METABOLİK ÇEŞİTLİLİK
I
YAŞAMIN FOTOTROFİK YÖNÜ
533
17.1 Fotosentez 17.2 Fotosentetik Pigmentler ve Hücre İçindeki Yerleşimleri 17.3 Karotenoidler ve Fikobilinler 17.4 Oksijensiz Fotosentez 17.5 Oksijenli Fotosentez 17.6 Ototrofik CO 2 Fiksasyonu: Calvin Döngüsü 17.7 Ototrofik CO 2 Fiksasyonu: Ters Sitrik Asit Döngüsü ve Hidroksipropiyonat Döngüsü
533
II
Prokaryotların genetik çeşitliliğindeki zenginlik metabolik çeşitliliğine de yansımaktadır. Yeşil kükürt bakterileri, klorozom içeren fototroflardır. Yukarıda Chlorobium tepidum'un hücre perif erinde puro şeklindeki yapılar olarak klorozomlar görülmektedir. Klorozomlar, yeşil bakterilerin fototrofik bir organizmanın en düşük ışık şiddetinde gelişmesini sağlar.
534 537 538 543 545 547
KEMOLİTOTROFİ: İNORGANİK ELEKTRON VERİCİLERİNİN OKSİDASYONUNDAN SAĞLANAN ENERJİ 548
17.8 inorganik Elektron Vericileri ve Enerjetikleri 17.9 Hidrojen Oksidasyonu 17.10 İndirgenmiş Kükürt Bileşiklerinin Oksidasyonu 17.11 Demir Oksidasyonu 17.12 Nitrifikasyon ve Anammoks III YAŞAMIN A N A E R O B İ K Y Ö N Ü : ANAEROBİK SOLUNUM 17.13 Anaerobik Solunum 17.14 Nitrat İndirgenmesi ve Denitrifikasyon İşlemi 17.15 Sülfatın İndirgenmesi 17.16 Asetojenez 17.17 Metanojenez 17.18 Ferrik Demir, Mangan, Klorat ve Organik Elektron Alıcıları
548 549 550 553 555
557
557 558 560 563 564 568
531
I
532 • Bölüm 17 • Metabolik Çeşitlilik
IV YAŞAMIN ANAEROBIK YONU: FERMENTASYON VE SİNTROFİ 571^ 17.19
17.23
Hidrokarbon Oksidasyonu
578
17.24
Metanotrofi ve Metilotrofi
579
17.25
Heksoz, Pentoz, ve Polisakkarit Metabolizması
581
Fermentasyon: Enerjetik ve Redoks Durumları
531
17.26
Organik Asit Metabolizması
584
17.27
Mikrobiyal Besinler Olarak Lipitler
585
17.20
Fermentatif Çeşitlilik
573
13.21
Sintrofi
575
VI AZOT FİKSASYONU
V HİDROKARBON OKSIDASYONU VE ORGANİK BİLEŞİKLERİN KATABOLİZ MASIN DA O2'NİN İŞLEVİ 577^ 17.22
Biyokimyasal Süreçlerde Bir Reaktant Olarak Moleküler Oksijen (O2)
586
17.28
Nitrojenaz ve Azot Fiksasyonu Süreci
586
17.29
Azot Fiksasyonunun Genetiği ve Regülasyonu
590
577
BOLÜMLE İLGİLİ SOZLUK Anaerobik solunum son elektron alıcısı olarak O 2 yerine SO42~ veya NO 3 " gibi bazı maddelerin kullanıldığı solunum Anammoks anoksik amonyak oksidasyonu Anoksijenik fotosentez oksijenin üretilmediği fotosentez Anoksik oksijensiz Anten fotokompleksle ilişkili olarak reaksiyon merkezine enerjiyi aktaran ışık toplayan pigment molekülleri Azot fiksasyonu biyolojik olarak N 2 'un NH 3 'a nitrojenazla indirgenmesi Bakteriyoklorofil anoksijenik fototrofların klorofil pigmenti Calvin döngüsü birçok ototrofik organizmada CO 2 fiksasyonunun biyokimyasal yolu Denitrifikasyon NO3~'m gaz formunda azot bileşiklerine özellikle N 2 'ye indirgendiği anaerobik solunum Disproporsinasyon bir bileşiğin kendisinden daha fazla oksitlenmiş ve daha fazla indirgenmiş iki yeni bileşiğe ayrılması Fermentasyon organik bir bileşiğin hem bir elektron vericisi ve hem de bir elektron alıcısı olarak iş gördüğü ve ATP'nin substrat seviyesinde fosforilasyonla üretildiği anaerobik katabolizma Fikobiliprotein siyanobakterilerde proteinlerle bir arada bulunan bir molekül fikosiyanin veya fikoeritrinden oluşan yardımcı pigment kompleksi Fotofosforilasyon fotosentezde ATP'nin üretilmesi
Fotosentez ATP'nin ışık merkezli reaksiyonlarla sentezlendiği ve CO 2 'nin hücre materyali şeklinde fikse edildiği reaksiyonlar serisi Fototrof enerji kaynağı olarak ışığı kullanabilen organizma Hidrogenaz H 2 alımı ve işlenmesini yapabilen yaygın olarak anaerobik mikroorganizmalarda bulunan bir enzim Hidroksipropiyonat yolu Chloroflexus ve birkaç Archaea'da bulunan ototrofik bir yol Homoasetojenez (asetojenez) ya H 2 ve CO 2 'den ya da organik bileşiklerden asetatın üretimi ile ilgili enerji metabolizması Karboksizom RubisCo'daki kristal cisimcikler Karotenoid fotosentetik zarlarda klorofille birlikte bulunan hidrofobik yardımcı bir pigment Kemolititrof enerji kaynağı olarak inorganik bileşikleri oksitleme yeteneğinde olan mikrorganizma Klorofil fotosentetik organizmalarda fotofosforilasyon sürecini başlatan ışığa duyarlı, Mg içeren porfirini Klorozom yeşil kükürt ve yeşil kükürtsüz bakterilerin periferinde bulunan ve anten bakteriyoklorofilleri (c, d veya e) içeren puro şekilli yapılar Metanojenez metanın (CH4) biyolojik olarak üretimi Metanotrof metanı oksitleyebilen bir organizma Metilotrof C—C bağları olmayan bileşikler üzerinde büyüyebilme yeteneğinde olan bir organizma Miksotrofik enerji kaynağı (elektron vericisi) olarak inorganik bileşiğin,
karbon kaynağı olarak organik bileşiklerin kullanıldığı bir beslenme şekli Monooksijenaz O 2 'nin bir atomunun substrata katıldığı, diğerinin ise H 2 O'ya indirgenmesini katalizleyen bir enzim Nitrifikasyon NH 3 'ın NO3~'a mikrobiyal dönüşümü Nitrojenaz azot fiksasyonu sürecinde N 2 'u NH 3 'a indirgeyebilen bir enzim Oksijenik fotosentez O 2 'nin açığa çıktığı, siyanobakteriler ve yeşil bitkiler tarafından gerçekleştirilen fotosentez Ototrof tek karbon kaynağı olarak CO2 kullanabilen organizma Reaksiyon merkezi fotosentetik elektron akışının başlangıç elektron transferi reaksiyonlarının gerçekleşmesini sağlayan klorofil (veya bakteriyoklorofil) ve birkaç bileşen içeren fotosentetik bir kompleks Redüktif deklorinasyon klorlanmış bir organik bileşiğin bir elektron alıcısı olarak kullanıldığı ve Cl~ açığa çıkmasıyla sonuçlanan anaerobik bir solunum şekli RubisCO Calvin döngüsünün anahtar bir enzimi olan ribüloz bisfosfat karboksilazm baş harfleri Sintrofi tek başına iken parçalayamadığı bir maddeyi iki veya daha fazla mikroorganizmanın işbirliği içinde parçalayabildiği süreç Ters elektron taşınımı daha zayıf bir elektron vericisinden güçlü bir indirgeyici oluşturmak için termodinamik gradiente karşı elektronların enerji gerektiren hareketi
17.1 • Fotosentez • 533
D
aha önceki bölümlerde, Dünya üzerindeki mikrobiyal yaşamın büyük filogenetik çeşitliliğinden bahsedilmişti. Şimdi de, bu çeşitliliğin arkasından, biyokimyasal süreçler üzerine özel bir vurgu yaparak metabolik çeşitlilik üzerine yoğunlaşacağız. Daha sonra mikrobiyal ekoloji-mikroorganizmaların birbirleri ve çevreleri ile olan ilişkileri-üzerinde durabiliriz. Metabolik çeşitlilik ve mikrobiyal ekoloji ele alman konulardır. Bu bölümde anlatılacak metabolik çeşitlilik konusunu Bölüm 18 ve 19'da tartışacağımız besin döngüleri ve diğer mikrobiyal aktivite ile ilgili konular tamamlayacaktır. Göreceğimiz gibi mikroorganizmalar ve metabolik reaksiyonları yeryüzü üzerindeki yaşamın devamlılığında anahtar rol oynamakta olup tarım ve diğer insan faaliyetlerinde yaşamsal öneme sahiptir (ÖOS- Kısım 1.4).
UI
YAŞAMIN FOTOTROFIK YÖNÜ
Bir enerji kaynağı olarak ışığın kullanımı olan fototrofi mikrobiyal dünyada oldukça yaygındır, ilk beş kısımda fototrofinin temel şekillerini inceleyeceğiz. Bunlara soluduğumuz oksijenin oluşumu da dahildir. Daha sonra, birçok fototrofun CO2'den tüm karbonlarını nasıl sağladıklarını göreceğiz.
Fotosentez Yerküre üzerindeki en önemli biyolojik süreç ışık enerjisinin kimyasal enerjiye dönüşümünün gerçekleştiği fotosentezdir. Fotosentezi gerçekleştiren organizmalar fototroflar olarak isimlendirilirler (Şekil 17.1»). Birçok fototrofik organizma aynı zamanda ototroftur, yani tek karbon kaynağı olarak CO2'i kullanırlar. Işıktan elde edilen enerji CO2'in organik bileşiklere indirgenmesinde kullanılır (fotoototrofi). Ancak, bazı fototroflar karbon kaynağı olarak organik maddeyi de kullanabilirler; bu yaşam biçimi ise fotoheterotrofi olarak adlandırılır (Şekil 17.1). Fotosentez yapabilmek için, bitki, alg ve birkaç prokaryot grubunda bulunan klorofil adı verilen ışığa
FOTOTROFLAR (enerji kaynağı olarak ışığı kul
Fotoototroflar (CO2 kullanır)
* Şekil 17.1 Enerji ve karbon kaynaklan bakımından fototrofik organizmaların sınıflandırılması. Doğada, fototrofik organizmalar habitatlarında elde edilebilir kaynaklara bağlı olarak metabolizmalarının şeklini değiştirirler. Fotoheterotrofi doğal olarak fotoototrofiyi baskılar.
duyarlı pigment gereklidir. Işık, kuantum denen enerji paketçikleri halinde fototrofik organizmalara ulaşır. Bu ışık enerji paketçiklerinin klorofil tarafından absorbsiyonu fotosentetik enerji dönüşüm sürecini başlatır ve bu sürecin sonundaki net ürün ATP'dir. Enerji Üretimi ve C02 Asimilasyonu
Bir fototrofun büyümesi iki farklı reaksiyon seti ile karakterize edilebilir: (1) ATP üretimi ve (2) CO2'in organik bileşiklere indirgenmesi. Ototrofik büyüme için gereken enerji ATP'den sağlanır, CO2'in indirgenmesi için gerekli elektronlar ise NADH'dan (NADPH) sağlanır. Bunlar (NADH veya NADPH) daha sonra tartışılacak olan çeşitli elektron vericilerden temin edilen elektronlar tarafından NAD+ (veya NADP+)'in indirgenmesi ile üretilir. Ototrofik reaksiyonları sürdürmek için, bazı fototrofik bakteriler çevrelerindeki elektron vericilerden, tipik olarak indirgenmiş kükürt kaynaklarından (H2S, S°, S2O32") veya H 2 'den indirgeyici güç elde ederler. Diğer taraftan, yeşil bitkiler, algler ve siyanobakteriler NADP+'ı NADPH'e indirgemek için indirgeyici gücün bir kaynağı olarak zayıf bir elektron kaynağı olan H2O'yu kullanırlar («& Şekil 5.9). H 2 O'nun oksidasyonu ile bir yan ürün olarak moleküler oksijen (O2) üretilir (Şekil 17.2»). Oksijen üretildiği için, bu organizmalardaki fotosentez, oksijenik fotosentez olarak adlandırılır. Birçok fo-
Anoksijenik indirgeyici güç H2S»,
Oksijenik
Karbon
Enerji
CO 2
A D P
1
Fotoheterotroflar (Organik Karbonu Kullanır)
„ -»
|
İndirgeyici güç H: O %
Karbon C 02
«s
Enerji
__ „ j, ADP
hv
•
SO42-
(CH 2 O) n
1/2 O 2
* » ATP
(CH 2 O) n
* -ATP
(b)
• Şekil 17.2 Fotosentezin özellikleri, (a) Anoksijeniğe karşı (b) oksijenik fotoroflarda enerji ve indirgeyici güç sentezi. Fototroflann her ikisi de ışıktan (hv) enerji elde etmelerine rağmen, oksijenik fototroflarda ışık aynca suyun oksijene oksidasyonunu da sağlar.
534 • Bölüm 17 • Metabolik Çeşitlilik
totrofik bakteride oksijen üretilmez ve bu yüzden süreç anoksijenik fotosentez olarak adlandırılır. Organizmaya bağlı olarak anoksijenik fotosentezle H2S gibi maddelerden direk olarak NADH'in üretimi ışıkla yapılabilir ya da yapılmayabilir. Diğer taraftan, oksijenik fotosentezle H 2 O'un O2'ye oksidasyonu daima ışık varlığında gerçekleşir (Şekil 17.2). Oksijenik fototroflar bu yüzden hem indirgeyici güç hem de enerji korunumu için ışığa gereksinim duyarlar.
H,C
H,C
Siklopentanon halkası
17.1 Kavramların Gözden Geçirilmesi •
•
Fototroflar ışıktan enerji elde ederler. Fotosentez, ATP'nin oluştuğu reaksiyonları ve NADH ile CO 2 'in indirgenmesinde ATP'nin tüketildiği reaksiyonları kapsar.
Klorofil a
•
Fotootrofların ve fotoheterotroflarm birbirlerine benzerlikleri ve farklılıkları nelerdir? • Bir oksijenik ve bir anoksijenik fototrof arasındaki önemli farklılık nedir?
Fotosentez sadece birkaç tip klorofil (oksijenik fototroflar) veya bakteriyoklorofil (anoksijenik fototroflar) içeren organizmalarda gerçekleşir. Klorofil, sitokromlar gibi bir porfirindir (eos Kısım 5.11). Fakat sitokromlardan farklı olarak, klorofilde porfirin halkasının merkezinde bir demir atomu yerine bir magnezyum atomu bulunur. Klorofil ayrıca, klorofilin fotosentetik zarlarda bulunan yağ ve hidrofobik proteinler ile ilişki kurabildiği bir hidrofobik alkol yan zinciri ve buna ek olarak porfirin halkasına bağlı özgül bileşenleri de içerir. Yüksek bitkiler, algler ve siyanobakterilerde temel klorofil olan klorofil s'ran yapısı Şekil 17.3a» 'da gösterilmiştir. Klorofil a yeşildir, çünkü en fazla kırmızı ve mavi ışığı absorblar, yeşili ışığı ise geçirir. Kısım 10.4'te elektromanyetik spektrumdan bahsetmiştik. Herhangi bir pigmentin spektral özellikleri en iyi onun absorbsiyon spektrumu ile ifade edilebilir. Bu spektrum, pigmentlerin farklı dalga boyundaki ışığı absorblamasınm bir ölçüm değeridir. Klorofil a içeren hücrelerin absorbsiyon spektrumu kırmızı (680 nm'lik bir dalga boyunda maksimum absorbsiyon) ve mavi ışıkta (430 nm'de maksimum) güçlü absorbsiyon göstermektedir (Şekil 17.3b). Klorofil Çeşitliliği Farklı absorbsiyon spektrumları ile ayırt edilen kimyasal olarak farklı bir kaç klorofil ve bakteriyok-
H,C
H,C
Siklopentanon halkası
Bakteriyoklorofil a (a)
0.9 0.8 0.7 0.6 cd
-os
Abs
Fotosentetik Pigmentler ve Hücre İçindeki Yerleşimleri
0.5 0.4
870
360 Â /
i
805(1
\430
A
47s
/ \ W§25 / \S \\ 5 9 0
0.3 0.2
W
rv / \J/ »1
X \
0.1 n 340 400
1 /1II1 /İl
11
500
600
700
800
900
Dalga boyu (nm) (b)
• Şekil 17.3 Klorofil a ve bakteriyoklorofil a'nın yapılan ve spektrumları. (a) İki molekül san ve yeşil olarak farklılaşmış bölümleri dışında benzerdir, (b) Yeşil alg Chlamydomonas (Kısım 14.13) hücrelerinin absorpsiyon spektrumlan (yeşil eğri). 680 ve 430 nm'deki pikleri klorofil a'dan kaynaklanır; 480 nm'deki pik karotenoidlerden kaynaklanır; fototrofik mor bakteri Rhodopseudomonas palustris (<3Cfe Kısım 12.2) hücreleri (kırmızı eğri). 870,805,590 ve 360 nm'deki pikler bakteriyoklorofil a varlığından kaynaklanır, oysa 525 ve 475 nm'deki pikler karotenoidlerden kaynaklanır.
17 2 • Fotosentetik Pigmentler ve Hücre İçindeki Yerleşimleri • 535
lorofil (bakteriyoklorofil anoksigenik fototroflarda bulunan klorofil tipi) vardır. Örneğin klorofil b 680 nm'den ziyade maksimum 660 nm'de absorbsiyon yapar. Birçok bitkide birden daha fazla tipte klorofil bulunur, fakat en yaygını klorofil a ve b'dir. Prokaryotlar arasında, siyanobakteriler klorofil «'ya sahiptirler, fakat mor kükürt bakterileri gibi anoksijenik fototroflar birkaç tip bakteriyoklorofilden herhangi birisine sahip olabilirler (Şekil 17.3 ve 17.4»). Bakteriyoklorofil a (Şekil 17.3) en fazla mor bakterilerde bulunur (Ö°G Kısım 12.2). Bu bakteriler fototrofun türüne bağlı olarak maksimum 800 ve 925 nm arasında absorbsiyon yaparlar. Farklı türler farklı pigment bağlayan proteinlere sahip olup, bakteriyoklorofil a'nın absorpsiyon maksimumu bu proteinlerin doğasındaki birkaç değişikliğe ve fotokomplekslerdeki yerleşim şekillerine bağlıdır. Filogenetik hatlar boyunca dağılım gösteren diğer bakteriyoklorofiller görünür ve kızılötesi spektrumun diğer bölgelerini absorblar (Şekil 17.4).
Niçin farklı organizmalar farklı dalga boylarında ışığı absorblayan farklı klorofil tiplerine sahiptirler? Muhtemelen bu, elektromanyetik spektrum enerjisini daha iyi kullanmak için bir stratejidir. Absorplanmış ışık enerjisi enerji korunumu için yararlıdır. Farklı pigmentlere sahip olan ve birinin kullandığı ışığın dalga boyunu diğeri kullanamayan iki organizma aynı habitatta bulunabilir. Bu yüzden, pigment çeşitliliği ekolojik öneme sahiptir. Fotosentetik Zarlar ve Kloroplastlar
Klorofil pigmentleri ve ışık toplama araçlarının diğer tüm bileşenleri hücre içindeki fotosentetik zar adı verilen özel zar sistemleri içinde bulunurlar. Fotosentetik zarların yerleşimi prokaryotik ve ökaryotik mikroorganizmalar arasında farklılıklar gösterir. Okaryotiklerde fotosentez, kloroplast adı verilen özel hücre içi organellerle ilgilidir (Şekil 17.5a»; ansKısım 14.3). Klorofil pigmentleri, kloroplastın tabaka benzeri (lamellar) zar yapılarına
Pigment/Absorp. maks. [in vivo) Bchlfl (mor bakteriler)/ 805,830-890
R6
Bchl b (mor bakteriler)/ 835-850,1020-1040
—CH3
C—O—CH 3
P/Gg°—H
-CH,
-H O
°
H Bchlc I „., (yeşil kükürt r bakterileri)/745-755| 3 OH Bchl cs (yeşil kükürtsüz bakterileri)/740
:H2—CH3
—C—CH, 3 IIII °
R7
™. "^"3
—H
F
—CH,
—H
S
—CH,
-CH,
H
I
—CH,
—CH,
OH H Bchl d (yeşil kükürt _T_T\A bakterileri)/705-740|^t-H3 OH
H Bchlc (yeşil kükürt __r_rH bakterileri)/719-726-| L t l 3 OH
__r J-T ~Ltı3
_r H ~<~3H7
F
—H
H
4 9
—H O
F
—CH,
-C4H9
H (heliyobakteri)/ 670, 788
C=CH2
—CH3*
:
2H5
-CH,
F
—H
"P, Fitil ester (C 2 0 H 3 9 O—); F, farnesil ester (C-^Hj^O—); Gg, grenilgeraniol ester (C-^H^O—); S, stearil alkol (C 1 8 H 3 7 O—). 6
C 3 ve C 4 arasında çift bağ yok; C 3 ve C 4 pozisyonlarında ilave H atomları.
c
C 3 ve C 4 arasında çift bağ yok; C 3 pozisyonunda H atomu.
''Bakteriyoklorofil c, d ve e, R 3 'de görülen değişik grupların izomerik karışımlarından oluşur.
• Şekil 17.4 Bilinen tüm bakteriyoklorofillerin (Bkl) yapısı. Rl - R7 pozisyonunda farklı bileşenlerin eklendiği yapılar listelenmiştir. Absorpsiyon özellikleri %60 sukroz gibi (ışık dağılımını ve spektrumun bozulmasını azaltır) viskoz bir sıvıda sağlam hücreleri süspanse ederek ve Şekil 17.3'de görüldüğü gibi absorpsiyon spektrumlanm belirleyerek saptanabilir, in vivo absorpsiyon maksimumları fizyolojik olarak absorpsiyon pikleri ile ilişkilidir. Organik çözücülerde çözülmüş bakteriyoklorofillerin spektrumu oldukça farklıdır.
536 • Bölüm 17 • Metabolik Çeşitlilik
Dış zar Granayı oluşturan tilakoyid yığınları
İç zar (b)
• Şekil 17.5 Kloroplast. (a) Kloroplastlan görünen bir alg hücresinin fotomikrografı. (b) Stroma adı verilen iç yüzeyde tilakoid zarların nasıl katlandığını ve grana adı verilen zar yığınlarının nasıl oluştuğunu gösteren detaylı kloroplast yapısı.
tutunmuşlardır (Şekil 17.5b). Bu fotosentetik zar sistemleri tilakoid olarak adlandırılırlar; tilakoid yığınlarına ise grana denir (Şekil 17.5b). Tilakoidler öyle düzenlenmiştir ki bu yüzden kloroplast iki kısma ayrılır. Bunlar; tilakoidleri çevreleyen matriks yüzey ve tilakoid dizilişi içindeki iç yüzeydir (Şekil 17.5b). Bu düzenlenme Kısım 17.5'te anlatılacağı gibi ATP sentezlemede kullanılabilen ışık merkezli bir proton motive güç oluşumunu mümkün hale getirir. Prokaryotlarda, kloroplastlar bulunmaz. Bunlarda fotosentetik pigmentler iç zar sistemlerine kaynaşırlar. Bu sistemler (1) sitoplazmik zarın içeriye doğru girinti yapmasıyla oluşur (mor bakteriler) (örneğin, ö°c>Şekil 12.3; ayrıca bakınız Şekil 17.12), (2) sitoplazmik zarın kendisinden oluşur (heliobakteriler; öOöKısım 12.20), (3) hem sitoplazmik zarda ve hem de özelleşmiş klorozom (chlorosome) adı verilen birim zarla çevrelenmemiş yapılarda oluşur (yeşil bakteriler; bakınız Şekil 17.17 ve £>cfeKısım 12.32) veya (4) tilakoid zarlarda oluşur (siyanobakteriler, sasKısım 12.25). Reaksiyon Merkezleri ve Anten Pigmentler
Klorofil veya bakteriyoklorofil molekülleri fotosentetik bir zar içerisinde 50-300 molekülden ibaret kompleksler oluşturacak şekilde proteinlerle ilişki halindedir (Şekil 17.6»). Reaksiyon merkezleri adı verilen bu pigment moleküllerinin sadece çok küçük bir miktarı ışık enerjisinin ATP'ye dönüşümünde direk olarak iş görür (Şekil 17.6). Reaksiyon merkezi klorofili veya bakteriyoklorofilleri daha fazla sayıda ışık toplayan veya anten klorofiller veya bakteriyoklorofillerle çevrilidirler. Anten pigmentleri ışığı toplamada iş görürler ve ışık enerjisini reaksiyon merkezine aktarırlar (Şekil 17.6). Doğada oldukça sık görülen düşük ışık yoğunluklarında, pigment moleküllerinin bu düzenlenişi fotonların yakalanması ve kullanılmasını sağlar. Aksi halde, reaksiyon merkezi fotokimyasının sürdürülmesinde yetersiz kalacaktır.
Düşük ışık etkinliğinde asıl işlev yeşil kükürt bakterileri ve Chloroflexus''un klorozom (Şekil 17.7 •)'unda gerçekleşir. Bu yapı, dev bir anten sistemidir. Fakat diğer fototroflarm anteninden farklı olarak klorozomdaki bakteriyoklorofil molekülleri proteinlere bağlı değildir ve onun yerine daha fazla yarı iletken bir devreye (a solid state circuit) benzer şekilde iş görür. Klorozom bakteriyoklorofilleri (bakteriyoklorofil c, d ve e, bakınız Şekil 17.4) ışığı absorplar ve bu enerjiyi sitoplazmik zardaki reaksiyon merkezinde yerleşik olarak bulunan bakteriyoklorofil fl'ya aktarır (Şekil 17.7). Bu düzenlenme,
1
;
RC
RC i
RC
RC
• Şekil 17.6 Fotosentetik bir zar içerisindeki reaksiyon merkezlerine karşı ışık-toplayan klorofil/bakteriyoklorofillerin düzenlenişine ait bir model. Işık toplayan moleküller (parlak yeşil) tarafından absorbe edilen ışık enerjisi fotosentetik elektron transport reaksiyonlarının başladığı yer olan reaksiyon merkezlerine (koyu yeşil, RC) aktarılır. Tüm pigment molekülleri spesifik pigment bağlayıcı proteinlerle zar içerisinde tutulur. Bu şekli Şekil 17.13 ve 17.15 ile kıyaslayınız.
17 3 • Karotenoidler ve Fikobilinler • 537 Görevlerini düşündüğümüzde niçin klorofil pigmentlerinin zarlarda bulunması bir zorunluluktur? Bir fotosentetik komplekste bulunan anten ve reaksiyon merkezi klorofil molekülleri arasındaki farklılık nedir ve niçin farklıdır? Hangi pigmentler klorozomda bulunur?
Karotenoidler ve Fikobilinler Klorofil veya bakteriyoklorofil fotosentez için zorunlu olmalarına rağmen, fototrofik organizmalar ışık enerjisini yakalama ve işleme işlevine karışan başka yardımcı pigmentler de bulundururlar. Bunlar karotenoidler ve fikobilinlerdir.
Bu pigmentler
başlıca fotokoruyucu bir rol (karotenoidler) veya ışığı toplamada bir görev (fikobilinler) üstlenirler.
(a)
Karotenoidler
TP
Zar proteinleri • Şekil 17.7 Yeşil kükürt ve yeşil kükürtsüz bakterilerin klorozomu. (a) Yeşil kükürt bakterisi Chlorobium tepidum hücresinin elektron mikrografı. Klorozomlara (oklar) dikkat ediniz, (b) Klorozomun yapı modeli. Klorozom (yeşil), sitoplaznük zann iç yüzeyine yakın vaziyette yerleşmiş durumdadır. Anten bakteriyoklorofil (Bkl) molekülleri (Bkl c, d veya e) klorozomun içinde tüp dizileri şeklinde düzenlenmiş olup enerji sitoplaznük zarda (mavi) bakteriyoklorofillerden ışık toplayan Bkl a molekülü aracılığıyla reaksiyon merkezi (RM) Bkl a'ya aktarılır. Taban plaka (TP) proteinleri klorozom ve sitoplazmik zar arasında birleştirici olarak iş görür.
düşük yoğunluklardaki ışığı absorplamada yüksek oranda etkilidir. Bu kapsamda, yeşil kükürt bakterilerinin bilinen tüm fototroflar içinde en düşük ışık yoğunluklarında gelişebildikleri görülür. 17.2 Kavramların Gözden Geçirilmesi Fotosentezin merkezi pigmenti klorofildir (veya bakteriyoklorofil). Klorofiller fotosentezin ışık reaksiyonlarının gerçekleştiği fotosentetik zarlarda bulunurlar. Anten klorofil molekülleri ışık enerjisini toplar ve reaksiyon merkezi klorofillerine aktarır.
En fazla bulunan yardımcı pigmentler daima fototrofik organizmalarda bulunan karotenoidlerdir. Karotenoidler, zara sıkı bir şekilde gömülmüş olan hidrofobik pigmentlerdir. Şekil 17.8»'de tipik bir karotenoid olan p-karotenin yapısı görülmektedir. Karotenoidler C — C ve C = C bağlarının değiştiği uzun hidrokarbon zincirlerine sahiptir. Bu düzenleme konjuge bir çift bağ sistemi olarak isimlendirilir. Karotenoidler tipik olarak sarı, kırmızı, kahve rengi veya yeşil renktedirler (coç> Şekil 12.2) ve spektrumun mavi bölgesindeki ışığı absorplar (bakınız Şekil 17.3). Çeşitli fototroflarm karotenoidlerinin tipi ve yapısı üzerinde oldukça fazla çalışma yapılmış olup anoksijenik fototroflarm önemli karotenoidleri Şekil 17.9»'da görülmektedir. Bu pigmentler anoksijenik fototroflarm farklı türlerinde gözlenen kırmızı, mor, pembe, yeşil, sarı veya kahverenginin parlak renklerinden sorumludurlar (ÖOÇ» Şekil 12.2 ve 12.5). Karotenoidler fotosentetik pigment komplekslerinde klorofil veya bakteriyoklorofil ile yakından ilişkilidirler. Fakat ATP sentezinde direk olarak iş görmemekle birlikte reaksiyon merkezine enerji transfer ederler ve bu transfer edilen enerji direk olarak klorofil tarafından yakalanan ışık enerjisinde olduğu gibi ATP yapımında kullanılabilir. Karotenoidler ayrıca fotokoruyucu ajanlar olarak da iş görürler. Parlak ışık singlet oksijen 0O2) gibi oksijenin toksik formlarının oluşmasına neden olabilen fotooksidasyon reaksiyonlarını katalizlediği için hücrelere zararlı olabilirler (<»a Kısım 6.16). Bu H,CCH
H,(X
• Şekil 17.8 Tipik bir karoteoid olan fi karatenin yapısı. Konjuge çift bağlı sistem turuncu renkte gösterilmiştir.
B
538 • Bölüm 17 • Metabolik Çeşitlilik
I. Alifatik karotenoidler
OCH,
İzorenieraten Anahtar 1 | Heliobakteriler Yeşil kükürtsüz bakteriler (Chloroflexus) Yeşil kükürt bakterileri
Mor bakteriler j g Mor bakteriler (hava varlığında) • • Y e ş i l kükürt bakterileri (kahverengi renkli türler)
Keto karotenoidler
• Şekil 17.9 Anoksijenik fototroflarda yaygın olarak bulunan bazı karotenoidlerin yapısı. Şekil 17.8'de gösterilen fi karoten yapısı ile burada nasıl çizildiğini kıyaslayınız. Basitleştirmek için, burada gösterilen yapılarda, metil (CH3) grupları sadece bağlar halinde gösterilmiştir. Aril karotenoidler alifatik karotenoidlerden ayrılırlar, çünkü bir uçta aromatik bir halka içerirler. Mor bakteriler Kısım 12.2'de, heliobakteriler Kısım 12.20'de, yeşil kükürt bakterileri Kısım 12.32'de, yeşil kükürtsüz bakteriler Kısım 12.35'de tartışılmıştır.
oksijen tipleri daha sonra okside olabilir ve bu yüzden fotosentetik araçların bileşenleri zarar görebilir. Karotenoidler toksik oksijen tiplerini baskılayabilir ve zararlı ışığın çoğunluğunu absorplayabilir. Fototrofik organizmalar ışıkta yaşamak zorunda oldukları için, karotenoidlerin fotokoruyucu işlevi önemli bir avantajdır. Fikobiliproteinler ve Fikobilizomlar
Siyanobakteriler ve kırmızı alglerdeki kloroplastlar fikobiliproteinler içerir. Fikobiliproteinler, bu
organizmaların başlıca ışık toplayan (anten) pigmentleridir. Fikobiliproteinler proteinlere kaynaşmış açık zincirli tetrapirolden ibaret olan kırmızı veya mavi pigmentlerdir (Şekil 17.10a»). Fikoeritrin denen kırmızı pigment 550 nm dalga boyu civarındaki ışığı en güçlü şekilde absorplarken, fikosiyanin (Şekil 17.10a) 620 nm'de en güçlü absorpsiyonu gerçekleştirir (Şekil 17.11»). Allofikosiyanin adı verilen üçüncü bir pigment yaklaşık 650 nm'de absorpsiyon yapar. Fikobiliproteinler fotosentetik zarlara kaynaşmış olan ve fikobilizomlar adı verilen yüksek moleküler ağırlıklı kümeler halinde oluşur (Şekil 17.10b,c). Fikobilizomlar allofikosiyanin moleküllerinin fotosentetik zar ile fiziksel teması sağlamak amacıyla oluşturulur. Allofikosiyanin, fikosiyanin veya fikoeritrin molekülleri ile çevrilidir (veya organizmaya bağlı olarak her ikisi ile de). Fikosiyanin ve fikoeritrin pigmentleri ışığın daha kısa dalga boylarını (daha yüksek enerji) absorplar ve enerjiyi reaksiyon merkezi klorofiline yakın olan allofikosiyanine aktarır. Bu da enerjiyi reaksiyon merkezi klorofiline aktarır. Böylelikle, fikobilizomların çok etkili enerjiyi biliprotein kompleksinden klorofil fl'ya aktardığı görülmektedir. Bu sayede, siyanobakterilerin açık bir şekilde düşük ışık yoğunluklarında çoğalması mümkün olmaktadır. Aslında, ışık yoğunluğu azaldıkça siyanobakteri hücrelerinde fikobilizom içeriği artar. Karotenoidler ve fikobiliproteinler gibi yardımcı pigmentlerin ışık-toplama görevi organizma için önemli bir avantajdır. Güneşten gelen ışık tüm görünür bölge aralığını dağıtır (ÖQQ Şekil 10.6). Klorofiller ise bu spektrumun sadece bir kısmında iyi absorpsiyon yapar. Yardımcı pigmentler, organizmanın elde edilebilir ışığın daha fazlasını yakalamasını sağlar.
-m
17.3 Kavramların Gözden Geçirilmesi
Karotenoidler ve fikobilinler gibi yardımcı pigmentler ışığı absorbe ederler ve enerjiyi reaksiyon merkezi klorofiline aktarırlar. Böylelikle fotosentezde kullanılabilir ışığın dalga boyu bandını genişletirler. Karotenoidler ayrıca hücrelerde fotooksidatif hasarı önlemede önemli fotokoruyucu bir işleve de sahiptir. • •
Hangi organizmalarda fikobiliproteinler bulunur? Bir fikobiliprotein yapısı klorofil yapısı veya bir karotenoidle kıyaslandığında nasıldır? • Fikosiyanin mavi-yeşil renktedir; onun tarafından ışığın hangi dalga boyları absorplanmaktadır (fi*fe Şekil 10.6)?
Oksijensiz Fotosentez Fototrofik organizmalarda ışık yoluyla ATP sentez süreci bir seri elektron taşıyıcılar içinde elektron aktarımını gerektirir. Bu taşıyıcılar elektronegatif
17 4 • Oksijensiz Fotosentez • 539
-CH, HN
Allofikosiyanin
1=CH—CH3
f=
CH 3
HN
-CH2—CH2—COOH
HC,
CH2—CH2—COOH CH3
HC
CH3
HN (a)
JT
Reaksiyon merkezine enerji transferi
-CH?—ChU
Fikosiyanin
• Şekil 17.10 Fikobiliproteinler ve fikobilizomlar. (a) Tipik bir fikobilin. Bu bileşik, bir karbon atomunun karbon monoksit olarak eksilmesi ile kapalı bir porfirin halkasından biyosentetik olarak oluşmuş açık zincirli bir tetrapiroldür. Görülen yapı siyanobakterilerde (<^fe Kısım 12.25 ve kırmızı alglerde (£**5 Kısım 14.13) bulunan fikosiyaninin prostetik grubudur, (b) Birfikobilizomyapısı. Fikosiyanin allofîkosiyaninden daha yüksek enerjileri (daha kısa dalgaboylan) absorplar. Klorofil a allofikosiyaninden daha uzun dalga boylarını absorplar. Enerji akışı böylece:fikosiyanin—> allofikosiyanin —> klorofil a şeklindedir, (c) Bir siyanobakteri olan Synechocystis'in ince kesitinin elektron mikrograu. Lamellar zarlara kaynaşmış koyu boyanan top benzeri fikobilizomlara (oklar) dikkat ediniz.
olanlardan daha elektropozitif indirgenme potansiyeli olanlara doğru seriler halinde fotosentetik komplekslerde düzenlenmişlerdir (Eo, o<*s Kısım 5.6). Göreceğimiz gibi, bunun sayesinde proton motive güçten ATP'nin sentezi gerçekleşir. Fotosentetik Reaksiyon Merkezleri Mor fototrofik bakterilerde fotosentetik araçlar çeşitli morfolojilere sahip sitoplazma içi zar sisteminde bulunurlar. Zar kesecikleri (kromoforlar) veya lamella yaygın bulunan zar tipleridir (Şekil 17.12*). Mor bakterilerin reaksiyon merkezleri L, M ve H alt birimlerinden oluşmuş üç polipeptitten ibarettir. Bu proteinler fotosentetik zara sıkıca gömülmüş ve çok kez zarı katetmişlerdir (Şekil 17.13b*}. L, M ve H polipeptidleri reaksiyon merkezi fotokompleksine bağlanmışlardır. Bu kompleks özel çift olarak 0.9 0.8
/
0.7 E
|
0-6
V—Klorofil \ a pikleri \
/
\
\ Fikosiyanin \ piki — _ *
\
0.5
1 0.4 0.3 0.2 0.1
340 400
\/n 500
600
V
700
800
Dalgaboyu (nm)
• Şekil 17.11 Yardımcı pigment olarak fikobiliprotein (fikosiyanin) içeren bir siyanobakterin absorpsiyon spektrumu. Fikosiyanin varlığının kullanılabilir ışık enerjisinin (600 ve 700 nm arası) dalga boyunu nasıl arttırdığına dikkat ediniz. Şekil 17.3i) ile kıyaslayınız.
adlandırılan iki molekül bakteriyoklorofil a, ilave olarak işlevi bilinmeyen iki bakteriyoklorofil a, iki molekül bakteriyofeofitin (magnezyum atomu eksik olan bakteriyoklorofil a), iki molekül quinon ve iki molekül karotenoid pigmentinden ibarettir (Şekil 17.13a). Bu reaksiyon merkezlerinin tüm bileşenleri sonuçta ATP üretiminin oluşması için gereken çok hızlı şekilde elektron transfer reaksiyonlarında birlikte rol oynayabilirler. Mor Bakterilerde Fotosentetik Elektron Akışı Fotosentetik reaksiyon merkezinin, reaksiyon merkezine ışık enerjisinin sağlanmasında iş gören ışık toplayan anten bakteriyoklorofil a kompleksleri ile çevrili olduğunu hatırlayınız (bakınız Şekil 17.6). Fotonlardan ışık enerjisi, antenden ekskiton adı verilen paketler halinde reaksiyon merkezine aktarılır. Bu ekskiton anten pigmentleri içinden reaksiyon merkezine göç eden yüksek etkinlikte enerjinin hareketli formlarıdırlar. Ekskiton enerjisi, bakteriyoklorofil a moleküllerinin özel çifte çarptığında fotosentez başlar (Şekil 17.13a). Enerjinin absorpsiyonu özel çifti uyarır ve onu çok düşük bir indirgenme potansiyeli olan güçlü bir elektron vericisine dönüştürür. Bu güçlü verici bir kez uyarılırsa, fotosentetik elektron akışmdaki sonraki basamaklar, elektronların bir zar içerisindeki düşük E0'lı taşıyıcılardan yüksek Eo lılara aktarılması sırasında salman enerjiyi dönüştürmekde iş görür. Uyarılmadan önce, P870 adı verilen bakteriyal reaksiyon merkezi, yaklaşık +0,5 V'luk bir E0'a, uyarılmadan sonra ise yaklaşık -l,0V'luk bir potansiyele sahiptir (Şekil 17.14»). P870 içinde uyarılan elektron, bir molekül bakteriyofeofitin a'yı indirgemek üzere reaksiyon merkezi içinde yoluna devam eder (Şekil 17.13a ve
jj
540 • Bölüm 17 • Metabolik Çeşitlilik
niyeden mili saniyeye kadar değişen düşük hızda daha fazla elektron aktarım olayları gerçekleşir. Quinondan gelen elektronlar, bir seri demirkükürt proteinleri ve sitokromlardan geçerek (Şekil 17.14 ve 17.15) en sonunda reaksiyon merkezine geri dönerek zar içerisine aktarılır. Sitokrom bcı ve sitokrom c2 anahtar elektron transport proteinleridir (Şekil 17.14 ). Sitokrom c2 zara-bağlı bcı kompleksi ve reaksiyon merkezi arasında bir elektron alış verişi yapan periplazmik bir proteindir («3°© Kısım 5.11 ve Şekil 5.20,17.14 ve 17.15). Fotofosforilasyon
Fotosentetik elektron akışı sırasında ATP sentezi, bir proton motive güç oluşumunun ve ATPaz aktivitesinin sonucu olarak proton motive gücün ATP oluşumuna dönüşümünde meydana gelir (<**> Kısım 5.12). Sitokrom c2 özel çift bakteriyoklorofillere bir elektron verdiğinde reaksiyon serileri tamamlanır (Şekil 17.13); bu, onları orijinal temel hal potansiyeline (E0'=+0,5V) geri döndürür. Reaksiyon merkezi daha sonra yeni enerji absorplayabilir ve süreç tekrarlanabilir. ATP üretimindeki bu yöntem fotofosforilasyon, özellikle kapalı bir devre içinde elektronlar hareket ettikleri için devresel fotofosforilasyon olarak isimlendirilir. Devresel fotofosforilasyon solunuma benzer. Çünkü zar içerisinde ilerleyen elektron bir proton motive güç oluşturur. Ancak, solunumdan farklı olarak devresel fotofosforilasyonda net
(a)
,
-'•:•-
bir elektron kazancı veya kaybı yoktur; elektronlar ba-
Lamelli membranlar
(b) • Şekil 17.12 Anoksijenilc fototroflarda zarlar, (a) Kromatoforlar. Bir veziküler fotosentetik zar içeren fototrofik mor bakteri Rhodobacter capsulatus hücresinin kesiti. Veziküller sitoplazmik zann kıvnlmı ile oluşur. Açık alanlar depo polimeri olan poli-/3-hidroksibutirafın (C*KI Kısım 4.13) depolandığı bölgelerdir. Bir hücre 1 (jm enindedir. (b) Bir halofilik mor bakterideki lamellar zarlar. Bir hücre yaklaşık 1,5 |jm enindedir. Aynca bu zarlar, vezikül oluşturma yerine sitoplazmik zar kıvrımından da oluşur. Bu yapılar siyanobakterüerin tilakoidlerine benzer şekilde zar yığınları olarak düzenlenirler.
17.14). Bu geçiş çok hızlı şekilde bir saniyenin yaklaşık sadece trilyonda üçü (3 X 10~12) kadar hızda gerçekleşir. Bir kez indirgendiğinde, bakteriyof eof itin a zar içerisinde birkaç aracı quinon molekülünü indirger. Bu geçiş de saniyenin milyarda birinden daha az hızda gerçekleşecek kadar hızlıdır (Şekil 17.14 ve 17.15*). Reaksiyon merkezinde, mikrosa-
sitçe dairesel bir rotada ilerler. Mor bakteriyal fotosentetik zarda elektron taşıma üyelerinin üç boyutlu ilişkisi Şekil 17.15'de gösterilmiştir. Solunumdaki elektron akışında olduğu gibi (0°o Kısım 5.11), ATP sentezini sürdürmek için kullanılan proton motive güç oluşturmanın temel bir aracı olarak fotosentetik elektron akışı {cfd Şekil 5.20) sırasında sitokrom bcı kompleksinin quinon havuzu ile temas ettiğine dikkat ediniz (Şekil 17.15). Bakteriyal Fotosentezin Genetiği
Mor fototrofik bakteriler gram-negatif prokaryotlardır (O°Ö Kısım 12.2) ve bazı türleri genetik uygulamalara yatkındırlar. Rhodobacter cinsinin türleri, özellikle R. capsulatus ve R. sphaeroides bakteriyal
fotosentezde genetik araştırmaların temel araçlarındandır. Bu mor kükürtsüz bakterilerin her ikisininde genom (o°& Kısım 12.2) dizilimleri çıkarılmıştır. Rhodobacter'de fotosentezle ilgili genlerin çoğunluğu fotosentetik gen kümesi adı verilen kromozomun 50-kbp lik bir bölgesini içeren birkaç operonda kümelenmiştir (Şekil 17.16»). Fotosentetik gen kümesindeki genler (1) bakteriyoklorofil biyosentezi (bch genleri), (2) karotenoid biyosentezi (crt genleri) ve (3) reaksiyon merkezinde pigment
17.4 • Anoksijenik fotosentez • 541
(a)
• Şekil 17.13 Mor fototrofik bakterilerde reaksiyon merkezlerinin yapısı, (a) Reaksiyon merkezinde pigment moleküllerinin düzenlemesi. Bakteriyoklorofil moleküllerinin "özel çifti" üst üste gelmiş katlamış olup kırmızı ile gösterilmiştir, quinon molekülleri koyu san gösterilmiş ve sekilin alt kısmına yönelmiştir.Yardımcı bakteriyoklorofiller özel çifte yakın halde olup açık san ve bakteriyofeofitin molekülleri mavi ile gösterilmiştir, (b) Reaksiyon merkezi protein yapısımn moleküler modeli, (a)'da tartışılan pigmentler, protein H (mavi), protein M (kırmızı) ve protein L (yeşil) adı verilen üç reaksiyon merkezi proteini ile zarlara bağlıdır. Reaksiyon merkezi pigmentprotein kompleksi, lipid çift tabakasına kaynaşmıştır.
-1.0 Güçlü elektron verici
Devresel Elektron Akışı
P870* \
-0.75
Bph
-0.5
\ QA
|
NAD(P)+
0
NAEKP)H
y
(V) -0.25
/ '
Q pool
.
0.0 Cytöc,
+0.25 Cytc 2
Zayıf elektron verici
+0.5
P870
S
Ters elektron akışı (enerji gerektiren)
molekülleri ve ışık toplama komplekslerini (puf ve puh genleri) bağlayan polipeptidlerle ilişkili olan proteinleri kodlar (Şekil 17.16). Gen kümesi, fotokomplekslerde bakteriyoklorofilin, karotenoidlerin ve pigment bağlayan proteinlerin fotokomplekslerde doğru miktarlarda koordineli senteziyle bütünlüğü sağlar. Anoksijenik fototroflarda fotosentetik gen kümesinin transkripsiyonuna neden olan regülatör sinyal O2'dir. Fotosentezin sadece anoksik koşullarda gerçekleştiği bu organizmalardaki pigment sentezini moleküler oksijen baskılar. Rhodobacter türlerinin biyoenerjetik çeşitliliği mor bakterilerdeki fotosentezin genetik analizinde büyük oranda yardımcı olmuştur. Fotosentezdeki kapasitelerine ek olarak, bu organizmalar oksijen varlığı veya yokluğunda karanlıkta solunum yaparak gelişebilir. Böylece, fotosentez yapamayan mutantlar kolayca elde edilebilir ve fotosentez genlerinin sayısını, organizasyonunu, ilişkisini ve ifadesini karakterize etmek için genetik araştırmalarda (e*K> Bölüm 10) kullanılır (Şekil 17.16).
I
Kırmızı veya kızıl ötesi ışık
Harici elektron vericileri (H 2 S, S 2 O 3 2 ', S°, Fe2+)
• Şekil 17.14 Mor bir bakteride anoksijenik fotosentezde elektron akışının genel şeması. Sadece tek bir ışık reaksiyonu gerçekleşir. Işık enerjisinin, zayıf bir elektron vericisini, P870, çok güçlü bir elektron vericisine, P870*, dönüştürdüğüne ve bu olayı takiben fotosentetik elektron akışındaki geri kalan aşamalann solunumdaki elektron akışına çok benzer olduğuna dikkat ediniz (Şekil 5.20). Bph, bakteriyofeofitin; Q , Q , ara ürün quinonlan; 0 havuzu, zardaki guinon havuzu; Cyt, sitokrom.
542 • Bölüm 17 • Metabolik Çeşitlilik DlŞ (periplazma) 3H
gelen enerji ile gerçekleştirilir. Ters elektron akışı ayrıca bir çok durumda aşırı derecede pozitif E0"i olan elektron vericilerden kemolititrofların indirgeyici güç elde etme mekanizmasıdır (bakınız Kısım 17.8-17.12).
+
Diğer Anoksijenik Fototroflarda Fotosentez Fotosentetik elektron akışındaki tartışmamız şimdiye kadar mor bakteriler üzerineydi. Benzer zar bileşenleri diğer anoksijenik fototroflarda fotofosforilasyonu sürdürmesine rağmen, indirgeyici güç üzerine etki eden bazı fotokimyasal reaksiyonlarda farklılıklar vardır. Şekil 17.18», mor ve yeşil bakterilerin ve heliobakterilerin fotosentetik elektron akışını kıyaslamaktadır. Son iki gruptaki reaksiyon merkezi bakteriyoklorofillerinin uyarılma durumlarının mor bakterilerininkinden kayda değer şekilde daha negatif Eo' olduğuna ve gerçek klorofil a (yeşil bakteriler) veya hidroksiklorofil a adı verilen klorofil a'nın yapısal modifiye bir şeklinin reaksiyon merkezinde bulunduğuna dikkat ediniz. Bu yüzden, mor bakterilerden farklı olarak, ilk kararlı alıcı molekülün (quinon) yaklaşık OV'luk bir Eo' değerine sahip olduğu yerde, yeşil bakteriler ve heliobakterilerin alıcıları (FeS proteinleri) NADH'dan çok daha elektronegatif bir Eo' 'a sahiptir. Yeşil bakterilerde, ferredoksin (bir FeS proteini tarafından indirgenmiş, Şekil 17.24a) adı verilen bir protein ters sitrik asit döngüsünde CO2 fiksasyonunda direk elektron vericisidir (bakınız Şekil 17.24a). Bu yüzden oksijenik fototroflar gibi (daha sonra tartışılacak), yeşil bakteriler ve heliobakterilerin her ikisinde ATP ve indirgeyici güç ışık reaksiyonlarının direk ürünleridir. Sülfür, yeşil bakterilerde indirgeyici güç sentezinde elektron vericisi olduğunda, S° globülleri mor bakterilerdeki gibi üretilir, ancak bu globüller hücre içi yerine dışarıda bulunurlar (Şekil 17.17b).
2H+ ATP
İç (sitoplazma) 3H
+
• Şekil 17.15 Mor fototrofik bir bakterinin fotosentetik zarında protein komplekslerinin düzenlenişi. Işıkla oluşan proton gradienti ATP sentaz (ATPaz) yardımı ile ATP sentezinde kullanılır. LH, Işık toplayan bakteriyoklorofil kompleksleri; RM, reaksiyon merkezi; Bf, bakteriyofeofitin; 0, quinon; FeS, demirsülfürlü protein; bcv sitokrom bcı kompleksi; c2, sitokrom c2. Sitokrom bc: kompleksi ve Q döngüsünün, detayı verilmeyen işlevi için Şekil 5.20'ye bakınız. ATPaz işlevinin tanımlaması için Şekil 5.2 l'e bakınız.
Mor Bakterilerde Ototrofi: Elektron Vericiler ve Ters Elektron Akışı Ototrofik olarak gelişen bir mor bakteride ATP oluşumu yeterli değildir. CO2'in hücre materyali şeklinde indirgenebilmesi için aynı zamanda indirgeyici gücün (NADH) yapılması gerekir. Daha öncede değinildiği gibi, S°, S2O32~ ve hatta Fe2+ çeşitli türler tarafından kullanılabilmesine rağmen bu indirgeyici güç mor kükürt bakterilerinde H2S'den gelmektedir. H2S mor kükürt bakterilerinde elektron vericisi olduğunda, S° globülleri hücreler içinde biriktirilir (Şekil 17.17a»). H2S gibi indirgenmiş maddeler c tipi sitokromlar tarafından okside edilir ve gelen elektronlar sonuçta fotosentetik zarın "quinon havuzunda" sonlanır (bakınız Şekil 17.14). Ancak, quinonun E 0 'i (yaklaşık 0 volt) NAD+'yı (-0,32 V) direk olarak indirgemek için yeterince negatif değildir. Bunun yerine, quinon havuzundan gelen elektronlar NAD+'yı NADH'a indirgemek için termodinamik gradiente karşı geriye doğru güçlendirilmelidir (Şekil 17.14). Enerji gerektiren bu süreç ters elektron akışı olarak isimlendirilir ve proton motive güçten A ML
•İli
H
B N F
17.4 Kavramların Gözden Geçirilmesi Bir seri elektron taşınım reaksiyonları anoksijenik fototroflarm fotosentetik reaksiyon merkezinde gerçekleşir ve sonuçta bir proton motive güç oluşur ve ATP sentezi gerçekleşir. CO2 fiksasyonu için indirgeyici güç çevrede mevcut indirgeyicilerden gelir ve mor fototroflarda ters elektron taşmımı gerekir. • Solunumdaki fosforilasyonla karşılaştırıldığında fotofosforilasyondaki elektron aktarımı nasıldır?
uı ı ı mı*e I•ıııııııııı ı PD
I
A
I BKCDE
F C X Y Z Q B A L M
• Şekil 17.16 Mor fototrofik bakteri olan Rhodobactcr capsulatus'un fotosentetik gen kümesinin haritası. Karotonoidleri sentezleyen proteinleri kodlayan crt genleri kırmızı ile, bakteriyoklorofil sentez proteinlerini kodlayan bch genleri yeşil ile gösterilmiştir. Reaksiyon merkezi polipeptidlerini kodlayan genler (puh ve puf genleri) mavi ile, ışık toplayıcı I polipeptidlerini (B870 kompleksi) kodlayan genler (puf genleri) san ile gösterilmiştir. Çapraz çizgilerle gösterilen genlerin görevleri bilinmemektedir. Oklar transkripsiyonun yönünü göstermektedir.
17 5 • Oksijenli Fotosentez • 543
ve elektronlara ayrılmasından oluşur. Işık reaksiyonları ile ilgili olan iki sistem fotosistem I vefotosistem II olarak adlandırılır. Her fotosistem, reaksiyon merkezinde bulunan klorofil a'nın farklı ışık dalga boyu spektrumuna sahip olması ile farklılaşır. Fotosistem I'deki klorofil P700 olarak adlandırılır ve uzun dalga boyundaki ışığı absorplar (kırmızı ışık ötesi), buna karşılık P680 olarak adlandırılan fotosistem H'deki klorofil ise kısa dalga boylarını absorplar (kırmızı ışığa yakın). Anoksijenik fotosentez gibi, oksijenik fotokimyasal reaksiyonlar zarlarda meydana gelir. Okaryotik hücrelerde, bu zarlar klorophstda bulunur (Şekil 17.5), ancak siyanobakterilerde fotosentetik zarlar sitoplazma içerisinde yığınlar halinde organize olurlar (Şekil 17.6). Fototrofların her iki grubunda da (oksijenik-anoksijenik) zarlar benzer bir yolla düzenlenir ve klorofil a'nm iki tipi zardaki özgül proteinlere bağlanır ve Şekil 17.19»'da gösterildiği gibi etkileşir.
(b)
Şekil 11.12 Aydınlık alan mikroskobu yardımı ile çekilmiş fototrofik mor bakterilerin fotomikrograflan. (a) Mor bakteri: Chromatium okenii. Hücre içinde biriken kükürt granüllerine (oklar) dikkat ediniz, (b) Yeşil bakteri: Chlorobium limicola. Refraktil yapılar hücre dışında biriken kükürt granülleridir (oklar). Her iki durumda da, indirgeyici gücü elde etmek için kükürt granülleri H2S'in oksidasyonundan sağlanır. C. okenii hücreleri yaklaşık 5 |jm çapında, C. limicola hücreleri yaklaşık 0,9 (jm çapındadır. •
Oksijenik Fotosentezdeki Elektron Akışı
Oksijenik fototroflardaki elektron akış yolu, kendi etrafında çevrilmiş Z harfine benzer ve ana taslağı Şekil 17.19'da gösterilmiştir. Buna "Z şeması" denilmektedir. Fotosistem IFdeki P680 klorofil a molekülünün indirgenme potansiyeli oldukça elektropozitiftir. Hatta O 2 /H 2 O çiftinden daha pozitiftir. Bu durum, termodinamik açıdan zor olan suyun hidrojen ve oksijen atomlarına ayrılması durumunda oksijenik elektron akışındaki ilk basamağı kolaylaştırır (Şekil 17.19). Suyun bir elektronu, yaklaşık 680 nm ışığın kuantum absorpsiyonunu takiben
Ters elektron akışı nedir ve niçin gereklidir? Hangi fototroflar ters elektron akışını kullanmaya gereksinim duyar?
Oksijenli Fotosentez Anoksijenik fototroflara karşılık, oksijenik fototroflardaki elektron akışı, iki farklı ancak birbiriyle bağlantılı fotokimyasal reaksiyonlarla ilişkilidir. Oksijenik fototroflar ışığı, hem ATP hem de NADPH oluşturmada kullanırlar. NADPH, suyun oksijen Mor bakteriler
Yeşil kükürt bakterileri
-1.25 -1.0
Heliobakteriler P7 38*
P8 Kla-OH
Kİ a
P8 7 0 \ ^
y
\
BKI Bf
-0.75 -0.5
En' M
1-
-0.25
•
0
Cyt +0.25 v
3 •
+0.5 Işık
~ Ters
elektron
I Cyt C P8 40* 553
**
Cyt
S*
• Şekil 12.18 Mor bakteriler, yeşil kükürt bakterileri ve heliobakterilerde elektron akışının kıyaslanması. Mor bakterilerde ters elektron akışında temel alıcının (quinon, O) NAD+/NADH çiftinden potansiyel olarak nasıl daha pozitif olması gerektiğine dikkat ediniz. E0"ı NADH'dan daha negatif olan ferredoksin (Fd) yeşil bakteri ve heliobakterilerde ışık merkezli reaksiyonlarla üretilmektedir. Yeşil bakterilerde ferrodoksin ototrofide karboksilasyon reaksiyonlarını gerçekleştirir (bakınız Şekil 17.24 a). Bkl, Bakteriyoklorofil; Bf, bakteriyofeofîtin. P870 ve 840 sırasıyla mor ve yeşil bakterilerin reaksiyon merkezleridir ve Bkl a'den ibarettir. Heliobakteri'lerin reaksiyon merkezleri (P798) Bkl g içermektedir. Chloroflexus'\xn reaksiyon merkezi mor bakterilerinMne benzer. Yeşil bakteriler ve heliobakterilerde reaksiyon merkezlerinde klorofil a'nm varlığına dikkat ediniz.
544 • Bölüm 17 • Metabolik Çeşitlilik
P700*
-1.25 Z Şeması:
-1.0
-0.75
\
N
Kla
° I
P680*
FeS Devresel elektron akışı (proton itici güç oluşturur)
-0.5
+
NAD(P)
-0.25
M Devresel olmayan elektron akışı (proton itici \ güç oluşturur)
+0.25
PC P700
+0.5
Fotosistem I
+0.75
+1.0
2H
P680
Fotosistem II
Işık
• Şekil 17.19 Oksijenik (yeşil bitki) fotosentezde elektron akışı,"Z"şeması. FSI ve FSII olmak üzere iki adet fotosistem (FS) bulunur. F, Feofitin; O, quinon; Kİ, klorofil a; Sit, sitokrom; PS, plastosiyanin; FeS, heme grubu içermeyen demir sülfür proteini; Fd, ferredoksin; Fp, flavoprotein; P680 ve P700 sırasıyla FSI ve FSII'nin reaksiyon merkezi klorofilleridir. Şekil 17.14 ile kıyaslayınız.
oksitlenmiş olan P680 molekülüne verilir. Işık enerjisi, P680'i yaklaşık -0,5 V E0''a sahip bir molekülü indirgeme yeteneğinde olan orta kuvvette bir indirgeyiciye dönüştürür. Bu molekülün yapısı bilinmemekle beraber muhtemelen feofitin a'dır (klorofil a magnezyum atomundan yoksundur). Buradan elektron, quinonlar, sitokromlar ve plastosiyanin olarak adlandırılan bakirli proteinleri içeren birçok zar taşıyıcılarına doğru yolculuk eder. Plastosiyanin, elektronları fotosistem I'e verir. Elektron, öncelikle ışığı absorbe eden ve NADP+'nın indirgenmesine yol açan adımı başlatan fotosistem I yani P700'ün reaksiyon merkezi klorofil tarafından alınır. Bunlar, NADP+'nm indirgenmesiyle sonlanan ve değeri gittikçe artan pozitif E 0 'ın birkaç taşıyıcısı yoluyla elektron taşır (Şekil 17.19). Oksijenik Fotosentezde ATP Sentezi
İndirgeyici gücün net sentezinin yanmda (NADPH) diğer önemli olaylar zardaki bir fotosistemden diğerine elektron akışı olurken gerçekleşir. Fotosistem II'deki elektron alıcısından, fotosistem I'deki reaksiyon merkezindeki klorofil molekülüne bir elektron
transferi sırasında, elektron transportu termodinamik açıdan uygun bir yönde gerçekleşir (negatiften pozitife). Bu durum ATP üretebilen bir proton motive gücü oluşturur. ATP üretiminin bu tipi devresel olmayan fotofosforilasyon olarak adlandırılır. Çünkü bu elektronlar okside olmuş olan P680'i tekrar indirgemek üzere geri dönmez, fakat bunun yerine NADP+'nın indirgenmesinde kullanılırlar. Yeterli indirgeyici güç olduğunda, ATP aynı zamanda oksidatif fosforilasyonda sadece fotosistem I ile ilişkili devresel fotofosforilasyonla üretilebilir (Şekil 17.18). Bu elektron transportu, elektronların ferrodoksinden sitokrom bf kompleksine yolculuğu sırasında oluşur, bf kompleksinden elektron transportu P700'e geri döner. Bu akış zar potansiyeli yaratır ve ilave olarak ATP sentezi gerçekleşir (Şekil 17.19'da kesikli çizilmiş hatta bakınız). Oksijenik Fototroflarda Anoksijenik Fotosentez
Fotosistem I ve II doğal olarak oksijenik süreçte birlikte iş görürler. Buna rağmen belli şartlar altında bazı algler ve siyanobakteriler, sudan başka kaynaklardan CO2 indirgenmesi için indirgeyici
17.6 • Ototrofik C02 Fiksasyonu: Calvin Döngüsü • 545
güç elde etmek için sadece fotosistem I'i kullanarak devresel fotofosforilasyonu gerçekleştirebilirler. Bu aslında anoksijenik fotosentezdir. Yeşil algler anoksijenik fotosentez için bir elektron vericisi olarak H2'yi kullanırken birçok siyanobakteri H2S'i kullanabilir. H2S kullanıldığında, H2S elemental kükürde (S°) okside olur ve kükürt granülleri yeşil kükürt bakterilerinin hücre dışında ürettiği ve depoladıklarına benzerdir (bakınız Şekil 17.17b). Bunun bir örneği Şekil 17.20»'de bir siyanobakteri olan Oscülatoria limnetica ile görülmektedir. Bu filamentli siyanobakteri, fotosentetik yeşil ve mor bakterilerle anoksijenik fotosentezin gerçekleştiği ve sülfürün bir oksidasyon ürünü olarak kükürtün üretildiği, sülfürce zengin tuz göllerinde yaşarlar (Şekil 17.20). O. limnetica'nm kültürlerinde, fotosistem H'den gelen elektron akışı H2S ile güçlü bir şekilde inhibe edilir, böylece eğer organizma canlı kalacaksa anoksijenik fotosentez zorunlu bir hal alır. Evrimsel yönden bakıldığında, devresel fotofosforilasyonun hem oksijenik hem de anoksijenik fototroflardaki varlığı, onların birbirleri ile olan yakın akrabalıklarının birçok belirtecinden biridir. Oscülatoria limnetica gibi oksijenik fototroflar fotosistem H'ye sahiptir ve bu yüzden suyu ayrıştırma yetenekleri vardır. Buna rağmen, bazı koşullar altında hala sadece fotosistem I'i kullanma yeteneğine sahiptirler. Nitekim anoksijenik fototroflar fototrofik gelişim sırasında sadece fotosistem I'i kullanırlar. 17.5
Kavramların Gözden Geçirilmesi
Oksijenik fotosentezde su, ototrofi için gerekli olan elektronları verir ve bir yan ürün olarak oksijen üretilir. Fotosistem I ve fotosistem II iki ayrı ışık reaksiyonudur. Fotosistem I, anoksijenik fotosentezdeki sisteme benzer. Fotosistem II, O 2 üretilmesi için H 2 O'nun ayrıştırılmasından sorumludur. • Devresel olmayan fotofosforilasyon terimi niçin oksijenik fotosentez için kullanılır? • Adsorpsiyon özellikleri ve Eo ile ilgili olarak fotosistem I ve H'deki iki reaksiyon merkezindeki klorofil molekülleri arasındaki temel farklılıklar nelerdir? •
^
,
*
• Şekil 12.20 Fotosenletik elektron verici olarak sülfür üzerinde anaerobik olarak gelişen filamentöz siyanobakteri Oscillatoria limnetica hücreleri. Hücre dışında oluşmuş sülfürün oksidasyon ürünü olan elemental kükürt globüllerine (oklar) dikkat ediniz.
Ototrofik CO Fiksasyonu: Calvin Döngüsü Hücre materyali içinde ototrofik gelişmeyi destekleyici olarak CO2 fiksasyonunun birçok biyokimyasal mekanizması bilinmektedir. Bunlardan en yaygın bilineni ise reaksiyonu bulan kişi olan Melvin Calvin'nin ismi ile adlandırılan Calvin döngüsüdür. Calvin döngüsünde NAD(P)H, ATP ve iki anahtar enzim olan ribuloz bisfosfat karboksilaz (RubisCO) ve fosforibulokinaz''a gereksinim vardır. Döngünün geri kalanı ise hem ototrof hem de heteroflar gibi birçok organizmada bulunan bir seri enzim aracılığıyla yürütülür. RubisCO ve PGA Oluşumu Calvin döngüsündeki CO2 indirgenmesinde ilk adım ribuloz bisfosfat karboksilaz ya da kısaca RubisCO tarafından katalizlenir. RubisCO doğada geniş çapta dağılış gösterir. Mor bakterilerde, siyanobakterilerde, alglerde, yeşil bitkilerde, birçok kemolitotrofik Bacteria ve hatta bazı halofilik ve hipertermofilik Archaea'da bile bulunur. RubisCO şekil 17.21» 'de gösterildiği gibi ribuloz bisfosfat ve CO2'den iki molekül 3-fosfogliserik asit (PGA) oluşumunu katalizler. PGA daha sonra, glikolizin bir ara molekülü olan gliseraldehid 3-fosfata fosforillenir ve indirgenir (««s Şekil 5.10). Buradan, glikolizde ilk basamakların geri dönmesiyle glukoz oluşabilir (Şekil 5.14). Calvin Döngüsünün Stolriyometrisi (katılan moleküllerin kantitatif oranlan) Calvin döngüsü reaksiyonlarını, 1 molekül glukozu (C6H12O6) oluşturmak için gerekli olan 6 molekül CO2'nin katıldığı reaksiyonlar olarak ele almak mümkündür. RubisCO'nun 6 molekül CO2'yi birleştirmesi için alıcı molekül olarak 6 ribuloz bisfosfat molekülüne ihtiyaç vardır (Şekil 17.22»). Bu, 12 molekül 3-fosfogliserik asit kazancını sağlar (toplam 36 karbon atomu). Böylece, 12 molekül hücre biyosentezi için 6 yeni ribuloz bisfosfat molekülü (30 karbon atomu) ve 1 heksoz molekülü (6 karbon atomu) oluşur. C3,C4,C5,C6 ve C7 ara ürünleri'nin katıldığı, bir seri kompleks yeni düzenlemeler sonucunda oluşturulan 6 ribuloz bisfosfattan 6 molekül ribuloz 5-fosfatm elde edilmesi sağlanır. Tekrarlayan bu oluşumdaki son basamak, fosforibulokinaz (Şekil 17.21c) tarafından ribuloz 5-fosfatm ATP ile fosforilasyonudur. RubisCO gibi, aynı zamanda bu enzim de Calvin döngüsü için benzersiz ve tektir. Calvin döngüsünün toplam sitokiyometrisinde, 12 molekül ATP ve NADPH, 12 molekül fosfogliserik asit'in (PGA) gliseraldehid 3-fosfata indirgenmesi için gereklidir. 6'dan fazla ATP molekülü ribuloz fosfatın ribuloz bisfosfata dönüşümü için gereklidir. Böylece Calvin döngüsüyle 6 CO2'den 1 heksoz sentezi için 12 NADPH ve 18 ATP gerekmektedir. Heksoz molekülleri glikojen, nişasta, poli-/3-
546 • Bölüm 17 • Metabolik Çeşitlilik
H 2 C-O-
(a)
H 2 C-O-PO 3 H 2 "I
H2C-O-PO3H2
c=o
-OOC-C-OH
I H-C-OH
CO,
u
r
nu
Ribuloz
H-O-OH
u r—d PTIH H2O-U-PU3H2
_
|
_
b|sfosfat karboksilaz ( R u b i s co)
(b)
_
_
_
_
_
_
_
C=0 I H-C-OH H?O I H 2 C-O-PO 3 H 2
cooH-C-OH H 2 C-O-PO 3 H 2 İki fosfogliserik asit (PGA)
H 2 C-O-PO 3 H 2
HO-C-H I H 2 O 3 P-O-C=O
coo-
'I
HO-C-H
+ADP
Gliseraldehit 3-fosfat
H 2 C-0
Biyosenteze
C=O I H-C-OH + I H-C-OH I H 2 C-O-PO 3 H 2
ATP Fosforibulokinaz
+ P; + NADP+
§jc=o
1,3-Bifosfogliserik asit
H2C-OH
H-C-OH I H 2 C-0
J
•
+ ATP
Fosfogliserik asit
C=O I H-C-OH
_
H 2 C-0
H 2 C-O-PO 3 H 2
(c)
_
Kararsız ara ürün
Ribuloz bisfosfat
HO-C-H
"OOC-C-OH I H
ADP Döngü baştan (a) tekrarlanır
Ribuloz bisfosfat
Ribuloz 5-fosfat
* Şekil 17.21 Calvin döngüsünde anahtar reaksiyonlar, (a) Ribuloz bifosfat karboksilaz enziminin reaksiyonu, (b) 3-fosfogliserik asitin (PGA) gliseraldehit 3-fosfata dönüşüm basamaklan. Hem ATP hem de NADPH'ın her ikisine de ihtiyaç duyulduğuna dikkat ediniz, (c) Fosforibulokinaz enzimi ile ribuloz 5-fosfatın CO2 alıcı molekül ribuloz bifosfata dönüşümü.
6CO, I
12 3-Fosfo/"—""" 12 ATP ^ * gliserat •*-«^_ ( yT (36 karbon) ^ V
6 Ribuloz 1,5-bisfosfat (30 karbon)
12 1,3-Bisfosfogliserat (36 karbon)
6 ATP. 12 Gliseraldehit 3-fosfat (36 karbon)
6 Ribuloz 5-fosfat (30 karbon) Tekrar şekeNv şel düzenelı >lemelerı*X%
10 Gliseraldehit 3-fosfat (30 karbon)
Fruktoz 6-fosfat (6 karbon)
Biyosenteze gider Genel stokiyometri: 6 CO 2 + 12 NADPH + 18 ATP *• C 6 H 1 2 O 6 (PO 3 H 2 ) + 12 NADP+ + 18 ADP + 17 P,
hidroksialkonat (oo& Kısım 4.11) gibi depo polimerlerine dönüşebilir ve daha sonra yeni hücre materyallerinin yapımında kullanılabilir. Karboksizomlar
CO2 fiksasyonu için Calvin döngüsünü kullanan birçok ototrofik prokaryot karboksizomlar olarak adlandırılan polihedral hücre inklüzyonları üretir. İnklüzyonlar yaklaşık lOOnm çapında ince bir birim yapıdan farklı bir zarla çevrilidir ve RubisCO moleküllerinin sıkıca paketlenmiş kristallin dizilerinden oluşur (Şekil 17.23», £»a Şekil 12.10a). Karboksizomların, sitoplazmanm ozmolarite etkisi olmaksızın daha hızlı CO2 fiksasyonuna olanak sağlamak için hücre içinde RubisCO miktarını arttıran bir mekanizma oldukları düşünülür (ozmotik basınç etkilemez, çünkü karboksizomlar çözünmeyen yapılardır).
• Şekil 17.22 Calvin döngüsü. CO2'den bir heksoz molekülünün üretimi görülmektedir. Yapıya katılan her altı molekül CO2 için bir fruktoz 6-fosfat üretilir. Fototroflarda, ATP fosforilasyondan ve ışıktan veya ters elektron akışından gelen NAD(P)H'dan üretilir. Şekil 17.21'de gerçekleşen biyokimyasal reaksiyonları takip etmek için verilen renk kodlarım kullanınız.
17 7 • Ototrofik C02 Fiksasyonu: Ters Sitrik Asit Döngüsü ve Hidroksipropiyonat Döngüsü • 547
• Şekil 17.23 Kalvin döngüsünün kristal yapıda enzimleri: Karboksizomlar. Kemolitotrofik kükürt okside edici Thiobacillus neapolitanus'dan saflaştırılan karboksizomların elektron mikrografı. Yapılar yaklaşık 100 nm çapındadır. Karboksizomlar obligat ototrofik prokaryotlann büyük bir bölümünde bulunur.
Karboksizomlar zorunlu kemolitotrofik sülfür okside edici bakterilerde (sırasıyla, ö°& Kısım 12.3, 12.4, 12.26 ve 12.27), nitrifiye edici bakterilerde, siyanobakterilerde ve proklorofitlerde bulunmuştur. Karboksizomlar mor anoksijenik fototroflar gibi (bu organizmalar hem ototroflar gibi hem de heterotroflar gibi gelişebilirler) fakültatif ototroflarda bulunmazlar. Böylece, karboksizom kesinlikle ototrofik koşullar altındaki yaşam için evrimsel bir adaptasyon olarak değerlendirilir. — [jHj] 17.6 Kavramların Gözden Geçirilmesi Birçok fototrofik ve diğer ototrofik organizmalarla gerçekleştirilen CO 2 fiksasyonu ribuloz bifosfat karboksilaz (RubisCO) enziminin anahtar bir rol oynadığı Calvin döngüsü yolu ile gerçekleşir. Calvin döngüsü CO 2 'nin şekere dönüştürüldüğü enerji gerektiren bir süreçtir. •
Ribuloz bifosfat karboksilaz enzimi hangi reaksiyonu gerçekleştirir? • Niçin ototrofik gelişme için indirgeyici güce ihtiyaç duyulur? • Karboksizom nedir?
Ototrofik CO, Fiksasyonu: Ters Sitrik Asit Döngüsü ve Hidroksipropiyonat Döngüsü Yeşil kükürt bakterilerinde ve yeşil kükürtsüz bakterilerde ototrofik CO2 fiksasyonuna alternatif mekanizmalar mevcuttur. Yeşil kükürt bakterisi olan Chlorobium'da (Şekil 17.7a ve 17.7b'ye bakınız) CO2 fiksasyonu ters sitrik asit döngüsü (Şekil 17.24a») olarak adlandırılan bir yol izi ile meydana gelir. Chlorobium'da, sitrik asit döngüsünün (OOR Şekil 5.22) ara ürünlerinde CO2'in redüktif fiksasyonunu katalizleyen iki ferredoksin bağlantılı enzim bulunur. Ferredoksin bağlantılı iki reaksiyon süksinil-CoA'nın a-ketogluterata karboksilasyonu ve asetil-CoA'nın pirüvata karboksilasyonu ile ilgilidir (Şekil 17.24a). Ters sitrik asit döngüsünün diğer pek çok reaksiyonu, döngünün normal oksidatif yönünün tersinde de çalışan enzimler tara-
fından katalizlenir. Bir istisna olarak yeşil kükürt bakterilerinde sitratı asetil-CoA ve oksaloasetata ayıran ATP bağımlı enzim olan sürat liyaz örnek verilebilir. Döngünün oksidatif yönünde sitrat, sitrat sintaz enzimi tarafından aynı şekilde bu moleküllerden üretilir (Ö°B> Şekil 5.22). Ototrofinin bir mekanizması olarak ters sitrik asit döngüsü aynı zamanda Thermoproteus («saç» Kısım 13.9) gibi Archaea'lan içeren belirli fototrofik olmayan hipertermofillerde ve bakteri filogenetik ağacında en erken dallanmış ototrof olan Aquifex'te de bulunmuştur (oo& Şekil 12.1 ve Kısım 12.37). Bu bulgular, tabi ki bu yol izi önceden ototrofinin bir "erken" evrim formu olabileceği düşünce ve önerisinden daha geniş çaplı olduğu yönünde açık kapı bırakmaktadır. Chlorottexus'ta Ototrofi Yeşil kükürtsüz fototrof olan Chloroflexus (Kısım 12.35) elektron vericisi olarak H 2 veya H2S ile ototrofik olarak gelişir. Buna rağmen, ne Calvin döngüsü ne de ters sitrik asit döngüsü bu organizmada iş görmez. Yerine hidroksipropiyonat yol izi olarak adlandırılan tek bir devresel döngü tarafından 2 molekül CO2 glioksalata indirgenir (Şekil 17.24b). Bu yol izi anahtar bir ara ürün olan hidroksipropiyonat yol izinin sentezine neden olur. Fototrofik bakterilerde, hidroksipropiyonat yol izinin sadece Bacteria soyağacmda en önce dallanan ve anoksijenik fototrof olan Chloroflexus'ta bulunduğu kanıtlanmıştır (Şekil 12.1). Bu olay hidroksipropiyonat yol izinin anoksijenik fototroflardaki ototrofide ilk olgu olabileceğini göstermektedir. Eğer Chloroflexus, Bacteria soyağacının da gösterdiği gibi (Şekil 12.1) diğer fototrofik organizmalardan çok önce evrimleşti ise hidroksipropiyonat yol izi belki de herhangi bir fototrofik organizmada ilk otrofik yol iziydi. Ancak Chloroflexus'a ilave olarak, hidroksipropiyonat yol izi Metallosphaera, Acidianus ve Sulfolobus gibi bazı hipertermofilik Archaea'da da iş görür (ÖO& Kısım 13.9). Bu organizmaların tümü fototrofik olmayan organizmalardır ve archaeal domainin tabanına yakın bir yerde bulunurlar. Hidroksipropiyonat yol izinin kökleri böylece çok derinlerde olabilir; bu yol izi belki de ototrofide doğanın ilk denemesiydi.
•m17.7
Kavramların Gözden Geçirilmesi
Ters sitrik asit döngüsü ve hidroksipropiyonat döngüsü sırasıyla yeşil kükürt ve yeşil kükürtsüz bakterilerde bulunan CO2 fiksasyonu yolizleridir. • CO 2 fiksasyonunun yönünü düşünerek eşil kükürt bakterisinden bir mor kükürt bakterisini ayırabilen az üç özelliği anlatınız. • CO2 fiksasyonunun yönünü düşünerek yeşil kükürt ve yeşil kükürtsüz bakteriler arasındaki mevcut farklılıklar ve benzerlikler nelerdir?
548 • Bölüm 17 • Metabolik Çeşitlilik Hücre materyali -
- Heksoz-P •
Trioz-P ADP ATP
Okzalasetat
Fosfoenolpiruvat
Î
Malat Fumarat
AMP ATP
Piruvat ruvat
Süksinat
Ferredoksinred~<'1 V.CC
ATP Süksinil-CoA • - Ferredoxin red
Asetil-CoA ATP
a-Ketoglutarat
Net reaksiyon:
3CO2 + 12H + 5ATP-
Izositrat
CO 2
-trioz-P
(a)
Hücre materyali
Î Î
CH3-C~CoA
HOOC-CH 2 -C~CoA
ATP
(Asetil-CoA)
COOH CHO
\
Malil ~ CoA" CH 2 OH-CH 2 -C~CoA (Hidroksipropionil-CoA)
Süksinil --CoA
r
CO, CH 3 CH 2 C ~ CoA (Propionil-CoA) (b)
Kil
Glioksilat
H |
O 11
Net reaksiyon:
COOH-C-C~CoA 2CO2 + 6H + 3ATP CH3 ATP (Metilmalonil-CoA)
KEMOLITOTROFI: İNORGANİK ELEKTRON VERİCİLERİN OKSİDASYONUNDAN SAĞLANAN ENERJİ
Bölüm 5'de temelde, enerji kaynağı olarak organik bileşiklerin kullanıldığı enerji metabolizması kemoorganotrofiye dayanan mikroorganizmalar üzerine yoğunlaşılmıştı. Bundan sonraki 4 kısımda enerji kaynağı olarak inorganik kimyasalların kullanıldığı yaşam tarzına sahip kemolitotroflarm yöntemleri, sorunları ve avantajları ele alınacaktır.
İnorganik Elektron Vericiler ve Enerjetikleri Enerjisini inorganik bileşiklerin oksidasyonundan elde eden organizmalara kemolitotrof denir. Çoğu kemolitotrofik bakteri, kendi ihtiyacı olan karbonu CO2'den elde etmektedir, bu yüzden bu bakteriler aynı zamanda ototrofturlar. Dikkat çektiğimiz gibi, bir organizma karbon kaynağı olarak CO2 kullanarak geliştiğinde (1) enerji (ATP) ve (2) indirgeyici
• Şekil 17.24 Fototrofik yeşil bakterilerde genel ototrofik yolizleri. (a) Ters sitrik asit döngüsü yeşil kükürt bakterisi Chlorobium'da CO2 fiksasyon mekanizmasıdır (ayrıca bakınız Şekil 17.17i); O^ö Kısım 12.32). Ferredoksin ., '
red'
indirgenmiş ferredoksin (her biri 2 H) gereksinilen karboksilasyon reaksiyonlarını belirtmektedir. Chlorobium'da, indirgenmiş ferredoksin ışık merkezli reaksiyonlar oluşmaktadır (bakınız Şekil 17.18). Oksaloasetattan itibaren, döngünün her turu üç C0 2 molekülünün yapıya katılması ve piruvat ürünü oluşmasıyla sonuçlanır. ATP-bağımlı enzim olan sitrat liyaz ile sitratın parçalanması C4 alıcısı olan oksalaasetatı oluşturur ve biyosentez için asetil-CoA üretir. Piruvatın fosfoenolpiruvata dönüşümü iki yüksek-enerjili fosfat bağına eşdeğer enerji tüketir, (b) Hidroksipropiyonat yolizi yeşil kükürtsüz bakteri Chloroflexus'da ototrofinin temelidir (cra&Kısım 12.35). Asetil-CoA metilmalonil-CoA oluşturmak üzere iki kez karboksillenir. Bu ara ürün asetil-CoA ve glioksilat oluşturmak üzere yeniden düzenlenir. Glioksilat muhtemelen bir serin veya glisin ara ürünü ile hücresel materyale dönüştürülür. Hidroksipropiyonat yolizinde indirgeyici gücün kaynağı NADPH'dır.
»-glioksilat
güce ihtiyaç duyar. Bazı kemolitotroflar, karbon kaynağı olarak organik bileşiklere ihtiyaç duyan aynı zamanda bir inorganik bileşiğin oksidasyonundan enerji elde edebilen miksotroflardır. Kemolitotroflarda, ATP üretim şekli, kemoorganotrofideki ile benzerdir. Farkları, kemolitotroflarm elektron vericilerinin organik olmaktan ziyade inorganik olmasıdır. Her iki metabolizmada da ATP sentezi, elektron vericisinin oksidasyonu ile sağlanır. Kemolitotroflarda indirgeyici güç eldesi, ya inorganik bileşik yeterince düşük indirgenme potansiyeline sahipse direk olarak inorganik bileşikten, ya da Kısım 17.5'te fototrofik mor bakterilerde tartışıldığı gibi ters elektron taşınımı ile sağlanır.
İnorganik Elektron Vericisi Kaynakları
Kemolitotroflar, çok sayıda inorganik elektron vericisi kaynağına sahiptir. Doğada jeolojik, biyolojik veya antropojenik tarzda elektron vericisi kaynakları bulunabilir. Volkanik aktivite, indirgenmiş kükürt bileşiklerinin, özellikle de H2S'in ana kaynağıdır. Tarımsal ve madencilik işletmeleri, fosil yakıtların yanması ve endüstriyel atıkların girmesi gibi çevreye doğal olmayan inorganik elektron vericile-
17.9 • Hidrojen Oksidasyonu • 549
ri ekler. Doğal olmayan bu inorganik elektron vericileri özellikle azot ve demir bileşikleridir. Biyolojik kaynaklar, özellikle de H2S, H2 ve NH 3 oldukça yaygındır. Kemolitotrofların ekolojik başarısı (cn$ Bölüm 19) ve metabolik çeşitlilikleri, bu kaynakların bolluğunun ve doğada kolayca bulunabilirliğinin açık göstergesidir. Kemolitotrofinin Enerjetiği
Elektron alıcısı olarak O2 tarafından oksitlendiğinde ATP sentezi için yeterli enerjiyi sağlayabilen çeşitli inorganik bileşiklerin indirgenme potansiyelleri TabloA1.2'de gösterilmiştir. Bölüm 5'ten de hatırlanacağı üzere daha ileri düzeyde ayrı ayrı iki yarı reaksiyon E0"a bağlı olarak serbest kalan enerjinin miktarı daha büyüktür. Örneğin H + /H 2 çifti ve Vı O 2 /H 2 O çifti arasındaki indirgenme potansiyeli farkı -1,23 V'tur ve bu fark -237 kj/mol'lük bir serbest enerji kazancına eşdeğerdir (Hesaplama için Ek l'e bakınız). Diğer taraftan H + /H 2 çifti ve NO3~/NO2~ çifti arasındaki potansiyel farkı daha azdır (-0.84 V) ve bu fark -163 kj/mol'lük bir serbest enerji kazanımı sağlar. Bu, ATP üretimi için yeterli bir miktardır (ATP'nin enerjice zengin fosfat bağı - 31,8 kj/mol'lük bir serbest enerjiye sahiptir, Tablol7.6'ya bakınız). Ancak, bazı oksidasyonlardan benzer hesaplamalarla ATP sentezi için yetersiz miktarda enerji elde edildiği gösterilebilir. Örneğin, eiektron alıcısı oJarak CO2'nin kullanıldığı H2S oksidasyonundan elde edilen enerji ATP sentezi için yetersizdir. Bu gibi enerji hesaplamaları çeşitli kemolitotrofların doğada var olmalarının gerekliliğini göstermektedir. Organizmalar, enerji kazanımı için gerçekleştirdikleri reaksiyonlarda termodinamik kurallara uymak zorunda oldukları için enerji kazanımmı ancak termodinamik olarak elverişli olan reaksiyonlarla sağlayabilirler (Kısım 17.21'e bakınız). Tablo 17.1, kemolitotrofik mikroorganizmalar tarafından gerçekleştirildiği bilinen bazı enerji kazanımı reaksiyonlarını özetlemektedir. Bu organizTablo 17.1 Elektron verici 1
Fosfit " Hidrojen Sülfit Kükürt Amonyum' Nitrit Ferro demir
malar Bölüm 12 ve 13'te anlatılmıştır. Besin döngüsünün merkezinde yer alan kemolitotrofik reaksiyonları göreceğimiz Bölüm 19'da ayrıca ekolojik görüş açısından kemolitotrofiyi de inceleyeceğiz. 17.8 Kavramların Gözden Geçirilmesi Kemolitotroflar tek enerji ve indirgeyici güç kaynağı olarak inorganik kimyasalları okside edebilir. Aynı zamanda birçok kemolitotrof, ototrofik olarak da gelişebilir. •
Kemolitotrofların inorganik bileşikleri kullanmasının iki amacını belirtiniz? • H 2 oksidasyonunda elektron alıcısı olarak oksijen 2 kullanıldığında, SO4 icullamldığı zamankinden niçin daha çok enerji kazancı sağlanır?
Hidrojen Oksidasyonu Hidrojen, mikrobiyal metabolizmanın yaygın bir ürünüdür ve birçok kemolitotrof, hidrojeni enerji metabolizmasında elektron vericisi olarak kullanabilme yeteneğindedir. Geniş bir alana yayılmış anaerobik H 2 oksidasyonu yapan ve farklı elektron alıcıları (örneğin; nitrat, sülfat, ferrik demir ve diğerleri) kullanan birçok Bacteria ve Archaea bilinmektedir ve bu organizmalar daha sonra bu bölümde ele alınacaktır (Kısım 17.14 ve 17.18'e bakınız). Burada sadece aerobik H 2 oksitleyici bakteriler anlatılacaktır. H2 Oksidasyonunun Enerjetiği
H2 oksidasyonu sırasında ATP üretimi; H 2 , 0 2 tarafından okside edilirken oluşan proton motive güç ile sağlanır. Toplam reaksiyon: AG°'= -237 kj Bu reaksiyon oldukça egzergoniktir ve en az bir ATP sentezi için yeterli enerjiyi sağlar. Bu reaksiyon hidrojenaz enzimi tarafından katalize edilmekte ve H 2 'den sağlanan elektronlar, öncelikle quinon alıcısına transfer edilir. Elektronlar buradan bir seri
Çeşitli inorganik elektron vericilerin oksidasyonundan elde edilen enerji verimleri'
Reaksiyon
Kemolitotrof tipi
Çiftin Jî 'ı AG° Elektron AG° (kj/reaksiyon) sayısı (kj/2e-) (V)
4 HPO/- + SO 4 2 " + H +- + 4 H P O / - + HS" H 2 + ±O2 -+ H 2 O HS" + H + + ±O2 -> S° + H 2 O S° + l | O 2 + H 2 O -> SO42" + 2 H* NH 4 + + 1±O2 -> NO 2 - 4- 2 H + + H 2 O NO,- + |Oj-+NO s Fe 2 + + H + + | O 2 ->• Fe 3 + + | H 2 O
Fosfit bakterileri Hidrojen bakterileri Kükürt bakterileri Kükürt bakterileri Nitrifikasyon bakterileri Nitrifikasyon bakterileri Demir bakterileri
-0.69 -0.42 -0.27 -0.20 +0.34 +0.43 +0.77
-91 -237.2 -209.4 -587.1 -274.7 -74.1 -0.77
2 2 2 6 6 2 1
* Ek l'deki değerlerden hesaplanan veri; Fe2* için değerler pH 2 için olup diğerleri için pH 7'dir. pH 7'de Fe3*/ Fe2* çifti yaklaşık +0,2V'dur. b Fosfit dışında, tüm reaksiyonlar elektron alıcı olarak O 2 ile eşleşmiştir. Bilinen tek fosfit oksitleyici elektron alıcısı olarak SO42" ile eşleşmiştir. ' Amonyum ayrıca anammoks organizmaları tarafından elektron alıcısı olarak NO~ ile okside edilebilir (bakınız Kısım 17.12).
-91 -237.2 -209.4 -195.7 -91.6 -74.1 -65.8
i
550 • Bölüm 17 • Metabolik Çeşitlilik sitokrom aracılığıyla en sonunda O2'ye ulaşmakta ve O2, H2O'ya indirgenir (Şekil 17.25»). Bazı hidrojen bakterileri biri çözünür formda, diğeri de zara bağlı olmak üzere iki adet hidrojenaza sahiptir (««s + Tablo 12.6). Çözünür hidrojenaz NAD 'nm H 2 ile direk olarak NADH'a indirgenmesiyle ilgili iken, zara bağlı hidrojenaz enerjetikle ilgilidir [H2'nin indirgenme potansiyeli (-0.42 V) oldukça düşük olduğu için, indirgeyici güç elde etmek amacıyla ters elektron akışının kullanılması gereksizdir] (Şekil 17.25). Ralstonia eutropha aerobik H 2 oksidasyonu çalışmalarında kullanılan model organizmadır ve bazı özellikleri Kısım 12.5'te anlatılmıştır. H2 Bakterilerinde Ototrofî Birçok hidrojen bakterisinin kemoorganotrofik olarak ta gelişebilmesinin yanında, kemolitotrofik olarak geliştiklerinde Calvin döngüsü ile CO2 fiksasyonu da yapmaktadır (Kısım 17.6'ya bakınız). CO2 fiksasyonunun sitokiyometrisine bakarsak; 6 H 2 + 2 O2 + CO2
(CH2O)
5 H2O
(CH2O) burada hücre materyalini simgelemektedir. Bununla birlikte; glukoz gibi kolayca kullanılabilir bir organik bileşik varlığında, tipik aerobik H 2 oksitleyici bakterilerdeki Calvin döngüsü ve hidrojenaz enzimleri baskılanır. Doğada, oksik çevrelerdeki H,'nin düşük seviyeleri mikroorganizmalar için en uygun seviyelerdir. Ortamda bu seviyelerde H 2 'nin bulunması sayesinde, aerobik hidrojen bakterileri kendi katabolik enzimlerini regüle edebilir. Bu organizmalar, çevrelerindeki kullanılabilir organik bileşik ve H 2 seviyesine bağlı olarak muhtemelen kemoorganotrofi ve kemolitotrofi arasındaki geçiş grubunu oluşturur. Bundan başka, birçok aerobik H bakterisi mikroaerofilik Dış
koşullarda da iyi bir şekilde gelişebilir. Bu nedenle, bu organizmalar H 2 kemolitotrofu olarak oksik/anoksik ortamların kesiştiği ara yüzeylerde, H 2 'nin fermentatif metabolizma ile sürekli ve fazla oksik ortamlardakilerden çok daha iyi düzeylerde sağlandığı ortamlarda başarılı bir şekilde gelişebilir.
17.10
İndirgenmiş Kükürt Bileşiklerinin Oksidasyonu
Birçok indirgenmiş kükürt bileşiği, daha önce bu bölümde ele alınmış olan renksiz ve bakteriyoklorofil (pigmentli) içeren yeşil ve mor kükürt bakterileri gibi çeşitli kükürt bakterileri tarafından elektron vericisi olarak kullanılır (Şekil 17.17'ye bakınız). Kemolitotrofi, bir Rus mikrobiyologu olan Sergei VVinogadsky'nin kükürt bakterileri üzerinde yaptığı çalışmalar sonucu ortaya çıkmıştır (Mikrobiyal Okuma Parçası VVinogradsky ve Kemolitotrofi ve £3°& Kısım 1.7'ye bakınız). Kükürt Oksidasyonunun Enerjetiği Elektron vericisi olarak kullanılan en yaygın kükürt bileşikleri; hidrojen sülfür (H2S), elemental kükürt (S°) ve tiyosülf attır (S 2 O 3 2 ). Kükürt oksidasyonunun son ürünü çoğu kez sülfattır (SO42~) ve H2S (oksidasyonu, -2) ile sülfat (oksidasyonu, +6) arasındaki oksidasyon basamaklarında toplam 8 elektron taşınır (Kükürt bileşiklerinin oksidasyonu için Tablo 17.3'e bakınız). Bir ara üründen başlayan kükürt oksidasyonlarmda daha düşük miktarlarda enerji eldesi söz konusu olur:
H2S
• SO 4 2 - +2H + 2 O2 (son ürün, sülfat) AG°'= -798,2 kj/reaksiyon
HS" + | O 2 + H+ > S + H2O (son ürün, kükürt) AG°'= -209,4 kj/reaksiyon S + H 2 O + \O2 > SO42- +2H+ (son ürün, sülfat) AG°'= -587,1 kj/reaksiyon S2O32
-*• Q - f cyt b -*~ cyt c -*- cyt a
İ2O + 2O2 > 2 SO42" + 2H+ (son ürün, sülfat) AG°'= -818,3 kj/reaksiyon (-409,1 kj/okside S atomu)
En indirgenmiş kükürt bileşiği olan H2S'in oksidasyonunun ilk basamağı sonucunda elemental kükürt (S°) oluşur. Bazı H2S oksitleyen bakteriler bu elemental kükürdü hücre içine bırakır (Şekil 17.26a döngüsü •). Kükürt, ilk oksidasyonun sonucunda enerji rezervi olarak hücre içine biriktirilir. H2S tükendiği Hücre materyali zaman kükürdün sülfata oksidasyonu ile ek enerji • Şekil 17.25 Aerobik H2 bakterilerdeki iki hidrojenazın biyoenerjitiği ve görevi. İki hidojenazı olan Ralstonia eutropha'da., elde edilebilir. Elemental kükürt elektron vericisi olarak dışazara bağlı hidrojenaz enerjitiğe tabi iken sitoplazmik hidrojenaz Cavlin döngüsü için NADH sentezler. Zara bağlı hidrojenazın rıdan sağlandığı zaman, elemental kükürdün son proton motive gücün oluşumuyla sonuçlanan elektron akışını derece yüksek olan çözünmezliğinden dolayı organasıl başlattığına dikkat ediniz. Birkaç H2 bakterisi sadece zara nizma kükürt partikülüne bitişik olarak büyümek bağlı hidrojenaza sahiptir ve bu organizmalarda indirgeyici güç zorundadır (Şekil 172.6b). Organizma partiküle sentezi ters elektron akışı sayesinde oluşur. H2az, hidrojenaz; cyt, sitokrom; 0, quinon. yapışarak, kükürt atomlarını sülfata oksidasyonla
17.10 • İndirgenmiş Kükürt Bileşiklerinin Oksidasyonu • 551
Mİkrobİyal Ek Bİlgİ
• Winogradsky ve Kemolitotrofi
emolitotrofik ototrofi kavramı, ilk kez ünlü Rus mikrobiyologu Sergei Winogradsky tarafından tasarlanmıştır (öQQ> Kısım 1.7). Bazı renksiz kükürt bakterileri (Beggiatoa, Thiothrix) (Şekil 1) oldukça büyük ve araştırma için elverişli olduğu için Winogradsky, kükürt bakterileri üzerinde çalışmalar yapmıştır. H2S bakımından zengin sular yeryüzünde oldukça yaygındır. İsviçre'nin Bernese Oberland bölgesinde, Beggiatoa ve Thiothrix'in oldukça geniş popülasyonlan, kanallardan taşan ve kükürt içeren sularda gelişir. Winogradsky, sadece beyaz ve filamentli hücreleri dikkate alarak mikroskobik ve fizyolojik çalışma ve gerekli deneylerin açık arazide yapılabilmesi için elverişli materyalleri bulmuştur (OOÇ» Kısım 12.4 ve Şekil 12.11 ve 12.13). Winogradsky, renksiz kükürt bakterilerinin sadece H2S içeren sularda bulunduğunu gösteren ilk kişidir. Kaynağından dışarıya akan sularda, H2S yavaş yavaş dağılmakta ve kükürt bakterileri kısa sürede yok oluır. Bu durum Winograsky'ye, kükürt bakterilerinin gelişiminin H2S'in bulunuşuna bağlı olduğunu göstermiştir. Winogradsky bu gözlemden sonra, Beggiatoa filamentlerinin sülfür açlığına maruz kaldıklarında kendi kükürt granüllerini de kaybettiklerini göstermiştir. Bununla birlikte Winogradsky, ortama az miktarda H2S eklendiği zaman kükürt granüllerinin hızla geri kazanıldığını da göstermiştir (Şekil 1). Winogradsky son olarak, H2S'in elemental kükürde okside edildiğini göstermiştir. Filamentler H2S açlığına maruz kaldığında, kükürt granüllerine ne olmaktadır? Winogradsky akıllıca yaptığı bazı mikrokimyasal testlerle, kükürt granülleri kaybolduğunda ortamda sülfatın belirdiğini göstermiştir. Winogradsky, Beggiatoa
ile ilgili son olarak (diğer renksiz kükürt bakterilerininde karışması ile) H2S'i elemental kükürde ve sonra da sülfata okside ettiğini göstermiştir (H2S —• S° —>SO/). Bu organizmanın gelişimi için mutlaka H2S'in gerekli olduğu görüldüğü için Winogradisky tek enerji kaynağının bu oksidasyon olduğunu var saymıştır. Winogradsky, Beggiatoa üzerindeki çalışmalarıyla elde ettiği ilk kanıt, bu organizmanın enerji kaynağı olarak inorganik maddeleri okside edebilmesidir. Bu, kemolitotrofi kavramının temelidir. Bundan yola çıkarak, Winogradsky nitrifiye edici bakterileri çalışmaya yönelmiş ve ilk kez bu grup üzerinde, inorganik bileşiklerin oksidasyonu ile ototrofik CO2 fiksasyonunu göstermiştir. Winogradsky'nin çalışmalarından önce, Nitrifikasyon süreci, toprağa karıştırılan lağımın sindirilmesi ile ilgili çalışmalardan biliniyordu. Örneğin, amonyakça zengin lağım toprak içerisinden geçirilerek amonyağın nitrata dönüştüğü gösterilmiştir. VVinogradsky buradan yola çıkarak, tek karbon kaynağı CO2 ve tek elektron vericisi amonyak olan tamamıyla mineral bir ortam kullanıp, nitrifiye edici bakterileri izole etmiştir. Amonyak kimyasal olarak kararlı bir bileşik olduğu için, amonyağın nitrite ve sonra da nitrata oksidasyonu; gösterilmesi kolay, değişmez bakteriyal bir süreçtir. Gerçekte VVinogradsky, nitrifikasyonun iki basamaklı bir süreç olduğunu, bir grup organizmanın NH4+'ü NO2~'ye ve daha sonra da ikinci bir grup organizmanın NO2~'ı NO 3 'e dönüştürdüğünü göstermiştir (Kısım 17.12'ye bakınız). Ortamda hiç organik madde kalmadığı için, organik maddenin (bakteriyal hücre materyali) CO2'den oluşturulması olasıdır. Ortamda amonyak veya nitrit bulunmadığında ise herhangi bir gelişme gerçekleşmez.
uzaklaştırabilir. Zarın veya periplazmik proteinlerin aktivitesi ile çözünmez haldeki S", HS~'e indirgenerek çözünür forma getirilmekte ve hücre içine alınarak kemolitotrofik metabolizma ile kullanılır. (Şekil 17.27»). Kükürt oksidasyonunun bir ürünü de H+'dur. Protonların üretimi pH'ı düşürmektedir. Sonuç olarak, indirgenmiş kükürt bileşiklerinin oksidasyonu ortamın asitleşmesine yol açar. Kükürt bakterileri, güçlü bir asit olan sülfirik asit (H2SO4) üretmekte ve ortam pH'ında göze çarpan bir düşüşe neden olur.
Dikkatli kimyasal analizler, bakteri tarafından oluşturulan organik madde miktarının, okside edilen amonyak veya nitrit miktarı ile orantılı olduğunu göstermiştir. VVinogradsky şöyle bir sonuca varmıştır: " Bu [süreç], ışığı kullanan ve klorofil içeren bitkiler hariç, fizyolojinin ana öğretisi olan 'doğada organik maddenin tam sentezinin yer alamayacağı" düşüncesi ile çelişmektedir." Böylece, kemolitotrofi terimi doğmuştur. Şu anki bilgilerimize göre; birçok kemolitotrofun ototrofisi ile fototroflann ototrofisi en az bir yönüyle benzerdir. Her iki grup da CO2 fiksasyonu için aynı biyokimyasal reaksiyon basamaklarını (Calvin Döngüsü) takip etmekte ve ribuloz bisfosfat karboksilaz enzimi bulundurur (Kısım 17.6'ya bakınız). •
Şekil 1 Beggiatoa ve kemolitotrofi. Beggiatoa'nın
Winogradisky
tarafından
ya-
pılmış çizimleri ve bu şekillerle birlikte kısa açıklayıcı çeviri bilgilen (Fransızca'dan). "Şek. 1. Beggiatoa alba'nm bir îilametinin şekli: (a) HsS'siz suda 48 saat sonra (zamanla sülfür granüllerinin kaybolduğuna
dikkat ediniz), Şek. 2.
Beggiatoa media filamentinin baş kısmı. Şek. 3. Bir Beggiatoa minima filamentinin baş kısmı.
Kükürt Oksidasyonunun Biyokimyası ve Enerjetiği
Çeşitli kükürt bileşiklerinin oksidasyonunun biyokimyasal basamakları Şekil 17.27'de özetlenmiştir. Oksidasyon sülfür ile başladığında; sülfit (SO32~) üretilmekte ve 6 elektronun oksidasyonu yapılır. Eğer S° başlangıç substratı ise, S° öncelikle sülfüre indirgenmesine rağmen aynı zamanda sülfit de üretilir (Şekil 17.27a). SO/'in SO 4 2 'e oksidasyonu için iki yol mevcuttur. Bu oksidasyon için kullanılan en yaygın sistem, sülfit oksidaz enziminin kullanıldığı sistemdir. Sülfit oksidaz elektronları direk olarak
552 • Bölüm 17 • Metabolilt Çeşitlilik
Süim Hücreye bağlı kükürt kompleksi ı..".ı..-._I ı ı-ı : f»
H2S
q_^o °
Elemental kükürt
X
^ - s n 2ı ) , (2 u 3
^~ *->
* - ? ~'r
e" — Sülfit
Tiyosülfat
Elektron taşıma sistemi !
G-
•AMP
AFS redüktaz
2e"
2e- - - V
\
-- '
Adenozin fosfosülfat (APS)
ADP
Substsrat düzeyinde fosforilasyon
SOV • Şekil 17.26 Kükürt bakterileri, (a) Beggiatoa tarafından internal kükürt granüllerinin birikimi.(b) Kükürt-oksitleyen archae Sulfolobus acidocaldorius'un bir elemental kükürt kristaline tutunuşu. Hücreler akridin turuncusu boyası ile boyandıktan sonra floresans mikroskobu ile incelenmiştir. Kükürt kristali floresan özellikte değildir. Sülfürün ve kükürtün ATP üretimi amacıyla nasıl okside olduğunu anlayabilmek için Şekil 17.27'ye bakınız.
SOj^ten sitokrom c'ye transfer etmekte ve elektron taşmımı sırasında oluşan proton motive güç aracılığıyla ATP üretimi sağlanır (Şekil 17.27b). Sülfit oksidaza ek olarak, sülfat indirgeyici bakterilerin metabolizması için gerekli bir enzim olan adenozin fosfosülfat (APS) redüktazın ters aktivitesi yolu ile de birkaç kükürt kemolitotrofu, SO32~'i SO42"'e okside edebilir (Şekil 17.27a ve şekil 17.38'i karşılaştırınız). Bu reaksiyon kükürt kemolitotrofları tarafından AMP'nin ADP'ye dönüştürülmesi ile bir adet yüksek enerjili fosfat bağı kazancı sağlanarak, SO42~ üretimi yönüne doğru devam ettirilir (Şekil 17.27a). Kükürt kemolitotrofları elektron vericisi olarak tiyosülfat'ı kullandığı zaman, tiyosülfat S° ve SO32"'e ayrılır ve sonuçta her iki tiyosülfat bileşeni ayrı ayrı SO42~ okside edilir. İndirgenmiş kükürt bileşiğinden kaynaklanan bütün elektronlar, sonuçta Şekil 17.27b'de gösterilen elektron taşınım sistemine girer. Çiftlerin indirgenme potansiyeline bağlı olarak, elektronlar flavoprotein (Eo'= -0,2) veya sitokrom c (E0'=+0,3) seviyesinden taşınıma katılır ve son elektron alıcısı olan O2'ye ulaşırken oluşan proton motive güç ATPaz'm ATP sentezlemesini teşvik eder. Ototrofik CO2 fiksasyonunda elektronlar, ters elektron akışından kaynaklanır (Kısım 17.5'e bakınız), sonuç olarak NADH kazancı sağlanır ve CO2, Calvin döngüsü yolu ile fiske edilir (Şekil 17.27b). Kükürt kemolitotrofları esas olarak aerobik bir grup oluşturmasına rağmen (c«s Kısım 12.4), bazı türleri nitratı elektron alıcısı olarak kullanıp anaerobik ola-
HSCO 2 + ATP
I
,2w3
orS° Calvin döngüsü
HPO
ADP
ATP
(b)
• Şekil 17.27 Kükürt kemolitotroflarınca indirgenmiş kükürt bileşiklerinin oksidasyonu. (a) Farklı bileşiklerin oksidasyonundaki basamaklar. Sülfit oksidaz yolizi oksitlenmiş sülfitin çoğundan sorumludur, (b) Kükürt bileşiklerinden gelen elektronlar bir proton motive güç oluşturmak üzere elektron taşıma zincirine katılır; tiyosülfat ve elemental kükürtten gelen elektronlar sitokrom c düzeyinde zincire girer. NADH ters elektron akışının enerji tüketen reaksiyonları tarafından oluşturulur. Çünkü elektron vericiler NAD+/NADH'dan daha fazla elektropozitifliğe sahiptir. Sit, sitokrom; FP, flavoprotein; 0, quinon. APS'nin yapısı için Şekil 17.38'e bakınız.
rak gelişebilir, Thiobacillus denitrificans bu yaşam
tarzının klasik bir örneğidir. 17.9-17.10 Kavramların Gözden Geçirilmesi Hidrojen (H2), H2S ve S° gibi indirgenmiş kükürt bileşikleri kemolitotroflar için mükemmel birer elektron vericisidir. Bu bileşikler, hidrojen bakterileri veya kükürt bakterileri tarafından okside edilebilmekte ve proton motive güç oluşturarak ATP sentezi yapılabilir. Aynı zamanda ototrof olan bu kemolitotroflar, CO 2 fiksasyonunu Calvin döngüsü ile sağlar.
17.11 • Demir Oksidasyonu • 553
• H2 üzerinde gelişmede, ihtiyaç duyulan özel enzim nedir? • Son ürün elemental kükürt olduğunda veya sülfat olduğunda H2S'in oksidasyonundan kaç adet elektron sağlanabilir?
17.11
Demir Oksidasyonu
Bazı prokaryotlar, ferro demirin (Fe2+) ferik demire (Fe3+) aerobik oksidasyonu şeklindeki reaksiyonlarla enerji kazanımı sağlarlar. Bu oksidasyondan az miktarda enerji elde edilebilir (Tablo 17.1 'e bakınız), bu nedenle de demir bakterileri gelişebilmeleri için, çok miktarda demiri okside etmeleri gerekir. Ferrik demir suda çökelen ve çözünmeyen ferrik hidroksit [Fe(OH)3] oluşturur (Şekil 17.28»). Ferro demir, nötral pH'da ve oksijenli koşullarda hızla ve biyolojik olmayan şekilde ferrik demire okside olur. Bu nedenle, ferro demir sadece anoksik koşullarda uzun süre kararlı kalmaktadır. Bununla birlikte; asit pH'da ve oksijenli koşullar altında da ferro demir kararlıdır. Bu durum birçok demir oksitleyici bakterinin, niçin zorunlu asidofilik olduğunu açıklar.
(b) • Şekil 12.28 Demir oksitleyen bakteriler, (a) Kömür maden alanından çıkan asidik maden drenajının oluşturduğu bir dere ve bir nehirin birleşimi görülmektedir. Asidik dere çok yüksek miktarda ferro demir (Fez+) içermektedir. Düşük pH değerlerinde, ferro demir kendiliğinden havanın etkisi ile okside olmaz ancak Acidithiobacillus ferrooxidans bu oksidasyonu gerçekleştirir. Çözünmez ferrik hidroksit ve kompleks demir tuzlan, kömür madencileri tarafından "yellow boy" olarak adlandırılan presipitat oluşturur, (b) A. ferrooxidans kültürleri. Görüntü, soldaki tüpte gelişmenin olmadığı soldan sağa doğru artan gelişme düzeyini gösteren bir seyreltme serisi. Gelişme, Fe2+'den Fe3+'ün üretimiyle anlaşılmaktadır. Buda kolaylıkla san-turuncu renk oluşumu ile sonuçlanan asitlik ve Fe(OH)3 oluşmu ile ortaya çıkar (Fe 3 t + 3H.O -> Fe(OH), + 3H+).
• Şekil 17.29 Nötral pH'da demir bakterileri: Sphaerotilus. Küçük bir bataklığın kenarındaki sızıntıdan toplanan Sphaerotilus'un demirle kaplanmış boş kılıflannın faz kontrast fotomikrografı. Sphaerotilus anoksik ferro demir içeren suyun oksik zonla karşılaştığı habitatlarda yaşayan tipik bir ara yüzey organizmasıdır.
En iyi bilinen demir oksitleyici bakteriler olan Acidithiobacillus ve Leptospirillum ferrooxidans, ferro demiri elektron vericisi olarak kullanıp ototrofik olarak gelişebilir (Şekil 17.28b). Her iki organizma da pH l'in altındaki pH değerlerinde gelişebilir. Bu organizmalar, kömür ocağı atıklarının bulunduğu bölgeler gibi asit kirliliği olan çevrelerde yaygın olarak bulunurlar. Bir Archaea üyesi olan Ferroplasma, son derece asidofilik bir demir okside edicidir ve pH O'da bile gelişebilme yeteneğine sahiptirler (Kısım 13.5). Bütün bu organizmaların asit kirliliğindeki ve mineral oksidasyonundaki işlevi Kısım 19.14 ve 19.15'te ele alınacaktır. Fe2+/nın nötral pH'daki kararsızlığına rağmen, bazı demir oksitleyici bakteriler, bu tip çevrelerde iyi gelişebilir, ancak bu gibi durumlar ferrodemirin oksijensiz koşullardan oksijenli koşullara taşındığı ara bölgelerde gerçekleşir. Bu zonlar arasındaki ara yüzeylerde, demir oksitleyici bakteriler, anoksik bölgeden gelen ferro demiri kendi kendine okside olmadan yakalayıp biyolojik olarak okside edebilir. Gallionella ferruginea ve Sphaerotilus natans bu ara bölgede yaşayan organizmalara örneklerdir. Bunlar tipik olarak, oluşturdukları karakteristik depozitlerle birlikte karışık halde bulunurlar (Şekil 17.29» ve ayrıca Şekil 17.43a). Ferro Demir Oksidasyonundan Enerji Eldesi Acidithiobacillus ferrooxidans'm demir oksidasyonunun enerjetiği ilginçtir, çünkü Fe3+/Fe2+ çiftinin indirgenme potansiyeli oldukça elektropozitiftir (pH 2'de + 0,77 V). A. ferrooxidans'm solunum zincirinde avec tipinde sitokromlar ve periplazmada bulunan, bakır içeren bir protein olan rustisiyanin bulunur (Şekill7.3O). Fe+3/Fe+2 çiftinin indirgenme potansiyeli oldukça yüksek bir değerde olduğu için, oksijene kadarki O/2 O 2 /H 2 O, Eo = +0.82 V) elektron taşınım yolu da oldukça kısa olur. Demir oksidasyonu, periplazmadaki rustisiyaninin Fe2+'den Fe3+'e bir elektron geçişi sağlaması
I
554 • Bölüm 17 • Metabolik Çeşitlilik Rustisiyanin
2+
üretebilir. Dolayısıyla, Fe okside eden asidofilik bakterilerin yaşadığı çevrelerde, hücre materyali oluşumunun azlığı, buna karşın çökelmiş ferrik demir miktarının fazlalığı bu bölgede demir oksitleyici bakterilerin varlığına işaret eder (Şekil 17.28 ve öCfe Şekil 19.37). Kısım 19.14 ve 19.15'te demir oksitleyici bakterilerin, önemli ekolojik süreçlerle olan bağlantısı anlatılacaktır.
Dış (pH 2) (periplazma)
• 2 Şekil 17.30 Asidofil Rcidithiobacillus ferrooxidans ile Fe * oksidasyonu sırasında elektron akışı. Periplazmik bakır içeren protein olan rustisiyanin, Fe2+'den gelen elektronların aracı alıcısıdır. Buradan gelen elektronlar kısa bir elektron taşıma zinciri boyunca hareket eder ve O2,nin H2O'ya indirgenmesi ile sonuçlanır. Calvin döngüsünü sürdürmek için gerekli indirgeyici güç ters elektron akışı reaksiyonlarından gelir. Zann her iki tarafındaki pH farklılığına (~4 birim) dikkat ediniz. ve dolayısıyla Fe 2 + / nin Fe 3+ 'e okside edilmesiyle gerçekleşir. Bu protein önce sitokrom c'yi indirgemekte, sitokrom c de sitokrom a'yı indirger. Son olarak da O 2 , H 2 O'ya indirgenir (Şekil 17.30). Daha sonra, proton aktaran ATPaz aracılığıyla zarda ATP sentezi gerçekleşir. ATP kazancı, elektron vericisinin yüksek potansiyelinden dolayı tipik şekilde düşüktür. A. ferrooxidans'm zardaki doğal proton gradientinin (sitoplazmanm pH'ı 5,5-6 iken, periplazmanın pH'ı 1-2'dir) sağlanması için, protonların ATPaz ile sitoplazmaya alınması yoluyla harcanmasına bağlı olarak iç p H kabul edilebilir sınırlarda tutulur (Şekil 17.30). Protonlar H 2 O oluşumu sırasında tüketilir, ancak bu reaksiyon elektron da gerektirir ve bu elektronlar ferro demirden sağlanır: 2 Fe 2+
2H +
2Fe 3+
Anoksigenik Fototroflarda Ferro Demir Oksidasyonu Ferro demir, anaerobik koşullarda belirli anoksigenik fototroflar tarafından okside edilebilir (Şekil 17.31). Bu durumda ferro demir, enerji metabolizmasında elektron vericisi olarak kullanılır, CO2 in indirgenmesi (ototrofi) için elektron vericisi olarak kul2+ 3+ lanılır. Fe /Fe çifti (0,2 V) bu organizmaların yaşadığı nötral pH'da, pH 2'de olduğundan çok daha az elektropozitiftir. Böylelikle, Fe2+'den kaynaklanan elektronlar, mor bakterilerin fotosistemindeki sitokrom c'yi indirger (Kısım 17.5'teki anoksigenik fotosenteze bakınız). Fototrofik mor bakteri grubunda yer alan organizmalar (Şekil 17.31b), elektron vericisi olarak Fe2+ ve S2~'nin okside edilebildiği koşullarda FeS'i de elektron vericisi olarak kullanabilir. Bazı fototrofik yeşil kükürt bakterileri (Chlorobium cinsi; <3°e> Kısım 12.32), Fe2+/yi fototrofik elektron vericisi olarak kullanabilmektedir. Bunun dışında, Fe2+ okside edebilen ve aynı zamanda NO3~'ü N2'ye indirgeyerek anoksik koşullar altında gelişebilen çeşitli kemotrofik denitrifiye edici bakteriler izole edilmiştir. Bununla birlikte, bu organizmalar
H2O
Sonuç olarak A. ferrooxidans, sitoplazmik zardaki doğal proton motive gücü kullanarak ve Fe 2+ 'yi elektron vericisi olarak kullanarak ATP sentezleyebilir (Şekil 17.30). A. ferrooxidans'ta ototrofi, Calvin döngüsü ile gerçekleştirilir ve elektron vericisi Fe 2 + / nin yüksek indirgenme potansiyeli nedeniyle, elde edilen enerjinin büyük bir bölümü CO 2 fiksasyonu için gerekli olan indirgeyici gücü sağlamak amacıyla ters elektron akışı reaksiyonlarında harcanır. Buna göre, A. ferrooxidans oldukça yüksek enerji isteğine rağmen, çok az miktarda enerji üretebilir. Bu nedenle de daha fazla enerji için, çok daha fazla miktarda Fe 2+/ i okside etmesi gerekir, bunu gerçekleştirdiğinde bile hücre materyalini az miktarda
(a) • Şekil 17.31 Anoksijenik lototrofik bakterilerle ferro demir oksidasyonu. (a) Anoksik haldeki kültür tüpünde Fe2t oksidasyonu. Soldan sağa doğru: Steril besiyeri, aşılanmış besiyeri, gelişen bir kültür görülmektedir. Kahverengi-kırmızı renk esasen Fe(OH)3presipitatından kaynaklanmaktadır, (b) Demir oksitleyen mor bakterinin faz kontrast fotomikrografı. Hücrelerin içerisindeki parlak ışık kinci alanlar gaz vezikülleridir («**s Kısım 4.12). Hücre dışındaki granüller demir presipitatlandır. Bu organizma filogenetik olarak mor kükürt bakterisi Chromatium'a akrabadır (C«5 Kısım 12.2).
17 12 • Nitrifikasyon ve Anammoks • 555
aerobik demir bakterileri gibi, demiri hem enerji hem de indirgeyici güç ihtiyacını karşılamada elektron vericisi olarak kullanabilmektedir. Fe2+ oksitleyen fototrofların keşfi ile fotosentezin evriminin anlaşılması ve eski sedimentlerde çok büyük miktarda ferrik demir bulunmasının nedeninin açıklanmasında önemli veriler elde edilmiştir. Bu keşifden önce; ferrik demirin oksijenik fototroflar tarafından sadece ferro demirin O, ile okside edilmesinden sağlanabildiği düşünülüyordu (o«5 Kısım 11.1). Ancak bu sedimentlerin yaşı göz önüne alındığında, ferrik demirin anoksijenik fototroflar tarafından da Fe2+/nin oksidasyonu ile anoksik çevrelerde üretilebildiği görülmektedir. 17.11 Kavramların Gözden Geçirilmesi
kendi elektron taşıma sistemlerine verir. Bu durum, serbest bırakılacak enerji miktarını ve her bir çift elektrondan üretilebilen ATP miktarını kısıtlar. İndirgenmiş azot bileşiklerinin oksidasyonuna birkaç anahtar enzim katılır. Amonyak oksitleyen bakteriler amonyak mononoksijenaz enzimi ile (mononoksijenaz enzimlerinin irdelenmesi için Kısım 17.22'ye bakınız) NH/ten NH 2 OH ve H 2 O üretir (Şekil 17.32). Daha sonra hidroksilamin oksidoredüktaz, NH2OH'ı NO2~'ye okside etmekte ve bu süreç ile 4 elektron taşınır. Amonyak monooksijenaz integral bir zar proteini, hidroksilamin oksidoredüktaz ise periplazmik bir proteindir (Şekil 17.32»). Amonyak monooksijenaz tarafından gerçekleştirilen reaksiyon; NH 3 +O 2
2e-
NH 2 OH
H2O
2+
Demir bakterileri, ferro demiri (Fe ) tek enerji kaynağı olarak kullanabilen kemolitotroflardır. Çoğu demir bakterisi, sadece asit pH'da ve çoğunlukla mineralce zengin maden işletmelerinden kaynaklanan asit kirliliğinin bulunduğu bölgelerde gelişir. Bazı fototrofik mor bakteriler anaerobik olarak Fe2*'yi Fe3+'e okside edebilir. Asidik pH'da Fe2+'nin Fe3+'e oksidasyonunda niçin çok az miktarda enerji elde edilebilir? • Rustisiyaninin görevi nedir ve hücrenin hangi bölgesinde yer almaktadır? • Fe2+ anoksik olarak nasıl okside edilebilir? •
Nitrifikasyon ve Anammoks Amonyak (NH3), ve nitrit (NO2~) Elektron vericisi olarak en yaygın kullanılan azot bileşikleridir. Bu bileşikler, nitrifikasyon süreci ile aerobik olarak kemolitotrofik nitrifiye edici bakteriler tarafından okside edilir (&*$ Kısım 12.3). Nitrifiye edici bakteriler toprakta ve suda yaygın olarak bulunurlar. Bir grup bakteri, nitrosofiye ediciler (Nitrosomonas
bir oksijen atomunun suya indirgenmesi için, dışarıdan sağlanan iki elektrona ilave olarak iki protona gereksinim vardır. Bu elektronlar, hidroksilamin oksidasyonundan sağlanır ve sitokrom c ve ubiquinon yolu ile hidroksilamin oksidoredüktaz üzerinden amonyak monooksijenaza bağlanır (Şekil 17.32). Böylelikle NH3'ün NO2~'ye oksidasyonundan kaynaklanan her dört elektrondan sadece ikisi terminal oksidaza bağlanabilir (sitokrom aa3, şekil 17.32). Nitrit okside edici bakteriler nitriti nitrata okside etmek için nitrit oksidoredüktazı kullanırken, elektronlar çok kısa bir elektron taşınım sisteminde terminal oksidaza taşınmaktadır (NO3~/ NO2~ çiftinin yüksek potansiyeli nedeniyle) (Şekil 17.33»). Nitrit okside edicilerin elektron taşınım zin-
NH2OH + H20
Periplazma
cinsi), amonyağı nitrite okside ederken, diğer bir grup bakteri ise {Nitrobacter) nitriti nitrata okside eder. Bu şekilde, bu iki grup organizma tarafından gerçekleştirilen amonyağın nitrata tam oksidasyonunda 8 elektron transfer edilir (Mikrobiyal Okuma Parçasına bakınız). Nitrifikasyonun Biyoenerjetiği ve Enzimolojisi
Azotlu bileşiklerden kaynaklanan elektronlar, elektron taşıma zincirine girmekte ve elektron akışı sayesinde proton motive güç oluşturulmakta ve dolayısıyla da ATP sentezi gerçekleştirilir. Bununla birlikte, elektron vericilerinin indirgenme potansiyelleri nedeniyle nitrifiye edici bakteriler de kükürt kemolitotroflarına benzer şekilde biyoenerjetik sorunlarla karşılaşır. NO 2 "/NH 3 çiftinin (NH3 oksidasyonunun ilk basamağı) E0"ı +0,34 V'tur. NO3~/ NO2~ çiftinin (NH3 oksidasyonunun ikinci basamağı) E0"ı ise daha da yüksek olup, yaklaşık +0,43 V'tur. Nispeten yüksek olan bu indirgenme potansiyelleri nedeniyle nitrifiye edici bakteriler elektronları, toplam sürecin ancak geç basamaklarında
NH 2 OH + H 2 8 Amonyak oksidasyonu
Oksijenin redüksiyonu
Sitoplazma
• Şekil 17.32 Amonyak oksidasyonu ve amonyak oksitleyen bakterilerde elektron akışı. Reaktantlar ve reaksiyon serilerinin ürünleri şekil üzerinde gösterilmiştir. Periplazmadaki sitokram c (sit c) zardaki sit c'nin farklı bir formudur. AMO, amonyak monoaksijenaz; HAO, hidroksilamin oksidoredüktaz; O, ubiquinon.
556 • Bolüm 17 • Metabolik Çeşitlilik
cirinde, a ve c tipi sitokromlar bulunur ve sitokrom aa3 aktivitesi ile proton motive güç oluşumu sağlanır (Sonuçta ATP sentezi sağlanır) (Şekil 17.33). Demir oksidasyonundaki gibi (Kısım 17.11'e bakınız) bu reaksiyonlarda da sadece az bir miktarda enerji elde edilebilir. Bu nedenle, nitrifiye edici bakterilerin gelişmesi zayıf olur. Nitrifiye Edici Bakterilerde Karbon Metabolizması
Kükürt ve demir okside edici kemolitotroflar gibi, aerobik nitrifiye edici bakteriler de CQ, fiksasyonu için Calvin döngüsünü kullanır ve bu sürecin ATP ve indirgeyici güç gereksinimi, zaten düşük miktarda enerji eldesi sağlayan enerji sisteminden sağlanır (Calvin döngüsünü yönlendiren NADH, ters elektron akışı ile sağlanır). Bu enerjetik baskı, nitrit okside ediciler için olumsuz bir durumdur ve belki de bu nedenle, birçok nitrit okside edici glukoz ve diğer belirli substratlar üzerinde kemoorganotrofik olarak gelişebilir (eoo Kısım 12.3). Anoksik Amonyak Oksidasyonu: Anammoks
Klasik nitrifiye edici bakteriler zorunlu aerob olmalarına karşın, indirgenmiş azot substratları üzerinde geliştiklerinde anoksik şartlarda amonyağı okside edebilirler. Anammoks (anoksik amonyak oksidasyonu) olarak bilinen bu süreç, oldukça ekzergoniktir ve organizmanın enerji metabolizmasıyla bağlantılıdır. Anammoks'da, elektron alıcısı olan amonyak nitrite okside olmakta ve gaz formunda azot kazanılır: NH 4 + + NO2-
> N 2 + 2 H2O
üyelerinden filogenetik olarak farklıdır (cno Kısım 12.28) (Şekil 17.34»). Planctomycetes; peptidoglikan içermeyen ve hücre içinde ökaryotik hücrelerin çekirdeğine analog, zarla çevrili yapılar bulunduran, alışılmamış Bacteria üyeleridir (c«s Kısım 12.28). B. anammoxidans'm ana bölmesi anammoksozom olarak adlandırılır ve anammoks reaksiyonu bu bölgede gerçekleşir (Şekil 17.34i)). Anammoksozom, birim zarla çevrili bir yapıdır, diğer bir deyişle, bir organeldir (Şekil 17.34b). Ancak, Brocadia, kesinlikle bir prokaryottur. Anammoksozom daha önce de belirtildiği gibi zarla çevrili, "çekirdek" benzeri bir yapıdır. Anammoksozomun zar lipitleri kendine özgüdür. Bu lipitler, fazlaca siklobütan halkası içeren yağ asitleri içerir (Şekil 24) ve bu yağ asitleri gliserole ester ve eter bağları ile bağlanır. Bu lipidler, difüzyona yüksek derecede dirençli olan, alışılmamış bir zar yapısı oluşturur. Bu güçlü anammoksozom zarı, hücreyi anammoks reaksiyonu sırasında oluşan toksik ara ürünlere karşı korur. Anammoks reaksiyonunda kullanılan NO2~'nin kaynağı, aerobik nitrifiye edici bakterilerin gerçekleştirdiği amonyak oksidasyonunun bir ürünü olan
AG° = -357 kj
Anammoks'u katalizleyen organizma, Brocadia anamrnoxidans, Bacteria'nm Planctomycetes şubesi
2H+
Anammoksozom
H+
;.
H2O Nitritin oksidasyonu Sitoplazma
ATP redüksiyonu 2 H,0
• Şekil 17.33 Nitrifikasyon bakterileri ile nitritin nitrata oksidasyonu. Bu reaksiyon serilerinin reaktantlan ve ürünleri şekilde verilmiştir. NOR, nitrit oksidoredüktaz.
• Şekil 17.34 Anammoks organizması Brocadia anammoKİdans. (a) Faz kontrast fotomikrografı. Bir hücre yaklaşık 1 pm çapındadır. Hücrenin merkezinde (ok) geniş fibrilli anammoksozom içeren zarla çevrili bölgelere dikkat ediniz. Brocadia, sitoplazmasında birkaç farklı tipte zarla çevrili bölgeleri içeren Planctomyces organizmaları ile filogenetik açıdan akrabadırlar (Kısım 12.28 ve Şekil 12.87).
17.13 • Anaerobik Solunum • 557
NO2- 'dir. (Şekil 17.32), Nitrifiye edicilerin iki grubu, aerobik (örneğin, Nitrosomonas) ve anaerobik (Brocadia) lağımlarda ve diğer amonyakça zengin atık su habitatlarında bir arada yaşarlar. Amonyak okside edicilerin iki grubunun da birlikte yaşadığı bu gibi çevrelerde, hem oksik hem de anoksik bölgelerde askıda duran partiküller mevcuttur. Karışık laboratuvar kültürlerinde oksijenin yüksek seviyeleri anammoks'u engellerken, klasik nitrifikasyonu destekler. Buna göre; doğada anammoks yoluyla olan amonyak oksidasyonu, sistemdeki O2 konsantrasyonunca yönlendirilir. Klasik nitrifiye edici bakteriler gibi, Brocadia anammoxidans da aynı zamanda ototroftur. Anammoks organizmaları CO2'yi tek karbon kaynağı, nitriti de elektron vericisi olarak kullanarak grlişip hücre materyalini üretebilir: CO,
2 NO2- + H2O
Ototrofik nitrifiye edicilerin tersine, B. anammoxidans Calvin döngüsü enzimlerinden yoksundur ve CO2 fiksasyon mekanizması açık değildir. Bununla birlikte; CO, fiksasyonu için elektron vericisi olarak nitrit kullanımının yanı sıra, nitrat üretimi de Nitrobacter gibi aerobik nitrifiye edicilerin gerçekleştirdiği reaksiyon ile tamamen aynı şekilde gerçekleşir (Şekil 17.33'e bakınız). Böylece, filogenetik farklılığa rağmen aerobik nitrifiye ediciler ve anammoks organizmaları, ortak substratları ve aynı ekolojiyi paylaşır. Anammoks aydınlatılmadan önce, amonyağın anoksik çevrelerde kararlı olduğu görüşü kabul görmekteydi. Bununla birlikte; şu anda amonyağın O2 yokluğunda okside edilebildiği kesindir. Anammoks, anoksik atık suların içeriği açısından çevresel olarak oldukça faydalı bir süreçtir. Azot kirliliğine maruz kalan akarsu ve nehirlerden amonyak ve ilgili aminlerin uzaklaştırılması, yüksek kalitede su sağlanmasında yardımcı olur. Anammoks üzerine yapılan ekolojik çalışmalar, bu sürecin aynı zamanda Brocadia'ya benzer organizmalar tarafından deniz sedimentlerinde de gerçekleştirildiğini göstermiştir. Bu buluş, denizsel çevrelerde kaybolduğu bilinen amonyağın yok olduşunun açıklanması açısından önemlidir, ancak bu sürecin mekanizması açıklanamamıştır. 17.12 Kavramların Gözden Geçirilmesi Amonyak ve nitrit, nitrifiye edici bakteriler tarafından elektron vericisi olarak kullanılır. Amonyak oksitleyen bakteriler nitrit üretir ve bu nitrit de nitrit oksitleyen bakteriler tarafından nitrata okside edilir. Anoksik amonyak oksidasyonunda, anammoksozom içinde N 2 ve NO3~ üretimi gerçekleşir. • Nitrosomonas'm ve Nitrobacter'in kullandığı inorganik elektron vericileri nelerdir? • Ajnonyak monooksijenaz enziminin substratları nelerdir?
•
Nitrifiye edici bakterilerin kullandığı karbon kaynakları nelerdir? • Anammoks reaksiyonu nedir ve aerobik nitrifikasyondan nasıl ayrılır?
WyM • • ! YAŞAMIN ANAEROBİK • T 1 1 1 YÖNÜ: ANAEROBİK SOLUNUM Anaerobik gelişme ökaryotlarda nadir görülen bir süreçtir. Prokaryotlarda ise anaerobik gelişme sıkça görülmektedir ve anaerobik metabolizma mekanizması oldukça yaygındır. Önümüzdeki birkaç kısımda anaerobik solunum ve prokaryotların O2'den başka diğer enerji kazandıran elektron alıcılarından yararlandıkları bazı süreçler incelenecektir.
Anaerobik Solunum Aerobik solunum sürecinin bazı ayrıntılarını Bölüm 5'te incelemiştik. Orada söylediğimiz gibi; terminal elektron alıcısı olarak kullanılan moleküler oksijenin görevi, elektron taşıma zincirindeki elektron taşıyıcılarından elektronları kabul etmektir. Ancak; çeşitli elektron alıcılarının O2 yerine kullanılabileceği ve bu durumda anaerobik solunum olarak adlandırılan sürecin gerçekleşmiş olacağını da belirtmiştik. Burada, bu süreçlerden bazıları ele alınacaktır. Anaerobik solunum sürecini kullanan bakterilerin elektron taşıma sistemlerinde sitokromlar, quinonlar, demirli-kükürtlü proteinler ve diğer özgül elektron taşıma proteinler bulunur. Dolayısıyla, bu organizmaların solunum sistemleri aerobların solunum sistemiyle analogtur. Bazı durumlarda; denitrifiye edici bakterilerde olduğu gibi, anaerobik solunum süreci aynı organizmanın aerobik formu ile rekabet eder. Bazı durumlarda, O2 varlığında aerobik solunum desteklenmekte ve çevredeki O2 tüketildiğinde diğer elektron alıcıları indirgenir. Bunların dışındaki anaerobik solunum yapan bakteriler zorunlu anaerobturlar ve O2'yi kullanma yetenekleri yoktur. Alternatif Elektron Alıcıları ve Elektron Kulesi Bir elektron vericisinin oksidasyonunda elektron alıcısı olarak O2 kullanıldığı zaman, aynı bileşiğin oksidasyonunda alternatif elektron alıcıları kullanıldığından daha fazla enerji kazanılır («**» Şekil 5.9). Bu enerji farklılıkları, elektron alıcılarının indirgenme potansiyellerine bakıldığında kolaylıkla görülür (Şekil 17.35»). O 2 /H 2 O çifti en elektropozitif çift olduğu için, diğer elektron alıcıların yerine O2 kullanıldığında daha fazla enerji elde edilebilir. O 2 /H 2 O çiftine yakın olan diğer elektron alıcıları Fe3+, NO3" ve NO2~'dir. Daha elektronegatif alıcılar SO42~, S ve CO2'dir. En yaygın anaerobik solunum tipleri Şekil 17.35'te verilmiştir.
558 • Bolum 17 • Metabolih Çeşitlilik -0.3
Anoksik
c c
CH 3 —COO"
-0.27
-0.25
CO 2
Karbonat solunumu; homoasetojenik bakteriler, zorunlu anaeroblar
s°
Kükürt solunumu; fakültatif aeroblar ve zorunlu anaeroblar
CH 4 CO 2
-0.22
HS-
Karbonat solunumu; metanojenik Archaea zorunlu anaeroblar
Sülfat solunumu (sülfat redüksiyonu); zorunlu anaeroblar
0 (V) Süksinat
Fumarat solunumu; fakültatif aeroblar
Fumarat
c c
NO2", N 2 O, N 2
+0.4
Fe 2 +
+0.75 Oksik (oksijen mevcut)
+0.82
Fe 3 +
H2O
Nitrat solunumu (denitrfikasyon); fakültatif aeroblar
Demir solunumu; fakültatif aeroblar ve zorunlu anaeroblar
Aerobik solunum; zorunlu ve fakültatif aeroblar
• Şekil 17.35 Anaerobik solunum örnekleri. Çiftler en fazla elektronegatif EQ "den (üst) en fazla elektropozitife (alt) doğru sırayla düzenlenmiştir. Bu anaerobik solunum çeşitlerinin nasıl enerji verimi sağladığım görmek için Şekil 5.9'la kıyaslayınız.
Asimilatif ve Disimilatif Metabolizma NO3~, SO42~ ve CO2 gibi inorganik bileşikler; hücresel azot, kükürt ve karbon kaynağı olarak birçok mikroorganizma tarafından indirgenir. Bu bileşiklerin indirgenmesinden elde edilen son ürünler yukarıdaki sıraya göre; amino grupları (—NH2), sülfidril grupları (—SH) ve organik karbon bileşikleridir. NO3-, SO42~ ve CO2 gibi inorganik bileşiklerin biyosentezde kullanılmak üzere indirgenmesine asimilasyon, bu reaksiyonları içeren sürece de asimilatif metabolizma denir. NO3", SO42 ve CO2'nin asimilatif metabolizmaları, anaerobik solunumda enerji metabolizması için elektron alıcısı olarak kullanılmalarından oldukça farklıdır. Bu iki indirgenme süreci ayırt etmek için bu bileşiklerin enerji metabolizmasında, elektron alıcısı olarak kullanılmalarına disimilatif metabolizma denir.
Asimilatif ve disimilatif metabolizmalar oldukça farklıdır. Asimilatif metabolizmada, hücre gelişmesi için gerekli bileşiklerin (NO3~, SO42~ veya CO2) sadece yeteri miktarı indirgenmektedir. Ürünler sonuçta, makromolekül formunda hücre materyaline dönüştürülmektedir. Disimilatif metabolizmada ise çok miktarda elektron alıcısı indirgenmekte ve indirgenmiş ürün hücre dışına bırakılmaktadır. Birçok organizma (örneğin; birçok Bacteria, Archaea, mantar, alg ve yüksek bitkiler) NO3~, SO42~ ve CO2 gibi bileşiklerin özümleme metabolizmasını kullanırken, sadece sınırlı sayıdaki organizma özellikle de prokaryotlar disimilatif metabolizmayı kullanmaktadır. 17.13 Kavramların Gözden Geçirilmesi Enerji kazanım metabolizmasında, elektron alıcısı olarak kullanılan en fazla kullanılan alıcı oksijen olmasına rağmen, birçok bileşikde elektron alıcısı olarak kullanılabilir. Anaerobik solunum sürecinin enerji verimi düşüktür, ancak oksijensiz çevrelerde solunumun gerçekleşmesini olanaklı kılar. • Anaerobik solunum nedir? • Elektron vericisi olarak H2 kullanıldığında NO3~ indirgenmesi niçin S" indirgenmesinden daha fazla tercih edilebilir bir reaksiyondur?
17.14
Nitrat İndirgenmesi ve Denitrifikasyon İşlemi
İnorganik azot bileşikleri, anaerobik solunumda kullanılan en yaygın elektron alıcılardır. Tablo 17.2 çeşitli inorganik azot bileşiklerini ve bu bileşiklerin oksidasyon durumlarını göstermektedir. Doğada en yaygın bulunan inorganik azot bileşikleri amonyak ve nitrattır ve her iki bileşik de atmosferde inorganik kimyasal süreçlerde oluşturulur. Doğadaki en kararlı azot formu azot gazı (N2)'dır. Azot fiksasyonu, biyosentetik azot kaynağı olarak N2'nin kullanımı, daha sonra bu bölümde anlatılacaktır (Kısım 17.28). En yaygın alternatif elektron alıcılarından biri de N2O, NO ve N2'ye indirgenen NO^'tır. Nitrat indirgenmesinin tüm ürünleri gaz formunda olduğu için, bunlar denitrifikasyon adı verilen süreç ile Tabi 17 2
Anahtar azot bileşiklerinin oksidasyon durumlar.
Bileşik Organik N(R — NH2) Amonyak (NH3) Azot gazı (N2) Nitröz oksit (N2O) Nitrojen oksit (NO) Nitrit(NO 2 ) +3 Nitrojen dioksit (NO2) Nitrat (NO,-) +5
Oksidasyon durumu -3 0
+1 (ortalama her bir N) +2 +4
i
17.14 • Nitrat indirgenmesi ve Denitrifikasyon işlemi • 559
Nitrat (IO3-)
kolayca çevreden kaybedilebilir (Şekil 17.36»). Bu süreç ile biyolojik olarak, gaz formda N 2 oluşturulmaktadır. N2, organizmalar için azot kaynağı olarak NO3"'ten çok daha az kullanılabilirdir ve bu yüzden denitrifikasyon, tarımsal açıdan zararlı bir süreçtir. Kanalizasyon suyu arıtımı (C«I Kısım 28.2) açısından ise denitrifikasyon süreci oldukça faydalıdır, çünkü bu süreç ile NO3~ N2'ye dönüştürülmektedir. Bu dönüşüm etkili bir şekilde algal büyümeyi artırabilen fiske edilecek azot miktarı kanalizasyon suyunun arıtılmış deşarj suyunda azalır (Kısım 19.5).
§.
Nitrit PO 2 ) Nitrit redüktaz
Nitrik oksit (NO) Nitrik oksit redüktaz
Nitröz oksit (IİJO) Nitröz oksit redüktaz
Atmosfere salınan gazlar (denitrifikasyon)
Disimilatif Nitrat İndirgenmesinin Biyokimyası
Dinitrojen (N2)"
• Şekil 17.36 Nitratın disimilatif indirgenme basamakları. Bazı organizmalar, örneğin E. coli sadece ilk basamağı gerçekleştirebilir. İlgili tüm enzimler anoksik koşullarda çalışır. Aynca, bazı prokaryotlann disimilatif metabolizmada NO3 'ü NH4+'e indirgeyebildikleri bilinir.
2H+
Disimilatif nitrat indirgenmesinin ilk basamağında iş gören, zarla bütünleşmiş ve molibden içeren, moleküler oksijen tarafından baskılanan enzim nitrat redüktazdır. Bu yol izine katılan enzimler (Şekil 17.37*) koordineli olarak düzenlenmekte, aynı zamanda O2 tarafından baskılanır. Buna ek olarak, anoksik koşullarda da bu enzimlerin tam olarak ve hızlı bir şekilde çalışması için nitrat bulunmalıdır. Nitrat indirgenmesinin ilk ürünü nitrit (NO2~ )'tir ve nitrit redüktaz enzimi bu ürünü nitrik oksi-
2H+
2e"
2H
Nitrat redüktaz
Sit b Sit b Sit o
NADH+ H +
2H+
NADH + H +
2H
H2O (a)
NO2" + H2O
(b)
N2O redüktaz 2 H +
^
\
2H Dış
Sit ö
NO redüktaz NADH+ H+ (c)
• Şekil 17.37 Solunum, (a) O2veya (b) NO3" bir elektron alıcısı olarak ve NADH elektron vericisi olarak kullanıldığında Escherichia coii'nin zarında gerçekleşen elektron taşıma süreci. Fp, flavoprotein; 0, ubiquinon. Yüksek oksijen konsantrasyonunda, taşıyıcıların dizilimi, sit £>562—> sit o —> Oz. Ancak, düşük oksijen konsantrasyonunda (gösterilmemiştir), dizilim, b568—> sit d —> O2şeklindedir. Elektron taşıma reaksiyonları sırasında, aerobik olarak okside edilen iki elektronun anaerobik elektron alıcısı olarak nitrat kullanımına göre nasıl daha fazla sayıda protonun yer değişikliğine neden olduğuna dikkat ediniz. Çünkü aerobik terminal oksidaz (sit o) bir proton pompalayabilir, (c) denitrifikasyon sırasında Pseudomonas stutzeri zarlarında gerçekleşen elektron taşımmımn olası şeması. Nitrat ve nitrik oksit (NO) redüktazlar sitoplazmik zarda yerleşmiştir. Oysa, nitrit (NO2~) ve nitröz oksit (N2O) redüktazlar periplazmiktir. Nitrat redüktaz dışında çeşitli redüktazlara aracı elektron vericiler kesin olarak tammlanmamıştır.
560 • Bölüm 17 • Metabolik Çeşitlilik
de (NO) indirger (Şekil 17.37c). Bazı organizmalar disimilatif süreç ile NO2~'yi amonyağa (NH3) indirgeyebilir, ancak gaz formundaki ürünlerin üretimi (denitrifikasyon) global bir öneme sahiptir. Çünkü bu süreç çevresel açıdan önemli olan, bitkilerin kullanabildiği azotun fiske edilmiş formunu (NO3~) tüketen ve gaz formda azot bileşikleri üreten bir süreçtir. Örneğin; N2O güneş ışınları tarafından NO'ya dönüştürülebilmekte ve NO atmosfer üzerindeki ozonla tepkimeye girerek yeryüzüne asit (Nitröz asit, HNO2) yağmurları şeklinde geri dönen nitrit formuna dönüşmektedir. Denitrifikasyonun biyokimyasal basamakları Şekil 17.37c'de gösterilmiştir. Disimilatif nitrat redüksiyonunun biyokimyasının detayları sadece NO3~'ü N O 2 ' y e indirgeyen Escherichia coli'yi ve tam denitrifikasyon yapan Paracoccus denitrificans ve Pseudamonas stutzeri'yi
de
içeren birkaç organizma üzerinde çalışılmıştır (Şekil 17.37c). E. coli'nin nitrat redüktazı, elektronları b tipi sitokromdan temin etmektedir. E. coli'nin aerobik ve anaerobik solunumu Şekil 17.37a ve b'de karşılaştırılmıştır. Buradan da görüldüğü gibi, NO3~/ NO2" çiftinin indirgenme potansiyelinden dolayı (+ 0.43 V) nitrat indirgenmesi (anaerobik solunum) sırasında sadece iki proton taşınırken, aerobik solunumda üç proton taşınmaktadır (y2O2/H2O2+0.82 V). Şekil 17.37c'de özetlendiği üzere P, denitrificans ve P. stutzeri nitrit redüktaz, nitrik oksit redüktaz ve
nitröz oksit redüktaz ile nitriti azota okside edebilir. Elektron taşınımı sırasında proton motive güç oluşmakta ve olağan şekilde ATPaz aracılığıyla ATP üretimi sağlanır. NO3~'ün N2'ye indirgenmesi sürecinde ek ATP kazancı olur, çünkü NO redüktaz proton çıkışına neden olur (Şekil 17.37c). Denitrifiye Edici Prokaryotlann Diğer Özellikleri
Çoğu denitrifiye edici prokaryot filogenetik olarak Proteobacteria üyesidir (en$ Kısım 12.2-12.8) ve fakültatif aerobtur. Ortamda nitrat bulunsa bile, oksijen varlığında aerobik solunum meydana gelir. Birçok denitrifiye edici bakteri, aynı zamanda ferrik demir (Fe2+) ve belirli organik elektron alıcılarını anaerobik olarak indirgeyebilir (Kısım 17.18'e bakınız). Bununla birlikte, çoğu denitrifiye edici bakteri fermentasyon yoluyla da çoğalabilir. Buna göre, denitrifiye edici bakteriler oldukça fazla sayıda alternatif enerji üretimi mekanizmalarına sahiptirler. 17.14 Kavramların Gözden Geçirilmesi Nitrat, anaerobik solunumda yaygın olarak kullanılan bir elektron alıcısıdır. Bunun kullanımı nitratı nitrite indirgeyen nitrat redüktaz enzimini gerektirir. Birçok bakteri, anaerobik solunumda denitrifikasyon adı verilen süreç ile nitratı kullanarak sonuçta N 2 üretebilmektedir. •
E. coli aerobik solunumda niçin NO3~ indirgenmesi sırasında elde ettiğinden daha fazla enerji elde edebilir?
• Disimilatif nitrat redüktaz hücrede nerede bulunur? İçerdiği alışılmamış metal nedir? • Pseudomonas stutzeri gibi organizmalar NO 3 solunumunda niçin E. coli'den daha fazla enerji elde eder?
Sülfatın İndirgenmesi Birkaç inorganik kükürt bileşiği, anaerobik solunumda önemli elektron alıcılarıdır. Anahtar kükürt bileşiklerinin oksidasyon durumları Tablo 17.3'te verilmiştir. Sülfat; kükürdün en okside formu olup, deniz suyunun ana anyonlarından birisidir ve doğada yaygın olarak bulunan sülfat indirgeyici bakterilerin kullandığı bir bileşiktir. Sülfat indirgenmesinin son ürünü olan H2S, birçok biyojeokimyasal sürece katılan önemli bir doğal üründür («aoa Kısım 19.13). Azot gibi, bunun da asimilatif ve disimilatif^ metabolizmasının ayrılması önemlidir. Yüksek bitkiler, algler, mantarlar ve birçok prokaryotu içeren çok sayıda organizma, sülfatı biyosentezde kükürt kaynağı olarak kullanılır. Enerji üretim süreçlerinde elektron alıcısı olarak sülfat kullanım yeteneğine sahip organizmalar, geniş ölçüde sülfat indirgenmesi yapabilen sülfat indirgeyici bakteriler ile sınırlıdır. Asimilatif sülfat indirgenmesinden elde edilen H2S'in kükürt atomu aminoasit gibi bileşiklerin yapışma katılarak organik kükürt formuna dönüştürülür, ancak dismilatif sülfat indirgenmesinde H2S dışarıya verilir. Tablo Al .2 ve Şekil 17.35'te gösterilen indirgenme potansiyellerinden anlaşılabileceği gibi sülfat, O2 ve NO 3 'ten çok daha az verimli olan bir elektron alıcısıdır. Bununla birlikte; NADH veya FADH kazancı sağlayan elektron vericiler kullanıldığında, ATP yapımı için yeterli enerji elde edilebilir. Sülfatın az verimli enerjetiği nedeniyle, organizma SO42~ üzerinde geliştiği zaman, O2 ve
a
°
Bileşik
'
Kükürt bileşikleri ve sülfat indirgenmesinde elektron vericiler Oksidasyon durumu
Anahtar kükürt bileşiklerinin oksidasyon durumları -2 Organik S (R — SH) -2 Sülfür (H2S) 0 Elemental kükürt (S°) +2 (ortalama her bir S) Tiyosülfat (S2O,2-) +4 Kükürt dioksit (SO2) +4 Sülfit (SO,2-) +6 Sülfat (SÖ/i Sülfat indirgenmesinde kullanılan bazı elektron vericiler Asetat Propiyonat Laktat Piruvat Butirat Uzun zincirli yağ asitleri Etanol ve diğer alkoller Fumarat Benzoat İndol Malat Kolin Hegzadekan
17.15 • Sülfatın İndirgenmesi • 561
NO 3 üzerinde geliştiği zamankinden daha düşük seviyede çoğalır. Sülfat indirgeyici bakteriler tarafından kullanılan bazı elektron vericiler Tablo 17.3'te listelenmiştir. Sülfat indirgeyici bakterilerin en çok kullandığı elektron vericiler H2, laktat ve pirüvat iken, diğerleri daha sınırlı olarak kullanılır. Bununla birlikte; sülfat indirgeyici bakterilerin çok çeşitli morfolojik ve fizyolojik tipleri bilinmektedir (Kısım 12.18 ve 13. 17). Bir Archea üyesi olan Archaeoglobus istisna olmakla birlikte, bilinen tüm sülfat indirgeyici prokaryotlar Bacteria üyesidir.
0
Kv y i ° ° ^^^•^^N'
OH
Disimilatif met;
ıbolizmada kullanılır
OH (Adenozin 5'-fosfosülfat)
APS
OH
0 II CH,-O-P-O-S-OH
Adenin
I
OH
II
II
o
o
OH I
O-P-OH Asimilatif metabolizmada kullanılır
PAPS
(Fosfoadenozin 5'-fosfosülfat)
(a)
ATP
so42
oluşur (Şekil 17.38a). Her iki durumda da sülfat indirgenmesinin ilk ürünü sülfittir (SO32~). Sülfit oluştuktan sonra sülfür sülfit redüktaz enzimi tarafından oluşturulur (Şekil 17. 38b). Disimilatif sülfat indirgenmesi sürecinde, elektron taşınım reaksiyonları proton motive gücü oluşturur ve bu da ATPaz aracılığıyla ATP sentezine olanak sağlar. Ana elektron taşıyıcısı olan sitokrom c3, periplazmik ve düşük potansiyelli bir sitokromdur (Şekil 17.39»). Sitokrom cy elektronları periplazmada yerleşik olan hidrojenazdan (aşağıda görülen) kabul eder ve bu elektronlar zara bağlı protein kompleksine aktarılır. Bu komplekse Hmc adı verilir ve elektronları sitoplazmik enzimler olan APS redüktaz ve sülfit redüktaz için kullanılabilir hale getirir (Şekil 17.39). 8H+
ATP ADP
PP|
ATP sülfürilaz
SO42~'in H2S'e indirgenmesinde birkaç ara basamakta sekiz elektron indirgenir (Tablo 17.3). Sülfat iyonu kararlıdır ve aktive edilmeden indirgenemez. Sülfat ATP ile aktive edilir. ATP sülfürihz enzimi, sülfat iyonu ile ATP'nin fosfatını birleştirir ve Şekil 17.38*'de gösterilen adenozin fosfosülfatı (APS) oluşturur. Disimilatif sülfat indirgenmesinde APS'deki sülfat, APS redüktaz enzimi tarafından direk olarak sülfite (SO32~) indirgenir ve AMP serbest kalır. Asimilatif indirgenmede, diğer P, APS'ye eklenir ve fosfoadenozinfosfosülfat (PAPS)
o _ _ p _ _ CH2 0 0 s_0H OH
enin / -- \
Sülfat İndirgenmesinin Biyokimyası ve Enerjetiği
-»APS
APS kinaz
APS
•+ PAPS
8e Hmc
NADPH 2 e~
fitilini
redüktaz
PAP
^AMP
Sülfit redüktaz
Dış
\
ADP
H2S
H2S
Atım
Disimilatif sülfat indirgenmesi
A J
H2S
Organik kükürt bileşikleri (sistein, metiyonin vs.)
Asimilatif sülfat indirgenmesi
(b)
• Şekil 17.38 Sülfat indirgenmesinin biyokimyası, (a) Aktif sülfatın iki tipi olan adenozin 5'-fosfosülfat (APS) ve fosfoadenozin 5'-fosfosülfat (PAPS) yapılabilir. Her ikisi de adenozin difosfafm (ADP) ikinci fosfatı ile sülfatın yer değiştirmesi sonucu oluşan ADP türevleridir, (b) Asimilatif ve disimilatif sülfat indirgenmesi şeması.
• Şekil 17.39 Sülfat indirgeyen bakterilerde elektron taşınımı ve enerji korunumu. Harici hidrojene (H2) ek olarak laktat, pirüvat gibi organik bileşiklerin katabolizmasından kaynaklanan Hz de hidrojenazı çalıştırabilir. Hidrojenaz enzimi (Hzaz), sitokrom c3 ve sitokrom kompleksi (Hmc) periplazmik proteinlerdir. Sitoplazmik zarın bir tarafından diğer tarafına kadar yerleşmiş olan bir başka protein, APS redüktaza elektron sağlayan (SO32 oluşur) sitoplazmik bir demir sülfür proteinine ve sülfit redüktaza (HZS oluşumu bakınız Şekil 17.38b) Hmc'den elektron aktarma işi yapar. LDH, laktat dehidrogenaz.
562 • Bolum 17 • Metabolik Çeşitlilik
Sülfat indirgenmesi olayında, Desulfovibrio gibi organizmaların H 2 ü z e r i n d e m i yoksa laktat gibi organik bir bileşik ü z e r i n d e m i gelişeceğinin belirlenm e s i n d e hidrojenaz enzimi anahtar rol oynar. Bun u n nedeni; laktatm H 2 üretimi ile birlikte pirüvat ü z e r i n d e n asetata d ö n ü ş t ü r ü l m e s i d i r (Asetat hücre dışına verilir, ç ü n k ü Desulfovibrio asetatı okside edem e y e n bir sülfat indirgeyicidir, <3°a Kısım 12.18). H 2 , sitoplazmik zarın karşı tarafında üretilmekte ve periplazmik hidrojenaz tarafından oksitlenerek proton motive g ü ç oluşturulur (Şekil 17.39). Sülfat 2 indirgeyici bakterilerin ü r e m e verimi h e r SO 4 ~'ün HS"'e indirgenmesi ile bir A T P üretildiğine işaret eder. H 2 ile birlikte reaksiyon şu şekildedir: 4H 2
2
SO 4 - + H +
HS"
4H2O AG° = -152 kj
Laktat veya p i r u v a t elektron vericisi o l d u ğ u n d a , ATP sadece p r o t o n motive güçten üretilir, ek olarak pirüvatın asetata v e C O 2 ' y e o k s i d a s y o n u sırasında asetil-CoA v e asetil fosfat yolu ile d e A T P üretilir (Bununla ilgili d a h a fazla bilgi için Kısım 17.19'a bakınız). Asetat Kullanımı ve Ototrofi Çoğu sülfat indirgeyici, sülfat indirgenmesinde elektron vericisi olarak kullandığı asetatın tamamını CO2'ye okside edebilir (Kısım 12.18). CH3COO-
SO 4 2 "
3H+
. 2CO2
H2S + 2H2O
AG° = -575 kj
Bu sürecin enerjetiği H 2 veya laktat metabolizması kadar iyi anlaşılamamasma karşın, asetat oksidasyonunun mekanizması bilinmektedir. Birkaç istisnası bulunmakla birlikte; asetat CO2'ye, asetat sentezi veya asetat oksidasyonu için birçok anaerob tarafından kullanılan, bir seri çift yönlü reaksiyonu içeren asetil-CoA yol izi ile okside edilir (Kısım 17. 16'ya bakınız). Bu yol izinin kullandığı anahtar enzim karbon monoksit dehidrojenazdır ve bu yol izi ilk olarak, bir enerji kazanım mekanizması ile H 2 + CO2'den asetat üreten homoasetojenik bakterilerde keşfedilmiştir (Kısım 17.16'ya bakınız). Birkaç sülfat indirgeyici bakteri aynı zamanda; H 2 (elektron vericisi olarak), SO42~ (elektron alıcısı olarak) ve CO2 (karbon kaynağı olarak) içeren anoksik mineral tuz ortamında, ototrofik olarak gelişebilir. Bu koşullar altında geliştiklerinde, ototrofik sülfat indirgeyicileri hücre materyali üretimi için asetilCoA yol izini kullanırlar. Asetat okside eden sülfat indirgeyici bakteri olan Desulfobacter, asetil-CoA yol izi enzimlerini bulundurur ve asetatı sitrik asit döngüsü ile okside eder (<£»& Şekil 5.22). Bu, kural dışı istisnai bir durumdur.
Kükürt Disproporsinasyonu Belirli sülfat indirgeyici bakteriler, disproporsinasyon adı verilen enerji metabolizmasının bir şekli ile ara oksidasyon durumundaki kükürt bileşiklerini kullanabilme yeteneğine sahiptir. Disproporsinasyon terimi ana bileşiğin, biri kendinden daha fazla okside diğeri ise daha fazla indirgenmiş iki yeni bileşiğe ayrılmasını ifade eder. Örneğin; Desulfovibrio sulfodismutans, tiyosülfatı aşağıdaki şekilde disproporsinasyona uğratır: 2
S2O3 -
H2O -
2
• SO, - + HS AG° = -21.9 kj/reaksiyon 2
Bu reaksiyonda S2O3 "'ün kükürt atomlarından biri 2 daha okside bir forma (SO4 ~ formuna) dönüşürken, diğeri daha indirgenmiş bir forma (H2S formuna) dönüşür. D. sulfodismutans tarafından gerçekleştirilen tiyosülfat oksidasyonu, organizmayı ATP yapımında kullanılan proton motive gücü oluşturmaya yönlendirir. Sülfit (SO32İ ve elementel kükürt (S°) gibi diğer indirgenmiş kükürt bileşikleri, diğer sülfat indirgeyiciler tarafından iyi bir şekilde disproporsinasyona uğratılabilir. Bu metabolizma şekli ile doğada H2S'i çeşitli ara ürünlere okside eden kükürt kemolitotrofları ile birlikte yaşayan sülfat indirgeyici bakterilerin, bu ara ürünleri kullanarak enerji elde etmesi mümkün olur (ö<^ Kısım 19.13). Fosfit Oksidasyonu En az bir sülfat indirgeyici bakteri, sülfat indirgenmesi yanında fosfit (HPO3~) oksidasyonu yapabilme yeteneğine sahiptir. Bu reaksiyon kemolitotrofiktir ve ürünleri fosfat ve sülfür'dür. 4HPO3
• 4HPO42" AG°'= -364 kj
Bu organizma, Desulfotignum phosphitoxidans, karbon ihtiyacı için sadece CO2'e ihtiyaç duyar (Bu yüzden bu ototroftur bir organizmadır). Fosfitin havada kendiliğinden okside olan bir bileşik olması nedeniyle, bu organizma zorunlu bir anaerobtur. Doğada fosfit kaynağı belirsizdir. Bununla birlikte; D. phosphitoxidans tek enerji kaynağı olarak fosfiti kullanabildiğinden, bu fosfit muhtemelen anoksik çevrelerde organofosfatların yıkımından kaynaklanmaktadır. Kükürt disproporsinasyonu (aynı zamanda kemolitotrofik bir süreç) ve H 2 kullanımı ile birlikte fosfit oksidasyonu, sülfat indirgeyici bakterilerin kemolitotrofik çeşitliliğini göstermektedir. 17.15 Kavramların Gözden Geçirilmesi Sülfat indirgeyici bakteriler sülfatı hidrojen sülfüre indirger. Sülfat indirgenmesi öncelikle, ATP kullanılarak adenozin fosfosülfat (APS) oluşturulması ile aktive edilir. Sülfat indirgenmesinde kullanılan elektron vericiler H 2 , organik bileşikler ve fosfittir. Kükürt bileşiklerinin disproporsinasyonu belirli kükürt indirgeyiciler için, ek bir enerji kazanımı stratejisidir.
17.16 • Asetojenez • 563 • •
2
2
S, SO4 -, SO3 -, S2O/-; H2S'i tanımlayınız. Disimilatif sülfat indirgenmesi sırasında sülfat, sülfite nasıl dönüştürülür? • Sülfat indirgeyici bakteriler için H 2 niçin önemlidir? • Disproporsinasyona bir örnek veriniz.
Tablo 17.4 I.
Enerji metabolizması sonucu asetat sentezi Acetoanaerobium noterae Acetobacterium ıvoodii Acetobacterium zvieringae Acetogenium kivui Acetitomaculum ruminis Clostridium aceticum Clostridium thermaceticum Clostridium formicaceticum Desulfotomaculum orientis Sporomusa paucivorans Eubacterium limosum (ayrıca butirat üretir) Treponema primitia (termit bağırsağından)
II.
Ototrofik metabolizmada asetat sentezi Ototrofik homoasetojemk bakteriler Ototrofik metanojenler Ototrofik sülfat indirgeyen bakteriler
Asetojenez Karbon dioksit, CO2, doğada yaygın olarak bulunur ve kemoorganotrofik enerji metabolizmasının ana ürünü olmasına karşın, genellikle anoksik habitatlarda boldur. Zorunlu anaerobik prokaryotların iki ana grubu olan homoasetoj enler ve metanoj enler, CO2'yi enerji metabolizmalarında elektron alıcısı olarak kullanabilirler. Her iki organizma grubunun da ana elektron vericisi hidrojendir. Asetojenez ve Metanojenez süreçleri Şekil 17AO»'da gösterilmiştir. Her iki süreç sonucunda da, zardaki ATPaz'ın yakıtı olan H+ ve Na+ iyon gradientleri oluşur. Asetojenezde, aynı zamanda substrat seviyesinde fosforilasyon yolu ile enerji kazanımını da gerçekleşir. Organizmalar ve Yolizleri
CO2 fiksasyonunun asetil-CoA yol izini kullanan organizmalar
III. Enerji metabolizmasında asetat oksidasyonu Reaksiyon: Asetat + 2 H2O -* 2 CO2 + 8 H Grup II sülfat redükleyiciler {Desulfobacter'va dışında) Reaksiyon: -» CO 2 + CH 4 Asetotrofik metanojenler (Methanosarcina, Methanosaeta)
Homoasetojenler tarafından gerçekleştirilen reaksiyon: H++2HCO3
• CH3COO- 4H2O
H2'ye ek olarak, asetojenez için elektron vericileri organizmaya bağlı olarak Cj bileşikleri, şekerler, organik ve aminoasitler, alkoller ve belirli azot içerikli bileşikler olabilir. Çoğu homoasetojen aynı zamanda NO3~ ve S 2 O 3 'yi de indirgeyebilir. Bununla birlikte; CÖ2 indirgenmesi muhtemelen en büyük ekolojik öneme sahip, ana reaksiyondur. Homoasetojenler arasındaki temel bağlantı, CO2 indirgenmesi yol izidir. Homoasetojenler, asetil-CoA yol iziyle CO2'yi asetata dönüştürmekte ve çoğu homoasetojende ototrofik gelişme de bu şekilde gerçekleşmektedir. Tablo 17.4'te asetil-CoA yol izi ile asetatı üreten veya okside eden başlıca organizmalar listelenmiştir. Acetobacterium ıvoodii ve Clostridium aceticum gibi organizmalar, şekerlerin fermentasyonu ile ya kemoorganotrofik olarak H(JU
4H2
2 HUU," AG°' = -105kJ
AG° = ATP
Metanojenez
Proton veya sodyum itici güce ilave olarak CH 3 —C—O~ substrat 4 H Q düzeyinde • fosforilasyon Asetojenez
* Şekil 17.40 Metanojenez ve Asetojenez süreçlerinin karşılaştırılması. Reaksiyonlarda salman serbest enerjideki farklılıklara dikkat ediniz.
(reaksiyon 1) veya elektron vericisi olarak H2'yi kullanıp CO2'yi asetata indirgemek yoluyla kemolitotrofik olarak (reaksiyon 2) olarak çoğalabilirler. Her iki durumda da, ana ürün asetattır: (1) C 6 H I 2 O 6 -
• 3CH 3 COO" 3H
(2) 2HCO3
+
CH3COO-
4H 2 O
Homoasetojenler glikolitik yol izi ile glukozu iki pirüvat ve iki NADH'a (4 H'a denk gelir) dönüştürerek fermente eder. Bu noktada iki asetat molekülü üretilir. (3) 2 piruvar
> 2 asetatr + 2CO2 + 4H
Homoasetat fermentasyonunda üçüncü asetat, reaksiyon 3'te oluşan iki CO2 molekülünün ve glikolizden kaynaklanan dört elektronun ve iki piruvatın iki mol asetata oksidasyonundan kaynaklanan dört elektronun indirgenmesinden elde edilir [reaksiyon (3)]. Pirüvattan başlayarak toplam asetat üretimi şu şekilde yazılabilir: 2 piruvar + 4H
> 3 asetat" + H+
Enerji metabolizmasında asetat üreten ve bunu dışarıya salan çoğu homoasetojenik bakteri gram pozitiftir ve çoğu Clostridium cinsi içerisinde sınıflandırılır. Diğer birkaç gram pozitif ve çok sayıda farklı gram negatif bakteri, ototrofik amaçlarla asetil-CoA yolizini kullanır ve hücresel karbon için CO2'yi indirger.
564 • Bölüm 17 • Metabolik Çeşitlilik
Asetil-CoA yol izi, belirli sülfat indirgeyici bakteriler için ototrofik gelişmede iş gören bir yol izidir (Kısım 12.18 ve 19.13). Bu yol izi ayrıca, H2+CO2 üzerinde ototrofik olarak gelişebilen metanojenler tarafından da kullanılır (Kısım 13.4,17.17 ve 19.10). Buna karşın belirli bakteriler, asetil-CoA yol izi reaksiyonlarını ters yönde kullanarak asetatı CO2'ye okside eder. Bu süreci asetotrofik metanojenler 13.4) ve sülfat indirgeyici bakteriler 12.18) gerçekleştirir. Asetil-CoA Yolizinin Reaksiyonları Calvin döngüsü (Kısım 17.6'ya bakınız) veya ters sitrik asit veya hidroksipropiyonat döngüleri (Kısım 17.7'ye bakınız) gibi diğer ototrofik yolizlerinden farklı olarak, asetil-CoA yolizindeki CO2 fiksasyonu bir döngü değildir. Bunun yerine, iki doğrusal yolizi ile CO2 indirgenmesi gerçekleşir - bir CO2 molekülü asetatın metil grubuna, diğer bir CO2 molekülü de karbonil grubuna indirgenir. Bunlar, sonuçta birleştirilerek asetil-CoA oluşturulur (Şekil 17.41»). Asetil-CoA yolizinin anahtar enzimi, karbon monoksit (CO) dehidrojenazdır. CO dehidrojenaz enzimi kofaktör olarak Ni, Zn ve Fe içeren kompleks bir enzimdir. CO dehidrojenaz aşağıdaki reaksiyonu katalizler; CO 2
• CO H 2 O
Form i I tetrahidrofolat
CO,
Me^T
Homoasetojenler; asetil-CoA yolizi reaksiyonlarının harcanmasıyla gelişebildikleri için, bu reaksiyonların düzeni tam bir enerji kazanımı sağlayacak şekilde olmalıdır (Şekil 17.41). ATP sentezinin bir kısmı asetil-CoA'nın asetat ve ATP'ye dönüşümü sırasında gerçekleştirilir (asetil-P yolu ile) (Kısım 17.19'a bakınız). Bununla birlikte; asetojenez sırasında sitoplazmik zarda oluşan sodyum itici güç (proton motive güç ile analogtur, ancak H + yerine Na+ içerir) nedeniyle, ek enerji kazanımı basamakları da ortaya çıkar. Zarın bu enerjili durumu, Na+ ile güçlendirilmiş ATPaz'ın aktivitesi ile enerji kazanımma izin verir. Benzer bir durum; süksinat fermente edicisi Propionigenium'da meydana gelir. Bu organizmanın Na + gradienti ile enerji kazanımı Kısım 17.20'de ele alınacaktır.
>CHO-THF-İ-»CH3-THF^»-» CH3 - B12 MetN
AXD THF
ATP
ve asetatın karbonil pozisyonu için CO üretilir (Şekil 17.41). Asetatın metil grubu ise tetrahidrofolat koenzimini içeren bir seri CO2 indirgenmesi reaksiyonundan kaynaklanır (Şekil 17.41). Metil grubu bu şekilde oluşturulduktan sonra, bu grup tetrahidrofolattan kofaktör olarak B12 vitamini içeren bir enzime transfer edilir (Şekil 17.41). Yolizinin son basamağında; CH 3 grubu, CO dehidrojenazdan kaynaklanan CO ile birleştirilir ve asetat oluşturulur. İlginç bir şekilde; bu reaksiyon mekanizmasında enzime bir nikel atomu ile bağlanan CH 3 grubu ile enzime bir demir atomu ile bağlanan CO grubu birleştirilir, bunun yanında; koenzim A ile son ürün olan asetil-CoA oluşturulur. Bu mekanizma, biyokimyada keşfedilmiş ilk alkil nikel reaksiyonudur.
m r
r.
CCynin metil grubuna indirgenmesi
**
Metil
tetrahidrofolat
H
*
CO2'nin ^ karbonil 4T~Nı grubuna indirgenmesi
0
7
f+ \
CO dehidrojenaz
17.16 Kavramların Gözden Geçirilmesi COı •Fe
itici güç
ATP CH3—C—O" « ^ ı ı — C H 3 - C ~ S C o A Asetat Asetil-CoA
Net: 4 H 2 + 2 CO 2 — Asetat" + 2 H2O + H+
• Şekil 17.41 Asetil-CoA yolizi reaksiyonları. THF, Tetrahidrofolat; B12, enzim bağlı bir ara üründe vitamin B12. CO, CO dehidrojenazdaki bir Fe atomuna bağlıdır. Aynı zamanda, CO dehidrojenazda bulunan organik bir nikel bileşiğindeki nikel atomunada CH3 grubu bağlıdır. Asetil-CoA'nın, ATP sentezinin devam etmesi için kullanılan bir Na+ pompasını nasıl güç kazandığına dikkat ediniz. Aynca ATP sentezi, asetil-CoA'nın asetata dönüşümü ile de gerçekleşmektedir.
Homoasetojenler elektron vericisi olarak genellikle H 2 'yi kullanan, CO2'yi asetata indirgeyen anaeroblardır. Asetat üretim mekanizması, obligat anaerobalar arasında oldukça yaygın olan ve ototrofi mekanizması olarak veya asetat katabolizması için kullanılan bir seri reaksiyonu içeren asetil-CoA yolizidir. • Asetatın yapısını çiziniz ve karbonil ve metil gruplarını belirtiniz. Asetil-CoA yolizinde asetatın karbonil grubunu üreten anahtar enzim nedir? • Homoasetojenler, asetat sentezi ile nasıl ATP üretmektedir? • Glikoliz yolu ile fruktoz katabolize edildiğinde kazanç sadece iki asetat molekülü ise, Clostridium aceticum fruktozu bu yol izi ile fermente edip, nasıl üç asetat kazanabilir?
17.17
Metanojenez
Biyolojik metan üretimi - metanojenez - zorunlu anaerobik bir Archaea grubu olan metanojenler tarafından gerçekleştirilir. Metanojenezin temel özellikleri, filogenisi ve taksonomisi Kısım 13.4'te anla-
17.17 • Metanojenez • 565
tılmıştır; burada ise metanojenlerin biyokimyası ve biyoenerjetiği üzerinde duracağız. Biyolojik metan üretimi; orijinal koenzimler ve şaşırtıcı bir komplekslik içeren bir seri reaksiyon yoluyla gerçekleşir. Tartışmamıza metanojenik reaksiyonların merkezinde bulunan koenzimleri ve metan üretiminin başladığı substratlar olan H2+CO2'yi göz önüne alarak başlayacağız.
genmesi için gerekli elektronları sağlayan redoks reaksiyonlarında iş görenler (Şekil 17.42» ve şekil 17.44'e bakınız). Koenzim metanofuran, metanojenezin ilk basamağında gereklidir. Metanofuran, beş üyeli furan halkası ve CO2'ye bağlanan bir amino azotu içerir (Şekil 17Âla). Metanopterin (Şekil 17.42b), folik asit vitaminine (<3°t> Şekil 20.17c) benzeyen metanojenik bir koenzimdir ve CO2'nin CH4'e indirgenmesi reaksiyonlarının ara basamaklarında C, taşıyıcısıdır. Koenzim M (CoM) (Şekil 17.42c), metanojenezin son basamağı için gerekli olan, metil grubunu (CH3) CH4'e dönüştüren küçük bir
Metanojenezde C, Taşıyıcıları Metanojenezdeki anahtar koenzimler iki sınıfa ayrılabilir: (1) ilk substrat olan CO2'den, son ürüne Cj parçası taşıyanlar; ve (2) CO2'nin CH4'e indir-
COCr I CH2
O CH2 II I CH2—CH2 [—NH —C—CH2—CH2—CH]3—CH
H,N—CH-CH 2 —O O Metanofuran
COO" COO"
coo-
(a)
H N
NH-<\ I V\ HC | CH,
N H
,VCH2[—CHOH]3—CH2—O // İCOH ^
\ı
I CH 2 CH 2
HOyl II L/OH.—o—p—n—CH O"
CH 3
COO"
Metanopterin (b) OH O H O H O CH3 O COO~ I I I II I II I H2C—CH—CH—CH—CH2—O—P—O—CH—C—NH—CH I I CH 2 0"
HS-CH 2 —CH 2 — S — 0 "
CH 2
Okside olmuş
O Koenzim M (CoM)
C=O I NH I HC—COO" I CH 2
(c)
CH 2
coo,CH3 H2NOC—H2C
CH2—CH2—COO"
H3C
Redükte olmuş
Koenzim F 4 CHP—COO"
-OOC—H,C
(e)
ÇH3 COO"
HS—CHj—CH2—CH2 —CH2-CH2—CHy-C—NH—CH—CH—O—P—0" COO"
Koenzim F 4 3 g
(d)
Koenzim B (CoB) (f)
* Şekil 17.42 Metanojenik Archaea'nm koenzimleri. Kahverengi ve san ile işaretlenmiş olan atomlar oksidasyon-redüksiyon reaksiyon bölgeleridir (F420-kahverengi) veya CO2'nin CH4'e indirgenmesi sırasında Cı bölümünün tutunduğu pozisyondur (metanofuran, metanopterin ve koenzim M-san). Belirli bir koenzimi işaretlemede kullanılan renkler (örneğin, CoB san renktir) Şekil 17.44 ve 17.46'da kullanılmış olup reaksiyonları takip etmede kullanılabilirler.
566 • Bölüm 17 • Metabolih Çeşitlilik
moleküldür. C^ taşıyıcısı olmamasına karşın; nikel içeren bir tetrapirol olan koenzim F4M'da (Şekil 17A2d), metil redüktaz enzim kompleksinin bir parçası olarak metanojenezin son basamağında gereklidir (daha sonra anlatılacaktır).
2.
Redoks Koenzimleri Koenzim F420 ve 7-merkaptoheptanoiltreoninfosfa
3
t veya Koenzim B (CoB), metanojenezde elektron vericilerdir. Koenzim F 420 (Şekil 17.42e) bir flavin türevidir ve yapısal olarak en yaygın flavin koenzimi olan FMN'ye (Ö°Ö Şekil 5.15) benzer. F420 aynı zamanda, metanojenezde elektron vericisi olarak birkaç CO2 indirgenmesi reaksiyonunda da rol oynar (Şekil 17.44'e bakınız). F420'nin okside formu 420 nm dalga boyu ışığı ve mavi-yeşil floresanı absorblar. Bu şekilde floresan, metanojenler gibi organizmaların mikroskobik tanısında kullanılabilir (Şekil 17.43*). CoB, metanojenezin son basamağında gereklidir ve bu basamak metil redüktaz enzim kompleksi tarafından katalizlenir. Şekil 17.42fde görüldüğü gibi, CoB'nin yapısı pantotenik asit vitaminine (asetil-CoA'nın bir parçası olan) benzer Şekil 5.12).
Formil grubu, metanofurandan metanopterin içeren enzime transfer edilir (Şekil 17.44'teki MP). Formil, sonuçta dehidre edilir ve iki ayrı basamakta metilen ve metil seviyesine indirgenir. Metil grubu, metanopterinden CoM içeren enzime transfer edilir.
-
Metil-CoM, F430 ve CoB içeren metil redüktaz sistemi tarafından metana indirgenir. Koenzim F430, CH3-CoMdan CH3 grubunu çıkarır ve Ni2+-CH3 kompleksini oluşturur. Bu kompleks, CoB'den kaynaklanan elektronlar tarfmdan indirgenerek, CH4 ve CoM ve CoB'nin disülfid kompleksi (CoM-S-S-CoB) oluşturulur. 5.
CoM-S-S-CoB H2 ile indirgenerek serbest CoM ve CoB rejenere edilir. Görüldüğü gibi bu reaksiyon, metanojenezde enerji kazanımına izin verir.
co2
CO2'nin formile indirgenmesi
n
- - M F - C - H Formil
C02'nin CH4'e İndirgenmesinin Biyokimyası
CO2'nin CH4'e indirgenmesinde, elektronlar genellikle H 2 'den sağlanır. Ancak, format, karbonmonoksit ve alkoller gibi belirli organik bileşikler de CO2 indirgenmesi için elektron sağlayabilir. Şekil 17.44» H 2 tarafından CO2 indirgenmesinin basamaklarını göstermektedir: 1.
O II M P MP- C - H
Formilin metilene ve daha sonra metile indirgenmesi
,i
F42Ored
H2O J ^;H F
CO2, metanofuran içeren enzim tarafından aktive edilir ve sonuçta f ormil seviyesine indirgenir. 2 H
1
42Û red
*MP-CH 3 Metil »--fCoM-SH.
| ..-*
Na+ itici güç
C0M-S-CH3 HS-CoB ^ I I
Metil redüktaz;
h F430 k o r n P l e k s i
- -CoM-S-S-CoB -
metil grubunun metana indirgenmesi
> AOn nv
Metilen
_u CH4Metan
1
Proton itici gQç
ATP
(b)
• Şekil 17.43 Metanojenik koenzim r420'den kaynaklanan yeşil floresans. (a) Eşsiz özelliğe sahip elektron taşıyıcısı F, „ 'nin keşfinden dolayı Methanosarcina barkeri hücrelerinde gözlenen otofloresans. Bir hücre yaklaşık olarak 1,7 pm'dir. Organizmalar floresans mikroskopta mavi ışık altında görülmektedir (<*%> Kısım 4.1 ve Şekil 4.6). (b) Metanojen olan Methanobacterium formicicum hücrelerinde F420 floresansı.
• Şekil 17.44 Elektron vericisi olarak H,'itin kullanıldığı CO2'den metanojenez yolizi. MF, metanofuran; MP, metanopterin; CoM, koenzim M; F42Oied, indirgenmiş koenzim F420; F430, koenzim F430; CoB, koenzim B. İndirgenmiş karbon atomu sarı ile gösterilmiş olup elektronların kaynağı kahverengi ile belirtilmiştir. Koenzimlerin yapılan için Şekil 17.42'ye ve geri dönüşebilir Na+ pompasını anlayabilmek için metine bakınız. Metanojenezin ilk basamağındaki hızlı elektron vericisi bilinmemektedir. CO2'in indirgenmesinde kullanılan elektronlar H2'den sağlanır, ancak bazı metanojenlerde, az sayıda organik bileşik CO2'i indirgemek amacıyla elektronlarını vererek oksitlenebilir (
17.17 • Metanojenez • 567
CH3OH -
MP
CoM
I
u
C H , - MP
MF
C H 3 - CoM Metanolun CO ? 'e oksidasyonu ile indirgeyici güç oluşumu
Metanolun metana indirgenmesinde indirgeyici gücün kullanımı
k^N^AT CH 4
Metanojenez
- C
co?
co
dehidrojenaz
C-CODH
o ;
CH 3 - C - CODH CoA J
Biyosentez için asetil-CoA oluşumu
fi!
CH,- C - CoA
Metil Bileşikleri ve Asetattan Metanojenez Kısım 13.4'te de öğrendiğimiz üzere H2+CO2'ye ek olarak metan, çeşitli metilenmiş bileşiklerden de elde edilebilir. Metanol gibi metil bileşikleri, metil gruplarını bir korinoid proteine vererek katabolize olmakta ve CH3-korinoid oluşturulur (Şekil 17.45*). Korinoidler, vitamin B]2 ve porfirin benzeri korin halkası ile merkezinde kobalt atomu bulunduran bileşiklerin temel yapılarıdır (one> Şekil 30.12). CH3-korinoid kompleksi, metil grubunu CoM'a vermekte ve metanın oluşturulduğu, CO2 indirgenmesinin son basamağı olarak tanımlanan basamakta kullanılan aynı yol kullanılarak CH3-CoM kazanımı olmaktadır (Şekil 17.44 ve 17.45a'yı karşılaştırınız). İndirgeyici güç (H2 gibi) son basamağı yönlendirmede elverişli değilse, elektron kazanımı için bir miktar metanol CO2'ye okside edilmelidir. Bu, metanojenezin ters yönlü basamakları ile gerçekleşir (Şekil 17.45a). Metanojenez için; substrat asetat olduğunda, asetat öncelikle asetil-CoA'ya aktive edilir. Bu da, daha sonra asetil-CoA yolizinin karbon monoksit dehidrojenazı ile etkileşir (Kısım 17.16'ya bakınız): Sonra; asetatın metil grubu korinoid enzime aktarılarak CH3-korinoid kazanımı sağlanır ve buradan da CoM aracılığıyla metanojenezin son basamağına taşınır (Şekil 17.45b). Eş zamanlı olarak, CO grubu da CO2'ye okside edilir. Ototrofi
Biyosentez (a) Metanol CH 4
Biyosentez
Metanojenlerde ototrofi Kısım 17.16'da anlatılmış olan asetil-CoA yolizi ile gerçekleştirilir. Gördüğümüz gibi, bu yolizinin bir kısmı metanol ve asetat katabolizması ile bütünleşmiştir (Şekil 17.45). Bununla birlikte; metanojenler, asetil-CoA yolizinin metil grubu üretimine giden reaksiyonlar serisini yönlendiren tetrahidrofolattan yoksundur (Şekil 17.41'e bakınız). Fakat bu, metanojenler için bir sorun değildir; çünkü bu organizmalar metil grubunu direk olarak elektron vericilerden (Şekil 17.45) veya metanojenez sırasında H2+CO2'den (Şekil 17.44) sağlarlar. Böylece; metil grubu hücre içinde bol miktarda bulundurulabilir. Asetatın karbonil grubu üretimi ise metanojenlerin ototrofik gelişimi sırasında CO dehidrojenaz enziminden elde edilir ve asetat sentezindeki son basamak homoasetojenlerdeki gibi gerçekleşir (Kısım 17.16 ve Şekil 17.41'e bakınız). Metanojenezde Enerji Korunumu
CO
(b) Asetat CH 4
Normal koşullar altında, H 2 ile CO2'nin CH4'e indirgenmesindeki serbest enerji değişimi, -131 kj/mol'dür. Bu enerji en az bir ATP sentezi için yeterlidir. Metanojenlerde bu enerji korunumundan, metil redüktaz basamağı denen son basamakla bağlantılı olarak söz etmiştik (Şekil 17.44). Bu son basamakta CoB ile CH3-CoM'un etkileşimi CH4 ve heterodisülfit, C0M-S-S-C0B oluştu-
* Şekil 17.45 Metanol ve asetatın metana dönüşümü. Asetil-CoA yolizinin bölümleri (bakınız Şekil 17.41) her iki reaksiyon serisi ile de ilişkilidir. Metanolde gelişme durumunda, metanolde bulunan karbonun çoğunluğu CH4'e dönüştürülür. Oysa daha az bir miktarı ya CO2'ye ya da asetil-CoA oluşumu yolu ile hücre materyaline asimile edilir. Kısaltmalar ve renk kodlan Şekil 17.42 ve 17.44'teki gibidir; Corr, oorrinoid-içeren protein. CODH, karbon monoksit de hidrojenaz.
• Bolüm 17 • Metabolik Çeşitlilik
rur. Bu son kompleks daha sonra CoM-SH ve CoBSH rejenerasyonu için F420'den gelen elektronlarla indirgenir (Şekil 17.44). Bu indirgeme, heterodisülfit redüktaz enzimi tarafından gerçekleştirilir, ekzergoniktir ve zar dışına proton çıkışıyla proton motive güç sağlanır (Şekil 17.46»). Proton transloke eden ATPaz tarafından, proton gradientinin harcanması diğer solunum süreçlerinde olduğu gibi metanojenez sırasında da organizmayı ATP sentezine götürür (ATPaz o^o Kısım 5.12'de anlatılmıştır). Heterodisülfit redüktaza elektron akışı; nadir görülen, zara bağlı ve bir fenazin bileşiği olan metanofenazin denen elektron taşıyıcısını gerektirir (Şekil 17.46). Son basamaktaki elektron taşınım sürecinde elektronları heterodisülfit redüktaza veren son elektron vericisi metanofenazin, değişimli olarak indirgenir (F420 tarafından) ve daha sonra okside edilir {b tipi sitokrom tarafından) (Şekil 17.46). Metil bileşiklerinden metanojenez aynı zamanda heterodisülfit redüktaz proton pompasına bağımlıdır; ancak bir ek faktör devreye girer. Daha önce de belirtildiği gibi; H2 yokluğunda CH3OH gibi bileşiklerden metanojenez, metilin metana indirgenmesi için gerekli elektronların sağlanması için bir miktar CH3OH'ın CO2'ye yükseltgenme-
sini gerektirir (Şekil 17.45). Bu işlem, enerji girişi gerektirmekte ve bunu için Na+ itici güç (Na+ ile enerjili hale gelmiş zar potansiyeli, Kısım 17.20'e bakınız) harcanır. Bu potansiyeldeki doğal enerji metanojenez sırasında CH3-MP'nin CH3-CoM'a dönüşümünden elde edilir. Ters reaksiyon enerji tüketmekte ve Na+ pompası tarafından yürütülür. Üstelik; metil gruplarının CO2'ye dönüşümünde ileri oksidatif basamaklar CO2'den CH4 oluşumuna götüren ters enzimatik basamaklar tarafından yürütülür (Şekil 17.44'e bakınız). Bu şekilde, metanojenlerde iki tip ATPaz görmüş olduk: adenozin trifosfat (ATP) sentezini oluşturan tipik bir proton pompası ve metil grubu oksidasyonunda işlevi olan Na+ pompası. 17. İ 7 Kavramların Gözden Geçirilmesi Metanojenez, CO2 ve H 2 'den veya metilenmiş bileşiklerden biyolojik olarak CH 4 üretimidir. Metanojenez, nadir bulunan çeşitli koenzimleri gerektirmekte ve bu süreç zorunlu anaerobiktir. Metanojenezde enerji korunumu hem proton hem de sodyum iyonu gradientlerini gerektirir. •
Metanojenezde C, taşıyıcıları olarak hangi koenzimler ve hangi elektron vericiler görev yapar? • H 2 varlığında ve yokluğunda, metanojenez sırasındaki CH 3 OH katabolizması basamakları niçin farklıdır? • Metanojenezde proton motive güç nasıl oluşur?
Ferrik Demir, Mangan, Klorat
17.18 ve Organik Elektron Alıcıları I H
(a)
—
\H M p H o k s M p H r e d ' d e indirgenme bölgesi
H Dış
Anaerobik solunumda anlatılan elektron alıcılarına ek olarak doğadaki ferrik demir (Fe3+), manganik iyon (Mn4+), klorat (C1O3~) ve çeşitli organik bileşikler de bakteriler için önemli elektron alıcılardır (Şekil 17.47»). Bakterilerdeki geniş çaplı çeşitlilik, bu elektron alıcıların indirgenebilmesini sağlamakta olup özellikle Fe3* ve NO 3 ve S gibi diğer elektron alıcılar indirgenebilen en yaygın alıcılardır (Kısım 17.14 ve 17.15'e bakınız). Ferrik Demir indirgenmesi
• Şekil 17.46 Metanojenezde enerji korunumu, (a) ATP sentezi ile sonuçlahan_elektron taşıma zincirinde bir elektron taşıyıcısı olan metanofenazinin (MPH'nin b bölümü) yapısı. Molekülün merkez halkası alternatif olarak indirgenebilir ve yükseltgenebilir. (b) Elektron taşıma zincirindeki basamaklar. H2'den gelen elektronlar F420'yi ve daha sonra metanofenazini indirger. Metanofenazin, b tipindeki bir sitokrom yoluyla zarın dışına protonları çıkararak heterodisülfür redüktazı indirger. Son basamakta, heterosülfür redüktaz, Co-M-S-S—CoB'yi HS-CoM ve HS-CoB'ye indirger. CoM ve CoB'nin yapılan için Şekil 17.42'ye bakımz.
Hem çeşitli kemoorganotrofik bakteriler, hem de çeşitli kemolitotrofik bakteriler enerji metabolizmalarında ferrik demiri elektron alıcısı olarak kullanabilmekte ve demir doğada bol bulunduğu için ferrik demir indirgenmesi anaerobik solunumun ana tiplerinden biridir. Fe3+/Fe2+ çiftinin indirgenme potansiyeli oldukça elektropozitiftir (Eo'= +0.2 V, pH 7'de) ve bu nedenle de Fe3+ indirgenmesi birkaç organik ve inorganik elektron vericisinin oksidasyonu ile eşleştirilebilir. Aromatik bileşiklerin de dahil olduğu çeşitli organik bileşikler, ferrik demir indirgeyicileri tarafından anaerobik olarak okside edilebilir, olayların tümünde, elektronlar ferrik demir redüktaz sistemi ile sonlanan elektron taşınım sistemine girer. Elektron akışı, ATP üretiminde kullanılabilen proton motive gücü oluş-
17 18 • Ferrik Dem», Mangan, Klorat ve Organik Elektron Alıcıları • 569 Alıcı/Urün (E^
Reaksiyon
Klorat/ Klorid (+1.03)
CIO,
Manganik iyon/ Manganöz iyon (+0.798)
6 e" 6H* 2 e"
Mn 4
O* 2 e" "O-Se-O"—|—^Se = O + H,0 II 2 H+ I
Selenat/ Selenit (+0.475)
o
Ferrik iyon/ Ferro iyon (+0.2)
o-
Fe 3 +
Dimetil sulfoksid (DMSO)/ Dimetilsülfit(DMS)(+0.16)
2 eH3C-S-CH3—
H2O
Arsenat/ Arsenit (+0.139)
Fumarat/ Süksinat (+0.03)
O"
• Şekil 17.47 Anaerobik solunumda bazı alternatif elektron a l ı c ı l a r ı . Farklı alıcılar için E.' farklılınağa d i k k a t ediniz.
turur. Ferrik demir indirgenmesi üzerine yapılan birçok araştırmada gram pozitif bir bakteri olan ve çeşitli organik elektron vericiler ile birlikte Fe3+/e bağlı olarak anaerobik olarak gelişen Sheıvaneüa putrefaciens kullanılmıştır. Diğer önemli Fe3+ indirgeyicileri Geobacter, Geospirülum ve Geovibrio'dur. Geobactcr metallireducens, Fe 3+ indirgenmesinin
fizyolojisi üzerine yapılan çalışmalarda model organizma olarak kullanılır. Bu organizma, aşağıdaki denklemdeki gibi elektron alıcısı olarak Fe3+'ü kullanıp asetatı okside edebilir:
tarafından gerçekleştirilir. Sheıvanella putrefaciens ve diğer birkaç bakteride asetat veya çeşitli diğer fermente edilemeyen karbon kaynakları üzerinde anoksik gelişme, elektron alıcısı olarak kullanılan Mn4+ ile gerçekleşir. Mn4VMn2+ çiftinin indirgenme potansiyeli oldukça yüksektir (Şekil 17.47); bu yüzden, birkaç bileşik Mn4+ indirgenmesi için elektronlarını verebilmelidir. Bu durum klorat için de geçerlidir, çünkü kloratm indirgenme potansiyali de oldukça pozitiftir (Şekil 17.47). Birkaç klorat indirgeyici bakteri izole edilebilmiş olup bunların çoğu fakültatiftir ve bu nedenle aynı zamanda aerobik gelişme yeteneğine de sahiptirler. Diğer inorganik maddeler anaerobik solunum için elektron alıcısı olarak iş görebilir. Bunlar selenyum ve arsenik bileşikleridir (Şekil 17.47). Doğal sistemlerde her zaman büyük miktarlarda bulunmalarına karşın, arsenik ve selenyum bileşikleri bazen kirliliğe yol açmakta ve çeşitli bakterilerin anoksik gelişmesini destekleyebilir. SeO42"'nin SeO32~'ye ve sonuçta Se"'a (metalik selenyum) indirgenmesi, selenyumun sudan uzaklaştırılması ve selenyumla kontamine toprakların temizlenmesi (biyoremediasyon) (Kısım 19.19) bakımından önemli bir metottur. Buna karşın; aslında arsenatın arsenite indirgenmesi, bir toksikasyon problemi oluşturur. Bazı yeraltı suları, çok miktarda çözünmez arsenat minerali içeren kayalar arasından akar. Bununla birlikte; eğer arsenat bakteriler tarafından arsenite indirgenirse, arsenit daha hareketli bir hale gelmir ve yeraltı sularını kontamine edebilir. Bu durum son yıllarda, temiz suların arsenikle kontamine olması nedeniyle Bangladeş'te ciddi bir problem olmuştur. Arsenat indirgenmesinin diğer tipleri yararlıdır. Örneğin; bir sülfat indirgeyici bakteri olan Desulfatomaculum SO42~ (HS~'e) ile birlikte arsenatı (AsO4v) arsenite (AsO33~) indirgeyebilir. Bu süreç sırasında arsenik ve sülfür —As2S3— mineral kompleksi- As2S3- kendiliğinden çökelir (Şekil 17.48»). Bu mineral; hücre içinde de en az hücre dışında olduğu
Asetat" + 8Fe3+ + 4H,O -> 2HCO3" + 8Fe2+ + 9H+ AG° = -233 kj Geobacter; aynı zamanda H2 veya aromatik hidrokarbon olan toluenin de dahil olduğu organik elektron vericilerini de kullanabilir (toluenin yapısı için şekil 17.56c'ye bakınız). Bu süreç çevresel öneme sahiptir, çünkü toluen hidrokarbon depo tanklarından istem dışı dökülerek veya sızarak, sıklıkla ferrik demirce zengin bölgeleri kontamine etmekte ve bu çevrelerdeki Geobacter gibi organizmalar doğal temizleyiciler olarak nitelendirilebilir. Mangan (Mn4t) ve Diğer İnorganik Maddelerin İndirgenmesi 4+
2+
Mangan metali, Mn ve Mn olmak üzere biyolojik olarak kararlı birkaç oksidasyon şekline sahiptir. Mn4+'ün Mn2+/ye anoksik indirgenmesi, çoğunluğu kemoorganotrof olan çeşitli mikroorganizmalar
• Şekil 17.48 Sülfat indirgeyici bakteri Oesullotomaculum auripigmentum'la arsenat indirgenmesi sırasında mineral arsenik trisülfür (As2S}) üretimi. Sol taraf, aşılamadan sonra kültür şişesinin görünümü. Sağ, iki haftalık gelişmeyi takiben. Orta taraf, As2S3'ün sentetik örneği. Mikroorganizmalar yoluyla mineral üretimine biyomineralizasyon denir.
570 • Bolum 17 • Metabolik Çeşitlilik
kadar iyi bir şekilde oluşturulabilir. Bu oluşum, bakteriyal aktivite ile mineral oluşumuna yani biyomineralizasyona örnektir. Bu durumda As2S3 oluşumu (Şekil 17.48) aynı zamanda toksik bileşiklerin (arsenik) detoksifikasyonunda iş görür ve bu tip aktiviteler arsenik içeren toksik atıkların mikrobiyal olarak temizlenmesi için pratik uygulamalara yol açar.
fototrofik mor bakteri de (Kısım 12.2) karanlıkta, anaerobik metabolizma için TMAO'yu elektron alıcısı olarak kullanabilme yeteneğindedir. TMAO'ya analog bir bileşik olan dimetil sülfoksit (DMSO) de çeşitli bakteriler tarafından dimetil sülfüre (DMS) indirgenebilir. DMSO hem denizsel çevrelerde hem de tatlı su çevrelerinde bulunan yaygın, doğal bir üründür. DMS güçlü ve Organik Elektron Alıcıları keskin bir kokuya sahiptir ve DMSO'nun DMS'ye Birkaç organik bileşik harici elektron alıcısı olarak, bakteriyal olarak indirgenmesi ile karakteristik koanaerobik solunuma katılabilr. Şekil 17.47'de liskusu oluşur. Campylobacter, Escherichia ve birçok telenmiş olan bileşiklerden en kapsamlı çalışılanı, mor bakteriyi içeren bir grup bakteri, enerji üretimi süksinata indirgenen fumarattır. Sitrik asit döngüiçin DMSO'yu elektron alıcısı olarak kullanabilir sü (CRS Şekil 5.22) fumarat ve süksinatın önemli ara (DMSO metabolizması hakkında daha fazla bilgi ürünler olduğunu gösterir. Anaerobik solunumda için <3«2» Kısım 19.13'e bakınız). elektron alıcısı olarak kullanılan fumaratm işlevi, TMAO/TMA ve DMSO/DMS çiftlerinin indirfumarat-süksinat çiftinin indirgenme potansiyelinin genme potansiyelleri benzer şekilde +0.15 V civa0 V'a (Şekil 17.35'e bakınız) yakın olması nedeniyle rındadır. Bu nedenle bu bileşikler, elektron taşınım fumarat indirgenmesinde NADH veya H 2 oksidaszincirinin sonlarında bulunmaktadır ve indirgenyonuna izin vermesidir. Enerji kazancı bir ATP senmeleri kısa sürmektedir. Fumarat indirgenmesintezi için yeterlidir. VVolinella succinogenes (elektron deki gibi, TMAO ve DMSO indirgenmesinde de b vericisi olarak H2'yi, elektron alıcısı olarak fumaratı tipi sitokrom (indirgenme potansiyeli 0 V civarınkullanıp gelişebilen bir organizmadır), Desulfovibrio da) terminal oksidaz olarak tanımlanır. gigas (sülfat indirgenmesi yapılamayacak koşullarElektron Alıcısı Olarak Halojen Bileşikleri: da da gelişebilen sülfat indirgeyici bir bakteridir), Clostridia grubunun bazı üyeleri, Escherichia coli İndirgeyici Deklorinasyon gibi bakterileri de içeren bir grup bakteri fumaratı Birkaç klorlu bileşik indirgeyici deklorinasyon elektron alıcısı olarak kullanabilme yeteneğindedir. veya dehalorespirasyon adı verilen süreçle anaeroTrimetilamin oksit bileşiği (Şekil 17.47) önembik solunum için, elektron alıcısı olarak iş görmekli bir organik elektron alıcısıdır. Trimetilamin oksit tedir. Örneğin; bir sülfat indirgeyici bakteri olan (TMAO) deniz balıklarının, vücutlarındaki fazla Desulfomonile anaerobik şekilde, elektron vericisi azotu atmak amacıyla oluşturduğu bir üründür. Çeolarak H 2 veya organik bileşikleri ve elektron alıcışitli bakteriler TMAO'yu güçlü kokusu ve tadı olan sı olarak da klorobenzoatı kullanarak gelişebilir: trimetilamine (TMA) indirgeme yeteneğine sahiptir. C7H4O2C1- + 2H > C7H5O2~ + HC1 Bozulmuş deniz balığında oluşan kokunun bir kısmı 3Klorobenzoat Benzoat bakteriyal aktivite ile üretilen TMA'dan dolayıdır. Çeşitli aerobik bakteriler TMAO'yu alternatif elekAynı zamanda sülfat indirgeyici bir bakteri olan tron alıcısı olarak kullanabilir. Buna ilaveten; birkaç Desulfomonile'nin.yanı sıra çeşitli diğer bakteriler r
Tablo 17.5
1
Redüktif deklorinasyon yapabilen temel bakteri cinslerinin özellikleri
I
Cins Özellik
Dchalobacter
Desultomonile
Desuliitobncterium
H2, format, piruvat, H2, laktat laktat Trikloroetilen, Orto-, meta-veya paratetrakloroetilen klorofenoller, NO3, fumarat, SO32-, S2O32-,S° Trikloroetilen Eten
Elektron alıcıları
Trikloroetilen, tetrakloroetilen
H2, format, piruvat, laktat, benzoat Metaklorobenzoat, tetrakloroetilen,
Tetracloroetilen indirgenme ürünii Diğer özellikler"
Dikloroetilen
Dikloroetilen
Sitokrom b içerir
Sitokrom c3 içerir; organik karbon kaynağı gereksinir; piruvatın fermentasyonu ile gelişebilir Delta Proteobakterilerle akraba
Elektron vericileri
Filogeni''
so 4 2 -, so 3 2 -, s 2 o 3 2 -
Dehalococcoides
•
Düşük GC içerikli gram pozitif bekterilerle akraba
"Tüm organizmalar zorunlu anaeroptur b Tartışma konusu prokaryotik filogeni için Bölüm 12 ve Şekil 12.1'e bakınız
Fermentasyon ile de gelişebilir
Peptidoglikan yoktur 1
Düşük GC içerikli gram pozitif bekterilerle akraba
Yeşil kükürtsüz Bacteria ile (Chlorofleius group) akraba
17.19 • Fermentasyon: Enerjctîk ve Redoks Durumları • 571
de bu yolizi ile bu sınırlı sayıdaki klorlu bileşikleri elektron alıcısı olarak kullanabilir (Tablo 17.5). Deklorinasyon ürünlerinin çoğu balık ve diğer hayvanların yaşamı açısından daha az roksik, hatta tamamen zararsız (nontoksik) iken indirgenmiş klorlu bileşiklerin çoğu toksiktir. Örneğin; Dehalococcoides adlı bakteri tri- ve tetrakloroetileni zararsız bir gaz formundaki etene indirger (Tablo 17.5). Dehalojenleyici bir organizma olan Dehalobacterium, toksik bir bileşik olan diklorometam (CH2C12) yağ asiti olan asetat ve formata dönüştürür. Bu nedenle; indirgeyici deklorinasyon sadece bir enerji metabolizması şekli değil, aynı zamanda çevresel öneme sahip biyoremedial bir süreçtir (Kısım 19.18). indirgeyici deklorinasyon yapan çoğu organizma, aynı zamanda sitrat veya indirgenmiş kükürt bileşiklerini indirgeme yeteneğindedir (Tablo 17.5), bu nedenle bu grup hem özel hem de fırsatçı türleri içerir.
•m17.18 Kavramların Gözden Geçirilmesi
inorganik azot, kükürt bileşikleri veya CO2'nin yanı sıra, hem organik hem de inorganik diğer maddeler de anaerobik solunumda elektron alıcısı olarak görev yapabilir. Bunlar; Fe3+, Mn4+, fumarat ve belirli klorlu bileşikler olabilir. Elektron vericisi olarak H 2 kullanıldığında, Fe1* indirgenmesi niçin fumarat indirgenmesinden daha verimli olmaktadır? • Biyominemlizasyona bir örnek veriniz. • TMAO parçalayan bakteriler, doğada hangi ortamlarda bol bulunabilir? Niçin? • İndirgeyici deklorinasyon nedir?
•
KIV 17.19
YAŞAMİN ANAEROBIK YÖNÜ: FERMENTASYON VE SİNTROFİ
Fermentasyon: Enerjetik ve Redoks Durumları
Oksijenin sudaki çözünürlüğü az olduğu için (25 °C'de hava ile denge halindeki damıtık suda 9.6 mg/L), çoğu çevre kolayca anoksik hale gelir. Bu tip çevrelerde, organik materyal dekompozisyonu anaerobik olarak gerçekleştirilidir. Bu şekildeki anoksik çevrelerde kullanılmayan SO42~, NO3", Fe3+ ve daha önce açıklanan diğer elektron alıcılar gibi elverişli elektron alıcıların varlığında, karbonun büyük bir bölümü fermentasyon ile katabolize edilecektir (CO2'nin elektron alıcısı olarak kullanılması istisnadır. CO2 anoksik çevrelerde nadiren sınırlayıcıdır. CO2'nin metana dönüşümü H2 gerektirir ve bu H2 fermentatif reaksiyonların bir ürünüdür). Kısım 5.9 ve 5.10'da toplam fermentasyon sürecini anlatmıştık. Orada, hem indirgenebilir hem de yükseltgenebilir olan fermente edilebilen substratların fermentasyonunda indirgenme-yükseltgenme sü-
Organik substratlar ADP
ATP
ADP ATP Substrat düzeyinde ^ fosforilasyon =
Hücre biyokütlesi
Fermentasyon ürünleri (asitler, alkoller, CO 2 , H2, NH3)
* Şekil 17.49 Fermentasyonun tüm süreci. Tipik bir fermentasyonda, çoğu karbon enerji metabolizmasının kısmen indirgenmiş bir son ürünü olarak dışan atılır ve sadece küçük bir miktarı biyosentezde kullanılır.
reçlerinde iç dengenin nasıl sağlandığını görmüştük (Şekil 17.49»). Organizma, enerji kazanımı metabolizmasında organik bileşikleri katabolize ediyorsa iki sorunla karşılaşır: (1) ATP şeklinde salınan enerjinin bir bölümünün korunması ve (2) elektron vericiden uzaklaşan elektronların kontrol altında tutulması. Fermentasyonda, ATP sentezi tipik olarak substrat seviyesinde fosforilasyon yolu ile gerçekleştirilir, bu mekanizmada organik ara bileşiğin fermentasyonunda enerjice zengin fosfat bağı ADP'ye transfer edilir ( ö ^ Kısım 5.9), İkinci problem olan redoks dengesi, orijinal substrattan üretilen fermentasyon ürünlerinin üretilmesi ve dışarıya çıkarılmasıyla çözülür (Şekil 17.49 ve 17.50»). Enerjice Zengin Bileşikler ve Substrat Seviyesinde Fosforilasyon Substrat seviyesinde fosforilasyonda enerji kazanımı, birçok farklı yolla meydana gelebilir. Bununla birlikte; ATP sentezi mekanizmasının merkezi, enerjice zengin bileşiklerin üretimidir. Bunlar, hidrolizi yüksek derecede ekzergonik olan, fosfat grubu içeren organik bileşikler veya koenzim-A molekülü içeren bileşiklerdir. Tablo 17.6'da biyokimyasal süreçler sırasında açığa çıkan enerjice zengin bazı ara ürünler listelenmiştir. Tablo 17.6'daki çoğu bileşik direk olarak ATP senteziyle (-31.8 kj/mol) eşleştirilebilir. Eğer bir organizma fermentatif metabolizmada, bu bileşiklerden birini kullanabiliyorsa, bu organizma bu şekilde ATP oluşturabilir. Substrat seviyesinde fosforilasyon ATP yapımı açısından, oksidatif fosforilasyondan (cets Şekil 5.13) daha dolaysız bir yoldur, enerjice zengin ara ürünlere anaerobik olarak götüren birkaç yolizi Şekil 17.50'de özetlenmiştir. Fermentatif Organizmaların Enerji Kazanımı Fermentatif organizmalar ne kadar ATP üretebilir? Daha önce belirtildiği gibi, glukoz fermente edicileri glikolizle (o**» Şekil 5.14) her bir glukozdan 2-3 ATP üretebilir. Bu miktar, fermentasyonla elde edilebilecek en fazla ATP miktarıdır, diğer substratların çoğu, daha az enerji sağlar. Bazı fermentasyonlardan serbest bırakılan potansiyel enerji, denge reaksiyonlarından ve Ek l'de verilen serbest enerji değerlerinden hesaplanabilir. Örneğin; glukozun etanol ve
572 • Bölüm 17 • Metabolik Çeşitlilik
CO2'ye fermentasyonundaki teorik enerji kazancı -235 kj/moldür ve yaklaşık 7 ATP üretimi için yeterlidir. Bununla birlikte; bu süreç ile yalnızca 2 ATP üretilebilir; bu durum organizmanın %100 verimin çok daha altında bir verimle çalıştığı anlamına gelir; enerjinin büyük bir bölümü ısı şeklinde kaybedilir.
Substart seviyesinde fosforilasyonda enerjice zengin bileşikler"
Tablo 12.6
Bileşik
Hidroliz sonu serbest enerji, ÛC" (kj/mol)"
Asetil-CoA Propionil-CoA Butiril-CoA Süksinil-CoA Asetilfosfat Butirilfosfat 1,3-Bisf osfogliserat
-35.7 -35.6 -35.6 -35.1 -44.8 ^4.8 -51.9
Karbamilfosfat Fosfoenolpiruvat
-39.3 -51.6 -88 Adenozin fosfosülfat (APS) Nl 0-f ormiltetrahidrof ola t -23.4 ATP hidrolizi sonucu serbest enerji -31.8 (ATP -» ADP + P) " Veri from Thauer, R. K., K. Jungermann ve K. Decker. 1977. Energy conservation in chemotrophic anaerobic bacteria. Bacteriol. Rev. 41:100-180'den alınmıştır. h Burada verilen AGO değerleri hücrelere gerekli olmayan "standart koşullar" içindir. Isı kaybı dahil, bir ATP yapımının enerji maliyeti 32 kj yerine 60 kj olup daha fazladır, bu nedenle burada verilen enerjice zengin bileşiklerin hidroliz enerjisi muhtemelen daha yüksektir. Basitleştirme ve kıyaslama amacıyla, tablodaki değerler her reaksiyonda açığa çıkan gerçek enerji olarak değerlendirilecektir.
Purinler Pirimidinler
Organik asitler: Laktat Akrilat Malat Fumarat Süksinat Sitrat
Amino asitler: Alanin Amino asitler Glutamat r Histidin Tirozin Lösin Treonin Aspartat Fenilalanin Homoserin izolösin Glisin HomoValin Triptofan Serin sistein Sistein Metiyonin Triptofan Şekerler: Heksozlar — * Pentozlar
Çeşitli Purinler Metanol Krotonat Lizin Glutamat y-Aminobutirat
Arjinin Agmatin Allantoin Pirimidinler
Oksidasyon-Redüksiyon Dengesi ve H2 Üretimi Tüm fermentasyon reaksiyonlarında, oksidasyon ve redüksiyon arasında bir denge olmalıdır. Denklemin sağ tarafında bulunan üründeki toplam elektron sayısı ile denklemin sol tarafında bulunan substratlardaki elektron sayısı eşit olmalıdır. Fermentasyonlar deneysel olarak laboratuvarlarda incelendiğinde, bir fermentasyon dengesi geleneksel olarak hesaplandığında herhengi bir ürün kaybının olmadığı saptanmıştır. Fermentasyon dengesi aynı zamanda teorik olarak substrat ve ürünlerin oksidasyonlarmdan da hesaplanabilir (Oksidasyon durumundan hesaplama işlemi için Ek l'e bakınız). Birkaç fermentasyonda, elektron dengesi moleküler hidrojen (H2) üretimi ile korunur. H 2 üretiminde, elektron alıcısı olarak iş gören protonlar sudan elde edilir. H 2 üretimi genellikle, organizmadaki çok düşük potansiyelli bir elektron taşıyıcısı olan ve ferrodoksin adı verilen bir demir-kükürt
/ Heksoz difosfat yolu
Alkoller: Etanol Etilen glikol
\ Heksoz monofosfat yolu
Fruktoz-1,6-PP Gliserat-1,3-PP
İCADP
3-Ketoaçil-CoA Butiril-CoA
Karbamil-P
Formil FH 4
Butiril-
ADP
C
•ATP
CO 2
Format Butirat
Piruvat • Asetil-CoA
Asetil fosfat -ADP •ATP Asetat
ATP Gliserat-3-P • Fostoenolpiruvat ADP
S
Süksinil-CoA
2-Ketobutinat
3-Alkilpiruvat
3-Arilpiruvat
PropiyonilCoA
2-AlkilasetilCoA
2-ArilasetilCoA
i
i Propiyonilfosfat
1 •
i
•
2-Alkil2-Arilasetilasetilfosfat fosfat L--ADP ir'ADP
KATP
KTP
Propiyonat 2-Alkil-asetat
Propiyonat
* Şekil 17.50 Fermente edilebilir çeşitli maddelerin anaerobik temel yıkım yollan. Subtrat seviyesinde fosforilasyon bölgeleri görülmektedir. Enerjice zengin CoA türevleri ve diğer zengin enerjili anahtar bileşikler mavi ile belirtilmiştir. Tablo 17.6'ya tekrar bakınız.
17 20 • Fermentatif Çeşitlilik • 573
protein varlığı ile ilgilidir. Elektronların ferrodoksinden H+'ya transferi Şekil 17.51«'deki örnekte açıklandığı gibi, hidrojenaz enzimi tarafından katalizlenir. Hidrojen üretiminin enerjetiği aslında oldukça elverişsizdir ve bu yüzden çoğu fermentatif organizma ürettiği diğer fermentasyon ürünlerine oranla çok daha az hidrojen üretir. Hidrojen üretiminin ana işlevi redoks dengesini sürdürmektir. Çoğu anaerobik bakterinin fermentasyon ürünlerinden biri de asetattır. Asetat veya diğer belirli yağ asitlerinin üretilmesi (Tablo 17.6'ya bakınız) enerjetik olarak avantajlıdır, çünkü bu asetat, organizmanın substrat seviyesinde fosforilasyon ile ATP yapmasına olanak sağlar. Asetat üretiminde oluşturulan, enerjice zengin anahtar ara ürün asetil-CoA'dır (Tablo 17.6 ve şekil 17.50'ye bakınız). Asetil-CoA, asetil fosfata (Tablo 17.6'da listelenmiş olan) dönüştürülerek asetil fosfatın fosfat grubu daha sonra asetat kinaz enzimi tarafından adenozin difosfata (ADP) transfer edilip ATP kazancı sağlanabilmektedir. Asetil-CoA'ya dönüştürülebilen ana substratlardan biri de glikolizin ana ürünü olan pirüvattır. Pirüvatın asetil-CoA'ya dönüşümü bir oksidasyon reaksiyonudur (Şekil 17.51) ve açığa çıkan fazla elektronlar ya daha indirgenmiş bir son ürün yapımında ya da serbest H2 oluşturma amacıyla kullanılır. 17.19 Kavramların Gözden Geçirilmesi Harici elektron alıcısı yokluğunda organik bileşikler, sadece fermentasyon ile katabolize edilebilir. Sadece belirli bileşikler fermente edilebilir ve çoğu fermentasyon, substrat seviyesinde fosforilasyon ile ATP kazanımı sağlamak için enerjice zengin organik bir ara ürün gerektirir. Fermentasyonlarda redoks dengesi sağlanabilmeli ve H 2 üretimi ile fazla elektronlar harcanmalıdır. • Substrat seviyesinde fosforilasyon nedir? • Fermentasyonda asetat üretimi enerjetik yönden niçin yararlıdır?
Fermentatif Çeşitlilik Fermentasyonlar, fermente edilen substrata veya oluşan fermentasyon ürününe göre sınıflandırılır. Bazı özgül fermentasyon reaksiyonları, Bölüm 12 ve 13'te özel prokaryot grupları anlatılırken ele alınmıştı. Burada, yaygın fermentasyonları vereceğiz. Fermentasyonlann Çeşitliliği Fermantasyonların bazı ana tipleri, oluşturulan ürünler temeline göre sınıflandırılarak Tablo 17.7'de özetlenmiştir. Alkol, laktik asit, propiyonik asit, karışık asit, bütirik asit ve homoasetik asit gibi bazı geniş kategorileri açıklayacağız. Birkaç fermentasyon, fermentasyon ürününden ziyade fermente edilen substrata göre sınıflandırılır. Örneğin; endospor oluşturan birçok anaerobik bakteri {Clostridium cinsi) asetat, amonyak ve H2 üretimi ile birlikte amino asitleri fermente edebilir Şekil 12.59). Clostridium acidiurici ve C. purinolyticum gibi diğer Clostridium türleri asetat, format, CO2 ve amonyak oluşturarak purinleri, ksantin veya adenini fermente edebilir. Buna karşılık, diğer anaeroblar aromatik bileşikleri fermente eder. Örneğin; Pelobacter acidigallici isimli bakteri, aromatik bir bileşik olan floroglukinolü (1,3,5-benzenetirol, C,H,O,) asetata fermente eder ve asetil-CoA'nm 6
o
J
asetata dönüşümü ile enerji kazanılır (Tablo 17.7). Anaerobların sınırlı bir grubu tarafından birçok alışılmamış fermentasyon gerçekleştirilir ve bunlar içinde tek bir bakteri tarafından gerçekleştirilen bazı fermentasyon tipleri de mevcuttur. Bazı örnekler Tablo 17.8'de listelenmiştir. Bu bakterilerin birçoğu, diğer bakterilerin katabolize edemediği substratları katabolize edebilecek biyokimyasal yeteneğe sahip olacak şekilde evrimleşmiş organizmalardır. Bununla birlikte; Tablo 17.7'de listelenmiş maddelerin substrat olarak fermentasyonda kullanımı, organizmanın ATP formunda serbest enerji kazanması için Tablo 17.6'da listelenen tipte enerjice zengin ara ürün oluşturmasını gerektirir. Substrat Seviyesinde Fosforilasyondan Yoksun Fermentasyonlar
Asetat + ATP Hidrojenaz
Ferredoksin
f 1
2 e-
h
~ADP
Asetil~P
Asetil-CoA + CO?
Piruvat
Substrat seviyesinde fosforilasyonla, direk ATP sentezi için yetersiz miktarda serbest enerji bırakan belirli substratlar, yine de organizmanın gelişmesini destekler. Bu tip durumlarda substratın katabolizması, zar boyunca proton veya sodyum gradienti oluşturan iyon pompalarıyla ilgilidir. Örneğin; Propionigenium modestum ve Oxalobader formigenes
tarafından gerçekleştirilen fermentasyonlar bu şekilde gerçekleşir. Her iki organizmada da dikarboksilik asitlerin fermentasyonu zara bağlı, enerji sağlayan iyon pompalarıyla eşleşmiştir. Propionigenium modestum aşağıdaki reaksiyonu
• Şekil 17.51 Piruvattan hidrojen ve asetat üretimi. Asetatın üretimi sırasında, enerjice zengin ara ürün olan asetil fosfatın hidrolizinden nasıl ATP sentezlendiğine dikkat ediniz (bakınız Tablo 17.6).
gerçekleştirir: Süksinat2
H2O
Propiyonat" + HCO3" AG° =-20.5 kj
574 • Bölüm 17 • Metabolik Çeşitlilik
Tablo 17.7
Yaygın baMeriyal fermentasyonlar ve yürütücü bazı organizmalar
Tip
Genel reaksiyon"
Organizmalar
Alkolik
Heksoz -> 2 Etanol + 2 CO 2
Homolaktik
Heksoz -> 2 Laktat" + 2 H +
Heterolaktik
Heksoz -> Laktat- + Etanol + CO 2 + H +
Propionik asit
Laktat" —> Propionat" + Asetat" + CO 2
Karışık asit
Heksoz -> Etanol + 2, 3-Butanediol + Suksinat 2 " + Laktar + Asetat" + Format" + H, + CO.
Butirik asit Butanol
Heksoz -» Butirat" + Asetar + H 2 + CO 2 Heksoz —> Butanol + Asetat" + Aseton + Etanol + H 2 + CO 2 Etanol + Asetat" + CO 2 -» Kaproat" + Butirat" + H 2 Fruktoz -> 3 Asetat" + 3 H + 2 H 2 O 4 H 2 + 2 CO 2 + H + ->• Asetat" + Asetat- + H,O - • CH, + HCO,"
Maya Zymomonas Streptococcus Bazı Lactobacillus'lsLT Leuconostoc Bazı Ladobacillus'lar Propionibacterium Clostridium propionicutn Enterik bakteri'' Escherichia Salmonella Shigella Klebsiella Enterobacter Clostridium butyricum Clostridium acetobutylicum
Kaproat Homoasetojenik Metanojenik
Clostridium kluyveri Clostridium aceticum Acetobacterium Methanosaeta Methanosarcina
' Reaksiyonlar, sürecin genel bir taslağı olarak verilmiştir. * Hiçbir organizma tüm ürünleri üretmez. Özellikle, butanediol üretimi sadece belirli enterik bakterilerle sınırlıdır.
Bu toplam reaksiyonda substrat seviyesinde fosforilasyondan sağlanan serbest enerji kazancı yetersizdir, ancak bununla birlikte bu olay tek enerji kazanımı reaksiyonu olarak organizmanın gelişmesini desteklemektedir. Propionigenium modestum'un zar boyunca hücre dışına saldığı sodyuma (Na+) bağlı olarak süksinatın dekarboksilasyonu (metil malonil- CoA ve membrana bağlı dekarboksilaz yoluyla) nedeniyle organizmanın gelişmesi mümkün olur (Şekil 17.52a»). P. modestum'un zarındaki Na+ u transloke eden ATPaz, bu Na+ gradientini harcayarak ATP sentezini gerçekleştirir (Şekil 17.52a). r
Tablo 17.8 Tipi
Oxalobacter formigenes okzalat fermentasyonunu gerçekleştirir: Okzalat2" +
Format" + HCO, AG° '=-26.7 kj
Okzalat, nötral pH'da okzalat2" şeklinde iyonize formda bulunmaktadır. Bunun formata dekarboksilasyonu bir proton harcar. Daha sonra formatm hücre dışına çıkarılması, zardaki proton transloke eden ATPaz ile ATP sentezini sağlayacak proton motive gücü oluşturur (Şekil 17.52b).
Nadir bazı bakterîyal fermentasyonlar Tüm dengedeki reaksiyon
Organizmalar
2 C 2 H 2 + 3 H 2 O -> Etanol + Asetat" + H + 4 Gliserol + 2 HCO," -* 7 Asetat" + 5 H + + 4 H 2 O 2 C,HİOH) 2 + 6 H O -» 4 Asetat" + Butirat- + 5 H +
Pelobacter acetylenicus Acetobacterium sp. Clostridium sp.
C6H6O3/)+ 3 H 2 O -• 3 Asetat" + 3 H +
Pelobacter massiliensis Pelobacter acidigallici
Smıflandırılamayan gram-pozitif oluşturmayan anaeroplar
Sitrat Akonitat Glioksilat
10 C 4 H 1 2 N 2 + 26 H 2 O -> 6 Asetat" + 7 Butirat- + 20 NH 4 + + 16 H 2 + 13 H + Sitrat3" + 2 H 2 O -> Format" + 2 Asetat" + HCO 3 " + H + Asonitat 3 " + H* + 2 H 2 O -• 2 CO 2 + 2 Asetat" + H 2 4 Glioksilat- + 3 H* + 3 H 2 O -» 6 CO 2 + 5 H 2 + Glikolat"
Süksinat Oksalat Malonat
Süksinat 2 " + H 2 O -» Propionat" + HCO," Oksalat 2 " + H 2 O -> Format" + HCO," Malonat 2 " + H 2 O -» Asetat" + HCO 3 "
Benzoat
2 Benzoat" -* Siklohekzan karboksilat" + 3 Asetat" + HCO 3 " + 3H +
Asetilen Gliserol Resorsinol (aromatik bir bileşik) Phloroglusinol (aromatik bir bileşik) Putresin '
Bacteroides sp. Acidaminococcus fermentans Smıflandırılamayan gram-negatif bakteri Propionigenium modestum Oxalobacter formigenes Malonomonas rubra Sporomusa malonica Syntrophus aciditrophicus
1
17.21 • Sintrofi • 575
Sodyumu dışarı atan dekarboksilaz
Format"
Oksalat2"
HCO3(b)
• Şekil 17.52 Suksinat ve oksalatın özel fermentasyonu. (a) Propionigenium modestum'la suksinat fermentasyonu. Sodyum geçiren bir ATPaz, ATP üretir; Sodyumun dışan atımı suksinat dekarboksilasyonu ile salınan enerjiye bağlıdır, (b) Oxalobacter formigenes ile oksalat fermentasyonu. Bir format-oksalat antiporter yoluyla oksalatın girişi ve formatın çıkışı proton tüketimine neden olur. ATP sentezi bir proton merkezli ATPaz'a bağlanır. Verilen reaksiyonun bütün substratlan ve ürünleri karşıt renklerde görülmektedir.
Propionigenium ve Oxalobacter'in
fermentas-
yonlarının ilgi çekici ve eşsiz yönü, ATP sentezinin substrat seviyesinde fosforilasyon ve elektron taşmımı olmadan gerçekleşmesidir. Bununla birlikte; her iki durumda da Na+ veya H+ pompalarına bağlı organik asit dekarboksilasyonu sonucunda kemiozmotik olarak ATP oluşumu meydana gelir. Bu organizmalar biyoenerjetik açıdan bize önemli bir ders vermektedirler: Bir kimyasal reaksiyondaki enerji kazancının ATP sentezi için gerekli 31.8 kj'den daha az olması, bu reaksiyonun bakteri için gelişmeyi destekleyici bir reaksiyon olmadığını göstermez. Eğer reaksiyon bir iyon gradienti ile eşleşebilirse, ATP üretimi mümkün olur. Bununla birlikte; zarla ilişkili bir ATPaz'ın, ATP oluşumu için yaklaşık 3H+ (veya 3Na+) gerektirmesi nedeniyle, reaksiyonun teorik olarak büyümeyi destekleyici olması için en az tek bir H+ veya Na+ pompası için gerekli enerjiyi sağlaması gerekir.
17.20 Kavramiarin Gözden Geçirilmesi Çok çeşitli fermentasyonlar bilinmekte ve çoğunlukla bir organizmanın fermentasyon ürünü, ikinci bir organizma tarafından fermente edilebilmektedir. Bazı fermentasyonlar enerjetikleri için temelde iyon gradientini (H+ veya Na+) kullanır. •
Suksinat ve okzalat fermentasyonlarmdaki alışılmamış özellik nedir? • Tablo 17.7 ve 17.8'de gösterilen yaygın fermentasyon ürünleri asetat gibi yağ asitleridir. Bu, enerjetik açıdan niçin önemlidir?
Sintrofi Mikrobiyolojide birçok örneği bulunan sintrofi; iki farklı organizmanın birlikte bir maddeyi parçalaması, bunu birbirinden bağımsız yapamaması ve bu şekilde enerji sağlaması durumudur. Kısım 19.10'da, sintrofinin metan üretimine götüren anoksik katabolizmadaki önemini göreceğiz. Burada sadece sintrofinin mikrobiyoloji ve enerjetik yönünü ele alacağız. Sintrofîk Reaksiyonlarda Hidrojen Tüketimi
Çoğu zaman sintrofik reaksiyonlardaki partnerler H 2 üretimi ve H 2 tüketimi ile bağlantılıdırlar, partnerlerden biri H 2 üretirken diğer partner H 2 tüketir. Bu nedenle; sintrofiye aynı zamanda türler arası H 2 transferi de denilir. Daha önce anlattığımız birçok organizma H 2 tüketicisi olabilir: denitrifiye edici bakteriler, sülfat indirgeyici bakteriler, homoasetojenler veya metanojenler. Sintrofiyi, etanolun asetata fermentasyonu ve sonuç olarak metan oluşumu süreci ile açıklayacağız (Şekil 17.53»). Görüldüğü gibi, etanol fermente edicilerin gerçekleştirdiği reaksiyondaki serbest enerji değişimi elverişsizdir (yani pozitiftir). Bununla birlikte; etanol fermente ediciler tarafından üretilen H2, metanojenez için metanojenler tarafından elektron vericisi olarak kullanılır (Şekil 17.53). İki reaksiyon toplandığı zaman, toplam reaksiyonun ekzergonik bir reaksiyon olduğu görülmektedir (Şekil 17.53) ve her iki partnerin sintrofik karışımdaki büyümesini desteklemektedir.
576 • Bölüm 17 • Metabolik Çeşitlilik Etanol fermentasyonu:
Butirat"
2 CH 3 CH 2 OH + 2 H2O -*- 4 H 2 + 2 CH 3 COO- + 2 H + AG°'= + 19.4 kj/reaksiyon Metanojenez: 4 H 2 + CO 2 -*• CH 4 + 2 H2O AG°'= - 130.7 kj/reaksiyon
CoA transferi
Butiril~CoA L - FAD IV* FM)H2 Krotonil-CoA
1
Çift reaksiyon: 2 CH 3 CH 2 OH + CO 2 •*• CH 4 + 2 CH 3 COCr + 2 H + AG°'= - 111.3 kJ/reaksiyon fa; Reaksiyonlar
ToH2 consumer
3-Hidroksibutiril~CoA NADH 2
• =. H 2
Asetoasetil~CoA Metanojen
Etanol fermenteri 2 Ethanol
Türler arası hidrojen transferi
' IH
2 Asetat
co 2
i
(b) H2'nin sintrofik transferi
• Şekil 17.53 Türlerarası H2 transferi. Etanol okside eden bir bakteri ve bu durumda bir metanojen gibi H2 tüketen işbirlikçi bir bakterinin sintrofik ilişkisi ile etanolun metan ve asetata fermentasyonu. (a)İlgili reaksiyonlar. Bu yüzden iki organizma ikili reaksiyonda açığa çıkan enerjiyi paylaşır, (b) H2'nin sintrofik transferinin doğası.
Diğer bir sintrofi örneği; yağ asidi okside edici sintrof Syntrophomonas tarafından gerçekleştirilen, bütiratın asetat ve H2'ye oksidasyonudur (Şekil 17.54»). Bütiraf + 2H2O •
2Asetat" + H+ + 2 R AG°'= +48.2 kj
Bu reaksiyonun serbest enerji değişimi yüksek derecede elverişsizdir ve Syntrophomonas saf kültürde bütirat üzerinde gelişebilir. Ancak, reaksiyonda H 2 üretilmişse, bu H2 partner organizma (bir metanojen gibi) tarafından tüketilir ve Syntrophomonas da karışık kültürde H 2 tüketici ile birlikte gelişebilir. Serbest enerji değişimi pozitif olan kimyasal reaksiyonlar, organizmanın gelişimini nasıl destekler? Şimdi de bunu açıklayacağız. Sintrofînin Enerjetiği
Sintrofik organizmaların gelişmesi sadece partner organizma H2'yi uzaklaştırdığı zaman gerçekleşiyorsa, bu uzaklaştırma açıkça reaksiyonun enerjetiğini etkiliyor demektir. Bu nasıl gerçekleşir? Ek l'de verilen serbest enerji kaynakları ile ilgili kısa özet, reaksiyona giren reaktant ve ürünlerin gerçek konsantrasyonlarının güçlü ve şiddetli bir şekilde enerjetiği değiştirebileceğinin göstergesidir. AG0' temelde standart koşullarda - bir molar ürün ve reaktant konsantrasyonu- hesaplanmasına rağmen,
Asetil-CoA
Asetil~CoA
Asetat"
Asetil~P
I
Asetat" + ATP (a) Sintrofik kültür
1. Krotonat oksidasyonu O II CH 3 HC=CH - C + H 2 O— 2 asetat" KrotonatO İ+H+ 2. Krotonat redüksiyonu O II CH3HC=CH—C
o~
_ +H2—butirar mm
ı
Proton itici güç
Özet: 2 krotonar + H2O — 2 asetat" + butirar
+ H + AG 0 ' = -340 kJ
(b) Saf kültür
• Şekil 17.54 Sintrofik ve saf kültürde Syntrophomonas ıvolfePnin gelişme enerjitiği. (a) Sintrofik kültürde, gelişme metanojen gibi H2 tüketen bir organizmanın varlığına bağlıdır. H2 üretimi, olasılıkla proton motive güç merkezli ters elektron akışına sahiptir (bakınız Kısım 17.4). Çünkü FAD/FADH2 veya NAD/NADH2'nin Eo ı 2HVH2'ninkinden daha elektropozitiftir (Şekil 5.9). (b) Saf kültürde enerji üretimi, kronatın butirata indirgenmesine bağlıdır.
AG temel olarak gerçek ürün ve reaktant konsantrasyonunda hesaplanır. Anoksik habitatlarda, H2, anaerobik solunum için güçlü bir elektron vericisi olduğu için, hemen tüketilir. Bu durum, H 2 konsantrasyonunu son derece düşük seviyede, tipik olarak 10~4 atm'in altında tutar (c«s Tablo 19.4). H 2 konsantrasyonu çok düşük seviyede ise ve reaksiyonun enerjetiğinin hesaplanmasında kullanılan AG, serbest enerji değişimi, (Ek l'deki AG hesaplanmasına bakınız), etanol veya yağ asitlerinin asetat ve H2'ye oksidasyonu ile birleşmiş ise reaksiyon ekzergonik hale gelir. Örneğin; H 2 konsantrasyonu H 2 tüketici partner tarafından son derece düşük seviyede tutulduğunda,
17 22 • Biyokimyasal Süreçlerde bir Reaktant Olarak Molekuler Oksijen (02) • 577 • Sintrofiye bir örnek veriniz. Bu örnekteki organizmaSyntrophomonas tarafından gerçekleştirilen bütirat ların her ikisi de nasıl fayda sağlayabilir? oksidasyonundan sağlanan enerji kazancı -18 kj • Şekil 17.53'te gösterilen etanolun sintrofik yıkımı sıradolayında olur. sında ATP'nin nasıl üretildiğini belirtiniz. Sintroflarm ATP üretim mekanizması, organiz• Yağ asidi okside eden sintroflar saf kültürde gelişebimaların gelişme şekline bağlı olarak hem substrat lir mi? Buna bir örnek veriniz ve bu koşullar altında seviyesinde hem de oksidatif fosoforilasyonu içerir. organizmanın nasıl ATP ürettiğini açıklayınız. Substrat seviyesinde fosforilasyon asetil-CoA'nın (etanol veya yağ asitlerinin beta-oksidasyonundan üretilen) asetata dönüşümü sırasında meydana geHİDROKARBON lir (Şekil 17.54:0); bu ürün, sintrofik koşullar altında OKSİDASYONU VE tek ATP kaynağı olabilir. Bununla birlikte; SyntropORGANİK BİLEŞİKLERİN homonas aynı zamanda anaerobik solunum da yaKATABOLİZMASINDA pabilir, çünkü bu bakteri saf kültürde doymamış yağ asitlerinin disproporsinasyonu ile gelişebilir. O2'NİN İŞLEVİ Örneğin; bir miktar krotonat asetata okside olaHidrokarbonlar, yeryüzünde bol bulunmakta olup rak, bir miktar krotonat da bütirata indirgenerek Syntrophomonas'm gelişmesini destekleyebilir (Şe- aynı zamanda kemoorganotroflar açısından mükil 17.54b). Syntrophomonas tarafından gerçekleşti- kemmel substratlardır. Hidrokarbonların aerobik yıkımını göreceğiz, bununla birlikte özel biyokimrilen krotonat indirgenmesinde de, fumaratın süksinata indirgenmesindeki (Kısım 17.18'e bakınız) yasal sorunları ortaya koyacağız. Ek olarak, daha gibi, organik elektron alıcılarının kullanıldığı diğer ileri metabolik çeşitliliği örneklemek amacıyla anaerobik solunumlardakine benzer şekilde proton kısaca polisakkaritlerin, yağların ve diğer birkaç motive güç oluşturulur ve ATP sentezlenir. maddenin aerobik yıkımından söz edeceğiz. O2 gerektiren bazı reaksiyonlarla başlıyoruz. Sintrofik durumlarda mutlaka ATP sentezlenir, burada Syntrophomonas bu gelişme tarzı ile Biyokimyasal Süreçlerde ek enerji kazancı sağlar; çünkü bu organizma bir şekilde FADH2 ve NADH2 gibi daha elektropozi17.22 bir Reaktant Olarak tif elektron vericilerinden H 2 üretir (Şekil 17.54a). Molekuler Oksijen (0,) Bu durum, ATP üretiminin bir kısmının ters elekEnerji oluşumu reaksiyonlarında elektron alıcısı tron akışı reaksiyonları (Kısım 17.5'e bakınız) ile yönlendirildiğinin göstergesidir. Yağ asidi ve alkol olarak O2'nin işlevini tartışmıştık (on& Kısım 5.11). okside eden sintrofik bakterilerin sınırlı bir yaşam O2'nin en önemli işlevi hücresel metabolizmada oltarzına sahip olduğu açıktır. Gerçekten de, sintromasına rağmen, O2 belirli anabolik ve katabolik süfik reaksiyonlardan elde edilebilen enerji, sadece reçlerde direk bir reaktant olarak da ilginç ve önemli birkaç kilojullük bir enerjiye karşılık gelmektedir. bir rol oynar. Ekolojik olarak; sintrofik bakteriler, karbon Oksijenazlar döngüsünün anahtar halkasıdır. Bu organizmalar, temel fermentatif organizmaların fermentasyon Oksijenazlar, O2'den organik bileşiklerin içerisine ürünlerini kullanmak ve diğer anaeroblarala birlikoksijen atomunun katılmasını katalizleyen enzimte kendilerine gerekli olan substratı, H2'yi, sağlalerdir. İki oksijenaz sınıfı vardır: Her iki O2 atomumak üzere evrimleşmiş bir mekanizmaya sahiptirnu da molekülün yapısına katan dioksijenaz ve iki ler. Buna karşın; aerobik organizmalar için sintrofi O2 atomundan sadece birini molekülün yapısına söz konusu değildir, çünkü elektron alıcısı olarak aktaran diğer atomu suya indirgeyen monooksijeO2'nin kullanıldığı reaksiyonların enerjetiği, aynı naz. Çoğu monooksijenaz, flavin aracılığıyla O2'ye substratın fermentatif katabolizmasmm enerjetidirek bağlanıp NADH veya NADPH (elektron ğinden daha verimlidir. Bu nedenle; sintrofik ilişkivericileri) tarafından indirgenmesine karşın, elekler, çok küçük miktarda enerji sağlayan ve yüksek tron vericisi olarak NADH veya NADPH'ı kullanır derecede özelleşmiş organizmaların gerçekleştir(Şekil 17.55»). Amonyak monooksijenaz daha önce diği, enerjetik açıdan marjinal reaksiyonları içeren tartışılmıştı (Kısım 17.12'ye bakınız) ve bu durumanoksik dönüşüm karakteristiklerindendir. da sitokrom c elektron vericiydi. Canlı organizmalarda birkaç reaksiyon tipi, re17.21 Kavramların Çözden Geçirilmesi aktant olarak O2 gerektirir. En iyi örneklerden biri, sterol biyosentezindeki O2 ilişkisidir. Kaynaşmış Sintrofi, birlikte etki ederek bazı bileşikleri parçalayabilen sterol halkası sisteminin (i*fc Şekil 4.18) oluşumu, ve bunu tek başına yapamayan iki organizma gerektirir. molekuler oksijen katılımını gerektirir. Bu gibi reBu süreçte genellikle bir organizma tarafından H 2 üretimi, partner organizma tarafından da H 2 tüketimi yapılmakaksiyonlar, anoksik koşullarda gerçekleşmemektadır. H 2 tüketimi, H 2 üreticisi tarafından gerçekleştirilen tedir; bu yüzden organizma anaerobik olarak gereaksiyonun enerjetiğini etkileyebilir ve ATP üretimine lişebilmek amacıyla ya sadece bu reaksiyona bağlı izin verir, aksi taktirde ATP sentezlenemez. olmamalı ya da yaşadığı çevreden gerekli mad-
KV
578 •
• Metabolik Çeşitlilik
^
^7^15
n-Oktan
O:O (O2)
3
Monooksijenaz
NAD+
C 7 H 1 5 CH 2 OH
H?O
n-Oktanol NAD +
C7H15C=O n-Oktanal H2O>
NAD +
OH C7H15C = O n-Oktanoik asit ATP
• CoA
AMPAsetil-CoA P-oksidasyonu (bakınız Şekil 17.69)
* Şekil 17.55 Monooksijenaz alitivîtesi. Bir monooksıjenazla katalizlenen alifatik hidrokarbonun oksidasyon basamakları. Bazı sülfat indirgeyen derütrifikasyon bakterileri anoksik koşullar altında alifatik hidrokarbonları parçalayabilir.
deleri (sterol) yeniden oluşturarak elde etmelidir. Biyosentez için O2 gereksiniminin evrimsel açıdan kayda değer bir önemi vardır. Yaşam ilk olarak evrimleştiğinde, yeryüzü atmosferinde O 2 bulunmamaktaydı; O2 ancak siyanobakterilerin evriminden sonra kullanılabilir hale gelmiştir (ens Bölüm 11. 17.22 Kavramların Gözden Geçirilmesi Elektron alıcısı olmasının yanı sıra oksijen, aynı zamanda belirli biyokimyasal süreçlerde kimyasal reaktant olarak da kullanılır. Oksijenaz adı verilen enzimler, O2'i biyokimyasal bileşiklerin yapısına katar. •
Monooksijenazlar ve dioksijenazlar arasındaki işlev farkı nedir?
Hidrokarbon Oksidasyonu Hidrokarbonlar sadece karbon ve hidrojen içeren ve suda yüksek derecede çözünmeyen organik bileşiklerdir. Düşük molekül ağırlıklı hidrokarbonlar oda sıcaklığında gaz formunda iken, yüksek moleküler ağırlıklı hidrokarbonlar sıvı veya katı formundadır. Alifatik hidrokarbonlarda, karbon atomları açık zincirlerle bağlanır. Alifatik hidrokarbonların zincir uzunlukları, dallanma dereceleri ve çift bağ sayıları arasında olağanüstü bir çeşitlilik mevcuttur. Aromatik hidrokarbonlar, aromatik halkalar içerir ve benzen türevleri olarak değerlendirilebilirler (Şekil 17.56'ya bakınız).
Alifatik Hidrokarbon Metabolizması
Birkaç bakteri ve birkaç küf ve maya aerobik koşullar altında, hidrokarbonları elektron vericisi olarak gelişmeyi desteklemek amacıyla kullanabilir. Doymuş alifatik hidrokarbonların oksidasyonunun ilk basamağı, reaktant olarak moleküler oksijen (O2) gerektirir ve oksijen molekülünün atomlarından biri tipik olarak okside edilmiş hidrokarbonun son karbon atomu ile birleştirilir. Bu reaksiyon, monooksijenaz tarafından gerçekleştirilir (Kısım 17.22'ye bakınız) ve tipik reaksiyon düzeni şekil 17.55'te görülmektedir. Bu reaksiyonun son ürünü asetil-CoA olup bu ürün sitrik asit döngüsünde katabolize edilir. Hem doymuş hem de doymamamış hidrokarbonlar anoksik koşullarda, iyi bir şekilde CO2'ye okside edilebilir. Bu süreç, bazı denitrifiye edici ve bazı sülfat indirgeyici bakterilerin oluşturduğu sınırlı bir grup tarafından gerçekleştirilir. Bu durum, burada monooksijenazın gerekli olmadığını göstermektedir. Parçalanma mekanizmasında, hidrokarbonların yağ asidine karboksilasyonu (CO2 eklenmesi) gerçekleşir. Bunu takiben, daha ileri düzeyde yıkım beta-oksidasyon ile sağlanır ve bu süreç O2 gerektirmez (Şekil 17.69'a bakınız). Aromatik Hidrokarbonlar
Birçok aromatik hidrokarbon, mikroorganizmalar tarafından aerobik olarak elektron vericisi olarak kullanılabilir. Bu mikroorganizmalardan en iyi çalışılmış olanı, bir bakteri cinsi olan Psendomonas'dhr. Bazıları çok büyük moleküller olan bu bileşiklerin metabolizmasında, tipik olarak ilk aşamada Şekil 17.56fl«'daki katekol veya yapısal olarak bununla ilgili olan bileşikler oluşur. Bu tek halkalı bileşikler başlangıç substratları olarak kabul edilir, çünkü oksidatif katabolizma yalnızca büyük aromatik moleküllerin, daha basit formdaki bu moleküllere dönüştürülmesinden sonra yürür. Protokatekuat ve katekolden daha ileri degredasyonlarla sitrik asit döngüsüne girebilen süksinat, asetil-CoA ve pirüvat gibi bileşikler oluşturulur (£«o Şekil 5.22). Aromatik hidrokarbonların katabolizmasının birkaç basamağı, genellikle oksijenaz gerektirmektedir. Şekil 17.56a, b ve c oksijenaz tarafından katalizlenen üç farklı reaksiyonu göstermektedir. Bunlardan birinde monooksijenaz, diğer ikisinde ise dioksijenaz kullanılır. Aromatik Bileşiklerin Anoksik Yıkımı
Aromatik bileşik eğer önceden oksijen atomu içeriyorsa, fakültatif aerobik bakteriler tarafından anaerobik olarak parçalanabilir. Örneğin; fenolik bileşikler belirli denitrifiye edici, fototrofik, ferrrik demir indirgeyici ve sülfat indirgeyici bakteriler tarafından parçalanır. Biyokimyasal açıdan, aromatik bileşiklerin katabolizması oksidatif halka bölünmesinden ziyade, redüktif halka bölünmesi ile yürütülür (Şekil 17.57»}. f?u; cfû'z zı'ncir/ı yağ asidi veya dikarboksilik asit kazanımı için halka indirgen-
17 24 • Metanotrofi ve Metilotrofi • 579 HoO + NAD
OH
NADH Benzen monooksijenaz
Benzen
(b)
Benzen epoksit Benzenediol Monooksijenaz
OH OH
Katekol 1,2-dioksijenaz
Katekol
(c)
Oc] / \
0:0
OH
OH
X
^ ^ OH_ Katekol dioksetan (hipotetikal) Dioksijenaz
0:0
CH, I OH OH
0H
Cis, cis-mukonat
ÇH3
CH 3
Katekol
NAD+
OH OH
Toluen
O:O Metil katekol 2,3-dioksijenaz
• Şekil 17.56 Aromatik bileşiklerin katabolizntasında oksijenazların rolü. (a) NADHin elektron vericisi olduğu bir monooksijenazla katekolun hidroksilasyonu. (b) Katekolun bir dioksijenazla cis, cis-mukonata parçalanışı. Her iki reaksiyonda farklı mekanizmaları göstermede reaktant oksijen atomları renkli olarak gösterilmiştir, (c) Toluenin parçalanmasında toluen dioksijenaz ve metil katekol 2,3-dioksijenaz aktivitesi. Her bir enzime katılan oksijen atomları farklı renklerle birbirlerinden ayrılmıştır. Katekol ve proto-katekuate, aerobik aromatik katabolizmada yaygın ara ürünlerdir. Proto-katekuate, katekolun OH gruplarının birinden iki karbon atomunun uzaklaşması ile oluşur ve bir karboksil grubu (COO) bulundurur.
Ardışık dioksijenazlar
meşini takiben, halka bölünmesini gerektirir. Bu ara ürünler asetil-CoA'ya dönüştürülebilir ve hem biyosentez hem de enerji kazanımı amacıyla kullanılabilir. Benzoat ve türevleri, yaygın doğal ürünler olup aerobik olarak kolayca parçalanabilirler. Oksijen atomu içermeyen benzen ve toluen (yapıları için şekil 17.56'ya bakınız) gibi aromatik bileşiklerin anoksik parçalanması da gerçekleştirilebilir. Benzen katabolizması, belirli denitrifiye edici bakteriler tarafından ve toluen katabolizması da belirli ferrik demir indirgeyici, fototrofik mor ve denitrifiye edici bakteriler tarafından gerçekleştirilir. Biyokimyasal olarak, toluen sonuçta bir benzoat türevi olan benzoil-CoA'ya dönüştürülür ve daha ileri katabolizması ise muhtemelen Şekil 17.57'de görülen halka indirgenmesi yolu ile gerçekleştirilir. 17.23 Kavramların Gözden Geçirilmesi Birçok mikroorganizma alifatik ve aromatik hidrokarbonları parçalayabilir. Aerobik katabolizma oksijenaz aktivitesi gerektirir. Anoksik aromatik parçalanma oksidatif yolizlerinden ziyade, redüktif yolizleriyle yürütülür. • Benzen ve benzoatın kimyasal yapısını çiziniz. Bu bileşikler aromatik mi yoksa alifatik midir? • Aromatik bileşiklerin aerobik metabolizma ile karşılaştırıldığında anaerobik olarak parçalanmasında temel farklılık nedir? Konuyla ilgili bir örnek veriniz.
Metanotrofi ve Metilotrofi Kısım 12.6'da metanotrof ve metüotrofların karbon
metabolizmasıyla ilgili özel durum anlatılmıştı. Ototrof olmamalarına rağmen, metilotroflar enerji metabolizması ve biyosentez için C, bileşiklerini (veya diğer C-C bağı içermeyen organik bileşikleri) kullanırlar. Burada, bu sürecin fizyolojisi üzerine odaklanacağız. Metan Oksidasyomınun Biyokimyası
Metanın CO2'ye oksidasyonunun temel basamakları aşağıdaki gibi özetlenebilir: CH4 -> CH3OH -» CH2O
• HCOO -* CCX
Metanotroflar ve metilotroflar CH4'ü kullanabilir (Kısım 12.6). Metanotroflar, formaldehit seviyesindeki ara bileşiğin tamamını veya yarısını asimile eder (kullandıkları yolizine bağlı olarak). Ototroflarla karşılaştırdığımız zaman karbon kaynağı olarak, daha okside bir bileşik olan CO2 yerine CH2O kullanılmasının büyük bir enerji tasarrufu olduğunu göreceğiz. Ancak burada enerji korunumu üzerinde yoğunlaşacağız. Oksik koşullar altında metan oksidasyonunun ilk basamağı metan monooksijenaz adlı enzimi geO
II C-CoA COOH TmmmmmŞfr 3 A s e t a t
ATP Benzoat
-
6
Benzoil CoA
H
P-Oksidasyon + C O 2 Pimelil-CoA
• Şekil 17.57 Redüktif halka ayrılışıyla benzoatın anoksik parçalanışı. Yolizinin tüm ara ürünlerinin koenzim A'ya bağımlı olduğuna dikkat ediniz. Üretilen asetat, sitrik asik döngüsünde daha ileri seviyede katabolize edilir (C*Sa Kısım 5.13 ve Şekil 5.22).
580 • Bölüm 17 • Metabolik Çeşitlilik
rektirir. Kısım 17.22'de tartıştığımız gibi, oksijenaz enzimi O,'den kaynaklanan oksijen atomunu veya atomlarını karbon bileşikleri içine (ve bazı azot bileşiklerine, Kısım 17.12'ye bakınız) aktarmakta ve hidrokarbon metabolizmasında çok büyük bir iş görmektedir. Monooksijenaz O2'den aldığı oksijen atomlarından birini substrata aktarırken, diğer oksijen atomu ise H2O'ya indirgenir. Metan oksidasyonunun eksiksiz çalışıldığı bir metanotrof olan Methylosinus'ta CH4'ün CH3OH'a oksidasyonu için gerekli olan elektronlar, sitokrom c'den gelir (Şekil 17.58»). Metanın metanole oksidasyonu sırasında, indirgeyici güç gereksinimi nedeniyle ATP sentezi engellenir. Bu nedenle; metanotrofların gelişim verimi (harcanan her mol substrat için üretilen hücre gramı), gelişme substratı olarak metan veya metanol kullanıldığında aynı olur. CH3OH'den CO2'ye kadar olan diğer oksidasyon basamaklarında, elektron taşınım zincirine katılan quinon veya NADH gibi tipik redoks kofaktörleri kullanılır. Buradan da proton motive güç oluşumu sonucunda ATP sentezi yapılır (Şekil 17.58). Metanın aerobik katabolizmasma ek olarak, bu hidrokarbonların anoksik oksidasyonu da yapılabilir. Bu, partner olarak her ikisi de zorunlu anaerobik organizma olan sülfat indirgeyici bakteriler ile metanojenlerin işbirliğini gerektiren sintrofik bir süreçtir. Bu süreci, Kısım 19.10'da detaylı bir şekilde inceleyeceğiz.
Cj'in Hücre Materyali Şeklinde Asimilasyonu
Kısım 12.6'da belirttiğimiz gibi tip I ve tip II olmak üzere iki metanotrof sınıfı bilinmektedir. Her bir sınıfın üyeleri; yaygın olarak birkaç fenotipik özelliği paylaşmakta ve aynı zamanda C, asimilasyonu için farklı bir mekanizma kullanır. Ana hatları Şekil 17.59»'da verilen serin yolizi, tip 2 metanotroflar tarafından kullanılır. Bu yolizinde, bir molekül formaldehit (CH4 oksidasyonundan üretilen, şekil 17.58'e bakınız) ve bir molekül CO2'den iki karbon birimi içeren asetü-CoA sentezlenir. Serin yolizi; her bir asetil-CoA sentezi için indirgeyici güç ve enerji olarak 2 NADH ve 2 ATP gerektirir. Serin yolizi, birkaç sitrik asit döngüsü enzimi ve kendine özgü bir enzim olan serin transhidroksimetilazı kullanır (Şekil 17.59). Ana hatları Şekil 17.60'ta gösterilen ribuloz monofosfat yolizi ise tip I metanotroflar tarafından kullanılır. Hücre materyali için gerekli tüm karbon atomlarının formaldehitten kaynaklanması nedeniyle ribuloz monofosfat yolizi, serin yolizinden daha hızlı ve verimli bir yolizidir. Ayrıca formaldehit, hücre materyali seviyesinde olduğu için indirgeyici güce de gerek duyulmaz. Ribuloz mo-
nofosfat yolizi, her bir gliseraldehit-3-fosfat moleC-ı substrat
i
HCHO Formaldehit Metilen tetrahidrofolat
Hidroksipiruvat vat
NADH NAD+ a
NADH x-*- FP —*- Q •=*- sit b -*- sit c T * - sit a
Tekrar döngü
ATP
V
Fosfoenolpirüvat
< HOOC-C - C H 2 -COOH Oksalasetat
ATP
Hücre karbonu • Şekil 17.58 Metanolrofik bakterilerce metan oksidasyonu. Metan (CH4), metan monooksijenaz enzimi ile metanole (CH3OH) dönüştürülür. İlk basamakta gereksinim duyulan elektronlar sitokrom c'den sağlanır ve bu reaksiyonda hiçbir enerji korunumu olmaz. Proton motive güç, zarda elektron akışı sırasında oluşturulur ve bu güç ATPaz'da harcanır. Biyosentez için gerekli karbonun temelde formaldehitten (CH2O) geldiğine dikkat ediniz. MMO, metan monooksijenaz; FP, flavoprotein; sit, sitokrom; O, quinon. Gözükmemesine rağmen, MMO aslında zarla ilişkili bir enzimdir.
[HOOC-CH 2 -CH 2 -C~S-CoA Malil CoA^
ATP
CoA* CH 3 -C~S-CoA Asetil CoA — • Biyosenteze gider Overall: Formaldehit + CO2 + CoA + 2 NADH + 2 H + + 2 ATP — Asetil-CoA + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 PI + 2 H2O • Şekil 17.59 Tip II metilotrofik bakterilerce C, birimlerinin hücre materyali şeklinde asimilasyonu için serin yolizi. Yolizinin ürünü olan asetil-CoA yeni hücre yapımı için başlangıç noktası olarak kullanılır. Yol izinin anahtar enzimi serin transhidroksimetilaz'dıi.
17.25 • Heksoz, Penloz ve Polisakkarit Metabolizması • 581 3 Formaldehit
17.24 Kavramların Çözden Geçirilmesi
HCHO ^ /
3 Ribuloz-5-P
3 Heksuloz-6-P CH2OH
CH2OH
H-C-OH
C=0
c=o
H-C-OH
•
H-C-OH
H-C-OH
H-C-OH | CH 2 OPO 3 2 "
CH 2 OPO 3 2 -
1 \\
D Metanotrofi, CH 4 'ün karbon ve enerji kaynağı olarak kullanılmasıdır. Metan monooksijenaz enzimi, metan katabolizmasmın anahtar enzimidir. Metanotroflarda C, birimleri, formaldehit seviyesinde ribuloz monofosfat yolizi veya serin yol izi ile hücre materyali şeklinde asimile edilir.
^r^Heksuloz-P-sintaz
izomeraz
Tekrar şeker ^ ı düzenlemeleri
/^ATP 2 Fruktoz-6-P + Fruktoz 1,6-bisfosfat
Gliseraldehit-3-P CHO 1 H-C-OH 1 CH 2 OPO 3 2 "
1
Biyosenteze
CH2OH I
CH 2 OPO3 2 " I
c=o I HO-C-H | H-C-OH
c=o I HO-C-H | H-C-OH
H-C-OH
H-C-OH
CH 2 OPO 3 2 "
Ribuloz monofosfat yolizinin enerji ve indirgeyici güç gereksinimi ne kadardır? Serin yolizinin enerji ve indirgeyici güç gereksinimi ne kadardır? Bu iki yol izi niçin birbirinden farklılaşır? • CH 4 'ün CH 3 OH'a oksidasyonu, niçin indirgeyici güç gerektirir? • Calvin döngüsü ve ribuloz monofosfat yolizinden hangisi daha büyük enerji girişi gereksinir? Niçin?
CH 2 OPO 3 J -
Tüm: 3 Formaldehit + ATP — • gliseraldehit-3-P + ADP
• Şekil 17.60 Tip I metilotrofik bakterilerdeki gibi birkarbonlu bileşiklerin asimilasyonunda ribuloz monofosfat yolizi. Heksuloz şekerin tam adı D-eritro-L-glisero-3-heksuloz 6-fosfat'tır. Döngünün tamamlanması ve bir molekül gliseraldehit3-P ile sonuçlanması için üç adet formaldehit gereklidir. Bu yolizinin anahtar enzimi heksuloz-P-sentaz'dır. "Tekrar şeker düzenlenmeleri" pentoz fosfat yolizinin enzimlerim içerir (bakınız Şekil 17.65).
külü için sadece bir molekül ATP gerektirmektedir (Şekil 17.60). Ribuloz monofosfat yolizinin, sürekli olarak düşük olan enerji gereksinimi nedeniyle tip I metanotrofların enerji kazancı (okside edilen her bir CH4 molekülüne karşılık üretilen hücre gramı), tip II metanotroflarınkinden daha fazladır. Bir formaldehit molekülü ile bir ribuloz-5fosfat molekülünü birleştiren enzim olan hekzulozfosfat sentaz ve hekzuloz-6-fosfat izomeraz enzimi
(Şekil 17.60) ribuloz monofosfat yolzine özgüdür. Yeniden şeker düzenlenmesinde kullanılan diğer enzimler pek çok değişik mikroorganizmada mevcuttur. Bu yolizinin ilk reaksiyonunun substratı olan ribuloz-5-P, Calvin döngüsünün C, alıcısı ribuloz 1,5 bisfosfat (eoa Kısım 17.6) ile hemen hemen aynıdır. Bu durum; her iki döngünün muhtemelen aynı evrimsel kökenden kaynaklandığının belirtisidir.
17.25
Heksoz, Pentoz ve Polisakkarit Metabolizması
Enerji oluşumunda kullanılabilen mekanizmalardan önce, organik bileşiklerin katabolizmasının özel birkaç yönünü, özellikle de polimerik maddelerin monomerik parçalara hidrolizlenmesini ele alarak kemoorganotrofik metabolizmayı tamamlamış olduk. Ayrıca hücrelerin pentoz şeker üretimi ve katabolizmasında kullandığı özel yolizlerini açıkladık. Şimdi polisakkaritlerin mikrobiyal yıkımı ile devam edeceğiz. Heksoz ve Polisakkarit Kullanımı
Heksoz adı verilen altı karbon atomlu şekerler birçok kemolitotrof için en önemli elektron vericilerdir ve aynı zamanda mikrobiyal hücre duvarı, kapsül, cıvık tabaka ve depo maddelerinin yapısal bileşenidirler. Birkaçı disakkarit olmakla birlikte; birçoğu polisakkarit olan doğadaki en yaygın heksoz kaynakları Tablo 17.9'da listelenmiştir. En önemli ik doğal polisakkarit selüloz ve nişastadır. Gerek selüloz gerekse nişasta glukoz birimlerinden oluşmalarına rağmen, bu birimlerin bağlanış tarzları farklıdır (Tablo 17.9, ««s Şekil 3.6) ve bu bağlanış, bu polisakkaritlerin özellikleri açısından son derece önemlidir. Selüloz, nişastadan daha çözünmez bir yapıya sahiptir ve genellikle daha yavaş sindirilebilir. Selüloz, uzun fibrillerden oluşmuştur ve organizmalar sıklıkla bu fibrillerle birleşir (Şekil 17.61»). Birçok mantar selülozu sindirebilir, bunlar çoğunlukla orman zemininde bitkisel materyalin yıkımından sorumludurlar. Bununla birlikte; bakteriler arasında selüloz sindirimi, yaygın olarak Sporocytophoga ve Cytophoga (Şekil 17.61, 17.62»;
<3O& Şekil 12.90) gibi kayan bakterileri, Clostridia ve aktinomisetleri içeren birkaç grupla sınırlıdır. Selülozun anoksik sindirimi birkaç Clostridium türü tarafından gerçekleştirilir; bu türler göl sedimentlerinde, hayvanların intestinal sistemlerinde ve anoksik lağım atığı sistemlerinde yaygın olarak
582 • Bolum 17 • Metabolik Çeşitlilik
Tablo 17.9
Heksoz ve pentoz şekerlerden oluşan ve doğal olarak oluşan polisakkaritler*
Polisakkarit Selüloz^/ Nişasta Glikojen Laminarin (laminarinaz) Paramilon
Bileşimi Glukoz polimeri (/3-l,4-) Glukoz polimeri (a-1,4-) Glukoz polimeri (a-1,4- ve a-1,6-) Glukoz polimeri (jS-1,3-)
Kaynakar Bitkiler (yaprak ve gövdeler) Bitkiler (yaprak ve tohumlar) Hayvanlar (kaslar) Deniz algleri (Phaeophyta)
Katobolik enzimler Selülaz (j6-l,4-glukanazlar Amilaz Amilaz, fosforilaz /3-1,3-Glukanaz
Glukoz polimeri (fS-1,3-)
0-1,3-Glukanaz
Ağar
Galaktoz ve galakturonik asit polimeri N-Asetilglukozamin polimeri (/3-l,4-) galakturonik asit polimeri (galaktozdan) Glukoz polimeri Ksiloz ve diğer şekerlerin heteropolimeri (/3-l,4- ve a-1,2 veya a-1,3 yan grupları) Glukoz-fruktoz disakkariti Glukoz-galaktoz disakkariti
Algler (Euglenophyta ve Xanthophyta) Marine algae (Rhodophyta) Fungi (hücre duvarları) Böcekler (dış iskeletleri) Bitkiler (yapraklar ve tohumlar)
Kitinaz
Kitin Pektin Dekstran Ksilan Sukroz Laktoz
Agaraz
Pektinaz (poligalakturonaz)
Bakteri kapsülleri veya cıvık tabakaları Dekstranaz Bitkiler Ksilanazlar Bitkiler(meyveler, sebzeler) Süt
Invertaz /3-Galaktozidaz
" Bu maddelerin her biri mikroorganizmalar tarafından parçalanır.
bulunurlar. Geviş getiren hayvanların rumenlerinde gerçekleştirilen temel süreç selüloz sindirimidir. Rumendeki bu süreç, aktif olarak selüloz parçalayan Fibrobacter ve Ruminococcus türleri tarafından gerçekleştirilir (««s Kısım 19.11). Şekil 17.6»3'teki laboratuvar kültüründe gösterildiği gibi nişasta, bakteriler ve mantarlar tarafından sindirilebilir. Amilaz adı verilen nişastayı sindiren enzimler; nişasta sindiriminin gerekli olduğu tekstil, temizlik, kağıt ve yiyecek endüstrilerinde önemli derecede yararlar sağlaır ve bu ticari enzimlerin kaynağını mantarlar ve bakteriler oluşturur (ooa Kısım 30.9). Hücre dışı oluşan bütün polisakkaritlerin substrat olarak kullanılması için, öncelikle hidro- Selüloz fibrili
lizle monomerik birimlere yıkılması gerekir. Buna karşın; depo ürünü olarak hücre içinde oluşturulan polisakkaritler hidrolizle değil, fosforolizle yıkılır. Bu süreç, inorganik fosfat ilavesini gerektirir ve sonuçta serbest heksozdan ziyade heksoz fosfat oluşturulur. Glukozun a-1,4 polimeri olan nişastanın yıkımı aşağıdaki şekilde özetlenebilir: (C6H12O6)n + Pi
»(C6H12O6)n., + Glukoz-1-fosfat
Glukoz-1-fosfatın enerji harcanmadan, glikolizin anahtar ara ürünü olan glukoz-6-fosfata dönüştürülebilmesi nedeniyle fosforoliz hücre için net bir enerji tasarrufu sağlar (c«a Şekil 5.14).
Bakteriler
• Şekil 17.61 Selüloz sindirimi. Selüloz fibrillerine selülozu sindiren bakterilerden Sporocytophaga myxococcoides'in tutunmasını gösteren transmisyon elektron mikrografı. Hücreler yaklaşık 0,5|jm çapındadır (£**> Şekil 12.90).
• Şekil 17.62 Selüloz ağar plağı üzerinde Cytophaga hutchinsonü kolonileri. Açık alanlar selülozun hidrolize edildiği yerlerdir.
17 25 • Heksoz, Pentoz ve Polisakkarit Metabolizması • 583
• Şekil 17.64 Cıvık materyal oluşumu. Dekstran üreten ve sukroz içeren bir besiyerinde gelişen bakteri olan Leuconostoc mesenteroides tarafından oluşturulan cıvık koloni. Aynı organizma glukoz üzerinde geliştiğinde, küçük kolonili ve cıvık yapıda değildir. Çünkü dekstran sentezi için sukroz gerekir (daha fazla tartışma için ö°Ö Kısım 21.3 ).
Pentoz Fosfat Yolizi • Şekil 17.63 Bacillus subtilis kolonileri tarafından nişastanın hidrolizi. İnkübasyondan sonra plaka Lugol iyot çözeltisi ile kaplandı. Nişasta hidrolizinin gerçekleştiği bölgelerde nişasta iyot kompleksinin karakteristik mor rengi görülmemektedir. Nişastanın hidrolizi, besiyerine difüze olan hücre dışı amilaz üretiminden dolayı bakteriyal kolonilerin biraz uzağında gerçekleşir.
Disakkaritler Birçok organizma, gelişme için disakkarüleri kullanabilir (Tablo 17.9). Mikroorganizmalar tarafından laktoz kullanımı oldukça fazla ekonomik öneme sahiptir, çünkü kesilmiş süt organizmaları laktozdan laktik asit üretir. Yüksek bitkilerin yaygın disakkariti olan sukroz, genellikle ilk olarak invertaz enzimi tarafından monosakkarit bileşiklere (glukoz ve fruktoz) hidrolizlenir ve monomerler normal yollarla metabolize edilir. /3-1,4-diglukoz ve selüloz sindiriminin ana ürünü olan sellobiyoz, selülozu parçalayamayan çeşitli bakteriler tarafından hızlı bir şekilde parçalanabilir. Mikrobiyal bir polisakkarit olan dekstran, dekstransukraz enzimini ve başlangıç maddesi olarak sükrozu kullanan bazı bakteriler tarafından sentezlenir: n sukroz
> (glukoz)n + n fruktoz dekstran
Dekstran; Leuconostoc mesenteroides ve diğer birkaç
bakteri tarafından bu yolla oluşturulur ve polimer formu güçlü bir cıvık tabaka veya kapsül olarak hücre etrafında biriktirilir (Şekil 17.64»). Dekstran oluşumu sukroz gerektirdiği için, bakteri, glukozlu veya fruktozlu ortamda geliştirildiğinde dekstran oluşmaz. Doğada dekstran veya diğer polisakkaritli kapsül bulunduran hücreler öldüğünde, bu materyaller fermentatif ve diğer kemoorganotrofik organizmalar tarafından kullanılabilir hale gelir.
Pentoz şekerler doğada genelde mevcuttur. Mevcut olmadıklarında, nükleik asitlerin omurgasını oluşturdukları için yapılmak zorundadırlar. Pentozlar heksoz şekerlerden yapılır ve bu sürecin ana yolizi Pentoz fosfat yolizidir. Şekil 17.65», pentoz fosfat yolizini özetlemektedir. Bu yolizinin birkaç özelliği burada vurgulanmalıdır. Öncelikle, oksidasyonu takiben dekarboksilasyon ile bir karbon atomu kaybedilmesiyle glukoz bir pentoza dönüştürülebilir. Bu; NADPH ve yolizinin
anahtar ara maddesi olan ribuloz-5-fosfatı oluşturur (Şekil 17.65). Daha sonra, ihtiyaç dduyulan nükleik asit sentezi için riboz (ve deoksiriboz) yapılır (ö«a Kısım 5.16). Elektron vericisi olarak pentoz şekerler aynı zamanda pentoz fosfat yolizini besleyebilir, daha ileri düzeyde katabolizmalarından önce tipik olarak fosforillenerek riboz-fosfat veya bununla ilgili bileşikleri oluşturabilirler (Şekil 17.65). Pentoz fosfat yolizinin ikinci önemli özelliği de şeker üretimindeki çeşitliliktir. Çeşitli şeker türevleri- C4, C5, C6 ve C 7 — bu yolizinin yardımcı reaksiyonlarında üretilir (Şekil 17.65). Bu, pentoz şekerlerden sonuçta heksoz kazanılmasına ve katabolik amaçlara veya biyosenteze (glukoneogenez, €f*s Kısım 5.15) izin verir. Pentoz fosfat yolizinin son önemli özelliği de NADPH üretimidir, indirgenmiş bir koenzim olan NADPH, hücrede redüktif biyosentez için kullanılır. Birçok hücre NADH'ı NADPH'a dönüştürebilme mekanizmasına sahip olmasına karşın, bu önemli koenzimin direk sentezi için ana yol pentoz fosfat yolizidir. 17.25 Kavramların Gözden Geçirilmesi Polisakkaritler doğada bol bulunmakta ve genellikle fosforoliz ile heksoz veya pentoz monomerlerine yıkılarak, enerji kaynağı olarak kullanılır. Nişasta ve selüloz bol bulunan polisakkaritlerdir. Pentoz fosfat yolizi temelde, biyosentez için pentoz şekerleri üretmektedir.
1
584 • Bölüm 17 • Metabolik Çeşitlilik ATP ADP GLUKOZ ~3cL» glukoz 6-fosfat CH2OP
CH 2 O P
H-C-OH H OH 6-fosfoglukonolakton
sü enzimleri ile sağlanmaktadır ve oksidatif fosforilasyonla ATP üretilir. Organik asitlerin anaerobik olarak kullanımı ise tipik olarak, bu bileşiklerin önce piruvata daha sonra da asetil fosfat yolu ile asetata dönüşümünü içerir ve bu süreçte substrat seviyesinde fosforilasyonla ATP üretilir (Kısım 17.19'a bakınız). Glioksilat Döngüsü
6-fosfoglukonik asit NADP
PENTOZLAR ATP
• '"1 HC-OH HC-OH I
c=o
CH2OP
I CH 2 OH ribuloz 5-fosfat
HC-OH HC-OH I HC-OH
I CHO riboz 5-fosfat ...
CH2OH ksiluloz-5-fosfat J
c6 + c3 <
** c 4
C 6 (Glukoneojenez)
Transketolaz
• Şekil 17.65 Pentoz fosfat yolizi. Yol izi (1) heksozlardan pentozlan oluşturmak için; (2) pentozlardan heksozlan oluşturmak için (glukoneojenez); (3) enerji kaynağı olarak pentozlan katabolize etmek için ve (4) NADPH oluşturmak için kullanılabilir. Yolizinin birkaç anahtar enzimi belirtilmiştir.
• • •
Fosforoliz nedir? Doğada bol bulunan disakkaritler hangileridir? Pentoz fosfat yolizinin hücredeki işlevi nedir?
Karbon kaynağı olarak iki veya üç karbonlu asitlerin kullanımı sadece sitrik asit döngüsü ile olmayabilir. Bu döngü; dört karbonlu bir asit olan, alıcı molekül okzalasetat her döngüde tekrar oluşturuluyorsa çalışmaya devam etmekte, herhangi bir karbon bileşiği biyosentetik reaksiyonlar için taşınsa bile tamamlanamadan engellenir (Ö°& Şekil 5.22). Asetat kullanılıyorsa, döngünün devam etmesi için gerekli olan okzalasetat glioksilat döngüsü ile üretilir (Şekil 17.66»): Bu döngü ismini, anahtar ara ürün olan glioksilattan alır. Bu döngü; birçok sitrik asit döngüsü reaksiyonuna ek olarak iki enzimden oluşmuştur. Bu iki enzim; izositratı süksinat ve glioksilata ayıran izositrat liyaz ve asetil-CoA ile glioksilatı malata dönüştüren malat sentazdır (Şekil 17.66). Biyosentez, glioksilat döngüsünü takiben gerçekleşir. İzositratın süksinat ve glioksilata ayrılması, süksinatın (veya buradan elde edilen diğer sitrik asit döngüsü ara ürünlerinin) biyosenteze girmesine izin verir, çünkü glioksilat asetil-CoA ile birleşerek malatı oluşturur. C4 ara ürünü (süksinat) 2 Piruvar (:oA "
labilir. Sürat, malat, fumarat ve süksinat gibi sitrik
asit döngüsü asitleri bitkiler tarafından oluşturulan doğal ve yaygın ürünlerdir ve bunlar aynı zamanda fermentasyonla, mikroorganizmalar tarafından da üretilir. Sitrik asit döngüsü önemli biyosentetik (ÖÖÖ Kısım 5.16) ve enerjetik (ö=«a Kısım 5.13) işlevlere sahip olduğu için, tam döngü veya bu döngünün ana parçalan üniversal olarak hemen hemen tüm mikroorganizmalarda mevcuttur. Dolayısıyla, bu döngüdeki asitlerin elektron vericisi ve karbon kaynağı olarak birçok mikroorganizma tarafından kullanılması sürpriz değildir. Dört, beş, altı karbonlu asitlerin aerobik kullanımı sitrik asit döngü-
CoA
V** C 0 2
Asetil CoA (2 C) -"
Organik Asit Metabolizması Birçok organik asit, karbon kaynağı ve elektron vericisi olarak mikroorganizmalar tarafından kullanı-
CO 2
\
Asetat"
Malat 2 "
/(4C)
•' Asetil CoA (2 C)
Oksalasetat2" (4 C)'
f Malat sintaz
Glioksilar (2 C)
Sitrat3" (6 C)
Süksinat2- (4 C) Özet: 2 Pirüvar Biyosentez
Süksinat2- + 2 CO 2 (C4)
(C, x 2)
* Şekil 17.66 Asetattan oksalaasetat sentezine neden olan glioksilat döngüsü. Eşi benzeri olmayan enzimlerden izositrat liyaz ve malat sentaz sitrik döngüsünün önemli reaksiyonlarını gerçekleştirir. Piruvatta gelişmeye ek olarak, glioksilat döngüsü aynca asetat üzerinde gelişmeyi de sağlayabilir.
17 27 • Mikrobiyal Besin Olarak Lipitler • 585
çekildikten sonra, sitrik asit döngüsünün sürdürülebilmesi için malat, okzalasetata dönüştürülür. Süksinat molekülü direk olarak porfirin (sitokrom, klorofil ve diğer tetrapiroller için gerekli olan) üretiminde kullanılabilir. Ayrıca C4 aminoasitlerinin iskeletini oluşturmak üzere okzalasetata veya glukoza dönüştürülebilir (Okzalasetat ve fosfoenolpirüvat yolu ile).
Clostridium perfringens
Fosfolipaz etkisi: yumurta sarısının presipitasyonuna neden olan salınmış yağ asitleri
Pirüvat ve C3 Kullanımı
Piruvat gibi üç karbonlu bileşikler veya piruvata dönüştürülebilen bileşikler (örneğin; laktat veya karbohidratlar) sitrik asit döngüsünde tek başlarına enerji kaynağı olarak kullanılamaz. Bazı sitrik asit döngüsü ara ürünlerinin biyosentez için kullanılması nedeniyle, döngüyü çalışabilir durumda tutmak için gerekli olan okzalasetat, CO2'den bir karbon atomu eklenmesiyle piruvattan veya fosfoenolpiruvattan sentezlenir. Bazı organizmalarda görülen bu basamaklar piruvat karboksüaz enzimi tarafından katalizlenir: Piruvat + ATP + CO2
> Okzalasetat + ADP + R
Diğer bazı organizmalarda ise bu reaksiyon, fosfoenol piruvat karboksüaz enzimi tarafından katalizlenir: Fosfoenolpiruvat + CO2
> Okzalasetat + P.
Bu reaksiyonlar, sitrik asit döngüsü ara ürünlerinin biyosentezde kullanılması nedeniyle kaybedilen okzalasetatı yerine koyarak döngünün devam etmesini sağlar. 17.26 Kavramların Gözden Geçirilmesi Organik asitler sıklıkla sitrik asit döngüsü veya glioksilat döngüsü ile metabolize edilir. İzositrat liyaz ve malat sentaz, glioksilat döngüsünün ana enzimleridir. • Asetat üzerinde gelişmede glioksilat döngüsü gerekli iken, niçin süksinat üzerinde gelişmede bu döngü gerekli değildir?
Inhibitör eklenmiş: fosfolipaz etkisi yok, bu yüzden yumurta sarısı presipitasyonu da yok.
• Şekil 17.67 Fosfolipaz aktivitesi. Yumurta şansı içeren bir agarlı besiyerinde gelişen Clostridium perfringens'in bir inokulasyon hattı etrafında görülen fosfolipaz etkisi. Pilağın yansına enzimin aktivitesini engellemek için bir fosfolipaz inhibitörü eklenmiştir.
zimler lipazlar adı verilen hücre dışı enzimlerdir (Şekil 17.67»). Sonuçta serbest gliserol ve serbest yağ asidi oluşmaktadır (Şekil 17.67 ve 17.68»). Lipazlar, çeşitli uzunlukta yağ asidi zinciri içeren yağlara etki eder. Fosfolipitler; yine ester bağlarını kıran ve fosfolipazlar olarak adlandırılan farklı bir enzim grubu tarafından hidrolizlenir (Şekil 17.68). Fosfolipaz A ve B yağ asidi esterlerini ayırırken, C ve D tipi fosfolipazlar fosfat ester bağlarını kırmaktadır ve bundan dolayı çeşitli tipte fosfolipazlar mevcuttur. Lipaz aktivitesi sonucunda, serbest yağ asidi ve gliserol oluşmaktadır. Bütün bu maddeler daha sonra, çeşitli kemoorganotrofik organizmaların etkisine maruz kalabilir. Yağ Asidi Oksidasyonu
Mikrobiyal Besin Olarak Lipitler Lipitler doğada bol bulunur. Bütün hücrelerin sitoplazmik zarları lipit içerir ve birçok mikroorganizma depo maddesi olarak lipit üretir. Bu maddeler, biyolojik olarak parçalanabilir ve mikrobiyal enerji kazanım metabolizması için oldukça uygun substratlardır. Hücre öldüğünde, lipitleri katabolize edilir ve CO2 ile birlikte son ürün oluşturulur. Yağ ve Fosfolipit Hidrolizi
Yağlar, gliserol ve yağ asidi esterleridir (Kısım 3.4) ve ölen organizmaların serbest hale geçen lipitleri hızla kullanılabilir duruma gelir. Mikroorganizmalar yağları, sadece ester bağı hidrolizinden sonra kullanabilmekte ve bu reaksiyondan sorumlu en-
Yağ asitleri, yapılarından iki karbon atomu uzaklaştıran ve beta-oksidasyon adı verilen süreç ile okside edilir (Şekil 17.69»). Okaryotlarda bu süreç ile ilgili enzimler mitokondride bulunurken, prokaryotlarda bu enzimler sitoplazmada bulunur. Yağ asidi öncelikle, Koenzim A ile aktive edilir; oksidasyon sonucunda asetil-CoA serbest kalır ve ana substratın karbon sayısından iki eksik karbonlu bir yağ asidi oluşur (Şekil 17.69). Beta-oksidasyon süreci daha sonra tekrarlanmakta ve diğer bir asetilCoA molekülü serbest bırakılır. Beta-oksidasyonda iki farklı dehidrojenasyon basamağı ortaya çıkar. İlk olarak, elektronlar flavin adenin dinükleotit'e (FAD) aktarılırken; ikinci olarak, bu elektronlar NAD+'a transfer edilir. Birçok yağ asidi birkaç karbon atomuna sahiptir ve net
I
586 • Bölüm 17 • Metabolik Çeşitlilik Gliserol
H3C - (CH 2 ) n - CH 2 - C H 2 - COOH
H 2 C-O-Yağasiti
(n + 4) karbonlu
H C - O - Yağasiti I H 2 C-O-Yağasiti
ATP-
yağ asiti CoA aktivasyonu
AMP + PP>
Lipaz
P « 11 H3C - (CH 2 ) n - CH 2 - C H 2 - C - CoA
(a)
•FAD
Fosfolipaz B H 2 C - O - Yağ asiti
I
I
H C - O - Yağ asiti
1°
Fosfolipaz A
O
Fosfolipaz C
H 3 C - ( C H 2 ) n - CH = C H - C - CoA
H 2 C-O-PT:O-(X)
OH
Çift bağ oluşumu
FADH
r^
' Fosfolipaz D
• Şekil 17.68 Lipazlar. (a) Bir yağ üzerinde lipazın aktivitesi. (b) Fosfolipit üzerinde lipazın aktivitesi. Dört ayn olan fosfolipaz A,B,C ve D'nin kesim bölgeleri gösterilmiştir. X, farklı fosfolipitlerde birkaç küçük organik molekülün bu pozisyonda olabileceğini ifade etmektedir. Şekil 3.7'deki bir fosfolipitin daha fazla tamamlanmış şekli ile bu diyagramı kıyaslayınız.
H
2°
Hidroksil ilavesi
OH O a R I II H3C - (CH 2 ) n - P CH - C H 2 - C - CoA , — NAD
Ketoya oksidasyon
NADH
O O Pil « |i H3C - ( C H 2 ) n - C - CH 2 - C - CoA
oksidasyondan asetil-CoA kazancı olur. AsetilCoA oluştuktan sonra, ya sitrik asit döngüsü yoluyla okside edilir veya glioksilat döngüsü yoluyla heksozlara veya diğer bileşenlere dönüştürülür. Yağ asitleri oldukça uygun elektron vericilerdir. Örneğin; 16 karbonlu bir yağ asidi olan palmitik asidin oksidasyonu sonucunda, net 129 ATP molekülü sentezlenir. Beta-oksidasyondan ve sitrik asit döngüsündeki asetil-CoA birimlerinin oksidasyonundan asetil-CoA'nın oluşumu sırasında ortaya çıkan elektron taşınım fosforilasyonu buna dahildir (&*> Kısım 5.13).
•m17.27
Kavramların Gözden Geçirilmesi
Yağlar, lipaz veya fosfolipazlarla metabolize edilerek serbest yağ asitlerine hidrolizlenir. Yağ asitleri beta-oksidasyon ile asetil-CoA parçalarına okside edilir, ardından sitrik asit döngüsü ile CO2 'ye okside edilirler. • •
Fosfolipazlarm görevleri nelerdir? Beta-oksidasyon teriminin anlamı nedir?
KVI
AZOT FIKSASYONU
Hücresel azot kaynağı olarak N 2 kullanımına azot fiksasyonu adı verilir. N 2 fiksasyon yeteneği, organizmayı fikse olmuş azot bağımlılığından kurtarır. Mikrobiyal ekosistemlerin azot isteği oldukça fazladır ve hücrelerin bu süreci gerçekleştirebilmesi bir avantajdır. Bunun dışında; belli tipte azot fiksasyonlarının tarımsal önemi de büyüktür, bu azot fiksasyonları soya fasulyesi gibi ekinlerin kültivasyonunu destekler.
CoA
I
Asetil-CoA'yı oluşturan kesim
H3C-(CH2)n-C-CoA
H3C-C-C0A
Bir sonraki basamağa hazır, (n + 2) karbonlu aktive olmuş yağ asiti
Asetil-CoA
• Şekil 17.69 Beta oksidasyon. Asetil-CoA'nın iki-karbonlu parçalanılın ardışık oluşumu ile sonuçlanan bir yağ asitinin beta oksidasyon mekanizması.
17.28
Nitrojenaz ve Azot Fiksasyonu Süreci
Sadece belirli prokaryotlar- bazı aerob ve anaeroblar- N 2 fikse edebilmektedir. Azot fikse eden organizmaların kısa bir listesi Tablo 17.10'da verilmiştir. Bazı azot fikse eden bakteriler serbest yaşar ve bu süreci gerçekleştirmek için bir konukçuya ihtiyaç duymaz. Buna karşın; diğerleri simbiyotiktir ve azot fiksasyonunu sadece belirli bitkiler ile iş birliği yaparak başarabilirler (Ö°Ö Kısım 19.22). Ancak; azotu fikse eden bitkiler değil, bakterilerdir. Çok öncelerden beri bilindiği gibi, ökaryotik hiçbir organizma azotu fikse edemez. Nitrojenaz Azot fiksasyonunda N 2 amonyağa indirgenir ve amonyaktan da organik bileşiğe dönüştürülür. İndirgenme süreci, dinitrojenaz ve dinitrojenaz redük-
taz adı verilen iki farklı proteinden oluşan nitrojenaz enzim kompleksi tarafından katalizlenir. İki
17 28 • Nitrojenaz ve Azot Fiksasyoau Süreci • 587
Tablo 17.10
Bazı azot fikse eden organizmalar9 Serbest yaşayan aeroblar
Kemoorganotroflar
Fototroflar
Bacteria: Siyanobakteriler Azotobacter Azomonas Agrobacterium Klebsiella Beijerinckia Bacülus polymyxa Mycobacterium flavum Azospirülum lipoferum Citrobacter freundii Acetobacter diazotrophicus Methylomonas Methylococcus Methylosinus Pseudomonas
Kemolitotroflar Alcaligenes Thiobacillus Acidithiobacillus Streptomyces thermoautotrophicus
Serbest yaşayan anaeroblar Kcmoorganotroflar
Fototroflar
Bacteria: Bacteria: Clostridium Chromatiutn Desulfovibrio Ectothiorhodospira Desulfobacter Thiocapsa Desulfotomaculum Chlorobium Chlorobaculum Rhodospirillum Rhodopseudomonas Rhodomkrobium Rhodopila Rhodobacter Heliobacterium Heliobacillus Heliophilum
Kcrtıolitotroflar Archaea: Methanosarcina Methanococcus Methanobacterium Methanospirillum Methanolobus
Simbiyotik Baklagil bitkileri
Baklagil olmayan bitkiler
Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium veya Azorhizobium cinsi bakterilerle ilişkili olan soya fasulyesi, bezelye, yonca, aksalkım vb
Frankia cinsi aktinomisetle ilişkili olan Alnus, Myrica, Ceanothus, Cotnptonia, Casuarina
" N2 fiksasyonu, listedeki birkaç cinsin sadece birkaç türünde olur. * N2 fiksasyonu, sadece anoksik koşullar altında gerçekleşir.
bileşen de demir içerir ve dinitrojenaz ayrıca molibden içerir. Dinitrojenazdaki demir ve molibden, FeMo-co olarak bilinen bir kofaktör içinde yer alır (Şekil 17.70») ve temel N 2 indirgenmesi, bu demirmolibden merkezinde meydana gelir. FeMo-co'nun bileşimi MoFe7S8 homositrattır (Şekil 17.70) ve her nitrojenaz molekülü içinde FeMo-co'nun iki kopyası bulunur.
• Şekil 17.70 Nitrojenazdaki demir-molibden kofaktörünün, FeMo-co, yapısı. Molibdene bağlanan üst bölümdeki Fc7Sa kübü, homositrata oksijen atomlanyla (alt, yeşille gösterilmiş tüm oksijen atomları) ve dinitrojenaza N ve S atomları ile bağlanmıştır. Herbir dinitrojenazda 2 adet FeMo-co molekülü bulunur. Nitrojenaz- dinitrojenaz ve dinitrojenaz redüktaz arasındaki ilişkiler Şekil 17.71'de gösterilmiştir.
N2, üçlü bağının kararlılığı nedeniyle son derece hareketsizdir ve bunun aktivasyonu enerjiye bağlı bir süreç ile gerçekleştirilir. N 2 'nin NH 3 'e indirgenmesi için altı elektron transfer edilmelidir. Nitrojenaz üzerinde arka arkaya üç indirgenme basamağı gerçekleşir ve hiçbir serbest ara ürün birikimi olmaz (Şekil 17.71»). Dinitrojenaz redüktaz, O2 tarafından hızla ve dönüşümsüz olarak inaktive edildiği için, azot fiksasyonu oksijen tarafından engellenir. Bu şekilde olmasına karşın, bu enzim aerobik azot fikse edicilerden de izole edilebilir. Aerobik azot fikse eden bakterilerin hücrelerinde O2 varlığında N 2 fiksasyonu gerçekleştirilebilir, ancak bu süreç saf enzimlerle gerçekleştirilememiştir. Bu organizmalarda nitrojenaz enzimi O2 ile inaktive olmaktan solunum hızı arttırılarak O2'nin hızla tüketilmesi, hücreye O2 geçişini yavaşlatan cıvık tabaka (Şekil 17.72») üretimi veya siyanobakterilerdeki gibi nitrojenazm özel bir tip hücrede (heterokist) bölümlenmesi (asça Kısım 12.25) gibi birkaç farklı mekanizma ile korunabilmektedir. Ek olarak; N 2 fiksasyonu oksijenin açığa çıktığı hücre ekstraktlarmda gerçekleştirilemez, Azotobacter gibi aerobik azot fikse ediciler nitrojenazlarını oksijenle inaktive olmaktan spesifik bir proteinle kompleks oluşturarak da koruyabilir; buna konformasyonel koruma adı verilir.
588 • Bölüm 17 • Metabolik Çeşitlilik
Piruvat + CoA
Asetil-CoA + CO ?
Piruvat flavodoksin oksidoredüktaz Flavodoksin (Yükseltgenmiş)1
Nitrojenaz enzim kompleksi
Flavodoksin (indirgenmiş)
Di nitrojenaz redüktaz
Dinitrojenaz redüktaz
(indirgenmiş)
(Yüksltgenmiş) ADP + P,
Dinitrojenaz
Dinitrojenaz
(Yükseltgenmiş)'
ndirgenmiş)
Ürünler
Nitrojenaz substratları
(a)
N=N-
HN=NH
H2N
NH 3
Tüm reaksiyon 8 H + + 8 e" + N 2 -* 2 NH 3 + H 2 (16-24 ATP
-16-24 ADP + 16-24 Pj)
• Şekil 17.71 Nitrojenazın görevi, (a) Piruvattan başlayan N2 fiksasyonu basamakları görülmektedir. Dinitrojenaz tarafından ihtiyaç duyulan elektronlar dinitrojenaz redüktazdan sağlanmakta olup her bir elektron 2-3 ATP'nin hidrolizim gerektirir, (b) H2'nin açığa çıkışını gösteren N2'un indirgendiği kuramsal basamaklar ve nitrojenaz aktivitesinin bir özeti.
Azot Fiksasyonunda Elektron Akışı Nitrojenazdaki elektron transfer sırası şu şekildedir: Elektron vericisi —> dinitrojenaz redüktaz —•dinitrojenaz —> N 2 (Şekil 17.71). Azot indirgenmesinde elektronlar, düşük potansiyelli demir-kükürtlü ptoteinler (ÖOD Kısım 5.11) olan ferrodoksinden veya flavodoksinden dinitrojenaz redüktaza transfer edilir. Clostridium pasterianum'da, ferrodoksin elektron vericisidir ve pirüvatm asetil-CoA+CO2'ye parçalanması ile indirgenir. Ek olarak; N, fiksasyonu için ferrodoksin veya flavodoksin indirgenmesi ATP gerektirir. Her elektron transfer döngüsünde dinitrojenaz redüktaz, ferrodoksin/flavodoksin tarafından indirgenir ve iki ATP molekülü bağlanır. ATP'nin bağlanması, dinitrojenaz redüktazm yapısını değiştirir ve dinitrojenaz ile dinitrojenaz redüktazın etkileşimine izin verecek şekilde, dinitrojenaz redüktazın indirgenme potansiyelini düşürür. Dinitrojenaz üzerine elektron transferine bağlı olarak ATP hidrolizlenir ve dinitrojenaz redüktaz dinitrojenazdan ayrılır. Bundan sonra, tekrar indirgenme ve ATP bağlanma döngüsüne geri dönülür (Şekil 17.71). Dinitrojenaz yeterince indirgendiğin-
• Şekil 17.72 Azot fikse eden Rzotobacter vinelandiihücrelerinde cıvık madde oluşumunun 0 2 ile uyarılması, (a) %2,5 O2'lik mikro-oksik koşullarda gelişen hücrelerin transmission elektron mikrografı; çok az cıvık materyal oluşumu delildir, (b) Hava varlığında (%21 O2) geliştirilen hücreler. Cıvık tabakanın (ok) oldukça koyu boyamşına dikkat ediniz. Cıvık madde, O2'nin hücreye difuzyonunu engeller ve bu şekilde de oksijenle nitrojenaz inaktivasyonu engellenir.
de azotu amonyağa indirger ve bu işlem FeMo-co merkezinde gerçekleşir (Şekil 17.70). N2'nin NH 3 'e indirgenmesi için sadece altı elektron gerekli olmasına karşın; bu süreçte sekiz elektron tüketilir, bunun nedeni her bir mol N2'nin indirgenmesi için iki elektronun H2 şeklinde kaybedilmesidir. Bu sonuca göre H 2 bir atık olarak düşünülse de, H2 oluşumu nitrojenazın reaksiyon mekanizmasının özel bir parçasıdır. Alternatif Nitrojenazlar Bazı azot fikse eden bakteriler, belirli gelişme koşullarında molibden içermeyen nitrojenazlar üretir. Bu şekildeki molibden yerine vanadium ve demir veya sadece demir içeren nitrojenaz- lara, alternatif nitrojenazlar adı verilir. Bu alternatif nitrojenazlarda FeMoco benzeri kofaktörler bulunur. FeVa-co, vanadium nitrojenazda yer alır. Demir nitrojenaz, FeMo-co ve FeVa-co'ya benzer şekilde demir-kükürt kümeleri içermesine karşın, ne Mo ne de Va içerir. Alternatif nitrojenazlar, yeterli derecede molibden mevcut ise sentezlenmez; molibden nitrojenazlar hücrenin temel nitrojenazlarıdır. Alternatif nitrojenazlar, molibdenin sınırlı olduğu habitatlarda, N2 fiksasyonunu gerçekleştiren yardımcılar olarak işlev göstermektedir (Kısım 12.9). Azot fikse eden Archaea Mo ve Va içeren sistemlerden yoksun olmalarına karşın, sadece demir içeren nitrojenazlara sahiptirler. Strcptomyccs thcrmoautotrophicus'un Özel Nitrojenazı Yapısal ve işlevsel olarak alışılmamış molibden nitrojenazlar termofilik bir streptomiset olan Streptomyces thermoautotrophicus''ta mevcuttur. Bu organizma
17 28 • Nitrojenaz ve Azot Fiksasyonu Süreci • 589
jenaz ile indirgenebilmesi için, sadece iki elektron termofilik (optimum sıcaklık, 65 °C), filamentli bir Actinobacteria üyesidir (<s*^3 Kısım 12.24). S. thermo- kullanılmakta ve etilen oluşturulur. Asetilenin etiautotrophicus, karbonmonoksiti (CO) elektron veri- lene (H 2 C=CH 2 ) indirgenmesi, gaz kromatografisi cisi olarak kullanan bir hidrojen bakterisidir. S. ther- ile azot fiksasyon sisteminin aktivitesini ölçmek moautotrophicus azot fikse eder ve nitrojenazı O2'ye için basit ve hızlı bir yoldur (Şekil 17.74»). Bu tektamamen duyarsızdır. S. thermoautotrophicus'un nit- nik, asetilen indirgenmesi tekniği olarak bilinir ve rojenazınm, Strl adı verilen dinitrojenaz bileşeninbilinmeyen bir sistemle, azot fiksasyonunu belirledeki üç farklı polipeptit, diğer azot fikse edicilerin mede yaygın olarak kullanılır. dinitrojenazmdaki polipeptitlerle bazı yapısal benN 2 fiksasyonunun kesin kanıtları, işaretleyizerlikler gösterir. Buna karşın Strl adı verilen dici olarak azot izitopu olan (15N) kullanılarak elde nitrojenaz redüktaz bileşeni, diğer dinitrojenaz reedilmiştir. (15N) radioizotop değildir ancak kararlı düktazlarla benzer değildir. Bununla birlikte; Str2, bir izotoptur. (15N) kütle spektoskopisi ile belirlesüperoksü dismutaz (cf*s Kısım 6.16) adı verilen ve nir]. Kültürün gaz fazı (15N ) ile zenginleştirilir, in2 mangan içeren enzim ile yüksek derecede homoloji kübasyondan sonra hücreler ve ortam sindirilebilir gösterir ve bu benzerlik farklı olan bu nitrojenazda ve amonyak üretilir. NH 3 damıtıldıktan sonra (I5N) bir işleve sahiptir (Şekil 17.73»). içeriği analiz edilir. Eğer (15N) bağlı NH 3 üretimi S. thermoautotrophicus''un nitrojenaz sistemin- söz konusu ise bu azot fiksasyonunun delili olarak deki elektron akışı, klasik nitrojenaz sistemlerindekabul edilir. kinin bir kopyasıdır. S. thermoautotrophicus'un nitrojenazmda, Str2 elektronları Strl'e taşınır. O2'nin Atmosfer, havada %10 C H (aeroblar) ya da karbonmonoksit dehidrojenazla indirgenmesinN ya da Ar %10 C H (anaeroblar) den oluşan süperoksit (O2~) elektronların kaynağıdır (Şekil 17.73). Klasik azot fiksasyonundaki; Pirüvat —» flavodoksin —> dinitrojenaz redüktaz —* dinitrojenaz reaksiyon dizisine benzer olarak, S. Hücre süspansiyonu thermoautotrophicus'un dizisi CO —> O2 —•> Str2 —> içeren tıpalı şişe Strl şeklindedir. Dikkate değer şekilde, oksijen ile inhibe olan nitrojenaza karşılık, S. thermoautotrophicus nitrojenazında reaksiyon mekanizması gereği oksijene bizzat ihtiyaç duyulur. S. thermoautotrophicus nitrojenazının klasik nitrojenazın harcadığı ATP'nin yarısını harcaması ve asetilen gibi üç bağlı diğer bileşikleri indirgeyeme= CI-Hp-H C = C mesi alışılmamış diğer özellikleridir (Şekil 17.74). Asetilen Etilen Bu özellikler; özellikle de oksijene duyarsızlık, bitNitrojenaz ki biyoteknologlarını mısır gibi azot fikse edici simbiyontlara sahip olmayan bitkilere azot fiksasyon Periyodik olarak örnek alımı ve gaz yeteneğini kazandırma yolunda çeşitli çalışmalara kromatografisine enjekte etme yönlendirmiştir. 2
2
2
2
2
2
Nitrojenaz Analizi: Asetilen İndirgenmesi Nitrojenaz, N 2 için tamamen spesifik değildir, aynı zamanda siyanid ve asetilen gibi bazı üçlü bağ içeren bileşikleri de indirgeyebilir. Asetilenin nitro-
Gaz kromatograf için kaydedici
2 2
1
Zaman 0
2NH, CO dehidrojenaz
Nitrojenaz
• Şekil 17.73 Streptomyces thermoautotrophicus'ta azot fiksasyonu reaksiyonları. Dinitrojenaz redüktaz ve dinitrojenazdan oldukça farklı olmalarına karşın, Str2 ve Strl işlev yönünden sırasıyla bu proteinlere eşdeğerdir.
2h
• Şekil 17.74 Nitrojenaz aktivitesi için asetilen indirgeme testi. Sonuçlar, deney başlangıcında (zaman 0) hiç C2H4 olmadığım, buna karşılık test ilerlediğinde C2H4 üretiminin arttığını göstermektedir. C2H4 üretildiğinde, C2H2'nin nasıl tüketildiğine dikkat ediniz. Eğer şişede bir enzim ekstraktı bulunsaydı, nitrojenaz aerobik bir bakteriden elde edilmiş olsa bile koşullar anoksik olurdu.
590 • Bolüm 17 • Metabolik Çeşitlilik
(15N2) asimilasyonu N 2 fiksasyonu için 'altın standart' bir yöntemdir. Asetilen indirgenmesi ise bu süreç için indirek bir yöntemdir, ancak daha hızlı ve daha duyarlıdır. Örneğin; toprak, su, kültür veya hücre ekstraktı asetilenle inkübe edildiğinde, reaksiyonların gaz fazları etşlen üretimi için gaz kromatografisi ile analiz edilir (Şekil 17.73). Bu metot, diğer metotlardan daha basit ve hızlıdır ve azot fikse edici bakterilerin habitatlarmda yapılan ekolojik çalışmalar için de oldukça kullanışlıdır.
Azot Fiksasyonunun Genetiği
17.29 ve Regülasyonu
Azot fiksasyon sürecinin yüksek derecede enerjiye bağımlı olması nedeniyle, nitrojenaz sentezi ve aktivitesi yüksek derecede kontrol altındadır. Bu kontrol N 2 fiksasyonundaki (Şekil 17.71) enzimlerle sağlanmakta ve bu enzimleri kodlayan birçok gene gereksinim vardır. Burada bu genleri tartışacağız. Azot Fiksasyonunun Genetiği En iyi çalışılmış azot fikse edici Klebsiella pneumoniae'de dinitrojenaz ve dinitrojenaz redüktaz genleri nif regülonu denen kompleks bir regülonun (operonların oluşturduğu büyük bir şebeke, oosKısım 8.6) bir bölümüdür. K. pneumoniae nif regülonu 24 kbp'lik bir DNA dizisinden oluşur ve birkaç transkripsiyonel birimde yer alan 20 gen içerir (Şekil 17.75»). Nif regülonunda; nitrojenazın yapısal genlerine ek olarak FeMo-co genleri, elektron taşınım proteinlerini kontrol eden genler ve çok sayıda düzenleyici gen bulunur. Dinitrojenaz a (nif D'nin ürünü) ve Ş> (nif K'mn ürünü) olmak üzere iki altbirimden oluşmuş kompleks bir proteindir. Nitrojenaz enzim kompleksinde bu altbirimlerin ikişer kopyası bulunur. Dinitroje-
naz redüktaz, nif H'nin ürünü olan iki benzer altbirimden oluşmuş dimer yapıda bir proteindir. FeMoco, birkaç genin katılımıyla sentezlenir. Bunlar nifN, V, Z, W, E, B ve Q'dur. Bunlar, molibdenin yapıya katılmasında iş gören bir ürünü kodlar. Nif A geni, diğer nif genlerinin transkripsiyonunu aktive eden pozitif düzenleyici bir proteini kodlar (Şekil 17.75). Nitrojenaz, yüksek derecede korunmuş bir proteindir ve nif HDK genleri bu korunmuş proteinin alt birimlerini kodlar. Bu alt birimler, azot fiksasyon kapasitesini ifade eden homolog genler yönünden değişik prokaryotlarm DNA'larım taramada moleküler problar olarak kullanılırlar. Bütün azot fikse edicilerde (alışılmamış Strepyomyces thermoautotrophicus'u ayrı tutarsak, Kısım 19.28'e bakınız), nif HDK benzeri, nitrojenaz için gerekli genetik ihtiyacı karşılayan spesifik genler mevcuttur. Alternatif nitrojenazlar (£»oKısım 17.28) kendi genleri tarafından kodlanır. Vanadium sistemindeki vnfHDK ve sadece demir içeren sistemdeki anfHDK, nifHDK ile önemli bir dizi homolojisi gösterir. Azot Fiksasyonunun Regülasyonu
Nitrojenaz, güçlü bir düzenleyici kontrole sahiptir. Azot fiksasyonu O2 ve NH 3 , NO3~ ve belirli aminoasitler gibi fikse edilmiş azot bileşikleri tarafından baskılanır. Şekil 17.75'te de gösterildiği üzere regülasyon, esas olarak transkripsiyon aşamasında gerçekleşir. Nif yapısal genlerinin transkripsiyonu Nif A proteini (pozitif regülasyon) tarafından aktive edilirken, nif genlerinin ifadesi, negatif bir regülatör olan NifL ile sağlanır ve bu NifL, O2'ye duyarlılığı sağlayan bir FAD molekülü (flavoproteinler için redoks koenzimi, CÖÖ Kısım 5.11) bulundurur. Yeterli O2 varlığında NifL, O2,ye duyarlı olan nitrojenazın sentezini engellemek üzere nif genlerinin transkripsiyonunu durdurur. Dinitrojenaz redüktaz
FeMo-co sentezi
FeMo-co sentezi
Dinitrojenaz redüktaz Düzenleyiciler süreci Pozitif
Homositrat sentezi
F
I J. M Z W V S U X
n
FeMo-co sentezi
j Metal merkez biyosentezi
Negatif ^Flavodoksin
4
Dinitrojenaz
N
' Dinitrojenaza FeMo-co eklenmesi t E
Y T K D H
Elektron taşımımı Piruvat flavodoksin oksidoredüktaz
DNA
Transkripsiyonel birimler
* Şekil 17.75 Üzerinde an fazla çalışılan ve azot fikse edici bakteri olan Klebsiella pneumoaiae'de niiregülasyonu. Bazı genlerin görevleri bilinmemektedir. Genlerin altında mRNA transkriptleri (Transkripsiyonel birimler) gösterilmiştir; oklar transkripsiyonun yönünü göstermektedir. FeMo-co sentezi ile ilgili proteinler san renkle gösterilmiştir. Diğer renkler Şekil 17.71'dekilerle benzerdir. Azot kaynağı olarak amonyak üzerinde gelişebilme yeteneğinde olmasına rağmen Klebsıella'daki azot fiksasyonu anoksik koşullar altında gerçekleşir.
17 29 • Azot Fiksasyonunun Genetiği ve Regülasyonu • 591
Amonyak, azot fiksasyonunu, hücrenin azot durumuna göre aktivitesi düzenlenen ve NtrC adı verilen bir protein yoluyla baskılar. Amonyak sınırlandığında NtrC aktiftir ve nifA'nm transkripsiyonu gerçekleşir. Bu da, nif A'yı yani azot fiksasyon aktivatörü olan proteini üretir ve nif transkripsiyonu başlar. Nitrojenaz tarafından üretilen amonyak, enzim sentezini baskılamaz; çünkü üretildikten çok kısa bir süre sonra organik yapıya katılır ve biyosentezde kullanılır. Ancak, amonyak fazla ise (doğal çevrede veya kültür ortamında) nitrojenaz enzimi hızlı bir şekilde baskılanır. Bu şekilde; ortamda zaten bol miktarda mevcut olan bir ürünün üretilmesi için ATP'nin harcanması engellenir. Bazı azot fikse edici bakterilerde, nitrojenaz aktivitesi amonyak tarafından düzenlenir; buna amonyak kapatma etkisi adı verilir. Amonyak miktarının fazla olması, dinitrojenaz redüktazın kovalent modifikasyonuna (<3^> Kısım 8.3) neden olur, bu da enzim aktivitesinin kaybolmasına yol açar. Amonyak seviyesi sınıra düştüğünde modifiye protein, aktif formuna geri döner ve azot fiksasyonu yeniden başlar. Amonyak kapatma etkisi, nitrojenaz tarafından ATP tüketimi kontrolünün hızlı ve geriye dönüşümlü bir yoludur. Bütün azot fikse edici
bakterilerde kapatma sistemi bulunmaz; ancak kapatma sistemini, bu sistemin ilk keşfedildiği organizma grubu olan fototrofik bakteriler gibi belirli gruplarda yaygın olarak görmek mümkündür.
m
17.28-17.29 Kavramların Çözden Geçirilmesi
Azot fiksasyonu -N2'nin NH 3 'e indirgenmesi-, dinitrojenaz ve dinitrojenaz redüktaz enzimlerini içeren ve nitrojenaz adı verilen enzim kompleksini gerektirir. Birçok nitrojenaz, metal kofaktör olarak molibden veya vanadium+demir içerir. Azot fiksasyonu süreci, yüksek derecede enerjiye bağımlı bir süreçtir. Nitrojenaz ve buna bağlı birçok düzenleyici protein, nif regülonu tarafından kodlanır. Asetilen ve siyanid gibi bazı maddeler, yapısal olarak N 2 ile benzerdir ve nitrojenaz tarafından indirgenir. Nitrojenaz ve azot fiksasyonu, O 2 ve NH 3 gibi iki etkili düzenleyici tarafından son derece sıkı bir şekilde düzenlenir. •
Nitrojenaz enziminin gerçekleştirdiği denklemini yazınız.
reaksiyonun
• FeMo-co nedir ve hangi metalleri içerir? • Azot fiksasyonu çalışmalarında C 2 H 2 nasıl yarar sağlar? • Nitrojenazm işlevini etkileyen fiziksel ve kimyasal faktörler nelerdir? Streptomyces thermoautotrophicus'un nitrojenaz sisteminin farkı nedir?
DEĞERLENDİRME SORULARI 1. Oksijenik ve anoksijenik fototroflar arasındaki temel farklılıklar nelerdir («*fc Kısım 17.1-17.5) ? 2. Işık toplama ve reaksiyon merkezi klorofillerinin görevleri nedir? Işığı toplayan klorofilleri yapamayan bir mutant (bu şekildeki mutantlar laboratuvarda kolayca izole edilebilirler) niçin doğada başarılı bir rekabetçi olamazlar (<«s Kısım 17.2)? 3. Fotosentetik pigmentler bir mor bakteride nerede bulunur? Ya bir siyanobakteride? Bir yeşil algde? Klorofil pigmentlerinin görevini düşündüğümüzde, niçin hücrede sitoplazma veya hücre duvarı gibi başka yerde bulunmazlar (ö°ö Kısım 17.3)? 4. Fotoroflarda bulunan yardımcı pigmentler nelerdir, görevleri nedir (C**> Kısım 17.3)? 5. Bir anoksijenik fototrofta ışık, ATP üretimini nasıl gerçekleştirir? Fotosentez ve solunumdaki elektron akışının benzer yönü nedir? Hangi yönden farklıdır (££*s> Kısım 17.4)? 6. Bir mor bakteride ototrofik gelişme için indirgeyici güç nasıl yapılır? Ya bir siyanobakteride (c°5 Kısım 17.4)? 7. Fotosistem I ve fotosistem H'de klorofil a'nm indirgenme potansiyeli birbirinden nasıl farklıdır? Fotosistem II klorofilinin indirgenme potansiyeli niçin o derece yüksek elektropozitif olmalıdır (O°ö Kısım 17.5)? 8. Calvin döngüsünü gerçekleştiren organizmalara özgü olan iki enzim nedir? Bu enzimler hangi reaksiyonları gerçekleştirir? Bu enzimlerin her ikisini de bulundurmayan bir mutant olsaydı ne olurdu (cscss Kısım 17.6)?
9. Hangi organizmalar ototrofik yolizleri olarak hidroksipropiyonat ve ters sitrik asit döngülerini gerçekleştirir (««s Kısım 17.7)? 10. Mor bir fototrofik bakteri ile Beggiatoa gibi renksiz bir kükürt bakterisinin H2S kullanımını karşılatırmız. Herbir organizmanın metabolizmasında H2S hangi işleve sahiptir ( ö 6 ^ Kısım 17.8)? 11. Hangi inorganik elektron vericiler Ralstonia ve Thiobacillus organizmaları tarafından kullanılır («3C^s Kısım 17.9 ve 17.10)? 12. Acidithiobacillus ferrooxidans'm metabolizmasının enerjetiğini etkileyen alışılmamış çevresel etken nedir (ö°ö Kısım 17.11)? 13. Oksijen gereksinimi, yürüten organizma ve gereksinim duydukları monooksijenazlar yönünden anammoks ile klasik nitrifikasyonun farklılıklarını belirtiniz («**» Kısım 17.12)? 14. Escherichia coli'de nitrat redüktaz enziminin sentezi oksijenle baskılanır. Biyoenerjetik bakımından, niçin bu represyon olayının ortaya çıkabileceğini düşünüyorsunuz (<SOö Kısım 17.13 ve 17.14)? 15. Desulfovibrio''da hidrojenaz niçin temel bir enzimdir (£»& Kısım 17.15)? 16. Homoasetojenler ile metanojenleri, (1) substratlar ve enerji metabolizması ürünleri, (2) enerji metabolizmasında elektron vericiler olarak organik bileşikleri kullanabilme, (3) otorofinin mekanizması ve (4) aerobik solunum yoluyla gelişebilme yönlerinden karşılaştırınız (ö°D Kısım 17.16 ve 17.17; bu soruyu yanıtlamadan
592 • Bölüm 17 • Metabolik Çeşitlilik
17.
18.
19.
20. 21. 22.
önce Kısım 13.4'de materyali gözden geçirmek için de istiyebilirsiniz). indirgeyici deklorinasyon ile ferrik demir indirgenmesini, (1) indirgenme ürünü ve (2) çevresel önemi açısından karşılaştıranız (ooo Kısım 17.18)? Substrat sevil/esinde fosforilasyon terimini tanımlayınız. Oksidatif fosforilasyondan farkı nedir? Fakültatif bir organizma düşünün, hangi besinsel koşullar organizmanın oksidatif fosforilasyondan ziyade substrat seviyesinde fosforilasyondan enerji elde edip edemeyeceğini belirler (£**> Kısım 17.19)? Birçok değişik bileşik teorik olarak fermente edilebilmesine karşın, fermentatif süreci desteklemek için, birçok organik bileşik sonunda nispeten az bir molekül grubundan birine dönüştürülmek zorundadır. Bu moleküller hangileridir ve niçin üretilmelidir (öQa Kısım 17.19 ve 17.20)? Substrat seviyesinde fosforilasyon yokluğunda fermentasyonlar nasıl gerçekleşir (ooo Kısım 17.20)? Niçin sintrofi bazen "türlerarası H 2 transferi" olarak adlandırılır ( « s Kısım 17.21)? Katalizledikleri reaksiyonlar yönünden Monooksijenazlarm dioksijenazlardan farkı nedir (C^ Kısım 17.22 ve 17.23)?
23. Bir metanotrofun metanojenden farkı nedir? Karbon asimilasyonu özellikleri bakımından tip I ve tip II metanojenler arasında ne gibi farklılıklar vardır (G°O Kısım 17.24)? 24. Selüloz ve hücre içi nişastayı glukoz birimlerine dönüşümü yönünden kıyaslayınız. Hangi enzimler bunu gerçekleştirir ve hangi süreç daha fazla enerji etkinliğine sahiptir («3Ss Kısım 17.25)? 25. Glioksalat döngüsünün temel işlevi nedir (tf*a Kısım 17.26)? 26. Niçin oksijenazlar hekzadekamn (Cl6) aerobik katabolizması için gerekli iken aynı denkİikte C ] 6 yağ asidi olan palmitat için gerekli değildir (<2°O Kısım 17.22 ve 17.27)? 27. Nitrojenaz enzimi ile katalizlenen reaksiyonu çiziniz. Bu reaksiyon için kaç adet elektron gereklidir? Kaç adedi gerçekten kullanılır? Açıklayınız (<S^ Kısım 17.28)? 28. Streptomyces thermoautotrophicus nitrojenazımn Azotobacter nitrojenazından'farkı nedir (û°ö Kısım 17.28)? 29. nif regülonunda hangi genler nitrojenaz proteinlerini kodlar (<»a Kısım 17.29)?
UYGULAMA SORULARI Klorofi a ve bakteriyoklorofil a'nm absorpsiyon spektrumunu karşılaştırınız. Hangi dalga boylarının absorbsiyonu herbir pigment tarafından tercih edilir ve bu moleküllerin absorpsiyonu ile görebildiğimiz spektrum bölgesini karşılaştırınız? Bitkilerin çoğunluğu niçin yeşildir? Fototrofik mor bakteri olan Rhodobacter'in karbon kaynağı olarak malat içeren bir ortamda fototrofik olarak gelişme hızı, karbon kaynağı olarak CO2'in bulunduğu (elektron vericisi olarak H 2 ile) ortamdakine göre yaklaşık iki kat daha fazladır. Bunun gerçek nedenini tartışınız ve iki farklı koşulda geliştirildiğinde Rhodobacter'i yerleştirilebileceğimiz beslenme tarzını listeleyiniz. Fizyolojik açıdan farklı olmalarına rağmen, kemolitotrof ve kemoorganotroflar, ATP üretimleri açısından bazı benzerliklere sahiptirler. Glukozu kullanan bir kemoorganotrofun gelişme veriminin (her bir mol substrata karşılık gram olarak elde edilen hücre miktarı) niçin kükürt kullanan bir kemolitotrofunkinden çok
daha yüksek olduğunu nedenleri ile birlikte tartışınız. Metanın CO,'den (H2'le birlikte) veya metanolden (H 2 yokluğunda) üretilmesi durumunda, Şekil 17.44 ve 17.45'te verilen yolizlerindeki değişik basamaklar kullanılır. Bu iki substrat ile oluşan metanojenez farklılıklarını karşılaştırınız ve niçin ters yönlü metabolize edildiğini tartışınız. Dekstran bir glukoz polimeri olmasına rağmen, glukoz dekstran yapımında kullanılmamaktadır. Dekstran sentezi ağız hijyeninde neden önemlidir. Açıklayınız (£»0, Kısım 21.3)? Pseudomonas fluorescens benzoat üzerinde aerobik olarak gelişebilir. Oysa, fototrofik bir bakteri olan Rhodopseudomonas palustris ise benzoat üzerinde anaerobik olarak gelişebilir. Aşağıdaki etkenler doğrultusunda bu iki türün benzoat metabolizmasını kıyaslayınız: oksijenaz gereksinimi, halka açılmasına yol açan başlangıç reaksiyonları ve merkezi metabolik yolizlerini besleyebilen ürün(ler)in oluşumu.
MIKROBIYAL EKOLOJİDE YÖNTEMLER
MIKROBIYAL T O P L U L U K L A R I N K Ü L T Ü R E BAĞLI ANALİZİ 594 18.1 18.2
Zenginleştirme ve İzolasyon Saf Kültür İzolasyonu
II
MIKROBIYAL TOPLULUKLARIN MOLEKÜLER (KÜLTÜRE BAĞLI OLMAYAN) ANALİZİ 600
18.3
Boyama Teknikleriyle Sayım ve Canlılık Tayini Genetik Boyamalar Özgül Genlerin Özgül Organizmalara PCR Yoluyla Bağlanması Çevresel Genomik (Metagenomik)
18.4 18.5 18.6 III
Floresan boyalar mikrobiyal ekolojide hem nitel hem de nicel amaçlarla kullanılabilir. Bazı durumlarda, özgül bir organizmanın tanısında oldukça özgül boyamalara gereksinim varken bazı durumlarda da, özgül olmayan boyamalar ortamda bulunan hücrelerin sayımında yeterli olmaktadır. Üstteki resimde, hücre içindeki DNA'yı mavi olarak boyayan ve sayım amacıyla daha iyi görülmelerini sağlayan ve DAPI olarak adlandırılan özgül olmayan bir boya ile boyanmış hücreler görülmektedir.
18.7 18.8
DOĞADA MİKROBİYAL AKTİVİTE ÖLÇÜMÜ Radiozotoplar ve Mikroelektrotlar Kararlı İzotoplar
594 598
600 602 604 606
607 608 610
r,93
594 • Bölüm 18 • Mihrobiyal Ekolojide Yöntemler
BOLÜMLE İLGİLİ SOZLUK Çevresel genomik doğal mikrobiyal toplulukları karakterize etmek için genomik yöntemlerin (dizileme ve genomların analizi) kullanılması DAPI doğal bir örnekte toplam hücre sayısını belirlemek için bakterileri boyamada kullanılan özgül olmayan floresan bir boya Denatüre edici gradient jel elektrof orez (DGGE) farklı dizilime sahip aynı büyüklükte nükleik asit fragmentlerini ayırabilen elektroforetik bir teknik En muhtemel sayı (EMS) çoğalmanın gerçekleştiği en yüksek seyreltmeyi saptamak için doğal bir örneğin seri olarak seyreltilmesi in situ floresans hibridizasyonu (FISH) zenginleştirilmiş organizmaları izlemek veya tanımlamak için kovalent olarak floresans boya bağlı özgül bir nükleik asit probu kullanılarak yapılan bir yöntem İzotop fraksinasyonu İzotop ayrışması (isotope fractionation) CO2 ve SO4~2
metabolizması sırasında çeşitli C ve S izotoplarının daha ağır izotopunun enzimler tarafından ayrıştığı ve bu süreçte C veya S'ün daha hafif izotopları ortamda zenginleşir. Lazer cımbız lazer ışınıyla saf kültür elde etmede kullanılan bir alettir. Bu yöntemde tek bir hücre lazer paketi ile optik olarak yakalanır ve çevrede bulunan hücrelerden ayrılarak steril üreme ortamına hareket ettirilir Metagenom herhangi bir çevrede mevcut genlerin tümü Mikrobiyal ekoloji mikroorganizmaların birbirleri ve çevreleriyle etkileşimini çalışma. Mikroelektrot küçük değer aralıklarında bir mikrobiyal habitat içine daldırılabilen, pH'ı ya da H2S veya O 2 gibi bazı bileşikleri ölçmede kullanılan küçük bir cam elektrot Mikrootoradyografi (MAR) fotoğraf emülsiyonuna maruz bırakılmış hücreler tarafından alman radyoaktif substratlarm görsel olarak ölçümü
ikrobiyal ekoloji; mikroorganizmaların birbirleriyle ve çevreleriyle ilişkileri ile il-
M
gilenir, biyoçeşülilik ve mikrobiyal aktivite
mikrobiyal ekolojinin asıl ilgi odağıdır. Mikrobiyal ekologlar biyoçeşitlilik çalışmalarında, değişik habitatlardaki mikroorganizmaların izolasyonunu, tanılanmasmı ve sayımını yapabilmelidir. Mikrobiyal aktivite çalışmalarında kullanılan teknikler mikroorganizmaların habitatlarmdaki işlevlerini ölçebilmelidir. Bu bölümde hem mikrobiyal çeşitliliğin ve hem de aktivitenin değerlendirilmesinde mikrobiyal ekologların kullandıkları aletler incelenecektir. Bu bölümde tanımlanacak yöntemler zenginleştirme ve izolasyon, özgül ve özgül olmayan hücre boyama yöntemleri, gen izolasyonu ve karakterizasyonu ve
mikroorganizmaların in situ (doğal çevrelerindeki) aktivitelerinin ölçülmesi için kullanılan yöntemleri içermektedir. Hem büyük ölçekte mikrobiyal toplulukların ekolojisi (örneğin; toprak veya su) hem de daha fazla özelleşmiş mikrobiyal habitatlar (örneğin; geviş getiren hayvanların rumeni veya baklagil bitkilerinin köklerinin nodülleri) Bölüm 19'da tartışılacaktır. Bu bölümde tanımlanacak aletler ile mikrobiyal ekolologlar, mikrobiyal toplulukların yapısı ve işlevi hakkındaki karmaşık sorular sorabilir.
M\
MİKROBİYAL TOPLULUKLARIN KÜLTÜRE BAĞLI ANALİZİ
Doğal bir çevrede tek tip mikroorganizma nadiren bulunur. Bunun yerine doğada mikroorganizmalar mikrobiyal topluluklar (öCöKısım 19.1 ve Şekil 19.1) halinde bulunurlar. Mikrobiyal ekologlar, mikro-
Nükleik asit probu hedef gende bir dizinin komplementeri ve genellikle 10-20 baz uzunluğunda olan bir oligonükleotit VVinogradsky kolonu çamur ile doldurulmuş ve bir göldeki gibi üzeri su ile kaplanmış aylar sonra bakterilerin geliştiği bir kolon Yeşil floresans protein bir hücreyi yeşil hale getiren floresan bir protein ve bu protein doğada bir organizmanın izlenmesinde kullanılabilir Zenginleştirme kültürü oldukça seçici kültür metotlarını kullanarak doğal bir örnekten mikroorganizmaların laboratuvar kültürlerini elde etmenin bir yolu Zenginleştirme Sapanı (Enrichment bias) çoğunlukla inokulumdaki yaygın veya ekolojik olarak önemli organizmaların çoğalmasını engelleyerek belli türlerin baskın hale geidiği sıvı zenginleştirme kültürleriyle ilgili bir problemdir
biyal hücrelerin izolasyonu ve karakterizasyonu ile mikrobiyal toplulukları incelemek için kültürel metotlar geliştirmişlerdir.
Zenginleştirme ve İzolasyon Bir mikrobiyal ekosistemi çalışmak için tek yol, mikroorganizmaları ekosistemden izole etmek ve laboratuvar kültüründe özelliklerini çalışmaktır. Bu süreç, zenginleştirme adı verilen bir işlemle topluluktan ayırarak ilgili organizmanın sayıca fazlalaştırılmasını ve daha sonra saf kültürdeki ilgili organizmanın izole edilmesini kapsar. İzolasyon önemlidir, çünkü izolasyon sayesinde ayrıntılı ve kontrollü laboratuvar çalışmaları için ve biyoteknoloji, endüstriyel ve çevre mikrobiyolojisi alanlarındaki uygulamalar için kültürler elde edilir. Doğadan mikroorganizmaların izolasyonunda yaygın olarak kullanılan yöntem kültür zenginleştirme tekniğidir. Zenginleştirilmiş bir kültürde, istenilen organizmalar için seçici olan ve istenmeyen organizmalar için engelleyici olan bir ortam ve bir inkübasyon koşulu oluşturulur. Etkin zenginleştirme kültürleri belirli bir nişin kaynaklan ve koşulları mümkün ölçüde birbirinin aynısıdır. Gerçekten, yüzlerce farklı zenginleştirme stratejileri bulunmuş olup Tablo 18.1 zenginleştirmede başarılı olan bazı örnekleri özetle sunmaktadır. Aşılama ve Zenginleştirme Kültür Sonuçlan Başarılı zenginleştirme kültür için, elde edilecek organizmayı içeren uygun inokulum (örnek) gerek-
18.1 • Zenginleştirme ve İzolasyon • 595
r
Tablo 18.1 Prokaryotlar için bazı kültür zenginleştirme metotları (bir sonraki sayfada devam etmekte) Işığa ihtiyaç duyan—fototrofîk bakteriler: Temel C kaynağı C02 Hava ile inkübasyon Azot kaynağı olarak N 2
Zenginleştirilen organizmalar Siyanobakteriler
Azot kaynağı olarak NO,", 55° C
Termofilik siyanobakteriler
Anoksik inkübasyon H 2 veya organik asitler; tek azot kaynağı olarak N 2
Mor kükürtsüz bakteriler, heliobakteriler
Elektron verici olarak H2S
Mor ve yeşil kükürt bakterileri
İnokulum Havuz veya göl suyu; sülfürce zengin bataklık; durgun ve kirli su; ham kanalizasyon çamuru; çürümekte olan yaprak, bitki çöpü; ışığa maruz kalmış nemli toprak Sıcak kaynak suyundan mîkrobiyal keçe Yukarıdaki bölgelere ilave olarak niperlimnetik göl suyu; pastörize toprak (heliobakteriler)
Işığa ihtiyaç duymayan kemolıtotrofik bakteriler; temel C kaynağı C02 (besiyeri organik C içermemelidir) Rava ile inkübasyon; aerobik solunum Elektron vericisi
Elektron alıcısı
Zenginleştirilen organizmalar
İnokulum
NH/
O2
NO 2
O2
Nitrifiye edici bakteriler (Nitrosomonas) Nitrifiye edici bakteriler (Nitrobacter)
Toprak, bataklık; kanalizasyon akıntısı
H2
O2 2
H2S, S", Sp, Fe2+, düşük pH Anoksik inkübasyon S°, S2O,2H2
O2 O2 NO,NO 3 " maya ekstraktı
Thiobacillus denitrificans Paracoccusus denitrificans
tnokulum Bataklık, göl sedimentleri, toprak,
Işığa ihtiyaç duymayan kemolıtotrofik bakteriler ve metanojenler; temel C kaynağı organik bileşikler Hava ile inkübasyon; aerobik solunum Elektron vericisi
Elektron alıcısı
Zenginleştirilen tipik organizmalaı
İnokulum
Pseudomonas fluorescens
Toprak, bataklık; göl sedimentleri; çürüyen bitki parçaları; tüm Bacillus zenginleştirmeleri için inokulumu pastörize (80°C'de 15 dk.) et.
ve azot kaynağı Laktat + N H /
+
Benzoat + NH Nişasta + NH Etanol (%4) + %1 maya ekstraktı, pH 6,0 Üre (%5) + %1 maya ekstraktı Hidrokarbonlar (örn. Mineral yağ, benzin, toluen) + NH+ Selüloz + NH4+
O O2 O2
Pseudomonas fluorescens Bacillus polymyxa, diğer Bacillus spp. Acetobacter, Gluconobacter
O2 O2
Sporosarcina ureae Mycobacterium, Nocardia, Pseudomonas (£«5Şekil 19.42)
O2
Cytophaga, Sporocytophaga
Mannitol veya benzoat N kaynağı olarak N
O2
(«sŞekil 12.90) Azotobacter
lidir. Böylelikle; zenginleştirme kültür uygun habitatı örnekleyerek başlar (Tablo 18.1). Zenginleştirme kültürler özel koşullar altında yüksek oranda seçici bir ortam içerisine inokulumu direk aşılayarak ve inkübe ederek gerçekleştirilir. Bu şekilde birçok prokaryot izole edilebilir. Örneğin; zenginleştirme kültür tekniğine (<^«»Kısım 1.6) öncülük eden Hollandalı Mikrobiyolog Martinus Beijerinck
I klasik bir zenginleştirme stratejisini kullanarak N 2 fikse eden bakteri olan Azotobacter'i ilk kez izole etmiştir. (Şekil 18.1»). Çünkü Azotobacter havanın N2'sini fikse etme kapasitesine sahiptir. Zenginleştirme amacıyla kullanılan besiyerlerinde amonyak ve diğer fikse edilmiş azot tipleri bulunmaz. Hava varlığında inkübasyon bu organizma için yüksek derecede seçicilik sağlar. Azot fikse etmeyen veya
596 • Bölüm 18 • Mikrobiyal Ekolojide Yöntemler
Tablo 18.1
Prokaryotlar için bazı kültür zenginleştirme metotlar (devamı)
Anoksik inkubasyon: anaerobik solunum Elektron vericisi Organik asitler
Elektron alıcısı
Zenginleştirilen organizmalar
İnokulum
KNO,(0.2%)
Pseudomonas (denitrifikasyon yapan türler)
Toprak, bataklık; göl sedimentleri
Maya ekstraktı Organik asitler Asetat, propiyonat, butirat
KNCU.1%) Na 2 SÖ 4 Na 2 SO 4
Bacittus (denitrifikasyon yapan türler) Desulfovibrio, Desulfotomaculum Yağ asiti oksitleyen sülfat indirgeyiciler
Asetat, etanol Asetat Asetat H2
S°
cıo,Na CO,
CH3OH CH,NH 2 veyaCH 3 OH
Na,CO, 3 KNO,
Desulfuromonas Geobacter, Geospirülum Çeşitli klorat indirgeyen bakteriler Metanojenler (sadece kemolitotrofik türler), homoasetojenler Methanosarcina barkeri Hyphomicrobium
Fe
3+
2
Anoksik inkubasyon: fermentasyon Elektron vericisi Elektron alıcısı ve azot kaynağı Glutamat veya histidin Harici bir elektron kaynağı eklenmez
Nişasta + NH 4 + Nişasta + azot kaynağı olarak N 2 Laktat + maya ekstraktı Glukoz veya laktoz + NH 4 +
Hiçbiri Hiçbiri Hiçbiri Hiçbiri
Glukoz + maya ekstraktı (pH5) Laktat + maya ekstraktı Suksinat + NACİ Oksalat
Hiçbiri Hiçbiri Hiçbiri Hiçbiri
Yukarıdaki gibi; veya kanalizasyon suyu arıtma çamuru; rumen içerikleri; denizel sedimentler Bataklık, sedimentler, kanalizasyon çamuru
Zenginleştirilen organizmalar
İnokulum
Clostridium tetanomorphum
Bataklık, göl sedimentleri, süt ürünleri (laktik ve propiyonik asit bakterileri); rumen veya bağırsak içerikleri (enterik bakteriler); kanalizasyon çamuru; toprak
Clostridium spp. Clostridium pasteurianum Veillonella spp. Escherkhia, Enterobacter diğer f ermentatif organizmalar Laktik asit bakterileri (Ladobacülus) Propiyonik asit bakterileri Propionigenium Oxaiobacter
•Tüm besiyerleri N, P, S Mg2*, Mn2+ Fe2+Ca2+, ve diğer iz elementler dahil bir mineral tuz karışımını içermelidir (<3°^> Kısım 5.1-5.3). Belli başlı bazı organizmalar, vitaminleri ve diğer büyüme faktörlerine ihtiyaç duyabilirler. Bu Tablo zenginleştirme metotlarına bir bakış olarak verilmiş olup termofilik (yüksek sıcaklık), hipertermofilik (çok yüksek sıcaklık) ve psikrofilik (düşük sıcaklık) türleri izole etmek için inkubasyon sıcaklığının veya ekstrem pH veya tuzluluğun etkisini belirtmemektedir. Uygun bir aşının elde edilebildiği farz edilmektedir.
Hava N2" I ^ O 2 (azot -I (solunumu kaynağı) \ destekler)
-''i.
Havada inkübe et
Mannitol eklenmiş mineral tuz besiyeri NH4+, NO3~, veya organik azot yok
N 2 fikse eden Azotobacter kolonileri
2. Aynı besiyeri üzerine ek Hava
(azot la^uı kaynağı)
, |
(solunumu destekler)
Toprak
3. Aynı besiyeri ancak NH 4 + eklenmiş
NH 4 + (azot kaynağı)
, Plaka +NH 4 + or - N H 4 + besiyerine ek Azot fiske etmeyen bakteri kolonileri
<-NH4+ besiyeri
anaerobik azot fikse eden bakteriler bu durumda üremeyeceklerdir (Şekil 18.1). Başarılı bir zenginleştirme kültür için hem kültür ortamı ve hem de inkubasyon koşullarının kritik etkisi üzerinde durulmalıdır. Yani, kaynakların ve koşulların her ikisi ilgili organizmanın en iyi şekilde zenginleştirilmesi için optimize edilmelidir. Bazı zenginleştirme kültür denemelerinde hiçbir sonuç alınmaz. Bunun anlamı, arzu edilen özellikleri gösteren organizmanın doğada olmamasından kaynaklanır. Alternatif olarak, bu tip bir organizma mevcuttur, ancak kültür koşulları zenginleştirmede yetersizdir. Bu nedenle, zenginleştirme kültür negatiflik yerine bir pozitiflik sağlayabilir. Ayrıca • Şekil 18.1 Azotobacter izolasyonu. Aerobik N2 fiske eden bakterilerin aranmasında genellikle Azotobacter veya ona yakın organizmalar elde edilir. Farklı şekilde, NH4+ gibi azotun fiske edilmiş formlarıyla yapılan zenginleştirmeler ise nadiren N2 fikse eden bakterilerin seçilmesine neden olmaktadır. Çünkü bu durumda azot fiksasyonu için seçici baskı ortadan kalkmaktadır.
18.1 • Zenginleştirme ve izolasyon • 597
zenginleştirme kültürde istenilen organizmanın izolasyonu, inokulumdaki organizmanın ekolojik önemi veya bolluğu hakkında bir anlam ifade etmez; pozitif bir zenginleştirme sadece örnekfe organizmanın bulunduğunu kanıtlar ve teorik olarak yalnızca tek bir canlı hücrenin bulunması yeterlidir. Winogradsky Kolonu
VVinogradsky kolonu, zenginleştirme kültür amacıyla uzun süreli bir bakteri kaynağı olarak kullanılabilecek minyatür anoksik bir ekosistemdir. Bu kolon, mor ve yeşil fototrofik bakterilerin, sülfat indirgeyen bakterilerin ve birçok diğer anaerobların izolasyonunda kullanılır (Şekil 18.2«). Ondokuzuncu yüzyılın sonlarında Sergei VVinogradsky adlı ünlü Rus mikrobiyologu (c**s Mikrobiyal okuma parçası, VVinogradsky'nin mirası, Bölüm 17 ve Kısım 1.7), kolonu ilk kez toprak mikroorganizmalarını çalışmak amacıyla kullanmıştır. Bir VVinogradsky kolonu, bir cam silindirin yaklaşık yarısına kadar organik maddelerce zengin tercihen sülfür içeren çamuru doldurarak hazırlanır (Şekil 18.2). Çamur içerisine ilk olarak karbonlu substratlar karıştırılır. Organizmaları zenginleştirebilecek substratlar belirlenir, fermentatif substratlardan kaçınılmalıdır (aşırı gaz oluşumuna yol açabilir). Çamura, tampon olarak CaCO3ve sülfat kaynağı olarak da CaSO4 eklenir. Kaba, hava girmemesine dikkat ederek çamur kabın içine sıkı şekilde doldurulur (Sekili8.2). Çamur, daha sonra göl, havuz veya hendek suyu ile (veya bir denizel kolon oluşturulacaksa deniz suyu) örtülür. BuharGradiyentler
laşmayı önlemek amacıyla silindirin ağzı kapatılır. Silindir güneş ışığının girmesi için pencere kenarına yerleştirilir ve gelişme için birkaç hafta süreyle bırakılır. Tipik bir VVinogradsky kolonunda çeşitli organizmalar gelişir. Algler ve siyanobakteriler su kolonunun üst bölümünde hızlı şekilde ortaya çıkar. Bu organizmalar O2 üreterek bu zonun oksik kalmasına yardımcı olurlar. Çamurdaki dekompozisyon süreçleri sülfat indirgeyen bakteriler için uygun substratlar olan organik asitler, H 2 ve alkollerin üretimini sağlar («»a Kısım 12.18,13.7,17.15 ve 19.13). Bu sayede, sülfat indirgeyiciler aracılığıyla ortaya çıkan sülfürü elektron vericisi olarak kullanan fotosentetik mor ve yeşil sülfür bakterilerinin (anoksijenik fototroflar, ö°a Kısım 12.2 ve 12.32) gelişimi başlar. Bu organizmalar tipik olarak kolonun kenarında çamurda leke gibi gözlenir. Fakat oksijenik fototroflar az ise o zaman bu organizmalar su içinde çoğalabilirler (Şekil 18.2). Fototrofik bakteriler için kolondan örnekleme işlemi uzun, ince bir pipet yerleştirerek ve biraz renkli çamur veya suyu çıkararak yapılır. Bu örnekler, mikroskopta inceleme amacıyla ve izolasyon ve karakterizasyon amacıyla zenginleştirme besiyerlerine aşılamak için kullanılabilir. VVinogradsky kolonu, çeşitli aerobik ve anaerobik prokaryotları zenginleştirme amacıyla kullanılmaktadır. Zenginleştirme kültürde hazır bir inokulum kaynağının sağlanması yanında kolonlar ayrıca belli bir bileşiği parçalayabilen, inokulumda mevcut bir organizma veya organizmalar olduğu hipotezini test etmek için o bileşikle de desteklene-
Kolon Folyo kapak
Göl veya havuz suyu —
Algler ve siyanobakteriler Mor kükürtsüz bakteriler Kükürt kemolitotrofları
Organik besin ve CaSO4'le desteklenmiş bataklık çamuru
Mor kükürt veya yeşil kükürt bakteri benekleri Anoksik çürüme ve sülfat indirgenmesi
(a)
• Şekil 18.2 İVinogradishy kolonu, (a) Tipik bir kolonun şematik görüntüsü. Kolon düşük güneş ışığı alacak şekilde yerleştirilir. Kemoorganotrofik bakteriler kolon içinde, aeroblar ve mikroaerofiller üst bölgelerde, anaeroblar H2S içeren zonlarda gelişir. Sülfat indirgenme sürecine kadar giden anoksik çürüme, H2S gradienti oluşturur. Yeşil ve mor kükürt bakterileri H2S toleranslarına göre tabakalaşır. (b) Üst kısma kadar anoksik olanWinogradisky kolonlarının şekli. Burada çamur içinde ve yukarıdaki su kolonunda üç farklı fototrofik bakteri yığını oluşmaktadır. Soldan sağa: Thiobacillus jenense, Chromatium okenii, (her ikiside mor kükürt bakterisi, Kısım 12.2) ve Chlorobium limicola (yeşil kükürt bakterileri, O&S Kısım 12.32).
598 • Bölüm 18 • Mikrobiyal Ekolojide Yöntemler
bilir. Bir kez ham bir zenginleştirme kurulduğunda, Bölüm 18.2'de tartışılacağı gibi saf kültürlerin devamlılığı sağlanabilir. Zenginleştirme Sapam (Bias)
Zenginleştirme kültür çok güçlü bir araç olmasına rağmen, birçok zenginleştirmede bir hata ve bazen de sonuçta çok ciddi bir hata ortaya çıkmaktadır. Tipik sıvı zenginleştirme kültürde, seçilen koşullar için en uygun organizma dominant hale gelir. Bununla birlikte, laboratuvar kültürü için en uygun organizma dominant olandan veya bir çok ekolojik olarak benzer organizmadan ziyade mikrobiyal ekosistemin sadece minör bir bileşenide olabilir. Zenginleştirme sapanı klasik sıvı zenginleştirme seyreltme kültürlerde (Kısım 18.2'ye bakınız) elde edilen sonuçların karşılaştırılması ile gösterilebilir. Zenginleştirmeyi takiben inokulumun seyreltilmesi veya plaklara direk ekim genellikle seyreltilmemiş inokulumun kullanıldığı sıvı zenginleştirmeden elde edilenden farklı organizmaları verecektir. Seyreltmenin, kantitatif olarak anlamsız olan ancak mikrobiyal topluluğun diğer üyelerinin gelişmesine şans vermek için inokulumdan gelen ve hızlı çoğalan "istenmeyen" türleri elimine ettiği düşünülür. Bu yüzden, inokulumun seyreltilmesi bugün mikrobiyolojide zenginleştirme kültürde yaygın bir uygulamadır. 18.1 Kavramların Gözden Geçirilmesi Kültür zenginleştirme tekniği, doğal örneklerden mikroorganizmaların elde edilmesinde bir araçtır. Belirli organizmalar için seçici besiyeri ve inkübasyon koşullan seçilerek zenginleştirme metodlanyla özgül reaksiyonlar incelenebilir. Beijerinck tarafından Azotobactefin izolosyonunu destekleyen zenginleştirme stratejisini tanımlayınız 2 • Niçin VVinogradsky kolonuna sülfat (SO4) ~ eklenmelidir? • Zenginleştirme sapanı nedir?
(b)
• Şekil 18.3 Saf kültür metodları. (a) Burada görüldüğü gibi genellikle plakalar üzerinde kolonileri ayrı düşen organizmaları saflaştırmak çok kolaydır, (b) Ağar çalkalama tekniği kullanılarak elde edilen oksijene duyarlı anaerop kolonileri. Sağdan sola yapılan seri seyreltme doğal olarak izole olmuş kolonileri vermektedir. Anaerobikliğin devam için tüpler steril bir parafin ve mineral yağ karışımı ile kaplanmıştır.
•
Saf Kültür İzolasyonu Tek tip mikroorganizmayı içeren kültürler olan saf kültürler, farklı tiplerde yapılan zenginleştirmelerle elde edilebilir. Genel izolasyon yöntemleri çizgi ekim, ağar çalkalama ve sıvı seyreltme şeklindedir. Agarlı plakalar üzerinde iyi gelişen organizmalar için çizgi ekim tekniği hızlı, kolay ve tercih edilen bir metottur (Şekil 18.3a»). İzole bir koloninin seçilerek tekrar çizilmesi ile ve daha sonra sıvı ortama transfer edilebilen bir saf kültür elde edilebilir. Uygun inkübasyon aletleri kullanarak (örneğin, anaeroplar için anoksik jarlar Ö^Ö Kısım 6.13), çizgi plaka metodu ile ağar üzerinde hem aerobik hem de anaerobiklerin saflaştırılması mümkündür.
Ağar Çalkalama ve En Muhtemel Sayı (EMS) Ağar çalkalamalı-tüp metodunda; karışık kültür erimiş ağar bulunan tüplerde seyreltilir ve bakteri kolonileri agarlı plakanın yüzeyinden ziyade ağar içine gömülü halde gelişir (Sekili 8.3b). Çalkalamalı tüpler, Winogradisky kolonlarından elde edilen fototrofik kükürt bakterileri ve sülfat indirgeyen bakteriler (c«5> Şekil 12.50g) gibi anaerobik prokaryotlarm saflaştırılmasmda yarayışlıdır (Şekil 18,2'ye bakınız). Tüplerdeki sıvı ortama hücre süspansiyonlarının seyreltilmesiyle saflaştırma sağlanır (Şekil 18.3b). Bu işlem tekrarlanarak yeni seyreltmeler için inokulum olarak kullanılmak üzere en yüksek seyreltme tüpünden bir koloni alınarak saf kültürler elde edilir. Benzer bir yöntem, sıvı bir besiyerinde tüp veya tüp serisinde üremenin görülmeyeceği seriye
18 2 • Saf Kültür İzolasyonu • 599
kadar inokulumun seyreltilmesidir (Şekil 18.4«). Örneğin 10 kat seri seyreltme yapıldıktan sonra üremenin görüldüğü son tüp, 10 veya daha az hücreden orijinlenmektedir. Bu yöntemin birçok kez tekrarlanması ile, saf kültürler elde edilebilir. En muhtemel sayı (veya EMS) tekniği (Şekil 18.4) olarak bilinen bu yöntem gıdalar, atık sular ve hücre sayımının rutin olarak yapılması gereken diğer örnekler için kullanılmaktadır. EMS, özel bir patojen gibi bir veya küçük bir organizma grubunu hedefleyen yüksek oranda seçici besiyerlerini ve inkübasyon koşullarını kullanarak veya tahmini toplam hücre sayılarını veren kompleks besiyerlerini kullanarak yapılabilir (ancak bölüm 6.7 de uygulanan uyarılara bakınız). Bir kültürü saflaştırmak için kullanılan metotlarla ilgili olarak, bir kez varsayılan saf kültür elde edildiğinde saflığını kontrol etmek gerekir. Bu işlem, \-mikroskopi 2- plakalar üzerinde veya çalkalamalı tüplerde koloni karakteristiklerinin gözlemi
ve 3-diğer besiyerlerinde gelişim yönünden kültürü test etme kombinasyonları ile yapılmalıdır. Son durumda, kültürün zayıf gelişeceği veya hiç gelişemeyeceği, buna karşılık kontaminantların hızla ge-
1 mi (sıvı) or 1 g (katı)
lişebileceği şüphesiyle besiyerlerinde kültürün gelişimini test etmek önemlidir. Son analizde, hücre şeklinin tek morfolojide gözlemlenmesi ve bunun yanında tek koloni şekli karakteristikleri ve çeşitli kültür ortamlarında yapılan gelişme testlerinde kontaminasyon görülmemesi kültürün aksenik (saf) olduğunun güçlü bir delilidir. Saf Kültür Probu—Lazer Cımbızlar Tanımlanan birçok klasik metoda ilaveten, mikroskopideki teknolojik ilerlemeler lazer cımbızlar gibi saf kültür elde etmede yeni aletler sağlamaktadır. Lazer cımbızlar, güçlü bir şekilde odaklanan kızıl ötesi lazer ve bir mikromanipulasyon aleti ile donatılmış bir inverted ışık mikroskobundan ibarettir (Şekil 18.5«). Görüntü alanındaki tek bir hücre lazer ışını ile optik anlamda yakalanabilir ve kontamine olan organizmalardan ayrılabilir. Lazer küçük nesneler (mikrobiyal hücreler gibi) üzerinde bir güç oluşturduğu için hücre yakalanabilir.
Zenginleştirme kültürü veya doğal örnek Seyreltme 1 mi
1 mi
r
*• 1 mi
1 mi
1 mi
)(—)C ^
Mikroskobun objektif merceği
Lazer ışığı
(a)
Optik olarak tutuklanmış hücre \
Ayırma noktası _ u -
* Şekil 18.4 En muhtemel sayı (EMS) analizi için yöntem. Mevcut bir zenginleştirme kültürü veya doğal bir su, toprak vb. gibi örnekler seçici bir kültür ortamına eklenir ve seri seyreltmeleri yapılır. Üremeyi gösteren son tüpde (örnekte gösterilen 10 s'lik seyreltme tüpü) 10 veya daha az hücre bulunur. Saf kültür elde etmenin bir aracı olarak, üremenin görüldüğü gösteren en yüksek seyreltme, inokulum olarak kullanılır ve işlem tekrarlanır. Örnekteki belirli tipteki bakterilerin sayılarını hesaplamada kullanılan, EMS, üremenin görüldüğü en yüksek seyreltme olarak tanımlanır. Eğer bu durumda kullanılan besiyeri, sülfat indirgeyen bakteriler için yüksek oranda seçici ise, bir araştırıcı örneğin her bir gramında böyle organizmaların 105-106 gibi sayılarda kültüre edilebilir hücrelerinin bulunduğu sonucunu çıkarabilir. Her bir seyreltmede birkaç tekrarlama yapmak, son olarak elde edilen EMS'nin doğruluğunu arttırır.
Kapiler tüp' (b)
Hücre karışımı Lazer
• Şekil 18.S Bakteri izolasyonu için lazer cımbızı (tweezers). (a) Lazer cımbızın prensibi. Bakteriyal hücre kadar küçük bir nesne üzerine güçlü şekilde odaklanmış bir lazer ışığı hücrelerin her hangi bir yönde sürüklenmesini sağlayan aşağıya doğru radyasyon kuvvet (Fa, Fb) yaratır, (b) İzolasyon. Lazer ışığı bir kapiler tüp içindeki bir karışımda mevcut olan tek bir hücreye kilitlenebilir ve diğer hücrelerden uzağa optik olarak tutuklanmış hücreyi sürükler (buradaki örnekte, istenen hücre sağdan sola doğru sürüklenir). İstenen hücre bir kez diğer hücrelerden yeterince uzaklaşınca, kapiler bölünür ve hücre steril bir tüpte besiyerine boşaltılır.
i
i •
)
i
600 • Bolüm 18 • Mikrobiyal Ekolojide Yöntemler
Lazer ışını hareket ettirildiğinde, lazer ile işaretli bakteriyal hücre de onunla birlikte ilerler. Eğer örnek kapiller bir tüpün içindeyse, hücre ve geri kalan popülasyon arasındaki bir noktadan tüpün kırılmasıyla tek bir hücre yakalanabilir ve izole edilebilir. Yakalanan hücre daha sonra bir saf kültür oluşturmak için steril besiyeri içeren küçük bir tüpe aktarılabilir (Şekil 18.5). Lazer cımbız teknolojisi özellikle kültür zenginleştirmede aşırı gelişen, normalde yavaş gelişme özelliğine sahip bakterileri izole etmek için veya seyreltme tabanlı zenginleştirme metotlarını kullanarak hatalara sebep olan düşük sayılardaki bu tipteki organizmalar için yararlıdır. Bir mikroskop sahasında özel organizmaları tanılayabilen spesifik boyaların kullanılması ile (Kısım 18.4'e bakınız), lazer cımbızlar ilgilenilen organizmaları bir karışımdan saflaştırmak amacıyla seçmek için veya daha ileri düzeyde laboratuvar çalışmaları için kullanılabilir. 18.2 Kavramların Çözden Geçirilmesi Bir kez başarılı bir kültür zenginleştirmesi yapıldığında, saf bir kültür; çizgi plaka, ağar çalkalama ve seyreltme metotları dahil geleneksel mikrobiyolojik yöntemler ile elde edilebilir. Lazer cımbızlar araştırıcıya bir mikroskop alanından bir hücreyi "seçmesine" izin verir ve onu tamamiyle kontaminantlardan uzaklaştırır. •
Ayrı ayrı koloniler elde etmede ağar çalkalama metodunun çizgi plakadan farkı nedir? • Bir EMS'de (Şekil 18.4'e bakınız), niçin her bir örnekteki kültüre edilebilen hücrelerin gerçek sayısı, büyümenin görüldüğü en yüksek seyreltme ile ondan sonraki seyreltme arasındaki olası bir sayı değeri olmaktadır? • Oldukça düşük sayılarda bulunan tek morfolojiye sahip bir bakteriyi bir zenginleştirme kültürde nasıl izole edebilirsiniz?
MİKROBİYAL TOPLULUKLARIN MOLEKÜLER(KÜLTÜRDEN BAĞIMSIZ) ANALİZLERİ Mikrobiyal ekologlar genellikle belirli organizmaların bulunup bulunmadığını ve sayısını öğrenmek için bir mikrobiyal habitattaki hücrelerin miktarını bilmek isterler. Böyle bir bilgi, bir ekosistemin etkinliği hakkında bilgi verir ve ekolojik anlamda en fazla ilgilenilen organizmaların gösterilmesine yardımcı olur. Hücre boyamaları bu sayıların belirlenmesinde mikrobiyologlara yardımcı olur ve burada olur ve metotlar detaylandırılacaktır. Doğal çevredeki organizmalar, genlerinin belirlenmesi ile de saptanabilirler. Çevresel genomik çalışma alanı, mikrobiyal toplulukların ortak genomları konusunda yeni ve ilginç yollar açmasına rağmen, bu tip çalışmada ya ribozomal RNA
Kısım 11.5-11.7) ya da spesifik bir metabolik süreci kodlayan genler genel hedeflerdir.
Boyama Teknikleriyle Sayım ve Canlılık Tayini Doğal örneklerdeki mikroorganizmaların sayımı için mikrobiyolojide birçok boyama metodu uygulanmaktadır. Bu metotlar, hücrelerin fizyolojisini veya filogenisini göstermemesine rağmen, bu teknikler yaygın şekilde kullanılmakta ve belli bir habitattaki hücrelerin toplam sayısı hakkında sayısal bilgi elde edilmesi için oldukça güvenilirdirler. DAPI Kullanılarak Yapılan Floresans Boyama
Floresan boyalar, yaygın şekilde ışık geçirmez ortamlardaki mikroorganizmaları boyamak için kullanılmaktadır. DAPI (4',6-diamido-2-fenilindol) bu amaç için yaygın kullanılan bir boyadır. DAPI ile boyanmış hücreler parlak mavi floresan vererek görme ve sayma da kolaydır (Şekil 18.6»). DAPI boyama, yaygın şekilde çevre, gıda ve klinik örneklerdeki mikroorganizmaların sayımı için kullanılmaktadır. Örneğe bağlı olarak, nonspesifik olarak arka zemini boyama genellikle floresan boyalarla yapılan boyamada bir problem olabilir, ancak nükleik asitleri boyayan DAPI inert maddelerle büyük oranda reaksiyon vermez. Bu nedenle; su, toprak gibi birçok örnek için, DAPI boyama, var olan hücre sayısı hakkında uygun bir tahmin verebilir. Seyreltik su numuneleri için, sıvının belli bir hacminin filtrelenmesinden sonra filtrenin yüzeyinde hücreler boyanabilirler. Alternatif olarak, hücreler, santrifüj edilerek konsantre edilebilir. Öte yandan, DAPI benzeri boyama teknikleri, spesifik olmama avantajına sahiptir: Bir örnek içindeki bütün mik-
* Şekil 18.6 DAPI ile boyanarak Floresan hale gelmiş Escherichia coli hücreleri. Bu boyama tekniği tipik olarak toplam mikrobiyal sayım yapmak için kullanılır. DAPI hücrelere nüfuz ederek ve DNA'ya bağlanarak çalışır; bu, doğal olarak prokaryotik hücrelerin aynı tarzda floresan üretmesini sağlar.
18.3 • Boyama Teknikleriyle Sayım ve Canlılık Tayini • 601
roorganizmalar DAPI ile boyanırlar. Ancak, diğer yandan, DAPI, canlı ve ölü hücreler arasındaki veya farklı hücreler arasındaki farklılığı ortaya çıkaramaz ve böylelikle bir çevre de bulunan spesifik organizmaları işaretleyemezler. Canlı Boyama Floresan bir boyama metodu, ölü bakteriyal hücrelerden canlıları ayırt etmek için geliştirilmiştir. Bu, bir örnekte bulunan organizmaların sayısı yanında aynı zamanda onların canlılıkları ile ilgili bilgiyide vermektedir. Farklılığın temeli, hücrelerin sitoplazmik zarın sağlam olup olmaması ile ilgilidir. Yeşil ve kırmızı renkli iki boya bir örneğe ilave edilir; yeşil floresan boya canlı veya cansız tüm hücrelere penetre olur, oysa propidiyum iyodid içeren kırmızı boya hücre membranı uzun süre bütünlüğünü koruyamayan ve sonuçta ölen hücrelere penetre olur. Böylece, canlılık yönünden değerlendirildiğinde yeşil hücreler canlı, kırmızı hücreler ise ölüdür (Şekil 18.7»). Laboratuvar kültürlerini kullanarak yapılan araştırmalar için yararlı olmasına rağmen, canlı/ölü boyama zemin materyallerinin spesifik olmayan boyanma problemlerinden dolayı bir çok doğal habitatların mikroskobik incelenmesi amacıyla kullanımı uygun değildir. Floresan Antikorlar Boyama teknikleri floresan antikorlar kullanarak daha spesifik hale getirilebilir. Antikorlar spesifik biyolojik ajanlardır ve Kısım 24.9'da floresan antikorlar teorisi tartışılacaktır. Belli bir organizmanın yüzey bileşenlerine karşı antikorların yüksek özgüllüğü toprak (Şekil 18.8») veya klinik bir örnek gibi bir çok mikroorganizma karışımını içeren kompleks bir habitat içinde bir organizmayı tanımlama veya izleme aracı olarak kullanılabilir.
• Şekil 18.7 Canlı boyama. LIVE/DEAD Bac Light™ Bacterial Viability Stain ile boyanmış Micrococcus luteus (koklar) ve Bacillus cereus'un (çubuklar) canlı (yeşil) ve ölü (kırmızı) hücreleri.
• Şekil 18.8 Bir hücre etiketi olarak floresan antikorlar. Floresan antikor tekniğini kullanarak kükürtlü toprak partiküllerinin yüzeyinde hipertermofilik archaea olan Sulfolobus acidocaldarius'un bakteriyal mikrokolonilerindeki hücrelerinin (bakteriyal hücreler yeşilimsi—san benekler olarak görünür) görünümü. Hücreler yaklaşık 1 ^m çapındadır.
Yöntem, ilgili organizmaya karşı zaman ve emek harcanmasını gerektiren spesifik antikorların hazırlanmasını gerektirir. Bu çoğunlukla zaman harcatan ve güç bir yöntemdir. Ancak, klinik anlamda ilgili organizmalar için, yüksek oranda özgül antikorlar ticari olarak satıldığından bunlar klinik laboratuvarlarda geniş çapta kullanılabilmektedir (coş. Kısım 24.9 ve Şekil 24.9). Bir Hücre Etiketi Olarak Yeşil Floresan Proteini Floresan hale getirmek amacıyla bakteriyal hücreler genetik mühendisliği yöntemleri ile değiştirilebilir. Bölüm 31'de tartışıldığı gibi, yeşil floresan protein (GFP) adı verilen bir proteini kodlayan bir gen aslında her hangi bir bakterinin genomuna yerleştirilebilir. Gen ifade edildiğinde, GFP içeren hücreler ultraviyole mikroskobu ile gözlendiklerinde yeşil görünürler (Şekil 18.9•). Doğal popülasyonlarla yapılan çalışma yararlı olmamasına rağmen (çünkü bu hücreler GFP geninden yoksundur), GFP etiketli hücreler bitki
• Şekil 18.9 Yeşil floresan boya (CFP). Yeşil floresan proteini ifade etmek için genetik olarak üzerinde çalışılmış Pseudomonas fluorescens hücreleri (Kısım 4.2). Hücreler arpa köklerine tutunmuş olup yeşil floresan vermektedir. Mavi boyanan hücreler arpa köklerinin normal flora üyeleri olup DAPI ile boyanmışlardır (bakınız Kısım 18.3 ve Şekil 18.6). GFP kullanan bir araştırıcı çevreye giren hücreleri takip edebilir.
602 • Bölüm 18 • Mihrobiyal Ekolojide Yöntemler
kökleri gibi bir çevreye katılabildiği (Şekill8.9) ve işaretli susun mikroskop ile takip edildiği çalışmalar mevcuttur. Bu metodu kullanarak, mikrobiyal ekologlar doğal mikroflora ve GFP etiketli eklenen suş arasında yerinde (in situ) mikrobiyal rekabeti çalışabilir veya eklenen bakteriler üzerine çevredeki stresin etkisini değerlendirme konusunu çalışabilirler. GFP geni, bir reporter gen olarak çeşitli bakterilerin laboratuvar kültürlerinde yaygın şekilde de kullanılmaktadır. Özel bir baskılayıcının kontrolü altında bir operonla birleştiği zaman, floresans kullanılarak bu genlerin transkripsiyonunel kontrolü çalışılabilir. Yani, GFP geni içeren genler transkribe edildiği zaman, GFP geni de transkribe edilmektedir. Yeşil proteini üreten tranlasyonu takiben, hücreler yeşil floresan verir Kısım 31.4 ve Şekil 31.7). Mşihroskopla İlgili Sınırlamalar Mikroskop doğal örneklerdeki mikroorganizmaların sayımı ve tanımlanmasında yararlı bir araçtır, fakat doğal ortamlardaki mikroorganizmalarla çalışmak için mikroskop yeterli midir? Birçok nedenle cevap hayırdır. Küçük hücreler büyük bir problem olabilir. Prokaryotların büyüklükleri oldukça farklıdır (oce, Kısım 4.4 ve Tablo 4.1) ve bazıları ışık mikroskobunun ayırt etme gücünün sınırına yakındır. Doğal örnekler gözlendiğinde, özellikle örnek yüksek seviyede partiküler madde veya fazla miktarda büyük hücreler içeriyorsa bu tip organizmalar kolaylıkla gözlenebilirler. Ayrıca, doğal örneklerde ölü hücrelerden canlı hücreleri veya cansız materyallerden hücreleri ayırt etmek oldukça zordur. Amaç basit bir sayım ise, bu faktörlerin tümü bazen de dramatik tarzda sonuçları etkileyebilir. Bununla beraber boyalarla ilgili en büyük sınırlama şimdiye kadar tartıştığımız gibi doğal bir habitattaki mikroorganizmaların çeşitliliğini ölçememeleridir. Diğer bir ifadeyle, mikroskop altında sayarken gözlemlediğimiz hangi mikroorganizma türleridir? Basit mikroskobik gözlemler ile yanılma çok kolaydır. Örneğin, morfolojik olarak benzer iki hücre gerçekte ekosistemde farklı rolleri oynayan genetik olarak arı türler olabilir (Şekil 18.10»). Basit boyama teknikleri bile bunu çözemez. Bu yüzden, mikroskop altında mikroorganizmaların doğal popülasyonları boyanmamış veya nonspesifik şekilde boyanmış olarak gözlendiğinde, bir çok hücre benzer "görülse" bile örneğin kesinlikle genetik olarak farklı bir topluluk içerdiği anlaşılmalıdır. Daha sonra göreceğimiz gibi, spesifik boyama metotları bunu ayırt edebilirler (Şekil 18.10b). Mikroskop, mikrobiyal ekologların önemli bir aleti olmasına rağmen, mikrobiyal ekosistemin
(b)
• Şekil 18.10 Morfoloji ve genetik çeşitlilik. Burada gösterilen fotoğraflar, (a) faz kontrast ve (b) filogenetik boyama (bakınız Kısım 18.4) yapılmış aynı hücre alanlarım göstermektedir. Büyük oval şekilli hücreler aslında oldukça farklı bir prokaryotik hücre morfolojisinde ve büyüklüğünde olmasına ve faz kontrast mikroskopisi ile benzer görülmesine rağmen, filogenetik boyama bunların genetik olarak iki ayn hücre tipi (bir boya san ve bir boya mavi) olduğunu ortaya çıkarmaktadır. Bu yüzden, doğal örneklerin basit ışık mikroskobu gözlemleri dikkatle yorumlanmalıdır, çünkü tek bir mikroskop sahasındaki ender görülen morfolojideki hücrelerin aynı organizmadan olduğunu düşünmek kolaydır. Mavi veya san ile boyanmış oval hücreler yaklaşık 2,25 pıtı çapındadır. Çiftler veya salkımlar halinde görülen yeşil hücreler 1 pm çapındadır.
gerçekten doğru olarak anlaşılabilmesi için, kültürel ve moleküler gereçlerle desteklenmelidir. Moleküler metotlar, spesifik mikroorganizmalarla ilgili olan spesifik genleri hedef alır. Genin varlığı organizmanın varlığını gösterir. Şimdi mikroskobun da dahil olduğu sayılan bu moleküler metodları göreceğiz (Şekil 18.10'a bakınız). 18.3 Kavramların Gözden Geçirilmesi Doğal örneklerdeki mikroorganizmaların tanımlanması için DAPI genel bir boyamadır. Bazı boyalar ölü hücrelere karşı canlıları ayırt edilebilir ve akraba hücrelerin bir veya küçük bir grubu için spesifik olan floresans antibadiler hazırlanabilir. Yeşil floresans proteini hücreleri otofloresan hale getirir bu çevreye giren hücreleri izlemek için bir araçtır. Saf kültürlerden farklı olarak, doğal örneklerde, morfolojik olarak benzer hücreler tamamiyle genetik açıdan farklı olabilirler. •
Niçin GFP'nin bir "boyama" metodu olduğumuz söylemek doğru değildir? • DAPI gibi boyalar spesifiklik anlamında floresant antibadilerden farkı nedir?
Genetik Boyamalar Nükleik asit probları, doğada mikroorganizmaları tanımlanması ve sayımı için güçlü metotlardır. Nükleik asit probunun bir hedef gende bir sekansa
18.4 • Genetik Boyamalar • 603
komplementer olan bir DNA veya RNA oligonükleoti olup hedef genle hibridizasyon yapabildiğini hatırlayınız (c**> Kısım 7.7 ve 11.7). Kısım 11.6'da tartışıldığı gibi, oligonükleotit probları bazı boyalar ile floresan hale getirilebilir. Bu floresan problar proba komplementer olan bir nükleik asit sekansı içeren organizmaları tanılamak için kullanılabilmektedir. Bu tekniğe floresan in situ hibridizasyon (FISH, OOÖ Kısım 11.6) adı verilmekte olup bu metodun 3 farklı uygulaması burada anlatılmıştır. FISH Yoluyla Filogenetik Boyama
Filogenetik boyalar,16S (prokaryot) veya 18S (ökaryot) ribozomal RNA'nm sinyal dizilerine komplementer baz dizisine sahip floresan ışık veren oligonukleotidlerdir (Ö°Ö Kısım 11.7). Filogenetik boyalar, hücre içine nüfuz ederek ve ribozomlardaki ribozomal RNA ile direk olarak hibridize olarak çalışırlar (G°S Şekil 11.14). Filogenetik problar organizmaların tüm domainleri için olduğu kadar, bireysel mikrobiyal türler için de dizayn edilebileceği için bir flogenetik boyanın özgüllük derecesi probun dizisi ile kontrol edilmelidir. FISH kullanarak bir araştırıcı daha sonra doğal bir örnekte belirli bir organizmayı (veya filogenetik boyanın özgüllüğüne bağlı olarak ilgili organizma grubu) tanılayabilir veya izleyebilir. Doğal örnekler filogenetik çoklu problarla da muamele edilebilirler. Her biri belli bir organizma veya organizma grubu ile reaksiyona girecek şekilde dizayn edilmiş ve her biri kendi floresan boyasını içeren uygun probları kullanarak, FISH bütün bir habitatı karakterize etmede kullanılabilir. (Şekil 18.11). Eğer FISH, konfokol mikroskop (Ö°Î> Kısım 3.2) ile birleştirilirse, örneğin bir biofilmde olduğu gibi gibi derinliği olan bir örnekteki mikrobiyal popülasyonu araştırmak mümkün olabilecektir (ca^ Kısım 19.3 ve Şekil 18.11 ve 19.4). Mikrobiyal ekolojiden başka, FISH teknolojisi, gıda endüstrisinde ve klinik tanıda spesifik patojenlerin tanımlanmasında popüler bir alet olmuştur.
• Şekil 18.11 Kanalizasyon suyunun FISH analizleri. (a) Kanalizasyon çamurunda nitrifikasyon yapan bakteriler. Kırmızı, amonyak oksitleyen (NH3 -> NO2~) bakteriler; yeşil, nitrit oksitleyen (NO2~—> NO3~) bakterilerdir. İki metabolik tipin yakın akraba olduklarına dikkat ediniz. Muhtemelen üreticilerden (amonyak oksitleyiciler) tüketicilere (nitrit oksitleyiciler) doğru NO2 çapraz beslenmeyi sağlamaktadır, (b) Bir kanalizasyon çamuru örneğinin konfokal lazer taramalı mikrografı. Örnek, her biri farklı bir floresan boya içeren (yeşil, kırmızı veya mor) ve her biri Proteobacteria'mn (Bacteha domainin birkaç önemli soyundan biri, Bölüm 12) farklı bir grubunu hedef alan üç filogenetik probla muamele edilmiştir. Yeşil-, kırmızı-, veya mor- boyanmış hücreler sadece tek bir probla muamele edilmiştir. Buna karşın mavi- ve san- boyanmış hücreler farklı renkleri veren iki probla reaksiyona sokulmuştur.
yonundan sorumlu, Ö^Ö Kısım 17.28), fotosentetik reaksiyon merkezini (anoksigenik fotosentez, Ö°Ö Kısım 17.4) veya spesifik ototrofik yolizlerini (CO2 fiksasyonu c*-^ Kısım 17.6 ve 17.7) kodlayan genler gibi spesifik, yüksek derecede korunmuş genlere sahip olan bakterileri tanılamak için kullanılmaktadır. Bir örnekteki floresan hücrelerin sayısı, doğal örnekteki yukarıdaki sırayla, azot fikse eden bakterilerin, fototrofik bakterilerin veya ototrofik bakterilerin sayısının bir tahmini olacaktır. Kromozom boyamanın tersine, in situ ters trankripsiyon (ISRT) FISH, doğal bir örnekteki hücreleKromozom Boyama ve in Situ Ters Transkripsiyon rin gen ifadesinin ölçümünde kullanılmaktadır (Şekil Diğer iki FISH teknolojisi kromozom boyama ve in 18.12£>,c). Bu metod doğal bir örnekteki hücreler ile situ ters transkripsiyondur. Sözü edilen ters trans- önceden transkribe edilmiş spesifik bir mRNA ile hibridize olan bir probun kullanımını içerir. Prob kripsiyon tekniği spesifik mRNA'yı hedeflerken bir kez reaksiyon verdiğinde, ters transkripsiyonla (böylece genler ifade edilir), kromozom boyama («3Oç> Kısım 9.13) komplementer bir DNA üretimi tekniği doğal örnekteki mikrofloranm spesifik gensağlanır ve sonra polimeraz zincir reaksiyonu (PCR, lerinin tanılanmasında kullanılmaktadır. c**> Kısım 7.9) ile çoğaltılır. Amplifiye edilen DNA Kromozom boyama, bir oligonükleotit probu daha sonra floresan bir prob ile reaksiyona sokulur veya tüm bir geni, gen setini ve hatta küçük prob (Şekill8.17b,c). ISRT FISH, doğal olarak doğal popüoluşturacak şekilde parçalanan tüm genomu florelasyonlardaki gen ifadesini kontrol eden faktörleri san etiketleme ile başlar. Problar daha sonra doğal araştırmak için ve bir örnekte yapılan deneysel sobir örnekteki organizmalardan elde edilen DNA'ya runların, spesifik genlerin transkripsiyonunu nasıl hibridize olurlar (Şekil 18.12a»). Kromozom boyaetkilendiğini göstermek için kullanılmaktadır. ma, doğal olarak nitrojenaz enzimini (azot fiksas-
604 • Bölüm 18 • Mikrobiyal Ekolojide Yöntemler •
Kromozom boyama ve ISRT FISH doğadaki hücreler hakkındaki farklı olayları ortaya çıkarır. Açıklayınız. • Bir toprak örneğindeki azot fikse eden bakterilerin sayımında hangi floresan tekniğini kullanırdınız?
Özgül Genlerin Özgül Organizmalara PCR Yoluyla Bağlanması Birçok ekolojik çalışma için organizmaları izole etmek, hatta saymak ya da Kısım 18.3 ve 18.4'te belirtilen boyaları kullanarak organizmaları mikroskopik yönden tanılamak gereksizdir. Aslında, kültür yapmaksızın ya da hücreleri gözlemleyerek bir habitatm biyoçeşitliliğinin araştırılması mümkündür. Bunun için, spesifik genler mikrobiyal topluluk içindeki biyoçeşitliliğin bir ölçüsü olarak karakterize edilmektedir. Mantıksal temeli ise aşağıda belirtildiği gibidir. Spesifik genler ekseriya spesifik organizmalar ile bağlantılıdır. Böylece, genin tanılanması organizmanın var olduğunu belirtir. Bu tip mikrobiyal topluluk analizlerinde çalışılan temel teknikler polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), denature edici gradient jel elektroforezi (DGGE) ya da moleküler klonlama ve DNA dizileme ve analizidir. Ayrıca, ileri(c)
• Şekil 18.12 Bakteriyal kromozom boyama ile çalışan floresan teknikler ve in situ ters transkripsiyon (ISRT). (a) Kromozom boyama. Escherichia coli (kırmızı) ve Oceanospirillum Unum (mavi) hücrelerinin karışımı. Her bir floresan boya temsili organizmadan elde edilen genomik DNA'dan oluşmuş DNA oligonukleotitlerine bağlanır. Her bir organizmanın genomlarında önemli sekans farklılıklarından dolayı etiketli genler sadece onların temsili organizmalarından elde edilen genomik DNA'sı ile hibridize olmaktadır, (b, c) ISRT. İki fotoğraf; Microbulbifer hydrolyticus (kısa şişkin çubuklar) ve Sagittula stellata (uzun, ince çubuklar) bakterilerinin karışık bir kültürünü göstermektedir. Sadece M. Hydrolyticus tarafından üretilmiş spesifik bir mENA'mn ters transkripsiyonu (<**sKısım 9.13) bir cDNA üretimini sağlamaktadır. Sonrasında cDNA, PCR ile çoğaltılıp floresan olarak etiketlenmiş bir prob ile hibridize edilmektedir, (b) bütün hücreler spesifik olmayan bir boya olan DAPI ile boyanmıştır (bakınız Şekil 18.6). (c) ISRT probu ile boyanmış hücreler. ISRT verisi, bir mikrobiyal topluluktaki organizmaların spesifik bir metabolik aktiviteyi gerçekleştirdiklerini anlamada yararlıdır.
18.4 Kavramların Çözden Geçirilmesi Çeşitli floresan boyama yöntemlerinin oluşu, nükleik asit problarmın gücünü gösterir ve bu yüzden bu tekniklerin boyama özellikleri oldukça spesifiktir. Bu yöntemler, filogenetik boyamayı ve ters transkripsiyon floresan in situ hibridizasyonu (FISH) kapsamaktadır. •
Hücrenin hangi kısmı filogenetik FISH'de floresan problar için hedeftir?
de göreceğimiz gibi, genomik teknikler de aynı zamanda mikrobiyal toplulukların kompozisyonunu karakterize etmede kullanılabilmektedir. Polimeraz Zincir Reaksiyonu ve Mikrobiyal Topluluk Analizi
PCR'ın prensibini Bölüm 7'de (««s Kısım 7.9) tartıştık. PCR'daki temel prensipleri hatırlayınız: (1) iki nükleik asit primeri bir hedef gen içindeki tamamlayıcı bir sekansa hibridize olur, (2) DNA polimeraz hedef geni kopyalar ve (3) hedef genin çoklu kopyaları, tamamlayıcı zincirlerin ayrılması, primerlerin bağlanması ve yeni sentezler şeklinde tekrarlanmasıyla yapılır (cwcs Şekil 7.28). Bir genin tek bir kopyasından milyonlarca kopya yapılabilir. Hangi genler hedef gen olarak kullanılmaktadır? Genellikle çoğaltılan gen 16S ribozomal RNA'yı kodlayan gendir. Gördüğümüz gibi, 16S rRNA dizi analizleri, mikroorganizmaların saf kültüründeki filogenetik akrabalıkları ortaya çıkarmak için kullanılabilmektedir (ÖOG Kısım 11.5 ve Şekil 11.13). Aynı şekilde, bir mikrobiyal topluluktan çoğaltılan İ6S genlerinin dizi analizleri o topluluğun filogenetik bir resmini çizebilir (Şekil 11.13). Alternatif olarak, spesifik bir organizmanın (ya da akraba organizma grubu) metabolizmasına özgü proteinleri kodlayan metabolik genler hedef genler olabilir. Ancak, PCR çoğaltımı için seçilen gen (veya genler) ile ilgili olarak, primerlerin spesifikliği şarttır. DNA kaynağı olarak doğal örneklerin kullanımında, primer dizaynı, tam ve kolay açıklanabilir PCR sonuçlarını elde etmede kritiktir.
İ.5 • Özgül Genlerin Özgül Organizmalara PCR Yoluyla Bağlanması • 605
MiKrooıyaı topluluk
i
DNA'yı ekstrakte et
mel metodu denature edici gradient gel elektroforezi
Toplam topluluk DNA'sı PCR
! Örnek
1 2
3 4
Genel veya özgül primerler kullanarak 16SrRNA genlerini çoğalt
Tüm 16S rRNA genleri Bantları çıkar ve 16SrRNA genlerini çoğalt
Farklı 16SrRNA genleri DGGE
Dizisini belirle Ağaç oluştur
sonuç ise bir jel üzerindeki hedef gen bantlarıdır (Şekil 18.13 ve 18.14»). İdeal olarak sadece verilen boyuttaki tek bir bant görülecektir (çoğaltılan DNA parçasının boyutu primerler arasındaki mesafe ile belirlenir). Eğer asıl hedef dizileme ise ilk olarak PCR ürünlerinin seçilmiş olması gerekir. Şimdi açıklayacağımız, PCR ürünlerinin ayrılmasının te-
Bantları çıkar
Dizisini Sizisin belirle Bacillus subtilis Bilinmeyen Bacillus türleri Ağaç Bacillus cereus oluştur Bacillus megaterium Düşük GC içerikli bilinmeyen gram pozitif Clostridium histolyticum Bilinmeyen Clostridium türleri
olarak adlandırılır. Denature Edici Cradient Jel Elektroforezi (DGGE): Benzer Genlerin Ayrılması
16S rRNA primerlerinin tek bir setinin kullanıldığı doğal mikrobiyal topluluklardan yapılan PCR çoğaltımı, tipik olarak tek bir boyutta çoğaltılan DNA parçasını taşıyan tek bir jel bandı oluşturur (Şekil 18.3 ve 18.14a). Ancak, saflığın görülmesine rağmen, bant doğal olarak istenilen gen ile yüksek oranda ilişkili fakat tanımlanmamış birçok gen içerir. Bu durum hedef genlerdeki başlama bölgelerinin (priming sites) yüksek oranda korunmuş olmasına rağmen, başlama bölgeleri (priming sites) arasındaki nükleotit sekansları, taşıyan farklı organizma türlerindeki hedef genin evrimsel farklılaşmasının bir sonucu olarak değişebileceğinden dolayıdır. Böylece, eğer amaç filogenetik analizlerdeki gibi çoğaltılmış genlerin dizilenmesi ise, dizi1
• Şekil 18.13 Bir mikrobiyal topluluğun PCR merkezli biyoçeşitlilik analizlerindeki basamaklar. Bu denemede toplam topluluk DNA'sından sadece düşük GC içerikli gram pozitif Bacteria'yı hedef alan primerler kullanarak bu bakterilerin 16SrRNA genleri amplifiye edilmiştir (Kısım 12.20). PCR bantları çıkarılmış ve farklı 16S genleri ya klonlayarak veya DGGE ile (bakınız Şekil 18.14i?) ayrılmıştır. DGGE jelde, örnek 2 ve 3'ün her biri tek tip bant içerirken 1, 2 ve 4 nolu örneklerde nasıl yaygın bant oluştuğuna dikkat ediniz. Dizi analizim takiben, filogenetik bir ağaç oluşturulur. Dizilerin çoğu herhangi bir tanılanmış türün 16S rRNA sekansına karşılık gelmemektedir bu yüzden "yeni" türlerin izolasyonu ümit edilmektedir. Bu tip bulgular; moleküler topluluk analizlerinde çok yaygındır çünkü doğada mevcut birçok organizma henüz kültüre edilememektedir.
Tipik bir topluluk analizi çalışmasında, toplam topluluk DNA bir mikrobiyal habitattan izole edilir (Şekil 18.13). Toprak ve diğer kompleks habitatlardan yüksek oranda saflaştırılmış DNA üreten uygun ticari kitler bu amaç için uygundur. Elde edilen DNA, habitatta orijinal olarak var olan tüm mikroorganizmalardan kaynaklanan karışık bir genomik DNA'dır (Şekil 18.13). Bu işlem, PCR'in, ilgilenilen hedef gen(leri)in bu karışımdan "çekip çıkarması" ve sekans analizi için yeterli kopyalarının yapılması işidir. Şekil 18.13 moleküler mikrobiyal topluluk analizindeki bir seri olayları göstermektedir. En son
2
3
(b)
• Şekil 18.14 PCR ve DGGE analizleri. DNA karışımı mikrobiyal bir topluluktan izole edilmiş ve Bacferia'nın 16SrRNA'sı için primerler kullanarak PCR amplifikasyonu yapılmıştır (a; kısım 1 ve 8). PCR ürünleri sadece tek bir bant vermiştir. Fakat bu ürünler DGGE ile saptandığında aslında altı ayn 16S rRNA gen sekanslarından ibaret olduğu ortaya çıkmıştır (b; kısım 1-8). Daha sonra bu altı bandın her biri saflaştırılmış, PCR ile tekrar amplifiye edilmiş (a; kısım 2-7) ve daha sonra da DGGE'de yürütülmüştür (b; kısım 2-7) Tüm bantların (a)'da PCR jelde aynı bölgede nasıl yürüdüğüne dikkat ediniz. Çünkü sekansları farklı olmasına rağmen onların tümü benzer büyüklüktedirler, (b)'de 2-7 kısımda her bir bant aynca sekanslanabilir ve Şekil 18.13'te gösterildiği gibi filogenetik bir ağaç oluşturulabilir.
606 • Bölüm 18 • Mikrobiyal Ekolojide Yöntemler
lemeden önce genin farklı formlarını tekrar çözmek için ek bir adıma ihtiyaç vardır. Bunu yapmanın tek yolu ise moleküler klonlamadır (Şekil 18.13, ««a Kısım 10.15). Alternatif olarak, baz dizisin'deki farklılıklardan dolayı ayrılma profillerinde farklılığa sahip aynı boyuttaki genlerin ayrılmasını sağlayan bir jel elektroforezi olan denature edici Gradient Jel Elektroforezi (DGGE) kullanılabilir (Şekil 18.13 ve Şekil 18.14b). DGGE bir üre ve formamid karışımı gibi DNA denaturantının bir gradienti olarak iş görür. Çift zincirli DNA parçaları yeterli denaturant içeren alana sahip jel bölgesinde hareket ettiği zaman zincirler hareket duraklarındaki noktalarda "ayrılmaya" başlar (Şekil 18.13 ve 18.14b). Ayrılma özelliklerindeki farklılıklar, büyük oranda baz dizilerindeki farklılıklar tarafından kontrol edilmektedir. Böylece, bir DGGE jel içinde gözlenen farklı bantlar sekansları değişen - ve bazen sadece çok azı- verilen bir genin farklı formlarıdır. DGGE gerçekleştirildiğinde, bantlar tek tek kesip alınabilir ve dizileri belirlenebilir (Şekil 18.13 ve 18.14). 16S rRNA genlerinin kullanımı, örneğin DGGE analizleri, bir habitatta var olan (farklı 16S rRNA genleri) filotip sayılarının detaylı bir tanılanmasını sağlar (Şekil 18.14b). Bu bantların dizi analizleriyle, topluluk içinde var olan gerçek türler, uygun veri tabanlarında, bilinen türlerle uygun dizilerin karşılaştırılmasıyla tanılanabilir (Şekil 18.13b). 16S rRNA'nın dışında metabolik genler için olan spesifik primerlerin kullanımı, spesifik gen taşıyan topluluk içindeki mevcut filotipler hakkında bilgi verir. Bir DGGE jel üzerinde elde edilen bantların sayısı, verilen bir gen hakkında habitatm biyokompleksliliği hakkında bir ipucu verir (Şekil 18.13 ve 18.14b). PCR Filogenetik Analizlerinin Sonuçları
Mikrobiyal toplulukların filogenetik analizleri, kalitatif analizlere ("hangi türler bulunur?") ilaveten kantitatif analizlerede ("her bir tipten kaç adet bulunur?") olanak sağlar. Aynı zamanda, bazı şaşırtıcı filogenetik açıdan çeşitli farklı organizmaları içeren sonuçlar da ortaya çıkarırlar. Hedef gen olarak 16S rRNA'nın kullanılmasıyla, pekçok doğal mikrobiyal topluluğun, laboratuvar kültürlerinden elde edilen ribozomal RNA dizileri birbiriyle uyum sağlamayan, filogenetik olarak farklılık değişik organizmaları bulundurduğu gösterilmiştir (Şekil 18.3 ve 18.4). Aslında, birçok durumda doğal topluluğun en çok bulunan üyeleri laboratuvar kültürleri yapılan türlerdir. Bu sonuçlar zenginleştirme kültür ile yapılan çalışmalarından elde edilen bilgilerimizin çok eksik olduğunu ve zenginleştirme sapanının (Kısım 18.1'e bakınız) büyük olasılıkla kültür-bağımlı biyoçeşitlilik çalış-
malarında ciddi bir problem oluşturduğunu açıkça ortaya koymaktadır. 18.5 Kavramların Gözden Geçirilmesi Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) küçük alt birim ribozomal RNA genleri ya da anahtar metabolik genler gibi spesifik hedef genleri çoğaltmada kullanılabilmektedir. Denature edici gradient gel elektroforezi (DGGE) doğal bir örnekte bulunan farklı türlerdeki bu genlerin büyük oranda farklı versiyonlarını belli oranda anlaşılması bakımından kullanılabilir. •
Primer özgüllüğünün, PCR ile yapılan başarılı mikrobiyal kommünite analizi için niçin anahtar olduğu söylenebilir? • PCR ile bir bant ve DGGE ile bir bant veren bir örneğin PCR/DGGE analizini yorumlaymız? PCR ile oluşturulan bir bant ve DGGE ile oluşturulan dört banttan ne sonuç çıkarırsınız? • Hedef gen olarak 16S ribozomal RNA kullanılan birçok moleküler doğal habitat çalışmalarından ne gibi şaşırtıcı bulgular elde edilmiştir?
Çevresel Genomu* (Metagenomiks) Mikrobiyal topluluklarla ilgili moleküler çalışmalara daha kapsamlı bir genetik yaklaşım ise, çevresel genomik ya da diğer bir adıyla metagenomiktir. Bu yaklaşımda, bir mikrobiyal topluluktan klonlanmış toplam DNA'nın rastgele dizi analizi (ÖQ& Kısım 15.2) o topluluğun tüm genlerinin ortaya çıkarılması için kullanılır (Şekil 18.15»). Çevresel genomikin hedefi birçok organizmanın saf kültürü için yapıldığı gibi, genom dizilerini tamamlamak ve bitirmek değildir (Bölüm 15). Bunun yerine düşünce, tanımlanabilir proteinleri kodlayan birçok geni taramak ve daha sonra hangi "filogenetik ağaca" ait olduğunu tanımlamaktır. Bu, 16S rRNA gibi filogenetik markerları içeren genlere eş dizilerle yapılır (Şekil 18.15). Aynı zamanda, önceki kısımda tartışılan moleküler topluluk analizlerinden gelen çevresel genomikleri ayırt etmek de önemlidir. Moleküler topluluk analizi tek bir genin biyoçeşitliliğine odaklanır. Aksi halde, çevresel genomiklerde mikrobiyal topluluk içindeki tüm genler- metagenom- örneklenir bu kommünitenin çok daha sağlam bir genetik resmini ortaya çıkarır. Çevresel genomik tek gen analizleri ile karşılaştırıldığında, daha büyük bir ölçeğe ve maliyete sahip olmasına rağmen, yaklaşım, doğal olarak daha detaylı bilgi verir. Dahası, metagenomik bir mikrobiyal topluluğun tek gen yaklaşımlarıyla gözden kaçırılmış olan özelliklerini ortaya çıkarabilir. Örneğin, Sargasso Denizinde yapılan prokaryotlarla ilgili metagenomik çalışmasında, önceden rRNA tabanlı topluluk analizleriyle gözden kaçırılmış olan muazzam bir çeşitlilik keşfedildi. Çünkü bu, PCR'da kullanılan üniversal ya da domainspesifik primerlerle tüm 16S rRNA genlerinin çoğaltılmasından kaynaklanmaktadır. Çoğaltılmayan
18 3 • Çevresel Genomiks (Metagenomiks) • 607 MiKrooıyaı topluluk
DNA'yı ekstrakte et
Topluluk örnekleme yaklaşımı
Toplam topluluk DNA'sı \
16S rRNA'yı kodlayan gen gibi tek geni çoğalt Dizisini belirle ve ağacı oluştur
Çevresel genomikler yaklaşımı Tüm DNA'nın restriksiyon kesimi ve rastgele dizi analizi Assemble ve kontrol
Üretilenler Filogenetik ağaç
Topluluğun toplam gen havuzu
1. Topluluğun birçok üyesinin filogenetik görüntüsü Yeni filotiplerin tanılanması
1. Tüm gen kategorilerinin tanılanması 2. Yeni genlerin keşfi 3. Özel filotiplere bağlantılı genler
• Şekil 18.15 Mikrobiyal topluluk analizlerinde tek gen ve çevresel genomik (metagenomik) yaklaşımlarının kıyaslanması. Metagenomik yaklaşımında, tüm topluluk DNA dizi analizinin yapıldığına; ancak, assemble ve kontrol genellikle saf kültürlerle yapıldığı için bütün "tamamlanmış genom" durumuna uygulanamadığına dikkat ediniz (Kısım 15.4). Bu yüzden assemble olmuş kromozomların küçük eksiklikleri olacaktır.
bu tip genler, elbette ki saptanmadan kalır. Çevresel genomik, önce PCR ile çoğaltmaksızın topluluk DNA'sının direkt olarak rastgele dizi analiziyle bu problemi orkadan kaldırır (Şekil 18.15). Bundan dolayı, tüm genler çoğaltılsın ya da çoğaltılmasın dizilenir.
İkinci bir örnekde, belirli Proteobakterilerde Kısım 13.3) bulunan ve ışık aracılı proton pompası olarak görev yapan proteorodopsini kodlayan genlerin, Sargasso Denizinde bulunan prokaryotların birçok yeni filogenetik grubu ile bağlantılı olduğu bulundu. Bu organizmaların kültürleri hala yapılamadığı için, bu metabolizma tipi ile bu spesifik filogeniler arasındaki bağlantı olmadığından şüphelenilmektedir. Bu örnekler, diğer yöntemlerle gösterilmesi mümkün olmayan mikrobiyal çeşitliliğin keşfi için, mikrobiyal genomiksin mikrobiyal ekolojiye nasıl yeni bir yaklaşım getirdiğini göstermektedir. Çevresel genomik her ikisi de mikrobiyal ekolojinin temel amaçları olan, mikrobiyal toplulukların hem filogenetik çeşitliliğini hem de metabolik çeşitliliğini tayin etmede güçlü bir olgudur. Dizileme maliyetini düşürdüğü gibi, muhtemelen daha fazla mikrobiyal topluluk analizleri genomik yaklaşımlara yönelecektir. Ancak, rastgele dizi analizine ilave olarak daha fazla hedeflenilmiş çevresel genomik yaklaşımları da olasıdır. Bunlar, özellikle mikrobiyal topluluklardaki gen ifadesini tayin etmede mikroarray'lerin kullanımını da kapsar (ooöKısım 15.11). Mikroarray'in kurgusuna bağlı olarak bir araştırıcı mikroarray'i kullanarak topluluğun her bir üyesinin, belirli grupların veya hatta mikrobiyal topluluğun geri kalan bölümünün transkripsiyonu üzerine çevresel parametrelerin etkisini ölçebilir. 18.6 Kavramların Gözden Geçirilmesi Çevresel genomik rastgele dizi analizi ve bir mikrobiyal kommünitede var olan organizmaların ortak genomlarının analizleriyle ilgilenir. • Metagenom nedir? • Çevresel genomik yaklaşımları, 16S rRNA gibi gen analizine dayanan mikrobiyal topluluk analizlerinden nasıl ayrılır?
DOĞADA MİKROBİYAL AKTİVİTE ÖLÇÜMÜ
Bu bölümdeki şimdiye kadar olan tartışmamızda biyoçeşitlilik üzerine yoğunlaştık. Şimdi ise (1) Pek çok olay arasında, çevresel genomik bilinen radyoizotopları, (2) mikroelektrodları ve (3) kararlı organizmalarda yeni genleri ve yeni organizmaizotopları kullanarak mikrobiyal aktivite ölçümüne larda bilinen genleri saptayabilir. Örneğin Sargasdönüyoruz. so Denizi çalışmalarında, belirli metabolizmaları FISH-MAR adlı bir teknik daha fazla hedeflekodlayan genler, bazen, bu genleri taşıdığı daha nilmiş aktivitenin tayinini göstermesine rağmen, önce bilinmeyen filogenetik grupların içinde budoğal bir örnekteki aktivite ölçümleri bütün miklundu. Örneğin, amonyak oksitleyen Bacteria'nm robiyal topluluk için ortak ölçümlerdir. Ancak, iyi (ctts Kısım 12.3 ve 17.12) anahtar enzimi olan dizayn edilmiş aktivite ölçümleri, bir habitattaki amonyak monooksijenaz enzimini kodlayan genlerin ana metabolik reaksiyonların hem tiplerini hem de Archaea'nın genomik yapısı içinde olduğu keşfediloranlarını ortaya koyabilir. Biyoçeşitlilik ölçümleri miştir. Böylece, amonyak oksitleyen Archaea'lar he- ile birlikte, bu parametreler o habitatın mikrobiyal nüz tanımlanmamasına rağmen, çevresel genomik ekolojisini tanımlar. Aynı zamanda bu parametrebu organizmaların kesin şekilde var olduklarını ler zenginleştirme kültürlerin tasarlanması için de göstermektedir. değerli bilgiler verir. Çevresel Genomiksin Potansiyeli
• Bölüm 18 • Mikrobiyal Ekolojide Yöntemler
Radyoizotoplar ve Mikroelektrotlar Pekçok durumda, mikrobiyal dönüşümlerin direk kimyasal ölçümleri, bir çevredeki mikrobiyal aktivite tayininde yeterli olur. Örneğin, bir sediment örneğindeki sülfat redükleyen bakteriler tarafından yürütülen laktat oksidasyonunun sonucu kolaylık2 la takip edilebilir. Laktat, tüketilir ve SO4 " H2S'e indirgenir (Şekil 18.16a»). Bu maddelerin tümü kimyasal açıdan kolaylıkla ölçülebilir. Ancak, oldukça yüksek duyarlılık gerektiğinde, dönüşüm oranlarının belirlenmesi gerekir, ya da bir molekülün akıbetinin takip edilmesi gereklidir, radyoizotoplar bu durum için oldukça uygundur. Örneğin, eğer fotoototrofi ölçülecekse ışığa bağlı olarak 14 CO2'nin mikrobiyal hücrelere alınması ölçülebilir (Şekil 18.16c). Eğer ilgilenilen sülfat indirgenmesi 35 2 35 ise, SO4 ~'nin H2 S'e dönüşüm oranları tayin edilebilir (Şekil 18.16c). Kemoorganotrofik aktivite, 14 C ile işaretli organik bileşiklerden 14CO2'nin saliminin izlenmesiyle kolaylıkla tayin edilebilir (Şekil İzotop metotları mikrobiyal ekolojide yaygın şekilde kullanılmaktadır. Ancak, bunlar, kontrollü olarak kullanılmak zorundadır, çünkü işaretli bileşiklerin bazı dönüşümleri tamamen (mikrobiyalden ziyade) kimyasal işlemlere bağlı olabilir. Burada ölü hücre kontrolü anahtardır. Ölçülebilen dönüşümün, ya mikrobiyal aktiviteyi engelleyen ya da fiilen organizmaları öldüren kimyasal ajan veya ısıtma işlemleri ile önlendiğini kesinlikle bilmek gerekir. Son konsantrasyonu %4 olan formalin, genellikle mikrobiyal ekoloji çalışmalarında Sülfat redüksiyonu
Fotosentez Aydınlık
Karanlık Zaman
FISH İle Radyoizotopların Kombinasyonu: FISH-MAR Radyoizotoplar, mikrootoradyografi (MAR) olarak adlandırılan mikroskobik bir teknikle mikrobiyal aktivite ölçümleri gibi kullanılabilir. Bu metotta, ya bir saf kültürün hücreleri olsun ya da bir mikrobiyal topluluktan alınan hücreler olsun, bu hücreler kemoorganotroflar için bir organik madde veya ototroflar için CO2 olabilen bir radyoizotopa maruz bırakılırlar. Bu maruz kalmayı takiben, hücreler daha sonra bir lama sabitlenir ve lam fotografik emülsiyona daldırılır. Bir süre karanlıkta bırakıldığında entegre olmuş substrattan kaynaklanan radyoaktif bozulma, emülsiyon içindeki gümüş zerreciklerini etkiler. Bunlar da hücrelerin içinde ve çevresinde siyah noktalar şeklinde belirir (Şekil 18.17««). Tanı ve aktivite ölçümlerini birleştirmede güçlü bir teknik olan FISH-MAR'da MAR FISH ile birleştirilebilir (Kısım 18.4'e bakınız). FISH-MAR, hem doğal bir örnek içindeki mikroorganizmaların metabolize ettiği partiküler bir radyoişaretli maddenin (MAR ile) tanılanmasma, hem de bunu yapan organizma(lar)ın tanılanmasma (FISH ile) olanak sağlar (Şekil 18.17b). FISH-MAR böylece basit tanılamanın ötesinde temel bir adımı gerçekleştirmektedir. Teknik, bileşenler üzerindeki değerli fizyolojik bilgileri de açığa çıkarır. Bu tip bilgiler sadece mikrobiyal ekosistemin aktivitesinin anlaşılmasında değil, aynı zamanda zenginleştirme kültürler için de yol göstericidir. Örneğin, hangi organizmaların hangi substratları metabolize ettiğinin bilinmesi, özgül zenginleştirme protokolerinin dizaynında kullanılabilir.
Zaman (b)
Mikroelektrodlar
Sülfat redüksiyonu
Formalin (hücreleri öldürür) kontrolü Zaman c)
bir kimyasal sterilant olarak kullanılır. Formalinin bu konsantrasyonu tüm hücreleri öldürür ve onun varlığında gerçekleşen radyoişaretli materyallerin dönüşümü yaşamsal olmayan süreçlere atfedilebilir (Şekil 18.1&0.
Zaman (d)
• Şekil 18.16 Mikrobiyal aktivite ölçümleri, (a) Sülfat indirgenmesi sırasında laktat ve H2S'in kimyasal analizi, (b-d) Radyoizotopların kullanımı, (b) 14CO2 içeren doğal deniz suyunda ölçülmüş fotosentez, (c) Bataklık çamurunda 35SO42~ kullanarak ölçülmüş sülfat indirgenmesi, (d) 14C-Glukozdan 14 CO'nin üretimi.
Mikrobiyal ekologlar doğadaki mikroorganizmaların aktivitesini çalışmak için mikroelektrotlar olarak adlandırılan küçük cam elektrodlar kullanırlar. En kullanışlı olan mikroelektrodlar pH, oksijen, N2O, CO2, H2 ya da H2S ölçümü yapanlardır. İfade edildiği gibi, mikroelektrotlar oldukça küçüktür, elektrotların uç kısımları 2-100/^m arasında değişir (Şekil 18.18a«). Mikroçevresel düzeyde mikrobiyal aktiviteyi takip etmek için bir milimetrelik veya daha küçük artışlarla elektrotlar habitat içine dikkatlice yerleştirilmelidir (Şekil 18.18b). Mikroelektrotlar çoğunlukla mikrobiyal fotosentez de dahil olmak üzere mikrobiyal aktivite çalışmalarında yaygın bir şekilde kullanılmaktadır.
18 7 • Radyoizotoplar ve Mikroelektrotlar • 609 Platin
Cam
Altın
(a)
• Şekil 18.18 Mikroelektrotlar. (a) Bir oksijen mikroelektrodunun şematik çizimi. Platin çubuk, bir katot olarak iş görür ve voltaj uygulandığında, O2 bir akım oluşturarak suya indirgenir. Katodun altın yüzeyinde O2'nin indirgenmesiyle oluşan akım, örnekteki oksijen konsantrasyonu ile orantılıdır. Elektrodun skalasma dikkat ediniz, (b) Mikrobiyal bir yığında kullanılan mikroelektrodlann fotoğrafı (bakınız Şekil 18.19a).
(c)
• Şekil 18.17 FISH-MAR. Floresan in situ hibridızasyonu (FISH), mikrootoradyografi (MAR) ile kombine haldedir, (a) gama Proteobacteria (FISH analizi ile) ve aynca bir ototrofa ait (MAR ile ölçülmüş 14CO2 alımı) kültürü yapılamamış bir filamentli hücre. Radyoaktif bozunma fotoğraf emülsiyonunu ışınlar ve siyah lekeler oluşur, (b) Escherichia coli (san hücreler) ve Herpetosiphon aurantiacus'un (filamentli, yeşil hücreler) karışık bir kültürü ile 14CO2'in alınması, (c), (b)'de görülen hücrelerin aynı sahadan MAR\. Alınan radyoaktivite filme yansıtılır ve sonuçta glukozun E. coli hücreleri tarafından asimile edildiğim, buna karşılık H. aurantiacus filamentleri tarafından edilmediğim göstermektedir.
Mikrobiyal yığınlar tipik olarak, en üst tabakada siyanobakterileri, bunun altındaki tabakada (yığının ışığı sınırlı aldığı yere kadar) ise anoksijenik fototrofik bakterileri ve daha aşağı tabakalarda özellikle sülfat redükleyici bakterilerden oluşan kemoorganotrofik bakterileri içeren mikrobiyal topluluklar şeklinde tabakalaşır (Şekil 18.18b ve 18.19«). Mikrobiyal yığınlar özellikle sıcak kaynak suları (Şekil 18.19) ve deniz gelgit alanları gibi oldukça farklı çevrelerde gelişirler. O2 mikroelektrotunun kullanımı ile mikrobiyal yığınlardaki (Şekil 18.19b) ya da toprak partiküllerindeki (oo& Şekil 19.2) oksijen konsantrasyonları çok iyi şekilde, iyi aralıklara oldukça doğru ölçülebilir. Bir mikromanipülatör, elektrotları bir örneğe kademe kademe dardırmak için kullanılır, böylece okumalar her 0,05-0,1 mm'de bir alınabilir (Şekil 18.18b ve 18.19b). Her biri farklı bir kimyasala duyarlı olan bir mikroelektrot setini kullanarak, aynı anda birçok mikrobiyal dönüşümün anlık ölçüm-
leri yapılabilmektedir. Örneğin, fotosentezin ve sülfat indirgenmesinin bir sonucu olarak birçok mikrobiyal çevrede her iki formun gradientlerinden dolayı oksijen ve sülfit ölçümleri sık sık birlikte yapılır (Şekil 18.18b). Alana yakın yerlerde O2 ve H2S karışmaya başlar, fototrofik ve kemolititrofik sülfür bakterilerin yoğun aktivitesiyle bu substratların her ikisi de en azından mikroelektrotların tespit sınırlarına kadar tükenebilir (Şekil 18.19b). Deney araçları olarak mikroelektrotları kullanarak, bir araştırıcı habitatı bozabilir. Oysa elektrotlar örneğin organik bir bileşiğin eklenmesiyle ya da yığın yüzeyini tarayarak batırılır ve bu bozulmaların spesifik bileşiklerin üretimi ya da tüketimi üzerine ne gibi bir etkisinin olduğu ölçülür. Bu tip çalışmalardan, bir çevrede gerçekleşen mikrobiyal etkileşim tiplerini sıklıkla algılamak mümkündür. Aynı zamanda deneyle cevapları alınabilecek spesifik sorular sormak mümkündür. Böylece, bir mikrobiyal çevrenin in-situ metabolizmasını modellemek mümkün olabilir. 18.7 Kavramların Çözden Geçirilmesi Doğal örneklerdeki mikroorganizmaların aktivitesi radiyoizotopların ve/veya mikroelektrodlann kullanımıyla çok duyarlı bir şekilde tayin edilebilir. Birçok durumda, ölçümler, tek bir tür popülasyonundan ziyade bir mikrobiyal topluluğun net aktivitesi ile ilgilidir. • •
Niçin radyoizotoplar mikrobiyal aktivite ölçümlerinde bu kadar kullanışlıdır?
Kısa adı MAR olan yöntem nedir ve MAR reaksiyonları nasıl saptanır? • Bir mikroelektrodun nasıl iş gördüğünü açıklayınız.
610 • Bölüm 18 • Mikrobiyal Ekolojide Yöntemler Enzim substartı
CO ? fikse eden enzimler
• Şekil 18.20 Örnek olarak karbonun kullanıldığı izoz 13 topik fraksinasyonun mekanizması. CO2'nin CO 2 'e göre doğada bulunma oram yaklaşık 19:l'dir. CO2'i fiske eden 12 enzimler tercihen daha hafif izotopu ( C) tercih eder. Bunun 12 sonucunda, fikse edilmiş karbon C bakımından zengin olup 13 başlangıç substratında bulunan C, bu fiske edilmiş karbon 13 içinde oldukça azalmıştır. C eksikliğinin derecesi isotopik bir fraksinasyon olarak hesaplanır (hesaplama için Şekil 18.21 'deki açıklamaya bakınız).
200
400
600
800
1000
O2 or H2S (nM)
• Şekil 18.19 Mihrobiyal yığınlar ve onlan çalışmak için mikroelektrodlann bunlarla çalışmada kullanımı, (a) Kısım (b)'de gösterilen denemede kullanılan ve sıcak su kaynağından alınmış bir mikrobiyal yığının fotoğrafı. Üst tabaka (koyu yeşil) siyanobakterileri (Kısım 12.25), altta birkaç tabaka anoksijenik fototrofik bakterileri (turuncu), özelliklede Chloroflexus'u (Kısım 12,35) içerir. Yığımn tümünün kalınlığı yaklaşık 2 cm'dir. (b) Sıcak su kaynağında bulunan mikrobiyal yığındaki oksijen, sülfür ve pH mikroprofilleri. Ordinat üzerindeki milimetrik eksen skalasına dikkat ediniz.
•
Kararlı izotoplar Birçok elementin nötron sayılarının değişimiyle izotopları oluşur. Belli başlı izotoplar kararsızdır ve radyoaktif bozunma sonucunda yıkıma uğrarlar. Kararlı izotoplar olarak adlandırılan diğer izotoplar radyoaktif değildirler ve ancak mikroorganizmalar tarafından farklı bir şekilde metabolize edilirler. Kararlı izotoplar doğadaki çeşitli mikrobiyal dönüşümlerin çalışılmasında kullanılabilir (Şekil 18.20»). Mikrobiyal ekolojide yapılan çalışmalarda, kararlı izotop için en kullanışlı olduğu kanıtlanan iki element karbon (özellikle CO2) ve kükürttür (özellikle SO42~ ve H2S). Karbon, doğada başlıca 12C olarak bulunur, ancak küçük bir kısmı (yaklaşık %5) 13 C olarak bulunur. Diğer taraftan, kükürt başlıca 32 S olarak bulunmakla birlikte bir miktar sülfür 34S olarak bulunur. Belirli bir bileşikteki bu izotopların doğada bulunma düzeyleri, C ve S, organizmalar tarafından metabolize edildiğinde değişmektedir çünkü biyokimyasal reaksiyonlar daha hafif izotop-
lan tercih eder. Yani, bileşikler enzimler tarafından metabolize edildiklerinde, daha ağır izotop, daha hafif izotoptan ayrılmaktadır (Şekil 18.20). Örneğin, CO2 fototrofik bir organizmaya verildiği zaman, karbon standartı ile ilişkili olarak hücresel karbonun 13C formu azalarak 12C formu artmaya başlar. Aynı şekilde, sülfatın bakterial indigenmesinden oluşan sülfür, jeokimyasal olarak oluşan sülfürden daha hafiftir. İzotopik Fraksinasyon olarak bilinen bu işlem (Şekil 18.20), eşsiz bir biyolojik olaydır ve partiküler bir dönüşümün mikrobiyolojik olup olmadığını anlamak amacıyla bir deneme olarak kullanılabilmektedir. Mikrobiyal Ekolojide İzotopik Fraksinasyonun Kullanımı
Bir örneğin izotopik bileşimi onun geçmişteki biyolojik bir kaydını taşır (Şekil 18.21 •). Karbon yönünden (Şekil 18.21), bitki materyali ve petrol (bitki materyalinden oluşan) benzer izotopik bileşimlere sahiptir. Her iki kaynaktan gelen karbon izotopik olarak biyolojik olmayan bir standarttan daha hafiftir çünkü 13CO2'nin ayrıldığı bir yol iziyle CO2 olarak fiske edilir (Şekil 18.21). Üstelik mikrobiyolojik kökenli metan oldukça hafif olup bu hafiflik, metanojenik Archae'nın (c«s Kısım 13.4) temel bir yolda ı3 C'ün ayrıldığını belirtir. Diğer taraftan, denizel karbonatlar kesin şekilde jeolojiktir (Şekil 18.21). Biyolojik ve jeolojik kökenli karbonlardaki 12 C ve 13C'nin oranlarının farklılıklarından dolayı, jeolojik katmanların 13 C/ 12 C izotop oranı eski zamanlardan kalma kayalardaki hayatsal faaliyetleri yerinde tayin etmek için kullanılmaktadır. İlginç bir şekilde, 3,5 milyar yıl kadar eski olan kayalardaki organik karbon bu zamanda yaşamın varlığı hakkındaki görüşü destekler biçimde bir takım fraksinasyonlar göstermektedir (Şekil 18.21).
18 8 • Kararlı izotoplar • 611
Denizel karbonat
I Volkanik kayalar H Denizel • sülfat
Atmosferik CO2 Kavlin döngüsü bitkileri
Sedimentel sülfit
Petrol
Meteorik sülfit
Metan
Aya ait sülfit Siyanobakteriler
Denizel bataklıktan gelen sülfit Elemental kükürt
Mor kükürt bakterileri Yeşil kükürt bakterileri -30 Yeni denizel sedimentler
-20
-10
0 10 34 5 S(% 0 )
20
30
3,5 milyar yıl yaşında kayalar -80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
+10
13
S C(° / O o)
• Şekil 18.22 Çeşitli kükürt içeren maddelerde 34S ve 32S için değer aralıklarını belirten kükürtün izotop jeokimyasının özeti. Değerler her bir kısımda binde (%o) olarak verilmiştir ve formülü kullanarak hesaplanmıştır:
• Şekil 18.21 Çeşitli maddelerin karbo n izotopik bileşenleri. Değerler her bir kısımda binde (%o) olarak verilmiştir ve formül kullanarak hesaplanmıştır: (13C/12C örnek)- (13C/I2C standart) ( I3 C/ l2 C standart)
X 1000
Standart, PeeDee kaya oluşumundan gelen bir belemnit örneğidir. Ototrofik organizmalar tarafından fikse edilmiş karbonun l 2 C bakımından zenginleşmiş ve 13C bakımından fakirleşmiş olduğuna dikkat ediniz.
Doğadaki sülfat indirgeyen bakterilerin aktivitelerini, 34S/32S'nin fraksinasyonuyla tanımlamak kolaydır (Şekil 18.22«). Standart bir sülfür ile karşılaştırıldığında, biyojenik olmayan sülfür oldukça ağır iken (örneğin volkanik depozitlerden oluşan volkanik kayalardaki gibi), sedimental sülfür 32S bakımından oldukça zengindir (Şekil 18.22). Fraksinasyon, sülfür döngüsü içindeki bu önemli bağlantıların bir araştırıcı tarafından izlenmesine imkan verir ve jeolojik katman aralarındaki kükürt döngünde rol alan prokaryotlarm aktivitelerini izlemede yaygın bir şekilde kullanılır. Sülfür izotop analizleri aynı zamanda, Ayda hayat olmadığının kanıtı olarak ta kullanılmaktadır. Örneğin, Şekil 18.22'deki bilgiler aydaki kayalarda bulunan sülfürlerin izotopik bileşiminin biyojenik sülfür yerine standart sülfür ile oldukça yakın olduğunu göstermektedir. Dünyadaki moleküler oksijen, siyanobakteriler tarafından yürütülen oksijenik fotosentez sonucunda oluştuğu için, oksijen izotopik analizleri (18O/16O), dünyanın anoksik çevreden oksik çevreye geçişini izlemek için kullanılmaktadır. Bu araç kullanılarak, dünyanın oldukça kademeli şekilde oksijenlendiğini ve mevcut oksijen seviyelerinin
(34S/32S örnek)- (34S/32S standart) (34S/32S standart)
X 1000
Standart, Canyon Diablo meteoritinden gelen bir demir sülfür mineralidir. Biyojenik orijinli sülfürün ve kükürtün 34S bakımından azalmış (32S bakımından zenginleşmiş) olduğuna dikkat ediniz.
yalnızca geçen 750 milyon yıl içinde ortaya çıktığını göstermek mümkün olmaktadır (005 Kısım 11.3 ve Şekil 11.8). Sonsöz Mikrobiyal ekologların takım çantasmdaki bazı tekniklerin anlaşılmasıyla birlikte mikrobiyal ekoloji disiplinini keşfetmek için Bölüm 19'a ilerliyoruz. Bu bölümde mikrobiyal toplulukların yapısı ve onların doğadaki temel aktiviteleri üzerinde duracağız. Birçok durumda, bu bölümde tanımlanan bir ya da daha fazla aracı, önemli kuralları anlatmaya yardımcı olmak için ve yüksek oranda farklılık gösteren mikrobiyal topluluklardaki aktif olan mikrobiyal türlerin büyük kısmını tanılamak için kullanacağız.
m
18.8 Kavramların Gözden Geçirilmesi
İzotopik fraksinasyon, çeşitli maddelerin biyolojik kökenlerini ortaya çıkarabilir. Fraksinasyon, substratlarma bağlandığında bir elementin daha ağır formunu ayrıştıran enzimlerin aktivitesinin bir sonucudur. •
Bir maddenin 12C/13C bileşenleri kendi olası biyolojik kökenlerini nasıl ortaya çıkarır?
•
Aydaki sülfürlerin niçin izotopik açıdan ağır olduklarının en basit açıklaması nedir?
612 • Bölüm 18 • Mikrobiyal Ekolojide Yöntemler
DEĞERLENDİRME SORULARI 1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Zenginleştirme kültür tekniğinin temeli nedir? Niçin bir zenginleştirici besiyeri bakterilerin yalnızca belirli bir grup veya gruplarının zenginleştirilmesi için uygundur (C«j Kısım 18.1)? VVinogradsky kolonunun prensibi nedir ve bu kolon hangi organizmaların tiplerinin zenginleştirilmesini sağlar? Bir sıcak su kaynağındaki mikrobiyal bir yığın gibi ekstrem bir ekosistem çevrede bulunan organizmaların zenginleştirilmesinde VVinogradsky kolonu nasıl kullanılabilir (cXKy Kısım 18.2)? Doğal bir örnekten bakteri sayımı için kullanılacak plan EMS'nin prensibini tanımlayınız (<*fe Kısım 18.2). Niçin lazer cımbızlar bir örnekte düşük sayılarda bulunan organizmaların elde edilmesi için seyreltme ve sıvı zenginleştirme metotlarından daha iyidir (£»to Kısım 18.2)? Doğal çevrelerdeki bakterilerin sayımı için kullanılan floresans boyaların ve floresan antibadileri karşılatırınız. Bu metotların her birinin ne gibi avantajları ve sınırlamaları vardır (C^b Kısım 18.3)? Mikrobiyal ekolojide nükleik asit probları kültür metotları kadar duyarlı olabilir mi? Nükleik asit metotlarının kültür metotları üzerinde hangi avantajlara sahiptir? Dezavantajları nelerdir (<W> Kısım 18.4)? Kromozom boyaması nasıl çalışır? Niçin bu boyama bazı spesifik metabolik süreçlerin gerçekleştirebildi-
8.
9. 10.
11. 12.
13. 14.
ği bir habitatta mikroorganizmaların sayımı için iyi bir yöntem olabilir (C**3 Kısım 18.4)? Yeşil floresans proteini nedir? Örneğin bir filogenetik strainin boyanmasıyla oluşan floresans bir hücreden yeşil floresanslı bir hücre ne gibi yöntemlerle ayrılır (SOQ Kısım 18.4)? Bir mikrobiyal topluluğun filogenetik resmi topluluk üyelerini kültüre etmeksizin nasıl elde edilebilir (ö«S5 Kısım 18.5)? Spesifik bir primer setinin kullanılmasıyla toplam topluluk DNA'smın PCR amplifikasyonundan sonra, niçin onları sekanslamadan önce ya klonlamak ya da ürünler üzerinde DGGE uygulamak gereklidir ( OQG Kısım 18.5)? Çevresel genomiklerin yeni bir organizmanın bilinen bir metabolizmasının nasıl keşfedildiğine bir örnek veriniz (O£*> Kısım 18.6)? Mikrobiyal ekoloji çalışmalarında radyoizotopik metotlarının önemli avantajları nedir? Fototrofik bakterilerle 14CO2 alımını göstermek için veya sülfat indirgeyen bakteriler ile35SO42~ indirgenmesini göstemek için bir izotopik deneye ne tür kontrolleri (en az iki tane tartışınız) eklerdiniz (£*%s Kısım 18.7)? FISH'in tek başına yeterli olamadığında FISH-MAR size ne anlatabilir (cfb Kısım 18.7)? Ototrofik organizmaların kenedilerince alman CO 2 'den daha mı fazla yoksa daha mı az 12C içerecektir Kısım 18.8)?
UYGULAMA SORULARI 1.
2.
3.
Niçin nitrifikasyon yapan bakteriler için zenginleştirme Tablo 18.1'de tanımlandığı gibidir? Niçin kaynak ve koşulların her ikisi de gereklidir? (Cevaplamadan önce Kısım 12.3 ve 17.12 materyali incelemek istemelisiniz.) Toprakta kükürt oksitleyen bakterilerin aktivite ölçümü için bir deney tasarlayınız. Eğer mevcut kükürt oksitleyicilerin sadece belirli türleri metabolik olarak aktifse bunu nasıl anlatabilir diniz? Sizin aktivite ölçümlerinizin biyolojik aktiviteden dolayı olduğunu nasıl kanıtlardınız? Kültürünün hiçbir şekilde yapılamayan Archaea'nm bir göl suyu örneğinde olup olmadığını bilmek istiyorsunuz. Bu bölümde tanımlanan teknikleri kullanarak, örnekte Archaea'nm varolup olmadığını nasıl saptardınız ve onlar varsa, göl suyu içinde hücrelerin ne kadarı Archaea'dır ?
4.
5.
Çeşitli toprak örneklerinde Calvin döngüsünü kullanan ototrofik büyüme yeteneğinde organizmaların bulunup bulunmadığını tanımlamak istiyorsunuz («3^s Bölüm 17.6). Bu yol izi eşsiz bir enzim olan ribuloz bifosfat karboksilaz (RubisCO) gerektirir. Bunu yapabildiğiniz iki yol tanımlayınız, bunlardan biri bir mikroskobik metot kullanılması ve diğeri de ya kültür metodu ya da mikroskobik metodu içermeyen bir metot kullanılması. Aşağıdaki problemi çözmek için bir deney tasarlayınız. H 'nin sınırlı olduğu veya olmadığı anoksik göl sedimentlerinde metanojenezin (CO2+4H2 —> CH4+H2O) oranını belirleyiniz. Ayrıca, dominant metanojen (bunların Archaea olduğunu hatırlayınız, ö°B Kısım 13.4) morfolojisini belirleyiniz. Son olarak, çözeltideki toplam Archeal popülasyonu ve toplam prokaryotik popülasyonunda baskın metanojenin hangi yüzdede olduğunu hesaplayınız.
M1KROBIYAL EKOLOJİ
I 19.1 19.2 19.3
II 19.4 19.5 III 19.6 19.7 19.8 IV
Mikroorganizmalar doğada birbirleri ile ve bitkiler ve hayvanlarla etkileşim içindedirler. Şekilde, su eğreltisi olan Azolla ve azot fiksasyonu yapan simbiyotik siyanobakter cinsi Anabaena arasındaki yararlı birliktelik görülmekte olup hücreler bitki yapraklarındaki boşluklarda yaşarlar.
v-
MIKROBIYAL EKOSISTEMLER Popülasyonlar, Birlikler ve Topluluklar Çevre ve Mikroçevre Yüzeylerde Mikrobiyal Gelişme ve Biyofilmler TOPRAK VE TATLI SU MİKROBİYAL HABİTATLARI Karasal Çevreler Tatlısu Çevreleri DENİZ MİKROBİYOLOJİSİ Denizel Habitatlar ve Mikrobiyal Dağılım Derin-Deniz Mikrobiyolojisi Hidrotermal Bacalar KARBON VE OKSİJEN DÖNGÜLERİ
19.9 Karbon Döngüsü 19.10 Sintrofi ve Metanojenez 19.11 Geviş Getiren Hayvanlarda Karbon Döngüsü V
DİĞER ÖNEMLİ BESİN DÖNGÜLERİ
19.12 Azot Döngüsü 19.13 Kükürt Döngüsü 19.14 Demir Döngüsü VI
19.15 19.16 19.17 19.18
614 614 61S 617
619 619 623 624
625 627 628
632
632 634 637
640
641 642 644
MİKROBİYAL BİYOREMEDİASYON
647
Cevherlerden Mikrobiyal Liçing Civa ve Ağır Metal Dönüşümleri Petrolün Biyoyıkımı Ksenobiyotiklerin Biyoyıkımı
647 649 651 653
613
614 • Bölüm 19 • Mikrobiyal Ekoloji
VII
19.19 19.20 19.21 19.22
BİTKİLERLE
İLİŞKİLER
MİKROBİYAL 655
Bitki Çevresi Likenler ve Mikoriza Agrobacterium ve Taç Tümörü Hastalığı Kök Nodul Bakterileri ve Baklagil Bitkileri ile Simbiyoz
656 656 659 661
BOLÜMLE İLGİLİ SOZLUK Anoksik oksijensiz bir çevre, genelliklede yüksek derecede indirgen (düşük E'o> Asidik maden drenajı demir sülfür minerallerinin mikrobiyal oksidasyonundan açığa çıkan H2SO4'ü içeren asidik su Azot fiksasyonu azotun amonyağa mikrobiyolojik olarak indirgenmesi Bakteroid Legüm bir bitkinin kök nodülü içinde bulunan ve N 2 fikse edebilen morfolojik olarak şekilsiz Rhizobium hücreleri Barofilik 1 atm'den daha büyük bir basınç altında bulunduğunda en iyi büyüyen bir organizma Barotolerant artan basınç altında da büyüyebilen fakat en iyi atmosferik basınçta büyüyebilen bir organizma Biyofilm porlu bir cıvık materyalle çevrilmiş ve bir yüzeye tutunmuş mikrobiyal hücre kolonileri Biyojeokimya biyolojik olarak gerçekleşen kimyasal dönüşümlerin çalışıldığı bilim dalı Biyokimyasal oksijen ihtiyacı bir su örneğinin mikrobiyal oksijen tüketme özelliği Biyoremediasyon mikroorganizmalar aracılığıyla petrol, toksik kimyasallar ve diğer kirleticilerin temizlenmesi Denitrifikasyon NO~3'ın azot gazı bileşiklerine indirgendiği mikrobiyal süreçler Ekosistem organizmaların bir topluluğu ile onların doğal çevresi
Enfeksiyon iplikçiği kök nodüllerinin oluşumu esnasında Rhizobium hücrelerinin hedefe ulaşmak için kullanabildiği ve kök hücrelerim enfekte edebildiği selülozik bir tüp Guild metabolik olarak birbirleri ile ilişkili olan mikroorganizmaların bir popülasyonu Hidrotermal ağız derin-denizdeki bir ılık veya sıcak su kaynağı Kara baca hem sıcak su hem de çeşitli mineralleri dışarı salan aşırı derecede sıcak (250-350°C) derin-deniz sıcak su kaynağı Kometabolizma bir bileşiğin primer enerji kaynağı olarak kullanılan ikinci bir organik bileşik varlığındaki metabolizması Kök nodülü simbiyotik azot-fikse eden bakterileri içeren bitki köklerindeki tümör benzeri bir büyüme Ksenobiyotik doğada doğal olarak gerçekleşmeyen tamamen sentetik olan ürün Leghemoglobin kök nodüllerinde bulunan O -bağlayan bir protein Liken bir fungus ve bir algin (veya siyanobakteri) simbiyotik ilişki içinde yaşaması Mikoriza bir mantar ve bir bitkinin kökleri arasındaki simbiyotik ilişki Mikrobiyal liçing mikrobiyal aktiviteler sonucu sülfürlü cevherlerden bakır gibi değerli metallerin uzaklaştırılması Mikroçevre bir mikrobiyal hücre veya hücreler grubunun etrafında bulunan çevre
ikroorganizmalar doğada yalnız değillerdir. Bir ekosistemde bulunan her bir mikroorganizma hem onun çevresiyle hem de diğer mikroorganizmalar ile ilişki içindedir. Bu ilişkiler sonucunda diğer organizmalara yararlı veya zararlı olabilecek önemli kimyasal ve fiziksel çevre değişiklikleri olabilir. Mikroorganizmaların zararlı, yararlı, veya nötral, tüm aktiviteleri biyosferin çalışmasında önemli ölçüde kontrol edilmektedir. Bu bölümde biz bu önemli mikrobiyal aktiviteleri inceleyeceğiz. İlk önce genel olarak mikrobiyal ekosistemlere bakacağız ve daha sonra mikroganizmatoprak, tatlısu, ve okyanuslar için birkaç farklı çevreleri inceleyeceğiz. Biz daha sonra dünya üzerinde bitki yaşamının devam etmesine yardımcı olan besin döngüleri üzerinde yoğunlaşarak mikrobiyal ekolojide bazı anahtar reaksiyonları inceleyeceğiz.
M
Nitrifikasyon NH 3 'ın NO3~ a okside edildiği süreç Oksik oksijen-içeren bir çevre, doğal olarak yüksek bir E'0'a sahip Pirit genel bir demir-içeren cevher, FeS2 Primer üretici CO2'den yeni organik materyal sentezlemek için ışığı kullanan bir organizma Proteorodopsin ATP oluşumunu katalizleyen ve bazı açık okyanuslarda Bacteria domaininde bulunan ışığaduyarlı bir protein Redüktif deklorinasyon C-Cl'den C-H'a karbon atomunu uzaklaştırarak bir organik bileşikten Cl'un Ch şeklinde uzaklaşması Rizosfer bitki köklerine oldukça yakın bölge Rumen içinde selülozun sindiriminin gerçekleştiği geviş getiren hayvanların çok kanallı midesindeki ilk bölme Sintrofi tek bir organizma tarafından gerçekleştirelemeyen bir süreci gerçekleştirmek için iki veya daha fazla mikroorganizmanın işbirliği kurduğu metabolik bir süreç Ti plazmiti bitkilere genleri transfer edebilen
Agrobacterium
tumefaciens
bakterisinde bulunan konjugatif bir plazmit Uçucu yağ asitleri (VFAs) rumen fermentasyonu esnasında üretilen temel yağ asitleri (asetat, propiyonat ve bütirat)
Bitki ve hayvanlarla mikroorganizmaların özel bazı ilişkileri inceleyerek kışımı bitireceğiz.
m
MİKROBİYAL EKOSISTEMLER
Popülasyonlar, Birlikler ve Topluluklar Doğada, Mikrobiyal hücreler popülasyonları oluşturmak üzere çoğalır. Metabolik olarak birbiriyle ilişkili popülasyonlara birlikler (guild) denir ve birlikler de mikrobiyal topluluklar (microbial community) içinde etkileşirler (Şekil 19.1»). Mikrobiyal topluluklar, sonraki süreçte makroorganizma toplulukları ile ve tüm ekosistemi ifade eden çevre ile ilişkiye girer.
19.2 • Çevre ve Mikroçevre • 615
Topluluk 1 Fotik zon: Oksijenik fototroflar 6CO 2 + 6 H 2 O — * C6H12O6 + 6 O2
t
Topluluk 2 Oksikzon: Aeroblar ve fakültatif aeroblar C6H12O6• 6O2 6CO2
Topluluk 3 (Sedimentler): . t
Anoksik zon: Fermentatif ve diğer anaeroblar 1. Birlik 1; metanojenik bakteriler (CO2 —»-CH») homoasetojenik bakteriler (CO2 —*- asetat) ; 2. Birlik 2: sülfat-indirgeyen bakteriler (SO/'—*- H2S) sülfür-indirgeyan bakteriler (S°—*• H2S) 3. Birlik 3: denitrifikasyon yapar» bakteriler (NO3~ — » . Ng) ferrik demir-indirgeyen bakteriler (Fe'3+ 4. Birlik 4: fermentatif bakteriler (şekerlerin, amino ve yağ asitler ve bunu gibi maddelerin fermente
• Şekil 19.1 Popülasyonlar, birlikler ve topluluklar -birgöl ekosisteminde mikrobiyal topluluk yapısına bir örnek, mikrobiyal komuniteler çeşitli türlerin hücrelerinin popülasyonlanndan ibarettir. Bir göl ekosisteminde, burada gösterildiği gibi çeşitli topluluklar bulunmaktadır. Sediment topluluğu için, temel guildler belirtilmektedir. CO2, SO,,2", S°, NO3" ve Fe3+'nın indirgenmesi Kısım 17.13-17.18'de tartışıldığı gibi anaerobik solunum örnekleridir.
Enerji, güneş ışığı, organik karbon ve indirgenmiş inorganik maddeler formunda ekosisteme girer. Işık, sadece karbonu değil aynı zamanda azot, kükürt, fosfor, demir, ve diğer elementleride içeren yeni organik maddelerin (Şekil 19.1 •) sentezlenmesi için fototrofik organizmalar (csa^Kısım 17.1-17.5) tarafından kullanılır. Dışarıdan ekosisteme giren organik madde (allokton) organik madde denir) ile bu yeni sentezlenmiş organik madde ve indirgenmiş organik maddeler kemoorganotrofik organizmaların metabolik aktivitelerinin sürmesini sağlar. Bunun aksine kemolititroflar, H2, Fe+2,S°, veya NH 3 gibi inorganik elektron vericilerinden enerjilerini elde ederler (<*%> Bölüm 17). Biyojeokimyasal Döngüler Mikroorganizmalar çevrede birkaç elementin, özelliklede karbon, kükürt azot ve demirin biyojeokimyasal döngüsünde önemli bir rol oynamaktadır. Bu kimyasal dönüşüm çalışmalarına biyojeokimya denir. Bir biyojeokimyasal döngü, bu anahtar elementlerin canlı sistemlerdeki döngüsü esnasında biyolojik ve kimyasal ajanlarla katalizlenen dönüşümlerini tanımlamaktadır. Element, ekosistem (Şekil 19.1) içinde hareket ettiği için ekseriya bu döngüler oksidasyon-redüksiyon reaksiyonlarını içermektedir (cfKi Kısım 5.6). Örneğin hidrojen sülfür formunda olan sülfür bir grup mikroorganizma tarafından, hem fototrofik ve hem de kemoorganotrofiklerce
hem kükürte (S°) hem de sülfata (SO42~) okside edilebilir. Sülfat sonrasında sülfat indirgeyen bakterilerin aktiviteleriyle sülfüre indirgenebilir. Sülfürün biyojeokimyasal döngüsü, sülfitin açığa çıkmasıyla tamamlanır (bak Şekil 19.29). Çeşitli tipte mikroorganizmalar biyojeokimyasal döngülere katılırlar ve çoğu durumda bu organizmalar diğer organizmaların, özellikle bitkilerin, ihtiyaç duyduğu element formlarını oluşturma yeteneğine sahip tek biyolojik ajanlardır. Biz bu bölümde karbon, azot, kükürt ve demiri de kapsayan birçok biyojeokimyasal döngüyü tartışacağız. 19.1 Kavramların Gözden Geçirilmesi Mikrobiyal topluluklar metabolik olarak ilişkili organizma birliklerinden ibarettir. Mikroorganizmalar enerji dönüşümlerinde ve canlı sistemlere gerekli elementlerin tekrar kazanılmasını sağlayan biyojeokimyasal süreçlerde en önemli rolü oynarlar. •
Bir mikrobiyal topluluktan bir mikrobiyal birlik nasıl ayrılır?
•
Bir biyojeokimyasal döngü nedir?
Çevre ve Mikroçevre Mikroorganizmalar yaşamlarını sürdüreceği uygun habitatlarda yaşarlar. Mikrobiyal habitatlar son derece çeşitlidir ve bu çeşitlilik hızlı bir şekilde değişir. Toprak ve su genel habitatları yanında, mikroorganizmalar daha yüksek organizmaların yüzeylerinde ve çoğu durumda ise onların içinde de yaşarlar. Mikroorganizmalar çoğunlukla böyle habitatlarda yüksek sayılara ulaşırlar ve önemli derecede besin açısından bitki veya hayvana avantaj sağlayabilirler. Mikroorganizma ve Mikroçevre Laboratuvar kültüründeki gibi, doğada mikroorganizmaların gelişmesi, besinlerin elde edilebilirliğine ve gelişme koşullarına bağlıdır (Tablo 19.1). Besinlerin tipi ve miktarındaki farklılıklar ile bir habitatın fizikokimyasal koşulları her bir özel organizma için niş'i ifade etmektedir. Ekolojik teori, her bir organizma için en başarılı olduğu ve prime niş olarak ifade edilen, en az bir nişin, bulunduğunu belirtmektedir. Organizma prime nişe hakimdir, ancak diğer nişlere de yerleşebilir; bu durumda yerleştiği nişlerde gösterdiği başarı prime nişte gösterdiği başarıdan daha az olacaktır. Yeryüzünde sayısız mikrobiyal niş mevcuttur ve azda olsa bu kadar fazla miktardaki metabolik çeşitlilik (c**s> Bölüm 17) ile biyoçeşitliliğin (003 Bölüm 12-14) evrimleşmesinde katkısı vardı.. Mikroorganizmalar çok küçük oldukları için habitatları da küçüktür. Bir mikrobiyal ekolog, mikroorganizma habitatıyla ilgili mikroorganizmanın yaşadığı ve metabolizmasını sürdürdüğü yer anlamında mikroçevre terimini kullanır. Mikrobiyologlar mikroorganizma ile çevresini düşündüğünde küçüklük kavrammının önemini
616 • Bölüm 19 • Mikrobiyal Ekoloji
Tablo 19.1
Doğada mikrobiya! gelişmeyi yöneten başlıca kaynaklar ve koşullar
Kaynaklar
Koşullar
Karbon (organik, CO2) Azot (organik, inorganik) Diğer makrobesinler (S, P, K, Mg) Mikrobesinler (Fe, Mn, Co, Cu, Zn, Mn, Ni) 2 3+ O 2 ve diğer elektron alıcıları NO3-, SO4 ', Fe , vb. 2+ + İnorganik elektron vericileri (H 2 , H 2 S, Fe , NH 4 , NO/, vb.
Sıcaklık: soğuk —> ılık —> sıcak Su potansiyeli: kuru —>• nemli —> ıslak pH:0->7-+14 O2: oksik —> mikrooksik —> anoksik Işık: parlak ışık ~» az ışık —> karanlık Ozmotik koşullar: tatlısu —» denizel —» aşırı tuzlu
bilmelidir. Örneğin, tipik bir S^um'lik çubuk şekilli bakterinin habitatmda 3 mm'lik uzunluk insan göz önüne alındığında 2 km'den daha fazla uzaklık anlamına gelir ve bu 3 mm'lik uzaklıktaki kimyasal ve fiziksel değişimler organizmayı büyük ölçüde etkileyebilmektedir. Örneğin 3 mm'lik bir toprak partikülünde, çoğu yönden kimyasal ve fiziksel olarak farklı birkaç mikroçevre mevcuttur. Bunu bir toprak partikülünde oksijen gibi önemli bir mikrobiyal besinin dağılımına baktığımızda görebiliriz. Mikroelektrotlar (o«3& Kısım 18.7) küçük toprak partikülleri içinde oksijen konsantrasyonlarını ölçebilirler. Gerçek bir denemeden elde edilen verilerden görüleceği gibi (Şekil 19.2*), toprak partikülleri oksijen içeriği bakımından homojen değildir. Küçük toprak partikülünün dış zonu tamamen oksiktir. Merkez ise (sadece kısa bir mesafe) tamamen anoksik (O2-siz) olabilir (Şekil 19.2). Biz bu şekilde, farklı nişlerin çok küçük çaptaki partiküllerde olabileceğini ve Şekil 19.2'de görüldüğü gibi niçin çeşitli fizyolojik tipte mikroorganizmaların tek bir "toprak partikül"ünde birlikte bulunabileceğini anlamış oluruz. Anaerobik organizmalar özellikle partikülün merkezine yakın yerlerde aktif olabilir. Mikroaerofiller (çok düşük oksijene gereksinim duyan aeroblar) merkezden daha dışarıya doğru alanlarda aktif olabilirler. Obligat aerobik organizmaların metabolizmaları, partikülün en dış ve tamamen oksik çevresinde aktiftir. Fakültatif anaeroplar partikül içinde dağılabilirler («»t» Kısım 6.15). Bir mikroçevrede fizikokimyasal koşullar hem geçici olarak ve hem de mikroçevre içindeki boşluğa bağlı olarak hızlı bir şekilde değişebilir. Örneğin, Şekil 19.2 de verilen oksijen konsantrasyonları "anlık" ölçümleri göstermektedir. Bir mikrobiyal solunum periyoduna takiben alınmış ölçümler veya topraktaki su içeriğinin artışı sonrasında alınmış ölçümler mikroçevre içindeki oksijenin miktarındaki hızlı değişimleri gösterecektir. Bu nedenlede, mikroçevrelerin heterojen oldukları ve bir mikroçevredeki koşulların hızlı bir şekilde değişebileceği sonucu çıkartılabilir. Bu şekildeki mikroçevreler nispeten küçük fiziksel bir partikülde yüksek mikrobiyal çeşitliliği sağlamaktadır. Nutrient (Besin) Seviyeleri ve Gelişme Oranlan
Nutrientler (veya ekolojik anlamda, kaynaklar, bakınız Tablo 19.1) genellikle belli] aralıklarla bir eko-
sisteme girer. Fazla miktarda nutrient -örneğin yaprak döküntüleri, ölü balık veya hayvan karkası- belli bir süre nutrient eksikliği periyodunu takiben ekosisteme girebilir. Bu yüzden doğada mikroorganizmalar "hem bolluk hem de kıtlıkla" karşı karşıya kalırlar ve bu yüzden birçok mikroorganizma, depo materyalleri olarak kaynaklar izin verdiği durumda depo polimerleri üretir. Rezerv polimerleri, nutrient azlığı periyodu sırasında kullanmak amacıyla, istenen büyüme koşullarında fazla nutrientleri depolarlar. Rezerv materyallerine örnek olarak poli-^-hidroksi bütirat ve diğer alkonatlar, polisakkaritler, polifosfat ve diğerleri sayılabilir Kısım 4.11). Doğada mikroorganizmaların logaritmik üremesi nadirdir. Büyüme tipik olarak nutrientlerin elde edilebilirliği ile ilişkili olarak gerçekleşir. Nadir olarak fizikokimyasal koşulların aynı zamanda optimum olmasından dolayı doğada mikroorganizmaların gösterdikleri büyüme oranlarının laboratuvarda kaydedilmiş büyüme oranlarından oldukça düşük olduğu saptanmıştır. Örneğin, sindirim sisteminde Escherichia coli'nin iki katma çık-
E
g
| o
3
0 Uzaklık (mm)
* Şekil 19.2 Bir toprak partikülünde 0 2 konsantrasyonunun dağılım haritası. Eksenler partikül çapını göstermektedir. Dağılım üzerindeki sayılar O2 konsantrasyonunu göstermektedir (yüzde olarak, hava %21 O2). Mikroorganizmaların oksijen ile ilişkisi bakımından, her bir zon farklı bir mikroçevre.
19 3 • Yüzeylerde Mikrobiyal Gelişine ve Biyofilmler • 617
ma zamanı yaklaşık 12 saat iken (her gün 2 defa iki katına çıkma) saf kültür halinde en iyi koşullarda, 20 dakika'lık minimum bir iki katına çıkma zamanı gibi çok kısa bir sürede çoğalmaktadır. Tipik toprak bakterilerinin doğadaki çoğalma hızı laboratuvarda çoğalma maksimum çoğalma hızlarının % Tinden daha azdır. Bu yavaş çoğalma oranlarının olası nedenleri şunlardır; 1. Nutrientlerin (Kaynaklar, Tablo 19.1) genellikle az miktarda bulunması ve/veya gelişme koşullarının optimalden uzaklaşması 2. Mikrobiyal habitat içindeki nutrientlerin dağılımının eşit miktarda olmaması ve 3. İstisnalar olsa da mikroorganizmalar doğal çevrelerde saf kültür halinde bulunmadıklarından diğer mikroorganizmalarla rekabet etmeleri gerekir. Mikrobiyal rekabet ve ilişki Elde edilebilir besinler için mikroorganizmalar arasındaki rekabet birkaç faktöre bağlı olarak şiddetli olabilir. Bu faktörler; besin alımındaki hıza, kalıtsal metabolik özelliklere ve son olarakda gelişme oranlarına bağlıdır. Her popülasyonun yoğunluğunun mikroorganizmanın bulunduğu habitatın onun prime nişine benzerlik derecesiyle orantılı olduğu tipik bir habitat, farklı mikroorganizma karışımı içerecektir (Şekil 19.1). Aynı nutrient için direk rekabet etme yerine, bazı mikroorganizmalar tek başlarına iken gerçekleştiremedikleri transformasyonları birlikte gerçekleştirirler. Sintrofi («»5Kısım 17.21) denen mikrobiyal ilişkinin bu şekli bazı anaerobiklerin (Kısım 19.10'da anlatılacak) rekabet başarısının artmasını sağlamaktadır. Metabolik ilişkiler komplementer metabolizmayı gerçekleştiren organizma gruplarının aktivitelerinde de görülebilir. Örneğin; Bölüm 17'de nitrit ve nitrat bakterileri gibi iki farklı organizma grubunun yer aldığı metabolik tarnsformasyonları tartıştık. Bu organizmalar birlikte NH 3 'ü NO 3 J e okside edebilirler. Oysa her iki grup tek başına bu olayı gerçekleştiremez (^saKısım 17.12). Nitrit bakterilerinin ürünü (NO2~) nitrat bakterileri için substrat olduğu için bu tip organizmalar beklendiği gibi doğada sıkı ilişki içindedirler ( ^ s Şekil 18.12a).
•
Niçin çok farklı fizyolojik grup organizmalar tek bir habitat içinde yaşayabilmektedirler?
Yüzeylerde Mikrobiyal Gelişme ve Biyofilmler Nutrientleri adsorbe etmelerinden dolayı yüzeyler önemli mikrobiyal habitatlardır. Bir yüzeyin mikro çevresindeki nutrient miktarı sıvı solusyondakinden çok daha fazla olabilir. Bu nedenle, yüzeylerdeki mikrobiyal sayı ve aktivite sıvıdakinden çok daha fazladır. Mikroskop lamları organizmanın tutunduğu ve geliştiği deneysel yüzeyler olarak iş görebilir. Bir lam bir mikrobiyal habitata batırıldıktan bir süre sonra alınır ve mikroskopta incelenir (Şekil 19.3««). Böyle yüzeylerdeki mikrokoloniler, doğadaki doğal yüzeylerde geliştiği kadar iyi gelişir. Gerçekte, batırılmış mikroskop lamlarının periyodik mikroskop incelemesi doğada tutunmuş mikroorganizmaların gelişme oranlarını ölçmede kullanılmaktadır (c«a Şekil 6.20b). Organik madde partikülü gibi bir nutrient de bir yüzey olabilir. Böyle yüzeylere tutunmuş mikroorganizmalar partikülün yüzeyinden direk olarak nutrientleri katabolize eder. Örneğin, bitki materyalleri toprakta hızlı bir şekilde mikroorganizmalar tarafından kolonize edilir ve basit boyama teknikleri ile bu tip katı yüzeye tutunmuş mikrobiyal popülasyonları saptanabilir (Şekil 19.3b) Biyofilmler Mikroorganizmalar, çoğu zaman bir yüzeye tutunmuş bakteriyal hücre yığınları ve hücreler tarafından salınmış yapışkan polisakkarit ile çevrelenmiş yapılar olan biyofilmlerle kaplanmış yüzeylerde
19.1 Kavramların Gözden Geçirilmesi Mikroorganizmalar çok küçük organizmalar olup aynı şekilde habitatları da küçüktür. Mikroçcvre, mikroorganizmanın yaşadığı gerçek yerdir. Doğada mikroorganizmalar ekseriya kıtlık-veya-bolluk içinde yaşarlar. Böylebir nişte sadece en iyi adapte olan türler iyi gelişir. Mikroorganizmalar arasındaki birliktelik, pek çok mikrobiyal ilişkide önemlidir. •
Belirli bir mikroorganizmadan oluşan nişi hangi özellikler tanımlar?
• Şekil 19.3 Yüzeylerde bulunan mikroorganizmalar, (a) Küçük bir nehirde suya batırılmış bir mikroskop lamı üzerinde gelişen bakteriyal koloniler. Parlak partiküller mineral meddedir. Kısa, çubuk-şekilli hücreler yaklaşık 3 |jm uzunluğundadır, (b) Toprakta bitki köklerini kolonize eden doğal bir mikrobiyal topluluğun floresans fotomikrografı. Mikrokoloni gelişimine dikkat ediniz. Preparat akridin oranj ile boyanmıştır.
618 • Bölüm 19 • Mikrobiyal Ekoloji
orum sensing denen bir mekanizma, ö°a» Kısım 8.10) ve bunun sonucunda biyofilm gelişir (Şekil 19.4a). P. aeruginosa akciğerlerde güçlü bir biyofilm şekli olan pnömoni belirtileri ile ortaya çıkan kistik fibröz hastalığı ile tanınmaktadır.(Kısım 8.10 ve 31.7). Niçin Bakteriler Biyofilm Oluşturur? Şüphesiz organizmaların yaşamasını ve büyümesini arttırdığı için bakteriler biyofilm oluşturur. Biyofilm oluşturmak için en az dört neden mevcuttur. Birincisi, biyofilmler bir korunma şeklidir. Biyofilmler, tutunmamış hücrelerin uzaklara sürüklenmesine sebep olan fiziksel kuvvetlere, bağışıklık sistemi hücrelerinin fagositozuna, antibiyotikler gibi toksik maddelerin penetresyonuna karşı hücreleri korumaktadır. İkincisi, biyofilm oluşumu hücrelerin uygun bir nişte kalmasını sağlar. Hayvan dokuları gibi nutrientce zengin yüzeylere veya nehirdeki bir kaya gibi (Şekil 19.4c), akışkan sistemlerdeki yüzeylere tutunmuş biyofilmler, nutrientlerin genellikle daha bol olduğu veya sürekli olarak nutrientin geldiği bir bölgede bakteriyal hücreleri sabitler. Üçüncüsü, biyofilmler oluşur, çünkü bakteriyal hücrelerin
• Şekil 19.4 Mikrobiyal Biyofilmler. (a) Bir deneyde Pseudomonas aeruginosa hücrelerinin oluşturduğu biyofilmin bir kesitsel görünüşü. San-yeşil tabaka (yaklaşık 15 um derinlikte) hücreleri içermekte olup alkalin tosfataz enzimi aktivite boyama ile boyanmıştır. Kırmızı alan yüzeydir, (b) Bir yaprak yüzeyi üzerinde gelişen doğal bir biyofilmin konfokal lazer taramalı mikroskopisi (Cf%$ Kısım 4.2). Hücrelerin rengi biyofilm içindeki derinliklerini gösterir: kırmızı, yüzey üzerindeki hücreleri; yeşil, 9 um derinlikte; mavi, 18 um derinlikte, (c) demirce-zengin Rio Tinto, İspanya bölgesinde kayalann yüzeyinde demir-oksitleyen prokaryotlann oluşturduğu bir biyofilm. Biyofilm üzerinden ve içinden Fe2+ zengin su geçtiğinde, demir-oksitleyen mikroorganizmalar enerji elde etmek için Fez+'yi Fe3+'e dönüştürürler (O^ö Kısım 17.11).
gelişirler (Şekil 19.4»). Biyofilmler mikrobiyal popülasyonun büyümesi için gerekli nutrientleri tutar ve akış sistemlerinde (Şekil 19.5*) bulunan yüzeylerden hücrelerin kopmasını engeller. Biyofilmler tipik olarak fazlaca porsu yapı içerir ve her bir tabakada bulunan mikroorganizmaların mikroskobik incelenmesi taramalı lazer konfokal mikroskobuyla yapılabilir (<**> Kısım 4.2) (Şekil 19.4) Hücreler arası iletişim, biyofilm gelişimi ve devamlılığında önemlidir. Bir yüzeye bir hücrenin tutunması biyofilm-spesifik genlerin ifadesi için bir sinyaldir. Bu genler hücreler arası sinyal molekülleri sentezleten ve polisakkarit oluşumunu başlatan proteinleri kodlar (Şekil 19.5a). Bilinen bir biyofilm oluşturucu olan Pseudomonas aeruginosa'da (Şekil 19.4ö), ana sinyal molekül homoserin laktonlar denen bileşiklerdir. Bu moleküller biriktiğinde, bu moleküller P. aeruginosa hücrelerinin yakınında toplanan kemotaktik ajanlar olarak iş görürler {au-
Tutunma (birkaç hücrenin uygun bir katı yüzeye yapışması)
Kolonileşme (hücrelerarası iletişim, gelişme ve polisakkarit oluşumu)
Gelişme (daha fazla gelişme ve daha fazla polisakkarit)
• Şekil 19.5 Biyofilmler. (a) Bakteriyal bir biyofilm oluşumu. Biyofilm birkaç hücrenin tutunması ile başlar, sonra gelişme ve hücreler arası iletişim gerçekleşir. Polisakkarit oluşumu gerçekleşir ve biyofilm geliştikçe daha fazla yoğunlaşmaya başlar, (b) Boyanmamış çelik bir boru üzerinde gelişen DAPI ile boyanmış (C°2> Kısım 18.3) biyofilmin fotomikrogrfı. Su kanallanna dikkat ediniz.
19.4 • Karasal Çevreler • 619
birbirleriyle yakın ilişki içerisinde yaşamaları sağlanır. Böylece, P. aeruginosa'da gördüğümüz gibi, hücrelerin yararına olan sinyal moleküller sayesinde hücreler arası iletişim kolaylaşır. Dahası, hücreler birbirlerine yakın olduklarında genetik değişim fırsatı ortaya çıkar. Ve dördüncüsü, biyofilmler kültür besiyerindeki gibi zengin nutrient konsantrasyonu olmayan doğada görülen bakteriyal hücre büyümesinin tipik bir şeklidir. Diğer bir deyişle, biyofilm laboratuvarda görülen zengin sıvı kültür yaklaşımına karşı doğada prokaryotlar için büyümenin "olağan" şekli olabilir. Biyofilm Kontrolü Biyofilmler tıpta ve ticari diğer sistemlerde önemli bir yere sahiptir. Vücutta, bir biyofilm içinde bulunan bakteriyal hücreler; bağışıklık sistemi, antibiyotikler ve diğer antimikrobiyal ajanlara karşı korunurlar. Biyofilmler birçok medikal ve dental koşullarda ayrıca periodontal hastalıklar, böbrek taşları, tüberküloz, Lejyoner hastalığı ve Staphylococcus enfeksionlarmda önemli etkilere sahiptir. Medikal implantlar biyofilm gelişimi için mükemmel yüzeylerdir. Bunlar; üriner kakater gibi kısa süreli aletler yanında yapay eklemlerde olduğu gibi uzun süreli aletleride içermektdir. Tahminler, Birleşik Devletlerde yılda 10 milyon kadar insanda implantlardan oluşan veya kullanışsız medikal işlemler yüzünden biyofilm enfeksiyonları oluştuğunu göstermektedir. Biyofilmlerin niçin rutin ağız hijyeninde bu kadar önemli olduğu anlaşılmaktadır. Dental plak tipik bir biyofilm olup dental çürüklerden sorumlu asit-üreten bakterileri içermektedir («aoo Kısım 21.3). Endüstriyel koşullarda biyofilmler borular içindeki suyun, petrolün veya diğer sıvıların akışını yavaşlatabilmekte ve boruların korozyonunu arttırabilmektedir. Biyofilmler ayrıca, açık deniz platformları, gemiler, ve kıyılardaki batık nesnelerin parçalanmasını başlatabilir. îçme suyu güvenliği su dağıtım şebekelerinde bulunan borularda (Birleşik Devletlerde çoğunlukla yüzyıla yakın geçmişi vardır) gelişen biyofilmlerce tehlikeye girmektedir. Su borularındaki biyofilmler çoğunlukla zararsız bakteri içermelerine rağmen, eğer patojenler başarıyla biyofilme kolonize olurlarsa onları öldürmek için standart klorlama işlemi yetersiz kalır. Hücrelerin periyodik salınımı hastalığın yayılmasına sebep olabilir. Kolera etkeni (£*-*£> Kısım 28.5 olan Vibrio cholera'nın bu tarzda yayılabildiğine dair bir takım bilgiler mevcuttur. Biyofilm kontrolü büyük bir iştir ve bu işi başaracak sınırlı düzeyde araç vardır. Boruları ve diğer yüzeyleri biyofilmlerden arındırmak için bir çok endüstri kuruluşu her yıl milyarlarca dolar harcamaktadırlar. Biyofilmlere nüfuz eden yeni antibiyotikler ve hücrelerarası iletişimi bozarak biyofilm oluşumunu önleyen bir takım ilaçlar geliştirilmektedir. Örneğin furanonlar denen bir grup kimyasal
abiyotik yüzeylerde gerçekleştirilen testlerde biyofilm önleyicisi olarak umut vermiştir. Furanonlar kararlı ve insanlara toksik olmadıkları için, onların ayrıca tıpta antibiyofilm ajanlar olarak ta uygulaması olabilir. — [(Hu 19.3 Kavramların Gözden Geçirilmesi Biyofilmler yüzeyler üzerinde oluşan cıvık materyal kaplanmış bakteriyal birlikteliklerdir. Biyofilmler bakteriyal hücrelerden salınmış ürünlerle birlikte inert yüzeylerin yıkımını sağlayabilmektedir. Biyofilm oluşumu hücreler arası iletişimin olduğu karmaşık bir işlemdir. • Biyofilm matriksinin kimyasal doğası nedir? • Niçin bir biyofilm akışkan sistemlerde yaşayan bakteriyal hücreler için iyi bir habitat olabilmektedir? • Birçok insanda bulunabilen ve tıbbi anlamda söylenebilecek bir biyofilm örneği veriniz.
TOPRAK VE TATLI SU MİKROBİYAL HABİTATLARI Başlıca mikrobiyal habitatlar arasında gölleri, doğal havuzları ve akarsuları içeren tatlı sular ile topraklar sayılmaktadır. Topraklar ve sular fiziksel yapıları nutrient bileşimi, sıcaklığı ve su potansiyeli bakımından değişiklik gösterir. Bu faktörlerin tümü mevcut mikroorganizma çeşitliliği ve sayısını etkilemektedir.
Karasal Çevreler Toprak kelimesi altında yatan anakayadan ayrı bir tabaka olarak Dünya yüzeyinin dış gevşek tabakasını ifade etmektedir (Şekil 19.6*). Toprağın gelişimi, asıl materyal (kaya, kum ve buzulların taşıdığı taş ve toprak vb.), topografi, iklim ve canlı organizmalar arasındaki karmaşık ilişkileri kapsamaktadır. Karasal çevreleri düşündüğümüzde, dikkatimiz toprağa ve bitkilere yönelmektedir. Çünkü ekosistemin fonksiyonunu etkileyen anahtar süreçlerin çoğu toprak içinde, bitki üzerinde veya yakınında gerçekleşir. Topraklar 2 ana kısma ayrılabilir; mineral topraklar ve organik topraklar. Onlar özellikle kayaların ayrışmasından ve diğer inorganik materyalden veya bataklık sedimentasyonundan oluşmaktadır. Burada çoğu alanlarda asıl kısım olan mineral toprak üzerinde durulacaktır. Toprak Oluşumu Topraklar, fiziksel, kimyasal ve biyolojik işlemlerin kombine bir sonucu olarak oluşur. Bu işlemlere maruz kalmış bir kaya incelendiğinde alg, liken (Kısım 19.20) veya yosunların oluştuğu görülecektir. Bu organizmalar kuru kara yüzeyinde uyku halinde (dormant) kalabilirler ve daha sonra ortamda nem bulunduğunda büyüyebilirler. Onlar fototrofiktirler ve kemoorganotrofik bakteri ve fungusların büyümesini sağlayan organik madde üretirler.
620 • Bölüm 19 • Mikrobiyal Ekoloji
O bölgesi dekompompoze olmamış — bitki materyalleri tabakası A bölgesi yüzey toprağı (organik maddece zengin, renk koyu, tarım için tilled, bitkiler ve yüksek sayıda mikroorganizma burada gelişir; mikrobiyal aktivite yüksek) B bölgesi toprak altı (toprak yüzeyinden süzülen mineraller, humus vb "maddeler burada birikir; az organik madde; A bölgesinden daha düşük • D j r mikrobiyal aktivite) toprak tabanı (direk olarak _kaya yataklarınden gelişir; genellikle mikrobiyal aktivite çok düşük)
Kemoorganotrofların sayısı yüzeyi örten bitki miktarıyla direk olarak artar. Kemoorganotrofların solunumu sonucunda üretilen karbondioksit, karbonik asite dönüşür (CO2 + H2O =^=^ H 2 C O 3 ) - B u da özellikle kireç taşından ibaret kayaların çözünmesinde önemli bir ajandır. Birçok kemoorganotroflar ayrıca kayaların daha küçük parçalara ayrılmasını sağlayan organik asitler üretir. Donma, çözünme ve diğer fiziksel işlemlerde kayalardaki çatlakların ilerlemesini sağlar. Ham bir toprak bu çatlaklarda oluşur ve öncü bitkiler oralarda gelişebilmektedir. Bitki kökleri daha ileri düzeyde çatlaklara nüfuz eder ve kayanın parçalanmasını arttırır ve onların salgıları rizosfer mikroflorasınm (bitki köklerinin etrafındaki toprak, bakınız Şekil 19.3b) gelişmesini arttırır. Bitkiler öldüklerinde onlardan artakalanlar toprağa karışır ve mikrobiyal gelişimi daha da arttıran nutrientler açığa çıkar. Mineraller çözünür hale geçer. Su bu kimyasalları daha derinlere taşır. Bu işlemler devam ettikçe toprağın kalınlığı artar ve daha fazla bitkinin gelişmesine izin verir. Toprak hayvanları görülmeye başlar ve toprağın üst tabakalarında karıştırma ve havalandırmayı sağlayarak önemli rol oynarlar. Materyallerin aşağıya doğru hareketi toprak profilini oluşturur (şekil 19.6). Tipik toprak profilinin oluşması klimatik ve diğer faktörlere bağlıdır. Fakat bu işlem yüzlerce yılı alan çok yavaş bir işlemdir. Bir Mikrobiyal Habitat Olarak Toprak
Mikrobiyal büyüme en fazla toprağın yüzeyinde, genellikle rizosferde gerçekleşir (Şekil 19.2, 19.3b, ve
* Şekil 19.6 Toprak, (a) Olgun bir toprak görünüşü. Toprak horizonlan toprak bilimcileri tarafından toprak zonlan olarak ifade edilmektedir, (b) O, A ve B horizonlanm gösteren bir toprak görünüşünün fotoğrafı. Carbondale, Illinois'den çekilen bu fotoğraf kilce zengindir ve bu yüzden çok küçük partiküller içermektedir ve çok yoğundur. Bunun gibi topraklar temel bir bileşen olarak kum içerenler kadar iyi drain olmazlar.
19.6b). Küçük toprak parçaları bile çok farklı mikroçevrelere sahip olabilirler (Şekil 19.2 ve 19.7«'yi kıyaslayınız). Böylece birkaç farklı tipte mikroorganizma görülebilir. Toprak partiküllerini direk olarak incelemek için genellikle fluoresans mikroskop kullanılır. Bu yöntemde topraktaki organizmalar fluoresan bir boya ile boyanırlar (bakınız Şekil 19.3 V) Bir toprak partikülündeki spesifik bir mikroorganizmayı gözlemlemek için, floresan-antibadi boyama (<*»a Şekil 18.8) veya filogenetik boyalar (C*3G Kısım 18.4) kullanılabilir. Mikroorganizmalarda ayrıca Taramalı (Scanning) elektron mikroskobu (Şekil 19.8«) yardımı ile toprak yüzeylerinde gözlenebilir. Taramalı elektron mikroskobu toprak
Mikrokoloniler
• Şekil 19.7 Mineral ve organik bileşenlerden oluşmuş ve toprak mikroorganizmalarının yerleşimini gösteren bir toprak agregatı. Çok az mikroorganizma toprak solüsyonunda serbest halde bulunur; Onların çoğu toprak partiküllerine tutunmuş mikrokoloniler halindedir.
19.4 • Karasal Çevreler • 621 • Şekil 19.8 Taramalı elektron mikroskobuyla toprak partikülleri yüzeyinde bulunan mikroorganizmaların gözlemlenmesi, (a) kısa, çubuk-şekilli bakterilerin oluşturduğv-*ir mikrokoloni. (b) Aktinomiset sporu (Kısım 12.24). (a)'da hücreler (b)'de sporlar yaklaşık 1-2 pm geruşliğindedir. (c) Fungal hif. Fungal hif yaklaşık 4 ym genişlikte olup mineral madde ile kaplıdır.
bakterilerinin morfolojisi hakkında mükemmel bilgi sağlamakta olup ayrıca toprak partikül yüzeylerindeki hücrelerin sayımında da kullanılabilmektedir. Topraktaki mikrobiyal aktiviteyi etkileyen ana faktörlerden biri suyun elde edilebilirliği olup biz daha önce mikrobiyal büyüme üzerinde suyun önemini tartışmıştık («aaaKısım 6.14). Su toprağın değişebilir bileşenlerinin başında olup topraktaki miktarı; yağmur suyuna, drenaja ve bitki örtüsüne bağlıdır. Su iki şekilde toprakta tutulur. 1- yüzeylere adsorpsiyonla 2- Toprak partikülleri arasında ince tabaka veya filmler halinde serbest su olarak. Toprakta suyun varlığı ile onun içindeki materyaller toprak solüsyonu olarak ifade edilir. İyi karışmış topraklarda, hava kolayca toprağa girer ve orada oksijen konsantrasyonları yükselebilir. Ancak, ıslanmış topraklarda bu oksijen mikroorganizmalarca hemen tüketilebilir. Böyle topraklar çabucak anoksik hale gelir. Böyle toprakların biyolojik özelliklerinde önemli değişiklikler görülmektedir. Biz Kısım 19.2 ve Şekil 19.2'de toprak mikroçevresindeki oksijen ilişkilerini tartışmıştık. Toprağın nutrient yapısı (kaynaklar, Tablo 19.1) mikrobiyal aktiviteyi etkileyen diğer önemli faktördür. En önemli mikrobiyal aktivite özellikle rizosfer civarındaki organik maddelerce zengin yüzey tabakalarındadır (Bakınız Şekil 19.6b). Toprak mikroorganizmalarının sayısı ve aktivitesi büyük oranda mevcut nutrient dengesine bağlıdır. Bazı topraklarda karbon, sınırlayıcı nutrient değildir bunun yerine fosfor ve azot gibi inorganik nutrientlerin elde edilebilirliği mikrobiyal üretkenliği sınırlamaktadır. Kara Yüzeyinin Derinliklerinin Mikrobiyolojisi Yer altı suyunun kimyasal yapısına ve kirleticilerin potansiyel liçingi (leaching) ve yer altı suyuna onların taşınmasına olan ilgi derin yüzeyaltı karasal çevrelerde mikroorganizmaların oynadığı rol üzerine çalışmalar artmaktadır. Toprak yüzeyinin birkaç yüz metre aşağısına uzanan derin toprak yüzeyaltı biyolojik bir atık alanı değildir. Hücre sayıları bir
toprak katmanındakinden çok daha düşük olmasına rağmen (Şekil 19.6) mikroorganizmalardaki bir farklılık, özellikle bakteri farklılığı, derin yüzey altı topraklarında mevcuttur. Örneğin, aseptik olarak 300 metreye kadar yapılmış sondaj deliklerinden toplanmış örneklerde prokaryotların farklı bir grubu olan çeşitli aerob ve fakültatif aeroblara ilaveten sülfat-indirgeyen bakteriler, metanojenler,ve homoasetojenler gibi bulunmaktadır (<£**& Kısım 17.15-17.17). Yüzey sularının bu mikroorganizmaların habitatlarına akması, onlara nutrient sağlanmasına yol açar. Ancak doğal habitatlarında bu bakterilerin metabolik hızları oldukça düşüktür (bakınız Mikrobiyal Sidebar, Mikrobiyal Life Deep Undergaround). Toprağın üst katmanlarındaki mikroorganizmalarla kıyaslandığında derinlerdeki mikroorganizmaların, biyojeokimyasalların döngüsündeki rolleri oldukça azdır. Ancak, çok uzun zaman diliminde, bu derinlikteki mikroorganizmaların metabolik aktiviteleri organik bileşiklerin yavaş mineralizasyonuna ve yer altı suyuna ürünlerin salınmasına neden olabilmektedir. Derin yüzeyaltı mikroorganizmaları ile topraktan yer altı suyuna süzülen toksik bileşiklerin (örn. benzen, tarım kimyasalları vb.) in situ bioremediasyonu için potansiyel günümüzde özel ilgi alanıdır. İnorganik nutrientlerin eklenmesi bu kimyasalların biyoyıkımmı teşvik edebilir ve kontamine olmuş yeraltı su katmanına özel mikroorganizmaların eklenmesi biyoyıkımı hızlandırabilir. 19.4 Kavramların Gözden Geçirilmesi Toprak sayısız mikroçevre ve nişi içeren karmaşık bir habitattır. Mikroorganizmalar aslında toprak partikülüne tutulu olarak toprakta bulunur. Yüzey toprağında mikrobiyal aktiviteyi etkileyen en önemli faktör suyun elde edilebilirliğidir. Derin toprakta ise (yüzeyaltı çevresi) nutrient elde edilebilirliği en önemli rolü oynar. • Mineral ve organik topraklar arasındaki fark nedir? • Topraklardaki mikrobiyal aktivite fazlalığını ve şeklini hangi faktörler yönetir? • Toprağın hangi bölgesi en fazla mikrobiyal olarak aktiftir.
622 • Bölüm 19 • Mikrobiyal Ekoloji
Mİkrobİyal Ek Bİlgİ
• Derin Yeraltında Mikrobiyal Yaşam
erin karasal yüzey altını çalışan mikrobiyologlar farklı fiziksel ve kimyasal çevrelere sahip olan birkaç bin metre derinlikteki yüzey altının canlı prokaryotlannı keşfettiler. Bu mikroorganizmalar nasıl bir yaşayan canlı olabilmektedir? İlk bulgular bunların sedimentler içinde biriken organik maddeyi yavaş katabolize ederek yaşayan çok yavaş büyüyen kemoorganotrofik bakteriler olduğunu göstermiştir. Ancak, derin kısımlarda su taşıyan bazalt katmanların mikrobiyal ekolojisi üzerine yapılan çalışmalar yavaş büyüyen kemoorganotroflann derin yeraltında yaşayan tek prokaryotlar olmadığını göstermiştir. Kemolitotrofik prokaryotlarda orada bulunmakta olup aslında yeraltı mikrobiyal popülasyonlara baskın olabildiği anlaşılmıştır. Bazaltlar organik maddeden yoksun demirce zengin volkanik kayalardır. Columbia River Basin (Washington, ABD) 'de 1500 m'ye kadar olan belli bazalt örneklerinde fazla miktarda anaerobik, kemolitotrofik bakteriler bulunmaktadır (Şek. la). Aynca Sülfat indirgeyen bakteriler, metanojenler ve homoasetojenlerde bulunmaktadır1. Bu yüzden Bacteria ve Archaea türleri derin yüzeyaltı ekosisteminde bulunmaktadır. Metanojenlerin kayalarda ve çevredeki yeraltı sularında bulunan metanın (CH4) karbon-kararlı izotop analizleri sonucunda metabolik olarak aktif oldukları görülmüştür. Ölçümler biyolojik metanojenez için tipik olan karbonun (12C) daha hafif izotopunda güçlü bir zenginleşme olduğunu göstermiştir ( s ° ö Kısım 18.8). Eğer
metanojenler aktifse muhtemelen diğer gruplarda aktiftirler. Ancak onların ürünleri (sülfat indirgeyicilerden H2S ve homoasetoj enlerden asetat) (Şek. 1£>) birikmez. Çünkü onlar diğer mikroorganizmalar tarafından tüketilmezler. Bu mikroorganizmalar kükürt oksitleyen kemolitotroflan ve asetatı kullanabilen çeşitli kemoorganotroflan içermektedirler. Bu anaeroblar arasındaki genel bir bağ onların enerji üreten metabolizmaları için bir elektron vericisi olarak H2'nin kullanımıdır (öO^Kısım 13.3,17.9, 17.14-17.18 ve aşağıdaki Şekil ljb). Hidrojen, organik maddenin fermentatif dekompozisyonunun yaygın bir ürünüdür (ooöKısım 17.19-17.21). Fakat eğer bazalt çok az organik materyal içerirse, H2, H2 tüketicilerinin metabolizmasını desteklemek için nereden sağlanmaktadır? Açıkça, H2'nin Columbia River'da bazalt kayalardaki demir mineralleri ile suyun güçlü kimyasal ilişkisinden orij inlenmektedir (bakınız Şek. ljb'de önerilen reaksiyon). Böyle reaksiyonlar inorganik kimyadan bilinmekte olup parçalanmış Columbia River bazaltının steril su ile karıştırıldığı laboratuvar çalışmalarında, hızlı H2 oluşumu gerçekleşmektedir2. H2 aynca bazaltın içinde süzüldüğü yeraltı suyunda in situ olarakta saptanmaktadır. Bu yüzden derin yeraltı bazaltlarında oluşmuş H2'nin elektron verici olması nedeniyle orada bulunan anaerobik prokaryotlann önemli popülasyonlannın büyümesini desteklemesi muhtemeldir. Eğer bu gerçekse, bu organizmalar, jeokimyasal yönü güçlü olan canlılar ola-
caklardır. Çünkü onların elektron alıcısı (metanojenler ve homoasetojenler durumunda CO2 ve sülfat indirgeyen bakteri2 ler durumunda SO4 ~) ve elektron vericisi olan H2, tamamen inorganik materyallerden türevlenmiştir. Bu yeraltı kemolitotroflan aynca fotosentetik primer üretim anlamında da önemli olacaklardır. İkinci söylenen, fotosentez, aslında tüm yüzeyde bulunan organizmalann gereksinim duyduğu moleküler oksijenin ve/veya organik maddenin kaynağıdır. Bazen bilimde olduğu gibi, ilave araştırma Columbia River bazalt bulgulannı sorgulamaktadır. Bu bazaltlarda çok fazla organik madde bulunmamasına rağmen, biraz bulunmaktadır Bu yüzden fermentasyon çeşitli yüzeyaltı H2 kemolitotroflan tarafından kullanılan H2'nin kaynağı olabilmektedir. H2 temelli Derin yer altı ekosistemlerinin ne kadar yaygın olduğu ve ekolojik olarak önemi üzerine H2 kaynağıyla bağıntılı olarak daha ileri araştırmalar beklemektedir. Fakat metabolik olarak aktif H2-tüketen mikroorganizmalann derin yüzeyaltına yerleştiği açıktır ve bu aslında bu çevrelerde onlann önemli biyojeokimyasal ajanlar olduklannı göstermektedirler. Aslında, biz yeryüzünün derin yüzeyaltında bulunan toplam prokaryotik sayılann şimdi çok fazla, aslında diğer tüm çevrelerden daha fazla olduğundan şüphelenmekteyiz (o°î»Kısım 1.3). Bu derin yüzeyaltı organizmalann aktiviteleri hala oldukça fazla bir gizem halindedir. Fakat onlar Yeryüzündeki nutrient döngüsünde önemli işlevlere sahiptirler. •
Şekil 1 Yeryüzününün derinliğinde mikrobiyal yaşam, (a) 1500 metrelik bir derinlikten toplanan bazalt parçacıklarının yüzeyine tutunmuş bir mikrobiyal biyofilmin lazer confocal totomikrogratı. Kırmızı renk, Nilden kırmızısı ile boyanmış bakteriyal hücreler iken; yeşil, bazalt yüzeyden yansıyan ışıktır. Biyotilmde hücreler, Şekil lb.'nin son reaksiyonunda belirtildiği gibi bazalttan açığa çıkan H2 üzerinde büyütülmüştür, (b) anoksik derin bazalt aküferlerinde büyüyen prokaryotlann önemli metabolik reaksiyonları
Methanogenesis: 4 H 2 + CO2 •*• CH 4 + 2 H2O Acetogenesis: 4 H 2 + 2 HCO3- + H + -*- CH3COCr + 4 H2O Sulfate reduction: 4 H 2 + SO 4 2 " + H + •*- HS~ + 4 H2O Proposed inorganic H 2 production: FeO + H2O -H 2 + FeO2 (b) 'Stevens.T. O., and J. P. MoKinley. 1995. Lithoautotrophic microbial ecosystems in deep basalt aquifers. Science 270:450-454. Anderson, R. T., F. H. Chapelle, and D. R. Lovely. 1998. Evidence against hydrogen-based microbial ecosystems in basalt aquifers. Science 287:976-977.
2
19.5 • Tatlısu Çevreleri • 623
Tipik olarak tatlısu çevreleri gölleri, su birikintileri, nehirleri, kaynakları vb. kapsamaktadır. Tatlısu çevreleri elde edilebilir nutrientleri ile kimyasal ve fiziksel özellikleri bakımından birbirlerinden oldukça farklıdır. Bu yüzden onların mikrobiyal çeşitliliklerindeki değişiklik olması sürpriz değildir. Çoğu sucul çevrelerde en fazla bulunan fototrofik organizmalar, mikroorganizmalardır. Oksik alanlara siyanobakteriler ve algler, Anoksik alanlara ise anoksijenik bakteriler hakimdir. Suda akıntıyla akan veya serbestçe askıda halde bulunan algler, fitoplanktonlar olarak isimlendirilir. Dibe veya kenara tutunanlar ise bentik alg olarak isimlendirilirler. Bu organizmalar organik madde üretiminde ışık enerjisini kullandıkları için onlar primer üreticidirler. Sonuçta sucul bir ekosistemde mikrobiyolojik aktivite fototrofik organizmaların primer üretimine bağlıdır. Oksijenik fototroflar hem yeni organik madde hem de oksijen üretirler. Eğer fotosentetik aktivite çok yüksekse, aşırı organik madde oksijen azalmasına ve anoksijenik koşullara götürür. Bu, aslında prokaryotlar arasında metabolizmanın (özellikle anaerobik solunum ve fermentasyon) alternatif şekillerim başlatır ( « a Kısım 17.13-17.21).
li substrat olmayabilir. Böyle çevrelerde bulunan mikroorganizmalar tipik olarak çok seyreltik koşullarda büyümeye uyum sağlamış olan oligotroflardır. Güçlü akıntı ve türbülanslar karışımı sağlar ve sonuçta dip tabakalara oksijen transferini gerçekleşir. Ancak ılımlı iklimlerdeki birçok gölde su kütlesi yaz aylarında tabakalaşır. Daha ılık ve daha az yoğun epilimnion denen yüzey tabakaları, daha soğuk ve daha yoğun dip tabakalarından (hipolimnion) ayrılır (Şekil 19.9*). Thermocline; epilimnion'dan hypolimniona geçiş zonudur. Yaz başında tabakalaşma başladıktan sonra dip tabakalar anoksik hale gelir (Şekil 19.9). Böyle göller, ekseriya gölü çevreleyen karadan gelen nutrient madde akışından çok daha fazla miktarlarda çözünmüş organik madde içerir. Bu, genellikle gölün organik maddesinin artmasına neden olan alg ve siyanobakteri patlamalarını başlatabilir. Geç sonbaharda ve kış başında, yüzey suları daha soğuk ve bu nedenle dip kısımlardan daha yoğun hale gelir. Bu, dip sularının tekrar havalanmasını sağlayan suyun dönüşüme girmesine neden olur. Bu yıllık döngü, suyun dip tabakalarının oksikten anoksiğe ve sonra tekrar oksik duruma geçişini sağlar. Mikrobiyal aktivite oksijen içeriğindeki bu değişiklikle birlikte değişir. Fakat diğer faktörler özellikle sıcaklık mikroorganizma aktivitesini ilave olarak güçlü bir şekilde etkiler.
Göllerde ve Nehirlerde Oksijen İlişkileri
Nehirler
Tathsu Çevreleri
Kısım 6.15'de oksijen gereksinimleri ve anaeroNehirlerde oksijen özellikle lağım, tarımsal ve enbiozis'i, Kısım 17.5'de fotosentez yolu ile oksijen düstriyel kirlenmedeki organik maddenin çok fazüretimini ve Kısım 19.2'de mikroçevrelerde oksijen üretimini tartışmıştık. Oksijen atmosferde en çok Göl yüzeyi O bulunan gazlardan biri olmasına rağmen (~% 21), O : suda sınırlı çözünürlüğe sahiptir ve onun büyük su 2 kütlelerinde atmosferle değişimi yavaştır. Oksije4 nin fotosentetik üretimi bir göl, okyanus vb. yüzey 6 tabakalarında ancak ışığın ulaşabildiği yüzey tabakalarında gerçekleşir (Şekil 19.1). Bu yüzey tabakala8 rında tüketilemeyen organik madde derinlere batar 10 ve suda çözünmüş oksijeni kullanan fakültatif mikroorganizmalar tarafından dekompoze edilir. 12 Tatlısu göllerinde oksijen tüketildiğinde, dip 14 tabakalar anoksik hale gelir. Buradaki aerobik orSedimentler16 ganizmalar örneğin; yüksek bitkiler ve hayvanlar 0 2 4 6 8 10 O (mg/I) büyüyemez ve dip tabakalar sadece anaerobik pro0 1 2 3 4 5 H S(mg/l) 0 4 8 12 16 20 Sıcaklık (°C) karyotlardan ve birkaç anaerobik ökaryot, özellikle de bazı protozoonlardan ibaret olur. Ayrıca, karbon ve diğer nutrientlerin döngüsünde solunum * Şekil 19.9 Yaz tabakalaşmasının bir sonucu olarak metabolizmasından fermentatif metabolizmayada ılıman bir gölün derinliklerinde anoksik koşulların gelişimi. Daha soğuk dip sulan daha yoğundur ve bakteriyal sülfat bir dönüşüm vardır (bakınız Kısım 19.9-19.11). indirgenmesinden dolayı H S içerir. Hızlı sıcaklık değişim zonu Oksijenin suda bulunup bulunmaması organik termoklin olarak ifade edilir. Tipik olarak sonbaharda ve kış madde varlığı ve karışmasıda dahil birkaç faktöre başlannda yüzey sulan soğuduğunda onlar hipolimnetik sulann bağlıdır. Eğer organik madde dağınıksa, (nutrient yoğunluğuna ve sıcaklığına ulaşır ki böylece dip suları yer değişgirdisi olmayan göl ve açık okyanuslar gibi) tüm tirir ve "göl dönüşümü"etkilenir. Veri kuzey Wisconsin (ABD)'de küçük bir tatlısu gölünden elde edilmiştir. oksijeni tüketecek kemoorganotroflar için yeter2
2
2
2
624 • Bölüm 19 • Mikrobiyal Ekoloji
la olması ile yakın ilişkilidir. Bir nehir içinde türbülans ve hızlı su akışı olsa bile geniş miktarda giren organik madde bakteriyal solunum neticesinde oksijen azalmasına yol açabilir (Şekil 19.10a •). Su bir lağım boşaltımından uzaklaştırıldığında, organik madde kademeli olarak tüketilir ve oksijen içeriği bir süre sonra normale döner. Suda oksijen azalması istenmez çünkü çoğu sucul hayvanlar oksijene ihtiyaç duyarlar ve çok az sürede olsa anoksik koşullarda ölürler. Dahası, oksijensiz duruma geçiş ile anaerobik bakterilerin kokulu bileşikler (örneğin: aminler, merkaptanlar,
Giriş suyu (lağım, diğer atıksular)
, Bakteri, organik karbon, ve BOl
yağ asitleri) üretmesine sebep olur. Bu bileşiklerin bazısı yüksek organizmalara toksiktir. Göllerde olduğu gibi lağım veya diğer kirleticilerden nehire gelen nutrientler ayrıca siyanobakteri ve alg patlamalarını tetikler (Şekil 19.10b). Bu artan organik madde yükü oksijen azalmasına götürür. Biyokimyasal Oksijen İhtiyacı Bir miktar suda mikrobiyal olarak oksijen tüketilmesi onun biyokimyasal oksijen ihtiyacıdır (BOİ). BOİ, alman bir su örneğini iyi havalandırarak, kapaklı bir şişeye yerleştirerek, standart bir zaman diliminde inkübe ederek (genellikle 20°C'de 5 gün), ve inkübasyon süresi sonunda kalan oksijeni ölçerek saptanmaktadır. Böylelikle BOl saptanması suda mikroorganizmalar tarafından okside edilebilen organik madde miktarının ölçümünü verir. Bir nehir bir organik kirletici ile kontaminasyonundan kurtarıldığında BOİ'deki düşme çözünmüş oksijendeki artışla ilişkili olduğu görülür (Şekil 19.10«). Bu yüzden biz bir su kütlesinde oksijen ve karbon döngüsünün organik karbonun miktarının tersi şekilde oksijen miktarı ile ilişkili olduğunu görmekteyiz. Bu özellikle organik karbonca zengin olan anoksik çevrelerde delildir (bakınız Kısım 19.9-19.11).
Akıntı mesafesi
19.5 Kavramların Gözden Geçirilmesi
(a)
Sucul ekosistemlerde fototrofik mikroorganizmalar genellikle asıl primer üreticileridir. Üretilen organik maddenin çoğu bakteriler tarafından tüketilir ve bu çevrede oksijen azalmasına neden olur. BOl bir su örneğinde oksijen - tüketiminin bir ölçümüdür.
• Şekil 19.10 Sucul sistemlere giren lağım veya diğer organik maddece zengin atıksulann etkisi, (a) Bir nehire organik maddenin girmesi ile çok hızlı şekilde bakteriyal sayıdaki bir artış ile O2 düzeyindeki bir azalış gerçekleşir. Eğer lağımdaki gibi, giriş suyunda NH4+ mevcutsa, NH4+ nitrifikasyon bakterilerince NO 3 'a okside edilir Kısım 12.3, 17.12 ve 19.12). Nitrifikasyonun iki basamağıda gerçekleştiği durumda NH4+ daki yükselmeyi kısa süreli olarak NO3~'taki yükselmenin takip ettiğine dikkat ediniz. Algler ve siyanobakteri sayısındaki artış inorganik nutrientler özelliklede PO,3" nedeniyledir, (b) Ötrofik (besince-zengin) bir göl olan Mendota Gölünde, Madison, Wisconsin tanmsal kaynaklardan gelen inorganik besinlerin oluşturduğu kirlilik nedeniyle oluşan alg, siyanobakteri ve makrofitlerin (sucul weeds) geliştiği görülmektedir. Ölü bitki ve algal materyal çok yüksek bir BOİ kaynağıdır. Böylelikle, bu fototroflar fotosentezle oksijen sağlamalarına rağmen, onların parçalanması yüksek-ölçekte O2 tüketimine sebep olmaktadır.
•
Bir primer üretici nedir?
•
Bir gölde, epilimnion ve hypolimnion nerededir?
•
Bir su örneğine organik madde katılması onun BOl'nı arttırır mı azaltır mı?
KIII
DENİZ MİKROBİYOLOJİSİ
Okyanuslar tuzluluk, ortalama sıcaklık, derinlik ve nutrient yapısı gibi bir çok yönden tatlısu çevrelerinden farklılaşır. Özellikle genetik boyamalar ve gen sekans analizi gibi (ö°e> Kısım 18.4-18.6) mikrobiyal ekolojinin moleküler araçlarını kullanma deniz mikroorganizmaları hakkında birçok yeni bilgiyi ortaya çıkarmaktadır. Biz burada 3 ana konu üzerinde duracağız: (1) açık denizlerdeki prokaryotlar, (2) derin - deniz mikrobiyolojisi, ve (3) derin - deniz hidrotermal çatlakları yakınındaki hayvan yaşamını destekleyen yaygın mikrobiyalekosistemler.
19 6 • Deniz Habitatları ve Mihrobiyal Dağılım • 625
Denizel Habitatlar ve Mikrobiyal Dağılım Tatlısu çevreleri ile kıyaslandığında, açık denizlerin nutrient miktarı genellikle çok azdır. Bu, özellikle azot, fosfor ve demir gibi anahtar inorganik nutrientler için bir gerçektir. Primer üreticilerin aktivitesi (başlıca, fotosentetik CO2 fiksasyonu) bu nutrientlerin eksikliğinde sınırlanır ve bu yüzden doğal olarak okyanularda tatlısu ekosistemlerinden daha düşük hücre sayıları bulunmaktadır. Ancak, okyanuslar çok geniş bir alan olduğu için orada gerçekleşen fotosentez ve oksijen üretiminin tamamı düşünüldüğünde Dünya'nın karbon dengesini sağlayan temel faktörler olduğu anlaşılır. Deniz mikrobiyal toplulukları denizel gıda zincirinden Dünya'nın iklimine kadar her şeyi etkiler.
Primer Üretkenlik Açık okyanuslarda gerçekleşen primer üretimin çoğu, önemli derinliklerde bile, klorofil a ve klorofil b içeren küçük oksijenik prokaryotiklerden prochlorophyte'lerin fotosentetik aktivitelerinden dolayı gerçekleşir. Prochlorococcus (siyanobakterilere yakın) oldukça önemli bir primer üreticidir (Şekil 19.11a» ve Ö°Ö Kısım 12.26). Tropikal ve subtropikal okyanuslarda planktonik filamentöz deniz siyanobakterisi Trichodesmium'da oldukça yaygındır (19.11b). Trichodesmium hücreleri bu sularda filament yığınları oluşturur ve askıda bulunan biyokütlenin önemli bir kısmını oluşturur. Trichodesmium, azot fiske eden bir siyanobakteridir ve bu organizma ile fikse edilmiş azotun üretimi denizsel çevrelerde azot döngüsünde (bakınız Kısım 19.12) önemli bir işleve sahiptir. Örneğin Ostreococcus çok küçük bir algdir. Yaklaşık sadece 0,7 um çaplık ölçüleri olan bu alg (Şekil 19.11c) bir Escherichia coli hücresinden bile daha küçüktür. Kıyı sularında prochlorophyte'ler ile birlikte çok küçük fototrofik ökaryotlar bulunmakta olup bunların bazısı bilinen en küçük ökaryotlar arasındadır. Kıyıya yakın okyanus alanları, açık okyanus sularından doğal olarak nutrient bakımından daha zengindir ve bu yüzden daha fazla fototrofik mikroorganizma popülasyonları beslenir (Şekil 19.12«). Bu da bakterilerin ve sucul hayvanların, örn. Balık ve kabukluların daha fazlasının bulunmasını sağlar. Körfezler ile lağım ve endüstriyel atıkları fazla miktarda alan bölgeler çok yüksek sayıda fitoplankton ve bakteriyal popülasyona sahip olabilir. Eğer kirlilik ciddi derecede ise, aerobik ve fakültatif bakteriler tarafından oksijenin tüketimi ve sülfat indirgeyen bakteriler tarafından da H2S'in üretimi sonucunda sığ denizsel sular sucul yaşam açısından anoksik ve toksik hale gelebilir (bakınız Kısım 19.13). Açık Okyanus Mikrobiyolojisi
İnorganik nutrient ve organik karbon miktarlarının az olmasına rağmen yüksek sayılarda prokaryotik
• Şekil 19.11 Deniz kaynaklı oksijenik fototroflar. (a) Subtropikal açık okyanus sularında dominant prototrof olan proklorofit Prochlorococcus hücrelerinin FISH filogeneteik boyanması (C^s Kısım 18.4). (b) Azot-fiske eden siyanobakteri Trichodesmium. Yaygın olarak tropikal sularda bulunan hücreler, aktif şekilde azot fiske eden filament yığınları oluşturur. Proklorofitler, algler ve siyanobakterilerin daha fazla anlaşılması için sırasıyla Kısım 12.26, 14.13 ve 12.25'e bakınız, (c) Deniz kıyı sularında önemli miktarlarda bulunan çok küçük bir alg (eukaryote) olan Ostreococcus'a ait bir hücrenin transmission elektron mikrografı. Ok kloroplastı işaret etmektedir. Prochlorococcus ve Ostreococcus hücrelerinin her ikiside yaklaşık 0.7 jjm çapındadır.
hücreler (105-106 arasında) açık okyanus sularında askıda halde bulunurlar. Ayrıca, ml'de yaklaşık 10" civarında çok küçük ökaryotik hücrelerde bulunur. Bu organizmalar bu sayıyı nasıl oluşturmaktadırlar? Elde edilen deliller bu açık okyanus mikroflorasının çoğunu destekleyici en önemli anahtar metabolizmanın ışık-merkezli enerji metabolizması olduğunu göstermektedir. Prochlorococcus, Trichodesmium, ve küçük fototrofik ökaryotlar daha önceden tartışılmıştı (bakınız Şekil 19.11). Anoksijenik fotosentezi gerçekleştiren diğer fototroflar da bulunur. Ancak, bunlar anoksik koşullar altında anoksijenik fotosentezi gerçekleş-
626 • Bölüm 19 • Mikrobiyal Ekoloji
için deniz bakterilerinin temel enerji metabolizmasını oluştururlar. Çevresel genomikler (ÖQE> 18.6), farklı dizilişteki rodopsin-benzeri proteinleri kodlayan genlerin açık okyanuslarda Proteobakterilerden başka bir çok bakteri şubesinde de bulunduğunu göstermiştir. Böylece metabolizmanın bu şekli Bacteria arasında yaygın şekilde kullanılmakta olup deniz sularında organik ve inorganik elektron vericilerinin çok düşük konsantrasyonlarından dolayı gelişmiştir (veya lateral gen transfer ile sağlanmıştır). ArchaelBacteria Dağılımı
* Şekil 19.12 Kuzey Atlantik okyayusunun batısında uydu aracılığıyla kaydedilmiş klorofil dağılımı. OrtaFlorida'dan kuzey Maine'ye kadar Birleşik Devletlerin doğu kıyısı noktalama işaretli gösterilmiştir. Fotoğrafın merkeze yakın kısım Cheasepeake Körfezidir; Büyük Göller üst soldadır. Fitoplanktonlarca zengin alanlar kırmızıyla gösterilmiştir (> 1 mg klorofil/m3); mavi ve mor alanlar daha düşük klorofil konsantrasyonunu göstermektedir (<0,01 mg/m3). Kıyı alanlarda ve Büyük Göllerde yüksek oranda primer üretkenlik olduğunu not ediniz.
tiren tipik mor ve yeşil bakteriler değillerdir Kısım 12.2 ve 12.33). Onun yerine, bunlar aerobik anoksijenik fototroflar olarak isimlendirilirler ve sadece aerobik koşullar altında anoksijenik fotosentezi gerçekleştirirler. Bunlar fotosentez yapabilen Proteobacteria'nın (««2» Bölüm 12) cinslerinden Erythrobacter ve
Roseobacter gibi
Açık denizlerdeki prokaryotlarm sayısı derinlik arttıkça azalır. Daha öncede bahsedildiği gibi, yü5 6 zey sularındaki hücre sayıları ortalama 10 -10 hücre/ml arasındadır. Her bir filogenetik domain'in hücrelerini ayırtetmek için filogenetik boyalar kullanıldığında (ÖO& Kısım 18.4), açık okyanuslarda derinlikle birlikte Bacteria ve Archae'nm ilginç bir dağılım gösterdiği bulunmuştur. Genelde, Bacteria türleri üst su katmanlarında (<1000), baskındır, Buna karşılık daha alt su katmanlarında Archae hafif baskınlık gösterir veya hemen hemen eşittir (Şekil 19.13•). Alt su katmanlarında bulunan Arc-
Archaea
organizmalar Proteobacteria'da olduğu için proteo-
rodopsin denmiştir (Kısım 12.1). Bu molekül muhtemelen enerji kaynağı için iz miktardaki organik maddeye bağımlılıktan organizmayı kurtarmak
Bacteria 5m
organizmaları
içerir ve muhtemelen onların metabolizmasını ve büyümesini desteklemek için üretilmiş ATP' yi kullanırlar. Deniz sularında, özellikle kıyıya yakın yerlerde böyle organizmalar büyük bir çeşitlilik gösterir. Oligotrofik tatlısu göllerinde de aerobik fototrof popülasyonları görülmektedir. Bu fototroflara ilaveten, okyanusların fotik zonlarmda (üst 300 metre) bulunan birçok prokaryot bir ışık algılama pigmenti rodopsinin bir şeklini içerir. Hücreler ışık enerjisini ATP'ye dönüştürmede bu pigmenti kullanırlar. Kısım 13.3'te biz ekstrem halofil Halobaterium'da (bir Archae türü) bulunan ve üzerinde iyi çalışılmış bacteriorhodopsin ve bu molekülün nasıl ATP sentezine karıştığını tartışmıştık. Açık okyanus prokaryotlarında bulunan rodopsin tipi bakteriorodopsine çok benzerdir fakat bu molekül filogenetik olarak bakteri olan (Archae değil) hücrelerde bulunur. Onu içeren
Archaea Bacteria (hücre/ml)
Yüzey
3x104
3x105
3x10 4
2x10 5
2x10 4
3x10 4
7x10 3
1x10"
5x10 3
3x10 3
4x103
4x103
10
100 m
100
500 m 1000 m
1,000
2000 m 5000 m
5,000 20
40
60
80
100
Toplam sayının yüzdesi (a)
(b)
• Şekil 19.13 Kuzey Pasifik Okyanus suyunda hem Archaea hem de Bactcria'ya ait prokaryotlann toplam yüzdesi, (a) Archaea ve Bacteria'nm derinlikle dağılımı, (b) Derinlikle birlikte Archaea ve Bacteria'nm tam sayılan (her bir milimetrede). Nature'dan 409:507-510 (2000) uyarlanmıştır.
19 7 • Derin Deniz Mikrobiyolojisi • 627
lıae hemen hemen yaygın şekilde hipertermofilleri içeren Archae'nin bir şubesi olan Crenaarchaeota türleridir (<**> Kısım 13.8-13.11). Şekil 19.13 teki veriden anlaşılacağı üzere, Archaea ve Bacteria hücrelerinin sırasıyla 1,3 X 1028 ve 3,1 X 1028 hücre kadar dünyadaki okyanuslarda bulunduğu tahmin edilmektedir. Bu rakamlar okyanusların, Dünyanın yüzeyinde en fazla mikrobiyal biyokütle içerdiğini göstermektedir (c0^ Kısım 1.3).
derinlikte büyüyen bir organizma 500 atm basınca karşı koyabilmelidir. Barotolerant ve Barofilik Bakteriler
Basınca farklı yanıtlar farklı derin-deniz prokaryotlarında açıkça görülür. Bazı organizmalar yüksek basıncı kolaylıkla tolere edebilirler; onlar barotolerant olarak isimlendirilirler. Farklı olarak, diğerleri en iyi basınç altında büyürler; bunlara 19.6 Kavramların Gözden Geçirilmesi barofilik denir. Yaklaşık 3000 m gibi derinliklerden izole edilDeniz suları bir çok tatlı sudan daha az nutrient içermekmiş ve büyüme ve metabolik aktivite üzerine batedir, halbuki mikrorganizmalarm asıl kısmı orada mevsıncın görevinin incelendiği organizmalar doğal cuttur. Bunların çoğu ATP sentezi yapmak için ışığı kulolarak barotoleranttır. Barotolerant organizmaların, lanır. Prokaryotlardan Bacteria domainin türleri okyanus 1 atm de 300 atm'den daha yüksek metabolik hıza yüzey sularında baskındır buna karşılık Archae türleri sahip oldukları gözlenmiştir. Halbuki, bu tip orgadaha derin sularda daha baskındır. nizmaların büyüme hızları her iki farklı basınçta • Prochlorococcus organizması okyanuslarda hem karda hemen hemen aynıdır (Şekil 19.14«). Bununla bon hem de oksijen döngülerine nasıl katkıda bulubirlikte 4000-6000 m ve hatta daha derinlerden alınur? nan örneklerden elde edilen mikroorganizma kül• Proteorodopsin ne demektir? Ve niçin böyle isimlentürleri doğal olarak barofiliktir ve yaklaşık 400 atm dirilmiştir? Proteorodopsinin keşfedilmesi genellikle basınçta optimum büyürler (Şekil 19.14). Barofiller organik maddenin az olduğu açık okyanus sularında en iyi basınç altında büyüyebilmelerine rağmen, bakteriyal hücre sayılarının nasıl fazla olduğu belirsizliğinin çözülmesine nasıl katkıda bulunur? çoğu 1 atm basınçta da büyüme kabiliyetlerini kay• Nasıl Bacteria ve Archaea okyanus sularında farklı şekilde betmemektedirler (Şekil 19.14). dağılmaktadır? Daha derin sulardan elde edilen örneklerde (10.000 m) ekstrem (obligat) barof iller bulunur. Bu organizmaların büyümek için temelde basınç Derin Deniz Mikrobiyolojisi gereksinimleri vardır. Örneğin Mariana çukurundan (Pasifik Okyanusu, >10.000m derinlikten) izole Görünür ışık açık okyanus suyunda yaklaşık 300 edilmiş Moritella bakterisi en hızlı şekilde 700-800 m. den daha aşağılara gidemez; Bu üst ışıklı bölge, atm basınçta büyümektedir ve doğal habitatında fotik zon olarak adlandırılır (Şekil 19.13). Fotik zo1035 atm gibi basınçta yaşayabilmektedir (Şekil nun altında yaklaşık 1000 m'ye kadar olan derinlik, 19.14 ve 19.15»). hayvanlar ve kemoorganotrofik mikroorganizmaların hareketinden dolayı biyolojik olarak oldukça aktiftir. 1000 m'den daha derinliklerdeki sular 1.0 nispeten biyolojik olarak inaktiftir ve derin deniz olarak bilinir. Tüm okyanus suyunun % 75'inden 0.8 daha fazlası derin denizdedir. Başlıca 1000 ve 6000 metre arasındadır. 0.6
Derin Denizde Koşullar
s
Derin denizde yaşayan organizmalar üç ana çevresel ekstrem koşullarla karşı karşıyadır: düşük sı-
(D
a
caklık, yüksek basınç ve düşük nutrient
m
düzeyleridir.
Yaklaşık 100 m'den daha aşağıdaki sular 2-3°C'de sabit kalır. Kısım 6.10'da sıcaklıktaki değişikliklere mikroorganizmaların yanıtlarını tartışmıştık. 100 m'den daha aşağıdan izole edilen bakteriler, psikrofiliktirler (soğuğu seven). Bazı ekstrem psikrofilikler yerinde olan (in sifw)sıcaklığa yakın dar bir sıcaklık aralığında büyüyebilir. Derin-deniz mikroorganizmaları derinliğe bağlı olarak yüksek hidrostatik basınçlara karşı koyabilmektedir. Basınç her 10 m derinlikte 1 atm artar. Böylece, 5000 m
0.4 0.2
3
200
400 600 800 1000 1200 Basınç (atm)
• Şekil 19.14 Barotolerant, barofilik ve ekstrem barofilik bakterilerin büyümesi. Ekstrem barofil (Moritella) Mariana Çukurundan (Mariana Trench) izole edilmiştir (bakınız Şekil 19.15). Barotolerant ve barofilik bakterilere (sol ordinate) kıyasla ekstrem barofilin (sağ ordinate) çok daha yavaş büyüdüğüne (herhangi bir basınçta) dikkat ediniz. Aynca düşük basınçlarda ekstrem barofilin büyüyemediğene de dikkat ediniz.
628 • Bölüm 19 • Mikrobiyal Ekoloji
Barotolerant veya barofilik prokaryotlar arasında farklılıklar olup, Moritella yaklaşık 400 atm' den daha düşük basınçlarda büyüyememektedir (Şekil 19.14). Ancak ilginçtir ki, Moritella kademeli olarak hafif şekilde basınç azalma periyotlarını tolere edebildikleri için bu şekildeki basınç azalmasıyla ölmezler. Ancak, basınç düşüklüğü birkaç saat sürdüğünde kültür canlılığı kaybolmaktadır. Moritella ayrıca sıcaklığada duyarlıdır. Onun optimum büyüme sıcaklığı yaşadığı ortamın çevre sıcaklığıdır (2°C). 10°C üzerindeki sıcaklıklar onun canlılığını önemli miktarda düşürür. Yüksek Basıncın Moleküler Etkisi Basınç, hücre fizyolojisi ve biyokimyasını etkilemektedir. Artan basınç enzimlerin substrat bağlama kapasitesini azaltmaktadır. Böylece, ekstrem barofillerin enzimleri, bu etkiyi azaltmak için katlanmış kıvrılmış halde bulunurlar. Diğer potansiyel, basınç duyarlılığı protein sentezi ve transport gibi membran aktivitelerini etkiler. Yüksek basınç altında büyüyen bir organizmanın sitoplazmik zarında doymamış yağ asitlerinde bir artış görülür. Bu değişikliğin muhtemelen uyum (adaptive) önemi vardır çünkü o membranın muhtemelen yüksek basınçlarda daha az jel olmasını sağlar. Moritella gibi ekstrem barofillerin düşük büyüme hızlarının sebebi muhtemelen hücre biyokimyası açısından önemli olan basıncın ve reaksiyon hızlarının önemli ölçüde düşmesi (bakınız Şekil 19.14) ve düşük sıcaklığın kombine etkisinden dolayıdır. 500-600 atm'e kadar büyüme yeteneğinde olan barofülerde (Şekil 19.14), yüksek basınçtaki büyümenin hücre duvarının protein yapısındaki değişikliklerle ilişkili olduğu görülmektedir. Detaylı çalışılmış bir barofilde, OmpH(outer membrane protein H) denen spesifik bir dış membran proteini (<s«s Kısım 4.9) 1 atm de büyüyen hücrelerde sentezlenememesine karşın basınç altında büyüyen
• Şekil 19.15 Derin deniz örneklemesi. 10.897 m'lik bir derinlikteki Mariana Çukurunun (Pasifik Okyanusu, Filipin açıklan) deniz tabanı sedimentine bir örnekleme tüpü yerleştiren mürettebatsız deniz altı aracı Kaiko'nu örnekleme kolu. Sediment tüpleri daha sonra geri alınır ve barofilik bakterilerin zenginleştirilmesi ve izolasyonu için kullanılır.
hücrelerde sentezlenmektedir. OmpH proteini bir tip porindir. Porinler, dış membran içinden periplazmaya doğru organik moleküllerin difuzyonunu amacıyla kanallar oluşturan yapısal proteinlerdir (ooç> Kısım 4.9 ve Şekil 435b). Düşük basınçlarda büyüyen barofil hücrelerde bulunan porin, yüksek basınçta muhtemelen tam olarak iş göremeyebilir ve bu yüzden yeni bir şekilde porin sentezlenmelidir. İlginçtirki, birkaç proteinin barofülerde basınçla kontrol edildiği görülmektedir. Çünkü birçok protein hem yüksek hem de düşük basınçlarda büyütülmüş hücrelerde aynıdır. Barofilik yaşam tarzı için çok önemli olduğu düşünülen basınca karşı, hücre duvarı ve onunla ilişkili proteinler ile transport proteinlerinin muhtemelen çok değiştiği görülmektedir. 19.7 Kavramların Gözden Geçirilmesi Derin deniz yüksek hidrostatik basınç ve düşük nutrientin hüküm sürdüğü soğuk, karanlık bir habitattır. Barofiller en iyi basınca altında büyürler ve daha fazla derinlikten elde edilmiş ekstrem barofiller büyümek için yüksek basınca ihtiyaç duyarlar. • Derinlikle birlikte basınç nasıl değişir? • Basınç altında optimum büyüyen barofülerde moleküler adaptasyonlar nasıl gerçekleşir?
Hidrotermal Bacalar Derin denizleri barotolerant ve barofilik bakterilerin yavaş büyümesini sağlayan düşük-sıcaklık ve yüksek-basınç çevreleri olarak düşünmemize rağmen bunun birkaç şaşırtıcı istisnası vardır. Mikroorganizmaların aktiviteleri sonucu çok sayıda hayvan toplulukları dünya da derin deniz sularında bulunan termal kaynaklarda görülür. Jeolojik olarak, bu kaynaklar okyanus tabanlarında yarıklarda, çatlaklarda görülür. Burada deniz tabanına yakın sıcak bazalt ve magma, yavaşça tabana doğru yayılır. Bu çatlak bölgelere sızan deniz suyu sıcak minerallerle karışır ve kaynaklardan dışarı çıkar (Şekil 19.16»). Bu su altındaki sıcak kaynaklar hidrotermal bacalar olarak bilinir Bacaların 2 temel tipi bulunmaktadır. 6-23°C'de hidrotermal sıvıyı dışarı veren ılık bacalar (2°C'de deniz suyuna). Kara bacalar olarak ifade edilen sıcak bacalar, Burada, deniz suyu ile karışan presipite olmuş materyalin koyu bir bulutu 270-380°C'de mineral-zengin su şeklinde dışarı çıkar (Şekil. 19.16 ve bakınız Şekil 19.19). Ilık bacalar 0,5-2 cm/ dk'da sıvıyı dışarıya vermelerine karşın sıcak bacalar yaklaşık 1-2 m/dk gibi daha yüksek hızlara sahiptir. Hidrotermel Bacalarda Yaşayan Hayvanlar Küçük basınçlı denizaltılar kullarak hidrotermal bacaları ziyaret etmek ve onlarla ilişkide olan organizmaları çalışmak mümkündür. Hidrotermal
19 8 • Hidrotermal Bacalar • 629
Ilık ağız (6-23°C) Sıcak ağız (~350°C) (Kara baca)
Hydrothermal fluid
350°C dış kenarlar
• Şekil 19.16 Derin deniz sıcak su kaynaklan: Hidrotermal bacalar. Ilık bacalar ve kara bacalarda oluşan ana kimyasallar ve jeolojik oluşumları gösteren diyagram. Ilık bacalardaki (bakınız Şekil 19.17) hidrotermal sıvı soğuk (2-3°C) denizsuyu ile karşılaştığında soğur. Kara bacalarda (bakınız Şekil 19.19), hidrotermal sıvı 350°C lik bir sıcaklıkta direk deniz tabanına ulaşır. Ilık bacalar ve karabacalar doğal olarak yaklaşık 2000 m derinlikte bulunur. Böyle derinlikler Woods Hole Oceanographic Institution, Woods Hole, MA'nın araştırıcıları tarafından kullanılan Alvin gibi küçük denizaltılar içindeki insanlar tarafından keşfedilebilmektedir.
bacalarda 2 m üzerinde uzunluğa sahip tüp şekilli kurtlar ve yüksek sayılarda dev deniz tarakları ve midyeler gibi invertebratlar bulunmaktadır (Şekil 19.17•). Derin denizlerin farklı bölgelerin biyolojik olarak çok fazla verimsiz olduğu düşünülürse, bu hayvan toplulukları fototrofik primer üreticilerin yokluğunda nasıl bulunmaktadırlar? ve onların enerji kaynağı (ları)nın doğası nedir? Hidrotermal sıvının kimyasal analizi H2S, Mn2+, H2 ve CO'yu içeren oldukça fazla indirgenmiş inorganik materyalleri içerdiğini göstermektedir. Bazı bacalar az miktarda H,S ancak buna karşılık yüksek miktarda NH 4 + içerir. Hidrotermal ağızdan dışarıya çıkan sıvıda organik madde bulunmamaktadır. Hayvanların, kemolitotrofik bakterilerin aktivitelerine bağımlı oldukları açıktır (o°o Kısım 12.3-12.5 ve 17.8-17.12). Bu tip bakteriler bacalardan dışarı çıkan inorganik enerji kaynakları sayesinde gelişirler. Deniz suyunda CO32" ve HCO3" olarak bulunan CO2, kemolitotroflar için organik karbona dönüştürülür ve daha sonra bunların bir kısmı hidrotermal ağızda bulunan hayvanları beslemek için kullanılır. Hidrotermal Bacalarda Mikroorganizmalar
Kükürt oksitleyen kemolitotroflar sülfür-çıkan ağız içinde ve civarında oldukça fazla sayıda bulunur.
* Şekil 19.17 Derin-deniz termal bacaların yakınında bulunan habitatlardan elde edilen invertebratlar. (a) Vücudundaki kılıfın (beyaz) ve tüyün (kırmızı) görüldüğü tüp şekilli kurtlar (Pogonophora familyası), (b) Kurdun tüyünün görüldüğü büyütülmüş fotoğraf. Tüy özellikle H2S içeren hidrotermal bacalardan besinleri toplar. Daha sonra kurdun içinde yaşayan simbiyotik sülfür-oksitleyen bakteriler transfer eder. Detaylar için metine bakınız, (c) Ilık ağzın çevresindeki midye yatakları. Midyelerin içinde ve çevresindeki elemental san kükürt birikimine (Kemolitotrofik simbiyontlann gerçekleştirdiği HZS oksidasyonundan oluşmaktadır) dikkat ediniz. Hidrotermal bacaların yakınında-bulunan kemolitotroflann bir listesi için Tablo 19.2'ye bakınız. Bazı ağız hayvanları besinleri için nitrifikasyon bakterileri (öOOKısım 12.3 ve 17.12) veya metilotrofik bakterilere Kısım 12.6 ve 17.24) ihtiyaç duyabilirler.
630 • Bölüm 19 • Mikrobiyal Ekoloji
Bacaların yakınında toplanan örneklerden Thiobacillus, Thiomicrospira, Thiothrix ve Beggiatoa kültürle-
ri elde edilmiştir (ö°e* Kısım 12.4 ve 17.10), ve saha denemeleri bu bakterilerin doğal popülasyonlarmm H2S ve S2O32~ oksidasyonunu ve CO2 fiksasyonunu gerçekleştirdiğini göstermiştir. Bazı bacalar nitrifikasyon bakterileri hidrojen-oksitleyen bakteriler, demir ve mangan oksitleyen bakterileri ile bacalardan çıkan metan ve karbon monoksit (CO) üzerinde büyüme olasıhğmdaki metilotrofik bakterileri içermektedir (Bu fizyolojik gruplar o°o Bölüm 12'de tartışılmaktadır). Tablo 19.2, muhtemelen hidrotermal ağız ekolojisinde rol oynayan kemolitotroflar için e" vericisi ve alıcılarını özetlemektedir. Hidrotermal Bacalann Yakınında Yaşayan Hayvanların Beslenmesi
Çeşitli kemolitotroflar termal bacalarda hayvanlarla simbiyotik ilişki içinde bulunurlar. Örneğin; 2 m uzunluğunda tüp şekilli kurtun (bakınız Şekil 19.17) bir ağız, sindirim sistemi veya bir anüsü yoktur. Fakat modifiye halde ve trofozom denen süngerimsi dokudan ibaret gastrointestinal boru içermektedir. Trofozom dokusu kurdun ağırlığının yaklaşık yarısını oluşturur. Bu doku sülfür granülleri ve ortalama 3,7 X W h/g trofozom dokusu gibi oldukça fazla miktarda prokaryotik hücre (Şekil 19.18») içermektedir. Geniş sferikal hücreler yapısal olarak denizlerde sülfür oksitleyen Thiovulum bakterisine benzerler. Bakteriyal hücreler ayrıca birçok ototrofik organizmanın CO2 yi hücresel materyale dönüştürmesinde iş gören yol izleri olan RubisCo ve Calvin çemberinin diğer enzimlerinin aktivitelerinide göstermektedir (Ö°O Kısım 17.6). Kemolitotrof simbiyontlarınm salgı ürünleri ve ölü hücreleri ile yaşamını sürdüren hayvan besinini bu yüzden kemolitotrofik bakterilerden sağlarlar. Tüp şekilli kurdun parlak kırmızı tüyü (Şekil 19.17b) kan damarlarınca zengindir ve trofozomdaki kemolitotroflara transfer etmek için O2 ile H2S (bakınız bir sonraki paragraf) için bir tuzak görevi görür. Dev deniz tarağı ve midyeler (bakınız Şekil 19.17c) ayrıca bacalar civarında da bulunur ve kükürt-oksitleyen bakteriyal topluluklar da bu hayvanların solungaç Tablo 19.2
• Şekil 19.18 Hidrotermal bacalardan elde edilen tüp şekilli kurtların trofozom dokusunda bulunan kemolitotrofik kükürt-oksitleyen bakteriler, (a) İçinde küre şekilli kemolitotrof kükürt-oksitleyen bakterilerin bulunduğu trofozom dokusunun taramalı elektron mikroskop görüntüsü. Hücreler 3-5 |jm çapındadır, (b) Kesiti alınmış trofozom dokusunda bulunan bakterilerin transmission elektron mikroskop görüntüsü. Hücreler ekseriya orijini bilinmeyen bir dış membranla çiftler halinde çevrilmişlerdir. Kemolitotrofik kükürt bakterileri Kısım 12.4,17.8 ve 17.10'da tartışılmaktadır. Science 2i3:340-342 (1981)'den izin alınarak basılmıştır.
(gill) dokularında yerleşmiş halde bulunurlar. Filogenetik analizler (
Hidrotermal baca primer üretkenliğinde potansiyel önemi olan kemolitotrofik prokaryotlar"
Kemolitotrof Kükürt-oksitleyen Nitrifikasyon yapan Sülfat-indirgeyen Metanojenik Hidrojen-oksitleyen Demir ve mangan-oksitleyen Metilotrofik11
Elektron vericisi W, S°, S2O32~ NH4+, NO2~ H2 H2
H2
2+
Fe , Mn C H 4 , CO
2+
Elektron alıcısı O2,NO3-
O2'
S°, S O 4 2 "
co2
O2, NO3~ O2
O2
Vericiden elde edilen ürün S , SO 4 ~ NO 2 ~, N O 3 ~ H2S CH4 H2O 3+ 4+ Fe , Mn CO2 i
I « £S^5 Kemilotrof metabolizma için Kısırr112.3-12.5 ve 17.8-17.12'ye bakınız > 0 Q C J Metilotrofi için Kısım 12.6 ve 17.24'e bakınız
1
19.8 • Hidrotermal Bacalar • 631
Diğer deniz hayvanları da besin açısından kemolitotroflara bağımlıdırlar. Örneğin metanotrofik simbiyontlar, Meksika körfezinde nispeten sığ derinliklerdeki doğal gaz sızıntıları yakınında bulunan bazı deniz hayvanları ile simbiyotik ilişkide yaşayarak hayvanlar için besinsel rol oynamaktadır (cz%\ Şekil 12.16). Gerçekte ototrof olmamalarına rağmen (CH4 organik bir bileşiktir) bu simbiyontlar enerji kaynağı olarak CH4 oksidasyonunu kullanarak hayvanın büyümesini desteklemektedirler. Aşın Sıcak Sular: Kara Bacalar Çok fazla derin denizler büyük hidrostatik basınç yaratırlar. Örneğin 2600 m derinlikte su, 450°C'ye ulaşıncaya kadar kaynamaz. Belirli ağız bölgelerinde süper ısınmış hidrotermal sıvı 350°C'ye kadar sıcaklıklarda dışarı çıkar. Bu süper ısınmış ancak kaynamamış su teorik olarak hipertermofilik bakteriler için bir habitat olabilir (aaç> Kısım 6.10 ve 6.12 ve Bölüm 13). Kara bacalardan sızan hidrotermal sıvı fazla miktarda metal sülfürleri, özellikle demir sülfürleri içerir ve soğuk deniz suyuna temas ettiğinde çabucak soğumaktadır. Presipitatlaşmış metal sülfürler, kaynak civarında bir "yanardağ ağzı" (Chimney) olarak ifade edilen kule oluştururlar (Şekil 19.19»). Aşırı sıcak hidrotermal sıvıda prokaryotların yaşamaması açık olmasına rağmen hipertermofil ve termofillerin deniz suyunda veya sıcak suyun soğuk okyanus suyuyla karıştığı hidrotermal sıvı gradientinde yaşadığına dair güçlü deliller vardır. Örneğin; yanardağ ağzı bacalarının duvarları hidrojen oksitleyen ve metan oluşturan bir organizma olan Metanopyrus gibi hipertermofilik pro-
• Şekil 19.19 350-C'lik bir sıcaklıkta kükürt ve mineralce zengin su çıkaran bir Hidrotermal açıklıkta kara baca. Kara baca ağzının duvarları bir sıcaklık kademesini göstermektedir ve birkaç çeşit prokaryot içermektedir (bakınız Şekil 19.20).
karyotlarla kaplıdır («*»û Kısım 13.4 ve 13.6). FISH teknolojisi, (Kısım 18.4) yanardağ ağzı bacalarının duvarlarında hem Bacteria ve hem de Archae hücrelerini saptamıştır (Şekil 19.20»). Bilinen en termofilik prokaryotlar olan Pyrolobus ve Pyrodidium türleride (««s Kısım 13.10-13.13) yanardağ ağzı bacalarının duvarlarında bulunmaktadır. Bacalar mineral kalıntılardan tıkandığında, hipertermofiller muhtemelen yeni oluşmuş bacaları kolonize etmek için akıntı ile uzaklaşırlar ve büyüyen yanardağ ağzı bacalarının duvarlarına kaynaşırlar. Sürpriz şekilde, büyümek için çok yüksek sıcaklıklara ihtiyaç duymasına rağmen, hipertermofiller kayda değer şekilde soğuk sıcaklıkları ve oksijene tolerans göstermektedirler. Bu yüzden, bir termal özellikten soğuk oksik deniz suyundaki başka bir yere hücrelerin taşınması bunun açık bir şekilde problem olmadığını göstermektedir. 19.8 Kavramların Gözden Geçirilmesi Hidrotermal bacalar derin—deniz sıcak su kaynaklarıdır ve oradaki volkanik aktivite, kemolitotrofik bakterilerin kullanabildiği fazla miktarda inorganik enerji kaynakları içeren sıvılar üretmektedir. Bu bakteriler CO2'yi organik karbon yapısına sokar ve bu organik karbonun bir miktarıda daha sonra derin-deniz hayvanları tarafından kullanılır. Derin-deniz hidrotermal ağzı habitatlarmm primer üreticileri; fototrofiklerden ziyade kemolitotrofiklerdir. •
Ilık bir hidrotermal ağız hem kimyasal hem de fiziksel olarak kara bacalarda nasıl farklılaşır?
•
Dev tüp şekilli kurt besinini nasıl elde etmektedir?
•
Niçin bir karabacadan çıkan 350°C sıcaklıktaki su kaynamaz?
• Şekil 19.20 Orta-Atlantik bölgelerinde (3500 m derinlik) Snake Pit ağız sahasındaki bir bacadan elde edilen kara baca materyalinin iilogenetik boyanması. Yeşil floresan bir boya tüm Bacteria 'nın 16S rRNA'sı ile reaksiyona giren bir prob ve Archaea için de bir 16SrRNA probuna kırmızı bir boya konjuge edilmiştir (C*^i Kısım 11.7 ve 18.4). Hücre sayılan en fazla baca duvarının daha dış bölgelerinde, en az da daha iç bölgelerinde bulunmaktadır. Bacanın merkezinden çıkan hidrotermal sıvı 300°C'dir. Günümüzdeki ortak görüş, mikrobiyal yaşamın yaklaşık 150°C civarında olabileceği ancak daha yukan sıcaklıklarda yaşamın temel moleküllerinin kararlı olamayacağı görüşüdür ( «»S Kısım 13 12).
632 • Bölüm 19 • Mikrobiyal Ekoloji
KIV
KARBON VE OKSİJEN DÖNGÜLERİ
Tablo 19.3
Global karbon döngüsü hem mikroorganizma ve hem de makroorganizma aktivitelerini içermekte olup aslında oksijen döngüsü ile bir arada gerçekleşmektedir, insan faaliyetleri sonucunda atmosfere giren CO2'nin artmasından dolayı karbon döngüsü uzun süredir bilimsel bir ilgi konusu olmaktadır. Bilim adamları karbon rezervuarlarının önemini daha iyi anlamak için, CO2'i azaltmak, ve ciddi global ısınma gibi gezegenimizin felaketletleri önlemek ve karbon transformasyonlarında model oluşturmak için kompartmanlar arasında ve içinde döngü oranlarını anlamak amacıyla karbon döngüsünü araştırmaktadırlar
Yeryüzünde başlıca karbon rezervleri
Rezervuar
Karbon (gigaton)
Yeryüzü üzerinde Toplam karbon yüzdesi
3
38 X 10 (> % 95'i 0.05 inorganik C'dur) Kayalar ve 75 X 106 (<% 80'i >99.5* sedimentler inorganik C'dur) 3 Karasal biyosfer 2 X 10 Sucul biyosfer 1-2 3 Fosil yakıtlar 4.2 X 10 Metan hidratlar 10" ' Bir gigaton 109 tondur. Veri Science 290:291-295 (2000)'den uyarlanmıştır * Organik karbonun çoğu prokaryotik hücrelerdedir. Okyanuslar
•
•
.
-
.
.
,
. •
•
•
•
Karbon Döngüsü Global kapsamda, karbon dünyanın tüm ana karbon rezervuarlarmda (atmosfer, kara, okyanus ve diğer sucul çevreler, sedimentler ve kayalar ve biyokütle) döngü halindedir (Şekil 19.21»). Bildiğimiz gibi, karbon ve oksijen döngüleri aslında bir arada gerçekleşmektedir. Bu, şimdi göreceğimiz gibi toprağın ve Dünya'daki diğer çevrelerin bir gerçeğidir.
Karbon Rezervuarlan En büyük karbon rezervuarı sedimentlerde ve yer kabuğu kayalarında bulunur (Tablo 19.3) fakat dönüşüm zamanı o kadar uzundur ki bu kompartmanın dışına akış, insan ömrüne göre çok uzundur. Canlı organizmalara baktığımızda çok miktarda organik karbon kara bitkilerinde bulunmaktadır. Bu karbon ormanlar ve yeşil alanlardaki karbonu ifade eder ve fotosentetik CO2 fiksasyonun önemli kısmını teşkil etmektedir. Ancak bundan da fazlası, canlı organizmalardan ziyade humus denen ölü prganik materyalde bulunur.
Humus, organik materyallerin kompleks bir karışımıdır. Humus kısmen toprak mikroorganizmalarının dekompozisyona dirençli protoplazmik yapılarından kısmen de dirençli bitki materyalinden oluşur. Bazı humik maddeler oldukça kararlıdır ve yaklaşık dönüşüm zamanı 40 yıldır. Bazıları ise çok daha çabuk dekompoze olur. Karbonun küresel transferinin en çabuk yolu atmosferik CO2 yolu iledir. Karbondioksit başlıca kara bitkilerinin fotosentezi ile atmosferden uzaklaştırılır ve kemoorganotrofik mikroorganizmalar ve hayvanların solunumu ile atmosfere geri döner. Çeşitli işlemlerin analiz edilmesi, atmosferik CO2 in önemli kısmının humusunda dahil olduğu ölü organik materyalin mikrobiyal dekompozisyonu yolu ile olduğunu göstermektedir. Ancak, son zamanlarda, insan aktiviteleri atmosferik CO2'e önemli derecede katkı yapmaktadır. Örneğin, sadece son 40 yılda, atmosferdeki CO2 düzeyleri yaklaşık %14 yükselmiştir. • Şekil 19.21 Karbon döngüsü. Karbon ve oksijen döngüleri birbirleriyle yakın ilişki içindedirler. Çünkü solunum süreçleri hem CO2 üretir hem de O2 uzaklaştırırken, oksijenik fotosentez hem CO2'i uzaklaştırır hem de O2 üretmektedir (ayrıca bakınız Kısım 19.5). Derin yüzey altı kısımlarda karbon döngüsü Yeryüzünün yüzeyindeki karbon döngüsü kadar önemli olabilir bakınız Mikrobiyal Şidebar, Mikrobiyal Yaşam Derin Yer altı), fakat bu verinin güvenilir oranlan yoktur. Yeryüzünde en fazla prokaryotik hücrenin okyanus ve karasal yüzelaltı bölgelerinde bulunduğu düşünülmektedir (£#^ Kısım 1.3 ve 19.4).
Hayvanlar ve mikroorganizmalar
"A Sedimentlerde ölüm ve mineral leşme
| Fosil | yakıtlar
\ Toprak oluşumu Kaya oluşumu
19 9 • Karbon Döngüsü • 633
Karbon Döngüsünde Fotosentezin Önemi Dünyada sentezlenen yeni organik maddeler için en temel yollar fotosentez ve kemosentez (Kemolitotroflarca gerçekleştirilen CO2 fiksasyonu) yoluyla gerçekleşmekte olup; en fazla organik madde fotosentez sonucu oluşmaktadır. Bu yüzden fototrofik organizmalar karbon döngüsünün temelini oluştururlar (Şekil 19.21). Fototrofik organizmalar genellikle ışığın bulunduğu habitatlarda yaşarlar. Bu nedenle de derin deniz ve diğer karanlık yerlerde fototrofik organizmalar bulunmaz. Oksijenik fototrofik organizmalar 2 ana gruba ayrılabilir; yüksek bitkiler ve mikroorganizmalar.
Yüksek bitkiler, karasal çevrelerin baskın fototrofik organizmalarıdır. Oysa fototrofik mikroorganizmalar sucul çevrelerin en yaygın fototrofik organizmalarıdır. Karbonun redoks döngüsü fotosentezle başlar (Şekil 19.22»): CO, + H,O ışık
(CH2O)+ O,
Burada (CH2O), polisakkarit (fotosentez sonucu oluşan organik maddenin hücrede biriken en temel şekli) gibi hücre materyalinin oksidasyon durumundaki organik maddeyi temsil eder. Fotosentetik organizmalar ayrıca hem ışıkta hem de
Oksijenik fotosentez Aerobik Kemolitotrofi
C02
Oksik Anoksik
Anaerobik solunum ve fermentasyon
Organik madde (CH2O)n
• Şekil 19.22 Karbonun redoks çevrimi. Şekil ototrofik (CO3—> organik bileşikler) ve heterotrofik (organik bileşikler —> C0 2 ) süreçleri karşılaştırmaktadır. San oklar oksidasyonlan göstermektedir; San oklar indirgenmeleri göstermektedirler.
karanlıkta solunumuda gerçekleştirmektedirler. Solunum için ana eşitlik oksijenik fotosentezin tersidir: (CH2O)+O2 >CO 2 + H 2 O ışık veya karanlık Burada (CH2O) yine depo polisakkariti temsil eder. Eğer fototrofik bir organizma hücre sayısı veya kütlesini arttıracaksa daha sonra fotosentez oranı solunum oranına göre artmalıdır. Eğer büyüme gerçekleşirse CO2'den polisakkarite fiske edilmiş karbonun bazısı biyosentez için başlangıç materyali olabilir. Tüm karbon döngüsünde, solunum oranı üzerinde fotosentez oranı lehine pozitif bir denge kurulur. Dekompozisyon Fotosentetik olarak fikse edilmiş karbon, mikroorganizmalar tarafından degrade edilir ve karbonun 2 temel şekli oluşur: Metan (CH4)ve karbondioksit (CO2) (şekil 19.22). Bu 2 gaz ürünü metanogenez aktivitelerinden veya fermentasyon, anaerobik ve aerobik solunum (CO2) şeklinde çeşitli kemoorganotroflarm aktivitelerinden oluşur. Anoksik habitatlarda CH4, H 2 ile CO2 in indirgenmesinden ve asetat gibi belli organik bileşiklerden üretilir. Ancak herhangi bir organik bileşik sonuçta sintrofik bakteriler ve metanojenlerin birlikte aktiviteleri ile CH4'e dönüşür: organik bileşiklerin fermentatif parçalanmasından oluşmuş H 2 metanojenler tarafından tüketilir ve CH4'a dönüştürülür (<x*a Kısım 17.17 ve bakınız bir sonraki Bölüm). Anoksik habitatlarda üretilmiş metan çözünmez bir bileşiktir ve metanotroflar tarafından CO2'e oksitlendiği oksik çevrelere transfer edilir. Bu yüzden tüm organik karbon sonuçta CO2'e dönüşür ve karbon döngüsü tamamlanır. Karbon çevriminin oksidatif ve redüktif kısımları arasındaki denge kritiktir: Bazı organizmala: rın metabolizma ürünleri diğerleri için şubstrattf f. Bu yüzden, döngünün milyarlarca yıl plduğu gij^j dengede kalması gerekir. Karbonun gaz formfannın miktarındaki herhangi bir değişiklik ciddi global sorunlara neden olabilir (fosil yakıtların yanması, ormanların yok edilmesi ile atmosferde CO2 düzeyinin artması). Dekompozisyon ifadesinde, CO2 ökaryotların aktivitelerinden çok daha fazla mikrobiyal aktivite ile salınır ve bu daha sonra inceleyeceğimiz gibi, özellikle anoksik çevrelerin bir gerçeğidir. 19.9 Kavramların Gözden Geçirilmesi Karbon ve oksijen döngüleri ototrofik ve heterotrofik organizmaların birbirini tamamlayıcı aktiviteleri sonucu birlikte gerçekleşir. Mikrobiyal dekompozisyon atmosfere salınmış CO 2 'in tek en büyük kaynağıdır.
634 • Bölüm 19 • Mikrobiyal Ekoloji
•
Doğada yeni organik madde nasıl yapılmaktadır?
•
Oksijenik fotosentez ve solunum hangi biçimde ilişki içindedir?
Sintrofi ve Metanojenez Biyolojik metanojenez sonucu oluşan metanın anoksik habitatlardaki karbon akışına büyük katkısı vardır. Metanojenez, tam bir anaerop olan Archaea'nm bir grubu olan metanojenlerce gerçekleştirilir. Biz metanojenezin biyokimyasını Kısım 17.17'de ve metanojenlerin kendisinide Kısım 13.4'te tartışmıştık. Çoğu metanojen anaerobik solunumda son elektron alıcısı olarak CO2'yi kullanır ve onu H 2 ile birlikte metana indirger (Şekil 19.22). Sadece diğer birkaç substrat (asetat bunların başında gelir) metanojenler tarafından direk olarak metana dönüştürülebilir. Böylece, en fazla CH4'e dönüşen organik bileşikler için metanojenler ihtiyaç duydukları substratları kendilerine sağlayan partner organizmalar ile takım oluşturmalıdırlar.
mente edicilerin fermentasyon ürünlerini fermente ederler. Örneğin Syntrophomonas zuolfei C4-Cg yağ asitlerini oksitleyerek asetat, CO2 (eğer karbon atomlarının sayısı çok olan yağ asiti ise), ve H 2 üretir (Tablo 19.4). Syntrophomonas'm diğer türleri C18'e kadar bazı doymamış yağ asitlerimde içeren yağ asitlerini kullanır. Syntrophobacter molinii propiyonatı okside eder ve asetat, CO2 ve H 2 üretir. Syntrophus gentiane ise aromatik bileşik olan benzoatı, asetat ve H2'ye ilave olarak CO2'e parçalar (Tablo 19.4). Gerçekte, organizmaların tam bir kombinasyonu ile her hangi bir organik bileşik hemen hemen tamamen metana dönüştürülebilir. Ancak H2 üreticilerin -sintrofların- saf kültürde sintrofik reaksiyonu gerçekleştiremediğini; onların büyümesi için H 2 - tüketen partner bir organizmaya ihtiyaç
Kompleks polimerler Selüloz, diğer polisakkaritler, proteinler
Bu sintrofların işidir.
Anoksik Dekompozisyon ve Sintrofi Kısım 17.21'de Biz aynı bileşiğin parçalanmasında iki veya daha fazla organizmanın birlikte iş gördüğü bir süreç olan sintrofi kavramını tartışıp sürecin arka tarafında enerjitiği üzerinde durmuştuk. Burada biz, sintrofik bakterilerin diğer organizmalarla olan ekolojik ilişkilerini ve anoksik karbon döngüsü için onların önemini göz önüne almaktayız. Bizim odaklandığımız nokta çok fazla anaerobik metabolizmanın gerçekleştiği anoksik tatlısu çevreleridir. Polisakkaritler, proteinler ve yağlar gibi polimerik maddeler ölü organizma ürünleridir ve prokaryotlarm birkaç fizyolojik grubunun birlikte iş görmesi ile CH4 ve CÖ2'ye dönüşmektedir. Selüloz gibi tipik bir polisakkaritin yıkılması için gerekli süreç yüksek moleküler ağırlıklı selülozu (Şekil 19.23» ve Tablo 19.4) sellobiyoz (glukoz-glukoz) ve oradan serbest glukoza ayıran selülolitik bakterilerle başlar (Şekil 10). Glukoz daha sonra primer fermente edicilerce asetat, propionat, butirat, süksinat, alkol, H 2 ve CO2 gibi çeşitli fermentasyon ürünlerine fermente edilir. Primer fermentasyonla üretilmiş H2 derhal metanojenler, homoasetojenler veya SO4 indirgeyen bakteriler (sülfatın yeterli düzeyde olduğu çevrelerde) gibi H2 tüketicilerce tüketilir. Ayrıca, asetat bazı metanojenlerce metana dönüşebilir. Fakat bu işlem, yağ asiti ve alkol oluşumundaki büyük miktarda karbonu bırakır. Bu bileşiklerin katabolizması sintrofi yoluyla gerçekleşmektedir (Şekil 19.23). Sintrofinin Rolü Kompleks organik materyallerin metana dönüşümünde anahtar organizmalar sintroflardır. Bu organizmalar sekonder fermente edicilere örnektir. Sintroflar, H 2 ve diğer ürünleri üreten primer fer-
Selülolitik ve diğer hidrolitik bakteriler
Hidroliz
Monomerler Şekerler, aminoasitler Fermentatif Fermentasyon bakteriler Propiyonat" Butyrate" Süksinat2" Alkoller Asetojenez
İ
H2-üreten yağ asiti oksitleyen bakteriler (sintroflar)
Homoasetojenler
AsetaT
Metanojenler
Fermentasyon
H 2 + CO 2 Metanojenler Metanojenler Metanojenler
CH4+O • Şekil 19.23 Anoksik dekompozisyon. Şema kompleks organik materyalin sonuçta metana (CH4) ve CO2'ye dönüşümünde fermentatif anaeroblann çeşitli gruplanmn iş gördüğü anoksik dekompozisyonunu gösteren tüm süreçtir. Bunun dışında H2 + CO2 homoasetojenler tarafından da tüketilebilmektedir. Sintroflann aktiviteleri ile, yağ asitleri ve alkoller metanojenler ve asetojenler için substratlara dönüştürülür. Bu şema tatlısu göl sedimentleri, lağım çamuru biyoreaktörleri veya rumendeki gibi sülfat indirgeyen bakterilerin küçük bir rol oynadığı çevreleri belirtmektedir.
19.10 • Sintrofi ve Metanojenez • 635
I Tablo 19.4
Organik bileşiklerin metane anoksik dönüşümünde gerçekleşen temel reaksiyonlar' Free-energy change (kj/reaction)
Reaksiyon type
Reaksiyon
Glukozun asetat, H2 ve CO2'ye fermentasyonu Glukozun butirat, CO2 ve H2'e fermentasyonu Butiratm asetat and H2'e fermentasyonu Propiyonatın asetat, H2 ve CO2 H2'e fermentasyonu Etanolun asetat and H2'e fermentasyonu Benzoatın asetat, CO, ve H2'e fermentasyonu H2+ CO2'den metanojenez Asetattan metanojenez H2+ CO2'den Asetojenez
Glukoz + 4 H2O -* 2 Asetat" + 2HCO3"+4H + 4 H 2 + Glukoz + 4 H2O -» Butirat" + 2HCO3+3H + 2 H 2 + Butirat- + 2 H O ~» 2 Asetat- + H +2 H + Propionat" + 3 H2O -» Asetat" + HCO 3 +H + 2 H2 + 2 Etanol + 2 H2O -* 2 Asetat" + 2 H + 4 H 2 + Benzoat" + 6 H2O -» 3 Asetat - + 2 H + CO2 +3 H 2 + 4 H2 + HCGy + H -» CH4 + 3 H2O Asetat" + H2O -» CH4 + HCO3" + 4H2+ 2HCO3"+ H -• Asetat" + 4 H2O
C
AG +
-207 -135 +48.2 +76.2 +19.4 +46.5 -136 -31 -105
-319 -284 -17.6 -5.5 -37 -18 -3.2 -24.7 -7.1
' Veri Zinder, S. 1984'den uyarlanmıştır. Organik atıkların metana anaerobik dönüşüm mikrobiyolojisi: Recent developments. Am. Soc. Microbiol. Nezvs 50: 294-298. b Standart koşullar: çözgenler, İM; gazlar, 1 atm. ' Tipik anoksik tatlisu ekosistemlerinde reaktantlann konsantrasyonları: yağ asitleri, lmM; HCO3~, 20 mM; glukoz, 10 uM; CH4,0.6 atm; H2,10"1 atm. AĞ" dan AG'yi hesaplamak için Ek bölümde gösterilmektedir.
gösterdiğini hatırlayınız. Bu gereksinim sintrofik süreçlerin enerjitiğini yapmak için gerekmektedir. Kısım 17.21'de açıklandığı gibi, Partner organizma ile birlikte H2 tüketimi sintroflann büyümesi için hayati bir önem gösterir. Tablo 19.4'deki reaksiyonlar standart koşullarda (çözgenler, 1 M; gazlar, 1 atm) yazıldığında, reaksiyonların serbest-enerjisi aritmetik şekilde pozitif yönde değişir. Yani, bu reaksiyonların AG°'si (c^> Kısım 5.4) egzergonik değildir (Tablo 19.4). Fakat partner bakterilerle H 2 tüketimi, sintrofun büyümesini desteklemek için yeterli enerji korunumunu sağlayan enerjitik yapıyı değiştirir. Bu, Tablo 19.4 de görülmektedir. Eğer H 2 konsantrasyonları partner organizmanın aktiviteleriyle çok düşük tutulursa, burada AG değerleri (habitatta gerçek koşullarda ölçülmüş serbest-enerji değişikliği) enerji korunumunu uygun kılabilir. Bu metabolik işbirliğinin son ürünleri CO2 ve CH4'dür. Sintrofik olarak katabolize edilmiş yapıların listesi hemen hemen sonsuzdur ve şimdi göreceğimiz gibi doymuş hidrokarbonlarıda içermektedir.
de, metanojenler metanojenez basamaklarını tersine çevirerek metanı CO2'ye okside ederler (<SB&> Kısım 17.17; Şekil 19.24b). Metabolizmanın sintrofik bir şekli ile üretilen H 2 ikinci bir organizma ile uzaklaştırılmazsa, bu reaksiyon enerjitik olarak tercih edilmez. Bu H2S üretiminde H 2 tüketen sülfat indirgeyicilerin işidir (Şekil 19.24). Bu enerjinin
Metanın Anaerobik Metabolizması Tatlı su ekosistemlerinde, anoksik sedimentlerde üretilmiş metan, oksik zona geldiğinde metanotroflar tarafından CO2'ye okside edilir (Şekil 19.22). Metan oksidasyonunun ilk basamağında monooksijenaz enzimi iş gördüğü için bu metan oksitleyen prokaryotlar metanın katabolizması için O2'ne ihtiyaç duyarlar (c*** Kısım 17.22 ve 17.24 ve Şekiller 17.55 ve 17.58). Buna karşılık, deniz sedimentlerinde metan, belli başlı sülfat indirgeyen bakterileri ve metanojenleri içeren hücre agregatları ile anoksik koşullar altında okside edilebilirler (Şekil 19.24a*). Metan agregatlarla nasıl okside edilir hala açık değildir, fakat iki alternatif önerilmektedir. Birin-
/ I
Organizma AG°'(kJ)
I Reaksiyon *- C 0 2 + 4 H 2
^CH 4 +2H 2 O 2
^SO4 "+4H2 + H
+
Toplam: SO42" + CH 4
Metanojen
+131
*• HS" + 4 H2O Sülfat indirgeyen-156 - HCO3- + HS" Sintrofik reaksiyon + H2O
-25
(b) • Şekil 19.24 Anoksik metan oksidasyonu. (a) Deniz sedimentlerinden elde edilen metan-oksitleyen hücre agregatlan. Agregatlar sülfat-indirgeyen bakterilerle (yeşil) çevrilmiş metanojenik bakterileri (kırmızı) içerir. Her bir hücre tipi farklı bir filogenetik FISH boyama ile boyanır ( O ^ Kısım 18.4). Agregatın çapı yaklaşık 30 |jm dir. (b) hücre agregatlannda sintrfik anoksik metan oksidasyonunun muhtemel mekanizması.
636 • Bölüm 19 • Mikrobiyal Ekoloji
çok az miktarını verir (Şekil 19.24b), ve bu enerjinin agregatları oluşturan elemanlar arasında nasıl paylaşıldığı açık değildir. Alternatif şekilde, metanojenik bileşen, sülfat indirgenmesi esnasında asetatı CO2'ye oksitleyen sülfat-indirgeyen bakteriyle CH4, asetata dönüştürülebilir. Bu ortaklık ne şekilde çalışırsa çalışsın, anoksik metan oksidasyonu iki organizmanın yalnız başına iken yapamadığı bir reaksiyonu gerçekleştirmek için işbirliğine gidilen sintrofik bir süreçtir. Son zamanlarda yapılan anoksik metan oksitleyen hücre agregatlarınm çevresel genomik analizleri (a°Q Kısım 18.6) ters metanojenez hipotezini desteklemektedir. Metanojenik Habitatlar Metanojenlerin obligat anaerobikliği ve kendilerine özel metabolizmalarına rağmen onlar dünyada yaygın olarak bulunurlar. Metanojenler bataklıklar veya rumen (bakınız Kısım 19.11) gibi sadece anoksik çevrelerde yüksek sayılarda bulunmasına rağmen, süreç normal olarak orman ve çayırlık topraklar gibi oksik olduğu düşünülen habitatlarda da oluşabilir. Böyle habitatlarda metanojenez, toprak parçalarının içi gibi anoksik mikroçevrelerde de oluşur (bakınız Şekil 19.2). Tablo 19.5 farklı habitatlardaki metanojenez hızları göstermektedir. Metanın biyojenik üretiminin gaz kuyularından ve diğer abiyojenik kaynaklardan gelen üretim oranından fazla olduğun dikkat ediniz. Geviş getiren Tablo 19.5
hayvanların geğirmesinden (bakınız Kısım 19.11) ve termitlerden, pirinç tarlaları ve doğal ıslak alanlardan salman metan n, biyojenik metanın en büyük kaynaklarıdır. Metanojenler aynı zamanda belli başlı bazı protozoonların endosimbiyontu olarakta bulunmaktadır. Böcek sindirim sisteminde bulunan serbest yaşayan sucul amipler ve flagellatlarm dahil olduğu birkaç protozoonunda metanojenleri barındırdığı görülmüştür. Örneğin; termitlerde metanojenler özellikle termit sindirim sisteminde barınan trichomonal protozoon hücreleri içinde bulunur (Şekil 19.25»). Protozoonların metanojenik simbiyontları Methanobacterium
veya Methanobrevibacter
cinsi-
nin çubuk şekilli türlerine benzemektedirler ( ^ a Kısım 13.4), fakat serbest yaşayan metanojenlerin gerçek akrabaları oldukları açık değildir. Termit sindirim sisteminde, endosimbiyotik metanojenlerin selülolitik protozoonların gerçekleştirdiği glukoz fermentasyonundan açığa çıkan H2'i tüketerek
Atmosfere salınma oranları'
Kaynak
CH4 emisyonu (1012g/year)
Biyojenik Ruminantlar Termitler Pirinç tarlaları Doğal sulak alanlar Dolgu topraklar Okyanus ve göller Tundra Abiyojenik Kömür Doğal gaz çıkışları Endüstriyel ve boru hatlarından kayıp Biyomasm yanılması Metan hidratlar Volkanlar Otomobiller Toplam Toplam biyojenik Toplam abiyojenik
80-100 25-150" 70-120 120-200 5-70 1-20 1-5 10-35 10-30 15-45 10^0 2-A 0.5 0.5 350-820 302-665 toplamın % 81-86'sı 48-155 toplamın % 13-19'u
"Veriler estimates in Tyler, S. C. 1991'den. The global methane budget, pp. 7-58, in E. J. Rogers and W. B. VVhitman (eds.), Microbial Production and Consumption ofGreenhouse Gases: Methane, Nitrogen Oxide$, and Halomethanes, American Society for Microbiology, Washington, DC. 'En son tahminler, düşük değerin muhtemelen daha doğru olduğunu göstermektedir.
• Şekil 19.25 Termitler ve karbon metabolizmaları. (a) Yaygın bir doğu (ABD) yer altı termit işçi larva görünümü altında ayrı bir işçiden ekstrakte edilmiş bir hindgut. Hayvan yaklaşık 0,5 cm uzunluğundadır. Metanojenezde oluşmasına rağmen asetojenez bu termitlerde anoksik karbon metabolizmasının temel şeklidir, (b, c) Zootermopsis angusticolis termitinin hindgufından elde edilmiş mikroorganizmalar. Tek bir mikroskop sahası iki farklı metotla fotoğraflanmıştır. (b) Faz kontrast, (c) Floresant koenzim yüksek içerikte F420'den dolayı metanojenlerin tipik rengini gösteren epifloresans (O°O Kısım 17.17 ve Şekil 17.42 ve 17.43). Metanojenler protozoon Tricercomitis sp. hücreleri içindedir. Bitki partikülleri san floresans üretir. Bir protozoon hücresinin ortalama çapı 15-20 ^ım dir. Floresans mikroskopiıün bir anlatımı için bakınız Kısım 4.1.
19.11 • Geviş Getiren Hayvanlarda Karbon Döngüsü • 637
protozoon konukçularma fayda sağlayacağı düşünülmektedir. Tablo 19.5' de görüldüğü gibi termitler biyojenik metanın ana kaynağı olabilmektedir. Asetojenik Habitatlar Metanojeneze rakip bir süreç asetojenezistir (c**$ Kısım 17.16). Bazı habitatlarda örneğin rumende homoasetojenlerin, metanojenlerle zayıf bir rekabet halinde olduğu görülmektedir. Bu yüzden, metanojenez dominant H2-tüketen süreçtir. Fakat termit sindirim sistemindeki gibi metanojenez'in gerçekleştiği diğer habitatlarda asetojenezis çok daha önemli bir süreçtir. Termit sindirim sisteminde anaerobik metabolizmanın dominant durumu nasıl idare edilmektedir? Basit enerjitik kavramlar temelinde, hidrojenden metanojenez, asetojenezise göre (sırasıyla, -136 kj karşın -105 kj) daha tercih edilebilir bir süreçtir ve bu yüzden metanojenler rekabetsi avantajına sahip olmalıdırlar. Ancak, termitlerde bu durum böyle değildir. Bunun nasıl gerçekleştiğine dair her biri deneysel delillerlede desteklenen üç neden vardır. Birincisi, Homoasetojenler kendilerini termit sindirim sisteminde hidrojen kaynağına metanojenlerden daha yakın bir pozisyona sokabilirler ve böylelikle homoasetojenler selüloz fermentasyonundan üretilen hidrojenin çoğunu tüketebilir, ikincisi, metanojenlerden farklı olarak, homoasetojenler glukozu (selülozdan gelen) fermente edebilir. Ve üçüncüsü, Termitler selülozla karışık yüksek oranda lignin içeren odunu yer ve bu tip materyal asetojenezisin tercih ettiği tarzda degrade edilir. Böylece, termit sindirim sistemindeki özelleşmiş habitatdaki faktörlerin birleşimi muhtemelen anoksik çevrelerde alışılmadık bir durum olarak metanojenezin üzerinde asetojenezisi baskın kılmaya katkıda bulunur. Metanojeneze Karşın Sülfidojenezis
Metanojenez ve asetojenezis; anoksik tatlı sularda ve karasal çevrelerde, denizsel sedimentlerden daha yaygındır. Bu durum, denizsel çevrelerde sülfat indirgeyen bakterilerin yaygın olması yönünde olup bu bakteriler hidrojen için metanojenler ve asetojenlerden daha fazla rekabet edebilmektedir. Bunun için biyokimyasal temel, H2'le sülfat indirgenmesinin enerjitiği ya metana ya da asetata H2'li CO2 indirgenmesinden daha iyi olduğu gerçeğinde yatar (Ö°C> Kısım 17.15-17.17); belli biyokimyasal nedenlerden dolayı, bu süreç sülfat indirgenmesini tercih eder. Ancak, sülfatın az bulunmasından dolayı, sülfidojenezisin çok düşük olduğu tatlı sularda metanojenez ve asetojenezis dominanttır.
•m19.10 Kavramların Gözden Geçirilmesi
Anoksik koşullar altında, organik madde öncelikle CH 4 ve CO2'ye parçalanır. Çoğu metan, H 2 üreten sintrofik bakterilerce oluşturulmuş H 2 ile CO2'nin indirgenmesinden oluşur; Bu organizmalar enerjitiklerini dengelemek için H 2 tüketimine bağımlıdırlar. Global bir temelde, Biyojenik CH 4 abiyojenik CH 4 'dan çok daha büyük bir kaynaktır.
• •
Asetojenezisin son ürünü nedir? Hangi anoksik habitatlar metanojenezden daha büyük asetojenezis gösterirler? • Niçin H 2 'den oluşan metanojenez deniz sedimentlerinde ana bir süreç değildir? • Oksijen yokluğunda metan nasıl okside olur?
19.11
Geviş Getiren Hayvanlarda Karbon Döngüsü
Geviş getiren hayvanlar Rumen denen özel bir sindirim organına sahip olan otçul (herbivor) memelilerdir. Rumen içinde, selüloz ve diğer polisakkaritlerin parçalanması mikroorganizma aktivitesi ile gerçekleşir. Çok önemli evcil hayvanların bazıları (örneğin; inek, koyun ve keçi) geviş getiren hayvanlardandır, insanın yiyecek maliyeti büyük oranda bu hayvanlara bağlı olduğu için rumen mikrobiyolojisi kayda değer ekonomik önemi vardır. Rumen Anatomisi ve Rolü Karasal bitkilerdeki organik maddeler çözünmez polisakkaritlerde bulunur ki bu polisakkaritlerin en önemlisi se/ü/ozdur. Memeliler -ve hemen hemen diğer tüm hayvanlar- selülozu parçalamak için gerekli enzimlere sahip değillerdir. Fakat geviş getiren hayvanlar sindiriri ajanlar olarak mikroorganizmaları kullanarak selülozu metabolize ederler. Bir selüloz parçalama bölgesi olaran rumenin kendine has özellikleri, nispeten büyük hacimde olması (bir inekte 100-150 litre, bir koyunda 6 litre) ve asidik mideden önce sindirim borusundaki pozisyonudur. Ayrıca, rumenin sabit ve hafif sıcaklık derecesi (39°C), sabit pH'ı (6,5), ve anoksik tabiatıda rumenin tüm görevleri içinde önemli faktörler arasındadır. Şekill9.26a« geviş getiren hayvanların sindirim sisteminin diğer kısımları ile rumenin ilişkisini göstermektedir. Bir ineğin (Şekil 19.26ü?) veya bir koyunun rumenine kısmende olsa fistül (fistula) denen bir örnekleme portu oluşturarak analizler için örnekleri almak mümkün olduğu için rumendeki sindirim süreci ve mikrobiyolojisi iyi anlaşılabilmektedir. Yiyecek ilk önce retikuluma girer ve buradan hızlı bir şekilde rumene pompalanır. Orada bikarbonat içeren tükürükle karışır ve döner (rotary) bir harekette çalkalanır. Bu peristaltik hareket sonucu oluşan iyi bir süspansiyon, mikrobiyal tutunma ve fermentasyonu destekleyerek selülozun öğütülmesini sağlar. Daha sonra yiyecek kütlesi retikuluma gider ve orada cuds denen küçük parçalar oluşturulur; bunlar ağıza geri çıkartılır ve tekrar çiğnenir. Şimdi iyi şekilde bölünmüş katılar, iyice tükürükle karıştırılır ve tekrar yutulur, fakat bu kez materyal direk olarak omasum'a ve oradan daha fazla gerçek bir (asidik) mide gibi bir organ olan abomasum'a geçer. Abomasum'da, kimyasal sindirim süreçleri başlar ve ince ve kaim bağırsakta devam eder.
638 • Bölüm 19 • Mihrobiyal Ekoloji Özofagus
YEM, SAMAN, vb.
Rumen İnce bağırsak
GevişYiyecek
Selüloz, nişasta, şekerler i Selülolizis, amilolizis Fermentasyon
ŞEKERLER
. . . , Format
Suksinat2
1
Propiyonat" + CO 2
Atmosfere geğirme ile uzaklaştırma
Rumen fermentasyonunun toplam stokiyometrisi: 57.5 glukoz —»-65 asetat" + 20 propiyonat" + 15 butirar + * Şekil 19.26 Rumen. Bir ineğin rumen ve gastrointestinal sistemi. Yiyecek özofagustan rumene doğru ilerler ve daha sonra geri çıkar ve sırasıyla retikulum, omasum, abomasum ve bağırsaklara girer. Abomasum asidik bir kanaldır ve domuz ile insanlar gibi monogastrik hayvanların midesine anologtur. (b) Fistullu bir Holstein ineğinin fotoğrafı. Açık olarak görünen fistul rumen girişe izin veren bir örnekleme aracıdır. Fistullu inekler ve koyunlar hem rumen mikrobiyolojisi ve hem de geviş getiren hayvan beslenmesinde çok yararlı bir çalışma aracıdır.
60 CO2 + 35 CH4 + 25 H2O
• Şekil 19.27 Rumende gerçekleşen biyokimyasal reaksiyonlar. Ana başlangıç substratı, glukoz (selülozdan) ve son ürünler işaretlenmiştir; Çizgili hatlar minör yol izlerini belirtmektedir. Uçucu yağ asitlerinin (UYA) rumendeki yaklaşık miktarları asetat, 60 mM; propiyonat, 20 mM; butirat, 10 mM'dır. UYA geviş getiren hayvanlar tarafından tüketilmektedir. Bu sebeptendir ki Sintrofik yağ asiti oksitleteyen bakteriler (bakınız Kısım 19.10) rumen mikrobiyal ekosisteminde gerekli değildir.
Rumende Mikrobiyal Fermentasyon Yiyecek rumende yaklaşık 9-12 saat kalır. Bu periyod esnasında selülolitik mikroorganizmalar selülozu disakkarit olan sellobiyoza ve serbest glukoza hidroliz ederler. Bu açığa çıkan glukoz daha sonra protein tekrar kazandırılabildiği ve hayvan tarafınözellikle asetik, propiyonik ve butirik asit gibi uçudan kullanılabildiği için, bir geviş getiren hayvan cu yağ asitleri ve karbondioksit ve metan üretiminin bu yüzden ot gibi proteini eksik olan yiyeceklerle gerçekleştirdiği bakteriyal fermentasyona uğrar beslendiğinde geviş getirmeyen hayvanlara karşı (Şekil 19.27»). Yağ asitleri rumen duvarının içinde besinsel olarak üstündürler. kan dolaşımına geçer ve enerjilerinin ana kaynağı hayvanlar tarafından okside edilir. Rumen Bakterileri Rumen oldukça fazla sayıda prokaryot içerir (1010-10n bakteri/g rumen içeriği). Sindirimdeki Rumende gerçekleşen biyokimyasal reaksiyonlar görevlerine ilaveten, rumen mikroorganizmaları karmaşıktır ve birçok mikroorganizmanın birlikhayvan için gerekli nutrientlerin ana kaynağı olan te gerçekleştirdikleri aktivitelerle oluşur. Rumen amino asitleri ve vitaminleri sentczlerler. Bakterianoksik olduğu için, doğal olarak anaerobik baklerin çoğu bitki materyallerine ve yiyecek partikülteriler baskındır. Ayrıca, selülozun CO2 ve CH4'e lerine sıkıca tutunurlar. Bu materyaller hayvanın dönüşümü çok basamaklı mikrobiyal bir gıda zingastrointestinal borusunda ilerler ve orada geviş ciri içerdiği için, birçok çeşit anaerob burada beslegetirmeyen hayvanlardaki gibi daha ileri sindirim nebilir (Tablo 19.6). süreçlerine uğrarlar. Rumenden birçok mikroorBirkaç farklı rumen bakterisi selüloz gibi poliganizma, abomasumda sindirilir ve bu yüzden merleri hidroliz ederek oluşan şekerleride uçucu bu mikroorganizmalar, hayvan için protein ve viyağ asitlerine fermente ederler. Fibrobacter succinotaminlerin önemli bir kaynağıdır. Bu mikrobiyal genes ve Ruminococcus albus en yaygın bulunan iki
19.11 • Ceviş Getiren Hayvanlarda Karbon Döngüsü • 639
Tablo 19.6
Bazı rumen prokaryotlannın özellikleri
Organizma
Filogenetik Morfoloji Gr;un boyama domain
Selüloz parçalayıcılar Fibrobacter succinogenesb Butyrivibrio fibrisolvens'
Negatif Negatif
B B
Çubuk Kıvrık çubuk
Ruminococcus albusb Clostridium lochheadü
Pozitiv Pozitiv
B B
Nişasta parçalayıcılar Prevotella ruminicola Ruminobacter amylophilus Selenomonas ruminantium Succinomonas amyhlytica Streptococcus bovis
Negatif Negatif Negatif Negatif Negatif
Laktat parçalayıcılar Selenomonas ladüytka Megasplıaera elsdenii
Negatif Pozitiv
Suksinat parçalayıcılar Schzvartzia succinovorans Pektin parçalayıcılar Lachnospira multiparus Metanoj enler Methanobrevibader ruminantium Methanomicrobium mobüe D
Fermentasyon Hareketlilik ürünleri
DNA (mol % CC) 45-51 41
Kok Çubuk (endosporlu) +
Suksinat, asetat, format Asetat, format, laktat, butirat, H 2 , CO 2 Asetat, format, H 2 , CO 2 Asetat, format, butirat, H 2 , CO 2
B B B B B
Çubuk Çubuk Kıvrık çubuk Oval Kok
Format, asetat, suksinat Format, asetat, suksinat Asetat, propiyonat, laktat Asetat, propiyonat, suksinat Laktat
40-42 49 49 — 37-39
B B
Kıvrık çubuk Coccus
Asetat, suksinat Asetat, propiyonat, butirat, valerat, kaproat, H 2 , CO 2
50
+
+ +
+
43-46 —
54
Negatif
B
Çubuk
+
Propiyonat, CO 2
46
Pozitiv
B
Kıvrık çubuk
+
Asetat, format, laktat, H 2 , CO 2
—
Pozitiv
A
Çubuk
31
Negatif
A
Çubuk
CH 4 (H 2 + CO 2 veya formattan) CH4(H2+CO2 veya formattan)
+
49
B, Bacteria; A, Archaea
'Bu türler ayrıca bitki hücresinin temel bir polisakkariti olan ksileni de parçalar (£Xfe,Kısım 17.25) c Ayrıca nişastayıda parçalar
selülolitik rumen anaeroblarıdır. Her iki organizma selülaz üretmesine rağmen, gram-negatif bir bakteri olan Fibrobacter selülozu parçalamak için yapısında periplazmik bir selülaz bulundurmaktadır (cs3öKısım 4.9). Bundan dolayı, Fibrobacter hücreleri selülozu sindirirken selüloz fibriline tutunmuş olmalıdır. Diğer taraftan, Ruminococcus, bakteriyal hücre dışında selülozun parçalandığı yer olan rumen içeriğine boşaltılan (bu yüzden, o bir hücre dışı enzimdir) bir selülaz üretir. Ancak, son olarak her iki durumda aynıdır: Serbest glukoz fermentatif anaeroblar için elde edilebilir hale getirilir. Eğer geviş getiren bir hayvan selülozdan nişastaca zengin (örneğin, hububat) bir diyete doğru aşamalı olarak geçiş yaparsa, daha sonra Ruminobacter amylophilus ve Succinomonas amyhlytica gibi
nişasta sindiren bakteriler rumende yüksek sayılara ulaşırlar. Düşük nişasta-içerikli bir diyette bu organizmalar düşük oranda yapıya katılırlar. Eğer bir hayvan polisakkarit pektince zengin legüm samanı ile beslenirse daha sonra pektin sindiren bakteri Lachnospira multiparus (Tablo 19.6) rumen florasının yaygın bir üyesi olur. Genellikle, rumenin mikrobiyal yapısındaki değişiklikler hayvanın hastalanmasına hatta ölmesine sebep olur. Örneğin, eğer bir inek tamamıyla arpadan aniden tahıl diyetine geçirilirse, Streptococcus bovis'in anlık büyümesi rumende gözlenir. Normal seviyedeki S. bovis, yaklaşık 107 hücre/g
(toplam rumen bakteri sayıları göz önüne alındığında önemsizdir) hızlı şekilde 1010 hücre /g üzerine çıkar. Bu aşama S. bovis'in nişasta üzerinde hızlı büyümesinden dolayı gerçekleşir. Ot temel olarak selüloz içerirken tahıl yüksek düzeyde nişasta içermektedir. Bir laktik asit bakterisi olarak (eea Kısım 12.19) S. bovis nişastanın fermentasyonu ile yüksek miktarda laktat üretir. Bu rumeni asitleştirir (asidosis denen bir durum) ve doğal rumen mikroflorasmı öldürür. Ciddi asidosis hayvanın ölümüne sebep olabilir. Asidosisten kaçınmak için, hayvanlar birkaç günlük periyotlarla arpadan tahıla doğru kademeli olarak geçirilir. Nişastaya yumuşak bir geçiş S. bovis yerine uçucu yağ asiti üreten nişasta parçalayıcılar için seçicilik sağlar (Tablo 19.6) ve bu yüzden doğal rumen mikrobiyal süreçleri bozulur. Sakkarolitik rumen mikroflorasının bazı fermentasyon ürünleri rumende ikinci fermente edicilerce enerji kaynağı olarak kullanılır. Böylelikle, suksinat, Schrvartzia tarafından propiyonat ve CO2'ye fermente edilir (Şekil 19.27) ve laktat, Selenomonas ve Megasphaera tarafından asetik ve diğer asitlere fermente edilir (Tablo 19.6). Fermentatif süreçler sonucunda rumende üretilen hidrojen metanojenlerce hızlı şekilde tüketildiği için asla birikmez. Rumenin yüksek yağ asiti içeriğine rağmen, sintroflar (ooö Kısım 19.10) orada önemli bir rol oynamazlar çünkü hayvanın kendisi yağ asitlerine önemli
640 • Bölüm 19 • Mikrobiyal Ekoloji
gereksinim duyarlar (Şekil 19.27). Yani, hayvan tarafından tüketilmiş olan propiyonat ve butiratla (Şekil 19.27), sintrofik dönüşüm süreci (Tablo 19.4 ve Şekil 19.23) rumende gerekli değildir. Rumen Protozoonları ve Funguslar Prokaryotlara ilaveten, rumen hemen hemen sadece siliyatlardan oluşmuş karakteristik protozoal faunaya (yaklaşık 106/ml) sahiptir («**s Kısım 14.10). Bu protozoonlarm çoğu obligat anaerobturlar ve bu özellik ökaryotlar arasında nadir bir özelliktir. Protozoonlar rumen fermentasyonu için gerekli olmamasına rağmen, onlar tüm sürece katılırlar. Gerçekte, bazı protozoonlar selüloz ve nişastayı hidroliz edebilirler ve glukozu fermente ederek bakteriler tarafından oluşturulan aynı organik asitlerin üretilmesine neden olurlar (Tablo 19.6). Rumen protozoonları ayrıca yiyecek kaynağı olarak rumen bakterilerimde sindirirler ve böylelikle rumende bakteriyal yoğunluğu kontrol etmede bir rol oynadığı düşünülmektedir. Anaerobik funguslarda rumende yaşarlar ve rumene ait sindirim işlemlerinde bir rol oynadıkları bilinmektedir. Rumen fungusları genellikle bir flagelli ve bir tallus form arasında olan türlerdir ve saf kültürlerle yapılan çalışmalar onların selülozu UYA'lerine fermente edebildiklerini göstermektedir. Örneğin, Neocalimastii glukozu format, asetat, laktat, etanol, CO2 ve H2'e fermente eden obligat anaerobik bir fungusdur. Bir ökaryot olmasına rağmen, bu fungusda mitokondrium ve sitokromlar bulunmaz ve bu yüzden zorunlu fermentatif şekilde yaşarlar. Ancak, Neocallitnastix hücreleri H 2 açığa çıkarmada iş gören ve hidrojenosom denen bir redoks organeli içerir ve bu yüzden filogenetik olarak sadece "ilk dallanan" Eukarya içinde bulunmaktadır (005 Kısım 14.2, 14.4, ve 14.9). Rumen fungusları selülozdan başka lignin (odunsu bitkilerin hücre duvarlarında sertleştirme ajanları), hemiselüloz, ve pektin gibi polisakkaritlerinde kısmi parçalanmasında önemli bir rol oynarlar. Geviş Getiren Hayvanların Beslenme Alışkanlıktan ve Gıda Kaynaklı Hastalıklar
Son yıllarda, emniyet tedbirleri, geviş getiren hayvanların, özellikle büyükbaş hayvanlar ve hayvanın mikroflorası üzerine onların etkileri, beslenme alışkanlıkları üzerine kurulmaktadır. İnsanlar, hızlı şekilde geviş getiren hayvanların diyetini arpadan daha fazla nişasta-temelli tahıl diyetlere doğru değiştirmiştir. Tahıl hızlı kiloartışı yapar ve hayvanı zayıf halden etli hale sokar. Bu yüzden, tahılla beslenen hayvanlar daha kısa sürede satışa sunulur ve onların eti daha değerlidir. Ancak, yüksek-nişastalı bir diyet sadece rumen mikroflorasını etkilemekle kalmaz aynı zamanda daha önce gördüğümüz gibi, rumenin sidirim kanalının aşağısındaki mikrobiyal yapıyıda etkilemektedir (Şekil 19.26a). Özellikle sindirim kanalının pH'ı tahılla-beslenen hayvanlarda daha asidiktir. Bu durum Escherichia
coli O157-.H7 (003, Kısım 29.8) gibi aside-toleranslı enteropatojenik E. coli strainlerini daha fazla asittoleransı olan patojen olmayan strainlerine karşın baskın hale getirir. Tahılla-beslenen hayvanlar kesildiğinde, bu E.coli hücreleri karkasa yapışabilir ve et ürünlerine özellikle sığır kıyması ve sığır sosisi gibi kıyma ürünlerine bulaşabilir. Bu yüzden, gıda kaynaklı hastalık riski artar (<3
Rumende hakim olan fiziksel ve kimyasal koşullar nedir? • UYA'leri nedir ve onların geviş getiren hayvanlar için değeri nedir? • Niçin Streptococcus bovis'in metabolizması geviş getiren hayvan besininde özel bir yere sahiptir? Geviş getiren hayvanın beslenme alışkanlıklarından dolayı insanda gıda kaynaklı hastalıklar nasıl olabilmektedir? • Çekal hayvanlar sindirim borusu anatomileri bakımından geviş getiren hayvanlardan nasıl farklılaşırlar?
JLğ\f •E W
D
'ĞER ÖNEMLİ BESİN DÖNGÜLERİ
Kantitatif bir temelde karbon doğada önemli bir döngü elementi olmasına rağmen, bitki ve hayvanların metabolizmasında önemli diğer birçok elementte mikroorganizmalarca döngüye katılırlar. Bu elementler azot, kükürt ve demiri içerir ve şimdi biz anahtar nutrientlerin döngüsünü inceleyeceğiz.
19.12 • Azot Döngüsü • 641
koşul altında nitrat indirgenmesinin son ürünü N 2 ve N 2 O'dur. Nitratın denitrifikasyon (Şekil 19.28) denen gaz azot bileşiklerine dönüşümü biyolojik Azot elementi, N, protoplazmanın anahtar bir yapı olarak oluşmuş gaz N2'nin temel aracıdır. Diğer elementidir ve birkaç oksidasyon durumunda bulutaraftan, denitrifikasyon zararlı bir süreçtir. Örnenur (sos Tablo 17.2). Biz daha önce mikrobiyal azot ğin, nitrat bulunduran verimli alanlar doğal olarak sürecinin üç temel süreci olan nitrifikasyonu («*& Kısım 17.12), denitrifikasyonu (<er*s Kısım 17.14), ve azot şiddetli yağmurlardan sonra suyla kaplanmış hale gelirler. Sonrasında hızla anoksik koşullar gelişir, fiksasyonunu (oeç> Kısım 17.28) tartışmıştık. Bunlar ve denitrifikasyon yaygın hale gelebilir. Bu süreç, ve diğer birkaç azot dönüşümleri Şekil 19.28»'de topraktan fikse edilmiş azotu uzaklaştırır. Diğer gösterilen redoks döngüsünde özetlenmiştir. taraftan, denitrifikasyon atıksu arıtımında yararlı bir süreç olabilir (CCÖ Kısım 28.2). Nitrat uzaklaşAzot Fiksasyonu tırılmasıyla ve su deşarj edildiği zaman büyüme sınırlandırılmış olmaktadır. Azotun anahtar redoks reaksiyonlarının birkaçı doğada hemen hemen tamamıyla prokaryotlar taAmonyak Değişimleri, Nitrifikasyon, ve rafından gerçekleştirilir (Şekil 19.28). Azot gazı, N2, Anammoks azotun en kararlı formudur ve Dünyada azot için Amonyak, aminoasit ve nükleotit gibi organik azot temel bir rezervuardır. Ancak, organizmaların sabileşiklerinin ayrışması esnasında üretilir (amodece küçük bir miktarı azot fiksasyonu (N2 + 8H nifikasyon, Şekil 19.28). Nötral pH'da amonyak, 2NH3 + H2) (<«s Kısım 17.28) işlemi ile bir azot amonyum iyonu (NH4+) olarak bulunmaktadır. kaynağı olarak N2'yi kullanabilir. Dünya üzerinde Anoksik koşullar altında, amonyak nispeten kaazotun tekrar döngüye katılması büyük bir oranda, rarlıdır (fakat bakınız Kısım 17.12), ve en anoksik amonyak ve nitrat gibi, daha kolay elde edilebilir sedimentlerde azotun baskın olduğu form bufiske edilmiş fomlarla alakalıdır. Ancak, birçok dur. Topraklarda, aerobik bozulmayla açığa çıkan çevrede böyle bileşiklerin az bulunması biyolojik amonyak hızlı bir şekilde yeniden döngüye girer azot fiksasyonunu önemli hale getirir. Biz legüm ve bitkilerde ve mikroorganizmalardaki aminoabitkilerde simbiyotik N 2 fiksasyonunu anlattığısitlere dönüştürülür. Amonyak uçucu olduğu için, mızda (bakınız Kısım 19.22), bu önemli süreci tektopraklardan (özellikle yüksek alkali topraklardan) rar görmüş olacağız. buharlaşma yolu ile bir miktar kayıp olur. Amonyağın atmosfere önemli kaybı, yoğun hayvan poDenitrifikasyon pülasyonlarının olduğu alanlarda (örneğin, sığır otlak alanları) gerçekleşir. Ancak, global anlamda, Biz, Kısım 17.14'te anaerobik solunumda alternatif amonyak atmosfere salınmış azotun hemen hemen bir elektron alıcısı olarak nitratı tartışmıştık. Birçok
Azot Döngüsü
Azot döngüsünde anahtar süreçler ve prokaryotlar Süreçler
Örnek organizma
Nitrifikasyon (NH 4 + ->-NO 3 ") NH /-» NO2"
Nitrosomonas
Nitrifikasyon N0 2 " N2
Nitrobacter
NO, Denitrifikasyon (NO3~—•- N 2 )
Bacillus, Pamcoccus, Pseudomonas
N 2 Fiksasyonu ( N 2 + 8 H - * - N H 3 + H 2 ) Serbest-yaşayan Aerobik Anaerobik
Azotobacter Siyanobakteriler Clostridium, mor ve yeşil Bacteriü
Simbiyotik
Amonifikasyon (organik-N
Amon*"
/ A z o t fiksasyon
Rhizobium Bradyrhizobium Frankia —*-NH 4 + ) Birçok organizma bunu yapabilir
Denitrifikasyon
Anammoks(NO 2 " + N H 3 -*• 2N 2 ) Brocadia
* Şekil 19.28 Azot için redoks döngüsü. Oksidasyon reaksiyonları san oklarla indirgenme reaksiyonları ise kırmızı oklarla gösterilmiştir. Hiçbir redoks değişikliklerinin gerçekleşmediği reaksiyonlar beyaz ile gösterilmiştir. Azot fiske eden prokaryotlann daha fazla bir listesi için <3°ö Tablo 17.10'a bakınız.
642 • Bölüm 19 • Mikrobiyal Ekoloji
sadece %15'ini oluşturur, asıl kısım N 2 ve N 2 O'dur (denitrifikasyondan). Nitrifikasyon, NH 3 'ın NO3~'e oksidasyonu iyi şekilde suyu uzaklaştırlmış topraklarda nötral pH'da nitrifikasyon bakterilerinin aktiviteleri ile gerçekleşir (ö=*> Kısım 12.3 ve 17.12) (Şekil 19.28). Denitrifikasyon nitratı tüketirken, nitrifikasyon nitratı üretir. Eğer materyal gübre ve lağım gibi proteince zengin materyalse, toprağa katıldığında nitrifikasyon oranı artar. Nitrat kolaylıkla bitkiler tarafından asimile edilmesine rağmen, onun suda çözünürlüğü fazladır ve hızlı şekilde fazla oranda yağmur alan topraklarda süzülür. Sonuç olarak, nitrifikasyon tarım bitkilerine yararlı değildir. Diğer taraftan, amonyak, pozitif yüklüdür ve sonuçta negatif yüklü kilce-zengin topraklara güçlü şekilde adsorbe olmaktadır. Susuz amonyak yaygın şekilde bir azot gübresi olarak kullanılır ve kimyasallar nitrifikasyon sürecini inhibe etmek için genellikle gübreye katılır. Nitrifikasyonun en yaygın inhibitörlerinden birisi nitrapyrin denen (N-SERVE olarakta bilinen 2-kloro-6-triklorometilpiridin) substitute bir piridindir. Nitrapyrin özel olarak nitrifikasyonda ilk basamak olan, NH 3 'm NO2~ a oksidasyonunu inhibe eder (00(5 Kısım 17.12). Bu etkili şekilde nitrifikasyon sürecinde her iki basamağıda inhibe eder çünkü ikinci basamak, NO2~ —> NO3~ birinciye bağımlıdır. Nitrifikasyon inhibitörlerinin eklenmesi gübrelemenin etkinliğini büyük oranda arttırır ve gübrelenmiş topraklardan süzülmüş nitratla suyollarının kirliliğinin önlenmesine yardımcı olmaktadır. Amonyak anammoks denen süreçle Brocadia ve ilgili organizmalarla anaerobik olarak katabolize edilebilmektedir. Bu reaksiyonda, amonyak elek-
tron alıcısı olarak nitrite (NO2~) okside edilir ve son ürün olarak N 2 oluşur. Anammoks'un mikrobiyolojisi ve biyokimyası Kısım 17.12'de tartışılmıştı. 19.12 Kavramların Gözden Geçirilmesi Yeryüzü üzerinde azotun temel formu sadece azot-fikse eden bakteriler tarafından kullanılabilen azot gazıdır (N2). Azot fiksasyonu ile veya organik azot bileşiklerinden amonifikasyon ile üretilen amonyak organik maddeye asimile edilebilir veya nitrifikasyon bakterileri ile nitrata okside edilebilir. Biyosferden azotun kaybolması denitrifikasyonun bir sonucu olarak gerçekleşir ve burada nitrat N 2 'ye tekrar döndürülür. •
Azot fiksasyonu nedir ve neden önemlidir?
•
NO 3 " —» N2~ ile sonuçlanan sürece ne denir?
•
Nitrapyrin bileşiği hem tarıma hem de çevreye nasıl yararlıdır?
•
Nitrifikasyon ve denitrifikasyon süreçlerinin farklılıkları nedir? Nitrifikasyon ve anammoks'un farklılıkları nedir?
Kükürt Döngüsü Sülfür değişimleri, sülfürün oksidasyon kademelerinin çeşitliliğinden dolayı azot döngüsünden çok daha karışıktır (Şekil 19.29»; oo» Tablo 17.3). Ayrıca, azottan farklı olarak, kükürtün bazı dönüşümleri hem kimyasal olarak hem de biyolojik olarak gerçekleşir. Sülfat indirgenmesi ve kemolitotrofik kükürt oksidasyonu sırasıyla Kısım 17.15 ve 17.10'da anlatılmıştı. Kükürtün redoks döngüsü ve kükürt dönüşümlerinde mikroorganizmaların gerekliliği şekil 19.29' da gösterilmiştir. Kükürtün bir çok oksidasyon durumu olabilirliğine rağmen, doğadaki kükürt oksidasyonunun yalnızca üç önemli formu
Kükürt döngüsünde anahtar süreçler ve prokaryotlar Organizma Süreç Sülfide/sülfür oksidasyonu (H2S —»-S0—»~SO42-) Aerobik Kükürt kemolitotrofları (Thiobacülu, Beggiatoa, daha başkaları) Anaerobik Mor ve yeşil fototrofik bakteriler, bazı kemolitotroflar Sülfat indirgenmesi (anaerobik) (SO42"—*- H2S) Desulfovibrio, Desulfobacter Kükürt indirgenmesi (anaerobik) (S°—^H2S) Desulfuromonas, çok sayıda hipertermofilik Archaea Kükürt disproportionation (S2O32~—»-H2S + SO42") Desulfurovibrio ve diğerleri Organik kükürt bileşiği oksidasyonu ve indirgenmesi (CH3SH-*~ CO2 + H2S) (DMSO-HDMS) Birçok organizma bunu yapabilir Desülfürilasyon (organik-S—*-H2S) Birçok organizma bunu yapabilir
Oksik DMSO 7 ^ D M S Sülfat indirgenmesi—
"~..
Anoksik
• Şekil 19.29 Kükürt için redoks döngüsü. Oksidasyonlar san oklarla indirgenmeler ise kırmızı oklarla gösterilmiştir. Hiçbir redoks değişikliklerinin gerçekleşmediği reaksiyonlar beyaz ile gösterilmiştir. DMSO, dimetilsulfksit; DMS, dimetilsülfür.
19.13 • Kükürt Döngüsü • 643
bulunur, -2 (sülfhidril, R-SH, ve sülfür, HS"), O (elemantal sülfür S°) ve +6 (sülfat, SO42~). Okyanusların, biyosfer için en fazla kükürt rezervlerini (sülfat formunda) içermelerine rağmen, yer kürenin en büyük kükürt miktarı sedimentlerde ve kayalarda sülfat mineralleri biçiminde bulunur (özelliklealçı taşı, CaSO4), özellikle (özellikle pirit, FeS2). Hidrojen Sülfür ve Sülfat İndirgenmesi En önemli uçucu sülfür gazı hidrojen sülfür (H2S)' dür. Bu madde bakteriyal sülfat indirgenmesinden üretilir (SO42- + 8H -• H2S + 2H2O + OH- ) (Şekil 19.29) ya da volkanlar veya sülfür kaynakları gibi jeokimyasal kaynaklardan yayılır. H2S uçucu olmasına rağmen bu gazın bulunma şekli çevredeki pH'ya bağlıdır; pH 7' den büyük olduğunda HS~ve S2~ baskın iken, pH 7'den küçük olduğunda ise H2S baskındır. Sülfat indirgeyen bakteriler oldukça çeşitli bir gruptur (<soo Kısım 12.18) ve doğada geniş alanlara yayılmıştır. Bununla birlikte tatlı sular ve birçok topraklar gibi birçok anoksik habitatlarda sülfat indirgeyen bakterilerin aktiviteleri mevcut sülfat varlığı düşük olduğundan sınırlı kalmıştır. Üstelik, sülfat üretimini sağlamak için organik e" vericilerinin gerekliliğinden dolayı (ya da organik bileşiklerin fermantasyon ürünü olan moleküler hidrojen) bu yalnızca organik materyallerin önemli miktarlarının bulunduğu yerlerde gerçekleşmektedir. Birçok deniz sedimentlerinde, sülfat indirgenmesi oranı karbon-smırlı olup bu oran organik madde ilavesiyle büyük oranda arttırılabilir. Bu önemlidir; çünkü lağım, lağım çamuru ve denizdeki pislikler, sedimentlerdeki organik madde miktarında önemli artışlara yol açabilir ve buda deniz sülfür kirliliğini tetikler. Sülfür (HS~) birçok organizma için toksik bir madde olduğundan dolayı sülfat indirgenmesi sonucu HS'nin oluşması potansiyel olarak zarardır. Sülfür toksiktir; çünkü hücredeki sitokrom demiri ile diğer önemli demir-içeren bileşiklerle birleşir. Sülfür demir ile birleşerek çevrede yaygın şekilde detoksifiye edilmektedir Bu birleşimde çözünmez FeS ve FeS2 (pirit) oluşur ve bu yerlerdeki birçok sedimentler siyah renklidirler. Sülfür ve Elementer Sülfür Oksidasyonu/ indirgenmesi Oksik koşullar altında, sülfür (HS") nötral pH'da (<x*$ Kısım 17.10) çabuk bir şekilde kendiliğinden okside olur. Çoğu aerob olan kükürt oksitleyen bakteriler sülfürün oksidasyonunu katalizleyebilir. Ancak kendiliğinden oldukça hızlı gerçekleşen bu reaksiyondan dolayı, bakteriyal sülfür oksidasyonu oluşur, sülfürün bakteriyal oksidasyonu sadece anoksik bölgelerden gelen H2S ile oksik alanlardan gelen O2'nin karşılaştığı alanlarda gerçekleşir. Ayrıca, eğer ışık varsa HS'nin anoksik oksidasyonuda gerçekleşebilir ve bu işlem fototrofik sülfür bakterisi tarafından katalizlenir (öt*s Kısım 12.2,12.32 ve 17.4).
Elementer sülfür, S°, kimyasal olarak kararlıdır fakat Thiobacillus ve Acidithiobacülus («c«> Kısım 12.4
ve 17.10) gibi sülfür-oksitleyen bakteriler tarafından kolayca okside edilir. Elementer sülfür çözünmezdir ve onu okside eden bakteriler sert sülfür kristallerine oldukça sıkı şekilde tutunurlar (sos Şekil 17.26b). Elementer sülfür-oksidasyonu sülfat (SO42) iyonları ve protonların oluşumu ile sonuçlanır ve bu yüzden sülfür oksidasyonu karakteristik şekilde pH'daki bir düşme ile sonuçlanır. Bazen pH'm düşüşünü sağlamak için alkali topraklara elementer sülfür eklenir, asidifikasyon sürecini gerçekleştirmek eşsiz şekilde thiobaciller sayesinde olur. S° okside olmasının yanında aynı zamanda indirgenebilir özelliktedir. Kükürtün H2S'e indirgenmesi (anerobik solunumun bir tipi; ÖO& Kısım 17.15) özellikle hipertermofilik Archae'ler (ÖO© Bölüm 13) arasında önemli bir ekolojik süreçtir. Sülfat indirgeyen bakteriler de bu reaksiyonu gerçekleştirmesine rağmen, doğadaki indirgenen S0'ün büyük miktarı muhtemelen SO 4 2 'ın H2S'e indirgeyemeyen filogenetik olarak farklı S° indirgeyicileri tarafından meydana getirilir. Bununla birlikte S° indirgeyicilerinin habitatları genellikle ekolojik bakış açısından dolayı sülfat indirgeyicilerle aynıdır. Bu iki grup bir birlik (guild) oluşturur (bakınız Kısım 19.1) ve birarda bulunurlar. Organik Sülfür Bileşikleri Biyojeokimyası tartışılan kükürtün inorganik biçimlerine ek olarak organik kükürt bileşiklerinin çoğunluğu canlı organizmalar tarafından sentezlenir ve bunlar biyojeokimyasal kükürt döngüsüne de girerler. Bu kötü-kokulu bileşiklerin çoğu yüksek oranda uçucudur ve bu nedenle de atmosfere girebilir. Doğada en bol bulunan kükürt bileşiği dimetil sülfürdür (H 3 C— S — CH3). Deniz algindeki osmoz düzenleyici çözgen olan dimetilsülfonyumpropiyonatın parçalanma ürünü olarak deniz çevrelerinde üretilir (ÖOD Kısım 6.14). Dimetilsülfonyumpropiyonat mikroorganizmalar tarafından bir karbon ve enerji kaynağı olarak kullanılır ve dimetilsülfür ve akrilata katabolize edilir. Yağ asiti propionatın bir türevi olan akrilat, büyümeyi desteklemek için kullanılır. Atmosfere salınan dimetilsülfür, fotokimyasal oksidasyonla metan sülfonat (CH3SO3), SO2 ve SO4~ e dönüşür. Bunun aksine, anoksik habitatlar içerisinde üretilen dimetilsülfür üç şekilde mikrobiyal olarak transforme edilebilir: (1) metanogenesis (CH4 ve H2S oluşur), (2) fototrofik mor bakterilerde [dimetil sülfoksit (DMSO)oluşur] fotosentetik CO2 fiksasyonu için bir e" verici olarak ve (3) belirli kemoorganotroflar ve kemolitotroflarda (ayrıca DMSO oluşur) enerji metabolizmasında bir e" verici olarak. Üretilen DMSO anaerobik solunum (C«D Kısım 17.18) için elektron alıcısı olabilir ve bunun sonucunda tekrar dimetil sülfür oluşturur. Diğer birçok metan etiol (CH3SH), dimetil sülfür (H 3 C-
644 • Bölüm 19 • Mikrobiyal Ekoloji
S-S-CH3) ve karbon disülfür (CS2)'i içeren organik sülfür bileşikleri global sülfür döngüsünde etkilidir fakat global anlamda dimetil sülfür en önemlisidir. 19.13 Kavramların Gözden Geçirilmesi Bakteriler kükürt döngüsünün hem indirgenmesinde hem de oksidasyonunda önemli roller oynamaktadır. Sülfat indirgeyen bakteriler hidrojen sülfürün üretildiği süreç olan anaerobik solunumda bir elektron alıcısı olarak sülfatı tüketirken, kükürt- ve sülfür-oksitleyen bakteriler sülfat üretirler. Sülfat, toksik olduğu ve ayrıca çeşitli metallerle reaksiyona girdiği için sülfat indirgenmesi önemli bir biyojeokimyasal süreçtir. Dimetil sülfür doğadaki ekolojik önemi olan temel organik sülfür bileşiğidir. •
H2S, sülfat indirgeyen bakterilerin bir substmtımıdır yoksa bir ürünümüdür?
•
Kükürtün bakteriyal oksidasyonu niçin pH'da bir düşüşe neden olmaktadır?
•
Doğada en yaygın organik kükürt bileşiği hangisidir?
Demir Döngüsü
Bakteriyal Demir İndirgenmesi
Bir çok organizma elektron alıcısı olarak ferrik demiri kullanabilir (Ö°& Kısım 17.18). Ferrik demir indirgenmesi suyla kaplanmış topraklar, bataklıklar ve anoksik göl sedimentlerinde yaygın olarak görülür. Anoksik bataklıklar ya da suyla kaplanmış topraklardan demirce-zengin yeraltı suyunun hareketi çok büyük miktarlarda ferro demir taşınımı ile sonuçlanabilmektedir. Bu demir yüklü su, oksijenli bölgelere ulaştığında, Ferro demir kimyasal olarak ya da demir bakterileri tarafından okside edilir (Ö«S Kısım 17.11). Daha sonra ferrik demir bileşikleri kahverengi demir birikintileri biçiminde dönüşerek çökelir (ötts Şekil 17.28c). Fe
2+
Fe(OH) 3 + 2 H +
Ferrik hidroksit presipitatı yeniden Fe3+'nin Fe 'ye indirgendiği süreçte diğer biyolojik olmayan maddelerle, örneğin humik maddelerle (Kısım 19.9), ilişkiye girebilirler(Şekil 19.30). Ferrik demir ayrıca çeşitli organik yapılarla da kompleksler oluşturabilir. Bu yolla, o çözünür ve bir elektron alıcısı olarak ferrik demir indirgeyen bakterilerin kullanabileceği form haline gelir. 2+
Demir dünyanın dış tabakasında en çok bulunan elementlerden birisidir. Demir yeryüzünün yüzeyinde, doğal olarak ferro (Fe2+) ve ferrik (Fe3+) olarak iki oksidasyon durumunda bulunur. Fe°, Fe2+ ya da Fe3+ cevherlerinin eritilmesinden elde edilen insan faaliyetlerinin temel bir ürünüdür. Sonrasında, doğada element demir döngüsü, öncelikle Fe2+ ve Fe3+ formları arasında gerçekleşir. Fe3+ in indirgenmesi ya kimyasal ya da anaerobik solunum sonucunda gerçekleşir ve Fe2+ nın oksidasyonuda (Ferrik) Ferrik demir redüksiyonu (bakteriyal veya kimyasal)
Ferrus demir oksidasyonu (bakteriyal veya kimyasal)
ya kimyasal olarak ya da kemolitotrofik metabolizmanın bir sonucu olarak gerçekleşir (Şekil 19.30»).
Asit pH'ta Ferro Demir ve Pirit Oksidasyonu
Kendiliğinden Fe2+'yi oksitleyebilen tek elektron alıcısı O2'dir. Nötral habitatlarda Fe2+, Gallionella ve Leptothrix gibi demir bakterileri tarafından okside edilebilir (Kısım 12.15 ve 12.16). Oksidasyon öncelikle ferro demirce-zengin anoksik yer altı suları ve hava arasındaki arayüzeylerde gerçekleşir. Buna rağmen, en yaygın bakteriyal demir oksidasyonu Fe2+'nin spontan oksidasyona karşı kararlı kaldığı asidik pH'larda gerçekleşir ve şimdi biz bu yöntemleri tartışacağız. Aşırı asidik habitatlarda, asidofilik kemolitotrof Acidithiobacülus ferrooxidans ve
(Ferrus)
* Şekil 19.30 Demirin redoks döngüsü. Doğada demirin temel formu Fe+2 ve Fe+3 tür. Fe° başlıca demir cevherlerinin eritilmesinde insan aktivitelerinden ortaya çıkan bir üründür. Ferro demir demir kemolitotroflannca aerobik olarak (veya nötral pH'da kimyasal olarak) ve belli anoksijenik fototrofik bakterilerce ve denitrifikasyon bakterilerince anaerobik olarak oluşur. Oksidasyonlar san oklarla indirgenmeler ise kırmızı oklarla gösterilmiştir.
buna akraba asidofilik demir oksitleyicileri, Fe2+'yi Fe3+'e oksitlerler (Şekil 19.31 •). Ferro demirin ferrik demire oksidasyonunda çok az enerji oluşturulur (<*>a Kısım--17.11) ve bu yüzden bu bakteriler büyümek için fazla miktarlarda demir okside etmelidirler; Sonuç olarak, az sayıda hücre bile demirin büyük bir kısmının presipitatlaştırılmasından sorumlu olabilir. A.ferrooxidans katı bir asidofildir ve asidik maden sularında ve asitli kaynak sularında çok yaygındır ve muhtemelen hafif asidik pH değerlerinde (pH 2-4) ferrik demirin çoğunun presipitatlaştırılmasından sorumludur. Acidithiobacülus ferrooxidans ve
Leptospirillutn
ferrooxidans sülfirik asidin baskın asit olduğu çevrelerde yaşarlar ve buralarda büyük miktarda sülfat bulunmaktadır. 20-30°C'de ve hafif asidik pH'da, A. ferrooxidans'm baskın olduğu görülürken diğer
19 14 • Demir Döngüsü • 645
Atmosfer: Hava Asit pH- Steril
Nötral pHSteril veya steril değil
Asit pH- Bakteri
Zaman (a)
(b)
• Şekil 19.32 Pirit ve kömür. Kükürt- ve demir-oksitleyen bakteriler tarafından okside edilebilen kömür içindeki pirit. Kuzey Arizona'da (ABD) Black Mesa oluşumundan elde edilen bir parçakömür. Altın-renkli sferik diskler (yaklaşık 1 mm çapında) piritin (FeS2) parçalanmış partikülleridir. (b) Bir yüzey kömür madenciliği işletmesinde bir kömür daman. Kömür oksijen ve neme maruz kaldığında kömür içindeki pirit partiküllerinde büyüyen demir-oksitleyen bakterilerin aktivitelerini teşvik etmektedir.
* Şekil 19.31 Fe" oksidasyonu. pH'ın fonksiyonu olarak ve Acidithiobacillus ferrooxidans bakterisinin varlığında ferro demirin oksidasyonu. Bakteriyal hücreler bulunmadığında asidik koşullar altında Fe+Z nin nasıl kararlı kaldığına dikkat ediniz, (b) Rio Tinto, İspanya'da asidofilik yeşil algleri ve çeşitli demiroksitleyen prokaryotlan içeren bir mikrobiyal yığın. Nehir yüksek oranda asidiktir ve yüksek miktarda çözünmüş metalleri, özellikle Fe+2 içerir. Kırmızı-kahve presipitatlar Fe+3 içermektedir.
taraftan 30-50°C ve daha asidik pH'da (1-2) L. ferrooxidans baskın organizmadır. Bu şartlar altında, ferrik demir, hidroksit olarak presipitatlaşmaz fakat jarosite olarak adlandırılan [HFe3(SO4)2(OH)6] kompleks bir sülfat mineral olarak presipitatlaşır. Jarosit sarımsı veya kahverengimsi bir presipitatdır ve Amerikalı maden işçileri tarafından "sarı oğlan" olarak adlandırılan çirkin görünümlü sarı boya olarak asitli maden sularında temel kirleticilerden birisidir (a»ö Şekil 17.28a ve bakınız Şekil 19.34). A. ferrooxidans ve L. ferrooxidans filogenetik
ve morfolojik olarak farklı olmakla birlikte metabolizmaları bakımından da farklıdırlar. L. ferrooxidans 2+ sadece Fe üzerinde büyüyebilirken, A. ferrooxidans kemolititrof olarak hem Fe2+ hem de S° üzerinde büyüyebilmektedir. Doğadaki en yaygın demir formlarından biri demir pirit (FeS2) tir. Pirit, ferro sülfür ile kükürtün reaksiyonundan oluşur ve yüksek oranda çözünemeyen kristal yapı oluşturur ve maden kömürü ile bir çok cevherin yapısında yaygın şekilde bulunur
(Şekil 19.32fl•). Piritin bakteriyal oksidasyonu madencilik işlemlerinde asidik koşulların gelişiminde büyük öneme sahiptir (Şekil 19.32fr). Ayrıca bakteriler tarafından piritin oksidasyonu cevherlerin mikrobiyal liçingi (leaching) denen süreçteki önemide düşünmeye değerdir. Piritin oksidasyonu kimyasal ve bakteriyal olarak katalizlenmiş reaksiyonların bir kombinasyonudur. İki elektron alıcısı bu süreçte iş görür: moleküler oksijen (O2) ve ferrik iyonlar (Fe3+) Madencilik süreçlerideki gibi (Şekil 19.32b) demir sülfür ilk açığa çıktığında, moleküler oksijen ile Şekil 19.33«'te görüldüğü gibi yavaş bir kimyasal bir reaksiyon gerçekleşir. Başlatıcı reaksiyon olarak adlandırılan bu reaksiyon sonucu ve sülfürün sülfata oksidasyonu ve asidik koşulların gelişimi görülür. Bu asidik koşullar altında açığa çıkan ferro demir oksijen varlığında nispeten kararlıdır. AciditFeS 2 (pyrite) + 3 j O 2 + H2O (a) Başlatıcı reaksiyon
Kendiliğinden (bakteriler katalizleyebilir) Hızlı şekilde kendiliğinden (bakterilerde katalizleyebilir) FeS 2
Yavaş şekilde kendiliğinden/^ (bakteriler L< katalizler) \
2 SO 4 2 ~ + 2 H +
Fe 3 +
(b) Çoğalma döngüsü
• Şekil 19.33 Mineral piritin oksidasyonunda demiroksitleyen bakterilerin rolü. (a) Temel biyolojik olmayan başlatıcı reaksiyon (b) Biyotik ve abiyotik bileşenlerin karıştığı çoğalma (propogation) döngüsü
|
646 • Bölüm 19 • Mikrobiyal Ekoloji hiobacillus ferrooxidans ve L. ferrooxidans daha sonra ferro demirin ferrik iyonlara oksidasyonunu katalizler. Bu asidik koşullar altında oluşan ferrik iyonlar çözünebilir haldedir ve kolaylıkla kendiliğinden daha fazla piritle reaksiyona girebilir ve onu, ferro iyonlarına ve ayrıca sülfat iyonlarına oksitleyelebilir: FeS2 + 14 Fe.3+ 8H 2 O 15 Fe2+ 2 SCV" + 16 FT Ferro iyonları bakteriler tarafından tekrar ferrik iyonlarına okside edilir ve bu ferrik iyonları tekrar daha çok pirit ile tepkimeye girer. Böylece, şekil 19.33'te görüldüğü gibi çoğalma döngüsü (propagationcycle) denilen döngü ile pirit oksidasyonunda hızlı bir artış görülür. Doğal koşullar altında ferro demirin bir kısmı bakteriler tarafından liç edilerek yer altı sularıyla çevredeki akarsulara taşınır. Bununla beraber, havalanmış kanal suyunda oksijen mevcut olduğundan, ferro demirin bakteriyal oksidasyonu bu akıntılarda gerçekleşir ve çözünmeyen ferrik presipitatı oluşur.
Asitli Maden Drenajı
piritle ilişkili diğer mineraller tüm kaya yapısının parçalanmasına sebep olur. Temel bir kaya yapısını oluşturan element olan alüminyum elementi sadece düşük pH'da çözünür halde olup sucul organizma3+ lar için yüksek oranda toksik olabilen Al oldukça fazla miktarlarda asidik maden sularında bulunur. Ferro demirin ferrik demire oksidasyonunda gerekli O2 ihtiyacının bilinmesi, asitli maden suyunun nasıl işlenecek hale getirileceğini açıklamaya yardım edecektir. Kömür madenden çıkarılmadığı sürece piritin oksidasyonu gerçekleşmez çünkü ne hava ne de bakteriler ona ulaşamaz. Kömür tabakası ortaya çıkarıldığında (Şekil 19.32b), kömür tabakası çabucak Acidithiobacülus ferrooxidans ile kontamine olur ve O2 ile suda piritin muhtemel oksidasyonuna katılırlar. Oluşan asit daha sonra çevredeki akarsulara süzülebilir (Şekil 19.34). Asidik maden drenajının yaygın olduğu yerlerde, oldukça güçlü asidofilik Archaea olan Ferroplasma, türlerinin bulunması doğaldır. Bu aerobik demir-oksitleyen prokaryot pH O'da ve 50°C ye kadar sıcaklıklarda büyüyebilmektedir. F. acidarmanus demir cevheri birikintilerinde pirit ara yüzeylerine tutunmuş cıvık hücre yığınları oluşturur (Şekil 19.35a•). California, Iron Mountain'de özellikle iyi
Sülfat minerallerinin bakteriyal oksidasyonu Asitli Maden Drenajı oluşumunda başlıca faktördür ve kömür ocağı madenlerinde karşılaşılan yaygın bir çevresel problemdir (Şekil 19.34»). Nehirlerde ve göllerde doğal su ve asidik maden suları ile karışması, doğal suyun kalitesinde ciddi bozulmaya sebep olur, çünkü hem asit ve hem de eriyen metaller sucul organizmalara toksiktir (p^ü Şekil 17.28ö). Ayrıca, bu şekilde kirlenmiş suları, insanların tüketmesi ve endüstride kullanılması uygun değildir. Piritin yıkımı neticesinde, sülfürik asitin ve ferro demirin oluşumu gerçekleşir ve pH değerleri pH 1 den daha düşük olabilir. Oluşan asit kömür ve
• Şekil 19.34 Bir ziftli kömür bölgesinden asidik maden drenajı. Presipitatlaşmış demir oksitlerden (CXK$ Şekil 17.28a) dolayı sanmsı-kırmızı renge dikkat ediniz.
• Şekil 19.35 Ferroplasma acidarmanus, Asidik maden drenajından sorumlu olan ekstrem bir asidofilik demir-oksitleyen achaeon. (a) Iron Mountain, Kanada'da asidik (O'a yakın pH) bir maden drenajı nehrinde büyüyen Ferroplasma hücre akıntıları, (b) Mineral madde arasında bir F. acidarmanus hücresinin taramalı elektron mikroskop fotoğrafı.
19 15 • Cevherlerden Mikrobiyal Liçing • 647
çalışılmış asidik maden drenaj bölgesinde, kalın biyofilm içinde F. acidarmanus O'a yakın pH'da yaşamını sürdürür. Bu bölgede 30g/l' ye yakın demir konsantrasyonlarında, F. acidarmanus daha önceden anlatılmış olan reaksiyonlar sonucunda daha 2+ fazla asidin oluştuğu taze substrat (Fe ) içinde sürekli olarak bulunmaktadır. Ferroplasma morfolojik olarak hücre duvarı-olmayan bir prokaryottur ve filogenetik olarak Thermoplasma''ya akrabadır (Şekil 19.35fr ve ana Kısım 13.5). 19.14 Kavramların Gözden Geçirilmesi Demir doğada başlıca iki oksidasyon durumunda bulu2+ 3+ nur, ferro (Fe ) ve ferrik(Fe ), ve bu metallerin bakteriyal ve kimyasal transformasyonları jeolojik ve ekolojik açıdan önemlidir. Bakteriyal ferrik demir indirgenmesi anoksik çevrelerde gerçekleşir ve bataklıklarda ve demirce zengin diğer sucul habitatlardan demirin yükünün değiştirilmesi gerçekleşir. Ferro demirin geniş çapta bakteriyal oksidasyonu düşük pH'da gerçekleşir ve bu kömürmadeni bölgelerinde çok yaygındır ve bunun sonucunda asitli-maden drenajı denen kirlenme oluşur. •
Mineral Fe(OH)3 ve FeS de bulunan demir hangi oksidasyon durumundadır? Fe(OH)3 nasıl oluşur? • Oksik şartlar altında biyolojik Fe2+ oksidasyonu niçin özellikle asidik pH'da gerçekleşir?
KVI
MİKROBİYAL BİYORE M E DİASYON
Mikroorganizmaların biyojeokimyasal potansiyelleri oldukça fazladır. Ayrıca, mikroorganizmalar Yeryüzü'nün en büyük kimyacılarıdır. Aslında, onlar düşük-dereceli cevherlerden değerli metallerin kazanımını sağlamada (mikrobiyal liçing) ve çevreyi temizlemede kullanılmaktadır. Biyoremediasyon terimi petrolü, toksik kimyasalları, veya diğer kirleticileri mikroorganizmalarla temizleme işini ifade etmektedir. Biyoremediasyon, kirleticileri temizlemek için yapılan pahalı fakat etkili bir yöntemdir ve bazı durumlarda iyi bir iş çıkarmak için tek pratik yoldur.
Cevherlerden Mikrobiyal Liçing Asidofilik bakterilerle asit üretimi ve mineral çözündürülmesi metal madenciliğinde yararlı bir rol oynayabilir. Sülfür formları diğer metallerle yüksek çözünmez mineralleri oluşturur ve bu metallerin kaynağı olarak kullanılan sülfürler genellikle maden cevheri sülfürlerdir. Eğer cevherdeki metal konsantrasyonu az olursa minerali geleneksel kimyasal yollarla konsantre etmek ekonomik açıdan mümkün olmayabilir. Bu koşullar altında mikrobiyal liçing (leaching) uygulanır. Mikrobiyal liçing özellikle bakır cevheri için kullanışlıdır. Çünkü bakır sülfür cevherlerinin oksidasyonu sırasında oluşmuş bakır sülfat oldukça iyi suda-çözünür. Ayrıca, dünyada bulunan bakır madeninin yaklaşık 1 /4'ü biyolojik liçingden elde edilir.
Sülfürün havada kendiliğinden okside olduğunu not etmiştik. Aynı zamanda çoğu metal sülfürler de kendiliğinden oksidasyona uğrar. Fakat bu oran H2S veya HS den çok daha yavaşdır. Ancak
Acidithiobacillus ferrooxidans gibi bakteriler ve metal
oksitleyen prokaryotlar sülfür minerallerinin oksidasyonunu çok daha hızlı katalizleyebilir, böylece metalin çözünürlüğüne yardım ederler (Şekil 19.33). Bakterilerin olması veya olmaması durumlarında bakır minerallerinin oksidasyon oranları şekil 19.36»'da gösterilmiştir. Oksidasyona duyarlılık da minerallere göre değişiklik gösterir ve kolayca oksitlenmesi nedeniyle bu mineraller, mikrobiyal liçinge daha uyumludur. Böylece, Pirotit (FeS) ve covellite (CuS) gibi demir ve bakır sülfür cevherleri kolayca liç edilir. Oysa Kurşun ve molibden cevherlerinde bu işlem çok daha az oranda gerçekleşir. Liçing Süreci Mikrobiyal liçing yönteminde, düşük-kalitede maden cevheri veya atık kaya büyük bir yığın halinde dökülür (leach dump) ve seyreltik sülfürik asit solüsyonu (yaklaşık pH 2) yığına süzdürülür (Şekil 19.37a»). Yığının tabanına gelen çözünmüş metalce zengin (verimli(pregnant) sıvı solüsyonu denir) sıvı (Şekil 19.37b) toplanır ve bir çöktürme tesisine nakledilir (Şekil 19.37c). Pregnant sıvı yığının tepesine geri pompalanır ve döngü tekrar ettirilir. Gerektiğinde düşük pH'ı sürdürmek için daha fazla asit eklenmesi gerekir. Bakterilerin sülfür minerallerinin oksidasyonunu katalizlediği çeşitli mekanizmalar vardır. Bunları göstermek için, biz bakırın +2 değerlikli olarak bulunan formu, Covellite, CuS, örneğini kullanacağız. Şekil 19.38«'de gösterildiği gibi, Acidihiobacillus ferrooxidans, CuS' deki sülfürü SO4'a oksitleyebilir. Bu reaksiyon ayrıca kendiliğinden de (spontan olarakta) meydana gelir. Ancak, bakır liçing işlemlerinde en önemli reaksiyon, ferro iyonlarının bakteriyal oksidasyonu ile oluşmuş ferrik iyonlarım bulunduran bakır cevherinin kimyasal oksidasyonunu içerir (Şekil 19.38). £100 Bakteri mevcut 50
Steril M
10 Zaman (g)
• Şekil 19.36 Covellit (CuS) mineralinden bakırın süzülmesi üzerine Acidithiobacillus ferromidans bakterisinin etkisi. Liçing işlemi bir laboratuvar kolonunda ve bakterinin büyümesi için gerekli inorganik nutrientleri içeren asidik liçing solüsyonunda yapılmıştır. Liçing aktivitesi kolonun dibinde liçing solüsyonunda bulunan çözünür bakın saptayarak izlenmiştir. Liçing solüsyonu esasen kapalı bir sistemi devam ettirmek için sürekli şekilde devir daim ettirilmiştir.
643 • Bölüm 19 • Mikrobiyal Ekoloji
(b)
• Şekil 19.37 Bakterileri kullanarak düşük kalitede bakır cevherlerinin süzülmesi. (a) Tipik bir liçing yığını. Düşük-kalitede cevher küçük parçalara ayrılır ve maruz kalınan yüzeyin mümkün olduğunca yüksek olduğu tarzda geniş bir tepe halinde yığılır. Borular tepenin yüzeyi üzerinden asidik liçing suyunu dağıtır. Asidik su yavaşça tepenin içinden süzülür ve dibe ulaşır, (b) Bir bakır liçing yığınından çıkan sıvı. Asidik su çözünmüş bakırca çok zengindir, (c) Uzun bir kanal içinde metalik demir üzerinde bakır-zengin suyun geçişiyle çözünmüş bakırın geri kazanımı, (d) Kanaldan uzaklaştırılan geri kazanılan bakır metalinin küçük bir tepesi daha ileri saflaştırma için hazırdır.
Hemen hemen bütün cevherlerde pirit vardır ve onun oksidasyonu ferrik demirin oluşumuna yol açar (Şekil 19.33). Ferrik demir sülfür mineralleri için mükemmel bir elektron alıcısıdır ve ferrik iyonları ile CuS'ın spontan reaksiyonu çözünebilir bakır ve ferro demir oluşumu ile sonuçlanır. Önemli olarak, derinlik koşulların liçing yığınların anoksik olma sebebi olabilir. Metal Kazanımı Çökeltim tesisi, liçing solüsyonundan çözünür bakırın kazanılması için kullanılan yerdir (Şekil 19.37c, d). Demir parçacığı, Fe°, Şekil 19.38'in alt kısmında gösterilen reaksiyonda olduğu gibi, süzülen sıvıdan bakır elde edilmesi amacıyla kullanılır ve bunun sonucunda Fe+2 oluşur. Çoğu liçing işlemlerinde, bakırın uzaklaştırılmasıyla oluşan Fe+2
Düşük kalitede bakır cevheri: bakır sülfür (CuS)
Bakır cevheri üzerine asidik liçing sıvısın serpilmesi
/İ\J/j\
Bakır cevheri bakırı çözen oksijen-bağımh (1) ve oksijen-bağımsız (2) reaksiyonlarla okside edilebilir: 1, CuS + 2 O 2 — Ctı 2 * + SO/" 2. CuS + 8 Fe 3 + + 4 H2O Cu 2 + + 8 Fe z + + SO42-+ 8 H* Asidik liçing sıvısı -"" liçing yığının tepesine geri pompalanır
Bakır metalinin geri kazanımı (Cu1 Fe° + C u 2 t — C u ° + F e 2 + OFe0 from stael cans)
ce zengin sıvı Acidithiobacillus ferrooxidans' in hızla
çoğaldığı ve Fe+2'i Fe+3'e oksitlediği bir oksidasyon havuzuna gönderilir. pH değerini düşük tutmak için ve böylece solüsyonda Fe+3'ün tutulmasını sağ-
H + — Fe3* + \ H2O LeptospiriIIum ferrooxidans
Acidithiobacillus ferrooxidans Bakır metali (Cu°)
Oksidasyon havuzu
• Şekil 19.38 Liçing tepesinin düzenlenmesi ve Cu°'ı (bakır metali) vermek için bakır sülfür minerallerinin mikrobiyal liçingi ile ilgili reaksiyonlar (bakınız 19.37). Reaksiyon 1, hem biyolojik hem de kimyasal olarak gerçekleşir. Reaksiyon 2 tam olarak kimyasaldır, ancak bakır-liçing sürecinde önemli reaksiyondur. Üretilmiş Fe2+'nin (CuS'deki sülfürün sülfata oksidasyonundan) Acidithiobacillus ferrooxidans ve LeptospiriIIum ferrooxidans tarafından Fe3+'ya okside edilmesi için Reaksiyon 2'nin nasıl gerekli olduğuna dikkat ediniz.
19.16 • Civa ve Ağır Metal Dönüşümleri • 649 lamak için havuza asit ilave edilir ve daha sonra bu ferrik demirce-zengin sıvı yukarı doğru pompala+3 nır ve Fe daha fazla sülfür mineralini oksitlemek için kullanılır (Şekil 19.37). Yüksek ısı da liçing işlemleri için bir problem oluşturabilir. A. ferrooxidans bir mezofildir fakat mikrobiyal aktiviteler sonucunda liçing deposu içindeki ısı spontan olarak sık sık yükselir. Thiobacillus türleri, Leptospirülum ferrooxidans, ve Sulfobacillus gibi termofilik demir oksitleyen kemolitotroflar ve yüksek ısılarda (60-80°C), Sulfolobus (a°ö Kısım 13.9) da cevherlerin liçing işleminde önemli organizmalardır. Diğer leaching (liçing) İşlemleri: Uranyum ve Altın Mikroorganizmalar uranyum- ve altm-içeren maden cevherlerinin eldesinde de kullanılırlar. Thiobacillus ferrooxidans'lar bir elektron alıcısı olarak O 2 ile U + 4 'ü U + 6 ' ya oksitleyebilirler. Ancak, uranyum liçingi muhtemelen, bakır liçinginde olduğu gibi A. ferrooxidans'larin katkısıyla Fe + 2 'ün Fe +3 ' e tekrar oksidasyonu sonucu oluşan Fe +3 'le uranyumun kimyasal oksidasyonuna bağlı olmaktadır. Reaksiyon şu şekilde gözlenir. UO 2 + Fe 2 (SO 4 ) 3 4+
(U )
3+
(Fe )
> UO 2 SO 4 + 2 FeSO4 (U b + )
19.15 Kavramların Gözden Geçirilmesi Bakteriler tarafından bakır cevherlerinin oksidasyonu, mikrobiyal liçing denen bir işlemle bakırın çözünmesine götürebilir. Liçing düşük-kaliteli cevherlerden bakırın, uranyumun ve altının geri kazammında önemlidir. Demir sülfür minerali olan piritteki demirin bakteriyal oksidasyonu da mikrobiyal—liçing sürecinin önemli bir parçasıdır. Çünkü üretilen ferrik iyonları cevherlerin oksidantmm kendisidir. • Anoksik koşullarda CuS nasıl okside edilebilir?
UO 2 den farklı olarak, oksitlenmiş uranyum minerali çözülebilir ve başka süreçlerle tekrar kazanılabilir. Altın doğal olarak, doğada çoğunlukla arsenik ve pirit içeren minerallerle ilişkili halde bulunur. A. ferrooxidans ve onun yakın akrabaları tutunmuş altının (Au) serbest bırakılmasında arsenopirit minerallerini çözmek için kullanılır: 2 FeAsS[Au] + 7 O 2 + 2 H 2 O + H 2 SO 4
• Şekil 19.39 Altın biyoliçingi. Ashanti Altın- sahalan, Gana, Afrika'da altın liçing tanklarının fotoğrafı. Tanklar içinde, Acidithiobacillus ferrooxidans, Acidithiobacülus thiooxidans ve Leptospirillum ferrooxidans karışımı tutunmuş altını içeren pirit/ arsenik minerali çözer ve altını salar. İlgili reaksiyonlar için metine bakınız
»
Fe 2 (SO 4 ) 3 + 2 H 3 AsO 4
[Au]
Altın daha sonra klasik altın-madenciliği yöntemleriyle siyanürle komplekslendirilir. Bakırın saflaştırılması geniş saflaştırma tanklarında olurken, altının saflaştırılması bakırdan farklı olarak nispeten daha küçük biyoreaktör tanklarında gerçekleşir (Şekil 19.39»). Biyolojik saflaştırmanın bu tipi bağlı altının %95 inden fazlasının serbest kaldığını gösterir. Ayrıca, Bu madencilik sürecinde arsenik ve siyanür zehirli atıklar olmasına rağmen, her ikiside altm-liçing biyoreaktöründe uzaklaştırılır. Arsenik, ferrik bir presipitat olarak ve siyanür (CN~) ise altın geri kazanım sürecinin daha sonraki basamaklarında mikrobiyal oksidasyonla CO 2 ye ve üreye çevrilerek uzaklaştırılır. Bu yüzden, küçük-ölçekli mikrobiyal altın saflaştırma metodları daha pahalı ve çevreye zararı olan geleneksel altın-madenciliği tekniklerine bir alternatif olarak daha popular hale gelmektedir. Ayrıca, pilot tesislerde çinkonun, kurşunun ve nikelin biyoliçing işleminde geliştirilmektedir.
• Niçin bakır cevheri liçing işleminde liçing sıvısını asidik tumak önemlidir? • Metal oksidasyonu noktasından hareketle, bakır liçing işlemi altm liçing işleminde nasıl farklılaşmaktadır?
19.16
Civa ye Ağır Metal Dönüşümleri
Metaller kayalarda, toprakta, sularda ve atmosferde düşük konsantrasyonlarda bulunurlar. Bunlardan bazıları hücre tarafından ihtiyaç duyulan iz elementlerdir (örneğin, kobalt, bakır, çinko, nikel, molibden, Kısım 5.1). Ancak, yüksek konsantrasyonlarda bu metaller organizmalara toksik olabilir, bunlardan birkaçı havayı da kontamineedebilecek derecede yeterince uçucudur. Bunlar civa, kurşun, arsenik, kadminyum ve selenyumdur. Birçok ağır metal, mikroorganizmalar tarafından katalizlenmiş redoks reaksiyonlarına maruz kalırlar. Ayrıca, birkaçı mikrobiyal etki ile organik formda da dönüştürülmektedir. Çevresel ilgi ve önemli derecede mikrobiyal katkıdan dolayı, tartışmamızı civa elementinin biyojeokimyası üzerinde yoğunlaştıracağız.
Civa ve Ağır Metal Dönüşümleri Civa birçok doğal çevrede oldukça düşük konsantrasyonlarda (ortalama 1 nanogram(ng)/litre) bu-
650 • Bölüm 19 • Mihrobiyal Ekoloji
Ilınmasına rağmen, geniş çapta endüstriyel üretim için kullanılmakta olup bir çok pestisitinde aktif bileşenidir. Canlı dokularda yüksek konsantrasyonlarda birikme yeteneklerinden dolayı, civa oldukça yüksek çevresel öneme sahiptir. Örneğin, Civa cevherlerinin işlenmesi ve fosil yakıtların yanması çevreye her yıl yaklaşık 40,000 ton civa salınmasına sebep olur. Bundan daha büyük bir miktar doğal jeokimyasal süreçle salınmaktadır. Ayrıca, civa elektronik endüstrisi, özellikle pil ve kablo üretimi, kimya endüstrisi, ve şehir atıklarının yanması sonucu oluşan bir yan-üründür. Atmosferde temel civa formu, uçucu olan ve fotokimyasal olarak civa iyonuna (Hg2+) okside olan elemental civa (Hg°)'dır (Şekil 19.40»). Civa iyonu kolaylıkla partikül haldeki maddeye adsorplanır ve oradan mikroorganizmalar tarafından metabolize edilebilir. Mikrobiyal aktivite sonucunda civanın metülenmesi gerçekleşir ve böylelikle metilciva, CH3Hg+oluşur (Şekil 19.40), Metabolik olarak civanın metülenmesi, metil-B12'den metil gruplarının verilmesi ile gerçekleşir. Metilciva oldukça toksiktir. Çünkü deri içinden adsorplanabilir. Aynca, o çözünür haldedir ve sucul besin zincirinde özellikle balıklarda birikebilir. Metilciva uçucu bir bileşik olan dimetilcivaya (CH3—Hg—CH3) mikroorganizmalar tarafından daha ileri düzeyde metillenir. Hem metil civa hem de dimetilciva hayvansal dokularda, özellikle kaslarda birikir. Metil civa Hg° veya Hg2+dan yaklaşık 100 kez daha toksiktir. Balıklarda birikim yapan güçlü bir nörotoksindir. Bu yüzden metilciva temel bir çevresel toksin olup insan tüketimi için yakalanan balıklarda metilciva seviyesinin artış gösterdiği tatlısu göllerinde onun birikimi önemli bir çevresel problemdir. Civa ayrıca insanlarda ve diğer hayvanlarda karaciğer ve böbreklerde hasara da neden olabilmektedir.
Birkaç diğer civa transformasyonları global ölçekte sülfat indirgeyen bakteriler (H2S + Hg2+ —> HgS) ve metan oluşturan bakterilerin (CH3Hg+ —> CH4+Hg°) karıştığı reaksiyonlarda görülür (bakınız Şekil 19.40). HgS'in çözünürlüğü çok düşüktür, bu yüzden anoksik sülfat indirgenmesinin gerçekleştiği sedimentlerde çoğu civa, HgS olarak bulunur. Ancak havalandırma altında, HgS'in oksidasyonu başlıca thiobacillus'lar tarafından gerçekleşir ve Hg2 ve SO42~özelliklede metil civa oluşur. Civa Direnci Yeterli yüksek konsantrasyonda Hg+2 ve CH3Hg+ sadece yüksek organizmalar için değil mikroorganizmalar için de toksik olabilmektedir. Bununla birlikte, birkaç bakteri biyolojik olark civanın toksik formlarını toksik olmayan formlarına dönüşümünü sağlayabilir. Civaya dirençli gram negatif bakterilerde civa redüktaz denen NADPH bağlı bir enzim Hg+2 yi Hg° a indirger. Bu reaksiyonda üretilen Hg° uçucudur ama insanlara ve hayvanlara toksik değildir. Hg+2 nın Hg° ya bakteriyal dönüşümü daha sonra CH3Hg+ nın Hg+2 ye dönüştürülmesi sağlanır (Şekil 19.41»). Civa direnci ile ilgili genler gram negatif bakteri Pseudomonas aeruginosa'da bir plazmit üzerin-
de bulunmaktadır, mer genleri denen bu genler bir operonda düzenlenmişlerdir ve düzenleyici protein olan MerR'nin kontrolü altındadırlar (Şekil 19.41a). İlginçtir ki; MerR hem baskılayıcı hem de
r R
(a) Hg
Regülasyon: represyon ve aktivasyon Periplazmik bağlanma proteini (-<• Civa (Hg 2+ ) redüktaz O
r
L
P
T l
A
D '-•-Regülasyon
'—*- Transport Bilinmeyen fonksiyon
CH 3 HgCH 3
Organik ve inorganik Hg kompleksleri
* Şekil 19.40 Civanın biyojcokimyasal döngüsü. Civanın ana rezervuarlan HgS olarak hayvan dokulannda birikebildiği veya presipitatlaşabildiği yer olan su ve sedimentlerdir. Sucul çevrelerde yaygın olarak bulunan çeşitli civa formlannın her biri farklı renklerde gösterilmiştir.
• Şekil 19.41 Pseudomonas aeruginosa'da Hg"'nın Hg°"a indirgenme mekanizması, (a) mer operonu. MerR ya bir represör olarak (Hg2+'rün yokluğunda) ya da transkrpsiyonel aktivatör olarak iş görmektedir, (b) Hgz*'rün transportu ve indirgenmesi. Hg2+, MerP ve MerT proteinlerinin her ikisinede sistein kalıntılan ile bağlıdır.
19.17 • Petrolün Biyoyıkımi • 651
düzenleyici olarak iş görür (Kısım 8). Hg+2 nin yokluğunda, MerR mer operonunun operatör bölgesine bağlanır ve mer TPCAD genlerinin transkripsiyonunu engeller (Şekil 19 Ala). Bununla birlikte, Hg+2 mevcut olduğunda MerR ile bir kompleks oluşturur ve daha sonra mer operonunun transkripsiyonunda bir aktivatör olarak iş görür. MerP periplazmik Hg+2 bağlayan proteindir (Şekil 19.41b). MerP, Hg+2 yi bağlar ve onu, civa redüktaz ile indirgenmesi için hücreye transfer eden bir membran proteini olan MerT'ye aktarır (Şekil 19.41b). Sonuçta, Hg2+ uçucu olan Hg°'a indirgenir ve hücreden uzaklaştırılır (Şekil 19.41b). Diğer Ağır Metallere Dirençlilik Hem gram(+) hemde gram (-) bakterilerinden izole edilmiş birçok plazmit (Ö«& Kısım 10.8) ağır metallere karşı dirençlilik genlerini içermektedir. Belli antibiyotik dirençli plazmitler de aynı zamanda civa ve arseniğe karşı dirençlilik genlerine sahiptirler. Diğer plazmitler sadece ağır metallere karşı dirençliliği kodlarlar. Herhangi bir metale karşı dirençlilik mekanizması çeşitlilik gösterir. Örneğin arsenat ve kadmiyum dirençliliği, enzimlerin faaliyeti ile gerçekleşir. Arsenat ve kadmium iyonlarının hangisi olursa olsun enzimler tarafından anında dışarı atılırlar. Böylece proteinlerin ağır metallerden dolayı denature olmaları önlenmiş olur. Diğer dirençlilik özellikleri, redoks değişiklikleri ile ilgilidir (Şekil 19.41). Yüksek düzeylerdeki birkaç metale doğal olarak dirençli olan bakteriler, genellikle dirençlilik genlerini bulunduran çoklu plazmitler bulundurmaktadır. Bu şekildeki çoklu-dirençli organizmalar metal endüstrisi atıksularında veya ağır metallerin demir veya bakırla birlikte süzüldüğü madencilik işlemlerinde yaygın olarak bulunmaktadır. — (ijHp 19.16 Kavramların Gözden Geçirilmesi Civanın önemli bir toksik formu metilcivadır. Daha sonra Hg2+ oluşur ve oda bakteriler tarafından Hg0' a indirgir. Bakterilerin, ağır metallerin toksisitesine karşı dirençlilik yetenekleri özellikle detoksifikasyon yapabilen veya metalleri dışarı pompalayabilen enzimleri kodlayan özel plazmitleri bulundurmasından dolayıdır. • Civanın organizmalara en toksik olan formu hangisidir? • Civa bakteriler tarafından nasıl detoksifiye edilir?
alanlarda gösterilmiştir (bakınız Şekil 19.43). Petrol biyoyıkımının biyokimyası Kısım 17.23'te anlatılmıştır. Orada hidrokarbona oksijen atomlarını katan oksijenaz enzimlerinin önemli rol oynadığı önemle üzerinde durduğumuz konuydu (c«s Şekil 17.55). Bu yüzden, bizim burada tartışacağımız konu, böyle enzimlerin aktivitesinin yararlı olduğu ve doğadaki hidrokarbon oksidasyonun en fazla gerçekleştiği aerobik süreçler üzerinde yoğunlaşmak olacaktır. Hidrokarbon Dekompozisyonu Birçok bakteri çeşidi, birkaç maya ve küf ve bazı siyanobakleriler ve yeşil algler petrol ürünlerini aerobik olarak oksitleyebilmektedirler. Doğal aktivitelere ilaveten insanların yol açtığı sucul ve karasal ekosistemdeki küçük ölçekli petrol kirliliğide oldukça yaygındır. Bu yüzden, bu çevrelerde elektron vericisi olarak hidrokarbonu kullanabilen çeşitli mikrobiyal kommüniteler bulunmaktadır. En basit hidrokarbon olan metan, bakterilerin sadece özel bir grubu olan metanotrofik bakteriler (ac*2> Kısım 12.6 ve 17.24) tarafından katabolize edilmektedir. Bu organizmalar daha yüksek yapıdaki hidrokarbonlar üzerinde büyüyemezler. Petrol-oksitleyen mikroorganizmalar petrol filmleri ve tabakaları üzerinde hızla gelişirler. Bundan sonra eğer sıcaklık ve inorganik besinler (özellikle azot ve fosfor) yeterli ise petrol-oksitleme aktivitesi oldukça artış gösterir (bakınız Şekil 19.43). Petrol suda çözünmez ve daha düşük yoğunlukta olduğu için yüzeyde kalır ve tabakalar oluşturur. Petrol-oksitleyen bakteriler ekseriya çözülmeyen petrol damlacıklarına oldukça fazla miktarlarda tutunurlar (Şekil 19.42 •). Bu bakteriler nihayetinde petrolü parçalarlar ve ince petrol tabakasını dağıtırlar. Mikroorganizmalar petrolü CO2'ye oksitleyerek temizlenmesine katılırlar (Şekil 19.43»). Büyük atıklarda, uçucu hidrokarbon parçaları hızla buharlaşır. Daha uzun zincirli alifatik ve aromatik bileşenlerin temizlenmesi için veya mikroorganizmalara parçalatılması için ortamda kalır. Biyoremediasyon aktiviteleri geliştirildiğinde çevrede bir petrol kirliliği sonrası kısa sürede petrol-oksitleyen bakteriler 103 ile 106 oranında artabilmektedir. Deneylerde izleyici (tracer) olarak kullanılan radyoizotopik hidrokarbonlar ve solunum aktivitesinin bir ölçümü olarak O2 almımı analizi
Petrolün Biyoyikımi Petrol organik madde açısından zengin bir kaynaktır bundan dolayıda hava ve neme maruz kaldıklarında bu hidrokarbonlara aerobik koşullarda birçok mikroorganizma kolaylıkla saldırabilmektedir. Bazı durumlarda, petrolle kirlenmiş alanlarda petrolün biyoremediasyonu istenir ve çeşitli nutrientler eklenerek biyoremediasyon arttırılabilinir. Buna ilave olarak, petrol biyoremediasyonunda prokaryotların önemi son yıllarda birkaç ham petrolle kirlenmiş
Yağ damlacıkl.
Bakteriler
• Şekil 19.42 Yağ damlacıklarında hidrokarbon oksitleyen bakteriler. Bakteriler yağ-su arayüzeyinde yüksek sayılarda bulunurlar, damlacığın içinde ise bulunmazlar.
652 • Bölüm 19 • Mihrobiyal Ekoloji
* Şekil 19.44 Yağ biyoyıkımı. Yağ-su ara yüzeylerinde yoğun mikrobiyal büyümenin oluştuğu benzin-depo tanklan.
* Şekil 19.43 Deniz çevresinde geniş çaplı yağ döküntülerini çevresel sonuçlan ve biyoremediasyonun etkisi. (a) 1989 da Exxon Valdez atığından kaynaklanan Alaska kıyıları boyunca kirlenmiş bir sahil, (b) Merkazdeki dikey okla gösterilen alan, dökülmüş petrolün mikroorganizmalar tarafından biyoremediasyonunu artırmak içirt inorganik besinlerle desteklenmiştir. Oysa sol ve sağdaki alanlarda böyle bir destek yapılmamıştır.
ideal koşullar altında petrolde uçucu olmayan bileşenlerin bakteriler tarafından yılda %80'e kadar oksitlenebildiğim göstermektedir. Ancak belli fraksiyonlar, örneğin dallı-zincirli ve polisiklik hidrokarbonlar çevrede çok daha uzun süre kalmaktadırlar. Dibe doğru çöken Atık petrol oldukça yavaş şekilde parçalanır ve balıkçılık ürerinde oldukça önemli uzun vadeli etkileri olabilir. Buna bağlı olarak ürün verimliliği açısından kirlenmiş sular üzerine ilgili aktivitelerde etkilenir. Petrol ve suyun birleştiği ara yüzeyler ekseriya büyük ölçekli bir alan üzerinde gerçekleşmektedir. Örneğin, petrol tankmdaki birikimleri nemden korumak neredeyse imkansızdır. Çünkü su petrol altında bir tabaka oluşturur. Bu yüzden, benzin ve ham petrol yüklü tankerlerde (Şekil 19.44») hidrokarbon-oksitleyen mikroorganizmalar için potansiyel habitattır. Eğer suda yeterli miktarda sülfat bulunursa, sülfat-indirgeyen bakteriler anoksik koşullar altında tanklarda hidrokarbon tüketerek büyüyebilirler (cos, Kısım 17.23). Üretilen sülfür (H2S) yüksek oranda koroziftir ve tanklarda çatlaklara ve ardından da sızıntılara sebep olmaktadır. Petrol Üretimi
Her ne kadar petrolün mikrobiyal
ayrıştırılma-
sı biraz kapsamlı olsa da özellikle yeşil algler tarafından hidrokarbonların mikrobiyal üretimi de gerçekleşmektedir. Örneğin kolonial alg olan Botryyococcus bmunii'de büyüme salgıladıkları petrol bileşimine benzeyen uzun hidrokarbon zincirleri C 30 -C 60 ile gerçekleşmektedir (Şekil 19.45»). B. bmunii'de hücrelerinin kuru ağırlıklarının yaklaşık %30'u petroldür. Bu ve petrol-üreten diğer alglerin petrol üretiminde yenilenebilir bir kaynak olarak kullanılmaları ilgi çekmektedir. Belirli özelliklerdeki petrolün eski zamanlarda göl yataklarında büyüyen B. braunii gibi yeşil alglerden oluştuğuna dair birçok delil vardır. 19.17
Kavramların Çözden Geçirilmesi
Hidrokarbonlar her zaman mikrobiyal saldırılara açıktırlar. Hidrokarbon oksitleyen mikroorganizmalar petrol kirliliği olan bölgelerin biyoremediasyonunda kullanılmakta olup onların aktiviteleri petrolden gelen karbon girişiyle dengeli biçimde inorganik nutrientlerin eklenmesi ile ilgilidir. Bazı algler hidrokarbonları üretebilir. •
Biyoremediasyon ne demektir?
* Şekil 19.45 Fototrofik olarak petrol üretimi. Botryococcus braunii yeşil alg hücrelerinin Nomarski interferans kontrast ataşmanı yardımı ile çekilmiş fotomikrografı.
19.18 • Ksenobiyotiklerin Biyoyıhımı • 653
•
Niçin glukoz ilave edildiğinde yağ parçalanması artmaz iken inorganik besinler ilave edildiğinde teşvik edilebilmektedir?
Ksenobiyotiklerin Biyoyikımı Ksenobiyotikler doğal olarak oluşmayan maddeler olan sentetik kimyasallardır. Ksenobiyotikler pestisitleri, poliklorlanmış bifenilleri (PCBs, elektrik ürünlerinlerinde ve ilişkili endüstrilerde kullanılır), cephaneleri, boyaları ve klorlu çözücüler gibi birçok bileşikleri içerirler. Birçok ksenobiyotik yapısal olarak doğal bileşiklerle ilişkilidirler. Bu yüzden enzimler tarafından doğal bileşiklere ayrıştırılabilirler. Diğer yandan bazı ksenobiyotik bileşikler herhangi bir organizmanın daha önce doğada parçaladığı bileşiklerden yapısal olarak çok farklı oldukları için bunların ayrıştırılmaları ya hiç olmaz ya da oldukça yavaştır. Burada biz daha ziyade mikrobiyal parçalanma için potansiyel bir örnek pestisitler üzerinde duracağız. Pestisit Katabolizmasi Çok geniş bir dağılımı olan ksenobiyoliklerden bazıları toksik atıkların temel bileşenleri olan pestisitlerdir. 1000'in üzerinde pestisit, kimyasal zararlı kontrol amacıyla satılmaktadır. Pestisitler, herbisit, insektisit ve fungisitleri kapsarlar. Pestisitlerin kimyasal tipleri çok geniş bir çeşitliliktedir. Bunlar klorlanmış bileşikleri, aromatik halkalıları, azot- ve fosfor-içeren bileşikleri ve diğerlerini içermektedir (Şekil 19.46•). Bu maddelerden bazıları belirli toprak mikroorganizmaları için karbon kaynağı ve elektron vericisi olarak uygun olmalarına rağmen diğerleri uygun değildir. Eğer bir madde mikroorganizmalar tarafından saldırıya uğrayabiliyorsa sonunda topraktan kaybolacaktır. Topraktaki bu tür yıkımlar genellikle istenir. Çünkü bileşiğin toksik birikimlerinden kurtulmuş olunur. Her ne kadar birbirleriyle yakın ilişkili olsalarda Tablo 19.7'de gösterildiği gibi bileşikler yıkım şekillerinden dolayı önemli farklılıklar taşırlar. Bu yüzden bazı bileşikler yıllarca değişmeden kalırlar buna karşın diğerleri sadece haftalar veya aylar süresinde önemli derecede ayrıştırılırlar. Ksenobiyotiklerin nisbi kalış zamanları yaklaşık olarak verilmektedir çünkü çevresel faktörlerdeki bir değişiklik de -sıcaklık, pH, havalandırma, ve toprağın organik madde içeriği — ayrıca parçalanmayı etkilemektedir. Birkaç klorlanmış insektisit o kadar parçalanmaya dirençlidirki (recalsitrant) 10 yılı aşkın süre parçalanmadan kalabilirler. Bununla birlikte, bir pestisitin ekosistemde tamamen ortadan kalkması için tamamen mikroorganizmalarla ayrıştırılması gerekli değildir. Çünkü pestisitin yok olması buharlaşma, filtrasyon veya kendiliğinden gerçekleşen kimyasal kırılma ile de
W-SCHCOOC 2 H 6 C H
DDT; diklorodifeniltrikloroetan (bir organofosfat)
3°
CH 2 COOC 2 H 6
Malathion; merkaptosuksinik asit dietil ester (bir organophosphate)
OCH2COOH
CI
CI H 2,4,5-T için CI eklenme bölgesi
H
CH 3
2,4-D; 2,4-diklorofenoksi asetik asit (bir klorofenoksi asetik asit türevi)
Atrazine, 2-kloro-4-etilamino-6izopropilaminotriazin (bir triazin türevi)
N-H C=O I N / \ CH3 CH3 Monuron; 3-(4-klorofenil)-1 Idimetilüre (birsubstitue üre)
Ck
C II
H^C, Klorlu bifenil (PCB); görünüm 2,3,4,2',4',5' hekzaklorobifenil'dir.
Trikloroetilen
• Şekil 19.46 Ksenobiyotik bileşiklere örnekler. Bu bileşiklerin hiçbirisi doğal şekilde mevcut olmamasına rağmen, onları parçalayacak çeşitli mikroorganizmalar bulunmaktadır. (Tablo 19.7'de doğada bozunmadan kalma süresi verilerine ve 2,4,5T'nin biyoyıkım yol izine bakınız).
T bl 19 7
Herbisitlerin ve insektisitlerin topraklarda bozunmadan kalma süreleri
Madde
% 75-80'ninin ortadan kalkma zamanı
Klorlu lnsektisitler DDT [l,l,l-trichloro-2,2-bis(p-chlorophenyl)ethane]" Aldrin Chlordane Heptachlor Lindane (hexachlorocyclohexane) Organofosfatlı insektisitler Diazinon Malathion Parathion Herbisitler 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic asit) 2,4,5-T (2,4,5-trichlorophenoxyacetic asit) Dalapon Atrazine Simazine Propazine •Şekil 19.46'da gösterilen yapı
i
i 4 yıl 3 yıl 5 yıl 2 yıl 3 yıl 12 hafta 1 hafta 1 hafta 4 hafta 20 hafta 8 hafta 40 hafta 48 hafta 1.5 yıl
1
|
654 • Bölüm 19 • Mifcrobiyal Ekoloji
gerçekleşebilmektedir. Ayrıca, "Biyoyararlanım"{B ioavailability) ksenobiyotik bileşiklere mikrobiyal saldırının olması ile olur. Birçok ksenobiyotik tamamen hidrofobiktir ve bu yüzden suda iyi çözünemezler. Bu bileşiklerin, organik madde, topraktaki kil ve sedimentler tarafından adsorplanması onların organizmaya girişini engeller. Sürfaktanlarm ve emülsifiye edicilerin eklenmesi genellikle ksenobiyotik bileşiklerin biyoyararlanımını ve sonuçta biyoyıkımını arttırır. Hem bakteri hem de fungus cinslerinin dahil olduğu bir çok organizma, pestisitleri ve herbisitleri metabolize edebilmektedirler. Bazı pestisitler hem karbon hem enerji kaynağı olabilirler ve tamamen CO2'e kadar oksitlenirler. Ancak, diğer bileşikler ise ya az ya da hiç saldırıya uğramazlar. Primer enerji kaynağı olarak diğer bazı organik bileşikler bulunursa bazı bileşikler ya kısmen ya da tamamen parçalanabilirler. Bu kometabolizma ya da kooksidasyon olarak adlandırılan bir durumdur. Ancak, eğer kırılma kısmense, bir pestisitin mikrobiyal parçalanma ürünü bazen orijinal bileşikten daha toksik olabilir.
1ÜÜ
2x10
10'
o
2
1
3
6
Zaman (g)
OH
cr
cr
OH
cr Süksinat2"
Redüktif Deklorinasyon
C7H4O2Cl- + 2H > C7H5O2" + HC1 Biyoremediasyon bakış noktasından, diğer bazı klorlanmış bileşikler ekolojik açıdan klorobenzoattan çok daha önemlidir. Örneğin, redüktif deklorinasyon dikloro-, trikloro- ve tetrakloro- (perkloro) etilen bileşikleri, kloroform, diklorometan, bazı poli klorlu hidrokarbonlar (PCBs; Şekil 19.46), ve çeşitli bromlu, florlu bileşikler ile gerçekleşebilir. Bazıları kansere yol açan (özellikle trikloroetilen, Şekil 19.46) bu toksik bileşikler, endüstriyel solventler olarak, yağ uzaklaştırma ajanları olarak ve elektrik transformatöründe izolatör olarak geniş çapta kullanılmaktadır. Onlar, petrol dökülme kazalarından veya depo taşıyıcıların çatlamasından veya terk edilen elektrik transformatörlerinden anoksik çevrelere girerler. Sonuçta, bu bileşikler Birleşik Devletlerde en sık saptanan yer altı suyu kontaminantı olarak yer altı suyuna geçerler. Redüktif deklorinasyon yapan birkaç cins (c**a Kısım 17.18) klorlu bileşiklerin büyük bir kısmını zararsız metabolitlere dönüştürebilir. Günümüzde anoksik çevrelerde bu toksisitesi yüksek olan bileşiklerin uzaklaştırılması amacıyla redüktif deklorinasyon yapan prokaryotların biyoremediasyon aktivitelerini arttırma konusuna büyük bir ilgi vardır.
5
(a)
2
Kısım 17'de biz redüktif deklorinasyon denen anaerobik solunumun bir şeklini tartışmıştık. Bu süreçte, klorlanmış organik bileşikler anoksik koşullar altında terminal elektron alıcısı olarak kullanılmaktadır (c«3 Kısım 17.18). Redüktif deklorinasyon çalışmasında bir laboratuvar modeli klorobenzoatm Desulfomonile bakterisi tarafından benzoata indirgenmesidir:
4
Dioksijenaz
CI
Asetat"
(b)
• Şekil 19.47 Herbisit 2,4,5 T'nin Biyoparça-lanması. (a) Tek karbon ve enerji kaynağı olarak 2,4,5-T üzerinde Burkholderia cepacianm büyümesi. Strain, herbisitin konsantrasyonunu düşük tutmak için bir kemostat kullanarak doğadan zenginleştirilmiştir. Burada 1,5 g/l 2,4,5-T üzerinde görülen aerobikbüyümedir. Molekülden klor salımmı biyoyıkım için bir belirteçtir, (b) 2,4,5-T biyoyıkımıiun aerobik yolizi. Bir dioksijenazın davranış mekanizması Bölüm 17'de tartışılmıştır (Şekil 17.56c).Birkaç bakteri anoksik koşullar altında aromatik bileşikleri katabolizleyebilir fakat çalışılan mekanizma burada gösterilenden oldukça farklıdır (Şekil 17.57).
Aerobik Deklorinasyon Klorlanmış bileşiklerin aerobik deklorinasyonu da mümkündür (Şekil 19.47), tabii burada oksijenin karıştığı biyokimyasal mekanizmalar rol oynamaktadır. Bu koşullar altında, klorlanmış aromatik bileşiklerin parçalanması oksijenaz enzimleri vasıtasıyla gerçekleşir (Kısıml7.22). Örneğin, pestisit 2,4,5T'nin aerobik parçalanmasında, deklorinasyonu takiben, bir dioksijenaaz enzimi aromatik halkayı yıkar. Bu süreç, sitrik asit döngüsüyle metabolize edilebilen bileşikleri oluşturur (Şekil 19.47b). Klorlanmış organik ksenobiyotiklerin aerobik yıkımlarının şüphesiz büyük ekolojik önemleri olmasına rağmen, redüktif deklorinasyonun özellikle çevresel önemleri vardır. Çünkü anoksik koşullar, hızlı şekilde kirletilmiş mikrobiyal habitatlarda ve biyokimyasal sınırlamaların olduğu alanlarda gerçekleşmektedir (Şekil 19.47b). Diğer taraftan bu işlevi, bileşiği parçalayabilen aerobik organizmalar üstlenir.
19 18 • Ksenobiyotiklcrin Biyoyıkımı • 655
Biyoparçalanabilir Plastikler Pestisitler ve diğer klorlanmış hidrokarbonlar gibi toksik atıkların biyodegredasyonu yanında çevresel anlamda diğer önemli bir alan plastikler gibi katı atıkların uzaklaştırılmasıdır. Tipik olarak atık gömme alanları fazla miktarda kağıt, gıda, bina yapım ve yıkım kalıntıları ve plastikleri içerir. Bu materyallerin parçalanma oranları genellikle çok düşüktür. Çünkü koşullar, özellikle nem ve oksijenin bulunmaması hızlı mikrobiyal aktivite için uygun değildir. Ayrıca, plastik gibi ürünler doğal olarak rekalsitranttırlar. Günümüzde plastik endüstrisi her yıl hemen hemen 40 milyar kilogram plastik üretir ve onun yaklaşık yarısı atık gömme alanlarına atılır. Plastikler çeşitli tipleri olan ksenobiyotik polimerlerdir: polietilen, polipropilen ve polistiren tipik örneklerdir (Şekil 19.48«). Bu sentetik polimerlerin çoğu on yıllarca atık gömme alanlarında ve çöp dökülen alanlarda değişmeden kalmaktadırlar. Bu problem günümüzde kullanımı olan ve sentetik polimerlere biyoparçalanabilir alternatif (biyopolimer denir) ler üzerinde araştırmalara götürmüştür. Böyle başarı öyküleri fotoparçalanabilir nişasta-bağlı polimerleri ve mikrobiyal plastikleri içermektedir. Fotobiyoparçalanabilir plastikler mikrobiyal saldırıya uygun modifiye polimerler olup yapısı ultraviyole radyasyona (güneş ışığından) maruz bırakılarak değiştirilen plastiklerdir. Nişastatabanlı plastikler ikinci bir biyoparçalanabilir polimerin kısa parçalarına bir bağ olarak nişasta katılır (esas Şekil 3.6a). Bu düzenlenme biyoyıkımı arttırır. Çünkü toprakta nişasta-parçalayan bakteriler nişastaya saldırır ve polimer parçalarını açığa çıkarır ve bu parçalar daha sonra diğer mikroorganizmalar tarafından parçalanır. Mikrobiyal olarak sentezlenmiş plastikler, depo polimeri polijS-hidroksialkanoat üzerine kuruludur (PHA, Ö°Ö Kısım 4.11) (Şekil 19.49»). PHA sentetik polimerlerin birçok genel özelliğine sahiptirler ve çeşitli |-CH 2 -CH 2 -| L Jn Polietilen
L
j-CH 2 -CH-| | CH 3 J Polipropilen
Jn Polistiren
C 6 H 7 O 5 (OC-CH3) 3 1 Jn
^-NH-CO-O-RJ L Jn Poliüretan
Polivinil klorür (PVC)
f"-CF2-CF2-l L
Jn
Teflon
9
-Si-Ot
Selüloz asetat
|-CH2-CHCI-| L -in
n
R Silikor
• Şekil 19.48 Sentetik polimerlerin kimyası. Şekil birkaç yaygın sentetik polimerlerin monomerik yapışım göstermektedir.
SANARA PFLEGE-SHAMPOO
• Şekil 19.49 Bahteriyal plastikler, (a) PHV/PHB kopolimerleri. (b) poli-/8-hidrokisibutirat (PHB) ve poli-/3-hidrokisivalerat (PHV bakınız a) kopolimerinden yapılmış bir şişe içinde paketlenmiş Avrupa'da satışa çıkarılmış bir çeşit şampuan. Bu materyal doğal bir ürün olduğu için, şişe kolaylıkla hem aerobik olarak hem de anaerobik olarak parçalanmaktadır.
(b)
kimyasal formlarda biyosentezi yapılabilmektedir. PHB (polHS-hidroksibutirat) ve PHV (poli-/3hidroksivalerat)'ın yaklaşık eşit miktarlarını içeren bir kopolimer şimdiye kadar en yüksek satış başarısı olan bileşiktir. Ancak, daha az fiyatları olduğu için petrol-tabanlı plastikler bugün hemen hemen tamamiyle tüm plastik pazarını oluşturmaktadır. 19.18 Kavramların Gözden Geçirilmesi İnsektisit, herbisit ve plastik (tümü ksenobiyotik olarak adlandırılır) gibi birçok kimyasal olarak sentezlenmiş bileşikler mikroorganizmalara tamamiyle yabancıdırlar. Fakat bununla birlikte onlar genellikle bir veya birkaç prokaryotla parçalanabilirler. Hem aerobik hem de anaerobik mekanizmalar bilinmektedir. •
Hangi kimyasal özellikler Şekil 19.46'da gösterilen bileşiklerce paylaşılır?
•
Kedüktif deklorinasyon nedir ve Şekil 19.47'de gösterilen reaksiyonlardan farklılığı nedir?
•
Hangi avantajlar sentetik polimerlere karşın biyopolimerleri üstün kılar?
fcfVII
BİTKİLERLE MİKROBİYAL İLİŞKİLER
Bu Kısımda bitkiler ile mikrobiyal ilişki konusuna üç örnekle yaklaşağız. Likenler, mikoriza ve legüm bitkilerin kök nodülleri gibi birçok yararlı simbiyotik ilişki vardır. Ayrıca bitki hastalıklarına sebep olan zararlı mikroorganizmlar da bulunmaktadır. İkinci duruma örnek olarak, burada hastalığın eşsiz özelliğinden ve hastalığın geçişinde mikrobiyal özelliğinden dolayı taç tümörü (crown gali) hastalığı üzerinde duracağız.
656 • Bölüm 19 • Mikrobiyal Ekoloji
Bitki Çevresi Mikrobiyal habitatlar gibi bitkiler de şüphesiz hayvanlardan çok farklıdırlar. Sıcakkanlı hayvanlarla kıyaslanırsa; hem günlük olarak hem de yıl boyunca bitkiler sıcaklıkla çok değişiklik göstermektedir. Hayvanların kompleks dolaşım sistemleriyle karşılaştırıldığında bitkilerin iç iletişim sistemleri yetersiz gelişmiştir ve bu yüzden bitki içindeki mikroorganizmaların transferi oldukça yetersiz gelişmiştir. Bu yüzden bitki içinde mikroorganizma taşınması nispeten yetersizdir. Bitkinin yerin üzerindeki kısımları özellikle yaprakları ve gövdeleri sık sık kurumaya maruz kalır ve bu sebepten birçok bitki nemin kaybolmasını önleyen ve mikroorganizmaları uzak tutan mumsu tabaka geliştirir. Diğer taraftan kökler, mikrobiyal aktivitenin ana alanıdır. Burada nem daha az değişken, nutrient konsantrasyonuda daha yüksektir. Rizosfer ve Filosfer
Rizosfer, kökün hemen dışında mikrobik aktivitenin genellikle yüksek olduğu bir bölgedir (bakınız Şekil 19.6b). Rhizoplane gerçek kök yüzeyidir. Bakteri sayısı rizosfer/rhizoplane'de köklerin yoksun olduğu toprak bölgelerinden daima daha yüksek, çoğunlukla da çok daha fazla yüksektir (Şekil 19.50»). Bunun sebebi köklerin önemli miktarda şekerler, aminoasitler, hormonlar ve vitaminleri dışarı atmalarıdır. Bu sayede, bakteriler ve funguslar kök yüzeyinde mikrokoloniler oluştururlar. Filosfer; bitki yaprak yüzeyidir. Yüksek nem koşulları altında, tropikal ve sıcak bölgelerin ıslak ormanlarında olduğu gibi bakteri ve fungusları içeren yaprak mikrobiyal florası oldukça fazladır (ÖOS Şekil 19.50a). Yapraklar bakterilere, karbonhidrat ve diğer besinleri sağlarken yaprakların üzerindeki bir çok bakteride azotu fikse etmektedir (Kısım 17.28, ve bakınız Kısım 19.22). 19.19 Kavramların Gözden Geçirilmesi Bitkiler üzerindeki önemli mikrobiyal habitatlar rhizoplane/rizosfer ve filosferde bulunmaktadır. •
Niçin bakteriler için bitkilerin kökleri bitki bulunmayan topraklardan daha cazip bir çevre olabilmektedir?
Likenler ve Mikoriza Likenler ekseriya çıplak kayalar, ağaç gövdeleri, ev çatıları ve çıplak toprak yüzeyinde büyüyen yapraklı ya da bir yeri kaplayarak gelişen organizmalardır. Genellikle büyüdükleri bulunmuştur (Şekil 19.51»). Likenler iki organizmanın- bir fungus ve bir alg veya siyanobakteri-simbiyozisinden oluşur. Bununla beraber, bu ilişkide küçük farklılıklar görülebilir. Örnek verirsek fungus, liken simbiyozisini oluşturmak için birçok farklı fototrof ile işbirliği kurabilir ya da tam terside olabilir.
(b)
• Şekil 19.50 Filosfer ve rizosfer mikrobiyal yaşam örnekleri, (a) Elmanın phyloplane (yaprak yüzeyi) üzerinde Aureobasidium pullulans mantarının florasans mikrografı. Hücreler FISH ile boyanmıştır (£&& Kısım 18.4) ve hem fungal filamentler hem de sporlar yeşil boya gösterecektir. Bir fungal filament yaklaşık 7 ;um çapındadır, (b) Yoncanın rizosfer/rizoplane üzerindeki bakteriyal hücrelerin lazer-taramalı confocal (OOs> Kısım 4.2) mikrograflan. Legüm bitkilerin kökleri ile azot-fikse eden bakterilerin ilişkisi Kısım 19.22'de tartışılmıştır, (c) Yoncanın kök saçağına tutunmuş Rhizobium leguminosarum biovar trifolii hücrelerinin taramalı elektron mikrografı. (b)'de ve (c)'deki bakteriyal hücreler yaklaşık 1 jjm çapındadır.
Alg fototrofiktir ve daha sonra fungusun beslenmesinde kullanılacak organik madde üretebilir. Fungus fotosentez yapamaz. Rüzgar ve yağmur sonucu oluşan erozyon koşullarında algin büyümesi fungusun yere sağlam bir çapa gibi tutunması ile sağlanır. Ayrıca fungusun suyu almasıda kolaylaşır. Fungus algin büyümesi için gerekli temel inorgonik besinleride likenin üzerinde yaşadığı kaya veya diğer substartlardan absorbe eder. Likenler genellikle diğer organizmaların büyüyemeyeceği yüzeylerde bulunurlar ve bu çevrelerde koloni kurmadaki başarıları alg ile fungus arasındaki mutual ilişkiden dolayıdır. Liken yapısı ve Ekolojisi
Likenler; fototrofik hücrelerle içinde yerleştiği birçok fungus hücresinin sıkı birliğinden oluşur (Şekil 19.52»). Likenin şeklini esas olarak fungus belirler ve oldukça fazla çeşitlilikteki fungus, liken birliği-
19 20 • Likenler ve Mikoriza • 657
Algal tabaka
Mantara ait hif
• Substarta kökbenzeri tutunma
* Şekil 19.32 Liken yapısı. Bir likenin içinden çapraz bir kesitin ptomikrografı. Algal tabaka daha fazla güneş ışığını alması amacıyla liken yapısı içine yerleşmiştir. • Şekil 19.51 Likenler, (a) Ölü bir ağaç dalında büyüyen bir liken, (b) Geniş bir kayanın yüzeyini kaplayan likenler.
ni oluşturabilmektedir. Alg tiplerindeki çeşitlilik daha azdır ve birçok farklı liken türünde aynı alg türü bulunabilmektedir. Bazı likenler fototrofik eleman olarak alg yerine siyanobakterleri-özelliklede N2-fikse eden türleri-içerirler. Genellikle alg veya siyanobakteriler liken yapısı içinde tabakalar yada kümeler halinde bulunurlar. Fungus alg ile ilişkisinden açıkça yarar sağlar ama bu ilişkiden alg nasıl bir yarar sağlamaktadır? Liken asitleri fungus tarafından salgılanan kompleks organik bileşikler olup bunlar alg tarafından ihtiyaç duyulan inorganik nutrientlerin çözünmesine ve parçalanmasına yardımcı olur. Fungusun bir başka rolüde fototrof canlıyı kuraklıktan korumaktır. Likenlerin yaşadığı habitatların bir çoğu kurudur (kayalar, çıplak toprak, çatılar) ve fungus genel olarak kuru havaya karşı alglerden daha fazla tolerans gösterebilirler. Çoğu liken çok yavaş büyür. Örneğin, Bir kayanın yüzeyinde gözlenen 2 cm'lik bir liken gerçekte birkaç yıllık olabilmektedir. Likenlerin büyüme miktarları yılda 1 mm ile 3 cm arasında değişiklik gösterir. Büyüme ölçüsü simbiyozisi oluşturan organizmalara, yağış miktarına ve güneş ışığını alışlarına bağlıdır. Mikoriza Mikoriza (literatür analmı, "kök fungusu") bitki kökleri ile mantarlar arasındaki simbiyotik işbirliğini ifade etmektedir. Mikorizanın iki sınıfı vardır. Ektomikorizada (Şekil 19.53»), mantar hücreleri kökün dış tarafında yaygın bir tabaka oluşturur. Bu tabaka, kök dokusuna oldukça az miktarda nüfuz etmektedir. Endomikoriza da, mantar miseli kök dokusunun içine epeyce nüfuz etmiştir.
Ektomikoriza çoğunlukla orman ağaçlarında bulunur özellikle kozalaklı ağaçlar, kayın, meşe ve boreal ve ılıman iklimdeki ormanlarda gelişirler. Bazı ormanlarda her ağacın hemen hemen her kökü mikorizaldir. Çam gibi (Pinus cinsi) mikorizal ağacın kök sistemi; hem uzun hem de kısa köklerden oluşur. Pinus'da karakteristik olarak dikotomik dallı olan kısa kökler, tipik mantar kolonizasyonunu gösterir ( Şekil 19.53a) ayrıca uzun kökler de sıklıkla kolonize edilmektedir. Endomikorizaya ektomikorizadan daha çok rastlanır. Endomikorizaran bir çeşidi olan Arbuscular mycorrhizae şimdiye kadar incelenmiş tüm karasal bitkilerin %8(Tinden fazlasının köklerinde bulunur. Birçok mikorizal mantar, selülozu ve yaprak parçalarını katabolize edemez. Fakat onun yerine büyümek için basit karbonhidratları kullanır ve genellikle bir ya da daha fazla vitamine ihtiyaç duyarlar. Karbonu kök salgılarından elde ederler buna karşın inorganik minarelleri topraktan alırlar. Mikorizal mantarlar doğada nadiren köklerin dışında bulunurlar, ve bu nedenle çoğunun zorunlu simbiyont olduğu düşünülebilir. Mikorizal mantarlar mikorizal yapının oluşumunu teşvik eden, köklerde morfolojik değişiklikler oluşmasını sağlayan bitki büyüme maddeleri üretirler. Ancak, fungus ve kök arasındaki bu yakın ilişkiye rağmen, tek bir çam türü 40'm üstünde mantar türüyle mikorizal birlik kurabilir. Mikorizal mantarların bitkiler üzerindeki yararlı etkisi, en iyi şekilde, mikorizal olanlar geliştiği, mikorizal olmayanlar ise gelişemediği fakir topraklarda gözlenir. Örneğin, ağaçlar özellikle uygun bir mantar inokulumu olmayan topraklarda yetiştirilirse yetiştirmenin ilerleyen zamanlarında suni şekilde inoküle edilen ağaçlar inoküle edilmemiş ağaçlardan çok daha hızlı büyümektedirler (Şekil 19.54»). Mikorizal bitkiler besinlerini çevreden
i
658 • Bölüm 19 • Mikrobiyal Ekoloji
V
t
Mantar ^ rizomorflar
* 11
w' •
^ ~ Çatallaşmı^B jk mikoriza ıf (a)
• Şekil 19.53 Mikoriza. (a) Thelophora terretis mantarının rizomorfu ile çamın (Pinusrigida)tipik ektomikorizal kökü. (b) Mantar ortağı SuiIIus bovinus'un absorptif miselyumun yaygın gelişimini gösteren Pinus contorta (lodgepole çamı)'mn köklenmesi. Bu topraktan besinleri yakalamak ektomikorizal köklerden fanbenzeri bir oluşum içinde büyümektedir.
daha verimli bir şekilde absorbe edebilmektedir. Böylece mikorizal bitkiler rekabet avantajına sahip olacaktır. Bu gelişmiş besin absorbsiyonu mantar miselleri tarafından sağlanan geniş yüzey alanından dolayı olmaktadır. Örneğin, Şekil 19.53fr'de gösterilen çam fidesinde, ektomikorizal mantar miselleri bitki kök sisteminde emici bölgenin önemli bir kısmını oluşturmaktadır. Basitçe bitkilere besin absorpsiyonuna yardımcı olması dışında, mikoriza aynı zamanda bitki çeşitliliğini kontrol etmedede önemli bir rol oynayacağı aşikadır. Aslında, alan çalışmaları (1) Topraktaki mikorizalarm bolluk ve çeşitliliği, ve (2) onda gelişen bitki çeşitliliğinin artması arasında pozitif bir korelasyon olduğunu göstermektedir. Böylece mikoriza bir bitki-mikroorganizma simbiyozisine temel bir örnek olup her iki partner de fayda sağlamaktadır. Mikorizal bitkilerin fizyolojik olarak daha fonksiyon olabilmektedir ve bir türle zengin bitki komunitelerinde rekabet başarıları yüksek olmaktadır. Buna karşılık fungus ise organik nutrientleri hazır bulması ile kazançlı çıkmaktadır.
/ r
Jk «*
J
I
1
* Şekil 19.54 Bitki büyümesi üzerine mikorizal mantarın etkisi. Çayır toprağında büyüyen Monterey çamının (Pinus radiata) altı aylık büyümesi: sol, mikorizal değil; sağ, mikorizal.
•m19.20
Kavramların Çözden Geçirilmesi
Likenler bir mantar ile bir alg veya siyanobakteri arasında olan simbiyotik ilişkidir. Mikoriza bitki kökleri ile ilişkide olan ve onların besin absorblama kabiliyetlerini arttıran funguslarla oluşturulur. Mikoriza bitki sağlığı ve rekabet gücü üzerine çok fazla olumlu etki sağlar. •
Endomikorizanın ektomikorizadan farklılığı nedir?
•
Niçin bitkilerle olan mikorizal ilişkiler bir çeşit simbiyosis olarak düşünülmektedir?
19 21 • Agrobacterıum ve Taç Tümörü Hastalığı • 659
19.21
Agrobacterıum ve Taç Tümörü Hastalığı
Bazı mikroorganizmalar, bitki hastalıklarına neden olan bitki patojenleridir. Kök nodul bakterisi Rhizobium'a yakın akraba olan Agrobacterium cinsi, birçok bitki çeşidinde tümör büyümesi oluşumlarına neden olmaktadır. Bu konuda üzerinde en fazla çalışılan iki tür taç tümörü (crovvn gali) hastalığına yol açan Agrobacterium tumefaciens ve saçak kök (hairy root) hastalığına yol açan Agrobacterium rhizogenes'dit. Bitkiler, yaralandığında callus adını verdiğimiz doku yığılmaları oluşturmalarına rağmen A. tumefaciens''in indüklemesi ile oluşan büyüme (Şekil 19.55 •) kallusta kontrolsüz büyümelere neden olduğu için farklıdır. İlginçtir ki birkez indüklendiğinde bu tümörler Agrobacterium hücrelerinin yokluğunda dahi büyümeye devam ederler. Anlaşıldığı üzere, Agrobacterium tümörü oluşturur ancak, onun yokluğunda da tümör gelişimini devam ettirir. Yani Agrobacterium bir kez tümör oluşumunu indüklediğinde, daha ilerisi için onun bulunmasına gerek yoktur. Ti (tumor mduction) plazmiti denen büyük bir plazmit (Şekil 19.56») tümör oluşumu için Agrobacterium hücreleri içinde bulunmalıdır (Şekil 19.55). A. rhizogenes hücreleri içinde, Ri plazmiti benzer bir plazmit, saçak kökün indüklenmesi için gereklidir. Enfeksiyonu takiben, Ti-Plazmit'in bir parçası olan transfer DNA (T-DNA) bitkinin genomuyla kaynaşır. T-DNA, tümör oluşumu için gerekli genleri taşımakta olup aynı zamanda da, opines adı verilen birkaç modifiye aminoasitin üretimi için de gerekli genleri bulundurur. Octopine[N2(l,3-dikarboksietil)-L-arjinin] ve nopaline[N2-(l,3dikarboksipropil)-L-arjinin] en çok bilinen opine aminoasitleridir. Opines, T-DNA tarafından transforme edilirek bitki hücreleri tarafından üretilir ve Agrobacterium hücreleri için karbon ve azot kaynağı olarak kullanılır.
* Şekil 19.55 Taç tümörü. Agrobacterium cinsi taç tümörü bakterileri tarafından bir tütün bitkisinde oluşturulan bir taç tümörü hastalığı tümörünün fotoğrafı. A. tumefaciens birçok bitkide kahverengi, odunsu benzeri büyümelere sebep olmaktadır. Taç tümörü meyve ağaçlarında ve güller ve papatyalar gibi çeşitli süs çiçeklerinde özel bir probleme sebep olurlar. Hastalık genellikle bitkiyi öldürmez fakat onu zayıflatabilir ve onu kuraklığa ve hastalıklara karşı daha duyarlı hale getirir. Kopmuş tümörler enfeksiyonu devam ettirmek için A. tumefaciens'in bir rezervuan olarak hizmet ederler.
ralı kısma bağlar ve bitki hücresi yüzeyinde geniş bakteriyal agregatlar oluşturur. Bu bakteriden bitkiye plazmit transferi safhasını oluşturur. Ti plazmit'in yapısı Şekil 19.56'da verilmiştir. Ti plazmitin sadece küçük bir parçası enfeksiyon için gerekli olmasına rağmen, aslında T-DNA (Şekil 19.56) bitkiye transfer edilir. T-DNA tümör oluşumunu teşvik eden genleri içerir. Ti plazmiti üzerinde bulunan vir genleri T-DNA transferi için gerekli olan proteinleri kodlamaktadır (Şekil 19.56). vir gen ekspresyonu, yaralı bitki dokuları tarafından sentezlenen bitki sinyal molekülleri tarafından indüklenir. Bazı teşhis edilenler fenolik T-DNA.
Tanıma ve DNA Transferi Tümör oluşumunu başlatmak için, Agrobacterium hücreleri ilk önce bitkideki yaralı kısma tutunmalıdır. Bitki dokusu tarafından Agrobacterium'un tanınması, bitki ve bakteri hücrelerinin yüzeyinde tamamlayıcı reseptör moleküller ile gerçekleşir. Bitki reseptör (alıcı) molekülünün bir pektin (kompleks bir polisakkarittir) türü, bakteriyal reseptör molekülünün ise hücre duvarı lipopolisakkariti içinde bulunan /3-glukanları içeren bir tip polisakkarit olduğu düşünülmektedir. Agrobacterium tumefaciens' in tumorojenik olmayan mutantlarıyla yapılan çalışmalar bakterinin bitkiye bağlılığı için gerekli en temel fonksiyonların bakteri kromozomunda taşındığını göstermektedir. Tutunmanın ardından, bakteri tarafından selüloz mikrofibrillerinin hızlı sentezi hücreleri ya-
Geçiş ile ilgili genler
(virülens faktörlerini kodlar)
Opin katabolizma genleri
• Şekil 19.56 Agrobacterium tumefaciens'in Ti plazmit'inin yapısı. T-DNA bitkiye aktarılan asıl bölgedir. Oklar her bir genin transkripsiyon yönünü belirtmektedir. Tüm Ti plazmit'i yaklaşık 200 kbp'lik DNA'dır ve T-DNA yaklaşık 20 kbp kadardır (Ti plazmit'inin daha ayrıntılı tartışması için Kısım 21.10'a bakınız.)
• Bölüm 19 • Mikrobiyal Ekoloji
bileşikler, acetosyringone, p-hydroxybenzoic asid ve vanilin içerir. vir genleri, T-DNA transferinde anahtardır. virA geni inducer molekül olarak iş gören bir protein kinazı (VirA) kodlar ve daha sonra virG geninin ürününü fosforile eder (Şekil 19.57«). Bu ürün fosforilasyonla aktifleştirilir ve diğer vir genleri de aktifleştirmede iş görür. VirD geninin ürünü (VirD) endonükleaz aktivitesine sahiptir ve DNA'yı Ti plazmit içinde, T-DNA'ya bitişik bir bölgede keser (Şekil 19.57). vir E geninin ürünü, endonükleaz aktivite sonucunda oluşmuş tek zincirli DNA'yı bağlayan bir DNA-bağlayan proteinidir ve bu küçük DNA parçasını bitki hücresi içine nakleder. Bakteriyal zara yerleşmiş olan VirB ve bitki ile bakteri arasında DNA tek ipliğinin transferinde aracılık yapar. Bu yüzden, T-DNA transferi (Şekil 19.57), bakteriyal konjugasyona benzer. (c**s Şekil 10.11). T-DNA bitkinin nükleer genomu içine yerleşmiş olup spesifik sıra değişiklikleri veya direk dizi tekrarlarının olduğu integrasyonu gerçekleşir. Ti plazmitin (Şekil 19.56) tumorijenezis (onc) genleri, opine biyosentezinin en az bir anahtar enzim olduğu gibi bitki hormonu üretimiyle ilişkili enzimleri kodlar. Bu genlerin ifadesi tümör oluşumuna yol açar. Saçak kök hastalığında iş gören Ri plazmitide onc genlerini içerir. Ancak, bu durumda genler, bitki hücrelerinin artan şekilde öksin duyarlılığı olmasına neden olur ve bunun sonucu olarak kök dokunun aşırı üretimi gibi hastalık belirtilerinin oluşumuna götürür. Ri plazmiti, ayrıca birkaç opine biyosentez enzimlerinide kodlar.
Fenolik bileşikler
Diğer vir genlerinin transkripsiyonu
VirE (tekiplikli DNA bağlama proteini)
E
E
(c)
Ti Pilazmidleriyle Genetik Mühendisliği Mikrobiyoloji ve bitki patolojisine göre, taç tümörü S ve saçak kök hastalıkları, bakteri DNA'sının bitki Agrobacterium hücresi hücrelerine fiziksel olarak transfer edilen eşsiz bir çeşitlilikte bitki bakteri etkileşimini içerir. Ancak, (d) DNA geçiş mekanizması bir defa anlaşılınca, artık Ti sisteminin bitkiye genetik olarak oynanmış DNA'yı vermek için bir vektör olarak kullanılabileciği hızla kesinlik kazanmıştır. Diğer taraftan, Ti doğal bir bit- • Şekil 19.57 Agrobacterium tumefaciens tarafından ki transformasyon sistemidir. Bu yüzden, yıllar içinde bitki hücresine T-DNA'nın transfer mekamizması. (a) VirA fosforilasyonla VirG'yi aktive eder ve VirG diğer vir genlerinin Ti/crown gali sistemindeki yoğunlaşma hastalıktan transkripsiyonunu aktive eder. (c) VirE bir tek zincirli DNAbiyoteknolojide yeni uygulamalara doğru kaymıştır. bağlama proteinidir, (d) VirB Agrobacterium ve bitki hücresi araGenetik mühendisliğinin gücü ile hastalık gensında bir konjugasyon köprüsü olarak iş görür. Bitki DNA polimeleri ortadan kaldırılmış modifiye edilmiş ("silahsızraz DNA'mn bitki genomuna kaynaşmadan önce transfer edildiği laştırılmış") Ti plazmitleri günümüzde transjenik tek zincirli DNA'ya komplementer zincir üretir. bitkilerin üretiminde kullanılmaktadır. Herbisit ve böcek direnci alanında çoktan başarı hikayeleri yazılmıştır ve bir çoğu yazılmak üzeredir. Biz Kısım 31.10'da bir vektör olarak Ti plazmitini bitki biyoteknolojisinde kullanımını tartışacağız. 19.21 Kavramların Gözden Geçirilmesi Taç tümörü bakterisi Agrobacterium yüksek bitkilerle eşsiz ilişki şeklinde girer. Bakterideki bir plazmit (Ti plazmiti) bitki genomuna bir parçasını aktarır bu şekilde taç tümörü hastalığını oluşturur. Taç tümörü plazmiti ayrıca tarım bitkilerinin genetik mühendisliğinde yaygın şekilde kullanılmaktadır.
• •
Opin nedir ve niçin üretilir? Ti plazmiti içinde bulunan vir genlerinin T-DNA'dan farkı nedir? • Taç tümörü hastalığının anlaşılması bitki moleküler biyolojisi alanında ne gibi kazanç sağlar?
19 22 • Kök Nödül Bakterileri ve Baklagil Bitkileri ile Simbiyoz • 661
19.22
Kök Nodul Bakterileri ve Baklagil Bitkileri ile Simbiyoz
En önemli bitki-bakteri etkileşimlerinden biri, gram negatif ve azot-fikse eden bakteriler ve legüm bitkileri arasında olandır. Legümler, tohum zarfı içinde tohumları taşıyan bitkiler olarak tanınırlar. Bu geniş grup, ekonomik olarak önemli; soya fasulyesi, yonca, adi yonca, fasulye ve bezelye gibi bitkile-
ri içeren geniş grubu kapsamaktadır. Bu bitkiler soya-işleme endüstrisi ve evcil hayvanların beslenmesinin ve ayrıca insan diyetinin temel sebzeleri olarak önemli ürünlerdir. Birkaç tarım endüstrisi legüm ürünleri etrafında döner ve azot eksikliği olan topraklarda legüm bitkisi yetişebilirliği çiftçilere heryıl milyonlarca dolar kazandırır. Rhizobium, BradyRhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, Azorhizobium ve Photorhizobium gram-
negatif hareketli çubuk-şekiUi Proteobacteria üyeleridir. Bunlar toprakta serbest-yaşayabilirler veya legüm bitkileri enfekte edebilir ve böylece simbiyotik bir ilişki oluşur. Bu cinslerin uygun bir türünün bir leguminous bitkisinin köküne enfekte olması, azot fiske eden kök nodüllerinin (Şekil 19.58») oluşumunu sağlar (c%%$ Kısım 17.28). Bu simbiyozlarla yapılan azot fiksasyonu tarımsal öneminin olması yanında, topraktaki bileşik azot miktarını da çok önemli derecede yükseltir. Azot eksikliği sıklıkla ekim yapılmayan topraklarda görüldüğü için, nodul oluşmuş legümler kimi koşullar altmda ayrı bir avantaja sahiplerdir ve diğer bitkilerin yetişemediği yerlerde iyi bir şekilde yetişirler (Şekil 19.59»). Leghetnoglobin ve Çapraz-Aşılama Grupları
Normal şartlar altında, yalnız başlarına ne legum bitkisi ne de onun bakteriyal simbiyontu azotu fikse edebilirler. Bu ikisinin aralarında etkileşimi ile azot fiksasyonu nasıl yapılmaktadır? Saf kültürde, rhizobia mikroaerofilik koşullarda büyütüldüğünde, N2,yi yalnız başına fikseedebilmektedir. Açıkça rhizobia N2'yi yalnız fiske etmesinde gerekli enerji için bir miktar O2'ye ihtiyaç duymaktadır. Ancak onların nitrojenazı (diğer azot fiske edenlerinki gibi, ocfe Kısım 17.28) O2 ile inaktive olur. Nodülde, O2' nin kesin miktarı, O2-bağlayan protein leghemoglobin ile kontrol edilir. Bu kırmızı, demir içeren protein daima sağlıklı N 2 fikse eden nodüllerde bulunur (Şekil 19.60») ve bitki konukçu ile bakteriyal simbiyontun etkileşimi ile oluşumu teşvik edilir. Leghemoglobin, nodul içindeki serbest O2 seviyesini düşük tutmak için, oksitlenmiş(Fe3+) ve indirgenmiş (Fe2+) formları arasındaki döngüde bir "oksijen tamponlayıcısı" olarak iş görür. Leghemoglobin-bağlı O2'nin, kök nodülünde serbest olan O2'e oranı 10.000:1 düzenindedir. Legüminöz bitki türlerinin, yaklaşık %90'ı nodülleşme yapabilmektedir. Ancak, Legüm türleri ve rhizobial türler arasında bir spesifiklik vardır. Rhizobial grubun Tek bir türü genellikle, bel-
• Şekil 19.58 Soya fasulyesi kök nodülleri. Nodüller Bradyrhizobium japonicum enfeksiyonu ile oluşur. Bu soya fasulyesi bitkisinin ana gövdesi yaklaşık 0,5 cm çapındadır.
li legum'leri enfekte edebilir diğerlerini edemez, rhizobia'nm bir türü veya bir grubu bir çaprazaşılanma grubu olarak bilinen ilişkili bir grup legümü enfekte edebilir (Tablol9.8). Ancak, bir rhizobial starin belli bir legüm'ü enfekte edebilse bile, her zaman azot fiske-eden nodul üretimi oluşmayabilir. Eğer strain genetik olarak yeterli değilse, oluşan nodüller küçük, yeşilimsi-beyaz ve azot fiske edemeyen nodüller olacaktır. Diğer taraftan, eğer strain yeterli olursa, nodüller büyük, kırmızımsı (Şekil 19.60) ve nitrojen fikse eden nodüller olacaktır. Yeterlilik bakterideki genlerle saptanabilir (bakınız bu Kışımın sonraki konularında tartışılacak nod genleri) ve asetilen indirgenmesi ile ölçülebilir Kısım 17.28).
HHHHİ
r
f - ;*
Si." ,* -
İL. j ^ İ
f' '
J ••it W
• Şekil 19.59 Bitki büyümesi üzerine nodülleşmenin etkisi. Azot-fakir topraklarda büyüyen nodülleşmiş (sol) ve nodülleşmemiş (sağ) bir soya fasulyesi bitkisi tarlası.
662 • Bölüm 19 • Mikrobiyal Ekoloji
Kök saçağı
1 Tanıma ve tutunma (rikadesin-aracılı] Rhizobial hücre
2. Kök saçaklarının kıvrılmasına neden olan bakteri tarafından nod faktörlerinin salgılanması. 3. İnvazyon. Rhizobia kök saçağına penetre olur ve bir "enfeksiyon ipliği" içinde çoğalır.
• Şekil 19.60 Kök nodul yapısı. Kırmızımsı pigment leghemoglobini görülen legüm bitkisi coronilla varia 'dan kök nodülünün kısımları.
4. Enfeksiyon iplikçiği içindeki bakteriler kök hücresine doğru büyür. Enfeksiyon İstila edilen bitki iplikçiği hücreleri ve yakınındakiler bölünme için teşvik edilir
Kök Nodülü Oluşumundaki Aşamaları Enfeksiyondaki ve kök nodüllerinin gelişimindeki safhalar günümüzde iyi anlaşılmaktadır (Şekil 19.61»). 1. Bakteri ve bitkinin her ikisinin de bir parçasının doğru eşini tanıması ve bakterinin kök saçaklarına bağlanması. 2. Bakteri tarafından nod faktörlerinin salgılanması. 3. Kök saçağına bakteriyal invazyon. 4. Enfeksiyon iplikçiği yolu ile ana köke yolculuk. 5. Bitki hücreleri içersindeki, bakteroidler olarak bilinen, modifiye bakteri hücrelerinin oluşumu ve azot-fikse etme safhasının gelişimi ve 6. Bitkinin hayata devamı, bakteriyal bölünme ve olgunlaşmış nodul kökü oluşumu. Biz şimdi nodülleşmeyi daha detaylı şekilde inceleyeceğiz. r
Tablo 19.8
Legüm bitkilerinin temel çaprazaşılama gruplan
Konukça bitki
Nodul oluşturan
Bezelye Fasulye
Rhizobium leguminosarum biovar viciae" Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli"
Fasulye Nilüfer
Rhizobium tropici Mesorhizobium loti
Yonca Kabayonca Soya fasulyesi Soya fasulyesi
Rhizobium leguminosarum biovar trifolii" Sinorhizobium melihti Bradyrhizobium japonicum Bradyrhizobium elkanii
Soya fasulyesi Sesbania rostrah j
Rhizobium fredii Azorhizobium caulinodans
(tropikal bir legüm) " Rhizobium leguminosarum'un birkaç varyetesi (biovarlan) mevcuttur, her biri farklı bir legümü nodülleştirme yeteneğinden kaynaklanır.
5. Bitki hücreleri içersindeki bakteroid halinin oluşumu
Yumrular
6. Bitki yaşamının devamı, bakteriyel hücre bölünmesi
• Şekil 19.61 Rhizobium tarafından enfekte edilmiş bir legümde bir kök nodulunun oluşumundaki basamaklar. Bir enfeksiyon iplikçiğinin fotomikrografi için Şekil 19.62a'ya bakınız. Kök nodüllerinin fotoğrafları için bakınız Şekil 19.58 ve 19.60. Bacteroid halinin oluşumu azot fiksasyonu için bir önkoşuldur.
Tutunma ve Enfeksiyon Legüm bitkilerin kökleri, rizosfer mikroflorasının büyümesini teşvik eden organik maddeler salgılar. Bu teşvik sadece rhizobia ile sınırlı değildir aynı zamanda birçok tip rizosfer bakterisi ile de teşvik edilebilir. Eğer toprakta rhizobia varsa bunlar rizosferde gelişirler ve yüksek popülasyon seviyelerine ulaşırlar. Legüm-Rhizobium birlikteliğinde bakterinin bitkiye tutunması, nodul oluşumunda ilk adımdır (Şekil 19.61). Rhicadhesin olarak bilinen özel bir adhezyon proteini; Rhizobium ve Bradyrhizobium türlerinin yüzeylerinde bulunur. Rhicadhesin kalsiyum bağlayan bir protendir ve
19 22 • Kök Nödül Bakterileri ve Bahlagil Bitkileri ile Simbiyoz • 663
kök saçaklarının yüzeyinde kalsiyum komplekslerine bağlanarak iş görebilir. Lectinler olarak bilinen karbonhidrat-içeren proteinler ve bitki hücre membranında spesifik reseptörler gibi diğer maddeler de, bitki-bakteri tutunmasında rol oynarlar. Rhizobial hücrelerin kök saçaklarına ilk girişi kök saç uçlarından olur. Bağlanmayı takiben, kök saçakları; nod faktörleri (daha sonraki konuya balanız) olarak bilinen bakteri tarafından çıkarılmış maddelerin etkisinin sonucu olarak kıvrılır. Kıvrılmayı takiben bakteriler kök saçaklarına girer ve kök saçlarının aşağısına yayılabilen, hastalık kanalı olarak bilinen bitki tarafından bir selülozik tüpün oluşumunu teşvik eder (tfft Şekil 19.62a). Kök saçaklarına kaynaşmış olan kök hücreleri sonradan rhizobia ile enfekte edilir ve nod faktörleri bitki hücre bölünmesini teşvik eder. Sürekli bitki hücresi bölünmesi nodul oluşumuna sebep olur (Şekil 19.62» ve 19.63» ayrıca bakınız Şekil 19.58 ve 19.60). Bakteroidler
Rhizobia bitki hücrelerinin içinde hızla çoğalır ve bakteroidler olarak bilinen, şişmiş, dallanmış ve şekilsiz bir yapıya dönüşür. Bakteroidler teker teker yada küçük gruplar halinde simbiozom denen yapıları oluşturmak için bitki hücre zarının bir parçasıyla çevrilir (bakınız Şekil 19.67). Simbiyozom'un oluşumundan hemen sonra azot fiksasyonu başlar, (azot fikse eden nodüller, asetileni etilene indirgenmesiyle edilebilir co^Kısım 17.28 ve Şekil 17.71). Bitki öldüğünde nodulun kötüye gidişi başlar ve bakteriler toprağa salınır. Bakteroidler bölünemezler. Fakat daima az sayıda uyku halinde, çubuk-şekilli rhizobial hücreler no-
dülde daima bulunmaktadır. Bunlar besini azalmış nodülde kalan ürünlerin bazılarını nutrient olarak kullanırlar. Daha sonra, bakteriler diğer köklerde hastalığı başlatabilir ya da toprakta serbest yaşamformunu devam ettirebilir. Nodul Oluşumu: Nod Genleri, Nod Proteinleri ve Nod Faktörleri Özel bir rhizobial strain aracılığıyla, legümün nodülleşmesinde önemli adımları yöneten genler; nod genleri olarak isimlendirilir (Şekil 19.64»). Farklı rhizobia türlerinden elde edilen birçok nod geni; yüksek derecede korunurlar ve sym plazmitleri (symbiosis için) olarak bilinen büyük plazmitlerde bulunurlar. Özel nodülleşme olaylarını yöneten nod genlerine ek olarak, sym plazmitleri kendine özel genleri içerirler; bunlar özel bir rhizobia türünü tek evsahibi olan bitkiyle sınırlandırır. Gerçekten, çapraz-aşılama grubunun spesifikliği (tablo 19.8), sym plazmitini basitçe transfer ederek rhizobia türleri çapraz olarak aktarılabilir. Rhizobium leguminosarum biovar viciae'nin Sym
plazmit'inde; nod genleri, azot fiksasyonu için nif genleri denen iki gen kümesinin, arasına yerleşmiştir (Şekil 19.64). Bu türde 10 nod geni tanılanmıştır. nod ABC genleri nod faktörleri olarak bilinen oligosakkaritlerin üretiminden sorumludurlar. Bu nod faktörleri kök saçlarının kıvrılmasına ve bitki hücre bölünmesini başlamasına ve nihayetinde nodul oluşumuna giden sürece neden olur (Şekil 19.62). Nod faktörleri çeşitli substituentlerin bağlandığı bir N-asetilglukozamin omurgasından ibarettir. (Şekil 19.65»). Konukçu spesifikliği verilen bir Rhizobium türüyle üretilen, nod faktör'ün tam ya• Şekil-19.62 Enfeksiyon iplikçiği ve kök nodüllerinin oluşumu, (a) Beyaz yoncanın (Trifolium repens) bir kök saçağında olşmuş Rhizobium leguminosarum biovar trifolii hücreleri tarafından oluşmuş bir enfeksiyon iplikçiği. Enfeksiyon iplikçiği içinde kök hücrelerine doğru hareket ettiği selülozik bir tüpten ibarettir, (b-d) Sinorhizobium meliloti hücreleri ile enfekte olan kaba yonca köklerinden elde edilen nodüller gelişimin farklı safhalarda görülmektedir. R. leguminosarum biovar trifolii ve Sinorhizobium meliloti'ian her ikisinin hücreleri yaklaşık 2 ^jm uzunluğundadır. Enfeksiyondan itibaren nodul oluşumuna kadar nodülleşme sürecindeki süre hem soyafasülyesinde hem de kaba yonca da yaklaşık bir aydır. Fotoğraf b-d Nature 35J:670-673'den alman izinle basılmıştır.
664 • Bölüm 19 • Mikrobiyal Ekoloji Ac CH 2 O HNAcy OH
OH
OH
(a) •t VV>*
-C -
•
-
Tür
• Şekil 19.63 Bir legüm kök nodulunun enine kesiti. Bir yer altı yonca nodulunun tekbir bakteri ile dolu hücresi içindeki ince bir kışımın elektron mikrografı. Rhizobium leguminosarum biovar trifolii yaklaşık 2 |jm uzunluğundadır.
Rı 2
Sinorhizobium meliloti
C16 : 2 o r C16:3
so 4 -
Rhizobium leguminosarum biovar viciae
C18: 1 or C18:4
Hor Ac
(b)
pısıyla saptanır. Bu yüzden universal olan ve nod omurgasını sentezleyen gen ürünleri olan nod ABC genlerine ilaveten Rhizobium'un her bir türü ilave nod genleri içerir. Bu genler, türe-özgü nod faktörlerini oluşturmak için temel nod faktörü omurgası üzerinde kimyasal değişiklikleri oluşturan proteinleri kodlar. Rhizobium leguminosarum biover viciae'de NodD
geni, diğer nod genlerinin transkripsiyonunu kontrol eden regülatör bir proten olan NodD'yi kodlar (Şekil 19.64). Nod F, nod faktörü açillendiren Nod A tarafından kullanılan spesifik bir acil taşıyıcı proteini kodlar (Şekil 19.65b). NodE ve NodL konukçu çeşitliliğine (çapraz-aşılama grupları) karışırlar, NodMnod faktörünün sentezinde iş gören bir glukozamin sentazdır, ve Nodl ve NodJ bakteriyal hücrelerden nod faktörlerini götürmede iş gören membran proteinleridir. NodD nod yapısal gen operonlarınm yukarısındaki DNA'ya bağlanır, ve inducer moleküllerle ilişki sonrasında transkripsiyonu ilerletir; Bu yüzden Nod D bir çeşit pozitif düzenleyici bir proteindir. (Ö°B Kısım 8.6) Anahtar inducerlar yaygın bitki ürünleri olan organik moleküller, bitki flavonoid-
• Şekil 19.65 Nod faktörleri, (a) Sinorhizobium meliloti ve Rhizobium leguminosarum biovar viciae tarafından üretilen nod faktörünün genel yapısı ve (b) Her bir türün kesin nod faktörünü ifade eden bir yapısal farklılıklar (Rv R2) tablosu. Merkezi heksoz birimi üç kereye kadar tekrarlanabilir. C16:2,iki çift bağlı palmitik asit; C16:3, üç çift bağlı palmitik asit; C18:1, tek çift bağlı oleik asit; C 18:4, dört çift bağlı oleik asit; Ac, Asetil.
leridir (Şekil 19.66a»). İlginçtir ki, R. Leguminosarum biovar viciae'de (Şekil 19.66a).nodD inducerla-
rına yapısal açıdan çok yakın akraba olan bir kısım flavonoidler diğer rhizobial türlerde bulunan nod genlerinin indüksiyonunu inhibe etmede iş görür (Şekil 19.66b). Bu, Rhizobium-legum ortak yaşamında bakteri ve bitki arasında gözlenen spesifiklik, özel bir bitki tarafından salgılanan flavonoidlerin kimyasal doğasında yattığını gösterir.
İnducer Inhibitor
H
• Şekil 19.64 Nod genleri. Bezelyeyi nodülleştiren tür olan Rhizobium leguminosarum biovar viciae 'nin Sym plazmiti üzerinde nod gen kümesinin organizasyonu. NodD'nin ürünü diğer nod genlerinin transkripsiyonunu kontrol eder. nod paketleri kırmızı ile işaretlenmiştir ve oklar nod genlerinin transkripsiyon yönünü belirtir, /IJ/ etiketli genler azot fiksasyonu için gerekli genleri kodlamaktadır (<3Oö Kısım 17.28).
5, 7, 3', 4'-Tetrahydroxyflavone
5, 7, 4'-Trihydroxyisoflavone
(a)
(b)
• Şekil 19.66 Bitki flavonidleri ve nodülleşme. Bir flavo nid molekülünün yapısı. Bu molekül (a) nod gen ifadesinin bir inducen ve (b) Bezelyeyi nodülleştiren Rhizobium leguminosarum biovar n'cj'ae'da nod geninin bir inhibitörüdür. Her iki molekülün yapısındaki benzerliklerine dikkat ediniz, (a)'da görülen yapının genel adı Juteotoı'dir ve ve bu yapı bir flavo türevidir, (b)'deki yapı genistein olarak isimlendirilir ve bu yapı da bir izoflavon türevidir.
19 22 • Kök Nodul Bakterileri ve Legüm Bitkileri ile Ortak Yaşam • 665
Nodülde Azot Fiksasyonunun Biokimyasi Kısım 17.28'de tartışıldığı gibi, azot fiksasyonu; demir ve molibden içeren büyük iki kısımlı bir protein olan nitrojenaz enzimi gerekir. Kök nodüllerindeki nitrojenaz serbest yaşayan N7 fikse eden bakterilerden elde edilen enzime, O2 duyarlılığı asetileni indirgeyebilme kabiliyeti gibi, benzer karakterler taşır. (c«s Şekil 17.71). Nitrojenaz kendi bakteroidler içerisine yerleşmiş olup bitki sitoplazması içerisine salınmazlar. Bakterioidler, N 2 fiksasyonu için gerekli enerji kaynağı bakımından bitkiye bağımlıdırlar. Simbiosom membranından geçen bakteroide özgü olan temel organik birleşikler succinate, malate ve fumarate gibi C4 organik asitlerinin olduğu sitrik asit çevrimindeki ara ürünlerdir (Şekil 19.67»). Bunlar ATP üretimi için elektron verici olarak ve pirüvata dönüşümünün ardından N2'nin indirgenmesi için elektronların son kaynağı olarak kullanılır (c«s Şekil 17.71).
Fotosentez \
Şekerler \
Bitki sitoplazması
Organik asitler Simbiyozom zarı
Bacteroid Sitrik asit döngüsü
O
'Elektronlar
Süksinat 2 ' -Malat 2 " Fumarat2"
Piruvar
N2'nin birleşiminin ilk kararlı ürünü amonyaktır ve nodul köklerinde amonyağın organik azot birleşiklerine özümsenmesi, özellikle bitki tarafından gerçeekleştirilir. Bakterioidlerin, organik yapı içerisine bir miktar amonyak özümsenmesine karşın bakterioidlerdeki amonyak özümseme enzimlerinin miktarı çok düşüktür. Buna rağmen; amonyak-özümseyen glutamine sentetaz («»s Şekil 5.27b) enzimi bitki hücresinin sitoplazmasında yüksek miktarlarda bulunur. Bundan dolayı bakteroidden bitki hücresine taşınan amonyak, bitkideki glutamin ve asparijin amino asitleri olarak bitki tarafından özümsenebilir (bakınız Şekil 19.67). Gövdeyi Nodülleştiren Rhizobiyumlar Bir çok legüm bitkisi köklerinde azot-fikse eden nodüller oluşturmasına rağmen, bir kaç legüm çeşidinin gövdelerinde nodüller oluşur. Gövdesinodülleşmiş legüm bitkileri, biyolojik aktivitenin çokluğundan dolayı azot-eksik toprakların bulunduğu tropikal bölgede çok yaygındır. Buradaki temel deneysel sistem, Azorhizobium caulinodans bakterisi etkisiyle nodülleşen ve tropikal bir legüm olan Sesbaina olmuştur (Şekil 19.68»). Gövde nodülleri doğal olarak gövdenin suya batan kısımlarında yada su seviyesinin hemen üzerinde kalan kısımlarında olur (Şekil 19.68). Sesbaina'da gövde nodüllerinin oluşumundaki olayların genel görünümü oldukça fazla kök nodüllerininkine benzer. Bir enfeksiyon iplikçiği oluşur, ve bakteroid oluşumu sonrasında N2-fiksasyonu safhasına geçilir. İlginçtir, bir kaç gövde nodülleştirici rhizobia, bakterioklorofil a'yı üretir ve bu yüzden anoksijenik fotosentezi gerçekleştirme potansiyeline sahip olur (ooo Kısım 17.4). Photorhizobium cinsinde gruplanmış olan bakterioklorofil-içeren rhizobia doğada yaygındır özelliklede tropik legümlerle ilişki halinde bulunurlar. Bu türlerde, ışık en azın-
Amino asitler Nitrojenaz
Elektron transport zinciri
O 2 + Lb Lb = Leghemoglobin O 2 -Lb
Glutamin Asparajin
- Bitkiye
• Şekil 19.67 Kök nodul bakteroidi. Bakte-roid'de gerçekleşen ana metabolik reaksiyonlar ve besin değişimlerinin şematik diyagramı. Simbiyozom bitkiden orijinlenen tek bir membranla çevrilmiş bakteroidlerin bir toplamıdır.
• Şekil 19.68 Gövdeyi nodülleştirilen azorhizobium tarafından gövde nodülleri. Fotoğraf tropikal legüm Sesbania rostrata'ıun gövdesini göstermektedir. Gövdenin sol tarafında aşılanmamış bölgelerdir, sağ benzer bölgelerde gövdenodülleştiren rizobia ile aşılanmıştır.
666 • Bölüm 19 • Mikrobiyal Ekoloji
dan azot fiksasyonu işleminde enerji-ihtiyacınm parçası olarak kullanılır. Legüm Dışı Bitkilerle Azot Fiske Eden Ortak Yaşamlar: Azolla-Anabaena ve Frankia
Rhizobianm dışındaki mikroorganizmaların karıştığı azot fikse eden ortak yaşamlar, legüm olmayan bitkilerinde oluşur. Örneğin, azot-fikse eden siyanobakteriler birkaç bitki çeşidiyle ortak yaşama girer. Eğrelti otu, Azolla bitkilerin yapraklarında küçük porların içerisinde Anabaea azollae olarak bilinen, heterokist bulunduran N2-fikse eden siyano bakterilerin bir türünü içerir (Şekil 19.69»). Azolla fikse edilmiş azotla pirinç tarlalarını zenginleştirmek için yüzyıllardır kullanılmaktadır. Pirinç ekilme işleminden önce, çiftçi, çeltik tarlasındaki pirinç yüzeyinin Azolla ile kaplı olmasına izin verir. Pirinç bitkileri yetişirken nihayetinde pirinç bitkileri Azolla 'yi baskılar ve bu da eğrelti otlarının ölümüne ve pirinç bitkisi tarafından özümsenecek olan eğrelti azotu salınmasına neden olur. Her üretim sezonu bu işlemin tekrarıyla, çiftçi azot gübrelemesine ihtiyaç olmaksızın verimli bir pirinç ürünü alabilir. Alder ağacı (cins Alnus), Frankia olarak bilinen filamentli, streptomycete-benzeri, azot-fikse eden bir organizmayı barındıran azot-fikse eden kök nodüllerine sahiptir (Şekil 19.70a»). Hücre ekstraktlarında çalışıldığında Frankia'nm nitrojenazı, Azotobacter (<3Q& Kısım 12.9) hücrelerindeki nitrojenaz gibi moleküler oksijene duyarlı olmasına rağmen, Frankia hücreleri yüksek oksijen stresinde N 2 fikse ederler. Bu, Frankia'nm vezikül denen hücreler üzerinde terminal şişkinliklerinde yerleşerek nitrojenazı korumasından dolayıdır (Şekil 19.70b).
(b)
• Şekil 19.69 Azolla-Anabaena ortaklığı, (a) Azolla pinnata'mn tek bir bitkiyi gösteren tam ilişki. Bitkinin çapı yaklaşık 1 cm'dir. (b) A. pinnata'nın parçalanmış yapraklarında gözlendiği gibi Siyanobakteriyal ortak Anabaena azollae. Anabaena azollae'nm tek hücresi yaklaşık 5 jjm genişliğindedir. Oval-şekilli heterosistlerin (daha parlak renkte) siyanobakterinin azot fiksasyonu bölgesi olduğuna dikkat ediniz. Heterosistler konusu için Kısım 12.25 ve Şekil 12.80'e bakınız.
• Şekil 19.70 Frankia ve Frankia hücreleri, (a) Kızıl ağaç Alnus glutinosa'ıan. kök nodülleri. (b) Comptonia peregrina'mn nodüllerinden saflaştınlmış Frankia kültürleri. Hif filamentlerinin ucundaki veziküllere (küre şekilli yapılar) dikkat ediniz.
Bu veziküller oksijen difüzyonunu engelleyen kaim duvar içerir. Böylelikle, vezikül içinde uygun seviyelerde O2 miktarı ile nitrojenaz aktivitesi sürdürülür. Bu kapsamda, N 2 fiksasyonunu (bakınız Şekil 19.69b; ö<=t> Kısım 12.25 ve Şekil 12.80) yerleşik bölgeleri bakımından Frankia vezikülleri bazı filamentöz siyanobakterilerce üretilmiş olan heterosistlere benzerler. Alder besin-fakir topraklarda çıplak toprak alanlarda kolonize olabilen karakteristik bir öncü ağaçtır. Onun bu yeteneği muhtemelen simbiyotik azot fiske eden Frankia ilişkisinden dolayıdır. Birkaç diğer küçük odunsu bitkide Frankia tarafından nodülleştirilmektedir. Rhizobium-legüm ilişkisinden farklı olarak, tek bir Frankia starini birkaç farklı bitki türünde nodul oluşturabilir. Ancak bu kapsamda Frankia /kök nodülü birlikteliğinin spesifikliği daha azdır. H M J K 19.22 Kavramların Gözden Geçirilmesi En yaygın ve önemli bitki-mikrop işbirliklerinden birisi legümlerle belli azot-fikse eden bakteriler arasında olandır. Bakteriler azot-fiksasyonu sürecinin gerçekleştiği kök nodüllerinin oluşumunu teşvik eder. Bitki kök nodul bakterilerinin ihtiyaç duyduğu enerjiyi sağlar bakteri ise bitkinin büyümesi için fiske edilmiş azotu sağlar. Birçok önemli ürün bitkisi legüm olduğu için legüm kök nodul bakterileri önemli bir tarımsal rol oynarlar. Diğer azot fiksasyonu ortak yaşamları eğrelti otu, Azolla ve nodul oluşturan Frankia'yı içerir.
19 22 • Değerlendirme Sorulan • 667
•
Legüm bitki üzerinde nod faktörleri nasıl etki yapar?
•
Leghemoglobin nedir ve fonksiyonu nasıldır?
•
Bacteroid nedir ve onun içinde ne gerçekleşir?
•
Rhizobium ve Frankia arasında temel benzerlikler ve farklılıklar nedir?
DEĞERLENDİRME SORULARI 1. Mikroorganizmaların, habitatlarmda yaşamak için ihtiyaç duydukları kaynaklar ve koşullardan birkaçını listeleyiniz ( ö " ^ Kısım 19.1 ve 19.2) 2. Niçin zorunlu anaerobik ve zorunlu aerobik bakterilerin aynı toprak örneğinden izole edilebileceğini açıkla3 yınız (ö" » Kısım 19.2) 3. Akan bir derenin içindeki bir kayanın yüzeyi sık şekilde bir biyofilm içerir. Akan bir derede büyümeyle kıyaslandığında biyofilm üzerindeki büyüme bakteriye ne gibi avantaj kazandırabilir («S^s Kısım 19.3)? 4. Biyofilmler enfeksiyoz hastalıkların tedavisini nasıl güçleştirebilirler (<£**> Kısım 19.3)? 5. Hangi toprak katmanında mikrobiyal sayı ve aktivitesi en yüksektir ve neden (c**s Kısım 19.4)? 6. Lağım gibi bir organik maddenin girişi nasıl ve ne şekilde bir nehir veya derenin oksijen içeriğini etkiler (£öo Kısım 19.5)? 7. Bakteriorodopsinin fonksiyonel anoloğu olarak proteorodopsin düşünüldüğünde, bu molekülün açık okyanuslar gibi organik maddenin çok az olduğu çevrede bir hücre yaşamına nasıl yarar sağlayabileceğini açıklayınız (c 8 3 ^ Kısım 19.6). 8. Barofilik ve barotolerant bakteriler arasındaki farklılık nedir? Bu iki grup ve ekstrem barofiller arasındaki farklılık nedir? Hangi özellikler barotolerant, barofil ve ekstrem barofil bakterileri benzer yapar (£3°^ Kısım 19.7)? 9. Hidrotermal bacalardan elde edilen hangi deliller prokaryotlarm ekstrem yüksek sıcaklıklarda büyüdüğü fikrini desteklemektedir (C*^ Kısım 19.8)? 10. Niçin oksijen ve karbon döngülerinin birbirine bağlı olduğu söylenebilir? (C^> Kısım 19.9)? 11. Syntrophobacter ve Syntrophomonas gibi organizmalar metabolizmaları termodinamik olarak tercih edilmeyen reaksiyonlar temeline dayalı olduğunda nasıl büyüyebilmektedirler? Bu organizmalar laboratuvar kültüründe nasıl büyümektedirler (C^ö Kısım 19.10)? 12. Bir rumen nedir ve geviş getiren hayvanların sidirim borusunda sindirim işlemi nasıl gerçekleşmektedir? Bir rumen sisteminin ana yararları ve dezavantajları nedir? Bir çekal hayvanla bir geviş getiren hayvanla nasıl kıyaslanır (c&& Kısım 19.11)? 13. Her bir süreçte tercih ettiği çevresel koşullar ve her bir süreçle berarber olan nutrient elde edilebilirliği ile ilgili organizmalar yönünde nirrifikasyon ve denitirifikasyon süreçlerini kıyasla ve karşılaştır (cs-Ss Kısım 19.12)? 14. Metanojenez tatlısularda baskın iken, niçin sülfat indirgenmesi deniz çevrelerinde temel anaerobik solunum şeklidir? Deniz çevresinde hiç metanojenez gerçekleşir mi? Eğer öyleyse, nasıl (<**$ Kısım 19.13)?
15. Hangi organizmalar anoksik şekilde kükürt bileşiklerinin döngüsüne katılırlar? Eğer kükürt kemolitotrofları hiç yayılmamış olsaydı, kükürt bileşiklerinin mikrobiyal döngüsünde bir problem olurmuydu? Hangi organik kükürt bileşikleri doğada dikkat çeker (c^ö Kısım 19.13)? 16. Niçin demir-oksitleyen kemolitotroflar obligat aerobturlar, ve niçin birçok demir oksitleyen bakteri asidofiliktir (£°o Kısım 19.14)? 17. Spontan kimyasal reaksiyonların bir kömür madeni damarını nasıl asitleştirebildiğini ve bundan sonra Acidithiobacillus ferrooxidans'm asit üretimini nasıl devam ettirdiğini açıklayınız (<**a Kısım 19.14)? 18. Acidithiobacillus ferrooxidans'm bakır madeni cevherlerinde yararı nasıldır? Bakır madeni cevherlerinin dolaylı oksidasyonunda hangi önemli basamak A. ferrooxidans tarafından gerçekleştirilir? Liçing ile üretilen bakır solüsyonlarından bakır nasıl geri kazanılır ( ö 8 ^ Kısım 19.15)? 19. Civa mer sistemi tarafından nasıl detoksifiye edilir («**» Kısım 19.16)? 20. Hangi fiziksel ve kimyasal koşullar sucul çevrelerde yağın hızlı mikrobiyal parçalanması için gereklidir? Petrol oksidasyonu sürecinde optimize edilmiş koşulları test etmek için bir deneme dizayn et (ö°£> Kısım 19.17)? 21. Ksenobiyotik bileşik nedir ve niçin mikroorganizmalar onlar katabolize etmede zorluklara sahiptir (<-*%s Kısım 19.18)? 22. Çevresel kirlilik problemlerini çözmede indirgeyici deklorinatörler nasıl yarar sağlarlar (Kısım 19.18)? 23. Mikoriza ağaçların büyümesini nasıl geliştirebilir (ö^â Kısım 19.20)? 24. Ti plazmiti üzerinde hangi genetik bilgi bulunur? Tümör oluşumunu etkilemeyen hangi gen(ler) Ti plazmitinden çıkabilir («»ö Kısım 19.21)? 25. Agrobacterium tarafından bir bitki tümörü üretimi ile bir Rhizobium türü tarafından bir kök nodülü üretimini karşılaştırınız ve kıyaslayınız. Hangi durumda bu yapılar benzerdir? Hangi durumda farklıdırlar? Her iki yapının oluşmasında plazmitleririn katkısı nedir (£OQ Kısım 19.21 ve 19.22)? 26. Bir kök nodülü üzerinde kök nodüllerinin gelişim basamaklarını tanımlayınız. Bitki ve bakteri arasındaki tanımanın doğası nasıldır ve nod faktörleri bunu kontrol edilmesinde nasıl yardımcı olur? Bunu Agrobacteriumbitki sistemindeki tanınmayla nasıl kıyaslanır Kısım 19.22)?
668 • Bölüm 19 • Mikrobiyal Ekoloji
UYGULAMA SORULARI Bir hidrotermal ağız ekosistemi bulunan bir göl ekosistemini kıyasla ve karşılaştır. Her bir ekosisteme enerji nasıl girmektedir? Her bir ekosistemde primer üretimin temeli nedir? Organizmaların hangi besinsel sınıfları ekosistemde bulunmaktadır ve onlar kendilerini nasıl beslerler?
4.
5.
Yüksek miktarda amonyum ve fosfat ancak çok az miktarda organik karbon içeren lağım salan bir lağım tesisini göz önüne getir. Bu lağımla hangi tipte organizmaların büyümesi artış gösterir? Deşarj noktasının önündeki ve arkasındaki oksijen profili şekil 19a'da gösterilenden nasıl farklılaşır? 3.
Şekil 19.13'teki veriye bakınız. Açık okyanus sularının oldukça yüksek derecede oksik olduğunu aklıda tutuunz ve açık okyanus Archaea ve Bacteria'sının olabilcek metabolik yaşam biçimlerini tahmin ediniz.
6.
14
C-etiketli selüloz az miktarda bir lağım çamuru bir tüpe katılır ve anoksik koşullar altında tüpün kapağı 14 kapatılır. Birkaç saat sonra tüpte CH 4 oluşur. Böyle bir sonucun nasıl meydana geldiğini tartışınız. Beslenmesinde sadece ot tüketen yeni bir hayvan keşfedildiğini göz önüne getir. Onun geviş getiren bir hayvan olduğuna dair senin şüphen var ve anotimik bir gözlem için bir o hayvandan bir örnek elde edebilirsin. Eğer hayvan geviş getiren bir hayvansa, arayıp bulmayı ümit ettiğin herhangi bir mikroorganizma ve cismin sindirim orgamndaki pozisyonunu ve temel komponentlerini tanımlayınız. Asitli Maden Drenajı kimyasal ve biyolojik bir proses parçasıdır. Asitli Maden Drenajına götüren kimya ve mikrobiyolojiyi tartış ve biyolojik olan anahtar reaksiyon(lar)ı belirtiniz.
