Histotechnik. Praxislehrbuch für die Biomedizinische Analytik

W

Gudrun Lang

Histotechnik Praxislehrbuch für die Biomedizinische Analytik

SpringerWienNewYork

Gudrun Lang Biomedizinische Analytikerin, Linz, Österreich

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ISBN-10 3-211-33141-7 Springer Wien New York ISBN-13 978-3-211-33141-5 Springer Wien New York

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Geleitwort Diagnosen, die auf Basis histologischer Präparate erstellt werden, besitzen den höchsten Sicherheitsgrad und die größte Aussagekraft gegenüber allen sonstigen diagnostischen Untersuchungen am Patienten. Außerdem haben sie einen weiteren, nicht zu unterschätzenden Vorteil, nämlich den der niedrigen Kosten. Wie gelangt man eigentlich zu einem guten oder – besser gesagt – schönen, histologischen Schnitt, Ziel und Wunschtraum eines jeden Pathologen? Die Verarbeitung eines Präparates beginnt bekanntlich bereits bei seiner Entnahme. Wie kann falsche Behandlung, die zu Schäden am Präparat führt, bereits bei der Entnahme vermieden werden? Schließlich kann die beste histologische Technik eine einmal eingetretene Veränderung nicht mehr wettmachen. Diese und viele weitere Fragen beantwortet dieses Buch. Beste technische Verarbeitung stellt nicht nur die Grundlage für einen qualitativ hochwertigen Befund dar, sondern ist unabdingbar für alle weiterführenden Untersuchungen wie Immunhistochemie und PCR. Seit längerer Zeit ist zu diesem Thema im deutschen Sprachraum keine so umfassende Publikation erschienen. Daher wird dieses Buch nicht nur den Biomedizinischen AnalytikerInnen in Ausbildung und bei der täglichen Laborarbeit eine wertvolle Stütze sein, sondern sollte auch allen angehenden PathologInnen helfen, sich mit der Technik der Aufarbeitung von Gewebe auseinander zu setzen. Nur wer die beste technische Qualität kennt und weiß, wie man sie erreichen kann, ist im Stande unzureichendes Material zurückzuweisen und damit Fehler zu vermeiden.

Univ. Doz. Dr. Gerhard Syré

Linz, Februar 2006

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Vorwort Das histologische Labor löst bei Vertretern unserer Berufsgruppe sehr unterschiedliche Reaktionen aus. Die eine Hälfte denkt an unangenehme Gerüche, monotone Tätigkeiten und unapettitliche Eindrücke. Die andere Hälfte denkt an einen sehr abwechslungsreichen Tagesablauf, an handwerkliches Geschick, an Teamwork und verantwortungsvolles Arbeiten. Als langjährige „Histotechnikerin“ teile ich die Begeisterung für diesen Bereich der Laboratoriumsmedizin und halte ihn für anspruchsvoll, auch wenn die Biomed. AnalytikerIn hier nicht selbst befundet. Die histologische Technik ist Grundlage für die Erstellung von pathologischen Befunden aber auch Basis für Forschungsarbeiten und Studien. Erkenntnisse daraus beeinflussen wiederum die Entwicklung neuer Therapieformen. Die Verantwortung den PatientInnen gegenüber ist hoch. Wir sind uns als HistotechnikerInnen bewusst, dass hinter jedem Präparat ein Mensch steht, der ungeduldig auf Antworten wartet. Proben, die uns überantwortet werden, sind Unikate und unwiederbringlich. Im Gegensatz zu bspw. Blutproben kann ein auffälliges Gewebeareal kein zweites Mal exzidiert werden. Wir verarbeiten die Gewebeproben über eine Vielzahl an Arbeitsschritten zu mikroskopierbaren Präparaten. Dabei befolgten wir schon immer Gesetze der Qualitätssicherung, noch bevor sie als solche bezeichnet wurden. Dies geschieht in dem Bewusstsein, dass auch die besten Mediziner aus schlecht verarbeitetem Material nichts mehr ablesen können und so eine Befunderstellung unmöglich wird. So bilden im pathologischen Institut MedizinerInnen und TechnikerInnen ein Team im Dienste des Patienten. Mit diesem Buch möchte ich den umfangreichen theoretischen Hintergrund unserer Tätigkeit beleuchten. Ich habe mich dabei bemüht, vor allem relevante Fakten aus der Sicht der Biomed. AnalytikerIn hier einzubringen. Im Vordergrund stehen die Abläufe im modernen, histodiagnostischen Labor. Vielleicht wird es verwundern, dass es sich hier nicht um ein „Rezeptbuch“ handelt. Der Grund liegt einerseits im Umfang, den genaue Testvorschriften mit entsprechenden Tipps und Tricks einnehmen würden, andererseits darin, dass veröffentlichte Rezepte entweder durch eigene Erfahrung oder durch genaue Quellen legitimiert sein sollten. Aufgrund der Vielzahl an funktionierenden Verarbeitungswegen kann man die eigenen nicht unbedingt als die ultimativ besten darstellen, wenn man die anderen in der Praxis nicht kennt. Ich habe deshalb Rezepte als „Beispiele“ angeführt bzw. nur allgemein beschrieben. Die „Basis“-Kapitel wie Fixierung, Einbettung, Schneide- und Färbetechnik sind recht ausführlich behandelt. Die „modernen“ Methoden wie Zellkultur, in-situ-Hybridisierung, PCR, Microarrays sind eher theoretisch umrissen. Es handelt sich bei diesen Bereichen um Spezialgebiete, die aus der Routine ausgelagert sind oder erst seit kurzem ihren Weg hinein finden. Für einen Einblick in die Farbenvielfalt der Histologie empfehle ich das Internet als leicht zugängliche Quelle. Eine Auswahl von interessanten Links mit Gewebebildern, Beschreibungen und Online-Protokollen habe ich im Anhang zusammengestellt. Ansprechen möchte ich mit diesem Buch Mitarbeiter im histologischen Labor, die die theoretischen Grundlagen ihrer Arbeit nicht außer Acht lassen wollen. Allen, die neugierig sind, möchte ich den Zugang etwas erleichtern. Es ist mir wichtig, dass sich un-

VIII

Vorwort

sere Berufsgruppe als Träger des histotechnischen Wissens sieht. Und ich denke, dass dieses Buch für Studenten der Laboratoriumstechnik als praktische Lernunterlage dienen kann. Mein Dank geht vor allem an meine Familie, die meine ungeteilte Aufmerksamkeit doch für längere Zeit entbehren musste. Ich bedanke mich auch bei Fr. Kreuzberger für das Korrekturlesen, bei Fr. Fliesser für ihre Unterstützung bei der EM-Technik, und bei Hrn. Univ. Dozent Syré für seine einleitenden Worte. Bei allen Firmen bedanke ich mich für das freundliche Bereitstellen der Geräteabbildungen. Außerdem danke ich all jenen, die mir zeigten, wie wichtig eine selbstständige Fortbildung, das berufliche Selbstbewusstsein und der Mut zur Umsetzung einer Idee sind. Gudrun Lang

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Inhaltsverzeichnis Aufgaben der histologischen Technik / Pathologie ................................................1 Ablauf in einem modernen, histodiagnostischen Labor .........................................3 Biochemie...............................................................................................................6 Untersuchungsmaterial .........................................................................................27 Fixierung ...............................................................................................................39 Verarbeitung von hartem Gewebe .......................................................................66 Makroskopische Begutachtung – Vom Fläschchen in die Kassette .....................82 Einbettungsprozess (Tissue processing) ..............................................................86 Mikrotomie .........................................................................................................123 Histologische Färbung........................................................................................159 Enzymhistochemie ..............................................................................................237 Immunhistochemie .............................................................................................257 In Situ Hybridisierung .........................................................................................295 Zellkultur .............................................................................................................319 Mikrowellentechnik .............................................................................................333 Mikroskopie ........................................................................................................344 Qualitätssicherung im Labor ...............................................................................354 Sicherheit im histologischen Labor .....................................................................371 Geschichte der histologischen Technik ..............................................................406 Abkürzungen ......................................................................................................411 Quellen ...............................................................................................................414 Bildnachweis .......................................................................................................422 Sachverzeichnis...................................................................................................423 Die Unterverzeichnisse finden sich bei den einzelnen Kapiteln.

Histotechnik

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Aufgaben der histologischen Technik / Pathologie Man könnte sagen: Der Zweck der histologischen Technik liegt darin, die Neugier des Menschen auf sein Inneres zu befriedigen. Die medizinische Forschung versucht schon seit Jahrhunderten, die Geheimnisse des menschlichen Lebens zu ergründen. Mit den Leichenöffnungen im Mittelalter wurde die Anatomie erkundet. Der erste Riesenschritt gelang mit der Erfindung des Mikroskops (1621). Dazu musste man auch Techniken entwickeln, die es möglich machten, Präparate von Zellen und Gewebe herzustellen. Damit wurde der Schritt von der Makroskopie in die Mikroskopie gemacht. Die Techniken wurden immer mehr verbessert und die darstellbaren Strukturen immer kleiner. Die Elektronenmikroskopie brachte uns in die Zelle hinein. Und die Molekularbiologie zeigt uns die Welt der Erbinformation, der menschlichen Codierung. Wer weiß, wie der nächste Schritt aussieht? Der Pathologe ist jener Mediziner, der die krankhaften Veränderungen im menschlichen Organismus untersucht. Er möchte herausfinden, wie diese Veränderungen aussehen und wodurch sie ausgelöst werden. Je nachdem, wie sich die Veränderung darstellt, wird er sie einer Erkrankung zuordnen können. Er liefert dem Kliniker Informationen, die für die Diagnose, Therapie und Prognose des Patienten ausschlaggebend sind. Als Untersuchungsmaterialien dienen dem Pathologen einerseits gewonnene Zellen (Zytologie) oder Gewebe (Histologie). Früher lag die Hauptaufgabe des Pathologen in der Leichenbeschau (Obduktion) zur Feststellung der Todesursache und Erforschung des Krankheitsverlaufs. Dieser Teil wird zu Gunsten der morphologisch-mikroskopischen Untersuchung von bioptischem Material zurückgedrängt. Als moderne Gebiete in der Pathodiagnostik kommen die Techniken der Zell- und Gewebekulturen, Immunologie, Molekularbiologie und Gentechnik dazu. Aufgaben der Obduktion: •

Überprüfung der klinischen Diagnose und der Therapieeffekte

•

Aussagen über Entstehung und Verlauf von Krankheiten

•

Abklärung der Folgezustände von Krankheiten

•

Erfassung der Todesursachen

•

Grundlagen für Statistiken über Krankheiten und Todesursachen

•

Erkennung von Erbkrankheiten (Familienplanung)

•

Ausbildung von Medizinern

•

Gerichtsmedizinische Erkenntnisse

•

Forschung

Aufgaben der morphologischen Untersuchungen: •

Instrument der Vorsorgeuntersuchung (z.B. Portioabstrich)

•

Sicherung der klinischen Diagnose

•

Frühdiagnose von Tumoren (z.B. Magenbiopsien)

•

Differenzierung von gut- und bösartigen Tumoren

2

Aufgaben der histologischen Technik

•

Erkennen von Stoffwechselerkrankungen, parasitären, bakteriellen, entzündlichen Erkrankungen

•

Nachweis von immunpathologischen Vorgängen

•

Informationen zur Therapiewahl

•

intraoperatives Instrument zur Diagnosesicherung (Schnellschnittuntersuchung)

•

Forschung

Aufgaben der molekularbiologischen Methoden in der Histotechnik: •

Nachweis von Erbkrankheiten (in-situ-Hybridisierung, Gen-Array)

•

Untersuchung von Wirkstoffen (genomspezifische Wirksamkeit von Medikamenten)

•

Darstellung von viralen Erregern (Human Papilloma Virus)

•

allgemein Darstellung von Genen

•

Forensik

•

Forschung

Aufgaben der Elektronenmikroskopie: •

allgemein Darstellung von Ultrastrukturen

•

Nachweis von Viren

•

bioptische Diagnostik von Niere, Leber und Muskel

•

Forschung

Aufgaben von Zell- und Gewebekulturen: •

Nachweis von Viren

•

Herstellung von Antikörpern

•

Zytogenetik

•

Nachweis von zellschädigenden Substanzen (Gifte, Strahlung, Onkogene)

•

Überprüfung von Medikamenten

•

tissue engineering (Gewebe- und Organersatz)

•

Forschung

Die unmittelbare Aufgabe der Histotechnik umfasst alle Prozeduren, die notwendig sind, um aus Gewebe mikroskopierbare Präparate zu fertigen. Im weiteren Sinne umfasst die Histotechnik auch die modernen Prozeduren, wo Gewebe in irgendeiner Form aufgearbeitet wird, um daraus Informationen zu gewinnen. Mit der Histotechnik verwandte Methoden findet man auch in der Botanik und in der Werkstoffanalyse.

3

Histotechnik

Ablauf in einem modernen, histodiagnostischen Labor Dieses Buch will anhand des Ablaufs in einem modernen, histodiagnostischen Labor die grundlegenden Prozeduren der Histotechnik beschreiben. Im Weiteren werden noch Spezialtechniken bzw. Spezialgebiete behandelt.

Zur Veranschaulichung wollen wir den Weg einer Appendix verfolgen. (Abb.1)

1.

Unser Patient hat seit mehreren Tagen heftige Unterbauchschmerzen. Er beschließt sich in der chirurgischen Ambulanz untersuchen zu lassen und erfährt die Diagnose „Appendicitis“. Die Operation wird gleich angesetzt. (Abb.2)

2.

Während der Operation wird dem Patienten im endoskopischen Verfahren die Appendix entfernt. Wir erhalten ein Operationspräparat.

Abb.1

3.

Um die Appendix Abb.2 möglichst gut zu erhalten, wird sie sofort in die Fixierlösung gebracht. Das Gewebe wird in einem mit Formalin gefüllten Probengefäß, das mit dem Datenetikett des Patienten beklebt ist, untergetaucht und „fixiert“. (Abb.3)

4.

Der Chirurg füllt einen Begleitschein aus. Darauf findet man die Daten des Patienten und die klinischen Angaben zur Operation.

5.

Gewebeprobe (Appendix) und Begleitschein werden ins Labor gebracht.

Abb.3

6.

In der „Materialannahme“ im pathologischen Institut wird die Probe entgegengenommen. Dabei werden die Angaben auf dem Gefäß und dem Begleitschein überprüft. Die Gewebeprobe bekommt eine Einlaufnummer zur Identifikation. Die zugehörigen Daten werden im EDV-System erfasst.

7.

makroskopische Beurteilung“ Der nächste Schritt ist die „m der Appendix. Der Pathologe beschreibt Aussehen, Form, Größe und Besonderheiten an der Gewebeprobe. Ist die Appendix schon gut durchfixiert, wird sie zurechtgeschnitten. Die aussagekräftigen Teile der Appendix kommen in eine Kunststoffkassette (2,5 x 3 x 0,5 cm), die mit der Identifikationsnummer beschriftet ist. (Abb.4)

Abb.4

4

Ablauf im histodiagnostischen Labor

Abb.5

8.

Gemeinsam mit vielen anderen Kassetten wird die Appendix über Nacht in einem Einbettungsautomat (processing) entwässert und dabei von der Fixierflüssigkeit in ein Paraffinbad übergeführt. (Abb.5)

9.

Am nächsten Morgen werden die Gewebestückchen in einen Paraffinblock ausgegossen (eingeblockt). Man hat nun einen kleinen Paraffinquader, in dem man die Gewebeteile erkennen kann. Dieser Quader ist fest verbunden mit dem gekennzeichneten Unterteil der Kunststoffkassette.

10. Der gekühlte Block kann nun in ein Mikrotom eingespannt werden. Mit diesem Gerät schneidet man mikrometerdünne Schnitte von der Appendix, die man auf Glasobjektträger aufbringt. 11. Diese Schnittpräparate werden mit der üblichen Übersichtsfärbung (Hämatoxylin-Eosin-Färbung) angefärbt. 12. Schließlich hat man ein fertiges histologisches Präparat, das zur mikroskopischen Befundung einem Pathologen vorgelegt wird. (Abb.6) 13. Der Pathologe erstellt einen histologischen Befund. In unserem Fall passt die Morphologie des Präparates mit der Diagnose „akute Appendicitis“ zusammen.

Abb.6

14. Der Befund wird in der Datenverarbeitung erfasst und an die Einsenderabteilung geschickt. Der Chirurg kann nun seinem Patienten die Bestätigung seiner klinischen Diagnose vorlegen. In ein paar Tagen wird dieser das Krankenhaus wieder verlassen können. 15. In der Pathologie werden alle Präparate im Archiv über viele Jahre aufgehoben. Der Befund ist Teil der Patientengeschichte. Der Rest der Appendix wird nach Fertigstellung des Befundes entsorgt. Bei einem komplikationslosen Fall dauert es von der Entnahme des Gewebes bis zum histologischen Präparat ein bis zwei Tage, je nach Größe des Gewebes. Die Befundung des Präparates hängt von der Schwierigkeit des Falles ab, sollte üblicherweise aber auch innerhalb eines Tages erfolgen, sofern keine weiteren, technischen Verarbeitungen notwendig sind. (Hier wurde der Postweg ins Labor und zurück zum Einsender nicht berücksichtigt.) Aus der kleinen Geschichte kann man vier Prozeduren der Histotechnik ableiten: 1. 2. 3. 4.

Fixierung Einbettung (processing) und Ausblocken Schneidetechnik (Mikrotomie) Histologische Färbung

Histotechnik

5

Außerdem kann man erkennen, dass die Qualität der Untersuchung nicht nur vom Labor allein abhängt. Auch die Probengewinnung und -behandlung vor dem Eintreffen im Labor ist Ausschlag gebend und sollte mittels „E Einsenderichtlinien“ festgelegt werden. Im Allgemeinen sollte Qualitätssicherung im Labor groß geschrieben werden (Probenidentifikation, einheitliche Arbeitsvorschriften, Fehlermanagement, etc.). Im modernen Histolabor spielt natürlich auch die elektronische Datenverarbeitung eine immer größer werdende Rolle. Einerseits kann sie in der Textverarbeitung, andererseits in der Datenverwaltung und auch zur Statistik und Befundauswertung eingesetzt werden. Da wir im Histolabor bleibende Präparate herstellen, die man als „Patientendokument“ ansehen kann, werden sie entsprechend den gesetzlichen Vorschriften jahrelang im Archiv aufbewahrt.

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Biochemie

Biochemie A. Aufbau der Zelle................................................................................................7 1. Schematische Darstellung einer Epithelzelle ..............................................7 2. Zellkern (Nukleus) .......................................................................................8 3. Nukleolus....................................................................................................8 4. Cytoplasma.................................................................................................8 5. Endoplasmatisches Reticulum (ER) .............................................................8 6. Ribosomen .................................................................................................9 7. Mitchondrien ..............................................................................................9 8. Lysosome....................................................................................................9 9. Golgi-Apparat ............................................................................................9 10. Zentriol .....................................................................................................10 11. Paraplasma ...............................................................................................10 12. Zellmembran ............................................................................................10 13. Mikrovilli ...................................................................................................10 14. Gewebe ....................................................................................................11 15. Interzellular-Substanz................................................................................11 B. Bausteine.........................................................................................................11 1. Wasser ......................................................................................................11 2. Salze .........................................................................................................12 3. Proteine ....................................................................................................12 4. Kohlenhydrate ..........................................................................................17 5. Lipide........................................................................................................22 6. Nukleinsäuren...........................................................................................25 C. Zusammenfassung...........................................................................................26

7

Histotechnik

Biochemie Um die Vorgänge bei der Fixierung und anderen histotechnischen Prozessen zu verstehen, muss man über die Bestandteile von Gewebe bzw. Zellen und deren biochemischen Eigenschaften Bescheid wissen. Der Inhalt dieses Kapitels wurde großteils dem Roche Lexikon Medizin, 5. Auflage © Urban & Fischer Verlag München entnommen. Für umfangreichere und detailliertere Erklärungen siehe die Lehrbücher von Zytologie, Histologie und Biochemie.

A. Aufbau der Zelle

Abb.7

1.

Schematische Darstellung einer Epithelzelle

Schematische Darstellung einer Epithelzelle mit den wichtigsten Organellen und typischen Oberflächendifferenzierungen. Einige der Zellbestandteile, die im Schnittpräparat zweidimensional erscheinen, sind zum besseren Verständnis dreidimensional und vergrößert herausgezeichnet. 1 Kern mit Hetero- (dunkel) und Euchromatin (heller) sowie Nucleolus; 2 Golgi Apparat; 3 Mikrovilli (mit Glykokalix); 4 Sekretgranulum (mit Exozytose); 5 Zentriolen; 6 Kinozilie; 7 Zonula occludens; 8 terminales Netz mit Zonula adhaerens; 9 Lysosom; 10 glattes endoplasmatisches Retikulum (glattes ER); 11 Peroxisom (ein Zytosom); 12 Verbindung (»gap junction«); 13 klathrinbedeckte Endozytosefigur; 14 Desmosom; 15 Glykogen; 16 Interzellularspalt; 17 Einfaltung des basalen Labyrinths; 18 Lamina densa der Basallamina; 19 Polysomen; 20 Hemidesmosom; 21 Mikrotubuli und Keratinfilamente; 22 Mitochondrium; 23 rauhes endoplasmatisches Retikulum (rauhes ER); 24 multivesikulärer Körper

8 2.

Biochemie

Zellkern (Nukleus)

Die größte Organelle der Zelle ist gegen das Zytoplasma abgegrenzt durch die Kernmembran (poröse, Stoffaustausch ermöglichende Doppelmembran). Der Zellkern enthält in seiner Matrix (Karyoplasma, Karyolymphe) Erbgut in Form der D NS (die bei der Mitose und Meiose als sichtbare Chromosomen erkennbar wird; Chromatin) und das Kernkörperchen (Nucleolus). Besteht zu 75% aus Eiweißkörpern (Nucleoproteine; u.a. an DNS gebunden, darunter Histone, und frei als Enzyme. Die Proteine können unter Umständen die Bildung antinukleärer Autoantikörper hervorrufen. 3.

Nukleolus

Der Nukleolus beschreibt einen scharf begrenzten, homogenen, R NS und basische Proteine enthaltenden Raum im Zellkern; bildet sich solitär oder multipel in der späten Telophase an Nucleolarchromosomen, wächst in der Interphase, löst sich zwischen Pro- und Metaphase auf oder ab. Bildungs- und primärer Sammelraum für m-RNS, r-RNS und Ribosomen. 4.

Cytoplasma

Das Protoplasma der Zelle (in der Elektronenmikroskopie bezeichnet als „Hyaloplasma“, in der Biochemie als „Zytosol“, in den Muskelzellen als „Sarkoplasma“) ist durchsetzt von Zellorganellen, Neuro-, Tono-, Myofibrillen; ist der Ort des Glucosestoffwechsels, der Fettsäuresynthese, Porphyrinbiosynthese, der Aktivierung von Aminosäuren und deren Übertragung auf die t-RNS, des Abbaus von Aminosäuren und Pyrimidinen; steht in lebhaftem Stoffaustausch (meist über Carrier) mit den Mitochondrien; ist beteiligt (zusammen mit der Zellmembran an der Bildung von Pseudopodien, Mikrovilli etc. 5.

Endoplasmatisches Reticulum (ER)

Das ER ist ein im Zellplasma (Endoplasma) gelegenes Zellorganell als System kommunizierender, bläschen- oder schlauchförmiger Hohlräume und konzentrischer Membran-Doppellamellen, welches mit dem kernnahen Raum (perinukleäre Zisterne) und, über den Golgi-Apparat, mit dem Extrazellularraum verbunden ist; liegt in der Nähe des Zellkerns, ist v.a. bei Zellproliferation sowie in Drüsen-, Nerven- und Embryonalzellen reichlich ausgeprägt (fehlt aber in reifen, kernlosen Erythrozyten, in Thrombozyten und in Bakterien). Die aus Phospholipiden und Proteinen bestehenden Wände enthalten RNS; sie sind z.T. mit Ribosomen besetzt (= rauhes endoplasmatisches Reticulum), z.T. aber ohne Ribosomenbesatz (= glattes endoplasmatisches Reticulum). Die Rauhform sieht man gelegentlich als dicht gelagerte parallele Zisternen = „Ergastoplasma“. Es enthält als „Retikuloplasma“ von den Ribosomen gebildete Polypeptide in Form von Granula, welche anschließend im Golgi-Apparat zur Endform der Proteine heranreifen; ist im Übrigen elektronenoptisch kontrastarm. Wird in seiner Glattform gebildet durch Knospung aus der Rauhform, von der auch die Kernmembran gebildet wird. Funktionen: Polypeptid-Transport, Synthese von Glykogen, Potentialverteilung in der Zelle (Calcium-Ionen-Akkumulation), Entgiftung von Endo- und Exotoxinen.

Histotechnik

6.

9

Ribosomen

Bei allen Organismen in Vielzahl vorhandene, elektronenmikroskopisch kleine, rundliche bis ellipsoide Zellpartikel (15–25 nm), in denen die Biosynthese der Eiweißkörper stattfindet (Anlagerung von t-RNS an die Codons der m-RNS und Verknüpfung der aktivierten Aminosäuren). Sie sind den Membranen des endoplasmatischen Retikulums angelagert (= gebundene Ribosomen; bilden v.a. Sekretproteine wie Verdauungsenzyme, Immunglobulin) oder frei im Zytoplasma, evtl. in Gruppen und v.a. zelleigene Proteine bildend. Sie enthalten basische Proteine, niedermolekulare Basen sowie v.a. RNS. 7.

Mitchondrien

Stäbchenförmiges bis kugeliges Organell der Zellen, das zahlreich im Zellleib der Kraftwerk“ der Zelle für Umwandlung von Substraten in Eukaryoten vorkommt als „K energiereiches ATP. Besteht aus feingranulärem Grundplasma und zwei Elementarmembranen; Von der inneren, eng der äußeren anliegenden Membran springen Falten und/oder Röhrchen, selten gestielte Bläschen in die Matrix vor (Crista-, Tubulusbzw. Sacculus-Typ). Die Matrix enthält außer DNS und RNS-Ribosomen zu Einheiten geordnete MultiEnzymsysteme für den Citratzyklus und oxidativen Fettsäureabbau; In der inneren Membran sind für die Atmungskette an ATP-Bildung beteiligte Enzyme eingelagert. Die Mitochondrien sind halbautonom; bilden einige ihrer Bauproteine, sind zu identischer Vermehrung = Reduplikation befähigt. 8.

Lysosome

Von einfacher Elementarmembran (Lipoproteine) umgebene, im Golgi-Apparat gebildete Zellorganellen, die reichlich Hydrolasen (wirksam bei saurem pH; z.B. Glucosidasen, Lipasen, Proteinasen etc.) enthalten. Ort der intrazellulären Verdauung von Kernsäuren, Glykogen, Proteinen, Glykosaminoglykanen, Lipiden; Bei Freisetzung der Enzyme (z.B. Zelltod): Autolyse der Zelle. 9.

Golgi-Apparat

Organell jeder kernhaltigen Zelle, das mikroskopisch – nach Schwärzung mit Osmiumsäure oder Silbersalzen – als Knäuel- und Bälkchenstruktur oder als Netz erkennbar wird; weist eine lipidfreie, nicht geschwärzte Innenstruktur auf; wird unterteilt in Cis-Golgi-Netzwerk und Trans-Golgi-Netzwerk; liegt meist in Kernnähe, im sog. Golgi Feld. Der Golgi-Apparat ist u.a. Sitz von Enzymen, die überwiegend an der Synthese und Modifizierung von Oligo- und Polysacchariden beteiligt sind. Er spielt eine zentrale Rolle im Zellstoffwechsel (chem. Abwandlung von Produkten des endoplasmatischen Retikulums, Speicherung, Transport).

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Biochemie

10. Zentriol Ein sich in der Interphase spontan verdoppelndes, zylinderförmiges, meist zweiteiliges, aus Mikrotubuli bestehendes Zellorganell im Zentroplasma. Zu Beginn der Mitose wandert je 1 Zentriol(enpaar) in Richtung der gegenüberliegenden Zellpole unter Bildung der Polstrahlung; besteht aus Mikrotubuli. In der Mitose ist das Zentriol Ansatzpunkt der polaren Fasern des Spindelapparates. 11. Paraplasma Die, meist tropfig-granulären, „toten“ Stoffe im Zytoplasma (paraplasmatische Einschlüsse), z.B. Wasser, Salze, Kohlenhydrate, Fette, Nahrungseiweiß, Vitamine, Pigmente, auch Viruspartikel. 12. Zellmembran Die jede tierische Zelle umgebende und deren inneres Milieu aufrechterhaltende, elastisch verformbare, lichtmikroskopisch nicht erfassbare Membran. Bestandteile: a. Lipide, v.a. Phosphatide, Cholesterin, Glykolipide, deren polare, hydrophile Enden in die wässrige Phase ragen, während die apolaren, hydrophoben Enden herausragen. b. Eiweißkörper; tauchen in den Lipidfilm ein, •

sind z.T. mehr zur Innen- bzw. Außenfläche hin gelagert oder durchdringen die Lipidschicht völlig (= Tunnelproteine), stehen durch ihre hydrophoben Bezirke mit den Lipiden in Wechselwirkung;

•

verfestigen als Strukturproteine die Membran und sind kontraktil (z.B. als Spectrine, Actin und Glykophorin der Ery-Membran)

•

als Glykoproteine ragen sie, wie auch die G lykolipide (v.a. Ganglioside), gegen die äußere Oberfläche vor und bestimmen weitgehend deren Elektronegativität, sind Träger der Antigenität (z.B. als Blutgruppensubstanz, Transplantationsantigene), besitzen Rezeptoreigenschaft (z.B. der Neuraminsäurerest der Ganglioside als Virusrezeptor), sind aber auch Ladungsträger;

•

andere wirken als Transportproteine oder als Enzymproteine.

Besondere Membrangebilde sind z.B. Mikrovilli, pseudopodienartige Fortsätze bzw. Membraneinstülpungen (für Phago- und Pinozytose), Zellkontaktgebilde. 13. Mikrovilli Fingerförmige, meist unverzweigte Ausstülpungen der Plasmaoberfläche (100– 800 nm; 50–100 nm dick) am Resorptionspol bestimmter Epithelzellen, z.B. der Enterozyten der Darmwand, in Nierentubuli, Plexus choroidei; bilden den sog. Bürstensaum dieser Epithelien; sind von einer Filamentschicht (= fuzzy coat = Glykokalix) bedeckt; besitzen Verdauungsenzyme, aktive Transportaktivitäten, Energiekonvertanten und im Inneren Längs- und Querfilamente.

Histotechnik

11

14. Gewebe Ein durch spezifische Leistungen gekennzeichneter Verband gleichartig entwickelter = „d differenzierter“ Zellen (samt deren Interzellularsubstanz); z.B. Epithel, Binde-, Stütz-, Muskel-, Nervengewebe, Blut. 15. Interzellular-Substanz Von Körperzellen gebildete und in den Interzellularraum ausgeschiedene, dem Gewebeaufbau dienende Stoffe, die sich z.T. zu retikulären, kollagenen und elastischen Fasern zusammenfügen (= g eformte Interzellularsubstanz), teils strukturlos bleiben und als Grund- oder Kittsubstanz (= ungeformte Interzellularsubstanz) das Bindebzw. Einschlussmittel für die Fasern bilden. Geformte und ungeformte Interzellularsubstanz treten stets gemeinsam auf, am reichlichsten im Knorpel- und Knochengewebe.

B. Bausteine Der Organismus ist aus anorganischen und organischen Stoffen aufgebaut. Ein Mensch besteht zu 70% aus Wasser, zu 15% aus Eiweiß, zu 10% aus Fett und zu 5% aus Mineralien. Anorganische Stoffe liegen mit Ausnahme von Wasser überwiegend in Form von Salzen vor. Gelöst im Wasser sind die Ionen für das Milieu (pH-Wert, osmotischer Druck) verantwortlich, das für die biologischen Reaktionen notwendig ist. Osmose ist die einseitige Diffusion einer Flüssigkeit durch eine semipermeable Membran mit der Tendenz, die Konzentrationsunterschiede gelöster Teilchen auf beiden Seiten auszugleichen. Durch die semipermeable Membran ungehindert durchtretende Wassermoleküle verdünnen die einseitig höhere Konzentration größerer Teilchen. Der dabei wirksame osmotische Druck entspricht dem, den die gleiche Menge gelöster Substanz bei gleicher Temperatur und gleichem Volumen in Gaszustand auf die einschließenden Raumwände ausüben würde. Der osmotische Druck in den Zellen und Körperflüssigkeiten beträgt 0,3 osm. (Abb.8) Abb.8 Osmose 1.

Wasser

Wasser hat eine sehr große Bedeutung im Organismus. Alle Stoffe werden darin transportiert, alle Reaktionen laufen im wässrigen Milieu ab. Wasser bindet sich als Hydratationswasser an Kolloide, wie Eiweiß und Glykogen. Es steht hier in enger räumlicher Verbindung zu den Strukturen und bewahrt sich gleichzeitig die Eigenschaft als Lösungsmittel für Salze.

12

Biochemie

Tabelle 1: entnommen aus H.C. Burck, histologische Technik Wassergehalt Gewebe Gewebe in %

Wassergehalt in %

Zahnschmelz

0,2

Lunge

79

Zahnbein

10

Herz

79

Knochen

22

Niere

80

Fettgewebe

30

Bindegewebe

80

Knorpel

55

Blut

80

Gehirn (Mark)

70

Gehirn (Rinde)

86

Leber

71

Lymphe

96

Haut

72

Tränen

98

Muskel

78

Schweiß

99,5

Pankreas

78

Speichel

99,5 Abb.9

Die verschiedenen Gewebetypen bzw. Organe haben einen unterschiedlich hohen Wassergehalt. Zahnschmelz enthält z.B. nur 0,2% Wasser, während Bindegewebe zu 80% aus Wasser besteht. Innerhalb des Gewebes verteilt sich das Wasser auf den intrazellulären Raum und die interstitielle Flüssigkeit. Zwischen diesen Räumen kommt es zu ständigen Wasserumlagerungen (Abb.9). In Bezug auf die histologische Verarbeitung muss man bedenken, dass wasserreiches Gewebe sich hier empfindlicher verhält als wasserarmes wie z.B. Knochengewebe. Die histologische Darstellung von Wasser gelingt im eigentlichen Sinne nicht. Wasser ist in den verwendeten Fixierreagenzien löslich und wird dann bei der Entfernung dieser Reagenzien herausgespült. Optisch leere Hohlräume innerhalb von Zellen gelten, wenn sie kein Fett enthalten, als intrazelluläre Wasseransammlungen (Vakuolen). 2.

Salze

Die gelösten Salze befinden sich in Form von geladenen Teilchen (Ionen) in unterschiedlicher Konzentration im intra- bzw. extrazellulären Raum. Am meisten vertreten sind hier Natrium-, Kalium- und Kalziumionen als positiv geladene Teilchen. Natrium kommt fast ausschließlich extrazellulär vor, Kalium dagegen hauptsächlich intrazellulär. Den anionischen Teil der Salze bilden Chloride, Phosphate und Karbonate. Um das osmotische Gleichgewicht zu erhalten, muss die Zelle ständig Ionen hinausbzw. hineintransportieren. Bei einer relativen Erhöhung des inneren osmotischen Drucks kommt es zur Zellschwellung durch Wasseraufnahme. Im Gegensatz dazu kommt es zur Zellschrumpfung bei relativer Abnahme des inneren osmotischen Drucks. Will man in der histologischen Verarbeitung diese Veränderungen vermeiden, muss man den osmotischen Druck der Fixierlösung an den physiologischen Zustand anpassen. 3.

Proteine

Proteine sind weitverbreitete Naturstoffe in tierischen und pflanzlichen Zellen, die aus Aminosäuren zusammengesetzt sind. Die Aminosäuren sind durch Peptidbindungen miteinander verbunden. Sie bilden charakteristische Ketten- und Raumstrukturen (Eiweißstruktur) und bestehen durchschnittlich aus 50% Kohlenstoff, 7% Wasserstoff, 16% Stickstoff, 20% Sauerstoff und 2% Schwefel.

13

Histotechnik

Nach Größe (Molekulargewicht) kann man sie unterscheiden in: •

Oligopeptide (mit weniger als 10 Aminosäuren)

•

Polypeptide (mit 10 bis 100 As.)

•

Proteine (Makropeptide; mit mehr als 100 As.)

Nach ihrer Gestalt kann man sie unterscheiden in: •

langgestreckte (fibrilläre) Proteine, die als Stütz- und Struktursubstanzen dienen (z.B. Keratin, Kollagen, Elastin, Myosin)

•

kugelige (globuläre) Proteine (Globulin, Albumin), die vielfältige Funktionen in Zellkern, Zellmembran und Zytoplasma sowie in Körperflüssigkeiten erfüllen (Plasmaproteine, Immunglobuline, Peptid- und Proteohormone, Enzyme) oder dem Sauerstofftransport dienen (Hämoglobin, Myoglobin).

Proteine, die mit Stoffen ohne Eiweißcharakter zusammengesetzt sind, werden auch Proteide genannt (Chromo-, Glyko-, Hämo-, Lipo-, Nucleo-, Metall-, Phosphoproteide oder -proteine). 3.1. Aminosäuren Aminosäuren sind frei oder gebunden (als Eiweißbaustein) vorkommende, mit einer Aminogruppe substituierte, aliphatische Carbonsäuren und aromatische Säuren. Die natürlichen Aminosäuren tragen die Aminogruppe allgemein an dem der endständigen Carboxylgruppe nächsten C-Atom, dem „Į-C-Atom“ (sind also AlphaaminoKarbonsäuren = Į-Aminosäuren, Abb.10). Seltener findet man sie an einer weiter entfernten Position z.B. als ȕ-Alanin oder γ-Aminobuttersäure. Die Į-Aminosäuren stellen insgesamt als Peptid- und Proteinbausteine eine für die Körpersubstanz, aber auch für den Intermediärstoffwechsel wichtige Stoffgruppe dar. Sie werden unterschieden nach verschiedenen Kriterien: Nach dem isoelektrischen Punkt in: •

neutrale Aminosäuren

•

saure Aminosäuren

•

basische Aminosäuren

•

amphoter: Aminosäuren mit je einer NH2- und COOH-Gruppe sind amphoter. Ihre Lösungen sind Ampholyte. Sie liegen in neutralen Lösungen als Zwitterionen, in saurem Milieu als Kationen, im alkalischen als Anionen vor.

Abb.10 Valin

Unterscheidung nach der Polarität der Seitenketten, und zwar als Aminosäure mit: •

neutraler und hydrophober (= unpolarer) Seitenkette

•

neutraler und hydrophiler (= polarer) Seitenkette

•

saurer und hydrophiler Seitenkette

•

basischer und hydrophiler Seitenkette

Nach Stoffwechselbesonderheiten werden unterschieden: •

ketoplastische (Ketokörper bildend)

•

aketoplastische

•

glukoplastische, d.h. in Zucker umwandelbare = metabolisierbare

•

aglukoplastische

14

Biochemie

Nach Biosynthese-Aspekten werden unterschieden: •

nichtessentielle Aminosäuren

•

essentielle Aminosäuren (in der Nahrung unentbehrlich, da nicht durch körpereigene Biosynthese ersetzbar; sind daher ausreichend zuzuführen)

Į-Aminosäuren als Bausteine der Proteine Alanin, Leucin, Arginin, Lysin, Asparagin, Methionin, Aspartat, Phenylalanin, Cystein, Prolin, Glutamin, Serin, Glutamat, Threonin, Glycin, Tryptophan, Histidin, Tyrosin, Isoleucin, Valin Aminosäuren haben die Fähigkeit sich durch Peptidbindungen miteinander zu verketten. Dabei wird die OH-Gruppe einer Aminosäure durch eine NH2-Gruppe substituiert. Es entsteht ein Säureamid. Wird nun ein H-Atom daraus durch einen Aminosäurerest ersetzt kommt man zur Peptidbindung. Durch Wiederholung entsteht ein Polypeptid. (Abb.11)

Abb.11 Peptidbindung

3.2. Proteinstruktur Als Primärstruktur bezeichnet man die während der Eiweißbiosynthese festgelegte Reihenfolge (Aminosäurensequenz) und Zahl der Aminosäuren. Als Sekundärstruktur bezeichnet man die räumliche Anordnung der Moleküle, z.B. schraubenförmig gewunden (Helix) oder regelmäßig abgewinkelt (Faltblattstruktur). Als Tertiärstruktur bezeichnet man die räumliche, über die Sekundärstruktur hinausgehende Anordnung der Polypeptidketten, z.B. in Form von Knäueln (globuläre Struktur), die über längere Strecken durch Wasserstoffbindungen, Disulfidbindungen, Ionenbeziehungen und Fremdmoleküle stabilisiert werden, ferner durch Einstülpung hydrophober Gruppen in das Innere der Ketten, bedingt durch das umgebende wässrige Milieu. Als Quartärstruktur bezeichnet man die räumliche Anordnung mehrerer Untereinheiten (Polypeptidketten) zu einem funktionsfähigen Proteinmolekül, wie z.B. beim Hämoglobin. Zur Analyse der Primärstruktur werden Proteine entweder unkontrolliert durch starke Säuren oder Basen abgebaut oder kontrolliert durch Einwirkung proteolytischer Enzyme (Endopeptidasen, Exopeptidasen) in kleinere Bruchstücke zerlegt (Proteolyse). Bei der Sequenzanalyse nach Pehr Edman (1950) reagiert die N-terminale (d.h. außenstehende, nichtgebundene) Aminogruppe mit Phenylisothiocyanat, wodurch die Peptidkette schrittweise um eine Aminosäure verkürzt wird; in einer Apparatur (Sequenator) kann die Aminosäurensequenz von Polypeptiden automatisch bestimmt werden. Die Analyse der Tertiär- und Quartärstruktur erfolgt durch Beugung kurzwelliger Strahlen (Elektronen, Neutronen, Röntgen- oder γ-Strahlen) an kristallisierten Molekü-

Histotechnik

15

len oder mit höchstauflösender Elektronenmikroskopie auch an gelösten Proteinen. Die Ergebnisse werden in Großrechnern zu einem dreidimensionalen Molekülbild zusammengefügt. 3.3. Hydratation Darunter versteht man in wässrigen Lösungen die Anlagerung von Wassermolekülen durch Nebenvalenzen an Ionen oder Moleküle (z.B. Proteine, Kolloide). Die Wassermoleküle werden in die Eiweißstruktur räumlich eingelagert und umgeben das Protein mit einer Hydratationshülle, wodurch das Protein „in Schwebe“ gehalten wird. Ursache hierfür ist die Dipoleigenschaft von Wasser. 3.4. Denaturierung Als Denaturierung bezeichnet man die im Allgemeinen nicht umkehrbare, den ursprünglichen Zustand zerstörende Strukturveränderung von Eiweißkörpern durch Fällung, Lösung von Peptidbindungen, Einwirkung verdünnter Säuren, Alkalien etc., Erhitzen oder Bestrahlung. Bei der Denaturierung kommt es zum Übergang von einer höheren Struktur zu einem wahrscheinlicheren, ungeordneten Zustand. Man kann leichte und starke Denaturierung unterscheiden. Leichte Denaturierung z.B. durch Entfernen der Hydratationshülle kann reversibel sein. Bei starker Denaturierung werden Peptidbindungen aufgebrochen. Bei der histologischen Fixierung kann man durch eine möglichst geringe Denaturierung den Erhalt der biologischen Reaktivität der Proteine erreichen, was beim Nachweis von Enzymen oder antigenen Strukturen wichtig ist. 3.5. Proteide Proteide sind aus Proteinen und anderen Stoffgruppen zusammengesetzte Moleküle. Je nach Stoffgruppe unterscheidet man: •

Phoshoproteide (z.B. Casein)

•

Chromoproteide (z.B. Hämoglobin)

•

Glykoproteide (Eiweiße mit einem Kohlenhydratanteil, der aus kurzen, Galaktose, Mannose, Fucose, Galaktose und Glucosamin oder Sialinsäure enthaltenden Seitenketten besteht; Mucine, Mucoide; Teil der Glykokalix)

•

Nukleoproteide (Chromatin)

•

Lipoproteide (für den Transport der wasserunlöslichen Lipide (v.a. Cholesterin, -ester, Triglyceride, Phospholipide) im Blut)

Nukleoproteide: Chromatin ist das spezifisch anfärbbare Material des Zellkerns. Es ist eine fädige Struktur, bestehend v.a. aus DNA und Histonen (basisches Chromosomenprotein), die gemeinsam Nucleosomen bilden, sowie aus internukleosomaler DNA, kleineren Mengen RNA und nichtbasischen Proteinen (Hertone). Die Arbeitsform von Chromatin ist im Zellkern dekondensiert und ausgebreitet; im Gegensatz zur Transportform, d.h. zu den in bestimmten Phasen des Zellzyklus mikroskopisch erkennbaren Chromosomen (siehe Nukleinsäuren).

16

Biochemie

Für die histologische Technik spielt die Darstellung des Chromatins eine große Rolle. Man spricht von gekräuseltem (crisp), lockerem oder verdichtetem Kernchromatin. Um Kerne in der Zellteilungsphase gut zu erkennen, verwendet man zur Fixierung Mittel, die eine relative Kernschwellung hervorrufen und die mitotischen Chromosomen kürzer und dicker erscheinen lassen. (Abb.12)

Abb.12 Chromatin

3.6. Enzyme Enzyme sind für den Stoffwechsel aller Organismen unentbehrliche Eiweißkörper, die als Biokatalysatoren die biochemischen Vorgänge durch Senkung der notwendigen Aktivierungsenergie ermöglichen, sie beschleunigen und in eine gewünschte Richtung ablaufen lassen, ohne selbst verändert zu werden. Durch ihre Eiweißstruktur sind sie befähigt, den Stoff, dessen Reaktion sie steuern sollen, zu erkennen (Substratspezifität), und ermöglichen so die Vielfalt gleichzeitiger Stoffwechselvorgänge. Die Eiweißbiosynthese der Enzyme kann dem Bedarf angepasst werden und ist organabhängig unterschiedlich sowie individuell verschieden. Manche Enzyme benötigen für ihre Wirkung niedermolekulare Stoffe (Cofaktoren, z.B. Metallionen), prosthetische Gruppen oder Coenzyme (Das vollständige Enzym wird als Holoenzym, der Eiweißbestandteil als Apoenzym bezeichnet.) oder aber den räumlichen Zusammenhang mit anderen Enzymen (Multienzymkomplex). Enzyme können im Körper entsprechend ihrer Funktion an Strukturen gebunden sein (Zell- und Zellkernenzyme, Mitochondrienenzyme; auch an der Zellmembran usw.)

Histotechnik

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oder frei in Körperflüssigkeiten vorliegen (z.B. Exkretions-, Serum-, Verdauungsenzyme). Sie werden meist nach der von ihnen katalysierten Reaktion oder nach dem spezifischen Substrat benannt. Dies geschieht durch das Anhängen der Silbe „-ase“ entweder an das umgesetzte Substrat (Phosphatase) bzw. an den Reaktionstyp (Hydrolase). Wie in jeder dynamischen Forschung wurde mit zunehmender Anzahl an entdeckten Enzymen die Benennung verwirrender. Als Abhilfe wurde ein Nummernsystem durch eine Kommission etabliert (EC-Nummern). Für die Histotechnik verbleibt man bei der Verwendung von gewohnten Bezeichnungen. Für detaillierte und umfangreiche Information über Enzyme verweise ich auf Literatur der Biochemie. (Enzymnomenklatur unter: www.expasy.org/enzyme) Nach internationalen Empfehlungen werden sie in sechs Hauptgruppen eingeteilt: 1. Oxidoreductasen: katalysieren Reaktionen, wo das Substrat oxidiert (gibt Elektronen ab) bzw. reduziert (nimmt Elektronen auf) wird. Bsp.: Oxidasen (Cytochromoxidasen), Dehydrogenasen 2. Transferasen: Enzyme, die best. Gruppen zwischen Donor und Akzeptor übertragen; z.B. Transaminasen, Phosphorylase 3. Hydrolasen: Enzyme, die Substrate in reversibler Reaktion hydrolytisch spalten, z.B. Esterase 4. Lyasen: Oberbegriff für alle, die Spaltung von Molekülen katalysierenden Enzyme: Katalasen, (De-)Carboxylasen, Aldolase etc. 5. Isomerasen: Enzyme, die die reversible Umwandlung eines Substrats in ein Isomer katalysieren; v.a. Razemasen, Epimerasen, cis-transIsomerasen 6. Ligasen: Enzym, das eine C–C-, C–N-, C–O- oder C–S-Bindung bewirkt Lokalisation in den Zellorganellen: •

Mitochondrien: Enzyme der oxidativen Stoffwechselvorgänge (z.B. Succinatdehydrogenase, Lactatdehydrogenase); bei Schädigung der Mitochondrien gehen die Enzyme ins Zytoplasma und weiter ins Blutplasma über (Nachweismöglichkeit).

•

Lysosome/endoplasmatisches Retikulum: Enzyme zur Regulation des Blutglukosespiegels, (z.B. Glucose-6-Phosphatase; Cytochrome; Saure Phosphatase, Esterasen); die Enzyme sind an der Struktur fixiert.

In der histologischen Technik spielen Enzyme einerseits als Markermoleküle zur Identifikation von bestimmten Zellen eine Rolle. Andererseits sind sie in der Immunhistochemie beim Antigenretrieval und als Teil des Detektionssystems eingesetzt. Beim Umgang mit Enzymen muss man ihre Empfindlichkeit gegenüber Fixierlösungen, hohen Temperaturen, pH-Wertverschiebungen und Verunreinigungen bedenken. 4.

Kohlenhydrate

Unter Kohlenhydraten versteht man die im Allgemeinen aus Kohlen-, Wasser- und Sauerstoff zusammengesetzten Zucker sowie deren chemische Abkömmlinge und monomeren Bausteine (Monosaccharide). Kohlenhydrate sind kalorisch hochwertige Energielieferanten und Baustoffe, die im Körper einer raschen, hormonal gesteuerten

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Biochemie

Verwertung unterliegen (Kohlenhydratstoffwechsel), z.T. aber in polymerer Form (Glykogen) gespeichert werden. Kohlenhydrate stellen eine wichtige Organkomponente dar. Chemisch gehören sie zu den Ketonen oder Aldehydderivaten von Alkoholen (mit vielen OH-Gruppen). Man kann sie unterteilen in Mono-, Oligo- und Polysaccharide nach Anzahl der Zuckereinheiten (= Saccharide). Als Polysaccharide sind sie wenig löslich und relativ stabil, als Mono- und Oligosaccharide gut löslich und von süßem Geschmack. Kohlenhydrate findet man in Kombination mit Lipiden als Glykolipide und weiters als Anteil der Nukleinsäuren. Die übrigen im Histoschnitt darzustellenden Kohlenhydratderivate werden als Mucosubstanzen oder Schleimstoffe zusammengefasst. Kohlenhydrate kann man unterteilen in: •

einfache Kohlenhydrate (= Monosaccharide)

•

zusammengesetzte Kohlenhydrate d.h. Disaccharide, Oligosaccharide, Polysaccharide

•

konjugierte Verbindungen Glykolipide und proteingebundene Kohlenhydrate (Glykoproteide).

4.1. Einfachzucker Monosaccharide sind einfache, hydrolytisch nicht weiter aufspaltbare Zucker der allgemeinen Formel [CH2O]n. Mono- und Oligosaccharide können wegen ihrer Wasserlöslichkeit im Histoschnitt nicht dargestellt werden. (Abb.13) Die einfachen Zucker werden unterteilt in: •

Aldosen (mit Aldehydgruppe)

•

Ketosen (mit Ketogruppe)

Abb.13 Glucose

Nach der Zahl der Kohlenstoffatome werden sie unterteilt in: Di- bis Nonosen (letztere mit 9 C-Atomen) •

6er-Zucker: Glucose, Galaktose, Fructose

•

5er-Zucker: Ribose, Desoxyribose

4.2. Zweifachzucker Disaccharide sind aus zwei Monosaccharid-Molekülen bestehende Zucker z.T. mit halbacetalischer OH-Gruppe und mit reduzierenden Eigenschaften. z.B. Maltose, Lactose, Saccharose (besteht aus Glucose und Fructose) 4.3. Mehrfachzucker Polysaccharide sind hochmolekulare Kohlenhydrate aus mehr als zehn glykosidisch verknüpften Monosacchariden. Sie werden unterteilt in •

Homo-Polysaccharide aus nur einem Kohlenhydrattyp als Baustein, z.B. Glykogen

•

Hetero-Polysaccharide aus verschiedenen KH-Bausteinen

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Histotechnik

4.3.1. Glykogen Glykogen (C6H10O5)n ist ein Makromolekül von zweigartiger Struktur. Es besteht aus einer linearen Kette mit Į-1,4-glucosidischen Bindungen und Verzweigungsstellen nach jeweils 8–12 Glucose-Einheiten durch Į-1,6-glucosidische Bindungen. Glykogen hat ein Molekulargewicht von 106 –107. Es ist optisch aktiv, reduziert nicht die FehlingLösung und gibt mit Jod eine Braun- bis Violettfärbung. Glykogen ist gegen Alkalien stabil; wird jedoch durch Säuren zu Glucose gespalten (Hydrolyse). Enzymatisch wird es von Amylase zu Maltose gespalten. Glykogen stellt die Kohlenhydrat-S Speicherform beim Menschen dar. Es wird vor allem in der Leber und Muskulatur gespeichert. (Abb.14) Glykogen bildet infolge des hohen Molekulargewichts eine kolloidale Lösung und muss deshalb in der histologischen Technik wie wasserlösliche Stoffe behandelt werden. Es kann aber bei rascher Fixierung dargestellt werden (wird in Protein-Netz sozusagen gefangen).

Abb.14 Glykogen

4.3.2. Glykokonjugate (Schleimstoffe) Die Erforschung der Schleimstoffe begann in der Mitte des 19. Jahrhunderts. Im Laufe des folgenden Jahrhunderts wurden Eigenschaften verschiedener Schleimstoffe definiert (löslich, unlöslich, sialin-, neuramin-hältig). Die wichtigsten Färbungen wurden in der zweiten Hälfte des 20. Jh. entdeckt, wie z.B. Perjodacid-Schiff (PAS)-, Alcian- oder Aldehydfuchsin-Färbung. Spezifische Identifikationen werden erst heutzutage durch immunhistologische und molekularbiologische Techniken erreicht, was aber vorerst nur in der Forschung Anwendung findet. Aufgrund der laufenden, neuen Erkenntnisse ist die Terminologie und Klassifikation der Kohlenhydratderivate recht unübersichtlich. Zu den mehrdeutigen Begriffen gehören „Mucine (Schleime), Mucoid, Mucopolysaccharid, Mucoprotein, Sialomucin, Sulphomucin“. Es gibt Einteilungen, denen die histochemischen Eigenschaften zugrunde liegen, und solche, die auf dem biochemischen Aufbau basieren. Der neue Begriff für Kombinationen von Proteinen und Kohlenhydraten ist Glykokonjugate. Glykokonjugate werden unterteilt in Proteoglykane und Glykoproteine.. a. Proteoglykane Proteoglykane haben unverzweigte Kohlenhydrat-Seitenketten (= Glykosaminoglykane, Mucopolysaccharide), bestehend aus wiederholten Einheiten aus zwei oder mehr verschiedenen Monosacchariden. Diese Einheiten beinhalten immer einen stickstoffhältigen Zucker und eine Zuckersäure. Zu den Zuckersäuren gehören Uronsäure und Sulfatester einer Hexose. z.B.: Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat, Dermatansulfat, Keratansulfat, Heparin. Sie bestimmen die Affinität zu kationischen Farbstoffen (basophile Anfärbung). (Abb.15)

20

Biochemie

Ein Proteoglykanmolekül besteht aus Chondroitin-, Dermatan- oder Keratansulfat mit einer typischen Länge von 50–200 nm gebunden an ein Trägerprotein von ca. 300 nm Länge. Oligosaccharide, ähnlich den Glykoproteinen (5–15 Einheiten), sind ebenso an das Trägerprotein gebunden. Die extrazelluläre Matrix enthält kleinere Verbindungsproteine und lange Stränge von Hyaluronsäure als dreidimensionales Geflecht, das Abb.15 Proteoglykan-Struktur und Hyaluronsäure den Raum zwischen den Kollagenfasern ausfüllt. Proteoglykane stellen die Hauptkomponente der Bindegewebe neben Kollagen dar. Die Zusammensetzung der Komponenten variiert in den Gewebetypen. Mucopolysaccharide (= Glykosaminoglykane) sind nicht-verzweigte PolysaccharidKetten. Ihre Bausteine sind evtl. sulfatierte Disaccharide, die aus einem Hexosamin (Aminozucker, z.B. Glucosamin, Galaktosamin) und einem Monosaccharid ohne Stickstoff bestehen. Saure Mucopolysaccharide lassen sich mit Alzianblau oder Toluidinblau anfärben. Neutrale Mucopolysaccharide sind in der Perjodacid-Schiff’schen-Reaktion positiv. Tabelle 2 Proteoglykane

Proteoglykan

Seitenketten (Zahl der Ketten pro Molekül)

Gewebe, Zellen

Subzelluläre Lokalisation

Knorpel (50 mg/cm3)

Komplex mit Hyaluronsäure u. Kollagen-Typ-IIFasern

Chondroitinsulfat

ca. 100

Keratansulfat

ca. 30

Fibromodulin

Keratansulfat

4

kollagenes Bindegewebe

bindet Kollagenfibrillen

Decorin

Chondroitinsulfat

1

kollagenes Bindegewebe

bindet Kollagenfibrillen

Biglycan

Keratansulfat

2

kollagenes Bindegewebe

perizelluläre Matrix

Versican

Chondroitinsulfat

20–25

Wand von Blutgefäßen

bindet Hyaluronsäure u. Kollagenfibrillen

Perlecan

Heparansulfat

3

Basallamina

bindet Laminin u. Kollagen Typ IV

BasalmembranProteoglykan hoher Dichte

Heparansulfat

4

Basallamina (u.a. der Nierenglomeruli)

bindet Laminin

Heparansulfat

3

Keratansulfat

1

Plasmamembran von Epithelzellen

Dermatansulfat

1

basal im einfachen Epithel, cirkumferentiell im mehrschichtigen Plattenepithel

Mastzellen

Mastzellgranula

Aggrecan

Syndecan

Serglycin

Heparin

ca. 12

Histotechnik

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b. Glykoproteine Glykoproteine haben eine Polypeptidstruktur mit verzweigten Kohlenhydrat-Seitenketten, die aus 2–12 Monosaccharideinheiten bestehen können. Glykoproteine sind in größerer Zahl und Variationen vorhanden als Proteoglykane. Oft findet man als Zucker Galaktose, Mannose, Glukosamin, Galaktosamin, Fucose (= „neutrale Zucker“) und Sialinsäure. Glykoproteine kommen an Zelloberflächen als G lykokalix (cell coat) und als Komponenten der Basallamina sowie der anschließenden Kollagenfibrillenschicht vor. Sie haben mechanische Aufgaben und bilden wahrscheinlich eine regulierende Stofftransportschranke zwischen interstitiellem Raum und anliegenden Zellen, wobei sie Stoffe an Zelloberflächen akkumulieren können. Weiters kommen sie als Enzyme und Hormone vor. Die schleimigen S ekrete der Drüsen von Verdauungs-, Bronchial- und Genitaltrakt sind großteils Glykoproteine und PAS-positiv. Glykoproteine gehören zu den Grundsubstanzen des Bindegewebes wie auch die Proteoglykane und die interstitielle Flüssigkeit. Amyloidablagerungen bestehen aus Glykoproteinen mit Sialinsäuren, sulfatierten Zuckern und neutralen Monosaccharidresten. Einteilung nach Culling (1985): I.

Neutrale Polysaccharide • Glucose beinhaltend (Glykogen, Stärke, Cellulose) •

N-Acetyl-glucosamine beinhaltend (Chitin)

Diese Gruppe gibt eine sehr starke PAS-Reaktion und eine negative Reaktion mit Alcianblau. II.

Saure Mucopolysaccharide (Proteoglykane) • mit Karboxylgruppen (Hyaluronsäure; Bindegewebe) •

mit Sulfatgruppen und Karboxylgruppen (Knorpel, Hornhaut, Blutzellen; Haut, Bindegewebe, Aorta, Lunge)

•

nur mit Sulfatgruppen (Aorta, Rinderhornhaut)

Es sind sogenannte Bindegewebsschleime und PAS-negativ. III. Glykoproteine (Mucine, Mucoid, Mucoproteine, Mucosubstanzen) • neutral (Eiweiß, Magenschleim, Epithelzellgranula) •

mit Karboxylgruppen (Sialoglykoproteine; Mucine von Gl. submaxillaris; Gl. Sublingualis, Dünndarm, oberer Teil der Colonkrypten; Serumglycoproteine, Blutgruppensubstanzen)

•

mit Sulfaltgruppen und Karboxylgruppen (Mucine vom Colon)

Diese Glykoproteine sind hauptsächlich epitheliale Mucine. Manche können auch im Bindegewebe auftauchen. Diese Glykoproteine können, müssen aber nicht PASpositiv sein. IV. Glykolipide • Cerebroside (Fettsäurerest gebunden an Kohlenhydrat) •

Phosphatide (beinhaltet kein Kohlenhydrat aber P AS positiv; Lecithin, Cephalin, Sphingomyelin)

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Biochemie

Weitere Form der Einteilung (Bancroft 2002): •

•

Saure Mucine ż stark sulfatierte Bindegewebsmuzine (Alcianblau pos. bei pH 1) ż stark sulfatierte epitheliale Muzine (Alcianblau pos. bei pH 1, PAS pos.) ż schwach sulfatierte epitheliale Muzine (Sulfomuzine, Alcianblau pos. bei pH 2,5) ż sulfatierte, histochemisch atypische Muzine (Alcianblau pos., keine Reaktion mit üblichen Techniken für sulfatierte Muzine) ż carboxylierte Muzine (Sialidase labile/-resistente Sialomuzine) ż sulfatierte Sialomuzine ż Hyaluronsäure (gleiche Anfärbbarkeit mit Alcianblau wie Sialomuzine) Neutrale Muzine

4.3.3. Glykokalix Glykokalix nennt man den Kohlenhydratanteil der Zellmembran (Glykoproteine und -lipide). Sie enthält saure und neutrale Mukoide mit Carboxyl- und Sulfatgruppen, ferner Immunglobulin-Rezeptoren und außerdem zahlreiche Antigene (darunter solche des HLASystems). Die Glykokalix wirkt durch ihren Enzymgehalt mit an der Aufnahme von Substraten in die Zelle (Abb.16). 4.3.4. Basalmembran

Abb.16 Zellmembran mit Doppellipidschicht, integrale Membranproteine und

Die Basalmembran stellt die lichtmikroskoKohlenhydratseitenketten pisch erkennbare, glasklare, aus Gitterfasern und proteoglykanhaltiger Kittsubstanz bestehende Grenzschicht (Lamelle) zwischen Bindegewebe und nicht-bindegewebigen Bestandteilen dar. Man findet sie bspw. unterhalb von Epithelien. Elektronenmikroskopisch ist es die 0,5–1 µm breite, zweischichtige Grenzlamelle mit äußerer, elektronendichter Lamina densa (die Topographie entspricht der lichtmikroskopischen Basalmembran). Histotechnisch lässt sich die Basalmembran durch die PAS-Reaktion und durch Silberimprägnation darstellen. 5.

Lipide

„Lipide“ ist die Sammelbezeichnung für Fette und fettähnliche Stoffe (= Lipoide) mit unterschiedlicher, chemischer Struktur. Gemeinsam ist ihnen die schlechte Löslichkeit in Wasser (und gute in organischen Lösungsmitteln), die auch die besonderen physikalisch-chemischen und biochemischen Eigenschaften der Lipide bestimmt: z.B. erfolgt der Transport im Blut durch Vereinigung mit Eiweißstoffen (Lipoproteine, Transportproteine für Steroidhormone, Albumin u.a.m.), in Fetttröpfchen und an Zellmembranen von Blutzellen.

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Histotechnik

Fett als exogenes (zugeführtes) Nahrungsfett und Depotfett ist ein wesentlicher Energielieferant und -speicher. Fette werden auch als K örperbaustoff (ca. 160 g/kg) und Wärmeisolator eingesetzt. Fette sind Träger essentieller Fettsäuren und fettlöslicher Vitamine. Zur Darstellung der Fette in der histologischen Technik muss man bedenken, dass sie durch die üblicherweise verwendeten, organischen Lösungsmittel aus dem Gewebe herausgelöst werden. Deshalb erfolgt die Anfärbung von Neutralfett am Gefrierschnitt mittels spezieller Fettfärbung (Sudan, Ölrot). Lipoide können beim Fixiervorgang durch die umgebenden, vernetzten Proteine „eingefangen“ werden. Tabelle 3 entnommen aus: Burck, histologische Technik Gewebe

Fettgehalt in %

Knochenmark

65

Gewebe

Fettgehalt in %

Skelett

10

Leber

21,3

Herz

8,3

Haut

15,0

Muskulatur

7,5

Gehirn

12,6

Nieren

5,2

Pankreas

10,5

Milz

3,0

5.1. Triglyceride Eine Lipid-Unterklasse der Neutralfette sind Triglyceride, die mit drei Molekülen gleicher oder verschiedener Fettsäuren pro Glycerinmolekül verestert sind. Diese Säuren sind v.a. Öl-, Linol-, Linolen-, Palmitin- und Stearinsäure. Triglyceride enthalten meist unverseifbare Begleitstoffe (Carotinoide, Sterine, Squalen etc.). Abhängig vom Gehalt an ungesättigten Fettsäuren sind sie flüssig bis fest, unlöslich in Wasser (hydrophob), löslich in organischen (lipophilen) Lösungsmitteln und empfindlich gegenüber Sauerstoff, Mikroorganismen, Enzymen, Wärme und hydrolytischen Stoffen. (Abb.17)

Abb.17 Triglycerid

Fettsäuren: Gesättigte Fettsäuren sind aliphatische Monocarbonsäuren der allgemeinen Formel CnH2n+1–COOH. (z.B. die Essig-, Butter-, Palmitin-, Stearinsäure) Ungesättigte Fettsäuren haben die allgemeinen Formel CnH2n–1,3,5–COOH. Sie werden unterschieden in einfach, doppelt oder dreifach bis mehrfach ungesättigte Fettsäuren. (z.B. die Ölsäure bzw. Linolsäure bzw. Linolensäure bzw. Arachidonsäure). Einige der ungesättigten Fettsäuren sind essentielle Fettsäuren (Linolsäure, Arachidonsäure). Diese werden vom Säugetierorganismus nicht synthetisiert, und ihr Fehlen in der Nahrung hat Mangelerscheinungen zur Folge. Sie sind Bestandteil von

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Biochemie

Phospholipiden und Prostaglandin-Vorstufen und stellen Substanzen der Zellmembran dar. Essentielle Fettsäuren sind auch für den Mitochondrienstoffwechsel notwendig. 5.2. Lipoide Das sind zu den Lipiden zugehörige, fettähnliche Stoffklassen wie Phosphatide, Ganglioside, Cerebroside, Sphingolipide, Wachse, Steroide und fettlösliche Naturstoffe (z.B. Carotinoide). 5.2.1. Phosphatide Phosphatide sind Lipoide mit mehreren unterschiedlichen Grundbausteinen (Phosphorsäure, Fettsäuren, mehrwertige Alkohole wie Glycerin oder Sphingosin, N-Basen wie Cholin oder Kolamin). (Abb.18) Zu den Phosphatiden gehören:

Abb.18 Į-Phosphatidcholin (=Į-Lecitin)

•

Phosphatidsäuren (z.B. Cardiolipin)

•

Phosphatidylcholine (z.B. Lecithin)

•

Kephaline

•

Inosit- und Acetalphosphatide (= Plasmalogene)

5.2.2. Ganglioside Sie stellen saure Glykolipide dar und bestehen aus Ceramid und Sialinsäure. Vorkommen: v.a. in grauer (8,65% der Gesamtlipide) und weißer Hirnsubstanz (4,16%) sowie in geringeren Mengen in Zellmembranen anderer Gewebe. 5.2.3. Sphingolipide Diese Klasse der Lipoide besteht aus Sphingosin und •

einer langkettigen Fettsäure,

•

einem Phosphorsäurerest,

•

einer stickstoffhaltigen Base oder

•

einem Oligo- oder Monosaccharid (S Sphingoglykolipide).

Wichtige Zellmembranbestandteile. 5.2.4. Steroide Für diese Stoffklasse typisch ist das Grundgerüst des Sterans; darunter als Naturstoffe z.B. Sterine, Gallensäuren, Steroidhormone, D-Vitamine, Krötengifte (Bufodienolide), Sapogenine und Herzglykoside. Die Benennung erfolgt mit Trivialnamen (nach Herkunft, Vorkommen, Wirkung) oder aber nach dem chemischen Grundgerüst unter Einbeziehung stereochemischer Merkmale; Bsp.: Östran, verschiedene natürliche Östrogene, Androstan, verschiedene natürliche Androgene, Corticosteroide, Cholesterin

25

Histotechnik

6.

Nukleinsäuren

In der Zelle gibt es verschiedene Untergruppen der Nukleinsäuren, denen unterschiedliche Aufgaben zugeordnet sind. Im Zellkern findet man als Träger der Erbsubstanz die Desoxyribonukleinsäure (DNS oder DNA). Die DNA fungiert als Vorlage (template) für die mRNA (m messenger Ribonukleinsäure), die eine Kopie des Hauptstranges darstellt und die Informationen für die Eiweißbiosynthese weitergibt (Transkription). Die mRNA verlässt den Zellkern und wird noch „nachbearbeitet“ (splicing), bevor sie an die Ribosomen ankoppelt. Ribosomen enthalten rRNA (rribosomale Ribonukleinsäure). Die tRNA (T Transfer-RNA) liest die einzelnen Codons der mRNA (Translation) und verknüpft die Aminosäuren entsprechend der vorgegebenen Sequenz. Die DNA hat die allgemeine Zusammensetzung (Base-[2-Desoxyribose]-Phosphorsäure)n. Sie ist ein Polynucleotid aus zahlreichen Mononucleotiden, die jeweils durch 3',5'-Desoxyribosephosphorsäurediester-Brücken miteinander verbunden sind (Abb.19). Es enthält die Basen Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin und kommt in allen chromosomenhaltigen Zellen vor. Sie befindet sich zumeist in enger Verbindung mit Proteinen (D Desoxyribonucleoproteid). Das Molekül besteht aus zwei komplementären zu einer D oppelhelix verdrillten Polynucleotidketten, wobei die Basenfolge (Sequenz) der einen Kette die Basensequenz der anderen bestimmt. Adenin steht dabei Thymin (A-T) bzw. Guanin steht Cytosin (G-C) gegenüber. Die Sequenz ist wirksam als genetischer Code für die Eiweißbiosynthese und damit funktionell für die Erbmerkmale. Die zu Genen zusammengefassten Einheiten enthalten auch Bereiche der Regulation (Suppressor, Promotor). Ribonukleinsäure (RNA) enthält anstelle von Thymin die Base Uracil und liegt fast immer einsträngig vor. Der Abbau (in geschädigten oder abgestorbenen Zellen) erfolgt enzymatisch durch Nucleasen. Geschädigte DNA kann durch zelleigene Enzymsysteme repariert werden (Defektentfernung durch Nucleasen; Neusynthese des Segmentes durch DNAPolymerase und dessen Einbau durch Ligase). Die histotechnische Darstellung von Nukleinsäuren erfolgt in Kombination mit den umgebenden Proteinen (Histonen). Das Chromatin erscheint in der Übersichtsfärbung (Hämatoxylin-Eosin-Färbung) basophil aufgrund seiner Phosphatsäurewirkung. Molekularbiologische Techniken zur Identifikation von Sequenzen beruhen vor allem auf der spontanen Anlagerung von komplementären Einzelsträngen (in-situHybridisierung).

Abb.19 DNA-Aufbau

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Biochemie

C. Zusammenfassung Bei der histotechnischen Aufarbeitung von Gewebe muss man berücksichtigen, mit welchen Grundbausteinen man es hauptsächlich zu tun hat. Gewebe kann stark wasserhaltig (schwammig) aber auch faserreich (derb), verkalkt (knochenhart), fettreich etc. sein. Und man muss bei der Gewebebehandlung bedenken, welche Substanzen man nachweisen will. Wasserlösliche Stoffe, wie z.B. Glykogen, werden durch wässrige Behandlung ausgeschwemmt. Fettsubstanzen werden durch die Behandlung mit organischen Lösungsmitteln entfernt. Enzyme, allg. Proteine, werden durch die denaturierende Wirkung von Fixiermittel und Wärme beeinflusst bzw. auch inaktiviert. Im Histodiagnostiklabor werden 99% der Proben gleich behandelt. Der Vorteil liegt im zeitsparenden Arbeitsablauf und in der Vergleichbarkeit der Ergebnisse. Die Aufarbeitungsmethode ist so gewählt, dass die Qualität für die routinemäßige Befundung von Operationspräparaten für fast alle Präparate sehr gut ist.

Histotechnik

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Untersuchungsmaterial A. Gewinnungsart ................................................................................................28 B. Vorbehandlung ...............................................................................................30 1. Fixiertes Gewebe......................................................................................30 2. Natives, unfixiertes Material .....................................................................30 C. Vitalzustand .....................................................................................................33 1. Tote Zellen, totes Gewebe .......................................................................33 2. Lebende Zellen.........................................................................................33 D. Einsenderichtlinien ..........................................................................................34 E. Faktoren der Vorbehandlung ..........................................................................35 F. Sonstiges Probenmaterial ...............................................................................37

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Untersuchungsmaterial

Untersuchungsmaterial Die Art des Materials in einem histodiagnostischen Labor ist hauptsächlich bedingt durch die in der Krankenanstalt angebotenen Leistungen und weiters durch die Einsendungen der niedergelassenen Ärzte oder Ambulatorien. Gewebeentnahmen werden auch von Allgemeinmedizinern, Zahnärzten, Gynäkologen, Dermatologen, Chirurgen etc. in ihren Ordinationen durchgeführt. In einem Schwerpunktkrankenhaus ist das Histolabor mit Gewebe von „Kopf bis zu den Zehen“ konfrontiert. In Spezialkliniken ist das Material mehr auf ein Gebiet (z.B. neurologische Klinik – Neuropathologie, orthopädische Klinik – Knochenpathologie, dermatologische Klinik – Hautpathologie) beschränkt und spezialisiert. In diese Spezial-Histologien werden auch Proben zur Diagnose eingesandt, die von den Allgemein-Pathologen nicht zweifelsfrei befundet werden konnten bzw. noch einer Befundbestätigung bedürfen. Die Speziallabors verfügen bspw. über eine Ausstattung für molekularbiologische oder elektronenmikroskopische Untersuchungen zur detaillierten Diagnose. Je nach Art des Krankenhauses wird auch eine Obduktionsabteilung vorhanden sein, die in das pathologische Institut integriert ist. Obduktionen waren früher die Hauptquelle von histologischem Material. Heutzutage stellt es nur mehr einen kleinen Teil dar. Die Menge an histologischen Untersuchungen ist in den letzten Jahrzehnten ständig angestiegen, bedingt durch die neuen, bioptischen Möglichkeiten aber auch durch Gesetze, die die Untersuchung von allen bei Operationen entnommenen Gewebeproben vorschreiben. Die Technik im histologischen Labor musste sich diesen Erfordernissen anpassen. Es wurden Standards für die Routine und eine möglichst automatisierte Verarbeitung entwickelt. Das histologische Untersuchungsmaterial unterscheidet sich in einem wichtigen Punkt von Vollblut, Serum oder Harn z.B. für klinisch-chemische Tests. Entnommene G ewebeproben sind Unikate. Es gibt sie kein zweites Mal. Wird das Material inadäquat behandelt, kann es für die histodiagnostische Untersuchung unwiederbringlich verloren sein.

A. Gewinnungsart Das Probengut im histologischen Labor stammt (hauptsächlich) von lebenden Patienten. Definitionsgemäß spricht man dabei von Biopsien: („bios“= Leben, „opsis“= sehen) •

Eine Biopsie ist die, vor allem mikroskopische (histologische und zytologische), Untersuchung einer Gewebeprobe, die dem lebenden Organismus mittels eines Instrumentes, z.B. einer Spezialkanüle, Vakuumsonde mit Schneidvorrichtung, durch Exzision etc. entnommen wurde.

•

Im weiteren Sinne versteht man unter Biopsie auch die zu diesem Zweck vorgenommene, gezielte (z.B. mit Ultraschall bei der Endoskopie) oder ohne vorherige

Histotechnik

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Darstellung des Entnahmeortes als „Blind-Biopsie“ vorgenommene Gewebsentnahme. •

Im histologischen Labor bezeichnet man als Biopsie das Gewebe, das durch die oben genannte Technik gewonnen wurde. Es wird entsprechend der Entnahmetechnik bzw. nach dem Organ benannt (Nadel-, Saug-, Stanz-, Exzisions-, Feinnadelbiopsie, Kürettage etc.; bzw. als Knochen-, Leber-, Lungen-Biopsie).

Nadelbiopsie: Gewebsgewinnung mittels spezieller Hohlnadel. Inzwischen v.a. als Feinnadelbiopsie (z.B. der Lunge; der Prostata). Feinnadelbiopsie: für Punktionszytologie (z.B. der Mamma, Lunge, Leber, Prostata) entwickelte Technik der Gewebsentnahme mit einer Punktionsnadel (evtl. unter sonographischer Kontrolle, Menghini-Nadel). Saugbiopsie: Materialentnahme durch eine Sonde, Kanüle etc. unter Soganwendung („Aspiration“, z.B. mittels Spritze); blind, unter Röntgenkontrolle oder mit Hilfe eines Endoskops (z.B. Mamma, Magen-Darmschleimhaut) Zangenbiopsie: Materialentnahme mittels Endoskop und eingebauter Miniaturzange. Stanzbiopsie: Materialgewinnung mittels Stanzgeräts, z.B. Stanzkanüle („Punchbiopsie“). z.B. Mamma 2 mm, Haut 2–8 mm Durchmesser. (Abb.20) Exzisionsbiopsie, Probeexzision: Darunter versteht man das „Herausschneiden“ bzw. die Entfernung eines Gewebe- oder Organteils („Exzisat“) mit einem scharfen Instrument (Skalpell, Schneideelektrode, scharfer Löffel); z.B. Haut.

Abb. 20 Hautstanzbiopsie

Kürettage (Curettage): die Gewinnung bzw. Entfernung eines biologischen Substrates von der Innenfläche eines Hohlorgans oder einer krankheitsbedingten Höhle mittels Kürette (stumpfer oder scharfer spezieller chirurgischer Löffel, voll oder gefenstert). Im engeren Sinne kennt man sie als Uteruskürettage zu Diagnosezwecken oder als therapeutische Kürettage- (z.B. Entfernung von Abortresten). Unter fraktionierter Kürettage versteht man die getrennte Entnahme aus Zervikalkanal und Cavum uteri. Exstirpation: die Entfernung eines umschriebenen Gewebeteils Totalexstirpation/E Ektomie: (das Herausschneiden) die vollständige operative Entfernung eines Organs evtl. unter Einbeziehung von Nachbarstrukturen (z.B. Appendektomie) Resektion: operative Teilentfernung eines Organs (z.B. Darmresektion) Elektroresektion: Entfernung von Weichteilen mit elektrochirurgischen Mitteln (z.B. Prostata: schrittweise Zerkleinerung und Entfernung der Prostata durch die Harnröhre) In der histologischen Umgangssprache unterteilt man das zu untersuchende Gewebe in: •

Biopsien: kleine Gewebeproben, die nicht weiter zurecht geschnitten werden müssen, ehe sie in den Einbettungsprozess gelangen (1–2 mm groß: Magen-,

30

Untersuchungsmaterial

Darm-Zangenbiopsien; bzw. 1 mm dick und bis 25 mm lang: Nieren-, Mamma-, Leber-Nadelbiopsien). •

Probeexzisionen: nächstgrößere Gewebeproben, müssen vor dem Einbettungsprozess nach bestimmten Kriterien zurechtgeschnitten werden (Haut-PEs).

•

Operationspräparate: Bei Operationen entnommene Organe, bzw. Organteile (Nephrektomie – Niere, Colektomie – Dickdarm, Appendektomie – Wurmfortsatz, Hysterektomie – Gebärmutter), die ebenfalls erst nach bestimmten Kriterien präpariert bzw. zurechtgeschnitten werden müssen.

In den letzten Jahren kam es zu einer mengenmäßigen Umverteilung in Richtung der Biopsien und Probeexzisionen. Die Weiterentwicklung der Technik ermöglicht nun die Entnahme und Diagnose sehr kleiner Gewebsstücke. So können schon kleine Läsionen erkannt und behandelt werden, was sich sehr günstig auf die Prognose auswirkt. Im Rahmen von Vorsorgeuntersuchungen werden suspekte Befunde durch Biopsieentnahme bestätigt oder widerlegt (Magen-, Darm-Biopsien; Mamma-Biopsien; HautPE). Operationspräparate sind oft das Ergebnis solcher Biopsiebefunde, wenn die Organentnahme durch die Diagnose indiziert ist (z.B. Magen-OP nach Karzinomdiagnose an der Biopsie). Bei der histologischen Untersuchung wird dann der Erstbefund bestätigt. Bzw. die klinische Diagnose, die zur Operation führte, soll bestätigt werden (z.B.: klinisch: Appendicitis – Appendektomie – histologisch: Appendicitis). Die histologische Untersuchung gibt weiters Auskunft, ob z.B. ein Tumor zur Gänze entfernt wurde, ob und wie viele Lymphknoten befallen sind, auch ob Mikroorganismen beteiligt sind. Das sind Informationen, die für die weitere Behandlung des Patienten und die Prognose benötigt werden. Das histodiagnostische Labor ist bemüht diese Informationen möglichst schnell bei möglichst hoher Qualität zu liefern.

B. Vorbehandlung 1.

Fixiertes Gewebe

Die meisten Gewebeproben kommen bereits fixiert ins histologische Labor. Das bedeutet, dass sie gleich nach der Entnahme in ein geeignetes Gefäß mit Fixierflüssigkeit (Formalin) gegeben wurden. Der Vorgang der Fixierung setzt sofort ein, die nachteiligen Veränderungen durch den Zelltod werden gestoppt und das Gewebe bleibt in gutem Zustand erhalten (siehe Kapitel Fixierung). 2.

Natives, unfixiertes Material

Einige, wenige Ausnahmen verlangen eine Einsendung des nativen Materials (ohne Fixierung, roh). Dabei steht hier weniger die native Begutachtung im Vordergrund, sondern die Möglichkeit für bestimmte Weiterverarbeitungen. Eine Fixierung ist nicht erwünscht, wenn •

an dem Gewebe formalin-empfindliche Enzyme untersucht werden

•

an dem Gewebe formalin-empfindliche, antigene Eigenschaften untersucht werden

Histotechnik

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•

das Gewebe als Quelle für Zellkulturen dienen soll

•

vom Gewebe ein Gefrierschnitt zur Schnellschnittuntersuchung hergestellt wird

•

vom Gewebe Abklatsch-Präparate hergestellt werden

•

ein Teil der Einsendung zum Tieffrieren asserviert wird

•

das Gewebe möglichst optimal fixiert werden soll (z.B. für empfindliche, immunhistologische Untersuchungen)

Bei der Einsendung von empfindlichem, nativem Gewebe ist meist eine Kühlung erforderlich. Es ist auch darauf zu achten, dass es nicht austrocknet (kleine Proben in „feuchten Kammern“, größere zwischen NaCl-feuchten Tupfern) und möglichst rasch ins Labor gelangt. Unfixiert werden auch Operationspräparate ins Labor gebracht, die einfach zu groß sind für eine fachgerechte Fixierung im Operationssaal. Eine vorherige Fixierung wäre auch nachteilig für die makroskopische Beurteilung und die fachgerechte Präparation durch den Pathologen. Schlechte Auswirkungen einer unsachgemäßen Fixierung sind zum Beispiel: •

uneröffneter Darm wird nur von außen fixiert, an der Schleimhaut kommt es zur Fäulnis

•

Magenschleimhaut verzieht sich, zieht sich zusammen

•

Bei Organen mit Bindegewebskapsel kommt es zu Parenchymquetschungen durch die stärkere Schrumpfung des äußeren Bindegewebes.

Natives Material soll möglichst rasch zur weiteren Bearbeitung ins Labor gebracht werden, um Fäulnis zu vermeiden. Ist das am selben Tag nicht möglich, soll es wenigstens im Kühlschrank gelagert werden. 2.1. Intraoperative Schnellschnittuntersuchung Eine Besonderheit unter diesen nativen Proben stellen jene zur intraoperativen Schnellschnittuntersuchung dar. Dabei wird, während der Patient noch in Narkose liegt, die exzidierte Probe auf schnellstem Weg ins Labor gebracht und dort ein Gefrierschnittpräparat hergestellt. An diesem wird ein vorläufiger Befund erstellt, der die weitere Vorgehensweise des Chirurgen bestimmt. Grundsätzlich kann man damit feststellen, um welche Art Tumor es sich handelt, und ob er bis über die Resektionsgrenzen hinausgeht oder im Gesunden entfernt wurde. Man muss aber auch bedenken, dass diese Technik aufgrund der schlechteren, morphologischen Darstellung des Gewebes ihre Grenzen hat, und das Gewebe für nachfolgende Spezialuntersuchungen eventuell verlorengeht. Der vorläufige Befund muss im Paraffinschnitt (übliche Methode) bestätigt werden. Die Dauer vom Eingelangen des Gewebes bis zur Befundübermittlung sollte im Idealfall bei 20 Minuten liegen. •

Beispiel: Bei einer Brustoperation wird festgestellt, ob es sich um einen malignen (bösartigen) oder benignen (gutartigen) Tumor handelt. Ist er maligne, muss je nach Größe des Tumors mehr oder weniger von der Brust und den Lymphknoten entfernt werden.

32 •

2.2.

Untersuchungsmaterial

Beispiel: Ein Hautstück mit Frage auf Basaliom wird zur Schnellschnittuntersuchung eingesandt. Es werden die Resektionsränder beurteilt. Geht der Tumor über den Rand hinaus, muss nachoperiert werden. Natives Material zur direkten mikroskopischen Untersuchung

Man versteht unter Nativpräparaten unfixierte, ungefärbte Zell- oder Gewebepräparate von lebenden Zellen oder frisch entnommenen Gewebeproben zur mikroskopischen Begutachtung. Nativpräparate werden meist direkt bei der Zellentnahme hergestellt. Dabei werden Zellen mittels Tupfer gewonnen, auf einem Objektträger verteilt und mit einem Tropfen physiologischer Kochsalzlösung benetzt. Darauf kommt ein Deckgläschen. Eine andere Methode stellt der „hängende Tropfen“ dar. Hier wird ein Tropfen Zellsuspension auf ein Deckgläschen gegeben. Dieses wird dann mit dem Tropfen nach unten auf einen Objektträger mit einer Vertiefung in der Mitte gelegt, sodass der Tropfen in seiner Form erhalten bleibt und mikroskopiert werden kann. Eine besondere Form nativer bzw. in diesem Fall lebender Zellen findet man in der Zellkultur. Sie kann man als Suspensionen oder Zellrasen direkt in ihrem Kulturgefäß mikroskopisch beobachten. Beispiele:

Nativpräparat vom Vaginalsekret bei der gynäkologischen Untersuchung (Flagellatennachweis, Mykosennachweis) oder von Hautschüppchen nach Kalilaugenbehandlung (Mykosennachweis) beim Dermatologen.

Da die Zellen, sobald sie dem Organismus entnommen sind, im Absterben begriffen sind, kommt es dabei zu Supravitalbeobachtungen. Lebende Zellen aus Zellkulturen in ihrem Kulturmedium liefern (IIntra-) Vitalbeobachtungen. Ist eine Zelle bereits abgestorben, erscheint sie aber noch in ihrem natürlichen Zustand, nennt man das Postvitaldarstellung. Die mikroskopische Untersuchung von Nativpräparaten ist im histodiagnostischen Labor eher selten und mehr in Speziallaboratorien vertreten. Für Nativpräparate von Gewebeproben darf eine gewisse Dicke nicht überschritten werden. Man legt das Stückchen in die Vertiefung eines speziell geschliffenen Objektträgers und bedeckt es mit physiologischer Kochsalzlösung und einem Deckglas. Eine moderne Methode zur Herstellung von 10-1000 µm dicken Gewebeschnitten ohne Vorbehandlung mittels Fixierung oder Einfrieren ist das Schneiden von nativem Gewebe mit dem Vibratom (siehe Mikrotomtechnik). Diese Schnitte können zur Darstellung von Strukturen genutzt werden, die durch die übliche Behandlung verloren gehen würden. Außerdem dienen sie als Vergleichsmaterial zur fixierten Probe (medizinische Forschung). Natives Material ist sehr kontrastarm. Man kann den Kontrast durch den Einsatz von Farbstoffen als Vitalfärbung steigern. Die Anfärbung basiert darauf, dass die lebenden Zellen oder die Zellbestandteile Farbstoffe aufnehmen. Letztlich wirken die Farbstoffe auf die Zellen toxisch. Die Vitalfärbung ist z.B. eine Technik der Zellkultivierung (siehe Kap. Zellkultur). Als Vitalfärbung bezeichnet man auch Färbemethoden, die am lebenden Tier vorgenommen werden. Der Farbstoff wird bei der Vitalfärbung meist durch Injektion oder durch Verfüttern appliziert. Bei der Supravitalfärbung werden überlebend gehaltene Organe oder Zellen in Farbstofflösungen eingelegt oder mit Farbstofflösungen perfundiert.

Histotechnik

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Beispiele für die Verwendung von Vitalfärbung direkt am Menschen sind z.B. die Anfärbung der Hornhaut mit Vitalfarbstoffen (zum Auffinden von geschädigten Epithelzellen mit Lyssamingrün) oder in der Chromoendoskopie (zum Auffinden von Läsionen mit Methylenblau, Lugol), weiters die Darstellung der Sentinel-Lymphknoten durch Einbringen des Farbstoffes in die Lymphbahn. 2.3. Zellsuspensionen (Punktionen) Zur Zellgewinnung aus Punktionen werden Ausstriche bzw. Cytospin-Präparate angefertigt. Cytospin ist der Handelsname für eine spezielle Zentrifuge, mit der Zellen angereichert und gleichzeitig auf einen Objektträger aufgebracht werden können. Für Punktionen von Körperflüssigkeiten und Sputa ist primär das zytologische Labor die Anlaufstelle. Aus angereicherten Zellsuspensionen können auch Zellblockpräparate hergestellt werden. Hier werden die Zellen in einem flüssigen Einbettmedium suspendiert und dann verfestigt. Der Block wird in der Histologie weiter in üblicher Weise zu Paraffinblöcken verarbeitet. Im mikrobiologischen Labor werden ebenso Ausstriche (aus bewachsenen Nährmedien) hergestellt, die mitunter im histologischen Färbelabor verarbeitet werden (Mikroorganismen-Färbungen). Die nachfolgenden Techniken erfordern meist die Fixierung der Zellen am Objektträger entweder durch lufttrocknen oder chemisch.

C. Vitalzustand 1.

Tote Zellen, totes Gewebe

Im histodiagnostischen Labor besteht die Mehrheit der Proben aus bereits abgestorbenem Gewebe. Durch die Fixierung wird die Zelle sofort abgetötet, der lebensähnliche Zustand aber möglichst erhalten. Unfixiertes Gewebe wird in den meisten Fällen ebenfalls aus mehrheitlich abgestorbenen Zellen bestehen. Durch die Entnahme wird die Sauerstoffzufuhr unterbrochen und der Zelltod setzt ein. 2.

Lebende Zellen

Um menschliche, lebende Zellen zu gewinnen und lebensfähig zu erhalten, muss man ihre Versorgung mit entsprechenden Nährstoffen gewährleisten. Dabei muss das Gewebe unmittelbar in ein Nährmedium überbracht werden. Trotzdem sind die Chancen, dass eine lebensfähige Zellpopulation aus Tumorzellen entsteht, eher gering. Eine Anwendung von Zellkulturen menschlicher Zellen (Lymphozyten, fetale Zellen gewonnen durch Amniozentese oder von Chorionzotten) ist die Darstellung von Chromosomensätzen für Molekularbiologie und Genetik. Für Zellkulturen in Speziallaboratorien verwendet man bestimmte Zelltypen, deren Eigenschaften und Erfordernisse bekannt sind und meist tierischen Ursprung haben (z.B. Epithelzellen von Hamster, Labormaus). Man untersucht ihre Reaktionen in zytotoxischen Tests für Medikamente, verwendet sie als Nährboden für Virennachweise oder in der Produktion von monoklonalen Antikörpern (siehe Kap. Zellkultur).

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Untersuchungsmaterial

D. Einsenderichtlinien Aus dem Ablauf im vorigen Kapitel ist ersichtlich, dass die Qualität des Endprodukts nicht nur vom Labor, sondern auch von der Probenentnahme und –asservation im großen Maße abhängt. Im Sinne der Qualitätssicherung hat das histologische Labor dafür zu sorgen, dass die Einsender über die optimale Vorbehandlung des Gewebes informiert sind (Einsenderichtlinien). Es ist zwar immer möglich, dass diese Vorschriften nicht eingehalten werden. Jedoch kann man den Einsender darauf hinweisen, wenn das Ergebnis durch eine unsachgemäße Vorbehandlung beeinträchtigt wurde. Tabelle 4 in Auszügen entnommen aus der Website des Instituts für Pathologie der Universität Bern (www.pathology.unibe.ch): Material / Fixation Bemerkungen Anwendung Biopsien, allgemein

Formalin

Standardfixation für Biopsien, soweit nachstehend keine anderen Angaben gemacht werden.

Resektate, allgemein

Formalin

Standardfixation für Resektate, soweit nachstehend keine anderen Angaben gemacht werden.

Curettage

Aethanol

Nach Entfernung des Blutes Fixation in 70 - 96 % Aethanol

Elektronenmikro.

Glutaraldehyd

Nur kleine Gewebestücke fixieren (max. 3 mm Kantenlänge).

Hirnbiopsie

Formalin, Glutaraldehyd

Telefonisch anmelden (spongiforme Enzephalopathie)

Hodenbiopsie

Bouin

Bouin bei Entnahme von Hodenbiopsien zwecks Fertilitätsabklärung. Hodenresektate in Formalin fixieren.

Larynx

Formalin

Resektate nicht aufschneiden sondern umgehend in toto einsenden, um korrekte Aufarbeitung zu ermöglichen.

Leberbiopsie

Formalin

Quantitative Eisenbestimmung (hepatic iron index): vom noch unfixierten Zylinder mind. 3 mm abschneiden und in sauberem Glasoder Plastikgefäß unfixiert an ein klinisch-chemisches Labor senden (wir führen Eisenbestimmung nicht durch). Eine Untersuchung an fixiertem Material ist im Prinzip möglich, kann jedoch das Resultat verfälschen.

Molekularbiologische Untersuchungen

Formalin, ev. zusätzlich nativ

Die gegenwärtig für diagnostische Zwecke angebotenen molekularbiologischen Tests lassen sich an Paraffinmaterial durchführen, allerdings ist die Sensitivität der Tests häufig geringer als bei der Verwendung von Nativmaterial. Insbesondere bei Lymphom-Verdacht ist daher die (zusätzliche) Einsendung von Nativmaterial angezeigt.

Muskelbiopsie

Formalin, Glutaraldhyd, nativ

Vergleiche hierzu die detaillierte Anleitung für die Entnahme von Muskelbiopsien.

Nierenbiopsien

nativ

Für die Durchführung von Immunfluoreszenz-Färbungen ist unfixiertes, für die histomorphologische und ev. elektronenmikroskopische Untersuchung fixiertes Biopsiematerial erforderlich. Nierenbiopsien sollen daher stets nativ und so rasch als möglich überbracht werden. Sie werden von uns den unterschiedlichen Bedürfnissen entsprechend weiterverarbeitet (vgl. detaillierte Anweisung). Telefonisch anmelden

Totales mesorektales Exzisat bei Rektumkarzinom

nativ

Für die Beurteilung der Radikalität der Exzision (zirkumferentielle Resektionsfläche) sind uneröffnete und unfixierte Rektumpräparate erforderlich. Das Material soll auf Eis gekühlt - aber nicht gefroren innerhalb weniger Stunden nach der Operation in unserem Institut eintreffen.

Zytogenetische Untersuchungen

nativ, vgl. entspr. Anleitung

Chromosomen können nur aus lebenden, proliferierenden Zellen präpariert werden. Material je nach Fragestellung; vgl. detaillierte Anleitung, bitte telefonisch anfragen

Histotechnik

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Als Medium für die Einsenderichtlinien bietet sich die EDV an. In einer Krankenanstalt ist ein vernetztes EDV-System bereits Standard. Man kann auf diesem Weg den Einsendern immer eine aktuelle Version der Einsenderichtlinien anbieten. Im Internet findet man auf vielen Websites von pathologischen Instituten sehr gute Beispiele dafür. Die Vorschriften werden entsprechend den Vorlieben, Erfordernissen und Leistungsangebot des einzelnen Instituts variieren (Tab 4).

E. Faktoren der Vorbehandlung 1.

Anmeldung im Labor für spezielle Fragestellungen – Ansprechpartner

•

Manche Untersuchungen benötigen eine besondere Vorbehandlung. Diese sollte der Einsender bei einem Ansprechpartner erfragen können.

•

Um zeitaufwendige Untersuchungen im Arbeitsablauf unterzubringen, ist eine Anmeldung notwendig.

•

bei Einsendungen außerhalb der offiziellen Einlaufzeiten

2.

Untersuchungsart – fixiert, nativ

Manche Untersuchungen können nur an nativem Material durchgeführt werden: z.B. Immunfluoreszenz an Haut-PE oder Nieren-Biopsien, Enzymnachweis auf nativen Rektumbiopsien, Abklatschpräparate von Lymphknoten; Asservierung von Gewebe zum Tieffrieren 3.

Gewünschte Vorbehandlung

Werden Großpräparate bereits fixiert eingeschickt, muss man sie entsprechend präparieren, um Gewebeschäden zu vermeiden. Besser ist es allerdings, unfixierte Organe in die Pathologie zu bringen, da der Pathologe die Unversehrtheit der Organkapsel und die Tumorausmaße prüft. Es könnten ansonsten wichtige Informationen verloren gehen! •

Hohlorgane sollen vor der Fixierung eröffnet und vom Inhalt befreit werden. (Gallenblase, Darm)

•

Cysten sollen eröffnet werden und mit passendem Material (z.B. Papierhandtüchern) gefüllt werden.

•

Organe mit Bindegewebskapseln sollen nach Vorschrift eingeschnitten werden.

4.

Art des Fixiermittels – Formalin, Alkohol, Glutaraldehyd

•

abhängig vom Gewebetyp

•

abhängig von der gewünschten Untersuchung

Für die Wahl des Fixiermittels verweise ich auf das Kapitel Fixierung. Das am meisten eingesetzte Fixans ist 4–10% neutral-gepuffertes Formaldehyd (NBF). 5.

Menge des Fixiermittels – Einsendegefäße

•

Das Mengen-Verhältnis von Gewebe zu Fixiermittel sollte mindestens 1:10 sein. Formalin wird bei der Fixierung verbraucht und eine zu geringe Menge verursacht eine inadäquate Fixierung.

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Untersuchungsmaterial

•

Die Einsendegefäße sollen natürlich der Größe des Gewebes angepasst sein. Eine Minibiopsie in einem halb-Liter-Gefäß ist nicht sinnvoll, ebensowenig wie eine mittelgroße Gallenblase in einem 100-ml-Gefäß. Das Material darf nicht hineingequetscht und dadurch beschädigt werden.

•

Die Einsendegefäße sollen aus einem d urchsichtigen Material sein (Glas, Kunststoff). Ob man wiederverwendbare, waschbare Gefäße oder Einmalartikel wählt, liegt bei der Leitung des pathologischen Instituts.

•

Die Form des Gefäßes soll zylindrisch sein.

•

Die Öffnung soll groß genug sein, um das Präparat leicht herauszuheben. Man bedenke dabei, dass es durch die Fixierung zu einer Härtung des Gewebes kommt. Material, das u.U. gerade noch ins Gefäß hineingedrückt werden konnte, kann oft nur mehr durch Zerschlagen des Glases wieder entnommen werden.

•

Es soll leicht mit einem Patientenetikett versehen werden können.

•

Für große (unfixierte) Operationspräparate bieten sich wiederverwendbare Kunststoffeimer an.

6.

Identifikation der Probe – Etiketten, Einsendeschein

Ein ganz besonderes Augenmerk muss der Identifikation der Probe geschenkt werden, um Verwechslungen zu verhindern. Dazu ist eine Beschriftung der Probe notwendig mit: •

Name

•

Geburtsdatum des Patienten

•

nähere Gewebebezeichnung, Lokalisation bzw. Durchnummerierung, wenn von einem Patienten mehrere Proben eingeschickt werden

•

event. Aufnahmenummer, Fallnummer etc.

7.

Information zu Klinik und Operation, Orientierung – Einsendeschein

Gleichzeitig mit der Gewebeprobe soll ein Einsendeschein im Labor eintreffen. Auf diesem Schein soll vermerkt sein •

Name und Geburtsdatum des Patienten

•

event. Aufnahmenummer, Fallnummer etc.

•

Einsender (auch Telefonnummer zum Nachfragen)

•

Angaben zur klinischen Diagnose

•

Entnahmeort des Gewebes

•

Orientierung des Gewebes (Zeichnung, Foto, Erklärung von Markierungen am Präparat)

•

Fragestellung

Es ist ungünstig, Abkürzungen, die nicht allgemein gültig bzw. verständlich sind, zu verwenden. Verschiedene Abteilungen benützen gleiche Abkürzungen für unterschiedliche Bedeutungen.

Histotechnik

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8.

Dauer von der Entnahme bis zum Eintreffen im Labor – Versandrichtlinien

•

Bei einer Gewebeentnahme innerhalb der Krankenanstalt sollten die Präparate innerhalb eines Tages ins Labor gebracht werden (Hol-und Bring-Dienst, Spontantransportanlage).

•

Gewebe, das sich in reichlich Fixiermittel befindet, kann mehrere Tage bei Raumtemperatur gelagert werden, bevor es ins Labor gelangt, ohne Schaden zu nehmen (Manche Einsender sammeln ihre Proben über eine Woche lang).

•

Kann unfixiertes Material nicht am selben Tag ins Labor gebracht werden, soll es über Nacht in einem Kühlschrank aufbewahrt werden (Kälte vermindert Autolyse, Fäulnis).

•

Die Einsendungen von niedergelassenen Ärzten erfolgen entweder auf dem Postweg oder über Botendienste. Bei Versand mit der Post müssen die bestehenden Richtlinien für den Versand von biologischem Material berücksichtigt werden. Auf jeden Fall muss das Gefäß so gut verschlossen und verpackt sein, dass es nicht zerbrechen und die Flüssigkeit nicht auslaufen kann. Eine ausgetrocknete, unbrauchbare Gewebeprobe wäre sonst die Folge.

•

Bei nativen Einsendungen über längere Distanzen muss die Kühlung gewährleistet sein. Man verwendet dazu Styroporbehälter, die mit Kohlensäureschnee gefüllt sind. Dahinein stellt man die Gefäße. Solche Behälter bewahren die tiefe Temperatur mindestens einen Tag (24-Std.-Botenschnelldienst). Über kurze Distanzen reicht eine Kühlung mittels Eiswürfeln oder Kühlelementen. Das Gewebe soll dabei nicht direkt mit den Kühlmedien in Kontakt treten und einfrieren, sondern in „feuchten Kammern“ vor dem Austrocknen bewahrt werden (z.B. Kunststoffröhrchen mit NaCl-feuchtem Tupfer am Boden).

9.

Bezugsquelle von Einsendegefäßen und Fixiermittel

Um die Fixierung in adäquaten Fixantien und Gefäßen zu gewährleisten ist es am besten, wenn das pathologische Institut diese den Einsendern zur Verfügung stellt. Ansonsten muss dafür gesorgt werden, dass der Einsender die entsprechenden Informationen erhält, um Verlegenheitsgefäße (Medizinfläschchen mit engem Hals) zu vermeiden.

F. Sonstiges Probenmaterial 1.

Obduktionen

Das Gewebe, das bei Obduktionen gewonnen wurde, wird prinzipiell gleich wie Operationspräparate behandelt. Man muss aber bedenken, dass es einem bereits toten Organismus entnommen wurde und somit die nekrotischen Vorgänge je nach Dauer schon fortgeschritten sind. Im histologischen Labor steht hier der Nachweis oder die Bestätigung der vermuteten Todesursache im Vordergrund. In Instituten, in denen die Ausbildung von Studenten betrieben wird, stellen Obduktionen die Quelle von Studienpräparaten dar. Die Geschwindigkeit der Befundung ist bei Obduktionsmaterial nicht vordergründig.

38 2.

Untersuchungsmaterial

Probenmaterial von Tieren

Gewebeproben von Tieren gewinnt man einerseits zur Diagnosefindung bei erkrankten Tieren und andererseits zu Forschungszwecken bei Versuchstieren. Für Forschungszwecke muss man eine optimale Gewebebehandlung gewährleisten. Dazu gehört zum Beispiel die Perfusionsfixierung von kleinen, narkotisierten Versuchstieren, um der lebendigen Darstellung möglichst nahe zu kommen. Tierisches Forschungsmaterial wird oft elektronenmikroskopisch oder molekularbiologisch verarbeitet. Tiere dienen auch als Quelle für Zell- und Gewebekulturen. Beim Umgang mit Tieren sind immer die Rechtsvorschriften zu beachten. 3.

Probenmaterial von Pflanzen

Histologische Techniken sind auch auf die Untersuchung von Pflanzen in der Botanik anzuwenden.

Histotechnik

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Fixierung A. Allgemeines.....................................................................................................40 1. Faktoren der Fixierung .............................................................................40 2. Fixierungsartefakte ...................................................................................42 B. Fixierung der Gewebe-Bausteine ....................................................................43 1. Proteine ....................................................................................................43 2. Lipide........................................................................................................44 3. Kohlenhydrate ..........................................................................................44 4. Nukleinsäuren...........................................................................................45 C. Fixiermittel.......................................................................................................45 1. Formaldehyd ............................................................................................46 1.1. Eigenschaften .................................................................................46 1.2. Wirkungsweise................................................................................47 1.3. Eindringgeschwindigkeit und Fixierungszeit ..................................48 1.4. Konzentrationsangaben..................................................................48 1.5. Rezepte ..........................................................................................49 1.6. Praktische Hinweise zur Anwendung ..............................................49 1.7. Verwendung in Fixiergemischen ....................................................50 1.8. Gefahren durch Formaldehyd ........................................................52 1.9. Formalin-Ersatz ...............................................................................53 2. Andere gebräuchliche Fixative .................................................................53 2.1. Glutaraldehyd (eigentlich Glutardialdehyd, 1,5-Pentandial)...........54 2.2. Osmiumtetroxid..............................................................................55 2.3. Sublimat (Quecksilberchlorid).........................................................56 2.4. Chromverbindungen ......................................................................57 2.5. Ethanol, Isopropanol, Methanol, Aceton........................................57 2.6. Pikrinsäure ......................................................................................58 2.7. Essigsäure.......................................................................................58 2.8. Gemische .......................................................................................59 3. Eigenschaften der einzelnen Fixative – Übersicht.....................................60 4. Übersicht der Fixative nach dem Untersuchungsziel ................................60 D. Andere Formen der Fixierung .........................................................................62 1. Trocknen...................................................................................................62 2. Gefrieren ..................................................................................................62 3. Gefriertrocknen.........................................................................................64 4. Gefriersubstitution ....................................................................................64 5. Bedampfen ...............................................................................................65 6. Phasentrennung........................................................................................65 7. Mikrowelle ................................................................................................65

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Fixierung

Fixierung A. Allgemeines Ziel der Histotechnik ist es, ein möglichst getreues Bild von der lebendigen Zelle und ihren Stoffwechselvorgängen zu erhalten. Jedoch wird bei der Entnahme von Gewebe die Versorgung mit Sauerstoff unterbrochen und der Zelltod und die damit verbundenen Vorgänge setzen unmittelbar ein. Infolge des Zelltodes kommt es zu morphologischen Veränderungen, die man als Nekrose zusammenfasst. Zuerst beobachtet man ein Anschwellen der Zellen, weiters kommt es einerseits zur Proteindenaturierung (Koagulation) und andererseits zur Autolyse (Kolliquation). Koagulation: Zytoplasma wird zunehmend azidophil und homogen, später erkennt man eine amorphe granuläre Trümmerzone und Zellkernveränderungen (Kernwandhyperchromasie; Pyknose, Karyorrhexis, Karyolyse). Kolliquation: Verflüssigung des Gewebes; mikroskopisch stellt sich eine strukturlose Masse dar. Unter Autolyse versteht man die Selbstverdauung durch zelleigene Enzyme (Hydrolasen). Diese werden beim Abbau der Zellorganellmembranen freigesetzt. Das Ausmaß dieser Autolyse ist abhängig vom Enzymreichtum des Gewebetyps. Zu den enzymreichen Geweben zählen Leber, Gehirn und Niere. Die Autolyse ist weiters von der Temperatur und der Dauer abhängig. Kühlung wirkt der Autolyse entgegen. Je mehr Zeit zwischen Entnahme und Fixierung vergeht, umso größer sind die Schäden an den Zellen. Sind am enzymatischen Abbau auch bakterielle Enzyme beteiligt, kommt es zur Fäulnis. Diese Bakterien halten sich im lebenden Organismus als Saprophyten auf und breiten sich nach dem Tod im Gewebe aus (z.B. Darm). Typisch ist der Fäulnisgeruch, der bei Eiweißabbau entsteht. Von Verwesung spricht man bei der im Anschluss an die Fäulnis einsetzenden oxidativ-bakteriellen Zersetzung organischer, v.a. stickstoffhaltiger Stoffe zu anorganischen Endprodukten (Ammoniak, CO2, Wasser, Nitrate, Sulfate). 1.

Faktoren der Fixierung

Um diesen Schäden entgegenzuwirken und das Gewebe für die weitere Verarbeitung vorzubereiten, verwendet die Histotechnik die Fixierung (fixus: unveränderlich, fest). Allgemein kann man eine Stabilisierung von Geweben, Organen oder Mikroorganismen durch Behandlung mit F ixierlösungen, aber auch durch Erhitzen (Kochen) oder Gefriertrocknen erreichen. Beim Einfrieren des Gewebes kommt es zum Stillstand der Stoffwechselprozesse (physikalische Fixierung). Es gibt viele verschiedene Varianten an Fixiermittel und Fixiertechniken. Die Wahl der Fixierart wird durch das angestrebte Ziel bestimmt. Dazu gehört bspw. die Bewahrung von bestimmten Substanzen, der Enzymaktivität oder die Darstellung von speziellen Strukturen. Die wichtigsten Faktoren sind Zeit, Temperatur und natürlich die Eigenschaften des Fixiermittels. Je weniger Zeit zwischen Gewebeentnahme und vollständiger Fixierung verstreicht umso besser. Eine niedrige Temperatur (4°C) verlangsamt die Autolyse

Histotechnik

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und stellt die schonendste Fixierung dar. Üblicherweise findet die Fixierung aber bei Raumtemperatur statt. Je höher die Temperatur, umso schneller läuft die Fixierung ab, jedoch werden auch die enzymatischen Prozesse beschleunigt. Temperaturen über 50°C führen sofort zur Gewebestabilisierung. Dabei erhöht sich allerdings das Risiko von Morphologieschäden (früher: Kochen zur Schnellfixierung bei Schnellschnittuntersuchung). Die Größe der Gewebeprobe beeinflusst die Qualität der Fixierung. Das Gewebe sollte in Relation zur Eindringgeschwindigkeit des Fixiermittels zurechtgeschnitten werden. In Bereichen, die noch nicht vom Fixiermedium erreicht sind, laufen die autolytischen Vorgänge weiter ab. Bei zu großen Stücken bleibt das Zentrum lange unfixiert und wird geschädigt. Bei manchen Fixiermitteln ist die Zeit, die sie für das Durchdringen des Gewebes brauchen, nicht gleichzusetzen mit der F ixierzeit. Z.B. Formaldehyd dringt schnell ein und bindet primär schnell an die Proteine. Es braucht aber entschieden länger, um die Querverbindungen herzustellen. Und je länger es auf die Zellstrukturen einwirkt, umso mehr Vernetzungen entstehen. Ist die Formalinfixierung im Gewebe noch nicht abgeschlossen, wirken die nachfolgenden Reagenzien, meist Alkohole, in ihrer typischen Weise darauf ein (Fixierung durch Wasserentzug). Ein möglichst feinmaschiges Netz der fixierten Zellstrukturen mit vielen Bindungen an das Fixierreagens hat den Vorteil, dass viele Zellinhaltsstoffe bewahrt bleiben. Auf der anderen Seite, werden dadurch Bindungsstellen blockiert, die man eventuell für den färberischen oder immunhistologischen Nachweis benötigt. Weiters muss man die Wahl des nachfolgenden Einbettungsmediums auf die „Maschengröße“ abstimmen. Stark vernetzende Fixiermittel, wie z.B. Glutaraldehyd, verlangen ein niedrigmolekulares Einbettungsmedium, das leichter in das Maschenwerk eindringen kann. Der pH-Wert der Fixierlösungen sollte für Aldehyde im physiologischen Bereich 7,2 – 7,6 gehalten werden, weil sie hier am besten funktionieren. Dazu dient die Zugabe von Puffern, wie z.B. Phosphat-, Tris-, Veronal- oder Acetatpuffern (Elektronenmikroskopie: z.B. Kakylatpuffer). Der gewählte Puffer sollte dabei nicht mit dem Fixiermedium reagieren, ansonsten würden die Funktionen von Puffer und Fixierung eingeschränkt. Weiters sollte der Puffer keine Enzymreaktionen hemmen oder mit Inkubationslösungen von histochemischen Untersuchungen reagieren. Manche Fixiermittel sind selber Säuren, oder sind als Säuren Bestandteil von Fixiergemischen. Ein relativ niedriger pH kann hier zur besonderen Darstellung von Kernchromatin dienen. Eine Pufferung würde in diesem Fall dem gewünschten Effekt entgegenwirken. Das Einlegen des Gewebes in die Fixierlösung nennt man Immersionsfixierung. Würde man das Fixiermittel über Blutgefäße in ein Organ einbringen, stellt das eine Perfusionsfixierung dar (z.B. bei noch lebenden, narkotisierten Versuchtieren; zu Forschungszwecken). Dazu wird das Blutgefäßsystem vorher mit physiologischer Lösung (Ringer oder Tyrode) von Blutzellen freigespült. Den auf das Gewebe ausgeübten Druck reguliert man über die Aufhängehöhe der Infusionsflasche, die mit Spülflüssigkeit und anschließend mit Fixans gefüllt wird (einfacher ist die Verwendung einer Perfusionspumpe). Manche Fixiermedien eignen sich auch zur K onservierung (z.B. Formalin). D.h. man kann das Gewebe darin für lange Zeit ohne Schädigung aufbewahren. Der durch

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Fixierung

Fixierung erreichte Zustand bleibt erhalten. Andere Fixiermedien verursachen auf Dauer z.B. Mazerierung oder Schrumpfung des Gewebes und müssen durch Konservierungsmittel ersetzt werden. Anforderungen an das Fixiermittel: • Es soll das Gewebe möglichst schnell durchdringen und fixieren. •

Es soll dabei auch bis zu einem gewissen Grad härten.

•

Es soll Autolyse und Fäulnis stoppen.

•

Es soll den räumlichen Aufbau bewahren.

•

Es soll Strukturen und Zellkomponenten erhalten.

•

Es soll die Nachweisbarkeit von Strukturen und Zellinhaltsstoffen erhalten.

•

Die Ergebnisse sollen reproduzierbar sein.

Weitere Anforderungen an das Fixiermittel im Histodiagnostiklabor: • Das Fixativ muss für die Herstellung von Präparaten zur morphologischen Diagnostik mit den üblichen Methoden geeignet sein (Paraffineinbettung, Übersichtsfärbung). •

Eine gewisse Unempfindlichkeit bei der unterschiedlichen Behandlung des Probenguts ist von Vorteil (unterschiedliche Fixierungszeiten, Temperatur, Menge,..).

•

Das Fixativ soll für die Mehrzahl der zu untersuchenden Proben geeignet sein.

•

Für die Vergleichbarkeit der Ergebnisse zwischen verschiedenen histologischen Labors ist es günstig, ein allgemein verwendetes Fixiermittel einzusetzen.

•

Da man im Routinelabor eine große Menge an Fixiermittel benötigt, sollte es auch nicht zu teuer und leicht herzustellen sein.

•

Für den Umgang mit Fixiermitteln im Routinelabor wäre ein für die Gesundheit unbedenkliches Reagens wünschenswert.

•

Die Entsorgung sollte problemlos sein.

2.

Fixierungsartefakte

Durch die Behandlung des Gewebes in der histologischen Verarbeitung wird das tatsächliche, naturgetreue Bild stets beeinflusst. Man erhält ein künstliches Abbild, das Äquivalentbild. Ein Äquivalentbild stellt die reproduzierbare und erfahrungsgemäß mit gesetzmäßiger Gleichheit auftretende, histologische Erscheinung dar (Nissl). Man kann also davon ausgehen, dass sich dieselbe Struktur in allen Präparaten färberisch gleich darstellt, sofern die Vorbehandlung die gleiche war. Durch die elektronenmikroskopischen Untersuchungen können Relationen zwischen den Ultrastrukturen und ihrer Darstellung im Äquivalentbild hergestellt werden. Dieses Wissen erlaubt ein zuverlässiges Arbeiten in der diagnostischen Morphologie. Das Äquivalentbild stellt sich abhängig von der Fixierung dar. Obwohl man im engeren Sinn das Äquivalentbild als Artefakt an sich, also Kunstprodukt, verstehen kann, bezeichnet man in unserer Fachsprache als „Artefakt“ eine Struktur, die vom Äquivalentbild abweicht (Fixier-, Schneide-, Färbe-Artefakte). Schrumpfung und Quellung des Gewebes bzw. der Zellen sind durch osmotische Effekte bedingt, denen man durch gepufferte Fixantien entgegenwirkt. Isotonische Lösungen weisen einen osmotischen Druck von 340 mosm auf. Die meist an die Fixierung anschließende Entwässerung verursacht eine weitere Schrumpfung. Je nach

Histotechnik

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Wassergehalt der Gewebearten und der einzelnen Strukturen, verhalten sich diese unterschiedlich empfindlich. Das kann zu Zerreißungen und Spaltenbildungen im Gewebe führen. Nach vollständiger Fixierung sollte das Gewebe für osmotische Einflüsse nicht mehr empfindlich sein. Die Rindenbildung tritt vor allem bei stark entwässernden Fixantien wie z.B. Alkohol oder Aceton auf. Dabei verhindert diese Verhärtung der äußeren Regionen ein weiteres, schnelles Vordringen des Fixiermittels (harte Rinde – unfixiertes Zentrum). Ein Phänomen, das beim Diffundieren der Fixierlösung durch das GeSubstanzwebe auftritt, ist die sog. „S flucht“ (Abb.21). Darunter versteht man die Konzentrationsverschiebung von üblicherweise gelösten Substanzen zu der zur Eindringrichtung entgegenliegenden Zellmembran. Am bekanntesten ist hier die „Flucht“ von Glykogen vor alkoholhaltigen Abb.21 Substanzflucht Fixantien. Dabei werden die Proteine im bereits durchtränkten Zellbereich ausgefällt und vernetzt. Die löslichen Substanzen reichern sich im verbleibenden flüssigen Plasmabereich an und werden schlussendlich im Proteinnetz eingefangen. Einige Fixiermittel hinterlassen während der Fixierung aber auch bei unsachgemäßer Folgebehandlung Niederschläge im Gewebe (z.B. Formalinpigment, SublimatNiederschlag) oder verändern die Anfärbbarkeit. Man muss dabei bedenken, dass durch die jeweiligen Fixiermittel auch falsch-positive histochemische Reaktionen entstehen können. Z.B. verursacht die Anlagerung von Glutaraldehyd an die Proteine eine positive Reaktion mit Schiff’schem Reagens (Glykogennachweis). Andererseits können Zellinhaltsstoffe, die durch das Fixiermittel nicht gebunden wurden, bei der nachfolgenden Behandlung verloren gehen, und nicht mehr nachgewiesen werden.

B. Fixierung der Gewebe-Bausteine 1.

Proteine

Die komplexe Struktur der Proteine (Sekundär- und Tertiärstruktur), die mit ihrer b iologischen Aktivität eng verbunden ist, wird durch eine Vielzahl chemischer Bindungen zwischen den Untereinheiten eines Proteinmoleküls aufrechterhalten (z.B. Wasserstoffbrückenbindung, kovalente Bindung, elektrostatische Kräfte). Darüber hinaus ist das Protein reichlich hydratisiert und so in kolloidaler Lösung gehalten. Wird die Hydratationshülle entfernt, reicht die elektrische Abstoßung nicht mehr aus. Koagulation, durch Wasseraufnahme reversiDas Eiweiß bildet Flocken und fällt aus (K bel). Bei anhaltender Einwirkung der denaturierenden Mittel wird die Veränderung irreversibel. Es kommt zur Stabilisierung durch Denaturierung (Abb.22): 1. Entfernen der Hydratationshülle 2. Ausfällen den Kolloids (aus dem hydrophilen wird ein hydrophobes Kolloid) 3. Freiwerden von Bindungsstellen zur Vernetzung

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Fixierung

Methoden zur Denaturierung: •

Hitze (Kochen, Mikrowelle)

•

Aussalzen (Zugabe Harnstoff, Guanidin)

•

Wasserentzug (konzentrierte Alkohole, Trocknen)

•

Ansäuern

von

Es kommt zu einer physikalisch-chemischen Veränderung des Moleküls ohne eine Änderung des prozentualen Anteils Abb.22 Proteindenaturierung und Vernetzung der Bausteine. Durch den Umbau der Sphäroproteine in Fasermoleküle werden reagible Gruppen freigelegt, die die Vernetzung der Fasern ermöglichen und auch die färberische Eigenschaft der Proteine verändern. Dabei werden an den Fasermolekülen auch die Ansatzstellen für proteinspaltende Enzyme freigelegt. Beim Kochen von Fleisch passiert prinzipiell derselbe Vorgang. Das gekochte Fleisch kann von den Verdauungsenzymen leichter zersetzt werden. Den Abschluss der Fixierung stellt die Vernetzung dar. Das wasserlösliche Sol der Proteine ist in ein neues, wirres Raumgefüge (Gel) mit wenig eingelagertem Wasser übergeführt worden. Die Denaturierung führt zum Verlust der biologischen Aktivität, was bei der Untersuchung von enzymatischer Aktivität oder antigener Strukturen ungünstig ist. Im Gegensatz zur Koagulation stellen Fixiermittel, die direkt an die Proteine binden und diese dadurch vernetzen, eine schonendere Fixierungform dar. Die wichtigsten Reagenzien dieser vernetzenden Gruppe sind Formaldehyd und Glutardialdehyd. Aber auch durch die direkte Vernetzung wird die biologische Aktivität beeinflusst. Alle diese Querverbindungen und Vernetzungen führen zu einem stabilen, dreidimensionalen Maschenwerk mit flüssigkeitsgefüllten Innenräumen. 2.

Lipide

Durch Fixierung der Proteine rund um Fetteinlagerungen, sowie durch die Fixierung des Proteinanteils von Lipoproteinen, lassen sich Lipide räumlich stabilisieren. Sie werden im Netz der Proteinfasern festgehalten. Bei der üblicherweise folgenden, histologischen Verarbeitung mit organischen Lösungsmitteln, werden die Fette aber herausgelöst und es bleiben nur die typischen Vakuolen. Eine tatsächliche Fixierung erreicht man durch Vernetzung ungesättigter Lipide durch Osmiumtetroxid, was besonders in der Elektronenmikroskopie zur Darstellung der Zellmembranen gelingt. Eine physikalische Fixierung durch Kälte nutzt man bei der Darstellung von Triglyceriden im Gefrierschnitt. 3.

Kohlenhydrate

Die Fixierung niedermolekularer Kohlenhydrate ist mit Fixierlösungen praktisch nicht möglich (ein Ausweg wäre die Gefriertrocknung und Formalinvapourisierung).

Histotechnik

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Höhermolekulare Kohlenhydrate (Glykogen) können durch Einfangen („trapping“) im Proteinfasernetz erhalten bleiben. Glykoproteine werden über ihren Proteinanteil fixiert. In allen wässrigen Medien der histologischen Verarbeitung besteht die Gefahr des Substanzverlustes. Dem kann man mit einem Celloidinhäutchen über dem Gewebeschnitt am Objektträger entgegenwirken (siehe Adhäsive). Das Fixiermittel der Wahl für den Glykogennachweis ist 96% iges Ethanol. Als Fixantien für Mucosubstanzen stehen alkoholische Bleinitrate zur Verfügung. Für saure Mucopolysaccharide verwendet man zur Fixierung Cetylpyridin-Chlorid oder den Zusatz von kationischen Farbstoffen (Toluidinblau, Safranin O, Acridin Orange). Es kommt dabei zu einer elektrostatischen Anziehung zwischen dem positiven Farbstoff und dem vielfach anionischen Mucopolysaccharid-Anteil und damit zur Salzbildung. 4.

Nukleinsäuren

Die Nukleinsäuren in den Gewebezellen befinden sich in sehr verschiedenen Stadien der Polymerisation und jede Fixiermethode bedingt Veränderungen in ihrem physikalischen Zustand. Die Fixierung durch Aldehyde kann man auf die Vernetzung des Proteinanteils am Nukleoproteid zurückführen. Formalin ist nicht wirklich ein gutes Fixiermittel für Nukleinsäuren, weil es in seiner Funktion eine große Anzahl an reaktiven Gruppen, die man für die spätere Färbung benötigen würde, blockiert. Das kann verbessert werden durch den Zusatz von Quecksilber- oder Chromsalzen. Präzipitierende Fixantien wie Alkohol, Essigsäure oder Karnoy’sche Lösung sind vorzuziehen, weil sie Bindungen zwischen den Nukleinsäuren und Proteinen aufbrechen und so die Anzahl an reaktiblen Gruppen erhöhen. Jedoch führt eine überlange Fixation mit Karnoy zur Extraktion von RNA und DNA. Die Chromosomen von Zellen während der Teilung werden durch koagulierende Fixantien sehr gut dargestellt. Die mitotischen Chromosomen erscheinen kürzer und dicker als bei Formalinfixierung.

C. Fixiermittel Es gibt kein universelles Fixiermittel, das als einziges alle Anforderungen erfüllt und den Nachweis aller Zellstrukturen erlaubt. Zur Darstellung spezieller Inhaltstoffe oder Strukturen bzw. Ultrastrukturen werden ausgesuchte Fixiermittel und -gemische eingesetzt, wobei ihre nachteilige Wirkung auf andere Zellbestandteile in Kauf genommen wird. Der Charakter des histologischen Labors hat einen Wandel durchgemacht. Früher wurden nur wenige besondere Proben mit entsprechendem Aufwand verarbeitet. Ein modernes Histodiagnostiklabor hingegen hat einen großen Probendurchlauf von Operationspräparaten und Biopsien zur morphologischen Diagnostik, wo sich die Behandlung der einzelnen Gewebestücke nicht stark unterscheidet und möglichst automatisiert wird. Das am weitesten verbreitete Fixiermittel im histodiagnostischen Labor ist die neutral gepufferte, wässrige Formaldehydlösung (NBF). Dieses Fixativ ist unter Umständen auch für elektronenmikroskopische Untersuchungen einsetzbar.

46 1.

Fixierung

Formaldehyd

1.1. Eigenschaften Formaldehyd ist ein stechend riechendes Gas (bei –20°C flüssig). Die kleinen Moleküle (-HCHO) lösen sich schnell in Wasser. Durch Anlagerung von Wassermolekülen kommt es zur Bildung von Dihydroxymethan (= Methylenglycol, HO-CH2-OH; Abb.23).

Abb.23 mit Erlaubnis von Scion Publishing Ltd.

Diese Moleküle neigen zur Polymerisation aus Histological and Histochemical Methods 3e by J.A. Kiernan (Abb.24), was besonders durch organische Substanzen und Sonnenlicht gefördert wird Polyoxymethylen). Bis zu einer Kettenlänge von 8 bis 10 sind die Polymere noch (P wasserlöslich, längere Polymere fallen als weißlicher Niederschlag aus. Diesen findet man häufig bei lange aufbewahrten Präparaten als Bodensatz. Die getrockneten Polymerisate sind als Paraformaldehyd im Handel.

Abb.24 Polymerisation von Formaldehyd; mit Erlaubnis von Scion Publishing Ltd. aus Histological and Histochemical Methods 3e by J.A. Kiernan

Eine gut wirksame Formaldehydlösung muss möglichst viele Monomere enthalten. Um der Polymerisation entgegen zu wirken wird bei käuflichen Lösungen meist Methanol zugesetzt. Formaldehyd ist maximal zu 3 7–40% in Wasser löslich (pH 2,8–4,0). Die wässrige Lösung nennt man Formalin.

Eine vor allem durch Sonnenlicht spontan hervorgerufene Reaktion zweier Formaldehydmoleküle, beschreibt die Reduktion des einen zu Methanol und die Oxidation des Cannizzaroreaktion). Dunkle Aufbewahrungsflaschen wiranderen zu Ameisensäure (C ken hier entgegen. Der pH wird deshalb mit der Zeit in den sauren Bereich verschoben. Um den neutralen pH-Wert zu bewahren, gab man früher Kalziumcarbonat (Marmorstückchen) in die Flasche. Heute verwendet man Puffer zur pH-Wert-Stabilisierung. Die Zugabe von Puffer soll auch die Aufspaltung in Monomere unterstützen. Für histochemische und elektronenoptische Zwecke, wo methanol- und säurefreie Formaldehydlösungen benötigt werden, muss man die Lösung aus Paraformaldehyd herstellen. Dazu wird das Pulver in Wasser auf 60°C erhitzt und die entsprechenden Salze zur Pufferung zugesetzt. Durch trockenes Erhitzen von Paraformaldehyd erhält man gasförmiges Formaldehyd, das für die Katecholaminfixierung verwendet wird. Abb.25 Methylenbrückenbildung; mit Erlaubnis von Scion Publishing Ltd. aus Histological and Histochemical Methods 3e by J.A. Kiernan

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Histotechnik

1.2. Wirkungsweise Formaldehyd ist ein proteinvernetzendes Fixativ. Es wirkt wenig denaturierend und erhält größtenteils die Sekundärstruktur der Proteine, sodass auch teilweise Enzymaktivitäten und Antigenstrukturen erhalten bleiben. Formaldehyd kann sich an unterschiedliche Teile der Protein-Moleküle binden und bildet dadurch Halbacetale mit einer freien Hydroxymethylgruppe. Diese Gruppen haben nun die Möglichkeit zu Querverbindungen mit anderen passenden, funktionellen Gruppen der Proteine. Die große Mehrheit dieser Quervernetzungen entsteht zwischen İ-Amino-Gruppen von Lysin und der Amino-Gruppe der Peptidverbindung. Das Proteinnetz wird durch die Methylenbrücken (Abb.25) stabilisiert. Dieses Proteinnetz verleiht dem Gewebe genügend Festigkeit, um die nachfolgenden Einbettungsprozesse zu überstehen. Das Fixativ wird dabei „verbraucht“. Bei alkalischem Milieu reagieren viele funktionelle Gruppen nicht, deshalb soll der pH-Wert 8 nicht überschreiten. Man kann annehmen, dass nicht alle Hydroxymethylgruppen einen Reaktionspartner finden. Während mehrjähriger Lagerung von Gewebe in Formalin werden diese Gruppen zu Säureresten weiteroxidiert, worauf die schlechte Anfärbbarkeit „alter“ Präparate zurückzuführen ist (Basophilie nimmt ab). An Protein gebundenes Formaldehyd kann durch Waschen in Wasser entfernt werden (über mehrere Wochen). Sehr langes Aufbewahren in Formalin verursacht eine extreme Härtung des Gewebes, einen Verlust der Anfärbbarkeit der Kerne und die Ablagerung von braunem „Formalin-Pigment“, das vom HämoglobinAbbau herstammt. Es kann durch alkoholische Pikrinsäurelösung entfernt werden. „Formalin-Pigment“ kommt bei neutral gepuffertem Formalin nicht vor. Die Härtung des Gewebes kann durch Behandlung mit 10% Zitronensäure rückgängig gemacht werden. Bei Austrocknung des Gewebes gibt man es in Dimethylsulfoxyd (DMSO) mit 5% Wasser zum Erweichen. Wirkung auf andere Gewebebestandteile: •

Enzyme:

empfindlich: Dehydrogenasen, Transferasen, Lyasen, Zytochromoxidasen. relativ stabil: Hydrolasen, viele Peroxidasen, Tetrazoliumreduktasen.

•

niedrig molekulare Kohlenhydrate: werden herausgelöst

•

hochmolekulare Kohlenhydrate: Glykogen wird teilw. im Proteinnetz eingefangen, bei der wässrigen Verarbeitung gehen aber große Mengen verloren.

•

Glyko- bzw. Lipo-Proteide werden mittels ihres Eiweißanteils vernetzt.

•

Schleimsubstanzen gehen teilweise verloren: besseres Ergebnis durch Zusatz von Bleinitrat (Lillie)

•

Lipide werden nur gering herausgelöst: besseres Ergebnis durch Zusatz von Kalziumchlorid (Baker); weitere Behandlung mit organischen Lösungsmitteln löst Fette heraus.

•

Harnsäurekristalle (Gichtnachweis) werden herausgelöst (Fixierung in 96% Ethanol)

•

Für Kernchromatin: nicht optimal, Zusätze verbessern die Anfärbbarkeit

Wegen des niedrigen Molekulargewichts von Formaldehyd ist die Fixierlösung hyperton. Trotzdem kommt es bei den üblicherweise verwendeten Verdünnungen eher zu

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Fixierung

geringen Schrumpfungen (ca. 10% Größenverlust nach Formalinfixierung und ParaffinEinbettung; lt. Burck). An Formaldehydfixierungen kann man fast alle anderen Fixierflüssigkeiten zur Nachfixierung anschließen. Z.B. Osmiumtetroxid für die Elektronenmikroskopie. Makroskopisch erkennt man die Fixierung an der Verfärbung des Gewebes von eventuell blutig-rot zu grau-braun, und an der Veränderung der Konsistenz von weich (event. zerfallend, matschig) zu druckelastisch fest. 1.3. Eindringgeschwindigkeit und Fixierungszeit Als Faustregel gilt eine Eindringgeschwindigkeit von ca. 1 mm/Std. Sie ist abhängig von Konzentration, Temperatur und Gewebekonsistenz. Dabei nimmt die Geschwindigkeit mit der zurückgelegten Strecke ab aufgrund der Wechselwirkung mit dem verfestigten Gewebe. Man versuchte die Eindringtiefe mithilfe einer Gleichung zu definieren (d = k¥t; t in Std, d in mm), wobei die Konstante (k) empirisch ermittelt wurde. Aber k variierte je nach untersuchtem Gewebe. Bei k = 0,78 gilt d = 3,9 mm in 25 Std.; bei k = 3,6 gilt d = 18 mm in 25 Std. Obwohl Formalin relativ schnell ins Gewebe eindringt und sich an die Proteinstrukturen bindet, läuft die Vernetzungs-Reaktion sehr langsam ab. Erst nach 24 Stunden sollte eine adäquate Fixierung erreicht sein. Eine komplette Fixierung benötigt ein bis zwei Wochen bei Raumtemperatur. Diese vollständige Vernetzung ist aber gar nicht erwünscht, weil dadurch funktionelle Gruppen, die für die Anfärbbarkeit oder für immunhistologische Nachweise wichtig sind, blockiert werden. Zusätzlich kommt es zu einer übermäßigen Härtung. Im Histodiagnostiklabor lässt man kleine Biopsien über wenige Stunden und größere Präparate bis zu 24 Stunden bei Raumtemperatur fixieren. Bei den modernen Einbettungsautomaten nützt man die erhöhte Temperatur (37–40°C) und die Behandlung mit Druck und Vakuum zur Beschleunigung der Fixierung. Eigentlich besteht hier eine Diskrepanz zwischen Theorie und Praxis, weil die Dauer der Fixierung zugunsten der schnellen Verarbeitung immer mehr gekürzt wird. Bei der Methode der mikrowellenunterstützten Fixierung lässt man das Formalin zuerst ins Gewebe eindringen und verkürzt anschließend die Vernetzungsphase durch Anregung mit der elektromagnetischen Strahlung. Für die Darstellung empfindlicher, neurologischer Strukturen soll mindestens eine bis mehrere Wochen fixiert werden (kann durch Mikrowellentechnik verkürzt werden). 1.4. Konzentrationsangaben Eine gewisse Nomenklaturverwirrung herrscht aufgrund der Tatsache, dass 35–40% Formaldehyd als konzentriertes oder 100%iges Formalin angesehen wird. So enthält 10% Formalin ca. 4% Formaldehyd. Für eine eindeutige Angabe soll man die Prozentangabe des Formaldehyds wählen. In Verwendung sind hauptsächlich 4–10%ige Formaldehydlösungen. Wobei die 4%ige Lösung am meisten verbreitet ist.

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1.5. Rezepte Lillie’s neutrales 4% Formaldehyd: 4,0 g ..... Natrium-Phosphat, monobasisch (NaH2PO4.H2O)........und 6,5 g ..... Natrium-Phosphat, dibasisch (Na2HPO4)......................lösen in 750 ml .... Aqua dest. 100 ml .... 37–40% Formaldehyd .................................................zugeben und auf 1000 ml..... mit Aqua dest. .............................................................auffüllen pH 7,2–7,4; mehrere Monate haltbar Carson’s neutrales 4% Formaldehyd: 100 ml ...... 37–40% Formaldehyd 900 ml ...... Aqua dest. 18,6 g ...... Natrium-Phosphat, monobasisch (NaH2PO4.H2O) 4,2 g ...... Natrium-Phosphat, dibasisch (Na2HPO4) pH 7,2–7,4; mehrere Monate haltbar Rezept mit Phosphatpuffer 4% Formaldehyd: 900 ml ...... 0,1 M Natrium-Phosphat-Puffer (pH 7,2–7,4) 100 ml ...... 37–40% Formaldehyd wenn nötig auf pH 7,2–7,4 einstellen; mehrere Monate haltbar Rezept mit Phosphatpuffer 8% Formaldehyd: 200 ml....... Phosphatpuffer (pH 7,8) 200 ml ...... 37–40% Formaldehyd 600 ml ...... Aqua dest. pH 7,4 1.6. Praktische Hinweise zur Anwendung Die übliche Anwendung von neutral gepuffertem Formalin ist die Immersionsfixierung, also das Einlegen des Gewebes in die Flüssigkeit. Das Eindringen und Durchdringen des Gewebes mit Fixiermittel sollte möglichst schnell und gleichmäßig erfolgen. •

Das Mengenverhältnis zwischen Probe und Fixiermedium muss ausreichend und das Probengefäß dementsprechend groß sein. optimal 1:20, mindestens 1:10

•

Das Fixativ soll von allen Seiten an das Gewebe herantreten können. Die Probe darf nicht am Boden des Gefäßes kleben. Das verhindert man durch Papiertücher oder Kunststoffgitter unter dem Gewebe, oder durch Einbringen des Gewebes in ein Gazesäckchen, mit dem man es im Fläschchen aufhängen kann.

•

Schwimmende (fettreiche, lufthaltige) Gewebe werden von oben mittels durchtränkten Papiertüchern benetzt oder mit Kunststoffgittern beschwert.

•

Die Gewebegröße soll an die Eindringgeschwindigkeit des Fixiermittels angepasst sein. 3–5 mm dicke Scheiben wären optimal.

•

Größere Präparate (Organe, Tumore) sollen deshalb in Scheiben geschnitten werden. Eventuell legt man zwischen die Scheiben wiederum Papier.

•

Barrieren in Form von Organkapseln sollen eingeschnitten werden (Organkapseln schrumpfen stärker als Parenchym und quetschen es dadurch.)

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Fixierung

•

Hohlorgane werden aufgeschnitten (Darm, Cysten).

•

Verziehen“ und könManche Gewebe wie z.B. Magenschleimhaut neigen zum „V nen auf Korkbrettchen mit Nadeln fixiert werden.

•

Vor der Weiterverarbeitung soll das gute Fixierergebnis anhand von Farb- und Konsistenzveränderung begutachtet werden.

•

Da Formalin bei der Fixierung verbraucht wird, soll die Flüssigkeit bei unvollständiger Fixierung gewechselt werden.

•

Beim Zurechtschneiden von formalindurchtränkten, großen Präparaten soll man die unangenehme und sehr wahrscheinlich gesundheitsschädliche Wirkung (beißender Geruch, Reizung der Schleimhäute) durch vorheriges W ässern der Präparate in Leitungswasser vermindern.

1.7. Verwendung in Fixiergemischen In Fixiergemischen werden häufig koagulierende und vernetzende Fixantien kombiniert, um daraus Vorteile bei der Gewebebehandlung zu ziehen. Mögliche Zusätze sind Puffer oder Gegenspieler zur schrumpfenden Wirkung des Hauptfixativs (Bsp.: Eisessig). 1.7.1. Glutaraldehyd-Formaldehyd-Gemisch nach Karnovsky Dieses Gemisch kombiniert das gute Penetrationsvermögens des Formaldehyds mit der stabilisierenden Wirkung des Glutaraldehyds. Damit wird es für die Herstellung von Präparaten für die Elektronenmikroskopie und die Semidünnschnitttechnik ideal. Es enthält 4% Formaldehyd (aus Paraformaldehyd) und 5% Glutaraldehyd, die mit Kakodylatpuffer vermischt werden. Basierend auf diesem Originalrezept wird häufig eine Kombination aus Formaldehyd und Glutaraldehyd in geringerer Konzentration verwendet. Glutaraldehyd-Formaldehyd-Gemisch nach Karnovsky: 2 g ........................Paraformaldehydpulver in 25 ml .....................Aqua dest. lösen. Unter dem Abzug wird in einem Becherglas das Wasser erhitzt, Paraformaldehyd eingerührt und der Aufschlämmung unter ständigem Rühren tropfenweise NaOH zugesetzt. Sobald der Neutralpunkt erreicht ist, löst sich das Paraformaldehyd schlagartig. abkühlen lassen. 10 ml .....................25% Glutaraldehyd 15 ml .....................0,2M Kakodylatpuffer (pH 7,4) zumischen. 1.7.2. Fixiergemisch nach Bouin Dieses Gemisch gehört zu den am häufigsten verwendeten Fixierungsflüssigkeiten. Es eignet sich für Übersichtspräparate, besonders zur Darstellung von Zellkernen und von Bindegewebe. Cytoplasmatische Organellen werden nur schwach, Lipide werden nicht erhalten. Die Schrumpfung in der Fixierlösung beträgt nur 2,5%. Man fixiert üblicherweise für 24 Stunden. Monatelanges Aufbewahren in der Lösung ist nicht nachteilig, es kommt aber zu einer leichten Entkalkung. Der Fixiermechanismus beruht auf der Fällung des Eiweißes durch Pikrinsäure. Es entstehen gelbe Eiweißpikrate. Pikrinsäure wirkt stark schrumpfend, Eisessig wirkt dem entgegen. Durch die Säurewirkung kommt es zu einer guten Darstellung von Kern-

Histotechnik

51

chromatin (Verwendung z.B. zur Darstellung von Mitosen bei der Fixierung von Hodenbiopsien bei Fertilitätsprüfung). Für das Bouin’sche Gemisch gibt es einige Modifikationen, die die Darstellung von Glykogen oder Lipiden verbessern sollen. In der Färbetechnik findet es Anwendung als „Umfixierung“ nach Formalin-Fixierung zur besseren Anfärbbarkeit des Bindegewebes bei Trichromfärbungen. Bouin’sches Gemisch: 15 ml .................... gesättigte, wässrige Pikrinsäurelösung 5 ml .................... 37–40% Formaldehyd 1 ml .................... Eisessig 1.7.3. Schaffer’sches Gemisch Diese Mischung aus Formaldehyd und Alkohol wurde wegen dem besonders guten Eindringen ins Gewebe für die Fixierung von Knochen empfohlen. Für immunhistochemische Nachweise ist es allerdings nachteilig. Nach der Fixierung (1–2 Tage) bringt man das Gewebe in 80% Alkohol, wo es auch aufbewahrt werden kann. Schaffer: 1 Teil ................ 37–40% Formaldehyd 2-3 Teile ............... 80–100% Ethanol (bei 80% Ethanol bleibt das Gewebe elastischer) neutral gepuffertes Schaffer’sches Fixiergemisch: 166,67 g ...............37% Formalin p.a. 320,00 g .............. Methanol abs. 13,33 g ............... Glucose-Phosphat-Puffer (pH 7,4) 1.7.4. Saline Formalin-Lösung Das ist ein einfaches, wässriges Formaldehyd-Fixativ. Es beinhaltet keine neutralisierenden Bestandteile. Der Säuregehalt steigt während der Lagerung. Die Lösung sollte mind. einen Tag vor Gebrauch hergestellt werden, um die Depolymerisation stattfinden zu lassen. Dann ist es mehrere Monate haltbar. 100 ml ................ 37–40% Formaldehyd 9 g ................. Natriumchlorid (NaCl) 1000 ml ................ Aqua dest. 1.7.5. Heidenhain’sches SUSA Der Name kommt von Sublimat und Säure. Kernfarbstoffe, Farbstoffe für Zytoplasma und Bindegewebe kommen klar zur Wirkung. Die Fixierung ist auch für manche histochemische Darstellungen von Kohlenhydraten geeignet. Die Wirkungsweise beruht auf dem Quecksilberchlorid. Es fixiert durch Salzbildung. Das Gemisch dringt rasch ein und eignet sich besonders für dünnes Material; wirkt entkalkend. Die Quecksilberniederschläge müssen vor der Färbung entfernt werden (Behandlung mit Jod-Ethanol Lösung).

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Fixierung

45 g .....................Quecksilberchlorid (HgCl2, Sublimat) 5 g ....................Natriumchlorid (NaCl) 20 g ....................Trichloressigsäure 40 ml ...................Eisessig 200 ml ...................37–40% Formaldehyd auf 1000 ml mit Wasser auffüllen 1.8. Gefahren durch Formaldehyd Das Sicherheitsdatenblatt der Fa. Merck enthält folgende Beschreibung für mind. 37%iges Formaldehyd: •

Giftig beim Einatmen, Verschlucken und Berühren mit der Haut

•

Verursacht Verätzungen

•

Verdacht auf krebserregende Wirkung

•

Sensibilisierung bei Hautkontakt möglich

•

Desinfizierende Wirkung

Sicherheitsmaßnahmen im Umgang mit Formalin: Auch bei der verdünnten Fixierlösung kann man von derselben Wirkung ausgehen. Deshalb ist es wichtig, dass mit Formalin nur gearbeitet wird: •

unter Abzug oder in gut belüfteten Räumen

•

mit Handschuhen, Augenschutz und Schutzkleidung

•

Bei Haut- und bes. Augenkontakt mit viel Wasser spülen!

•

Für schwangere Labormitarbeiterinnen bestehen Beschäftigungsbeschränkungen für den Umgang mit Formaldehyd.

„Bisher existiert noch keine Studie, die eindeutige Beweise für eine Beziehung zwischen Formaldehyd-Exposition und erhöhter Tumorrate in diesen Bereichen zeigen konnte. Die z.T. positiven Befunde von Formaldehyd in den Tierversuchen und die nur begrenzten Hinweise auf eine kanzerogene Wirkung beim Menschen führte zu einer Einstufung von der IARC in die Gruppe 2A als „wahrscheinlich kanzerogen für den Menschen“. Bislang ist es noch umstritten, ob Formaldehyd als genotoxisches Kanzerogen anzusehen ist. Trotz der bekannten genotoxischen Wirkung gehen einige Wissenschaftler davon aus, dass die genotoxische Wirkung nicht im Vordergrund steht, sondern dass beispielsweise die erhöhte Zellproliferation bei der Tumorinduktion durch Formaldehyd die entscheidende Rolle spielt (Monticello und Morgan, 1997).“ Aus dem Forschungsbericht FZKA-BWPLUS Untersuchungen zum Mechanismus Formaldehyd-induzierter Mutationen von Günter Speit und Oliver Merk BWB 99005 Entsorgung: In der Umwelt baut sich Formaldehyd sehr schnell ab (biologische Abbaubarkeit 97,4%/5d). Es ist giftig für Wasserorganismen und auch in Verdünnung noch ätzend. Es hat eine desinfizierende Wirkung. Gefahr für Trinkwasser beim Eindringen von großen Mengen ins Erdreich und/oder Gewässer.

Histotechnik

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Das Sicherheitsdatenblatt rät, Formaldehyd nicht in Gewässer, Abwasser oder Erdreich gelangen zu lassen. In den verschiedenen Staaten gelten unterschiedliche Bestimmungen für die Entsorgung. In manchen ist vor dem Abgießen in den Kanal die vorherige Neutralisation mittels anderer Reagenzien vorgeschrieben. 1.9. Formalin-Ersatz Die gesundheitsgefährdenden und auch im Umgang unangenehmen Eigenschaften einerseits, andererseits die fixiertechnischen Nachteile von Formalin bewogen immer wieder zur Erfindung von Fixativen, die das allgemein gebräuchliche Formalin ersetzen sollen. Beispiele: •

HOPE (Hepes-Glutamic acid buffer mediated Organic solvent Protection Effect): Es soll eine optimale Fixierung mit besonderem Augenmerk auf molekularbiologische Interessen (Nukleinsäuren, Antigenstrukturen) erreichen und eine Paraffineinbettung möglich machen. Hepes ist ein Puffer, der gerne in der Elektronenmikroskopie eingesetzt wird (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid).

•

Prefer-Fixativ (Fa. Anatech): Inhaltstoffe sind Glyoxal, Ethanol und Puffer; Es soll weniger gesundheitsschädlich sein als Formalin, wobei man noch nicht auf lange Beobachtungszeiten zugreifen kann.

Der große Nachteil beim Weggang vom allgemein gebräuchlichen Fixiermittel ist, dass z.B. Ergebnisse von Studien mit formalinfixierten Gewebe nicht übertragen werden können. Auch werden die von Firmen angebotenen Gerätschaften, Reagenzien, empfohlene Verdünnungen etc. auf formalinfixiertes Material abgestimmt, sodass sich ein Vorreiter der neuen Technik erst seine eigenen Standards und Protokolle erarbeiten muss. 2.

Andere gebräuchliche Fixative

Im Laufe des letzten Jahrhunderts wurden viele verschiedene Fixiermittel und Modifikationen davon entwickelt. Manche davon waren weit verbreitet, wurden aber wegen der Giftigkeit der Bestandteile oder wegen umständlicher Handhabung für die routinemäßige Verarbeitung durch Formalin verdrängt. Man versucht die Fixantien nach ihrer Wirkungsweise auf Proteine einzuteilen. Bei der Zuordnung zu den einzelnen Kategorien kam es im Laufe des letzten Jahrhunderts je nach Wissensstand zu Veränderungen. Die wenigsten Fixantien sind jedoch bis ins Detail erforscht und viele Mechanismen sind noch unbekannt. So findet man auch in den Quelltexten je nach Alter verschiedene Aussagen. •

Proteinvernetzung

•

Koagulation

•

Salzbildung

•

Quellung

•

unbekannte Wirkungsweise

54

Fixierung

2.1. Glutaraldehyd (eigentlich Glutardialdehyd, 1,5-Pentandial) Glutaraldehyd (C5H8O2) ist das am meisten verwendete bifunktionale Aldehyd in der Fixierung (seit 1962). Es polymerisiert in der wässrigen Lösung durch Aldol-Kondensation. Dimere und Trimere sind die am reichlichsten vorhandenen Verbindungen in der Lösung. Das gleichzeitige Vorhandensein unterschiedlich langer Moleküle ist wahrscheinlich mitverantwortlich für den guten Fixiereffekt. Die Länge der Polymere nimmt mit der Alterung der Lösung zu, gleichzeitig steigt der pH-Wert. Feste Polymere präzipitieren in alkalischen Lösungen. (Abb.26) Man erhält Glutaraldehyd als 25% (= konzentrierte) wässrige Lösung mit pH 3. Es wird im Kühlschrank aufbewahrt. Sobald die Lösung zu viele langkettige Polymere enthält, ist sie für die Fixierung nicht mehr zu gebrauchen (Test im SpektralphoAbb.26 Polymerisation von Glutardialdehyd; mit Erlaubnis tometer), weil die großen Moleküle von Scion Publishing Ltd. aus Histological and nur schwer ins Gewebe eindringen Histochemical Methods 3e by J.A. Kiernan können. Das Fixativ sollte nach dem Neutralpufferzusatz noch ca. 8 Std. verwendbar sein.

Abb.27 Proteinvernetzung durch Glutardialdehyd; mit Erlaubnis von Scion Publishing Ltd. aus Histological and Histochemical Methods 3e by J.A. Kiernan

In den Glutaraldehydpolymeren gibt es zwei Arten von funktionalen Aldehydgruppen: die terminalen (an den Enden) und die in der Mitte der Kette. Die endständigen Aldehydgruppen können sich mit Aminogruppen der Proteine zu Iminen verbinden, die jedoch nicht sehr stabil sind. Den größeren Anteil an der Vernetzung tragen die mittelständigen Aldehydgruppen, die die stabilere Form der Imine bilden. (Abb.27)

Bei der Fixierung mit Glutaraldehyd muss man bedenken, dass sehr viele Aldehydgruppen nicht abgesättigt werden und somit als Reaktionspartner für nachfolgende histochemische Reagenzien bereit stehen (PAS-Reaktion, Feulgen, Immunhisto, Lektinhisto). Außerdem wirken sie reduzierend, was bei autoradiografischen Untersuchungen falsch positive Ergebnisse bringen kann. Für diese Tests muss man passende Blockierschritte vorschalten. Üblicherweise wird dies mit Zugabe von 50 mM Glyzin oder Lysin im Waschpuffer nach der Fixierung erreicht. Glutaraldehyd dringt sehr langsam ins Gewebe ein und führt zu starker Härtung (0,5 mm in 4 Std.; lt. Johannessen 1978). Deshalb ist die Immersionsfixierung nur für wenige Kubikmillimeter große Gewebsstücke sinnvoll (bei 4oC, 12 Std.). Die Diffusionsstrecke sollte für eine optimale Fixierung ohne Zonierungserscheinungen nicht mehr als 1 mm betragen. Alternativ dazu wird für die Fixierung von Versuchstieren Perfusionsfixierung angewendet (lebensnahe Darstellung der Ultrastrukturen). Nach vollständiger Durchdringung ist die Vernetzung aller Bindungsstellen innerhalb von

Histotechnik

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wenigen Stunden abgeschlossen. Glutaraldehyd bewirkt eine feinmaschige Vernetzung. Es eignet sich deshalb weniger zur Paraffineinbettung (langkettige Moleküle) als zur Kunststoffeinbettung. Diese Eigenschaft macht es zum Fixativ der Wahl für die E lektronenmikroskopie. Die Zellorganellen bleiben gut erhalten. Die am häufigsten verwendete Fixierlösung ist 2-2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphat- oder Kakodylatpuffer pH 7,2-7,4. Auch die Wahl des Puffers spielt eine Rolle für die elektronenmikroskopische Darstellungsqualität: Phosphatpuffer bewirkt eine dichtere Strukturumgebung im Cytoplasma, kann aber zu unspezifischen Niederschlägen mit Schwermetallen führen. Kakodylatpuffer wirkt extrahierend, dies wird verhindert durch Zugabe von 25 mg/50 ml CaCl2. Im Anschluss an die Aldehydfixierung muss für die elektronenoptische Kontrastierung noch mit Osmiumtetroxid (stabilisiert die lipidhaltigen Membranen) nachfixiert oder mit Schwermetallsalzen gefärbt werden. Enzymaktivitäten werden stärker gehemmt als bei Formaldehydfixierung. Man nimmt aber an, dass die rein monomere Lösung für die Darstellung von Enzymen vorteilhafter ist. Die Enzymaktivität nimmt mit der Fixierdauer ab. Im Überschuss vorhandene biogenene Amine können durch Glutaraldehyd präzipitiert werden (EM-Nachweis von adrenalin- bzw. noradrenalinhältigen Zellen). Glutaraldehyd ist auch in stark verdünnten Lösungen noch sehr wirksam (bis 0,25%). 2.2. Osmiumtetroxid Osmiumtetroxidlösungen wurden schon 1865 in die Mikrotechnik eingeführt. Die gelben Kristalle der bereits bei Raumtemperatur flüchtigen Substanz sind wasserlöslich, aber noch löslicher in unpolaren Lösungsmitteln. Dabei entsteht durch die organischen Substanzen Osmiumdioxid. Dieser Effekt tritt nicht bei Formaldehyd, Glutaraldehyd und Aceton auf, vorausgesetzt die Lösungen sind rein. OsO4 gehört in die Gruppe der Platinmetalle, hat einen Schmelzpunkt von 41°C und einen Siedepunkt von 121°C, dadurch erklärt sich der hohe Dampfdruck. Die Dämpfe aus dem Feststoff aber auch von wässrigen Lösungen sind stark irritierend für die Schleimhäute von Mund, Rachen und Augen. Die Hinweise in den mitgelieferten Sicherheitsdatenblättern sind unbedingt zu beachten! Außerdem ist für den Bezug von OsO4 eine Giftbezugslizenz erforderlich. Zur Sicherheit werden bestimmte Osmiumtetroxidmengen in Ampullen eingeschmolzen, die zum Ansetzen von Stammlösungen (2%ig) direkt im Lösungsmittel zerschlagen werden, aber es werden auch 4%ige wässrige Lösungen angeboten. Osmiumtetroxid ist sehr giftig, wird aber in der Umwelt rasch abgebaut (zu metallischen Osmium reduziert). Es gibt Methoden zum Recycling gebrauchter Lösungen, um das Entsorgen des teuren Stoffs zu umgehen. Osmiumtetroxid extrahiert eine größere Menge von Proteinen und Kohlenhydraten, verursacht aber auch eine gewisse Quervernetzung der Proteine zu einem Gel. Die genauen Vorgänge sind noch nicht geklärt. Osmierte Präparate sind durch den oxidativen Effekt von OsO4 bis auf wenige Ausnahmen (z.B.DNA Antikörperfärbung) für die Immuncytochemie bzw. Enzymhistochemie nicht brauchbar. Sicher ist die fixierende Wirkung von Osmiumtetroxid durch Anbindung an die ungesättigten Bindungen von Lipiden. Dabei bildet sich ein zyklischer Ester. (Abb.28)

56

Fixierung

Abb.28 Osmiumtetroxid-Bindung Abb.29 Osmiumtetroxid-Vernetzung; mit Erlaubnis von Scion Publishing Ltd. aus Histological and Histochemical Methods 3e by J.A. Kiernan

Es tritt eine Elektronenwanderung von der C=C Doppelbindung zu Osmium auf, es wird 6-wertig. Stehen zwei ungesättigte Bindungen passend zueinander, kann es zur Quervernetzung (cross-linkage) kommen (Abb.29). Es entsteht ein Diester mit dem Nebenprodukt OsO3. Dieses Oxid ist instabil und wird in unlösliches, schwarzes Osmiumdioxid und Osmiumtetroxid umgewandelt (2OsO3 Æ OsO2(s) + OsO4). So kommt es gleichzeitig zur Stabilisierung und Anfärbung durch den OsmiumdioxidNiederschlag, was durch Überführen in Alkohol noch verstärkt wird. Besonders die regelmäßig angeordneten Lipid-Moleküle von biologischen Membranen lassen sich durch Osmiumtetroxid sehr wirkungsvoll fixieren, schwarz anfärben und elektronisch dicht machen. Das Erscheinungsbild der Plasmamembran entsteht durch Ausdiffundieren des Osmium-Reaktionsproduktes in die hydrophile Region, denn eigentlich sollte die elektronendichte Membran innen liegen. Diese trilaminare Erscheinung wird durch anschließende Uranyl- und Bleikontrastierung noch verstärkt. Im Gewebe kommt es zu keiner Reaktion von Nucleinsäuren mit OsO4. Es können allerdings DNA und RNA-Stränge dargestellt werden. Dies macht man sich bei DNASpritepräparaten zu Nutze, da die Reaktion mit den einzelnen Basen eine unterschiedliche ist. Es wird hauptsächlich zum Nachfixieren (Post-Fixation) nach Formaldehyd- oder Glutaraldehydfixierung für die Elektronenmikroskopie verwendet. Für die Lichtmikroskopie ist die Verwendung dieses Fixativs vorteilhaft für die Darstellung von Mitochondrien und Myelinscheiden von Nervenfasern. Es dringt aber nur 0,5–1,0 mm ins Gewebe ein, was die Anwendung auf sehr kleine Stücke beschränkt. Es lässt sich auch auf Gefrierschnitten zur Lipiddarstellung nutzen. Der Inhalt von Fettzellen lässt sich hier mit unpolaren Osmiumtetroxidlösungen anfärben. Osmiumtetroxid hat einen Effekt auf die Anfärbbarkeit von Proteinen mit anionischen Farbstoffen (Lichtmikroskopie). Normalerweise acidophile Proteine werden durch basische Farbstoffe angefärbt. Man nimmt einen Reaktionsverlauf zwischen Osmiumtetroxid und Protein an, bei dem durch Oxidation und Hydrolyse lösliches Osmat oder Osmiamat entsteht (kein schwarzer Niederschlag). 2.3. Sublimat (Quecksilberchlorid) Nach Burck (1966) ist Sublimat (HgCl2) den Salzbildnern (Schwermetallsalze), nach Kiernan (1999) eher den vernetzenden Fixativen zuzuordnen. Die Wirkungsweise ist noch nicht wirklich aufgeklärt. Bei der Zugabe von Natriumchlorid in die Fixierlösung entstehen Quecksilberchlorid-Anionen, die an die Proteine anbinden und eine Quervernetzung hervorrufen. Diese Bindungen sind aber in Anwesenheit von Halogenen, Säuren oder Thiosulphat instabil. Man nimmt auch die stabilere Brückenbildung zu der schwefeligen Gruppe von Cystein an. Lipide werden nicht fixiert, aber Quecksilber bindet an ungesättigte Fettsäuren.

Histotechnik

57

Sublimatfixierungen erfolgen immer in Mischungen. Zusammen mit Chromsalzen, Essigsäure, Formalin oder Trichloressigsäure zählte es zu den häufig verwendeten Fixantien. Für sich allein angewandt ruft es starke Zytoplasmaschrumpfungen und Rindenbildung hervor. Sublimatfixierungen zeigen eine sehr klare Anfärbbarkeit mit Farbstoffen. Nachteilig sind die hohe Giftigkeit des weißen Pulvers und die notwendige Nachbehandlung. Während der Fixierung mit Sublimat-Mischungen entsteht ein kristalliner oder amorpher Niederschlag von unbekannter Zusammensetzung, wahrscheinlich hauptsächlich Hg2Cl2. Dieser Niederschlag wird durch Jod-Jodkali-Lösung oder JodEthanol-Lösung entfernt. Danach wird die Jodverfärbung mittels Natriumthiosulfat entfernt. 2.4. Chromverbindungen Chromverbindungen, die in der Fixierung verwendet werden, sind Chromtrioxid (CrO3) und Kaliumdichromat (KCr2O7). Sie beinhalten das Metallion in seiner höchsten Oxidationsstufe (+6). Chromtrioxid in Wasser gelöst ist die rot-orange Chromsäure. Im niedrigen pH-Bereich liegen mehr HCrO4 Ionen vor, die die rötliche Farbe bewirken. Im höheren pH-Bereich liegen mehr Cr2O7 Ionen vor. Die Farbe verschiebt sich ins Gelbe. Zur Fixierung eignen sich nur saure Lösungen (unter pH 3,5). Sie können Proteine und Chromatin koagulieren. Es entsteht eine netzartige Textur im Cytoplasma und die Chromosomen von Teilungszellen werden gut dargestellt. Die DNA wird teilw. hydrolysiert und reagiert positiv auf histochemische Aldehydnachweise. In weniger sauren Lösungen werden Proteine verfestigt, aber nicht koaguliert. Sie fixieren die Nukleinsäuren nicht. Der Fixiermechanismus ist nicht geklärt. Man nimmt an, dass sich Makromoleküle rund um das sechswertige Chrom bilden. Chromsäure wird beim Gerben verwendet, wo es Kollagen in Leder umwandelt. Dieser Vorgang ist mit der Fixierung vergleichbar. Die größte Anzahl an Bindungen wird zwischen Chromatomen und den Carboxylgruppen der Aminosäuren gebildet. Chromsäure und Chromate haben nicht dieselbe Wirkungsweise. Der Zusatz von Chromaten zu Fixiermischungen verbessert ihre Eigenschaften. Anscheinend bewirken sie eine primäre Stabilisierung der Proteine, die dann durch die folgende Formaldehyd-Vernetzung verfestigt wird. Chromaffine Reaktion: Adrenalin und Noradrenalin ergeben mit Dichromaten eine Braunfärbung. In Chromaten fixiertes Gewebe muss 12–48 Std. in Leitungswasser ausgewaschen werden. Chromionen, die mit Alkohol in Kontakt kommen, ergeben einen unlöslichen grünen Niederschlag. In den Fixiergemischen von Zenker (saurer pH) und Helly (höherer pH) wird Kaliumdichromat verwendet. 2.5. Ethanol, Isopropanol, Methanol, Aceton Diese Reagenzien entfernen die Wasserhülle von Proteinen. Es kommt zur Koagulation durch Wasserentzug, wobei Wasserstoffbrücken aufgebrochen werden und die Tertiärstruktur zerstört wird (= Denaturierung). Die chemische Zusammensetzung, auch die Aminosäuresequenz, bleibt aber aufrecht.

58

Fixierung

Lösliche Cytoplasmaproteine werden koaguliert und die Zellorganellen zerstört. Kernsäuren werden nicht präzipitiert und bleiben wasserlöslich. Bei niedrigen Temperaturen (unter 5oC) präzipitiert Ethanol viele Proteine ohne Denaturierung, wodurch die biologische Aktivität von Enzymen erhalten bleibt. Alkohole und Aceton extrahieren sehr viele Fette aus dem Gewebe. Kohlenhydrate bleiben meist unbeeinflusst. Ethanol und Methanol machen Glykogen der Leber unlöslich (im Gegensatz zu Aceton). Wasserentziehende Fixiermittel sind primär schlecht für Gewebeblöcke geeignet, weil sie zwar rasch eindringen, aber gleichzeitig eine starke Rindenbildung und Schrumpfung bewirken. Das Gewebe wird schnell spröd und schlecht schneidbar. Deshalb werden sie vorzugsweise in Fixiermischungen verwendet. In reiner Form eignen sie sich gut für Ausstriche (Hauptfixativ in Cytodiagnostik) und Gewebeabklatsche (Imprints), weiters für Gefrierschnitte zum Enzymnachweis (Fixierung in eisgekühltem Aceton). Alkoholfixierung wird verlangt für den Nachweis von Glykogen (Substanzflucht wird besonders deutlich) und Harnsäurekristallen. Dabei muss man auch bei der weiteren Behandlung die bleibende Wasserlöslichkeit bedenken. Für die Fixierung verwendet man hochkonzentriertes Ethanol 100% = absolut). Niedrig konzentriertes Ethanol führt zu Mazeration.

(96%

oder

2.6. Pikrinsäure Eine gesättigte Pikrinsäurelösung (= Trinitrophenol) verursacht Koagulation durch Salzbildung (Pikrate) mit den basischen Gruppen der Proteine. Die Präzipitation tritt in neutralen Lösungen nicht auf und Neutralisation löst Pikrate wieder auf. In Pikrinsäuremischungen fixiertes Gewebe wird gleich in 70%igen Alkohol übergeführt, um die Lösung im Wasserbad zu vermeiden. Man kann jedoch annehmen, dass in pikrinsäureund formalinhältigen Fixantien die Proteine bereits stabil sind. Der niedrige pH-Wert von Pikrinsäure-Lösungen ermöglicht die Hydrolyse der Nukleinsäuren (ungeeignet für quantitative DNA- oder RNA-Bestimmung). Lang anhaltende Fixierung bewirkt eine schlechtere Anfärbbarkeit und Strukturerhaltung. Pikrinsäure dringt nur langsam ins Gewebe ein und verursacht eine starke Schrumpfung, härtet aber nicht. Es hat eine leicht entkalkende Wirkung. Pikrinsäure wird immer in Gemischen (z.B. Bouin, siehe Kap. 1.7.2.) verwendet. Zur Herstellung geht man von einer gesättigten wässrigen oder alkoholischen Lösung aus. Auswaschen kann man Pikrinsäure mittels 70% Alkohol (Blöcke) und Lithiumkarbonatlösung (Schnitte). Weiterbehandlung mit neutral gepuffertem Formalin kehrt die Pikratbildung wieder um. Trockene Pikrate sind explosiv (siehe Sicherheit im Histolabor). 2.7. Essigsäure Essigsäure fixiert Proteine zwar nicht, koaguliert jedoch die Nukleinsäuren. Der Wirkungsmechanismus ist nicht bekannt. Essigsäure dringt rasch ins Gewebe ein und verursacht Schwellung. Sie wird in Gemischen eingesetzt, um die Zellkerne gut darzustellen, und der schrumpfenden Wirkung anderer Reagenzien entgegen zuwirken. 97–100% Essigsäure nennt man Eisessig.

Histotechnik

59

2.8. Gemische 2.8.1. Karnoy'sches Fixativ 60 ml .................... Alkohol abs. 30 ml .................... Chloroform 10 ml .................... Eisessig (oder 5 ml Eisessig) Karnoy dringt rasch ein, koaguliert Proteine und Nukleinsäuren und extrahiert Lipide. Viele Kohlenhydrate bleiben erhalten. Bis 5 mm dicke Gewebsblöcke sind innerhalb von 6–8 Std. fixiert und werden dann in 96% oder 100% Alkohol weiterbehandelt. Bei Fixierung über 18 Std. kann es zur Hydrolyse der Nukleinsäuren und deren Verlust kommen (besser mit 5 ml Eisessig). 2.8.2. Zenker’s / Helly’s Fixativ Diese Lösungen beinhalten Quecksilberchlorid und Kaliumdichromat. Sie bringen ein hervorragendes morphologisches Ergebnis, sind aber mit vielen histochemischen Techniken nicht verwendbar. Vor der Weiterverarbeitung muss das Gewebe von allen Quecksilber- und Dichromatspuren durch Wässern und Jodieren befreit werden. Zenker’s Stammlösung: 50 g ..................... Quecksilberchlorid (HgCl2) 25 g ..................... Kaliumdichromat (K2Cr2O7) 10 g ...................... Natriumsulfat (Na2SO4.10H2O) auf 1000 ml mit Aqua dest. auffüllen. ewig haltbar Zenker’s Gebrauchslösung: 100 ml .................. Stammlösung 5 ml .................. Eisessig niedriger pH, Kernmorphologie wird gut dargestellt Helly’s Gebrauchslösung: 100 ml .................. Stammlösung 5 ml .................. 37–40% Formaldehyd Cytoplasmabestandteile (Mitochondrien, sekretorische Granula) werden gut dargestellt. 2.8.3. Flemming’s Fixativ 2,0 ml ................... 2% Osmiumtetroxid 1,5 ml ................... 5% Chromsäure 0,5 ml ................... Eisessig auf 10 ml mit Aqua dest auffüllen für einige Tage haltbar; geeignet zur Darstellung von mitotischen bzw. meiotischen Zellen. Die Gewebestückchen dürfen nur bis zu 1 mm dick sein, 6–18 Std. Fixierung in sehr reinen Glasgefäßen.

60 3.

Fixierung

Eigenschaften der einzelnen Fixative – Übersicht

Tabelle 5a entnommen aus Histological and histochemical Methods by J.A. Kiernan ; mit Erlaubnis von Scion Publishing Ltd. Ethanol

Essigsäure

Trichloressigsäure

Pikrinsäure

Formaldehyd

gewöhnliche Konzentration

70-100

5-35

2-5

0,5-5

2-10

Eindringen

schnell

schnell

schnell

langsam

ziemlich schnell

+++

++

Schwellung

keine

Schrumpfung

+++

+

keine

Härtung

+++

keine

keine (?)

+

++

bindet nicht an, koagulierend

etwas Extraktion

bindet nicht an, koagulierend

bindet an, koagulierend

bindet an, nicht koagulierend

Effekt auf Nukleinsäuren

kein

Präzipitation

etwas Extraktion

teilw. Hydrolyse

leichte Extraktion

Effekt auf Kohlenhydrate

kein

kein

kein

kein

kein

Effekt auf Fette

starke Extraktion

kein

kein

kein

langsame chem. Veränderungen

Effekt auf Enzymaktivität

manche werden bei Fix. in Kälte erhalten

Hemmung(?)

Hemmung

Hemmung

manche werden bei kurzer Fix. in Kälte erhalten

Effekt auf Organellen

zerstörend

zerstörend

erhaltend

verzerrend

erhaltend

Färbung mit anionischen Farbstoffen

zufriedenstellend

dürftig

zufriedenstellend

gut

ziemlich dürftig

Färbung mit kationischen Farbstoffen

zufriedenstellen

gut

gut

zufriedenstellend

gut

nur für Abstriche, Schnitte oder kleine Blöcke

nicht

ziemlich gut, aber nicht in Verwendung

dürftig, nie allein in Verwendung

verwendbar

Effekt auf Proteine

allein einsetzbar

4.

Übersicht der Fixative nach dem Untersuchungsziel

„Mikroskopische Technik, Romeis“, Ausgabe 1989, nennt diese Spezialfixantien: Tabelle 6: Fixiermittel Übersicht

5-10% Formalin, neutrales Formalin, Bouin, Schaffer, Zenker

Hämatologie

Helly, Maximow, Zenker

Mitochondrien

Flemming, Zenker

Myofibrillen

Susa

Neurofibrillen

Sannomiya, neutrales Formalin, Bleinitrat-Formalin

Schleim, Knorpel

Sannomiya, neutrales Formalin, Bleinitrat-Formalin

Kalk, Knochen

neutrales Formalin, Schaffer

Glykogen

Gendre

Lipide

Formalin-Kalzium, Kaformacet, Osmieren

61

Histotechnik

Tabelle 5b Glutaraldehyd

Quecksilber chlorid

Dichromation pH < 3,5

Dichromation pH > 3,5

Osmiumtetroxid

0,25-4

3-6

0,2-0,8

1-5

0,5-2

Eindringen

langsam

ziemlich schnell

langsam

ziemlich schnell

langsam

Schwellung

keine

Schrumpfung

keine

gewöhnliche Konzentration

+

+

keine

keine

keine

keine

Härtung

++

++

++

+

+

Effekt auf Proteine

bindet an, nicht koagulierend

bindet an, koagulierend

bindet an, koagulierend

bindet an, koagulierend

bindet an, etwas Extraktion

Effekt auf Nukleinsäuren

leichte Extraktion

Koagulation

Koagulation, teilw. Hydrolyse

etwas Extraktion

leichte Extraktion

Effekt auf Kohlenhydrate

kein (?)

kein

Oxidation

kein

etwas Oxidation (?)

Effekt auf Fette

wie Formaldehyd

Plasmatische Reaktion

Oxidation von Doppelbindungen

langsam unlöslich machend

bindet an, Oxidation von Doppelbindungen

Effekt auf Enzymaktivität

die meisten werden gehemmt

Hemmung

Hemmung

Hemmung

Hemmung

Effekt auf Organellen

gut erhaltend

erhaltend

wahrscheinlich verzerrend

sehr wenig Verzerrung

gut erhaltend

Färbung mit anionischen Farbstoffen

ziemlich dürftig

gut

zufriedenstellend

gut

Acidophilie wechselt zu Basophilie

Färbung mit kationischen Farbstoffen

zufriedenstellend

gut

zufriedenstellend

zufriedenstellend

zufriedenstellend

kaum allein in Verwendung

dürftig

dürftig

dürftig

spezieller Einsatz

allein einsetzbar

Die folgende Tabelle (Tab. 7) wurde direkt aus „histologische Technik, H.C. Burck“ (Erstausgabe 1966) übernommen, um die Vielzahl an Fixierlösungen aufzuzeigen. Die Eignung des Fixativs nimmt mit der Reihung in der Zeile ab. Das Histodiagnostiklabor nutzt wie bereits bemerkt nur mehr eine geringe Anzahl an verschiedenen Fixiermitteln. In Speziallabors und in der Forschung hat jedoch jede optimierte Fixierlösung ihre Berechtigung. Tabelle 7: Fixiermittel Übersichtspräparate

Formalin, Bouin, Zenker, Schaffer

Cytologie (Blut)

Helly, Zenker, Flemming

Plasmastruktur

Helly, Zenker, Maximow

Mitochondrien

Flemming, Zenker, Formalin

Myofibrillen

Sannomiya, Susa

Harnsäure

abs. Alkohol

Lipide

Osmiumtetroxid, Ciaccio, Sulfosalicylsäure

Glykogen

Lison-Vokaer, Karnoy, Alkohol

Mucopolysaccharide

Lillie

Kalk

neutrales Formalin, Alkohol

Neurofibrillen

Cajal (Pyridin)

Knochen

Helly, Formalin, Susa

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Fixierung

Knorpel

Helly, Lillie, Formalin

Blutbildungsorgane

Maximow, Helly

Blutausstrich

Methanol

Muskulatur

Susa, Sannomiya

Nervensystem

Cajal (Brom-Formol), Formalin

Drüsen

Bichromat, sublimathaltiges Fixativ

Aorta, Gefäße

Sannomiya, Lillie, Maximow

Darm

Schaffer, Susa

Niere

Orth

Nebenniere

Bichromathaltiges Fixativ

Hoden

Karnoy, Bouin

Hypophyse

Bouin

Punktionsflüssigkeit

Ether/Ethanol

Elektronenmikroskopie

Osmiumtetroxid, Formalin + Osmiumtetroxid, Glutaraldehyd

Fluoreszenzuntersuchung

Formalin (wenn möglich), keine Metallsalze

D. Andere Formen der Fixierung 1.

Trocknen

Das Entfernen von Wasser hat stabilisierende Wirkung auf das Gewebe, da es eine Denaturierung der Proteine bewirkt. Prinzipiell geschieht bei der Einwirkung von konz. Alkohol oder Aceton dasselbe wie beim Lufttrocknen jedoch ohne das Herauslösen von verschiedenen Substanzen. Lufttrocknen ist nur für dünne Präparate (Abklatsch, Abstrich, Ausstrich, Gefrierschnitt) geeignet, weil es durch die Trocknung zum Zusammensintern der Strukturen kommt. Man lässt bspw. Gefrierschnitte, die für enzymhistochemische Untersuchungen oder für Immunfluoreszenzuntersuchungen hergestellt werden, lufttrocknen. Es kommt dabei zu einer Gewebestabilisierung und Anhaftung an die Glasunterlage. Auch Gewebeabklatsche und Blutausstriche werden zuerst luftgetrocknet. Meist haben die nachfolgenden Färbelösungen auch fixierende Wirkung. 2.

Gefrieren

Beim Einfrieren von Gewebe werden die biologischen Vorgänge gestoppt und das Gewebe verfestigt. Durch diese Stabilisierung wird es schneidbar und sie ermöglicht die Herstellung von mikroskopierbaren Präparaten. Außerdem wird dadurch die Migration von Gewebebestandteilen verhindert. Am besten wäre ein möglichst schnelles Einfrieren, um die Eiskristallbildung zu vermeiden (Schockgefrieren, snap-freezing). Eiskristalle zerstören die Zellstrukturen und wachsen umso größer, je langsamer das Einfrieren vor sich geht. Je höher die Einfrierrate ist umso besser. Eine i deale Einfrierrate von mind. 10.000oC/sek führt zur Bildung einer homogenen, glasartigen Eismasse (Vitrifikation) und die Kristallbildung bleibt günstigerweise aus (im Histolabor wird das nicht erreicht). Das Fixieren durch Gefrieren wird praktiziert beim sogenannten Gefrierschnitt bpsw. zur intraoperativen Schnelluntersuchung (kurz Schnellschnitt) oder auch beim Asservieren von nativen Gewebeproben für spätere Untersuchungen. Die Anforderungen an den Gefriervorgang sind dabei unterschiedlich. Für den Schnellschnitt ist das relativ langsame Einfrieren bei –20°C ausreichend. Es kommt dabei zwar zur Eiskristallbil-

63

Histotechnik

dung. Die morphologischen Veränderungen sind jedoch nicht so dramatisch, weil die Strukturen ihre Plätze beim Auftauen wieder einnehmen. Proben für molekularbiologische Untersuchungen müssen dagegen schockgefroren werden. Beim Schockgefrieren auf –196oC in flüssigem Stickstoff besteht die Gefahr des Leidenfrost’schen Phänomens. Das ist die Bildung eines Gasmantels rund um das Gewebe beim Aufeinandertreffen des „warmen“ Gewebes und der Kühlflüssigkeit. Der Gasmantel führt zu einer gewissen Isolierung gegenüber der Kältewirkung. Auch soll der „Kälteschock“ tatsächlich zu groß sein für die Zellen. Experten empfehlen deshalb das Gefrieren in der Gasphase von flüssigem Stickstoff (–170°C), wobei sich das Gewebe innerhalb eines dicht-schließenden Cryoröhrchen umgeben von Gefriermedium befindet. Ein Kühlmittel, wo das Leidenfrost’sche Phänomen nicht auftritt ist z.B. Isopentan. Es wird mit flüssigem Stickstoff auf –160oC gekühlt. In das noch flüssige Isopentan wird das Proberöhrchen versenkt. Bei einer anderen Methode wird das Gewebe zuerst mit Gefrierschutzmittel durchtränkt und dann langsam eingefroren. Geeignete Mittel sind DMSO, Glycerol, Propylenglykol und Sucrose nach best. Rezepturen. Die Durchtränkung erfolgt über mind. 12 Std. bei Kühlschranktemperatur (4oC). Tiefgefrorene Proben werden transportiert, indem man die Gefäße in isolierende Kühlbehälter, die mit Kohlensäureschnee (–80oC) gefüllt sind, stellt. So soll die Kälte mind. einen Tag erhalten bleiben. Zur langfristigen Lagerung von tiefgefrorenem Gewebe verwendet man Tiefkühlbehälter für flüssigen Stickstoff, in die man die Proben versenken kann, bzw. Tiefkühlgeräte bei –80°C. Eine Lagerung bei –20°C ist für Spezialuntersuchungen (RNANachweis) nicht zu empfehlen. Tabelle 8: Gefriermittel Stickstoff farb-, geruch- und geschmacklos leichter als Luft (ab T > 5°C) flüssig bei –210 bis –196oC inert (unbrennbar und reaktionsträge) extrem trocken und wenig wasserlöslich

Kohlendioxid farblos mit schwach säuerlichem Geschmack und Geruch schwerer als Luft Sublimationspunkt bei –80oC inert (unbrennbar und sehr beständig) höhere Wasserlöslichkeit als Stickstoff

Isopentan farblose Flüssigkeit mit charakteristischem Geruch schwerer als Luft flüssig bei –160° bis 28°C Gemische mit Luft sind explosibel nicht in Wasser löslich

Es stehen automatisierte Methoden zum Schockgefrieren für morphologische Untersuchungen zur Verfügung (z.B. GentleJane, Cryobath) GentleJane Schnelleinfrier-System (Abb.30): Ein Energieabsorber aus massivem rostfreiem Stahl wird in flüssigem Stickstoff auf –196°C abgekühlt und auf die einzufrierende Probe platziert. Der Energieabsorber kühlt die Probe auf eine ultra niedrige Temperatur. Ein Mechanismus sichert den ständigen Kontakt zur Probe. Das Einfrieren dauert 8 bis 10 Sekunden. Abb.30 GentleJane Fa. Instumedics

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Fixierung

Eine einfache Methode zum Schnelleinfrieren und gleichzeitigem Herstellen von Gefrierblöcken: Auf einem soliden Block von Kohlensäureschnee (–80°C) wird ein Ausgießschälchen aus Kunststoff (Tissue-Tek) gelegt. Dahinein gießt man Cryogel (OCT) und platziert das einzufrierende Gewebe in der fester werdenden Masse. Das Cryogel wird vorher durch Umrühren von Luftblasen befreit. Die fertigen Blöcke werden bei –80°C gelagert. Bei der Verwendung von flüssigem Stickstoff als Kühlmittel wird das Cryogel brüchig und die Handhabung wird schwieriger. 3.

Gefriertrocknen

Bei der Gefriertrocknung kommt es nach dem Schockgefrieren zum Absublimieren des Gewebswassers. Dazu wird das tiefgefrorene Gewebe langsam unter Vakuum auf -40°C erwärmt. Das Eis geht dabei gleich von der festen in die gasförmige Phase über (Sublimation). Der Wasserdampf wird in einem Kondensator aufgefangen. Das Gewebe kann im Weiteren unter Vakuum mit Paraffin durchtränkt werden und auf dem üblichen Weg geschnitten werden. Die Gefriertechnik für die Elektronenmikroskopie erfordert besondere Maßnahmen. Wird ein Gewebsstück zur Gefriertrocknung oder Gefriersubstitution vorbereitet, soll es nicht dicker als 0,2 mm sein. Das Einfrieren kann bei Normaldruck oder Hochdruck (mehrere Kilobar) geschehen. Der hohe Druck wirkt der Eiskristallbildung und -ausdehnung entgegen und führt zu Vitrifikation. Vorteile und Anwendungen dieser Technik: • Erhalt der enzymatischen Aktivität • Erhalt von antigenen Strukturen • Erhalt von niedermolekularen, wasserlöslichen Substanzen • Möglichkeit zur RNA-Darstellung durch ISH • Bewahrung von Ultrastrukturen, Zellorganellen, Membrandarstellungen (Elektronenmikroskopie) • Blitzlichtaufnahme von Zellvorgängen durch Schockgefrieren im ms-Bereich • Bestandteil der Gefrierätz-Technik für Elektronenmikroskopie • Lyophilisieren von Pharmazeutika, Lebensmitteln zum Haltbarmachen 4.

Gefriersubstitution

Bei der Gefriersubstitution erfolgt die Entfernung des Gewebswassers durch Einbringen der gefrorenen Stücke in wasserentziehende, tiefgekühlte Reagenzien wie z.B. Ethanol oder Aceton unter –49°C für 1–2 Wochen. Das organische Lösungsmittel löst bei dieser Temperatur das Eis, aber koaguliert die Proteine nicht. Sobald die Dehydrierung abgeschlossen ist, wird die Temperatur für wenige Stunden auf 4°C erhöht, um die Koagulation zu ermöglichen. Anschließend erfolgt die Einbettung in Paraffin über ein Zwischenmedium. (Automatisierte Gefriersubstitution für die EM Abb.31)

Abb. 31 Leica EM AFS2

Histotechnik

5.

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Bedampfen

Sehr kleine oder dünne Präparate können auch durch Bedampfen mit Osmiumtetroxid oder Formaldehyd fixiert werden (2–24 Std., feuchte Kammer). Diese Methode wird aber äußerst selten angewandt (Studien von Monoaminen). 6.

Phasentrennung

Dabei wird das Präparat in eine Flüssigkeit gebracht, die sich nicht mit Wasser mischt, z.B. eine Glutaraldehydlösung in Heptan. Glutaraldehyd diffundiert von der Lösungsmittelphase in die wässrige Phase der Zell- bzw. Gewebsflüssigkeit, ohne die Ionenverteilung zu beeinflussen. Das Lösungsmittel extrahiert weniger Proteine und freie Aminosäuren, als bei einer üblichen Immersionsfixierung. 7.

Mikrowelle

Die mikrowellenunterstützte Fixierung ist im Kapitel Mikrowellentechnik genauer beschrieben. Ein Geräte zur Gewebeschnelleinbettung (Continuous Rapid Tissue Processing, Fa. Sakura) verspricht eine adäquate Fixierung von bis zu 2 mm dicken Gewebestücken innerhalb von 15 min. Die Gewebekassetten werden dabei über vier Retorten im 15Minuten-Takt bis zur Paraffineinbettung geführt. Die Fixierungsretorte enthält kein Formaldehyd sondern eine Mischung aus Aceton, Isopropanol und Polyethylenglykol. Weiters werden die Proben der Mikrowellenanregung und Durchmischung ausgesetzt (siehe Einbettungstechnik).

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Verarbeitung von hartem Gewebe

Verarbeitung von hartem Gewebe A. Dekalzifikation – Entkalkung............................................................................68 1. Entkalkung durch Säure............................................................................68 2. Entkalkung durch Chelatbildung ..............................................................69 3. Prüfung der Entkalkung ............................................................................71 4. Vor- bzw. Nachbehandlung ......................................................................71 5. Beschleunigung der Entkalkung ...............................................................72 6. Erweichen von Knorpel und Horn (Nägel, Haare).....................................72 7. Einbettung................................................................................................72 8. Schneiden.................................................................................................73 9. Oberflächenentkalken ..............................................................................73 10. Färbung entkalkter Proben.......................................................................73 11. Untersuchungsmaterial im Histodiagnostiklabor ......................................74 B. Mazeration ......................................................................................................75 C. Hartschnitttechnik – Hartschlifftechnik ............................................................76 1. Geräte zur Präparatherstellung.................................................................76 2. Beispiele für Knochenverarbeitung ..........................................................77 3. Färbungen an unentkalkten Schliffpräparaten..........................................78 4. Färbungen an Methacrylatschnitten von unentkalkten Knochenbiopsien .........................................................79 5. Fluoreszenz-Markierung in Knochen.........................................................79 6. Autoradiografie ........................................................................................80 7. Kontaktradiografie....................................................................................80 8. Histomorphometrische Methoden am unentkalkten Knochen .................80

67

Histotechnik

Verarbeitung von hartem Gewebe Die Geräte und Techniken der Routinehistologie sind auf ein gewisses Maß an G ewebehärte eingestellt. Von den meisten Gewebetypen können Paraffinschnitte mit den üblichen Mikrotomen hergestellt werden. Gewebe, das aus diesem Rahmen fällt, ist Knochengewebe bzw. kalkhartes (verkalktes) Gewebe. Knochen ist zusammengesetzt aus organischen (30%) und anorganischen (70%) Komponenten. Den größten Anteil des organischen Materials stellt das Kollagen dar. Weiters findet man andere Proteine, die von den Osteoblasten synthetisiert werden (Osteocalcin, Osteonectin). Der zelluläre Anteil wird von den Osteoblasten (Knochenaufbau), Abb.32 anorganische Osteoklasten (Knochenabbau) und den Osteozyten (versorgen Knochensubstanz umgebenden Knochenbezirk) gebildet. Der Hauptanteil an anorganischer Substanz wird von Hydroxyapatit mit der Formel Ca10(PO4)6(OH)2 ausgemacht. Kleine Mengen von Magnesium, Fluor, Kalium, Carbonaten und Citraten finden sich ebenfalls (Abb.32).

Abb.33

Anatomisch unterteilt man Knochengewebe in kompakten Kortikalknochen (sehr dichte Struktur) und spongiösen Knochen (Wirbelkörper, Epiphyse der langen Knochen). Der spongiöse Knochen entsteht durch Umbau und Abbau mit Hilfe der Osteoklasten und -blasten. In Abhängigkeit von Zug- und Druckkräften bei der mechanischen Belastung bildet sich eine typische Trabekelverteilung (Abb.33). Im spongiösen Knochen findet man das eingelagerte, hämatopoetische Knochenmark mit den blutbildenden Zellen.

Beispiele von Knochen-Proben im histodiagnostischen Labor: Extremitäten bei Amputationen, Hüftkopf, Kieferknochen, Beckenkammstanzen (Knochenmarkbiopsie) Mögliche Zuweisungsdiagnosen: Osteomyelitis, Arthritis, traumatische Fraktur, nekrotische Veränderungen, Osteomalazie, Osteoporose; In verkalkten Strukturen kommt es zur Anlagerung oder Einlagerung von Kalziumsalzen. Dies kann bei pathologischen Vorgängen alle Weichteilgewebe betreffen. Die Verkalkungen werden mittels Röntgen- und Ultraschalluntersuchung aufgedeckt. Beispiele: verkalkte Herzklappen, Gefäße; Mikroverkalkungen in der Mamma. Sehr wichtig für die ordnungsgemäße, histologische Knochenverarbeitung ist die ausreichend gute Fixierung. Das Mengenverhältnis zwischen Gewebe und Fixierflüssigkeit soll mindestens 1:20 betragen. Die Fixierzeit soll mindestens 12 Std., besser 48 Std. (je nach Größe) betragen. Günstig ist es größere Stücke mittels Bandsäge in 5 mm dicke Scheiben zu schneiden. Die Kompaktheit dieser Gewebeart behindert die Durchdringung mit Fixierflüssigkeit. Liegt das Hauptaugenmerk bei der Diagnosefindung nicht auf dem mineralisierten sondern auf dem organischen und zellulären Anteil des Knochengewebes, müssen zur optimalen Darstellung die anorganischen Substanzen herausgelöst werden. Das Knochengewebe wird dadurch erweicht und mit den üblichen histologischen Routinemethoden schneidbar gemacht. Den Vorgang nennt man Dekalzifikation oder Entkalkung.

68

Verarbeitung von hartem Gewebe

A. Dekalzifikation – Entkalkung Der Hauptbestandteil von Knochengewebe, Hydroxyapatit, liegt im nassen Zustand im Gleichgewicht mit seiner gesättigten Lösung vor. Die gesättigte Lösung enthält sehr wenige Ionen dieses schwerlöslichen Salzes. Ca10(PO4)6(OH)2 ļ 10Ca2+ + 6PO43- + 2OHWenn die Kalzium-, Phosphat- oder Hydroxy-Ionen kontinuierlich von der rechten Seite entfernt werden, wird das Reaktions-Gleichgewicht nicht erreicht. Die Reaktion wird solange von links nach rechts ablaufen, bis der Apatit aufgelöst ist. 1.

Entkalkung durch Säure

Besteht in der umgebenden Flüssigkeit eine hohe Konzentration an Wasserstoffionen wird die Reaktion H+ + OH- ļ H2O mit den Hydroxy-Ionen des gelösten Apatits ablaufen und sie damit der oberen Reaktion entziehen. Als Quelle für Wasserstoffionen benötigt man eine starke Säure. Am gebräuchlichsten sind Ameisensäure, Salpetersäure und Salzsäure: Ca10(PO4)6(OH)2 + 20H+ + 20Cl

ļ

10Ca2+ + 20Cl

+

6H3PO4 + 2H2O

Ca10(PO4)6(OH)2 + 20H+ + 20NO3

ļ

10Ca2+ + 20NO3

+

6H3PO4 + 2H2O

Ca10(PO4)6(OH)2 + 20HCOOH

ļ

10Ca2+ + 20HCOO

+

6H3PO4 + 2H2O

Das Kalzium aus dem Knochengewebe findet sich wieder als gelöste Kalzium-Ionen in der Entkalkungsflüssigkeit. Die Entkalkungsflüssigkeit soll regelmäßig gewechselt werden. Ist die Entkalkung abgeschlossen, darf man in der letzten Portion keine Kalzium-Ionen mehr nachweisen können (Ammoniumoxalat-Test). Die Säure wirkt nicht nur auf den Apatit, sondern allgemein auf das Gewebe. Es kommt zur Hydrolyse der Nukleinsäuren und einer daraus resultierenden schlechten Anfärbbarkeit mit Hämatoxylin. Auch für quantitative DNA-Messungen ist säureentkalktes Gewebe ungeeignet. Weiters hemmt die Säure die Wirkung der meisten Enzyme. Bei der Einwirkung von Säure auf Carbonate entsteht Kohlendioxid, das in winzigen Bläschen aus dem Gewebe diffundiert. Sofern die Probe gut fixiert wurde und dadurch gegen osmotische Einflüsse unempfindlich gemacht wurde, kommt es zu keiner starken morphologischen Veränderung. Voraussetzung ist die Kontrolle des Entkalkungsvorganges, um eine zu lange Einwirkung der Säure zu vermeiden. Starke Säuren entkalken in 24–48 Std., schwache Säuren benötigen 9–10 Tagen.

69

Histotechnik

Entkalkerflüssigkeiten schwache Säuren:

Essigsäure und Pikrinsäure wirken als Bestandteil von Fixierlösungen schwach entkalkend. Zitronensäure

starke Säuren:

organisch:

Ameisensäure (mit pH 1,5–3,5; ca. 8% wässrig) Milchsäure Trichloressigsäure

anorganisch: Salpetersäure (5–10% wässrig) Salzsäure (5–10% wässrig) •

Salpetersäure entkalkt schneller als Ameisensäure, verursacht dadurch aber auch schneller Hydrolyse der Nukleinsäuren und sollte nicht länger als 48 Std. einwirken.

•

Üblicherweise dauert die Entkalkung eines 5 mm Würfels von spongiösem Knochengewebe 3–5 Tage (Culling 1974). Die Flüssigkeit sollte alle 24 Std. gewechselt werden.

•

Das Mengenverhältnis von Gewebe zu Entkalker soll 1:20 betragen.

•

Die Reaktionstemperatur ist üblicherweise Raumtemperatur. Dekalzifizierlösung nach Clark: 250 ml .................. Ameisensäure (90%) 750 ml .................. Aqua dest. 34 g ................... Natriumformiat (HCOONa)

pH = 2,0; minimiert die Verschlechterung der Kernanfärbbarkeit ; extrahiert wenig Proteoglykane vom Knorpel bei diesem pH. Einige Lösungen enthalten Alkohol oder Formaldehyd, um bei mangelhafter Fixierung dies während der Entkalkung auszugleichen. Dekalzifizierlösung nach Gooding und Stewart: 100–250 ml .......... Ameisensäure (90%) 100 ml .................. Formaldehyd (36–40%) auf 1000 ml mit Aqua dest auffüllen. Es werden solche Entkalkungslösungen und Schnellentkalker auch im Handel mit unterschiedlicher Zusammensetzung angeboten. 2.

Entkalkung durch Chelatbildung

Ein Chelatbildner ist eine organische Verbindung, die fähig ist, sich mit einem Metallion zu einem Metall-Chelat zu verbinden. Im Chelat ist das Metallatom kovalent innerhalb eines Fünfer- oder Sechserringes gebunden. Chelate sind stabile Moleküle, die das Metallion nicht leicht wieder abgeben. Ist nun das chelatbildende Reagens im Überschuss vorhanden, wird es in einer Lösung, die Metallionen enthält, diese binden. Abb.34 EDTA-Chelatbildung

70

Verarbeitung von hartem Gewebe

Ethylendiamintetraacid (EDTA) bildet mit Natrium und den anderen Alkalimetallen normale Salze. In Kontakt mit allen anderen Metallen, wie auch mit Kalzium, entstehen aber stabile, trotzdem lösliche Chelatverbindungen (Abb.34). Befindet sich ein Knochenstück in EDTA-Lösung, werden die freien Kalziumionen durch EDTA gebunden. Um das Reaktionsgleichgewicht zwischen ungelöstem und gelöstem Apatit wieder herzustellen, werden Kalziumionen aus dem Knochen ständig freigegeben, bis der Apatit gänzlich aufgelöst ist. Wasserstoffionen spielen bei dieser Reaktion keine Rolle. Das Reaktionsoptimum verläuft im schwach alkalischen Bereich. So werden auch Nukleinsäuren und Enzyme nicht beeinflusst. Ein allzu hoher pH wäre wegen der Extraktion von Proteoglykanen nicht vorteilhaft. EDTA entkalkt um ein Vielfaches langsamer aber viel schonender als Säuren. Knochenbiopsien benötigen ca. 3–4 Tage zur Entkalkung, kortikale Knochenproben benötigen ca. 6–8 Wochen. EDTA - Entkalkerflüssigkeiten Dinatrium-EDTA-Lösung: 5 oder 10 g............Dinatrium Ethylendiamintetra-acetat (Salz) in 100 ml ...................Aqua dest. 4 % NaOH Lösung zugeben bis zu einem pH zwischen 7 und 8 Ammonium-EDTA-Lösung: 14 g ......................EDTA (Säureform) 9 ml .....................Ammoniumhydroxidlösung 28–30% 76 ml .....................Aqua dest. Mischen bis zu Lösung; Ammoniumhydroxid zugeben bis zu einem pH von 7,1 Tris-gepufferte 10% EDTA-Lösung TRIS = Tris(hydroxymethyl)aminomethan pH = 7,2 Chelatbildende Entkalkerflüssigkeiten sind auch im Handel erhältlich. •

Ammonium-gepufferte EDTA-Lösungen sollen 3x schneller entkalken als die erste Lösung.

•

Die Kalziumionen sinken in der Entkalkerflüssigkeit zu Boden. Deshalb ist eine Agitation mittels Magnetrührer oder Luftblasen von Vorteil.

•

Die EDTA-Lösung soll alle 3–5 Tage gewechselt werden.

•

Das Mengenverhältnis von Gewebe zu Entkalker soll 1:20 betragen.

•

EDTA-Salze präzipitieren in alkoholischen Lösungen. Deshalb soll nach dem Entkalken eine Wässerung angeschlossen werden.

•

Reaktionstemperatur ist üblicherweise Raumtemperatur.

•

Für mehrere kleine Proben erscheint es günstig, diese in beschrifteten Kunststoffkassetten in die Entkalkerlösung zu bringen und die Durchmischung mit Magnetrührer vorzunehmen.

Histotechnik

71

3.

Prüfung der Entkalkung

•

Bei größeren Gewebeproben kann man die Schneidbarkeit an einer unwichtigen Stelle prüfen.

•

An einem gleichgroßen Vergleichsstück kann man die Entkalkung durch Einschneiden prüfen. Man nimmt an, dass das Probenstück ebenso entkalkt ist wie die Kontrolle.

•

Ammoniumoxalat-Test: Bei kontinuierlichem Wechsel der Entkalkungsflüssigkeit dürften in der vermeintlich letzten Portion keine Kalziumionen mehr zu finden sein. Ammoniumoxalat bildet in einer alkalischen Lösung mit Kalzium ein unlösliches Salz. Diese Eigenschaft nützt man zur Prüfung aus. Der Test ist sowohl für säureentkalkte als auch EDTA-entkalkte Stücke geeignet. 1. 2. 3.

Man entnimmt 5 ml der gebrauchten Entkalkerlösung und gibt tropfenweise Ammoniumhydroxid zu bis zu einem pH>7. 5 ml einer wässrigen, gesättigten Ammoniumoxalat-Lösung (ca. 3%) zugeben. 30 min stehen lassen; Tritt eine Trübung durch Kalziumoxalat auf, sind noch Kalziumionen vorhanden. Die Entkalkung muss fortgesetzt werden.

•

Mit einem zur Verfügung stehenden Röntgengerät kann man die Gewebedichte prüfen.

4.

Vor- bzw. Nachbehandlung

Je nach verwendeter Fixierlösung und Entkalkerlösung muss man folgende Punkte bedenken: •

Dichromationen werden durch Ameisensäure reduziert.

•

Phosphatpuffer von neutralgepuffertem Formalin wirkt der Säurewirkung entgegen.

•

Quecksilber und Zinkionen bilden Chelatverbindungen mit EDTA.

Um das zu vermeiden, soll vor der Entkalkung ausgiebig gewässert werden. Im Anschluss an die Entkalkung soll man folgende Punkte bedenken: •

EDTA bildet in alkoholischen Lösungen unlösliche Präzipitate.

•

Entkalkerflüssigkeiten, die HCl enthalten, können mit Formaldehyd giftige Dämpfe entwickeln.

Um das zu vermeiden, soll nach dem Entkalken ausgiebig gewässert werden. Um ein Quellen der Kollagenfasern während des Wässerns zu verhindern muss der Knochen vorher in eine 5%ige Natrium- oder Lithiumsulfatlösung gebracht werden. Für die Routinehistologie, wo die meisten Präparate ca. 12–24 Std. in Formalin fixiert werden, dann für meist 6–48 Std. z.B. mit 5% Salpetersäure entkalkt werden und anschließend in einen Einbettungsautomaten (beginnend mit Formalin) überführt werden, bringen diese Wässerungen keine signifikanten Vorteile.

72 5.

Verarbeitung von hartem Gewebe

Beschleunigung der Entkalkung

Nachdem die Entkalkung einen Hemmschuh in der schnellen Verarbeitung darstellt, ist man bemüht, Techniken zur Beschleunigung zu finden. Wenn man allerdings die Geschwindigkeit überbewertet, kann es auf Kosten der guten Anfärbbarkeit und antigenen Eigenschaften des Gewebes gehen. Eine Erhöhung der Konzentration des Entkalkers führt zur schnelleren Entkalkung, aber auch zu einer vermehrten Gewebeschädigung. Eine Möglichkeit besteht darin, das Gewebe zu erwärmen, wobei auch hier die Gefahr von Gewebeschädigung besteht. Im Speziellen werden mikrowellen-unterstützte Prozeduren angeboten, die die Geschwindigkeit der Dekalzifizierung verzehnfachen sollen. Kok und Boon raten die Temperatur bei 37oC zu halten. Es gibt aber auch Mikrowellenprotokolle für 50oC. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die Reaktion durch Ultraschall zu beschleunigen. Durch die Ultraschalltechnik werden schnell und zielgerichtet kristalline Strukturen der Knochensalze zertrümmert. Dadurch soll eine rasche und zellschonende Entkalkung mit geeigneten Lösungen durchgeführt werden. Verkürzungen der Entkalkungszeit um bis zu 75% sollen erreicht werden (Abb.35). Eine aus der Mode gekommene Methode ist die Elektrolyse unter Anlegen von Spannung in der Entkalkerflüssigkeit.

Abb.35 Ultraschall-Entkalker Fa. Medite

Fragliche Mittel zur Beschleunigung: Durchmischung (Magnetrührer, Luftblasen), Vakuumbehandlung. 6.

der

Entkalkerflüssigkeit

Erweichen von Knorpel und Horn (Nägel, Haare)

Diese Materialen sind bis zu einem gewissen Grad auch durch Entkalkerflüssigkeiten zu erweichen. Knorpel ist weitgehend aus makromolekularen Kohlenhydraten aufgebaut, aber enthält auch öfters unlösliche Kalziumsalze. Mögliche Lösungen zum Erweichen von Fingernägeln: alkalische Hypochloritlösung; 10% Kalilauge, 5% Phenol-Lösung und – sehr innovativ – Haarentfernungslotion aus der Kosmetik. 7.

Einbettung

Entkalkte Proben der Routinehistologie werden in derselben Weise wie alle anderen Materialien dehydriert und mit Paraffin infiltriert (siehe Einbettungsprozess). Größere kompakte Knochenstücke erfordern für eine adäquate Einbettung verlängerte Zeiten, die man einerseits über eigene Programme der Automaten, andererseits durch händische Einbettung erreicht (Speziallabors). Unvollständige Einbettung macht sich durch kreidiges, matschiges und bröckeliges Verhalten beim Schneiden bemerkbar. Hartes Gewebe soll beim Ausgießen im Block so orientiert sein, dass die Längsseite parallel zur Schneiderichtung liegt.

Histotechnik

8.

73

Schneiden

Trotz Entkalkung kann sich das Schneiden schwierig gestalten, da die dichten, kollagenen Strukturen sehr derb sind. Von Vorteil sind hier stabile, moderne Mikrotome ausgestattet mit Messern bzw. Einmalklingen (high-profile) für hartes Gewebe. Gut gekühlte Blöcke unterstützen durch das festere Paraffin die Schnittgewinnung. Die Schnittdicke entspricht der von Weichgewebe. Oft werden auch erst beim Schneiden kleine, verkalkte Einschlüsse bemerkt, die typischerweise streifige Muster am Schnitt hinterlassen. Manche winzige Kalkpigmente sind überhaupt erst am gefärbten Schnitt erkennbar und stellen sich beim HE-Schnitt blau dar. Entkalktes Gewebe neigt leider zum Abschwimmen von den Objektträgern. Mit Adhäsiv beschichtete Objektträger sind hier vorteilhaft. Kommt es zum Aufrollen des Schnitts am Objektträger ist ein Antrocknen über Nacht bei 37°C in waagrechter Lage anzuraten. 9.

Oberflächenentkalken

Darunter versteht man die Einwirkung von Säuren auf die Oberfläche von bereits in Paraffin eingeblocktem Gewebe. Wenn bei der Herstellung der Paraffinschnitte Probleme auftreten, weil man auf versteckte Kalkeinschlüsse trifft, oder die Entkalkung einfach zu kurz war, kann man sich mit Oberflächenentkalken behelfen. Die oberflächliche Paraffinschicht wird beim Anschneiden entfernt. Günstig ist es auch das Paraffin durch eine Pinzette vorsichtig abzukratzen. Nun kann man das Gewebe für kurze Zeit (ca. 15 min) mit konzentrierter Ameisensäure bedecken oder den Block mit der Oberfläche nach unten in die Säure legen. Das genügt, um die oberste Schicht zu entkalken und einen Schnitt zu gewinnen. Die Qualität wird dabei aber nicht überragend sein. Bei der Verwendung von Stahlmessern ist zu bedenken, dass die Säure die Schneide zerstört und deshalb sorgfältig abgewaschen werden soll. 10. Färbung entkalkter Proben Als Übersichtsfärbung wird wie für alle histologischen Präparate eine HämatoxylinEosin-Färbung durchgeführt, die die Beurteilung der morphologischen Veränderungen durch Degeneration, Entzündung u.ä. zulässt. In der Routine wird meist kein Unterschied bei der Färbung von entkalkten und nichtentkalkten Proben gemacht, obwohl die Säureeinwirkung auf das Gewebe längere Kernfärbungen (doppelte Dauer) erfordern würde. Durch Behandlung mit 4–5% Natriumbicarbonatlösung für 10 min bis 2 Std. kann man die Kernfärbbarkeit wieder restaurieren. Die meisten Färbeprotokolle für Weichgewebe sind ohne Modifikation auf entkalktes Gewebe anzuwenden. Bindegewebsfärbungen werden zur Darstellung von Kollagenfasern (Trichromfärbungen), Knorpel (modifiziertes Alcianblau, Methylenblau), Zwischensubstanzen (PAS) und Gitterfasern (Versilberung) durchgeführt. (siehe histolog. Färbung). Zu den speziellen Knochenfärbungen gehört die Holmes Silberimprägnation oder die Pikrothioninmethode nach Schmorl zur Darstellung der Kanälchen und Hohlräume.

74

Verarbeitung von hartem Gewebe

Enzymhistochemie wird durch die Säurewirkung oft verhindert, hier ist Entkalkung mit EDTA erforderlich. Immunhistochemie wird meist nach den üblichen Protokollen für Paraffinschnitte durchgeführt. Wichtig ist hier die vollständige Fixierung bevor die Entkalkungsreagenzien auf das Gewebe einwirken, um die Antigene möglichst gut zu erhalten. 11. Untersuchungsmaterial im Histodiagnostiklabor 11.1. Beckenkammstanzen Indikation Bei Verdacht auf eine Erkrankung des blutbildenden Systems muss u.U. eine Knochenmarkbiopsie zur Diagnosesicherung herangezogen werden. Der Pathologe erhält damit Auskunft über die allgemeine Zellzahl, über das quantitative Verhältnis und die lokale Verteilung der Blutbildungsreihen und über Reifungsstörungen. Das Ergebnis sollte mit dem Peripherblutbild korrelieren. Entnahme Bei der Entnahme am hinteren Beckenkamm gewinnt man einen Knochenmarkzylinder (2–3 mm dick, 20–30 mm lang) mit Hilfe der "Jamshidi-Nadel" (Abb.36). Bei der Gewinnung sollte die Nadel den Markraum nicht tangential trefAbb.36 fen, sonst könnte das Präparat mehrheitlich aus Knochen bestehen, was die Beurteilung nachteilig beeinflusst. Je nach der vorgesehenen Einbettungsmethode erfolgt die Fixierung der Biopsie (z.B.: 4–10% neutral gepuffertes Formaldehyd). Unmittelbar nach der Biopsiegewinnung erfolgt die Aspiration des Knochenmarks zur Herstellung der hämatologischen Ausstriche. Verarbeitung Man kann bei der Verarbeitung von Beckenkammstanzen zwischen Paraffin- bzw. Kunststoffeinbettung wählen. Für die Paraffineinbettung muss der Knochenmarkzylinder nach ausreichender Fixierung (mind. 12–24 Std.) entkalkt werden. Dies kann gepuffertem EDTA (pH 7,4) über 3–4 Tage erfolgen, oder man schonend mit tris-g wählt eine schnellere Methode mittels Ameisensäure für 6-10 Std. Beschleunigt man die Entkalkung durch Wärme, sollte man 45°C nicht überschreiten. Weiters kann die Biopsie in derselben Weise wie die anderen Biopsien den Einbettungsprozess durchlaufen und in Paraffin ausgegossen werden. Entkalkte Beckenkammstanzen können an den üblicherweise für die Routine verwendeten Mikrotomen geschnitten werden. Die dichten Strukturen im hämopoetischen Mark erfordern sehr dünne Schnitte von 1 µm Dicke. Die Entkalkung mittels Ameisensäure soll Vorteile für immunhistochemische Darstellungen bringen. Der aussagekräftige Nachweis von Enzymen (Napthol-AS-D-Chloracetatesterase) ist dann allerdings aufgrund des einwirkenden niedrigen pH’s nicht möglich. Dieses Thema bietet immer noch Grund für Diskussionen und spaltet die Untersucher in zwei Lager der „neutralen“ und der „sauren“ Entkalker. Für die Kunststoffeinbettung ist keine Entkalkung notwendig. Die Härte des umgebenden Materials unterstützt die Gewinnung von dünnen Gewebsschnitten, an denen

Histotechnik

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auch enzymhistochemische Test durchgeführt werden können. Man bedient sich am besten eines Einbettungskits (Technovit). Dabei wird das Gewebe mit monomeren Glycolmethacrylat durchtränkt und anschließend die Polymerisation mittels Aktivator in Gang gesetzt. Die ausgehärteten Blöcke werden an stabilen Mikrotomen geschnitten. Färbungen Als Übersichtsfärbung wird eine Hämatoxylin-Eosin-Färbung durchgeführt. Um die gewünschten Informationen über die blutbildenden Zellen und die umgebenden Strukturen zu erhalten, benötigt man verschiedene Spezialfärbungen. Dazu gehören: Giemsa-Färbung, Eisen-Nachweis (Berliner-Blau), Gitterfaserfärbung, PAS-Reaktion, Naphtol-AS-D-Chlorazetatesterase, Saure Phosphatase. Die genauen Färbeprinzipien kann man im Kapitel „histologische Färbung“ bzw. „Enzymhistochemie“ nachlesen. Immunhistochemische Färbungen nehmen auch in der Knochenmarkshistologie einen zunehmend wichtigen Teil der Diagnostik ein. 11.2. Operationspräparate von Knochen Amputierte Extremitäten werden aufgrund ihrer Größe unfixiert in die Pathologie gebracht. Können sie nicht sofort verarbeitet werden, müssen sie bei Kühlschranktemperatur aufbewahrt werden. Aus den Läsionen werden Proben entnommen und der Großteil des restlichen Amputats verworfen. Zur Gewinnung von Knochenproben muss ein entsprechendes Stück herausgesägt werden. Mit einer Bandsäge wird der Knochen in 5 mm dicke Scheiben geschnitten, um den Zugang der Reagenzien optimal zu ermöglichen. Nach ausreichend langer Fixierung erfolgt die Entkalkung durch Säure, bis der Knochen schneidbar wird. Hüftkopfpräparate sind relativ häufige Einsendungen. Hier wird ebenfalls mittels Bandsäge eine Scheibe herausgesägt, fixiert und entkalkt. 11.3. Verkalkte Operationspräparate Die häufigsten Proben dieser Art sind verkalkte Herzklappenanteile und Schilddrüsenpräparate. Nach adäquater Fixierung erfolgt die Entkalkung mit Säure. Hier wird darauf geachtet, wenn möglich, für die Untersuchung kalkfreies Gewebe zu gewinnen, das der zerstörerischen Säureeinwirkung nicht ausgesetzt werden muss. 11.4. Behandlung von Zahnmaterial Zahnschmelz besteht fast zur Gänze aus Kalziumsalzen mit einem dünnen Netzwerk von Proteinen, das normalerweise nach der Entkalkung zusammenfällt. Die Fixierflüssigkeit sollte deshalb stark vernetzend wirken. Burck empfiehlt zur Entkalkung konzentrierte Ameisensäure 1:1 mit 70% Alkohol gemischt.

B. Mazeration Um nur den anorganischen Bestandteil des Knochens zu bewahren und den organischen Teil zu entfernen, fertigt man ein Mazerationspräparat an. Dies geschieht entweder durch Aufkochen des Knochens in einer Sodalösung oder durch Einwirkung von Enzymen. Das verbleibende Trabekelgerüst (siehe Abb. 32) wird mittels Dünnschlifftechnik mikroskopierbar dünn geschliffen.

76

Verarbeitung von hartem Gewebe

C. Hartschnitttechnik – Hartschlifftechnik Will man beide Komponenten des Knochengewebes (organische und anorganische) erhalten, muss man sich einer aufwendigeren Technik bedienen. Beispiele der Anwendung sind die Untersuchung von Knochenimplantaten und ihrer Wirkung auf das Knochengewebe, Untersuchung von Zähnen, Präparateherstellung für die Mikroautoradiografie z.B. von Kieferknochen. Mögliche Fragestellungen sind renale Knochendystrophie, Osteoporose und Osteomalazie. Ein Grund für die Wahl dieser Technik ist auch, dass die nachteilige Wirkung der Entkalkung auf Enzyme und antigene Strukturen umgangen wird. Dadurch ist sie auch attraktiv für die Verarbeitung von Knochenmarkbiopsien. Meist wird das Gewebe auch hier nach der Fixierung in ein Medium eingebettet. Paraffin wäre viel zu weich für die Herstellung dieser Präparate. Kunststoffe (Methacrylate) bieten die benötigte Konsistenz und ähnliche Härte wie das Knochengewebe selbst. Dabei erfolgt zuerst eine Durchdringung des Gewebes mit der monomeren Flüssigkeit, und dann eine Anregung zur Polymerisation mittels Initiator (Reagens, UVLicht; siehe Einbettungsprozess). Am gebräuchlichsten sind Methylmethacrylate (MMA) aber auch die etwas weicheren Glycolmethacrylate (GMA). Manche Proben können auch direkt ohne Vorbehandlung bis zu einer gewissen Dicke gesägt oder geschliffen werden (Zähne). Eine weitere Alternative bietet die Herstellung von Gefrierschnitten von Trephinoder Nadelbiopsien von Knochengewebe. Diese werden auf einer Mischung von Trockeneis und Isopentan (–70°C) schockgefroren und dabei in Gefriermedium eingebettet. Das Gefriermikrotom muss mit harten Wolframcarbid-Messern ausgerüstet sein. Die Schneidetemperatur liegt zwischen –30°C und –35°C. Zur Schnittgewinnung ist die Anwendung eines Schnitt-Transfer-Systems mittels „Klebeband“ anzuraten. Die Methode ist geeignet für Enzym- und Immunhistochemie. 1.

Geräte zur Präparatherstellung

•

Sägemikrotom: diamantbeschichtetes, horizontal rotierendes Lochsägeblatt (280 µm dick, 600 rpm), das Präparat wird in einer einstellbaren, langsamen Geschwindigkeit darauf zubewegt. Wasserkühlung; Schnittdicke 100–500 µm;

•

Diamantbandsäge: diamantbeschichtetes Sägeblatt, bis 500 µm Schnittdicke meist als Vorbereitung für:

•

Hartschnittmikrotom, Hochleistungsmikrotom: Schlittenmikrotom, 20–30 µm Schnittdicke, mit und ohne Motor, vibrationsfrei, Stahlmesser, für spongiösen Knochen

•

Dünnschliffgerät: auch für kompakten Knochen und Implantate, für hartes und weiches Gewebe innerhalb eines Blocks, bis ca. 50 µm Schnittdicke; Das befestigte Präparat wird mit einem rotierenden Schleifteller mit Schleifpapier unterschiedlicher Körnung bearbeitet. Abschließend wird das Präparat noch poliert bis zu einer minimalen Kerbtiefe von 0,1 µm. (Abb.37–39)

77

Histotechnik

2.

Beispiele für Knochenverarbeitung

•

Oberschenkel-Präparat:

Der Einfluss eines Oberschenkelhals-Implantates auf das Knochengewebe soll untersucht werden. Um von allen Regionen Schnitte zu erhalten, wird der ganze Knochen in Methacrylat schrittweise eingebettet. Von diesem großen Kunststoffblock werden 700 µm dicke Scheiben in definierten Abständen mit der Diamantbandsäge hergestellt. Die Scheiben werden mit einer Vakuumpresse auf Plexiglasobjektträger plan aufgeklebt. Die Objektträger werden in das Rotationsschliffgerät eingespannt und bis zu einer definierten Dicke geschliffen. Zuerst werden gröbere, dann feinere Schleifpapiere verwendet, schließlich wird noch die Oberfläche poliert. Die Präparate sind ca. 50 µm dick, können gefärbt und mikroskopiert werden. •

Zahnpräparat in Trenn-Dünnschlifftechnik:

Der Zahn wird in Methacrylat eingebettet. Es entsteht ein Kunststoffblock, der mit der Vakuumpresse auf beiden Flächen mit je einem Plexiglasobjektträger beklebt wird. Diese Objektträger werden in das Trennschleifsystem eingespannt und ein 100-200 µm dicker Schnitt abgetrennt. Dieser Schnitt wird wiederum in das Mikroschleifsystem eingespannt, angeschliffen, feingeschliffen und poliert bis zu ca. 50 µm Dicke. •

Zahnpräparat ohne Vorbehandlung:

Zähne, die fest genug und nicht brüchig sind, können direkt in das Sägemikrotom eingespannt werden. Für einen planen Anschnitt wird ein Teil des Zahnes entfernt. Unter Wasserkühlung werden 70–100 µm dicke Sägeschnitte hergestellt. Beim Entnehmen der empfindlichen Schnitte kann man sich durch Aufkleben mittels Sekundenkleber auf ein Deckglas behelfen.

Abb.37–39 Rotationsschleifsystem, Presse, Bandsäge; alle von Fa. Exakt

78 •

Verarbeitung von hartem Gewebe

Präparate von nicht-entkalkten Beckenkammstanzen

Die fixierten Knochenstanzen werden in kleinen Förmchen in Methacrylat ausgegossen. Darauf klebt man eine Halterung, die in den Präparatehalter eines Mikrotoms eingespannt werden kann. Je nach Härte des Knochens stellt man an Rotationsmikrotomen oder an Hartschnittmikrotomen 1–3 µm dicke Schnitte her, die an üblichen Glasobjektträgern haften und gefärbt werden können. Zur leichteren Schnittgewinnung kann man sich eines Schnitt-Transfer-Systems bedienen. 3.

Färbungen an unentkalkten Schliffpräparaten

Bei 20–200 µm dicken Schliffpräparaten wird eine Oberflächenfärbung durchgeführt. Färbeprotokolle für Paraffinschnitte müssen hier modifiziert werden, indem man die Färbezeiten verlängert und/oder die Oberfläche entplastet oder anätzt. Vorbereitung: Das Schliffpräparat wird mit einem Alkohol-Azeton Gemisch entfettet und anschließend in H2O2 (30%) gegeben. Die H2O2-Lösung mazeriert die Präparateoberfläche, wodurch die Anfärbbarkeit verbessert wird. 3.1. Toluidinblau-Färbung Diese Färbung zeichnet sich durch Einfachheit und gute Standardisierung aus. Sie bietet Differenzierungsmöglichkeiten durch metachromatische Farbeffekte. Mineralisierte Hartgewebe bleiben ungefärbt bis blassblau, Zellen, Zellkerne, Osteoidsäume, Kittlinien, Kollagenfasern sind blau, Mastzellengranula, Knorpelmatrix, frühe Wundheilungsareale metachromatisch rotviolett gefärbt. Technik-Beispiel: Nach Spülen mit Aqua dest. werden die Objektträger während 15-30 Minuten in Toluidinblau-Lösung eingetaucht und anschließend erneut gespült. 3.2. Masson-Goldner-Trichromfärbung (Bindegewebsfärbung) Diese ist eine der vielen Trichromfärbungen und gilt heute als Standardfärbung für die Zahn- und Knochenmorphometrie, da neben guter Zellfärbung mineralisierte und nicht-mineralisierte Knochenmatrix farblich klar unterschieden werden können. Mineralisierte Hartgewebematrix und Kollagen werden leuchtend grün, Osteoid bzw. Wurzelzement rot, Zellkerne blauschwarz, Zytoplasma rötlich-braun, Erythrozyten orange angefärbt. Technik-Beispiel: Das Präparat wird 30 Minuten in Weigerts-Eisenhämatoxylin gefärbt. Der Objektträger wird mit Wasser gespült und anschließend für 7 Minuten in Masson-Lösung (Goldner I) gefärbt. Zwischen den folgenden Färbungen wird das Präparat jeweils mit 2% Essigsäure abgespült. Anschließend Gegenfärbung mit Phosphormolybdänsäure, Orange-G und Lichtgrün bei 60°C im Brutschrank bei Expositionszeiten von 5 bzw. 15 Minuten. Zum Abschluss erfolgt die Spülung mit Aqua dest. 3.3. von Kossa - Färbung Es handelt sich dabei um eine indirekte Methode, die Kalziumionen sichtbar zu machen. Die in der Silbernitratlösung angebotenen Silberionen reagieren mit den Karbonat- und Phosphationen des Kalks und verdrängen die Kalziumionen. Diese Silberionen werden durch starke Lichteinwirkung zu metallischem Silber reduziert.

Histotechnik

79

Technik-Beispiel: Der Dünnschliff wird für 60 bis 90 Minuten in 5% Silbernitratlösung dem Tageslicht ausgesetzt. Die Färbedauer wird individuell der Färbeintensität angepasst. Das Knochengewebe sollte eine dunkelbraune bis schwarze Farbe annehmen. Das Präparat wird mit Aqua dest. abgespült, für 1–2 min Soda-Formol-Lösung entwickelt und nach dem Wässern für weitere 5 min in Natriumthiosulfat-Lösung fixiert. Die Gegenfärbung kann mit Masson-Lösung und Phosphormolybdänsäure-Orange-G durchgeführt werden. 3.4. Färbung nach Giemsa Diese Färbung liefert guten Farbkontrast zwischen Zellen und der Interzellularsubstanz der Weich- und Hartgewebe; außerdem lässt sie zusätzlich an nicht entkalkten Schliffpräparaten, wie auch bei der Toluidinblau-Färbung, Veränderungen der Zahnhartsubstanzen erkennen. Mineralisierte Hartgewebematrix wird rosa bis zartrosa, Kollagen und Osteoid blassblau, Zellen und Zellkerne unterschiedlich blau, eosinophile Granula (z.B. in Granulozyten) rot, Mastzellgranula und Knorpelmatrix rotviolett dargestellt. 3.5. Hämatoxylin-Eosin-Färbung Diese rasche und einfache Färbung ist die Standardfärbung für die Routine des histologischen Labors. Sie zeigt Zellkerne, basophile Substanzen und grampositive Bakterien blau, alles Übrige in den verschiedenen Tonabstufungen rot. Romeis empfiehlt Mayers Hämalaun zur Färbung; es kann aber jede andere Hämatoxylinfärbung zur Anwendung kommen. 4.

Färbungen an Methacrylatschnitten von unentkalkten Knochenbiopsien

Im Interesse stehen die Darstellung der Mineralisierung des Knochens (vonKossaFärbung), der Aktivität der knochenresorbierenden Zellen (tartratresistente Saure Phosphatase) und die Darstellung von Aluminium in Bezug auf bestimmte Krankheiten (Irwin-Färbung). Als Übersichtsfärbung dient die Hämatoxylin-Eosin-Färbung. Nicht entkalkte Knochenmarkbiopsien werden ebenso wie die entkalkten gefärbt. 5.

Fluoreszenz-Markierung in Knochen

Aktiv mineralisierender Knochen baut Tetracycline ein und zeigt diskrete fluoreszierende Banden im Schnitt. Je nach verwendetem Fluorochrom erscheint der mineralisierte Knochen in verschiedenen Farbnuancen. Man verabreicht dem Patienten zwei definierte Dosen von fluoreszierender Substanz mit mindestens 10 Tagen Zeitabstand dazwischen. Frühestens drei Tage nach der zweiten Gabe kann eine Knochenbiopsie entnommen werAbb.40 Fluoreszenzmarkierung den, von der MMA-Schnitte hergestellt werden. Am ungefärbten Schnitt erscheinen zwei Banden in einem messbaren Abstand, entsprechend der Pause zwischen den Gaben. So lässt sich die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Mineralisierung bestimmen. (Abb.40)

80 6.

Verarbeitung von hartem Gewebe

Autoradiografie

Ähnlich wie bei der Fluoreszenzmarkierung werden hier dem Patienten radioaktivstrahlende Marker verabreicht, die im Knochen eingebaut werden. Die Bildgebung erfolgt durch Übertragung der Strahlung auf einen empfindlichen Film. 7.

Kontaktradiografie

Die Kontaktradiografie stellt ein Röntgenbild des Dünnschliffes her, das zur quantitativen Analyse verwendet werden kann. Dichtere, stärker mineralisierte Bezirke erscheinen beinahe weiß, da nur wenige Röntgenstrahlen hier durchdringen. Es kann auch eine digitale Bildgebung angeschlossen sein. Das Präparat muss von hoher Qualität sein und zwischen 70–130 µm dick. Film und Präparat sollen dicht aufliegen. (Abb.41) 8.

Abb.41 Kontaktradiografie

Histomorphometrische Methoden am unentkalkten Knochen

Für den Orthopäden sind besonders die Knochenauf- und -abbauvorgänge von Interesse (z.B. Osteoporoseverlauf). Die quantitative Aufarbeitung von Gewebe nennt man Histomorphometrie. Die meisten Analysen werden durchgeführt zur Bestimmung der relativen Menge von mineralisiertem Knochen und Osteoid, ebenso wie die Aktivität der Knochen ab- und aufbauenden Zellen. Histomorphometrische Analysen von Knochen erfordern, dass die separaten Komponenten des Gewebes sich differenziert anfärben, sodass sie einfach erkannt und unterschieden werden können. Die kombinierte vonKossa/Hämatoxylin/Eosin-Färbung ist geeignet für einige dieser Messungen, da die Silberfärbung den mineralisierten Anteil des Knochens darstellt und die HEFärbung die Zellen und das nichtmineralisierte Osteoid anfärbt. Das Ausmaß der osteoklastischen Knochenresorbtion wird sichtbar gemacht durch Nachweis von tartrat-resistenter Saurer Phosphatase. Das Ausmaß der osteoblastischen Aktivität erkennt man an Fluoreszenz-Markierungen am ungefärbten Schnitt. Die manuelle Histometrie führt man mit Hilfe eines Zählrasters im Mikroskop durch. Um die tatsächlichen Werte errechnen zu können, werden den Rasterabständen Millimeter- bzw. Mikrometermaße zugeordnet (Abb.42). Die Abschnitte des Rasters, die sich mit dem Merkmal decken, werden gezählt und in Bezug zu bestimmten Größen gesetzt.

Abb.42 Mikrometerabgleich

So erhält man relative Werte wie z.B.: •

Prozentanteil von spongiösem Knochen am Gesamtknochenvolumen

•

Prozentanteil von Osteoid am Gesamtknochenvolumen

•

Prozentanteil von Osteoidoberfläche an der Gesamtoberfläche

•

Prozentanteil von knochenresorbierenden Zellen (= saure Phosphatase pos.) an der Gesamtoberfläche

81

Histotechnik

Dasselbe Prinzip gilt auch für die Fluoreszenzmarkierung. Berechnete Werte sind hier z.B. •

Prozentanteil von einfach-markierter Fläche an der gesamten Oberfläche

•

Prozentanteil der doppelt-markierten Fläche an der gesamten Oberfläche

Eine wichtige Größe bei der Knochenmorphometrie ist die mittlere Osteoidsaumdicke als Maß einer gestörten Mineralisierung. Die so gewonnenen Daten können mit Referenzwerten verglichen werden. Es stehen computerunterstützte Methoden zur automatisierte Morphometrie zur Verfügung. Bei der Auswahl der Färbungen ist hier zu bedenken, dass möglichst ein Schwarz-Weiß-Effekt zwischen mineralisiertem und nichtmineralisiertem Gewebe entsteht. Die untersuchten Schnitte sollen einwandfrei sein, da das Gerät Artefakte nicht als solche erkennen kann. Das Computerprogramm wird auf die darzustellenden Strukturen geeicht (bestimmter Grauwert, Farbe). Es wird ein virtuelles 2D-Bild aufgebaut, an dem die notwendigen Abmessungen vorgenommen werden. Stellt man Serienschnitte einer Biopsie her, die morphometrisch ausgewertet werden, kann man ein virtuelles 3D-Bild erzeugen. Moderne konfokale Raster-Lasermikroskope tasten mittels Laserstrahl den Gewebsschnitt ab und erzeugen ein digitales Bild, das weiterverwendet werden kann.

Abb.43

Eine Alternative zur histologischen Aufarbeitung stellt die Mikrocomputertomografie dar, die besonders in der Osteoporoseforschung ihre Bedeutung hat. Dabei werden Knochenbiopsien radiologisch vermessen und 3D-Bilder durch Computerberechnungen erzeugt (Abb.43).

82

Makroskopische Begutachtung

Makroskopische Begutachtung – Vom Fläschchen in die Kassette Im histodiagnostischen Labor treffen laufend Gewebeproben ein (siehe Kap. Untersuchungsmaterial). Diesen werden I dentifikationsnummern zugeordnet. Die Patientendaten und alle relevanten Informationen werden mittels EDV erfasst. Im Ablauf der histologischen Technik kommen nach dem Schritt der Fixierung die makroskopische Begutachtung und das Zuschneiden der Gewebeprobe. Wobei diese Reihenfolge in Abhängigkeit von der Größe und des Fixierungszustandes des Präparates variieren kann. Die „Makro“ wird vom Pathologen durchgeführt. Bioptische Proben, die nicht zugeschnitten werden müssen, können auch von Biomedizinischen AnalytikerInnen verarbeitet werden. Die Qualitätssicherung ist bei der Makro ein wichtiges Thema. Sobald das Gewebe dem beschrifteten Einsendegefäß entnommen wurde, läuft die Identifikation nur mehr über eine Nummer. Deshalb ist der Vergleich von Patientendaten auf Einsendegefäß und Einsendeschein und von Identifikationsnummer auf Einsendegefäß, Einsendeschein und Kassette essentiell. Die makroskopische Begutachtung und das Zuschneiden der Gewebeproben erfordern ein detailliertes Wissen von Anatomie und Pathoanatomie, da eine falsche Verarbeitung hier wichtige Informationen für die Diagnose und Prognose zerstören kann. Diese Informationen können aufgrund der Einmaligkeit des Untersuchungsmaterials nie wieder beschafft werden. Bei der „Makro“ werden zur Dokumentation die Eigenschaften der Gewebeprobe aufgezeichnet. Dazu gehören: •

Fixierungszustand: nativ, fixiert

•

Größe, Form, Lokalisation des Präparats bzw. der Läsion: Längenangaben in drei Dimensionen, „dreieckig“, „rautenförmig“; Die früher gängigen Größenbezeichnungen waren oft Vergleiche aus der Natur wie z.B. erbsen-, walnuss-, kindskopfgroß.

•

Farbe bzw. Verfärbungen: z.B. grünliche Gallenblase, dunkelbraunes Areal am Hautstück

•

event. Gewicht

•

eröffnetes bzw. uneröffnetes Präparat (Darm, Gallenblase etc.)

•

Distanz zwischen Läsion und Resektionsrand

•

Aufzählung der einzelnen Bestandteile bei größeren Op-Präparaten: z.B. Colon plus Mesocolon plus Appendix

•

Konsistenz: z.B. Curettage-Material, schleimig, derb, prall, elastisch, kalkhart etc.

•

bei Cysten Beschreibung des Inhaltes: serös, eingedickt, hämorrhagisch,...

•

Orientierung: z.B. durch den Chirurgen angebrachte Fadenmarkierungen, bzw. „nicht orientierbar“

•

Abweichungen von der standardmäßigen Verarbeitung: z.B. voreingeschnittene Organe

Makroskopisch erkennbare pathologische Veränderungen (Läsionen) oder auch ihr Fehlen werden beschrieben (z.B. Tumore, Polypen, Perforationen, Schleimhautverdi-

Histotechnik

83

ckungen, Verkalkungen). Weiters wird auch deren Lage im Präparat dokumentiert und ob sie bis an den Resektionsrand heranreichen, bzw. die Organgrenzen überschreiten. Zur Dokumentation bietet sich auch die (digitale) Fotografie an. Das Zuschneiden der Präparate erfolgt durch den Pathologen nach vorgegebenen Standards und Richtlinien, die für einzelne Organe und Erkrankungen bestehen (erfasst von der Österreichische Gesellschaft für Pathologie u.a.). Unfixierte Operationspräparate werden zuerst für eine optimale Fixierung präpariert (siehe praktische Hinweise Kap. Fixierung). Vom fixierten Material werden Bezirke, die für die Diagnose ausschlaggebend sind, herausgeschnitten. Dabei sollen alle Informationen, die das Präparat beinhaltet, bewahrt werden. Zu diesen Informationen gehören z.B. Tumortyp, Eindringtiefe des Tumors, Orientierung, Entfernung im Gesunden, Anzahl der Lymphknoten etc. Faustregeln beim Zuschneiden der Gewebeblöcke: •

Bei der Frage, ob der Tumor über die Resektionsgrenzen bzw. Organgrenzen hinausgeht, sollen die Resektionsflächen vor dem Einschneiden mit Tusche gefärbt werden.

•

Gewebe wird ausgegeben aus befallenem, gesundem und randständigem Bezirk.

•

Von allen unterschiedlich erscheinenden Bezirken soll Gewebe ausgegeben werden.

•

Pro Kubikzentimeter Gewebe (z.B. Struma, Lipom) soll eine Kassette ausgegeben werden.

•

Geschichtetes Gewebe soll quer zur Schichtung geschnitten werden.

•

Kleinere Proben werden ebenso nach Standards zugeschnitten und oft zur Gänze ausgegeben.

•

Ungeformtes oder nicht orientierbares Gewebe wird entweder nur zerkleinert oder ohne Schneiden zur Gänze ausgegeben.

•

Abweichungen vom Standard müssen dokumentiert werden.

Zur Bewahrung der Orientierungsinformation gibt es die Möglichkeit zur Markierung mit Präparationstusche. Diese Farben überstehen die nachfolgenden Prozesse und sind im fertigen Schnitt wiederzufinden. Färbt man die Außengrenzen eines Operationspräparats mit Tusche, erkennt man am gefertigten Gewebeschnitt den Resektionsrand. Man kann die Farbmarkierung auch zur Unterscheidung von gleichartigen Stücken innerhalb einer Kassette, oder als Orientierungshilfe zum richtigen Einblocken der Stücke verwenden. Ansonsten werden Zeichnungen (mit Schnittführung) bzw. Fotos angefertigt, die Rückschlüsse vom fertigen Gewebeschnitt auf die Orientierung am Präparat erlauben. Spezielle Behandlung der Proben: •

Knochen und kalkhartes Gewebe müssen nach dem Fixieren durch Dekalzifizieren erweicht werden.

•

Natives Gewebe für spezielle Fragestellungen muss nach den Vorgaben verarbeitet werden: z.B. Lymphknotenabklatsche, Gewebeasservation durch Schockgefrieren

•

Schnellschnittuntersuchungen

84

Makroskopische Begutachtung

Die Gewebeblöcke werden zur weiteren Verarbeitung in die Einbettungskassetten aus Kunststoff gelegt (Abb.44). Beim Zuschneiden der Blöcke soll man bedenken, dass die Kassetten nicht vollständig ausgefüllt sein sollen. Die modernen Einbettsysteme arbeiten effizienter, wenn die Flüssigkeiten leicht durch die Ritzen der Kassetten fließen können und nicht durch das Gewebe allzu sehr gebremst werden. Die Dicke der Blöcke soll bei 3–5 mm liegen. Bei der Schnellverarbeitung liegt die gewünschte Dicke bei 1–2 mm. Besonders die mikrowellenunterstützte Einbettung erfordert gleichmäßig große Präparate, um ein Verkochen bzw. insuffizientes Einbetten zu vermeiden. Es gibt mittlerweile Hilfsmittel, die das Herstellen von planen, dünnen Blöcken erleichtern sollen. Kleines Biopsiematerial (Magen-Darm-Biopsien, Bronchialbiopsien, etc.) benötigt kein weiteres Zuschneiden. Die Stückchen werden gezählt, eventuell nach Größe und Aussehen beschrieben und in die Einbettkassetten gelegt. Es ist hier der Labororganisation überlassen, ob diese Tätigkeit von einem Pathologen oder von Biomed. AnalytikerInnen durchgeAbb.44 Einbett-Kassetten Fa. Sakura führt wird. Die Größe der einzelnen Blöcke wird von der Kassettengröße bedingt. Standardkassetten sind 2,5x3x0,5 cm groß und haben vorne und seitlich aufgerauhte Flächen zur Beschriftung. Diese Beschriftungsflächen werden benötigt für die Identifikationsnummer und die zusätzlichen Informationen über den Gewebsblock (Orientierung, Verarbeitungsart, etc.). Im Handel gibt es weiters Kassetten mit kleinerer Probenkammer und feinerem Gitter für kleinstes Material. Eine übliche Methode für kleinstes Material ist die Verwendung von flachen Kunststoff-Schwämmchen, zwischen die die Proben gelegt werden. Ein Nachteil der Schwämmchen liegt darin, dass sie am noch weichen Gewebe Artefakte verursachen können (dreieckige Löcher) bzw. beim Einbettungsprozess durch Flüssigkeitsverschleppung und dichtes Packen Probleme bereiten. Diese Probleme treten bei der Verwendung von kleinen Filtersäckchen (aus Papier oder Nylon) oder perforiertem Kassettenpapier nicht auf. Für besonders große Präparate werden zur Herstellung von Großflächenschnitten auch Megakassetten angeboten (4fache Grundfläche der Standardkassetten). Die Beschriftung der Kassetten muss lösungsmittelresistent sein. Bleistift eignet sich gut, es gibt spezielle Schreibstifte für diesen Zweck; oder man kann die Kassetten auch durch einen Kassettenprinter beschriften lassen. Neben der Identifikationsnummer und der Stückanzahl kann man auf der Kassette auch Informationen zur richtigen Orientierung beim Ausgießen, bzw. zur gewünschten Verarbeitung (z.B. Färbungen) vermerken. Während der Makro soll über die ausgegebenen Blöcke Protokoll geführt werden. Die Liste enthält die Menge der Blöcke (bzw. Kassetten), ihre Bezeichnungen und eventuelle Kommentare. Ganz moderne Systeme (Laborinformationssystem LIS) bieten die Vernetzung von Kassettendrucker, Protokollführung, event. auch Verrechnung und weiters der Objektträgerbeschriftung.

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Histotechnik

Durchgeführt wird die Makro an eigenen Zuschneidetischen (Abb.45). Diese sind unbedingt mit einer Wasserleitung, Abfluss, Formalinspender und -sammler (je nach Entsorgungsvorschrift), Abzug, ausreichender Beleuchtung und Diktaphon ausgerüstet. Heutzutage sollten auch Computerbildschirme und Digitalkameras leicht anzubringen sein. Das Zuschneidebesteck besteht aus großen, schweren Messern, Einmalklingen und -haltern, Scheren, chirurgischen und anatomischen Pinzetten, Sonden und sonstigem Hilfsmaterial. Gearbeitet wird auf einem Schneidbrett aus Kunststoff, das der Messerwirkung widersteht, jedoch nicht zu rutschig ist. Der ganze Arbeitsplatz soll leicht zu reinigen und zu desinfizieren sein. Die Teile der Gewebeproben, die nicht der weiteren Verarbeitung zugeführt werden, werden in ihrem Fixiermittel (sofern es auch zur Konservierung geeignet ist) aufbewahrt, bis der Befund abgeschlossen ist. So stehen sie für etwaige Nacharbeiten noch zur Verfügung. Die Aufbewahrung erfolgt nach einer bestimmten Organisation (Datums- oder Nummernreihung) in Schränken mit Abzügen. Unfixiertes Gewebe muss dabei unbedingt gekühlt gelagert werden. Grundsätzlich richtet sich die Art der Gewebeverarbeitung in der Makro nach der gewünschten Fixierung und Einbettung. Im Histodiagnostiklabor ist die Formalinfixierung und Paraffineinbettung die übliche Methode. Mit dem Ansteigen der Probenmenge wurden routinetaugliche Prozesse, Geräte und Hilfsmittel entwickelt. Dazu gehören die Kunststoffkassetten, die die Metallkörbchen und Gazesäckchen ablösten, und die Infiltrations-Prozessoren, die die manuelle Einbettung und die Histokinette verdrängten. Je nach Labororganisation gibt es Protokolle für eine S chnelleinbettung kleiner Präparate (über wenige Stunden) und Standardprotokolle für eine Einbettung über Nacht. Dementsprechend erfolgt die weitere Behandlung der Blöcke. Bei der Standardbehandlung werden die tagsüber gesammelten Blöcke am Ende des Arbeitstages in den Einbettungsautomat gestellt und das Programm gestartet. Bis dorthin achtet man darauf, dass das Gewebe nicht austrocknet und lässt es in Formalin weiterfixieren. Weiter geht es am nächsten Tag mit dem Ausgießen bzw. Einblocken (siehe Einbettungsprozess).

Abb.45 Zuschneidetisch Fa. Propath

Die Sicherheit der Mitarbeiter soll durch die Verwendung eines Abzugs gewährleistet werden, der die nach unten fallenden Formalindämpfe absaugt und entweder mit Aktivkohlefilter arbeitet oder ins Freie führt. Besonders infektiöses Material (HIV, Hepatitis B/C) soll entsprechend gekennzeichnet sein, obwohl selbstverständlich jede Probe als potentiell gefährlich anzusehen ist. Das Tragen von Handschuhen ist hier eine Mindestanforderung. Stich- und Schnittverletzungen sind an entsprechender Stelle zu melden. Um die Gefahr von Augenverletzungen durch Formalinspritzer zu verhindern, ist das Tragen von Schutzbrillen anzuraten.

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Einbettungsprozess

Einbettungsprozess (Tissue processing) A. Paraffinwachseinbettung .................................................................................88 1. Nachbehandlung nach Formalin-Fixierung ..............................................88 2. Beispiel eines Einbettungsprotokolls........................................................88 3. Faktoren des Einbettungsprozesses .........................................................89 4. Arbeitsschritte ..........................................................................................91 5. Automation...............................................................................................94 6. Ausgießen, Einblocken.............................................................................97 7. Tissue Microarray....................................................................................100 8. Rückführen..............................................................................................101 B. Gelatine-Einbettung...................................................................................... 102 C. Agar-Einbettung............................................................................................103 D. Celloidin-Einbettung (Nitrocellulose) ............................................................104 E. Polyethylenglykol-Einbettung (PEG)..............................................................105 F. Polyesterwachs-Einbettung ...........................................................................106 G. Kunststoff-Einbettung ................................................................................... 107 1. Prinzip.....................................................................................................108 2. Kunststoff-Typen ....................................................................................111 H. Übersicht - Processing-Reagenzien ...............................................................119 1. Nachbehandlung bei Fixierung mit anderen Fixantien ..........................119 2. Dehydratation-Reagenzien .....................................................................120 3. Reagenzien zur chemischen Dehydratation............................................120 4. Clearing-Reagenzien ..............................................................................120 5. Reagenzien für kombinierte Entwässerung und Clearing universelle Lösungsmittel .......................................................................121 6. Einbettungsmedien ................................................................................121

Histotechnik

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Einbettungsprozess (Tissue processing) Um fixiertes Gewebe in einen Zustand zu bringen, der das Anfertigen von mikrometerdünnen Schnitten erlaubt, muss man es dem Einbettungsprozess unterziehen. Man kann sich fixiertes Gewebe als ein feinporiges, unregelmäßiges Netzwerk vorstellen. Die Fixierflüssigkeit füllt die Hohlräume darin aus und enthält die löslichen Substanzen. Diese Hohlräume entsprechen den sonst mit Gewebswasser gefüllten Bereichen. Das Prinzip des Einbettungsprozesses besteht darin, dass die Flüssigkeit, die das Gewebe durchtränkt, durch eine nachfolgende ersetzt wird. Aus der Fixierflüssigkeit wird das Gewebe über verschiedene Zwischenschritte in das Einbettungsmedium geführt. Das Einbettungsmedium ist üblicherweise bei Raumtemperatur fest. Zum Einbetten wird es durch Erwärmen verflüssigt bzw. ist als monomere Form flüssig. Es dringt in das Gewebe-Netzwerk ein und verfestigt sich beim Abkühlen oder Polymerisieren. Um einen schneidbaren Gewebsblock zu erhalten, legt man das Gewebestück in ein Förmchen, übergießt es mit Einbettungsmedium und lässt es aushärten („Ausgießen“, „Einblocken“). Die histologische Technik hat viele verschiedene Einbettungsprozeduren entwickelt, die sich durch unterschiedliche Vor- bzw. Nachteile auszeichnen. Sie werden je nach Anforderung eingesetzt. Die Anforderungen an das moderne Histodiagnostiklabor bestehen darin, dass •

die kontinuierlich ansteigende Probenmenge effizient verarbeitet werden soll

•

die Verarbeitung für den größten Teil der Proben einheitlich und adäquat ist

•

die Verarbeitung nachfolgende histochemische, färberische und immunhistologische Untersuchungen unterstützt.

•

die Verarbeitung im Labor mit anderen Instituten vergleichbar ist

•

die Dauer der Verarbeitung möglichst kurz bei sehr guter Qualität ist

•

die verwendeten Reagenzien möglichst geringe Toxizität aufweisen

•

die Verarbeitung den wirtschaftlichen Ansprüchen des Instituts entspricht

•

der Arbeitsablauf nicht zuviel Personal bindet.

Entsprechend diesen Anforderungen wurden allgemein verwendete moderne Techniken und Geräte eingeführt. Der große Vorteil in der einheitlichen Verarbeitung liegt auch in der Entwicklung von Testvorschriften und Färbeautomaten, die allgemein einsetzbar sind und vergleichbare Ergebnisse erzielen (Studien). Früher wurden wenige Proben je nach Gewebeerfordernissen über mehrere Tage nach unterschiedlichen Protokollen händisch eingebettet. Moderner Einbettungsprozess in der Routinehistologie: •

Paraffinwachseinbettung nach Formalinfixierung als Standardverfahren

•

in Einbettungsautomaten verschiedener Bauart

•

Dauer ca. 12–14 Std. über Nacht

•

Schnellverfahren innerhalb weniger Stunden für kleine Biopsien

•

Geräte mit integrierten Filtern und Abzügen

•

standardisiertes Zubehör (Kassetten, Förmchen, Objekthalter beim Mikrotom)

•

optimierte Reagenzien für Standardverfahren

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Einbettungsprozess

Die Innovation geht weiter in Richtung Schnellverfahren, bei dem durch eine Einbettzeit von wenigen Stunden, bzw. von nur mehr einer Stunde, eine Befundung innerhalb eines Tages erreicht wird. Die Umlaufzeit der Proben soll von mehreren Tagen auf einen einzigen verkürzt werden.

A. Paraffinwachseinbettung In der Routinehistologie hat sich die Einbettung mit Paraffinwachs nach Formalinfixierung durchgesetzt (FFPE-Gewebe = formalinfixiert und paraffin-eingebettet). Es ist für die meisten Gewebetypen (event. nach Entkalkung) für die morphologische Diagnostik geeignet. Zur Durchführung stehen Einbettungsautomaten unterschiedlicher Bauart zur Verfügung. Die manuelle Einbettung wird meist nur mehr bei irgendwelchen Fehlfunktionen der Geräte oder bei übergroßen Präparaten durchgeführt. Der Einbettungsprozess sollte nur an gut fixiertem Gewebe durchgeführt werden. Unvollständig fixiertes Gewebe reagiert empfindlich auf die physikalischen und chemischen Einwirkungen der Reagenzien. 1.

Nachbehandlung nach Formalin-Fixierung

Formalin sollte aus dem Gewebe durch ausgiebiges Wässern in Leitungswasser entfernt werden. Dies ist besonders bei ungepuffertem Formalin wichtig, da es hier zur Bildung von Formalinpigment (Niederschläge) kommen kann. Es hat auf die nachfolgenden Färbereagenzien eine reduzierende Wirkung. Man will durch das Auswaschen auch die Verunreinigung der Alkoholreihe verhindern. Die Dauer des Auswaschens sollte dabei so lange wie die Dauer der Fixierung sein. In der Routine verzichtet man auf diese langwierige Prozedur. Zum einen wird neutral gepuffertes Formalin zur Fixierung verwendet, zum anderen wird meist in den Einbettungs-Automaten für eine optimale Behandlung noch weiterfixiert. Zum Auswaschen genügt der nachfolgende, niedrigprozentige Alkohol. Die Verunreinigung der Alkoholreihe erfordert jedoch regelmäßiges Wechseln der Reagenzien. 2.

Beispiel eines Einbettungsprotokolls Einkammer-Einbettautomat, Vakuum-Infiltrations-Prozessor Schritt Reagens Dauer Temperatur Fixierung

Entwässerung

Clearing

Infiltration

Druck/Vakuum

8% Formaldehyd

1 Std.

37oC

ja

8% Formaldehyd

1 Std.

37oC

ja

50% Ethanol

1 Std.

37oC

ja

70% Ethanol

1 Std.

37oC

ja

96% Ethanol

1 Std.

37oC

ja

96% Ethanol

1 Std.

37oC

ja

100% Ethanol

1 Std.

37oC

ja

100% Ethanol

1 Std.

37oC

ja

100% Xylol (-ersatz)

1 Std.

37oC

ja

100% Xylol (-ersatz)

1 Std.

37oC

ja

Paraffin

3/4 Std.

60oC

ja

Paraffin

3/4 Std.

60oC

ja

Paraffin

3/4 Std.

60oC

ja

Paraffin

3/4 Std.

60oC

ja

Histotechnik

3.

89

Faktoren des Einbettungsprozesses

3.1. Prinzip Beim Einbettungsprozess geht es um Diffusionsvorgänge durch das stabilisierte, feinporige Gewebe. Dadurch werden die Konzentrationsunterschiede der ProzessReagenzien innerhalb und außerhalb der Gewebeprobe ausgeglichen. Dabei gilt, dass je höher der Konzentrationsunterschied zwischen den Lösungen ist, umso schneller erfolgt der Austausch. 3.2. Gewebe Durch die natürlichen oder künstlich entstandenen, ultrastrukturellen Poren im Gewebe erfolgt der Flüssigkeitsaustausch. Während der anschließenden Gewebeverarbeitung kommt es zu Schrumpfung und Härtung in unterschiedlichem Ausmaß, was meist auch die Porösität verringert. Im Allgemeinen ist das Ausmaß der Schrumpfung bei Gewebe, das mit nichtkoagulierenden Fixantien (Formalin) fixiert wurde, größer als bei Gewebe, das mit koagulierenden Fixantien (Ethanol) fixiert wurde. Die Postfixation mit koagulierenden Fixantien (Helly, Bouin) nach Formalinfixierung führt zu einer vergrößerten Empfindlichkeit des Gewebes. Werden bestimmte Substanzen (z.B. Lipide durch organische Lösungsmittel) aus dem Gewebe herausgelöst, führt das ebenfalls zu Schrumpfung und verminderter Durchlässigkeit. Man kann durch verschiedene Zusätze die Empfindlichkeit des Gewebes beeinflussen und hartes Gewebe vor weiterer Härtung bewahren (z.B. Phenolzusatz beim Intermedium). Schwammiges, parenchymreiches Gewebe wird meist schneller infiltriert als hartes, dichtes und auch fettreiches Gewebe. Die Gewebeblockdicke muss bei der Prozedurdauer miteinberechnet werden. Für die Standardmethode sollten die Stücke 3-5 mm nicht überschreiten. Für dickeres und dichteres, bzw. kleines Material müssen bzw. können modifizierte Rezepte verwendet werden. 3.3. Reagenzien Zu den chemischen und physikalischen Eigenschaften, die den Vorgang beeinflussen gehören: Polarität, Konzentration, Mischbarkeit mit Wasser, Lösungsmitteln und Einbettmedium, Verdampfungsrate und Viskosität. Wärmeleitfähigkeit, Wärmekapazität, Siedepunkt und elektromagnetische Leitfähigkeit sind besonders wichtig für mikrowellen-unterstützte Prozeduren. Die • • • • • • •

Reagenzienwahl zur Einbettung wird bedingt durch Fixierlösung Einbettungsmedium erwünschte Dauer zur Verfügung stehende Automaten Routine bzw. Forschungsarbeit Wirtschaftlichkeit Toxizität

90

Einbettungsprozess

3.3.1. Polarität Es kommt im Allgemeinen zur Schrumpfung beim Übergang von Lösungen mit höherer zu solchen mit niedrigerer Polarität. Um die Gewebeschäden zu minimieren, sollte der Konzentrationsunterschied gering gehalten werden. Man verwendet eine Reihe der polaren Lösungen in absteigender Konzentration (stark polares Fixans bis zum unpolaren Einbettmedium). 3.3.2. Konzentration Ist der Konzentrationsgradient zwischen intra- und extrageweblicher Flüssigkeit zu hoch, kommt es zu einer schnellen Diffusion, was starke Schrumpfung zur Folge hat. Deshalb erfolgt der Einbettungsprozess immer über eine Reihe von Reagenzien mit aufsteigender Konzentration. Je empfindlicher das Gewebe, umso kleiner sollten die Konzentrationsunterschiede sein (aufsteigende Alkoholreihe). 3.3.3. Mischbarkeit Wenn die meist wässrigen Fixantien nicht mit dem Einbettmedium mischbar sind, muss das Wasser zuerst von Alkohol und der Alkohol anschließend von einem Intermedium verdrängt werden. Das Intermedium ist nicht mit Wasser, jedoch mit absolutem Alkohol und dem Einbettmedium mischbar. Viele Intermedien sind extrem wasserintolerant und mischen sich nicht mit wasserhaltigen Alkoholverdünnungen. Durch die industrielle Herstellung von hochwertigem, absolutem Alkohol tritt diese Schwierigkeit kaum mehr auf. Zusatz von Phenol zum Intermedium toleriert Wasserrückstände im absoluten Alkohol und erlaubt das Clearing direkt aus 70–95% Alkohol. Man verwendet dies bei Gewebe, das nicht der härtenden Wirkung von absolutem Alkohol ausgesetzt werden soll. Processing-Reagenzien, die mit Wasser und dem Einbettmedium gleichermaßen mischbar sind, werden universelle Lösungsmittel genannt und verringern die Anzahl der Zwischenschritte. Um starke Gewebeschrumpfung zu vermeiden, werden sie auch in ansteigender Konzentration verwendet. 3.3.4. Verdampfungsrate Lösungsmittel mit einer hohen Verdampfungsrate werden im Infiltrationsschritt schneller aus dem Gewebe entfernt, und die Gefahr von Rückständen im Einbettmedium ist weniger gegeben. 3.3.5. Viskosität Diese Eigenschaft ist besonders beim Clearing- und Infiltrations-Schritt wichtig, da hier oft hochmolekulare Substanzen eingesetzt werden. Dabei verhält sich die Viskosität umgekehrt proportional zur Temperatur. Bei einem zu großen Unterschied der Viskosität der eindringenden und austretenden Flüssigkeit kommt es zu Schrumpfung. 3.4. Prozessbedingungen 3.4.1. Temperatur Niedrige Temperaturen erhöhen die Stabilität des Gewebes aber auch die Viskosität der Reagenzien, was zu verlängerten Einwirkzeiten führt.

Histotechnik

91

Gleichmäßige Temperatur beim Prozess bringt ein feiner strukturiertes Ergebnis und weniger Artefakte. Am meisten werden aber Prozesse mit wechselnd hohen Temperaturen eingesetzt. Hitze erhöht die kinetische Energie und Diffusionsrate der Substanzen und verringert gleichzeitig ihre Viskosität. Die Anwendung von Temperaturen zwischen 37o–45oC während Entwässerung und Clearing verringert die Dauer, führt aber eventuell zu einer verstärkten Schrumpfung. Die Gewebeschrumpfung während der Infiltration mit Paraffin ist hauptsächlich auf die Hitzewirkung auf Kollagen zurückzuführen. Die Infiltrationstemperatur sollte höchstens 2–3oC über dem Schmelzpunkt des Einbettmediums liegen. Die meisten Gewebetypen sind unempfindlich gegenüber einer langen Verweildauer in geschmolzenem Paraffin (ca. 55–60oC). Die Wirkung der Mikrowellentechnik beruht hauptsächlich auf dem Phänomen der inneren Erwärmung und verkürzt die Einwirkzeit. 3.4.2. Druck und Vakuum Der Druck im Einbettautomaten ist wahrscheinlich zu gering, um eine tatsächliche beschleunigende Wirkung zu haben. Verminderter Druck (Vakuum) während dem Entwässern, Clearing und Infiltration erhöht die Qualität des Einbettungsprozesses. Eingeschlossene Luft wird entfernt, Siedepunkte werden herabgesetzt und das Abdampfen der Reagenzien erleichtert. 3.4.3. Bewegung Die Diffusionsrate wird durch Agitation in der Lösung erhöht. Behindernd wirkt ein zu dichtes Zusammenpacken der Gewebekassetten, wodurch zu wenig Gewebeoberfläche erreichbar ist. Von Vorteil ist eine gleichmäßige Bewegung innerhalb des Reagensgefäßes (Magnetrührer, vertikale Korbbewegung), eine lockere Schüttung oder zumindest das gleichmäßige Schlichten der Kassetten, sodass die Gitteröffnungen durchgängig sind. Automaten mit Druck- und Vakuum-Behandlung bewirken hier wahrscheinlich eine Mikroagitation. Ultraschall-Geräte verursachen eine BewegungsAnregung im Hochfrequenzbereich. Man hält ein Mengenverhältnis von 1:50 zwischen Gewebe und Reagenzien für optimal (Was in der Praxis eigentlich nicht erreicht wird). 4.

Arbeitsschritte

4.1. Vervollständigen der Fixierung Eine erhöhte Temperatur ermöglicht dem Fixativ eine effiziente Wirkung auf die dünnen Gewebescheiben. Dauer: Für 3–5 mm dicke Gewebescheiben rechnet man 2 x 60 min im Automaten bei 37–45oC für eine vollständige Fixierung. Zwei Fixierbäder sind von Vorteil, da im ersten meist Verunreinigungen miteingeschleppt werden, das zweite ist dann rein. 4.2. Entwässerung (Dehydrieren) Formalin ist ein wässriges Medium, Paraffin ist ein hydrophobes Medium, also mit Wasser nicht mischbar. Um das Gewebe von einer Phase in die andere zu führen, müssen Flüssigkeiten dazwischen geschaltet werden, die einerseits mit Wasser und

92

Einbettungsprozess

andererseits mit organischen Lösungsmitteln (zumindest in hochprozentiger Form) mischbar sind. Es wird dabei das ganze Wasser aus dem Gewebe verdrängt und entfernt. Dazu dienen Alkohole. Am meisten verwendet wird Ethanol in aufsteigender aufsteigende Alkoholreihe“). Konzentration (50%–70%–96%–100% = „a Wirkung von Ethanol Ethanol entzieht dem Gewebe das freie Wasser (= Entwässerung, Dehydrierung) und löst manche Zellbestandteile auf, die dann ausgeschwemmt werden (z.B. Lipide). Gut fixiertes Gewebe sollte kaum mehr für osmotische Veränderungen empfindlich sein, trotzdem ist es noch durch die verschiedenen Reagenzien des Einbettungsprozesses beeinflussbar. Im Gesamten wirkt hochprozentiger Alkohol auf das Gewebe schrumpfend (ca. 10–15%) und härtend. Diese Wirkung verstärkt sich, wenn die Konzentrationsunterschiede sehr hoch sind. Schonende Behandlung erreicht man durch geringere Gradationsschritte. Die ständige Entfernung von gebundenem Wasser aus Kohlenhydraten und Proteinen während langanhaltender Einwirkung von absolutem Alkohol macht das Gewebe extra hart und spröde. Manche Gewebe sind besonders empfindlich (Kolloid, Blut, Kollagen). Die erhöhte Temperatur bei der Infiltration verstärkt dieses Problem. Fixiertes Gewebe wird durch längere Einwirkzeit von niedrigprozentigem Alkohol nicht nachteilig beeinflusst. Die bei der Dehydrierung verwendeten Alkohole haben ebenfalls fixierende und zwar koagulierende Wirkung und verursachen als Postfixation ein typisches Bild, falls die Formalinfixierung noch unzureichend war. Dauer: Bei der manuellen Methode rechnet man für 3–5 mm dicke Gewebescheiben 2–4 Stunden pro Ethanolbad, wobei die Dauer in den hochprozentigen Alkoholen verdoppelt wird. Im Automaten genügen je 60 min bei 37–45oC bei den niedrigprozentigen Alkoholen und je 2 x 60 min bei 37–45oC bei den hochprozentigen Alkoholen. Die Verwendung von je zwei Alkoholbädern ist sinnvoll, da das erste meist durch Verschleppung verunreinigt wird. Das letzte Alkoholbad ist dann möglichst wasserfrei. 4.3. Clearing (Intermedium) Das „Zwischenmedium“ vermittelt zwischen dem 100% Ethanol und dem Paraffin. Es ist gut mit Alkohol und auch mit Paraffin mischbar. Wasser oder Alkoholverunreinigungen im Paraffin führen zu einer schlechten Schneidbarkeit und sollen deshalb vom Intermedium komplett verdrängt werden. Der englische Begriff „clearing“ entspricht dem deutschen „aufhellen“ oder „klären“ und bezieht sich darauf, dass diese Medien einen Brechungsindex haben, der ähnlich dem von fixiertem Gewebeprotein ist. Ist das Gewebe vollständig durchtränkt, wirkt es durchscheinend. Das am meisten verwendete Reagens ist Xylol (Dimethylbenzol, C6H4(CH3)2). Xylol gehört zu den Kohlenwasserstoffen und hat einen typischen Geruch. Es hellt das Gewebe schnell auf und macht es durchscheinend. Xylol wirkt härtend auf formalin-fixiertes Gewebe. Es sollte deshalb nicht zu lange darin verbleiben. Es ist als organisches Lösungsmittel fähig Lipide aus dem Gewebe zu lösen. (Abb.46)

Abb.46 Xylol

Das früher sehr häufig verwendete Benzol wurde wegen seiner Giftigkeit und Kanzerogenität aus dem Gebrauch genommen. Benzol klärt schneller und härtet weniger als

Histotechnik

93

Xylol. Xylol steht auch in Verdacht krebserregend zu sein. Es führt zu Kopfschmerzen und Schäden an ZNS und Niere. Es wirkt hautreizend und entzündlich. Um diese Gefahren zu vermeiden wurden Xylolersatzmittel unter verschiedenen Handelsnamen vom Chemikalienhandel erzeugt. Da die Labormitarbeiter beim Einbettungsprozess im Automaten diesem Lösungsmittel nur wenig ausgesetzt sind, verwendet man hier das günstige Xylol weiterhin. Es gibt einige Intermedien, die dem Xylol bezogen auf das Ergebnis überlegen sind. Die Handhabbarkeit und Wirtschaftlichkeit sind jedoch gute Argumente für dieses Lösungsmittel. Dauer: Die manuelle Methode rechnet insgesamt zwischen 4–13 Std. für das Clearing-Reagens. Der Endpunkt wird hier durch das Beobachten der Gewebetransparenz bestimmt. Im Automaten verkürzt sich die Zeit auf 2 x 60 min Xylol bei 37–45oC, wobei das erste Bad wieder Verunreinigungen durch Verschleppung aufweisen kann, das zweite soll alkoholfrei sein. 4.4. Infiltration Unter Infiltration versteht man das Eindringen einer Substanz, die meist auch als Einbettmedium dient, in die Gewebehohlräume bis zur Sättigung. Zur Infiltration muss das Infiltrationsmedium flüssig sein. Im Falle von Paraffin geschieht die Verflüssigung durch Erhitzen über den Schmelzpunkt (ca. 52–60oC). Die Infiltration mit niedrig schmelzendem Paraffin ist für das Gewebe schonender (event. Vorteil für den Antieinbetten“ wird doppelt gebraucht. Zum einen als Synonym gen-Erhalt). Der Begriff „e für Infiltration, zum anderen bedeutet er dasselbe wie „ausgießen“ oder „einblocken“. Dabei wird ein fester Block aus Einbettmedium erzeugt, in dem sich das Gewebe in bestimmter Orientierung befindet. Bei Paraffin erfolgt die Verfestigung durch Abkühlen. Andere Einbettmedien infiltrieren in ihrer monomeren Form oder gelöst in Lösungsmittel und werden fest durch Polymerisation bzw. Abdampfen des Lösungsmittels. Vakuum-Infiltration wird unter vermindertem Druck (Vakuum) durchgeführt und führt zu einer Verkürzung der Prozedur. Der verminderte Druck bei erhöhter Temperatur erleichtert dem Intermedium das Abdampfen und das Eindringen des Einbettungsmediums. „Doppeleinbettung“ bedeutet, dass Gewebe vorerst in einer Lösung infiltriert und eingebettet wird. Dieser Block wird durch eine andere Lösung wiederum infiltriert und einbettet (z.B. Zellblockbildung in Agar/Paraffin). Die Gewebestücke können aus Regionen von sehr unterschiedlicher Konsistenz bestehen. Beim Schneidevorgang besteht die Gefahr, dass hartes auf weiches Material gedrückt wird und die Strukturen verzerrt und zerstört werden. Um dünne, gleichmäßige Schnitte zu erhalten, müssen diese Unterschiede durch das Medium ausgeglichen werden. Das Einbettungsmedium muss im festen Zustand härter sein, als die härteste Gewebestruktur. Die Matrix muss elastisch genug sein, um Gewebeverzerrungen wieder auszugleichen, und plastisch genug, um dünne Schnitte herstellen zu können. Das Anhaften des Mediums am Gewebe wird durch die feinkristalline Struktur erreicht, die sich eng an die Gewebestrukturen legt. Viskosität und Schmelzpunkt beeinflussen die Dauer der Infiltration.

94

Einbettungsprozess

Anforderungen an ein Einbettungsmedium: •

Schmelzpunkt zwischen 30o und 60oC (fest bei Raumtemperatur)

•

schnelle Infiltration

•

transparent

•

stabil (Lagerung)

•

homogen

•

nicht giftig

•

geruchlos

•

kostengünstig

•

soll nachfolgende Prozeduren unterstützen

•

einfach in der Anwendung

•

schnittbandfähig (Rotationsmikrotom)

Die Wahl des Einbettungsmediums wird bedingt durch: •

Härte des Gewebes

•

Untersuchungsziel

•

Dicke der gewünschten Schnitte

•

Wirtschaftlichkeit

Paraffinwachs: Paraffin ist eine polykristalline Mischung aus festen, gesättigten Kohlenwasserstoffen (CnHn+2), die bei der Raffinierung von Erdöl entstehen. Paraffin ist weder mit Wasser noch mit Alkohol mischbar. Es ist ca. 2/3 so dicht und etwas elastischer als getrocknetes Eiweiß. Die Härte des Paraffins ist abhängig vom Molekulargewicht. Höher molekulare Paraffine haben einen höheren Schmelzpunkt. In der Histologie verwendet man Paraffine mit einer Kettenlänge von 20–35 Kohlenstoffatomen und einem Schmelzpunkt zwischen 52–58oC. Paraffin im Handel wird durch seinen Schmelzpunkt charakterisiert (üblich zwischen 39–68oC) und ist in Form von Pastillen erhältlich. Beim Abkühlen von flüssigem Paraffin kommt es zum Auskristallisieren. Je schneller die Abkühlung vor sich geht, umso feinkristalliner und homogener ist das Ergebnis. Grobkristallines Paraffin erkennt man an den weißlichen „Sprüngen“, es erscheint gesprenkelt. Das Erkalten führt zu einer Volumensverminderung, das Paraffin zieht sich nabelartig ein. Im histologischen Labor verwendet man heutzutage Paraffinwachs mit verschiedenen Zusätzen, die die Eindringgeschwindigkeit erhöhen, die Schnittherstellung vereinfachen und die Homogenität auch bei langsamem Abkühlen erhalten (Dimethylsulfoxid DMSO, plastische Polymere). Es gibt auch Zusätze, die den Schmelzpunkt entweder erniedrigen oder erhöhen (und damit die Härte bei Raumtemperatur). Für dickere Schnitte benötigt man weicheres, für dünnere härteres Paraffin. Überhitztes Paraffin wird durch Oxidation gelb und beim Abkühlen seifig. 5.

Automation

Ein modernes, histodiagnostisches Labor ist mit entsprechenden Geräten zum Gewebe-Processing ausgestattet. Üblicherweise werden die Automaten am Ende eines

95

Histotechnik

Arbeitstages mit den Proben bzw. Kassetten gefüllt. Der Prozess läuft über Nacht und am nächsten Morgen wird die Verarbeitung fortgesetzt. Die manuelle Behandlung ist überholt und wird nur mehr im Notfall oder für spezielle Anforderungen durchgeführt. Bei der manuellen Durchführung muss man bedenken, bei welchen Schritten das Gewebe ohne Schaden zu nehmen länger im Reagens verbleiben kann (über Nacht im 70% Alkohol, bzw. Intermedium). Zur Beschleunigung werden die Reagenzien mittels Magnetrührer durchmischt. Im Infiltrationsschritt ist die Verwendung einer Vakuumkammer mit Flüssigkeitsfalle von Vorteil. Die modernen Automaten sind mikroprozessorgesteuert und mit integrierten Filtern und Abzügen ausgestattet. Sie ermöglichen die Wahl verschiedener Programme und Funktionen und auch das Einstellen einer Endzeit des Vorganges. 5.1. Gewebe-Transfer-Prozessor Die Reagensgefäße befinden sich im Kreis angeordnet auf einem „Karussell“. Meist stehen bis zu dreizehn Stationen zur Verfügung. Die Kassetten befinden sich in einem Korb und werden entsprechend dem gewählten Programm von einem Reagensgefäß ins nächste überführt. Die Stationen können je nach Modell beheizt werden. Das Gewebe wird mit dem Korb auf- und abbewegt. Die Kapazität umfasst je nach Model 30–110 Kassetten. Dieser Gerätetyp erlaubt ein Maximum an Flexibilität in der Wahl der Reagenzien und Programmen. Die Vorläufer-Modelle (Histokinette) waren mit Uhrwerk und Programmierkarte ausgestattet. (Abb.47) 5.2. Reagens-Transfer-Prozessor

Abb.47 Leica TP 1020

Der Automat besteht aus einer Prozesskammer (Retorte) und mehreren Reagenzienbehältern, aus denen die Flüssigkeiten in die Retorte gepumpt werden. Es gibt auch hier 10–12 Reagenzienstationen und 3–4 geheizte Paraffinwachsstationen. Die Geräte erlauben für alle Protokollschritte die Wahl der Temperatur (30–45oC bzw. ca. 60oC). Je nach Modell kann man 100–300 Kassetten in der Prozesskammer auf einmal verarbeiten. Je nach Gerätetyp bieten sie Druck- und Vakuum oder Rotationsbewegung. Es besteht die Möglichkeit für Schnell-Einbettungsprogramme für kleine Gewebsstücke (Biopsien). Der Vorteil dieser Bauart liegt im geschlossenen System, Dämpfe treten nicht nach außen. Das Gewebe kann in der Retorte nicht austrocknen, bei Störungen gibt es Alarmsysteme und Diagnoseprogramme zum Troubleshooting. Eventuell nachteilig ist, dass es nicht für alle histologischen Reagenzien verwendbar ist, weil der Gebrauch von leicht entzündlichen oder korrodierenden Chemikalien zu gefährlich wäre.

96

Einbettungsprozess

Nach der Einbettung läuft ein Reinigungszyklus ab, der das verbleibende Paraffin in der Retorte entfernt. Für den regelmäßigen Wechsel der Reagenzien ist es vorteilhaft, die Anzahl der verarbeiteten Kassetten zu notieren. (Abb.48) 5.3. Mikrowellen-Technik Wichtig für die Verarbeitung mit der Mikrowelle sind die einheitliche Dicke der Gewebescheiben und die Verwendung von Geräten, die eine genaue Zeit- und Leistungseinstellung haben. Die Prozedur ist für geringe Probenmengen geeignet und beschleunigt den Vorgang. Aufgrund der Flüchtigkeit der verwendeten Reagenzien sollen die Geräte eine Ventilation aufweisen (siehe Kap. Mikrowellen-Technik). Eine neue Anwendung des mikrowellen-unterstützten Gewebe-Processing ist das sogenannte C ontinuous Rapid Tissue Processing (CRTP, Fa. Sakura). Es erlaubt eine Verkürzung des Präparateumlaufs im Labor. Abb.48 VIP 5 Fa. Sakura Anstelle von Schnelleinbettungen, die nur für kleine Biopsien anzuwenden sind, erfolgt für den Großteil der verarbeiteten Proben eine routinemäßige Schnelleinbettung innerhalb von einer Stunde. Auf diesem Wege soll eine histologische Befundung für die Mehrzahl der Proben innerhalb eines halben Tages erreicht werden. Die restlichen Präparate benötigen weiterführende Behandlungen oder Untersuchungen (Immunhisto, Färbungen). Bei mikrowellenunterstützten Prozessoren ist eine limitierende Voraussetzung, dass die Gewebeblöcke eine einheitliche Dicke aufweisen sollen. Zu diesem Zweck wird ein spezielles „Makrobesteck“ mitgeliefert, das hier unterstützen soll. Als positive Eigenschaft wird der geringe Reagenzienverbrauch und -abfall genannt. Der Einbettungsprozess wird in vier Retorten durchgeführt. Die Proben bleiben jeweils 15 min in einer Station. Das Gerät kann kontinuierlich mit bis zu max. 40 Kassetten beladen werden, sodass alle 15 min fertige Blöcke weiterverarbeitet werden können (120 Blöcke/Std.). Damit kommt es zu einem kontinuierlichen Abarbeiten der anfallenden Proben im Gegensatz zur heutzutage üblichen „Batch“-Arbeitsweise. Die gewonnene Qualität soll der morphologischen Diagnose genügen. Die Anfärbbarkeit tendiert eher ins Azidophile. Weiters bleiben DNA und RNA für weitere Untersuchungen erhalten. (Abb.49) Abb.49 XPRESS Fa. Sakura

97

Histotechnik

1. Schritt: 2. Schritt: 3. Schritt: 4. Schritt:

Dehydration und Fixierung (Mischung aus Aceton, Isopropylalkohol, Polyethylenglycol; Mikrowelle) Dehydration und Fixierung (Mischung aus Aceton, Isopropylalkohol, Mineralöl; Mikrowelle) Einleitung der Paraffinimprägnation (Mischung aus Paraffin und Mineralöl; Vakuum und Hitze) Paraffinimprägnation (Paraffin; Vakuum und Hitze)

5.4. Ultraschall-Technik Mit Ultraschall kann man Fíxierung, Gewebe-Processing für Elektronenmikroskopie, Entkalkung, Gewebeerweichung, Färbereaktion u.a. beschleunigen. Es gibt auch Schnelleinbettverfahren für 1–2 mm dicke Stücke, die knapp zwei Stunden benötigen. Ein Reagensbehälter wird in einer Detergenslösung in den Ultraschallreiniger (50W) gehängt. Für die Paraffininfiltration wird das Bad aufgeheizt. Die Gewebeproben befinden sich in Plastik- oder Metallkassetten. Koagulierendes Fixativ sorgt für die beste Stabilisation für Ultraschall-Processing. Das Gewebe wird in Ethanol dehydriert und in Toluol geklärt (oder auch Methylbenzoat oder Methylsalicylat). Die Morphologie bleibt großteils gut erhalten. 6.

Ausgießen, Einblocken (Embedding)

Nach durchgeführter Infiltration befinden sich das Gewebe bzw. die Kassetten in flüssigem Paraffin. Die Gewebehohlräume sind mit Paraffin ausgefüllt. Die Gewebestücke sollen nun richtig orientiert in einem Block aus Paraffin ausgegossen werden. Zum Ausgießen verwendet man Paraffin mit hohem Schmelzpunkt (60oC), um den Blöcken bei Raumtemperatur die nötige Festigkeit zu verleihen. Die Belastung für das Gewebe durch diese Temperatur ist nach abgeschlossener Infiltration nicht mehr Ausschlag gebend. Der feste Block soll in einen Mikrotom-Präparatehalter eingesetzt werden können. Bei diesem Vorgang muss die Identifikation des Präparates erhalten bleiben.

Abb.50–51 Ausgießschälchen und fertige Paraffin-Blöcke

6.1. Geräte Es stehen heutzutage Einbettungsgeräte und standardisiertes Zubehör zur Verfügung. Passend zu den Gewebekassetten sind Ausgießschälchen aus Metall oder Kunststoff erhältlich. In diese Förmchen wird das Gewebe ausgegossen. Es gibt sie in verschiedenen Größen (1x1 cm, 2x2 cm, 2x3 cm, etc.). Der Kassettenboden mit der Beschriftung kann darauf gesetzt werden und haftet durch das erstarrte Paraffin. Der Kassettenboden stabilisiert den Block und passt in den Präparatehalter des Mikrotoms. (Abb.50-51)

98

Einbettungsprozess

Die Einbettungsgeräte bestehen aus einem gewärmten Paraffinreservoir, einem Paraffinspender (mit Hand- oder Fußtastenbedienung), gewärmten Bereichen für die Gewebekassetten und Ausgießschälchen und weiters einer Kühlplatte (–10oC). Dazu gibt es elektrisch heizbare Pinzetten, die bei der Handhabung von paraffindurchtränktem Material sehr hilfreich sind. Ansonsten werden die Pinzetten in speziellen Halterungen gewärmt. Ist die Pinzette zu kühl, erstarrt das Paraffin daran. Das Gewebe bleibt daran haften, was die Handhabung erschwert. (Abb.52) Zur individuellen Blockgestaltung gibt es verstellbare Rahmen. Es werden auch Wegwerfartikel und Ausgießringe, die man in den Blockhalter einspannen kann, angeboten.

Abb.52 TissueTek Fa. Sakura

Seit kurzem ist auch ein Ausblockautomat auf dem Markt. Dieses Gerät der Fa. Sakura wird mit Paraform-Kassetten bestückt, die das Gewebe in seiner Orientierung halten. Die Paraform-Kassette wird in einen Rahmen eingelegt, der dieselben Maße wie die üblichen Kassetten hat. Beim Ausblocken wird die Paraform-Kassette nach unten in das Ausgießschälchen gedrückt und mit ausgegossen. Der Block hat wieder die übliche Form und kann samt Paraform in gewohnter Weise geschnitten werden. 6.2. Ablauf 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13.

Kassette aus gewärmter Aufbewahrungslade entnehmen Kassette öffnen, Deckel verwerfen Anzahl der Gewebestückchen prüfen passende Ausgießschale auswählen Boden mit flüssigem Paraffin bedecken Gewebe richtig orientiert auf Boden setzen kurz auf Anfrierplatte abkühlen lassen, Gewebe bleibt haften (solange andrücken, bis es nicht mehr federt) Kassettenboden mit Identifikationsnummer aufsetzen flüssiges Paraffin auf Kassettenboden füllen Ausgießschälchen auf Kühlplatte stellen Block verfestigt sich aus Ausgießschälchen heben fertig zum Schneiden

Histotechnik

99

Die Zeiten der individuellen Formenanpassung und der Paraffintöpfe auf rauchenden Heizplatten sind im Routinebetrieb vorbei. Es gibt jedoch Rahmen und Einbettungsringe zum Aufsetzen für außergewöhnliche Gewebegrößen. Es werden auch Kassetten angeboten, die für eine effiziente Platzausnutzung im Prozessor noch in einzelne Kammern unterteilt sind, deren Inhalt dann separat ausgegossen werden muss. Die Identifikation der Probe läuft über den beschrifteten Kassettenteil. Falls dieses System nicht angewandt wird, muss man in den Paraffinblock einen Papierstreifen mit der Blockbezeichnung miteinschmelzen bzw. den Einbettring anschreiben. Ist beim Ausgießen ein Fehler unterlaufen, kann man den Block wieder einschmelzen und den Vorgang wiederholen. 6.3. Grundregeln beim Ausgießen •

Die Struktur, die am Boden des Ausgießschälchens liegt, ist im fertigen Block die oberste Schicht. – daher:

•

Plane Schnittfläche mit Struktur des Interesses flach auf den Boden des Ausgießschälchens legen; zur Kennzeichnung kann man die gegenüberliegende Fläche mit Präparatetusche oder Einkerbungen markieren;

•

geschichtetes Gewebe: Oberfläche senkrecht auf Boden, Schichtung parallel zur Schneiderichtung: z.B. bei Hautbiopsien, Cystenwänden, Konisationen

•

längliches Gewebe: parallel zur Schneiderichtung: Strukturen gleicher Dichte sollen bezogen auf die Schnittrichtung hintereinander liegen. z.B. Nadelbiopsien, Wände

•

Gänge, Gefäße: im Querschnitt aufstellen

•

bei mehreren Stücken: ż versetzt: Scharten aufgrund eines Stückes beeinflussen das zweite Stück nicht. ż geordnet: Der Pathologe hat eine bessere Übersicht am Objektträger. ż in selbe Ebene einbetten: alle Stücke sollen in einem Schnitt erfasst werden.

•

rund um Gewebe Paraffinsaum: erleichtert die Schneidetechnik, hält z.B. im Wasserbad auseinanderstrebendes Fettgewebe zusammen

•

Angaben über Stückzahl, die in der Kassette sein soll, beachten

•

Immer nur eine Kassette öffnen, um Verwechslungen zu vermeiden.

•

Je nach Institut gibt es verschiedene Regelungen bez. Orientierung (bestimmte Form bedeutet z.B. „rechts“ oder „links“)

•

Je nach verwendetem Mikrotomtyp: Schlitten- bzw. Rotationsmikrotom

•

schnelles Abkühlen Æ klarer Block (langsam Æ gesprenkelt) (Abb.53)

100

Einbettungsprozess

Abb.53 Ausgießen und Gewebeorientierung

7.

Tissuearray (Multigewebeblock)

Eine besondere Form der Blockherstellung ist die Fertigung eines Tissuearray-Blocks. Dazu benötigt man fertige Paraffinblöcke, wo man mit Hilfe eines Gerätes Stanzen von bestimmtem Durchmesser aus einem Areal von besonderem Interesse herauspunktiert. Diese Stanzen werden in einen Zielblock, der vorher entsprechend gelöchert wurde, in einem Rastermuster eingesetzt. Je nach Größe der Stanzen (0,6-4 mm) können 20 bis 600 Proben pro Block vereint werden. Die Anwendungsgebiete dieser Technik umfassen vor allem die Durchführung von teuren Tests (in situ Hybridisierung, Genomaustestung) in der Forschung für möglichst viele, gleichartige Proben zum Screening (Studien). Auch für Referenzlabors ist es eine gute Möglichkeit eine große Menge an Proben zu verarbeiten und die Quellblöcke wieder zurückzuschicken. Andererseits können Multigewebeblöcke hergestellt wer-

101

Histotechnik

den, die zum Beispiel als Multi-Positivkontrollen für verschiedene Tests eingesetzt werden. Derartige Blöcke können mit der geeigneten Ausstattung selbst hergestellt werden oder von Firmen bezogen werden, die zum Teil auch laboreigene Quellblöcke verarbeiten und gleich die entsprechenden Schnitte liefern. Das Schneiden von Tissuearray-Blöcken ist manchmal schwierig, falls sich die Punktionen nicht richtig mit dem umgebenden Paraffin verbinden. Dazu gibt es TapeTransfersysteme zur Unterstützung. (Abb.54) Zur Auswertung ist eine genaue Protokollführung über die Position der einzelnen Proben notwendig. Dazu werden auch Computerprogramme (spotbrowser) angeboten. Die Weiterführung stellt die computerunterstützte Gewebeauswertung der „Spots“ dar.

Abb.54 Tissue-Array Herstellungsschema und fertige Schnitte

Vorteile: •

Abschöpfung von wertvollem Material: Von einem Quellblock können 20–30 Nadelpunktionen gewonnen werden, die als Teil eines Microarray-Blocks zu 100–300 Schnitten führen können.

•

Einheitliche Technik: Alle Tumorzellen der verschiedenen Quellblöcke werden gleichzeitig einer einheitlichen Prozedur unterzogen. Man umgeht damit Objektträger-zu-Objektträger-Abweichungen.

•

Einsparung von Reagenzien: Anstelle von z.B. 50 Objektträgern wird nur einer verarbeitet und benötigt deshalb umso weniger Reagenzien, was vor allem für sehr teure Anwendungen von Vorteil ist.

•

Wird aus einem Quellblock eine oder nur wenige Punktionen herausgestanzt, bleibt der restliche Block intakt und kann wieder verwendet werden.

8.

Rückführen

Bei ungenügend entwässertem oder paraffindurchtränktem Gewebe kommt es bei der Schnittherstellung zu Schwierigkeiten. Das Gewebe erscheint „matschig“, die Färbung des Blockes ist uneinheitlich, der Schnitt „explodiert“ sobald er auf die Wasseroberfläche aufkommt. Will man die Einbettung des Gewebeblockes nun verbessern, muss man ihn erst bis zu den Alkoholschritten rückführen und in weiters wieder einbetten. Dies geschieht entweder auf händische Weise oder man bedient sich bei einem Vakuum-Infiltration-Prozessors des Reinigungszyklusses. Dabei wird die Retorte

102

Einbettungsprozess

zuerst aufgeheizt, was das Paraffin im Block verflüssigt, weiters folgen mehrere Durchgänge mit Xylol- und Alkoholbädern. Das Paraffin wird komplett gelöst und der Block kann erneut dem Einbettungsprozess zugeführt werden. Hier sollte man allerdings beim 70% Alkohol starten und ein Programm mit kürzeren Zeiten fahren, um eine zu starke Härtung zu vermeiden. Es kann aber trotzdem zu ziemlichen Morphologieschäden führen. Es wurde auch von einer Methode berichtet, wo die geschmolzenen Paraffinblöcke gleich wieder dem Einbettungszyklus beginnend bei Formalin zugeführt werden. Schlecht infiltrierte Zonen werden besser verarbeitet, gut infiltrierte Zonen bleiben vor weiterer Dehydrierung durch das Paraffin bewahrt. Bei diesem Bericht gab es aber keine Angaben über den verwendeten Automaten bzw. über Risiken für die Maschine (Histologic, Mai 2003). Bei der händischen Methode richtet man sich nach den Zeiten der händischen Einbettung und führt sie in umgekehrter Reihenfolge durch.

B. Gelatine-Einbettung Gelatine wird aus dem Kollagen von Knochen, Schweinsschwarten und Rinderhaut durch chemisch-thermische Verfahrensschritte gewonnen. Bindungen, die das Kollagen stabilisieren und die helikale Struktur der einzelnen Kollagenstränge werden zerstört. Dadurch entsteht eine Molekülstruktur aus Knäueln, deren Faltung beim AbkühAbb.55 Gelatine-Gewinnung len vom Zufall bestimmt ist (Abb.55). Da Gelatine aus Proteinsträngen aufgebaut ist, wird es durch die Einwirkung von Aldehyden (Formalin) stabilisiert und wasserunlöslich gemacht. Gelatine ist ein wasserlösliches Einbettungsmedium. Man benötigt keine Entwässerung, und dadurch eignet es sich prinzipiell zum Nachweis von Stoffen, die durch organische Lösungsmittel herausgelöst würden. Sein Schmelzpunkt liegt bei 35–40oC. Es durchdringt das Gewebe. Das nachfolgende Trocknen führt zu einem gehärteten Block, von dem man bis zu 2 µm dicke Schnitte herstellen kann. Diese Methode wurde aber durch die moderne und einfachere Kunststoffeinbettung und Gefriertechnik abgelöst. Zur Doppeleinbettung mit Paraffin ist es aufgrund seines niedrigen Schmelzpunktes nicht geeignet. Einsatz findet es als Einbettungsmittel für die Herstellung von Gefrierschnitten von kurz fixiertem Gewebe zur Darstellung von Enzymen. •

Kurz formalin-fixiertes und puffer-gespültes Gewebe wird mit Gelatinelösung in aufsteigender Konzentration (12,5%–25%) bei 37oC durchtränkt.

•

Es wird in einer Petrischale orientiert und mit Gelatine übergossen.

•

Im Kühlschrank wird es fest.

•

Anschließend kann man einen Block herausschneiden.

•

Diesen trocknet man an der Luft und stabilisiert ihn anschließend in 4% Formalin.

•

Geschnitten wird im Cryostat auf albumin- oder chromgelatine-beschichtete Objektträger.

Histotechnik

103

Die Gelatine im Schnitt wird nicht entfernt und färbt sich durch saure Farbstoffe stark an. Die Gelatine lässt sich bei Bedarf durch Einwirkung von 10% Natron- oder Kalilauge herauslösen. Beispiel Gelatine-Lösung: 30 g ................... Gelatinepulver 30 ml .................. Glycerol 140 ml .................. Wasser 1 Kristall ............... Thymol

C. Agar-Einbettung Agar-Agar wird aus verschiedenen Rotalgen-Arten durch Ausziehenlassen mit siedendem Wasser, Reinigung (Heißfiltration), Konzentration und schonender Trocknung gewonnen. Das Pulver ist elfenbeinfarben. Agar ist an sich geruch- und geschmacklos. Das Naturprodukt findet hauptsächlich in den Bereichen Lebensmitteltechnologie und Mikrobiologie Verwendung. In der Mikrobiologie wird Agar-Agar zur Herstellung fester Nährböden eingesetzt. Zusammensetzung: Es handelt sich bei den Agar-Inhaltsstoffen zu 90% um Kohlenhydrate, wobei der größere Teil davon (bis zu 70%) gelierende Agarose und der geringere Anteil (bis zu 30%) nichtgelierendes Agaropektin darstellt. Sulfat macht bis 7% und Pyruvat zwischen 0,05 und 3% der Trockenmasse von Agar-Agar aus. Die 2% Agarlösung wird durch Aufkochen in Aqua dest. hergestellt. In siedendem Wasser löst sich das Agarpulver auf, in kaltem Wasser quillt es. Grundsätzlich entfaltet Agar-Agar seine volle Gelierfähigkeit erst, wenn man das Pulver für etwa 2 Minuten mit Flüssigkeit kocht. Wenn die heiße Lösung abkühlt, bildet sich eine mehr oder weniger feste, gallertartige Masse (bei 60°C flüssig, bei 30°C fest). Agar ist ein wasserlösliches Einbettmedium, das sich zur Doppeleinbettung mit Paraffin- oder Kunststoffeinbettung eignet. Die Doppeleinbettung ist sinnvoll bei Zellsuspensionen und bröckeligem, zerfallenden Gewebestückchen. Dazu wird die Zellsuspension in der Fixierlösung zentrifugiert. Es entsteht ein Zellpellet, der Überstand wird abgegossen. Das Gewebe wird in flüssigem Agar resuspendiert und zentrifugiert (in Eppendorfröhrchen). Nach dem Abkühlen kann der Block dem üblichen Einbettungsprozess zugeführt werden. Agar wird bei der Hämatoxylin-Eosin-Färbung nicht angefärbt. Mit Alcianblau lässt es sich anfärben. Im Handel ist ein auf Agarose basierendes Einbettmedium erhältlich, das zur Anwendung kurz auf 60oC erwärmt wird bis es flüssig ist (Histogel, Fa. Microm). Weiters wird das fragile Gewebe oder das Zellpellet damit bedeckt und dann gekühlt, bis ein fester Brocken entsteht. Dieser wird in einer Kunststoffkassette wie üblich mit Formalin, aufsteigender Alkoholreihe, Intermedium und Paraffin verarbeitet.

104

Einbettungsprozess

D. Celloidin-Einbettung (Nitrocellulose) Diese Art der Einbettung ist umständlicher und zeitaufwendiger als die Paraffinwachsmethode, hat aber für bestimmte Gewebetypen große Vorteile. Dazu gehören Knochen, Gehirn und Augen (Glaskörper). Außerdem erfolgt die Einbettung bei Raumtemperatur, was die Methode für temperaturempfindliche Gewebe attraktiv macht, und es unterstützt die Präparation von großen Gewebepräparaten. Nachteilig ist, dass einige Färbungen nicht angewandt werden können und die Schneidetechnik umständlich ist. Weiters sind die verwendeten Reagenzien leicht flüchtig und feuergefährlich. So bleibt die Celloidineinbettung heutzutage auf die Forschungsarbeit beschränkt. Celloidin ist ein Zellulosedinitrat, das durch die Behandlung von Zellulose mit verdünnter Salpetersäure gewonnen wird. Es ist auch als Nitrozellulose bekannt und in Form von durchsichtigen Tafeln oder in watteähnlicher Form im Handel erhältlich (unter verschiedenen Handelsnamen z.B. Collodion). Celloidin ist unlöslich in Ether und sehr schlecht löslich in Alkohol, aber gut löslich in Ether/Alkohol 1:1 - Gemisch. Celloidin ist im trockenen Zustand sehr feuer- und explosionsgefährlich und wird nur angefeuchtet mit Alkohol aufbewahrt (Verwendung von Nitrocellulose als Schießbaumwolle). Man arbeitet mit einer 8 % Stammlösung. Die moderneren Techniken verwenden LVN (low viscosity nitrocellulose, als Pulver erhältlich), das Wasserreste bis zu 6 % toleriert und leichter in das Gewebe eindringt. Es erreicht eine bessere Härtung des Blocks und ist in verschiedenen Viskosegraden erhältlich. Der Einsatz von Celloidin in Einbettungsautomaten ist durch die leichte Entflammbarkeit und hohe Flüchtigkeit der Reagenzien nicht zu empfehlen. Verwendung findet diese Technik bei der Darstellung von Gehirnen (menschlichen oder z.B. zur Erstellung eines anatomischen Atlas von Labormausgehirnen in Atlasbanken). Bei der Verarbeitung von Gehirnen kommt es zu einer erheblichen Schrumpfung, was bei der Morphometrie beachtet werden sollte. Es werden Schnitte zwischen 10 und 30 µm hergestellt. Hirn-Färbungen sind z.B.: Hämatoxylin-Eosin, PTAH, Myelinfärbungen, Masson Trichrom; es können aber auch immunhistochemische Untersuchungen durchgeführt werden. Weitere Beispiele:

die Einbettung von entkalktem Schläfenbein die Präparation des empfindlichen Augapfels

Beispiel eines Einbettungsprotokolls: Entwässern Intermedium Infiltration

aufsteigende Alkoholreihe absoluter Alkohol

wie zur Paraffineinbettung

Ether/Alkohol 1:1

4-6 Std

2 % Celloidinlösung

2 Tage

4 % Celloidinlösung

2 Tage

8 % Celloidinlösung

8 Tage

Ausgießen

in 8 % Celloidinlösung

Eindicken

auf 16 % Celloidinlösung

Exsikkator, bis zähflüssig, mehrere Tage lang

Vorhärten

Dämpfe von 70% Alkohol

gummiartig

Herausschneiden Härten

des Gewebeblockes in 70 % Alkohol oder GlycerinAlkohol

kunststoffartig

Histotechnik

105

Die Dauer der Infiltration kann statt Tage auch Wochen betragen, je nach Gewebetyp und Größe (z.B. entkalktes Schläfenbein). Das Ausgießen erfolgt in durchsichtigen Gefäßen mit genügend breitem Durchmesser (Abb.56). Das Gewebsstück wird auf den Boden gelegt und mit 8 % Celloidin überschichtet. Man lässt das Lösungsmittel langsam entweichen, damit die Flüssigkeit gleichmäßig eindickt und sich kein Häutchen bildet. Als nächstes erfolgt die Härtung des Mediums, indem man das offene Gefäß in eine Glasschale (mit Deckel) stellt, die mit 70 % Alkohol gefüllt ist. Die Dämpfe härten die zähe Celloidinlösung zu einer gummiartigen Konsistenz so Abb.56 Einbetten mit Celloidin weit, bis man das Gewebe umschneiden kann. Der gewonnene Block wird in 70% Alkohol gegeben und weiter gehärtet, bis er schneidfähig wird. Die Lagerung muss ebenfalls in Alkohol erfolgen. Die Blöcke dürfen nicht austrocknen. Es gibt verschiedene Prozeduren mit anderen Lösungsmitteln. z.B. Methanol, Tetrahydrofuran, Amylazetat. Zur Härtung eignet sich auch Chloroform. Die Schneidetechnik für Celloidin-Blöcke erfordert die ständige Benetzung mit 70% Alkohol, damit der Block nicht austrocknet. Die Schnitte haben eine Dicke zwischen 10 und 30 µm (bis 100 µm möglich) und werden in 70% Alkohol gesammelt. Da sie schlecht auf Objektträgern haften, werden sie flottierend (schwimmend) gefärbt und anschließend auf Eiweißglycerin beschichtete Objektträger aufgeklebt. Das Celloidin kann mit 96% Alkohol und Ether/Alkohol herausgelöst werden. Kombiniert man die Celloidin-Technik mit der Paraffinwachseinbettung kann man den Vorgang vereinfachen, bewahrt aber die Vorteile der Celloidin-Technik. Die Doppeleinbettung wird angewandt für Gehirn, bröckeliges und entkalktes Gewebes, im Besonderen auch für die Herstellung von Ganzkörperschnitten von kleinen Tieren. Sie eignet sich speziell für Gewebe, die aus harten und weichen Komponenten bestehen. Eine Methode arbeitet so, dass nach der Infiltration mit 4% Celloidin das Gewebe in Chloroform und Toluol-Phenol als Zwischenmedien überführt wird und weiters mit Paraffin durchtränkt wird. Die Schnitte werden in üblicher Weise wie Paraffinschnitte hergestellt. Die Doppeleinbettung erlaubt auch die Gewinnung von Semidünnschnitten bis zu 1 µm.

E. Polyethylenglykol-Einbettung (PEG) Bei dieser Art der Einbettung nutzt man die polymerisierende Eigenschaft von Ethylenglykol. Je länger die Ketten umso fester ist das Produkt und umso höher ist der Schmelzpunkt. Man kennzeichnet die PEG-Produkte durch ihr Molekulargewicht (Handelsname z.B. Carbowax). (Abb.57; mit Erlaubnis von Scion Publishing Ltd. aus Histological and Histochemical Methods 3e by J.A. Kiernan)

Abb.57 Polyethylenglykol MG einer Einheit= 44,05

106

Einbettungsprozess

Bei Zimmertemperatur ist •

PEG 200–500 flüssig,

•

PEG 500–900 salbenartig und

•

PEG 1000–10000 paraffinähnlich.

Durch Mischen der einzelnen Polymerisate kann man die Festigkeit bestimmen. Polyethylenglykol (PEG) wurde schon 1950 als Ersatz der Paraffinmethode eingeführt. Der Nachteil der Paraffinmethode liegt in der Verwendung von aggressiven Reagenzien und der hohen Temperatur, weiters der langen Dauer und der Maskierung von manchen Antigenen. Genau hier liegen die Vorteile von PEG. Es ist in allen Polymerstufen wasserlöslich, kann durch seine hygroskopische Eigenschaft auch zum Dehydrieren und gleichzeitig zum Einbetten verwendet werden, was die Dauer verkürzt. Wählt man die Einbettungstemperatur bei 37oC (und schneidet bei tieferen Temperaturen) ist es für enzymhistologische und immunhistologische Untersuchungen besonders schonend. Die Blöcke können mit den auch für Paraffin üblichen Mikrotomen geschnitten werden. Durch den Wegfall von Alkoholen und Intermedien ist es umweltverträglicher. Im Vergleich zu Cryostatschnitten, wo die antigenen Eigenschaften am besten erhalten bleiben, ist die morphologische Darstellung besser. Beispiel eines Einbettungs-Protokolls: Fixierung Auswaschen des Fixativs Entwässerung Infiltration Ausgießen

Formaldehyd 4% Leitungswasser PEG 400/Wasser 1:1 PEG 400/Wasser 3:1 PEG 400 PEG 1000 PEG 1550/PEG 4000 1:9 PEG 1550/PEG 4000 1:9

30 min 30 min 30 min 30 min, 40oC 30 min, 58oC 58oC

Der große Nachteil von PEG liegt in der umständlichen Schneidetechnik, da die Schnitte nicht an der Wasseroberfläche bleiben und sich nicht strecken. Dazu gibt es spezielle Streckflüssigkeiten. Weiters ist die Schnittherstellung schwieriger und die Schnitte haften schlecht auf den Objektträgern. Die Blöcke ziehen Wasser aus der Umgebung an, man muss sie deshalb gut verschlossen mit einem Entfeuchtungsmittel aufbewahren. Bei der Einbettung kann eine ungleichmäßige Schrumpfung entstehen, dies kann man durch Dehydrieren mit Alkohol vor PEG-Einbettung verhindern. Um diese Hindernisse zu umgehen, wurde ein Kit entwickelt, der neben den verschiedenen Konzentrationen von PEG auch Hilfsmittel zum Schnitttransfer, silanisierte Objektträger und Trocknungsmittel enthält (SuperEmbedKit). Die 5 µm dicken Schnitte werden auf Agarose Blöcke gestreckt und auf die Objektträger aufgeklebt. In einem nachfolgenden Pufferbad wird das PEG herausgelöst und der Agaroseblock entfernt. Die Schnitte sollen bei immunhistologischer Färbung mit Immunogoldmethode eine hervorragende Qualität liefern. Trotzdem hat es sich in der Routine nicht als Paraffinersatz durchgesetzt.

F. Polyesterwachs-Einbettung Polyesterwachs ist ein synthetisches Wachs eingeführt durch Dr. H. F. Steedman (Glasgow, 1960). Sein größter Vorteil gegenüber Paraffinwachs und Esterwachs ist der

Histotechnik

107

niedrige Schmelzpunkt (37oC), was zu einer Reduktion der Gewebehärtung und -schrumpfung und zum Erhalt von antigenen Strukturen führt. Das Wachs ist in den meisten organischen Lösungsmitteln löslich, einschließlich Alkoholen, Ether, Ester, Ketone und heißem Wasser. Ein Erwärmen auf 25oC vereinfacht das Lösen. Das Wachs zeigt eine gute Wassertoleranz und ist fast durchscheinend. Die Schnittdicke liegt zwischen 2 und mehr Mikrometer bei Raumtemperatur (10-22oC). •

Das Gewebe wird über Alkohol entwässert bis zum 96% Alkohol,

•

weiters kommt es in ein Alkohol-Polyesterwachsgemisch mit ansteigendem Polyesterwachsanteil und

•

anschließend in das Einbettmedium.

Es ist wichtig, dass das Lösungsmittel vollständig aus dem Block entfernt wird. Ausgegossen wird in derselben Weise wie bei Paraffinblöcken, jedoch in Einmalschälchen. Das künstliche Wachs soll nicht allzu lange vorher verflüssigt werden (bleibt sonst weich beim Abkühlen). Die Schnittherstellung ist ebenfalls ähnlich wie bei Paraffin, wird aber als schwieriger beschrieben. Polyesterwachs 90/10 ist eine Mischung aus PEG-400-diestereat und Cetylalkohol 90:10. Geschnitten wird üblicherweise bei kühlen Raumtemperaturen oder im Cryostaten. Die Schnitte werden auf silanisierte Objektträger aufgezogen. Schnitte und Blöcke werden im Kühlschrank aufbewahrt. Absoluter Alkohol löst das Polyesterwachs vom Schnitt. Die Einbettungstechnik wurde für die Immunhistochemie wiederentdeckt, setzte sich aber nicht durch.

G. Kunststoff-Einbettung Einige Bereiche der morphologischen Diagnostik benötigen eine detailreichere Darstellung der Zellen und Zellkerne als dies die Paraffinmethode ermöglicht. Das betrifft vor allem Gewebeproben von Nieren, Knochenmark und Lymphsystemen; in zunehmendem Ausmaß auch den Einsatz bei metabolischen Knochenerkrankungen und Hauttumoren. Um diese hohe Auflösung zu erreichen, müssen die Schnitte eine Dicke unter 1 µm haben (S Semidünnschnitte). Die Folge davon ist die Verwendung von härterem Einbettmaterial, das die Herstellung von Semidünnschnitten unterstützt. Als weiterer Vorteil gegenüber der Paraffinmethode verursacht Kunststoff weniger Schrumpfung und Auftrennung von Gewebeschichten und es führt im Gegensatz zu Paraffin zu einer glatten Schnittfläche ohne Gewebezerreissungen. Unumgänglich ist die Verwendung von Kunststoffen zur Einbettung in der ElektroUltradünnschnitte). nenmikroskopie (U Für die Verarbeitung von unentkalktem Knochengewebe benötigt man ebenfalls Kunststoffe. Hier werden aus den Gewebeproben Hartschnitte bzw. Schliffe hergestellt (siehe Verarbeitung von hartem Gewebe). Es sind verschiedene Kunststoffe und Einbettungskits erhältlich, die den diversen Ansprüchen entsprechen.

108

Einbettungsprozess

Bevorzugte Kunststoffeigenschaften: •

Schnelle Infiltration durch niedrige Viskosität der monomeren Lösung

•

Gleichmäßige und reproduzierbare Polymerisation

•

Keine Gewebeartefakte aufgrund der Einbettung (z.B. Schrumpfung)

•

Einfache Handhabung der Kits

Kunststoffe können unterschieden werden in: •

hydrophobe bzw. hydrophile Kunststoffe

•

nach dem Härtegrad

•

nach Aushärtungstemperatur (37°C-60°C, Raumtemperatur, Minusgrade)

•

nur für die Lichtmikroskopie oder auch für Elektronenmikroskopie (stabil im Elektronenstrahl) geeignet

Die von der Industrie entwickelten Kunststoffmischungen sind adaptiert für spezielle Anwendungen: •

für die Gewinnung von Semi- und Ultradünnschnitten

•

Polymerisation wahlweise durch UV-Bestrahlung, Temperaturerhöhung oder chemischen Start.

•

Polymerisation bei Minusgraden, „kühle“ Polymerisation (für enzymatische Untersuchungen)

•

Erhalt der antigenen Proteinstrukturen durch hydrophile Eigenschaften (für immunologische Untersuchungen)

1.

Prinzip

Das Grundprinzip der Kunststoffeinbettung ist die Infiltration des Gewebes mit einer monomeren bzw. vorpolymerisierten Kunststofflösung und weiters das Starten der Polymerisation mit unterschiedlichen Mitteln (Initiator, UV-Licht, Wärme). 1. 2. 3. 4.

Der in der Mischung enthaltene Initiator wird durch Wärme bzw. durch Lichteinwirkung zum Zerfall gebracht. Es entstehen dabei freie Radikale. Freie Radikale des Initiators (Katalysators) werden in die Lösung abgegeben. Bei Einwirkung von hoher Temperatur oder starker UV-Strahlung wird die Abgabe der Radikale vermehrt. Die Radikale lagern an die Doppelbindungen des Monomers an, was das Monomer selbst zu einem Radikal werden lässt. Das „aktivierte“ Monomer lagert sich an das nächste an. Dadurch entsteht eine aliphatische Polymerkette. Die Radikale des Initiators beenden die Polymerkette, indem sie an die Enden ansetzen.

Ist die Freisetzungsrate der freien Radikale zu hoch, kommt es zu einer frühzeitigen Beendigung des Polymerisationsprozesses. Ursache kann eine zu hohe Temperatur bzw. UV-Intensität sein. In der Folge wird der Kunststoff spröd und schwer schneidbar. Ist die Freisetzungsrate der freien Radikale zu niedrig, wächst die Polymerkette langsam und der Kunststoff braucht lange zur vollständigen Polymerisation. Je homogener die Polymerkettenlänge ist, umso gleichmäßiger wird der Kunststoffblock.

109

Histotechnik

Um eine Spontanpolymerisation zu verhindern, enthält die Mischung Hemmstoffe (z.B. Hydrochinon). Weiters sollte man Monomerlösungen immer gekühlt und dunkel lagern. Weitere Zusätze erlauben das Regulieren der Sprödigkeit (Plastizität). Akzeleratoren beschleunigen die Reaktion. Quervernetzende Reagenzien erhöhen die Widerstandsfähigkeit des Blocks. Die UV-Polymerisation funktioniert nur bei indirekter Bestrahlung und der geeigneten Wellenlänge (360 nm). 1.1. Reaktionstemperatur Die Polymerisation ist eine exotherme Reaktion und verursacht eine Erhöhung der Blocktemperatur. Die Wahl der Reaktionstemperatur ist wichtig für das angestrebte Untersuchungsziel. Für temperaturlabile Inhaltsstoffe und Antigene sollte „kkühle“ Polymerisation mit indirekter UV-Bestrahlung gewählt werden. Auch bei UV-induzierter Polymerisation erhöht sich die Temperatur. Um eine Überhitzung zu vermeiden, muss die Reaktion in einer Kühlkammer durchgeführt werden. Dadurch wird die Blocktemperatur von 37°C nicht überschritten. UV-Licht kann zwischen –10 und +20°C eingesetzt werden. Je tiefer die Temperatur, umso länger dauert die Polymerisation bei gleicher UV-Intensität. Für alle anderen Fälle kann die hitzeinduzierte Polymerisation verwendet werden, wo Temperaturen um 60°C erreicht werden. Die Dauer der Polymerisation kann durch die Wahl der Induktionstemperatur verändert werden (zu hoch Æ Block wird spröd). Der Einbettungsprozess wird in kleinen Kunststoffgefäßen, die nicht mit dem Einbettmedium interferieren, oder in Gelatinekapseln durchgeführt. Verschließbare Gefäße sind günstig, um eventuell entweichende Dämpfe zurückzuhalten bzw. die Sauerstoffzufuhr zu verhindern. Es wird eine möglichst kleine Menge an Kunststoff gewählt (Je größer die Menge umso höher die Reaktionstemperatur). Für UVBestrahlung müssen die Gefäße UV-durchlässig sein. 1.2. Einbettungsprozess Die Fixierung des Gewebes erfolgt meist mit neutral gepuffertem Formaldehyd bzw. Glutaraldehyd und Osmiumtetroxid für die Elektronenmikroskopie. Auch andere Fixantien sind verwendbar. Die Einbettung wird mangels geeigneter Systeme und aufgrund der geringen Anzahl an Proben meist händisch durchgeführt. Hilfreich sind hier Geräte zur dauernden Bewegung der Lösungen (Rotator, Schüttler). Kleine Gewebeproben verbleiben dabei im Einbettungsgefäß und die Reagenzien werden vorsichtig heraus- und hineinpipettiert. Die Entwässerung erfolgt über Ethanol oder Aceton, bzw. bei manchen hydrophilen Kunststoffen über eine aufsteigende Kunststoffmischung. Als gebräuchlichstes Intermedium wird Propylenoxid verwendet. Bei der I nfiltration werden die vorgeschalteten Reagenzien durch den Kunststoff in mehreren Schritten ersetzt. Bei hochviskösen Kunststoffen ist die Infiltration unter Vakuum vorteilhaft (Vorsicht! leicht flüchtige Komponenten können verdampfen).

Abb.58

110

Einbettungsprozess

Ausgegossen wird in (Einmal-)Ausgießschälchen aus Kunststoff, meist Silikon, bzw. in (verschließbaren) Kapseln aus Kunststoff oder Gelatine. In diesen Formen erfolgt die Polymerisation und Verfestigung des Kunststoffes. Will man sichergehen, dass die Kunststoffgefäße der Harzmischung standhalten, verwendet man diese bereits zur Infiltration. (Abb.58) Semidünnschnitte (0,2–1 µm) werden an Rotationsmikrotomen und Hochleistungsmikrotomen, Ultradünnschnitte (unter 0,2 µm) an Ultramikrotomen hergestellt. Für Schliffpräparate (50 µm) benötigt man die entsprechenden Apparaturen (siehe Knochenpräparation). Je nach Art des Kunststoffes kann oder muss das Einbettmedium aus dem Schnitt durch Entplasten (Entharzen) entfernt werden. Manche Kunststoffe erlauben durch ihre hydrophilen Eigenschaften die Anfärbung ohne vorheriges Entplasten. Für die EM versucht man das heikle Entharzen durch Verwendung hydrophiler Kunststoffe zu umgehen. Die meisten F ärbetechniken (Lichtmikroskopie) für Paraffinschnitte sind auf Kunststoffschnitten mit geringen oder gar keinen Modifikationen nach dem Entplasten anwendbar. Bei nicht entplasteten Schnitten müssen die Färbezeiten meist erhöht werden, um zufriedenstellende Ergebnisse zu erreichen. Hydrophile Kunststoffe ermöglichen das Eindringen der Farbstoffe. Enzymhistochemie und Immunhistochemie können auf entplasteten Schnitten ebenfalls durchgeführt werden. Umbetten von paraffineingebettetem Material für die Elektronenmikroskopie: Prinzipiell kann aus Paraffinmaterial die interessante Stelle ausgestanzt und als Block eingebettet werden, bzw. die einzelnen Schnitte werden eingebettet. Da die lichtmikroskopische Fixierung für die Ansprüche an Strukturerhaltung und Kontrast meist nicht ausreichen sind, wird das Gewebe/der Schnitt nach dem Entparaffinieren in die wässrige Phase zurückgeführt, nach der Standard-EM-Methode mit Glutaraldehyd und Osmiumtetroxid fixiert, entwässert und wie in der normalen Prozedur vorzugsweise in Epon eingebettet. Es kann auch ohne Glutaraldehydfixierung und Osmierung direkt an die Entparaffinierung über Propylenoxid eine Harzeinbettung angeschlossen werden. Diese kurze Methode ist vor allem dann angezeigt, wenn nur Semidünnschnitte erforderlich sind. Durchführung: Paraffin wird vollständig aus dem gestanzten Material entfernt durch Schmelzen des Blockes im 65°C Brutschrank, 2–2 1/2 Std. auf Filterpapier, in Xylol überführen 3 x 30–45 min, 2 x 100% Ethanol je 10 min, weiter die Alkoholreihe zurück bis in Kakodylatpuffer, Glutaraldehydfixierung usw. oder kurze Methode wie oben.

111

Histotechnik

2.

Kunststoff-Typen

2.1. Methacrylate Methacrylate sind Ester mit der allgemeinen Formel H2C=C(CH3)COOR, wobei die C=O-Bindung konjugiert ist mit der C=C-Bindung. (Abb.59) Der Rest R ist • • •

•

Methyl in MethylMethacrylat (MMA) n-B Butyl in ButylMethacrylat (BMA) 2-hydroxyethyl in Glykolmethacrylat (GMA, HEMA) Hydroxybutyl in HydroxybutylMethacrylat (HBMA)

Abb.59 Polymerisation von Methacrylat; mit Erlaubnis von Scion Publishing Ltd. aus Histological and Histochemical methods 3e by J.A. Kiernan

Ursprünglich wurden Methacrylate für die Elektronenmikroskopie entwickelt, haben ihr Einsatzgebiet jetzt aber hauptsächlich in der Lichtmikroskopie; besonders auch in der Verarbeitung von unentkalktem Knochen mit Implantaten. Je nach Zusätzen und Mischungen gibt es ebenso Anwendungen für die Elektronenmikroskopie bei speziellen Fragestellungen. Die Monomerlösung der Hersteller enthält einen Stabilisator, um spontane Polymerisation zu unterdrücken (Hydrochinon). Dieser muss vor der Polymerisation nicht entfernt werden. Als Initiator (= Katalysator) wird hier üblicherweise Benzoylperoxid eingesetzt. Dieses Pulver wird angefeuchtet in Form einer Paste geliefert (trocken: Explosionsgefahr). Sauerstoffzufuhr behindert die Polymerisation und sollte deshalb durch Abdecken verhindert werden. Weitere Initiatoren: Azobisisobutyronitril, Benzil, Benzoin (lichtsensitiv). 2.1.1. Methyl-Methacrylat / Butyl-Methacrylat Methylmethacrylat ist eine flüchtige, klare, unangenehm riechende Flüssigkeit, nicht mischbar mit Wasser. Es benötigt Entwässerung über eine aufsteigende Alkoholreihe und infiltriert schnell bei Raumtemperatur. Sein Polymer nennt man auch Plexiglas. Es gehört zu den h arten Kunststoffen und wird bei hartem Gewebe (Knochen) eingesetzt. Methacrylateinbettung kann man zur Einbettung von mineralisierten aber auch nicht mineralisierten Proben einsetzen. Der Kunststoff wird durch Zusätze erweicht. Dazu gehört Butylmethacrylat, Polyethylenglykol oder Dibutylphthalat. Zum Ausgießen verwendet man Gelatinekapseln oder verschließbare Kunststoffgefäße, die nach der Aushärtung weggebrochen werden können. Geschnitten wird je nach Kunststoffhärte auf motorisierten Mikrotomen mit Stahlmessern, speziellen Glasmessern (Ralph) oder Diamantmessern. Man erreicht eine Schnittdicke von 1–3 µm. MMA-Schnitte können aus einem warmen Wasserbad auf beschichtete Objektträger aufgezogen werden. Anschließend erfolgt das Trocknen bei 56–60°C.

112

Einbettungsprozess

Der Kunststoff kann durch Xylol vom Schnitt entfernt werden. Vor der Färbung erfolgt das „Entplasten“ üblicherweise für 10-20 min. Der Einsatz von MMA verringert sich zugunsten von hydrophilen Glykolmethacrylaten. Haben hydrophile Kunststoffe für Färbungen und Enzymnachweise gewisse Vorteile, so stellen sie für die immunhistologischen Tests ein Problem dar. Hydrophile Kunststoffe sind nicht löslich und verbleiben zur Färbung im Schnitt. Das erschwert den Zugang von großmolekularen immunologischen Reagenzien. Hier erweisen sich Methylmethacrylate, die vor dem Färben aus dem Schnitt gelöst werden, als vorteilhafter. 2.1.2. Glycol-Methacrylat GMA ist ein weicher, mit üblichen Mikrotomen und Messern schneidbarer Kunststoff. Glykolmethacrylat ist mischbar mit Wasser oder Alkohol, aber das Polymer ist unlöslich in den üblichen Lösungsmitteln. Die fixierten Proben können in Alkohol oder GMA entwässert werden. Die Polymerisation erfolgt bei niedriger Temperatur nach Initiation mit Benzoylperoxid oder UV-Bestrahlung. Die Wasserlöslichkeit und die niedrigere Reaktionstemperatur machen es für die Darstellung von Enzymreaktionen geeignet. Die Fa. Kulzer hat diesen Kunststoff als Einbettungskit Technovit 7100 gebräuchlich gemacht. Eine Schnittdicke bis zu 1 µm ist möglich. Die Schnitte werden im Wasserbad gestreckt, auf beschichtete Objektträger aufgezogen, je nach Wunsch bei 60°C oder Raumtemperatur getrocknet. Die Färbungen erfolgen ohne vorheriges Herauslösen des Kunststoffes. Man kann GMA auch auf gefriergetrocknetes oder gefriersubstituiertes Material anwenden. 2.1.3. Hydroxypropyl Methacrylat (HPMA) Die Verwendung von wasserlöslichen Kunststoff-Einbettmedien wurde zuerst zur Erforschung von cytochemischen Vorgängen an unfixierten Materialien eingesetzt. Es hat sich herausgestellt, dass auch formalinfixiertes und HPMA-eingebettetes Gewebe die Reaktivität einer Anzahl an Enzymen bewahrt. Es stellt sich als eines der besten Mittel für die Schnittgewinnung und Stabilität unter Elektronenbeschuss dar. Modifikationen der Methode arbeiten mit Zusätzen für Quervernetzungen (Divinylbenzen) oder PEG für eine geringere Viskosität und leichtere Polymerisation. 2.1.4. Beispiele für Einbettungskits von Acrylaten a. Histocryl-Einbettung für Lichtmikroskopie (Fa. EMS) Hydrophiler Acrylat-Kunststoff, gut für Nierengewebe, Lymphomgewebe, Beckenkammstanzen; Entwässerung:

über aufsteigende Alkoholreihe

Polymerisation: durch Benzoylperoxid, exotherme Reaktion, soll unter Kühlung erfolgen Schneiden:

u.U. auf Routinemikrotomen, besser mit Spezialmikrotomen, Glasmesser

Schnittdicke:

1–5 µm

Färben:

ohne entplasten

113

Histotechnik

b. Unicryl-Einbettung für Elektronen- und Lichtmikroskopie (Fa. EMS) Weitgehend hydrophile Acrylatkunststoffe, bei Minusgraden noch flüssig Verwendung:

Universaleinbettmittel, Immunolabeling, in-situ-Hybridisierung, Histochemie

Polymerisation: wahlweise „kühle Polymerisation“ durch UV-Bestrahlung oder bei 60°C Entwässerung:

aufsteigende Alkoholreihe und Aceton

Schneiden:

Semi- und Ultradünnschnitte

Färben:

ohne entplasten; ein eigener Färbekit wird angeboten.

c. London Resin White (LRW) Sehr weitverbreitetes, hydrophiles Einbettmedium Verwendung:

Histochemie, Immunhistochemie, in-situ-Hybridisierung

Polymerisation: wie bei Unicryl Entwässerung:

aufsteigende Alkoholreihe bis 100% oder bereits ab 70%igem Ethanol mit Harz mischbar

Schneiden:

Semi- und Ultradünnschnitte

Färben:

ohne Entharzen, mit Richardson für Vorschnitte

d. Methacrylate für niedrige Temperaturen (Lowicryl-Serie) Diese Kunststoffe sind stark quervernetzende Acrylate und Methacrylate. Ihre Formel bedingt eine geringe Viskosität bei niedrigen Temperaturen (von –35°C bis –80°C). Der Forscher kann zwischen polaren (hydrophilen) oder unpolaren (hydrophoben) Medien wählen. Die Einbettsysteme bestehen aus Vernetzer, Monomer-Mischung und Initiator. Verwendung:

für Immunolabeling der Schnitte mit Antiseren, Lectinen oder kolloidalen Goldpartikeln; für Scanning Transmissionselektronenmikroskopie, Dunkelfeld-Beobachtung, die Einbettung von gefriersubstituierten Proben

Polymerisation: durch UV-Bestrahlung Schneiden:

Ultradünnschnitte mit Diamant- oder Glasmessern

Färben:

mit Uranylazetat oder Bleicitrat

Bei der Verwendung von Lowicrylharzen ist aufgrund möglicher sensibilisierender Wirkung Vorsicht geboten! e. Technovit 9100 – Methylmethacrylat für die Lichtmikroskopie (Fa. Kulzer) Technovit 9100 ist ein Einbettsystem basierend auf Methylmethacrylat, das bei tiefen Temperaturen aushärtet. Es wurde für das Einbetten von mineralisiertem Gewebe mit weitreichenden Möglichkeiten zur Färbung für die Lichtmikroskopie entwickelt. Die Verwendung ist möglich für alle Routinetechniken: Färben, Immun- und Enzymhistochemie, in-situ-Hybridisierung.

114

Einbettungsprozess

Die Basis-Lösung ist zusammengesetzt aus organischen Monomeren, mit mindestens einer C=C-Doppelbindung. Mit Z usätzen wird die Lösung für die Lagerung stabilisiert und die hydrophile Eigenschaft verstärkt. •

PMMA-Pulver ist ein interner Füllstoff und besteht aus PMMA Mikro-Pellets. Es verringert den Polymerisations-Schrumpfungseffekt und die Reaktionstemperatur.

•

Der Härter besteht aus zwei Komponenten und ist ein Derivat von Dibenzoylperoxid. Er erlaubt die Polymerisation bei Temperaturen unter 0°C.

•

Ein Regulator erlaubt eine kontrollierte Polymerisation auch bei größeren Mengen ohne Erhöhung der Reaktionstemperatur.

•

Weiters gibt es PMMA-Zusätze, die die Einbettung von großen Präparaten wie z.B. Femurschäften erlauben.

f. Technovit 7100 und 8100 – Glycolmethacrylat für Lichtmikroskopie (Fa. Kulzer) Diese Methode erlaubt die Herstellung von Serienschnitten mit 1 µm Dicke. Sie ist weniger empfindlich auf Sauerstoffeinwirkung. Eine Abdeckung der Einbettschälchen ist nicht notwendig. Die Polymerisationstemperatur geht nicht über 40°C hinaus, was auch enzymhistochemische Untersuchungen erlaubt. Technovit 8100 polymerisiert bei Temperaturen um 4°C, ideal für die Immunhistologie. Ausgegossen wird in Teflonschälchen, die im Kit beinhaltet sind. Mittels Zweikomponentenkleber basierend auf Methylmethacrylat werden die Blöcke auf die Präparatehalter aufgeklebt. g. Glycolmethacrylat (GMA) für Elektronenmikroskopie GMA wurde als Einbettmedium für ultrastrukturelle, cytochemische Studien mit enzymhistochemischen und autoradiografischen Techniken in der Elektronenmikroskopie eingeführt. Entwässerung:

über monomere GMA-Lösung

Infiltration:

in vorpolymerisierter Kunststofflösung (durch Erhitzen und schnelles Abkühlen, mehrmals wiederholt. Die vorpolymerisierte Lösung wird im Kühlschrank aufbewahrt.)

Ausgießen:

in Gelatinekapsel; Die Kapseln sollen gleich geschlossen werden, um möglichst wenig Luft an das Gemisch kommen zu lassen.

Polymerisation: UV-Licht Bestrahlung für 25–48 Std., „kühle“ Polymerisation bei 3°C Schneiden:

Ultradünnschnitte, aufziehen auf beschichtete Grids

Färben:

mit Uranylazetat oder Bleiacetat

h. Polyethylenglykol-Glykolmethacrylat Einbettung (PEG-GMA) Dieses wassermischbare Einbettmedium ist ideal für die Gewebepräparation für cytochemische Studien und Enzymlokalisation, wenn eine Korrelation zwischen Licht- und Elektronenmikroskopie notwendig ist. Und zwar, wenn dickere und dünnere Schnitte vom selben Block gewonnen werden sollen. Das Einbettmedium besteht aus einem Gemisch von Polyethylenglykol und Glykolmethacrylat, weiters Reagenzien zur Vernetzung und Erhöhung der Plastizität. So können Schnitte von 1–2 µm Dicke für die Lichtmikroskopie hergestellt werden.

115

Histotechnik

Entwässerung:

erfolgt über GMA bei Raumtemperatur

Einbettung:

im vorpolymerisierten Gemisch (zur Vorpolymerisation wird aufgeheizt auf ca. 98°C bis sirupartig); in Gelatinekapsel mit einer frischen vorpolymerisierten Mischung

Polymerisation: unter UV-Licht für 12–16 Std.; die Gelatinekapsel wird anschließend in warmem Wasser entfernt. Schneiden:

Ultraschnitte können auf Kupfer-Grids aufgezogen und mit Uranylazetat oder Bleicitrat gefärbt werden. 1 µm-Schnitte stellt man an konventionellen Rotationsmikrotomen mit Stahlmessern her..

2.2. Epoxidharze Der Name Epoxid bezieht sich auf eine chemische Gruppe, wo ein Sauerstoffatom an zwei Kohlenstoffatome gebunden ist. Gemeinsam bilden sie einen dreiteiligen Ring (Abb.60). Ein Epoxidharz ist eine Substanz, die die beschriebene Gruppe enthält und zur Bildung einer dreidimensionalen Struktur durch Polymerisation und Quervernetzung fähig ist. Die RückAbb.60 Epoxid führung in die monomere Form ist dann nicht mehr möglich. Epoxidharze sind sehr belastbare Kunststoffe, werden einfach polymerisiert und produzieren nur geringe Schrumpfung. Sie sind ziemlich viskös. Die Zusammensetzungen der Kunststoffe unterliegen meist dem Firmengeheimnis. Für die Lichtmikroskopie wird eine Schnittdicke von 0,5–1 µm an motorisierten Hochleistungsmikrotomen mit Glas- oder Diamantmessern erreicht (Semidünnschnitte bzw. Vorschnitte für EM). Eine kleine Anzahl an monochromatischen Färbungen kann am nicht-entharzten Schnitt durchgeführt werden. Für Spezialfärbungen muss das Epoxidharz mittels alkoholischer Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxidlösung in einer äuEntharzen: je 2 min methanolisches NaOH – ßerst heiklen Prozedur entfernt werden (E Methanol/Benzol – Aceton). Epoxidharzeingebettetes Gewebe eignet sich wegen seiner hohen Eigenfluoreszenz nicht für fluoreszenzmikroskopische Methoden. Das Haupteinsatzgebiet der Epoxidharze liegt in der Elektronenmikroskopie. Aufgrund ihrer Härte, geringen Schrumpfung und Widerstandskraft im Elektronenstrahl unterstützen sie die Darstellung der Ultrastrukturen. Vorbereitung der Einbettungsmischungen: Es ist essentiell, dass die Komponenten der viskösen Einbettungsmedien gründlich verrührt werden, um eine einheitliche Polymerisation zu erreichen. Unzureichendes Mischen ist der Hauptgrund für Schneideprobleme bei Epoxidharzen. Zur Erleichterung erwärmt man den Kunststoff, den Härter und den Behälter auf 60°C. Am besten stellt man die Lösung kurz vor Gebrauch her. Sie kann aber gut verschlossen für mehrere Wochen im Kühlschrank und für mehrere Monate bei –20°C gelagert werden. Während der Infiltration wird das Medium bei Raumtemperatur gehalten oder auf 60°C erwärmt. Als Aufbewahrungsgefäße haben sich Einmalkunststoffspritzen bewährt. Beim Abfüllen lässt man die Luftblasen entweichen und drückt den Kolben soweit, bis sich der Kunststoff an der Spitze befindet. Die Spritze wird zum Lichtschutz mit Alufolie umwickelt und im Kühlschrank gelagert. So wird auch die weitere Verarbeitung vereinfacht.

116

Einbettungsprozess

Probleme, die bei Epoxid-Einbettung auftreten können: •

schlechte Schneidbarkeit

•

Schnitte zerfallen bei Kontakt mit dem Wasserbad

•

Löcher im Schnitt

•

ungleichmäßig gehärteter Block

•

zu harte oder zu weiche Blöcke

Gründe für schlechte Epoxid-Einbettung: •

unvollständige Dehydration

•

hohe Luftfeuchtigkeit (tropische Länder)

•

schlechtes Vermischen der Komponenten

•

unpassende Zugabe des Beschleunigers

•

Harz zu viskös (bereits vorpolymerisiert durch zu lange oder falsche Lagerung)

2.2.1. Araldit (wasserunlöslich) Araldit 502 ist ein Epoxidharz, das zu einem hellgolden gefärbten Block führt. Gewebe, das in Araldit eingebettet werden soll, wird auf die übliche Weise mit organischen Lösungsmitteln entwässert. Die Anwendung von Propylenoxid als Intermedium ist anzuraten, weil Epoxidharze besonders gut in Propylenoxid löslich sind. Dem Harz wird zugesetzt: •

als Härter DDSA (Dodecenylbernsteinsäureanhydrid)

•

als B eschleuniger DMP-30 (2,4,6-Tris-(dementhyl-aminomethyl)-phenol) (bzw. BDMA = Benzyldimethylamin)

Um den endgültigen Block mehr zu härten, gibt man statt DDSA MNA (methyl nadic anhydride) zu. Die Konsistenz des ausgehärteten Harzes kann durch Variation der Mengenverhältnisse von Araldit und Härter bestimmt werden. Am besten stellt man die Lösung frisch her. Eingebettet wird in speziellen Einbettkapseln, die mit Einbettmedium gefüllt werden. Sie werden über Nacht oder länger bei 60°C ausgehärtet. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur werden sie zurechtgetrimmt und geschnitten. Beispiel eines Standard-Einbettungsprotokolls: Fixierung und Kontrastierung Entwässerung

Intermedium Infiltration Ausgießen in Kapseln

Glutaraldehyd gefolgt von Osmiumtetroxid 70% Ethanol

10 min

100% Ethanol

10 min

100% Ethanol

15 min

100% Propylenoxid

15 min

100% Propylenoxid

15 min

Araldit-Mischung / Propylenoxid 1:1

60 min

Araldit-Mischung

6–12 Std., Raumtemperatur

Einbettmedium

über Nacht bei 60°C

117

Histotechnik

2.2.2. Epon bzw. Embed (Eponersatzstoffe, wasserunlöslich) Embed 812 ist der Ersatzkunststoff der Fa. EMS für Epon 812, der am meisten verwendete Einbettungskunststoff für die Elektronenmikroskopie. Die Herstellung von Epon 812 wurde 1978 eingestellt. Embed 812 (je nach Hersteller auch Glydicether 100 oder Agar 100) erfüllt dieselbe exzellente Präservation und Schneidequalität wie Epon 812 und kann in allen Formeln damit ersetzt werden. Luft (1961) führte Epon 812 als bewährtes, für Pflanzen- und Tierhistologie geeignetes Einbettmedium ein. Embed 812 bietet eine schnelle Infiltration, einfaches Schneiden und Stabilität unter Elektronenbeschuss, zufriedenstellende Färbung von Semidünn- oder Vorschnitten für Lichtmikroskopie und ultradünnen Schnitten für Elektronenmikroskopie. Das Einbettmedium besteht aus den Mischungen A und B und DMP-30 als Beschleuniger: A: Embed 812 und DDSA (Dodecenyl Succinic Anhydrid) B: Embed 812 und MNA (Methyl-5-Norbornene-2,3-Dicarboxylic Anhydrid) Für eine bessere Penetration und Stabilität wird DMP-30 durch BDMA (Benzyldimethylamin) ersetzt. Leichte Veränderungen beim Beschleuniger (DMP-30 oder BDMA) bewirken drastische Unterschiede bei der Farbe und Sprödigkeit des Blocks. Beispiel eines Einbettungsprotokolls: Fixierung und Kontrastierung Entwässerung Intermedium Infiltration Ausgießen in Kapseln

Glutaraldehyd gefolgt von Osmiumtetroxid 70% Ethanol 100% Ethanol 100% Ethanol 100% Propylenoxid 100% Propylenoxid Einbettmedium/Propylenoxid 1:1 Einbettmedium/Propylenoxid 2:1 Einbettmedium Einbettmedium

10 min 10 min 15 min 15 min 15 min 60 min, Raumtemperatur über Nacht 2 Std. Raumtemperatur 24 Std. bei 60oC

Erwärmen der Reagenzien erleichtert das Abmessen und Mischen. Unmittelbar vor der Verwendung werden die Mischungen A und B vereint und der Beschleuniger zugegeben. Gründliches Mischen ist sehr wichtig, um einheitliche Blöcke zu bekommen. Die Härte des Blocks wird durch Variation der Mengen von A und B verändert. Die Lösungen können vorbereitet und im Kühlschrank aufbewahrt werden. Besser ist jedoch eine Herstellung unmittelbar vor Verwendung. Für den Infiltrationsschritt sollte ein Schüttler zur Durchmischung verwendet werden. Zum Einbetten wird das Gewebe in eine Einbettkapsel oder Silikonform (vor Gebrauch mit Vaseline ausfetten) gelegt und mit Medium überschichtet. Nach dem Aushärten und dem Abkühlen auf Raumtemperatur wird der Block getrimmt und am Ultramikrotom geschnitten.

118

Einbettungsprozess

Schnelleinbettung für die Pathodiagnostik: Da die Differentialdiagnose für manche Krankheitsbilder die Unterstützung der Elektronenmikrokopie erfordert und diese vom Pathologen rasch gestellt werden muss, wurden Protokolle zur Schnelleinbettung (3–5 Std.) entwickelt. Dabei ist es besonders wichtig, dass die Präparate sehr klein (0,5-1 mm3) gehalten werden. Beispiel eines Einbettungsprotokolls: Fixierung und Kontrastierung

Glutaraldehyd gefolgt von Osmiumtetroxid

20–30 min und 20–30 min

Entwässerung

acidiviertes Dimethoxypropan (DMP)

2 x 5 min

Embed/ac. DMP 1:1

15 min

Embed rein

15 min

Embed rein (neues Behältnis)

20 min

Embed

60 min bei max 95°C

Infiltration Ausgießen in Kapseln

2.2.3. Low Viscosity Resin LV (Fa. Agar Scientific) Der Vorgänger dieses Einbettmediums heißt Spurr Low Viscositiy Resin und ist in vielen Publikationen zu finden. Er wurde aber wegen der gesundheitsschädlichen Komponente ERL 4206 vom Markt genommen und ersetzt. Dieses Harz hat eine extrem niedrige Viskosität und ermöglicht dadurch ein sehr schnelle Infiltration des entwässerten Gewebes. Vorteilhaft ist es wegen seiner Universalität, es können damit auch Knochen und Holz, sowie große Gewebestücke eingebettet werden. Es hat gute Schneide- und Kontrastiereigenschaften. Das Einbettprotokoll entspricht in etwa dem von Epon (Embed). 2.2.4. Durcupan (wasserlöslich, Fa. Fluka) Als wasserlösliches Einbettmedium für die Elektronenmikroskopie ist es geeignet für die Untersuchung von enzymatischen Prozessen bzw. für histochemische Untersuchungen im submikroskopischen Bereich. Bei der Entwässerung werden Alkohole und Aceton vermieden. Beispiel eines Einbettungsprotokolls Fixierung

Entwässerung und Infiltration

Ausgießen in Kapseln

Bspw.: Osmiumtetroxid, Kaliumpermanganat, 10% Formaldehyd Einbettmittel/Aqua dest. 1:1

30 min, Schüttler

Einbettmittel/Aqua dest. 7:3

45 min, Schüttler

Einbettmittel/Aqua dest. 9:1

45 min, Schüttler

Einbettmittel

90 min, Schüttler

Einbettmittel

90 min, Schüttler

Einbettmittel-Mischung zur Polymerisation

über Nacht, Kühlschrank

Einbettmittel-Mischung zur Polymerisation

2-3 Tage, 37–40oC

Histotechnik

119

Der Einbettungskit enthält mehrere Komponenten: •

wasserlösliches, aliphatisches Polyepoxid

•

Diazid mit aliphatischen Seitenketten als Härter I

•

Phenol-Derivat mit Aminogruppen als Härter II

•

Dibutylphthalat als Plasticizer

Ein Gemisch dieser Komponenten ergibt eine polymerisationsfähige Lösung. Gibt man zuwenig Phenol-Derivat zu, wird der Block zu weich; zuviel Phenol-Derivat macht den Block granulär. Die formalinfixierten Gewebe ohne nachfolgende Osmierung zeigen in der Elektronenmikroskopie wenig Kontrast und schlechte Strukturerhaltung durch geringe Proteinvernetzung. Letzteres ist von Vorteil für bestimmte histochemische Untersuchungen. Zur Kontrasterhöhung muss man entweder die fertigen Schnitte mit Schwermetallen behandeln, oder man fügt diese den Infiltrationsschritten zu. Die Ultradünnschnittherstellung bei Durcupan ist schwierig, da der Kunststoff relativ weich ist. Man verwendet Glasmesser. Die Schnitte lässt man auf 20–50% Aceton in Wasser aufschwimmen. Für bessere Schneidqualität kann man den Block in Methacrylat doppeleinbetten.

H. Übersicht - Processing-Reagenzien Hier sind nur Beispiele der vielen verwendeten Reagenzien aufgezählt. Es besteht kein Anspruch auf Vollständigkeit, nachdem sich dieses Buch an der Routinehistologie orientiert. 1.

Nachbehandlung bei Fixierung mit anderen Fixantien

•

Chromhältige Fixantien (z.B. Zenker, Helly): Gewebe, die in chromhältigen Fixantien stabilisiert wurden, müssen mind. 8–12 Std. in fließendem Leitungswasser ausgewaschen werden. Chromionen würden sonst in der alkoholischen Lösung zu einem unlöslichen, grünen Niederschlag reduziert werden.

•

Quecksilberhältige Fixantien (z.B. Zenker) müssen ebenso ausgewaschen werden und weiters mit Jodlösung behandelt werden, um schwarze quecksilberhältige Niederschläge zu entfernen. Die auftretende Verfärbung durch Jod wird mit Natriumthiosulfatlösung wieder behoben.

•

Bei pikrinsäurehältigen Fixantien (z.B. Bouin) wäscht man in 70–80% Alkohol bis die Gelbfärbung verschwunden ist. Üblicherweise wird das Gewebe dann gleich in den nächst-konzentrierten Alkohol weitergeführt. Zurückbleibende Pikrinsäure kann die Qualität der Einbettung verschlechtern.

•

Chromfreie Sublimat- oder Trichloressigsäuregemische (SUSA) wäscht man in 90–96% Alkohol aus. Trichloressigsäure-fixierte Kollagenfasern schwellen ansonsten in wässriger Umgebung.

•

In Karnoy fixiertes Gewebe ist beinahe wasserfrei und wird direkt in den absoluten Alkohol übergeführt.

•

Osmiumtetroxid-Niederschläge durch Alkohol verhindert man mittels Auswaschen in Leitungswasser.

120

Einbettungsprozess

•

Elektronenmikroskopie: Auswaschen des Fixans in Puffer (Kakylatpuffer, Phosphatpuffer)

2.

Dehydrations-Reagenzien

Bei sehr vielen Methoden muss das wässrige Medium für die Einbettungsphase entfernt werden. •

Ethanol: am meisten verwendet; härtet bei zu langer Einwirkung; Absoluter Alkohol enthält meist noch 1 % Wasser – ist aber zu vernachlässigen; postfixative Wirkung

•

Methanol: flüchtig, teuer; selten eingesetzt

•

Isopropanol: langsamer als Ethanol, geringe Härtung, in der Mikrowellentechnik als Intermedium eingesetzt.

•

Aceton: sehr schnell, Gewebe wird hart und spröd; in Schnelleinbettungsmethoden als Intermedium eingesetzt.

3.

Reagenzien zur chemischen Dehydration

Statt der meist verwendeten Methode, Wasser durch andere Lösungen zu ersetzen, lässt es sich auch durch eine chemische Reaktion entfernen. •

Dimethoxypropan (DMP): Es nimmt H2O auf und bildet dadurch Methanol 2,2-D und Aceton, die im nachfolgenden Clearingreagens löslich sind. Der Clearingschritt ist notwendig, weil die Reaktionsprodukte nicht in Paraffin löslich sind. DMP ist ziemlich viskös und dringt langsam ins Gewebe ein.

4.

Clearing-Reagenzien

Da die meisten Entwässerungs-Reagenzien nicht mit dem Einbettungsmedium mischbar sind, müssen Lösungsmittel dazwischen geschaltet werden. Früher wurden am häufigsten Benzol und Chloroform verwendet, die bessere Ergebnisse liefern und weniger härten, aber gesundheitsschädlicher und umständlicher in der Anwendung sind. •

Xylol: am meisten verwendet, aromatischer Kohlenwasserstoff, wahrscheinlich kanzerogen; klärt schnell, führt bei langer Einwirkung zu Härtung.

•

Toluol: ähnlich wie Xylol

•

Produkte der Erdölverarbeitung: aromatische oder aliphatische Verbindungen (mineral spirits) unterschiedlicher Zusammensetzungen; klären langsamer aber sanfter als Xylol; hautirritierend, sehr giftig und narkotisierend in hohen Dosen; Bsp.: ShellSol-Reihe von ShellChemicals. Alkoholunlösliche M ineralöle (flüssige Paraffine) kann man als Bestandteil von erwärmten Isopropanol/Ethanol/Mineralöl-Gemischen als Intermedium einsetzen. Mineralöle sind im Gegensatz zu den mineral spirits unbedenklich für die Gesundheit und infiltrieren auch fettiges Gewebe sehr gut.

•

Chlorkohlenwasserstoffe: klären viel langsamer aber schonender als Xylol; als Zerstörer der Ozonschicht wurden sie im Gebrauch eingeschränkt.

•

Trichlorethan: manchmal als Xylolersatz eingesetzt; sehr flüchtig, giftige Dämpfe

Histotechnik

121

•

Amylacetat, Methylbenzoat, Methylsalizylat: starker Geruch, eingesetzt bei der Einbettung ganzer Bandwürmer

•

Terpene: ursprünglich Öle pflanzlichen Ursprungs, jetzt auch teilw. synthetisch; langsame, schonende Infiltration, jedoch schwer aus Einbettungsmedium zu entfernen; z.B. Zedernholzöl, Limonen (Orangengeruch in Xylolersatzmittel), Terpineol

•

Propylenoxid: für die Epoxideinbettung

5.

Reagenzien für kombinierte Entwässerung und Clearing - universelle Lösungsmittel

Diese Reagenzien ermöglichen eine schnellere Einbettung, weil sie wasserlöslich und gleichzeitig mit dem Einbettungsmedium mischbar sind. Man kann auf das Intermedium verzichten. Diese Reagenzien sind meist ziemlich teuer. •

Tertiärer Butanol: verwendet bei der Pflanzenuntersuchung

•

Dioxan: Diethylendioxid; bewirkt geringere Schrumpfung und Härtung als Alkohol. Es arbeitet schnell aber schonend und wird in aufsteigender Konzentration verwendet. Gewebe kann ohne Schaden lang darin verbleiben; gesundheitsschädlich und wahrscheinlich kanzerogen; kann explosive Peroxide bilden.

•

Tetrahydrofuran: sehr flüchtig, Ethergeruch. schnelle Entwässerung, wenig Schrumpfung und Härtung; weniger giftig als Dioxan; kann explosive Peroxide bilden.

6.

Einbettungsmedien

•

wässrige Medien: - Agar hat einen hohen Schmelzpunkt und einen niedrigen Gelierpunkt. Das macht es ideal für Doppeleinbettung von vielen kleinen Gewebeteilchen. Agar wird durch Alcianblau angefärbt. - Gelatine: Ist in der Anwendung zwar ähnlich wie Agar, ist aber aufgrund seines niedrigen Schmelzpunktes nicht für die Doppeleinbettung geeignet. Man setzt es z.B. bei Phospholipid- und Enzym-Studien für die Gefrierschnitttechnik ein. CMC): Einbettungsmedium für Ganzkör- Natriumcarboxymethylcellulose (C perschnitte. - Polyvinyl-Alkohol (PVA): Hochpolares, wasserlösliches Medium; Eingesetzt bei histochemischen Studien über Lipide und Enzyme. Das Gewebe wird bei erhöhter Temperatur durch eine ansteigende PVA-Reihe infiltriert (1-2 Wochen). Anschließend wird durch langsames Austrocknen ein fester Block gebildet, der auf die übliche Weise geschnitten werden kann.

•

wasserlösliches Medium: Polyethylenglykol ist ein wasserlösliches Medium, verwendet für die Untersuchung von hitze- und lösungsmittellabilen Lipiden und Proteinen. Außerdem ist es nützlich, um die Gewebeschrumpfung und Schädigung durch die Paraffinwachstechnik zu umgehen.

122

Einbettungsprozess

•

wasser-tolerante Medien: - Diethylenglykoldiestereat ist ein harter, spröder, wassertoleranter Ester (Schmelzpunkt 47–52°C). Es hat bestimmte Defizite bei der Verwendung für die Routinehistologie, außer in Kombination mit anderen Substanzen wie z.B. Esterwachsen. Es muss jedoch unverändert für dünne Schnitte von gefriergetrocknetem und Osmiumtetroxid-fixiertem Gewebe für die Lichtmikroskopie verwendet werden. Das Gewebe wird ähnlich wie bei der Paraffinwachsmethode dehydriert und geklärt. - Esterwachse haben niedrige Schmelzpunkte, sind hart bei Raumtemperatur und haben gute adhäsive Eigenschaften. Sie eignen sich deshalb gut zur Verarbeitung von chitinhältigen Präparaten und durch Wärmeeinwirkung gehärtetes Gewebe. - Polyesterwachs: niedriger Schmelzpunkt, reduziert wärmeinduzierte Artefakte und ist geeignet für hitzelabile Gewebe, um Härtung durch Wärmeeinwirkung zu vermeiden. Es gilt als ideales Medium für die kombinierte Licht- und Scanning-Elektronenmikroskopie. Die Eigenschaften des Wachses erleichtern immunhistologische Untersuchungen, da antigene Eigenschaften gut erhalten bleiben. Der große Vorteil dieser Methode liegt in der nahezu isothermalen Prozedur aufgrund der Infiltration direkt aus dem 96% Alkohol.

•

wasserabweisende Medien: - Paraffin: siehe vorher - Nitrocellulose: Celloidin und Low Viscosity Nitrocellulose (LVN) ist unlöslich in Wasser, aber löslich in Ethanol-Diethylether, Amylacetat, Methylbenzoat, Methylsalicylat und Ethoxyethanol. Es ist leicht entflammbar und explosiv in trockenem Zustand (besondere Aufbewahrung).

•

Kunststoffe: sind je nach Zusammensetzung den Unterteilungen zuordenbar..

Histotechnik

123

Mikrotomie A. Einbettmedien - Schnittdicken ......................................................................124 B. Mikrotom.......................................................................................................125 1. Schlittenmikrotom ..................................................................................126 2. Rotationsmikrotom .................................................................................128 2.1. Kryostat ........................................................................................129 2.2. Ultramikrotom...............................................................................129 3. Gefriermikrotom .....................................................................................130 4. Rocking Mikrotom (Schaukelmikrotom) ..................................................130 5. Sägemikrotom ........................................................................................131 6. Vibratom .................................................................................................131 7. Disc-Mikrotom ........................................................................................132 C. Mikrotommesser............................................................................................132 1. Stahlmesser ............................................................................................132 2. Einmalklingen .........................................................................................134 3. Wolframcarbidmesser.............................................................................135 4. Glasmesser .............................................................................................135 5. Diamantmesser.......................................................................................136 6. Saphirmesser ..........................................................................................136 D. Schneidetechnik ............................................................................................137 1. Schneidewinkel.......................................................................................137 2. Herstellen von Paraffinschnitten ............................................................139 3. Herstellen von Gefrierschnitten .............................................................145 4. Schneiden am Ultramikrotom .................................................................148 5. Herstellen von Sägepräparaten ..............................................................152 6. Herstellen von Schliffpräparaten.............................................................152 E. Anhaften der Schnitte am Objektträger ........................................................152 1. Adhäsive .................................................................................................153 2. Tape-Transfersystem ..............................................................................156 F. Laser Capture Microdissection (LCM)............................................................157

124

Mikrotomie

Mikrotomie Das Kernstück bei der Herstellung von mikroskopischen Präparaten ist die Mikrotomie („micro“ = klein, „tomo“ = schneiden) – das Schneiden von hauchdünnen Schnitten von den hergestellten Gewebeblöcken. Von der Qualität dieser Schnitte hängt die Qualität der gesamten histologischen Untersuchung ab. Die Geräte, die dafür verwendet werden, nennt man Mikrotome. Das sind Präzisionsinstrumente, die die Herstellung von •

Schnitten zwischen 0,5 und 60 µm (event. bis 300 µm) für die Lichtmikroskopie und von

•

Schnitten unter 0,5 bis zu 0,01 µm für die Elektronenmikroskopie ermöglichen.

A. Einbettmedien - Schnittdicken Die erreichbare Schnittdicke ist wesentlich von der Konsistenz des Einbettmediums abhängig. Die Wahl des verwendeten Einbettmediums ist wiederum abhängig vom untersuchten Gewebe und vom Untersuchungsziel. Im histodiagnostischen Labor werden Paraffinblöcke verarbeitet. Die Mehrzahl der gewonnenen Schnitte ist 3–4 µm dick. Besonders dichtes Gewebe (Lymphknoten, Knochenmarkbiopsien, Nierenbiopsien) erfordern eine geringere Dicke (2 µm, bzw. 1 µm). Andere, schwierig zu schneidende Gewebetypen, wie z.B. derbes, hartes Knochengewebe oder fettreiches Gewebe, erlauben manchmal nur Schnittdicken um 5–8 µm. Die Darstellung mancher Strukturen gelingt in relativ dickeren Schnitten besser, wie z.B. kollagene Fasern in Trichromfärbungen oder Bakterien in der ZiehlNeelsen Färbung. Die Angabe über die Schnittdicke bezieht sich hier auf die Mikrometereinstellung am Mikrotom. Während der Manipulation kommt es durch die Erwärmung immer auch zu einer gewissen Ausdehnung des Blocks, was zu dickeren Schnitten führt. Kunststoffeinbettungen für die Lichtmikroskopie erlauben die Herstellung von dünneren Schnitten (z.B. Glycolmethacrylat 0,5–2 µm bei Beckenkammstanzen). Eine weitere Verwendung von Kunststoffen bei der Verarbeitung von nicht-entkalktem, harten Knochen führt zu Schliffpräparaten um die 50 µm oder zu Sägeschnitten um 20-30 µm. Kunststoffeinbettungen für die Elektronenmikroskopie z.B. in Epoxidharzen erlauben die Herstellung von Schnitten bis zu 0,01 µm, sogenannte Ultradünnschnitte. Unter Semidünnschnitten versteht man etwas dickere Schnitte (bis 1 µm), an denen lichtmikroskopisch die Orientierung der gewünschten Details ausgemacht wird. Mit weicheren Einbettmedien, wie z.B. Celloidin, kann man 10–300 µm dicke Schnitte anfertigen (z.B. Gehirnschnitte, Glaskörperschnitte). Mit neuesten Techniken können einzelne Bereiche oder auch Zellen aus Paraffin- bzw. Gefrierschnitten mittels Laser capture microdissection (LCM) geschnitten werden. Dieses Miniaturmaterial wird dann z.B. der Molekularbiologie zur DNA-Diagnostik zugeführt.

Histotechnik

125

B. Mikrotom Im Histodiagnostiklabor werden die Schnitte an sogenannten Schlitten- bzw. Rotationsmikrotomen hergestellt, die für die gewünschte Schnittdicke (1–10 µm) und Paraffineinbettung geeignet sind. Es gibt verschiedene Bauarten von Mikrotomen, die unterschiedliche Anforderungen unterstützen. Die Entwicklung von Mikrotomen begann in der zweiten Hälfte des 19. Jahrhunderts, wo einfache Geräte erfunden wurden, die die Herstellung mikroskopischer Präparate erleichtern sollten. Davor fertigte man mittels einer scharfen Rasierklinge und einer ruhigen Hand dünne Häutchen zur Mikroskopie an. 1899 wurde in Cambridge das sog. Rocking Microtome eingeführt, das bis in die Zwanziger Jahre das am Abb.61 Rotationsmikrotom Minot meisten verbreitete Instrument war. Es wurde später vom Rotationsmikrotom (ältestes 1885 von Minot, Abb.61) weitgehend abgelöst. Das Schlittenmikrotom ist etwas älter und wurde zum Schneiden harter Strukturen (Botanik) eingesetzt. Die wichtigsten Namen im deutschsprachigen Raum waren Ernst Leitz, Carl Reichert und Carl Zeiss. Ihre Namen sind auch in den modernen Produkten immer noch vertreten. Moderne Mikrotome unterscheiden sich einerseits in ihrer Funktionsweise, andererseits im Leistungsvermögen und Ausstattung. Es gibt verschiedene Herstellerfirmen, die eine Vielzahl von Mikrotomen anbieten. Die Wahl des Mikrotomtyps richtet sich nach: •

gewünschter Schnittdicke

•

Einbettungsmedium (Konsistenz)

•

Härte des Gewebes

•

Größe des Gewebes

•

Fixierzustand des Gewebes

•

Herstellung von Serienschnitten / Einzelschnitten

•

bevorzugte Schneidetechnik

Prinzip: Im Prinzip besteht jedes Mikrotom aus •

einem Gerätekörper, der den Vorschubmechanismus enthält,

•

einer Präparatehalterung und

•

einer Messerhalterung mit dem Messer.

Je nach Typ wird das Präparat auf das Messer bzw. das Messer auf das Präparat zubewegt. Die Präparateebene wird dabei in bestimmten voreingestellten Schritten nach vor verschoben, sodass bei jedem Schub ein Schnitt von vorbestimmter Dicke vom Block abgehoben wird. Die Mechanismen zum Präparatevorschub sind typabhängig verschieden. Am Gerät findet sich eine Skala, an der man die Schnittdicke einstellen kann (digital oder mechanisch).

126

Mikrotomie

Die Präparateebene sollte im Präparatehalter in alle Richtungen einstellbar und justierbar sein, um möglichst wenig Material beim Anschnitt zu verlieren. Die Messerhalterung sollte die Einstellung der Schneidewinkel erlauben (in Schneiderichtung und in Bezug zur Präparatebene = Deklination und Inklination). Für alle Mikrotome ist wichtig, dass sie vibrationsfrei arbeiten und für den jeweiligen Zweck stabil genug sind. Bei einer großen Menge an Probengut ist es wichtig, dass die Handhabung unkompliziert und körperlich nicht anstrengend ist. Die Reinigung der Geräte soll einfach vorzunehmen sein. Grundtypen: •

Schlittenmikrotom (sliding und sledge microtome)

•

Rotationsmikrotom (rotation microtom)

•

Kryostat (cryostat)

•

Ultramikrotom (ultramicrotome)

•

Gefriermikrotom (freezing microtome)

•

Schaukelmikrotom (rocking microtome)

•

Sägemikrotom (sawing microtome)

•

Vibratom (vibratome)

•

Scheibenmikrotom (disc microtome)

1.

Schlittenmikrotom

Bei diesem Typ wird der Messerschlitten auf einer Gleitbahn horizontal vor und zurück bewegt. Das Präparat ist auf der Präparatehalterung fixiert. Beim Schneidevorgang wird das Messer durch den Block gezogen und so eine dünne Schicht an der Oberseite des Blocks abgetragen. (Abb.62-64)

Abb.62 Leitz 1208

Abb.63 Leica SM 2000R

Abb.64 Microm HM 450

Über einen Vorschubmechanismus wird das Präparat um die eingestellte Mikrometerzahl vertikal nach oben bewegt. Bei den alten Modellen erfolgt der Vorschub durch Anschlag an eine Skala am hinteren Ende der Gleitbahn. Dadurch wird die Bewegung über eine Schraube und Zahnräder in die vertikale Richtung übertragen. Die Gleitbahnen und das ganze Gerät sind aus Metall. Für ein leichteres Gleiten werden die Bahnen geölt. Der Benützer muss darauf achten, dass sich kein Rost darauf bildet oder die Bahnen ungleichmäßig abgenutzt werden.

127

Histotechnik

Bei den modernen Schlittenmikrotomen wurde die Gleitbahn durch wartungsfreie Rollen und ein Laufband ersetzt, die die Bewegung wesentlich erleichtern und den Messerschlitten in der Bahn stabilisieren. Über die Mechanik wurde ein Gehäuse gesetzt, was die Reinigung und den Schutz der Teile vereinfacht. Der Präparatevorschub erfolgt entweder mechanisch oder elektronisch gesteuert, motorbetrieben. Eingeführt wurden Schlittenmikrotome zum Schneiden von harten, großen Materialien. Der Vorteil der Geräte liegt in der Stabilität und dem verstellbaren Messerwinkel in Bezug zur Schneiderichtung (Deklination). In unseren Breiten werden Schlittenmikrotome häufig in der Routinehistologie eingesetzt. Im Gegensatz dazu sind im englischsprachigen Raum eher die Rotationsmikrotome vertreten. Mögliche Ausstattung von Schlittenmikrotomen: •

Einmalklingenhalter (als Ersatz für große Stahlmesser)

•

Präparatehalter für Mega-Kassetten (vierfache Grundfläche der Standardkassetten)

•

Kühlaufsätze für den Präparatehalter (ermöglicht tiefere Schneidetemperaturen oder bewahrt die Blocktemperatur bei längerer Manipulation)

•

elektronische Regelung, digitale Anzeigen

•

Retraktionsmodus (Block zieht sich beim Rückweg des Messer zurück, schont das Messer)

•

Hilfsmittel zum Einstellen der Schneideebene

•

motorisierter Grobvorschub und mehr

Verwendete Messer: •

Stahlmesser

•

Einmalklingen (aus Stahl oder Wolframcarbid)

•

Glasmesser

•

Wolframcarbidmesser

Das Prinzip der Schlittenmikrotome findet man wieder in abgeänderter Form bei den Hochleistungsgeräten zur Herstellung von Präparaten von sehr harten und/oder großflächigen Geweben (Kunststoffeinbettungen). Diese Geräte sind zum Teil mit einem Motor zum gleichmäßigen Vorschub des Gewebeblocks in horizontaler Ebene auf das Messer zu ausgestattet. Das Messer ist fixiert. Die Blöcke können bis zu einer Fläche von 200x250 mm bei Paraffineinbettung und 80x100 mm bei Kunststoffeinbettung verarbeitet werden (Abb.65-66). Für noch größere Präparate benötigt man sogenannte Tetrander-Mikrotome.

Abb.65 Leica SM 2400

Abb.66 Leica SM 2500

128 2.

Mikrotomie

Rotationsmikrotom

Bei diesem Mikrotomtyp ist das Messer starr fixiert und steht quer mit der Schneide nach oben. Der Gewebeblock wird senkrecht darauf zu bewegt. Die vertikale Bewegung des Präparats wird durch ein Handrad ausgelöst. Bei jeder Umdrehung erfolgt der Vorschub des Präparats in Richtung Messer. Die Geräte können mit einem Motor ausgestattet sein. Ihr Einsatzgebiet umfasst die Herstellung von Paraffinschnitten in der Routinehistologie und die Herstellung von Semidünnschnitten von kunststoffeingebettetem Gewebe für die Lichtmikroskopie. (Abb.67-68)

Abb.67 Microm HM 340 E

Abb.68 Leica RM 2265

Die Besonderheit dieses Geräts ist die Herstellung von Schnittbändern für Serienschnitte. Die Schneide des Messers und die Breitseite des Blockes stehen parallel. Die Schnitte bleiben an der Breitseite aneinander haften und werden als Band ins Wasserbad gebracht. Mögliche Ausstattung eines Rotationsmikrotoms: •

Motor

•

elektronische Regelung, digitale Anzeigen

•

Geschwindigkeitsregulierung

•

Schneidfenstereinstellung

•

Rocking-Modus (Handrad wird für den Präparatvorschub nur über eine kleine Strecke nach vor und zurück bewegt)

•

Retraktionsmodus

•

Fußtastenbedienung

•

Aufsatz zum Schnitttransfer (Wasserbrücke direkt in ein Wasserbad)

•

optischer Aufsatz

•

Kühlaufsätze und mehr

Verwendete Messer: •

Stahlmesser

•

Einmalklingen (aus Stahl oder Wolframcarbid)

•

Glasmesser

•

Wolframcarbid-Messer

Dasselbe Prinzip wird auch in den Kryostaten und bei den Ultramikrotomen eingesetzt

129

Histotechnik

2.1. Kryostat Beim Kryostat ist das Rotationsmikrotom in eine Kühlkammer eingebaut. Die Temperatur kann entsprechend dem Gerätetyp bis zu -60°C abgesenkt werden. Präparat, Messer und Zubehör haben dieselbe Temperatur, was die Schnittgewinnung sehr erleichtert. Eingesetzt werden Kryostaten bei der Herstellung von Gefrierschnitten von unfixiertem Gewebe (Schnellschnitt, Enzymhistochemie), von fixiertem Gewebe zur Umgehung des Einbettungsprozesses, aber auch zum Schneiden von Industrieprodukten. Die Schnittdicke bei Gewebe zur Schnellschnittuntersuchung liegt bei 5–10 µm. (Abb.69-70) Es gibt auch tragbare Tischkryostate, die z.B. direkt im OP eingesetzt werden können. Andererseits werden auch sehr große Kryostate für Großflächenschnitte (bis 40 cm) im Handel angeboten.

Abb.69 Leica CM1850

Abb.70 Microm HM560DL

Mögliche Ausstattung eines Kryostaten: •

Motor (mit Geschwindigkeitsregulation)

•

Schnellfriereinrichtung

•

Retraktionsmodus

•

Schneidefenster

•

Vakuumabsaugung

•

getrennte Temperatureinstellung für Präparatehalter und mehr

Verwendete Messer: •

Stahlmesser

•

spezielle Einmalklingen

2.2. Ultramikrotom Ultramikrotome werden in der Elektronenmikroskopie zur Herstellung von Ultradünnschnitten (0,01–0,5 µm) benötigt. Das Gewebe ist hier in Kunststoff (siehe Einbettungsprozess) eingebettet, um diese Dicke („Dünne“) erreichen zu können. Zur lichtmikroskopischen Vorbeurteilung des Blocks werden auch Semidünn- oder Vorschnitte hergestellt. Die Größe der Präparate liegt im Millimeterbereich. Der Präparatvorschub erfolgt über einen thermischen Mechanismus, bei dem sich ein Bifurkationsmetall kontrolliert ausdehnt. Das Schneiden läuft, um möglichst gleichmäßige Schnitte zu erhalten, motorisiert unter mikroskopischer Beobachtung (binokuläre Präparierlupe) ab. Das Gerät ist mit einer Kalt-Lichtquelle ausgestattet, die eine Beurteilung der Schnittdicke aufgrund der Reflexion an der Wasseroberfläche des Schneidetroges erlaubt. Zur Ausstattung kann auch eine Antistatikeinrichtung und Fiberglasbeleuchtung gehören. Lässt sich das Messer bzw. Präparatehalter von senkrecht zur Vorschubrichtung auf schräg verstellen, kann man das Mikrotom auch zum „Trimmen“ (Zuspitzen) des Blocks verwenden. (Abb.71-72)

130

Mikrotomie

Zur Anfertigung von Gefrierschnitten wird das Ultramikrotom mit einer Kühlkammer ausgerüstet. Verwendete Messer (in Verbindung mit einem Trog): •

Wolframcarbidmesser (für Semidünnschnitte)

•

Glasmesser (für Semidünnschnitte und Ultradünnschnitte)

•

Diamantmesser (für Semidünnschnitte und Ultradünnschnitte)

•

Gefrierschnittmesser (für wet und dry Methode)

Abb.71 Schema Ultramikrotom

3.

Gefriermikrotom

Das Gefriermikrotom wurde ca. 1920 eingeführt und ist jetzt durch den Kryostat abgelöst. Das Gewebe wird auf einem Präparatetisch mit Wasser oder Gefriermedium aufgefroren. Die Kühlung erfolgt durch Kohlensäureschnee. Das Messer wird in einer Kreisbewegung auf das Gewebe zubewegt. Die neueren Modelle sind mit einem Kühlaggregat ausgerüstet und sind direkt auf einem fahrbaren Tisch montiert. Hier ist auch das Messer kühlbar. Ca. 15 µm dicke Schnitte können gewonnen werden. Eingesetzt wurde es u.a. für Schnellschnittuntersuchungen. (Abb.73) 4.

Abb.72 Leica EM UC6

Abb.73 Leitz Gefriermikrotom 1310

Rocking Mikrotom (Schaukelmikrotom)

Dies war das am weitesten verbreitete Mikrotom in den Zwanziger Jahren des vorigen Jahrhunderts. Die Herstellung von bis zu 5 µm dicken Schnitten war relativ einfach und zuverlässig. Das Rocking Microtome ist nicht sehr stabil und „wandert“ beim Schneiden. Es wurde dann von den moderneren Mikrotomen verdrängt und findet heute nur mehr für botanische Zwecke Verwendung. (Abb.74) Abb.74 NET Rocking Mikrotom

131

Histotechnik

5.

Sägemikrotom

Sägemikrotome arbeiten nach einem grundsätzlich anderen Schneideprinzip. Wird bei Rotations- und Schlittenmikrotomen ein Messer gleichmäßig durch den Block gezogen, so erfolgt hier das Schneiden durch ein horizontal rotierendes, diamantbeschichtetes Innenloch-Sägeblatt. Die Rotationsgeschwindigkeit liegt bei 600 rpm. Das Präparat wird dem Sägeblatt (280 µm dick) ganz langsam angenähert und dieses schleift sich praktisch durch das harte Gewebe. Das eingebaute Wasserkühlsystem verhindert die Überhitzung des Präparates. Eingesetzt wird es zum Schneiden von Knochen und Zähnen, die meist in Kunststoff eingebettet sind. Es wird eine Schnittdicke von 30 µm erreicht. Das Sägemikrotom wird auch zur Vorbereitung für Schliffpräparate verwendet. Hier werden 100–500 µm dicke Gewebeblöcke benötigt, die weiters in einer Schleifmaschine auf 50 µm dicke Präparate dünngeschliffen werden. (siehe Verarbeitung von Abb.75 Leica SP 1600 hartem Gewebe) (Abb.75) 6.

Vibratom

Das Vibratom ist zur Herstellung von Schnitten von nativem und (leicht) fixiertem Gewebe geeignet. Man umgeht damit den zeitaufwendigen und gewebeabtötenden Prozess der Einbettung und ermöglicht die lichtmikroskopische Untersuchung von lebenden Zellen. Vibratome finden ihren Einsatz z.B. in der neurologischen Forschung, wo sehr weiches, fragiles und extrem empfindliches Gewebe untersucht wird. Der Name bezieht sich auf die vibrierende Bewegung der Klinge. Die Amplitude der Klingenschwingung wird über die elektrische Spannung bestimmt, die angelegt wird. Die Vibrationsstärke muss dem Gewebe angeglichen werden. Die Klinge wird motorbetrieben in einer Geschwindigkeit von 0,05–5 mm/s durch das Gewebe bewegt. Es wird eine Schnittdicke von ca. 30 µm erreicht. (Abb.76-77) Das Präparat wird direkt auf die Probenplatte mit Acrylatadhäsiv aufgeklebt und auf einer doppelwandigen Schale befestigt. Die Schale enthält physiologischen Puffer, der die Vitalität der Zellen erhält und als Medium zum Aufschwimmen der Schnitte dient. An den Schnitten können immunhistologische und elektrophysiologische Untersuchungen durchgeführt werden. Es werden auch Vibratome in Kryostaten und Vibratom-Kryostate für Großflächenschnitte angeboten. Verwendete Messer: •

Stahlklingen

•

Glasklingen

•

Saphirklingen

Abb.76 Microm HM 650

Abb.77 Leica VT 1000 S

132

7.

Mikrotomie

Disc-Mikrotom

Diese Innovation der Firma Leica bringt eine neue Art der Schneidetechnik. Das Messer steht hier fix und das Präparat rotiert, montiert auf einer flachen Scheibe, auf das Messer zu. Diese Methode soll möglichst kompressionsfreie Schnitte erzeugen und dabei sicher und schnell arbeiten. Die Annäherung der Blocks zum Messer erfolgt automatisch mittels Sensor. Es bietet höhere Sicherheit für den Benützer, da der Präparatewechsel in sicherer Entfernung vom Messer durchgeführt wird. (Abb.78)

Abb.78 Leica DCS

C. Mikrotommesser Auch die Mikrotommesser haben sich im Laufe der Entwicklung verändert. Die ersten Präparatoren arbeiteten mit sehr scharfen Rasiermessern. Für die Mikrotome wurden dann Stahlmesser unterschiedlicher Form entwickelt, die in der modernen Routinehistologie großteils durch Einmalklingen ersetzt wurden. Besonders hartes Gewebe bzw. Einbettmedium bedarf sehr widerstandsfähiger, scharfer Messer in Form von Glas-, Diamant- oder Wolframcarbidmessern. Grundsätzlich müssen Mikrotommesser entsprechend der Gewebehärte bzw. der Konsistenz des Einbettmediums ausgewählt werden. Die Messer werden in entsprechende Halterungen im Messerbock montiert. Wichtig ist die Stabilität des Messers, damit es beim Schneiden nicht flattert, natürlich die Schärfe, um dünne Schnitte zu erhalten, und eine einwandfreie Schneide ohne Scharten. Bei der Handhabung von Mikrotommessern muss man sich immer der Verletzungsgefahr bewusst sein. Aufbewahrt werden Mikrotommesser in eigenen Holzschachteln, um die Schneide zu schützen. Messertypen: •

Stahlmesser (Carbonstahl)

•

Einmalklingen aus Stahl, bzw. Wolframcarbid

•

Wolframcarbidmesser

•

Glasmesser

•

Diamantmesser

•

Saphirmesser

1.

Stahlmesser

Stahlmesser waren vor der Einführung der Einmalklingen die üblichen Mikrotommesser für die Routinehistologie. Sie bestehen aus besonders gehärtetem, rostfreiem Carbonstahl von Werkzeugqualität. Es gibt voll gehärtete, die auch nach mehrmaligem Schleifen ihre Qualität behalten, und oberflächlich gehärtete Messer. Die Messer sind in unterschiedlichen Längen zwischen 10 und 30 cm erhältlich.

133

Histotechnik

1.1. Messergeometrie Die Mikrotommesser erhalten durch ihre Form unterschiedliche Eigenschaften für den Einsatz in der Mikrotomie. (Abb.79)

Abb.79 Messergeometrie

Wie aus dem Schema ersichtlich, nimmt die Stärke der Messerklinge von A nach D hin zu. Die Messer haben neben ihrer Grundform noch einen Facettenschliff an der Schneide. Er entsteht dadurch, dass man zum Anschleifen einer scharfen Schneide den Messerrücken erhöht. Es entstehen so an der Messerschneide zwei Facettenhälften, die einen größeren Winkel einschließen, als die Hauptflächen des Messers. Man findet nach DIN 6581 folgende Winkel am Mikrotommesser (Abb.80):

Abb.80 Messerwinkel

1.2. Messerschleifen Durch die Abnützung der Schneide bei der Schnittherstellung vermindert sich die Qualität, das Messer wird stumpf und bekommt Scharten. Das Schleifen der Messer in den verschiedenen Profilen mit Facette erfordert große Fachkenntnis und Übung. Das händische Schleifen wurde schon durch die Einführung von Schleifapparaten im histologischen Labor zurückgedrängt. Und durch den fast ausschließlichen Einsatz von Einmalklingen ist das „Heimschleifen“ praktisch verschwunden. Die Vertreiber von Stahlmessern bieten Schleifdienste an, wohin man die Messer zur Wiederaufbereitung einschicken kann.

134

Mikrotomie

1.2.1. Händisches Schleifen Das Schleifen und Abziehen erfolgt an Streichriemen oder Streichstöcken mit Schmiermitteln und Schleifpasten unterschiedlicher Körnung. Um den richtigen Winkel zu erreichen, wird eine Halterung über den Messerrücken gezogen. Es erfolgt zuerst ein grobes Anschleifen und weiters der Feinschliff. Man achtet dabei auf ein Durchziehen des Messers über die ganze Länge des Riemens bzw. Stockes, wobei ein gewisser Druck ausgeübt wird. Die Schleifpasten enthalten Industriediamanten mit 1 µm bzw. 6 µm Durchmesser. 1.2.2. Schleifapparate Die Stahlmesser werden in das Gerät in einem bestimmten Winkel eingespannt. Die Schleiffläche rotiert exzentrisch für einen gleichmäßigen Abrieb. Ein Wendemechanismus ermöglicht das gleichmäßige Schleifen auf beiden Seiten. Schmiermittel bewahren die Schneide vor Überhitzung und entfernen den Abrieb. Die Stahlmesser werden zur Lagerung eingeölt. Dieses Öl muss vor der Verwendung mit Benzin entfernt werden. Beim Schneiden mit Stahlmessern hat sich bewährt, dass man mit einem Messer den Block anschneidet und dann das Messer auswechselt. Das „gute“ Messer hat eine hervorragende Schneide für die Gewinnung des Gewebsschnittes und wird so länger scharf bewahrt. Selbstgeschliffene Messer sind zum Anschneiden geeignet, sollten aber nach mehreren Durchgängen wieder zum Schleifen eingeschickt werden. (Abb.81) 2.

Abb.81 Leica SP 9000

Einmalklingen

Einmalklingen bestehen aus gehärtetem Carbonstahl bzw. aus Wolframcarbid. Sie sind ca. 8 cm lang und ca. 0,25–0,35 mm dick. Wichtig bei der Verwendung von Einmalklingen ist, dass sie in einer Halterung vibrationsfrei befestigt sind und so dieselbe Stabilität liefern wie große Messer. Die Messerhalter gibt es mit Schrauben bzw. Schnellverschlussklammer. (Abb.82-83) Die Schneide der Einmalklingen kann beschichtet werden mit Chrom oder Platinlegierungen bzw. mit Teflon, was die Schneidqualität und Lebensdauer erhöht. Die Klingen

Abb.82 Einmalklingenhalteralter

Abb.83 Einmalklingen Fa. Feather

Abb.84 Schneidengeometrie

135

Histotechnik

werden in unterschiedlicher Qualität für unterschiedliche Anwendungen angeboten (Routine, hartes Gewebe, sehr dünne Schnitte, große Präparate, Gefrierschnitte). Sie sind in Klingenspendern abgepackt, die eine sichere Handhabung erleichtern. Einmalklingen eignen sich auch gut für den Kryostaten, weil sie beim Auswechseln schnell die Umgebungstemperatur annehmen. Geometrie (Abb.84): Einmalklingen können nach C-Profil bzw. D-Profil geformt sein. Man unterscheidet beim C-Profil low profile blades und high profile blades. 3.

Wolframcarbidmesser

Messer aus diesem sehr widerstandsfähigen Material werden zur Herstellung von Präparaten mit sehr harter Konsistenz für die Lichtmikroskopie eingesetzt. Sie sind sehr beständig, aber aufgrund der Härte spröd. Ihre Form entspricht ihrem Einsatzgebiet. Dreieckige Wolframcarbidmesser werden auf Ultramikrotome montiert, klingenförmige benutzt man auf Rotationsmikrotomen bzw. Schlittenmikrotomen. Man setzt sie zum Schneiden von unentkalktem und entkalktem Knochen, Plastikeinbettungen in Glykol- und Methyl-Methacrylat und Epoxid für eine Schnittdicke zwischen 1 und 15 µm ein. Dreieckige Messer (9,6 x 25,4 x 9,6 mm) haben einen Schneidwinkel von 40°. 4.

Glasmesser

Glasmesser sind widerstandsfähig aber sehr spröd, und man muss sehr vorsichtig mit ihnen umgehen. Die Qualität der Schneide wird durch die Glasqualität bestimmt. Sie werden verwendet zur Herstellung von Semidünnschnitten von Kunststoff bzw. Paraffin, wobei das Profil der Schneide die Einsetzbarkeit bestimmt. Für die Elektronenmikroskopie werden sie, wo die Qualität ausreichend ist und man auf den Einsatz von teuren Diamantmessern verzichten kann, zur Herstellung von Ultradünnschnitten verwendet. Vom Ralph-Profil gibt es Unterarten je nach Schneiden-Höhe:

Abb.85

Von links nach rechts eignet sich das Profil mehr für weiche bis harte Kunststoffe. Wird die Schneide zu flach, ist sie ungeeignet zur Schnittgewinnung (Abb.85). Bei anderen Profilen verläuft die Schneide linear in unterschiedlichen Winkeln (45–65o für Kunststoff, niedriger für Paraffin). Die Messer werden mittels Messeradapter auf Rotations-, Schlittenmikrotomen und Vibratomen eingesetzt. Für Ultramikrotome montiert man auf sie einen Trog (aus Metall oder Kunststoff = „boat“). Dieser wird mittels Zahnzement oder mit Klebeband befestigt bzw. festgeschraubt und so wasserdicht mit dem Messer verbunden. (Abb.86) Glasmesser werden erst kurz vor Gebrauch hergeAbb.86 Glasmesser mit stellt, weil sie bei längerer Lagerung ihre Schärfe montierten Trögen verlieren (Glasfluss). Aus käuflichen Glasstangen (25–35 mm breit, 6–8 mm stark) werden Parallelogramme oder Dreiecke mit einer bestimmten Neigung zur Kante gebrochen. Händisch ist das möglich, aber etwas

136

Mikrotomie

schwierig (wurde früher mit speziellen Brechstangen gearbeitet). Deshalb werden Geräte (Knife Maker) angeboten, die Messer mit unterschiedlichen Profilen brechen können. (Abb.87) 5.

Diamantmesser

Diamant wird als industrielles Material teilweise gefördert aber größtenteils synthetisch hergestellt. Da es die härteste Substanz ist, wird es zum Schneiden, Schleifen und Polieren von harten Materialien verwendet.

Abb.87 Leica Knifemaker

Diamantmesser sind die härtesten, verwendeten Messer. Man schleift sie aus reinen, hochwertigen Diamanten ohne Einschlüssen oder Rissen in der optimalen Orientierung. Es wird eine glatte Oberfläche auf Atomebene angestrebt. Diamantmesser müssen erst nach Jahren nachgeschliffen werden. Die Diamantplatte wird mit metallurgischer Technik in einen Bronzeblock gefasst, um jede Lockerung zu vermeiden. Der Diamantmesserblock wird mit einem Schneidetrog („boat“) aus Aluminium oder Stahl verbunden, und gemeinsam auf das Ultramikrotom montiert. Befestigt wird der Messerblock am Trog mittels Epoxidharzen oder Verschraubung. Der Freiwinkel ist einAbb.88 Diamantmesser Fa. Diatome gestellt auf 4°. (Abb.88) Die Diamantmesser werden in unterschiedlichen Stärken, Längen und Schneidwinkeln angeboten. Für Semidünnschnitte gibt es eine etwas billigere Ausführung, den HistoDiamanten. Die Schneidenlänge variiert zwischen 1 und 8 mm, der Schneidwinkel variiert zwischen 35° und 55° (die größeren Winkel sind für härteres, spröderes Material). Mit Diamantmessern kann man Ultradünnschnitte aus kunststoffeingebettetem Material herstellen mit einer Schnittdicke zwischen 10 und 200 nm, bzw. Semidünnschnitte zwischen 500 nm und 5 µm. Der Kunststoff ist hier Epoxidharz bzw. Aralditharz (auch für Spurr, LRW, Lowycryl etc.). Es werden auch Diamantmesser für die Gefrierschnitttechnik angeboten (wet oder dry-Technik) und solche zum Trimmen des Blocks. Pflege der Diamantmesser: Sie kommen gereinigt und einsatzbereit aus der Fertigung. Nach dem Benutzen müssen Schneiderückstände entfernt werden. Dazu gibt es eigene Kunststoffstäbchen. Wichtig ist, dass man die Schneide nicht mit der Hand berühren darf und sie nicht durch andere Gegenstände verletzt. Aufbewahrt werden Diamantmesser in ihren Kästchen. 6.

Saphirmesser

Saphirmesser werden aus einem künstlich hergestellten Monokristall geschliffen. Saphir gehört nach Diamant zu den härtesten Materialien. Chemisch ist es Aluminiumoxid Al2O3. In der Mikrotomie finden sie Einsatz in Vibratomen, wo sie glatte, dünne Schnitte bis zu 20 µm ermöglichen.

137

Histotechnik

D. Schneidetechnik Grundsätzlich muss man sagen, dass die Fertigkeiten beim Schneiden nicht theoretisch vermittelt werden können. Hier ist die Übung ausschlaggebend und man benötigt ein gewisses Maß an Gefühl und Geschicklichkeit um gute Schnitte herstellen zu können. In der Routinehistologie wird eine bestimmte Menge an Proben möglichst zeiteffizient verarbeitet. Das heißt, dass auch die Schneidegeschwindigkeit entsprechend sein sollte. Dazu muss man anmerken, dass ein Neuling zuerst an der Qualität und erst dann an der Geschwindigkeit arbeiten soll, die sich dann meist von selbst einstellt. Faktoren zum Gelingen sind: • • • •

1.

stabiles, gut eingestelltes Mikrotom scharfes Messer gut gekühlter Block richtig eingestellte Schneidewinkel

Schneidewinkel

Die wichtigen Winkel für die Schneidetechnik sind die sogenannte Inklination und die Deklination. 1.1. Inklination Die Inklination entspricht der Neigung des Messers zur Präparatebene und damit auch dem Freiwinkel (clearance angel) zwischen Facette und Blockoberfläche. Bei einem C-Profil-Messer mit einem Keilwinkel von 27o und einem Facettenwinkel von 17o schneidet man mit einer Inklination (Neigung) von 15o und einem Freiwinkel von 1,5o. (Abb.89)

Abb.89 Inklination

138 c.

Mikrotomie

Bei einer Inklination über 18° wird das Messer zu steil, es rumpelt über den Block und führt zu Rippeln (chattering).

d. Bei einer Inklination unter 13,5o liegt die Facette auf dem Gewebe auf, der Freiwinkel ist null bzw. negativ. Die Schneide erfasst das Gewebe nicht, keine Schnittgewinnung; bzw. es wird abwechselnd zu dick und zu dünn geschnitten. Weicheres Einbettungsmedium kann man mit möglichst kleinem Freiwinkel schneiden, um dünne Schnitte zu erhalten. Optimales Schneiden gelingt bei einem Freiwinkel zwischen 0–5o. 1.2. Deklination Unter Deklination versteht man den Schneidewinkel in Bezug zur Schneidrichtung. Bei einem Rotationsmikrotom zur Serienschnittherstellung steht das Messer quer (Dekl. = 90o). Beim Schlittenmikrotom kann man die Deklination verstellen. Je härter das Gewebe ist, umso schräger stellt man das Messer. Die übliche Einstellung liegt zwischen 120–160o. (Abb.90)

Abb.90 Deklination

1.3. Begriffe Anschlagen

Anschneiden Aufschneiden Aufziehen

Einzelschnitt Feintrieb

Grobtrieb

Messerbock

kommt vom älteren Schlittenmikrotom, wo mit dem Messerbock am hinteren Ende der Gleitbahn der Mikrovorschub angeschlagen wurde; wird im übertragenen Sinne auf die Betätigung des Mikrovorschubs verwendet. mittels Grobvortrieb wird das Paraffin oberhalb des Gewebes vom Block entfernt, bis das Gewebestück in der ganzen Fläche erscheint. Der gesamte Block wird im Serienschnitt oder Stufenschnitt aufgearbeitet. Der gestreckte Schnitt wird auf einen Glasobjektträger gebracht. Zieht man mehrere Schnitte auf einen Objektträger auf, sollten sie gleich orientiert und geordnet sein. Der Schnitt haftet durch Adhäsionskraft. Man nimmt jeden gewonnenen Schnitt einzeln mit dem Pinsel ab das Heben des Blockes in kleinen Schritten um die eingestellte Mikrometeranzahl, wird durch Anschlag an einen Hebel beim mechanischen, bzw. über einen Kontakt beim elektronischen Mikrotom ausgelöst. das Heben des Blockes in größeren Schritten mittels Makroschraube oder Trimmhebel, bzw. wird beim elektronischen Mikrotom der Grobtrieb am Display gewählt (genaue Trimmeinstellung in Mikrometer). Messerhalterung, Schlitten; bei den älteren Schlittenmikrotomen ein schweres Metallteil, das den Schneidvorgang stabilisiert

139

Histotechnik

Serienschnitt Strecken

Stufenschnitt

Trimmen

2.

Man gewinnt ein Band von zusammenhängenden Schnitten (am Rotationsmikrotom). Die Schnitte sind meist wellig und etwas komprimiert. Sie schwimmen auf der Wasseroberfläche und die Wärme bewirkt die glättende Ausdehnung des Paraffins. Zu heißes Wasser löst das Paraffin und der Schnitt wird löchrig. Man gewinnt einen Einzelschnitt, trimmt im Grobtrieb weiter und gewinnt wiederum einen Einzelschnitt, usw. Die Schnitte werden in der Reihenfolge der Herstellung auf den Objektträger gezogen. kommt vom „Zurechtschneiden“ von nicht standardisierten Blöcken, Paraffin um das Gewebe wird bis auf wenige mm weggeschnitten. Es wird im Routinehistolabor mit „Anschneiden“ und auch „Grobtrieb“ gleichgesetzt. Im Elektronenmikroskopielabor bedeutet es das konische Zuspitzen des Kunststoffblockes.

Herstellen von Paraffinschnitten

2.1. Zubehör •

zwei Pinsel (Malpinsel mit langen bzw. kurzen Borsten, je nach Vorliebe), feine Pinzette

•

Bleistift bzw. lösungsmittel-resistenter Stift; Objektträgerdrucker (Slideprinter)

•

Glasobjektträger mit Mattstreifen (gereinigt, fettfrei, event. beschichtet)

•

Wasserschüssel Raumtemperatur (kaltes Wasserbad)

•

Wasserbad (40–45°C), gefüllt mit Aqua dest. (event. Unterteilungen, Adhäsivzusätze)

•

Kühlplatte (–10 bis –15°C)

Abb.91 Wasserbad Fa. Microm

Abb.92 OT-Drucker Leica

Abb.93 Kühlplatte Fa. Leica

Anleitung in Kurzform 1. Block kühlen

6.

Feinschneiden und Schnitt abheben

2.

7.

Schnitt strecken lassen im Wasserbad

Glasobjektträger beschriften

3.

Messer einspannen

8.

Aufziehen auf Objektträger

4.

Block einspannen

9.

Trocknen

5.

Anschneiden (Trimmen)

140

Mikrotomie

Abb.94 Schema Schlittenmikrotom

2.2. Ausführliche Anleitung am Schlittenmikrotom 1.

Bevor der Block geschnitten wird, wird er auf einer K ühlplatte gekühlt. Das dauert für frisch ausgegossene Blöcke ca. 15 min. Falls die Schnittgewinnung anschließend zu lange dauert, erwärmt sich der Block wieder und das Schneiden wird schwierig. Besser ist es, ihn wiederum auf die Kühlplatte zu legen. Die Kühlung bewirkt eine Verfestigung und Härtung des Paraffinblockes

2.

Einstellungen am Mikrotom: Feintrieb (z.B. 3 µm), Grobtrieb (z.B. 30 µm), Schneidewinkel (z.B. 10°), Retraktion, Vorschubgeschwindigkeit beim elektronischen Mikrotom (Abb.94)

3.

Objektträger mit der Identifikationsnummer des Blocks beschriften. Man verwendet dazu Bleistifte oder lösungsmittelfeste Schreibstifte (oder OT-Printer).

4.

Das Messer wird in den Messerbock, bzw. die Einmalklinge in den Adapter und dieser in den Messerbock gespannt. Vorsicht beim Umgang mit dem Messer: Einerseits auf die eigene Gesundheit achten, andererseits die Klinge nicht durch Kontakt mit Metall verletzen. Das Messer vibrationsfrei einschrauben. Beim Einsetzen der Einmalklinge darauf achten, dass sie vollständig im Adapter sitzt.

5.

Den Block in den Präparatehalter fest einsetzen. Meist wird er durch eine Klammer fixiert. Darauf achten, dass • • •

der Block eben im Präparatehalter aufliegt, die Oberfläche des Blockes horizontal ist (mit dem Präparatehalter einstellbar), die Orientierung des Blocks der Länge nach parallel zur Schneiderichtung ist.

Beim Ausgießen der Präparate wurde die Schneiderichtung mitbedacht. Ist das nicht der Fall, lässt sich der Präparatehalter entsprechend verdrehen, bzw. der Block auch quer einspannen. Das ist auch günstig, wenn Gewebe durch Scharten verletzt wird. •

Gewebebereiche ungleicher Konsistenz sollen nebeneinander in Bezug zur Schneiderichtung liegen (Gewebe mit Schichtaufbau).

141

Histotechnik

•

Härteres vor weicherem Gewebe oder umgekehrt führt zum Quetschen der weicheren Struktur. (Abb.95)

6.

Annähern: Messer vorsichtig auf Block zuschieben. Block entweder heben oder senken bis das Messer knapp über der Blockoberfläche steht.

7.

Anschneiden (trimmen): GrobAbb.95 Gewebeschichtung und Orientierung vorschub mit der Makroschraube, bzw. dem automatischen Grobvorschub; gleichmäßiges Durchziehen des Messers, dicke Schnitte (ca. 20-40 µm) werden abgehoben. Bei Schnittdicke und der Trimm-Geschwindigkeit muss man auf die Größe und Konsistenz des Gewebes Rücksicht nehmen. Man schneidet den Block so weit an, bis das Paraffin zwischen über dem Gewebe entfernt ist, und die Gewebeoberfläche zur Gänze erscheint. Die Schneide mit dem Pinsel vom Paraffin säubern. Mit dem Pinsel immer senkrecht von der Messerfläche zur Schneide hin putzen. Mehrmals mit dem Messer mit automatischem Vorschub über den Block fahren, bis die Oberfläche glatt erscheint. Das angeschnittene Gewebe erscheint matt.

8.

Feinschneiden: Einmal anschlagen - Block hebt sich um die eingestellte Mikrometerzahl - Messer bis zur Blockkante führen, gleichmäßig durchziehen. Der Schnitt neigt zum Einrollen, deshalb die Schnittecke mit einer leichten Drehbewegung mit dem Pinsel der linken Hand auffangen, mit dem zweiten Pinsel den Schnitt vom Messer senkrecht abstupsen. Hilfreich ist ein leichtes Anblasen, das den Schnitt vom Messer abhebt. Der linke Pinsel trägt den Schnitt ins Wasserbad und lässt ihn in einer leichten Drehbewegung hineingleiten. Man unterscheidet eine glänzende Unterseite und eine matte Oberseite am Schnitt. Die glänzende, glatte Seite haftet besser am Objektträger. (Abb.96)

Abb.96 Schneiden am Schlittenmikrotom

142 9.

Mikrotomie

Strecken: Der Schnitt ist meist leicht gewellt. Ist der Schnitt sehr faltig, kann man ihn im kalten Wasserbad mit dem Pinsel etwas glätten. Im warmen Wasserbad streckt sich der Schnitt. Falten im Schnitt lassen sich im warmen Wasserbad nicht mehr entfernen.

10. Zum Aufziehen führt man den Objektträger ziemlich steil auf den schwimmenden Schnitt zu. Mit dem Pinsel wird der Schnitt in die richtige Richtung bugsiert und auf den Objektträger gezogen. Beim steilen Herausziehen des Objektträgers bleibt der Schnitt haften. Das Wasser darunter läuft ab. So kann man den Schnitt auch von einem Wasserbad ins andere überführen. •

Solange er noch nicht angetrocknet ist, lässt er sich wieder leicht vom Objektträger entfernen.

•

Durch die Wärme kleben die Schnitte leicht aneinander oder auch am Pinsel, deshalb Vorsicht beim Hantieren.

•

Zum besseren Haften und um das Herumwandern der Schnitte im Wasserbad zu vermeiden, können Zusätze verwendet werden (z.B. Eiweißglycerin).

•

Falls man viele Schnitte im Wasserbad in bestimmter Reihenfolge aufziehen muss, empfiehlt es sich Unterteilungen (z.B. Strohhalme, Papierstreifen) zu verwenden.

•

Ist das Wasserbad durch Schnittreste oder Fett verunreinigt, legt man zur Reinigung ein Papierhandtuch auf die Oberfläche und zieht es wieder ab.

11. Man lässt den Objektträger am Wasserbadrand oder eigener Heizplatte trocknen, bis mehrere fertig sind und sortiert sie gemeinsam in ein Färbetragerl. Beim Antrocknen verbinden sich die Gewebestrukturen mit den Glasstrukturen. Das wird bei mit Adhäsiv beschichteten bzw. bei Objektträgern mit positiver Oberflächenladung noch verstärkt. Üblicherweise werden die Objektträger anschließend bei ca. 60°C getrocknet (angebacken). Dabei verflüssigt sich das Paraffin und eventuell unter dem Schnitt eingeschlossenes Wasser kann abdampfen. Bei Objektträgern, die nur bei Raumtemperatur getrocknet werden, muss man darauf achten, dass sich kein Wasser unter dem Schnitt befindet. Das Paraffinhäutchen trocknet vom Rand her an und schließt das Wasser ein. Dieses verhindert die Anhaftung des Gewebes und wirkt auch gleichzeitig nachteilig darauf ein (wichtig für Immunhistochemie). 2.3. Ausführliche Anleitung am Rotationsmikrotom Die Grundtechnik ist dieselbe wie beim Schlittenmikrotom, nur die Bewegungsrichtungen sind verändert. 1.

Einstellungen am Mikrotom: Feintrieb (z.B. 2 µm), Grobtrieb (z.B. 20 µm), Messerwinkel, Retraktion, Schneidegeschwindigkeit, Schneidefenster (bei Motor) wählen.

2.

Einspannen des Messers bzw. Einmalklinge, gut fixieren

3.

Einspannen des Präparates: Die Oberfläche des Blockes sollte senkrecht und parallel zur Messerrückseite stehen. Die Unterkante des Blockes sollte parallel zur Schneide stehen. Die Präparateebene lässt sich mit Hilfe des Präparatehalters einstellen.

4.

Annähern des Blockes an das Messer, bis er knapp dahinter steht und A nschneiden mit Grobtrieb bis die Gewebefläche zur Gänze erscheint

143

Histotechnik

5.

Feinschneiden am Rotationsmikrotom: Bei jeder Rotation des Handrades wird der Block der Schneideebene entgegen (horizontal) und auf das Messer zubewegt (vertikal). Es zieht durch den Block und hebt die oberste Schicht ab. Der Schnitt bleibt am Messer hängen. Der nächste Schnitt schiebt den vorigen weiter und bleibt einerseits am ersten Schnitt andererseits am Messer haften. So entsteht ein Band von zusammenAbb.97 Serienschnittband hängenden Schnitten (= Serienschnitt, Abb.97).

6.

Strecken: Man fasst den ersten Schnitt des Bandes mit der Pinzette und hebt es vom Messer weg. Dabei kann man es etwas strecken, ohne es zu zerreißen. Die Anzahl der zusammenhängenden Schnitte muss man entsprechend der Anforderung wählen. Mit dem Pinsel der zweiten Hand streift man das Band vom Messer und führt es mit Pinsel und Pinzette ins Wasserbad. Im kalten Wasserbad lässt es sich noch etwas glätten. Im warmen Wasserbad strecken sich die Schnitte.

7.

Aufziehen: Das Schnittband wird der Länge nach auf den Objektträger orientiert. Ob ein oder zwei Bänder auf einen Objektträger aufgezogen werden, obliegt den Vorlieben des Instituts.

8.

Trocknen: Die Schnitte werden ebenfalls am Rand des Wasserbades bzw. auf eigenen Heizplatten getrocknet.

2.4. Schneidetipps Schneideartefakt Streifen, Aufsplitten des Schnittes der Länge nach

komprimierte, gefaltete oder aneinandergeklebte Schnitte

Ursache Harte Bestandteile im Gewebe oder Einbettmedium

Behebung Paraffin reinigen Gewebe entkalken

Scharten oder Verschmutzung am Messer

Schneidezone weiterschieben, reinigen

stumpfes Messer

Messer austauschen, Schneidezone weiterschieben

zu warmer Block

Block kühlen

Inklination zu hoch

Winkel korrigieren

schmutzige Messerschneide

säubern

Schnittdicke zu dünn eingestellt

Schnittdicke größer einstellen

Schnittgeschwindigkeit zu schnell

sehr dünne Schnitte verlangen eine langsame Geschwindigkeit

lockeres Messer

Schrauben festziehen

zu weiches Einbettungsmaterial

umbetten

grobkristallines Paraffin aufgrund zu langsamen Erkaltens

erneut ausgießen

Paraffin mit Intermedium verunreinigt

rückführen, wieder einbetten

144

Mikrotomie

Schneideartefakt Schnitte rollen sich zusammen

Ursache anhauchen

stumpfes Messer

Messer austauschen, Schneidezone weiterschieben

Schnittdicke zu groß gewählt

Schnittdicke einstellen

Messer oder Block locker

Schrauben festziehen

Inklination zu niedrig Abwechselnd dünne und dicke Schnitte

Behebung

Luftfeuchtigkeit zu gering

Winkel korrigieren wenn möglich, zurechtschneiden

Block ist zu hart oder zu groß

Erweichen des Blocks durch Anfeuchten mit Wasser Deklination erhöhen

Block zu kalt Schnitte hängen nicht aneinander beim Serienschnitt

Serienschnittband ist gekrümmt

Schmierige, unschneidbare Stellen im Block

Schnitte zerfallen, Gewebe trennt sich vom Einbettmedium im Wasserbad

Beim Schneiden entsteht ein quietschendes Geräusch, Schnitte zeigen Rippeln (chattering)

Serienschnitt: Schnitte bleiben beim Zurückfahren am Block hängen

zu hartes Paraffin Inklination zu groß

erwärmen durch anhauchen oder durch das Licht der Lampe wiedereinbetten in weichem Paraffin den Block in weiches Paraffin eintauchen Winkel korrigieren

Schnittdicke zu groß gewählt

dünnere Schnittdicke einstellen

stumpfes Messer

Messer austauschen, Schneidezone weiterschieben

die Kanten des Blocks sind nicht parallel

zurechtschneiden

der Block ist nicht parallel zur Messerkante

Block richtig einspannen

Inklination zu groß

Winkel korrigieren

Unregelmäßigkeiten der Schneide

Messer austauschen, Schneidezone weiterschieben

unregelmäßig dichtes Gewebe

nicht zu korrigieren

Unregelmäßigkeiten im Einbettmedium

erneut einbetten

Intermedium ist im Block verblieben

wenn möglich rückführen, erneut einbetten

Gewebe unvollständig entwässert und/oder schlecht infiltriert

wenn möglich zurückführen und erneut einbetten

Gewebe war zu lange in Paraffin oder Paraffin war zu heiß

meist irreversibel

Gewebe ist zu hart bez. dem gewählten Einbettmedium

wenn möglich zurückführen und erneut einbetten

Wassertemperatur ist zu hoch

korrigieren

schlecht infiltriertes, fettreiches Gewebe

Paraffinsaum hält Schnitt zusammen, aufziehen aus kaltem Wasserbad

Freiwinkel passt nicht

Winkel korrigieren

Messertyp passt nicht

stabileres Messer wählen Erweichen des Blocks durch Anfeuchten mit Wasser

Gewebe ist zu hart

eventuell weicheres Einbettmedium verwenden Deklination erhöhen

Block oder Messer locker

Schrauben festziehen

Inklination zu klein

Winkel korrigieren

stumpfes Messer

Messer austauschen, Schneidezone weiterschieben

schmutziges Messer oder Unterseite des Blocks

reinigen, austauschen

145

Histotechnik

3.

Herstellen von Gefrierschnitten

Gefrierschnitte werden hauptsächlich für die Schnellschnittdiagnostik am Kryostaten hergestellt. Weiters benötigt man sie für enzymhistologische, immunhistologische und färberische Untersuchungen, wo die übliche Paraffineinbettung die Struktur zerstören bzw. auflösen würde. Das Prinzip entspricht der Schnittgewinnung am Rotationsmikrotom, wo der Block auf das feststehende Messer zubewegt wird. Die Temperatur im Kryostat liegt für den klinischen Bereich zwischen –5 bis –35°C (–21°C passend für die meisten Schnellschnitte). Benötigtes Zubehör wird ebenfalls innerhalb des Kryostaten auf dieser Temperatur gehalten. Zur Arbeitsplatzsicherheit muss man sagen, dass man hier unfixiertes Gewebe, das potentiell infektiös sein kann, verarbeitet. Und besonders die Kälte konserviert Krankheitserreger sehr gut. Deshalb ist hier das Tragen von Handschuhen und ein regelmäßiges Reinigen und Desinfizieren des Gerätes Vorschrift. Hervorragendes Anschauungsmaterial und Lernvideos bietet die Website von Dr. Stephen Peters www.pathologyinnovations.com/index.html. 3.1. Zubehör •

Gefriertische zum Auffrieren des Gewebes

•

Pinsel

•

Gefriermedium (z.B.: OCT Compound): Es ist wasserlöslich, hinterlässt keine Rückstände in der Färbung, und ist für eine Stabilisierung von Gewebe bei -10°C und darunter geeignet; enthält: Polyvinylalkohol, Carbowax

•

Kryospray, Kältespray: Tetrafluoroethan in Aerosolform, Druckflasche

•

Glasobjektträger mit Mattstreifen (event. beschichtet)

•

Bleistift bzw. lösungsmittelresistenter Schreiber

•

Streckplättchen: gehört zum Kryostat; ein Kunststoffplättchen, das knapp über die Schneide vorragt und an beiden Breitseiten unten feine Streifen als Abstandhalter zum Schneidetisch (bzw. Messer) trägt, sodass der Schnitt eingefangen wird und sich auf den Schneidetisch schiebt.

•

spezielle Einmalklingen für Kryostat, Messer im C-Profil

3.2. Anleitung in Kurzform 1. 2. 3. 4. 5.

Gefriertisch vorbereiten Objektträger beschriften Gewebe anfrieren Gefriertisch einspannen Messer einspannen

6. 7. 8. 9.

anschneiden mit Grobtrieb feinschneiden auf Objektträger aufziehen gleich fixieren oder lufttrocknen

3.3. Ausführliche Anleitung 1.

Einstellungen am Mikrotom: Kryostattemperatur (z.B. –21°C), Präparatehaltertemperatur, Schnelleinfrieren, Feintrieb (z.B. 5 µm), Grobtrieb (z.B. 20 µm), Messerwinkel, Vakuumabsaugung, Streckplättchenposition, Schneidefenster, Schneidegeschwindigkeit (Motor) wählen.

146

Mikrotomie

2.

Vorbereiten der Gefriertische: Die Tische werden mit Gefriermedium (OCT) bedeckt und im Kryostat in die Halterungen gesteckt. Es entsteht eine ebene, gefrorene Schicht, die als Unterlage für das Gewebe dient.

3.

Objektträger mit der Identifikationsnummer beschriften.

4.

Anfrieren des Gewebes auf Gefriertisch: Das Präparat wird richtig orientiert auf den Tisch gesetzt und mit Gefriermedium bedeckt. Es soll ein mind. 3 mm großer Saum rund um das Präparat entstehen. Zum schnellen Frieren sind manche Kryostaten mit einem Gefrierstempel ausgerüstet. Dieser wird vorsichtig auf das mit Gefriermedium bedeckte Gewebe heruntergelassen, dadurch kommt es zu einer schnelleren Temperaturübertragung. Das Durchfrieren wird beschleunigt (nicht anzuwenden bei Gewebe, das zum Umfallen neigt!) und eine ebene Fläche zum Anschneiden wird erzeugt. Es dauert ein bis drei Minuten, bis der Block gefroren ist. Eine andere Technik bedient sich Einfrierformen, in die das Gewebe eingelegt und mit Gefriermedium aufgefüllt werden. In das noch weiche Gefriermedium wird der Gefriertisch gedrückt. Nach dem Durchfrieren entnimmt man den Block durch Herausschlagen (Prinzip wie bei Ausgießen mit Paraffin). Eine weitere Methode verwendet Glasobjektträger, auf denen das Gewebe unter Sicht in Gefriermedium orientiert wird. Der Objektträger wird im Kryostat abgekühlt, bis sich das Medium verfestigt. Kurz vorher wird der Gefriertisch daraufgedrückt und beim Gefrieren befestigt. Man erhält damit eine plane Oberfläche.

5.

Präparat in Halterung einsetzen, fixieren: Die Orientierung soll der Struktur des Gewebes entsprechen. Längsstrukturen werden der Länge nach orientiert.

6.

Messer einspannen, fixieren

7.

Anschneiden: Präparat heben bzw. senken, bis es knapp unterhalb des Messers steht. Mit dem Grobtrieb dicke Schnitte vom Präparat abheben, bis das Gewebe in voller Fläche erscheint. Die Schnitte schieben sich unter das Streckplättchen. Bei einer Ausstattung mit Absaugung werden die Schnipsel in einen Abfallbehälter gesaugt.

8.

Feinschneiden: Im Feintrieb mehrmals über das Präparat ziehen, bis die Schnitte gleichmäßig abgehen. Je nach Vorliebe mit Streckplättchen arbeiten oder es zurückklappen.

9.

•

Streckplättchen: Schnitt schiebt sich unter das Streckplättchen auf den Schneidetisch (bzw. Messer).

•

ohne Streckplättchen: Schnittecke mit gekühltem Pinsel auffangen und während des Schneidens den Schnitt auf Schneidetisch führen und strecken.

Einen Objektträger (Raumtemperatur) dem Schnitt annähern. Der Temperaturunterschied bewirkt ein Überspringen und Anhaften des Schnitts auf dem Glas. Ist der Objektträger zu kühl, wärmt man ihn an der Rückseite mit dem Finger, bis der Schnitt haftet.

10. Bei der Schnellschnittfärbung (Hämatoxylin-Eosin) wird der Schnitt gleich in Fixierlösung getaucht und weiter gefärbt. Für andere Anwendung werden die Schnitte an der Luft getrocknet.

147

Histotechnik

Schnitte können auch tiefgefroren gelagert werden, um sie zu einem späteren Zeitpunkt auszuwerten. Es gibt dazu eigene Gefrierschutzmedien, meist auf Sucrosebasis. 3.4. Schneidetipps Schneideartefakt Abwechselnd dünne und dicke Schnitte Beim Schneiden entsteht ein quietschendes Geräusch, Schnitte zeigen Rippeln (chattering) Brüche im gefrorenen Gewebe

Präparatevorschub, aber keine Schnittgewinnung

Schnitte verziehen sich oder rollen sich auf Risse im Schnitt Schnitte tauen auf während des Schneidens Frost auf dem Messer

Schnitt klebt am Streckplättchen

Schnitt verdreht sich auf eine Seite

Schnitt löst sich vom Objektträger

Schnitt zeigt horizontale Spalten

Ursache falsche Schneidetemperatur Präparat ist nicht ordentlich auf Gefriertisch fixiert Präparat ist nicht ordentlich auf Gefriertisch fixiert und vibriert beim Schneiden zu schnelles Einfrieren zu großes Probe lockeres Messer Präparat ist nicht ordentlich auf Gefriertisch fixiert falscher Messerwinkel Streckplättchen zu weit vorne Gewebe ist noch nicht gefroren der Spalt des Streckplättchens ist zu klein Schnittdicke zu dünn stumpfes Messer Probe ist übergefroren zerstörte oder schmutzige Schneide Cryostat- oder Messer-Temperatur zu hoch Cryostat war zu lange geöffnet der Spalt des Streckplättchens ist zu klein Gewebe oder Fett klebt am Streckplättchen unpassende Cryostat- oder Messertemperatur Ablagerung auf Schneide Scharte im Messer, stumpfes Messer kaputtes Streckplättchen fixiertes Gewebe geschnitten kein Adhäsiv verwendet fettes Gewebe knorpeliges Gewebe zu heftiges Handling Probe ist zu kalt

Behebung Schneidetemperatur dem Gewebetyp anpassen Gewebe abnehmen und neuerlich anfrieren

Gewebe abnehmen und neuerlich anfrieren

wenn möglich neues Stück anfrieren Schrauben festziehen Gewebe abnehmen und neuerlich anfrieren Winkel korrigieren Streckplättchen zurück länger anfrieren lassen einrichten Schnittdicke vergrößern wechseln oder weiterschieben wenn möglich neues Stück anfrieren Messer wechseln oder reinigen Temperatur korrigieren Cryostat schließen einrichten reinigen Temperatur korrigieren reinigen Messer wechseln oder weiterschieben auswechseln Adhäsiv verwenden sanfter arbeiten Temperatur korrigieren mit Finger anwärmen

148

Mikrotomie

3.5. Optimale Schneidetemperaturen für Gefrierschnitte Gewebe Brustgewebe (fettreich)

Temperatur in Minusgraden

Gewebe

Temperatur in Minusgraden

20–25+

Lippe

10–20

Brustgewebe (wenig Fett)

13–20

Lunge

13–20

Cervix

15–20

Lymphoidgewebe

13–20

Darm

13–20

Milz (blutiges Gew.)

5–10

Muskel

13–20 13–20

Fett

25+

Gallenblase

10–15

Nasalgewebe

Gehirn

5–10

Nebenniere

5–10

Haut (mit/ohne Fett)

10–15

Niere

13–20

Haut (mit Fett)

13–20

Ovar

15–20

Herz und Gefäße

15–20

Pankreas

13–20

Hoden

10–25

Prostata

15–20

Knochenmark

15–25

Rectum

13–20

Knorpel

10–15

Schilddrüse

13–20

Larynx

13–20

Uterus Curettage

5–10

Leber

5–13

Zunge

13–20

Die Kammertemperatur liegt meist etwas unter der optimalen Schneidetemperatur. Die Präparattemperatur kann bei entsprechender Ausstattung optimal gewählt werden. Da die Temperaturanpassung immer eine gewisse Zeit in Anspruch nimmt, geht man von –20°C als Standardtemperatur aus, da die meisten Gewebe in diesem Bereich (plus-minus 5°) gut zu schneiden sind. Gewebe, das bei sehr tiefen Temperaturen gelagert wurde (z.B. in flüssigem Stickstoff), muss man sich der Schneidetemperatur anpassen lassen. 4.

Schneiden am Ultramikrotom

Am Ultramikrotom werden Semi- und Ultradünnschnitte von in Kunststoff eingebettetem Gewebe für die Licht- bzw. Elektronenmikroskopie hergestellt. Das Schneideprinzip entspricht einem Rotationsmikrotom, wobei der Präparat-Vorschub in minimalen Schritten über eine elektronisch kontrollierte, thermische Regelung erfolgt. Die verwendeten Messer sind Glas- und Diamantmesser verbunden mit einem wassergefüllten Trog (boat). Wichtig ist auch die Ausstattung des Geräts mit einer Lichtquelle, die Reflektionen und Interferenzen auf der Wasseroberfläche bzw. den Schnitten erzeugt. Dies ist wichtig, um die Schnittdicke zu kontrollieren. Geschnitten wird unter mikroskopischer Beobachtung durch eine binokuläre Präparierlupe. Da die Diamantkante an sich hydrophob ist, zum Schneiden aber benetzt sein muss, kann es Probleme geben bei der Einstellung des Wasserspiegels. Die kann durch Einlegen des Diamantmessers in eine 1%ige Deconlösung (=Detergens) für mehrere Stunden verbessert werden. 4.1. Trimmen Die Gewebestückchen sind nur Kubikmillimeter groß und sind in der Spitze des Kunststoffblocks (z.B. in Form eines Eppendorfhütchens) zu finden. Das überstehende Kunststoffmaterial muss entfernt werden, sodass das Gewebe (bzw. Zellen) an der Oberfläche erscheint. Weiters wird der Block so zugespitzt, dass die Form einer stumpfen Pyramide entsteht. Saubere, parallele Kanten und feine Oberflächen sind Grundvoraussetzung für ein gleichmäßiges Schneiden. (Abb.98)

149

Histotechnik

Beim Trimmen werden meist eigene Trimmmesser bzw. ältere Messer verwendet. Bevor man zum Schneiden übergeht, soll man zum Schutz der „guten“ Schneide möglichst hochwertige Messer für die letzten Trimmschnitte einsetzen, damit keine MaterialRückstände am Block bleiben. Für geübte Techniker ist das Trimmen mit einer Rasierklinge die schnellste Methode.

Abb.98 Trimmen für Ultramikrotom

Tipps: •

Das Ausmaß des Trimmens hängt von der gewünschten Schnittgröße ab.

•

Im Allgemeinen wird das Schneiden umso leichter, je kleiner der Block ist.

•

Die Oberfläche soll 0,5 mm nicht überschreiten, um den Druck, den Messer und Block aufeinander ausüben möglichst gering zu halten.

•

Die Form der Oberfläche bildet ein Trapez (bzw. Dreieck oder Rechteck) mit der längeren Seite als Unterkante.

•

Die Unter- und Oberkante des Trapezes müssen parallel sein und weiters parallel zur Schneidekante sein.

•

Für das Trimmen sind meist mehrere Glasmesser zu verwenden, die man auswechselt, bevor sie zu stumpf oder schartig werden.

Durchgeführt wird das Zurechtschneiden oder Trimmen mit: •

Rasierklinge

•

Ultramikrotom: Das Messer wird etwas schräg zur Blocklängsrichtung gestellt und der Block in verschiedenen Stellungen eingespannt, bis er rundherum zugespitzt ist. Bzw. der Präparatehalter wird zur Seite gedreht.

•

Trimmgerät (Schleifapparat): Hier werden die Flächen mittels eines Diamant- bzw. Wolframcarbid-Mahlwerkes auf die gewünschte Form geschliffen. (Abb.99)

Abb.99 Leica Trim

4.2. Zubehör •

Wimpern-Pinselchen

•

frisch gebrochene Glasmesser, Diamantmesser

•

Trägernetzchen (= grid) aus Kupfer für Elektronenmikroskopie (event. mit formvar befilmt; mit oder ohne Kohlebedampfung zur Kontrastverstärkung) (Abb.100)

Abb.100 Trägernetzchen = Grid

150

Mikrotomie

4.3. Anleitung 1.

B lock einspannen, Messer einspannen: Bei der Manipulation muss man darauf achten, dass weder die Blockoberfläche noch die Messerschneide durch Anstoßen verletzt werden. Der Messertrog wird mit Aqua dest. gefüllt, bis ein konvexer Meniskus entsteht. Mit einer Spritze wird soviel Wasser abgesaugt, bis eine weiße bis silberne Reflexion auf der Wasseroberfläche an der Messerschneide entsteht. Die Beleuchtung muss man eventuell entsprechend nachjustieren. Die Messerschneide wird durch das Wasser befeuchtet (wet cutting) und die Schnitte können möglichst kompressionslos abflotieren. Auf einer trockenen Schneide würden die Schnitte haften bleiben und könnten nicht auf die Trägernetzchen übertragen werden.

2.

Block annähern: mittels Grob- und Feintrieb wird der Block der Schneide unter mikroskopischer Kontrolle angenähert. Wurde dasselbe Mikrotom zum Trimmen verwendet, stimmt die Schneideebene überein. Ist das nicht der Fall, muss der Block unter mikroskopischer Kontrolle entsprechend orientiert werden. (Dazu bedient man sich des Schattens, den die Messerkante auf die Blockoberfläche wirft.)

3.

Anschneiden: bis gleichmäßige Schnitte entstehen.

4.

Feinschneiden: Entsprechend dem Gewebe und dem Einbettmedium werden die Schnittgeschwindigkeit (z.B. 0,7–0,9 mm/sek) und Schnittdicke (z.B. 60–90 nm) eingestellt. Der Freiwinkel ist variabel und meist mit 6° einzustellen. Durch das richtige Einstellen einer am Ultramikrotom befindlichen Präparierlupe und einer ebenfalls eingebauten Lichtquelle kann auf der Wasseroberfläche des Trogs ein Lichtreflex erzeugt werden, der die sonst nur schwierig auszumachenden Schnitte deutlich sichtbar werden lässt. Zugleich zeigen die Ultradünnschnitte bei der schrägen Beleuchtung (wie alle dünnen Schichten) I nterferenzfarben, wobei die spektrale Zusammensetzung des reflektierten Lichts von der Schichtdicke abAbb.101 hängt. Somit besteht die Möglichkeit, die Schnittdicken annähernd zu bestimmen und zu dicke Schnitte auszusortieren. Dünne Schnitte erscheinen silbern bis leicht golden. Es entsteht ein Schnittband, das auf der Wasseroberfläche aufschwimmt. (Abb.101)

5.

Aufziehen: Für elektronenmikroskopische Untersuchungen werden die Schnitte auf Kupfer-, Nickel- oder Goldnetzchenträger (grid) aufgezogen. Man bugsiert die Schnitte dabei mit einem Wimpernpinselchen auf das 3 mm große Netzchen und entfernt das überschüssige Wasser mit Filterpapier. Das Übertragen der Semidünnschnitte auf einen Objektträger wird mit einem kleinen Glasstab, der am vorderen Ende zu einem Kügelchen geschmolzen ist, ausgeführt. Wenn die Schnitte nicht größer als 3mm im Durchmesser sind ist es einfacher, sie mit einem Lochgrid von der Wasseroberfläche aufzunehmen, (sie bleiben durch die Adhäsion in der Öffnung des Grids) und sie auf den Objektträger aufzusetzen.

151

Histotechnik

4.4. Schneidetipps Für ein gutes Gelingen sind ein ordentlich getrimmter Block, ein scharfes Messer und ein homogen auspolimerisierter Block Ausschlag gebend. Schneideartefakt jeder 2. Schnitt kommt

Ursache

Behebung

Schnittdicke zu dünn eingestellt

Schnittdicke erhöhen

Schnittband krümmt sich

Trapezkanten sind nicht parallel

besser trimmen

gar kein Schnitt kommt

Ende des Präparat-Feed ist erreicht

zurückstellen Schneide mit Alk. abs. und Kunststoffstab reinigen

Schneide lässt sich nicht befeuchten

Schneide verschmutzt

Bei gefülltem Trog mit Reinigungsstab über die Schneide fahren als Folge eines zu niedrigen Wasserspiegels

Blockoberfläche wird nass

Schwierigkeiten beim richtigen Einstellen der Beleuchtung für die adäquate Reflexion

Rippeln (chatter)

Kompression

Bei Epoxidharzen ist das eventuell auf elektrostatische Aufladung zurückzuführen aufgrund geringer Luftfeuchtigkeit

Streifiger Block

Streifiger Schnitt

Wasserspiegel erhöhen Erhöhen der Luftfeuchtigkeit Wasserspiegel etwas verringern Block mit Filterpapier trocknen Elektrostatik durch entsprechende Ausrüstung verhindern

Einige Methacrylate sind hydrophil und ziehen Wasser an.

Wasserspiegel verringern

als Folge eines zu niedrigen Wasserspiegels

Wasserspiegel erhöhen

externe Vibrationen

Aufstellort wechseln

schlecht eingestelltes Mikrotom

Mikrotom-Service

Schrauben nicht fixiert

fest anziehen

Schneidedruck ist zu groß

Blockgröße verringern

Freiwinkel zu klein

erhöhen

Der Block ist zu weich.

härteres Einbettmittel verwenden

Messerwinkel ist zu groß.

Von 45o-Messer auf 35o-Messer wechseln

stumpfes Messer Freiwinkel ist zu groß.

Scharten

Trog mit etwas zu viel Wasser füllen, einige Minuten warten und Wasserstand richtig einstellen

Messer zum Nachschleifen einsenden neues Glasmesser brechen verringern

Schneidegeschwindigkeit zu hoch

verringern

Schneide mit Fingern oder einem festen Gegenstand berührt

vermeiden

Rückstände vom Trimmen

Trimmen nach Vorschrift

harte Teile im Block

härteres Messer verwenden

übliche Abnützung

nicht zu vermeiden

Freiwinkel zu gering

erhöhen

schmutzige Schneide

reinigen

inhomogenes Gewebe und Einschlüsse im Block

erneut einbetten

kleine Mängel an der Schneide

Messer weiterschieben

schlecht polymerisierter Block

besser einbetten

inhomogener Block

152 5.

Mikrotomie

Herstellen von Sägepräparaten

Sägemikrotome sind zum Schneiden von extrem harten und spröden Materialien geeignet, wie z.B. Knochen oder Zahn, eingebettet in Methylmethacrylat. Es werden Schnittdicken von 30 µm erreicht. Das Schneideprinzip unterscheidet sich grundsätzlich von den anderen Techniken. Wird bei den anderen Mikrotomen ein Schnitt durch die Keilwirkung eines Messers abgehoben, so schleift sich beim Sägemikrotom ein diamantbeschichtetes Sägeblatt praktisch durch den Block. (Abb.102) Das Präparat wird in der Präparatehalterung fixiert. Die Höhe des Blocks wird so justiert, dass die Oberfläche knapp über der oberen Kante des Sägeblatts liegt. Die Blockoberfläche muss getrimmt werden. Das bedeutet, dass eine plane Oberfläche erzeugt wird, bevor der eigentliche Schneidvorgang beginnt. Während des Sägens, muss der Wasserfluss justiert werden, damit der Strahl auf die Schneide trifft. Die optimale Geschwindigkeit, in der das Präparat auf die Säge zubewegt wird, muss für jedes eigens bestimmt werden. Allgemein gilt, je langsamer die Annäherung ist, umso geringere Kräfte wirken auf Objekt und Sägeblatt. Nach Abb.102 Sägeprinzip dem Trimmen wird die erste Schicht vom Sägeblatt entfernt und die gewünschte Schnittdicke wird eingestellt. Dabei muss die Sägeblattstärke der gewünschten Schnittdicke hinzugezählt werden. Ist das Sägeblatt z.B. 280 µm dick und der Schnitt soll 120 µm dick werden, muss man 400 µm einstellen. Der Schnitt kann nun angefertigt werden und wird vom Sägeblatt abgehoben. Für sehr dünne Sägeschnitte von ca. 20–30 µm, muss man den Schnitt während des Sägens stabilisieren. Dazu klebt man ein Glasdeckgläschen mit Cyanoacrylatkleber auf die getrimmte Oberfläche. Die Rotationsgeschwindigkeit des Sägeblatts ist ca. 600 Umdrehungen/min. 6.

Herstellen von Schliffpräparaten

Siehe: Verarbeitung von hartem Material

E. Anhaften der Schnitte am Objektträger Die übliche Methode, um Gewebsschnitte auf Glasobjektträgern zu halten, ist sie bei ca. 60°C zu trocknen. Dabei verbindet sich das Gewebe mit Bindungsstellen am Glas. Ein alter Begriff dafür ist „anbacken“. Das Antrocknen kann man auf speziellen Heizplatten (Auflegen der Objektträger) oder in Brutschränken, am besten mit Umluftausstattung, durchführen. In der Routinehistologie werden immer mehrere Schnitte in Färbekörben zur leichteren Handhabung zusammengefasst. Weitere Methoden sind die Mikrowellenbehandlung oder längeres, schonendes Antrocknen bei niedrigeren Temperaturen. Beim Erhitzen über den Schmelzpunkt des Einbettmediums wird das Paraffin flüssig und kann so bei der weiteren Behandlung leichter aus dem Schnitt gelöst werden. Die Mehrzahl der hergestellten Paraffinschnitte haftet ohne weitere Hilfsmittel auf den Glasobjektträgern und wird durch die üblichen Färbemethoden nicht abgelöst. Manche rigorosere Techniken, wie zum Beispiel in der Immunhistochemie, führen dazu,

Histotechnik

153

dass Schnitte leichter abschwimmen. Dazu gehört auch die Behandlung mit sehr alkalischen Lösungen (> pH 8). Andererseits neigen auch bestimmte Gewebetypen (z.B. Knorpel) oder dickere Schnitte dazu, leichter abzuschwimmen. Bei sehr teuren Tests bzw. bei unwiederbringlichem Probenmaterial stellt das ein großes Problem dar, abgesehen von der investierten Arbeit, die dann umsonst war. Um dem entgegenzuwirken bedient man sich sogenannter Adhäsive, die man vorher auf die Glasobjektträger aufbringt und die die Schnitte besser haften lassen. Man spricht dann von beschichteten Objektträgern. Diese Beschichtung kann entweder Adhäsivselbst hergestellt werden, oder man bezieht die beschichteten oder „A Objektträger“ von den entsprechenden Firmen. Für die neuen Techniken wie in-situHybridisierung, in-situ-PCR und Microarray zur Darstellung von Nukleinsäuren oder Proteinen benötigt man besonders adhärente Produkte. Bei diesen Tests werden die Schnitte auf über 100°C erhitzt und mehreren Waschvorgängen ausgesetzt. Besondere Anforderungen an Adhäsive sind, dass sie keine Eigenfluoreszenz aufweisen oder störende Hintergrundeffekte bewirken. Die Adhäsive werden auf die Objektträger aufgebracht, diese werden gekennzeichnet und bis zum Gebrauch staubfrei gelagert. Oder die Mittel werden als Zusatz zum Wasserbad verwendet, was die Anhaftung der Schnitte erhöht und auch das Kreisen der Schnitte auf der Wasseroberfläche vermindern soll. Die Methode des Transfer-Tapes bedient sich eines „Klebebandes“, das den Schnitt vorerst auf dem Objektträger festhält, aber zur weiteren Verarbeitung aufgelöst wird. Dieses System dient mehr der Unterstützung bei der Schnittgewinnung als der Anhaftung. Im Routinebetrieb wird immer mehr auf die käuflichen Adhäsiv-Objektträger zurückgegriffen, weil die manchmal umständliche und zeitaufwendige Herstellung von beschichteten Objektträgern sich nicht mehr rechnet. 1.

Adhäsive

1.1. Mayer’s Albumin, Eiweiß-Glycerin Hühner-Eiweiß-Albumin ist das Hauptprotein des Eiweißes. Es ist ein phosphoryliertes Glykoprotein. Mayers Albumin ist das Allgemein-Adhäsiv für den üblichen Gebrauch. Es ist für bestimmte Tests nicht anzuwenden, weil es eine Eigenfluoreszenz und Doppelbrechung aufweist. Außerdem führt es oft zu Hintergrundanfärbung des Objektträgers. Es löst sich in starken Laugen oder Säuren und ist deshalb z.B. nicht für Ammoniak-Silberimprägnationen geeignet. Die Lösung wird aus frischem Hühnereiweiß oder lyophilisiertem Hühnerweiß hergestellt. Rezeptvorschlag: Gleiche Menge an Hühnerweiß und Glycerin, filtrieren, Thymolkristalle zusetzen oder: 5% Lösung aus lyophilisiertem Albumin in 0,5% NaCl Lösung herstellen; mit gleicher Menge an Glycerin mischen, filtrieren, Thymolkristalle zusetzen. Die Lösungen sind für mehrere Jahre bei Raumtemperatur haltbar. Die Besiedelung mit Mikroorganismen wird durch das Thymol verhindert.

154

Mikrotomie

Anwendung: Ein kleiner Tropfen wird auf einen Objektträger aufgebracht und gleichmäßig verteilt. Der Objektträger wird getrocknet und ist dann fertig für die übliche Verwendung. Alternativ dazu kann man Eiweiß-Glycerin in das Wasserbad zum Strecken der Schnitte geben (20 ml auf 1 l Wasser). Die Antrocknungstemperatur der Schnitte soll bei 60°C liegen, damit das Eiweiß koaguliert und den Schnitt besser festhält. Die Eiweißglycerin-Schicht soll möglichst dünn sein. 1.2. Gelatine Gelatine wird aus Kollagen gewonnen und ist damit auch ein GlykoproteinAbkömmling. Gelatine färbt sich bei manchen Färbungen mit. Rezeptvorschlag: 0,5% Gelatinelösung aus Gelatinepulver herstellen. Anwendung: In 0,5% heiße Gelatinelösung bei 60–80°C eintauchen. Einige Sekunden darin lassen, damit sich die Objektträger aufwärmen. Abtropfen lassen, über Nacht bei 37°C trocknen lassen. Bei Raumtemperatur lagern. Die so präparierten Objektträger können beliebig lange aufbewahrt werden. 1.2.1. Glycerin-Gelatine Rezeptvorschlag: 10 g Gelatine in 60 ml Aqua dest. quellen lassen, dann erwärmen, bis sich die Gelatine löst. 50 ml Glycerin und 1 g Phenol zusetzen. 1.2.2. Chrom-Gelatine Chromgelatine soll gegenüber Eiweißglycerin den Vorteil haben, besonders bei Behandlung mit stark alkalischen Lösungen die Schnitte besser festzuhalten und hier gegenüber Adhäsiven, die mit positiver Ladung arbeiten, in Vorteil zu sein. Rezeptvorschlag: 10 g Gelatine in 1000 ml heißem Aqua dest. lösen (nicht kochen), 5 g Chromkaliumsulfat (Chromalaun) zugeben, wenige Thymolkristalle zugeben. Bei Raumtemperatur lagern. Anwendung: •

15 ml als Adhäsiv im Wasserbad zugeben.

•

Zur Objektträgervorbereitung, Objektträger in Adhäsiv untertauchen, trocknen lassen

•

Man verteilt einen großen Tropfen auf dem Objektträger und lässt ihn dann trocknen.

Die beschichteten Objektträger sollen innerhalb von drei Monaten verwendet werden.

Histotechnik

155

1.3. Silanisierte Objektträger Behandlung mit 3-A Aminopropyltriethoxysilan (APES) bewirkt eine positiv geladene Glasoberfläche. Grundsätzlich weist die Glasoberfläche mehr negativ geladene SilikatGruppen auf. Gereinigte Objektträger werden in eine 2%igen APES-Lösung in Aceton getaucht. Die Lösung beinhaltet Spuren von Wasser, die für den Vorgang notwendig sind. Der Ethoxy-Silicon-Teil von APES reagiert mit dem Wasser. Das ziemlich unstabile Reaktionsprodukt verbindet sich mit Silikat-Säuregruppen auf der Glasoberfläche, und setzt Wasser als Nebenprodukt frei. Dadurch entsteht eine Glasoberfläche, die mit Aminogruppen (vom APES) bestückt ist. Die Bindung zwischen Glas und APES ist hier kovalent, also sehr stark. Im Gegensatz zu Polylysin ist die Bindung des APES an das Glas auch bei sehr niedrigem pH stabil. Das Anhaften des Gewebes auf silanisierten Objektträgern beruht darauf, dass in Abhängigkeit zum umgebenden Milieu im Gewebe reichlich negativ geladene Gruppen als Bindungsstellen vorhanden sind (Carboxylgruppen, Sulphatestergruppen). Knorpel beinhaltet die meisten sauren Gruppen, die auch bei stark saurem pH erhalten bleiben, und verlangt deshalb nach dem stärksten Adhäsiv. In alkalischem Milieu wird die Wirkung der positiv geladenen Gruppen zurückgedrängt und die Haftwirkung auf das Gewebe wird schlechter. Silanisierte Objektträger werden oft statt lysinisierten verwendet. Sie haben dieselben Einsatzgebiete, silanisierte OT sind aber günstiger. Die Manipulation von APES soll unter Abzug erfolgen. Der Vorteil gegenüber den klassischen Adhäsiven ist, dass keine Hintergrundfärbung, keine Eigenfluoreszenz oder Doppelbrechung auftritt. Anwendung: Objektträger in 2 % 3-Aminopropyltriethoxysilan in Aceton für 2 min eintauchen; in Aqua dest. spülen; bei 37oC trocknen; lagern bei Raumtemperatur 1.4. Poly-L-Lysin Polylysin ist ein synthetisches Peptid; ein Polymer mit multiplen Aminogruppen, von denen die meisten über einen großen pH-Bereich positiv geladen sind. Dadurch haftet es gut an der Glasoberfläche, die mit negativ geladenen Silikat-Gruppen bedeckt ist. Die Aminogruppen sind so reichlich, dass sie einerseits am Glas und andererseits am Gewebe anbinden. Ein lysinierter Objektträger ist somit mit positiv geladenen Gruppen bestückt, die die negativ geladenen Gruppen im Gewebe anziehen. Da Polylysin und Silan beide mit positiven Ladungen arbeiten, sind ihre Anwendungsgebiete und Einschränkungen ähnlich. Lysinisierte Objektträger sind für proteolytische Behandlung und für sehr saure Lösungen eher nicht zu verwenden. Anwendung: Poly-L-Lysin Stammlösung 1:10 in Aqua dest. verdünnen. Objektträger 5 min bei Raumtemperatur eintauchen; abtropfen lassen, 1 Std. bei 60oC oder über Nacht bei Raumtemperatur trocknen; Die gebrauchte Lösung filtrieren und im Kühlschrank lagern (für mehrere Monate haltbar). 1.5. Celloidin-Häutchen Celloidin (Nitrozellulose) entsteht durch Behandlung von Zellulose mit einer Mischung aus konzentrierter Salpeter- und Schwefelsäure (Zellulosenitrate und Nitritester) und

156

Mikrotomie

wird unter verschiedenen Handelsnamen angeboten. Die Celloidinlösung wird hier sehr verdünnt angewandt und kann häufig wieder verwendet werden. Werden Schnitte einer sehr rauen Behandlung, vor allem der Einwirkung von Alkalien und heißen Säuren, unterzogen, ist es ratsam dem Abschwimmen durch einen Filmüberzug mit Celloidin entgegen zu wirken. Der Film muss beide Seiten, alle Kanten und Ecken bedecken. Das Celloidinhäutchen ist durchlässig für Farbstoffe und andere Färbereagenzien. Anwendung: •

1% ige Lösung von Celloidin in einer Ethanol/Ether-Mischung 1:1 herstellen.

•

Schnitte entparaffinieren und in Alkohol spülen.

•

Objektträger für 5 min in Celloidinlösung tauchen, abfließen lassen.

•

In 80% Alkohol 5 min spülen.

•

Kurz in Aqua dest. spülen und mit Prozedur fortfahren.

•

Nach der Färbung löst sich der Film langsam im Alkohol des Entwässerungsschrittes (bei Schwierigkeiten: Ether/Alkohol verwenden).

1.6. Objektträger mit positiver Ladung Es werden unter verschiedenen Handelsnamen Objektträger mit positiver Ladung angeboten, die die Anhaftung von Schnitten für sehr „raue“ Behandlung erhöht. Das Grundprinzip ist auch hier die Behandlung mit reaktiven Silikonverbindungen, wobei die genauen Vorgänge firmengeheim sind. Das führt zu einer elektrostatischen Anziehung zwischen Gewebe und Glasoberfläche und im weiteren zu einer kovalenten Bindung. Ihre Vorteile sind dieselben wie bei silanisierten Objektträgern gegenüber den klassischen Adhäsiven. Zusätzlich bieten sie ein gut zu beschriftendes Feld und eine Kennzeichnung als Adhäsiv-Objektträger. Die ready-to-use Methode unterstützt das Labor in der Rationalisierung. Die Objektträger werden für unterschiedliche Applikationen angeboten, wie z.B. für Gefrierschnitte, besonders schwer bindende Gewebe oder Goldlabeling. Zu beachten ist, dass diese Objektträger ein Ablaufdatum aufweisen. Dazu gehören z.B. Histobond (Fa. Marienfeld), Superfrost-plus (Fa. Menzel), Superfrost plus Gold (Fa. Menzel) Es gibt auch käufliche, lysinisierte Objektträger. Nicht nur gebrauchsfertige Objektträger sondern auch gebrauchsfertige Adhäsive werden vom Handel angeboten, die teilweise auch als Zusatz für das Wasserbad verwendet werden (Bsp.: Novobond, Tissuebond, Biobond Fa. Novocastra, Tissue Section Adhesive Fa. Microm). 2.

Tape-Transfersystem

Dieses System ist auf Gefrierschnitte und Paraffinschnitte anzuwenden. Besonders beim Schneiden von MicroTissueArray-Blöcken ist es hilfreich, um alle Spots auf den Objektträger zu transferieren und dort zu fixieren. Folgende Vorteile soll es bringen: •

Es erhält die Morphologie des Gewebes.

•

Jeder Schnitt kann gewonnen werden (weniger Abfall von wertvollem Material).

157

Histotechnik

•

Es ermöglicht ultraplane, kompressionslose Schnitte (ideal für Laser-CaptureMicrodissection) und bis zu 2µm dünne Gefrierschnitte.

•

Schnittgewinnung von schwierig zu schneidendem Gewebe (auch schlecht infiltriertes, fettes Gewebe) wird erleichtert.

•

Ist im Routinebetrieb einsetzbar.

Das System besteht aus einem durchsichtigem „Klebeband“, Adhäsivobjektträgern, UV-Lichtstation, Roller und Lösungsmittel. Das „Klebeband“ wird auf den Block aufgebracht, der Schnitt wird direkt auf dem Band gehalten. Dieses wird auf die speziellen Objektträger transferiert und mittels Roller luftblasenfrei befestigt. Die Kunststoffbeschichtung wird durch UV-Bestrahlung polymerisiert. Das Klebeband wird danach im Lösungsmittel entfernt und der Objektträger ist fertig zur weiteren Verwendung ohne Antrocknen im Brutschrank. (Abb.103) Zu beachten ist: •

Die Adhäsivobjektträger sind sehr lichtempfindlich. Die Kunststoffpolymerisation wird schnell angeregt.

•

Der Anwendung soll rasch erfolgen. Immer nur einen Objektträger bearbeiten.

•

Der Kunststoff soll gleichmäßig am Objektträger verteilt sein.

•

Luftblasen sollen vermieden werden. Das Gewebe unter einer Blase geht verloren.

•

Die Entparaffinierung in Xylol soll für mind. 2 Std. erfolgen.

•

Rückstände am Objektträger stammen vom Kunststoff, nicht von Paraffin, und stören die Prozeduren nicht.

Abb.103 TapeTransfer System Fa. Alphametrix

F. Laser Capture Microdissection (LCM) Gewebe enthält oft nur einen Bruchteil an Zellen oder Zelltypen, die für den Molekularbiologen von Interesse sind. LCM erlaubt es, homogene Zelltypen und mehrzellige Strukturen isoliert aus histologischen oder zytologischen Proben zu gewinnen. Das Prinzip dahinter liegt im Herausnehmen von Strukturen mittels Laser direkt aus einem Gewebeschnitt (Abb.104). Dabei wird ein Transferfilm, der bei Laserbestrahlung schmilzt und auf dem Gewebe haftet, auf den Schnitt gelegt. Im Gerät wird die Region des Interesses eingestellt und beschossen. Wird der Film abgenommen, heben sich auch die gewünschten Strukturen ab und können transferiert werden. Da die Gewinnung von Nukleotiden zum Hauptanwendungsgebiet gehört, wurde dafür ein kommerzielles System entwickelt, das die Handhabung erleichtert (Veritas Laser Capture Microdissection system, Abb.105). Anwendung findet es in der Genom-Untersuchung

158

Mikrotomie

für PCR-Techniken oder Microarrays. RNA und DNA bleiben bei dieser Methode intakt. Es eignen sich dazu formalinfixierte Gewebe als Paraffinschnitt bzw. unfixiertes Gewebe als Gefrierschnitt. Auch aus Abklatschen, Ausstrichen oder Zellkulturen kann man gezielt Zellen entnehmen. Die Zellen werden durch diese Methode weder chemisch noch morphologisch verändert. Für Proteinanalysen wird unfixiertes Gewebe verlangt.

Abb.104 Prinzip Laser Capture Microdissection

Zur Identifikation der gewünschten Zellen können histochemische und immunhistologische Techniken angewandt werden.

Abb.105 Veritas LCM System Fa. Arcturus

Ablauf Nukleinsäuren-Gewinnung: 1. Der Schnitt wird zuerst mit einer haftenden Folie von störenden Partikeln gereinigt. 2.

Objektträger wird ins Gerät eingespannt und die Region des Interesses eingestellt.

3.

Eine Kunststoffkappe wird mittels eines Arms auf diese Region gesetzt. Dabei bleibt ein definierter Spalt von 12µm zwischen Gewebe und Transferfolie, die sich auf der Kappe befindet, frei.

4.

Durch Aktivierung des Lasers dehnt sich die Folie punktuell bis zum Gewebe hin aus und haftet an den gewünschten Zellen.

5.

Wird der Arm zurückbewegt, bleiben die Zellen an der Kappe haften. Die restlichen Strukturen bleiben unbeeinflusst.

6.

Die Kappe wird auf ein speziell designtes Extraktionsgefäß aufgesetzt. Durch Zugabe des Extraktionspuffers werden die Nukleotide freigesetzt. Ein Eppendorfhütchen passt auf dieses Extraktionsgefäß. So können die gelösten Substanzen leicht in die entsprechenden Reagensgefäße überführt und weiterverarbeitet werden.

Histotechnik

159

Histologische Färbung A. Geschichtliches..............................................................................................161 B. Farbstoffe ......................................................................................................162 1. Allgemeines............................................................................................162 2. Chemische Struktur ................................................................................165 3. Einteilung der Farbstoffe ........................................................................165 C. Färbetheorie..................................................................................................170 1. Faktoren der Färbereaktion ....................................................................170 2. Einteilung der Färbereaktion nach Bindungstyp.....................................176 D. Vorbehandlung..............................................................................................186 1. Formalin-fixiertes-Paraffin-eingebettetes Gewebe (FFPE) ......................179 2. Andere Vorbehandlungen ......................................................................180 E. Färbeprotokolle.............................................................................................180 1. Allgemeines............................................................................................180 2. Begriffe ...................................................................................................181 3. Laborausstattung ....................................................................................182 4. Hinweise für die Praxis............................................................................182 F. Übersichtsfärbung: Hämatoxylin – Eosin – Färbung ......................................183 1. Farbstoffe-Färbeprinzip ..........................................................................184 2. Protokoll HE-Färbung .............................................................................188 3. Färbeergebnis HE-Färbung ....................................................................189 G. Spezialfärbungen...........................................................................................189 1. Bezeichnungen .......................................................................................190 2. Trichromfärbungen .................................................................................190 3. Nachweis von Aldehyden (Darstellung der Glykoproteinen) ..................191 4. Silberimprägnation .................................................................................192 5. Histochemische Nachweismethoden......................................................194 6. Enzymhistochemische Nachweismethoden ............................................195 7. Mikrowelle in der Färbetechnik ..............................................................195 H. Bindegewebe- und Stützgewebe-Darstellung..............................................195 1. Van-Gieson-Färbung ..............................................................................197 2. Masson-Trichrom-Färbung .....................................................................198 3. Einschritt-Trichrom nach Gomori (CAB)..................................................199 4. MSB-Färbung (Martius-yellow-Solubel Blue-Brillant crystal) ...................199 5. Trichromfärbung nach Mallory/Cason (SFOG)........................................199 6. Weigert’s Resorcin-Fuchsin-Färbung ......................................................200 7. Verhöff’sche Färbung .............................................................................201 8. Silberimprägnation nach Gomori............................................................201 9. Perjodsäure-Silbermethenamin-Imprägnation nach Gomori/Jones........203 10. Romanowsky Giemsa-Färbung ...............................................................204 I. Lipid-Darstellung ...........................................................................................205 1. Sudan-III-Färbung......................................................................................206 J. Kohlenhydrat-Darstellung ...............................................................................207 1. Perjod-Acid-Schiff’sche Reaktion nach McMannus .................................207 2. Best’s Carmin-Färbung ...........................................................................210 3. Alcianblau-Färbung ................................................................................210 4. Müller-Mowry-Färbung (Kolloidales Eisen, Hale-Färbung) .....................211 5. Azur A - Färbung ....................................................................................212 6. Kohlenhydrat-Darstellung mit Lektinen ..................................................212

160

Histologische Färbung

K. Amyloid-Darstellung .....................................................................................213 1. Kongorot nach Highman ........................................................................214 L. Pigment-Darstellung .....................................................................................215 1. Berliner-Blau-Reaktion ............................................................................217 2. Silberimprägnation nach Fontana-Masson .............................................217 3. Schmorl-Reaktion ...................................................................................218 4. Hall-Färbung (Fouchet)...........................................................................219 5. von Kossa-Silberimprägnation................................................................219 6. Alizarinrot S-Färbung.............................................................................. 220 7. Rhodanin-Färbung.................................................................................. 220 M. Mikroorganismen-Darstellung .......................................................................221 1. Gramfärbung ..........................................................................................221 2. Ziehl-Neelsen-Färbung ........................................................................... 222 3. Silberimprägnation nach Grocott-Gomori (GMS) ...................................222 4. Warthin-Starry-Versilberung ...................................................................223 N. Darstellung neurologischer Strukturen..........................................................224 1. Kresylechtfärbung................................................................................... 225 2. Versilberung nach Bielschowsky .............................................................226 3. Luxol-Fast-Blue nach Klüver-Barrera.......................................................226 4. PTAH-Färbung (Phosphorwolframsäure-Hämatoxylin nach Mallory) ......227 O. Nukleinsäuren-Darstellung ............................................................................227 1. Feulgenreaktion......................................................................................228 P. Darstellung von biogenen Aminen................................................................228 Q. Darstellung funktioneller Gruppen................................................................229 R. Knochenfärbungen........................................................................................229 S. Nachbehandlung der Schnitte ......................................................................230 T. Färbeautomaten............................................................................................233 U. Färbung in der Elektronenmikroskopie .........................................................235

Histotechnik

161

Histologische Färbung Hat die Gewebeprobe alle in den vorigen Kapiteln beschriebenen Stadien durchlaufen, hat man nun einen Glasobjektträger vor sich, auf dem sich ein ca. 3 µm dicker Paraffinschnitt befindet. Das Gewebe hebt sich meist weißlich vom Hintergrund ab, das umgebende Paraffin ist gut zu erkennen. In dieser Form ist der Schnitt aber noch nicht zum Mikroskopieren geeignet. Ungefärbtes Gewebe ist relativ kontrastarm. Bei der lichtmikroskopischen Beurteilung kann man die Strukturen nur schwer differenzieren. Um diesen Kontrast zu erhöhen, behandelt man die Gewebeschnitte mit Farbstoffen, die bestimmte Affinitäten zu den unterschiedlichen Gewebekomponenten aufweisen. Aufgrund bestimmter Gesetzmäßigkeiten verhalten sich die Gewebestrukturen den Farbstoffen gegenüber immer gleich und können so identifiziert werden. Für die morphologische Diagnostik benötigt man in erster Linie eine Übersichtsfärbung, die alle Strukturen in typischer Weise darstellt. Es gibt verschiedene Übersichtsfärbungen. Durchgesetzt hat sich weltweit die Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE). Jede eingelangte Gewebeprobe wird mit der HE-Färbung angefärbt und mikroskopisch beurteilt. Beim Großteil der Proben ist diese Methode ausreichend. Ist so noch keine Diagnose zu erstellen, werden weitere Schritte unternommen. Dazu gehören die sogenannten Spezialfärbungen, wo ausgesuchte Gewebestrukturen gezielt angefärbt werden. Die Färbemechanismen dabei sind unterschiedlich. Weitere Methoden sind immunhistochemische, enzymhistochemische und molekularbiologische Techniken zur Diagnosefindung.

A. Geschichtliches Die Geschichte der histologischen Färbung ist eng verknüpft mit der Textilfärbung. In beiden Gebieten wurden vorerst Naturfarbstoffe verwendet, die teilweise schon 3000 v.Chr. bei den Ägyptern zu finden waren (Blauholz, Indigo, Krappwurz, Reseda, Safran). Einen Meilenstein in der Farbstoffentwicklung brachte die Entdeckung des Phenols und des Anilins im Steinkohleteer durch den deutschen Chemiker Friedlieb Ferdinand Runge im Jahre 1834. Zwanzig Jahre später, 1856, entdeckte William Perkin in London den ersten künstlich hergestellten Anilinfarbstoff. „Mauvein“ wurde zur Seidenfärbung eingesetzt. In der Folgezeit verdrängten die aufkommenden, auf chemischem Wege hergestellten Farbstoffe die Naturfarbstoffe fast vollständig vom Textilfärbemarkt. Mit künstlichen Farbstoffen konnte man Baumwollfasern besser und künstliche Fasern wie Polyester überhaupt erst anfärben. Parallel dazu wurden sehr viele künstliche Farbstoffe in die Histotechnik eingeführt. Auf empirischem Wege wurden Techniken und Rezepte entwickelt, deren biochemischer Hintergrund bis heute noch nicht vollständig aufgeklärt ist. In der Bezeichnung vieler Histofärbungen findet man die Namen der Entwickler dieser Zeit wieder (siehe Kapitel „Geschichte“). F ür die morphologische Diagnostik waren die Spezialfärbungen über ein Jahrhundert lang die Methode der Wahl. Es gab wenig Neuentwicklungen aber dafür Modifikationen der bewährten Rezepte. Erst in den 80erJahren des 20. Jh. kam es zu einem weiteren großen Schritt in der Histotechnik. Durch das Aufkommen der modernen Diagnosetechniken wie I mmunhistologie oder

162

Histologische Färbung

in-situ-Hybridisierung wurde der Einsatz der im Vergleich unspezifischen Spezialfärbungen teilweise verdrängt. Für die Routinehistologie hat sich eine kleine Zahl der unzähligen Färberezepturen durchgesetzt, die man auch weltweit überall findet. Die gleichnamigen Rezepte variieren dabei in mehr oder weniger großem Ausmaß, die Prinzipien sind jedoch dieselben. Tabelle 9 nach Farbenlexikon von Thomas Seilnacht www.seilnacht.com

Jahr 1856 ab1863 1868 1877 1878 1884 1893 1896 1914

Verbreitung der künstlichen Farbstoffe Perkin stellt erstmals Mauvein, einen Anilinfarbstoff, her. Gründung von Farbstofffabriken (Bayer, Hoechst, BASF). Graebe und Liebermann gelingt die Alizarinsynthese (künstlicher „Krappfarbstoff“). Der Mengenanteil an künstlich produziertem Alizarin überholt das natürliche auf dem Weltmarkt. Dem deutschen Chemiker Baeyer gelingt die Indigosynthese. Böttiger entwickelt Kongorot, den ersten direktfärbenden Azofarbstoff. Es sind bereits 324 künstliche organische Farbstoffe bekannt. Beginn der Indigoproduktion bei BASF. Der Marktanteil an natürlichem Indigo beträgt nur noch 4%.

B. Farbstoffe 1.

Allgemeines

Als Farbstoff bezeichnet man eine Substanz, die nicht nur selbst färbig ist, sondern auch die Fähigkeit hat, sich an ein Substrat zu binden. Im Weiteren versteht man darunter auch Färbereagenzien, die erst durch eine Bindungsreaktion am Gewebe oder durch histochemische Entwicklungsreaktionen färbig werden. Farbe entsteht durch Absorbtion bzw. Reflexion eines Teils des durchgehenden bzw. reflektierten weißen Lichts in einer bestimmten Wellenlänge im sichtbaren Bereich. Sichtbares Licht ist eine elektromagnetische Wellenstrahlung im Bereich von 400–800 nm Wellenlänge. Weißes Licht entsteht durch gleichzeitiges Auftreten aller Wellenlängenbereiche. Die Farbempfindung wird erst durch das Auftreffen der Strahlung auf die Sinneszellen im Auge ausgelöst. Je nach Spezies ist die Wahrnehmung von Farbe unterschiedlich (Tab.10). Voraussetzung für eine L ichtabsorbtion ist eine Wechselwirkung zwischen den Elektronensystemen der Farbstoffmoleküle und dem Licht. Es müssen in der Verbindung unbesetzte Bindungsorbitale vorhanden sein. Bei Lichtabsorbtion können Elektronen diese Orbitale Abb.106 Delokalisation (kurzzeitig) besetzen. Geeignet für den der Elektronen Wechsel in solche Orbitale sind Elektronen in Phenol und von Doppelbindungen, Dreifachbindungen, Phenolation aromatischen Ringsystemen und nichtbindende Elektronenpaare.

163

Histotechnik

Im Zusammenhang mit der absorbierten Wellenlänge steht die Anzahl an konjugierten Doppelbindungen, die in einer Substanz vorhanden sind und in deren Bereich sich die Elektronen frei bewegen können. Die Bindungselektronen sind nicht exakt zu den Atomkernen zuordenbar, also d elokalisiert (Abb.106). Eine besondere Rolle spielen hier aromatische Ringsysteme wie Benzol. Benzol absorbiert Licht bei einer Wellenlänge, die unterhalb des sichtbaren Bereichs liegt, und erscheint farblos. Durch das Einbringen von weiteren Gruppen wird die „Ausdehnung“ über die sich die π−Elektronen bewegen können vergrößert und die Wellenlänge des resorbierten Lichts wird in den sichtbaren Bereich geschoben. Manche Substanzen zeigen im sauren bzw. basischen Milieu eine unterschiedlich große Delokalisation der Elektronen und damit unterschiedliche Farbe. Diese kann man als Indikatoren einsetzen (z.B. Alizarin von gelb nach blau). Tabelle 10 nach Farbenlexikon von Thomas Seilnacht www.seilnacht.com Wellenlänge des Zugeordnete Farbe des Farbeindruck des "Restlichts" absorbierten absorbierten Farbanteils (reflekt. Komplementärfarbe) Lichts (in Nanometer) 400–435

violett

435–480

blau

gelbgrün gelb

480–490

grünblau

orange

490–500

blaugrün

rot

500–560

grün

purpur

560–580

gelbgrün

violett

580–595

gelb

blau

595–605

orange

grünblau

605–770

rot

blaugrün

Fluorochrome sind Substanzen, die im UV-Bereich absorbieren und langwelligeres Licht emittieren. Das bedeutet, dass Elektronen durch die Einwirkung höherer Energie auf ein hohes Niveau gehoben werden und beim Rückschritt ein Zwischenniveau belegen und dabei weniger Energie wieder abgeben. Schließlich fallen sie wieder in das Ausgangsniveau zurück. (Abb.107) Die Atomgruppen, die als Basis für die Färbigkeit gelten, nennt man Chromophore (z.B. Ethylen, Karbonyl, Sulfin, Azo, Nitroso, Nitro). Aromatische Verbindungen mit chromophoren Gruppen nennt man C hromogene. Sie sind färbig, Abb.107 Fluoreszenzprinzip binden aber nicht an ein Substrat. Das wird durch die Einführung von auxochromen Gruppen erreicht. Sie verleihen dem Molekül durch base- oder säurebildende Gruppen eine elektrische Ladung. Der Begriff „auxochrom“ bedeutet farbverstärkend. Sie zeigen neben ihrer „Bindungs“Wirkung auch eine Intensivierung der Farbe und haben so auch „chromophore“ Eigenschaften. (Abb.109)

164

Histologische Färbung

häufige chromophore Gruppen: •

-C=C-

Ethylen

•

-C=N-

Imin

•

-C=O-

Carbonyl

•

-N=N-

Azo

•

-NO2

Nitro

•

Chinon (Abb.108)

Abb.108

Abb.109 farbverstärkende Wirkung von auoxochromen Gruppen

häufige auxochrome Gruppen: Je nach Ladung unterscheidet man basische und saure Auxochrome, die zur Bildung von basischen (positiv geladenen) bzw. sauren (negativ geladenen) Chromogenionen führen. Man kann auch beide Typen auf einem Farbstoffmolekül finden. Die Säurenstärke nimmt von Schwefelsäure- zu Carbonsäurerest ab, Hydroxylgruppen sind noch schwächer. Je saurer die Umgebung ist (mehr H+-Ionen), umso mehr wird die Dissoziation zurückgedrängt und umso weniger Farbstoff ist als Anion vorhanden. Der pH-Wert der Farbstofflösung hat eine tiefgreifende Wirkung auf den Färbeeffekt. Er beeinflusst sowohl den Farbstoff als auch das Substrat, da es sich hier meist um amphotere Proteine handelt. •

-HSO3

Sulfatylgruppe

neg.

•

-COOH

Carboxylgruppe

neg.

•

-OH

Hydroxyl

neg.

•

-NH3

Aminogruppe

pos.

Eine dritte Art von auxochromer Gruppe sind die reaktiven A uxochrome, die direkt durch Bildung von Hydroxyl- oder Aminogruppen an das Substrat kovalent binden. Diese direkten Farbstoffe werden am Gewebe nicht eingesetzt.

165

Histotechnik

Farbstoffe bestehen meist aus einer Vielzahl von Kombinationen der typischen Molekülgruppen. Von einem Grundtyp ausgehend bestehen verschiedene Varianten, die sich in ihren physikalischen und chemischen Eigenschaften unterscheiden. Da ihre korrekte chemische Bezeichnung sehr umständlich ist, werden Farbstoffe meist mit sog. Trivialnamen versehen. Gleiche Farbstoffbezeichnungen werden oft in verwirrender Weise für verschiedene Substanzen gebraucht. Außerdem variieren die Inhaltstoffe der angebotenen Farbstoffe je nach Erzeuger. Selten wird ein Farbstoff in reiner Form geliefert. Es gibt hier Differenzen von Erzeuger zu Erzeuger, aber auch innerhalb von Chargen. Die eindeutige Identifizierung von Farbstoffen erfolgt über die Color-Index-Nummer (CI), die von der Society of Dyers and Colourists vergeben wird. In der Anwendung sollte man bei neuen Chargen oder Wechsel der Bezugsquelle das Färberezept erst an bekanntem Gewebe austesten, um unliebsame Überraschungen zu vermeiden. Im Umgang mit Färbereagenzien darf man nicht vergessen, dass sie ebenso gesundheitsschädlich sein können, wie alle anderen Reagenzien, auch wenn sie „nette“ Namen haben und schön aussehen. Das Tragen von Handschuhen und das Arbeiten unter Abzug sollte deshalb Grundvoraussetzung sein. Für alle Reagenzien werden Sicherheitsdatenblätter mit entsprechenden Anweisungen zur Handhabung und Entsorgung bereitgestellt. 2.

Chemische Struktur

Aufgrund bestimmter typischer Strukturen, von denen die Farbstoffe abgeleitet werden, können diese zusammengefasst werden. Dabei sind die typischen Gruppen nicht nur auf eine Farbstoffart beschränkt. In den Quellen ist die Einteilung nicht einheitlich. Die Strukturformeln der Farbstoffe können am besten auf der Website von Bryan Llewellyn (stainsfile.info/StainsFile/javaindex.html) nachgelesen werden, wo eine detaillierte Beschreibung von sehr vielen Farbstoffen zu finden ist. Noch genauere Erklärungen findet man in „Conn’s Biological Stains“ (siehe Quellen). Die nachfolgende Tabelle 11 wurde der Website entnommen. Für den täglichen Umgang mit Farbstoffen im Routinelabor ist es wohl nicht ausschlaggebend die genauen Strukturen zu kennen. Es ist jedoch interessant, das Molekulargewicht (Größe), das Ladungs-, das Absorbtions- und das Löslichkeitsverhalten in Relation zu den Färbeanleitungen zu setzen. Dadurch werden die Färberezepte viel verständlicher und nachvollziehbarer. 3.

Einteilung der Farbstoffe

Man kann Farbstoffe nach unterschiedlichen Kriterien zusammenfassen. 3.1. Herkunft •

natürlich:

Natürliche Farbstoffe werden schon seit Jahrtausenden verwendet. In der Histotechnik ist das Hämatoxylin, das aus Blauholz gewonnen wird, am bekanntesten. Zu den biologischen Farbstoffen gehören z.B. Chlorophyl, Hämoglobin, Carotinoide, Melanin.

•

künstlich: Künstliche Farbstoffe nennt man auch Anilinfarben oder Teerfarbstoffe, da sie ursprünglich wie Anilin aus Teer als Rohstoff gewonnen wurden. Es gibt eine Vielzahl an künstlichen Farbstoffen. Ihre Entwicklung ging parallel mit dem Aufschwung der organischen Chemie.

166

Histologische Färbung

3.2. Verwendung •

•

industriell: Textil-, Kunststofferzeugung, Farben- und Lackerzeugung. Bei den industriell verwendeten Farbstoffen unterscheidet man: ƒ

Direkte Farbstoffe: Der Farbstoff haftet durch Adsorption.

ƒ

Beizenfarbstoffe: Die Komplexbildung der Metall-Ionen vermittelt die Bindung zwischen Faser und Farbstoff.

ƒ

Küpenfarbstoffe: Der in reduziertem Zustand lösliche Farbstoff dient zum Tränken der Faser, bei Oxidation entsteht ein unlöslicher, fest haftender Farbstoff (z.B. Indigo)

ƒ

Entwicklungsfarbstoffe: Die Faser wird mit einer Farbstoffkomponente getränkt, dann erst wird mit der zweiten Komponente der unlösliche Farbstoff auf der Faser entwickelt (z.B. Azofarbstoffe).

ƒ

Pigmentfarbstoffe: Bei Kunststoffen wird meist noch vor der Verarbeitung der unlösliche, feinst verteilte Farbstoff zugesetzt. Dadurch ist der Kunststoff durch und durch gefärbt.

Medizinisches Labor: Farbstoffe werden zur in-vitro-Diagnostik eingesetzt. In vivo verwendet man sie als Vitalfarbstoffe (bei Versuchstieren, Zellkultur, zur Markierung von Lymphwegen für Operationen).

3.3. Elektrische Ladung / Säure-Base-Verhalten •

basischer Farbstoff: freie Farbbase oder das Salz einer solchen mit positiven auxochromen Gruppen (z.B. Methylenblau)

•

saurer Farbstoff: freie Farbsäure oder das Salz einer solchen mit negativen auxochromen Gruppen (z.B. Eosin, Kongorot, Säurefuchsin)

•

amphoterer Farbstoff: negative und positive Gruppen halten sich die Waage

•

indifferente Farbstoffe: enthalten keine säure- oder basebildenden Gruppen sondern indifferente Gruppen (=O, -OCH3, –OC2H5).

•

neutraler Farbstoff: Verbindung der Farbsäure und der Farbbase (Salzbildung, z.B. eosinsaures Methylenblau)

•

neutrales Farbgemisch: Farbbase und Farbsäure liegen nebeneinander vor ohne Verbindung; Färbeergebnis entspricht nicht dem des neutralen Farbstoffes.

•

lysochromer Farbstoff: besitzt keine auxochrome Gruppe, rein physikalisches Färbeprinzip durch höhere Löslichkeit des Farbstoffes im Substrat (z.B. Fettfärbung durch Sudanfarbstoffe)

167

Histotechnik

Tabelle 11a: Farbstoffklassen aus der Website von Bryan Llewellyn (stainsfile.info/StainsFile/javaindex.html)

Farbstoffklasse Beispiel

Acridin Acridin-Orange

Anthrachinon Alizarin red S, Nuclear fast red

Diarylmethan Auramin O

Triarylmethan Pararosanilin, Methylblau Azo Orange G Biebrich Scarlet Diazonium Fast red B Nitro Pikrinsäure ChinoniminAzin Neutralred, Safranin O

abgeleitet von

allgemeine Formel

168

Histologische Färbung

Tabelle 11b

Farbstoffklasse Beispiel ChinoniminOxazin Celestin blue B QuinoniminThiazin Methylenblau Tetrazolium NitroblauTetrazolium XanthenFluorene Pyronin

XanthenFluorene Rhodamin

XanthenFluorone Eosin

Phthalocyanin Alzianblau, Luxol fast blue

abgeleitet von

allgemeine Formel

169

Histotechnik

3.4. Anfärbung der Zellbestandteile Kernfarbstoffe: Das Kernchromatin ist aufgebaut aus den Nukleinsäuren (Phosphorsäure, Zucker, Base) und anhängenden Proteinen (Histone) und zählt zu den basophilen Gewebeanteilen. D.h. es ist insgesamt negativ geladen aufgrund der Phosphatgruppen und zieht basische Farbstoffe an. Die Stärke dieser Eigenschaft ist abhängig vom pHWert der Lösung in Zusammenhang mit dem isoelektrischen Punkt der amphoteren Kernproteine. Im Interphasekern sind allerdings nur jene Teile des Chromatins stark basophil anfärbbar, die auf Heterochromatin beruhen, während die Euchromatinanteile nicht angefärbt werden. Es bildet das Heterochromatinmuster des Interphasekerns. Die meisten Kernfarbstoffe sind positiv geladen und daher basische Farbstoffe. Sie lagern sich an die negativ geladenen Phosphatgruppen der DNS des Zellkerns (Chromatin) an. Allerdings ist die Färbbarkeit der Zellkerne mit Hämalaun und Eisenhämatoxylin nach Entfernen von Nukleinsäuren noch immer gegeben, sodass man auch Bindungen an nicht saure Gruppen (Argininreste) annehmen kann. Eine elektive Kernfärbung kann durch Einstellen des pH-Wertes der Farblösung zwischen dem isoelektrischen Punkt der Kerne (ca. 3,8) und dem des Plasmas (ca. 6,5) erreicht werden. In diesem Bereich liegt der Kernfarbstoff als Base vor und bindet an die sauren Chromatinbestandteile, jedoch nicht an die basischen Plasmabestandteile. Basophil erscheinen auch jene Strukturen im Zytoplasma, die bei diesem pH-Wert ebenfalls saure Gruppen aufweisen. Dazu gehören RNA-hältige Ribosomen und sulfatierte Kohlenhydrate (Mastzellgranula, Knorpelmatrix, Zellsekrete).

Abb.110 Kernechtrot

Beispiele: •

Mayers Hämalaun: Der basophile Naturfarbstoff Hämatoxylin wird künstlich gereift und mit Beize zu einem Lack entwickelt. Färbeergebnis = blau (siehe Hämatoxylin)

•

Weigerts Eisenhämatoxylin: Es wird ein Eisenhämatein-Lack erzeugt. Färbeergebnis = blauschwarz (siehe Hämatoxylin)

•

Kernechtrot-Aluminiumsulfat: Kernechtrot gehört zur Gruppe der Anthrachinonfarbstoffe und ist ein saurer Farbstoff. Als reiner Farbstoff zählt es zu den Plasmafarbstoffen. Aluminiumsulfat agiert hier als Beize. Es entsteht ein Aluminiumlack, der eine rote Kernfärbung bewirkt. Kernechtrot wird gerne als Gegenfärbung bei histochemischen Reaktionen benutzt. (Abb.110)

•

Methylenblau: Das ist ein basischer Thiazinfarbstoff; Färbeergebnis = blau

Plasmafarbstoffe: Die meisten Plasmafarbstoffe sind sauer, negativ geladen und binden an positiv geladene Gewebeelemente (a azidophil). Die basischen Aminosäuren wie z.B. Arginin, Histidin und Lysin sind häufige Bindungspartner. Es tritt dabei keine spezifische Plas-

170

Histologische Färbung

mafärbung auf, sondern alle passenden Bindungspartner werden genommen. Der Kontrast zwischen Kern und Plasma entsteht durch die vorgeschaltete Kernfärbung. Der pH-Wert der Lösung muss dabei zwischen pH 4 und 6 liegen. In diesem Bereich sind die Plasmaproteine positiv geladen. Unterhalb von pH 4 geht der Farbstoff in seine Säureform über und steht zur Bindung nicht mehr voll zur Verfügung Beispiele: •

Eosin Y

Xanthenfarbstoff, sauer, rosa bis hellrot

•

Chromotrop 2R

Monoazofarbstoff, sauer, kräftig rot

•

Orange G

Azofarbstoff, sauer, orange

•

Säurefuchsin

Triphenylmethanfarbstoff, sauer, klares rot

•

Lichtgrün

Triarylmethanfarbstoff, sauer, hellgrün

•

Anilinblau

Triphenylmethanfarbstoff, sauer, blau

•

Pikrinsäure

Nitrofarbstoff, sauer, gelb

C. Färbetheorie Die biochemischen Grundlagen zur Färbetheorie sind noch nicht gänzlich aufgeklärt. Aufgrund der verschiedenen, färbbaren Strukturen muss man mehrere Färbeprinzipien miteinbeziehen und kann keines isoliert sehen (Elektroadsorbtion, chemische Bindung, physikalische Löslichkeit, tertiärstruktur-bedingte Mechanismen, indirekte Färbung). Die Bindung von Farbstoffen unterliegt denselben Gesetzen wie alle anderen chemischen Reaktionen und dieselben Bindungskräfte werden dabei aktiv. Bei der Reaktion wird ein Gleichgewicht entsprechend den herrschenden Reaktionsbedingungen angestrebt. 1.

Faktoren der Färbereaktion

1.1. Bindungskräfte der Reaktion •

Ionenbindung

•

kovalente Bindung

•

Wasserstoffbrückenbindung

•

Van-der-Waals-Kräfte

Der wichtigste Bindungstyp für die Farbstoffchemie ist die I onenbindung, wo man es mit unterschiedlich geladenen Reaktionspartnern zu tun hat. Die kovalente Bindung findet man z.B. bei der Anwendung von Beizfarbstoffen. Es ist eine starke Bindung, wo die Reaktionspartner ein Elektronenpaar gemeinsam besitzen. W asserstoffbrückenbindung und Van-der-Waals-Kräfte haben mit der Dipoleigenschaft von Molekülen bzw. Atomen aufgrund der beweglichen Elektronen zu tun. Es kommt dabei zur Anziehung von entgegengesetzt geladenen Molekülanteilen der Reaktionspartner. Die Bindungsenergie ist hier um ein Vielfaches geringer als bei Ionen- und kovalenter Bindung.

171

Histotechnik

1.2. Massenwirkungsgesetz A+BļC+D

Die Stoffe A und B verbinden sich und zerfallen wieder zu C und D. Diese Reaktion läuft in beide Richtungen zur selben Zeit ab.

Das „Ende“ einer Reaktion ist dann erreicht, wenn die Geschwindigkeit der „Hin“Reaktion gleich der Geschwindigkeit der „Rück“-Reaktion entspricht. Es entsteht ein dynamisches Gleichgewicht. Die Reaktion wird durch die Gleichgewichtskonstante K charakterisiert, die von den Reaktionsgeschwindigkeiten abhängig ist. K > 1: Endprodukte überwiegen K § 1: Ausgangsstoffe und Endprodukte in gleichen Mengen K < 1: Ausgangsstoffe überwiegen Die Reaktionsgeschwindigkeit ist abhängig von der Konzentration der Reaktionspartner, von der Reaktionstemperatur, der Struktur und dem Verteilungszustand der Stoffe. In der histologischen Färbung wird der Farbstoff meist im Überschuss angeboten, um eine schnelle Reaktionsgeschwindigkeit zu erreichen. Meist wird nach einer definierten Dauer die Reaktion abgebrochen, wenn das gewünschte Ziel erreicht ist (progressive Färbung). Durch Anheben der Temperatur lässt sich die Geschwindigkeit ebenfalls erhöhen. Eine Änderung der Reaktionsbedingungen kann eine Stabilisierung des Färbeprodukts bewirken (z.B. Bläuen nach Hämatoxylin). Bei einer Überfärbung kann durch Veränderung der Reaktionsbedingungen eine Umkehr der Reaktion erreicht werden (Differenzieren nach regressiver Färbung durch pH-Wert-Verschiebung ins Saure). 1.3. pH-Wert Auch in reinem Wasser läuft ständig die Reaktion von H2O + H2O ļ H3O+ + OH- ab. Diesen Vorgang nennt man Autoprotolyse. Reines Wasser enthält sehr viele Wassermoleküle neben sehr wenigen H3O+- und OH--Ionen. Die Zahl der H3O+-Ionen ist gleich der Zahl der OH--Ionen (=10-7 mol/l). In allen wässrigen Lösungen ist das Produkt aus der Konzentration der Hydroniumund Hydroxidionen konstant (Kw = 10-14). Zufügen einer Säure erhöht die Hydronium-Ionen Konzentration im Wasser. Da jedoch Kw konstant ist, muss die Konzentration der Hydroxid-Ionen entsprechend abnehmen bis das Gleichgewicht wieder erreicht ist. Die Konzentration der HydroniumIonen ist das Maß für den sauren oder basischen Charakter einer Lösung. Zur Vereinfachung der Schreibweise ist der pH-Wert definiert als der negative, dekadische Logarithmus der Hydronium-Ionenkonzentration einer wässrigen Lösung. • saure Lösung pH < 7 • neutrale Lösung pH = 7 • basische Lösung pH > 7

172

Histologische Färbung

Beispiele in der Histotechnik Aqua dest Leitungswasser (Österreich) Alcianblaulösung CAB-Lösung SFOG-Lösung Methenamin-Silberlösung

pH-Wert ca. 7 6,74 – 7,60 2,5 bzw. 1 1,8 1,09 9

Tabelle 12: pH-Beispiele in der Histotechnik Tabelle 13: Je kleiner der pKs-Wert umso stärker ist die Säure

Säure Perchlorsäure Salzsäure Schwefelsäure Permangansäure Salpetersäure Chromsäure Phosphorsäure Ameisensäure Essigsäure Kohlensäure Phenol Ammoniak

pKs-Wert –10 –7 –3 –2,25 –1,3 –0,61 2,1 3,74 4,75 6,5 9,95 23

Wendet man das Massenwirkungsgesetz auf gelöste Säuren und Basen an, kann man Säuren- bzw. Basenkonstanten ableiten, die die Stärke bzw. Schwäche beschreiben. Je stärker eine Säure ist, umso mehr ist sie in positiv geladene H+-Ionen und negativ geladene Restionen dissoziiert (HA ļ H+ + A-). Lösungen verschiedener Salze können sauer, basisch oder neutral reagieren. Diese Reaktion hängt davon ab, ob das Kation oder Anion eine so starke Säure oder Base ist, dass das Autoprotolysegleichgewicht im Wasser verschoben wird. Puffer: Enthält eine wässrige Lösung eine schwache Säure (z.B. Essigsäure) und ihre konjugierte Base (z.B. Natriumacetat) oder eine schwache Base und ihre konjugierte Säure, so ist diese Lösung gegenüber Zugabe von Säuren und Basen ziemlich unempfindlich. Sie besitzt ein Dämpfungsvermögen gegenüber der Zugabe von Säuren und Basen. Der pH-Wert der Färbelösung spielt bei der Färbetechnik eine bedeutende Rolle. Man kann damit die Anfärbbarkeit von Strukturen erhöhen oder unterdrücken, bzw. erst möglich machen (siehe auch: 2.1. Ionenbindung). Weiters werden Säuren unterschiedlicher Stärke als Oxidationsmittel verwendet. 1.4. Salze Bei manchen Färbereaktionen dienen gelöste Salze dazu, sich an die entgegengesetzt geladenen Bindungsstellen am Gewebe zu binden und dadurch die Ladung zu neutralisieren. So wird der Zugang eines gleich-geladenen Farbions ermöglicht, das dann kovalent an das Substrat binden kann (z.B. Kongorotfärbung mittels NaCl in alkoholischer Lösung). 1.5. Fixierung Die Vorbehandlung des Gewebes beeinflusst die Qualität der Anfärbung, da hier unterschiedlich viele Bindungsstellen herausgebildet bzw. belegt werden. So ermöglichen saure, denaturierende Fixantien das Aufbrechen des Chromatins und legen damit Bindungsstellen für den Kernfarbstoff frei. Andererseits kann eine zu lange Vernetzungsfixierung Bindungsstellen für Farbstoffe blockieren. Formalin und Osmiumtetroxid rufen eine stärkere Basophilie, saure Dichromatlösungen eine stärkere Eosi-

Histotechnik

173

nophilie hervor. Die Fixierung mit Glutardialdehyd verursacht ohne Aldehydblockierung eine falsch-positive PAS-Reaktion. Das Fixativ kann die Zusammensetzung des Gewebes beeinflussen, indem es Komponenten herauslöst, die dann nicht mehr dargestellt werden können (Aceton- oder Alkoholfixierung löst Lipide, wässrige Fixantien lösen Glykogen). Andere Reagenzien, wie z.B. Protease, können die Gewebeeigenschaften so verändern, dass es zu einer beschleunigten Anfärbbarkeit bzw. zu einer Veränderung in der Selektivität kommt (Alcianblau färbt dann untypischerweise Kerne an). 1.6. Einbettungsmedium Färbeprotokolle für Paraffinschnitte müssen nicht immer auf Gefrierschnitte oder Kunststoffschnitte passen. Gefrierschnitte zeigen meist eine unregelmäßigere Oberfläche und nehmen Farbstoffe schneller auf, was insbesondere bei Trichromfärbungen zu Überfärbungen führen kann. Die Kunststoffe, die vor der Färbung nicht entfernt werden, nehmen Einfluss auf die Färbereagenzien. Sie unterscheiden sich in ihrer Molekülgröße und ihrer Affinität gegenüber den üblichen Lösungsmitteln. Kunststoff kann Farbstoffe abschirmen oder zu sehr anziehen, was zu schwachen Ergebnissen bzw. zu Hintergrundfärbungen führt. Unregelmäßigkeiten der Färbung sind auf unterschiedliche Durchdringung der Strukturen (lipophile, hydrophile, dichte, lockere Strukturen) zurückzuführen. 1.7. Physikalische Faktoren •

Die Farbstoffverteilung im Gewebe wird durch die Dichte der Strukturen beeinflusst.

•

Ist die Löslichkeit eines Farbstoffes im Substrat höher als in der angebotenen Verdünnungslösung, diffundiert er zur niedrigeren Konzentration (Fettfärbung).

•

Die unterschiedliche Diffusibilität zweier oder mehrerer Farbstoffe kann ausgenützt werden. Ein Farbstoff kommt vor bzw. nach dem anderen Farbstoff zu den elektrostatischen Bindungsstellen (feindisperse/grobdisperse Farbstoffe). Das geschieht zeitabhängig. Nach zu langer Färbezeit kommt es zu einer Vermischung (Trichromfärbungen).

•

Dünne Gewebeschnitte färben sich schneller an als dicke.

•

Proben mit unregelmäßiger Oberfläche färben sich schneller an als glatte. (GefrierschnittÆParaffinschnittÆKunststoffschnitt)

•

Verteilte Zellen (Imprints, Ausstriche) färben sich schneller an als Schnitte

•

„Angeschnittene“ Zellstrukturen sind für die Farbstoffe leichter zu erreichen als intakte (große / kleine Zellgranula).

•

Schwellung von Gewebestrukturen kann eine Beschleunigung der Anfärbbarkeit bewirken. Z.B.: wässrige Lösungen führen zum Anschwellen von schleim- und glykosaminglycanreichen Strukturen; extreme pH-Werte führen zum Anschwellen von Kollagen.

1.8. Lösungsmittel Die Farbstoffe werden dem Substrat meist in wässriger oder alkoholischer Lösung angeboten, wobei das Lösungsmittel selbst Einfluss auf den Färbeprozess haben kann.

174

Histologische Färbung

Wasser ist ein Lösungsmittel von sehr hoher Polarität aufgrund des Dipolverhaltens der einzelnen Moleküle. Durch Zugabe von weniger-polaren Lösungsmittel, wie z.B. Ethanol, kann das Ausmaß der Polarität reguliert werden. Unpolare Lösungsmittel (Xylol) werden meist zum Abstoppen des Färbeprozesses und Bewahrung des Ergebnisses verwendet. •

Wasser:

hoch polar, die Moleküle lagern sich mit dem positiven Dipol an negativ geladene Ionen und mit dem negativen Dipol an positiv geladene Ionen an und erleichtern so die Lösung.

•

Ethanol:

ist nach Wasser das meist gebräuchlichste Lösungsmittel. Es ist weniger polar als Wasser. Elektrostatische Bindungsreaktionen in alkoholischer Lösung verlaufen oft langsamer und die Farben bleiben blasser.

•

Mischung: Durch bestimmte Mischungsverhältnisse können die Farbstoffeigenschaften in eine gewünschte Richtung verändert werden. Eine Verringerung der Polarität des Lösungsmittels kann die ionische Bindung unterdrücken und die Dipol-Dipol-Reaktion hervorheben (z.B. Kongorot in alkoholischer Lösung).

1.9. Differenzierung Unter Differenzierung versteht man das Entfernen von überschüssigem Farbstoff aus dem Gewebe. Dabei wird von bestimmten Strukturen erwartet, dass sie den Farbstoff besser zurückhalten als andere. Differenzieren ist im Prinzip ein Entfärben, aber mit selektivem Ergebnis. Das Herauslösen des Farbstoffes ist natürlicherweise mit der Stärke der Bindung und diese mit dem optimalen Reaktionsmilieu verknüpft. Durch Veränderung der Reaktionsbedingungen, wie z.B. Polarität der Lösung, Konzentration der Reaktionspartner, Veränderung des pH-Wertes, wird die Bindungskraft beeinflusst. Abgebrochen wird die Differenzierung durch Entfernen des differenzierenden Faktors. Differenzierungsmittel: •

Lösungsmittel des Farbstoffes: Wasser (Aqua dest., Leitungswasser), verdünntes Ethanol;

•

verdünnte Säuren: z.B. 1% HCl in 70% Ethanol für regressive Hämalaunfärbungen. Die Säuren konkurrieren mit den Farbstoffen um die Bindungsstellen am Gewebe. Meist verwendete Art der Differenzierung. Die pH-Wertverschiebung verändert das Bindungsverhalten.

•

verdünnte Basen: Die Basen konkurrieren mit den Farbstoffen um die Bindungsstellen am Gewebe. Die pH-Wertverschiebung verändert das Bindungsverhalten.

•

Beize: Es entsteht ein Wettkampf zwischen ungebundener und an Farbstoff gebundener Beize um die Bindungsstellen am Gewebe. Ausschlaggebend ist dabei das Mengenverhältnis zwischen Farbstoff und Beize. (Bsp.: Heidenhain’s Eisenhämatoxylin)

•

Oxidationsmittel: Farbstoffe werden durch Oxidation gebleicht. Wird selten angewendet.

•

andere Farbstoffe: Ähnlich agierende Farbstoffe konkurrieren um die Bindungsstellen am Gewebe. Findet Anwendung bei succedanen Trichromfärbungen.

175

Histotechnik

1.10. „Fang“-Reagenzien Trapping-Reagenzien benötigt man, um das Herauslösen des Farbstoffes vom Gewebe zu verhindern. Der Lösungsvorgang wird dabei nicht ganz gestoppt, sondern soweit verlangsamt, dass in bestimmten Strukturen die Färbung erhalten bleibt und nur der Hintergrund entfärbt wird. Damit kommt es zu einer Kontrastverstärkung. Trapping-Reagenzien werden oft mit „Beizen“ verwechselt. Ihre Funktion ist aber verschieden. Tabelle 14 Trapping Reagens

Beize

gewöhnlich kein Metall

mind. zweiwertiges Metall

kein bestimmter Reaktionstyp

Komplexbildung

gewöhnlich mit basischen Farbstoffen verwendet

mit speziellen sauren Farbstoffen verwendet

wird für den Färbevorgang nicht benötigt

Färbung ist ohne Beize nicht möglich

gewöhnlich nach der Färbung verwendet

gewöhnlich vor der Färbung verwendet

verhindert das Herauslösen des Farbstoffes

kann zum Herauslösen des Farbstoffes eingesetzt werden

Das am meisten verbreitete Beispiel für ein Trapping-Reagens ist Jod bei der Gramfärbung. Das Reagens bildet eine unlösliche Verbindung mit dem Farbstoff (hier Kristallviolett), die innerhalb einer Struktur präzipitiert. Weiters wird ein Lösungsmittel aufgebracht, in dem der präzipitierte Farbstoff löslich ist. Der Farbstoff wird aus der darzustellenden Struktur schwerer herausgelöst als aus anderen. Der Grund dafür wird noch diskutiert. 1.11. Löslichkeit der Farbstoffe Um die Anfärbung an der gewünschten Stelle im Gewebe zu bewahren, muss man über die Wirkung der nachfolgenden Reagenzien Bescheid wissen. •

Manche Färbeprodukte wie „Berliner-Blau“ oder metallisches Silber sind praktisch unlöslich in den üblichen Lösungsmitteln.

•

Azofarbstoffe und Formazane sind in Wasser wenig aber in organischen Lösungsmitteln sehr löslich und sollten deshalb mit einem wässrigen Eindeckmedium eingedeckt werden.

•

Metallkomplexfarbstoffe (Hämalaune) werden durch die üblichen Lösungsmittel kaum beeinflusst.

•

Dies gilt jedoch nicht für andere basische Farbstoffe (Kristallviolett, Methylenblau), die in verdünnten Alkoholen differenziert werden können.

•

Saure Farbstoffe (Eosin Y, Orange G) sind wenig löslich in Alkohol, wie auch wasserlösliche, basische Farbstoffe (Alcianblau).

•

Fettfärbungen (Sudan) haben eine große Affinität zu organischen Lösungsmittel und dürfen auch nur wässrig eingedeckt werden.

•

Mit basischen Farbstoffen angefärbte Schnitte müssen deshalb schnell dehydriert werden. Saure Farbstoffe sind hier weniger empfindlich. Üblicherweise werden Schnitte, die basische und saure Farbstoffe enthalten, mit nicht-wässrigen Eindeckmedium eingedeckt, um die Farbe zu erhalten.

176

Histologische Färbung

1.12. Metachromasie Unter Metachromasie versteht man das Erscheinen der angefärbten Struktur in einer anderen Farbe als die der Farblösung. Man nimmt an, dass dies auf die Aggregation der Farbmoleküle am Substrat zu größeren Komplexen zurückzuführen ist. Diese tritt besonders bei hochkonzentrierten, großmolekularen Farbstoffen auf. Die Aggregate zeigen andere Absorbtionseigenschaften, als der Farbstoff in Lösung. Ein typisches Beispiel hiefür ist die Romanovsky-Giemsa Färbung. Orthochromasie nennt man die farbgleiche Anfärbung. 2.

Einteilung der Färbereaktion nach Bindungstyp

Wie weiter oben schon erwähnt, können die einzelnen Bindungstypen nicht isoliert gesehen werden. Bei der Farbstoffbindung treten alle Bindungstypen zu unterschiedlichen Anteilen auf. 2.1. Ionenbindung - Elektroadsorbtion Die Reaktionspartner in der Histotechnik sind die Farbstoffmoleküle mit sauren oder basischen Gruppen einerseits und die Gewebebestandteile, hauptsächlich Proteine bzw. Aminosäuren, die ebenfalls saure und basische Gruppen beinhalten, andererseits. Je nach auxochromer Gruppe unterscheidet man saure (anionische, „minus“) und basische (kationische, „plus“) Farbstoffe. sauer: Phenol, Carbonsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure (mit ansteigender Stärke). basisch: Aminogruppe Abb.111 amphotere Aminosäure

Die Aminosäuren verhalten sich amphoter. Das heißt: sie zeigen sich je nach pH-Wert der Lösung als Anionen oder Kationen. (Abb.111) Niedriger pH-Wert bedeutet hohe Hydronium-Ionenkonzentration und damit Unterdrückung der Säuredissoziation, um das Reaktionsgleichgewicht wieder herzustellen. Die Aminosäure ist positiv geladen. Ein hoher pH-Wert bedeutet eine niedrige Hydronium-Ionenkonzentration und damit eine Verstärkung der Dissoziation. Die Aminosäure ist negativ geladen. Bei einem bestimmten pH-Wert heben sich Säure- und Basenwirkung auf. Bei diesem isoelektrischen Punkt verhalten sich Aminosäuren neutral. (Abb.112-113) Wo der isoelektrische Punkt liegt, ist je nach Aminosäure bzw. Protein unterschiedlich und liegt für Plasmastrukturen höher als für Kernstrukturen. Der Grund liegt in der unterschiedlichen Säurestärke von Carbonsäure und Phosphorsäure als Bestandteil von DNA und RNA. Die Dissoziation von schwächeren Säuren wird durch Zugabe von Hydronium-Ionen leichter unterdrückt. So kommt es in einem bestimmten Milieu zu einer elektrostatischen Anziehung zwischen negativ geladenen Zellproteinen und positiv geladenen Farbstoffen und umgekehrt.

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Histotechnik

In sehr saurer Lösung sind Kernproteine und Plasmaproteine beide positiv geladen, da hier auch die Dissoziation der Phosphorsäure unterdrückt wird. Bei sehr niedrigem pH-Wert sind nur mehr Strukturen, die Sulfatgruppen enthalten (z.B. Proteoglykane) als Anionen vorhanden und können durch kationische Farbstoffe gezielt gefärbt werden (Alcianblau). In alkalischer Lösung sind beide Gruppen negativ geladen. Bei pH 4,5–6 sind die Kerne negativ und das Plasma positiv geladen. Bei diesem pH-Wert gilt: Das Zytoplasma ist acidophil. Der Zellkern ist basophil. Ribosomen im Zytoplasma sind aufgrund ihres Gehalts an RNS auch basophil. Aufgrund dieses Verhaltens kann man hier die Kerne elektiv anfärben. basophil“ und „aciDie Begriffe „b dophil“ sind relative Bezeichnungen Abb.112–113 isoelektrischer Punkt und sind vom pH-Wert abhängig. Eine basophile Struktur reagiert bevorzugt mit basischen Farbstoffen, eine acidophile Struktur bevorzugt mit sauren Farbstoffen. Man kann die Basophilie bestimmter Strukturen unter Berücksichtigung der Reaktionsbedingungen durch eine Versuchsreihe definieren. Tabelle 15 pH-Werte - Gewebereaktion ProteoKern Plasma glycane stark sauer 1–2

2,5–3

positiv

RNA, DNA negativ

positiv

positiv

negativ

negativ

Farbstoff kationisch/basisch zur Darstellung von sulfatierten Kohlenhydraten

Wirkung • •

erhöhte Ionisation der Aminogruppen Unterdrückung der SäurenDissoziation mit Ausnahme der Sulfatgruppen

• •

erhöhte Ionisation der Aminogruppen Unterdrückung der SäurenDissoziation mit Ausnahme der Sulfatgruppen und Phosphatgruppen von DNA und RNA Säurewirkung der anionischen Farbstoffe wird unterdrückt

kationisch/basisch zur Darstellung des Kernchromatins • •

4–-6

>6

negativ

negativ

positiv

negativ

negativ

negativ

anionischer/saurer Plasmafarbstoff kationischer/bas. Kernfarbstoff

kationische/bas. Farbstoffe färben alles an

• • • • •

erhöhte Ionisation der Aminogruppen, Unterdrückung der SäurenDissoziation von schwachen Säuren, Carboxylgruppen dissoziieren Idealer Bereich für Übersichtsfärbungen erhöhte Ionisation der Carboxylgruppen verstärkte Säuren-Dissoziation

178

Histologische Färbung

Die meisten anionischen und kationischen Farbstoffe werden in saurer Lösung verwendet. Durch die erhöhte Konzentration an Hydronium-Ionen wird die Ionisierung der basischen Auxochrome verstärkt und die Dissoziation der sauren Auxochrome unterdrückt. Entsprechend dem Verhalten der Reaktionspartner kann man die Stärke der Anfärbung durch Zugabe von Säure (meist als Essigsäure) beeinflusst werden. Z.B. kann man die Anfärbung des Plasmas durch einen sauren Farbstoff mittels Säurezugabe verstärken, weil damit eine erhöhte Ionisation der Gewebe-Aminogruppen erreicht wird (Eosin mit wenigen Tropfen Eisessig). Eine Erhöhung des pH-Wertes wird meist durch Zugabe von Natriumtetraborat (= Borax) bzw. Natriumcarbonat durchgeführt. Verstärkung der Färbewirkung: z.B. Zugabe von Essigsäure beim Einsatz von sauren Farbstoffen bei der Masson Trichrom-Färbung Zugabe von Borax zu Methylenblau als basischer Farbstoff. Abschwächung der Färbewirkung: z.B. Zugabe einer kleinen Menge Essigsäure zu Neutralrot, um ungewollte Hintergrundfärbung zu vermeiden. 2.2. Kovalente Bindung - Indirekte Färbung (Beizenfarbstoffe) Die Reaktionspartner sind hier wiederum die Gewebebestandteile einerseits und die Farbstoffe andererseits, wobei hier die Bindung erst durch die Einwirkung von „Beizen“ ermöglicht wird. Als Beizen werden meist Salzlösungen von Aluminium, Chrom, Eisen, Molybdän oder ähnlichen Komplexbildnern verwendet. Diese Ionen bilden mit den Farbstoffmolekülen C helatverbindungen, indem sie sich an eine Hydroxylgruppe, die einem Elektronendonator (z.B. Ketogruppe) benachbart ist, anstelle des Wasserstoffes anlagern. Die Bindung der Metallionen an das Substrat dürfte im wesentlichen Phosphat- und Carboxylpositionen betreffen und ebenso Chelatbildung als Grundlage haben. Bei höherer Wertigkeit des Metallions können auch Multichelatkomplexe entstehen, was aufgrund der Molekülgröße Einfluss auf die Färbeeigenschaften hat. Ein Beizmittel kann definiert werden als polyvalentes Metallion, das Komplexe mit bestimmten Farbstoffen bildet. Diese Komplexverbindung bezeichnet man als Lack. Lacke wirken stets als basische Farbstoffe und werden hauptsächlich als Kernfarbstoffe eingesetzt. Beispiele:

Hämalaun (Mayer’s, Gill’s, Harris’ Hämatoxylin), Eisenhämatoxylin (Weigert, Heidenhain), Kernechtrot-Alaun

Da die Lacke positiv geladen sind, nimmt man eine Bindung vor allem an die negativ geladenen Kernsäuren an. Jedoch wurde auch nach DNA-Extraktion eine Farbstoffbindung an Kernstrukturen festgestellt, was auf kovalente Bindungen an die Kernhistone schließen lässt und die größere Komplexität dieses Reaktionstyps zeigt. Dem Substrat können Beize und Farbstoff in verschiedener Weise angeboten werden.

179

Histotechnik

1.

zuerst Beize - dann Farbstoff (z.B. Heidenhain’s Eisenhämatoxylin)

2.

zuerst Farbstoff - dann Beize (sehr selten)

3.

Beize und Farbstoff gemeinsam als Lack (z.B. Hämalaun)

zweizeitige Methode

einzeitige Methode

Bei einem gleichzeitigen Anbieten von Beize und Farbstoff in einer Lösung ist das Mischungsverhältnis ausschlaggebend. Die Beize fungiert im Überschuss als eigene Differenzierung. Bei richtigem Mischungsverhältnis ist es möglich, die Hintergrundfärbung und das Überfärben zu verhindern. Tabelle 16 Häufige Chelat-Strukturen (www.stainsfile.info/StainsFile/javaindex.html) Struktur Chelatverbindung Struktur Chelatverbindung

D. Vorbehandlung 1.

Formalin-fixiertes-Paraffin-eingebettetes Gewebe (FFPE)

Die meisten Farbstoffe werden in wässriger oder alkoholischer Lösung aufgebracht. Das hydrophobe und alkoholunlösliche Paraffin verhindert bzw. erschwert den Zugang der Farbstoffe zum Gewebe. Es muss daher vor der Färbung entfernt (= Entparaffinieren) und der Schnitt in ein wässriges Medium gebracht werden (= Rehydrieren). Entparaffiniert wird in Reagenzien, die auch als Intermedien beim Einbettungsprozess verwendet werden (z.B. Xylol, Xylolersatzmittel = Clearing-Reagenzien). In der Routinehistologie werden die warmen Objektträger direkt aus dem 56–60°C Brutschrank, wo die Schnitte antrockneten und das Paraffin verflüssigt wurde, in die Lösung eingestellt und gleichmäßig bewegt. Ist das Paraffin nicht vollständig herausgelöst, wird die Färbung fleckig. Das lange Verbleiben in der Entparaffinierungslösung wirkt sich dagegen nicht negativ auf das Gewebe aus. Rehydriert wird gleich anschließend in der absteigenden Alkoholreihe bis zum Aqua dest. Diese Schritte können auch automatisiert ablaufen.

180

Histologische Färbung

Der entparaffinierte und rehydrierte Schnitt kann nun der histologischen Färbung zugeführt werden. Im Allgemeinen verläuft eine histologische Färbung im Histodiagnostiklabor so: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Antrocknen der Schnitte im 56–60°C (Umluft-)Brutschrank 25–30 min Entparaffinieren in Clearingreagens (Xylol 3 x 5 min) Rehydrieren in absteigender Alkoholreihe (100–96–70–50% Alk.) je 1–2 min bis Aqua dest. Einwirkung der Färbereagenzien nach bestimmtem Rezept Dehydrieren in aufsteigender Alkoholreihe (96–100% Alk.) je 1–2 min bis Alk.abs. Klären in Clearingreagens (Xylol) Eindecken mit Eindeckmedium und Deckgläschen

Bei Gefrierschnitten entfallen Punkt 1 bis 3. Bei bestimmten Färbesubstraten bzw. Färbeprodukten, die in organischen Lösungsmitteln löslich sind, entfallen Punkt 5 und 6. 2.

Andere Vorbehandlungen

Wird anstelle der üblichen Fixierung mit neutral gepuffertem Formalin ein anderes Mittel verwendet, muss man die erforderlichen Vorbehandlungen durchführen, um etwaige Beeinflussungen der Färbung zu vermeiden. •

Entfernung von Quecksilberpräzipitaten nach quecksilberhältigen Fixantien durch eine alkoholische Jodlösung und nachfolgendem Natriumthiosulfat

•

Entfernung von Pikrinsäure durch 0,2% Lithiumcarbonatlösung

•

Entfernung von „Formalin-Pigment“ durch eine gesättigte alkoholische Pikrinsäurelösung

•

Entfernung von Osmiumdioxid durch 1–2% Wasserstoffperoxid

•

Blockieren von freien Aldehydgruppen nach Glutaraldehydfixierung durch eine Natrium-Borhydrid-Lösung

Für die Behandlung vor dem Färben ist natürlich auch das Einbettmedium ausschlaggebend (siehe Kapitel Einbettungsprozess). Manche Medien müssen vor der Färbung nicht entfernt werden (z.B. Gelatine, verschiedene Kunststofftypen), sofern sie die Farbstoffe ins Gewebe eindringen lassen. Für andere muss man das entsprechende Lösungsmittel einsetzen, um den Zugang der Farbstoffe zu ermöglichen (z.B. Celloidin – 96% Alkohol, Ether/Alkohol; Polyesterwachs – Alk. abs.; manche Kunststoffe mit Xylol).

E. Färbeprotokolle 1.

Allgemeines

Dieses Buch stellt nicht den Anspruch, ein vollständiges Nachschlagewerk für alle Färbemethoden zu sein. Ich möchte nur einige wenige Methoden des Routinebetriebes im Prinzip vorstellen. Dazu gehört die Hämatoxylin-Eosin-Färbung als Routinebzw. Übersichtsfärbung und oft verwendete Spezialfärbungen zur Darstellung von bestimmten Gewebestrukturen.

Histotechnik

181

Die einzelnen Protokolle variieren von Anwender zu Anwender. Sei es aufgrund unterschiedlicher Traditionen oder verschiedener Quellen oder besonderer Vorlieben der Befunder. Es gibt bereits viele Sammlungen von histologischen Techniken. Die neueren sind allerdings in englischer Sprache. Auch das Internet bietet einige Websites, wo man sich einerseits Protokolle, andererseits Abbildungen und histologische Schulungen ansehen kann. Aus diesem Grund beschränke ich mich hier bei den Ausführungen über Spezialfärbungen auf Prinzip und Färbeergebnis und verweise bzgl. Protokolle auf die oben erwähnte Literatur. Außerdem bietet die Forschung natürlich ein weites Feld für histologische Anwendungen, wo zur Darstellung von ganz bestimmten Strukturen oder Substanzen ein weitaus größerer Aufwand betrieben wird. Die meisten Färbeprotokolle beinhalten den Entparaffinierungs- und Rehydrierungsschritt als gemeinsamen Beginn und beschreiben dann die Abfolge der Behandlung mittels Farbstoffen und Lösungen (Dauer, Temperatur etc.) und enden wiederum mit der Dehydrierung, Klären und dem Eindecken. 2.

Begriffe

Übersichtsfärbungen werden, wie der Name sagt, durchgeführt, um einen Überblick über das gesamte Gewebe, die Strukturen, die Zellverteilung, die Kern-PlasmaRelationen, die Anfärbbarkeit zu erhalten. Sie bestehen aus Kernfärbung und Plasmafärbung. Spezialfärbungen werden zur Darstellung und Identifikation bestimmter Strukturen durchgeführt. Sie bestehen aus Substratfärbung und Gegenfärbung. Die Gegenfärbung kann eine Kernfärbung oder eine allgemeine Hintergrundfärbung sein und erhöht den Kontrast. Der Farbstoff kann regressiv oder progressiv aufgebracht werden. Unter regressiver Färbung versteht man die Überfärbung der Strukturen durch einen Farbstoff im Überschuss und die nachfolgende Differenzierung. Dabei wird der überschüssige Farbstoff bis zum gewünschten Ergebnis wieder herausgelöst. Unter progressiver Färbung versteht man das Einwirken des Farbstoffes über eine bestimmte Dauer bis die gewünschte Intensität erreicht ist. Dazu verwendet man verdünnte Farbstofflösungen. Die Dauer wird empirisch ermittelt. Ist bei einem Farbstoff eine Überfärbung fast nicht möglich aufgrund seiner Spezifität, sodass sich das Färbeergebnis nach einer gewissen Zeit kaum mehr ändert, spricht man von E ndpunktfärbung. Werden verschiedene Farbstoffe gleichzeitig angeboten, spricht man von Simultanfärbung. Werden sie hintereinander angeboten, nennt man es Succedanfärbung. Dies sind Begriffe, die besonders bei Trichromfärbungen vorkommen. Erfolgt die Bindung des Farbstoffes ohne Zusätze (Beize) an das Substrat, spricht man von direkter oder substantiver Färbung. Erfolgt die Bindung des Farbstoffes mit Hilfe von Zusätzen, die gleichzeitig oder nacheinander aufgebracht werden, spricht man von einzeitiger bzw. zweizeitiger, indirekter (adjektiver) Färbung.

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Histologische Färbung

Eine besondere Form der Färbung ist die Imprägnation, wo sich Metallionen an das Substrat anlagern (Silber-, Gold-Färbungen). Um das Färbeergebnis haltbar zu machen, schließt man hier eine Fixierung (Natriumthiosulfat) an. 3.

Laborausstattung

Für die praktische Durchführung der Färbungen werden verschiedene Gerätschaften benötigt. Arbeitsplatz:

Digestorium (Abzug), Färbewanne, Handschuhe

Geräte:

Analysenwaage, Magnetrührer, Heizplatte, Brutschrank (60°C), Brutschrank oder Wasserbad (37°C), Kühlschrank (2–8°C) Kurzzeitmesser (mech., digital), (Kolbenhub-)pipetten

Laborgeschirr:

aus hitzebeständigem Glas Glasküvetten in unterschiedlicher Größe (Färbetröge) Messzylinder, Kolben, Trichter Pinzetten, Glasstäbe Objektträgerkörbe

Verbrauchsgüter:

Einmalpipetten aus Kunststoff, Filterpapier unterschiedlichen Grades, Tropfpipetten

zur Reagenzienaufbewahrung: Giftschränke für organische und anorganische Reagenzien Kühlschrank, Gefrierschrank (–20°C) Automation:

4.

manche Laboratorien sind mit Färbeautomaten für die HE- und auch für Spezialfärbungen ausgestattet, Eindeckautomat für Glasdeckgläschen oder Kunststofffilm

Hinweise für die Praxis

Die Schnitte für die Spezialfärbungen sollten möglichst zur gleichen Zeit vorbereitet, getrocknet, entparaffiniert und rehydriert werden. Somit kann man alle Färbungen zur selben Zeit starten und der Ablauf ist leichter zu organisieren. Als nächster Schritt werden die Objektträger je nach Färbung sortiert (erkennbar an der Beschriftung), um einen Überblick zu erhalten. Ein/e erfahrene/r Biomed. AnalytikerIn kennt die meisten gebräuchlichen Färberezepte meist auswendig und benötigt schriftliche Unterlagen nur mehr als Kontrolle. Ist man noch nicht so versiert, sollte man das Färbeprotokoll zuerst Punkt für Punkt durchgehen, um keine Überraschungen zu erleben, falls dort und da ein Reagens fehlt. Der/die HistotechnikerIn muss entsprechend der Anleitung die Reagenzien zur rechten Zeit vorbereiten. In einem gut organisierten Labor sollte es nicht dazu kommen, dass man mitten im Rezept vor einer leeren Färbeflasche steht und auf einmal mit dem „Kochen“ anfangen muss. Reagenzien, die zur Neige gehen, müssen rechtzeitig wieder erneuert werden. Sinnvollerweise startet man bei jenem Färbeprotokoll, das mit dem längsten Inkubationsschritt beginnt (usw.). Diese Objektträger sind dann für eine Weile versorgt und man hat Zeit sich den Färbungen mit den kürzeren Intervallen zu widmen. Oft sind die Färbungen mit langen Inkubationszeiten auch jene, die am längsten dauern. Beginnt man mit diesen, wird die Gesamtarbeitszeit für die Spezialfärbungen verkürzt.

Histotechnik

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Obwohl das Protokoll natürlich streng einzuhalten wäre, ist das in der Praxis manchmal nicht ganz zu schaffen. Hier ist es wichtig, jene Punkte in der Färbevorschrift zu kennen, die eine Verlängerung verzeihen (z.B. Bläuschritte nach Hämatoxylin, Spülschritte in Aqua dest.). Andererseits kennt der erfahrene Färber auch die heiklen Stellen (Differenzierungen, Versilberungen, Entfärbung durch zu langes Spülen bspw. bei Methylenblau). Für Inkubationszeiten gilt grundsätzlich, dass die Verzögerung in Relation zur Gesamtzeit zu sehen ist. Bei 60 min und mehr Inkubationszeit ist eine Minute mehr oder weniger nicht Ausschlag gebend. Jedoch ist eine Minute bei 10 minütiger Färbedauer schon eine Überschreitung um 10 Prozent. Also: je kürzer die Dauer, umso genauer ist sie einzuhalten! Dem trägt auch die Verwendung von Digital-Kurzzeitmessern für Zeiten unter drei Minuten Rechnung. Für längere Zeiten sind die üblichen „Eieruhren“ ausreichend. Farbstoffe können durch Einstellen der Objektträger in eine Küvette bzw. durch Aufgießen auf einer Färbebrücke aufgebracht werden. Das Aufgießen ist sparsamer und eignet sich für kleinere Mengen. Pro Objektträger rechnet man ca. 6 ml Reagens. Der Objektträger muss komplett mit einer „Flüssigkeitshaube“ bedeckt sein (waagrecht hinlegen, nicht anstoßen!). Vorsichtig muss man mit Flüssigkeiten sein, die stark zum Verdunsten neigen (acetonhältige Sudanlösung). Hier kann es leicht zu Niederschlägen oder Trocknungsrändern kommen. Stellt man die Objektträger aus einer Spülflüssigkeit heraus in das Färbereagens ein, soll man darauf achten, abfließende Flüssigkeit am Küvettenrand gut abtropfen zu lassen, um ein „Verwässern“ der Farblösung zu vermeiden. Besonders wenn diese über einen längeren Zeitraum verwendet wird. Will man bei der Färberei Laborgeschirr sparen, kann man Küvetten für Spülschritte wieder verwenden. Man muss aber wissen, was drin war (Leitungswasser – Aqua dest. – Alkohol), und wie empfindlich die Färbung darauf reagiert. Für Versilberungen sind bspw. Spuren von Leitungswasser schädlich, wenn sie in Kontakt mit der Silberlösung kommen. In der Praxis hat sich gezeigt, dass die rehydrierten Schnitte das trockene Stehen über Nacht bei Raumtemperatur ganz gut tolerieren, falls die Färbung erst am nächsten Tag erfolgt. Es gibt aber auch die Ansicht, dass rehydrierte Schnitte keinesfalls mehr austrocknen dürfen und höchstens in Aqua dest. übernachten können.

F. Übersichtsfärbung: Hämatoxylin – Eosin – Färbung Das Ziel der Routinefärbung ist die gut reproduzierbare Herstellung von Äquivalentbildern von histologischem Gewebe. Die Methode soll möglichst unempfindlich sein gegenüber Schwankungen bei der Vorbehandlung des Gewebes. Der Aufwand der Färbetechnik soll möglichst gering sein und auch wirtschaftlich und umweltpolitisch vertretbar sein. Hier hat sich die Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE) an formalin-fixiertem Gewebe weltweit durchgesetzt. Üblicherweise wird täglich eine große Anzahl an HE-Färbungen je nach eingelangter Probenmenge durchgeführt. In den letzten Jahren wurde hier die händische Färbung immer mehr durch die Automation verdrängt. So lassen sich die großen Mengen effektiv bewältigen und gleichzeitig kann man ein möglichst einheitliches Ergebnis er-

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Histologische Färbung

halten. Zur Kontrolle der Qualität müssen regelmäßige Prüfungen der Färbeergebnisse durchgeführt werden. Dabei berücksichtige man auch den Alterungsprozess der Farblösungen und die Variationen bei der Herstellung. Übersichtsfärbungen werden, wie der Name sagt, durchgeführt, um einen Überblick über das gesamte Gewebe, die Strukturen, die Zellverteilung, die Kern-PlasmaRelationen, die Anfärbbarkeit zu erhalten. Mit Hilfe dieser Färbung sollte am Großteil der Fälle bereits eine Diagnose erstellt werden können. Die Übersichtsfärbungen bestehen aus K ernfärbung und Plasmafärbung. Dazu setzt man möglichst kontrastreiche Farbstoffe ein. 1.

Farbstoffe–Färbeprinzip

1.1. Hämatoxylin Hämatoxylin wird in verschiedenen Rezepturen und zu unterschiedlichen Zwecken angewandt. Die Hauptanwendung liegt aber in der Kernfärbung als Bestandteil der Hämatoxylin-Eosin-Färbung und mehrerer Spezialfärbungen. Gewonnen wird der Naturfarbstoff Hämatoxylin aus Blauholz (Mittelamerika, Westindien). Der wirksame Farbstoff ist allerdings nicht das Hämatoxylin selbst, sondern sein Oxidationsprodukt Hämatein. Man müsste eigentlich von Hämatein-Färbung sprechen, das hat sich aber nicht verbreitet. Die Oxidation (R Reifung) von Hämatoxylin zum leicht sauren Farbstoff Hämatein geschieht durch den Luftsauerstoff im Verlauf einiger Wochen oder unmittelbar durch Einsatz von Oxidanzien (kkünstliche Reifung). Man verwendet dazu z.B. Kaliumjodat oder Quecksilberoxid. Durch weitere, zu lange, Reifung wird der Farbstoff wieder gebleicht, die Farblösung wird schwächer. Die Hämateinlösung ist gelbbraun gefärbt und für die histologische Technik ohne Nutzen, weil der Farbstoff schlecht an Gewebekomponenten bindet. Durch Zusatz Beize) kommt es zu Komplexbindungen von Hämatein und verschiedener Alaunsalze (B Metallion. Es entstehen gut färbende Hämatoxylinlacke (Hämateinlacke). Die Zugabe von Säure (Zitronensäure, Essigsäure) bestimmt den pH-Wert der Farblösung und die Zugabe von Chloralhydrat, Glycerol oder Ethylenglycol wirkt als Stabilisator, um ein Überoxidieren und eine Bakterienbesiedelung zu verhindern. Die Lacke sind stark positiv geladen und eignen sich zur progressiven bzw. regressiven Anfärbung der Zellkerne (negativ geladenes Kernchromatin). 1.1.1. Hämalaune Hämatoxylinlacke des Aluminiums, die mit Alaunen (Kalialaun) gebildet werden, nennt man Hämalaune (Mayer’s, Harris’, Gill’s, Ehrlich’s, Cole’s, Delafield’s) und eignen sich zur Kernfärbung bei der Hämatoxylin-Eosin-Färbung. Ehrlich’s und Delafield’s Hämatoxyline sind Beispiele für die natürliche Reifung von Hämatein durch den Luftsauerstoff. Die natürlich gereiften Farblösungen zeigen oft eine längere Haltbarkeit und Stabilität der Qualität. Die künstlich gereiften sind dagegen sofort verwendbar. Beim Stehen der fertigen Farblösung an der Luft oxidiert der Farbstoff weiter. Als sichtbares Zeichen entsteht ein Film an der Oberfläche, der durch filtrieren wieder

Histotechnik

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entfernt werden kann, wobei der Lösung aber Farbstoff entzogen und sie dadurch schwächer wird. Die Farbe des Lackes ist pH-abhängig. Unter pH 3 erscheinen die Lösungen rotbraun. Bei höheren Werten tritt die bekannte, charakteristische blaue Farbe auf. Man färbt in saurer Lösung und führt dann den Hämatoxylinlack durch Spülen in Leitungswasser oder schwachen Basen in seine blaue Form über (B Bläuen). Dies bedeutet zugleich eine Fixierung der Färbung, da die Hämatoxylinlacke bei höherem pH schlecht löslich sind. Differenziert wird die Färbung in sauren Lösungen (2% Essigsäure, 0,1–0,25% HCl). Die Empfindlichkeit der Hämalaune auf Säuren macht sie für manche Spezialfärbungen mit stark sauren Farblösungen unbrauchbar. Hier greift man auf das stabilere Eisenhämatoxylin zurück bzw. führt die Coelestinblau-Hämalaun Methode durch. Hämalaune können je nach Färbedauer und Konzentration als p rogressive oder regressive Färbung verwendet werden. Die Reaktionsgeschwindigkeit wird vom Mischungsverhältnis zwischen Farbstoff und Beize beeinflusst. Die Hämalaune zeigen unterschiedliche Mischungsverhältnisse. Gill’s Hämatoxylin wird in einfacher-, doppelter und dreifacher Konzentration angeboten (Gill I,II,III), um dem Rechnung zu tragen. Es zeigt eine höhere Stabilität, aber auch Affinitäten zu Schleim, Gelatineadhäsiven und den Glasobjekträgern im Vergleich zu Mayer’s und Harris’. Gefrierschnitte benötigen im Allgemeinen eine kürzere und Schnitte von entkalktem Gewebe eine verlängerte Einwirkzeit. Mayer’s Hämalaun 1 g ......Hämatoxylin 1 l.........Aqua dest. 0,2 g .......KJO3 (zur künstlichen Reifung, oxidiert Hämatoxylin zu Hämatein) 50 g .......Aluminium-Kaliumsulfat (Beize) kurz erwärmen oder über Nacht bei Raumtemperatur stehen lassen 50 g .......Chloralhydrat (Stabilisator) 1 g .......Citronensäure (zum pH-Wert senken) kurz aufkochen oder über mehrere Tage stehen lassen Färbedauer: 5–10 min (progressiv), 10–20 min (regressiv) für formalinfixiertes, paraffineingebettetes Gewebe Harris’ Hämatoxylin 5 50 100 1 40 2,5

g ......Hämatoxylin ml .....Ethanol abs. (Lösungsmittel) g ......Aluminiumkaliumsulfat (Beize) l ........Aqua dest. ml......Eisessig (pH-Wert-Kontrolle) g ......Quecksilberoxid (Oxidationsmittel) oder 1 g Natriumjodat als Ersatz

Färbedauer: 30–60 sek. (progressiv), 5–15 min (regressiv) für formalinfixiertes, paraffineingebettetes Gewebe

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Histologische Färbung

Farbstoffbindung von Hämalaun: Man nimmt an, dass es zuerst zur Elektroadsorbtion kommt, die dann in eine stabile, kovalente Bindung übergeht (Farbe kann nicht durch einfaches Spülen in Alkohol entfernt werden.). Bindung an DNA: Im stark sauren Milieu wird die Dissoziation der Säuregruppen im Gewebe reduziert. Die K ernsäuren reagieren basophil (negativ geladen) und lassen sich durch das positiv geladene Hämalaun gut anfärben ( basischer Farbstoff in saurer Lösung). Es kommt zu einer koordinativen Bindung des Aluminiums an zwei benachbarte oder auch ein einziges Phosphor-Atom. Der Farbstoff reagiert wahrscheinlich auch mit dem nicht-sauren Anteil des Chromatins (z.B. Argininreste der Histone) direkt durch Hämatein (leicht saurer Farbstoff). Färbeergebnis von Hämalaun: Die Hämalaunfärbung führt in erster Linie zur kontrastreichen Darstellung der Zellkerne in blauem oder violettem Farbton, sie ist im wesentlichen eine Kernfärbung. Daneben färben sich auch Ergastoplasma, Muzin, Bakterien und Kalkeinschlüsse blau. Saure Grundsubstanz und manche Sekretkörnchen färben sich ebenfalls. Bei Verwendung alter (überoxidierter) Färbelösungen kann es zur grauen oder zart graublauen Hintergrundfärbung kommen. 1.1.2. Eisen-Hämatoxylin Hier werden Eisensalze als Beizmittel und gleichzeitig als Oxidationsmittel eingesetzt. Am häufigsten verwendet man Eisenchlorid und Eisenammoniumsulfat. Zu dieser Gruppe gehören Weigert’s, Heidenhain’s, und Verhoeff’s Hämatoxyline. Da die Gefahr der Überoxidation gegeben ist, bereitet man hier Stammlösungen für Farblösung und Beizmittel separat vor und mischt sie kurz vor Gebrauch. Das Beizmittel eignet sich bei Überfärbung auch zur Differenzierung. Weigert’s Hämatoxylin wird vorzugsweise bei Spezialfärbungen angewendet, wo eine Behandlung mit sauren Farblösungen folgt, weil es gegen Entfärbung durch Säuren relativ unempfindlich ist. Das Färbeergebnis sind schwarze Kerne. Bei der Methode für Heidenhain’s Hämatoxylin wird erst die Beizlösung auf die Schnitte gebracht und danach die Farblösung. Das Färbeergebnis sind grau-schwarze Mitochondrien, Muskelfasern, Myelin und Chromatin. Die Empfindlichkeit gegenüber der Entfärbung nimmt von Mitochondrien bis zu Chromatin hin ab, wodurch gezielt bestimmte Strukturen hervorgehoben werden können. Weigert’s Eisenhämatoxylin Hämatoxylinlösung (gelblich) .........................und Eisenbeizelösung (rötlich) ..............................mischen im Verhältnis 1:1 Lösung wird schwarz-violett frisch herstellen, höchstens 5 Tage verwenden (bräunlichÆ verwerfen) Bei einem Mischungsverhältnis 1:2 wird die Anfärbung verlangsamt und man spart den Differenzierungsschritt. Färbedauer: 5–10 min (progressiv), 15–30 min (regressiv)

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Hämatoxylinlösung 10 g .................. Hämatoxylin 1000 ml ................ 96% Alkohol Die Lösung sollte mehrere Wochen natürlich reifen. Eisenbeizelösung 40 ml .................. 29% wässriges Eisen(III)Chlorid 950 ml .................. Aqua dest. 10 ml .................. 25% HCl 1.1.3. Phosphorwolfram-Hämatoxylin: Die einzige, weit verbreitete Anwendung dieser Hämatoxylinform ist jene nach Mallory. Auch hier kann man natürlich (über mehrere Wochen) und künstlich gereifte Lösungen herstellen. Die PTAH-Färbeprozedur selbst beinhaltet die Behandlung mit Dichromat- und Permanganatlösungen und die Hämatoxylineinwirkung über Nacht. Als Ergebnis erhält man eine Anfärbung aller Gewebskomponenten in Schattierungen von zart braun bis dunkelblau. 1.1.4. Geschichte Hämatein wurde 1520 nach der spanischen Invasion in Mexiko nach England gebracht und als direktes Färbemittel verwendet. Mitte 18. bis Mitte 19. Jhd. kam es zur Einführung als biologischer Farbstoff, aber ohne großen Erfolg. Erst Böhmer entdeckte 1865 die gute Färbewirkung nach dem Beizen mit Metallen. Nach dieser Entdeckung begann die schnelle Zunahme der Anwendungen mit verschiedensten Rezepten. Manche sind immer noch in Verwendung. Dazu gehören Hämatoxyline nach Delafield, Ehrlich, Mayer und Harris (Aluminium-Beize), Weigert, Weil, Verhoeff und Heidenhain (Eisen-Beize) und Mallory (Wolfram-Beize). 1.2. Eosin Es gehört zu den Xanthenfarbstoffen und ist chemisch T etrabrom-Fluorescein. Das am meisten verbreitete ist Eosin Y (yellowish), daneben gibt es Eosin S, Eosin B und andere (zu unterscheiden durch CI-Nummer). Es ist ein saurer Farbstoff und in Wasser und Alkohol löslich (Abb.114). Der pH-Wert der Färbelösung liegt zwischen 4–6 und wird mittels Eisessig eingestellt. Der Bindungstyp, der hier zur Anwendung kommt ist die Ionenbindung zwischen dem negativ geladenen, anionischen Farbstoff und den positiv geladenen, kationischen Plasmaproteinen. Elektive Plasmafärbung gibt es dabei nicht; denn auch Bindegewebe und Zwischensubstanz, in manchen Fällen auch Paraplasma werden mitgefärbt. Eosin färbt Cytoplasma, Bindegewebe und Abb.114 Eosin Y Kollagenfasern kräftig rot. Auch Kernstrukturen nehmen den Farbstoff an, wodurch nach vorangegangener Kernfärbung mit Hämalaun das typische rötlich-violette Mischbild entsteht. Der Zusatz von 1 Tropfen Eisessig zur Plasmafärbung erleichtert durch Abbruch des alkalischen Bläuens die Kontrastbildung und verhindert, dass die Lösung nach dem Wässern alkalisch

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Histologische Färbung

bleibt. Die Färbung erfolgt regressiv. Zuerst wird überfärbt und im anschließenden Wasser und auch Alkohol reichlich differenziert. Die Konzentration der Eosin-Gebrauchslösung reicht von 0,5 bis 2%ig und kann in Wasser, aber auch Ethanol angesetzt werden. Größere Kontraste der Zellkomponenten kann man durch eine Mischung von Eosin Y und Phloxin B erreichen. Hier lassen sich Kollagen und Muskel gut unterscheiden. Eosin-Farbpulver, die Natriumsulfat enthalten, eignen sich nicht zur Plasmafärbung und fallen durch Präzipitatbildung in der Lösung auf. 2% wässrige Eosin-Lösung 20 g ..................Eosin Y 1000 ml .................Aqua dest. Vor Gebrauch 1–2 gtt Eisessig pro Färbeküvette zugeben, der pH sollte zw. 4–6 liegen

2.

Protokoll HE-Färbung

Welches der Hämalaune zur Kernfärbung verwendet wird, hängt ab von der Vorliebe des Betrachters. Die Intensität der Eosin-Färbung und ihre Zusammensetzung können ebenso variieren. Das Färbeprotokoll muss entsprechend dem gewünschten Färbeergebnis erstellt werden. Der pH-Wert der Hämalaunlösung liegt bei 3–4, der Farbton erscheint bräunlich-rot. Um die gewünschte Blaufärbung zu erreichen, spült man die Schnitte anschließend an die Färbung am einfachsten in lauwarmem Leitungswasser (pH liegt um 7). Ein Spritzer 1% Lithiumcarbonatlösung zum Leitungswasser erhöht die alkalische Wirkung. Zum Bläuen eignet sich auch die Scott’sche Lösung. Regressiv färbende Hämalaune werden vor dem Bläuen in saurem Wasser (Aqua dest. mit einigen Tropfen Eisessig) differenziert. Eosin wird immer im Überschuss angeboten und im Weiteren durch Wasser bzw. aufsteigende Alkoholreihe differenziert. Beispiel: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

Schnitte entparaffinieren ................................................................. 3 x 5 min hydrieren in absteigender Alkoholreihe bis Aqua dest. ................ je 1–2 min Kernfärbung in Mayer’s Hämatoxylin ................................................... 12 min in Leitungswasser .................................................................................. spülen in lauwarmen Leitungswasser bläuen ................................................... 3 min Plasmafärbung in 2 % wässrigem Eosin Y + 1 gtt Eisessig................... 2 min in Leitungswasser .................................................................................. spülen entwässern in aufsteigender Alkoholreihe..................................... je 1–2 min klären in Xylol eindecken

Um Farbniederschläge zu verhindern kann man nach dem Hämatoxylin in saurem Aqua dest. spülen und dann erst in Leitungswasser.

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Protokoll für Gefrierschnitte: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12.

3.

Gefrierschnitt herstellen sofort in 36% Formol (fixieren) .............................................................. spülen in Aqua dest. ......................................................................................... spülen in Harris’ Hämatoxylin einstellen ........................................................... 1 min in saurem Wasser (differenzieren) .......................................................... spülen in Leitungswasser (stoppt Differenzierung) ............................................ spülen in alkalischem Wasser (bläuen)..................................................................5 sek in 96% Alkohol ...................................................................................... spülen in 2% alkoholisches Eosin einstellen .............................................. 15–20 sek in 96% – 100 % – 100 % Alkohol (entwässern) ....................................... spülen in 2 x Butylacetat ................................................................................... spülen eindecken mit Eindeckmedium auf Kunststoffbasis

Färbeergebnis HE-Färbung

Zellkerne, Kalk, saurer Schleim, grampositive Bakterien .......................blau-violett Cytoplasma, Kollagenfasern, Erythrozyten und restliche Gewebeanteile ............................................................... in Rottönen Es treten Effekte der Mehrfachfärbung auf: Es kommt nicht nur zur ausschließlichen Anfärbung der Kerne durch Hämalaun sondern auch zur Anfärbung mit Eosin. Wobei die rote Farbe durch die Blaufärbung überdeckt wird (schöner rotstichiger Blauton der Kerne).

G. Spezialfärbungen Täglich fällt eine gewisse Anzahl an Spezialfärbungen an. Dies variiert je nach der Anforderung durch die Befunder aber auch je nach den allgemeinen Vorgaben des Instituts. Mit dem Einzug von Standardisierung und Zertifizierung in die pathologischen Institute werden diese Unterschiede wahrscheinlich ausgeglichen werden. Auch für die Spezialfärbungen werden Automaten in verschiedenen Bauarten angeboten, wobei hier die händische Durchführung bis jetzt noch mehr verbreitet ist. Jedes Institut hat ein gewisses Repertoire an Spezialfärbungen in Abhängigkeit vom eingelangten Probenmaterial und Leistungskatalog. Die Aufzeichnungen darüber sollten nicht nur das eigentliche F ärbeprotokoll, sondern auch das Färbeprinzip, das Färbeergebnis, die Reagenzienherstellung und Sicherheitsmaßnahmen umfassen. Die benötigten Reagenzien bedürfen einer entsprechenden Verwaltung und Aufbewahrung für eine sichere und praktische Handhabung (laut Sicherheitsdatenblatt). Eine Möglichkeit ist die Gruppierung der Reagenzien nach Färbung bzw. nach Alphabet. Einige Reagenzien werden für mehrere Färbungen gemeinsam verwendet und werden so zusammengefasst. Es gibt Reagenzien, die täglich frisch hergestellt werden und solche, die man über einen längeren Zeitraum verwenden kann oder als „Stammlösungen“ vorhanden sind. Die „Ablaufdaten“ und der Reagenzienwechsel müssen im Labor geregelt werden, um eine gleichmäßige Qualität zu erreichen (z.B. nach Verwendungsdauer oder nach einer gewissen Anzahl an Schnitten).

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Histologische Färbung

Die Bezugsquellen der Farbstoffe und die richtigen CI-Nummern sind zu vermerken, da besonders in diesem Bereich große Qualitätsunterschiede herrschen und das gleiche Ergebnis meist nur vom selben Erzeuger zu erwarten ist. Optimal wäre das Erstellen von Datasheets für jede selbst hergestellte Farbstofflösung. Datasheet: •

Herstellungsdatum

•

Ablaufdatum

•

Rezept

•

Chargennummern der verwendeten Bestandteile

•

Sicherheitsangaben zu den Reagenzien (ätzend, kanzerogen,...)

•

Name des Mitarbeiters

Will man sich das eigenhändige Herstellen von Farblösungen ersparen, werden im Handel auch sehr viele fertige Färbereagenzien angeboten. 1.

Bezeichnungen

Die Benennung der Spezialfärbungen ist wie die Bezeichnung der Farbstoffe sehr unübersichtlich. Oft beinhalten sie den Namen des „Erfinders“ oder desjenigen, der sie weiterentwickelt hat (z.B. Gömöri, Mallory, Hale, etc.). Weiters werden die einzelnen Farbstoffe im Färbungsname angeführt (z.B. Alcianblau, Mucicarmin, Sudan, etc.), die Technik (Trichrom, Imprägnation, etc.) oder manchmal auch die dargestellte Struktur (Eisenfärbung, Reticulinfärbung, etc.). Erschwerend kommt hinzu, dass in anderen Staaten oft andere Bezeichnungen für die gleiche Färbung gebräuchlich sind. Außerdem entwickeln die einzelnen Labors oft liebevolle Spitznamen, die man dann schwer wieder mit den „Originalen“ in Verbindung bringt. Ähnlich wie bei den CI-Nummern gibt es Bestrebungen, hier eine einheitliche und internationale Nomenklatur zu erstellen. So uneinheitlich die Bezeichnungen sind, so schwierig gestaltet sich eine Gruppierung der Spezialfärbungen nach Technik bzw. Färbesubstrat, oder nach dargestelltem Gewebetyp. Meist kann man Spezialfärbungen hier mehreren Gruppen zuordnen. Hier ein Versuch sie vorerst nach der angewandten Technik und weiters nach Färbesubstrat einzuteilen. Die vorgestellten Spezialfärbungen erfassen bei weitem nicht die tatsächliche Anzahl und sollen nur als Beispiele dienen. 2.

Trichromfärbungen

Die Bezeichnung Trichromfärbung ist ein allgemeiner Name für Färbungen zur selektiven Darstellung von Muskelfasern, Kollagenfasern, Fibrin und Erythrozyten. „Trichrom“ bedeutet „drei Farben“ und bezieht sich auf die Behandlung des Gewebes mit mind. drei verschiedenen Farbstoffen, wobei einer auch der Kernfarbstoff sein kann. Diese Farbstoffe können simultan (gleichzeitig) oder succedan (nachfolgend) aufgebracht werden. Vorgeschaltet wird die Kernfärbung mit säureresistentem Farbstoff (Eisenhämatoxylin) oder einer kombinierten Kernfärbung mit Coelestin und Hämalaun. Über das genaue Färbeprinzip ist man sich noch nicht ganz klar. Wahrscheinlich besteht eine Kombination aus ionischer Anziehung der Reaktionspartner und den unterschiedlichen, physikalischen Eigenschaften beim Eindringen in die Gewebestruktur. Die dreidimensionale Struktur des Gewebes ergibt sich aus der Wechselwirkung zwi-

Histotechnik

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schen Gewebeproteinen und Fixans. Je nach Konstruktion bauen sich fein- bzw. grobporige Maschenwerke auf. Feindisperse, niedrig molekulare Farbstoffe (z.B. Chromotrop, Pikrinsäure) dringen schneller in alle feinmaschigeren Strukturen ein. G robdisperse, hochmolekulare Farbstoffe (z.B. Anilinblau) dringen langsamer in die Strukturen ein, besetzen eher die großmaschigeren Bereiche und vertreiben auch die feindispersen Farbstoffe wieder von hier. Man unterbricht die Färbung, solange der grobdisperse Farbstoff die feinen Strukturen noch nicht erreicht hat. Bei zu langer Einwirkung kommt es zu Überfärbung mit den hochmolekularen Triphenylmethanfarbstoffen. Man muss also die verwendeten Farbstofftypen in Relation zueinander setzen, um das Färbeergebnis richtig zu interpretieren. Erwärmen beschleunigt den Färbevorgang. Der pH-Wert der Trichrom-Farblösungen liegt sehr niedrig meist zwischen 1 bis 3. Dies bewirkt eine verstärkte Ionisation der Ammoniumgruppen an den positiv geladenen Plasmaproteinen. Kernfärbung mit Hämalaun würde bei diesem pH-Wert wieder entfärbt werden, deshalb verwendet man meist das säureresistente Weigert’s Eisenhämatoxylin. Die besten Resultate an Intensität und Klarheit erzielt man nach Fixierung mit Fixierlösungen nach Helly oder Zenker, aber auch nach B ouin. Deshalb erfolgt vor der Färbung eine Umfixierung von üblicherweise formalinfixiertem Gewebe direkt am Schnitt mittels Bouin (1 Std. bei 60°C), was Bindungsstellen an den Plasmaproteinen für die Farbstoffe freisetzt. Die Aufgabe von Phosphormolybdänsäure bzw. Phosphorwolframsäure in Trichromfärbungen ist nicht ganz geklärt. Meist werden sie als Beizen bezeichnet. Jedoch wurde bei der Behandlung mit Phosphormolybdän- bzw. Phosphorwolframsäure eine allgemeine Verringerung der Anfärbbarkeit, mit Ausnahme der kollagenen Fasern, festgestellt, sodass die Wirkung eher als blockierend bezeichnet werden könnte. Dabei lassen sich die Zellkomponenten unterschiedlich gut von diesen „farblosen, sauren Farbstoffen“ blockieren. Sie treten in Konkurrenz zu den anderen niedrigmolekularen Farbstoffen. Phosphormolybdän- bzw. Phosphorwolframsäure werden alternativ verwendet, obwohl gewisse Unterschiede im Resultat auftreten können. Je nach Methode werden sie in gemeinsamer Lösung mit einem „kleinen“ Farbstoff oder vor einem „großen“ Farbstoff aufgebracht. Außerdem haben sie stark azidivierende Wirkung. Es eignen sich viele anionische Farbstoffe zum Einsatz bei Trichromfärbungen. Beispiele dafür sich Pikrinsäure (229), Orange G (452), Ponceau 3R (494), Biebrich Scarlet (556), Säurefuchsin (586), Kongorot (697), Lichtgrün SF (793), Anilinblau (800), Fast Green FCF (809). Die Zahlen in Klammer stehen für das Molekulargewicht. 3.

Nachweis von Aldehyden (Darstellung der Glykoproteinen)

Man findet Glykoproteine als Bauelemente in Kollagenfibrillen (= Faserbaustein), Retikulinfasern, Basalmembranen, Zelloberflächen (Glykokalix), Glykogen und Grundsubstanz des Bindegewebes. Sie treten dabei in unterschiedlicher Dichte auf.

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Histologische Färbung

Gykoproteine gehören zu den neutralen Mucopolysacchariden und sind Keton- und Aldehydderivate aus Einfachzuckern. Als funktionelle Gruppen dieser Moleküle treten Hydroxylgruppen in typischer Anordnung in Erscheinung (-OH). Formt man die Alkoholgruppen nun durch Oxidation mittels Säuren in Aldehyde um, können diese durch zwei Reaktionsarten nachgewiesen werden. Glykoproteine werden also indirekt durch Nachweis von Aldehyden dargestellt. Die Aldehyde wirken dabei reduzierend auf ihre Reaktionspartner. Nachweis von Aldehyden: 1. mit fuchsinschwefeliger Säure (Perjodacid-Schiff’sche Reaktion) 2. durch Versilberung in ammoniakalischer Silbernitratlösung Bei Überoxidation werden die reagiblen Gruppen zu unbrauchbaren Produkten weiteroxidiert. Je nachdem welches Gewebselement dargestellt wird, verwendet man unterschiedlich starke Oxidationsmittel. Dadurch werden Substrate mit geringerer Anzahl an Alkoholgruppen „unsichtbar“ gemacht. Das Färbeergebnis wird dadurch klarer. Die benötigte Oxidationsstärke ist proportional zur Anzahl der Alkoholgruppen: •

• •

Retikulinfasern: aufgrund der feinen Struktur bieten sie sehr viele reagible Gruppen an, im Gegensatz zu kollagenen Fasern. Kaliumpermanganat (stärkstes Oxidationsmittel) – Versilberung nach Gomori Pneumocystis, Pilze, Glykogen: Chromsäure – Grocott-Gomori Basalmembranen: Perjodsäure – Jones-Methenamin oder PAS

Diese Strukturen sind argyrophil und PAS-positiv. 4.

Silberimprägnation

In der histologischen Technik unterscheidet man a rgyrophile (griech.) und argentaffine (lat.) Strukturen, was eigentlich beides „silberliebend“ bedeutet. Argentaffine Strukturen sind fähig ohne Vorbehandlung metallisches Silber aus Silbernitratlösungen zu reduzieren, das sich am Reaktionsort ablagert. Eine argentaffine Reaktion wird von Polyphenolen, Aminophenolen und aromatischen Polyaminen in Ortho- und Parastellung hervorgerufen (z.B. Darstellung von Melanin-Pigment nach Fontana-Masson). Argyrophile Strukturen benötigen eine oxidierende Vorbehandlung, um dieselbe Wirkung zu erzielen. Dazu gehören z.B. glykoproteinhältige Strukturen wie Basalmembranen oder Bindegewebsfasern (siehe oben). Ein Vorteil dieser Methoden liegt im deutlichen Kontrast der gefärbten, schwarzen Struktur gegenüber dem hellen Hintergrund, der Nachteil liegt in der aufwendigen Färbung. alle argyrophilen Techniken beinhalten: •

Oxidation durch mehr oder weniger starke Säuren (Umwandlung von Hydroxylgruppen zu Aldehydgruppen)

193

Histotechnik

•

Sensibilisierung und Entwicklung durch Diaminsilberionen in basischer Lösung (pH 9)

•

Tönen durch Goldchloridlösung (wenn gewünscht)

•

Fixierung durch Natriumthiosulfat

Die Reaktionslösung muss gelöste Silberionen in basischem Milieu beinhalten. Die Gewebestrukturen haben reduzierende Wirkung (Aldehydgruppen) und fällen so metallisches Silber aus, das sich als bräunlicher Niederschlag am Reaktionsort darstellt. Die Verwendung von reduzierenden Chemikalien (Formalin) beschleunigt diesen Vorgang. Dabei werden „Silberkeime“, die sich an die Struktur anlagern (Sensibilisierung), rasch zu metallischem Silber „entwickelt“. Beim Tönen wird Silber durch eine Goldchloridlösung in Silberchlorid überführt und metallisches Gold schlägt sich anstelle des Silbers nieder. Der Goldniederschlag ist stabiler, die Färbung geht vom Bräunlichen ins Blauschwarze. Der Vorgang der Silberreduktion kann allein durch Licht ebenso ausgelöst werden (Fotografie). Deshalb müssen nach der Entwicklung freie Silberionen durch Natriumthiosulfat gebunden (fixiert) und damit vom Gewebsschnitt entfernt werden. Beispiele:

Methenamin-Silberimprägnation nach Jones bzw. Grocott-Gomori, Reticulindarstellung nach Gomori (= Gitterfaserfärbung)

Die Versilberungen zählen zu den „heiklen“ Spezialfärbungen. Die Reaktion ist empfindlich auf Verunreinigungen der Glasküvetten. Meist wird säuregereinigtes Glas verlangt, das keinerlei Silberspuren früherer Färbungen mehr aufweist. Diese Silberspuren fungieren als „Silberkeime“. Silber hat die Eigenschaft sich an diese „Keime“ vermehrt anzulagern und entzieht sich dadurch der eigentlichen Färbereaktion. Aus demselben Grund soll man auch keine Färbebrücken und Pinzetten aus Metall verwenden (rostfreier Stahl scheint ok zu sein). •

Zum Reinigen des Laborgeschirrs spült man es vorerst mit Detergens (Bürsten) und entfernt dieses wieder durch reichlich Spülen mit Leitungswasser gefolgt von Aqua dest.

•

Dann lässt man eine kleine Menge von konzentrierter Salpetersäure in alle Winkeln der Küvette dringen. Dies löst die Silberspuren.

•

Weiters wieder spülen mit Aqua dest.; kein Leitungswasser, da sonst Silbersalze aus der Säure gefällt werden, die sich wieder am Glas anlegen.

•

Reichlich spülen mit Leitungswasser

•

Abschließendes Spülen mit Aqua dest. und staubfrei trocknen lassen.

Beim Färbevorgang muss man darauf achten, dass kein Leitungswasser in Kontakt mit Silberlösungen kommt, weil sonst Silberchlorid ausgefällt wird. Im stark alkalischen Milieu neigen die Schnitte zum Abschwimmen. Dem kann durch Adhäsive entgegengewirkt werden, diese machen sich aber durch Hintergrundfärbung bemerkbar. Die Reaktionen laufen bei den M ethenamin-Versilberungen oft sehr schleppend, nur um dann plötzlich umzukippen. Wenn man diesen Punkt übersieht, kommt es zu Überfärbungen, die nur sehr schwer wieder rückgängig zu machen sind. Zur Entfärbung eignet sich hier beispielsweise fotografische Fixierlösung. Das „Brechen“ der Silberlösung erkennt man am Silberspiegel auf allen Glasoberflächen (schwarze Küvet-

194

Histologische Färbung

te). Die Reaktionsgeschwindigkeit ist sehr an die Temperatur und die Puffermenge gekoppelt. Es empfiehlt sich hier unter laufender Beobachtung zu färben. Bei den ammoniakalischen Versilberungen ist das Verhältnis von Silberionen und Ammoniak für das Färbeergebnis entscheidend. Ein Überschuss an Silberionen führt zu Überfärbungen und fleckigem Hintergrund, ein Überschuss an Ammoniak zu unvollständiger Imprägnierung. Um das richtige Verhältnis zu erreichen, stellt man rücktitrierte Lösungen her, was ein bestimmtes Maß an Erfahrung bedarf. Den Spülschritt zwischen Sensibilisierung und Entwicklung darf man auch nicht zu lange oder zu kurz wählen, um das richtige Färbeergebnis zu erhalten. Versilberungen werden häufig zur Darstellung neurologischer Strukturen angewendet. Jedoch ersetzt die Einführung der immunhistochemischen Techniken hier einen Großteil der Färbungen. Die Spezifität der Antigen-Antikörper-Reaktionen erlaubt eine genaue Identifikation, während die Versilberungen eher unspezifisch sind bzw. ihr Mechanismus nicht vollständig geklärt ist. Weitere Imprägnations-Methoden verwenden Goldchlorid bzw. Osmiumtetroxid als reduzierbare Metallionen. Diese Techniken sind aber im Routinelabor kaum zu finden. Bsp.: Darstellung von Astrozyten, peripheren Nervenenden, Golgi-Apparat, degeneriertem Myelin. Über die Haltbarkeit von silbernitrathaltigen Lösungen: •

Durch die Aufbewahrung der Lösungen im Kühlschrank wird die Haltbarkeit verlängert.

•

Die Haltbarkeit von ammoniakalischen Lösungen bei RT ist 2–3 Tage, im Kühlschrank 10–14 Tage.

•

Ammoniakalische Silberlösungen färben nach 2–3 Tagen anscheinend besser. Nach 5 Tagen verfärben sie sich gelb-bräunlich (manchmal dunkler werdend) färben aber trotzdem.

•

Die Haltbarkeit von Methenamin-Lösungen im Kühlschrank beträgt Monate.

•

Die Haltbarkeit von Fontana-Masson Lösung beträgt über einen Monat.

•

Bei der Aufbewahrung von Silbernitratlösungen ist zu beachten, dass es zur Bildung von explosiven Präzipitaten kommen kann, insbesondere bei der Lagerung bei Raumtemperatur im Licht (weniger Gefahr bei Kühlschrank-Lagerung).

•

Silbernitratpulver wird bei RT-Lagerung grau-violett (behält im Kühlschrank die Farbe). Lösungen mit verfärbtem Silbernitrat sind weniger stabil.

5.

Histochemische Nachweismethoden

Der Begriff „histochemisch“ wird hier für Methoden verwendet, wo durch die darzustellende Gewebestruktur ein angebotenes Reagens in ein farbiges Endprodukt umgesetzt wird. Es handelt sich hier allerdings nicht um enzymatische Reaktionen. Dazu gehören bspw. die Umsetzung von Kaliumferrozyanid-Lösung in „Berliner Blau“ zur Darstellung von dreiwertigen Eisenionen, wie auch die Umsetzung von farbloser, fuchsinschwefeliger Säure in das rotviolette Endprodukt bei der PAS-Färbung (Näheres siehe später).

Histotechnik

6.

195

Enzymhistochemische Nachweismethoden

Hier bewirken im Gewebe enthaltene Enzyme die Umsetzung eines angebotenen, farblosen Substrats in ein farbiges Endprodukt, das am Reaktionsort präzipitiert. Diesem Bereich wird ein eigenes Kapitel gewidmet. 7.

Mikrowelle in der Färbetechnik

Der Einsatz der Mikrowelle bietet sich besonders bei den Spezialfärbungen an, um die Inkubationszeiten zu verkürzen. Deshalb wurden in den letzten Jahren viele Rezepte für die Mikrowelle modifiziert. Die Wirkung wird vor allem auf die schnelle Temperaturerhöhung zurückgeführt. Es bedarf aber besonderer Kenntnisse, um sie effektiv und sicher einzusetzen (siehe Kap. Mikrowellentechnik).

H. Bindegewebe- und Stützgewebe-Darstellung Das Bindegewebe ist mesenchymalen Ursprungs und hat Teil am Aufbau aller Organe, indem es Stroma, Kapseln und weitere Strukturen bildet. Bindegewebe besteht einerseits aus Zellen, andererseits aus zwischenzelligen Substanzen. Die Mengenverteilung und Ausformung ist stark an die Funktion des jeweiligen Bindegewebes gebunden. Die Bindegewebszellen kann man in fixe (Fibroblasten, -zyten) und freie (Abwehrzellen, Blutzellen) unterscheiden. Bei der Zwischensubstanz unterteilt man in Grundsubstanz und eigentliches Bindegewebe (Fasern). Kollagenfasern sind Bestandteil von Sehnen und Muskelfaszien, liegen in der Lederhaut, im gefäßführenden Bindegewebe, in Knorpel und Knochen. Kollagene Fasern sehen silberweiß glänzend aus. Beim Kochen wird Kollagen zu flüssiger Gelatine denaturiert („kolla“ = Leim). Sie haben eine kreuzweise und spiralige Anordnung mit wechselndem Drehsinn (Scherengitteranordnung). Kollagenfasern erscheinen in der Versilberung braun (nicht schwarz wie Retikulinfasern). Sie können einen Durchmesser von 1–20 µm haben, abhängig von der Anzahl an Kollagenfibrillen, aus denen sie zusammengesetzt sind. Man unterscheidet mind. elf Kollagentypen. Kollagenfibrillen sind PAS-positiv und argyrophil. Elastische Fasern kommen nur in Form von Netzen vor. Sie liegen als Begleitstrukturen der Kollagenfasern im interstitiellen Bindegewebe und in Organkapseln, in großen Mengen in der Lunge. In der Wand herznaher Arterien bilden sie gefensterte Membranen. Nahezu rein elastische Strukturen sind selten und beim Menschen nur im Ligamentum flavum zu finden. Elastische Fasern sind acidophil, congophil und lichtbrechend. Nach Oxidation erscheinen sie ziemlich basophil aufgrund der Bildung von Sulfatgruppen. Junge, elastische Fasern zeigen sich PAS-positiv. Untergruppen der elastischen Fasern sind Oxytalan-Fasern und Elaunin-Fasern. Retikulinfasern bilden feine, gitterartige Strukturen. Die einzelnen Fäserchen ziehen über die Oberfläche mehrerer Zellen hinweg. Sie bestehen aus Kollagen Typ I (20-25 nm) und III (30–35 nm) und lassen sich durch Versilberung darstellen. Das r etikuläre Bindegewebe bildet das Grundgerüst der lymphatischen Organe (Milz, Lymphknoten). Sie kommen auch sonst im lockeren Bindegewebe und in Eingeweideorganen vor (Leber, Niere, Nebenniere, Schleimhaut des Magen-Darm-Trakts).

196

Histologische Färbung

Die Basalmembran ist das Produkt einer extrazellulären Kondensation von Glykoproteinen, Mucopolysacchariden und Proteinen unterhalb der basalen Oberfläche zumeist von Epithelien. Eine regelmäßige Komponente der Basalmembran ist die Basallamina. An sie schließt eine netzförmige Schicht an, die aus verdichteter Grundsubstanz und dünnen unregelmäßigen Bündelchen von Kollagenfibrillen, den R etikulinfasern, zusammengesetzt ist, und lichtmikroskopisch dabei häufig homogen erscheint. Diese Schicht kann auch so schwach entwickelt sein, dass lichtmikroskopisch eine Basalmembran zu fehlen scheint. Die Basalmembran des Trachealepithels enthält in dieser Schicht elastische Fasernetze. Die Basalmembran ist P AS-positiv. Basalmembranen haben vorwiegend mechanische Aufgaben. Die Dicke der Basalmembran variiert. In den Nierenglomeruli als Abgrenzung der Kapillaren ist sie relativ dick mit ca. 350 nm und kann hier infolge von Erkrankungen (Diabetes, membranöse Nephropathie) merkbar verdickt sein. Die Grundsubstanz (oder Kittsubstanz) besteht hauptsächlich aus interstitieller Flüssigkeit, Proteoglykanen (= saure Mucopolysaccharide) und Glykoproteinen (= neutrale Mucopolysaccharide). Ihre Anfärbung wird unter „Kohlenhydratdarstellung“ beschrieben. Im Knorpel findet man knorpelbildende Zellen (= Chondrozyten). Sie produzieren Knorpelgrundsubstanz bestehend aus Proteoglykanen und Glykoproteinen. Zur Verfestigung enthalten sie kollagene Fasern. Je nach Fasergehalt spricht man von hyalinem Knorpel, elastischem Knorpel und Faserknorpel. Knochen ist zusammengesetzt aus organischen und anorganischen Komponenten. Den größten Anteil des organischen Materials stellt das Kollagen dar. Weiters findet man andere Proteine, die von den Osteoblasten synthetisiert werden. Der zelluläre Anteil wird von den Osteoblasten (Knochenaufbau), den Osteoklasten (Knochenabbau) und den Osteozyten (versorgen umgebenden Knochenbezirk) gebildet. Der Hauptanteil an anorganischer Substanz wird von Hydroxyapatit mit der Formel Ca10(PO4)6(OH)2 ausgemacht. Kleine Mengen von Magnesium, Fluor, Kalium, Carbonaten und Citraten finden sich ebenfalls. Anatomisch unterteilt man Knochengewebe in kompakten Kortikal-Knochen (sehr dichte Struktur) und spongiösen Knochen (Wirbelkörper, Epiphyse der langen Knochen). Der spongiöse Knochen entsteht durch Umbau und Abbau mit Hilfe der Osteoklasten und -blasten. In Abhängigkeit von Zug- und Druckkräften bei der mechanischen Belastung bildet sich eine typische Trabekelverteilung. Im spongiösen Knochen findet man das eingelagerte hämopoetische Knochenmark mit den blutbildenden Zellen. Die nötige Vorbehandlung für knochenhartes Gewebe wurde im Kapitel „Dekalzifikation“ beschrieben. Fettzellen gehören auch zu den Bindegewebszellen haben aber anstelle einer sekretorischen Funktion eine Speicherfunktion. Ihre Größe ist abhängig vom Gehalt an gespeichertem Fett, das als kleine Tropfen oder im Ganzen zu sehen sein kann. Neutralfett wird während der üblichen Behandlung des Gewebes in der Histotechnik durch organische Lösungsmittel entfernt. Deshalb ist hier der Nachweis am besten an unfixierten Gefrierschnitten zu machen. Muskelgewebe wird gegliedert in glatte, quergestreifte Skelett- und quergestreifte Herzmuskulatur. Sie sind aus spindelförmigen Zellen aufgebaut, die zu Bündeln (Mus-

197

Histotechnik

kelfasern) zusammengefasst sind. Aufgrund ihres Gehalts an kontraktilen Proteinen haben sie die Fähigkeit, sich zusammenzuziehen (Alpha Aktin, Aktin, Myosin). Jeder Typ von Muskelgewebe beinhaltet eine gewisse Menge an Bindegewebe. Jeder Muskel und jede Muskelzelle ist von kollagenen und elastischen Fasern umgeben, die zusammen an den Ansatzpunkten des Muskels binden. Fibrin ist ein unlösliches fibrilläres Protein gebildet durch Polymerisation aus einem kleineren, löslichen Protein, dem Fibrinogen (Plasmaprotein). Fibrin findet man meist bei Vorgängen, die der Gewebezerstörung als akute Entzündungsreaktion folgen. Das Plasmafibrinogen polymerisiert und bildet das unlösliche Fibrin außerhalb der Gefäße. Im Paraffinschnitt ist Fibrin stark eosinophil. Mithilfe von Trichromfärbungen lässt sich das Alter des Fibrins (bzw. der Entzündung) festlegen. Unter F ibrinoid versteht man Ablagerungen von Fibrin in Verbindung mit anderen Proteinen. Man findet es z.B. bei akuten gefäßzerstörenden Vorgängen (Vasculitis). Ansonsten verweise ich auf die übliche Literatur zur Mikroanatomie des Menschen. Tabelle17a und 17b: aus Bancroft & Gamble, Theory and Practice of histological Techniques, 5. Edition, S 149, © 2002 Elsevier Inc.; mit Erlaubnis abgedruckt

1.

Gewebetyp

VG

Masson Trichrom

MSB

PTAH

PAS

Retic

Meth.Silber

Muskel

gelb

rot

rot

blau

+

grau

grau

Kollagen

rot

blau/grün

blau

orange-rot

+

grau

-

Elastin Retikulin Basalmembran

gelb gelb gelb

blau/grün blau/grün

blau blau blau

orange-braun orange-braun orange

++ +++

schwarz grau

schwarz

Osteoid

rot

blau/grün

blau

orange-rot

+

grau

-

Knorpel Fibrin

variab. gelb

variabel rot

variab. rot

variabel blau

++ +/-

variab. grau

variab. -

Gewebetyp

autofluoreszierend

lichtbrechend

polarisierend

Muskel Kollagen Elastin Retikulin Basalmembran Osteoid Knorpel Fibrin

– – + – – – – –

– – + – – – – –

– + – – – + – –

HE dunkelrosa dunkelrosa rosa rosa dunkelrosa purpur rosa

Van-Gieson-Färbung

1.1. Ziel Selektive Darstellung von kollagenen Fasern, Muskel und Cytoplasma; häufig in Kombination mit der Elastika- (Resorcin-Fuchsin) Färbung als Elastika-vanGieson Färbung (EVG).

198

Histologische Färbung

1.2. Prinzip Simultane Färbung mit Pikrinsäure und Säurefuchsin als Pikrofuchsin (= VanGieson, Säurefuchsin in gesättigter Pikrinsäure). Zuerst erfolgt die Kernfärbung mit säurefestem Eisenhämatoxylin nach Weigert. In stark saurer Lösung wird Kollagen von Säurefuchsin angefärbt. Pikrinsäure sorgt für den sauren pH und tritt als Färbung von Muskel und Cytoplasma in Erscheinung. Die Hypothesen für die Farbstoffaffinitäten reichen von Durchlässigkeit-und-Diffusionstheorie, über die Elektroadsorbtion bis zur Wasserstoffbindung. 1.3. Färbeergebnis Zellkerne ..........................................................................schwarz Kollagen ............................................................................hellrot Muskel und Cytoplasma .......................................................gelb Schleim ......................................................................gelb bis rot Färbung verblasst mit der Zeit. 2.

Masson-Trichrom-Färbung

2.1. Ziel Selektive Darstellung von kollagenen Fasern und allgemein von Bindegewebe 2.2. Prinzip Succedane Trichromfärbung: Zuerst erfolgt die Kernfärbung mit säurefestem Eisenhämatoxylin. Dann die Einwirkung einer Farblösung aus Säurefuchsin und Ponceau de Xylidin. Weiters wird Phosphormolybdänsäure aufgebracht und am Ende Fastgreen bzw. Anilinblau, je nach Vorliebe für grünes oder blaues Kollagen. Die Originalmethode wurde mehrfach verändert, die Farbstoffe ausgetauscht und Inkubationszeiten verändert. Bspw. kann Ponceau durch Biebrich-Scarlett ersetzt werden. (Abb.115)

Abb.115 Fastgreen FCF

2.3. Färbeergebnis Kerne................................................................................schwarz Cytoplasma, Erythrozyten, Fibrin, Muskel ............................... rot Kollagen ............................................................... grün bzw. blau

Histotechnik

3.

199

Chromotrop-Anilinblau-Färbung nach Gomori (CAB)

3.1. Ziel Selektive Darstellung von kollagenen Fasern und allgemein von Bindegewebe 3.2. Prinzip Es handelt sich um eine simultane Trichromfärbung mit den sauren Farbstoffen Chromotrop (Monoazofarbstoff) und Anilinblau (Triphenylmethanfarbstoff). Der dritte Farbstoff ist Hämatoxylin als Weigert’s Eisenhämatoxylin (säurefester Kernfarbstoff). Vorab erfolgt die Kernfärbung, dann die Behandlung mit Phosphormolybdänsäure und weiters die simultane Einwirkung von Chromotrop und Anilinblau. 3.3. Färbeergebnis Kerne .........................................................................blauschwarz Zytoplasma, Muskel, Erythrozyten .......................................... rot kollagene Fasern ................................................................... blau

4.

MSB-Färbung (Martius-yellow-Solubel Blue-Brillant Crystal)

4.1. Ziel Selektive Darstellung von Bindegewebskomponenten, besonders von Fibrin 4.2. Prinzip Succedane Trichromfärbung: Zuerst Kernfärbung mit Eisenhämatoxylin bzw. CelestinHämalaun. Dann erfolgt hintereinander die Behandlung mit Martius yellow, Brillant crystal scarlett, Phosphorwolframsäure und Methylblau mit Differenzierungschritten in Aqua dest. bzw. saurem Wasser. 4.3. Färbeergebnis Kerne ............................................................... schwarz bzw. blau Erythrozyten .........................................................................gelb Muskel ..................................................................................... rot Fibrin ....................................................................................... rot altes bzw. sehr altes Fibrin ................................... gelb bzw. blau

5.

SFOG-Färbung nach Mallory/Cason

5.1. Ziel Darstellung von Kollagenfibrillen und Differenzierung gegenüber Epithelgewebe und/oder Muskelgewebe, Proteinablagerungen

200

Histologische Färbung

5.2. Prinzip Es handelt sich um eine simultane Trichromfärbung mit den Farbstoffen Orange G (Monoazofarbstoff), Säurefuchsin (Triphenylmethanfarbstoff) und Anilinblau (Triphenylmethanfarbstoff), die eine selektive Anfärbung von Muskel, kollagenen Fasern, Fibrin und Erythrozyten bewirken sollen. Vorgeschaltet wird eine Kernfärbung mit Hämatoxylin als Weigert’s Eisenhämatoxylin (säurefester Kernfarbstoff) und die Behandlung mit Phosphormolybdänsäure. (Abb.116-117)

Abb.116 Orange G

Abb.117 Säurefuchsin

5.3. Färbeergebnis Kollagenes und retikuläres Bindegewebe ....... scharf dunkelblau saure Mukosubstanzen ......................................................... blau Erythrozyten ............................................................... rot-orange Muskelgewebe ................................................leuchtend orange Proteinablagerungen............................................................... rot Zellkerne ..........................................................................schwarz 6.

Weigert’s Resorcin-Fuchsin – Färbung

6.1. Ziel Darstellung von elastischen Fasern und Bindegewebskomponenten. 6.2. Prinzip Die theoretischen Grundlagen für die Anfärbung der elastischen Fasern sind noch nicht völlig geklärt. Die Fasern lassen sich durch eine größere Anzahl an unterschiedlich aufgebauten Farbstoffen (Eosin, Phloxin, Kongorot) mehr oder weniger unspezifisch anfärben. In unreifen Fasern, die noch bindungsfähige Aldehydgruppen enthalten kommt es zu einer positiven PAS-Reaktion. Außerdem enthalten die Fasern eine Glykoprotein-Komponente. Die effektivste Anfärbung der Fasern gelingt mit Farbstoffen mit sehr langen Ketten von konjugierten Doppelbindungen und einer großen Anzahl an hydrophoben GrupF uchsin. Der Farbstoff wird durch pen. Zu diesen gehört Resorcin-F Kochen von basischem Fuchsin mit Resorcin und Eisenchlorid hergestellt, wobei der genaue Aufbau nicht bekannt ist. Wahrscheinlich enthält er verschiedene Verbindungen mit aromatischen Ringen an Abb.118 der Triphenylmethanstruktur. Resorcin

201

Histotechnik

Zuerst erfolgt die Anfärbung mit ResorcinFuchsin. Danach wird mit verdünntem Alkohol differenziert. Es folgt die Kernfärbung mit säurefestem Eisenhämatoxylin. Die übliche Gegenfärbung ist eine Bindegewebsfärbung mit Pikrofuchsin (= vanGieson). (Abb.118-119) Abb.119 Fuchsin

6.3. Färbeergebnis Elastische Fasern ............................................... braun bis violett Kollagen ......................................................................... pink-rot Kerne ......................................................... schwach blauschwarz Hintergrund ..........................................................................gelb

7.

Verhöff’sche Färbung

7.1. Ziel Darstellung der elastischen Fasern 7.2. Prinzip Die Farblösung enthält Hämatoxylin, dreiwertiges Eisen (als Eisenchlorid) und Jod (als Kaliumjodid). Man nimmt an, dass große Molekülkomplexe mit schwarzem Hämatein entstehen, die sich durch Van-der-Waal-Kräfte an die elastischen Fasern lagern. Nachdem der Farbstoff der Kernfärbung nach Weigert ähnelt, färben sich Kerne und auch Myelinscheiden grau-schwarz. Als Gegenfärbung kann VanGieson (= Pikrofuchsin) angeschlossen werden. 7.3. Färbeergebnis Elastische Fasern, Kerne, Myelinscheiden ...................... schwarz Cytoplasma, Kollagen ............ entsprechend der Gegenfärbung 8.

Silberimprägnation nach Gomori

8.1. Ziel Darstellung der retikulären Fasern (Gitterfasern, argyrophile Fasern). 8.2. Prinzip Retikulinfasern bestehen aus Kollagenfibrillen mit einem Durchmesser zwischen 30 und 50 nm. Die Oberflächen der Kollagenfibrillen tragen Proteoglykan- (saure MPS) und Glykoproteinauflagerungen (neutrale MPS, Fibronektin, konzentrierter als bei kollagenen Fasern) und haben deshalb eine positive PAS-Reaktion und Argyrophilie. Bei der Versilberung erhält man allerdings klarere Kontraste als bei PAS- und Trichromfärbungen.

202

Histologische Färbung

Die Technik verläuft nach folgendem Schema: •

Aufbereiten der Fasern durch Oxidationsmittel (Kaliumpermanganat, oxidiert die Alkoholgruppen der Glykoproteine zu Aldehyden)

•

Abstoppen der Oxidation durch Kaliumdisulfit

•

Imprägnation durch Metallsalzlösung (Eisenalaun)

•

Sensibilisierung) Anlagerung von Silberionen an die Aldehydgruppen (S

•

Entwicklung durch ein Reduktionsmittel (Formalin)

•

Tönen mittels Goldchlorid

•

Fixierung durch Entfernen des noch ionisierten Silbers (Natriumthiosulfat bindet Silberionen).

•

Weiters folgt noch eine Kernfärbung mit Kernechtrot zur Kontrastierung.

Als Gebrauchslösung verwendet man eine ammoniakalische Silbernitratlösung. Diese enthält Diaminsilberionen, die sich an die Aldehydgruppen der retikulären Fasern binden. Ammoniakalische Silberlösung nach Gomori: 30 ml ..............................10 % AgNO3 ................................................. mit 6 ml ..............................10 % KOH ..................................................... versetzen Es entsteht ein dunkelbrauner Niederschlag (Silberoxid in alkalischer Lösung). Niederschlag mit tropfenweiser Zugabe von konzentriertem Ammoniak lösen. 10 % AgNO3 tropfenweise zugeben, beim Schütteln wird die Lösung wieder klar, soviel Silbernitrat zusetzen bis sich eine leicht bräunliche Verfärbung nicht mehr wegschütteln lässt. mit Aqua dest. 1:1 verdünnen, pH 9

Es entstehen lösliche Diaminsilberionen nach der Reaktionsgleichung: 2NH4OH + 2AgNO3 Æ 2NH4NO3 + Ag2O(s) + H2O Ag2O + 4NH4OH Æ 2[Ag(NH3)2]+ + 2OH- + 3H2O Die vorerst angelagerten Silberionen sind mengenmäßig zuwenig, um die Fasern sichtbar zu machen. Glücklicherweise neigt Silber dazu, sich an diese „Silberkeime“ anzulagern, und lässt sich hier durch Formalin reduzieren, sodass die Fasern scharf abgegrenzt erkennbar werden. Vor der „Entwicklung“ erfolgt noch ein Spülschritt in dest. Wasser, der überschüssige Silberlösung entfernt. Zu langes Spülen schwächt die Färbung ab. Zu kurzes Spülen bewirkt eine unspezifische Hintergrundfärbung. 8.3. Färbeergebnis Retikulinfasern .................................................................schwarz Kerne ...................................................................................... rot

Histotechnik

9.

203

Perjodsäure-Silbermethenamin-Imprägnation nach Gomori/Jones

9.1. Ziel Darstellung von B asalmembranen 9.2. Prinzip Basalmembranen beinhalten einen gewissen Anteil an Glykoproteinen, der durch Versilberung dargestellt werden kann. Die Hydroxylgruppen an den Glykoproteinen werden durch 0,5% Perjodsäure zu Aldehyden oxidiert. Die Verwendung von Perjodsäure macht die Färbung besonders geeignet für die Basalmembrandarstellung. Grocott modifizierte die Methode für die Darstellung von Pilzen, indem er die Perjodsäure durch die stärkere 5% Chromsäure ersetzte (siehe Mikroorganismen). Als Reaktionslösung wird die alkalische Methenaminsilberlösung eingesetzt. Natriumtetraborat agiert in der Lösung als Puffer. Goldchlorid wird zum Tönen eingesetzt und Natriumthiosulfat entfernt das nicht reduzierte Silber. Je nach Vorliebe schließt man eine Gegenfärbung mit Lichtgrün zur Kontrastierung an. Man kann die Imprägnation auch mit einer Kernfärbung kombinieren. Methenamin-Silberlösung nach Gomori 400 ml ............. 3 % Hexamethylentetraminlösung (= Methenamin, Hexamin) 10 ml ........... 10 % Silbernitratlösung .......................zugeben (Verhältnis 1:40) wird zuerst trüb, schwenken bis wieder klar Im Kühlschrank in dunkler Flasche aufbewahren. kurz vor Gebrauch der bereits vorgewärmten Lösung: x ml................ 5% Natriumtetraborat (Borax) ...........zugeben, gut mischen (Verhältnis 1:10) Bei Überschuss an Methenamin entsteht ein löslicher Hexamethylentetramin-SilberKomplex [2C6H12N4.3AgNO3]. Dieser Komplex ist ebenso wie die Diaminionen bei der ammoniakalischen Silberlösung durch Aldehyde reduzierbar. Die primäre Trübung der Lösung ist zurückzuführen auf einen unlöslichen Komplex, der bei einem 1:1 Mischungsverhältnis entsteht. 9.3. Färbeergebnis Basalmembranen ............................................................ schwarz alle argentaffinen Strukturen .......................................... schwarz (Hintergrund ................................................................... grünlich) (Kerne ......................................................... je nach Kernfarbstoff)

204

Histologische Färbung

10. Romanowsky Giemsa-Färbung 10.1. Ziel Darstellung von Blut- und Knochenmarkszellen. Darstellung von Helicobacter pylori, Parasiten 10.2. Prinzip Dieser zur Gruppe der Romanowsky-Farbstoffe zählende Farbstoff ist ein Gemisch aus Methylenblau, Eosin und deren Derivaten (Azur A, Azur B). Diese sind löslich in Methanol. Glycerol wird zur Stabilisierung zugesetzt. Die Stammlösungen werden kurz vor Gebrauch mit Wasser verdünnt, damit die Farbstoffe ihre Wirkung entfalten können. Heutzutage werden käufliche Stammlösungen bevorzugt verwendet. (Abb.120) Jeder der basischen Teerfarbstoffe ist in der Lage, mit Eosin ein Salz zu bilden, z.B. Methylenblau-Eosinat, Azur-Eosinat. Mischungen dieser basischen Teerfarbstoffe und ihrer Salze mit Eosin färben das Cytoplasma und die Zellkerne der Blutzellen Abb.120 Azur B je nach dem pH-Milieu. Der neutrale Farbstoff bringt eine eigentümlich rötlichviolette Anfärbung des Kernchromatins von Leukozyten zustande, die aus den einzelnen Eigenschaften von Eosin, Methylenblau und Azur nicht erklärt werden kann. DieGiemsa-Effekt oder Polychromasie. Dieser ses Phänomen nennt man Romanovsky-G Effekt ist zurückzuführen auf die Bindung der kationischen Dimere von Azur B an die DNA und die Bindung von Eosin-Anionen an das bereits gebundene Azur B. Das pH-Milieu ist maßgeblich und sollte idealerweise für die verschiedenen Fixantien bestimmt werden. Niedrigerer pH ergibt selektiveres Anfärben des Chromatins und weniger Basophilie des Cytoplasmas, höherer pH ergibt dichtere Kerne und erhöht die Basophilie des Cytoplasmas. Der pH-Wert sollte für formalinfixiertes Gewebe um pH 4 liegen. Idealerweise werden die Schnitte vor der Färbung in entsprechender Pufferlösung gespült. Die Gebrauchslösung wird im selben pH hergestellt. Anschließend soll man wieder in Pufferlösung spülen. Bei der regressiven Färbeprozedur kommt es zuerst zu einer Überfärbung. Der überschüssige Farbstoff wird durch Differenzieren in saurem Wasser, Puffer bzw. 96% Ethanol wieder herausgelöst. Das Färbeergebnis ist stark vom pH abhängig. Beim Differenzierungsschritt wird ein zu blaues Ergebnis durch Spülen in 0,01% Eisessiglösung in Richtung Rosa verändert. Ein zu rosa-lastiges Ergebnis ist auf zu niedrigen pH zurückzuführen. Die Färbung gilt auch als Übersichtsfärbung und zeigt mehr cytoplasmatische Details als die HE-Färbung. Es gibt verschiedene Varianten dieses Färbungstyps.

205

Histotechnik

10.3. Färbeergebnis Kerne .........................................................................................blau bis rot-violett basophile Granula .................................................................................violett-blau eosinophile Granula............................................................................................ rot neutrophile Granula................................................................................... braunrot Azurgranula...............................................................................................purpurrot Epitheloidzellen u. Bindegewebe ........................................... hellrot bis rotorange Zytoplasma der Lymphozyten und Monozyten................................................. blau Zytoplasma der Granulozyten........................................................................ rötlich Thrombozyten .......................................................blau mit violettem Innenkörper Erythrozyten ........................................................................................ blassrötlich Bakterien .......................................................................................................... blau Nukleolen ........................................................................ rotviolett bis dunkelblau Mastzellgranula u. Schleim ......................................................................purpurrot Kalk ......................................................................................................... ungefärbt Kollagen und Keratin ........................................................................................ rosa Knorpelmatrix ................................................................................................ violett

I.

Lipid-Darstellung

Die Darstellung der Lipide hat im Routinelabor eher untergeordnete Funktion. Der Großteil der Lipide wird nämlich durch die Einwirkung von organischen Lösungsmitteln beim Paraffin-Einbettungsprozess herausgelöst und entzieht sich damit der Darstellung. Deshalb lassen sich diese Fettstoffe nur am Gefrierschnitt des unfixierten oder kurzfixierten Gewebes darstellen. Lipide wie bspw. Phospholipide, Lipofuszine und Leukozytengranula binden an andere Gewebekomponenten und widerstehen der Paraffineinbettung. Für spezielle Lipiduntersuchungen erfolgt die Fixierung am besten in gepuffertem KalziumFormol. Durch Formaldehyd kommt es bei manPhospholipide Fette chen Lipidgruppen zu chemischen VerändeGanglioside Cholesterol und freie Fettsäuren rungen, die es leichter wasserlöslich machen. Sie Sulfatide können dadurch ausgespült werden. Eine tatCerebroside einfache Ester sächliche Lipidfixierung im Sinne einer Vernetzung gelingt nur mit Osmiumtetroxid und Chromsäure. Für die histochemische Darstellung sind bestimmte Eigenschaften der Lipide wichtig. Dazu gehören der physikalische Zustand (flüssig, fest), der abhängig ist von der Sättigung und der Länge der Fettsäuren, und weiters die Differenzierung in hydrophobe und hydrophile Lipide in Abhängigkeit von ihren funktionellen Gruppen. Die Gewebeschnitte lassen sich mit einer sauren Chloroform-Methanol-Mischung entfetten. Mittels wasserfreien Acetons kann man hier selektiv bestimmte Lipide herauslösen. Mehr oder weniger hydrophil

hydrophob

Da man in der Routine auf die besonderen Anforderungen wenig Rücksicht nehmen kann, bleibt die Lipid-Darstellung eher ein Bereich der Forschung.

206

Histologische Färbung

Im Histolabor färbt man: Neutralfett mit Sudanfarbstoffen

• •

Lipofuszin bei der Pigmentidentifizierung

•

Myelinscheiden als neurologische Struktur Beispiele für histochemische Methoden der Forschung: • Nachweis freier Fettsäuren durch Kupfer-Rubinsäure • Nachweis von Cholesterol durch Perchlorsäure-Naphtochinon • Nachweis von ungesättigten Lipiden durch UV-Schiff’sche Methode • Nachweis von Triglyceriden durch Kalziumlipase • Nachweis von cholinhältigen Phospholipiden mit Dichromatsäure-Hämatein • Nachweis von Cerebrosiden durch eine modifizierte PAS-Reaktion

Immunhistologische Methoden sind bis jetzt noch im Hintergrund. Die Mehrzahl der Lipide wirkt nicht antigen. Eine Ausnahme bilden hier Ganglioside. 1. 1.1.

Sudan-III-Färbung Ziel

Darstellung von Neutralfett im Gewebe; Fett erscheint pathologischerweise z.B. nach Knochenfrakturen oder Verletzungen von fettreichen Körperarealen als Fettembolie in Gefäßen. Die Embolie lässt sich so nachweisen (Todesursache). Fettbestandteile von zerfallenden Zellen können als Fetttröpfchen dargestellt werden. Liposarkome können von anderen Tumortypen differenziert werden. 1.2. Prinzip Färbungen mit öllöslichen Farbstoffen basieren auf der größeren Löslichkeit der Farbstoffe in lipoiden Substanzen als im Reagens selbst. Bei dieser physikalischen Methode diffundieren die Farbstoffe von der höheren Konzentration im angebotenen Lösungsmittel zu den Neutralfetten. Sie gehen dabei keine eigentliche Bindung ein und werden deshalb auch als Lysochrome (Sudan III, Sudan IV, Ölrot O) bezeichnet. Das Lösungsmittel (z.B. Aceton, Alkohol) darf jedoch die Lipoide nicht aus dem Gewebe extrahieren. Aufgrund der leicht flüchtigen Lösungsmittel kommt es oft zu Farbniederschlägen in der gesättigten Lösung. Besser ist es in geschlossenen Gefäßen zu färben. Ein häufig verwendeter Farbstoff dieser Gruppe ist Ölrot O, das weniger anfällig für Farbniederschläge ist. (Abb.121) Die Anfärbbarkeit der hydrophoben Lipide ist entsprechend ihrer Zusammensetzung und Sättigung unterschiedlich. Sudan Black B enthält zwei Farbstoff-Hauptkomponenten und mehrere andere und soll möglichst alle Lipidarten anfärben, insbesondere nach Vorbehandlung mit Bromid. Es ist jedoch anfällig für falschpositive Ergebnisse. Fette, die bei diesen Färbetemperaturen fest sind, lassen Abb.121 Ölrot O sich durch die Sudanfarbstoffe nicht

Histotechnik

207

oder schlecht anfärben. Sie liegen in kristalliner Form vor und zeigen Doppelbrechung in polarisiertem Licht (freies Cholesterol). Die Darstellung mit Lysochromen gelingt nur bei flüssigen Lipiden. Um feste Lipide anfärbbar zu machen, muss man sie mit Bromidwasser behandeln. Die Färbung wird am Gefrierschnitt von nativem oder formolfixiertem Gewebe durchgeführt. Der Gefrierschnitt wird luftgetrocknet oder in konz. Formaldehyd fixiert, in Farblösung eingestellt, kurz in 50–70% Alk. gespült bis keine Farbschlieren mehr abgehen, Kernfärbung erfolgt mit Hämalaun. Die Verwendung von positiv-geladenen bzw. mit Chromgelatine beschichteten Objektträgern ist von Vorteil. Gefrierschnitte von fixiertem Gewebe haften kaum auf dem Glas. Solche Schnitte werden deshalb flottierend gefärbt und zum Abschluss auf einen Objektträger aufgebracht. Die Zugabe von Dextrin in der Ölrot-O-Lösung stabilisiert den Farbstoff (nach Churukian). 1.3. Färbeergebnis Neutralfett ............................................................. leuchtend rot Kerne .................................................................................... blau

J. Kohlenhydrat-Darstellung Für den biochemischen Aufbau von Kohlenhydraten siehe Kap. Biochemie. Die Polysaccharide kommen im Körper mehrheitlich als Mischung vor. Zur histochemischen Darstellung bedient man sich der typischen, funktionellen Gruppen (Glykol, Karboxyl- und Estersulfate), wobei die Zuordnung zu den verschiedenen, biochemischen Gruppen nicht möglich ist. Weitere Informationen kann man durch Blockierungsreaktionen oder Enzymandauung oder ihrer Kombination erhalten (Diastase, Amylase, Hyaluronidase, Sialidase). Die Identifikation von Mucosubstanzen oder zumindest der Vergleich ihrer Anfärbbarkeit in Tumoren kann den Ursprung von Metastasen und den Tumortyp aufklären. Heutzutage setzt man hiezu immunhistologische „Anfärbe-Muster“ zur Unterscheidung von epithelialen oder mesenchymalen Zellen ein. 1.

Perjod-Acid-Schiff’sche Reaktion nach McMannus

1.1. Ziel Darstellung von neutralen Mucosubstanzen, Glykogen, Basalmembranen, Pilzen Glykogen, ein Glucosepolymer, ist die Speicherform der Kohlenhydrate und findet sich in Leber, Herz- und Skelettmuskulatur in größeren Mengen. Es gehört zu den Homopolysacchariden und ist aus vielen, gleichen Untergruppen (= Glucose) aufgebaut. Glykogen ist relativ unlöslich in Wasser und kann bei rascher Fixierung dargestellt werden (wird in Protein-Netz sozusagen gefangen). Glykogen wird durch Diastase gelöst (indirekter Nachweis von Glykogen). Um eine positive Glykogendarstellung allein zu erhalten, kann die Blockierungsreaktion mit Dimedon durchgeführt werden.

208

Histologische Färbung

Tabelle 18: PAS-Reaktion der Kohlenhydrate Kohlenhydrate in

PAS-Reaktion

Leberzellen, Skelett- und Herzmuskel, Vaginalepithel als Glykogen

positiv, Diastase sensitiv

Oberflächendrüsen des Magens, Kolloid der Schilddrüse als neutrale Mukosubstanzen

positiv, Diastaseresistenz

Cornea, Knorpel, elastische Arterien, Haut, Herzklappen, Aorta, Nierenpapillen

negativ, Alcianblau positiv bei pH 1

muköser Schleim der Speicheldrüsen, Becherzellen im Colon

negativ, Alcianblau pos.

Becherzellen im Duodenum, Glandulae tracheales, bronchiales

positiv

Glandula sublingualis

positiv

Glaskörper, Synovia, Ganglion

negativ

1.2. Prinzip Die PAS-Färbung ist eine histochemische Reaktion zum Nachweis von bestimmten Kohlenhydraten, deren Glykolgruppen durch die Perjodsäure zu Aldehydgruppen oxidiert werden. Diese reagieren mit dem Schiff’schen Reagens und bewirken eine rot-violette Farbe. Spülen in Metabisulfit entfernt überschüssiges Schiff’sches Reagens und verhindert falsch positive Ergebnisse durch angelagerten Farbstoff an andere Gewebeelemente. Zur Kontrastierung wird eine Kernfärbung mit Hämalaun angeschlossen. Als Gegenfärbung kann man bei der Darstellung von Pilzen auch Lichtgrün verwenden. Wirkung der Perjodsäure: Perjodsäure in der verwendeten Konzentration und Dauer ist fähig eine bestimmte Konstellation von OH-Gruppen unter Abspaltung von Ameisensäure z u Aldehyden zu oxidieren. Diese Glykolgruppierung findet sich in neutralen Zuckern, Sialinsäure und manchen N-acetylamino-Zuckern. Zu den neutralen Zuckern gehören Glucose, Galactose, Mannose und Fucose. Verlängert man die Einwirkung der Perjodsäure um ein Vielfaches, lassen sich auch Alkoholgruppen der Uronsäuren oxidieren (Differenzierung zu Keratanen). Sialinsäure hingegen wird sehr schnell oxidiert und bei der PAS-Methode meist überoxidiert. Sie bedarf einer „sanften“, kurzen Oxidation, um sie selektiv darzustellen. Bei der Verwendung anderer Oxidationsmittel hat sich eine Überoxidation gezeigt. Das heißt, die darzustellenden Strukturen wurden über die Aldehydgruppen hinaus oxidiert und standen so der Reaktion nicht mehr zur Verfügung. Für andere Anwendungen war dies wieder von Vorteil (Chromsäure bei Grocott, Kaliumpermanganat bei Reticulinfärbung). Das Schiff’sche Reagens wird hergestellt, indem man Pararosanilin (basisches Fuchsin) mit schwefeliger Säure behandelt. Schwefelige Säure entfärbt

Abb.122 Bildung der „fuchsinschwefeligen Säure“

209

Histotechnik

Fuchsin. Das Hydrogensulfit-Ion wird an das zentrale C-Atom der Triphenylmethanverbindung addiert und damit das chromophore System unterbrochen. Es entsteht eine farblose Verbindung (= fuchsin-schwefelige Säure), früher bekannt als Leukofuchsin. (Abb.122) "Fuchsinschwefelige Säure" reagiert mit Aldehyden unter Regeneration des chromophoren Systems. Dabei entsteht über ein Carbinolamin ein Diimin, das sich mit schwefliger Säure zu einem mesomeriestabilisierten Kation umsetzt. Man erkennt die Reaktion an der Entwicklung der typischen rot-violetten Farbe. (Abb.123) Beim anschließenden Spülen mit Bisulfit kommt es zu einer Konkurrenzreaktion um die Aldehydgruppen. Überschüssige fuchsinschwefelige Säure wird entfernt.

Abb.123 Entwicklung der rot-violetten Farbe

Schiff’sches Reagens: Für die Herstellung von Schiff’schem Reagens gibt es unterschiedliche Rezepte, wobei die Lösungen auch teilweise erwärmt werden müssen. Hier ein Beispiel von kalt hergestelltem Schiff’schen: Lösung A: 0,5 g ............................................... Pararosanilin 15 ml ............................................. 1N HCl Lösung B: 0,5 g ............................................... Natriumdisulfit 85 ml ............................................. Aqua dest. A und B mischen, über Nacht dunkel stehen lassen, am nächsten Tag durch Aktivkohle filtrieren (durch die Aktivkohle werden überschüssige Schwefelverbindungen entfernt); Schiff’sches Reagens ist farblos, färbt aber Hände und Kleidung rot. Test für Aktivität: füge ein paar Tropfen Schiff’sches zu 5 ml 40%igem Formaldehyd in einer Petrischale. Aktives Schiff’sches: schnell entsteht eine purpurrote Farbe; bläulich-rote Farbe zeigt das Altern des Reagens an. Mit Glutaraldehyd fixierte Proben bedürfen einer Aldehydblockierung vor der Färbung, da sonst falsch positive Ergebnisse auftreten. Eine zu starke Oxidation am Beginn der Färbung verursacht Überoxidation der Alkohole über die Aldehydgruppe hinaus, was zu falsch negativen Ergebnissen führen kann. Zur selektiven Glykogendarstellung bedient man sich seiner Diastase-Empfindlichkeit. Zwei Gewebsschnitte werden PAS gefärbt, wobei einer vorher mit Diastase (oder Amylase) behandelt wird. An Stellen, wo im Kontrollschnitt die Färbung positiv ist und im Diastase-Schnitt negativ, handelt es sich um Glykogen. Die PAS-Färbung kann auch bei anderen Methoden als Zusatzfärbung eingesetzt werden.

210

Histologische Färbung

1.3. Färbeergebnis alle PAS-positiven Strukturen ............................................... rot-violett Glykogen, Pilzzellwände, Basalmembranen, neutrale Mucopolysaccharide, bestimmte epitheliale Sulfomucine und Sialomucine, Sphingomyelin (Gefrierschnitt), Kolloid der Schilddrüse, Pars intermedia der Hypophyse Zellkerne ........................................................................................blau 2.

Best’s Carmin Färbung

2.1. Ziel Darstellung von Glykogen 2.2. Prinzip Carmin gehört zu den großmolekularen, anionischen Farbstoffen mit einer Vielzahl an hydrophoben Gruppen. Man nimmt eine direkte Hydrogenbindung an die Hydroxylgruppen des Glykogens an. Kaliumkarbonat und Kaliumchlorid in der Farblösung begünstigen die Hydrogenbindung. Die Ammoniumhydroxidlösung ergibt einen hohen pH-Wert (10–11) und unterdrückt damit unspezifische Anfärbungen an andere Gewebskomponenten. Die Kernfärbung erfolgt vor der Inkubation mit Eisenhämatoxylin oder Hämalaun. Nach der Färbelösung wird differenziert. Die Fixierung in alkoholischem Fixans wird angeraten. Das Überziehen der Schnitte mit Celloidinhäutchen nach dem Entparaffinieren bewahrt vor dem Abschwimmen und weiterer Glykogenextraktion. Kommt es während der Fixierung zur „Glykogenflucht“ erkennt man eine typisch streifige Anfärbung der Zellen. 2.3. Färbergebnis Glykogen .................................................................helles karmesinrot Fibrin, Mastzellengranula, manche Schleime ................................ rosa Kerne ....................................................................... schwarz bzw. blau 3.

Alcianblau-Färbung

3.1. Ziel Darstellung saurer Mukosubstanzen 3.2. Prinzip Alcianblau ist ein wasserlöslicher, basischer Phtalocyaninfarbstoff. Die blaue Farbe ist zurückzuführen auf das Kupfer im Molekül. Man nimmt an, dass der positiv geladene Farbstoff eine elektrostatische Bindung mit den sauren Abb.124 Alcianblau Gruppen der Mukopolysaccharide (MPS) eingeht, die bei dem sehr sauren pH-Wert 2,5 negativ geladen sind. (Abb.124)

211

Histotechnik

Zur selektiven Darstellung der MPS mit Sulfatgruppen wird der pH Wert der Lösung auf pH 1 gesenkt. Dabei wird die Dissoziation der Carboxylgruppen unterdrückt, die dadurch keine negative Ladung aufweisen. Durch verschiedene Blockierungs- und Restaurierungsmethoden können die Mucine den jeweiligen Untergruppen zugeordnet werden. Die Kernsäuren (Chromatin) werden durch Alcianblau aufgrund seiner Molekülgröße nicht angefärbt. Die Ankopplungsstellen werden nicht erreicht. (1%ige Alcianblaulösung in 3%iger Essigsäure, pH 2,5 oder pH 1 einstellen). stark sulfatierte Mucine: schwach sulfatierte Mucine: Hyaluronsäure und N-acetylSialomucin:

pH 1 gute Anfärbung pH 2,5 – 1 und darunter gute Anfärbung pH 3,2-1,7

gute Anfärbung

Anstelle der Gegenfärbung mit Kernechtrot kann man auch eine PAS-Färbung anschließen, die gleichzeitig die neutralen Mucosubstanzen purpurrot anfärbt. 3.3. Färbeergebnis Saure Schleimsubstanzen .................................... leuchtend blau Kerne .................................................................................hellrot Hintergrund ................................................................... zartrosa

4.

Müller-Mowry-Färbung (Kolloidales Eisen, Hale-Färbung)

4.1. Ziel Darstellung von sauren Mucosubstanzen mit Carboxyl- und Sulfatresten. Insbesondere zur Differenzierung von chromophoben (Hale pos.) zu hellzelligen (Hale neg.) Nierenzellkarzinomen. 4.2. Prinzip Kolloidale Eisenionen reagieren bei niedrigem pH-Wert mit carboxylierten und sulfatierten Schleimsubstanzen. Das überschüssige Reagens wird durch Spülen entfernt und die im Gewebe verbleibenden, dreiwertigen Eisenionen reagieren mit gelbem Blutlaugensalz (= Ferrocyankalium) zu blauem Berlinerblau. 4 FeCl3 + 3 K4Fe(CN)6 Æ Fe4[Fe8CN)6]3 + 12 KCl Als Gegenfärbung wird Kernechtrot als rote Kernfärbung eingesetzt. Es kann eine PAS-Färbung angeschlossen werden. 4.3. Färbeergebnis saure Mucosubstanzen .......................................................... blau Eisenablagerungen, Hämosiderin ......................................... blau Kerne ..................................................................................hellrot Hintergrund ........................................................................... rosa

212 5.

Histologische Färbung

Azur A - Färbung

5.1. Ziel Differenzierte Darstellung von Mucosubstanzen 5.2. Prinzip Sulfatierte und carboxylierte Muzine zeigen im Gegensatz zu neutralen Muzinen metachromatische Effekte. Diese Eigenschaft verändert sich in Abhängigkeit zum pHWert der Lösung. Bei pH 3 zeigen nur sulfatierte Muzine Metachromasie. Die Identifikation mittels Metachromasie ist aber als heikel zu betrachten, da viele Faktoren diese Eigenschaft beeinflussen. Farbstoffe, die den Effekt auslösen, sind Thiazine, Azur A, Toluidinblau. Zuerst erfolgt die Behandlung mit Kaliumpermanganat, was die Aufnahme des Farbstoffs erleichtert und zu Stabilität führt. Dann Bleichen mit Oxalsäurelösung, Einstellen in Färbelösung, Differenzierungsschritt in Uranylnitrat. 5.3. Färbeergebnis Saure Mucosubstanzen .......................................... violett bis rot Hintergrund .......................................................................... blau

6.

Kohlenhydrat-Darstellung mit Lektinen

Lektine sind Proteine pflanzlichen Ursprungs, die fähig sind Glykoproteine zu binden. Als erstes traten sie als Hämagglutinine bei der Blutgruppenserologie in Erscheinung. Die Blutgruppen-Eigenschaften an den Erythrozyten leiten sich von Glykoproteinen an ihrer Oberfläche ab. Lektine können diese ebenso spezifisch binden wie Antikörper. Durch ihre Größe und mittels mehrerer Bindungsstellen sind sie fähig zur Agglutination der Erythrozyten. Die Spezifität gegenüber den unterschiedlichen Glykoproteinen befähigt den Forscher zu deren Identifikation. Sie eignen sich aufgrund ihrer Eigenschaften auch für die Immunhistologie, wo dann der sekundäre Antikörper ein AntiLektin ist (vgl. Kap. Immunhistochemie). Lektine werden entsprechend ihrer Affinität zu den terminalen Zuckern in fünf Gruppen eingeteilt: •

Glucose und Mannose (z.B. Concanavalin A)

•

N-acetylglucosamin

•

Galactose und N-acetylgalactosamin

•

L-Fucose

•

Sialinsäure und Uronsäure

Die Testdurchführungen ähneln denen der Immunhistochemie. Die einfachste Methode ist die Anwendung von fluoreszenzmarkierten Lektinen (direkte Methode). Sie werden in einer Konzentration von 0,1 mg/ml in Wasser oder NaCl gepuffert auf pH 7.0–7,6 auf die Schnitte für 15–60 min aufgebracht. Nach einem Waschschritt wird entweder entwässert und mit einem Eindeckmittel auf Kunststoffbasis oder Wasserbasis (ohne Entwässern) eingedeckt. Damit lassen sich schwer erkennbare Zellen wie z.B.

Histotechnik

213

Mikrogliazellen in Nervengewebe, Nervenfasern, Muskelfasertypen und Teile von Nierentubuli darstellen. Ähnlich wie bei der Immunhistologie müssen die Ergebnisse immer zusammen mit Negativ- und Positivkontrollen und mit Kontrollen der Affinität interpretiert werden. Es gibt auch „Demaskierungsmethoden“ mit Enzymen für bessere Färberesultate. Die Bindung an Gewebeglykoproteine kann durch Zugabe einer großen Menge an Monosacchariden oder passenden Glykosiden kompetitiv gehemmt werden. Im Test werden alle unerwünschten Bindungsstellen durch Glykoside abgesättigt und nur die gewünschten spezifischen Bindungsstellen bleiben aktiv. Weiters gibt es Blockierreagenzien, die bestimmte Bindungsreaktionen hemmen. Z.B. hemmt Acetylierung und Oxidation (durch Perjodsäure) die Bindung von Concanavalin A an Glycosyl- und Mannosylreste.

K. Amyloid-Darstellung Im 19. Jahrhundert wurden bei Obduktionen des öfteren degenerative Organveränderungen mit wachsähnlicher Textur beschrieben, deren Ursprung lange nicht geklärt werden konnte. 1853 wurde ihr stärkeähnliches Verhalten gegenüber der Jodreaktion entdeckt, was zur Namensgebung „Amyloid“ führte (Amylon = Stärke). 1922 wurde Kongorot als Amyloidfarbstoff entdeckt. Nach dem Einsatz von Röntgenstrahlung und Elektronenmikroskopie zur Aufklärung wurden 1971 die Eigenschaften von Amyloid so festgelegt: •

Amyloid ist ein hauptsächlich extrazelluläres, üblicherweise amorphes, eosinophiles Material.

•

Es gibt nach Anfärbung mit Kongorot eine apfelgrüne Doppelbrechung mit polarisiertem Licht.

•

Es zeigt eine charakteristische fibrilläre Struktur.

•

Es ist hauptsächlich zusammengesetzt aus Protein in einer ȕ-Faltblatt-Formation.

Mit modernen Techniken konnte man weitere Erkenntnisse über den Aufbau von Amyloid erhalten. Amyloiddeposits bestehen immer bis zu 15% aus nicht-fibrillärem Glykoprotein. Daran binden bestimmte Glykosaminoglykane, die stets zu finden sind (Heparansulfat, Chondroitinsulfat, Dermatansulfat). Das Glykoprotein ist wahrscheinlich für das Färbeverhalten gegenüber der Jodlösung verantwortlich. Man kann mittlerweile zwanzig verschiedene Amyloide nachweisen, die von verschiedenen Proteinvorläufern gebildet werden. Die kleinste Einheit ist das Protofilament, das wie eine Wendeltreppe aus Strängen in ȕ-Faltblatt-Formation entlang einer Glykoprotein-Achse gebaut ist („Stufen“). Mehrere solcher Protofilamente bilden eine Fibrille in Helix-Struktur. (Abb.125-126) Die Fibrillen sind parallel aneinander gelagert und lassen dabei Spalten in definierter Breite frei. An diese parallelen Strukturen binden wahrscheinlich die Farbstoffe durch Wasserstoffbrückenbildung in ebenso geordneter Weise, worauf die Fähigkeit zur Doppelbrechung hinweist. Wird die geordnete Struktur zerstört, verliert gefärbtes Amyloid diese Eigenschaft. In der Ablagerung liegen die Fasern zusammengefasst in kleineren, parallelen Paketen wirr durcheinander. Der übliche Nachweis von Amyloid ist die Anfärbung mit Kongorot in verschiedenen Varianten. Die Schwierigkeit bei der Darstellung liegt beim Auffinden von kleinen De-

214

Histologische Färbung

posits, aufgrund der schlechteren Anfärbbarkeit nach langer Fixierdauer oder auch bei alten Ablagerungen. Hilfreich ist hier die Doppelbrechung Abb.125-126 Amyloidfibrillenstruktur und Modell in „apfelgrün“, die der Amyloid-Helix mit wiederholten auch kleinere Stellen Einheiten aufdeckt. Kongorot färbt als saurer Farbstoff mehrere Gewebekomponenten an. Das wird durch alkalische Färbelösungen unterdrückt. Unspezifische Anfärbungen erscheinen nicht doppelbrechend. Andere Farbstoffe zeigen auch eine gewisse Affinität (z.B. Siriusrot), aber keine Doppelbrechung. Amyloid zeigt auch Affinität zu fluoreszierenden Farbstoffen, wie Thioflavin. Dieser Test zeichnet sich durch höhere Sensitivität jedoch Verlust von Spezifität aus. Immunhistologische Methoden haben sich auch weiterentwickelt. Leider sind die einzelnen Proteinbausteine nicht so leicht nachzuweisen, da es durch den Einbau in die dichte Amyloidstruktur zu einer Veränderung ihrer antigenen Eigenschaften kommt. Aus diesem Grund sind spezielle Antigenretrieval Prozeduren mit bspw. Ameisensäure oder Guanidinthiocyanid notwendig. Da nun bestimmte Amyloidtypen mit den entsprechenden Erkrankungen in Verbindung gebracht werden, wäre die exakte Identifikation für die Diagnostik sehr vorteilhaft. Aufgrund der Bedeutung von amyloiden Fasern bei Krankheiten wie Alzheimer, Kreuzfeld-Jakob oder Rheuma, wird die Forschung weiter vorangetrieben. Amyloidose ist keine einzelne Erkrankung, sondern eher eine Gruppe diverser krankmachender Prozesse, charakterisiert durch extrazelluläre Ablagerungen, in einem oder vielen Organen. Man unterteilt in primäre und sekundäre Amyloidose. Bei letzterer ist eine meist chronisch infektiöse Erkrankung vorangegangen. 1.

Kongorot nach Highman

1.1. Ziel Darstellung von Amyloid. 1.2. Prinzip Kongorot, ein kolloidaler saurer Diazofarbstoff, lagert sich an die parallel zueinander liegenden Amyloidfibrillen an, wobei es zu einer Wasserstoffbrückenbildung kommt. Bei Betrachtung im polarisierten Licht kommt es zu einer grünen Farbgebung. Kongorotgefärbtes Amyloid erscheint in 2 µm dünnen Schnitten im Fluoreszenzmikroskop (546 nm) leuchtend rot. Nach der Einwirkung des Farbstoffes erfolgt die Differenzierung in alkoholischem Kaliumhydroxid (alkalisch), was unerwünschte Anfärbung von Kollagen und Cytoplasma entfernt. Als Gegenfärbung setzt man Hämalaun als blaue Kernfärbung ein. Bei der „alkalischen Kongorotfärbung nach Puchtler“ erfolgt zuerst die Kernfärbung mit Hämalaun, weiters die Einwirkung von alkalischer Natriumchloridlösung in 80%

215

Histotechnik

Ethanol. Kongorot wird in gesättigter NaCl-Lösung in 80% Alkohol aufgebracht. Bei dieser Methode ist die Farblösung zwar weniger stabil, unspezifische Färbungen werden aber unterdrückt. 1.3. Färbeergebnis Amyloid, elastische Fasern, eosinophile Granula .................... rot in polarisiertem Licht ........................................................... grün bei 546 nm Anregungswellenlänge......................................... rot Kerne .................................................................................... blau

L. Pigment-Darstellung Als Pigment versteht man einen in Körperzellen und -gewebe vorkommenden Stoff in Körnchenform oder in gelöster Form, der eine (meist braun bis schwarze) Eigenfärbung aufweist. Die Eigenschaften dieser Stoffe, insbesondere der Mineralien und der Strukturen nicht-organischen Ursprungs, machen es schwierig, sie zu identifizieren. Über ein Ausschluss-Verfahren kann man sie bestimmten Gruppen zuordnen. Man unterscheidet endogene, exogene und artficielle Pigmente (bspw. fixierungsbedingt, aufgrund von Malaria).

Abb.127 Einteilung der Pigmente

216

Histologische Färbung

Endogene Pigmente: •

hämatogene Pigmente - Abbauprodukte der Blut-, Muskel- und Gallenfarbstoffe (Hämo-, Myoglobin, Hämatoidin, Hämosiderin, Bilirubin)

•

nicht hämatogene Pigmente - lipogene Pigmente (Lipo- und Hämofuszine) - Melanin (Pigmentierung von Haut, Haaren, Iris)

Exogene Pigmente: •

in der Haut: Kohle, Tusche (Tätowierung), Teer, Pulverschmauch, Metalle (z.B. Siderosis)

•

in Verdauungs- und Atmungswegen: Pflanzenfarbstoffe (Carotinoide, Lipochrome), Pikrinsäure, Dinitrophenol etc. bzw. Kohle-, Stein-, Metallstäube (Anthracosis, Silikose)

Abb.128 Identifikationsschema für Pigmente

217

Histotechnik

1.

Berliner-Blau-Reaktion

1.1. Ziel Darstellung von dreiwertigen Eisenionen. Kleine Mengen Eisen findet man normalerweise in der Milz und im Knochenmark. Große Mengen findet man bei Hämochromatose mit Ablagerungen in der Leber und im Pankreas und bei Hämosiderose mit Ablagerungen in Leber, Milz und Lymphknoten. Hämoglobin von zerstörten Erythrozyten wird im Gewebe rasch zu Hämosiderin abgebaut. Mit der Berlinerblaureaktion wird es nachgewiesen. Die Färbung eignet sich event. auch zur Asbestfaserdarstellung in der Lunge. Asbestfasern werden über die Atemluft aufgenommen und werden bald von Protein, das Hämosiderineinlagerungen hat, bedeckt (= asbestos bodies). 1.2. Prinzip Das Eisen von Ferritin und Hämosiderin wird durch die Einwirkung der Salzsäure freigegeben. Die dreiwertigen Eisenionen reagieren sofort mit gelbem Blutlaugensalz (= Ferrocyankalium, Kaliumferrocyanid) zu blauem Berlinerblau. 4 FeCl3 + 3 K4Fe(CN)6 Æ Fe4[Fe8CN)6]3 + 12 KCl Die histochemische Eisenreaktion erfasst nur ionisiertes Eisen, nicht hingegen das in organischen Verbindungen eingelagerte. Das Eisen im Hämoglobin kann nicht ohne drastische Zerstörung am Gewebe freigesetzt werden und entzieht sich daher dieser Darstellung. Da Eisen bei Autolyse frühzeitig die Zellen verlässt, ist eine schnelle Fixierung wünschenswert. Die Einwirkung von Säuren (z.B. bei Entkalkung) kann Eisenionen aus dem Gewebe lösen. Zur Gegenfärbung setzt man Kernechtrot für eine rote Kernfärbung ein. 1.3. Färbeergebnis Eisenablagerungen, Hämosiderin ......................................... blau Kerne ..................................................................................hellrot Hintergrund ........................................................................... rosa

2.

Silberimprägnation nach Fontana-Masson

2.1. Ziel Darstellung von argentaffinen Substanzen (Melanin), argentaffine Granula (z.B. von karzinoiden Tumoren und einigen neurosekretorischen Granula). Man findet Melanin als braunes bis schwarzes Pigment im Ektoderm oder Gewebe ektodermalen Ursprungs (Haar, Haut, Retina, Iris und gewisse Teile des ZNS). In Fällen pathologischer Veränderung findet man Melanin und seine Vorstufen in Melanomen und anderen Tumoren.

218

Histologische Färbung

Melanin entsteht aus Tyrosin, das durch Tyrosinase (DOPA-oxidase) zu Dihydroxyphenylalanin (DOPA) oxidiert wird, dann weiter zu Melanin. Es ist unlöslich in Wasser; schwache Säuren und Alkalien greifen es nicht an, wohl aber starke Säuren und Laugen. Melanin ist unlöslich in organischen Lösungsmitteln und kann zuverlässig gebleicht werden. Es ist nicht mit Fettfärbungen darstellbar, enthält kein Eisen und ist PAS-negativ. Es hat eine reduzierende Eigenschaft, sodass es eine positive „Schmorl'sche Reaktion“ zeigt und Silbersalze reduziert. Im Cytoplasma findet man es gebunden an Proteine als sogenannte Melaningranula. Nachweismethoden für Melanin umfassen reduzierende Techniken, TyrosinaseEnzymnachweise, Löslichkeits- und Bleichtests, Fluoreszenz und Immunhistochemie. 2.2. Prinzip Melanin ist ein argentaffines Pigment. D.h. es reduziert in ammoniakalischen Silberlösungen die Ionen zu metallischem Silber. Weiters werden die Silberniederschläge mittels Goldchlorid getönt. Dann erfolgen die Fixierung mittels Natriumthiosulfat und eine Kernfärbung zur Kontrastierung. Die Methode ist nicht spezifisch; andere reduzierende Substanzen (z.B. Formalinpigment) ergeben auch eine positive Reaktion. Als Gegenfärbung wird Kernechtrot für eine rote Kernfärbung eingesetzt. 2.3. Färbeergebnis Melanin, argentaffine Granula .........................................schwarz Zellkerne.................................................................................. rot Hintergrund ....................................................................... rötlich

3.

Schmorl-Reaktion

3.1. Ziel Darstellung von Lipofuszin, Melanin 3.2. Prinzip Melanin und Lipofuszin können durch ihre reduzierende Eigenschaft Kaliumferricyanid in Kaliumferrocyanid umwandeln. Dieses bildet in der Gegenwart von dreiwertigem Eisen Berliner-Blau. Man kann eine VanGieson-Färbung anschließen. Lipofuszin entsteht durch einen langsamen Oxidationsprozess aus Lipiden und Lipoproteinen. Es sind deshalb unterschiedlich starke Anfärbungen je nach Alter zu erwarten. Zur exakten Identifikation sollte ein Schema von Färbungen durchgeführt werden (PAS, Schmorl, Ziehl-Neelsen, Sudan black B, Aldehyd Fuchsin, Fontana-Masson). 3.3. Färbeergebnis Lipofuszin, auch Melanin, Gallenfarbstoffe, Hämatoidin, argentaffine, chromaffine Zellen ....................verschiedene Schattierungen von blau-schwarz

219

Histotechnik

4.

Hall-Färbung (Fouchet)

4.1. Ziel Bilirubin ist der wichtigste Gallenfarbstoff und ist ein normales Produkt beim Erythrozytenabbau. Der Gallenfarbstoff umfasst meist ein Gemisch aus Biliverdin und an Glucuronid konjugiertes und unkonjugiertes Bilirubin. Erhöhte Mengen an Gallenfarbstoff können auf eine Verlegung der Gallengänge innerhalb oder außerhalb der Leber deuten. Bei Patienten mit Lebertransplantation ist die Differenzierung in Gallenfarbstoff und Lipofuszin-Pigment wichtig. Gallenfarbstoffe sind nicht autofluoreszent im Gegensatz zu Lipofuszin. 4.2. Prinzip Eisenchlorid bewirkt bei Anwesenheit von Trichloressigsäure durch Oxidation die Umwandlung von Bilirubin in das grüne Biliverdin und das blaue Cholecyanin. Die Farbschattierung reicht von olivgrün bis smaragdgrün in Abhängigkeit von der Menge an Gallenfarbstoff. Angeschlossen wird eine Anfärbung mit VanGieson (= Pikrofuchsin) zur Kontrasterhöhung. 4.3. Färbeergebnis Gallenpigment ..................................................................... grün Muskel und Zytoplasma.........................................................gelb Kollagen .................................................................................. rot

5.

von Kossa-Silberimprägnation

5.1. Ziel Indirekter Nachweis von Kalzium im Gewebe durch Darstellung von Phosphaten und Karbonaten. Abnormale Ablagerungen von Kalzium (-Karbonat, -Phosphat; Kalk) kann man in sämtlichen Gewebetypen finden. In der HE-Färbung wird Kalk dunkelblau dargestellt. 5.2. Prinzip Die Nachweismethode basiert auf den Vorgängen der Versilberung. Die Gewebefixierung muss in neutraler Lösung erfolgt sein. Es handelt sich dabei um eine indirekte Methode, die Kalziumionen sichtbar zu machen. Die in der Silbernitratlösung angebotenen Silberionen reagieren mit den Karbonat- und Phosphationen des Kalkes und verdrängen die Kalziumionen. Diese Silberionen werden durch starke Lichteinwirkung zu metallischem Silber reduziert. Nicht reduziertes Silber wird durch Natriumthiosulfat entfernt (Fixierung). Eine Kernfärbung wird zur Kontrastierung angeschlossen. CaCO3 + 2Ag+ Æ Ag2CO3 + Ca2+ Ca3(PO4)2 + 6Ag+ Æ 2Ag3PO4 + 3Ca2+

220

Histologische Färbung

Diese Technik funktioniert zuverlässig bei Kalziumkarbonat und Kalziumphosphat – nicht aber bei Kalziumoxalat. Bei Verwendung von nicht-gepuffertem Formalin kann es zu falsch positiven Reaktionen kommen, da Formalinniederschläge Silber ebenso reduzieren können. Die erzielte Silberreaktion kann auch differenziert werden, indem man die Präparate in Abschwächer der Fotografie-Technik stellt (Mischung aus 1 Teil 10% wässrigem Kaliumhexacyanoferrat (III) und 9 Teilen 10% wässriger Natriumthiosulfatlösung). Als Gegenfärbung wird Kernechtrot für eine rote Kernfärbung eingesetzt. 5.3. Färbeergebnis Kalziumsalze ....................................................................schwarz Zellkerne ................................................................................. rot

6.

Alizarinrot S-Färbung

6.1. Ziel Darstellung von Kalzium 6.2. Prinzip Alizarinrot S bildet mit Kalzium einen Chelatkomplex. Bei pH 4,2 soll es zu einer spezifischen Anfärbung kommen. Die vonKossa-Methode ist im Routinelabor mehr vertreten. 6.3. Färbeergebnis Kalziumablagerung ..................................................... orange-rot

7.

Rhodanin-Färbung

7.1. Ziel Darstellung von Kupfer-Ablagerungen, wie sie bei Mb. Wilson in der Leber vorkommen. 7.2. Prinzip Das Reagens (p-Dimethylaminobenzylidenerhodanin) bildet mit den Kupferionen einen rötlich-braunen Farbkomplex. Als Gegenfärbung kommt Hämalaun als blaue Kernfärbung zum Einsatz. 7.3. Färbeergebnis Kupfer............................................................... hellrot bis orange Zellkerne................................................................................ blau

Histotechnik

221

M. Mikroorganismen-Darstellung Für detailreiche Erklärungen über Mikroorganismen verweise ich auf entsprechende Literatur. Bei der Fixierung mit Formaldehyd werden die im Gewebe enthaltenen Mikroorganismen abgetötet. Die Behandlung mit den Reagenzien des Einbettungsprozesses tut das ihre, sodass das paraffindurchtränkte Gewebe keine Infektionsquelle mehr darstellt. Eine besondere Stellung nehmen hier die Prionen (Erreger der Kreutzfeld-Jakob-Krankheit) ein. Da es sich hier um Proteine handelt, hat die übliche Behandlung zuwenig Wirkung auf die Prionen. Gewebe und Schnitte bleiben infektiös. Die Einwirkung von 96% Ameisensäure über eine Stunde auf fixiertes Gewebe gefolgt von längerem Spülen soll die Prionen deaktivieren ohne das Gewebe zu sehr in Mitleidenschaft zu ziehen. Die Diagnose infektiöser Erkrankungen beginnt bei den klinischen Untersuchungen und führt zur Austestung im mikrobiologischen, serologischen und histologischen Labor. Bei eingesandtem Gewebe kann die AnOrganismus Größe wesenheit von Mikroorganismen offensichtlich Viren 20-300 nm sein (Eiter, Cysten, Pseudomembranen) oder indirekt durch Entzündungszeichen im Mycoplasmen 125-350 nm Histoschnitt angezeigt werden. In der HEChlamydien 200-1000 nm Färbung werden viele Mikroorganismen angeRickettsien 300-1200 nm färbt. Zur besonderen Darstellung in der Bakterien 1-14 µm Lichtmikroskopie gibt es Spezialfärbungen. ViPilze 2-200 µm ren kann man im Elektronenmikroskop visualiProtozoen 1-50 µm sieren. Weiters stehen immunhistologische und molekularbiologische Techniken zur VerfüMetazoen 3-10 mm gung.

1.

Gramfärbung

1.1. Ziel Darstellung von Bakterien und Unterscheidung in gram-positive und gram-negative Mikroorganismen. 1.2. Prinzip Grampositive und gramnegative Mikroorganismen nehmen alle den Farbstoff (Kristallviolett) auf. Die Behandlung mit Jodlösung stabilisiert den Farbstoff in der Bakterienwand. Beim Differenzieren mit Aceton werden die gramnegativen Bakterien wieder entfärbt. Die Zellwandeigenschaften der grampositiven Bakterien verhindern das Auswaschen. Die biochemischen Hintergründe sind trotz des Alters dieser Technik noch immer unklar. Man nimmt an, dass die Zellwandeigenschaften dieses Verhalten hervorrufen. Die äußere Peptidoglycan-Schicht soll den Kristallviolett-Jodkomplex zurückhalten. Bei gram-negativen Bakterien ist diese Schicht dünner und wird durch den Differenzierungsschritt angegriffen. Manche Bakterien haben eine so dicke Zellwand, dass der Farbstoff erst gar nicht eindringen kann. Sie erscheinen auch gram-negativ. Abgestorbene gram-positive Bakterien werden gram-negativ.

222

Histologische Färbung

1.3. Färbeergebnis grampositive Bakterien ........................................................ blau gramnegative Bakterien ......................................................... rot Kerne ...................................................................................... rot

2.

Ziehl-Neelsen-Färbung

2.1. Ziel Nachweis von säurefesten Stäbchen (Mycobakterien) 2.2. Prinzip Die Lipoid-Kapsel der säurefesten Organismen nimmt, unterstützt durch den Einfluss von Wärme und Phenolsäure, Karbolfuchsin auf. Sie widersteht der Entfärbung durch Salzsäure Alkohol. Auch die übrigen Bakterien ohne Wachskapsel nehmen den Farbstoff auf, werden aber durch Salzsäure-Alkohol wieder entfärbt. Die Lipoid-Kapsel der Mycobakterien hat ein so großes Molekulargewicht, dass sie bei Raumtemperatur wachsförmig ist und so das Eindringen des wässrigen Gegenfarbstoffs Methylenblau verhindert. Bei Mycobakterienarten mit zarter Wachsstruktur kann beim Entparaffinieren die Zellwand zerstört werden. Als Folge funktioniert die Anfärbung nicht (Lepramycobakterien). Beim Absterben verlieren die Bakterien die lipide Hülle und auch ihre Anfärbbarkeit. Mycobakterien sind PAS-positiv und GMSpositiv, was bei schlecht funktionierender ZN-Färbung hilfreich sein kann. Um falsch-positive Ergebnisse durch Kontamination mit bakterienhältigem Leitungswasser zu umgehen, ist als Spülmittel vor der Inkubation ausschließlich Aqua dest. einzusetzen. Mycobacterium tuberculosis Das sind schlanke, 0,4 µm breite und 3–4 µm lange, säurefeste Stäbchen, die keine Sporen bilden und unbeweglich sind. Tb können je nach Stamm als Einzelzellen vorliegen oder Aggregate aus Hunderten von Zellen bilden, so dass zopfartige Strukturen sichtbar werden. Wachsen aerob; Tb weisen eine dicke Zellwand mit Schichtstruktur auf: Zytoplasmamembran – Murein (Proteine, Polysaccharide, Phosphatide, Glykolipide und Wachse)

2.3. Färbeergebnis säurefeste Stäbchen ................................................................ rot Hintergrund und andere Bakterien ....................................... blau

3.

Silberimprägnation nach Grocott-Gomori (GMS)

3.1. Ziel Darstellung von Pilzen, Pneumocystis carinii 3.2. Prinzip Pilze sind relativ große Mikroorganismen. Ihre Zellwände sind reich an Glykoproteinen, die durch Versilberung oder Schiff’sche Reaktion dargestellt werden können.

223

Histotechnik

Die funktionellen Gruppen der Glykoproteine in den Zellwänden der Pilze und anderen glykoproteinhaltigen Strukturen werden durch die Chromsäure zu Aldehyden oxidiert. Die Chromsäure oxidiert so stark, dass sie einen Anteil der entstandenen Aldehydgruppen zu nicht reagierenden Endprodukten weiteroxidiert. Dadurch werden die schwächeren Hintergrundreaktionen von Kollagenfasern und Basalmembranen unterdrückt. Nur Substanzen, die eine große Menge an Glykoproteinen enthalten, wie z.B. Pilzzellwände und Schleimsubstanzen, aber auch Glykogen verbleiben reaktiv mit der Methenamin-Silberlösung und reduzieren sie zu metallischem Silber. Die Inkubationslösung enthält die löslichen Diaminsilberionen, die sich mit Methenamin in basischem Milieu bilden. Natriumtetraborat agiert als Puffer (pH 9). Goldchlorid wird zum Tönen eingesetzt. Natriumthiosulfat entfernt beim Fixierschritt das nicht reduzierte Silber. Als Gegenfärbung verwendet man Lichtgrün. (Abb.129) Pilze lassen sich auch gut durch die C AS-Färbung (Chromsäure-Schiff-Färbung) darstellen. Hier wird die Perjodsäure der gebräuchlichen PAS-Färbung durch Chromsäure ersetzt und ansonsten die Technik beibehalten.

Abb.129 Lichtgrün SF

Pneumocystis carinii: Pneumocystis carinii ist der Erreger der Pneumozystose, die sich vorwiegend in einer interstitiellen Pneumonie bei Kleinkindern und Patienten mit Immunsuppression manifestiert. Es handelt sich wahrscheinlich um ein Protozoon. Man unterscheidet im Entwicklungszyklus Trophozoiten, präzystische und intrazystische Stadien. Die Entwicklung erfolgt in den Alveolen der Lunge bis zu den Zysten (7–10 µm), die eine dicke Wand haben und mehrere intrazystische Stadien beinhalten.

3.3. Färbeergebnis Pilze, P. carinii, Actinomyceten und verwandte Spezies .................................................. schwarz Schleimsubstanzen ................................................................grau Hintergrund ......................................................................... grün Harnsäure und Urate ....................................................... schwarz

4.

Warthin-Starry-Versilberung

4.1. Ziel Darstellung von Spirochäten (Treponema pallidum); Helicobacter pylori (= Campylobacter pyloridis), Calymmatobacterium granulomatis (Donovankörper), Erreger der Catscratch-Disease (Bartonella henselae) und Borreliose (B.burgdorferi) 4.2. Prinzip Es handelt sich um eine argyrophile Darstellungsmethode. Die Bakterien können Silberionen aus der Lösung binden, benötigen aber zum Reduzieren ein Reduktionsmittel. Die Schnitte werden in saurer Silberlösung sensibilisiert. Das Reduktionsmittel

224

Histologische Färbung

enthält Silberionen und Hydrochinon in Gelatinelösung. Um das optimale Färbeergebnis zu ermitteln, sollte man mehrere Schnitte unterschiedlich lange inkubieren. Helicobacter pylori: Es handelt sich dabei und helikale, spiralig gekrümmte gramnegative Stäbchen, die 0,2–0,5 µm dick und 0,5–5 µm lang sind. Sie zeigen an einem oder an beiden Polen eine einzige Geißel. Sie wachsen aerob, zeigen starke Urease-Aktivität Man findet sie gehäuft im Magenantrum an den schleimbildenden Zellen, bei Typ B-Gastritis in 60–90% der Fälle.

Weitere Färbungen für Hp sind Alciangelb-Toluidinblau, Steiner, Gimenez, und Giemsa. Hp kann auch immunhistologisch dargestellt werden. 4.3. Färbeergebnis Spirochäten .....................................................................schwarz Donovankörper ...............................................................schwarz

N. Darstellung neurologischer Strukturen Neuropathologie gehört zu den spezialisierten Gebieten der morphologischen Diagnostik und wird selten in einer Routinehistologie zu finden sein. Probengut der Neuropathologie: •

Gehirnbiopsien (von Operationen)

•

Biopsien von peripheren Nerven

•

Biopsien der Hypophyse

•

Skelettmuskelbiopsien

•

Gesamtes Gehirn (Autopsie)

• Rückenmark (Autopsie) Die Gewebeproben sind meist sehr klein und empfindlich auf Quetschung und Austrocknung. Sie sollten nativ und gegen Austrocknung geschützt möglichst rasch ins Labor gebracht werden. Je nach Anforderung werden Teile der Probe einerseits für Gefrierschnitte tiefgefroren und andererseits für Kunststoff- oder Paraffineinbettung fixiert, bzw. für die Elektronenmikroskopie vorbereitet. Gehirne werden im Ganzen fixiert. Nach 3–4 Wochen sind sie meist fest genug, um in Scheiben geschnitten zu werden. Die Stabilisierung durch Mikrowellen verspricht eine schnelle Festigung des Gehirns, sodass es hier gleich in Scheiben geschnitten werden kann (siehe Kap. Mikrowellentechnik). Große Abschnitte des Gehirns können auch im Ganzen in Polyethylenglykol eingebettet werden und an speziellen Mikrotomen (Tetrander) geschnitten werden. Für periphere Nervenfasern gibt es die Verarbeitung zu Zupfpräparaten. Dabei werden Nerven unter mikroskopischer Kontrolle in kleinere Bündelchen geteilt, die dann mit Osmiumtetroxid geschwärzt und mit Kunststoff-Monomer durchtränkt werden. Die geschwärzten Fasern werden herausgezupft und auf einem Objektträger angeordnet und mit einem Deckglas bedeckt. Das Präparat härtet aus und wird mikroskopiert. Bei Muskelbiopsien führt die Fixierung in neutral gepuffertem Formalin zu einer starken Gewebeverzerrung. Um dem entgegenzuwirken sollten die Stückchen zuerst auf einer Unterlage anhaften, bevor sie in die Fixierlösung gebracht werden. Die bessere

Histotechnik

225

Methode zur Beurteilung von Muskelbiopsien sind Gefrierschnitte. Hier werden die transversal geschnittenen Muskelstückchen in gekühltem Isopentan auf einem Bad von flüssigem Stickstoff zu einem Gefrierblock orientiert. Der Aufbau des Nervensystems ist sehr komplex. Man unterteilt in animales und vegetatives Nervensystem mit sensorischen und motorischen Verbindungen, die Erregungen in entsprechender Richtung leiten. Ziel und Ausgangspunkt dieser Erregungen sind Kerngebiete im Gehirn und Rückenmark, der sog. g rauen Substanz. Um diese Kerne sind die Leitungen, Fasern, die sog. weiße Substanz, verteilt. Eine weitere Gliederung ist jene in Z entralnervensystem (= Gehirn und Rückenmark) und peripheres Nervensystem (Ganglien, Nerven). Die erregungsleitende Struktur des Nervensystems ist die Nervenzelle. Diese liegen in Ketten hintereinander geschaltet. Sie bestehen aus dem Perikaryon (Zellleib), den Dendriten (rezeptive Strukturen) und dem Neurit (Axon, Weiterleitung). Die Morphologie der Nervenzellen ist je nach Funktion sehr unterschiedlich. Bei den Nervenfasern unterscheidet man markscheidenführende und markscheidenfreie. Die Nervenfasern werden im ZNS durch Glia zu Bahnen, im peripheren NS durch Bindegewebe zu Nerven verbunden. Die Erregungsübertragung von einer Nervenzelle auf die nächste erfolgt an Synapsen durch Neurotransmittersubstanzen. Die Gliazellen der Neuroglia dienen dem Stofftransport, der Markscheidenbildung, dem Aufbau mechanischer Strukturen, der Isolierung und der Narbenbildung. Sie sind bei Degenerations- und Regenerationsvorgängen beteiligt und sind Hauptquelle von Tumoren im ZNS. Die Gliazellen der Makroglia im ZNS heißen Astrozyten (sternförmig in Versilberungen). Ganglien gehören zum peripheren NS und stehen mit den Nerven in Verbindung. Man unterscheidet sensible und vegetative Ganglienzellen, die meist feinverteilte Nissl-Substanz und eventuell Lipofuszin enthalten und in lockerem Bindegewebe zusammengefasst sind. Myelin ist die isolierende Schicht, die die Nervenfasern im peripheren NS umgibt und von den Schwann’schen Zellen gebildet wird. Myelin besteht aus speziellen Proteinen, Lipiden und Cerebrosiden. Die histotechnische Darstellung von neurologischen Strukturen wird hauptsächlich durch empirisch entwickelte Versilberungen durchgeführt. Es besteht eine Vielzahl an Variationen. Es gibt auch einige Farbstoffe, die Affinitäten zu neurologischen Strukturen zeigen. Nissl-Substanz lässt sich durch viele basische Farbstoffe anfärben (Methylenblau, Azur, Thionin, Toluidinblau, Kresylechtviolett). Die neueren Entwicklungen erlauben die Darstellung mittels immunhistologischer Techniken. Ein wachsendes Gebiet der Neurohistologie ist die Erforschung der Demenzen und ihrer Ursachen. Dazu gehören bspw. die Alzheimerkrankheit oder die KreutzfeldJakob-Krankheit mit ihren speziellen Erscheinungsformen im histologischen Schnitt. 1.

Kresylechtfärbung

1.1. Ziel Darstellung von Nissl-Substanz, Übersichtsfärbung der Neurohistologie

226

Histologische Färbung

1.2. Prinzip Ionenbindung des basischen Farbstoffes an die im Cytoplasma fein verteilte Granula. Kresylecht färbt nicht nur Nissl-Substanz, sondern auch Kerne und Myelinscheiden, was durch einen Differenzierungsschritt in 0,25% Essigsäure auf das gewünschte Maß reduziert wird. 1.3. Färbeergebnis Nissl-Substanz ...........................................violett bis dunkelblau Neurone ................................................ schwach violett bis blau Zellkerne .................................................................... violett-blau 2.

Versilberung nach Bielschowsky

2.1. Ziel Darstellung von Axonen 2.2. Prinzip Versilberung. Zuerst lagern sich Silberionen aus einer Silbernitratlösung an. Durch Einwirkung von ammoniakalischer Silberlösung in einem zweiten Schritt wird dies noch verstärkt. Danach wird Formalin als Entwickler zugesetzt. Die Entwicklerlösung enthält Gelatine, um der Silberpräzipitation entgegen zu wirken. Es erfolgt wieder Tönen durch Goldchlorid und Fixieren durch Natriumthiosulfat. Das Spülen in ammoniakalischem Wasser vor der Färbung reduziert die Hintergrundfärbung. Färbt man mehrere Schnitte parallel, erhöht sich die Chance auf ein optimales Färbeergebnis. 2.3. Färbeergebnis Axone, Neurofibrillen, Dendrite ......................................schwarz 3.

Luxol-Fast-Blue nach Klüver-Barrera

3.1. Ziel Darstellung von Myelinscheiden als umgebendes Material von Nervenfasern. 3.2. Prinzip Luxol-Fast-Blue ist der alkohollösliche Gegenpart zum wasserlöslichen Alcianblau (Kupfer-Phtalocyanin) und zeigt eine starke Affinität zu Phospholipiden und starken Cholinbasen. Die Anfärbung der Lipoproteine erfolgt durch Ionenbindung. Es erfolgt zuerst eine Überfärbung der wieder solange differenziert werden, bis Zur Gegenfärbung wird Kresylechtviolett bung noch vertieft. Es kann aber auch schlossen werden.

Strukturen, die in Lithiumcarbonat-Lösung graue und weiße Substanz erkennbar sind. (siehe oben) eingesetzt, was die Myelinfäreine PAS oder Hämatoxylinfärbung ange-

Histotechnik

227

3.3. Färbeergebnis Myelin, phospholipidhältig...................................... blau bis grün Kerne, Nisslsubstanz..............................................pink bis violett

4.

PTAH-Färbung (Phosphorwolframsäure-Hämatoxylin nach Mallory)

4.1. Ziel Darstellung von Astrozyten (reaktiv, Proliferation, Differenzierung in Neoplasma) 4.2. Prinzip Die Schnitte werden in Zenker (quecksilberhältig) umfixiert und in Lugol’sche Jodlösung und 96% Alkohol gebracht, um die Quecksilberniederschläge zu entfernen. Nach Oxidation mit Kaliumpermanganat erfolgt die Entfärbung in Oxalsäure. Dann erfolgt die Inkubation in PTAH für 12–24 Std. bis zum gewünschten Ergebnis. 4.3. Färbeergebnis Astrozyten-Fibrillen .............................................................. blau Kerne .................................................................................... blau Myelin ................................................................................... blau Neurone ............................................................................... rosa

O. Nukleinsäuren-Darstellung Nukleoproteine sind Kombinationen von basischen Proteinen (Protaminen und Histonen) und Nukleinsäuren. Desoxyribonukleinsäure (DNA) findet man im Zellkern, Ribonukleinsäure (RNA) findet man hauptsächlich in den Ribosomen. Die Untereinheit von DNA und RNA nennt man Nukleotid. Ein Nukleotid besteht aus einer Phosphat- und einer Zuckergruppe mit einem anhaftenden Basenring. Der Zucker in DNA ist Desoxyribose, in RNA ist es Ribose (siehe Biochemie). Durch Hydrolyse (Einwirkung von Hitze und Säure) zerfallen Nukleinsäuren in Phosphatgruppen, Zucker und Basen. Die Darstellung der Nukleinsäuren ist einerseits bedingt durch die Reaktion der Farbstoffe mit den Phosphatgruppen und andererseits durch die Bildung von Aldehyden aus dem Zucker Desoxyribose. Für die Basen gibt es keine histochemischen Methoden. Das optimale Fixiermittel für Nukleinsäure ist alkohol- und säurehältig (Karnoy). Formalin ist für die Routinehistologie akzeptabel. Fixierung bei tiefen Temperaturen (4°C) in gepuffertem Formalin ist für nachfolgende, molekularbiologische Techniken vorteilhaft. Durch starke Säuren werden Nukleinsäuren mit fortschreitender Dauer extrahiert. Dies kann bei Fixierung mit Bouin bzw. Entkalkung mit Salpetersäure auftreten. Hier ist die Anwendung von EDTA als Chelatbildner vorzuziehen. Nukleinsäuren lassen sich durch Enzyme (Ribonuklease, Desoxyribonuklease) gezielt extrahieren. Chemische Extraktion gelingt mit Hitze und starken Säuren (Trichloressigsäure, Perchlorsäure).

228

Histologische Färbung

Zu den darstellenden Techniken gehören: •

Feulgenreaktion

•

Methylgrün-Pyronin-Färbung: DNA färbt sich mit Methylgrün bläulich-grün. RNA färbt sich mit Pyronin rosa bis rot.

•

Fluoreszenz mit Acridinorange (und anderen Fluorochromen)

•

Gallocyanin-Chromalaun-Färbung

•

Die sensitivste Methode ist die Identifikation der DNA mittels in-situ-Hybridisierung.

1.

Feulgenreaktion

1.1. Ziel Darstellung von DNA, in Kombination mit Mikrodensitometrie zur Darstellung von Zellploidie. Die Intensität der Feulgenfärbung ist proportional zur Konzentration der Nukleinsäure. 1.2. Prinzip Milde, saure Hydrolyse (1M HCl, 60°C) bricht die Zuckerbindung auf. Die entstehenden Aldehydgruppen werden durch die Schiff’sche Reaktion nachgewiesen (siehe PAS). Weiters erfolgt die Gegenfärbung mit Lichtgrün je nach Vorliebe. RNA wird nicht dargestellt. Das Ausmaß der Hydrolyse ist hier die kritische Größe. Eine zu starke Hydrolyse kann zu einem falsch-negativen Ergebnis führen. Dabei muss man die durch das Fixativ bedingte Hydrolyse miteinbeziehen. Für Formaldehyd liegt die Hydrolysezeit bei 8 min. Aldehydgruppen, die durch ein Fixans (z.B. Glutaraldehyd) ins Gewebe gebracht wurden, oder von vornherein bestanden, müssen mittels Natriumborohydrid blockiert werden. 1.3. Färbeergebnis DNA ............................................................................ rot-violett Cytoplasma .......................................................................... grün

P. Darstellung von biogenen Aminen Diese Stoffgruppe gehört zu den sehr kleinen, leicht löslichen Substanzen, deren Nachweis in der Routinehistologie kaum vorkommt. Um sie zu erfassen, bedarf es meist der Gefriertrocknung. Zu den am Histoschnitt nachweisbaren Aminen gehören Dopamin, Adrenalin, Noradrenalin, Serotonin und Histamin. Am Ort ihrer Ausschüttung findet man sie in größeren Mengen, meist gebunden an eine Proteinmatrix. Adrenalin-, Noradrenalin- und Dopamin-hältige Zellen nennt man „chromaffin“, da sie nach Dichromatfixierung bräunlich erscheinen.

Histotechnik

229

Serotonin: Zellen, die Serotonin beinhalten nennt man argentaffine Zellen entsprechend ihrem Verhalten gegenüber ammoniakalischen Silberlösungen. Die Darstellung erfolgt aufgrund der Phenol-Gruppe des Serotonins, die als Reaktionspartner für eine Azokupplung fungiert. Sensitivere Techniken benötigt man, um diese Substanzen in Neuronen darzustellen. Dabei entstehen z.B. mit den angebotenen Reaktionspartnern fluoreszierende Endprodukte.

Q. Darstellung funktioneller Gruppen Diese Techniken kommen kaum im Routinebetrieb vor. Formalinfixierung ist ausreichend, besser sind Mischungen auf Alkoholbasis wie z.B. Karnoy’s. Die chromogenen Reaktionen sind oft nicht sehr spezifisch und müssen durch „Blockierungsreaktionen“ aussagekräftiger gemacht werden. Beispiele (in vereinfachter Erklärung): •

Hydroxylgruppen (primäre, sekundäre Alkohole in Kohlenhydraten, Aminosäuren): werden in Sulphatester umgewandelt, die sich durch kationische Farbstoffe bei pH 1,0 anfärben lassen.

•

Karbonsäuren (in Glykoproteinen und Proteoglykanen, Fettsäuren, Proteinen): zur Darstellung von Karbonsäuren in Proteinen werden die funktionellen Gruppen in Ketone umgewandelt, die an ein Reagens binden, das eine Naphtolgruppe enthält. Die Naphtolgruppe reagiert mit einem Diazoniumsalz zu einem farbigen Produkt.

•

Aminogruppen (z.B. primäre NH2-Gruppen in Lysin): Hydroxynaphtaldehyd reagiert mit der funktionellen Gruppe, sodass ein Naphtol an diesem Ort mit einem Diazoniumsalz zu einem farbigen Produkt reagieren kann.

•

Aldehyde: Aldehyde werden oft während histochemischer Prozeduren erzeugt (Feulgen, PAS, Versilberungen) und durch ihre reduzierende Wirkung dargestellt. Oder durch Anbindung von Naphtol durch ein entsprechendes Reagens und Reaktion mit einem Diazoniumsalz entsteht ein farbiges Produkt.

R. Knochenfärbungen Siehe: Kapitel „Verarbeitung von hartem Gewebe“; Hier werden die Techniken zur Darstellung von entmineralisiertem Knochen in Paraffineinbettung und von mineralisiertem Knochen in Kunststoffeinbettung beschrieben. Im Histodiagnostiklabor werden keine Unterschiede zwischen entkalktem und „normalem“ Gewebe bezüglich der Spezialfärbungen gemacht. Die Säureeinwirkung kann aber das Ergebnis beeinflussen (z.B. falsch-negative Berlinerblau-Färbung, FeulgenFärbung, schlechte Kernanfärbbarkeit).

230

Histologische Färbung

S. Nachbehandlung der Schnitte Zur Erinnerung nochmals das allgemeine Schema einer histologischen Färbung: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Antrocknen der Schnitte im 60°C- (Umluft-)Brutschrank ................. 25–30 min Entparaffinieren in Clearingreagens (Xylol).......................................... 3x5 min Rehydrieren in absteigender Alkoholreihe bis Aqua dest.................je 1–2 min Einwirkung der Färbereagenzien nach bestimmtem Rezept Dehydrieren in aufsteigender Alkoholreihe bis Alk.abs. ...................je 1–2 min Klären in Clearingreagens (Xylol) Eindecken mit Eindeckmedium und Deckgläschen

Die meisten Färberezepte enden mit einem Spülschritt, wo überschüssiger Farbstoff noch entfernt wird, und schließlich befindet sich der gefärbte Histoschnitt in einem wässrigen oder alkoholischen Medium. Die folgenden Schritte geschehen in der Absicht, ein permanentes, gut mikroskopierbares Präparat herzustellen, das möglichst vor dem Ausbleichen der Farben bewahrt wird. Außerdem soll es gegen mechanische und bakterielle Einwirkungen geschützt sein. Zu diesem Zweck muss der Schnitt „eingedeckt“, das heißt mit einem Eindeckmedium und einem Deckglas bedeckt und luftdicht eingeschlossen werden. Heutzutage verwendet man fast ausschließlich Eindeckmedien auf Kunststoffbasis. Diese sind löslich in organischen Lösungsmitteln, wie z.B. Xylol, Butylacetat und ihren Substituten (Clearingreagenzien), und härten durch Verdampfen des Lösungsmittels aus. Im festen Zustand zeigen sie einen ähnlichen Brechungsindex wie Glas, wodurch die Mikroskopiequalität optimiert wird. Die künstlichen Einschlussmittel haben die natürlichen, wie z.B. Kanadabalsam, im Histodiagnostiklabor verdrängt. Nachdem hauptsächlich xylol-lösliche Einschlussmittel verwendet werden, die mit Wasser nicht mischbar sind, muss dieses im Entwässerungsschritt über eine aufsteigende Alkoholreihe (96%–Alk.abs.) entfernt und durch Alkohol verdrängt werden. Das Prinzip basiert wieder auf Diffusion von der höheren zur niedrigeren Konzentration. Die Dauer der Spülschritte ist stark abhängig von der Empfindlichkeit der Farbstoffe oder Farbprodukte auf das Herauslösen durch verdünnte Alkohole (siehe Löslichkeit 1.11.). Das basische Methylenblau der Ziehl-Neelsen-Färbung ist bspw. stark löslich in 96% Alkohol. Hier lässt man den Farbstoff vorher möglichst gut vom Objektträger ablaufen und bringt ihn gleich in abs. Alkohol, spült in kurz und gibt ihn schnell weiter in Xylol. Alcianblau, bspw., hat hingegen eine so starke Bindung an das Gewebe, dass es weder durch Wasser noch durch Alkohol entfernt werden kann. Hier ist die Dauer der Spülschritte unkritisch. Die Immersion mit Xylol und ähnlichen Reagenzien nennt man K lären, bezugnehmend auf die Clearingreagenzien beim Einbettungsprozess bzw. auf ihre aufhellende Wirkung. Das Verbleiben in diesen Lösungen ist meist nicht kritisch. Wasserlösliche Einschlussmittel sind wiederum notwendig, wenn organische Lösungsmittel das Färbeprodukt bzw. Substrat herauslösen würden und deshalb vermieden werden müssen (z.B. Fettfärbung, Formazane als Farbprodukt der Azoreaktion). Sie werden auch verwendet, um sich den Entwässerungsschritt zu ersparen. Saure Farbstoffe (Bsp. Eosin) würden aber in einem wässrigen Einschlussmittel „ausbluten“.

231

Histotechnik

Zur Abdeckung dienen plane Deckgläschen aus Glas mit definierter Dicke (0,17 mm) und unterschiedlichen Größen. Um den Arbeitsfluss zu beschleunigen wurden in den letzten Jahren Eindeckautomaten entwickelt, die schnell Einzug in die Histolabors hielten. Diese arbeiten einerseits mit Glasdeckgläschen andererseits mit Zellulose-Acetatfilmen. Der Film wird in einem Endlosband auf den Objektträger, der vorher mit Lösungsmittel benetzt wurde, aufgebracht und weiters bei der entsprechenden Länge abgekappt. Dabei wird der Kunststoff angelöst und klebt auf dem Objektträger. Der vordergründig bestechende Vorteil Abb.130 Glaseindecker ist die GeschwindigFa. Medite keit, das Fehlen von Luftblasen und das schnelle Trocknen der Schnitte. Nachteilig erweist sich, dass nach wenigen Jahren Luft unter den Film zieht. Das Eindecken mit Glas bietet nicht die Geschwindigkeit und Durchsatzkapazität aber Präparatbeständigkeit und optische Qualität, die man für Mikrofotos benötigt. (Abb.130-131)

Abb.131 Folieneindecker Fa. Sakura

Die Glas-Eindecker tropfen eine bestimmte Menge Einschlussmittel auf den Schnitt und senken dann ein Deckgläschen darauf herab. Somit wird die händische Methode weitgehend kopiert.

Manuelles Eindecken: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Objektträger aus organischem Lösungsmittel entnehmen Überschüssige Flüssigkeit abtropfen lassen Deckgläschen mit passender Größe (Schnitt muss vollständig abgedeckt sein) wählen Je nach Größe ein bis drei Tropfen Einschlussmittel auf das Gläschen tropfen Deckgläschen an Schmalseite schräg auf Objektträger aufsetzen, aufgleiten lassen Einschlussmittel verteilt sich gleichmäßig unter dem Gläschen Eventuell auftretende Luftblasen durch leichtes Aufdrücken entfernen (mit Pinzette oder behandschuhten Finger, Fingerabdrücke muss man vermeiden) Trocknen lassen, in waagrechter Lage

Schlecht eingedeckte Schnitte lassen sich reparieren, indem man die Objektträger erneut in das Lösungsmittel stellt und wartet, bis das Deckgläschen leicht abgleitet. Dann erneut eindecken. Fehler beim Entwässern und Eindecken: •

Wasser wurde nicht vollständig entfernt, durch zu schnelles Spülen oder Wasserbeimengungen in den Reagenzien. Æ Schnitt wird blind

232

Histologische Färbung

•

Zu langes Entwässern bei empfindlichen Farbstoffen Æ Schnitt „blutet“ aus.

•

Entwässern bei xylollöslichen Farbprodukten Æ Färbeergebnis wird zerstört.

•

Luftblasen unter dem Deckgläschen machen den Schnitt blind.

•

Zu kleine Deckgläschen verhindern, dass der Schnitt vollständig durchgesichtet werden kann.

•

Zu wenig Einschlussmittel führt dazu, dass beim Trocknen Luft unter das Gläschen zieht.

•

Überstehende Deckgläschen sind eine Gefahrenquelle für Verletzungen und behindern die Archivierung.

Einschlussmittel: Einschlussmittel kann man unterteilen in hydrophobe und hydrophile, und diese wiederum in adhäsive und nicht-adhäsive Medien. Adhäsive Mittel wirken als „Kleber“ und halten das Deckglas nach dem Trocknen an Ort und Stelle. Bei nicht-adhäsiven Mitteln müssen die Ränder des Deckgläschens mit flüssigem Paraffin, Nagellack oder Harz-Medium abgedichtet und fixiert werden, um ein Austrocknen und Verrutschen zu verhindern. Besondere Erfordernisse bestehen für die Fluoreszenzmikroskopie. Hier werden Zusätze verwendet, die das Ausbleichen der Fluorochrome verlangsamen. Eine spezielle Art von Einschlussmittel enthält selbst einen fluoreszierenden Farbstoff, der beim Eindecken gleichzeitig eine Kernfärbung bewirkt (Propidiumjodid). Der Brechungsindex ist eine Haupteigenschaft des Eindeckmediums. Ist der Brechungsindex des Eindeckmediums ähnlich dem von fixiertem Gewebe (1,53–1,54) lässt es den Schnitt transparent erscheinen und nur die gefärbten Areale sind zu erkennen. Bei einem Brechungsindex weit unter oder über diesem Wert wäre der Schnitt gut sichtbar, aber die Auflösung zu schwach. Im Routinebetrieb werden Einschlussmittel üblicherweise aus dem Handel bezogen. Es gibt eine größere Anzahl an käuflichen Eindeckmedien (z.B. Eukitt, Pertex). Sie beinhalten Acrylkunststoff (Zusammensetzung ist Firmengeheimnis) in unterschiedlichen Lösungsmitteln (Xylol, Toluol). Auch wasserlösliche Eindeckmedien sind erhältlich (z.B. Aquatex). Das führende Eindeckmedium bis zur Einführung der künstlichen Mittel war Kanadabalsam. Er wird aus einer Fichte (Abies balsamea) gewonnen und gehört chemisch zu den Terpentinen. Der getrocknete Balsam wird zur Anwendung mit Xylol aufgelöst. Er wirkt als leichtes Reduktionsmittel und führt deshalb zum Ausbleichen der Farbstoffe nach Monaten oder Jahren. Gegenüber den künstlichen Medien ist er sehr teuer geworden. Anforderungen an ein gutes Eindeckmedium: •

Es soll farblos und transparent sein.

•

Es soll das Gewebe vollständig durchdringen und Zwischenräume füllen.

•

Widerstandsfähigkeit gegen Einfluss von Mikroorganismen

•

Beim Trocknen soll es weder Auskristallisieren noch Schrumpfen.

•

ähnlicher Brechungsindex wie hochwertiges Glas

•

schnelles Trocknen (innerhalb von 20 min)

Histotechnik

•

Es soll ein klares Bild und keine Mikroskopieartefakte bieten.

•

Haltbarkeit der Präparate (zehn Jahre und länger)

•

kein Vergilben

•

möglichst passiv gegenüber UV, keine Eigenfluoreszenz

•

kompatibel mit Automaten

233

Man kann Kunststoff-basierende und wässrige Eindeckmedien auch selbst herstellen (Bsp.: DPX, Glycerol-Gel, Fructosesirup, Apathy’s Medium). Apathy’s Medium 50 g ..................... Gummi arabicum 50 g ..................... Sucrose 50 ml .................... Aqua dest. kleiner Kristall Thymol Das ergibt 100 ml Eindeckmittel. Ein paar Monate haltbar bis Zucker auskristallisiert oder trüb. Das Eindecken ist der abschließende Schritt vor dem Mikroskopieren und stellt den Schlusspunkt der histologischen Technik im engeren Sinne dar. Die fertigen Präparate werden nun dem Pathologen zur Befundung vorgelegt. Als Mitarbeiter des Labors sollte man sich dessen bewusst sein, dass die Qualität der Befundung unmittelbar mit der Qualität der Histotechnik zusammenhängt und unsere Verantwortung dem Patienten gegenüber hier ihre Basis hat.

T. Färbeautomaten Um die ständig ansteigenden Mengen im Histodiagnostiklabor zu bewältigen, empfiehlt sich die Anschaffung eines Färbeautomaten. Qualifiziertes Laborpersonal kann die Färbetätigkeit zu Gunsten anderer Aufgaben dem Gerät überlassen. Die Entwicklung geht zu vollautomatischen Färbern, die das Antrocknen, Färben und Eindecken in einem System übernehmen. Färbeautomaten werden in unterschiedlichen Bauweisen von verschiedenen Herstellern angeboten: •

Zitadellenfärber

•

Linearfärber

•

Robotfärber

•

Tellerfärber

Alle Geräte moderner Bauart bieten Variationen an der Objektträgerkapazität, an der Anzahl von gleichzeitig durchführbaren Färbungen, geheizte Färbestationen oder solche mit fließendem Leitungswasser. Der Einsatz intelligenter Computersysteme ermöglicht bei manchen Modellen gleichzeitiges Färben unterschiedlicher Protokolle, die Programmierung einer großen Anzahl an einzelnen Protokollen und die statistische Auswertung zur Qualitätssicherung. Ein Aspekt der Qualitätskontrolle ist die Nachvollziehbarkeit aller am Schnitt durchgeführten Schritte. Durch Identifikation der Objektträger mittels Barcode wird das ermöglicht. Interne Filter vermindern die Belastung der Umgebung mit Chemikalien.

234

Histologische Färbung

Für welchen Typ sich das Labor letztendlich entscheidet, hängt hauptsächlich von der Menge an Schnitten ab, die mit Routinefärbung bzw. Spezialfärbung verarbeitet werden, und vom Spezialfärberepertoire. Außerdem spielt die Labororganisation eine Rolle. Kontinuierliche Färber werden bevorzugt, wenn auch eine kontinuierliche Lieferung der Schnitte an die Befunder gewünscht ist. Ein Aspekt ist auch die Flexibilität der Geräte, um auf spezielle Färbe-Wünsche der Befunder einzugehen. Andererseits minimiert eine strikte Vorgabe an Protokollen die Fehlermöglichkeiten. Einfache Handhabung und ready-to-use Kits sind meist mit höheren Kosten verbunden. Notwendig ist auch die Kompatibilität des Färbers mit einem automatischen Eindecker, um zeitaufwendiges Herumsortieren der Schnitte zu vermeiden. 1.

Zitadellenfärber

Dies ist die älteste Form der automatischen Färber. In der Bauart ähnlich der Histokinette, konnte über eine Zeitkarte das Färbeprogramm eingegeben werden. Die Reagenzienbehälter sind in einem Karussell angeordnet. Die Objektträger werden senkrecht in Körben von Behälter zu Behälter gehoben. Manche moderne Modelle können kontinuierlich beladen werden. Je nach Einstellung wird der Korb im Reagens auf und ab bewegt zur gleichmäßigen und beschleunigten Einwirkung (Agitation). (Abb.132) Je nach Ausführung ist eine bestimmte Anzahl an Protokollen zu programmieren. Diese Art eignet sich sehr gut zum Abarbeiten großer Mengen gleicher Färbungen (Routinefärbung). Bei weiterentwickelten Modellen gibt es auch gleichzeitige Färbung verschiedener Protokolle, geheizte Stationen und Anschluss an Leitungswasser.

Abb.132 Varistain Fa. Shandon

2.

Abb.133 Leica ST 4040

Linearfärber

Für Linearfärber ist typisch, dass die Reagenzienbehälter in einer Reihe angeordnet sind. Die Objektträger werden senkrecht in Körben von einer Seite zur anderen bewegt und verbleiben eine vorgewählte Dauer pro Küvette im Reagens. Die Objektträger können kontinuierlich geladen werden. Agitation ist wählbar. Diese Modelle sind sehr gut geeignet für kontinuierlichen Workflow großer Mengen einer Färbung. (Abb.133)

235

Histotechnik

3.

Robotfärber

Für diese Modelle ist typisch, dass die Färbestationen einzeln in allen Richtungen angefahren werden können. Sie bieten für die Programmierung die höchste Flexibilität. Die Geräte können mit integriertem Trocknungsofen ausgerüstet sein. (Abb.134) Bei einer Modellgruppe werden die Objektträger senkrecht in Körben von einer Station zur anderen transportiert und im Reagens versenkt. Kontinuierliches Beschicken ist möglich. Bei der anderen Gruppe liegen die Objektträger waagrecht im Gerät. Ihre Position wird definiert bzw. sind die Objektträger mit einem Barcode identifiziert. Die Reagenzien sind in Reservoirs vorhanden, aus denen die benötigte Menge entnommen und auf die Schnitte pipettiert wird. So lassen sich auch kleine Mengen an Spezialfärbungen effektiv bearbeiten. Diese Geräte immitieren die händische Methode am ehesten und lassen meist auch die Verwendung der gewohnten Reagenzien zu. Weiters gibt es Modelle, wo die Objektträger senkrecht und einzeln im Gerät stehen. Sie werden mit einem Aufsatz verbunden, der einen definierten Spalt zwischen Schnitt und Aufsatz freigibt. Die Reagenzien werden von einem Reservoir in diesen Aufsatz pipettiert und durch die Kapillarwirkung auf dem Schnitt verteilt. Abb.134 Leica Autostainer ST 5010

4.

Tellerfärber

Die Objektträger werden horizontal im Kreis platziert. Sie sind je nach Modell mit Barcode bzw. aufgrund der Position identifiziert. Die Färbereagenzien befinden sich auf einem Rondell und sind ebenso mit Barcode versehen. Die Reagenzien werden in Kits angeboten. Kleine Mengen werden entnommen und auf den Objektträger pipettiert. Die Färbeprotokolle sind vorprogrammiert und umfassen die wesentlichsten Spezialfärbungen der Histodiagnostik, auch Versilberungen. Die ObjektträgerAbb.135 Nexes Special Stainer stationen lassen sich je nach Modell einzeln oder im Fa. Ventana Gesamten beheizen. Die Systeme sind sehr einfach zu handhaben, bieten aber weniger Flexibilität. Sie sind für Labors mit geringer Anzahl an Spezialfärbungen sehr gut geeignet. Ein positiver Sicherheitsaspekt ist die geringe Menge an Reagenzien, die im Labor gelagert werden muss. (Abb.135)

U. Färbung in der Elektronenmikroskopie Dünnschnitte von biologischen Präparaten haben im TEM ein geringes Elektronenstreuvermögen. Um die biologische Struktur sichtbar zu machen, muss ihr Kontrast durch Anlagerung von Schwermetallatomen auf der Schnittoberfläche erhöht werden.

236

Histologische Färbung

Gebräuchliche Kontrastierungsmittel sind Lösungen von Uranylazetat (0,5–6%) sowie verschiedene Bleisalzlösungen (-acetat, -citrat, -hydroxid etc.). Solche Kontrastierungen werden häufig auch kombiniert verwendet. Die Bleikontrastierung ist wegen des extrem niedrigen Lösungsproduktes von Bleicarbonat möglichst in einer CO2-freien Atmosphäre durchzuführen (wird erreicht durch Zugabe von Natriumhydroxidplätzchen in die Kontrastierumgebung). Mögliche Färbeartefakte sind tupfenförmige Bleiniederschläge (sog. „Bleihunde“) bzw. kristalline Niederschläge durch Ausfällungen von Uranylazetat.

Abb. 136 Leica EM STAIN

Für die Färbung, auch Doppelfärbung, stehen Färbeautomaten zur Verfügung, die gute und saubere Kontrastierung ermöglichen (Abb. 136). Die Lösungen sind allerdings kostspielig und daher für die Färbung von kleinen Serien unrentabel. Die Salze werden von den Objekten unterschiedlich stark absorbiert, sodass später im elektronenmikroskopischen Bild unterschiedlich intensiv markierte Strukturen erscheinen. Man spricht von positive staining, wenn eine Struktur das Kontrastierungsmittel absorbiert hat oder wenn es von ihm eingelagert wird. Dem steht das negative staining gegenüber, bei dem sich die Metallionen beim Trocknen der Metallsalzlösung um die eigentlichen Strukturen herum lagern. Im Elektronenmikroskop ist demnach nicht die Struktur selbst, sondern die Umgebung durch hohen Kontrast gekennzeichnet. Negative staining wird in der Regel zur Sichtbarmachung von Makromolekülen und Molekülkomplexen (DNA-Spritingpräparation, Ribosomen, Viren u.a.) und nicht für Dünnschnitte eingesetzt. Eine weitere Möglichkeit zur Steigerung des Kontrastes bietet die sogenannte BlockFärbemethode. Dabei wird das Objekt entweder im Anschluss an die Osmierung mit 2% Uranylazetat en bloc kontrastiert oder während der Entwässerungsphase bspw. einer wässrigen Lösung von 1–2% Uranylazetat in 70% Ethanol für die Dauer von ein bis mehreren Stunden ausgesetzt. Der Verkauf von Uranylazetat ist seit 2005 lt. Chemikaliengesetz nicht mehr gestattet. Der Besitz von 25 g ist aber erlaubt (entspricht den vorgegebenen Micro- und Millicurie). Färben von Vorschnitten (Semidünnschnitten) für die EM: Es steht nur eine sehr eingeschränkte Auswahl an meist monochromatischen Färbungen zur Verfügung. Diese sind aber sehr einfach auszuführen. Man trocknet den Schnitt (0,5–1 µm) nach dem Übertragen auf den Objektträger auf einer Heizplatte bei 95°C, bedeckt dann den Schnitt mit einem ausreichend großen Tropfen fertiger Färbelösung, wartet bis diese zu dampfen beginnt (ca. 10 sec) und spült den Objektträger mit A.dest ab. Als Färbelösungen werden verwendet: •

1% Toluidinblau O in 2,5% Natriumkarbonatlösung,

•

Azur II oder Methylenblau (0,1–1%) alleine oder in Kombination (Richardsongemisch) in 1% Natriumtetraborat (Borax) lösen und filtrieren.

Für Spezialfärbungen muss in einer äußerst heiklen Prozedur das Epoxidharz mittels alkoholischer Natriumhydroxid- oder Kaliumhydroxidlösung entfernt werden.

Histotechnik

237

Enzymhistochemie A. B. C. D.

Enzyme ..........................................................................................................238 Indikationen...................................................................................................239 Fixierung........................................................................................................239 Nachweisprinzip ............................................................................................240 1. Diazo-Reaktion .......................................................................................240 2. Tetrazolium-Reaktion..............................................................................242 3. Metall-Präzipitationsreaktion ..................................................................243 4 Farbige Substrate ...................................................................................243 5. Praxis-Tipps ............................................................................................243 E. Phosphatasen ................................................................................................244 1. Alkalische Phosphatase ..........................................................................244 2. Saure Phosphatase .................................................................................245 3. Glucose-6-Phosphatase ..........................................................................246 F. Esterasen .......................................................................................................246 1. Unspezifische Esterasen..........................................................................247 2. Lipasen ...................................................................................................247 3. ACE (AChE, Acetylcholinesterase)..........................................................247 4. Cholinesterase ........................................................................................248 5. Naphtol AS-D Chlorazetatesterase.........................................................248 6. Peptidasen und Proteinasen...................................................................249 G. Oxidoreductasen...........................................................................................249 1. Succinodehydrogenase (SDH, Bernsteinsäuredehydrogenase)..............251 2. Coenzym abhängige Dehydrogenasen ..................................................252 3. Diaphorasen ...........................................................................................253 4. Peroxidasen ............................................................................................253 5. Cytochromoxidase..................................................................................255 6. Tyrosinase (DOPA-Oxidase) ...................................................................256 7. Aminoxidase (Monoaminoxidase, MAO) ................................................256

238

Enzymhistochemie

Enzymhistochemie Enzymhistochemische Untersuchungen spielen in der Routinehistologie eine eher untergeordnete Rolle. Der Grund liegt vor allem darin, dass für die meisten Enzyme der Nachweis nur auf Gefrierschnitten optimal funktioniert. Das setzt voraus, dass die Fragestellung auf jeden Fall im Vorhinein bekannt sein muss, um eine optimale Gewebevorbereitung durchzuführen. Nachdem die meisten eingelangten Proben in der Routinehistologie formalinfixiert und paraffineingebettet werden, ist die Möglichkeit für Enzymtests bereits genommen. Hier liegt die Immunhistochemie im Vorteil, wo die meisten Antigene nun auch mit paraffingängigen Antikörpern ausgetestet werden können. Nachdem Enzyme als Eiweißkörper ebenso antigene wie katalytische Eigenschaften haben, könnten sie mittels Immunhistologie dargestellt werden (sofern bereits Antikörper erhältlich sind). Die Enzymhistochemie (oder Histotopochemie) gestattet aufgrund einer streng spezifischen Lokalisation von Enzymaktivitäten in der Zelle eine elektive Darstellung von Gewebestrukturen. Die Enzymhistochemie erlaubt, Einblick in die biologischen Verhaltensweisen der verschiedenen Gewebestrukturen zu gewinnen. Die Erforschung der Gewebeenzyme bietet ein weites Feld. Für den Histologen genügt meist die Darstellung der enzymhältigen Zellen als Ganzes, während in der Elektronenmikroskopie die genaue Lokalisation der Enzymaktivität in den jeweiligen Zellorganellen gefunden werden soll. Die Biochemiker unterscheiden viele verschiedene Enzymarten, die jedoch losgelöst vom Gewebe im Reagensglas ausgetestet werden. Die Histochemiker müssen hier bei der Untersuchung den Einfluss der dreidimensionalen Gewebestruktur und der anderen anwesenden Substanzen miteinbeziehen (bspw. die Diffusion der Enzyme aus Organellen; die Diffusion des Färbeprodukts in die Umgebung; Vorhandensein von Hemmstoffen; die Bindung von geladenen Färbeprodukten an entgegengesetzt geladene Strukturen der Zelle, die nicht der eigentliche Aktivitätsort sind).

A. Enzyme In lebenden Organismen katalysieren Enzyme chemische Stoffumwandlungen. Man findet sie frei in Körperflüssigkeiten und Cytoplasma, aber auch an Zellorganellen gebunden. Ein Enzym wird durch seine katalytische Aktivität charakterisiert; d. h. durch seine Fähigkeit, die Umsetzung eines oder mehrerer Substrate in einer spezifischen Reaktion zu definierten Produkten zu beschleunigen. Enzyme sind im Allgemeinen Proteine. Enzymproteine weisen eine spezifische Struktur auf, d.h. eine spezifische Primär-, Sekundär- und Tertiärstruktur sowie, falls das Enzym aus mehreren Untereinheiten zusammengesetzt ist, eine bestimmte Quartärstruktur. Die Anordnung der Atome in einer definierten Struktur wird durch den pH-Wert der Lösung, Temperatur, Ionenstärke etc. beeinflusst. Deshalb haben diese Faktoren einen entscheidenden Einfluss auf die katalytische Aktivität eines Enzyms. Mit Hilfe enzymatisch katalysierter Reaktionen kann zum einen die Menge eines Enzyms, zum anderen die Konzentration von Substraten bestimmt werden. Beides wird klinisch zur Diagnose und Charakterisierung von Stoffwechselerkrankungen angewandt. Die katalytische Wirkung der Enzyme kann durch bestimmte Hemmstoffe verhindert werden. Diese Inhibitoren können spezifisch für ein Enzym oder eine Enzymgruppe sein und blockieren das aktive Zentrum des Proteins. Diese Eigenschaft wird zur Diffe-

239

Histotechnik

renzierung von Enzymen verwendet, die das gleiche Substrat umsetzen können. Die Inhibitoren sind meist hochgradig giftig.

B. Indikationen Die Enzymhistochemie verwendet man hauptsächlich zur Identifizierung von Gewebestrukturen aufgrund ihrer Enzymmuster und auch zur Erkennung biologischer bzw. funktioneller Eigenschaften. Sie stellt damit eine interessante Ergänzung zur klassischen Histologie dar. Man führt die Enzymhistochemie fast ausschließlich auf Gefrierschnitten durch und sie ist auch als Mittel zur Schnellschnittdiagnose einsetzbar. •

Mb. Hirschsprung und Hypoganglionose des Colons: Darstellung von Ganglienzellen (LDH, SDH), Darstellung von Nervenfasern (ACE)

•

allgem. Tumordiagnostik: Differenzialdiagnose bei besonderer Verdachtsdiagnose

•

lymphatische Gewebe, Knochenmarkzellen: Esterase, saure Phosphatase, alkal. Phosphatase

•

Muskelgewebe: zur Identifikation der Fasertypen (ATPase, Phosphorylase), Enzymmangel (Cytochromoxidase, Phosphofructokinase, Aldolase), Nekrose (saure Phosphatase, unspez. Esterase)

•

Hyperparathyreoidismus: SDH, LDH

•

Hirntumore: LDH, alkal. Phosphatase, ATPase

•

Dünndarmschleimhaut zum Nachweis von Lactase- oder Sucrasemangel

•

Darstellung von Mastzellen und Zellen der myeloischen Reihe: Esterase

•

Zellmembrantransportaktivitäten, selektive, resorptive und exkretorische Prozesse (Bürstensaum der proximalen Nierentubuli): alkalische Phosphatase

•

Lysosomale Strukturen: saure Phosphatase

•

aerobe und anaerobe Glykolyse: Dehydrogenasen

C. Fixierung Zum Nachweis der Enzymaktivität in situ muss wesentlich auf die Gewebevorbehandlung Rücksicht genommen werden. Jede Fixierung führt zu einer wenigstens partiellen Inaktivierung der Aktivität. Daher untersucht man bis auf wenige Ausnahmen in erster Linie natives, frisch entnommenes Material. Die einzelnen Enzyme sind gegenüber Fixiermittel unterschiedlich empfindlich. Gegen Aldehydfixierung empfindlich:

Dehydrogenasen, Transferasen, Lyasen, Zytochromoxidasen.

Gegen Aldehydfixierung relativ stabil:

Hydrolasen, viele Peroxidasen, Tetrazoliumreduktasen.

Das generelle Ziel der Fixierung für die histochemische Darstellung von Enzymen ist, die maximale Enzymaktivität an der originalen Lokalisation und gleichzeitig die Morphologie zu bewahren. Die Fixierung sollte für jede Art von Gewebe und Enzym gesondert bedacht werden und schonend vor sich gehen.

240

Enzymhistochemie

Die Fixierung muss für enzymhistochemische Zwecke möglichst kurz, bei neutralem pH-Wert und bei 4°C stattfinden. Varianten: •

Gewebe fixieren in 4% wässrigem Formaldehyd oder 4% Formaldehyd in isotoner NaCl-Lösung über Nacht. Blöcke auswaschen, Gefrierschnitte herstellen, Test durchführen

•

Gefrierschnitte herstellen, in Aceton oder Formaldehyd fixieren, auswaschen in Aqua dest., Test durchführen

•

Gefrierschnitte herstellen, Test durchführen, Schnitte in Formaldehyd fixieren

D. Nachweisprinzip Dem Enzym wird ein spezifisches Substrat angeboten. Bei der katalysierten Reaktion zwischen Substrat und dem vorerst farblosen Indikator wird dieser in einen Farbstoff umgewandelt. Oder bei der katalysierten Reaktion entsteht ein Zwischenprodukt, das sich mit einem zweiten Stoff zu einem farbigen Endprodukt verbindet. Dieser Farbstoff soll an Ort und Stelle gut an Gewebeproteine binden und sich nur schwer herauslösen lassen (ansonsten diffuses Bild). Die Bindungsmechanismen sind abhängig vom entstandenen Farbstofftyp. Somit entsteht der Farbstoff am Ort der Enzymaktivität. Faktoren, die die Umsetzungs- und Bindungsreaktion beeinflussen: •

Art und Menge des Substrats (zu hohe Konzentrationen führen zur Enzymhemmung)

•

Pufferung zu einem für die Reaktion optimalen pH

•

Temperatur: Die meisten Reaktionen lässt man bei 37°C ablaufen, manche haben das Optimum jedoch bei Raumtemperatur oder sogar 4°C (niedrige Temperaturen wirken der Diffusion entgegen).

•

Allgemein: Faktoren des Massenwirkungsgesetzes für chemische Reaktionen

Man unterscheidet die Reaktionstypen: •

Diazo-Reaktion

•

Tetrazoliumsalz-Reaktion

•

Metallpräzipitations-Reaktion

•

Farbige Substrate-Methode

Meist werden die Schnitte in die Substratlösung eingestellt, bzw. die Lösung wird aufgetropft. Hier diffundiert das Substrat zum Ort des Enzyms. Das Färbeprodukt liegt im Gewebe. Eine weitere Methode ist das Aufbringen von substrathältigen F ilmen, in die das Enzym hinein diffundieren soll. Das Färbeprodukt liegt dann im Film, nicht im Gewebe. 1.

Diazo-Reaktion

Das Enzym spaltet vom Substrat Phenole oder aromatische Amine ab. Diese verbinden sich mit dem gleichzeitig angebotenen Diazoniumsalz zu einem Azofarbstoff am Ort des Enzyms. Charakteristisches Merkmal der Azofarbstoffe ist die Azogruppe N=N.

241

Histotechnik

a. Diazotierung: Primäre aromatische Amine (z.B. Pararosanilin) werden mit Natriumnitrit-Lösung in saurer Lösung in das Diazoniumsalz (z.B. hexazotiertes Pararosanilin) umgewandelt. Wichtig ist ein Überschuss an Mineralsäure, da sonst bereits gebildetes Diazoniumsalz gegen Ende der Reaktion mit noch nicht diazotierten, aromatischen Aminen kuppeln würde. Das so gewonnene, labile Diazoniumsalz muss r asch verarbeitet werden, da es leicht durch Wärme oder Licht zersetzt wird. b. Azokupplung: Diazoniumlösungen werden mit Phenolen oder aromatischen Aminen zur Reaktion gebracht. Bei dieser Kupplungsreaktion entsteht ein Azofarbstoff mit der typischen funktionellen Gruppe. Die Phenole oder aromatischen Amine entstehen durch die Enzymeinwirkung auf ein Substrat. (Abb.137)

Abb.137 Azo-Kupplung; mit Erlaubnis von Scion Publishing Ltd. aus Histological and Histochemical Methods 3e by J.A. Kiernan

Diazoniumsalze "kuppeln": •

mit Aminoverbindungen in schwach saurer Lösung

•

mit Phenolen in schwach alkalischer Lösung

Bei der simultanen Methode werden Diazoniumsalz und Substrat gleichzeitig auf das Gewebe gebracht. Es besteht auch die Möglichkeit, zuerst das Substrat anzubieten und in einem zweiten Schritt die Kupplung mit dem Diazoniumsalz ablaufen zu lassen. Dabei kann man für beide Reaktionen die jeweils optimalen Bedingungen erzeugen. Der Nachteil liegt darin, dass sich das Zwischenprodukt zu einem gewissen Grad herauslösen lässt, bevor die endgültige Bindungsreaktion eintritt.

242 2.

Enzymhistochemie

Tetrazolium-Reaktion

Durch eine Wasserstoffübertragung vom Substrat auf das Tetrazoliumsalz entsteht eine farbige Formazanverbindung, die möglichst unlöslich ist und gut an die Proteinstrukturen bindet. Das Tetrazoliumsalz dient als Protonen bzw. Wasserstoffakzeptor. Tetrazoliumverbindungen sind charakterisiert durch vier Stickstoffatome und ein Kohlenstoffatom in einem Fünferring. Am gebräuchlichsten sind NBT und TNBT. (Abb.138-140) NBT: blassgelbliche Substanz, die unter Wasserstoffaufnahme ein blaues, unlösliches amorphes Diformazan bildet. TNBT: gelbes Pulver, völlig lösliche Kristalle; Wird durch Wasserstoffaufnahme zu rotbraunem, alkohol-unlöslichem Formazan. Die Reaktion läuft bei Raumtemperatur oder 37°C ab (10–20 min). Durch Einbringen der Schnitte in gepuffertes Formalin wird die Reaktion gestoppt und das Gewebe für die weiteren Schritte stabilisiert. Man kann eine passende Gegenfärbung anschließen. Formazane von NBT und TNBT sind unempfindlich auf Entwässerung und können mit Kunststoff-Einschlussmedien eingedeckt werden. Andere Farbprodukte sind löslich in organischen Lösungsmitteln und verlangen wässrige Einschlussmedien. Für eine sichere Interpretation des Ergebnisses ist das Mitlaufenlassen von Negativkontrollen (ohne Substrat, mit Inhibitoren) wichtig. Negative Testresultate können auf das Herauslösen von Abb.138-140 Tetranitroblau-Tetrazoliumchlorid; Nitroblau-Tetrazoloiumchlorid; Formazan Reaktionspartnern aus dem Schnitt, auf ungewünschte Reaktionen mit anderen Elektronenakzeptoren oder auf zu schwache Reaktionen zurückzuführen sein. Man sollte das Ergebnis deshalb durch weitere Testansätze mit bestimmten Zusätzen absichern. Zusammensetzung der Inkubationslösung: Puffer:

pH 7,0–7,2 (zu hoher pH kann zu falsch-negativen Ergebnissen führen), TRIS-Puffer wird oft verwendet, aber auch Phosphatpuffer (sofern sich durch andere Inhaltstoffe keine Phosphat-Präzipitate bilden) sind gebräuchlich.

243

Histotechnik

Substrat:

Üblicherweise handelt es sich dabei um ein organisches Anion in Form von Natrium-Salz (0,1 M). pH-Wert Veränderungen infolge der Substratzugabe sollen wieder durch 1M NaOH bzw. 1M HCl korrigiert werden.

Coenzyme:

Werden für die Darstellungsreaktionen Coenzyme benötigt, müssen sie künstlich zugegeben werden. Der natürliche Gehalt ist zu gering.

Cofaktoren:

Manche Enzymreaktionen benötigen Spuren von Metallkationen.

Tetrazoliumsalz:

Die Konzentration liegt zwischen 10-4 bis 10-3 M. Zur Verdünnung dient entweder Aqua dest. oder ein organisches Lösungsmittel (Dimethylformamid).

Hemmstoffe:

Kalium- oder Natriumazid hemmt die zelluläre Respiration durch den Luftsauerstoff. Damit werden diese natürlichen, in diesem Fall unerwünschten, Reaktionen unterdrückt.

Schützende Wirkstoffe:

Durch Mittel hoher Viskosität (synthetische Polymere) wird die Diffusion der löslichen Enzyme weg von ihrem natürlichen Wirkungsort gehemmt. Bei kurz fixiertem Gewebe ist dies meist nicht nötig.

Beschleuniger:

(zwischenzeitliche Elektronenakzeptoren) Diese Substanzen lassen sich sehr schnell reduzieren und geben die Elektronen dann weiter an das Tetrazoliumsalz. Dadurch wirken sie reaktionsbeschleunigend. Bspw. Phenazinmethosulfat bewirkt eine schnellere und stärkere Farbentwicklung, aber unter Umständen auch unspezifische Farbniederschläge. Es ist lichtempfindlich, die Reaktion soll im Dunkeln erfolgen.

3.

Metall-Präzipitationsreaktion

Die durch die Enzymwirkung abgespaltenen Gruppen (bspw. Phosphate) verbinden sich mit Bleiionen. Die anschließende Behandlung mit Ammoniumsulfid verdrängt den ersten Bindungspartner. Es entstehen unlösliche Bleisulfide, die am Ort der Aktivität präzipitieren. 4.

Farbige Substrate

Hier wird durch enzymatische Hydrolyse ein vorerst löslicher Farbstoff unlöslich gemacht und präzipitiert in der Gewebestruktur. Diese Methode wird wenig eingesetzt. 5.

Praxis-Tipps

•

Gefrierschnitt-Dicke sollte bei 12–20 µm liegen, da dann die Reaktionen rascher ablaufen.

•

Mit Hilfe eines Föns oder eines Trockengerätes kann das Antrocknen des Schnittes am Objektträger beschleunigt werden.

•

Die luftgetrockneten Schnitte können im allg. direkt in das Inkubationsmedium gebracht werden; die Fixation wird angeschlossen.

244

Enzymhistochemie

•

Kernfärbung mit Hämalaun kann angeschlossen werden.

•

Eingedeckt wird mit wasserlöslichem Eindeckmedium oder mit Kunststoff-Einschlussmittel nach Entwässerung.

•

Die Inkubationsmedien können portionsweise eingefroren werden. Lagerung bei –20 bis –30°C, für ca. 3 Monate.

•

Trockenmedium-Vorrathaltung: Die Trockensubstanzen werden eingewogen, im Mörser verrieben, im Kühlschrank mit sorgfältiger Vermeidung von Feuchtigkeitsaufnahme aufbewahrt und kurz vor Gebrauch aufgelöst.

•

Verwendete Gefäße sollen immer mit Aqua dest. gespült werden. Enzymatische Reaktionen sind empfindlich auf Verunreinigungen besonders durch Detergenzien.

•

Die Verwendung von Positiv- und Negativkontrollen bei der Testdurchführung ist anzuraten, um falsch-positive Ergebnisse auszuschließen. Negativkontrollen erhält man durch Inkubieren in „substratfreien“ Lösungen, durch Hitzedeaktivierung oder durch Einsatz von Inhibitoren.

•

Als schonendste Entkalkung zum Erhalt der Enzymaktivität dient EDTA (10 g in 100 ml 0,1M Phosphatpuffer pH 7,1) bei 4°C.

Der nachfolgende Abschnitt beschreibt Beispiele von Enzymnachweisen in Prinzip und Färbeergebnis.

E. Phosphatasen Diese Enzyme hydrolysieren organische Phosphatester und werden aufgrund ihres optimalen Reaktions-pHs klassifiziert. Alkalische Phosphatase findet man in vielen Zelltypen, besonders in auf Endozytose und Pinocytose spezialisierten Regionen. Saure Phosphatasen sind hauptsächlich lysosomale Inhaltsstoffe. •

pH 9,0

alkalische Phosphatasen

•

pH 5,0

saure Phosphatasen spezifische Phosphatasen

• 1.

Alkalische Phosphatase

1.1. Ziel Alkalische Phosphatase lässt sich bspw. im Cytoplasma von Granulozyten (neutrophilen, basophilen, aber nicht eosinophilen) und ihren unmittelbaren Vorläufern nachweisen. In myeloischen Leukämien zeigen abnormale Leukozyten fast keine alkalische Phosphatase. 1.2. Prinzip Durch Hydrolyse von einfachen Naphtolen wird Į-Napthol freigesetzt. Dieses primäre Reaktionsprodukt wird mit einem passenden Diazoniumsalz gekoppelt (z.B. Fast red TR). Als Substrat agiert Natrium-Į-Napthylphosphat, als Kupplungspartner Fast red TR. Der pH-Wert der Inkubations-Lösung wird mittels 0,2 M Tris-Puffer auf 9,0–9,4 eingestellt. Die Reaktion erfolgt bei Raumtemperatur. (Abb.141)

245

Histotechnik

Gefrierschnitte sind vorteilhaft. Die Fixierung erfolgt in Formol-Kalzium bei 4°C. Bei der Verwendung von Paraffinschnitten muss die Inkubationszeit verlängert werden. Als Kernfärbung setzt man Methylgrün ein und deckt in wässrigem Einschlussmedium ein, da das Reaktionsprodukt üblicherweise in unpolaren Flüssigkeiten löslich ist (Xylol). 1.3. Färbeergebnis Aktivität von alkal. Phosphatase ............................. rötlich-braun Kerne ................................................................................... grün 1.4. Inhibitoren Es gibt keine Hemmstoffe von hoher Spezifität für alkalische Phosphatasen, aber die katalytische Reaktion wird durch Einstellen der Schnitte in Jod-Kaliumjodid verhindert. Hemmstoffe für bestimmte Anwendungen: Cystein, Levamisol.

Abb.141 Abspaltung der Phosphatgruppe und Azokupplung; mit Erlaubnis von Scion Publishing Ltd. aus Histological and Histochemical Methods 3e by J.A. Kiernan

2.

Saure Phosphatase

2.1. Prinzip Das Prinzip ist identisch zur Darstellung von alkalischer Phosphatase. Als Substrat verwendet man Natrium-Į-Napthylphosphat. Durch Enzymwirkung entsteht Į-Napthol, das sich mit einem passenden Diazoniumsalz (z.B. Fast garnet GBC) kuppeln lässt. Gefrierschnitte sind vorteilhaft, die in Formol-Kalzium bei 4°C fixiert werden. Die Inkubationslösung wird mittels 0,1M Acetatpuffer auf pH 5 gebracht. Die Reaktion erfolgt bei 37°C. Als Kernfärbung setzt man Methylgrün ein und deckt in wässrigem Einschlussmedium ein. 2.2. Färbeergebnis Aktivität von saurer Phosphatase ............................................ rot Kerne ................................................................................... grün

246

Enzymhistochemie

2.3. Inhibitoren Saure Phosphatasen werden großteils durch Fluoridionen gehemmt (Natriumfluorid). 3.

Glucose-6-Phosphatase

3.1. Prinzip Der Nachweis basiert auf der Metall-Präzipitationstechnik. Das Enzym hydrolysiert Glucose-6-Phosphat in der Gegenwart von Bleiionen und bildet dadurch ein Präzipitat aus Bleiphosphat. Dieser weiße Niederschlag wird durch Einwirkung mit verdünntem Ammoniumsulfid in schwarzes Bleisulfid übergeführt. Alkalische und saure Phosphatase wird hier ebenso erfasst. Glucose-6-Phosphatase ist als empfindliches Enzym nur im Gefrierschnitt nachzuweisen. Die Fixierung erfolgt in 10% Formaldehyd nach der Inkubation. 3.2. Färbeergebnis Aktivität von Glucose-6-Phosphatase ................... braun-schwarz

F. Esterasen Esterasen können Carbonsäuren hydrolysieren. Der optimale Reaktions-pH-Wert liegt zwischen 5,0 und 9,0. Die verschiedenen Esterasen können nicht wie die Phosphatasen mit Hilfe ihres pH-Optimums oder eines bestimmten Substrats identifiziert werden. Die Zuordnung gelingt aufgrund ihrer unterschiedlichen Empfindlichkeit auf verschiedene Hemmstoffe. Die Mehrzahl der Esterasen kann das Substrat Į-Napthylacetat hydrolysieren. Sie werden als unspezifische Esterasen zusammengefasst. Diese Gruppe wird entsprechend ihrer spezifischen Reaktionen auf ein Substrat und der Empfindlichkeit gegenüber spezifischen Inhibitoren unterteilt. Als Inhibitoren wirken Organophosphate (bspw. diethyl-p-nitrophenylphosphat E600, di-isopropyl-fluorophosphat DFP) oder Quecksilberverbindungen (Sulphydryl-Verbindung) wie bspw. p-chloromercuribenzoat PCMB. Diese Reagenzien sind extrem giftig (AChE-Hemmer). Die Enzymhemmung ist irreversibel. Es ist deshalb möglich, die Enzym-Blockierung dem Test vorzuschalten. Die meisten Esterasen werden durch Formalinfixierung zerstört, bestimmte Enzyme dieser Gruppe überstehen die Behandlung und können auch am Paraffinschnitt dargestellt werden. Tabelle 18 Unspezifische Esterasen

Spezifische Esterasen

Carboxylesterasen

Organophosphatsensitiv

Arylesterasen

Organophosphatresistent

SulphydrylHemmer sensitiv

Cholinesterasen

Acetylesterasen

Organophosphatresistent

SulphydrylHemmer resistent

Lipasen (Paraf.)

Acetylcholinesterasen

Histotechnik

1.

247

Unspezifische Esterasen

1.1. Prinzip Das Enzym setzt vom Substrat Į-Napthylacetat Į-Napthol frei. Dies wird an ein passendes Diazoniumsalz (hexazotiertes Pararosanilin) gekoppelt, sodass ein unlösliches Farbstoffpräzipitat am Ort der Aktivität abgelagert wird. Gefrierschnitte werden hergestellt und in Formol-Kalzium bei 4°C fixiert. Als Puffer agiert Dinatriumhydrogenphosphat. Die Reaktionstemperatur liegt bei 37°C. Die Schnitte werden mit Methylgrün gegengefärbt und zum Abschluss entwässert und mit Harz eingedeckt. Bei dieser Methode reagieren auch Lipasen und Cholinesterasen. Cholinesterasen können während der Inkubation mit Eserin gehemmt werden. Werden die Schnitte zuerst mit einer verdünnten Lösung von E600, und anschließend mit einer PCMB-Lösung behandelt und weiters in einem substrathältigem Medium mit zugesetztem PCMB inkubiert, bleibt nur mehr die Acetylesterase-Aktivität übrig. 1.2. Färbeergebnis Aktivität von Esterase ............................................. rötlich-braun Kerne .................................................................................... grün 2.

Lipasen

2.1. Prinzip Lipasen haben die Fähigkeit, langkettige Ester zu hydrolysieren, besonders solche mit gesättigten Fettsäuren. Man findet die Enzyme hauptsächlich im Pankreas. Bei der Enzymreaktion wird das Substrat Tween 60 umgesetzt. Es entstehen Fettsäuren, die mit Kalziumionen Kalziumseifen produzieren. Die Behandlung zuerst mit Bleiionen und anschließend Ammoniumsulfid führt zu einem dunkelbraun-schwarzem Präzipitat am Ort der Aktivität. Der Test kann auf Paraffinschnitten durchgeführt werden. 2.2. Färbeergebnis Aktivität von Lipase ................................ gelb bis braun-schwarz

3.

Acetylcholinesterase (AChE, ACE)

3.1. Ziel Man weist erhöhte ACE-Aktivität bei Fehlen von Ganglienzellen (Mb. Hirschsprung) und bei hyperplastischer, neuronaler Colondysplasie in den parasympathischen Nervenfasern nach. Die Färbung ermöglicht die Differenzierung zwischen Aganglionose und Hypoganglionose des Colon. Acetylcholinesterase gehört zu den Hydrolasen und hydrolysiert den Neurotransmitter Acetylcholinester zu Acetat und Cholin an den Sy-

248

Enzymhistochemie

napsen. Acetylcholinesterase ist im Nervengewebe, an motorischen Endplatten, Muskel-Sehnen-Verbindungen und an Erythrozyten lokalisiert. 3.2. Prinzip Die Methode der Wahl ist die Thiocholintechnik nach Karnovsky und Roots auf Gefrierschnitten. Das Inkubationsmedium zeigt vorzugsweise Stellen von ACE-Aktivität, aber auch die Lokalisation unspezifischer Cholinesteraseaktivität. Man kann hier durch passende Substratwahl und auch durch Einsatz bestimmter Hemmsubstanzen eine Differenzierung erreichen. Als Substrat wird Acetylthiocholinjodid angeboten. ACE setzt vom Substrat Thiocholin frei, das Ferricyanid zu Ferrocyanid reduzieren kann. Das Ferrocyanid verbindet sich mit Kupferionen zu einem dunklen, unlöslichen Kupferpräzipitat (= Hatchett’s Braun). Zur Kontrastverstärkung können die Niederschläge mit Diaminobenzidin (DAB) und Wasserstoffperoxid getönt werden. Dabei bewirkt das Kupferferrocyanid die Katalyse der Oxidation von DAB durch H2O2. Iso-OMPA (Tetraisopropylpyrophosphoramid) dient zur Hemmung vor allem von unspezif. Cholinesterase und dient so zur spezifischen Darstellung der ACE-Aktivität. 3.3. Färbeergebnis Das Reaktionsprodukt ist .................................braun bis schwarz 4.

Cholinesterase

Eine andere Bezeichnung ist auch Pseudocholinesterase. Sie kann ebenso Acetylcholin hydrolysieren, aber viel langsamer als ACE. Die bevorzugten Substrate sind Cholinester mit Acylgruppen. Man findet ChE in Serum, in Neuroglia und in einigen Neuronen. AChE- und ChE-Darstellung werden in neurohistologischen Techniken eingesetzt. Das Nachweisprinzip ist dasselbe wie bei der Acetylcholinesterase. Als Substrat wird jedoch Butyrylthiocholin verwendet, das durch Cholinesterase schnell, durch Acetylcholinesterase langsam umgesetzt wird. ACE wird selektiv gehemmt durch BW 284C51. 5. 5.1.

Naphtol AS-D Chlorazetatesterase Ziel

Darstellung der neutrophilen Granulozyten und ihrer Vorläuferzellen, Leukämien, Erkrankungen des blutbildenden Systems; Differenzierung der Vorstufen-Reihen 5.2. Prinzip Die in den Lysosomen enthaltene Esterase bewirkt eine Abspaltung von Napthol vom Substrat Naphtol-AS-D-Chlorazetat. Das Naphtol wird an das Diazoniumsalz (hexazotiertes Pararosanilin) angelagert. Es entsteht durch Azokupplung ein Azofarbstoff am Ort der Esterase. Der Nachweis gelingt auf Paraffinschnitten.

Histotechnik

249

Naphtol-AS-Acetat löste das bisher verwendete beta-Naphtylacetat ab, da es eine höhere Kupplungsgeschwindigkeit und festere Gewebebindung (geringe Löslichkeit) hat, was ein klareres Bild ergibt. 5.3. Färbeergebnis Das Reaktionsprodukt ist .......................................................................................rot normale Zellen der neutrophilen Reihe sind ab den Promyelozyten .....................................................................................mäßig positiv leukämische Promyelozyten ................................................................... stark positiv normale Myeloblasten, Zellen der erythropoetischen Reihe, Lymphozyten und Plasmazellen .................................................................... negativ 6.

Peptidasen und Proteinasen

Die proteolytischen Enzyme katalysieren die Hydrolyse von Peptidbindungen zwischen Aminosäuren in Polypeptiden und Proteinen. Die verschiedenen Enzyme zielen auf spezielle Aminosäuren in der Polypeptidkette, oder auf endständige Aminosäuren. Manche Peptidasen hydrolysieren synthetische Substrate, wie Naphtylamide. Bei der Nachweisreaktion wird Naphtol frei, das durch ein Diazoniumsalz gebunden wird. Es entsteht ein unlöslicher Azofarbstoff als Reaktionsprodukt. Eine spezielle Form der Nachweistechniken sind Substrat-Film-Applikationen. Der Gelatinefilm enthält belichtete, entwickelte und fixierte Silberpartikel (schwarzer Film). Enzymaktivität im Gewebe diffundiert in den Film und löst hier die Gelatine samt Partikel auf. Das führt zu „Löchern“ am Ort der Aktivität. Eine Weiterentwicklung der Methode bringt auf Gefrierschnitte einen Film auf, der Substrat und fluorogene Substanzen enthält, die Proteine binden können und so die Fluoreszenz am Ort der Enzymaktivität entwickeln.

G. Oxidoreductasen Diese als „Atmungsfermente“ bezeichneten Enzyme haben die gemeinsame Aufgabe, durch Oxidation der Nährstoffe unter Abspaltung von Wasser, die vom Körper benötigte Energie schrittweise freizusetzen (Citratzyklus). Der Ort der zellulären Respiration liegt in den Mitochondrien. Im Citratzyklus arbeiten eine große Anzahl an Substraten und Enzymen zusammen mit einer viel kleineren Anzahl an Elektronen-Überträgersubstanzen (Coenzyme und prosthetische Gruppen). Dabei kann eine Überträgersubstanz für mehrere substratspezifische Enzyme im Einsatz sein. Das Coenzym ist selbst kein Protein, kann ins Cytoplasma diffundieren und bindet reversibel an das Apoenzym (Protein), das den substratspezifischen Teil ausmacht. Eine p rosthetische Gruppe ist eine organische Verbindung, ebenfalls kein Protein, und bindet kovalent an das Apoenzym. Gebunden an das Apoenzym, nimmt das Coenzym Elektronen vom Substrat und Protonen entweder vom Substrat oder vom umgebenden Medium auf. So wird das Coenzym reduziert und das Substrat oxidiert. Im Endeffekt erhält das Coenzym ein oder zwei Wasserstoffatome vom Substrat, und man kann die Überträgersubstanz deshalb auch Wasserstoffakzeptor nennen. (Abb.142)

250

Enzymhistochemie

Abb. 142 Oxidation und Reduktion der Überträgersubstanzen Abb. 143 Zitronensäurezyklus

Die reduzierte Form des Coenzyms agiert als Elektronendonator für die enzymatische Reduktion eines anderen Substrats. Das Original-Coenzym wird so regeneriert. Enzyme, die die Re-Oxidation von reduzierten Coenzymen katalysieren, nennt man Diaphorasen. Der Citratzyklus findet in mehreren Stufen statt und umfasst die wiederholte Oxidation und Reduktion von verschiedenen prosthetischen Gruppen, Coenzymen und Cytochromen. Letztere sind Proteine, die eisenhältige Hämgruppen beinhalten. Die Cytochromoxidase transferiert Elektronen und Protonen zu molekularem Sauerstoff. Es katalysiert die Reduktion von Sauerstoff zu Wasser (O + 2H Æ H2O).

Histotechnik

251

Jeder Schritt beinhaltet den enzymatisch katalysierten Transfer von Protonen und Elektronen von einem Substrat zu einem Akzeptor. Üblicherweise ist der Akzeptor ein Coenzym wie NAD+ oder NADP+ oder eine prosthetische Gruppe wie FMN oder FAD. Die Dehydrogenase (bestehend aus Apoenzym und oxidierte Form des Coenzyms) bindet spezifisch an das Substrat und macht es hochreaktiv für das Coenzym. Nach der Reaktion lösen sich das oxidierte Substrat und das reduzierte Coenzym vom Apoenzym und sind frei für weitere Reaktionen. Die Spezifität beruht auf dem Apoenzym, auch wenn es erst durch die Kupplung mit dem Coenzym an das Substrat binden kann. Die Reihenfolge der Zyklusreaktionen verläuft gemäß ihren Redox-Potentialen. Normalerweise erfolgt die Elekronenübertragung über Flavoproteinenzyme, Ubichinon und das Cytochromsystem zu molekularem Sauerstoff. (Abb.143) In der histotechnischen Darstellung der Enzyme wird die Tatsache ausgenützt, dass der Zyklus durch Einbringen eines künstlichen Elektronenakzeptors (Tetrazoliumsalz) unterbrochen werden kann. Sobald ein Substrat in der Nähe eines Tetrazoliumsalzes oxidiert wird, wird das freiwerdende Elektron auf das Tetrazoliumsalz übergehen. DaFormazan) am Ort der katalytischen Aktivibei entsteht eine stabile, farbige Substanz (F tät. Beim histochemischen Nachweis der D ehydrogenasen wird das natürliche Substrat in Überschuss angeboten. Eine entsprechende Menge an Akzeptor, Coenzym bzw. zwischenzeitlicher Überträgersubstanz muss im Medium bzw. Gewebe vorhanden sein. Diaphorasen werden ebenso durch Tetrazoliumreduktion nachgewiesen, wobei dem Medium die passende reduzierte Form des Coenzyms (= Substrat der Reaktion) zugegeben wird. Manche O xidasen verwenden molekularen Sauerstoff als Akzeptor und überspringen so alle Zwischenkomponenten des Elektronentransportsystems. Ihre Darstellung funktioniert nach anderen Prinzipien. Bspw. entsteht bei der katalysierten Reaktion Wasserstoffperoxid, das durch weitere Indikatorreaktionen nachgewiesen wird. Die Anwendung der Oxidasedarstellung liegt eher im Forschungsbereich und wird an Gefrierschnitten von Tiergewebe durchgeführt. Oxidoreductasen sind im allg. viel empfindlicher als die früher beschriebenen Hydrolasen. Deshalb kann das Gewebe nicht im Vorhinein fixiert und schon gar nicht in Paraffin eingebettet werden. Am widerstandsfähigsten sind die Diaphorasen und Laktatdehydrogenase. 1.

Succinodehydrogenase (SDH, Bernsteinsäuredehydrogenase)

1.1. Ziel Darstellung von Ganglienzellen (Mb. Hirschsprung), Darstellung von Mitochondrien 1.2. Prinzip SDH gehört zu den Oxidoreduktasen und ist ein Flavoprotein mit der prosthetischen Gruppe FAD. Die Succinodehydrogenase setzt Succinat in Fumarat um und gibt dabei den abgespalteten Wasserstoff an FAD oder an Cytochrom ab. Der Reaktionsort findet sich in den Mitochondrien als „Zellkraftwerke“.

252

Enzymhistochemie

Tetrazolium-Methode nach Massey und Singer: Beim enzymatischen Nachweis wird als Substrat Natriumsuccinat und als Indikator Tetranitro-Tetrazoliumblau-chlorid (TNBT) angeboten. Der abgespaltene Wasserstoff geht auf TNBT über. Es entsteht ein rotbraunes Formazan. Der Test wird auf Gefrierschnitten durchgeführt. Die Verwendung von billigerem NBT ist auch möglich, hat aber den Nachteil einer zu geringeren Proteinbindung und einer begrenzten Beständigkeit. Die SDH-Methode ist zur Darstellung von Ganglienzellen bei Biopsien geeignet, die nicht älter als 10 min sind. Ansonsten verwendet man die LDH-Methode. Eine Variante ist die SDH-plus-Methode mit Phenazinmethosulfat-Potenzierung. Durch den Zusatz werden auch geringere Mengen an SHD erkannt und wirkt so den Aktivitätsverlusten bei längeren Transportwegen entgegen. Der Test muss in Dunkelheit durchgeführt werden und sollte nicht länger als 10 min dauern, da es ansonsten zu unspezifischen Farbniederschlägen kommen kann. 1.3. Färbeergebnis Das Reaktionsprodukt ist .............................................. rot-braun

1.4. Inhibitoren Natrium-Malonat dient als kompetitiver Inhibitor. Vorinkubation in einer 0,005M Lösung und anschließende Zugabe in derselben Konzentration zum Inkubationsmedium verhindert die Enzymreaktion. 2.

Coenzym abhängige Dehydrogenasen

Dazu gehören z.B. Alkohol-DH, Glycerolphosphat-DH, Lactat-DH, Glucose-6Phosphat-DH, Glutamat-DH. Wobei die Lactatdehydrogenase zu den widerstandsfähigeren Enzymen zählt. Das Prinzip entspricht dem Nachweis mittels Reduktion eines Tetrazoliumsalzes, wobei die Bildung des Formazans durch die entsprechende Diaphorase hervorgerufen wird (Re-oxidation des Coenzyms). Dehydrogenase setzt Substrat um, Wasserstoff geht auf NAD über Æ NADH, Diaphorase katalysiert Reaktion NADHÆ NAD, Wasserstoff geht auf NBT über Æ Formazan bildet sich. Das positive Resultat entsteht nur an Orten, die Diaphorase enthalten. Das Inkubationsmedium besteht aus den stabilen Anteilen: •

Puffer (0,2 M Tris-HCl Puffer, pH 7,2)

•

Magnesiumchlorid (Metallionen)

•

Natriumazid (Cytochromhemmer)

•

Polyvinyl-alkohol oder –pyrolidone (synthetisches Polymer hemmt Diffusion).

Dieser Stammlösung werden Tetrazoliumsalz, Substrat und passendes Coenzym kurz vor Gebrauch zugegeben. Die Reaktion lässt sich durch Phenazinmethosulfat beschleunigen.

Histotechnik

253

Beispiel für Inkubationslösung zum Nachweis von Lactatdehydrogenase: •

Substrat = Natriumlactat

•

Indikator = NBT

•

Coenzym = NAD (Nikotinamid-Adenin-Dinucleotid)

Die teuren Reagenzien werden in geringer Menge zusammengemischt und auf den waagrecht liegenden Objektträger in einer feuchten Kammer bei 37°C aufgebracht. Nach regelmäßiger Kontrolle wird die Reaktion durch Spülen in gepuffertem Formaldehyd abgestoppt. Eine Kernfärbung kann angeschlossen werden. Eingedeckt wird mit wässrigem Einschlussmedium. Mit Hilfe von Negativkontrollen muss das Ergebnis abgesichert werden. Bei einem Medium ohne Substrat darf keine Färbung entstehen, bei einem Medium ohne Coenzym ist jegliche Farbgebung auf die Wirkung anderer vorhandener Enzyme zurückzuführen. Ein falsch negatives Ergebnis könnte auf eine zu geringe Menge an NAD oder NADP schließen lassen und sollte durch einen weiteren Testansatz mit erhöhter Konzentration abgesichert werden. 3.

Diaphorasen

Hier wird einer ähnlichen Stammlösung wie zum Nachweis von Coenzym abhängigen Dehydrogenasen als Substrat die reduzierte Form eines Coenzyms (NADH, NADPH) zugegeben. Die Diaphorase bewirkt die Übertragung des Wasserstoffs auf das Tetrazoliumsalz. Am Ort der Aktivität entsteht das farbige Formazan. 4.

Peroxidasen

Peroxidasen katalysieren die Oxidation von verschiedenen Substanzen (reduzierte Coenzyme, Fettsäuren, Aminosäuren, reduzierte Cytochrome) mit Hilfe von Wasserstoffperoxid. Man findet Peroxidasen in den Granula von Leukozyten, in einigen Neuronen und einigen sekretorischen Zellen (Brust, Schilddrüse). Die endogene Peroxidase widersteht der Formaldehydfixierung, diese sollte aber vier Stunden nicht überschreiten. Exogene Peroxidase (Detektionssystem bei Immunhistologie) widersteht ebenfalls kurzer Formaldehydfixierung. Prinzip: Der Nachweis basiert auf der katalysierten Reaktion zwischen Wasserstoffperoxid und anderen Substanzen, die durch Oxidation zu einem unlöslichen farbigen Produkt werden (Benzidin, Diaminobenzidin DAB, Tetramethylbenzidin TMB, Aminoethylcarbazol AEC). Die Farbprodukte haben unterschiedlich lange Haltbarkeit. Zu permanenten Ergebnissen führen DAB und AEC. TMB wird bspw. bei einer sensitiven Technik zur Darstellung von HRP (horseradish peroxidase) als intravitaler Marker im Tierversuch verwendet. Man kann hier das Färbeprodukt durch Zugabe von Natriumnitroferricyanid stabilisieren. Peroxidasen sind dazu fähig die farblose Form mancher Farbstoffe durch Oxidation in ihre farbige Form zu verwandeln. Bspw. Patent blue VF bindet als anionischer Triphenylmethanfarbstoff an das Protein am Reaktionsort und wird zur Darstellung von Hämoglobin eingesetzt.

254

Enzymhistochemie

4.1. Peroxidase-Darstellung mit Diaminobenzidin Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB) ist das gebräuchlichste Chromogen zur Peroxidase-Darstellung. DAB wird durch Wasserstoffperoxid unter der katalytischen Wirkung von Peroxidase schnell in eine u nlösliche, amorphe, braune Substanz umgesetzt. Die in der ersten Reaktion entstehenden Verbindungen werden in einer weiteren Reaktion, ebenfalls unter Peroxidase-Katalyse, zu Polymeren zusammengebaut. Diese amorphe Substanz kann innerhalb von intakten Zellorganellen gesichtet werden. Andere kristalline Farbprodukte würden die Organellen zerstören und den unmittelbaren Ort der Entstehung verlassen. (Abb.144) Abb.144 Diaminobenzidin Sind in der Inkubationslösung Nickel- oder Kobaltsalze anwesend, formiert sich statt brauner eine blau-schwarze Farbe, was den Kontrast verstärkt. Diese Schwärzung lässt sich auch durch Nachosmikation in einer sauren Mischung aus Osmiumtetroxid und Kaliumferrocyanid erreichen. DAB-Farbprodukte sind unlöslich, die Schnitte können entwässert und mit KunststoffEinschlussmittel eingedeckt werden. Falsch-positive Reaktionen sind meist auf die Anwesenheit von Cytochrom-Oxidase und Katalase zurückzuführen. Cytochrom-Oxidase wird aufgrund ihrer Empfindlichkeit durch die Fixierung mit Formaldehyd üblicherweise inaktiviert. Katalase (baut H2O2 zu Wasser und Sauerstoff ab) kann ebenfalls die Umsetzung des Chromogens bewirken und wird durch Aminotriazol gehemmt. Peroxidase und Katalase können aufgrund ihrer Tabelle 19 Konzentration H2O2 Peroxidase Katalase katalytischen Wirkung bei ununter 0,003 M aktiv nicht nachzuweisen terschiedlichen Konzentratiobei 0,015 M aktiv nen von Wasserstoffperoxid größer 0,05 M gehemmt differenziert werden (Nachbei 4 M alle gehemmt aktiv weis mit Benzidin). Das Inkubationsmedium enthält DAB in Pufferlösung (pH der Reaktion bei 7,3), weiters eventuell Kobaltchlorid und Nickelammoniumsulfat. Die Inkubationslösung wird kurz vor Gebrauch hergestellt, unmittelbar vor Gebrauch wird das Substrat (Wasserstoffperoxid) zugegeben. Die Schnitte werden ca. 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Eine Gegenfärbung kann angeschlossen werden. Nach Entwässern und Klären wird in Kunststoff eingedeckt. Als Negativkontrolle wird in der Inkubationslösung das Wasserstoffperoxid weggelassen. Falsch-positive Reaktionen sind wahrscheinlich auf Cytochromoxidase zurückzuführen. Weiters kann als Negativkontrolle die endogene Peroxidase auch durch Inhibitoren inaktiviert werden. Inhibitoren: Peroxidase wird durch Cyanid- und Azidionen in passender Konzentration gehemmt. Die Einwirkung von 0,3% Wasserstoffperoxid hemmt die Enzymaktivität irreversibel. Die Hemmung der endogenen Peroxidase ist im Zusammenhang mit der i mmunhistologischen Technik ein wichtiges Thema, wo als Detektionssystem HRP (horseradish peroxidase, Meerrettichperoxidase) verwendet wird.

255

Histotechnik

4.2. Peroxidase-Darstellung mit Aminoethylcarbazol

Abb.145 AEC

Aminoethylcarbazol (AEC) ist ein beliebtes Chromogen zum Nachweis peroxidase-gebundener Nukleotide bzw. Antikörper. Der Vorteil der AEC-Anwendung liegt im klaren Kontrast des roten Farbprodukts gegenüber der üblichen Gegenfärbung mit Hämalaun. Es ist jedoch alkohollöslich und kann nur mit wasserlöslichen Eindeckmitteln eingedeckt werden.

Das Inkubationsmedium enthält AEC gelöst in Dimethylformamid. Die acetatgepufferte Lösung soll pH 6 nicht überschreiten. Das Farbprodukt würde sich sonst wieder lösen. Unmittelbar vor Gebrauch wird Wasserstoffperoxid zugegeben, 2–5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Eine Gegenfärbung kann angeschlossen werden, wobei alkoholische Lösungen vermieden werden müssen. Eingedeckt wird in wässrigem Medium. (Abb.145) 5.

Cytochromoxidase

Im letzten Teil der Zellrespirationskette werden von Cytochrom c Elektronen auf Cytochrom a und aa3 übertragen. Von diesen werden die Elektronen auf den Sauerstoff übertragen. Cytochromoxidase katalysiert die Reaktion, bei der die reduzierte Form von Cytochrom c in die oxidierte Form umgesetzt wird. Cytochromoxidase beinhaltet Eisenatome (eng gebunden an eine der Hämgruppe ähnlichen, prosthetischen Gruppe) und Kupferatome. (Abb.146) Das Enzym wird durch Cyanid- und Azidionen gehemmt, weiters auch durch verschiedene andere toxische Substanzen, wie Hydrogensulfid und Kohlenmonoxid. Cytochromoxidase kommt in allen Zellen von aerob lebenden Organismen vor. Man findet sie in den Mitochondrien. Der Nachweis dient als Indikator für die Sauerstoffumsetzung der Zelle und gehört in das Gebiet der Forschung. Der Nachweis erfolgte früher mit der NADI-Methode. Die Naphtol-Diamin-Technik führte zu einem relativ instabilen Farbstoff. Die modernen Techniken verwenden DAB zur Darstellung. Die Oxidation von DAB durch Cytochrom c unter katalytischer Wirkung von Cytochromoxidase resultiert im unlöslichen, braunen Polymer, das durch Metallionen noch geschwärzt werden kann.

Abb.146 Atmungskette

Dem gepufferten Inkubationsmedium muss exogenes Cytochrom c zugegeben werden und weiters Katalase, um falsch positive Reaktionen zu vermeiden. Während des Tests entsteht H2O2, das durch Peroxidaseanwesenheit umgesetzt werden könnte. Die zugesetzte Katalase zerstört das Wasserstoffperoxid.

256 6.

Enzymhistochemie

Tyrosinase (DOPA-Oxidase)

Dieses Enzym katalysiert die Reaktion von Tyrosin über Dihydroxyphenylalanin (DOPA) zu Melaninpigment, ein stabiles, schwarzes, unlösliches Polymer. Die Methode ist deshalb ungewöhnlich, weil hier als Substrat und Endprodukt natürliche Substanzen auftreten. Es lassen sich mit dem Test melaninproduzierende Zellen nachweisen. Gefrierschnitte werden in Inkubationslösungen, die Tyrosin und DL-DOPA bzw. nur DL-DOPA als Substrate enthalten, bei 37°C eingestellt. Phospatpuffer stabilisiert den pH-Wert bei 7,4. Als Kontrollinkubationslösungen dienen reiner Phosphatpuffer und eine Lösung, die einen Inhibitor enthält. Durch die Negativkontrolle kann man schon vorher bestehendes Melanin erkennen und vom Testergebnis differenzieren. 7.

Aminoxidase (Monoaminoxidase, MAO)

Dieses Flavoproteinenzym setzt Verbindungen wie Dopamin, Noradrenalin und Serotonin um. Bei der Reaktion entsteht Wasserstoffperoxid. Der Elektronenakzeptor ist FAD als prosthetische Gruppe des Enzyms. Die Enzymdarstellung erfolgt durch den Nachweis des gebildeten Wasserstoffperoxids. Dies geschieht entweder durch Ceriumpräzipitation und Indikation durch DABOxidation oder mittels zugegebener Peroxidase und DAB-Oxidation. Der Test wird bspw. an frei schwimmenden Vibratomschnitten (30 µm dick) durchgeführt. Die Inkubation kann bis zu 48 Std. dauern.

Histotechnik

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Immunhistochemie A. Prinzip............................................................................................................258 B. Anwendung der Immunhistochemie .............................................................259 1. Grundlagen der diagnostischen Anwendung .........................................259 2. Anwendung der IHC in der Pathologie ..................................................259 C. Antikörper .....................................................................................................260 1. Wichtige Eigenschaften ..........................................................................262 2. Marker ....................................................................................................265 D. Begriffe..........................................................................................................268 E. Fixierung, Processing, Schneiden in der Immunhistologie ............................270 F. Antigen-Demaskierung .................................................................................272 1. Andauung durch proteolytische Enzyme ................................................272 2. Hitze .......................................................................................................272 3. Kombination von Hitze und Enzymandauung.........................................275 G. Methoden......................................................................................................275 1. Reaktionspartner.....................................................................................275 2. Direkte Methode (Ein-Schritt-Methode) .................................................278 3. Indirekte Methode (Zwei-Schritt-Methode) ............................................279 4. Drei-Schritt-Methode..............................................................................281 5. Unmarkierte-Antikörper-Methode (PAP, APAAP) ...................................281 6. ABC-Methode (Avidin-Biotin-Complex) .................................................282 7. LAB / LSAB-Methode (Labelled-Strept-Avidin-Biotin) ............................282 8. Doppelfärbungen ...................................................................................283 H. Amplifikationsmethoden ...............................................................................283 1. Amplifikation durch Wiederholung.........................................................283 2. Amplifikation durch Imidazol ..................................................................284 3. Amplifikation mit biotinyliertem Tyramid................................................284 4. Amplifikation durch Silberpräzipitation bei Gold-Labelling-Methoden ..284 I. Hintergrund-Färbung ....................................................................................284 1. Hydrophobe und elektrostatische Wechselwirkungen ...........................284 2. Endogene Enzymaktivität .......................................................................285 3. Endogenes Biotin ...................................................................................286 4. Spezifische Hintergrundfärbung .............................................................286 5. Sonstige Ursachen ..................................................................................287 J. Qualitätssicherung in der Immunhistologie...................................................287 1. Positivkontrollen .....................................................................................288 2. Negativkontrollen ...................................................................................288 3. Troubleshooting .....................................................................................289 K. Bearbeitung von zytologischem Material und Gefrierschnitten ....................290 L. Protokoll-Beispiel für LSAB-Methode............................................................291 M. Automation ...................................................................................................292

258

Immunhistochemie

Immunhistochemie Die Entwicklung der immunhistologischen Techniken gehört zum größten Fortschritt in der feingeweblichen Befundung seit der Einführung von histochemischen Färbungen im Laufe der letzten hundert Jahre. In der Mitte der fünfziger Jahre gelang bereits der Nachweis von Mikroorganismen in Gewebeschnitten mittels Antigen-Antikörper-Reaktion durch die „direkte Immunfluoreszenz“. Seit den Sechziger- und Siebzigerjahren befassen sich die Forscher mit Nachweismethoden basierend auf Farbstoffentwicklung am Ort der Ag-AK-Reaktion. In der Mitte der 80iger Jahre begann der Einzug der Immunhistologie in das Histodiagnostiklabor. Die Idee der eindeutigen Identifizierung von Gewebeeigenschaften durch spezifische Antigen-Antikörper-Reaktionen war vorerst auf Gefrierschnitte beschränkt. Durch intensive Forschungsarbeit auf diesem Gebiet konnten bald routinefähige Techniken für formalin-fixierte, paraffineingebettete Gewebe angeboten werden. Die Anzahl der nachweisbaren Gewebeeigenschaften stieg rasant an. Um dieser Entwicklung Rechnung zu tragen, wurden Automaten zur Unterstützung gebaut, die eine gleichmäßige Behandlung der Schnitte garantieren. Die Standardisierung der immunhistologischen Methoden ist von großer Bedeutung, da sich geringe Abweichungen je nach Empfindlichkeit des Epitops entsprechend auswirken können. Eine laborübergreifende Standardisierung ist aufgrund der Variationsmöglichkeiten der Testabläufe noch nicht gegeben. Durch die Spezifität der Methode, die mittlerweile zum Routinerepertoire gehört, wurden viele unspezifischere bzw. weniger stabile Techniken (wie z.B. histochemische Färbungen, Enzymhistochemie) zurückgedrängt. Weiters wurden in verschiedenen Bereichen differenziertere Diagnosen möglich, die mit den bisherigen Methoden nicht erreicht werden konnten. Und die Entwicklung ist weiter in Gang, um eine höchstmögliche Sensitivität der Tests zu erreichen. Die Immunhistologie erhält auch zunehmend an Bedeutung für die therapeutischen Maßnahmen am Patienten durch die eindeutige Identifikation von Tumoren. Dieses Thema ist sehr umfangreich und aufgrund der Aktualität in vielen Veröffentlichungen vertreten. Hier alle Einzelheiten zu erläutern würde den Umfang des Buches sprengen, deshalb beschränke ich mich auf allgemeine Beschreibungen der Techniken und verweise auf entsprechende Literatur.

A. Prinzip Der Nachweis beruht auf der Affinität von Antikörpern zu einer bestimmten Gewebeeigenschaft (= Epitop; bspw. Aminosäurengruppe, Oligosaccharidkette) als AntigenAntikörper-Reaktion. Im Idealfall kommt es zu einer spezifischen und starken Bindung zwischen Antikörper und Epitop am Gewebeschnitt. Der Antikörper ist mit einem Detektionssystem gekoppelt, das sein Vorhandensein auf dem Gewebeschnitt sichtbar macht. Mittels moderner Detektionssysteme können schon geringe Mengen an Epitop verstärkt dargestellt werden. Das Ziel ist es, ein Signal am Ort des Epitops (und nur dort) in ausreichender Stärke zu erkennen. Das Prinzip der Methode klingt einfach, die praktische Umsetzung ist jedoch mit verschiedenen Schwierigkeiten konfrontiert. Dazu gehört die Stabilität des Epitops bei der Gewebebehandlung, die Erreichbarkeit des Epitops durch den Antikörper, das

Histotechnik

259

Einstellen der optimalen Reaktionsbedingungen für Antigen-Antikörper-Reaktionen, inklusive der idealen Konzentrationen der Reaktionspartner und die Möglichkeit von unspezifischen Bindungen durch die beteiligten Antikörper an andere Gewebestrukturen. Lektinhistologie: Lektine können ebenfalls in gleicher Weise wie Antikörper eingesetzt werden. Es handelt sich dabei um Proteine oder Glykoproteine meist pflanzlichen aber auch tierischen Ursprungs. Sie besitzen eine spezifische Affinität zu bestimmten Polysacchariden.

B. Anwendung der Immunhistochemie Die immunhistologischen Techniken haben ein breites Anwendungsspektrum. In der Routinehistologie liegt ihre Bedeutung natürlich in der morphologischen Diagnostik. Das große Gebiet der Untersuchungen an Zellen, Geweben und deren Funktionsweisen in der Forschung kommt ohne diese Methoden nicht aus. Hier werden für das jeweilige Experiment die Protokolle erstellt. Die IHC kann durchgeführt werden auf Gefrier-, Kunststoff- und Paraffinschnitten, Vibratomschnitten, frei flottierenden Schnitten und auch auf Zellkulturen. Neben der Tumordiagnostik ist auch der direkte Erregernachweis im Gewebe eine wichtige Anwendung (z.B. Spirochäten, Helicobacter pyl., Erreger der catscratch disease, u.v.m.) 1.

Grundlagen der diagnostischen Anwendung

Zellen lassen sich z.B. durch zellspezifische Proteine, sog. Intermediärfilamente, charakterisieren. Dazu gehören: Cytokeratine (Epithelzellen), Vimentin (mesenchymale Zellen), Desmin (glatte, quergestreifte Muskulatur, Herzmuskel), Gliafilament-Protein (bestimmte Gliazellen, Astrozyten), Neurofilament (Neuronen). Weitere Unterscheidungsmerkmale sind spezifische Zellinhaltsstoffe wie z.B. Hormone, Enzyme oder Glykoproteine. Lymphozyten bzw. Leukozyten exprimieren je nach Differenzierungs- und Aktivierungsgrad andere CD-Marker (= Cluster of Differentiation) an ihrer Zellmembran. Die Basis für den Einsatz der Immunhistochemie stellt immer die Histomorphologie dar. Der Pathologe setzt den immunhistologischen Nachweis gezielt aufgrund verschiedener „Verdachtsmomente“ ein. Bei der Befundinterpretation muss die Morphologie mit der IHC vereinbar sein. 2.

Anwendung der IHC in der Pathologie

•

Klassifizierung und Diagnose von wenig differenzierten, malignen Tumoren o o

Tumorzellen unterschiedlicher Herkunft können morphologisch ähnlich aussehen. Bei kleinen Biopsien muss die Diagnose an sehr wenigen Zellen erfolgen.

Mithilfe einer Untersuchungskaskade lassen sich die Zelleigenschaften bestimmen und die Zugehörigkeit zu Tumorgruppen darstellen.

260 •

Immunhistochemie

Identifikation des Primärtumors bei Metastasen o o

Die Morphologie der Metastasenzellen lässt keine Rückschlüsse auf den Primärtumor zu. Die Anzahl der Tumorzellen ist zu klein.

Organspezifische bzw. zellspezifische Marker weisen den Weg zum Primärtumor. •

Identifikation von infektiösen Erregern o o

•

Eine Verdachtsdiagnose aus dem HE-Schnitt kann bestätigt werden. Virennachweis in Tumorgewebe (Lymphom – Epstein-Barr-Virus).

Klassifizierung von Lymphomen und Leukämien Unterscheidung von B- und T-Lymphozyten. Die genaue Klassifizierung ist für eine adäquate Behandlung unbedingt notwendig.

•

Prognose und Therapie Manche Tumorarten exprimieren Zelleigenschaften, die entscheidend für das Ansprechen einer Therapie sind (Östrogenrezeptoren, HER-2 bei Mamma-Karzinom). Andere Antigene geben Auskunft über die Aggressivität des Tumors bzw. das Ansprechen auf Chemotherapie.

C. Antikörper Für umfangreichere und detaillierte Informationen über das Immunsystem und über Antikörper verweise ich auf entsprechende Literatur. Hier eine vereinfachte Darstellung: Verabreicht man einem Versuchstier eine fremde, makromolekulare Substanz (Antigen), wird sie vom Immunsystem als körperfremd erkannt. Es kommt zur Bildung von Antikörpern gegen diese Substanz, um sie zu neutralisieren. Die Substanz bietet dem Organismus diverse Epitope, gegen die jeweils spezifische Antikörper synthetisiert werden. Immunologisch unterschiedliche Antikörper binden im SchlüsselSchloss-Prinzip an die Fremdsubstanz. Es handelt sich dabei um polyklonale, heterogene Antikörper, die von verschiedenen Plasmazellen stammen. (Abb.147)

Abb.147 polykl. AK

Gewonnen werden die Antikörper aus dem Serum der Versuchstiere. Werden mehrere Tiere einer Spezies mit der gleichen Substanz immunisiert, kann man die Seren poolen (sammeln). Durch Salzpräzipitation und Affinitätschromatographie werden die Seren von den übrigen Serumproteinen gereinigt.

Abb.148 monoklonale Antikörper

Tiere, die zur Antikörperproduktion eingesetzt werden, sind hauptsächlich Maus, Kaninchen, Meerschweinchen, Schwein oder Ziege. Man verabreicht das Antigen durch sogenannte Inokulation unter die Haut. Dadurch erfolgt die I mmunisierung. Wiederholte Immunisierung nennt man Boostern. Das hat den Effekt einer ver-

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Histotechnik

mehrten Antikörperbildung (höhere Konzentration im Serum) und einer Verbesserung der Antikörperqualität (= Affinitätsreifung). Antikörper, die nur von einer Plasmazelle stammen, sind nur gegen ein bestimmtes Epitop gerichtet. Fusioniert man die Plasmazelle mit einer „unsterblichen“ Myelomzelle, erhält man einen Antikörper-produzierenden Zellklon. Die Herstellung der monoklonalen Antikörper erfolgt in Zellkulturen, sie werden aus dem Kulturmedium gewonnen (Abb.148). Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern ist teurer und schwieriger als die Produktion von polyklonalen Antikörpern. Im Histodiagnostiklabor verwendet man industriell hergestellte Antikörper. Die Entwicklung von neuen Antikörpern und Nachweismethoden bleibt der Forschung vorbehalten. Die Antikörper der immunhistologischen Technik gehören hauptsächlich zur Gruppe der Gamma-Immunglobuline (IgG). Sie sind charakteFc, Fragrisiert durch ihre Y-Form mit dem gleichbleibenden Anteil (F ment constant) als „Stamm“ und den modifizierbaren Anteil (F Fab, Fragment Antibody-binding) als „Äste“. Das fab-Fragment wird so synthetisiert, dass es genau zu dem Epitop passt. Teilt man den AntiAbb.149 IgG körper der Länge nach in zwei gleiche Hälften, besteht jede Hälfte aus heavy chain, Gammakette) und einer kürzeren Keteiner langen Kette (h te (llight chain, Kappa- oder Lambdakette) im fab-Bereich. Die einzelnen Teile des Antikörpers sind mit Disulphidbrücken miteinander verbunden. Der Aufbau des fcFragments mit seinen angelagerten Oligosacchariden ist für die jeweilige Spezies konstant. (Abb.149)

Abb.150 sekundäre Antikörper

Produktion monoklonaler Primärantikörper 1. Antigen in Maus (Immunisierung) 2. Antikörperproduktion 3. Plasmazellgewinnung / -Fusionierung 4. Zellklonbildung 5. Antikörpergewinnung 6. Reinigung

Immunglobuline haben als Makromoleküle selbst antigene Eigenschaften. Verabreicht man einer anderen Spezies artfremde Antikörper (z.B. MausAntikörper in Kaninchen), werden wiederum polyklonale Anti-Antikörper gebildet, die gegen das fc-Fragment gerichtet sind. Diese sog. sekundären Antikörper (Abb.150) reagieren im Weiteren mit allen Antikörpern der ersten Tierart (z.B. Kaninchenanti-Maus-AK). Als polyklonale Antikörper können sie an mehrere Epitope des fc-Fragments ankoppeln. Dieser Mechanismus wird bei den mehrstufigen Testabläufen ausgenutzt, um den Nachweis sensitiver zu machen.

Produktion polyklonaler Sekundärantikörper 1. Maus-Antikörper = 2. Antigen 2. Kaninchen-Immunisierung 3. Antikörperproduktion 4. Poolen von Seren mehrerer Tiere 5. Antikörpergewinnung 6. Reinigung

262 1.

Immunhistochemie

Wichtige Eigenschaften

1.1. Monoklonal – Polyklonal Der Unterschied bei der Erzeugung wurde schon beschrieben. Vorteile monoklonaler Antikörper: •

Durch die einheitliche Zusammensetzung des Antiserums kann man mit einer gleichbleibenden Qualität rechnen, auch von Charge zu Charge.

•

Es kommt zu keinen Reaktionen durch unspezifische Antikörper.

•

Kreuzreaktionen treten selten auf.

•

Die Ergebnisse sind garantiert reproduzierbar.

Nachteil monoklonaler Antikörper: •

teurer

•

Der Nachweis ist von den Eigenschaften eines einzigen Antikörpertyps abhängig.

•

Wird das nachzuweisende Epitop beim Prozess zerstört, kommt es zu einem falsch negativen Ergebnis.

•

Antikörper mit niedriger Affinität führen zu leicht löslichen AntigenAntikörper-Bindungen und damit zu einem schwachen Ergebnis.

Bei sorgfältiger Auswahl des gesuchten Antikörpers sollte der monoklonale Antikörper dem polyklonalen überlegen sein. In der Praxis führen vergleichende Testansätze zur Wahl des optimalen AK. Vom Verhalten der polyklonalen AK darf man nicht direkt auf die Eigenschaften des monoklonalen AK für dasselbe Antigen schließen. 1.2. Größe Es gibt fünf Fraktionen von Immunglobulinen (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE), mit unterschiedlichen Strukturen und Einsatzbereichen. Gamma-Immunglobuline gehören zu den kleineren mit 150 kD. Kleinere Antikörper haben es einfacher, in das Gewebemaschenwerk einzudringen. Auch kommt es weniger zu gegenseitiger sterischer Behinderung bei der Bindung. In der Praxis wurde aber keine effektive Abschwächung der Reaktion bei Verwendung großmolekularer AK festgestellt. 1.3. Protein Als Protein unterliegt der Antikörper der Beeinflussung durch pH-Wert und Salzkonzentration in der Lösung. Zur Optimierung des Reaktionsmilieus verwendet man Pufferlösungen (als Verdünnungslösung und bei Waschschritten). •

PBS (= phosphate-buffered-saline): 0,8–0,9% ige NaCl-Lösung in 0,03 M Phosphatpuffer, pH 7,2–7,4.

•

Tris-Puffer (= TBS): 0,01 M enthält Trizma-Base und NaCl, wird mit 2N HCl auf pH 7,6 eingestellt

An das Makromolekül lassen sich Farbstoffe, Fluorochrome, Enzyme, kolloidale Metalle, Dextran-Polymere, Biotin oder Radioisotope anbinden. Dies geschieht z.B. durch Zugabe von Glutaraldehyd, das ähnlich wie bei der Fixierung zu Vernetzungen zwischen den Reaktionspartnern führt. Man nennt die Antikörper dann markierte oder

263

Histotechnik

konjugierte Antikörper (Abb.151). Bei der Markierung kommt es auch zur Anbindung der Marker im antigenbindenden Bereich oder in seiner Nähe, wodurch die Antigenbindung ver- oder behindert werden kann. Markierte Antikörper zeigen deshalb eine schwächere Affinität als unmarkierte. Die Proteine in Lösung neigen dazu, bei der Lagerung Aggregate zu Abb.151 bilden, was sich durch vermehrte unspezifische Anbindung am Gewebeschnitt bemerkbar machen kann. Diese Eigenschaft wird durch die Reinigungsart der Antikörper-Seren beeinflusst. Ionentausch-Chromatographie führt hier zu besseren Ergebnissen. Bei der Lagerung der Antikörper verhalten sich isolierte AK gegenüber solchen, denen andere Serumproteine beigemengt wurden, weniger stabil. Auch die nachfolgend beschriebenen Eigenschaften wie Spezifität und Affinität werden durch die Art der Reinigungsverfahren und Lagerung beeinflusst. 1.4. Spezifität Antikörper sollen spezifisch an die entsprechende antigene Determinante (= Epitop) binden. Das heißt, die Aminosäurenbzw. Oligosaccharidstrukturen müssen ideal zusammenpassen, damit eine starke Bindung entsteht. Man spricht hier vom typischen Schlüssel-Schloss-Prinzip. (Abb.152) Das Epitop sollte dabei typisch für ein bestimmtes Antigen sein, damit man von einem s pezifischen Nachweis sprechen kann. Findet man dieselbe antigene Determinante auf verschiedenen Zelltypen, kann man sie durch diese Eigenschaft nicht unterscheiden.

Abb.152 Schlüssel Schloss-Prinzip

Die Spezifität eines Antikörpers ist für bestimmte Bedingungen gegeben. So kann die Spezifität eines Antikörpers, der für Gefrierschnitte entwickelt wurde, am Paraffinschnitt mangelhaft sein (z.B. weil das Epitop durch Fixierung und Paraffineinbettung zerstört oder beeinträchtigt wurde).

Abb.153 Kreuzreaktionen

Wenn ein Antikörper an ähnliche Epitope koppelt, bzw. wenn der Antikörper an idente Epitope auf verschiedenen Antigenen koppelt, spricht man von Kreuzreaktivität. Ein spezifischer Antikörper gegen ein typisches Epitop sollte keine Kreuzreaktivität zeigen. Bindungen der Antikörper an Gewebeelemente, die nicht auf eine AgAK-Reaktion zurückzuführen sind (unspezifische Reaktionen), bezeichnet man nicht als Kreuzreaktionen.

1.5. Affinität / Bindungsstärke Die Ag-AK-Bindung beruht auf Wasserstoffbrückenbindung, elektrostatischer Anziehung und Van-der-Waal-Kräfte. Es kommt zu keiner kovalenten Bindung. Die AntigenAntikörper-Komplexbildung unterliegt den Gesetzen der chemischen Reaktion. Es wird ein Gleichgewicht zwischen antigengebundenen und freien AK angestrebt.

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Bei der Testdurchführung muss man bedenken, dass die Antigen-Antikörper-Reaktion reversibel ist und Einflüsse, die die Bindung schwächen, vermieden werden sollen. Dazu gehören hohe Salzkonzentration, hohe Temperatur und niedriger pH-Wert. Unter Affinitätsreifung versteht man, die Verbesserung der Antikörperqualität bei wiederholter Immunisierung der Versuchtiere. •

Je höher die Affinität eines AK ist, desto geringer ist die benötigte Konzentration an freiem Antigen, um alle verfügbaren Bindungsstellen abzusättigen und ein Gleichgewicht zu erreichen.

•

Je höher die Affinität eines AK ist, desto rascher bindet er an das Gewebsantigen und ergibt so schon während einer kurzen Inkubation eine intensivere Färbung als ein weniger affiner AK.

•

Je höher die Affinität eines AK, umso besser hält die Bindung während der oft „rauen“ Testbedingungen.

•

Die Affinität der Bindung hängt bei monoklonalen Antiseren von der Qualität eines einzigen Klons ab. Polyklonale Antiseren enthalten Antikörper unterschiedlicher Affinität, die sich ausgleichen können.

•

Hohe Spezifität bedeutet nicht automatisch hohe Affinität. So kann der Antikörperklon zwar sehr spezifisch, aber von geringer Bindungsstärke sein, was sich bei der Testdurchführung als nachteilig erweist.

1.6. Antikörpertiter In der Immunhistochemie wird der Antikörpertiter als die höchste Verdünnung eines Antiserums definiert, mit der eine optimale, spezifische Anfärbung bei geringstem Hintergrund (= unspezifische Färbung) erzielt wird. Bei monoklonalen AK wird die K onzentration in µg/ml angegeben. Sie dient als Basis zur Herstellung der benötigten Verdünnung. Als Verdünnungslösungen sind hauptsächlich PBS bzw. Tris-Puffer im Einsatz. Hier sollte man bedenken, dass PBS die Sensitivität der Immunreaktion zwischen Antigen und monoklonalen AK verringern kann. PBS ist für Testansätze, die mit alkalischer Phosphatase arbeiten, ungünstig, weil die enthaltenen Phosphate das Enzym hemmen. Verdünnungen werden als Verhältnis des konzentrierten AK-Serums zum Gesamtvolumen angegeben (1:10 = 1 Teil Serum + 9 Teile Verdünnung). Zur Bestimmung der idealen Verdünnung erfolgt eine sogenannte Titration. Dabei variiert man den von der Herstellerfirma empfohlenen Verdünnungs-Bereich bei konstanter Inkubationszeit. Das Ziel ist ein Färbeergebnis, das eine möglichst klare, spezifische Färbung bei mögSignal-Rausch-Relation). lichst geringer Hintergrundfärbung zeigt (S 1.7. Reaktionstemperatur - Inkubationszeit Reaktionstemperatur, Antikörpertiter und Inkubationszeit stehen in einem engen Zusammenhang. Änderungen eines Faktors beeinflussen auch die anderen Parameter. (Abb.154) Die Geschwindigkeit der Reaktion lässt sich durch Veränderung der AK-Konzentration leicht beeinflussen. Eine doppelte oder dreifache Konzentration kann bereits zu einer Beschleunigung um ein Vielfaches führen. Eine zu hohe AK-Konzentration führt jedoch zu starken, unspezifischen Bindungen (Hintergrundfärbung). Deshalb muss man

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hier das optimale Mittelmaß zwischen Geschwindigkeit und gutem Ergebnis wählen. Die gewählte Inkubationszeit ist dann genau einzuhalten, um vergleichbare Resultate zu erhalten. Andererseits kann man durch sehr lange Inkubationszeiten (bis 48 Std.) hohe AK-Konzentrationen bei teuren Seren vermeiden. Über-Nacht-Inkubationen geschehen meist bei 2–8°C. Höhere Temperaturen beschleunigen die Ag-AK-Reaktion. Beim Austesten der optimalen Ergebnisse (Titrieren) in der Routine-Praxis bleibt man meist bei konstanten Inkubationszeiten (meist zwischen 20–60 min) und konstanter Temperatur (RT oder 25°C/37°C) und variiert die AKKonzentration. Wie bei allen Reaktionen spielt auch die Bewegung des Reagens eine Rolle. Durch die Verwendung von Rotatoren bzw. Mischungstechniken in Automaten wird die Zeit verkürzt.

Abb.154 Relationen

1.8. Handhabung im Labor Käufliche Antiseren haben meist eine garantierte Stabilität über mehrere Jahre. Die genauen Lagerungsvorschriften des Herstellers sind allerdings einzuhalten. Dazu gehört auch die Einhaltung der Kühlkette bei frisch eingetroffenen Reagenzien. Von Vorteil ist eine Protokollführung, wo Chargennummern, Lieferdatum und Ablaufdatum verzeichnet werden. Für die Charakterisierung des gekauften Antikörpers bietet sich das Führen eines eigenen Data-Sheets an, wo man die optimalen Testvorschriften (Konzentration, Vorbehandlung) bzw. Erfahrungswerte notiert. Die wichtigste Komponente bei der Lagerung ist die richtige Temperatur. Kühl- und Gefriergeräte sollten hier einem Kontrollsystem unterliegen, um die teure Ware nicht zu gefährden. Unverdünnte Antiseren sollten portioniert bei –20°C gelagert werden. Tiefgefrorene Seren sollen schonend auf Raumtemperatur gebracht werden. Verdünnte Antiseren und Färbekits mit vorverdünnten Komponenten sollten bei 2–8°C gelagert werden, um wiederholtes Auftauen und Einfrieren zu vermeiden. Verwendete Reagenzien werden möglichst rasch wieder in die optimalen Lagerbedingungen gebracht. Proteine in Lösung neigen dazu, sich an die Behälterwände anzulagern. Geeignete Materialien bieten deshalb möglichst wenig Adsorbtionsmöglichkeiten für die Proteine. Dazu gehören z.B. Polypropylen, Polykarbonat oder Borsilikatglas. Durch die Zugabe von Rinderserumalbumin (BSA = bovine serumalbumine) als Trägerprotein werden Adsorbtionsverluste vermindert. 2.

Marker

Wie bereits erwähnt kann man an die makromolekularen Antikörper andere Moleküle chemisch binden, mit denen man die Reaktion „sichtbar“ machen kann. Auf die „Bindungsreaktion“ folgen Reinigungsschritte, die die konjugierten Antikörper von anderen konjugierten Serumproteinen befreien sollen.

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2.1. Enzyme Enzyme werden am häufigsten zum Markieren von Antikörpern verwendet. Üblicherweise binden mehrere Enzymmoleküle an ein Antikörpermolekül. Diese Enzymmoleküle können ihrerseits eine große Menge an Chromogen zu einem stabilen Farbstoff umsetzen, bis das Reaktionsgleichgewicht erreicht ist. Am häufigsten in Verwendung ist die Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase HRP) in Kombination mit dem gebräuchlichsten Chromogen DAB (Diaminobenzidintetrahydrochlorid). Das Farbergebnis ist ein unlösliches, stabiles, braunes Endprodukt am Ort der Reaktion und damit am Ort des Antigens. Alternativ dazu gibt es andere Chromogene wie AEC (Amino-ethyl-carbazol), das ein rotes, jedoch xylol-lösliches Endprodukt ergibt. Die Schwierigkeit beim Nachweis mit Hilfe von Peroxidase ist das Vorhandensein von natürlicher Enzymaktivität im Gewebe. Diese sog. endogene Peroxidase muss dementsprechend blockiert werden (siehe Kap. Hintergrund). Die gebräuchlichste Alternative zur HRP ist Alkalische Phosphatase AP (aus Kälberdarm). Sie wird bei blutreichem Gewebe bevorzugt, um die Beeinflussung durch die endogene Peroxidase zu umgehen. Endogene Phosphatase wird üblicherweise durch Zugabe von Levamisol zur Substratlösung blockiert, bzw. wird sie durch Hitzeeinwirkung bei der Ag-Demaskierung völlig inaktiviert. Setzt man verschiedene Enzyme gleichzeitig ein, kann man das zur gleichzeitigen Darstellung verschiedener Antigene nützen (Doppelfärbungen). Siehe auch: Kapitel Enzymhistochemie, Nachweis von Peroxidase bzw. alkal. Phosphatase 2.2. Fluorochrome Die gebräuchlichsten Fluorochrome sind Fluoresceinisothiocyanat (F FITC) und TetraTRITC). In alkalischer Lösung (pH 9–10) binden diese methyl-rhodaminisothiocyanat (T Substanzen kovalent mit Proteinen. Sie reagieren dabei mit der İ-Aminogruppe von Lysin. Im Idealfall binden zehn Fluorochrommoleküle an ein Antikörpermolekül. FITC zeigt sich als grüne Farbe (Anregung bei 490 nm, Emission bei 550 nm), TRITC als rote Farbe (Anregung bei 520–554 nm, Emission bei 582 nm) im Fluoreszenzmikroskop. Die Fluorochrome waren die ersten Marker der Immunhistologie. Als nachteilig gilt, dass man ein entsprechendes Mikroskop zur Auswertung benötigt und das Farbergebnis nicht dauerhaft stabil ist. Es gibt Eindeckmedien, die das Verblassen des Fluorochroms verlangsamen. Weitere Beispiele für Fluorochrome: DTAF (Dichlorotriazinylamino-Fluorescein, gelb-grün), LRSC (Lissamon-Rhodamin-Sulfonylchlorid, rot), Texas Red (rot), AMCA (Amino-Methylcoumarin-Acetat, blau). In der richtigen Kombination lassen sich die Farbstoffe zur Doppelmarkierung einsetzen, um gleichzeitig verschiedene Epitope darzustellen. Als Kern-Gegenfärbung eignet sich DAPI (Diamino-Phenylindol, blau) oder Propidiumjodid (rot).

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2.3. Biotin Antikörper lassen sich mit Biotin markieren (= Biotinylierung). Biotin ist Vitamin H und bildet das Coenzym oder die prosthetische Gruppe für mehrere Enzyme, die Carboxylgruppen transferieren. Es zeigt eine sehr starke Affinität zu Avidin oder Streptavidin. Avidin ist ein Glykoprotein aus dem Hühnereiweiß. Jedes Molekül besteht aus vier identen Untereinheiten, die jeweils ein Molekül Biotin binden können. Die Affinität zwischen Avidin und Biotin ist sehr hoch, obwohl keine kovalente Bindung vorliegt. Streptavidin ist ein Protein bakteriellen Ursprungs mit ähnlichen Eigenschaften wie die von Avidin. Avidin neigt bei physiologischem pH dazu, sich an lektinähnliche, negativ geladene Gewebebestandteile zu binden. Deshalb wird Streptavidin bevorzugt. (Abb.155) Avidin und Streptavidin lassen sich wiederum mit Enzymen oder Fluorochromen markieren. Das Biotinmolekül ist so klein, dass es die Funktion des Makromoleküls, an dem es hängt, nicht beeinträchtigt. So wie bei der endogenen Peroxidase muss bei manchen Gewebetypen das endogene Biotin blockiert werden (Leber, Niere, Darm). 2.4. Dextran-Polymer

Abb.155 Biotin

Die Idee hinter diesem Marker ist, dass man an den Antikörper ein möglichst großes Molekül anhängt, auf dem eine Vielzahl an Enzymmolekülen befestigt ist. Diese große Anzahl an Enzymen kann dann eine große Menge an Chromogen umsetzen und macht die Methode dadurch sehr sensitiv. (Kleine Menge an Antigen wird durch eine größere Menge an Chromogen sichtbar gemacht.) 2.5. Radioisotope Der Nachweis von Radioisotopen am Schnitt erfordert das entsprechende, radiologische Equipment und wird meist in der Forschung eingesetzt. Diese Methode ist notwendig zur quantitativen Auswertung von Epitopen. 2.6. Kolloidale Metalle Hier wird üblicherweise kolloidales Gold verwendet. Die Lösung besteht aus einem makromolekularen, stabilisierenden Reagens, das die Goldpartikel von definierter Größe (20–150 nm) umgibt und so ein Zusammenklumpen verhindert. Mit kolloidalem Gold lassen sich Immunglobuline, Lektine oder auch andere Substanzen, die Affinitäten zu bestimmten Gewebemolekülen haben, markieren. Zu diesen Substanzen gehört Protein-A. Es handelt sich dabei um einen Zellwandbestandteil des Staphylococcus aureus, der mit den Immunglobulinen bestimmter Spezies reagiert. Das Einsatzgebiet von immunhistologischen Techniken mit kolloidalem Gold liegt vor allem in der Elektronenmikroskopie zur Darstellung von Eigenschaften auf ultradünnen Kunststoffschnitten. Für die Lichtmikroskopie müssen die Goldpartikel erst noch durch eine Silberpräzipitationsreaktion sichtbar gemacht werden. 2.7. Quantum Dots QD’s sind Nanopartikel aus Halbleitermaterial, umgeben von einer weiteren Schicht eines organischen Farbstoffes (Lumophore) und einer äußeren Kunststoffschicht, die

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für die Bindungseigenschaften notwendig ist. Sie emittieren ähnlich wie Fluorochrome nach Anregung mit einer bestimmten Wellenlänge Licht in einer anderen definierten Wellenlänge bzw. Farbe. In welcher Farbe diese Emission resultiert, hängt von der Größe des QD’s ab. Die Anregungsenergien liegen für alle QD’s im ähnlichen Bereich. Die Emissionswellenlängen sind deutlich verschoben, was die Unterdrückung der Hintergrundstrahlung erleichtert. Der Vorteil gegenüber den Fluorochromen liegt darin, dass es zu keinem Photobleaching kommt. Die Anwendung von Quantum Dots hat sehr großes Potential, vor allem im Bereich der Microarray-Technik (siehe auch in situ Hybridisierung).

D. Begriffe Affinitätsabsorption Beschreibt die Entfernung von unerwünschten AK aus einem Serum durch Affinitätschromatographie. Das Serum durchfließt eine Matrix, die die entsprechenden Antigene enthält. Dadurch werden die unerwünschten AK gebunden und zurückgehalten. Affinitätsisolierung Bei der Chromatographie wird dem Serum das Antigen gegen den gewünschten AK angeboten, dieser wird gebunden und zurückgehalten. In einem nachfolgenden Schritt können die Immunglobuline wieder herausgelöst und gewonnen werden. Amplifikation Darunter versteht man die Steigerung der Signalstärke. Je mehr Moleküle des Markers dem Antigen zugeordnet werden können, umso klarer wird das sichtbare Ergebnis. Deshalb werden verstärkt Techniken angewandt, die in mehreren Schritten eine höhere Anzahl an Markermolekülen an den Ort des Antigens bringen. (Abb.156) Antiserum Ein Serum, das Antikörper enthält.

Abb.156

Brückenantikörper Ist meist mit dem Sekundärantikörper gleichzusetzen und dient als Bindeglied zwischen dem Primärantikörper und den nachfolgenden Reagenzien. Chromogen Das Chromogen wird dem Markerenzym angeboten und in ein bestimmtes, farbiges, stabiles Endprodukt umgesetzt. Demaskierung (Retrieval) Die determinanten Gruppen im Gewebe werden durch Fixierung und Einbettungsprozess beeinträchtigt, sodass ohne Vorbehandlung kein Nachweis gelingt. Diese Vorbehandlung nennt man Demaskierung. Sie kann auf unterschiedliche Weise durchgeführt werden und ist für die einzelnen Epitope anzupassen.

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Detektionssystem Damit bezeichnet man das Zusammenspiel der einzelnen Testkomponenten, um am Ort des Antigens ein sichtbares Signal zu erzeugen. Epitop Das ist derjenige Bereich eines Antigens, an den der Antikörper bindet. Es handelt sich dabei um Gruppen von Aminosäuren innerhalb eines Proteins, oder um Zuckerseitenketten bei Polysacchariden. Man bezeichnet das Epitop auch als antigene Determinante. Immunisierung Vorerst wurde damit der Vorgang beim Impfen zum Erlangen von Immunität beschrieben. In der Immunhistologie bezeichnet man damit das Einbringen eines Antigens in den Organismus zur Produktion von Antikörpern. Gegenfärbung Ähnlich wie bei den anderen histochemischen Färbungen wird zur Orientierung und Kontrastierung eine zweite Farbe auf den Schnitt gebracht (meist Kernfärbung mit Hämalaun). Hintergrund Der Hintergrund ist prinzipiell unerwünscht und bezeichnet unspezifische Färbung neben dem gewünschten Signal (Signal-Rausch-Verhältnis). Immunhistochemie, Immuncytochemie Je nach Region werden diese Begriffe als Synonym verwendet. Im deutschsprachigen Gebiet versteht man unter Immunhistochemie die immunhistologischen Techniken, die am Gewebeschnitt durchgeführt werden. Immuncytochemie beschäftigt sich mit intrazellulären Vorgängen und dem Nachweis in der Elektronenmikroskopie. Kreuzreaktion Der Antikörper reagiert mit identen Determinanten auf anderen Antigenen, bzw. reagiert mit ähnlichen Determinanten. Marker (engl. Label) Eine Substanz, die mit einem Antikörper oder Protein konjugiert wird, als Teil eines Detektionssystem. Die Art des Markers bestimmt das Ausmaß der Amplifikation, das durch das Detektionssystem erreicht wird, mit. Monoklonaler Antikörper Immunologisch identes Immunglobulin, das von einer Plasmazelle bzw. ihrem Klon stammt (meist von Mäusen, jetzt auch von Kaninchen). Nicht-Immunserum (= Normalserum) Serum, das aus Tieren vor der Immunisierung gewonnen wurde. Sollte alle Komponenten wie das Antiserum außer dem Antikörper enthalten.

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Polyklonale Antikörper Immunologisch heterogene Antikörper, die von verschiedenen Plasmazellen stammen und bei der Immunantwort auf ein Antigen mit verschiedenen Epitopen gebildet werden (meist von Kaninchen, Ziege). Primärer Antikörper Das ist jener Antikörper, der gegen das nachzuweisende Epitop gerichtet ist. Er wird beim Test als erstes Reagens auf den Schnitt aufgetragen. Sekundärer Antikörper Der sek. Antikörper ist gegen den primären Antikörper (fc) gerichtet. Er wird beim Test als zweiter AK aufgetragen und bildet die Brücke zu weiteren Reagenzien, sofern welche eingesetzt werden. Titer Darunter versteht man die höchste Verdünnung eines Antiserums, die ein optimales Signal-Rausch-Verhältnis bewirkt.

E. Fixierung, Processing, Schneiden in der Immunhistologie Während der Entwicklung der immunhistologischen Techniken wurde auch an einem optimalen Fixans zu diesem Zweck gearbeitet. Neben gepufferten Formaldehydlösungen zeigte sich bei pikrathältigen und zinkhältigen Fixantien ein sehr gutes Ergebnis. Jedoch wurde kein Mittel gefunden, das für alle Nachweise optimal war. Bei der Einführung der IHC in die Routine zeigte sich die Beeinflussbarkeit der Testergebnisse durch eine gute oder schlechte Fixierung. Zu kurze Fixierung führt zu Morphologieeinbußen, Empfindlichkeit der Epitope auf die Reagenzien und Temperaturen beim Einbettungsprozess. Eine zu lange Fixierung vor allem durch vernetzende Fixanzien erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass auch das Epitop „miteingebunden“ wird und dass ein zu engmaschiges Netzwerk entsteht. Dies hat zu einem neuen Verständnis im Processing geführt, wo darauf geachtet wird, das Gewebe für die Immunhistologie brauchbar zu erhalten. Standardisierung bei der Wahl des Fixiermittels und der Einbettungsreagenzien, der Temperaturen und Zeiten resultierte in besseren und reproduzierbaren Ergebnissen. Sehr dazu beigetragen hat die Verwendung der Einbettungsautomaten. Im Endeffekt wurde die Immunhistologie den vorherrschenden, gebräuchlichen Fixiermitteln angepasst, um sie in der Histodiagnostik effektiv einzusetzen. Dazu gehören neutral gepufferte Formaldehydlösungen zwischen 4–10 %. Frisches Gewebe soll innerhalb von 30 min in die Formaldehydlösung gebracht werden. Die Fixierzeit soll zwischen 6–24 Std. und nicht über 48 Std. liegen. Bouin’sche Lösung und quecksilberhaltige Lösungen wie B5 oder Zenker zeigen in bestimmten Bereichen Vorteile gegenüber Formalin. Sie benötigen jedoch eine Nachbehandlung und verändern die Gewebeeigenschaften bezüglich der Anfärbbarkeit (siehe Kap. Fixierung). Für die Elektronenmikroskopie gibt es glutaraldehydhältige und paraformaldehydhältige Fixiermittel. Das Gewebe sollte in max. 10x10x3 mm große Blöckchen für den Einbettungsprozess geschnitten werden. Für das Gewebeprocessing im Einbettungsautomaten ist wich-

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tig, dass die Temperatur von Alkoholen und Intermedien nicht über 45°C und die Paraffintemperatur nicht über 60°C ansteigt. Ein regelmäßiges Wechseln der Reagenzien soll eine optimale Behandlung garantieren. Für die Herstellung von Schnitten gelten dieselben Regeln, wie bei der üblichen Mikrotomie. Nachdem es sich um recht teure Tests und manchmal um sehr kleine Gewebeproben handelt, ist natürlich besondere Sorgfalt angebracht. Zerkratzte, faltige oder zu dicke Schnitte sollten nicht vorkommen. Da die Schnitte, besonders bei der Demaskierung, einer recht rauen Behandlung ausgesetzt sind, werden sie auf Adhäsiv-Objektträgern aufgezogen. Es gibt Käufliche in unterschiedlicher Qualität. Die Adhäsiv-Objektträger können aber auch selbst hergestellt werden (siehe Adhäsive: Silanisierung, Poly-L-Lysin, Chromgelatine). In „Praxis der Immunhistologie, Sabine Noll et al.“ wird sogar das Aufkleben der Schnitte mittels Bastelkleber beschrieben. Das Abschwimmen der Schnitte während des Tests ist ein öfters vorkommendes Problem. Ein Tipp dazu ist, auf das ordentliche Ablaufen des Wassers beim Aufziehen des Schnittes zu achten. Insbesondere, wenn die Schnitte nicht gleich im Anschluss bei 60°C getrocknet werden. Lufttrocknende Paraffinschnitte schließen Wasser unter dem Gewebe ein und dieses verhindert dadurch die Interaktion der negativen Gewebeladungen mit der positiv geladenen Beschichtung. Weitere Komponenten einer guten Gewebehaftung sind Retrieval-pH (hoher pH Wert erleichtert das Ablösen, siehe Kap. Demaskierung), Retrieval-Dauer und natürlich die Art des Gewebes. Je weniger negativ geladene Gewebekomponenten vorhanden sind, umso weniger Bindungspartner stehen zur Verfügung. Trocknen und Entparaffinieren Die Antrocknungstemperatur sollte 60°C nicht überschreiten. Trockene Hitze über 60°C schadet den Schnitten. Sie sollten mindestens eine Stunde bei dieser Temperatur trocknen, um ein Ablösen vom Objektträger zu vermeiden. Es gibt auch hier in der Handhabung Varianten. Bspw. 60 min bei 60°C und weiters über Nacht bei 37°C, oder die ganze Nacht bei 60°C oder die ganze Nacht bei 37°C mit vorheriger längerer Trocknung bei Raumtemperatur. Auch hier gilt es, die ideale Methode selbst herauszufinden. Bevor die Immunhistochemie durchgeführt wird, muss das Paraffin aus dem Schnitt entfernt werden. Das beste Mittel dafür ist Xylol. Der Einsatz von Xylolersatzmittel ist noch umstritten. Während die einen nur auf Xylol schwören, sehen andere keine negativen Auswirkungen bei Xylolersatzmitteln. Die Entparaffinierung soll sehr gründlich sein (mind. 20 min). Anschließend erfolgt die Rehydrierung in einer absteigenden Alkoholreihe bis zu Aqua dest. Die Schnitte werden dann in die Pufferlösung übergeführt und können weiterverarbeitet werden. Wichtig ist, dass die Schnitte im entparaffinierten Zustand nicht mehr austrocknen. Neue Methoden umgehen das kanzerogene Xylol durch Aufheizen der Paraffinschnitte in Pufferlösung (z.B. in der Mikrowelle oder im Immunhistoautomaten). An die Entparaffinierung wird das Epitopretrieval direkt angeschlossen. Man hat festgestellt, dass die Nachweisbarkeit von Antigenen auf vorgefertigten, noch nicht entparaffinierten Schnitten mit der Lagerungsdauer abnimmt. Die Empfindlichkeit der Epitope ist dabei unterschiedlich. Die Schnitte sollten deshalb innerhalb einer Woche verarbeitet werden. Man untersuchte, ob die Aufbewahrung bei

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4°C oder Raumtemperatur bzw. entparaffiniert in Protektionslösung bei –20°C die Nachweisbarkeit verlängert. Dabei zeigte sich eine Abnahme der Reaktion nach 4 Wochen bei allen Lagervarianten. Die Aufbewahrung tiefgefroren in Sucrose bewahrte das Ergebnis am längsten (Preservation of Estrogen Receptor in Paraffin Sections, Christine M. Bromley et al; The J.Histochenol. 17:115, 1994).

F. Antigen-Demaskierung Unter Maskierung des Antigens versteht man, dass durch Vernetzungsreaktionen aufgrund der Fixierung bzw. durch Membranen der Zugang des primären Antikörpers zu seinem Reaktionspartner nicht möglich bzw. erschwert ist. Durch die Demaskierung werden diese Vernetzungen und Membranen aufgebrochen, das Netz wird lockerer und durchgängiger (= Permeabilitätssteigerung). Durch die Entwicklung der Demaskierung wurde der routinemäßige Einsatz von Antikörpern auf formalinfixiertem-paraffineingebettetem Gewebe erst ermöglicht. Es gibt verschiedene Varianten der Vorbehandlung. Wichtig ist es, für den jeweiligen Antikörper bzw. Epitop die richtige Methode herauszufinden. Es ist schwierig, hier eine Standardisierung einzubringen, da von Labor zu Labor Nachweismethoden, Antikörper und Fixierung variieren. Firmen, die automatisierte Immunhistogeräte und Reagenzien vertreiben, bieten meist Prozeduren an, die auf die laborspezifischen Bedürfnisse noch angepasst werden können. Im Routinebetrieb nähert man sich dem optimalen Ergebnis meist durch eine Kompromisslösung an. Es wird für alle AK, die eine Art von Demaskierung benötigen, eine einheitliche Methode und Dauer gewählt. So wird der Arbeitsaufwand bei annehmbarem Ergebnis geringer gehalten. 1.

Andauung durch proteolytische Enzyme

Als theoretische Grundlage für die enzymatische Demaskierung gilt die Annahme, dass durch die Enzymwirkung die fixierungsbedingten Protein-Vernetzungen aufPIER = progebrochen werden und die Permeabilität des Gewebes gesteigert wird (P teolytisch induziertes Epitop Retrieval). Die am häufigsten eingesetzten Enzyme zur Demaskierung sind Protease (0,1%) und Trypsin (0,05%) gelöst in Puffer. Die Dauer der Einwirkung liegt zwischen 15 und 40 min bei Raumtemperatur oder bei 37°C. Der Nachteil der enzymatischen Einwirkung liegt in der Gefahr der zu starken Andauung, die zu einer schlimmen Morphologiezerstörung führt. Sie wird deshalb auf wenige Antigene beschränkt, wo sie unbedingt notwendig ist. Im Umgang mit Enzymlösungen ist wichtig zu wissen, dass die gelösten Enzyme einen optimalen Zeitraum für ihre Wirkung haben. Protease- und Trypsinlösungen haben ca. 10 min nach dem Auflösen ihre optimale Wirkung, nach 30 min kommt es zu einem Aktivitätsverlust. Zum Abstoppen der Enzymaktivität setzt man oft eisgekühlte Pufferlösung ein. Ausführliches Spülen sollte auch den gleichen Effekt haben, um ein Nachwirken der Andauung zu verhindern. 2.

Hitze

Eigentlich nahm man an, dass Hitze in jeglicher Form der immunhistologischen Austestung schadet. Umso erstaunlicher war die Erkenntnis, dass ausgerechnet sehr heiße Temperaturen die Verwendung der IHC auf formalinfixiertem Gewebe erst ermög-

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lichten. Unter HIER (heat induced epitop retrieval) versteht man die Einwirkung von feuchter Hitze im Bereich um 100°C bei pH-Werten von 2 bis 10, die zu einer erhöhten Permeabilität des fixierten Gewebes führt. Dadurch werden Epitope freigelegt und für die Bindung von Antikörpern zugänglich gemacht. Welche Mechanismen dahinter stecken, wird noch erforscht. Man nimmt bspw. an, dass die Proteinmodifikation durch das Formalin mithilfe der Demaskierung rückgeführt und remodifiziert wird. Dadurch können Antikörper wieder an das Epitop binden. Andere Untersuchungen drehen sich um die Kalzium-bindende Wirkung der Retrievallösung. Kalzium-ProteinKomplexe sollen das Antigen maskieren und werden bei der Demaskierung wieder gelöst. Bei der Entwicklung der Antigen-Retrieval-Methoden (AR) wurden von den Forschern alle möglichen Varianten an Temperatur, Zeit, pH-Wert, Molaritäten und Inhaltsstoffen ausgetestet. Darauf basierend wurden Empfehlungen für den Routinebetrieb abgegeben. Dauer und Temperatur stehen in einem indirekten Verhältnis zueinander. Je niedriger die Temperatur umso länger soll die Einwirkzeit sein. Metallionen (z.B. Bleithiocyanat) als Inhaltsstoffe der Retrieval-Lösung haben verbessernde Wirkung gezeigt. Aufgrund der Toxizität wurden jedoch Alternativen gesucht, die zur Entwicklung der AR mit Citrat- und EDTA-Puffer führten. Die Schnitte werden auf unterschiedliche Weise mit verschiedenen Geräten erhitzt. Wurden früher meist Haushaltsgeräte fürs Labor adaptiert, so ziehen jetzt die Firmen nach und produzieren entsprechend justierbare, präzise Laborgeräte, die teilweise digital programmierbar sind. Sie erhöhen damit die Reproduzierbarkeit der Testdurchführung. Retrieval-Lösungen können entweder selbst hergestellt werden oder auch käuflich erworben werden. Sehr gebräuchlich sind Citratpuffer pH 6, EDTA-Lösung pH 8 und Tris-EDTA pH 9,9 oder 10. Die Zusammensetzung der käuflichen RetrievalLösungen unterliegt meist dem Firmengeheimnis. Auch hier gilt wie für die gesamte Immunhistologie: ausprobieren. Antigennachweise gelingen unterschiedlich gut nach den verschiedenen Methoden. Aufgrund der vielen Variationsmöglichkeiten an Retrieval-Lösungen, Geräten und Dauer, inklusive der Vorbehandlung des Gewebes können Prozeduranleitungen nur als Ausgangspunkt für eigene Versuche angesehen werden. Ein Effekt des AR ist die Erhöhung der Sensitivität der Tests, weshalb meist höhere AK-Verdünnungen für ein optimales Ergebnis nötig sind (neue AR-Methode – erneutes Austitrieren des Primär-AK). 2.1. Druckkochtopf Auch hier waren es zuerst – und sind es großteils immer noch – gängige Haushaltsgeräte, die im Labor eingesetzt werden. Auf einer Heizplatte wird die Retrieval-Lösung zuerst zum Kochen gebracht. Die Schnitte kommen in die kochende Lösung und der Deckel wird verschlossen. Eine schonendere Variante ist es, die puffergefüllten Küvetten auf den Gareinsatz im Kocher zu stellen, weil die Schnitte der sprudelnd kochenden Lösung nicht ausgesetzt werden. Nach der ausgetesteten Inkubationszeit wird der Kochtopf abgekühlt, die Schnitte ebenfalls langsam abgekühlt. Ein

Abb.157 Decloaking-Chamber Fa. Biocare Medical

274

Immunhistochemie

„Schockieren“ der Objektträger soll vermieden werden. Die Auskühlzeit zählt zur gesamten Retrieval-Zeit dazu und muss für eine Standardisierung immer gleich eingehalten werden (z.B. 8 min kochen, 20 min auskühlen). Durch den erhöhten Druck werden Temperaturen über 100°C erreicht. Die Retrievaltemperatur liegt bei 120°C. Die Methode ist reproduzierbarer als die MikrowellenTechnik und weit verbreitet. Als Weiterentwicklung für das Labor sind Geräte auf dem Markt, bei denen man Aufheizdauer, Temperatur etc. digital einstellen kann, was die Reproduzierbarkeit weiter steigert und die Bedienung erleichtert. (Abb.157) 2.2. Mikrowelle Die Mikrowelle hat als Gerät im histologischen Labor ihre Fans und ihre Zweifler. Tatsache ist, dass man sich über Funktion und Wirkungsweise gut informieren muss, um optimale Ergebnisse zu erhalten oder auch fremde Vorschriften für das eigene Labor zu adaptieren. Die Mikrowelle eignet sich besser zur Demaskierung von kleineren Objektträgermengen. Man benötigt dazu mikrowellengeeignete Küvetten, die jedes Mal mit derselben Anzahl an Objektträgern aufgefüllt werden (Leer-OT). Das garantiert ein einheitliches Aufheizen. Man stellt die Schnitte in die vorgewärmte Retrieval-Lösung, bedeckt die Küvette lose und kocht das Ganze für ca. 15 min in 5-Minuten Intervallen. Dabei kommt es zum Überkochen des Puffers, deshalb ist ein Untergefäß vorteilhaft. Das fehlende Volumen wird mit Puffer oder Aqua dest. wieder aufgefüllt (je nachdem, ob Flüssigkeit heraussprudelt bzw. nur verdampft). Anschließend lässt man die heiße Küvette in einem kalten Wasserbad langsam auskühlen. Eine Variante ist die Verwendung von mikrowellen-geeigneten Dampfdrucktöpfen, wo das Auffüllen des Puffers entfällt. Allgemein sagt man, dass es nicht leicht ist, mit der Mikrowelle reproduzierbare Ergebnisse zu erreichen. Hier fallen Bedienungsunterschiede besonders auf. 2.3. Autoklav Die Demaskierung im Autoklav ist vergleichbar mit jener in der Mikrowelle. Der Autoklav ist jedoch für größere Mengen an Objektträgern geeignet und die Ergebnisse sollen gleichmäßiger ausfallen. Man arbeitet mit Temperaturen von 110–120°C für 10–30 min. Die Objektträgerhalter sollen mikrowellengeeignet sein, um die Behandlung zu überstehen. 2.4. Wasserbad Hier erfolgt die Erwärmung durch ein im Labor übliches Wasserbad auf 95°C. Die Temperatur wird durch ein Thermometer direkt im Wasser kontrolliert, um eine konstante Puffertemperatur zu garantieren. 2.5. Dampfgarer Der Dampfkocher stellt eine Möglichkeit für die Erwärmung der Schnitte dar, die von manchen Anwendern bevorzugt wird. Ein Vorteil liegt darin, dass einzelne Objektträger unabhängig voneinander nach der gewünschten Retrieval-Zeit entnommen werden können.

Histotechnik

3.

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Kombination von Hitze und Enzymandauung

Manche Antigene sind nur nach intensiver Demaskierung mittels Hitze und anschließender Andauung nachzuweisen. Es ist darauf zu achten, dass die Enzymeinwirkung entsprechend verkürzt wird, um keine zu großen Schäden an der Morphologie zu erhalten.

G. Methoden Die Entwicklung der immunhistologischen Techniken trägt der Nachfrage nach möglichst sensitiven Methoden, die sich in den Routineablauf eines Histolabors integrieren lassen, Rechnung. 1.

Reaktionspartner

1.1. Antigen Das Antigen stellt jene Gewebeeigenschaft dar, die der Pathologe nachweisen will. Ein Antigen verfügt über mehrere Epitope (antigene Determinanten). Ein Epitop ist meist eine bestimmte Aminosäuresequenz, die eine typische dreidimensionale Struktur aufweist. Die antigenen Determinanten können sich dabei auf der Zelloberfläche (membranständig), im Zellkern oder im Zytoplasma befinden (manchmal auch Mischformen). Man nennt dies das Reaktionsmuster des jeweiligen Antikörpers. Antigene zeigen eine unterschiedliche Empfindlichkeit bei der Behandlung des Gewebes. Die Mehrzahl lässt sich nach entsprechender Vorbehandlung (Demaskierung) in formalin-fixiertem paraffin-eingebettetem (FFPE) Gewebe nachweisen. Manche Antigene sind besonders empfindlich und der Nachweis beschränkt sich auf Gefrierschnitte. Hier wird die Beeinflussung durch Fixativ, Lösungsmittel und Wärme umgangen. Muss in FFPE-Gewebe ein sehr empfindliches Antigen nachgewiesen werden, bedarf es einer besonderen Suche nach der optimalen Testvorschrift. Bei immunhistologischen Methoden muss man die Möglichkeit immer miteinbeziehen, dass ein Antigen, das sich nicht darstellen lässt, trotzdem vorhanden sein kann. Das Antigen könnte durch die Gewebebehandlung so verändert worden sein, dass der AK keine passende Bindungsstelle mehr findet. Antigene haben mehrere Epitope, die unterschiedlich stark beeinflusst sein können. Polyklonale Antikörper sind deshalb bei empfindlichen Antigenen chancenreicher ein intaktes Epitop zu finden. Nicht jede Methode eignet sich für eine quantitative Beurteilung von Antigenen, d.h. wo das entstandene Signal proportional zur Menge an Antigen ist. Zu quantitativen Tests gehören solche, die radioisotop-markierte AK einsetzen. Besonders Testabläufe, die Brücken-AK verwenden, kann man nur als qualitativen Test ansehen. Es gibt sogenannte semiquantitative Tests, die vor allem prognostische / therapeutische Antigene betreffen. Hier ist besonders auf genaue Einhaltung der etablierten Testvorschrift und die standardisierte Präanalytik zu achten. 1.2. Primärer Antikörper Auf Gewinnung und Eigenschaften wurde schon eingegangen. Der Primär-AK ist derjenige Teil der Testvorschrift, um den sich alles dreht. Die Anzahl an verwendeten Primär-AK im Histodiagnostiklabor hat sich von unter zehn auf über hundertfünfzig erhöht. Es werden einfach immer mehr diagnostisch bzw. prognostisch relevante Zellei-

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Immunhistochemie

genschaften entdeckt und in den Routinebetrieb integriert. Bevor jedoch ein neuer Test ins Repertoire aufgenommen werden kann, muss der richtige aus den vielen angebotenen Antikörpern herausgesucht werden. Als gutes Hilfsmittel dient hier das Internet, wo es bereits eigene AK-Suchmaschinen gibt. AK werden mit dem Namen des Antigens, gegen das sie gerichtet sind, und mit der Spezies-Zugehörigkeit bezeichnet. Weiters wird bei monoklonalen AK die Klonbezeichnung angegeben. Das mitgelieferte Datenblatt gibt weiters Auskunft über Isotypen, Chargennummer, Präsentation und Spezifität. Auch praktische Hinweise für den bevorzugten Färbemodus und Verdünnungen, Lagerung und Rekonstitution bei Lyophilisaten werden gegeben. Ist im Labor bereits ein etabliertes Detektionssystem vorhanden, wird man den Antikörper passend dazu kaufen. Bevor der neue Antikörper zum Einsatz kommt, muss die optimale Verdünnung, Demaskierungsform, Inkubationszeit, Blockierungsreaktionen etc. in verschiedenen Testansätzen an Kontrollgeweben herausgefunden werden. Als Kontrollgewebe sollte dazu ein bekanntes, positives Tumorgewebe verwendet werden, das schätzungsweise jene Antigenkonzentration aufweist, die auch auf den Testschnitten zu erwarten ist. Ein „zu“ positiver Kontrollschnitt könnte über eine schlechte Präsentation hinwegschummeln und ein negatives Proben-Ergebnis könnte dann falsch-negativ sein. Multigewebeblöcke, die passende Gewebe in unterschiedlicher Reaktionsstärke beinhalten, bieten sich hier praktischerweise an. Das Ziel ist es ein möglichst klares, hintergrundarmes Ergebnis zu erreichen, wobei die gute Morphologie des Gewebsschnittes erhalten bleiben soll. Pipettierfehler und „Rechenfehler“ fallen bei der Herstellung der Gebrauchslösungen ins Gewicht. Bei selbst hergestellten Pufferlösungen muss der Umgang mit dem pHMeter selbstverständlich sein. Die benutzerfreundlichen, im Handel erhältlichen Stammlösungen und vorverdünnten Gebrauchslösungen erleichtern hier den Testablauf. Die Verdünnungslösungen bestehen aus Puffern (PBS oder Tris) mit stabilisierenden Zusätzen wie bspw. bovines Serumalbumin (BSA), einem Konservierungsmittel (Natriumazid) und eventuell einem Detergens zur gleichmäßigeren Verteilung des Reagens am Schnitt. Der pH-Wert der Verdünnungslösung liegt bei 7,4. 1.3. Sekundärer Antikörper / Brückenantikörper In den Mehrschritt-Methoden wird ein Antikörper, der gegen den Primärantikörper gerichtet ist und aus einer anderen Spezies stammt, eingesetzt. Der Sekundärantikörper kann selbst markiert sein und/oder die Verbindung zu den nächsten Bindungspartnern darstellen. Da im Überschuss der Brücken-AK zugegeben wird, sind nicht alle seiner fab-Bindungsstellen abgesättigt. Das ermöglicht die „Brückenbildung“ zum nächsten Reaktionspartner. Der Sekundärantikörper wird meist als Teil eines Detektionskits verwendet, zu dem auch die Komplexe und das Chromogen gehören. Die Bestandteile der käuflichen Kits sind sehr gut aufeinander abgestimmt. Die Verwendung selbst hergestellter Lösungen wird in der Praxis seltener. 1.4. Enzymkomplexe/-konjugate Diese Reaktionspartner werden auch als Bestandteil von Detektionskits angeboten. Dazu gehören PAP-, APAAP-, ABC-Komplex und markiertes (Strept-)Avidin.

Histotechnik

277

Peroxidase-Anti-Peroxidase und Alkalische-Phosphatase-Anti-alkalische Phosphatase bestehen aus dem jeweiligen Enzym und dem Antikörper, der gegen das Enzym gerichtet ist und aus derselben Spezies stammen muss wie der Primärantikörper. Bei der Wahl des Detektionskits ist dies zu berücksichtigen, ansonsten muss noch ein weiterer Antikörper der passenden Spezies dazwischen geschaltet werden. Die Enzymkomplexe werden durch Immunreaktion erzeugt, es kommt zur Präzipitation. Durch Zugabe von Antikörper im Überschuss werden die Präzipitate beim Anstreben des Reaktionsgleichgewichts wieder gelöst. Der Einsatz des Avidin-Biotin-Komplexes bzw. des markierten (labelled) (Strept-)Avidin-Konjugates beruht auf der Affinität zwischen Avidin (bzw. Streptavidin) und Biotin (siehe Marker). Sie enthalten keine Antikörper und sind deshalb universeller einsetzbar. Der ABC-Komplex wird vorab zusammengemischt und besteht aus großmolekularen Vernetzungen aus (Strept-)Avidin, Biotin und konjugiertem Enzym. Das L(S)A-Konjugat ist ein gebrauchsfertiges Reagens und wesentlich kleiner als der ABC-Komplex. 1.5. Chromogene Die Chromogenlösungen werden mit dem passenden Puffer und Substrat hergestellt. Für Peroxidase: Das Chromogen wird durch Wasserstoffperoxid (Substrat) unter der katalytischen Wirkung von Peroxidase schnell in eine farbige Substanz umgesetzt (siehe Kap. Enzymhistologie). Am gebräuchlichsten sind: •

DAB (Diaminobenzidin): braunes Farbprodukt, in organischen Lösungsmittel unlöslich; Die Färbung kann durch anschließendes Spülen in Kupfersulfatlösung (bzw. Nickel-, Kobalt oder Osmiumtetroxidlösungen) intensiviert werden.

•

AEC (Amino-ethylcarbazol): rotbraunes Farbprodukt, in organischen Lösungsmitteln löslich

Für Alkalische Phosphatase: Die alkalische Phosphatase setzt das angebotene Substrat durch Hydrolyse um. Die entstandene Substanz verbindet sich mit dem Chromogen zu einem sichtbaren AzoFarbstoff (siehe Kap. Enzymhistologie). Am gebräuchlichsten sind: •

Fast Red (Naphtol AS-MX-Phosphat): rotbraunes Farbprodukt, in organischen Lösungsmitteln löslich

•

BCIP/NBT (Brom-Chlor-Indolylphosphat / Nitroblautetrazoliumchlorid): Dunkelblau-violettes Farbprodukt, in organischen Lösungsmitteln unlöslich

•

Neufuchsin (Pararosanilin): rotes Farbprodukt, teilw. in organischen Lösungsmitteln löslich

Ein besonderes Substrat, dessen Umsetzung durch alkalische Phosphatase katalysiert wird, sind chemilumineszente Substanzen. Ein Beispiel ist das Adamanthyldioxethanphosphat AMPPD. Wird durch das Enzym der Phosphatrest abgespalten, so entsteht das entsprechende Phenolat-Anion. Ein Elektronentransfer vom Phenolat zum Dioxetan induziert dessen Zerfall in Adamantanon und dem angeregten Anion des

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Immunhistochemie

3-Hydroxybenzoesäuremethylesters. Beim Übergang des angeregten Zustandes in den Grundzustand wird schließlich ein Photon emittiert. So lange das Enzym arbeitet und ausreichend AMPPD vorhanden ist, wird ein konstanter Lichtstrom emittiert, wobei die Lichtintensität proportional zur Enzymkonzentration ist. 1.6. Gegenfärbung Zur besseren Darstellung der Morphologie werden die Kerne in einer zum Chromogen kontrastierenden Farbe gefärbt. Der gebräuchlichste Kernfarbstoff ist Hämalaun, das bei DAB bzw. AEC verwendet wird. Weitere Kernfarbstoffe: Methylgrün, Kernechtrot, Methylenblau

Abb.158 Legende zu den Abbildungen

2.

Direkte Methode (Ein-Schritt-Methode)

Die am meisten gebräuchlichste, direkte Methode ist die direkte Immunfluoreszenz, wo der Primärantikörper mit einem Fluorochrom konjugiert ist. Das ist eine schnelle Methode, einfach in der Anwendung und hat sich seit ihrer Entwicklung in den Fünfziger Jahren nicht wesentlich verändert. Der markierte Primärantikörper wird aufgetragen, danach erfolgen Spülschritte und das Eindecken in einem Mittel, das vorzugsweise ein „Anti-Fading“-Reagens enthält. Die Inkubation Abb.159 direkte IF muss im Dunkeln erfolgen und dauert zwischen 30– 60 min. Das Testergebnis sollte sofort im Fluoreszenzmikroskop begutachtet werden, spätestens nach einer Woche. Die Schnitte werden dazu in einer feuchten Kammer im Kühlschrank aufbewahrt. Man führt sie in der Regel auf Gefrierschnitten durch. Sie ist aber nach Vorbehandlung auch auf Paraffinschnitten möglich. Das Haupteinsatzgebiet ist die Untersuchung von Nierenerkrankungen und Dermatosen. (Abb.159)

279

Histotechnik

Empfohlene Kontrollen: Negativkontrollen: •

Inkubation nur mit PBS anstelle des Antiserums: Nur die Autofluoreszenz des Gewebes darf erkennbar sein.

•

Inkubation mit einem fluorochrommarkierten Normalserum: Erkennbare Fluoreszenz ist auf unspezifische Reaktionen von Serumproteinen mit dem Gewebe zurückzuführen.

•

Kontrollschnitt, der das gesuchte Antigen sicher nicht enthält.

•

Inkubation mit dem markierten Antiserum, dem zuvor das gesuchte Antigen im Überschuss zugeführt wurde: Es darf keine spezifische Färbung stattfinden.

Positivkontrolle: •

Kontrollschnitt, der das gesuchte Antigen sicher enthält.

Einschränkungen der direkten Methode: Bei einer geringen Anzahl an nachweisbaren Antigenen im Schnitt kann die Sensitivität des Tests zu niedrig sein. D.h., die Menge an gebundenem „Signal“ ist im Mikroskop nicht erkennbar. Ein weiterer Nachteil dieser Methode liegt in der Verwendung von markierten Primärantikörpern. Aufgrund des aufwendigen Markierungsverfahrens sind diese Reagenzien teurer und die Auswahl ist nicht so groß, wie bei unkonjugierten Primärantikörpern. Weiters muss man mit einer eingeschränkten Affinität des Antiserums rechnen, da die Fluorochrome auch den antigenbindenen Teil des Antikörpers besetzen können. Ein allgemeiner Nachteil bei der Verwendung von Gefrierschnitten ist die Morphologieeinbuße durch Gefrierartefakte. Außerdem können bei Fluoreszenztests Morphologie und Immunreaktion nicht am selben Testschnitt beurteilt werden. Direkte Polymermethode: Eine moderne Anwendung der direkten (Einschritt-) Methode ist die Verwendung von primären Antikörpern, die mit einem Polymer gekoppelt sind. An diesem Polymer haftet neben einer Anzahl primärer AK auch eine größere Menge an Enzym. Bei hochaffinen AK eignet sich diese Technik als schnelle Methode zur intraoperativen Diagnostik (Schnellfärbung) und vereint hohe Sensitivät und Geschwindigkeit. 3.

Indirekte Methode (Zwei-Schritt-Methode)

Bei dieser Technik wird das Gewebe mit einem unkonjugierten Primärantikörper inkubiert. Als zweiter Schritt erfolgt die Inkubation mit einem konjugierten Antiserum, das gegen den Primärantikörper gerichtet ist, dem sog. Sekundärantikörper. Mehrere polyklonale Sekundärantikörper binden an einen Primärantikörper und verstärken damit das Signal. Die Methode wird sensitiver, es kommt zu einer Signalamplifikation. Auf diese Weise kann man ein Antigen im Gewebe, aber auch bei bekanntem Antigen - den Primärantikörper im Serum nachweisen. (Abb.160)

Abb.160 indirekte Methode

280

Immunhistochemie

Die indirekte Methode mit Fluorochromen wird bspw. beim Nachweis von Autoantikörpern im Serum angewendet. Dabei wird ein Kontrollgewebe mit Patientenserum überschichtet. Eventuell vorhandene, passende Antikörper (= Primär-AK) binden an das Gewebe. Weiters wird mit konjugiertem Anti-Human-IgG inkubiert, das sich an den Primär-AK anlagert. Eine häufige Anwendung ist der Nachweis von Autoantikörpern bei Dermatosen. Das Prinzip dieser Technik findet man auch bei Serumtests, wo eine Oberfläche mit bekanntem Antigen beschichtet ist (RIA, Elisa). Ist der Sekundärantikörper mit einem Enzym anstelle des Fluorochroms konjugiert, muss noch mittels Detektionssystem ein sichtbares Farbprodukt hergestellt werden. Der Arbeitsaufwand ist zwar größer, aber das Ergebnis ist im Vergleich zur Immunfluoreszenz sensitiver und permanent. Zur Darstellung von vereinzelten Epitopen im Gewebeschnitt wird trotzdem die IF bevorzugt, da einzelne leuchtende Punkte auf dunklem Hintergrund leichter auszumachen sind, als ein Pünktchen Chromogen im gefärbten Schnitt. Der Vorteil gegenüber der direkten Methode liegt in der größeren Sensitivität, da der Primär-AK nicht durch Markierung geschwächt wird und es zu einer Signalverstärkung kommt. Weiters steht eine große Auswahl an unkonjugierten Primär-AK zur Verfügung. Der Sekundärantikörper ist für alle Tests, in denen die gleiche Spezies eingesetzt wird, geeignet. Empfohlene Kontrollen: Negativ-Kontrollen: •

IF: Weglassen beider Antisera zeigt nur mehr die Autofluoreszenz des Gewebes.

•

IF: PBS anstelle des Primär-AK zeigt Autofluoreszenz oder Fluoreszenz, die auf unspezifische Bindungen durch das sekundäre Serum zurückzuführen sind.

•

Enzym: Weglassen beider Antisera zeigt endogene Enzymaktivität.

•

Enzym: Weglassen des primären AK zeigt unspezifische Bindung von enzymgebundenen Proteinen an das Gewebe.

•

Ersetzen des primären AK durch ein Normalserum zeigt unspezifische Bindungen von Immunglobulinen an das Gewebe.

•

Inkubation mit einem primären Antiserum, dem vorher Antigen im Überschuss zugegeben wurde, darf keine spezifische Färbung zeigen.

Positivkontrolle: •

Kontrollschnitt, der das gesuchte Antigen sicher enthält.

Polymermethode: Eine neuere EntwickZwei-Schritt-P lung der indirekten Methode verwendet sekundäre Antikörper, die an ein großes „Rückgrat“-Molekül, ein Dextran-Polymer, gebunden sind. Dabei wird die Idee, möglichst viele Marker an einen Primär-AK zu koppeln weitergeführt. Abb.161 2-Schritt Polymer-Meth.

281

Histotechnik

So wird hier die Sensitivität des Tests um ein Vielfaches gesteigert und ist vergleichbar mit den nachfolgend beschriebenen mehrstufigen Methoden, wobei sich der Arbeitsaufwand verringert. (Abb.161) 4.

Drei-Schritt-Methode

Bei dieser Technik erfolgt nach der Inkubation mit einem konjugierten sekundären AK die Bindung durch einen dritten konjugierten AK, der gegen den Sekundär-AK gerichtet ist. Dadurch wird die Anzahl an Markermolekülen am Ort des Epitops weiter gesteigert. Die Sensitivität wird erhöht. Die Möglichkeiten für unspezifische Hintergrundfärbungen durch die konjugierten Antiseren sind aber gegeben. (Abb.162) 5.

Abb.162 3-Schritt-Methode

Unmarkierte-Antikörper-Methode (PAP, APAAP)

Das besondere Reagens, das hier zum Einsatz kommt, ist der Peroxidase-AntiPeroxidase-Komplex. Dabei bilden zwei Antikörper, die gegen das Enzym gerichtet sind, und drei Enzyme einen Komplex. Der Antikörper muss von derselben Spezies wie der Primärantikörper stammen. So kann der eingesetzte, bivalente Brückenantikörper einerseits an den Primärantikörper und andererseits an den PAP-Komplex binden. Nacheinander werden dem Gewebe Primärantikörper, Brückenantikörper (im Überschuss) und PAP-Komplex angeboten. Dazwischen erfolgen Waschschritte in Pufferlösung und anschließend die Farbentwicklung durch ein Chromogen. Eine zu hohe Konzentration an Primärantikörper kann eine solche Dichte an Kopplungsstellen für den Brückenantikörper hervorrufen, dass die Bindungsstellen des Brückenantikörpers abgesättigt werden und keine Bindungsstellen für den PAPKomplex übrig sind. Es kommt trotz hoher Primär-AKKonzentration zu einem schwächeren Endergebnis. Eingedenk dieses Phänomens können bei dieser Methode keine Rückschlüsse auf die Quantität des Antigens gezogen werden. (Abb.163)

Abb.163 PAP-Meth.

Die PAP-Methode zeigt eine größere Sensitivität im Vergleich zu den vorigen Methoden und man erreicht ein „klareres“ Bild, weil die Affinität der Komplexpartner zueinander größer ist, als zu anderen Gewebeproteinen. Zur Steigerung der Signalausbeute kann man Komplex und Brücken-AK mehrfach alternierend aufbringen.

Ähnlich wie die PAP-Methode funktioniert die A PAAP-Methode mithilfe eines Alkalische Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase Komplexes. PAP und APAAP Methoden gehörten jahrelang zu den empfindlichsten und verlässlichsten Techniken und waren deshalb sehr verbreitet. Jetzt werden sie zunehmend von neueren Methoden abgelöst.

282

Immunhistochemie

Empfohlene Kontrollen: Negativkontrollen: •

Weglassen des Primär-AK und des PAP-Komplexes zeigt die endogene Peroxidase.

•

Weglassen des primären AK zeigt unspezifische Bindung von enzymgebundenen Proteinen an das Gewebe.

•

Weglassen von Primär- und Sekundär-AK zeigt unspezifische Bindung des PAP-Komplexes an das Gewebe.

•

Ersetzen des primären AK durch ein Normalserum zeigt unspezifische Bindungen von Immunglobulinen an das Gewebe.

•

Inkubation mit einem primären Antiserum, dem vorher Antigen im Überschuss zugegeben wurde, darf keine spezifische Färbung zeigen.

Positivkontrolle: • 6.

Kontrollschnitt, der das gesuchte Antigen sicher enthält.

ABC-Methode (Avidin-Biotin-Complex)

Bei dieser Methode wird der Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC) kurz vor dem Auftragen bereits im Röhrchen hergestellt. Es bildet sich eine makromolekulare Struktur, die im Weiteren an den biotinylierten SekundärAntikörper bindet. Der Vorteil liegt in der größeren Zahl an Markern, die dadurch an den Ort des Antigens gebracht werden kann. Die Sensitivität der ABC-Methode ist höher als bei den Techniken mit unkonjugierten-AK-Methoden. Um die Ausbeute an Markern noch zu erhöhen, kann man an den Avidin-Biotin-Komplex in einem weiteren Schritt einen biotinreichen Komplex von BiotinPeroxidase und Avidin (= CBA) aufbringen. Durch alternierende Inkubation mit ABC und CBA kommt es zu einer starken Signalamplifikation. (Abb.164)

Abb.164 ABC-Methode

Empfohlene Kontrollen: Ähnlich wie bei der PAP-Methode. 7.

LAB / LSAB-Methode (Labelled-Strept-Avidin-Biotin)

Bei dieser Technik wird die starke Affinität zwischen Biotin und Avidin bzw. Streptavidin ausgenützt. Als Sekundär-AK fungiert ein mehrfach biotinylierter Antikörper, an den sich enzym-konjugiertes Avidin bzw. Streptavidin anbindet. Jedes Biotinmolekül steht als Bindungspartner zur Verfügung (in der Grafik nur zwei), wodurch eine Amplifikation erreicht wird. (Abb.165) Anschließend erfolgt wieder die Farbentwicklung durch das Chromogen. Die Sensitivität dieser Technik soll jene der ABC-Methode um das vier- bis achtfache übersteigen. Die LSAB-Methode mit Peroxidase und DAB ist derzeit die am

Abb.165 LSAB-Meth.

Histotechnik

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meisten verbreitete Technik. Ihr härtester Konkurrent für die Zukunft ist die ZweiSchritt-Polymer-Methode (s.o.), wo eine ähnliche Anzahl an Enzymmolekülen an den Reaktionsort gebracht wird. Ein Vorteil der Polymer-Methode liegt auch darin, dass kein Biotin zur Anwendung kommt. Endogenes Biotin spielt deshalb keine Rolle. Empfohlene Kontrollen: Ähnlich wie bei der PAP-Methode. 8.

Doppelfärbungen

In manchen Fällen, besonders für Forschung und Studien, ist es vorteilhaft, gleich zwei oder mehr Antigene in einem Schnitt gleichzeitig darzustellen. Für eine erfolgreiche Doppelfärbung muss man sich eine richtige Strategie im Vorhinein überlegen. Die unterschiedliche Färbung wird durch verschiedene Detektionssysteme und Chromogene erzeugt. Die Vorbehandlungsschritte sollten beide Antigene gleichermaßen vertragen bzw. benötigen. Die Detektionssysteme dürfen keine Kreuzreaktionen auslösen (unterschiedliche Spezies müssen gewählt werden). Die Chromogene müssen gleiche Eigenschaften bezüglich Lösungsmittel zeigen. Wäre eines der Farbprodukte xylollöslich, würde sich das Reaktionsergebnis beim Entwässern auflösen. Beide Antigene werden zunächst einzeln dargestellt, um das erwartete Ergebnis abschätzen zu können. Bei der Doppelmarkierung werden die Detektion des ersten AK und die Detektion des zweiten AK hintereinander geschaltet. Für eine Gegenfärbung muss man wiederum die Löslichkeit des Farbstoffes miteinbeziehen. Eine Erleichterung dieser Überlegungen soll die Doppelfärbung mit zwei Dextranpolymer-Markern darstellen. Diese unterscheiden sich einerseits darin, dass sie mit Sekundär-Antikörpern gegen verschiedene Spezies (anti-Maus, anti-Kaninchen) konjugiert sind, und andererseits darin, dass sie entweder mit HRP oder mit AP bestückt sind. Die eingesetzten Primär-AK stammen aus Maus oder Kaninchen. Die eingesetzten Chromogene werden entweder von HRP oder AP zu differenzierbaren Farben umgesetzt. Die Darstellung der Antigene erfolgt hintereinander, dazwischen wird ein Waschschritt geschaltet, der das erste Polymer entfernt (Envision Doublestain, Fa. Dako; patentgeschützt).

H. Amplifikationsmethoden Ist das Antigen im Gewebe nur spärlich vorhanden, bzw. wurde es durch die Vorbehandlung geschädigt, kann man durch den Einsatz bestimmter Mechanismen eine Verstärkung des schwachen Signals bewirken. 1.

Amplifikation durch Wiederholung

Bei den unmarkierten Enzymkomplexmethoden kann man durch mehrfach alternierendes Aufbringen von Brückenantikörper und Komplex eine Steigerung des Signals erreichen. Man bringt dadurch eine größere Menge Enzym an den Ort des Antigens, was wiederum einen gesteigerten Umsatz des Chromogens hervorruft. Bei der LSAB-Methode kann man eine Signalverstärkung bewirken, indem man zwischen den primären Antikörper und den biotinylierten Sekundärantikörper einen weiteren Antikörper aufträgt, der gegen den primären AK gerichtet ist und als Bindungspartner für das folgende Detektionssystem passt. So bringt man eine größere Zahl von Antikörpern an den Ort des Antigens. – Amplifikation durch Mehrschrittsystem

284 2.

Immunhistochemie

Amplifikation durch Imidazol

Der DAB-Chromogenlösung wird ein Verstärker zugegeben, der die Umsetzungsreaktion der Peroxidase erhöht. Imidazol (C3H4N2, 1,3-Diazo-2,4-cyclopentadien) ist ein farb- und geruchloser Feststoff. Man findet es als Grundgerüst von Histamin und Histamidin. 3.

Amplifikation mit biotinyliertem Tyramid

Findet sich Peroxidase als Marker am Ort des Antigens, kann man dies zur Verstärkung der Reaktion mit biotinyliertem Tyramid nützen. Die Peroxidase setzt bei Anwesenheit von Wasserstoffperoxid Tyramid zu einem Derivat um, das schnell an Protein bindet. Nach der Zugabe von mit Peroxidase markiertem Avidin bindet dieses an das Biotin des Tyramids. Es kommt zu einer verstärkten Farbumsetzung des Chromogens. Die Farbentwicklung passiert am Ort des Antigens und seiner unmittelbaren Umgebung. 4.

Amplifikation durch Silberpräzipitation bei Gold-Labelling-Methoden

Die Goldmarkierung am Ort des Antigens lässt sich meist nur im Elektronenmikroskop sichtbar machen. Erst durch die photochemische Entwicklung von Silberpartikeln, die sich an das Gold anlagern, verstärkt sich das Signal und lässt sich auch im Lichtmikroskop darstellen. Das ionische Silber wird als Silberacetat angeboten, es lagert sich an die Goldpartikel an. Die Entwicklung zu metallischem Silber erfolgt mittels Hydrochinon in gepufferter Lösung. Danach erfolgen die Fixierung und eine Gegenfärbung. Das Prinzip entspricht im Wesentlichen der Versilberung bei der histologischen Färbung und bedarf derselben Sorgfalt.

I.

Hintergrund-Färbung

Eine optimale immunhistologische Färbung zeigt eine klare Reaktion am Ort des Antigens. Charakteristisch für eine echt-positive Reaktion ist oft eine Heterogenität von Zelle zu Zelle, bzw. eine klare, abgegrenzte Zellmembrananfärbung. Ist die Reaktion ausschließlich auf Zellkerne beschränkt, kann man auch von einer echt-positiven Reaktion ausgehen. Es gibt jedoch einzelne Untersuchungsmaterialien, wo Zellkernfärbung als falsch-positive Reaktion auftreten kann (endogenes Biotin, Nekrose, Schwermetallfixans, starke Säuren als Entkalkungsmittel). Hintergrundfärbung ist prinzipiell unerwünscht. Aufgrund verschiedener Mechanismen kommt es jedoch häufig zu unspezifischen Anfärbungen, die eine eindeutige Befundung erschweren. Um diese Hintergrundfärbung möglichst zu minimieren, bedient man sich verschiedener Techniken. 1.

Hydrophobe und elektrostatische Wechselwirkungen

Die meisten Proteine zeigen hydrophobe Eigenschaften. D.h. sie zeigen eine geringe Affinität zu Wassermolekülen und neigen dazu, sich aneinander zu binden und Wasser dadurch auszuschließen. Die hydrophobe Interaktion ist typisch und führt zu einer Stabilisation von Proteinstrukturen und auch Immunkomplexen. Unter den Gewebeproteinen findet man diese Hydrophobie besonders bei Bindegewebe (Kollagen, Laminin, Elastin, Proteoglykane, u.a.), Plattenepithelien und Fettzellen. In Abhängigkeit von Zeit, Temperatur und pH-Wert steigert die Einwirkung von Fixanzien diese Eigenschaft. Immunglobuline ihrerseits sind ebenfalls stark hydrophob. Durch Lagerung und Verdünnungsmedium wird die Hydrophobie und Aggregationsneigung beein-

Histotechnik

285

flusst. Je näher der pH-Wert beim isoelektrischen Punkt des Antikörpers liegt, desto stärker ist die hydrophobe Wechselwirkung. Gegenmaßnahme: •

Optimierung des AK-Verdünnungsmittels (pH-Wert, hintergrundreduzierende Mittel, Zusatz von 1% Rinderserumalbumin, fettarmem Milchpulver, Casein)

•

Optimierung der Fixierung

•

Verwendung von Detergens (z.B. Tween 20)

•

Verwendung von Normalserum (1–5%ig, unmittelbar vor dem primären AK, von der selben Spezies wie der sekundäre AK, darf nicht hämolytisch sein)

Immunglobuline zeigen als Ampholyte negative bzw. positive Ladungen je nach pHWert der Lösung. Sie können am Gewebeschnitt jeweils entgegengesetzt geladene Reaktionspartner finden, was zu Hintergrundfärbung führt. Die Erhöhung der Ionenstärke vermindert diese Erscheinung. Hydrophobe und elektrostatische Wechselwirkungen führen oft gemeinsam zu Hintergrundfärbung. Meist führen jedoch Maßnahmen gegen die eine Ursache zur Verstärkung der anderen. Avidin hat als Glykoprotein eine bestimmte Affinität zu negativ geladenen Gewebestrukturen und führt so zu Hintergrundfärbung. Durch Ersatz von Avidin durch Streptavidin wurde dieses Problem umgangen. 2.

Endogene Enzymaktivität

Die Farbstoffentwicklung bei den immunologischen Tests erfolgt durch Chromogenumsetzung mittels Enzym. Eine eindeutige Aussage liegt nur dann vor, wenn ausschließlich extra, d.h. durch das Detektionssystem, zugeführtes Enzym dafür verantwortlich ist. Sogenanntes endogenes Enzym führt zu „falsch-positiven“ Reaktionen. Deshalb muss es in einer Vorbehandlung blockiert und inaktiviert werden. 2.1. Peroxidase Endogene Peroxidaseaktivität wird praktischerweise gleichgesetzt mit „Pseudoperoxidaseaktivität“. Man findet sie bei allen Hämoproteinen (Hämoglobin, Myoglobin, Cytochrom, Katalase). Die Enzymaktivität bewirkt die Freisetzung von molekularem Sauerstoff aus Peroxiden (H2O2). Enzymblockierung: Die Peroxidaseaktivität wird aufgrund von Substratzugabe im Überschuss kompetitiv gehemmt. Die Hemmung erfolgt meist vor der Immunreaktion. An Erythrozyten im Gewebeschnitt kann man die erfolgreiche Blockierung überprüfen. Gefärbte Erythrozyten zeugen von einer unvollständigen Blockierung. •

5–10 min in 3%iger wässriger Wasserstoffperoxidlösung oder

•

20 min in 0,6%iger Wasserstoffperoxidlösung in Methanol

Bei blutreichem Gewebe kann es durch die Reaktion zum „Sprudeln“ auf dem Schnitt kommen, was ein gewisses Maß an Zerstörung bedeutet. Hier greift man als Alternative auf Methoden mit alkalischer Phosphatase zurück. Nicht-kompetitive Hemmung erfolgt durch ein Gemisch aus Natriumazid und H2O2.

286

Immunhistochemie

2.2. Alkalische Phosphatase Endogene, alkalische Phosphatase kommt verstärkt in Dünndarmepithel, Knochengewebe, Nierentubuli, Leber, neutrophilen Granulozyten, Endothelzellen, Epithelien der Harnblase sowie in Trophoblasten der Plazenta vor. Enzymblockierung:

3.

•

Die Enzymaktivität wird durch Zugabe von 0,2–0,3 mM Levamisol zur Substrat-Chromogenlösung inhibiert. Fehlerhafte Konzentrationen können hier auch die AP des Detektionssystems blockieren.

•

Hitze-induzierte Antigendemaskierung bei Paraffinschnitten führt ebenfalls zu einer Inaktivierung von AP.

Endogenes Biotin

Endogenes Biotin findet man in Leber-, Nieren-, Darm- und lymphatischem Gewebe. Geringere Mengen sind auch in Geweben des zentralen Nervensystems und im Fettgewebe vorhanden. An dieses Biotin bindet Avidin als Avidin-Biotin-Enzym-Komplex. Avidin hat ja vier Bindungsstellen für Biotin, die aber vorerst nicht abgesättigt sind. So gelangt Enzym an den Ort des endogenen Biotins und zeigt eine falsch-positive Reaktion. Es hat sich gezeigt, dass die HIER-Methoden das Auftreten des endogenen Biotins steigern. Besonders klare, falsch-positive Reaktionen in Tumorzellen können zu Fehlinterpretationen führen und müssen unbedingt durch Negativkontrollen aufgedeckt werden. In manchen Publikationen wird deshalb für alle Protokolle, die HIER enthalten, dieser Blockierungsschritt empfohlen. Biotinblockierung: Die Biotinblockierung erfolgt durch Inkubation mit 0,01-0,1% Avidinlösung und weiters mit 0,001–0,01%iger Biotinlösung (käuflicher Blockierkit, oder selbst hergestellt aus Hühner-Eiweiß und Trockenmilch). Avidin bindet an das endogene Biotin. Die noch offenen Bindungsstellen des Avidins werden durch Biotin wieder abgesättigt. Dieses gebundene Biotin steht aber für den LSAB-Komplex als Bindungspartner nicht mehr zur Verfügung. Um die Problematik des endogenen Biotins zu umgehen, muss man auf Methoden ausweichen, die nicht mit diesem Detektionssystem arbeiten (PAP, APAAP, Dextran-Polymer). 4.

Spezifische Hintergrundfärbung

Hier kommt es zu Anfärbungen aufgrund von unerwünschten Immunreaktionen. Antiseren können als „Verunreinigung“ Antikörper enthalten, die als natürliche Antikörper Affinitäten zu menschlichen Gewebestrukturen haben. Sie sind meist in geringer Konzentration vorhanden und fallen bei der Gebrauchsverdünnung nicht mehr auf. Andere Antikörper sind erst durch die Immunisierung als unerwünschte Produkte entstanden, konnten aber bei der Serum-Reinigung nicht entfernt werden. Diese Probleme treten bei monoklonalen Antikörpern nicht auf. Manche nachzuweisende Antigene diffundieren vom Ort ihrer Synthese bzw. Speicherung in das umliegende Gewebe. Um dem entgegenzuwirken sind eine sofortige, richtige Fixierung und eine schonende Behandlung des Gewebes notwendig. Durch Quetschung werden Zellen zerstört und Plasmainhaltsstoffe verteilt.

Histotechnik

287

Phagozyten können das gesuchte Antigen in sich aufnehmen und zeigen dann eine untypische Immunreaktion. Zu Kreuzreaktivität kommt es, wenn ein oder mehrere Epitope des gesuchten Antigens auf anderen Proteinen vorkommen. Durch sorgfältiges Auswählen der Antiseren bzw. Klone kann dieses Problem vermieden werden. Manche humane Zellen besitzen auf ihrer Oberfläche Rezeptoren für Fc-Fragmente bestimmter Maus-Immunglobuline. Die Bindung von Antikörpern an Fc-Rezeptoren kann verhindert werden, indem man Fab-Fragmente statt ganzer IgG-Moleküle verwendet oder durch sorgfältiges Screenen monoklonaler Antikörper. 5.

Sonstige Ursachen

Diffuse Anfärbungen durch Chromogen findet man auch bei: •

Verletzung des Gewebes durch Quetschen

•

Unvollständige Entparaffinierung

•

Proteinzusätze in Wasserbädern (zum Schnittaufziehen)

•

Bakterien- und Pilzkontamination in Wasserbädern

•

Unvollständige Chromogenauflösung

•

Nekrotische Areale (unvollständige Fixierung)

Ungleichmäßige Anfärbung durch Chromogen findet man bei: •

Austrocknen des Schnittes

•

Unebenheiten im Schnitt

•

Ablaufen des Serums

•

Luftblasen des Serums während der Inkubation

J. Qualitätssicherung in der Immunhistologie Bei den fast unzähligen Variationsmöglichkeiten beginnend bei der Gewebevorbehandlung (Fixierung, Einbettung, Demaskierung, Blockierung), Antikörper(klon)auswahl, Inkubationszeiten, -temperatur, bis zum Detektionssystem kann man sich vorstellen, welche Bedeutung die Qualitätssicherung hier einnimmt. Insbesondere für die semiquantitative Beurteilung von therapierelevanten Antikörpern, wo ein Score basierend auf Menge und Reaktionsstärke der angefärbten Zellen ermittelt wird, ist die Standardisierung des gesamten Testablaufs und der Präanalytik ein wichtiges Thema. Um die Aussagekraft der Ergebnisse zu bestätigen werden Kontrollen benötigt. Idealerweise setzt man Kontrollen für den jeweiligen Antikörper, für das Detektionssystem und für unspezifische Gewebereaktionen ein. Die Erkenntnisse über verwendete Antikörper, Systeme und Testvorschriften müssen in Protokollen und Antikörper-Blättern festgehalten werden. Die Variationsmöglichkeiten liegen nicht nur innerhalb des eigenen Labors, sondern bestehen auch von Labor zu Labor. Tatsächlich gibt es wahrscheinlich ebenso viele Immunhistoprotokolle wie Histolabors. Ringversuche durch Gruppen gleichgesinnter Laboratorien, wo Gewebeschnitte mit bekannten Antigenen zur Austestung verschickt werden, dienen zur Kontrolle der Aussagekraft der eigenen Befundung. Außerdem führen sie zum Wissensaustausch und zur Verbesserung der Methoden.

288 1.

Immunhistochemie

Positivkontrollen

Als Positivkontrollen setzt man Gewebe ein, das vorzugsweise aus dem eigenen Labor stammt und damit dieselben Vorbehandlungen erfahren hat wie die Patientenprobe. Es gibt jedoch auch, besonders für Krankheitserreger, käufliche Positivkontrollen im Handel. Die Schnitte müssen für den ausgewählten Testablauf eine bekannte positive Reaktion zeigen. Die Stärke der Reaktion sollte von schwach bis stark gehen, damit falsch negative Ergebnisse ausgeschlossen werden können. Man soll vom Ergebnis nicht nur positiv oder negativ, sondern auch die Sensitivität der Versuchsanordnung ablesen können. Es gibt die Möglichkeit, für jeden Antikörper des Testlaufs einen extra Objektträger mit einer Positivkontrolle mitzuführen, oder den Kontrollschnitt direkt zur Patientenprobe aufzuziehen. Eine gute Alternative stellt die sogenannte endogene Kontrolle dar. Hier findet man am Schnitt neben dem unbekannten Areal bekannte Zellen, die normalerweise eine positive Reaktion zeigen. In diesem Fall sind alle Vorbehandlungen genau gleich, was die Positivkontrolle sehr aussagekräftig macht. Für semiquantitative Auswertungen von therapie-relevanten Antikörpern ist eine endogene Kontrolle nicht ausreichend. Da hier die Reaktionsstärke mitbeurteilt wird, braucht man bekannte, unterschiedlich starke Kontrollfälle als adäquate Vergleichswerte. Bei den Multikontrollblocks (Tissue arrays) stellt man sich einen Block aus verschiedenen bekannten Positivkontrollen zusammen. So hat man schnell eine passende Kontrolle bei der Hand. Diese Blöcke gibt es ebenfalls im Handel. Normalgewebe, das die gewünschte Eigenschaft exprimiert, dient als geeignete Kontrolle. Informationen darüber erhält man bspw. aus den Antikörper-Datasheets. Hier ein Teil einer ausführlichen Auflistung von Normalgewebe als Kontrolle aus Histologic Vol. XXVIII, No.1, Mai 1998 Appendix Tonsille

Serotonin, S100, HHF35, Desmin, SMA AACT, AAT, BCL2, CD43, F VIII, F XIIIa, CD34, HPL, IgA, IgD, IgG, IgM, Kappa, Lambda, L26, LCA, Leu22, Leu7, LN-1, LN-2, Lysozym, MIB-1, MAC387, Myeloperoxidase, MT-1, MT-2, Neutrophile Esterase, PCNA, PLAP, UCHL, Ulex

Um die Spezifität der erworbenen Antikörper und Antiseren auszutesten, untersucht man die Ergebnisse auf unterschiedlichen Gewebearten. Die Methode der k ompetitiven Hemmung des Antikörpers deckt unspezifische Verunreinigungen auf. Hier wird das Antiserum mit Peptiden inkubiert, die den Antikörper spezifisch binden. Ein Immunhistotest mit diesem vorinkubiertem Serum darf keine positive Reaktion ergeben. Findet sich ein positives Ergebnis, ist es auf unspezifische Bindungen zurückzuführen. 2.

Negativkontrollen

Negativkontrollen zeigen alle unspezifischen Reaktionen auf (siehe Hintergrund). Verwendet man als Negativkontrolle Gewebe, das das gesuchte Antigen sicher nicht enthält, kann man den Schnitt gemeinsam mit der Patientenprobe aufziehen. Es zeigt unspezifische Bindungen des Antiserums, aber nicht den 1:1 Vergleich zum untersuchten Gewebe.

Histotechnik

289

Die gebräuchlichste Negativkontrolle ist das Ersetzen des primären Antikörpers durch Normalserum (Serum derselben Spezies vor der Immunisierung). Es sollte dieselbe Zusammensetzung wie das Antiserum mit Ausnahme des spezifischen Antikörpers haben und deckt unspezifische Bindungen durch andere Serumproteine auf. Eine Ersatzlösung für den monoklonalen Primär-Antikörper wäre auch Zellkulturmedium, das dem Überstand der Zellkultur bei der AK-Produktion (aber ohne AK) entspricht. Ersetzt man den Primär-AK durch Puffer, sind positive Reaktionen auf unspezifische Bindungen des Detektionssystems zurückzuführen. Will man die endogene Peroxidase nachweisen, lässt man nur das Chromogen einwirken. Inkubation mit einem primären Antiserum, dem vorher Antigen im Überschuss zugegeben wurde, darf keine spezifische Färbung zeigen (kk ompetitive Hemmung). Es stellt die ideale Negativkontrolle dar, wird aber aufgrund der teuren Herstellung selten im Histodiagnostiklabor angewandt. Eine B lockierkontrolle verhindert das Anbinden des Komplexes an den Brückenantikörper durch Zugabe von unmarkiertem Antikörper aus derselben Spezies wie der Primärantikörper. Dadurch werden unspezifische Bindungen des Komplexes an das Gewebe aufgezeigt. Bei der Einführung eines neuen Systems (oder Reagenzien) sollten Negativkontrollen verwendet werden, um systematische Fehler aufzudecken. Essentiell ist, dass die Negativkontrolle dieselben Prozeduren durchläuft wie die Patientenprobe. Besonders auf die gleiche Retrieval-Methode ist hier Wert zu legen, um endogenes Biotin aufzudecken. Beim Einsatz von Positiv- und Negativkontrollen gibt es unterschiedliche Überzeugungen. Einerseits wird auf die Wichtigkeit der Kontrollen und vor allem auf ihr Mitführen bei jedem Testlauf und jeder Patientenprobe verwiesen. Andererseits gibt es die Meinung, dass Positivkontrollen bei gängigen (immer funktionierenden) Antikörpern nicht notwendig und Negativkontrollen in Anbetracht des großen Arbeitsaufwandes verzichtbar seien. Für den Einsatz von Kontrollen gibt es derzeit Empfehlungen, aber keine Vorschriften. So ist es dem Institut überlassen, hier die Waage zwischen Kosteneffektivität und Verlässlichkeit zu halten. 3.

Troubleshooting

Angesichts der vielen Schritte, Vorbehandlungen und Reagenzien, die bei immunhistologischen Methoden benötigt werden, gestaltet sich das Troubleshooting dementsprechend umfangreich. Treten Probleme auf, ist es günstig den Testablauf von hinten aufzurollen. Zuerst beleuchtet man Chromogen und anschließend Detektionssystem und Primärantikörper. Kann man hier Fehlleistungen ausschließen, liegt das Problem direkt am Gewebe. Ist der Fehler identifiziert, muss man das Testprotokoll entsprechend ändern. Fehler in der Immunhistochemie zeigen sich meist als zu viel Reaktion (starker Hintergrund, unspezifische Anfärbungen), als zu schwache bzw. keine Reaktion oder als ungleichmäßige Färbung. Ein gutes Hilfsmittel findet man im Handbuch für immunchemische Färbungen der Fa. Dako im Kapitel Fehlersuche und Behebung, wo mögliche Ursachen und die passenden Lösungen aufgelistet sind.

290

Immunhistochemie

3.1. Falsch-negative Ergebnisse •

Im Laufe einer neuen Testeinführung: Die optimale Verdünnung wird erst ausgetestet.

•

Bei einem etabliertem Test: Zuerst wird der Test wiederholt, inklusive einer Positivkontrolle, wobei besonderes Augenmerk auf Qualität der Reagenzien und Ablaufdaten gelegt wird. Ist auch die Positivkontrolle negativ, sollte der Test an einem weiteren positiven Gewebe wiederholt werden. Der Grund für ein negatives Ergebnis liegt oft in einem Fehler bei der Testdurchführung (Verwechslungen, Reagens vergessen, Reagens ist vom Schnitt abgelaufen, Lösungsmittel). Ist das auszuschließen, müssen die Reagenzien unter die Lupe genommen werden.

3.2. Falsch-positive Ergebnisse Der Umgang mit falsch-positiven oder zu starken Reaktionen ist problematischer. Aufgedeckt werden falsch-positive Färbungen durch die Negativkontrollen. Ein zu starker Hintergrund kann durch verschiedene Maßnahmen reduziert werden (siehe Hintergrund). Im Laufe einer neuen Testeinführung muss hier das richtige Protokoll und die ideale Antikörperverdünnung gefunden werden. Tritt ein zu starker Hintergrund bei einem etablierten Test auf, wird der Test als erste Maßnahme mit besonderem Augenmerk auf Reagenzien und Ablaufdaten wiederholt. Ist das Ergebnis immer noch unzureichend, muss man sukzessive auf Fehlersuche gehen. Manche falsch-positive Reaktionen erscheinen sehr „echt“, weil sie z.B. auf die Tumorzellen bzw. auf Zellkerne beschränkt sind. Ein Hinweis auf die „Falschheit“ bietet eventuell eine gewisse Homogenität der Anfärbung. Ein sehr wichtiger Aspekt ist hier die Erfahrung des Befunders und die Kenntnis über das zu erwartende Ergebnis.

K. Bearbeitung von zytologischem Material und Gefrierschnitten Immuntechniken auf zytologischem Material sind in der morphologischen Diagnostik noch nicht sehr verbreitet, obwohl es Anwendungen dafür gibt. Das Untersuchungsmaterial besteht aus Ausstrichen oder Zentrifugaten von Punktionsmaterial. Man kann aus Zellsuspensionen auch Blöcke aus Paraffin herstellen (Zellblockverfahren mittels Agar-Agar oder Plasma). Für die Immunhistochemie ist die Herstellung von Zellblöcken anzuraten, die dann in üblicher Weise wie Paraffinblöcke behandelt werden können. Außerdem ist die Anzahl an Objektträgern nicht so eingeschränkt wie bei Ausstrichen. Ausstriche und Cytospinpräparate bedürfen einer schonenderen Behandlung als Gewebeschnitte. Die Fixierung erfolgt am besten durch gekühltes Aceton oder ähnliche Mischungen wie für Gefrierschnitte. Alkohol wirkt hier nachteilig auf die Bewahrung mancher Antigene. Der ölige Film, den Fixiersprays auf der Oberfläche erzeugen, muss vor der Weiterverarbeitung mit Alkohol entfernt werden. Die Blockierung der endogenen Peroxidase geschieht in einer 0,3% H2O2-Lösung in Methanol. Bei Blutausstrichen ist ein Ausweichen auf Methoden mit alkalischer Phosphatase sinnvoll. Bezüglich des Lufttrocknens von Ausstrichen und Cytospin-Präparaten findet man unterschiedliche Aussagen in der Literatur. Einerseits wird stundenlanges Lufttrocknen

Histotechnik

291

vorgeschlagen, andererseits vor der nachteiligen Wirkung gewarnt und sofortiges Fixieren verlangt. Die Immunhistoprotokolle laufen dann ähnlich wie bei Paraffinschnitten. AntigenRetrieval kann für bestimmte Antigene vorteilhaft sein, auch wenn es theoretisch aufgrund der fehlenden Formalinfixierung gar nicht notwendig wäre. Gefrierschnitte werden in der üblichen Weise hergestellt. Schockgefrieren mittels flüssigen Stickstoffs oder Isopentans ist nicht unbedingt notwendig. Aber die Gefriergeschwindigkeit sollte trotzdem möglichst schnell sein. Die Schnitte werden auf vorbehandelten Objektträgern aufgezogen. Sie verbleiben bis zur Fixierung in der Kühlkammer des Cryostaten. Nach Dr. R.T. Miller soll lufttrocknen möglichst vermieden werden. Die Schnitte werden nur kurz (ca. 1 min) in gekühltem Aceton, Methanol, Formalin, Aceton/Methanol oder Formalin/Aceton fixiert. Die adäquate Behandlung ist dabei hauptsächlich vom nachzuweisenden Antigen abhängig und wird im Versuch bestimmt. Der weitere Ablauf ist ähnlich wie bei Paraffinschnitten. Es hat sich auch bei manchen Antigenen, ein Antigen-Retrieval als vorteilhaft erwiesen, obwohl dies rein theoretisch auf nicht-formalinfixiertem Gewebe gar nicht notwendig wäre. Die Lagerung von Gefrierschnitten oder cytologischen Präparaten geschieht bei –20°C. Die Objektträger müssen dabei in Alufolie eingewickelt werden. Ein Trocknungsmittel im Aufbewahrungsbehälter ist anzuraten. Der Vorteil der Gefrierschnitttechnik liegt in der Geschwindigkeit, weil Fixierung und Einbettungsprozess umgangen werden. Nachteilig sind die meist schlechtere Morphologie und die Schwierigkeiten beim Schneiden von fettreichem oder kalkigem Gewebe.

L. Protokoll-Beispiel für LSAB-Methode 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19.

Paraffinschnitte herstellen bei 60°C antrocknen .............................................................................. 60 min Entparaffinieren in Xylol..................................................................... 3 x 7 min Rehydrieren über absteigende Alkoholreihe bis 70% Alk................ je 1–2 min Blockieren der endogenen Peroxidase in 0,5% H2O2/Methanol........... 10 min eventuell Antigen-Retrieval (z.B. Citratpuffer pH 6, 20 min Druckkochtopf) in Tris-buffered-saline TBS pH 7,6 spülen............................................... 5 min Inkubation mit 10% Kaninchen-Normalserum....................................... 10 min Inkubation mit primärem Antikörper in optimaler Verdünnung ...... 20–40 min In TBS spülen .................................................................................... 2 x 5 min Inkubation mit biotinyliertem Brückenantikörper Kaninchen-anti-Maus in optimaler Verdünnung ...................................................................... 15 min In TBS spülen .................................................................................... 2 x 5 min Inkubation mit Peroxidase-markiertem Streptavidin ............................. 10 min In TBS spülen .................................................................................... 2 x 5 min Inkubation mit DAB Substratlösung......................................................... 3 min In Aqua dest spülen Gegenfärbung mit Hämatoxylin............................................................3-5 min Bläuen Entwässern über aufsteigende Alkoholreihe, Klären und Eindecken

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Immunhistochemie

Um ein Abfließen der Seren zu verhindern, wird der Schnitt mit einem Fettstift umrandelt. Bei der Handhabung muss man darauf achten, dass die Schnitte nie austrocknen. Die Inkubationsschritte erfolgen in der feuchten Kammer. Das ist ein Behälter, wo am Boden befeuchtete Papiertücher für eine erhöhte Luftfeuchtigkeit sorgen und damit das Austrocknen der Schnitte verhindern. Die Objektträger müssen waagrecht auf „Stegen“ liegen. Nach den Spülschritten wird der Puffer gut abgeschüttelt bzw. mit einem fusselfreien Tuch abgewischt, um keine weiteren Verdünnungseffekte zu erhalten. Die benötigten Reagenzien werden kurz vorher auf Raumtemperatur gebracht und anschließend gleich wieder gekühlt.

M. Automation Schon öfters habe ich auf die enorme Zunahme der immunhistologischen Tests hingewiesen. War in den Anfängen eine manuelle Technik noch ausreichend, so zeigten sich beim Handling von großen Objektträgerzahlen bald gewisse Schwierigkeiten. Besonders das Einhalten von fixen Inkubationszeiten und die gleichmäßige Behandlung wurden kompliziert, obwohl es für reproduzierbare Ergebnisse besonders wichtig ist. Als Antwort darauf wurden Immunofärbeautomaten entwickelt. Es gibt sie in unterschiedlichen Bauarten, Kapazitäten und Leistungsangeboten. Auf welches der vielen Geräte die Wahl trifft, hängt vom Arbeitsumfang, Personalausstattung und Zielsetzung des Labors ab. Dass die Qualität der Färbungen einwandfrei sein soll, ist selbstverständlich. Ebenso wird die zuverlässige Betreuung durch den Hersteller bei technischen Problemen eine Rolle spielen. Die momentan verfügbaren Geräte arbeiten alle im Batch-Modus. D.h. eine bestimmte Menge an Proben wird abgearbeitet, bevor der nächste Lauf gestartet werden kann. Neueste Entwicklungen zielen in Richtung „kontinuierlicher Beladung“ der Geräte. Bauarten (Abb.166-169): •

Tellerfärber: Die Objektträger werden auf einem Rondell horizontal aufgelegt. Der Teller dreht sich zur Pipettierposition. Die Reagenzien befinden sich auf einem zweiten Rondell oberhalb des OT-Tellers. Bei neueren Entwicklungen bleibt das OTRondell fix, die Reagenzien werden zur Pipettierstelle bewegt.

•

Robotfärber – horizontale Objektträgerlage: Die Objektträger liegen auf definierten Positionen, die Reagenzien werden aufpipettiert und abgeblasen. Hier wird die händische Methode am ehesten imitiert. Als Equipment gibt es umrandete Objektträger, die das Ablaufen der Reagenzien verhindern.

•

Robotfärber – senkrechte Objektträgerlage: Hier gibt es zwei Varianten. Abdeckplatte: Auf den Objektträger wird eine Kunststoffform aufgesetzt, die ein bestimmtes Reagensvolu-

Abb.166 Benchmark XT Fa. Ventana (Tellerfärber)

293

Histotechnik

men halten kann. Die Reagenzien werden von oben einpipettiert. Sobald von oben Flüssigkeit zugeführt wird, wird das vorige Reagens nach unten verdrängt. Kapillarspalt: Die Objektträger werden in einer Halterung so angeordnet, dass ein Kapillarspalt von definierter Größe bestehen bleibt. Werden die Objektträger nun in eine Reagenswanne eingestellt, zieht sich die Flüssigkeit nach oben. Zum Entfernen der Reagenzien werden die Objektträger auf eine saugfähige Unterlage gestellt. Kapazität: Von 20 bis zu ca. 100 Objektträger können pro Lauf abgearbeitet werden.

Abb.167 Techmate 500 Fa. Dako (Kapillarspalttechnik)

Die Kapazität der Reagenzienplätze reicht von 20 (primäre AK) bis 84. Die wichtigste Zahl dabei ist die Menge an Primärantikörpern, die in einem Lauf pipettiert werden können. Die Geschwindigkeit und damit die Durchlaufkapazität pro Tag ist ebenso ein Unterscheidungskriterium der Geräte. Ausstattungsmöglichkeiten: •

Offene Systeme für sehr viele Protokollvarianten und Reagenzien: für Labors, die Wert darauf legen, Reagenzien von verschiedenen Herstellern in veränderbaren Konzentrationen und Zusammensetzungen, einsetzen zu können. Will man die gewohnte händische Methode auf den Automaten übertragen, benötigt man offene Systeme. (Protokolloptimierung für Forschungszwecke)

•

Eingeschränkt offene Systeme für gebrauchsfertige Kits: Hier sind die Geräte auf die herstellereigenen Reagenzien optimiert und nur mit diesen zu fahren. Die Protokolle sind vorprogrammiert. Modifikationen sind nur eingeschränkt möglich. Diese Systeme sind einfach zu bedienen und wenig fehleranfällig.

•

Temperaturwahl (teilweise für einzelne Objektträgerpositionen, bis zu 99°C): Die Inkubationszeiten können bei höheren Inkubationstemperaturen (z.B. 37°C) verkürzt werden. Temperaturen bei 100°C ermöglichen die Anwendung von automatisiertem Antigenretrieval und in-situ-Hybridisierung. Durch die erhöhte Temperatur kann die OT-Vorbereitung (Antrocknen, Entparaffinieren) in den Protokolllauf integriert werden.

Abb.168 Eridan Fa. Dako (Horizontal-Robotfärber)

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Immunhistochemie

•

Barcodemarkierung (Objektträger, Reagenzien): Die notwendigen Informationen werden mittels Barcode-Drucker auf Etiketten übertragen und diese auf die Objektträger geklebt. Die Reagenzienbehälter, bzw. gebrauchsfertigen Reagenzien sind mit Barcode markiert. Die intelligenten Automaten identifizieren Probe und Reagenzien, arbeiten das Protokoll ab und speichern die Testdaten zur Dokumentation ab (Qualitätssicherung). Eine neue Methode der Abb.169 Mozaik Fa. Invitrogen Markierung der Firma InfoGlyph bringt eine hö(Senkrecht-Robotfärber) here Informationsmenge auf derselben Fläche unter. Die codierten Daten werden dabei mittels Laser auf eine Oberfläche übertragen.

•

Liquid Coverslip: Um ein Austrocknen der Schnitte während der Inkubation zu verhindern, werden die Objektträger mit einem Ölfilm überschichtet.

•

Kontinuierliches Beschicken während laufendem Testvorgang

•

Inklusive Entparaffinierung (mit oder ohne Xylol)

•

Inklusive HIER / enzymatische Andauung

•

Modulare Erweiterungsmöglichkeiten

•

PC-gesteuert

•

Gleichzeitiges Bearbeiten von IHC und FISH/CISH oder Spezialfärbungen.

•

Go away: Der Labormitarbeiter kann das Gerät während des Testlaufs alleine lassen. Teilweise auch Testläufe über Nacht möglich.

Es gibt auch unterstützende Geräte für die händische Verarbeitung. Bspw. Workstations, wo die Objektträger senkrecht in Racks organisiert sind und mit Kunststoffformen verbunden sind, die ein bestimmtes Reagensvolumen halten können. Für die Rackpositionen stehen einzelne Zeitmesser zur Verfügung. (Abb.170) Abb.170 Sequenza Immunostaining Center Fa. Thermo-Shandon

Histotechnik

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In Situ Hybridisierung A. Anwendungen ...............................................................................................296 B. Prinzip............................................................................................................298 1. Sonden ...................................................................................................300 2. Marker ....................................................................................................301 C. Ablauf............................................................................................................302 1. Gewebe-Vorbehandlung ........................................................................302 2. Denaturierung ........................................................................................303 3. Hybridisierung ........................................................................................303 4. Detektion................................................................................................305 5. Gegenfärbung ........................................................................................306 6. Puffer ......................................................................................................306 7. Protokoll-Beispiel für DNA-ISH...............................................................307 8. Kontrollen ...............................................................................................308 9. Auswertung Interphasen-ISH ..................................................................308 10. Hintergrund ............................................................................................309 11. Kunststoffschnitte, Gefrierschnitte..........................................................309 D. Automation ...................................................................................................309 E. In-situ-PCR.....................................................................................................310 F. Extraktion von Nukleinsäuren aus fixiertem Gewebe ....................................310 G. Microarrays ....................................................................................................312 H. Begriffe..........................................................................................................315

296

in situ Hybridisierung

In situ Hybridisierung Die in-situ-Hybridisierung (ISH) ist eine sehr moderne Untersuchungstechnik zur I dentifikation von DNA- bzw. RNA-Sequenzen, die seit Kurzem Einzug in das Histodiagnostiklabor hält. Die Methode der in-situ-Hybridisierung wurde 1969 eingeführt. Sie blieb jedoch vorerst der Forschung vorbehalten. Erst die Entwicklung bestimmter Techniken für die DNA-Verarbeitung führte dazu, dass die ISH nun als Routinemethode angesehen werden kann. Die ISH verbindet immunologische und molekularbiologische Methoden zu einem starken Diagnosewerkzeug. Die Bezeichnung „in situ“ (lat.) bedeutet „am Ort“. Sie bezieht sich darauf, dass der Nachweis der Sequenzen an ihrer ursprünglichen Lokalisation erfolgt. In diesem Falle innerhalb eines Gewebeschnittes im Zellkern, bzw. an Chromosomen. Der Pathologe hat also die Möglichkeit gleichzeitig Informationen aus Gewebemorphologie und ISH auszuwerten. Im Gegensatz dazu erfolgt für die „Blotting-Methoden“ zuerst die Extraktion des Genmaterials.

A. Anwendungen Die Anwendungsmöglichkeiten sind vielfältig: •

Detektion von Veränderungen am Genom in Chromosomen- und Zellkernpräparaten (Pränatalanalytik, Zytogenetik)

•

Tumordifferenzierung, Identifikation von Patienten für spezielle Therapien

•

Nachweis von (onkogenen) Viren innerhalb von Zellen (HPV, CMV, EBV)

•

Genexpression und -regulation

Man unterscheidet: •

Interphasen-in-situ-Hybridisierung: in jener Phase des Zellzyklus, in der das Chromatin entspiralisiert vorliegt und im Lichtmikroskop mehr oder weniger homogen erscheint. Während der Interphase kommt es zur Verdoppelung des Chromatins. (Abb.171)

•

Metaphasen-in-situ-Hybridisierung: in jener Phase des Zellzyklus, in der sich die Chromosomen in der Äquatorialebene der Zelle anordnen. Die Schwesterchromatiden sind noch nicht getrennt. (Abb.172)

Abb.171 Schematischer Interphasenkern mit Fluoreszenzsignal am Ort der Zielsequenz

Abb.172 Schematisches Chromosom mit Bänderung und Fluoreszenzsignal am Ort der Zielsequenz

Interphasen-ISH wird auf Zellausstrichen von Zellkulturen und von aus Gewebe isolierten Kernen und Abklatschen durchgeführt. Und nun ist die Interphasen-ISH auch auf FFPE-Schnitten möglich geworden.

Histotechnik

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Tumordiagnose: Der Status von Tumorsuppressoren und Onkogenen wird durch ISH dargestellt. Onkogene entstehen durch Mutationen aus Protoonkogenen. Ihre Amplifikation führt zu einer Störung im Zellzyklus. Dabei entstehen bspw. vermehrt Abb.173 Schematischer Wachstumsfaktoren und bewirken eine Interphasen-Kern mit Zellproliferation (z.B. Her2neu Onkogen amplifiziertem Gen bei Mammakarzinom, EGFR –Wachstums(hell) und zwei GenSignalen zur Kontrolle faktor). Ihre Gegenspieler sind die Tumorder Diploidie (dunkel) suppressorgene. Tumorsuppressoren sind an der Wachstumsregulation beteiligt. Ein Beispiel sind sog. Brustkrebsgene, deren Aufgabe im Schutz der Zelle vor maligner Entartung liegt (BRCA 1, BRCA 2); Alterationen eines der beiden Gene mit der Folge eines Funktionsverlustes markieren ein hohes Risiko, an einem Mammakarzinom zu erkranken. (Abb.173) Tumorviren oder onkogene Viren verursachen durch das Einschleusen ihrer DNA bzw. RNA die Verwandlung von normalen Zellen in Tumorzellen. Dazu gehört bspw. das Human Papillomavirus (HPV), das als Ursache für das Cervixkarzinom gilt. Pränatale Diagnostik: Ein Beispiel der Anwendung von Interphasen-ISH ist der Nachweis von Gendefekten an unkultivierten Amnionzellen in der pränatalen Diagnostik. Der Vorteil liegt darin, dass keine Zellkulturen benötigt werden und der Test innerhalb von 24 Std. durchgeführt werden kann. Die Proben-Kerne werden dabei denaturiert und mit DNA-Sonden für die Chromosomen 13, 18, 21, X und Y hybridisiert. So lassen sich Trisomien der entsprechenden Chromosomen darstellen (21 Down-Syndrom, 13 Pätau-Syndrom, 18 Edwards-Syndrom, Triple-X-Syndrom, YYSyndrom, Ullrich-Turner-Syndrom). In der Zytogenetik werden Chromosomen in der Metaphase untersucht. Dazu werden aus einer Zellkultur Zellen in der Metaphase gewonnen. Die ISH wird hier zur Unterstützung bei speziellen Fragestellungen eingesetzt. (Abb.174) •

Durch Spindelgift (Colchizin) werden die Zellen in der Metaphase arretiert und man verhindert, dass die Schwesterchromatiden auseinanderweichen.

•

Durch h ypoosmotische Behandlung werden die Zellen zur Schwellung gebracht und die Darstellung erleichtert.

•

Fixiert werden die Chromosomen durch ein Essigsäure-Methanol-Gemisch.

•

Abb.174 Karyogrammausschnitt Auftropfen und/oder Verteilen der Suspension auf einem säure-gereinigtem Objektträger, beim Antrocknen haften die Chromosomen auf der Oberfläche.

•

An Metaphasenchromosomen werden zur Identifikation B änderungen (Färbung) durchgeführt, die die typischen Bänder (Streifenmuster) hervorbringen.

•

Damit erfolgt die Karyotypisierung nach standardisierter Nomenklatur.

Bei den Chromosomenveränderungen unterscheidet man numerische und strukturelle Aberrationen (Translokation, Amplifikation, Deletion, Insertion etc.), die man durch die ISH darstellen kann. Besonders die Anzahl der Mikrodeletionssyndrome, die mit-

298

in situ Hybridisierung

tels FISH identifiziert werden, steigt an (z.B. Williams-Syndrom, Prader Willi/Angelmann-Syndrom). Bei einer Mikrodeletion fehlt das erwartete Signal am Chromosom. Mithilfe der sog. RNA-ISH kann das Maß der mRNA-Expression in einem Zellverband analysiert werden. Man erhält damit ein spezifisches Expressionsmuster von Genen. Durch den Nachweis von Messenger-RNA erkennt man, welche Proteine in dieser Zelle gerade produziert werden. Man kann damit die Genexpression und -regulation untersuchen. (Abb.175)

Abb.175 Schematische Zelle mit mRNAAnfärbung im Cytoplasma (dunkel) mit CISH

Ein Beispiel ist die Identifikation von B-Lymphozyten, die entweder kappa- oder lambda lightchain Immunglobuline erzeugen. Die Differenzierung der B-Zellen ist wichtig für die Diagnostik von reaktiven bzw. neoplastischen lymphoiden Proliferationen.

B. Prinzip Die DNA ist im Zellkern in Form einer Doppelhelix vorhanden. Die beiden DNAStränge bestehen aus Mononukleotiden (Desoxyribose, Base, drei Phosphatgruppen). Die Nukleotide sind über Phosphorsäurediesterbrücken miteinander zu einem Polynukleotid verknüpft, wobei sie zwei der drei Phosphatgruppen verlieren. Die Sequenz (Abfolge) der Basen bestimmt dabei den genetischen Code (Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin). Der zweite DNA-Strang enthält die komplementären Basen (Watson CrickBase-Pairing). Die Basen binden durch Wasserstoffbrücken aneinander. Die Doppelhelix lässt sich durch hohe Temperaturen und bestimmte Lösungsmittel (Formamid) in Einzelstränge auftrennen (= Denaturierung). Die Stränge vereinigen sich jedoch wieder, sobald die Temperatur wieder abkühlt (= A nnealing, Renaturierung). Als Hybridisierung bezeichnet man die Vereinigung zweier DNA-Stränge unterschiedlicher Herkunft. Ein Hybrid entsteht durch Kreuzung unterschiedlicher Spezies.

Abb.176 Prinzip FISH

Führt man eine Reaktion zwischen einer bekannten DNA-Sequenz (= S onde) und der Probe herbei, kann man auf das Vorhandensein ihrer komplementären Sequenz schließen (= Zielsequenz). Um diese Bindungsreaktion sichtbar zu machen, wird die Sonde markiert (ähnlich wie bei markierten Antikörpern). Als Markierung dienen bspw.

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Histotechnik

Fluorochrome (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, FISH) oder ein indirektes System mittels Biotin/Antikörper/Enzym oder Biotin/Streptavidin/Enzym. Der Nachweis mittels Enzym führt zu einer Umsetzung eines Chromogens am Ort der Reaktion (Chromogen-in-situ-Hybridisierung, CISH). Marker: Fluorochrome, Radioisotope; Biotin, Digoxigenin (DIG); Gold. (Abb.176) ISH wird durchgeführt auf Chromosomen- bzw. Zellausstrichen, auf Schnittpräparaten von in Paraffin oder Kunststoff eingebettetem Gewebe, auf Gefrierschnitten, auf Cytospinpräparaten, auf DNA-Fasern, auf „dicken“ unfixierten Schnitten, auf Ganzkörperpräparaten (z.B. Insekten) und auch auf Chromosomen in Suspension. Kommen bei der ISH zwei unterschiedlich markierte Sonden (bspw. FITC - grün und Texasrot - rot) zum Einsatz, erhält man eine Doppelfärbung und die gleichzeitige Darstellung zweier Zielsequenzen (Nachweis von Mikrodeletionen). Unter Multi-Colour-FISH versteht man die Anfärbung aller Chromosomen durch eine jeweils andere Farbe. Die Farbunterschiede sind nur durch eine spezielle Kamera (Charge-coupled-device CCD) auszumachen, die aufgrund des Emissionsmusters eine Falschfarbendarstellung erzeugt. Diese Methode eignet sich besonders gut zur Untersuchung von Translokationen und der Zusammensetzung von Markerchromosomen. Diese sind durch die übliche Karyotypisierung nicht zuordenbar. (Abb.177)

Abb.177

Beim Reverse Painting wird das zu charakterisierende Chromosom isoliert, die DNA amplifiziert (PCR) und markiert. Die markierte DNA dient als Sonde und wird mit normalen Metaphasen-Chromosomen hybridisiert und so identifiziert. Alle übrigen Methoden bezeichnet man im Gegensatz dazu als „fforward-painting“. Eine intelligente Anwendung der FISH ist die Comparative Genomic Hybridization (CGH). Hier werden das gesamte Test-Genom mit einer Farbe (FITC) und ein gesamtes Normal-Genom mit einer anderen Farbe (TRITC) markiert. Beide lässt man zu gleichen Teilen mit Normal-Chromosomen hybridisieren. Bei der Hybridisierung konkurrieren sie um homologe Bindungsstellen. Weiters führt man noch eine DAPIBänderung durch. Man gewinnt dadurch drei Fluoreszenz-Bilder, die einerseits die Hybridisierung der Proben-DNA andererseits die Hybridisierung der Normal-DNA

300

in situ Hybridisierung

und drittens die Bänderung zeigen. Mithilfe computerunterstützter Auswertung werden Stellen von erhöhter normaler Fluoreszenz (= Deletion in der Probe) und erhöhter Proben-Fluoreszenz (= Amplifikation) lokalisiert. Führt man diesen Test nicht auf Chromosomen, sondern auf einem Biochip durch, spricht man von Matrix-CGH. Der Biochip (Mikroarray) ist dabei mit dem normalen Genom in Form von DNA-Sequenzen bestückt. Übrigens wird die Sonde im Englischen als „probe“ bezeichnet. Die Zielsequenz ist das „target“. 1.

Sonden

Im Histodiagnostiklabor werden selbst hergestellte Sonden wohl eher eine Seltenheit sein. Herstellerfirmen bieten käufliche Sonden, bzw. auch Sonderherstellungs- und Markierungskits an. Manche Firmen stellen auch sogenannte custom-made Sonden her, die auf die Wünsche des Verbrauchers abgestimmt sind. •

Doppelsträngige DNA-Sonden, die mithilfe der Nick-Translation, Random Primer-Methode oder PCR in unterschiedlichen Längen erzeugt werden. Doppelsträngige Sonden werden bei der Anwendung denaturiert. Beim Annealing stehen als Bindungspartner Einzelstränge der Sonde u nd der Probe zur Verfügung. Es kommt zur Reaktion von Sonde-Probe und in geringer Menge von Sonde-Sonde. Dadurch wird die Sensitivität des Tests gemindert. Optimale Ausbeute bestünde bei einer Reaktion nur von Sonde mit Probe. Sie gehören trotzdem zu den meist verwendeten Sondentypen.

•

Einzelsträngige DNA-Oligonukleotide (20–30 Basen, synthetisiert) Oligonukleotide zeigen aufgrund ihrer geringen Größe weniger Signal. Abhilfe schafft hier ein Cocktail aus passenden Oligonukleotiden, die an mehrere Stellen der Ziel-DNA binden können.

•

Einzelsträngige RNA-Sonden werden synthetisiert oder mittels RNA-Polymerase erzeugt. RNA-Sonden gehören zu den empfindlichen Bindungspartnern. Sie werden von den überall vorkommenden RNasen bedroht. Die Verarbeitung ist komplizierter und erfordert Reinraumumgebung. Ihr Einsatz in der Routine ist deshalb selten.

•

Sonden für repetierte Sequenzen: für häufig vorkommende, chromosomenspezifische Zielsequenzen. Zu den am meisten gebrauchten repetierten Sequenzen gehören die (peri-)zentromerischen, chromosomenspezifischen alpha- und einige beta-Satelliten. Sie eignen sich für Metaphasen- und Interphasen-ISH. Sie dienen in der Interphasen-ISH zur Darstellung der Ploidie.

•

Sonden für Single copy Sequenzen: Sonden von geringer Größe für eine einzelne Zielsequenz, die nur einmal auf dem haploiden Chromosomensatz zu finden ist. Sie gehören zu den in Plasmiden klonierten Genen bzw. Genfragmenten. Eignen sich für Metaphasen- und Interphasen-ISH. Die geringe Größe kann zu Detektionsproblemen führen.

•

Sonden für Whole Chromosom Paints (WCP): Cocktail aus mehreren Sonden, klonierte DNA-Segmente zur Darstellung des ganzen Chromosoms bzw. des kurzen oder langen Arms. Die ganze Anfärbung von Chromosomen durch Fluorochrome wird bei der automatisierten Chromosomensortierung eingesetzt.

Histotechnik

301

•

Telomer-Sonden: eine Form von single copy Sequenzen, die für einen bestimmten Chromosomen-Arm spezifisch sind. Sind praktisch zur Darstellung von Deletionen an Armenden.

•

Split- oder B reak Apart-Sonden: zur Darstellung von Translokationen. Die Sonde besteht aus zwei Teilen, die centromerisch und telomerisch zum Bruchpunkt des Gens binden, und mit unterschiedlichen Fluorochromen markiert sind. Normale Chromosomen zeigen ein Signal in Mischfarbe, translocierte Gene erkennt man an zwei unterschiedlich gefärbten Signalen. Das Zielgen der Translokation ist nicht dargestellt.

•

Fusion-Sonden: Zur Detektion von Translokationen zu einem bekannten Zielgen. Zwei unterschiedlich markierte Sonden binden an den translocierten Genteil bzw. an das Zielchromosom. Normale Chromosomen erkennt man an zwei getrennt wahrnehmbaren Signalen in unterschiedlicher Farbe. Translokationen erkennt man an einem fusionierten Signal in Mischfarbe.

Die richtige Länge (Anzahl Basen/-paare) ist ein wichtiger Faktor für das Gelingen des Tests. Optimal für Chromosomen-ISH ist eine Länge von 200–300 Basenpaaren (bp). Für Gewebeschnitte eignen sich Sonden von 50–200 Basenpaaren, da zu lange Sonden schwerer in fixiertes Gewebe eindringen. Oligonukleotide penetrieren am leichtesten, zeigen dagegen eventuell ein zu geringes Signal. 2.

Marker

Früher waren radioaktiv markierte Sonden sehr stark im Einsatz. Dabei wurde ein Phosphat-Isotop in die Sonde eingebaut. Die Strahlung wurde mithilfe eines empfindlichen Films detektiert (Kontaktradiografie). Aufgrund der Gefahren im Umgang mit Radioaktivität wird diese Form zugunsten anderer Methoden verdrängt. Käufliche Sonden sind meist mit Fluorochromen (FITC, TRITC, TexasRed) oder Haptenen (Biotin, Digoxigenin) bestückt. Fluorochrome haben die negative Eigenschaft, dass das Ergebnis nicht photostabil ist und ein teures Fluoreszenz-Mikroskop mit passendem Filtersatz nötig ist. Bei biotinylierten Sonden spielt dagegen die endogene Biotinaktivität des Gewebes eine unangenehme Rolle, was bestimmte Blockierungsschritte notwendig macht. Eine Alternative zur Biotinylierung ist die Markierung mit Digoxigenin (DIG). Die Forschung beschäftigt sich mit der Suche nach optimalen Markierungsmethoden, wie bspw. Chemilumineszenz (Dioxetan) oder Quantum-Dots. Die Markierung von DNA erfolgt während der Sondensynthese, wobei der Marker in Form von markierten Nukleotiden in die Sonde eingebaut wird. An Oligonukleotide werden meist mehrere markierte Nukleotide durch terminale DesoxynukleotidTransferase „ans Ende“ gebunden („markierter Schwanz“). Diese Endmarkierung lässt sich auch zur Darstellung von DNA-Bruchstücken in apoptotischen Zellen ausnützen. Bei selbst hergestellten Sonden muss der Erfolg und Ausmaß der Markierung getestet werden. Dazu werden definierte Spots auf eine Matrix (z.B. Nylonmembran) aufgebracht und mittels Detektionssystem angefärbt (Dot-Blotting). •

Nick translation: Mit Hilfe von Nukleasen werden DNA-Stücke geschnitten. Die Polymerase nimmt einerseits Basenpaare aus dem Doppelstrang heraus und fügt andererseits (markierte) Nukleotide entsprechend der einsträngigen Vorlage ein.

302

in situ Hybridisierung

•

Random primer Markierung: einsträngige DNA wird mit einer Mischung von allen möglichen Oligo(Hexa)-nukleotiden hybridisiert. Diese Primer legen sich nach dem Zufallsprinzip an und sind Startpunkte für die Synthese des copy-Stranges mithilfe des Klenow-Enzyms (= Polymerase).

•

Polymerase chain reaction (PCR) Markierung: Mit Hilfe von speziellen Primern wird das gewünschte DNA-Stück bei der PCR amplifiziert. Dabei baut die Polymerase markierte Nukleotide ein.

•

End-Markierung: Terminale Desoxynukleotid-Transferase ist fähig Nukleotide an Oligonukleotid-Enden zu binden.

•

In vitro transcription: Markierung von RNA mit Hilfe von Bakteriophagen

•

Chemische Markierung: mit photosensitiven Substanzen, immunogenen Substanzen

Beispiel für Sondenherstellung mittels Nick-Translation: • •

• •

Herstellung eines dNTP-Gemisches aus: 1 Vol. Biotin-16-dUTP, 2 Vol. dTTP, 3 Vol. dATP, 3 Vol. dCTP und 3 Vol. dGTP Folgende Bestandteile werden in einem Reaktionsgefäß gemischt und anschließend mit sterilem Aqua dest. auf 18 µl aufgefüllt: 0,1–2 µg gereinigte Plasmid-DNA, 10 µl dNTP-Gemisch und 2 µl 10x Puffer Dem Reaktionsansatz 2 µl Enzymmischung hinzufügen und 90 min bei 15°C inkubieren Markierungsreaktion stoppen durch Zugabe von 2 µl EDTA und Erwärmen auf 65°C

C. Ablauf Die ISH ist eine Methode, die ihren Ursprung in der Zytogenetik hat. Erst als Weiterentwicklung wurde die Technik für das formalinfixierte, paraffineingebettete Gewebe adaptiert. Für zytogenetische Techniken und auch für gentechnisches Grundwissen verweise ich auf entsprechende Literatur. 1.

Gewebe-Vorbehandlung

Die ISH im Histolabor wird üblicherweise auf Schnitten von formalin-fixierten und in Paraffin eingebettetem Gewebe (FFPE) durchgeführt. In FFPE-Gewebe sind DNA und mRNA gut nachweisbar. Die Methode ist aber auch auf Gefrierschnitten, ZellblockPräparaten und Ausstrichen anzuwenden. Aufgrund der „rauen“ Behandlung sind beschichtete Objektträger (plus-charged, Poly-L-Lysin, silanisiert) zu empfehlen. Ansonsten erfolgt die Schnittherstellung in der üblichen Methode. Eine Gefahr für das Gelingen des Tests stellen Nukleasen dar, die auch auf der Haut des Laboranten zu finden sind. Obwohl die Fixierung das Kernmaterial relativ unempfindlich macht, sollte man besonders für den Nachweis von mRNA nukleasefreie Materialien (reines Wasser, Handschuhe, Laborgefäße) verwenden. DNase wird durch Autoklavieren zerstört, RNase ist widerstandsfähiger und verlangt nach spezieller Präparation der Laborgefäße (Diethyl pyrocarbonat DEPC behandeltes Wasser zum Spülen).

Histotechnik

303

Die Vorbehandlung des Gewebes umfasst das Entparaffinieren und das Zugänglichmachen der DNA für die Reagenzien. Die DNA befindet sich im Zellkern in enger Verknüpfung mit den Histonen als Chromatin und ist umgeben von Membranen. Außerdem verhindert die formalinbedingte Vernetzung der Gewebeproteine den uneingeschränkten Zugang der Sonden. Ähnlich wie bei der Demaskierung in der Immunhistochemie wird die Permeabilität des Gewebes mittels Erhitzen in saurem Puffer oder Natriumthiocyanat erhöht. Die Histone werden anschließend durch Andauung (Proteinase K, Pepsin) entfernt. Diese Vorbehandlung ist ein kritischer Schritt. Einerseits sollte die Morphologie der Zellkerne nicht zu sehr leiden, andererseits führt eine zu kurze Andauung eventuell zu einem falsch-negativen Testergebnis. Eine Acetylierung des Gewebes nach der Andauung vermindert die unspezifische Reaktion aber auch die spezifische Bindung der Sonde (Hintergrundverminderung). 2.

Denaturierung

Ist an der Reaktion doppelsträngige DNA beteiligt, muss sie zuerst durch hohe Temperatur in ihre Einzelstränge aufgetrennt (geschmolzen) werden. Dabei können Zielsequenz und Sonde gemeinsam oder getrennt denaturiert werden. Der Objektträger wird auf einen Heizblock aufgelegt, der Schnitt ist mit (Pre-)hybridisierungslösung und Deckgläschen bedeckt. Die Höhe der Temperatur ist abhängig von der Häufigkeit bestimmter GC-Basenpaare in der Zielsequenz und liegt zwischen 85°C und 95°C. Überhitzung über 100°C muss vermieden werden. Die Zugabe von Formamid senkt die Schmelztemperatur. Die Dauer liegt zwischen 3–5 min. 3.

Hybridisierung

Während der Hybridisierung sollen eine maximale Reaktion der Sonde mit der Zielsequenz und gleichzeitig eine minimale unspezifische Reaktion erfolgen. Zur Kontrolle dient eine ausbalancierte Zusammensetzung der Hybridisierungs-Lösung, bei einer optimalen Temperatur und Dauer. Stringenz: Die Stringenz definiert den Prozentsatz an homologen und nicht-homologen Bindungen (matches/mismatches) von Sonde und Zielsequenz. Niedrige Stringenz: Anzahl an mismatches ist erhöht. Hohe Stringenz: nur exakt komplementäre Basenpaare binden. "stringent" (lat.) heißt bündig, zwingend. Beim stringenten Waschen werden unpassende Sequenzen weggeschwemmt. Die Zusammensetzung der Waschlösung bestimmt, wie fest die Wasserstoffbrücken halten. Sie wird aufgrund der Schmelztemperatur der DNA kalkuliert. Die Schmelztemperatur (Tm) ist jene Temperatur, bei der doppelsträngige und einsträngige DNA im stabilen Gleichgewicht stehen. Bei Tm ist die Stringenz 100%, Sonde und Ziel bleiben nur an den homologen Stellen hybridisiert. Stringenz über 100% führt zu Einzelsträngen und wird bei der Denaturierung angestrebt. Üblicherweise wird die ISH bei einer Stringenz zwischen 70% (niedrig) und 90% (hoch) durchgeführt. Die Stringenz wird beeinflusst durch die Zusammensetzung der DNA-Sequenzen, die Länge und Art der Sonde, Markierung, Temperatur und Zusammensetzung der Hybridisierungslösung (monovalente Kationen, Formamid). Höhere Temperatur, höhere Formamid- und geringere Salzkonzentration ergeben höhere Stringenz. Kürzere Son-

304

in situ Hybridisierung

den können bei hoher Homologie stabiler an die Zielsequenz binden als längere Sonden mit geringerer Homologie. Temperatur: Die Annealing-Temperatur liegt optimalerweise 25°C unter dem Schmelzpunkt. Bei tieferen Temperaturen kommt es zu einem gewissen Maß an partiell-homologem Annealing. Durch Zugabe von Formamid lässt sich die optimale Temperatur auf 37–45°C einstellen. Während der Hybridisierung und dem Waschen muss die Temperatur exakt eingehalten werden. Eine Abänderung um 1°C führt zu einer Veränderung der Stringenz um 1%. Inhaltsstoffe der Hybridisierungslösung: •

Puffer: Der Salzgehalt der Lösung beeinflusst die Stringenz der Reaktion. Hohe Konzentrationen verursachen Bedingungen für niedrige Stringenz, während bei niedrigen Salzkonzentrationen nur Sequenzen mit vollständiger Übereinstimmung aneinander binden können. Bei der Hybridisierung wird der pH-Wert meist bei 7,0 gehalten.

•

Anionische Makromoleküle wie Dextran sollen den unspezifischen Hintergrund reduzieren.

•

Lachssamen-DNA im Überschuss schirmt die nicht homologen Sequenzen der Sonde ab, und verhindert damit elektrostatische Anbindung an das Gewebe. Synthetisierte PNA-Sonden können hiefür auch eingesetzt werden. PNA ist ein DNAAnalog mit einem Polyamid-Rückgrat.

•

EDTA in der Lösung bindet Magnesium, das für die Aktivität von Nukleasen notwendig wäre.

•

Formamid: Die organische Flüssigkeit (CH3NO) destabilisiert die Doppelhelix. Die Konzentration beträgt meist 20–60%. Es erlaubt eine niedrigere Temperatur. Formamid ist sehr toxisch und wird bei modernen Protokollen, so weit es geht, vermieden.

Beispiel einer Hybridisierungslösung: Digoxigenin-markierte cDNA-Sonde (Endkonzentration 0,5–2 µg/ml) 1 µl ................0,5 M Tris-HCl, pH 7,4 50 µl ................20x SSC-Puffer 1 µl ................50 mM EDTA 100 µl ................50% Dextransulfat 250 µl ................Formamid 500 µl ................steriles Wasser Der Schnitt wird mit der Lösung überschichtet und mit einem Deckgläschen bedeckt. Man kann durch die Zugabe von kleinsten Partikeln eine bestimmte Spaltbreite definieren. Das Deckgläschen wird mittels Kleber (Rubbercement) fixiert und abgedichtet. Der Objektträger sollte sich in einer feuchten Kammer befinden, um Austrocknung zu vermeiden. Die Dauer der Hybridisierung reicht von 1–2 Std. bis 16–20 Std..

Histotechnik

4.

305

Stringentes Waschen

Anschließend an die Hybridisierung erfolgt das stringente Waschen. Die Zusammensetzung der Waschlösung wird nach der gewünschten Stringenz gewählt. Sie enthält Puffer (SSC), event. MgCl2, Detergens und Formamid (optional). Die Waschtemperatur ist genau einzuhalten. Zu hohe Temperatur kann zum Verlust der vorher gebundenen Sonde führen. Das Waschen bei einer etwas erniedrigten Stringenz gegenüber der Hybridisierungslösung soll unspezifische Hintergrundfärbung und Mismatches vermindern. Letztendlich soll nur homolog gebundene Sonde am Gewebeschnitt verbleiben. 5.

Detektion

Die Art der Detektion ist in erster Linie natürlich vom eingesetzten Marker abhängig. Damit wird auch das Auflösungsvermögen und die Sensitivität festgelegt. Für DNADNA Hybridisierung kommen meist Fluorochrome zur Anwendung. Für DNA-RNA Hybridisierung mit Oligonukleotiden ist die Detektion mithilfe von Antikörper / Enzym / Substrat-Systemen verbreitet. 5.1. Direkte Methoden •

Direkte Fluorochrommarkierung ist am meisten verbreitet und hat den großen Vorteil von einfach durchzuführenden Zwei- oder Mehrfachfärbungen (Z.B. rotes locusspezifisches und grünes centromerspezifisches Signal). FISH wird im Fluoreszenzmikroskop begutachtet. Zur Dokumentation ist eine hochwertige Optik und (digitale) Fotografie notwendig, um das Ergebnis auf Dauer zu erhalten.

•

Markierung mit Goldpartikeln wird in der Elektronenmikroskopie eingesetzt.

•

Radioaktive Markierung wird durch Kontaktradiografie sichtbar gemacht. Die Belichtungszeit dauert 12–24 Std. (und länger). Die Methode gilt als sehr sensitiv, aber als langwierig und gesundheitsgefährdend.

5.2. Indirekte Methoden Ähnlich wie in der Immunhistochemie wird ein weiterer Schritt zur Detektion benötigt. Dabei kommt es auch zur Signalamplifikation. Biotinylierte Sonden sind Bindungspartner für: •

Streptavidin-Enzym-Komplexe

•

Streptavidin-Fluorochrom-Komplexe

Digoxigenin-markierte Sonden sind Bindungspartner für: •

Anti-DIG-Antikörper/Enzym-Komplexe

•

Anti-DIG-Antikörper/Fluorochrom-Komplexe

FITC-markierte Sonden sind Bindungspartner für: •

Anti-FITC-Antikörper/Enzym-Komplexe FITC zeigt immunogene Eigenschaften. Dadurch kann man die vergängliche Fluoreszenz durch permanente Chromogenbildung ersetzen und im Lichtmikroskop beurteilen.

306 •

in situ Hybridisierung

unkonjugiertes Anti-FITC: Ist der erste Bindungspartner an die markierte Sonde ein Antikörper ohne Konjugation (z.B. Maus-anti-Fluorescein), wird ein weiterer Antikörper (z.B. Pferd-anti-Maus) eingesetzt. Dieser kann wiederum biotinyliert sein und mittels Streptavidin-Enzym-Komplex detektiert werden. Durch dieses Mehrschritt-System kommt es zu einer höheren Signalamplifikation am Ort der Zielsequenz.

Enzyme: Die Auswahl an Enzymen ist ähnlich wie bei der Immunhistochemie. •

Meerrettichperoxidase (HRP)

•

Alkalische Phosphatase (AP)

•

Beta-Galaktosidase (GAL)

Die Enzymaktivität muss auf histochemischen Wege nachgewiesen werden. Dabei erfolgt die Umsetzung eines angebotenen Chromogens in eine farbige Substanz (siehe Immunhistochemie). Endogene Enzymaktivität muss wieder blockiert werden, um keine falsch-positiven Ergebnisse zu erhalten. Chromogene: •

DAB (Diaminobenzidin): für Peroxidase, braunes Farbprodukt, in organischen Lösungsmitteln unlöslich

•

AEC (Amino-ethylcarbazol): für Peroxidase, rotbraunes Farbprodukt, in organischen Lösungsmitteln löslich

•

TNBT (TetraNitrotetrazoliumblauchlorid: für alkalische Phosphatase, rotbraunes Farbprodukt, in organischen Lösungsmitteln unlöslich

•

BCIP/NBT (Bromochloroindolylphosphat / Nitroblautetrazoliumchlorid): für alkalische Phosphatase, dunkelblau-violettes Farbprodukt, in organischen Lösungsmitteln unlöslich. Durch enzymatische Hydrolyse wird BCIP in Phosphationen und Bromchlorindoxyl gespalten. Diese reaktive Verbindung reduziert das gelbe, lösliche NBT zu einem dunkelblau-violetten Formazan.

•

Fast Red: für Galaktosidase, rotes Farbprodukt

6.

Gegenfärbung

Für die FISH erfolgt eine Gegenfärbung der Kerne mittels DAPI (Diamidinophenylindol), das eine blaue Fluoreszenz zeigt. DAPI wird als Kernfarbstoff bzw. zur Bänderung von Chromosomen benützt. Eine Alternative zu DAPI ist Propidiumjodid, das eine rote Kernfärbung hervorruft. Diese Farbstoffe können Bestandteil des Eindeckmediums sein. Für die CISH eignet sich als Kontrastfarbe Hämalaun als blauer Kernfarbstoff bei rotem Färbeergebnis (z.B. AEC, DAB). Für ein blaues Färbeergebnis (BCIP/NBT) eignet sich eine rote Gegenfärbung (Kernechtrot). 7.

Puffer

Puffer werden bei der ISH in Inkubationslösungen und zum Waschen verwendet. Viele Puffer werden in konzentrierter Form als Stammlösung angesetzt und kurz vor der Testdurchführung entsprechend verdünnt.

307

Histotechnik

Beispiele: •

10x Phosphat buffered saline (PBS):

1,37 M NaCl; 89,8 mM KOH; 113 mM NaH2PO4

•

20x Standard saline citrate (SSC):

3 M NaCl, 0,3 M tri-Natriumcitrat, pH 7,0

•

1x Tris buffered saline (TBS):

10 mM Tris-HCl, 170 mM NaCl, 3,4 mM KCl, pH 7,4

•

10x Tris-EDTA Puffer (TE):

100 mM Tris, 10 mM EDTA

•

Alkalische Phosphatase-Substratpuffer: 100 mM Tris-HCl ph 9,0, 50 mM MgCl2 Hexahydrat, 100 mM NaCl

8.

Protokoll-Beispiel für DNA-ISH

Diese Anleitung enthält nicht alle Details und soll nur den umfangreichen Ablauf der Testdurchführung demonstrieren. Vorbehandlung 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Schnitte entparaffinieren: Xylol ....................................................... 3 x 10 min Rehydrieren bis Aqua bidest. in absteigender Alkoholreihe Vorbehandlungspuffer (Citratpuffer/MES-Puffer pH 6) .................. 5 min, 98°C auskühlen lassen .................................................................................... 20 min in Waschpuffer spülen Andauen mit Protease ............................................................ 3–10 min, 37°C in Waschpuffer spülen aufsteigende Alkoholreihe bis Alk. abs. und lufttrocknen Eventuell nachfixieren in 0,4% Paraformaldehyd in 1xPBS, wieder spülen, aufsteigende Alk.reihe und lufttrocknen.

Denaturierung und Hybridisierung 10. Schnitte mit 10 µl Hybridisierungslösung (inkl. Sonde) bedecken, Deckgläschen 22x22 mm, mit Kleber verschließen 11. Denaturierung................................................................................ 5 min, 82°C 12. Schnitte zur Hybridisierung über Nacht bei 42°C in feuchter Kammer belassen 13. Waschen in 2x SSC und dabei Deckgläschen abspülen .................. 2 x 20 min 14. Einstellen in 0,1 x SSC mit MgCl2 und Detergens ....................... 30 min, 42°C 15. Einstellen in Waschpuffer ........................................................................ 5 min Detektion bei indirekter Methode 16. Inkubation mit Anti-Digoxigenin-Alkalische Phosphatase Konjugat in bestimmter Verdünnung ....................................................................... 30 min 17. in Waschpuffer spülen 18. Inkubation mit Substrat/Chromogen-Lösung .......................................... 5 min 19. in Aqua dest. spülen 20. Gegenfärbung mit Mayer’s Hämatoxylin ................................................ 3 min 21. in Leitungswasser spülen 22. mit wässrigem Eindeckmedium eindecken

308

in situ Hybridisierung

Gegenfärbung bei Fluorochrommarkierung 16. 17. 18. 19. 20.

9.

Schnitte in aufsteigender Alkoholreihe dehydrieren lufttrocknen mit Antifading Eindeckmedium mit Dapi oder Propidiumjodid eindecken Deckgläschen mit bspw. Nagellack fixieren Die Objektträger sollen ab Schritt 10 nur mehr bei gedämpftem Licht bearbeitet werden.

Kontrollen

Positiv-Kontrolle: Schnitt einer Gewebeprobe, die garantiert das gesuchte Ziel enthält und idealerweise dieselbe Prozedur durchlaufen hat, wie das Testgewebe. Die Positiv-Kontrolle soll dabei ein mittelstarkes Signal aufweisen, um eine Abschwächung des Systems in irgendeiner Form zu erkennen. Eine Kontrollsonde, die sicher hybridisiert, überprüft das gesamte Testsystem. Negativ-Kontrollen: Hier werden Schnitte der Gewebeprobe mit einem Ersatzreagens inkubiert, das keine bzw. andere spezifische Sonden enthält. Damit lassen sich unspezifische Anfärbungen und endogene Enzymaktivitäten darstellen. •

Die Hybridisierung wird mit einer Sonde durchgeführt, die ident – nicht komplementär – zur Zielsequenz ist.

•

Inkubiert man Gewebe, von dem man sicher weiß, dass es die Zielsequenz nicht enthält, mit der Sonde, kann man Rückschlüsse auf Kreuzreaktivität zwischen Sonde, Antikörpern und Gewebe ziehen.

•

Als Negativkontrolle beim mRNA-Nachweis eignet sich ein Gewebeschnitt, der mit RNase behandelt wurde.

•

Zur Kontrolle des Detektionssystems lässt man die Inkubation mit dem Antikörper aus. (Darstellung endogener Enzyme)

10. Auswertung Interphasen-ISH Die Beurteilung erfolgt je nach Detektionssystem im Fluoreszenzmikroskop oder Lichtmikroskop. Auch digitale Bildauswertungen sind üblich. Prinzipiell müssen die Positiv- und Negativ-Kontrollen in die Interpretation miteinbezogen werden, um falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse auszuschließen. Ist in der Patientenprobe kein Signal zu erkennen, bedeutet es nur, dass die Zielsequenz nicht nachgewiesen werden konnte, aber nicht, dass sie nicht trotzdem vorhanden sein könnte und nur unterhalb der Testsensitivität liegt. Ein positives Ergebnis bedeutet die Hybridisierung einer Sequenz, die üblicherweise zu 80–90% homolog ist, und häufig genug auftritt, um detektiert zu werden. Die Morphologie ist für den in-situTest eine bedeutende Komponente bei der Auswertung. Die Testbeurteilung sollte deshalb von einem fachkundigen Pathologen durchgeführt werden. Bei der Auswertung des Testergebnisses wird eine M indestanzahl an Kernen untersucht. Die Kerne müssen dabei bestimmten Kriterien entsprechen, damit sie miteinbezogen werden (nicht überlappend, vollständig, intakt). Normalerweise sind pro Kern zwei Signale für die Zielsequenz an den zwei homologen DNA-Strängen zu finden. Es zeigt sich jedoch, dass nicht jeder normale Kern zwei Signale und nicht jeder „mutierte“ Kern drei (oder mehr) Signale aufweist. Ein Grund liegt z.B. im „Halbieren“

309

Histotechnik

eines Kerns bei der Schnittgewinnung. Außerdem kann im Interphasekern bei der Einleitung der nächsten Zellteilung die Verdoppelung der DNA schon erfolgt sein, was zu vier Signalen führen muss. Bsp.: Für die Schnelltests zur pränatalen Diagnostik müssen mind. 50 auswertbare Zellen herangezogen werden, im Zweifelsfall noch mehr. 11. Hintergrund Hintergrundfärbung ist grundsätzlich unerwünscht, da sie die spezifische Anfärbung maskieren kann. Hintergrund bei Fluorochrom-Präparaten kann verursacht sein durch: •

Objektträger nicht fachgerecht vorbereitet (schlecht gereinigt, offen gelagert)

•

Kontaminierte Reagenzien (DAPI-Anfärbung von Bakterien-DNA)

•

Reagenskonzentration zu hoch

•

Elektrostatische Bindung von DNA-Sonden an Cytoplasmastrukturen

•

Falsche Stringenz gewählt, Blocking Lachs-DNA zu gering

•

Markierte Sonde ist zu lang; freie Marker-Moleküle sind im Reagens enthalten.

12. Kunststoffschnitte, Gefrierschnitte Für Einbettungen in Kunststoff wie bspw. für die Elektronenmikroskopie werden vernetzende Fixantien benötigt, die die Denaturierung und das Eindringen der Sonde und Detektions-Reagenzien behindern. Als Kunststoff wird hydrophober Acrylkunststoff verwendet (Polymertemperatur bei 55–65°C). Die Schnitte werden auf Grids aufgezogen und ähnlich wie bei der Färbetechnik Schnitt-nach-unten auf das Reagens aufschwimmend inkubiert. Für Gefrierschnitte kann die Fixierung vor bzw. nach dem Anfrieren erfolgen in Abhängigkeit von Gewebe, Methode und darzustellender Nukleinsäure. Für mRNA wird die Fixierung vorher durchgeführt, um RNasen zu inaktivieren und die Diffusion der Zielsequenzen zu minimieren.

D. Automation Wie am Protokollbeispiel ersichtlich, ist die in-situHybridisierung eine sehr umfangreiche Technik mit vielen Einzelschritten. Um hier eine Standardisierung im Labor zu erreichen, kann man Automaten einsetzen. Manche der modernen Immunhisto-Automaten mit einer positions-abhängigen Temperaturwahl bieten diese zusätzliche Leistung an (siehe Immunhistologie). Je nach Modell sind hier Immunhistochemie und in-situ-Hybridisierung gemeinsam durchführbar. Sehr praktisch sind Systeme, die ohne weitere Betreuung über Nacht das lange Testprotokoll abarbeiten. Weiters sind bei den Herstellern auch vorgefertigte Sonden und Detektionssysteme erhältlich.

Abb.178 Hybridizer Fa. Dako

310

in situ Hybridisierung

Im Gegensatz zu diesen vollautomatischen Modellen, gibt es auch unterstützende Geräte. Diese übernehmen zwar nicht die Auftropf- und Waschschritte, sorgen aber für eine genaue Temperatur- und Zeiteinstellung während Denaturierung und Hybridisierung. Dazu gehören Heizblöcke, die digital einstellbar sind und auch mit einer feuchten Kammer ausgestattet sind. (Abb.178)

E. In-situ-PCR Diese Technik ist die Kombination von in-situ-Hybridisierung und Polymerase-ChainReaction. Es erlaubt die Amplifizierung von Genmaterial am Ursprungsort, ist aber noch eine reine Forschungsmethode. Dabei wird das Reaktionsmedium in einem definierten, abgedichteten Raum zwischen Objektträger und bspw. einem zweiten Objektträger bewahrt. Nach mehreren Zyklen mit Denaturierung und Hybridisierung erfolgt die Detektion. Das Prinzip der PCR umfasst das Aufschmelzen des Doppelstranges in die Einzelstränge und das Anlagern von Desoxyribonukleotid-Triphosphaten (dNTPs) an bestimmte Orte des Einzelstranges. Der Einzelstrang fungiert als Vorlage (templateDNA). Zugegebene Primer (definierte Oligonukleotide, 18–22 Basen) binden am Beginn und am Ende der gesuchten Sequenz, hitzeresistente Polymerase (bakterielle Taq-Polymerase) katalysiert die Anlagerung der passenden Nukleotide. Die neu entstandenen Doppelstränge werden im nächsten Schritt wieder aufgetrennt und erneut hybridisiert. Die Vermehrung der Sequenzen erfolgt theoretisch exponentiell. 15–30 Zyklen werden auf Chromosomen- und Zellausstrichpräparaten mithilfe eines Thermocyclers durchgeführt. An die PCR wird die in-situ-Hybridisierung mit markierten Sonden angeschlossen. Das Potential der in-situ-PCR liegt in der Detektion von Sequenzen, für die die ISH allein zu wenig sensitiv wäre. Man kann damit z.B. Gene in Zellen nachweisen, die absichtlich durch den Forscher eingebracht wurden (Kontrolle der erfolgten Transduction in der Gentherapie). Zyklus:

Denaturierung (95°C, Auftrennung in Einzelstränge) Æ Annealing der Primer (40°C) Æ Polymeraseaktivität (72°C, Bildung der neuen Doppelstränge) Æ Denaturierung (95°C, erneute Auftrennung in Einzelstränge) Æ etc....

F. Extraktion von Nukleinsäuren aus fixiertem Gewebe Um Nukleinsäure als isoliertes Molekül untersuchen zu können, muss es aus seiner Umgebung extrahiert werden. Die Extraktion aus unfixierten Zellen ist eine etablierte Methode der Molekularbiologie. Für fixiertes Gewebe müssen Modifikationen vorgenommen werden. Die Behandlung des Gewebes mit Fixiermitteln beeinflusst natürlich auch das Kernmaterial. Fixantien mit Formalin als Hauptinhaltstoff verursachen einen Abbau der Nukleinsäurestränge in unterschiedliche Bruchstücke. Je länger die Einwirkung andauert, umso kürzer werden die Sequenzen. Durch schonendes Fixieren bei 4°C kann dieser Abbau verlangsamt werden. Die Verarbeitung bei der Paraffineinbettung scheint ein teilweises Reannealing hervorzurufen. Die zufallsbedingt zerkleinerte DNA ist für Southern blotting ungeeignet, jedoch für die Analyse von kurzen Sequenzen verwendbar.

311

Histotechnik

Nach der morphologischen Begutachtung der in üblicher Weise gefärbten Schnitte, werden vom entsprechenden Paraffinblock eine gewisse Menge an Schnitten hergestellt und in ein Reagensgefäß transferiert (Eppendorf-Hütchen). Zum Entparaffinieren wird Xylol zugegeben, nach bestimmter Zeit wird die Lösung zentrifugiert und der Überstand wird abpipettiert. Dies wiederholt man mit Alkoholen in absteigender Konzentration bis zu einer Pufferlösung. Um die Nukleinsäuren freizusetzen, müssen die Zellen zuerst aufgeschlossen werden. Dazu dienen mechanische und vor allem enzymatische Methoden. Die Fixierung verursacht eine stärkere Einbindung der Nukleinsäuren in die umgebenden Proteine, was eine verlängerte Aufschlussprozedur notwendig macht (im Vergleich zu gefrorenem, unfixierten Gewebe). Die Andaulösung besteht aus Proteinase K und Natriumdodecylsulfat (SDS) in Puffer. SDS löst Zellmembranen und erleichtert den Zugang des Enzyms. Die Inkubation erfolgt bei 37°C für 1–7 Tage bis zum vollständigen Aufschluss. Die Lösung wird dabei viskös. Aus der entstandenen Suspension erfolgt die Isolation. RNA und DNA besitzen eine hohe Wasserlöslichkeit und fallen in bestimmten Alkohol-Wasser-Mischungen als Makromoleküle aus. In organischen Lösungsmitteln wie Chloroform oder Phenol sind Nukleinsäuren sehr schlecht löslich, weshalb man durch E xtraktion mit solchen Lösungsmitteln Eiweiße und hydrophobe Komponenten von ihnen abtrennen kann. Die Extraktionslösung wird in das Reaktionsgefäß zugegeben (Abb.179). Dieses wird sanft geschüttelt und Abb.179 zentrifugiert. Die wässrige Phase enthält die Nukleinsäuren und wird in ein anderes Gefäß überführt. Zum Ausfällen der Nukleinsäuren wird eine bestimmte Salzkonzentration eingestellt und absoluter Alkohol zugegeben. Bei der Präzipitation erscheint eine fädige, faserige Substanz. Die ausgefällte Nukleinsäuren werden zu einem Pellet zentrifugiert, der Überstand abpipettiert. Mit einem passenden Puffer wird das Pellet auf die gewünschte Konzentration r esuspendiert.

Abb.180 DNA-Extraktion und Blotting

Aufgrund der physikalisch-chemischen Unterschiede zwischen den Nukleinsäurentypen und ihrer differierenden Nukleasensensibilität lassen sie sich weiter isolieren. Nukleinsäuren sind negativ geladen und wandern daher im elektrischen Feld zum Pluspol. Diese Eigenschaft nützt man in der elektrophoretischen Auftrennung von Nukleinsäurekomponenten. Die Trennung ist abhängig von der angelegten Spannung, den Trägergeleigenschaften sowie der Ladung und der Form der Moleküle (Abb.180). Die Agarose-Gelelektrophorese ist eine Standardmethode, um DNA-

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in situ Hybridisierung

Fragmente unterschiedlicher Größe aufzutrennen. Das Gel ist dabei in horizontaler Lage und völlig von Elektrophoresepuffer bedeckt. Zur Detektion der Banden, können diese durch interkalierende Farbstoffe (Ethidiumbromid, Abb.181) angefärbt werden. Eine andere Darstellungsmethode ist die Überführung der Banden auf eine Nylon- oder NitrozelluloseBlotting). Die Visualisiemembran (B rung kann nun mithilfe immunologischer Techniken bzw. durch Hybridisierung mit markierten DNA Sonden Abb.181 interkalierendes Ethidiumbromid erfolgen (Northern-Blot (RNA) und Southern-Blot (DNA)). Die extrahierten Nukleinsäuren können vor der Identifikation auch durch PCR amplifiziert werden. Dabei wird die gesuchte Sequenz vermehrt und das Auftrennungsmuster der Elektrophorese mit bekannten Proben verglichen. Zur Sequenzierung lassen sich dann auch Microarrays einsetzen. Bei der quantitativen PCR vergleicht man das Amplifikationsprodukt mit einer bekannten Probenmenge. R eal-Time-PCR ermöglicht die Quantifizierung aufgrund von Fluoreszenzintensität. Dafür gibt es unterschiedliche Methoden. Z.B. werden durch die Polymerase auch fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide eingebaut, die erst durch den Einbau von einem Quencher (Unterdrücker) befreit werden und somit detektierbar werden. Für die Extraktion von RNA aus Gewebe oder Zellen muss bedacht werden, dass sie ständig von RNasen bedroht wird. Die Verarbeitung ist aufwendiger und zum Blockieren der RNase wird zur Extraktionslösung Guanidiumthiocyanat zugegeben. Der Verdau benötigt kürzere Inkubationszeit, weil die RNA aus dem Zytoplasma und nicht wie die DNA aus dem Zellkern freigegeben werden soll. Eine Variante der Anwendung ist die Microdissection-Methode, wo aus Paraffinschnitten Tumorzellen gezielt isoliert werden. Ihre DNA wird extrahiert, in RNA übersetzt, amplifiziert und mit einem Gen-Chip hybridisiert. Hier kann die Gewebemorphologie direkt mit dem „Gen-Ergebnis“ in Relation gesetzt werden. Bis diese Technologie in die Routinehistologie Einzug hält, wird es aber noch etwas dauern.

G. Microarrays Microarrays dienen zum Aufarbeiten und Austesten einer sehr hohen Anzahl an Interaktionen zwischen verschiedenen Bindungspartnern. Diese Bindungspartner können Nukleinsäuren, Proteine oder andere Substanzen sein, die als Reaktionspartner in Frage kommen. Das Prinzip ist meist so, dass ein in seiner Struktur bekannter Bindungspartner irreversibel an einer Oberfläche befestigt ist und eine in Aufbau oder Zusammensetzung unbekannte Probe diesem angeboten wird. Anwendung findet diese Technik bei der Genomaustestung, GenexpressionsdarstelGenomic, Proteomic) und vor allem auch bei der Suche nach neuen Medikalung (G drug-targeting). Die Industrie bietet hier für verschiedene Spezies Genommenten (d Chips an, die das gesamte Genom repräsentieren (Human Genom Array Fa. Affimetrix, Human Genom Chip Fa. ArrayIt). Die Genomaustestung beinhaltet die Zu-

Histotechnik

313

kunftsaussichten des „gläsernen Menschen“, was einerseits individualisierte Therapie andererseits spezielle Vorsorgemedizin bedeuten kann (Ethikfrage). Bei der Entwicklung neuer medizinischer Wirkstoffe wird untersucht, welche Substanz sich am besten als Bindungspartner für einen speziellen Rezeptor an/in der Zelle eignet. Damit wird eine sehr große Anzahl an potentiellen Medikamenten durch die invitro-Diagnostik auf eine überschaubare Menge eingegrenzt, die dann durch weitere Austestung (Zellkulturen, Tierversuch, Studien) auf ihre Eignung geprüft werden. In der medizinischen Diagnostik sind hauptsächlich DNA-Chips im Einsatz, die mit Oligonukleotiden bestückt sind. Nukleotide sind relativ unempfindlich im Gegensatz zu Proteinen. Bei Proteinen ist die räumliche Struktur stark mit ihrer Funktionalität und Bindungsfähigkeit verknüpft. Bei der Immobilisierung auf einem Träger kommt es hier leichter zu Denaturierung und Verlust der Funktion (P Protein-Chips). Zu den ProteinChips gehören Arrays, auf denen Antikörper immobilisiert sind, mit denen Proteine identifiziert werden können. Für die Tumordiagnostik ist die Identifizierung von tumortyp-spezifischen Genveränderungen wichtig. Die Entwicklung geht dahin, einen Chip herzustellen, der alle relevanten Genmutationen in Gänze darstellen kann. Wichtig sind hier SNPs (single nucleotid polymorphism) als „Visitenkarte“ von Erkrankungen. Gen-Chips können auch direkt zum Nachweis von Erreger-Genomen und ihrer Charakterisierung bezüglich Resistenzen eingesetzt werden. Dieser direkte Nachweis eliminiert im Gegensatz zu Antikörpertests aus dem Serum das diagnostische Fenster zwischen Infektion und Immunantwort. Je nach Menge der zu untersuchenden Interaktionen bzw. Größe der Reaktionsfläche spricht man von Mikro- und Makroarrays. Grundsätzlich gibt es Biochips in verschiedenen Formaten. Die Industrie arbeitet daran, die Anzahl an immobilisierten Molekülen auf einer Trägerfläche immer weiter zu erhöhen, und die Trägerfläche dabei zu verkleinern. Die Vorläufer der Microarrays sind Mikrotiterplatten (bis 1536-NapfPlatten). Die modernen Chips haben die Größe von üblichen Glasobjektträgern und tragen bis zu 200.000 Spots pro cm2. Beim Hochdurchsatzscreening für drugtargeting werden am Tag 10.000–100.000 Analysen durchgeführt. Die Absicht in der Miniaturisierung liegt darin, die Menge des benötigten Probenmaterials möglichst gering zu halten (µg-Bereich) bei möglichst großem Informationsgewinn. Je nach Umfang und Fragestellung unterscheidet man in globale und spezifische Arrays. Globale Arrays liefern oft sehr viele Basisdaten, deren Nutzen sich erst herausstellen muss (z.B. Gene mit unbekannter Funktion). Im Gegensatz dazu enthalten spezifische Arrays wenige Spots, die sich direkt auf eine Problemstellung beziehen (z.B. Expression eines Gens unter bestimmten Bedingungen). „Array“ bedeutet etwa soviel wie „Anordnung“ oder auch „Matrix“. Es bezieht sich auf den strukturierten Aufbau des Materials. Die riesige Menge an Molekülen wird in Spot“ beschreibt den Punkt, wo die Substanz bebestimmte Muster organisiert. Ein „S Grid“ zusammengefasst und dieser wiederum festigt ist. Mehrere Spots werden als „G als „S Super-Grid“. Die Spotgröße liegt im µm-Bereich und ist abhängig vom jeweiligen Herstellungsmodus. Die Forschung geht dahin, hier in den Nanometer-Bereich zu gelangen. Die gespottete Probenmenge liegt im Pikoliter-Bereich. (Abb.182)

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Abb.182 Microarray Aufbau

in situ Hybridisierung

In der Forschung werden je Experiment und Fragestellung selbst hergestellte Chips verwendet. Dafür gibt es entsprechende Apparaturen, die ein Überführen der isolierten Substanzen auf den Objektträger ermöglichen (spotten). Als Matrix dienen beschichtete Glasobjektträger (silanisiert, lysinisiert). Im diagnostischen Labor bedient man sich industriell hergestellter Chips. Bei der Produktion unterscheidet man die On-ChipSynthese von Oligonukleotiden (mithilfe photolithografischer Masken bzw. Verfahren, wo Basenbausteine mittels Inkjet-Applikators auf die Spots gespritzt werden) und die Deponierung von vorgefertigter DNA auf K ontakt-Spotting, Inkjet oder Piezodem Microarray (K Dispenser).

Die Spotgröße und das Auflösungsvermögen des Detektionssystems müssen aufeinander abgestimmt sein. Zur Visualisierung der Interaktionen verwendet man Ag-AK-Reaktionen mit markierten Antikörpern bzw. direkt markierte Bindungspartner (Fluoreszenz, Radioaktivität, Chemilumineszenz, Quantumdots). Moderne Systeme arbeiten mit der unterschiedlichen optischen Aktivität eines einzelnen Bindungspartners bzw. der gekoppelten Bindungspartner nach erfolgter Reaktion auf einer Goldoberfläche (Oberflächenplasmonen-Fluoreszenzspektroskopie). Zur Detektion benötigt man optische Systeme, die eine Anregungswellenlänge erzeugen und gefiltert durch den Chip leiten. Die vom Chip emittierten Signale werden aufgefangen (CCD-Spezialkamera oder Lasertechnik) und in digitale Werte übersetzt. Das gesamte System bezeichnet man als M icroarray-Scanner. Um diese Informationsfülle aufgrund der Unzahl an Interaktionen zu verarbeiten, braucht man entsprechende Computersoftware. Das Programm muss die Art und Position des Spots mit Abb.183 Signalauswertung dem Reaktionsergebnis korrelieren. Kommen unter-schiedlich markierte Sonden zum Einsatz, müssen die Einzelbilder rechnerisch übereinander gelegt werden (z.B. bei ExpressionsExperimenten, Comparativer Genomaustestung). Der Rechner stellt die Ergebnisse in einer verständlicheren Form dar. Die Intensitätsdaten werden in Falschfarben (rot und grün) oder bspw. als „Heat-Map“ dargestellt. Zusätzlich optimiert die Software die eintreffenden Signale, um ein ideales Signal- Rausch-Verhältnis zu bekommen. (Abb.183) Zur Austestung der Genexpression wird überprüft, welches Gen (unter welchen Bedingungen) an- bzw. ausgeschaltet ist. Angeschaltete Gene erkennt man am Vorhandensein ihres mRNA-Transkripts im Cytoplasma. Deshalb wird die mRNA nach Zelllyse gewonnen und als Vorlage für eine copyDNA genommen. Dazu benötigt man die Aktivität der Reversen Transkriptase. Beim Kopiervorgang werden Marker (Fluorochrome) eingebaut. Die mRNA wird im Anschluss abgebaut. Die markierte, einzelsträngige cDNA bleibt übrig und wird im Hybridisierungsschritt den auf dem Array vorhandenen

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Histotechnik

Oligonukleotiden angeboten. Die homologen Sequenzen binden aneinander, ungebundene DNA wird weggewaschen. Danach erfolgt die Detektion. (Abb.184)

Abb. 184 Ausschnitt aus einem DNA-Microarray mit gleichzeitiger m-RNA-Hybridisierung unterschiedlicher Quellen mit verschiedenen Fluorochromen markiert. Die Bilder werden unabhängig ausgewertet und anschließend die Expressionsrate ermittelt.

Eine andere Variante amplifiziert die gewonnene mRNA durch PCR. Dann wird sie markiert (chemisches Anhängen eines Farbstoffes / Einbauen von markierten Nukleotiden). Die RNA wird am Chip hybridisiert, die Reaktion detektiert. Die Hybridisierung dauert mehrere Stunden (5–12 Std.). Zur Genomaustestung wird die gewonnene DNA mittels Nukleasen zufallsbedingt in kleinere Stücke zerteilt und/oder durch Random-priming amplifiziert und markiert. Die doppelsträngige DNA muss vor der Hybridisierung noch denaturiert werden. Biochip:

Zusammenfassender Begriff für alle Array-Typen (DNA-, Protein-)

Microarray:

Spotgröße kleiner als 250 µm

Macroarray:

Spotgröße größer als 300 µm

Proben-DNA:

an Oberfläche immobilisierte DNA (Oligonukleotide)

Target-DNA:

die zu untersuchende markierte cDNA, die identifiziert werden soll

Genom-Chip:

das gesamte Genom einer Spezies kann mithilfe eines einzelnen Chips analysiert werden

Genomics:

Studie der Genregulation

Proteomics:

Studie der Zellproteine

Transcriptomics:

Studie der mRNA-Expression

H. Begriffe Die Begriffserklärungen wurden hauptsächlich dem Glossar der Website: Das Biotech/Lifesciences Portal Baden Württemberg entnommen. (www.bio-pro.de/de/glossar/index.html) Annealing Komplementäre, einzelsträngige DNA verbindet sich zum Doppelstrang = Renaturierung Basentriplett (= Codon) Die Abfolge dreier Basen codiert die Synthese einer Aminosäure.

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in situ Hybridisierung

cDNA complementary/copy DNA. DNA, die mit Hilfe eines viralen Enzyms (Reverse Transkriptase) nach Vorlage einer mRNA synthetisiert wird. Diese DNA ist zur ursprünglichen mRNA komplementär. Denaturierung Doppelsträngige DNA wird in Einzelstränge aufgetrennt, durch Einwirkung von hoher Temperatur und Lösungsmittel. DNA-Polymerase Enzym, das die Synthese von DNA nach einer DNA-Vorlage katalysiert (z.B. bei der Replikation). Wird vielfach in der Gentechnik zur In-vitro-Synthese von DNA-Stücken verwendet. Expressivität Art und Ausmaß der phänotypischen Ausprägung eines Gens; bezeichnet das Phänomen, dass Anlageträger unterschiedlich starke klinische Symptome aufweisen. Genexpression Ausbildung der in einem Gen festgelegten Eigenschaft zur Umsetzung der genetischen Information in Proteine. Sie erfolgt in der Regel als Transkription von DNA zu mRNA und anschließender Translation von mRNA zu Protein. Genom Gesamtheit aller im Zellkern vorhandenen Chromosomen, alle DNA-Sequenzen eines Individuums oder im weiteren Sinn einer Spezies. Gensonde DNA- oder RNA-Sequenz, welche spezifisch markiert ist (z.B. radioaktiv) und an komplementäre Nukleinsäuresequenzen bindet. Aufgrund der Markierung ist eine Identifizierung der erkannten Sequenzen möglich. Hybridisierung Zusammenlagerung einzelsträngiger Nukleinsäuremoleküle (z.B. DNA-RNA) über Wasserstoffbrücken zwischen den komplementären Basen. Interphase der Zeitabschnitt zwischen zwei Mitosen im Zellzyklus. Der Zellkern zeigt während der Interphase intensive Stoffwechselleistung und Synthesearbeit („Arbeitskern“). Im HE-Schnitt zeigt sich das typische Heterochromatinmuster. Messenger-RNA mRNA; Ribonukleinsäure, die von einer DNA transkribiert wird und Codons für die Aminosäuresequenz eines Proteins enthält.

Histotechnik

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Metaphase das mittlere, auf die Prophase folgende Stadium der Mitose und der Meiose, in dem die Chromosomen maximal spiralisiert und in der Mitte zwischen beiden Polen des sich bildenden Spindelapparates zu einer Sternform („Monaster“) angeordnet sind (Chromatiden bzw. Chromosomen noch nicht getrennt). (Abb.185)

Abb.185

Nick Durch DNase erzeugtes Einzelstrangbruchstück der DNA. Nuklease Nukleinsäurespaltendes Enzym. Man unterscheidet Endo- und Exonukleasen, DNasen und RNasen. Nukleotide Bausteine der Nukleinsäuren. Sie setzen sich aus einer Base, einem Zuckerrest und drei Phosphatgruppen zusammen. Bei der DNA- bzw. RNA-Synthese werden Nukleotide miteinander über eine Phosphordiesterbindung verknüpft. Dabei werden zwei Phosphatgruppen abgespalten. Oligonukleotid Nukleinsäure, bestehend aus wenigen Nukleotiden Plasmid Extrachromosomales, ringförmiges DNA-Molekül, das bei Bakterien und Hefen vorkommt und sich unabhängig vom Hauptchromosom vermehren kann. Häufig tragen Plasmide Gene für Resistenzfaktoren (z.B. gegen Antibiotika), die den Trägern einen Selektionsvorteil vermitteln. Wenn die Gegenwart eines Plasmids für ein Bakterium keinen Überlebensvorteil bietet, dann verliert es dieses mit der Zeit. Plasmide mit Transfergenen können von einem Bakterium auf ein anderes übertragen werden. Promotor Startsignal der Transkription auf einem Gen Primer Die Synthese von Makromolekülen (z.B. Glykogen) anregende „Starter“-Moleküle, z.B. Präkursoren (die in das Endprodukt eingehen). Auch Oligonukleotide bei der PCR. Rekombinante DNA Experimentell verknüpfte DNA (z.B. Plasmid-DNA und neu zu exprimierende DNA aus einem anderen Organismus). Reverse Transkriptase Polymerase, die mit RNA als Vorlage die komplementäre DNA synthetisiert; wird in der Gentechnologie zur Herstellung von cDNA aus RNA benutzt. Ursprünglich aus Retroviren isoliert.

318

in situ Hybridisierung

Satellit Ein endständig mit dem proximalen Teil eines Chromosomenarmes über eine Einschnürung (Nucleolarkonstriktion) verbundenes Chromosomensegment. Sequenzierung a.

DNA-Sequenzierung: Methode zur Entschlüsselung der Erbinformation durch Ermittlung der Basenabfolge.

b. Protein-Sequenzierung: Methode zur Ermittlung der Aminosäurenabfolge. Transkription Synthese eines einzelsträngigen RNA-Moleküls (mRNA) nach der Vorlage der doppelsträngigen DNA (= Umschreibung von DNA in RNA). Translation Prozess, bei dem die Basensequenz der mRNA in die Aminosäuresequenz des Proteins übersetzt (translatiert) wird. Dieser Vorgang findet an den Ribosomen statt. Nach der Vorlage eines einzigen mRNA-Moleküls können zahlreiche Proteinmoleküle synthetisiert werde Vektor DNA-Vehikel, das sich in einer Zelle autonom replizieren kann (Replikation) und mit dessen Hilfe Fremd-DNA in eine Zelle eingeschleust wird. Vektoren (Plasmid, Phage oder Virus) sind wichtige Werkzeuge der Gentechnik zum Klonieren rekombinanter DNA.

Histotechnik

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Zellkultur A. Technik ..........................................................................................................320 1. Kulturgefäße ...........................................................................................321 2. Kulturmedien ..........................................................................................322 3. Methoden ...............................................................................................323 3.1. Gewinnung von Primärkulturen ....................................................323 3.2. Mediumwechsel............................................................................324 3.3. Subkultivierung / Passagieren ......................................................324 3.4. Zellzahlbestimmung......................................................................325 3.5. Kryokonservierung........................................................................326 3.6. Vitalfärbung zur Testung auf Lebensfähgikeit von Zellen .............326 3.7. Zellsynchronisation .......................................................................327 3.8. Klonieren ......................................................................................327 3.9. Massenkultur ................................................................................327 B. Anwendungsbeispiele ...................................................................................328 1. Toxizitätstest...........................................................................................328 2. Virusnachweis .........................................................................................329 3. Chromosomenpräparation .....................................................................330 C. Gewebe- und Organkulturen ........................................................................330 D. Begriffe..........................................................................................................331

320

Zellkultur

Zellkultur Unter Zellkultur versteht man das Anzüchten und Vermehren von lebenden Zellen unter sterilen Bedingungen in Nährmedien. Die Primärzellen stammen aus Einzelzellen bzw. aus Zellverbänden und vermehren sich über Mitose. Das Kultivieren von lebenden Zellen geht über die Aufgaben des klinischen Histolabors natürlich hinaus. Es kommt allerdings vor, dass Material von eingesandten Proben für weitere Untersuchungen in Zellkultur asserviert werden muss. Wie früher schon beschrieben, befindet sich Gewebe, das dem versorgenden Organismus entnommen wurde, in einem sofort einsetzenden Absterbeprozess. Um hier lebens- und vermehrungsfähige Zellen zu erhalten, muss man sie in eine geeignete Umgebung bringen, die den osmotischen Veränderungen entgegenwirkt, die Zellen versorgt und ihre Abfallprodukte neutralisiert. In solchen Transportmedien können die Proben wenige Stunden bei 4°C bis zur Weiterverarbeitung verbleiben. Idealerweise werden sie sofort verarbeitet. Beispiele für die Kultivierung von menschlichen Zellen sind Kulturen • • • • •

von durch Amniozentese gewonnene Zellen (pränatale Zytogenetik) von embryonalen Zellen (in-vitro-Fertilisation) von hämatopoetischen Stammzellen (Leukämietherapie) von Endothelzellen, Keratinozyten (Hauttransplantate) Die Gewinnung von Kulturen aus soliden Tumoren gelingt nur teilweise. (Grundlagenforschung, Cytostatikaempfindlichkeit,..)

Zellkulturen sind großteils tierischen Ursprungs (Hamster, Maus) und dienen als Untersuchungsmaterial für verschiedene Fragestellungen bzw. als Produktionsmittel für die Gewinnung von bestimmten Substanzen (z.B. monoklonale Antikörper, Insulin, Interferon). Sogenannte etablierte oder kontinuierliche Zelllinien mit definierten Eigenschaften können dabei aus „Zellbanken“ bezogen werden. • • • • • • • •

Virennachweis, Virenzüchtung Toxizitätstests Nachweis kancerogener und mutagener Substanzen Genetische Untersuchungen (Chromosomenpräparate, Transfektion, Klonierung) Produktion von Antikörpern, Medikamenten,.. Wirkungsnachweis von Substanzen (z.B. Diuretika an Nierenzellen) Grundlagenforschung Tissue engineering

A. Technik Um die Zellkulturen vor Kontamination mit vermehrungsfähigen Mikroorganismen und im weiteren auch mit Viren zu bewahren, sind besondere Vorsichtsmaßnahmen bei der Verarbeitung notwendig. Dazu gehört das Abtrennen geeigneter Arbeitsbereiche mit gefilterter Reinluft und positivem Innen-Luftdruck. Als Arbeitsplatz wird eine Reinraumwerkbank benötigt, die einerseits die Proben vor Kontamination, andererseits die Mitarbeiter vor Infektion schützt. Je nach Zielsetzung des Labors werden hier verschiedene Anforderungen gestellt (Klassifizierung biologischer Agenzien von harmlos bis höchst gefährdend in die Klassen 1–4).

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Histotechnik

Die Gefahr der Kontamination von Zellkulturen liegt darin, dass die Kulturmedien sehr gute Nährböden darstellen und die Keimvermehrung fördern. Dabei werden Nährstoffe verbraucht und schädigende Stoffwechselprodukte angereichert, was zum schnellen Absterben der Zellen führen kann. Dem wirkt einerseits die sterile Arbeitstechnik, andererseits der Zusatz von Antibiotika zum Nährmedium entgegen. Die Sterilität der Kultur muss dementsprechend ausgetestet und laufend kontrolliert werden (primär mikroskopisch). 1.

Kulturgefäße

Die Zellen werden hauptsächlich auf Unterlagen aus Glas, Metall oder Kunststoff gezüchtet. In Suspension gezüchtete Kulturen sind für tierische Zellen eher selten. Die Oberflächen der Kulturgefäße werden auf die zu kultivierende Zelllinie abgestimmt. Es kommen unterschiedliche Beschichtungen zum Einsatz, die das Wachstum und Anhaften fördern. Zelloberflächen zeigen im physiologischen pH-Bereich hauptsächlich negative Ladung. Die Beschichtungen bringen positive Ladungen auf den Untergrund (Bsp.: Polylysin, Kollagen, Fibronectin, Gelatine, fetales Kälberserum) und können gleichzeitig eine Auslese bestimmter Zellen bewirken. Durch bivalente Kationen (Kalzium, Magnesium) im Medium kann eine Brückenverbindung zur unbehandelten Glasoberfläche geschaffen werden. Als Kulturgefäße sind Kunststoffbehälter in vielen Formen sehr verbreitet. Sie werden vom Hersteller steril und gebrauchsfertig geliefert und sind meist Einmalartikel. Gefäße aus Glas unterliegen ebenfalls gewissen Qualitätsanforderungen und müssen vorbehandelt und beschichtet werden (Borsilikatglas, säurebehandelt, silikonisiert). Wieder verwendbare Materialien müssen penibel gereinigt und dekontaminiert werden. Beispiele für Kulturgefäßformen: •

Petrischalen

•

Röhrchen

•

Kulturflaschen, abgeflacht, mit schräg gestelltem Hals, stapelbar (Abb. 186)

•

Rollerkulturflaschen

•

Massenkulturgefäße (Wannenstapel, Microcarrier, Hohlfasermodule, Festbettreaktor)

•

Multischalen

•

Mikrotiterplatten

•

Objektträger in Kombination mit speziellen Kulturaufsätzen

Ausschlaggebend für die Auswahl ist die Fläche für die Anzüchtung und damit die erwartete oder benötigte Zellzahl (Standardplastikflasche 75 cm2 für ca. 2x107 Zellen). Das Medienvolumen sollte bei allen Arten von Kulturgefäßen im Verhältnis zur Wachstumsfläche so gehalten werden, dass ein Gasaustausch an der Oberfläche stattfinden kann (günstiges Verhältnis von Fläche zu Volu-

Abb.186 Kulturflasche Fa. Nunc

322

Zellkultur

men 1:2 bis 1:6). Es gibt hier Systeme für einige Tausend Zellen bis zur Massenproduktion. Um einen Gasaustausch während der Anzüchtung möglich zu machen, sind die Gefäße mit membranbestückten Stopfen versehen bzw. werden die Drehverschlüsse nicht vollständig zugedreht. Die Kulturen werden in Brutschränken aufbewahrt, die eine bestimmte Umgebung gewährleisten. Es wird dabei z.B. für den richtigen CO2-Gehalt, die richtige Temperatur und Luftfeuchtigkeit gesorgt. 2.

Kulturmedien

Für die aus einem Organismus isolierten Zellen muss unter in-vitro-Bedingungen eine Umgebung geschaffen werden, die Proliferation, Wachstum und, wenn nötig, Differenzierung und Ausübung typischer Zellfunktionen erlaubt. Sie bewahrt die nötige Osmolalität (270–340 mOsmol/kg) und pH-Wert (7,2–7,4). Grundsätzlich wird das Mediumrezept nach den Anforderungen der zu kultivierenden Zellen gewählt. Zellen reagieren unterschiedlich auf die Zusammensetzungen der Medien. Im Umgang mit den Zellen muss der Experimentator auf ihre „Wünsche und Vorlieben“ eingehen. Andererseits wird durch die Wahl des Mediums z.B. die Ausbeute an Zellprodukten gesteigert, oder die Reingewinnung erleichtert. Es gibt eine große Anzahl an Rezepten, die in der Literatur nachgelesen werden können. Beispiele: •

Basalmedium Eagle (BMR) eignet sich für primäre Kulturen von Säugerzellen

•

Dulbeccos Modified Eagle Medien (DMEM) sind Standardmedien für Säugerzellen

•

Minimal Essential Medium (MEM) ist für ein großes Spektrum von Säugerzellen geeignet.

•

Williams Medium E ist für die Kultur von Leberepithelzellen entwickelt worden.

Kulturmedien enthalten: •

Essentielle Substanzen: nicht selbst synthetisierte Substanzen; Aminosäuren, Salze, Vitamine

•

Puffer:

NaHCO3, Glutamin, HEPES; zum Neutralisieren der Stoffwechselprodukte

•

Antibiotika:

optional; zur Unterdrückung von Keimwachstum

•

Serum:

enthält makromolekulare Substanzen; Wachstumsfaktoren, Hormone, Bindungsproteine, Anheftungsfaktoren, Aminosäuren, anorganische Salze, Spurenelemente, Puffersysteme

•

Zusätze:

z.B. für selektives Wachstum von Zellen, Phenolrot als pH-Indikator; Ersatzstoffe für Serumbestandteile bei serumfreien Medien

•

Reinstes Wasser:

gewonnen mittels Spezialharz-Systemen, UV-Bestrahlung, Ultrafiltration

Histotechnik

323

Nährmedien werden hergestellt aus: •

Gebrauchsfertigen Teillösungen

•

Konzentraten

•

Pulvermischungen

Bei der Entwicklung von Kulturmedien erkannte man die wachstumsfördernde Wirkung von Serum (Kälber-, Rinder-, Affen-, Hühnerserum). Der genaue Inhalt war und ist aber nicht bis ins Detail geklärt. Erst mit der Zeit fand man die Bedeutung von Wachstumsfaktoren, Hormonen, Morphogenen u.a. heraus. Die Seren sind biologischen Ursprungs, sehr komplex und nicht eindeutig zu definieren. Der Einfluss von unbekannten Antikörpern, Inhibitoren, Chargenschwankungen, ungewollten Selektionsursachen oder Infektionsquellen (Stichwort BSE) ist so nicht vorherzusagen. Um diesen Nachteilen aus dem Weg zu gehen, wird bei bestimmten Fragestellungen wie bpsw. bei der Erzeugung von Humanmedikamenten Serum durch definierte Zusätze ersetzt. Die Zusammensetzung der Kulturmedien muss genau dokumentiert werden und ihre Haltbarkeitsdauer darf nicht überschritten werden. Farbveränderungen und trübe Lösungen weisen auf falschen pH-Wert und Kontamination hin. 3.

Methoden

3.1. Gewinnung von Primärkulturen Unter Primärkultur versteht man das Anzüchten von Zellen, die direkt aus einem Organismus entnommen wurden. Für Organ- und Gewebekulturen muss die Struktur noch erhalten bleiben, für Zellkulturen ist eine v ollkommene Dissoziation notwendig. Die Dissoziation kann durch mechanische und enzymatische Einwirkung auf Gewebe erfolgen, bzw. man lässt Einzelzellen vom Gewebestück auf geeignetem Untergrund auswachsen. Normale Zellen benötigen immer ein Substrat zum Anwachsen, Tumorzellen wachsen in Suspension. Eine Ausnahme unter den Normalzellen stellen Blutzellen dar, die nur in Suspension wachsen. Die enzymatische Zellgewinnung ist die Methode der Wahl. Die Einwirkung verursacht jedoch auch Zellschädigung je nach verwendetem Enzym (Bsp.: Trypsin, Collagenase, Dispase, Pronase; Hyaluronidase und DNase als Komponente). •

Die Entnahme des Gewebes soll so aseptisch wie möglich erfolgen. Ist das nicht möglich, wird die Antibiotikakonzentration erhöht.

•

Verarbeitung erfolgt in der Reinraumwerkbank.

•

Das Gewebe wird möglichst fein geschnitten.

•

Die enzymatische Zerlegung des Gewebes erfolgt bei 37°C oder 4°C, zur Beendigung werden die Zellen abzentrifugiert und das Sediment gewaschen.

•

Die Zellkonzentration muss für Primärkulturen höher sein als für Subkulturen.

•

Nach der Inokulation wird mittels Vitalfärbung der Erfolg getestet.

•

Primärkulturen werden zu Beginn häufig beobachtet, um auf Veränderungen gleich zu reagieren (Mediumwechsel, Begasung, Antibiotika).

324

Zellkultur

Beispiel: Gewinnung von humanen Keratinozyten aus Spalthaut Die Hautproben werden in 1x2 cm große Stücke geschnitten, in einer Petrischale aufgelegt und über Nacht mit Dispase-Lösung inkubiert. Dadurch kommt es zu einem Ablösen der Epidermis (Spalthaut). Umgeben von Nährmedium wird die Epidermis vorsichtig abgezogen und in Trypsinlösung inkubiert. Nach Abstoppen der enzymatischen Reaktion die Zellen mit Medium aufnehmen, durch ein Netz passieren und zentrifugieren. Die Zellen zählen und in bestimmter Verdünnung in einem Kulturgefäß aussäen. (Abb.187)

Abb.187 Hautgewebe vor und nach der Diaspaseandauung: a. komplettes Hautgewebe; b. Epidermis; c. Dermis

Beispiel: Gewinnung einer Zellkultur aus soliden Humantumoren Die nicht nekrotische Tumorprobe sollte aseptisch gewonnen werden und sofort in ein bereitstehendes Transportmedium gegeben werden. Unter sterilen Bedingungen wird das Gewebe so klein wie möglich geschnitten und durch ein Netz passiert. Die Zellen werden mit Medium gefüttert, zentrifugiert und mit Medium gewaschen. Die Erythrozyten werden durch Puffer lysiert bzw. durch Gradienten-Zentrifugation entfernt. Die Tumorzellen werden wiederum gewaschen und in warmem Medium aufgenommen. Die Suspension wird auf eine bestimmte Verdünnung eingestellt und in einer Multischale ausgesät. Die Zellen wachsen nach 3-5 Tagen bzw. auch erst nach Wochen richtig aus. 3.2. Mediumwechsel Die Inhaltsstoffe des Kulturmediums werden mehr oder weniger schnell verbraucht oder werden bei der Bebrütungstemperatur 37°C abgebaut. Um die Versorgung der Zellen zu gewährleisten, muss das Kulturmedium regelmäßig ausgetauscht und erneuert werden. Dazu verwendet man vorzugsweise elektrische Pipettierhilfen. Bei der Handhabung in der Reinraumwerkbank muss Kontamination vermieden werden. Das Kulturmedium wird oberhalb des gewachsenen Zellrasens abgesaugt ohne ihn zu berühren. Bei Suspensionskulturen wird das Medium oberhalb der sedimentierten Zellen abgesaugt, bzw. wird neues Medium dem alten einfach zugefügt. Vor und nach dem Wechsel muss der Zustand der Zellen unter dem Phasenkontrastmikroskop kontrolliert werden. 3.3. Subkultivierung / Passagieren Nach Erreichen der Maximaldichte der Zellen, meist beim vollständigen Bewachsen der Oberfläche als M onolayer, teilen sich die Zellen nicht mehr. Es kommt zur kontaktinduzierten Wachstumshemmung. Gleichzeitig werden die Intervalle zwischen den Medienwechseln immer kürzer. Nach gewisser Zeit würden die Zellen absterben. Deshalb werden Zellen durch Passagieren in bestimmter Verdünnung in ein neues Kulturgefäß übergeführt. Dazu müssen die adhärenten Zellen vorerst von der Unterla-

325

Histotechnik

ge gelöst und in Suspension gebracht werden (Abklopfen, Andauen mit Trypsin, Abschaben). Die Zellzahl wird bestimmt und die Verdünnung eingestellt. Dann erfolgt das Einsäen in ein neues, meist durch adhärente Faktoren vorbehandeltes Gefäß. Man lässt die Kultur in Ruhe anwachsen und überprüft nach zwei oder drei Tagen Wachstum und Zelldichte. Zum Subkultivieren von Suspensionskulturen wird ein bestimmtes Volumen einfach in eine neue Kulturflasche überpipettiert. Die meisten Zelllinien sterben nach einer gewissen Anzahl an Passagen ab. Sogenannte kontinuierliche Zelllinien erhält man aus Zellkulturen, die mehr als siebzig Subkultivierungen überstanden haben. Die Subkulturen zeigen dabei nicht unbedingt dieselben Zelleigenschaften wie die Primärkultur und können auch untereinander differieren. Die Zelllinien können bei „Z Zellbanken“ tiefgefroren bezogen werden. Beispiele: •

MDCK Zelllinie: Die Epithelzelllinie stammt aus der Niere einer Cockerspanielhündin und wurde 1958 von Madin und Darbin in Kultur genommen.

•

HeLa-Zellen (humane Portiokarzinomzellen)

•

RPMI (humane, periphere Lymphozyten; von gesunden Probanden)

•

Verozellen (Affennierenfibroblasten)

•

CHO-Zellen (Chinese hamster ovary)

•

BHK-Zellen (Baby hamster kidney)

3.4. Zellzahlbestimmung Die Zellzählung ist routinemäßig vor jedem Überführen in ein neues Kulturgefäß vorzunehmen und zu protokollieren. Als Techniken stehen die manuelle und die automatisierte Methode zur Auswahl. Es werden dabei die vitalen Zellen gezählt. Dazu muss eine Vitalfärbung zur Differenzierung zwischen lebenden und abgestorbenen Zellen durchgeführt werden. Hämocytometer (Neubauer-Zählkammer Abb.188): Glasobjektträger mit Raster und Deckglas für ein definiertes Probenvolumen; ein Zählquadrat (dicker Rahmen) repräsentiert ein Volumen von 1 µl. Die Zählkammer wird mit der Zellsuspension gefüllt. Die Zählung erfolgt im Mikroskop und danach die Berechnung der Zellkonzentration pro Milliliter. Die Gesamtzellzahl ergibt sich aus dem Volumen der Zellsuspension mal der Zellzahl pro ml. Abb.188

Elektronische Zellzähler: Elektronische Zellzähler arbeiten nach dem Widerstandmessprinzip. Die Zellsuspension wird durch eine Kapillare in einem elektrischen Feld geleitet. Je nach Größe ändert sich die Leitfähigkeit am Durchtrittspunkt. Somit kann man die Anzahl aber auch die Größenverteilung darstellen. Die lebend/tot-Differenzierung beruht darauf, dass tote bzw. geschädigte Zellen mit defekter Zellmembran kleiner aufscheinen als vitale Zellen. Beim Zelltod wird die Zellmembran durchgängig. Tote Zellen werden in der Größe ihres Zellkerns dargestellt. Durchflusscytometrie: Durchflusscytometer werden nicht nur zur einfachen Zellzählung eingesetzt, sondern für vielfältige Anwendungen in der biomedizinischen For-

326

Zellkultur

schung. Mithilfe dieser Geräte werden nicht nur quantitative sondern auch qualitative Messungen durchgeführt. Beispiele dafür sind: Zellkinetikmessungen zur Tumortypisierung, DNA-Messungen, Messen und Sortieren von Chromosomen, Oberflächenbindungen, Proliferationsstadien uvm. Fluorescence activated Cell Sorter FACS: Das Messprinzip beruht auf der Methode der hydrodynamischen Fokussierung, d.h. die mit einem spezifischen Fluoreszenzfarbstoff angefärbten Partikel werden kontinuierlich hintereinander an einer Lichtquelle vorbeigeführt. Durch Pressluft gelangen die in Suspension vereinzelt und gefärbt vorliegenden Partikel in eine Kapillare, aus der sie in die Probenkammer geschleust werden. Ein Hüllstrom aus entgastem Wasser erzeugt in dieser Kapillare mit dem Probenstrom eine laminare Strömung, mit der die Partikel zentriert und mit hoher Geschwindigkeit auf die Messstelle zugeführt werden. Auf diese Weise wird jeder Partikel einzeln durch die optimale Fokussierungsebene des Objektivs geleitet. (Abb.189) Das durch Laser angeregte Fluoreszenzsignal wird auf einem Detektor aufgenommen und digital umgesetzt. Daraus wird mittels Software ein Diagramm ausgewertet, das bspw. Größe und Menge der Teilchen (Zellen) aufzeigt. Die Ablenkung der Zellen je nach Ladungsstärke in einem elektrischen Feld, wird zum Sortieren und Aufteilen von Zellen genutzt (bspw. zum Klonieren von Kulturen aus einer einzelnen Zelle).

Abb.189 Prinzip FACS

Das Einbringen der Fluorochrome passiert z.B. durch in DNA interkalierende Farbstoffe (Propidiumiodid), durch Einbau von Bromdesoxyuridin in DNA oder durch AntigenAntikörper-Reaktionen mit Fluoreszenz markierten Antikörpern. 3.5. Kryokonservierung Das am Leben Erhalten von Zellkulturen ist mit großem Aufwand verbunden. Günstiger ist es zur Bewahrung von Zelllinien, sie auf –196°C einzufrieren. Als Schutzsubstanzen dienen Glycerin und Dimethylsulfoxid (DMSO). Der Zellsuspension wird dabei Einfriermedium zugegeben. Man lässt das Einfriermedium in die Zellen bei Kühlschranktemperatur eindringen und friert dann schrittweise über –20°C, Gasphase von Stickstoff und flüssigem Stickstoff ein. Kulturen können auch direkt in der Kulturflasche für kürzere Zeit eingefroren werden. Dazu wird das Kulturmedium durch Einfriermedium ersetzt. 3.6. Vitalfärbung zur Testung auf Lebensfähigkeit von Zellen Die Differenzierung zwischen lebenden und toten Zellen beruht auf einer unterschiedlichen Affinität zu bestimmten Farbstoffen. Der Farbstoff dringt in tote, permeabilisierte Zellen ein, in lebende nicht, was unter dem Mikroskop beurteilt werden kann. Eine andere Methode basiert auf der Aufnahme eines Farbstoffs in lebende Zellen, der dann im Zellinneren in ein Fluorochrom metabolisiert wird.

Histotechnik

327

Der am weitest verbreitete Test ist der Trypanblaufärbetest. Die vorgewärmte Trypanblaulösung wird einer Zellsuspension zugegeben und vorsichtig vermischt. Nach einer Inkubationszeit von 2–5 min, wird die Suspension in eine Neubauer-Zählkammer pipettiert. Die Zählung muss sofort erfolgen. Lebende Zellen dürfen nicht angefärbt sein, während tote Zellen durchgängig blau angefärbt sind. Der Farbstoff ist cytotoxisch, sodass nach längerer Inkubationszeit eine Zunahme der toten Zellen zu beobachten ist. 3.7. Zellsynchronisation Für manche Untersuchungen wird eine Anzahl von Zellen benötigt, die sich gerade im selben Abschnitt des Zellzyklus befinden. Zellen im selben Rhythmus laufen sozusagen „synchron“. Man kann dazu synchrone Zellen aus der Population isolieren und sortieren. Oder man bedient sich chemischer oder physiologischer Methoden, die in den Zellstoffwechsel eingreifen. •

Abkühlung während der logarithmischen Wachstumsphase auf 4°C und nachfolgende Erwärmung.

•

Zellen in der Mitose haften schlechter auf der Unterlage als andere, lassen sich durch Schütteln in Suspension bringen und gewinnen.

•

Colcemid blockiert die Zellen reversibel in der Metaphase.

•

Serumentzug führt zu einem Verharren der Zellen in der G1-Phase.

•

Isoleucinmangel erhält die Zellen in der G0-G1-Phase.

3.8. Klonieren Für verschiedene Fragestellungen ist es wichtig, Zellpopulationen zu erhalten, die aus einer einzelnen Zelle entstanden sind (Klon). Eine elegante Methode ist die automatisierte mittels elektronischen Zellsortierers (FACS, Fluorescence activated cell sorter). Händisch wird kloniert, indem eine Zellsuspension in bestimmter Verdünnung auf einer Mikrotiterplatte verteilt wird. Weiters wird mikroskopisch geprüft, wie viele Zellen in den einzelnen Vertiefungen liegen. Jene Zellpopulationen, die aus einer einzelnen Zelle entstehen, werden nach einer Vermehrungsphase entnommen, die anderen verworfen. Die Gewinnung von adhärenten Zellklonen ist schwieriger. Dazu wird bspw. ein mit Trypsin getränktes Filterpapierchen auf eine Zellgruppe gelegt, die von einer einzelnen Zelle abstammt. Die Zellen haften dann auf dem Filterpapier und werden in ein anderes Kulturgefäß übergeführt. 3.9. Massenkultur Für die Gewinnung sehr großer Zellmengen (Biomasse) oder einer großen Menge an Zellprodukten gibt es verschiedene Systeme für adhärente oder suspendierte Zellen. Für adhärent wachsende Zellen ist die erreichte Oberfläche ausschlaggebend, wobei der Arbeitsaufwand an der Zellkultur und der Mediumbedarf gering gehalten werden sollen.

328

Zellkultur

Rollerflasche: bis zu 2000 cm2 Oberfläche; Die Flaschen werden ständig rotiert. Das Kulturmedium bedeckt dabei rhythmisch die jeweils unten befindlichen Zellen. Es erfolgt eine verbesserte Umströmung und Begasung der Zellen. Wannenstapel: insgesamt 6000 cm2; Kulturschalen sind übereinander gestapelt und verschweißt. Zum Medienwechsel und zur Zellernte sind die Schalen über Öffnungen miteinander verbunden. Kapillarreaktor: In den Hohlfasern dieser Einheit fließt das Nährmedium, die Zellen wachsen dazwischen und erhalten die Nährstoffe durch Diffusion. Die Begasung erfolgt durch Silikonschläuche. Die Kultur kann wochenlang gehalten werden. Hier wachsen adhärente Zellen und auch Zellen in Suspension. Microcarrier-Kultur: Die Zellen haften auf Kunststoffkügelchen (40–300µm) und werden durch Rühren in Suspension gehalten. Die Kulturen werden z.B. in sogenannten Spinner-Flaschen gehalten. Darin befindet sich ein Rührstab, der das Medium ständig in Bewegung hält. Festbettreaktor: für industrielle Produktion

B. Anwendungsbeispiele 1.

Toxizitätstest

Lässt sich die toxische Wirkung von Substanzen auf Zellen und isolierte Gewebe in vitro beobachten, kann man dadurch die Anzahl an Tierversuchen verringern, die bei der Entwicklung neuer Wirkstoffe notwendig sind. Andererseits unterstützen Toxizitätstests die Erforschung von Wirkungsmechanismen giftiger Substanzen. Solche Tests müssen den Vorschriften und Normen der Arzneimittelgesetze entsprechen. Nachdem im Organismus verschiedenste Wechselwirkungen zum Tragen kommen, wäre eine Gewebekultur, die dem in-vivo-Zustand nahe kommt, zur Untersuchung anzustreben. Solche Systeme sind allerdings schwer über einen größeren Zeitraum stabil zu halten. Als Untersuchungsbasis dient z.B.: •

acht bis zehn Tage vorbebrütetes Hühnerei

•

Hautgewebe von Versuch- bzw. Schlachttieren

•

Rinderaugen von Schlachttieren

•

Gewebeschnitte (z.B. Hirnschnitte, Leberschnitte)

•

histio- bzw. organotypische Zellkultur (dreidimensional)

•

Monolayerkulturen von adhärenten Zellen (z.B. Maus-, Humanfibroblasten)

Für Studien sind lineare Beziehungen zwischen Ursache und Wirkung, d.h. zwischen Toxizität und Zellzahl notwendig. Es soll ein reproduzierbares Ergebnis erhalten werden bezogen auf die Konzentration der zu prüfenden Substanz, die Dauer der Exposition und der Erholungsphase nach der Applikation und die Quantifizierung der verursachten Schäden.

Histotechnik

329

Prüfung der Zellschäden: •

Ausschlussmethode aufgrund der Aufnahme von Farbstoffen (Trypanblau) in tote Zellen

•

Aufnahme von ungeladenen Farbstoffmolekülen (Neutralrot) in lebende Zellen und pH-Wert abhängige Farbstoffentwicklung bei der Einlagerung in intakte Lysosome

•

pH-Wert Änderung des Mediums (Farbumschlag von Phenolrot, Biosensoren)

•

Aufnahme von Fluoresceindiacetat in lebende Zellen, Fluorescein entsteht bei der Membranpasssage; kombiniert mit Ethidiumbromid-Aufnahme in tote Zellen (lebend = grün, tot = rot)

•

Enzymfreisetzung nach Schädigung der Zellen

•

Ablösungstest; geschädigte Zellen lösen sich leichter vom Untergrund

•

Immunologische Proliferationsnachweise: spezielle Antikörper erkennen proliferierende Zellen

•

MTT-Test: ein Tetrazoliumsalz wird durch Enzymwirkung von intakten Mitochondrien blau. Der Farbstoff lässt sich extrahieren und photometrisch bestimmen.

•

Wachstumshemmung durch Substanz, Prüfung durch Zellzahlbestimmung

Der Nachweis mutagener Substanzen erfolgt an dafür geeigneten Säugerzelllinien (Maus, Hamster). Es erfolgt ein vergleichender Ansatz einer Zellkultur mit und einer ohne zu prüfender Substanz. Die Mutationen sind mit Resistenzen gegenüber bestimmten Mitteln verknüpft, wodurch die Mutanten die Behandlung überleben und gezählt werden können. 2.

Virusnachweis

Die Virusisolierung dient dem Infektiösitäts- und Pathogenitätsnachweis. Sie gilt meist als langsame aber sensitive Methode, bleibt allerdings Speziallaboratorien vorbehalten. Für die Isolierung vieler Viren stehen semipermanente (z.B. humane Lungen- oder Vorhautfibroblasten) und permanente Zelllinien (immortalisierte Karzinomzellen) zur Verfügung. Die Zelllinien wachsen als Monolayerkulturen in Flaschen. Abhängig von Virus- und Zellart führt eine Infektion zur Ausbildung eines cytopathischen Effekts (CPE): lichtmikroskopisch sichtbare, morphologische Veränderung der Zellen. Z.B. Abrundung und Ablösung der Zellen aus dem Verband, Synzytienbildung, Einschlusskörperchen, Riesenzellbildung. Das zu untersuchende klinische Material wird auf den Zellrasen aufgebracht und inkubiert. Die beimpfte Kultur wird an den folgenden Tagen regelmäßig lichtmikroskopisch auf morphologische Veränderungen hin kontrolliert. Das Auftreten eines lichtmikroskopisch sichtbaren CPE dauert mitunter 1–2 Wochen. Ist ein CPE aufgetreten, muss weitere Diagnostik durchgeführt werden: •

Virustypisierung mittels gepoolter Antiseren

•

Immunfluoreszenztests zum Nachweis

•

Molekularbiologischer Nachweis: PCR

330 3.

Zellkultur

Chromosomenpräparation

Siehe In situ Hybridisierung

C. Gewebe- und Organkulturen Gewebe besteht im Gegensatz zu einzelnen Zellen aus organisierten Verbänden von Zellen unterschiedlicher Art, die in Beziehung zueinander stehen. Bei der Gewebekultur möchte man die Funktion und Struktur möglichst lange aufrechterhalten. Dies ist sogar bei 250 µm dicken Gewebeschnitten in Kultur sehr schwierig. Es kommt bei längerer Kultivierung zum Auswandern, Auswachsen und Dedifferenzierung von Zellen aus dem Gewebeverband. Andererseits ist die komplexe Versorgung der Zellen vermindert und man spricht hier auch von einem verzögerten Zelltod während der Kulturphase. Die Wirkmechanismen, die den Erhalt von Struktur und Funktion von Gewebe ausmachen, werden noch erforscht. Man spricht hier von morphogenen Faktoren und Zytokinen, die die Zell- und Gewebeentwicklung steuern. Organkulturen in vitro stellen für Kurzzeitexperimente eine gute und gebräuchliche Methode dar, um bestimmte Aussagen in physiologischer, pharmakologischer und toxikologischer Hinsicht zu treffen. Organpräparate von Säugetieren kommen z.B. in der Pharmakologie zum Einsatz (Meerschweinchendarm). Es kommt bei der Organkultur darauf an, dass während der Kulturphase die Zelldifferenzierung, die Histoarchitektur sowie die Gesamtfunktion des jeweiligen Organs mit seinen einzelnen Geweben möglichst vollständig erhalten bleibt und, wenn möglich, weiter entwickelt wird. Dazu wird vorzugsweise embryonales, fötales oder neonatales Material verwendet. Gewebe in Kultur verhält sich aufgrund verschiedenster Faktoren meist anders als in vivo. Besonderes Interesse gilt der Entwicklung von Organkonstrukten aus Stammzellen. Unter dem Begriff Tissue engineering wird eine Vielzahl an Verfahren zusammengefasst, mit denen kultivierte Zellen, Gewebe oder sogar Organoide aufgebaut werden. Teils handelt es sich um funktionelle Strukturen, die als lebendes Implantatmaterial am Patienten dienen sollen, teils um Maschinen, die am Krankenbett arbeiten. Ein Ziel ist es Fremdtransplantationen von Organen, die zu Abstoßungsreaktionen führen können, zu vermeiden. Dazu werden patienteneigene Zellen entnommen, kultiviert und wieder eingesetzt. Beim Tissue engineering werden aus den kultivierten Zellen mithilfe von Biomatrizen Gewebekonstrukte erzeugt. Die Matrix muss dabei bioverträglich sein, und die Zellen zu der gewünschten Differenzierung und Funktion anregen. Optimal sind Matrizen, die sich im Anschluss wieder abbauen lassen (enzymatisch). Der Experimentator muss jene Bedingungen finden, die hier zum optimalen Ergebnis führen, und die Funktionalität auch auf Dauer erhalten. Beispiele für Therapien: •

Knochenmarktransplantation (Leukämie)

•

Keratinozytentransplantation (Verbrennung, Geschwüre): heile Keratinozyten werden gewonnen und in Kultur vermehrt, auf synthetischer, extrazellulärer Matrix gezüchtet; „Patches“ von kultivierten Zellen werden dann auf die zerstörten Hautpartien aufgebracht.

Histotechnik

331

•

Knorpelzelltransplantation: Chondrozyten werden gewonnen, in Kultur vermehrt und durch spezielle OP-Techniken in das geschädigte Gelenk gebracht.

•

Knorpelgewebeimplantation (Gelenkknorpelbeschädigung durch Rheuma, Brüche, Knochenkrebs): gewonnen Chondrozyten werden auf einer geeigneten Matrix (Scaffold) zu einem Bindegewebekonstrukt gezüchtet.

•

Organmodule (Überbrückung bis zur Organtransplantation, Leber, Niere), Forschungsstadium

Wünschenswert sind auch Organteile oder Gewebe, die die Fähigkeit zur Expression von Substanzen haben, die dem Patienten fehlen (z.B. Insulin, Dopamin). Leider verlieren die Implantate nach einer bestimmten Zeit ihre Funktionalität, bzw. es kommt zur Abstoßungsreaktion gegenüber der Biomatrix. Die Konstruktion von künstlichen Gefäßen gelingt schon erfolgreich und stellt in Zukunft große Einsatzmöglichkeiten dar. Die Erzeugung von Dialysegeräten auf biologischer Basis ist noch mit Schwierigkeiten konfrontiert. Dabei sollen kultivierte Leberoder Nierenzellen in einem System aus Hohlfaserkapillaren angesiedelt werden, die hier ihre blutreinigende Funktion aufnehmen. Stammzellen gelten als Quelle für Gewebekonstrukte. Ihr Einsatz erzeugt aber noch ungelöste ethische und zellbiologische Probleme. Stammzellen aus dem eigenen Nabelschnurblut hätten die Potenz, sich bei Bedarf in ein benötigtes Organ „verwandeln“ zu lassen. Es würde keine immunologische Abstoßungsreaktion zeigen. Stammzellen von anderen Personen oder genveränderten Tieren würden ähnliche Behandlungsprobleme wie bei Fremdtransplantaten zeigen.

D. Begriffe Adhärenz: Anhaftung von Zellen an einer Oberfläche. Cytophatischer Effekt (CPE): Zellzerstörung und Lyse Dichteabhängige Wachstumshemmung: Zellvermehrung nimmt mit zunehmender Zellzahl ab (Kontaktinhibition). Generationszahl: Anzahl der Populationsverdopplungen einer Kultur Generationszeit: Dauer zwischen zwei aufeinander folgenden Zellteilungen Hybridzellen: Zellen, die durch Verschmelzen von zwei verschiedenartigen Zellen entstanden sind. Hybridomzelle: eine fusionierte Zelle aus einer primär immunkompetenten Milzzelle und einer Myelomzelle. Klon: Population von Zellen, die sich von einer einzigen Zelle ableitet. Konfluenz: Adhärent wachsende Zellen schließen sich als Monolayer zusammen. Monolayer: Zellen wachsen in einer einlagigen Schicht Multilayer: Zellen wachsen in mehrlagigen bzw. unregelmäßigen Schichten

332

Zellkultur

Passage: hat die selbe Bedeutung wie Subkultur. Dabei werden Zellen von einem Kulturgefäß in ein anders überbracht und meist auch verdünnt. Populationsdichte: Zellzahl pro Fläche bzw. pro Volumen Primärkultur: die angezüchteten Zellen, Gewebe oder Organe stammen direkt aus einem Organismus. Sättigungsdichte: maximale Populationsdichte Strikt adhärente Zellen: benötigen unbedingt eine Unterlage um sich zu vermehren. Suspensionskulturen: Die Zellen befinden sich in einem flüssigen Medium und vermehren sich ohne Anhaften an eine Oberfläche. Zelllinie: eine Primärkultur nach der ersten Subkultivierung Zellstamm: Aus einer Primärkultur oder einer Zelllinie werden Zellen mit bestimmten Eigenschaften selektiert. In den Subkulturen sollen diese Eigenschaften erhalten bleiben.

Histotechnik

333

Mikrowellentechnik A. Mikrowellen-Physik ........................................................................................334 B. Faktoren der Energieaufnahme.....................................................................335 1. Resonanz des Körpers ............................................................................335 2. Leitfähigkeit des Materials......................................................................335 3. Dipolarität...............................................................................................335 4. Relaxationszeit ........................................................................................336 5. Erwärmung .............................................................................................336 6. Dielektrizitätskonstante...........................................................................336 7. Eindringtiefe ...........................................................................................336 C. Temperatursteigerung...................................................................................337 D. Mikrowellenherde..........................................................................................337 1. Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit Mikrowellenherden ................338 2. Leistungsregelung ..................................................................................338 3. Mikrowellenprozessor.............................................................................339 E. Praktisches Arbeiten mit Mikrowellen ...........................................................339 F. Anwendungen ...............................................................................................340 1. Stabilisierung von unfixiertem Gewebe durch Mikrowellen....................340 2. Mikrowellenunterstützte Fixierung mit Fixativen ....................................340 3. Mikrowellen zur Gewebeeinbettung mit Paraffin....................................341 4. Mikrowellen und Gefrierschnitte.............................................................342 5. Mikrowellen zur Entkalkung ....................................................................342 6. Mikrowellen und Färben.........................................................................343

334

Mikrowellentechnik

Mikrowellentechnik Die Mikrowellentechnologie ist ein Ableger der Radar-Forschung für Kriegszwecke. Das Magnetron wurde durch Albert Wallace Hull schon im Jahre 1921 als leistungsfähige Mikrowellensenderöhre entwickelt. Aber erst 1940 wurde es der Öffentlichkeit vorgestellt. Der Gebrauch von Mikrowellenherden in der Küche nahm ab den siebziger Jahren ausgehend von den Vereinigten Staaten stark zu. Ab den achtziger Jahren wurden erste Versuche mit dem Einsatz von Mikrowellen in der histologischen Technik unternommen, vorerst im Bereich der Fixierung mit handelsüblichen Haushaltsgeräten. Die Ergebnisse wurden mit einer gewissen Skepsis verfolgt. Engagierte Histotechniker trieben aber die Idee weiter und entwickelten gemeinsam mit Pharmafirmen entsprechende Mikrowellengeräte, die den Namen Laborgeräte verdienten (späte achtziger Jahre). Eine Antriebsfeder stellte der Wunsch nach Beschleunigung der langwierigen histologischen Verfahren da. Hier stellt aber die zu verarbeitende Menge an Gewebe eine beschränkende Größe dar (Routinetauglichkeit). Es liegen nun Mikrowellentechniken für die Fixierung, Einbettung, Entkalkung, Färbung, Immunhistologie etc. vor. In der Medizin findet man Mikrowellen in der Strahlentherapie zur gezielten Überhitzung von Tumoren aber auch z.B. in der Physiotherapie zur Wärmebehandlung. Die Akzeptanz der Mikrowellentechnik ist sehr unterschiedlich. Nach einem gewissen Boom blieb die Mehrzahl der histologischen Labors doch bei den traditionellen Methoden. Nicht zuletzt, weil das Arbeiten mit der Mikrowelle von vielen verschiedenen Umständen beeinflusst wird. Mittlerweile werden von der Industrie auch routinetaugliche Geräte zur Paraffineinbettung angeboten, die auf Mikrowellentechnik beruhen (siehe Einbettungsprozess).

A. Mikrowellen-Physik Mikrowellen werden durch ein sogenanntes Magnetron erzeugt. Am einfachsten lässt sich die Funktion eines Magnetrons mit der einer Pfeife vergleichen. Wenn in der Pfeife ein Luftstrom über eine scharfe Kante streicht, entsteht im Pfeifenkörper eine Schwingung.

Abb.190 Magnetron

Im Magnetron wird ausgehend von der Glühkathode ein Elektronenstrom erzeugt, der durch das Magnetfeld der beiden Ringmagnete in eine kreisförmige Bahn umgelenkt wird. Dabei streichen die Elektronen entlang der Schlitze in der Anode und regen Schwingungen in den Resonatorkammern an. (Abb.190)

335

Histotechnik

Kennzeichen von elektromagnetischen Wellen: •

Sie breiten sich im Vakuum mit Lichtgeschwindigkeit aus.

•

Magnetische und elektrische Felder stehen senkrecht aufeinander, und beide stehen senkrecht zur Ausbreitungsrichtung.

•

Mikrowellenimpulse können sehr kurz sein und deshalb für Entfernungs- und Zeitmessungen verwendet werden.

•

Sie breiten sich geradlinig aus und liefern klare Schatten und Reflexionen.

Ein breites Band wird durch das bekannte Spektrum von elektromagnetischen Wellen abgedeckt. z.B. Radiowellen, infrarote Wellen, UV-Licht, sichtbares Licht, Gammastrahlen. Die Mikrowellen liegen zwischen den Radiowellen und den Infrarotwellen. Als Mikrowellen bezeichnet man elektromagnetische Wellen mit einer Wellenlänge zwischen einer Frequenz von 300 MHz und 300 GHz. Die üblichen Mikrowellengeräte arbeiten mit einer Frequenz von 2,45 GHz, das entspricht einer Wellenlänge von 12,2 cm. Das Energieniveau von Mikrowellen ist um ein Vielfaches kleiner als bei ionisierender Strahlung, deshalb können sie keine Veränderung von chemischen Verbindungen verursachen. Sie haben nur soviel Energie, um Moleküle oder Molekülteile in Rotation zu bringen. (Abb.191)

Abb.191 Elektromagnetische Welle im Vakuum

B. Faktoren der Energieaufnahme 1.

Resonanz des Körpers

Abhängig von der Frequenz ergibt sich ein Absorbtionsmaximum bei einer bestimmten Körpergröße. Bei 2,45 GHz entspricht das ungefähr 6 cm Länge (etwa Küvettengröße). 2.

Leitfähigkeit des Materials

•

In ideale Leiter können elektromagnetische Wellen nicht eindringen.

•

In gute Leiter können elektromagnetische Wellen nur oberflächlich eindringen.

•

In dielektrisches Material (homogenes, nicht-leitendes Material) dringen elektromagnetische Wellen in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren bis zu einer gewissen Tiefe ein.

•

In idealen Nicht-Leitern bewegen sich elektromagnetische Wellen wie im Vakuum.

3.

Dipolarität

Bei den dielektrischen Medien unterscheidet man induzierte und permanente Dipolmoleküle. Induziert: In normalerweise neutralen Molekülen wandert die Elektronenwolke bei einem angelegten Spannungsfeld Richtung Pluspol (Kathode).

336

Mikrowellentechnik

Permanent: Das tritt bei asymmetrischen Molekülen auf, wo auch ohne Spannungsfeld einseitig mehr Elektronen gesammelt sind. Z.B. Wasser, Methanol. 4.

Relaxationszeit

Im elektrischen Feld versuchen sich die permanenten Dipole entsprechend der Ladung auszudrehen. Die für die Verbindung typische Zeit bis zur Anpassung nennt man Response- oder Relaxationszeit. Im Wechselspannungsfeld dreht sich das Dipolmolekül in seiner Relaxationszeit, beim Polwechsel rotiert das Dipol weiter. Für dieses Phänomen müssen Frequenz und Relaxationszeit zusammenpassen. Für Wassermoleküle funktioniert diese Rotation bei der Mikrowellenfrequenz. Wird die Frequenz erhöht, kommt es zu keiner Rotation und keiner Energieaufnahme mehr. Große, biologische Moleküle (viele Proteine) haben ein großes Dipolmoment und eine lange Relaxationszeit. Deshalb reagieren sie bei 2,45 GHz nicht mit Rotation. Kleinere biologische Moleküle reagieren ähnlich wie Wassermoleküle. 5.

Erwärmung

Die Rotationsbewegungen verursachen Molekülzusammenstöße und thermische Bewegung, was zur Erwärmung führt. In wässrigen Lösungen sind Proteine von einer Hydratationshülle umgeben, was für die Energieaufnahme eine Rolle spielt. Interessant ist in diesem Zusammenhang auch das Clustermodell, wo man annimmt, dass sich mehrere Wassermoleküle zu Gruppen zusammenschließen, die im Wechsel wieder aufbrechen und sich verbinden. Die Mikrowellenenergie könnte so auch einen Effekt auf die Denaturierung haben. Gelöste Ionen im Wasser gruppieren sich entsprechend ihrer Ladung um die Dipolenden. Es kommt dadurch zu mehr Kollisionen und einer schnelleren Erwärmung. 6.

Dielektrizitätskonstante

Die Dielektrizitätskonstante ist ein Maß für die relative Durchlässigkeit eines Materials. Diese ist bei flüssigem Wasser sehr hoch bei niedrigen Frequenzen (unterhalb von Mikrowellen). Steigt die Frequenz, nimmt die Durchlässigkeit ab. Im Mikrowellenfrequenzbereich ist die Durchlässigkeit sehr niedrig und dadurch die Energieaufnahme optimal. Das stellt die Grundlage für die Anwendung von Mikrowellenherden und auch für ihren Einsatz in der Histotechnik dar. Die 2,45 GHz-Mikrowellenfrequenz entspricht ca. einem Zehntel der Relaxationsfrequenz von Wasser. Bei einem idealen Zusammenpassen würden die elektromagnetischen Wellen nur oberflächlich wirken, was durch diese Verschiebung verhindert wird. 7.

Eindringtiefe

Die Eindringtiefe ist abhängig von der Absorbtionsfähigkeit, der Dielektrizitätskonstante und der Temperatur des Materials und der Frequenz. Sie liegt bei Gewebe (37°C) je nach Art bei 1–8 cm. Im Gegensatz dazu liegt die Eindringtiefe bei Metallen als gute Leiter im Mikrometerbereich. Deshalb eignen sich Metalle zum Abschirmen der Mikrowellengeräte, wobei an ihrer Oberfläche große Ströme auftreten.

Histotechnik

337

C. Temperatursteigerung Der Temperaturanstieg in homogenen Medien verläuft nicht gleichmäßig. Er ist von verschiedenen Faktoren abhängig. 1.

dem Strahlungsniveau: Bei niedriger Mikrowellenintensität nimmt die Energie beim Eindringen ab und tiefer liegende Strukturen werden weniger erwärmt.

2.

den dielektrischen Eigenschaften des Materials: Materialien haben sehr unterschiedliche Dielektrizitätskonstanten und Eindringtiefen.

3.

den thermischen Eigenschaften des Materials: Es ist hier zu beachten, wie sich die erzeugte Wärme im Körper verteilt (Wärmeleitung) und auch die Wärme an die Umgebung abgibt. Bei Flüssigkeiten kann man das durch Umrühren beeinflussen. Gleichzeitig werden auch die dielektrischen Eigenschaften durch die Temperaturveränderung beeinflusst. (Eindringtiefe in Wasser bei 1°C ist ca. 1 cm, bei 95°C ca. 9 cm)

4.

den anderen p hysikalischen Eigenschaften des Materials: z.B. die Verdampfung von Flüssigkeiten verbraucht viel Energie. Ein anderes Beispiel: Reines Eis absorbiert die Mikrowellenenergie weniger als flüssiges Wasser. Auch die G röße (Resonanzverhalten) und Orientierung in Bezug auf die Ausbreitungsrichtung des Feldes beeinflussen das Verhalten. So kann der heißeste Punkt innerhalb des Körpers liegen und nicht an der Oberfläche.

5.

Orientierung und Form von Grenzschichten im Objekt: Auch zu beachten ist der Aufbau des Körpers, innere Grenzflächen, Ausrichtung. Gewebe eines Typs ist als homogen zu betrachten. Befinden sich zwei homogene Materialien in der Mikrowellenbestrahlung, verhalten sie sich entsprechend ihren dielektrischen Eigenschaften und spezifischer Wärme und erwärmen sich unterschiedlich (z.B. Gewebe in Xylol) Spezifische Wärme bedeutet hier, dass einem Material mehr Energie zugeführt werden muss als einem anderen, um dieselbe Temperatur zu erreichen.

D. Mikrowellenherde Ein Mikrowellenherd besteht aus einer Kammer mit Metallwandung. Von einem Magnetron wird ein elektromagnetisches Feld mit 2,45 GHz und einer Wellenlänge von 12,2 cm (Vakuum und Luft) erzeugt. Die Energie der erzeugten Mikrowellen kann durch den Absorbtionsmechanismus im Füllgut in Wärme umgewandelt werden.