatın indirgendiğini değil, aynı zamanda demirin sülfide bağlanarak hücre verimini artıracak şekilde detoksifiye edildiğini de gösterir. Besi yerinin siyaha dönüşmesi bir miktar üreme olduğunu gösterir. Bu aşamada saflaştırma için, iç yüzeyi ince bir ağar tabakasıyla kaplanmış tüplere ( rulo tüpler) ya da oksijensiz özel bir kapta (ö°öŞekil 6.26) bulunan Petri plaklarına ekim yapılır. Saflaştırma için bir başka seçenek sallamalı ağar tüpler kullanmaktır. Sallamalı tüp yönteminde başlangıçta zenginleştirilmiş sıvıdan bir miktar alınır, eritilmiş ağar içeren bir tübe eklenir, iyice karıştırılır ve bir seri eritilmiş agarlı tüplerde seri sulandırım yapılır (ooaKısım 18.2 ve Şekil 18.3b). Katılaşan ağar yüzeyinde tek tek dağılmış olan sülfat indirgeyici hücreler üreyerek siyah koloniler oluşturur (Şekil 12.50g). Bu koloniler aseptik koşullarda alınarak, aynı besi ortamlarına ekilir, saf kültür elde edilene kadar bu işlemler tekrarlanır. 12.18 •m Sülfat ve (9)
• Şekil 12.50 Sülfat indirgeyen (a-e) ve kükürt indirgeyen (f) bakterilerden bazı temsilcilere ait faz-kontrast fotomikrograflar. (a) Desulfovibrio desulfurican; hücre çapı yaklaşık 7 jiım'dir. (b) Desulfonema limicola; hücre çapı yaklaşık 3 jiım'dir. (c) Desulfobulbus propionicus; hücre çapı yaklaşık 1,2 /iım'dir. (d) Desulfobacter postgatei; hücre çapı yaklaşık 1,5 /xm'dir. (e) Desulfosarcina variabüis (interferens kontrast mikroskop görüntüsü); hücre çapı yaklaşık 1,25 /iım'dir. (f) Desulforomonas acetoxidans; hücre çapı yaklaşık 0,6 /iım'dir. (g) Sülfat indirgeyen bakterilerin zenginleştirilmiş kültürü. Soldaki, steril besiyeri; ortadaki, siyah ferrus sülfidleri (FeS) gösteren pozitif zenginleştirilmiş kültür; sağdaki, sülfat indirgeyen bakterilerin "sallama tüpü"ndeki kolonileri. 18.2)
Kavramların Gözden Geçirilmesi
kükürt indirgeyen bakteriler delta Proteobacteria'nm büyük bir grubudur. Oksijensiz koşullarda SO4"2 veya S°'ı H2S'e indirgedikleri fizyolojik süreç bu grubun ortak özelliğidir. Sülfat indirgeyen bakterilerin iki fizyolojik alt grubu vardır: I. gruptakiler asetatı CO2'e okside edemez, II. gruptakiler ise okside edebilir. • //. grupta yer alan sülfat indirgeyen bir bakteriyi zenginleştirmek ve izole etmek için hangi organik substratı kullanırdınız? • Kemolitotrofik ve ototrofik üreme yeteneği olan sülfat indirgeyen bakteriler için: (1) Elektron vericisi nedir? (2) Elektron alıcısı nedir? (3) Hücresel karbon kaynağı nedir? • Desulfuromonas ile Desulfovibrio arasında fizyolojik açıdan nasıl bir fark vardır?
374 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bactcria
ŞUBE 2 VE 3: GRAM-POZİTİF BACTERİA VE ACTİNOBACTERİA
12.19
Sporlanmayan, Düşük GC'li, Grant'Pozitif Bacteria: Laktik Asit Oluşturan Bacteria ve Akrabaları
Anahtar Cinsler: Staphylococcus, Micrococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Sarcina Bu bölümün giriş kısmmdagram-pozitifBacteria'nın düşük GC'li ve yüksek GC'li (Actinobacteria) olmak üzere iki büyük filogenetik alt diviziyoya ayrıldığını görmüştük. Bu kısımda düşük GC'li alt diviziyoda bulunan cinslerden bahsedeceğiz. Gerçekte Actinobacteria üyesi olmasına rağmen, morfolojik olarak büyük ölçüde Staphylococcus'a benzemesi nedeniyle Micrococcus da bu kısımda incelenecektir. Sporlanmayan gram-pozitif basil ve koklar olan laktik asit bakterileri de bu kısım kapsamında ele alınacaktır ( Tablo 12.22).
madır. Bölüm 21'de S. aureus'un patojenitesi, Bölüm 26 ve 29'da ise stafilokok hastalıkları tartışılacaktır. Micrococcus türleri deriden de izole edilebilmekle birlikte, daha yaygın olarak cansız objelerde, toz partiküllerinde ve toprakta bulunurlar. Sarcina Sarcina cinsi birbirine dik üç düzlemde bölünerek sekiz veya daha fazla hücreden oluşan paketler oluşturan türleri içerir (Şekil 12.52a•). Sarcina türleri zorunlu anaerob olup, asit toleransları aşırı yüksektir, şekerleri fermente edebilirler ve pH'sı 2'nin altında olan ortamlarda üreyebilirler. Sarcina ventriculi türünün hücreleri, hücre duvarını çevreleyen kaim bir selüloz tabakası içerir (Şekil 12.52W. Bitişik hücrelerin selüloz tabakaları birbirine bağlanır. Bu tabakalar, S.ventriculi hücrelerini paket halinde bir arada tutan çimento maddesi olarak işlev yapar.
Staphylococcus ve Micrococcus Staphylococcus (Şekil 12.51») ve Micrococcus tipik solunum metabolizmasına sahip aerobik bakterilerdir. Her ikisi de katalaz-pozitiftir. Bu test bu iki grubun Streptococcus ve diğer bazı gram-pozitif koklardan ayırt edilmesine olanak verir. Gram-pozitif koklar düşük su potansiyeline nispeten dirençli olup, kurumaya ve yüksek tuz konsantrasyonlarına karşı oldukça iyi tolerans gösterirler. Çok tuzlu ortamlarda gelişme yetenekleri izolasyon için bir seçicilik sağlar. Örneğin, uygun bir inokulum % 7.5 NaCl içeren zenginleştilmiş ortamlı bir ağar plağına ekilir ve plak aerobik koşullarda inkübe edilirse, oluşan kolonilerin çoğunluğu gram-pozitif koklardır. Bu gruptaki birçok tür pigment taşır ve bu ek özellik gram-pozitif kokların seçilmesinde kolaylık sağlar. Micrococcus ve Staphylococcus cinsleri, oksidasyon-fermentasyon (O/F) testi temel alınarak kolayca ayırt edilebilir (c^Tablo 24.3). Micrococcus zorunlu aerobdur ve yalnız oksijenli ortamlarda glukozdan asit oluşturur. Buna karşılık Staphylococcus fakültatif aerobdur ve hem oksijenli hem de oksijensiz ortamlarda glukozdan asit oluşturur. Ayrıca Staphylococcus hücre kümeleri oluşturduğu halde (Şekil 12.51a), Micrococcus oluşturmaz. Staphylococci insan ve hayvanlarda yaygın olarak bulunan kommensaller ve parazitler olup, ciddi enfeksiyonlara neden olurlar. İnsanlarda iki esas tür tanımlanmıştır. Bunlardan biri olan Staphylococcus epidermidis pigment oluşturmayan, deri veya mukozal zarlarda bulunan patojen olmayan bir organizmadır. İkinci tür olan Staphylococcus aureus (Şekil 12.51) yanık, çıban, sivilce, zatürre, osteomiyelit, menenjit ve artrit gibi patolojik durumlarla ilgili olarak ortaya çıkan, sarı pigmentli bir organiz-
(b) • Şekil 12.51 Staphylococcus. (a)Tipik Staphylococcus aureus hücrelerinin tarayıcı elektron mikrografı, hücre gruplarnın düzensiz yerleşimini göstermektedir. Tek bir hücre yaklaşık 0,8 /xm çapındadır, (b) Bölünmekte olan S. aureus hücresinin transmisyon elektron mikrografı. Kalın gram-pozitif hücre duvarına dikkat ediniz (CnoKısım 4.8).
12.19 • Sporlanmayan, Düşük CC'li, Cram-Pozitif Bacteria: Laktik Asit Oluşturan Bacteria ve Akrabaları • 375
Tablo 12.22 Başlıca gram pozitif koh cinslerinin ayırtedici özellikleri Cins
Hücre Fermentas- DNA Filogenetik Hareket düzenlenmesi yonla üreme (mol % CC) grup3
Diğer özellikler
Micmcocus
Küme, tetrat
66-73
Actinobacteria
Tam aerob
Staphylococcus
Küme, çift
30-39
Düşük GC
Bu grupta hücre duvarında teikoik asit içeren tek cins
Stomatococcus Planococcus Sarcina
56-60 39-52 28-31
Actinobacteria Düşük GC Düşük GC
Bu grupta kapsülü olan tek cins Birincil olarak denizde Aşırı asit toleranslı, hücre duvarında selüloz var
Ruminococcus
Küme, çift Çift, tetrat Sekiz ya da daha çok hücreli küpsü paketler Çift, zincir
39-46
Düşük GC
Zorunlu anaerob; rumen, çekum ve birçok hayvanın sindirim sisteminin büyük kısmında bulunur
Peptococcus
Küme, çift
50-51
Düşük GC
Peptostreptococcus
Yığın, kısa zincir
28-37
Düşük GC
Zorunlu anaerob, peptonları fermente eder ancak şekerleri etmez Zorunlu anaerob; peptonları fermente eder; insan normal florasının yaygın bir üyesi; deri, sindirim, vajinada bulunur ayrıca vajinal ve cerahatli akıntılardan da izole edilmiştir
"Tamamı gram-pozitif Bacteria'nm üyesidir (Şekil 12.1'e bakınız).
Sarcina türleri topraktan, çamurdan, dışkıdan ve mide içeriğinden izole edilebilir. Aşırı asidik koşulları tolere edebilme özelliğinden dolayı, S. ventriculi insanların ve diğer tek mideli hayvanların midesinde yaşayabilen ender organizmalardandır. Pilorik ülserler gibi bazı gastrointestinal şikayetleri olan insanların midesinde S. ventriculi'nin hızla üreyebildiği gözlenmiştir. Bu patolojik durum besinlerin bağırsağa geçişini geciktirir ve düzeltilmesi için genellikle cerrahi operasyon gerekir. Laktik Asit Bakterileri ve Laktik Asit Fermentasyonlan Laktik asit bakterileri, fermentasyon ürünü olarak ya sadece ya da önemli miktarda laktik asit üreten gram-pozitif basil ve koklardır. Bu grubun üyeleri porfirinleri ve sitokromları içermedikleri için elektron taşınmasına bağlı fosforilasyon yapamazlar. Dolayısıyla sadece substrat düzeyinde fosforilasyon ile enerji elde ederler. Tüm laktik asit bakterileri anaerobiktir. Birçok anaerobun aksine, laktik asit bakterilerinin çoğu O2'e duyarlı değildir ve O2 olsa da olmasa da üreyebilirler. Bu nedenle bunlara aerotolerant anaeroblar adı verilir. Çoğu laktik asit bakterisi enerjisini yalnızca şeker metabolizmasından elde ettiği için bunlar genellikle şeker içeren habitatlarla bulunur. Bu bakterilerin (b) • Şekil 12.52 Sarcina. (a) Tipik gram-pozitif kok Sarcina sp. hücrelerinin faz-kontrast fotomikrografı. Tek bir hücre yaklaşık 2 )im çapındadır, (b) İnce kesitin elektron mikrografı. (c) Hücrenin selüloz içeren en dıştaki hücre tabakası.
376 • Bölüm 12 • Prokaryotih Çeşitlilik: Bactetia
en tipik özelliği biyosentetik yeteneklerinin sınırlı olmasıdır. Gereksinim duydukları besin maddeleri arasında amino asitler, vitaminler, pürin ve pirimidinler vardır (a^öTablo 5.4) Laktik asit bakterilerinin altgrupları arasındaki en önemli fark şekerlerin fermentasyonu sonucunda oluşan ürünlerden kaynaklanır. Homofermentatif olarak adlandırılan grubun ürettiği tek fermentasyon ürünü laktik asittir. Diğer grup heterofementatif olarak adlandırılır. Bunlar laktatm yanı sıra etanol ve CO2 de üretir (Tablo 12.23). Şekil
Homofermentatif
12.53» bu iki grubun glukozu fermente ederken izledikleri yolları özetlemektedir. Fermentasyonda gözlenen farklılıklar glikolizdeki anahtar enzim olan aldolaz'm bulunup bulunmamasından kaynaklanır (cöaŞekil 5.14). Heterofermentasyon yapanlar aldolazdan yoksun olduğu için fruktoz bifosfatı trioz fosfata yıkamazlar. Bunun yerine, glukoz 6-fosfatı 6-fosfoglukonat'a oksitlerler ve daha sonra bunu pentoz fosfata dekarboksile ederler. Bu ürün de fosfoketolaz enzimiyle trioz fosfat ve asetilfosfat oluşturmak üzere yıkılır (Şekil 12.53).
Heterofermentatif
Glukoz ATP
Glukoz A T P
ADP Glukoz 6-fosfat L*.NAD + •:
rATP
NADH
6-fosfoglukonik asit U-NAD+ *••-•
•ADP Fruktozl ,6-bifosfat
NADH
co2
Ribuloz 5-fosfat Pentoses
N. Ksikilozö-fosfat
Gliseraldehit 3-fosfat
,
Dihidroksiaseton fosfat
Gliseroldehit 3-fosfat P,
NAD +
Asetil fosfat NADH
. NAD+ 4Asetaldehit
1,3-Bifosfogliserik asit
Jc I Ic
1,3-Bifosfo gliserik asit
ADP
ADP
ATP
ATP
ADP
ATP
ATP
Piruvat"
Laktar
NAD +
Etanol
Ic
ADP
K
•NAD+
Piruvar Net kazanç = 2 ATP 2 laktat Fermente edilen bir glukoz başına
f * NAD Laktat"
Net kazanç = 1 ATP (1 laktat + 1 etanok 1 CO2) fermente edilen glukoz başına
• Şekil 12.53 Homofermentatif ve heterofermentatif laktik asit bakterilerindeki glukoz fermentasyonu Etanol oluşturan reaksiyonlarda ATP oluşturulmadığına dikkat ediniz.Eğer ortamda oksijen varsa, çoğu heterofermantatif laktik asit bakterisi NADH ile birlikte oksijeni indirgeyebilir (flavin enzimlerin aracılığı ile) ve su oluşturur; daha sonra etanoUe birlikte asetat oluşturulur ve bu da ek olarak bir ATP üretimim sağlar.
12.19
Tablo 12.23
Sporlanmayan, Düşük CC'li, Gram-Pozitif Bacteria: Laktik Asit Oluşturan Bacteria ve Akrabaları * 377
Laktik asit bakterlerinin belli Başlı cinslerinin ayrımı
Hücre şekli ve düzenlenmesi Cins/DNA (mol % GC) Zincir ya da tetrat kökler Homofermentative
Heterofermentatif Basil, tipik zincir halinde Homofermentative Homofermentative
Streptococcus (34-46) Enterococcus (38-40) Lactococcus (38-41) Pediococcus (34-42) Leuconostoc (38^11) Lactobacillus (32-53) LactobaciUus (34-53)
1
Filogenetik olarak bütün organizmalar gram-pozitif Baderia'nm düşük GC'li alt diviziyosundadır
Heterofermentasyon yapanlarda, trioz fosfat sonuçta laktik aside çevirilir ve bu arada 1 mol ATP oluşturulur. Bununla birlikte, redoks dengesinin sağlanabilmesi için üretilen asetilfosfat, pentoz fosfat üretimi sırasında oluşturulan NADH'tan gelen elektronları kabul eder ve etanole çevrilir. Bu olay sırasında ATP kazancı yoktur. Bu nedenle heterofementörler glukozdan, homofermentörler gibi 2 mol ATP değil, sadece 1 mol ATP üretirler. Heterofermentörler 6-fosfoglukonatı dekarboksile ettiklerinden, fermentasyon ürünü olarak CO2 oluşturdukları halde, homofermentörler ya çok az CO2 oluştururlar ya da hiç CO2 oluşturmazlar. Bu nedenle heterofermentlerin varlığını saptamanın kolay bir yolu, laboratuvar kültüründeki CO2 üretiminin gözlenmesidir. Tablo 12.23'te görülen çeşitli laktik asit bakteri cinsleri hücre morfolojilerine, DNA baz bileşimlerine, filogenilerine ve fermentatif metabolizmalarına göre tanımlanmışlardır. Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc ve Pediococcus cinsle-
rinin üyeleri oldukça benzer DNA baz oranlarına sahiptir; buna ek olarak sustan susa oldukça az değişkenlik gözlenir. Öte yandan Lactobacillus cinsi DNA bileşimi bakımından birbirinden oldukça farklı üyeler içerir; dolayısıyla homojen bir grup oluşturmaz. Streptococcus ve Diğer Koklar Streptococcus cinsi (Şekil 12.54») habitatları birbirinden oldukça farklı homofermentatif türler içerir. Bazı türler hayvanlar ve insanlar için patojeniktir (oceaKısım 26.2). Diğer streptokoklar ise laktik asit üreticisi olduklarından yayık ayranı, hayvan yemi ve diğer fermente ürünlerin üretiminde önemli rol oynarlar («sssKısım 29.2). Bazı türler diş çürümesinin temel nedenidir (£«sKısım 21.3). Patojenik olmayan streptokokları insanlar için patojen özellik taşıyanlardan ayırmak için üç cins tanımlanmıştır. Lactococcus cinsi süt ürünleri üretimi açısından önemli streptokokları içerirken, Enteroccoccus cinsi fekal kaynaklı streptokokları içerir.
• Şekil 12.54 Cram-pozitif kokların faz-kontrast (a) ve taramalı elektron (b) mikrograflan. (a) Lactococcus lactis. (b) Streptococcus sp. Her ikisinde de hücreler yaklaşık 0,5-1 /um çapındadır.
Streptococcus cinsindeki organizmalar Tablo 12.24'te gösterilen özelliklerine göre iki benzer gruba ayrılmıştır. Bu cinsin altdiviziyolara ayrılmasında kanlı ağardaki hemoliz oldukça önemlidir. Streptolizin O veya S üreten suşlarm kolonileri tamamen hemolize uğramış kırmızı kan hücrelerinden oluşan geniş bir zon ile çevrelenmiştir. Bu olay /3 hemoliz olarak adlandırılır (öo&Şekil 21.17a). Diğer yandan birçok streptokok, laktokok ve enterokok hemolizin üretmez; bunun yerine kanlı ağar üzerindeki koloniler etrafında yeşilimsi veya kahverengimsi zonlar oluşmasına neden olur. Bu durum gerçek bir hemolizden kaynaklanmaz. Bu görünümün nedeni, kırmızı kan hücrelerinin renginin bozulması ve hücrelerin potasyum kaybetmesidir. Bu tip reaksiyon a hemoliz olarak adlandırılır. Streptokoklar ve benzerleri özgül karbohidrat antijenlerin bulunup bulunmamasına göre de immünolojik gruplara ayrılırlar. Bu antijenik gruplar (ya da yaygın adıyla Lancefield grupları; Streptococcus taksonomisinde öncü olan Rebecca Lancefield'e ithafen) harflerle gösterilir; A'dan O'ya kadar olanlar yakın zamanda tanımlanmıştır. İnsanlarda bulunan /3-hemolitik streptokoklar genel olarak A grubu antijenleri içerirken, enterokoklar D grubu antijen içerirler. B grubu streptokoklar genellikle hayvanlarda bulunurlar ve ineklerde mastitis'e (meme iltihabı) neden olurken ayrıca bazı insan enfeksiyonları ile de ilişkilidirler. Laktokoklar N grubu antijen içerirler ve patojenik değildirler. Leuconostoc cinsi heterofermentatif koklar içinde yer alır. Leuconostoc suşları sitrat metabolizması ile tatlandırıcı özellikteki diasetil ve asetoin üretir. Bu suşlar süt ürünleri üretiminde fermentasyon için başlangıç kültürü olarak kullanılmaktadır. Bazı Leuconostoc suşları sükroz üzerinde üretildiğinde fazla miktarda dekstran polisakkaritler (a-1,6 glukan) üretmekte olup (co^Şekil 17.64), bunların bazıları kan nakillerinde plazma katkı maddesi olarak tıpta kullanım alanı bulmuştur. Diğer Leuconostoc suşları levanlar adı verilen fruktoz polimerleri gibi bazı polimerleri üretirler.
378 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
Tablo 12.24
Grup
Streptokoklar, laktokoklar ve entrokokların ayırıcı özellikleri
Antijenik gruplar (Lance field)
Streptococci Pyogenes altgrubu Viridans altgrubu Enterococci
-
Lactococci
N
A,B,C,F,G
D
Örnek Türler Streptococcus pyogenes Streptococcus mutans Enterococcus faecalis Lactococcus lactis (bak Şekil 12.54a)
Kanlı ağardaki İyi hemoliz üreme tipi 10° C'de 45° C'de Liziz (;3) Yeşillenme (a) Liziz (/S) yeşillenme ya da hiçbiri Yok
+
60° C'de 30dk canlı kalma
Breme %0.1 metilen mavisi içeren
sütte
%40 safra asitli brothda
-
-
-
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
Habitat
Solunum yolları, sistemik Ağız, sindirim kanalı Sindirim kanalı, vajina, bitkiler
• +
+
Bitkiler, süt ürünleri
Lactobacillus Laktobasiller tipik olarak çubuk şeklinde bakterilerdir. İnce, uzun ya da kıvrık kısa şekillerde olabilirler (Şekil 12.55»). Çoğu tür homofermentatif olmakla birlikte, heterofermantatif olanları da vardır (Tablo 12.23). Laktobasiller süt ürünlerinde yaygın olarak bulunur; bazı suşlar ise fermente edilen süt ürünlerinin yapımında kullanılır. Örneğin, Lactobacülus delbrueckii (Şekil 12.55c) yoğurt yapımında, L. acidophilus (Şekil 12.55a) asidofilik süt üretiminde, diğer bazı türler ise salamura, hayvan yemleri ve turşu yapımında kullanılır (ö°öKısım 29.2). Laktobasiller asidik koşullara diğer laktik asit bakterilerinden çok daha dirençlidirler ve 4 gibi düşük pH'larda rahatlıkla ürerler. Bu nedenle, bol karbohidrat içeren (örneğin domates suyu ve pepton içeren) zenginleştirilmiş asidik ortamlar kullanılarak doğal materyallerden seçici olarak izole edilebilirler. Laktobasillerin asit direnci onlara, laktik asit fermentasyonu sırasında, pH değeri diğer laktik asit bakterilerinin yaşayabileceği seviyenin altına düştüğünde dahi üreme olanağı sağlar. Bu nedenle laktobasiller genel olarak laktik asit fermentasyonlarının son basamaklarından sorumludurlar. Her zaman olmasa da bazen patojen olabilirler. Listeria Listeria gram-pozitif kokobasillerdir. Üç ile beş arasında değişen sayıda hücre zincir oluşturmak üzere dizilme eğilimindedir (öooŞekil 29.9). Listeria filogenetik olarak Lactbacillus türlerine benzer ve homofermentatif laktik asit bakterileri gibi glukozdan asit oluşturur, fakat gaz oluşmaz. Ancak, gerçek laktik asit bakterileri, mutlak oksijensiz koşullarda gelişebilme yeteneğindedirler ve katalaz enziminden yoksundurlar. Buna karşılık Listeria, üremek için mikrooksik veya tam oksijenli koşullar gereksinir ve katalaz üretir. Listeria'nm. bir çok türü bilinmesine rağmen, besin kaynaklı önemli bir hastalık olan listeriosis (sooKısım 29.10 ve Şekil 29.9) etkeni olan L. monocytogenes en çok ilgi çeken türdür. Bu orga-
• Şekil 12.55 Lactobacillus türlerinin faz-kontrast ve elektron mikrografları. (a) Lactobacillus delbrueckii Hücreler yaklaşık 0,75 genişliğindedir. (b) Lactobacillus brevis, transmisyon elektron mikrografı. Hücreler 0,8X2 /xm ölçülerindedir. (c) Lactobacillus delbrueckii, tarayıcı elektron mikrografı. Hücreler yaklaşık 0,7 /xm çapındadır. Lactobacillus'un hem heterofermentative hem de homofermentative türleri bilinmektedir(Şekil 12.53 ve Tablo 12.23'e bakınız).
12 20 • Endospor-Oluşturan, Düşük GC'li, Gram-pozitif Bacteria: Bacillus, Clostridium ve Akrabaları • 379
nizma kontamine olmuş besinlerle, genellikle hazır yiyeceklerle (peynir yaygın bir aracıdır) bulaşır ve hafif hastalıklara neden olabildiği gibi, ölümcül menenjit formuna kadar değişen diğer hastalıklara da sebep olabilir.
12.20
Endospor-Oluşturan, Düşük GC'li, Gram-pozitif Bacteria: Bacillus, Clostridium ve Akraba Gruplar
Anahtar Cinsler: Bacillus, Clostridium, Sporosarcina, Heliobacterium Endospor-oluşturan birçok bakteri cinsi tanımlanmış olup (Tablo 12.25), bu tanımlamada hücre morfolojileri, biçimleri, endosporun hücredeki yerleşimi (Şekil 12.56»), O2 ile olan ilişkiler ve enerji metabolizması temel alınmıştır. Kısım 4.13'te bakteriyal endospor oluşum süreci, yapısı ve ısıya direnci tartışılmıştı. Endospor oluşturan organizmaların tümü filogenetik olarak "düşük GC" grubuna dahil olan gram-pozitif Bacteria'dır. En çok çalışılan iki cinsten biri olan Bacillus'un türleri aerob veya fakültatif aerob iken, Clostridium cinsi tamamen anaerobik, fermentatif türleri içermektedir. Endospor oluşturan gruplardan birisi olan helioBacteria fototrofiktir {Helio kelimesi Yunanca'da güneş anlamına gelir). Endospor-oluşturan bakteriler arasında önemli oranda genetik heterojenlik bulunur. Örneğin, Bacillus türlerindeki GC oranı yaklaşık olarak %40 oranında çeşitlilik gösterir. Endospor-oluşturan bakteriler doğada özellikle toprakta bulundukları için, ekolojik olarak birbirleri ile ilişkilidirler. Bu organizmaların insanlar ve hayvanlar için patojen olanları aslında saprofit toprak organizmalarıdır ve konakçıları tesadüfen enfekte ederler. Endospor oluşturabilme yeteneği, toprak organizmaları için Tablo 12.25
bir avantajdır; çünkü toprak, besin değeri, sıcaklık ve su aktivitesi bakımından oldukça fazla çeşitlilik gösteren doğal bir çevredir. Dolayısıyla, uzun süre (belki de milyonlarca yıl, o°öKısım 4.13) dormant halde kalabilen, ısıya ve kurumaya dayanıklı yapılar doğadaki yaşam mücadelesinde oldukça avantajlıdır. Endospor-oluşturan bakterileri topraktan, besinlerden, tozdan ve diğer materyallerden seçici olarak izole etmek için örnek 80°C'de 10 dakika muamele edilir. Pastörizasyon adı verilen bu işlem vejetatif hücreleri etkili bir şekilde öldürdüğü halde, endosporların canlı kalmasına olanak verir. Isı ile muamele edilmiş örnekler uygun ortamlar içeren plaklara ekilir ve Bacillus türleri aerobik, Clostridium türleri ise anaerobik koşullarda inkübe edilerek kolayca üretilir. Bacillus ve Paenibacillus Tablo 12.26'da Bacillus grubuna ait bazı örnek türler listelenmiştir. Bacillus ve Paenibacillus türleri herhangi bir karbon kaynağı içeren tanımlı ortamlarda oldukça iyi gelişirler. Birçok basil ürettikleri hücredışı hidrolitik enzimler sayesinde polisakkarit (c«öŞekil 17.63), nükleik asit ve lipid gibi kompleks polimerleri yıkarak, bunları karbon kaynağı ve elektron vericisi olarak kullanabilir. Basillerin çoğu basitrasin, polimiksin, tirosidin, gramisidin ve sirkulin gibi antibiyotikler üretir. Birçok durumda bu antibiyotikler, kültürün üremenin durgunluk fazına girmesi ve sporlanmaya başlamasının ardından, sporlanma sırasında salınır. Bazı basiller, özellikle de P. popilliae ve B. thuringiensis, böcek larvasitleri üretirler. Paenobacülus popilliae kınkanatlı Japon böceğinin ve bunun yakın akrabası olan Scarabaeidae familyasına dahil böceklerin larvalarında süt-hastalığı (milky disease)
Endospor oluşturan önemli bakteri cinsleri9
Özellikleri Basiller Aerobik veya fakültatif, katalaz üretir Mikroaerofilik, katalaz yok;homofermemtatif laktik asit üreticisi Anaerobik: Sülfat redüksiyonu Sülfatı redükte etmez, fermemtatif Termofilik,optimum sıcaklık 67-700C,fermemtatif Gram-negatif; H2+CO, üzerinde homoasetojen olarak üreyebilir Halofil,Ölü Deniz'den izole edilmiştir Hücre başına 5'e kadar spor üretir; N2 fikse eder Asidofil, optimum pH 3 Alkalifil, optimum pH 9 Fototrofik Sintrofik, yağ asitlerini degrade edebilir ancak sadece H2 kullanan bakterilerle aynı ortamda ürediğinde (ö^Kısım 17.21) Klorofenolleri indirgeyerek deklorine eder (CK^Kısım 17.18) Koklar (çoğunlukla tetratlar veya paketler halinde düzenlenmiş), aerobik
Cins
DNA (mol % GC)
Bacillus Paenibacillus Sporolactobacillus
32-69 40-54 46-47
Desulfomaculatum Clostridium (Şekil 12.56'ya bakınız) Thermoanaerobacter Sporomusa Sporohalobacter Anaerobacter Alicyclobaciüus Amphibacillus Heliobacterium, Heliophüium, Heliorestis Syntrophospora
38-50 21-54 31-39 41-49 31 29 52-60 36-38 50-58 37
Desulfitobacteriutn Sporosarcina(Şeki\ 12.60'a bakınız)
' Filogenetik olarak bütün organizmalar gram-pozitif Bacteria'nm düşük GC'li altdiviziyosundadır
46 40-41
380 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria • Şekil 12.56 Endosporların farklı yerleşimlerini gösteren Clostridium türlerinin faz-kontrast fotomikrografı. (a) Clostiridium cadaveris, terminal sporlar, (b) Clostridium sporogenes, subterminal sporlar. Hücreler yaklaşık 1 fi,m genişliğindedir. (c) Clostridium bifermentans, merkezi sporlar. Hücreler yaklaşık 1,2 /un çapındadır.
denilen ölümcül bir hastalığa neden olur. Bacillus thuringiensis farklı böcek gruplarının larvalarında ölümcül hastalıklara neden olur. Ancak bazı suşlar etkilenen konakçıya özgüldür. Bu konakçılar arasında ipekböceği, lahanakurdu, çadırtırtılı, ağaçlara zarar veren bir çeşit güve (gypsy moth) gibi lepidoptera üyeleri vardır. Diğer suşlar sivrisinek ve karasinek gibi diptera üyelerini öldürür. Bir diğer grup Colorado patates böceği gibi coleoptera üyelerine özgüdür. B. thuringiensis suşlarının Japon böcekleri üzerinde toksik etkisi olduğu da keşfedilmiştir. B. thuringiensis ve P. popilliae''den elde edilen spor preparasyonları biyolojik insektisitler olarak satılmaktadır. Paeniobacillus popilliae'xm\ neden olduğu has-
talık septisemi iken, B. thuringiensis zehirlenmeye neden olur. Her iki böcek patojeni de sporlanma sırasında parasporal cisim adı verilen kristal yapıda bir protein oluşturur. Bu protein sporangium içinde, ancak endosporun hemen dışında depo edilir (Şekil 12.57»). B. thuringiensis''in kristal proteini (parabazal cisimcik) larvanın bağırsağında proteolitik yıkımla toksine dönüşen bir protoksindir. Toksin bağırsak epitel hücrelerine bağlanır ve lizizi takiben konakçı hücrelerinin sızıntı yapmasına yol açan por oluşumunu teşvik eder.
Çeşitli B. thuringiensis suşlarmdan kristal proteinleri kodlayan genler izole edilmiştir. B. thuringiensis'in kristal proteinini kodlayan genler (ticari olarak "Bt-toksini" olarak bilinir) bitkileri böceklere karşı 'doğal' dayanıklı hale getirmek için bitkilere aktarılmıştır. Ayrıca genetik mühendisliği yöntemleri ile toksisiteyi artırmak ve direnci düşürmek için genetik olarak değiştirilmiş çeşitli Bt-toksinler geliştirilmiştir («»»Kısım 31.10). Clostridium Clostridia türleri solunum zincirinden yoksun olduğu için, Bacillus türlerinin aksine, sadece substratdüzeyinde fosforilasyon ile ATP elde eder. Bu organizmalarda anaerobik yolla enerji elde etmeyi sağlayan birçok mekanizma bulunur (fermentatif çeşitlilik Kısım 17.20'de tartışılacaktır). Clostridium cinsinin alt gruplara ayrılması, bu özelliklerine ve kullanılan fermente edilebilir substratın niteliğine göre yapılır (Tablo 12.27). Clostridiumların birçoğu, fermente ettiği şekerlerden son ürün olarak genelde bütirik asit elde eder. Bunlardan bazıları aseton ve bütanol da oluşturabilir. Clostridiumların yaptığı aseton-bütanol fermentasyonu endüstriyel açıdan bu maddelerin
Tablo 12.26 Temsilci Bacillus türlerinin özellikleri
Özellikler
Cins/Tür
I. Endosporlar oval veya silindirik, fakültatif aeroblar, kazein ve nişasta hidrolizi yapar, sporangia şişkin değil, endospor duvarı ince Termofil ve asidofiller
Bacülus coagulans Alicyclobacülus acidocaldarius Bacillus licheniformis Mezofiller Bacillus cereus Bacillus anthracis Bacillus megaterium Bacillus subtüis Böcek patojeni Bacillus thrungiensis Sporangia belirgin şekilde şişkin, spor duvarı kalın Termofil Mezofil
Böcek patojeni II. Endosporlar küresel, zorunlu aerob, kazein ve nişasta hidrolizi yapamaz Sporangia şişkin Sporangia şişkin değil
Geobacillus stearothermophilus Paenibacillus polymyxa Bacillus macerans Bacillus circulans Paenibacillus larvae Paenibacillus popilliae
1
Endospor yerleşimi
DNA (mol % CC)
Merkezde veya uçta Uçta Merkezde Merkezde Merkezde Merkezde Merkezde Merkezde
47 60 46 35 33 37 43 34
Uçta Uçta Uçta Merkezde veya uçta Merkezde veya uçta Merkezde
52 44 52 35 41
1 i
f Bacillus sphaericus Sporasarcina pasteurü
Uçta Uçta
37 38
j
12 20 • Endospor-Oluşturan, Düşük CC'H, Gram-pozitif Bactcria: Bacillus, Clostridium ve Akrabaları • 381 Endospor
Kristal
• Şekil 12.57 Böcek patojeni Bacillus thuringiensis'delü toksik parasporal kristal. Spor oluşturan hücreye ait ince kesitin elektron mikrografı. Kristalin protein (B-toksin) çoğu böceğin sindirim sistemi hücrelerini parçalayarak toksik etki yapar.
esas kaynağı olması bakımından önem taşımıştır. Aseton-bütanol tipindeki bazı clostridiumlar azot fiksasyonu yapar. En güçlü N2 fiksasayonu yapan Clostridium pasteurianum
muhtemelen topraktaki
anaerobik azot fiksasyonunun çoğundan sorum-
Tablo 12.27
j
Bazı clostridia gruplarının özellikleri
Anahtar özellikleri I.
ludur. Clostridiumların bir grubu selülozu asit ve alkollere yıkarak fermente eder. Bunlar topraktaki selülozu anaerobik olarak parçalayan en önemli organizmalardır. Şekerlerden bütirik asit ve bütanol oluşumunun biyokimyasal basamakları oldukça iyi çalışılmıştır (Şekil 12.58*). Glukoz, Embden-Meyerhof metabolik yoluyla piruvata yıkılır. Piruvat ise fosforoklastik tepkime aracılığı ile asetil-CoA, CO2 ve hidrojene (indirgenmiş ferrodoksin aracılığı ile) yıkılır («»öKısım 17.19 ve Şekil 17.51). Daha sonra asetil-CoA glikolitik tepkimelerden elde edilen NADH ile fermentasyon ürünlerine indirgenir. Çeşitli ürünlerin miktarları fermentasyon süresi ve koşullarından etkilenir. Bütirik fermentasyonunun erken safhalarında, bütirik asit ve asetik asit baskın ürünlerdir. Ancak ortamın pH'sı düştükçe asitlerin sentezi durur ve nötral ürünler olan aseton ve bütanol birikmeye başlar. Bununla birlikte, eğer CaCO3 kullanılarak ortam nötral pH'da tutulursa, çok az nötral ürün oluşur. Oluşan ürün karışımı üç kısım bütirik asit, bir kısım asetik asit içerir. Bu durum fizyolojik açıdan önem taşır; çünkü nötral ürünlerin oluşumunun aksine, asit üretimi ek ATP sentezine olanak verir (Şekil 12.58).
Diğer özellikleri
Karbohitratı fermente edenle r Selülozu fermente edenler Fermentasyon ürünleri: asetat, laktat, süksinat, etanol, CO2, H2 Şekeri, nişastayı ve pektini Fermentasyon ürünleri: aseton, bütanol, etafermente edenler nol, izopropanol, bütirat, asetat, propionat, süksinat, CO2, H2; bazıları N2 fikse eder Birincil olarak şekerleri asetik asite fermente edenler
CO2'den asetatın tamamen sentezi; bazı türlerde sitokrom var
Sadece pentoz ya da metilopentozları fermente edenler
Sol yönlü (left-handed) oluşmuş yüzük şekilli hücreler,helikal zincirler; fermentasyon ürünleri: asetat, propionat, n-propanol, CO2, H2 Fermentasyon ürünleri: asetat, diğer yağ asitleri, NH3, CO2, bazen H2 bazıları ayrıca şekerleri bütirata ve asetata fermente eder; ekzotoksin üretebilir
II. Amino asitleri fermente edenler
III. Karbohidratları veya amino asitleri fermente edenler IV. Pürini fermente edenler V. Etanolu yağ asitlerine fermente edenler
Glukozdan fermentasyon ürünleri: asetat, format, az miktarlarda izobütirat ve izovalerat Ürik asit ve diğer pürinleri fermente eder, asetat, CO2 ve NH 1 oluşturur Bütirat, karporat ve H2 üretir; elektron alıcısı olarak asetata ihtiyaç duyar; şekerleri, amino asitleri ve pürinleri kullanmaz
Tür
DNA (mol % GC)
C. cellobioparum" C.thermocellum C. butyricum C. acetobutylicum C. pasteurianum C. perfringens C. acetkum Mooerella thermoacetka C. formicaceticum C. methylpentosum
28 38-39 27-28 28-29 26-28 24-27 33 54 34 46
C.sporogenes C. tetani C.botulinum
26 25-26 26-28
C. tetanomorphum C. propionicum C.bifermentans
25-28 35 27
C.acidurici
27-30
C. kluyveri
30
""C." ile başlayan bütün türler Clostridium cinsindendir. •
382 • Bolum 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
Diğer bir grup clostridia enerjilerini amino asitleri fermente ederek elde eder. Bazı türler tek bir amino asiti fermente ederken, bazıları da yalnızca amino asit çiftlerini fermente eder. Bu durumda biri elektron vericisidir ve oksitlenmiştir, diğeri ise elektron alıcısı olarak çalışır ve indirgenmiştir. Bu tip eşleşmiş amino asit yıkımı Stickland reaksiyonu olarak bilinir. Örneğin, Clostridium sporogenes Şekil 12.59»'da gösterildiği gibi glisin ve alanin karışımını katabolize eder. Stickland reaksiyonlarında elektron alıcıları ya da vericileri olarak çalışabilen çeşitli amino asitler de Şekil 12.59'da listelenmiştir. Stickland oksidasyonunun ürünleri her zaman N H y CO2 ve oksitlenen amino asitten bir eksik sayıda karbon atomu taşıyan bir karboksilik asittir (Şekil 12.59). Tek başına fermente edilebilen amino asitler alanin, sistein, glutamat, glisin, histidin, serin veya treonindir. Ürünler genellikle asetat, bütirat, CO2 ve H2'dir. Clostridiumların amino asitleri fermente etmesi sonucunda oluşan ürünler kötü kokuludur ve bu kötü koku clostridial aktiviteyle oluşmuş kokuşmanın (pütrefikasyon) sonucudur. Bütirik aside ek olarak, üretilen diğer kokulu bileşikler Glukoz i Glikoliz
Asetol"
Piruvat"
ATP
t Fosforoklastik tepkimereaction
ADPAsetil ~P«—*Asetil-CoA + CO 2 + Fd kırmı | t - • •*•! Asetaldehit
T' Etanol
1-Asetil-CoA
I
Asetoasetil-CoA — — — •• Asetoasetal" CO 2
C H 3 - CO- C H 2 - C O - CoA 2H
Aseton CH 3 —CO-CH 3 |«i Izopropanol CH3-CHOH-CH3
P-Hidroksibütiril-CoA H20*-| Krotonil-CoA 2H Bütiril-CoA
Bütiraldehit
A n p ADP
A T p
Bütinat C H 3 - C H 2 - C H 2 - COO"
Butanol C H 3 - C H 2 - C H 2 - CH2OH
• Şekil 12.58 Clostridia'daki bütirik asit grubundan üretilen fermentasyon ürünlerinin metabolik oluşum yolu. "2H" işareti bir molekül NADH'dan gelen 2 elektronu gösterir. Asetat ve bütirat üretiminin sonucunda substrat düzeyinde fosforilasyonla fazladan ATP'nin nasıl ortaya çıktığına dikkat ediniz(öcfeKısım 17.19). Aksine, bütanol ve aseton(bu ürünler tipik olarak 1:1 oranında bulunur çünkü bütanol oluşumunda 2 NADH gerekliyken; aseton oluşumunda NADH gerekli değildir) oluşumu ATP deposunu tüketir çünkü bütiril coA'dan Bütirata dönüşüm aşaması atlanmıştır.
izobütirik asit, izovalerik asit, kaproik asit, hidrojen sülfit, metilmerkaptan (kükürtlü amino asitlerden), kadaverin dizinden), putresin (ornitinden) ve amonyaktır. Clostridiumların asıl doğal habitatı toprak olup, topraktaki anoksik 'ceplerde' yaşarlar. Bu oksijensiz ortam, fakültatif organizmaların organik maddeleri metabolize etmesi sonucunda oluşur. Ayrıca, bazı clostridiumlar memelilerin bağırsağındaki oksijensiz ortamda yaşar. Bunun yanı sıra, Kısım 21.8'de tartışıldığı üzere çeşitli clostridiumlar bazı özel koşullarda insanlarda hastalık etkeni olabilmektedir. Clostridium botulinum botulizme, C. tetani tetanoza, C. perfringens gazlı kangrene ve hem amino asit hem de şeker fermentasyonu yapan diğer clostridiumlar birçok hastalığa neden olur. Bu patojen organizmaların metabolizmalarında alışılmadık bir durum gözlenmemekle birlikte özgül toksinler ya da gazlı kangrende olduğu gibi bir grup toksin üretmeleriye ayırt edilirler (o^Kısım 21.10 ve Tablo 21.4). C. perfringens ve bunun akrabası olan türler ayrıca insanlarda ve evcil hayvanlarda gastroenterite (mide-bağırsak iltihabı) neden olabilir («»»Kısım 29.6) ve koyunlarda, ördeklerde ve başka bazı hayvanlarda botulizm görülebilir. Bu toksinlerin organizmanın doğal habitatında ne gibi bir rol oynadığı çözülemeyen ekolojik bir sorun olmayı sürdürmektedir. Sporosarcina Sporasarcina cinsi endospor oluşturan organizmalar arasında benzersizdir; çünkü bunlar basil değil kok şeklindedir. Sporosarcina küreselden ovale kadar değişen şekillerde olabilen zorunlu aerob hücreler içerir. Bu hücreler birbirine dik iki ya da üç düzlemde bölünerek dört, sekiz ya da daha fazla hücreden oluşan paketler oluşturur (Şekil 12.60*). Sporosarcina'mn en önemli türü S. ureae'dır. Bu organizma (Şekil 12.60), pastörize edilmiş toprak örneğinden hazırlanan sulandırımların %8 üre içeren bazik nutrient ağara ekilerek inkübe edilmesiyle, zenginleştirilerek elde edilebilir. Çoğu toprak bakterisi %2 gibi az bir miktar üre ile kuvvetle inhibe olur. Ancak S. ureae yüksek miktarlardaki üreyi CO2 ve NH 3 'e yıkabilir ve bu sırada pH'yı yükseltir. S. ureae bazik koşullara olağanüstü tolerans gösterir ve pH'sı 10'a kadar olan ortamlarda gelişebilir. Bu özellikten yararlanılarak bu organizma topraktan izole edilir. Sporosarcina ureae toprakta oldukça yaygın olarak bulunur. Bu konudaki çalışmalar, hayvanların sürekli olarak idrar (üre kaynağı olarak) yaptığı topraklarda S. ureae sayısının çok fazla olduğunu ortaya çıkarmıştır. Toprak organizmalarının çoğu üreye oldukça duyarlı olduklarından, bu sonuçlar doğadaki en temel üre parçalayıcısı olan S. ureae'nm ekolojik önem taşıdığını gösterir. HelioBacteria HelioBacteria, GC oranı düşük, gram-pozitif fototrofik bakterilerdir. HelioBacteria oksijensiz (anok-
12.21 4 Hücre Duvan Bulunmayan, GC Oranı Düşük Gram-Pozitif Bacteria: Mikoplazmalar « 383
Oksidasyon basamakları
Redüksiyon basamakları
Eşli fermentasyona katılan Amîoasitler (Siticland reaksiyonu)
Glisin H2C -COO"
Okside edilen amino asitler: Alanin Lösin Izdösin Valin Histidir
NH 2
-2P;
Asetil ~ P A D P
[H3C-COO"] Asetat" Toplam: Alanin + 2 Glisin
2 Acetyl , Substrat düze- — yinde fosforilasyon
P 2ADP
2 ATP
2 Asetat"
+ 2 H 2 O + 3 ADP + 3 P, •
2[H 3 C-COCr] + 2 NH 3
3 Asetat"
sijenik) fototrof olup, bakteriyoklorofil g adı verilen benzersiz bir bakteriyoklorofil üretir (oo^Kısım 17.2). Bu grup Heliobacterium, Heliophilum, Helio-
restis ve Heliobacillus olmak üzere dört cins içerir. Bilinen Heliobacteriumlarm tümü çoğunlukla sivri uçla sonlanmış kısa ya da uzun çubuklar şeklindedir (Şekil 12.61 •). Heliophilum morfolojik olarak ilginçtir, çünkü bunun basil şeklindeki hücreleri demet (Şekil 12.61b) halinde organize olur ve bu demet bir bütün halinde hareket eder. HelioBacteria zorunlu anaerobtur. Ancak anaerobik fototrofik olarak gelişmesine ek olarak karanlıkta piruvatı fermente eder ve kemoorganotrofik olarak da üreyebilir (helioBacfcnanm yakın akrabaları olan çoğu clostridiumlar gibi). Bacillus ya da Clostridium türlerinin endosporları gibi, helioBacteria endosporları da (Şekil 12.61c) çok miktarda Ca2+ ve endosporun tanımlayıcı molekülü olan dipiko-
+ CO 2 + 3 NH 4 + + 3 ATP
Redukte edilen amino asitler: Glisin Prolin Hidrolesipoli Triptofan Arjinin
• Şekil 12.59 CJosfridiıun sporogenes'&e alanin ve glisin arasındaki eşleşmiş yükseltgeme-indirgeme reaksiyonu (Stickland reaksiyonu). Anahtar substratlann, aracılann ve ürünlerin yapılan devam eden reaksiyonun kimyasal yapısını açıklamak için (parantez içinde) gösterilmiştir. Gösterilen reaksiyonda glisin elektron alıcısıyken alaninin nasıl elektron vericisi olduğuna dikkat ediniz.
linik asit (öOöKısım 4.13) içerir. Heliobacteriumlar toprakta ve özellikle pirinç tarlalarının olduğu topraklarda yaşar ve kuvvetli N 2 fiksasyonu aktivitesi ile pirinç üretimine faydalı olurlar. Oldukça bazik özellikteki sodalı göllerde ve bu göllerin etrafını çevreleyen bazik topraklarda çok sayıda heliobacterium çeşidi bulunmuştur.
•m12.19-12.20 Kavramlana Gözden Geçirilmesi
"Düşük GC'li, gram-pozitif bakteriler basil ve kokları, sporlanan ve sporlanmayan türleri içeren büyük bir filogenetik gruptur. Endospor oluşumu ise özellikle Bacillus ve Clostridium cinslerinin en göze çarpan özelliğidir. Gram-pozitif bakteriler topraktaki organik maddenin yıkımından sorumlu olan başlıca organizmalardır. Bunların az sayıdaki türü patojeniktir. •
Staphylococcus'u Bacillus'tan ayıran başlıca özellikler nelerdir? • Heterofermentatif ve homofermentatif laktik asit bakterilerini birbirinden nasıl ayırt edersiniz? • Bacillus ve Clostridium türleri arasındaki en önemli fizyolojik farklılıklar nelerdir? • Endospor oluşturan cinsler içinde sadece heliobacter'lere ait olan özellikler nelerdir?
Hücre Duvan Olmayan, GC Oranı
12.21 Düşük Gram-Pozitif Bacteria: Mycoplasma'Iar
• Şekil 12.60 Sporosarcina ureae hücrelerinin faz-kontrast fotomikrografı. Tek bir hücre yaklaşık 2 /xm genişliğindedir. Çoğu hücre paketi sekiz hücre içerir.
Anahtar Cinsler: Mycoplasma, Spiroplasma Mikoplazmalar hücre duvarı olmayan ve hücre duvarı olan forma dönüşemeyen mikroorganizmalardır. Bağımsız olarak büyüyüp gelişebilen en küçük mikroorganizmalardır. Çok basit hücre yapıları ve çok küçük genoma sahip olmaları evrimsel açıdan bunları ilginç kılmaktadır. Hücre
384 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
(c)
• Şekil 12.61 Heliobakter hücre ve endosporlan. (a) Heliobacillus mobilis'in elektron mikrografı, peritriş kamçılı bir tür. (b) Heliophilum fasciatum, grup elektron mikroskobu ile gözlenmiştir, (c) Heliobacterium gestü'ye ait endosporlann faz mikrografı.
duvarları olmadığından gram-pozitif boyanmıyor olmalarına rağmen bu organizmalar, filogenetik olarak düşük GC oranına sahip olan gram-pozitif Bacteria ile akrabadır. Bu organizmalar muhtemelen bir zamanlar hücre duvarına sahipti. Ancak özel habitatlara yerleşme sürecinde duvarlarını kaybetmişlerdir. Mikoplazmalar parazitik canlılardır ve çeşitli hayvan ve bitkileri konakçı olarak kullanırlar. Mikoplazmalann Özellikleri
Elektron mikroskop incelemelerinde mikoplazmalann hücre duvarından yoksun olduğu gözlenmiştir. Bu bulgu kimyasal analizlerle de desteklenmiş ve muramik asit, peptidoglikan ve diaminopimelik asit içermedikleri saptanmıştır (öOöKısım 4.8). Bölüm 4'te ozmotik olarak dengelenmiş bir ortamda hücrelerin nasıl protoplast haline dönüştüğü ele alınmıştı. Ozmotik dengeleyici ortamdan uzaklaştırıldığında protoplastlar su alır, şişer ve patlarlar (Şekil 4.33). Mikoplazmalar hücre duvarlarının olmayışı ile protoplastlara benzemekle birlikte ozmotik lizize karşı daha dirençlidirler ve protoplastların lizize uğradığı koşullarda hayatta kalırlar. Ozmotik lizize karşı dayanıklılık sağlayan başlıca etmen, mikoplazmalann hücre zarlarını diğer prokaryotlannkinden daha kararlı kılan sterol varlığıdır (cc^sKısım 4.5). Bazı mikoplazmalar büyüme ortamında sterollerin bulunmasını gereksinir. Sterol gereksinimi, mikoplazmaları iki gruba ayırmak için kullanılan temel kriterdir (Tablo 12.28). Sterollere ek olarak, çoğu mikoplazma lipoglikan olarak adlandırılan bileşikler içerir (Tablo 12.28). Lipoglikanlar, zar lipidlerine kovalent bağlı uzun heteropolisakkarit zincirleri olup, birçok mikoplazmanın sitoplazmik zarı içine gömülüdür. Lipoglikanlar gram-negatif bakterilerdeki lipopolisakkaritlere (LPS) benzerler (oo&Kısım 4.9), ancak lipid A omurgasından ve bakteriyal LPS'nin tipik bileşeni olan fosfattan yoksundurlar. Lipoglikanlar hücre zarını sağlamlaştırmaya yardımcı olurlar ve mikoplazmalann hayvan hücrelerindeki yüzey reseptörlerine tutunmasını sağlarlar. Lipopolisakkaritler gibi lipoglikanlar da deney hayvanlarına enjekte edildiğinde antikor sentezini stimüle ederler.
Mikoplazmalann Üremesi
Mikoplazma hücreleri küçük ve değişik formlara sahip hücrelerdir. Bu biçim çeşitliliği hücre duvarından ve dolayısıyla rijiditeden yoksun olmalarının bir sonucudur. Aynı kültür içinde küçük kok şeklinde elemanlar, daha büyük şişkin formlar, değişik uzunluklarda ve genellikle dallanmış filamentöz formlar bir arada bulunabilirler (Şekil 12.62»). Kok şeklindeki küçük elemanlar (0.2-0.3 /j-m büyüklüğünde) bağımsız üreyebilme yeteneğine sahip en küçük mikoplazma birimleridir. Mikoplazma kültürlerinde sıklıkla bu hücrelerin yaklaşık 0.1 fjbva çapa sahip türevleri bulunmakla birlikte, bunlar canlı değildir. Diğer bir deyişle, minimum 0.2-0.3 /im boyutlara sahip olan ve üreyebilen bu birim serbest-yaşayan en küçük hücreyi temsil eder. (öOöKısım 4.4). Buna ek olarak, çoğu 500-1100 kbç'lik DNA'ya sahip mikoplazmalann genomu birçok prokaryotik genomdan daha küçüktür (Tablo 12.28). Bu büyüklükteki genom zorunlu parazitik olan chlamydia ve rickettsia genomları ile kıyaslanabilir (Bkz. Kısım 12.27 ve 12.13). Mikoplazma genomunun büyüklüğü E. coli genomunun yaklaşık beşte biri ya da dörtte biri kadardır. Bir Mycoplasma türü olan M. genitalium, dizisi tam olarak ortaya çıkarılmış 580 kbç'lik bir genom içerir (csaaKısım 15.3). Bu küçük genomun herhangi bir Bacteria türünün yaşamsal işlevlerini gerçekleştirebilmesi için gerekli DNA miktarının alt sınırına yakın olduğu düşünülmektedir (Bölüm 13'te bir Archaea türü olan Nanoarchaeum'un daha küçük
genoma sahip olduğunu göreceğiz). Mikoplazmalar sıvı kültürlerde ve ağar ortamında farklı üreme gösterirler. Ağar üzerinde bu organizmalar üreme eğiliminde olduğu için besi yeri içine gömülü hale gelirler. Bu koloniler karakteristik bir görünüme sahiptir ve 'sahanda yumurta'ya benzerler. Yoğun özellikteki koloni merkezi ağar içine doğru gömülmüş olup, merkezin çevresi daha açık renkli dairesel bir alan ile çevrelenmiştir (Şekil 12.63«). Tahmin edilebileceği gibi, mikoplazma üremesi hücre duvarı sentezini inhibe eden penisillin, vankomisin ve diğer antibiyotiklerle engellenemez. Ancak, bu mikroorganizmalar da diğer bakteriler gibi hücre duvarı
12.21 • Hücre Duvarı Bulunmayan, GC Oranı Düşük Gram-Pozitif Bacteria: Mikoplazmalar
Tablo 12.28 Cins
385
Mikoplazmalann başlıca özellikleri DNA Genom büyüklüğü (mal % GC) (kilobaz çifti)
Özellikler
Lipoglikanların varlığı
Sterollere ihtiyaç duyanlar Ç°ğ u patojenik; fakülatatif aeroblar (Şekil 12.62'ye bakınız) Sterollere ihtiyaç duyabilir ya da duymaz; zorunlu anaeroblar; nişastayı parçalar, etanol ve CO2 yanında asetik, laktik ve formik asitleri üretir, büyükbaş ve küçükbaş rumeninde bulunur Spiral veya tirbişon şekilli hücreler; birçok fitopatojenik durumla (bitki hastalıkları) ilişkili (Şekil 12.64'e bakınız)
23-41
600-1350
29-33
1500-1600
25-30
940-2200
Ureaplasma
Koksu hücreler; bazen küme ya da kısa zincir halinde; optimal pH 6'da ürer; güçlü üreaz reaksiyonu; insanlarda birçok boşaltım sistemi hastalığıyla ilişkili; tallum asetat tarafından inhibe edilir
27-30
750
Entomoplasma
Fakültatif aerob; böcekler ve bitkilerle ilişkili
27-29
790-1140
27-36 40
1500 1500
27-30
870-1100
Mycoplasma Anaeroplasma
Spiroplastna
Sterollere ihtiyaç duymayanlar Acholeplasma
Fakültatif aeroblar
Asteroleplasma
Zorunlu anaerob; büyükbaş ve küçükbaş rumeninden izole edilmiştir
Mesoplasma
Filogenetik ve ekolojik olarak Entomoplasma ile ilişkilidir "Filogenetik olarak, bilinen bütün mikoplazmalar "Düşük GC" gram-pozitif Bacteria üyesidir.
dışındaki yapıları hedef alan antibiyotiklere karşı duyarlıdırlar. Mikoplazma kültürleri için kompleks besi ortamları gerekir. Birçok mikoplazma türü maya özütü-pepton-sığır kalp infüzyonu içeren kompleks besiyerlerinde bile ya çok az ürer ya da hiç üremez. Taze serum ya da ascitic sıvı, doymamış yağ asitleri ve sterollerin sağlanması için gereklidir. Bazı mikoplazmalar nispeten basit besiyerlerinde üretilebilmekte ancak, bazı türler için tanımlı vasatlar geliştirilmiştir. Çoğu mikoplazma karbon ve enerji kaynağı olarak karbohidratları kullanır ve birçok vitamin, amino asit, pürin ve pirimidin gibi büyüme faktörlerini gereksinir. Mikoplazmalarm enerji metabolizması tek tip olmayıp, çeşitlilik gösterir. Bazı türler kesinlikle aerob iken, diğerleri fakültatif, hatta zorunlu anaerob olabilirler.
Spiroplastna Spiropksma cinsi hücre duvarından yoksun helikal veya spiral şekilli hücreler içerir (c»ûŞekil 12.64). Hücre duvarları ve kamçılan olmayan bu hücreler vida gibi dönerek ya da yavaş bir dalgalanma ile hareket ederler. Bu hareketlilikte hücre içi fibrillerin rol oynadığı saptanmıştır. Bu organizmalar kenelerden, böceklerin hemolenf (Şekil 12.64) ve bağırsaklarından, damarlı bitkilerin sıvılarından, bu sıvılarla beslenen böceklerden, çiçek yüzeylerinden ve bitkilerin diğer bölümlerinden izole edilmişlerdir. Turunçgillerde palamutlaşma hastalığı (citrus stubborn disease) adı verilen hastalığa, mısır bitkisinde mısır bodurlaşma hastalığına (corn stunt)
neden olan Spiroplasma cüri, hasta turunçgillerin yapraklarından ve mısır bitkisinden izole edilmiştir. Hastalıklı bitkilerin elektron mikroskop incelemelerinde mycoplasma-benzeri başka cisimcikler de görülmüştür. Bu durum bitkilerle ilişkili büyük bir mikoplazma grubu olabileceği fikrini vermektedir. Bilinen bazı Spiroplasma türleri balansı spiroplasmosisi'ne ve kınkanatlı bir böcek olan Melolontha'da görülen letarji hastalığı gibi çeşitli
böcek hastalıklarına neden olurlar.
m
• Şekil 12.62 Mycoplasma mycoides'in metal-gölgeleme preparatının elektron mikrografı. Koksu ve hif benzeri yapılara dikkat ediniz. Zincir oluşturan hücrelerin ortalama çapı 0,5 /Ltm'dir.
12.21 Kavramların Gözden Geçirilmesi
Mikoplazma grubu hücre duvarı olmayan ve çok küçük genomlu hücrelere sahip organizmaları içerir. Çoğu türler zarlarını güçlendirmek için sterollere ihtiyaç duyar. İnsanlar, hayvanlar ve bitkiler için patojenik olan mikoplazmalar vardır.
386 • Bölüm 12 • Proharyotik Çeşitlilik: Bacteria
r,f .
i
• Şekil 12.63 Mycoplasma kolonilerinin ağar üzerindeki tipik "sahanda yumurta" görüntüsü. Koloniler yaklaşık 0,5 mm çapındadır. •
Mikoplazmalarm hücre zarları diğer prokaryotların hücre zarlarına göre neden daha güçlü olmak zorundadır? • Mikoplazma grubu filogenetik olarak nerede yer alır? • Neden hareketli spiroplasmalar normal bakteriyal kamçı taşıyamazlar?
12.22
GC Oranı Yüksek Gram-Pozitif
Bacteria (Actinobacteria): Coryneform ve Propiyonik Asit Bakterileri
Anahtar Cinsler: Corynebacterium,Arthrobacter, Propionibacterium GC oranı yüksek gram-pozitif bakteriler kendi şubeleri olan Actinobacteria içerisinde yer alırlar. Bu, 30'dan fazla familya bulunduran büyük bir gruptur (öttsKısım 11.10). Actinobacteria türleri toprak ve bitki materyalleri üzerinde yerleşen, tipik olarak basilden filamentöz şekillere kadar değişen, özellikle aerobik prokaryotlardan ibarettir. Mycobacterium türleri (örneğin Mycobacterium tuberculosis)
gibi dikkate değer istisnalar olmakla birlikte büyük çoğunluğu, zararsız kommensallerdir. Bazıları antibiyotik ve süt ürünlerinin üretimi bakımından önemli ekonomik değere sahiptir. Şimdi çubukşekilli örneklerle başlayacağız. Corynefteferia
7% *i •' ,\ ı . , • "»•,
î
•
•
•
;
.
•
;
^ • ^ •*• 1 * , *
j
w"'-"
:
v. I . . "S ,-. ••••;
•
•'
^
^
^ * 5 :
• Şekil 12.64 Drosophila pseudoobscura sineğinin hemolenfinden elde edilmiş "sex ratio" spiroplasmamn karanlık alan mikrografı. Sex ratio spiroplasma ile enfekte dişi sinekler sadece dişi nesiller oluşturur. Tek bir spiroplasma hücresi 0,15 fim çapındadır. Karanlık-alan mikroskobu bu aşın ince hücreleri görünür hale getirir.
Coryneform bakterilerdeki ana cinsler Corynebacterium ve Arthrobacter'dii. Corynebacterium cinsi
hayvan ve bitkilerde patojen olan, aynı zamanda saprofit çok çeşitli bakteri gruplarını bulundurur. C. diphtheriae (difteri etkeni) gibi bazı türler patojendir (coöKısım 26.3). Öncelikli olarak toprakta yaşayan mikroorganizmaları bulunduran Arthrobacter cinsi Corynebacterium'dan, basil şeklindeki
hücrelerin küresel şekle ve daha sonra tekrar basil şekline dönüşümü şeklindeki gelişim döngüleriyle ayrılırlar (Şekil 12.67). Ancak coryneBacfera'nın bazı üyeleri gelişim süreçlerinde kok şeklinde veya pleomorfik olabilir, bu nedenle bu iki cins arasında, yaşam döngüleri temel alınarak yapılan ayırım kesin değildir. Corynebacterium hücreleri genellikle uç kısımları şişkin hücrelerdir, bu onlara golf sopasışeklinde bir görüntü verir (cins adı olan koryne Yunanca 'sopa' anlamındadır), ancak Arthrobacter türlerinin çok azı golf sopası şeklindedir. Toprakta yaşayan tüm bakteriler arasında en sık rastlanan Arthrobacter cinsine ait mikroorganizmalardır. Spor veya diğer dinlenme hücreleri oluşturmamalarına rağmen besin yokluğu ve kuraklığa önemli ölçüde dirençlidirler. Arthrobacterler heterojen bir grup olup önemli derecede beslenme çeşitliliği gösterir ve bu cinsin; herbisitleri, kafeini, nikotini, fenolleri ve diğer istisnai organik bileşikleri paraçalayan suşları izole edilmiştir.
Coryneform bakteriler gram-pozitif, aerob, hareketsiz, çubuk şeklinde olup, normal uygun gelişme koşullarında düzensiz-şekilli, golf sopası veya V-şeklinde karakteristik düzenlenmeleri gösteren mikroorganizlardır. V-şekilli hücre grupları, hücre bölünmesinin hemen sonrasında kırılma hareketi sonucu meydana gelir (buna bölünme sonrası kırılma hareketi ya da basit olarak kırılarak bölünme denir) (Şekill2.65). Kırılarak bölünme, hücre duvarının iki tabakadan oluşmasından kaynaklanmaktadır; yalnızca içteki tabaka çapraz-duvar oluşumuna katılır, böylece çapraz-duvar oluşumu tamamlandıktan sonra hücre duvarının dıştaki tabakasına tutunmuş iki yeni hücre oluşur. Hücre duvarının dış tabaka• Şekil 12.65 Arthrobacter'de kırılarak bölünme. sındaki kırılma ile kırılan kısımdan itibaren iki hücArthrobacter crystallopoites'te koparak bölünme ile sonuçlare birbirlerinden uzaklaşır (Şekil 12.65) ve bu şekilde nan karakteristik V-şekilli hücre gruplarının fotomikrograflan. V-şekilli formlar oluşur. Hücreler yaklaşık 0,9 fim çapındadır.
12.22 « CC Oranı Yüksek Cram-Pozitif Bacteria (Actinobacteria): Coryneform ve Propiyonik Asit Bakterileri • 387
P) • Şekil 12.66 Arthrobacter'de hücre bölünmesi. Arthrobacter crystallopoites'te kırılarak bölünme ve V-şekılli hücre gruplarının oluşumunu gösteren elektron mikrografı. (a) Dıştaki hücre duvan tabakası kırılmadan önce (ok), (b) Dıştaki hücre tabakasının bir taraftan kırılmasından sonra. Hücreler 0,9-1 /im çapındadır.
Propiyonik Asit Bakterleri
Propiyonik asit bakterileri (Propionibacterium cinsi) ilk kez, fermentasyon ürünü olan CO2'in karakteristik delikler oluşturduğu isviçre (Emmentaler) peynirinden izole edilmişlerdir. Ayrıca, peynirin kendine özgü benzersiz tadını bu bakterilerin oluşturduğu propiyonik asit vermektedir. Diğer bazı bakteriler tarafından da üretilmesine karşın, propiyonik asitin büyük çoğunluğu bu bakteriler tarafından üretilir, bu da bu cinsin ayrımında belirleyicidir. Bu grupta bulunan bakteriler; laktik asiti, karbohidratları, polihidroksi alkolleri fermente eden gram-pozitif anaeroblardır. Öncelikle propiyonik asit, asetik asit ve CO, üretirler. Kompleks besiyerine gereksinim duyarlar ve oldukça yavaş ürerler.
(d)
Şekil 12.68 glukozdan propiyonik asit oluşumundaki enzimatik tepkimeleri göstermektedir. L aktik asit bakterilerinde olduğu gibi glikolitik yolu ilk yıkım olan glukozdan piruvat oluşumu izler, ancak oluşan NADH propiyonik asitin oluştuğu evrede okside olur. Piruvat, metirmalonil-CoA'dan transkarboksilaz reaksiyonuyla bir karboksil grubu alır. Böylece okzaloasetat ve propiyonil-CoA oluşur. Son ürün CoA transferazla katalizlenir ve süksinat ile reaksiyona girer ve bu şekilde suksinilCoA izomeri olan metilmalonil-CoA'ya dönüşür ve döngü tamamlanır (Şekil 12.68). NADH'in oksidasyonu okzaloasetat ve süksinat basamakları arasında gerçekleşir ve yükseltgenme-indirgenme (oksidasyon-redüksiyon) dengesi sağlanır. Propionibacterium, propionat, asetat ve CO2 oluşturmak üzere laktat'ı da fermente edebilir. Laktik asitten propiyonatm anaerboik olarak fermentasyonla oluşumu, birçok bakteri için laktik asitin fermentasyonun son ürünü olması nedeniyle ilginçtir (Kısım 12.19). Propiyonik asit bakterileri diğer bakterilerin oluşturdukları fermentasyon ürünlerinden anaerobik yolla enerji elde edebilme yeteneğine sahiptirler. Bu metabolik yol ikincil fermentasyon olarak adlandırılır. İsviçre peyniri üretiminde laktik asitin propiyonata fermentasyonu önemlidir. Başlangıç kültürü (starter), homofermentatif streptococci-lactobacilli karışımı ve propiyonik asit bakterilerinden oluşur. Birincil fermentasyon homofermentatif mikroorganizmalar tarafından süt kesiğinin oluşumu sırasında laktozun laktik asite dönüşümüyle gerçekleşir. Çökelek (protein ve yağ) tükenmeye başladığında propiyonik asit bakterileri hızla gelişmeye başlarlar. İsviçre peyniri için karakteristik olan gözler (delikler) CO2 gazının kesik içine difüzyonuyla meydana gelir. Fermentasyonda laktat Şekil 12.68 de gösterildiği gibi propiyonata dönüşmek üzere piruvata okside olur. Propiyonat, Propionigenium bakterileri tarafından süksinatm fermentasyonu yoluyla da oluşur. Bu organizma filogenetik ve ekolojik olarak Propionibacterium'la akraba değildir, ancak fermentasyon enerjileri açısından oldukça ilginçtirler. Kısım 17.20'de Propionigenium'larm fermentasyonu ele alınacaktır.
(e)
(t)
(9)
• Şekil 12.67 Arthrobacter globiformis'in kültür üzerinden gözlenen yaşam döngüsü evreleri, (a) Tek bir koksu yapı; (b-e) çubuğa dönüşüm ve predominant çubukları içeren mikrokolonilerin oluşumu; (f-g) çubukların koksu forma dönüşümü. Hücreler yaklaşık 0,9 fj.m çapındadır.
388 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
tüberküloz lezyonunda organizmanın tanımlanmasına neden olmuştur. Daha sonradan bu özellik, Mycobacterium cinsinin tanımlanması için iyi bir taksonomik özellik olmuştur.
3 Laktar L»- 3 NAD
+
3NADH 3 Piruvat
2 okzaloasetat
2
ATP
Aside-Dirençli Boyanma (Ziehl -Neelsen Boyama)
Asetat" + CO 2 + NADH
:
K
2NAD
+
2
2 Malat "
f * 2H2O 2
2 Fumaral " - 2NADH ATP V | V
2
NAD 2
2 Süksinat "
Sitokiometri: 3 Laktat
—
2 Propiyonat" + Asetar + CO 2 + 3-5ATP
• Şekil 12.68 Propionibacterium tarafından laktattan propiyonik asitin oluşturulması. 4 NADH'ın 3 laktatın daha sonradan okzaloasetat ve fumarat redüksiyonunda tekrar yükseltgenen 2 piruvat/asetat+CO2'ye oksidasyonu sırasında oluştuğuna dikkat ediniz.Aynca, propiyonil~ CoA'dan gelen CoA grubunun enerji nötral akışı içindeki propiyonat oluşumu sırasında süksinata aktarılmasına dikkat ediniz.
Actinobacteria: Mycobacterium Anahtar cinsler: Mycobacterium Mycobacterium cinsi gelişme döngüsünün bazı evrelerinde aside-dirençli (asit-fast) boyanma özelliği ile kolaylıkla ayırt edilebilen, çubuk şekilli organizmalardan oluşur. Bu şekilde boyanma özelliği Mycobacterium un kendine özgü olan hücre yüzeyindeki mikolik asit adı verilen bir çeşit lipidten kaynaklanır ki bu lipid yalnızca Mycobacterium cinsinde bulunur. İlk kez, tüberküloz çalışmalarına öncülük eden Robert Koch tarafından tanımlanmıştır (Kısıml.6). Aside-dirençli boyanma özelliği,
Boyama aşamalarında bazik fuksin ve fenol karışımı kullanılır. Boya, yayılmış örneğin bulunduğu mikroskop lamının buharlaşma noktasına kadar 2-3 dakika yavaş ısıtılması ile hücre içerisine girer. Burada fenolün rolü fuksinin lipidler içerisine girmesini arttırmaktır. Distile su ile yıkandıktan sonra, asit-alkol karışımı ile boya giderme (dekolorizasyon) işlemi uygulanır. Tekrar yıkandıktan sonra, karşıt boyama olarak metilen mavisi kullanılır. Aside dirençli boyanmayan bakteriler ve zemin son aşamadan sonra mavi gözlenirken, aside dirençli bakteriler ise kırmızı olarak görülür (öOoŞekil 26.7). Aside dirençli boyama için gerekli olan anahtar yapı mikolik asittir. Mikolik asit dallanmış zincir içeren hidroksilipidlerin meydana getirdiği karmaşık bir gruptur (genel yapısı Şekil 12.69a'da gösterilmiştir). Aside dirençli boyama sırasında, mikolik asitin karboksil gurubu ile fuksin reaksiyona girer (Şekil 12.69b). Ayrıca mikolik asitin Mycobacterium hücre duvarında bulunan peptidoglikan tabakaya kovalent bağlı olması, hücre yüzeyine hidrofobik yoğunlukta mumsu bir kıvam kazandırır. Hücre yüzeyindeki yüksek-lipid içeriğinden dolayı MycoBacteria gram boyama yöntemi ile kolaylıkla boyanamaz. Eğer hücrenin sahip olduğu lipoidal kısım bazik etanol ile uzaklaştırılacak olursa zarar görmemiş olan hücre aside-direnç özelliğini kaybederken gram-pozitif boyanma özelliği kazanır. Mycobacteria'nın Özellikleri
MycoBacteria oldukça pleomorfik olup, dallanma ya da filamentöz büyüme gösterebilen mikroorganizmalardır. Ancak actinomycetes (Kısım 12.24) gurubunun tam aksine mycoBacteria filamentleri, kırılmış basil ve koklardan oluşur ki; bu da karmaşık bir görüntü yaratır. Bu görüntü gerçek mi-
Tablo 12.29 Temsilci mycobacteria'nın bazı özellikleri
I
+ 1
I
Pigmentasyon
I I
I
I Yok Eski koloniler renkli (Şekil 12.70c'ye bakınız) Yok Fotokromojenik
I
Yok Renkli Yok Fotokromojenik
•
+
Hızlı üreyen türler Mycobacterium smegmatis Mycobacterium phlei Mycobacterium chelonae Mycobacterium parafortuitum
İnsan patojeni
1
Mycobacterium bovis Mycobacterium kunsasii
45°C'de üreme
+ 1
Yavaş üreyen türler Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium avium
Nitrat redüksiyonu
I
Tür
%5 NaCl'de üreme
+
12 23 • Actinobacteria: Mycobacterium • 389
+
NH, c r H I
H I
F^-C-C-COCT OH R, (a) Mikolik asit; F^ ve R2 uzun zincir alifatik hidrokarbon
(b) Bazik fuksin
• Şekil 12.69 Aside-dirençli (Asit-fast) boyama. Asidedirençli boyamada kullanılan boya, (a) mikolik asitin ve (b) bazik fuksiıün yapısı. Fuksin boyası COO" ve NH2* arasındaki iyonik bağlar aracılığı ile mikolik asit ile birleşir. selyal yapı değildir. Genellikle mycobacteria Yavaş üreyenler ve hızlı üreyenler olarak iki ana guruba ayrılır (Tablo 12.29). Mycobacterium tuberculosis yavaş
üreyen gurubun tipik bir örneği olup seyreltilerek yapılmış olan ekim sonucunda, birkaç gün-haftalık inkübasyondan sonra gözle görülebilir koloniler oluşturur. (M. tuberculosis'i ilk izole eden Koch, ekimden sonra uzun süre beklediği için başarılıydı «»aKısım 1.6). Katı besiyerinde geliştirildiğinde MycoBacteria sıkı, kompakt, genellikle bükülmüş koloniler oluşturur (Şekill2.70a). Böyle bir koloni morfolojisi göstermesinin neden yüksek lipid içeriği ve hücre yüzeyinin hidrofobik yapısından hücrelerin birbirine yapışmasından kaynaklanır. Çoğunlukla mycobacterlerin besin ihtiyaçları oldukça basittir. Gelişme genellikle; amonyumun azot kaynağı, gliserol veya asetatın sadece karbon ve elektron vericisi olarak kullanıldığı basit mineral tuz içeren besi yerinde ve hava içeren ortamda gerçekleşir. Mycobacterium tuberculosis''in üreme-
sini lipid ve yağ asitleri hızlandırır ve genellikle yumurta sarısının (iyi bir lipid kaynağıdır) kültür ortamına eklenmesiyle çok daha verimli bir üreme elde edilir. M. tuberculosis'İn patolojik materyalden ilk izolasyonunda, sıklıkla gliserol-yumurta ortamı (Lowenstein-Jensen besiyeri) kullanılır.
Hücre duvarının yüksek lipid içeriğinden dolayı M. tuberculosis alkali ve fenol gibi kimyasal ajanlara karşı zamanla önemli derecede bir direnç oluşturabilir ve bu özellik hasta kişinin salyasından ve diğer kontamine olmuş materyallerden organizmanın seçici izolasyonu için kullanılır. Salya ilk olarak 1 N NaOH İle 30 dakika muamele edilir, nötralize olduktan sonra ise izolasyon ortamına ekilir. Çoğu Mycobacterlerin karakteristik özelliği sarı karetenoid pigment oluşturma yetenekleridir (Şekil 12.70c). Pigmentasyona dayanarak, mycoBacteria üç grupta sınıflandırılabilir: Pigment içermeyenler (M. tuberculosis, M. bovis'in içinde yer aldığı grup) ; sadece ışıklı ortamda kültürü yapıldığında pigment üretenler ki; bu özelliği taşıyan fotokromojenler (M. kansasii, M. tnarinum'un içinde yer aldığı grup) ve karanlıkta bile kültüre edildiğinde yine pigment oluşturabilenler ki bu özelliğe sahip skotokromojenler (örneğin, M gordonae; Tablol2.29)). Işıkla indüklenme (fotoindüksiyon) ile karotenoid yapımı kısa-dalga boyunda ışığı (mavi) gerektirir ve sadece O2 varlığında gerçekleşir. Mevcut veriler, fotoindüksiyonun en kritik olayının, ışık-katalizli oksidasyon olduğuna ve karotenoid biyosentez yolunun ilk başlarında yer alan enzimlerden birinin ışıkla indüklendiğine işaret etmektedir. Aynı diğer karetenoid-içeren bakterilerde olduğu gibi mycoBacteria karetenoidleri de eşlenmemiş elektronlu (singlet) oksijenin vereceği oksidatif hasardan organizmayı korur (cw&Kısım 6.16). M. tuberculosis virülensi, ağar veya sıvı besiyerlerinde, bakteri zincirlerinin birbirine geçmesi ve yan-yana bir araya gelmesi sonucu uzun, ipliksi yapılar oluşturmaları ile ilişkilidir (Şekill2.70£>). İpliksi yapıdaki büyüme hücre yüzeyindeki karakteristik bir gilikolipidin kord (cord) faktör varlığını göstermektedir (Şekil 12.71). Tüberküloz hastalığının patojenitesi ayrıntılı olarak Kısım 26.5'te tartışılacaktır.
• Şekil 12.70 Mycobacteria'mn karakteristik koloni morfolojisi, (a) Mycobacterium tuberculosis, yoğun, kıvrımlı koloni yapısı gösterir. Koloni yaklaşık 7mm çapındadır, (b) Hastalık yapan M. tuberculosis kolonisinin erken evresi, karakteristik iplik benzeri üreme biçimini gösterir. Tek bir hücre yaklaşık 0,5 /xm çapındadır. (Aynca, M. tuberculosis'in Robert Koch tarafandan yapılmış tarihi çizimlerine bakınız, CSSsKısım 1.13.) (c) AİDS hastalarında fırsatçı patojen organizma olarak bulunan Mycobacterium avium'un izole edilen bir susundan alınan kolonileri.
390 • Bölüm 12 • Prokaryotih Çeşitlilik: Bacteria OH I CH 2 O-CO-CH-CH-C 6 0 H 1 2 0 (OH) C24H49 H
H
OH
OH OH I OC-CH-CH-C60H120(OH)
• Şekil 12.71 Kord faktörünün yapısı, mikobakteriyal glikolipid: 6,6 -dimikolitrehaloz. İki özdeş uzun zicir dialkoller morla gösterilmiştir.
• Şekil 12.72 Nocardia. Tipik ülamantöz hücre yapısını (miselyum) gösteren Nocardia emsinden bir aktinomiset kolonisi. Her bir filament yaklaşık 0,8-1 ^,m çapındadır.
bir grup oluştururlar. Bu yüzden miselyal sporoluşum davranışı hem filogenetik hem de taksonomik önem taşır. Burada Streptomyces cinsine odaklanacağız.
12.22-12.23 Kavramların Gözden Geçirilmesi GC oram yüksek gram-pozitif bakteriler; Corynebacterium, Arthrobacter, Propionibacterium ve Mycobacterium gibi organizmaları bulundurur. Aslında Zarasız toprak bakterileridir, fakat M. tuberculosis tüberküloz hastalığının etkenidir. M. tuberculosis hücrelerinin mikroskobik olarak gözlenebilmesi için özel bir boyama prosedürü (asidedirençli boyama) gerektiren, lipidce zengin, mumsu yapıda bir dış yüzey tabakasına sahiptir. •
Kırılarak bölünme nedir ve hangi organizmalar bu yolla bölünür? • Hangi organizma İsviçre peynirinin olgunlaşmasında yer alır ve hangi kimyasal bileşikler peynirin aromasımn oluşmasına katkıda bulunur ve deliklerin oluşmasına neden olur? • Mikolik asit nedir, hangi organizma tarafından üretilir ve bu madde kendini üreten hücreye ne özellik kazandırır?
12.24
Filamentöz Actinobacteria: Streptomyces ve Diğer Actinomycetes
Anahtar cinsler; Streptomyces, Actinomyces Actinomycetes grubu, filamentöz, gram-pozitif bakterilerin geniş bir kısmını oluşturur ve dallanan filamentler meydana getirirler. Başarılı büyüme ve dallanmanın sonucu olarak miselyum denilen bir filamentler ağı oluşur (Şekil 12.72). Bakteri miselyumu, bakteri boyutlarında olmasına rağmen, filamentöz fungi'nin oluşturduğu miselyum ile analog yapıdadır (<£»oŞekil 14.25). Tablol2.3'da görüldüğü gibi çoğu Actinomycetes spor oluşturur ve spor oluşum mekanizmalarındaki çeşitlilik, alt gruplara ayrımda kullanılır. Actinomycetes'lerin çoğu üyesinin DNA baz kompozisyonu % 63-78 oranında GC içermektedir. Bu üst sınır GC yüzdesine sahip organizmalar, bilinen tüm bakterilerden daha yüksek GC oranına sahiptirler. Filogenetik olarak, actinomycetesler tutarlı
Streptomyces Streptomyces cinsi çok sayıda tür ve varyete bulundurur. GC baz oranları, %69-73 mol gibi dar bir aralıkta toplanmasına rağmen, 500'ün üzerinde Streptomyces türü tanımlanmıştır. Streptomyces türlerinin filamentleri tipik olarak 0.5-1 /j-m çapındadır ve uzunlukları belirli değildir. Ayrıca vejetatif fazda çapraz-duvar yapısı gözlenmez. Streptomyces'lerin büyümesi filament ucunda gerçekleşir ve genellikle dallanma ile devam eder. Bu yüzden vejetatif fazda kompleks, sıkı şekilde paketlenmiş bir matriks oluşur ve bu da yoğun bir şekilde sarılmış miselyum ve sonrasında da koloninin oluşmasına neden olur. Koloni yaşlandıkça, yüzeyinde spor meydana getirecek sporofor adı verilen karakteristik bir aeriyal (üst) filament oluşur (Şekil 12.73). Streptomyces sporları konidiya (conidia) adını alır ve Bacillus ve Clostridium endosporlarmdan oldukça farklıdır. Bir endosporun oluşumuna neden olan hücresel değişikliklerin tersine streptomyces sporları, her bir hücrenin spora dönüşümünü müteakip çok çekirdekli sporoforlarda çapraz-duvarlarm oluşumu ile meydana gelir (Şekil 12.74). Aeriyal filamentlerin şekli, düzenlenişlerindeki farklılık ve spor-taşıyan yapıları, Streptomyces türlerini sınıflandırmada kullanılan temel özelliklerdir (Şekil 12.75 sayfa 393). Konidiya ve sporoforlar çoğunlukla pigmentli olup, olgun koloni renginin oluşmasına katkıda bulunurlar (Şekil 12.76, sayfa 393). Olgun koloninin ağar plağı üzerindeki toz renkli görüntüsü, yoğun yapısı ve rengi ayırımını kolaylaştırır (Şekil 1276b). Streptomyces1 in İzolasyonu ve Ekolojisi Streptomyces'ler esas olarak toprak organizmaları olup, çok azı sucul habitatlarda bulunur. Topra-
24 • Filamentöz Actînobacieria: Strcptomyces ve Diğer Actinomycetes • 391
Tablo 12.30 Temsilci Actinomycetes ve akraba Aktinobakteri cinsleri (tamamı gram-pozitif) Başlıca Gruplar
DNA (mol % GC)
Coryneform bakteri gurubu: basiller, bazen çubuk şekilli, çeşitli morfolojilerde; aside-dirençli ya da filamentöz değil; kırılarak bölünme Corynebacterium: düzensiz boyanan kısımlar, bazen granüler; sıklıkla çubuk şekilli şişkin; biki ve hayvan patojeni, ayrıca toprak saprofiti Arthrobacter: kok-basil morfogenezi; toprak organizması Celluluomonas: korineform morfoloji; selülozu sindirir; fakültatif aerob Kuthia: zincirler oluşturan ve yuvarlak başlı basiller; daha sonra koksu Brei'ibacterium: kok-basil morfogenezi; peynir ve deride Propiyonik asit bakterileri: anaerobikten aerotolorenta değişir; basil veya filamentler, dallanır Propionibacterium: hareketsiz; aerotoleranta aerotolorenta değişir; propiyonik asit ve asetik asit üretir; süt ürünlerinde (İsviçre peyniri); deride,bazen patojenik olabilir Eubacterium: zorunlu anaeroblar; bütirik, asetik, formik ve laktik asitleri içeren bir organik asit karışımı oluşturur; sindirim sisteminde, yumuşak dokularda hastalık yapıcı, toprakta; patojenik olabilir; muhtemelen sindirim sisteminin predominant üyesi Zorunlu anaeroblar Bifidobacterium: düzgün mikrokoloniler, filament yok; korineform hücreler yaygın; süt emen çocukların sindirim sisteminde bulunur Acetobacterium: homoasetojen; sedimentler ve lağımda Butyrivibrio: kıvrık basiller; rumende Thermoanaerobacter: basiller, termofilik, sıcak su kaynaklarında bulunur Actinomisetler: filamentöz, sıklıkla dallanan; çok çeşitli I. Grup Actinomycetes: aside-dirençli değil; fakültatif aerobik; miselyum oluşmaz; dallanan filamentler oluşabilir; basil, koksu veya korineform hücreler Actinomyces: anaerobikten fakültatif aerobiğe değişir; filamentöz mikrokoloni; fakat filamentler geçicidir ve korinoform hücrelere ayrılırlar; insanlar veya hayvanlar için patojenik olabilir; ağız boşluğunda bulunur Diğer cinsler: Arachnia, Bscterionema, Rothia, Agromyces II. Grup Mycobacteria: aside-dirençli; filamentler kısa Mycobacterium: patojenler, saprofitler; zorunlu aeroblar; hücre ve hücre duvarının yağ içeriği fazladır; mumlar, mikolik asit; basit beslenme; yavaş büyüme; tüberküloz, cüzam, granüomalar, kuş tüberkülozu; ayrıca toprak organizmaları; hidrokarbon okside ederler III. Grup Azot fikse eden Actinomycetes: bitkilerin azot fikse eden simbiyontları; gerçek miselyum oluşturur Frankia: çeşitli bitki köklerinde iki tip nodul oluşturular; muhtemelen mikroaerofilik; yavaş büyuür; N2 fikse eder IV. Grup Actinoplanes: gerçek miselyum oluşturur; spor oluşturur, sporangiya içinde taşınır Actinoplanes, Streptosprongium V. Grup Dermatophylus grubu: miseliyal filamentler enine bölünür, ve hareketli koksu kümeler oluşturmak için en az iki yatay düzlemde; aeriyal miselyumlar yok; epidermal enfeksiyonlara neden olması muhtemeldir Dermatophius, Geodermatophilus VI. Grup Nokardiyalar: miselyal filamentler çoğunlukla koksu ve yassı elemanları oluşturmak için bölünür; aerial sporlar ara sıra oluşturulur; bazen aside-dirençli; hücre ve hücre duvarının yağ içeriği fazladır Nocardia: yaygın toprak organizması; zorunlu aerob; çoğu hidrokarbonları kullanır Rhodococcus: toprak saprofitleri; birçok böceğin sindirim sisteminde bulunur; hidrokarbonları kullanır VII. Grup Streptomycetes: miselyumlar bozulmadan kalır, uzun spor zicirleri ve aeriyal miselyumlar boldur Streptomyces: Yaklaşık 500 tanımlanmış türü vardır, çoğu antibiyotik üretir Diğer cinsler (morfolojileriyle ayrılır): Streptoverticillum, Sporochthya, Kitasatoa, Chainia VIII. Grup Micromonospora grubu: miselyumlar bozulmadan kalır; sporlar tek tek, çift ya da zincir şeklinde oluşur; çoğu termofilik; saprofitler toprakta bulunur, bitki düküntülerini çürütür; bir tür endospor oluşturur Micromonospora, Microbispora, Themobispora, Thermoactinomyces, Thermomonospora
51-65 59-70 71-73 36-38 60-67 53-68 26-48
55-67 39-43 36-42 37-39
57-69
62-70
67-72
69-71
56-75
61-72 59-69 69-75 67-73
54-79
"Filogenetik olarak, bütün türler {Acetobacterium, Butyrivibrio ve Thermoanaerobacter hariç) Actinobacteria'dadır.
ğm karakteristik toprak kokusu, streptomycetes'in ürettiği geosmin denilen bir dizi metabolitten kaynaklanır. Bu maddeler doymamış halka içeren karbon bileşikleri, oksijen ve hidrojen içeren seskuterpenoid (sesquiterpenoid) bileşiklerdir. En sık rastlanan geosmin trans- l,10-dimetil-trans-9 dekalol'dur. Geosmin ayrıca bazı siyanobakterler tarafından da üretilir (Kısıml2.25). Streptomyces'ler asidik topraklara nazaran alkali ve nötral toprakta gelişmeyi tercih ederler.Çok sayı-
da Streptomyces genellikle suyu süzülmüş toprakta (kumlu ya da kireçli toprak gibi), Streptomyces'lerin üreme için diğer toprak bakterilerinin aksine düşük su potansiyeli isteği olduğuna dair bazı kanıtlar mevcuttur. Streptomyces'lerin topraktan izolasyonu oldukça kolaydır. Steril su içerisinde süspanse edilen toprak seyreltilerek seçici ağar ortamına yayma yapılır ve daha sonra 25°C de inkübasyona bırakılır (cosŞekil 30.7a). Genellikle Streptomyces için seçici olan besiyeri; nişasta, asparjin ve kalsiyum malatın
392 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
Büyüme fazı
Uç kıvrılır
Ucun bölümlenmesi
Hücre duvarı kalınlaşır ve büzülür
Sporlar olgunlaşır
• Şekil 12.74 Streptomyces'dc spor oluşumu. Streptomyces'in aerial hifleriiün (sporoforlar) sporlara (Konidiya) dönüşüm evrelerinin diyagramı.
Streptomyceslerin Antibiyotikleri • Şekil 12.73 Actinomyceteslerin birçok spor taşıyan yapılarının fotomikrografı (a) Streptomyces, monovertisillat tip. (b) Streptomyces, kapalı spiral tip. Filamentler her ikisinde de yaklaşık 0,8 yum genişliğindedir.Bu fotoğrafları şekil 12.75'deki çizimlerle karşılaştırınız.
karbon kaynağı, sindirilmemiş kazein ya da potasyum nitratın azot kaynağı olarak kullanıldığı inorganik tuzların bulunduğu bir ortamdır. Normal hava bulunan ortamda yapılan inkübasyondan 5-7 gün sonra, Streptomyces'in karakteristik kolonilerinin meydana geldiği gözlenir (Şekil 12.76 ve 12.77) ve bu ilginç kolonilerin sporları başka ortama ekilerek, saf kültürü elde edilir. Besin açısından, Streptomycetesler çok yönlüdür. Gelişme-faktörü istekleri az olup; şekerler, alkoller, organik asitler, amino asitler ve bazı aromatik bileşikler gibi çok sayıda bileşiği, karbon kaynağı olarak kullanabilirler. Çok sayıda izolatı, hücre dışı hidrolitik enzimleriyle; polisakkaritleri (nişasta, selüloz ve hemiselüloz), proteinleri, yağları parçalayabilir. Bazı suşları hidrokarbonları, lignini, tanini hatta kauçuğu bile kullanabilirler. Streptomyces eldesi için kazein, nişasta gibi polimerleri içeren alkali bir ağar ortamına, sulandırılmış toprak örneği, yayma yöntemi ile ekilir (Şekil 12.76a). Sadece tek bir izolat, 50 farklı karbon kaynağını kullanabilmektedir. Streptomycetesler zorunlu aerob canlılardır ve sıvı ortamda gelişmelerini arttırmak için genellikle havanın olması için bazı işlemler yapılmalıdır. Sporulasyon genellikle sıvı ortamda gerçekleşmezken, yalnız ağar yüzeyinde veya başka bir katı substrat kullanıldığında gözlenir. Ancak bu organizmalar sabit bir sıvı kültür yüzeyinde ince bir zar meydana getirebilir.
Streptomyceteslerin en çarpıcı özelliği belki de antibiyotik üretebilmeleridir (Şekil 12.31). Çoğunlukla antibiyotik üretildiğine dair kanıtlar, Streptomyces'in izolasyon aşamasının başlangıcında ağar plağı üzerinde görülebilir: Yakınındaki diğer bakteri kolonileri inhibe edilerek zonlar oluştururlar (Şekil 12.76a ve 12.77a; oo绪ekil 30.7a). Yaklaşık olarak Streptomyces izolatlarının % 50'sinin antibiyotik üreticisi olduğu kanıtlanmıştır. Streptomyceslerin oluşturdukları antibiyotiklerin ekonomik değerinin olması ve tıbbi önem taşıması nedeniyle, bu antibiyotik üreticiler üzerinde çok fazla sayıda çalışma yapılmıştır. Streptomyceslerin 500'ün üzerinde farklı antibiyotik üretebildikleri gösterilmiş, çoğunun kimyasal yapısı tanımlanmış (Şekil 12.77) olup daha fazlasından da şüphelenilmektedir (<£»Q>Kısım 30.5 ve 30.6). Bazı organizmalar birden çok antibiyotik üretir ve çoğunlukla bir organizma tarafından üretilen çeşitli antibiyotiklerin kimyasal molekül yapıları arasında bir ilişki yoktur. Aynı antibiyotik dünyanın farklı yerlerinde yayılım gösteren farklı türler tarafından oluşturulabilir. Antibiyotik üreten organizma kendi antibiyotiğine dirençli olmasına karşın, diğer streptomyceteslerin oluşturdukları antibiyotiklere karşı genellikle duyarlı olur. Antibiyotik sentezinde görev alan enzimlerin kodlanması için birçok gene ihtiyaç vardır ve bu yüzden Streptomyces türlerinin genomları tipik şekilde çok uzundur (8Mbç ve daha büyük (c«»Tablol5.1). Altmışdan fazla streptomiset antibiyotiği, insan, veteriner hekimlik, tarım ve endüstride pratik uygulama alanı bulmuştur. Tablo 12.31'de bilinen en yaygın Streptomyces antibiyotiklerinin kaynağı listelenmiştir. Atasal molekülün kimyasal yapısı temel alınarak organizmalar sınıflar içerisinde gruplandırılmıştır. Günümüzde pek çok bulaşıcı hastalık, halen kullanılmakta olan antibiyotikler-
12 24 • Filamentöz Actinobacteria: Streptomyces ve Diğer Actinomyceles • 393
Düz
Kıvrımlı
Açık, halkalar basit spiraller kancalar
Püsküllü
Açık spiraller
Kapalı spiraller
Monovertisillat spiyal yok
Spirallı, mono vertisillat
# Şekil 12.75 Sterptomycetes'de spor taşıyan yapıların çeşitli tipleri. Streptomyces'in örnek verilen türleri yalnız bir tip spor taşıyan yapı oluşturur. Şekil 12.73 ile karşılaştırınız.
• Şekil 12.76 Streptomyces. (a) Kazein-nişasta ağar petrisinin üzerine yayılmış toprak dilusyonundan üremiş Streptomyces ve toprak bakterileri kolonileri. Streptomyces kolonileri bir çok renktedir(bir çok siyah koloni arkaplanda), fakat mat, pürüzlü ve dağılmayan yapılarıyla kolayca ayırt edilirler, (b) Streptomyces coelicolor' un yakın çekim fotoğrafı.
le gerekli şekilde kontrol edilemediğinden, halen yeni streptomiset antibiyotikleri araştırılmaktadır. Ayrıca antibiyotiklere-dirençli patojenlerin artması, yeni ajanların keşfinin devamına neden olmaktadır. Antibiyotik endüstrisinde, Streptomyces üzerinde yapılan birçok uygulamalı çalışmanın yanı sıra, üretilen antibiyotiklerle, yılda milyarlarca dolar kazandığı halde, Streptomyces ekolojisi yeterince an-
laşılamamıştır. Diğer prokaryotlarla olan ilişkileri ve antibiyotikleri ilk olarak oluşturmalarıyla ilgili ekolojik mantık günümüzde çok az bilinmektedir. Bir hipoteze göre Streptomyces türlerinin antibiyotik oluşturmaları, ki bu antibiyotik üretimi demektir, sporulasyon (besinin tükenmesi ile tetiklenen işlev) ile ilgilidir ve sınırlı besin ortamında, Streptomyces ile yarışan diğer organizmaların üremesini engellemek içindir. Bunun sayesinde Streptomyces
Spiralli bivertisillat
Bivertisillat spiral yok
T
Tablo 12.31 Streptomyces türleri tarafından sentezlen en bazı yaygın antibiyotikler Etkiledikleri3 Kimyasal sınıfı Yaygın ismi Üretici Aminoglikozidler
Streptomisin Spektinomisin Neomisin
S. griseus1" Streptomyces spp. S. fradiae
Tetrasiklinler
Tetrasiklin
S. aureofaciens
Makrolitler
Klortetrasiklin Eritromisin
S. aureofaciens Saccaropolyspora erythraea S. lincolnensis S. noursei S. nodosus S. venezuelae
Polienler Hiçbiri
Klindamisin Nistain Amfosetin B Kloramfenikol
Çoğu gram-negatif bakteriler M. tuberculosis, penisillinaz üreten N. gonorrhoeae
Geniş spektrumlu, toksisite sonucu oluşan bölgesel durumlarda kullanılır Geniş spektrumlu, gram-pozitif ve gram-negatif bakteriler, riketsiyalar ve klamidyalar, Mycoplasma Tetrasiklinle aynı Çoğu gram-pozitif bakteriler, sıklıkla penisillin yerine kullanılır, Legionella Zorunlu anaeroblara karşı etkili, özellikle Bacteroides fragilis Funguslar, özellikle Candida enfeksiyonları
Funguslar Geniş spektrumlu, tifo hastalığı için tercih edilir
"Çoğu antibiyotik birçok farklı bakteriye karşı etklidir. Bu sütundaki bilgiler verilerin antibiyotiklerin klinik uygulamalarını verir. Bu antibiyotiklerin çoğunun yapıları ve etkileme şekilleri Kısım 12.7 - 12.9'da verilmiştir. b "s." ile başlayan tüm türler Streptomyces cinsindendir.
394 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria • Streptomyces için antibiyotik üretimi neden avantaj olabilir?
ŞUBE 4: CYANOBACTERIA VE PROCHLOROPHYTLER Cyanobacteria Anahtar Cinsler: Synechococcus, Oscülatoria, Nostoc Cyanobacteria geniş ve morfolojik olarak heterojen fototrofik Bacteria grubudur. Cyanobacteria mor ve yeşil bakterilerden (Kısım 12.2 ve 12.32'ye bakınız) oksijenik, fototrof olmalarıyla temel farklılıklar gösterir. Cyanobacteria, Bacteria'nm başlıca şubelerinden birini temsil eder ve gram-pozitif Bacteria'ya uzaktan akrabalık gösterir (Şekil 12.1). Kısım 11.1'de gördüğümüz üzere, bu organizmalar Dünya'da oksijen-üreten ilk fototrofik organizmalardı ve Dünya atmosferinin oksijensiz durumdan (anoksik) oksijenli (oksik) hale dönüşümünden sorumluydular. Cyanobacteria'nın Yapısı ve Sınıflandırılması
• Şekil 12.77 Streptomyces' den gelen antibiyotikler, (a) Kalabalık bir petride toprak mikroorganizmaların antibiyotik aktiviteleri. İnhibisyon alanlarıyla çevrelenmiş küçük koloniler streptomycetestir; büyük yaygın koloniler ise Bacillus türleridir, (b) Kırmızı renkli antibiyotik adesilprodigiyosin Streptomyces coelicolor kolonileri tarafından salınmaktadır.
sporulasyonu tamamlayabilir ve baskın bir yapı oluşturarak, hayatta kalma şansını yükseltebilir. — HBJ 12.24 Kavramların Çözden Geçirilmesi Streptomisetler hava filamentlerinin son kısmında spor oluşturan, büyük bir filamentöz, gram-pozitif bakteri grubudur. Tetrasiklin ve neomisin gibi klinik olarak yararlı antibiyotiklerin çoğu Streptomyces türleri tarafından üretilir. •
Streptomyces türlerindeki sporlar ve spor oluşum süreci Bacillus türlerinden nasıl ayrılır? • Streptomyces hangi enerji sınıfında yer alır ve bu organizmalar enerjilerini hangi bileşikden elde ederler?
Cyanobacteria'nın morfolojik çeşitliliği çok ilginçtir (Şekil 12.78). Hem tek hücreli, hem de filamentöz şekilleri ile bu morfolojik tipler arasında önemli varyasyonlar bilinmektedir. Yine de cyanobacteria sadece beş morfolojik gruba ayrılabilmektedir: (1) ikiye bölünen (binari-fizyon) tek hücreli (Şekil 12.78a); (2) çoğa bölünen (koloniyal) tek hücreli (Şekil 12.78b); (3) azot fiksasyonunda görevli heterosist adı verilen farklılaşmış hücreler içeren filamantöz (Şekil 12.78d ve Şekil 12.80); (4) heterosistik olmayan filamentöz (Şekil 12.78c); ve (5) dallanan filamentöz türler (Şekil 12.78e). Tablo 12.32 her grupta halen kabul edilen temel cinsleri göstermektedir. Siyanobakteriyal hücreler tipik bakteri (çapı 0,5-1 fim) büyüklüğü ile 40 jjun çapa (Oscülatoria princeps türünde, (««sŞekil 4.44a) varan değişiklikler gösterir. Cyanobacteria'nın hücre duvar yapısı gramnegatif Bacteria'ya benzer, duvarlarında peptidoglikan bulunur (Şekil 12.79). Pek çok cyanoBacteria hücre gruplarını veya filamentleri bir arada tutmaya yarayan (örnek olarak Şekil 12.78a'ya bakınız) geniş zamklı (müsilaj) zarflar veya kılıflar üretir. Fotosentetik zar sistemi genellikle karmaşık ve çok tabakalıdır (cs^Şekil 17.10b), bununla birlikte bazı daha basit siyanobakterlerde lameller sitoplazma çevresinde düzgün iç içe daireler halinde yerleşiktir (Şekil 12.79). Siyanobakterilerde sadece klorofil a olmak üzere tek tip kolorofil bulunur. Ayrıca hepsinde tipik pigmentler olan fikobilinler (cttsŞekil 17.10a) de var-
12.25 • Cyanobacteria • 395
(b)
(c)
• Şekil 12.78 Cyanobacteria arasındaki morfolojik farklılıklar: cyanobao teriadaki beş ana morfolojik tip. (a) Tek hücreli, Gloeothece, faz kontrast; tek bir hücre 5-6 /um çapındadır; (b) koloniyal, Dermocarpa, faz kontrast; (c) flamentöz, Oscillatoria, açık alan; tek bir hücre 15 jüim genişliğindedir; (d) filamentöz heterosistöz, Anabaena, faz kontrast; tek bir hücre yaklaşık 5 (im genişliğindedir; (e) dallanan filamentöz, Fischerella, açık alan.
dır, bunlar fotosentezde aksesuar pigment görevi görürler. Fikobilinlerin fikosiyaninler sınıfı mavidir ve yeşil klorofil a ile birlikte, bakterinin mavi-yeşil renginden sorumludur. Bununla beraber, bazı siyanobakterler kırmızı bir fikobilin olan fikoeritrin üretir; bu pigmenti bulunduran türler ya kırmızı ya da kahverengi olur.
(e)
hücrelerin farklılaşmasıyla oluşur ve heterosistik eyanoBacteria'da azot fiksasyonunun gerçekleştiği tek yerdir (N2'nin NH 3 'e indirgenmesi, ceç>Kısım 17.28). Çok çalışılmış heterosistik cyanobacterium Anabaena''da, heterosistte her biri bir birim olarak Heterosist
Yapısal Çeşitlilik: Gaz Vezikülleri ve Heterosistler
Pek çok cyanobacteria'da, bilhassa açık sularda (plankton türler) bulunan türlerde gaz vezikülleri (
•!./../ • Şekil 12.79 Cyanobacterilerdeki tilakoidler. Cyanobakteri Syenechoccus lividus'a. ait ince kesitin elektron mikrografı. Tek bir hücre yaklaşık 5/xm çapındadır. Tilakoid memebranlann hücre duvarına paralel gittiğine dikat ediniz.
t
Vejetatif hücreler
Vejetatif hücreler
(b)
• Şekil 12.80 Heterosistler. (a) Cyanobacteri Anabaena içindeki heterokistler. Heterosistler, heterosistler siyanobakterilerdedeki azot fiksasyonunun gerçekleştiği tek yerdir, (b) Heterokist oluşum süreci modeli. Heterokist, oksijen üretme yeteneğini kaybeder (Fotosistem II, C^Kısım 17.5) ve azot fiksasyonu için gerekli indirgeyicileri komşu vejetatif hücrelertarafından üretilen organik maddeden elde eder. Glutamin, fikse edilmiş azotun heterosistlerden vejetatif hücrelere taşınma formudur.
396 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
Tablo 12.32 Cyanobacteria'nın grup ve cinsleri Grup
Cins
DNA (mol % GC)
I. Grup: Tek-hücreli: tek tek hücreler ya da hücre kümeleri
Gloeotheca (Şekil 12.78a), Gloebacter, Synechococcus, Cyanothece, Gleocapsa, Synecocystis, Chamaesiphon, Merismopedia
35-71
II. Grup: Pleörokapsaleyan: küçük küresel hücrelerin çoğa bölünerek oluşturduğu baosit adı verilen hücreler
Dermocarpa (Şekil 12.78b), Xenococcus, Dermocarpella, Pleurocapsa, Myxosarcina, Chroococcidiopsis
40-46
III. Grup: Osilotoryan : tek düzlemde ikiye bölünen filamentöz hücreler
OsciUatoria (Şekil 12.78c), Spirulina, Arthrospira, Lynggbya, Mycrocoleus, Pseudanabaena
40-67
IV. Grup: Nostokoleyan: heterosist oluştran filamentöz hücreler
Anabaena(Şeki\ 12.78d), Nostoc, Calothrix, Nodularia, Cylinodrosperum, Scytonema
38-46
V. Grup: Dallanan: Hücreler dallar oluşturarak bölünürler
Fischerella(Şeki\ 12.78e), Stigonema, Chlorogloepsis, Hapalosiphon
42-46
ifade edilebilen nif genlerinin bitişik dizilerini oluşturacak karmaşık gen düzenlenmesi ortaya çıkar (nif genleri nitrojenazı kodlar, Kısım 17.28). Heterosistler, komşu vejetatif hücrelerle hücreler arası bağlantılara sahip olup, bu hücreler arasında karşılıklı madde alış verişi yapılır. Fotosentez ürünleri vejetatif hücrelerden heterosistlere geçer, azot fiksasyonu ürünleri de heterosistlerden vejetatif hücrelere geçer (Şekil 12.80b). Heterosistlerde fikobilin pigmentleri az miktarda bulunur ve fotosistem H'den (oksijen açığa çıkartan ve redükleyici gücü H2O'dan alan fotosistem) yoktur 2
17.5). Fotosistem II olmadan heterosistler CO2'yi fikse edemez ve dolayısıyla N2'yi NH,'e indirgeyecek elektron vericisinden yoksundur; bu sorun fikse edilen karbonun komşu vejetatif hücreden heterosiste aktarılmasıyla çözülmektedir (Şekil 12.80fr). Heterosistler hücre içine yavaş O2 difüzyonunu sağlayan çok miktarda glikolipid ihtiva eden kalınlaşmış hücre duvarı ile çevrilidir. Çünkü nitrojenaz enziminin oksijen hassasiyetinden dolayı (Kısım 19.29), heterosist anoksik bir çevre sağlar ve bu şekilde sadece aerobik olmakla kalmayıp aynı zamanda da oksijen üreten organizmada azot-fikse edici sistemi stabilize eder. Gerçekten de bazı heterosistik olmayan filamentöz siyanobakteriler O2'i uzaklaştırmak için, içinden yoğun N 2 gazı geçirilen anaerobik ortamda üretildiğinde normal vejetatif hücrelerinde nitrojenaz üreterek azot fiksasyonu yaparlar. Siyanofisin (Cyanophycin) ve Diğer Yapılar
Çoğu siyanobakterin elektron mikrografında siyanofisin adı verilen bir yapı görülür. Bu yapı aspartik asit ile arjinin'in kopolimeridir: Asp — Asp — Asp — Asp —Asp — I
I
I
I
I
Arg
Arg
Arg
Arg
Arg
ve hücre kütlesinin %10 kadarını oluşturabilir. Siyanofisin bir azot depo ürünüdür ve dış ortamda azot azaldığı zaman, bu polimer yıkılarak hücresel
-
azot kaynağı olarak kullanılır. Siyanofisin aynı zamanda siyanobakteriler için bir enerji deposudur. Siyanofisin'den kaynaklanan arjinin, ornitin oluşturmak üzere hidroliz olabilir, karbamil fosfat'in (<3C^Kısım 17.19) ara ürün olduğu reaksiyonla arjinin dihidrolaz enzimi aktivitesiyle ATP üretebilir. Arjinin + ADP + P. + H2O -» Ornitin + 2 NH 3 + CO2 + ATP Cyanobacteria'nın çoğunda bulunan arjinin dihidrolaz, karanlık periyodlarda bakterinin yaşamını sürdürebilmesi için ATP kaynağı olarak kullanılabilir. Çoğu cyanoBacteria kayma hareketi gösterir; gerçek dönüşlü kamçı hiçbir zaman bulunmamıştır. Kayma, hücre ya da filaman katı bir yüzeyle veya diğer bir hücre veya filamanla temas edince gerçekleşir. Bazı siyanobacterilerde kayma basit bir hareket değildir; rotasyonlar, geri dönüşler ve filamentlerin uzamasıyla birlikte ortaya çıkar. Kayan türlerin çoğu ışığa yönelme (fototaksi) ve aynı zamanda kemotaksis hareketi gösterir (^ö^Kısım 4.16). Filamantöz cyanoBacteria arasında, hormogonya (Şekil 12.81a,b) oluşumu ile sıklıkla filamanların fragmentasyonu gerçekleşir; bunlar filamentlerden koparak kayar gider. Bazı türlerde, organizmayı karanlık, kuruluk veya donma dönemlerinde koruyan, dinlenme halindeki sporlar veya akinetler (Şekil 12.81c) oluşur. Bu hücrelerde kalınlaşmış dış duvarlar mevcuttur; dış duvarın çatlaması ile çimlenip yeni bir vejetatif filament dışa doğru gelişir. Bununla beraber, pek çok cyanobacteria vejetatif hücresi kuruluğa ve düşük sıcaklıklara oldukça dirençlidir. Cyanobacteria'nın Fizyolojisi
Cyanobacteria'nın beslenmesi basittir. Vitaminlere gereksinme yoktur, nitrat veya amonyak azot kaynağı olarak kullanılır. Azot-fikse edebilen türler yaygındır. Denenen türlerin çoğu zorunlu fototroftur, karanlıkta organik bileşikler üzerinde üreyemez. Bununla beraber, bazı cyanoBacteria glukoz ve
12 26 • Prochlorophytler ve Kloroplastlar
397
Cyanobacteria'nın Ekolojisi ve Filogenisi f Hormogonyum ayrılması
(a) Hormogonyum
Akinet
• Şekil 12.81 Filamentöz cyanobactera'da yapısal farklılıklar, (a) Oscilatoria'da. hormogonyum oluşumunun başlangıç evresi. Boş alanların hormogonyumlann filamentlerden ayrılma yeri olduğuna dikkat ediniz, (b) Daha küçük bir Oscilatoria türünün hormogonyumu. Hücrelerin her iki ucunun da yuvarlak olduğuna dikkat ediniz. Nomarsky interferans kontrast mikroskobu, (c) Faz kontrast mikroskobuyla görüntülenmiş Anabaena'ya ait akinet (dinlenme sporu).
Cyanobacteria doğada karasal, tatlı su ve deniz habitatlarında yaygın dağılım gösterir. Genellikle, ekstrem çevresel etkenlere alglerden daha dayanıklıdır ve sıcak su kaynaklarında (ö°aTablo 6.1), tuzlu göllerde ve diğer ekstrem çevrelerde baskın veya tek oksijenik fototrofik organizmadır. Çoğu tür kayaların veya toprağın yüzeyinde bulunur ve hatta bazen kayaların içinde olabilir (
Şekil 14.38). Yoğun güneş ışığı alan çöl topraklarında, siyanobakteriler sıklıkla yüzeyde yaygın kabuk oluştururlar ve yılın çoğunda dormant halde kalıp, kısa kış dönemi ve bahar yağmurlarında ürerler. Sığ deniz körfezlerinde, ılık deniz suyu sıcaklığı bulunduğundan siyanobakteriyal katmanlar oluşabilir. Bilhassa besin maddelerince zengin tatlı su göllerinde, cyanoBacteria gelişim patlamaları gösterebilir (eocŞekil 19.10b). Az sayıda cyanobacteria ciğerotu, eğreltiler ve cycad'larda simbiyotiktir; bazıları likenlerin fototrofik bileşeni olarak bulunur. Su eğreltisi Azolla'da olduğu gibi (^»öKısım 17.28 ve 19.22) siyanobakteriyal endofiti (Anabaena'nm bir türü) azot fikse ederek bitkinin kullanmasını sağlar. Cyanobacteria'nın muhtelif türlerinin genomik DNA baz kompozisyonu tayin edilmiştir. Tek hücreli olanların GC oranı %35 den %71'e kadar değişebilir, bu sınır o kadar geniştir ki bu, grubun çoğu üyesinin birbiriyle çok az genetik ilişkisi olduğunu akla getirir. Diğer taraftan, heterosist oluşturanlarda bu oran %38 ila %46 arasında değişmektedir. Çoğunlukla cyanoBacteria, filogenetik olarak da morfolojik gruplarla aynı hattı oluşturur. Filamantöz heterosistik ve nonheterosistik türler belirli grupları oluştururlar, aynı zamanda dallanmış formlar da gruplaşır. Bununla beraber, tek hücreli cyanoBacteria filogenetik olarak yüksek farklılık gösterir, değişik morfolojik gruplarla değişik temsilciler filogenetik ilişki içindedir.
| Prochlorophytler ve Kloroplastlar asetat gibi basit organik bileşikleri ışık varlığında özümleyebilir (fotoasimilasyon). Az sayıda cyanoBacteria, başlıca filamentöz türler olmak üzere, şekeri hem karbon hem enerji kaynağı olarak kullanarak karanlıkta glukoz ya da sükrozda üreyebilir. Cyanobacteria'nın bazı metabolik ürünlerin pratikte önemi büyüktür. Siyanobakterilerin çoğu güçlü nörotoksinler üretir ve bu organizmaların aşırı biriktiği ortamlardaki suları kullanan hayvanlar ölebilir. Çoğu siyanobakteri aynı zamanda tatlı sulardaki toprak kokusu ve taddan sorumludur, bu sular içme suyu kaynağı olarak kullanılırsa, estetik sorunlar oluşabilir. Oluşan başlıca bileşik geosmiridir (trans-l,10-dimetil-trans-9-dekalol). Bu madde pek çok actinomycetesler (Kısım 12.24'deki tartışmaya bakınız) tarafından da üretilir ve yeni çapalanmış, nemli toprağın "topraksı" kokusundan sorumludur.
Anahtar Cinsler: Prochlorococcus, Prochloron, Prochlorothrhc Prochlorophytes'ler (Proklorofitler), klorofil a ve b taşıyan ancak fikobilin bulundurmayan oksijenik (oksijenli) fototroflardır. Proklorofitler, böylece hem siyanobakterilere (çünkü prokaryottur ve klorofil a taşır) hem de yeşil bitki /yeşil alglerin kloroplastına benzer (çünkü fikobilinler yerine klorofil b taşır). Filogenetik olarak, siyanobakterilerle özgül olarak ilişkilidir. Prochloron Prochloron bulunan ilk proklorofittir. Doğada deniz invertebratlarının (didemnid ascidians) simbiyontu olarak bulunur, ancak laboratuvarda kültürü yapılamamıştır. Didemnid dokusu boşluklarından tanımlanmış Prochloron'un hücreleri kabataslak küreseldir (Şekil 12.82), ve 8-10 yu,m çapındadır.
398 • Bolüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
Prochlorothrix ve Prochlorococcus
• Şekil 12.82 Proklorofit Prochlororiun elektron mikrografı. Geniş intrasitoplazmik zarlara dikkat ediniz (tilakoyidler). Hücreler yaklaşık 10fim çapındadır. Siyanobakterilerin aksine fikobiliproteinleri yoktur.
Prochloron ince kesitlerinin elektron mikrografları (Şekil 12.82) kloroplastta gözlenen benzer, yaygın tilakoid (thylacoid) zar sitemi bulunduğunu göstermiştir (Şekil 14.6). Prochloron'un filogenetik olarak Bcıcteria'mn bir üyesi olduğunun daha ileri delili hücre duvarında peptidoglikan varlığını gösteren muramik asitin bulunmasıdır (oossKısım 4.8). Prochloron'un karotenoidleri siyanobakterlerinkine benzer, baskın olarak /3-karoten ve zeaksantin bulunur. Farklı tunikat (ascidian) varyetelerinden elde edilen Prochloron örneklerinin genomik DNA GC oranı %31 ila %41 arasında değişir ve genetik heterojenlik gösterir. Bu yüzden, muhtemelen değişik Prochloron türleri bulunabilir, ancak doğrulanması için laboratuvar kültürleri ve saf kültürlerin araştırılması gerekmektedir.
Prochlorothrix saf kültürde üretilebilen filamentöz bir proklorofittir (Şekil 12.83). Prochloron'a benzer olarak, Prochlorothrix de klorofil a ve b bulundurur ve fikobilinleri bulundurmaz, ancak tilakoyid zarları Prochloron'dan daha az gelişmiştir (Şekil 12.82 ve 12.83b'yi karşılaştırın). Yeni bir proklorofit, Prochlorococcus açık okyanuslardaki öfotik zonda yaşar. Fototrof canlının bu hücreleri, küçük kok olup çapları 1 /im'den daha küçüktür (c«*iŞekil 19.11a). Diğer proklorofitler gibi, Prochlorococcus hücreleri klorofil b ihtiva eder. Bununla beraber, Prochlorococcus hakiki klorofil a'dan yoksundur, bunun yerine divinil klorofil a adı verilen değişik bir klorofil a taşır. Prochlorococcus'un hücreleri aynı zamanda a-karoten taşır (/3- yerine), bu pigment daha önceleri prokaryotlarda bilinmiyordu. Okyanuslardaki sayıları çok fazla olduğundan (104-105 hücre/ml), Prochlorococcus gibi proklorofitler muhtemelen açık okyanus sularında primer üreticiler olarak oldukça önemli ekolojik öneme sahiptir. Diğer proklorofitlerin bir başka varyetesi de izole edilen Acaryochloris'dir (Şekil 12.83c) ve majör pigment olarak klorofil d taşır. Klorofil aynı zamanda çeşitli alglerde de bulunur (ökaryotik hücreler,
Endosimbiyoz tartışmasına dayandırıldığında («3QöKısım 2.6,11.4 ve 14.4) proklorofitlerin evrimsel önemi açıkça görülmektedir. Proklorofitlerin bulunmasına kadar, kloroplastın hep cyanobacteria'nın ilkel bir ökaryotik hücre ile endosimbiyotik ilişkisinden kaynaklandığı düşünülüyordu. Bununla beraber, bu hipotez bilimsel olarak tatmin edici
• Şekil 12.83 Filamentöz proklorofit Prochlorotrix ve Acaryochloris'in faz ve elektron mikrografları. (a) Faz kontrast, (b) Membranlann düzenlenmesini gösteren ince kesitin elektron mikrografı. Hücrelerin yarıçapı yaklaşık 2 /nm'dir (c) Acaryochloris. Bu proklorofit esas klorofil pigmenti olarak klorofil d içerir. Hücre yaklaşık 1,5 /um çapındadır.
12.27 • Chlamydia • 399
değildi ve bunun önemli bir sebebi vardı: Şayet • Siyanobakterilerin mor bakterilerden farklı en az üç bitki kloroplastları, klorofil b yerine fikobüinleri ihözelliğini tanımlayınız. tiva eden siyanobakteriyal bir endosimbiyontdan • Heterosist nedir? Görevi nedir? köken aldıysa günümüzdeki pigment içeriği nasıl evrimleşti? Cyanobacteria yerine Prochorophytes'in • Siyanobakteriler, proklorofitler ve bildiğimiz mısır yeşil bitki kloroplastlarının atası olduğu hipotezi bitkisinin kloroplastları nasıl benzerlik gösterir? Hangi yönlerden farklıdır? bu önemli açmaza çözüm getirmiştir. Bununla beraber, filogenetik analizler Prochloron, Prochlorococ- • Prochlorococcus'un ekolojik önemi nedir? cus veya Prochlorothrix'in yeşil bitki kloroplastınm en yakın atası olduğunu göstermemiştir. Bunun yerine, prokolorofitler, siyanobakterler ve bitki kloŞUBE 5: roplastlarının tümü ortak bir atayı paylaşmıştır ve CHLAMYDİA siyanobakteriyal şube içinde belirli hatlar olarak kalmıştır. Başka bir hipotezle, prokaryotik oksijenik fototChlamydia roflarda gözlenen pigmentasyon örnekleri açıklanabilmektedir. Siyanobakteriler ve proklorofitler, Chlamydia ve Chlamydophila cinslerindeki organizfikobilinleri ve sadece klorofil «'dan başka kloromalar zayıf metabolik kapasiteleri olan zorunlu pafilleri, ya klorofil b ya da d, ihtiva eden atalardan razit bakterilerdir ve Bacteria' nın ayrı bir şubesini evrimleşmiş olabilir. Bu noktadan sonra siyanobakteriyal hat, aksesuar kolorofilleri kaybederek oluşturur (Şekil 12.1'e bakınız). Birkaç önemli tür evrimleşirken, proklorofit hattı fikobilinler olmatanımlanmıştır (Tablo 12.33): Chlamydophila psittaci, dan devam edebilmiştir. Günümüzde her bir gruppsittakoz hastalığının etkeni; Chlamydia trachomatis, ta görülen pigmentin tamamlayıcısı da böylece trahom ve diğer bazı insan hastalıklarının etkeni; ve kendi belirli habitatlarındaki en iyi fotosentetik Chlamydophila pneumoniae, muhtelif solunum belirpigment kombinasyonunu gösteriyor olabilir. tileri (sendromlarının) etkeni (Tablo 12.33). Psittakoz kuşlarda görülen ve sıklıkla insanlara bulaşarak pnömoni-benzeri (zatürre) belirtilere 12.25-12.26 Kavramların Çözden Geçirilmesi sebep olan epidemik bir hastalıktır. Trahom göze Siyanobakteriler ve proklorofitler oksijenik fototrofik hasar veren bir hastalıktır, korneanın kılcal damarprokaryotlardır. Proklorofitler siyanobakterilerden klolanması (vaskülarizasyonu) ve çizilmesiyle karakrofil b veya d ihtiva etmeleri ve fikobilinleri bulunmamaterizedir. Trahom, insanlarda en önemli körlük nesıyla açıkça ayrılırlar. Dünya atmosferindeki oksijenin denlerinden biridir. Chlamydia trachomatis'in diğer siyanobakteriyal fotosentez sonucunda ortaya çıktığı düsuşları üro-genital (idrar ve cinsel) yolu enfekte şünülmektedir.
Tablo 12.33
Chlamidia ve < Chlamidophila cinslerine ait türlerin ayırt edici özellikleri
Özellikler
Chlamydia trachomatis Chlamydophila psittaci
Chlamydophila pneumoniae
Konaklar Enfeksiyon bölgesi İnsandan insana geçiş DNA mol %GC DNA:DNA hibridizisyonuna" göre C. trachomatis'e homoloji yüzdesi DNA, kilobaz çifti/genom (Echerichia cali: 4600) İnsan hastalıkları
İnsanlar Mukoz membran Yaygın 42-45 100
Kuşlar, memeliler, nadiren insanlar Birçok bölge Nadiren 39-43 10
İnsanlar Solunum mukozası Mümkün 40 10
1000
550
-1000
Trakoma, otitis media, nongonokokkal üretrit (erkeklerde), üretral inflamasyon( kadınlarda), lemfogranoloma venerum, servisit —
Psittakosis
Solunum sistemi sendromları
Kuş klamidyası (papağanlarda, muhabbet kuşlarında), pnömoniya, eklem dokusu artiriti veya konjuktivit (kedi, koyun, inek, domuz, at
—
Evcil hayvan hastalıkları
"DNA:DNA hibridizasyonunun açıklaması için Kısım 11.11'e bakınız
yavrularında)
400 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
eder, halen klamidyal enfeksiyonlar cinsel yolla bulaşan hastalıkların en önde gelenlerindendir (ooöKısım 26.13). Chlamydophila psittaci, Chlamydia trachomatis ve Chlamydophila pneumoniae'nin özel-
likleri ve sebep oldukları hastalıklar Tablo 12.33'de gösterilmiştir. Moleküler ve Metabolik Özellikler
Hastalık etkenleri olmalarının yanı sıra klamidyalar, oluşturdukları biyolojik, evrimsel ve metabolik problemlerden dolayı merak uyandıran organizmalardır. Biyokimyasal çalışmalar klamidyaların gram-negatif-tip hücre duvarı taşıdığını, hem DNA ve hem de RNA taşımalarıyla açıkça hücresel olduklarını göstermiştir. Enfekte hücrelerin ince kesitlerinin elektron mikroskopisi, hücrelerin ikiye bölündüğünü (binari-fizyon) göstermiştir (Şekil 12.84»). Klamidya'nın biyosentez kapasitesi Bacteria'nm diğer zorunlu hücre-içi parazit grubu olan riketsiya'dan daha sınırlıdır (Kısım 12.13'e bakınız). Önceleri klamidyaların "enerji parazitleri" olduğu düşünülüyordu ve konakçılarından, riketsiya'lar gibi sadece biyosentetik ara ürünleri temin etmekle kalmayıp aynı zamanda da ATP sağladıkları sanılıyordu. Ancak, C. trachomatis genomunun dizi analizlerinin ardından bu hipotez sorgulanmıştır (ooaKısım 15.3). C. trachomatis''in yaklaşık 1 Mbç'lik kromozomu, ATP sentezi ile ilgili, kolayca teşhis edilebilen genler taşır ve hatta peptidoglikan biyosentezini kodlama fonksiyonu olan genleri de taşır. Bu da söz konusu organizmanın hücre-duvarı polimerlerinin kimyasal analizinde her ne kadar sonuç negatif çıksa da peptidoglikan ihtiva edebileceğini akla getirmektedir. Bununla beraber, klamidya muhtemelen hala bütün Bacteria arasında en basit biyokimyasal kapasiteye sahiptir, bu durumun özeti Tablo 12.34'de verilmiştir. İlginç olan, hücre bölünmesi sırasında septum (ara bölme) oluşumunun anahtar proteini olan Tablo 12.34
• Şekil 12.84 Chlamidia. Fare doku kültürü içerisindeki, psitakoz(papağen hastalığı) üyesi Chlamidia psittaci'mn, bölünen hücresine (ağsı cisim, şekil 12.85' e bakınız) ait ince kesitin elektron mikrografı. Tek bir klamidiyal hücre yaklaşık 1 fim çapındadır.
FtsZ'yi kodlayan genin C. trachomatis genomunda bulunmayışıdır (<3°öKısım 6.2). Daha önceleri bu proteinin, hem Archaea hem de Bacteria dahil bütün prokaryotlarm üremesi için vazgeçilmez olduğu düşünülüyordu. Hatta, C. trachomatis'de bulunan genlerin belirli bir "ökaryotik kanca" taşıdığı ve bu geni patojenik hayat tarzına yardımcı olabilecek şekilde konak genlerinden aldığı düşünülüyordu (Tablo 12.33; oOûKısım 21.7 ve 26.13). Chlamydia'nın Hayat Siklusu
Tipik bir klamidya türünün hayat döngüsü Şekil 12.85«'de verilmişitir. Hayat döngüsünde iki hücresel tip görülmektedir: (1) küçük, yoğun ve elementer cisim denilen, kurumaya karşı oldukça dirençli ve klamidya'nın yayılmasını sağlayan form, ve (2) daha büyük, daha yoğun, retiküler cisim denilen hücre, bu ikiye bölünerek çoğalan vejetatif formdur. Elementer cisimler çoğalmayan, ancak enfeksiyonun iletilmesi için özelleşmiş hücrelerdir. Bunun aksine, retiküler cisimler bulaşıcı olmayan şe-
Zorunlu hücre içi paraziti olan riketsiya, klamidya ve virüslerin karşılaştırılması Riketsiyalar
Klamidyalar
Virüsler
Nükleik asit
RNA ve DNA
RNA ve DNA
Ya RNA ya da DNA(tek veya çift zincirli), asla ikisi bir arada olmaz
Ribozomlar Hücre duvarı Bölünme sırasında yapısal bütünlük Metabolik kapasiteleri
Var
Var
Yok
Peptidoglikan var Korunur
Peptidoglikan vara" Korunur
Duvar yok Kaybolur
Makromolekül sentezi
Yapılır
Yapılır
Sadece konağın imkanlarıyla yapılır
ATP-üretme sistemi Glutamatı okside etme yeteneği Antimikrobiyal antibiyotiklere duyarlılık Filogeni
Var Var
Var" Yok
Yok Yok
Duyarlı
Duyarlı (Penisillin hariç)
Dirençli
Alfa Proteobacteri;I
Klamidyal şube
Hücre değil
Özellik Yapısal
n 15.4) ve peptidoglikan ve ATP sentezi için "Bir klamidyal tür olan Chlamydia trachomatis''in genomunun sekansı tamamen çıkarılmıştır (öt^sKısır olan genler mevcuttur. Ancak klamidyada penisillin duyarlılığının olmaması, peptidoglikanın sentezlenmediği şüphesini doğurmaktadır.
12.28 • Planctomyces: Filogcnctik Olarak Kendine Özgü Saplı Bakteri • 401 Retiküler cisim
Elementer cisim • ^ ^ 1 - 0 . 3 um
Kırılgan hücre duvarı, bölünen forma enfeksiyöz değil
Katı hücre duvarı, büyümez infektöz
Elementer cisim konak hücreye saldırır
2. Elementer cisimcik fagositozu
6. Elementer cisimciğin salınımı
5. Elementer gövdeye dönüşüm
retiküler cisim görülmektedir. Bir seri hücre bölünmesinden sonra, oluşan vejetatif hücreler elementer cisimlere dönüşerek konak hücre parçalanmasıyla açığa çıkar ve diğer hücreleri enfekte edebilir. Jenerasyon süreleri retiküler cisimler için 2-3 saat olarak ölçülmüştür, bu da riketsiya'dan önemli derecede daha hızlıdır. Özet olarak, klamidya konağının kaynaklarında parazitlenmek dahil etkili ve verimli bir hayatta kalma stratejisi göstermek ve yayılma için de dirençli hücre formlarını üretmek için evrimleşmiş görülmektedir (Tablo 12.34). Bu durumda, klamidya'nın çok farklı hastalık sendromlarıyla ilişkili olması sürpriz değildir (Tablo 12.33; Kısım 26.13). 12.27 Kavramların Gözden Geçirilmesi
3. Retikülar cisimciğe dönüşüm
4. Retiküler cisimciklerin çoğalması
Klamidya aşırı küçük parazitik bakteridir ve insanda çok çeşitli hastalıklara sebep olabilir. Klamidya çok küçük bir genoma sahiptir ve belirgin şekilde çoğu metabolik fonksiyondan yoksundur. •
Tablo 12.34'ün verilerini rehber olarak kullanarak, klamidya'nın rekettsiya'dan nasıl ayırt edildiğini söyleyiniz. Virüslerden nasıl ayırt edilir? • Elementer cisim ve retiküler cisim arasındaki fark nedir? • Klamidya genomunun sekanslanmasıyla ortaya çıkan sürpriz durumlar nedir?
(a) Elementer cisimler
ŞUBE 6: PLANCTOMYCES/PIRELLULA
12.28
Planctomyces: Filogenetik Olarak Kendine Özgü Saplı Bakteri
Anahtar Cinsler: Planctomyces, Pirellula, Gemmata Bu şube morfolojik olarak kendine özgü Planctomyces, Pirellula, Gemmata ve Isosphaera cinslerinin de
• Şekil 12.85 Chlamidia'nın enfeksiyon döngüsü, (a) Döngünün şematik diagramı:tüm döngü 48 saat kadar sürer, (b) İnsan klamidiyal enfeksiyonu. Enfekte follop tüpü hücresi patlamakta ve olgun elementer cisimler salmaktadır.
killerdir ve tek görevleri konakçı içinde çoğalarak yayılma için büyük bir inokulum oluşturmaktır. Riketsiya'dan farklı olarak (Kısım 12.13'e bakınız), klamidya arthropodlarla taşınmaz, başlıca solunum sisteminin işgalini havadan (airborne) sağlar. Buradan elementer cisimlerin kuruluğa direncinin önemi anlaşılmaktadır. Şekil 12.84'de bölünen bir
dahil olduğu bakterileri bulundurur. Bunların en iyi çalışılmış olanı Planctomyces'dir (Şekil 12.86*). Kısım 12.16'da Caulobacter gibi saplı bakterileri incelenmişti. Planctomyces de saplı bir bakteridir. Caulobacter'den farklı olarak, Planctomyces'in sapı proteinden oluşur ve hücre duvarı veya sitoplazma içermez (Şekil 12.86'yı Şekil 12.41 ile karşılaştırınız). Planctomyces'in sapı muhtemelen tutunmada görevlidir ama Caulobacter'in prostekal sapından çok daha dar ve ince bir yapıdır. Planctomyces Grubunun Diğer Özellikleri Planctomyces ve akrabaları peptidoglikandan yoksun olmaları ve hücre duvarlarının S-tabaka tipinde olup (ö°ûKısım 4.8 ve 4.10), çok miktarda sistein (sistin olarak) ve prolin içeren proteinden oluşmasıyla ilgi çekicidir. Peptidoglikan bulundurmayan
402 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
• Şekil 12.86 Planctomyces ntaris'in metal gölgele preparafının elektron mikrografı. Tek bir hücre yaklaşık 1-1,5 /un uzunluğundadır. Sapın fibriler yapısına dikkat ediniz. Aynca pili çok bol bulunmaktadır. Kamçının, her hücrede ve tomurcukta, hücrenin sapsız kutbundan geliştiğine de dikkat ediniz.
bir organizmadan bekleneceği gibi, bu organizmalar peptidoglikan sentezini bozan penisillin ve se• Şekil 12.87 Çekirdekli prokaryotlar. Nükleer zarfla kaplı falosporin gibi antibiyotiklere dirençlidir. nükleoidi gösteren Gemmata obscuhglobus hücresine ait ince Ccıulobacter gibi (Şekil 12.41), Planctomyces de kesitin elektron mikrografı. Hücre yaklaşık 1,5 (im çapındadır. tomurcuklanan bir bakteridir ve hareketli yayılan hücrelerin bir yüzeye tutunarak, tutunma noktalaŞimdiye kadar Planctomycetes'in bütün türlerında bir sap oluşturması ve ters kutupta tomurrinin şu veya bu şekilde hücre içi bölmeleri (komcuklanarak yeni bir hücre oluşturulan tipik "hayat partmanları) olduğu bulunmuştur. Bazı kompartdöngüsü" gösterir. Yavru hücre bir kamçı geliştimanlarda DNA'dan yoksun olduğundan başka rerek tutunduğu ana hücreden ayrılır ve döngüye fonksiyonlar üstlenmiştir. Bilinen prokaryotlarm tamamen yeniden başlar. Fizyolojik olarak, Plancdiğer hiçbir grubunda ökaryotlara bu kadar bentomyces türleri tipik fakültatif aerob kemoorganotzeyen iç bölmeler bulunmamıştır. Planctomycetes roflardır, ya şekerlerin fermentasyonu veya soluhücrelerinin kendine özgü kompartmanlaşması numu ile ürerler. Planctomyces'in asıl habitatı suculdur, hem tatlı prokaryot ve ökaryot arası yapısal farkların bulanık su hem de denizde yaşarlar. Isosphaera filamentöz, gözükmesine sebep olmaktadır. Bununla beraber, Planctomycetes hücre yapısından başka, diğer bazı kayan, sıcak su kaynaklarında yaşayan bir bakteridir. Caulobacter gibi (Kısım 12.16'ya bakınız), yönlerden de farklıdır, bu fark özellikle Bacteria Planctomyces ve akrabalarının izolasyonu sıvı vasat domain'inin içinde işgal ettikleri özgül filogenetik pozisyonla ilgilidir (Şekil 12.1). gerektirir. Bu grubun bilinen bütün üyeleri peptidoglikandan yoksun olduğundan, zenginleştirme, penisillin eklenmesiyle daha seçici yapılabilir. ŞUBE 7: Bölüm 2'de prokaryot ve ökaryot hücreler araVERRUCOMICROBIA sındaki başlıca yapısal farkları öğrenmiştik. Özellikle, ökaryotların zarla-sarılı çekirdeği (ö°c>Kısım 2.2) 12.29 Verrucomicrobium ve olduğunu biliyoruz. Ancak, Planctomycetes'in biliProsthecobacter nen bütün prokaryotlar arasında aşırı hücre bölmeleri (kampartmanlaşması) göstererek farklı olduğu, Anahtar Cinsler: Verrucomicrobium hatta zarla-çevrili çekirdek yapısı olduğu bilinmektedir. Örneğin, Gemmata bakterisinde (Şekil 12.87»), Bu bakteri şubesi, prostekah (saplı) Proteobacteria nükleoid, nükleer bir zarf ile çevrilidir. Gemmata''da (Kısım 12.16'ya bakınız) ile sitoplazmik sap deniDNA kovalent olarak kapalı, halkasal ve süper kıvlen yapıların oluşum özelliğim paylaşır. Verrucorımlı (süperkoil) form halinde kalır, bu da prokarmicrobium ve Prosthecobacter cinsleri her hücrede yotlarda tipiktir (öo^Kısım 7.3), fakat çok yoğundur iki ile birkaç adede kadar sap üretir (Şekil 12.88*). ve sitoplazmanın kalan kısmından hakiki bir birim Aynı zamanda tek bir sap taşıyan, kamçılı ve saplızar (unit membran) ile ayrılmıştır (Şekil 12.87). Diolmayan yayılma hücreleri (Kısım 12.16'ya bakınız) ğer ilginç bir bölme Planctomyces''in akrabası olan, bulunduran Caulobacter (Şekil 12.41) hücrelerinden Brocadia anammoxidans'm' anamoksozom'unda bu- farklı olarak, Verrucomicrobium ve Prosthecobacter silunur. Bu bakteri amonyağın, N2'a anaerobik okdasmetrik olarak ikiye bölünür ve hem ana hem yavru yonunu kapalı anamoksozom yapısında gerçekleşhücreler hücre bölünmesi sırasında sap (prosteka) tirir (öOöKısım 17.12). taşır. Verrucomicrobium sözcüğü Yunancada yumru
PVII
12.30 • Bacteroides ve Flavobacterium • 403
habitatlarda yaşayabilirler. Burada grup içindeki iki ana cins üzerinde odaklanılacaktır.
Bacteroides ve Flavobacterium
* Şekil 12.88 Bölünen Venumicrobium spinosum hücresinin negatif boyanmış transmisyon elehtron mikrografı. Siğilimsi prostekaya dikkat ediniz.Tek bir hücre yaklaşık 1 /um çapındadır.
anlamına gelen "warty" 'den gelir ve V. spinosum çok sayıda prosteka üreten görünüşü ile bu isme çok uyumludur. Verrucomicrobia üyeleri diğer prostekalı bakterilerle, hücre duvarlarında peptidoglikan bulundurma ve aerobik ya da fakültatif aerobik olarak çeşitli şekerleri fermente etme özelliklerini paylaşırlar. Verrucomicrobia doğada yaygın olarak bulunur. Orman ve tarımsal topraklarda bulunduğu gibi tatlı su ve deniz ortamlarında da yerleşir. Filogenetik olarak bilinen tüm diğer Bacteria gruplarından farklıdır (Şekil 12.1). Bu grup filogenetik olarak Planctomyces ve Chlamydia'nm bulunduğu şubelerle yakından ilişkilidir (Şekill2.1), fakat her iki gruptan kesinlikle ayrılıp kendine has bir hat oluşturduğu açıktır. Prosthecobacter türlerinde, ökaryotiklerin tubulin genleriyle önemli homoloji gösteren iki gen bulunmuştur. Tubulin, ökaryotlarda hücre iskeletinin yapılmasında anahtar protein rolündedir (coç> Kısım 14.5). Önemli hücre bölünme proteini FtsZ (csoKısım 6.2) aynı zamanda tubulin homologu da olmasına rağmen, Prosthecobacter proteinleri yapısal olarak FtsZ'den ziyade, ökaryotik tubulinlere çok benzer. Bu proteinin Prosthecobacter'deki görevi bilinmemektedir çünkü, ökaryotik-benzeri bir hücre iskelet yapısı, bu organizmalarda gözlenmemiştir. Diğer taraftan, söz konusu genler, ya ortak bir atayı paylaştıkları ya da iki domain'e ait hücreler arasında gen transferi olmasından dolayı Verrucomicrobia ve ökaryotik hücreler arasında özel bir akrabalık ilişkisi bulunduğu konusunda sinyal vermektedir.
ŞUBE 8: FLAVOBACTERIA Flavoacteria, zorunlu aeroblardan zorunlu anaeroblara kadar çeşitlilik gösterip, genel bir filogenetik çizgi üzerinde birleşir. Bu organizmalar çeşitli
Anahtar Cinsler: Bacteroides, Flavobacterium Bacteroides cinsi, zorunlu anaerobik, sporlanmayan sakkarolitik, şeker ya da proteinleri fermente edip, fermentasyonda tamamen türe bağlı olarak asetat ve süksinatı son ürün olarak oluşturan türleri içerir. Bacteroides normalde kommensal olarak insan ve diğer hayvanlarda bulunur (c^Kısım 19.11 ve 21.4). Aslında, Bacteroides türleri insan kalın bağırsağında sayı olarak baskın olup, yapılan ölçümlerle insan dışkısının bir gramında 1010 kadar hücrenin varlığı gösterilmiştir. Ancak bazı Bacteroides türleri patojen olabilir ve insan enfeksiyonlarıyla ilişkilendirilmiş en önemli anaerobik karakterli bakterilerdir. Bacteroides türleri, Bacteria içinde sifingolipidleri
sentezleyen alışmadık çok az birkaç gruptan biridir. Sifingolipidler, gliserol yerine uzun-zincirli amino alkol sfingozin 'inin yer aldığı lipidlerin heterojen bir toplamıdır (Şekil 12.89»). Sfingolipidler, sifingomiyelin, serebrositler ve gangliyositler gibi, memelilerin özellikle beyin ve diğer sinir dokularında yaygın olarak bulunurlar. Bacteroides'in aksine Flavobacterium türleri başlı-
ca tatlı su ve denizler olmak üzere sucul habitatlarda bulundukları gibi, besinlerde ve besin imalatı yapan tesislerde bulunur. Flavobacterium kolonileri genellikle sarı pigmentlidir ve fizyolojik olarak aerobtur. Kullandıkları besin kaynakları oldukça sınırlı olup, karbon ve enerji kaynağı olarak glukoz dışındaki diğer karbon bileşiklerini çok az kullanırlar. Flavobakteriler, ender olarak patojendirler; yalnızca F. meningosepticum adı bir türü bebeklerdeki menenjit vakalarıyla ilişkilidir. Bu gruptaki diğer önemli cinsler ise psikrofilik ya da psikrotolerant'lardır (o«c»Şekil 6.11). Bunlar, özellikle Polaribacter ve Psychroflexus'u kapsar. Bu
gruptaki diğer birçok cins de ayrıca 20°C'nin altında üreyebilme yeteneğindedir.
H2C-OH HC-OH H2C-OH
ı* H H H,C-(CH 2 ) 1 2 -C=C-C-C-CH 2 OH 3
2(12
H
|
|
2
OH NH 3 +
• Şekil 12.89 Sifingolipidler. Gliserolün (a) sifingozin (b) ile karşılaştırılması. Karakteristik olarak Bacteroides türlerindeki sifingolipidlerde esterleşen alkol sifingozindir; bir yağ asidi N atomu ile (kırmızı ile gösterilen) terminal -OH grubuna (yeşil ile gösterilen) peptid bağı ile bağlanır; bu oluşumda fosfatidil kolin (sifingomyelin) ya da çeşitli şekerlerden (serebrozidler, gangliyozidler) herhangi biri bulunabilir.
404 • Bölüm 12 • Prokaryotih Çeşitlilik: Bacteria
ŞUBE 9: CYTOPHAGA GRUBU
Cytophaga ve Akraba Gruplar Anahtar Cinsler: Cytophaga, Flexibacter, Rhodothermus, Salinibacter Chytophaga grubundaki organizmalar uzun, ince, gram-negatif çubuk şeklindedir. Çoğu sivri uçla sonlanıp, kayarak hareket eder (Şekil 12.90a,b»). Cytophaga'ya morfolojik ve fizyolojik benzerlik gösteren yakın cins Sporocytophaga, mikrosist (Şekil
12.90d) denilen küresel dinlenme sporlarıyla daha çok tomurcuklanan myxoBacteria'nm ürettiklerine benzerlik gösterir (Kısım 12.17 ye bakınız). Toprak ve suda çok bol miktarda bulunurlar. Cytophaga'ların çoğu, selüloz (12.90c), ağar (Şekil 12.90Ö), kitin gibi polisakkaritleri sindirirler. Selüloz parçalayıcıları, mineral tuz ağar ortamı üzerine yerleştirilen bir parça selüloz filtre kağıdının üstüne küçük toprak kırıntılarının eklenmesi ile kolayca izole edilebilirler. Bakteriler, selüloz fibrillerinin üzerine yapışıp onları sindirir ve yayılan koloniler oluştururlar (Şekil 12.90c). Cytophaga'lar çözülebilir, hücre dışı ve selüloz-sindirici enzimler (selülaz) üretmezler. Onun yerine, selülazlar hücre zarfına tutunmuş bir şekilde dururlar ki, bu da hücrelerin selülozu sindirmek için neden selüloz fibrillerine tutunduğunu açıklamaktadır. Saf kültürde, Cytophaga selüloz liflerinin gömülü olduğu ağar üzerinde üretilebilir. Bu ortamda, selülozun sindirildiği yerde şeffaf zon oluşumu organizmanın varlığını belirtir (Şekil 12.90c; ayrıca Şekil 17.62'ya bakınız). Cytophaga ve Sporocytophaga zorunlu aerobik
olup, muhtemelen doğada oksijenli çevrede prokaryotlar tarafından yapılan selüloz sindiriminin büyük kısmını sağlarlar. Çok sayıda Cytophaga türü ayrıca balıklara patojen olup, kültür balıkçılığı sektöründe önemli sorunlara yol açabilir. Bu hastalıklardan en önemli ikisinden biri C. columnaris'in etken olduğu columnaris hastalığı ve C. psychrophüa'mn etken olduğu soğuk-su-hastalığıdır.
Her iki hastalık da ayrıcalıklı olarak atıkların kabul edildiği kirli sulardaki ve balık çiftlikleri, su ürünleri yetiştiriciliği gibi yüksek sınırlandırılmış sularda yaşayan stresli olan balıkları etkiler. Hasta olan balıkta çoğunlukla solungaçların etrafında doku harabiyeti görülür. Bu harabiyet, enfekte balıktan izole edilmiş olan Cytophaga türlerinin tipik kuvvetli proteolitik etkilerinden kaynaklanır. Flexibacter cinsi Cytophaga'dan, türlerinin selü-
lotik olmamaları ve iyi üreyebilmek için kompleks besi yerine gereksinim duymalarıyla ayrılırlar. Bazı Flexibacter türlerinin hücreleri değişikliğe uğrayarak; uzun, kayan, çapraz-duvardan yoksun ipliksi flament şeklinden, kısa ve hareketsiz basil-
• Şekil 12.90 Cytophaga ve Sporocytophaga (a) Ağan parçalayan agarolitik deniz Cytophaga türününün petri kabında oluşturduğu görüntü, (b) Selüloz üzerinde üreyen Sporocytophaga kolonileri. Selülozun parçalandığı açık alanlara dikkat ediniz (oklar). (c) Sülüloz filtre kağıdı üzerinde üremiş olan C. h u tchinsonü hücrelerinin faz kontrast fotomikrografisi. (d) Sporocytophaga myxococcoides'm basil şekilli hücrelerinin ve küresel mikrosistlerinin faz kontrast fotomikrografisi (Hücreler yaklaşık 0,5 /im ve mikrosistler ise 1,5 /xm çapındadır).
lere dönüşürler. Çoğu türleri ise sitoplazmik zarda yerleşen karoteneoidlerden ya da gram-negatif dış zarında yer alan fleksirubin denilen pigmentlerden dolayı renklidir. Flexibacter genellikle toprak ve tatlı su saprofit i olup, şimdiye kadar patojen bir türü tanımlanmamıştır.
12 32 • Chlorobium ve Diğer Yeşil Kükürtlü Bakteriler • 405
Rhodothermusl Salinibacter Rhodothermus ve Salinibacter cinsleri Cytophaga şubesinin içinde olmalarına rağmen uzak akrabalardır. Rhodothermus ve Salinibacter gram-negatif, kırmızı veya sarı pigmentli, zorunlu aerobik kemoorganotrofik bakterilerdir. Rhodothermus termofilik olup ortalama 60-65 °C de ürer. Rhodothermus şeker ya da basit ve kompleks polisakkaritlerin bulundukları ortamlarda iyi ürer. Bu organizmalar sığ denizlerde, sıcak su kaynaklarında ve hatta karasal sıcak su alanlarında da saptanmışlardır. Rhodothermus biyoteknolojik önemi olan, amilaz (nişastayı parçalar), selülaz (selüloz parçaları) ve ksilanazın (bitki hücre duvarındaki hemiselülozları parçalar) da dahil birçok sıcaklığa dayanıklı hidrolitik enzim sentezler. Salinibacter, ekstrem halofilik, kırmızı bir bakteri olup, diğer tüm Bacteria içinde tuza en dayanıklı ve tuza en çok gereksinim duyan bakteridir. Aslında, tuza gereksinimi ile Halobacterium (Kısım 13.3) gibi sınır aşırı halofilik Archea'ya rakiptir. Bilinen tek türü Sallinibacter ruber, aşırı tuzlu göletlerde ve etraflarındaki yüksek oranda tuz bulunan çevrelerde yaşar. Salinibacter, Halobacterium'la ortak olarak, Bacteria domain'i içindeki halofillerde çok nadir olarak bulunan K+ u uygun bir çözünen olarak kullanma özelliğini taşır, (çoğu halofilik Bacteria, tuzlu-ortamlarındaki su dengesini kurmak için, çözünen organik mddeyi ya sentezler ya da biriktiriler, öo^Kısım 6.14). Bir hayli yüksek oranda hidrolitik olan Rhodothermus'un aksine, Salinibacter, Halobacterium'a benzer olarak, aminoasitleri elektron vericisi olarak kullanarak çok iyi ürer. Bu yüzden filogenetik olarak benzersiz olmalarına rağmen, muhtemelen bu organizmaların paylaştıkları ekstrem çevredeki kendilerine özgü istekleri nedeniyle, Halobacterium ve Salinibacter'de fizyolojik stratejilerinin aynı yol boyunca birleştiği benzer bir konvergent evrim görülmektedir.
ŞUBE 10: YEŞİL KÜKÜRT BAKTERİLERİ 12.32
Chlorobium ve Diğer Yeşil Kükürt Bakterileri
Anahtar Cinsler: Chlorobium, Chlorobaculum, Prosthecochloris, "Chlorochromatium " Yeşil kükürtlü bakteriler, filogenetik olarak hareketsiz anoksijenik (oksijensiz) fototrof bakterilerden ayrı bir grupta yer alan, sedece zorunlu anaerobik ve fototrofik türlerin izole edildiği bir gruptur. Morfolojik olarak sınırlandırılmış olup, kısadan uzuna değişen basiller içerir (Tablo 12.35 ve Şekil 12.91 •). Mor kükürlü bakteriler gibi, elektron vericisi olarak H2S'i kullanarak onu öncelikle S°'e sonra da SO42~ 'ye okside ederler. Ancak mor kükürtlü bakterilerinden farklı olarak, yeşil kükürtlü bakterilerin oluşturduğu kükürt hücre dışında depo edilir (Şekil 12.91a; <=»öŞekil 17.17b). Türlerinin çoğu ışık varlığında bazı organik bileşikleri özümleyebilir (bu, footoheterotrofi'dir; Ö°Q Şekil 17.4). Zorunlu ototrofi, mor bakterilerdeki gibi Calvin döngüsü tepkimeleri ile desteklenmez onun yerine ototrofinin özel bir durumu olarak sitrik asit döngüsündeki basamakların tersine ilerlemesiyle gerçekleşir (cö^Kısım 17.7, ters (revers) sitrik asit döngüsü).
12.28-12.31 Kavramların Gözden Geçirilmesi Planctomyces grubu saplı, tomurcuklanan bakterileri içerirken; flavobakteriler çeşitli gram-negatif; hayvanlar, gıdalar ve toprakla ilişkili kamçıyla veya kayarak hareket eden bakterileri içerir. Verrucomicrobia üyeleri çoklu prostekalı hücreleri ile ayrılırlar. Cytophaga grubu toprakta, suda, sıcak su kaynakları ve termal ortamlarda bulunan zorunlu aerobik kemoorganotrofik bakterileri içerir. •
Hücre duvarı ve DNA düzenlenmesi açısından Planctomyces'e özgü özellikler nelerdir?
•
Planctomyces'in sapı Caulobacter'in sapından nasıl ayrılır?
•
Doğada çok bol miktarlarda Bacterioides'i nerede bulabilirsiniz?
•
Cytophaga türlerini doğadan izole etmenin bir yöntemini açıklayınız.
•
Rhodothermus ve Salinibacter'i habitatları ve fizyolojileri açısından karşılaştırınız.
• Şekil 12.91 Fotorofik yeşil kükürtlü bakteriler, (a) Chlorobium limilicola; hücreler yaklaşk 0,8 ^ım genişliğindedir. Kükürt granüllerinin hücre dışında depolandığına dikkat ediniz, (b) Chlorobium elathratiformes, üç boyutlu ağ oluşturan bir bakteridir; hücreler yaklaşık 0,8 /um genişliğindedir.
406 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bactcria
Fototrofik yeşil kükürt bakteri Tablo 12.35 cinsleri ve özellikleri Özellikler Düz veya kıvrık basiller, bazıları dallanan; hareketsiz; yeşil veya kahverengi renkte; bazıları gaz kesecikleri içerir Küre veya oval, hareketsiz; prosteka oluştum; yeşil veya kahverengi Basiller, kayma ile hareket; yeşil
Cins (mol % CC) Chlorobium (49-58) Chlorobaculum (56-58)
(a)
Prosthecochloris (50-56) Chlororhepeton (47)
Pigmentler ve Ekoloji Yeşil kükürtlü bakteriler bakteriyoklorofillerden, bakterioklorofil a'yı içerip bunun yanı sıra bakterioklorofil c, d veya e de bulundurmaktadır. Bu sonuncu pigmentler sadece ışığın yakalanması tepkimelerinde rol oynarlar ve klorozom (chlorosome) denilen benzersiz yapılarda bulunurlar (Şekil 12.92»). Klorozomlar boyları eninden uzun, bakteriyoklorofillerce zengin, dışlarında ince ve birim zar (membran) yapısında olmayan bir zarla çevrilmiş, hücre periferindeki sitoplazmik zara tutunmuş yapılardır (Şekil 12.92; ayrıca Şekil 17.7'ye bakınız). Yeşil kükürtlü bakterilerdeki enerji transferi üzerinde yapılan çalışmalarla (c°sKısım 17.2), ışık enerjisinin klorozomlar içindeki bakteriyoklorofil c, d veya e tarafından absorbe edilip, sitoplazmik zarda (bulunan bakteriyoklorofil a'ya kanalize edildiği gösterilmiştir. Fotosentetik enerji dönüşümü ve ATP sentezi aslında burada gerçekleşmektedir (oooŞekil 17.7). Hem yeşil hem de kahverenkli yeşil kükürtlü bakteri türleri bilinmektedir, kahverenkli türlerde bakteriyoklorofil e ve bakteriye kahverengini veren karetenoidler bulunmaktadır (Şekil 12.93»; öooŞekil 17.9). Mor kükürtlü bakteriler (Kısım 12.2) gibi yeşil kükürtlü bakteriler de özellikle H2S'in bulunduğu (genellikle yeşil kükürtlü bakteriler mor kükürtlü bakterilerilere göre, sülfide daha çok tolerans gös-
• Şekil 12.92 Yeşil kükürt bakterisi Chlorobium tepidum'a ait ince kesitin Elektron mikrograh. Klorozornlann hücre çeperinde olduğuna dikkat ediniz. Tek bir hücre yaklaşık 0,7 /un genişliğindedir.
• Şekil 12.93 Yeşil ve kahverengi Chlorobium'Ua. (a) Chlorobium tepidum ve (b) Chlorobim phaeobacteroides'in tüpdeki kültürleri. C. phaeobacteroides hücreleri bakteriyo klorofil e ve kahverenkli karotenoid izorenieraten içerirken; C. tepidum yeşil karotenoid bakteriyofil c ve a serisini içerir. Yeşil ve kahverengi karotenoidlerin özel yapısı için Şekil 17.9'a bakınız.
terirler.) anoksik sucul ortamlarda yaşarlar. Klorozomun yeterli ışık-toplama yeteneği sayesinde yeşil kükürtlü bakterilere fotosentetik etkinlikleri için küçük bir ışık bile yeterli olmaktadır ve bu nedenle, başka fototrofik organizmaların bulunmadığı göllerin en derin yerlerinde bile bulunurlar. Chlorobium tepidium türü (Şekil 12.92) termofilik olup, yüksek oranda sülfid içeren sıcak su kaynaklarında yoğun mikrobiyal yığınlar oluşturur. C. tepidium aynı zamanda genomunun (2.1 Mbç) gen analizinin tamamen yapılması (anoksijenik fototroflarm ilk tanımlanmış olanı) ile de dikkate değer. C. tepidium hızla ürer ve hem konjugasyon hem de transformasyonla yapılan genetik manipulasyonlar için uyumludur. Yeşil kükürtlü bakterilerin moleküler biyoloji çalışmalarında model organizma haline gelmiştir. Yeşil Kükürt Bakteri Birlikleri Belirli bazı yeşil kükürtlü bakteriler, kemoorganotrofik bir bakteri ile birlik (konsorsiyum) denilen iç-içe iki üyeli bir birliktelik kurabilir. Bir konsorsiyumda her iki organizma da birbirinden yarar sağlar ve böylece değişik fototrofik ve kemotrofik bileşenleri içeren birlik grupları doğada bulunur. Epibiont denilen fototrofik bileşen, mekanizması henüz çözülememiş olan bir mekanizma ile fototrofik olmayan hücreye fiziksel olarak tutunur (Şekil 12.94). "Chlorochromatium aggregatum" adı genellikle yaygın olarak gözlenen bir birlik için kullanılır fakat bir yerine iki ayrı organizmayı temsil ettiği için taksonomide resmi bir yeri yoktur. Fototrofik olmayan merkezi (sentral) bir hücreyi çevreleyen, epibiontları bakteriyoklorofil c veya d ile yeşil-renkli karotenoid içeren yeşil kükürtlü bakterilerden oluşan, Chlorochromatium aggregatum birliğinin rengi yeşildir (ekil 12.94e). Yapısal olarak benzer "Pelochromatium roseum" organizması kahve-renklidir. Dahası, diğer birliklerde epibiont hücreleri morfolojik olarak virgül şeklindedir (Şekil 12.94£>,c).
12.33 • Spiroketler » 407
reler boyanmaz (Şekil 12.94/,g). Ayrıca laboratuvar kültürü çalışmalarıyla merkez hücre ve epibiontlarm sinkronize olarak aynı anda bölündükleri gösterilmiş ve iki bileşenin bir biçimde iletişim halinde oldukları izlenimi edinilmiştir. Bu hücrelerin neden ve nasıl bir araya geldikleri henüz açıklık kazanamamıştır. Diğer taraftan, laboratuvar ve alan çalışmalarıyla birliklerlerdeki epibiontlarm, ışık şiddetinin çok kısıtlı bir aralığına ve sülfid konsantrasyonlarına uyumlu olduğu saptanmıştır. Merkez hücreler, verimli bir fotosentez için, diğer hareketsiz fototroflara su kolonu içinde uygun dizilme olanağı sağlıyor olabilir.Birlik içindeki merkez hücresi muhtemelen bu düzenlenme şeklinden, yeşil kükürtlü bakteriler tarafından oluşturulup dışarıya salınan fotosentetik CO2 sayesinde üretilen besinleri alarak yararlanır. 12.32 Kavram/ana Gözden Geçirilmesi Yeşil kükürtlü bakterileri klorozom adı verilen, kendilerine özgü yapıları üreten zorunlu anaerobik anoksijenik fototroflardır. Bu organizmalar çok düşük ışık yoğunluklarında üreyebilir ve H2S'i S° ve SO4~2'ye okside edebilirler. Fototrofik yeşil bakterileri ve fototrofik olmayan merkezi bir hücre içeren konsorsiyumlar sülfidik sucul ortamlarda yaygındırlar. • •
Kolorozomlarda hangi pigmentler bulunur? Ototrofi ile ilgili olarak yeşil kükürt bakterilerine has özellik nedir (öOoKısım 17.7)? • Yeşil bakteriyal konsorsiyumların epibiyontlarmm gerçek kükürt bakterileri olduğu konusundaki fikirleri destekleyen kanıt nedir?
fe; • Şekil 12.94 Yeşil kükürtlü bakterilerin konsorsiyumları. "Chlorochromatium aggregatum" veya "Pelochromatium roseum" daki yeşil veya kahverengi konsorsiyumların (a-c) faz kontrast mikrograflan ve (d) transmisyon elektron mikrografı. (a-c) Fototrofik olmayan sentral organizma pigmentli fototrofik bakterilerden açık renklidir. (d)Klorozomlara dikkat ediniz(oklar). Tüm bir konsortsiyum yaklaşık 3 /xm çapındadır, (e) Chlorochromatium aggregatum hücrelerinin diferansiyel kontrast mikrografı. (f-g) Florasans mikrograflar. (f) DAPI boyalı hücreler (DNA'yı boyar), (g) (f)'deki ile aynı preparatın yeşil kükürtlü bakteriler (san) için olan filogenetik prob ile boyanmasıyla hazırlanmış preparat.
Bazı yeşil bakteriyal birlikler laboratuvar koşullarında üretilebilirler. C. aggregatum konsorsiyumu ortalama bir merkezi hücre başına 12 epibiont içerirken, P.roseum ise hücre başına 20 kadar epibiont içerir. Epibiontlarm gerçekten yeşil kükürtlü bakterilerden oluştuğunun somut kanıtları, epibiontlarm ince kesitlerinde klorozomların net bir şekilde görülmesi (Şekil 12.94d) ve moleküler kanıtlardır. Birlikler, yeşil kükürtlü bakteriyal 16S rRNA için özgül olan floresan oligonükleotit probu ile muamele edildiğinde (BALIK teknolojisi, Kısım 11.7 ve 18.4) epibiontlar floresan boyanırken merkez hüc-
ŞUBE 1 1 : SPIROCHETES
Spiroketler Anahtar Cinsler: Spirocheta, Treponema, Cristispira, Leptospira, Borrelia Spiroketler gram-negatif, hareketli, sıkıca sarılmış, tipik olarak ince ve kıvrımlı şekillerde olan Bacteria grubudur (Şekil 12.95»). Morfolojik olarak benzersiz olan bu prokaryotlar, Bacteria içinde büyük bir filogenetik hat oluştururlar (Şekil 12.1). Spiroketler sucul çevrede ve hayvanlarda yaygın olarak bulunur. Bazıları, hastalığa neden olur, buna insanlara cinsel yolla bulaşan sifiliz (frengi) de dahildir (ca^ Kısım 26.12). Spiroketler bir protoplazmik silindirden oluşurlar. Hücre duvarı ve zarı tarafından çevrelenmiş bölgeler içerirler (Şekil 12.96•). Hareket, her kutuptan çıkan bir veya daha fazla kamçı tarafından sağlanmaktadır (12.96). Diğer taraftan, tipik bakteri kamçısından («»sKısım 4.14) farklı olarak, Spiroket kamçısı her kutupta protoplazmik silindirin üzerine geri katlanmalar gösterir ve hücrenin periplazması üzerinde yerleşik kalır; bu nedenle bunlara
408 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
f 1 •
•
:
.
'
• - , - .
•••••
•
:
.
a» (a)
(b)
• Şekil 12.95 Spiroketlerin morfolojisi Aynı büyütmedeki iki spiroket, büyüklük açısından gruptaki geniş aralığı göstermektedir, (a) Spirochatea stenostrepta, faz kontrast mikroskobu ile görüntülenmiştir. Tek bir hücre yaklaşık 0,25 /u.m çapındadır ve 250 fim (0,25 mm)'ye kadar uzunlukta olabilir.
endoflajel (içkamçı) denir. Hem endoflajel hem de protoplazmik silindir çok katlı ancak esnek olan dış kılıf denilen bir zarla çevrilidir (Şekil.12.96).
hareket diğer prokaryotlardaki kamçı hareketinden daha düzensiz ve sarsıntılıdır. Sınıflandırma
Spiroketlerin Hareketleri
Spiroketler alışılmadık bir hareket tarzına sahiptir. Her bir endoflajel, bir uçtan tutunur ve sonra hücrenin boyunun üçte ikisi kadar uzar. Tıpkı bakteri kamçısında («^a^Kısım 4.14) olduğu gibi endoflajel bir eksen üzerinde döner. Ancak dış kılıf esnek bir yapı gösterirken protoplazmik silindir sert-bükülmez bir özellik gösterdiğinden, iki endoflajel da aynı yöne doğru dönerken, protoplazmik silindir tam ters yöne dönerek Şekil 12.96b'de gösterildiği gibi hücrenin bükülmesini sağlar. Bu durum endoflajelin dönmesiyle (Şekil 12.96b) protoplazmik silindirin her iki ucunda oluşan dönme kuvvetine bağlı olarak spiroketin bükülme ya da burkulma hareketine neden olur. Böylece, endoflajelin hücreden dışarıya uzanmamasına rağmen, dönme hareketi hücre hareketine neden olur. Bu
Spiroketler başlıca; habitatları, patojeniteleri, filogenileri, morfolojik ve fizyolojik özellikleri esas alınarak sekiz cinse ayrılırlar. Tablo 12.36'da önemli cinsler ve özellikleri verilmiştir. Spitochaeta ve Cristispira Spirochaeta cinsi, serbest yaşayan, anaerobik ve fakültatif aerobik spiroketleri kapsar. Bu organizmalar olarak su ve nehir çamuru, havuzlar, göller ve okyanuslar gibi sucul çevrelerde bulunurlar. Spirochaeta cinsine ait S. plicatilis (Şekil 12.95b), ol-
dukça büyük bir spiroket olup, H2S-içeren tatlı su ve denizlerde bulunan bir türdür. S. Plicatilis'in endoflajeli bir demet oluşturacak şekilde kıvrımlı protoplazmik silindirin etrafını sarmalar. Bu spiroketin her bir kutbunda ortalama 18 ile 20 ara-
Endoflagellum (sert, döner, protoplazmik silindirin bir başına tutunmuş)
Endoflogellum
Dış kılıf (esnek)
Protoplazmik silindir (sört, çoğunlukla helikai; (b) • Şekil 12.96 Spiroketlerde hareket, (a) Endoflajellum'u gösteren Spirocheata zuelzerae'ye ait preparatın elektron mikrografı. Tek bir hücre yaklaşık 0,3 /im çapındadır, (b) Protoplazmik silindir, endoflajelin ve dış kılıfın düzenlenmesini gösteren spiroket hücresi dikey kesiti ve sert endoflajelin dönüşünün, protoplazmik silindirin ve dış kılıfın (ters yönde) dönmesini sağladığı hareket şekli. Eğer kılıf serbest ise, hücre uzunlamasına eksende dönecektir ve o boylu boyunca hareket edecektir. Eğer kılıf katı bir yüzeyle ilişkili ise, hücre yavaşça ileri doğru kayacaktır.
12.33 • Spirohetler • 409
Tablo 12.36
Cins Cristispira
1
Spiroket cinsleri ve özellikleri Boyutlar
Genel özellikleri
30-150 x 0.5-3.0
3-10 tam sarmal; faz kontrast mikroskobu ile görülebilen endoflagel püskülleri var Aerobik veya fakültatif aerobik; sıkı veya gevşek sarmal oluşturmuş Mikroaerofilik ya da anaerobik; 0,5/xm'ye kadar genişlikte helikal veya yassı sarmal Mikroaerofilik; yaklaşık 1 /um genişliğinde 5-7 sarmal
(/im)
Spirochaeta
5-250 X 0.2-0.75
Treponema
5-15 x 0.1-0.4
Borrelia
8-30 x 0.2-0.5
Leptospira
6-20 x 0.1
Leptonema
6-20 x 0.1
Brachyspira
7-10 x 0.35-0.45
Brevinema
4-5 x 0.2-0.3
Aerobik, eğri ve kanca şeklinde başları olan sıkı sarılmış yapı, uzun zincir yağ asitlerine ihtiyaç duyar Aerobik; uzun zincir yağ asitlerine ihtiyaç duymaz Anaerob
DNA
Endoflagel (mol % GC) Habitat sayısı — >100 Yumuşakçaların
2^0
50-65
2-32
25-53
7-20
46
2
33^3
2
54
8-28
25-27
2
34-36
Mikroaerofil, 16S rRNA sekansı ile spiroket hattında derin bir dal oluşturur (Şekil 12.1'e bakınız)
smda değişen endoflajel bulunmaktadır.Kültürü yapılmış diğer bir tür, Spirocheta stenostrepta Şekil 12.95a'te gösterilmiştir. H2S'ce zengin çamurlarda zorunlu anaerob olarak yaşar. Şekerleri glikolitik yolla fermente ederek, etanol, asetat, laktat, CO2 ve H 2 oluşturur. Spirocheta aurantia turuncu pigmentli fakültatif anaerob bir türdür. Şekerleri anaerobik koşullar altında gilikolitik yolla fermente ederken, aerobik koşullarda ise CO2 ve asetata okside eder. Cristispira cinsi (Şekil 12.97»), doğada deniztarağı ve istiridyeler gibi belirli bazı yumuşakçaların kristal kalemi (crystalline style) içinde bulunan benzersiz yayılım gösteren türler içerir. Kristal kalem bir kese içinde yerleşmiş esnek, yarı-katı bir çubuk olup sindirim sisteminin sert yüzeyine karşı döner, böylece sindirime karışacak besinlerin küçük partiküllerini öğütür. Yumuşakçaların kristal kalem içinde büyük spiroket olarak bulunan cristispiralar, bir türbuşon gibi ileri-geri yaptıkları hareketleriyle mikrosop altında görülebilir Cristispira hem tatlı su hem de deniz yumuşakçalarında görülür fakat yumuşakçaların tüm türlerinde bu-
sindirim sistemi; kültür edilmemiştir Sucul, serbest yaşar, tatlı su ve deniz insanlarda ve diğer hayvanlarda kommensal ya da parazitik İnsanlar ya da diğer memeliler, artropodlar Serbest yaşayan veya insanlar ve diğer memelilerde parazit
Hastalıklar
1
Bilinmiyor
Bilinmiyor
Frengi, ekvator frengisi, domuz dizanterisi, pinta Tekrarlayan humma, Lyme hastalığı, büyükbaş ve küçükbaş borreliosisi Leptospirosis
Serbest yaşayan
Bilinmiyor
Sıcak kanlı hayvanlarn sindirim sisteminde Fare ve kır farelerinin kan ve dokularında
Tavuk ve domuzlarda ishal Laboratuvar farelerinde bulaşıcı
lunmazlar. Ne yazık ki, Cristispira kültüre edilememiştir, bu yüzden neden benzersiz bir habitatla sınırlandığının fizyolojik temeli bilinmemektedir.
• Şekil 12.97 Cristispira. Büyük bir spiroket olan Cristispira'ya ait ince kesitin elektronmikrografı. Tek bir hücre yaklaşık 2 /im çapındadır. Çok sayıdaki endoflagele dikkat edi-
410 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
Treponema Anaerobik, konak-ilişkili spiroketlerdir. İnsan ve hayvanlarla kommensal ya da parazit olarak yaşayanları Treponema cinsi içinde yer alır. Treponema pallidum, sifiliz (frengi) etkeni (c«öKısım 26.12) olup, Treponema! n\n en iyi bilinen türüdür. Morfolojisiyle diğer spiroketlerden ayrılır; hücre spiral yapılı değildir, düz dalga şeklindedir. T. pallidum hücresi dikkat çekecek kadar ince olup yalnızca 0.2 /xm çapındadır. Bu nedenle, karanlık-alan mikroskobu şüpheli lezyon (yara) salgılarının incelenmesinde uzun zamandan beri kullanılan bir yöntem olmuştur («»sŞekil 26.28). T. pallidum, yapay olarak tavşanlarda ve maymunlarda enfeksiyon oluşturmasına rağmen doğada yalnız insanlarda hastalık yapmaktadır. Laboratuvar koşullarında hiçbir şekilde elde edilememiş olmasına rağmen, hayvanlar üzerindeki çalışmalardan (enfekte edilmiş tavşanlardan saflaştırılmıştır) alınan virulan T. pallidum hücrelerinin, bir sitokrom sistemi içerip mikroaerofil oldukları saptanmıştır. Ayrıca bu hücreler, T. pallidum genomunun (1.14 Mbç) dizi analizi için yeterli miktarda DNA üretir (oo^Kısım 15.3). Treponema cinsinin diğer türleri insanların ağız boşluğunda kommensal olarak yaşayıp, genellikle diş ve dişeti arasında kalan dar bir alandan kazıma yöntemiyle alınan örneklerde görülebilir. Treponema denticola, oral treponemaların başlıcalarmdan biridir. Sistein ve serin gibi amino asitleri fermente ederek, fermentasyon asidi olarak en fazla asetat oluşturması yanı sıra CO2, NH 3 ve H2S oluşturur. Metabolik olarak sıra dışı Treponema cinsleri termitlerin (karıncaların) son bağırsak bölgesinden izole edilmiştir. Termitlerin genellikle ağaç ve ağaç ürünleri üzerinde beslenmeleri nedeniyle bunların çevreleri fazla miktarda selülotiktir. Selülozdan salınan glukozun fermentasyonu sonucunda H 2 ve CO2 oluşmaktadır. Treponema primitia ayrıca homoasetojen olayı ile H 2 + CO2'yi asatata çevirir (ocoKısım 17.16 homoasetojenozis tartışmasına bakınız). Bu şekilde Bacteria'nm bir filogenetik grubunda enerji metabolizması oluşumu, clostridia ve benzerlerinin dışında ilk örnektir (Kısım 12.20). Son bağırsak spiroketlerinden olan Treponema azotonutricum, spiroketlerde daha önce görülmemiş bir özellik olan moleküler azotu fikse etme (N2 fiksasyonu, ««sKısım 17.28) yeteneğindedir. Spiroketler ayrıca geviş getiren hayvanların rumenlerinde de bulunurlar (ooç>Kısım 19.11). Treponema saccharophilum (Şekil 12.98*) sığırların rumeninde bulunan pektinolitik büyük bir türdür. Treponema saccharophilum zorunlu anaerob olup,
pektin, nişasta, inulin ve diğer bitki polisakkaritlerini fermente eder. Muhtemelen bu ve diğer spiroketler, bitki polisakkaritlerinin uçucu yağ asitlerine çevrilmesinde ve gevişenler tarafından enerji kaynağı olarak kullanılmasında önemli rol oynarlar (<30oKısım 19.11). Treponema cinsi filogenetik olarak tek olmasına rağmen T. pallidium ve diğer Tre-
•
• Şekil 12.98 Treponema ve Borrelia. (a) Büyükbaş hayvan işkembesinden elde edilmiş büyük pektinolitik spiroket Treponema saccharophilum'un faz-kontrast fotomikrografı. Tek bir hücre yaklaşık 0,4 fim çapındadır. Solda, düzenli kıvrılmış hücreler; sağda düzensiz kıvrılmış hücreler vardır, (b) Lyme hastalığı etkeni Borrelia burgdorferii'nin tarayıcı elektron mikrografı.
ponema cinsleri birbilerine uzak olabilir. Çünkü, T. pallidium genomik DNA'sının GC oranı %53 iken, bu cinsin diğer türlerininki %38 ve %40 ya da yaklaşık %25 civarındadır. Borrelia Borrelia cinsindeki türlerin çoğu hayvan ve insan patojenidir. Borrelia recurrentis insanlarda dönücü (dönek) ateş etkeni olup, bulaşımı bir böcek vektörü, çoğunlukla da insan vücut biti ile olur. Dönücü ateş, genellikle önce 3-7 gün süren yüksek ateş ve genel bir kas ağrısıyla kendini gösterip bunu daha sonra 7-9 gün süren bir iyileşme dönemi takip eder. Tedavi edilmese, ateş iki ya da üç kez daha döngüsünü tekrarlayıp (bu nedenle adı dönücü ateş), enfekte kişilerin %40 ve üzerinin ölümüne neden olmaktadır. Neyse ki, organizma tetrasikline oldukça diğer borrelia'ların veteriner hekimlikte önemleri büyüktür, bu türler sığır, koyun, at ve kuşlarda hastalıklara neden olurlar. Borrelia burgdorferi (Şekil 12.98b), kenelerden geçen Lyme hastalığının etkeni olup, insan ve hayvanları enfekte eder. Lyme hastalığı Kısım 27.4'te ayrıntılı olarak tartışılacaktır. Borrelia burgdorferi ayrıca, şimdiye kadar bilinen prokaryotlarm çok azında bulunan doğrusal bir kromozoma (halkasalm aksine) sahiptir. B. burgdorferi'nin oldukça küçük olan genomunun (1.44 Mbç) dizi analizi tamamen yapılmıştır (c«iKısım 15.3). Leptospira ve Leptonema Leptospira ve Leptonema cinsleri zorunlu aerobik, uzun
zincirli yağ asitlerini (örneğin,oleik asit) elektron
12.34 • Deinococcus/Thermus
vericisi ve karbon kaynağı olarak kullanan spiroketlerdir. Birkaç istisna dışında yalnızca bu substratlar leptospiralar tarafından üreme için kullanılır. Leptospira hücreleri ince, çok kıvrımlı (he'ezonlu) ve genellikle uçları yarım daire şeklinde kıvrılmış kanca morfolojisi gösterirler. Günümüzde, bu grubun içinde bazı serbest-yaşayanlar ve çoğu da parazitik olmak üzere çeşitli türler tanımlanmıştır. Leptospira interrogans (parazitik) ve L. biflexa (serbest yaşam) bu cinsin iki önemli türüdür. Leptospira interrogans suşları insan ve hayvanlar için parazittir. Köpek ve domuzlar da bu suşlarm önemli taşıyıcılarından olmasına rağmen, çoğu leptospiranm doğal konakları rodentlerdir (kemiriciler). İnsanlarda en yaygın leptospiral sendrom leptospirozis'dir. Bu hastalıkta organizma böbreğe yerleşerek böbrek yetmezliğine ve ölüme neden olabilir. Leptospiralar genellikle vücuda müköz membranlardan ya da derideki yara ve kesiklerden girer. Vücudun çeşitli yerlerinde kısa süreli bölünmelerden sonra, böbrek ya da karaciğere yerleşerek nefrit (böbrek iltihabı) ve sanlığa neden olur. Organizma vücuttan idrarla dışarı atılarak diğer kişilere çoğunlukla bu enfekte idrarla temas halinde bulaşır. Penisillin, streptomisin ya da tetrasiklinlerle mümkündür, ancak organizmanın tam olarak böbrekten temizlenmesi için tedavinin uzatılması gerekebilir. Köpekler gibi evcil hayvanlar leptospirozis'e karşı ölü virulan suşlarm kullanıldığı distemper-leptospira-hepatit karma aşı ile aşılanırlar. İnsanlarda önlem, hastalığın hayvanlardan temizlenmesi ile sağlanır.
• 411
termofilik kemoorganotrofik bakterilerdir. Kısım 7.9 tartışılıldığı gibi, bu enzim ısıya çok dayanıklı olduğundan, DNA amplifikasyonu için polimeraz zincir reaksiyon (PCR) tekniğinde kullanılan en önemli enzimdir. Bu şubenin üyeleri gram-negatif boyanmaktadır. Muramik asit çapraz-köprüleri içindeki diaminopimelik asitin yerine ornitin bulunduran çok ender bir peptidoglikan içermektedir (a^Kısım 4.8). Çok sayıda Deinococcus ve Thermus türleri tanımlanmış olup, hepsi şekerleri, aminoasitleri, organik asitleri ve çeşitli kompleks bileşikleri yıkarak aerobik olarak ürerler. Burada daha çok Deinococcus üzerinde yoğunlaşacağız. Deinococcus cinsi, gram-pozitif koklardan oluşan dört tür içerir; bunların arasında D. radiodurans en iyi çalışılmış olanıdır. Bu hücrenin hücre duvarı çok kompleks bir yapı gösterip (Şekil 12.99»), normalde sadece gram-negatif bakterilerde bulunan dış bir zarın (öOöKısım 4.9) da bulunduğu bir çok katmandan oluşmuştur. Ancak D. radiodurans, E. coli gibi gramnegatif bakterilerin dış zarından farklı olarak, lipid A içermez. Bu organizma toprakta bulunur ve toz partiküllerinin üzerinden bile izole edilebilir. D. radiodurans'ın Radyasyon Direnci
Deinococların çoğu, karetenoyidlerine bağlı olarak kırmızı veya pembe renktedir, birçok susu UV ışınlarına ve kuruluğa bir hayli dayanıklıdır. Bu radyasyon direnci, deinococların izolasyonunda avantaj olarak kullanılabilmektedir. Bu dikkate değer organizmalar; toprak, çekilmiş et, toz ve filtre edildikten sonra yoğun UV ışınlarına (veya hatta gama) tabi tutulmuş hava örneğinin yüksek 12.33 Kavramların Gözden Geçirilmesi miktarda tripton ve maya özütü içeren zengin bir besi yerine ekilmesiyle izole edilir. D. radiodurans Spiroketler serbest yaşayan ve patojenik türleri içeren, suşlarmm çoğu, radyasyona bakteriyal endosporsıkıca sarılmış, hareketli, helikal prokaryotlardır. lardan bile daha dayanıklı olduğundan yüksek • Hem yapı hem de fonksiyon açısından Spiroketlerin dozda radyasyon, D. radiodurans dışındaki diğer endoflajellaları, Echerichia coli'nin kamçısıyla nasıl organizmaların yok olmasını sağlayıp deinococlakarşılaştırılır? rın izolasyonunun doğru yapılmasını sağlar. Ör• Spiroketlerin insanlarda neden olduğu iki hastalık yazınız. neğin, D. radiodurans hücreleri 15,000 gray (Gy) (lGy= lOOrad) radyasyon ışınına tabi tutuldu• Cristispim spiroketinin habitatı nedir? ğunda bile hayatta kalabilmektedir. Bu, organiz• Spiroketlerin insanlarda neden olduğu iki hastalığı listeleyiniz. manın kromozomunun yüzlerce parçaya ayırmaya yeterli bir miktardır (aksine, bir insan 10 Gy'den daha az bir miktar radyasyonla öldürülebilir.) ŞUBE 12: Bu etkileyici radyasyon direncine ek olarak, D. radiodurans mutajenik diğer birçok ajanın etkilerine DEINOCOCCI karşı da dirençlidir. D. radiodurans üzerinde etkili olduğu bulunan tek kimyasal mutajen, DNA'da deDeinococcus/Thermm lesyona neden olan nitrozoguanidindir. Delesyon, bu organizma tarafından nokta mutasyonunda olduğu Anahtar Cinsler: Deinococus, Thermus gibi etkili bir şekilde tamir edilemediği için bu yol Bu Bacteria şubesi sadece birkaç cins içermektedir. ile D. radiodurans'ın mutantları izole edilebilir. D. radiodurans ile yapılan çalışmalarla bu bakGrubun en iyi incelenen cinsleri Deinococcus ve Thermus'tur. Taq DNA polymerase enziminin sap- terinin, hasarlı DNA bölgelerini etkin bir şekilde tamir ettiği gösterilmiştir. D. radiodurans çok tandığı Thermus aquaticus'\ı içeren Thermus cinsi
412 • Bölüm 12 • Proharyotik Çeşitlilik: Bacteria
Dış zar
Peptidoglikan
Sitoplazmik zar
sayıda değişik DNA tamir enzimi içermektedir. D. radiodurans'da DNA tamir enzimi RecA'ya (o°oKısım 10.6) ek olarak, DNA'daki tek ya da çift zincir kırıklarını ve yanlış eşleşmeleri kesip çıkaran RecA-bağımsız DNA sistemleri de bulunmaktadır. Gerçekten, tamir işlemi, parçalara ayrılmış küçük bir kısımdan kromozomu yeniden bir araya birlaştirebilecek kadar etkilidir. Ayrıca, D. radiodurans hücrelerindeki DNA'nın benzersiz dizilimin de bu radyasyon direncinde rol oynayabileceği düşünülmektedir. D. radiodurans hücreleri her zaman ikili ya da tetradlar (Şekil 12.99a) halinde bulunurlar. D. radiodurans DNA'sı tipik bir çekirdek materyalinde (nükleoid) olduğu gibi hücre içinde dağınık halde bulunacağı yerde, yüzük benzeri düzenli bir halka şeklinde toplanır (Şekil 12.99c). Homolog rekombinasyon için uygun bir ortam hazırlanması için bitişik bölmelerdeki nükleoidlerin birleşmesi sonucunda tamir kolaylaştırılır. Bu yoğun rekombinasyon sonucunda tamir edilmiş tek bir kromozom ortaya çıkarak bu kromozomu bulunduran hücre, büyüme ve bölünme yeteneği kazanır.
ŞUBE 13: YEŞİL KÜKÜRSÜZ BAKTERİLER Bacteria'mn bu şubesi filogenetik olarak ayrı bir grup olup, sadece bir kaç cins içerir. En iyi bilineni, tüm temsilcilerinin hepsi termofilik olan anoksijenik fototrof Chloroflexus cinsidir. Bu grubun zorunlu aerobik, kemotrofik üyesi olan Thermomicrobium, gram-negatif, en iyi üremeyi kompleks bir besi yerinde 75 °C de gerçekleştiren basillerden oluşur. Filogenetik yeniliği yanı sıra zar lipidleri açısından da ilginçtir. Bacteria ve Eucaria'mn içerdiği giliserol ile esterleşmiş yağ asitlerinden oluşmuş lipidlerini hatırlayalım (Kısım 3.4 ve 4.5). Bunun aksine Thermomicrobium'un lipidleri, gliserol yerine 1,2-dialkol içerirken, ester ya da eter bağları içermemektedir (Şekil 12.100). Thermomicrobium hücreleri ayrıca, prokaryotların bu domaini için imza sayılan hücre-duvarı polimeri olan peptidoglikanı içermemekle Bacteria türleri için alışılmadık bir durum gösterir (<^>Kısım 11.9).
Chloroüexus ve Akraba Gruplar • Şekil 12.99 Radyasyon dirençli kok Deinococcus radiodurans. Tek bir hücre yaklaşık 2,5 fim çapındadır, (a) D. radiodurans'm transmisyon elektron mikrografı. En dıştaki zar tabakasına dikkat ediniz, (b) Hücre duvarının yüksek büyütmedeki mikrografı. (c) D. Radiodurans hücrelerinin, nükleotit (yeşil) morfolojisini göstermek için renklendirilmiş transmisyon elektron mikrografı.
Anahtar Cinsler: Chloroüexus, Heliothrix, Roseiflexus Chloroflexus ve diğer çoğu yeşil kükürtsüz bakteriler (daha sonra görüleceği gibi Chloroflexus fizyolojisi nedeniyle isimlendirilmiştir), filamentöz olup cyanobacteria ile birlikte nötr ile alkali arasında değişen sıcak su kaynaklarında kaim mikrobiyal yığınlar oluştururlar (Şekil 12.101* ve 18.18a). Chloroflexus benzeri organizmalar deniz mikrobiyal yığınla-
13 35 • Chlorottexus ve Akraba Gruplar • 413 OH OH
(a) Dış OH OH Zar —
OH
CH 3 H 3 C
\ OH
(b)
• Şekil 12.100 Thermomicrobium\xn nadir lipidleri. (a) Burada gösterildiği gibi (13-metil-l,2 nonadekandiol) T. roseum'dan elde edilmiş lipidler. Diğer Bacteria ve Archea'mn aksine, hem ester hem de eter bağlarının bulunmadığına dikkat ediniz (ö°öKısım 4.5). (b) İki katmanlı zar oluşturmak amacıyla, dialkol molekülleri tahminen metil gruplarıyla karşı karşıya gelirler ve OH grupları iç ve dış hidrofilik yüzeyleri oluşturur. Küçük miktardaki dioUer yağ asitlerinin ikincil -OH grubuna (kırmızıyla gösterilmiş) esterleşirken, birincil -OH grubu (yeşille gösterilmiş) fosfat ile bir hidrofilik molekül ile bağ oluşturabilir.
rmda da bulunur. Anoksijenik fototrof olmasına rağmen, fotosentetik mekanizması hem mor bakterilerin hem de yeşil kükürtlü bakterilerin özelliğini gösterdiği için Chloroflexus, tam anlamıyla "hibrid" bir fototroftur. Yeşil kükürtlü bakterilere benzer olarak Chloroflexus, bakteriyoklorofil c ve klorozom (chlorosome) içermektedir (klorozomun elektron mikrografı için, Şekil 12.92'ye bakınız). Ancak, bakteriyoklorofil a da Chloroflexus hücrelerinin sitoplazmik zarı üzerinde yerleşerek yapısal olarak mor bakterilerdekine benzer fotosentetik bir reaksiyon merkezi oluşturur (tam tersine yeşil kükürtlü bakterilerdeki reaksiyon merkezi oldukça farklıdır, oooŞekil 17.18). Filogenisi ve benzersiz ototrofi mekanizmasından dolayı (aşağı bakınız), Chloroflexus' un, fotosentetik reaksiyon merkezinin oluşup, daha sonra özgül-klorozom genlerinin yanal transferle kabul edildiği ilkel bir fototrof formun kalıntısı olabileceği düşünülmektedir. Filogenetik bakımdan Chloroflexus 'un bilinen en ilkel fototrofik bakteri olduğu çok açıktır (Şekil 12.1). Chloroflexus'un Fizyolojisi Fizyolojik olarak Chloroflexus mor kükürtsüz bakterilere, gerçekleşen fotoototrofi açısından benzemektedir; ancak organik bileşiklerin karbon kaynağı olarak eklenmesiyle en iyi fototrofik üreme gerçekleşmektedir (fotoheterotrofi). Chloroflexus ayrıca kemoorganotrof olarak, karanlıkta aerobik solunumla da iyi üremektedir. CO2'in hücreye
• Şekil 12.101 Yeşil kükürtsüz bakteriler. (a)Termofilik fototrof Chloroflexus auratiacus'vn faz fotomikrografı. Hücreler yaklaşık l/xm çapındadır, (b) Büyük fototrof Oscillochloris'm faz mikrografı. Hücreler yaklaşık 5 yum genişliğindedir. Parlak olarak kontrast oluşturan madde tutunmak için kullanılan yapıdır, (c) Strafiye Michigan gölünde üreyen Chloronema türlerine ait filamentlerin renkli fotomikrografı. Bu hücreler CMoronema'nın dalgalı filamentleridir ve yaklaşık 2,5 ^ım çapındadır, (d) Chloroüexus auratiacus'un (sağ) ve Roseiflexus'un (sol) tüpdeki kültürleri. Roseiflexus'da bakteriyoklorofil c ve klorozomlar yoktur vesonuçolarakCMoro/feyus'unyeşilrengideftosei/fejajs'dayoktur (OOOKısım 17.2 ve Şekil 17.7).
dahil edilmesinde sadece Chloroflexus ve diğer filogenetik "ata " sayılan az sayıdaki bakterilere özgü
olan hidroksipropiyonat metabolik yolu 'nun
kullanılması ilginçtir; bunun anoksijenik fototroflarm filogenetik atası olarak Chloroflexus'un (Şekil 12.1) evrimsel duruşunun aydınlatılmasında önemli olduğu kabul edilmelidir. Bu yeni ototrofik metabolik yolun biyokimyası Kısım 17.7'de incelenecektir. Diğer Yeşil Kükürtsüz Bakteriler
Chloroflexus'a ek olarak, termofil Heliothrix, büyük-hücreli mezofil Oscillochloris (Şekil 12.102b) ve Chloronema (Şekil 12.102c) fototrofik yeşil kükürtsüz bakterilerdendir. 2-5 yu,m eninde ve bir-
414 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
kaç yüz mikrometre boyunda olabilen oldukça büyük hücreleriyle, Oscillochloris ve Chloronema alışılmışın dışında bakterilerdir (Şekil 12.101c). Bu bakterilerin her ikisi de diğer yeşil kükürtlü bakteriler ve mor kükürtlü bakterilerle birlikte, düşük oranda sülfid içeren tatlı su göllerinde bulunmaktadır. Yeşil kükürtsüz şubesine bağlı Roseiflexus ve Heliothrix cinsleri Chloroflexus''tan oldukça farklıdır. Bu fototroflar, bakteriyoklorofil c ve klorozom içermedikleri için, Chloroflexus''tan daha çok fototrofik mor bakterilere benzerler (ö°oKısım 12.2). Pigment içeriklerindeki bu açık farklılıklara rağmen,
Chloroflexus, Roseiflexus ve Heliothrix
ortak birçok özellik paylaşmaktadır. Bunlara filamentöz yapıları ve termofilik yaşam tarzları dahildir. Eğer şüphelenildiği gibi Chloroflexus, yeşil kükürtlü bakterilerden yanal gen transferiyle klorozom ve bakteriyoklorofil c biyosentez genlerini aldıysa Chloroflexus ve Roseiflexus'\m fenotipik olarak birbirlerinden ayrılamaması mümkündür. Heliothrix'm saf kültürü elde edilememiş ancak Roseiflexus'un saf kültürü elde edilebilmiştir. Roseiflexus'un hücreleri filamentöz olup, yoğun karotenoyid içeriklerinden dolayı kültürleri sarı/ turuncu rengindedir (Şekil 12.101d).
12.34-12.35 Kavramların Gözden Geçirilmesi Deinococcus ve Chloroflexus'\m her biri Bacteria'mn farklı ana soy hatlarında yer alan anahtar cinslerdir.Deinococcus radiodurans, bilinen tüm organizmalar içinde radyasyona en dayanıklı olandır ve Chloroflexus hem mor hem de yeşil bakterilerin karakteristik fotosentetik özelliklerini gösteren anoksijenik fototroftur.
Thermotoga ve Thcrmodcsulfobactermm
12.36
Anahtar Cinsler: Thermotoga, Thermodesulfobacterium Thermotoga, çubuk şeklinde bir termofil olup 90°C'ye kadar (en iyi 80 °C'de) üreme yeteneği gösterir. Thermotoga hücreleri kılıf-benzeri zarf ("toga" için Şekil 12.102a*'ya bakınız) içerip, gramnegatif boyanır ve spor oluşturmaz. Thermotoga, anaerobik fermentatif kemoorganotroftur. Şeker ve nişasta gibi polimerleri kullanıp, fermentasyon ürünleri olarak laktat, asetat, CO2 ve H 2 oluşturur. Organizma aynı zamanda, elektron vericisi olarak H2 ve elektron alıcısı olarak ferrik demir (Fe3+) kullanarak anaerobik solunumla da üreyebilmektedir. Thermotoga türleri, deniz hidrotermal çıktılarından izole edilebildikleri gibi karasal sıcak su kaynaklarından da elde edilebilirler. Thermotoga'nın genomunun dizi analizi tamamen yapılmış ve ilginç olarak bu organizmanın birçok archeal genler içerdiği saptanmıştır. Gerçekten genlerinin %20'sinden fazlası yatay (horizontal) gen transferleriyle hipertermofilik Archea' dan gelmiş olabilir (Kısım 15.8). Çoğu Archea ile beraber yaşadıkları çok sıcak habitatlarda Thermotoga'nın, Archea türleri ile yoğun yanal (lateral) gen değişimlerine maruz kalıp, belki de böyle ekstrem koşullarda yaşayabilmesine yardımcı olacak birçok gen kazanmış olabileceği farzedilmektedir. Diğer Bacteria'da çok az sayıda arehea-benzeri gen tanımlanmasına rağmen şimdiye kadar yalnızca -y-.
h
•
Deinococcus radiodurans yüksek seviyedeki radyasyon altında nasıl hayatta kalmayı başarmaktadır? • Chloroflexus ve Roseiflexus hangi yönlerden Chlorobium'a benzer hangi yönlerden Rhodobacter'e benzer? • Thermomicrobium''un kendine has özelliği nedir? (a)
14-16: AŞIRI DALLANMIŞ HİPERTERMOFİLİK BAKTERİLER Bacteria grubunun bu üç şubesi Bacteria filogenetik ağacının en altında varsayılan "kök" ün hemen yanında yer alır («ssoŞekil 11.6 ve 12.1). Her şube bir ya da iki önemli cinsten oluşmuştur. Çoğunun anahtar özelliği hipertermofil olması ve en iyi üremenin (optimal) 80°C üzerinde gerçekleşmesidir 6.10 ve 6.12).
(b)
• Şekil 12.102 Hipertermofilik bakteriler, (a) Thermotoga maritima- optimum sıcaklık 80°C. Dışta hücreyi çeviren tabakaya ("toga") dikkat ediniz, (b) Aquifex pyrophilus- optimum sıcaklık 85°C. Thermotoga hücreleri (ince kesit) 0,6X3,5 /um; Aquifex hücreleri (donmuş -kesit mikrografı) 0,5X2,S fim boyutlanndadır. Hem Thermotoga hem de Aquifex Bacteria ağacında kendi filogenetik hatlarını oluştururlar. (Şekil 12.1'e bakınız)
12.37 » Aqui(ex, Thermocrinis ve Akrabaları 4 415
Thermotoga'da domainler arasında böylesine büyükderecede yanal gen transferi görülmektedir.
Böylece Thermodesulfobacterium'da derin bir filogenetik hat (Şekil 12.1) ve ayrıca hem Archaea hem de Bacteria özelliklerini gösteren bir lipid profili görülmektedir (Şekil 12.101fr). Thermotoga'da olduThermodesulfobacterium ğu gibi, bu da belki Archaea'dan Bacteria'ya doğru Thernıodesulfobacterium (Şekil 12.103a»), termofilik, olan yanal gen akışının başka bir durumudur. Busülfat-indirgeyen bakterdir. Thermotoga ile Aquifex nunla birlikte, düşük GC oranlı termofilik gramarasında yer alan ayrı bir şube olarak filofenetik pozitif Bacteria'nm üyesi olan Ammonifex bakterisi, ağaçta yerini almıştır (öOoŞekil 12.1). Üreme sıH 2 oksidasyonunun NO3" 'in NH 3 'a indirgenmesiycaklığı optimal olarak 70°C olduğu için gerçek bir le eşleştiği reakiyonla anaerobik olarak üremekte hipertermofil olmamasına rağmen Thernıodesulfove ayrıca Thermodesulfobacterium''dakine benzer bacterium, bilinen tüm sülfat-indirgeyen Bacteria lipidler içermektedir. Bu nedenle, Bacteria'da eterarasında en termofilik olanıdır (sülfat-indirgeyici bağlı lipidler belki de önceleri düşünüldüğünden archaeon, Archaeoglobus gerçek bir hipertermofil- daha yaygın olarak bulunmaktadır. dir, Kısım 13.7). Diğer "grup I" sülfat-indirgeyiciler gibi (Kısım 12.18'e bakınız), Thernıodesulfobacterium Aqui£cx, Thermocrinis ve Akraba zorunlu anaerobtur; enerji metabolizmasında elekt12.37 Gruplar ron vericisi olarak asetatı kullanamaz, onun yerine laktat, piruvat ve etanol gibi bileşikleri kullanarak Anahtar Cinsler: Aquifex, Thermocrinis SO42 1 H2S'e indirger. Thernıodesulfobacterium'un olağan olmayan bi- Bacteria'nm bilinen en termofil üyesi olan Aquifex yokimyasal bir özelliği, eter-bağh lipidler'in bu- cinsi (Şekil 12.102b) zorunlu kemolitotrofik ve ototlunmasıdır. Bu lipidlerin Archaea'ya özgü olduğu, rofik hipertermofildir. Çeşitli Aquifex türleri elektron vericisi olarak H2, S° ya da S2O32~ ü , Elektron archaeal lipidlerde poli-izoprenoid C2(| hidrokaralıcısı olarak da O2 ya da NO 3 'ı kullanarak 95°C nin bonun (fitanil) yan zincir olarak yağ asitlerinin ye(en iyi, 85°C) üstünde üreyebilirler. Sadece çok dürine geçtiği anımsanmalıdır (c-ssKısım 4.5 ve 11.9). şük O2 konsantrasyonları, Aquifex tarafından toleThernıodesulfobacterium'daki eter-bağlı lipidler alıre edilir ancak bilinen çok az sayıda aerobik hiperşılmışın dışındadır çünkü gliserol yan zincirleri termofil (ya da tam olarak mikroaerofil) bakteriden Archaea'da olduğu gibi fitanil içermez («s-feKısım biri olarak kalır (diğer az sayıdaki Archaea türleri 4.5), onun yerine bazı yağ asitleri yanı sıra, sadece ile birlikte, oasKısım 13.5 ve 13.9). Beslenmeyle ilbu bakteriye özgü C17 hidrokarbondan oluşmuş gili çalışmalarla, Aquifex'in, maya veya et özütü bir bileşik içerir (Şekil 12.103b). gibi kompleks karışımların da dahil olduğu organik bileşikler üzerinde tam kemoorganotrofik olarak üreyemediği gösterilmiştir. Aquifex'\n akrabası olan Hydrogenobacter, çoğu özellikleri ile Aquifex'e benzerlik gösterir ancak zorunlu bir aerobtur. Aquifex'teki ototrofi, önceleri yalnız Bacteria domaini içindeki yeşil kükürtlü bakterilerde bulunan (Kısım 12.32 ve 17.7'ye bakınız) ters (revers) sitrik asit döngüsü enzimleriyle desteklenir. Aquifex aeolicus'un tam genomunun dizi analizi yapılmış olup («scfeKısım 15.3), tüm kemolitorofik/ ototrofik yaşam tarzınınm yalnızca 1.55 Mbç (E. coli genomunun üçte-biri büyüklükte) gibi şaşırtı(a) cı bir küçüklükte olan bir genom ile desteklendiEter bağı ği saptanmıştır. Bu gerçek daha önce ilkel yaşam formlarının fizyolojik özellikleriyle birlikte Kısım 11.2'de tartışılmıştı. Hem Archaea hem de Aquifex gibi Bacteria türleHidrofilik kısım H C—R rindeki çoğu hipertermofillerin H2 kemolitotrofları oldukları, aynı zamanda filogenetik ağaçta çok er(o) ken dönemde çıkan hatlar olarak dallandıkları (oeç» Şekil 11.13, 12.1 ve 13.1) ve erken Yerküre koşul• Şekil 12.103 Thermodesulfobacterium. (a) T. mobile larındaki ilkel organizmalar için H 2 'in en önemli hücrelerinin faz fotomikrografı. (b) T. mobile'in lipidlerinden elektron vericisi olduğu keşfedilmiştir (««*»Kısım birinin yapısı. Bunların eter bağı ile bağlı olmalarına rağmen, 13.13). H2 'den yararlanılıp proton motive gücün iki hidrofobik yan zincirin j4rciıae'lardaki fitanil grubu gibi oluşturulması ile kullanılabilir eneri olarak ATP olmamasına dikkat ediniz (<3CÇ>Kısım 4.5). "R" işareti fosfat nin elde edilmesi Şekil 11.6'da gösterilmiştir. grubu gibi hidrofilik bir bir grubu ifade eder. 2
416 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
Thermocrinis
tü (debris) olmayıp yaşayan organizmalar olduğu gösterilmiştir. Bundan başka 80-90 °C den düşük Thermocrinis (Şekil 12.104*), Aauifex ve Hydrogenobacter'in ilginç bir akrabasıdır. Hiperter- olmayan sıcak su kaynaklarındaki çıkış yerlerinde katmanların varlığı, Brock'un bu organizmaların mofilik (en iyi sıcaklık, 80 °C) kemolitotrof olan bu üreyebilmeleri için gerçekten çok sıcak derecelere organizma, elektron alıcısı olarak O2 ni kullanıp, gereksinim duydukları ve hatta kaynar suda bile H 2 , tiyosülfat veya kükürdü okside etme yetenebulundukları hipotezini desteklemektedir. Bu iki ğindedir ve bu molekülleri elektron vericisi olarak sonuç, sonradan Brock ve diğer araştırıcılar tarakullanır. fından sıcak su kaynakları, hidrotermal (menfez) Bilinen tek türü Thermocrinis ruber, Yellowsve diğer termal çevrelerde, gerçekten düzinelerle tone Milli Park'inin sıcak su kaynağının çıkış hipertermofilik prokaryot cinslerinin keşfedilmeyerinde üreyerek, filamentöz şeklindeki hücsiyle desteklenmiştir. Hipertermofillerle ilgili daha relerinin silisli topaklara tutunmasıyla pembe kapsamlı bilgi için oo&Kısım 6.10, 6.12, 13.4-13.13 renkli bir "katman" oluşturur (Şekil 12.104a). Duve 19.8 'e bakınız. rağan (statik) kültürlerde, T", ruber hücreleri ayrı basil-şeklinde ürer (Şekil 12.104b). Ancak, üreme ortamının damla damla katı cam yüzeyine akıtılŞUBE 17 VE 18: masıyla oluşturulan akışkan bir sistemde üretilirse NİTROSPİRA VE Thermocrinis hücreleri cam yüzeye tutunup sanki doğadaki akışkan habitatındaymış gibi katman DEFERRİBACTER morfolojisi gösterir (Şekil 12.104a). Thermocrinis ruber'in, 1960 yılında termal biyo12.38 Nitrospira, Deferribacter ve Akraba Gruplar lojinin öncüsü Thomas Brock tarafından çalışılması nedeniyle mikrobiyolojide tarihsel bir önemi vardır. Brock tarafından pembe renkli katmanların Anahtar Cinsler: Nitrospira, Deferribacter (Şekil 12.104») protein ve nükleik asit içerdiği keşHaklarında oldukça az bilgi olmasına karşın, fedildikten sonra bunların sadece mineral çökünBacteria'n\n çok sayıda başka şubesi, ribozomal RNA dizi analizleriyle tanımlanmıştır. Böyle iki şube, Nitrospira ve Deferribacter organizmalarını içermektedir (Şekil 12.1). Fizyolojik olarak bu organizmalar, ya kemolitotrof ya da kemoorganotrof olup mezofil'den termofile kadar değişirler. Nitrifiye edici Proteobacteria'da (Kısım 12.3 ve 17.12'ye bakınız) olduğu gibi, Nitrospira NO2~ 'ı NO3"' a okside edip ototrofik olarak ürer. Klasik nitrifiye edici bakterilerle fizyolojik olarak çok yakın ilişkiler içinde olmasına rağmen filogenetik olarak onlardan oldukça uzaktır. Ayrıca Nitrospira, nitrifiye edici Proteobacteria türlerinde bulunan yoğun iç zarlardan yoksundur (Şekil 12.7 ve 12.8). Bununla birlikte Nitrospira'mn, nitrifiye edici Proteobacteria ile çoğunlukla aynı çevrede yaşaması nedeniyle, fizyolojik yeteneğinin nitrifiye edici Proteobacteria'dan yatay gen akışı ile geçmiş olabileceği öne sürülmüştür (ya da tersi). Bilindiği gibi, fizyolojik özelliklerin bu elde ediliş mekanizmasını prokaryotik dünya geniş çapta kullanmıştır (öoç> Kısım 10.6-10.12). Nitrospira grubu içindeki diğer cinslerden biri Leptospirillum, demir-okside eden kemolitotorof bir bakteridir. Kömür ve demir madenciliğiyle iliş• Şekil 12.104 Thermocrinis. (a) Thermocrinis ruber hücrekili maden asit drenajından sorumludur (Kısım lerinin, Yellowstone Ulusal Parkı'ndaki Octopus Spring, Lower Geyser Basin'in dışa akan kısmındaki (85°C ) silisöz birikinti 19.15). Thermodesulfovibrio ise termofilik sülfattabakasına tutunmuş filamentöz uzantılan(ok). Pembe renk bir indirgeyici bir bakteridir ve sıcak su yataklarınkaretonoyid pigmentden kaynaklanır, (b) Silikon kaplı cam üzedaki mikrobiyal yığınlarda yerleşir (Kısım 18.7). rinde üremiş basil şekilli T. ruber'in tarayıcı elektron mikroskop görüntüsü. Kilsi yapılar silikondur. T. ruber'in tek bir hücresi Thermodesulfovibrio ve Thermodesulfobacterium isimleri ve fizyolojileriyle benzer olmalarına (Kısım yaklaşık 0,4 /im çapında ve 1-3 /xm uzunluğundadır.
Değerlendirme Sorulan
12.36'ya bakınız) rağmen, birbirlerinden farklı organizmalardır. Deferribacter Deferribacter cinsi kendi hattını oluşturup (Şekil 12.1), özel bir anaerobik enerji metabolizmasına sahip türler bulundurur. Bu grup içindeki diğer cinsler Geovibrio ve Flexistipes'tir; Flexistipes cinsi,
zorunlu anaerobik fermentatif bir bakteridir. Deferribacter ve Geovibrio anaerobik solunum3+ 4+ da çok yönlülük gösterip, Fe ve Mn gibi metal iyonlarının da bulunduğu çeşitli elektron alıcıları kullanır. Anaerobik solunum Bölüm 17'de tartışılacak ve bu işlemde çok farklı son elektron alıcılarının bağlanabilme yeteneğinde olduğu gösterilecektir. Deferribacter grup üyeleri zorunlu anaerob oldukları gerçeğine rağmen, alışılmışın dışında geniş sayıda alternatif elektron alıcıları kullanabilme yeteneği göstermektedir. Aksine, nitrat ya da metalleri elektron alıcısı olarak kullanıp anaerobik so-
417
lunumla üreme yeteneğinde olan organizmaların çoğu fakültatif aerob olup, anaerobik solunumla üredikleri gibi tam aerobik olarak da üreyebilme yeteneğindedirler (cosKısım 17.13). 12.3S-12.38 Kavramların
Gözden
Geçirilmesi
Thermotoga, Thermodesulfobacterium ve Aquifex yüksek sıcaklık derecelerinde üreyip, her biri Bacteria'mn ayrı ana hattının temsicisidir. Aquifex ve Thermocrinitis Hj- okside eden kemolitotrofken, Thermotoga ve Thermodesulfobacterium'un her ikisi de anaerobik kemoorganotroftur. Nitrospira ve Deferribacter'in her biri kendi şubesini oluşturur. •
Thermotoga ve Thermodesulfobacterium un katabolik metabolizmalarını karşılaştırın. • Genomik bir (bakış açısıyla) bakıldığında; Aquifex'in H 2 + CO 2 +O 2 gazlarında üreyebilmesi neden şaşırtıcı görünmektedir? • Nitrospira ve Deferribacter'in metabolik özelliklerini karşılaştırın.
DEĞERLENDİRME SORULARİ 1. Bu bölümde incelenen bakteri şubelerinin içerisinde fizyolojileri bakımından en fazla çeşitlilik gösteren gruplar hangileridir? O 2 ihtiyaçları, kullandıkları karbon kaynakları ve enerji metabolizmaları yönünden örnek veriniz. 2. Gram reaksiyonunun nasıl bir tahmini filogenetik değere sahip olduğuna ait örnekler veriniz. 3. Cyanobacteria ile prochlorophytes'lerin ortak yanları nedir? Kloroplastlarla ortak yanları nedir? Birbirleriyle olan filogenetik ilişkileri nasıl değerlendirilir? 4. Planctomyces şubesindeki türler ile Archea'nm ortak yanlan nedir? Ökaryotik hücreler ile ortak yönleri nelerdir? 5. Chlorobium ve Chloroflexus hangi yönlerden benzerdir? Hangi yönlerden birbirlerinden ayrılırlar? 6. Acetobacter, Methylococcus, Azotobacter, Desulfovibrio, Lactobacillus, Nitrobacter, Oscillatoria Bacteria cinslerinin her birini diğerlerinden ayıran başlıca fizyolojik özelliklerini tanımlayınız.
7. Streptococcus, Spirillum, Streptomyces, Verrucomicrobium ve Spirocheta Bacteria cinslerinin her birini diğerlerinden ayıran başlıca morfolojik özelliklerini tanımlayınız. 8. Bacillus, Mycoplasma, ve Mycobacterium gibi Grampozitif Bacteria cinslerim birbirinden ayıran anahtar özellikleri nelerdir?. 9. Chlamydia ve rikettsia'ların hangi özellikleri ortaktır? Birbirlerinden ayrılan özellikleri nelerdir? 10. Thermotoga, Aquifex, ve Thermocrinis türlerinin genel fizyolojik özellikleri nelerdir? 11. Mor kükürtsüz ve yeşil kükürtsüz bakterileri metabolizmaları, morfolojileri ve filogenileri açısından karşılaştırınız. 12. Thiobacülus, Nitrosomonas, Ralstonia eutropha, Methylomonas, Acetobacter, Gallionella,ve Propionibacterium bakterilerinden her birinin enerji metabolizmasında kullandığı elektron vericilerini yazınız ve organizmayı aerob ya da anaerob olması açısından değerlendiriniz.
418 • Bölüm 12 • Prokaryotik Çeşitlilik: Bacteria
UYGULAMA SORULARI 1. Filogenetik yapıları ve fizyolojik özelliklerini kullanarak Eschereria coli' nin Thermodesulfobacterium''dan çok daha evrimli olduğu konusunu tartışınız. 2. Bu bölümde verilmiş olan örnekleri kullanarak aşağıdaki durumları savununuz ya da çürütünüz a) "Hücre
morfolojisi kesinlikle filogenetik olarak tahmin edilebilir değere sahip değildir" b) Fizyoloji kesinlikle filogenetik değere sahip değidir.
PROKARYOTIK ÇEŞİTLİLİK: ARCHAEA 1 FILOGENI VE GENEL METABOLİZMA 13.1 13.2
Archaea'm Filogenetiğine Genel Bakış Archaea'da Enerji Korunumu ve Ototrofi
11 ŞUBE EURYARCHAEOTA 13.3 13.4 13.5 13.6 13.7
III
Ekstrem Halofilik Archaea Metan-Üreten Archaea: Metanojenler Thermoplasmatales: Thermoplasma, Ferroplasma ve Picrophilus Hipertermofilik Euryarchaeota: Thermococcales ve Methanopyrus Hipertermofilik Euryarchaeota: Archaeglobales ŞUBE
CRENARCHAEOTA
Crenarchaeotların Habitatları ve Enerji Metabolizmaları 13.9 Karasal ve Volkanik Habitat Kaynaklı Hipertermofiller: Sulfolobales ve Thermoproteales 13.10 Denizaltı Volkanik Habitat Kaynaklı Hipertermofiller: Desulfurococcales
420 420 421 422 422 426 430 432 433 434
13.8
r
Archaea türleri Nanoarchaeum (kırmızı hücreler) gibi hipertermofilik parazitleri de içermektedir. Nanoarchaeum, bilinen tüm prokaryotlar arasında en küçük genoma sahiptir.
IV
ŞUBE
NANOARCHAEOTA
13.11 Nanoarchaeum V YÜKSEK SICAKLIK DERECELERİNDE YAŞAM VE EVRİM 13.12 Biyomoleküllerin Sıcaklık Stabilitesi 13.13 Hipertermofilik Archaea, H 2 ve Mikrobiyal Evrim
434
436 439 441 441
442 442 444
419
420 • Bölüm 13 • Prokaryotik Çeşitlilik: Arabaca
BOLÜMLE İLGİLİ SOZLUK Asetil-CoA yolu sülfat indirgeyen bakterileri, homoasetojenleri ve metanojenlerin dahil olduğu obligat anaeroblarda yaygın görülen bir ototrofik CO 2 fiksasyon yolu Asetotrofik Asetat kullanıcı Bakteriyorodopsin bazı ekstrem halofillerin ürettiği, retinal içeren ve ışık-aracılığıyla proton motive güç oluşturabilen bir membran proteini Crenarchaeota hem hipertermofilik hem de soğukta-yaşayan prokaryotları içeren bir Archaea şubesi Çözünen uyumlu maddeler bir halofilik organizmanın ozmotik basıncı korumak için stoplazmasında biriktirdiği organik ya da inorganik bir madde Ekstrem halofil üremesi, yüksek konsantrasyonlardaki (genel-
Ş
likle %10 ya da daha fazla) NaCl'e bağlı bir organizma Euryarchaeota başta metanojenler olmak üzere, ekstrem halofilleri, Thermoplasma ve bazı deniz türlerini içeren bir Archaea şubesi Fitanil genellikle Archaea'm lipitlerinde bulunan ve 20 karbon atomu içeren dallanmış-zincirli bir hidrokarbon Halorodopsin stoplazmada Cl~ biriktiren, ışıkla çalışan bir klorür pompası Hidrotermal baca ılıktan (~20°C) çok yüksek sıcaklık derecelerine (>300°C) kadar sıcak su çıkaran derin deniz kaynağı Hipertermofil 80°C ve üzerindeki sıcaklık derecelerinde optimum üreyen bir prokaryot
Korarchaeota arkeal köke çok yakın dallanan hipertermofilik bir Archaea şubesi Metanojen metan üreten bir prokaryot; CH 4 , ya bazı organik bileşiklerden ya da CO 2 ile H 2 'nin redüksiyonundan üretilmektedir Nanoarchaeota arkeal köke en yakın dallanan, çok küçük, parazitik bir Archaea şubesi Solfatara çoğunlukla hipertermofilik Archaea'm yaşadığı genellikle asidik, kükürtçe-zengin, sıcak bir ortam Termozom hipertermofillerde kısmi ısı-denatürasyonuna uğramış proteinlerin yeniden katlanmasında görev yapan bir ısı-şok proteini (şaperonin) Ters D N A giraz hipertermofillerde bulunan ve halkasal DNA'ı pozitif süpersarmal hale getiren bir protein
bize bu organizmaların domain içerisindeki diğer soylara göre çok daha yavaş evrimleştiklerini göstermektedir. Bundan dolayı bu tür organizmalar "ilk" Archaea ve belki de genel olarak erken yaşam formları için iyi bir model olabilirler; bu bölümün sonunda bu konuya tekrar döneceğiz (bakınız Kısım 13.13). Diğer taraftan hipertermofilik okyanus Archaea Topluluklarına ait ribozomal RNA (rRNA) genlerinden Crenarchaeota'nın soğukta yaşayan akrabaları tanımlanmıştır. (aooKısım 18.5 ve 19.6). Filogenetik açıdan bakıldığında bunlar çok daha hızlı evrimleşen türlerdir ve dolayısıyla ağaçta daha uzun dallarda yerleşirler (Şekil 13.1). Crenarchaeota'yı Kısım 13.8-13.10'da daha detaylı bir şekilde ele alacağız. Euryarchaeota Archaea'm fizyolojik yönden FİLOGENİ VE GENEL farklı bir grubunu oluşturmaktadır. CrenarchaeotMETABOLİZMA lar gibi Euryarchaeotların da büyük bir kısmı herhangi bir ekstrem ortamda yaşamaktadır. Bu şube Mrchaca'mn Füogenetigine Genel metanojenik Archaea —metabolizmaları CH4 üretiBakış mine bağlı organizmalar— ve bazı ekstrem halofilik Archaea cinslerini, "halobakterileri" içermekteArchaea'm filogenetik ağacı Şekil 13.1 »'de verilmiştir. Ağaç Crenarchaeota ve Euryarchaeaota olarak dir (Şekil 13.1). Bu iki grubun fizyolojik farklılıkları adlandırılan iki temel şubeye bölünmüştür. Diğer çalışılmaya uygun organizmalardır. Ekstrem haloiki şube Korarcaheota ve Nanoarchaeota, köke en ya- filler çoğu zaman zorunlu aerobik iken, metanojenkın yerde dallanmıştır (Şekil 13.1). Kültürü yapılan ler ise en zorunlu anaerobturlar. Archaea arasında Crenarchaeota çoğunlukla, biliEuryarchaeotların diğer grupları, köke yakın nen en yüksek sıcaklık derecelerinde üreyebilen dallanan hipertermofil Thermococcus ve Pyrococcus, organizmaları içeren hipertermofilik türleri —80°C metanojen Methanopyrus (Şekil 13,1) ve fenotipik oladen daha yüksek optimum sıcaklık derecelerinde rak mikoplazmalara (<^*sKısım 12.21) benzeyen hücüreyen organizmalar— içermektedir. Hipertermore duvarı olmayan prokayot olan Thermoplasma''yi fillerin büyük bir kısmı kemolitotrofik ototroftur ve içermektedir. Sonuçta henüz kültüre edilmemiş dehabitatlarında fototrofik yaşam olmadığı için bu orniz euryarchaeotları, Crenarchaeota'ya paralel olaganizmalar bu tip zor koşullara sahip ortamlardaki rak arkeal ağacın üst kısmına yakın bulunan dalları tek primer üreticilerdirler. oluşturmaktadırlar (Şekil 13.1). Euryarchaeotların Crenarchaeota'nın hipertermofilik türleri, çoğu tatlısu ve karasal habitatlarda da yaşamakta16S ribozomal RNA-temelli yaşam ağacında kısa dırlar. Euryarchaeota'yı Kısım 13.3-13.7.'de daha aydallara yerleşerek yakın bir şekilde kümelenme rıntılı bir şekilde ele alacağız. eğilimindedirler (ö^Şekil 11.13 ve 13.1). Bu da
imdi Archaea domainini ele alacağız. Onbirinci bölümde Bacteria ve Archaea arasında bulunan önemli fenotipik ve filogenetik farklılıkları belirtmiştik. Bu bölümde bu organizmaların kendilerini inceleyeceğiz. Archaea'm bazı temel özellikleri arasında (Tablo 11.3'te verilmiştir), hücre duvarlarında peptidoglikan içermemelerini, eter-bağlı lipitlerinin varlığını ve kompleks RNA polimerazlarını sayabiliriz. Ancak bunların dışında, Archaea çok büyük fenotipik farklılıklar da göstermektedir ve bu bölümde bu konuyu ele alacağız. Bölüm 12 Bacteria'da olduğu gibi domain içindeki evrimsel ilişkiyi göstermek için Archaea''ya genel bir filogenetik bakışla bu bölüme başlayacağız.
13 2 • Archaea'da Enerji Korunumu ve Ototrofi • 421 Deniz Euryarchaeota'lan Deniz Crenarohaeota'ları
Euryarchaeota Ekstrem halofiller
Methanobacterium Methanocaldococcus
Methanosarcina Methanospirillum
Hipertermofiller
Korarchaeota Nanoarchaeota • Şekil 13.1 Archaea'm 16S ribozomal RNA dizi karşılaştırmalarına göre yapılmış detaylı filogenetik ağacı. Şu ana kadar denizel Euryarchaeota ve denizel Crenarchaeota sadece topluluk örneklemelerinden tanımlanmıştır (fi^SKısım 11.7, 18.5 ve 18.6). Methanobacterium türlerinin hiçbiri hipertermofil değildir.
Korachaeota (Şekil 13.1) ilk olarak Yellowstone'da, az görülen bir sıcak su kaynağında yaşayan organizmaların topluluk örneklerinden elde edilen rRNA genlerinden keşfedilmiştir; bu organizmaların saf kültürleri bulunmamaktadır. Korarchaeota henüz resmen taksonomik olarak kabul edilmemiştir, ancak bu organizmalar açıkça arkeal ağaçta köke yakın şekilde dallanmaktadırlar. Bu yüzden bu organizmaların biyolojik özellikleri eski Archaea'm özelliklerine benzeyebilir. Archaea domainine en son eklenen şube Nanoarchaeaota'dır. Bu şubenin tek cinsi olan Nanoarchaeum, bir crenarchaeote olan Ignicoccus hücrelerine tutunarak yaşayan çok küçük bir parazitik prokaryottur. Çok küçük hücre ve genom boyutu (<s^sTablo 15.1) ile eski filogenisi birleştiğinde bu organizmayı gerçekten ilginç kılmaktadır. Tüm bu konuları ve Nanoarchaeota'ı genel olarak Kısım 13.11. de ele alacağız. Archaea'm filogenisine genel bir bakışla Archaea'm metabolik özelliklerinin kısa bir tanımını yapmış olduk. Bundan sonraki aşamada Archaea'm kültüre alınmış önemli üyelerini tanımlayacağız.
Arciıaea'da Enerji Korunumu ve Ototrofi Archaea'm temel gruplarından biri olan metanojenlerdeki enerji metabolizması, prokaryotik Bacleria veya Archaea'm diğer gruplarmdakine ben-
zememektedir. Metanojenez ile ilgili özelliklerin büyük bir kısmını 17. Bölüme sakladık ve burada Bacteria'ya çok daha fazla benzeyen ancak metanojenik olmayan Archaea'm metabolizması üzerine yoğunlaştık. iîrchaea'da Ketnoorganotrofi ve Kentolitotrofi Bazı Archaea üyeleri kemoorganotrif iktir, yani gelişmeleri için organik bileşikleri karbon kaynağı olarak kullanırlar. Archaea da glukozun katabolizması küçük modifikasyonlar bulunan Entner-Doudoroff (<3<*>Kısım 12.7) veya glikolitik (<»>Kısım 5.10) yollarla yapılmaktadır. Archaea'da asetatın CO2'e oksidasyonu sitrik asit döngüsü («^^Kısım 5.13) veya bu döngünün küçük varyasyonlara sahip reaksiyonlarıyla ya da asetil-CoA metabolik («**» Kısım 17.16) yolu ile yapılmaktadır. Archaea'daki amino asitlerin ve diğer makromolekül öncüllerinin biyosentezi hakkında çok az şey bilinmektedir, ancak muhtemelen temel monomerler, daha önce Bacteria'da (<=^Kısım 5.15-5.17) belirtildiği gibi temel biyosentetik aracılardan üretilmektedirler. Bazı Archaea üyelerinde a, b ve c tipi sitokromları içeren elektron taşıma zincirleri bulunmaktadır. Bu ve diğer elektron taşıyıcıları kullanan Archaea'm büyük bir kısmında kemoorganotrofik metabolizma, organik elektron vericisinden bir elektron taşıma zincirine elektronların girişiyle başlar ve sonuçta O2, S° veya bazı diğer elektron alıcıların redüksiyonu gerçekleşir. Bu olayların aynı anda meydana gelmesi
422 • Bölüm 13 • Prokaryotik Çeşitlilik: Archaea
sonucunda membrana-bağlı ATPazlar (ATPazm görevinin tanımı için a»öKısım 5.12) üzerinden adenozin trifosfat (ATP) sentezini sağlayan bir proton motive güç kurulur. Archaea'da kemolitotrofi genel bir elektron vericisi olan H2 ile de gerçekleştirilmektedir. Hipertermofilik Archaea'm kemolitotrofik metabolizmasına, ilerde değineceğiz (bakınız Kısım 13.8). Archaea'da Ototrofi Ototrofi kapasitesi Archaea'da yaygındır ve birkaç farklı metabolik yol ile gerçekleşmektedir. Metanojenlerde ve muhtemelen kemolitotrofik hipertermofillerin büyük bir bölümünde CO,, asetil-CoA metabolik yolu veya bu yolun bazı modifikasyonları (£»5Kısım 17.16) ile fikse edilmektedir. Diğer hipertermofillerdeki CO2 fiksasyonu ise yeşil kükürt bakterilerinin ototrofik metabolizmasında da (OQQKısım 12.32 ve 17.7) iş gören ve bir reaksiyonlar serisi olan ters sitrik asit döngüsü ile veya Bacteria ve
ökaryotlardaki en yaygın ototrofik yol olan Calvin döngüsü («»öKısım 17.6) ile gerçekleşmektedir. Oldukça fonksiyonel ve termostabil özellikleri bulunan RubisCO enzimlerini (RubisCO Calvin döngüsünün ilk basamağını katalizler) kodlayan genler, bir metanojen olan Methanocaldococcus jannaschii ve
bir Pyrococcus türünden karakterize edilmiştir, bu organizmalar hipertermofildir. Archaea'daki çoğu katabolik ve anabolik yolların büyük bir kısmının Bacfen'a'dakilere benzedikleri görülmüştür. Bu sonuç metabolizmanın uzun bir evrimsel geçmişten geldiğini gösteren iyi bir örnektir. Verilen temel bilgiler sonrasında yaşamın bu büyüleyici domaininin organizma çeşitliliği ile ilgili kısımlarına başlayacağız.
m
13.1 • 13.2 Kavramların Çözden Geçirilmesi
Archaea dört temel şubeden oluşur, Euryarchaeota, Crenarchaeota, Korarchaeota ve Nanoarchaeota. Metanojenez hariç Archaea türlerindeki biyoenerjetikler ve ara metabolizma çeşitli Bacteria türlerindekine çok benzemektedir. •
Archaea'm hangi şubesinde çoğunluğu kültüre alınmış hipertermofiller bulunmaktadır?
•
Archaea'da bulunan ototrofik yollar nelerdir?
bu organizmaların halofilik değil, aynı zamanda çok yüksek miktarda, hatta bazen doygunluğa yakın miktarda, tuza ihtiyaç duyduklarını belirtmek için kullanılmaktadır. Başka bir ifadeyle, bir ekstrem halofil, üremesi için en az 1.5 M (yaklaşık %9) NaCl'e ihtiyaç duyan bir organizmadır. Optimum üremeleri için 2-4 M NaCl'e (%12-23) ihtiyaç duymaktadırlar. Ekstrem halofillerin neredeyse tümü 5.5 M NaCl'de (NaCl için doygunluk sınırı) üreyebilmektedir. Ancak bazı türler bu tuzluluk oranında sadece çok yavaş gelişmektedir. Aşırı Tuzlu Ortamlar
Aşırı tuzlu habitatlar dünya üzerinde oldukça yaygın bulunmakla beraber, ekstrem aşırı tuzlu habitatlar az bulunmaktadır. Bu tür ortamların çoğu dünyanın sıcak ve kuru bölgelerinde bulunmaktadır. Tuz göllerinin iyonik kompozisyonu oldukça farklılık gösterebilmektedir. Aşırı tuzlu bir göldeki baskın iyonların çeşitliliği, gölün bulunduğu ortamın genel iklimsel koşullarına, topografyasına ve jeolojisine bağlıdır. Örneğin Utah'daki (USA) Büyük Tuz Gölü (Great Salt Lake) (Şekil 13.2a») aslında deniz suyunun yoğunlaşmış halidir. Göldeki iyon konsantrasyonları oldukça yüksek olmakla beraber, oransal miktarları deniz suyundaki kadardır. Büyük Tuz Gölündeki (Great Salt Lake) baskın anyon klor, baskın katyon sodyumdur; ayrıca hafif alkali pH'da dahi önemli miktarda sülfat dahi bulunmaktadır (Tablo 13.1). Bunun aksine diğer bir aşırı tuzlu havzada bulunan Ölü Deniz ise oldukça düşük miktarda sodyum ve yüksek miktarlarda magnezyum içermektedir (Tablo 13.1). Soda gölü sularının kimyası Büyük Tuz Gölü (Great Salt Lake) gibi aşırı tuzlu göllerinkine benzemektedir, ancak gölü çevreleyen kayalarda karbonat minerallerinin miktarı yüksek olduğundan dolayı soda göllerinin pH'ı oldukça yüksektir. Böyle ortamlarda suyun pH'nın 10-12 olması beklenen bir durumdur (Tablo 13.1 ve Şekil 13.2c). Ayrıca soda göllerinde neredeyse Ca+2 ve Mg+2 bulunmamaktadır çünkü bunlar yüksek pH ve karbonat konsantrasyonlarında çökmektedir (Tablo 13.1). Tablo 13.1
ŞUBE EURYARCHAEOTA İyon
Ekstrem Halofilik Archaea
Na* K* 2
Anahtar cinsler: Halobacterium, Haloferax, Natronobacterium
Ekstrem halofilik Archaea (Şekil 13.1) solar tuz buharlaştırma gölleri, doğal tuz gölleri veya yapay tuzlu habitatlar ve yoğun bir şekilde tuzlanmış balık, et benzeri bazı gıdaların yüzeyleri gibi yüksek oranda tuz içeren ortamlarda yaşayan farklı bir gruptur. Bu tür habitatlar aşırı tuzlu habitatlar olarak adlandırılırlar. Ekstrem halofil terimi, sadece
Mg * 2
Ca '
aBr so/HCO 3
pH
Bazı yüksek tuzlu ortamların iyonik kompozisyon-" Konsantrasyon (g/l)
Büyük Tuz Gölü11
Ölü Deniz
Zugm Gölü
40.1 7.7 44 17.2 225 5.3 0.5 0.2 6.1
142 2.3 <0.1 <0.1 155 —
105 6.7 11 0.3 181 0.2 27 0.7 7.7
23 67 11
"Karşılaştırma için deniz suyunun içeriği (gram/litre): Na+, 10.6; K+, 0.38; 2 2 2 Mg *, 1.27; Ca *, 0.4; Cl, 19; Br, 0.065; SO4 , 2.65; HCO3", 0.14; pH 7.8. ''Şekil 13.2n'ya bakınız. 1 Wadi El Natroun, Mısır (Şekil 13.2c'ye bakınız). .
.
.
•
.
•
.
-
.
,
•
.
-
13 3 • Ekstrem Halofilik Archaea • 423
• Şekil 13.2 Halofilik Archaea'm Aşın tuzlu ortamları, (a) Büyük Tuz Gölü (Utah), iyonlarının oram deniz suyundakine benzeyen ancak deniz suyunun yaklaşık on katı iyon konsantrasyonuna sahip olan aşın tuzlu bir göldür. Yeşil renk başlıca, halofilik yeşil bir alg olan Dunalieüa salına hücrelerinden kaynaklanmaktadır, (b) San Francisco körfezi (California), yakınındaki bulunan solar tuzun elde edildiği deniz suyu buharlaştırma göllerinin havadan görünümü. Kırmızı-mor renk başlıca Halobacterium hücrelerindeki bakteriorodopsin ve bakterioruberinlerden kaynaklanmaktadır, (c) Hamara gölü, (Wadi El Natroun, Mısır). pH"ı 10 olan bu soda gölünde üreyen pigmentli haloalkalifil patlaması. Gölün kıyılarında trona (NaHCO3.Na2CO3.2H2O) birikintilerinin bulunması dikkat çekicidir, (d) İspanya tuzlalannda kare bakterileri de içeren halofilik prokaryotlann taramalı elektron mikrografı.
Çeşitli halofilik mikroorganizmalar, farklı kimyasal yapılara sahip olan aşırı tuzlu habitatlarda yaşamaktadırlar. Bazı organizmalar sadece belirli özellikteki bir çevrede yaşarken, bazıları ise çeşitli habitatlara yayılarak yaşamaktadır. Bunun yanı sıra oldukça sert şartlara sahipmiş gibi görünmesine rağmen tuz gölleri yüksek derecede üretken ekosistemler olabilmektedir (buradaki üretken terimi yüksek miktardaki CO1 fiksasyonu anlamındadır; ototrofi). Bu ortamlarda mikroorganizma olarak yalnızca Archaea bulunmamaktadır. Ökaryotik bir alg olan Dunaliella tuz göllerinin çoğunda bulunan önemli bir oksijenik fototroftur. Dunaliella'nm bulunmadığı yüksek pH'h alkali soda göllerinde anoksijenik fototrofik mor bakteri cinsleri Ectotrhodospira ve Halorhodospira (Kısım 12.2) baskın olarak bulunmaktadır. Oksijenik ve anoksijenik fototroflarm primer üretiminden kaynaklanan organik maddeler kemoorganotrofik özellikteki ekstrem halofilik Archaea'm gelişmesini sağlamaktadırlar. Ayrıca Haloanaerobium ve Halobacteroides gibi bir-
kaç ekstrem halofilik kemoorganotrofik Bacteria de böyle ortamlarda iyi gelişmektedirler.
Deniz tuzlaları da ekstrem halofilik prokaryotlann habitatlarıdır. Deniz tuzlaları deniz suyu ile doldurulmuş ve buharlaştırma sonrası solar deniz tuzunun elde edildiği, küçük çevresi kapatılmış havuzlardır (Şekil 13.2b, d). Tuzlalar, ekstrem halofiller için minimum tuzluluk sınırlarına ulaştıkları zaman, halofilik Archaea'm yoğun üremesi'den (patlama olarak adlandırılır) dolayı suyun rengi kırmızımsı mor renge dönmektedir (Şekil 13.2b ve c'de daha ilerde değinilecek olan karotenoidler ve diğer pigmentlerden kaynaklanan kırmızı renklenme görülmektedir). Genellikle kare şekilli türler dahil olmak üzere, morfolojik yönden farklı, çeşitli Archaea tuzlalarda bulunmaktadırlar (Şekil 13.2d). Ayrıca ekstrem halofiller deniz balığı, tuzlanmış domuz eti ve sucuk gibi yüksek oranda tuzlanmış bazı gıdalarda da tespit edilmiştir. Ekstrem Halofilik Archaeahn Taksonomisi ve Fizyolojisi
Tablo 13.2'de günümüze kadar tanımlanmış ekstrem halofilik Archaea'm listesi verilmiştir. 14 eks-
424 • Bölüm 13 • Prokaryotik Çeşitlilik: Archaea
i
Tablo 13.2 Bazı Ekstrem Halofilik Archaea Cinsleri Cins
Morfoloji
DNA(%molGC)
Habitat
Extreme Halophiles Halobacterium Halorubrum Halobaculum Haloferax Haloarcula Halococcus Halogeometricıım Haloterrigena
Çubuk Çubuk Çubuk Düz disk Düzensiz disk Kok Çubuk Çubuk, oval
66-71 62-71 70 60-66 63-65 59-66 59-60 59-60
Tuzlanmış balık; deri; aşırı tuzlu göller; tuzlalar; Ölü Deniz; Tuzlalar Ölü Deniz Ölü Deniz; Tuzlalar Tuz havuzları; Ölü Vadi (CA); deniz tuzlaları Tuzlanmış balık; tuzlalar Solar tuzlalar Tuzlu toprak
Haloalkalifiller Natronobacterium Natrinema Natrialba Natronomonas Natronococcus Natronorubrum
Çubuk Çubuk Çubuk Çubuk Kok Düz hücreler
65 70 60-63 61-64 63-64 59-60
Yüksek derecede tuzlu soda gölleri Tuzlanmış balık; deri Soda gölleri; kıyı kumu Soda gölleri Soda gölleri Soda gölleri •••••••••••••MHMHMHi^HMMİ
trem halofil cinsini tanımlamak için 16S ribozomal RNA gen dizilemesi ve diğer kriterler kullanılmıştır (Tablo 13.2). Bu grubun ilk tanımlanan ve en iyi çalışılmış üyesi olan Halobacterium (Şekil 13.3») cinsinden dolayı, ekstrem halofilik Archaea için toplu olarak genellikle "halobakteriler" terimi de kullanılmaktadır. Natronobacterium, Natronomonas
ve akrabaları aşırı halofilik oldukları kadar alkalifilik olmaları nedeniyle diğer aşırı halofillerden ayrılırlar. Natronobakteriler çok düşük Mg2+ konsantrasyonları ve yüksek pH (9-11) da optimum ürediklerinden dolayı soda gölleri (bakınız Tablo 13.1 ve Şekil 13.2c) bu organizmalar için uygun habitatlardır. Ekstrem halofilik Archaea gram negatif boyanırlar, ikiye bölünerek çoğalırlar ve spor veya dinlenme evreleri oluşturmazlar. Halobakterilerin büyük bir kısmı hareketsizdir ancak birkaç suş flagella aracılığıyla zayıf hareket etmekte veya gaz
vezikülleri aracılığyla yüzebilmektedirler. Halobacterium ve Halocccus'un genomik organizasyonu, toplam hücresel DNA'nm %25-30'una yakın oranda plazmit içermesinden dolayı farklıdır. Bu plazmitlerin GC baz oranları (%57-60 GC) kromozomal DNA'nm baz oranlarından (%66-68 GC) tamamen farklıdır. Ekstrem halofillerin plazmitleri doğal olarak meydana geldiği bilinen en büyük plazmitler arasında yer almaktadır (cöaKısım 10.9). Ekstrem halofilik Archaea türlerinin büyük bir kısmı zorunlu aerob'tur. Halobakterilerin çoğu, enerji kaynağı olarak amino asitleri veya organik asitleri kullanırlar ve optimal üremeleri için (başlıca vitaminler olmak üzere) pek çok üreme faktörüne ihtiyaç duyarlar. Birkaç Halobacterium türünün karbohidratları okside ettiği bilinmektedir ancak bu çok nadir görülen bir özelliktir. Halobacterium'da a,bvec tipi sitokrom içeren elektron transport zincirleri bulunmaktadır ve membran-aracılı kemiozmotik olaylar sonucu açığa çıkan bir proton motive güç ile aerobik üreme aşamasında enerji elde edilmektedir. Bazı halofilik Archaea anaerobik üreye bilmektedirler. Bazı türlerde şeker fermentasyonuna bağlı anoksik üreme ve nitrat veya fumarat redüksiyonuna bağlı anaerobik solunum yapıldığı (ccfeKısım 17.13) gösterilmiştir. Ekstrem Halofillerde Su Dengesi
• Şekil 13.3 Ekstrem halofil Halobacterium saiiaram'un ince kesit elektron mikrografı. Bir hücrenin çapı yaklaşık 0.8 IJ,m dir. (a) Boyuna kesitteki bölünen bir hücrenin nükleotitleri görülmektedir, (b) Hücre duvarının glikoprotein alt ünite yapısını gösteren yüksek-büyütmeli elektron mikrografı.
Ekstrem halofilik Archaea üremeleri için yüksek miktarlarda sodyuma ihtiyaç duyarlar. Halobacterium'da yapılan detaylı tuz ihtiyacını belirleme çalışmaları sonrasında, hücrelerin ihtiyaç + + duyduğu Na 'un, Na 'a kimyasal olarak yakın bir + iyon olan K dahil olmak üzere diğer herhangi bir iyonla giderilemediği ortaya konmuştur. Bununla birlikte Halobacterium hücreleri üremeleri için hem Na+ ve hem de K+'a ihtiyaç duyarlar, çünkü her bir iyon ozmotik dengenin sağlanmasında önemli rol oynamaktadır. Kısım 6.14'de öğrendiğimiz gibi mikroorganizmalar yaşamları süresince karşılaştıkları
13 3 • Ekstrem Halofilik Archaea • 425
ozmotik güçlere karşı koymak zorundadırlar. Halobacterium'un NaCl'ce zengin habitatları gibi yüksek-çözünür madde içeren ortamlardaki organizmalar ozmotik güce karşı koyabilmek için intraselüler çözünür maddeleri sentezlemek veya biriktirmek zorundadırlar. Bu maddeler uyumlu çözünür maddeler olarak adlandırılırlar. Bu bileşikler yüksek ozmotik şartlar altında hücrenin su kaybetme eğilimini, hücrenin çevresine göre pozitif su dengesini sağlayarak engellerler (c^Kısım 6.14). Halobacterium hücreleri uyumlu çözünür madde olarak organik madde yerine çevreden stoplazamaya pompaladıkları yüksek miktardaki K+'u kullanırlar. Bu sayede hücre içindeki K+ konsantrasyonunun hücre dışındaki Na+ konsantrasyonuna göre daha yüksek olması sağlanır (Tablo 13.3). Bu iyonik durum pozitif su dengesinin korunmasını sağlar. Halobacterium'un hücre duvarı (Şekil 13.3b) glikoproteinden meydana gelmiştir ve sodyum iyonları ile kararlı halde tutulmaktadır. Soydum iyonları Halobacterium duvarının dış yüzeyine bağlanarak hücresel bütünlüğün devam etmesini sağlarlar. Na+ miktarı yetersiz olduğunda hücre duvarı parçalanır ve hücre lizize uğrar. Bu durum Halobacterium'un glikoprotein yapısındaki hücre duvarında asidik (negatif yüklü) amino asitler olan aspartat ve glutamatın çok yüksek miktarda bulunmasından kaynaklanmaktadır (co^Figure 3.12). Bu amino asitlerin karboksil gruplarının sağladığı negatif yükler Na+ ile kaplanmıştır. Na+ konsantrasyonu seyreltildiği zaman proteinlerin negatif yüklü kısımları aktif bir şekilde birbirini iter ve hücrenin lizizine neden olur. Halofilik Stoplazmik Bileşenler
Halobacterium'un hücre duvarı proteinleri gibi stoplazmik proteinleri de oldukça asidiktir, fakat aktiviteleri için gerekli olan iyon, Na+ değil K+'dur. Doğal olarak Halobacterium hücrelerindeki (Tablo 13.3) baskın internal katyon K+ olmaktadır. Yüksek asidik amino asit kompozisyonunun yanı sıra, halobakteriyal stoplazmik proteinler tipik olarak halofilik olmayanlara kıyasla daha az miktarda hidrofobik amino asitler ve lizin (bazik bir amino asit) içerirler. Bu durum oldukça mantıklıdır çünkü yüksek orandaki iyonik bir stoplazmada polar proteinler çözünme eğiliminde iken, polar olmayan proteinler kümelenme eğilimlidirler ve bundan dolayı aktivitelerini kaybedebilirler. Halobacterium'un Tablo 13.3 İyon
Halobacterium salinarum hücrelerindeki iyonların konsantrasyonu
Çevredeki konsantrasyon (M) 3.3
Hücredeki konsantrasyon (JM)
0.05
0.8 5.3
0.13
0.12
3.3
3.3
ribozomları da stabiliteleri için yüksek miktarda K+ gerektirirler, oysa halofil olmayanların K+'a ihtiyaçları yoktur. Böylece ekstrem halofilik Archaea yüksek iyonik ortamlarda yaşamak için hem internal hem de eksternal yönden iyi bir şekilde adapte olmuşlardır. Dış ortama maruz kalan hücresel bileşenler stabiliteleri için yüksek miktarda Na+'a iytiyaç duyarlarken, internal bileşenler ise yüksek miktarda K+'a ihtiyaç duyarlar. Bacteria'nm uyumlu çözünür madde olarak K+'u kullanan birkaç ekstrem halofilik üyesi hariç, prokaryotlarm diğer hiçbir grubunda böyle özel katyonlara yüksek miktarlarda ihtiyaç duyulduğu saptanmamıştır. Halobakterilerde Bakteriorodopsin ve Işık-aracılı ATP Sentezi
Ekstrem halofilik Archaea'm bazı türleri ışıktemelli ATP sentezi yapabilmektedirler. Bu olay klorofil pigmentleri olmadan gerçekleştiği için fototosentez değildir. Fakat kırmızı ve turuncu karotenoidlerin—genellikle bakterioruberinler olarak adlandırılan C50 pigmentleri— dahil olduğu diğer ışığa-duyarlı pigmentler bulunmaktadır. Aşağıda anlatılacağı gibi bu indüklenebilir pigmentler enerji korunumu olayına girmektedirler. Düşük havalandırma koşullarında Halobacterium salinarum ve diğer bazı ekstrem halofiller bakteriorodopsin olarak adlandırılan bir protein sentezleyerek ve membranlarma eklerler. Bakteriorodopsin olarak adlandırılmasının nedeni, yapı ve fonksiyon yönünden gözün görme pigmenti olan rodopsin'e benzemesinden dolayıdır. Bakteriorodopsine bir retinal molekülü bağlıdır, retinal karotenoid benzeri bir pigment olup ışığı absorblayabilir ve proton motive gücün oluşmasını katalizleyebilir (Şekil 13.4*). Retinal bekteriorodopsine mor bir renk verir. Halobacterium hücreleri yüksek havalandırmalı koşullardan oksijenin sınırlı olduğu
Bakteriorodopsin
ATP
ADP + P; ATPaz
• Şekil 13.4 Bakteriorodopsin aktivitesinin mekanizmasinini gösteren model. Yaklaşık 570 nm dalga boyundaki ışık (hi'jj,,), bakteriorodopsinin protonlanmış retinalini trans formdan (RetT) cis formuna (Retc) dönüştürür, bu olayla birlikte membramn dış yüzeyine bir proton yer değiştirerek geçer, böylece bir proton motive güç kurulur. ATPaz aktivitesi proton motive güçten sağlanmaktadır.
426 • Bölüm 13 • Prokaryotik Çeşitlilik: Archaea
koşullara (bakteriorodopsin sentezine neden olur) maruz bırakıldıklarında bakteriorodopsin sentezleyerek membranlarma eklemelerinden dolayı, kademeli olarak renkleri kırmızı veya turuncudan daha kırmızımsı-mor bir renge doğru değişmektedir. Bakteriorodopsin spektrumun yeşil bölgesindeki görünür ışığı (yaklaşık 570 nm) absorblar. Absorbsiyonu takiben normalde hep-trans konfigürasyonunda bulunan bakteriyorodopsinin retinali uyarılır ve cis formuna dönüştürülür (Şekil 13.4). Bu dönüşüm membranm dış yüzeyindeki bir protonun yer değiştirmesine yol açar. Retinal molekülü stoplazmadan bir proton aldıktan sonra karanlıkta daha karalı olduğu tüm-trans izomerine dönüşür, ve döngü tamamlanır (Şekil 13.4). Membranın dış yüzeyinde proton biriktiğinden dolayı, proton yerdeğiştirici ATPaz'ın aktivitesi ile ATP sentezinin gerçekleştirilmesi için membran yeterince "yükleninceye" kadar proton motive güç (ö»sKısım 5.12) artmaya devam eder (Şekil 13.4). Halobacterium salinarum'da ışık-aracılığıyla ATP
üretimi, anoksik şartlarda organizmanın yavaş bir şekilde üremesini sağlar. Halobacterium'un ışıklauyarılan proton pompası ayrıca Na + /H + antiport aktivitesi (ö°oKısım 4.6) ile hücrenin dışına Na+'u pompalama görevimde yaparak ozmotik denge için gerekli K+ dahil olmak üzere çeşitli besinlerin alınmasını sağlar. H. salinarum tarafından amino asitlerin alınmasının dolaylı bir şekilde ışık aracılığıyla gerçekleştiği gösterilmiştir, çünkü amino asitlerin taşınması bir amino asit/Na+ simporter'ı (cn$ Kısım 4.6) tarafından Na+'un alınması ile gerçekleşir. Amino asit alımının devam etmesi ışık-temelli Na + /H + antiporter üzerinden Na+'un uzaklaştırılması olayına bağlıdır. Diğer Rodopsinler Halobacterium salinarum'un membranında bakteriorodopsinin yanı sıra en az 3 adet diğer rodopsinler de bulunmaktadır. Halorodopsin karşıt iyon olan K+ için hücre içine klorür (Cl) pompalayan ışık-temelli bir pompadır. Halorodopsinin retinali Cl'u bağlar ve hücre içine taşır. Alıcı rodopsinler olarak adlandırılan iki ışık sensörü H. salinarum'da bulunmaktadır. Bu ışık alıcıları organizma tarafından fototaksis'in (ışığa doğru hareket, o^Kısım 4.16) kontrolünde kullanılmaktadır. Alıcı rodopsinler kemotaksisteki (<3QoKısım 4.16 ve 8.13) proteinlere benzeyen bir dizi protein ile etkileşime girerek flagellanm rotasyonunu etkiler. Bu sayede H. salinarum hücrelerinde bulunan bakteriorodopsinin ATP sentezi yapabileceği şekilde ışığa doğru hareketini sağlarlar (Şekil 13.4). Deniz mikrobiyolojisinin (cooKısım 19.6) anlatıldığı kısımda açık deniz sularında bulunan Bacteria türlerinin proteorodopsinler olarak adlandırılan bakteriorodopsin benzeri proteinler içerdiklerini göreceğiz. Bilindiği kadarıyla farklı dalga boylarındaki ışığı absorblayan birkaç farklı spektral formunun bulunması haricinde proteorodopsin, bakteriorodopsin gibi görev yapmaktadır. Denizlerde çözünmüş organik madde konsantrasyonu çok düşük olduğu için (cosKısım 19.6) zorunlu ke-
moorganotrofik yaşam tarzı smırlanabilmektedir. Dolayısıyla, pretorodopsinin ekolojik olarak deniz prokaryotlarında enerjinin korunumunu sağlayan bir mekanizma olmaktadır. 13.3 Kavramların Çözden Geçirilmesi Ekstrem halofilik Archaea üremek için yüksek miktarlarda NaCl'e ihtiyaç duyar. Bu organizmalar stoplazmalarmda kompatible solute olarak yüksek seviyelerde KC1 biriktirirler. Bu tuzlar hücre duvarı stabilitesi ve enzim aktivitesini etkilerler. Işık -aracılı proton pompası bakteriorodopsin, ekstrem halofillere ATP yapımı konusunda yardımcı olur. •
Halobacterium ve Natronobacterium arasındaki temel fizyolojik farklılık nedir? + • Halobacterium hücreleri yüksek miktarda Na 'a ihtiyaç duyuyorsa, neden stoplazmik enzimleri için bu geçerli değildir (bakınız Tablo 13.3). • Bakteriorordopsin bir H. salinarum hücresine ne tür yarar sağlar? Halorodopsin ne tür yarar sağlar?
Metan-Üreten Archaea: Metanojenler Anahtar Cinsler: Methanobactehum, Methanocaldococcus,Methanosarcina
Pek çok Euryarchaeota enerji metabolizmalarının ayrılmaz bir parçası olarak metan (CH4) üretirler. Böyle organizmalar metanojen olarak adlandırılırlar ve metanın oluşma aşamasına metanogenezis denir. Metan, İtalyan fizikçi Alessandro Volta tarafından "yanabilen hava" olarak keşfedilmiştir, Volta metan gazını bataklık sedimentlerinden toplayarak yanabildiğini göstermiştir. Tatlısu sedimentlerine tutunmuş metan toplandıktan sonra dikkatlice tutuşturularak kolay bir şekilde Volta deneyi gerçekleştirilebilir (Şekil 13.5»). Sonraki bölümlerde metan oluşumunun biyokimyasal olarak benzersiz ve şaşırtıcı derecede kompleks olan aşamalarını göreceğiz (oOöKısım 17.17). Bunun yanı sıra Şekil 13.5'te görülen bataklık gibi doğadaki pek çok anoksik habitatlarda organik madde biyoyıkımmdaki son aşamanın nasıl metanojenez olduğunu göreceğiz (öo&Kısım 19.10). Tablo 13.4'de doğadaki biojenik metanın temel kaynakları listelenmiştir. Metanojenlerin Çeşitliliği ve Fizyolojisi
Metanojenler çeşitli morfolojiler gösterirler (Şekil 13.6* ve Tablo 13.5). Metanojenlerin taksonomileri, filogenetik analizleri kadar fenotipik analizleri de temel alınarak yapılmaktadır (Tablo 13.5). Metanojenler içerisinde birkaç taksonomik ordo tanımlanmıştır (taksonomide bir ordo yakın familyaları içerir, her bir familya bir yada daha fazla cins içerir; en» Tablo 11.6). Metanojenlerin hücre duvar yapısı kimyasal açıdan çeşitlilik göstermektedir. Methanobacterium ve yakın türlerinde pseudopeptidoglikan yapıda hücre duvarı (Şekil 13.7a •), Methanosarcina ve yakın türlerinde metanokondroitin (omurgalı
13.4 • Metan-Vreten Archaea: IYletanojenler • 427
Tablo 13.4 Metanojenlerin Habitatları I. Anoksik sedimentler: Bataklık, su birikintileri (bakınız Şekil 13.5), ve göl sedimentleri, çeltik tarlaları, nemli topraklar (O'S&Kısım 19.10) II. Hayvanların sindirim sistemi: (a) sığır, koyun, kanada geyiği, geyik ve deve gibi geviş getiren hayvanların rumeni (CCOKısım 19.11) (b) At ve tavşan gibi körbağırsaklı hayvanların kör bağırsağı (öOöKısım 19.11) (c) İnsan, domuz ve köpek gibi tek mideli hayvanların kaim bağırsağı (<**5Kısım 21.4) (d) Sellülotik böceklerin hindgut'u (örneğin termitler) III. H2+CO2'in jeotermal kaynakları: hidrotermal bacalar (C«3> Kısım 19.8) IV. Yapay biyoyıkım tesisleridağım çamuru parçalayıcıları (Cöo Kısım 28.2) V. Çeşitli anaerobik protozoalarm endosimbiyontları Şekil 19.26)
• Şekil 13.5 Massachusetts Woods Hole'deki Mihrobiyal çeşitlilik yaz kursunda Volta deneyinin gösterilmesi. Woods Hole'daki sedir bataklığında anaerobik dekompozisyonun meydana geldiği tatlısu sedimentlerinin üzerine büyük bir huni ters çevrilerek yerleştirilmiştir. Huni içerisindeki su hava ile yer değiştirdikten sonra huni kapatılımış ve sedimentler bir çubukla kanştınlırak tutunmuş metan kabarcıklarının ters çevrilmiş huni içerisine toplanması sağlanmıştır. Daha sonra huninin kapağı açılır açılmaz hemen huni ağzına yakın bir alev tutuluyor ve sonuçta metan tutuşuyor. Bu deney yaklaşık 200 yıl kadar önce önce metanı"yanabilen hava" olarak tanımlayan İtalyan fizikçi Alessandro Volta tarafından yapılmıştır. hayvanların bağ dokusunda bulunan kondroitin polimerine benzemesinden dolayı bu ad verilmiştir) yapıda hücre duvarı (Şekil 13.7b), Methanocaldococcus (Şekil 13.8a») ile Methanoplanus türlerinde protein veya glikoprotein yapıda hücre duvarları ve Methanospirillum'da S-tabakası yapısında hücre duvarı bulunmaktadır (Şekil 13.6; ^s^Kısım 4.8). Fizyolojik olarak metanojenler obligat anaerobturlar ve bunların kültürü için zorunlu anoksik teknikler gereklidir. Türlere bağlı olarak metanojenlerin kültürleri H 2 ve CO2'li (4:1 oranında, yanda reaksiyonu gösterilmiştir) bir atmosfer altında mineral tuzların bulunduğu bir ortamda veya komp-
(b)
lex bir ortamda yapılabilmektedir. Oldukça yüksek (Şekil 13.8 ve bakınız Şekil 13.13) veya düşük sıcaklık derecelerinde veya oldukça yüksek tuz konsantrasyonlarında optimum üreyebilen "ekstremofilik" türlerin tanımlanmasına rağmen bilinen metanojenlerin çoğu mezofilik ve nonhalofiliktir. Metanojenlerin Substratları Metanojenlerin saf kültürlerinin en az 11 substratı metana dönüştürdükleri gösterilmiştir (Tablo 13.6). İlginç bir şekilde bu substratlar glukoz, yağ ve organik asitler gibi (asetat ve piruvat hariç) genel kullanılan maddeleri içermezler. Metanojen ve diğer anaerobik bakterilerin reaksiyonları yardımıyla glukoz gibi maddeler, metana dönüştürülebilirler. Doğru bir karışık kültürle herhangi bir organik bileşik hatta hidrokarbanlar bile, metan ve CO2'e dönüştürülebilmektedir (öotaKısım 19.10). Metanojenik substratları oluşturan üç grup bileşiğin listesi Tablo 13.6'da verilmiştir. Bunlar; CO2-tipi substratlar, metil substratlar ve asetotrofik substratlar'dır. CO2-tipi substratlar doğal olarak CO 2 içerirler. Elektron vericisi olarak H 2 kullanılarak CO 2 , metana indirgenir. CO 2 + 4H 2 -» CH 4 + 2H 2 O AG0' = -131 kj
(c)
(d)
• Şekil 13.6 Morfolojik yönden büyük farklılık gösteren metanojenik Archaea hücrelerinin taramalı elektron mikrograflan. (a) Methanobrevibacter ruminantium. Bir hücre yaklaşık 0.7 /im çapındadır, (b) Methanobrevibacter arboriphilus. Bir hücre yaklaşık 1 /xm çapındadır, (c) Methanospirillum hungatii. Bir hücre yaklaşık 0.4 /xm çapındadır, (d) Methanosarcina barkeri. Bir hücre yaklaşık 1.7 yiım genişliğindedir.
428 • Bölüm 13 • Prokaryotik Çeşitlilik: Archacı
Tablo 13.5 Bazı metanojenik ArcAaeaa'in özellikleri Metonojenezde kullanılan substratlar
DNA (mol % GC) 30-55 27-31 23-26 33
Çubuk
H 2 + CO2/ format H 2 + ÇO2, format Metanol + H 2 (her ikisi gerekli) H 2 + ÇO2; S0'de redükleyebilirler; hipertermofil H 2 + CO2, format
Düzensiz kok Kok Kok Kok
H 2 + CO2, piruvat + CO2, format H 2 + CO2, format H 2 + CO2 H 2 + CO2
29-35 31-34 31-33 31
Kısa çubuk Düzensiz kok Spiral Levha-şekilli hücreler (sivri uçlu ince levhalar halinde) Düzensiz kok Düzensiz kok Düzensiz kok Düzensiz kok
H 2 + CO2, format H 2 + ÇO2, format H 2 + CO2, format
49 47-52 45-50
H2 H2 H2 H2 H2
39-50 48-52 49-61 54-60 38-45
Paketler halinde geniş düzensiz koklar Yığınlar halinde düzensiz koklar Düzensiz kok Düzensiz kok Düzensiz kok
H 2 + ÇO2, metanol, metilaminler, asetat
Cins
Morfoloji
Methanobacteriales Methanobacterium Methanobrevibacter Methanosphaera Methanothermus
Uzun çubuk Kısa çubuk Kok Çubuk
Methanothermobacter Methanococcales Methanococcus Methanothermococcus Methanocaldococcus Methanotorris Methanomicrobiales Methanomicrobium Methanogenium Methanospirillum Methanoplanus Methanocorpusculum Methanoculleus Methanofollis Methanolacinia Methanosarcinales Methanosrcina Methanolobus Methanohalobium Methanococcoides Methanohalophilus Methanosaeta
Uzun çubuklardan filamente kadar değişen şekillerde
Methanosalsutn Methanopyrales Methanopyrus
+ CO2, format + CO2, format, alkoller + ÇO2, alkoller, format + CO2, format + ÇO2, alkoller
36^3 Metanol, metilaminler Metanol, metilaminler; halofil Metanol, metilaminler Metanol, metilaminler, metil sülfitler; halofil Asetat Metanol, metilaminler, dimetilsülfit
Zincirler halinde çubuklar
32-61
H 2 + ÇO2; hipertermofil, 110°C'de ürer
39^6 37 42 39-41 52-61 38^0 60
"Taksonomik ordolar koyu yazılmıştır.
(b) • Şekil 13.7 Metanojenik ArcAaea'ın ince kesitlerinin transmisyon elektron mikrograflan. (a) Methanobrevibacter rummantum. Bir hücre 0.7 fim çapındadır, (b) Methanosarcina barkeri'de kaim hücre duvan ve hücre bölünmesinin şekli ve çapraz duvar oluşumu görülmektedir. Bir hücre 1.7 fim çapındadır. M. barkerf mn duvan protein ve polisakkaritlerden meydana gelmiştir oysa M. ruminantum'un hücre duvan peptidoglikan (<33Q Şekil 4.33a) içerir.
13 4 • Metan-Üreten Archaea: Metanojenler • 429
• Şekil 13.8 Hipertermofilik ve termofilik metanojenler. (a) Methanococcus jannaschii'min (optimum sıcaklık, 85°C) gölgeleme preparasyonu elektron mikrografı. Bir hücre yaklaşık 1 fim çapındadır, (b) Methanotorris igneus'un (optimum sıcaklık, 88°C) ince-kesit elektron mikrografı. Bir hücre yaklaşık 1 fim çapındadır, (c) Methanothermus fervidus'un (optimum sıcaklığı 88°C) ince-kesit elektron mikrografı. Bir hücre yaklaşık 0.4 fim çapındadır, (d) Methanosaeta thermophila''nın (optimum sıcaklığı 60°C) faz kontrast mikrografı. Bir hücre yaklaşık 1 fim çapındadır. Hücre içindeki ışığı kıran yapılar gaz vezikülleridir (OQö kısım 4.12).
Birinci gruptaki diğer substratlar ise format (basitçe CO2+H2'nin birleşmiş formudur) ve CO'dir (karbon monoksit). Metanojenik substratların ikinci grubu metülenmiş maddelerdir (Tablo 13.6). Aşağıda metil substrat örneği olarak metanol (CH3OH) verilmiştir. Metanol iki şekilde kullanılarak CH4 üretilebilmektedir. Birincisi CH3OH, H 2 gibi bir dış elektron vericisi kullanarak redüklenebilir:
CH3OH+ H 2
• CH4 + H 2 O
AG°'=-113kj
H 2 'nin yokluğunda alternatif olarak, CH3OH molekülleri CO2'e okside edilerek, diğer CH3OH moleküllerinin CH4'e redüklenmesi için ihtiyaç duyulan elektronlar üretilir: 4CH3OH
• 3CH4 + CO2 2H2O
AG°'= -319kj
Sonuncu metanojenik işlem asetatın CO2 ile CH4'e ayrılmasıdır, bu aşama asetotrofik reaksiyon olarak adlandırılır:
Çeşitli metanojenik Arkeler tarafından Tablo 13.6 metana dönüştürülen substratlar
CH3COO- + H2O -> CH 4 + HCO3-
CO2-tipi substratlar Karbon dioksit, CO2 (elektronlar H2, bazı alkoller veya piruvattan gelmektedir) Format, HCOO Karbonmonoksit, CO II. Metil substtatlar Metanol, CH3OH Metilamin, CH3NH3+ Dimetilamin, (CH3)2NH2+ Trimetilamin, (CH3)3NH+ Metilmerkaptan, CH3SH Dimetilsülfit, (CH3)2S III. Asetotrofik substratlar Asetat, CH3COO Piruvat, CH3COCOO-
Sadece birkaç metanojen asetotrofik özelliktedir (Tablo 13.5). Ancak lağım çamuru (cBöKısım 28.2) gibi yüksek metanojenik habitatlarda üretilen metan ölçümleri, metanın yaklaşık üçte-ikisinin asettatan üçte-birinin H 2 + CO2'den meydana geldiğini göstermiştir. Böylece her ne kadar bilinen anlamda bir çeşitlilik göstermiyorlarsa da asetotrofik metanojenler ekolojik olarak oldukça önemli organizmalardır. Yukarıdaki herbir reaksiyonun incelenmesinden de anlaşılacağı gibi, bu reaksiyonların tümü enerji-verici (ekzergonik)'dir ve ATP sentezinde için kullanılabilirler. Metanojenezin biyokimyasal ayrıntıları Bölüm 17'de verilecektir. Burada sadece,
I.
AG°'= -31kj
430 • Bölüm 13 • Prokaryotik Çeşitlilik: Archaea
proton motive güç ve ATP sentezinin kemiozmotik mekanizma ile olan (
Hücre Duvarı İçermeyen Archaea
Thermoplasma ve Ferroplasma hücre duvarı içermeyen Archaea'dır, bu bakımdan mikoplazmalara (ö°&Kısım 12.21) benzerler. Thermoplasma (Şekil 13.9a) optimum olarak 55°C'de ve pH 2'de kompleks ortamda üreyen bir kemoorganotroftur. Thermoplasma''nin iki türü tanımlanmıştır; T. Bir Metanojen/Arkeon Modeli Olarak Acidophilum ve T. Volcanicum. Thermoplasma'nm Methanocaldococcus jannaschii türleri fakültatif aerobturlar, kükürt solunumu yaparak hem aerobik hem de anaerobik üremekKısım 15.3 te anlatılacağı gibi hipertermofilik metatedirler. Çoğu Thermoplasma susu kendiliğinden nojen Methanocaldococcus jannaschii (Şekil 13.8a) ve ısınan kömür atığı yığınlarından izole edilmiştir diğer birkaç metanojenin genom dizileri çıkarılmış(Şekil 13.10»). Kömür atığı, kömür parçaları, pirit tır. M. jannaschii''nin 1.66-Mbp olan halkasal geno(FeS ) ve kömürden ekstrakte edilen diğer organik 2 mu yaklaşık 1700 gen içermektedir. Dizi analizi ile maddeleri içerir. Açık kömür madenlerinde kömetanojeneze giren enzimler ve diğer bazı önemli mür atıkları yığınlar halinde döküldüğü zaman, hücre fonksiyonlarını kodlayan genler tanımlankendiliğinden ısınarak yanar (Şekil 13.10). Bu olay, mıştır. M. jannaschii''nin merkezi metabolik yolları ve hücre bölünmesi gibi fonksiyonlarını kodlayan genlerinin büyük bir kısmının Bacferia'dakine benzemesinin yanısıra transkripsiyon ve translasyon gibi önemli moleküler işlemlerini kodlayan genlerinin büyük bir kısmının bakterilerden çok ökaryotlardakine daha fazla benzemesi ilginçtir. Bu bulgular, Archaea'm Bacteria ve Eukarya (at^sKısım 11.8 ve Şekil 11.13) domainleri arasında yer aldığını gösteren filogenetik yaşam ağacıyla da uyuşmaktadır. Genom analiz ile M. jannaschii genlerinin yaklaşık %50'inin herhangi bir organizma grubunda benzerinin bulunmadığı da gösterilmiştir. Bu bulgular ya henüz keşfedilmemiş çok sayıda yeni hücresel fonksiyonu kodlayan arkeal DNA olduğunu ya da mevcut fonksiyonların büyük bir kısmının artık (ve tamamen farklı) gen setleri tarafından kodlandığını göstermektedir. 13.4 Kavramların Gözden Geçirilmesi Metanojenik Archaea, metabolizmaları metan (CH4) üretimine bağlı, zorunlu anaerobik prokaryotlardır. •
Volta deneyi neyi göstermektedir?
•
Metanojenlerin başlıca substratları nelerdir?
Thermoplasmatales; Thermoplasma, Fcrroplasma ve Picrophilus Anahtar Cinsler: Thermoplasma, picrophilus, Ferroplasma Archaea'm farklı bir filogenetik soyu üç adet termofilik ve asidofilik prokaryotu içermektedir: Thermoplasma, Ferroplasma, ve picrophilus (Şekil 13.1). Bu organizmalar bilinen en asidofilik mikroorganizmalar arasında yer almaktadır, hatta Picrophilus pH O'ın altında dahi üreyebilmektedir. Bu organizmalar Euryarchaeota içerisinde Thermoplasmatales olarak adlandırılan kendi ordosunu da oluşturmaktadırlar. Konuya mikoplazma benzeri organizmalar olan Thermoplasma ve Ferroplasma' nin tanımı ile başlayacağız.
(b)
• Şekil 13.9 Thermoplasma türleri, (a) Bir asidofilik, ter mofilik mikoplazma-benzeri arkeon Thermoplasma acidophilum hücresinin ince kesit elektron mikrograt. Hücrelerin çapı 0.2 den 5 jiım'ye kadar değişen oranda farklılık göstermektedir. Şekildeki hücre yaklaşık l/im çapındadır, (b) Sıcak su kaynaklarından izole edilen Thermoplasma volcanicum hücrelerinin gölgeleme preparasyonu. Hücreler 1-2 fim çapındadır. Çok sayıdaki flagella'ya dikkat ediniz.
13 4 • Thermoplasmatales: Thermoplasma, Ferroplasma ve Picrophilus • 431
sıcak kömür atıklarından organik bileşikleri alarak metabolize eden Thermoplasma'iun üreme aşamasını başlatır. Thermoplasma'nın ikinci türü olan T. volcanicum, dünya genelinde bulunan, sıcak asidik topraklardan izole edilmiştir ve çok sayıdaki flagellasıyla oldukça hareketlidir (Şekil 13.9b). Hücre duvarı olmadan ozmotik stres altında yaşamak ve ekstrem çevresel koşullar olan düşük pH ve yüksek sıcaklık çiftine karşı koymak için Thermoplasma'da benzersiz bir hücre membranı yapısı evrimleşmiştir. Membran lipoglikan («3°c>Kısım 12.21) olarak adlandırılan bir lipopolisakkaritbenzeri madde içermektedir. Bu madde mannoz ve glukoz içeren bir tek tabakalı tetraeter lipit membran yapısından oluşmaktadır (Şekil 13.11»). Bu molekül Thermoplasma'nm toplam lipit içeriğinin önemli bir parçasını oluşturmaktadır. Membranda glikoproteinler de bulunmaktadır. Ancak; steroller bulunmamaktadır. Bu moleküller Thermoplasma membranını sıcak asidik şartlara karşı dayanıklı hale getirmektedir. Thermoplasma ilginç bir genoma sahiptir. Thermoplasma diğer mikoplazmalar gibi (c^Kısım 12.21 ve 15.3) küçük bir genom içerir (1.5 Mbp). Bunun yanısıra Thermoplasma DNA'sı, ökaryotik hücrelerin nükleozomları gibi (o^Kısım 7.3 ökaryotlarda DNA'nın düzenlenmesi kısmında verilmiştir) DNA'yı küresel partiküller şeklinde organize eden, DNA'ya bağlanan yüksek bazik karakterdeki bir protein ile kompleks oluşturmuştur. Bu protein ökaryotik hücrelerin bazik histon proteinlerinin homologudur. Aynı şekilde histon-benzeri proteinler diğer birkaç Euryarchaeota'da da bulunmuştur (Bakınız Kısım 13.12)'. Ferroplasma Ferroplasma, Thermoplasma'nın bir
kemolitotrofik
akrabasıdır. Ferroplasma güçlü bir asidofildir; ancak bir termofil değildir, optimum olarak 35°C'de ürer. Ferroplasma (c^öŞekil 19.35) enerji elde etmek için Fe+2'i Fe+3'e okside eder (bu reaksiyonda asit üretilir; c^Kısım 19.14 ve bakınız Şekil 13.15rf) ve karbon kaynağı olarak CO2 kullanır (ototrofi). Ferroplasma, pirit (FeS2) içeren maden atıklarında üremektedir. Pirit organizmanın enerji kayna-
Eter bağı
HOOO-
[R]8Glu(a1 -1)R • Man (a1 — 2) Man («1 -» 4) Man (ot1 • 3)
• Şekil 13.11 Thermoplasma acidophilum*un tetraeter lipoglikan yapısı. Glu, Glukoz; Man, Mannoz. Eter bağlan (yeşil renkte gösterilmiş) ve lipidin çift tabakadan çok tek tabakalı membran oluşturması dikkat çekicidir Şekil 4.19£> ile karşılaştırınız).
ğıdır. Ferroplasma'ran ekstrem asidofilik özelliği, habitat pH'nm ekstrem asidik değerlere düşmesine neden olur. Acidithiobacillus ferrooxidans ve Lep-
tospirillum ferrooxidans gibi asidofilik organizmalar tarafından Fe+2'in oksidasyonu sonucunda meydana getirilen orta dereceli bir asiditeden sonra, Ferroplasma aktif hale geçerek çok düşük pH'lı tipik asit maden drenajını oluşturur. Ferroplasma'nın aktiviteleri sonucu pH'ı 0 olan asidik sular üretilebilmektedir (öOöŞekil 19.35 ve Kısım 19.14 ve 19.15). Picrophilus Thermoplasma ve Ferroplasma'nın filogenetik akrabası Picrophilus''tur. Thermoplasma ve Ferroplasma eks-
trem asidofil olmalarına rağmen, bunlardan daha fazla asidofil özellikte olan Picrophilus, pH 0.7'de optimum üremektedir ve hatta pH -0.06! kadar düşük bir pH derecesinde dahi üreyebilmektedir. Ayrıca Picrophilus bir hücre duvarına da sahiptir (Ş tabakası, öOoKısım 4.10) ve DNA'sı Thermoplasma ve Ferroplasma DNA'sından daha düşük bir GC baz oranına sahiptir. Böylece filogenetik açıdan yakın olmalarına rağmen Thermoplasma, Ferroplasma
ve Picrophilus oldukça farklı genomlara sahiptir. Picrophilus'un iki türü asidik Japon solfataralarından izole edilmiştir. Bu türler Thermoplasma gibi kompleks ortamlarda heterotrofik üremektedir. Picrophilus'un fizyolojisi ekstrem asit toleransının anlaşılmasında bir model olarak ilgi çekmektedir. Ştoplazmik membranı ile yapılan çalışmalar, lipitlerin optimum pH değerlerinde benzersiz bir şekilde düzenlenerek, yüksek düzeyde asit geçirmeyen bir membran oluşturduğunu göstermiştir. Bununla birlikte pH 4 gibi orta dereceli asidik pH değerlerinde ise Picrophilus hücrelerinin membranları hızla zayıflamakta ve hücreler parçalanmaktadır. Açıkçası, bu organizma sadece yüksek asidik habitatlarda canlı kalmak için evrimleşmiştir. 13.5 Kavramların Gözden Geçirilmesi
• Şekil 13.10 Tipik kendiliğinden ısınan bir kömür atığı yığını, TheraıopJasmıi'nın habitatı. Kömür parçası, pirit ve diğer mikrobiyal substratlan içeren yığın, mikrobiyal metabolizmadan dolayı kendiliğinden ısınır.
Thermoplsama, Ferroplasma ve Picrophilus, kömür atığı yığınları ve asidik solfataralarda yaşayan, Archaea'm kendi filogenetik familyasını oluşturan ekstrem asidofilik termofillerdir. Thermoplsama ve Ferroplasma hücreleri hücre duvarı içermezler ve bu bakımdan mikoplazmalara benzerler.
432 • Bölüm 13 • Prokaryotik Çeşitlilik: archaea Thermoplasma ve Picrophilus hangi yönlerden birbirlerine benzerler? Hangi yönlerden ayrılırlar? Thermoplasma hücre duvarsız yaşamında canlı kalmak için hücre membranım nasıl güçlendirmiştir? Ferroplasma üremek için gerekli enerjiyi nasıl sağlar?
Hipertermofilik Euryarchaeota: Thermococcales ve Methanopyrus Anahtar cinsler: Thermococcus, Pyrococcus, Methanopyrus
Birkaç euryarchaeota sıcak ortamlarda yaşamaktadır ve bunların bazıları hipertermofildir. Burada Arkeal ağaçta (Şekil 13.1) köke çok yakın dalda bulunan üç hipertermofilik euryarchaeotadan bahsedeceğiz. Bu organizmalardan ikisi Thermococcus ve Pyrococcus'tur, fenotipik özellikleri 13.8-13.10. kısımlarda anlatılacak olan hipertermofilik crenarchaeotlara benzemektedir ve farklı bir ordo oluştururlar: Thermococcales (Bakınız Tablo 13.9). Diğer organizma olan Methanopyrus ise bir metanojendir. Temel fizyolojik özellikleri yönünden diğer metanojenlere çok benzemektedir; ancak hipertermofilik özelliği ve filogenetik pozisyonundan dolayı farklıdır. Thermococcus ve Pyrococcus Thermococcus dünyanın çeşitli bölgelerinde bulunan anoksik termal sulara özgü küre şekilli bir hipertermofilik euryarchaeottur. Küresel hücreleri bir demet polar flagella içerir ve bu yüzden oldukça hareketlidirler (Şekil 13.12a»). Thermococcus bir obligat anaerobik kemoorganotroftur; 70-95°C'de S°'ü elektron alıcısı olarak kullandığı proteinler ve diğer kopleks organik karışımların (bazı şekerleri içeren) bulunduğu ortamlarda üremektedir. Pyrococcus morfolojik
lık ihtiyacından dolayı Thermococcus''tan ayrılmaktadır. Pyrococcus 70 ve 106°C arasında, optimum olarak 100°C'de üremektedir. Thermococcus ve Pyrococcus metabolik yönden birbirlerine oldukça benzemektedirler. Proteinler, nişasta veya maltoz elektron vericisi olarak okside edilir ve açığa çıkan elektronlarla terminal elektron alıcısı olan S° indirgenerek H 2 S üretilir. Thermococcus ve Pyrococcus'un
özelliklerinin büyük bir kısmı ilerde tanımlanacaktır (bakınız Tablo 13.8 ve 13.9). Methanopyrus Methanopyrus çubuk şekilli bir hipertermofilik metanojendir (Şekil 13.13»). Methanopyrus denizaltındaki hidrotermal bacaların yakınlarındaki sedimentlerden ve hidrotermal bacaların "kara duman bacaları" (öo&Kısım 13.8 ve 19.8 hidrotermal bacalar için) duvarlarından izole edilmiştir. Methanopyrus, Archaea ağacında özel bir filogenetik pozisyonda bulunmaktadır (Şekil 13.1). Arkeal ağacın temeline yakın yer almaktadır ve hem hipertermofilerle (Methanopyrus'un maksimum üreme sıcaklığı 110°C) hem de metanojenlerle ortak fenotipik özelliklere sahiptir. Methanopyrus sadece H2+CO2'ten metan üretir ve bir ototrofik organizma olarak oldukça hızlı ürer (jenerasyon süresi optimum sıcaklık derecesi olan 100°C'de 1 h'ten daha azdır). Methanopyrus hücreleri mezofilik metanojenlere benzemezler, sitoplazmalarmda yüksek miktarda ve çözünmüş halde, glikoliz kaynaklı bir madde olan siklik 2,3-difosfogliserat bulundururlar. Bu madde Methanopyrus''ta 1 molardan daha yüksek konsantrasyonda bulunmaktadır. 2, 3-difosfogliseratm
•
yönden Thermococcus'a
benzemektedir (Şekil 13.12b). Pyrococcus (Latince'de "ateştopu" anlamındadır) çok daha yüksek sıcak(a)
CH 3 OH
CH 3
CH,
CH,
Eter bağı
(b)
(b)
• Şekil 13.12 Denizaltı volkanik alanlarından elde edilen küresel şekilli hipertermofilik Archaea. (a) Thermococcus çeler. Gölgelenmiş hücrelerin elektron mikrografı (flagella demetine dikkat ediniz), (b) Bölünen Pyrococcus furiosus hücresinin. İnce-kesit elektron mikrografı. Her iki organizma yaklaşık 0.8 [im çapındadır.
* Şekil 13.13 lUethanopyrus. Methanopyrus optimum olarak 100°C'de ürer ve sadece CO2+H2'dan CH4 üretir, (a) Bir Methanopyrus kandleri hücresinin elektron mikrografı, bu organizma bilinen en termofilik metanojendir (üst sıcaklık sının 110°C). Hücre ölçüleri 0.5 X 8/ım. (b) M. Kandleri'mn yeni lipitinin yapısı. Bu Archaea'daki normal eter lipit eter bağlı lipit yapısıdır (^o^Kısım 4.5), sadece farklı olarak Geranilgeraniol olarak adlandırılan bir doymamış ftanil yanzinciri taşımaktadır. Bu farklı lipidin doymuş fitanil lipitlerinden daha önce ortaya çıktığı ve böylece Methanopyrus'un Archaea\n çok eski bir soyundan geldiği düşünülmektedir; Şekil 13.1'deki veriler de bu hipotezi desteklemektedir.
13.7 • Hipertermofilik Euryarchaeota: Rrchaeglobales • 433
hücre içerisindeki DNA ve enzimlerin denatürasyonunu önlemek için termostabilize edici bir ajan olarak görev yaptığı düşünülmektedir (bakınız Kısım 13.12). Methanopyrus diğer tanımlanmış organizmaların içermediği zar lipitlerine sahip olma özelliği ile de farklıdır. Archaea'm lipitleri hatırlanacak olursa; gliserol yan zincirlerinde yağ asitleri yerine eter bağı ile bağlı fitanil grupları bulunmaktadır (cnoKısım 4.5). Methanopyrus'un eter-bağlı lipiti doymamış formdadır, ancak diğer hipertermofilik Archaea'nm lipidi doymuş dibifitanil tetraeter yapısındadır bulunmaktadır (Şekil 13.13b; öOöKısrm 4.5 ve Şekil 4.19). Arkeal lipitlerin biyosentezinin yapıldığı metabolik yolun biyokimyasından dolayı, Methanophyrus lipitinin ilkel bir özellik olduğu kabul edilmektedir. Filogenetik konumu, hipertermofilik özelliği, anaerobik metabolizması ve ilkel lipitlerinden dolayı Methanopyrus en eski yaşam formları için ilginç bir model olmaktadır (coaKısım 11.1-11.3 ve 13.13) Methanopyrus'un keşfi ile, önceleri biyojenik metanojenezin meydana gelmesini engelleyecek kadar sıcak olduğu düşünülen, sıcak okyanus sedimentlerindeki, metanın kaynağına açıklık getirilmiştir. Methanopyrus'un bulunduğu derinlikte (yaklaşık 2000 m) su 350°C'ye kadar sıvı halde kalmaktadır. Bu, diğer hipertermofilik metanojenlerin de 110°C ve hatta daha yüksek sıcaklık derecelerinde üreme yeteneklerinin bulunabileceğini göstermektedir.
Hipertermofilik Euryarchaeota: Rrchaeglobales Anahtar cinsler: Archaeglobus, Ferroglobus
İlerde anlatılacağı gibi pek çok hipertermofilik Crenarchaeota, elementel kükürtü (S°) elektron alıcısı olarak kullanıp H2S'e redüklediği anaerobik solunumları katalizlemektedir (bakınız Tablo 13.8). İlginçtir, bu crenarchaeotların hiçbirisi SO42~'ı H2S'e indirgeyen bir sülfat-indirgeyicisi değildir. Ancak hipertermofilik bir euryarchaeota olan Archaeglobus gerçek bir sü/fat-indirgeyicisidir ve Euryarchaeota içerisinde filogenetik olarak farklı bir soy oluşturmaktadır (Şekil 13.1). Archaeglobus ve Genomu Archaeglobus, hidrotermal akıntıların yakınlarındaki deniz sedimentlerinden izole edilmiştir. Archaeglobus metabolizmasında, H2, laktat, piruvat, glukoz veya kompleks organik bileşiklerin oksidasyonunu sülfatın sülfite redüksiyonu ile birleştirir. Archaeglobus hücreleri düzensiz koklar şeklindedir (Şekil 13.14a») ve kültürleri optimum olarak 83°C'de ürer. Archaeglobus ve metanojenler ortak özelliklere sahiptirler. 17. bölümde metanojenez biyokimyasının benzersiz olduğunu öğreneceğiz. Kısaca bu işlem bir seri yeni koenzimleri gerektirmekte-
_»» -~+'
(b) • Şekil 13.14 Archaeglobales. (a) Sülfat-redükleyen hipertermofil Archaeglobus fulgidus'un transmisyon elektron mikrografı. Hücre 0.7 fim çapındadır, (b) Bir ferröz demir-okside eden, nitrat-redükleyen Ferroglobus placidus'un dondurma-kırma elektron mikrograh. Hücre yaklaşık 0.8 fim çapındadır.
dir. Birkaç istisna haricinde bu koenzimler sadece metanojenlerin hücrelerinde bulunmaktadır (G°Ö Kısım 17.17). Archaeglobus'un bu koenzimleri içermesine rağmen, kültürünün gelişmesi aşamasında az miktarda metan üretmesi ilginçtir. Dolayısıyla filogenetik olarak metanojenlere oldukça yakın olan Archaeoglobus'un (Şekil 13.1) fizyolojik anlamda, kükürt redüksiyonu ve metanojenezin enerji -koruyan aşamaları arasında köprü kuran bir geçiş organizması tipini temsil edebileceği düşünülmektedir. Archaeglobus'un genom dizisi metanojenez ile ilgili bir bilmeceyi ortaya çıkarmıştır. Archaeglobus metan üretebilmesine rağmen, metanojenezte önemli bir enzim olan metil-CoM redüktaz genini içermediği belirlenmiştir (<^o&Kısıml7.17). Dolayısıyla Archaeglobus'un ürettiği az miktardaki metan bu önemli enzimin aktivitesiyle meydana gelmemektedir ve metan üretiminin kökeni tam olarak belli değildir. Archaeglobus'un genomu yaklaşık 2400 gen içermektedir ve büyük bir kısmı metanojenlerin genleri ile ortaktır (bakınız Kısım 13.4). Bununla birlikte Archaeglobus genomu bu organizma için özel olan çok sayıda gen de içermektedir. Bu durum Archaea''daki büyük genetik çeşitliliğe bir örnek teşkil etmektedir. Bacteria türlerinde olduğu gibi her bir arkeal genomdaki genlerin yaklaşık olarak üçte biri özeldir, yani diğer herhangi bir organizmada bulunmamaktadır (ööa>Kısım 15.3).
434 • Bölüm 13 • Prokaryotik Çeşitlilik: Archaea
Ferroglobus
ŞUBE CRENARCHAEOTA
Ferroglobus (Şekil 13.14b) Archaeoglobus ile akraba
olmasına rağmen sülfat-indirgeyen bir bakteri değildir. Onun yerine Ferroglobus demir-yükseltgeyen bir kemolitotrofik ototroftur, Fe+2'in Fe+3'e yükseltgenmesi ve NO3~'m NO 2 ve NO'e indirgenmesini birleştirerek enerji elde etmektedir (bakınız Tablo 13.8). Ferroglobus enerji metabolizmasında elektron vericisi olarak H 2 veya H2S de kullanabilmektedir. Ferroglobus bir sığ deniz hidrotermal akıntısından izole edilmiştir ve optimum olarak 85°c'de üremektedir. Ferroglobus, özellikle anoksik koşullarda Fe2+'i +3 Fe 'e yükseltgeyebildiğinden dolayı ilginç bir organizmadır. Bu reaksiyon eski kayalarda Fe3+'ün neden bol miktarda bulunduğunu açıklayabilir («oooKısım 11.3). Çünkü daha önce kayalardaki Fe3+'ün siyanobakterilerin ürettiği O, ile (oksijenik fotosentez) Fe2+/nin okside edilmesinden kaynaklandığı düşünülüyordu. Ferroglobus'un metabolizmasından, siyanobakterilerin orijin tarihleri ve devamında dünyanın oksijenlenmeye başladığı tarih çıkarılabilir (cooKısımll.l ve 11.2). Bazı anoksijenik fototrofik bakteriler de anoksik koşullarda Fe2+'i yükseltgeyebilirler (<3°oKısım 17.11). Dolayısıyla, eski Fe3+ oluşumu için çeşitli anoksik yolların bulunduğu bilinmektedir. Buda siyanobakterilerin ilk olarak ne zaman evrimleştiklerini doğru bir şekilde tahmin etmek için bir fırsat sunmaktadır. 13.6 - 13.7 Kavramların Gözden Geçirilmesi Hipertermofilik euryarchaeota, Thermococcales, Archaeglobales ve Methanopyrus'u içermektedir. Bu gruptaki tüm organizmaların optimum üreme sıcaklıkları 80°C'nin üzerindedir. •
Thermococcus'un metabolizması Methanopyrus'un metabolizmasından nasıl farklılık göstermektedir?
•
Hangi hipertermofilik Euryarchaeaota gerçek bir sülfat indirgeyicisidir?
•
Ferroglobus'un metabolizması Archaeglobus'un metabolizmasından nasıl farklılık göstermektedir?
Crenarchaeotlar Euryarchaeotlardan filogenetik olarak ayrıdır (Şekil 13.1). Şube kaynayan ve donmuş sular gibi doğada heriki ekstrem sıcaklık noktalarında yaşayan üyeleri içermektedir. Bununla birlikte kültürü yapılan crenarchaeotların tümü hipertermofildir (optimum üreme sıcaklıkları 80°C'nin üzerindedir) ve bazılarının optimum sıcaklıkları gerçekten suyun kaynama noktasının üzerindedir. Crenarchaeotların habitatları ve enerji metabolizmalarına genel bir bakış ile başlayacağız ve sonra bazı önemli cinslerin özelliklerini tanımlayacağız.
Crenarchaeotların Habitatları ve Enerji Metabolizmaları Crenarchaeota'nın habitatlarınm özeti Tablo 13.7'de verilmiştir. Bu habitatlar çok sıcak ve çok soğuk ortamları içermektedir. Hipertermofilik Archaea'ın büyük bir kısmı jeotermal olarak ısınan ve elementel kükürt ve sülfitleri içeren toprak veya sulardan izole edilmişlerdir (Şekil 13.15») ve türlerin büyük bir kısmı kükürtü metabolize etmektedir. Karasal ortamlarda, kükürtçe zengin kaynak sularında, kaynar çamurda ve topraklarda sıcaklık 100°C'ye kadar çıkabilmektedir. Bu ortamlar H2S ve S0'ün biyolojik oksidasyonu sonrası üretilen sülfürik asitten (H2SO4) (cööKısım 17.10 ve 19.13) dolayı hafiften, ekstreme kadar değişen oranlarda asidik olabilmektedirler. Bu şekildeki sıcak ve kükürtce-zengin ortamlar solf atara olarak adlandırılmaktadır. Solfataralar İtalya, İzlanda, Yeni Zellanda ve Wyoming (USA)'deki Yellowstone Ulusal Parkı başta olmak üzere dünya genelinde yaygın bir şekilde bulunmaktadır (Şekil 13.15). Çevrelerindeki jeolojiye bağlı olarak solfataralar hafif asidik ile hafif alkali pH 5-8 veya pH l'in altında olacak şekilde ekstrem asidik olabilmektedirler. Hipertermofilik crenarchaeotlar her iki tip ortamlardan elde edilmişlerdir fakat bu organizmaların büyük bir kısmı nötral veya hafif asidik habitatlar-
Tablo 13.7 Crenarchaeotanın Habitatları Termal alan'
Özellik
Karasal
Deniz
Yer
Solfataralar (sıcak kaynaksular, fümeroller, mudpots, buharla-ısınmış topraklar); jeotermal elektrik santralleri; Yer kabuğunun derinlikleri
Sıcaklık
Yüzey 100°C; yüzeyaltı 100°C üzeri NaCI genellikle %1'den az; pH 0.5-9 CO 2 , CO, CH 4 , H 2 , H2S, S°, S2Of, SO42-, NH 4 + , N 2
Denizaltı sıcak su kaynakları, sıcak sedimentler ve bacalar ("kara duman bacaları"); derin petrol kaynakları 400°C'ye kadar (bacalar) NaCI orta derecede yaklaşık %3; pH 5-9 Karasal alandaki ile aynı
Tuzluluk/pH Gaz ve diğer besinler
"1 Bakınız Şekil 13.10 ve 13.15 (CWs Şekil 19.19-19.21) Bakınız şeKil 13.16. Euryarchaeota'nm bazı türleri de deniz suyunda bulunmaktadır.
Termal olmayan alan'
1
Dünya genelindeki okaynuslarda planktonik; kıyıya yakm ve derin Antarktik suları; Deniz buzulu; deniz süngerlerinin simbiyontları -2 ile +4°C NaCI %3-8; pH 7-9 CO2, Oy N2; kemolitotroflar için NH4+ gibi inorganic substratlar
1
13 8 • Crenarchaeotlarin Habitatları ve Enerji Metabolizmaları • 435
•r*
• Şekil 13.15 Hipertermofilik Archaea'ın habitatlan. (a) Yellowstone Ulusal Parkmdaki tipik bir solfatara. Hidrojen sülfürce zengin buhar yer yüzeyine ulaşmaktadır. Sıcaklık ve asiditeden dolayı sadece prokaryotlar bulunmaktadır. (£>) Kükürtce-zengin sıcak su kaynağı, yoğun Sulfolobus popülasyonunu içeren bir habitat. Solfataralar ve kükürtlü kaynak sularındaki asidite Sulfolobus ve benzeri prokaryotlann H2S'i S° ve H2SO4'e (sülfürik asit) yükseltgemelerinden kaynaklanmaktadır, (c) Tipik bir nötral pH'lı kaynar su kaynağı, Yellowstone Parkı; Imperial Geyser. Böyle habitatlarda oldukça farklı hipertermofilik Archaea türleri bulunabilmektedir. Burda S°'ün SO42 'e oksidasyonundan fazla Fe2+'in Fe3+'e oksidasyonu gerçekleşmekte ve asidik koşulların açığa çıkmasına neden olmaktadır (Fe3+ + 3H2O -^Fe(OH)3 + 3H+).
H
(b)
da yaşamaktadır. Bu nötral habitatlara ek olarak hipertermofilik Archaea yapay termal habitatlarda özellikle jeotermal elektrik santrallerinin kaynar derecedeki çıkışlarında çok iyi gelişmektedirler. Hipertermofilik Crenarchaeota deniz altındaki hidrotermal baca olarak adlandırılan sıcak kaynak sularında da bulunmaktadır. Bu habitatların jeolojisi ve mikrobiyolojisi Kısım 19.8'de verilmiştir. Burda sadece dikkat edilmesi gereken nokta şudur; deniz altındaki sular yüzeydeki sulardan çok daha sıcak olabilirler çünkü su basınç altındadır. Gerçekten d e optimum olarak 100°C'nin üzerinde üreyen tüm hipertermofiller denizaltı kaynaklıdırlar. Denizaltı kaynakları, hem Vulcano kıyılarındaki (İtalya) sığ bacalar gibi (2-10 metre derinlikte) hem de okyanus derinliklerindeki bacalar (2000-4000 metre derinlikte) gibi dip bacaları içermektedir («»aKısım 19.8). Dip bacaları şimdiye kadar mikroorganizma barındırdığı bilinen en sıcak habitatlardır. Soğukta-Yaşayan Crenarchaeotlar
•».v
Hipertermofillerin aksine soğukta-yaşayan crenarchaeotlar (Tablo 13.7), termal olmayan birçok ortamdan ribozomal RNA genlerinin kommünite örneklemelerinden tanımlanmışlardır. Örneğin, floresan filogenetik problar (^oc-Kısım 11.7 ve 18.4) kullanılarak dünyadaki bütün deniz sularında crenarchaeotlar bulunmuştur (Şekil 13.\6b*). Hipertermofillerin tam aksine deniz crenarchaeotları Antartika yakınlarındaki buz denizi (Şekil 13.16W ve hatta donmuş sularda gelişmektedirler. Bu organizmalar planktoniktir (serbestçe asılıdırlar veya su kolonundaki asılı partiküllere tutunmuşlardır) ve hem besince fakir ve hemde soğuk (deniz sularında sıcaklık 2-4°C ve deniz buzulunda sıcaklık 0°C'den daha düşük) sularda yüksek miktarlarda bulunurlar (~104/ml). Hala fizyolojilerinin sırrının bilinmemesine rağmen deniz suyundan filtre edilen deniz crenarchaeotlarmm lipit analizleri sonucunda bu organizmaların bir Archaea özelliği (««s Kısım 4.5 ve 19.11) olan eter bağlı lipitler içerdikleri gösterilmiştir. Deniz crenarchaeotlarmın ekolojisi Kısım 19.6'da verilmiştir. Deniz ortamlarında soğukta-yaşayan Euryarchaeota türleri de bulunmaktadır. Şimdiye kadar yapılan çalışmalardan bu organizmaların ılıman yüzey sularında yüksek oranda bulundukları, crenarchaeotların ise soğuk (Şekil 13.16a) sularda ve oldukça derin sularda çok daha bol bulundukları belirlenmiştir (««sKısım 19.6 ve Şekil 19.13).
436 • Bölüm 13 • Prokaryotik Çeşitlilik: Rrchaea
• Şekil 13.16 Soğukta-yaşayan Crenarchaeota. (a) Antartika yanmadasının gemiden çekilmiş fotoğrafı. Burda görülen buz yüzeyinin altında bulunan dondurucu sular soğukta-yaşayan crenarchaeotlann habitatlandır. (b) Crenarchaeota türlerinin 16S rRNA'lanndaki bir işaret dizisini tamamlayan yeşil floresan boya takılı bir oligonukleotit ile filogenetik boyama yapılmış deniz suyunun floresan fotomikrografı (^^Kısım 11.7'da burada kullanılan metod tanımlanmıştır). Mavi hücreler tüm hücreleri boyayan DAPI boyası ile boyanmıştır (C°c>Kısım 18.3 ve Şekil 18.6). Yeşil boyanan hücreler soğukta-yaşayan Crenarcahaeota'dır. Açık okyanus sularında bulunan Bacteha ve Archaea\n tanımı için Kısım 19.6 ve Şekil 19.13'e bakınız.
membrana elektron transferi yapılarak proton motive gücü oluşturulur, membrandaki ATPazların protonların yerini değiştirmesi ile ATP üretilir (cnaKısım 5.12). Hipertermofilik Crenarchaeotların büyük bir kısmı H 2 'i elektron vericisi olarak, S° veya NO3'ı elektron alıcısı olarak kullanarak anoksik şartlar altında kemolitotrofik üreyebilmektedir. Bir kaç hipertermofilik crenarchaeota H 2 'i aerobik olarak da okside edebilmektedir (Tablo 13.8). Elektron alıcısı olarak ferrik demirin (Fe3+) kullanıldığı H 2 solunumu da bazı hipertermofillerde meydana gelmektedir (Tablo 13.8). Sadece bir tane sülfatindirgeyen hipertermofil bilinmektedir (euryarchaeot olan Archaeglobulus, bakınız Kısım 13.7). Dolayısıyla biyoenerjetik seçeneklerden sadece fotosentezin kullanılmadığı anlaşılmaktadır. Bilinen en termofilik fototrofik organizma 73°C'ye kadar üreyebilmektedir (^ooTablo 6.1), bu sıcaklık çoğu hipertermofil için çok soğuk kalmaktadır (bakınız Tablo 13.9). Hipertermofilik crenarchaeotların habitataları ve enerji metabolizmaları hakkında temel bilgiler verildiği için şimdi bazı örnek organizmalara geçilecektir.
Enerji Metabolizması
Birkaç istisna hariç hipertermofilik Crenarchaeota obligat anaerobtur. Enerji üreten metabolizmaları ya kemoorganotrofik ya da kemolitotrofiktir (veya Sulfolobus'ta. olduğu gibi her ikisidir) ve oldukça çeşitlilik gösteren farklı elektron alıcı ve vericileri bulunmaktadır (Tablo 13.8). Fermentasyon çok sık görülmemektedir ve çoğunlukla biyoenerjetik stratejileri anaerobik solunumlardır (Tablo 13.8). Araerobik solunumdaki enerji korunumu aşamaları Bacteria' daki aynı genel mekanizma ile gerçekleşmektedir. Stoplazmik
Karasal ve Volkanik Habitat Kaynaklı Hipertermofiller: Sulfolobales ve Thermoproteales Anahtar cinsler: Sulfolobus,Acidianus, Thermoproteus, Pyrobaculum
Volkanik habitatların sıcaklıkları 100°C kadar yüksek olabilmektedir ve dolayısıyla hipertermofilik Archaea için uygundurlar. Bu ortamlardan filogenetik olarak akraba olan Sulfolobus ve Acidianus izole edilmiştir. Bunlar Sulfolobales olarak adlan-
Tablo 13.9 Hipertermofilik Arcfıaea'da enerji kazanım reaksiyonları Besinsel sınıfı
Enerji-üreten reaksiyon
Kemoorgfanotrofik
Organik bileşik + S° — H 2 S + CO2
AnR
Kemolitotrofik
Organik bileşik + SO42~ -• H 2 S + CO2 Organik bileşik + O2—>H2O + CO2 Organik bileşik -» CO2 + H 2 + yağ asitleri Organik bileşik + Fe 3+ -• CO2 + Fe 2+ Piruvat ->CO 2 + H 2 + asetat H 2 + S°->H 2 S
AnR AeR F AnR F AnR
Metabolih tipa"
H 2 + NO-T -» NO2~ + H 2 O (Bazı türler tarafından, AnR N 2 'e indirgenmektedir) 4 H 2 + NO3+3~ + H +2+-> NH 4 + ++ 2 H 2 O + OH~ AnR AnR H 2 + 2 Fe -» 2 Fe + 2 H AeR 2 H 2 + O 2 ->2H 2 O AeR 2 S° + 3 O 2 + 2 H 2 O -• 2 H 2 SO 4 AeR 2 FeS2 + 7 O 2 + 2 H 2 O -* 2 FeSO4 + 2 H 2 SO 4 AnR 2 FeCO3 + NO 3 ~ + ° H 2 O -> 2 Fe(OH)3 + NO2~ + 2 H O V + 2 H + + H 2 O 2 + AnR 4 H 2 + SO4 ~ + 2 H - > 4 H 2 O + H 2 S AnR 4 H 2 + CO2 -• CH 4 + 2 H 2 O a
AnR, anaerobik solunum; AeR, aerobik solunum; F, fermentasyon
Örnek Thermoproteus, Thermococcus, Desulfurococcus, Thermofilum, Pyrococcus Archaeoglobus Sulfolobus Staphylothermus, Pyrodictium Pyrodictium Pyrococcus Acidianus, Pyrodictium, Thermoproteus, Stygiolobus, Ignicoccus Pyrobaculum Pyrolobus Pyrobaculum, Pyrodictium, Archaeoglobus Acidianus, Sulfolobus, Pyrobaculum Sulfolobus, Acidianus Sulfolobus, Acidianus, Metallosphaera Ferroglobus Archaeoglobus Methanopyrus, Methanocaldococcus, Methanothermus
13 9 • Karasal ve Volkanik Habitat Kaynaklı HipertermofiIIer: Sulfolobales ve Thermoproteales • 437
Tablo 13.9 Bazı hipertermofilik Crenarchaeota'lann özellikleri Sıcaklık Grup/Cins3 Sulfolobales Sulfolobus
Morfoloji
02" ile Uişki
Acidianus Metallosphaera
Loblu kok Kok Kok
Stygiolobus Stetteria Sulfophobococcus
Loblu kok Kok Disk-şekilli
Ae Fac Ae An An An
Thermosphaera
Kok
Thermoproteales Thermoproteus Thermophilum Pyrobaculum Caldivirga Thermocladium
DNA (mol % GC)
Minin mm
Optimum
Optimum Maksimum PH
An
37 31 45 38 65 54-56 46
55 60 50 57 68 70 67
75 88 75 80 95 85 85
Çubuk Çubuk Çubuk Çubuk Çubuk
An An Fac An An
56 57 46 43 52
60 70 74 60 60
88 88 100 85 75
96 95 102 92 80
6 5.5 6 4 4.2
Desulfurococcales Desulfurococcus
Kok
An
51
Aeropyrum Staphylothermus
Kok Kümeler şeklinde koklar
Pyrodictium
Filamentli disk-şekilli
Ae An An
56 35 62
70 70 65 82
85 95 92 105
95 100 98 110
6 7 6-7 6
Pyrolobus Thermodiscus Ignicoccus Hyperthermus Sulfurisphaera
Loblu kok Disk-şekilli
53 49 35 56 33
Kok
43^6
90 75 65 75 63 40
106 90 90 102 84 75
113 98 103 108 92 85
5.5 5.5 5 7
Sulfurococcus
Fac An An An Fac Ae
Archaeoglobales Archaeogiobus Ferroglobus
Kok Düzensiz kok
An An
46 43
64 65
83 85
95 95
7 7
Kok Kok
An An
38-57 38
70 70
88 100
98 106
6-7
Thermococcales Thermococcus Pyrococcus
Düzensiz kok Düzensiz kok Kok
87 95 80 89 102 95 90
2-3 2 2 3 6 7.5 7
2 2.5
6-8
" "ales" ile biten grup isimleri ordo isimleridir (£%%SKısım 11.10). b Ae, aerob; An, anaerob; Fac, fakültatif. ' Bir tür 121°C'nin üzerinde üreyebilmektedir. '' Bu hipertermofil ordonun cinsleri filogenetik olarak Euryarchaeota'nın üyeleridir (bakınız Kısım 13.6 ve 13.7).
dırılan ordonun en temel cinslerini oluşturmaktadır (Tablo 13.9).
da üreyebilmektedir. Sulfolobus, belirgin loblar içeren az ya da çok küresel şekilli hücrelerdir (Şekil 13.17a). Hücreler sıkı bir şekilde kükürt kristallerine tutunmaktadır, bunlar floresan boyalar kullaSulfolobales nılarak mikroskopta görülebilmektedirler (17.26b). Kükürt ve organik bileşiklerin aerobik solunumuSulfolobulus, sıcaklığı 90°C'e kadar çıkan, pH'ı 1-5* nun yanı sıra Sulfolobus Fe2+'i Fe3+/e de yükseltgeolan, kükürtce-zengin asidik sıcak su kaynaklayebilmektedir. Organizmanın bu özelliği yüksek rında (Şekil 13.15) üremektedir. Sulfolobus (Şekil sıcaklıklarda demir ve bakır cevherlerinin saflaştı13.17a») karbon kaynağı olarak CO2'i fikse eden rılmasmda uygulanmıştır (o°c>Kısım 19.15). ve H2S veya S°'ü H2SO4'e oksitleyen bir aerobik keSulfolobulus'a benzeyen diğer bir fakültatif molitortroftur. Sulfolobus kemoorganotrofik olarak aerob da asidik solfatarik kaynaklarda yaşamaktadır. Bu organizmanın adı Acidianus'tur (Şekil 13.17b), anaerobik üreyebilmesiyle çok açık bir şekilde Sulfolobulus''tan ayrılmaktadır. Acidianus, Tarihsel not: Sulfolobulus ilk olarak Thomas Brock ve meslektaşları tarafından 1970'te bulunmuştur ve resmen 1972'de tanımı yapılmıştır. Daha önce izole hem aerobik hemde anaerobik şekilde S°'ü kullaedilmiş olan Thermus aquaticus (ekstrem derecede termostabil olan Taq DNA nabilmektedir. Aerobik şartlar altında organizma polimerazın kaynağı, ^ * ^ K ı s ı m 7.9) ile birlikte Sulfolobulus''un keşfi, genel S°'ü elektron vericisi olarak kullanmaktadır, O2'i olarak hipertermofilik mikrobiyoloji alanı ile ilgili çalışmaları başlattığı düşünülmektedir. Özellikle Sulfolobus 80°C'nin üzerinde üreyebildiği gösterilen ilk elektron alıcısı olarak kullanarak S°'ü H2SO4'e okprokaryottur. Thomas Brock bu kitabın ilk 7 basımının baş yazarıdır ve şimdi side eder. Anaerobik olarak Acidianus S°'ü elektron Madison VVisconsin Üniversitesinde emekli bir profesördür. 1980 den bu yana Almanya Regensburg Üniversitesinden Kari Stetter ve meslektaşları yeni cins alıcısı olarak kullanır (elektron vericisi olarak H 2 ve türleri keşfederek hipertermofilik mikrobiyoloji alanında büyük ilerlemeler kullanarak) ve indirgenmiş ürün olarak H2S oluşkaydetmişlerdir.
438 • Bölüm 13 • Prokaryotik Çeşitlilik: Archaea
• Şekil 13.17 Asidofilik hipertermofilik Archaea, Sulfolobales. (a) Sulfolobulus acidocaldarius'un ince kesit elektron mikrografı. (b) Acidianus infernus'nn ince kesit elektron mikrografı. Her iki, organizmanın çapı 0.8 ile 2 /im arasında değişmektedir.
turur. Dolayısıyla Acidianus kültürlerindeki S°'ün metabolik akibeti O2'nin varlığı veya yokluğuna bağlıdır. Sulfolobulus gibi Acidianus da yaklaşık olarak küresel şekildedir ancak loblu değildir (Şekil 13.17b). 65°C'den maksimum 95°C'e kadar olan sıcaklık derecelerinde üremektedir, optimum üreme sıcaklığı ise yaklaşık 90°C'dir. Thermoproteales Thermoproteales'in önemli cinsleri, Thermoproteus, Thermofilum ve Pyrobaculum'dur. Thermoproteus ve Thermofilum cinsleri nötral veya hafif asidik sıcak su kaynaklarında yaşayan çubuk şekilli hücrelerdir. Thermoproteus, 0.5 /j,m çapında, 1-2 yitm uzunluğundaki kısa hücrelerden (Şekil 13.18a •) 70-80 ^m uzunluğundaki flamentelere kadar değişen farklı uzunluklarda esnek olmayan çubuk şekilli hücrelerdir. Thermofilum flamentleri çok ince olup genişlikleri 0.17-0.35 /jnn olabilmekte ve uzunlukları 100 m'e kadar değişebilmektedir (Şekil 13.18b). Hem Thermoproteus hemde Thermofilum kesin olarak anaerobtur, bunlar S°-temelli anaerobik solunum yaparlar (Tablo 13.8). Hipertermofillerin büyük bir kısmından farklı olarak Thermoproteus ve Thermofilum 'un oksijen duyarlılığı oldukça yüksektir ve bu açıdan metanojenlere benzemektedirler (bakınız Kısım 13.4). Dolayısıyla kültürleri yapılırken sıkı tedbirler alınmak zorundadır. Thermoproteus izolatlarının çoğu, H 2 varlığında kemolitotrofik olarak veya maya özütü, küçük peptitler, nişasta, glukoz, etanol, mala t, fumarat veya forma t gibi kompleks karbon kaynaklarında kemoorganotrofik olarak üreyebilmektedir (bakınız Tablo 13.8). Thermoproteus ve Thermofilum benzer GC baz oranlarına (%56-58) sahiptir ancak nükleik asit hibridizasyon analizlerine (o°öKısım 11.11) göre genomları farklıdır.
(b)
• Şekil 13.18 Çubuk şekilli hipertermofilik Archaea, Thermoproteales. (a) Thermoproteus neutrophilus'un ince kesit elektron mikrografı. Bir hücre yaklaşık 0.25 /xm. çapındadır, (b) Thermofilum librum'un ince kesit transmisyon elektron mikrografı; bir hücre 0.5 X 3.5 fim ebatlanndadır.
13 10 • Denizaltı Volkanik Habitat Kaynaklı Hipertermofiller: Desulfurococcales • 439
Pyrobaculum (Şekil 13.18c) çubuk şekilli bir hipertermofildir. Thermoproteales ordosu içerisinde aerobik solunum yapan türlere sahip tek cinsttir. içerisinde tektir. Ayrıca Pyrobaculum kültürleri elektron alıcısı olarak NO3", Fe3+ veya S°'ü ve elektron vericisi olarak H2'i kullanarak anaerobik solunum yapabilmektedir (bu kemolitotrofik ve ototrofik üremedir). Pyrobaculum'un diğer türleri S°'ü H2S'e indirgeyerek organik elektron vericilerinde üreyebilmektedirler. Pyrobaculum'un optimum üreme sıcaklığı 100°C'dir ve bu organizmanın türleri hem hidrotermal akıntılardan hem de sıcak su kaynaklardan izole edilmişlerdir.
13.10
Denizaltı Volkanik Habitat Kaynaklı Hipertermofiller: Desulfurococcales
Anahtar cinsler: Pyrodictium, Pyrolobus, Ignicoccus, Staphylothermus
Şimdi, bilinen en termofilik Archaea'm yaşadığı denizaltı volkanik habitatlara döneceğiz. Bu habitatlar sığ termal kaynak sularını ve derin-deniz hidrotermal bacalarını içermektedir. Oldukça ilginç olan bu mikrobiyal habitatların jeolojisi Kısım 19.8'de ele alınmıştır. Burada tanımlanan organizmalar Archaea'm Desulfurococcales olarak adlandırılan ordo-seviyesindeki bir grubu içerisinde toplanmıştır (Tablo 13.9). Pyrodictium ve Pyrolobus Pyrodictium ve Pyrolobus 100°C'nin üzerindeki sıcaklıklarda optimum üreyen prokaryot örnekleridirler. Pyrodictium için optimum sıcaklık 105°C ve Pyrolobus için optimum sıcaklık 106°C'dir. Pyrodictium hücreleri düzensiz disk-şekillidir ve kültürlerinde elementel kükürt kristallerine tutunarak miselyum benzeri bir tabaka oluşturarak ürerler. Hücre yığını, her bir hücreye bağlı ipliklerin ağ oluşturmasıyla meydana gelmiştir (Şekil 13.19a, b»). İpliklerin içi boştur ve bakteriyal flagelladakine (c^öKısım 4.14) benzer bir tarzda düzenlenmiş proteinden meydana gelmiştir. Ancak, filamentler hareket olayına karışmazlar, bunun yerine tutunma organları olarak görev yaparlar (bakınız Şekil 13.22). Pyrodictium hücrelerinin duvarı glikoptoteinden meydana gelmiştir. Fizyolojik yönden Pyrodictium, kesin bir anaerobtur, elektron alıcısı olarak H2 ile S°'ü kullanarak kemolitotrofik veya elektron alıcısı olarak kompoleks organik bileşik karışımlarını kullanarak kemoorganotrofik üremektedirler (bakınız Tablo 13.8).
• Şekil 13.19 Optimum üreme sıcaklığı >100 C olan Desulfurococcales. (a) Pyrodictium oecultum'un (optimum üreme sıcaklığı 105°C), karanlık-alan mikrografı. (b) P. oecultum'un ince kesit elektron mikrografı. Hücrelerin çaplan 0.3'ten 2.5 fim'ye kadar değişmektedir, (c) Pyrolobus fumarii'nin ince kesiti, bilinen en termofilik prokaryot (optimum üreme sıcaklığı 106°C'dir); bir hücre yaklaşık 1.4 fim çapındadır.
440 • Bölüm 13 • Prokaryotik Çeşitlilik: ArcJiaea
Pyrolobus fumarii (Şekil 13.19c) özellikleri en iyi bilinen en termofilik prokaryot olma özelliğini sürdürmektedir. Maksimum üreme sıcaklığı 113°C'dir (Tablo 13.9). Pyrolobus "kara duman" olarak adlandırılan hidrotermal bacalarının duvarlarında yaşamaktadır (öaaKısım 19.8 ve Şekil 19.20), ototrofik özelliği ile bu inorganik çevreye organik karbon katkısında bulunmaktadır. 113°C'nin üzerinde üreyebildiği belirlenen diğer Pyrolobus türleri de izole edilmiştir. Bundan dolayı Pyrolobus cinsi bilinen en termofilik mikroorganizmaları içermektedir. Pyrolobus hücreleri kokkoid şekillidirler (Şekil 13.19c). Hücre duvarı proteinden meydana gelmiştir. Organizma, H 2 'nin yükseltgendiği ve NO3" (NH4+'e), S2O32" (H2S'e) veya çok düşük konsantrasyonlardaki O2'in (H2O'ya) indirgendiği reaksiyon çiftleri ile üreyen bir obligat H 2 kemolitotrofudur. Ekstrem termofilik özelliğinin yanı sıra Pyrolobus, maksimum üreme sıcaklığının üzerindeki sıcaklıklara da büyük ölçüde dayanıklıdır. Örneğin P. fumarii kültürü 1 h otoklavdan (121°C) sonra canlı kalabilmektedir, bu şartlara bakteri endosporu (eooKısım 4.13) dahi dayanamamaktadır. Desullurococcus ve Igaicoccus Desulfurococcales'in diğer önemli üyeleri ordoya adını veren Desulfurococcus (Şekil 13.20a) ve Ignicoccus'tur.
Desulfurococcus
bir bakteri
olan
Pyrodictium gibi S°'ü indirgeyen kesin bir anaerobtur, ancak Pyrodictium daha az termofilik olması, optimum olarak 85°C civarında üremesi ile Desulfurococcus'tan ayrılmaktadır. Ignicoccocus optimum 90°C'de üremektedir ve diğer pek çok hipertermofilik Archaea''da olduğu gibi H2/S°'e dayalı bir metabolizması vardır (Tablo 13.8). Ignicoccus (Şekil 13.20b) yeni bir hipertermofildir çünkü Bacteria'daki gibi bir dış membmna sahiptir (<3°&Kısım 4.9). Ignicoccus'un dış membranının farklı olmasının yanı sıra hücre stoplazmasmda da bazı farklılıklar bulunmaktadır. Bu farklılıklar oldukça geniş bir periplazm oluşmasını sağlamaktadır (Şekil 13.20b). Gerçekten Ignicoccus'un periplazm hacmi bazen kendi stoplazmasının 2-3 katı kadar olmaktadır, oysa gram-negatif Bacteria'da periplazmik hacim sitoplazmanın yaklaşık %25 katı kadardır. Ignicoccus'un periplazmında ayrıca membrana-bağlı veziküller (Şekil 13.20b) de bulunmaktadır, bu yapılar maddelerin hücre dışına çıkarılmasında görev yapıyor olabilirler. Ayrıca bazı Ignicoccus türleri bir sonraki kısımda anlatılacak olan küçük parazitik bir prokaryot olan Nanoarchaeum'a konak görevi yapmaktadır.
• Şekil 13.20 Kaynama noktasının altındaki sıcaklıklarda optimum üreyen Desulfurococcales örnekleri, (a) Desulfurococcus saccharovorans hücresinin ince kesiti; bir hücre 0.7 jiım çapındadır, (b) Ignicoccus islandicus hücresinin ince kesiti. Tüm hücre oldukça geniş bir periplazmla («3°OKısım 4.9) çevrilmiştir. Hücrenin kendisi yaklaşık lyiım çapındadır ancak periplazmla beraber çapı 1.4
Şekil 4.4b'yi karşılaştırınız). Staphylothermus çoğu hipertermofilik akrabaları gibi kemolitotrof değildir, optimum 92°C'de üreyen bir kemoorganotroftur. Enerji, peptitlerin fermentasyonundan elde edilmektedir, fermentasyon ürünleri olarak yağ asitleri, asetat ve izovalerat üretilmektedir (Tablo 13.8). Staphylothermus izolatları hem sığ deniz hidStaphylothermus rotermal bacaları hem de çok sıcak kara duman Desulfurococcales'in morfolojik olarak farklı bir bacalarından izole edilmişlerdir (e«oKısım 19.8). üyesi Staphylothremus cinsidir (Şekil 13.21 •). StaphDolayısıyla bu organizma denizaltındaki termal ylothermus hücreleri yaklaşık l/u,m çapında küre şealanlarda geniş yayılım göstermektedir ve bulunkillidir ve 100'e kadar hücrelerin bir araya geldiği dukları bu bölgelerde muhtemelen ölü organizmakümeler oluşturabilmektedirler. Bu özellikleri ile lardan kaynaklanan proteinlerin önemli bir tüketiStaphylococcus'a benzemektedirler (Şekil 13.21 ile cisi olmaktadır.
13.11 • Nanoarchaeum • 441
mektedir. Bu birliktelikten Ignicoccus'un herhangi bir fayda sağlayıp sağlamadığı bilinmemektedir. Nanoarchaeum hipertermofiliktir, optimum üreme sıcaklığı yaklaşık 90°C'dir. Nanoarchaeum'un metabolizması bilinmemektedir fakat konağı H 2 'i elektron vericisi ve elementel kükürtü elektron alıcısı olarak kullanarak üreyen bir ototroftur. Nanoarchaeum izolatları hem denizaltı hidrotermal bacalarından hemde karasal sıcak su kaynaklardan izole edilmişlerdir. Nanoarchaeum'un dünyadaki uygun sıcak habitatlarda yayıldığı düşünülmektedir. Sadece bir türü bilinmektedir, N. equitans. Nanoarchaeum'un Genomiği ve Filogenisi • Şekil 13.21 Hipertermofil Slaphylothremus marinus (optimum üreme sıcaklığı 92 C). Gölgelenmiş hücrelerin elektron mikrografi. Bir hücre yaklaşık l/xm çapındadır.
Nanoarchaeota Archaea içerisinde diğer şubelerden farklı derin bir soyu temsil etmektedir (Şekil 13.1). Nanoarchaeota'nm filogenetik yerini tam olarak belirlemede bazı zorluklar ile karşılaşılmıştır, çünkü 13.8 - 13.10 Kavramların Gözden Geçirilmesi grubun 16S ribozomal RNA'sı oldukça farklıdır. Nanoarchaeum 16S rRNA'sı çok sayıda yer değişikHipertermofilik Crenarchaeota yaşamın sürdüğü, bilinen liği içermektedir, hatta diğer Archaea şubeleri araen sıcak habitatlarda yaşamaktadır. Bu organizmaların sında yüksek oranda korunmuş bölgelerde dahi soğukta-yaşayan filogenetik akrabaları da bilinmektedir. bu değişiklikleri içermektedir. Gerçekte Archaea'm Crenarchaeota'da çok değişik morfolojik tipler bilinmekbilinen tüm türlerinden 16S rRNA genlerini çoğalttedir ve gelişmeleri için bazı farklı metabolik stratejiler mak için (PCR kullanarak) kullanılan oligonüklekullanmaktadırlar. otit primerleri Nanoarchaeum genlerini çoğaltmada • Sulfolobus ve Pyrolobus arasındaki temel farklılıklar nebaşarısız olmuştur. lerdir? Staphylothermus ve Ignicoccus arasındaki temel farklılıklar nelerdir? Nanoarchaeum genomu sadece 0.49 Mbp dir. Bu bilinen herhangi bir hücredeki en küçük genom• Elementel kükürt (S°) ile ilgili olarak Acidianus'un farklı dur. Şaşırtıcı bir şekilde Nanoarchaeum genomu olan metabolik özelliği nedir? amino asitler, nükleotitler ve koenzimlerin biyosen• H 2 'i elektron vericisi olarak kullanan organizmaların tezini kapsayan metabolik fonksiyonlarda rol alan hangi enerji sınıflarını, ne olarak adlandırıyoruz? H 2 'i kullanabilen Crenarchaeota cinslerinin listesi ve kulgenleri içermemektedir. Ayrıca Nanoarchaeum'un landıkları elektron alıcıları nelerdir. genomunda glikoliz gibi katabolik metabolik yollarda görevli proteinleri kodlayan genler eksiktir. Muhtemelen bu fonksiyonların tümü NaŞUBE naoarchaeum için konağı Ignicoccus tarafından NANOARCHAEOTA yerine getirilmektedir. Nanoarchaeum ÂTPaz Küçük parazitik hücreler olan Nanoarchaeota'yı ((«sKısım 5.12) için gerekli bazı gerileri (ancak içeren Archaea'm tek şubesidir. Bu etkileyici protümünü değil) içermektedir. Bu yüzden orgakaryotlar bilinen en küçük genomu içeren prokarnizmanın fonksiyonel bir ATPaz'a sahip olup yot olmaları gibi bazı sürprizlere sahiptirler. olmadığı bilinmemektedir. Eğer ATPaz'a sahip
-m
IV
Nanoarchaeum .
Nanoarchaeum parazit olarak veya muhtemelen Crenarchaeot Ignicoccus'un (bakınız Kısım 13.10) simbiyontu olarak yaşayan oldukça küçük kokkoid hücreli bir cinstir. Nanoarchaeum hücreleri yaklaşık 0.4 fim çapındadır ve Escherichia coli hücresi hacminin yaklaşık %1'i oranında bir hacme sahiptir. Nanoarchaeum hücreleri sadece Ignicoccus hücrelerinin yüzeyine tutundukları zaman replike olurlar. Bir Ignicoccus hücresi başına tek, çift veya 10 yada daha fazla Nanoarchaeum hücresi bulunabilmektedir (Şekil 13.22fl«). Nanoarchaeum'un hücre duvarı S-tabakasmdan oluşmaktadır (^°^Kısım 4.10) ve duvar periplazmik boşluk olarak görünen yapının üzerini kaplamaktadır (Şekil 13.22b). Nanoarchaeum saf kültür halinde üreyemez ancak konak olarak Ignicoccus ile birlikte üreyebil-
.
•
•
•
:
• Şekil 13.22 Nanoarchaeum. (a) Ignicoccus (yeşil) hücrelerine tutunmuş Nanorachaeum (kırmızı) hücrelerinin floresan mikrografı. Hücreler her bir organizmayı hedef alan özel nükleik asit problan kullanılarak FISH ile boyanmıştır (i^OaKısım 11.7). (b) Bir Nanoarchaeum hücresinin geçirmeli ince kesit elektron mikrografı. Farklı hücre duvarına dikkat ediniz. Nanoarchaeum hücreleri yaklaşık 0.4 fim çapındadır.
442 • Bölüm 13 • Prokaryotih Çeşitlilik: Archaea
değilse ve substrat-düzeyinde fosforilasyon olanaksızsa, bu takdirde Nanoarchaeum muhtemelen konağı Ignicoccus'un hem enerji hemde karbon parazitidir. Nanoarchaeum genellikle ihtiyaç duyduğu çoğu metabolitler yönünden Ignicoccus'a parazittir, tıpkı Rickettsia ve Chlamydia'nm insan konaklarını aynı amaçla enfekte etmesi gibi (eosKısım 12.13, 12.27, 26.13 ve27.3). Genlerinin büyük bir kısmı kayıp olduğundan dolayı Nanoarchaeum''da acaba hangi genler bulunmaktadır? Nanoarchaeum "temel" moleküler işlemler (DNA replikasyonu, transkripsiyon ve translasyon) için ihtiyaç duyulan önemli enzimlere ait genlerin tümünü içermektedir. Genomu büyük ölçüde azaltılmış olmasına rağmen, Nanoarchaeum moleküler biyolojinin santral dogmasını (DNA-»RNA—»protein) yerine getirmek için gerekli genleri atmamıştır (gerçekte bunu yapamaz, çünkü bir hücredir). Genomunun küçük kapasiteli olmasının yanı sıra Nanoarchaeum bilinen tüm organizmalar arasındaki en kompakt genoma da (gen yoğunluğu) sahiptir. Nanoarchaeum'un tek halkasal kromozomunun %95'den fazlası proteinleri kodlamaktadır. Evrim ve Nanoarchaeum Nanoarchaeum prokaryotların evriminde nerede yer almaktadır? Organizma Archaea ağacında dipte yer almaktadır (Şekil 13.1). Bu durum Nanoarchaeum'un bilinen Archaea'dan daha önce ortaya çıktığını göstermektedir. Bununla birlikte Nanoarchaeum daima bir parazitmiydi? Muhtemelen değildi, çünkü bu Nanoarchaeum'un, parazit olmadan önce serbest yaşayan bir konaktan türevlendiği anlamına gelmektedir. Nanoarchaeum'un atasının serbest yaşayan bir prokaryot olup olmadığına bakmaksızın, bugün onun oldukça küçük olan hücre ve genom büyüklüğüne şaşırmaktayız. Açıktırki Nanoarchaeum hem hücre hacmi hemde genetik kapasite açısından canlılığın sınırlarında veya sınırlarına yakın yaşamaktadır. Gerçekte Nanoarchaeum''dan daha az gen içeren kendi kendine replike olan yapılar olarak sadece virüsler bilinmektedir, tabiki virüsler hücre değildir. Şu anda Nanoarchaeum'un evrimi için en iyi senaryo, onun parazitik yaşam tarzını kullanmak için arkeal soyda erkenden ayrılan bir hipertermofil olduğudur. Serbest-yaşayan Nanoarchaeota bilinmemektedir ve dolayısıyla aksi görülmediği sürece parazitizm, bugün anladığımız şekliyle bu şubenin ayırıcı bir özelliği olarak kabul edilecektir. 13.11 Kavramların Gözden Geçirilmesi Nanoarchaeum küçük, parazitik, Archaea'm erkendallanmış bir üyesidir. Bilinen organizmalarda bulunan en küçük genoma sahiptir. Nanoarchaeum temel moleküler işlemler hariç diğer tüm genlerden yoksundur ve dolayısıyla çoğu hücresel ihtiyaçları yönünden konağı Ignicoccus'a bağımlıdır. • Nanoarchaeum'u özellikle evrimsel perspektif açısından ilginç kılan durum hangisidir? •
Nanoarchaeum'un bir hipertermofil olduğunu nasıl anlıyoruz?
YÜKSEK SICAKLIK DERECELERİNDE YAŞAM VE EVRİM Hipertermofilik arkeler diğer prokaryotların üredikleri sıcaklık derecelerinden çok daha yüksek sıcaklıklarda üremektedirler. Bu ekstrem sıcaklık toleransının mekanizması nedir? Yaşamın mümkün olmadığı sıcaklık limitleri varmıdır? Bu soruların cevapları bize dünyanın erken tarihi ile ilgili ip uçları verecektir.
13.12
Biyomoleküllerin Sıcaklık Stabilitesi
Hipertermofillerdeki protein ve DNA stabilitesi yüksek sıcaklıklarda yaşayabilmek açısından önemlidir. Proteinlerin büyük bir kısmı yüksek sıcaklıklarda denatüre olurlar, bu yüzden termostabil proteinlerin özelliklerini tanımlamak için çok sayıda araştırma yapılmıştır. Protein termostabilitesini anlaşılmasında gözler molekülün katlanmasına çevrilmiştir. Nükleik asitlerin stabilitesi üzerinde de sıcaklığın etkisi bulunmaktadır ve DNA'larmı korumak için hipertermofillerde özel yöntemler evrimleşmiştir. Protein Katlanması ve Termostabilitesi
Hipertermofillerdeki termostabil proteinlerin amino asit kompozisyonları özellikle farklılık göstermemektedir. Gerçekte hipertermofillerdeki enzimler primer ve daha üst yapısal düzenlenmeleri (cBöKısım 3.6-3.8) yönünden mezofilik bakterilerin ısıya karşı kararsız benzerleriyle genellikle aynı temel yapısal özelliklere sahiptirler. Bununla birlikte termostabil proteinlerde termostabiliteyi arttıran bazı ilave özellikler bulunmaktadır. Bunlar proteinin açılma eğilimini azaltan yüksek hidrofobik merkezler ve proteini bir arada tutmaya yardımcı olan ve açılmasına engel olan protein yüzeyinde çok sayıda bulunan iyonik etkileşimlerdir. Sonuç olarak, proteinin sıcaklık direncini en fazla etkileyen faktör proteinin kendi katlanmasıdır. Amino asit dizisindeki küçük değişiklikler bile genellikle bir molekülün belirli bir kısmındaki katlanmayı değiştirmek için yeterli olmaktadır, buda o molekülün sıcaklığa dayanıklı olması veya sıcaklığa duyarlı olması için yeterlidir. Şaperoninler: Proteinlerin Doğal Yapılarında Kalmalarına Yardım Eden Proteinler
Bölüm 7'de (kısmen) denatüre olmuş proteinlerin tekrar katlanmasında görev yapan ve şaperoninler (ısı-şok proteinleri, <3oç>Kısım 7.17) olarak adlandırılan bir grup protein hakkında bilgi verilmiştir. Hipertermofilik prokaryotlar tipik olarak sadece çok yüksek sıcaklık derecelerinde görev yapan özel şaperonin grupları üretirler. Örneğin Pyrodictium hücrelerindeki (Şekil 13.23») başlıca şaperonin, termozom olarak adlandırılan bir protein kompleksidir. Bu kompleks hücrenin diğer proteinlerinin yüksek sıcaklıklarda doğru bir şekilde katlanmalarını ve görevlerini sürdürmelerini sağlamaktadır.
13 12 • Biyomoleküllerin Sıcaklık Stabilitesi • 443
süpersarmal hale getirir (tüm hipertermofilik olmayan prokaryotlarda bulunan ve DNA'yı negatif süpersarmal haline getiren DNA girazın tersi öc^Kısım 7.3). Pozitif süpersarmal yapı DNA'yı sıcaklığa karşı büyük oranda stabilize eder ve DNA heliksinin etkili bir şekilde denatürasyona maruz kalmasını engeller. Optimum üremeleri yaklaşık 80°C'nin altında olan herhangi bir organizmada ters girazm bulunmaması, yüksek sıcaklık derecelerinde bu enzimin DNA stabilitesindeki önemini gösteren iyi bir kanıt olmaktadır. DNA Stabilitesi: DNA'ya-Bağlanan • Şekil 13.23 Pyrodictium abyssfnin taramalı elektron mikrografı. Pyrodictium, yüksek sıcaklıklardaki makromoleküler stabilite yönünden bir model olarak çalışılmıştır. Hücreler, onlan birbirlerine bağlayan yapışkan bir glikomatriks ağla sarılmışlardır.
Ayrıca termozom maksimum üreme sıcaklıklığmm üzerindeki sıcaklık derecelerinde bile hücrelerin canlılığını sürdürmesine yardımcı olabilmektedir. Örneğin Pyrodictium hücreleri maksimum üreme sıcaklığına (110°C) yakın derecelerde ürediklerinde yüksek miktarlarda termozom proteini üretirler. Bundan dolayı hücreler bunu takip eden bir ısı şokunda hatta bir saat otoklavda (121°C) dahi canlı kalabilmektedir. Böyle bir sıcaklık uygulamasına maruz bırakıldıktan sonra optimum sıcaklığa geri dönülerek yapılan denemelerde, sıcaklığa oldukça dirençli olan termozom, Pyrodictium'un tekrar üreme ve bölünmesini başlatacak denatüre olmuş yeterli miktardaki önemli proteini yeniden katlar. Böylece, şaperonin aktivitesi sayesinde pek çok hipertermofilin ürediği üst sıcaklık sınırı, bunların canlılıklarını sürdürebildikleri üst sıcaklık sınırlarından
daha düşük olmaktadır. Bu "güvenlik ağı" maksimum üreme sıcaklıklarının üzerindeki sıcaklıklara kısa süreyle maruz kalan hücrelerin ölmemesi için muhtemelen bir sigorta görevi görmektedir. Yüksek Sıcaklıklarda DNA'nın Stabilitesi: Çözünür Maddeler ve Ters Giraz
DNA yüksek sıcaklıklarda yapısı bozulmadan ve erimeden nasıl kalmaktadır? Bu olaya çeşitli mekanizmalar karışmaktadır. Bu mekanizmalardan biri hücresel çözünür madde miktarlarının arttırılmasıdır. Örneğin daha önce belirtildiği gibi Methanopyrus gibi hipertermofilik metanojenlerin stoplazmalarmda (bakınız Kısım 13.6) molar düzeylerde potasyum siklik 2,3-difosfogliserat bulunmaktadır. Bu madde DNA'da yüksek sıcaklıklarda meydana gelen depurinasyon veya depirimidizasyon (glikozidik bağın hidrolizi sonucu bir nükleotit bazının kaybı) gibi kimyasal hasarı önlemektedir. Bu kimyasal değişim mutasyona (cs^oKısım 10.2) neden olabilir. Tüm hipertermofiller bu maddeyi üretmediğinden dolayı, diğer DNA-stabilizasyon mekanizmaları da mevcuttur. Sadece hipertermofillerde bulunduğu düşünülen özel bir protein, bu prokaryotların DNA'nın erimemesinin başlıca nedenidir. Tüm hipertermofiller ters DNA giraz olarak adlandırılan bir DNA topoizomeraz üretirler. Ters giraz DNA'yı pozitif
Proteinler
Hipertermofillerde DNA giraz ve tuzların yanı sıra, diğer proteinler de DNA dupleksi bütünlüğünün sürdürülmesinde görev yapabilmektedirler. Örneğin Sulfolobulus hücrelerinde DNA'ya-bağlanan küçük bir ısı-stabil protein DNA'nın minör oluklarına (öo^Şekil 7.5) spesifik olmayan bir şekilde bağlanmakta ve DNA'nın erime sıcaklığını 40°C kadar arttırmaktadır. sac7d olarak adlandırılan bu protein DNA'ya güçlü bir şekilde bağlanarak gen regülasyonunda (öOaDNA'nın bükülmesi, Kısım 8.4) görev alabilmektedir. Euryarchaeota türleri de DNA'ya bağlanan proteinler içermektedirler. Fakat Sac7d'nin aksine bunlar oldukça bazik proteinlerdir ve Eukarya'm histon proteinleriyle yüksek oranda amino asit dizi benzerliği ve katlanma özelliği göstermektedirler. Bu archaeal histonlar özellikle hipertermofilik metanojen Methanothermus fervidus'ta çok çalışılmıştır.
Bu organizmadaki histonlar nükleozom benzeri yapılar oluşturarak DNA'yı kompakt ve bükülü hale getirir (Şekil 13.24») (oooKısım 7.3). Bu yapıların çok yüksek sıcaklıklarda DNA'nın çift-zincirli yapıda kalmasını sağladıkları gösterilmiştir. Arkeal histonlar Halobacterium gibi ekstrem halofilik Archaea dahil olmak üzere Euryarchaeota'ın büyük bir kısmında bulunmuştur. Ancak ekstrem halofiller termofil olmadıkları için arkeal histonlar DNA stabilitesine yardımın yanı sıra gen ifadesinin düzenlenmesi gibi diğer fonksiyonlara da sahip olabilmektedirler.
" < ? - • • / • '
• * ' .
-•'•••
" \ .
• Şekil 13.24 Arkeal histonlar ve nükleozomlar. Arkeal histon Hmf (hipertermofilik metanojen Methanothermus fervidus'dan gelmektedir, bakınız Şekil 13.8c) kopyalarının etrafım saran düz plazmit DNA'lanmn oluşturduğu, dairesel görünümlü, koyu boyanmış nükleozomlann (oklar) elektron mikrografı. Bu mikrografı Şekil 7.9'da verilen Eukarya'm nükleozom ve histonlannm çizildiği resim ile karşılaştırınız.
444 • Bölüm 13 • Prokaryotik Çeşitlilik: ArcJıaca
Lipit Stabilitesi
rurlar (ö^Şekil 19.19). Pyrodictium, Methanopyrus ve Pyrolubus'un dahil olduğu bazı hipertermofiller kara duman bacalarının duvarından izole edilmişleridir. Duvarın iç kısmında 250°C'den 350°C'ye kadar, dış kısmında ise 2°C'e kadar değişen bir sıcaklık derecelenmesi bulunmaktadır ve muhtemelen organizmalar optimum sıcaklıklarına en yakın duvar bölgelerinde yer almaktadır. Süperısınan sularla ilgili çalışmalar suyun steril olduğunu göstermiştir, bu da böyle yüksek sıcaklıklarda hem küçük moleküllerin hem de makromoleküllerin anında yıkılabildiğini gösteren sonuçlarla paralellik göstermektedir. Biyomoleküllerin stabilitesi ile ilgili laboratuvar denemeleri sonucunda bildiğimiz kadarıyla canlılığın üst sıcaklık sınırı derecesi büyük olasıkMonomerlerin Stabilitesi la 140-150°C'dir. Bunun üzerindeki sıcaklıklarda, Makromoleküllerin stabilitesinin yanı sıra monomerle- organizmalar temel yaşamsal biyomoleküllerinin rin termal değişkenliği de hipertermof illerin ürediksıcaklık değişkenliğinin üstesinden gelemeyebilirleri üst sıcaklık sınırlarının belirlenmesinde önemli ler. Örneğin ATP 150°C 'de hemen yıkılmaktadır. bir faktör olmaktadır. Makromoleküllerin ne kadar Dolayısıyla eğer organizmalar 150°C gibi yüksek bir stabil olduğu önemli değildir çünkü, temel yapı sıcaklıkta üreyebiliyorsa, bunların enerji ekonomiletaşları stabil olmadığı zaman yaşam da mümkün rinin kesinlikle ATP dışında başka bir şeye dayalı ololmayacaktır, ilginç olan, gerçekte yaşam için üst ması gerekir. Bu evrimin üstesinden gelemediği bir sıcaklığı makromoleküllerden daha çok küçük moolgumudur? Kesin olarak bir şey söylemek için çok leküllerin termal değişkenliğinin belirlemesidir. erkendir. Ancak, birgün 150°C ve üzerinde üreyebi120°C kadar "düşük" sıcaklıklarda dahi bazı len "süper" hipertermofiller keşfedilirlerse, biyoloji önemli küçük moleküller büyük ölçüde yıkılve biyokimyada yeni temel prensiplerin ortaya çıkamaktadır. Örneğin enerji metabolizmasındaki iki cağı açıktır. önemli molekül olan ATP ve NAD+ (cio&Bölüm 5) bu sıcaklıklarda hızla hidroliz olurlar. ÖrneHipertermofilik Archaea, H2 ve ğin ATP veya NAD+'nin in vitro yanlanma süresi 13.13 Mikrobiyal Evrim 120°C'de 30 dakikadan daha azdır ve bu derecenin üzerindeki sıcaklıklarda yarılanma ömrü çok daha Neden Archaea'm çoğu ekstrem ortamlarda yaşayüksek oranlarda azalma göstermektedir. (Not: Bu maktadır? Ekstrem olmayan habitatlarda yapılan değerler suda yapılan ölçümlerle belirlenmiştir. moleküler problama sonucunda Archaea'm çevreDolayısıyla stoplazmada bu moleküllerin stabilitemizdeki tüm ortamlarda (ve hatta içimizde kaim si halen keşfedilmemiş sıcaklık koruyucu ajanlarbağırsağımızdaki metanojenler gibi) bulundukları dan dolayı sudaki değerlere göre çok daha yüksek gösterilmiştir ancak, burda önemli olan konu külolabilir.) Dolayısıyla yaşam için üst sıcaklık sınırı türü yapılan Archaea'm ekstrem ortamlara yaptıkları 120°C'midir? Hücredeki küçük moleküllerin stabiadaptasyonlardır. İzolasyonu zor olan deniz ve toprak lite problemi olmasına rağmen, yaşam için üst sıArchaea'nm da kültürleri yapılıncaya kadar, ekstrecaklık sınırı muhtemelen 120°C'nin üzerindedir. mofilinin bir Archaea özelliği olduğu söylenemez. Ancak tüm Archaea'nm, ekstrem organizmalar olduMikrobiyal Yaşamın Sıcaklık Sınırlan ğunu kabul ettiğimiz taktirde bu durum bize genel olarak dünya ve evrim hakkında ne ifade edecektir? Bildiğimiz kadarıyla yaşam suya bağımlı olduğu Çeşitli tipteki aşırı ekstrem ortamlar günümüzde için, 100°C'den daha sıcak habitatlar sadece deniz olduğu gibi dünyanın erken zamanlarında da buluntabanı gibi basınç altındaki yerlerde bulunmaktamaktaydı ve yaşam ilk olarak böyle ortamlarda meydır. Gerçekten, 100°C'nin üzerinde üreyebilen tüm dana gelmiş olabilir. Hücresel yaşamın evrimleştiği hipertermofilik Archaea'm yaşamları bu süperısıyaklaşık 4 milyar yıl önceki zamanlarda, neredeyse nan (Tablo 13.9) ortamlarla sınırlıdır. Böyle ortamkesin olarak dünya bugünkünden çok daha sıcaktı lar nasıl olur ve yaşam nasıl gerçekleşir? 121°C'de (ooöKısım 11.1) ve muhtemelen sadece hipertermoüreyebilen yeni bir Pyrodictium türü olduğuna dair filler için uygundu. Dolayısıyla, mevcut hipertermobazı kanıtlar bulunmaktadır. Dolayısıla Pyrolobus filler dünyadaki ilk yaşam formlarının kalmtılarımıfumarii'nin geliştiği üst sıcaklık sınırı (113°C) yadır? Archaea'm filogenetik ağacının hipertermofiller şam için üst sıcaklık derecesi olmamaktadır. hakkında bize neler anlattığına bakalım. Derin-deniz hidrotermal kara duman bacaları, süperısman doğal ortamlar ve bu ortamların mikrofloraları için bir model oluşturmaktadır. Kara Hipertermofiller ve Onların Yavaş Evrimsel duman bacaları 250-350°C'de hidrotermal sıvı çıKronometreleri karırlar ve sıvıdaki metal sülfitlerden dolayı baca Hipertermofilik Archaea'm rRNA genlerinin moolarak adlandırılan dikey metalik yapılar oluştuleküler dizilemeleri, bu organizmaların diğerleHücresel lipitlerin stabilitesi nasıl sağlanır? Hipertermofiller yüksek sıcaklıklarda membranlarmın parçalanmasını nasıl önlerler? Neredeyse tüm hipertermofiller dibifitanil tetraeter modeli üzerine inşa edilmiş lipitler üretirler (cccKısım 4.5 bu lipitlerin yapısı için). Dibifitanil tetraeter lipitler doğal olarak sıcaklığa dirençlidirler çünkü fitanil üniteleri arasındaki kovalent bağ normal çift tabakalı lipit yerine tek tabakalı bir lipit membran yapısı oluşturmaktadırlar (cs^Şekil 4.19). Kovalent bağlarla desteklenen bu yapı, yağ asitlerinden oluşmuş çift tabakalı lipit'in parçalanma eğiliminde olduğu sıcaklık derecelerine karşı direnç göstermektedir.
13 13 • Hipertermofilik Archaea, H2 ve Mikrobiyal Evrim • 445
rine oranla daha yavaş evrimleştiklerini ortaya koymaktadır (Şekil 13.1). Aynı durum Thermotoga ve Aquifex gibi hipertermofilik Bacteria için de söylenebilir (Şekil 12.1). Bu sonuç evrimsel ağaçların incelenmesi neticesinde ortaya çıkmaktadır— hipertermofiller tipik olarak daha kısa ve köke yakın dallanmaktadırlar (<3°oŞekil 12.1 ve 13.1). Termal habitatlarm kendileri neden hipertermofillerin böyle yavaş evrimsel saatlere sahip olduklarını açıklayabilirler. Çok yüksek sıcaklıklarda yaşayan organizmalar yaşamları için gerekli olan özellikleri devam ettirme yönünden güçlü baskılar altında olabilirler. Spontan mutasyonlar sonucu bir proteinin amino asit dizisinde meydana gelen herhangi bir değişim o proteinin sıcaklık stabilitesini azaltmayan bir değişiklik olmalıdır. Eğer mutasyon sıcaklık stabilitesini düşürürse, bu tamamen öldürücü olabilir. Ekstrem olmayan ortamlarda yaşayan organizmalar açısından bu tür baskılar, bu organizmaların proteinlerinin farklılaşmasında önemli bir kontrol edici faktör olmamaktadır. Diğer bir deyişle belirli bir noktadan sonra hipertermofillerin yaşaması fazladan bir evrimsel değişim getirmeyebilir, çünkü, uyumlarını arttırmak için yapılacak girişimler, bütün hücresel moleküllerin sıcaklıkta stabil kalma gereksinimi ile dengelenmelidir. Eğer yaşam, birçok evrimsel senaryanun da ön gördüğü gibi dünya sıcakken meydana gelmişse o zaman hipertermofilik Archaea ve Bacteria günümüzde kalan erken yaşam formlarının yaşayan en yakın akrabalarıdır. Bundan dolayı hipertermofillerin biyolojisi sadece ilginç olmakla kalmayıp, aynı zamanda geçmişe bir pencere de açmaktadır. İlkel Bir Enerji Kaynağı Olarak Hidrojen (H2)
Bu bölümü bitirmeden önce erken yaşam formlarının biyolojisi ile ilgili son ipuçlarını belirtmek zorundayız. Hipertermofilik prokaryotların özellikle en yüksek sıcaklık derecelerinde üreyenlerin metabolik mekanizmalarında H2 metabolizmasının ne kadar sık yer aldığı dikkat çekicidir (Şekil 13.25»). Hipertermofillerin büyük bir kısmı elektron vericisi olarak H2'i ve S°, NO3', Fe3+ veya O2 gibi bir ya da daha fazla sayıdaki elektron alıcısını kullanarak anaerobik olarak üremektedirler (bakınız Tablo 13.8). H metabolizması muhtemelen eski meta-
bolik mekanizmanın fizyolojik bir kalıntısıdır. Bu mekanizmalar ilkel organizmalarda evrimleşmiştir, çünkü başlangıçta ortamda uygun inorganik elektron alıcıları ve H 2 hazır kullanalıbilir durumdaydı ve ayrıca H2'nin katabolizması biyokimyasal olarak oldukça basit bir işlemdir (ö^Şekil 11.6). Şekil 13.25, biyolojideki üç enerji korunumu işleminden birini gerçekleştiren prokaryotların üremesi için bilinen üst sıcaklık derecelerinin sınırlarını göstermektedir. Sıcaklığa duyarlılığın en fazla fotosentezde olduğu açıkça görülmektedir ve bunun fotofosforilasyon (^a^Şekil 17.15) aşamasına karışan büyük çoklu-protein komplekslerinin stabil kalmamasından kaynaklandığı düşünülmektedir. Kemoorganotrofi 110°C'ye kadar olan sıcaklık derecelerinde meydana gelmektedir, çünkü bu derece hem H 2 ile S°'ü elektron alıcısı olarak kullanarak kemolitotrofik üreyebilen hemde bazı organik bileşikleri fermente edebilen Pyrodictium occultum'un ürediği üst sıcaklık sınırıdır (Tablo 13.9). 110°C'nin üzerinde sadece H2-yükseltgeyen Archaea bilinmektedir. Bunlar H 2 oksidasyonu ve Fe3+ redüksiyonu çiftini kullanan Pyrolobus cinsi ve bir Pyrodictium türüdür (Tablo 13.9 ve Şekil 13.25). Hidrotermal baca örneklerinden 120°C'nin üzerindeki sularda Archaea'm mevcut olduğunu gösteren kanıtlar bulunmasına rağmen bu organizmaların henüz kültürleri yapılamamıştır. Günümüzdeki H2 okside eden hipertermofilik Archaea ve Bacteria, (<3«5Kısım 12.5 ve 12.37) çeşitliliği H 2 oksidasyonu evrimininin metabolik bir başarı olduğunu göstermektedir. Gerçekte parazitik Nanoarchaeum (bakınız Kısım 13.11) metabolizması hakkında çok az bilgimizin olmasına rağmen, laboratuvar kültürlerinde H2'nin bu organizmanın üremesini teşvik ettiği bilinmektedir. Nanoarchaeum genetik olarak tüm prokaryotların en basit organizması olabilirini? H 2 'nin prokaryotların çok sayıdaki farklı fizyolojik grupları tarafından kullanılması (hatta dünyanın en derininde yaşayanlar dahil) (cfi&Kısım 19.4) bu enerji kaynağının eski olduğunu göstermektedir. Hem pekçok ekstrem hipertermofilin habitatı olan hidrotermal bacalarının ve hem de dünyanın sıcak, derin alt yüzey alanlarının canlılığın ilk ortaya çıktığı ortamlar olduğu ileri sürülmektedir. Bu ortamlar H 2 içerirler ve diğer inorganik elektron S° veya Fe2+
Termofilik Kemolitotrofi 95"
Termofilik Kemoorganotrofi Termofilik Fototrofi
i
73° 40
50
60
70
80 Sıcakhk(-C)
90
100
110
120
130
• Şekil 13.25 Enerji metabolizması için üst sıcaklık sınırlan. Fototrofi, Synechococcus lividus (Bacteria, siyanobakteriler); Kemoorganotrofi, Pyrodictium occultum (Archaea); kemolitotrofi- S° elektron vericisi, Acidianus infernus (Archaea); kemolitotrofi-Fe2+ elektron vericisi, Ferroglobus placidus (Archaea); kemolitotrofi-H2 elektron vericisi, Pyrolobus fumarii (Archaea, 113°C); Pyrodictium sp., suş 121 (Archaea, 121°C). Suş 121 aynca format varlığında da üremektedir fakat bu bileşik H 2 +CO 2 aracılığıyla metabolize edilebilmektedir.
446 • Bölüm 13 • Prokaryotik Çeşitlilik: Archaea
verici ve alıcılarının bol bulunduğu ortamlardır. Bunlar aynı zamanda UV radyasyonuna maruz kalmamaktadırlar. Eğer bu hipotez doğru ise Bölüm 12 ve burda tartışılan hidrojen-okside eden hipertermofiller muhtemelen dünyanın en eski biyolojisinin kalıntılarıdırlar.
muhtemelen 140-150°C'dir. Hidrojen (H2) katabolizması, hücrelerin ilk enerji üreten mekanizmasıdır.
13.12-13.13 Kavramların Gözden Geçirilmesi Hipertermofiller çok yüksek sıcaklıklarda ve hatta suyun kaynama noktasından da yüksek sıcaklıklarda yaşayabilmelerine rağmen, canlı organizmaların yaşayamayacakları sıcaklık sınırları bulunmaktadır. Bu sınır
•
Hipertermofiller protein ve DNA gibi önemli moleküllerini bozulmadan nasıl korurlar?
•
Yaşamın niçin bir bir üst sınırının bulunması gerektiği ile ilgili olarak en az iki neden belirtiniz.
•
Mevcut hipertermofillerin eski organizmalara çok yakm olduklarını ileri süren fizyolojik ve filogenetik kanıtlar nelerdir?
DEĞERLENDİRME SORULARI 1.
Tüm Archaea''da ortak olan bazı özellikler nelerdir?
2.
Pyrodictium, Thermoplasma veya Methanosarcina organizmaları arasından hangisi ekstrem halofil Halobacterium'a en yakın akrabadır. (İpucu: Cevabı Şekil 13.1'dedir). Her üç organizmanın sahip olduğu enerji metabolizması formu nedir (<3°c>Kısım 13.1 ve 13.2)?
7. Methanobacterium gibi diğer metanojenlerle karşılaştırıldığında Methanopyrus'a özgün olan fizyolojik özellik nedir? (ööoKısım 13.6)? Archaeoglobulus'a özgün olan fizyolojik özellik nedir? (öö&Kısım 13.7)? 8.
Escherichia coli gibi organizmaların yaşayamadığı yüksek tuzlu ortamlarda Halobacterium gibi organizmalar nasıl yaşayabilmektedir. (02oKısıml3.3)?
Crenarchaeota'da hangi enerji metabolizması formları bulunmaktadır? Hangi enerji metabolizması formu bulunmamaktadır (ö^Kısım 13.8)?
9.
Mikrobiyoloji alanında tarihsel açıdan Sulfolobus neden ilgi çekmektedir (c^oKısım 13.9)?
4.
Halobacterium salinarum'daki alıcı rodopsin, halorodopsin ve bakteriorodopsin'in görevlerini karşılaştırınız (oooKısım 13.3).
10. Pyrolobus fumarii'yi (oo&Kısım 13.10)?
5.
CO2/in CH 4 'e indirgendiği metanojenezte elektron vericisi nedir («3°öKısıml3.4)?
6.
Thermoplasmatales'in tüm üyelerini bir araya getiren ayırıcı temel fizyolojik özelliklerden biri nedir? Neden bu özellik onlardan bazılarının maden atıklarında başarılı bir şekilde kolonize olmalarına imkan vermektedir (cs^Kısım 13.5 ve Kısım 19.14 ve 19.15)?
3.
ilginç
kılan
özellik
nedir
11. Nanoarchaeum diğer Archaea'a hangi yönlerden benzemektedir? Hangi yönlerden benzememektedir (osa&Kısım 13.11)? 12. Ters giraz nedir ve hipertermofiller için neden önemlidir (««öKisim 13.12)?
UYGULAMA SORULARI 1. 2.
Şekil 13.1'deki verileri bir rehber gibi kullanarak, bakteriorodopsinin neden geç bir evrimsel özellik olabileceğini tartışınız. Aşağıdaki cümlenin doğruluğunu veya yanlışlığını kanıtlayınız: Yaşamın üst sıcaklık sınırı, protein
veya nükleik asit gibi makromoleküllerin stabilitesi ile ilgili değildir.
OKARYOTIK HÜCRE BİYOLOJİSİ VE ÖKARYOTİK MİKROORGANİZMALAR
OKARYOTIK HÜCRE YAPISI/İŞLEVİ 14.1 14.2 14.3 14.4 14.5
II
Ökaryotik hücreler, hem mikroorganizmaları hem de bitki ve hayvan hücrelerini kapsar. Şekilde görülen yeşil alg Dunaliella, membranla çevrili nükleus, mitokondri ve kloroplast gibi tipik fototrofik ökaryot hücre organellerine sahiptir.
Ökaryotik Hücre Yapısı ve Nükleus Solunum ve Fermentasyon Organelleri: Mitokondri ve Hidrojenozom Fotosentetik Organel: Kloroplast Endosimbiyoz: Mitokondri ve Kloroplastlarm Bakterilerle İlişkisi Diğer Organeller ve Ökaryotik Hücre Yapıları
ÖKARYOTİK G E N E T İ K VE MOLEKÜLER BİYOLOJİNİN ESASLARI
14.6 14.7 14.8
Doğrusal DNA'nın Replikasyonu Ökaryotik Genetiğe Genel Bakış RNA Splaysı (Ayıklanması) ve Ribozimler
III
OKARYOTIK MIKROBIYAL ÇEŞİTLİLİK
14.9 14.10 14.11 14.12 14.13
Eukarya'ran Filogenisi Protozoa Cıvık Küfler Funguslar Algler
448 448 449 451 452 453
455
455 456 458
460 460 463 467 469 472
447
• Bölüm 14 • Öharyotih Hücre Biyolojisi ve Öharyotik Mikroorganiz
BOLÜMLE İLGİLİ SOZLUK Alg fototrofik ökaryotik mikroorganizma Amipsi hareket sitoplazmik akışla organizmanın hareketinin sağlandığı bir hareket tipi Cıvık küf hücre duvarına sahip olmamaları ile protozoanlara benzeyen ve kümelenerek fruktifikasyon yapılarını (hücresel cıvık küfler) veya protoplazma kütlesini (hücresel olmayan cıvık küfler) oluşturan fototrofik olmayan bir ökaryot Endosimbiyoz bağımsız yaşayan bakterilerin hücre içine alınarak enerji üreten organeller şeklinde değişimi Eukarya tüm ökaryotik organizmalar Fagositoz bir partikülün, mebranın bir bölümü tarafından çevrelenerek hücre içine taşındığı, partiküler besinlerin sindirilme mekanizması Flagellat bir veya daha fazla flagellanın çırpma-şeklindeki davranışı ile hareket eden bir protozoan Funguslar sert hücre duvarlarına sahip fototrofik olmayan ökaryotik mikroorganizmalar Hidrojenozom bazı anaerobik ökaryot mikroorganizmalarda bulunan
endosimbiyoz orijinli bir organel olup piruvatı H2, CO2 ve asetata oksitleme işlevi yamsıra bir ATP üretir Hücre iskeleti mikrofilamentlerin diziliminin hücrenin şeklini belirlediği ökaryotik hücrelere özgü yapı (iskelet) Kitin yaygın olarak fungus ve alglerin hücre duvarında bulunan bir N-asetiluglkozamin polimeri Kloroplast ökaryotik fototrofların fotosentetik organeli Konidiya fungusların eşeysiz sporları Krista bir mitokondrinin iç membranı Küf filamentli bir fungus Maya tek hücreli bir fungus Mayoz gamet oluşumu sırasında diploit kromozom sayısının gametlerdeki haploit kromozom sayısına indirgendiği nükleer bölünme olayı Mikrof ilamentler bir hücrenin şeklinin muhafazasında yardımcı olan, ipliksi polimer olan aktin proteini (bkz. hücre iskeleti)
Mitokondri ökaryotik organizmaların solunum organeli Mitoz ökaryotlarda hücre bölünme-
u bölümde ökaryotik mikroorganizmaların yapı, filogeni ve çeşitliliğini göreceğiz. Diğer bir deyimle, ökaryotik hücre biyolojisinin temel prensipleri burada ele alınacaktır. Temel bilimle ilgisinin yanında, burada öğreneceklerimiz bu kitabın daha ileriki bölümlerinde mikrobiyolojinin tıbbi ve uygulamalı yönlerinin anlaşılması yönünden de yararlı olacaktır.
B
ÖKARYOTİK HÜCRE YAPISI/ İŞLEVİ
si sırasında kromozomların replike olarak her bir yavru hücreye eşit dağılması olayı Nükleus genomu içeren organel Ökaryot Eukarya'nm bir üyesi Protozoa genellikle hücre duvarlarından yoksun fototrofik olmayan tek hücreli ökaryotik mikroorganizmalar Ribozim katalitik RNA RNA işlenmesi öncül bir RNA'nm olgun formuna dönüşümü Siliyat sil adı verilen birçok kısa uzantılarla hızlı hareket eden bir protozoan Splaysozom primer RNA transkriptinden intronlarm çıkarılmasını katalize eden bir ribonükleoprotein kompleksi Sporozoa hareketsiz parazitik protozoanlar Şapkalı mantar büyük ve genellikle yenilebilen fruktifikasyon organı (fruiting body) adı verilen bir yapıya sahip filamentli bir fungus Telomeraz ökaryotik kromozom uçlarındaki DNA'yı replike eden bir enzim kompleksi Tilakoyit kloroplastlarda fotosentetik pigmentleri taşıyan bir membran tabakası
guslarda olduğu gibi) veya olmayabilirler (hayvan hücreleri ve çoğu protozoanda olduğu gibi). Diğer hücre içi yapılar tipik olarak Golgi cihazı, peroksizomlar, lizozomlar, endoplazmik retikulum, mikrotübül ve mikrofilamentlerdir (Şekil 14.1). Hareket organelleri olan flagella ve siller ökaryot hücrelerin bazılarında bulunurken bazılarında bulunmaz. Nükleus
Nükleus, ökaryotik hücrenin genomunu bulundurur (Şekil 14.2*). Ökaryotlarda nükleusun içinde Takip eden beş kısımda ökaryotik hücrenin yapıbulunan DNA histonlar etrafında sarılarak nüklesı ve organellerle, bakteriler arasında endosimbiyoz ozotnîan, bunlar da kromozomları oluşturur (bkz. adı verilen ilişkinin atasal bağı ele alınacaktır Şekil 14.13). Birçok ökaryotik hücrede nükleus Kısım 11.4). mikrometrelerce çapta olup ışık mikroskobunda boyanmadan bile görülebilir (Şekil 4.7a). Ancak, daha küçük ökaryotlarda nükleusu görmek için Ökaryotik Hücre Yapısı ve Nükleus özel boyama tekniklerine gereksinim duyulur. Nükleus, her biri kendine özgü işlevi olan ve Tipik bir ökaryotik hücre Şekil 14.1 «'de gösterilmiştir. Prokaryotların tersine ökaryotlar membranla çev- birbirine belli uzaklıkta bulunan bir çift membranla çevrilidir. İç zar basit bir kese iken, dış zar birçok rili bir nükleus ve organizmanın tipine bağlı olarak birkaç diğer organel içerirler. Örneğin, mitokondriler yerde endoplazmik retikulumla devam eder. İç ve dış zarlar sırası ile nükleoplazma ve sitoplazma ile ökaryotik hücreler arasında hemen hemen evrensel iken, pigmentli kloroplastlar sadece fototrofik hüc- özel ilişkiler içinde bulunurlar. Nükleer membran ayrıca iç ve dış membranın relerde bulunurlar. Ökaryotik hücreler bir hücre duvarına sahip olabilir (bitki hücreleri, algler ve fun- bir araya gelerek temas ettiği yerlerde porlar oluş-
14.2 • Solunum ve Fermentasyon Organelleri: Mitohondri ve Hidrojenozom • 449 Mikrotübüller
Düz endoplazmik retikulum
Mitokondri
Pürüzlü endoplazmik retikulum
Sitoplazmik membran
Flagella i
Ribozomlar
Mitokondri
Mikrofilamentler Peroksizom
Lizozom
Golgi kompleksi
Kloroplast
Nükleus
Nükleer zar Nükleer porlar
Nükleolus
o Şekil 14.1 14.1 Bir ökaryotik hücrenin şematik görünümü. Her ne kadar tüm ökaryotik hücreler bir nükleusa sahipse de, burada gösterilen organellerin ve yapıların hepsi tüm okaryotlarda bulunmayabilir.
turur (Şekil 14.2). Porlardaki protein kompleksleri, diğer proteinlerin ve nükleik asitlerin nükleer transport adı verilen bir olayla nükleusun içine ve dışına taşınmasında görev yaparlar. Sitoplazmik membrandan madde taşınımı gibi (ao& Kısım 4.7) nükleer transport için de enerjiye gereksinim duyulur ve bu enerji, enerjice zengin bir bileşik olan guanozin trifosfatın (GTP) hidrolizinden sağlanır. Nükleusun içinde bulunan nükleolus, ribozomal RNA'nm sentezlendiği yerdir (Şekil 14.1). Nükleolus RNA bakımından zengin olup genellikle ışık mikroskobunda görülebilir. Sitoplazmada sentezlenen ribozomal proteinler nükleolusun içine taşınır ve burada ribozomal RNA'larla bir araya gelerek ökaryotik ribozomların küçük ve büyük alt üniteleri oluşur. Ribozom alt üniteleri daha sonra sitoplazmaya taşınır ve küçük ve büyük alt ünite bir araya gelerek protein sentezinde rol alan tam bir ribozomu oluştururlar.
Solunum ve Fermentasyon Organelleri: Mitokondri ve Hidrojenozom Mitokondri ve hidrojenozom kemotrofik enerji metabolizması için özelleşmişlerdir. Her iki organel de membranla sarılı olmalarına rağmen oldukça farklı işlevlere sahiptir.
Mitokondriler
Aerobik ökaryot hücrelerde solunum ve oksidatif fosforilasyon (ATP yapım mekanizması) (tf*a Kısım 5.11 ve 5.12) mitokondrilerde gerçekleşir. Prokaryotik bir hücrenin boyutlarına sahip mitokondriler çubuk-şekilli veya hemen hemen küresel olabilirler (Şekil 14.3*). Tipik bir hayvan hücresinde mitokondri sayısı genel olarak hücrenin tipi veya büyüklüğüne bağlı olmak üzere 1000'in üzerinde olabilir. Bir maya hücresi çok daha az mitokondriye sahip olabilir (bkz. Şekil 14.2). Mitokondriler iki membranla çevrilidirler. Nispeten geçirgen olan dış membranda lipid ve proteinler aynı oranlarda bulunup çeşitli küçük kanallar aracılığı ile iyon ve küçük organik moleküllerin geçişi sağlanır. Daha az geçirgen olan iç membran protein bakımından dış membrana göre daha zengindir. Mitokondri membranmda steroller bulunmadığından (<^s Kısım 4.5) bu membranlar sterol içeren sitoplazmik zara göre çok daha az bir sertlikte bulunurlar. Bu nedenle mitokondriler oldukça farklı biçimler kazanabilirler (Şekil 14.3b, c). Mitokondriler ayrıca krista adı verilen bir seri katlanmış iç membran sistemine sahiptir. İç membranm içe doğru girintilerinin uzantıları olan bu membranlar, solunum ve ATP yapımında görev alan enzimlerin bulunduğu bölgelerdir. Kristalar, özellikle ATP başta olmak üzere metabolit-
450 • Bölüm 14 • Ökaryotik Hücre Biyolojisi ve Ökaryotik Mikroorganizmalar
Krista —"^ Porlu dış membran' (a)
•f -,:-
* Şekil 14.2 Nükleus. Bir maya hücresinin buzla dondurulmuş gravüründe (freeze-etching) nükleusun dış yüzeyim gösteren elektron mikrografı. Bu elektron mikroskobu tekniğinde (oCfe Kısım 4.3) örnek dondurulur, kınhr ve ince bir kısmı mikroskop altında incelenir. Hücre yaklaşık 8 /J,m, nükleus ise yaklaşık 1.5 jjim genişliğindedir.
lerin matriks içine ve dışına taşınmasını sağlayan özel düzenleyici transport proteinlerine de sahiptir (Şekil 14.3a). Matriks başta sitrik asit döngüsü enzimleri olmak üzere organik maddelerin oksidasyonunda görev yapan bir seri enzim içerir Kısım 5.13). Hidrojenozomlar
Bazı cmaerobik ökaryot mikroorganizmalar mitokondri bulundurmaz. Bunun yerine bu hücreler hidrojenozomlara sahiptir (Şekil 14.4a«). Her ne kadar bir mitokondrinin büyüklüğüne sahiplerse de bu organellerde kristalar ve sitrik asit döngüsü enzimleri bulunmaz. Hidrojenozomlara sahip çeşitli ökaryotik mikroorganizmaların hepsinde metabolizma zorunlu fermentatif olup bunlar ya zorunlu ya da aerotolerant anaerobdur. Örnek olarak Trichomonas gibi kamçılı parazitler (bkz. Kısım 14.10) ve geviş getiren hayvanların rumen (işkembe)'lerinde yaşayan çeşitli siliyat protozoanlar verilebilir (ö=O Kısım 19.11). Hidrojenozomlardaki en önemli biyokimyasal reaksiyon piruvatın H2, CO2 ve asetata oksidasyonudur (Şekil 14.4b). Piruvat, H2O ve CO2'nin yanında (Şekil 14.4b) enerjice zengin bir bileşik olan asetil-CoA'ya oksitlenir (asetil-CoA'dan asetat oluşumu sırasında ilave ATP yapılır, oo» Kısım 17.19). Bazı anaerobik ökaryotların sitoplazmalarında metanojenler gibi H2 tüketen simbiyotik
•
•
(b)
• Şekil 14.3 Mitokondrinin yapısı, (a) Mitokondrinin genel yapısını gösteren bir diyagram. İç ve dış membranlara dikkat ediniz, (b, c) fare dokusundan çeşitli morfolojide mitokondrilerin transmisyon elektron mikrograflan. Kristalara dikkat ediniz.
prokaryotlar bulunur (ö°o>Kısım \7.25b,c). Simbiyontlar hidrojenozomlar tarafından yapılan H2 ve CO2'yi kullanarak metan üretirler (Şekil 14.4b). Hidrojenozomlar bir elektron transfer zincirine ve sitrik asit döngüsüne sahip olmadıklarından mitokondrilerin tersine piruvat katabolizması sonucu oluşan asetatı oksitleyemezler. Bu nedenle asetat hidrojenozomlardan konakçı hücrenin sitoplazmasma verilir (Şekil 14.4b). 14.2 Kavramların Gözden Geçirilmesi Mitokondri ve hidrojenozom ökaryotik hücrelerin enerji yapan organelleridir. Mitokondriler aerobik solunumda görevli iken; hidrojenozomlar sadece bazı zorunlu anaerobik ökaryotlarda bulunan ve piruvatı fermente ederek H 2 , CO2, asetat ve ATP üreten yapılardır. •
Mitokondride hangi kilit reaksiyonlar meydana gelir? Hücrenin hangi kilit ürünleri mitokondri tarafından yapılır?
•
Mitokondri ve hidrojenozomdaki piruvat metabolzmasım karşılaştırınız ve farklılıklarını belirtiniz.
14 3 • Fotosentetik Organel: Kloroplast • 451
(a)
• Şekil 14.5 Kloroplastların varlığını gösteren alg hücrelerinin fotomikrograflari. (a) Bir diatom olan Stephanodiscus'un floresan fotomikrografı. Kloroplastlardaki klorofiller (oklar) ışığı absorbe ederler ve kırmızı floresan yayarlar, (b) Bir fototrof olan Spirogyra'nın spiral şekilli kloroplastlannın (oklar) faz-kontrast fotomikrografı.
Hidrojenozom Asetat
• Şekil 14.4 Hidrojenozom. (a) Aerobik bir flagelli olan Trichomonas vaginalis hücresinin ince kesitinde beş adet hidrojenozomun varlığını gösteren bir elektron mikrografı. Bu yapıların iç kısmım Şekil 14.3'teki mitokondri ile karşılaştırın, (b) Hidrojenozomun kimyası. Piruvat hidrojenozomlar tarafından alınır ve Hz, CO,, asetat ve ATP (hepsi kırmızı gösterilen) ürünlerine dönüştürülür. Hidrojenozomun kilit enzimleri piruvat: ferrodoksin oksidoredüktaz ve hidrojenazdır. Hidrojenozoma sahip ökaryotlann sitoplazmasmda genellikle endosimbiyotik metenojenler bulunmakta olup (öOQ Kısım 13.4) H2 + CO2'den metan üretirler (£»ö Şekil 19.26c).
Fotosentetik Organel: Kloroplast Kloroplastlar klorofil içeren organeller olup fototrofik ökaryotlar olan alglerde bulunurlar. Birçok algin kloroplastı nispeten büyük olup ışık mikroskobunda rahatlıkla görülebilir (Şekil 14.5*). Hücre başına kloroplastların büyüklüğü, şekli ve sayısı önemli ölçüde değişir ve mitokondrilerin tersine kloroplastlar genellikle prokaryotik hücrelerden oldukça büyüktür. Mitokondriler gibi kloroplastlar, en dışta geçirgen bir membran, onun altında çok daha az geçirgen olan bir iç membran ve membranlar arası bir boşluğa sahiptir, iç zar stroma adı verilen kloroplast lümenini (boşluk) çevreler, fakat mitokondri iç membramnda olduğu gibi krista benzeri bir katlanma göstermez (Şekil 14.3fl). Bunun yerine klorofil
ve fotosentez için gerekli olan diğer bileşikler tilakoyitler adı verilen bir seri yassı membran diskleri üzerinde bulunurlar (Şekil 14.6*). Görevleri ATP sentezi için gerekli olan proton-hareket kuvveti sağlamak olduğundan, tilakoyit membranlar iyon ve diğer metabolitlere geçirgen değildir (oca Kısım 5.12). Yeşil alg ve yeşil bitkilerde tilakoyitler tipik olarak grana adı verilen belirgin yapısal birimler halinde üst üste dizili bulunurlar (c«ö Şekil 17.5). Kloroplast stroması büyük miktarlarda ribüloz bisfosfat karboksilaz (RubisCO) enzimi içerir. RubisCO fotosentetik organizmaların çoğunda CO2'in bir seri biyosentetik reaksiyon sonucu organik bileşiklere çevrildiği Calvin döngüsünde kilit bir katalist olarak rol oynar (<*^ Kısım 17.6). Toplam kloroplast proteininin %50'sinden fazlası RubisCO olup, bu enzimle glukoz biyosentezinde kilit bir bileşik olan fosfogliserik asit yapımı katalizlenir (eKfe Kısım 5.10 ve 5.15). Kloroplastm en dış membranmın geçirgenliği sayesinde fotosentez sırasında yapılan glukoz ve ATP sitoplazmaya geçebilir ve burada yeni hücre materyalinin yapımında kullanılabilirler.
.-...:, Kloroplast \ • 4 — Tilakoid r , .-Jm
• Şekil 14.6 Kloroplast. Altın şansı alg Ochromonasdanica'nın bir kloroplastının transmisyon elektron mikrografı. Tilakoitlere dikkat ediniz.
452 • Bölüm 14 • Ökaryotik Hücre Biyolojisi ve Ökaryotik Mikroorganizmalar
-m
14.3 Kavramların Gözden Geçirilmesi
Kloroplastlar ökaryotik fototroflarda fotosentetik enerji yapımı ve CO 2 fiksasyonunun yapıldığı bölgelerdir. • •
Stromamntilakoyitterdenfarkı nedir? RubisCO'nun işlevi nedir ve nerede bulunur?
Endosimbiyoz: Mitokondri ve Kloroplastların Bakterilerle İlişkisi Nispeten otonom olmaları, büyüklükleri ve prokaryotlara morfolojik olarak benzerliklerinden dolayı mitokondri ve kloroplastların eski bakterilerden orijin aldıkları ileri sürülmüştür. Bu organellerin endosimbiyoz (endo "içinde" anlamına gelir) adı verilen bir olayla, prokaryotik bir hücrenin daha büyük bir hücre ("konakçı") tarafından yutulması ve yutulan hücrenin orada bir organele çevrilmesi ile ortaya çıktıkları ileri sürülmüştür (o°o Kısım 11.4 ve Şekil 11.9). Birkaç moleküler kanıt burada özetleyeceğimiz endosimbiyotik teoriyi desteklemektedir: 1. Mitokondri ve Kloroplastlar DNA'ya sahiptir. Her ne kadar işlevlerinin çoğu nükleer DNA tarafından kodlansa da, birkaç organel bileşiği organellerin kendi içinde bulunan daha küçük bir genom tarafından kodlanır. Bunlara bazı ribozomal RNA'lar, transfer RNA'lar ve solunum zincirinin (mitokondrilerde) ve fotosentetik sistemin (kloroplastlarda) bazı proteinleri dahildir. Bu nedenle, fototrofik olmayan ökaryot hücreler biri endosimbiyontdan diğeri konakçının hücre nükleusundan olmak üzere iki farklı
kaynaktan DNA'ya sahip birer genetik kimeralardır. Fototrofik ökaryotlar (algler ve daha yüksek bitkiler) üç farklı kaynaktan DNA içerirler: mitokondri ve kloroplast endosimbiyontları ve nükleus. Aynen prokaryotların çoğunda olduğu gibi, mitokondri DNA'sının çoğu ve tüm kloroplast DNA'sı halkasal formda bulunur (oos Kısım 2.2, 7.2 ve 7.3). Özel boyama teknikleri kullanılarak hücrede mitokondri DNA'sı görülebilir (Şekil 14.7»). Organel genomlarının birçok diğer ilginç özelliklerini Kısım 15.7'de göreceğiz. 2. Ökaryotik nükleus bakteri orijinli genlere sahiptir. Genomik dizileme (e°ç» Bölüm 15) ve diğer genetik çalışmalar, birkaç nükleer genin organellere özgü işlevleri kodladıklarını açıkça ortaya koymuştur. Bu genlerin dizilerinin arkeik veya ökaryotlarm gen dizilerinden çok bakterilerin gen dizilerine benzemesi, onların başlangıçta yutulan bir hücreden şimdiki organele değişimi sırasında bakteri simbiyotundan nükleusa geldiklerini göstermektedir.
• Şekil 14.7 Saccharomyces cerevisiae mayasının hücreleri. Mitokondrial DNA'yı göstermek için hücreler 4'6diamidin-2'-fenilindol dihidroklorit (DAPI) ile boyanmışlardır ( C^Kısım 18.3). Her mitokondri iki ila dört arasında halkasal kromozoma sahip olup, kromozomlar kullanılan floresan boya ile mavi boyanmışlardır.
3. Mitokondri ve kloroplastlar kendi ribozomlarına sahiptir. Protein sentezinde (COÜKısım 7.16) görev yapan hücresel yapılar olan ribozomlar ya ökaryot hücrelerin sitoplazmasında olduğu gibi büyük bir formda [80 Svedberg (S) birimi] ya da prokaryotlarda olduğu gibi küçük bir formda (70S) bulunurlar. Mitokondri ve kloroplastlar da ribozomlara sahip olup prokaryotlarda olduğu gibi ribozom büyüklükleri 70S'dir. 4. Antibiyotik özgünlüğü Birkaç antibiyotik (bir örnek olarak streptomisin) özellikle 70S ribozomun işlevini etkileyerek bakterileri öldürür veya inhibe eder. Aynı antibiyotikler mitokondri ve kloroplastlarda da protein sentezini benzer şekilde inhibe eder. 5. Moleküler f ilogeni Karşılaştırmalı RNA dizileme metotlarını (o°o Kısımlar 11.4-11.8) ve organel genom çalışmalarını (oo& Kısım 15.7) kullanan filogenetik çalışmalar, kloroplast ve mitokondrinin bakterilerden orijin aldıklarını ikna edici bir şekilde ortaya koymuştur. Modern ökaryotik hücreler böylece endosimbiyoz olayı ile en az iki oldukça farklı organizmanın bir araya gelmelerinden ortaya çıkmıştır (£Wo Kısım 11.3 ve Şekil 11.7). Hidrojenozomların da endosimbiyont oldukları konusunda oldukça güçlü deliller vardır. Örneğin, karıncaların bağırsağında (sesa Kısım 19.10) yaşayan anaerobik siliyat bir protozoan olan Nyctotherus ovalis'ûe mitokondriler bulunmazken, DNA ve ribozom içeren hidrojenozomlar vardır. Ayrıca, hidrojenozomlara sahip ökaryotlarm hücre nükleusunda bakteri orijinli proteinleri kodlayan genler vardır. Bu nedenle aynen mitokondrilerde olduğu gibi hidrojenozomlar da endosimbiyoz kökenlidir. Hidrojenozomların aslında mitokondrilerin metabolik olarak dejenere formları olup, anaerobik bir
14 5 • Diğer Organeller ve Ökaryotik Hücre Yapılan • 453
konakçı hücrede enerji eldesi ve piruvatı fermente etmeye dönük solunumla donatılmış organeller oldukları düşünülmektedir. Her ne kadar mitokondride solunumla sağlanan enerji miktarı ile kıyaslanamazsa da, hidrojenozomlar asetat üretimi ile hücrelere laktat ve etanol fermentasyonundan elde edilenden daha fazla enerji sağlarlar (Şekil 14.4b, oe*s Kısım 5.10 ve 17.19). Bu nedenle mitokondri ve hidrojenozomlar a ATP yapımı için farklı stratejiler geliştirmiş, işlevsel olarak birbiriyle ilşkili organeller olarak bakılabilir. Mitozomlar adı verilen diğer yapılar mitokondrilerin daha da dejenere formları olup enerji ile ilgili tüm işlevlerini kaybetmişlerdir (bkz. Kısım 14.9). Gördüğünüz gibi birçok kanıt, bu organellerin ortaya çıkmalarının ökaryotik konakçı hücreler tarafından serbest yaşayan bakterilerin endosimbiyotik alımını sonucu ortaya çıktıkları yönündedir. Bu barışçıl birliktelikte konakçı hücreler enerji üretimi için özelleşmiş bir ortak kazanırken, simbiyontlarm kendileri kararlı ve destekleyici bir büyüme ortamına sahip olmuşlardır. Endosimbiyozun evrimsel bir başarı hikayesi olduğu mitokondri, hidrojenozom ve kloroplastlarm bugün hemen tüm ökaryotik hücrelerde bulunmaları ile doğrulanmaktadır. 14.4 Kavramların Gözden Geçirilmesi Ökaryotların kilit organelleri fotosentezden sorumlu kloroplast, solunumdan sorumlu mitokondri ve fermentasyonda görev alan hidrojenozomdur. Bu organeller bakterilerden orijin alıp diğer hücreler içinde kalıcı olmuşlardır (endosimbiyoz). •
Organellerin bakterilerle ilişkisini destekleyen moleküler kanıtlan özetleyiniz. • Nyctothents için mitokondriye göre hidrojenozomla yaşamak niçin daha iyidir?
Diğer Organeller ve Ökaryotik Hücre Yapıları
membran materyali de burada yapılır ve hücre bölünmesinden önce çeşitli membran sistemlerini genişletmek için hücre boyunca bu materyal oralara taşınır (bkz. Şekil 14.1). Golgi kompleksi ER ile birlikte çalışan fakat ER'dan farklı bir membran dizilimi gösteren bir organeldir (Şekil 14.1 ve 14.8«). ER'den gelen hormonlar veya sindirim enzimleri gibi salgılanacak ürünler ve hücredeki diğer membranlı yapılarda iş görecek maddeler Golgi kompleksinde kimyasal olarak modifiye edilirek buralara yönlendirilirler. Golgiler daha önce var olan bir Golginin bölünmesi ile ortaya çıkarlar ve salgı ve membran proteinlerini hücrede gidecekleri en son yere bağlı olarak farklı biçimde modifiye eden çeşitli enzimler içerirler. Modifikasyonların birçoğu proteinleri, özel glikoproteinlere çeviren glikozidasyonu (şeker monomerlerinin eklenmesini) içerir. Lizozom ve Peroksizomlar
Lizozomlar (Şekil 14.1) membranla çevrili yapılar olup protein, yağ ve polisakkaritler gibi makromoleküllerin hücrede sindirilmesi için çeşitli sindirici enzimler içerirler. Bunu yaparak, hücre bu materyalleri yeni biyosentezler için geriye dönüştürmüş olur. Lizozomların iç pH'sı sitoplazmanınkinden iki birim küçük (yaklaşık 5) olup, lizozomun içindeki hidrolitik enzimler bu pH'da optimum çalışırlar. Bu hidrolitik enzimler aktiviteleri açısından spesifik olmayıp eğer lizozomun kendi yapısına girmeyeceklerse potansiyel olarak kilit tüm makromolekülleri parçalayabilirler. Böylece lizozom litik aktivitenin sitoplazmadan ayrılmış bir bölgede olmasına imkan tanır. Makromoleküllerin lizozomda hidrolizi sonucu açığa çıkan monomerler lizozomdan ayrılıp sitoplazmaya geri gelirler ve hücre için besin olarak kullanılırlar. Peroksizom membranla çevrili bir yapı olup (Şekil 14.1) O2'ni alkoller ve uzun zincirli yağ asit-
Ökaryotik hücrelerde tipik olarak çeşitli diğer sitoplazmik yapılar mevcuttur. Bunlar endoplazmik retikulum, Golgi cihazı, lizozomlar, peroksizomlar ve
hareket organelleri olan ftagella ve sillerdir. Ancak mitokondri ve kloroplastlarm tersine bu yapılarda DNA ve ribozomlar bulunmaz ve bunlar endosimbiyotik orijinli değildir. Endoplazmik Retikulum ve Golgi Kompleksi
Endoplazmik Retikulum (ER) nükleer membranın devamı olan bir membran ağıdır. İki tip endoplazmik retikulum gözlenir: ribozomların yapışık olduğu pürüzlü ve ribozomsuz düz endoplazmik retikulum (Şekil 14.1). Düz ER lipidlerin sentezinde ve karbohidrat metabolizmasının bazı durumlarında görev alır. Pürüzlü ER, ribozomlarmın aktivitesi yolu ile glikoprotein üretiminin esas yeri olup, yeni
• Şekil 14.8 Golgi kompleksi. Bir protozoan olan Toxoplasma göndü hücresinin bir kısmının transmisyon elektron mikrografi. Golgi kırmızı boyanmıştır. Golgi kompleksini yapan çok katlı membran tabakalarına dikkat ediniz (Membran dizileri 0.5-1.0 pim çapındadır). Sitoplazmik granüller gibi diğer yapılar diğer renklerde gösterilmişlerdir. Her hücresi bu organelden bir tane içerdiğinden Golgi kompleksim çalışmak için T. göndü model bir sistem olarak kullanılır.
454 • Bölüm i 4 • Ökaryotik Hücre Biyolojisi ve Ökaryotik Mikroorganizmalar
leri dahil çeşitli hidrojen vericileri ile redükleyerek hidrojen peroksit (H2O2) üretirler. Peroksizomda üretilen H 2 O 2 katalaz enzimi ile H2O ve O2'ye parçalanır (<3ö& Kısım 6.16). Peroksizomlar yağların emilim ve sindiriminde görevli safra tuzlarının sentezinde de görev alırlar. Protein ve lipidlerini sitoplazmadan alarak oluşan peroksizomlar sonuçta hücre ile eş zamanlı büyüyen ve bölünen membranla çevrili bir yapı şekline dönüşürler.
Aktin ve tübülinin yapısal ve fonksiyonel homologlarının prokaryotlarda MreB ve FtzS proteinleri olduklarını daha önceki bölümde gördük (ÖSOO Kısım 6.1). Bu göstermektedir ki, her ne kadar ökaryotlardan çok daha küçük hücrelerse de prokaryotlar da belli seviyede bir hücre içi iskelete ihtiyaç duyarlar. Prokaryotlarda MreB ve FtzS proteinlerinin bulunması ökaryotik hücre iskeletinin derin evrimsel köklerinin olduğunu göstermektedir.
Mikrofilamentler ve mikrotübüller
Tlagella ve Şiiler
Nasıl ki evler yapısal bir iskeletle desteklenirse, ökaryotik hücrelerin bütünlüğü ve hareket etmeleri için de bir iskelet sistemine ihtiyaç vardır. Hücre
Flagella ve Şiiler ökaryotik mikroorganizmaların birçok türünde bulunurlar. Flagella ve siller hareket organelleri olup yüzme hareketiyle hücrelerin hareketini sağlarlar. Siller esasında kısa flagellalar olup eş zamanlı titreme ile hücrenin ortam içinde genellikle oldukça hızlı biçimde ileriye doğru itilmesini sağlarlar. Flagellalar uzun yapılar olup tek veya gruplar halinde hücreyi bir çırpma hareketi ile ve genellikle sillerden daha yavaş olarak hareket ettirirler (Şekil 14.10a»). Ökaryotik hücrelerin flagellaları yapı olarak bakteri flagellalarmdan oldukça farklıdır (
içinde bu yapısal ağ mikrofilarnent ve mikrotübül adı
verilen proteinlerden oluşan yapısal filamentlerle sağlanır. Bu filamentler hep birlikte hücrenin iskeletini oluştururlar. Mikrofilamentler 8 nm çapında olup aktin proteini polimerleridir. Bu fibriller hücre boyunca yapısal bir platform oluşturarak hücrenin biçimini belirlerler (Şekil 14.1 ve 14.9»). Mikrotübüller 25 nm çapında daha büyük filamentler olup tübülin proteininden oluşurlar. Bu filamentler mikrofilamentlerle beraber hücrenin şeklinin oluşumunda rol oynarlar. Mikrotübüller ayrıca hem hüre içi yapıların hareketi (örneğin; hücre bölünmesi sırasında kromozomların ayrılması) ve hem de organizmanın kendisinin hareketinde rol alırlar (örneğin; flagellalı ökaryotlarm flagellasmın hareketi, bkz. Şekil 14.1 ve 14.10).
v v
v
*
« ••'- • >
I'-ıJ
V I : ••"
v S ' ^ - . . " ^ ,'.'•";':••• '''.*>! ''.'"*'''•• 'Z'.:
' -'••:"., Flagellalar
Siller
r** .- "• /..*>' '•.>',','••;''>'• »'^ i^İ-V'/»// • ;*V •'
• Şekil 14.9 Ökaryolik hücre dokusunun mikrofilamentleri. Hücresel bir cıvık mantar olan Dictyostelium discoideum'un (aynca bkz. Şekil 14.28) hücre iskeleti olarak mikrotübüllerle beraber aktin filamentlerini gösteren bir elektron tomografik resim. Mikrofilamentler yaklaşık 8 nm çapındadır. Elektron tomografi transmisyon elektron mikroskobu ile çekilmiş bir seri resimden hücrenin üç boyutlu yapısının oluşturulması metodudur.
• Şekil 14.10 Ökaryotik hücrelerin hareket organelleri olan flagella ve siller. (a) Flagellalar tek veya çoklu olarak bulunabilirler. Siller yapı olarak flagellaya oldukça benzer fakat çok daha kısadırlar. Prokaryotların bir bot pervanesi gibi dönerek hareketi sağlayan flagellasmın tersine (ÖOQ Kısım 4.14 ve Şekiller 4.53- 4.58), ökaryotik flagella çırpmabenzeri bir harekete sahiptir, (b) Bir fungus olan Blastocladiella emersonij'nindış örtü, dıştaki dokuz çift mikrotübül ve merkezdeki bir çift mikrotübülün varlığını gösteren flagellumunun yatay kesiti.
14 6 • Doğrusal DNA'mn Replihasyonu • 455
Bundan dolayı prokaryotik ve ökaryotik flagellum arasında açık bir fark görülür. Prokaryotik flagellumun flamenti flagellin adı verilen tek bir proteinin sarmal dizilişinden yapılmıştır ve yapı hücre duvarı içinde ve membramnda gömülü bulunan dönen bir motor kompleksi içine sıkıca bağlıdır (Ö°O Şekil 4.56). Ayrıca bakteri flagellumu proton hareket kuvvetinin enerjisi ile hücreyi iter (ef*s Kısım 4.14 ve 5.12). Tersine ökaryotik flagellum ATP enerjisi ile mikrotübüllerin biri biri üzerinden kayması sonucu çırpma-benzeri bir hareketle hücreyi iter. Tüm hareketli hücrelerde hareket muhtemelen yaşamsal bir öneme sahiptir; hareket kabiliyeti, hareketli organizmalara yeni habitatlar keşfetmelerini ve oralardaki kaynaklan kullanmalarını sağlar. 14.5 Kavram/arın Gözden Geçirilmesi Ökaryotlarda, temel organellerin yanısıra belirli işlevlere sahip birkaç diğer yapı da sitoplazmada bulunmaktadır. Bunlar; ribozomların bulunduğu ve hücrede lipid sentezinin yapıldığı yer olan endoplazmik retikulum; protein modifikasyonu ve salgılanmasında görevli Golgi cihazı; makromoleküler sindirimde rol oynayan lizozom ve H2OO üretiminde görev alan bir organel olan perokszomdur. Ayrıca hücrenin iskeletini oluşturan proteinden yapılmış mikrofilamentler ve mikrotülbüller bulunur. Flagella ve siller yaygın mikrotübüler yapıya sahip hareket organelleridir. • •
Düz ER pürüzlü ER'den nasıl ayrılır? Lizozomda gerçekleşen aktiviteler niçin sitoplazmadan özellikle belirgin bir biçimde ayrılmıştır? • Destek sağlamalarının yanısıra mikrotübüllerin diğer işlevleri nelerdir?
sol ucunun esasında doğrusal bir kromozonun ucu olduğunu varsayınız. Hatta eğer RNA primeri oldukça kısa ve onu ortadan kaldırmak için özel bir enzim olsa bile, bilinen tüm DNA polimerazlar bir primere ihtiyaç duyduğundan hiç bir DNA polimeraz onun yerine DNA'yı koyamaz. Bu nedenle eğer bir şey yapılmazsa DNA molekülü her replike olduğunda biraz daha kısalacaktır. Doğrusal DNA'nın replikasyonu özel itina gerektirir ve bu problemin aşılması için en az iki çözüm vardır. Bir Protein Primer Aracılığı ile Doğrusal DNA'nın Replikasyonu
Doğrusal DNA genomu bulunduran virüsler (bunlar ökaryotları enfekte eden çoğu virüsü içerir) ve birçok doğrusal plazmit doğrusal DNA'nın replikasyon problemini bir RNA primeri yerine bir protein primeri kullanarak çözerler. Her ne kadar tüm DNA polimerazlar her nükleotiti serbest bir hidroksil (OH) grubuna eklemeli ise de, bazı DNA polimerazlar ilk bazı doğrusal kromozomların uçlarına bağlı olan spesifik proteinler üzerindeki bir hidroksil grubuna bağlayabilirler (Şekil 14.11 •). Bu proteinler plazmit veya virüs tarafından kodlanır ve kromozomların uçlarını tanımada iş görürler. Bu protein primerleri kaldırılmazlar ve böylece bu plazmitler veya virüsler kendi DNA'larının 5' uçlarına proteinleri daimi bir şekilde bağlı tutarlar. Protein primerleri bazı doğrusal bakteri kromozomlarının replike olmasında da aracılık yaparlar Kısım 15.4). Telonterler ve Telomeraz
ÖKARYOTİK GENETİK VE MOLEKÜLER BİYOLOJİNİN ESASLARI Ökaryotik genetik ve moleküler biyolojisinin birkaç yönü prokaryotik hücrelerin çoğunda bulunmaz. Bunlar, (1) doğrusal genetik elementlerin replikasyonu (halkasalın tersine); (2) mitoz ve mayoz ve (3) mesajcı RNA'larm işlenmesidir. Bu konuların her birini burada kısaca göreceğiz.
Telomerler adı verilen ökaryotik kromozomların uçlarının replikasyonunda özel bir metot kullanı5'-uca kovalent olarak bağlanmış protein
3'
5'
3' g
, HO-lJ
iJ-OH
•J
Doğrusal DNA'nın Replikasyonu Plazmitlerin çoğu ve bazı virüs ve organel genomlarında olduğu gibi prokaryot kromozomları da halkasaldır (Ö^O Kısım 15.7). Tersine, ökaryotik hücreler doğrusal DNA içerirler. İster doğrusal ister halkasal olsun kromozomdaki DNA'nın repliksayonunun tüm basmakları hemen hemen aynıdır. Ancak, halkasal DNA'larda olmayan bir durum doğrusal genetik elementlerin replikasyonunda kilit bir problem teşkil eder: her zincirin 5' ucundaki DNA'nın replikasyonu.
Problemin doğasını anlamak için önce Şekil 7.13'ü gözden geçiriniz. Bu diyagramdaki DNA'nın
Yeni 5' ucu
i
95'
• Şekil 14.11 Protein primerleri ile doğrusal DNA'nın replikasyonu. DNA'mn yeni zincirlerinin 5' uçlanna kovalent olarak özel proteinler bağlanır. Protein üzerinde serbest OH grubuna dikkat ediniz. DNA polimeraz III bu OH grubuna bir nükleotit ekleyebilir.
456 • Bölüm 14 • Okaryotik Hücre Biyolojisi ve Okaryotik Mikroorganizmalar
lir. Telomerler 20'den yüzlere varan sayılarda peş peşe tekrar eden kısa (genellikle 6 baz çifti uzunluğunda) DNA dizileridir (Şekil 14.12a*). Farklı ökaryotların genellikle telomer dizileri yakın ilişkili olup daima birkaç guanin içerirler. Replikasyon ile ilgili olarak, bu guanince zengin dizi DNA çift zincirinde leading (kesintisiz) zincir üzerinde bulunur ve telomeraz adı verilen bir enzimde bulunan komplementer (tamamlayıcı) RNA zincirinin 3' ucu ile baz çifti yapar (Şekil 14.12a). Telomeraz enzimi telomerik DNA'nın guanince zengin 3' ucundaki uzantısına bağlanınca aktive olur. Enzimin kendisi bir kofaktör olarak küçük bir RNA'ya sahip olduğundan, DNA sentezine başlamak için telomeraz bir kalıba ihtiyaç duymaz. Bir RNA'yı kalıp alarak DNA yaptığından, telomeraz esasen bir çeşit revers transkriptazdır (cs^a Kısım 9.13). Telomeraz peş peşe çalışıp leading (kesintisiz) zinciri uzatarak uzun bir zincir yapar. Bir kere bu uzun zincir yapılınca diğer zincir (lagging, kesintili) bir RNA primeri ile normal şekilde eşleşir ve DNA replike olur (Şekil 14.12b). Herhangi bir
Telomerik DNA 5'--
3'"
Kesintisiz zincir İTT3'
CCCCAACCCCAA 5'
14.6 Kavramların Gözden Geçirilmesi Doğrusal genetik elementlerin uçları replikasyon mekanizması için halkasal genetik elementlerde olmayan bir probleme sebep olurlar. Bazı prokaryotik ve viral doğrusal elementler bu problemi bir protein primeri kullanarak çözerler. Ökaryotlar ise bu problemi telomeraz adı verilen özel bir enzimin DNA'nın bir zincirinin ucunu uzatması ile çözerler. •
Bir protein DNA replikasyonu için bir primer olarak nasıl kullanılabilir? • Telomeraz nedir ve işlevi nedir?
Okaryotik Genetiğe Genel Bakış Burada bazı okaryotik genetik prensipleri kısaca gözden geçireceğiz. Okaryotik hücreler mitozla bölünür ve daha sonra eşeysel üreme gösterirler. Eşeyli üremede mayozla dişi ve erkek gametler oluşur ve bunlar daha sonra kaynaşarak zigotu yaparlar. Bu durum prokaryotların tek yönlü olan çiftleşme olayından oldukça farklıdır (<&*s> Bölüm 10) ve ekmek mayası Saccharomyces cerevisiae'yi
Kesintili zincir 3' AÂCCCCAAC 5' RNA kalıbı (a)
genin bir kısmının kaybolmasını önleyecek uzunlukta olduğu sürece DNA replikasyonu sırasında telomerlerin illa da belli sayıda bir tekrardan oluşmuş olması gerekmez.
model ökaryot olarak ele alıp bu olaylar üzerinde burada duracağız. Mitoz ve Mayoz
Telomeraz
İlk altı başlık uzantı
Telomeraz bir uzantı bouy hareket eder
Dört kez tekrar
(b) • Şekil 14.12 Okaryotik kromozomun bir ucundaki telomeraz aktivitesi için model, (a) Bir telomerdeki DNA'nın ucunda dört guanin içeren guanince zengin tekrarlan gösteren bir diyagram ve kısa bir RNA kalıbı içeren telomeraz enzimi, (b) Telomerazla katalizlenen guanince zengin dizinin uzama basamakları. Telomeraz aktivitesinden sonra, kesintili zincir primeraz yardımı ile bir RNA primeri ile eşleşebilir ve DNA polimeraz ve ligazla kesintili zincir tamamlanabilir.
Genetik bir bakış noktasından okaryotik hücreler iki formda bulunabilirler: haploit veya diploit. Diploit hücreler her kromozomun iki kopyasına sahipken, haploit hücreler her kromozomdan bir kopya içerirler. S. cerevisiae'nin hücreleri daima haploit (vejetatif) durumda bulunabilirler (16 kromozomlu). Fakat seyrek olarak iki haploit maya hücresi birleşebilir ve diploit bir hücre (32 kromozomlu) ortaya çıkarabilirler (bkz. Şekil 14.14). Bu durum çok hücreli hayvan ve bitkilerdeki durumla karıştırılmamalıdır. Bu organizmalarda diploit faz organizmanın kendisinde varken, haploit faz sadece gametlerde oluşur. Mitozun replikasyondan sonra bir hücrede kromozomların yoğunlaşması, bölünmesi ve her bir yavru hücre için iki sete ayrılması olduğunu hatırlayınız (Şekil 14.13»). Haploit S. cerevisiae hücrelerinde (Şekil 14.14»), hücre başına 16 kromozom sağlamak için her hücre bölünmesinden önce mitoz olur. Mayoz diploit durumdan haploit duruma geçme olayıdır. Mayoz iki bölünmeyi kapsar. İlk mayotik bölünme genetik durumun diploitden haploite dönüşümünü sağlayan homolog kromozomların hücrelere dağılımını içerir. İkinci mayotik bölünme esas olarak mitozun aynısı olup, iki haploit hücre bölünerek toplam dört haploit gamet (askosporlar, Şekil 14.14) oluşur.
14 7 • Ökaryotik Genetiğe Genel Bakış • 457
Saccharomyces cerevisiae'nin kromozomlarından
• Şekil 14.13 Işık mikroskopunda mitoz. Nükleik asit ve kromozomları görünür yapmak için boyanmış soğan kök hücreleri, (a) Metafaz. Kromozomlar hücrenin merkezinde kromozom çiftleri oluştururlar, (b) Anafaz. Kromozomların ayrılması.
Mayada Eşleşme Olayı: Eşleşme Tipleri
Mayalar eşleşme tipleri adı verilen iki farklı hücre formuna sahiptir; buna erkek ve dişi gametlere analog bir olay olarak bakılabilir. Zıt tiplerin eşleşmesi sonucu diploit hücre oluşur. Tek bir diploit hücreden, her bir çifti eşleşme tipi olan dört gametlik bir yapı oluşur. Gametlerin içinde oluştuğu hücreye askus, aksusun içindeki hücrelere askosporlar denir (Şekil 14.14). Saccharomyces cerevisiae'nin iki eşleşme tipi a ve
birinin üzerinde MAT lokusu adı verilen bir bölge vardır. Bu bölgeye a veya a geni insert olabilir. Hangi gen bu lokusta bulunuyorsa MAT promotoru onun transkripsiyonunu kontrol eder. Eğer, bu lokusta a geni bulunuyorsa hücre a eşleşme tipine, a geni bulunuyorsa hücre a eşleşme tipine dönüşür. Maya genomunun başka yerlerinde de a ve a genlerinin kopyaları bulunmasına rağmen bu genler ekspresyon olmazlar. Bu suskun kopyalar insert olan genin kaynağıdır. Eşleşme tipi değişikliğinde (Şekil 14.15») uygun gen (a veya a) suskun olduğu bölgesinden kopyalanarak MAT bölgesine yerleşir ve orda daha önce bulunan genin yerini alır. Yani, eski eşleşme tipini sağlayan gen kesilerek atılır, yerine yeni eşleşme tipi gen insert olur. a ve a genleri manyetik teyp kasetlerine analog olarak alınıp bu olay kaset mekanizması olarak adlandırılmıştır. Hangi gen MAT lokusuna yerleşmişse o gen transkriplenecektir. Saccharomyces cerevisiae'nin a ve a genleri regü-
latör genlerdir. Diğer olaylara ilaveten bu genler eşleşme sırasında salgılanan a faktör veya a faktör peptid hormonlarının yapımını düzenlerler. Bu hormonlar zıt eşleşme tipi hücrelere bağlanarak onların hücre yüzeylerinde sebep oldukları değişmelerle hücrelerin kaynaşmasına (füzyon) imkan sağlar (Şekil 14.16*). Zıt tipteki eşleşme hücreleri bir araya gelince, diploit bir zigotla sonuçlanan hücre ve nükleus füzyonu gerçekleşir (Şekil 14.16). Zigot mayozla haploit vejetatif forma dönüştürülerek yaşam döngüsü tamamlanır (Şekil 14.14).
a olarak adlandırılır. Bir hücrenin a veya a olması genetik olarak belirlenir ve a tipi hücreler sadece a tipi ile eşleşirler. S. cerevisiae'nin bazı haploit suşları a veya a olarak kalırken, diğer suşlar bir eşleşme tipinden ötekine geçebilirler. Şekil 14.15'te gösterilmiş olan olayda eşleşme tipindeki bu değişimin sebebi bir genin eklenmesinden (insert) kaynaklanır.
14.7 Kavramların Gözden Geçirilmesi Ökaryotik hücreler eşeyli üreme ile eşleşebilir ve DNA alışverişinde bulunabilirler. Eşeysiz hücre bölünmesi sırasında kromozomların uygun dağılımı mitozla sağlanır. Mayozla oluşan haploit hücreler kaynaşarak diploit zigotu oluştururlar. Mayada iki eşleşme tipi vardır ve maya hücreleri bir tipten diğerine dönüşebilirler. Nükleer füzyon
Hücre füzyonu
Eşeysiz çoğalma (mitoz)
Askosporlar (haploid)
Askus
• Şekil 14.14 Tipik bir maya olan Saccharomyces cerevisiae'nin yaşam döngüsü. S. cerevisiae'nin bir haploit hücresi 16 kromozom taşır.
458 • Bölüm 14 • Ökaryotik Hücre Biyolojisi ve Ökaryotik Mikroorganizmalar Sessiz «-tip esas gen
/
Promotor MAT Lokusu a-type gen
Eşleşmenin değiş-tokuşu
Sessiz a-tip esas gen «eşleşme tipindeki hücre
Ifllî a-tip genin atılması
a-tip genin kopyası
a-eşleşme a-tip gen
tipindeki hücre
(a) Diploid tomurcuk Diploid nükleus
• Şekil 14.15 Mayanın a eşleşme tipinden a eşleşme tipine değişimini sağlayan kaset mekanizması. Aktif lokusa (okuyucu-başlık) hangi "kaset" yerleşmiş ise eşleşme tipini o belirler. Burada gösterilen olay tersinirdir. Dolayısı ile a eşleşme tipi de a'ya dönüşebilir. •
Eğer insan hücrelerinde diploit kromozom sayısı 46 ise insan sperminde kaç kromozom bulunur?
•
Haploit bir Saccharomyces hücresinin diploit bir hücreye nasıl dönüştüğünü açıklayınız.
RNA Splaysı (Ayıklanması) ve Ribozimler Bölüm 7'de transkripsiyon işlemi ile birkaç tip RNA'nın yapıldığını öğrendik: mesajcı RNA, transfer RNA ve ribozamal RNA (et*s kısım 7.10). Ökar-
yotlarda ve daha seyrek olarak prokaryotlarda intron adı verilen ara RNA dizileri kesilip kaldırılır. Buna RNA işlenmesi denir. mRNA'nın işlenmesi sonucu geriye ekzonlar kalır. Bunlar protein kodlama yapan RNA dizileri olup, birbirlerine bağlanarak olgun (işlevsel) mRNA'ları yaparlar (<3°G Kısım 7.1). İntronlarm kesilip atılması ve ekzonların biri birine bağlanması (kesip-bağlama) olayı spalys (splice) olarak adlandırılır. Splaysozom, RNA'ya Başlık Takılması ve Poly-A Kuyruğu
Kesip-bağlama splaysozom adı verilen birkaç ribonükleoproteinden (hem RNA ve hem protein içeren enzimler) yapılmış bir kompleksle yapılır. Splaysozom ribozom büyüklüğünde büyük bir makromoleküler kompleks olup, yapıya direkt girmeyen diğer protein faktörlerle beraber, bu kompleksin aktivitesinde 100'ün üzerinde protein görev alır. Splaysozom intronlarm kesilip atılması ve ekzonların birleştirilerek olgun bir mRNA oluşturulmasında görev yapar (Şekil 14.17»). RNA'nın ayıklanması mRNA nükleusta iken olur. Kesilip bağlanan bölgelerde bazı korunmuş bazlar bulunduğuna ve intronun bir lariat yapı (kement) şeklinde kesilip alındığına dikkat ediniz (Şekil 14.17). Bu kesilmiş nükleotitler daha sonra
Eski haploid hücreler (b)
• Şekil 14.16 Hansenula v/ingei mayasında eşleşme olayının elektron ntikrografları. (a) İki hücre temas noktalarında birleşmiş ve iç oluşumlarını birbirlerine doğru göndermişlerdir, (b) geç faz eşleşmesi. İki hücrenin nükleuslan birleşmiş ve eşleşen hücrelerin sağında diploit bir yapı (tomurcuk) meydana gelmiştir. Bu tomurcuk sonuçta ayrılır ve diploit bir hücre soyunun progenitörü (öncüsü) olur. Hansenu/a'nın tek bir hücresi yaklaşık 10 /xm çapındadır.
hücre tarafından serbest nükleotitlere parçalanırlar. Birçok mRNA'da tek bir gen içinde birden fazla intron bulunabilir. Dolayısı ile olgun mRNA oluşumu sırasında onların splaysozom tarafından tanınıp kesilip atılmalarının önemi açıktır. Ökaryotik mRNA'nın işlenmesinde iki diğer özel basamak vardır. Her iki basamak ayıklama olayından ve olgun mRNA'nın translasyon için sitoplazmaya taşınmasından önce nükleusta gerçekleşir. İlk basamak başlık takılması (capping) olarak adlandırılır ve esasen trankripsiyon bitmeden önce gerçekleşir. Başlık takma mRNA'nın 5'-fosfat ucuna metillenmiş bir guanin nükleotitinin
eklenmesidir. Seyrek olarak başlık takma sırasında ökaryotik mRNA'nın 5' ucuna yakın diğer nükleotitler de modifiye olurlar. En son işlenme basamağı pre-mRNA'nm 3' ucunun kırpılması ve poli-A kuyruğu adı verilen yaklaşık 200 adeniletlık yapının oluşturulmasıdır. Hem eklenmiş başlık hem de poli-A kuyruğu translasyona uğramaz. Guanozin başlığı, özel başlık bağlanma proteinleri sayesinde mRNA ve ribozom arasında başlama kompleksinin oluşumunu kolaylaştırarak translasyona yardımcı olur (cf^> Kısım 7.16). Poli-A kuyruğunun işlevi daha az bilinmektedir. Bu kuyruk muhtemelen ökaryotik mRNA'ları RNAaz'larla hızlı parçalanmaya karşı koruyucu bir işleve sahiptir. Alternatif (veya ilave) olarak poli-A kuyruğu, translasyon aygıtına translasyona hazır şeyin diğer bazı RNA formlarından çok onun mRNA olduğu-
14 8 • RNA Splaysı (Ayıklanması) ve Ribozimler • 459 Ekzon 1 Intron Ekzon 2 5' ı—naMıwı»ııınııınniBİııı*a 3' (a)
Korunmuş bazları
i
Splaysozomun oluşması
Splaysozom
(b)
5'kesim bölgesinden kesilme, kement (lariat) oluşumu
\
I
ntron (lariat)
4
Parçalanır
3' kesim bölgesinden kesilme, ekzonların bağlanması
5' MMMMMHHH 3 Ekzon1 Ekzon 2
1
Olgun mRNA
Translasyon için sitoplazmaya taşınır
(e) • Şekil 14.17 Splaysozomun aktivitesi. Bir ökaryotta protein kodlayan bir gen transkriptinden bir intronun kesilip atılması, (a) Tek bir intron taşıyan pre(öncül)-mRNA. 5' kesim bölgesinde GU dizisi, 3' kesim bölgesinde AG dizisi korunmuştur. Aynca iç kısımda dallanma bölgesi olarak hareket eden bir A vardır (b) Splaysozomu oluşturmak üzere RNA üzerine birkaç ribonükleoprotein partikülü bağlanır (kahverengi gösterilenler). Bu partiküllerin her biri işleme mekanizmasında farklı rol alan küçük RNA molekülleri içerirler, (c) 5' kesim bölgesinin kesilmesi ve bir dallanma noktasımn oluşması eş zamanlı olur. (d) İki ekzon birleşirken 3' kesim bölgesi kesilir. Tüm olay sırasında iki fosfodiester bağının kırıldığına ve ikisinin kurulduğuna dikkat ediniz, (e) Son ürünler birleşmiş ekzonlar (mRNA) ve kesilip atılmış intronlardır.
da birkaç ribozim bulunmuşsa da, bunlar daha çok ökaryotlarda yaygındır. Ribozimler protein enzimler gibi çalışarak "aktif bölgeleri" ile substratlara bağlanır ve onların ürüne dönüşümünü katalizlerler (ÖOB Kısım 5.5). Okaryotik ribozimlerin çoğu, kendi kendini ayıklayan intronlar olup, bunlar kendilerini bir RNA molekülünden kesip ayıran ve bitişik ekzonları biri birine bağlayan enzimlerdir. En iyi çalışılmış ribozim bir protozoan olan Tetrahymena'da bulunur. Bu ribozim 413 nükletidden oluşan bir intron olup, guanozinin varlığında kendini daha uzun bir prekürsör (öncü) rRNA'dan keserek ayırır. Bu olay sırasında ribozim iki bitişik ekzonu birleştirerek olgun rRNA'yı oluşturur (Şekil 14.19). Tetrahymena ribozimi dizi spesifik bir endoribonükleaz
olup syplaysozoma analog bir reaksiyon gerçekleştirir (Şekil 14.17). Prekürsör RNA'dan ayrılınca ribozimin kendisinden kısa bir oligonükleotit parçası kesilir atılır ve bunu takiben ribozim halkasal bir yapı kazanır (Şekil 14.19). Her ne kadar kendi kendini işleyen ribozimler aynen bir protein enzim gibi spesifik bir reaksiyonla katalizasyon yaparlarsa da bunlar protein enzimlerden kilit bir yönle ayrılırlar. Protein enzimlerden farklı olarak, kendini işleyen bir ribozim bu reaksiyonu sadece bir kez yapar. Örneğin; Tetrahymena riboziminin halkasal parçası sonunda hücre tarafından parçalanır (Şekil 14.19 •). Bu şekilde kendini işleyen ribozimlere (reaksiyonda eksojen bir guanozine ihtiyaç duyduklarından) tümüne birden grup-I intronlar adı verilir. Bu grup intronlar çeşitli diğer ökaryot ve bazı mitokondri ve kloroplast genlerinde bulunmuşlardır. Pre-mRNA (pirimer transkript)
Ekzon 1
Ekzon 2 1
Ribozimler
Bazı RNA tipleri hücrede hem enzim ve hem de RNA olarak iş görürler. Ribozimler adı verilen katalitik RNA'lar bir seri önemli hücresel reaksiyonlarda görev alırlar. Her ne kadar prokaryotlar-
Ekzon 3
5' -Başlığı 3' -Poliadenilasyon Dur
Başlama 5' - Başlığı
nu gösteren "translasyon olabilir" ligin bir moleküler sinyali gibi hareket edebilir. Okaryotik mRNA'nın oluşumunu sağlayan üç basamak Şekil 14.18«'de özetlenmiştir. Ökaryotlarda olgun, işlevsel bir mRNA'nın sentezi, prokaryotların çoğu geni için geçerli olan transkripsiyonla direkt işlevsel mRNA'larm üretilmesine göre çok daha karmaşık ve dinamik bir olay olup birkaç basamakta gerçekleşir (ocfe Kısım 7.13).
Poly-A bölgesi Dur
Başlama
Poly-A kuyruğu 3'
i
+- mm
Olgun mRNA
Dur
Başlama
Protein
İntronlar kesilir
I
ÎAAAAAAA Sitoplazmaya taşınım ve translasyon
• Şekil 14.18 Ökaryotlarda pre-mRNA'nın mRNA'ya işlenimine genel bir bakış. İşlenme (splays) basamaklan 5' ucuna bir başlık takılmasını, intronlann çıkarılmasını ve 3' ucunun kırpılarak poli-A kuyruğunun eklenmesini kapsar. Translasyon sırasında kullanılacak başlama ve stop kodonlannın yerleri de belirtilmiştir.
460 • Bölüm 14 • Okaryotik Hücre Biyolojisi ve Okaryotik Mikroorganizmalar Guanozin
Ekson 1 (a)
intron
Ekson 2
•
Splays (ayıklama) nedir? Nerede oluşur ve oluşması için ne gereklidir?
• Ribozim nedir? Tüm grup-I intronlarm enzimatik aktivite için ihtiyaç duyduğu substrat hangisidir?
-rRNA prekürsörü (öncülü)
III Kesilmiş intron (ribozim)
OKARYOTİK MIKROBIYAL ÇEŞİTLİLİK
Burada mikrobiyal Eukarya'nm çeşitliliğini keşfedeceğiz. Bunlar; protozoa, cıvık küfler, funguslar ve algleri içerir. Bu organizmalara filogenetik bir bakışla giriş yapacağız. Mikrobiyal ökaryotların biyolojileri açısından oldukça çeşitli olduklarını ve bazılarının filogenetik olarak oldukça gelişmişken, ilkel ökaryotların özelliklerini hala korumuş olan diğer bazılarının ise çok daha az gelişmiş olduklarını göreceğiz.
Eukarya'mn Filogenisi
Parçalanma
• Şekil 14.19 Bir protozoan olan TetraJıymenatain kendi kendisini işleyen ribozomal intronu. Böyle moleküllerde işlenme reaksiyonu için kritik öneme sahip önemli oranda ikincil yapı bulunur, (a) Bir ribozomal RNA öncüsü (prekürsörü) 413 nükleotitlik bir intron taşır, (b) Guanozin nükleotiti ilave edildiğinde intron kendi kendini işleyerek kaldırır ve iki ekzonun birleşmesini sağlar, (c) Kesilen intron daha sonra 15 nükleotitlik bir fragmanını kaybeder ve halkasal bir yapı kazanır.
Protein enzimlerin baskın olduğu bir dünyada ribozimler neden ortaya çıkmış olabilirler? Ribozimlerin, hücrenin esas katalistleri olan proteinlerin ortaya çıkmasından önceki bir "RNA yaşamı" adı verilebilecek daha basit bir yaşam formunun günümüze kalan kalıntıları olabileceği ileri sürülmüştür. Gerçekten de hücresel bir yapı ortaya çıkmadan çok önce bir RNA dünyasının olduğu düşünülmektedir. Bu konuyu Bölüm ll'de tartıştık (anç> Kısım 11.2). Her ne kadar hemen bütün biyokataliz olaylarında proteinler RNA enzimlerinin yerini almışsa da, RNA ile katalizlenen birkaç reaksiyon hala bulunmaktadır. Bunlar; ya RNA dünyasından geriye kalan son "fethedilmemiş kaleler" veya alternatif olarak protein enzimlerinin yapamadığı veya zayıf bir katalizleme yaptıkları reaksiyonları mümkün kılan yapılar olarak günümüze taşınmışlardır. 14.8 Kavramların Gözden Geçirilmesi Okaryotik pre-mRNA'larm işlenmesi özel olup 3 farklı basamakta gerçekleşir: ayıklama, başlık takma ve kuyruk takma. Bazı diğer transkriptlerde intronlar kendilerini işlerler ve RNA'nın kendisi reaksiyonu katalizler. Katalitik aktiviteye sahip RNA moleküllerine ribozimler denir ve hücrede önemli rol oynarlar.
Evrensel filogenetik yaşam ağacından 11.13), Eukarya'nm kendi filogenetik domainini oluşturduklarını ve bakterilerden çok arkeiklere benzediklerini gördük. Eukarya'nm bu filogenisi sitoplazmik ribozomlarm küçük alt ünitesinden (SSU) elde edilen 18S ribozomal RNA dizisinin karşılaştırılmasından elde edilmiştir (<**» Kısım 11.5). Birçok mikrobiyolog filogenetik ağaçların özellikle SSU rRNA başta olmak üzere karşılaştırmalı dizi analizleri ile mümkün olabileceği üzerine hemfikirdir ve bunlar elimizde olan en iyi moleküler filogenetik ağaçlar olup genellikle mikrobiyal filogeniyi doğru bir resimle ortaya koyarlar. Ancak, prokaryotik domainler olan bakteri ve arkeikler için bu bağlamdaki görüş birliği ökaryotlar için olandan çok daha güçlüdür. Bazı ökaryotların gen ve proteinlerinin dizi karşılaştırılmaları 18S rRNA'dan daha farklı bir filogenetik ağaç topolojisi ortaya koymuştur. Bu noktada Eukarya filogenisinin en iyi temsilinin hangi filogenetik ağaçla olduğu konusunda bir görüş birliği yoktur. Bu nedenle burada okaryotik filogeniyi iki zıt şekilde resmeden iki filogentik ağaç vereceğiz (Şekil 14.20»). Bunun için ilk ökaryotları günümüz ökaryotlarından açık biçimde farklı gösteren SSU ağacı ile başlayacağız. Daha sonra Eukarya'nm evrimi sırasında gerçekleşip filogentik büyük bir ayrılımla sonuçlanan alternatif bir filogenetik ağaç üzerinde duracağız. Hem SSU ve hem de alternatif filogenetik ağaçlar yaşamın 3 domainden oluştuğunu göstermektedir. Bu filogonetik ağaçların uyuşmazlığı genellikle okaryotik ataların detayları konusunda olmaktadır. Eukarya'nm Ribozomal RNA Ağacı
Moleküler filogeni döneminden önce okaryotik organizmalar dört alem (kingdom) içinde gruplanmışlardır; Bitkiler, hayvanlar, funguslar ve çeşitli mikrobiyal ökaryotları içeren protistler. Bu 4 alem
14 9 • Eukarya'nın Filogenisi • 461
Microsporidia (Encephalitozoon)
Tripanozomlar (Trypanosoma) öglenoidler (Euglena) Cıvık mantarlar Entamoeba (küfler) Silliler
Apicomplexa (Plasmodium) Dinoflagellatlaı>
Hayvanlar Çok hücreli Bitkiler "Taçlanmış" Yeşil algler —Kırmızı algler
Bakteriler
(a) D i n o
Kahverengi flagellatlar Apicomplexa algler Silliler \ (Plasmodium) Diatomlar Domisetler Yeşil algler Kırmızı
Hayvanlar
Bitkiler
Microsporidia Funguslar
Parabasilidler (Trichomonas) Diplomonadlar (Giardia) Tripanozomlar (Trypanosoma) Öglenoidler (Euglena)
Cıvık küfler
• Şekil 14.20 Eukarya'nın filogenetik ağacı, (a) Karşılaştırmalı 18S ribozomal RNA'ya dayalı filogenetik ağaç. Endosimbiyontlar (mitokondri ve kloroplastlar)'ın Bakteri domaininden nasıl orijin aldıklarına dikkat ediniz, (b) Diğer ökaryotik gen ve proteinlere dayalı olarak elde edilmiş başka bir filogenetik ağaç. Filogenetik olarak (a)'da "erken" olarak belirtilmiş soylar hem (a) ve hem de (b)'de koyu gösterilmiştir.
bir filogenetik alem içinde toplanan prokaryotlarla beraber canlı organizmaların 5-alemini oluşturdu Ancak, SSU rRNA dizilemesi çalışmaları açıkça göstermiştir ki, beş-alemli sistemde çok hücreli bitki ve hayvanların evrimsel önemleri oldukça abartılırken, prokaryotların geniş filogenetik çeşitliliği ise neredeyse gözden uzak tutulmuştur. SSU ağacı bu durumu düzeltmiş ve ökaryotlar için oldukça merak uyandıran bir filogeni ortaya koymuştur. Eukarya'nın SSU filogenisinin bazı detayları Şekil 14.20a'da görülmektedir. Ökaryotik soy ağacı
bakteri ve arkeiklerin kökenleri ile aynı perspektife konduğunda, önemli organeller olan mitokondri ve kloroplastın bakterilerden orijin aldıklarını ve arkeiklerin birçok yönleri ile bakterilerden çok ökaryotlara
benzediklerini göstermektedir. Bol miktarda kanıt bu yargıyı desteklemektedir. Ayrıca, filogenetik SSU ağacında birkaç mikrobiyal ökaryotun derin köklerinin olduğunu görmekteyiz (Şekil 14.20fl). Tersine, ökaryotik kökenin "en tepesinde" yer alan bitki ve hayvanların oldukça gelişmiş organizmalar olduklarını görmekteyiz. Algler ökaryotik ağaç-
462 • Bölüm 14 • Okaryotik Hücre Biyolojisi ve Okaryotik Mikroorganizmalar
ta bir dağılış gösterirken (daha çok nispeten yeni olanlar), funguslar (Oomisetler hariç) oldukça dar ve nispeten yeni bir filogenetik ünite olarak karşımıza çıkmaktadır (Şekil 14.20a). İlk Ökaryotlar
Ökaryotlarm rRNA soy ağacı, mikroorganizmaları en az gelişmiş mikrobiyal ökaryotlardan, "taçlanmış türler" diyebileceğimiz en gelişmiş ökaryotlara kadar basamak basamak gösterir (Şekil 14.20a). İlgi çekenler ise filogenetik olarak "erken" ökaryotlar olan ve eski atalarından günümüze kadar gelen, en az gelişmişlik gösteren günümüz modern mikroorganizmalarıdır. rRNA soy ağacı Giardia gibi diplomonadların, Encephalitozoon gibi mikrosporidlerin ve Trichomonas gibi gibi parabasilidlerin erken ökaryot olduklarını açıkça göstermektedir. Böyle bir yargıya varmak için bu organizmaların taşıdıkları diğer özellikleri nelerdir? Giardia, Trichomonas ve Encephalitozoon diğer
ökaryotlardan önemli bir özellik ile ayrılırlar: bunların hepsi mitokondri taşımayan ökaryotlardır. Bu
organizmaların hepsi membranla çevrili bir nükleusa sahipken, mitokondrileri yoktur. Trichomonas gibi bazıları hidrojenozomlara sahipken (bkz. Kısım 14.2 ve Şekil 14.4), diğerleri değildir. Acaba bu organizmalar hiç endosimbiyoza uğramamış eski ökaryotlarm kalıntıları mıdır? Böyle bir yargıya SSU ağacının topolojisi ile varılsa da, genetik ve diğer çalışmalar bunu desteklememektedir. Hassas nükleik asit belirleme metotları ve genomik dizi verileri kullanılarak, mitokondri taşımayan böyle ökaryotlarm nükleuslarında bakterilerden orijin alan genlerin bulunduğu ortaya konmuştur. Bu durum, aerobik ökaryotlarm bugün nükleuslarında bulunan mitokondrial genlere eşdeğerdir (bkz Kısım 14.4 ve 15.7). Bu bize mitokondri taşımayan ökaryotlarm da bir zamanlar endosimbiyontlara sahip olduklarını, fakat bilinmeyen bir sebeple onları hücrelerinden dışarı attıklarını ve bu ortaklıktan sadece kendi nükleuslarında kalabilmiş bakteriyal spesifik genlerin günümüze geldiğini göstermektedir. Mitokondri taşımayan ökaryotlarm bir zaman önce bu organele sahip oldukları yönündeki diğer bir delil direkt gözlemle olmuştur. Örneğin; bilim adamları Giardia'nm mitokondri benzeri proteinler yaptığını ve bu proteinlerin hücrede bir araya geldiklerini gözlemlemişlerdir. Yüksek ayırımlı elektron mikroskopta bu protein kümelerinin çift tabaka membranla çevrili oldukları gösterilmiştir. Mitokondrilerin bu kalıntılarına mitozomlar adı verilmiş ve daha sonra bu yapıların SSU rRNA dizisi (Şekil 14.20a) bakımından Giordia'dan çok daha gelişmiş olan Entemoeba gibi birkaç diğer mitokondri taşımayan ökaryotta da bulunduğu belirlenmiştir. Mitozomların enerji eldesi için birkaç protein içeren, mitokondrilerin oldukça dejenere formları oldukları ileri sürülmüştür. Hidrojenozom, mitokondri ve şimdi de gördüğümüz gibi mitozomların varlığına dayanarak,
mitokondri taşımadığı düşünülen okaryotik organizmaların esasen hiçbir zaman öyle olmadıkları düşünülmektedir. Solunumsal veya fermentatif bir organelle endosimbiyotik bir ilişkiye hiç girmemiş okaryotik mikroorganizmalar ya tamamen ortadan kalkmış ya da bilim adamları henüz onları keşfedememişlerdir. Eğer böyle organizmalar varsa bunların organellere sahip olmaması ve nükleuslarında bakterilerden gelen genlerle ilgili tüm kanıtlardan yoksun olmaları gerekir. Ayrıca, 18S rRNA dizisine dayanarak böyle organzimaların ökaryotlarm filogenetik soyağacmda Giardia''dan bile önce dallanma göstermeleri gerekir (Şekil 14.20a). Eğer varsa, hiç endosimbiyont içermemiş hücrelerin bulunması ökaryotlarm mikrobiyal çeşitliliğini çalışan bilim adamları için heyecan verici bir hedeftir. Bu problemi çalışmak için yaklaşımlardan biri özellikle anoksik, orta derecede sıcak habitatlar (dünyanın ilk zamanlarındakine benzer şartlar, Kısım 1.1.1) başta olmak üzere çeşitli habitatlardan rRNA'larm toplu örneklerinin alınması olmalıdır (ona Kısım 11.7). Eğer böyle organizmalar bugün yaşıyorlarsa, 18S rRNA'ya özgü PCR primerleri kullanılarak belirlenebilirler. SSU soyağacı üzerinde Giardia'dan önce dallanma gösterecek rRNA'ların belirlenmesi, onları sentezleyen organizmaların belirlenip kültürlerinin yapılmasını mümkün kılacaktır. Böyle organizmaların birçok olağan dışı özellikler gösterecekleri tahmin edilmektedir. Mikrosporidia Problemi
Mikrosporidler evrimsel bir muammadır. SSU soyağacına dayanılarak (Şekil 14.20a) bu ilk ökaryotlar küçük (2-5 /um) parazitik hücreler olup, mitokondri taşımayan diğer ökaryotlardan yapı olarak daha da geride bulunurlar. Encephalitozoon gibi mikrosporidler küçük genomlara sahip olup Golgi kompleksi ve hidrojenozomlar dahil hiçbir organel taşımazlar (mitozomların bulunup bulunmadığı ise bilinmemektedir). Örneğin, Encephalitozoon'un genomu Escherichia coli'ninkinden 1.5 Mbç küçük olup sadece 2.9 Mbç büyüklüğündedir. Gerçekten de mikrosporidlerin "ilkel" bir ökaryotta olabilecek özelliklere sahip olması, onların rRNA soyağacı üzerindeki yerleri ile uyuşmaktadır (Şekil 14.20a). Ancak rRNA'nın bu grupta çok hızlı bir evrimleşme göstermesi (Şekil 14.20a'daki soyağacmdaki uzun dalla belirtilmiştir), mikrosporidlerin SSU soyağacı üzerindeki yerinin bazıları tarafından sorgulanmasına yol açmıştır. Bu durum, böyle mikroorganizmaların soy ağaca yerleştirilmesinde sorunlar yaratabileceklerini göstermektedir. Bu problemi çözmek için mikrosporid ve diğer mitokondri taşımayan ökaryotlardan diğer gen ve proteinlerin dizi çalışmaları yapılmıştır ve bunlar hep birlikte bize şimdi göreceğimiz gibi oldukça farklı evrimsel bir durumu anlatmaktadır. Okaryotik Evrime Alternatif Bir Bakış
Bazı okaryotik gen ve proteinlerin moleküler dizi analizlerinden elde edilen soyağaçları rRNA'ya
14.10 • Protozoa • 463
dayalı soyağaçlarmdan dramatik biçimde farklılık gösterirler (Şekil 14.20b). Tübülin proteinleri, RNA polimeraz ve ATPaz alt üniteleri dahil birkaç molekülün dizileri bu soyağaçlarmı oluşturmak için kullanılmıştır. Ancak bu konudaki en çarpıcı bazı bilgiler rRNA gibi mükemmel filogenetik belirteçler olan ısı-şok proteinleri ve ilgili şaperoninlerin dizilerinden elde edilmiştir (oo& Kısım 7.17 ve 8.9). Bu alternatif ökaryotik soyağaçları SSU rRNA soyağaçları ile nasıl karşılaştırılabilir? İlk olarak SSU rRNA ağacının önemli bir özelliği olan ve Giardia gibi en az gelişmiş organizmalardan en gelişmiş çok hücrelilere olan evrimsel merdiven burada yoktur (Şekil 14.20a). Bunun yerine, alternatif soyağaçları ayrılmanın ökaryotlarda peş peşe geldiğini ve bu ayrışımın bilinen birçok ökaryot organizmayı kapsamadığını ortaya koymaktadır (Şekil 14.20b). Her ne kadar bu alternatif soy ağaçları, "atanın soyu" formundaki bir filogenetik soyağacından (Şekil 14.20a) daha az tatminkar bir resim ortaya koymakta ise de en son moleküler dizi verileri bunu göstermektedir. İkincisi, alternatif soyağacmda funguslar ve hayvanlar yakın ilişkili görülürler. Üçüncü olarak, SSU rRNA soyağacmda oldukça erken dallanma gösteren mikrosporidlerin burada özellikle gelişmiş funguslara yakın oldukları görülmektedir (Şekil 14.20). İlginç olan, mikrosporidlerin bazı yönleri ile fungus sporlarına benzeyen küçük enfektif spor benzeri yapılarla bulaşmalarıdır. Isı-şok genlerinin çalışılması sonucu bakteriyal ısı-şok genlerinin (mitokondrilerdekilere benzer) Encephalitozoon'da belirlenmesi ile fungal/mikrosporidium bağlantısı sağlamlaştırılmıştır. Bu durum, bu organizmaların bir zamanlar mitokondriye sahip olduklarını güçlü bir şekilde ortaya koymaktadır.
şeyin bir yansımasıdır. Karşılaştırmalı dizi sonuçları elde edildikçe ve diğer çalışmalar (daha önce bahsedilen mitozomların keşfi gibi) ökaryotik biyolojinin yeni yönlerini ortaya koydukça, ökaryotların gerçek filogenisi en sonunda ortaya konacaktır. Mikrobiyologlar SSU rRNA soyağaçlarınm bazı soruları cevaplayabileceği ve ökaryotların en son filogenisinin bu her iki soyağacından yararlanılarak ortaya konabileceği konusunda hemfikirdir. Şimdi mikrobiyal ökaryotların filogenisi hakkında bir düşünceye ve bu bağlamda cevaplanmamış birçok soruya sahibiz. Şimdi bu organizmaların kendilerini ele alalım. Buna protozoa ile başlayacağız.
Bu oldukça farklı iki ökaryotik filogeni resminden hangi yargıya varılabilir? Bir kere şu yargıya varabiliriz; ökaryotların gerçek filogenisi hala devam eden bir olgudur. Diğer bir deyimle, Şekil 14.20'de gösterilen soyağaçlarınm her ikisi de ökaryotik filogeni üzerine "son sözü" söyleyemez. İki filogenetik ağacın uyuşmaması ökaryotların evrimsel hikayeleri ve farklı moleküllerde bulunan filogenetik bilgi konusunda anlamadığımız birçok
Protozoanlar hücre duvarı olmayan ökaryotik tek hücreli mikroorganizmalardır (Şekil 14.21*). Bunlar genellikle renksiz ve hareketlidir. Protozoanlar ökaryotik doğaları ve çok büyük olmaları ile prokaryotlardan, klorofile sahip olmamaları ile alglerden, hareketli olmaları ve birçok durumda bir hücre duvarı taşımamaları ile diğer fungus ve mayalardan ve fruktifikasyon organları (fruiting bodies) oluşturmama özellikleri ile cıvık küflerden ayrılırlar.
(b)
(c)
•m14.9
Kavramların Gözden Geçirilmesi
Ribozomal RNA dizileri ile ökaryotik hücreler kendi evrimsel soy hatlarını (Eukaryd) oluştururlar. Giardia ve Trichomonas gibi bazı mikrobiyal ökaryotlar erken dallanma gösteren türler iken, soyağacımn en gelişmiş (taçlanmış) ökaryotları çok hücreli bitki ve hayvanları içerir. Diğer gen ve proteinlerin karşılaştırmalı dizi analizleri daha değişik bir evrimsel resmi ortaya koymaktadır. •
Hücresel yönden bakıldığında, ökaryotların gruplamasında beş-alem hipotezi neden yanlıştır? • Giardia gibi bir organizmanın bir insan hücresinden çok ilkel ökaryotlara daha yakın olduğunu gösteren delilleri özetleyiniz. • Eukarya'mn alternatif filogentik soyağaçları, SSU rRNA soyağacından temelde hangi yönlerden farklılıklar gösterir?
14.10
Protozoa
Anahtar Cinsler: Amoeba, Paramecium, Trypanosoma
(d)
• Şekil 14.21 Tipik protozoanlar. (a) Amip (Amoeba). (b) Tipik bir siliyat olan Paramecium (aynca bkz. Şekil 14.25). (c) Bir flagelli olan Dunaliella (bu flagelli kloroplast taşır ve bu nedenle bir alg olarak da kabul edilir), (d) İnsan kırmızı kan hücresinde büyüyen apikompleksli bir sporozoon olan Plasmodium vivax.
464 • Bölüm 14 • Okaryotik Hücre Biyolojisi ve Okaryotik Mikroorganizmalar
Ayrıca, daha önce bahsedildiği gibi protozoanlar filogentik olarak çeşitli olup Eukarya soyağacmda birkaç soy hattı üzerinde gözlenirler (Şekil 14.20). Protozoanlar çeşitli tatlı su ve deniz habitatlarında bulunurlar; büyük bir kısmı insan dahil diğer hayvanlarda parazitiktir ve bazıları toprakta ve ağaç yüzeyleri gibi havalı habitatlarda çoğalırlar. Protozoanların çoğu genellikle diğer hücreler gibi tanecik maddeler etrafında esnek membranları ile bir yapı oluşturup fagositoz adı verilen olayla onları yutar ve hücre içine alıp sindirirler. Bazı protozoanlar bakteri hücreleri veya küçük okaryotik hücreleri gullet (boğaz kanalı) adı verilen özel bir yapı ile yutarlar (bkz. Şekil 14.25). Kendi besinlerini "yakalayan" organizmalarda olduğu gibi, protozoanların çoğu hareketlidir. Aslında, bu organizmaların hareket mekanizmaları onları taksonomik alt gruplara ayırmada kullanılan kilit özelliklerden biridir (Tablo 14.1). Amipsi bir hareket şekline sahip protozoanlar Sarcodina, flagella kullanarak hareket edenler Mastigophora, silleri kullanarak hareket edenler Ciliophora olarak adlandırılmıştır. Dördüncü bir grup olan Apicomplexa genellikle hareketsiz olup hepsi yüksek yapılı hayvanlar için parazitiktir. Mastigophora: Flagelliler (Kamçılılar)
Flagella(kamçı)ların aktivitesi sayesinde bu protozoa gurubunun üyeleri hareketli olup hepsine birden flagelliler (kamçılılar) adı da verilir (Şekil 14.21c ve Şekil 14.22»). Flagelli protozoanlar Giardia gibi erken organizmalardan öglenoidlere ve dinoflagellatlara kadar rRNA filogenetik ağacı boyunca dağılım gösterirler (Şekil 14.20a). Bu nedenle okaryotik mikroorganizmaların birçok çeşidi bu tür hareketi habitatlarını değiştirmek için kullanırlar. Her ne kadar flagelli protozoanların çoğu serbest yaşayan organizmalarsa da insanlar dahil hayvanlar için bazıları parazitik veya patojeniktir. En önemli patojenik Mastigophora'lar tripanozomlardır. Bu organizmalar Afrika uyku hastalığı
dahil insan ve omurgalı hayvanlarda bir seri ciddi hastalığa sebep olurlar. İnsanları enfekte eden bir
Membran çırpması
Kırmızı Kan nucresı
Tripanozom hücresi
• Şekil 14.22 Tripanozomlar. Kandan elde edilen flagelli bir protozoan olan ve Afrika uyku hastalığının sebebi Thrypanosoma bruceii'iûn fotomikrografı.
cins olan Trypanosoma protozoanları yaklaşık 20 fim boyunda oldukça küçük, ince hilal şeklinde organizmalardır. Bunlar bazal bir gövdeden orijin alan tek bir flagelluma sahip olup, flagellum lateral biçimde hücre boyunca geriye doğru katlanmış olup yüzey membranının bir parçası ile kuşatılmıştır (Şekil 14.22). Hem flagellum ve hem de membran organizmanın kendini ileri doğru itmesinde kullanılır. Böylece kan gibi oldukça yoğun bir sıvı içinde bile etkili hareket mümkün olur. Kronik ve genellikle öldürücü Afrika uyku hastalığına sebep olan tür Trypanosoma brucei'dir. İnsanlarda parazit esas olarak kan dolaşımında yaşar ve çoğalır fakat hastalığın ileri aşamalarında merkezi sinir sistemi saldırıya uğrayarak beyin ve omurgada hasatlığın karakteristik nörolojik belirtisi olan yangı (enflamasyon) oluşur. Parazit konakçıdan konakçıya kan emici bir sinek olan ve sadece Afrika'nın bazı kısımlarında bulunan çeçe sineği Glosina sp. ile geçer. Parazit sineğin bağırsak boşluğunda çoğalır ve böceğin salgı bezi ve ağız kısımlarını istila eder ve buralardan sinek tarafından ışınlan yeni bir insana geçer. Diğer parazitik flagelliler arasında insanlara cinsel yolla bulaşan bir patojen olan Trichomo-
Tablo 14.1 Önemli protoza gı uplannın özellikleri Grup
Yaygın isim
Tipik temsilcileri
Mastigophora
Flagellatlar
Euglenoids" Sarcodina
Fototrofik flagellatlar Amipler
Ciliophora
Siliyatlar
Balantidium, Paramecium
Apicomplexa
Sporozoonlar
Plasmodium, Toxoplasma
Trypanosoma, Giardia, Leishtnania, Trichomonas
Euglena Amoeba, Entamoeba
'Bu grup aynca alglerle birlikte ele alınmıştır (bkz. Kısım 14.13 ve Tablo 14.3).
Habitatlar
Yaygın hastalıklar
Tatlı sular; hayvan parazitleri Tatlı sular; bazen denizler Tatlı sular ve denizler; hayvan parazitleri; rumen Tatlı sular ve denizler; hayvan parazitleri; rumen Esas olarak hayvan parazitleri; böcekler (parazitik hastalık taşıyıcıları)
Afrika uyku hastalığı, giardiaz, leyşmanyaz Bilinmiyor Amipli dizanteri (amibiyaz) Dizanteri Sıtma, toksoplazmozis
14.10 • Protozoa • 465
nas sayılabilir (£**> Kısım 26.13). Bu parabasilid protozoa (böyle adlandırılmasının sebebi diğer işlevlerinin yanında Golgi cihazına yapısal bir destek görevi yapan parabazal bir gövde taşımasıdır) omurgalı ve omurgasızların bağırsak ve ürogenital boşluklarında yaşar. Trichomonas'm birçok türü karınca ve diğer böceklerin bağırsağında yaşar («Efe Kısım 19.10). Hatta bazı flagelliler fototrofiktir. Bunlar kloroplast taşıyan flagellatlar olan öglenoidlerdir. Kloroplast onların fotosentetik çoğalmalarına imkan tanır. Ancak karanlıkta tipik bir öglenoid olan Euglena'nm hücreleri (bkz. Şekil 14.33a) kemoorganotrof olarak büyüyebilirler. Bu yönüyle bu organizmalar flagelli protozolardan fenotipik olarak ayırt edilemezler. Birçok öglenoid bilinmekte olup bunlar genellikle tatlı sularda yaşayan akuatik (sucul) organizmalardır. Ancak diğer flagelli protozoanlardan farklı olarak öglenoidler patojenik değildir (bkz. Kısım 14.13). Sarcodina: Amipler Sarkodinlere Amoeba (amipler) (bkz. 14.21a) gibi vejetatif fazda çıplak olan ve foraminiferler (Şekil 14.23») gibi vejetatif büyüme sırasında bir kabuk salgılayan amipler örnek verilebilir. Amipler tatlı suda yaşayan bir tür olup mikroskobik 15 /iım olanlardan hemen hemen çıplak gözle görülebilen 750 um hücrelere sahip olanlara kadar çeşitli büyüklüklerde olabilirler. Kabuklu sarkodinler birçok ilginç morfolojik formda bulunurlar. Kabulü formların en iyi bilineni foraminiferlerdir. Foraminiferler esas olarak kıyı sularında yaşayan deniz organizmalarıdır. Test adı verilen kabukları belirgin özellikler gösterir ve çoğunlukla oldukça gösterişlidirler (Şekil 14.23). Testler (kabuklar) genellikle kalsiyum karbonattan yapılmıştır. Hücre teste sıkıca bağlı değildir ve amip hücresi beslenme sırasında kısmen kabuktan dışarı çıkar. Ancak testin ağırlığından dolayı hücre genellikle dibe batar ve organizma sedimentlerin üzerindeki bakteri ve kırıntı-döküntüden oluşan partiküllü maddelerle beslenir. Foraminiferlerin kabukları çürümeye karşı nispeten dirençli olup kolayca fosilleşirler (örneğin, ingiltere'deki White Cliffs of Dover-Dover Beyaz Kayalıkları-eski bir denizin dibini kaplayan foraminifer kabukların-
• Şekil 14.23 Kabuklu amipler: foraminiferler. Gösterişli ve çok loblu test'e dikkat ediniz.
dan oluşmuştur). Bu organizmalar mükemmel fosil kaydı bıraktıklarından diğer herhangi bir protozoana göre bu organizmaların jeolojik zamanlar boyunca yayılışı hakkında daha iyi bir fikre sahibiz. Patojenik Amipler
Çeşitli çıplak amipler insan ve diğer omurgalıların ağız içi boşluğu veya bağırsak boşluğunu habitat olarak seçmiş parazitlerdir. Bu organizmalar bulundukları habitatlarda hücresel olmayan cıvık küfler (bkz. Kısım 14.11) tarafından da başvurulan bir hareket mekanizması olan amipsi hareketle yer değiştirirler (Şekil 14.24»). Parazitik bir amip için iyi bir örnek Entamoeba histolytica'dır (ÖOCJ Şekil
28.13). Çoğu kez enfeksiyon herhangi açık bir belirtiye sebep olmaz. Ancak bazı bireylerde E. histolytica bağırsak boşluğunda amibiyaz adı verilen ve kanlı bir ishal durumu ile kendini belli eden ülserleşmeye neden olur. E. histolytica'nın insandan insana bulaşması kist formunda olup su ve besinin dışkı ile kontaminasyonu sonucu olur. Ambiyazın etiyolojisi (nedeni) ve patojenitesini Kısım 28.8'de ele alacağız. Ciliophora: Siliyatlar
Siliyatlar yaşam döngülerinin bazı safhalarında siller (Şekil 14.25»; ayrıca bkz.Şekil 14.21b) adı verilen hareket işlevini yerine getiren yapılara sahip protozoanlardır. Siliyatlar ayrıca protozoanlar arasında iki nükleusa sahip yegane organizmalardır: sadece kalıtım ve eşeyli çoğalma ile ilişkili olan mikronükleus ve sadece RNA yapımı (transkripsiyon) veya hücre büyüme ve işlevinin çeşitli aşamalarında görev yapan makronükleus (bkz. Şekil 14.26). En iyi bilinen ve en geniş dağılım gösteren siliyatlar muhtemelen Paramecium cinsine ait olanlar olup (Şekil 14.25), grubun bu cinsi burada örnek olarak ele alınacaktır. Siliyatların çoğu belirgin bir ağız bölgesi aracılığı ile veya ağzın devamı olan bir boğaz kanalı ile tanecik maddeleri yutarak besinlerini sağlarlar (Şekil 14.25fo). Bir kere içeri alınınca, besin partikülleri boğaz kanalından aşağı taşınarak
. Şekil 14.24 Bir filmden alınan hareketli bir amip olan Amoeba proteus'un yandan görünüşü. Yukarıdaki şekil ile aşağıdaki şekil arasındaki zaman farkı yaklaşık 6 saniyedir. Oklar yüzey üzerindeki belli sabit bir noktayı göstermektedir. Tek bir hücre yaklaşık 80 fJbm çapındadır.
466 • Bölüm 14 • Öharyotih Hücre Biyolojisi ve Ökaryotih Mikroorganizmalar
getiren hayvanların ön midesinde (rumen, işkembe) («pöö Kısım 19.11) genellikle karakteristik bir zorunlu anaerobik siliyatler faunası bulunur. Bu protozolar burada sindirim ve fermentatif işlemler için yararlı bir rol oynarlar. Apicomplexa (Sporozoonlar)
• Şekil 14.25 Siliyat bir protozoan olan Paramecium. (a) Faz fotortükrografı. (b) Taramalı elektron mikrografı. Her iki mikrograftaki sillere dikkat ediniz. Tek bir Paramecium hücresi yaklaşık 60 /xm çapındadır.
Sporozoonlar olarak da adlandırılan apikompleksler zorunlu parazitik protozoanların büyük bir grubunu oluşturur (Şekil 14.21d). Bu parazitler sıtma (Plasmodium türleri), toksiplazmoz (Toxoplasma) ve kokidioz (Eimeria) gibi şiddetli hastalıklara sebep olurlar. Sporozoonlar hareketsiz bir olgun fazları bulunmamaları ile karekteristik olup bitki ve funguslarda olduğu gibi besinlerini membran aracılığı ile erimiş formda alırlar. Her ne kadar sporozoa ismi spor oluşumunu tarif etse de bu organizmalar bakteri, alg ve funguslarda görülen gerçek dinlenme sporları oluşturmayıp bunun yerine sporozüler adı verilen ve yeni bir konakçıya geçişte iş gören analog yapılar oluştururlar. Çeşitli omurgalı ve omurgasızlar Sporozoa için konakçı olup konakçı değişiminin gerçekleştiği bazı durumlarda yaşam döngüsünün bir kısmı bir konakçıda diğer kısmı başka bir konakçıda devam eder. Sporozoonların en önemli üyeleri ganellikle kuşlarda parazit olarak bulunan kokidia (coccidia) ve kuşları ve insan dahil memelileri enfekte eden Plasmodium cinsidir (sıtma parazitleri) (Şekil 14.21d). Özellikle gelişmekte olan ülkelerde sıtmanın insanlarda önemli bir hastalık olmasından dolayı, bu hastalığa ve sıtma parazitlerinin özelliklerine Kısım 27.5'de geniş yer ayıracağız. Sporozoon parazitler ilginç olarak apikoplast adı verilen bir plastid içerirler. Bu plastid kloroplastlarm dejenere formu olup bir kloroplastm pigmentlerine ve fotosentetik yeteneğine sahip değildir. Ancak, kloroplast gibi apikoplast da kendisine ait bir genoma sahip olup ekpresyon yapan birkaç gen taşır. Apikoplast işilevlerinin çoğu nükleus tarafından kodlanmakta olup, bu yönü ile mitokondriye benzerler. Apikoplastlar yağ asidi, izoprenoid ve hem biyosentezini gerçekleştirirler ve oluşan ürünler sitoplazmaya taşınırlar. Apikoplastın kırmızı bir
sitoplazmaya getirilir ve orada sindirim enzimlerinin salgılandığı bir yapı olan besin vakuolü içersinde hapsedilirler. Harekette görev alan sillerine ilaveten birçok siliyat, trikokistlere sahiptir. Bunlar dış hücre tabakasının altına bağlı uzun, kasılabilir ince filamentler olup protozoanun bir yüzeye yapışmasına imkan tanır ve bir predatör saldırısına uğradığında hücreye hücresel savunmaları uyarıcı sinyaller sağlarlar. Didinium gibi predatör siliyatta ise yutma işlemi trikokistlerin ava tutunup onu felç etmesi ile başlar. Birçok Paramecium türü (ve birçok diğer protozoan) endosimbiyotik bakteriler için konakçı olup, bakteriler bu organizmaların sitoplazmasmda veya makronükleusunda bulunurlar. Normalde konakçının çevreden almak zorunda olduğu vitamin ve diğer büyüme faktörlerinin, bazı durumlarda bu endosimbiyontlar tarafından sentezlendiği ve dolayısı ile bunların konakçıda besinsel bir rol oyandıkları konusunda deliller vardır. Karıncaların bağırsağında bulunan siliyat protozoanlara gelince; endosimbiyotik metanojenler hidrojenozomlarında piruvat oksidasyonundan gelen H2'yi kullanarak (Şekil 14.4) sonuçta atmosfere salman metanı üretirI» ler (ÖOÖ Kısım 19.10 ve Şekil 19.26b, c). Her ne kadar birkaç siliyat protozoan hayvanlar için parazitik ise de, bu şekilde bulunma siliyatlar için diğer protozoa gruplarına göre daha sınırlıdır. Esas olarak evcil hayvanlarda bir parazit olan Balantidium coli türü (Şekil 14.26) seyrek de olsa insan bağırsak boşluğunu enfekte ederek Enta• Şekil 14.26 insanlarda dizenteri benzeri hastalığa moeba histolytica tarafından sebep olunan dizanteri sebep olan siliyat bir protozoan Baianfidum coli. Koyu mavi benzeri belirtiler ortaya çıkarabilir. Ayrıca, geviş boyanan yapı makronükleustur.
14.11 • Cıvık Küfler • 467
alg hücresinin bir sporozoon tarafından endosimbiyotik yutulmasından orijin aldığı, kloroplastm sonuçta bozularak Sporozoon hücresinde oldukça özelleşmiş fotosentetik olmayan bir rol üstelendiği düşünülmektedir. İ 4.10 Kavramların Gözden Geçirilmesi Protozoanlar tek hücreli mikrobiyal ökaryotlar (Eukarya) olup tipik olarak hücre duvarı taşımazlar ve çeşitli yapılarla hareket ederler. Birçok protozoan insan ve diğer hayvanlar için patojeniktir. • Bir protozoan olan Paremecium'u, yine bir protozoan olan Trypanosoma'dan farklı kılan en az iki önemli özelliği belirtiniz. • Sporozoa diğer tüm protozoanlardan hangi yönleri ile ayrılırlar? • Bir alg olan Euglena neden aynı zamanda bir protozoan olarak kabul edilir?
Cıvık Küfler Anahtar Cinsler: Dictyostelium, Physarum
Cıvık küfler fenotipik olarak hem fungus ve hem de protozoanlara benzeyen mikrobiyal ökaryotlardır. Funguslar gibi (bkz. Kısım 14.12), cıvık küfler bir yaşam döngüsüne sahip olup spor üretebilirler. Ancak, protozoa gibi (bkz. Kısım 14.10), cıvık küfler hareketli olup katı bir yüzey üzerinde hızlıca hareket edebilirler (bkz. Şekiller 14.27-14.29). Filogenetik bir bakış açısından, cıvık küfler amipsi protozoanlara yakındır (Şekil 14.20a). Cıvık küfler, vejetatif formda tek bir amip şeklinde bulunan hücresel cıvık küfler ve vejetatif formda plazmodya adı verilen çeşitli büyüklük ve biçimlerdeki protoplazma yığınları halinde bulunan hücresel olmayan cıvık küfler olarak adlandırılan iki grup altında toplanabilirler (Şekil 14.27»). Cıvık küfler esas olarak dökülmüş yapraklar gibi ölü (çürüyen) bitki materyali, ağaç kütükleri üzerinde ve toprakta yaşarlar. Besinleri genel olarak bakteriler başta olmak üzere fagositozla yuttukları diğer mikroorganizmalardır. Cıvık küfler vejetatif bir formda uzun zaman durabilir ve en sonunda farklılaşmış spor benzeri dormant bir yapıda kala-
bilirler. Bunlar daha sonra çimlenerek aktif amipsi durumu oluştururlar. Hücresel Olmayan Cıvık Küfler
Physarum gibi cıvık küfler vejetatif fazda saysısız büyüklükte büyüyen bir protoplazma kütlesi olarak bulunurlar (Şekil 14.27). Amipsi hareketle hareket eden bu yapıda, plazmodyum bir kaide üzerinde akarken hareket sırasında karşılaşılan besin partikülleri yutulur. Amipsi hareket sitoplazmik akış sonucu gerçekleşir. Plazmodyumun ucu daha az kasıldığından ve yoğun (viskoz) olduğundan, sitoplazma daha az dirençle karşılaşacağı ön kısma doğru akar. Sitoplazmik akış, ökaryotik hücrelerin sitoplazmik zarlarının hemen altındaki ince bir tabakada bulunan mikrofilamentlerle sağlanır (bkz. Kısım 14.4 ve Şekil 14.1 ve 14.9). Hücresel olmayan cıvık küflerde sitoplazmik akış her biri ince sitoplazmik mebranla çevrili belli sayıda yönde olur (Şekil 14.27). Akışın kendisi hücresel metabolitlerin dağıtılması için bir mekanizmadır. Hücresel olmayan cıvık küflerden biri olan plazmodyum genetik olarak diploitdir (Şekil 14.27). Bu protoplazma kütlesinden bir sporangium ve haploit sporlar üretilebilirler. Uygun şartlar altında sporlar çimlenerek bir arada bulunan haploit hücreleri yaparlar. Bir arada bulunan hücrelerin kaynaşması (füzyon) tekrar diploit plazmodyumu ortaya çıkarır. Hücresel Cıvık Küfler- Dictyostelium Dictyostelium discoideum hücresel cıvık bir küf olup mikroorganizmalar arası yardımlaşma ve hücreler arası iletişim çalışmaları için bir model olarak kullanılmıştır. Bu komünal organizma göz alıcı bir yaşam döngüsüne sahip olup, vejetatif hücreler kümeler oluşturur, bir hücre kütlesi olarak hareket eder ve en sonunda içinde hücrelerin farklılaştığı ve spor oluşturdukları fruktifikasyon organları (fruiting bodies) üretirler (Şekil 14.28* ve 14.29»). Dictyostelium hücreleri besinden mahrum kaldıklarında kümeler oluşturup hücrelerin bireyselliklerini kaybettikleri fakat kaynaşmadıkları (füzyon) bir yapı olan yalancı plazmodyum (pseudoplasmodium)
oluşur. Bu kümeleşme her ikisi de kemotaktik ajanlar olarak iş gören siklik adenozin monofosfat (cAMP)
• Şekil 14.27 Cıvık küfler. Bir ağar yüzeyinde büyüyen Physarum hücresiz cıvık küfün plazmodyası.
ve spesifik bir glikoproteinin üretimleri ile tetiklenir (prokaryotlarda çeşitli regülatör sistemler için cAMP'nin işlevini Kısım 8.7'de tartıştık). Bu bileşikleri ilk üreten hücreler diğer vejetatif hücreler için bir ilgi merkezi olurlar ve agrege olmuş hücre kütlelerinin oluşmasını sağlayarak onların yığın (slug) adı verilen yapışkan hareketli bir kütle oluşturmalarına neden olurlar. Fruktifikasyon organlarının oluşumu yığın hareketi durduğu zaman ve dikey bir oryentasyona gelindiği zaman başlar (Şekil 14.28 ve 14.29). Fruktifikasyon organları daha sonra bir gövde (sap)
468 • Bölüm 14 • Ökaryotik Hücre Biyolojisi ve Ökaryotik Mikroorganizmalar
*
l
.
fcfl
Ca)
• Şekil 14.28 Hücresel cıvık küf Dictyostelium discoideum Hin yaşam döngüsünün çeşitli basamaklanndaki fotomikrograflan. (a) Kümelenme öncesi basamaktaki amipler. Düzenli bir yapı ve oryentasyonun olmadığına dikkat ediniz, (b) Kümeleşen amipler. Düzgün biçim ve düzenlemenin olduğuna dikkat ediniz. Hücreler bir yönde akmakta, (c) Kümelenmiş amiplerin düşük ayrımda görünümü, (d) Bir ağar yüzey üzerinde hareket eden ve arkalarında iz bırakan harketli yalancı plazmodyalar kümesi, (e, f) Fruktifikasyon organının (fruiting body) ilk safhaları. Bu yapıların büyüklükleri için Şekil 14.29'a bakınız.
ve bir başa değişir; yığının ön ucundaki hücreler gövde hücrelerine dönüşürken, arka ucundakiler sporlara dönüşürler. Gövde hücrelerine dönüşen hücreler selüloz salgılamaya başlar ve bu da gövdenin sağlamlığına katkıda bulunur. Yığın'in arkasındaki hücreler gövdeyi uca kadar tırmanarak başı oluştururlar. Arka kısımdaki hücrelerin çoğu sporlara farklılaşırlar. Baş kısmının olgunlaşması ile sporlar salınır ve dağılırlar. Her spor daha sonra çimlenerek vejetatif bir amip oluşturur. Dictyostelium'da fruktifikasyon organları ve spor oluşumu döngüsü eşeysiz bir olaydır. Ancak
• Şekil 14.29 Hücresel cıvık küf Dictyostelium diseoidcam'de fruktifikasyon organı oluşumundaki basamaklar. (A-C) Amiplerin kümeleşmesi; kümeleşme cAMP ile tetiklenir. (D-G) Kümeleşmiş amiplerden oluşan kütlenin hareketi; (H-L) toplanma (culmination) ve fruktifikasyon organı oluşumu; (M) Gövde (stalk) ve baş kısmından oluşan olgun fruktifikasyon organı. Kütlenin arka kısmındaki hücreler başı oluşturur ve sporları yaparlar. Fruktifikasyon organı vejetatif hücreleri rejenere edebilen ve yeni bir yaşam döngüsü başlatabilen sporlar içerir.
makrosist (macrocyst) olarak bilinen eşeyli sporlar da üretilebilirler. Makrosistler selüloz bir duvarla kaplanmış amip kümelerinden oluşurlar. îki amibin konjugasyonunu takiben büyük tek bir amip gelişir ve geriye kalan amipleri fagositozla yemek için harekete geçer. Bu noktada bu dev amip etrafında kalın bir selüloz duvar oluşarak olgun makrosistleri oluşturur; bu yapı uzun zaman dormant kalabilir. Sonuçta diploit nükleus mayoza uğrayarak haploit nükleusları yapar ve onlar da yeni bir amibin içine girer ve vejetatif büyüme bir kez daha yeniden başlar (Şekil 14.28 ve 14.29).
14.12 • Funguslar • 469
14.11 Kavramların Gözden Geçirilmesi Hücresel olmayan cıvık küfler hareketli protoplazma kütleleri iken, hücresel cıvık küfler sporların salındığı fruktifikasyon organlarını yapan bireysel hücre kütleleridir. •
Dictyostelium discoideum'un yaşam döngüsündeki esas basamakları tanımlayınız. • Makrosist nedir?
kayba sebep olan hastalıkların büyük kısmının sebebi esasen funguslardır (Tablo 14.2). İnsan dahil hayvanlarda parazit olan birkaç fungus bulunmasına rağmen, diğer mikroorganizmalara göre hayvan patojenleri olarak funguslar genellikle daha az öneme sahiptir (o°Q patojenik funguslarla ilgili bir açıklama için Kısım 27.8'e bakınız). Hücre Duvarları ve Metabolizma
Funguslar Anahtar Cinsler: Penicillium, Aspergillus, Saccharomyces, Candida
Diğer birçok farklılıklar yanında funguslar protozoanların tersine hücre duvarlarına sahiptir ve spor üretirler. Funguslar SSU rRNA soyağaçları veya diğer moleküller üzerine dayalı soyağaçlarıyla olsun sıkı bir filogenetik demet oluştururlar (Şekil 14.20). Fungusların 3 büyük grubu göze çarpar: Küfler, Mayalar ve Mantarlar.
Fungusların habitatları oldukça çeşitlidir. Bazı funguslar akuatik olup esas olarak tatlı sularda yaşarken, birkaçı ise denizlerde bulunur. Ancak fungusların çoğu karasaldır. Onlar toprak veya ölü bitki materyali üzerinde yaşarlar ve organik karbonun mineralizasyonunda önemli roller oynarlar. Fungusların büyük bir kısmı karasal bitkilerin parazitleridir. Tahıl bitkilerinde önemli ekonomik
Fungal hücre duvarları doku olarak bitki hücre duvarlarına benzerken kimyasal yönleriyle farklılıklar gösterirler. Her ne kadar bitki hücre duvarlarının polisakkariti olan selüloz bazı fungusların hücre duvarlarında bulunsa da fungusların çoğunun hücre duvarları bir glukoz türevi olan N-asetilglukozaminden (Ö°O Şekil 3.5) yapılmış kitin içerir. Bazı fungal hücre duvarlarında kitinin yerine mannanlar, galaktozanlar ve kitozanlar gibi diğer polisakkaritler bulunur. Fungal hücre duvarları tipik olarak %80-90 oranında polisakkarit olup proteinler, lipitler, polifosfatlar ve inorganik iyonlar hücre duvarının çimento matriksini yaparlar. Fungusların biyoteknolojik kullanımlarının yaygınlığından dolayı fungal hücre duvarı kimyasının anlaşılması önemlidir (ctts Bölüm 30 ve 31). Fungusların araştırma ve endüstriyel amaçlar için sınıflandırılmasında fungal hücre duvarının kimyasal yapısı kullanılmaktadır.
Tablo 14.2 Önemli fungus gruplarının özellikleri" Grup
Yaygın isim
Hifler
Tipik temsilcileri
Eşeyli sporun tipi
Habitatlar
Yaygın hastalıklar
Ascomycetes
Keseli funguslar
Septalı
Neurospora, Saccharomyces, Morchella (göbek mantarı)
Askospor
Toprak, çürüyen bitki materyali
Flemenk karaağaç hastalığı, kestane küfü, çavdar mahmuzu, çürüme
Basidiomycetes
Kadeh fungusları, Şapkalı mantarlar Ekmek küfleri
Septalı
Amanita (zehirli mantar), Agaricus (yenilebilir mantar) Mucor, Rhizopus (ekmek küfü)
Bazidiyospor
Toprak, çürüyen bitki materyali
Gövde kararması buğday pası, mısır isi
Zigospor
Toprak, çürüyen bitki materyali
Besin bozulması, nadiren parazitik hastalık
Oomycetes
Su (nem) küfleri
Koenositik
AUomyces
Oospor
Akuatik
Patates küfü, bazı balık hastalıkları
Deuteromycetes
Fungi imperfecti (Eksik funguslar)
Septalı
Penicillium, Asper- Hiç biri bilingillus, Candida memektedir
Toprak, çürüyen bitki materyali, hayvanların vücut yüzeyi
Bitki solgunluğu, ayak mantarı gibi hayvan enfeksiyonları, yüzey veya sistemik enfeksiyonlar (Candida)
Zygomycetes
Koenositik
•Filogenetik olarak farklı olan Oomisetler hariç, fungusların diğer grupları yakın akrabadır (bkz. Şekil 14.20). Burada verilen birçok organizmanın fotoğrafı için Şekiller 14.30-14.34' e bakınız.
470 • Bölüm 14 • Ökaryotik Hücre Biyolojisi ve Ökaryotik Mikroorganizmalar
Funguslar kemoorganotrof olup tipik olarak basit besinsel gereksinimleri vardır. Birçok fungusun düşük pH veya yüksek ısı (62°C'ye kadar) derecelerindeki çevre şartlarında çoğalmasına bir de fungal sporların doğada her yerde yayılmış olmaları eklendiğinde, bu organizmaların besin ürünlerinin, mikrobiyal kültür ortamlarının ve yüzeylerin yaygın kontaminantları olarak karşımıza çıkmaları sürpriz değildir. Ancak küf ve mayaların sınıflandırılması fizyolojik temellerine göre değil, bunun yerine çeşitli farklı eşeysel sporların oluşumu dahil onların çeşitli hücre döngüsü motiflerine göre yapılır (bkz. Tablo 14.2). Flamentli Funguslar: Küfler Küfler filamentli funguslar dır. Bunlar doğada yay-
gın olup daha çok ekmek, peynir veya meyveler üzerinde bulunurlar. Küflerin çoğu zorunlu aerobdur. Her filament uçtaki hücrenin uzamasıyla çoğu zaman uç kısımda büyür (Şekil 14.30*). Tek bir filament hif olarak adlandırılır. Hifler genellikle bir yüzey boyunca beraber büyüyerek miselyum adı verilen ve mikroskopta kolayca görülebilen kompak demetler oluştururlar (Şekil 14.31»). Tek tek bulunan hiflerin büyüdükçe dallanmalarından miselyumlar ortaya çıkar ve bu dallar bir araya gelerek kompakt bir misel tabakası (mat) oluştururlar. Çoğu durumda fungal bir hifteki vejetatif hücre birden fazla nükleus (sıklıkla yüzlerce nükleus) içerir. Böylece tipik bir hif, boru (tüp) şeklinde (koenositik yapı olarak bilinir) bir yapı olup stiplazmasında birçok nükleus bulundurur. Fungal miselyumdan diğer hifsel dallar uzanıp yüzeyde hava ile temas edebilir ve bu havalı dallar üzerinde konidia adı verilen sporlar oluşur (Şekil 14.30). Konidyalar eşeysiz sporlardır (oluşumları gametlerin birleşmesini kapsamaz) ve çoğu zaman pigmentli olup (Şekil 14.31; ««s Şekil 14.1a)
kuraklığa dayanıklıdırlar. Konidyalar funguslarm yeni habitatlara yayılışında görev yaparlar. Bunlar oluştuğu zaman miselyumun beyaz rengi değişerek konidyalarm siyah, mavi-yeşil, kırmızı, sarı veya kahverengi renkleri ortaya çıkar. Bu sporların varlığı miselyal mat'a oldukça tozlu bir görünüm kazandırır (Şekil 14.31a). Eşeyli üremenin bir sonucu olarak bazı küfler eşeyli sporlar da üretirler (Tablo 14.2). Sporlar ya tek hücreli gametlerin veya gametangia adı verilen özelleşmiş hiflerin füzyonu (kaynaşması) ile oluşurlar. Alternatif olarak eşeyli sporlar, iki haploit hücrenin birleşip bir diploit hücre oluşturmalarından ve daha sonra onun mayoz ve mitoza uğrayarak bireysel sporları oluşturmalarından da orijin alabilirler. Gruba bağlı olarak (bkz. Tablo 14.2) farklı tipte eşeyli sporlar üretilir. Kapalı bir kese (askus) içinde oluşan sporlara askosporlar (bkz. Şekil 14.14), çomak şekilli bir yapının (bazidium) ucunda oluşanlara ise bazidiyosporlar adı verilir (Tablo 14.2 ve bkz. Şekil 14.32c). Yaygın bilinen ekmek mayası Rhizopus gibi zigomisetes fungusları tarafından üretilen zigosporlar makroskopik, görünür yapılar olup hiflerin füzyonu ve genetik değiş-tokuştan ortaya çıkarlar. Sonuçta zigospor olgunlaşır ve eşeysiz sporlar üretirler. Sporlar havada dağılıp düştükleri yerde çimlenir ve yeni fungal miseller oluştururlar. Funguslarm eşeyli sporları tipik olarak kuraklığa, ısıya, donmaya ve bazı kimyasal ajanlara dirençlidir. Ancak fungal eşeyli sporlar ısıya bakteriyal endosporlar kadar dirençli değildir (c»o Kısım 4.13). Eşeyli veya eşeysiz olsun bir fungus sporu çimlenebilir ve yeni bir hif ve miselyuma gelişebilir. Özellikle bazidiyomiset (bkz. Tablo 14.2) üyeleri başta olmak üzere birçok fungusun esas ekolojik aktivitesi doğal kaynaklardan elde edilen odun, kağıt, elbise ve diğer ürünlerin dekompozisyonudur (parçalanma). Bu ürünleri kullanan bazidiyo-
Konidialar (sporlar)
•-J/' Çimlenme
(b)
• Şekil 14.30 Küf yapısı ve büyümesi, (a) Tipik bir küfün fotomikrografı. Havalı hiflerin uçlannda konidyalar küresel yapılar olarak görülmektedir, (b) Bir küfün yaşam döngüsü diyagramı. Konidyalar ya rüzgarla veya hayvanlarla taşınabilirler.
14.12 • Funguslar • 471
(b)
• Şekil 14.31 (a) Bir ağar plaka üzerinde büyüyen Aspergillus türünün kolonileri. Filamentli hücrelerin (miselyum) ve kolonilere tozlu ve mat bir görünüm kazandıran eşeysiz sporların (bkz. Şekil 14.30Jb) kitle halindeki görünümlerine dikkat ediniz, (b) Aspergillus fumigatus'nn konidyafor ve konidyalan.
misetler bunlardaki selüloz veya lignini karbon ve enerji kaynağı olarak kullanabilirler. Lignin yapı malzemesi fenolik bileşikler olan kompleks bir polimerdir. Odunsu bitkilerin önemli bir bileşeni olup selülozla birlikte onlara dayanıklılık kazandırır. Doğada lignin parçalanması hemen hemen tamamıyla odun-çürükçül funguslar adı verilen bazı bazidiyomisetlerin aktiviteleri ile olur. İki tip odun çürümesi bilinir: kahverengi çürükçülde tercihen selüloz saldırıya uğrayıp lignin metabolize edilmeden bırakılırken, beyaz çürükçülde hem selüloz ve hem de lignin parçalanır. Ormanlardaki odunsu materyalin parçalanmasında oynadıkları kilit rolden dolayı beyaz çürükçül funguslar büyük ekolojik öneme sahiptir.
Spor çimlenmesi
bağlantısı Olgun mantar
(d)
Makroskobik Funguslar: Şapkalı Mantarlar
• Şekil 14.32 Şapkalı Mantarlar, (a) Oldukça zehirli bir mantar olan Amanita. (b) Mantarın fruktifikasyon organının altındaki lameller spor taşıyan bazidialar içerirler, (c) Mantar basidialanndan salınan basidosporlann taramalı elektron mikrografı. (d) Tipik bir mantann yaşam döngüsü. Manatarlann bir besin kaynağı olarak üretilmeleri Kısım 30.14'te ele alınacaktır.
Şapkalı mantarlar filamentli bazidiyomisetler olup yenilebilen büyük fruktifikasyon organları oluştururlar (Şekil 14.32a, b»). Bir besin kaynağı olarak şapkalı mantarların ticari üretimlerini Kısım 30.14'te ele alacağız. Şapkalı mantar fungusları yaşamlarının büyük bölümünü toprakta, yaprak atıkları ve çürümekte olan odunlar üzerinde basit bir misel olarak geçirirler. Ancak, genellikle yağış ve serin havaları
takiben çevresel şartlar uygun olduğunda fruktifikasyon organları ilk önce toprak altında düğme şeklinde küçük bir yapı ile başlar ve daha sonra yerin üzerinde görebileceğimiz tam büyümüş bir fruktifikasyon organına gelişir (Şekil 14.32a). Bazi-
472 • Bölüm 14 • Ökaryotik Hücre Biyolojisi ve Ökaryotik Mikroorganizmalar
diyospor olarak adlandırılan eşey sporları (Şekil 14.32c), şapkanın altında lameller (gills) adı verilen düz yapılar üzerinde oluşurlar (Şekil 14.32b ve d). Mantar bazidiyosporları rüzgarla dağılır ve genellikle nemli ve organik madde bakımından zengin bir toprağın bulunduğu uygun bir ortama geldiklerinde döngü yeniden başlar (Şekil 14.32rf). Tek Hücreli Funguslar: Mayalar
Mayalar tek hücreli fungus olup çoğu Ascomycetes'lere dahildir (Tablo 14.2). Maya hücreleri küre biçimli, oval veya silindirik olup hücre bölünmesi tipik olarak tomurcuklanma (budding) ile olur (Şekil 14.33»). Tomurcuklanma olayında yeni bir hücre eski hücrenin dışa doğru büyümüş küçük bir yapısı olarak başlar; tomurcuk gittikçe büyür ve daha sonra ayrılır (Şekil 14.33 ve 14.34»). Her ne kadar mayaların çoğu tek hücre olarak çoğalırlarsa da bazı mayalar filamentler de oluşturabilir. Bu türlerde bazı özellikler sadece filamentli form tarafından ifade olunabilir. Örneğin vajinal, oral veya ciğer enfeksiyonlarına ve kazanılmış bağışıklık yetmezliği (AIDŞ) hastalarında sistemik doku hasarına sebep olan bir maya Candida albicans'da patojenite için filamentli faz esastır («*»e> Kısım 26.14). Maya hücreleri tipik olarak bakteri hücrelerinden çok daha büyüktür ve bu büyüklükleri sayesinde ve nükleus gibi büyük hücre içi yapılara sahip olmalarından dolayı mikroskopta bakterilerden kolayca ayırt edilebilirler (Şekil 14.34). Bazı mayalar eşleşme denen ve iki hücrenin biri birine kaynaştığı (füzyon) bir olayla eşeyli çoğalabilirler. Zigot adı verilen kaynaşmış hücrenin içinde sonuçta askosporlar gelişir. Eşleşme tipleri'nin önemli özellikleri dahil, tipik bir maya olan Saccharomyces''in eşeysel döngüsünü Kısım 14.7'de gördük (bkz. Şekiller 14.14-14.16). Mayalar meyve, çiçek ve ağaç kabukları gibi şeker bakımından zengin habitatları tercih ederler. Çoğu maya hem tamamen aerobik hem de fermen-
• Şekil 14.34 Saccharomyces ceravisiae'de tomurcuklanarak bölünme ile çoğalma. Burada gösterilen zamana bağlı bir seri fotoğraf olup tek bir hücreden başlayarak tomurcuklanma ile bölünme görülmektedir. Nükleusun büyüklüğüne dikkat ediniz. Faz-kontras mikrografı. S. cerevisiae'mn tek bir hücresi yaklaşık 8 /Xm çapındadır.
tatif metabolizma yapma yeteneğindedir. Birçok maya türü özellikle böcekler başta olmak üzere hayvanlarla simbiyotik olarak yaşarlar ve birkaç türü insan ve hayvanlar için patojeniktir. (Ö°C» Kısım27.7). En önemli ticari mayalar Saccharomyces cinsine ait ekmek ve bira mayalarıdır. (c«s Mikrobiyal Kenar Haber, Maya Fermentasyonu Ürünleri, Bölüm 5). Bu mayaların esas habitataları hiç şüphesiz ki meyve ve meyve sularıdır. Ancak dikkatli seçilimler ve mikrobiyologlar tarafından üzerlerinde yapılan genetik manipülasyonlardan dolayı oldukça geliştirilmiş olan bugünün ticari mayalan yabanıl suşlardan muhtemelen oldukça farklıdırlar. S. cerevisiae mayası yıllardan beri model organizma olarak çalışılmış (bkz. Kısım 14.7) ve genom dizisi tamamen deşifre edilen (aydınlatılmış) ilk ökaryot olmuştur (O«Î> Kısım 15.6).
14.12 Kavramların Gözden Geçirilmesi Funguslar mayalardan ve kürlerden oluşurlar. Funguslar protozoanlardan sert hücre duvarları, spor üretmeleri, hareketsiz olmaları ve filogenetik konumları ile ayrılırlar. Şapkalı mantarlar büyük, genellikle yenilebilen funguslar olup bazidosporları içeren fruktifikasyon organlarına (fruiting bodies) sahiptir. • • •
Küfler mayalardan hangi yönleri ile farklılık gösterir? Kitin nedir ve fungustaki işlevi nedir? Küllerdeki konidiyalar, askosporlardan hangi yönleri ile ayrılırlar?
Algler Anahtar Cinsler: Chlamydomonas, Euglena, Gonyaulax
Algler ökaryotik organizmaların (Şekil 14.35» ve 14.36») büyük ve çeşitlenmiş bir grubu olup klorofil içerirler ve oksijenik fotosentez yaparlar (cos, • Şekil 14.33 Yaygın bilinen ekmek ve bira mayası Saccharomyces ceravisiae'nin taramalı elektron mikrografı. Tomurcuklanarak bölünmeye ve daha önceki tomurcuklanmalardan kalma izlere dikkat ediniz. Büyük tek bir hücre yaklaşık 8 /un çapındadır.
Kısım 17.5). Bunlar, siyanobakteri ve proklorofitlerle
karıştırılmamalıdır (cos, Kısım 12.25 ve 12.26). Bu iki grup organizma da oksijenik fototroftur, fakat bunlar bakteri olup bu nedenle alglerden (Eukarya) evrimsel olarak oldukça farklıdırlar. Her ne kadar
14.13 • Algler • 473
• Şekil 14.35 Yeşil algleri temsil eden ışık mikrograflan. (a) Micrasterias. Tek bir hücre, (b) Birçok hücre içeren Volvox kolonisi, (c) Scenedesmus. Dört hücreli bir paket, (d) Spirogyra. Filamentli bir alg. Yeşil sarmal (spiral) biçimli kloroplastlara dikkat ediniz.
alglerin çoğu büyüklük olarak mikroskopik ise de birçok formu çok hücreli olup makroskopiktir; örneğin, diatomların filogenetik akrabası olan kelp 30 metrenin üzerinde bir boya ulaşabilir. Alg Çeşitliliği
Alglerin çoğu ya tek hücreli olarak (Şekil 14.35a ve c) veya koloni formunda hücre kümeleri şeklinde bulunurlar (Şekil 14.35b). Hücreler uç uca dizildikleri zaman algin filamentli olduğu söylenir (Şekil 14.35d). Filamentli formlar arasında filamentleri hem düz hem de karışık dallanma gösteren türler vardır. Algler klorofil içerdiklerinden yeşil görünürler. Ancak, yaygın bulunan birkaç alg klorofile ilaveten ksantofil ve karotenoid gibi yeşil rengi maskeleyen diğer pigmentleri içerdiklerinden kahverengi veya kırmızı görünürler. Alg hücreleri, fotosentetik pigmentlerin membranla çevrelenmiş olduğu bir yapı olan bir veya daha fazla sayıda kloroplast içerirler (bkz. Kısım 14.3). Kloroplastlar kendilerine özgü yeşil renkleriyle mikroskopla ayırt edilebilirler (Şekil 14.35). Kloroplastların genel yapı ve özelliklerini Kısım 14.3'te, filogenilerini ise Kısım 12.27 ve 14.4'te tartıştık.
Şekil 14.20 incelendiğinde alglerin filogenik olarak heterojen bir grup olduğu görülür. Her ne kadar yeşil algler (Chlorophyta, Tablo 14.3) ve belli bir ölçüde kırmızı algler (Rhodophyta, Tablo 14.3) yeşil bitkilerle oldukça yakın ilişkili iseler de kahverengi algler ve diatomlar gibi diğer alg grupları 18S rRNA kriteri bakımından daha az gelişmiş organizmalardır (Şekil 14.20a). Hatta bunlardan da daha az gelişmiş olanları Euglena algi gibi öglenoidlerdir (Şekil 14.36a). Öglenoidler tüm filogenetik soyağaçlarında Trypanosoma gibi flagelli protozoanlarla filogenetik bir ilişki gösterirler (Şekil 14.20). Bu nedenle Euglena hücrelerinin kloroplastlarını kaybetmesi ve tamamen heterotrofik bir organizma olarak yaşamaya başlaması sürpriz değildir (bkz. Kısım 14.10). Kırmızı algler (Şekil 14.36b) kloroplastlarmda klorofil b taşımamaları ve siyanobakteriler tarafından esas ışık yakalayıcı pigmentler olarak kullanılan fikobiliproteinleri (O^Ö Kısım 17.3) taşımaları ile dikkate değerler. Tersine, yeşil alglerin kloroplastlarmda fikobilinler bulunmazken klorofil aveb vardır. Dinoflagellatlar flagelli, esas olarak denizlerde bulunan algler olup birkaç grup protozoanın filogenetik akrabalarıdırlar (Şekil 14.20). Bazı dinoflagellatlar serbest yaşarken (Şekil 14.36/), diğerleri
474 • Bölüm 14 • Ökaryotik Hücre Biyolojisi ve Ökaryotik Mikroorganizmalar
(a)
(d)
• Şekil 14.36 Yeşil algler (Chlorophyta)'in dışındaki algler, (a-b) ışık mikrograflan. (a) Euglenophyta'mn bir üyesi olan Euglena (hücre yaklaşık 15 (JLm genişliğindedir). Bu organizma filogenetik olarak yeşil alglerden (bkz. Şekil 14.20) çok daha az gelişmiş olup flagelli protozoanlarla birçok ortak özelliğe sahiptir (bkz. metin), (b) Bir kırmızı deniz algi olan Polysiphonia (Rhodophyta) deniz bitkilerinin yüzeylerine bağlanarak çoğalır (hücreler yaklaşık 150 fJLm genişliğindedir). (c-f) Taramalı elektron mikrograflan. (c-e) Diatom frustulleri (kabuk). Frustul bir slika kılıf veya duvar olup diatom hücresini çevreler, (c) Pennate simetri gösteren deniz diatomu Nitzschia'mn frustulu (hücre yaklaşı 10 fjum genişliğindedir). (d) Radyal simetri gösteren deniz diatomu Thalassiosira'mn frustulu (bir hücre yaklaşık 5 fjim çapındadır), (e) Radyal simetri gösteren deniz diatomu Asteriolampra 'mn frustulu (hücre yaklaşık 5 mikronmetere genişliğindedir). (f) Deniz dinoflagellatı olan Ornühocercus magnificus'un hücresi. Hücreye has kısım merkezdeki globüler yapıdır: bağlı gösterişli yapılar lists (parmaklıklar) olarak adlandırılırlar (hücre yaklaşık 30 ^ m genişliğindedir).
14.13 • Algler • 475 *•
T
Tablo 14.3 Önemli alg gruplarının özellikleri
Grup
Yaygın isim
Tipik temsilcileri
Karbon rezerv metaryalleri
Morfoloji
Pigmentler
Chlorophyta Yeşil algler
Tek hücreliden yapraksıya
Klorofil aveb Chlamydomonas Nişasta (a-1,4glukan), sükroz
Euglenocl phyta
Öglenoidler
Tek hücreli, fla- Klorofil a ve b Euglena (bkz. gellalı Şekil 14,36»)
Dinoflagellata
Dinoflagellatlar Tek hücreli, fla- Klorofil a ve c, Gonyaulax; Pfi- Nişasta (a-1,4esteria gellalı ksantofiller glukan)
Hücre duvan
Başlıca habitatlan
Selüloz
Tatlı su, toprak, birkaçı deniz
Paramilon (/3-l,2- Hücre duvarı Tatlı su, birkaçı yok glukan) deniz Selüloz
Silikadan Tatlı su, deniz, yapılmış üst toprak üste çakışan iki bileşik Selüloz Deniz
Chrysophyta Altın-sansı alg- Tek hücreli ler, diatomlar
Klorofil a ve c Nitzschia (bkz. Lipidler Şekil 14.36c)
Phaeophyta Kahverengi algler
Filamentliden yapraksıya, bazen büyük ve bitki benzeri
Klorofil a ve c, Laminaria ksantofiller
Lamarin (/3-l,3glukan), mannitol
Rhodophyta Kırmızı algler
Tek hücreli, filamentliden yapraksıya
Klorofil a ve d, Polysiphonia fikosiyanin, (bkz. Şekil fikoeritrin 14366)
Floridean nişasta Selüloz (a-l,4-glukan ve (a-l,6-glukan))
"Bu grup ayrıca protozoa ile birlikte ele alınmıştır (bkz
Çoğu zaman deniz
Deniz
Kısım 14.10).
mercan resiflerini (kayalıklarını) yapan hayvanlarla simbiyotik bir ilişki içinde bulunup kendileri için bir korunma ve barınak sağlarken, fotosentetik olarak bağladıkları karbonu bir besin kaynağı olarak resife verirler. Toksik Dinoflagellatlar
Gonyaulax gibi dinoflagellatlar seyrek olarak çiçeklenme (bloom) olarak adlandırlan yoğun süspansiyonlar olarak büyüyüp, yardımcı pigment olarak bulunan ksantofillerden dolayı parlak kırmızı renkte görünürler. Bu çiçeksi yapılar (blooms) zaman zaman kirli, ılık, kıyı sularında klasik "kırmızı kuşaklar (tides)" (Şekil 14.37a») oluştururlar. Bunlar genellikle balık zehirlenmeleri ile ilişkili olup, kontamine su ve o bölgedeki midyeleri tüketen insanlarda yaygın zehirlenmelerle kendilerini belli ederler (oo^ Kısım 28.4). Toksisitenin sebebi Gonyaulax tarafından üretilen potent bir nörotoksin olup, bu madde nanogram seviyelerde bile balıkları öldürebilir. Dinoflagellatlarm diğer toksik bir cinsi Pfiesteria'dır. P. piscicida'nm (Şekil 14.37b) toksik
sporları balıkları enfekte eder ve onların hareketini etkileyip derilerini bozan nörotoksinler sonuçta balığın ölümüne sebep olurlar. Derinin parçalandığı bölgelerde lezyonlar oluşur ve buralarda fırsatçı patojenik bakteriler büyüme başlar (Şekil
14.37c). P. piscicida yoğun balık ölümlerine neden olabilir (Şekil 14.37c). Örneğin, 1991 yılında Kuzey Carolina'daki (ABD) Nuese Estuary'de bir Pfiesteria salgını sonucu bir milyardan fazla balık ölmüştür ve Birleşik Devletlerin doğu kıyısı boyunca benzer salgınlardan şüphelenilmiştir. Pfiesteria toksikliğinden kaynaklanan insan zehirlenmeleri oluştuğu düşünülmüşse de, buradaki bağlantısı balıklardaki gibi kesin ortaya konmamıştır. Pigmentler, Enerji Metabolizması ve Rezerv Polimerleri
Algleri sınıflamada taşıdıkları klorofillerin çeşidi, yapılan karbon rezerv polimerlerinin türü (örneğin nişasta ve birkaç nişasta türevi), hücre duvarlarının yapısı ve hareket şekilleri gibi birkaç özellik kullanılır. Tüm algler klorofil a taşırlar. Bazı algler klorofil fl'dan az farklı diğer klorofilleri de bulundururlar. Klorofil a'ya ilaveten bulunan bu klorofiller özel alg gruplarına özgüdür. Klorofil ve diğer fotosentetik pigmentlerin alglerdeki dağılımı Tablo 14.3'te özetlenmiştir. Bütün algler H2O'yu bir elektron verici kaynak olarak kullanıp oksijen üreten (oksijenik) fotosentez yaparlar (oa& Kısım 17.5). Ayrıca bazı algler H2'yi elektron kaynağı olarak kullanarak oksijenin üretilmediği fotosentez de yaparlar. Birçok alg zorunlu fototrof olup, karanlık ortamda organik
476 • Bölüm 14 • Ökaryotih Hücre Biyolojisi ve Ökaryotik Mikroorganizmalar
(c) • Şekil 14.37 Toksik dinoflagellat'lar. (a) Goniaulax gibi toksin üreten dinoflagellatlann aşın çoğalması ile meydana gelen bir "kırmızı kuşağın" fotoğrafı. Toksin suya salınır ve aynca dinoflagellatlarla beslenen deniz kabuklulannda birikir. Toksin kabuklulara zarar vermezken bunlan yiyen insan ve balıklan zehirleyebilir, (b-c) Toksik Pfiesteria. (b) P. piscicida'nın toksik bir sporunun taramalı elektron mikrografı. (c) P.piscicida tarafından öldürülen balık. Deriyi bozan lezyonlara dikkat ediniz.
maddeleri kullanıp büyüyemez. Ancak, bazı türler kemoorganotrofik olarak büyüyebilirler ve karanlıkta basit şeker ve organik asitleri parçalayabilirler. Algler tarafından kullanılan en yaygın organik bileşiklerden biri asetat olup, bu bileşik birçok flagelli ve klorofit tarafından esas karbon ve enerji kaynağı olarak kullanılabilir. Ayrıca, bazı algler basit organik molekülleri ışıkta asimile ederken (fotoheterotrofluk; <^A Şekil 17.1 ve Kısım 17.4), karanlık ortamda bu moleküllerle büyüyemezler. Alg sporlarının sınıflanmasında kullanılan kilit özelliklerden biri fotosentez sonucu sentezlenen rezerv polimerin yapısıdır. Chlorophyta bölümündeki algler yüksek bitkilere benzer şekilde nişasta (a-l,4-bağlı glukoz) üretirler. Tersine, diğer gruplardaki alglerin bazısı polimer diğer bazısı serbest monomer olan bir seri rezerv maddesi yaparlar; bu maddelerin en önemlileri Tablo 14.3'te verilmiştir. Alglerin Hücre Duvarları
Alglerin hücre duvarlarının yapı ve kimyasında oldukça çeşitlilik gözlenir. Çoğu durumda hücre
duvarı selüloz fibrillerinden oluşan bir ağ yapısında olup, bu yapı genellikle pektin, ksilanlar, mannanlar, alginik asit veya fukinik asit gibi diğer polisakkaritlerle desteklenir. Bazı alglerde hücre duvarı ilave olarak kalsiyum karbonat birikintileri ile kuvvetlendirilir; bu formlar kalkerli (calcereous) veya mercansı (coralinne) algler olarak adlandırılırlar. Bazen hücre duvarlarında kitin de (bir N-asetilglukozamin polimeri, ÖÖÖ Şekil 3.5) bulunur. Öglenoidlerde bir hücre duvarı bulunmaz (Şekil 14.36a). Diatomlarda (Şekil 14.36c-e) hücre duvarı protein ve polisakkaritin eklendiği silika'dan oluşur. Hatta hücre ölüp, organik materyal ortadan kalksa bile, frustule (sert kabuk) adı verilen dış yapının (Şekil 14.36c-e) bozulmadan kalması, hücrenin dayanıklı yapısından bu slikalı bileşiğin sorumlu olduğunu göstermektedir. Bu diatom kabuklar bozulmaya dirençli olduğundan, yapı uzun zaman bozulmadan muhafaza olur ve bunlar bilinen en iyi alg fosillerini yaparlar. Bu mükemmel fosil kayıtlarından, diatomların Dünya üzerinde ilk olarak yaklaşık 200 milyon yıl önce ortaya çıktıkları bilinmektedir. Diatomlar frustullerinde morfolojik
14.13 • Algler • 477
olarak tipik bir simetri formu gösterirler. Simetri örnekleri pennate (bir eksenin karşı yüzleri üzerinde benzer parçalara sahip olmak) (Şekil 14.36c) ve radyal simetriyi içerir (Şekil 14.36d,e) Alg hücre duvarlarında bazısı 3-5 nm genişliğinde porlar mevcut olup, bu porlardan sadece su, inorganik iyonlar, gazlar ve metabolizma ve büyüme için gerekli küçük molekül ağırlıklı diğer besin molekülleri gibi maddeler geçer. Fagositik aktiviteleri olmayıp, bu yönleri ile algler fagositik protozoanlar ve cıvık küflerden ayrılırlar. Alglerin Hareketi
Bilindiği kadarıyla siller alglerde bulunmadığı için, birçok algin hareketi flagella ile olur (Şekil 14.10). Euglena gibi (Şekil 14.36a) flagelli algler tipik tek bir polar flagellaya sahipken, Chlorophyta'nm flagelli türleri ya iki veya dört polar flagellaya sahiptir. Dinoflagellatlar (Şekil 14.36/; 14.37) transvers (çapraz) ve lateral olmak üzere farklı uzunluklarda ve hücreye farklı noktalardan giren iki flagellaya sahiptir. Tranvers flagella lateral olarak bağlı iken, boylamasına (longüudinal) olan flagella hücrenin lateral oluğundan orijin alır ve hücre boyunca uzanır (Şekil 14.37b). Birçok durumda vejetatif algler hareketsiz olup, sadece hareketli gametler oluştururlar. Bazı diatomlar gibi birkaç alg ayrıca kayma hareketi ile hareket edebilirler. Kayma filamentli siyanobakteriler ve çeşitli diğer prokaryotlar arasında yaygın bir hareket şeklidir (ooç> Kısım 4.15).
kendi avantajlarına sahiptir. Taşlar güneşle ısıtılır ve karın erimesinden gelen su emilir ve nispeten uzun zaman tutularak büyüme için gerekli nemlilik sağlanır. Ayrıca gözenekli bir kaya tarafından absorbe edilen su kayayı daha şeffaf yapar ve böylece daha çok ışık alg tabakalarına ulaşır. Siyanobakteriler (Şekil 14.38b) ve çeşitli yeşil algler dahil, geniş bir fototrof çeşidi endolitik komünitiler oluşturabilirler. Serbest yaşayan fototroflara ilaveten yeşil alg ve siyanobakteriler endolitik liken topluluklarında funguslarla bir arada bulunurlar (liken simbiyozunun açıklaması için oooKısım 19.20). Bu kaya içi komünitelerin metabolizması ve büyümesi ile kayalar yavaş yavaş aşındırılır ve aşınma bölgelerinden su girip donabilir, tekrar eriyebilir ve sonuçta kayayı parçalayarak mikrobiyal kolonizasyon için yeni habitatlar ortaya çıkarır. 14.13 Kavramların Gözden Geçirilmesi Algler fototrofik Eukarya olup kloroplast adı verilen bir yapı içinde klorofil ve karotenoid pigmentleri taşırlar. Kloroplastm kendisinin kökeni bakteri domainindedir. •
Algler siyanobakterilerden hangi yönlerden farklılık gösterir? • Kırmızı alglerle ilgili olağandışı olan nedir? • Alglerin esas habitatı nedir?
Alg Ekolojisi ve Endolitik Alg Toplulukları
Algler hem tatlı su ve hem de deniz suyu gibi akuatik habitatlarda bol bulunurlar. Ayrıca algler balık tankları ve yüzme havuzları gibi insan yapımı su birikintilerinde ve yağmur sonucu oluşan ve güneşe açık geçici su kümelerinde de bulunurlar. Algler ayrıca çoğu toprakta yaygın bulunurken, birkaç tür kuru ortamlarda ve hatta suyun çok az bulunduğu aşırı kuru topraklarda bile bulunurlar (<**s Kısım 6.14). Algler ayrıca aşırı asidik habitatlarm da dominant ve yegane fototrofik mikroorganizmalarıdır; pH derecesi 4'ün altındaki habitatlarda siyanobakteriler bulunmaz ve bu nedenle oksijenik fotosentez esas olarak alglerin ve birkaç aside dirençli bitkinin aktivitesi ile olur. Örneğin kırmızı alg Cyanidium pH 2'nin altındaki habitatlarda büyüyebilir. Bazı algler kayaların içinde büyürler ve bu endolitik fototroflar (endo "içinde" anlamına gelir) kuarz içeren gözenekli kayalarda yaşarlar ve tipik olarak yüzeye yakın katmanlarda bulunurlar. Endolitik fototrofik komüniteler yaygın olarak çöl gibi kuru veya Antartika gibi soğuk-kuru ortamlarda yaşarlar (Şekil 14.38»). Örneğin ısı ve nemliliğin oldukça düşük olduğu Antartika Kuru Vadilerinde (Antarctic Dry VValleys) bir kayanın içinde yaşam
• Şekil 14.38 Endolitik siyanobakteri. (a) İsrail'in Negev Çölü Makhtesh Gadol'dan siyanobakteri Chroococcidiopsis hücrelerinden oluşan bir hücre tabakasını gösteren bir kireç taşı fotoğrafı, (b) Negev Çölündeki bir kum taşından izole edilen Chroococcidiopsis hücrelerinin fotomikrografı.
478 • Bölüm 14 • Okaryotik Hücre Biyolojisi ve Okaryotik Mikroorganizmalar
DEĞERLENDİRME SORULARI 1.
Okaryotik hücreleri prokaryotik hücrelerden kesin olarak farklı kılan en az üç özelliği belirtiniz (C*^> Kısımlar 4.1-4.5).
2.
Yapı olarak mitokondri ve hidrojenozom nasıl benzerlik gösterirler? Aralarındaki fark nedir? Metabolik olarak nasıl birbirinden farklıdırlar (ö^Kısım 14.2)?
3.
Bir kloroplastta oluşan en önemli fizyolojik olaylar (enerji ve karbonla ilişkili) hangileridir (Kısım 14.3)?
4.
Streptomisin gibi bir antibiyotiğin organellerde protein sentezini bloke ettiğini bilmemiz bize bu organellerin bakterilerle ilişkisi hakkında neyi açıklar ( ^ Û Kısım 14.4)?
5.
Mikrofilament ve mikrotübüller arasındaki kimyasal farklılıklar nelerdir? Böyle yapılar prokaryotik hücrelerde gerçekten de yok mudur? (Bu soruyu cevaplamadan önce Kısım 6.2'yi okumanız gerekecektir.) Kısım 14.5). Verilen okaryotik hücre yapılarının işlevleri nelerdir: endoplazmik retikulum, Golgi kompleksi, lizozom, peroksizom («s*^ Kısım 14.5). Ökaryotlardaki ve prokaryotlardaki flagellanın hareket farkını açıklayınız (C^ Kısım 14.4 ve 14.5). Telomeraz aktivitesinin yokluğu sonucu okaryotik DNA'dan gen kaybının nasıl olduğunu tartışınız Kısım 14.6).
9.
Mitoz ve mayoz olaylarının fark ve benzerliklerini karşılaştırmalı olarak izah ediniz. Saccharomyces ceravisiae'mn çoğalması için hangi olay kesinlikle gereklidir ve neden? Bir maya hücresinin eşleşme tipi nasıl belirlenir (<**> Kısım 14.7)?
10. Okaryotik mRNA'lar "işlenilmeli" iken prokaryotik RNA'larm çoğu için buna neden gerek yoktur (£°& Kısım 14.8)? 11. Mikrobiyal ökaryotlarm filogenileri henüz tam oturmamıştır. Şekil 14.20'de gösterilen iki filogentik soyağacı arasındaki önemli anlaşmazlıkları tartışınız (c*to Kısım 14.9). 12. Bazı önemli protozoa gruplarının yaygın isimleri nelerdir (c»o Kısım 14.10) ? 13. Physarum ve Dictyostelium organizmaları arasındaki temel farklılıklar nelerdir (Kısım 14.11)? 14. Protozoanları, fungus ve alglerle kıyaslayarak bir grubun üyesini diğerinden farklı kılan en az iki yolu belirtiniz. Bu gruplardan hangileri cıvık küflere en çok benzer ve neden (ö°ö Kısım 14.12 ve 14.13)? 15. Alglerin farklı grupları hangi yollarla biri birlerinden ayrılırlar (£**» Kısım 14.13)? 16. Frustul nedir ve hangi alg grupları üretirler (<&K> Kısım 14.13)?
UYGULAMA SORULARI 1. Eğer mitokondri ve kloroplast gibi organeller bir zamanlar serbest yaşayan okaryotik hücrelerse, Kısım 14.4'te verilen organellerin moleküler özellikleri nasıl farklı olurdu?
2.
Bir sonraki bölümde, okaryotik hücrelerin genel olarak prokaryotik hücrelerden çok daha büyük genomlara sahip olduğunu öğreneceksiniz. Bunun bir sürpriz olmadığını gösteren üç neden sıralayınız.
MIKROBIYAL GENOMİKLER I 15.1 15.2 15.3
II 15.4 15.5 15.6
III 15.7 15.8 15.9
Genom dizisi bir organizmanın genetik planını gösterir. Her genomik proje, genomun uygun ölçülerdeki parçalarının örneğin; bir bakteriyofaja klonlanması ile başlar. Escherichia coli içerisinde replike olan beyaz M13 bakteriyofaj plakları, klonlanmış DNA içermektedir.
IV
GENOMİK KLONLAMA TEKNİKLERİ
480
Genomik Klonlama Vektörleri ve Dizi Analizi Genomun Dizi Analizi Genomun Yorumu
480 483 484
MIKROBIYAL GENOMLAR Prokaryotik Genomlar; Büyüklük ve ORF İçerikleri Prokaryotik Genomlar; Biyoinformatik Analizler ve Gen Dağılımları Ökaryotik Mikrobiyal Genomlar
DİĞER GENOMLAR VE GENOMLARIN EVRİMİ Organel Genomları Evrim ve Gen Aileleri Genomik Madencilik
485 485 486 490
492 492 495 496
GEN İŞLEVLERİ VE REGÜLASYONU
497
15.10 Proteomikler 15.11 Microarray ve Transkriptom
497 498
479
480 • Bölüm 15 • Mihrobiyal Cenomikler
BOLÜMLE İLGİLİ SOZLUK Açık okuma kalıbı transkripsiyonu yapıldığında, kompozisyonu ve uzunluğu bilinen bir protein üretmek üzere translasyonu da gerçekleştirilebilen ve okuma kalıbı içerisinde stop kodonu bulundurmayan DNA dizisi. İşlevsel açık okuma kalıbı hücre içerisinde genellikle bir proteini kodlar Biyoinformatik protein ve DNA dizilerine ulaşabilmek, depolamak ve analiz etmek için bilgisayar araçlarının kullanımı Gen ailesi organizmada diğer genlerle baz dizisi bakımından ilişkili olan genler Genom bir hücre veya virüsün genlerinin tümü Genomikler genomların haritalanması, DNA dizilerinin belirlenmesi, analizi ve karşılaştırılmasını içeren disiplin Homolog bir veya daha fazla gen ile ortak evrimsel ataya sahip olan gen
Ortolog bir organizmada bulunan genin, farklı türden bir organizmadaki gen ile benzer yapıda olması (Bakınız paralog) Paralog gen duplikasyonunun bir sonucu olarak, aynı organizmadaki bir genin bir ya da daha fazla benzerinin bulunması (Bakınız ortolog) Proteom herhangi bir zaman diliminde bir hücre, doku veya organizmada bulunan proteinlerin tamamı Proteomikler bir organizmaya ait proteinlerin yapı, işlev ve regülasyonlarınm genom düzeyinde veya geniş ölçekli olarak incelenmesi Rastgele dizi analizi genomun bütününe ulaşmak amacıyla, genomdan rastgele küçük parçaların çoğaltılması, dizi analizinin yapılması ve bilgisayar ortamında birleştirilmesi RNA düzenlenmesi protein kodlayan bir genin RNA transkriptinin zorunlu
ir oraganizmanın genomu, o organizmaya ait genlerin bütünüdür. Bir organizmanın genom dizisinin bilinmesi yalnız genlerini ortaya koymakla kalmaz, bunun yanında organizmanın işlevleri ve evrimsel geçmişi hakkında da önemli ipuçları verir. Genomik diziler ayrıca gen ifadesinin, genomdaki genetik bilginin transkripsiyonunun ve translasyonunun çalışılmasına da olanak sağlamaktadır. Gen ifedesinin çalışılması için kullanılan geleneksel yaklaşım, bir gene veya ilişkili bir grup gene odaklanmaktır. Günümüzde, bir organizmaya ait genlerin tamamının ifadesi bir deney sonucunda örneklenebilmektedir. Genomikler ifadesi; genomların haritalanması, dizisinin belirlenmesi, analiz edilmesi ve karşılaştırılması esaslarına dayanır. Bu bölüm mikrobiyal genomikler üzerine odaklanmıştır.
B
kodlama özelliklerine ulaşmak için, RNA işlenmesi dışındaki işlemlerle modifikasyonu Transkriptom özel koşullar altında bir organizma içerisinde üretilen mRNA'larm tamamı Yapay Kromozom çok büyük yabancı DNA ilavelerini taşıyabilen ve hücre içerisinde, daha çok hücresel kromozom gibi bulunan klonlama vektörüdür. Yaygın olarak kullanılanlar, bakteri yapay kromozomu (BAC) ve maya yapay kromozomlarıdır (YAC) Yatay gen transferi genetik değişimle transfer edilmiş bir başka organizmaya ait bir genin, bir organizmada bulunması Yorum genomikler esas alındığında, ham DNA dizisi verilerinin organizmada yer alan genlerin liste haline dönüştürülmesi ("genlerin tayini") işlemidir
loji alanındaki bu çağ klinik ilaçlar ve mikrobiyal evrim gibi pek çok alanda yeni gelişmeler vaat etmektedir. Teknolojideki ihtiyaçları karşılayan gelişmeler olmadan büyük ve karmaşık genomların baz dizilerinin belirlenmesi ve analizi imkânsız olurdu. Bu gelişmelerin önemli bir kısmını DNA dizi analizi otomasyonu oluşturmaktadıKon&Kısım 7.8). Bir başka ilerleme ise, DNA ve protein dizilerinin analizi, depolanması ve erişimi amacı ile geliştirilen ve biyoinformatik olarak adlandırılan ileri bilgisayar tekniklerinde sağlanmıştır. Halen büyük DNA fragmentlerinin klonlanmasında ilerlemeler devam etmektedir. Bu bölümde bazı mikrobiyal genom modelleri, bu genomların analizi için kullanılan bazı teknikler ve mikrobiyal genomiklerin bize bu yönde ne avantajlar sağladığını tartışacağız. Konumuza klonlama ile başlayacağız çünkü genomiklerin tasarlanmaya başlanması için bu aşamanın kusursuz bir şekilde gerçekleşmesi zorunludur.
1976 yılında dizi analizi yapılan ilk genom, MS2 virüsüne ait 3569 nükleotitlik RNA genomudur (««s Kısım 16.1). 1977 yılında dizi analizi yapılan ilk DNA genomu ise; küçük, tek zincirli bir DNA' ya sahip 4>X174 virüsünün (aaz> Kısım 16.2) 5386 nükleotitlik dizidir. Bu başarı Frederick Sangerin yönetGENOMİK KLONLAMA tiği bir grup tarafından gerçekleştirilmiş ve DNA TEKNİKLERİ dizi analizi için Sanger dideoksi tekniğinin ortaya Bu bölümde tartışacağımız birçok teknik, Bölüm çıkmasını sağlamıştır (cs^Kısım 7.8). Dizi analizi 10'da tartışılan in vitro tekniklerin modifiye edilmiş yapılan ilk hücresel genom 1995 yılında, Hamilton veya genişletilmiş halidir. Bu in vitro tekniklerin O Smith, J. Craig Venter ve Rockville (ABD) Genotemel prensipleri aynıdır, fakat buradaki asıl amaç mik Araştırmalar Enstitüsündeki (TIGR) meslektek bir gen veya gen gruplarından çok bir organiztaşları tarafından tanımlanan 1.830.137 baz çiftlik manın genomunun tamamının çalışılmasıdır. Haemophüus influenzae kromozomudur. 2000 yılının güzüne gelindiğinde, yaklaşık 3 milyar baz çifti Genomik Klonlama Vektörleri içeren haploit insan genom dizisinin taslağı yayınve Dizi Analizi lanmıştır. Bugün yüzlerce genomun dizi analizi tamamlanmış ve birçoğunun analizinin yapılması Daha önce (£«aKısım 10.15-10.17) moleküler kloniçin çalışmalar ise devam etmektedir. "Genomik lamada kullanılan bazı plazmit ve viral vektörleri Çağ" in içerisinde bulunduğumuz açıktır ve biyogörmüştük. Örneğin; pBR322 fajı ve lambda bakte-
15.1 • Genomih Klonlama Vektörleri ve Dizi Analizi • 481
riyofajmın charon türevleri, genomik analizleri de kapsayan klonlama ve dizi analizi çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bakteriyofaj M13, bakteriyal ve maya yapay kromozomları gibi daha özelleşmiş vektörleri ise bu bölümde inceleyeceğiz.
Faj M13mpl8, Mİ 3 fajının; klonlamayı kolaylaştırmak amacı ile, intergenik bölgesi modifiye edilmiş bir türevidir (Şekil 15.1a»). Kullanışlı modifikasyonlardan biri Escherichia coli'de (3-galaktozidaz
enzimini kodlayan lacZ geninin işlevsel parçasının ilavesidir. M13mpl8 fajıyla enfekte olan hücreler, indikatör ortamlar üzerindeki renkleri sayesinde kolaylıkla belirlenebilir (/3-galaktozidaz enzimi laktozu glukoz ve galaktoza parçalamasının yanı sıra, mavi renk oluşumuna naden olan bileşiği de parçalayabilir Şekil 15.1b). Bu lacZ geni 54 bç uzunlukta ve çoklu bağlayıcı (polilinker) olarak isimlendirilen bir DNA parçasını içerecek şekilde modifiye edilmiştir. Çoklu bağlayıcı, M13 genomunda yer almayan, pek çok restriksiyon enzim kesim bölgelerine sahip olması nedeniyle klonlamada kullanılabilir. Çoklu bağlayıcı, lacZ geninin kodlama bölgesinin başlangıcına ilave edilmiştir ve enzim aktivitesini etkilemez. Ancak klonlama sürecinde ilave DNA'nın çoklu bağlayıcıya eklenmesi, geni inaktif hale getirir. İlave DNA'ları içeren fajlar renksiz
Bakteriyofaj M13'ten Türetilen Vektörler
M13, konakçısını öldürmeden replike olabilen ipliksi yapıda (filamentöz) bir bakteriyofajdır (on^ Kısım 16.3). Bu fajın olgun partikülleri hücre parçalanmasına yol açmadan tomurcuklanma suretiyle konakçı hücrelerinden salınır ve enfekte olan hücreler faj DNA' sı için sürekli kaynak teşkil eder. Mİ 3 faj genomunun büyük bir kısmı virüs replikasyonu için ihtiyaç duyulan genleri içerir. Ancak, intergenik dizi olarak tanımlanan küçük bölge klonlama bölgesi olarak kullanılabilmektedir. 5 kbç uzunluğa kadar çeşitli boyuttaki yabancı DNA'lar virüs canlılığını etkilemeden klonlanabilir. Genom büyüdükçe olgun virüs partiküllerinin (virion) gelişmesi kolaylaşır. SamHI Smal Kpn\
EcoH\
Sa/I
Xba\
Pst\
Hind\\\
Polylinker-g aat tCG AGC TCG GTA CCC GGG GAT CCT CTA GAG TCG ACC TGC AGG CAT GCA AGC •
I
t
t
I
İ
f
t
•AsnSer Ser Ser Val Pro Giy
i
l
t
t
I
i
l
f
î
.
Asp Pro Leu Glu Ser Thr Cys Arg
l
l
His Ala
Ser-
(a)
Klonlanan DNA'yı içeren faj
Klonlanan DNA'yı içermeyen faj
* Şekil 15.1 Bakteriyofaj M13 aracılığı ile klonlama. a) Klonlama vektörü olarak kullanılan M13'ün bir türevi olan M13mpl8' in kısmi haritası. Vektör lac promotorunu (lacP) ve /3-galaktozidaz enziminin işlevsel kısmını kodlayan lacZ genini içermektedir. Bu genin başlangıcında farklı kesim bölgeleri içeren, fakat okuma kalıbı düzenini koruyan bir çoklu bağlayıcı (polilinker) bulunmaktadır. Çoklu bağlayıcı tarafından kodlanan amino asitler gösterilmiştir. Çoklu bağlayıcıya klonlanan birçok DNA fragmenti, lacZ genini kesintiye uğratmakta ve /3-galaktozidaz aktivitesinin kaybolmasına neden olmaktadır, b) X-gal olarak adlandırılan (5-bromo-4-kloro-3-indolil /3-o-galaktopiranozit) kimyasal ve duyarlı bakterilerin bulunduğu ortamda, M13mpl8 vektörü ve bu vektör kullanılarak elde edilen klonlann oluşturduğu plaklar. /3-galaktozidaz X-gal'i hidrolize ettiğinde, çözünmeyen mavi bir boya ortaya çıkmaktadır. Bu ortamdaki çok sayıda mavi plak klonlanan DNA' yi içermeyen vektörlere işaret etmektedir. Renksiz olan diğer birçok plak ise, yabancı DNA' nın vektöre ilave edildiğini ve lacZ geninin bozulduğunu göstermektedir. Bakteriyofaj M13' ün klonlama gibi genetik tekniklerde kullanımı, seçim ve eleme özelliklerinin her ikisini birden sağlamaktadır. Mavi/Beyaz renk farkı kullanılarak, klonlanan DNA'yı içeren faj seçilebilir. Ancak PCR ürünü klonlanmadıkça, ilgilenilen gen klonunu içeren fajı bulmak için beyaz plaklann tümü elenmelidir. c) Bu seçim ortamının bir bölümünün büyütülmüş hali.
482 • Bolüm 15 • IHikrobiyal Genomikler
plak oluşumuna yol açar (f3-galaktozidaz aktivitesi yok) ve bu sayede klonlan tanımlamak kolaylaşır (Şekil 15.1b, c). Benzer düzenlemeler lambda klonlama vektöründe ve plazmit klonlama vektörlerinde, klonlanan DNA içeren kolonilerin veya plakların belirlenmesinde kullanılmaktadır. M13'ün Moleküle* Klonlamada Kullanımı
M13 vektörüne DNA'yı klonlamak için; replikatif çift zincirli DNA, enfekte konakçıdan izole edilir ve restriksiyon enzimiyle kesilir(eo&Kısım 16.3). Daha sonra yabancı DNA da aynı enzimlerle muamele edilir. Ligasyonla (bağlama reaksiyonu), yabancı DNA 'yi içeren çift zincirli Mİ3 molekülleri elde edilir. Bu moleküller, transformasyon yolu ile (öt*a Kısım 10.7) hücre içerisine sokulduğunda, replike olarak klonlanmış DNA'yı içeren tek zincirli bakteriyofaj DNA partikülleri üretilir. Üretilen tek zincirli M13 DNA daha sonra doğrudan DNA dizi analizi için kullanılabilir. Yabancı DNA'nm ilave edildiği bölgenin baz dizisi bilindiğinden (kullanılan restriksiyon enzimlerinin özelliklerinden dolayı) bu bölgeyi içine alan bir çift primerin düzenlemesi ve bu noktadan ileriye doğru Sanger dizi analizi yöntemi kullanılarak tüm DNA dizisinin belirlenmesi mümkündür. M13 türevleri, büyük yabancı DNA moleküllerinin bile dizi analizi için çok kullanışlı olmakta ve farklı genomların dizi analizinde ön plana çıkmaktadır. Mİ 3 benzeri vektörler veya 2 kb civarında klonlanmış DNA taşıyabilen plazmit vektörleri, prokaryotik genomların taranması amacıyla gen kütüphanelerinin oluşturulmasında elverişlidir (<3OöKısım 10.15). 20 kb veya daha büyük (£»oKısım 10.17) DNA' lan taşıyabilen bakteriyofaj lambda vektörleri de genomik projelerde yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak dizi analizi yapılacak genomun büyüklüğü arttıkça tüm dizinin elde edilebilmesi için ihtiyaç duyulan klon sayısı da artar. Bu nedenle, ökaryotik mikroorganizmaların veya insan gibi yüksek ökaryot formlarının DNA kütüphanelerinin yapımında, büyük DNA parçalarını taşıyabilen vektörlere sahip olmak gerekir. Bu, kütüphanenin başlangıç büyüklüğünün kontrol edilebilir olmasını sağlar. Bu tip vektörler geliştirilmiş ve yapay kromozomlar olarak adlandırılmıştır. Bakteriyal Yapay Kromozomlar: BAC lar
Birçok bakteri, bünyesinde kararlı durumda replike olabilen büyük plazmitler içerir. Örneğin E. coli'ye ait F plazmiti, böyle bir plazmitdir (cSsKısım 7.4 ve 10.10). F plazmiti, E. coli' de kararlı durumda replike olur. Bu plazmitin E. coli' de F plazmiti olarak adlandırılan ve yüksek miktarda kromozomal DNA taşıyabilen doğal türevleri bulunmaktadır (i»aKısım 10.12). İstenilen özellikleri taşımasından dolayı F plazmiti, bakteriyal yapay kromozom veya BAC'lar olarak isimlendirilen klonlama vektörlerinin yapımında kullanılmaktadır. Şekil 15.2» F plazmiti esaslı BAC'm yapısını göstermektedir. 99.2 kb' lık F ile kıyaslandığında,
Klonlama bölgesi Seçici marker
Kopya sayısını düşük tutar
sopA
repE
Replikasyon için gerekli
• Şekil 15.2 Bir bakteriyal yapay kromozomun genetik haritası. BAC'lar, E. coli F plazmitinin bir türevidir. Şematize edilen BAC 6.7 kb'dir. Haritanın yukansındaki klonlama bölgesi çok sayıda farklı restriksiyon enzim tanıma serisi içermektedir, cat geni kloramfenikol antibiyotiğine dirençliliği sağlar. Diğer genler ise plazmit replikasyonunda görev alır. 99.2 kb büyüklükteki F plazmitinde (C*-*iŞekil 10.18) tüm bu genler yoğun replikasyon bölgesinde bulunur. Bundan dolayı BAC'lar tüm F plazmitinin sadece küçük bir kısmını içerir.
vektör sadece 6.7 kb büyüklüğündedir. BAC, F plazmitinden sadece replikasyon için gerekli oriS ve repE ile kopya sayısını çok düşük tutan sopA ve sopB genlerini içermektedir (oo&Kısım 10.9). Bu plazmite, konakçıya kromfenikol direçliliği kazandıran cat geni ve DNA'nm klonlanabilmesi için bazı restriksiyon kesim tanıma serilerini içeren klonlama bölgesi eklenmiştir. Bu tip BAC vektörüne 300 kb'dan daha büyük yabancı DNA eklenebilmekte ve içinde stabil bir şekilde muhafaza edilebilmektedir. BAC vektörü için tipik konakçı, doğal tipten farklı olarak, normal restriksiyon ve modifikasyon sistemlerinden yoksun E. coli mutantıdır (aOöKısım 7.7 ve 9.6). Bu mutantlar BAC'ı zarar görmekten korur. Tipik olarak konakçı, bazı rekombinasyon yolları açısından noksan olabilir (ooöKısım 10.6). Bu durum, klonlanan DNA' nın BAC tan konakçı kromozomuna rekombinasyonuna ve yeniden düzenlenmesine engel olur. Maya Yapay Kromozomları: YAC'lar
Yapay kromozom teriminin kaynağı, tarihsel olarak BAC'lar değil maya yapay kromozomları ya da kısaca YAC'lardır. Bu vektörler maya içerisinde normal kromozomlar gibi replike olabilir ve çok büyük DNA parçalarının eklenebileceği bölgeler içerir. YAC ların normal ökaryotik kromozomlar gibi işlev gösterebilmeleri için; 1) DNA replikasyon orijinine 2) Kromozom uçlarında DNA replikasyonunun gerçekleşebilmesi için telomerlere (ooöKısım 14.6) ve 3) Sentromere (mitoz sırasında kromozomların ayrılması için gerekli kromozom bölgesi), sahip olmaları gerekir. Bu vektörler ayrıca konak hücreye, tipik olarak Saccharomyces cerevisiae mayasına, aktarıldıktan sonra, seçim için kullanılabilecek bir gen ve bir klonlama bölgesi de içermelidir. Şekil 15.3» yabancı bir DNA klonlanan YAC vektörünün şemasını göstermektedir.
15.1 • Genomik Klonlama Vektörleri ve Dizi Analizi • 481
riyofajmın charon türevleri, genomik analizleri de kapsayan klonlama ve dizi analizi çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bakteriyofaj M13, bakteriyal ve maya yapay kromozomları gibi daha özelleşmiş vektörleri ise bu bölümde inceleyeceğiz.
Faj M13mpl8, M13 fajmın; klonlamayı kolaylaştırmak amacı ile, intergenik bölgesi modifiye edilmiş bir türevidir (Şekil 15.1a •). Kullanışlı modifikasyonlardan biri Escherichia coli'de fi-galaktozidaz
enzimini kodlayan lacZ geninin işlevsel parçasının ilavesidir. M13mpl8 fajıyla enfekte olan hücreler, indikatör ortamlar üzerindeki renkleri sayesinde kolaylıkla belirlenebilir (/3-galaktozidaz enzimi laktozu glukoz ve galaktoza parçalamasının yanı sıra, mavi renk oluşumuna naden olan bileşiği de parçalayabilir Şekil 15.1b). Bu lacZ geni 54 bç uzunlukta ve çoklu bağlayıcı (polilinker) olarak isimlendirilen bir DNA parçasını içerecek şekilde modifiye edilmiştir. Çoklu bağlayıcı, Mİ 3 genomunda yer almayan, pek çok restriksiyon enzim kesim bölgelerine sahip olması nedeniyle klonlamada kullanılabilir. Çoklu bağlayıcı, lacZ geninin kodlama bölgesinin başlangıcına ilave edilmiştir ve enzim aktivitesini etkilemez. Ancak klonlama sürecinde ilave DNA'nm çoklu bağlayıcıya eklenmesi, geni inaktif hale getirir. İlave DNA'ları içeren fajlar renksiz
Bakteriyofaj M13'ten Türetilen Vektörler M13, konakçısını öldürmeden replike olabilen ipliksi yapıda (filamentöz) bir bakteriyofajdır (<3°c> Kısım 16.3). Bu fajm olgun partikülleri hücre parçalanmasına yol açmadan tomurcuklanma suretiyle konakçı hücrelerinden salınır ve enfekte olan hücreler faj DNA' sı için sürekli kaynak teşkil eder. Mİ 3 faj genomunun büyük bir kısmı virüs replikasyonu için ihtiyaç duyulan genleri içerir. Ancak, intergenik dizi olarak tanımlanan küçük bölge klonlama bölgesi olarak kullanılabilmektedir. 5 kbç uzunluğa kadar çeşitli boyuttaki yabancı DNA'lar virüs canlılığını etkilemeden klonlanabilir. Genom büyüdükçe olgun virüs partiküllerinin (virion) gelişmesi kolaylaşır. BamHI Smal Kpn\
EcoRl
Sal\
Xba\
Pst\
H/ndlIl
Polylinker-g aat tCG AGC TCG GTA CCC GGG GAT CCT CTA GAG TCG ACC TGC AGG CAT GCA AGC
I
I
I
I
I
I
I
••• Asn Ser Ser Ser Val Pro Giy
I
I
I
I
I
I
I
I
Asp Pro Leu Glu Ser Thr Cys Arg
I
I I
His Ala Ser —
(a)
Klonlanan DNA'yı içeren faj
Klonlanan DNA'yı içermeyen faj
(b)
• Şekil 15.1 Bakteriyofaj M13 aracılığı ile klonlama. a) Klonlama vektörü olarak kullanılan M13'ün bir türevi olan M13mpl8' in kısmi haritası. Vektör lac promotorunu (lacP) ve /3-galaktozidaz enziminin işlevsel kısmım kodlayan lacZ genini içermektedir. Bu genin başlangıcında farklı kesim bölgeleri içeren, fakat okuma kalıbı düzenim koruyan bir çoklu bağlayıcı (polilinker) bulunmaktadır. Çoklu bağlayıcı tarafından kodlanan amino asitler gösterilmiştir. Çoklu bağlayıcıya klonlanan birçok DNA fragmenti, lacZ genini kesintiye uğratmakta ve /3-galaktozidaz aktivitesinin kaybolmasına neden olmaktadır, b) X-gal olarak adlandırılan (5-bromo-4-kloro-3-indolil /8-o-galaktopiranozit) kimyasal ve duyarlı bakterilerin bulunduğu ortamda, M13mpl8 vektörü ve bu vektör kullamlarak elde edilen klonlann oluşturduğu plaklar. /3-galaktozidaz X-gal'i hidrolize ettiğinde, çözünmeyen mavi bir boya ortaya çıkmaktadır. Bu ortamdaki çok sayıda mavi plak klonlanan DNA' yi içermeyen vektörlere işaret etmektedir. Renksiz olan diğer birçok plak ise, yabancı DNA' nın vektöre ilave edildiğini ve lacZ geninin bozulduğunu göstermektedir. Bakteriyofaj M13' ün klonlama gibi genetik tekniklerde kullanımı, seçim ve eleme özelliklerinin her ikisini birden sağlamaktadır. Mavi/Beyaz renk farkı kullamlarak, klonlanan DNA'yı içeren faj seçilebilir. Ancak PCR ürünü klonlanmadıkça, ilgilenilen gen klonunu içeren fajı bulmak için beyaz plakların tümü elenmelidir. c) Bu seçim ortamının bir bölümünün büyütülmüş hali.
482 • Bölüm 15 • Mikrobiyal Cenomikler
plak oluşumuna yol açar (Ş-galaktozidaz aktivitesi yok) ve bu sayede klonları tanımlamak kolaylaşır (Şekil 15.1b, c). Benzer düzenlemeler lambda klonlama vektöründe ve plazmit klonlama vektörlerinde, klonlanan DNA içeren kolonilerin veya plakların belirlenmesinde kullanılmaktadır. M13'ün Moleküler Klonlamada Kullanımı
Mİ 3 vektörüne DNA'yı klonlamak için; replikatif çift zincirli DNA, enfekte konakçıdan izole edilir ve restriksiyon enzimiyle kesilir(coaKısım 16.3). Daha sonra yabancı DNA da aynı enzimlerle muamele edilir. Ligasyonla (bağlama reaksiyonu), yabancı DNA 'yi içeren çift zincirli Mİ 3 molekülleri elde edilir. Bu moleküller, transformasyon yolu ile («*>ö Kısım 10.7) hücre içerisine sokulduğunda, replike olarak klonlanmış DNA'yı içeren tek zincirli bakteriyofaj DNA partikülleri üretilir. Üretilen tek zincirli Mİ 3 DNA daha sonra doğrudan DNA dizi analizi için kullanılabilir. Yabancı DNA'nın ilave edildiği bölgenin baz dizisi bilindiğinden (kullanılan restriksiyon enzimlerinin özelliklerinden dolayı) bu bölgeyi içine alan bir çift primerin düzenlemesi ve bu noktadan ileriye doğru Sanger dizi analizi yöntemi kullanılarak tüm DNA dizisinin belirlenmesi mümkündür. Mİ 3 türevleri, büyük yabancı DNA moleküllerinin bile dizi analizi için çok kullanışlı olmakta ve farklı genomların dizi analizinde ön plana çıkmaktadır. M13 benzeri vektörler veya 2 kb civarında klonlanmış DNA taşıyabilen plazmit vektörleri, prokaryotik genomların taranması amacıyla gen kütüphanelerinin oluşturulmasında elverişlidir (öo&Kısım 10.15). 20 kb veya daha büyük (««»Kısım 10.17) DNA' lan taşıyabilen bakteriyofaj lambda vektörleri de genomik projelerde yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak dizi analizi yapılacak genomun büyüklüğü arttıkça tüm dizinin elde edilebilmesi için ihtiyaç duyulan klon sayısı da artar. Bu nedenle, ökaryotik mikroorganizmaların veya insan gibi yüksek ökaryot formlarının DNA kütüphanelerinin yapımında, büyük DNA parçalarını taşıyabilen vektörlere sahip olmak gerekir. Bu, kütüphanenin başlangıç büyüklüğünün kontrol edilebilir olmasını sağlar. Bu tip vektörler geliştirilmiş ve yapay kromozomlar olarak adlandırılmıştır. Bakteriyal Yapay Kromozomlar: BAC lar
Birçok bakteri, bünyesinde kararlı durumda replike olabilen büyük plazmitler içerir. Örneğin E. coli'ye ait F plazmiti, böyle bir plazmitdir (csssKısım 7.4 ve 10.10). F plazmiti, E. coli' de kararlı durumda replike olur. Bu plazmitin E. coli' de F plazmiti olarak adlandırılan ve yüksek miktarda kromozomal DNA taşıyabilen doğal türevleri bulunmaktadır (öooKısım 10.12). İstenilen özellikleri taşımasından dolayı F plazmiti, bakteriyal yapay kromozom veya BAC'lar olarak isimlendirilen klonlama vektörlerinin yapımında kullanılmaktadır. Şekil 15.2• F plazmiti esaslı BAC'm yapısını göstermektedir. 99.2 kb' lık F ile kıyaslandığında,
Klonlama bölgesi Seçici marker
Kopya sayısını düşük tutar
sopA
repE
Replikasyon için gerekli
* Şekil 15.2 Bir bakteriyal yapay kromozomun genetik haritası. BAC'lar, E. coli F plazmitinin bir türevidir. Şematize edilen BAC 6.7 kb'dir. Haritanın yukansındaki klonlama bölgesi çok sayıda farklı restriksiyon enzim tamma serisi içermektedir, cat geni kloramfenikol antibiyotiğine dirençliliği sağlar. Diğer genler ise plazmit replikasyonunda görev alır. 99.2 kb büyüklükteki F plazmitinde (
vektör sadece 6.7 kb büyüklüğündedir. BAC, F plazmitinden sadece replikasyon için gerekli oriS ve repE ile kopya sayısını çok düşük tutan sopA ve sopB genlerini içermektedir (ö^öKısım 10.9). Bu plazmite, konakçıya kromfenikol direçliliği kazandıran cat geni ve DNA'nın klonlanabilmesi için bazı restriksiyon kesim tanıma serilerini içeren klonlama bölgesi eklenmiştir. Bu tip BAC vektörüne 300 kb'dan daha büyük yabancı DNA eklenebilmekte ve içinde stabil bir şekilde muhafaza edilebilmektedir. BAC vektörü için tipik konakçı, doğal tipten farklı olarak, normal restriksiyon ve modifikasyon sistemlerinden yoksun E. coli mutanhdır (öo&Kısım 7.7 ve 9.6). Bu mutantlar BAC'ı zarar görmekten korur. Tipik olarak konakçı, bazı rekombinasyon yolları açısından noksan olabilir («»»Kısım 10.6). Bu durum, klonlanan DNA' nın BAC tan konakçı kromozomuna rekombinasyonuna ve yeniden düzenlenmesine engel olur. Maya Yapay Kromozomları: YAC'lar
Yapay kromozom teriminin kaynağı, tarihsel olarak BAC'lar değil maya yapay kromozomları ya da kısaca YAC'lardır. Bu vektörler maya içerisinde normal kromozomlar gibi replike olabilir ve çok büyük DNA parçalarının eklenebileceği bölgeler içerir. YAC ların normal ökaryotik kromozomlar gibi işlev gösterebilmeleri için; 1) DNA replikasyon orijinine 2) Kromozom uçlarında DNA replikasyonunun gerçekleşebilmesi için telomerlere (oOöKısım 14.6) ve 3) Sentromere (mitoz sırasında kromozomların ayrılması için gerekli kromozom bölgesi), sahip olmaları gerekir. Bu vektörler ayrıca konak hücreye, tipik olarak Saccharomyces cerevisiae mayasına, aktarıldıktan sonra, seçim için kullanılabilecek bir gen ve bir klonlama bölgesi de içermelidir. Şekil 15.3» yabancı bir DNA klonlanan YAC vektörünün şemasını göstermektedir.
15 2 • Genomun Dizi Analizi • 483 Seçici marker TEL
ARS CEN
Not i
Not I ARAYA GİREN \
YAC
URA3
TEL
* Şekil 15.3 Yabancı DNA içeren bir maya yapay kromozomunun (VAC) şeması. Yabancı DNA vektöre Not I restriksiyon bölgelerinden klonlanmıştır. Telomerler TEL, sentromerler CEN olarak ifade edilmiştir. Replikasyon orijini ise ARS (otonom replikasyon dizisi) olarak gösterilmiştir. Seçim için kullanılan gen URA3'tür. Klonun transforme edildiği konakçı bu gende mutasyon içerdiğinden, normal + gelişim için urasile ihtiyaç duyar (Ura). Bu YAC i içeren konakçı hücreler Ura hale dönüşür. Şema ölçekli çizilmemiştir. İlave edilen DNA normalde 200-800 kbç, vektör ise sadece 10 kbç uzunluğundadır.
YAC vektörleri yalnız 10 kbç boyutunda olmasına rağmen, 200-800 kbç' lik klonlanmış DNA parçasını taşıyabilir. Belirli bir DNA parçasının BAC veya YAC vektörlerine klonlandığınm doğrulanmasının ardından, bu bölge daha detaylı analiz veya dizi analizleri için plazmit ya da bakteriyofaj vektörlerine yeniden klonlanabilir. YAC'lar BAC'lara göre daha büyük DNA taşıyabilmelerine rağmen, klonlanan bölgenin rekombinasyonu veya yeniden düzenlenmesi mayalarda E. coli'ye kıyasla daha fazla problem oluşturur. İşte bu nedenle BAC'lar genomik klonlamada YAC lara kıyasla daha yaygın olarak kullanılmaktadır . 15.1 Kavramların Gözden Geçirilmesi Genomların dizi analizi ve analiz edilen parçaların bir araya getirilmesi amacı ile kullanılabilecek özelleşmiş klonlama vektörleri düzenlenmiştir. M13 gibi bazı türevler, hem doğrudan DNA dizi analizinde ve hem de klonlanmada kullanılmaya elverişlidir. Yapay kromozomlar gibi diğer sistemler ise, megabaz boyutuna yaklaşan büyük DNA parçalarının klonlanması için uygundur. •
Yabancı DNA'nın klonlanabilmesi için M13, lambda , BAC ve YAC'larm kapasitelerini kıyaslayınız? • Maya Yapay Kromozomunun, maya hücresi içinde kromozom gibi davranması nasıl mümkün olur?
Genomun Dizi Analizi Genomun analizi, restriksiyon endonükleaz enzim kesimleri ile üretilen tüm genom parçalarını içeren genomik kütüphanenin oluşturulması ile başlar. Bu işlemin tamamlanmasının ardından dizi analizine geçilir. Rastgele Dizi Analizi Günümüzde genomik dizi analizi projelerinin hemen hemen hepsinde rastgele dizi analizi tekniği uygulanmaktadır. Bu teknik; çok hızlı dizi analizi kapasitesi, bilgisayar kullanımı ve otomasyon ile gerçekleştirilmektedir. Rastgele dizi analizi, özel olarak desteklenen insan projesinin de dahil olduğu ökaryotlar yanında, prokaryotlarm kromozomları için de kullanılmaktadır. Tüm genom rastgele dizi analizi teknikleri, genomun tamamının rastgele klonlanmasmı ve klonların dizi analizlerini kapsar. Bu yöntemde, klonlanan DNA'ların herhangi birinin sırası ve yeri bilinmeden, klonlar dizi analizine tabi tutulur. Diziler daha sonra, bilgisayar tarafından üst üste
çakışan bölgelerin araştırılması esasına göre analiz edilir. Örtüşen bölgeler, dizi analizi yapılan bölgelerin doğru sıra ile birleştirilmesine olanak sağlar. Rastgele dizi analizi yönteminde elde edilen veriler, çoğu kez ihtiyaç duyulandan fazladır. Çünkü tüm dizilerin elde olunduğundan emin olmak için, birçoğu aynı ya da benzer olan, çok sayıda klonun dizi analizinin yapılmasına gerek vadır. Bu nedenle, genomun her bir parçası için tipik olarak 7-10 adet fazla dizi elde edilir. Aynı bölgenin 7-10 kata ulaşan tekrarı, dizi içerisinde herhangi bir noktada ortaya çıkacak belirsizlik olasılığını büyük oranda düşürür. Rastgele dizi analizinin verimli olması için, klonlanmanın etkin şekilde gerçekleşmesi (fazla sayıda klona ihtiyaç vardır) ve klonlanan DNA' nın mümkün olduğunca rastgele oluşturulması gerekir. Restriksiyon bölgeleri rastgele değildir, fakat genomda sık bulunan ve kısa bir tanıma serisine sahip bir enzim kullanılarak, genomik DNA' da rastgele kesimler oluşturulabilir. Daha fazla rastgele parça elde edebilmek için ise, DNA nebulizer aracılığı ile mekanik olarak kırılabilir. Nebulizer, hortum benzeri küçük bir açıklığa sahiptir ve DNA içeren çözeltiyi bu açıklıktan partiküler halde püskürterek DNA' mn kırılmasına yol açar. DNA parçaları jel elektroforezi kullanılarak saflaştırıldıktan sonra, vektör içerisine klonlanarak konakçıya transforme edilir (ao&Kısım 7.7). Genomun Birleştirilmesi Rastgele dizi analizinin tamamlanmasının ardından, birleştirme olarak adlandırılan işlem ile tüm parçalar düzenlenmelidir. Örneğin, prokaryotlara ait çevrimsel genomun birleştirilmesinde; tüm parçaların doğru sıraya konulması ve çakışanların elimine edilmesinin ardından genom, genlerin ve işlevsel bölgelerin tanımlanması işlemi olan yorum için uygun hale gelir (bak. Kısım 15.3). Dizide boşlukların kaldığı bazı durumlarda, rastgele analizi ve birleştirme işlemleri sonunda genomun tamamının dizisi elde edilemez. Bu gibi durumlarda, boşlukları içerdiği tahmin edilen klonlar araştırılabilir. Bu işlem için uygulanabilecek bir yöntem; dizilerde bulunan boşluk bölgelerinin bilinen uçlarına özgül tamamlayıcı primerler kullanılarak PCR reaksiyonlarının gerçekleştirilmesidir. Burada, ilave klonların rastgele dizi analizi yöntemindeki gibi rastgele değil, yönlendirilmiş olduğuna dikkat edilmelidir. Ancak bu klonlardaki diziler, boşluklara uygun yakınlıkta bulunan ve üst üste çakışan dizileri içermelidir.
484 • Bölüm 15 • Mikrobiyal Cenomikler
Bazı genom projelerinin amacı, tüm genom dizisinin belirlenmesi anlamına gelen "kapalı genom" elde etmektir. Diğer projeler, küçük boşlukların analizleri gerçekleştirilmediği için, taslak seviyesinde kalmıştır. Rastgele dizi analizi ve birleştirme işlemleri büyük çapta otomatize sistemlerde gerçekleştirilirken, boşlukların tamamlanması otomasyona izin vermez. Bu nedenle kapalı genomun oluşturulması, taslak genom dizisinin oluşturulmasına kıyasla daha yüksek maliyet içerir. 15.2 Kavramların Gözden Geçirilmesi Rastgele DNA dizi analizi tekniklerinde; küçük genom parçalarının klonlanması ve dizi analizlerinin yapılmasından sonra, üst üste çakışan bölgeler bilgisayar ortamında birleştirilerek, dizinin son hali oluşturulur. •
Rastgele dizi analizinin neden çok doğru bir genom dizisi verdiği düşünülür? • Genomun birleştirilmesi süresince ne yapılmaktadır?
Genomun Yorumu Genom dizi analizi projelerinde nihai amaç yalnız genomun dizisinin yapılması değil, aynı zamanda dizilerin içerdiği genlerin belirlenmesidir. Genomik analizlerde, dizi analizi ve birleştirme işlemlerinin tamamlanmasından sonraki aşama, yorumlama yani ham dizi verilerini genom içerisinde yer alan genlerin listesi haline dönüştürülmesi aşamasıdır. Kuramsal Genlerin Yerlerinin Belirlenmesi: ORF'lerin tanımlanması
Herhangi bir organizmaya ait genlerin büyük bir çoğunluğu proteinleri kodlamakta ve birçok mikrobiyal genomda, genomun büyük bir bölümü bu kodlama dizilerini içermektedir. Çünkü mikrobiyal ökaryotların genomları, hayvan ve bitki genomlarına kıyasla daha az intron içerirken, prokaryot genomları intron içermez. Mikrobiyal genomlar, regülatör ve transkripsiyonel terminator bölgeler tarafından sınırlanan ve sayıları yüzden bine kadar değişen çok sayıda açık okuma kalıbı (ORF) içermektedir (öttsKısım 7.13). İşlevsel ORF, hücre içerisinde protein kodlayan ORF' dir. Bu nedenle, protein kodlayan veya protein kodlama potansiyelindeki genlerin yerlerinin belirlenmesi için en basit yol, genomun dizisinin ORF'ler bakımından bilgisayar ortamında araştırılmasıdır. Bilgisayar Bir ORF'yi Nasıl Bulur?
Hücre içerisinde ribozomlar, genellikle AUG olan
bir start (başlama) kodonundan translasyonu baş-
latmak suretiyle okuma kalıbını tespit eder. Daha sonra ribozom bu işlemi okuma kalıbında yer alan stop kodonuna ulaşıncaya kadar sürdürür (c 3 ^ Kısım 7.13). Bir ORF' nin bulunması için ilk adım, dizi içerisinde bu sinyallere bakmaktır. Ancak olası işlevsel ORF'lerin tanımlanması, okuma kalıbı içerisinde yer alan start ve stop (sonlanma) kodonlarının araştırılmasından daha karmaşık bir süreçtir. Çünkü bu
kodonlar rastlantısal olarak ortaya çıkabilmektedir. Bu nedenle diğer ipuçları araştırılmaktadır. Bir ORF'nin işlevsel olduğunu gösterecek ipuçlarından biri boyutudur. Hücresel proteinlerin çoğu 100 veya daha fazla aminoasit içerdiğinden, birçok işlevsel ORF 100 kodondan (300 nükleotitden) daha uzundur. Ancak bilgisayarın 100 kodondan kısa ORF'leri gözardı edecek kadar basit düzeyde programlanması, bazı işlevsel genlerin gözden kaçırılmasına neden olacaktır. Bunun için diğer faktörler de dikkate alınmalıdır. Birçok organizma sinonim kodonlar arasında tercihte bulunduğundan (&*$ Kısım 7.14), kodon eğilimi bir ORF'nin işlevsel olup olmadığı hakkında ipucu verebilir. Eğer verilen ORF'nin kodon kullanımı genel kodon kullanımından oldukça farklı ise, bu ORF ya işlevsel değildir ya da işlevsel olabilir fakat yatay gen transferiyle alınmıştır (£»oKısım 15.8). Ayrıca, prokaryotik ribozomların translasyona başlangıç kodonundan (çoğunlukla 5') değil, mRNA üzerindeki başlangıç kodonunun önünde bulunan Shine-Delgarno serilerini tanıyarak başladıkları hatırlanmalıdır (<**aKısım 7.16). Bu nedenle, bir prokaryotik genomun DNA dizisinin, potansiyel Shine-Delgarno serileri bakımından araştırılması hem bir ORF'nin işlevsel olup olmadığının ve hem de hangi başlangıç kodonunun kullanıldığının belirlenmesine yardımcı olacaktır. Şekil 15.4», bilgisayar tarafından "vuruş" olarak tanımlanacak bir DNA bölgesini ORF karakteristikleriyle birlikte göstermektedir. En küçük plazmitler veya viral genomlarda tüm genler tek bir zincirden transkribe edilse de, genomun bazı bölgelerinde her iki zincirden de transkripsiyon yapılmaktadır. İşte bu nedenle bilgisayarın, DNA'nin her iki zincirinde de tarama yapması gerekmektedir. Şekil 15.4 bir genin bir zincirden, bir başka genin ise diğer zincirinden ifade edildiği bir şemayı göstermektedir.
• AGGA
• TAC (XXX)n ATT
Transkripsiyon terminatörü
* Şekil 15.4 İşlevsel açık okuma kalıplan. Geni için gösterilen dizi, zincirlerden birinde yaklaşık 8 bazla start kodonundan (ATG) ayrılmış işlevsel Shine-Delgarno (AGGA) serisi içerir. Start kodonunu kodlayan bazları yaklaşık 100 anlamlı kodon takip eder ve sonunda bir stop (anlamsız) (UAA en yaygın kullanılan stop kodonudur) kodonu bulunur. DNA molekülünde geni olarak tammlanan ORF'nin üst akış yönünde promotor, alt akış yönünde ise bir transkripsiyon terminatörü yer alır. Gen2 de aynı elemanları içermekte, ancak ters yönde ifade edilmektedir. Shine-Delgarno serileri, start kodonlan, anlamlı kodonlar ve stop kodonlan yalnız RNA düzeyinde işlevseldir. Burada gösterdiğimiz DNA bazları (baz çiftleri) bu işlevsel dizileri kodlamaktadır.
486 • Bolum 15 • Mikrobiyal Genomikler
Prokaryotik Genomların Büyüklükleri
Bakteri ve Arke türlerine ait prokaryotik genomların analizleri, ORF içerikleri ve genom büyüklükleri arasında güçlü bir ilişkinin bulunduğuna işaret etmektedir (Şekil 15.6»). Gerçekte, organizma ne olursa olsun, prokaryotik DNA'larm bir megabazı yaklaşık 1000 ORF kodlamaktadır (Şekil 15.6). Bu nedenle prokaryotlarda, genomunun büyük kısmını kodlama yapmayan DNA'larm oluşturduğu ökaryotlardan farklı olarak (özellikle büyük genomlu organizmalarda, c«5sTablo 15.3), genom büyüklüğünün artışı ile orantılı bir şekilde gen sayısı da artmaktadır. Genomik dizilerin analiz edilmesi, bazı temel biyolojik sorulara yanıt bulmamıza olanak sağlamaktadır. Örneğin; Mycoplasma genitalium veMycoplasma pneumoniae'ya ait küçük genomlarının analizi, M. genüallium' da bulunan 470 ÖRF'nin tümünün M. Pneumoniae'da da bulunduğunu göstermiştir. Diğer organizmalarda homolog genlerin araştırılması ve transpozon mutasyonu (Kısım 10.14) gibi teknikler kullanarak gereksiz genlerin belirlenmesi sonucu, bilim adamları; yaklaşık 300 protein kodlayan genin, hücresel varlığın sürdürülebilmesi için yeterli olabileceğini tanımlamıştır. Bilinen hiçbir organizma bu kadar düşük sayıda gen içermemektedir. Fakat bazı ender organizmalar, diğerlerine oranla küçük genomlara sahiptir. Örneğin; bir ototrof olan Methanocaldococcus jannaschü (Arke) (öOöKısım 13.4 ve 17.7) yalnız 1738 ORF içerir. Bu ORF içeriği, söz konusu organizmanın sadece canlılığını sürdürmesini değil, aynı zamanda CO2'den organik hücresel bileşiklerin sentezlenmesini de sağlamaktadır (fl*s Kısım 13.4). Aquifex aelicus (Bakteri) da ototroftur ve 1.5 Mbç' lik boyutu ile bilinen en küçük ototrof genomuna sahiptir (Tablo 15.1). Methanocaldococcus ve Aquifex'\erm her ikisi de hipertermofiliktir. Buradan, kaynama derecesine yakın sıcaklıktaki sularda ototrofik hayat döngüsüne sahip canlıların, büyük genomlara ihtiyaç duymadıkları sonucunu çıkarmak mümkündür. Tablo 15.1'de verilen genomların küçük olması rastlantı değildir. Küçük genomlar için dizi analizi stratejileri daha basit olduğundan, dizi analizi çalışmalarının ilk dönemlerinde küçük genomların dizi analizinin yapılmasına yönelik eğilim bulunmaktaydı. Mycoplasma genitalliumun genomunun, Chlorella (ooaKısım 16.6) ve Bakteriyofaj G (c*x$ Kısım 9.2) virüslerinden daha küçük olduğu unutulmamalıdır. Bilinen en küçük prokaryot genomu, M. Genitallium'un genomundan daha küçük olan Nanoarchaeum equitans (Arke) genomudur. Bu organizmaya ait genom, M. genitallium'un genomundan (Tablo 15.1) 90 kbç daha küçüktür. N. eauitans hipertermofilik olup, diğer bir hipertermofil Ignicoccus' un parazitidir (öSoKısım 13.11). N. ecjuitans'm gen içeriğinin analizi, anabolizma ve katabolizmada görev alan proteinleri kodlayan hemen hemen tüm genlerden yoksun olduğunu göstermiştir. Ancak ilginç olarak N. equitans'm genomu, daha büyük bir genoma sahip olan M. genitallium'den daha fazla ORF içermektedir (Tablo 15.1). Bu durum N. eauitans genomunun daha yoğun olmasından ve hemen hemen kodlama yapmayan DNA bölgesi içermemesinden kaynaklanmaktadır.
1 2
3
4
5
6
7
10
Genomun büyüklüğü (megabaz) * Şekil 15.6 Prokaryotlarda genom büyüklüğü ile ORF içeriği arasındaki ilişki. Bu veriler bakteri ve arke türlerini içeren 115 prokaryotik örneğin genomlarının tamamının analizi sonucu elde edilmiştir. Kaynak: Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 101: 3160-3165 (2004).
Bazı prokaryotlar çok büyük genomlara sahiptir. Soya fasulyesi kök nodüllerinde azot tespit eden Bradyrhizobium japonicum, (<s%Kısım 19.22) örneğin, bir ökaryot olan Saccharomyces cerevisiae mayasından 2800 adet fazla ORF içermektedir (a»i.Börüm 15.6 ve Tablo 15.1). Streptomyces türünün tipik üyesi olan ve 8 Mbç'den daha büyük düzlemsel kromozoma sahip Streptomyces coelicolor bakterisinde, 7846 ORF bulunmaktadır. Bu miktar S. cerevisiae'in sahip olduğu ORF' lerden yaklaşık 1800 adet daha fazladır. Daha büyük prokaryotik genomların olduğu bilinmektedir, fakat bu genomların dizi analizi henüz tamamlanmamıştır. Bunlar, 9.2 Mbç'lik Myxococcus xonthus kromozomu ve 12.3 Mbç'lik Sorangium cellulosum (cösKısım 12.17) kromozomudur. Bu bakterilerin her ikisi de kayan bakteri olup, bilinen en büyük prokaryotik genomlara sahiptir. Bu boyutlarla karşılaştırılabilecek bir genoma ArMerde henüz rastlanmamıştır (Tablo 15.1). Bu nedenle prokaryotik genomların büyüklükleri, büyük virüsler ile küçük ökaryotlara ait kromozom büyüklükleri arasında tanımlanır. 15.4 Kavramların Gözden Geçirilmesi Dizi analizi yapılmış prokaryotik genomların büyüklükleri 0.49 Mbç ile 9.1 Mbç'i arasında değişim gösterir. En küçük prokaryotik genom büyüklüğü, en büyük virüslerle benzer boyutlardayken, en büyük prokaryotik genomlar, bazı ökaryotlarm genomlarından da daha fazla gen içerir. Prokaryotlarda ORF içeriği genom büyüklüğü ile orantılıdır. •
Bradyrhizobium, Nanoarcheaum'dan kaç adet fazla gen içerir? Bu durum iki organizmanın yaşam şeklini nasıl etkiler?
•
4 Mbç'lik bir genom yaklaşık olarak kaç adet ORF içerebilir?
Prokaryotik Genomlar: Biyoinformatik Analizler ve Gen Dağılımları Birleştirme ve yorum aşamalarını takiben, tipik genomik analizlere gen karşılaştırma işlemi ile devam edilir. Buradaki temel soru "bir organizmadaki genlerin tamamının, diğer organizmadakiler ile nasıl karşılaştırılacağı" dır. Bu tip analizler, dizi
15.5 • Prokaryotik Genomlar: Biyoinformatik Analizler ve Gen Dağılımları • 487
Tablo 15.1 Seçilmiş prokaryotik kromozomlar Organizma
Büyüklük (baz çifti) ORF* Yorumlar
Bacteria Mycoplasma genitalium
580,070
470
Bilinen en küçük bakteriyal genom (O^Kısım 12.21)
Mycoplasma pneumoniae
816,394
677
Pnömoniye neden olur (ö°&Kısım 12.21)
Borrelia burgdorferi
910,725
853 894
Spiroket, düzlemesel kromozom, Lyme hastalığı etmeni (G^Kısım 12.33 ve 27.4) Zorunlu hücre içi paraziti, yaygın insan patojeni (OCfeKısım 12.27 ve 26.13
Chlamydia trachomatis
1,042,519
Rickettsia prozvazekü
1,111,523
834
Treponema pallidum
1,138,006
1041
Spiroket, frengi etmeni (£>°ÖKısım 12.33 ve 26.12)
Aquifex aeolicus
1,551,335
1544
Hipertermofil ototrof ( « « « ı s ı m 12.37)
Zorunlu hücre içi paraziti, endemik tifüs etmeni (
Prochlorococcus marinus
1,657,990
1590
Okyanuslarda en fazla bulunan fototrof ( ö ^ K ı s ı m 12.26 ve 19.6)
Helicobacter pylori
1,667,867
1590
Peptik ülser etmeni (ö°OKısım 26.10)
Streptococcus pyogenes
1,852,442
1752
Kızıl ve faranjit etmeni, patojen ( ^ ö K ı s ı m 26.2)
Thermotoga maritima
1,860,725
1877
Hipertermofil, ( ö ^ K ı s ı m 12.36) ayrıca Bak. Şekil 15.7
Chlorobium tepidum
2,154,946
2288
Model fototrofik bakteri (<3°ÖKısiin 12.32)
Staphyhcoccus aureus
2,814,816
2593
Nazokomiyel enfeksiyonların ana etmeni (öOOKısım 12.19 ve 25.7)
Deinococcus radiodurans
3,284,156
2185
Radyasyon dirençli, çok kromozomlu («»»Kısım 12.34)
Synechocystis sp.
3,573,470
3168
Siyanobakteri (ö**»Kısım 12.25)
Bdellovibrio bacteriovorus
3,782,950
3584
Diğer prokaryotlarm predatorü (öO2>Kısım 12.14)
Geobacter sulfurreducens
3,814,139
3467
Biyoremedasyon için model (ce^Kısım 17.18)
Caulobacter crescentus
4,016,942
3767
Kompleks yaşam döngüsü (£*QöKısım 12.16)
Bacülus subtüis
4,214,810
4100
Gram pozitif genetik model ( « ^ K ı s ı m 12.20)
Mycobacterium tuberculosis
4,411,529
3924
Tüberküloz etmeni (ce^Kısım 12.23 ve 26.5)
Escherichia coli
4,639,221
4288
Gram negatif genetik model (öOöKısım 12.11)
Bacülus anthracis
5,227,293
5738
Patojen biyosavaş ajanı (<**5Kısım 12.20)
Rhodopseudomonas palustris
5,459,213
4836
Metabolik açıdan çok yönlü anoksijenik fototrofik (<£>°SKısım 12.2)
Pseudomonas aeruginosa
6,264,403
5570
Metabolik açıdan çok yönlü oportunistik patojen (CK^Kısım 12.7)
Streptomyces coelicolor
8,667,507
7825
Düzlemsel kromozom içerir, antibiyotik üretir (O°öKısım 12.24)
Bradyrhizobium japonicum
9,105,828
8317
N 2 tespiti, baklagillerde nodul oluşturur (eöOKısım 19.22)
Archaea 490,885
552
1,564,905
1509
Termofilik, asidofilik (e°öKısım 13.5)
Methanocaldococcus jannaschii 1,664,976 1,669,695 Aeropyrum pernix
1738
Metanojen (O°öKısım 13.4)
1841
Hipertermofil (OOaKısım 13.9)
Pyrococcus horikoshii
1,738,505
2061
Hipertermofil (<**SKısım 13.6)
Methanothermobacter
1,751,377
1855
Metanojen (<=»aKısım 13.4)
2,178,400
2436
Hipertermofil (ö°öKısım 13.7)
Halobacterium salinarum
2,571,010
2630
Ekstrem halofil, bakteriyorodopsin (^aoKısım 13.3)
Sulfolobus solfataricus
2,992,245
2977
Hipertermofil, sülfür kemolitotrof (0°&Kısım 13.9)
Nanoarchaeum equitans Thermoplasma acidophilum
thernıoautotrophicus Archaeoglobus fulgidus
Bilinen en küçük genom (<3°ÖKısım 13.11)
"Bunlar ve yüzlerce diğer prokaryotik genomu, kar amaçlı olmayan genomik araştırmalar enstitüsü (TIGR), web sitesindeki TIGR veritabanından (www.tigr.org/ tab), Rockwille MD ve http//www.genomesonline.org. sitesinden bulunabilir. Diğer ilişkili web sitelerinin adresleri de burada mevcuttur. *Açık okuma kalıpları. ORF'lerin belirtilmesinin amacı, organizmanın kodlayabileceği toplam protein sayısını tahmin edebilmektir. 100'den fazla amino asit kodlayan ORF'ler bulunmaktadır Küçük ORF'ler, çalışılan her organizmanın kodon kullanımı veya bir başka organizmanın bir geni ile benzerlik göstermedikçe protein kodlamaz.
analizi yapılmış genomun diğer organizmalar ile ne kadar yakın ya da uzak olduğunu ortaya koyar. Bu aktiviteler biyoinformatik 'in büyük bölümünü teşkil eder. Prokaryotik Genomların Gen İçeriği Bir organizmadaki genlerin tamamı, bir çok durumda bu organizmanın biyolojisini tanımlar. Bir diğer deyişle genomlar, organizmaların yaşam
tarzı ile şekillenmektedir. Örneğin; obligat parazit bir bakteri olan Treponema pallidum' un (c«öKısım 26.12), gereksinimi olan amino asitleri konakçısından sağlandığından, aminoasit biyosentezi için çok az gene ihtiyaç duyacağı düşünülebilir. Gerçekten, bilgisayar incelemesi sonucunda, Treponema pallidum 'un konakçısından aldığı bazı peptitleri serbest aminoasitlere dönüştürecek proteazları kodlayan genlere sahip olmasına rağmen, aminoa-
• Bölüm 15 • Mikrobiyal Cenomihler
şekerlerin metabolizması ile ilgilidir. Tüm bunlar, T. maritima'nm organik materyal bakımından zengin bir çevrede yaşamını sürdürdüğüne işaret etmektedir. Prokaryotlara ait genler ve aktiviteleri üzerine yapılan bazı analizler Tablo 15.2'de verilmiştir. Benzer veriler, tamamlanmış ve yorumlanmış her yeni genom yayınlandığında ilave edilmektedir. Şu ana kadar elde edilen bilgiler, prokaryotlarda gen dağılımında farklı bir modelin olduğunu açıkça göstermektedir. Örneğin, prokaryotik genomlarda metabolik genler en fazla bulunan gen sınıfı olsa da, genom boyutu küçüldükçe translasyonda rol alan genlerin yüzdesi metabolik genlerin yüzdesine yaklaşmaktadır (Tablo 15.2 ve ö°&Şekil 15.8). Diğer yandan, DNA replikasyonu ve transkripsiyonunda rol alan genlerin, hücre biyolojisi için büyük bir önem taşımasına rağmen, prokaryotik
sit biyosentezi için gerekli tanımlanabilir genlerden yoksun olduğu görülmüştür. Tam tersine parazit olmayan Escherichia coli, amino asit biyosentezi ve metabolizmasına katılan 131 gene, Bacillus sııbtilis ise 200'den fazla gene sahiptir. Karşılaştırmalı analizler, bir organizmanın bilinen özelliklerinden hareketle, içermesi zorunlu olan enzimleri kodlayan genlerin araştırılması açısından yararlıdır. Örneğin, Thermologa maritima (Bakteri), sıcak deniz sedimentlerinde bulunan bir hipertermofildir ve çok sayıda şekeri katabolize etme yeteneğinde olduğu bilinmektedir. Şekil 15.7» T. marüima'nm genom analizinden türetilmiş bazı metabolik yolları ve transport sistemlerini özetlemektedir. Tahmin edilebileceği gibi, genom özellikle karbonhidrat ve amino asit transport genleri açısından oldukça zengindir. Genomunun büyük kısmı (%7) aynı zamanda basit ve kompleks
Peptit ABC transport sistemleri
Glukoz
Dallanmış zincirli amino asitler
Glukonat
DOUDOROFF İZ YOLU Glukoz-6-P —•- 6 Fosfoglukonat
1
PENTOZ FOSFAT
\
Glisilin Asetamit Treonin
Amino asitler
KDPG
DHAP •*— Gliserol-3-P -*— Gliserol 33 flagellar ve motor genler
Pruvat —*• Okzalasetat —»- Aspartat
Aspartat —*- Malat
cheAlB/C/DmmtY A
7MCP1er Asetil-CoA OR ^ " 1 2-oksiglutarat 1 Aldehitler ! Ketoizovalerat 1
Histidin Glutamat —»-Prolin Glutamin
ADP + P,
Kemotaktik sinyaller
ATP
Katyonlar LI
«M'W"tı İ J ı
imana*»
•îl'HH'i.
Katyonlar
Riboz Maltoz
Gliserol 3-P ATP sintaz
Gliserol akımı
Urasil
NH 4 +
Potasyum
Demir
* Şekil 15.7 Bakteri grubu üyesi Thermotoga maritima' ya ait bazı metabolik iz yolları ve transport sistemleri. Şekil, bu organizmanın metabolik özelliklerini göstermektedir. Bunlar; genomik dizi analizi sonucu tanımlanmış, transporttan sorumlu proteinlerin yanı sıra, bazı organik bileşiklerin metabolizması ve enerji üretimi için gereken metabolik iz yollarını kapsamaktadır. Gen isimleri verilmemiştir. Genom birçok ABC transport sistemi içerir (OCç>Kısım 4.7). Bunların 12'si karbonhidratlar, 14'ü peptitler ve aminoasitler, diğerleri ise iyonlar için işlev görür. Bunlar şekilde, birçok alt üniteye sahip yapılar olarak gösterilmiştir. Diğer tip transport proteinleri de tanımlanmış ve yuvarlak içine alınarak ifade edilmiştir. Bu organizmanın sahip olduğu flagellası, 7 transdüktör (MCP' ler) ve çeşitli kemotaksi (che) genleri («s^Kısım 8.13) yanında, flagella oluşumunda görev alan genler de (C**aKısım 4.14) gösterilmiştir. Şeker metabolizmasının bazı elemanlan aynca verilmiştir. Bu şekil Genomik Araştırmalar Enstitüsü (TIGK) tarafından yayınlanan çizimden adapte edilmiştir.
15 5 • Prokaryotik Genomlar: Biyoinformatik Analizler ve Gen Dağılımları •
Tablo 15.2
Bakteriyal genomlarda gen fonksiyonu Her bir kategoride yer alan genlerin kromozomdaki yüzdesi
İşlevsel kategori Metabolizma Yapısal Transport Regülasyon Translasyon Transkripsiyon Replikasyon Diğer bilinen Bilinmeyen
Escherichia Haemophilus Mycoplasma coli influcnzae genitalium (4.64 Mbç) (1.83 Mbç) (0.58 Mbç)' 21.0
19.0
14.6
5.5 8.5 4.5 1.3 2.7
4.7 7.0 6.6 8.0 1.5 4.9
3.6 7.3 6.0
8.5 38.1
5.2 43.0
10.0
21.6 2.6 6.8 5.8
32.0
" Kromozom büyüklükleri. Listede bulunan her organizma yalnız bir halkasal kromozom içerir.
genomunun sadece küçük bir bölümü oluşturması şaşırtıcıdır (Tablo 15.2). Tanımlanmayan ORF'ler
Organizmadan organizmaya farklılıklar görülse de, birçok durumda çalışılan bir genomda tanımlanabilen genlerin oranı %70 ya da toplam ORF'lerin sayısından daha düşüktür. Tanımlanmamış ORF'ler, "kuramsal proteinleri", yani varlıklarını bildiğimiz ancak tanımlayamadığımız proteinleri kodlar. Tanımlanmamış bir ORF, protein kodlama yeteneğindeki bir geninin tüm işaretlerini, yani; ribozom bağlanma bölgesi (Operon içerisinde Shine-Delgarno serilerinin alt kısmında bulunan bir bölge), start ve stop kodonlarını içerir, ancak tanımlanmış herhangi bir proteinle amino asit dizisi bakımından homoloji göstermez. Tanımlanmamış ORF'ler bize prokaryotik genler hakkında hala bilmediğimiz pek çok şeyin olduğu gerçeğini anımsatır. Diğer yandan, bir organizmadaki bir genin işlevinin belirlenmesi yolu ile, bir başka organizmada yer alan tanımlanmamış homolog ORF'nin de aynı proteini kodladığı bulunabilir. Dünyada özellikleri en iyi anlaşılmış organizma olan E. co/f'nin 4300 geninden sadece 2700'ünün işlevinin tanımlanmış olması ilgi çekicidir. Ancak E. co/f'nin makromolekül sentezi ve gelişimi için gerekli olan merkezi metabolizma genlerinin büyük çoğunluğu tanımlanmıştır. Bundan dolayı tanımlanamayan ORF'lerin işlevleri aydınlatıldıkça, büyük çoğunluğunun organizmalar için zorunluluk arzetmeyen ya da nadir proteinleri kodladığı görülecektir. Kuramsal proteinlerin tanımlanmasında ilerleme kaydedildikçe, E. coli'de makromolekül sentezi ve merkezi metabolizmadan sorumlu genlerin yüzdesinin düşeceği tahmin edilmektedir. Escherichia coli'de tanımlanamayan proteinlerin çoğunun; nadir substratların katabolizmasında işlev gören ya da yalnız özel koşullar altında üretilen veya merkezi metabolik reaksiyonların "yedekleme" sistemlerini teşkil eden proteinlerin regülasyonunda görev aldığı düşünülmektedir.
Genom Büyüklüğünün Bir İşlevi Olarak Gen Kategorileri
Tablo 15.2' de sunulan verilerden de anlaşılacağı üzere; bir organizmanın içerdiği genler, o organizmanın genom büyüklüğüne bağlı olarak hücresel işlevleri arasında bölüşülür. Bu durum Şekil 15.8*'de, Bakteri türlerine ait çok sayıda genom için özetlenmiştir. Bu şekilde protein sentezinde rol alan genlerin yüzdesinin, örneğin küçük genomlu organizmalarda büyük oranda arttığı görülmektedir. Bunun aksine, ikili regülasyon sistemlerinin de dahil olduğu regülasyon (sinyal transdüksiyonu, öOsKısım 8.12) ve transkripsiyonda rol alan genler, büyük genomlu organizmalarda anlamlı bir şekilde artmaktadır. DNA replikasyonu ve enerji üretimi gibi diğer temel hücresel süreçlere ait genler için ise, genom büyüklüğüne bağlı olarak düşük düzeyde oransal farklanma meydana gelir (Şekil 15.8). Şekil 15.8'de özetlenen genomik analizler, bir çok gen göz ardı edilse de, protein sentezinden sorumlu genlerin göz ardı edilemeyeceğini ortaya koymaktadır. Genom küçüldükçe, translasyon süreçlerinde rol alan genlerin yüzdesi artar (Tablo 15.2). Diğer yandan büyük genomlu organizmalar, küçük genomlu organizmalara oranla transkripsiyon ve diğer regülasyon tiplerinde görev alan genleri daha fazla içerir. Özel gen ifadelerini kontrol eden bu regülasyon sistemleri, muhtemelen hücrenin mevcut koşullara daha iyi yanıt vermesini sağlar. Küçük genomlu organizmalarda, çoğunlukla parazit olmaları ve ihtiyaçlarını konakçılarından karşılamaları nedeniyle, bu tip regülatör sistemler zorunlu değildir. Tam aksine, büyük genomlu organizmaların genomları, birçok regülatör ve özel metabolik genleri kodlama kapasitesine sahiptir. Bu durum, çoğunlukla toprakta bulunan büyük genomlu prokaryotlarm habitatlarmda daha yarışmacı olmalarını sağlamaktadır. Toprak, karbon ve enerji kaynağı bakımından fakir veya çok zayıf olup, farklı tipleri bulunmaktadır (c«o>Kısım • DNA replikasyonu • Translasyon Transkripsiyon Sinyal transdüksiyonu • Enerji üretimi
2000
4000
6000
8000
10,000
Genomdaki toplam ORF'ler
* Şekil 15.8 Toplam ORF' terin genomdaki yüzdesi cinsinden işlevsel gen kategorilerinin gösterimi. Küçük genoma sahip organizmalarda translasyon ve DNA replikasyonunu kodlayan genlerin, büyük genoma sahip organizmalarda ise transkripsiyonel regülatör genlerin yüzde oranı artmaktadır. Kaynak Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 101:3160-3165 (2004).
490 • Bölüm 15 • Mikrobiyal Cenomihler
19.2 ve 19.4). Çeşitli metabolik seçenekleri kodlayan büyük genom, bu tip bir habitat içinde güçlü şekilde seçilebilir. Tablo 15.1'de listelenen prokaryotlardan genom büyüklükleri 6 Mbç'ini geçenler toprakta yaşamaktadır.
• • •
Her işlevsel ORF bir protein kodlar mı? Kuramsal protein nedir? Prokaryotlar hangi kategorideki genleri yüzde olarak daha fazla içerir?
Ökaryotik Mikrobiyal Genomlar
Bakteri ve Arkelerde Gen Dağılımları
Gen kategorilerinin analizi, aralarında Tablo 15.2'de gösterilen üç Bakterinin de bulunduğu çok sayıda prokaryot üzerinde de yapılmış ve elde edilen sonuçlar Şekil 15.9 • 'da karşılaştırılmıştır. Şekilde verilen sonuçların, hem Bakteri ve hem de Arkelere ait genomların içerdiği genlerin ortalaması olduğu unutulmamalıdır. Ortalamalar dikkate alındığında Arke türlerinin; Bakterilere oranla genomlarının daha büyük bölümünü enerji ve koenzim üretimine ayırdığı görülmektedir (Şüphesiz, bu sonuçlar metanojenik Arkeler tarafından üretilen fazla sayıdaki koenzimlere bağlı olarak sapma gösterir. <**> Kısım 13.4 ve 17.17). Diğer taraftan Arkeler, membran biyosentezi ve transport gibi hücre membran işlevlerine veya karbonhidrat metabolizmasına, Bakterilerden daha az gen ayırır. Prokaryotların her iki grubu da işlevleri bilinmeyen ya da kuramsal proteinleri kodlayan çok sayıda gene sahiptir. Ancak, Arkelerde bu iki grup gen Bakterilerden daha yaygın olarak bulunur (Şekil 15.9). Bundan dolayı, genom büyüklüğüne ilave olarak (Şekil 15.8) hücresel organizasyon düzeyinde de gen sayısının kontrol edildiği söylenebilir (Şekil 15.9). Bu tip veriler Bakteri ve Arkelerin yaşam şekli arasındaki farklılıkları yansıtır. 15.5 Kavramların Gölden Geçirilmesi Birçok gen, diğer organizmalarda bulunan genlerle gösterdiği dizi benzerlikleri kullanılarak tanımlanabilir. Ancak, dizi analizi yapılmış genlerin önemli bir kısmının işlevi bilinmemektedir. Genel olarak Bakteri ve Arkelerin içerdikleri genler birbiri ile ilişkili fakat farklıdır. Biyoinformatik, genomik analizlerde önemli rol oynar.
Karbohidrat metabolizması
Hücre membranı
Çok sayıda bilinen mikrobiyal ökaryot bulunmaktadır ve bugüne kadar, çeşitli mikrobiyal ve yüksek ökaryotik genomların dizi analizi yapılmıştır (Tablo 15.3). Saccharomyces cerevisiae mayası, endüstride yaygın olarak kullanılmasından ve hücre biyolojisi için model organizma olmasından dolayı oldukça önemli bir ökaryottur (Bölüm 30). Bu nedenle söz konusu organizma üzerinde yoğunlaşacağız. Maya Genomu
Haploit maya genomu, 220 kbç'den 2352 kbç'ine kadar değişen boyutlarda 16 kromozom içerir. Mayanın toplam çekirdek genomu (Mitokondri, bazı plazmit ve virüs benzeri genetik elementler hariç) yaklaşık 13.392 kbç' dir. Bu genomun tam dizi analizinin yapılmasına rağmen, neden yaklaşık ifadesinin kullanıldığını merak etmiş olabilirsiniz. Mayalar, diğer pek çok ökaryot gibi, büyük oranda tekrar eden DNA' ya sahiptir (co^Kısım 7.4). 1997 yılında maya genomunun dizi analizi yayınlandığında, tüm "özdeş" tekrar bölgelerin dizi analizi yapılmamıştı. Özdeş veya çok benzer uzun bölgelerin dizi analizini yapmak ve elde edilen verileri uygun bir çerçeve içerisinde toplamak güçtür. Örneğin 12. maya kromozomu, yaklaşık 1260 kbç olan 100-200 adet maya rRNA geni tekrarını içerir. Bu rRNA gen tekrarlarını bir başka tekrar serisi takip eder. Bu bölgenin dizi analizi tamamen yapılamadığından, maya genomunun kesin boyutu bilinmemektedir. rRNA operonlarmdaki 100-200 özdeş tekrarın yanısıra, maya çekirdek genomu tRNA'lar için 275 gen (sadece birkaçı özdeş) ve diğer tip kod
Koenzim metabolizması
Enerji üretimi
Bilinmeyen fonksiyon
Genel tahmin
Fonksiyonel kategori * Şekil 15.9 Bakteri ve arkelerin gen kategorilerindeki değişimler. Veriler 34 Bakteri ve 12 Arke türünün ortalamalarıdır. "Bilinmeyen işlev" protein kodladığı bilinen fakat, işlevi bilinmeyen genleri, "Genel tahmin" ise, var olup olmadığı kesin olarak bilinmeyen kuramsal proteinleri kodlayan genleri ifade etmektedir. Kaynak Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 101:3160-3165 (2004).
15 6 • Okaryotik Mihrobiyal Genomlar • 491
içermeyen RNA'lar için ise 80 gen içermektedir (öCJ&Kısım 7.16). Maya'da 6340 adet olası ORF'nin olduğu tahmin edilmiş, fakat yapılan detaylı analizler sonucunda bu sayı, bazı prokaryotlardan da az olan 5570' e düşmüştür (Tablo 15.1). Bunların hemen hemen 3400'ü işlevleri bilinen proteinleri kodlamaktadır. Bu organizmanın çok farklı genetik ve biyokimyasal tekniklerin uygulanmasına olanak vermesi, proteinlerin işlevlerinin tanımlanmasında önemli avantajlar sağlar. Mayanın Minimal Gen İçeriği ve İntronların Varlığı
Bilinen genlerin hangileri maya için zorunludur? Maya ya da herhangi bir mikroorganizmada bu sorunun araştırılmasında, bozucu (knockout) mutasyonların rol aldığı bir mekanizma kullanılmaktadır (oasKısım 10.14). Bozucu mutasyonlar, bir genin işlev dışı bırakılması esasına dayanır. Genellikle bu tip mutasyonlar, haploit bir organizmada hücrenin gelişimi için gerekli olan gende yapılamaz. Ancak maya diploit durumda da geliştirilebilmektedir (oo^Kısım 14.7). Bu tip mutasyonlar diploitde oluşturulduktan sonra, haploit durumda bulunup bulunmadıkları araştırılarak, bir genin bir hücrenin canlılığı için gerekli olup olmadığı belirlenebilir. Bu gibi teknikler kullanarak, maya ORF'lerinin 877'sinin yaşam için zorunlu olduğu, 3121'inin ise olmadığı açıkça görülmüştür. Bu sayının, prokaryotlarda hücresel yaşam için ihtiyaç duyulan minimal sayıdan yaklaşık 300 adet daha fazla olduğuna dikkat edilmelidir (oooBölüm 15.3). Ökaryotlar, prokaryotlardan daha karmaşık organizmalar olduğundan, minimal gen sayısının daha fazla olması normaldir. Tablo 15.3
Yorumlar cuniculi
Saccharomyces cerevisiae
Caenorhabditis elegans
Drosophila melanogaster
Genom büyüklüğü
Kromozom sayısı
Protein kodlayan genler"
2.9 Mbç
11
1997
Bu maya endüstriyel açıdan önemli bir organizma olmasının yanısıra (Kısım 30.10 ve 30.13) biyokimyasal ve genetik çalışmalar için de modeldir Hayvan gelişimi ile ilgili çalışmaları için önemli bir model olan halkalı solucan Meyve sineği yoğun olarak çalışılan bir model organizmadır
13 Mbç
16
5570
97 Mbç
6
19099
180 Mbç
4
13601
125 Mbç
5
25498
2500 Mbç 3000 Mbç
23
30000
23
25000-35000c
Bu, bitkilerdeki genetik çalışmalar için model bir organizmadır
Mus
Sıçan, memeli model sistemi
Homo sapiens
Diğer bazı önemli okaryotik mikroorganizmaların genomlarının da dizi analizi yapılmıştır. Sıtma etkeni bir parazit olan Plasmodium falciparum' un genom dizi analizi için uluslararası işbirliği yapılmıştır (c«5Kısım 27.5). P. falciparum' un 27 Mbç' lik genomu, büyüklükleri 0.7 ile 3.4 Mbç arasında değişen 14 kromozom içermektedir. Encephalitozoon cuniculi insanlarda ve diğer hayvanlarda akciğer enfeksiyonuna neden olan bir hücre içi patojendir. E. cuniculi mitokondriden yoksundur (ö^aKısım 14.9). Haploit 11 kromozom içeren ve yalnız 2.9 Mbç olan genomu pek çok prokaryot genomundan daha küçüktür (Tablo 15.1). Ustilago maydis, yaklaşık 20 Mbç büyüklüğünde genoma sahip, bitki patojeni bir Fungus' dur. Bu patojen, mısırda büyük ekonomik kayıplara yol açan leke hastalığına neden olur.
Çok küçük genom; insan patojeni
Arabidopsis thaliana musculus
Diğer Okaryotik Mikroorganizmalar
Bazı okaryotik çekirdek genomları
Organizma Encephalitozoon
Mayalar, ökaryot olması nedeniyle intron içerir (cösKısım 7.1). Ancak mayanın protein kodlayan genlerinde toplamda sadece 225 intron bulunur, intron içeren birçok maya geninde saptanan tek intronlar, oldukça küçüktür ve bulunduğu genin 5' ucuna yakın bir bölgede yer alır. Bu durum Tablo 15.3'te verilen daha yüksek organizmaların genomlarından çok farklıdır. Örneğin, Caemorhabditis elegans solucanın genlerinde ortalama 5 ve meyvesineği Drosophila genlerinde ise 4 intron bulunmaktadır, intronlar ayrıca, gen başına ortalama 5 intron içeren hardal bitkisi Arabidopsis'de de yaygındır. Arabidopsis genlerinin %75'den fazlası intron içerir. İnsanlarda hemen hemen protein kodlayan genlerin tümü intronlara sahiptir ve gen başına 10 veya daha fazla intronun bulunması ender rastlanan bir durum değildir. Ayrıca bu organizmalarda intronlar ekzonlardan çok daha büyüktür.
İnsan genomu, yalnız taslak haliyle mevcuttur.
Tüm veriler bu organizmaların haploit çekirdek genomlarına aittir Protein kodlayan genlerin sayısı, bilinen genlerin ve işlevsel proteinleri kodlayan genlerin dizilerinin sayısı esas alınarak hesaplanmıştır. İki farklı grup tarafından "taslak" dizi analizleri yayınlanmasına rağmen, insan genomundaki gen sayısı halen tartışılmaktadır. Gen sayısı 60 000 gibi yüksek sayıda olabilir.
492 • Bolum 15 • Mikrobiyal Genomiklcr
Leishmania majör (leishmaniasis), Candida albi-
cans (bazı maya enfeksiyonları, öOaKısım 27.8), Entamoeba histolytica (amipli dizanteri, o«öKısım 14.9 ve 28.8) Giardia lamblia (giardiasis, s^sKısım 28.6) ve Pneumocystis carini (AiDS'le ilişkili pnemoni, oeiöKısım 26.14) gibi patojenler başta olmak üzere, diğer ökaryotik mikroorganizmaların genomlarının dizi analizinde önemli gelişmeler sağlanmıştır. Ayrıca, fare ve sıçanların genomlarının tam dizisi bilinmektedir. Tabi ki insan genom dizisi de çıkarılmış, ancak henüz tamamen yorumlanmamıştır (Tablo 15.3).
•m
15.6 Kavramların Gözden Geçirilmesi
Saccharomyces cerevisiae ve diğer birçok mikrobiyal ökaryot genomunun bütününün dizi analizi yapılmıştır. Maya tarafından kodlanan 5570 proteinden, yalnız 877'si yaşam için zorunludur. Mayanın protein kodlayan genlerinin sadece birkaçı intron içerir. •
Bir genin bulunduğu organizma için yaşamsal önem taşıdığını nasıl gösterirsiniz? • Okaryot organizma Encephalitozoon'un genomunda olağandışı durum nedir?
DİĞER GENLER VE GENOMLARIN EVRİMİ Hücrelerin yanısıra, organelleri ve virüsleri içeren diğer yapılar da genoma sahiptir. Bu bölümde organel genomları ve genom evriminin bazı noktalarını ele alacağız. İlgilenilen genler için genomların nasıl «araştırıldığı" üzerinde durarak bölümü sonlandıracağız.
karakteristik genom yapısı Şekil 15.10'da verilmiştir. Kloroplast genomunda yer alan genlerin çoğu, ototrofide ve fotosentezde görev alan proteinleri kodlar. Ancak kloroplast genomu aynı zamanda kloroplast ribozomlarında kullanılan rRNA'ları, translasyon sistemi tarafından kullanılan tRNA'ları, translasyon ve transkripsiyonda görev alan proteinlerin birkaçını ve diğer bazı proteinleri de kodlamaktadır. Kloroplast içerisinde işlev gören bazı proteinler, tahminen serbest yaşayan fotosentetik endosimbiyontların evrimleşmesi sonucu oluşan kloroplastlardan çekirdek içerisine göç eden genler tarafından kodlanır. Serbest yaşayan prokaryotlardan farklı olarak, kloroplast genlerinde intronlar yaygın olarak bulunur. Bu intronlar kendi kendini işleme yeteneğindedir (aocsKısım 14.8). Kloroplast genomlarının analizleri endosimbiyotik hipotezi kesin olarak desteklemektedir (csnöKısım 11.4). Örneğin, kloroplast genomlarının; Escherichia coli, Siyanobakteri ve diğer Bakterilere
homolog olan genleri içerdiği gösterilmiştir. Kloroplastlar, diğer genlerin yanı sıra, hücre bölünmesinde görev alan proteinleri kodlayan genleri de içerir (««sBölüm 6.2). Bu durum, kloroplast bölünme mekanizmasının, Bakterideki mekanizma ile benzer olduğunu akla getirmektedir. Ayrıca, membranlardan proteinlerin taşınmasında rol alan kloroplast genleri, bakteride bulunan genler ile büyük ölçüde benzerdir. Mitokondriyel Genomlar
Mitokondriler enerji üretiminde görev almakta ve birçok ökaryotik organizmada bulunmaktadır. Mitokondriyel genomlar esasen oksidatif fosfoOrganel Genomları rilasyonla ilgili proteinleri kodlamakla birlikte, kloroplast genomlarında olduğu gibi, protein senTemel organeller olan mitokondri ve kloroplastlar, tezi için gerekli translasyonel proteinleri, rRNA ve kendilerine ait DNA içerir (««»Kısım 14.4). MitotRNA'ları da kodlamaktadır. Ancak birçok mitokondri ve kloroplastların her ikisi de endosimbiyoz yolu ile Bakterilerden türemiştir (£%*$Kısım 11.4kondriyel genom, kloroplastlardan daha az sayıda protein kodlar. ve 14.4). Bundan dolayı, bu organellerin DNA'ları tarafından kodlanan proteinlerin bakterilerle, Ökaryot ve Arkelerin proteinlerine nazaran daha yakın LSC ilişkili olması şaşırtıcı değildir. Bu durum birçok yönden doğrudur, ancak, mitokondriyel genomlar oldukça gizemlidir. Öncelikle fotosentetik organel kloroplast ile başlayacağız. Kloroplast Genomları
Bilinen tüm kloroplast genomları, çevrimsel DNA molekülleridir. Ayrıca, kloroplastlarda herbiri özdeş olan birkaç genom kopyası bulunmaktadır. Tipik kloroplast genomu yaklaşık 120-160 kbç İR büyüklüğünde olup, 6-7 kb'lık iki ters tekrar serisi içerir (Şekil 15.10»). Çeşitli kloroplast genomlarının tam dizi analizi yapılmış ve bunların bazılassc rı Tablo 15.4'te özetlenmiştir. Kamçılı protozoa Mesostigma viride en erken farklılaşmış yeşil bitki • Şekil 15.10 Tipik bir kloroplast genomunun haritası. nesli üyesidir. Bu protozoa'nm kloroplastı, bugüne Kloroplastların genomları çift zincirli ve çevrimsel DNA molekülkadar tanımlananlardan daha fazla protein kodlaleridir. Birçoğu küçük tek (SSC) ve büyük tek (LSC) kopya bölgeyan gen ve tRNA geni içerir. Mesostigma viride' nın lerinin sınırlarını oluşturan iki ters tekrar serisi (IRAve n y içerir.
15.7 • Organel Genomları • 493
Tablo 15.4
Bazı kloroplast genomları Gen Kodu
Büyüklük (bp)
Organizma Chlorella vulgaris Euglena gracilis Mesostigma viride Pinus thunbergü Oryza sativa Zea mays
Yeşil alg Protozoa Protozoa Kara çam Çeltik Mısır
150,613 143,170 118,360 119,707 134,525 140,387
Proteinler 77 67 92 72 70 70
6
tRNA
rRNA
Ters Tekrarlar
31 27 37 32 30 30
1 3 2 1 2 2
Yok Yok Var Var Var Var
" Tüm kloroplast genomları dairesel ve çift zincirlidir (Kısım 14.4) ' Bunlar işlevsel olması muhtemel ORF'ler ve işlevi bilinen proteinleri kodlayan genleri içermektedir. ' Her bir ünite, rRNA genlerini içeren bir RNA operonudur (4^&Kısım 7.13) ' Bak. Şekil 15.10 ' Ters tekrarlar bulunmakla birlikte, bunlar büyük ölçüde kesilerek kısaltılmıştır.
200'den fazla mitokondriyel genomun dizi analizi yapılmıştır. Diğerleri yalnız 3 adet gibi çok az sayıda protein kodlayan gene sahipken, en büyük mitokondriyel genom 62 protein kodlayan gen içermektedir, insanlar dahil tüm hayvanların mitokondrileri sadece 13 protein (ilave 22 tRNA ve 2 rRNA), Saccharomyces cerevisiae mayasının mito-
kondrisi ise sadece 8 protein kodlamaktadır. Kloroplastlar „evrensel" genetik kodu kullanırken, mitokodriler biraz farklı basitleştirilmiş kodlar kullanmaktadır (i«sKısım 7.14). Bu durumun küçük genomlar için oluşan seçici baskıdan kaynaklanması olasıdır. "Standart" sallantılı eşleştirmeler bile dikkate alınsa, 22 adet mitokondriyel tRNA, bütün genetik kodu okumada yetersizdir. Bundan dolayı mitokondrilerde kodon-antikodon arasındaki baz eşleşmesi, hücrelerde olduğundan daha esnektir (Şekil 7.34). Mitokondri genomları, çevrimsel ve tek DNA' dan oluşan kloroplast genomlarından oldukça farklıdır. Örneğin; alg, protozoa ve mantarları içeren bazı türlerin mitokondriyel genomları düzlemseldir. Diğer yandan, örneğin, Saccharomyces cerevisiae mayasında restriksiyon ve genetik haritaları, mitokondriyel genomun çevrimsel olduğunu gösterse de, ana in vivo formu düzlemseldir (Bakteriyofaj T4'ün genetik olarak çevrimsel fakat fiziksel olarak düzlemsel yapıda olduğunu hatırlayınız ÖOÖ Kısım 9.9). Şekil 15.11 »'de 16.569 bç'lik (13 gen) insan mitokondriyel genomunun haritası verilmiştir. Maya mitokondriyel genomu daha büyüktür (85,779 bç), ancak yalnız 8 adet protein kodlayan gene sahiptir. Maya mitokondriyel genomu, proteinleri ve RNA'ları kodlayan genlerin dışında, herhangi bir işleve sahip olmayan AT bakımından zengin DNA bölgeleri de içerir. Son olarak, birkaç organizmaya ait mitokondriler içerisinde küçük plazmitlerin yer aldığı ve bu durumun mitokondriyel genom analizini daha da karmaşık hale getirdiği bilinmelidir. Mitokondriyel ve kloroplast genomlarının analizinde bir diğer sorun ise; organel DNA ve protein dizilerinin bilinmesi durumunda bile, özel bir proteini kod-
layan genin bulunmasının bazen zor oluşudur. Bu durum RNA düzenlenmesinden kaynaklanmaktadır (Bakınız, Mikrobiyal Köşe).
Phe 12S
Thr D-loop jf I Pro
Cytb
Arg Giy ND3 ATPaz 6 ATPaz8
• Şekil 15.11 İnsan mitokondriyel genomunun haritası. İnsan çevrimsel mitokondri genomu 16 569 bç içerir. Genom 16S ve 12S rRNA (prokaryotlardaki 23S ve 16S karşılığı) ve 22 tRNA'lan kodlar. Bu genler turuncunun iki tonuyla gösterilmiştir. Koyu turuncu renk saat yönünün tersine, açık turuncu renk ise saat yönünde transkribe edilen genleri ifade etmektedir (tRNA'lann aminoasit dizaynı, saat yönünün tersine transkribe edilen genler için dışarda, saat yönünde transkribe edilen genler için ise içerde gösterilmiştir). 13 protein kodlama yeteneğindeki gen, yeşil renk ile verilmiştir (Koyu yeşil tonda olanlar saat yönünün tersi, açık tonda olanlar ise saat yönünde transkribe edilir). Genler; Cyti): Sitrokom b, ND1-6: NADH dehidrogenaz kompleksinin bileşenleri, COI-III: Sitrokom oksidaz kompleksinin alt üniteleri, ATPaz 6 ve 8: Mitokondriyel ATPaz kompleksinin polipeptidlerini kodlar. İki promotor D-ilmek olarak adlandırılan ve DNA replikasyonunu da kapsayan bölgede yer alır.
494 • Bölüm 15 • Mikrobiyal Genomikler
Mİkrobİyal Ek Bİlgİ
• RNA1 nın Düzenlenmesi
ölüm 7 ve 14'te bazı genlerin içerdiği kodlama bölgelerinin, kodlama yapmayan ve intron olarak adlandırılan bölgelerle ayrıldığım görmüştük. Tipik olarak intronlar, olgun mRNA'yı oluşturmak üzere, transkripsiyondan sonra meydana gelen ve işleme adı verilen bir süreçte çıkarılır (öCç>Kısım 14.8). Organellerin genomlarında, "işleme" nin hemen hemen tersi bir mekanizma olan, RNA düzenlenmesi' durumunun saptanması ilginçtir. RNA düzenlenmesi; transkripsiyonu yapılan DNA'da bulunmayan nükleotitlerin olgun mRNA' ya ilavesi ya da çıkarılması işlemidir. Bu düzenleme aynı zamanda mRNA' daki bir bazın bir başka baza değişmesine yol açan kimyasal modifikasyonu da kapsamaktadır. RNA düzenlenmesi her iki durumda da kendi geni tarafından kodlanan polipeptide, bir ya da daha fazla farklı amino asidi ilave etmek suretiyle kodonlan değiştirebilmektedir. Tripanazom ve benzeri protozoa mitokondrilerinde (€3O^Kısım 14.10) bazı mitokondriyel transkriptler, çok sayıda üridilat ilavesi veya nadiren çıkarılması yolu ile düzenlenir. Bu tip RNA düzenlemesinin bir örneği Şekil 1 • 'de verilmiştir. RNA düzenlemesi, mRNA'da yer alan ve özel düzenlemelere katılan enzimlere "rehberlik" eden kısa diziler tarafından kontrol edilmektedir. Bu işlem doğru bir
şekilde kontrol edilmelidir. Çünkü, çok fazla veya az bazın ilavesi okuma kalıbı kaymasına neden olarak, ürünü işlevsiz hale getirebilir. Bir bazın bir başka baza değiştirilmesi suretiyle gerçekleştirilen bir diğer RNA düzenlenmesi, yüksek bitkilerin mitokondri ve kloroplastlannda oldukça yaygındır. Bazı mRNA'lar içerisindeki özel bölgelerde, oksidatif deaminasyon yolu ile Sitozin (C); Urasil (U)'e dönüştürülür (Tersi modifikasyon daha nadir meydana gelir). Mısır kloroplastında C'nin U'le dönüştürüldüğü en az 25 bölge bulunmaktadır. Bu durum çoğunlukla organeller için gerekli olsa da, C'nin U'e programlanmış dönüşümü, memeli çekirdek geni için de saptanmıştır. Düzenlenmenin olduğu bölgeye bağlı olarak, meydana gelen yeni kodon, gen tarafından kodProtein mRNA DNA
lanmayan bir protein dizisinin oluşumuna öncülük edebilir. RNA düzenlenmesi karmaşık bir süreç olmasına rağmen, organel genomlarının analizinde önemli bir engel teşkil etmez. Bu durum, söz konusu organeller tarafından kodlanan proteinlerin küçük ve oldukça iyi korunmuş olmalarından ileri gelmektedir. Hücrelerde yaygın olarak bulunan RNA düzenlenmesinin aksine, farklı organizmalardaki ortolog genlerin tanımlanması ve genomik yorumların yapılması, genom analizlerinde bugüne kadar karşılaşılan en önemli güçlüklerdir. RNA düzenlenmesinin işlevi ve orijini bilinmemektedir. Fakat bazı bilim adamları bu işlemin; ribozimler («?52»Kısım 14.7) ve diğer katalitik RNA'larla birlikte, RNA dünyasının diğer bir parçası olduğuna işaret etmektedir (CttsKısım 11.2). •
...Leu Cys; P h e Tıp Phe Arg PhePheCys...
•i • *•i mmm— ... ...
G G TTT TCC C C AAA AGG
AGG TCC
G ... C ...
Şekil 1. Rfl/a Düzenlenmesi Sekilin üst kısmı Trypanasoma bruei protozoonuna ait sitokrom oksidaz enziminin alt ünitesi IH'ün aminoasit dizisinin bir kısmını göstermektedir (C&%s Kısım 14.10). Bu protein mitokondri tarafından kodlanmaktadır. Aminoasit dizisinin altı da, bu bölge için haberci RNA dizisi de verilmiştir (mRNA). Büyük harfle yazılmış olan bazlar genden transkribe edilenlerdir. mRNA'da yer alan küçük harfle yazılmış olanlar ise RNA düzenlenmesi ile transkript içerisine yerleştirilen bazlardır. DNA' da birçok enformasyonel boşluk olsa da, molekülde boşluk bulunmaz. Baz çiftleri arasındaki boşluklar görülebilirliği kolaylaştırmak amacı ile konulmuştur.
Organeller ve Çekirdek Genomu
Kloroplastlar ve mitokondriler kodladıklarından daha fazla proteine ihtiyaç duyar. Örneğin; sadece organel translasyonunda, kodladıklarından daha fazla protein görev yapar. Bu nedenle, birçok organel işlevi çekirdek genleri tarafından yönetilir. Maya mitokondrisinin birbirinden farklı 400'den fazla proteini içerdiği tahmin edilmekte, önceden de bahsettiğimiz gibi, bunların sadece 8 adedi maya mitokondrisi tarafından kodlanmaktadır. Dolayısı ile maya mitokondrisi tarafından ihtiyaç duyulan proteinlerin neredeyse tümü çekirdekte bulunan genler tarafından kodlanmaktadır. Bu genlerin (ve proteinlerin) ökaryotik çekirdekte ve sitoplazmada özel işlev görmesi ve bu işlevlerin aynısını organellerde de yapması, bu durumu açıklayabilir. Ancak gerçek durum böyle değildir. Birçok organel proteini, çekirdekte bulunmasına, transkripsiyonlarının ve translasyonlarının hücre sitoplazmasmda yapılmasına rağmen, organeller tarafından kullanılır. Bu nedenle söz konusu proteinler organellere taşınmak zorundadır.
Çalışılan ilk mitokondriyel proteinler, translasyonda görev yapan proteinlerdir. Bu çekirdek kodlu mitokondriyel proteinlerin Eukarya yerine, Bacteria proteinleri ile yakın ilişkili olduğu bulunmuştur. Bu nedenle ilk olarak mitokondriyel proteinleri kodlayan birçok genin, mitokondriden çekirdeğe transfer edildiği fikri ortaya çıkmıştır. Ancak bu dönemde genomik yaklaşımların geliştirilmemiş olmasından dolayı, bu sorunun aydınlatılması oldukça güçtü. Bu sorunun analizi için; bir ökaryot genom dizisine, bu ökaryotun mitokondri genomuyla filogenetik olarak yakın ilişkili olan Bakteri türüne, ve karşılaştırma yapabilmek için diğer bakterilerin genom dizisine ihtiyaç vardır. Ökaryotun mitokondriyel genomunun bilgisinden çok (zira çok az protein kodlamaktadır), mitokondride görev yapan proteinlerin bilgisine gereksinim duyulur. Tüm bu gereksinimleri, Saccharomyces cerevisiae
mayası karşılamakta ve bu organizmada gerçekleştirilen analizler aydınlatıcı bilgiler sunmaktadır.
15 8 • Evrim ve Gen Aileleri • 495
Mitokondriyel proteinleri kodlayan 400 çekirdek geninden, sadece 50 adetinin, mitokondriye işaret eden filogenetik soy ile (a-Proteobakteri, öOöKısım 12.1) yakından ilişkili bulunması ilginçtir. Diğer 150 adedi Bakterilerle ilişkili, fakat a-proteobakterilerle ilişkili değildir. Ancak geri kalan 200 protein, Bakterilerde bilinen genlerle benzer bir homoloji içermeyen genler tarafından kodlanmaktadır. Bakterilerle yakın ilişkili olan proteinler genellikle enerji dönüşümü, translasyon ve biyosentez işlevlerinden sorumlu iken; diğer proteinler membran, regulasyon ve taşıma ile ilişkilidir. Bu nedenle, mitokondrilerin kökeninin endosimbiyotik ilişkilere dayandığına dair birçok işaret bulunsa da, genomik analizler genetik geçmişlerinin tahmin edilenden daha karmaşık olduğunu göstermektedir. 15.7 Kavramların Gözden Geçirilmesi Kloroplast ve mitokondriler çekirdek genomundan bağımsız küçük genomlara sahiptir. Bu genomlar enerji metabolizmasında yer alan bazı proteinleri; tRNA'ları, rRNA'ları ve diğer bazı proteinleri kodlamaktadır. Organellerin genomları çekirdek genomundan bağımsız olsa da, organellerin kendileri bağımsız değildir. Çekirdekte yer alan çok sayıda gen, organel işlevi için gerekli birçok proteini kodlar. Bu genler farklı filogenetik geçmişlere sahiptir. •
Maya ve insan mitokondirilerinde genom büyüklüğü ile gen içeriği arasında nasıl bir ilişki vardır? • Mayada mitokondriyel işlevleri kodlayan genlerle ilgili nadir rastlanan durum nedir? • RNA düzenlemesi nedir? RNA işlenmesinden nasıl ayrılır ?
Evrim ve Gen Aileleri Genomiklerin önceliği, şüphesiz ki bir organizmada bulunan genlerin dizi analizini yapmak, sayılarını ve işlevlerini belirlemektir. Ancak genomikler; dizi analizinin yapılması, genlerin belirlenmesi ve bu sonuçlara göre organizmanın çevresiyle nasıl etkileşeceğine yönelik yorumlar yapılmasından daha çok şey ifade etmektedir. Karşılaştırmalı genomikler organizmalar arasında evrimsel ilişkilerin açıklanmasında da bize yardımcı olur. Evrimsel ilişkilerin genom dizileri kullanılarak yeniden düzenlenmesi, türetilmiş karakteristiklerden ilkel tiplerin ayrılmasına yardım etmekte ve tek gen (örneğin 16S rRNA «^o&Kısım 11-5 ve 14.9) analizlerini temel alarak, filogenetik ağaçlardaki belirsizlikleri çözümleyebilmektedir. Bu bilgiler erken yaşam formlarını anlamamıza ve biyolojinin en merak edilen "yaşam nasıl başlamıştır" sorusuna yanıt bulmada yardımcı olur. Gen Duplikasyonu ve Gen Aileleri: Paraloglar ve Ortologlar
Prokaryot ve ökaryot genomlarının her ikisi de, organizma içinde diğer genlerle ilişkili olan gen
aileleri içerir. Büyük gen aileleri üyesi birçok genin, karşılaştırmalı genomikler sonucu; genel bir kural olmasa da, diğer genlerin duplikasyonu yoluyla türediği gösterilmiştir. Bir organizmanın evrimi sürecinde meydana gelen gen duplikasyonu sonucu çoğalan bu genler paralog olarak adlandırılır. Farklı organizmalarda bulunan, yapısal olarak
benzer ancak tür oluş sürecinde ayrılan genler ise ortolog olarak adlandırılmaktadır. Paralog genlere bir örnek olarak, insanlarda laktat dehidrogenaz (LDH) izoenzimlerini kodlayan genler verilebilir. Bu enzimler, farklı yapısal özelliklerde olmasına rağmen yakın akrabadır ve aynı enzimatik reaksiyonları katalize ederler. Bunun aksine, LDH ortologları; örneğin insan LDH izoenzimi ve Escherichia coli LDH' sidir. Genlerin veya gen ailelerinin çalışılması karşılaştırılmalı genomiklerin temel görevidir. Pek çok mikroorganizmada kromozomların dizi analizi yapıldığından, bu dizilerin karşılaştırması kolaylıkla gerçekleştirilebilmekte ve elde edilen sonuçlar çoğunlukla şaşırtıcı olmaktadır. Örneğin; Arkelerde DNA replikasyonu, transkripsiyon ve translasyonda rol alan genler bakterilerdeki genlerden çok, Ökaryot genleri ile benzerlik göstermektedir. Ancak bilgi işlemlerinde rol alan genlerden farklı olarak metabolik işlevleri kodlayan genler gibi bazı Arke genleri, ökaryotlardakilerden çok Bakterilerdeki genlere benzemektedir. Biyoinformatiğin güçlü analitik araçları; yaşamsal faaliyetler arasındaki bu gibi genetik ilişkileri, tek gen, gen grupları veya genom düzeyinde kolaylıkla anlamamızı sağlamaktadır. Karşılaştırmalı ribozomal RNA dizi analizleri ile yaşamın filogenetik yapısına bakıldığında, alman sonuçlar («sMöKısım 11.5), tüm canlılarda bulunan genlerin çoğunun ortak evrimsel kökene sahip olduğunu göstermiştir. Bu analizler aynı zamanda, az sonra üzerinde konuşacağımız önemli bir konu olan horizontal (yatay) gen transferine dair örnekler de sunmaktadır. Yatay Gen Transferi
Evrim, genetik özelliklerin bir jenerasyondan diğerine transferi esas alınarak öngörülmüştür. Aynı zamanda, yatay (lateral) gen transferi de meydana
gelmekte ve bu durum özellikle genomun tümünde yapılan evrimsel çalışmaları karmaşık hale getirebilmektedir. Yatay gen transferi; atadan döle doğru olan normal kalıtım sürecinden farklı olarak, genlerin bir hücreden diğerine aktarılmasıyla meydana gelir. Prokaryotlarda transformasyon, transdüksiyon ve konjugasyon olmak üzere 3 yatay gen transfer yöntemi bulunmaktadır («3°öBölüm 10). Yatay gen akışı doğada oldukça yaygındır ve farklı gruplar arasında da meydana gelebilen bir süreçtir. Ancak bu gen akışının karşılaştırmalı genomikler kullanılarak tespit edilebilmesi için, organizmalar arasındaki farklılık oldukça fazla olmalıdır. Örneğin, insan patojenleri olan Chlamy-
496 • Bölüm 15 • Mikrobiyal Cenomihler
dia (0°öKısım 15.3 ve 26.13) ve Ricketsia'da Kısım 12.13 ve 27.13) ökaryotik orjine sahip bazı genler bulunmuştur. Ayrıca, genomik analizler,
• •
Paralog ve ortolog genleri karşılaştırın Bir prokaryotta meydana gelebilecek yatay gen transfer mekanizmalarından birini tanımlayın.
Thermetoga moritima' nın (bir Bakteri türü) arke
orjinli olan 400'den fazla gen (genomun % 20'den fazlası) içerdiğini göstermiştir. Bu genlerin 81 adedi farklı gen gruplarında yer almaktadır. Bu durum, söz konusu genlerin, Thermetoga ile aynı sıcak ortamda bulunan Arkelerden yatay gen transferi yolu ile alındığına işaret etmektedir. Genler yorumlandığında, genom içerisindeki yatay gen transferleri belirlenebilir. Uzak akraba türlerde bulunan, ancak benzer proteinleri kodlayan genlerin varlığı, bu genlerin yatay transfer ile kazanıldığının bir işaretidir. Yatay transfer edilen genlere dair bir diğer ipucu ise, araştırılan genomda kodon eğilimi veya G-C (o^Kısım 11.10) içeriği bakımından oldukça farklı ORF veya ORF'lerin bulunmasıdır. Bu ipuçları kullanılarak, prokaryot genomlarında çok sayıda yatay gen transferi örneği tanımlanmıştır. Yatay transferi gerçekleştirilen genler; replikasyon, transkripsiyon ve translasyon gibi temel DNA işlemlerini kodlayan genlerden çok, tipik metabolik işlevleri kodlayan genlerdir. Arkeler ve Bakterilerde bulunan ve daha önce sözü edilen benzer metabolik genler bunlara örnek teşkil eder. Bunun yanı sıra, birçok patojenin («âKısım 21.8 ve 21.9) yatay aktarımla kazanılmış virülens geni belirlenmiştir. Prokaryotlar doğada gen alışverişi yapmaktadır. Bu süreç, muhtemelen genomun belirli bir koşul ya da habitat için "ince ayar" yapmasında işlev görmektedir. Chlamydia trachomatis'm genomunun bir ökaryotik kaynaktan, muhtemelen konakçısı olan insandan, yatay gen transferi ile kazanıldığı belirlenmiştir. Bu durum, ökaryotik çekirdek genlerinin mitokondriyel atadan alınması durumunun tersidir (bak. Kısım 15.7). Eğer C. tractomatise'de tanımlanan bu genler insandan sağlanmış ise, prokaryotlar ile ökaryotlar arasında yatay gen transferinin gerçekleşmesinde kesin bir sınırlamanın olmadığı ortaya çıkmaktadır. Genomların evrimsel analizi, uygulamada da yarar sağlamaktadır. Prokaryotik organizmalara, özellikle de patojenik bakterilere ait genleri kesin tanımlayabilirle yeteneği, bu genleri hedef alan klinik amaçlı kullanım için özel teropatik ve diagnostik araçların geliştirilmesine yardımcı olmaktadır.
Genomik Madencilik Daha önce tartıştığımız gibi, genomik analiz bir organizmanın genetik planını sağlar. Genomik analizler sayesinde, bir organizmanın metabolizması ve ekolojisi hakkında oldukça önemli bilgiler elde edebiliriz. Ancak, genomik analizler sonucunda; genellikle bir metabolik yol veya süreçle ilişkili bir veya daha fazla genin kayıp olduğu görülür. Bu, organizmanın yeni bir metabolik yol kullandığı veya metabolizmaya en az bir yeni reaksiyonun katıldığı anlamına gelmektedir. Bu gibi durumlarda, kayıp işlevde rol alan proteini kodlayan genin araştırılması ilgi odağı olmaktadır. Bu işlem bilgisayar programıyla kolaylıkla yapılabilir. Bahsedilen genin belirlenmesi için, bir organizmanın genomun dizisini içeren veritabanında söz konusu genin araştırılması genomik madencilik olarak adlandırılır. Synechocystis'in DNA polimerazınm araştırılması buna iyi bir örnektir (Şekil 15.12»). Synechocystis'in DNA Polimerazı: İnteinler ve Genomik Madenciliğin Yararlan
Tüm Bakteri türleri, DNA replikasyonunda temel polimeraz olarak kullanılan, E. coli DNA polimeraz III'e benzer bir DNA polimeraz içerir (a°öBölüm 7.6). Bu enzim birçok alt üniteyi içeren kompleks bir yapıya sahiptir. dnaE geninin ürünü olan DnaE, polimeraz reaksiyonlarını katalizleyen alt ünitedir. DNA polimerazlar tüm hücreler için büyük önem 745 kbç
ORF1
ORF2
Transkripsiyon ve translasyon
Protein kendi-kendine düzenlenme +
15.8 Kavramların Gözden Geçirilmesi Genomikler, bir organizmanın evrimsel geçmişinin araştırılması için kullanılabilir. Organizmalar akraba dizilere sahip gen aileleri içermektedir. Eğer bu yapılar gen dublikasyonları sonucu ortaya çıkmış ise paralog, evrimsel soy oluş sürecinde çoğalmış ise ortolog olarak adlandırılmaktadır. Organizmalar, aynı ortamda bulundukları organizmalardan yatay gen transferi olarak adlandırılan mekanizma ile gen kazanabilir.
!
_ İnteinler
DnaE proteini
• Şekil 15.12 inteinler; Sysnechocystis dnaE geninin bölünmesi. Her iki ORF, turuncu oklarla gösterildiği gibi, ters yönlerde transkribe edilir. Bu ORF'lerin protein ürünlerinin her biri, inteinin bir bölümünü içerir (ORF2'nin protein ürünü, standart amino ucundan karboksi ucuna doğru çizilmiştir). Arkelerin DNA replikasyon enzimlerinin birçoğu da inteinler içerir. Yani inteinler sadece Bakterilerle sınırlı değildir.
15.10 • Proteomikler • 497
taşımaları ve iyi korunmuş proteinler olmaları nedeniyle, herhangi bir Bakterinin genomu incelendiğinde, E. coli dnaE geni ile benzerlik gösteren bir gen (bir ortolog gen) bulunacaktır. Ancak, Synechocystis'İn genomu araştırıldığında (o^Tablo 15.1) böyle bir gene rastlanmamıştır. Bunun yerine, işlevi bilinmeyen ve birleştirildiklerinde dnaE ile yüksek benzerlik gösteren bir geni meydana getiren iki ORF belirlenmiştir. Fakat bu iki ORF Synechocystis kromozomunda 700 kbç'nin üzerinde bir bölgede, farklı DNA zincirlerinde bulunmaktadır. Bu durum söz konusu ORF' lerin ters yönlerde transkribe edildiğine işaret etmektedir. Bu iki ORF dnaE'nin gerçekten bir parçası olabilir mi? Söz konusu iki ORF'nin dizi analizleri dikkatli bir şekilde yapıldığında, durumun bu olduğu anlaşılmıştır. Genler, kendi kendine mRNA işlenmesi reaksiyonunu yapabilen bir inteinin; tamamlayıcı yarılarını kodlar. Daha sonra Synectocystis''in bu iki ORF'si klonlanmıştır. Transkripsiyonu ve translasyonu gerçekleştikten sonra bu intein, enzimatik olarak aktif ve tam DnaE proteinini oluşturmak üzere iki yarı arasında işleme reaksiyonunu katalizler (Şekil 15.12). Synochocystis' in dnaE genini düzenlemek için neden bu işleme mekanizmasını kullandığı bilinmemektedir. Neden ne olursa olsun, evrim bize bu organizmada dnaE geninin ifadesi için en iyi çözümün bu olduğunu göstermektedir. Synochocystis bu durumda olan tek örnek değildir. Küçük genomlu parazit arke Nanoarchaeum equitans'm da dâhil olduğu bazı arkelerin DNA replikasyon genleri de inteinler içerir (ö°Q>Tablo 15.1). Günümüzde rutin olarak yapılan tüm genom analizleri ve karşılaştırma sistemleri olmadan, nadir rastlanan bu mekanizmaların nasıl aydınlatıldığını anlamak oldukça güçtür. Genom araştırmaları birçok süprize açıktır ve pratik uygulamaları olan keşiflere liderlik etmektedir.
sidir. Proteom terimi herhangi bir zamanda bir hücrede bulunan proteinlerin tümünü ifade eder. Proteomun tanımı "bir organizmanın genomu tarafından kodlanan tüm proteinler" kadar basit değildir. Bir organizmadaki genler sürekli sabit olsa da, bu genlerin ifadeleri regüle edilmektedir (a°aBölüm 8). Bir hücrede bulunan proteinlerin sayısı ve türü, çevresi ya da yaşam döngüsü gibi diğer faktörlere bağlı olarak değişim gösterir. Bir organizmanın proteinlerinin yapı, işlev ve regülasyonlarmm genom boyutunda çalışılması proteomikler veya işlevsel genomikler adını alır. İki yönlü jel elektroforezi Proteomiklerde bir yaklaşım iki yönlü poliakrilamit jel elektroforezinin kullanılmasıdır. Bu teknik, bir hücre kültürü örneğinde bulunan tüm proteinleri ayırma, tanımlama ve ölçme yeteneğindedir. Şekil 15.13«'de Escherichia coli proteinlerini ayıran iki yönlü (2-D) bir jel gösterilmektedir. Birinci yönde (şekildeki yatay yön) proteinler, her bir proteinin net yükünün sıfıra ulaştığı pH' da izoelektrik noktalarına göre ayrılır. İkinci yönde, her amino asite sabit bir yük verilmesi sureti ile proteinler denatüre edilir. Proteinler daha sonra büyüklüklerine göre ayrılır (çoğunlukla DNA molekülleri de bu şekilde büyüklüklerine göre ayrılır; eoaŞekil 7.22).
M r (kDa) 16081-
43•
15.9 Kavramların Gözden Geçirilmesi Genomik madencilik olarak adlandırılan, belirli bir genin genomik veri tabanlarında araştırılma süreci dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Bu uygulama yeni genlerin bulunması ya da bulunan genin işlevinin belirlenmesi için yapılabilir. •
Bir intein kendi kendini işleyen bir introndan nasıl ayırt edilir?
GEN İŞLEVİ VE REGÜLASYONU Proteomikler Genomik çalışmaların bir başka amacı, hangi genlerin protein ürünü oluşturmak üzere ifade edildiğinin ve oluşan ürünlerin işlevlerinin belirlenme-
25-
126 pH
• Şekil 15.13 Proteomikler: Proteinlerin iki yönlü poliakrilamit jel elektroforezi. Şekil, Escherichia coli kültürüne ait proteinlerinin otoradyogramıru göstermektedir. Jel üzerindeki her nokta ayn bir proteindir. Proteinler görünür hale gelmeleri için radyoaktif metionin ile işaretlenir. Önce proteinler denatürasyon koşullan altında, çoğu E. coli proteininin bulunduğu pH 5-7 aralığında konsantre edilerek izoelektrik noktalanna göre aynlır (bazik ribozomal proteinler bu aralıkta kaybolur). İkinci yön ise, denatüre edilen proteinleri, en büyük proteinler jelin üst kısmında olacak şekilde büyüklüklerine ( Mr; burada kilodalton olarak verilmiştir) göre ayırır.
498 • Bölüm 15 • Mikrobiyal Genomikler
E. coli ve diğer birkaç organizmada olduğu gibi, 2-D jellerde analiz edilen yüzlerce protein, biyokimyasal veya genetik olarak tanımlanmış ve bunların regülasyonları farklı koşullar altında çalışılmıştır. 2-D jeller kullanılarak, farklı gelişim koşullan altında belirli bir proteinin varlığı veya yokluğu, çevresel koşulların bir işlevi olarak proteomun belirlenmesinde kullanılabilir. İki yönlü jel sistemi kullanılarak, bilinmeyen bir proteinin belirli bir genle ilişkilendirilmesinde, protein jelden saflaştırılır ve N-terminal bölgesinin dizi analizi yapılır. Bu dizi bilgisi, genomik DNA'da söz konusu proteini kodlayan geni PCR ile çoğaltmak için kullanılacak oligonükleotit probların dizaynında yeterli olabilir (öo^Kısım 7.9). Ardından, dizi analizi ve karşılaştırmalı genomiklerden yararlanılarak genin işlevinin belirlenmesi mümkün olabilir. İşlevsel ve Yapısal Genomikler
Proteomikler çoğunlukla yoğun denemeler gerektirse de (Şekil 15.13) in silico teknikler oldukça kullanışlı olabilir. Bir organizmanın genomunun dizisi belirlendikten sonra, daha önceden dizi analizleri yapılmış diğer organizma genomlarıyla benzerlikleri karşılaştırılarak, genlerin yerleri ve tanımlamaları yapılabilir. Burada en önemli olan "dizi", proteinin aminoasit dizisidir. Genetik kodun dejenere olmasından dolayı (Ö^SKısım 7.14) DNA dizisindeki farklılık, amino asit dizisinde önemli farklılığa neden olmayabilir (Şekil 15.14»); %50'den fazla dizi benzerliği olan proteinler, genellikle benzer işlevlere sahiptir, %70'in üzerinde benzerliği olan proteinler ise, kesinlikle aynı işlevleri içerir. Bir proteinin muhtemel işleviyle ilgili önemli bir ipucu, diğer proteinlerde bulunan ve proteinin bilinen işlevsel bölgelerini kodlayan
dizilerin tanımlanmasıdır. Proteinlerin işlevsel bölgeleri; metal, nukleotit ya da diğer kofaktörler için bağlanma yerleri içerebilir. Örneğin; NAD+ bağlanma bölgesine sahip bir protein, kesinlikle redoks reaksiyonlarının (ö^aKısun 5.7) bazı tiplerine katılan bir proteindir. Özel protein bölgeleri, özgül dizilere sahiptir. Ancak bunları işlevsel yapan üç boyutlu yapılarıdır (ö°BKısım 3.8). Yapısal genomikler, bir organizmada bulunan proteinlerin yapı ve işlevlerinin ortaya çıkmasını sağlayan üç boyutlu protein yapısının belirlenmesini esas alır. Öncelikli amaç; herhangi bir proteinin primer yapısından yola çıkarak, in siliko teknikler yardımıyla, proteinin yapı ve işlevinin tahmin edilmesidir. Bu amaca henüz ulaşılamamış olsa da, daha fazla dizi verisi oluştukça ve analiz edildikçe, bu yöntemin gerçekleşmesi mümkün olacaktır. Genomikler ve proteomikler arasındaki ilişki o zaman daha da güçlü bir hale gelecektir. Proteomikler ile genomiklerin birleştirilmesi, farklı organizmalardaki gen ifadesinin çevresel uyarımla ilişkisine dair önemli ipuçları verir. Böyle bir bilgi temel bilimsel fayda sağlamasının yanı sıra, uygulama potansiyeli de taşır. Bu uygulama potansiyeli; tıpta, çevre ve tarımda avantajlar taşır. Bütün bu alanlarda genom ve proteom arasındaki ilşkinin ve regülasyonun anlaşılması, insanlara pek çok hastalığın nedenlerinin tanımlanması yanında, kirlilik ve tarımsal verimlilikle ilgili eşi görülmemiş bir kontrol sağlayacaktır. 15.10 Kavramların Gölden Geçirilmesi Proteom herhangi bir zamanda bir organizmada bulunan bütün proteinleri içerir. Proteomiklerin amacı, bu proteinlerin yapı, işlev ve regülasyonunun anlaşılması amacıyla çalışılmasıdır. •
Bir organizma birden fazla proteoma sahip olabilir mi? • İşlevsel genomik nedir?
1
2
3
AGA
UCA
CUU
, ArgJ
Ser
Leu
CGA
UCG
CUG
Ser
Ala
Arg
AGU
GCA
CGU
• Şekil 15.14 Nükleik asit ve aminoasit dizi benzerliklerinin karşılaştırılması. Şekilde üç farklı nükleoüt dizisi gösterilmektedir (uygunluk için RNA da gösterilmektedir). 2 ve 3. diziler sadece üçüncü pozisyonda, 1. diziden farklıdır. Ancak 1. ve 2. dizi tarafından kodlanan aminoasitler dizilimi aym iken, 3. dizi tarafından kodlananlar bu dizilimden farklıdır.
Microarray ve Transkriptont Proteomiklerin ana amaçlarından biri, gen ifadesinin çalışılmasıdır. Fakat, bu aşamanın çalışılması için başka yollar da mevcuttur. Gen ifadesinin genellikle transkripsiyon seviyesinde regüle edildiğini anımsayın («»»Bölüm 8). îfade edilecek bir gen, öncelikle transkribe edilmelidir. Bir genin hangi koşullar altında transkribe edildiğinin bilinmesi, genin işlevi hakkında da bilgi verebilir. Proteoma benzer olarak, belirli koşullar altında üretilen mRNA' larm tümü transkriptom olarak adlandırılır. Transkriptom analizi için mikrodizinler (microarray) olarak adlandırılan güçlü bir teknik geliştirilmiştir.
15 11 • Mikrodizinler (Microarrays) ve Transkriptom • 499
Mikrodizinler ve Silika DNA Cipi
Bölüm 7'de; nükleik asit hibridizasyon tekniklerinin, özel DNA parçaları üzerindeki genlerin yerlerinin belirlenmesinde nasıl yardımcı olduğunu tartışmıştık (öO&Kısım 7.7). Hibridizasyon teknikleri ayrıca, özel DNA parçalarına mRNA' nın hibridizasyonu suretiyle gen ifadelerinin ölçülmesinde, genomik dizi verileri ile birleştirilerek kullanılabilir. Bu teknik, mikrodizinlerin veya diğer adıyla gen ciplerinin düzenlenmesi sonucu büyük gelişme kaydetmiştir. Mikrodizinler, genlerin veya bir organizma genomunun bütününü temsil eden gen gruplarının tutundurulduğu ve belirli bir modele uygun olarak dizildiği küçük katı destek materyalleridir (Şekil 15.16a). Genler PCR ile veya alternatif olarak, her bir genin genomik dizisi esas alınarak tasarlanmış oligonükleotitler kullanılarak sentezlenir. Bu genler (veya gen parçaları) katı desteğe tutundurulduğunda; özel bir koşul altında gelişen hücrelerin mRNA'larıyla hibridize edildikten sonra, bir bilgisayar tarafından taranarak analiz edilebilir. Çip üzerinde özel bir mRNA ve DNA arasındaki hibridizasyon, genin ifade edildiğini kanıtlar. Mikrodizinlerin yapılması ve uygulanmasında kullanılan bir yöntem, Şekil 15.15»'de gösterilmiştir. Aynı yöntem, her biri binlerce farklı DNA parçası içerebilen 1-2 cm silika mikrodizin cipleri düzenlenerek, bilgisayar ciplerinin (fitolitografi) üretimine uyarlanmıştır (Şekil 15.15 ve 15.\6*). Örneğin; bir firma, insan genomunun tamamını üzerinde bulunduran tek bir insan genom dizin cipi pazarlamaktadır (Şekil 15.16a). Bu çip, 47.000'den fazla transkripti analiz edebilmesinin yanı sıra, klinik tıpta kullanmak üzere 6500 oligonükleotiti bulunduran ilave bir bölüm içermektedir. Şekil 15.16b'de Saccharamyces cerevisiae genomunun ifa-
desinin analizinde kullanılan bir cipin bir bölümü gösterilmektedir. Şekil 15.16fe'de gösterilen gen cipi S. cerevisiae'mn proteinlerini kodlayan 5600 adet geni taşımakta ve dolayısıyla bu organizmadaki gen ifadesinin tamamı tek bir deneyle ölçülebilmektedir. Bu deneyde; çip, uygun koşullar altında geliştirilen maya hücrelerinden sağlanan mRNA'lar ile hibridize edilir ve daha sonra floresan bir boya ile işaretlenir. Özel işaretlenmiş mRNA, çip üzerinde sadece kendi dizisiyle tamamlayıcı olan DNA'ya bağlanır. Hibridizasyonun analizinde, çip bir lazer floresan dedektör ile taranır ve sinyaller bilgisayar tarafından analiz edilir Çip üzerindeki tamamlayıcı DNA dizilerinden hangilerinin mRNA'lar ile hibridizasyon verdiğine bağlı olarak, farklı hibridizasyon şablonları oluşur (Şekil 15.15 ve 15.16b). Hibridizasyon gen ifadesinin kalitatif, bağlanma derecesi ise kantitatif ölçüsüdür (Şekil 15.16b). Hibridizasyon ve lazer taramasını takiben, bilgisayar hangi genlerin ifade edildiğini ve ifadenin düzeyini gösteren bir liste oluşturur. Böylece, gen cipleri kullanılarak ilgilenilen organizmanın uygun koşullar altındaki transkriptomu kolayca belirlenebilir.
GenX
Gen Y
GenZ HHHHRB1 Gen X, Y ve Z ile tamamlayıcı küçük ss oligonükleotitlerin sentezi
••••
i DODDDDODD
Cipteki belirli bölgelere DNA'nın bağlanması
DDDDDDGDD DDDDDDDDD1 — DDODODDDn
DDD__ DDDDDDDDI DDDDDDDS DO • •:•;
•
DNA cipi Gelişme koşulu
j f
[•ısımı
Gen X ifade edildi Gen Y ve Z ifade edilmedi
GenY GenZ
• •
Gelişme koşulu 2
V DDDDD DDDDDDDDD DDDDDDDDD DDDDDDDDD ODDODDDDD DDDDDDDDD DDDDDDDOD înDDDDDDD
GenX
İşaretli mRNA ile cipin muamele edilmesi ve taraması
DOI DDDDDDDDD DDDDDDDDD aODDODODD DDDDDDDDD DDDDDDDDD DDDDDDDOD nnroDDOOD Gen X ifade edilmedi Gen Y ve Z ifade edildi
• Şekil 15.15 Transhriptomun ölçülmesi: DNA ciplerinin yapımı ve kullanımı. Bir organizmanın tüm genlerine uygun kısa tek zincirli (ss) oligonükleotitler ayn ayn sentezlenir (^°ö Kısım 7.8) ve bir DNA cipi (mikrodizin) yapmak üzere belirli bir düzene göre sabitlenir. Özel koşullar altında geliştirilen hücrelerden elde edilen işaretli mRNA'lar, çip üzerinde yer alan DNA problan ile hibridize edilir ve ardından çip lazer ile taranır.
DNA Ciplerinin Uygulamaları: Gen İfadesi
Gen cipleri kullanılarak, cipe tutundurulmuş genlerle ilgili genel veya oldukça özel bilimsel sorunlar çalışılabilir. Örneğin; mRNA popülasyonunun tamamının prob olarak kullanılmasıyla, bir organizmanın tüm gen ifadesi araştırılabilir (Şekil 15.16b). Tam tersine, tek tek veya gruplar halinde farklı genlerin değişik koşullar altındaki ifadeleri de karşılaştırılabilir. Binlerce genin aynı anda hızlı bir şekilde hem kantitatif hem de kalitatif olarak ifadelerinin eş zamanlı analiz edebilebilmesi, metabolizma ve regülasyonun karmaşıklığının basit hale getirilmesinde büyük avantaj sağlar. Bu; hem prokaryotlar gibi 400-8000 ya da daha fazla gene sahip "basit" organizmalar (Tablo 15.1) hem de yaklaşık 30,000 farklı gene sahip insan gibi karmaşık organizmalar için geçerlidir. Örneğin; S. cerevisiae gen cipi (Şekil 15.16b), bu organizmanın metabolik kontrolünün detaylı olarak çalışılmasında kullanılmıştır. Mayalar, fermentasyon ve aerobik solunum yolu ile gelişebilir.
500 • Bölüm 15 • Mikrobiyal Cenomikler
"ifadesi gerçekleşirken", 1000'den fazla genin "ifadesi baskılanmıştır". Ayrıca, mikrodizinler aracılığı ile, işlevleri bilinmeyen bazı maya genlerinin, fermentatif durumdan aerobik solunuma geçiş sürecinde ifade edilip edilmediğine bakılarak, olası işlevleri ile ilgili ipuçları elde edilebilir. Günümüzde, gen ifadeleri hakkında mikrodizinler kadar detaylı bilgi verebilecek bir başka yöntem bulunmamaktadır. Mikrodizinler genomik düzeyde gen ifade süreçlerinin incelenmesinde güçlü yaklaşımlar sunduğu açıktır. Tanımlamada Kullanılan Uygulamalar
• Şekil 15.16 Transkriptomun ölçülmesi: DNA cipleri ve gen ifade ölçümünde kullanımları: a) İnsan genom cipi: Bu çip üzerinde 40.000'den fazla gen parçası bulunur, b) Hibridize edilmiş bir çip. Fotoğraf, Saccharomyces cerevisiae mayasının silika jel gen cipi üzerine tutundurulmuş ve toplam genomunun 1/4' ünü teşkil eden DNA parçalarının bir bölümünü göstermektedir. Burada her genin birkaç kopyası bulunmaktadır. Söz konusu genler özel koşullar altında geliştirilen maya hücrelerinden sağlanan floresan mRNA ile işaretlenmiştir. Cipin zemini mavidir. RNA'nın DNA ile hibrit oluşturduğu bölgeler maksimum hibridizasyona bağlı olarak beyaza doğru değişen renk tonuyla gösterilmektedir. Çip üzerinde farklı genlerin yerleri bilindiğinden, çip tarandığında ifadesi yapılan özel genler ortaya çıkacaktır.
Transkriptom analizi kullanılarak; maya hücrelerinin fermentatif (anoksik) ortamdan, oksijenli ortama alınmasıyla hangi genlerin ifade edilip, hangi genlerin ifade edilmediğinin izlenmesi mümkün olmuştur. Gen ifadesinin transkriptom analizleri; mayaların aerobik gelişime geçiş esnasında, büyük bir metabolik "tekrar programlanma" geçirdiklerini göstermiştir. Sitrik asit döngüsü işlevleri (aerobik gelişim için gerekli olan) bu değişimle güçlü bir şekilde aktive edilirken; etanol üretimini (anahtar bir fermentasyon ürünü) kontrol eden genlerin tümünün ifadesi güçlü bir şekilde baskılanmıştır. Bu metabolik geçiş sırasında 700'den fazla genin
Gen ifadelerinin araştırılmasında kullanılmalarının yanı sıra, mikrodizinler mikroorganizmaların tanımlanmasında da kullanılabilir. Örneğin, belirli bir organizmaya ait genomik DNA parçalarını prob olarak kullanmak suretiyle, hibridizasyon farklarına bakılarak yakın akraba türlerin ayırımı yapılabilir. Bu teknik, klinik örneklerdeki patojen virüsler ya da bakterilerin veya gıda gibi çeşitli kaynaklardaki organizmaların özel türlerinin hızlı bir şekilde tanımlanmasına olanak sağlamaktadır. Böyle cipler, gıda endüstrisinde E. coli O157:H7 gibi, belirli patojenlerin tespit edilmesinde kullanılmaktadır (öOöKısım 29.8). Makroorganizmalan tanımlayabilen DNA cipleri de bulunmaktadır. FoodExpert-ID olarak adlandırılan ticari bir çip, değişik omurgalı hayvanlara ait 88,000 gen parçasını içermekte ve gıda sektöründe, gıdaların saflığının araştırılmasında kullanılmaktadır. Örneğin çip, gıda etiketinde belirtilen etin varlığını onaylayabilir ve katkı ya da bileşen olarak gıdaya ilave edilmiş yabancı bir hayvan etinin var olup olmadığını belirleyebilir. Nihai amaç, her bir et ürünü için içerisinde dokularının varlığı tanımlanan hayvan türlerini listeleyen "tanımlama kartını" elde edebilmektir. Bu tüketiciye, tükettikleri gıda ürünlerine daha fazla güvenmelerini sağlamaktadır. FoodExpert-ID aynı zamanda hayvan yemlerinde, prionun sebep olduğu "deli dana hastalığının" ortaya çıkmasıyla kaygıya neden olan, omurgalı yan ürünlerinin bulunup bulunmadığının tespit edilmesinde kullanılabilir (ö°e»Kısım 9.14 ve 29.11). Çevresel Genomik Uygulamaları
DNA çip teknolojisi, mikrobiyal ekologların en önemli amacı olan, çevredeki mikrobiyal toplulukların belirlenmesi ve aktivitelerinin tanımlanması açısından da oldukça faydalıdır (ö^Bölüm 19). Günümüzde mikorbiyel ekoloji alanında, çevresel genomikler olarak adlandırılan yeni bir çalışma alanı doğmuştur (a°öKısım 18.6). Rastgele dizi analizi ve gen ifade mikrodizinlerinin kapasitesi ve gücü, toprak ya da göl suyu gibi habitatlarda bulunan mikroorganizmaların tüm genomlarının dizili-
• Uygulama Sorulan • 501
-m
mini yapmak ya da gen ifadelerini tanımlamak için yeterlidir. Metagenom olarak adlandırılan toplam genomlar, bir ekosistemin genetik potansiyelini tanımlar. Daha sonra, mikrodizinler kullanılarak, bu doğal mikrobiyal topluluklar gen ifade düzeyleri bakımından da araştırlabilir. Bu teknikler bir ekoloğa; bir mikrobiyal ekosistemin işlevlerine ve bu ekosistem içerisindeki özel üyelerin tüm ekosistem üzerinde nasıl etkili olduğuna dair güçlü ve karmaşık sorular sorma olanağı sağlar. Bölüm 18.6'da teknolojinin spesifik örneklerle birlikte çevresel genomikler, özel örnekler verilerek tartışılmaktadır.
15.11 Kavramların Çözden Geçirilmesi
Mikrodizinler belirli bir düzen ile katı bir desteğe tutundurulmuş genler veya gen parçalarıdır. Bu dizinler mRNA'ya hibridize edilmek suretiyle gen ifade düzeylerinin belirlenmesinde kullanılabilir. Dizinler, tüm genomun (transkriptom) transkripsiyon seyrinin analiz edilebilmesi için yeterli büyüklükte ve yoğunluktadır. •
Belirli bir enzimin gen ifadesi mikrodizinler kullanılarak çalışılırken neleri belirleyebilirsiniz ya da belirleyemezsiniz? • Belirli koşullar altında tüm genomun gen ifade biçiminin bilinmesi neden yararlıdır?
DEĞERLENDİRME SORULARI 1. 2. 3. 4.
5.
6. 7.
8.
M13 fajma klonlanan genler "izlenerek" tespit edilebilir ifadesinin anlamı nedir (O^* Kısım 15.1)? Büyüklük, replikasyon için gerekli olan özellikler ve klonlanan DNA miktarı açısından BAC lar ile YAC lan karşılaştırınız (£*fe Kısım 15.1). "Rastgele dizi analizi" yöntemlerinde, rastlantısal dizilim zorunlu olmasına rağmen, toplam genom dizilimi nasıl belirlenir (ö°ö Kısım 15.2)? Genomun "birleştirilmesi" ne anlama gelir? Bu nasıl gerçekleşir? Birleştirme işlemi, yorumlamadan nasıl ayırılır? Hangi süreç önce gerçekleşir (<3°OKısım 15.3)? Tablo 15.1'de organizmalar, kromozomlarının büyüklüklerine göre artan sırayla listelenmiştir. Genom büyüklüğü ve ORF içeriği arasında nasıl bir ilişki vardır (ö°CsKısım 15.4)? Genomunuz, Nanoarchaeum'un genomundan ne kadar büyüktür? Nanoarchaeum'a göre kaç adet fazla geniniz vardır (ö°OKısım 15.14 ve 15.16)? Toplam genom esas alındığında, küçük genomlu organizmalarda hangi sınıf genler baskındır? Büyük genomlu organizmalarda bu durum nasıldır (fi*^ Kısım 15.5)? Bakterilerde ve Arkelerde ORF kısaltması, çoğunlukla "gen" ifadesiyle eş anlamlıdır. Buna karşın ökaryot-
9.
10.
11 12. 13.
larda durum böyle değildir. Tartışarak açıklayın Kısım 15.16). Kloroplastların mı yoksa mitokondrilerin mi genomu daha büyüktür? Mitokondri ve kloroplast genomlarının ender özelliklerine birer örnek veriniz (öCfe Kısım 15.7). E. coli'deki RNA polimerazm beta alt ünitesini kodlayan genin, Bacillus subtilis'm rpoB geni ile ortolog olduğu belirtilmiştir. İki gen arasındaki bu ilişki ne ifade etmektedir? Bacillus subtilis' in rpoB geninin hangi proteini kodladığını tahmin ediyorsunuz? E. coli' nin farklı sigma faktörlerini (SQ& bak. Tablo 8.2) kodlayan genler paralogtur. Bu ifade, genler arasında nasıl bir ilişki olduğunu anlatmaktadır (ö°o>Kısım 15.8)? Bir genomda yatay olarak aktarılmış genlerin nasıl belirlenebileceğini açıklayınız (ö^Kısım 15.8). întein nedir? Intenler nasıl belirlenebilir («3^sKısım 15.9)? 2-D protein jeli neyi gösterir? Böyle bir jelin sonuçları ile protein işlevleri arasında nasıl bağlantı kurulur (öQö Kısım 15.10)?
14. Genom, genomikler, proteom, proteomikler ve transkriptom terimleri arasındaki ayırımı açıklayınız 15.11).
UYGULAMA SORULARI 1.
2.
Rastgele dizi analizi yapılırken, dizi içerisinde "boşlukların" kalması mümkündür. Bu boşlukların nasıl kapatılacağını ve dizinin nasıl tamamlanabileceğini açıklayınız. Mayanın çekirdek genomunun dizi analizi yayınlanmış olmasına rağmen, bu genoma ait dizinin tamamı asla belirlenememiştir. Maya mitokondriyel genomu, doğru dizi analizi için büyük zorluklar taşımaktadır. Her iki durum için de DNA dizi uygulamalarındaki zorlukları tanımlayın.
3.
E. coli kültürü, minimal bir ortamdan (tek karbon kaynağı içeren) amino asitler, bazlar ve vitaminler açısından zengin bir ortama alındığında hangi proteinlerin baskılandığı nasıl belirlenebilir? (ö°öKısım 8.5) Her iki gelişim koşulunda da hangi genlerin ifade edildiği nasıl belirlenebilir?
VİRAL ÇEŞİTLİLİK
PROKARYOT VİRÜSLERİ
503
16.1 RNA Bakteriyofajları 16.2 İkozahedral Tek Zincirli DNA Bakteriyofajları 16.3 Filamentli Tek Zincirli DNA Bakteriyofajları 16.4 Çift Zincirli DNA Bakteriyofajları: T7 16.5 Mu: Çift Zincirli Transpoze Olabilen DNA Bakteriyofajı 16.6 Archaea Virüsleri
503
I
II
505
507 508 510 512
OKARYOT VİRÜSLERİ
513
16.7 Bitki Virüsleri 16.8 Pozitif Zincirli RNA'ya Sahip Hayvan
513
Virüsleri: Poliovirüs ve Coronavirüsler
515
16.9 Negatif Zincirli RNA'ya Sahip Hayvan Virüsleri: Rabies (Kuduz), Influenza (Grip) ve Benzeri Virüsler 16.10 Çift Zincirli RNA Virüsleri: Reovirüsler 16.11 Çift Zincirli DNA'ya Sahip Hayvan Virüslerinin Replikasyonu 16.12 Çift Zincirli DNA Virüsleri: Herpesvirüsler 16.13 Çift Zincirli DNA Virüsleri: Poxvirüsler 16.14 Çift Zincirli DNA Virüsleri: Adenovirüsler 16.15 Ters Transkriptaz Kullanan Virüsler: Retrovirüsler ve Hepadnavirüs
502
517 520 521 523 524 525 526
Virüsler, prokaryotlardan insanlara kadar olan tüm organizma tiplerini enf ekte eder. Virüslerin çok farklı replikasyon yolları vardır ve viral sınıflandırma bu yollara göre yapılır.
16.1 • RNA Bakteriyofajlan • 503
BOLÜMLE İLGİLİ SOZLUK Bakteriyofaj bakteri hücrelerini enfekte eden virüs Çakışan genler bir gen bölgesinin tümünde ya da bir kısmında diğer bir genin de bulunması Dönen halka replikasyonu bakteriyofaj 4>X174'de, kalıp olarak halkasal bir ipliğin kullanılmasıyla, diğer zincirde 3' uçta DNA sentezi devam ederken 5' ucun koparak yapıdan ayrılmasıyla gerçekleşen DNA replikasyonu Eksi (Negatif) zincirli nükleik asit bir virüs mRNA'sının (tamamlayıcı ya da) karşıt anlamlı tek bir RNA ya da DNA ipliğinden oluşan viral nükleik asit Hepadnavirüs DNA'dan oluşan genomunu bir RNA aracı molekülü ile replike eden virüs Kılıflı virolojide lipoprotein bir membranla çevrili bir virionu tanımlar
Konkatemer iki ya da daha fazla viral genom içeren doğrusal nükleik asit molekülü Nükleokapsit protein bir kapsit içinde paketlenmiş nükleik asitten oluşan bir virüs partikülü Poliprotein poliovirüs'de üretilen ve daha sonra birkaç farklı protein oluşturacak şekilde parçalanacak olan büyük bir protein Pozitif (Artı) zincirli nükleik asit bir virüs mRNA'sı ile aynı nükleik asitleri içeren tek bir RNA ya da DNA ipliğinden oluşan viral nükleik asit Replikatif form tek zincirli DNA virüslerinin replikasyonunda aracı olan bir çift zincirli DNA molekülü Retrovirüs replikasyon döngüsünün bir kısmında genomunu DNA'ya çevirebilen, bir RNA virüsü
undan önceki bölümlerde, Bacteria, archaea ve Eukarya, olarak gruplanan mikrobiyal hücrelerin muazzam çeşitliliği incelenmiştir. Bu bölümde virüsler ve genomlarının çeşitliliği üzerinde durulacak ve virüslerin çeşitliliği üzerindeki bilgiler harmanlanacaktır. Dokuzuncu bölümde ise virolojinin genel prensipleri verilmiştir. Bütün hücreler genetik materyal olarak çift zincirli DNA içerir. Virüslerde ise tek zincirli RNA, çift zincirli RNA, tek zincirli DNA ya da çift zincirli DNA genetik materyal olarak bulunur (<3QaKısım 9.1). Bu durum, ilerde göreceğimiz gibi, replikasyon ve gen ifadesi yollarının oldukça ilginç olmasını sağlar. Bu bölümde viral çeşitliliği, her grupta yer alan virüslerin ayrı ayrı replikasyon yollarını inceleyerek göstereceğiz. Virüsleri prokaryot ve ökary otları enfekte eden virüsler olarak ayrı ayrı tartışacağız. Bu iki hücre tipi arasındaki farklılık, enfekte eden virüslerin yaşam döngülerini de etkilemektedir.
B
PROKARYOT m M VİRÜSLERİ Birçok virüsün Bacteria ve Archaea'lan enfekte ettiği bilinmektedir. Dokuzuncu bölümde değindiğimiz gibi en iyi bilinen bakteri virüsleri genom olarak çift zincirli DNA taşımaktadır (c«sKısım 9.8). Bununla birlikte diğer genom tiplerini de içeren bir çok bakteriyofaj bulunmaktadır. Bunların en basiti olan RNA genomu taşıyan virüslerle bu bölüme başlayacağız.
RNA replikaz bir RNA kalıbından RNA sentezlenmesini sağlayan bir enzim Ters transkripsiyon RNA'da bulunan genetik bilginin DNA'ya kopyalanması Transpozaz bir DNA parçasının diğer bir DNA'ya bağlanmasını katalizleyen bir enzim Virion hücre dışında bulunan, nükleik asiti bir protein kapsit ve bazı durumlarda diğer materyallerle de çevrili olan, tam bir virüs Virüs hücrelerde replike olan, ancak hücre dışında da bulunabilen RNA ya da DNA içeren bir genetik element
RNA Bakteriyofajlan Bakteriyofajlarm çoğu pozitif anlamlı genom içerir. Böyle virüslerde viral genom -pozitif zincirli RNA - ve viral mRNA aynı nükleotit dizilerini taşır (öo&Kısım 9.5). İlginç olan enterik bakterilerdeki RNA virüslerinin, sadece konjugatif bir plazmit içeren bakteri hücrelerini enfekte etmesidir. Bu plazmit bulunduğu bakteri hücresine konjugasyon olayında donör hücre görevi yükler (otasKısım 10.9 ve 10.11). Bu virüslerin enfekte ettikleri bakterilerin ilk olarak piluslanna tutunması nedeniyle, virüs enfeksiyonu sadece donör hücrelerde olur. Konjugatif bir plazmit tarafından kodlanan bu piluslar mutlaka donör hücrelerde bulunur (Şekil 16.1»). Faj MS2
Yaklaşık 25 nm büyüklüğünde oldukça küçük olan bakteriyal RNA virüslerinin hepsi ikozahedral (öasKısım 9.2») kapsitlidir ve her bir kapsitte 180 kopya kapsit proteini bulunur. Bazı RNA faj genomlarının tam nükleotit dizisi bilinir. Örneğin Escherichia coli bakterisini enfekte eden MS2 RNA faj genomu 3569 nükleotit uzunluğundadır.
• Şekil 16.1 Küçük RNA Bakteriyofajlan. Escherichia coli donör hücresinin pilusuna tutunan küçük bir RNA fajı virionlanrun elektron mikrogran.
504 • Bölüm 16 • Viral Çeşitlilik
MS2 fajının genetik» haritası Şekil 16.2a«'da, çoğalma aşamaları ise Şekil 16.2b'de görülmektedir. Küçük genomları sadece dört protein kodlar. Bu proteinler olgunlaşma proteini (tek bir kopya olarak virionda bulunur), kapsit proteini, liziz proteini (virüs partikülünün hücre dışına çıkmasıyla sonuçlanan liziz işleminde yer alır) ve viral RNA'nın replikasyonunu sağlayan enzim olan RNA replikaz alt ünitesidir. RNA replikazın virüs tarafından kodlanan bir polipeptid ve konukçu hücre polipeptidlerinden oluşmuş karma bir protein olması oldukça ilginçtir. Olgunlaşma proteini, enfektif virionlarm üretimi için gerekli bazı viral proteinlerin işlenmesinde bir proteaz olarak görev görür. Faj MS2 genomu, artı anlamlıdır (coaKısım 9.7) ve bu nedenle de hücreye girdiğinde direk olarak protein sentezinde kullanılabilir. RNA replikaz sentezlendikten sonra, kalıp olarak genomik RNA kullanılarak eksi anlamlı RNA sentezlenebilir (Şekil 9.1 l'e bakınız). Eksi anlamlı RNA sentezinden sonra, kalıp olarak eksi RNA kullanılarak daha fazla artı RNA yapılır. Yeni sentezlenen artı
Liziz proteini Olgunlaşma proteini
5' 1 130
* Ü3'
Replikaz
3395 3569
1308 1335 1724 1761
(a) MS2 Genetik haritası Viral genom (ss RNA.+)
Eksi zincir ıcir f sentezi X
S
X N
RNA replikaz
^ \ V
D( Doğrudan mRNA ol; olarak kullanılır ^^
(ss RNA,-) Artı zincir sentezi
i
i Translasyon
RNA replikaz
•
?
(ss RNA.+)
I
Paketlenme
, 9 ©Virüs 9 9 ü tarafından o Q o kodlanan , proteinler
Kapsit proteini ve olgunlaşma proteini
Liziz proteinin üretimi Hücreden virion salınması (b) Viral çoğalma esnasında gerçekleşen olaylar
• Şekil 16.2 Bakteriyofaj 1HS2 a) RNA bakteriyofajı MS2'nin genetik haritası. Liziz protein genini hem kapsit hem de replikaz genleri ile nasıl çakıştığına dikkat ediniz, (a), RNA'daki nükleotitlerin pozisyonunu, (b) çoğalma aşamalarını gösterir.
RNA zincirleri, viral protein sentezinde kullanılır. Olgunlaşma protein geni RNA'nın 5' ucunda bulunur. RNA'nın katlanması (aşağıda görüldüğü gibi) olgunlaşma protein sentezini sınırlar. Viral RNA kompleks ikincil bir yapı oluşturacak şekilde katlanır. Katlanma sonrası viral mRNA'daki dört AUG translasyonel başlama bölgesinden ilk önce, kapsit proteinlerinin bulunduğu başlama kodonunda translasyon başlar. Replikaz mRNA'da ilk translasyonun olduğu bölgeler arasındadır. Hücrede kapsit proteinlerinin sayısı artınca, bu proteinler replikaz proteininin AUG başlama kodonu çevresindeki RNA'ya bağlanarak replikaz sentezinin durmasına neden olur. Olgunlaşma proteini başlama bölgesinde sınırlı sayıda translasyon olur ve bunun sonucunda da bu protein sadece birkaç kopya olarak sentezlenir. Bu olayda en fazla sentezlenen virüs proteini, viral gelişme için de yüksek miktarda gerekli olan, kapsit proteinidir. Çakışan Genler ve MS2 Paketlenmesi
Bakteriyofaj MS2'nin ilginç bir özelliği, dört virüs proteininden liziz proteinini kodlayan gen bölgesinin, hem kapsit hem de replikaz genleri ile çakışmasıdır (Şekil 16.2a'daki genetik haritaya bakınız). Bunun gibi çakışan genler çok küçük viral genomlarda yaygın olarak görülür (Kısım 16.2'ye bakınız) ve küçük genomların etkin şekilde kullanımını sağlar. MS2 liziz geninin başlama kodonu, RNA sekonder yapı oluşturacak şekilde katlandığı için ribozomlara kolay bağlanmaz. Ancak ribozomda kapsit protein sentezi durduğunda, RNA'nın bu bölgesindeki sekonder yapı bozulur ve bazen bu bozulma liziz geninin ribozomda okunmasını sağlar. Protein sentezindeki bu tür bir sınırlama, hücrenin erken lize olmasını önler. Paketlenme için gerekli olan kapsit proteinleri yeterli miktarda çoğaltıldığında, liziz başlar. Sonuç olarak, MS2 virionlarının paketlenmeleri tamamlanır ve hücre lizizi sonrasında virionlar hücreden ayrılır. MS2 gibi küçük RNA virüslerinin çoğalma özellikleri oldukça basittir. Viral RNA, mRNA olarak iş görür ve üzerindeki uygun başlama bölgelerine ribozomların kontrollü bir şekilde bağlanmasını sağlayarak gen ifadesini düzenler. MS2 bakteriyofajına benzer özellikte bazı pozitif zincirli RNA bakteriyofajlarının olduğunun bilinmesine rağmen, negatif zincirli RNA genomu içeren herhangi bir bakteriyofaj henüz keşvedilememiştir. Negatif zincirli RNA genomu ökaryot virüslerde oldukça yaygındır (Kısım 16.9'a bakınız). Ancak genetik materyal olarak parçalı çift zincirli RNA taşıyan bakteriyofajlar vardır. Bunlardan en iyi bilineni konukçu olarak Pseudomonas syringae bakterisini kullanan 6 bakteriyofajıdır. Kılıflı olan bu virüs (lipit bir membranla çevrilidir, «^a^Şekil 9.12), ökaryotları enfekte eden reovirüslere benzer özellikler gösterir (Kısım 16.10'a bakınız).
16 2 • Ikozahedral Tek Zincirli DNA Bakteriyofajlan • 505 üenom replıkasyon orjini
•m
16.1 Kavramların Gözden Geçirilmesi
Bazı RNA virüsleri bakterileri enfekte eder. Bu virüslerdeki küçük RNA genomunun direk olarak translasyonu sonrasında birkaç protein sentezlenir. •
Pozitif ve negatif zincirli RNA virüslerinin genomları arasındaki farklılıklar nelerdir?
•
Çakışan genleri tanımlayınız?
Ikozahedral Tek Zincirli DNA Bakteriyofajları Bazı bakteriyofajlar artı anlamlı tek zincirli DNA genomu içerir. Böyle bir genom transkribe edilmeden önce, çift zincirli bir molekül oluşturmak üzere tamamlayıcı bir DNA ipliği sentezlenmelidir (<3Bç>Kısım 9.7 ve Şekil 9.11). Bu bakteriyofajlar çift zincirli DNA'dan replike olur ancak viral çoğalmada sadece pozitif zincirli DNA paketlenir (bilinen negatif zincirli bir DNA bakteriyofajı bulunmamaktadır). Bu bölümde iyi bilinen bir faj olan 0X174 fajını tartışacağız. Daha sonra genetik mühendisliği çalışmalarında kullanılan (oooKısım 15.1) ve yaşam döngüsü 0X174 fajmdan farklı olan tek zincirli DNA bakteriyofajı Mİ 3 üzerinde durulacaktır. Bakteriyofaj 0X174, halkasal tek zincirli DNA genomu ve ikozahedral kapsit içeren virüslerden biridir. Yaklaşık 25 nm çapında oldukça küçük olan bu virüslerin protein kapsitleri 60 kopya olarak bulunan tek bir proteinden yapılmıştır, bu da ikozahedral bir virüsde en az bulunabilecek protein sayısıdır. İkozahedral yapının uçlarında dikey çıkıntı oluşturacak şekilde bazı proteinler tutunmuştur (o^sŞekil 9.12). Sadece birkaç gen taşıyan bu küçük DNA virüsleri, konukçu hücre DNA replikasyon sistemini viral DNA'nın replikasyonunda yaygın olarak kullanır. Faj 0X174 Genomu 0X174 fajı Escherichia coli bakterisini enfekte eder. Genomu 5386 nükleotitli halkasal tek zincirli DNA'dan oluşur. 0X174 DNA'sı dizi analizi yapılan ilk DNA molekülüdür. Frederick Sanger ve meslektaşları tarafından 1977 yılında genomun nükleotit dizisi başarılı bir şekilde belirlenmiştir. Günümüzde, DNA dizi analizi rutin ve oldukça otomatize edilmiş bir işlemdir (<3*aKısım 7.8). 0X174 fajı çakışan genlere sahip olduğu gösterilen ilk genetik element olduğu için oldukça önemlidir, bu olay MS2 RNA fajmda da tartışılacaktır (bakınız Kısım 16.1). Örneğin, 0X174 genomunda B geni A geni içinde, K geni ise hem A hem de C genlerinde bulunur (Şekil 16.3»). 0X174 gibi çok küçük virüslerde, virüs proteinlerinin tümünü kodlayacak büyüklükte DNA olmadığından, DNA parçaları farklı okuma kalıplan (reading frame) tarafından birden fazla sayıda okunur (Şekil 16.3).
A A* B C D
Replikatif form DNA sentezi Konukçu DNA sentezinin durdurulması Kapsit öncülerinin oluşumu DNA olgunlaşması Kapsit oluşumu
E F G H J K
Konukçu hücre lızizı Büyük kapsit proteini Büyük çıkıntı proteini Küçük çıkıntı proteini DNA paketleme proteini Fonksiyonu bilinmiyor
(a) <)>X174 genetik haritası
ssDNA ssDNA (viral nesil) (b) (|)X174 replikasyonundaki aşamalar.
• Şekil 16.3 4>X174 Bakteriyofajı, tek zincirli bir DNA fajı. a) Genetik harita. Çakışan gen (A/B, K/B, K/C, K/A ve D/E) bölgelerine bakınız. Genler arasındaki bölgeler renklendirilmemiştir. A* proteini translasyonun tekrar başlamasıyla A genini kodlayan dizinin sadece bir kısmı kullanılarak yapılır (metne bakınız), b) 0X174 çoğalma aşamaları. Replikatif form ds DNA'dan ss DNA oluşumu dönen halka replikasyonu ile olur, Şekil 16.4'de daha fazla detay gösterilmiştir.
0X174 genetik haritasında görüldüğü gibi, D ve E genleri çakışır, E geni tamamen D geni içinde yer alır. Ayrıca D geninin sonlanma kodonu J geninin başlama kodonu ile üst üste gelir (Şekil 16.3a). Çakışan genlerden başka 0X174 fajmda A* proteini olarak adlandırılan küçük bir protein, A geni için mRNA'da translasyonun (transkripsiyon değil) tek-
rar başlamasıyla sentezlenir. A* proteini okunur ve A proteini gibi aynı mRNA okuma kalıbından sonlanır ancak okuma kalıbında farklı bir başlama kodonu ile başlar, bu da onun çok küçük bir protein olmasını sağlar.
506 • Bölüm 16 • Viral Çeşitlilik
Dönen Halka Mekanizmasıyla DNA Replikasyonu
Hücresel DNA daima çift zincirli formda replike olduğundan (oo&Kısım 7.5), tek zincirli 0X174 genomunun replikasyon işlemi ilginçtir. Enfeksiyonda, artı anlamlı viral DNA protein kapsitinden ayrılmaya başlar. Hücreye giriş işlemi tek zincirli DNA'nın, replikatif form (RF) olarak adlandırılan çift zincirli bir yapıya çevrilmesiyle başarıyla tamamlanır (Şekil 16.3b). Viral DNA'nın RF DNA'ya çevrilmesini sağlayan, hücre tarafından kodlanan, primaz, DNA polimeraz, ligaz ve giraz enzimleridir («ao&Kısım 7,5), Hücrelerde, lagging ipliğin replikasyonu, primaz aktivitesiyle kısa RNA primerlerinin oluşumu ile olur (öoaKısım 7.5). Bu RNA primerleri lagging zincirde aralıklarla yapılır ve daha sonra DNA'dan uzaklaştırılır. Primerin bulunduğu bölgede DNA polimeraz I ile DNA sentezlenir (caaŞekil 7.16). 0X174 DNA'smda benzer durum görülür ancak DNA tek zincirli halkasal formdadır. Bu DNA'nın replikasyonunun başlangıcında, primaz bir ya da daha çok özel başlama bölgelesinde kısa bir RNA primerinin sentezlenmesini sağlar. Daha sonra DNA, DNA polimeraz III ile sentezlenir ve primer DNA'dan uzaklaştırılarak lagging zincirde olduğu gibi DNA polimeraz I ile bu bölgede DNA sentezlenir. Bu da tam bir halkasal çift zincirli replikatif formun oluşumuyla sonuçlanır. Replikatif form oluştuğunda, geleneksel yarı konservatif replikasyonla teta yapısı oluşturularak kopyalanır (eoaŞekil 7.16). Replikatif formdan 0X174 mRNA yapılır ve daha sonra tüm viral proteinler sentezlenir. Ancak tek zincirli viral genomların oluşumu, dönen halka (rolling circle) replikasyonu olarak adlandırılan DNA replikasyonu ile gerçekleştirilir (Şekil 16.4«). Dönen halka bir zincirin kesilmesi sonucu ortaya çıkar. Bu kesikteki DNA'nın 3' ucu yeni zincirin sentezinde kullanılır. Halkanın sürekli dönmesi 0X174 genomunu oluşturacak doğrusal tek zincirli bir yapının sentezlenmesini sağlar. Bu sentez sadece bir zincirin (negatif anlamlı) kalıp olarak kullanılması nedeniyle asimetriktir. Bu olay çift zincirli DNA fajı olan lambda fajmdaki dönen halka replikasyonundan farklıdır («sŞekil 9.20). 0X174 fajında, A geni tarafından gen A proteini olarak adlandırılan, RF'un artı anlamlı zincirini parçalayan bir protein kodlandığında, genom sentezi başlar. Sentezlenen viral zincir belli bir uzunluğa ulaştığında (0X174 için 5386 nükleotit), gen A proteini bu yapıyı koparır ve sonra tek zincirli halkasal DNA oluşturacak şekilde yeni sentezlenen bu tek zincirin iki ucunu birleştirir. 0X174 Fajında Transkripsiyon ve Translasyon
0X174 fajında viral mRNA sentezi replikatif form DNA'da olur. mRNA sentezi birkaç büyük promotorda başlar ve sonlanır (Şekil 16.3a, genetik haritaya bakınız). Polisistronik mRNA moleküllerinden (««sKısım 7.13) daha sonra çeşitli faj prote-
'Gen A proteini - Orjindeki kesme bölgesi
. + zincirin 3'ucu Uzama noktası (ikinci virüs zincirinin 3' ucu) 5'
Yer değiştiren zincir
Uzama noktası 5'
İkinci virüs zincirinin 3' ucu Bir virüs genomu + Tamamlanan bir döngü
Gen A proteini ile kesim ve bağlanma
• Şekil 16.4 0X174 fajında halkasal döngü replikasyonu. Replikasyon gen A proteini ile artı anlamlı DNA zincirinin kesilmesiyle çift zincirli replikatif formun orjin bölgesinden başlar (DNA'nın her iki zinciri şemanın anlaşılır olması için açık yeşil olarak gösterilmiştir).Yeni bir genom sentezlendikten sonra (halkanın bir dönüşü sonrasında), gen A proteini yeni zinciri keser ve bu zincirin iki ucunu birbirine bağlar.
16 3 • Filamentli Tek Zincirli DNA Baktcriyofajlan • 507
inleri sentezlenir. Daha önce belirttiğimiz gibi, bazı viral proteinler aynı DNA dizisindeki farklı okuma kalıplarından oluşturulan mRNA'lardan yapılmıştır (Şekil 16.3a, çakışan genler). Böyle küçük bir genoma sahip 0X174 fajının, ancak bu şekilde çok farklı proteinleri kodlayabilmesi mümkün olabilir. Sonuç olarak, olgun 0X174 virionları oluşur. Hücreden virionların çıkışı, gen E proteininin aktivitesiyle hücre lizizi sonucu gerçekleşir. E proteininin hücre duvarında peptidoglikan sentezinde yer alan enzimlerden birinin aktivitesini önleyerek liziz işlemini gerçekleştirmesi oldukça ilginçdir (i^Kısım 6.3). Yeni sentezlenen hücre duvar materyalindeki zayıflık nedeniyle hücre, virüslerin serbest kalmasını sağlayacak şekilde lize olur. 16.2 Kavramların Gözden Geçirilmesi X174 virüsünün tek zincirli DNA genomunun çok küçük olması nedeni ile, çakışan genler tüm viral proteinlerin kodlanması için gereklidir. Bu virüs, çakışan gen biyolojisini anlamamız için ilk örnektir. Viral DNA'nm çoğalması yuvarlak döngü mekanizması ile gerçekleştirilir. •
Eğer <£X174 genomu tek zincirli ve artı anlamlıysa, neden MS2 fajında olduğu gibi direk mRNA olarak kullanılamaz? • 4>X\7A nükleik asi tinin replikatif formunun, virionda bulunan nükleik asit formundan farkı nedir?
Filamentli Tek Zincirli DNA
Baktcriyofajlan Filamentli DNA fajları, 0X174 fajından tamamen farklı olarak ikozahedml simetri değil de helikal simetri gösterir. Bu grupta yer alan fajlar arasında en fazla çalışılanı Escherichia coli bakterisini enfekte eden M13 fajıdır. fi ve fd fajları da bu grupta bulunur. Filamentli DNA fajları küçük RNA fajları gibi sadece konjugasyon yapan donör hücreleri enfekte eder. Bu bakterilerin piluslarına tutunduktan sonra hücreye girerler (««»Kısım 10.11 ve Şekil 16.1). Hatta bu fajlar 0X174 fajı gibi halkasal tek zincirli DNA içerseler bile çubuk (filament) şeklindedirler.
sadece bulanıklığın azaldığı bölgeler bakteriyal tabakada oluşmaktadır. Filamentli fajlarda DNA replikasyonunun çoğu aşamaları 0X174 fajma benzemektedir (Kısım 16.2 ve Şekil 16.4'e bakınız). Hücreyi öldürmeksizin hücreden çıkma özelliği tomurcuklanma ile gerçekleşmektedir. Bu mekanizmada, A proteini olarak bilinen bir proteinin bir kaç kopyasını içeren virionun son (uç) kısmı ilk olarak hücre dışına çıkar, bunu virionun diğer kısımları izler (Şekil 16.5»). Mİ 3 fajmda diğer bakteriyofajlarda olduğu gibi hücre içinde virion birikmesi olmaz. Bunun yerine, olgun M13 virion oluşumu sitoplazmik zarının iç yüzünde olur ve virüs paketlenmesi tomurcuklanma işlemi ile birlikte olur. Faj M13 ve Genetik Mühendisliği
M13 fajının bazı özellikleri, klonlama ve DNA dizileme aracı olarak kullanımını sağlar. İlk olarak, Sanger dideoksinükleotit metoduyla dizi analizi kolayca yapılabilen tek zincirli DNA'ya sahiptir («»©Kısım 7.8). İkinci olarak, klonlama işlemi için gerekli genomik DNA'nın çift zincirli formu, faj replikatif form oluşturduğunda doğal olarak üretilir. Üçüncüsü, enfekte hücreleri gelişme fazında tutarak klonlanmış DNA'yı sonsuz olarak muhafaza edebilir, bu da klonlanmış DNA kaynağının sürekli olmasını sağlar. Son özelliği de lambda fajı gibi (öosŞekil 9.17 ve 9.18 ve Kısım 10.17), faj M13 genomuda da herhangi bir protein kodlamayan ve farklı miktarda yabancı DNA ile (ö°öKısım 15.1) yer değiştirebilen intergenik bir bölgenin bulunmasıdır. Bu ve diğer nedenlerle faj M13, biyoteknologlarm kullandıkları araçların önemli bir kısmını oluşturur.
Hücre duvarı
, Sitoplazmik membran • Sitoplazmik membrana gömülü kapsit proteinleri
Kapsit proteinleri
C-proteirn
%0000000000000000S9»M0 Faj M13
Faj M13 model bir filamentli bakteriyofajdır. Faj, genetik mühendisliğinde klonlama vektörü ve DNA dizileme aracı olarak geniş bir şekilde kullanılmaktadır («3c*5Kısım 15.1). Faj M13 virionu, sadece 6 nm çapında, ancak 860 nm uzunluğundadır. Filamentli DNA fajları, konukçu hücreyi lize etmeksizin hücreden ayrılma gibi oldukça ilginç bir özelliğe sahiptir. Böylece, faj M13 ile enfekte bir hücre gelişmeye devam edebilmekte ve virionları hücre dışına çıkartabilmektedir. Virüs enfeksiyonu hücre gelişmesinin yavaşlamasına sebep olmakta, ancak diğer taraftan bir hücre virüsüyle birlikte ortamda kalabilmektedir. Tipik plaklar (o<=*sŞekil 9.6b) bu nedenle gözlenmemekte, bunun yerine
tyğ \
Faj DNA'sı: ss halkası
A-proteini VS Hücre dışı
\-
-Yer değiştiren dış protein Sitoplazma
* Şekil 16.S Filamentli fajlann hücre dışına çıkması. Enfekte ettiği hücreyi lize etmeden çıkan bir filamentli tek zincirli faj (M13 ya da fd gibi) virionumın şekli. A proteini, kapsit proteinlerinin biriktiği membrandaki bir bölgeden, ilk olarak membraiu geçer. Hücre içindeki halkasal DNA dış faj protein dimerleri ile çevrilidir, bunlar sitoplazmik zardan DNA geçerken kapsit proteinleri ile yer değiştirir.
508 • Bölüm 16 • Viral Çeşitlilik
16.3 Kavramların Gözden Geçirilmesi M13 gibi bazı tek zincirli DNA virüsleri filamentli virionlara sahiptir. Bu virüsler DNA dizileme ve genetik mühendisliği için çok faydalı araçlardır. Bunlar ayrıca konukçu hücreyi öldürmeksizin hücreden çıkabilirler. •
Faj M13 genomunu tanımlayınız. Genomun bu faj tarafından üretilen mRNA ile ilişkisi nasıldır? • M13 virionlan enfekte konukçu hücreyi öldürmeksizin hücreden nasıl çıkarbilirler?
Çift Zincirli DNA Bakteriyofajları: T7 Çift zincirli DNA bakteriyofajları tüm virüsler içinde en fazla çalışılanlarıdır. Bölüm 9'da bu grupta yer alan T4 ve lambda fajlarını tartıştık (eosKısım 9.9 ve 9.10). Moleküler biyoloji ve gen regülasyonunun anlaşılması için önemli bir model olmaları nedeniyle, bu bölümde 17 fajı ve gelecek bölümde ise Mu fajı olmak üzere bu virüslerin ikisi üzerinde durulacaktır.
Bakteriyofaj T7 Rcplikasyonu: İlk Olaylar Bakteriyofaj 17 ve onunla yakından ilişkili olan T3, Escherichia coli ve diğer bazı enterik bakterileri özelikle Shigella bakterisini enfekte eden nispeten küçük DNA virüsleridir. Virion ikozahedral bir baş bölgesine ve çok kısa bir kuyruğa sahiptir (Şekil 16.6»). 17 genomu, 39,936 bp'lik doğrusal çift zincirli bir DNA molekülünden oluşur. 17 genomunda, çakışan genlerle birlikte (Kısım 16.1 ve 16.2'ye bakınız), maksimum genetik ekonomi sağlamak üzere belirli genlerde frame shift ve translasyonal tekrar başlangıçlar gibi diğer translasyon stratejileri de bulunur. Bu yolları Kısım 16.2'deki <£X174 ile ilişkilendirerek tartışacağız. 17 genetik haritası Şekil 16.6'da gösterilmiştir. 17 kromozomundaki genlerin dizilimi, virüs çoğalmasının düzenlenmesini etkilemektedir. Virion bakteriyal hücreye tutunduğunda, genetik haritanın sol ucundaki genler hücreye ilk olarak girecek şekilde DNA hücreye enjekte olur. Bu uçtaki bazı genler, biribirine yakın üç promotor kullanılarak
İşlevi
Genler 1 Sol uç
mımmımmfst İlk promotorlar 0.3 M Konukçu restriksiyonunu engelle r 0.7 Protein kinaz
Konukçu RNA polimerazla transkribe edilir Promotor
1 m
T7 RNA polimeraz Bilinmiyor «— DNA replikasyon orjini DNA ligaz 1.7 • • Zorunlu değil 2 mm Konukçu RNA polimerazını inaktive eder DNA replikasyonu Endonükleaz 3 3.5 M Lizozim ve konukçu lizizi Helikaz, primaz için proteinler
1.1 •
-M 4
Promotor
•
«I
DNA polimeraz
"
Virion proteini Baş proteini
7
8 I Promotor
T7RNA polimerazla Promotor transkiribe edilir
Promotor
Ekzonükleaz
6
14
Virion proteini Baş proteini
J:
«• •I
3. T7, DNA replikasyonu ve transkripsiyon için gerekli kendi proteinlerinin tümünü kodlar.
-
5. Patlatma büyüklüğü (Escherichia coli konukçusunda): yaklaşık 100 virüs/hücre
Kuyruk proteini Kuyruk proteini
Baş proteini
17
2. Genom, 39,737 bç'lik doğrusal çift zincirli DNA'dır.
4. Tüm 100 T7 genomundan bir kopya yapılması için gerekli süre: 5 dakika
9 • Baş paketleme proteini Başlıca baş proteini 10 «M« 11
Bacteriofaj T7 1. Replikasyon döngüsü 25 dakikadır.
Baş proteini
Faj yapısal bileşenleri ve olgunlaşma proteinleri
Kuyruk proteini DNA'nın olgunlaşması DNA'nın olgunlaşması
• Şekil 16.6 T7 bakteriyofajının gen sayılarını, yaklaşık büyüklüklerini ve gen ürünlerinin işlevlerini gösteren genetik haritası. İlk promotorlann transkripsiyonunu konukçu RNA polimeraz gerçekleştirir. Diğer tüm promotorlann transkripsiyonunu Tl RNA polimeraz yapar. Genler sayı ile belirtilmiştir.
16 4 • Çift Zincirli DNA Bakteriyofajlan: T7 • 509
(ilk promotorlar) hücresel RNA polimeraz enzimiyle hemen transkribe edilir. Bu ilk proteinlerden biri, hücreyi yabancı DNA'dan koruyan bir mekanizma olan (co^Kısım 7.7), konukçu restriksiyon sistemini engeller. Bu olay, T7 genomunun tümü hücreye girmeden önce antirestriksiyon proteini sentezlenerek, çok hızlı olur. Bu ilk sentezlenen proteinlerin bir diğeri, T7 RNA polimeraz olarak adlandırılan viral bir RNA polimerazdır. İlk mRNA moleküllerinin diğer ikisi, konukçu RNA polimerazı inhibe eden proteinler kodlar, bu nedenle konukçu genlerinin transkripsiyonu gibi ilk genlerin transkripsiyonu da engellenir. Konukçu RNA polimeraz bu nedenle sadece ilk bir kaç geni transkribe etmede kullanılır. T7'ye özgü RNA polimeraz daha sonra görev alır ve fajm transkripsiyon işlemlerinin büyük kısmını tamamlar. Faj 17 RNA polimeraz, genom boyunca dağılmış sadece faja özgü promotorları tanır (Şekil 16.6). T7 RNA polimeraz bu promotorlar için spesifiktir (bu diziler tipik E. coli promotorları ile ilişkili değildir, 0Bç>Kısım 7.10 ve 7.11) ve ayrıca oldukça etkili bir RNA polimerazdır. (Genetik mühendisleri T7 RNA polimeraz kullanarak güncel bazı genleri yüksek oranda transkribe edebilirler; «o&Kısım 31.4.) Bu durum T4 fajma benzememektedir, T4 fajı enfeksiyonda T4 spesifik sigma faktörü ile beraber konukçu RNA polimerazı da kullanır (öoe>Kısım 9.9).
Replikasyon orjini ^ 5'
5' Tamamlanmış zincirler
(a) DNA polimeraz ye ligaz aktivitesi G A B C D E F G
T7'de Genom Replikasyonu
T7'de DNA replikasyonu tek bir orjinden başlar (Şekil 16.6'da gösterilmiştir) ve bu orjin noktasından her iki yönde devam eder (Şekil 16.7»). T7 DNA'smın replike olan molekülleri elektron mikroskobunda karakteristik yapılarıyla tanınabilirler. Replikasyon orjininin sol uca yakın olması nedeniyle Y şeklindeki moleküller, replike olan T7 DNA'nın elektron mikrograflarında belirgin olarak görülür. İlk replikasyonda, kabarcık şeklindeki molekül görülebilir (Şekil 16.7). T7 spesifik DNA polimeraz enzimini de kapsayan bazı virüs tarafından kodlanan proteinler, T7 replikasyonu için gereklidir. Bu durum T4 (ö°&Kısım 9.9) ya da <£X174 (Kısım 16.2'ye bakınız) fajlarında görülmez. T7 DNA'nın her iki ucunda bulunan 160 bp'lik
Terminal tekrar
G' A' B' C D' E' F G' Replike olmamış terminal tekrarların çift oluşturması G
A
„
B
C
D
E
F
G
^^•1WW—II———W
G' A' B' C D' E' F G' DNA polimeraz ve ligazla bir konkatemer oluşturmak üzere yeni ve eski molekülün birleştirilmesi (b) B C
I II /
• Şekil 16.7 T7 bakteriyofajının doğrusal çift zincirli DNA genomunun replikasyonu. (a) Göz ve Y ara formları oluşturacak şekilde DNA'mn iki yönlü replikasyonu (kolay anlaşılması için, kalıp olarak kullanılacak her iki zincir açık yeşil renkte ve yeni sentezlenen her iki zincir ise koyu renkli olarak gösterilmiştir), (b) Replike olmayan uçlarından DNA moleküllerinin birbirine bağlanmasıyla konkatemerlerin oluşumu. Genler rastgele (belli bir kural olmaksızın) gösterilmiştir, (c) Kesim yapan bir enzim olan endonükleaz aktivitesiyle T7 konkatemerlerinden olgun viral DNA moleküllerinin üretimi. Sol: Enzim okla gösterilen spesifik bir bölgedeki tek zincirde kırılma yapar; orta: DNA polimeraz tek zincirli uçlan tamamlar; sağ: terminal tekrarlı olgun T7 molekülü. Bakteriyofaj T4 de doğrusal genomunun replikasyonu için Şekil 16.7c ile Şekil 9.13'ün karşılaştınlmasmda görüleceği gibi rekombinasyon kullanır.
DNA polimeraz
• Kesici enzim
5'3' G||G' A || A B C C D D' E E F İİ F
DNA polimeraz ' Tek zincirlerde kırık oluşturan kesici (oklar) enzimler (c)
Tek zincirlerdeki kırıkların DNA polimerazla tamamlanması
G İİ İİG' 3'5' Terminal tekrarlı olgun T7 molekülü
510 • Bölüm 16 • Viral Çeşitlilik
direk terminal tekrarlı diziler, DNA replikasyonu için önemli bir yapısal özelliktir. 5' ucuna yakın DNA replikasyonunda, RNA primer molekülleri replikasyon tamamlanmadan önce uzaklaştırılır. Bu nedenle her ipliğin 5' ucunda T7 DNA'nın replike olmamış bir kısmı kalır (Şekil 16.7a aşağı kısma bakınız). Kısım 14.6'da tartışıldığı gibi, doğrusal DNA'dan oluşan genetik elementler, DNA replikasyonunda bu problemi çözmek için çeşitli stratejiler geliştirmiştir. 17 fajının kullandığı yol uçlarında tekrarlamak diziler bulunan T4 fajına benzemektedir (o^aKısım 9.9). İki ayrı DNA molekülündeki zıt yöndeki 3' zincirleri üst üste gelir, orijinal T7 DNA'nın iki katı büyüklüğünde bir DNA molekülü olacak şekilde 5' zincirlerle çift oluşturabilir (Şekil 16.7b). Bu yapının replike olmamış kısımları daha sonra, konkatemer olarak adlandırılan doğrusal bir iki moleküllü yapı oluşturacak şekilde, T7 DNA polimeraz ve ligaz aktivitesiyle çift zincirli hale getirilir. Devam eden replikasyon ve rekombinasyon, konkatemerlerin uygun büyüklüğe ulaşmasını sağlar, ancak bu olay sonunda faj tarafından kodlanan bir endonükleaz özel bir bölgede, terminal tekrarlı virüs genom büyüklüğünde doğrusal DNA molekülleri oluşturacak şekilde, her bir konkatemeri keser (Şekil 16. 7c). T7 fajmda, lambda gibi ancak T4'den farklı bir şekilde, konkatemer spesifik bir diziden kesildiği için, her bir T7 virionunda DNA dizisi aynıdır. T4 fajında bu durum görülmez. Bu fajm DNA'sı sadece terminal fazlalıklar içermez halkasal olarak da diziliminin değiştiği (circularly permuted) bir "headful (baş doldurma) mekanizması" kullanarak DNA'sırtı işler («»Kısım 9.9). 16.4 Kavramların Gözden Geçirilmesi Bakteriyofaj 17 çift zincirli DNA genomu konukçu hücreye daima aynı yönde girer. T7'de son genler virüs tarafından kodlanan RNA polimeraz kullanılarak transkribe edilir. T7 genomunun replikasyon stratejisi, 17 DNA polimerazı kullanmak, terminal tekrarlı bölgeler içermek ve konkatemer oluşturmaktır. • 17 genomunun sadece tek yönlü olarak hücreye girmesinin önemi nedir? • Terminal tekrarların anlamı nedir? • Faj T4 ve 17 DNA replikasyonunun benzer ve farklı yönleri nelerdir?
başka, Mu ile enfekte olan bir konukçu hücre, mutant bir fenotipe sahip olarak kabul edilir. Pek çok bakteri mutantını kolayca oluşturabilen Mu, bakteri genetiğinde kullanılan yararlı bir fajdır. Transpozonlar konukçu genomunda bir bölgeden diğer bir bölgeye hareket edebilen DNA parçalarıdır. Hem prokaryot hem de ökaryotlarda bulunurlar ve genetik varyasyonda önemli rol oynarlar ((cnaKısım 10.14). Mu her ne kadar bir bakteriyofaj olsa da, gerçekten transpozisyonla DNA'sim replike eden büyük bir transpozondur. Mu Fajının Temel Özellikleri Bakretiyofaj Mu, ikozahedral bir baş, helikal bir kuyruk ve altı kuyruk uzantısına sahip büyük bir virüsdür (Şekil 16. 8«). Mu genomu doğrusal çift zincirli DNA içerir. Genetik haritası Şekil 16. 9a*'da gösterilmiştir. Şekilde baş ve kuyruk proteinlerini sentezleyen genlerin fazlalığı ve genomun her iki ucunda replikasyonda ve konukçu seçiminde önemli olan genler görülmektedir. Mu DNA'sı yaklaşık 39 kbp olmakla birlikte bunun sadece 37.2 kbp'lik kısmı Mu genomunu oluşturur. Bunun nedeni, Mu DNA'sınm her iki uçta konukçu DNA'sı içermesidir. Mu DNA'sının sol ucunda 50 - 150 bp'lik, sağ ucunda ise 1-2 kbp'lik konukçu DNA bulunur. Bu konukçu DNA dizileri değişkendir, Mu'nun önceki konukçu genomuna inserte olduğu bölgeye bitişik DNA dizilerinden oluşur. Bu olay nasıl gerçekleşir? Mu faj virionu oluştuğunda, Mu genomu içeren fajın baş kısmını dolduracak kadar uzun bir DNA konukçudan koparak ayrılır. DNA baş kısım dolana kadar paketlenir, ancak sağ uçta bulunan DNA her virionda farklı bir şekilde kesilir. Bunun sonucu olarak genetik haritada da görüldüğü gibi, faj genomunun sağ ucunda (attR bölgenin sağı) değişen dizilimde bir konukçu DNA bulunur. Böylece, tek bir enfekte hücreden ayrılan her bir virion, farklı konukçu DNA taşıdığı için genetik olarak diğerlerinden farklı olacaktır. Mu ve Ters Çevrilen G Bölgesi Genetik haritada görüldüğü gibi (Şekil 16.9a), Mu genomunun G olarak adlandırılan özel bir parçası ya G+ ya da G~ olarak gösterilen yönde ters çevrilir. Bu parçanın yönü fajda bulunan kuyruk uzantı-
Mu: Çift Zincirli Transpoze Olabilen DNA Bakteriyofajı En ilginç bakteriyofajlardan biri bakteriyofaj Mu'dur. Lambda gibi temperent bir virüsdür (<3Qç> Kısım 9.11), ancak transpozonlar gibi replike olur (<*feKısım 10.14). Bu faj konukçu genomuna katıldığında mutasyona sebep olduğu için Mu olarak adlandırılır. Mu fajının mutajen özelliği, virüs genomunun konukçu genleri içine bağlanarak o genleri inaktive etmesinden kaynaklanmaktadır. Bundan
* Şekil 16.8 Mu bakteriyofajı. Mutasyona neden olan çift zincirli DNA fajı olan Mu virionlannın elektron mikrografı.
16.5 • Mu: Çift Zincirli Transpoze Olabilen DNA Balrteriyofajı • 511
Ters çevrilen G parçası (konukçu aralığı)
Son mRNA sentezinin pozitif aktivatörü Represör Katılma replikasyon Konukçu DNA
attL
farklı konukçu hücrelerin hedef alınmasını sağlayan basit bir mekanizma olarak kabul ederiz. Mu Replikasyonu
Değişken uç (konukçu DNA)
Transpozaz
(a) I
Katılma noktası: Duplike olan bölge
Konukçu DNA'da transpozazla yapılan iki ayrı kesim G CCG A C G G CT Tek zincire dönme ve Mu'nun eklenmesi
G C C GA| C G G CT Beş baz çiftinin duplikasyonuyla sonuçlanan DNA onarımı
• Şekil 16.9 Bakteriyofaj Mu replikasyonu. (a) Mu genomunun genetik halitası. Detaylar için metne bakınız. Bir repressör kodlayan küçük c gen bölgesine, ve aktivatör bir protein kodlayan büyük C gen bölgesine dikkat ediniz. Baş ve kuyruk gen bölgeleri gösterilmemiştir, (b) Konukçu DNA'ya Mu'nun bağlanmasında, konukçu DNA'nın 5 bp'lik dizisinin kopyalanması gösterilmiştir.
Tartıştığımız çift zincirli DNA genomuna sahip T4 (aoöKısım 9.9), 17 (Kısıml6.4'e bakınız), Lambda (öasKısım 9.10) ve Mu bakteriyofajlarının hepsi doğrusal genoma sahiptir. Virüsler doğrusal genom uçlarının replikasyonunda, tamamen birbirinden farklı üç yol kullanır (oooKısım 14.6, protein primer kullanımı). Terminal tekrarlara sahip T4 ve 17 konkatemerler oluşturmada rekombinasyon kullanır. Bundan farklı olarak lambda , enfeksiyon sonrası genomunu halkasal hale getirir. Diğer fajların hiçbirinde bulunmayan bir özelliğe sahip olan Mu ise, genomunu büyük bir DNA molekülünün bir parçası olarak replike eder. Mu tarafından konukçu bir hücrenin enfeksiyonunda, DNA enjekte olur ve adeninlerinin yaklaşık % 15'inin asetilasyonla modifiye edildiği bir sistemle konukçu restriksiyon enzimlerinden korunur. Lambdadan farklı olarak Mu DNA'nın konukçu genomuna bağlanması, hem litik hem de lizogenik gelişim için gereklidir. Bağlanma için bir transpozaz enzimi olan gen A ürününün aktivitesi gereklidir. Mu DNA'nın bağlanacağı konukçu DNA'daki hedef bölgede, konukçu DNA'daki 5 bp'lik bir dizi kopyalanır. Şekil 16.9b'de görüldüğü gibi, Mu'nun bağlanacağı bölgedeki konukçu DNA dizisinin kopyalanması, bu bölgede ayrı ayrı yapılan iki kesim sonucu oluşur. Bu kesim sonucu oluşan tek zincirli bölgeler, Mu bağlanma işleminin bir kısmını oluşturacak şekilde, çift zincirli hale çevrilir. Bu kısa konukçu DNA dizisinin kopyalanması, transpozon hareketinin tipik bir özelliğidir (ooaKısım 10.14). Mu fajmın litik gelişmesi, ya ilk enfeksiyonda, eğer Mu repressör (c geninin ürünüdür) oluşmamışsa, yada bir lizogen teşvikiyle gerçekleşebilir. Her iki durumda da Mu DNA'nın replikasyonu, konukçu genomunda pek çok bölgeye Mu'nun tekrarlanan hareketini sağlar. Başlangıçta, Mu'nun sadece ilk genleri transkribe olur, ancak sonra C proteini üretilir (C, son transkripsiyonun pozitif bir aktivatörüdür) ve Mu baş ve kuyruk proteinleri sentezlenir. Sonuçta, litik olaylar gerçekleşir ve olgun faj partikülleri serbest kalır. Mu fajında lizogenik gelişme için, konukçu genomuna bağlı Mu DNA'nın transkripsiyonunu önleyen repressör proteininin yeterli miktarda birikimi gereklidir.
larının tipini belirler. Konukçu hücreye adsorpsiyon, kuyruk uzantıları ve hücre yüzeyi arasındaki moleküler etkileşimlerle kontrol edildiğinden, Mu'nun konukçu olarak kullanabileceği hücreler fajdaki ters çevrilebilen bu parçanın yönüyle belirlenir. Örneğin, eğer G parçası G+ yönünde ise, faj Escherichia coli Kİ 2 susunu enfekte edebilecek kuyruk uzantılarını sentezleyecektir. Eğer G parçası G" yönünde ise, faj farklı olarak E. coli C susunu ya da diğer bazı enterik bakteri türlerini enfekte edecektir. İki kuyruk uzantısı proteini, bu küçük G parçasında zıt zincirlerden kodlanır. — (jj^H 16.5 Kavramların Gözden Geçirilmesi G parçasının solu, bu parçada direk olarak + transkribe edilen bir promotordur. G yönünde, Bakteriyofaj Mu bir transpozon olarak da kabul edilen S ve U genlerini direk transkribe olan promotoru temperant bir virüsdür. Litik ya da lizogenik gelişmede, aktiftir, oysa G~ yönünde, zıt zincirdeki S' ve U' genomu transpozaz aktivitesiyle konukçu kromozomuna genlerini direk transkribe edilen farklı bir promobağlanır. Hatta litik döngüde genomu büyük bir DNA molekülü olarak replike olur. Genom her iki ucunda kısa tor aktiftir. G bölgesinin ters çevrilmesi nadir bir konukçu DNA dizileri taşıyacak şekilde virionda paketolaydır ve G bölgesine komşu bir genin kontrolü lenir. altındadır. Ters çevrilme özelliğini bu nedenle,
512 • Bölüm 16 • Viral Çeşitlilik • •
Transpozon nedir? Doğrusal genomunun uçlarını tamamiyle replike etmek için Mu hangi mekanizmayı kullanır?
F ? ••'••%;:*
Archaea Virüsleri Konukçu olarak metanojenik (oQç»Kısım 13.4), halofilik ve alkalofilik (c^^Kısım 13.3), ve hipertermofilik (oasKısım 13.6-13.10) Archaea türlerini kullanan bazı virüsler keşfedilmiştir. Metanojenik ve halofilik arkeleri enfekte eden Archaea virüslerinin çoğu, T4 fajı (öiacKısım 9.9) gibi enterik bakterileri enfekte eden fajların baş ve kuyruk tiplerine benzer özelliklere sahiptir. Halofilik ve haloalkalofilik Archaea'lar olan Halobacterium salinarum H fajı ve
Natrialba magadii Chl fajı gibi bazı kuyruklu virüsleri, T4 fajındaki gibi halkasal dizilimini değiştiren (circularly permuted) ve terminal fazlalıkları olan doğrusal çift zincirli DNA genomuna sahiptir. Bu virüsler T4 fajındaki "head full" mekanizmasını kullanarak DNA'larını paketlerler (oo&Kısım 9.9 ve Şekil 9.13). Sulfolobus ve Pyrococcus Virüsleri Bu kısımda hipertermofilleri enfekte eden (Crenarchaeota şubesinin türleri, es-^Bölüm 13) çok farklı ve morfolojik olarak tek olan arke virüslerine odaklanacağız. Hipertermofil sülfür okside eden Sulfolobus, morfolojik yapıları oldukça farklı olan virüslerin konukçusudur. Sulfolobus habitatı olan sıcak asidik topraklar ve sıcak su kaynakları (<*fe Kısım 13.8), göz önüne alındığında, bu virüslerin sıcaklığa ve aside oldukça dirençli olmaları bir zorunluluk olarak ortaya çıkmaktadır. Sulfolobus türlerini enfekte eden, sık görülen kısa adı SSV olan virüs, rozet gibi gruplar da oluşturabilen iğ şeklinde virionlara sahiptir (Şekil 16.10a«). Termal çevrelerde oldukça yaygın olarak görülen bu virüsler, Yellowstone Ulusal Parkı gibi Japonya ve İrlanda'daki sıcak su kaynaklarından izole edilebilirler. SSV virionları, kuyruklu bakteriyofaj T4 doğrusal genomundan (yaklaşık 168 kbp) oldukça küçük yaklaşık 15 kbp uzunluğunda halkasal çift zincirli DNA içerir (Bacteria'da bilinen bir halkasal çift zincirli DNA virüsü yoktur). ikinci bir Sulfolobus bakteriyofaj morfolojik yapısı, düzgün helikal çubuk şeklidir (Şekil 16.10b). Bu gruptaki virüslerden kısa adı SIF olan virüs, yaklaşık 35 kbp uzunluğunda doğrusal çift zincirli DNA genomu taşır. İğ ve çubuk şekli olmak üzere pek çok değişik yapı virüs izolasyon çalışmalarında görülmüştür. Filamentli bakteriyofaj morfolojisine benzer çok uzun çubuklar (Kısım 16.3'e bakınız) ve uçları sivri büyük iğ şeklinde virüsler bu grupta bulunur Şekil 16.10). Ayrıca Sulfolobus cinsini (yada Archaea'nm herhangi bir üyesini) enfekte eden herhangi bir RNA virüsü bulunamamıştır.
* Şekil 16.10 Arheal virüsler. Crenarchaeota virüslerinin (a, b) ve Euryarchaeota virüsünün elektron mikrografı. (a) Sulfolobus solfataricus (sıcaklık optimumu, 80°C) türünü enfekte eden iğ şeklindeki virüs SSVİ. (b) 5. solfataricus türünü enfekte eden filamentli virüs SIFV. (c) Pyrococcus abyssi (sıcaklık optimumu, 96°C) türünü enfekte eden iğ şeklindeki virüs PAV1. Virüslerin büyüklükleri: SSVİ, 40 X 80 iraı; SIFV, 50 X 900-1500 nm; PAV1, 80 x 120 nm'dir. Bu morfolojilerden başka kuyruklu bakteriyofajlara benzeyen kuyruklu virüslerin (Kısım 9.9) bazı Archaea lan enfekte ettikleri bilinmektedir.
İğ şeklinde bir virüs, Euryarchaeota arke şubesi içinde yer alan Pyrococcus cinsini de enfekte eder (c«sKısım 13.6). PAV1 olarak adlandırılan bu virüs SSV'ye benzer, ancak daha uzundur ve çok kısa bir kuyruk içerir (Şekil 16.10c). PAV1 fajı yaklaşık 18 kbp halkasal çift zincirli DNA içerir ve hücreyi lize etmeksizin konukçu hücreden ayrılması oldukça ilginçtir. Bu fajm filamentli Escherichia coli fajı M13'e benzer şekilde tomurcuklanma mekanizmasıyla hücreden ayrılması olasıdır (Kısım 16.3'e bakınız). Pyrococcus optimum gelişme sıcaklığı yaklaşık 100°C olan bir hipertermofildir, bu da PAV1 virionlarınm yüksek sıcaklıkta stabil kalmaları gerektiği anlamına gelir. Genomik kıyaslamalar PAV1 ve SSV tip virüslerin, benzer morfolojik yapıda olmalarına rağmen, çok az dizi benzerliği gösterdiğini ortaya çıkarmıştır. Bu da her iki virüsün evrimsel olarak ortak bir kökene sahip olmadığını göstermektedir.
16.7 • Bitki Virüsleri • 513
Arke Virüslerinin Replikasyonu ve Evrimi
leştirilirken ökaryotlarda, translasyon sitoplazmada,
Arke virüslerinin replikasyon çalışmalarında, genom replikasyonunda ve virion paketlenmesindeki önemli aşamaların açıklanmasına hala ihtiyaç duyulmaktadır. Ancak, bu virüslerinin genomları dikkate alındığında, diğer çift zincirli DNA virüslerinden farklı herhangi bir önemli yeni replikasyon stratejisinin, bu çalışmalarda ortaya çıkma olasılığı yoktur. Ancak, replikasyonda kullanılan konukçu polimerazları ve ilgili enzimlerden ziyade virüslerde gerçekleşen pek çok moleküler detayın, nispeten yeni keşvedilen bu virüslerde ilerde çalışılması beklenmektedir. Arke virüslerinin çok küçük genomları dikkate alındığında, konukçuya çok bağlı oldukları ve çakışan genlerde olduğu gibi DNA'larını ekonomik olarak kullanma özelliğine sahip oldukları tahmin edilmektedir. İğ şeklinde virüsler Bacteria türlerinde bulunmaz. Bacteria virüslerine genomlarının oldukça sınırlı benzerlikleri, arke virüslerinin bilinen bakteriyofajlarla aynı soyu paylaşmadıklarını gösterir. Bunun aksine, yapısal ve genomik çalışmalar,
transkripsiyon ve DNA replikasyonu ise çekirdekte
kuyruklu Archaea virüslerinin Bacteria'daki benzer
fajlarla aynı soyu paylaştıklarını göstermektedir. Bu durum, Bacteria'dan Archaea'ya (ya da tersi) faj genlerinin aktarımı sonucunda (Bölüm 10) ya da aynı evrimsel kökeni paylaşmaları nedeniyle gerçekleşebilir. Archaea türlerinin virüsleri çoğaltabildikleri açıktır. Ve her ne kadar arke virüslerinin konukçularmı nasıl etkiledikleri (litik virüslerden farklı olarak) henüz bilinmesede, en azından bazı Archaea virüslerinin Bacteria'dakine benzer şekilde («»s Bölüm 9) arke genetiğine etki yapmamaları şaşırtıcıdır. Bu nedenle de hem temperent virüslerin (
m
16.6 Kavramların Gözden Geçirilmesi
Çeşitli virüsler Archaea enfekte eder. Çift zincirli halkasal DNA genom taşıyan çoğu arke virüs tipi, Bacteria'daki bakteriyofajlarda bulunmamaktadır. Her ne kadar baş/ kuyruklu tipte virüsler bilinse de çoğu arke virüsü iğ şeklinde morfolojiye sahiptir. Archaea'nm hangi grubu/gruplarında baş/kuyruklu tipte fajlar keşfedilmiştir? Bacteria'nm kuyruklu fajlarıyla ilişkileri nedir? • Yüksek sıcaklıkta gelişenler ile metanojenik ve halofilik Archaea'yı enfekte eden virüslerin morfolojilerini karşılaştır.
olur. Ayrıca ökaryotlardaki mRNA'lar, cap ve poly A kuyruğu taşır (««»Kısım 14.7 ve 14.8). Bu farklılıkların ökaryotlarda replike olan virüslerle ilişkisini göreceğiz. Bazı hayvan virüslerini Bölüm 9'da tartıştık (oooKısım 9.12). Genel biyolojileri ve insan hastalıklarındaki rolleri, hayvan virüslerine olan ilgiyi arttırmıştır. Bu bölümün kalan kısmında hayvan virüslerine dikkatlerimizi odaklayacağız. Ancak, ökaryotların tümünün hayvanlar olmaması nedeniyle, iki iyi bilinen bitki virüsünü de incelemeye alacağız.
Bitki Virüsleri Bitki hücre duvarları kaim ve serttir. Bitkileri enfekte eden ve çok hücreli bitkilerde enfekte hücreden komşu hücrelere yayılan, ancak bir kaç bitki virüsü bilinir. Bilinen bitki virüslerinin büyük çoğunluğu pozitif zincirli RNA virüsleridir. Bu virüslerdeki
küçük genomların bitki içinde hücreden hücreye virüsün transferini kolaylaştırdığı düşünülür. Tütün Mozaik Virüsü: Genel Özellikleri
Rus bilim adamı Dimitri Ivanovsky 1892 yılında, tütün mozaik hastalığına sebep olan etkenin bakterileri tutan filtrelerden geçebildiğini gösterdi. 1898'de Hollandalı mikrobiyolog Martinus Beijerinck (ceöKısım 1.7) bu ajanın sadece filtre edilemediğini değil, aynı zamanda canlı bir organizmanın çoğu özelliğine sahip olmadığını da gösterdi. Bu ajan, tanımlanmış ilk virüs olan tütün mozaik virüsüdür (TMV). Helikal simetrili bir viriona sahip olan TMV (oeaKısım 9.2), tek kopya halinde pozitif zincirli RNA genomu ve 2130 kopya kapsit proteini taşır (öOsŞekil 9.2). Genetik materyalin, diğer virüslerde ve hücrelerde DNA iken, RNA olabileceği ilk kez TMV de gösterilmiştir. TMV tütün gibi domates bitkisini de enfekte ettiği için ziraaatte ciddi bir problem oluşturur. Bir bitkinin TMV ile enfekte olabilmesi için bitki hücre duvarında virionun girebileceği bir hasarın olması gereklidir. Kapsitin atılması hücre içinde olur.
•
OKARYOT VİRÜSLERİ Prokaryotik hücre ve ökaryotik hücre arasındaki farklılıklar, onları enfekte eden virüsler üzerinde bazı sınırlamalara neden olur. Örneğin, prokaryotlarda transkripsiyon ve translasyon birlikte gerçek-
TMV Genomu ve Replikasyonu
TMV RNA genomu 6395 nükleotit içerir. Genom haritası Şekil 16.11 «'de gösterilmiştir. Bakteriyofaj MS2 gibi (Kısım 16.1'e bakınız), TMV sadece dört protein kodlar. Genom, bitki hücresinde translate edilmesi için gereki 5'cap (öOöKısım 14.8), ve 3' uçta da transfer RNA benzeri bir yapı oluşturacak şekilde bir katlanma içerir (Şekil 16.11). Küçük RNA bakteriyofajlarmda, viral genomun viral mRNA olarak da kulanıldığını gördük (bak. Kısım 9.7). Ancak ökaryotlarda polisistronik mRNA translate edilemez (oosKısım 14.7), bu nedenle TMV genle-
514 • Bolüm 16 • Viral Çeşitlilik
Durma kodonu
Cap MTH
5'
I
RNP
MP
tRNA benzeri yapı \ CP 3'
* Şekil 16.11 Tütün mozaik virüsünün genetik haritası. Genom, 5' uçta cap ve 3' uçta tRNA benzeri bir yapıya sahip (büyük olarak çizilmiştir) pozitif zincirli RNA'dır. MHT geni hem metiltransferaz hem de RNA helikaz aktivitesine sahip bir protein kodlar. RNP geni RNA'ya bağlı bir RNA polimeraz enzimi kodlar. Bu enzim, MHT genini izleyen bir durdurucu kodon olmasına rağmen, ribozomlarda okunarak sadece bir poliprotein olarak translate edilir. MP geni bir hareket proteini kodlar, ve CP geni kapsit proteini kodlar. Bu iki protein, enfeksiyonda yapılmış olan negatif zincirli RNA kullanılarak sentezlenen subgenomik mRNA'lardan translate edilir. Tütün mozaik virüsü, tütün bitkisinden başka domates, biber ve ıspanak bitkilerinin de dahil olduğu bir grup bitkiyi enfekte edebilir.
rinin ifadesi MS2 gibi küçük bakteriyofajlardakinden farklıdır. TMV'deki ilk gen MTH olarak adlandırılan, RNA'ya cap bağlanmasınında görevli metiltransferaz ve RNA helikaz olmak üzere iki enzimatik aktiviteye sahip, bir enzim kodlar. RNP geni, RNA'ya bağlı RNA polimeraz (RNA replikaz) enzimini kodlar. Virüs bu enzimle, genomik RNA'sının daha fazla kopyasını çıkarmak için kullanacağı, negatif zincirli bir kopyasını sentezler. Bu protein, MHT kısımlarını da kapsayan bir poliproteinin bir parçası olarak sentezlenir (Kısım 16.8'e bakınız). MTH geninin sonunda durdurucu kodon olmasına rağmen, bir ribozom tarafından tesadüfen okunduğunda bu poliprotein sentezlenir. Bu olay biraz nadir olduğundan, bu uzun protein oldukça az miktarda yapılır. Kalan iki gen hareket proteinini (MP) ve kapsit proteinini (CP) kodlar. Küçük iki monosistronik mRNA negatif zincirli RNA'dan yapılır, ve herbiri bu proteinlerin birini üretmek üzere translate edilir. Diğer virüslerin kapsit proteinleri gibi, TMV kapsit proteinleri de virion oluşumu için mutlaka gereklidir. Virion yeni bitkilerin enfeksiyonu için gereklidir. Hareket proteini enfekte bitkide TMV'nin komşu hücrelere geçişini sağlar. Bitki hücreleri, hücre duvarları arasında köprü oluşturarak bitki hücrelerini biribirleriyle ilişki halinde tutan, plazmodezmata olarak adlandırılan yapılara sahiptir. Plazmodesmata çok dar kanallardır, o kadar dardırlar ki ne TMV virionları ne de serbest RNA'lar kolayca bu açıklıklardan geçemezler. Hareket proteini yeni genomik artı zincirli RNA'ya bağlanır ve oldukça ince (yaklaşık 2.5 nm) bir kompleks oluşturur. Oluşan bu nükleoprotein kompleksleri, plazmodezmata boyunca hareket ederek komşu hücreleri enfekte eder. Daha önce anlatıldığı gibi, pek çok pozitif zincirli bitki RNA virüsü bilinir. Ayrıca Bacteria (Kısım 16.1'e bakınız) ve hayvanlarda (Kısım 16.8'e bakınız) da pozitif zincirli RNA virüsleri bulunur. Genetik analizler, bu virüslerin çoğunun oldukça farklı konukçuları olmalarına rağmen birbirleriy-
le yakın bir ilişki içinde olduklarını ve tümünün RNA replikasyonlarının birbirlerine benzediğini göstermiştir. TMV'de olduğu gibi, genelde konukçu hücre farklılıklarıyla ilişkili olarak, biraz farklı replikasyon stratejilerine sahiptirler. DNA Bitki Virüsleri: Chlorella
Yeşil algler mikrobiyal yeşil bitkilerdir ve Chlorella yeşil alglerin oldukça geniş bir yayılım gösteren cinsidir. Çoğu Chlorella türü serbest yaşar, ancak Chlorella-benzeri alglerin bazısı Paramecium gibi
protozoaların bulunduğu tatlı su ya da deniz hayvanlarının endosimbiyontlarıdır (oosKısım 14.4). Bu fototrofik endosimbiyontların çoğu, organizmadan ayrı olarak laboratuvarda geliştirilebilir ve bunların bazısı virüsler için konukçudur. Bunlar içinde en fazla çalışılan virüs Paramecium bursaria chlorella virüs l'dir (PBCV-1). Virüs PBCV-1, büyük ikozahedral virionlara (Şekil 16.12») ve çift zincirli DNA genomuna sahiptir. Virionlar enfektifliği için gerekli olan lipit bir yapıya sahiptir. Ancak kapsit içinde bu lipit membran bulunduğu için virion kılıfsızdır. Chlorella virüslerinin genomları oldukça büyüktür. Tümü 300 kb'dan fazladır (diğer virüslerle kıyaslamak için Tablo 9.1'e bakınız). Çoğu durumda DNA metilasyonla modifiye edilebilir. PBCV-1 genomunun dizi analizi tamamlanmıştır. Bu 330,742-bp genom, 370'den fazla farklı protein ve 10 tRNA kodlar. Genom uçlarında, poxvirüslerinde bulunanlara (Kısım 16.13'e bakınız) çok benzer bir şekilde, tamamlanmamış baz çiftli saç tokası (hairpin loops, oosŞekil 7.8) yapıları bulunur.
^gM;
- Kapsit
Lipit membran •
«%•*
• Şekil 16.12 Chlorella virüs PBCV-1 virionunun kesiti. lipit çift tabakalı bir membran kapsit kabuğu altında görülür. Virion yaklaşık 170 nm çapındadır. Şekil bir kaç transmission elektron mikrograftan hazırlanmıştır. Chlorella yeşil alglerin bir üyesidir (Kısım 14.13). Çok büyük virüsler olmaları yamnda, Chlorella virüsleri 0.3 Mbp'den büyük olmak üzere oldukça büyük bir genom da içerirler.
16.8 • Pozitif Zincirli RNA'ya Sahip Hayvan Virüsleri: Poliovirüs ve Coronavirüsler • 515
Chlorella Virüslerinin Replikasyonu
Virüs PBCV-1 bakteriyofajlarda olduğu gibi hücrelere girer. Virion konukçunun hücre duvarına spesifik olarak bağlanır, daha sonra virion tarafından taşınan en az beş farklı enzim, temas ettiği noktadaki hücre duvarını parçalar. Viral DNA, boş virionu hücre dışında bırakarak hücre içerisine girer. Okaryotların çoğu çift zincirli DNA virüslerinde olduğu gibi, PBCV-1 DNA çekirdekte replike olur ve RNA'da orada sentezlenir. PBCV-1, DNA replikasyonunda görevli bir DNA polimerazı da içeren bazı enzimleri kodlar. Ancak her ne kadar PBCV-1 bazı transkripsiyon faktörlerini kodlasa da, kendi RNA polimerazını kodlamaz. PBCV-1 genlerinin bir kaçı daha sonra uzaklaştırılacak intron içerir (öo^Kısım 7.1). Virüs mRNA'ya cap takılır, kullanılan enzimlerin bazısı virüs tarafından kodlanır. İlk mRNA, son mRNA değil, poly-A kuyruğuna sahiptir. Bakteriyofaj T4 gibi, PBCV-1 kendi tRNA'larının bir kısmını kodlar. Her ne kadar PBCV-1 gibi virüsler için bilinen konukçular, diğer hücrelerden endosimbiyontlar olarak elde edilen sadece Chlorella türleri olsa da, bu virüsler doğada geniş bir yayılım gösterir. Bu nedenle, çok fazla doğal konukçuları olabilir. Ayrıca, Chlorella virüsleri algleri enfekte eden diğer virüslerle de ilişkilidir. Çift zincirli büyük DNA genomlarına sahiptirler, bunların bir kısmı halkasaldır. Chlorella virüsleri hakkında diğer bir ilgi çekici gerçek de, genomlarının bir kaç restriksiyon modifikasyon enzim sistemini kodlamasıdır (c^Kısım 7.7 ve 9.9). Gerçekte, prokaryotların ve bir kaç bakteriyofajın dışında, restriksiyon enzimlerinin tek kaynağını oluştururlar. Böylece Chlorella virüslerinde, hem prokaryotik hem de ökaryotik genetik elementlerin tipik özelliklerini görürüz.
m
16.7 Kavramların Gözden Geçirilmesi
Çoğu bitki virüsü pozitif zincirli RNA genomuna sahiptir, keşvedilen ilk virüs olan tütün mozaik virüsü (TMV) buna örnektir. Bu virüslerin genomları, hücre duvarlarındaki aralıklardan hücreler arası ilişkiler kurarak bitki içinde hareket edebilirler. Çok büyük çift zincirli DNA genomlarına sahip Chlorella virüsleri gibi, başka bitki virüs tipleri de bilinir. •
Çoğu bitki RNA virüsü bir hareket proteini kodlar. Bunun enfeksiyondaki rolü nedir? • Her ne kadar TMV genomu bir mRNA olarak kullanılsa da, virüs tarafından şifrelenen tüm proteinler ondan translate edilemez. Açıklayın. • Chlorella virüslerinin hangi özellikleri prokaryotlardakilere benzer?
Pozitif Zincirli RNA'ya Sahip Hayvan Virüsleri: Poliovirüs ve Coronavirüsler Bazı pozitif zincirli RNA hayvan virüsleri insanlarda ve diğer hayvanlarda hastalıklara sebep olurlar.
Bunlar poliovirüsler, soğuk algınlığına sebep olan rhinovirüsler, SARS gibi solunum hastalıklarına sebep olan coronavirüsler ve hepatit A
virüsüdür.
Keşvedilen ilk hayvan virüsü bu grupta yer alan, ruminantlarda zayıflığa ve ölüme sebep olan, şap virüsüdür. Oldukça büyük olan coronavirüsler hariç, bu virüsler çok küçük (yaklaşık 30 nm çapında) (pico küçük demektir) oldukları için picornavirüsler olarak adlandırılırlar ve tek zincirli RNA içerirler. Bu bölümde poliovirüs ve coronavirüs üzerinde duracağız. Poliovirüs biyolojisinin anlaşılması çok önemlidir. Bir zamanlar çocuk felci (polio) insanların en önemli salgın hastalıklarından biriydi, ancak etkin bir aşının geliştirilmesi (cotsKısım 22.13) hastalığın hemen hemen tamamiyle kontrol altına alınmasını sağladı. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) hastalığı dünyadan yok edecek bir aşılama programı kurmuştur ve günümüzde virüsün sadece bir kaç ülkede Afrika'da ve Hindistan'da bulunduğu bildirilmiştir. Poliovirüs Replikasyonu: Genel Özellikleri Poliovirüs virionu, her virionda 60 morfolojik üniteli ve her bir ünitesi de dört farklı proteinden oluşmuş, ikozahedral bir yapıya sahiptir (Şekil 16.13a). Poliovirüs genomu 7440 baz uzunluğunda doğrusal tek zincirli RNA molekülünden oluşur (oooTablo 9.1). Viral RNA'nın 5' ucunda, VPg protein olarak adlandırılan RNA'ya kovalent olarak bağlı bir protein vardır. RNA'nın 3' ucunda poly-A kuyruğu vardır. Poliovirüs replikasyon aşamaları Şekil 16.13b'de gösterilmiştir. Virüsün RNA genomu, mRNA olarak da kullanılır. İlginç olan bu RNA'nın, ökaryotlardaki translasyonda normalde gerekli olan (eeçsKısım 14.8), cap taşımamasıdır. Poliovirüs RNA'nın 5' ucunda, birkaç stem-loop yapısı oluşturacak şekilde katlanmalar yapmış uzun bir dizi bulunur. VPg proteini ve stem-loop yapısı cap bağlanma kompleksi gibi hareket ederek poliovirüs mRNA'nın ribozoma bağlanmasını sağlar. Viral RNA monosistroniktir ancak poliprotein olarak adlandırılan tek bir protein halinde virüsün tüm proteinlerini kodlar. Bu daha sonra tek proteinlere parçalanır. Tüm poliovirüs replikasyon işlemi hücre sitoplazmasmda gerçekleşir. Enfeksiyonun başlangıcında, poliovirüs virionu hassas bir hücrenin yüzeyindeki özel bir reseptöre tutunur ve hücreye girer. Hücre içinde ilk olarak virüs partikülü kapsitinden ayrılır ve serbest RNA ribozomlara bağlanır. Viral RNA daha sonra, tek bir başlama kodonundan büyük bir poliprotein halinde translate edilir. Bu büyük protein (yaklaşık 2200 amino asitli) daha sonra (parçalanma ara ürünlerini içeren) virionun dört farklı yapısal proteininin dahil olduğu yaklaşık 20 küçük proteine parçalanır. Bunların içinde RNA'ya bağlı VPg proteini, hem eksi hem de artı RNA'nın sentezinden sorumlu RNA polimeraz (RNA replikaz) ve poliproteinin parçalanmasını sağlayan en az bir virüs şifreli pro-
516 • Bölüm 16 • Viral Çeşitlilik
5'
Poliovirüs genomu
î î
Yeni + zincirlerin sentezi
Eksi zincirin sentezi
<_ .
Polia
vpg
Translasyon
Poliprotein
/ I'\YUY I Büyük proteini parçalayan, proteazlar
Aktif gen ürünleri
' % j Yapısal kapsit proteinleri
L
j
Proteaz
I
RNA replikaz
(b)
• Şekil 16.13 Poliovirüs. (a) Poliovirüs virionlannın elektron difraksiyon analizini temel alan bir bilgisayar modeli. Çeşitli yapısal proteinler farklı renklerde gösterildi, (b) Poliovirüs replikasyonu. Virüsün tek zincirli RNA'sı mRNA olarak, büyük bir protein üretmek üzere, direk translate edilir. Bu protein, yapısal kapsit proteinleri ve poliovirüs RNA'mn replikasyonunu gerçekleştiren RNA polimerazı kapsayan aktif viral proteinleri üretmek üzere parçalamr. Kapsit proteinleri ve RNA'dan poliovirüs oluşumu bunu izler. Sonradan parçalanacak bir poliprotein üretmek üzere mRNA'nın translasyonu diğer virüslerde de kullanılan bir yoldur (Kısım 16.15'e bakımz).
teaz da bulunur. Postranslasyonal parçalanma olarak
adlandırılan bu parçalanma işlemi, hayvan hücrelerindeki normal hücre metabolizmasında olduğu gibi hayvan virüslerinin pek çoğunda da olur. Poliovirüs RNA Replikasyonu
Viral RNA replikasyonu enfeksiyondan hemen sonra başlar ve yeni sentezlenen RNA replikazla katalizlenir. Bu replikaz artı anlamlı viral RNA'yı komplementeri eksi anlamlı RNA'ya transkribe eder. Bu eksi zincir daha sonra artı zincirli viral genomların sürekli transkripsiyonu için kalıp olarak kullanılır. Bu transkripsiyon virüse özgü RNA replikazla katalizlenir. Artı zincirli genomların bir kısmı tekrar eksi zincirlere transkribe edilir ve bu olay sonunda 1000 kadar eksi zincir hücrede bulunabilir. Bu eksi zincirlerden bir milyon artı zincir oluşturulabilir. Hem artı hem de eksi zincirler, transkripsiyon için bir primer olarak görev gören küçük VPg proteinine (sadece 22 amino asit uzunluğunda) kovalent olarak bağlanır. Poliovirüs çoğalması bir kez başladığında, konukçu RNA ve protein sentezi engellenir. Konukçu protein sentezi, cap'lı mRNA'ların translasyonu (
munun 5' ucunun daha önce bahsedilen sekonder yapısı nedeniyle bu sınırlamadan etkilenmez. Coronavirüsler ve SARS
Coronavirüsler tek zincirli artı anlamlı RNA virüsleridir. Poliovirüsler gibi sitoplazmada replike olurlar ancak daha büyük olmaları ve replikasyon detayları yönünden poliovirüslerden farklıdırlar. Coronavirüsler insanlarda ve diğer hayvanlarda soğuk algınlığının yaklaşık %15'ini kapsayan solunum enfeksiyonlarına sebep olurlar (öo^Kısım 26.8). 2003'de bir coronavirüs, insanlarda alt solunum sisteminde öldürücü bir zatürre olan, akut solunum yetmezliği sendromu (severe acute respi-
ratory syndrome, SARS)'na sebep olmuştur (etx$ Kısım 25.8). Coronavirüs virionları kılıflı, az çok yuvarlak, 60-220 nm çapında ve yüzeylerinde ucu kalın çubuk şeklinde glikoprotein uzantıları içerir. Bu uzantılar virüse taç takmış gibi bir görüntü verir (corona Latince taç anlamına gelmektedir) (Şekil 16.14«), (aynı zamanda Şekil 25.9). Coronavirüs genomları bilinen RNA virüslerinin en büyükleri olduğu için oldukça değerlidir (27-31 kb; SARS virüsü yaklaşık 29,700 nükleotit uzunluğundadır). Coronavirüs genomu 5' metilli cap ve 3' poly-A kuyruğuna sahiptir ve hayvanlarda direk mRNA olarak fonksiyon gösterebilir. Ancak, viral prote-
16.9 • Negatif Zincirli RNA'ya Sahip Hayvan Virüsleri: Rabies (Kuduz), Influenza (Grip) ve Benzeri Virüsler • 517 yönünden poliovirüslerden farklıdır. Oysa, poliovirüsler gibi coronavirüsler de çocuk felcinde nadir olarak görülen ölümcül akut enfeksiyon gibi bazı hastalıklara da sebep olabilirler. SARS'daki ölüm oranları 60 yaşın altındakilerde %13,60 yaşın üstündekilerde ise yaklaşık % 45 kadar değişmektedir («»»Kısım 25.8). 16.8 Kavramların Çözden Geçirilmesi
/ Cap
\ Replikaz geni
I
Enfeksiyon, genomun serbest kalışı 3' AAAA Replikaz geninin translasyonu -Replikaz
Poliovirüs gibi küçük RNA virüslerinde, viral RNA direk olarak, virüs oluşumu ve nükleik asit çoğalması için gerekli pek çok küçük protein haline enzimatik olarak parçalanacak uzun bir poliprotein üretecek şekilde translate edilir. Coronavirüs, bazı açılardan poliovirüse benzeyen ancak bazı replikasyon özellikleri farklı olan, büyük tek zincirli RNA virüsüdür. • Konukçu RNA çekirdekte sentezlenmek zorunda iken, poliovirüs RNA nasıl sitoplazmada sentezlenebilir? • Poliovirüs ve SARS virüsünde, protein sentezi ve genom replikasyonu aşamalarındaki benzerlikler ve farklılıklar nelerdir?
(-) zincirin sentezi 5'
Monosistronik mRNA'ların sentezi
N
Genom kopyalarının sentezi
3
,
•••P'AAAA •••• 5' 3' Translasyonla viral proteinlerin oluşumu
•5'•Mm M M H A AAA3'
••İMİ•••••••AAAA
Viral oluşum (b)
* Şekil 16.14 Coronavirüsler. (a) Bir coronavirüsün elektron mikrograü. (b) Coronavirüs replikasyon aşamalan. Mesajcı ENA'nın kodladığı viral proteinler, viral genomun transkripsiyonu ile üretilen replikaz enzimiyle yapılan (-) zincir transkripsiyonu ile üretilir. inlerin çoğu genomik RNA translasyonu ile yapılmaz. Bunun yerine enfeksiyonda, genomun sadece bir kısmı, bir viral RNA replikaz üretmek üzere translate edilir. Replikaz tüm genomun negatif anlamlı bir zincirini üretmek üzere kalıp olarak genomik RNA'yı kullanır ve daha sonra bundan monosistronik mRNA'lar transkribe edilir. Daha sonra bunlar viral proteinler üretmek üzere translate edilir. Genomların üretimi negatif zincirli RNA'nin transkripsiyonuyla da yapılır. Viral kapsit oluşumu ve paketlenme, ökaryotlardaki önemli bir salgı organeli olan Golgi aygıtında olur (£**» Kısım 14.5), paketlenme tamamlanınca virionlar hücre yüzeyine bırakılır. Coronavirüs, virion büyüklüğü, genom büyüklüğü ve cap içerme, VPg proteininin olmaması ve poliprotein üretimi ve parçalanmasının olmaması
Negatif Zincirli RNA'ya Sahip Hayvan Virüsleri: Rabies (Kuduz), Influenza (Grip) ve Benzeri Virüsler Poliovirüs ve coronavirüs replikasyonu, artı zincirli genomun, yeni artı zincirlerin sentezleneceği eksi bir zincir çevrilmesine ihtiyaç duymaktadır. Ancak, RNA hayvan virüslerinin çoğunda genomik RNA eksi anlamlı RNA'dır. Bunlar bu nedenle negatif zincirli virüsler olarak adlandırılırlar. Bu bölümde, rabies virüsünü içeren rhabdovirüsler ve influenza virüsünü içeren orthomyxovirüsler olmak üzere iki önemli örneği tartışacağız. Önemli bir enfektif hastalığa sebep olan insan patojeni Ebola virüsü (octoKısım 25.10), negatif zincirli bir RNA virüsüdür. Bilinen negatif zincirli RNA bakteriyofajları ya da arke virüsü bulunmamaktadır. Rhabdovirüsler: Genel Özellikleri Patojen negatif zincirli RNA virüslerinin en önemlisi, insanlarda ve hayvanlarda kuduz hastalığına sebep olan rabies virüsüdür. Dünyada, her yıl insanlarda (çoğu ölümcül) 30,000 üstünde kuduz vakası, evcil ve yabani hayvanlarda ise sayısız kuduz olayı görülür (oocdKısım 27.1). Rabies virüsü bir rhabdovirüs olarak adlandırılır, "çubuk" anlamına gelen rhabdo kelimesi, virüs partikülünün şeklini gösterir. Diğer bir çok çalışılan rhabdovirüs, sığır, domuz, at ve bazen insanlarda vesicular stomatitis hastalığına sebep olan bir virüs olan vesicular stomatitis virüsüdür (VSV) (Şekil 16.15 •). Potato yellom dzuarf virüs gibi rhabdovirüslerin çoğu, hem böcekleri hem de bitkileri enfekte ederek önemli zirai problemlere sebep olurlar.
518 • Bölüm 16 • Viral Çeşitlilik
Rhabdovirüslerin Oluşumu
• Şekil 16.İS Rhabdovirüsün (veziküler stomatitis virüsü) elektron mikrografı. Partikül yaklaşık 65 nm çapındadır. Rhabdovirüsler rabies (kuduz) virüsünü de içerir. Kuduz hastalığı Kısım 27.l'de tartışıldı.
Rhabdovirüsler kılıflı virüslerdir, nükleokapsitlerinin çevresi yoğun ve kompleks bir lipit tabakasıyla çevrilidir. Rhabdovirüslerde virion, kurşun şeklinde, yaklaşık 70 nm çapında ve 175 nm uzunluğundadır (Şekil 16.15). Helikal simetri gösteren nükleokapsit, virüs ağırlığının sadece küçük bir kısmını oluşturur (virionun yaklaşık % 2-3'ü RNA'dır).
Viral mRNA'ların translasyonu viral kapsit proteinlerinin sentezine sebep olur. Kılıflı virüslerin paketlenmesi çıplak bir virionun paketlenmesinden daha komplekstir. Nükleokapsit proteinleri ve kılıf proteinleri olmak üzere iki çeşit kapsit proteini oluşturulur. Nükleokapsit viral RNA çevresinde nükleokapsit protein moleküllerinin toplanmasıyla ilk olarak oluşur. Kılıf proteinlerinin amino uçlarında, hidrofobik amino asit lider dizileri bulunur (Kısım 7.16). Bu proteinler sentezlendiğinde şeker kalıntıları, glikoproteinler oluşturmak üzere ilave edilir. Bu glikoproteinler, karakteristlik membrana bağlı proteinlerdir, lider dizilerinin molekülden uzaklaştırıldığı sitoplazmik zara göç ederler ve oradaki konukçu membran proteinleri ile yer değiştirirler. Nükleokapsitler daha sonra virüse özgü glikoproteinlerin bulunduğu sitoplazmik zara, büyük bir özgüllükle viral glikoproteinleri tanıyarak, giderler. Nükleokapsitler glikoproteinlerin bulunduğu yere gelince, glikoproteinlerle çevrilerek tomurcuklanarak hücreden ayrılırlar. Bu olay ortada bir nükleokapsit bulunan, virüs tarafından kodlanan membran proteinleri taşıyan ve konukçu hücre lipit membram ile çevrili bir kılıfa sahip virion oluşumu ile sonuçlanır. Tomurcuklanma işlemi hücrenin kendisine belirgin bir zarar vermez, belli periyotlarla bu şekilde virion salınımı devam edebilir. Sonuçta konukçu zarar görür, ancak virüs üretiminden değil başka faktörler nedeniyle bu zarar meydana gelir.
Rhabdovirüslerin Replikasyonu
Rhabdovirüs virionu enfeksiyon işlemi için gerekli
Viral RNA polimeraz
bazı enzimleri içerir. RNA'ya bağlı RNA polimeraz
(bir RNA replikaz tipidir) bunlardan biridir. Kısım 9.7'de tartışıldığı gibi, böyle bir enzimin bulunması, negatif zincirli virüslerin genomu direk olarak translate edilemediği için, zorunludur. Genom ilk olarak artı zincire çevrilmelidir, ancak bir RNA kalıbından RNA'yı transkribe edecek konukçu enzimleri mevcut değildir. Rhabdovirüs RNA'sı iki çeşit RNA oluşturacak şekilde sitoplazmada transkribe edilir (Şekil 16.16»). İlki virüsün yapısal genlerini (örneğin, VSV beş gene sahiptir) kodlayan bir grup mRNA'dır. Her bir mRNA monosistroniktir, tek bir protein kodlar. İkinci tip RNA, viral genomun tam bir kopyası olan, komplementer artı anlamlı RNA'dır (VSV genomu 11,162 nükleotit uzunluğundadır). Bu uzun artı zincirli RNA'lar, virion üremesi için negatif zincirli genomik RNA moleküllerinin sentezi için kalıp olarak kullanılır. İlk olarak viral RNA polimerazı kodlayan mRNA ilk transkripsiyon işlemiyle yapılır. Bu şekilde hem mRNA hem de genomik RNA kalıbı olacak bir çok artı zincirli RNA molekülünün oluşumunu sağlayan viral RNA polimerazın, pek çok kopyasının sentezi gerçekleşir (Şekil 16.16).
- zincirli atasal RNA
mRNA'lar (+ anlamlı)
1Translasyon I (konukçu enzimlerin
T
_
Proteinler
+ zincirli RNA
- zincirli RNA nesli
kullanımı)
-I
Kılıf
Virüs nesli
• Şekil 16.16 Negatif zincirli bir RNA virüsünün çoğalması sırasında gerçekleşen olaylar. Virionda taşınan viral RNA polimerazın önemine dikkat ediniz. Bu olay, hayvan hücrelerinde bir RNA kalıbından RNA yapılamadığı için oldukça kritiktir.
16.9 • Negatif Zincirli RNA'ya Sahip Hayvan Virüsleri: Rabies (Kuduz), Influenza (Crip) ve Benzeri Virüsler • 519
Influenza ve Diğer Orthotnyxovirüsler
Negatif zincirli virüslerin diğer bir grubu, önemli bir insan patojeni olan influenza virüsünü içeren orthomyxovirüslerdir. Myxo kelimesi bu virüslerin, hücre yüzeylerinin mukus ya da slim tabakalarına bağlanabildiklerini gösterir, influenza virüsünde bu mukus tabaka, bu virüslerin ilk olarak solunum yoluyla yayılması nedeniyle, solunum sisteminin mukuz membranıdır (o^Kısım 26.8). Ortho kelimesi bu grubu, paramyxovirüs grubu gibi negatif zincirli diğer virüs gruplarından ayırır. Kabakulak ve kızamık virüsleri gibi (Kısım 26.7) önemli insan patojenlerini içeren paramyxovirüsler, rhabdovirüslerin moleküler biyolojilerine benzer özellikler gösterirler. Orthomyxovirüsler, dünyada milyonlarca insanın ölümüne sebep olan 1918 influenza pandemisi sırasında başlayıp sonrasında devam ederek, uzun yıllar geniş bir şekilde çalışılmıştır (oooKısım 26.8). Orthomyxovirüsler, bir kaç ayrı parça halinde virionlarında viral RNA bulunan, kılıflı virüslerdir. Orthomyxovirüslerin genomu, bu nedenle parçalı olarak bilinir, influenza A virüsünde genom, 890'dan 2341 nükleotite kadar molekül büyüklüğü değişen sekiz doğrusal tek zincirli parça halindedir. Yaklaşık 6-9 nm çapında ve 60 nm uzunluğunda olan influenza virüs nükleokapsiti, helikal simetri gösterir. Bu nükleokapsit, konukçudan oluşan ve virüse özgü pek çok protein taşıyan lipit bir kılıf içinde bulunur (Şekil 16.17a«). influenza virüsü tomurcuklanarak hücreden ayrıldığı için, virüs belirgin bir şekle sahip değildir ve polimorfik olduğu söylenir (Şekil 16.17a). Konukçu hücre yüzeyi ile ilişki kurabilen kılıfın dışında proteinler bulunur. Bunlardan biri, kırmızı kan hücrelerinin aglutinasyonuna (kümeleşmesine) sebep olduğu için, hemaglutinin olarak adlandırılır. Kırmızı kan hücreleri virüsün normalde enfekte ettiği bir hücre tipi değildir. Ancak bu hücrelerin yüzeyinde, solunum sisteminde bulunan mukus membranlı hücrelerin yüzeyinde de bulunan sialik asit bulunur. Bu nedenle kırmızı kan hücreleri sadece aglutinasyon aktivitesinin denenmesi için uygun bir hücre tipidir, influenza virüs hemaglutininin önemli bir özelliği, bu hemaglutinine karşı direk olarak oluşan antikorların, virüsün hücreyi enfekte etmesini engellemesidir. Bu nedenle hemaglutinine doğru yöneltilen antikorlar virüsü nötralize eder, bu da immünizasyon işleminde influenza için bağışıklık oluşturan bir mekanizmadır (c**s Kısım 22.13 ve 26.19). influenza virüs yüzeyindeki ikinci bir protein tipi nöraminidaz olarak adlandırılan bir enzimdir (ocs^Şekil 26.19). Nöraminidaz, nöraminik asitin bir derivatı olan, sitoplazmik zarın sialik asit bileşenini parçalar. Nöraminidaz virüs oluşum işleminde önemli bir görev görür. Konukçu membranmdaki sialik asitin zarar görmesi, virüs oluşumunu bloke eder ya da olgun virüs partikülü halinde yapılaşmayı önler.
Nöraminidaz Hemaglutinin Viral RNA polimeraz
RNA endonükleaz
RNA genomu (sekiz parçalı) §•% (b)
• Şekil 16.17 influenza virüsü, (a) İnsan influenza virionlarmın elektron mikrografı. (b) Şema seğmentli genomu da içeren bazı viral yapılan gösteriyor. Grip hastalığı Kısım 26.8'de tartışıldı.
Influenza Virüs Replikasyonu
Nöraminidaza ilaveten, influenza virionları, negatif zincirli genomun pozitif zincirliye çevrilmesini sağlayan (rhabdovirüslerde tartışıldığı gibi) RNA'ya bağlı RNA polimeraz (RNA replikaz) ve
konukçunun cap'lı öncü mRNA'larmdan bir primer kesen enzim olan RNA endonükleaz olmak üzere iki anahtar enzim taşır. Virion hücreye girince, kılıftan nükleokapsit ayrılmaya başlar ve daha sonra çekirdeğe gider. Viral nükleik asit replikasyonu çekirdekte olur. Kapsitin ayrılması virüs RNA polimerazm aktivitesi sonucu olur. Mesajcı RNA molekülleri, viral endonükleazla yeni sentezlenen cap'lı hücresel mRNA'ların 5' uçlarından kesilen oligonükleotit primerler kullanılarak, virüs RNA'sından çekirdekte transkribe edilir. Böylece, viral mRNA'lara 5' cap takılmış olur. Viral mRNA'lara poly-A kuyruğu ilave edilir ve virüs mRNA molekülleri translasyon için sitoplazmaya hareket eder. Her ne kadar
520 • Bölüm 16 • Vira! Çeşitlilik
influenza virüs RNA'sı çekirdekte replike olsa da, tüm viral proteinler sitoplazmada sentezlenir. On virüs proteini, virüs genomunun sekiz parçasından kodlanır. Altı parçanın her birinden tek bir protein kodlayan mRNA'lar transkribe edilir, kalan ikişer parçanın her birinden ise iki protein kodlayan mRNA'lar transkribe edilir. Son olay, ökaryotik ribozomların başlama kodonu olarak sadece mRNA'nın 5' ucuna yakın olan AUG kodonunu tipik olarak tanımaları nedeniyle, prokaryotlarda olduğu gibi gerçek polisistronik mRNA'lar kullanılarak yapılmaz (öOoKısım 7.16). Bundan dolayı bir RNA'dan sadece bir protein yapılabilir. Bu iki parçadan transkribe edilen orijinal büyüklükteki uzun mRNA'ların her biri bir protein verecek şekilde translate edilir. Ancak her iki durumda da ilave bir protein, konukçu RNA splicing mekanizmasıyla mesajın daha sonra tekrar işlenmesiyle translate edilir. Bu olay RNA virüslerinin, çakışan genler gibi (Kısım 16.2), küçük bir genomun kodlama potansiyelini nasıl arttırabileceklerini gösteren diğer bir örnektir. Sentezlenen proteinlerin bazısı influenza virüs RNA replikasyonu için gereklidir, diğerleri ise virionun yapısal proteinleridir. Genomik RNA sentez stratejisinin tümü, eksi zincirli viral genomun oluşumu için artı zincirli kalıpların oluşumuyla sonuçlanan ilk transkripsiyon dahil, rhabdovirüslere benzemektedir. Tam bir kılıflı virionun oluşumu, rhabdovirüslerde tanımlandığı gibi, tomurcuklanma işlemiyle olur. influenza ve Antijenik kayma/sapma influenza virüsünün parçalı genomu, önemli bir olaya neden olur. influenza virüsü ve bu familyanın diğer virüsleri, aynı hücreyi enfekte eden genetik olarak farklı iki ayrı virüs türünün RNA genom parçalarının yeniden düzenlenmesiyle oluşan, antijenik sapma (shift) olarak adlandırılan bir özellik gösterirler. Bunun sonucunda orijinal virüslerden oldukça değişik yüzey proteinleri içeren virionlar oluşur. Yüzey proteinleri, yapay anlamda (a°&Kısım 22.13) ya da doğal enfeksiyonda immünizasyonun sonucu olarak oluşturulacak antikorların önemli hedefleridir. Ancak antijenik sapma oluştuğunda, influenza virüsünün bir ya da diğer türüne karşı oluşan ilk immünite, genetik olarak yeni virüslerle enfeksiyonu önlemede yetersiz kalır. Antijenik sapmanın, virüsün yeni formuna karşı popülasyonda immünite oluşmadığı için, influenzanm pandemi ve epidemisine neden olacağı düşünülür (««aKısım 26.8). Antijenik sapma antijenik kayma (drift)'dan farklıdır. Antijenik kaymada, influenza virüs virionlarının yüzeyindeki nöraminidaz ve hemaglutinin proteinlerinin yapısı, genellikle anlaşılması zor bir şekilde bu proteinleri kodlayan genlerdeki mutasyonla değişir. Bu değişiklikler influenza virüsünün yüzey özelliklerini değiştirir, antikorlar önceki virüsü uzun süre tanıyamaz ya da daha az etkili olur. Böylece, etkili immünitenin oluşma-
sı için, yeni antikorların üretilmesi gerekir. Bu da neden influenza aşılarının bir yıldan daha fazla nadiren koruma sağladığını gösteren önemli bir sonuçtur (
Neden negatif zincirli virüslerin virionlarmda enzim taşımaları gereklidir? • Parçalı genom nedir? • Antijenik sapma ve antijenik kayma arasındaki farklar nelerdir?
Çift Zincirli RNA Virüsleri:
16.10 Reovirüsler
Reovirüsler çift zincirli RNA genomlarına sahip hayvan virüslerinin önemli bir grubudur. Tipik bir reovirüs olan Rotavirüs, 6-24 aylık bebeklerde görülen ishalin en yaygın etkenidir. Solunum enfeksiyonlarına sebep olan reovirüsler de bilinir, bazıları ise bitkileri enfekte eder. Biz ilk olarak reovirüsler ile yakın ilişkili olan bakteriyofaj <j>6 virüsünü inceledik (Kısım 16.1'e bakınız). Reovirüs virionları 60-80 nm çapında, ikozahedral simetrili çift duvarlı kılıfsız bir nükleokapsitten oluşur (Şekil 16.18). Bu çift zincirli RNA virüslerinin virionları, mRNA ve yeni RNA genomlarının sentezlenmesi için gerekli, virüs tarafından kodlanan enzimler içerirler. Reovirüslerin Replikasyonu Reovirüslerin genomu, 10-12 molekül doğrusal çift zincirli RNA parçası halinde bulunur. Replikasyon konukçu sitoplazmasında olur. Çift zincirli RNA mRNA olarak görev görmez. Reovirüs replikasyonunda ilk aşamada, virüs tarafından kodlanan RNA'ya bağlı RNA polimeraz enzimi ile, eksi zincir kalıp olarak kullanılarak artı zincirli mRNA transkribe edilir. Viral mRNA cap takılıp, viral enzimlerle metillendikten sonra translate edilir. Genellikle, genomdaki her RNA molekülü tek bir protein kodlar, bazı durumlarda son ürünü vermek üzere oluşan proteinde parçalanma da olur. Ancak, üretilen mRNA'ların biri iki protein kodlar, ama RNA'nm kendisi bu işlemi gerçekleştiremez. Bunun yerine ribozom, bu mesajda ilk genin başlama kodonunu bazen atlayıp, ikinci genin başlama kodonuna bağlanabilir. Bundan dolayı, genelde ökaryotik ribozomların mRNA'daki ilk AUG kodondan başlaması olayı, bu olayda gerçekleşmez.
16.11 • Çift Zincirli DNA'ya Sahip Hayvan Virüslerinin Replikasyonu • 521
16.10 Kavramların Gözden Geçirilmesi Reovirüsler parçalı çift zincirli RNA genomu içerirler. Negatif zincirli RNA virüsleri gibi reovirüsler, virionlarmda RNA'ya bağlı RNA polimeraz enzimini taşırlar. •
Reovirüs genom replikasyonumın, influenza virüsüne benzeyen ve farklı olan tarafları nelerdir?
Çift Zincirli DNA'ya Sahip Hayvan
16.11 Virüslerinin Replikasyonu
Pek çok çift zincirli DNA hayvan virüsü vardır, bunların bazısı insanlara patojendir. Bu grupta polyoma ve papilloma virüsler, herpesvirüsler, pox virüsler ve adenovirüsler bulunur. Sitoplazmada replike olan pox virüsler hariç, hepsinin genomları çekirdekte replike olur. Bu ve ileriki bölümlerde, bu grup virüslerin her birinin replikasyonunu tartışacağız. Polyomavirüsler: SV40
• Şekil 16.18 Çift zincirli RNA virüsleri: Reovirüsler. (a) Reovirüs virionlanru gösteren elektron mikrograt (her biri yaklaşık 70 um çapında), (b) Reovirüs virionunun, dondurularak suyu uçurulmuş virion elektron mikrograflanndan hesaplanan üç boyutlu yapısı.
Enfeksiyonun başlangıcında, reovirüs virionu hücresel bir reseptör proteinine bağlanır. Tutunma bir kez gerçekleştiğinde virüs hücreye girer ve normalde imha edileceği yer olan, lizozomlara gider (c**»Kısım 14.5). Ancak virüs partikülünün dış kabuğu, lizozom içinde lizozomal enzimlerle parçalanma ve iki proteinin uzaklaştırılmasıyla, değiştirilir. Bu kapsitin uzaklaştırılması işlemi viral RNA polimerazı aktive eder ve bundan sonra virüs replikasyon işlemi başlar. Reovirüs replikasyonu, hücrede zarar görmeden kalmış, viral core'un hücre içi karşılığı olan ve subviral partikül olarak adlandırılan bir yapı içinde olur. Tek zincirli pozitif anlamlı 10 cap'lı RNA'nın her biri, RNA'nın sentezlendiği yapı içinde çift zincirli hale getirilir. Tek zincirli artı RNA'lar, çift zincirli virüs genomik RNA'larını oluşturmak üzere, karşıt zincirleri olan eksi anlamlı RNA zinirlerinin sentezinde kalıp olarak kullanılır. Yeterli viral kapsit proteininin bulunması durumunda gerçekleşen kapsit oluşumu sonrasında, olgun virionlar oluşturulur ve hücre lizizi ile dışarı bırakılır.
Polyomavirüs grubundaki bazı virüsler hayvanlarda tümör oluşumunu teşvik ederler, gerçekte oma eki tümör anlamındadır. Bu DNA tümör virüslerinin biri ilk olarak maymunlardan izole edildiği için simian (insana benzer maymun) virüs 40 ya da SV40 olarak adlandırılmıştır. SV40 virüsü, genetik mühendisliği teknikleriyle çalışılan ilk genetik elementtir ve ökaryotik hücrelerdeki genlerin hareketi için bir vektör olarak geniş bir kullanım alanına sahiptir (eo&Kısım 31.4). SV40 virionu, 45 nm çapında, 72 protein alt ünitesi içeren ikozahedral kafalı ve kılıfsızdır. RNA virüslerinden farklı olarak, virionlarmda enzim taşımazlar. SV40 genomu, 5243 bp'lik çift zincirli bir DNA molekülünden oluşur. DNA halkasaldır (Şekil 16.19 •) ve virionda süperheliks oluşturacak şekilde bulunur. SV40'm baz dizisi belirlenmiştir ve genetik haritası Şekil 16.20»'de gösterilmiştir. SV40 nükleik asiti çekirdekte replike olur, proteinleri ise sitoplazmada sentezlenir. Virionun son paketlenme aşaması çekirdekte olur. Bu virüslerin replikasyonu, ilk ve son olmak üzere iki farklı aşamaya ayrılabilir, tik aşamada, viral DNA'nın ilk bölgesi transkribe olur (Şekil 16.20). İlk transkript olan tek bir RNA molekülü, hücresel RNA polimerazla yapılır, ancak bundan büyük ve küçük olmak üzere iki mRNA yapılır. İntronlar SV40 genomunda bulunur, daha sonra ilk RNA transkribinden çıkarılırlar. Sitoplazmada, mRNA'lara cap takılır ve iki protein oluşacak şekilde translate edilir. Bu proteinlerin biri, T antijeni, replikasyon orjini olan atasal DNA'daki bölgeye bağlanır; bu da viral genom sentezini başlatır. SV40 genomu, kendi DNA polimerazını kodlayamayacak kadar küçüktür, bu nedenle de konukçu DNA polimerazlarmı kullanır. Replikasyon tek bir replikasyon orjininden başlayarak her iki
522 • Bölüm 16 • Viral Çeşitlilik
• Şekil 16.19 Polyomavirüsler. Bir tümör virüsünün açık halkasal (süper heliks oluşturmamış) DNA'sının elektron mikrografı. Her bir halkanın çevre uzunluğu yaklaşık 1.5 |jm'dir. Polyomavirüs DNA, konukçu DNA polimerazı kullanarak hayvan hücrelerinde replike olur.
yönde gerçekleşir (o»*sŞekil 7.16). Bu işlem, konukçu hücre DNA replikasyonu için tanımlanmış olan aynı olayları kapsar (öOsKısım 7.5 ve 7.6). Son SV40 mRNA molekülleri, ilk mRNA sentezi için kullanılan komplementer ip kullanılarak sentezlenir (Şekil 16.20'ye bakınız). Transkripsiyon replikasyon orjinine yakın bir promotorda başlar. Bu son RNA, daha sonra VP1, VP2 ve VP3 olmak üzere üç kapsit proteininden sorumlu mRNA'ları üretmek üzere, splice edilir, cap ve poliadenillenir. Bu proteinleri kodlayan genlerin çakışması ilginçtir (Şekil 16.20), bu özellik bu bölümde pek çok kez görülmüştür (Kısım 16.1, 16.2 ve 16.4'e bakınız). SV40 kapsit protein mRNA'ları daha sonra sitoplazmaya geçer ve viral kapsit proteinleri olarak
translate edilir. Sonra bu proteinler virion paketlenmesinin olacağı çekirdeğe geri dönerler. Yeni SV40 virionlarmın salınması hücre lizizi ile gerçekleşir. Polyomavirüslerin bazısı kansere sebep olur. Polyomavirüs grubundaki bir virüs konukçu bir hücreyi enfekte ettiğinde, konukçu hücre tipine bağlı olarak iki replikasyon tipinden biri oluşabilir. Bazı konukçu hücre tiplerinde, üretken (permissive) hücreler olarak bilinir, virüs enfeksiyonu, yeni virionların oluşumu ve konukçu hücrenin lizizi ile sonuçlanır. Üretken olmayan diğer konukçu hücre tiplerinde ise çoğalma olmaz. Bunun yerine virüs DNA'sı, bir profaja benzer şekilde (Kısım 9.10), konukçu DNA'ya bağlanır, bu işlem hücreleri genetik olarak değiştirir (Şekil 16.21 •). Bu hücreler çoğalma kontrol sistemlerini kaybederler ve transformasyon olarak adlandırılan bir işlemle tümör hücrelerine çevrilirler (o°öŞekil 9.24). Tümör oluşturan retrovirüslerdeki gibi (««sKısım 9.13 ve 16.15), özel polyomavirüs genlerinin yorumlanması, hücreleri transforme hale getirir (Şekil 16.21).
16.11 Kavramların Gözden Geçirilmesi SV40 gibi çift zincirli DNA hayvan virüslerinin çoğu çekirdekte replike olur. Küçük bir genoma sahip olan SV40, genetik kodlama potansiyelim arttırmak için çakışan gen stratejisini kullanır. Bu virüslerin bazısı kansere sebep olur.
Tümör virüs DNA'sı
Konukçu DNA'sı
Konukçu DNA'ya bağlanan viral DNA
Tümör virüs mRNA'sı
O
I I i
Enfeksiyon
Katılma
Transkripsiyon
Translasyon
Viral proteinler hücreyi tümör haline çevirir
Büyük T intron
• Şekil 16.20 Polyomavirüs SV40'in genetik haritası. VP1, VP2 ve VP3, SV40 kapsitini oluşturan üç proteini kodlayan genlerdir. Oklar transkripsiyon yönünü gösterir. VP1, VP2 ve VP3 kodlayan genlerdeki çakışmaya dikkat ediniz.
• Şekil 16.21 SV40 gibi bir polyomavirüs tarafından hücre transformasyonunda gerçekleşen moleküler olayların genel akış şeması. Viral DNA'nın ya tümü ya da bir kısmı konukçu hücre DNA'sına bağlanır. Hücre transformasyonunu kodlayan viral genler transkribe olur ve sitoplazmaya aktanlan viral mENA molekülleri oluşturulur. Bunlar, konukçu hücreleri tümör hücrelerine çevirebilen fonksiyonları kodlayan transformasyon yapan proteinleri oluşturmak üzere translate edilir (Şekil 9.24).
16 12 • Çift Zincirli DNA Virüsleri: Hcrpesvirüsler • 523
SV40 benzeri bir virüs, influenza virüsünde tartışıldığı gibi, virionda enzim taşımaya neden ihtiyaç duymaz? SV40'da, nasıl bir mRNA'dan daha çok transkript elde edilebilir?
16.12
Çift Zincirli DNA Virüsleri: Herpesvirüsler
Herpesvirüsler, çift zincirli DNA virüslerinin büyük bir grubudur. Bölüm 26'da tartışılan uçuk, genital uçuk, su çiçeği, zona ve enfektif öpüşme hastalığını kapsayan, insanlar ve hayvanlarda pek çok hastalığa sebep olurlar. Herpesvirüslerin ilginç özelliklerinden biri, sadece stres şartları altında aktif olacak şekilde, uzun süre vücutta latent (gizli) kalma yetenekleridir. Hem uçuk ve genital uçuğa sebep olan herpes simplex virüsü, hem de su çiçeği ve zonaya sebep olan varicella-zoster virüs, deri enfeksiyonlarına periyodik olarak sebep olacak şekilde, sensör ganglianın nöronlarında latent kalabilir. Herpesvirüslerin önemli bir grubu, kanserin klinik formu olan tümöre sebep olur. Örneğin, Epstein-Barr virüs, Orta Afrika ve Yeni Gine'deki çocuklarda yaygın olarak görülen bir tümör olan Burkitt's lymphoma'ya sebep olur. Burkitt's lymphoma, virüs enfeksiyonuna bağlı olarak oluşan ilk bilinen insan kanserleri arasındadır. Epstein-Barr virüs, enfektif öpüşme hastalığı olarak adlandırılan, insanlarda kötü huylu olmayan genel bir rahatsızlığa da sebep olabilir. Herpesvirüsler: Genel Özellikleri Herpesvirüs partikülü, yapısal olarak komplekstir, dört farklı morfolojik üniteden oluşur. Herpes simplex tip I yaklaşık 150 nm çapında kılıflı bir virüsdür (Şekil 16.22a»); virüsün core olarak adlandırılan orta kısmında doğrusal çift zincirli DNA bulunur. Herpesvirüs nükleokapsiti, ikozahedral simetrilidir ve herbiri farklı protein içeren 162 kapsomerden oluşur. Nükleokapsit dışında, tegument olarak adlandırılan, sadece herpesvirüslerde bulunan lifli bir yapıda olan şekilsiz bir tabaka vardır. Tegument çevresinde, dış kısmında çok sayıda küçük uzantı içeren kılıf vardır. Çok fazla miktarda protein virionda bulunur, ancak bunların tümü karakterize edilmemiştir. Herpes simplex tip I virüs genomu, en az 84 ayrı polipeptid kodlayan, 152,260 bp'lik (SV40 genomundan yaklaşık 30 kez daha büyük) büyük bir doğrusal çift zincirli DNA molekülünden oluşur. Herpesvirüs Enfeksiyon ve Replikasyonu
Herpesvirüs enfeksiyonu, spesifik hücre reseptörlerine virüsün tutunması sonucu gerçekleşir. Virüs kılıfı ile sitoplazmik zarın füzyonunu takiben nükleokapsit hücre içinde serbest kalır. Nükleokap-
Gecikmiş
DNA nesli
mmm Virüs nesli
• Şekil 16.22 Herpesvirüs. Bir herpes virionunun (yaklaşık 150 nm çapında) elektron mikrografından başlayarak herpes simplex virüs çoğalma aşamaları. Herpesvirüslerde DNA replikasyonu viral bir DNA polimerazla hücre çekirdeğinde tamamlanır.
sitler, viral DNA'nın serbest kalacağı çekirdeğe hareket ederler. Virüs partikülündeki proteinler konukçunun makromolekül sentezini engellerler. Enfeksiyonu takiben, üç çeşit mRNA üretilir: bunlar, beş düzenleyici protein kodlayan ilk mRNA'lar; DNA polimeraz içeren DNA replikasyon proteinlerini kodlayan gecikmiş mRNA'lar ve virüs partikülünün yapısal proteinlerini kodlayan son mRNA'lardır (Şekil 16.22b). İlk çeşit mRNA üretiminde, viral genomun yaklaşık üçte biri, bir konukçu hücre RNA polimerazı ile transkribe edilir, ilk mRNA'lar, gecikmiş (ikinci çeşit) proteinlerin sentezini teşvik eden bazı düzenleyici proteinleri kodlar. Gecikmiş proteinler, ilk proteinler yapıldıktan hemen sonra görülürler. Bu aşamada, viral genomun yaklaşık %40'ı transkribe edilir. Gecikmiş aşama esnasında sentezlenen pek çok anahtar protein arasında, bir viral spesifik DNA polimeraz, deoksiribonükleotitlerin sentezini yapan enzimler ve bir DNA bağlanma proteini bulunur. Bu enzimler viral DNA replikasyonunda görev alırlar.
524 • Bölüm 16 • Viral Çeşitlilik
Herpesvirüs DNA sentezi çekirdekte olur. Enfeksiyon sonrası, herpesvirüs genomu halkasal hale geçer (bakteriyofaj lambda da olduğu gibi) (ssssKısım 9.11) ve dönen halka (rolling circle) mekanizması ile replike olur («*^Şekil 9.20). Ancak, replikasyonun üç orjini burada görülür. Uzun concatamerler oluşturulur, bunlar DNA bakteriyofajları için tanımlanana benzer bir şekilde, paketlenme işlemi esnasında virüs genomik DNA'sı uzunluğunda parçalara bölünecek şekilde işlenir (eo&Kısım 9.9 ve 16.4). Viral nükleokapsitler çekirdekte oluşturulur ve çekirdeğin iç membranı boyunca gerçekleşen tomurcuklanma işlemi sonucunda bir virüs kılıfının oluşumu sağlanır. Olgun virionlar daha sonra hücre dışına endoplazmik retikulum yoluyla salgılanır. Bu nedenle, herpesvirüslerin paketlenmesi, çekirdek membranı yerine sitoplazmik zarda paketlenen diğer kılıflı RNA virüslerinden farklıdır. Cytomegalovirüs
Cytomegalovirüs (CMV) önemli ve çok yaygın görülen bir herpesvirüsdür. CMV tipik bir herpesvirüs gibi replike olur ve 40 yaşlarında Amerika'daki tüm ergin insanların % 50 - 85'inde bulunur. Sağlıklı fertlerin CMV ile enfeksiyonunda, uzun süreli sağlık sorunu ya da herhangi bir belirti görülmez. Ancak, CMV enfeksiyonu, immün sistemi baskılayıcı ilaç verilenlerde (örneğin organ nakli olan, bazı kanser ve dializ hastaları) ya da AİDS virüsü HIV ile enfekte olanlar gibi, immün sistemi tehlikede olan fertlerde ciddi hastalıklara sebep olabilir. Böyle bireylerde CMV, zatürre, retinitis (gözle ilgili) ve mide - barsak hastalıklarına sebep olabilir. Bu hastalıklar çok ciddi olabilir ve sıklıkla enfekte bireylerin ölümüne de sebep olabilir. Sağlıklı konukçu immün sisteminde, CMV kontrol edilir. Ancak, CMV enfekte fertlerin hücrelerinde dormant kalır ve immün sistem tehlike altında olduğunda, immün sistemin kontrol altında tutulma derecesine bağlı olarak, belirti şiddetlerinin orta düzeyde tutulmasını sağlayarak, tekrar aktifleşebilir. Epstein-Barr virüs gibi, CMV enfektif öpüşme hastalığına da sebep olur.
Çift Zincirli DNA Virüsleri:
16.13 Poxvirüsler
Pox virüsler bilinen en kopmleks ve büyük hayvan virüsleri içinde yer alır (Şekil 16.23»), Bu virüsler, DNA virüsleri içinde sitoplazmada replike olan tek
gruptur. Bu nedenle pox virüsüyle enfekte olan konukçu hücre, ökaryot hücrelerde sadece organellerde gerçekleşen bir olay olan, çekirdek dışında DNA sentezler.
Pox Virüslerin Genel Özellikleri Pox virüsler tarihsel olduğu gibi tıbbi açıdan da önemlidir. Smallpox detaylı olarak çalışılan ve aşı geliştirilen (Edward Jenner tarafından 1798 yılında) ilk virüsdür. Dünyada bu aşının sürekli uygulanmasıyla, çiçek (smallpox) hastalığı doğada tamamen yok edilmiştir. Bu şekilde yok edilen ilk enfektif hastalıktır. Diğer önemli pox virüsleri cowpox ve tavşanların önemli bir enfektif ajanı olan ve Avusturalya tavşan popülasyonunun kontrolünde kullanılan (Q°&Kısım 25.5) rabbit myxomatosis virüs'dÜT. Bazı pox virüsleri tümörlere de sebep olur. Pox virüsler çok büyüktür, o kadar büyüktürler ki ışık mikroskobu altında görülebilirler. Pox virüsler üzerindeki çoğu araştırma, smallpox virüsüne çok benzeyen ve çiçek aşısı olarak kullanılan, vaccinia virüs ile yapılmıştır. Vaccinia virionu, yaklaşık 400 X 240 X 200 nm boyutlarında tuğla şeklindedir (Şekil 16.23). Virionun kılıfı yoktur ancak membran benzeri bir yapıda düzenlenmiş küçük tüp şeklinde proteinli bir dış yüzeyle çevrilidir (Şekil 16.23). Virion içinde, bileşimi bilinmeyen iki lateral yapı ve protein alt üniteli bir tabaka ile çevrelenmiş DNA içeren bir nükleokapsit bulunur. Pox
virüs
genomu
doğrusal
çift
zincirli
DNA'dan oluşur. Vaccinia virüs genomu yaklaşık
16.12 Kavramların Gözden Geçirilmesi Herpesvirüsler büyük çift zincirli DNA virüsleridir. Viral DNA halkasal hale gelir ve dönen halka mekanizması ile replike olur. Herpesvirüsler çeşitli hastalıklara sebep olurlar ve periodik olarak viral replikasyonu başlatacak şekilde, konukçuda latent durumda kendilerini tutabilirler. •
Neden herpesvirüsler replikasyon öncesi DNA'larını halkasal hale getirirler? • Herpesvirüs nükleokapsiti nerede oluşturulur ve kılıflarının protein içeriklerini bu nasıl etkiler?
* Şekil 16.23 Pox virüsleri. Negatif olarak boyanmış vaccinia virüs virionunun elektron mikrografı. Virion yaklaşık 400nm (0.4|jm) uzunluğundadır. Vaccinia virüsü, hem bir çiçek aşısı hem de genetik olarak düzenlenmiş bir aşı olarak kullanılır (Kısım 31.8).
16.14 • Çift Zincirli DNA Virüsleri: Adenovirüsler • 525
185 kbp'liktir ve yaklaşık 180 gen içerir. Pox virüs DNA'sı, komşu zincirler arasında oluşturulan fosfodiester bağlarının bir sonucu olarak, çift heliksin iki ipliğinin uçlarından çapraz olarak bağlanması nedeniyle benzersizdir. Pox virüs DNA uçları bundan dolayı daha önce tartışılan Chlorella virüslerine çok benzemektedir (Kısım 16.7'ye bakınız). Pox Virüslerin Replikasyonu Vaccinia virionları hücrelere alınır ve nükleokapsitler sitoplazmada serbest kalır. Viral genomun kapsitten ayrılmasının, enfeksiyon sonrası sentezlenen bir viral proteinin aktivitesine ihtiyaç duyması ilginçtir. Bu protein viral DNA tarafından kodlanır. Bu proteini kodlayan gen, virüs partikülü içinde bulunan viral kodlu bir RNA polimerazla transkribe edilir. Kapsittin uzaklaşmasını sağlayan bu gene ilaveten, diğer pek çok viral gen transkribe edilir. İlk transkriptler, hala nükleokapsit içinde olacak şekilde, cap ve poliadenillenerek mRNA haline çevrilir. Genom kopyaları, viral kodlu bir DNA polimerazla yapılır. Vaccinia DNA tamamiyle kapsitinden ayrıldığında, sitoplazma içinde inklüzyon yapılarının oluşumu başlar. Bu inklüzyon yapılarının içinde, virionların oluşumu için gerekli transkripsiyon, replikasyon ve kapsit oluşumu gerçekleşir. Her bir enfekte virion kendi inklüzyon yapısını başlatır, böylece enfeksiyonun çoğalmasına bağlı olarak inklüzyonların sayısı artar. Genomik DNA molekülleri, virionların içine birer molekül konulacak şekilde, bir havuz oluşturur. Olgun virionlar sitoplazmada birikir. Özel bir hücreden çıkış mekanizması görülmemiştir, virionların çoğu sadece enfekte hücre parçalandığında ortama salınmaktadır. Pox Virüsler ve Rekombinant Aşılar Vaccinia virüs, genetik olarak düzenlenmiş aşıların yapımını sağlayacak şekilde (<3QoKısım 31.8), diğer virüslerin genetik olarak değiştirilmiş proteinleri için bir konukçu olarak kullanılır. Bölüm 22'de göreceğimiz gibi aşı, hayvanda immün cevabın oluşmasını sağlayan bir maddedir ve aynı ajanla ileriki enfeksiyonlardan hayvanı koruma görevi görür. Vaccinia virüsün insan sağlığına ciddi bir etkisi yoktur ancak yüksek oranda immümojeniktir. Bundan dolayı da vaccinia virüs, patojenik virüs proteinlerinin taşıyıcısı olarak güvenilirdir ve immün cevabın oluşmasını teşvik için etkin bir araçtır. Moleküler klonlama metodları (ooaBölüm 10 ve 31), influenza virüs, rabies virüs, herpes simplex tip I virüs ve hepatit B virüsü gibi çeşitli viral patojenlerin anahtar viral proteinlerini vaccinia virionlarmda yorumlamada ve daha sonra da patojene karşı aşı geliştirilmesinde kullanılmaktadır (osöKısım 31.8). Vaccinia virüs gibi adenovirüslerin de insanlarda çok az sağlık sorunlarına sebep olmaları nedeniyle, adenovirüslerin bir araç olarak kullanıldığı (gelecek bölüme bakınız) benzer bir aşı sistemi geliştirilmiştir.
İ 6.13 Kavramların Gözden Geçirilmesi Tartıştığımız diğer DNA virüslerinden farklı olarak pox virüsler, sitoplazmada replike olan oldukça büyük virüslerdir. Bu virüsler insanlarda hastalıklara da sebep olurlar, ancak aşılama kampanyası doğada smallpox virüsünü tamamen ortadan kaldırmıştır. • Pox virüslerin sitoplazmada DNA'larını replike edebilmeleri neden önemlidir? • Pox virüsler genetik mühendisliğinde nasıl kullanılırlar?
Çift Zincirli DNA Virüsleri:
16.14 Adenovirüsler
Adenovirüsler, ikozahedral doğrusal çift zincirli DNA virüslerinin önemli bir grubudur. Adeno ismi, Latince "bez" anlamındadır ve insanların bademciklerinden ve adenoid bezlerinden ilk olarak izole edildikleri için bu adla adlandırılmışlardır. Adenovirüsler insanlarda zayıf solunum enfeksiyonlarına sebep olurlar. Hatta bu virüslerin çoğu sağlıklı insanlardan da izole edilebilir. Adenovirüslerin genomları yaklaşık 36 kbp'lik doğrusal çift zincirli DNA'dan ibarettir. DNA'nın 5' ucuna kovalent bağlarla bağlı, DNA replikasyonu için gerekli olan, terminal protein olarak adlandırılan bir protein vardır. DNA, replikasyonda önemli olan 100-1800 bp'li (virüs tiplerine göre sayısı değişen) tersine terminal tekrarlı bölgelere sahiptir. Adenovirüslerin Replikasyonu: İlk Olaylar Poxvirüslerden farklı olarak, adenoviral DNA replikasyonu çekirdekte olur (Şekil 16.24»). Virüs partikülü çekirdeğe gittikten sonra, nükleokapsit ayrılır ve bir viral DNA - histon kompleksine çevrilir, ilk transkripsiyon konukçu RNA polimerazıyla tamamlanır ve çok sayıda primer transkript yapılır. Transkriptler intron içerirler ve bu nedenle de olgun transkriptler üretmede ilk olarak splice edilmelidirler; daha sonra translasyon öncesi cap ve poliadenillenirler. Çoğu virüslerde tipik olarak görüldüğü gibi, ilk adenoviral proteinler DNA replikasyonunun düzenlenmesinde görev alırlar, son proteinler ise yapısaldır. Viral DNA replikasyonu, primer olarak terminal proteini ve DNA polimeraz olarak da virüs tarafından kodlanan diğer proteinleri kullanır. Terminal protein, DNA replikasyonunu sürdürmek üzere kovalent olarak bağlı bir sitosin uzantısı içerir. Adenovirüslerin Replikasyonu: Genom Replikasyonu Adenoviral genom replikasyonu iki uçtan birinde başlar, iki zincir senkron olmayan bir şekilde replike olur (Şekil 16.24). Replikasyon halkasının ürünleri, bir çift zincirli ve bir tek zincirli moleküldür (Şekil 16.24). Ancak, daha sonra tek bir replikasyon mekanizması görülür. Tek zincir, tersine terminal
526 • Bölüm 16 • Viral Çeşitlilik
Ters Transkriptaz Kullanan
Terminalprotein
i
Kopyalanan artı zincir
16.15 Virüsler: Retrovirüsler ve Hepadnavirüsler
Kısım 9.12'de, ters transkriptaz enzimi kullanarak ters transkripsiyonla replike olan virüslerin bir grubu olan retrovirüsleri tartıştık. Genomlarmdaki nükleik asit tipleriyle birbirinden ayrılan, ters transkriptaz kullanan iki farklı virüs tipi vardır.
i
Hepadnavirüsler DNA genomu taşırken, retrovirüsler
i
Halka oluşum yönü Tersine terminal tekrarlarla halkasal olan eksi zincir
5'
Kopyalanan eksi zincir
Tamamlanmış doğrusal çift zincir
RNA genomuna sahiptirler. Bu bölümde her iki replikasyon modelini örneklerle inceleyeceğiz. Retrovirüsler: Genel Kurallar
Retrovirüslerin iki kopya RNA genomu taşıyan kılıflı virionlara sahip olduğunu hatırlayalım (öOöŞekil 9.24). Virion, ters transkriptaz ve spesifik bir tRNA'da dahil olmak üzere bazı enzimler içerir. Her ne kadar retroviral genom artı anlamlı cap ve kuyruklu olsa da direk mRNA olarak kullanılmadığından, enzimler retrovirüs replikasyonu için gereklidir. Genom kopyalarının biri ters transkriptazla DNA'ya çevrilir ve konukçu genomuna bağlanır. Doğrusal çift zincirli bir molekül olarak oluşturulan DNA, kapsitsiz viral core partikülü içinde sitoplazmada sentezlenir. Ters transkripsiyon aşamaları Şekil 16.25»'de verilmiştir. Ters Transkriptaz Aktivitesi
• Şekil 16.24 Adenovirüs DNA'sının replikasyonu. Loop oluşumu (halkasal) nedeniyle lagging zincirsiz replikasyon oluşumuna, sentezin her iki zincirde leading olduğuna dikkat ediniz.
tekrarlarıyla halkasal olur ve yeni bir komplementer zincir 5' uçtan sentezlenmeye başlar (Şekil 16.24). Bu replikasyon mekanizması, geleneksel DNA replikasyonunda olduğu gibi bir lagging zincir oluşumunu içermemesi nedeniyle, dikkate değerdir (cesöKısım 7.6). Bunun yerine, DNA sentezi yeni sentezlenen her iki DNA zincirinde leading pozisyonunda olur (Şekil 16.24).
-m
16.14 Kavramların Gözden Geçirilmesi
Farklı çift zincirli DNA hayvan virüsleri farklı genom replikasyon stratejilerine sahiptir. Adenovirüslerde olduğu gibi protein perimerler içerebilirler ve lagging zincirin sentezinden kaçman ve çekirdekte gerçekleşen bir replikasyon modeli içerebilirler. • Adenovirüs çift zincirli DNA genomunu, lagging zincirin sentezi yapılmaksızın nasıl replike eder tanımlayınız?
Ters transkriptaz aslında bir DNA polimerazdır, ancak gerçekte üç enzimatik aktivite gerçekleştirir: (1) bir RNA kalıbından DNA sentezi (ters transkripsiyon), (2) bir DNA kalıbından DNA sentezi, ve (3) ribonükleaz H aktivitesi (RNA:DNA hibritinden RNA ipliğini uzaklaştıran bir enzimatik aktivitedir). Tüm DNA polimerazlar gibi, ters transkriptaz DNA sentezi için bir primere ihtiyaç duyar. Retrovirüs ters transkripsiyonu için primer, spesifik bir hücresel transfer RNA'dır (tRNA) (Şekil
16.25). Primer, önceki konukçu hücrede paketlenme aşamasında virion içine konulur. Bir tRNA primeri kullanılarak, RNA'nın 5' ucunda 100 ya da daha çok nükleotit, DNA'ya ters transkribe edilir. Bir kez RNA'nın 5' ucunda ters transkripsiyon olduğunda, işlem durur. Kalan RNA'yı kopyalamada, ki bu da virüs RNA'sının büyük bir kısmını oluşturur, farklı bir mekanizma rol oynar. îlk olarak, molekülün 5' ucundaki terminal tekrarlı RNA dizisi, ters transkriptazın ribonükleaz H aktivitesi ile uzaklaştırılır. Bu olay, viral RNA'nın diğer ucundaki RNA segmentine komplementer olan küçük bir tek zincirli DNA oluşumuna izin verir. Bu kısa tek zincirli DNA parçası daha sonra, viral RNA dizi kopyalanmasının devam edeceği, viral RNA molekülünün diğer ucu ile hibridize olur.
16.15 • Ters Transkriptaz Kullanan Virüsler: Retrovirüsler ve Hepadnavirüsler • 527 , Direk t e k r a r l a r ^ ^ ^
'
R
P
B
Virion RNA'sı
R
•
3
5 /
>
_
-PrimertRNA
i 1
Yeni DNA
Yeni DNA
"
I ı
O'
3-5S -
_
^
_
_
_
DNA-zincirinin uzamasını sağlayan sentezin devamı
Primer
Yeni DNA
° ~
hariç + zincir RNA'nın tümü ribonükleaz H aktivitesi uzaklaştırılır 5'MSMHMHH
5'
3'
i LTR
^
3' uca tRNA ve DNA'nın transferi
s
i
^
Ters transkriptaz ribonükleaz H aktivitesi ile uçtaki tek virion RNA'nın uzaklaştırılması
E? ^^^m- •• -^w«*wwıılımımıı^m^ıın-~-^———•
3
_
Ters transkriptazla 5'uçta -100 nükleotitlik DNA'nın ters transkripsiyonu
Artı zincir DNA'nın kısalan parçasının tamamlanması ve her iki primerin uzaklaştırılması
Diğer zincire ters transkriptazın transferi ve - zincir DNA sentezinin tamamlanması
LTR
5'——«»——I 3'
tm^mtlmmmmmmmm^ımmmmımm 3' Ters transkriptaz aktivitesi ile çift 5' zincirli DNA oluşumu
i Provirüs oluşturmak üzere konukçu kromozomal DNA'ya bağlanma
* Şekil 16.25 Tek zincirli retrovirüs RNA'sından çift zincirli DNA'nın oluşum aşamaları. KNA'da işaretli R dizileri her uçta bulunan direk tekrarlardır. PB olarak işaretlenen dizi primerin (tRNA) bağlandığı yerdir. Orjinal RNA'dan daha uzun direk tekrarlara sahip DNA üretiminde DNA sentez aşamalanna dikkat ediniz. Bunlar uzun terminal tekrarlar (LTR) olarak adlandırılır.
528 • Bölüm 16 • Viral Çeşitlilik
Şekil 16.25'de özetlendiği gibi, her iki uçta uzun terminal tekrarlı (LTR) çift zincirli bir DNA
molekülü oluşturacak şekilde, ters trankripsiyon ve ribonükleaz H aktiviteleri devam eder. Bu LTR bölgeleri, güçlü transkripsiyon promotorları içerirler ve konukçu DNA'ya bağlanma (integrasyon) işleminde de görev alırlar. Konukçu genomuna viral DNA'nm integrasyonu, Mu virüs DNA'sının integrasyonuna benzer (Kısım 16.5'e bakınız). İntegrasyon hücresel DNA'nm herhangi bir yerinde olabilir ve bir kez integre olduğunda, provirüs olarak adlandırılan retroviral DNA, stabil bir genetik element olarak kalır (Şekil 16.25).
/
Cap
|
pol AAAAA...
kapsit proteinleri
MIH
Retroviral Gen İfadesi, İşlenmesi ve Virion Oluşumu
Provirüs olarak, retroviral genom yorumlanabilir, ya da yorumlanmayıp latent durumda kalabilir. Eğer sağ LTR'deki promotorlar aktive olursa, integre proviral DNA, hücresel bir RNA polimerazla cap ve poliadenillenen transkriptlere transkribe olur. Bu RNA transkriptleri ya virionlarda paketlenir ya da işlenir ve virüs proteinlerine translate edilir. Retrovirüsden böyle bir mRNA'nın işlenmesi ve translasyonu, Şekil 16.26»'da gösterildi. Tüm retrovirüsler, genomlarında sırasıyla gag, pol ve env olarak düzenlenmiş en az üç gene sahiptir. Mesajcı RNA'nın 5' ucundaki gag "geni" bir kaç küçük viral protein kodlar. Bunlar ilk olarak, bir proteazla (kendisi poliproteinin bir parçasıdır) daha sonra işlenecek bir poliprotein şeklinde sentezlenir. Yapısal proteinler kapsiti oluşturur, ve proteaz virionda paketlenir. pol Geni, gag proteinlerini içeren büyük bir poliprotein olarak daha sonra translate edilir (Şekil 16.26). Yapısal proteinlerle karşılaştırıldığında pol ürünleri sadece küçük miktarlarda gereklidir ve ribozom bir hata yaparsa onların sentezine gerek duyulacağı için bu olay uygun bir şekilde gerçekleşir. Ribozom pol gen ürünlerini üretmede, ya gag geninin sonundaki bir durdurucu kodon boyunca okuma yapmalıdır ya da bu bölgedeki farklı bir okuma kalıbına kesin bir dönüş yapmalıdır. Bunlar oldukça nadir olaylardır. pol Gen ürünü iki şekilde işlenir. îlkinde gag proteinlerinden ayrılır, ikincisinde ise, ters transkriptazla birlikte virionda paketlenen DNA integrasyonu için gerekli bir protein olan, integrazdan ters transkriptaz ayırır (Şekil 16.26). env Gen translasyonu için, tam uzun bir mRNA, ilk olarak gag ve pol bölgelerinden ayrılarak işlenir, env Ürünü yapılır ve daha sonra iki ayrı kılıf proteini olarak işlenir (Şekil 16.26).
gag
Proteaz
«3-
/
\
(a)
Cap AAAAA..
ENV
(b)
• Şekil 16.26 Retrovirüs mRNA'sının translasyonn ve proteinlerin işlenmesi, (a) Üstte gag, pol ve env olmak üzere üç genli tam uzun bir mRNA gösterildi. Yıldız işareti, bir durdurucu kodondan geçerek ribozomun okuması gerektiği yeri ya da GAG-POL poliproteinini sentezlemede okuma kalıbında tam bir değişikliğin yapıldığı yeri gösterir. İnce mavi oklar protein işlenme olaylarım gösterirken, kalın mavi oklar translasyonu gösterir. gag Gen ürünlerinden biri bir proteazdır. POL ürünü ters transkriptaz (RT) ve integraz (İN) oluşturmak üzere işlenir, (b) gag-pol Bölgelerinin çoğunun uzaklaştırıldığı işlenmiş mRNA. Bu kısaltılmış mesaj, iki kılıf proteinine (EP), EPİ ve EP2, parçalanacak olan ENV poliproteinini vermek üzere translate edilir.
Bir Retrovirüs Olan HIV Her ne kadar yukarda tanımlanan retrovirüslerin replikasyon tipleri kompleks olarak kabul edilse de, gerçekte bu oldukça "basit" bir retrovirüsün tipik bir örneğidir. AİDS hastalığı etkeni olan, retrovirüs human immunodeficiency virüs 1 (HIV-1) genomu, anlatılandan çok daha karışıktır ve bazı küçük genler içerir. Genlerinin yorumlanmaları için, sadece proteazlarla işlenen proteinlerinin bulunmasına gerek duymazlar, aynı zamanda intronların kompleks alternetif splicing örneklerine de ihtiyaç duyarlar. Ancak olgun proteinler oluşturmada çok sayıda proteaz aşamasına ihtiyaç duyma
özellikleri, retrovirüsleri diğer virüslerden ayır-
16.15 • Ters Transhriptaz Kullanan Virüsler: Retrovirüsler ve Hepadnavirüsler • 529 maktadır. Bu bakımdan, spesifik proteaz inhibitörleri, HIV-1 enfeksiyonlarını da kapsayan retroviral enfeksiyonları tedavi etmede kullanım için geliştirilmiştir («»sKısım 20.10 ve 26.14). Ters Transkripsiyon Yapan DNA Virüsleri: Hepadnavirüsler Çeşitli genom yapıları ve replikasyon modelleri gösteren virüslerin yaşam döngülerini gördük. Ancak bunların hiçbiri, önemli bir kanla taşınan patojen olan, human hepatitis B virüs gibi hepadnavirüslerden daha olağanüstü olamaz (<*^Kısım 26.11). "Hepadnavürüs" adı, virüsün karaciğeri (bu nedenle "hepa") enfekte etmesi ve genomunun DNA olması (bu nedenle "dna") nedeniyle verilmiştir. Hepatit B virüs virionları, küçük, düzensiz çubuk şeklinde partiküllerdir (Şekil 16.27a«).
Hepadnavirüslerin genomları, virüsün yaşam döngüsünün benzersiz ve çok kompleks olmasına rağmen, 3-4 kb büyüklüğünde bilinen virüsler içinde en küçük olanlarıdır. Retrovirüsler gibi hepadnavirüsler de replikasyon döngülerinde ters transkriptaz kullanır. Ancak, retrovirüslerden farklı olarak, hepadnavirüslerin DNA genomu, retrovirüslerdekine zıt olarak bir RNA aracılığı ile replike olur. Hepadnavirüslerin genomları sadece kısmen çift zincirli DNA'dan oluşur (Şekil 16.27b). Bir zincir tamamlanmamıştır ve her iki zincir de boşluklara sahiptir. Buna rağmen, iki zincir komplementer baz çiftleri arasındaki hidrojen bağlarıyla halkasal bir şekilde birlikte bulunurlar. Virionda taşınan bir viral DNA polimeraz sitoplazmaya girdiğinde bu DNA'nın replikasyonunu tamamlar. Bu polimeraz, son derece çok yönlü bir proteindir. DNA polimeraz artı ters transkriptaz aktivitelerini gösterir ve DNA zincirin birinin sentezi için bir protein primer olarak da görev görür! Genomun küçük olmasına rağmen virüs, hepadnavirüslerin biyolojisinde bir kez daha görülen, küçük virüsler tarafından yaygın olarak kullanılan çakışan gen stratejisi ile (Kısım 16.1,16.2 ve 16.4), bir kaç protein kodlar (Şekil 16.27b). Hepadnavirüs genom replikasyonunda, terminal tekrarlı bir transkript verecek şekilde konukçu RNA polimerazıyla (çekirdekte) transkripsiyon gerçekleşir (Şekil 16.27b). Polimerazın halkasal molekülün çevresinde çoğunlukla biraz ilerlemesi nedeniyle tekrarlar olur. Viral ters transkriptaz daha sonra, retrovirüs replikasyonuna çok benzer şekilde, RNA'dan DNA kopyalar, ancak bu durumda DNA (retrovirüslerdeki RNA'nm aksine) yeni oluşan virionlarda paketlenmeye başlar (Şekil 16.27b). Hepadnavirüsler bu nedenle küçük bir genomun ne kadar çok şey yaptığının inanılmaz örnekleridir. Hepatit B virüsü, bu bölümün başında anlattığımız (Kısım 16.1-16.3'e bakınız) tek zincirli RNA ya da DNA bakteriyofajlarından daha küçük, 3.4 kb büyüklüğünde, genoma sahiptir. Yine de, bu küçük virüs önemli bir insan hastalığına sebep olabilir. Sonraki bölümde (Kısım 26.11) hepatit belirtilerini inceleyeceğiz. 16.15 Kavramların Gözden Geçirilmesi
0.7 kb
• Şekil 16.27 Hepadnavirüsler. (a) Hepatit B virionlannın elektron mikrografı. (b) Hepatit B genomu. Kısmen çift zincirli olan genom yeşil olarak gösterildi. Pozitif zincirin tam olmadığına dikkat ediniz. Transkriptlerin büyüklükleri de gösterildi. Hepatit B virüsünde genlerin tümü çakışır ve ortak kullanılır, genler genomdaki her bazı kapsar. Ters transkriptaz, konukçu RNA polimerazıyla yapılan tek genom uzunluğundaki bir mRNA'dan DNA genomu üretir.
Retrovirüsler RNA genomu içerirler ve yaşam döngülerinde DNA kopyasını yapmak için ters transkriptaz kullanırlar. Hepadnavirüsler DNA genomu içerirler ve bir RNA kopyasından genomik DNA yapmak için ters transkriptaz kullanırlar. Virüslerin her iki tipi de kompleks gen yorumlanma mekanizmalarına sahiptirler • Neden proteaz inhibitörleri insan AİDS'İ için etkili bir uygulama olarak kullanılır? • Retrovirüsler ve hepadnavirüslerin replikasyon döngülerinde ters transkriptazm oynadığı farklı rolleri tanımlayınız?
530 • Bölüm 16 • Viral Çeşitlilik
DEĞERLENDİRME SORULARI 1.
Virüslerde bulunan genom tiplerini tanımlayın. Her bir genom tipi için (giriş bölümü) en az bir virüsü (ya da virüs grubunu) örnek olarak verin. 2. Çakışan genler nedir? Çakışan genlere sahip virüslere örnek verin (Kısım 16.1,16.2,16.4,16.11 ve 16.15). 3. Çoğu bakteriyofaj tek zincirli DNA genomuna sahiptir. Bu virüsler tarafından taşınan genlerin nasıl transkribe ve translate ediliğini açıklayın (Kısım 16.2 ve 16.3). 4. Bacteria, bitkiler ve hayvanlarda pozitif zincirli RNA virüslerinin olduğu bilinir. Bu virüslerin, özellikle Bacteria'lan ve ökaryotları enfekte edenlerin, gen yorumlanmaları arasındaki önemli farklar nelerdir (Kısım 16.1 ve 16.8). 5. Enfeksiyonda T7 genomunun bir ucu daima hücreye ilk olarak girer. Bu enfeksiyon işleminin ilerlemesi için gereklidir. Açıklayın (Kısım 16.4). 6. Bakteriyofaj Mu neden mutajeniktir? Mu'nun DNA'ya bağlanması için hangi özellikler gereklidir (Kısım 16.4)? 7. Bakteriyofajlarm çift zincirli DNA virüslerinin genomlarıyla karşılaştırıldığında, PAV-1 gibi arkevirüslerin genomunun hangi özelliği enderdir (Kısım 16.6)? 8. Tütün Mozaik virüsü hangi genom tipini içerir? Yapı ve büyüklük anlamında Chlorella benzeri virüslerle nasıl karşılaştırılırlar (Kısım 16.7)?
9. Poliovirüsün VPg proteininin fonksiyonu nedir ve genomları poliovirüsler gibi artı anlamlı RNA olan coronavirüsler, VPg proteinsiz nasıl replike olur (Kısım 16.8)? 10. Rhabdovirüsler benzersiz bir genom yapısına sahiptir. Genomlarının yapısı nasıldır ve neden replikasyonlarında virionun enzim taşıması zorunludur (Kısım 16.9)? 11. Biyolojide reovirüs genomu benzersizdir. Açıklayın (Kısım 16.10). 12. Her ne kadar hayvan virüsleri bazı bakteriyofajlarda olduğu gibi temperent olarak tanımlanmasalar da (c**s Kısım 9.10), bazısı latent enfeksiyonlar oluşturabilir. Hayvan virüslerinin buna benzeyen iki tipini açıklayın (Kısım 16.11 ve 16.15). 13. Her ne kadar herpesvirüslerin ve adenovirüslerin genomları çift zincirli DNA olsa da, replikasyon özellikleri tamamen farklıdır. Ayrıntıları açıklayın (Kısım 16.12 ve 16.14). 14. Çift zincirli DNA hayvan virüslerinden farklı olarak, pox virüslerin DNA replikasyon işlemlerinin tek bir yönü dikkat çekicidir. Bu benzersiz özellik nedir ve virionda paketlenen özel enzimler olmaksızın bu iş nasıl başarılabilir (Kısım 16.13)? 15. Proteaz inhibitörlerine virüs replikasyonunu hassas yapan retroviral genlerin yorumlanması hakkında ne bilinir (Kısım 16.15)?
UYGULAMA SORULARI Bakteriyofaj MS2'nin RNA genomundan yapılan tüm proteinler aynı miktardadır. Neden olduğunu açıklayınız? Proteinlerin biri daha çok bir repressör gibi görev görür (oOöKısım 8.5), ancak translasyonal düzeyde fonksiyon görür. Bu hangi proteindir ve nasıl bir fonksiyona sahiptir? 2. Çift zincirli RNA virüslerinin genomları neden parçalıdır, mekanizmayı açıklayın.
3.
4.
Adenovirüs gibi bazı virüslerde DNA'mn her iki zincirin replikasyon mekanizması süreklidir (leading). Kısım 7'de öğrenilen kuralı bozmaksızın nasıl tüm DNA sentezi 5' —» 3' yönünde olur gösterin. Genetik elementlerin çoğu, ters transkriptazı bir poliproteinin parçası olarak ve /veya küçük miktarlarda yapmak üzere üretir. Neden bu şekilde yapıldığı hakkında ne düşünüyorsunuz?
