Handbuch Validierung in der Analytik

Stavros Kromidas

Handbuch Validierung in der Analytik

Handbuch Validierung in der Analytik Stavros Kromidas mit Beitragen von J. Ermer, K.-P. Gerbling, J. Hauswald, L. Huber, J. Kleiner, S. Kiippers, H.-J. Kuss, J. S. Morkowski, H.-S. Noack, W. Ockels, G. Papke, J. Peters, M. Rieth, R. Staal, M. Ulmschneider

@wI LEYVCH Weinheim . New York . Chichester . Brisbane . Singapore . Toronto

Dr. Stavros Kromidaa NOVIA GmbH Rosenstrak I6 661 25 Saarbrucken Das vorlicgcnde Werk wurde sorgfdtig erarbeitet. Dennoch ubernehmen Autor und Verlag fur die Richtigkcit von Angaben, Hinweisen und Ratschlagen sowie fur eventuelle Druckfehler keine Haltung.

1. Nachdruck 200 1 2. Nachdruck 2003 3 . Nachdruck 2008

Die Deutsche Bihliothek - CIP-Einheitsaufnahme Ein Titeldatensati f'ur diesc Publikation ist bei der Deutschen Bibliothek erhiiltlich. ISBN 978-3-527-2981 1-2

0WILEY-VCH Verlag GmbH, D-69169 Weinheim (Federal Republic of Germany), 2000 Gedruckt auf' saurelreiem Papier. Alle Rcchtc, insbesondere die der Ubersetzung in andere Sprachen, vorbehalten. Kein Teil diescs Buches darf ohne schriftliche Genehmigung des Verlages in irgendeiner Form - durch Photokopie, Mikroverfilmung oder irgendein anderes Verfahren - reproduziert oder in eine von Maschinen, insbesondere von Datenverarheitungsmaschinen, verwendbare Sprache ubertragen oder ubersetzt werden. Die Wiedergabe von Warenbezeichnungen, Handelsnamen oder sonstigen Kennzeichen in diesem Buch berechtigt nicht zu der Annahme, daR diese von jedermann frei benutzt werden durfen. Vielmehr kann es sich auch dann um eingetragene Warenzeichen oder sonstige gesetzlich geschiitzte Kennzeichen handeln, wenn sie nicht eigens als solche markiert sind. All rights reserved (including those of translation into other languages). No part of this book may be reproduced in any form by photoprinting, microfilm, or any other means - nor transmitted or translated into a machine language without written permission from the publishers. Registered names, trademarks, etc. used in this book, even when not specifically marked as such, are not to be considered unprotected by law. Satz: Text- und Software-Service Manuela Treindl, D-93059 Rcgensburg Druck: Strauss Offsetdruck, D-69509 Morlenbach Bindunp: GroBbuchhinderei J. Schaffer, D-67269 Gninstsdt Umschlagge\taltung: Wolfgang Scheftler, D-55 128 Mainz Printed i n the Federal Republic of Gennany.

Vorwort

Wenn man sich intensiv mit dem Thema ,,Validierung" beschaftigt, gerat man leicht in das Philosophische oder aber man diskutiert lange uber Kommastellen. Beides kann wichtig sein - solange das Eine nicht den Blick fur das Andere versperrt. Ich denke, das Hinterfragen von Allem und die klare Zielsetzung machen eine zeitgemaBe Validierung aus. Im vorliegenden Buch wird versucht, sich mit grundsatzlichen Fragen zur Validierung in der Analytik auseinanderzusetzen. Aber im gleichen MaBe geht es auch und vor allem um den Validierungsalltag. So haben wir uns bemuht, moglichst viele Praxisbeispiele, Anregungen und Vorschlage vorzustellen und zu diskutieren. Die Ausfuhrungen sollen Anregung und Hilfe sowohl fur den Praktiker vor Ort sein als auch fur den Planer uber das ,,wieviel" an Validierung. Das Ziel des Buches ist es, einen Beitrag fur eine zweckgerichtete, bezahlbare Validierung zu leisten. Mein Dank gilt den Kollegen, die ihr Wissen und ihre Erfahrung uber die Validierung in Spezialgebieten zur Verfugung gestellt haben. Cornelia Reinemuth, Peter Biel und Steffen Pauly von Wiley-VCH danke ich fur die stete Kooperationsbereitschaft und ihre Flexibilitat. Saarbrucken. Januar 2000

Stavros Kromidas

Verzeichnis der Autoren

Dr. Joachim E m e r Aventis Pharma Deutschland Global Pharmaceutical Development Analytical Sciences Gebaude H 790 Industriepark Hochst 65926 Frankfurt Tel: 069/305- 16574 Fax: 069/305-8392 1 Email: [email protected] Dr. Klaus-Peter Gerbling Schering AG Biological Quality Control 13342 Berlin Tel: 030/468- 12293 Fax: 030/468- I8034 Email: klauspeter.gerbling@ schering.de Joachim Hauswald Bayer AG Abteilung PH-OP-ELB-QW Gebaude 302 42096 Wuppertal-El berfeld Tel: 0202/36-7654 Fax: 0202/36/2633 Email: [email protected] Dr. Ludwig Huber Agilent Technologies Deutschland GmbH Produkt Marketing Hewlett-Packard-Str. 8 76337 Waldbronn Tel: 07243/602-209 Fax: 07243/602-50 1 Email: [email protected]

VIII

Verzeichnis der Autoren

Dr. Joachim Kleiner Perkin Elmer Verkauf und Service Abteilung Technische Schule Rengoldshauser Str. 11 88662 Uberlingen Tel: 075511919-132 Fax: 0755 11919-139 Email: [email protected]

Dr. Stavros Kromidas NOVIA Chromatographie und MeBverfahrens GmbH Rosenstr. 16 661 25 Saarbriicken Tel: 0489719754-0 Fax: 0689719754- 15 Email: [email protected] Dr. Stephan Kuppers Schering AG Abteilung InprozeB-Analytik 13342 Berlin Tel: 0301468- 17819 Fax: 030/468-978 19 Email: [email protected] Dr. Hans-Joachim Kuss

Psychiatrische Universitiitsklinik Neurochemische Abteilung NuBbaumstr. 7 80336Miinchen Tel: 08915 1602731 Fax: 08915 1605853 Email: [email protected] Janusz S. Morkowski Fohrliweg 8 CH-8600 Dubendorf Tel: 0041/1/8211466 Fax: 004 I 11/82 12207 Email: [email protected] ehemals EMPA (EidgenossischeMaterialpriifungs- und Forschungsanstalt),Leiter Qualitatswesen

Verzeichnis drr Autoren

Dr. Siegfried Noack BAM Bundesanstalt fur Materialforschung und -prufung Abteilung I13 Unter den Eichen 87 12205 Berlin Tel: 03018 104-4 I36 Fax: 030/8 104- 1 I 17 Email : s .noack @ bam .de Dr. Werner Ockels Spectral Service Laboratorium fur Auftragsanalytik GmbH Geschaftsleitung Vogelsanger Str. 250 50825 Koln Tel: 022 1/54 147 1 Fax: 0221/541921 Email: [email protected] Dr. Gunter Papke Hessisches Landesamt fur Umwelt und Geologie HLUG Abteilung Umweltanalytik Rheingaustr. 186 65203 Wiesbaden Tel: 061 116939-357 Fax: 061 1/6939-333 Email: [email protected] Dr. Jurgen Peters Schott Gerate GmbH Abteilung AG-Applikation Im Langgewann 5 657 19 Hofheim Tel: 06 I92/209 1- 168 Fax: 06 19212091-222 Email: [email protected]

Ix

Dr. Michael Rieth Merck KGaA Abteilung Pha Prod AL-QB Frankfurter Str. 250 64293 Darmstadt Tel: 06 15 I /72-4448 Fax: 06 1 5 1 /72-65 13 Email: michael .rieth (3merck.de Dipl.-lng. Rolf Staal Aventis Pharma AG Director Process Excellence Industrial Technologies Theodor-Heuss-Allee 2 60486 Frankfurt Tel: 069/305-7943 Fax: 069/305-83882 Email: [email protected] Dr. Michel Ulmschneider Hoffmann - La Roche AG Abteilung POBQ Bau 62, Biiro I25 CH-4070 Basel Tel: 004 I /6 1 /688-8700 Fax: 004 I /6 1/688-3006 Email: [email protected]

Zum Aufbau des Buches

Das Buch besteht aus vier Teilen. Teil A und B sowie der Anhang stellen die aktualisierte und teilweise erweiterte Version von ,,Validierung in der Analytik" dar, das im Juni 1999 im gleichen Verlag erschienen ist. Vor allem die Kapitel ,,Richtigkeit" (Abschnitt 3.4), ,,Linearitat" (Abschnitt 3.7) und ,,Haufige Fragen zur Validierung" (Kap. 4) sind stark erweitert worden. Teil A (Kromidas, Morkowski) umfal3t eine Einfuhrung in die Thematik, einen Schwerpunkt bilden formale Aspekte. Validierung und verwandte Begriffe werden definiert, anhand von Beispielen erlautert und kommentiert. AnschlieBend werden Methoden vorgestellt, wie ,,Validierung" prinzipiell angegangen werden kann. Dieser Teil ist allgemein gehalten, es geht hier um Grundsatzliches und um eine ganzheitliche Betrachtung. Im Teil B (Kromidas) werden wir uns mit der Praxis der Validierung beschaftigen: In den ersten Kapiteln werden die Themen ,,Voraussetzungen der Validierung", ,,Dokumentation" und ,,Qualifizierung von Geraten" behandelt. Die Validierungsparameter werden anschlieBend einzeln erlautert und deren Ermittlung im Detail beschrieben. Dazu werden zahlreiche Beispiele benutzt. Neben den Jdassischen" Validierungsparametem werden auch Aspekte, die erst in letzter Zeit in den Vordergrund rucken, ausfuhrlich besprochen: Methodenfahigkeit, MeBunsicherheit und erweiterte Unsicherheit. SchlieBlich wird auf haufige Fragen zur Validierung und auf typische Fehler eingegangen. Die Chromatographie als haufige analytische Methode wird immer wieder als Beispiel verwendet, um in diesem Teil die Validierungsparameter und den Gang einer Validierung zu erlautem. Teil C ist der Validierung in einzelnen Techniken bzw. in einem bestimmten Umfeld gewidmet. Der Leser findet hier z. T. sehr detaillierte Anweisungen zur Durchfuhrung sowie Hinweise auf Spezifika der Validierung in der Spektroskopie (Ockels), Emissionsspektralanalyse ICP-OES (Noack), Mikrobiologie (Rieth), Titrimetrie (Peters) und bei Computeranwendungen (Huber) sowie Chemometrie (Ulmschneider). Der spezielle Teil wird mit Vorschlagen fur die Validierungspraxis im behordlichen Umfeld und bei Normverfahren (Papke) sowie in der Pharma gemaB den ICH-Richtlinien (Ermer, Hauswald) abgeschlossen. Teil D betrifft die Okonomie bei Validierungen: Notwendiger Umfang, Durchfuhrungsmodus und Ansatze einer ,,intelligenten" Validierung, die ein Minimum an Aufwand moglich machen. Dem einfuhrenden Abschnitt uber Grundsatzliches zur Validierungsokonomie (Kromidas) folgt die Vorstellung zweier Werkzeuge, die als komplementar zu der ,,klassischen" Validierung gelten konnen: Statistische ProzeBkontrolle, SPC (Staal) und Schatzen der MeBunsicherheit (Kuppers). Im Anhang finden sich neben statistischen Tabellen, Register von deutschen und englischen Begriffen und Definitionen weitere Informationen rund um die Validierung. Das Buch mu13 nicht unbedingt linear gelesen werden, man kann problemlos hin und her ,,springen". Dazu wurden die einzelnen Kapitel so verfafit, daB sie abgeschlossene Module

XI1

Zum Aujbau des Buches

darstellen. Damit wurde versucht, dem Charakter des Buches als Nachschlagewerk gerecht zu werden. Verweise geben die Stellen im Buch wieder, wo bestimmte Begriffe noch einma1 und/oder ausfuhrlicher erklart werden. Validierung ist eine individuelle Angelegenheit. Es ist auch gut so. Aus diesem Grunde wurde bewuljt nicht auf ,,Vereinheitlichung" getrimmt, unterschiedliche Auffassungen der Autoren oder gar abweichende Definitionen blieben stehen. Auch wurde manche Wiederholung in Kauf genommen, um die Harmonie im textlichen Kontext nicht zu beeintrachtigen. SchlieDlich werden einige wichtige Begriffe von mehreren Autoren, die naturgemaD unterschiedliche Akzente setzen, diskutiert. So beispielsweise ,,MeBunsicherheit" (Morkowski, Kromidas, Papke, Kuppers), ein Begriff, der - zumindest was die praktische Umsetzung anbelangt - voll im Flulj ist. Der Leser moge davon profitieren.

Inhalt

Teil A Grundlagen Stuvros Kromidas und Janusz S. Morkowski

Vorwort V Verzeichnis der Autoren

VII

Zum Aufbau des Buches

XI I

1

Grundsatze der Validierung in der Analytik und im Prufwesen

1.1 1.2

Einfuhrung 1 Definition, Erlauterung und Kommentierung von Begriffen der Qualitatssicherung 3 Validierung 4 Verifizierung 11 Qualifizierung bzw. Qualifikation 1 1 Charakterisierung 12 Messen, Prufen, Justieren, Kalibrieren, Eichen 13 Grundvoraussetzungen fur die Validierung einer analytischen Methode 15 Die Unsicherheit der Ergebnisse von Messungen, Priifungen und Analysen Methoden zur Charakterisierung von analytischen Methoden 17 Die Charakterisierungsmethoden 18 Erste Charakterisierungsmethode 19 Zweite Charakterisierungsmethode 19 Dritte Charakterisierungsmethode 20 Vierte Charakterisierungsmethode 22 Funfte Charakterisierungsmethode 23 Kombination der funf Charakterisierungsmethoden 26 Weitere Methoden vom Typ B 27

1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.2.4 1.2.5 1.3 1.4 1.5 1.5.1 1.5.1.1 1.5.1.2 1.5.1.3 1.5.1.4 1.5.1.5 1.5.1.6 1.5.1.7

16

1.6 1.7 1.8

Charakterisierung (Qualifizierung) von Methoden als letzter Schritt einer Validierungsprozedur 27 Freigabe von Methoden, Dokumentation 28 SchluBbemerkungen 28

2

Vor Beginn der Validierungsarbeiten: Voraussetzungen, Dokumentation, Geratequalifizierung 3 1

2.1 2.2 2.3 2.3.1 2.3.2

Voraussetzungen 3 1 Dokumentation 33 Geratequalifizierung 34 Das ,,V"-Modell 37 Empfehlungen fur die Praxis

40

Teil B Die Praxis der Validierung Stuvros Kmmidus 3

3.1 3.2 3.3 3.3.1 3.3.2 3.3.2.1 3.3.2.2 3.3.2.3 3.3.2.4 3.3.3 3.3.4 3.3.4.1 3.3.4.2 3.3.4.3 3.3.5

Die Validierungsparameter (oder nach IS0 17025: Verfahrensmerkmale)

41

Literaturuberblick 4 1 Die Validierungsparameter einer analytischen Methode 43 Prazision 46 Definitionen und Erlauterungen 46 Prazisionsarten 49 Wiederholprazision, Wiederholbarkeit (friiher: Wiederholgenauigkeit) 49 Vergleichsprazision, Vergleichbarkeit (haufig auch: Reproduzierbarkeit, selten Ubertragbarkeit) 49 Laborprazision oder laborinterne Vergleichsprazision 49 Weitere Prazisionen 50 MeB- und Methodenprlzision 5 1 Rechenbeispiele 52 Vergleich von Mittelwerten und Variationskoeffizienten 52 Vergleich von MeBwertreihen 53 Vergleich von Methoden, die aus stochastisch unabhangigen Schritten bestehen 56 Angaben zur Prazision und deren Deutungsmoglichkeiten 58

lnhalt

3.3.6 3.3.6.1 3.3.6.2 3.3.6.3 3.3.6.4 3.3.6.5 3.3.7 3.3.7.1 3.3.7.2 3.3.7.3 3.4 3.4.1 3.4.2 3.4.2.1 3.4.2.2 3.4.2.3 3.4.2.4 3.4.2.5 3.4.2.6 3.4.3 3.4.4 3.4.5 3.5 3.5.1 3.5.2 3.5.2.1 3.5.2.2 3.5.2.3 3.5.3 3.5.4 3.5.5 3.6 3.6.1 3.6.2 3.6.3 3.6.4 3.6.5 3.6.6 3.7 3.7.1 3.7.2

XV

Umgang mit Zahlen und Moglichkeiten zu deren Beurteilung 60 Ausreinertests oder Verlafilichkeitstests 60 Trendtest nach Neumann 64 Ermittlung der Wiederholgrenze 65 F- und Cochran-Test 65 Zusammenfassung der Tests und abschlierjendes Beispiel 68 Abschlierjende Fragen zur Prazision 71 Welche Prazision kann noch akzeptiert werden? 71 Wie kann ich die Prazision erhohen? 74 Was sind die Vor- und Nachteile bei grol3er Prazision? 75 Richtigkeit 77 Definitionen und Erlauterungen 77 Priifung auf Richtigkeit 78 Vergleich mit einem (oder mehreren) Referenz- oder Arbeitsstandard(s) 78 Vergleich mit einer unabhangigen, moglichst validierten Methode bekannter Richtigkeit 83 Wiederfindungsexperimente nach Zusatz bekannter Menge an Analyt (Referenzsubstanz!) 85 Elementbilanzierung 86 Indirekte Uberpriifung uber Massenbilanzen 86 Plausibilitatsbetrachtung 87 Merjunsicherheit, Ergebnisunsicherheit und Vertrauensbereich 87 Zusammenfassung von Tests zum Vergleich und zur Beurteilung von Zahien und Zahlenreihen 97 Wie sol1 ich nun die Richtigkeit uberpriifen? 99 Robustheit 101 Definition und Erlauterungen 101 Priifung auf Robustheit 102 Methodenrobustheit, Robustheit I: friihes Stadium 102 Verfahrensstabilitat 103 Anwendbarkeit, Robustheit I1 105 Zeitlicher Ablauf der Robustheitstests 107 Kommentare, Hinweise 110 Robustheit in der HPLC 110 Selektivitat und Spezifitat 116 Definitionen und Erlauterungen 116 Grundsatzliches zur Priifung auf Selektivitat 117 Prufung auf Selektivitat von bekannten Proben in der HPLC 1 17 Priifung auf Selektivitiit in der HPLC bei Proben unbekannter Zusammensetzung 118 Uberprufung der Selektivitat in der HPLC - Schnellmethoden 126 Zusammenfassung 131 Linearitat 133 Einleitung und Definitionen 133 Durchfiihrung der Linearitatstests 136

3.7.2.1 3.7.2.2 3.7.2.3 3.7.2.4 3.7.2.5 3.7.2.6 3.7.2.7 3.7.2.8 3.8 3.8.1 3.8.2 3.8.3 3.9 3.9.1 3.9.2 3.9.3 3.9.4 3.10 3.1 1 3.11.1 3.1 1.2 3.11.3 3.1 1.4

Grundsatzliches 136 Priifung auf Linearitat 138 Beurteilung der Ergebnisse 143 Welche MethodenkenndatenAnformationen konnen aus einer linearen Kalibrierfunktion gewonnen werden? 147 FlieBschema zur Kalibrierung und zur Ermittlung der Linearitat 1.57 Beispiel zur Prufung auf Linearitat 163 Eine kritische Betrachtung der Kriterien fur Linearitat 176 Gewichtete lineare Regression 179 Wiederfindung oder Wiederfindungsrate 184 Definitionen und Erlauterungen 184 Ermittlung der Wiederfindungsrate 18.5 Praktische Hinweise und Bemerkungen 186 Nachweis-, Bestimmungs- und Erfassungsgrenze 187 Definitionen und Erlauterungen 188 Ermittlung der Nachweis-, Bestimmungs- und Erfassungsgrenze 189 Kommentare und Hinweise 19 1 AbschluObemerkungen und Empfehlungen 192 Arbeitsbereich 19.5 Prozefi- und Methodenfahigkeit 19.5 Definitionen und Erlauterungen 195 Beispiele 198 Akzeptanzkriterien, Bewertung von Prozessen und Methoden 200 Mafinahmen bei unzureichender Methodenfahigkeit - zu kleine cMK’s 204

4

Haufige Fragen zur Validierung

4.1 4.2

Ermittlung der interessantesten Fragen 20.5 Antworten auf die sieben wichtigsten Fragenkomplexe

5

Haufige Fehler bei der Validierung analytischer Methoden

5.1 5.2

Allgemeine Fehler und Interpretationsfehler 223 Fehler im Zusammenhang mit der praktischen Durchfuhrung der Validierung 230

205 206 223

Znhalt

XVII

Teil C Zur Validierung einzelner Techniken und Gebiete Agilent, Aventis, BAM, Bayel; Hessische Landesanstalt fur Umwelt, HofSmann - La Roche, Merck, Schering, Schott, Spectral Service

6

Techniken und Gebiete 239

6.1

Validierung in der Spektroskopie 239

Werner Ockels, Spectral Service, Koln 6.1.1 6.1.2 6.1.3 6.1.4 6.1.5

Einleitung 239 Infrarot-Spektroskopie 240 UVIVIS-Spektroskopie 240 Massenspektroskopie 240 NMR-Spektroskopie 241

6.2

Validierung von Analysenverfahren mit ICP-OES

245

Siegfried Noack, BAM Berlin 6.2.1 6.2.2 6.2.2.1 6.2.2.2 6.2.2.3 6.2.3 6.2.3.1 6.2.3.2 6.2.3.3

Einleitung 245 Beschreibung methodenbedingter Leistungsmerkmale der ICP-OES 246 Spektrale und nicht spektrale Storungen 246 Untergrundermittlung 247 Kurzzeit- und Langzeitstabilitat (Drift) 247 Optimierung methodenbedingter Leistungsmerkmale der ICP-OES 248 Spektrale und nicht spektrale Storungen 250 Untergrundermittlung 25 1 Kurzzeit- und Langzeitstabilitat (Drift) 252

6.3

Validierungsaspekte bei Arbeiten in mikrobiologischen Labors

254

Michael Rieth, Merck KGaA, Darmstadt Klaus-Peter Gerbling, Schering AG, Berlin 6.3.1 6.3.1.1 6.3.1.2 6.3.1.3 6.3.2

Priifung auf Sterilitat (flussige und filtrierbare Arzneimittel) 254 Validierungsplan fur die Durchfuhrung der Sterilitatspriifung 254 Beschreibung der Durchfuhrung 255 Validierungsbericht 256 Mikrobiologische Dichtigkeitspriifung (Closure Integrity Test) von Primarbehaltern eines aseptisch hergestellten Wirkstoffs unter Worst Case Bedingungen des VerschluBsystems 251 6.3.2.1 Validierungsplan 257 6.3.2.2 Beschreibung der Priifflaschen und Stopfen 258

XVIII

In hult

6.3.2.3 Testmikroorganismus, Herstellung der Tauchsuspension und Keimzahlbestimmung 259 Mikrobiologische Integritatsprufung 259 6.3.3 6.3.3.1 Dichtigkeitspriifung 259 6.3.3.2 Wachstumsprufung nach der Dichtigkeitspriifung 260 6.3.3.3 Ergebnisse 260 Qualifizierung eines Anal ysesystems am Beispiel Mikrotiterplatten6.3.4 photometer 262 6.3.4.1 Qualifizierungsplan fur das computergestutztes System Mikrotiterplattenphotometer 262 6.3.4.2 Betrieb des computergestutzten Systems 263 6.3.4.3 Testprogramme fur die Systemeignung, Qualifizierung und Requalifizierung 265 6.3.4.4 Nachweis der korrekten Installation und Funktionalitat des computergestutzten Systems sowie der umgebenden Raumeinrichtung 267 6.3.4.5 Raumeinrichtungen 268 Qualifizierungsbericht fur das System Mikrotiterplattenphotometer 269 6.3.5 6.4

Validierung einer Titrationsmethode

270

Jiirgen Peters, Schott Gerate GmbH, Hofheim

6.4.1 6.4.2 6.4.3 6.4.4 6.4.5 6.4.6 6.4.7 6.4.8 6.4.9

Einleitung 270 Ubersicht Validierungsmerkmale 270 Voraussetzungen fur eine Titration 270 Prufmitteluberwachung 273 Praktisches Vorgehen 274 Validieren einer Saure-Base-Titration 27.5 Validieren einer Karl Fischer Titration 281 Ubertragen auf andere Titrationen 284 Zusammenfassung 285

6.5

Validierung von Software und computerisierten Analysensystemen

286

Ludwig Huber; Agilenr GrnbH, W ~ ~ d b r o n n

6.5.1 6.5.2 6.5.3 6.5.4 6.5.4.1 6.5.4.2 6.5.4.3 6.5.5 6.5.6

Einleitung 286 Definition von computerisierten Systemen und Softwarekategorien 286 Ubersicht einer Gesamtvalidierung 288 Beitrag des Gerateherstellers bzw. Softwarelieferanten zur Validierung 290 Installation 29 I Testen des Gesamtsystems vor der Inbetriebnahme 292 Ausgeubte Softwarefunktionen und Darstellung der Ergebnisse 292 Automatischer Test des Computersystems ohne Geratehardwaretest 294 Validierung von Anwendungsprogrammen, die vom Benutzer erstellt wurden 296

Inhalt

6.5.7 6.5.8 6.6

XIX

Nachtragliche Untersuchung und Validierung von existierenden Systemen 299 Zusammenfassung 300 Validierung von chemometrischen Methoden am Beispiel multivariater Datenanalyse in der Nah-Infrarot Spektroskopie 302

Michel Ulmschneider; Hofmann - La Roche AG, Basel 6.6.1 6.6.2 6.6.3 6.6.3.1 6.6.3.2 6.6.3.3 6.6.4

Einleitung 302 Allgemeines zur multivariaten Datenanalyse 302 Praktisches Beispiel aus der Nah-Infrarot Spektroskopie 304 Grundlagen 304 Methode 305 Kalibrierung und Validierung 306 Fazit 306

6.7

Basisvalidierung -primary validation verfahren 308

-

in der Normung von Analysen-

Giinter Papke, Hessisches Landesamt fur Umwettschutz, Wiesbaden

6.7.4.4 6.7.4.5

Einleitung 308 MeBunsicherheit in der Normung 3 10 Modelle zur Abschatzung von MeBunsicherheiten 31 1 Unprazisionsangaben aus laborinternen Messungen 3 1 1 Unprazisionsangaben aus Ringversuchsergebnissen 3 1 1 Probleme bei der Anwendung des DIN-Basisvalidierungspapieres 312 Praxisbeispiele zur Ableitung von Schatzwerten fur die MeBunsicherheit aus Prazionswerten 3 12 Praxisbeispiel zur Ableitung von Schatzwerten fur die MeBunsicherheit aus Nachweis-, Erfassungs- und Bestimmungsgrenzwerten nach DIN 32645 3 15 Praxisbeispiel zur Ableitung von Schatzwerten fur die MeBunsicherheit aus Prazisionswerten von Kontrollkarten 316 SchluBbemerkungen 3 16 Anhang und Erlauterungen 3 18

6.8

Validierung in der pharmazeutischen Analytik

6.7.1 6.7.2 6.7.3 6.7.3.1 6.7.3.2 6.7.4 6.7.4.1 6.7.4.2 6.7.4.3

320

Joachim Ermer; Aventis, Frankfurt

6.8.1 6.8.2 6.8.2. I 6.8.2.2 6.8.2.3 6.8.2.4 6.8.2.5

Einleitung 320 Regulatorische Anforderungen zur analytischen Validierung 320 Deutschland [84] 321 Europaische Gemeinschaft [85] 32 1 USA 322 Kanada [89] 323 Good Manufacturing Practice [90] 325

xx

Inhalr

6.8.2.6 International Conference on the Harmonization of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) 325 6.8.3 Planung, Durchfiihrung und Bewertung von Validierungsstudien 332 6.8.3.1 Spezifitat 332 6.8.3.2 Linearitat und Arbeitsbereich 339 6.8.3.3 Richtigkeit 347 6.8.3.4 Prazision 348 6.8.3.5 Nachweis- und Bestimmungsgrenze 35 I 6.8.3.6 Robustheit 356 6.8.3.7 Systemeignungstest 356 6.8.3.8 Rationelle Validierung 357 6.8.3.9 Validierungskonzept wahrend der Arzneimittelentwic klung und -herstellung 358 6.8.3.10 Validierung als integraler Teil der Qualitatssicherung 359 6.9

Forderungen der ICH zur Validierung in der Pharmaindustrie am Beispiel der HPLC 360

Joachim Hauswald, Bayer AG, Wuppertal

6.9. I 6.9. .1 6.9. .2 6.9. .3 6.9. .4 6.9. .5 6.9. .6 6.9.1.7 6.9. I .8 6.9.1.9 6.9.2 6.9.3

Praktische Durchfuhrung 360 Spezifitat 360 Linearitat 361 Arbeitsbereich 362 Prazision 362 Richtigkeit 363 Nachweisgrenze 364 Bestimmungsgrenze 364 Robustheit 364 Systemeignungstest (System Suitability Testing) Dokumentation 366 AbschlieBende Bemerkungen 366

365

Teil D Okonomie bei Validierungen Aventis, NOVIA, Schering 7

Umfang, Ablaufschema, zeitlicher Ablauf und Kosten der Validierung 367

Stuvros Kromidus, NOVIA GrnbH, Saarbrucken

7.1 7.1.1 7.1.2 7.1.3 7.2 7.2.1 7.2.2 7.3 7.3.1 7.3.2 7.4 8

Umfang einer Validierung 367 Validierungsumfang in Abhangigkeit von dem Analysenverfahred dem MeBprinzip 369 Validierungsumfang in Abhangigkeit vom Analysenziel 372 Valdierungsumfang abhangig von der Haufigkeit und Wichtigkeit der Probe 375 Vorgehensweise bei der Validierung 376 FlieBschema und zeitlicher Ablauf 376 Kommentare zum FlieBschema 376 Kosten der Validierung und Ansatze fur deren Senkung 384 Senkung der Validierungskosten 384 Fazit 39 1 Wie geht es weiter? 393 Uber die Einsatzmoglichkeit der statistischen ProzeBkontrolle, SPC, in der Analytik 403

Rolf Stual, Aventis, Frankfurt

8.1 8.1.1 8.1.2 8.1.3 8.2 8.3

Validierung - und was kommt danach? 403 Konsequenzen - das Werkzeug statistische ProzeBkontrolle, SPC 405 Vorteile durch die Anwendung der statistischen ProzeBkontrolle 412 Schwierigkeiten bei der Anwendung der statistischen ProzeBkontrolle 413 Analysenergebnisse an Spezifikationsgrenzen 4 15 Die Gefahren der Uberjustierung in der Analytik und deren Beseitigung 4 18

9

Schatzen der MeBunsicherheiVErgebnisunsicherheit 423

Stephan Kuppers, Schering AG, Berlin

9.1 9.2 9.3 9.3.1 9.3.2 9.3.3

Ergebnisunsicherheit - eine Einleitung 423 Grundlagen 424 Beispiele 429 Beispiel aus der Chromatographie 429 Beispiel aus der Spektroskopie 43 1 Beispiel eines physikalischen Messverfahrens (Karl-Fischer-Wassertitration) 433

XXIl 9.4 9.5

Zusarnrnenfassung und Empfehlung Statistische ProzeBkontrolle 436

10

SchluBwort 439

A

Anhang

A1 A2

Abkiirzungen (Auswahl) 441 Definitionen und Erlauterungen von Begriffen aus den Bereichen ,,Validierung" und ,,Qualitatssicherung" 444 Englische Ubersetzung einiger wichtiger Begriffe zurn Kornplex ,,Validierung" (Auswahl) 462 Register der Rechenbeispiele 464 Statistische Tabellen 466 Softwareprograrnrne zur Methodenvalidierung und Qualitatssicherung (Auswahl) 475 Niitzliche Adressen (Auswahl) 479 Publikationen zum Thema Validierung in der Analytik (Auswahl) 483 Weiterbildung 490

A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 Literatur

441

493

Sachwortregister

434

501

Handbuch Validierung in der Analytik Stavros Kromidas Copvriaht 0 2000 WILEY-VCH Verlaa GmbH

Teil A Grundlagen Stavros Kromidas, NOVIA GmbH, Saarbriicken Janusz S. Morkowski, Dubendoe Schweiz

1

Grundsatze der Validierung in der Analytik und im Priifwesen

1.1

Einfuhrung

Validierung bedeutet, auf die Frage zu antworten, ob ein Priifverfahren, eine analytische Methode oder eine MeS-Priifeinrichtung fur die Erfullung einer ganz bestimmten Aufgabe geeignet ist. Um auf diese Frage antworten zu konnen, muS man dreierlei wissen: - Wie lautet die bestimmte Aufgabe, die gelost werden soll? - Durch welche charakteristischen Leistungsmerkmale kann das fur die Losung der Auf-

gabe vorgesehene Verfahren auf Eignung getestet werden? Wie lauten die experimentell ermittelten Werte der ausgesuchten Merkmale?

Somit konnen die von der Aufgabenstellung her geforderten Fahigkeiten des Verfahrenst der Methode/der Prufeinrichtung mit den tatsachlichen Leistungsmerkmalen verglichen werden und die eigentliche Validierungsfrage auf Eignung beantwortet werden. Stellt der Validierer anschlieBend auch noch formal fest, daR das vorgesehene Verfahren tatsachlich imstande ist, die gestellten Forderungen zu erfullen, so sind alle Schritte der Validierungsprozedur normgerecht ausgefuhrt. Bemerkung: Der Einfachheit halber wird im folgenden nicht von dem Verfahren/der Methode/der Priifeinrichtung sondern stellvertretend von der Methode die Rede sein.

2

I Grundsiitze der Validierung in der Analytik und im Prufiesen

Tab. 1-1 Ablauf einer Validierungsprozedur (allgerneines Schema) Der Auftraggeber

Das Labor

benotigt Informationen, damit er eine bestimrnte Aufgabe erfullen oder losen kann. Er uberlegt sich, um welche konkrete Informationen es sich handeln sol1 und beschreibt diese moglichst genau.

bestimrnt eine Methode, mit deren Hilfe es den Auftrag des Aufgabenstellers bearbeiten will. Eventuell wird die Methode vorgegeben. Es definiert samtliche KenngroRen (Leistungsoder Verfahrensmerkmale) der vorgesehenen Methode, deren Prufung zur Losung der Aufgabe erforderlich sind.

Spezifikation

Charakteristische KenngroSen von Methoden sind z. B.

Die fur die Aufgabenlosung benotigten Informationen werden in dem an das Labor vergebenen Auftrag als (Qualitatits-)Forderungen spezifiziert. Genannt werden die zulassigen Werte der charakteristischen KenngroBen des verwendeten Verfahrens; insbesondere die zulassige Gesamtunsicherheit der Ergebnisse der Prufung. Gegebenenfalls werden die Forderungen erst nach klarenden Gesprachen init dem Labor spezifiziert.

-

-

Wiederholbarkeit Vergleichbarkeit Nachweis- und Bestimmungsgrenze Anwendungsbereich Selektivitat Robustheit Linearitat Gesamtunsicherheit der Ergebnisse

Vergleich Im AnschluR an die obigen Schritte werden die (Qualitats-)Forderungen des Aufgabenstellers mit den Werten der charakteristischen KenngroOen der Methode verglichen. ~

7

Qualifizierung der Methode Methode modifizieren bzw. AlternativMethode suchen Aufgabenstellung andern

1 (

nein

d. h. Feststellung der Eignung Die Validierungsprozedur endet mit der formalen Feststellung des Labors, daB die vorgesehene Methode fur die Losung der spezifischen Aufgabe geeignet oder eben nicht geeignet ist, d. h. da13 sie sich qualifiziert hat oder nicht.

ja

1.2 Dejinition, Erlauterung und Kommentierung

3

Zusammenfassend bedeutet das Gesagte folgendes: Methodenvalidierung bedeutet, die Absicht des Auftraggebers zu kennen und anschlieknd herauszufinden, ob eine Methode fur den vorgesehenen Verwendungszweck geeignet ist. Die Validierung betrifft immer zwei Parteien: 1. Der Aufgabensteller Zunachst mu13 jemand da sein, der eine Aufgabe stellt. Die zu losende Aufgabe kann sich auch aus den Interessen der Offentlichkeit ergeben oder sie kann aus den Forderungen von Gesetzen, Verordnungen oder normativen Dokumenten resultieren. Es ist letztlich belanglos, wer die Aufgabe formuliert; dies kann ein externer oder interner Kunde sein, ebenso gut kann das Labor selbst jene Forderungen formulieren, welche die Methode erfullen rnulj.

2. Der Aufgabenloser Der Aufgabensteller benotigt jemanden, der fur ihn die Aufgabe lost, also ein Labor. Um eine vollstandige Validierung durchzufuhren, mu13 das beauftragte Labor nun folgendes tun: - Es mulj die Aufgabe, und allenfalls auch das Problem des Auftraggebers, verstehen und - es mul3 abklaren, ob die fur die Aufgabenlosung vorgesehene Methode imstande ist, Ergebnisse zu liefern, die fur die Aufgabenlosung nutzlich sein werden; oder mit anderen Worten, ob sie fur den vorgesehenen Verwendungszweck geeignet ist. Gegebenenfalls mulj es eine Alternativmethode vorschlagen. - Es wird dem Aufgabensteller mitteilen, dalj es im Stand ist, die gestellte Aufgabe zu losen. - Im Zweifelsfall wird es die Eignung der Methode zu uberprufen haben, d. h. es hat zu priifen, ob die ermittelten Zahlenwerte der Merkmale von einer leistungsfahigen, sprich von einer fur die konkrete Aufgabenstellung geeigneten Methode zeugen. Die Validierungsprozedur laljt sich am besten in einem Ablaufschema darstellen. Dieses zeigt, dalj sowohl der Auftraggeber in seiner Funktion als Aufgabensteller, wie auch das Labor als Auftragnehmer und Aufgabenloser bei der Validierung eine wichtige Rolle zu ubernehmen haben, siehe Tab. 1- 1. In der Praxis kommt es oft vor, dalj das Labor die Fragestellung des Kunden so gut versteht, dalj es sehr wohl im Stand ist, stellvertretend fur den Kunden selbst die geplante Vorgehensweise zu definieren und dann mit ihm abzusprechen.

1.2

Definition, Erlauterung und Kommentierung von Begriffen der Qualitatssicherung

Trotz klarer Vorstellungen bezuglich des Begriffs Validierung, wie sie in der obigen Einfuhrung dargelegt wurde, und trotz vieler Diskussionen daruber, besteht bis heute immer noch eine gewisse Verwinung bezuglich venvandter Begriffe wie Validierung, Zertifizierung,

4

I Grutdtiitze der Wrlidierung in der Antilytik

itnd

inr Pri{tweseti

Charakterisierung, Verifizierung und Qualitizierung. Diese Konfusion hat weit mehr als nur linguistische oder semantische Bedeutung. Die Autoren pliidieren keinesfalls fur die Beibehaltung oder gar zwingende Verwendung all dieser Begriffe. Es zeigt sich jedoch, dal3 dadurch eher Probleme auftreten als daCj deren Verwendung der Klarung dient. Leider existieren sie und werden in der Praxis immer noch in eigenwilliger und zugleich arbitrarer Weise verwendet, was die Verstandigung zwischen den betroffenen Parteien nicht gerade erleichtert: Wollte man die heutige Situation in der Analytik charakterisieren, so durfte folgendes - aul3er in der Pharmaindustrie, wo der Validierungsgedanke sehr weit fortgeschritten und strukturiert ist - wohl haufig zutreffen: Viele der Betroffenen wissen heute ganz genau, was fur sie selbst Validierung, Verifizierung und Qualifizierung bedeutet; nur meinen leider andere Leute unter diesen Begriffen nicht genau das gleiche und manchmal sogar etwas recht Unterschiedliches. Oft werden auch die klaren Auslegungen der Begriffe Validierung, Verifizierung und Qualifizierung aus Regelwerken wie IS0 8402: 1994 und DIN EN IS0 17025:2000, siehe unten, ignoriert. Ein Beispiel: In dem Dokument der ILAC ,,Guideline for validating test methods'' 3rd draft of ILAC WG6: 1994-05- 13 wird der Begriff Validierung, wie in der IS0 8402 definiert, nicht beachtet und fur den eigenen Gebrauch eine Umschreibung verwendet, die gemaB der Norm auf den Begriff Verifizierung zutrifft. Was notwendig ist, ist einerseits eine Verstlndigung unter den Betroffenen bezuglich der Begrifflichkeiten, andererseits sollte eine pragmatische, dem Laboralltag dienende Auslegung angestrebt werden. Diesem Zweck sollen die nachfolgenden Definitionen und Erlauterungen dienen.

1.2.1 Validierung Mit Validierung verbindet jeder Analytiker die Uberprufung einer Methode auf Brauchbarkeit. Der Begriff Validierung taucht offiziell erst in den 70er Jahren auf: 1975 in Europa: 1978 in den USA:

Richtlinie des Rates 75/3 18 (EWG) FDA, im Zusammenhang mit der Produktion von Arzneimittel

Nachfolgend eine Auswahl von Definitionen aus der Literatur. -

-

Dertinger, Giinshirt, Steinigen in ,,GAP Praxisgerechtes Arbeiten in pharmazeutischanalytischen Laboratorien", Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH. Stuttgart 1984: ,,Kilidiesiing ist der Nuchrr~eisund rlie Dokurnentution der Ziivesliissigkeit eirier M e thode.'' H. Bosshardt, F. Schorderet, H. Feltkamp, P. Fuchs und H. Sucker, Pharmazeutische Qualitatskontrolle, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1983: .,Unter klidierirng \iersteht man rlie Gesamtheit aller sich iiber Planung, Aiisfiihriirig wid Dokiirnrritrrtiorr rrstsekkenden MaJnuhmen, die die Giiltigkeit einer ctnulytischen Methotle hewriseri. ller Prilfuujivund richtet sich riuch der Methoclik, der Appircitiir Litid den Ar~forulPriiri~~eri ( i n die Giite des Resulttits."

1.2 Definition, Erluuterung und Kommentierung

5

Chapmann, 1985: ,,Validierung he@ nichts Anderes als gesunder Menschenverstand gut organisiert und gut dokumentiert. '' - FDA, 1986 (im Hinblick auf Produktion): ,,Validierung ist der dokumentierte Nachweis, daJ ein bestimmter ProzeJ mit einem hohen Grad an Sicherheit kontinuierlich ein Produkt erzeugt, dus vorher dejinierte Spezifikationen und Qualitatsmerkmale erfiillt. - Inspectorate for Health Protection, Food Inspection Service, Niederland: ,,Vulidierung ist die Prozedur; die sicherstellt, daJ eine Testmethode so zuverlassig ist wie miiglich. Dieser ProzeJ besteht aus einem (Test)Programm, das zur Beantwortung folgender Fragen fiihrt: ,,Wierichtig ist es? und ,,Wieprazise ist die Methode in den Handen des Routineanwenders? - Rompp Chemie Lexikon, 1992 (ebenfalls auf die Produktion bezogen): ,, Vufidienwg umfaJt (nach dern verbindlichen Code von ,,Good Validation Practices '' in der Pharmazeutischen Industrie, Anm. der Autoren) die systematische Uberpriifung der wesentlichen Arbeitsschritte und Einrichtungen in Entwicklung und Produktion einschlieJlich der Kontrolle von pharmazeutischen Produkten mit dem Ziel, sicherzustellen, daJ die hergestellten Produkte bei Innehaltung der festgelegten Produktions- und Kontrollverfahren zuverlassig und reproduzierbar in der gewiinschten Qualitat hergestellt werden konnen. - USP<1225>: ,,Validierung ist der ProzeJ, durch den mittels Laborexperimenten gezeigt wird, daJ die Leistungsmerkmale (Charakteristika) einer Methode den Forderungen fiir eine beabsichtigte Anwendung geniigen. '' - ICH, 1995: ,,Das Ziel bei der Validierung einer analytischen Methode ist zu zeigen, daJ sie f u r den beabsichtigten Zweck geeignet ist - I S 0 8402, 1994 0 2.18: Jestatigen aufgrund einer Untersuchung und durch Bereitstellung eines objektivenNachweises, daJ die besonderen Forderungen f u r einen speziellen beabsichtigten Gebrauch erfiillt worden sind." (objektiver Nachweis: nachweisbare Informationen basierend auf Tatsachen, die man durch Beobachtung, Messung, einen Test oder auf eine andere Art und Weise (other means!) erhalt) -

"

"

"

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I'.

Jungst wurde ein Schritt vollzogen, der Beachtung verdient: Aus dem I S 0 Guide 25 und der EN 45001 (1989) wurde eine neue internationale Norm, die I S 0 17025 (Allgmeine Anfordemngen an die Kompetenz von Pruf- und Kalibrierlaboratorien). Mit der neuen Norm wird dem Vorschlag der DIN Rechnung getragen, eine Gleichstellung der Wertigkeit des ISO-Standards mit der europaischen Norm EN 45001: 1997-06 zu erreichen. Die EN ISO/IEC 17025: 2000 hat den Status einer Deutschen Norm und ist seit Dezember 1999 in Kraft. Seit April 2000 existiert eine dreisprachfige Fassung (deutsch, englisch, franzosisch) (zu beziehen bei: Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin). I S 0 17025 kann als ein wichtiger Bezugspunkt fur analytische Laboratorien (Pruf- und Kalibrierlaboratorien) angesehen werden. Daher lohnt es sich, die fur uns interessanten Textpassagen der Norm im Wortlaut zu verfolgen. Bemerkenswertenveise erscheinen fur die Verfasser die ,,Validierung von Verfahren" und die ,,Schatzung der MeBunsicherheit" gleichwertige Werkzeuge der Qualitatssicherung zu sein. Jedenfalls erhalten im Text beide Verfahren eine gleichwertige Stellung in der Hierarchieebene (Punkt 5.4.5 und 5.4.6).

6

1 Grundsatze der Vulidierung in der Analytik und im Prufiesen

,,5.4.5 Validierung von Verfahren

5.1.5.1 Die Validierung ist die Bestatigung durch Untersuchung und Bereitstellung cines Nachweisec, daR die besonderen Anforderungen fur einen speziellen beabsichtigten Gebrauch erfullt werden. 5.4.5.2 Das Laboratoriurn rnuR nicht in norrnativen Dokurnenten festgelegtc Verfahren, sclbstentwickclte Verfahren, Verfahren nach normativen Dokurnenten, die aufierhalb ihres vorgesehenen Anwendungsbereiches angewendet werden, und Erweiterungen von Verfahren nach norrnaliven Dokurnenten validieren, urn zu bestatigen, daB die Verfahren fur den beabsichtigten Gebrauch geeignet sind. Die Validierung mu8 in dem Umfang durchgcfuhfl werden, der zur Erfullung der Erfordernisse der beabsichtigten Anwendung oder des betreffenden Anwendungsgebiets notwendig ist. Das Laboratoriurn rnuR die erhaltenen Ergebnisse und das fur die Validierung verwendete Verfahren aufzeichnen und festlegen, oh das Vcrfahrcn fur den beabsichtigten Gebrauch geeignet ist. Anmerkung 1: Validierung kann Verfahren fur Probenahrne, Handhabung und Transport urnfassen. Anmerkung 2: Zur Bestirnrnung der Verfahrensrnerkrnale sollte eine der folgenden Methoden oder eine Kombination davon verwendet werden: Kalibrierung rnit Bezugsnormalen oder Referenzrnaterialien; Vergleich rnit Ergebnissen, die rnit anderen Verfahren erzielt wurdcn; - Vergleiche zwischen Laboratorien; systernatische Beurteilung der Faktoren, die das Ergebnis beeinflusscn; Beurteilung der Ergebnisunsicherheit auf der Grundlage wissenschaftlichen Verstehens der theoretischen Grundlagen des Verfahrens und praktischer Erfahrung. Anmerkung 3; Wenn einige Anderungen in den validierten nicht genorrnten Verfahren vorgenomrnen werden, sollte der EinfluR solcher Anderungen dokumentiert werden und, sofern angernessen, sollte eine neue Validierung vorgenornnien werden.

5.4.5.3 Der Bereich und die Genauigkeit der rnit validierten Verfahren erreichbaren Werte (z. B. Ergebnisunsicherheit, Nachweisgrenze, Selektivitat des Verfahrens, Linearitat, Wiederholgrenze und/oder Vergleichsgrenze, Robustheit gegen aufiere Einflusse und/oder Querempfindlichkeit gcgenuber Beeinflussungen durch die von der Matrix der Probe/des Prufgegenstandes), wie sie fur die beabsichtigte Anwendung beurteilt werden, rnussen den Erfordernissen des Kunden entspree hen. Anmerkung I: Validierung schlieBt Beschreibung der Anfordemngen, Bestirnrnung der Verfahrensrnerkrnale, eine Priifung, dab die Anforderungen durch Anwendung der Methode erfiillt werden, und eine Aussage zu ihrer Gultigkeit ein. Anmerkung 2: Bei weiterer Entwicklung des Verfahrens sind regelrnaRige Prufungen erforderlich, die sicherstellen sollen, daR die Erfordernisse des Kunden weiterhin erfullt werden. Jede Anderungen dcr Anforderungen, die Modifizierungen des Entwicklungsprogramrns erfordern, rnussen gepruft und genehrnigt werden. Anmerkung 3: Bei der Validierung sind irnrner die Kosten, Risiken und technischen Moglichkeiten abzuwagen. In viclen Fallen konnen der Bereich und die Unsicherheit der Werte (1.B. fur Genauigkeit, Nachweisgrenze, Selektivitat, Linearitat, Wiedcrholprazision, Reproduzierbarkeit,

1.2 Dejinition, Erliiuterung und Kommentierung

7

Robustheit, Querempfindlichkeit) mangels Information nur in vereinfachter Weise angegeben werden. 5.4.6 Schatzung der MeSunsicherheit 5.4.6. I Ein Kalibrierlaboratorium oder ein Priiflaboratorium, das interne Kalibrierungen durchfuhrt, mu8 uber ein Verfahren zur Schatzung der MeBunsicherheit fur alle Kalibrierungen und alle Arten von Kalibrierungen verfugen und dieses anwenden. 5.4.6.2 Priiflahoratorien mussen uber Verfahren fur die Schatzung der MeBunsicherheit vcrfugen und diese anwenden. In bestimmten Fallen kann die Art der Priifmethode eine strenge metrologische und statistisch gultige Schatzung der MeBunsicherheit ausschlieljen. Das Laboratorium mu8 in solchen Fallen mindestens versuchen, alfe Komponenten der MeRunsicherheit zu ermitteln, und eine vernunftige Schatzung der MeBunsicherheit vornehmen und sicherstellen, daB der Prutbericht keinen falschen Eindruck bezuglich der Unsicherheit erweckt. Eine vernunftige Schatzung mu6 auf der Kenntnis der Durchfuhrung des Verfahrens und auf der Art der Messung basieren und z. B. von vorhergehender Erfahrung und von Validierungsdaten Gebrauch machen. Anmerkung I : Der Grad der Strenge, die bei der Schatzung der MeBunsicherheit erforderlich ist, hangt von Faktoren ah wie z. B. - die Anforderungen der Prufmethode; die Anforderungen des Kunden; das Vorhandensein enger Grenzen fiir die Entscheidung bezuglich der Einhaltung einer Spezifikation. Anmerkung 2: In den Fallen, wo ein bekanntes Priifverfahren die Grenzwerte der Hauptquellen der MeRunsicherheit und die Form der Darlegung des berechneten Ergebnisses festgelegt hat, wird angenommen, daB das Laboratorium diesen Abschnitt der Internationalen Norm durch Befolgen der Festlegungen fur die Priifmethode und die Form des Prufberichtes erfullt hat (siehe 5.10).

5.4.6.3 Bei der Schatzung der MeBunsicherheit mussen alle Unsicherheitskomponenten, die fiir den betreffenden Fall von Bedeutung sind, in Betracht gezogen werden, wobei angemessene Auswertungsverfahren zu verwenden sind. Anmerkung I : Zu den Quellen, die zur Unsicherheit beitragen, gehoren unter anderem die verwendeten Bezugsnormale und das venvendete Referenmmterial, benutzte Verfahren und Einrichtungen, Umgebungsbedingungen, Eigenschaften und Zustand des zu priifenden oder zu kalibrierenden Gegenstandes und das Bedienungspersonal. Anmerkung 2: Das voraussichtliche Langzeitverhalten des zu prufenden undoder zu kalibrierenden Gegenstandes wird ublicherweise bei der Schatzung der MeRunsicherheit nicht berucksichtigt. Anmerkung 3: Weitere Informationen sind in den Normen der Reihe I S 0 5725 und in dem ,,Guide to the expression of uncertainty in measurement" enthalten (siehe Literaturhinweise)." Kommentare zum Entwurf - Die fur diese Textlange relativ haufige Anzahl von Passagen zurn Therna zielgerichtete

Validierung

8

I Griiridsiit,-e der kilidierung in dc,r Antrlytik itrid ini Priifivesen ,, . . . fur einen

speziellen beabsichtigten Gebrauch ..."

,. . .. mussen den Erfordernissen des Kunden entsprechen . .."

., . . . da13 die Erfordernisse des Kunden noch immer erfullt werden

. . ."

zeugen von einer Praxisniihe und einer wesentlich stLkeren Kundenorientierung im Vergleich zu alteren Texten. Das ist eine erfreuliche Entwicklung. Es gilt jetzt diesen Geist im Alltag zu leben. - Folgende, eindeutige Aussage schafft Klarheit: Genormte Verfahren mussen nicht validiert werden. Ob allerdings stets darauf verzichtet werden kann, wenn es tatskhlich um Wahrheitsfindung geht, sollte individuell entschieden werden. - Die Schritte einer Validierung sollten folgende sein: Beschreibung der Anforderungen Findung und Bestimmung von aussagefiihigen Verfahrensmerkmalen Vergleich der Anforderungen mit den erhaltenen Werten der Verfahrensmerkmale JdNein-Aussage uber die Eignung der Methode fur den vorgesehenen Gebrauch. Folgende Passage zeugt von einer Kenntnis der Situation im Labor und kann als Entgegenkommen gegenuber den analytischen Laboratorien bewertet werden: ,,In vielen Fiilen konnen der Bereich und die Unsicherheit der Werte (. . .) mangels Information nur in wreinjuchter Weise angegeben werden." Erfreulicherweise erfahren durch die Erwiihnung erstmals in dieser Norm und in diesem Zusammenhang die Probenahme und der Transport den ihnen gebuhrenden Stellenwert. Die Anforderung, da13 das Laboratorium die Ergebnisse und verwendeten Verfahren aufzeichnen md3, bekraftigt das tatsachliche Ziel bei einer Validierung: Der Validierer mu13 Aussagen machen und nicht lediglich Zahlen/Daten erzeugen. Dem erfahrenen Leser fallt beim Aufzlhlen von erreichbaren Werten zweierlei auf: Die klassischen, wichtigen Elemente ,,Richtigkeit" und ,,Prazision" fehlen, dafur taucht ,,Ergebnisunsicherheit" auf. Hier wird die Auffassung der Verfasser offenkundig: Es ist ein Pliidoyer fur die Ermittlung bzw. Schiitzung der ,,Ergebnisunsicherheit" als ubergeordnetes Merkmal, das geeignet ist, die tatsachliche Streuung von Werten (zufiillige Abweichungen = Prazision, systematische Abweichungen = Richtigkeit) zu beschreiben und einen realen Vertrauensbereich anzugeben (siehe Ausfuhrungen weiter unten und in Abschnitt 3.4.3).Systematische und zufallige Fehler sind nur Beitrage zur Gesamtunsicherheit der Ergebnisse. Eine Unterscheidung in systematischen und zufiilligen Fehlern ist nicht notwendig. Es wird die ,,Nachweisgrenze", nicht jedoch die ,,Bestimmungsgrenze" erwiihnt. Auf Anfrage von S. Kromidas wurde folgendes als plausibler Grund fur den Verzicht genannt: Ein Nicht-Naturwissenschaftler kann mit dem Begriff Nachweisgrenze umgehen, eine klare Abgrenzung zur Bestimmungsgrenze ist nicht trivial. Dies wurde in einer Reihe von juristischen Auseinandersetzungen deutlich. Der Verzicht auf ,,Bestimmungsgrenze" kann fachlich wie folgt begrundet werden: Bestimmungsgrenze ist letzten Endes nichts mehr als eine erweiterte MeBunsicherhheit.

-

I .2 Definition, Erlauterung und Komrnentierung

9

Deswegen ist - ubrigens in Ubereinstimmung mit IS0 1 1843- 1, siehe Abschnitt 3.2. I die Benutzung des Begriffes ,,Bestimmungsgrenze" expressis verbis nicht notwendig. Die Ausfuhrungen im Entwurf von IS0 17025 kommen der Praxis sehr nahe und sind daher praktikabel. Zwei wichtige Forderungen werden leider nicht envahnt: Die Methodenstabilitat und die Methodenfahigkeit. Die Methodenstabilitat beschreibt die Abhangigkeit eines Ergebnisses von der Zeit bei Anwendung der konkreten Methode unter realen Bedingungen. Es geht um die Streuung von Ergebnissen, wenn alle relevanten Faktoren im realen Routinealltag wirksam sind und nicht nur wahrend der relativ kurzen Zeit der Validierungstatigkeit. Die Praxis zeigt immer wieder, dall die Nichtbeachtung dieses Aspektes zu unnotigen Differenzen zwischen Validierer und Routineanwender und zu erheblichen Kosten fuhrt. Das Wort ,,kontinuierlich" aus der FDA-Definition wurde hier schon ausreichen, um die Aufmerksamkeit auf diesen wichtigen Punkt zu lenken. Es ist zu hoffen, daB in einer kommenden Revision die Methodenstabilitat als gleichwertiger Validierungsparameter Zugang in den Normentext findet. Auch die Methodenfahigkeit verdient mehr Beachtung. Nur so besteht die Chance, daB bei der Festlegung von Spezifikationen analytische Realitaten beriicksichtigt werden, s. Abschnitt 3.11 und 5.2. Vor dem Versuch einer Zusammenfassung werden sieben Validierungsthesen fur die Analytik vorgestellt. Diese lehnen sich an die sieben Validierungsthesen fur die Herstellpraxis nach Sucker [ 11 an: -

-

-

Validierung ist ein Arbeitsinstrument zur Qualitatssicherung neben anderen wie z. B. SPC (Statistische ProzeBkontrolle). Validierung ist produkt- und zweckspezifisch auszufuhren. Die Verantwortung uber AusmaB und Art liegt beim Analytiker. Validierung heiBt, das Notwendige zu tun, aber eine Eskalation zu vermeiden. Alle kritischen KenngroBen der Methode mussen validiert werden, aber nicht wahl- und kritiklos alle. Methodenvalidierung beginnt am besten beim Endergebnis und geht im Analysenablauf bis zum ersten Schritt zuruck. Validierung kann nicht durch Abhaken von Resultaten mittels Checkliste erfolgen. Eine fehlerfreie Analytik (,,wahrer Wert") gibt es nicht. Nach Moglichkeit sind die statistische Relevanz und damit die MeBunsicherheit zu ermitteln. Fur validierte Methoden sind Art und Haufigkeit der notwendigen Kontrollen festzulegen mit dem Ziel, den Gesamtanalysenaufwand zu minimieren, aber dennoch die erforderliche Ergebnissicherheit zu erzielen.

Resume' und Kommentar Die Definition der I S 0 Norm 17025: 2000 la& dem Analytiker nahezu alle Freiheiten, wenn er nur erstens weil3, was er will (,,besonderen Forderungen fur einen speziellen, beabsichtigten Gebrauch") und zweitens in der Lage ist, eine fachgerechte Durchfuhrung zu garantieren, d. h. wenn er einen ,,objektiven Nachweis" liefert.

10

I tirirticl.tiit:e di>r Kilidierung in der Anulytik und

itn

Prufwsen

Betnerkung: In der Norm 17025 fehlt im Vergleich zu IS0 8402 das Wort ,,objektiv".

Die drei wichtigen Elemente der ISO-Definition sind: -

Untersuchung: Nachweis: beabsichtigter Gebrauch:

Es sind Fakten gefragt Es geht um nachvollziehbare Kriterien Validierung ist eine zielgerichtete Prufung

Wird n u n die ISO-Definition 8402 bzw. die neue aus der Norm 17025 zu Grunde gelegt, so wird dem Validierer - jedenfalls aus analytischer Sicht - kaum ein grober Fehler unterlaufen, wenn er folgende Voraussetzungen erfiillt: Eindeutig detinieren, was mit der Methode beabsichtigt ist. Festlegen, was und wie gepruft werden SOH. Aus den ermittelten Zahlen Aussagen beziiglich Methodeneignung treffen. - Alle Daten, die zu den gemachten Aussagen fiihren, dokumentieren. -

-

Die Realitat sieht manchmal allerdings so aus, daB der Kontrollierende einer Institution/ Behiirde stur nach einer Validierungs-Checkliste vorgeht. Sind vom Validierer die in der Liste aufgefuhrten Validierungselemente abgearbeitet, so ist die Validierung erfolgt, ansonsten nicht. Zu diesem Handicap siehe Abschnitt 7. Wir schliel3en die Diskussion uber das, was unter Validierung manchmal verstanden wird, mit einigen Zitaten ab. Diese stammen aus Schriften fiihrender Gerltehersteller und zeigen, daB immer wieder meist unwissentlich viillig verzerrte Bilder von der Validierung gegeben werden. I . Aus einer Produktmitteilung eines Geriiteherstellers A: ,,Ein GroJteil der HPLC-Anwendrr ist heute den sogenunnten GLP-Richtlinien untemwfen. Behiirden wie BGA oder FDA verlungen die Vulidierung einer Analysenrnethode. Zusiitzlich miissen ulle Anu!\senrrgehni.s.se permunent uufEi~ihultungder Vufidierungsgrenzen iiherpruft werden. 2. Aus einer Kundenschrift eines Gerateherstellers B: ,,Unter Validierung wird die (regelrnusige) Uherprufurig der Grnauigkrit eines MeJgerates wrstanden ... '* 3. Aus einer Produktmitteilung eines Gerlteherstellers C: ,,Die Beurteilung des Dosiergeriitt1.s ... Nur rrmn ulle clrei Werte innerhalb der fe.stgelegten Bereiche liegen, hut dus Dosiersystetn die Kilidierung erfolgreich hestanden. "

"

Kornrnenture Zu 1 : a) Nur ca. 5 c/o der HPLC-Bestimmungen sind GLP-pflichtig.

b) Validierung ist keine GLP-Forderung. c) Es gibt keine .,Validierungsgrenzen" sondern Spezifikationsgrenzen bzw. Methodenfihigkeitsindices,siehe Abschnitt 3.1 1. Zu 2: Beschriebenes Procedere entspricht nicht einer Validierung sondern (vermutlich) der Uberpriifung der MeBprazision und eventuell einer Kalibrierung. Zu 3: Beim Dosiersystem handelt es sich nicht um Validierung sondern um Verifizierung, siehe unten.

1.2 Definition,Erliiirterunq

irnd

Kotiiriieritir~irr~,q

II

I .2.2 Verifizierung Definition gemaB IS0 8402: 1994, (i 2.17: ,,Bostiitigen uufgrund einer Untersuchung und durch Bereitstc~llungeines obiektiwi Nuchweises. rluJ festgelegte Forderungen erjiiillt worden sind." Die Normenbegriffe fur Validierung und Verifizierung unterscheiden sich nur geringfugig. Die ,,besonderen Forderungen fur einen speziellen beabsichtigten Gebrauch" in der Definition der Vahdierung werden bei der Verifizierung durch die ,,festgelegten Forderungen" ercetzt. Auf diesen Unterschied werden wir weiter unten noch einmal eingehen.

1.2.3 Qualifizierung bzw. Qualifikation Dieser Begriff wird leider fur zwei unterschiedliche Tatbestiinde benutzt: I . Nach dem Deutschen Arzneibuch: DAB 9, Band I , 1992, S. 747-748 ,,Validierung von Sterilisationsprozessen" wird folgende Definition verwendet: Als Qualifikation vvircljener Trilabschnitt der Kilidierirng he=eichtiet, der sich, ohne Beriicksichtigung des Sterilisiergutes. nur mit der Fiinktionstiic.htigkeit des Sterilisutors be$lfit. Hierzu gehiiren w r mlleni Eichung und Koritrolle drrpli~.~ikulischet~ M<Ji'iristrirtnente vvie z. B. Tlierrnorneter; Tlierniofiihler; Matiorneter 11. u. '' und 2. GemiiR IS0 8402,1994, (i 2.13, ,,Qualifizierungsprozess" und IS0 8402, 1994, (i 2.14 ,,Qualifizierung" bzw. ,,qualifiziert: Der Begriff QualifizierungsprozeR gema0 I S 0 8402, 1994, 5 2.13 wird beschrieben als ,,ProzeB zur Darlegung, ob eine Einheit zur Erfullung der festgelegten Qualitltsforderung fiihig ist." Der Begriff Qualifizierung gem80 IS0 8402,1994, (i 2.14 lautet: ,,Stutir.s einer Einh~it, bt*erFriihre Fiihigkeit :ur Eijiillung der-festgelegtm Qiitilitiit.s#~)rderiiiig durgelegt vvirr& ". 1,

Kotnmo i i tu r Im Labor handelt es sich bei der Qualifizierung um die formale Feststehng, daR das f u r eine bestimmte Messung vorgesehene Verfahren voraussichtlich geeignet ist, den Qualitiitsforderungen des Auftraggebers zu genugen. Aus der Sicht der Qualitatssicherung erfolgt der Qualitizierungsprozess im Rahmen der Vertragsprufung. Dieser sol1 dem Auftraggeber bestiitigen, dal3 das Labor uber ein Prufverfahren verfugt und es entsprechend beherrscht und so seine Erwartungen erfullen kann.

Be isp ie Ie Nachfolgend wird versucht, die Begriffe Validierung, Verifizierung und Qualifizierung (nach DAB) am Beispiel der HPLC zu erliiutern: QualifiLierung:

Uberpriifung der Geratespezifikationen - ohne Eluent und Probe Erreicht die Lampenenergie de\ Detektors einen beatimmten Wert? - 1st im gexamten MeBbereich des Siiulenofen\ die vom Hersteller atigegebene Temperaturkonstanz von 0. I ' C erreichbar?

-

Veriti;lierung:

Prufung auf HPLC typische Forderungen Erreicht der Detektor mit MeOH 31s Eluent bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 1 ml/min und einer Detehtionwellenl~ingevon 254 nm ein fur die HPLC ubliches Basislinienrauschen 0.04 inAU? - 1st die Systempriizision, gemessen mit MeOH als Eluent iind eineni unkritischen Testgemisch, kleiner 1 %'? -

Validieriing:

Eignung der vorliegenden HPLC-Methode f u r ein bestiinmtes Trennproblem - Tensidanalytik mit lonenaustauscher: wird mit vet-diinnter SchwefelsYure (eine andere Viskositiit als der fur Geriitetests ubliche Eluent MeOH!) und realen Feuerloschmittel-Proben die geforderte PrYzisio n von 2 5% erreicht'? - Trennung von Phosphorlipiden: welche Nachweisgren/.e wird erreicht bei einer Detektionswellenlange von 200 nm mit einer Diolphase und einem Chloroform/Methanol Eluenten?"

Zusainmenfassend ist festzuhalten, dal3 bei der Veritizieriing die Anlage auf die voin Hersteller angegebenen bzw. von der HPLC-Gemeinschaft erwarteten SpeLitikationen gepruft wird. D. h., es handelt sich um eine Uberprufung einer allgemein formulierten Qualitiitsforderung. Bei der Qualitiyierung (nach DAB) geht es um die Uberprufung technischer Werte. also letrten Endes uin das Ablesen von Widerstinden und Spannungswerten der nicht in Betrieb befi nd I ic hen An 1age. Bei der Validierung liegt der Schwerpunkt auf der Frage. ob eine Trennung init dieser Apparatur den von dein Kunden bzw. der Behiirde festgelegten/erwarteten Q u 1', I 'Ititsmerkmalen entspricht. D. h., hier handelt es sich um eine anwendungsbezogene Prufung. In der Praxis wird oft zwischen Verifizierung und Qualitizierung einer Anlage nicht iinterschieden. eine Tatsache, die sicherlich nicht ins Gewicht fYllt. Ziir Qualifizierung einer Anlage siehe Abschnitt 2.3. DaO die Verwendung mehrerer, iihnlicher Begriffe offensichtlich eher fiir Verwirrung denn fiir KlYrung sorgt x i g t folgende Tatsache: Beim DAR (Deutscher Akkreditierungs Rat) wurde im AusschuB Technische Fragen (ATF) erwogen, den Begriff .,verification" generell ails nllen Punkten zu entfernen, urn MiBverstiindnissen vorzubeugen.

1.2.4 Charakterisierung In der Norm IS0 8402: 1994 wird dieser Begriff nicht genannt. Charakteriaiert wird eine Methode, indem man die Werte fiir ihre charakteristischen Kenngriissen ermittelt. Die Werte dieser Kenngrossen sind die Leistunga- oder Verfahrens~nerkmalswerteder untersuchten Methode. Sie dienen zur AbschYtmng der Unaicherheiten von Ergebnissen. die mit dieser Methode erzielt werden kiinnen. Die Charakterisierung erfal3t allerdings nicht nur die spezifischen Eigenheiten der Methode selber, sondern auch alle wesentlichen spezifischen Eintluase, die in .jeneiii Labor

1.2 Definition, Erliiuterirng und Kommentierrtng

13

wirksam sind und zur Unsicherheit des Ergebnisses beitragen konnen. Diese Einfliisse sind z. B.: Die Eigenheiten jener Personen, welche die Methode im gegebenen Labor anwenden; d. h. die praktische Erfahrung und Fertigkeit dieser Personen im Umgang mit der Methode, ebenso ihr theoretisches Wissen uber die Hintergrunde der Methode, aber auch ,,ihre Tagesform" bei der Durchfuhrung der Arbeiten. - Die aul3eren laborspezifischen Einflusse wie z. B.: Temperatur, Feuchtigkeit, Luftdruck, Erschutterungen. Verunreinigungen von Wasser, Luft und technischen Gasen etc., verursacht durch Partikel, Bakterien, Sporen, Pilze und andere Fremdsubstanzen, elektromagnetische Felder, Strahlungen jeglicher Art, Spannungsschwankungen im elektrischen Versorgungsnetz. - Die inneren fur das Versuchsobjekt spezifischen Einfliisse, d. h. Einflusse der Matrix wie z. B. Kornigkeit und Inhomogenitat, die chemische Zusammensetzung von Gemischen, die physikalisch-chemische Aktivitat von Beimengungen in den untersuchten Proben, z. B. auf die Oberflachenaktivitat. -

Als wesentlich sollten jene Einflusse gelten, welche das Ergebnis der Messung iiber das tolerierbare Ma13 hinaus beeinflussen konnen, insbesondere jene, welche die Unsicherheit der Gesamtergebnisse uber die zulassigen Grenzen des Vertrauensbereiches einer bestimmten Kenngrosse vergroBern kiinnen. Falls sich die Frage stellt, wie reprasentativ die Ergebnisse der im Labor untersuchten Proben fur jene Gesamtheit sind, so mussen bei der Charakterisierung der Methode weitere Einflusse auf das Gesamtergebnis untersucht bzw. abgeschatzt werden, namlich: Die laborexternen Einflusse auf das Gesamtergebnis wie z. B. die Reprasentativitat des Probenahmeortes, des Probenumfangs, der Probenahmedauer, der Probenmenge. Zu berucksichtigen ist ebenfalls die Moglichkeit wesentlicher Probenveranderung wlhrend des Transportes ins Labor. Um eine Methode genau charakterisieren zu konnen, miissen die ermittelten Ergebnisse uber einen llngeren Zeitraum verfolgt werden (Methodenstabil itat).

1.2.5 Messen, Prufen, Justieren, Kalibrieren, Eichen In der analytischen Qualitatssicherung bzw. generell im Priifwesen sind eine Reihe von Tiitigkeiten notwendig. Diese werden vor (Eichen, Justieren, Kalibrieren), wuhrend (Messen) und nuch Ende dervalidierung (Priifen) ausgefuhrt. Tabelle 1-2 gibt die DIN-Definitionen und zur Veranschaulichung je ein Beispiel wieder [ 21.

14

I Grundsatze der Vulidierung in der Anulytik und im Pruffivesen

Tab. 1-2 Grundbegriffe der MeBtechnik. Begriff

Definition nach DIN 13 19 T. 1

Beispiel (Chromatographie)

Messen

Messen ist der experimentelle Vorgang, durch den ein spezieller Wert einer physikalischen GroBe als Vielfaches cincr Einheit oder eincs Bezugswertes ermittclt wird.

Die Retentionszeit eines Peaks wird mit 8 min gemessen.

Prufen

Prufen heiRt feststellen, ob der Priifgegenstand cine oder mehrere vorgcgebene Bedingungcn erfullt.Mit dem Prufen ist daher immer der Vergleich mit vorgcgebenen Bedingungen verbunden. Anmerkung: Prufgegenstund knnn sowohl die Probe a1.y uuc/z dci,y Mejjgeruf sein!

Funktionsprufung des Chromatographen durch Auftrennung ciner Testmischung und Freigabe odcr Sperrung oder

Justieren (Abgleichcn)

Justieren im Bereich der MeBtechnik heiBt. ein MeRgerat so einstellen oder abgleichen, daB die MeBabweichungen moglichst klcin werden oder daR die Betrage der MeBabweichungen die Fehlergrenzen nicht uberschreiten. Das Justieren erfordert also einen Eingriff, der das MeBgerat oder die MaRverkorperung meist bleibend verandert

Abgleichen der FluBrate mittels Potentiometer, so daR die cingestclltc FluBrate mit der gemessenen ubereinstimmt.

Kalibrieren (Einmessen)

im Bereich der MeBtechnik heist, die MeBabweichungen am fertigen MeBgerat feststcllen. Beim Kalibricrcn erfolgt kcin technischer Eingriff am MeBgerat. Anmerkung: Kulibrieren kann sich s o wohl uufdie Festlegung des Mejkusummenhangs als uuch czufdessen Uberpriifung beziehen.

Fcststellen des MeBzusammenhangs zwischen Signal und Konzentration (Aufstellen dcr Kalibrierfunktion)

Das Eichen eines MeBgerates umfaBt die von der zustandigen Eichbehorde nach den Eichvorschriften vorzunehmenden Prufungen und die Stcmpelung. Anmerkung: An die Stelle der Eichbehiirde kunri (iuch eine Stelle treten, der die Eichhefiignis iibertrcigen wurde.

Eichung der fur die Substanzeinwaage verwendeten Analysenwaage

Eichen

Prufung einer Charge auf k e n Wirkstoffgehalt und Vergleich mit Spezifikationsforderungen.

oder Uberprufung, ob der zuvor fcstgclegte MeBzusanimenhang noch gultig ist (Uberprufen dcr Kalibrierfunktion)

1.3 Gritndvoruusset,-rtrlgenf u r die Vrrlidierung einer cinciljtisdien Methock

1.3

15

Grundvoraussetzungen fur die Validierung einer analytischen Methode

Es ist unbestritten, daD nur fachlich kompetente Laboratorien imstande sind, analytische Methoden zu validieren. Wichtig ist dabei, dalj das Verstandnis fur die Validierung, die Auslegung der Normenbegriffe und fur die sich daraus ergebenden Forderungen in der Laborpraxis vereinheitlicht, harmonisiert und pragmatisch angelegt werden. Aus der oben formulierten Auslegung des Begriffes Validierung ergeben sich fur die Laborpraxis folgende Forderungen: 1. Der vom Labor zu erfiillende Auftrag mu13 so weit beschrieben sein, daR sich daraus die an die analytische Methode zu stellenden Leistungsforderungen klar und eindeutig ableiten lassen. 2. Die ublichen Leistungsmerkmalswerte der analytischen Methode mussen als Werte der benotigten charakteristischen KenngroDen bekannt oder zu ermitteln sein. Die Methode mu8 schriftlich fixiert vorliegen; sie sollte neben Angaben wie Methoden- und Einstellparameter, Art und Giite der eingesetzten Chemikalien usw. bei Bedarf auch folgende Angaben enthalten: Probenahme, Probenkonservierung, Probentransport, Probenvorbereitung, Sequenzaufbau bei der Messung, Arbeitsbereich usw. 1st eine der beiden Forderungen nicht erfullt, so ist die Durchfuhrung einer Validierung nicht moglich. 3. In einem Labor mit einem Qualitatsmanagement-System sollte die Erfullung der in den Punkten 1 und 2 genannten Voraussetzungen und die Uberprufung der Machbarkeit zwingender Bestandteil der Vertragsuberprufung sein. Damit die obigen Forderungen erfullt werden konnen, mu8 das Labor zumindest ein fur die Auftragserfullung genugend zahlreiches, fachlich qualifiziertes Personal zur Verfugung stellen, eine Leitung haben, welche die Fuhrungsaufgaben verantwortlich wahrnimmt, uber angemessene Raumlichkeiten, Infrastruktur und Hilfsmittel und uber die benotigten Einrichtungen zur Messung, Analyse undloder Priifung verfugen. Weiterhin mulj es die fur den Auftrag erforderlichen Verfahren und Methoden so weit beherrschen, daB das dem Auftraggeber zugesicherte Qualititsniveau der vereinbarten Dienstleistung sichergestellt ist. Nach bisherigen Erfahrungen ist es uberdies vorteilhaft, wenn das Labor ein zweckmaRiges( !) Qualitltsmanagement und ein angemessenes Qualitatssicherungs-System betreibt, welches gewlhrleistet, daR die Qualifikation des Personals, die Laborausrustung und Verfahrensbeherrschung laufend den jeweiligen Bedingungen angepaBt werden. Fragen der ausreichenden Personalqualifikation undoder der angemessenen und zweckm3Digen Ausrustung von Laboratorien, die bei der Durchfuhrung von Validierungen in jedem Fall bedeutsam sind, werden in diesem Buch weiter nicht behandelt (siehe dazu 13,411.

1.4

Die Unsicherheit der Ergebnisse von Messungen, Prufungen und Analysen

Jeder MeClwert ist mit einer M~~~~rtri.sic.hrrhrit behaftet. Obwohl trivial. werfen wir nun doch einen Blick aufden Unterschied zwischen physikalischen und chemischen Messungen. Bei physikalischen Messungen ist der MeDwert unabhiingig vom MeBobjekt: Ich messe eine Strecke von 2,5 m, egal ob es sich um eine Latte handelt. einen Baum oder die lichte Hiihe in meinem Buro. Die MeBunsicherheit beschriinkt sich auf den Mel.(vorgang/die Messung selbst. Bei chemischen Verfahren stellt die Probe die .,Materialisierung" des analytischen Problems dar. Sie selbst ist die grol3e Unbekannte: Von der Probenahme bis zur Auswertung niit Hilfe von ReferenLen kiinnen eine Reihe MeRunsicherheiten das Ergebnis beeinflussen. Bereits jetzt kiinnen wir folgendes festhalten: -

-

Je mehr ,,Chemie" eine Methode enthiilt, um so aufwendiger ist die Vnlidierung. 1st .,Physik" dominant, reicht oft eine Kalibrierung ;IUS. Es ist eminent wichtig fur ISK (in statistischer Kontrolle) -Prozesse 7 u sorgen, bei denen der unbekannte Anteil der Menunsicherheit xu vernachlassigen ist.

N u n zu den Definitionen: Im I S 0 ,,Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement" (GUM) von 199.3 sowie in der Revision von 1995 heiRt es zur Unsicherheit: ,.Die Unsicherheit des Ergebnisses einer Messung reflektiert den Mangel an einem genauen Wissen uber den Wert der MeRgriiOe. Das Ergebnis einer Messung 1st auch nach der Korrektur einer erkannten systematischen Einwirkung (effect) immer noch eine Schiitmng des Wertes der Mel3groRe infolge der Unsicherheit. die sich aus der Beeintlussung durch zufiillige Einwirkungen und aus der unvollstiindigen Korrektur des Ergebnisses bezuglich der systematischen Einwirkung ergibt.

Hinweis Das Ergebnis einer Messung kann (nach Korrektur) unwissentlich sehr nahe beiin Wert der MeBgriiRe liegen (und dem zufolge einen vernachliissigbaren Fehler beinhalten) und dennoch kann es eine groCje Unsicherheit haben; daher sollte die Unsicherheit einer Messung nicht mit dem verbleibenden Fehler verwechselt werden". Mit .,verbleibender Fehler" ist wohl die verbleibende systematische Abweichung des MePergebnisses gemeint. Im GUM heiMt es weiter:

..In der Praxis sind viele Ursachen der MeRunsicherheit miiglich, dazu gehoren: a ) Fehlerhafte Annahme des Analyten (solvatisiert, Dissoziationsgrad. als Hydrochlorid vorliegend? usw.) b) Cross-Kontamination oder kontaminierte Reagenzien bzw. kontaininierte Leerproben. c) N icht repriisentative Probenahme; d) Ungenugendes Wissen uber die Auswirkungen der Umweltbedingungen auf die Messung oder eine ungenugende Messung der Umweltbedingungen,

1.5 Methoden Zur Chnrrrkterisierung voii cmcilytischen Metliockn

17

e) Ablesefehler einer analogen Anzeige durch die messende Person, f) begrenzte Auflosung oder Nachweisgrenze des Instruments, g) ungenaue Werte der Meastandards und des Referenzmaterials, h ) ungenaue Werte von Konstanten und anderen Parametern, die aus externen Quellen stammen und in den Algorithmen zur MeBwert-Reduktion verwendet wurden, i) Annlherungen und Annahmen, die in die MeBmethode bzw. -prozedur aufgenommen wurden, J ) Schwankungen bei den wiederholten Beobachtungen der MeBgroBe bei scheinbar konstanten Bedingungen. Diese Ursachen sind nicht unbedingt unabhlngig von einander, einige der Ursachen von a) his i ) konnen die Ursache J ) beeinflussen. Eine nicht erkannte systematische Einwirkung kann bei der Abschatzung der Unsicherheit des MeBergebnisses natiirlich nicht berucksichtigt werden, obwohl sie zu dessen Fehler beitriigt". Eine Reihe von Dokumenten (BIPM, IEC/IFCC/ISO/uPAC/IUPAP,OIML) definieren MeRunsicherheit als: ,,Parameter, der die Streuung der Werte kennzeichnet, die eigentlich der MeRgroBe zugeordnet werden konnten.

Anmerkungen I . Der Parameter kann beispielsweise eine Standardabweichung (oder ein gegebenes Vielfaches davon), oder die halbe Weite eines Bereiches sein, der ein festgelegtes Vertrauensniveau hat. 2. MeBunsicherheit enthalt im allgemeinen viele Komponenten. Einige dieser Komponenten konnen aus der statistischen Verteilung der Ergebnisse einer MeBreihe ermittelt und durch empirische Standardabweichungen charakterisiert werden. Die anderen Komponenten, die ebenfalls durch Standardabweichungen charakterisiert werden konnen, werden aus angenommenen Wahrscheinlichkeitsverteilungenermittelt, die sich auf Erfahrung oder andere Informationen grunden. 3. Es wird vorausgesetzt, daB das Meaergebnis der beste Schiitzwert fur den Wert der MeBgroBe ist, und daB alle Komponenten der Unsicherheit zur Streuung beitragen, eingeschlossen diejenigen, welche von systematischen Einwirkungen herriihren, z. B. solche, die von Korrektionen und Bezugsnormalen stammen". Naheres zur Me& und Ergebnisunsicherheit findet sich in Abschnitt 3.4.3.

1.5

Methoden zur Charakterisierung von analytischen Methoden

Die Forderung, dab Laboratorien nur solche Verfahren anwenden durfen, die fur den vorgesehenen Gebrauch tatsachlich geeignet sind, bedeutet, daB der vorgesehene Gebrauch klar

18

I Grundsatze der klidierung in der Analytik und im Prufwesen

beschrieben sein muB und die sich aus der beabsichtigten Anwendung ergebenden besonderen Forderungen spezifizieit sind. Erst an solchen Spezifikationen la& sich ermessen, wie weit die Eignungspriifung (Validiemng) gehen muB, damit der Aufwand in einer zweckmarjigen Relation zu den Bedurfnissen des Auftraggebers steht. Fur die Laborpraxis ist dabei bedeutsam, darj es dem Labor freigestellt bleibt, die fur einen bestimmten Anwendungsbereich typischen Forderungen und Spezifikationen auf Gmnd der eigenen Erkenntnisse und Erfahrungen nach bisherigen Kundenwunschen zu formulieren, womit eine Validierung a priori moglich wird, d. h. schon bevor ein neuer Kunde auftritt. Bei einem solchen Vorgehen bleibt dem Labor die Aufgabe zu uberpriifen, ob das (vorvalidierte) Verfahren auch fur den ganz konkreten Auftrag ebenfalls geeignet ist. Die nachfolgenden Beispiele zeigen, wie die Charakterisierung eines Priif- bzw. Kalibrierverfahrens durchgefiihrt werden kann, sofern die oben genannten Vorbedingungen erfullt sind. Die bei der Charaktersierung eines Pruf- bzw. Kalibrierverfahrens ermittelten Daten sind statistisch zu bearbeiten gemaB den Empfehlungen des I S 0 ,,Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement", second version, 1995. In dieser ISO-Richtlinie wird zwischen zwei Methoden zur Bestimmung der Unsicherheit von Prufergebnissen wie folgt unterschieden: -

-

Methoden des Typs A stutzen sich auf die Schiitzung der Unsicherheit von Messungen mit Hilfe statistischer Verfahren auf der Grundlage experimentell ermittelter Daten. Methoden des Typs B sind Schatzverfahren auf der Grundlage anderweitiger Informationen, 2. B. von Erfahrungswerten.

Die fur die verschiedenen Verfahrensstufen geschatzten MeBunsicherheiten werden gemlB den Regeln des Gesetzes uber die Fehlerfortpflanzung als Varianzen kombiniert. Bei Priifungen darf man erfahrungsgemao in den meisten Flllen die individuellen Beitrage der einzelnen Verfahrensstufen an die Gesamtunsicherheit als unabhlngig voneinander und als normalverteilt betrachten. Nur in Ausnahmefallen. wenn namlich eine Korrelation zwischen zwei oder mehreren Verfahrensstufen vorliegen sollte, ist gemas den Regeln der Kovarianzanalyse zu verfahren.

1.5.1 Die Charakterisierungsmethoden Es lassen sich mehrere Methoden zur Charakterisierung von Pruf- bzw. MeBverfahren anwenden . Sie unterscheiden sich durch die anzuwendende Verfahrensweise, durch die Art (zufallige Abweichungen, systematische Abweichungen, Gesamtabweichungen) und den Erfassungsgrad (Vollstandigkeitsgrad mit dem das Verfahren bei der Schiitzung erfaBt wird) der geschatzten Unsicherheit der Ergebnisse. Alle hier vorgestellten Methoden der Char&terisierung haben ihren praktischen Wert und sollten dem gegebenen Sachverhalt und den Moglichkeiten entsprechend und unter Berucksichtigung der spezifischen Bedurfnisse gewahlt werden.

1.5 Metliodrri ;.ur Chitrctktrri.sirriiri,~1'on iinrilytischcri Mrthoden

19

1.5.1.1 Erste Charakterisierungsmethode Systematische Beurteilung der Faktoren, die das analytische Ergebnis beeinflussen konnen Bei dieser Methode werden alle relevante Parameter (Einfluljgroljen) der Methode systematisch variiert und deren EinfluB auf das Ergebnis quantifiziert. Diese Charaktersisierungsmethode ist immer dann zweckmaljig oder einzig rnoglich, wenn dem Messenden gesicherte Referenzen nicht zur Verfugung stehen. Dies ist oft bei der Analyse von unbekannten Proben und bei der Anwendung von Prufverfahren der Fall. die sich lediglich auf Meljkonventionen (,,Kochrezepte") stutzen. Zu typischen iiuljeren Einflussen, welche analytischen Pruf- bzw. Meljergebnisse beeintlussen konnen, gehoren beispielsweise: Temperatur, Strahlungen, Luftfeuchte, Luftdruck, Luftfremdstoffe, Spannung des elektrischen Stroms, Magnetfelder oder mechanische Erschutterungen. Zu inneren Einflussen gehoren z. B. Inhomogenitlt, bzw. Verunreinigungen des MeRobjekts oder Bestandteile einer untersuchten Substanz, die ein Gemisch aus verschiedenen Stoffen darstellt (Matrixeffekte).

Kommentur Diese Charakterisierungsmethode kann praktisch unbegrenzt, d. h. in allen Bereichen des Priifwesens, verwendet werden und hat insoweit eine nahezu universelle Anwendungsmoglichkeit. Zu den Ergehnissen der ersten Churakterisierungsmethode

Die mit Hilfe der ersten Charakterisierungsmethode erhaltenen Ergebnisse sind Schitzwerte fur die zufiilligen Abweichungen der Unsicherheiten der Ergebnisse von Analysen bzw. Messungen. Sie sind fur das untersuchte analytische Verfahren charakteristisch und sind bei Einhaltung gleichbleibender Wiederholbedingungen als eine VerfahrenskenngriiOe des validierenden Labors anzusehen. Die so ermittelten Kenngroljen besagen indessen nichts uber die Richtigkeit der mit diesem analytischen Verfahren gewonnenen Ergebnisse, d. h. dalj in diesem Fall die systematische Abweichung vom richtigen Ergebnis unbekannt bleibt.

1.5.1.2 Zweite Charakterisierungsmethode Kalibrierung mit Referenznormalen/Referenzmaterialienund gleichzeitige Untersuchung der EinfluRgroljen Wird eine Kalibrierung zugleich zur Charakterisierung eines MeRverfahrens verwendet, so mulj sie durch eine systematische Untersuchung der Einflusse auf das Kalibrier- bzw. Me& ergebnis - gem213 der oben geschilderte ersten Charakterisierungsmethode - erganzt werden. Die zur Kalibrierung verwendeten Referenzen mussen dabei bezuglich Art und Grolje der durch sie dargestellten Merkmalswerte den zu messenden Prufobjekten entsprechen. AuRerdem sind die Werte jener Einflusse systematisch zu untersuchen, welche das Kalibrierbzw. Meljergebnis merklich, d. h. uber das zulassige Ma13 hinaus, beeinflussen konnen.

KonimrritorWi rd beisp ie I s we ise de r Ei n tl u B de r A i i Ren tern peratur fur eine n best i in in ten Te in pera t urbereich untersucht, so sind MeBergebnisse, die bei Temperaturen gewonnen wurden. die auBerhalb dieses Bereichs liegen, als nicht gesichert bzw. nicht vertrauenswurdig zu betrnchten. Aus diesem Crund sollten Ergebnisse von Messungen beispielsweise wie folgt priisentiert werden: ,.Die charakteristischen KenngroBen X, Y, Z dieses MeBverfahrens wurden fur den Temperaturbereich rwischen 18 "C und 24 "C ermittelt".

Er,yd~rri.s.srrider- :n,vitrri Chcir-trX.trrisirrirri~~.sriirthodr Die tnit der zweiten Charakterisierungsmethode erhaltenen Ergebnisse sind zuniichst iihnlich wie bei der ersten Charaktersisierungsmethode - Schatzwerte fur die zufiilligen Abweichungen der Unsicherheiten von MeBergebnissen. Bei Einhaltung gleichbleibender Wiederholbedingungen sind sie als eine VerfahrenskenngroRe des untersuchten MeOverfiihrens anzusehen. Dank der Verwendung gesicherter Referenfen ermiiglicht diese Charakterisierutigsmethode zusiitzlich eine Aussage uber die systematische Abweichung der init diesem MeMverfahren gewonnenen Ergebnisse, also die Uberprufung der Richtigkeit. Die Unsicherheit dieser zweiten Aussage hlngt im wesentlichen n u r noch von der Qualitiit der Referenz - oder genauer genommen von der Unsicherheit derdurch die Refercnz verkijrperten Merkmalswerte ab.

Zii dtw

KomrnentrirDie Unsicherheit der verwendeten Referenzen mu8 den Spezitikationen des MeRverfahrens entsprechen oder besser als die Forderungen sein. Die Unsicherheit der Referenj. sollte dem Gebrauchszweck ebenso angemessen sein, wie der Kostenaufwand fur die Referenz. welcher die Gesamtmessung nicht mehr belasten sollte als unbedingt notig. I 3.1.3 Drittc Charakterisierungsmethode Vergleich der Ergebnisse, die mit einem weiteren Verfahren ermittelt wurden In dieser Charuhterisierungsmethode werden die tnit dein zu charakterisierenden Meljvertahren erhaltenen Ergebnisse mit den Ergebnissen eines (oder mehrerer) underen iiniibhiingigen Me6verI:ihrens (Vergleichs- oder Referenzverfahren) verglichen. Dabei werden in beiden Mei.lvcrfohren die gleichen Me8objekte unter Wicderholbedingungen verwendet. Es kann vorkommen. dal3 das Vergleichsverfahren ein Refcrenmerfiihren ist. d. h. did3 die ni i t i h m e rm i t t e 1ten Erge bn i \ \e au f g es i c hert e Refere n / e ti zii rue kg etii h rt u erde II hii11 tie n . Die drittc Cti~irakterisict-tingsmethodeist dann niitzlich, wenn einerseits keine gcsicherten Referenzcn iinmittelbar verfugbar sind und anderseits dcr Aufwand fiir eine \ystematische Untcrsuchung der Einfliisse aufdie MeBgrijRen mittel\ der er\ten Charakterisieriingsmcthode ;iu\ /citlichen und/oder aus Kostengriinden nicht i n Frage kommt.

1.5 Methoden zur Chariikterisirrurig von iinciljtischrn Mettiodi~n

21

Kommentar Die Wahl des Vergleichsverfahrens sollte dem Verwendungszweck des untersuchten MeRverfahrens entsprechen, insbesondere beziiglich der zulassigen Ergebnisunsicherheit. ebenso sollte bei dessen Wahl beriicksichtigt werden, daR der rnit dem Vergleichsverfahren verbundene Aufwand und die damit verbundenen Kosten in einem akzeptablen Verhiiltnis zu den Bedurfnissen des Auftraggebers stehen. Zu den Ergebnissen der dritten Charakterisierungsmethode

Die Unsicherheit der mit dem zu charakterisierenden MeRverfahren ermittelten Ergebnisse ist unmittelbar davon abhangig, wie groR die Unsicherheit der rnit dem Vergleichsverfahren gefundenen Ergebnisse ist. Je kleiner der Unterschied zwischen den Ergebnissen der verglichenen Verfahren, um so starker die Vermutung, daR sich die charakteristische Unsicherheit des untersuchten MeBverfahrens nur geringfiigig von jener des Vergleichsverfahrens unterscheidet. Wir schlagen vor, den Unterschied zwischen den mit zwei unabhiingigen Meherfahren ermittelten Ergebnissen - bei Einhaltung von Wiederholbedingungen der Ergebnisunsicherheit jedes der beiden Verfahren gleichzusetzen. Verwendet man bei dieser Untersuchung mehrere MeBobjekte rnit unterschiedlichen Werten des gleichen Merkmals, so erhalt man im Resultat eine ganze Reihe von Unsicherheiten, die nach statistischen Regeln bearbeitet werden konnen. Je nach Art des Vergleichsverfahrens sind die Unsicherheiten der rnit der dritten Charakterisierungsmethode ermittelten Ergebnisse charakteristisch fur: 1. die zufilligen Abweichungen der Unsicherheiten, wenn niimlich das Vergleichsverfahren auf eine Referenz nicht zuriickgefuhrt werden kann; 2. die zufalligen Abweichungen der Unsicherheiten, zugleich aber auch fur die systematischen Abweichungen der Unsicherheiten, wenn namlich das Vergleichsverfahren ein Referenzverfahren ist und auf eine gesicherte Referenz zuruckgefiihrt werden kann. Wurde das zum Vergleich verwendete Referenzverfahren gernii0 der zweiten Methode bereits charakterisiert, so liegen Angaben iiber die charakteristische Ergebnisunsicherheit dieses Verfahrens schon vor. In diesem Fall ist auch eine Aussage iiber den Vertrauensgrad der Ergebnisunsicherheit des untersuchten MeBverfahrens moglich.

Kommentar Die Wahl des Vergleichsverfahrens sollte dem Verwendungszweck des untersuchten MeRverfahrens entsprechen, insbesondere bezuglich der zulassigen Ergebnisunsicherheit, ebenso sollte bei dessen Wahl berucksichtigt werden, daB der rnit dem Vergleichsverfahren verbundene Aufwand und die damit verbundenen Kosten in einem akzeptablen Verhiiltnis zu den Bediirfnissen des Auftraggebers stehen.

1.5. I .4 Vierte ChnrakterisierungsInethode

VergleichsrnessungeIi zwischen Laboratorien (Laborvergleichsversuche, Ringversiiche) In dieser Methode wird das untersuchte MeRverfahren mittels der Ergebnisse von Vergleichsmessungen zwischen mehreren Laboratorien charakterisiert. Die am Vergleichsversuch teilnehmenden Laboratorien verwenden alle das gleiche MeBverfahren und Lintersuchen alle die gleichen Priifobjekte unter den fur ihr Labor spezitischen Gegebenheiten (Vergleichsbedingungen). Das untersuchte MeBverfahren wird charakterisiert, indem die Ergebnisse der Vergleichsmessungen mit statistischen Mitteln bearbeitet und dargestellt werden. Kotiiiiiuittir

ZLIVergleichsniecsLingen zwischen rnehreren Laboratorien, deren Zweck die Charakterisieriing eines Meaverfahrens ist', sollten nur solche Laboratorien eingeladen werden. welche das LU charakterisierende Verfahren in vertrauenswurdiger Weise bezuglich Wissen, Erfithrung und Ausrustung beherrschen. Vergleichsmessungen zwischen Laboratorien mussen gut geplant, kompetent begleitet und mit statistischen Mitteln ausgewertet und dargestellt werden. Die Teilnahinebedingungen und der Durchfiihrungsniodus mussen schon im voraus bekannt sein. Das Verfahren selber ist bis ins Detail schriftlich niederzulegen: insbesondere bezuglich solcher Verfahrenselemente, die auf das Endergebnis einen inerklichen Eintlufi haben kiinnen. Eine Vergleichsmessung mu13 von einem besonders kompetenten Labor (Referenzlabor). welches das untersuchte Verfahren hervorragend beherrscht. geleitet und betreut werden. tlcw Ergehriissrri tler lierteti Clicirtikterisirr-irri~~.stiirtliode Mit Hilfe dieser Charnkterisierungsrnethode wird pro Prufobjekt von jedem der teilnehmenden Laboratorien ein (oder mehrere) Ergebnis(se) geliefert. Diese Reihe von Ergebnissen ist die Grundlage fur die Schltzung der zufdligen Abweichung der Unsicherheit des MeOergebnisses fur das gegebene MeOobjekt. Werden i m Vergleichsversuch mehrere Prufobjekte mit verschieden groRen Werten des gleichen Merkmals untersucht, so ergibt sich eine Reihe von Ergebnissen, aus denen fur das untersuchte MeRverfahren die Unsicherheit der Ergebnisse unter Vergleichsbedingungen als eine charakteristische VerfahrenskenngrBRe, die .,Standardunsicherheit" berechnet werden kann. Sie gilt furjenen Bereich, welcher der Spanne der Merkmalswerte der untersuchten Priifobjekte entspricht. Die so ermittelte Kenngrii1.k besagt indessen nichts uber die Richtigkeit der mit diesem Meliverfithren gewonnenen Ergebnisse, d. h. daR die systematische Abweichung vom richtigen Ergebnis weiterhin unbekannt bleibt. Die Vertrauenswurdigkeit der Standardunsicherheit hiingt im wesentlichen von der Vertrauenswurdigkeit der teilnehmenden Laboratorien ab. Je kleiner die Unterschiede zwischen den Ergebnissen der Laboratorien, um so stlrker die Vermutung, dal3 Zir

1

Vcrglcichsverauchc /wisehen Lahoratoricn werden fur vcrschicdene Aulgahcn eingesetlt. n i n lich: .,mr Charaktcriaicrung von McBvcrfahren" odcr ,,mr Charakterisicrung der Eigcnschalicn. d. h. dcr Merkrnalswcrte von Stoflcn" (Marerialzer1ili;ricrung) oder ,,mr Uhcrprufung dcr lcchnischen Leiqtungsfihigkcir von Lahoratorien" (prolicicncy testing)

die rnit dem untersuchten Verfahren erzielen Werte eine verhaltnismiiljig geringe Unsicherheit haben. Fur eine detaillierte Auseinandersetzung rnit dem Thema ,,Ringversuche" siehe G. Gorlitz in [3]. I S.1.5 Funfte Charakterisierungsmethode

Geordnete Schatzung der Ergebnisunsicherheit auf der Grundlage von Wissen und Erfahrung (Ein Schiitzverfahren vom Typ B) Das Vorgehen bei der .,Schatzung" von U, sieht in kurzester Darstellung wie folgt aus: 1. Der gesamte Meovorgang wird Schritt um Schritt, d. h. von der MeRplanung uber die

Festlegung der Probenahmeorte, Probenahmedauer. Probenzahl, der Messung der Hilfsparameter (Temperatur, Wasserdampfgehalt, Zusamniensetzung der Case usw.), der eigentlichen Probenahme und dem Probentransport usw. bis zur allerletzten Auswertung und Berechnung, ohne irgendeine Auslassung einer Verfahrensstufe, aufgelistet. Bei jeder Verfahrensstufe wird abgeschiitzt, welchen Einflul3 die Unsicherheit dieses Schritts (Ui) auf die Unsicherheit des Endergebnisses (U,-Wert) haben konnte. 2. Die so aufgelisteten einzelnen Schritte werden nun zu griifieren Verfahrensmodulen zusammengefaBt, wie z. B. Probenahme, Probentransport, Probenvorbereitung, Anreicherung oder Verdunnung der Probe, Messung der gesuchten Merkmalswerte, Auswertung und Berechnung der Ergebnisse. 3 . Fur jedes Verfahrensmodul wird nun die Unsicherheit des Moduls U, anhand der fur die einzelnen Verfahrensstufe geschatzten Unsicherheiten U, (gemal3 der Regel fur die Fehlerfortpflanzung nach GauB) als prozentualer Beitrag des Moduls an die Gesamtunsicherheit U, berechnet. Aufgrund einer breit abgestutzten Erfahrung wird dabei angenommen, daR sich die Einzelunsicherheiten normal verteilen und daR sie in den allermeisten Fallen untereinander nicht korrelieren. 4. Aus den prozentualen Unsicherheiten der Module U, wird schlieljlich die Gesamtunsicherheit U, des Endergebnisses der Messung (ebenfalls nach GauR) ermittelt. Alle soeben beschriebenen Schatzungen werden fur zwei Situationen gemacht, ngmlich fur: a) Unsicherheiten. die sich bei Standardsituationen (S-Fall) ergeben haben, d. h. bei Situationen, wie sie in der Praxis beim Schiitzenden in etwa 2/3 aller Fiille bei Anwendung des geschiitzten Verfahrens vorgelegen haben; angegeben wird die obere Grenze dieses Streubereichs und b) Unsicherheiten, welche bei Anwendung des geschatzten Verfahrens in ungunstigen Situationen (X-Fall) beim Schiitzenden nur selten angefallen sind, d. h. rnit einer Hiiufigkeit von einmal pro 20 Standardsituationen bis zu einmal pro 100 Standardsituationen (d. h. mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 bis 99 %). Nicht gemeint sind damit die denkbar schlimmsten Fiille iiberhaupt (worst cases), die in der Praxis selten Relevanz haben. Angegeben wird hier die obere Grenze dieses Streubereichs. Das hier beschriebene ,,Verfahren zur geordneten Schiitzung der U,-Werte von Prufungen", das auf einen Vorschlag von J. S. Morkowski 15-71 zuruck geht, wurde in die neue

IS0 Norm 17025 aufgenommen (s. Abschnitt 1.2. I ) . Die bisher mit diesem Schatzverfahren gesammelten Erfahrungen bestiitigen ohne Ausnahme die Vermutung. da8 es Ergebnisse ( U ,.-Werte) liefert, welche den Erwartungen versierter Praktiker sehr nahe kommen.

Vorbedingungen fur die Teilnahme an der Schatzung sind: Ein gutes Verstiindnis des MeBprinzips, insbesondere der wissenschaftlich-theoretischen Hintergrunde, aufdenen es aufbaut, und ein Verstiindnis fur die Bedeutung der miiglichen EinfluUgroBen - ein haufiger und schon liinger dauernder Umgang mit dem betreffenden (oder init einem sehr iihnlichen) MeBverfahren einschliefllich der Fiihigkeit zur Beurteilung der Plausibilitiit der Ergebnisse von Messungen bzw. Analysen und last but not least der Mut, um die vorhandenen Unsicherheiten LU benennen und zu quantifizieren. -

lnfolge der Schiitzung der Unsicherheiten fur zwei verschiedene ..Betriebssituritionen" bei der anwendung des Verfahrens ergeben sich zwei Zahlenreihen. aus denen zwei U,Werte berechnet werden. Der erste U,-Wert (S-Fall) wird einer einfachen Standardunsicherheit gleichgesetzt. Der zweite Wert (X-Fall) betriigt in vielen Bereichen des Prufwesens erfahrungsgemifl das zwei- bis dreifache dieser Standardunsicherheit (bei sehr unsicheren Verfrihren allerdings noch mehr). Die von einzelnen erfahrenen Messenden ( u . U. bei mehreren Personen aus dem gleichen Labor) geschiitzten U,-Werte werden wie die EinAergebnisse aus einer Vergleichsmessung zwischen Laboratorien (Ringversuch) behandelt. Die Anwendung der funften Charakterisierungsmethode bedeutet in der Praxis: -

-

-

Es ist moglich. die charakteristische KenngriiBe U, des Meflvert'ahrens unter Vergleichsbedingungen zu schgtzen. Diese wird ausgedruckt als Grenze des Vertrauensbereichs (mit 2/3 und I/,,,-Wahrscheinlichkeit) fur die Unsicherheit der Einzelwerte. Die Schwachpunkte der Verfahrensstufen, die den groaten Beitrag zur Gesamtunsicherheit des Gesamtverfahrens liefem, konnen identifiziert werden. Es ist dadurch miiglich, das Verfahren hinsichtlich der Gesamtunsicherheit zu verbessern. Insbesondere durch gezielte MalJnahmen zur Verminderung der Unsicherheit jenes Verfahrensschrittes, welcher erkanntermaBen den gro13ten Beitrag an die Gesamunsicherheit liefert. Bei der Berechnung der Gesamtunsicherheit U, des Verfahrens aus den Unsicherheiten der Verfahrensmodule U, istjeweils zu prufen. ob die Module sich hinsichtlich der Unsicherheit gegenseitig beeinflussen, d. h. oh sie miteinander korrelieren.

Erg&iiisseii derfiii!fttw Chcircrktc~ri.sirriiri~.sriirtlioilr Das Ergebnis einer Schatzung init der funften Charakterisierungsmethode kann hvispirlscceise wie folgt angegeben werden: ,.Fur 2/3 aller Fiille betriigt im S-Fall die Standardunsicherheit des Gesamtergebnisses U, dieses Prufverfahrens rund Ki c/r (Sch3t7wert fur Standardsituationen. d. h. bei Anwendung des Verfahrens unter gunstigen bzw. normgerechten Bedingungen). Im X-Fall. d. h. in 95 8 aller Fille ist die Unsicherheit des Gesamtergebnisses U, nicht groBer als ?7 r/o

Zir &ii

1.5 Methoden zur Chrtrukteri.rierungvon unulytisc~henMethodm

25

(Schatzwert fur den Fall, dalj das Verfahren unter ungunstigen Bedingungen durchgefuhrt werden mulj). - Diese Schatzwerte gelten fur Raumtemperaturen zwischen 20 "C und 25 "C und Luftfeuchtigkeiten zwischen 45-55 % r. F. Die Nachweisgrenze dieses Prufverfahrens liegt bei 2 mg Prufsubstanzkg Probe im Trockenzustand." Die Cute der mittels der funften Charakterisierungsmethode gefundenen Schatzergebnisse ist zunachst ein Spiegelbild des Wissens und der Erfahrung des Schiitzers betreffend des geschiitzten Verfahrens. Zugleich sind sie aber auch ein Ausdruck seines Konnens zur realistischen Darstellung jener Fehler, die (scheinbar nur) in seinem Labor schon aufgetreten sind und ein Zeichen seines kritischen Sinnes, der Unsicherheitsquellen erkennt, was den Schatzer uberaus ehrt. Man darf ohne zu zogern vermuten, dalj die Ergebnisse solcher Schatzungen durch wissende, erfahrene und der Wahrheit mutig ins Auge schauende Praktiker nicht schlechter (und nicht schockierender!) sind, als die oft ,,unglaublichen" Ergebnisse von Vergleichsversuchen zwischen Laboratorien (gemalj der vierten Charakterisierungsmethode),bei denen sich die Ergebnisse untereinander oft ganz wesentlich unterscheiden. In beiden Fallen werden die groljen Streuungen der Ergebnisse durch die gleichen Ursachen bewirkt, namlich durch die vielfaltigen und oft bedeutsamen Einflusse auf die einzelnen Schritte des Verfahrens, die in den Laboratorien in unterschiedlicher Weise wirksam werden, die aber in der Laborpraxis allzu oft aus Unwissenheit unbeachtet oder als untergeordnet unerwahnt bleiben. Sind die Problematik und Tucken eines Verfahrensmoduls dem Schiitzenden nicht gut gelaufig, so kann er schwerlich dessen Unsicherheit U, schatzen. Damit ist er auch auljer Stand, die Gesamtunsicherheit U, des Verfahrens zu schatzen. Tut er es dennoch, darf dies nur unter dem Vorbehalt geschehen, dalj die fehlende Erfahrung sobald wie moglich gewonnen und der provisorische Schatzwert allenfalls korrigiert wird. Dies bedeutet, daO das unbekannte Modul so schnell wie nur moglich nach einer der 0. g. vier ersten Methoden charakterisiert wird oder, sofern dies experimentell nicht moglich ist, statt dessen erfahrene Praktiker befragt werden, mit deren Hilfe eine Schitzung der Unsicherheit des besagten Moduls U, durchgefuhrt wird 181. Die Vorteile und die Nutzlichkeit der funften Methode zur Charakterisierung der Unsicherheit der Ergebnisse sind evident. Oft stellt sie die einzige praktikable Moglichkeit dar, um eine erste Abschiitzung der Gesamtunsicherheit U, eines quasi neuen Verfahrens zu erlangen; z. B. dort, wo Priif-, Melj- oder Analysenergebnisse schnellstens benotigt werden und wo das ,,neue" Verfahren aus an sich wohl bekannten, erprobten und gut beherrschten Verfahrensmodulen ad hoe zusammengebaut wird. In einem solchen Fall wird die Gesamtunsicherheit U-, ails den schon von fruher her bekannten Unsicherheiten U, der verwendeten Verfiihrensniodule abgeschatzt. Bei diesem Vorgehen sollte klar sein, daB die verwendeten U,-Werte nach verschiedenen Charakterisierungsmethoden ertnittelt wurden. Die einen kiinnen eine experimentelle Grundlage haben und andere auf der Basis von Erfahrung und dem wissenschaftlichen Verstandnis des verwendeten PrinTips geschiitlt worden sein. Die soeben geschilderte Situation kommt bei F+E-Arbeiten ofter vor. Nicht immer kann hiei- schon im voraus gesagt werden, BUS welchen Verfahrensmodulen das jeweils benotigte Verfahren zusatnmengebaut werden wird. Eine schnelle Schatzung des U,-Wer-

26

I Grundsutze der W i d i e r u n g in der Anulytik und im Priifwesen

tes ist nur ein Notbehelf. dem mit einer systematischen Untersuchung der EinfluBgroBen oder durch Vergleich der Ergebnisse mit einem anderen unabhangigen Verfahren oder dem Vergleich mit anderen Laboratorien so bald wie moglich abgeholfen wird. Diese Charakterisierungsmethode, die quasi eine Alternative zur klassischen Validierung darstellt, gewinnt stets an Bedeutung. So ist sie bereits mehrfach Gegenstand von Publikationen gewesen. GemaB ihrer wachsenden Bedeutung wird in Abschnitt 3.2 und in Kapitel9 ausfuhrlich auf deren praktische Anwendung eingegangen. Es kann vorkommen, daB die schon bestehende Charakterisierung eines Verfahrens oder eines Verfahrensmoduls, welche bereits nach einer Charakterisierungsmethode vom Typ A (d. h. Methoden 1-4) erfolgte, um eine Charakterisierungsmethode vom Typ B erweitert werden muB. Am besten geeignet scheint hierfur die Charakterisierungsmethode 5. 1 .S.1.6 Kombination der funf Charakterisierungsrnethoden

Das Wissen eines Labors um die Unsicherheiten der verschiedenen Verfahrensstufen basiert auf recht unterschiedlichen Erfahrungen. Die das Verfahren anwendende Person mag die eine Verfahrensstufe recht gut im Griff haben; uber eine andere Verfahrensstufe wurde sie gerne etwas mehr wissen; schliefilich weiB sie uber eine weitere Verfahrensstufe nur soviel, daB sie recht unzuverlassig ist und verrnutlich erhebliche Unsicherheiten in sich birgt. Dieses ungenugende Wissen um die Unsicherheit bestimmter Verfahrensstufen spiegelt das realistische Problem wider, rnit dem sich der Validierende oft konfrontiert sieht. Aus diesem Grund setzt sich in der Praxis die Charakterisierung eines komplexen Verfahrens oft aus mehreren Charakterisierungsmethoden zusammen, d. h. daB sie eine Kombination von mehreren der 0. g. funf Charakterisierungsmethoden ist.

Beispiel Basiert eine Verfahrensstufe auf einer Messung mit dem Ziel, physikalische Merkmalswerte eines MeBobjekts festzustellen, so wird man zu dessen Charakterisierung die zweite Charakterisierungsmethode verwenden (Kalibrierung mit systematischer Untersuchung der wesentlichen EinfluBgroBen). Fur die Abschatzung der Unsicherheiten, die sich aus der Probenvorbereitung ergeben konnen, wird man oft die erste Charakterisierungsmethode nehmen (systematische Untersuchung der EinfluBgroBen). Sollen indessen die Unsicherheiten abgeschatzt werden, die sich in einem bestimmten Verfahren bei der Probenahme und dem Probentransport ergeben konnen, so ist eine gute Kenntnis der wissenschaftlichen Zusammenhange und eine ausgiebige praktische Erfahrung im Umgang rnit diesem Verfahren die einzige realistische Grundlage fur die Ermittlung realistischer Werte von U, gemal3 den Regeln der funften Charakterisierungsmethode. Die gesuchte Gesamtunsicherheit des Ergebnisses U, kann in diesern Fall nur dank einer Kombination der 0.g. drei Charakterisierungsmethoden (fur die gesuchten drei U,Werte) ermittelt werden.

1.6 Chrirtiktc.risieriing (Qualififizieruns)von Methodm

27

1.5.1.7 Weitere Methoden vom Typ B

In FHllen, da eine Verwendung einer der 0. g. funf Charakterisierungsmethoden nicht moglich oder nicht zweckmHSig ist, bleibt manchmal die Moglichkeit, eine weitere Charakterisierungsmethode vom Typ B einzusetzen, so 2. B.: 1. Charakterisierung eines Verfahrens durch Sirnulotion, d. h. Untersuchung analoger Prufobjekte mit bekannten Merkmalswerten. Diese Methode ermittelt die zur Charakterisierung des untersuchten Verfahrens bendtigten Informationen (insbesondere den Wert von U,) durch Messung von gut bekannten. d. h. kalibrierten MeSobjekten, welche dem zu prufenden Original bezuglich der maBgebenden Merkmalswerte sehr Hhnlich sind. Zu beachten ist dabei, daf3 das durch Simulation charakterisierte MeSverfahren den Bedurfnissen des Auftraggebers ZLI genugen verrnag. Diese Simulationsmethode konnte man als eine Ableitung der zweiten Charakterisierungsmethode mit einer ..Quasi-Kalibrierung" bezeichnen. 2. Charakterisierung eines Verfahrens durch Ber-echnungen,die sich aufverifizierte Rechenmodelle stutzen.

Diese Charakterisierungsmethodeermittelt die benotigten Informationen (insbesondere den Wert von U,) durch Berechnungen, die von reellen Prufergebnissen ausgehen und diese in ein veritiziertes Rechenmodell einbringen. Dies berucksichtigt zugleich die wissenschaftlichen Zusammenhlnge des untersuchten Verfahrens ebenso wie die anderweits untersuchten Einflusse auf das Gesamtergebnis. Bedingung fur die Verwendung dieser Methode ist einerseits, daR das verwendete Rechenmodell durch plausible Rechenergebnisse verifiziert wurden und dem neuesten Stand der Erkenntnisse/der Technik entspricht und daR es anderseits den Bedurfnissen des Auftraggebers genugt.

1.6

Charakterisierung (Qualifizierung) von Methoden als letzter Schritt einer Validierungsprozedur

Letzter Schritt der Validierungsprozedur ist der Vergleich der gefundenen charakteristischen Merkmalswerte der untersuchten Methode mit den Forderungen, wie sie sich aus einem Auftrag oder aus Spezifikationen ergeben, urn eine bestimmte Aufgabe angemessen losen zu konnen. 1st das Ergebnis des Vergleichs positiv, d. h. dal3 die fur den Auftrag vorgesehene Methode geeignet ist, so hat das Labor dies formell durch eine schriftliche Erkllrung festzustellen. In der Praxis wird man sagen: die Methode ist validiert und fur einen bestimmten Verwendungszweck qualifiziert. Fur Akkreditierstellen stellt sich die Frage, wie diese Forderungen der IS0 17025 praxisnah zu uberprufen sind. Im Sinne des Qualitatsmanagements (ISO-9000 ff.) fordert die Norm vom Labor eine Dienstleistung, die der Aufgabe des Kunden angemessen ist und eine dementsprechende Prufung des Vertrages erfordert. Die fur die Aufgabe vorgesehene Methode ist darauthin zu uberprufen, ob sie fur die Losung des konkreten Kundenpro-

blems tatsiichlich geeignet ist, d. h. daB. die Methode zu validieren ist. 1st die Eignung uberpriift und gewiihrleistet, so hat das Labor diese Tatsache xu bestiitigen. Gemiil!, den vorausgegangenen Ausfuhrungen wird die vorgesehene Methode fur den konkreten Kundenauftrag qualitiriert. Es kann vorkommen, dal!, das Labor irn Vertrag einschrankend feststellen muR, d.'1.I< es einige Forderungen nicht oder nur teilweise erfullen kann (weil es z. B. fur die Messung eines bestiinmten Merkmalswertes nicht eingerichtet ist). SchlieBlich ist zu beachten. dal!, die vollstindige Vertragsprufung nicht nur die Beherrschung des Meaverfahrens behandelt (d. h . Personalqualifikation, Merkmalswerte der Methode, angemessene Einrichtungen u. 2. m.) sondern auch andere Aspekte wie z. B. rechtliche Gesichtspunkte, Terminfragen, die Verfugharkeit von geeignetem Personal und Einrichtungen und nicht zuletzt die Kostenfrage.

1.7

Freigabe von Methoden, Dokumentation

Der Laborleiter ist dnfur verantwortlich, dal3 alle in seinein Labor verwendeten Methoden (vorrangig die nicht genormten) charakterisiert werden in einein Umfang, welcher den1 beabsichtigten Verwendungszweck angemessen ist. Bevor eine Methode in einem Labor routincmiil3ig eingcsetzt wird, muB sie vom Laborleiter fur den Gebrauch ausdrucklich freigegeben werden. Aus Erfahrung wissen wir. dal3 genormte Verfahren oft ohne eine kritische Uberprufung in die laufende Laborpraxis ubernommen werden. Das kann sich riichen, geht es bei der Methode tatsachlich um Wahrheitsfindung und nicht nur um eine formale Konformitlitsprufung. Der Zeitpunkt der Freigabe einer Methode sollte aus deren Dokumentation klar ersichtlich sein. Die init der Anwendung einer Methode betraute Person sollte den Laborleiter dariii~fai~frnerks;iin machen. wenn bei deren Anwcndung Bedingungen von jenen abweichen, die geinliB Dokumentation fur ihrc Charakterisierung mnOgebend waren (definierter Anwendungsbereich). Die Durchfuhrung und die Ergebnisse der Charaktei-isierung einer Methode miissen LILISreichend tiokumentiert und anschlieSend nrchiviert werden, siehe Abschnitt 2.2.

I .8

SchluBbemerkungen

Die ISO-Definition ;itis den1 Juhre I994 iind der nahc/ii woitgleiche Test der IS0 17025:2000 schafl'ten Klarheit be/iiglich des Begriffes Validierung. Es sind gutc Definitionen: Der Analytiker hcwahrt weiterhin seine Frriheit -.jedenfnlls l i i t i t Definition. Die Vcrwirrung. was Validiei-tins sein sollte. diirite somit spiirhar nachl;i\\cn. Es geht ,jet/t iii tlcr Vrilidic.ruiig\praxis tin1 Inhalte. Durchfiihriingsmodiis u n r l den Umg;ing niit Zahlcn. Datiiit \vcrden v,ir tins i n den nichsten Knpiteln heschliftigen. Abhzngig von dci- konkietcn Fr;igestellung abrr auch von dcn :thtiiellcn Mijglichkciten gibt es unterschiedliche Wege. eine Validierung durch/ufuhren.

1.8 Schluj’hernerkungen

29

Einen Ansatz stellen die vorgestellten Charakterisierungsmethoden dar. Deren Anwendungsbereich erstreckt sich uber alle zu validierenden Verfahren. Diese Methoden zeigen dem Labor einen Weg, wie es den Nachweis fuhren kann, daB eine bestimmte Methode fur den vorgesehenen Verwendungszweck geeignet ist, bzw. ob es den Forderungen eines Auftraggebers entspricht. Dem Fachbegutachter einer Akkreditierstelle konnen sie helfen, auf die Frage zu antworten, ob das Labor die Fiihigkeit besitzt, geeignete Verfahren einzusetzen, d. h. solche, die geeignet sind, die vom Auftraggeber gestellten Aufgaben in angemessener Weise zu Iosen.

In der Praxis konnte die Anwendung der einzelnen Charakterisierungsmethoden wie folgt aussehen: Die erste Charakterisierungsmethode ist fur Konventionsmethoden geeignet. Hier ist die Untersuchung der EinfluBprarameter wichtig, es geht um Vergleichbarkeit von Ergebnissen. Kalibrierung ist eine hervorragende Moglichkeit (zweite Charakterisierungsmethode) wenn Normale, zertifizierte Referenzmaterialien oder sehr gut charakterisierte Standards vorhanden sind. Ergebnisvalidierung durch Vergleich ist sicher und schnell. 1st eine der genannten Moglichkeiten nicht gegeben, und ist weiterhin das Wissen um Richtigkeit wichtig, kann man sich der dritten Charakterisierungsmethode bedienen, namlich des Methodenvergleichs.

In der Praxis werden diese drei Methoden oft kombiniert: Kalibrierung mit Standards, gefolgt von der Untersuchung der spezifischen EinfluBparameter auf das Ergebnis oder Prufung auf Richtigkeit durch Methodenvergleich und parallele Untersuchung der EinfluBparameter. Die dritte Charakterisierungsmethode sollte nur bei Mangel an Referenzsubstanzen eingesetzt werden. Die vierte Charakterisierungsmethode (Ringversuche) wird immer seltener zu Validierungszwecken von Methoden eingesetzt. - Das Schiitzen der MeRunsicherheit, funfte Charakterisierungsmethode, sollte in F+EBereichen kunftig mehr eingesetzt werden. Tatsachlich erfreut sie sich einer wachsenden Beliebtheit. -

Eine weitere Charakterisierungsmethode ist die Uberprufung der Mrrhodrnsrubilitiit, d. h. die Verfolgung eines Ergebnissesrnertes in Abhangigkeit von der Zeit mit Hilfe der statistischen ProzeBkontrolle, SPC (s. Kapitel 8 und 9). Die unbestrittenen Erfolge der SPC in der Produktion verschaffte ihr Gehor auch in der Analytik. Ein erster Hinweis dafur: Neuerdings verlangen immer mehr FDA-Inspektoren den Beweis, daB die Prozesse in statistischer Kontrolle, ISK, sind [8]. Die Beweisfuhrung, daR die zu untersuchende Methode einen 1SK-Prozel!,darstellt, wird bereits als eigenstandiger Punkt im Rahmen der Validierung angesehen [9].

Handbuch Validierung in der Analytik Stavros Kromidas Copvriaht 0 2000 WILEY-VCH Verlaa GmbH

2

Vor Beginn der Validierungsarbeiten: Voraussetzungen, Dokumentation, Geratequali fizierung

2.1

Voraussetzungen

Vahdierung ist Nachweis der Qualitiit; Qualitiit bedeutet Eignung fur einen bestimmten Gebrauch, .,fitness for use'' [3]. Folglich ist Validierung eine zweckgebundene Priifung auf Eignung, ein Eignungsnachweis. Und ein Eignungsnnchweis bedarf eines grrigneten Umfeldes. Die Faktoren, die die Qualitiit einer analytischen Tiitigkeit - also auch einer Vahdierung - bestimmen, sind jene bekannten 5 M's: Mensch, Maschine, Methode, Material, Milieu. Man konnte hier ein sechstes ,,M" hinzufugen: Management. Auf die Validierung bezogen bedeutet das folgendes (s. Abb. 2-1): Weiterhin sollte vom Management die Bereitschaft bestehen, mit allen Beteiligten das Validierungsziel gemeinsam zu formulieren oder wenigstens unniiljverstandlich mitzuteilen. Schlieljlich sollten wichtige Daten iiber die Probe, wie Ort, Art und Zeitpunkt der Entnahme, Transport, Konservierung usw. bekannt sein. Das Wissen um die Historie der Probe kann bei spater auftretenden Fragen von entscheidender Bedeutung sein.

Mensch

_ _ _ _ _ ~ ~

+

qualifiziertes Personal, das die Methode beherrscht ~~~

~~

Maschine

+

qualifiziert, kalibriert, robust

Methode

eindeutig charakterisiert, geeignet

Material

+ +

Milieu

+

Das (analytische) Umfeld und mogliche Einflusse sind bekannt, z. B. Feuchtigkeit, Temperatur, Strahlen, Schwingungen

Management

+

Das Labormanagement steht hinter dem Validierer, ausreichende Zeit und notwendige Mittel sind gewahrt, inhaltliche Differenzen uber Urnfang und Modus der Validierung sind zu diesem Zeitpunkt bereits beige-

Qualitat der eingesetzten Materialien bekannt und f u r die konkrete Aufgabe ausreichend

legt. Das hei0t zusammengefa0t: Das Management sorgt f u r eine reibungslose Ausfuhrung der Validierung. ~~

Ahh. 2-1 Faktoren. die die Oualitat von Ergehniswm heeinfluscen

1. Zielsetzung genau definieren, bei Auftragen von auOerhalb des Labors rnit dern Auftraggeber die Ziele unrnil3verstandlichfestlegen (Was will ich/der Kunde wissen und warum?). 2. Daraus abgeleitet: Leistungsrnerkrnale und Akzeptanzkriterien (Was muB ich rnessen/welche Daten brauche ich, urn die gestellte(n) Frage(n) beantworten zu konnen?) 3. Methode, soweit sie nicht festgelegt ist, rnit geeigneten Leistungsrnerkrnalen wahlen (Mit welcher Methode kann ich die benotigten Daten ermitteln?'). 4. Prufer bestirnrnen, evtl. Validierungstearn bilden (Die (der) Verantwortliche verfugt uber

fachliche und soziale Kompetenz). 5. Zusarnrnen rnit dern (der) Prufer(in) bzw. Validierungstearn detaillierten Validierungsplan rnit genauen Anweisungen zu folgenden Punkten erstellen: Art, Durchfuhrungsrnodus und Haufigkeit der Experirnente fur die einzelnen Prufpunkte inkl. statistischer Berechnungen Spezifikationsgrenzen, Arbeitsbereich und MaBnahmen bei Abweichungen (rf - then, Umgang rnit Zahlen, AusreiBertests) Qualitatskriterien und Art der Prufung fur Geratschaften und Reagenzien -

Kontrollen und Plausibilitatsbetrachtungen Vorgehensweise zurn Herausfinden der kritischen Punkte der Methode (siehe auch Robustheit, Abschnitt 3.4)

Die kritischen Punkte der Methode stellen gleichzeitig Kriterien fur einen spateren Systerneignungstest dar. Weiterhin dienen sie als Basis fur zukunftige Entscheidungen, wann eine Revalidierung notwendig ist2. 6. Methode auf Basis der experirnentell errnittelten Ergebnisse und den Anforderungen charakterisieren (Ja, sie ist aufgrund dieser Ergebnisse fur den und den Konzentrationsbereich/fur diese Matridnach den Forderungen der Behorde X usw. geeignet - oder nicht geeignet) . 7. Ernpfehlungen, wie in der Laborroutine rnit dern rninirnalsten Aufwand die relevanten Charakteristika der Methode uberpruft werden sollen, z. B. durch das Fuhren einer Regelkarte rnit einer Qualitatsprobe.

8. Dokurnentation und Archivierung.

2

Es wird auch die Meinung vertreten, dan die Methodenauswahl eigentlich vor der Validierung abgeschlossen 1st In diesem Fall beginnt die Validierung rnit Punkt 4 Der klassische Systemeignungstest - Gfache Messung eines Standards vor und am Ende einer Menserie - kann in vielen Fallen ohne Verlust an Information entfallen bzw in groneren Zeitabstanden erfolgen Voraussetzung dafur 1st ein robustes Gesamtverfahren Dies kann mit Hilfe der SPC uberpruft werden (s Kapitel 8)

Abh. 2-2 Schrirrc cincr Mcthodcnvalidierung

2.2 Dokumentution

33

Sind diese Voraussetzungen gegeben oder konnen sie geschaffen werden, so folgt anschlieRend eine genaue Planung des Vorhabens. Abbildung 2-2 ist als Checkliste gedacht, die fur den eigenen Fall modifiziert werden kann.

2.2

Dokumentation

D i e Validierung wird in der Regel m i t der Erstellung eines Berichtes beendet. Er basiert auf dem Validierungsprotokoll, das wlhrend der Messungen sukzessiv erstellt wird. Wie zu erwarten, gibt es unterschiedliche Auffassungen uber Umfang, Tiefe und Form des Validierungsberichtes. Abbildung 2-3 gibt einen Uberblick uber wesentliche Inhalte eines Validierungsberichtes wieder. In Zusammenhang mit Dokumenten zu Validierung wird auch der Vulidution Muster P l m , VMP, genannt. Dieser kommt aus der Pharmaindustrie und bezieht sich - Shnlich

Kurze Zusammenfassung mit kommentierter Stellungnahme Zielsetzung und Anwendungsbereich der Methode, evtl. Angabe von Spezifikationsgrenzen Prinzip und Charakteristika der Methode, ggf. rnit Literaturangaben und Hinweis auf Standardwerke

-

Genaue Beschreibung der untersuchten Muster mit Angaben uber Probenahme, -konservierung und -transport, Probenvorbereitung, Arbeitsbereich und Matrix Eingesetzte Gerate und Chemikalien inkl. Tests zur Qualitatskontrolle bzw. Hinweis auf Qualitatsdaten (z. B. zertifizierte Referenzmaterialien, Kalibrierung) Detaillierte Beschreibung der Messungen mit Angaben uber samtliche experimentelle Bedingungen. Es ist fur den Leser hilfreich, wenn im Validierungsbericht bei den entsprechenden Validierungsparametern je ein Rechenbeispiel enthalten ist, z. 6. F- und &Test bei der Richtigkeitsprufung durch Methodenvergleich oder Berechnung der V i s bei zwei Konzentrationsniveaus (s. Abschnitt 3.2 und 3.3).

-

Optische Hilfen sind sehr einpragsam: Chromatogramme, Tabellen, Spektren, Kalibrationskurven, Regelkarten usw. Zu den Ergebnissen gehoren neben ermittelten Zahlen auch: - Akzeptanzkriterien Spezifikationsgrenzen Angaben zur Methodenfahigkeit - Angaben zur MeOunsicherheit - Tests fur die Routine und Kriterien fur Revalidierungen Name des Validierers und des Gegenprufers

Abb. 2-3 Miigliche lnhalrc cincs Validicrungsberichtcs.

dem Regelwerk GMP - im wesentlichen auf die Produktion (Herstellung). Die Analytik spielt in diesein Zusammenhang eine untergeordnete Rolle. Daher wird hier nur k u r r darauf eingegangen. VMP ist ein Dokument mit Informationen uber die Firmenphilosophie z u m Validierungsprograrnm der Firina. d. h. wie die Firma ihrc Vtilidierungsaufgabcn erledigt. Die Intention eines VMP ist:

- eine Beschreibung zu besitzen fur: warum, von wem, wie und wann die Validierung zu -

-

erfolgen hat, Infomiationen uber aktiielle Regelwerke, Anordnungen, Hinweise bwiiglich Validierung LLI liefern. sowie die Kompetenz der Firma fur adiiquate Validierungen zu deinonstrirren,

Die Ziele eines VMP in1 Einzelnen sind: in einem GMP-Dokument den Umfang der geplanten Validierungsaktivitiiten zu detinieren, - die einzelnen Aktivitiiten zu strukturieren und zii Prioritiiten/ReiherifoIgen festrulegen, - die ~ ~ I L notwendigen L I Arbeitsgrundlagen festzulegen (z. B. durch Vcrweis auf gultige SOP'S oder interne oder externe Richtlinien). die Verantwortlichkeiteii innerhalb der Aktivitliren dcs VMP abzugrenxn, Pliine uber den notwendigen Zeit- und Kaparitiitsbedarf aufzustellen und damit die Gcsaintkosten der im VMP zusammengefaDten Validierungsprolekte transparent zu machcn. -

~

Die Zielset/iing und Gliederung cines VMP konnen nach Scheidmeir [ I01 wie folgt rusammengefiiDt werden. siehe Abb. 2-4.

2.3

Geratequalifizierung

Eine wichtige Voraussetzung fiir eine korrekte Validierung von instrumentellen Methoden ist ein qiialitij.iertes Geriit. Die Eignungsprufung des Geriites erfolgt durch die Geriitequalifizierung, die auf vertraglich vereinbarten Spezitikationen rwischen Anwender und Hersteller fuOt. Dieses Konzept basiert auf dem sogenannten Lebenszyklus-Model1 und hat seinen Ursprung in der pharmazeutischen Industrie. s o wird es u. a. von der FDA, PMA und PIC (zu den Abkurzungen siehe Anhang) vorgeschlagen. Interessierten Lesern sei auf die detaillierten Ausfuhrungen in [ I 1-13] verwiesen. Die funf Lebenszyklus-Phasen sind: -

.,Tender-Enquiry Phase": ,.Pre-Qualification": ,,Qualification": ,,Validation": ,,On-Going-Evaluation'~:

Lastenheft mit projektbezogenen Forderungen Entscheidung fur ein Design Funktionstest Priifung auf zweckgebundene Eignung Erhaltung des validierten Zustands fur die gesamte Lebensdauer des Geriites

-

Einleitung, Zielsetzung des betreffenden VMP's ~~~~~

.

~

Definieren des Geltungsbereichs Kurzbeschreibung des Umfeldes, in dem die Validierungsprojekte geplant sind, z. B.: Produktionsstatten, Produkte, Anlagen Liste aller Validierungsprojekte, z. B. Betriebsmittel, Prufmittel, Verfahren

-

Validierungsaktivitaten, z. B. Kalibrierung, IQ, OQ (s. Text), Computetvalidierung, Prozek-/Methodenvalidierung, Reinigungsvalidierung Festlegungen zu folgenden Punkten, z. B. Dokumentation und Archivierung, Aktionsplan fur ,,out of spec"-Situationen, Verantwortlichkeiten fur jedes Projekt Zeitplan aller Validierungsaktivitaten und Priorisierung Verweise auf die gultigen Richtlinien und Standardarbeitsanweisungen (SOP'S) zu folgenden Punkten: - Organisation Genehmigungsverfahren - Archivierung - Formatvorlagen - Abweichungs- und Anderungskontrolle (,,change control management") - Anlagen, die bei Bedarf aktualisiert werden - Auflistung aller zitierten Dokumente, hierhin gehoren einzelne SOP's fur Methodenvalidierungen - Auflistung aller zu validierenden Objekte (Einrichtungen, Produkte) rnit den jeweiligen Validierungsverantwortlichen

Abb. 2-4 Glicdcrung eines Validalion-Master-plans (VMP).

Nachfolgend w i r d dieses Konzept auf die Geritequalifizierung bezogen, vorgestellt und kurz erliutert. Allgerneingultige Leistungscharakteristika und MelJbereiche, die fur den Einsatz gefordert werden und durch den Kaufvertrag zwischen Anwender und Lieferant vereinbart werden, (operational spezification, Leistungsspezifikation). fallen unter die W i r d der Forderungskatalog urn fur den konkreten Einsatz (besondere Umweltbedingungen, Ausbildungsstand des Personals) relevante Punkte erweitert, spricht man von einer FS (functional spezijiication, funktionale Spezifikation). D i e allgemeinen Leistungscharakteristika sowie die speziellen Forderungen fuhren zu den schlufiendlichen Anforderungen des Kunden. A u f Basis der funktionalen Spezifikationen werden nun die technischen Spezifikationen festgelegt. Sie werden auch Ausfuhrungs-Spezifikationen genannt. Das so erstellte Lastenheft bildet die Basis fur die Auswahl des Gerites. Dieser Part mit den detaillierten Anforderungen des Kunden w i r d als design qual$iicarion, DQ (,,Designqualifizierung") bezeichnet.

0s

Die oben beschriebenen Aktivitiiten gehoren zeitlich in ein fruhes Stadium, niimlich wiihrend der Entscheidungstindung fur eine Methode bzw. bei den Kaufverhandlungen f u r ein Geriit nachdem die Methode entschieden worden ist (5. ersten Punkt des Lebenszyklus). Es kann an dieser Stelle diskutiert werden, ob solche Festlegungen und Vereinbarungen als Teil der Validierung angesehen werden sollten oder ob Validierung mit dem physischen Eintreffen von Geriit, Probe und Chemikalien im Labor beginnt. Betrachtet man die Validierung vom tiiglichen Geschehen etwas IosgelW so fangen die ersten Gedanken zur Validierung praktisch zeitgleich mit den ersten Losungsansiitzen fur ein analytisches Problem an. ja sie sind ein Teil davon. Andererseits wird der Praktiker vor Ort die Erstellung eines Lastenheftes kauin als Teil einer Validierung auffassen. Der Leser miige diese Frage fur sich entscheiden, das weitere Vorgehen wird davon kaurn beeinfluBt. Nachdeni n u n das Geriit bestellt und geliefert ist. beginnt die Gerstequalifizierung EQ (04~ripmwt~ ~ ~ ~ / ~ ~Das ~ ist ; ~der , ~Prozefi / t ; zur ~ ~Sicherstellung, ~ ? ~ . daO das Geriit fur den

beabsichtigten Gebrauch geeignet ist und dalj es gem20 den zwischen Anwender und Lieferanten vereinbarten Spezifikationen arbeitet. Die Geriitequalifizierung erfolgt in drei Stufen: -

IQ (installation qualification, Installationsqualifizierung)

-

OQ (operational qualification, funktionale Qualifizierung)

-

PQ (performance qualification, Leistungsqualifizierung)

In der Literatur wird die design qualification oft als der erste Schritt der Geriitequalitizierung angesehen. Die Argumentation lautet, dalj eine erste ..Qualifizierung" bereits eine richtige Entccheidung fur Design und Hersteller ist. In diesem Fall stellt Ger~itequali~i~ierung eine nicht ;ius drei, sondern iius vier Stufen bestehende Mafinahme dar: DQ. IQ, OQ, PQ. -

Unmittelbar nach der Lieferung erfolgt die IQ (installation qualification. Installationsqua1i tizierung).

-

Bei der IQ wird festgestellt, ob das Geriit wie bestellt und spezitiziert geliefert wurde und oh es ordnungsgemii0 am fur die vorgesehene Aufgabe geeigneten Ort installiert worden ist. Das ist der formale Abnahmetest des Geriites vor Ort. Dieser beinhaltet den Check aller installierten Teile und Vergleich init den Herstellerspezifikationen bzw. Vereinbarungen z. B. Berucksichtigung der Sicherheitsaspekte,Vollstiindigkeit der Zubehiirteile, korrekte Installation der Anschl e, Vorhandensein aller Handbucher (wenn tereinbart, in Deuthch!). korrekte Anzeige der Dia,onosewerte. An zweiter Stelle erfolgt die OQ (operational qualification, funktionale Qualifizierung). Bei der OQ wird festgestellt, ob das Geriit ,,hier und jetzt" entsprechend den Funktionsspezitikationen ( h w . zusatzlich vereinbarten ,,funktionalen" Spezitikationen) arbeitet. OQ wird direkt nach der IQ durchgefuhrt, aber auch nach grokren Austauschaktionen. Standortwechseln brw. Reparaturarbeiten. Die korrekte Funktion des Geriites kann ggf. init Hilfe von Testmischungen uberpruft werden. Beispiele einer OQ in der HPLC sind Flufirichtigkeit, Mischungsqualitiit beim Gradienten. Wellenliingengenauigkeit,Temperaturkonstanz. Man kann durchaus die Auffassung vertreten, dal.3 die Kalibrierung des Geriites bereits in diesen Schritt gehiirt.

Es sei noch angemerkt, daB bei der OQ gerade die kritischen Gerateparameter identifiziert und uberpruft werden sollten. Das heifit konkret, daR eine OQ erst nach Uberprufung der Funktionsfihigkeit an der unteren und oberen Spezifikationsgrenze also unter ,,worst-case"-Bedingungenerfolgreich beendet ist ! - Als letzter Schritt folgt die PQ (performance quulijcation, Leistungsquuli~~ienrng). Bei der PQ wird mittels einer typischen Applikation die Leistungsfahigkeit des GeAtes fur den vorgeschlagenen Routinegebrauch festgestellt. Diese Uberprufung erfolgt sinnvollerweise unter Verwendung von Anwenderproben, es wird beispielsweise getestet, oh ein gewunschter oder erwarteter Prlzisionswert rnit dem Gerat erreicht wird. Ein bewlhrtes Werkzeug fur die Routine stellen hier die Regelkarten (statistische ProzeBkontrolle, SPC) dar. Um MiRverstiindnisse zwischen den beiden Begriffen ,,Systemtest" und ,,Systemeignungstest" zu vermeiden, sollte man klarstellen, daB der Systemtest (oder Geratetest) rnit einfachen Testmischungen durchgefuhrt wird. Es werden keine individuellen Proben verwendet, weil es ja hier um die Qualifizierung des Gerates und nicht um die der Methode geht; mogliche Fehler durch die Methode (z. B. Proben rnit komplexer Matrix) sollen auBen vor bleiben. Fur den Geriitetest wird haufig der weniger gliickliche Begriff ,,Gerute~~alidierurIg" verwendet. Der Gerltetest ist die Voraussetzung, der erste Schritt, allenfalls ein Teil der Methodenvalidierung. Abhangig von der Art der Anlage konnen naturgema8 Gerltetests sehr unterschiedlich ausfallen [ 14, 151. Der Systemeignungstest (system suitability test, SST) umfaBt Gerlt, Methode, Probe und Rechner als ,,integrales System". Die Durchfuhrung m u j rnit realen Proben erfolgen und zwar dringend. Selbstverstandlich kann man auch den pragmatischen Weg gehen und nur den Systemeignungstest durchfuhren: Wird ein kleiner Wert fur den Variationskoeffizienten V , (s. Kapitel 3) ermittelt, so gewinnt man die Erkenntnis, daB der Fehler (Streuung) durch das Gerat und die Methode unterhalb der vorgegebenen bzw. tolerierten Grenze liegt. Der Nachteil hierbei ist, daB die einzelnen Beitrlge von Gerat und Methode zur Gesamtstreuung im Verborgenen bleiben. Die mogliche Antwort eines Pragmatikers ware: ,,Solange der V , unter den geforderten 1,5 % liegt, interessiert mich nicht, wo der Fehler herkommt." Diese Antwort wlre unter Umstanden auch zu akzeptieren.

2.3.1 Das ,,V"-Model1 Eine ubersichtliche Darstellung der einzelnen Schritte einer Geriitequalifizierung gelingt rnit dem ,,V"-Modell. Der linke Schenkel eines ,,V" reprlsentiert die Aktivitiiten vor der Realisierung eines Projektes, der rechte Schenkel vom ,,V" die Testaktivitaten, d. h. die Prufung nach der Lieferung. Dieser Ansatz sei nachfolgend kurz erlautert. Am Anfang steht die Idee. Daraus ergeben sich Forderungen der Anwender an das Produkt. Es schliel3t sich die Entscheidung fur ein Design entsprechend den Forderungen an. Nun wird bestellt und geliefert. Nach der Lieferung erfolgt der Test, oh technisch alles in Ordnung ist. Der nlchste Schritt ist die Qualifizierung d. h. der Check, ob die Kundenanforderungen erfullt sind. Der Lebenszyklus schlient rnit dem Routineeinsatz, der auch Modifizierungen und Wartung beinhaltet, siehe Abb. 2-5.

Kunde

Lieferant. eventuell zusamrnen mit dern Kunden

Forderung

Qualifizierung

( Design ) KonzeDtion

Abnahmetest

U

V

Realisierung

Abb. 2-5 Das P r i w i p des ..V"-Modclls tur einen Produkt-Lchens/.yklus

Auf die Geriitequalifizierung ubertragen siihe das .,V"-Modell wie folgt aus: Auf der linken Seite stehen die Spezifikationen entsprechend den Wunschen des Anwenders. Nach Auswahl von Geriit und Lieferant erfolgt die Bestellung des Geriites mit dem gewunschten Design, es folgt n u n die Geriitelieferung in der erhofften Ausfuhrung. Ex schlieot sich jetzt die Qualifizierung an, das ist die Uberpriifung, ob die Spezifikationen und/oder Sonderwiinsche i n der gelieferten Ware entsprechend den Vereinbarungen realisiert wurden. Diese Tests machen den rechten Schenkel vom ,,V" aus, siehe Abb. 2-6. Dieses Modell ist allgemein anwendbar. So konnte nach Maldener [ 161 das ,.V"-Modell fur einen Computer wie in Abb. 2-7 dargestellt ausaehen: Der linke Schenkel beschreibt die Aktivitiiten fur die Zeit vor und der rechte Schenkel fur die Zeit nach Lieferung, also die Test ze i t . Ein Ztrhlrrihei.s~iie1sol1 die Notwendigkeit eines strukturierten Vorgehens, wie oben dargestellt, zumindest fur computergestutzte Anlagen unterstreichen [ 171: Es geht um neun Softwareprojekte der US-Regierung aus den 80er Jahren im Wert von 6.750.000 Mio. US-$. Eine Analyse ergab folgendes: Bestellte aber nicht gelieferte Software: Gelieferte aber nie benutzte Software: Nirgends belegbare Software: Software anwendbar erst nach Modifizierung: Software anwendbar wie geliefert:

2.900.000 $ 3.200.000 $ 350.000 9; 200.000 $

IOO.OOO $ (entspricht 2 % des Gesamtwertea)

LeistungsQualifizierung

Leistungsspezifikationen

V

U

Funktionale Spezifikationen

Funktionale Qualifizierung

Technische Spezifikationen

U

lnstallationsqualifizierung

Bestellung und Ausfuhrung

V

Abb. 2-6 Das ,,V"-Modell fur ein Gcriit incl. Geratequalilizicrung.

Lastenheft

Anwendertests

Funktionale Qualifizierung

Pflichtenheft

Installationsqualifizierung

Detailspezifikationen

Definition von Modulen

U

-

Modultest

lmplementierung ( Hard- und Soflware )

Abh. 2-7 Dai, ,.V"-Modell tiir einen Computer, LIMS odcr cine compuicr-isicrte Anlagc.

Die Uberpriifung ergab a l s Grunde fehlende oder miljverstandene Forderungen der Kunden, Unflexibilitiit des Lieferanten, um new bzw. erst spgter verstandene Kundenanforderungen umzusetzen und fehlerhafte oder fehlende Dokuinentation seitens der Kunden. Den Lowenanteil, niirnlich 65 % macht der erstgenannte Grund BUS. niinilich fehlende oder nicht exakt formulierte Forderungen der Kunden. Auch wenn fur diesen konkreten Fall ein Schinunzeln aus europiiischem Munde durchaus verstandlich ist. stellt sich dieses allgemeine Problem nach den Erfahrungen des Autors auch hierzulande nicht rninder wichtig dar.

2.3.2 Empfehlungen fur die Praxis Neben der IQ sollte auch die OQ vemunftigerweise von Mitarbeitern des Lieteranten durchgefuhrt werden. Bei griiljeren und komplexen Installationen, wie LIMS, ist von Vorteil, wenn ein Fachrnann auf Anwenderseite den Tests beiwohnt. OQ-Tests sollten auch und gerade an den Spezitikationsgrenzen des Gerztes durchgefiihrt werden und nicht im mittleren iiblichen Bereich sei es, dal3 diese GI-enzen fur die geplante Anwendung viillig irrelevant sind. Die einzelnen Schritte IQ, OQ, PQ sind als eigenstiindige Schritte LU behandeln. Das bedeutet, es sollen tatsiichlich drei verschiedene Pliine mit genau definiertem Leistungsumfang existieren. Alle Tests inkl. Rohdaten und Testergebnisse sind zu dokumentieren und ZLI archivieren. Uber den Archivierungsumfang von Systerneignungstests in der Routine mu8 konform mit dein bestehenden Qualitlits-Management (QM-System) individuell entschieden werden.

Handbuch Validierung in der Analytik Stavros Kromidas Copvriaht 0 2000 WILEY-VCH Verlaa GmbH

Teil B Die Praxis der Validierung Stavros Kromidas, NOVIA GmbH, Saarbrucken

3

Die Validierungsparameter (oder nach IS0 17025: Verfahrensmerkmale)

3.1

Literaturiiberblick

Es wurde eine Literaturrecherche fur die Jahre vor I990 und 1990-1999 mit den key-words ,,Methode" und ,,Validierung" durchgefuhrt. Das Ziel war, einen Uberblick uber die verschiedenen Facetten der Validierung in der Analytik zu erhalten -jedenfalls was publizistische Aktivitat betrifft. Hier das Ergebnis in Kurze: Die Zahl der Publikationen zum Thema Validierung mit analytischem Hintergrund steigt standig. Die meist untersuchten Parameter sind: Prazision, Richtigkeit und Linearitat. An zweiter Stelle treffen wir auf Nachweis- und Bestimmungsgrenze, Selektivitat und Robustheit. Als Letzte werden Vertrauensbereich, MeOunsicherheit und Methodenfahigkeit genannt. Die wichtigsten Kriterien f u r den Validierungsumfang sind die Art der Probe, Entwicklungsstufe des Produkts und das Ziel der Validierung. Bei biologischen Proben und allgemein bei Proben mit ,,schwieriger" Matrix (Milch, Lebensmittel) wird neben den anderen Parametern erwartungsgemal3 stets die Wiederfindungsrate uberpruft. In solchen Proben wird weiterhin die Sicherheit durch die sogenannte cross- Vulidierung erhoht, im einfachsten Fall durch Vergleich der Kalibrationskurven bei zwei Methoden, z. B . Anwendung von LC-MS, urn eine RIA-Methode zu ,,crossvalidieren" oder Einsatz von GC-MS oder Immunoassay, um eine HPLC-Methode zu ,,crossvalidieren".

Entsprechend ihrer Wichtigkeit wird bei den analytischen Verfahren an erster Stelle von Validieruiigen chromntographischer Methoden berichtet, gefolgt von denen spektroskopischer Methoden. Bei chroinatographischen Verfahren konxntrieren sich die Untersuchungen aiifdie Methode. wiihrend in der Spektroskopie das Testen des Geriites im Vordergrund steht. So geht es bei der ..technical validation" ausschlieBlich iim die Kalibrieriing (AAS. NIR, FTIR, NMR), bei der quantitativen UV-Spektroskopie spielen Priizision. Richtigkeit, Robustheit und Linenritiit ebenfalls eine wichtige Rolle. Die nieisten Publikutionen stammen aus den1 Bereich ..life science" und spexiell ails der Phariiia. S o treffen wir fiir die Zeit vor 1990 prakticch niir auf Publikationen uber Validieriingen chromntogruphischer Methoden von Pharmaka und Wirkstoffsiibstanzen. Neben dem Abchecken der ublichen Validierungsparameter, siehe unten, kann Validierung auch ein sehr spezieller Test sein.

Beispicllo -

-

-

~

~

Vdidierungstests in einer ..strengen" GLP-Umgebung kann gleich bedeutenti sein mit Tests zur Uberprufung der Sicherheit: Richtigkeit des Integrationsalgorithmus. des Kalibrationsmodells, der Berechnungsformel und der exportierten Daten I 1 XI. VLiIidierungsexperirnente zum Regenerierungsgrad von lonenaustauscher aiif Cellulose-Basis 1191. Validierung von toxikologischen Testa 120.2 I I. Validierung von alternativen Methoden xu toxikologischen Tests 1221. Die SpeLifika von bestimmten Substanxklassen bzw. Produkten fiihren d a m . dal.3 i n Greinien Validierungsrichtlinien speziell fur diese Bereiche erarbeitet wcrden: z. B. Europiiisches Diskussionsforum fur die Validierung von Bioaerosolen 1231, Konferenz zum Thema Methodenvalidierung von bioanalytischen Methoden: Bioverfugbarkeit, Bioiquivalenz und Pharmakokinetik 1241, und ICH. i n der Richtlinien iiber die Validierung in der Pharmaindustrie ausgearbeitet werdcn [ 25 I. Im europiiischen Forschungszentrum in Ispra, Italien, existiert schlieDlich seit kurzem ein European Centre for the Validation of Alternative Methods. Seit 1998 hat auch in den USA das Interagency Coordinating Committee o n the Validation o f Alternative Methods (ICCVAM) a l s behordliche Stelle die Arbeit aufgenommen.

Eine aktuelle Recherche kurz vor Fertigstellung des Buches ergab folgende Trends: -

Wenn eine neue Methode oder eine neue Applikation p u b l i k r t wird, gehiirt hlufig inindestens eine ..Mini"-Validierung einfach dazu.

-

Dac tleilJige Abarbeiten eines ,,Validierungskatalogs" wird immer seltencr angetroffen. das Befascen mit den kritischen Schritten einer Methode ruckt mehr i n den Vordergrund. Stark in der Di\ku\sion sind zur Zeit folgende Themen: OOS (Out Of Spec)-Situationen und die Folgen Melhinsicherheit

3.2 Die ~ilidierun~spcrrcinieter riner rrrirrlytisc~henMethoclr

43

Variabilitiit von Analysenmethoden, ,,Adjustment" vs. Revalidierung, Methodentransfer. -

Von den Validierungsparametern genieljen hochste Aufmerksamkeit nach wie vor die Linearitit (eher die ,,Kalibrierfunktion") sowie die Erfassungs- und Bestimmungsgrenze.

- Generell wird eine vorsichtige, Analytik(er)-freundlichere Stiinmung seitens der Be-

horden beobachtet. Diese wird in der neuen ISO-Norm 17025 sichtbar, es folgen einige Beispiele aus dem Pharmabereich, der als stark reglementiert gilt [26, 27 I: ,,Die Mittelwertbildung aus Mehrfachbestimmungen oder Mehrfachinjektionen wird von der FDA voll akzeptiert und nur das aus diesen Mehrfachbestimmungen hervorgehende Analysenresultat mulj gegen die Spezifikation abgeglichen werden. Schon auf der Stufe des Labors ist es moglich, anhand von Checklisten Werte aus fehlerhaften Tests zu eliminieren und diese durch das Ergebnis dann nur einer einzigen Wiederholanalyse zu ersetzen. Folgende Forderungen werden zur Zeit mit guter Aussicht auf Erfolg diskutiert: Verzicht auf die verbindliche Vorgabe, einen zweiten Analytiker mit einem Revalidierungs-Test zu beauftragen, da dies eine weitere Quelle von Variabilitiit darstellen kann und teilweise nicht umzusetzen ist. Einzelwerte von Mehrfachbestimmungen mussen nicht den Spezifikationen entsprechen, sondern nur das aus ihnen abgeleitete Analysenresultat. Verzicht auf die Forderung, schon im Falle von noch spezifikations-konformen, aber eng an den Grenzen liegenden Analysenergebnissen (,,Borderline Results") zusiitzliche Untersuchungen bis hin zu Stabilitatsuntersuchungen der betreffenden Charge vorzugeben. Kann ein Labor belegen, daR die eingesetzten Prozesse ISK (In Statistischere Kontrolle) sind, so kann auf Revalidierung verzichtet werden."

3.2

Die Validierungsparameter einer analytischen Methode

Auflistungen der in Frage kommenden Validierungsparameter (auch: Verfahrensmerkmale, ValidierungskenngroBen, Validierungsmerkmale, Validierungselemente) sind vielfach in Publikationen erschienen. In den einzelnen Literaturzitaten gibt es nur geringe DifferenZen. In Tab. 3- 1 sind diese Validierungsparameter sowie weitere Begriffe aufgefuhrt, die im Rahmen einer Validierung von Relevanz sein konnen.

Knmrnen tcr r Richtigkeit his einschlieRlich Robustheit sind die Priifpunkte, die fast ausnahmslos immer genannt werden, oft auch der Arbeitsbereich. Selten werden Empfindlichkeit und Stabilitat von Losungen als eigenstiindige Validierungselemente aufgefuhrt. Erstere meist im Zusammenhang mit der Linearitat, Letztere im Zusammenhang mit Robustheit. Der Begriff Erfassungsgrenze gewinnt international - allerdings noch sehr zogernd - zu Lasten der Bestimmungsgrenze an Gewicht. Es sind Bestrebungen im Gange, nur noch von

Tab. 3-1 Miigliche Prufpunktc hci cincr Mcthodcnvnlidicrung in dcr Annlytik rung!

~

Maxiinaltordc-

Pru fpu nkt

Englischc Be/cichnung

Aussage uhcr _ . _

Richtigkeil

trucnes, accuracy 0 1 the mean oder einlach: accuracy

systcmatische Fchlcr

precision

zulilligc Fchlcr

Wicdcrholpriizision odcr Wiederholharkeit

repeatability

Priiiision unter Wicdcrholhcdingungcn: I Prohc, 1 Prufcr. I Gcriit. identische Rcagcniien. kur/c Zeilabstiinde

Lnhorprii/ision

intermediate precision

~

Priirision

-

~

~

~~

Einc Probe, sonst rnchrcrc Variablen. B. 2. Prufcr und/odcr 3. Gcriit undloder 2. Tag uhw. L.

-

Vcrglcichsprii/ision odcr Vcrgleichbarkeit

reproducibility

Priiiision unter Vcrglcich4xdingungcn:

I Prohc. 2. Priilcr. 2. (ieriit. 2. Labor (Messung in jcdcm Lahor unter Wiederholhcdingungcn )

Linearitiir

linearity. selten: annlytical response

mathematischer Zusammcnhang Lwischen Mel.lwcrt(Signal) und Konicntration oder Mcngc

Selektivitiir

wlccrivity

Fiihigkcit. allc intcrc\sicrcndc Analytcn nebeneinander ohne gcgenaeitige Stcirung xu bestimmcn

Wiederfindung oder Wiederfindungsratc

recovery

Ausbcute nach allcn Schritten der Analysc

Nachwcisgrenzc oder sclten: Detcktionsgrcnre

limit o f detection, LOD

klcinste nachwcisharc Mcnge (odcr KonLcntration 1

Besliriiniting\grcnie

limit of quantification. LOQ odcr limit of detcrmi nation

klcinste quantifiiicrharc Menge (odcr Konzcntration)

Rohusthcil

robustness/ ruggedness

Stiiranlalligkcit dcs Ergchnisses durch variicrcndc Bcdingungcn

rohustncss

Stiiranlalligkcit durch vcriindcrte Mcthodcnpararnctcr / . B. pH. Temperatur

~

Mcthodcnrohustheit

-

Vcrf~ihrcn\\tahilitat

-

Anwcndharkcit oder scltcn: Uhcrtragbarkcit

Stahilitiit der Ergchni\w fur die Daucr dcr Analyscnscric ruggedness

Stiiranliilligkeit durch Wechwl von Anwcndcr, Lahor. Cicriit

3.2 Die &ilidierungspurumeter einer unulytischen Methodc

45

Priifpunkt

Englische Bczeichnung

Aussage uber . ..

Arhcitshcreich odcr (dynamischer) MeRbcrcich

range

Konzentralionshereich iiir akzcptahlcl hestatigte Angahcn iihcr Richtigkcit, Prazision, Sclektivitiit, Lincaritat und Robustheit

Empfindlichkeit

scnsitivity

Fahigkeit, kleine Kon7~ntration~diflerenzen noch zu hestimmen: Stcigung der Kalibriergerade

Stabilitat

stability

Stabilitat von cingcsctztcn Liisungcn, Chemikalien usw.

Erfassungsgrcnze odcr Entscheidungsgrcnzc

limit of decision

Geringster Gehalt, der hei tatsichlichcr Anwesenhcit identifiziert wcrden kann; liegt zwischen Nachweis- und Bestimmungsgrenzc

Gcnauigkcit

accuracy

systematische und zutllligc Fchlcr, Genauigkeit ist kein eigenstandigcr Priifpunkt sondern sinngciniil!, dcr Oberbegriff fur Richtigkeit und PrYzision

Spezifitiit (wird oft h y n onym mit ,,Sclcktivitat"

spccificity

Fahigkeit, rinr Substanz (odcr Suhstanzklasse) ohne St(irung durch andcrc Komponenten zu hestimmen

Mehnsichcrhci t

uncertainty of the measurcment

Schwankungdw-cich dcs Mcliwcrtc9

Methoden fahigkeit

method capability

Fahigkeit, Ergebnisse xu liclcrn, dic innerhalb der Spezifikationsgrcnzcn liegen

MethodenstabilitSt/ ProzeBstabilitiit

mcthod stability/ process stability

Stabilitat dcs analytischcn Prozcsses/der Methode i n AbhSngigkcit von der Zeit

~~~~

verwendct )

~~

Erwcitertc Unsicherheit

~

Bereich, in dem ein Wert mit eincr gegebenen Wahrscheinlichkeit xu finden sein wird. Dieser wird durch ,,allc" realistischen, zufalligen und systcmatischen Fehler vorgegebcn.

Nachweisgrenze zu sprechen. Die Argumentation: ,,Nachweisgrenze" kann man auch einem Nicht-Naturwissenschaftler erklaren, ,,Bestimmungsgrenze" sei etwas schwieriger. Im Ubrigen ist Bestimmungsgrenzeja nichts Anderes als eine erweiterte MeBunsicherheit, der Zahlenwert ist individuell festzulegen (s. Abschnitt 3.9). Genauigkeit wurde fruher haufig synonym mit Richtigkeit benutzt. Sie urnfafit jedoch sowohl systematische als auch Zufallsfehler und als Oberbegriff fur Richtigkeit und Prlzi-

sion stellt sie keinen eigenstiindigen Prufpunkt dar. Um MiRverstiindnisae 7,u vertneiden. sollte dieser Begriff im Rahmen der Validierung nicht rnehr benutzt werden. Zwischen Selektivitnt und Spezifitiit wird oft kein Unterschied gemacht. Dieser Usus verhindert, daR man sich gerade dem Unterschied zwischen selektiven und spezitischen Messungen bewuBt w i d , siehe Abschnitt 3.6.1. Das Schiitzen der MeBunsicherheit gewinnt in Bereichen, in denen ex schnell uni einen ersten Eindruck von der Methode geht. an Bedeutung, wird allerdings allgemein nicht als Validierungselement angesehen - eher als Alternative zur Validierung. Methodenfihigkeit ist zweifelsohne ein sehr wichtiges Kriterium fur die Eignung einer Methode in der Produktanalytik. Es geht um die biniire Entscheidung: Produkt innerhalb der Spezifikation jdnein? Um so tnehr erstaunt es, daO dieses Element - was ja ein Urteil uber eine Ermittlung von Zahlen hinaus darstellt - relativ selten genannt wird, gerade in Fiillen, in denen Spezifikationsgrenxn vorgegeben sind. Ein weiteres wichtiges Kriterium ist die Stabilitiit des analytischen Prozesses. Das ist die Abhiingigkeit eines Ergebnisses von der Zeit bei Anwendung unter realen Bedingungen. Obwohl dieser Punkt ebenfalls ein erninentes Kriterium fur die Eignung einer Methode ist, wird man erst in jungster Zeit stiirker darauf aufmerksam. In Kapitel 8 und 9 wird auf dieses Kriterium niiher eingegangen. Es ist wichtig, sich ein ganzheitliches Urteil iiber die Eignung einer Methode xu bilden. Aus diesem Grunde werden nachfolgend neben den klassischen Validierungsparamctern auch das Schatmi der MeBunsicherheit und die erweiterte Unsicherheit (5. Abschnitte 4.3. 6.7 und Kapitel 9) sowie die MethodenMhigkeit (s. Abschnitt 3. I 1 ) ausfuhrlich behandelt.

3.3

Prazision

3.3.1

Definitionen und Erlauterungen

Priizision ist das Ma8 fur die Ubereinstimmung unabhiingiger Analysenergebnisse untereinander oder einfach ausgedruckt: das Ma8 fur die Streuung von Analysenergebnissen. Als Streuungsmalj und damit als PriizisionsmaB wird die Standardabweichung .Y. die relative Standardabweichung srCI.die identisch ist mit dem Variationskoeftizient V,, und etwas seltener die Varianz s2, verwendet.

,y

=

(x,

-

I7 -

mit:

-

EinLelwert

.I- Mittelwert

1

TI-

n s V $ s-

Anzahl der Messungen Standardabweichung Vdriationskoeffizient (relative Standardabweichung) . Vananz

Es gelten folgende Analogien: Priizision =

Streuparameter

Statistische GroOe: Standardabweichung Information: Grad der Streuung einzelner Werte um den Mittelwert, die Streuung ist das Ergebnis von zufalligen Fehlern

Richtigkeit =

Lageparameter

Statistische GroBe: Mittelwert Information: Abstand des Mittelwertes vom richtigen (,,wahren") Wert; dieser Abstand wird durch systematische Fehler (bias) bestimmt. Dem Sinne nach sollte er eigentlich ,,Unrichtigkeit" heiOen!

Genauigkeit = Streu- plus Lageparameter

Information: Abstand eines einzelnen Wertes vom richtigen (,,wahren") Wert, hervorgerufen durch systematische plus zufallige Fehler.

In Abb. 3- 1 werden die Unterschiede dieser drei verwandten Begriffe graphisch dargestellt.

Priizision,Streuung einzelner Werte urn den Mittelwert, Man : Standardabweichung

9.

............

richtiger Wert

t

+

Mittelwert Einzelwert Richtigkeit

( dern Sinne nach sollte es eigentlich " Unrichtigkeit " heinen! )

richtiger Wert

4

Einzelwert Genauiakeit des Wertes "x"

4

Abb. 3-1 Graphischc Darstcllung der Begriffe Prazision, Richtigkeit und Gcnauigkeit.

Siimtliche statistische Vergleiche und Ruckschlusse gelten unter der Annuhme einer repriiaentativen Probe. Gegebenenfalls ist diese Annahine ru veritirieren. Eine Standardabweichung kann grundsiitzlich fur jede statistische Verteilung von Werten verwendet werden. Wenn allerdings der Standardabweichung eine Wahrscheinlichkeit zugeordnet werden soll. so inuR von einer Norinalverteilung der Werte ausgegangen werden kiinnen. Zur Prufung auf Normalverteilung eignen sich mehrere Tests wie der Kolmogorov-Test, x'-Anpassungstest, Shapiro-Wiek-Test oder das Eintragen der Werte in ein Wahrscheinlichkeitsnetz. Diese Tests werden in den einschliigigen Buchern uber Statistik beschrieben. Hier wird der Schnelltest auf Normalverteilung nach David vorgestellt, der sich gerade fur eine kleine Stichprobe ( N < 10) eignet. Ein schsrferer Test ist der Chi-Quadrat-Test 12x1: Die Werte sind mit einer vorgegebenen Wahrscheinlichkeit (meist P = 99 %) normalverteilt, wenn der Quotient aus Spannweite R und Standardabweichung .s innerhalb der von David vorgegebenen GrenLwerte befindet. siehe Tabelle nach David, Abschnitt A.6. PG =

GroDter Wert Kleinater Wert Standardabweichung ~

R

- -

,\

Be ispic1 / 281

27 Einxlwerte werden aufAusreil3er bei der Bestinimung des Nitrat-Gehaltea einer Wasserprobe gepruft: Die MeBwerte: 0.5 1

0.5 I

0.49

0.5 1

0.5 I

0.53

0.38

0.5 1

0.43

0.53

0.52

0.48

0.52

0.50

0.53

0.49

0.37

0.53

0.54

0.55

0.52

0.43

0.52

0.5 1

0.52

0.50

0.4v

Sortierung der Daten nach der GroOe: 0.42

0.46

0.47

0.3X

0.48

0.49

0.49

0.40

0.49

0.50

0.50

0.5 I

0.5 I

0,s I

0.5 1

0.5 1

0.5 I

0.52

0.53

0.52

0.52

O,S2

0.52

0,53

0.53

0,53

0,55

Berechnung der PrufgriiBe nach David: Die Spannweite betriigt: R = 0.55

-

,\

= 0.0292

I1

= 27

0-42 = 0.13

3.3 Priizision

pG

R s

=-=

49

0 13 = 4,45 0,0296

Aus der Tabelle nach David werden die folgenden Werte g, und goentnommen ( P = 99 %, P: Signifikanzniveau, Wahrscheinlichkeit, P von propability): Da die Zahl27 in der Tabelle nicht aufgefuhrt wird, werden die nlchst benachbarten Zahlen, ngmlich 25 und 30 zur Prufung herangezogen. g , = 3,15

go = 5.06 (fur n = 25 und P = 99 %)

go = 5,26 gu = 3,27 (fur n = 30 und P = 99 %)

4,39 liegt zwischen der unteren und oberen Grenze. Es kann eine Normalverteilung der MeBwerte angenommen werden. ,.Unabhlngige" Ergebnisse konnen auf unterschiedliche Art und Weise gewonnen werden. Nachfolgend werden die unterschiedlichen Prazisionsarten besprochen.

3.3.2 Prazisionsarten 3.3.2. I Wiederholprazision, Wiederholbarkeit (fruher: Wiederholgenauigkeit) Damit ist die Prazision unter Wiederholbedingungen gemeint. Wiederholbedin~lrrigeii(DIN 5 1848, I S 0 5725) sind Bedingungen, unter denen voneinander unabhangige Ermittlungsergebnisse in kurzen Zeitabstgnden erhalten werden; und zwar mit rlernselben Verfahren. an identischen Objekten (selbe Probe), in dernselhen Labor, durch den selhen Bearbeiter und mit derselhen Gerateausrustung.

3.3.2.2 Vergleichsprazision, Vergleichbarkeit (hlufig auch: Reproduzierbarkeit, selten Ubertragbarkeit) Damit ist die Priizision unter VergleichsbedingunXengemeint. Vergleichsbedingungen (DIN 5 1848, I S 0 5725) sind Bedingungen, unter denen Ermittlungsergebnisse mit rlernselhen Verfahren, an identischern Material (selbe Probe), aber in ivrschiedenen Labors, von verschiedenen Bearbeitern und mit verschiedener Gerateausrustung erhalten werden.

3.3.2.3 Laborprazision oder laborinterne Vergleichsprlzision Man versteht darunter die Prlzision von Ermittlungsergebnissen derselben Probe innerhalb eines Labors bei bewuBter Anderung eines Parameters. Bei der Ermittlung kann beispielsweise ein anderer Bearbeiter und/oder ein anderes GerBt beteiligt sein, die Analyse wird an

unterschiedlichen Tagen durchgefuhrt, eventuell durch EinsatL von Reagenyien anderer Charge usw. Was genau und in welchem Ausmal!, variiert werden sollte, hiingt von der konkreten Fragestellung und der konkreten personellen und apparativen Laborsituation ah. Das bedeutet zweierlei. Zuniichst gilt zu uberlegen, was sich bei der Routineanwendung der betreffenden Methode realistischerweise indern kbnnte. AnschlieRend ist zu prufen, inwieweit diese Variablen das Ergebnis beeinflussen, das he& nichts anderes als die Priizision der Methode unter realen Bedingungen zu bestimmen.

3.3.2.4 Weitere PriiLi sionen Recht selten wird von der ,,Priizision LWZ Srrie ,711 Scrir" (between-run precision oder ,,within day" oder ,,intra day") berichtet. Es handelt sich dabei um die Ubereinstimnung zwischen voneinander unabhiingigen Ermittlungsergebnissen, die mit tferi?.selhrriVerfahren, an ic/e/7ti.~c/7riii Material (selbe Probe). in drnisr//~rn Labor. durch tlerise/brri Bearbeiter. aber in i , e / : ~ ~ . h i r r / eSerien / i ~ r i erhalten werden. Ebenso spricht man auch von einer ,,frii:isio/i im 7ug ; I ( 7iig". .,day to day" oder ,,interday". Das ist nichts Anderes, als die Wiederholpriilision, allerdings nicht ..in liurl.cn Zeitabstiinden" sondern eben an z. B. 6 darauffolgenden Tagen. Die Wiederholpriizision wird praktisch in jedem Labor uberpruft. Eine Prufung aut' Laborpriizision empfiehlt sich immer, sobald die Methode iius irgendeinem Grund als .,kritisch" einzustufen ist: z. B. Methode zur Gehaltsbestiminung, quantitative Bestimmung von Verunreinigungen, neue Methode im Labor. Die Vergleichsprii~isionkann von den ublichen Validierungsarbeiten abgekoppelt betrachtet werden. Deren Uberprufung wird notwendig, wenn mehrere Labors tnit der betreffenden Methode arbeiten sollen. So wird richtigerweise immer wieder angernerkt, daR Vergleichspriizision eigentlich kein Validierungsparameter einer Methode darstellt. Gleichauf ist sie ein wichtiges Kriterium fur die VerliilJlichkeit der Ergebnisse der betreffenden Methode, wenn sie i n verschiedenen Labors eingesetzt wird. So stellen Ringversuche vor allem iin nicht reglementierten Bereich (Pharma), wie Untersuchungsiimter, Auftragslabors, Institute usw. ein wichtiges Werkzeug der Qualitiitssicherung. Priizision gilt generell als quantitatives Ma13 f u r die Robustheit einer Methode, siehe Abb. 3-2 und Abschnitt 3.5.2.3. Bei Vorgabe von Spezifikationsgrenzen (sind sie gerechtfertigt?) ist eine priizise Methode stets eine robuste Methode und damit eine .,gute" Methode. Bei vorgegebenen SpeTifikationsgrenzen wiire in Abb. 3-2 die priizise Methode I fur die Routine vorzuziehen. Auch wenn es zu einer stiirkeren Streuung der Werte durch allerlei Eintlusse kiime, wiirden sich die Werte dennoch innerhalb der Spe7ifikationsgrenzen befi nden.

3.3 Prii:i.sion

e- Spezifikationen

51

--+

A

.4-4

a

Y 0

F 3

:m

I I

Charakteristik

I

Abb. 3-2 Zu Spe~itikarionsgrenzenund Prazision von Methoden. 1 prilzise, 2 weniger prlLise.

3.3.3 Me& und Methodenprazision In der instrumentellen Analytik gibt es prinzipiell zwei unterschiedliche Grunde fur eine Streuung von Ergebnissen, namlich das Analysengerat selbst und die Methode. Die einzelnen Beitrage hangen von dem MeBprinzip und der Komplexitat des Analysengerates ab, sowie der Anzahl und dem Schwierigkeitsgrad der Schritte einer Methode, der Konzentration, der Matrix usw. Somit ist zwischen MeB- und Methodenprazision zu unterschieden. Die MeJprazision (Geriitepruzision, Systemprazision) ist ein Ma13 fur die Schwankungen, die durch das Analysengerat selbst verursacht werden. Erinittlung Ein Standard oder eine stabile, homogene Probe wird sechsfach (manchmal zehnfach) gemessen und der Variationskoeffizient bestimmt. In der HPLC z. B. geschieht dies, indem man eine Standardlosung sechsfach injiziert und den Variationskoeffizienten uber die Peakflachen bestimmt. Die Methodenpra:ision ist ein Ma8 fur die Schwankungen der Ergebnisse, die durch alle Schritte der Methode verursacht werden, z. B. Probenahme, Wiegen, Probenvorbereitung, Extraktion, Filtration, Messung, Auswertung. Ermittlung Sechs unabhangige Einwaagen (bzw. sechs Muster, wenn die Probenahme ein Teil der zu validierenden Methode ist) werden analysiert und der Variationskoeffizient bestimrnt.

3.3.4 Rechenbeispiele 3.3.4.1 Vergleich von Mittelwerten und Variationskoeftiirienten Der ledigliche Vergleich von Mittelwerten liefert ein verxrrtes Bild der Realitlit. Zur Beurteilung eines Ergebnisses gehart auch das Wissen uni die Streuung der Werte. die zu diesem Ergebnis fuhrten.

Brispicl Zwei Labormitarbeiter analysieren den Cehalt eines Wirkstoffs in einer neuen Forniulierung (mg/Kapsel). Die erhaltenen Ergebnisse lauten:

-

1. Anwcnder

2. Anwender

30.3

30.5

30.3

30.4

30.3

30.5

30.2

30.7

30.0

30.2

30.3

29.1 -

= 30,23

.Y

= 30,23

.Y

= 0.12

s

= 0.58

V,,

= 0,40

v,,

= 1,92

.I-

ObwohI der Mittelwert in beiden Mel3aerien identisch ist (30,23),ist die Streuung der Werte im zweiten Fall groBer (VK2 = 1.92 gegenuber V,, = 0.40). Das konnte miiglicherweise a n der Arbeitsweise des zweiten Anwenders oder an deaaen Apparatur oder an einer fehlerhaften Waage liegen.

Bciticrkirii~g: Der Mittelwert und die Standardabweichung kijnnen heute nahezu von jedern Taschenrechner berechnet werden. NichtsdestotrotL sollen Ihnen hier zwei empirische Formeln nicht vorenthalten werden: .\

=

.\

=

griiBter Wert

+ kleinster Wcrt 1

grd3ter Wert

-

.Y

kleinster Wert

3.3 Priizisiori J''

53

ist abhangig von der Anzahl der Werte und kann folgender Tabelle entnommen werden: n

X

2

I ,4

3

I ,9

5 6

2.6

2.1 3,3

10

20

3.9

50

4,h

Fur obige Beispiele erhalten wir:

x

=

30,3 + 30,O 2

=:

30,15

(errechneter Wert: 30,23)

(errechneter Wert: 0.58)

s=

30,3 - 30,O = 0,l 1 2.7

(errechneter Wert: 0,I2)

3.3.4.2 Vergleich von Meljwertreihen Zum Vergleich der Prazision zweier MeBwertreihen eignet sich der Variationskoeffizient (relative Standardabweichung) und nicht die Standardabweichung.

Beispiel Eine HPLC-Methode, die in zwei Labors routinemiiljig Iiiuft, rnacht Problerne. Die Retentionszeiten schwanken stark. Da die Bedingungen in beiden Labors vollig identisch sind (sogar die Charge der stationLen Phase und auch der ,,Packer" der Saule) wurden die Pumpen verdachtigt. Darauthin wurde die Fluljkonstanz der zwei Pumpen uber die Prizision der Retentionszeit verglichen. Bei beiden Pumpen wurde ein s-Wert von 0,12 festgestellt; ausschlieljlich diese Information wurde weitergegeben und diskutiert. Sind also beide Pumpen gleich ,,gut"? Das mu13 nicht sein. Der erste Anwender wollte den Test schnell durchfuhren und verwendete Substanz A, die schnell eluiert. Der zweite Anwender nahm dafur Substanz B, die in der Probe als letzte eluiert. Nach sechsmaliger lnjektion der Substanz A in Anlage A und der Substanz B in Anlage B erhllt man folgende Retentionszeiten [min]:

Anlagc A

Anlage B

2.3

10.1

2.2

9.9

2.3

10.2

2.4

10.0

2.1

I0.0

2.4

9.9

.s

= 0. I2

.P

= 0.12

v,

= 5.26 %

v,

= 1,20 %

Bei gleicher Standardabweichung (hier: s = 0,12) und unterschiedlicher Absolutwerte kann der Variationskoeffizient zweier MeDreihen recht unterschiedlich sein. In diesem Beispiel arbeitet die zweite Pumpe wesentlich priiziser als die erste. Man kann bei einer kleinen Stichprobe ( N < 12) eine Sicherheit einbauen, in dem der Wert der Standardabweichung mit einem sogenannten Vertrauensfaktor multipliziert wird. Die untere V e r t r f i i 4 ~ ~ n . s ~ s r e i ~ ~ ~ ~ fiir die Standardabweichung kann n u n wie folgt berechnet werden:

mit:

.xu

Standardabweichung fur die untere Vertrauensgrenze

K , einseitiger Vertrauensfaktor fur P = 0,95 und f = ti-l

Sein Wert kann fiir eine Anzahl von MeBwerten zwischen 5 und 13 nachfolgender Tabelle en t n o mme n we rde n : ./= I!

-

I

Kf 2.372

2,089 1.915

1,797 X

1.71 I

9

1.645

I0

1.593

II

I .5s I

12

1.515

3.3 Prii:isioii

55

Fur unser Beispiel mit n = 6 Werten ergibt sich: f =6-1=5 K f = 2,089

In der Analytik sind Doppelbestimmungen iiblich. In diesem Fall wird die Standardabweichung wie folgt berechnet:

und in einer MeRreihe mit n-Werten:

mit:

n = Anzahl der Werte

Nehmen wir an, daR beim obigen Beispiel die Retentionszeiten der Substanz A in der Anlage A durch Doppelinjektion ermittelt wurden. 1. Injektion

2. Injektion

Wie grol3 ist nun die resultierende Standardabweichung?

I 2.6

s = &(2.3

~

2,2)*+ (2.2- 2.2)' + (2,3- 2.4)' + (2.4- 2,s)' + (2,l- 2.3)'

+ (2.4- 2,s)'

=

.\

\i

0.0 1 + 0 f 0.0 1 + 0.0 1 + 0.04 + 0.0 I 12

=

0,082

Der Gesamtmittelwert aus I I = 2 . 6 = 12 MeBwerten betragt 2,32. sornit ergibt sich als Variationskoeffkient fiir alle I2 MeRwerte:

v, =-.

2.32

100 = 552

%I

Es inu1.5 individuell entschieden werden, ob der Vorteil der Abnahine des Variationskoeftkienten von 5,26 % auf 3 3 2 % den Mehraufwand durch die Doppelbestirninung ausgleicht (s. auch Abschnitt 3.4.3).

3.3.4.3 Vergleich von Methoden. die aus stochastisch unabhiingigen Schritten bestehen Stoc~Iici.sti,sc~k 1~17uhlziingige Pro:esse sind Prozesse, bei denen die einzelnen Schritte sich gegenseitig nicht beeinflussen. I n der Analytik bedeutet dies, daR ein Fehler, der in Schritt A einer Methode gemacht wurde, den Fehler, der miiglicherweise wiihrend des Schrittes B passiert. nicht beeinflufit. Wenn eine Probe falsch eingewogen wurde, hat dies keinen EintluB auf die Richtigkeit bei der Wellenliingeneinstellung eines Photometers (stochastisch unabhiingiger ProzeB). Ein Fehler bei der Extraktion dagegen kann die Linearitiit und die Selektivitiit in der HPLC beeintriichtigen (stochastisch abhiingiger ProzeD). Bei stochastisch unabhangigen Prozessen, wie sie in der Analytik oft vorkommen, gilt die Additivitat der Varianzen:

rnit:

\lc, Ge5amtvarianz der Methode \f

7

Varianz von Schritt I

5.

Varianz von Schritt 2

5;

Varianz von Schritt 3 u\w.

Was kann ein Anwender n u n in der Praxis mit dieser Aussage anfangen? Betrachten wir ein fiktives Beispiel: Be isp ie 1 Zwei Methoden sollen aus je drei Schritten bestehen; niimlich Einwaage inkl. Aliquotieren. Festphasenextraktion und Messung. Die Streuung der Werte in den einzelnen Schritten (Beitrag zur Gesamtstreuung) ist unterschiedlich. siehe Tab. 3-2. Bei Methode I 1st der Fehler bei den einzelnen Schritten gleich gro0 (.s = 3 ) , bei Methode 2

~

57

3.3 Priizisiori

Tab. 3-2 Vergleich zweier Methoden anhand der Streuung der Wcrte in den einzelnen Tcilachrit-

ten.

Methode 2

Methodc 1 ~~

Einwiegcn incl. Ahquotieren

3

9

6

36

Fcstphasenextraktion

3

9

2

4

Messung

3

9

1

I

Standardabwcichunglvarianz

1 Sge5

=

9

C

sics = 27

1 "ges

=

9

C

sic, = 4 1

ist das Wiegen und Aliquotieren mit einem groRen Fehler (s = 6), dafur aber die Festphasenextraktion und die Messung mit einem kleineren Fehler behaftet (s = 2 und s = 1 ). Welche Methode ist ,,besser"? Methode 1 ist vorteilhafter, denn obwohl die Summe der drei Standardabweichungen in beiden Fallen 9 ergibt, ist die Summe der Varianzen (das Quadrat der Standardabweichung) im ersten Fall 27, im zweiten 41. Durch Wurzelziehen ergibt sich als Gesamtstreuung (Gesamtstandardabweichung) im ersten Fall ein Wert von 5,2, im zweiten Fall ein Wert von 6,4. Das bedeutet, daB Methode 1 priiziser ist. -

Nehmen wir jetzt weiterhin an, dab durch Automatisierung des Extraktionsschrittes mittels eines Roboters die Streuung der Werte bei der zweiten Methode auf einen Wert von 0,5 herabgesetzt wird. Die zweite Methode wird dadurch vielleicht schneller, jedoch nicht praziser als die erste, denn 36 + 0,25 + 1 = 37,25. Und J37,25 = 6.1

ist immer noch groBer als der Wert 5,2 bei der ersten Methode. Als Konsequenzen fur die Praxis ergeben sich erstens, daB es sich lohnt, das Gesamtverfahren genauestens zu analysieren, um die kritischen Schritte ausfindig zu machen. Diese miissen zuerst und ausfuhrlich validiert werden, urn sie gegebenenfalls anschlieBend zu optimieren. In der Praxis wird Schritten, die ohnehin recht unkritisch sind und dazu gehort z. B. der MeBvorgang - oft eine unverhlltnismaBig groBe Aufmerksamkeit geschenkt! Zweitens muB bei Investitionen, die das Ziel haben. eine ,,bessere" Analytik zu ermoglichen, eine kritische Beurteilung des PreisLeistungsverhiiltnisses unerlaBlich sein. Wie soeben gezeigt, ist simple Mathematik dabei hilfreich. -

Noch ein weiteres fiktives Beispiel dazu: Ein HPLC-Verfahren weist eine Standardabweichung aller Schritte bis auf die Messung von s = 2 auf, die MeBprazision des 10 Jahre alten HPLC-Gerates betragt s = 030. Lohnt sich eine Investition von ca. 80.000 DM fur ein HPLC-Gerat der neuesten Generation mit einer MeBprazision von s = 0,15? Wegen der sicherlich exzellenten Prszision bestimmt nicht, der Gewinn ist vernachlassigbar:

Streuung aktuell:

sic\= 2' sgc, =

Streuung zukunftig:

+ 0,SO'

44,250

.sics = 2'

=

+ 0,IS'

=

4.250.

2,062 ! =

4,022,

spe, = 44,022 = 2,006!

Selbstverstandlich stellt ,,Priizision" nicht das einzige Kriterium fur oder gegen eine Neuanschaffung dar. Sol1 allerdings die Prazision verbessert werden, so mu13 man an dem kritischen Schritt ansetzen, im besprochenen Beispiel an dem Geschehen I W der Messung. z. B . Probenvorbereitung: Es gilt, den Term ,,2'" zu verkleinern. ResuriiP Ein Ma13 fur die Streuung eines Mittelwertes ist die S t t i r i r l r i r ~ ~ t i h r r , f / [ , ~ ? i ~ / ~ , s . Fur den Vergleich der Priizision von MeBwertreihen eignet sich der Vtiricitiori.skoc:'~;tfi,-iPnt. Ein Ma8 fur die Streuung der einzelnen Schritte eines Prozesses ist die Vtiritiri: in diesen Schritten. -

3.3.5

Angaben zur Priizision und deren Deutungsmiiglichkeiten

Wiederholtests sind eine Selbstversthndlichkeit in allen Bereichen, in denen Znhlen ermittelt werden. So auch bei der Validierung. Priizision stellt ein wichtiges Verfahrensmerkmal dar. Deren Uberprufung, sowie die Uberprufung der Richtigkeit wird sogar als Minimalvalidierung bezeichnet: 6fach Bestimmung einer Probe und Vergleich mit einem Referen/.standard. Gleichauf ist Priizision neben Robustheit und Linearitat das Vrilidierungselement mit der hochsten Quote an MiOverstSndnissen, wenn es um die praktische Durchfuhrung geht. Das durfte zum einen durch unterschiedliche Interpretation von xu vielen, ungliicklichen oder ungenauen Formulierungen herruhren. Zum Anderen herrscht kein einheitlicher Umgang mit gewonnenen Zahlen. Nachfolgend wird kurz auf die lnterpretationsbandbreite von Angaben eingegangen. AnschlieBend werden wir uns etwas ausfuhrlicher mit dem Urngang mit Zahlen beschhftigen (s. Abschnitt 3.3.6).

Beispiclc 1st ,,Bestimmung" gleich Messung oder umfal3t eine .,BestimmLing" mehr? Zitat aus einer SOP: .,Bestimmung: Einwaage und Aufarbeitung je einer Probe und eines Standards. Doppelinjektion . . .'* Wie ist die Aussage ... .. Die Anzahl der Werte zur Ermittlung der Prii7ision betrug I2 '' LU deuten? 6 Einwaagen. Doppelbestimmung = I 2 Werte 4 Einwaagen, 3fach Bestimmung = 12 Werte 12 Einwaagen. Einfachbestimmung = 12 Werte I 2 Einwaagen. Doppelbestimmung, daraus Mittelwert = 12 Werte Drei Konzentrationen (z. B. 80 %, 100 %. 120 'k des erwarteten Gehaltes). zwei Einwaagen, Doppelbestimmung = 12 Werte. -

3.3 Prii5sion

59

Tab. 3-3 Priizisionsdaten eines HPLC-Experimentesunter Wiederholbedingungen.

RetentionsLeit rminl

-

X Y

VK

Flache

Flache/RetentionsLeit

6,52

4325

663,34

6,49

4290

66 1,02

6,50

4330

666, I5

0,53

4288

656,66

6,49

4335

667,95

6,48

4315

665,90

6,50

43 14

663,50

0,O I9

20,35

4.14

0,29 % !

0,47 %!

0,62 %!

- Wurden Standards vermessen oder reale Proben, wie ist der EinfluR der Matrix? - 1st der Ausgangsstatus der Probe gleich gewesen? z. B.: 1st die Temperatur der Probe zwischen der ersten und der letzten Einwaage kon-

stant gewesen?

- Wurden Verdampfungsprobleme des Losungsmittels berucksichtigt, vor allem, wenn

Probedstandards unterschiedlich lang benutzt wurden? Wurden bei StreRtests die Bedingungen konstant gehalten? - 1st der Zeitabstand zwischen den einzelnen Messungen konstant gewesen? - 1st bekannt, auf welche Konzentration die angegebenen Prlzisionswerte sich beziehen? - Wurde zur Ermittlung des Variationskoeffizienten bei einer chromatographischen Trennung die Absolutfllche der Peaks, der daraus errechnete Gehalt oder womoglich das Verhlltnis aus Flache und Retentionszeit verwendet? (siehe d a m Beispiel in Tab. 3-3). -

Wird nicht eindeutig definiert, welche Zahlen zum Vergleich genommen werden, ist Vergleichbarkeit von Ergebnissen nicht gegeben. Deswegen ist die Aufnahme von Rechenbeispielen in Validierungsberichten und Priifvorschriften eine gute Praxis. Zur Vergleichbarkeit von Ergebnissen siehe auch weiter unten. - Wurden die Messungen mit einer - im Vergleich zum Laboralltag - besonderen Sorgfalt durchgefuhrt? Wurden beispielsweise die verwendeten Hilfsmittel (Waage, Pipetten, Detektor) unmittelbar davor kalibriert? - Handelt es sich bei der angegebenen Standardabweichung um die ,,iibliche" Standardabweichung, z. B. 6 Werte pro MeRserie, 6 MeRserien, also Standardabweichung aus 36 MeRwerten oder vielleicht um die Standardabweichung der Mittelwerte: 6 Mittelwerte aus den 6 MeRserien und Standardabweichung der 6 Mittelwerte?

3 Die ~ilidirncngspar.umeter

60

3.3.6 Umgang mit Zahlen und Moglichkeiten zu deren Beurteilung Es liegt in der Natur der Sache, daB MeBwerte streuen. Das kann man problemlos auch akzeptieren. Man sollte sich allerdings auf objektive Kriterien verstiindigen, wenn es urn die Entscheidung geht, welche Abweichungen nicht mehr akzeptiert werden und wie beim Auftreten eines solchen Falles weiter verfahren werden soll. Gelten keine objektiven Kriterien fur alle rnit der Methode Arbeitenden, so ist eine wichtige Voraussetzung fur eine Vergleichbarkeit von Ergebnissen nicht gegeben. Es ist nahezu zweitrangig welche Kriterien gelten. Sind sie einrnal festgelegt, kann nun deren Einhaltung rnit Hilfe von Tests gepruft werden. Allen Tests gemeinsarn ist die Berechnung bestimmter Zahlen (PrufgroRe oder Prufwert) und anschliefiend der Vergleich rnit Tabellenwerten. Fur diese Berechnung sind sehr einfache rnathernatische Operationen notwendig, benotigt werden lediglich der Mittelwert und die Standardabweichung. Beurteilung von Werten einer MeBserie bedeutet nun die Beantwortung folgender Fragen: 1. Gibt es AusreiRer? 2. Liegt ein Trend vor? 3. 1st in der Routine die Differenz zweier Werte, unter Wiederholbedingungen gewonnen, noch akzeptabel? 4. 1st es statthaft, diese zwei MeBreihen zu vergleichen?

Dazu eignen sich folgende Tests: -

AusreiBertests Trendtest nach Neumann Errnittlung der kritischen Wiederholgrenze F- und Cochran-Test

Fur den Vergleich zweier Werte, z. B. Soll-/Istwert (Richtigkeitsprufung), eignet sich der tTest und der Wilcoxon-Test. Diese werden in Abschnitt 3.4.2.1 besprochen. Nachfolgend werden oben genannte Tests kurz erliiutert. 3.3.6.1 AusreiBertests oder Verlablichkeitstests

Zweck:

Uberprufung, ob es sich bei einem Wert, der von den anderen auffallend stark abweicht, urn einen AusreiBer oder um eine zufdlige Abweichung handelt.

Vorteil:

Die Entscheidungsgrenze wird innerhalb des Labors/Abteilung ,,norrniert", es gelten objektive Entscheidungskriterien.

Nachteil: Es entsteht ein zusitzlicher Aufwand. Wichtig: Es mu6 f u r den Fall einea AusreiRers geklLt sein, wie weiter verfahren wird. In der Literatur herrscht keine allgerneine Meinung vor. Die Moglichkeiten rei-

3.3 Priizision

61

chen von: .,der Wert wird ersatzlos gestrichen" bis ,,der Wert wird durch zwei (drei) neue Werte ersetzt". SchlieBlich gilt ebenfalls zu klaren, ab welcher Haufigkeit und welcher Abweichung welche MaBnahrnen ergriffen werden rnussen. Werden laut SOP Ausreiljer lediglich eliminiert ohne Hiiutigkeit und Anzahl weiterzumelden oder zu dokumentieren, wird von Nichtbeteiligten die Prazision und die Robustheit der Methode uberschatzt. Die zwei bekanntesten Tests sind der Dixon- und der Grubbs-Test. Dixon-Test Vorgehen: Man bilde die GroBe Q nach der Gleichung

mit:

x, ausreifierverdachtiger Wert x2 benachbarter Wert

R Spannweite (Abstand zwischen kleinstem und groBtem Wert)

und vergleiche diese mit einem Tabellenwert, siehe Dixon-Tabelle, Abschnitt A.6. Der Wert gilt als AusreiBer, wenn die berechnete GroBe Q groljer als der entsprechende Tabellenwert bei einem Signifikanzniveau von P = 99 % ist, d. h. wenn die Wahrscheinlichkeit fur die Richtigkeit dieser Aussage 99 % betrlgt.

Beispirl I Es werden folgende Werte ermittelt: 7,0, 7.8, 5,0, 8,3,9,0, 6,9, 14,O ausreiflerverdachtiger Wert: 14

Uberprufung: Q =

~

114-91 5 = - = 036 9 9

0,56 ist kleiner als 0,64, laut Dixon-Test ist der Wert 14 kein AusreiBer. Das bedeutet nicht, daR der Wert richtig ist! Der Test sagt lediglich aus, daB die Wahrscheinlichkeit, daR dieser Wert ein AusreiBer ist, im vorliegenden Fall ,,nur" ca. 94 % betriigt. In der Analytik hat sich eingeburgert, einen Wert als AusreiBer anzusehen, wenn die Wahrscheinlichkeit dafur 99 % betragt.

Begt-iirzdung Aufgrund der in der Regel geringen Anzahl der ermittelten Werte sollten statistische Tests vorsichtig interpretiert und deshalb nur signifikante (99 %) und nicht lediglich wahrschein-

liche (95 %) Unterschiede berucksichtigt werden [29]. Man kann sich naturlich - wenn strengere Kriterien sinnvoll erscheinen - auf ein Wahrscheinlichkeitsniveau von 95 % oder gar 90 c/o verstiindigen.

Beispiel2 Es geht noch einmal um die oben angegebene Reihe mit dem Unterschied, daO der Wert ,,5,0" durch den Wert ,,6,5" ersetzt wird. 7,0, 7 3 , 6,5, 6 3 , 8,3, 9,0, 6,9, 14,O ausreiflerverdiichtigter Wert: 14

Uberprufung: Q

=

~

114-91 7,s

5 73

= -=

0,67

0,67 ist groRer als 0,64, laut Dixon-Test ist der Wert ,,14" ein AusreiOer. Je weniger die Werte in einer Reihe streuen, d. h. je prlziser eine Messung ist, um so eher werden AusreiOer erkannt. Uberspitzt ausgedruckt: Je unprlziser eine Methode ist, urn so geringer ist die Gefahr, auf AusreiOer zu treffen. Oder anders formuliert: Bei einer auf Priizision ,,getrimmten" Methode werden auch kleine Abweichungen als AusreiRer .,entlarvt". Die Anwendung einer solchen Methode in der Routine ist erschwert, s. auch ,,Robustheit", Abschnitt 3.5. Der Test nach Dixon ist generell relativ unscharf, fuhrt jedoch in geringerem MaRe zu falsch positiven Ergebnissen. Dem koinmt der Test nach Grubbs entgegen, da er nur deutlich abweichende Werte erkennt [29]. Grubbs-Test Dieser hat die gleiche Zielsetzung wie der Dixon-Test. Auch hier wird gepruft, ob ein Wert mit einer starken Abweichung ein AusreiOer ist oder nicht. Vorgehen: Man bildet die PrufgriiBe Q nach der Gleichung:

mit:

xI ausreil3erverdachtigter Wert

X Mittelwert s

Standardabweichung

und vergleiche diese mit einem Tabellenwert, siehe Grubbs-Tabelle Abschn. A.6. Der Wert gilt als AusreiBer, wenn die berechnete GroBe Q grol3er ist als der entsprechende Tabellenwert bei einem Signifikanzniveau P = 0,99.

3.3 Priizision

63

Beispiel Bei einer Gehaltbestimmung wurden folgende Werte ermittelt: 50,48, 52,47, 53, 61, X : 51,84, s : 5,04 ausreifierverdiichtiger Wert: 61

Uberprufung: Q =

61 - 5 l,84 5,04

=

1,817

I ,8 I7 ist kleiner als 1,944 ( P : 99 %) und sogar kleiner als 1,822 ( P : 95 %). Laut GrubbsTest kann der Wert ,,6 I nicht als AusreiBer deklariert werden. "

Bei dem Dixon-Test werden fur die Berechnung nur drei Werte benotigt: der ausreiserverdlchtige Wert, der Nachbarwert und der kleinste bzw. groljte Wert der Serie (zur Ermittlung der Spannweite). Die Anzahl der Werte dazwischen ist fur die Berechnung nicht relevant. Je groBer die Anzahl der MeBwerte ist, um so weniger aussagekrlftig wird der DixonTest. Die Empfehlungen in der Literatur fur einen Dixon-Test schwanken zwischen 5 und 8 Werten. Bei dern Grubbs-Test werden durch die Einbeziehung von X und s in die Berechnungsformel alle Werte berucksichtigt. Er eignet sich ab 6 bis 8 Werten. Eine Schwlche des Grubbs-Tests sollte nicht verschwiegen werden: Sind in einer Reihe zwei extreme Werte vorhanden, so heben sie sich gegenseitig auf. Das Ergebnis nach dem Grubbs-Test wurde lauten: ,,kein AusreiBer". Eine Abhilfe bietet der sogenannte ,,paired Grubbs-Test", auf den hier nicht eingegangen wird, siehe dazu [30]. Es folgen nun zwei Tests, die selten erwahnt werden, die aber nicht minder praktikabel sind. Henning-Test Vorgehen: Man bilde die GriiBe Q nach der Gleichung:

Q

= Ix, - XI

und uberpruft, ob

3 s 2. Q ist mit:

x, AusreiBerverdlchtiger Wert

X Mittelwert Ein AusreiBer liegt vor, wenn Q groBer ist als die dreifache Standardabweichung.

Beispiel Eine Kapillar-GC-Methode liefert folgende Retentionszeiten: 14,38, 14,40 , 14,38, 14,36, 14,37, 14,38, 14,38, 14,39, 14,39, 14,38, 14,41 ausreifierverdlchtigter Wert: 14,41

s = 0.01 I IXI -

x-1 = 14.41

-

14,M = 0,030

3 s = 0,033 > 0,030 Ausaage: Der Wert ,,41" ist ein AufJreilJer Mittelwertabweichung Viele Labors gehen einen einfachen pragmatischen Weg: Ein Wert gilt als AusreiOer, wenn er um mehr als *I0 56 von dem Mittelwert abweicht. Der AusreiOertest nach Nalimov pruft den groBten und den kleinsten Wert auf Ausreifler, niiheres s. [2X].

Brmrrkittig Es sei noch einmal betont: In der Analytik geht es u. a. urn Vcrpleichbarkeit. eine Voraussetzung dafiir ist die Existenz objektiver Kriterien. Auch folgende Empfehlung einiger Organisationen (z. B. FDA) entspricht einer objektiven Vorgehensweise - obschon mancher Analytiker evtl. daniit P r o b l e m hiitte: Es gibt prinzipiell keine AuareiBer. es werden siimtliche ermittelte Werte bei den Bercchnungen z. B. von V , beriicksichtigt.

3.3.6.2 Trendtest nach Neumann Zielsetzung: Priifen, ob die MeRwerte im zeitlichen Verlauf fallen oder ansteipen Br ispiele,f l i t - Twt i d s Werte fallen, wenn die Probe sich zersetzt. Werte steigen an bei anfiinglicher Adsorption der Probe an der Oberfliiche einer Stahlkapillare in einem Fliissigkeitastrom und allmiihlicher Siittigung der selbigen. Vorgehen:

mit:

ti

.t-,, \

Man bildet die GriiRe Q nach der Gleichung:

Anrahl der Mel3werte x,,, MeBwerte. Die Werte werden nach ihrer chronologixhen Reihenfolge ge-

ordnet Standardabweichung

3.3 Prii,-i.rion

65

Diese GroBe Q wird mit einem entsprechenden Tabellenwert, siehe Neumann-Tabelle, Abschnitt A.6, bei einem Signifikanzniveau P = 95 % verglichen. 1st Q grol3er als der Tabellenwert, liegt mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 % ein Trend nicht vor. Wiihrend bei den AusreiBertests sich ein Signifikanzniveau von P = 99 % (99 % Wahrscheinlichkeit) eingeburgert hat, ist jenes bei den anderen Tests meist P = 95 %. Der Trendtest nach Neumann wird nicht so oft durchgefuhrt, da eine Drift von Zahlen auch ohne diesen Test leicht erkannt wird. Werden Kontrollkarten gefuhrt, ist das Erkennen einer Drift nicht nur leichter sondern man erhalt noch weitere zusatzliche Informationen. 3.3.6.3 Errnittlung der Wiederholgrenze Bei Anwendung von Routinemethoden lautet im Falle von Doppelbestimmungen eine hiiufige Frage im Alltag: Welche Differenz zwischen den Einzelwerten sollte noch akzeptiert werden? Diese Differenz, die kritische Wiederholdifferenz r; ist

mit:

.s

f

Standardabweichung aus Validierungsdaten empirisch ermittelter Zahlenwert, der von dem gewahlten Signifikanzniveau und der Verteilung der Werte abhangt [30].

Fur ein Signifikanzniveau P = 95 % (s. oben) und unter der Annahme einer Normalverteilung ist der Wert v o n f = 1,96 und somit r r =

1,96. h . s = 2,77 . s

= 2,8 . s

Das heifit, es wird akzeptiert, wenn in 5 Fiillen von 100 (95 %!)die Differenz zweier Einzelwerte bis ca. die dreifache Standardabweichung betragt. Fur ein Signifikanzniveau von 90 % ergibt sich ein Faktor von 2,3 und fur ein Signifikanzniveau von 99 % ein Faktor von 3,65. Der Test Lur Ermittlung der Wiederholgrenze erinnert an den Henning-Test. Ob Henning-Test, kritische Wiederholgrenze oder Methodenf&higkeit (siehe Abschnitt 3.1 1 ), das Prinzip der Gaukistatistik dringt durch. Eine Streuung von +3 s urn einen MeBwert, also eine Spanne von insgesamt 6 s, wird hiiufig als Konvention akzeptiert. Die Wahrscheinlichkeit niimlich, daR der Wert bei der n2chsten Messung sich innerhalb eines Streufensters von 6 s befindet, ist ca. 99,73 %. 3.3.6.4 F- und Cochran-Test

Vorhrrnerkung Sowohl fur den F- (nach dem Autor Fisher) als auch fur den Cochran-Test gelten folgende Voraussetzungen: I . beide Datenreihen sind normalverteilt, 2. beide Datenreihen sind frei von AusreiBern.

F-Test, Test auf Varianzenhomogenitiit Zweck:

Priifen, ob die Standardabweichungen aus zwei unterschiedlichen MeOreihen vergleichbar sind, ob also Varianzenhomogenitat herrscht (Test auf Gleichheit der Varianzen). 1st das der Fall, so stammen die Werte aus einer Grundgesamtheit. Dabei mussen die zwei Meljreihen nicht gleich groB sein.

Vorgehen:

Man bildet die Prufgrolje F nach der Gleichung:

F

t,wobei s I> s2 ist SL

=

.y>

mit: s,,.s2 Standardabweichungen der zwei MeBreihen Der erhaltene Wert wird mit einem Tabellenwert F ( P , f l , f 2 ) siehe , F-Tabelle, Abschnitt A.6 verglichen. Dabei bedeuten: ji Zahl der Freiheitsgerade, es gilt: f = n - 1 n Anzahl der Meljwerte 1st F groljer als der Tabellenwert, so gilt ein Unterschied der Standardabweichungen mit einer vorgegebenen Wahrscheinlichkeit als erwiesen, z. B. fur n , = n2 = 6 und P = 95 % gilt: F = 5,OS; fur n 1 = 6, n2 = 10 und P = 99 % gilt: F = 6,O6

Beispiel Es sollen die Gehalte des Wirkstoffs NOVIALIN aus den Produktionschargen A und B auf Varianzenhomogenitlt getestet werden. 18,3 18,l 18,6 17,9 18,O X = 18,22, s = O , 3 O 24,2 24,0 25,l 23,9 23,8 X = 24,30, s = O,55

Produktionscharge A: Produktionscharge B:

0SS2

F = -= 534 0,302

Aus der Tabelle wird ein Wert F (95 %,fl und f2 = 5 - 1 = 4) von 6,39 entnommen. Weil F < F (95 %, 4, 4) ist, nlmlich 3 3 4 < 6,39, besteht Varianzenhomogenitat (die korrekte Formulierung lautet: ,,Varianzeninhomogenitat kann nicht nachgewiesen werden"). Bitte beachten Sie dabei, daR die Mittelwerte recht unterschiedlich sind. Als zusammengefaljte Standardabweichung ergibt sich: Sgcs

=

s,

+ s, 2

-

0,30 + O,S5 2

=

O,43

3.3 Priizision

67

Brmrrkung: Der Variationskoeffizient ist ein strengeres und aussagekraftigeres Vergleichskriterium fur Prlzision als der F-Test. Letzter stellt lediglich ein grobes MaB fur die Gleichartigkeit von Streuungen dar. Im oberen Beispiel betriigt der V , fur die Produktionscharge A 1,65 c/o, fur die Produktionscharge B 2,26 %. Cochran-Test Zweck:

Priifen, ob Standardabweichungen aus mehreren unterschiedlichen Meljreihen zusammengefaljt werden durfen, ob also Varianzenhomogenitat herrscht.

Im Unterschied zum F-Test gilt der Cochran-Test fur identische Proben und gleich grolje Mefireihen. Vorgehen:

Die Priifgrolje C ist der Quotient aus grol3ter zu vergleichender Varianz und der Summe aller Varianzen.

mit:

grol3te Standardabweichung Zahl der Mefireihen Standardabweichung der i-ten Meljreihe

,,s

k s,

Der erhaltene Wert wird mit einem Tabellenwert C ( P , n, k ) , siehe Cochran-Tabelle, Abschnitt A.6, verglichen. 1st C griiljer als der Tabellenwert, so ist die Standardabweichung C,,, mit der vorgegebenen Wahrscheinlichkeit P unterschiedlich von den ubrigen Standardabweichungen (z. B. fur P = 9.5 c/o, n = 5 und k = 5 gilt: C (9.5,5,.5) = 0,505).

Beispirl Nach betrlchtlichen Bemuhungen kann endlich bei der Valin GmbH das neue Produkt Validol in Produktion gehen. Der Gehalt sol1 von nun an von den drei Mitarbeitern, Herrn Quant, Frau Chrom und Frau Peak-Schmal bestimmt werden. Folgende Zahlen wurden ermittelt: -

2

4

5

6

X

F

93,4

1.0

91.9

92,n

92.20

0.72

0.52

913

92.0

91.5

92,9

91,24

0,84

0.71

91,2

90.2

91.4

91.7

90,76

039

0,3S

1

2

3

Herr Quant:

92,2

91s

Frau Chrom: Frau Peak-Schmal:

91,O

89,9

90.1

90,9

MclJwcrtc

C=

0,842 0,72'

+ 0,844 + 0,59'

-

0,7 1 0 3 + 0,71 + 0 3

=

0,449

Aus der Tabelle wird ein Wert fur C (95 %, 6,6) von 0,445 entnommen. Da C > C (95 %,6, 6) ist, kann nicht von einer Varianzenhomogenitat ausgegangen werden. Aussage:

Die Variabilitgt der Arbeitsweise von Frau Chrom ubersteigt etwas die der anderen Anwender - jedenfalls fur die gegebene Methode und Probe (Frau Chrom Jefert" eine Varianz von 0,7 I , das fuhrt zu 0,449 > 0,445). Bei den strengen Kriterien von P = 95 % sollte ein(e) erfahrene(r) Kollege(in) die Bestimmung ubernehmen, oder Frau Chrom mul3te geschult werden. Sind weniger strenge Kriterien vertretbar ( P = 99 %), so kann Frau Chrom weiterhin im Team arbeiten, denn trotz der gleichen Varianz von 0,7 1 ergibt sich jetzt: 0,449 < 0,520 (C fur 99 96,6, 6 = 0,520), siehe Cochran-Tabelle, Abschnitt A.6.

3.3.6.5 Zusammenfassung der Tests und abschlieoendes Beispiel Wenn i n einein Labor Werte erzeugt werden, sind moglicherweise folgende Fragen von Interesse. Diese Fragen werden um so wichtiger, je weniger bekannt die angewandte Methode ist, siehe nachfolgende Tab. 3-4. In Abb. 3-3 ist die Vorgehensweise bei der Bewertung von MeRreihen als FlieBschema dargestellt. Tab. 3-4 Fragen und Liisungsmiiglichkeiten.

Fragc:

Antwort durch:

Sind die Werte normalverteilt?

David-Test

Gibt es AusrciBcr?

AusreiDertests Trendtest nach Neumann

Streucn sic ,,normal" oder driften sie? Wie groB darl die Differen/ iwischen zwci cinzclnen Werten sein (z. B. bci Doppclbestimmung)'?

Wicdcrholgrenze

Wie gro8 ist die Unsicherheit des Mittclwcrtes (MeBwertes)in Zahlen au5gcdruckt (Erliiutcrung und Berechnung siehe ,,Richtig-

MclJunsicherheit

Wie groB ist der Schwankungsbercicheines Werles, d. h. inncrhalh welcher Grenzen kann der ,,wahrc" Wcrt sich hefinden (Erlauterung und Berechnung siehe ,,Richtigkcit", Ahschnitt 3.4)?

Erweiterle Unsichcrhcit (Vcrtrauensbereich)

kcit", Ahschnitt 3.3)?

Zum Vergleich von Zahlen zweier MeBwertreihen siehe Abschnitt 3.4.4. Eben besprochene Punkte werden im nachfolgenden Beispiel zusammengefaBt.

MeRwertreihe DAVID - Test

I

Werte normal verteilt

NElN

Ursachenforschung

Mittelwertab-

+

I

AusreiRer gefunden '?

JA

AusreiRer mit 2 oder 3

+ neuen Werten ersetzen und Test wiederholen

I

JA

Trendtest oder v

I

Neumann

d

er

Beurteilung

c

ENDE

Abb. 3-3 Tcsts zur Bewertung von Zahlen cincr Mel3wcrtreihe.

Ursachenforschung Dokumentation mit folgenden Angaben: - Mittelwert mit Ergebnisunsicherheit und Vertrauensbereich - Standardabweichung und Variationskoeffizient - Angaben zu den Bedingungen wie: Anzahl der Werte, Doppelbestimmung? Konzentration etc.

Brispiel In der Zentralen Analytik der Valikrom GmbH wurden im Rahmen von Stabilitiitsuntersuchungen des neuen Pflanzenschutzmittels ,,VAL1DAN" folgende Gehalte des Wirkstoffs ,,NOVIALOL" gefunden ( 76): 90,l 91,2 93,l 89,s 89,9 90,2 -

x = 90,67 s

= 132

V , = 1.46 % -

David-Test:

R

pG=-= s

93,l - 89,9 = 2,42 1,32

Fur n = 6 und P = 99 % erhalt man aus der Tabelle die Werte g, = 2,15 und g , = 3,14. Das bedeutet: 2,42 liegt zwischen 2,lS und 3,14. Mit einer Wahrscheinlichkeit von 99 96 sind die Werte normalverteilt. -

AusreiRertest nach Dixon: AusreiRerverdiichtiger Wert: 93,l

Die berechnete PrufgroRe (Q = 0,528) ist niedriger als die aus der Tabelle entnommene (Q = 0,698). Damit ist mit einer Wahrscheinlichkeit von 99 % kein AusreiRer festzustellen. -

Trendtest nach Neumann:

(90,l - 91,2)? + (91,2 -%,I)*

+ (93,l - 893)' + (89.5 (6 - I ) . 1,32*

~

89,9)'

+ (X9,9 - 90,2)'

=

2,07

Die berechnete PrufgroBe (Q = 2,07) ist deutlich groBer als die aus der Tabelle entnommene (Q = 0,89). Deshalb ist rnit einer Wahrscheinlichkeit von 05 5% kein Trend feststel I bar.

3.3 Pruzision -

71

Wiederholgrenze: r = 2.8 . .Y = 2.8 . 1,32 = 3,696 = 3,70 Statistisch gesehen wird die Differenz zwischen zwei gemessenen Werten (ermittelt unter Wiederholbedingungen) nur alle 20 ma1 groBer sein als ca. 3,70. Im vorliegenden Beispiel und den 6 Zahlenwerten betragt die grol3te Differenz 3,6 (93,l - 89,s = 3,6).

Die MeBunsicherheit und der Vertrauensbereich werden ausfuhrlich in Abschnitt 3.4.3 behandelt. Um jedoch vorliegendes Beispiel vollstandig darzustellen, werden auch diese GroBen hier ermittelt.

mit:

Ef

t II

MeBunsicherheit t- oder Studentfaktor (Tabellenwert) Anzahl der MeBwerte

Vertrauensbereich: x + u : Obergrenze und x - II : Untergrenze, d. h.: 90,67 k 1,39, also 90,67 - I ,39 = 89.28 und 90,67 + 1,39 = 92,06 Aussage:

Mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 o/o liegt der ,,wahre" Wert zwischen 89,28 und 92.06.

3.3.7 AbschlieBende Fragen zur Prazision 3.3.7. I Welche Prazision kann noch akzeptiert werden? Hier sollte zuniichst zwischen MeB- und Methodenprazision unterschieden werden. -

MeBprlzision: Nachfolgend sind beispielhaft typische Werte fur die MeBprazision in der instrumentellen Analytik angegeben. Diese Werte sind im Normalfall bei fehlerfreien Instrumenten zu erreichen. VK Fcuchtcmcssung

Ti tration Viskosimctric

<2% < 0,05 7c <0.I %

pH-Mcssung

<0,15 96 (im stark alkalischen wesentlich hiiher)

Pholoinctric

< I %

Chromatographic (HPLC, GC)

< I %

Kapil larclcktrophorc\c/ Elektrochromatographie

<2%

-

Methodenpriizision: Die noch zu akzeptierende Methodenpriizision ist natiirlich abhiingig von der Komplexitiit der Methode, der Matrix und der Konzentration. Sind beispielsweise in der Pharma-Qualit2tskontrolle Vk-Werte zwischen 1 bis 2 % ublich, so waren in der Umweltanalytik VK-Werte von 10 5% oder gar 1.5 % ' durchaus akzeptabel. Ein Zahlenbeispiel sol1 demonstrieren, daR ein VK-Wert von 10 % fur eine Nebenkomponente mit einem Gehalt von 0,5 % gar kein so schlechtes Ergebnis ist. Fur X = 0,5 und VK= 10 %I 12l3t sich die Standardabweichung wie folgt ausrechnen:

Die MeRunsicherheit fur 6 Werte und P = 95 % ergibt sich wie folgt (ausfiihrliche Erliiuterung siehe Abschnitt 3. I):

Der Vertrauensbereich betragt 0,5 k 0,05. Der ,,wahre" Wert befindet sich in einem Bereich zwischen 0,45 und 0,55 - ein Ergebnis, mit dem sich sicherlich ,,leben" liil3t. Was ist nun die zuliissige Obergrenze des VK-Wertes einer Methode bei der Gehaltsbestimmung? Als Forderung gilt, daB der Vertrauensbereich (die zweifache MeBunsicherheit) fur den Gehaltwert nicht grol3er sein sollte als der halbe Toleranzbereich nus den vorgegebenen Spezifikationsgrenzen:

2 s 2.u=t.-< '

JT;

Es gilt: s =

v,

(OSG - USG) 2

.x

100

vK.x

.

einsetzen, nach VK auflosen und man erhiilt 100 den maximal ,,.mliissigen" V,-Wert fur die konkreten Spezitikationaanforderungen. Man kann nun in obiger Formel furs,

v,

<

Fur t (95 %,,f-

(OSG - USG) . 4.t.x 00)

'

100

= 1,96 (t-Tabelle, siehe Abschnitt A.6) lautet die Ungleichung:

3.3 Priizision

K'

mit:

<

73

(OSG - USG) & 100 4 . 1,96 . X '

'

OSG obere Spezifikationsgrenze USG untere Spezifikationsgrenze

Beispiel Vorgegebene Spezitikationsgrenze: 98 % - 102 % Mittelwert: 100 Anzahl der Werte: 6

K'

<

(102 - 98). & . 100 4.1,96.100

-

4 . 2 , 4 5 . 100 = 1,25 4 . 1,96 . 100

Der Variationskoeffizient V , sollte im vorliegenden Beispiel hochstens 1,25 betragen. 1st er groBer, so ist die Streuung der Ergebnisse dieser Methode unverhaltnismal3ig stark im Vergleich zu den Spezifikationsforderungen. Zu dieser Problematik siehe Abschnitt 3.1 1. Fur den Pharmabereich sind folgende Forderungen ublich: Gchalt dcr Nehen- und Abbauprodukte hemgcn a u i die Hauptkomponente

Richtwert fur zulassigen V K

> 10%

3%

10%- I r/c

I %-O,I

c/r

5% 10 R

Tabelle 3-5 gibt fur eine Reihe von Analytkonzentrationen in der Probe die veranschlagte bzw. akzeptierte Variationskoeffizienten unter Wiederhol- ( VKr) und Vergleichbedingungen ( VKR) wieder. Diese Tabelle basiert auf einer grundlegenden Arbeit von Horwitz aus dem Jahre 1982 [ 3 1 1. Horwitz entwickelte an Hand von zahlreichen Ringversuchen (ca. 3.000) uber mehrere Jahre eine empirische Gleichung fur die maximal akzeptierte/erwartete Streuung in Abhangigkeit von dem Anteil Analyt in o/o in der Probe. -

vK,ll,,x

mit:

c

2' 1-0.s Igr)

-

Konzentration des Analyten in der Probe (Decimal)

Bei einer reinen, 100 c/o Probe gilt c = 1 und entsprechend Igc = 0:

Tab. 3-5 Analytkonr.cntration und erwartetc/ublichc relative Standardabweichung unter Wiederhol- und VcrEleichsbedingungen. VKr

VKR

100

1,34

2

50

1.49

2,22

20

1.71

235

I0

I ,90

2.83

5

2.10

3.14

2

2.4 I

3,60

I

2.68

4,00

0.50

2,97

4.44

0.1

3,7Y

5.66

0,0 1

5,30

7,9 1

0.00 I

7.30

10,90

'% Analyt

Anteil

0.000 1

11

16.42

0,00001

IS

2239

0.00000 1

21

3 1.34

0,000000 I

30

44,78

Weiterhin stellte Horwitz ebenfalls empirisch fest, daB VK,-Werte unter Wiederholbedingungen meist u m einen Faktor 0,5 bis 0,75 kleiner sind als die entsprechenden VKRWerte bei den Ringversuchen, also unter Vergleichsbedingungen. Daraus resultiert als Vorschlag folgende Gleichung:

mit:

VK,Variationskoeffizient unter Wiederholbedingungen V K R Variationskoeffizient unter Vergleichsbedingungen

3.3.7.2 Wie kann ich die Prazision erhohen? Am einfachsten erhoht man die Prazision durch mehr Messungen - ein vollig legitimer, jedoch aufwendiger Weg! Die Standardabweichung ist der Wurzel aus der Anzahl der Messungen indirekt proportional, siehe Abb. 3-4.

3.3 Priizision

1

5

10

15

75

20 n

Abb. 3-4 EinfluB der Anzahl von Wiederholmessungen ( u ) auf die GraRe der Standardahweichung (s) des Mittelwertes [32].

3.3.7.3 Was sind die Vor- und Nachteile bei groBer Prazision? Vorteile Je groljer die Prazision d. h. je kleiner die Standardabweichung und j e geringer die Streuung der Werte ist, urn so eher werden Verschiebungen des zu uberwachenden Prozesses erkannt, siehe Abb. 3-5 [32]. Ein Labor hat die Aufgabe, einen Produktionsprozelj zu uberwachen. Es SOH, sobald sich gemessene Werte auljerhalb der Kontrollgrenze (+3 s) befinden, Alarm geben. Wenn nun das zu messende Merkmal des Produktes sich aufgrund einer Verschiebung des Produktionsprozesses um e verschiebt, wird sich auch der Zahlenwert (Mittelwert), der im Labor errnittelt wird, urn diesen Betrag e verschieben. Aufgrund der aktuellen Streuung der Analysenwerte wird in ca. 16 % der FIlle diese Verschiebung registriert (siehe Abb. 3-5). Gelingt es eine prazisere Methode einzufuhren, wird irn selben Fall bereits in 84 5% der Falle diese Verschiebung registriert. Wenn keine prazisere Methode zur Uberwachung des Prozesses zur Verfiigung steht, sollte die Anzahl der Messungen erhoht werden. So kann die in Abb. 3-5 gezeigte empfindlichere Anzeige der Mittelwertverschiebung auch dadurch erreicht werden, daB man viermal so viele Messungen durchfuhrt (s. auch Abschnitt 3.4.3). Nachteile Bei einer ,,zu" groljen Prazision der Methode werden leicht etwas abweichende Werte als AusreilJer gedeutet, siehe Beispiel beirn Dixon-Test. Weiterhin ist eine ,,zu" prazise Methode unter Routinebedingungen nicht robust genug. Eine jede kleine Anderung in den Bedingungen wurde zu einem groBeren Wert fur V , fiihren, der dann moglicherweise nicht akzeptiert werden kann.

3 Die Vulidieritngspammeter

76

Sind Spezifikationsgrenzen vorgegeben, wie z. B. in der Produktanalytik, so kann das Ziel nur heisen: moglichst prazise Methode. Wird eine Methode neu validiert, so sollten aufgrund der Ergebnisse am den Experimenten zur Prazision erst dann die Spezifikationsgrenzen realistisch festgelegt werden.

I

,e e+

J

verschobene Haufigkeitsverteilung

Wahrscheinlichkeit, daR ein Einzelwert KO 1st = 16%

>

X

OriginaldesMittepl aus 4 werts Verteilung

,+e

I

Wahrscheinlichkeit, daB ein Mittelwert >KO ist = 84%

verschobene

Abb. 3-5 Emptindlichere Anzcigc cincr Mittelwertverschiebung mit einer prlriseren Methode bzw. einer Vierfachmessung im Vcrgleich LU Einzelmessungen.

3.4 Richrigkeit

3.4

77

Richtigkeit

3.4.1 Definitionen und Erlauterungen Richtigkeit ist das Man der Ubereinstimmung zwischen dem ermittelten Wert und einem als richtig angesehenen Wert. Man bezieht sich demnach auf einen Wert, der konventionell als fehlerfrei und somit als richtig gilt - z. B. ein zertitiziertes Referenzmaterial -, da der wahre Wert prinzipiell nicht bekannt sein kann. In der Literatur wird jedoch oft nicht zwischen ,,wahrem" und ,,richtigem" Wert unterschieden. Als quantitatives MaB fur die Richtigkeit (eigentlich fur die ,,Unrichtigkeit") gilt die systematische Ergebnisabweichung (engl.: bias). Mit unrichtigen Ergebnissen ist u. a. in folgenden Fallen zu rechnen: Mangelhafte Selektivitat der Methode Beispiel: Bei einer HPLC-Methode liegt unter dem Peak eines Wirkstoffes ein nicht abgetrennter Peak eines Metaboliten, die Gehaltsangabe des Wirkstoffes ist mit einem konstanten, systematischen Fehler behaftet. Wiederfindungsrate kleiner als I00 % Beispiel: Bei der Reinigung von Proteinen wird abhangig von der Konzentration ein bestimmter Anteil irreversibel an der Glasoberflache der Reinigungssaule sorbiert. Hier handelt es sich um einen konzentrationsabhangigen, sprich proportional systematischen Fe h I er. Falsch angenommener Gehalt eines Referenzstandards aufgrund von Zersetzung Beispiel: Man bezieht sich bei einem in-vitro-Experiment auf den angegebenen Gehalt von 99,8 % des zertifizierten Referenzmaterials. Durch Unterbrechung der Kuhlkette und beschleunigte Zersetzung betragt jedoch der tatskhliche Gehalt im Moment des Vergleichs nur 99,l %. Die Konsequenz ist ein unrichtiges Ergebnis: Es handelt sich um einen proportional systematischer Fehler, das AusmaB hangt vom Zeitpunkt der Bestimmung ab. Falsch gefundener Gehalt wegen unterschiedlicher Matrix Beispiel: Ein Freigabelabor verwendet ein gut charakterisiertes Muster als Standard. Die Produktion variiert geringfugig die Rezeptur ohne diese ,,kleine" Anderung der Qualitatskontrolle mitzuteilen. Das Labor arbeitet weiterhin mit dem alten Standard. Wegen der veranderten Matrix und deren EinfluB auf die Selektivitat ergibt sich womoglich ein konstanter systematischer Fehler. Bei Trennmethoden sind die zwei unabdingbaren Voraussetzungen fur Richtigkeit das Vorhandensein von Selektivitat und eine bekannte Wiederfindung. Dazu muB man anmerken, daB zwar eine richtige Methode immer eine selektive Methode ist, aber eine selektive Methode nicht automatisch ein richtiges Ergebnis liefert. Es gibt noch weitere Ursachen fur einen systematischen Fehler, namlich wenn keine konstante Ausbeute bei der Extraktion erreicht wird, oder eine Zersetzung des Analyten stattfindet oder ein systematischer Fehler bei der Messung z. B. Detektion, Injektion usw. auftritt.

3.4.2

Prufung auf Richtigkeit

Nachfolgend werden die eimelnen Methoden anhand von Beispielen dargestellt und kommen t iert .

3.4.2. I

Vergleich rnit einem (oder mehreren) Referenz- oder Arbeitsstandard(s)

Der K&r-mz.stuIidurd ist im idealen Fall ein zertitkiartes Referenzmuteriul, dessen Gehalt als bekannt und richtig gilt (Sollwert). 1st ein solches nicht erhiiltlich, kann ein sehr gut charakterisierter synthetischer Standard verwendet werden. Bestehen Zweifel an der Qualitiit des Standards, so kann uber die Massenbilanzen sein tiitsgchlicher Gehalt uberpruft werden. Beispielsweise wird von einem neuen Lieferanten ein Standard mit einem deklarierten Wirkstoffgehalt von 95 5% geliefert. Die restlichen 5 '3- sollen aus 2 %- Wasser, 1 '3Restliisemittel und 2 7c Natriumchlorid bestehen. N u n werden diese Restbestandteile quantitativ analysiert. Die Analysenmethoden kijnnen sein: Wasser mittels Karl-Fischer, Restliisemittel mittels Kapillar-GC und Natriumchlorid mittels ionenselektiver Elektroden oder Photometrie. Ergibt sich ein Anteil der Nebenbestandteile von groRer/kleiner als 5 56, so besteht ein berechtigter Verdacht auf falsch deklarierten Gehalt des Wirkstoffs. Vergleich einer Probe unbekannten Gehaltes mit einem Standard bekannten Gehaltes Zur Prufung auf Richtigkeit gibt es zwei Miiglichkeiten. Zum einen einen Soll/lst-Vergleich und Uberprufung mit dem t- (otler Stuclent-)Test, zum zweiten eine vereinfachte Richtigkeitskontrolle nach Doerffel. Der [-Test ist mit Abstand der am weitesten Verbreitete. a ) Sollwert-t-Test Zuniichst wird der 1st-Wert durch 6-fach-Bestinimung unter Wiederholbedingungen erinittelt (Mittelwert), anschlieliend wird die Standardabweichung berechnet. N u n wird uberpruft, oh der Sollwert mit einer gegebenen Wahrscheinlichkeit innerhalb des ~ ~ r t r r r ~ r r r z s h r r r i c des h e . ~Analysenergebnisses liegt, d. h. ob die Methode fur diesen bekannten Wert (Sollwert) einen ,,Richtigkeitsbereich" abdeckt.

mit:

.? ermittelter Mittelwert P Sollwert (Standard) IT - pl = I I MeBunsicherheit odervertnluensintervall, 11. MaB fur die MeBwertS

I7

abweichung (systematischer Fehler, bias) Standardabweichung Zahl der Wiederholmessungen, oft 17 = 6

3.4 Richtigkeit

79

Mit diesem Test konnen generell zwei Mittelwerte verglichen werden und zwar auch dann, wenn die Anzahl der MeBwerte unterschiedlich ist. In diesern Fall gilt folgende Gleichung:

r

mit:

x,

'

s

Mittelwert I

X2 Mittelwert 2 nl n2

Anzahl der Werte bei der Ermittlung von x, Anzahl der Werte bei der Ermittlung von x2

Der resultierende Wert f wird mit dem Wert aus der r-Tabelle verglichen (s. r-Tabelle, Abschnitt AS). 1st rgefs rTahelle so liegt der Sollwert rnit der vorgegebenen Wdhrscheinlichkeit innerhalb des Vertrauensbereichs des Analysenergebnisses. Fur eine 6-fachBestimmung ( n = 6) und einer Wahrscheinlichkeit von 95 % ( P = 95 %, f (Freiheitsgrad) = n - 1 ) ist t = 2,57 1 , d. h. tgef.sollte kleinedgleich 2,57 1 sein. Der r-Test setzt Varianzenhomogenitat voraus, d. h., es wird Normalverteilung angenommen. Stimmt diese Voraussetzung nicht, so konnen die effektiven Freiheitsgrade nach Welch errechnet werden [33].

Kommentar: Der Sollwert-t-Test birgt, obschon sehr verbreitet, eine Gefahr: Der Wert fur p wird in die Formel eingesetzt ohne genaue Kenntnis dartiber zu haben, wie prazise die Methode ist, d. h. wie die aktuelle Streuung von p ist. Es wird in jedem Fall empfohlen, den Sollwert ,u mit der zu validierenden Methode zu messen. Erst namlich die Differenz zwischen dem bekannten, ,,richtigen" Wert p und dem unter Wiederholbedingungen tatsachlich ermittelten Wert p ergibt die Summe der systernatischen und der zufalligen Fehler wieder. Eine Einschrankung ist, dal3 das Ergebnis nur fur diesen Standard gultig ist. b) Doerffel-Test Der gefundene Wert kann auch nach dern Ansatz von Doerffel beurteilt werden: Solange IX - pl < 1,5 . s / & ist, besteht kein Grund zur Annahme eines systematischen Fehlers. mit:

x errnittelter Mittelwert p Sollwert (Standard) s Standardabweichung

Betragt die Differenz IX - pi 2 2 s / & , ist ein systematischer Fehler der Methode wahrscheinlich. Bei kleinen Werten von n (n < 10) sollte anstelle des Faktors 2 der Wert aus der r-Tabelle fur n - 1 Freiheitsgraden und P = 95 % verwendet werden.

W i I cox on-Te \ t Neben der Richtigkeitsprufung kann zusiitzlich gepruft werden. o b die crinittelten Werte uin den Mittelwert symmetrisch verteilt sind (Wilco.uon-72.st). Zuniichst werden die Differenzen der einzelnen MeBwerte vom Mittelweit ermittelt und anschlieknd diese Differenzen dem Betrag nach geordnet. Sie erhalten Rangzahlen, d. h., die kleinste Differem Ax, = .~~",,,\\~"-MitteIwert erhiilt die Rangzahl 1. die Lweitkleinste 2 usw. Bci gleichern Differenzbetrag werden die Rangzahlen gernittelt. Die Rangzahlen werden addiert und der erhaltene Wert wird mit einem Tabellenwert verglichen, der der Wilcoxon-Tabelle (s. Abschnitt A.6) entnommen wird. 1st Wfcl < WT,,hcllc,,~cr,, so sind die ermittelten Werte mit einer gegebenen Wahrscheinlichkeit asymmetrisch urn den Mittelwert verteilt. Fur I I = 6 und P = 95 % ist W,ah = 17, d. h., Wgcl.solltekleiner/gleich 17 sein. Der Wilcoxoii-Test wird nicht oft angewandt. Br ispie I I n einem Labor sol1 die Richtigkeit einer neuen inhouse-Methode fur eine Gehaltsbestiinmung durch Soll-/lst-Vergleich mit einem zertifizierten Rei'erenzstandard uberpruft werden.

SoI I wert : Gemessene Werte: Mi t te I we i t : Standardnbweichunf:

95,90 96,20 96,4O 96,lO 96,OO 95,9O 96-50 96, I8 0.23

t-Test

E\ wurde ein 4gnitikanter Unterschied zwischen Sollwert und gefundenem Mittelwert fe\tge\ te I It .

Doerffcl-Tat (Prufung auf signifikante Abweichung) Gilt t'iir vorliegenden Fall die Ungleichung

3.4 Richtigkeir

81

Da n = 6, wird statt dem Faktor 2 der Wert 2,57 I aus der r-Tabelle verwendet: 96,18 - 95,90 >

237 1 . 0,23 2,45

0,28 > 0.24 Es wurde ein signifikanter Unterschied zwischen Sollwert und gefundenem Mittelwert festgestellt. Das Ergebnis ist mit folgender MeBunsicherheit verbunden:

*

Das bedeutet, daB der Mittelwert um X u , d. h. 96,18 k 0,241 schwanken kann, also zwischen 95,94 und 96,42. Genaueres zur MeB- und Ergebnisunsicherheit siehe weiter unten. -

Wilcoxon-Test Die Ermittlung der MeBwertdifferenzen 95,9 - 96,2 = 0,3; 95,9 - 96,4 = 0,5 usw. ergibt folgende Rangliste: Differenzen

Rangzahlen

0,30

3

0.50

4

0.20

2

0.10

I

0.00

0

0.60

5

Da Wgc, = 15 kleiner ist als Wtab = 17,liegt eine symmetrische Verteilung der erhaltenen Werte um den Mittelwert vor.

Ergrhnis Die gefundenen Werte sind zwar um den Mittelwert symmetrisch angeordnet, es kann aber keine Ubereinstimmung zwischen Sollwert und ermitteltem Mittelwert angenommen werden. Brmerkutig Die Validierungsparameter ,,Richtigkeit" und ,,Priizision" sind keine voneinander unabhangige Charakteristika einer Methode. Liegt eine Methode mit einer geringen Prazision vor, so wird man bei der Uberpriifung der Richtigkeit moglicherweise dafur ,,belohnt".

Wiirden beispielsweise im o. a. Beispiel die Werte bei gleichem Mittelwert starker streuen und ergibt sich dadurch eine Standardabweichung z. B. von 0,30 statt von 0.23, so betriigt tfcF= 2.287 und ist folglich kleiner als 2,571. Das Ergebnis muBte als richtig angesehen werden. Umgekehrt kann bei einer groBen Prazision einer Methode der t-Test - trotz akzeptabler Selektivitiit und Wiederfindungsrate - zu der Aussage fuhren: .,Ergebnis unrichtig". Dies wird in Abb. 3-6 schematisch dargestellt. Eine ,,zu" priizise Methode kiinnte auch Schwierigkeiten in der Routineanwendung bereiten (s. auch Priizision, Abschnitt 3.3 und Robustheit, Abschnitt 3.5). Vergleich mehrerer Proben (oft 6) unterschiedlichen Gehaltes, die idealerweise den erwarteten Arbeitsbereich abdecken, mit Referenzstandardproben bekannten Gehaltes Dieser Test ist xu empfehlen, wenn die Richtigkeit der Methode uber einen griifieren Konzentrationsbereich uberpruft werden SOH. Es werden die 6 Gehalte durch Doppelbestimmung sowie die GriifJen a und b aus der linearen Regression ermittelt. .T<;c,l,

mit:

+ h.r,

.r(;cm Gemessener Wert, hier: Gehalt (I

h .t-,

r

= Ll

Konstanter, systematischer Fehler Proportionalitiitskonstante,Ma13 fur einen miiglichen. proportionalen Fehler Sollwert. hier: Gehalt der Standardprobe. er gilt als fehlerfrei

Sollwert I

Gehalt

Sollweri

Gehalt Abb. 3-6 Der Mirrclwert cincr .,xu" prHLisen Methode (unteres Bild) erscheinr hei den1 t-Test ala .,zignilikant" entlernt vom Sollwert [34].

3.4 Richrigkeit

83

AnschlieSend wird (qualitativ: jalnein oder quantitativ: mittels t-Test) gepriift, ob die erhaltenen Werte fur a und h sich von den Idealwerten a = 0 und h = 1 unterscheiden. Tun sie es (a = 0, h = I), so ist xGem=x,und man erhalt eine Winkelhalbierende. Ansonsten bedeutet a # 0 daS ein konstanter, und b # 1, daB ein proportionaler systematischer Fehler vorliegt. Bei zu groBer Extrapolation kann ein konstant systematischer Fehler (a f 0) vorgetauscht werden.

mit:

Ordinatenabschnitt der Regressionsgerade Steigung s, Standardabweichung von a s,, Standardabweichung von h a b

1st t, bzw. th groBer als der Wert der t-Tabelle f u r f = n - 2, so liegt fur die vorgegebene Wahrscheinlichkeit ein konstant systematischer (t,) bzw. ein proportional (t,,) systematischer Fehler vor. Wird ein konstant systematischer Fehler festgestellt, so ist dieser unabhangig von Konzentration bzw. Gehalt des zu bestimmenden Stoffes. Bei einem proportional systematischen Fehler liegt eine Abhangigkeit von der Konzentration vor. Auch hier hangt die Aussage uber die Richtigkeit von der Korrelation der MeRwertpaare ab: 1st die Standardabweichung sehr klein, so ergeben sich grol3e t-Werte und damit besteht die Gefahr, daS trotz ,,ausreichend" richtiger Methode systematische Fehler ,,erkannt" werden. 3.4.2.2 Vergleich mit einer unabhangigen, moglichst validierten Methode bekannter Richtigkeit Ein Vergleich zweier gleichwertiger Methoden macht naturlich dann Sinn, wenn beide Methoden vergleichbare Selektivitaten aufweisen. Die eine Methode ist die zu validierende Methode, die zweite eine bekannte, gut charakterisierte Methode (Referenzmethode). Nacheinander fuhrt man folgende Schritte durch: Bildung der Differenzen der erhaltenen Werte aus den beiden Methoden Bildung des Mittelwertes dieser Differenzen - Bildung der Standardabweichung der Differenzen - Errechnen des t-Wertes (DifSerenzen-t-Test) -

AY,= . I , (Methode 1 j - x , (Methode 2)

AT

-

=

;[ j Ayf

I1

\i

s ~ \ = (,I

mit:

-

l)-'z ,"

(AT, - AT):

AY Mittelwert der Differenzen .sA Standardabweichung der Differenzen

1st der erhaltene t-Wert g r i i k r als der tabellierte r-Wert (95 % . f = IZ - 1 ). so gilt mit der vorgegebenen Wahrscheinlichkeit als erwiesen, dab es einen Unterschied lwischen beiden Methoden gibt. Somit sind beide Methoden nicht gleichwertig. Gilt eine der zwei Methoden als konventionell richtig, so liefert die zweite Methode mit der vorgegebenen Wahrscheinlichkeit unrichtigc Ergebnisse.

Beispiel Der Gehalt einer Nebenkomponente des Wirkstoffs .,Validol" sol1 in Zukunft mittels einer schnellen elektrochromatographischen Methode bestimmt werden. Die Ergebnisse nicht identischer Ruckstandsproben sollen mit den Ergebnissen nach der altbewzhrten und validierten HPLC-Methode verglichen werden. Wcrtc ncuc Mcthodc [pglkg]

32

2x

18

3Y

II

20

Wcrk alte Methode [pglkg]

21

24

16

30

I0

13

5

4

2

9

I

7

Diflcrcnz

KT

Mittelwert der Differenren: = 4.67 Standardabweichung der Differenzen: .sA = 3.0 I

t = 4.67 3,0 1

'

Ji = 3.80

TestgroBe t: Tabellenwert fur T I = 6 fur ein Signitikanmiveau 9.5 %. t (95 %. 5 ) = 2 5 7

3.4 Richti,qkr,it

85

Richtigkeit durch Methodenvergleich Ergebnis nach Methode II ( zu validieren )

t

;-.

:.- - * ''

B

A : beide Methoden gleichwertig

Bei Einpunktvergleich kann Fall D unerkannt bleiben

Abb. 3-7 Prufung auf Richtigkeit durch Methodenvergleich 135, 361.

Weil tgef> ttah,namlich 3,SO > 2,57, ist ein systematischer Unterschied der zwei MeBreihen mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 5% erkennbar. Mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 o/o liefert die neue Methode fur diese Proben (fur diesen Konzentrationsbereich und diese Matrix usw.) unrichtige Ergebnisse. Der nlchste Schritt wlre die Suche nach systematischen Fehlern bei der neuen Methode. Beim Vergleich zweier Methoden konnen vier Falle auftreten, siehe Abb. 3-7. Aus Abb. 3-7 wird ersichtlich, welches Risiko eingegangen wird, wenn zur Prufung auf Richtigkeit durch Methodenvergleich Proben nur einer Konzentration vermessen werden: Wenn die zwei Geraden sich wie im Fall D schneiden - das ist der Fall bei konstantem und proportionalem Fehler - und man zufallig genau diese Konzentration fur die Prufung gewahlt hat, so wird falschlicherweise Richtigkeit vorgetauscht. Oder es wird eine kleine ,,Unrichtigkeit" akzeptiert (Punkt x), wenn die Differenz zwischen gefundenem und Sollwert gerade bei dieser Konzentration als vernachlassigbar erscheint. Die Richtigkeitsprufung durch Methodenvergleich sollte bei mindestens drei Konzentrationen erfolgen.

3.4.2.3 Wiederfindungsexperimente nach Zusatz bekannter Menge an Analyt (Referenzsubstanz!) H h f i g e Namen fur dieses Verfahren sind: Aufstockverfahren, Additionsmethode, ,,Spiken" einer Probe. Wiederfhdungsexperimente sind besonders dann empfehlenswert, wenn auf Grund komplexer Matrix eine Auswirkung selbiger auf die Richtigkeit zu erwarten ist.

Folgende Varianten sind hier denkbar: Dem Analyt werden synthetische Proben (Muster) zugegeben. Dem Analyt werden reale Proben (Muster) zugegeben. Dem Analyt werden Placebos zugegeben. -

Fur eine ausfuhrliche Beschreibung, siehe Abschnitt 3.7.2.5 und 3.8.

3.4.2.4 Elementbilanzierung Man fuhrt eine Elementanalyse (C,N) sowie z. B. eine HPLC-Analyse der Komponenten durch. berechnet die sich aus den HPLC-Gehalten der Komponenten ergebenden Mengen an C, N (Summierung der Peakfliichen, 100 C/r Normierung) und vergleicht die sich aus der Addition der Einzelwerte ergebende Summe C, N mit dem aus der Elementanalyxe ermittelten Wert.

Beispiel Eine Probe bestehe HUS den Bestandteilen NaCI. Wasser, Hauptkomponente und Nebenkomponente. In der nachfolgenden Tabelle ist der aus den Gehalten der Komponente umgerechnete % C sowie der aus der Elementanalyse gemessene angegeben. Gchalt

%C

NaCl

2.0 fi

-

Wawx

2.0

-

ci

Wcrt (i C rlu\ Elemcntanal y\c

HPIX: Hauptkomponcnte

Nehcnkomponente I Surnrne

90.0 fk

30.0 %

6.0 %

2,0 '?c

100,o

70

32,O %

31,s Yc

Mit diesem Verfahren lafit sich z. B. prufen, ob die HPLC-Methode die organischen Komponenten komplett erfafit. Diese Methode funktioniert zuverlassig nur fur die Hauptkomponente und bei einem hohen Anteil an Wasser, Salz, Placebo usw. in der Probe. Weiterhin mussen die Molekulargewichte, Struktur und Responsefaktoren aller Komponenten bekannt sein. Die Anwendung dieses Verfahrens hat sich bisher noch nicht durchgesetzt.

3.4.2.5 Indirekte Uberpriifung uber Massenbilanzen Die quantitative Analyse s2mtlicher Inhaltsstoffe einer Probe mu8 theoretisch 100 r/r ergeben. Beispielsweise ergibt sich fur die Hauptkomponente einer Probe durch Abziehen der Gehalte aller Begleitstoffe ein Gehalt von 94 56.

100 ?h Probe Wasser Sulfatasche Anorganische Salze Losungsmittel Placebobestandteile Rest: 94 ?h Dieser Gehalt wird nun mit Hilfe eines Standards bestltigt. 1st das nicht der Fall, so bedeutet das - unter der Annahme, daB die Bestimmung der oben aufgefiihrten Stoffe ,,im Griff' ist - zweierlei: Es wird bei der Bestimmung der Hauptkomponente ein systematischer Fehler gemacht oder der Gehalt des Standards ist falsch deklariert. Die Methode der Massenbilanzierung hat sich in der Praxis bewahrt und wird oft zur Uberpriifung der Gehalte von Standards eingesetzt (Info: Dr. Martin Jungheim, Bayer AG, Leverkusen). 3.4.2.6 Plausibilitltsbetrachtung Wenn keines der 0.a. Verfahren angewandt werden kann bzw. der Aufwand nicht gerechtfertigt erscheint, kann eine Aussage zur Richtigkeit uber eine Plausibilitat erfolgen: Ein Ergebnis ist wahrscheinlich richtig, wenn die Selektivitat und die Linearitat der Methode bewiesen wurden und die Regressionsgerade durch den 0-Punkt verlluft.

3.4.3 MeBunsicherheit, Ergebnisunsicherheit und Vertrauensbereich Jeder Zahlenwert ist mit einer MeBunsicherheit verbunden. Bei komplexen analytischen Verfahren mit mehreren Schritten sollte vielleicht von ,,Ergebnisunsicherheit" gesprochen werden. Damit ware der Tatsache Rechnung getragen, daB es um mehr als lediglich um die Unsicherheit des MeBvorganges geht. Der Terminus ,,MeOunsicherheit" scheint sich jedoch generell durchzusetzen, so erscheint er auch in der neuen I S 0 17025. In Tab. 3-6 ist eine detaillierte Auflistung von haufig vorkommenden Unsicherheitsquellen zu sehen (Quelle: BAM QMH-P-10.2, Anlage 3). Eine ahnlich hilfreiche Auflistung findet sich in 1371. Tab. 3-6 Aufzahlung haufig vorkommender Unsicherheitsquellen.

Unsicherheiten I.

Unsicherheiten,

die mit der Pro-

bcnahrndProbenautbereitung - zusamrnenhangen

Quellcn

a) Nahrne von Proben, die das Untersuchungsobjekt nur eingcschrankt reprasentieren (Typ A', Typ B') h ) KontaminationNeranderung von Proben bei ihrer Nahrne (Typ B)

c) KontarninationNeranderung von Proben bei ihrcr physikalischen Auibereitung (Typ B)

Tab. 3-6 Forlscinmg ~

Unsichcrhcitcn

~

~

Qucllen d ) Homogcnisierung (Unvollstiindigkeit) (Typ B )

e ) Kontamination/Veranderung von Proben hci ihrer Lagerung (Typ B ) 1 1 Au1schlul.l (Unvollstandigkcit. Kontarnination. Intcrfcrcn/,cn) (Typ B ) g) Chemisehe Prohcnvorberci~ung/rennungs~cchnikcn (Unvollstiindigkeit, Kontarnination) (Typ B) 2. Unsichcrhcitsheitriige. die i n i t den Eigcnschaftcn dcs untcrsuchlcn Ohjekts /iis;iinrncnh2ingcn

a ) Rauschcn. lnstabilitiit dcs unkrsuchten Objekls (Lcitl. Anderung dcr Kennwcrte) (Typ A, Typ B ) b ) Vcriindcrung oder Alterung dcs untersuchten Oh.jckts (Leiti. Andcrung der Kennwcrtc) (Typ A, Typ B ) c) Inhomogcni tiit/Ungleichliirmigkcit des untcrsuchtcn 0h.jckts

(iirtl. Andcrung der Kennwcrtc) (Typ A, Typ B )

Matrixclfckte/Wechsclwirkunpcn (Typ B) 3. Unsicherheirsheitragc. die dcrn angcwandtcn Me'3Prut'vcrfahrcn anhaiicn

a) unmrcichcndc Realisierung hLw. Definition dcr Mc1.l-/ ErgcbnisgriiBe (NBhcrungcn/ldcalisicrun~en/Hypothcscn) (Typ B )

b) Unsichcrhcit von Verfahrcnspararnetcrn (7.B. auch Umgcbungsbedingungcn) und dcr bcrucksichtigten EinlluRgriil.(cn (Typ A, Typ B) c) Vcrnachliissigte Einflul3griiRcn (z. B. Temperatur, Lultdruck, magn. Fcldstiirkc) (Typ B) d ) Begrcwtc Instrumcntcnaulliisung, Un\chiirfc b/w. Unsicherheit der Lage von Diskriminatorschwcllcn ctc. (Typ B )

e ) Nachwcisgrcnzen, begrcn/rc Einpllndlichkeit (Typ B ) f) Rauschcn bzw. zufalligc Siiircinllusse (wie Stiirlcldcr ctc.) (Typ A. Typ 8) g) Unzureichcndc lrnpedanzanpassung und Ubcrtragung/Wandlung dcr Mel.lgriil.lc (Typ B) h ) Totzcitcn dcr Apparatur (Fchlcr durch KoinLidenLcn) (Typ B)

i ) Dynainik dcr Apparatur (Frcqucn/gang/Uhcrschwingen/Resonan/en )

j)

Unkrschiedliche Wahrnchmung/Visualisierung dcr Mcl&iiSen (Typ A. Typ B)

k ) Auswcrtung, Rcchengcnauigkcit ctc. (Typ B )

I) 4. Unsichcrheit der Rcleren/.wertc. die dcr Mcssungl prufung /ugrllnde liegcn

Unsichcrhcil crmittelt aus Ringvergleichen (Typ A. Typ B )

a ) Unsichcrhcit zertifiLiertcr Werlc/Kalibrierwcrte (Typ B ) h ) Drift/Altcrung von Rcfcrcn/wcrtcii/Rcfcren/mntcrialicn(Typ B) c ) irnporticrtc Werte aus der Lircratur (Tabellenwcrkc, Konktanten. ggl. aktuclle Veroffentlichungcn, etc.) (Typ B )

d) wie 3 ) I

Typ A. Typ B: Erlautrrung k h c Tcxr

3.4 Richtigkeit

89

Zur Quantifizierung der Unsicherheitsbeitrage gilt: Typ A ist meBtechnisch zuglnglich und erlaubt eine statistische Auswertung, Typ B verkorpert unbekannte systematische Abweichungen, die nur durch Abschatzung zuganglich sind. In Tab. 3-6 konnen die einzelnen Beitrage abhangig oder unabhangig voneinander sein. Sie haben zufiilligen und systematischen Charakter. Zufallige Beitrlge fuhren zur Variation der (Einzel-)Ergebnisse bei wiederholten Messungen unter vergleichbaren MeBbedingungen. Sie konnen mit empirisch statistischen Verfahren (z. B. empirische Standardabweichung eines Mittelwertes) abgeschatzt werden (Typ A), die unbekannten systematischen Beitrage rnussen geeignet geschatzt bzw. im Falle importierter Werte, aus den Angaben ermittelt werden (Typ B). Erliiurerungen Die Standardunsicherheit berechnet sich nach:

mit:

Standardabweichung n Anzahl der MeBwerte s

Diese Formel berucksichtigt nur zufallige MeBabweichungen bei der Ermittlung eines (Mitte1)wertes. Wenn man zusatzlich mit systematischen Abweichungen rechnet - und das sollte man, denn mogliche Fehler von dem EinfluB der Temperatur bei volumetrischen Messungen bis zu Differenzen beim Gehalt des Referenzmaterials sind in der Analytik Realitaten - brauchte man eine groSere Sicherheit bei den Angaben von Zahlenwerten. Zitat aus dem ,,Leitfaden zur Angabe der Unsicherheit beim Messen" (Beuth Verlag, Berlin): ,,Obwohl sich u universe11 zur Angabe der Unsicherheit eines MeBergebnisses verwenden IaBt, ist es in einigen industriellen, kommerziellen und regulatorischen Anwendungen sowie dann, wenn Gesundheits- und Sicherheitsaspekte zum Tragen kommen, haufig erforderlich, die Unsicherheit in Form eines Bereichs um das MeBergebnis anzugeben, von dem erwartet werden kann, daB er einen groBen Anteil der Verteilung der Werte umfaBt, die der gemessenen GroBe sinnvollerweise zugeordnet werden konnen." Der erste Ansatz, um aus einer Standardunsicherheiteinen tatsachlichen Vertrauensbereich (oder Vertrauensintervall) zu erhalten (MeSunsicherheit), ist das Multiplizieren der Standardunsicherheit mit dem entsprechenden t-Wert aus der t-Tabelle (Student-Faktor). Das ist nichts anderes als der ubliche r-Test, nur, daB nicht der t-Wert gesucht sondern entsprechend der Anzahl der MeBwerte der t-Wert (Student-Faktor) aus der Tabelle in die Formel eingesetzt wird. Dazu wird die ubliche Formel fur den t-Test' nach der MeBunsicherheit u aufgelost: I

Der Begriff t-Test wird ublicherweise fur den Soll/Ist-Vergleich verwendet. Mangcls anderer Bezeichnung wird fur den hier besprochenen Zusammenhang (Ermittlung der MeBunsicherheit) die Schreibweise ,,t-Test" verwendet.

Der zweite Ansatz basiert aufeinem Vorschlag von I S 0 GUM (Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement, I993 bzw. Quantifying Uncertainty in Analytical Meansurement. Eurachem, 1995 bzw. die deutsche Ubersetzung: Die Ermittlung der Me& unsicherheit in der analytischen Chemie, 1998). Der Extrakt aus diesem Konzept wird nachfolgend zusammengefafir, das Prinzip wurde ausfuhrlich in Abschnitt 1 .S. I .S erliiutert. Der interessierte Leser findet daruber hinaus sehr detaillierte Beschreibungen incl. Beispiele in mehreren Literaturstellen uber MeBunsicherheit, siehe Abschnitt A.9. Die Vorgehensweise ist im Wesentlichen folgende: Unsicherheitsquellen werden identifiziert und die wesentlichen Beitriige werden als Standardunsicherheit quantifiziert. Dies geschieht entweder durch eine statistische Auswertung (Typ A) oder eine Schiitzung (Typ B). Ein Beispiel zum Typ A ist die Ermittlung der MeBunsicherheit durch den Soll/lst-Vergleich. Ein Beispiel zum Typ B ist das Schiitzen der MeBunsicherheit beim Pipetieren von Liisungen unterschiedlicher Viskositiit. die u. a. hervorgerufen wird durch den EinfluB wechselnder Teniperaturen. - Alle wesentlichen Beitriige werden quadratisch addiert. Diese Vorgehensweise setzt voraus, daD die Fehler bei den einzelnen Beitrigen unabhangig voneinander sind, dal3 es sich also um stochastisch unabhangige Prozesse handelt (Additivitiit der Varianzen). 1st dies nicht der Fall mufiten Kovarianzen berucksichtigt werden. -

Brispirl Man betrachte eine Verdunnungsreihe aus derselben Stammlosung oder die Kalibration mit einem Referenzmaterial. Ein falsch deklarierter Gehalt fuhrt in beiden Fallen zu gleichsinnigen Abweichungen d. h. in diesem Fall wirken sich nicht nur zufiillige sondern auch ein systematischer Fehler aufdas Ergebnis aus. Da das Rechnen mit Kovarianzen aufwendig ist, kiinnen die einzelnen Beitrige linear addiert werden. In diesem Fall ergibt sich naturlich ein griiBerer Wert fur die Unsicherheit. Ein einfaches Zahlenbeispiel sol1 dies demonstrieren. Die Unsicherheiten der drei Schritte einer Methode seien 1. 2 und 3

oder: 1/=1+2+3=6

3.4 Richtigkeit -

91

Durch Addition der einzelnen Beitrage wird eine kombinierte Stundardunsicherheit ermittelt; sie ist ein MaB fur Abweichungen des Wertes durch den EinfluB aller bekannten Fehlerquellen.

- SchlieBlich wird die kombinierte Standardunsicherheit mit einem ,,Enveiterung.~fukfor'~

k multipliziert, man erhalt die erweiterte Unsicherheit. Die resultierende erweiterte Unsicherheit stellt - ahnlich wie bei dem ,,t-Test" - auch einen Vertrauensbereich dar. Das ist der Bereich, der mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 % den ,,wahren" Wert der ermittelten GroBe enthalt. k hat einen Wert zwischen 2 und 3, GUM empfiehlt k = 2, was einem Signifikanzniveau von 95 % entspricht. Sollte ein ,,groBzugigerer" Bereich sinnvoll erscheinen, so sollte die kombinierte Standardunsicherheit mit dem Faktor k = 3 multipliziert werden, was einem Signifikanzniveau von 99 % entspricht. Es ist zu beachten, dai3 das Multiplizieren der kornbinierten Standardunsicherheit rnit einer Konstanten keine neue Information, sondern nur die selbe Information in einer anderen Form liefert . Ein pragmatischer Ansatz zum Herausfinden des geeigneten Erweiterungsfaktors fur den eigenen Bedarf ware folgender: Man tragt in einer Regelkarte die entsprechenden Werte fur einen ausreichenden Zeitraum ein. Die Streuung der Werte zeigt das tatsachliche AusmaB aller EinfluBfaktoren auf das Ergebnis. Damit wird der Bereich ermittelt, in dem ein Wert erwartet werden kann. Und genau aus diesem Bereich, dem Vertrauensbereich, kann der Erweiterungsfaktor k ruckgerechnet werden. Ein Blick auf die t-Tabelle zeigt, daB fur das Vertrauensniveau von 95 % die t-Werte zwischen 3,182 (Anzahl der MeBwerte: drei) und 2,042 (Anzahl der MeBwerte: 30) liegen. Das heifit, der vorgeschlagene Wert von k zwischen 2 und 3 entspricht in etwa den t-Werten fur die ublich erzeugte Zahl von Laborwerten zwischen drei und dreiBig. Die durch die zwei Ansatze errechneten Vertrauensbereiche sind gar nicht so vie1 anders! Was bedeutet das konkret? Betrachten wir noch einmal die Werte aus dem oben aufgefuhrten Beispiel zur Prufung auf Richtigkeit niittels Soll/Ist-Vergleich: Sollwert: 95,90 Gefundener Mittelwert: 96,18 Standardabweichung: 0,23 Anzahl der Werte: 6 Standardunsicherheit:

uSt =

s

=

0,23

- 0,094 -

,,t-Test": t .s

2 3 7 1 . 0,23

t .s

4,032.0,23 = o,378

P = 9 5 %:

u=-=

P=99%:

u=-=

&

A

&

&

=

0,241

Erweiterte Unsicherheit fur k = 2 und k = 3:

95 %, k = 2

uE

=

k . u,,

=

2 . 0,094 = 0,188

99%,k=3

uE

=

k . u,,

=

3 . 0,094 = 0,282

Dac Vertrauensintervall (Vertrauensbereich) ware nach dem ,,t-Test":

95 % 99 5%

96,18 k 0,24 I d. h. 95,94 - 96,42 96, I8 f 0,378 d. h. 95,SO - 96,56

und nach dem Konzept der erweiterten Unsicherheit:

95%,k=2 99 %, k = 3

96,18 f 0, I88 d. h. 95,99 - 96,37 96.18 f 0,282 d. h. 95,90 - 96,46

Je grofier die Anmhl der MeBwerte, um so kleiner wird der Vertrauensbereich. Nehmen wir fur unser Beispiel nun eine Amah1 von 20 MeBwerten an; durch die griiRere Anzahl der MeRwerte nimmt bei konstantem Mittelwert von 96. I8 die Standardabweichung von 0.23 auf 0,18 ab. ,.r-Test":

95 %

1I =

2,093 0,I 8 20

=

0,084

99 c/c

1(

=

2,861 0.18 20

=

0,l I5

'

'

Es ergibt sich folgendes neues Vertrauensintervall: 95 % 99 7c

96,18 k 0,084 = 96,lO - 96,26 96,18 k 0, I I5 = 96,07 - 96,30

Erweiterte Unaicherheit:

95%.k=2

UE

99 %. k = 3

lfE =

=2.

0,I 8 = 0,081 20

0,18 3 . - = 0,121 20

3.4 Richtigkeit

93

Auch hier ergibt sich ein neues Vertrauensintervall: 95 %, k = 2 99 %, k = 3

96,18 f 0,08 I = 96,lO - 96,26 96, I8 f 0, I2 I = 96,06 - 96,30

und damit zusammenfassend: Vertrauensbcrcic h nach dem ,.t-Test"

Vertrauensbereich nach dem Konzept der erweiterten Unsicherhcir

6 Werte

6 Werte

P = 95 7%

95,94 - 96,42

k =2

95,99 - 96,37

P = 99 %

95,SO - 96,56

k =3

95,90 - 96,46

20 Werte

20 Werte

P = 95 %

96,lO - 96,26

k =2

96,lO - 96,26

P = 99 96

96,07 - 96,30

k =3

96,06 - 96,30

Fuzit: Wie dieses Beispiel zeigt. fuhrt die Verwendung des (Student-)t-Faktors im Vergleich zum Konzept der erweiterten Unsicherheit zu einem groBzugigeren und damit ,,sichereren" Vertrauensbereich gerade fur eine kleine Stichprobe. Und gerade im Handling einer kleinen Anzahl von Werten liegt die Stlrke der t-Verteilung! Je grol3er die Anzahl der MeBwerte, um so ghnlicher werden die Ergebnisse nach den zwei Ansatzen. Denn mit steigender Anzahl der MeBwerte nahert sich der Wert des t-Faktors dem Erweiterungsfaktor k = 2, z. B. ist fur 20 Werte t = 2,093 und fur 30 Werte t = 2,042. Die t-Verteilung geht langsam in die GauB-Verteilung uber, naheres s. Werke uber Statistik. Bereits bei 20 Werten ergeben sich praktisch identische Vertrauensbereiche. Deswegen wird verschiedentlich vorgeschlagen, fur eine kleine Anzahl von MeBwerten (n < 10) den ,&Test" zu benutzen, sonst jedoch generell die erweiterte Unsicherheit mit dem Erweiterungsfaktor k = 2. Diese Empfehlung ist gut und sachlich begrundet, es mu8 die Praxis zeigen, ob sie sich durchsetzt. Wir kommen zum SchluB kurz auf die Beweggrunde fur die verstlrkte Diskussion uber die ,,erweiterte Unsicherheit". Seit etlichen Jahren existieren nebeneinander folgende zwei Auffassungen: Der klassische Ansatz ,,kennt" systematische und zufallige Fehler, die Verfahrensmerkmale, die diese beschreiben, sind Richtigkeit und Prlzision. Diese Betrachtungsweise ist weit verbreitet. Zeugnis davon ist die Tatsache, daB fast ausnahmslos in jeder Literaturstelle zum Thema Validierung Richtigkeit und Priizision behandelt bzw. berechnet werden. Die Verfechter der erweiterten Unsicherheit vertreten die Auffassung, daB man eine derartige Unterscheidung gar nicht machen konne und solle. Die Argumentation lautet: Mit jedem Schritt eines Verfahrens mu13 - neben den zufllligen Fehlern - stets mit einem zusgtzlichen systematischen Fehler gerechnet werden. Es ist jedoch prinzipiell nicht moglich, alle potentiellen Fehlerquellen zu erfassen, geschweige denn deren Beitrage exakt zu berechnen. Also muB der ermittelte Wert mit einem Erweiterungsfaktor k (,,Sicherheitsfaktor") multipliziert wer-

den. Es ersibt sich somit ein Bereich, in dern ein Wert nach Einwirkung allerlei Eintlusse wahrscheinlich zu finden ist, auf die Unterscheidung systematische/zufiillige Fahler kann verzichtet werden. Mit der Anzahl von ermittelten Werten wiichst prorentual auch das Risiko von systematischen Fehlern, deswegen ergibt sich mit wachsender Anzahl von Werten ein - gegenuber dem ,,t-Test" - grofizugiger Vertrauensbereich. Wir beenden diesen Diskussionspunkt mit folgender Feststellung: Der r-Test stellt eine gut eingefiihrte Praxis dar. Die MeSunsicherheit bzw. erweiterte Unsicherheit ist zur Zeit in aller Munde, so wird dervorschlag aus dem GUM vielerorts stark diskutiert und oft bereits favorisiert, hat jedoch noch keine breite Anwendung gefunden. Das Konzept der MelSunsicherheit und der erweiterten Unsicherheit konnte nach der Inkraftsetzung der IS0 17025 Ruckenwind bekommen (s. auch Abschnitt 1.2. I ). Anhand zweier Beispiele sol1 noch einrnal die Anwendbarkeit des Vertrauensintervalls in der Praxis bewufitgemacht werden.

B r isp ir 1 I Die Wirkstoffproduktion der S.K.T.-JANE GmbH stellt den Wirkstoff ,,THESAAR - K N 95" her. Die Firma hat sich vertraglich aufeinen zu liefernden Gehalt von 80 c/r verptlichtet. Die Qualitiitskontrolle benutzt eine HPLC-Methode, der Gehalt wird ublicherweise durch Doppelbestimmung uberpruft: (,,Doppelbestimmung" heil3t zwei wirklich unabhiingige Bestimmungen und nicht Doppelinjektion!) In Tab. 3-7 sind fur vier VK's und fur 2, 3 und 4 Wiederholmessungen die sich ergebenden Vertrauensbereiche angegeben. Tab. 3-7 Vcrtrauensintervalle in Ahhiingigkcit von dcr Zahl der Wiederholmcssungcn Variationskocffi7icntcn V , der Methode lur cincn angcnommenen Gehalt von 80 % ,

II

und dcm

t,

n

11

0.5

I

I .5

2

3.57

7,lY

10.79

14.38

X.90

3

0.99

I .9x

2.98

3.97

2.48

4

0.64

I ,27

1.91

2.54

I .s9

7

i

"'

Es gilt: I/

t .s

= -

Ji

In der Forrnel fur die MeRunsicherheit t

[ I = - - . -

JJT

v,

'S

100

i/

wird s durch

v, ' X ~

100

ersetzt und wir erhalten:

3.4 Richtigkeit

95

So erhalten wir beispielsweise fur einen VK von 1,5 9% und eine Doppelbestimmung ein Vertrauensintervall von 10,79: 12,706 1,5 . 80

u = -.

Jz

-= 10,79

100

Fur einen VK von 0,5 % und eine dreifache Bestimrnung ergibt sich entsprechend ein Vertrauensintervall von 0,99: 4,303 0,5 . 80 - 0,99 u=-.-h 100 So weit zu den Werten der Tabelle. Welche Konsequenzen konnen nun daraus gezogen werden? Irn ersten Zahlenbeispiel hat der MeBwert eine Melhnsicherheit von 10,79 %. Um genau diese 10,79 % mu8 das Handelsprodukt angereichert werden. Nur wenn der Hersteller des Produktes ein solches mit einer Wirkstoffkonzentration von 80 % + 10,79 % = 90,79 % liefert, hat er strenggenommen den Liefervertrag erfullt. Er hat also Mehrkosten von absolut 10,79 % an Wirkstoff pro Jahr. Denn nur diesen Gehalt von 90.79 % kann man ,,wahrscheinlich" (Wahrscheinlichkeit P = 95 %) von 80 % - Gehalt unterscheiden, wenn nur eine Doppelbestimmung durchgefuhrt und eine Methode rnit einem V , von 1,5 % benutzt wird. Will man eine hohere Signifikanz (Wahrscheinlichkeit P = 99 %) bei der Entscheidung ,,Produkt in Ordnung jdnein" erreichen, d. h. auf der ,,sicheren Seite" sein, sieht es noch ungunstiger aus. Es existieren zwei Wege aus dern Dilemma: Entweder mu8 die Analytik praziser werden (kleinerer V,) oder es mussen mehr Messungen durchgefuhrt werden (groRerer Wert fur n). [38] Bemerkung: ,,Prazisere" Analytik, d. h. Verkleinerung von VK bedingt nicht unbedingt eine Anderung der experimentellen Bedingungen. Ein kleinerer VK ist auch durch Mehrfachrnessung einer Probe zu erreichen. Eine Doppelinjektion wurde beispielsweise den V , von I ,5 auf etwa I , eine Dreifachinjektion auf etwa 0,4 ,,drucken". Auf eine Berechnung wird hier verzichtet, s. dazu das Beispiel in Abschnitt. 3.3.4.2 und Abbildung 3-4. Die Werte der Tab. 3-7 zeigen eindeutig, welche Strategie die effektivere ist. Eine prazisere Analytik, d. h. V , = I % oder gar 0,5 % fuhrt zu einer Abnahme der MeBunsicherheit von 10,79 auf 7,19 bzw. 3,57. Die Erhohung von unabhangigen Messungen jedoch, z. B. auf 4, fuhrt bei konstanter Prazision ( V , = 15 %) zu einer Mehnsicherheit von 1,9 1, d. h. das Produkt mu13 statt auf 80 ,,nur" auf 8 1,91 O/o eingestellt werden, die Firma verliert nur I ,91 % des wirkstoffbezogenen Jahresertrages. Sogar eine Erhohung der Wiederholmessungen urn Eine - z. B. von 2 auf 3 - fuhrt zu einer merklichen Ersparnis durch die Abnahme des Vertrauensintervalls von 10,79auf 2,98. Aber: Durch mehr Wiederholrnessungen (oder prazisere Analytik) wird naturlich die Qualitat des Produktes nicht verbessert!

Als weitere. allgemeine Konsequenz gilt: Ein Verfahren, das unpriizise ist, aber kurz dauert - und dadurch mehr unabhiingige Messungen ermiiglicht -, ist einem priiziseren Verfahren. das Iiinger dauert und dadurch weniger Messungen erlaubt, vorzuziehen. Einen echten Gewinn bringt die friihe Information. Durch das fruhe Erkennen von Ausreifiern kann inan gezielter und hiiufiger den Produktionsprozefi verbessern. weil eben durch die fruhe Inforination eine h d e r u n g sofort erkannt wird, s. auch Abbildung 3-5, Abschnitt 3. I 1 und 5. I . Es sind vielfach enorme Verbesserungs-Potentiale vorhanden, auf die hier nicht eingegangen werden kann. Bei.7pit.l 2: In vielen SOP'S wird ein V , zwischen 1 % und 2 % verlangt. Gibt es eine Begrundung fur diese Zahlen? Betrachten wir dazu weitere iibliche Zahlenwerte aus der Welt der Produktanalytik: 6 Messungen, Spezitlkationsanforderung 99 % - 101 % oder 98 % - 102 70.Wir konnen n u n mit diesen Zahlen die sich ergebenden V,'s ausrechnen:

.\- -

sowie

11 =

t

'

v,

.r

'

100

I102 - 100)

'

2,57 I . I00

'

100

= 1,91 , also = 2 %

Welchen Wert darf dabei die MeRpriizision hochstens haben? Nach der Additivitiit der VarianJen. s. Abschnitt 3.3.4.3, gilt:

Unter der Annahme, daB

.sk\tI.,,I1,cI1t

, \ k(Probenvorbereitung'?!). ~ gilt welter:

3.4 Richtigkrit

Im Bereich um 100 o/o gilt vereinfacht V, -

- 0,7 J7 I

Stnstrument - -

97

= s und somit ergibt sich fur beide Falle:

2 -und slnstrument = 1,40.

J7

Eine MeBprazision von 1,4 oder sogar von 0,7 zu erreichen durfte heute bei mangelfreien Geraten kein Problem sein. Hinweis: Bei einem s-Wert (bei einem x-Wert von 100 = V,-Wert) von etwa 1 haben wir unter der Annahme einer GauB'schen Normalverteilung einen Schwankungsbereich der Werte um etwa 6 Prozentpunkte: 2 3 .F = 6 s und 6 . s ( VK) = 6 %. Das bedeutet, dal3 auch fur den Fall, dall der Mittelwert ,,in spec" ist, d. h. beispielsweise um 100 %, einzelne Werte sich weit jenseits der Spezifikationsgrenze von zwei bzw. vier Prozentpunkten (99 % - 101 % bzw. 98 % - 102 %) befinden konnen. Ohne hier tiefer einsteigen zu wollen, gilt Folgendes: Die Forderung, daB alle MeBwerte ,,in spec" sein mussen, ist unsinnig, sinnvoll ist sie nur fur den Mittelwert, s. ausfuhrliche Erlauterungen in Abschnitt 3. I 1.

3.4.4 Zusammenfassung von Tests zum Vergleich und zur Beurteilung von Zahlen und Zahlenreihen I n Abschnitt 3.3.6.5 und im vorliegenden werden mehrere Tests zur Bewertung und Beurteilung von Zahlen vorgestellt. Diese Tests und deren Zielsetzung sind in Tab. 3-8a und 3-8b abschlieBend zusammengefafit.

Tab. 3-8a Tests zur Beurlcilung von Zahlen bzw. Zahlenreihen und deren Aussage. Test

ZielsetzunglbeabsichtigteInformation

David-Test

Sind die ermittelten Werte normalverteilt?

Berechnung der Wicderholstandardabwcichung bzw. dcs Variationskoeffizienten

Wie ist die Streuung der unter Wicderholbedingungen ermittelten Werte?

AusreiBertests

Sind mit einer vorgegebencn Wahrscheinlichkeit Ausreil3er enthalten?

I-TCSI

Befindet sich ein Wert (rnit ciner vorgegebenen Wahrscheinlichkeit) im Vertrauensbereich des Sollwertes?

Trendtest nach Neumann

Gibt es einen zeitlichen Trend bei der Ermittlung der Zahlen?

Tab. 3-8a Forlsctzung ~

Test

Zielsetzung/hcahsichti~te Information

Wiederholgrcnxe

Welche Differenz sollte hei zwei daraullolgenden Wiedcrholmessungen in dcr Regel (Wahrscheinlichkeit: 95 %) nicht lberschritten wcrden?

MeRunsichcrheil

Mit dieser Mel3unaichcrheit ist ein MeBwcrt bchaftet, der mit dieser Methodc (d. h. mit diewr Standardahweichung und dirsrr An/ahl von Wertcn) ermittclt wurde.

Vertraucnshercich des MelJwertes

Das ist die ohere und untere Grenre der Zahlcnwcrte, die sich aus dem Wert der MeRunsicherheit crgebcn.

Erweitertc Unsicherheit

Das 1st ein Vcrtraucnsintervall. In dicscm sollten die Werte mi1 einer gegebenen Wahrscheinlichkeit sich hefinden: vielfaches der Mehnsicherheit (zuiillige plus systematische Fehler).

Wilcoxon-Test

Sind die Wcrte einer MelJseric um den Sollwert symmetrisch verteilt?

Tab. 3-8b Tests zum Vergleich von zwei Zahlenreihen. Test

Anmerkungcn

Vergleichsgrcnrc

Diese DilfcrenL der Mittelwerte v o n Lwei Zahlenreihen (cine Probe, zwei Anwendcr, zwei Cerate, zwei Labors) kann mil einer vorgegehenen Wahrscheinlichkeit (meist 95 %) erwartet werdcn. Die Lwei Mittelwerte wurden unter Wiederholbedingungen ermittelt.

F-Test

Konnen die Standardabweichungcn von zwei MelJrcihcn ( A . B. je 6 Messungen von zwei Produktchargcn oder j e 6 und 12 Messungen von zwei Mustern aus einer Deponie) verglichen werden? D. h. gchiiren diese Zahlen einer Grundgesamtheit?

Coc hran-Test

Sind m6gliche Differenzen bei dcr Analyse einrr Prohe mittels gleicher Anzahl v o n MeBwerten durch mchrcre Labors oder mehrcre Mitarheiter oder unterschiedliche Konfiguration von Geraten signifikant oder nicht'! Das ist Ictrten Endes nichts andcrcs als ein Ausreilkrtest lur MeBreihen.

3.4 Richtigkeit

99

3.4.5 Wie sol1 ich nun die Richtigkeit uberpriifen? Wenn zuverlassige Referenzsubstanzen zur Verfugung stehen z. B. zertifizierte Referenzmaterialien, Normale - Proben, deren Gehalt durch mehrere, unabhangige Methoden eindeutig bestimmt wurde - eigene Muster, die durch Spektroskopie und weitere physikalische Methoden zweifelsfrei charakterisiert wurden so empfiehlt sich in jedem Fall die erste Methode (Soll/Ist-Vergleich): ZweckmaBigerweise sollten mindestens drei Konzentrationsniveaus untersucht werden. -

Sind Referenzsubstanzen nicht vorhanden, so fallt bei Trenntechniken der Schwerpunkt auf die Uberprufung der Selektivitat und der Wiederfindung. Dies geschieht durch Vergleich mit bekannten und validierten Methoden oder durch Wiederfindungsexperimente und Priifung der Selektivitat (siehe Abschnitt 3.6). Bei Wiederfindungsexperimenten werden Losungen bekannten Gehaltes verwendet - wie bei der Linearitat: Der Gehalt der jeweiligen Referenzlosung wird berechnet und gegen den 1st-Wert aufgetragen. Somit konnen sowohl die Linearitat als auch die Richtigkeit mit den gleichen Daten beurteilt werden [39], siehe auch Kapitel7. Wenn moglich sollte die Vergleichsmethode eine stochiometrische d. h. eine Absolutmethode sein wie z. B. Titration oder Elementaranalyse. Die Annahme der Richtigkeit wird durch ein lineares Regressionsmodell mit a = 0 erhartet. Bei der Angabe der Richtigkeit sollte folgendes angegeben werden: geprufte Konzentration, Anzahl der Wiederholmessungen, evtl. Vorzeichen der Abweichung, Vertrauensintervall, Signifikanzniveau. Einfacher Test zum Vergleich zweier MeBwertreihen Werden statistische Tests nicht unbedingt gefordert, so konnten folgende zwei pragmatische Kriterien fur den Vergleich zweier MeBwertreihen gelten (Vergleich zweier Methoden zur Gehaltsbestimmung, zweier Chargen, der Arbeitsweise zweier Mitarbeiter, oder zweier Labors usw.): - Wenn die zwei VK's nicht groBer als 2 % sind und -

die relative Differenz der zwei Mittelwerte nicht mehr als 2 % betragt, so ist Richtigkeit und Prazision der zwei MeBwertreihen vergleichbar. 1st eine der zwei Methoden eine Referenzmethode, so liefert die zu prufende Methode richtige und prazise Werte.

Ein vereinfachtes Schema zur Vorgehensweise bei der Uberprufung der Richtigkeit zeigt Abb. 3-8.

Wilcoxon-Test )

JA + ( t-Test, evtl.

r L

Abb. 3-8 Schema zur Uberprulung der Richtipkeit

ENDE

Richtigkeit bewiesen 7

I

JA I

+

NElN

I

I

NElN

Richtigkeit bestatigt ?

Fehler aufheben

ENDE

Tests sorgfaltiger bzw. urnfangreichere Tests durchfuhren

k b

ENDE

1 Trenntechniken: Selektivitat, Linearitat, Wiederfindung und Gerat uberprufen

Systernatische Fehler gefunden ?

(erneut) kalibrieren, Optik OK ?

Spektroskopische und physikalischl chernische Methoden einsetzen

Auf andere Methoden ausweichen

Vergleich mit einer Referenzrnethode. Richtigkeit bewiesen ? (Differenzen &Test)

I

1

Referenzsubstanzen / Norrnale vorhanden ?

3.5 Robustheit

3.5

10 I

Robustheit

3.5.1 Definition und Erlauterungen Robustheit ist die Flhigkeit eines Verfahrens, ein Ergebnis zu liefern, das durch variierende Bedingungen nicht oder unwesentlich verfllscht wird. Oder: Robustheit beschreibt das AusmaB der Unabhangigkeit eines Ergebnisses von Anderungen aller relevanten EinfluBparameter. Als Ma8 fur die Robustheit gilt der Bereich, in dem das Ergebnis von einer Anderung eines Parameters unahhungig ist. Das Ergebnis beispielsweise ist stabil bzw. die Methode ist robust zwischen pH = 6 und 8, zwischen 30 "C und 50 'C, sie ist unabhlngig vom Dichtungsmaterial und fur die Matrix x, y und z usw. Nachfolgende Ausfuhrungen sollen etwas Klarheit in die unterxchiedlich benutzte Nomenklatur bringen. Im Englischen werden fur den deutschen Begriff ,,Robustheit" die Begriffe ,,robustness" und ,,ruggedness" verwendet. Zwar bemuhen sich die einzelnen Organisationen in letzter Zeit redlich um unmifiverstandliche Definitionen, doch wird durch deren Zahl die Situation nicht gerade erleichtert. Nachfolgend wird der Versuch einer Klarstellung unternommen. - USP<1225>

Fur USP ist ,,ruggedness" der Grad der Reproduzierbarkeit von Ergebnissen, wiedergegeben im V,-Wert, wenn Bedingungen variiert werden. ,,Variierende Bedingungen" kann laut USP bedeuten: Wechsel des Labors, des Anwenders, des Gerates, der Reagenzien, der Temperatur, des Zeitpunkts der Analyse usw. - also im Prinzip alles. ,,Ruggedness" ist somit laut USP ein Ma8 fur die Reproduzierbarkeit von Ergebnissen zwischen unterschiedlichen Anwendern und unterschiedlichen Labors unter ublichen experimentellen Bedingungen. Die Definition fur ,,robustness" ist identisch mit der ICH, s. dort. -

-

NATA Fur NATA bedeutet ,,ruggedness" das Gleiche wie Reproduzierbarkeit; im Gegensatz zu USP - fur die jegliche Anderung der Bedingungen moglich ist - ist fur die Australier eine Methode ,,rugged", wenn sie ,,nur" bei einer Anderung von Anwender oder Labor oder Gerat vergleichbare Ergebnisse liefert. FDA, ICH Bei ICH und FDA wird nur ,,robustness" erwahnt. Und ,,robustness" ist die Prufung der Flhigkeit einer Methode, ein Ergebnis zu liefern, das von kleinen aber realistischen und eindeutig definierbaren Anderungen der Methodenparameter wie pH-Wert. Temperatur, Extraktionszeit, chromatographische Saulen (Chargen, Hersteller) usw. unbeeinflufit bleibt. Im ubrigen sind das Experiniente, die in die Methodenentwicklung gehoren, ,,robustness" sei laut ICH nicht Bestandteil einer Methodenvalidierung.

So weit zur Nomenklatur.

Robustheit ist eines der wichtigsten Charakteristika einer Methode. das erfreulicherweise immer starker ins BewuOtsein ruckt. Das ist eine positive Entwicklung, denn ein nicht unerheblicher Teil der Analysenkosten wird durch nicht robuste Methoden verursacht. Es kiinnte sinnvoll sein, eine allgemeine Beschreibung fur das Vorgehen bei Arbeiten in der instrumentellen Analytik als SOP zu verfassen. Sie wurde sich durch ihren universellen Charakter von konkreten Prufanweisungen/-vorschriften unterscheiden und sie wiire Neueinsteigern in der Analytik eine groBe Hilfe. Bedarf ist vorhanden. Vcrriierenrle h’cdingiingeti kiinnen unterachiedlicher Natur sein und sie hiingen vom konkreten Prufverfahren ab:

I . Anderung von Methodenparametern (changes in method parameters, robustness, s. o.), Methodenrobustheit, Robustheit I. Beispiel: Anderung von pH-Wert, Ionenstiirke, Temperatur, Proben- und Matrixkonzentration; irreversible Sorption bestimmter Komponenten an Oberflachen von Hilfsmitteln wie Probengeber, Dichtungen, Pipetten abhiingig von den aktuellen experimentellen Bedingungen, Qualitat der eingesetzten Chemikalien usw. 2. Stabilitiit des Ergebnisses uber die vorgesehene Zeit (Laufzeit einer Analysenserie, Dauer der Kampagne usw.), Verfahrensstabilitiit. Beispiel: Stabilitiit von Losungen, Alterung der eingesetzten Mittel wie chromatographische Siiulen, Geratschaften, zeitabhiingige Sorption an Oberfliichen. 3. Variierende Parameter bei der Durchfuhrung in der Routine (changes in operating conditions, ruggedness) Anwendbarkeit, Robustheit 11. Hoispiel: Wechsel von Anwender, Geriit oder Labor, Zeitpunkt der Messung.

3.5.2

Priifung auf Robustheit

Es ist aus okonomischen Grunden sinnvoll, die Uberprufung der Robustheit zeitlich in zwei bzw. drei Stufen durchzufuhren.

3.5.2.1 Methodenrobustheit, Robustheit I: fruhes Stadium Bri.vpiele Zu Beginn des Lebenszyklus einer chromatographischen Methode wird ublicherweise die Selektivitat durch Variation der Methodenparameter ubeipriift. Werden diese Ergebnisse. die ja gleichzeitig Experimente zur Robustheit darstellen, in der Prufvorschrift/SOP entsprechend dokumentiert, so erspart man sich spiiter manchen Arger. Weiterhin kiinnen hier kritische Parameter der Methode ausfindig gemacht werden, die als Kriterien f u r die Robustheit der Methode in einem spateren Systemeignungstest verankert werden. Das sind auch hervorragende Kriterien fur die Notwendigkeit von Revalidierungsarbeiten bei etwaigen Veriinderungen, denn durch diese Tests wird ja festgestellt, welche Anderung in welchem AusmaD das Ergebnis beeinflufit.

-

3.5 Robustheit

103

- Wenn eine neue Freisetzungsapparatur installiert wird, so gehort zu den ersten Experi-

menten die Uberpriifung der Freisetzungsraten in Abhlngigkeit von der Ruhrgeschwindigkeit, vom pH-Wert und von der Temperaturkonstanz im ganzen Raum. Bei einer Universalpriifmaschine wird der Einflu13 von Erschutterungen und Temperaturschwankungen auf die Messung einzelner Pruflinge getestet. - Bei rheologischen Messungen (Messungen der dynamischen Viskositat) ware gleich zu Beginn der EinfluB von Temperatur, Erschutterungen und Art des Probeneinflusses auf die Ergebnisprazision zu untersuchen. Unmittelbar danach sollte der EinfluB von Temperatur, Matrix und Konzentration auf die FlieRgrenze und die Thixotropie getestet werden.

3.5.2.2 Verfahrensstabilitat Durch solche Experimente gewinnt man recht fruh ein erstes Gefuhl fur die Robustheit der betrachteten Methode. Nachdem nun die Methode ausgearbeitet ist, sollte - wenn notwendig - deren Verfahrensstabilitat uberpriift werden. Stabilitat von Losungen Eine Kontrollprobe wird wahrend einer Iangeren Zeit immer wieder gegen die frische Losung eines im Kuhlschrank aufbewahrten oder tiefgefrorenen Standards vermessen. Die Losung der Kontrollprobe gilt bei den aufbewahrten Bedingungen fur den Zeitraum so lange als stabil, wie die Gehaltsdifferenz einen bestimmten, vorher festgelegten Schwellenwert nicht uberschreitet.

Gegebenenfalls mussen ein F- und ein t-Test durchgefuhrt werden Streuung der Werte abhangig von der Zeit

Es wird der V , zu Beginn einer MeRserie und zum SchluB bzw. nach 12, 24,48 Stunden bestimmt. Auch hier gilt eine bestimmte, noch akzeptable VK-Differenz als Ma13 fur die Verfahrensstabilitat. Beispiel Es geht um die Verjiuhrensstahifitutbei der HPLC-Bestimmung der Nebenkomponente Methyl-NOVIATULIN. Die Spezifikationsgrenze liegt bei I ,5 %, die Bestimmungsgrenze von 0,l % wurde im Vorfeld durch die Kalibrierwertmethode (Abschnitt 3.9.2) ermittelt. Es wurden die Gehalte zu Beginn der MeRserie am Montagmorgen um 8.30 Uhr und am Ende der aktuellen Kampagne am Dienstag um 14.30 Uhr gemessen. Es sol1 anhand der erhaltenen Werte die Zuverlassigkeit sowie die Stabilitat der Methode fur diesen Zeitraum uberpruft werden.

Beginn der Messung: 0.81 %

0.80 56

0,79 c/r

0,77 56

0,84 56

0.85 56

-

.r = 0,81 s = 0,030

v,

= 3.74 %

Die erste Frage lautet, o h die Prlzision des Verfahrens fur diesen Bereich uberhaupt akzeptabel ist. Dazu berechnet man die Standardabweichung an der Spezifikationsgrenze ( I ,5 %):

Bei einer Doppelbestimmung erwarten wir in 95 % der Fille eine Differenr von hbchstens: Y

= 2,8 . s = 2.8 . 0,056 = 0,16

Der Vertrauensbereich fur den Gehalt sollte nicht griilkr sein als der halbe Toleranzbereich aus den vorgegebenen Spezifikationsgrenzen (s. Abschnitt 3.3.7.1). Das bedeutet im vorliegenden Fall: I/

<

I/

<

(OSG - USG) 2 1.5 ~

-

0.1

2

=

0.7%

0,16 als ,,erlaubte" Differenz, siehe oben, ist um mehr als Faktor 4 kleiner als der halbe Bereich zwischen der Bestimmungs- und Spezifikationsgrenze (4 . 0.16 = 0,64 < 0.7). Damit konnen wir uns beruhigt mit der eigentlichen Frage nach der Verfahrensstabilitit befassen.

Ende der Messung: 0,77 %

0,75 '/r

.Y = 0.78 s = 0,026

v,

= 334 8

0,80 %

0,76 %

0 3 2 c/c

0.78 C/r

3.5 Robustheit

105

Der F-Test ergibt: s2

0,0302

si

0,0262

F='=-

=

1,33 < 5,os

Nachdem wir nun wissen, dalj mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 % es keinen signijkunten Unterschied der Standardabweichung zwischen den zwei MeRserien gibt, kann jetzt der t-Test zur Prufung der Richtigkeit angewandt werden: -

=

0,81

-

0,78

0, 0302 + 0, O2tj2

. v%

=

1,85 < 2,228

Mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 % andern sich die Mittelwerte wahrend der Laufzeit der Meljserie von 30 Stunden nicht. Das Verfahren ist fur die Dauer dieser Meljserie stabil, die Prlzision und die Richtigkeit sind hinreichend.

3.5.2.3 Anwendbarkeit, Robustheit I1 Die Anwendbarkeit der Methode sol1 vor dem Routineeinsatz gepriift werden. Der Aufwand hlngt hier vom beabsichtigten, zukunftigen Einsatz der Methode ab. Wir unterscheiden hier folgende zwei Falle:

1. Die Methode wird ausschlieljlich im eigenen Labor eingesetzt. In diesem Fall sollte die Laborpriizision uberpruft werden. Dabei wird die Frage beantwortet, ob das Ergebnis konstant bleibt, wenn im Routineeinsatz realistische Anderungen unausweichlich sind, z. B. ein anderer Anwender die Analyse durchfuhrt, oder ein anderes Gerat verwendet wird. Welche Anderungen in welchem Ausmalj getestet werden, hangt von der konkreten Laborsituation ab: Welche gewollte oder ungewollte Anderungen sind denkbar und was kann die Zukunft noch an Variablen bringen? Beispielsweise werden 6 unabhangige Proben (6 Einwaagen) von einem anderen Anwender als dem Methodenentwickler am nachsten Tag an einem anderen Gerat vermessen. Oder er verwendet zusatzlich anderes Wasser undoder nimmt fur die Sulfatasche-Bestimmung andere Tiegel. Hier sind der (begrundeten) Phantasie keine Grenzen gesetzt. So kiinnen durch einen ,,unorthodoxen" Sequenzaufbau bei einer automatischen HPLCMethode Verschleppung, Uberladung der Saule, Matrixeffekte usw. schnell erkannt werden. Eine gute Praxis ist folgende: Die Validierung selbst sol1 mit unabhangigen Analysenserien von einer Personal-Gerlte-Chemikalienkonfiguration,die den spateren Routineeinsatz reprasentiert, durchgefuhrt werden. Das mag im ersten Moment etwas aufwendig klingen, doch erhalt man dadurch realistischere Werte fur die Kenndaten der Methode. Eine ,,abgespeckte" Version ist das ,,3 x 3 x 3-Modell" zur Uberprufung der Robustheit: Drei Anwender ermitteln mit drei Saulen (Tiegel in der Gravimetrie, Kuvetten

in der UV-Spektroskopie. Elektroden in der Titrirnetrie, usw.) an drei Geraten be\timmte Verfahrenskenndaten. Eine Vorgehenswei\e. bei der g1eichLeiti.g rnehrerc. Variablen veriindert werden, hat einen Vor- und einen Nachteil.

Beispiel Ein zweiter Bearbeiter fiihrt nach drei Tagen die Analyse einer bei Raumtemperatur aufbewahrten Probe an einem Geriit eines anderen Herstellers durch, indem er Reagenzien eines anderen Lieferanten verwendet. 1st der VK vergleichbar (F-Test) mit dem V , unter Wiederholbedingungen, so kann man wohl von einer recht robusten Methode ausgehen. Und man hat durch dieses kombinierte Experiment Zeit gespart. Variiert jedoch der VK stark, so bleibt der kritische Part der Methode im Verborgenen. Variationen: Wie oben, man verwendetjedoch stets tiefgefrorene Proben zur Errnittlung der Laborprlzision, d. h. Anwendbarkeit der Methode im Laboralltag. Ein Anwender priift die Wiederholstandardabweichungnach 6, 12,24,48 Stunden, wobei die Probe aul3er wahrend der Meflzeit sich im Kiihlschrank befindet, so wird die Verfahrensstabilitiit ermittelt. So wird festgestellt. welcher Akerung die Hilfsmitel wiihrend der Analysenzeit, bei realen Routinebedingungen, ausgesetzt sind. Bei Stabilitltsuntersuchungen bleiben samtliche Methodenbedingungen bis auf die Aufbewahrungstemperatur bzw. -bedingungen der Probe konstant. In diesem Zusammenhang sollte auch an die Robustheit des Auswertesystems gedacht werden. So kiinnte man versuchen, den PC durch komplexe und eventuell unsinnige Rechenoperationen, mehrere parallele Anwendungen. bewuBt kreierte Datenflut, uniibliches ,,Springen" in einem pull down menue usw. bewul3t stark zu beanspruchen. Ubersteht er solche ,,Strapazen", hiitte er einen pragmatisch angelegten Robustheitstest uberstanden. Gegebenenfalis gehort ein solcher Hartetest zur QualifiLierung eines PC's/einer computerisierten Anlage. ~

~

2. Die Methode sol1 auch auf3erhalb des eigenen Labors eingesetzt werden. Die Methode sol1 nun zweckrnafligerweise in einern zweiten oder dritten Labor unter Wiederholbedingungen vermessen und die VK's verglichen werden (Vergleichbarkeit). Die Vergleichsprazision 1st somit ein Kriterium fur die Robustheit. Nehmen mehrere Labors an solchen Tests teil, so ist die Rede von den Ring-oder L a h o r v e r ~ ~ l ~ ~ i c ~ h s v e rDa s i i sie ~ ~ hrecht ~ ~ naufwendig . und teuer sind, nimmt deren Zahl in reglementierten Bereichen, in denen ohnehin konkrete Vorgaben existieren, merklich ab. In folgenden Fallen sind Laborvergleichsversuche nach wie vor bedeutsam, deren Zahl nimmt sogar zu: Adaption neuer Methoden, behordliches Umfeld L B. UntersuchungsSmter. LUFAs, BAM. EMPA

3.5 Robustheit

107

- Auftragslabors nehmen an Laborvergleichsversuchen teil, urn ihre Chancen bei der

Vergabe von Auftragen, insbesondere durch kommunalelbehordliche Auftraggeber, zu wahren. - Herstellung von Referenzmaterialien.

3.5.3 Zeitlicher Ablauf der Robustheitstests Mit der Methodenentwicklung sol1 auch die Methodenrobustheit uberpruft werden. Wie ist der EinfluR von pH-Wert, Temperatur usw. auf das Ergebnis? Unmittelbar danach oder parallel zur ersten Stufe folgt, bei Bedarf, die Uberprufung der Stabilitat von Losungen bzw. der Verfahrensstabilitat. Hier wird untersucht, o b die Proben und das analytische System uber die vorgesehene Zeit stabil bleiben. Fur eine einfache Entscheidung sollte folgende Frage beantwortet werden: ,,Ist die Differenz zwischen VK ,jetzt" und VK nach x-Stundeaagen noch akzeptabel? Die noch akzeptierte Differenz sollte auf Basis von Erfahmngswerten vorher festgelegt worden sein. Die objektive Beurteilung erfolgt durch F- und ?-Test d. h. Vergleich der Standardabweichungen und der Mittelwerte ,jetzt" und nach x-StundedTagen. Ein gutes Vergleichskriterium ist die relative Verfahrensstandardabweichung(s. Abschnitt 3.7.2.4). Ein bewahrtes Werkzeug zur Uberprufung der Stabilitat von Prozessen sind die Regelkarten. Vor dem Einsatz der Methode in der Routine sollte deren Anwendbarkeit getestet werden. Im Falle der Anwendung im eigenen Labor durch die Laborprazision und bei Anwendung in mehreren Labors durch die Vergleichsprazision. Dafur eignet sich VK als objektives Kriterium fur die Robustheit = leichte Anwendbarkeit einer Methode sowohl was die Labor- als auch die Vergleichsprazision betrifft. Neben der einfachen Streuung der Werte innerhalb einer MeRserie (VK) kann uber die Varianzenhomogenitat gepruft werden, ob die zwei Wertereihen einer Grundgesamtheit entstammen, z. B. Werte mit Gerat A und Gerat B erhalten, Analyse von Mitarbeiter 1 und Mitarbeiter 2 durchgefuhrt, Werte stammen aus Labor 1 und Labor 2 usw. Das wird schematisch in Abb. 3-9 [34] dargestellt. Es liegt auf der Hand, dal3 der Ursache fur die Streuung, wie auf der linken Seite der Abbildung dargestellt, nachgegangen werden muB.

Abb. 3-9 Zur Robusthcit von Methoden; beim Wechsel von der Situation A zur Situation B (anderes Labor, andercs Geriit usw.) zeigt sich, da13 MethodeA2 robuster ist als Methode A l [34].

Ahb. 3-10 Zur Priiiision und Rohustheit von Methoden

Viele Methoden sind zu ,,priizise". L%t man sich (oft unnotig) auf sehr enge Spezifikationsgrenzen ein, hat man in der Zukunft mit einer nicht robusten Methode zu kampfen: Eine jede winzige Anderung in den Methodenparametern oder in der Umgebung kann zu einer Streuung der Werte fiihren und man gerLt leicht aul3erhalb der Spezifikationsgrenzen. Abbildung 3- 10 zeigt fur den gkichen Mittelwert eine sehr prlzise und nicht robuste sowie eine weniger priizise aber robuste Methode. Sind die Spezifikationsgrenzen vorgegeben, so sollten stets miiglichst priizise Methoden angestrebt werden, siehe Abb. 3- 10, Abschnitt 3.7.2 und 3. I I .3. Wichtig ist, die Spezitikationsgrenxen stets nach den tatsiichlichen Bedurfnissen und den Gegebenheiten im Alltag zu definieren (wenn man darf ...). Es kann gegebenenfalls mit Blick aufeine Kostenbegrenmng sinnvoll sein, parallel oder in

Kombination zu prufen z. B. die Stabilitiit von Liisungen zusammen mit der Laborpriizision oder der MeBpriizision (sechs Standardlosungen) - parallel in zwei Labors mit Analyse der Standard- und Probeliisungen (unabhiingige Einwaagen) nach 24, eventuell auch nach 48 Stunden usw. -

Ein Lhnlicher 3-Stufen-Plan wird von HPB (kanadisches Pendant der FDA) vorgeschlagen: Stufe 1: Wie empfindlich reagiert die Methode auf kleine Anderungen? 2 Chargen eines chromatographischen Materials Kleine Veriinderungen der mobilen Phase Anderer Anwender Stufe 2: Wie reagiert sie bei griiBeren Veranderungen? Unterschiedliche Saulentypen Anderes Geriit Anderes Labor Stufe 3: Anwendbarkeit auflerhalb des eigenen Labors'? - Testen in anderen Labors

3.5 Robustheir

Tab. 3-9 Robustheit von Methoden ggf. variiert werden sollten.

AASIAESIICP -

-

Spaltbreite Art der Dosierung Gasilufi Brcnnzeit (bei Flamnie) Temperatur (bei Graphit) Mineralisierungsgrad

-

Charakteristische Parameter, die bei einzelnen Methoden

Polarographie/ Vol tammetrie lonenstarke des Grundelektrolyten TropfgroOe, -geschwindigkeit Konkurrenzreaktionen an der Quecksilberoberflache Unerwunschte Nebenreaktionen, (vor allem im Spurenbereich!) Stabilitat von Losungen - Temperatur Abscheidungszeit Trenntechniken

-

Ti tration -

-

-

-

-

Gravimetrie/ Thermogravimetrie Bei Sulfatasche: Pyrosulfatbildung? Behandlung des Wagegllschens, Tiegelmaterials Temperatur bzw. Heizrate Substanzverteilung im TrockengefiB Bei Gasbrenner: Gaszufuhr, Luftzufuhr, Flammenabstand Bei Trockungsverlust: ungewunschte Umsetzung (Oxidationen, Dehydratisierungen)? Wirksamkeit von Mg (CL04)2und P205: Oberflache! Beschaffenheit: GranuWfest etc.

GC: GasfluB Splitverhaltnis bei der Injektion Aufheizrate Headspacetechnik und Matrix DC: Plattenmaterial Feuchtigkeit Auftragsart und -dauer Laufmittel CE: Injektion -

-

-

-

-

Spannung Pufferstarke und -stabilitat - Warmeabfuhr HPLC/IC: - pH-Wert - Temperatur FluB Charge der stationaren Phase

-

-

-

Qualitat des Urtiters Ertassung des Endpunktes (Potentiometer/Indikator) Ternperaturdifferenz: TitriergefiaRIWaage F"1lgeschwindigkej( Titriergeschwindigkeil C0,-Konzentration im Titriermittel

Spektroskopie -

-

-

-

109

-

Spaltbreite Zeitkonstante Probenvorbereitung (PreBling, Verreibung) Konzentration: a) der Probe selbst b) einzelner Probekomponenten Probelosungsmittel pH-Wert Temperatur Wellenlangerichtigkeit Streulicht'?

3.5.4 Kommentare. Hinweise Robustheit ist vermutlich das individuellste aller Kriterien einer Methode bezuglich Umfang und Durchfuhrungspraxis. So ist beispielsweise AAS eine robustes Verfahren, es besteht kaum Bedarf fur eine Uberprufung der Robustheit im eigentlichen Sinne. Bei einer UV-Messung gibt es dann schon einige Faktoren, die das Ergebnis beeinflussen kiinnen: Temperatur, Matrix. pHWert, Feuchtigkeit. Es gibt schliefilich komplexe HPLC-Methoden, bei denen die Uberprufung der Robustheit mit Sicherheit den Liiwenanteil der Methodenvalidierung darstellt. In Tab. 3-9 sind fur einige wichtige Verfahren die Parameter wiedergegeben, die bei der Uberprufung der Robustheit gepruft werden kiinnen. Robustheit ist abhangig von der Konzentration. Als quantitatives Mafi fur die Robustheit einer Methode kiinnten die verschiedenen Niveaus der Prazision bei unterschiedlichen Konzentrationen gelten.

3.5.5 Robustheit in der HPLC Nachfolgend werden einige Ansatze zur Uberpriifung der Robustheit in der HPLC vorgestellt. Diese Vorschlage gelten sinngemlB fur alle chromatographischen sowie verwandten Trenntechniken wie Kapillarelektrophorese und Kapillarelektrochroiiiatographie.Der notwendige Umfang der Experimente hiingt vom konkreten Fall ab. Der Einflufi einer komplexen Matrix sollte stets untersucht werden, ansonsten bestimmen Art der Probe und Trennmechanismus Umfang und AusmaBe der Experimente. So sind beispielsweise bei der Trennung von ionischen Substanzen pH- Anderungen kritisch. (s. Abb. 3- 1 I ), bei Normal-Phase-Trennungen spielen Spuren von Wasser im Hexan eine wichtige Rolle, Scherkrifte bei der Filtration von biologischen Proben kiinnen zu einer Fragmentierung von groBen Proteinen fuhren, die Pufferstarke beeinflufit die Wartneabfuhrung bei der Kapillarelektrophorese, Wechsel des Gerates in der Kapillarelektrophorese kann zur Anderung der Migrationszeit und der Nachweisgrenze fuhren ( s . Abb. 3- 12), die Temperaturkonstanz in der Elektrochromatographie ist immer noch eines der Hauptprobleme, und einige Mikroliter mehr oder weniger Tetrahydrofuran/ Cyclohexan als Liisungsinittel fur PAK's (Polyaromatische Kohlenwasserstoffe) lassen das Fluoreszenzsignal stark schwanken. Tab. 3- 10 gibt die Parameter einer HPLC-Methode wieder, die geandert werden kiinnen. Vorgehen zur Uberprufung der Robustheit in der HPLC Anhand eines Beispiels wird cine miigliche Vorgehensweise erlautert. 1. Man miichte zunachst den EinfluB ritzrs Parameters auf die chromatographische GroOen fest s te I I e n. Zunlchst sol1 entschieden werden a ) welche chromatographischen GriiBen zur Charakterisierung des Ergebnisses xu Rate

gezogen werden, z. B. Flache, Retentionszeit. . .. und b) welche Parameter fur die konkrete Methode kritisch sind.

3.5 Rohusrheit

+

10

1I I

pH 6.70

20

30

Minuten

40

50

60

Abb. 3-11 EinlluR des pH-Wertes irn Eluenten auf die Trcnnung von Arninosauren mittels RP-HPLC (Quelle: Waters).

Nehmen wir als Beispiel eine Spurenbestimmung. Untersucht wird die Anderung der Retentionszeit, der Bodenzahl, der Flache und der Hohe durch eine Variation der Zeitkonstante. Die Werte beim ublichen Einsatz der Methode und einer Einstellung der Zeitkonstante von 0,5 s entsprechen dem Nullniveau. Die resultierenden Anderungen bei einer Anderung der Zeitkonstante zwischen 0, I2 s und 2 s werden in einer Grafik prozentual eingetragen, wobei - wie bei den Residuen - auf die griil3te Abweichung normiert wird, s. Abb . 3- 13 [40]. Aus Abb. 3-13 wird zum Einen ersichtlich, daR die Zeitkonstante - wie erwartet - am starksten die Peakhohe beeinflufit. Zum anderen wird bei der gewahlten Zeitkonstante von 0,5 unnotig Peakhohe und damit Nachweisgrenze ,,verschenkt". (In diesem Beispiel handelt es sich um eine KorngroBe von 10 pm, bei der Anwendung der modernen 5 pm oder 3,5 pm Materialien fillt diese Beeinflussung noch gravierender aus!) Ahnlich der Zeitkonstante kann der EinfluB auch anderer Parameter untersucht werden, die vom Validierer fur diese Methode als kritisch eingestuft werden.

2. Man konnte anschlieBend den EintluB mehrerer Parameter auf eine bestimmte chromatographische GroRe uberpriifen. Man wahlt beispielsweise die Peakflache als chromatographische GroBe, wenn es sich um eine Cehaltsbestimmung handelt oder Peakhohe, wenn es um eine Spurenbestimmung von Nebenkomponenten geht.

350 300 -

250 200

-

150 -

-.

1007=.,50

/-------

-

0

0.000 0.00

flr 1

1

1

/L

L

C

,I 1

5.00

1

1

1

1

1

1

10.00

1

1

1

1

1

15.00

1

1

18.01

Abb. 3-12 EIcI\~rophcrogratnmhci idcntischcn Bedingungcn aher an 7wci unlcr\chicdlichcn Gcraten (Qucllc: Dr. Michael Krimcr, NOVARTIS, Bascl).

3.5 Robustheit

I 13

Tab. 3-10 Uberprufung der Robustheit einer HPLC-Methode.' EinfluBfaktoren

U berpru fu ng

Probenvorbereitung:

Extraktionszeit, Ultraschallzeit, Dauer und Art der Entgasung, Starke des Probelosungsmittels, z. B. mehdweniger Acetonitril als im Eluent, EinfluU der Probelosungsmittel auf Retention, Peakflache und -form abhangig vom lnjektionsvolumen

Verschleppung:

Der Injektion einer hochkonzentrierten Liisung folgt die Injektion von reinem Eluent. Bei einem Peak griillier als 50 '31der Nachweisgrenze (PeaWRausch-Verhaltnis > 3 : I ) ist die Verschlcppung nicht zu vernachlassigen.

Flu Rrate:

+S % und EinfluB auf Peakhohe, -flache und Retentionszeit.

Gradient:

Verweilvolumen, Design und Volumen der Mischungskammer, Mischungsqualitat abhangig a) von der Viskositat der Elucntcn A und B, b) von der Steilheit.

Eluent:

-

Normal-Phase: +SO ppm H 2 0 im Eluent

-

RP: +5 c/o organischer Anteil, z. B. bei einem 60/40 Wasser/Acetonitril-Eluenten 55/45 und 65/35 testen. ionische Komponenten: ?O,S pH-Wen, +5 mMol Puffer bzw Ionenpaarreagenz.

-

Saule:

Charge, Lieferant, Art und Dauer des ,,Einfahrens" bei ncuen/gebrauchten Saulen, Alter und Historie der Saule, Ubcrladung. irreversible Sorption bestimmter Bestandteilc der Probe.

Temperatur:

+s oc.

Dctcktion:

h + 2 nm, Zeitkonstante +0,2 sec (bei 10 mV-Ausgang),

Spaltbreite und Referenzwellenlange beim Dioden-Array.

Datenauswertung:

Datenaufnahmerate (Sample Rate) +2-4 Datedsec., Threshold-Wen, manuelle/automatische Integration, Integration mit/ohne ,,Splin"

Irreversiblc Adsorption bestimmter Komponenten in der Adage:

Flachc(n) mit und ohne SBule vergleichen.

'

Diese Tahelle gilt als Bcispiel einer Maximalforderung: Die Auswahl der zu priifenden kritischen Parameter 1st abhangig von der Methode und individuell festzulegen!

Anderung in %

2

17

= 0,12

S

=2s

- 4L

Retention

Bodenzahl

Flache

Konzentration

Hohe

Konzentration

Abb. 3-13 Auswirkung der Anderung der Zeitkonstante auf HPLC-Parameter.

Nun werden alle chromatographischen Parameter - fur die man sich entschieden hat im relevanten Bereich geandert und die jeweilige, prozentuale Anderung grafisch dargestellt, s. Abb. 3- 14 [40] als Beispiel fur die Peakhohe. Wahrend die Peakflache aul3er bei Anderung von Flu13 und Wellenlange sonst konstant bleibt, andert sich die Peakhohe bei einer Anderung von Packungsqualitat, pHWert, Temperatur, Wellenliinge und Elementenzusammensetzung. Diese Aussagen sind aus der Theorie bekannt und sicherlich nichts Neues. Nun - und das ist sehr wichtig - erkennt man hier schnell, welche Methodenparameter welchen EinfluR in welchem AusmaB in dieser konkreten Methode haben. Diese optische Darstellung ist leicht durch EXCEL zu realisieren und liefert eine Fulle an Informationen. Es wird empfohlen, eine solche Darstehng zur Illustration der Robustheit dem Validierungsbericht und spiiter auch der SOP beizulegen. Wird nun ein Parameter nach dem anderen variiert, so waren z. B . fur 6 Parameter mitje 2 Levels insgesamt 12 Experimente notwendig. Um die Anzahl der Experimente auf ein notwendiges Minimum zu reduzieren, wurden mehrere Modelle der Faktorenversuchsplanung entwickelt, die teilweise in der Literatur beschrieben sind [4 1-43]. Diese helfen tatsachlich Zeit zu gewinnen, sind allerdings in der Praxis nur bei entsprechendem mathematischen Hintergrund der Anwender praktikabel. Die ublichen Auswerteprogramme unterstutzen solche Modellrechnungen nicht. Man kann jedoch durch eine uberlegte Auswahl der zu verandernden Parameter auch ohne Modellrechnungen Zeit gewinnen. Es ist moglich, gleichzeitig zwei Parameter zu verandern, ohne dabei Informationen zu verlieren, eine solche Moglichkeit wird in Tab. 3- 1 1 gezeigt.

3.5 Robustheit

115

nu

60°C

10%

Saule 1

max

1,5ml/min

270nm

min

40°C

3Yo

2,5ml/min

280nm

Saule 2

Abb. 3-14 EinfluR von HPLC-Parametern auf die Peakhohe.

Wird z. B. der Flu8 und die Saule gleichzeitig geandert (Zeile 2 ) , so wissen wir, daB eine Anderung von Totzeit und Peakflache nur dem FluB (2), eine Anderung der Peakhohe (bei kleinen FluBanderungen) und der relativen Retention nur der Saule (3) zuzuschreiben ist. Ahnlich beeinfluBt eine geanderte Elutionskraft (1) nur die Retentionszeit, wahrend die GroBe des Signals bei konstanter Retentionszeit nur durch eine veranderte Wellenlange (5) zu andern ist (Zeile I ) . Werden gleichzeitig der FluB und die Temperatur geandert (Zeile 3), so ist fur die Anderung der Flache und der Totzeit die Ursache ausschlieBlich die Flu& anderung ( 2 ) ,wahrend restliche Anderungen der Temperatur (4) zuzuschreiben sind. Beim Vorgehen wie in Tab. 3- 1 1 gezeigt, reduziert sich die Anzahl der Experimente von 12 auf 8. Handelt es sich bei der Methode um die Trennung von neutralen Substanzen, spielt der pHWert keine Rolle. Hier waren nur 6 Experimente notwendig usw. Solche Tabellen konnen individuell erstellt werden. Tab. 3-10 Bcispiel eines Designs zur iikonomischen Uberpriifung der Robustheit in der HPLC. Erlauterungen der Ziffern im Text. 1

2

3

X

X

4

X

5

6

X

5

1

1

2

2

3

2

3

2

4

3

3

X

X

5

1

2 2

2

4

4

6

6

6

4

X

6

6

A: Anderung, N Bodenzahl, A: Peakflache, tR: Rerentionszeit, k: Retentionsfaktor (friihcr k’-Wert), to: Totzeit, H : Peakhohe

3.6

Selektivitat und Spezifitat

3.6.1 Definitionen und Erlauterungen Selektivitiit ist die Fiihigkeit einer Methode, wrschierlerie, nehrrieiriurider :~r.hestimrneride Korripotietiterz ohne gegenseitige Storung zu erfassen und sie somit eindeutig zu identifizieren. Verwandt mit dem Begriff der .,Selektivitit" ist der Begriff ,,Spezifitiit". Spezifitiit ist die Fiihigkeit einer Methode, eine Substanz oder eine Substanzklasse ohne Verfiilschung durch andere in der Probe vorhandene Komponenten 7,u erfassen und sie somit eindeutig zu iden t i ti zieren . Eine .re/ektitv Methode liefert richtige Ergebnirse fur al/e interessierenden Analyten, wohingegen eine spez(fische Methode richtige Ergebnisse fur eincw Analyten liefert, wahrend andere Analyten sich gegenseitig storen konnen. Be isp ie Ir Eine ionenchromatographische Methode ist selektiv, wenn sie alle vorhandenen organischen Ionen in einer Abwasserprobe erfaBt. Hier handelt es sich um eine selektive Methode fur organische Ionen. Eine FIA-Methode (Flieflinjektionsanalyse) arbeitet spezifisch, wenn sie Chromat in einer Rheinwasserprobe eindeutig identifizieren kann, man spricht von einer spcyijischeti Bestiinmung fur Chromat. ZusammengefaBt heiljt das folgendes: Selektivitiit ist relativ, sie kann verbessert, erhoht werden z. 9. durch selektivere Wechselwirkungen i n der Chromatographie. Selektivitat mu13 bewiesen werden, somit stellt sie ein wichtiges Validierungselement bei Trenntechniken dar. Spezifitiit ist absolut und somit prinzipiell nicht zu verbessern, so unterliegt sie nicht der Beweisnot. Eine 100 c/o selektive Methode ist eine spezifische Methode. Daher spricht IUPAC von der Spezititiit als das ,,non plus ultra", als die ultimative Selektivitiit. In der Praxis wird in der Regel zwischen ,,Selektivitat" und ,,Spezititiit" nicht unterschieden. Beide Begriffe werden synonym verwendet, wobei der Begriff ,,Selektivitat" im deutschen Sprachraum hlutiger vorkommt, wiihrend im Englischen in letzter Zeit eher von ,,specificity" die Rede ist, z. B. in den ICH-Guidelines. Das ist insofern etwas bemerkenswert, als gerade die ICH-Texte sich vorwiegend an ,,Chromatographeure" wenden. Folgende knappe Definition erscheint fur den taglichen Sprachgebrauch pragmatisch: Selektivitat ist die Fahigkeit einer Methode zur Unterscheidung aller interessierender Stoffe in der Probe. Das Vorhandensein von Selektivitiit ist eine der Grundvoraussetzungen fur die Richtigkeit von Trenntechniken. Bei einer Reihe von anderen Methoden wiederum ist die Art der Bestimmung per se spezitisch, denn es wird hier eine bestimmte, charakteristische Eigenschaft der Substanz gemessen. Beispiele dafur sind u. a. AAS, FTIR, emymatische Tests, Immunoassays, "C-Radioaktivitat, P-NMR, Gen-Antigen-Wechselwirkungen. In diesen Fiillen spielt Selektivitiit im Rahmen einer Methodenvalidierung eine untergeordnete Rolle. Die Selektivitiit ist dagegen eines der wichtigsten Kriterien fur die Cute von Trenntechniken wie Chromatographie und Kapillarelektrophorese bzw. Elektrochromatographie. Aus diesem Grunde wird nachfolgend aufdie Prufung der Selektivitat in der Chromatogra-

3.6 Selektivitut und SpeziJitat

1 17

phie, speziell HPLC, eingegangen. SinngemaR gelten diese Ausfuhrungen fur alle Trenntec hniken.

3.6.2 Grundsatzliches zur Prufung auf Selektivitat 1. Wenn die Richtigkeit bereits bewiesen wurde (s. Abschnitt 3.4.2), kann auf eine Pru-

fung der Selektivitat verzichtet werden, denn wenn das Ergebnis richtig ist (keine systematischen Fehler), mu13 die Methode, die zu diesem Ergebnis fuhrte, selektiv sein. 2. Fur alle Trenntechniken empfiehlt sich vor der eigentlichen Trennung, Tests mit Leerwerten durchzufuhren um sicher zu sein, daR ,,Systempeaks" erkannt und identifiziert sind. Je komplexer die Probe undoder j e komplexer der Eluent ist, um so dringender wird diese Maljnahme zu einem ,,MuK'. Bei Gradiententrennungen sollte ein Blindgradient (Gradient ohne Probe) gefahren werden, weiter sollte j e nach Trennproblem folgendes injiziert werden: ein Systemleerwert (Eluent), ein Probeleerwert oder Leerprobe (Placebo bzw. Matrix ohne Probe) oder ein Methodenleerwert. Das ist eine ,,Wasserprobe", die samtliche Schritte der Probenvorbereitung bis einschlieBlich Injektion durchlaufen hat. Bei der Injektion dieser Leerwerte sollte das Signal von Peaks - falls vorhanden - hochstens 30 % bis 50 % der Nachweisgrenze betragen.

3.6.3

Prufung auf Selektivitat von bekannten Proben in der HPLC

Vergleich der Chromatogramme von der Probe und eines Standards, der alle denkbaren Storsubstanzen inkl. Matrix im erwarteten Konzentrationsbereich enthiilt. ,,Storsubstanzen" sind: Verunreinigungen, Zersetzungs- und Nebenprodukte, Hilfsstoffe, Matrix- und Formulierbestandteile, Restlosemittel usw. Zusatzliche Sicherheit erhalt man, wenn ausschlieRlich die Matrix ohne eine einzige der erwarteten Komponenten analysiert wird. Man spricht hier von Positiv- und Negativprufungen. - Die ,,Storsubstanzen" kijnnen auch der Probe zugesetzt werden. Es gilt zu beweisen, daR die interessierende Komponenten neben den zudosierten ,,StorsubstanZen" zweifelsfrei quantitativ bestimmt werden konnen. Stehen nicht alle ,,StorsubstanZen" zur Verfugung, so kann man sich behelfen, indem man durch StreRtests (Licht, Hitze, Feuchtigkeit, Oxidation, saure/alkalische Hydrolyse) Zersetzungsprodukte erzeugt. Sie werden dann zusammen mit der Matrix analysiert. AnschlieBend werden die Profile (,,fingerprints") der Chromatogramme von Probe und gestreRten Standards verglichen. Bei StreRtests sollte die Relevanz fur die Praxis bewahrt bleiben. Es sol1 noch einmal auf den EinfluR der Matrix hingewiesen werden: Gerade bei Konzentrationen in der Nahe der Nachweisgrenze kann die Matrix nicht nur Flache und Hohe sondern auch Peakfonn und Retentionszeit stark beeinflussen. - Es konnen schliel3lich als letzter Ausweg ahnliche Substanzen - d. h. die selben funktioneilen Gruppen, ahnliches Molekulargewicht - in der erwarteten Konzentration zusammen mit der Matrix analysiert werden. -

1 18

3 Die ~ilidierirng.spparumetev

3.6.4 Prufung auf Selektivitat in der HPLC bei Proben unbekannter Zusammensetzung Die Uberprufung der Selektivitat einer chromatographischen Methode fur unbekannte Proben - in Kombination mit geringen Analytmengen und komplexer Matrix - durfte den schwierigsten Fall darstellen. Was die Probenart betrifft, sind Umweltproben am problematischsten, da der Metabolismus nicht immer bekannt ist und mit Uberraschungen gerechnet werden muR. Systematische Variation der Methodenparameter

1. Einstellparameter an der Apparaturhzw. Anderungen physikalischer Natur. 1. Hier wird nicht die Selektivitat - Abstand zwischen den Peakspitzen - sondern die Aufli/sung Abstand zwischen den Peaks an der Peakbasis - erhoht, (s. Abb. 3- 15).

Beispirle Kleineres Totvolumen einer isokratischen HPLC- Anlage, kleinere Partikel der stationaren Phase, besser gepackte Slulen, kleineres Injektionsvolumen, Erhohung der Datenaufnahmerate (Sample-Rate), Erniedrigung der Zeitkonstante des Detektors (bei 10 bis 1 OOmV-Ausgang), Anderung der Wellenllnge/des Detektionsprinzips usw. 2. Anderungen chemischer Natur, das sind Anderungen, die die Wechselwirkung der Probe mit der stationfren Phase beeinflussen konnen.

Beispiele Temperatur, stationare Phase, mobile Phase inkl. Anderung von pH-Wert, Ionenstarke, Modifier. In der chromatographischen Fachliteratur wird ausfuhrlich auf die Uberprufung der Selektivitat bzw. Selektivitatserhohung in der HPLC eingegangen.

gute Selektivitat schlechte Auflosung

Abb. 3-15 Zum Unterschied zwischen Selektivitat und Aufllisung in der chromatographic

3.6 Selektivitiit und Sprzifititcit

1 19

3. Aufnahme einer Kalibriergerade im unteren Konzentrationsbereich Geht die Gerade durch den Nullpunkt oder schneidet sie die y-Achse? Durchfuhrung und Details siehe Kapitel 3.7.

4. Das Ergebnis wird mit dem Ergebnis einer zweiten, unabhiingigen (chromatographischen) Methode verglichen - RP-HPLC und Normal-Phase-HPLC - lonenpaarchromatographie/Kapillarelektrophorese -

HPLC/ELISA Chromatographie/Spektroskopie

5. Off-line-/on-line-K~pplung zweier Verfahren rnit moglichst unterschiedlichen Trennprinzipien bzw. Trennmechanismen Man spricht hier von mehrdimensionaler Chromatographie oder orthogonalen Trenntechniken.

Beispiel 1 On-line-Kopplung HPLC/AusschluBchromatographie: Trennung eines Co-polymers nach den chemischen Eigenschaften mittels Gradienten-RP und anschlieaende Trennung nach den Molekulargewichten mittels GPC, siehe Abb. 3- 16, Quelle: Peter Kilz, PSS, Mainz. Trotz aufwendiger Optimierungsexperimente war es nicht gelungen, mittels nur eines Trennprinzips die gewiinschte Auflosung zu erzielen (Abb. 3- 17 und 3-18). Beispiel 2 On-line-Kopplung RP-HPLC rnit AMD-DC: ,,Vortrennung" mittels HPLC. Die Fraktionen werden weiter mittels AMD-DC aufgetrennt. Dabei werden die Peakkapazitaten (die Anzahl der Peaks, die man rnit Hilfe einer Methode auftrennen kann) der zwei Methoden multipliziert, z. B. Trennung von zehn Peaks in der HPLC undTrennung von sechs Flecken in der DC; theoretisch sind durch eine Kopplung HPLC-DC 60 Komponenten aufzutrennen! In Abb. 3-19 wird die Trennung eines Emulgators mittels RP gezeigt. Quelle: Dr. Klaus Burger, Bayer AG, Dormagen. Peak ,,D", der mittels HPLC nicht mehr aufgetrennt werden kann, wird on-line rnit Hilfe der DC im AMD-Modus weiter aufgetrennt - rnit hervorragendem Erfolg, wie in Abb. 3-20 ersichtlich ist. Folgende Moglichkeiten sind bei der Off-line/on-line-KopplungChromatographie/ Spektroskopie denkbar: HPLC - UV - (DAD) HPLC - MS(MS) HPLC - MALDI - TOF HPLC - NMR GC - MS GC - AES CE - MS

-

PSS 3D - Flachendarstellung eines Stern Blockcopolymeren

18

Styro - Anteil [% x 101

Abb. 3-16 On-line Kopplung H P L C E P C Lur Trcnnung von Stcrnblocl\polymcren; y-Achsc: RPHPLC-Trcnnung nach Sorptionscigcnschat‘ten, x-Achsc: GPC-Trcnnung nach Molekiilgr(il.(c (Au5schlul3chromalographie).

3.6 Selekrivitat und Spe:@tiit

12 1

Projektion HPLC ( 1.Dimension ) A

16 1412-

10 20

30 40

50 60

70

RP-Elution [rnl]

80 90

Abb. 3-17 Trennung von Sternblockcopolymerennach einem RP-Trennmechanismus.

25 15 10 5 11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

GPC - Elution [mi]

Abb. 3-18 Trennung von Sternblockcopolymerennach einem GPC-Mechanismus.

Beispiel3 On-line-Kopplung HPLC-MALDI: HPLC-Trennung eines Fettsaurengemisches und Untersuchung einzelner HPLC-Peaks mittels MALDI, siehe Abb. 3-2 1 bis 3-2 I b, Quelle: Dr. Michael Schmitt, Zentrale Analytik, Henkel KGaA, Diisseldorf. Die Kopplung Chromatographie - Spektroskopie zeigt eindrucksvoll den eingeschlagenen Weg in der Analytik. In dem Mafie, wie es gelingt die Spezifitat zu erhohen, in dem MaBe verliert die Trennung, die einen selektiven Vorgang darstellt, an Bedeutung. Eine Erhohung der Selektivitat ist fast immer mit betrachtlichem Aufwand verbunden, denn es ist vie1 ,,Chemie" notwendig. Selektive Wechselwirkungen sind oft nur durch langwierige Optimierungsversuche zu erzielen. Bei der Spezifitat steckt der Aufwand im Vorfeld, namlich in der Entwicklung des MeBprinzips; ,,Physik" ist gefragt.

Ahh. 3-19 RP-Trennung eines Emulgators (Quelle: Dr. Klaus Burger, Bayer AG, Dormagen).

680[mV/10 Absl

1

0

D

Iodine A420

60mm

Abh. 3-20 DC-On-linc-Trennung der Fraktion ,,D" des HPLC-Chromatogramms aus Abb. 3- 19.

So werden kurze Saulen eingesetzt, die im ersten Schritt schnelle, gerade ausreichende HPLC-Trennungen erlauben. Die anschlieRende on-line Kopplung mit MS, M S M S (ggf. im multiple reaction mode oder MALDI-TOF) fuhrt zu schnellen und recht verlal3lichen Aussagen.

3.6 Selektivitiit und Sprzifitiit

123

Method: silion

PlARlO Manual lnjektion 1 CH 1 mL 400

Fr.5

350

F

300 250 Fr.3 200

n Fr.6

0

10

20

30

40

46

Minutes Abb. 3-21 HPLC-Chromatogramm nach der Reaktion von Fettsauren mit Ethylenoxid (Quelle: Dr. Michacl Schmitt. Henkel KGaA, Dusseldorf).

6. Kombination der zwei letztgenannten Moglichkeiten

Kopplung zweier unabhangiger Trennmethoden und anschlieljende Kopplung rnit spektroskopischen VerfahredSensoren. Diese Moglichkeit, namlich die Kopplung - vorzugsweise in miniaturisierter Form zweier chromatographischer Verfahren rnit unterschiedlichem Trennmechanismus und anschlieljende Kopplung rnit hochauflosenden spektroskopischen Verfahren (MS (MS), AES, NMR) oder rnit chemischedbiologischen Sensoren gibt die groljtmogliche Sicherheit.

Beispiele Gelelektrophoretische ,,Vortrennung" und anschlieflende Kopplung rnit Kapillar-LCMS oder LC-CE-DAD- oder LC-CE-MS oder HPLC-GC-MS oder Kapillar-LC-DCFTRaman oder Kapillar-LC-DC-Wirkungsdetektor [44]. Die Entwicklung von neuen Feldern auf breiter Basis wie Kombinatorische Chemie und Wirkstoffchemie auf Proteinbasis hangt u. a. vom Vorhandensein schneller Analytik mit spezifischer Detektion ab. Es wiire denkbar, did3 die MS-MS-Kopplung (ohne vorherige chromatographische Trennung!) in spatestens 10bis 15 Jahren bestimmte Bereiche der Analytik revolutionieren wird, denn bezuglich Schnelligkeit und Spezifitat ist MS-MSKopplung unubertroffen.

Abb. 3-21a On-line MALDI-Spektrum der Fraktion Nr. I aus Abb. 3-2 I.

3.6 Selektivitiit und Spetifitiit N

0 0

m

0 0

co

a,

F m

. r

0

m

0 9 0 b

4-z m d

:-i 9

0 0

m

3.6.5 Uberprufung der Selektivitat in der HPLC - Schnellmethoden Oben vorgestellte Methoden sind am aussagekraftigsten, aber auch aufwendig und teuer. Es gibt daneben eine Reihe einfacher Moglichkeiten, die Peakreinheit und darnit die Selektivitat der Methode zu uberprufen. Dazu werden einfache, chromatographische Regeln verwandt und chromatographische GroBen wie Peakbreite, Retentionszeit, Peakhohe und flache und Asyrnmetriefaktor, benutzt. Weiterhin kann die erste und zweite Ableitung des Peaks zu Hilfe gezogen werden (Ableitungs-Chromatographie). Peakbreite und Retentionszeit Das Verhaltnis von Peakbreite und der dazugehorenden Retentionszeit ist charakteristisch und bei bestirnmten chromatographischen Bedingungen konstant fur eine Substanz, d. h. die Peakbreite ist der Retentionszeit linear proportional. Tragt man demnach die Peakbreite an der Peakbasis - oder bei 10 % Peakhohe - gegen die dazugehorende Retentionszeit, die z. B. durch Eluentenanderung zunirnmt, auf, so ergibt sich fur eine Kornponente eine charakteristische Gerade. Befindet sich nun aufgrund rnangelnder Selektivitat ein weiterer Peak unter dem zu betrachtenden Peak, so wird das Verhaltnis Peakbreite/Retentionszeit gestort, weil es unwahrscheinlich ist, dal3 zwei Komponenten bei Erhohung der Retentionszeit sich in gleichem MaBe verbreitern. Weicht fur eine gegebene Komponente die Peakbreite von dern durch die Gerade vorgegebenen Wert ab, so besteht der Verdacht, daB der Peak nicht homogen ist. Beispiel Man tragt die Peakbreite/Retentionszeit-Werteeiner Standardsubstanz auf, das ware quasi die ,,Kalibrierung". AnschlieBend werden die Werte des Peaks aufgetragen, den man in der Probe als diese Kornponente vermutet. Man muBte die gleichen Punkte auf der Gerade erhalten. 1st es nicht der Fall, so besteht der Verdacht, dal3 eine Verunreinigung unter dem Peak vorhanden ist. Es kann sich naturlich auch urn eine Komponente handeln, die bei einer bestimmtem Eluentenzusarnmensetzung, einem bestimmtem pH-Wert oder einer bestimmten Temperatur in zwei Gleichgewichtsformen vorkommt, z. B. ionischhicht ionisch, solvatisierthicht solvatisiert usw. Oder aber der Mechanismus fur die Wechselwirkung dieser Substanz mit der stationairen Phase lndert sich ah einer bestirnmten Eluentenzusarnmensetzung: RPWechselwirkungen konnen beispielsweise silanophilen Wechselwirkungen weichen [45]. Eine Variante dieses Experimentes ist folgende: Man tragt die Peakbreiten verwandter Substanzen z. B. substituierte Phenole oder Zucker gegen die Retentionszeit auf. Auch hier ergibt sich fur eine homologe Reihe und einen einheitlichen Mechanismus eine Gerade. Eine Abweichung von der linearen Abhangigkeit weist auf eine mangelhafte Abtrennung der entsprechenden Substanz von einer Storkornponente hin (s. Abb. 3-22) Quelle: Prof. Siegfried Ebel, Universitat Wurzburg.

Asymmetriefaktor und Peakhohe Die Ableitung von Asymrnetrie- (A,) und Tailingfaktor ( r ) sind der Abb. 3-23 zu entnehmen.

3.6 Selektivitiit und Spezijitiit

I

1 1

2

I 3

I 4

127

t,lrnin J 5

Abb. 3-22 Abhiingigkeit der Peakbreite von der Retentionszeit bei der HPLC-Analyse eines Antiepileptika-Gemisches. Phenobarbital und Methylphenobarbital konnten nicht getrennt werden (Quelle: Prof. Siegfried Ebel, Universitat Wurzburg).

Abb. 3-23 Zur Definition von Asymmetrie- und Tailingfaktor, A, und 7:

In der Literatur wird auch folgende Definition angegeben:

As

b

=U

Bei symrnetrischen Peaks ist As = 1. Der Asymmetriefaktor bleibt konstant, unabhangig davon, bei welcher Hohe er gemessen wird. Tragt man nun den Asymmetriefaktor gegen

Tab. 3-12 Hiiufigc Ursachcn fur Tailing und Tests xur Urwchenfor\chung Ursnche

Test

U hcrladung

weniger injiLieren

ZwciIc Koniponcnte an der Peakflankc

Wenigcr in.ji/icren. Mcthodcnhcdingungen vari ieren

Bildung labilcr Mctallkomplcxc durch Konlamination dcr stationiircn Phase mil Metallioncn

4-4' Bipyridyl injkicrcn, ist die stationiirc

Schlcchte Packung

Phase nietallionenlrei. erhrlt man einen symmctri x h e n Peak. Die Injektion eincr jcden Komponente luhrl

zum Tailing

Ionischc Wechsclwirkungcn in dcr RP-HPLC

Nur die Injektion von ionischen Komponcnten fuhrt Lum Tailing ( L . B. Ethylanilin, Phthalsiurc). Jedc ncutrale Komponentc eluiert \ymmetrisch.

die Peakhohe auf (z. B . an der Peakbasis) bei 10 %, 30 %, 50 56, 70 % und 90 76 der Peakhohe, so sollte sich eine Parallele zur x-Achse (Peakhohe) ergeben. Tritt eine Abweichung auf, so wiiren zuerst folgende Ursachen fur ein Tailing ausmschliekn ( s . Tab. 3- 12). Wenn obige Ursachen ausgeschlossen werden kiinnen, besteht der Verdacht auf eine mangelhafte Trennung. Asyinmetriefaktor und Retentionszeit Ahnlich der Peakbreite ist der Asymmetriefaktor eines Peaks fur eine bestimnite Komponente unabhiingig von der Retentionszeit. Triigt man nun den Asymmetriefaktor bei einer bestimmten Peakhohe oder noch besser bei mehreren Peakhohen - gegen die Retentionszeit auf, so ergibt sich bei homogenen Peaks eine Parallele zur x-Achse (Retentionszeit). Bei Abweichung besteht der Verdacht auf Inhomogenitiit des Peaks. Abbildung 3-24 zeigt diese Auftragung fur die simulierten Peakiiberlappungen aus Abb. 3-25, AbschlieOend sei noch angemerkt, dal3 bei gleicher Retentionszeit zweier Komponenten es unwahrscheinlich ist, da13 auch die restlichen chromatographischen GriiBen vollig identisch sind. Somit eroffnet sich die Moglichkeit, eine Komponenten-Matrix zu erstellen, d. h. jede Kotnponente hat fur gegebene chromatographische Bedingungen ihre ,,eigene" Zahlenkombination von z. B. Peaktliiche, Peakhohe, Asymmetriefaktor und Peakbreite bei einer bestimmten Wellenliinge und Injektionsmenge. Weiterhin ist bei einem homogenen Peak das Peakhiihenverhiiltnis zweier bei verschiedenen Wellenliingen aufgenommenen ~

H,L,\ konstant. H,., Steht schlieBlich ein Diodenarray-Detektor zur Verfugung, so konnen folgende Verhiiltnisse msatzlich errechnet werden:

Signale

~

3.6 Selektivitiit und Spezifitiriit

Peakhohe ~~

Peakflache Peakhohe bei A2 Peakflache

~~

Peakhohe

bei A,(oder Amax) oder

Asy mmetriefaktor

bei

129

A,

Peakhohe bei A, Asy mmetriefaktor

Abb. 3-24 Abhangigkeit des Asymmetriefaktors von der Peakhohe fur die simulierten Peaks aus Abb. 3-25 (Quelle: Prof. Siegfried Ebel, Universitat Wurzburg).

Abb. 3-25 Uberlapptc Peaks in dcr HPLC (simuliert) (Quelle: Prof. Siegfried Ebel, Universitat Wurzburg).

Abb. 3-26 Erste Ablcitung der Peaks aus Abb. 3-25.

Diese Quotienten reagieren empfindlicher auf Verunreinigungen als die iibliche RatioplotBildung (,.Peak-purity"-Test) [46,47].Mit Hilfe der Chemometrie kann eine recht sichere Zuordnung von Peaks auch bei nicht ausreichender Auflosung erfolgen: Durch Einsatz geeigneter Software konnen substanzspezifische rnehrdimensionale Diagrarnme erstellt werden. ,,Fit"-Routinen geben anschliefiend sehr zuverlassige Inforrnationen uber Peakhomogenitat - schon eine visuelle Entscheidung ist recht sicher [48]. Ableitungschrornatographie

Eine Peakinhornogenitat kann durch die erste und zweite Ableitung des iiblichen Peaks (GauBkurve) sichtbarer gemacht werden. In Abb. 3-25 sind vier simulierte Uberlappungen dargestellt. Irn Fall 1 (Schulter) ist eine Peakiiberlappung noch direkt zu erkennen. Eine Uberlappung wie irn zweiten Fall erkennt man erst in der 1. Ableitung (Abb. 3-26) und noch eindeutiger in der 2. Ableitung (Abb. 3-27). Die Voraussetzungen fur brauchbare Ergebnisse sind hier ein sehr gutes Peak-RauschVerhaltnis und eine Datenaufnahmerate von rnindestens 4 Datenpunkten pro Sekunde.

3.6 Selektivitiit und Spe5jitut

131

Abb. 3-27 Zweite Ableitung der Peaks aus Abb. 3-25.

3.6.6 Zusammenfassung Bei physikalischen und spektroskopischen Methoden handelt es sich um selektive oder gar spezifische Messungen, ein wesentlicher Vorteil gegeniiber den aufwendigen Trenntechniken. Daher wird fur neue analytische Probleme, fur die keine Referenzsubstanzen hergestellt bzw. durch Reinigung gewonnen werden konnen, eine Verlagerung der Praferenz von chromatographischen Trenntechniken hin zu Spektroskopie (genauer: Spektrometrie) erwartet. Treibkrafte sind ,,Schnelligkeit", ,,Robustheit" und eben Selektivitat". Eine (ganzheitliche) Wirtschaftlichkeitsanalyse zeigt beispielsweise, dal3 sogar eine MS-MS-Kopplung mit einem heutigen Anschaffungspreis von 200 bis 300 T Euro sich rechnet. Die Uberpriifung der Selektivitat ist eine der aufwendigsten Aufgaben bei der Validierung einer chromatographischen Methode. 1st die Probe bekannt und stehen Vergleichsproben zur Verfugungen, halt sich der Aufwand in Grenzen. Hier gilt es, ,,nur" zu zeigen, dal3 die chromatographische Auflosung zwischen den interessierenden Peaks ausreichend ist. Als Kriterium in der HPLC wird verschiedentlich eine Auflosung von R > 1,5 empfohlen.

Dabei sollte man folgende Punkte beachten: Richtigerweise bezieht sich die Forderung auf ,.R" (Resolution. Auflosung) obwohl manchmal irrtiimlicherweise die Rede von der Selektivitiit ist. Das Ziel ist in der Tat ein ausreichender Abstand zwischen den Peaks an der Peakbasis und nicht zwischen den Peakspitzen. Der Unterschied zwischen Selektivitat und Auflosung wird in Abb. 3- I5 dargestell. Bei gleicher Selektivitat der Methode in beiden Fallen ist die Autliisung im unteren Bild besser als im oberen. Dies ist durch eine Erhiihung der Bodenzahl, d. h. durch eine Verbesserung der Trennleistung (Effizienz) zu erreichen. Vollstandig aufgeliiste Peaks sind nicht unbedingt notwendig. Die Selektivitiit der Methode ist hinreichend, wenn sich das MeSsignal des betreffenden Analyten so auswerten lafit, dafi die Anforderungen an die Richtigkeit erfullt sind. -

Wie erwartet, ist der Aufwand bei unbekannten Proben (moglicherweise eine grol3e AnzahI an zu trennenden Komponenten, womoglich noch bei unterschiedlicher Konzentration und komplexer Matrix) am griifiten. Wenn es sich um eine wichtige Probe handelt. ist nahezu jeder Aufwand gerechtfertigt, denn von der Selektivitiit hiingt direkt die Richtigkeit des Ergebnisses ah. So kann evtl. auch an eine Derivatisierung gedacht werden. Die Priizision nimmt evtl. ab. aber die Selektivitat wird verbessert. Es gilt, von Fall zu Fall zu unterscheiden, oh vielleicht bei einer selektiven Methode eine Priizision von ,,nur" V , = 5 r/r in Kauf genommen werden kann. Am Beispiel der HPLC konnte die Uberprufung der Selektivitiit bei einer unbekannten Probe wie folgt aussehen (Abb. 3-28).

1. Chromatographisches System wird nichtlunwesentlich verandert - Herrschen optimale apparative Gegebenheiten? Einstellungen am Gerat wie Wellenlange, Zeitkonstante, Datenaufnahmerate usw., Totvolumen der Apparatur etc. uberprufen, evtl. optimieren. Moglichkeiten der Software ausnutzen. RatioplotVPeakpuritytests beim DAD, 1. und 2. Ableitung, Peakformanalyse, Chemometrie - Chromatographische Regeln nutzen. Beispielsweise kann bei einer isokratischen Trennung die Peakbreite sowie der Asymmetriefaktor bei unterschiedlichen Peakhohen in Abhangigkeit von der Retentionszeit aufgetragen werden. 2. Es werden Methodenparameter verandert 2. 6. andere Saulen einsetzen bzw. eine zweite Saule in Serie schalten, Injektionsvolumen bzw. -menge verringern, Eluent und Temperatur andern, Moglichkeiten der Miniaturisierung ausschopfen. 3. Aufwendigere MaOnahmen, Kopplung - Fraktionieren und off-line-/on-line-Kopplung rnit anderen Verfahren. - Fraktionieren und off-line-/on-line-Kopplung rnit Spektroskopie bzw. chemischenl Biosensoren. Abb. 3-28 Uhcrprutung dcr Selcktivitat bei cincr Prohc unbekanntcr Zusan1tncnset;rung am Bcispiel dcr HPLC.

3.7 Lineuritiit

133

Die sicherste aber auch aufwendigste Methode zum Beweis von chromatographischer Selektivitat ist die Kopplung zweier unabhangiger Verfahren miteinander und off-lineionline- Uberprufung der Fraktionen mittels Spektroskopie. Ziel und Wichtigkeit der konkreten analytischen Methode bestimmen den zu vertretenden Aufwand.

3.7

Linearitat

3.7.1

Einleitung und Definitionen

Wozu braucht man eigentlich eine Kalibrierung? In der instrumentellen Analytik werden durch Anwendung unterschiedlicher physikalischer MeBprinzipien MeBwerte erhalten. Der MeBwert muB nun - im Gegensatz z. B. zu einer Langenmessung mit einem geeichten MetermaB - in das Analysenergebnis umgerechnet werden. Dazu bedarf es im Vorfeld der Kalibrierarbeit. Dabei werden dem MeBwert empirisch bekannte Substanzkenndaten wie z. B. Menge oder Struktur zugeordnet. D. h. beispielsweise, es wird experimentell ermittelt, welchem MeBwert welche Menge der zu prufenden Substanz entspricht. Eine richtige Kalibrierung ist somit die Grundvoraussetzung per se fur quantitativ-analytisches Arbeiten. Uber Linearitat und ,,Mathematik": Linearitat ist das Validierungselement, dem vermutlich in der Literatur die ausfuhrlichsten Berechnungen gewidmet sind. Auch nur ein Versuch in diese Richtung wurde nicht nurden Rahmen sondern auch die Intention des vorliegenden Buches sprengen. Im Folgenden wird nur das sinnvoll Notwendigste beschrieben, wobei nicht ganz auf Formeln verzichtet werden kann. Der interessierte Leser sei auch auf die weiterfuhrende Literatur verwiesen [49, 501. Beim Begriff ,,Linearitat" verbindet der Analytiker die Korrelation zwischen Signal und Konzentration bzw. Menge. Und er hofft, daB diese Korrelation, d. h. die Kalibrierfunktion, durch eine Gerade zu beschreiben ist. Linearittit ist nun die Fahigkeit einer Methode innerhalb eines gegebenen Konzentrationsbereichs Ergebnisse zu liefem, die der Konzentration des Analyten direkt proportional sind. In diesem Zusammenhang werden mehrere Termini synonym verwendet. Nachfolgend wird versucht, die kleinen inhaltlichen Unterschiede, die doch vorhanden sind, aufzuzeigen: -

(Grund)Kalibrierung: Ermittlung des Zusammenhangs zwischen MeBwerten (Signal) und verschiedenen Konzentrationen (Menge, Substanzgehalt) anhand von Standardlosungen. Hier geht es um die Abhangigkeit Signal/Konzentration, also um die Kalibrierung des Analysenprinzips - naturlich inclusive der verwendeten Apparatur. Deswegen bleiben typische Charakteristika einer bestimmten Methode wie Extraktionsausbeute, Matrixeinflusse etc. aul3en vor.

-

-

-

-

Rrgrr.s.vion:Mit Regression wird die Art der Abhlngigkeit zwischen Variablen charakterisiert, hier rwixhen Konzentration und MeOwert. ~ulibrie~u/z~ oder t i ~Regressionsmodell ff oder Regressionsanalyse: Das ist das mathematische Model1 mit dem der Zusammenhang zwischen Me13wei-t (Signal) und Konzentration am besten zu beschreiben ist. Lineares Regressionsmodell oder doch quadratische Kalibrierfunktion? Korrrlationscina!\.sr: Diese priift den Grad der Abhiingigkeit zwischen Variablen. Ein Ma13 fur diese Abhiingigkeit ist der Korrelationskoeffizient - eine reine Indexzahl. Linraritut: Diese bezieht sich auf die konkrete Methode, d. h. auf den Zusammenhang zwischen Signal und Konzentration nach Durchfuhrung samtlicher Schritte der Methode.

Auf einen Nenner gebracht bedeutet dies, daR die Linearitat einer Methode abhiingig ist von der Kalibrierfunktion. D. h. von der Abhingigkeit des MeRwertes von der Konzentration (spezifisch fur ein MeRprinzip und das entsprechende Geriit), aber auch die konkrete Probe mit der charakteristischen Matrix und den weiteren Methodenspezifika spielen eine Rolle. Wenn die Probe ,,unkritisch" ist, wenn sie z. B. vorher durch AufschluR uniformiert wird oder wenn es sich um eine spezifische Bestimmung handelt, dann richtet sich das Augenmerk ausschliel3lich auf die (Grund)Kalibrierung z. B. FTIR, AAS. Dazu sollte zum Einen angemerkt werden, daR die Wortwahl .,Linearitat" etwas unglucklich ist. Suggeriert der Name doch, dal3 ein linearer Zusammenhang ,.besser" sei oder sogar anzustreben ist. Selbstverstlndlich ist das Rechnen mit einer linearen Gleichung einfacher. Es ist allerdings ausschliefilich notwendig, einen mathematisch beschreibbaren Zusammenhang zwischen Signal und Konzentration zu haben. Im ubrigen gibt es Falle, bei denen, bedingt durch das MeRprinzip, ein linearer Zusammenhang nicht erwartet werden kann: Messung mit bestimmten ionenselektiven Elektroden, Rontgenfluoreszenz, DC mit Densitometer, Immunoassays. Der Terminus ,,Kalibrierfunktion" mag hier generell geeigneter zu sein. Immer wieder wird das Wort ,,Analysenfunktion" (analytical response) vorgeschlagen. Dieser Begriff 1st allerdings ,,vergeben". Er wird in der Literatur fur die inverse Kalibrierfunktion benutzt. Aus dem erhaltenen MeRwert gilt es dabei, den gesuchten Gehalt zu ermitteln. Zum Zweiten wird oft von der Linearitat einer Methode berichtet, ,.ermittelt" wird sie jedoch durch Vermessen von Standards; z. B. 6-fach Injektion von sechs Aliquoten einer Standardlijsung in eine HPLC-Anlage. Hiermit wird jedoch bestenfalls die Kalibrierfunktion mit Hilfe von Standards ermittelt, nicht jedoch die Linearitat der Methode. Und nur im gunstigsten Fall ist Kalibrierung (mit Standards) gleich Linearitiit (Analyt + Matrix). Es mu13 mindestens eininal - eben im Rahmen der Methodenvalidierung - die Linearitit mit realen Proben oder synthetischen Proben plus Placebo gepruft werden. Es hat sich wiederholt gezeigt, daB die Matrix den linearen Bereich einengen kann. Sogar Unterschiede durch verschiedene Formulierung bei gleicher Matrix sind bekannt z. B. Pulver und Tablette. Wenn bewiesen wurde, da13 reale Proben und Standards sich buuglich der Linearitiit identisch verhalten, so konnen in der Routine selbstverstandlich als Kontrollproben reine Standards verwendet werden. Es liegt auf der Hand, daR zur Herstellung von Kontrollproben und Standardlosungen unterschiedliche Hersteller oder zumindestens unterschiedliche Chargen notwendig sind, um eventuelle systematische Fehler feststellen zu konnen.

3.7 Lineaririit

0

03

1

2

03

25 + x

Proportionalitat

0

135

1

Linearitat, aber keine Proportionalitat

2

25 + x

Abb. 3-29 Dcr Unterschicd zwischen Proportionalitat und Linearitat.

Bemerkung : Der Begriff ,,Linearitat" wird in vielen Standardwerken definiert, so z. B. im ICH QADokument: ,,The linearity of an analytical procedure is its ability (within a given range) to obtain test results which are directly proportional to the concentration (amount) of analyte in the sample". Diese Definition ist nicht korrekt, die Beschreibung trifft exakt auf die Proportionalitat zu, zur Erlauterung s. Abb. 3-29. Der Unterschied zwischen Linearitat und Proportionalitat bedeutet fur die Praxis folgendes: Im Falle von Proportionalitat kommt man mit einer Einpunkt-Kalibrierung aus (ein Punkt der Geraden ist stets der 0-Punkt) wahrend man bei Linearitat mindestens eine Zweipunkt-Kalibrierung benotigt. Trotz dieses Unterschieds wird, entsprechend des allgemeinen Sprachgebrauchs, in diesem Buch weiterhin die Rede yon der ,,Linearitat" sein, auch wenn die Abhangigkeit zwischen Konzentration und Signal proportional sein sollte.

Wir schlieben die Diskussion zur Normenklatur mit der Bemerkung ab, daO eine Unterscheidung oft nicht gemacht wird, und dal3 die Begriffe Kalibrierung, Kalibrierfunktion, Linearitiit, Regressionsmodell synonym benutzt werden. Es sol1 nur darauf geachtet werden, da13 unter einem Begriff das Gleiche verstanden wird.

3.7.2 Durchfiihrung der Linearitatstests 3.7.2.1 Grundsiitzliches

Die Angaben in der Literatur iiber die Anzahl der unbedingt notwendigen MeBpunkte (Konzentrationen) sowie den abzudeckenden Konzentrationsbereich variieren stark. Es werden zwischen drei und zehn K~n=entrationsni\'Yuiis empfohlen. Wird eine lineare Abhiingigkeit angenommen, so werden die Messungen oft bei drei Konzentrationen durchgefuhrt. Die Zahl funf stellt die Mindestanzahl dar. um eine Krummung feststellen zu konnen, das ist ein ublicher Wert im Pharmabereich (ICH-Richtlinien). Die Zahl sechs ist die am haufigsten Angetroffene. SchlieRlich empfiehlt die DIN 38402, Teil 5 I zehn Werte. Die empfohlene Anvrhl der Messurzgen pro Kon:entrtrrion variiert in der Literatur meist zwischen zwei (Doppebestimmung) und sechs, selten wird sogar von zehn Messungen berichtet. Es liegt auf der Hand, dal!, eine Mehrfachbestirnmung die Sicherheit der Messung erhoht. Wird nun der Aufwand mit rnehr als drei Messungen betrieben, so sollten unabhangig hergestellte Kahbrierhsungen verwendet werden. In diesem Fall kann in einem Arbeitsschritt auch die Methodenpriizision fur die jeweilige Konzentration bestimmt werden. Hernerkirng: Doppel- oder Dreifachbestimmungen stellen nicht immer stochastisch unabhSngige Messungen dar. Die Werte sollten gemittelt werden und die dann erhaltenen jeweiligen Mittelwerte der einzelnen Konzentrationen sollten zur Berechnung herangezogen werden. Bei einer linearen Gleichung y =(I + bx ist y die Variable und x die konstante GrGBe. Man mu13 dafur sorgen, daB diese prinzipielle Forderung erfullt wird. Das heiBt nichts anderes, als daB groBte Sorgfalt der Bestimmung von x gelten soll. Die verwendeten Referenzsubstanzen mussen sehr gut charakterisiert sein, weiterhin mu13 peinlichst darauf geachtet werden, dal!, durch entsprechend ausreichend eingewogener Menge Wiegefehler vermieden werden. Noch ein kritischer Punkt: Die Konzentration von Losungen mit Referenzsubstanzen muB konstant bleiben, was bedeutet, daR man das Verdampfen von Liisungsmitteln bei haufiger Entnahme .,im Auge" behalten soll. Hier kann sich die Dichte Sndern und es schleicht sich ein proportional-systematischer Fehler ein. Weitere Bedingung ist, dal3 die Fehler von y unabhiingig von der Konzentration .r sind. Die Realitiit ist hiiutig anders. Wenn bei einer Messung manch relativer Fehler konstant bleibt, nimmt der absolute Fehler bei hoheren Analytkonzentrationen zu. Als Konzentrationsbereich fur den Linearitatstest werden folgende Angaben am hiiufigsten (Pharmaindustrie) genannt:

3.7 Linearittit

137

Gehalt, Wirkstoff 80 % bis 120 %, z. B. Spezifikation der Komponente liegt bei min. 18 %, max. 22 %. Die Linearitat sollte zwischen 14,4 % und 26,4 % gepriift werden. Gleichformigkeit (content uniformity): Von 50 % bis 70 % als Untergrenze und von 130 % bis 150 % als Obergrenze. Die haufigsten Angaben in der Literatur bewegen sich zwischen 70 % bis 130 %. Gehalt, Freisetzung: +20 9% der Spezifikationsgrenze (deklarierte Dosierung). Bei retardierter Wirkstofffreigabe wird der Bereich auf 110 % erweitert. Verunreinigungen (Reinheit): Von der Bestimmungsgrenze bis 120 % der Spezifikation, z. B. die Spezifikation einer Nebenkomponente betrlgt max. 0,l %, die Bestimmungsgrenze mu6 dann 0,03 % betragen. Die Linearitat sollte hier zwischen 0,03 % und 0,12 % gepruft werden. Der Arbeitsbereich der Kalibriergeraden sollte so gelegt werden, daf3 sich die zu erwartende Konzentration der Probe in der Mitte der Kalibriergerade befindet. Die Herstellung von Losungen erfolgt auf unterschiedliche Weise: Unabhiingige Einwaagen von synthetischen Mischungen bzw. Referenzsubstanzen. Diese Praxis ist aus analytischer Sicht die beste, allerdings auch die Aufwendigste. - Verdunnungen aus einer Stammlosung rnit oder ohne Placebo (Merke: Bei einer Verdiinnungsreihe des Analyten wird nur die Linearitat des Analysengerateslder Apparatur gepruft). Diese leider haufig angetroffene Vorgehensweise ist nicht sinnvoll, da ein eventeull gemachter systematischer Fehler sich fortpflanzt. - Unterschiedliche Volumina aus einer Stammlosung rnit oder ohne Placebo: Das bedeutet, es werden aus einer Stammlosung parallele Losungen abgewogen bzw. abgefullt. Dieser Usus ist ein vernunftiger Kompromiss zwischen den zwei erstgenannten Praxen. Definierte Aufstockungen: Das ist ebenfalls eine ubliche, gute Praxis. - Oft sind Vemnreinigungen als Standard nicht vorhanden oder einfach nicht bekannt. Fur diesen Fall kann wie folgt verfahren werden: Die Linearitat wird rnit Verdunnungen der Hauptkomponente gepruft z. B. 0,l %-0,5 %. Abhangig vom speziellen Fall wird mit dem gleichen oder korrigierten Responsefaktor gerechnet. Obwohl in diesem Fall eine einzige Komponente zur Prufung der Linearitat verwendet wird, empfiehlt sich dringend fur die zwei Konzentrationsniveaus (Gehalt und Spurenbereich) zwei Regressionsmodelle zu ermitteln bzw. die Varianzenhomogenitat zu priifen, siehe weiter unten. -

Die Linearitat von Verunreinigungen kann in der Chromatographie auch indirekt uber die Flachenprozente uberpruft werden: Es herrscht fur die Vemnreinigungen Linearitat vor, wenn das Ergebnis unabhangig vom Injektionsvolumen ist. Die Flachenprozente bleiben konstant, solange die Konzentration der unbekannten Verunreinigung sich linear verhalt. Als Kriterium gilt folgendes: Die Standardabweichung der Ergebnisse rnit unterschiedlichen Injektionsvolumina unterscheidet sich von der Standardabweichung bei Wiederholmessungen nicht signifikant. Dazu sollte ein F-Test durchgefuhrt werden. Wenn bei der Validierung auch die Nachweis- und Bestimmungsgrenze bestimmt werden soll, so empfiehlt es sich, die Konzentrationsreihe aus unterschiedfichen Einwaagen

und nicht aus einer Stammliisung anzusetzen, um Linearitiit, Nachweis- und Bestimmungsgrenze in einem Arbeitsschritt zu priifen.

3.7.2.2 Priifung auf Linearitat Dam gibt es folgende Moglichkeiten: -

Visueller Linearitatsteat Eine grobe Abweichung von der Linearitat wird leicht erkannt. Es wird gepriift werden, welches mathematische Modell den ermittelten Zusammenhang der Wertepaare KonzentratiotdSignaI am besten beschreibt. Zunzchst werden die lineare Kalibrierfunktion und die Kalibrierfunktion zweiten Grades

sowie die jeweiligen Reststandardabweichungen berechnet. Wie wird nun vom Rechner die beste Gerade/Kurve gefunden? Es wird zunlchst eine Vielzahl von Geraden/Kurven durch alle gemessene Punkte gelegt. AnschlieBend werden die ,,Reste" oder Residuen addiert. ,,Reste" oder Residuen ist derjeweilige vertikale Abstand eines gemessenen Punktes von der errechneten Gerade bzw. Kurve. Die Gerade bzw. Kurve mit der kleinsten Summe wird als die beste ( B P s t g r t - a h , Bestkurve) auserkoren. oder .,Reststreuung"? Und was bedeutet ,Rrststandur~lahwei~hiin~" Das ist nichts anderes als die Standardabweichung, errechnet aus den Zahlenwerten dieser Reste. Die Reststandardabweichung ist somit ein Ma8 fur die Streuung der MeUwerte um die Regressionsgerade bzw. um die Kurve bei Funktionen zweiten Grades. Sie wird, wie wir gesehen haben, aus der Standardabweichung der Differenzen von den MeBwerten und den dazugehorigen Werten der errechneten Kalibriergerade bzw. -kurve ermittelt. Der allgemeine lineare Zusammenhang

lautet fur die Chromatographie: Peaktlache = (I . Konzentration (oder Menge) + h Wenn a eine Konstante i\t und h = 0. ist die Peakflache proportional der Konrentration oder der Menge. Es folgt n u n ein Vergleich der Reststandardabweichung, der linearen und der quadratischen Kalibrierfunktion.

3.7 Lineciririit

139

a) vereinfachte, qualitative Aussage: 1st die Reststandardabweichung der vom Rechner errechneten Funktion I . Grades kleiner oder gleich der Reststandardabweichung der Funktion 2. Grades, so ist die Kalibrierfunktion im untersuchten Arbeitsbereich linear. b) Rechnerische Uberprufung: (DIN 38402, Teil 5 1, Anpassungstest nach Mundel) - Aus den zwei Reststandardabweichungen wird die Differenz der Abweichungrvarianzen DS berechnet.

mit:

DS2 sy, sy2 N

Differenz der Abweichungsvarianzen Reststandardabweichung der linearen Funktion Reststandardabweichung der quadratischen Funktion Anzahl der Messungen, d. h. Anzahl der Konzentrationen, bei Doppel- oder Dreifachbestimmung Anzahl der Mittelwerte.

AnschlieBend wird der Priifwert, PW, berechnet PW=-

DS2 SY:

und dieser rnit dem Tabellenwert aus der F-Tabelle (Freiheitsgrad,f, = 1, f 2 = N - 3, P = 99 %) verglichen. Wenn PW 5 F, ist die Kalibrierfunktion linear, bei PW > F i s t die Kalibrierfunktion in diesem Arbeitsbereich nicht linear. Hier handelt es sich also um einen modifizierten F-Test (bei der Ermittlung der PriifgroBe werden die unterschiedlichen Freiheitsgrade zwischen Gerade und Kurve - 2 und 3 - beriicksichtigt), der von Mandel in den 30er Jahren fur die Entscheidung ,,linear/quadratisch" vorgeschlagen wurde. - Der KorrelutinnskoefSizient rnit dem groBten Wert entspricht dem Modell rnit der

besseren An passung. z. B. lautet ein errechneter Korrelationskoeffizient r = 0,99983 bei der Funktion 2. Grades und r = 0,99964 bei der Funktion 1. Grades. So wird die Abhangigkeit Signal/Konzentration im untersuchten Arbeitsbereich rnit einer Funktion 2. Grades besser beschrieben. Zu den Entscheidungskriterien fur Linearitat siehe auch Abschnitt 3.7.2.3. -

Schatzverfahren (Dr. Noack, BAM, Berlin) Um den Linearitatsbereich zu ermitteln, sind eine Blank-L6sung (MeBwert Rmin), eine Losung mit der angenommenen oberen Konzentration des Arbeitsbereichs (MeBwert: R,,,) sowie eine Losung rnit halber Maximalkonzentration (MeBwert: R0.5max) je zehn ma1 zu messen.

Es 1st dann jeweils der MeRwert fur die halbe Maximalkonzentration zu schatzen

als Mittelwert aus Rmi, und R,,,,, max

(geschltzt) = 0.5 x (R,,,,, + R,,,,,)

AnschlieRend ist jeweils (i= 1 his 10)die Differenz Dj zwischen (geschltzt) zu ermitteln:

und Ro,~,,,,,

1st die Differenz etwa in 50 % der Falle positiv bzw. negativ, dann kann eine Linearitlt angenommen werden. Sind die Differenzen dagegen in neun oder gar allen zehn Flllen nur positiv bzw. nur negativ, dann liegt ein nicht linearer Zusainmenhang zwischen Signal und Konzentration vor. -

Residualanalyse Residuen sind die vertikalen Abstande der Meljwerte von der Regressionskurve. Zur graphischen Darstellung sollte zweckmarjigerweise als x-Achse der in Frage kommende Arbeitsbereich, als Abschnitt auf der y-Achse die positiv- bzw. die negativ-groRte Abweichung verwendet werden. 1st das gewlhlte mathematische Modell richtig. so sind die Residuen um das Nullniveau normalverteilt. In Abb. 3-30 [32] sind mehrere mogliche Fllle gezeigt, die auftreten konnen.

Abb. 3-30 Graphischc Darstellung von Residuen in Ahhangigkcit von den KonLentrationcn .x. a ) idealcr Verlaul. d. h. richtiger Modcllansat/. h) lincarcr Trend. evtl. ialscher Ansatz odcr Rechenichler c ) anstcigende Varianzcn. d. h. Varianzcninhomogenilat d ) nicht-lincarer Vcrlaui, dn falschc Regressionsfunkrion gewiihlt

3.7 Linearittit

3

3.2

3,4

3,6

3,8

14 I

4,2

4

+ x

Abb. 3.31 Kalibrierung init konzentrationsabhangiger Steigung.

Abb. 3-32 Residuenplot der Kalibrierung aus Abb. 3-30.

Durch die Residualanalyse werden Trends leicht und sicher erkannt, s. Abb. 3-3 1 und 3-32. Die Abhangigkeit Signal-Konzentration in Abb. 3-3 1 ist nicht linear. Dies IaRt sich einfach beweisen, in dem die Steigung zwischen den MeBpunkten berechnet und anschliefiend gepruft wird, ob sie konstant bleibt: x ( i + I)-x(i)

y(i+ i)-y(i)

0,439

0,25

0,027

0,108

0,461

0,25

0,028

0,112

X

.v

3

0,4 12

3.25

33

AyIAx

3,15

0,498

0,25

0,03 1

0,124

4

0,530

0,25

0,032

0, I28

Ein Trend ist bei der Steigung eindeutig zu erkennen. Bereits bei kleinen Konzentrationsbereichen wird dies festgestellt. Einfacher werden derartige Trends mit Hilfe eines Residuenplots, s. Abb. 3-32 erkannt. Ublicherweise wird bei einer nicht-linearen Funktion der Arbeitsbereich eingeengt oder es werden die experimentellen Bedingungen geiindert (s. Beispiel in Abschnitt 3.7.2.4) oder man verwendet mehr Punkte (Konzentrationen) zur Errechnung des mathematischen Modells mit der Hoffnung, jetzt doch eine akzeptable Linearitat zu erhalten. Dieser Aufwand ist nach Ansicht des Autors nicht immer gerechtfertigt. KonzentrationSignal-Zusammenhlnge wie in Abb. 3-33 dargestellt, sind durchaus fur eine quantitative

? ' 9

T a 7

6 5 4 3 2 1

0 1

2

3

4

5

6

7

8

9

1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5

+ .r

Abb. 3-33 Nicht lineare ahcr komtante, inathcniatisch heschrcibbarc Korrclation /wisehen Signal und Konzentration.

Gehaltsbestimmung geeignet. Als Vorauscetzung gilt lediglich das Vorhandensein einer robusten Methode und das Herrschen von konstanten experimentellen Bedingungen - eine Forderung. die eigentlich immer gelten sollte! 1st diese Forderung erfullt, besteht eine konstante - wie auch immer geartete - Korrelation zwischen Konzentration und Signal. Diese Meinung wird auch von anderen Autoren geteilt. So William Horwitz: ,.Linearity is not an absolute requirement for a calibration curve. As long as the response-concentration relationship is repeatable, satisfactory concentration estimates are possible." Aus den .r-y-Wertepaaren kiinnen eine Reihe kommerzieller Programme den mathematischen Zusammenhang zwischen x und y errechnen. So wurde von EXCEL fur die Werte im besprochenen Beispiel folgender Zusammenhang ermittelt:

Man erhiilt beispielsweise fur die bekannte Konzentration x = 1.3 einen graphisch interpolierten Wert fur J von ca. 5,13. s. Abb. 3-33, und einen nach der Formel errechneten von 5.1553. Folgende Vorgehensweise kann man sich fur die Praxis vorstellen: 1. Die .r-y-Werte werden aufgetragen, es entsteht ein Graph. 2. Mit Hilfe von ublichen Softwareprogrammen wird aus den experimentell ermittelten Daten der mathematische Zusammenhang ermittelt. 3. Fur drei Konzentrationsniveaus (,,Unten", ,,Mitte", ,,Oben") werden nun die drei Werte zuin Einen graphisch ermittelt und zum Anderen nach der ermittelten Formel berechnet. 4. Nach vorher definierten Kriterien (z. B . hochste Differenz 5 5%) wird eine mogliche Differenz zwischen den zwei Befunden akzeptiert oder nicht. Im ersten Fall wiire die

3.7 Linetrrifiit

143

Kalibrierung beendet, im zweiten Fall wird der ubliche, oben beschriebene Weg eingeschlagen: Lineare Regression, quadratische Regression, Mandeltest usw.

3.7.2.3 Beurteilung der Ergebnisse Es folgen einige Hinweise fur die praktische Durchfuhrung und Beurteilung der Ergebnisse. Es sollte vor einer Kalibrierung ein Test auf Normalverteilung z. B. nach David, siehe Abschnitt 3.3, durchgefuhrt werden. 1st die Bedingung einer Normalverteilung nicht erfullt, so nimmt die Aussagekraft im Hinblick auf die Analysenergebnisse ab [5 I]. Aus Abb. 3-34 kann entnommen werden, daB moglicherweise im unteren und im oberen Konzentrationsbereich keine Normalverteilung herrscht. Die Ermittlung der MeBwerte ist mit Fehlern behaftet. Der Gesamtfehler setzt sich zusammen aus der Prazision der Messung (MaB: Reststandardabweichung der Kalibriergeraden) und der Summe der Fehler, die mit der Kalibrierung zusammenhiingen. Dazu gehoren die Anzahl der Kalibrierlosungen. die Anzahl der Wiederholmessungen, die Steigung und damit die Art der Probe und das Detektionsprinzip. Nach dem Fehlerfortpflanzungsgesetz folgt, dal3 die ,,wahre" Kalibriergerade zwischen zwei Hyperbelasten (Prognose- oder Vertrauensbander) liegt. Das bedeutet, daB fur einen vorgegebenen Wert x sich

A

f

y2.........................................................................................

a k -

X

PrognoseInterval1

Abb. 3-34 Kalibriergerade und Prognoseintervall. Normalverteilung herrscht nicht zwangslrulig im gesamten Arbeitsbereich!

t,

rwei zugehorige y-Werte ergeben, und t2 in der Abb. 3-34. Der Abstand der Lwei yWerte wird nach folgender Gleichung von passenden Softwareprogrammen wie folgt berechnet.

mit:

(I

h ,sy N N

s .t-

Steigung der Geraden Ordinatenabschnitt Reststandardabweichung Anzahl der KalibrierlZisungen (Anzahl der Konzentrationsniveaus) Anzahl der Wiederholmessungen pro Kalibrierliisung (Einfach-, Doppel-und Dreifachbestimmung) Konzentration der Kalibrierliisung Mitte des Arbeitsbereichs

Q,, Quadratsumme x, Q,, =

c1.2

-

(c -TI )I

~

N

Uingekehrt heiRt es, dal3 fiir ein bestimmtes Signal der tatsiichliche Analytwert x in einem bestimmten Bereich anzutreffen ist. Dieser Bereich ergibt sich durch den Schnittpunkt der Horizontalen des -Wertes mit dem oberen und unteren Hyperbelast um die Kalibriergerade und heiRt Vertrauensbereich oder Konfidenz- oder Prognoseintervall. Er kann durch Umstellung der oben angegebenen Gleichung ermittelt werden.

mit:

<*

y

Signalwert der Probe Mitte des Signalbereiches

Wann ist n u n das Prognoseintervall klein? Das ist der Fall. wenn vor allern die Messung priizise (kleiner Wert der Standardabweichung s") und die Methode empfindlich ist (groRer Wert fiir die Steigung u siehe obige Formel): SchlieOlich kann man selbst den Bereich mitbestimmen, in dem inan ,.streng" (kleiner t-Wert, P = 95 %) oder ,,grolMigig" ist (groRer r-Wert. P = 99 %). Weniger ausgepriigt ist der Einiluss einer steigenden Anzahl von Kalibrierliisungen ( N ) und an Wiederholungsbestimmungen. Gunstig wirkt sich ein in der Mitte liegender Signalwert aus. Bei den Extremen (sehr verdunnte/sehr konzentrierte Losungen) ist der Prognoseintervall 7 - y groli. In einem Beispiel (Abschnitt 3.7.2.6) werden wir den Eintlul3 von N und N aufdas Ergebnis mit Zahlen belegen. Sol1 n u n - anders als bei Gehaltsbestimmungen - ein grol3er Konzentrationsbereich abgedeckt werden, s o ist mit Hilfe des F-Tests die Varianzenhomogenitiit zu uberprufen. 1st sie nicht gegeben - da die Streuung der Werte bei Lwei Konzentrationen signifikant unter-

3.7 Linrciritiit

145

schiedlich ist - so sollte der Konzentrationsbereich eingeengt werden oder es ist mit einer gewichteten Regression zu arbeiten, s. Abschnitt 3.7.2.8. Hier sol1 auf ein Dilemma hingewiesen werden: Mit mehr Punkten in der Mitte der Geraden haben wir dort ein sehr enges Prognoseintervall - die Uberprufung der Linearitat jedoch uber einen groBen Konzentrationsbereich ist ungenau. Bei gleicher Verteilung der Punkte uber den ganzen Konzentrationsbereich wird die Linearitst wahrhaftiger gepruft (Varianzenhomogenitat vorausgesetzt), aber das Prognoseintervall ist breit. Folgende Punkte sollten bei der Ermittlung der Linearitat bedacht werden:

- Die gewiihlten MeBwerte sollten iiquidisfuantsein z. B. 5 ppm, 10 ppm, I5 ppm, 20 ppm, -

-

25 ppm, 30 ppm und nicht etwa 1,2, 10,50, 100, 1000. Beim Vergleich von Ergebnissen sollte immer geklart werden ob bei den Messungen die Menge bei konstantem Volumen der Losung erhoht wurde, oder ob 2. B. die doppelte Menge durch doppeltes Volumen einer Stammlosung vermessen wurde? Ein Vergleich von Ergebnissen ist nur moglich, wenn die Anzahl der Punkte, die Anzahl der Bestimmungen pro Konzentration und die Verteilung uber einen bestimmten Konzentrationsbereich identisch sind. Sonst kann es leicht passieren, daB fur eine Methode unterschiedliche Resultate erhalten werden, siehe Abb. 3-35a und b.

2oooooo

r

2000000

20 1500000 :m Y G

2

n

1000000 500000

I

n

Abb. 3-35a und b Unterschiedliche Empfindlichkeit und Aufircten eines Matrixell’ckies bei cin und dcrselben Mcthode, wenn die Anzahl der Punkte und dcren Vcrteilung sich andert.

Eine hohe Priizision der MeBwerte fuhrt leicht zur Errechnung einer Kalibrierfunktion zweiten Grades. Das heist: je groOer die Streuung der MeBwerte ist, um so groBer die Wahrscheinlichkeit fur ein lineares Regressionsmodell. ... Umgekehrt gilt die Aussage: je prlziser die Methode, um so geringer die Standardabweichung bei Mehrfachbestimmungen und um so kleiner der lineare Arbeitsbereich. Die Linearitat ist abhiingig von der Robustheit der Methode. So kann beispielsweise ein nicht konstanter pH-Wert im Eluent nicht nur die Priizision sondern auch die Linearitat und die Empfindlichkeit einer HPLC-Methode beeintlussen. Die Uberpriifung auf AusreiBer nach der Erstellung der Kalibriergeraden kann wie folgt erfolgen: Es wird das Prognoseintervall ohne Beriicksichtigung des ausreiaerverdlchtigen Wertes berechnet. Befindet sich nun dieser Wert innerhalb des Prognoseintervalls, so handelt es sich um keinen AusreiRer (AusreiBertest nach Huber). Es sollen nur gemessene und nicht extrapolierte Werte in die Berechnung aufgenommen werden. So ist beispielsweise der tatsiichlich gemessene kleinste Wert die Bestimniungsgrenze, oder aber der Nullwert (Konzentration 0). Wenn Nullwerte (Konzentration 0, MeBwert 0) berucksichtigt werden, so fuhrt dies zu Krummung der Kalibrierfunktion im unteren Konzentrationsbereich [34]. Ein positiver Blindwerj (existierender MeBwert bei Konzentration 0) ist ein Hinweis fur einen konstanten systematischen Fehler. Handelt es sich um keinen Matrixeffekt und kiinnen weiterhin Pipetierfehler ausgeschlossen werden. so bedeutet dies z. B. in der Chromatographie, daR der betrachtete Peak nicht homogen ist. In diesem Fall mu8 die Selektivitiit verbessert werden. Ein tiepriver Blitidvvert gibt zuniichst keinen physikalischen Sinn. Wenn ein MeBfehler, z. B. durch Justieren und erneute Kalibration, ausgeschlossen werden kann, so kann es sich bei der Flussigchromatographie uni eine unkontrollierte Adsorption groBerer Molekule an sogenannten ,,hungrigen Oberfliichen" handeln, siehe Abb. 3-36. Ein typisches Beispiel ist die Adsorption von Proteinen an Dichtungen. Stahl- und Glasoberfllchen. Dieses Phiinomen ist auBer von der Temperatur, Losungsmittel. Beschaf-

Abb. 3-36 ..Vcrlust" cincr Kornponente liihrt hci Extrapolation der Gcraden zu ncgarjvcn Signalwcrten, Erliiuterung siche Text.

3.7 Lineuritiit

147

fenheit der betreffenden Oberflachen usw. auch von der Konzentration und der Matrix abhiingig. Negative Blindwerte werden auch bei Zweistrahlgeraten in der UV-Spektrometrie bei nicht vollkommen identischer Beschaffenheit der zwei Kuwetten beobachtet. - Eine Einpunkt-Kalibrierung ist erlaubt, wenn Linearitat gegeben und der Achsenabschnitt a = 0 ist (also Proportionalitat herrscht!). Als vereinfachtes Entscheidungskriterium, ob der ermittelte y-Achsenabschnitt signifikant von Null verschieden ist, gilt wenn der y-Achsenabschnitt groBer als die dreifache Standardabweichung des Blindwertes (6-fach-Bestimmung bei Konzentration 0) ist. Urn bei einer Einpunktkalibrierung proportionale Fehler zu vermeiden, sollte die Konzentration der Kalibrierlosung rnoglichst nahe der Konzentration der Probelosung liegen. So mussen beispielsweise bei quantitativen DC-Bestimmungen mit einem Densitometer die Flecken der Kalibrier- und Probelosung annahernd gleichen Mengen entsprechen. 3.7.2.4 Welche Methodenkenndatenlhformationen konnen aus einer linearen Kalibrierfunktion gewonnen werden? Der Arbeitsbereich ist der Konzentrationsbereich (untere - obere Grenze), fur den die ermittelte Kalibrierfunktion Gultigkeit besitzt. Die Steigung b ist ein Ma6 fur die Empfindlichkeit einer Methode. Je groBer die Steigung, um so empfindlicher ist die Methode, desto leichter konnen kleine Konzentrationsunterschiede noch registriert werden: Das bedeutet, daB eine geringe Konzentrations- bzw. Mengenanderung in den Proben zu einer moglichst groBen Anderung des MeBwertes (Signals) fuhrt. Diese Forderung ist wichtig fur den Spurenbereich. Fur die ,,normale" Routine allerdings stehen storungsfreie Messungen im Vordergrund. In diesem Fall wird man wohl zugunsten der Prazision auf moglichst groBe Empfindlichkeit verzichten. Schliefilich sei noch angemerkt, daR bei einer gekrummten Kalibrierfunktion die Empfindlichkeit eine Funktion der Konzentration ist. Ein Achsenubschnittu ungleich 0 bedeutet, daB bei einer Konzentration von 0 ein Signal gemessen wird, der Blindwert stellt einen konstanten, systematischen Fehler dar. Hier wird empfohlen, mit der errechneten Kalibrierfunktion inclusive Achsenabschnitt zu arbeiten. Man konnte zwar von allen MeRwerten den Blindwert abziehen - vorausgesetzt der Blindwert ist konstant - doch ist der erstgenannte Ansatz der sicherere. Der Korrelationskoefizient r geniefit als wichtiges Kriterium fur Linearitat eine hohe Akzeptanz. Doch sollte sein Informationswert etwas differenzierter betrachtet werden. Was bedeutet ein Korrelationskoeffizient von 0,999?

Beispiel Es wurden wassrige Losungen von Fluorescein in einem Fluorimeter vermessen und es ergaben sich folgende Intensitaten (s. Abb. 3-37 und Tab. 3- 13) [49].

I

0

I

2

I

4

I

I

6

8

I

I

1 0 1 2 Konzentration (pglmL)

Ahh. 3-37 Kalihrationsplott der Datcn aus Tah. 3-13.

Tab. 3-13 Linearititadaten hci dcr Bcstiminung von Fluorescein mit cinem Fluorirnctcr [4Y] McOdaten Konzcn-

tration

berechncte Datcn

Intensitat

IP&/111ll

.r

.T)?

?',- .?

(?., ~.i? (x, -.?)(XI

.v;

?i

0

2. I

-6

36

66.0

5.0

-4

I6

l,o -x, i

12 I .oo

2

65.6 I

32.4

4

9.0

-2

4

-4,l

I6,X 1

-0.5

0.25

.v,

-

(XI

~

-1

8.2 0

6

12.6

0

0

X

I7,3

2

4

I0

2 I .o

4

I6

7,9

62.4 I

3 I ,h

I2

24.7

6

36

I1,6

I34,Sh

6Y.6

42

17.64

x,4

-

?.I

3.7 Linetrritiit

149

Der Korrelationskoeffizient errechnet sich wie folgt:

i

r=

I

2 16,2

=

JiiGiiG

- 2 16,2 = 0,9980 -

216944

Obwohl einige Werte sich nicht auf der errechneten Gerade in Abb. 3.37 befinden, ist r ,,ziemlich gut". Das wird oft beobachtet. Eine Aussage wie ,,MethodeA hat einen grofieren Korrelationskoeffizienten als Methode B, sie ist deshalb besser" ist nicht a priori richtig. Betrachten wir dazu Abb. 3-38 [49].

I

5

I

I

I

I /

Y 4

3 2 1

0 5 4

3 2 1

0

1

2

3

4

5

Abb. 3-38 Linearitat einer ,,Gemden" rnit r = 0,986.

In Abb. 3-38 oben ist eindeutig ersichtlich, daR trotz einem r von 0,986 die Werte sich aufeiner Kurve betinden. Im unteren Bild haben wir eine sehr gute Korrelation zwischenx und j’- nur sie ist nicht linear. Ein hoher Absolutbetrag fur den Korrelationskoeftiizienten ist ein notwendiges, aber nicht hinreichendes MaR fur die Linearitat. Es mu6 weiterhin bekannt sein, wie der Rechner ab- und aufrundet. Im vorliegenden Beispiel wurde eine Nicht-Berucksichtigung der Zahlen hinter dem Komma eine glatte 1,000 liefern; wird dagegen eine Kommastelle beriicksichtigt ergibt sich ein Wert von r = 0,9991. Dazu noch folgende Bemerkung: Durch eine Quadrierung von r werden Unterschiede stiirker sichtbar. So ist in der Literatur vielfach vom Bestiriiriithrirsrnt~~~ r2 die Rede. Auch bei gleichem. groBen Wert von r wissen wir wenig uber die Qualitat zweier Methoden. Man muB noch einmal betonen: r ist ein MaR dafur, wie gut eine Korrelation zweier Werte durch eine mathematische Funktion zu beschreiben ist. Ein grofier Wert von r heiBt lediglich, daR groRe x-Werte zu groSen y-Werten und kleine x-Werte zu kleinen 1-Werten fuhren. Die Korrelation zwischen x und y ist rnit dirsrr mathematischen Funktion gut zu beschreiben. Und das ist wiederum nicht der Fall, wenn bei einer stetigen Zunahme von x die Zunahme von y ma1 stiirker. ma1 weniger stark ausfiillt. Das Ergebnis ware hier eine willkurliche, ,,chaotische“ Streuung der Punkte um eine Gerade oder eine Kurve. Folglich kann ein Korrelationskoeffizient von 0,999 selbstverstiindlich die Verhaltnisse sowohl bei einer Geraden als auch bei einer Kurve wiedergeben. In Abb. 3-39 haben wir zwei Methoden rnit identischem, hohen r-Wert. Die zwei Methoden konnen sicherlich nicht als gleichwertig bezeichnet werden. Es liegt auf der Hand, daR a und b (additiver und systematischer Fehler) mehr lnformationen liefern. Zusammenfassend gilt folgendes: Der Korrelationskoeftizient ist ein Ma8 fur den Grad der Anpassung eines mathematischen Modells an die experimentell ermittelten Werte, wlhrend die Gute einer Methode eher rnit der Emptindlichkeit (Steigung) zu beurteilen ist. Die Rest.strrtirl~irCiLIh).(.L’i~hiing ist die Streuung der MeRwerte um die Regressionsgerade, also ein Prii:isionsrn~~Jfur die Messung. Ein legales Mittel fur eine Verkleinerung der Reststandardabweichung ict die Erhohung der Messungen, es wird immer wieder von 10 MeRwerten pro Konzentration berichtet. Wird n u n die Reststandardabweichung auf die Mitte des Arbeitsbereichs normiert (dies geschieht durch Division rnit der Steigung), so kann die Ve~~~hrens,standrrrdclhwric~hung errechnet werden. Wir konnen zusammenfassend festhalten, daR eine Methode um so leistungsfiihiger ist, je griiRer die Steigung und je kleiner die Reststandardabweichung ist. Die Verfahrensstandardabweichung sxOist somit ein Ma13 fur die Leistungsfahigkeit einer Methode.

X

X

Ahh. 3-39 Zwci Kalibrationsplotts rnit idcntischcm Korrclationskoetli/ienten

s,

sY

=-

b

Wir haben bereits bei der Prazision gesehen (Abschnitt 3.3.4.2),daR die Normierung einer GroBe auf einen Wert die bessere Information liefert. So wurde dort durch Division der Standardabweichung durch den Mittelwert und Multiplikation mit 100 der Variationskoeffizient (relative Standardabweichung) erhalten. Genau das gleiche Prinzip wird auch hier angewandt: Wird die Verfahrensstandardabweichung durch die Konzentration in der Mitte des Konzentrationsbereichs dividiert und mit 100 multipliziert, erhalten wir auch hier eine NormierungsgroBe, den Vefahrenvariarionskoefizienten oder relative Vefahrerisstundurdubweichung

Vorausgesetzt, daB die MeBwerte sich auf gleiche Konzentrationen beziehen, erlaubt die relative Verfahrensstandardabweichungeinen Vergleich verschiedener Verfahren. Ein einfaches Beispiel sol1 demonstrieren, welche Anderungen in einer Methode welche KenngroBen, die im Rahmen der Kalibrierung erhalten werden, in welchen Ma8 beeinflussen, Tab. 3- 14. Es wurde eine lineare Regression mit 10 Probelosungen durchgefuhrt, die Originalwerte sind in der ersten Reihe der Tab. 3-14 zu sehen [50]. Bei einer neuen Probe wird ein Matrixeffekt beobachtet (Werte der 2. Reihe). Es verandert sich der Ordinatenabschnitt, sodass sich eine parallele Verschiebung gegenuber der Originalgeraden ergibt. Die restlichen Werte bleiben konstant. Beim Vermessen einer weiteren Probe mit dem gleichen Analyten aber einer anderen Matrix wird eine proportional systematische Abweichung der Signalwerte beobachtet, die die Steigung verandert (Werte der 3. Reihe). W a r e n d die Werte fur den Ordinatenabschnitt a, den Korrelationskoeffizienten r und das BestimmtheitsmaR r2 sich nur wenig verandern wird eine merkliche Anderung der relativen Verfahrensstandardabweichung vk, beobachtet. Im einem dritten Experiment wurde ein AusreiBer provoziert, s. Werte der 4. Reihe. Durch dieses ,,MiBgeschick" andert sich die Steigung und die relative Verfahrensstandardabweichung stark, die Werte fur den

Tab. 3-14 Eintluli ctwaiger Verandcrungcn auf die Kenndaten eincr linearcn Rcgression.

Wert

Steigung b Ordinatenabschnitta Korrelationskoeffizientr BestirnmtheitsmaR r' relative Verfahrensstandardahweichung

I . Reihe:

2. Reihc:

3. Reihc:

4. Rcihe:

Original

ti-Wert verandert

Steigung verandert

AusreiUer

0,994

0,994

3,004

3,O I 0

0,0333

2,033

-0,020

0,9994

0,9994

0,9988 2,216 5%

0,166

0,9999

0,997 1

0,9988

0,9998

0,9942

2,216 %

0,740 %

4,517 lo

Ordinatenabschnitt, den Korrelationskoeffizienten und das Bestimmtheitsmalj dagegen nur wenig.

Ftrzit: Der Korrelationskoeffizient eignet sich als lndikator fur proportional systematische Fehler und fur AusreiBer nicht, er reagiert sehr &age". Es sei hier folgende platte Ausdrucksweise erlaubt: Man kann mit der Methode machen, was man will, der Korrelationskoeffizient liefert mindestens zwei ,,9" nach dem Komma, nicht einmal das BestimmtheitsmaB ist zu bewegen. Anders formuliert: Ein stets ,,guter" Korrelationskoeffizient tauscht eine robuste Methode vor. Das ,,ehrlichste" und aussagekriiftigste Kriterium fur derartige Veriinderungen ist die relative Verfahrensstandardabweichung. Der Verfahrensvariationskoeffizient ist schlieljlich ein geeignetes Beurteilungskriterium fur die Robustheit aller kalibrierbedurftigen Analyseverfahren in der Routine. Bleibt er konstant, ist die Methode fur den betrachteten Zeitraum robust. Nachfolgend wird von Dr. Joachim Kleiner und Dr. Ulrich Lernhardt (Bodenseewerk Perkin-Elmer, Uberlingen) diese Moglichkeit ausfuhrlich dargestellt. Fur den eiligen Leser ist ein Resume vorgeschaltet, anschlieBend wird ein mathematischer Ansatz fur die Tageskalibrierung entwickelt. Bei der Validierung eines Analysenverfahrens wird zur Absicherung der niedrigsten Konzentration im Arbeitsbereich die Bestimmungsgrenze herangezogen. Diese KenngroBe wird aus dem Vertrauensbereich der Kalibriergeraden gewonnen 1521. Die Absicherung der Bestimmungsgrenze erfordert in der Regel eine dynamische Anpassung des Arbeitsbereichs. In der Routineanalytik istjedoch ein schneller Vergleich von 1st-Kalibrierung und Qualitiitsziel wiinschenswert. In den AQS Merkblattern zu den Rahmenempfehlungen der Landerarbeitsgemeinschaft Wasser (LAWA) fur die Qualitiitssicherung bei Wasser-, Abwasser und Schlammuntersuchungen wird fur kalibrierbeduftige Analysenverfahren, speziell in der Atomspektrometrie, zur internen Qualitatskontrolle die relative Verfahrensstandardabweichung als Beurteilungskriterium herangezogen. Um ein Analysenverfahren zu beherrschen, wird auf der Grundlage empirischer Untersuchungen gefordert, daB diese KenngroRe kleiner 3 3 3 r/C sein mul3: Damit gilt die Bestimmungsgrenze als abgesichert [ 5 3 ] . Nachdem seit 1994 die Begriffe Nachweis- und Bestimmungsgrenze fur die cheinische Analytik in der DIN 32 645 unterschiedlich zur bisherigen Festlegung geregelt wird [54), wird dieses Kriterium unter den neuen Begriffen betrachtet. Das empirische Qualitatsziel fur die relative Verfahrensstandardabweichung [ 5 5 ] wird aus dem theoretischen Ansatz abgeleitet, daB am untersten Kalibrierpunkt die maximale Ergebnisunsicherheit (in Konzentrationseinheiten) hochstens gleich dieser Konzentration selbst sein dad. Hierzu werden die Begriffe und Formalismen der DIN 32 645 benutzt. Weiterhin erfolgt eine Verallgemeinerung des Qualitiitsziels auf unbeschrankte Arbeitsbereiche sowie auf eine variable Anzahl von eingesetzten Kalibrierstandards. Da der Wert der Verfahrensstandardabweichung eine einfach zu berechnende GroBe ist, eignet sich diese Kenngriilje zur Qualitiitskontrolle bei Routineanalysenverfahren. Der ige Wert der relativen Verfahrensstandardabweichung fur beliebige Arbeitsbereiche kann aus einer hyperbolisch gekrummten Fllche ermittelt werden. Im gebrauchlichen Spezialfall - I0 Kalibrierpunkte aquidistant uber eine Konzentrationsdekade verteilt - ergibt sich das bereits in 1531 empirisch ermittelte Qualitiitsziel (3,4 56).Die Verfahrens-

3.7 Linearitiir

153

standardabweichung in der relativen Darstellung enveist sich damit als einfaches Qualitatskriterium zur Beurteilung der Tageskalibrierung. Fur die Beurteilung der Tageskalibrierung bezuglich der Kalibrierprazision bedarf es einer KenngroBe, die einfach zu berechnen ist und deren Beurteilung einer allgemein gultigen Theorie genugt. Die relative Verfahrensstandardabweichung scheint hierzu geeignet, da die Reststandardabweichung ein Malj fur die Kalibrierprazision darstellt. Das Bestreben, fur die relative VerfahrensstandardabweichungWerte kleiner 3,33 % zu erreichen, setzt voraus, daB die Kalibrierung in einem sehr restriktiven Rahmen angelegt wird. Die Gultigkeit dieses Qualitatszieles ist nur dann gewahrleistet, wenn der Arbeitsbereich mit einer 10-Punktkalibrierung genau eine Konzentrationsdekade erfaBt. Somit ist obiges Qualitatsziel im Allgemeinen nicht auf Verfahren ubertragbar, die einen groBeren oder kleineren Arbeitsbereich als eine Konzentrationsdekade besitzen oder eine Anzahl von Kalibrierstandards ungleich 10 verwenden. Genau dies zeichnet in der Regel Routineanalysenverfahren aus.

Theoretischer Ansatz Fur die Wahl des Arbeitsbereichs ist bei niedrigen Konzentrationen die quantitative Bestimmbarkeit der untersten Kalibrierkonzentration eine unabdingbare Forderung. Nach DIN 32 645 wird der Wert der Bestimmungsgrenze durch den Vertrauensbereich der Kalibriergeraden und der Festlegung einer zu akzeptierenden relativen Ergebnisunsicherheit an der Bestimmungsgrenze (z. B. 33 %) festgelegt. Als Randbedingung fur die Wahl der relativen Ergebnisunsicherheit wird vorausgesetzt, daB die sich ergebende Bestimmungsgrenze im quantitativ erfaBbaren Konzentrationsbereich liegen mu& Quantitativ erfaBbar sind Konzentrationen ab der Erfassungsgrenze, die formell mit der Nachweisgrenze der fruheren Definition z. B. [54] ubereinstimmt. Damit ergibt sich die Forderung, daB die unterste Kalibrierkonzentration groBer als die Konzentration an der Erfassungsgrenze sein muR. Fur den Routineeinsatz eines Analysenverfahrens stellt sich das Problem jedoch nicht aus dieser Sicht, denn der Arbeitsbereich wird unter Umstanden durch andere Erfordernisse wie z. B. durch die zu vermessenden Proben bestimmt. Die Anzahl der zu verwendenden Kalibrierstandards fur die Routinekalibrierung kann ebenfalls von I0 abweichen. Damit ist der t-Faktor, Mittelwert in x und der Summenausdruck Q , im Wurzelausdruck zur Berechnung der Vertrauensbandbreite [ 521 durch methodisch, analytische Festlegungen vorgegeben. 1

mit

Q,

c(x, N

=

-

X)2

i= I

mit:

VB Vertrauensbereich Reststandardabweichung b Steigung

sy

(x-X)2

N Q, x x t

AnLahl der Konzentrationen Summenauadruck Messwert Mittelwert von x t-Faktor

Unter diesen Gegebenheiten wird die Weite des Vertrauensbereiches der Kalibriergeraden nur noch durch die aktuelle Prlzision der Kalibration beatimrnt - ausgedruckt in der Reststandardabweichung (sY). Damit wird die tagliehe Erfassungsgrenze ausschlieRlich von der Reststandardabweichung bzw. der Verfahrensstandardabweichung .sxo abhangig. Fur die Tagesjustierung muB dann gefordert werden, daB die untere Arbeitsbereichsgrenze aktuell im quantitativ erfaljbaren Bereich liegen muR. Dies ergibt fur die Prlzision der Kalibrationsdaten die Mindestanforderung, daB die Verfahrensstandardabweichung einen bestimmten Wert nicht ubersteigen darf, urn der Forderung X E < -xl zu genugen (mit: X E Erfassungsgrenze, x I kleinste Konzentration). Die Erfassungsgrenze ergibt sich nlherungsweise aus der doppelten Breite des Vertrauensbandes in Konzentrationsrichtung am Schnittpunkt der Kalibrationsgeraden mit der Ordinate. An der Konzentration x = 0 ergibt sich Gleichung 2 als Ansatz zur Berechnung von XE.

mit:

X E Erfassungsgrenze

Wird im Grenzfall die Konzentration der Erfassungsgrenx gleich dem untersten Wert der Kalibrierung (xI)gesetzt, so ergibt Gleichung ( 2 ) bei festgelegten analytischen Randbedingungen eine Forderung an die VerfahrensstandardabweichungsXO.Gleichung (2) kann jedoch nicht analytisch geschlossen nach .sxO aufgelost werden.

Verallgemeinerung Damit die Verfahrensstandardabweichung sxo auch fur Analysenverfahren mit nicht nlher festgelegten Kalibrationsbereichen als einfach zu berechnende Qualitatsbeurteilungsgro~e benutzt werden kann, mufi die Ausgangsuberlegung geringfugig abgelndert werden. Die Bedingung X E < x , wird ersetzt durch die Forderung, daB die doppelte Breite des Vertrauensbereichs am untersten Konzentrationspunkt xI hochstens gleich dem Konzentrationswert aelbst ist [xl2 2 . V B ( x l 1.) Dieser Ansatz gewlhrleistet eine relative Ergebnisunsicherheit (Definition siehe 1541)von maximal 50 c/o am untersten Kalibrierpunkt. Damit kann sichergestellt werden, daB x , - V B ( x l )> 0 ist, d. h. die untere Arbeitsbereichsgrenze ist eindeutig vom theoretischen Blindwert (gegeben durch den Achsenabschnitt der Kalibriergeradengleichung) unterscheidbar. Hieraus ergibt sich folgender Gleichungsansatz:

3.7 Linearitii~

I 55

Als einzige Bedingung wird das Uberdecken des Arbeitsbereiches mit 6quidistanten Konzentrationsabstanden beibehalten. Mit dieser Voraussetzung konnen folgende Berechnungsterme durch die Kenntnis des niedrigsfen ( x , ) und hiichsten ( x N )Kalibrierstandards ausgedruckt werden. -

Konzentrationsmittelwert:

-

Abstand der Konzentrationswerte:

-

Konzentrationsfolge:

xi mit

= x,

i = 1,

+ (i - 1 ) . d,

..., N

Damit vereinfacht sich der Summenterm fur Q, zu: Q,

=

( x , - &[*-0,5] i=l

N-1

und der gesamte Wurzelausdruck zu W,:

Somit kann die Ansatzgleichung (3) nach sx0aufgelost werden und als relative GroOe bezuglich der Arbeitsbereichsmitte (relative Verfahrensstandardabweichung s,.,~~~,) dargestellt werden: -

sX0,reI -

t ( P .N

-

1 2) . (I

+ j ) . WN

mit dem Arbeitsbereichsparameterj: xN = j . x I Da das Problem in der Verallgemeinerung zwei zusatzliche EingangsgroBen (Anzahl der Kalibrierkonzentrationen und Ausdehnung des Arbeitsbereichs) besitzt, ergibt sich fur die

156

3 Die Vulidierungspummeter

18-191 17-16; 16-17 15-16 14-15 13-14 12-13 11-12

:: I 10-11l

7-8

6-7

1

,

5-6 4-5

2-3 3-4

1

1-2

0-1

Arbeitsbereich j m it Xn = j * X1

r

U

-

N 0

Abb. 3-40 Maximal zulassige relative Verfahrensstandardabweichungen.

relative Verfahrensstandardabweichung,die maximal erreicht werden darf, um dem Qualitatsziel VB(x,)5 x, zu geniigen, eine in zwei Raumrichtungen hyperbolisch gekriimmte Flache (Abb. 3-40), die mittels eines Tabellenkalkulationsprogramms, z. B. EXCEL, berechnet und dargestellt werden kann. In Tab. 3-15 sind exemplarisch die maximalen relativen Verfahrensstandardabweichungen fur 4 Kalibrierbereiche mit unterschiedlicher Anzahl von Kalibrierpunkten aufgelistet. Hieraus ist zu erkennen, da13 die Anforderung an die Kalibrierprazision mit abnehmender Anzahl an Kalibrierstandards zunimmt. Ebenfalls bestatigt wird die empirisch gefundene Forderung aus [53]. Tab. 3-15 Maximale relative Verfahrensstandardabweichung in [%I

4 Punkte

5 Punkte

10 Punkte

20 Punkte

8,3 4,1 2,3

12,5

14,6

62

10 X I

6,O 38 1,6

x,,= 20 X I

0,9

1,2

13

7,3 4,o 2,l

Kalibrierbereich xEI= 2 x,

x N = 5 x, XN =

(*): Empirisches Qualitatsziel aus: Vom

3,4 (*I

Wasser, 74,91-105 (1990): 3,33 %.

3.7 Lineciritiit

157

Zusammenfassung Die Verfahrensstandardabweichung ist eine grundlegende KenngriiBe, mittels der die Prlzision der Kalibrationsmessungen um die Ausgleichsgerade beschrieben wird. Da der Wert der Verfahrensstandardabweichung eine einfach zu berechnende GroBe ist, eignet sich diese Kenngrolje zur Qualitatskontrolle von Analysenverfahren im Routineeinsatz. Die Qualitatskontrolle mittels der Verfahrensstandardabweichung ist bei uneingeschranktem Arbeitsbereiche mit variabler Anzahl von Kalibrierstandards allgemeingultig beschreibbar. Es ergibt sich ein Maximalwert fur die relative Verfahrensstandardabweichung, der aus einer hyperbolischen Fllche im dreidimensionalen Raum ermittelt werden kann. Hiermit erweist sich die Verfahrensstandardabweichungin der relativen Darstellung als einfaches Qualitatskriterium fur die Beurteilung der Prazision der Tageskalibrierung. Die bis dato gemachten Ausfuhmngen sollen nun zunachst in einem FlieBschema incl. Kommentierung und in einem abschlieaenden Beispiel zusammengefaat werden. 3.7.2.5 Flieljschema zur Kalibrierung und zur Ermittlung der Linearitat

1. Errnittlung der Signalwerte fur den gewunschtenlerwarteten, "unteren" und "oberen" Konzentrationsbereich. Dazu werden je sechs oder zehn (DIN 38402 Teil51) unabhangig voneinander hergestellte Kalibrierlosungen verwendet.

Ersfer Test: Test auf Normalve~ei/u~g

I

Nein-

Werte normal verteilt?

iJa

Arbeitsbereich einengen

Zweiter Test: Test auf Varianzenhomogenitat

I

Varianzenhornogenitat gegeben?

2.

-Nein-

Mit einer Gewichtung arbeiten, s. Abschnitt 3.7.2.8.

Herstellung von Kalibrierlosungen, Messung und Erhalt der entsprechenden Signale

3.A. Ermittlung rnit Hilfe spezieller Validierungssoftware-Programme oder EXCEL der Bestgeraden (lineare Regression) und der Bestkurve (quadratische Regression) rnit den dazu gehorenden KenngroOen; u. a. Ordinatenabschnitt, Steigung, Reststandardabweichung, Verfahrensstandardabweichung,relative Verfahrensstandardabweichung

Abb. 3-41 FlieBschcma Kalihdcrung.

B

Durchfuhrung des Mandeltests d h Frage beantworten "Wetches mathematische Modell (linear oder quadrattsch) beschreibt am besten, die von mir experimentell gefundene Abhangigkeit des Signals von der Konzentration? Und welter Falls das quadratische Modell "besser" ist, 1st es signifikant besser?

Lineare Regression angepaOter bzw. nicht signifikant "schlechter" als die quadratische?

Nein, d. h. quadratische Regression signifikant besser

Arbeitsbereich einengen. experimentelle Bedingungen andern, Anzahl der Kalibrierpunkte erhohen und erneut den Mandeltest durchfuhren

Nein

I

quadratische Regression immer noch signifikant besser?

Messung auf Fehler uberprufen und bei negativem Befund fur die Zukunft mit einer quadratischen Regression arbeiten C

Vertrauensbander um die Bestgerade (Streuung der y-Werte, Prazision der Messung) sowie Prognoseintervall (Streuung der x-Werte, Gute der Kalibrierung) ermitteln Bei Bedarf AusreiOertest nach Huber durchfuhren.

Ende der Kalibrierung

Bemerkungen Die relative Verfahrensstandardabweichung 1st ein wichtiges Gutekriterium einer Methode Als solches eignet 1 sie sich fur den Vergleich von Methoden, bei Wiederholmessungen be1 Ringversuchen etc Ihm gebuhrt besondere Beachtung 2 Es wird empfohlen. den Residual- und den Sensitivitatsplot aufzunehmen Mit Hilfe der Residualanalyse werden Trends erkannt eine wichtige Information, die die Reststandardabweichung nicht zu liefern vermag Der Sensitivitatsplot 1st ein strenges Kriterium fur das Vorhandensein von Linearitat im unteren und im oberen Konzentrationsbereich, s Abschnitt 3 7 2 7

Abb. 3-41 Fortsetzung.

3.7 Lineuritiit

159

Kommentar - Nach Eingabe der experimentellen Daten bzw. iibernahme der selbigen aus einer EXCEL

-Tabelle erfolgen mit Hilfe von dafur ausgelegten Softwareprogrammen automatisch die Berechnungen des Punktes 3 a) bis 3 c). Einige Programme erlauben dariiber hinaus die Prufung auf Normalverteilung und Varianzenhomogenitat bzw. die Durchfuhrung des Bartlett-Tests, Punkt 1, die Residualanalyse und der Sensitivitatsplot, Punkt 4, sind ebenfalls Bestandteil mehrerer Softwarepakete. Als ,,Kalibrierung" werden ublicherweise die Aktivitaten der Punkte 2 bis 3 c) oder sogar nur 2 und 3 a) des FlieBschemas bezeichnet. Wie auch immer, braucht der Analytiker heute ,,nur" die Kalibrierlosungen sorgfaltig herzustellen und zu vermessen, die Wertepaare Konzentration/Signal einzugeben (wenn sie nicht automatisch ubernommen werden), die KenngroBen der Kalibrierfunktion werden dann automatisch ermittelt. Die Aufgabe des Analytikers besteht nun darin, sich mit der Aussagekraft dieser Zahlenwerte auseinander zu setzen. Zu kritischen Punkten bezuglich Linearitat s. auch Abschnitt 3.7.2.3, 5.2 und 7. -

Die Streuung der MeBwerte uber den gesamten Arbeitsbereich mu13 konstant sein, will man zur Berechnung der Kalibrierfunktion die ungewichtete Regressionsanalwe durchfuhren. Bis auf solche Falle, in denen der abgedeckte Konzentrationsbereich relativ gering ist - wie z. B. bei Gehaltsbestirnmungen in der Pharmaindustrie- sollte die Konstanz der Varianzen (Streuung) stets uberpriift werden. Der in DIN 38 402 Teil5 1 empfohlene F-Test zur Uberprufung der Varianzenhomogenitat (Gleichheit der Streuung) ist nicht geeignet wie in [56] sehr schon dargelegt wird. Wenn nun eine groBere Streuung bei einer bestimmten Konzentration ubersehen wird, zeigt die Kalibrierfunktion bei Anwendung der ungewichteten Regressionsanalyse einen falschen Verlauf. Die Folge ist eine falsche Steigung und somit ein falsches Ergebnis. Geeigneter als der in der DIN empfohlene F-Test ist der Bartlett-Test. Der Bartlett-Test priift den Verlauf der Streuung im betrachteten Bereich insgesamt, wahrend der F-Test letztlich nur die Streuung zweier MeBreihen miteinander vergleicht (,,unten" und ,,oben") [56].Der BartlettTest ist somit nichts anderes als ein kombinierter Test auf Normalverteilung und Varianzenhomogenitat. Genaueres zum Bartlett-Test, s. [57]. 1st der Aufwand gerechtfertigt? Ja, er ist es, wenn ein grofier Konzentrationsbereich abgedeckt werden soll. Die Norm empfiehlt 10 MeBwerte pro Konzentration, also insgesamt 20 MeBwerte. Der BartlettTest verlangt mindestens 5 MeBwerte fur eine MeBreihe. Wird nun der Arbeitsbereich gleichmaBig in 5 Konzentrationsniveaus unterteilt und wird pro Konzentration eine MeBreihe mit 6 Werten bestimmt, hatten wir insgesamt 30 Mefiwerte. Der Mehraufwand ist insofern gerechtfertigt, als dadurch ein moglicher systematischer Fehler bei der Kalibrierung vermieden und daruberhinaus quasi als Nebenprodukt, die Prazision des Verfahrens fur die 5 Konzentrationen ermittelt wird.

- Aufgrund des MeBprinzips (z. B. HPLC mit UV-Detektion) wird in der Analytik oft

eine lineare Abhangigkeit erwartet. Wird nun eine ,,schlechte" Linearitat festgestellt, kann dies ein Hinweis auf einen Fehler in der Methode oder im Detektionssystem sein:

160

. .. .. .. -

-

Mogliche Frhlrrqirellen in der HPLC, die zu einer schlechten Linearitat fiihren "1: Der Analyt ist schlecht liislich: Weil dieses Problem recht hiiufig auftritt, ist es besser, jede Konzentration einzeln einzuwiigen, damit der Fehler auch erkannt wird. Uberladung der Trennsiiule Der Analyt koeluiert mit einer weiteren Substanz oder wird durch den Systempeak unterlaufen Der Analyt wird z. T. an der stationLen Phase adsorbiert Der Analyt zersetzt sich auf der SIule Beginnende Hydrolyse oder sonstige Veriinderung des Analyten Die Linearitat und/oder der MeBbereich des Detektionssystems ist ungeniigend.

Man sollte mit den KenngrBRen, die ermittelt werden konnen, wie der Abstand der Hyperbelaste urn die Kalibriergerade. Prognoseintervall und Verfahrensvariationskoeffizient bewuBt umgehen. Fragen wie: Lohnt sich statt einer Einfach- eine Dreifachbestimmung, wenn das Verfahren recht priizise ist? Wieviel Konzentrationsniveaus brauche ich wirklich? Wie vergroRert sich das Prognoseintervall in Abhangigkeit von der erwarteten Konzentration? konnen objektiv beantwortet werden. Der Abstand der Hyperbelaste und das Prognoseinterval1 sind GroRen, die sehr klar zeigen, welcher Arbeitsaufwand in Bezug auf eine Verbesserung zu akzeptieren ist. Der Verfahrensvariationskoeffizient ist ein hervorragendes Giitekriterium eines Verfahrendeiner Methode, weil in dieser GroBe folgende wichtige KenngroRen enthalten sind: Reststandardabweichung, ein Ma13 der Streuung der MeRwerte urn die Bestgerade ( PriizisionsmaB) Steigung, ein Man fur die Empfindlichkeit einer Methode, wichtig gerade im Spurenbereich (EmpfindlichkeitsmaR) Der Verfahrensvariationskoeffizient bezieht sich wie wir gesehen haben auf die Mitte des Konzentrationsbereichs. Diese ist in der Regel identisch mit der Zielkonzentration. Daher ist VLoein geeignetes charakteristisches Giitekriterium einer Methode fur die quantitative Bestimmung eines Analyten in einer bestimmten Konzentration unter den konkreten experimentellen Bedingungen.

In dem FlieRschema und im Kommentartext ist die Rede bewuljt von Kulihrirrung und nicht von Li/ieciritiit. Die Kalibrierung wird mit Kalibrierliisungen durchgefiihrt. Sie enthalten den gut charakterisierten Analyten (Standard) und das Losungsmittel. Die realen Proben jedoch konnen daruber hinaus noch Begleit-. Zusatz-, Fullstoffe usw., d. h. eine mehr oder weniger komplexe Matrix, enthalten. Die Matrix kann die Kenngrol3en der Kalibrierfunktion (Steigung, Arbeitsbereich usw.) beeinflussen. Daher ist es unerliiRlich. im Rahmen der Validierung diesen EinfluR zu iiberpriifen. Nachfolgend wird die Vorgehensweise fur eine derartige Uberprufung skizziert. In [ 58 I findet sich eine detaillierte Beschreibung mit Zahlenbeispielen.

3.7 Lineuritat

161

Durchfuhrung der (Grund-)Kalibrierung wie oben beschrieben und Ermittlung der Kalibrierfunktion (z. B. lineare Regression) Herstellung von Blindlosungen: Eine Blindlosung ist eine synthetische Losung, die die Matrix der spater zu analysierenden realen Proben (Placebo, Formulierung, Abwasser, Staubextrakt usw.) und das Losungsmittel enthalt. 1st eine analytfreie Matrix nicht herzustellen, so ist die Standardaddition anzuwenden, s. weiter unten. Die Blindlosungen werden mit Analyt (Standard) aufgestockt. Man erhalt Losungen mit der selben Konzentration wie die Kalibrierlosungen. Diese ,,Probelosungen" werden nun vermessen. Ein erstes ,,Gefuhl" uber den EinfluB der Matrix auf die einzelnen KenngroBen kann man bereits jetzt erhalten, indem man folgende Quotienten bildet: SteigungKalibrierung . 100% SteigungLinearitit

ReststandardabweichungKalibrierung

.loo%

ReststandardabweichungLinearitat

Wenn man dieses Experiment mit den in Frage kommenden Matrices oder auch bei modifizierten Analysenbedingungen durchfuhrt, kann man interessante Informationen erhalten. Beispiele: In der Matrix Blut ist die Empfindlichkeit der Methode XYZ zur Bestimmung des Metaboliten Methylvalidols um so und soviel Prozent geringer als im Urin. Durch Wechsel des Schrittes ,,Filtration" mit ,,Zentrifugation" in der Probenvorbereitung sind bei sonst gleichen Analysenbedingungen die Prognosebander um die Bestgerade um so und soviel Prozent naher geriickt, d. h. die Prazision der Methode ist um so und soviel besser geworden. Jetzt werden die x-Werte (Gehalte) der ,,Probelosungen" ausgerechnet, indem die Signalwerte der ,,Probelosungen" in die Gleichung fur die Kalibrierung eingesetzt werden. AnschlieBend wird rnit den Gehalten der Kalibrierlosungen und den gefundenen Gehalten der ,,Probelosungen" eine lineare Regression durchgefuhrt. Dazu werden die errechneten Werte der Probelosungen auf der y-Achse und die der Kalibrierlosungen auf der x-Achse aufgetragen. Im Idealfall hatte die Matrix bei einer Konzentration des Analyten von 0 keinen EinfluB auf das Signal und dariiber hinaus wurde sie keine konzentrationsabhlngige Abweichungen hervorrufen. In diesem Fall ware kein Matrixeffekt feststellbar, man erhielte eine Winkelhalbierende, die Steigung w&e I und der Achsenabschnitt 0, s. auch Abschnitt 3.4.2. I . xProhs = I . XKalihrierung -IXProhe = XKalihrierung Wie kann man nun objektiv beurteilen, wie ,,schlimm" der EinfluB der Matrix ist? Dazu mussen die Vertrauensbereiche des Ordinatenabschnitts und der Steigung ermittelt werden. - SchlieBt der Vertrauensbereich ( P = 95 %) der Steigung den Wert 1,O rnit ein, ist eine proportional-systematische Abweichung nicht festzustellen SchlieBt der Vertrauensbereich ( P = 95 %) des Ordinatenabschnitts den Wert 0 rnit ein, ist eine konstant-systematische Abweichung nicht festzustellen.

Dieser Befund wurde bedeuten, daR der MatrixeintluB nicht signifikant ist und man den Gehalt des Analyten in der realen Probe mit den Daten aus der (Grund)Kalibrierung bestimmen kann. Auch wenn die Signifikanz statistisch nicht nachgewiesen werden kann, konnte aus analytischer Sicht die Information uber einen vorhandenen EinfluB der Matrix von Interesse sein. Dafur eignen sich folgende Quotienten, in denen praktisch alle wichtigen KenngroBen enthalten sind:

PrognoseinteTVallK,I,~r,e~n~ . 100 ?h PrognoseinteTVaIll,,,,,,,,,,

relative V e r f a h r e n s ~ t a n d a r d a b w e ~ c h u n. g100 ~ ~8~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ relative VerfahrensstandardabweichungLinearitat Ergibt die oben skizzierte statistische Bewertung, daB der EinfluR der Matrix auf Steigung und Achsenabschnitt signifikant ist, konnen die Daten der Kalibrierung zur Bestimmung von realen Proben nicht verwendet werden. Man mul3te hier das Verfahren der Stundurdaddition anwenden [ 58 1: - Eine Originalprobe wird rnit detinierten Mengen an Analyt aufgestockt und vermessen. Man erhalt beispielsweise fiinf Signale (ein Signal der Originalprobe, vier Signale aus den vier Aufstockliisungen), die konzentrierteste Losung sollte hochstens die doppelte Konzentration der Originalprobe haben, die Linearitat des Detektors darf nicht uberschritten werden. Die funf Signale werden gegen die Originalkonzentration und den vier Aufstockungen aufgetragen (Signale auf der y-Achse, Konzentrationen auf der x-Achse), man erhalt die Aufstockfunktion rnit wahrscheinlich anderen KenngroBen als die Kalibrierfunktion. Auch hier gilt, objektiv - d. h. mit statistischen Mitteln - zu beurteilen, ob die Unterschiede signifikant sind. Dazu werden zwei Tests durchgefuhrt: 1. Priifung der Reststandardabweichungen der zwei Funktionen (Kalibrierung, Aufstockung) auf Varianzenhomogenitat nach dem ublichen F-Test. 2. Mittelwert-t-Test der zwei Steigungen. Erweisen sich die Unterschiede als signifikant, so hat die Matrix einen ,,zu" starken EinfluB auf das Ergebnis, der Fehler (bias) ist nicht zu akzeptieren. Da bei der beschriebenen Vorgehensweise die Matrix die einzige Variable ist, konnen andere systematische Fehler (konstant und proportional) ausgeschlossen werden. In diesem Fall mussen die experimentellen Bedingungen auf vorliegende Matrix hin optimiert werden (Probenvorbereitung, Detektion, usw.) oder es mu13 auf ein Alternativverfahren ausgewichen werden. Bemerkung: Verschiedentlich wird vorgeschlagen, in jedem Fall drei Experimente unter gleichen Bedingungen durchzufiihren und anschliel3end die drei Verfahrensvariationskoeffizienten zu vergleichen: 1. Kalibrierung mit Standardlosungen 2. ,,Kalibrierung" mit Standardlosungen, denen Matrix zugegeben ist. 3. ,,Kalibrierung" rnit realen Proben, denen definierte Mengen an Standard zugegeben ict (Standardaddition).

3.7 Linearitiit

163

Diese Verfahrensweise liefert sicherlich gesicherte Informationen; es sol1 individuell entschieden werden, in welchen Fallen der Aufwand gerechtfertigt erscheint.

3.7.2.6 Beispiel zur Priifung auf Linearitat [51] Nachfolgendes Beispiel ist fur Leser gedacht, die anhand einer ublichen Fragestellung die einzelnen Schritte bei der Entwicklung und Beurteilung eines Linearitatstests sukzessiv und detailliert verfolgen mochten. Fur erfahrene Anwender durfte diese detaillierte Beschreibung von geringerem Interesse sein. Das ausgewahlte Beispiel dient ausschlieljlich didaktischen Zwecken: Selbstverstandlich sollte in der Praxis die Prufung auf Linearitat mit Hilfe von Softwareprogrammen erfolgen, zu kommerziellen Softwareprogrammen s. Anhang A 6. Das Schmerzmittel Acetylsalicylsaure (ASS) in einer Tablette, die 0,5 g ASS pro Tablette enthalten soll, wird mit Hilfe der UV-Spektroskopie untersucht. Dazu wurde die Tablette in heiljem Wasser gelost und so verdunnt, dalj (schatzungsweise) 175 pg/L ASS in der verdunnten Losung enthalten sind. Es entstand bei der Messung eine Extinktion von 0,643. Daraufhin beschlolj der Analytiker, die Kalibrierfunktion in einem Arbeitsbereich zwischen

100 pg/L und 300 pg/L ASS zu untersuchen. Es steht ein ASS- Standard von der gleichen Firma zur Verfugung. Der Matrixeinflulj ist zu vernachlassigen.

1. Priifung auf Varianzenhomogenitat Fur die Reihe 1 (verdunnteste Losung) wurden 10 ma1 separat eine Losung von 100 pg/L ASS hergestellt und bei 247 nm jeweils die Extinktion gemessen. Fur die Reihe 2 (konzentrierteste Losung) wurden 10 ma1 separat eine Losung von 300 pg/L ASS hergestellt und bei 247 nm jeweils die Extinktion gemessen. Mcssung Nr. I 2 3 4 5 6 7 8 9 10

100 l r g n

Reihe 1

Reihe 2 300 p g n

0,24 I 0,239 0,239 0,244 0,240 0,237 0,239 0,244 0,24 1 0,231

0.94 I 0,93 1 0,933 0,927 0,942 0,952 0,944 0.93 1 0,929 0,920

Die Berechnung der Varianxn s 2 erfolgt mit:

mit:

s 2 Varianzenhomogenitat

.vi Messwert

Mittelwert N Anzahl der Konxntrationen

y

Fur die Reihe I ergibt sich: .sf = 0.00000610.

Fur die Reihe 2 ergibt sich:

S;

= 0,00009063.

Aus den Varianzen errechnet sich eine PrufgroBe PG:

P G = s12 = 0,00009063 = 14,85 ,yf O.000006 10 DerTabellenwert FlautetV;=IO- I..f2=

10- ] , p = 9 9 % ) = 5 , 3 5 .

Ergehriis: Varianzenhomogenitiit hegt nicht vor!

Die Werte der hoch konzentrierten Losungen schwanken stiirker als die Werte der niedrig konzentrierten. Vielleicht ist die Gultigkeit des Lambert-Beerschen Gesetzes fur die Spektroskopie bereits uberschritten und somit eine Linearitat nicht gewlhrleistet. Oder die Herstellung der konzentrierteren Losung ist auf diese Art und Weise wegen beginnender Hydrolyse nicht moglich. Es wurde darauthin separat 10 ma1 eine Konzentration von 250 pg/L ASS hergestellt und jeweils die Extinktion gemessen. Die Konzentration der verdunnten Liisung wurde mit 100 pg/L belassen. Mcswng

Nr. I

2 3 4

S

6 7 X 9 I0

Rcihc 1 100 pg/L

Rcihc 3 250 pg/L

0,241 0.239 0,239 0,244 0.240 0.237 0.239 0.244 0.24 I 0.237

0,76 I 0.763 0.760 0.757 (1.764 0,763 0.76 I 0.756 0.758 0.766

3.7 Lineciritiit

16.5

Die Berechnung der Varianzen s2erfolgt mit:

s2

=

c

(Y; - L? N-1

Fur die Reihe 1 ergibt sich: s: = 0,00000610. Fur die Reihe 2 ergibt sich: si = 0,0000109. Aus den Varianzen errechnet sich eine PriifgroBe PG: p G = -si =

$

0,0000109 = 1,78 0,00000610

Der Tabellenwert F lautet (fi = 10 - l,f2 = 10 - 1, P = 99 %) = 5,35

Ergehnis: Vananzenhomogenitit ist gegeben (genauer: eine Varianzeninhomogenitat kann nicht nachgewiesen werden)

Aussage:

Es konnen keine signifikanten Unterschiede in der MeBwertstreuung bei den zwei Konzentrationen festgestellt werden.

2. Ermittlung der Kalibrierfunktion

a ) Lineure Regression

Wertetabelle (Arbeitsbereich 100 bis 250 pg/L, 7 Kalibrierlosungen): Konz.

Nr.

Extinktion

x,-

y;

10 000

24,000 38,875 58,350 82,425 110,800 46,025 189,750 650,225

Y

X ~

X ,!;

~~~

6 7

I00 I25 I50 I75 200 225 250

0,389 0,47 1 0,554 0,649 0.759

22 500 30 62.5 40 000 50 625 62 500

0,057 0,096 0,151 0,22 1 0,306 0,42 I 0.576

Summe

1225

3,373

231 875

1 ,83 I

I 2 3 4 S

0,240

0,31 I

15 625

~

-

Berechnung der Bereichsmitte:

y = -

c?’, N

-

y=-

3,3373 = 0,482 7

50

100

150

Regression Ausgahc: Ordinatenabschnitt y(0) Rcststandardabweichung s) Korrelationskoetfirient r Anzahl der Messungen N Freiheitsgradc .f Sreigung h

200

250

-0,l 176 0,0 142 0,19976 7 5 0,00343

Abb. 3-42 Kalibrierkurvc fur die Bestimrnung von ASS.

-

Berechnung der Quadratsummen

Q,,

=

Q,,

=

231875-

~

1225’ 7

=

17500

3,37? 1,832 - -= 0,2064 7

Q,, =650,225-(1225.3,373/7)

= 59,95

300

Konzentration x [pg/L]

3.7 Lineuritut -

Berechnung der linearen Kalibrierfunktion (lineares Regressionsmodell) p=b. +a

Extinktion = b . Konzentration

+a

Berechnung der Steigung m:

h = 59’95 = 0,00343

I7 500

Berechnung des Ordinatenabschnitts a: a =J-h.i

u = 0,482 - 0,00343. 175 = -0,1176

Aufstellung der Kalibrierfunktion: Extinktion = 0,00343 . Konzentration -

Berechnung der Reststandardabweichung s Y

sy =

-

+ (-0, I 176)

i

Berechnung der Verfahrensstandardabweichung .yxo

=

.sXo =

5. h

~

0,O 142 = 4,139 0.00343

167

Berechnung der relativen Verfahrensstandardabweichung

-

v,,

= 4'139 .

17.5

100% = 2,36.5%

h) Qriadrufischr Regrt.ssicm Wertetabelle (Arbeitsbereich 100 his 2.50 pg/L, 7 Kalibrierlosungen): Nr.

-

Konz.

Signal

-

'

v,

I

100

0.240

I 0 000

I 000 000

I00 000 000

0.0576

24.000

2 400.00

2

125

0,31 I

15625

I953 125

244 140625

0,0967

38.875

4 859,37

3

150

0.389

22 500

3 375 000

506 250 000

0. I5 I3

58,350

8 752.50

82,425

I4 424,37

22 I60,OO

4

175

0,471

30 625

5 359 375

937 890 625

0.22 I8

5

200

0,554

40 000

8 000 000

1600 000 000

0.3069

1 10,800

6

225

0,649

SO 625

1 1 390 625

2562 890 625

0,42 I2

146.025

32 855.62

7

250

0,759

62 500 15 625 000

3906 250 000

0.5 760

I 89.750

47 43730

C

1225

3.373 23 1 875 46 703 I25

9857 421 875

1 .X3 16

650.225

I32 889.37

Berechnung der Bereichsmitte:

122.5 = 17.5pg 7

-

y=-

-

3,373 = 0,482 7

\'=-

-

.r;

\8-

Berechnung der Quadratsummen:

L

i

3.8 Wieder$ndung und Wiuderj5ndungsrute

3,3732 7

Qyy = 1,832 - -= 0,2064

Qxy

=

y]

[

650,225- 1225.

=

59,95

[

Qxxx

=

7 = 6 125000 c 4 6 7 0 3 125 - 1225 231875]

Qxxy

=

l32889,4- 3,373.

i

7

- Berechnung der quadratischen Kenndaten:

quadratische Steigung n:

n =

n=

Qxy

. Qxxx

(ex,,1

2

- Qxxy

- Qxx

Qxx

.Qxxxx

59,95.6125000 - 21 158,75.17500 = o,ooooo537 (6125000)2- 17500-2,177.lo9

169

lineare Steigung h: Qxy

b=

- ‘1

. Qxxx

Qxx

59,95 - 0,00000537I ’ 6 125 000 I7 500

b=

=

o,OO 545

Ordinatenabschnitt a:

CI =

3,373 - 0,001545. I225 - 0,000005371.23 187.5 7

o,0334

Die Gleichung der quadratischen Funktion lautet demnach:

Extinktion = 0,000005371 * Konz.* + 0,001545 * Konz. + 0,0334 -

Berechnung der Reststandardabweichung sy:

sY

=

1,83 1 - 0,0334.7373 - 0,00 1545.650,225 - 0,00000537 1 . 2 3I 875

7-3

sY = 0,0038 -

Berechnung der Empfindlichkeit E:

E

=

h+2.n.F

-

E = 0,001545 + 2 0,000005371 * 175 = 0,00343 -

Berechnung der Verfahrensstandardabweichung: S,()

=

S,[, =

sY -

E

0,0038 = 1.1 17 0,00343

3.7 Lineaririit - Berechnung der relativen Verfahrensstandardabweichung:

vxo = s,o.100% X

1,l 17 vl.o= . 100% = 0,638% 175

c ) Vergleich der Duten beider Regressionsunsatze (Mandeltest) lineare Regression N

0,00000537 1

-

B

-

quadratische Regression

0,003457

0,00 1 545

A

-0,l 176

0,0343

rY

0,0 I42

0,0038

.rxo

4,1392

1,117

2,365 8

0,638 8

Berechnung der Varianzendifferenz: Berechnung der Varianzen aus den Standardabweichungen:

Linear:

s;L

= 0,0142' = 0,0002016

Quadrutisch:

S&

=

0,003g2 = 0,0000144

Berechnung der Varianzendifferenz: Ds2 = [ ( N - 2 ) . s ; ~ ] - [(N - 3 ) . s&]

Ds2 = 5 . 0,0002016- 4 .0,0000144 = 0,0000950 Berechnung der PriifgroBe PG:

DS'

PG

=-

PG

=

9,50 .

1,444.

=

65,9

17 1

-

Bewertung:

F ( P = 99 c/o / j ' ,= l,,f2 = 7 - 3) = 21,20 (It. F-Tabelle) PG = 65,9 Ausstige: Die quadratische Regression ist signifikant besser als die lineare Regression.

3. Kalibrierstrategien: Strategieprinzip (s. auch Okonomie der Validierung 7. I ) :

Es sollte untersucht werden, oh durch eine Einengung der Menwerte oder eine Neukalibrierung nach einer anderen Probenvorbereitungsvorschriftvielleicht doch eine akzeptable Linearitit erreicht werden kann. -

Strtitegie

I : Eiriengiirig a i f 6 Dater? Konicntration pg/L

Extinktion

I00

0.240 0.3 I I 0,380 0,411 0.554 0,649

I25

1

so

175

100 125

Daten der linearen Regression: Arbeitsmitte x Arbeitsmitte Steigung der Geraden h Ordinatenabschnitt a Reststandardabweichung .sy Verfahrensstandardabw. sx0 Verfahrensstandardabw. V,,, Quadratsume Q,,

162,s 0,436 0,003269 -0,00947 0,0078 2,385 1,468 % 8083,33

Daten der quadratischen Regression: Quadratische Steigung tz: lineare Steigung h Ordinatenabschnitt N Reststandardabweichung .sY Verfahrensstandardabw. s , ~ ~ Verfahrensstandardabw. V,, Empfindlichkeit E

0,00000400 0,oo 1964 0,00360 0,oo 1 8 0,5376 0,326 r/r 0,00326

3.7 Linenritiir

Bewertung beider Regressionen: Varianzendifferenz DS2 PriifgroBe PG F(P = 99 %, f i = 1, f2 = 3)

173

0,0002335 72,06 34,12

Ergehnis: Die quadratische Anpassung ist immer noch signifikant besser! - Strutegie 2: Neukalibrierung

Es wird das bisher venvendete Losemittel ,,heiBes Wasser" gegen Methanol ausgetauscht und neue Werte im Bereich von 125 his 235 pg aufgenommen (Auf eine erneute Bestimmung der Varianzenhomogenitat wurde verzichtet.) Konzentration

Extinktion

125

0,309 0,372 0,434 0,493 0,554 0,649

145 165

I85

205 235

- Daten der linearen Regression: Arbeitsmitte x

Arbeitsmitte y Steigung der Geraden b Ordinatenabschnitt u Reststandardabweichung sY Verfahrensstandardabw. s,, rel. Verfahrensstandardabw. V,, Quadratsume Q,,

176,67 0,4685 0,003075 -0,0747 0,oo14 0,464 0,263 % 8083,33

- Quadratische Regression:

-

Quadratische Steigung n lineare Steigung h Ordinatenabschnitt a Reststandardabweichung sy Verfahrensstandardabw. s, Verfahrensstandardabw. V,,

-0,00000020 I 0,003002 -0,0685 0,OO 16 0,5235 0.296 %

Empfindlichkeit E:

0.00307

- Bewertung:

Varianzendifferenz Ds2 PriifgroBe PG F(P = 99 % , f i = 1 ,f2 = 3)

0,00000393 2,32 34,12

-

E r p h r i s : Die quadratische Anpassung liefert formal zwar immer noch bessere Werte, der Unterschied ist jedoch nicht signifikant, sondern zufallig. Eine lineare Regression kann angewendet werden.

4. Ermittlung der unbekannten Konzentration Die urspriinglich aufgenommene Extinktion der Probe, die in heiBem Wasser geliist wurde, betrug 0,564. Nach der Umstellung der Arbeitsvorschrift (Losung in Methanol) erhielt man eine Extinktion der Probenlosung von 0,55 1. Die Geradengleichung

wird umgeformt zu:

= Extinktion - (-0,0747) ~~~~~~~~~~i~~ 0,003075

Konzentration =

'3'

- (-070747) = 203,47 pglL 0,003075

5. Ausreifiertest nach Huber Im vorliegenden Fall existiert kein ausreifierverdachtiger Wert, daher wird hier auf den Huber-Test verzichtet.

6. Ergebnis der Bestimmung Fur einen bestirnmten Signalwert j existiert eine Reihe moglicher .? -Werte; der .,wahre" Wert befindet sich in einern Bereich, dem Prognoseintervall, dessen GriiRe durch die zwei Hyperbeliiste (Prognose- oder Vertrauensbznder) urn die Kalibriergerade bestimmt wird, s. Abb. 3-34. Mit Hilfe folgender Gleichung kann dieser Bereich errechnet werden:

In unserem Beispiel betragen nun der t-Wert nach der zweiseitigen Tabelle (95 c/o, f = 4): 2,776, die Anzahl der Kalibrierlosungen: 6, die Anzahl der Bestimmungen pro Kalibrierliisung: 1. Es wird folgendes Interval1 berechnet:

3.7 Lineuritut

1

xu,o = 203,47 k Xu,o

&o

I75

(0,551 - 0,4685)2

1

0,0030752 . 8083,33

L+ + 1

=

203,47 f 1,2638699.

=

203,47 f 1,2638699. 1,1211493

=

203,47 k 1,4169868

-

0,0903093

Ergehnis: Der tatsachliche Wert der AcetyIsalicy.-aure liegt mit einer statistisc..m Sic..:t ..eit von P = 95 % zwischen 202,05 und 204,89 pg/L. Angenommen, der Anwender mochte das Prognoseintervall verkleinern. Die Prazision der Messung zu erhohen (kleinere Reststandardabweichung sy) oder auf einen empfindlicheren Detektor auszuweichen (Erhohung der EmpfindlichkeitBteigung rn) erscheinen als zu aufwendige Mafinahmen. Deswegen werden folgende zwei Strategien verfolgt: 1. Erhohung der MeBwerte von 6 auf 20 2. Statt einer Einfach- sol1 eine Dreifachbestimmung durchgefuhrt werden. Zu 1.: Erhohung der Mefiwerte (N) auf 20

iu,o = 203,47 f

1

+

20

1

+

(0,551 - 0,4685)2 0,0030752 . 8083,33

1

iU." = 203,47 f 0,9565528 . 1,068 1335

iU,<) = 203,47 f 1,02 Der Wert der Acetylsalicylsaure liegt mit einer statistischen Sicherheit von P = 95 % zwischen 202,45 und 204,49 p g k . Zu 2.: Erhohung der Anzahl der Wiederholmessungen

Xu,,,

=

203,47 f

(i) auf 3

(035 1 - 0,468a2 0,0030752 .8083,33

.; ,,,,, = 203,47 F 1,2638699. 0,7678378

Der Wert der Acetylsalicylsaure liegt mit einer statistischen Sicherheit von P = 95 c/c zwischen 202.50 und 204,44 pg/L. Bei einer Vierfachbestimmung liegt der Wert zwischen 202,57 und 204.37 mg/L.

Kominenttrr: Es ist fraglich, o b der Aufwand mit den 20 MeRwerten die erzielte Verkleinerung des Vertrauensbereichs von 2,84 (204,89 - 202,05 = 2,84) auf 2,04 (204,49 - 202,45 = 2,04) rechtfertigt. Die 3-fach-(4-fach-)Messung fuhrt zu einer Verkleinerung des Bereichs auf 1,94 ( 1,go). Wenn also eine Verkleinerung des Vertrauensbereichs durch ,,FleiB" angestrebt werden soll, ist eine Mehrfachbestimmung sinnvoller (Strategie Nr. 2) als eine Erhohung der Anzahl der MeBwerte (Strategie Nr. I ) . 3.7.2.7 Eine kritische Betrachtung der Kriterien fur Linearitlt Als Akzeptanzkriterien fur eine lineare Kalibrierfunktion gelten ublicherweise folgende: -

Korellationskoeffizient, r > 0,999 y-Achsenabschnitt, a < 0 his 5 9% der Zielkonzentration Reststandardabweichung, s\. < 1,s bis 2 8

Diese Kriterien sind jedoch als Beweis fur eine Linearitlt nicht ausreichend - vor allem nicht im unteren Konzentrationsbereich.

Beispiel I Wirkstoffanalyti k Neben der ,,klassischen" Auftragung Signal gegen Konzentration sind weitere Auftragungsarten moglich. z. B. Responsefaktor (Quotient aus Signal und Konzentration) gegen Konzentration. Diese Auftragung wird gelegentlich als Rrsponsr- oder Sensiriviriir.s-P/or bezeichnet. Solange eine Proportionalitat zwischen Erhohung des Signals und Konzentration herrscht, bleibt der Quotient konstant: der lineare Bereich wird durch eine Parallele zur x-Achse (Konzentration) wiedergegeben. In Abb. 3-43 wird eine Auftragung Signal (Fliiche) gegen Konzentration (mg/I) gezeigt. Der errechnete Korellationskoeffizient ist r = 0,99995 (rechtes Bild), der auch optisch zu erkennende lineare Bereich erstreckt sich von ca. 25 mg/l his 500 mg/l. Wird n u n der Responsefaktor gegen Konzentration aufgetragen (,,Response Plot"), Abb. 3-44 ergibt sich als linearer Bereich der Konzentrationsbereich von ca. 100 mg/l bis vielleicht 400 tng/1. Durch diese Auftragung kann ein kleinerer ,,abgesicherter" linearer Bereich definiert werden. Diese Auftragung stellt ein strengeres Linearitltskriterium dar und eignet sich, um sehr friih und sicher Abweichungen zu erkennen. beispielsweise werden Verdunnungs-/Pipetierfehleroder Stabilitltsprobleme sichtbar.

3.7 Lineorilut 24

24

20

20

177

Lineare Regression y = a + b.x a=17 b = 24,343

16

16

s

s

812

g12

5

L

m

8

8

4

4

0

I

0

200

I

I

I

I

400

600

800

1000

Konzentration in mg/l

0

0

200

400

600

800

1000

Konzentration in mgll

Abb. 3-43Priifung auf Linearitat durch die Auftragung des Signals gegen die Konzcntration.

Beispiel 2 Bestimmung von Manitol [59] Abbildung 3-45 gibt die Auftragung Signal gegen Konzentration in Form der Flachenverhaltnisse Manitol/interner Standard gegen Konzentration fur die Konzentrationsbereiche 5 bis 80 mg/ml und 12 bis 28 mg/ml wieder. Ebenfalls aufgetragen (rechte ,,y-Achse") ist ahnlich dem ersten Beispiel - der Quotient am Flachenverhaltnis und Konzentration (Responsefaktor). Der Korrelationskoeffizient fur den Konzentrationsbereich 5 bis 80 mg/ml betragt r = 0,99952 und fur den Konzentrationsbereich 12 bis 28 mg/ml r = 0,99965. Beide Werte sind ,,gut", ein linearer Zusammenhang kann fur beide Falle zweifelsohne bestatigt werden. Sollte nun ein linearer Zusammenhang tatsachlich vorliegen, so wurden die Responsewerte eine Parallele zur Konzentrationsachse bilden. Im linken Teil der Abb. 3-45 ( 5 bis 80 mg/ml) kann davon gar keine Rede sein, es werden ca. 15 % Differenz bei den Responsewerten beobachtet. Linearitat ist dagegen nur fur den kleineren Konzentrationsbereich ( 12-28 mg/ml) gegeben. Dort betragt die Differenz nur ca. 1,5 %. Damit wird ersichtlich, dalS ein Korrelationskoeffizient r > 0,999 kein ausreichender Beweis fur einen linearen Zusammenhang im gesamten untersuchten Bereich ist. Es wird empfohlen, als weiteres Kriterium fur Linearitat den Quotienten aus Responsefaktor und Konzentration hinzuzuziehen. Fur die einzelnen Zielsetzungen waren folgende Linearitatskriterien denkbar:

178 2:

24

K 0 .c

F

c

c

W

23

5m

c

m ._ ul

22

21

I

I

I

0

200

400

I

600 Konzentration in mg/l

I

I

800

1000

Abb. 3-44 Prufung a u l Linearitat durch die Auftragung des Quotientcn aus Signal und Konzcntration (Response) gcgen die Konzentration.

om 0,086 0,082

0,09

:m

0,086

C c -

P

f

0

2 f 0

0,078 $ 0,074

._ m 2,5 L

W

g

9c

2

L a,

u

2 Y m W

0,082

-i

-f 0

0

1,5

0,078 $ 0,074

a,

n

Abb. 3-45 Prufung a u l Linearitat durch die Auftragung des Verhaltnisscs Signal/Konzentration geLinearitat herrscht pen die Konzentration ( a ) und des Responsefaktors gegcn die Konzentration (3). nur fur den untcren Konzentrationsbereich. siche rechtcs Bild.

3.7 Linearitat

179

Wirkstoffgehalt: r 2 0,999 fur 80 bis 120 % des Sollwertes - y-Achsenabschnitt I 2 % des Sollwertes - Reststandardabweichung I 1,5 % - Differenz der Responsefaktoren I 2,5 % -

Verunreinigungen:

- r 2 0,980 fur 0,l bis 2,5 % der Hauptkomponente bzw. der Verunreinigung - y-Achsenabschnitt I 10 % des Signals bei 2,5 % der Hauptkomponente bzw. der Ver-

-

unreinigung Reststandardabweichungen

I 10 % fur < 0,5 % I S% fur 0,s % bis S % 12,s % fur > 5 % Differenz der Responsefaktoren I 5 % fur Konzentration > 0,5 % und 5 10 % fur Konzentrationen < 0.5 %

Gehalt, Freisetzung: rl0,990 y-Achsenabschnitt 5 5 % (komplette Freisetzung, x = 100 %) Reststandardabweichung I 1,5 % (komplette Freisetzung, x = 100 %) Differenz der Responsefaktoren I 3 %

-

Gleichformigkeit, content uniformity: r 2 0,990 y-Achsenabschnitt I 5 % (Sollwert: 100 %) Reststandardabweichung I 1,5 % (Sollwert: 100 %) Differenz der Responsefaktoren I 3 %

-

Ein Problem bei groSen Arbeitsbereichen kann die mangelnde Varianzenhomogenitat sein. Andererseits ist das Arbeiten mit einer Kalibrierfunktion fur einen grol3en Konzentrationsbereich sinnvoll, wenn in einer Probe sowohl der Gehalt der Hauptkomponente als auch der Nebenkomponente(n) bestimmt werden soll. Wird hier die ubliche lineare Kalibrierfunktion verwendet, kann es bei geringen Konzentrationen zu Uberbefunden kommen. Ein Ausweg ist die gewichtete lineare Regression. Dazu existieren mehrere Modelle. Es folgt nun als Beispiel ein Ansatz von Dr. H. J. KuS, Universitat Miinchen. 3.7.2.8 Gewichtete lineare Regression Eine Kalibration ist nur uber einen bestimmten Konzentrationsbereich, den Arbeitsbereich, gultig. Nur in diesem Bereich durfen Analysenwerte errnittelt werden. Die einfachste Beziehung zwischen dem MeSsignal und der Konzentration ist eine Gerade. Dieser Zusammenhang ist bei chromatographischen MeBverfahren im Gegensatz zu den enzymatischen Verfahren meist gegeben. Die Uberpriifung der Linearitat der Kalibrierfunktion ist eine zentrale Forderung der Validierung, die Anpassung an eine Geradengleichung erfolgt mit

der linearen Regression. Dieses Rechenverfahren minirniert die Surnme der quadratischen Abweichungen in der y-( MeBwert-Richtung. Die Konzentrationswerte werden als so exakt angenommen. daB ihre Abweichung vernachliissigbar ist. Bei der linearen Regression werden die Abweichungen der MeBwerte bei den kleineren und den griilJeren Konzentrationen gleich berucksichtigt, d. h. gleiche Varianzen (Quadrate der Abweichungen von der berechneten Geraden in y-Richtung) uber den Arbeitsbereich vorausgesetzt, wie beispielsweise in der Abb. 3-46 gezeigt. Je groljer der Arbeitsbereich ist, desto geringer ist die Wahrscheinlichkeit der Varianzenhomogenitat, die ublicherweise mit dem F-Test (Quotient der gr6Reren durch die kleinere Varianz) fur jeweils 6 bis 10 MeBwerte jeweils bei der kleinsten und der groRten Konzentration des Arbeitsbereichs getestet wird. Wenn man zu jeder Konzentration nur einen MeBpunkt hat, gibt z. B. die graphische Darstellung der Abweichungen von der berechneten Geraden einen Eindruck von der Verteilung der Varianzen. Mit einer Tabellenkalkulation IZBt sich die Differenz eines MeRwerts von dem bei dieser Konzentration aus der Geradengleichung ermittelten y-Wertes (yher) leicht berechnen und darstellen. Stellt man nun fest, wie es bei einem Arbeitsbereich vom Faktor 100 leicht sein kann, daR die Abweichungen im oberen Konzentrationsbereich erheblich hijher sind, als im unteren Bereich, ist die lineare Regression nicht mehr zulissig und sollte in der einfachen Form nicht mehr durchgefuhrt werden. Es bietet sich an, die gewichtete lineare Regression zu verwenden, d. h. MeBpunkte mit kleinerem Absolutfehler auch starker zu berucksichtigen. Eine ausfuhrlichere Diskussion zur gewichteten Regression ist in [49)enthalten. Die lineare Kalibrierfunktion stellt den Zusammenhang her zwischen den mit sehr geringem Fehler herstellbaren Konzentrationen und den mit einem Fehler behafteten MeBwerten. In der Chromatographie sind dies die gernessenen Fliichen oder Hohen. Es sollen deshalb die quadratischen Abweichungen der MelJpunkte von der Geraden nur in y-Richtung minimiert werden:

c (?.'her

-

ygC"~)'= Minimum

Unterscheiden sich nach dem F-Test die Varianzen der MeRwerte bei der hochsten und der niedrigsten Konzentration signifikant voneinander, konnen die Varianzen durch eine w= I / y oder \t.=1/y2 Gewichtung ausgeglichen werden [60]. Es wird dann:

2

-

ygOrl1)' \ta = Minimum

Die Geradengleichung (Kalibrierfunktion) lautet: Jher

= hx; + N

Einsetzen in die obige Gleichung ergibt:

3.7 Lineciritut

18 1

ausgeklammert ergibt sich: b2 Cx2w + 2 ba

Minimum

+ 2 ha c x w -

2 b c x y w + a2

cw

-

2 a c y w +cy2w=

Fur das Differenzieren nach a mussen nur der 2., 4. und 5 . Ausdruck beriicksichtigt werden:

S c l Sa = 0 = 2 b ~ x x c + r ~2 a

cw- 2cyw

Nach a aufgelost ergibt sich:

Fur das Differenzieren nach b ergeben nur die ersten drei Ausdriicke von Null verschiedene Werte:

SC I S b = 0 = 2 b C x 2 w + 2 a

c xw - 2

XYW

Der Faktor 2 wird herausgestrichen und fur a der vorherige Wert eingesetzt:

b=

2

Nach diesen Gleichungen ist es nur notwendig, die Summen derxw, yw, x w, xyw und w zu bilden, um b und LI auszurechnen. Fur die ungewichtete lineare Regression haben die Werte alle die gleiche Wichtung von 1 . Damit geht die Summe uber alle Gewichtsfaktoren w in die Anzahl der Werte II uber und es ergibt sich eine Gleichung, die u. a. in 1611 hergeleitet ist. Eine EXCEL-Maske, die die gewichtete (und ungewichtete) Regressionsberechnung einschlieOlich einer Graphik der Kalibriergeraden und der Abweichungen beinhaltet, kann von [email protected] angefordert werden. Darin ist ebenfalls die Berechnung der Verfahrensstandardabweichungenthalten, wie in [ 321 als KenngroOe vorgeschlagen.

Praxis Erfolgt eine Mehrfachbestimmung des grol3ten und des kleinsten Wertes im Arbeitsbereich, so durfen sich dievarianzen um den Faktor 5 unterscheiden, damit sich auf dem 5 %-

Niveau noch kein signifikanter Unterschied ergibt. Das heifit. daB sich die Standardabweichungen nur um etwas mehr als den Faktor 2 unterscheiden durfen. Hat man z. B. in der Gaschromatographie mit manueller lnjektion einen dominierenden InjektionsvolumenFehler. so zeigt der F-Test bereits einen signifikanten Unterschied, wenn der Arbeitsbereich deutlich mehr als den Faktor 2 umfaBt. Fur diesen Fall kann man eine gleiche prozentuale Abweichung im Arbeitsbereich annehmen und eine l/y 2 Gewichtung ist angemessen (vgl. Abb. 3-47). Damit wiirde der prozentual gleiche Fehler, der bei hohen Konzentrationen eine weit gr6Rere Absolutabweichung ergibt auf etwa gleiche Abweichungen und Varianzen gebracht. Eine noch starkere Heruntergewichtung der Varianzen fur die hohen Konzentrationen ist unsinnig. Haufig wird man einen geringeren EinfluB von Volumeneffekten (auch: Probenvorbereitung) haben und mit einer I /y Gewichtung eine genugende Varianzenhomogenitat herstellen konnen.

Vuriarz,quotientenwichtiin~ Da man nach DIN sowieso die Varianzen am oberen und unteren Punkt des Arbeitsbereichs bestimmen soll, kann dieser Wert auch zur exakten Gewichtung herangezogen werden. Durch eine I/cX Wichtung wird der gebrochene Exponent so gewahlt, da13 die Varianzen gleich sind, d. h. der F-Test immer 1 ergibt. Damit ist auch keine Willkur mehr gegeben, sich fur I/c oder l/c2 entscheiden zu mussen. Um den Exponenten zu finden, mu13 nur der Logarithmus des experimentellen F-Wertes durch den Logarithmus des Konzentrationsquotienten (obere durch untere Konzentration des Arbeitsbereichs) geteilt werden. Auf diese Art werden die Varianzen so gewichtet, daB sie am oberen und am unteren Punkt des Arbeitsbereichs gerade gleich sind. Mit den nach den D1N-Richtlinien ermittelten Werten ist damit die bestmogliche Schitzung der Verteilung der Abweichungen moglich. Aus dem Ergebnis fur den Achsenabschnitt (I l%Btsich der Effekt der Gewichtung aufdie berechnete Gerade ablesen. Durch die hoheren Varianzen bei der hoheren Konzentration wird ein hoher MeBpunkt zu sehr und ein MeRwert fur eine geringe Konzentration zu wenig berucksichtigt. Dies fuhrt im Allgemeinen zu einem gro13eren Wert fur a. Nun sollte der Achsenabschnitt a moglichst nahe am Nullpunkt liegen. Urn sich dessen Bedeutung zu veranschaulichen, kann man das u nach der Geradengleichung in eine Konzentration ruckrechnen. Eine negative Konzentration, d. h. eine Parallelverschiebung der Geraden nach unten gibt physikalisch nur in Ausnahmefallen einen Sinn. Eine positive Konzentration fur u wiirde einem uberlagerten Systempeak entsprechen. der physikalisch moglich ist, aber durch eine Leerprobe ausgeschlossen werden kann. Auf jeden Fall sollte die dem Achsenabschnitt entsprechende Menge moglichst nicht grofier sein, als der Fehler des MeRwerts bei der kleinsten Konzentration. Damit ware er nicht von Null zu unterscheiden und miiRte nicht beachtet werden. Da die Abweichungen bei den unteren Konzentrationen mit der gewichteten Regression mehr und damit realistischer berucksichtigt werden, wird sich im Regelfall eine bessere Annaherung der Geraden an den Nullpunkt ergeben. Vie1 wichtiger ist aber, daB die Schatzung der Genauigkeit der ermittelten Werte realistisch ist. Unter der ublichen Voraussetzung der Varianzenhomogenit~twerden die hohen Werte zu exakt und die unteren Werte zu unexakt angegeben Das entspricht im Regelfall nicht den tatslchlichen (mel3baren) Gegebenheiten. Erst die gewichtete Regression liefert hier ein realistisches Bild.

3.7 Linearitut

,

1

Abb. 3-46 Homogene Varianmxieilung mit F = 1.

I Abb. 3-47 Varianzverteilung, dic durch cine l/c2 Gewichtung auqgeglichcn wird

183

Die dargestellte Methode ist generell anwendbar. Der Gewichtungsexponent sollte aber nur zwischen 0 und 2 liegen, weil Werte aul3erhalb dieses Bereichs kaum physikalisch erkliirbar sind. A priori sind die hlufig vorkommenden Probleme wlhrend einer Validierung mit dem F-Test ausgeschlossen. Er ist immer ideal erfullt. Es ist auch keine Entscheidung fur oder gegen die Gewichtung notwendig. Im Fall experimentell ermittelter gleicher Varianzen am oberen und unteren Punkt des Arbeitsbereichs geht die gewichtete Regression in die ungewichtete Regression uber, weil sich eine Gewichtung aller Werte von 1 ergeben muR. I n Abb. 3-46. ist ein Beispiel einer homogenen Varianzverteilung mit F = 1, d. h. gleichen Absolutwerten der Varianz dargestellt. (Aus Grunden der Darstellung wurden die Abweichungen mit 50 c/o unten und 10 c/o oben unrealistisch grofi angesetzt). Abbildung 3-47 zeigt eine Varianzverteilung, die durch eine I /c2Gewichtung exakt ausgeglichen wird. Sowohl am oberen, als auch am unteren Punkt des Arbeitsbereichs betriigt die Standardabweichung SO 5% des MeRwertes. Durch die Quadrierung der Abweichungen ergibt sich fur den Varianzquotienten ein F von 25 in einem 5-fachen Konzentrationsbereich. Der Exponent errechnet sich aus dem Quotienten des Logarithmus beider Werte zu 2.

3.8

Wiederfindung oder Wiederfindungsrate

3.8.1 Definitionen und Erlauterungen Die Wiederfindung oder Wiederfindungsrate ist das Verhiiltnis des unter Wiederholbedingungen gemessenen Mittelwertes zum richtigen Wert des Analyten in der Probe.

mit:

W Wiederfindungsrate in o/o x gemessener Mittelwert xR richtiger Wert

Der Idealwert fur W ist 100 %. Mit Hilfe der Wiederfindungsrate kann die gesamte Methode bewertet werden! Denn wird der Wert .rRtatsiichlich gefunden ( W = 100 %), so ist die Selektivitiit, die Richtigkeit und die Robustheit bewiesen - natiirlich nur fur diesr Konzentration, rliesr Matrix und iiberhaupt diese experimentellen Bedingungen. Eine hohe Wiederfindungsrate bedeutet, daR wiihrend siimtlicher Schritte der Methode keine nennenswerten Substanzverluste zu verzeichnen sind, eine wichtige Voraussetzung fur Spurenmethoden. Wird eine Wiederfindungsrate von beispielsweise 80 5% gefunden, so muRte der gefundene Wert mit dem Faktor 1,2S multipliziert werden. Sei es, dab der Substanzverlust von externem oder internem Standard ebenfalls 20 % betriigt; in diesem Fall ist Vergleichbarkeit gegeben, eine rechnerische Korrektur entfdlt.

3.8 Wiederfindung oder Wiederfindungsrate

I 85

3.8.2 Ermittlung der Wiederfindungsrate Analyse von zertifizierten Referenzmaterialien Steht ein zertifiziertes Referenzmaterial zu Verfiigung, so wird der zertifizierte Wert als richtiger Wert in die oben angegebene Formel eingesetzt. Zudosierungs- oder Aufstockungsexperimente (,,spiken" einer Probe) Einer Leerprobe (analytfreie Probe mit Matrix) oder einer ublichen Probe wird eine bekannte Menge einer Kalibriersubstanz zugesetzt. Diese Kalibriersubstanz ist in der Regel der Analyt selbst; sollte dies nicht moglich sein, kann eine dem Analyten moglichst ahnliche Substanz verwendet werden. Isotopenmarkierte Analyten werden immer seltener benutzt. Die Moglichkeiten im Einzelnen: 1. Leerprobe

mit:

W Wiederfindungsrate CgemessenGemessene Konzentration des zudosierten Analyten (Kalibriersubstanz!) CzugesetLt Zugesetzte Konzentration

2. Probe mit Analyt a) Es wird Analyt zugesetzt. Insgesamt werden drei Losungen hergestellt, die samtliche Schritte der Methode durchlaufen. Losung 1 : zu V 1 ml Probelosung V2 ml Kalibrierlosung geben, man erhiilt Signal Sl Losung 2: zu V 1 ml Probelosung V2 ml Losungsmittel geben, man erhalt Signal s2 Losung 3: zu V I ml Losungsmittel V2 ml Kalibrierlosung geben, man erhalt Signal S3 Die Wiederfindungsrate W errechnet sich folgenderrnal3en:

w = (Sl-S2)/S3 x

100

Hinweis

Es kann vorkommen, dal3 ein geringer Teil des Analyten aus der Kalibrierlosung an der Matrix sorbiert wird (Losung I). In diesem Fall ist S1-S2 nicht gleich S3 sondern kleiner, es wird eine kleinere Wiederfindung vorgetauscht.

b) Es wird eine dem Analyt ahnliche Substanz zugesetzt. Sie ist praktisch der interne Standard.

Mit

W Wiederfindungsrate S , Signal des internen Standards in der Probelosung S, Signal des internen Standards in der Kalibrierlosung, normiert auf die Konzentration des internen Standards in der Probelosung

lndirekt uber die Richtigkeit Wird die Richtigkeit durch Soll-/Is(-Werte uberpruft, so ergibt sich die Wiederfindungsrate durch die Steigung der Regressionsgerade. Massenbilanzierung Die Moglichkeit der Massenbilanzierung (Tests zur Ermittlung der einzelnen Probenbestandteile und Normierung auf 100 %) ist aufwendig und wird selten benutzt (s. Abschnitt 3.4.2.5).

3.8.3 Praktische Hinweise und Bemerkungen Der Wert des Aufstockverfahrens ist insofern begrenzt, als man damit nur die Richtigkeit der Stufen der Methode bestimmt, die der Aufstockung folgen [29]. - Der zugesetzte Analyt mu6 in der gleichen Form zugesetzt werden wie er vermutlich in der Probe vorliegt. - Die Wiederfindungsrate kann von der Analytkonzentration abhangig sein. Deswegen ist es wichtig, daB bei Vergleichtests der bekannte Gehalt in etwa dem Gehalt in der Probe entspricht. Gegebenenfalls ist durch Messungen mit unterschiedlichen Gehalten eine Wiederfindungsfunktion zu erstellen. Sie gibt die Abhangigkeit der Wiederfindungsrate von der Konzentration exakt wieder. Bei Zudosierexperimenten sol1 darauf geachtet werden, dal3 der lineare Bereich nicht uberschritten wird. Weiterhin d a d durch Losungsmittel keine Veranderung der Matrix oder Verdunnungsfehler (Volumenkontraktion) auftreten. Diese Probleme werden minimiert, wenn die Kalibriersubstanz so konzentriert wie moglich zudosiert wird. Desweiteren muB die Probe homogen sein. Die akzeptierte Wiederfindungsrate hangt naturlich vom Gehalt des Analyten ab. Als Beispiel einer Empfehlung (EPA) sind in Tab. 3- 16 Richtwerte fur Wiederfindungsraten in Pflanzenschutzmittelformulierungen in Abhangigkeit von der Wirkstoffkonzentration angegeben. -

3.9 Nachweis-, Bestimmungs- und Erjussungsgrenze

187

Tab. 3-16 Richtwerte fur Wiederfindungsraten in Abhangigkeit vom Wirkstoffgehalt in der Probe.

Wirkstoffkonzentration in %

akzept. Wiederfindungsrate

> 10

98,O - 102,O

1-10

97,O - 103,O

<1

95.0 - 105.0

Die Wiederfindungsexperimente sollten in funf Niveaus, vornehmlich von 80 % bis 120 % der Zielkonzentration durchgefuhrt werden. - Es sollte auch die irreversible Adsorption des Analyten, z. B. an einer chromato-

-

graphischen Saule uberpriift werden: Vergleich von PeakflachePeakhohe mit und ohne Saule. Eine Differenz von ca. 2 % kann noch akzeptiert werden. Bei den Wiederfindungsexperimenten sol1 peinlichst auf konstante experimentelle Bedingungen geachtet werden. Die Adsorption an Oberflachen ist ein sehr empflindlicher Vorgang und minimale Anderungen der Bedingungen konnen die Kinetik stark beeinflussen. Das ist z. B. bei Streatests zu beachten.

Wenn eine Wiederfindungsrate kleiner 100 % gefunden wird, so kann die erhaltene Differenz wie folgt beurteilt werden: Liegt der berechnete Wert innerhalb des Vertrauensbereichs des gemessenen? Fur ein Zahlenbeispiel zur Berechnung des Vertrauensbereichs siehe Abschnitt 3.4.3. Ermittlung der zwei Vertrauensbereiche, vom berechneten und gemessenen Wert. Anschlieaend Vergleich beider Werte nach dem ?-Test bzw. Priifung, ob der Vertrauensbereich des gemessenen Wertes den Wert 100 % einschlieat. Ein Zahlenbeispiel fur den &Test findet sich in Abschnitt 3.2. Liegt der gemessene Wert um mehr als der vierfache Variationskoeffizient vom Wert 100 entfernt, so gilt die Wiederfindungsrate als ausreichend. Beispiel Der Variationskoeffizient einer Methode sei 1,5 %, die Wiederfindung 95,70 %. Folglich betragt die Differenz: 100 % - 95,70 % = 4.30 %. Der vierfache Variationskoefizient berechnet sich zu: 4 . V , = 4 . I ,5 = 6. Da 4,3 < 6 k kann die Wiederfindungsrate als ausreichend akzeptiert werden.

3.9

Nachweis-, Bestimmungs- und Erfassungsgrenze

Der Autor lebte noch bis vor kurzem in der Annahme, daR mit diesen drei Begriffen die Verhaltnisse im untersten MeBbereich eigentlich zu beschreiben sind. Er ist eines Besseren belehrt worden. Folgende Begriffe werden im besprochenen Zusammenhang verschiedentlich zitiert:

Nachweiskriterium Nachweisgrenze - Nachweisvermiigen - qualitative Nachweisgrenze Bestimmungsgrenze Erfassungsgrenze - Erfassungsvermogen Erkennungsgrenze - Entscheidungsgrenze Quantifizierungsgrenze Kritischer Wert der MeRgroRe -

3.9.1 Definitionen und Erlauterungen I n Klammer unter dem Begriff ist die Quelle aufgefuhrt, in der dieser Begriff definiert ist. Der Text auf der rechten Seite ist nicht unbedingt identisch mit dem Text aus dieser Quelle! Nachweisgrenze (DIN 32645)

Bestimmungsgrenze (DIN 32645)

Kritischer Wert der MeRgroRe (DIN 32645)

Erfassungsgrenze (DIN 32645)

Kleinste nachweisbare Menge. Das ist nichts Anderes als die Entscheidung fur die Frage: Analyt vorhanden jdnein? Irrtumswahrscheinlichkeit SO %: SO % Leerwert, 50 c/o MeBwert. Altere. selten benutde Bezeichnuns: Nachweisvermiigen. Kleinste quantifizierbare Menge. Das ist die Menge, die mit einer vorgegebenen Richtigkeit und Priizision quantitativ erfal3t werden kann. Oft: dreifdche Nachweisgrenze. Sie sollte hochstens 50 % der unteren Spezifikationsgrenze betrdgen. MeBwert, bei dessen Uberschreitung unter Zugrundelegung einer definierten Irrtumswahrscheinlichkeit erkannt wird, daB die Menge des Analyten in der Probe griil3er ist als diejenige in der Leerprobe. Vereinfacht ausgedruckt: Das Signal, das der Nachweisgrenze entspricht. Mindestmenge, die mit vorgegebener Wahrscheinlichkeit nachgewiesen werden kann. Oft: Zweifdche Nachweisgrenze; sie liegt also zwischen Nachweis- und Bestimmungsgrenze. Die Erfassungsgrenze mu8 kleiner sein als der erste Kalibrierpunkt. Der Begriff ,,Erfassungsgrenze" wurde bis vor kurzem nur in Deutschland verwendet und ist in der DIN 32645 zu finden. SinngemaR identisch ist die ,,Entscheidungsgrenze". Er taucht zum ersten Ma1 auf der internationalen ,,Buhne" in der neuen I S 0 11843-1 auf, siehe weiter unten, sowie bei der IUPAC.

3.9 Nuchweis-, Bestimrniingv und Erfii:fsungsgrenze

Entscheidungsgrenze (Amtsblatt der Europaischen Gemeinschaften Nr. L 223 vom 1 1.08.1987)

189

Die Entscheidungsgrenze ist der geringste Gehalt des Analyten, der bei tatsachlicher Anwesenheit mit angemessener statistischer Sicherheit nachgewiesen wird und entsprechend den Kriterien der Methode identifiziert werden kann.

In der neuen I S 0 11843-1, first edition 1997, fur die es noch keine offizielle deutsche Ubersetzung existiert, heiBt es zu Nachweis- und Erfassungsgrenze:

Nachweisgrenze

Kritischer Wert der Nettokonzentration oder des Gehalts.

Erfassungsgrenze

Minimale detektierbare Nettokonzentration oder Gehalt.

Erkennungsgrenze DIN 55350

Signalwert, dessen oberer Abstand vom geschatzten Blindwert so groB ist, daB seine rein zufallige Uberschreitung durch einen MeBwert der Blindprobe unwahrscheinlich ist.

Quantifizierungsgrenze (Amtsblatt der Europaischen Gemeinschaften Nr. L 223 Bestimmung des Analyten mit einem angegebenen vom 1 I .08.1987)

Die Quantifizierungsgrenze ist der kleinste gemessene Gehalt, oberhalb dessen eine Ma13 an Richtigkeit und Wiederholbarkeit innerhalb eines Labors moglich ist.

Unterschiede in der Normenklatur: Funk [32]

Nachweiskriterium bei Funk entspricht dem kritischen Wert der MeBgroBe in DIN 32645. Nachweisgrenze entspricht der Erfassungsgrenze in DIN 32645.

DIN 55350

Erfassungsgrenze entspricht der Nachweisgrenze in DIN 32645. Erfassungsvermogen entspricht der Erfassungsgrenze in DIN 32645. Erkennungsgrenze entspricht dem kritischen Wert der MeBgroOe in DIN 32645.

IUPAC

Als “detection limit” wird bei IUPAC die Erfassungsgrenze definiert.

3.9.2 Ermittlung der Nachweis-, Bestimmungs- und Erfassungsgrenze -

Abschiitzung aus der Signalhohe Ausgehend von einer Leerprobe wird die Konzentration des Analyten stetig erhoht bis ein Signal eindeutig erkennbar wird. Oder umgekehrt: es wird mit immer kleineren Analyt-Konzentrationen ,,gespickt“ bis kein Signal mehr erkennbar ist. Letztere Vorgehensweise konnte zu Problemen durch Verschleppung fiihren.

- Fur die Ermittlung der Nachweisgrenze wird ein Sigtial/Rau.schVerhiiltnis von 3: I und

fur die Bestimmungsgrenze von 9: I (in der Literatur manchmal 10:I ) ernpfohlen. Das ist ein beliebtes Verfahren in der Chromatographie (Peak/Rausch-Verhaltnis). -

Blindwert- oder Leerwertmethode bzw. Blindwert-/Leerwertverfahren (direkte Methode )

rnit:

NWG Nachweisgrenze BSG Bestimmungsgrenze .yBllnd Achsenabschnitt der Kalibrierfunktion .sBllnd Wiederholstandardabweichung von 6 Leerwertproben

Man findet allerdings in der Literatur auch fur die Wiederholstandardabweichung die Angabe: Standardabweichung einer Probe nahe der Nachweisgrenze/bzw. Reststandardabweichung (aus den Werten fur die Kalibriergerade). Dam werden standardisierte Referenzproben verwendet rnit einer Konzentration. die 10 % bis 50 % kleiner ist als die niedrigste Konzentration der Kalibrierlosung. Das Argument hierbei ist, daO man rnit ,,echten" Probelijsungen eher mit einer Normalverteilung der Werte rechnen kann als rnit Leerwertproben. Als letzter und denkbar schlechtester Ausweg gilt die Messung von Losungsmittelproben. -

Kali brierverfahren oder Kalibriergeradenverfahren oder Kalibrierkurven-/Kalibriergeradenmethode (indirekte Methode) NWG = 3,3 . SR,I,](J S

mit:

BSG

=

l o .s B I ~ ~ ~ d s

.sBllnd Standardabweichung von vornehrnlich sechs (Empfehlung nach DIN

32645: zehn) Leerwertproben oder aber auch Reststandardabweichung der Werte fur die Kalibriergerade in der NIhe der Nachweis- bzw. Bestimmungsgrenze -

Es gibt eine Reihe weiterer Moglichkeiten zur Ermittlung von Nachweis-, Bestirnmungsund Erfassungsgrenze. Sie werden nachfolgend zusammengefaRt. Es werden die Formeln fur NWG und BSG angegeben, im erstgenannten Fall auch fur die Erfassungsgrenze

Erfassungsgrenze = xsllnd+ 6 ,sBllnd oder

3.9 Nuchweis-, Bestirnnzungs- und Erfussungsgrenze

19 1 oder oder

NWG = 3 . Blindwert, mit:

BSG = 10. Blindwert

Mittelwert aus (sechs) Blindwertmessungen (blanks, Leerwerte) sBllnd Standardabweichung bei der - vornehmlich (Empfehlung aus dem ,,orange book" von IUPAC) - 6-fachen Messung des Blindwertes (blank, Leerwert) s~~~~~~~~ Standardabweichung bei der vornhemlich 6-fachen Messung des Signalrauschens

XBlind

Die NGG bzw. BSG ist die Menge an Analyt, die jeweils den so errechneten Signalwerten zuzuordnen ist. - Menge in einer Verdunnungslosung (aus der Verdunnungsreihe einer Kalibrierprobe),

deren sechsfache Bestimmung einer gerade noch akzeptierten Streuung (z. B. V , = 10 oder 20 %) aufweist. Diese Empfehlung, die ursprunglich aus Kanada stammt, und von EURACHEM ubernommen wurde, geniefit immer mehr Akzeptanz.

3.9.3 Kommentare und Hinweise Leerwert- und Kalibriermethode Eine Voraussetzung bei der Bestimmung der NWG und BSG ist, daR die MeBwerte der Kalibrierproben normal verteilt und voneinander unabhangig sind. Noch sicherer ist, wenn sie an unterschiedlichen Tagen hergestellt und analysiert werden. Eine zweite Voraussetzung ist, daB im Bereich zwischen Leerwert und hochstem Kalibrierwert Varianzenhomogenitat besteht. Es empfiehlt sich, als hochste Konzentration nicht mehr als das IOfache der erwarteten NWG zu nehmen, z. B. 0,l bis 10 ppm. Je mehr der Auswertebereich nach hoheren Konzentrationen verschoben wird, um so mehr verschiebt sich auch der resultierende Mittelwert (Schwerpunkt) nach oben. Die Gefahr dabei ist, dal3 die erhaltenen Werte fur NWG/BSG zu hoch sind und die Fahigkeit des Verfahrens fur diesen unteren Spurenbereich unterschatzt wird. In der Praxis werden oft zwei Kalibriergeraden aufgenommen oder zumindest zwei Konzentrationsbereiche fur sich getrennt betrachtet. Der Eine zur Ermittlung der Linearitat und der Andere zur Bestimmung von NWG und BSG. Als dritte Voraussetzung gilt, dal3 der Verlauf der Kalibrierfunktion linear sein muR, zu den Linearitatskriterien gerade im Spurenbereich siehe Abschnitt 3.7.2.7. Zur Priifung, ob die errechnete NWG plausibel ist, sollte diese Konzentration synthetisch hergestellt und mehrfach bestimmt werden. Der ,,validierte" Wert fur die NWG/BSG ist der tatsachlich gemessene Wert bei Anwesenheit der Matrix!

Die NWG(BSG) nach dem Blindwert- und Kalibrierkurvenverfahren sind recht iihnlich. wiihrend die Erkennungsgrenzen deutlich differieren. Dies ruhrt daher, daB Blindwerte bei zeitlichem Abstand weitaus schwerer zu reproduzieren sind als Standardabweichungen und Steigungen von Kalibriergeraden. Peak/Rausch-Verhiiltnis Bei der Bestimmung des Peak/Rausch-Verhaltnissesin der Chromatographie sollte zur Ermittlung des Rauschens etwa die zehnfache Peakbreite genommen werden. Das PeakRausch-Verhiiltnis hangt stark von dem aktuellen Zustand einer Anlage und den experimentellen Bedingungen ab, z. B. Detektor, Reinheit von Losungsmitteln, Temperatur usw.

3.9.4 AbschluBbemerkungen und Empfehlungen -

Wenn aus regulatorischer Sicht keine Notwendigkeit existiert, durfte in der Praxis fur quantitative Bestimmungen die Ermittlung der BSG, fur qualitative Aussagen die der NWG ausreichend sein. Dies kann durch die Definition der Nachweisgrenze begriindet werden. Nachweisgrenze ist als diejenige Analytkonzentration definiert, deren 9.5 c/c Prognosebereich sich nicht mit dem Blindwert (X = 0) uberschneidet. Da der Blindwert ebenfalls eine statistische Hiiufigkeitsverteilung aufweist, ergibt sich eine 500/ige Uberschneidung beider Verteilungskurven und damit ein Fehlerrisiko von 50 %. Somit ist nur eine qualitative Aussage moglich. Die Bestimmungsgrenze ist definiert als diejenige Analytkonzentration, deren 9.5 % Prognosebereich sich nicht mit dem 95 9% Prognosebereich des Blindwertes (X = 0) uberschneidet. Damit ergibt sich ein fur quantitative Aussagen hinreichendes Fehlerrisiko von 5 %. Interessanterweise ist in der neuen IS0 11843-1 nur von der Nachweis- und der Erfassungsgrenze die Rede, der Begriff ,,Bestimmungsgrenze" fehlt giinzlich. Genau s o verhiilt es sich bei der I S 0 Norm 17025 Abschnitt 1.2.1. Der Grundgedanke der Verfasser ist vereinfacht ausgedruckt der Folgende: Mit der Nachweisgrenze als erstem ,,Vet-dachtsmoment" fur das Vorhandensein des Analyten und der Erfassungsgrenze als ziemlich sichere Information (2fache Nachweisgrenze, lrrtumswahrscheinlichkeit nahezu Null) ist alles an primiiren Begriffen, die notwendig sind, gegeben. Bestimmungsgrenze ist letzten Endes nichts anderes als eine erweiterte MeRunsicherheit: Empfehlung der DIN 32645, 533 %, Empfehlung der IUPAC, k10 %. Das heiRt konkret, daB der Anwender den Vertrauensbereich fur die Nachweisgrenze bestimmen kann und ihn als prozentualen Wert fur die Bestimmungsgrenze angeben kann. Der Vorteil ist dabei, daO man tlexibel ist, der angegebene Wert kann der Situation angepaBt werden. I m Pharmabereich sind 10 % sicherlich akzeptierbar, im Umweltbereich sind eher die DIN-Empfehlungen von 33 % praxistauglicher. Folgende Mindestforderung gilt fur den ersten, niedrigsten Punkt der Kalibriergeraden [62]. .r

-

2 V,(X) > 0

3.9 Ntrchweis-, Bestimmungs- und Erfir.ssungsgrenze

mit:

193

kleinste Analytkonzentration V,(x) Vertrauensbereich von n

x

Diese Zusammenhange werden in Abb. 3-48 und 3-49 graphisch dargestellt [62]. Die Nachweisgrenze entspricht dem Punkt x in Abb. 3-48, die Erfassungsgrenze ist die zweifache Nachweisgrenze (gestrichelte Linie). Diese Konzentration ist nichts anderes als der zweifache Vertrauensbereich der Analytkonzentration x. Einfach ausgedruckt: Unterhalb dieser Konzentration und bis zur Nachweisgrenze ist man ,,ziemlich" sicher, daB der Analyt wirklich vorhanden ist, Punkt 1, Abb. 3-49. Erst oberhalb dieser Konzentration und zwar fur die Bedingung x - 2 . V e ( x ) > 0 sind quantitative Aussagen erlaubt. Wo Punkt 2 in Abb. 3-49 liegen soll, also was als Bestimmungsgrenze definiert wird, sollte der Analytiker nach der konkreten Fragestellung entscheiden.

I

2* v0

X

Konzentration

Abb. 3-48 Nachweis- und Erfassungsgrenze nach DIN 32645.

Konzentration Abb. 3-49 Erfassungs- und Bestirnrnungsgrenze.

-

Unabhangig vom ausgewahlten Verfahren gebuhrt dem EinfluB der Matrix hochste Aufmerksamkeit. Wenn dieser Konzentrationsbereich tatsachlich von Relevanz ist, sollten vor einer endgultigen Weitergabe der ermittelten NWGBSG ausreichende Robustheitsexperimente durchgefuhrt worden sein. Ohne auf weitere Details einzugehen seien hier einige Fragen aufgefuhrt, die ggf. zu klaren waren: Das Verhaltnis Peakhohe/Peakbreite ist in der HPLC konstant, bei kleiner werdenden Peaks jedoch nimmt es ab. Dieser Effekt ist stark matrix-abhangig. Wird nun die Peakhohe gemessen, gilt zu prufen, ob die BSG tatsachlich als die dreifache NWG angenommen werden darf. Vielleicht ist gerade in diesem Bereich die Krummung der Kalibriergerade starker, obwohl die Varianzenhornogenitat gegeben ist. Kann man damit rechnen, daB das Verhaltnis Matrix/Analyt konstant bleibt? Wenn nicht, sollten eventuell zwei getrennte Verdunnungen erfolgen. In der Chromatographie ist die Kinetik und damit die Peakhohe - durch irreversible Sorption auch die Peakflache - mengenabhangig. Das fuhrt zu einer starken Streuung der Werte in diesem Bereich. Der Vorschlag von Eurachem, die NWG/BSC uber die individuell akzeptierte Streuung der erhaltenen Werte zu ermitteln ist ein praxisnaher Ansatz.

Welches Verfahren ist vorzuziehen? Die Ermittlung uber das PeakRausch-VerhAtnis ist in der Chromatographie sehr verbreitet und es wird von Behorden (noch) akzeptiert. Dennoch sind Ergebnisse aus oben genannten Grunden nicht immer vergleichbar. - Die Blindwert- und Kalibrierwertverfahren werden von vielen Softwareprograrnrnen unterstutzt, sind leicht anwendbar und als ,,offizielle" Verfahren genieBen sie eine hohe Akzeptanz. Das Blindwertverfahren liefert etwas kleinere Werte als das Kalibrierwertverfahren. - Das Verfahren uber den noch akzeptierten V , ist ein gutes Verfahren, denn es werden quasi alle Faktoren, die die NWG/BSG beeinflussen, berucksichtigt. Es kann an die aktuelle Fragestellung angepaat werden. Der Nachteil dabei ist, daB es durch eine evtl. groBe Anzahl von Verdunnungsschritten recht aufwendig ist. Ein ebenso pragmatischer Ansatz ist die Angabe der Bestimmungsgrenze uber den individuell akzeptierten Vertrauensbereich. -

Mit dem Ziel, nicht mehr als notwendig zu tun, kann sich der Aufwand fur die Prufung der aktuellen Notwendigkeit anpassen. Man konnte sich folgende Vorgehensweise beispielhaft vorstellen: Befindet man sich in einem fruhen Stadium der Methode oder geht es um eine ,,quick and dirty" Fragestellung, reicht durchaus, die Nachweisgrenze uber das PeakRauschVerhaltnis oder uber den dreifachen Blindwert zu berechnen. Erst spater, wenn der Bedarf ansteht (der Kunde hat nach den ersten Vorversuchen den Auftrag tatsachlich erteilt und es mu13 ein Validierungsbericht abgegeben werden, die Methode sol1 nun eingereicht werden, der Termin fur die FDA-Inspektion steht fest usw.), sollten statistisch abgesicherte Werte ermittelt werden: Anwendung des Kalibrierwert- oder Leerwertverfahrens.

3.11 ProzeJ- und Merhodenfihigkeit

195

Tab. 3-17 Zielsetzung, Probe und empfohlener Arbeitsbereich fur die Pharmaindustrie (ICHEmpfehlung). Test

Arbeitsbereich

Gehalt (Wirkstoff und Arzneiform)

80- 120 % der Zielkonzentration

Gleichformigkeit des Gehaltes (content uniformity)

70-130 % der Zielkonzentration

Freisetzung

*20 % OSG/USG

Nebenprodukt

Spezifikation - 120 % der Spezifikation

Nebenprodukt, Arzneiform

ab 0,5 % bei Tagesdosis < 1mg ab 0,25 % bei Tagesdosis < 1-10 mg ab 0,l % bei Tagesdosis 10 mg - 1 g ab 0,05 % bei Tagesdosis > 1 g

Gehalt und Reinheit zusammen

Spezifikation Nebenprodukt - 120 % der Gehaltspezifikation

3.10 Arbeitsbereich Der Arbeitsbereich ist der Konzentrationsbereich des Analyten in der Probe (unterelobere Grenze) mit einem akzeptablen MaR an Prazision, Richtigkeit und Linearitat. Dieser kann aus der Linearitat abgeleitet werden. Der Arbeitsbereich hangt direkt von der Prazision der Methode ab: je praziser eine Methode ist, um so strengere Kriterien gelten fur die Linearitat und demnach desto geringer ist der Arbeitsbereich. Die Angabe des Arbeitsbereichs in einem Validierungsbericht ist insofern eminent, als Richtigkeit, Prazision, Selektivitat und Robustheit der Methode von der Konzentration abhangen. Richtigkeits-, Prazisions- und Robustheitsangaben ohne gleichzeitigen Bezug auf eine Konzentration sind nicht brauchbar. Laut ICH, fur den Pharmabereich maagebend, gelten folgende Arbeitsbereiche abhangig vom Testzweck [63], siehe Tab. 3- 17. Da der ,,Gehalt" nur in Bereichen wie Pharma, Pflanzenschutz, Kosmetik, Lebensmittel relevant ist, spielt der Arbeitsbereich nur dort eine Rolle. In anderen Bereichen reicht meist eine Grenzwertangabe aus: Nicht grofierkleiner als ,,x".

3.1 1 ProzeB- und Methodenfahigkeit 3.1 1.1 Definitionen und Erlauterungen ProzeBfahigkeit liegt vor, wenn die Streuung eines (Produktions)Prozesses im Vergleich zu den Spezifikationswerten gering ist. Als MaB werden Fahigkeitsindices verwendet, sie verknupfen die Streuung von Priifergebnissen mit den Forderungen.

Analog spricht man von der Methodenfiihigkeit. Die Methodenfiihigkeit gibt Aufschlufi, in wie weit die durch die Methode verursachte Streuung mit den gestellten Forderungen konform ist. Methodenflhigkeit ist somit das Verhiiltnis der vorgesehenen Spezifikationsgrenzen zu der tatsiichlichen Streuung der Methode. Allgemein gilt:

"p

mit:

~

Toleranzbreite Prozefibreite

-

OSG - USG 6s

ProzeRfahigkeitsindex OSG Obere Spezifikationsgrenze USG Untere Spezifikationsgrenze cp

Fur eine Methode gilt entsprechend cM.Der Fuhigkeifsindexc,,/cMsollte demnach mindestens 1 sein. weil in diesem Fall die Streuung der Produktion/Methode genau zwischen den Spezifikationsgrenzen liegt. Oft ist zwar die Rede von der Methodenfiihigkeit, als Symbol wird aber statt ,,cM",.,cp'' verwendet. Warum ist die Kenntnis von cMwichtig? Es ist von elementarer Bedeutung, die Qualitat von Produkten gem28 Spezifikationen zu beurteilen. Zur Ermittlung der Prozefifiihigkeit z. B. eines Herstellprozesses werden nun Merkmalswerte ermittelt und diese zu den Forderungen in Beziehung gesetzt. Merkmalswerte werden allerdings durch Prufmethoden ermittelt. Die Mefigenauigkeit der Prufmethode beeinflufit folglich die Aussage iiber die ProzelJfiihigkeit. Wenn die Prufmethode zu sehr streut, konnen falsche Ruckschlusse auf die ProzeBfiihigkeit gezogen werden. Auf diese Problematik werden wir weiter unten eingehen. Die ProzeBfahigkeit bezieht sich immer auf eine routinemiifiige Anwendung der Methode. Und sie kann nur ermittelt werden, wenn fur den betrachteten Zeitraum der analytische ProzeB in statistischer Kontrolle (ISK) ist. Die Methodenfiihigkeit (auch .,Methotlrripotential" und in der Fertigungsindustrie ,,Muschinrnfiihih.keit" genannt) wird in einer Kurzzeituntersuchung ermittelt. cMist n u n eine aussagefiihige GriiDe nur fur mittenzentrierte Prozesse. Der korrigierte Fiihigkeitsindes c~~ berucksichtigt dagegen eine Verschiebung des Mittelwertes und ist daher vorzuziehen.

cMK

mit:

=

OSG - X h 3s

oder

C,,

=

.Yh -

USG

3s

.q, Beiugwert, z. B. Mittelwert cMK

ist bei mittenzentrierten Prozessen gleich cM

3. I I Pmzejl- und Methodenfiihigkeit

197

Abbildung 3-50 gibt diese Zusammenhlnge graphisch wieder [64]. Es geht um Bogenschiel3en. In Abb. 3-50 sind Zielscheiben mit Punkten fur die Treffer von 4 Bogenschutzen skizziert. Daneben ist in Form einer Haufigkeitsverteilung dargestellt, wie die entsprechende Verteilung der Treffer, bezogen auf das Ziel, aussieht und welchen Wert die zugehorigen Flhigkeitsindices haben. ProzeRfahigkeit

-X

USG

Bogenschutze 1

OSG

ProzeR 1

USG ?

Bogenschutze2

ProzeR 2

-X

USG

Bogenschutze3

OSG

OSG

ProzeR 3

I

1

I/ Cpk = 0.4

~

USG

Bogenschutze4

USG = Untere Spezifikationsgrenze

ProzeR 4

OSG i

OSG = Obere Spezifikationsgrenze

Abb. 3-50 Zusamnienhang zwischen Streuung, Lage des Mittelwertes. Spezifikationsgrcnzc und Methodenfihigkeit [64], Erlautcrung siche Text.

3.1 1.2 Beispiele Zwei Beispiele sollen n u n der Erlauterung dienen. Zurn Einen geht es um den Zusarnmenhang Spezifikationsgrenze, Standardabweichung und Methodenfahigkeit. Das zweite Beispiel befaljt sich mit dem Unterschied zwischen Methodenfahigkeitsindex und korrigiertem Methodenfahigkeitsindex. Wie soeben dargestellt ist der Fahigkeitsindex cM ein Kriterium fur die Eignung (FBhigkeit) einer Methode. Verkniipft er doch die Streubreite von Ergebnissen mit Spezifikationsforderungen. Nehmen wir an, daR zwei Methoden beispielsweise den gleichen cM-Wert von cM= 1,3 haben. Sind beide Methoden automatisch gleich ,,gut"? Nicht unbedingt. Dazu folgendes Zahlenbeispiel:

a) Die Spezifikationsforderung fur eine Gehaltsbestimmung ist 98 o/o bis 102 %. Bei der ersten Methode betragt die Standardabweichung s = 0,5, dernnach ist CM =

OSG-USG 6s

-

102-98 4 - 1,3 6 . 0.5 3

Die zweite Methode weist die doppelte Standardabweichung auf, niimlich s = I , demnach ist

CM

=

OSG-USG 6s

-

102-98 6.1

-

4 6

-

0,67

Der Vergleich fuhrt zu der Aussage, daR die zweite Methode ungeeignet ist: Die Werte streuen stark, sie ist zu unpriizise. Wenn man die Spezifikationsgrenzen der zweiten Methode auf die Werte 96 o/o bis 104 o/o festlegt, ergibt sich fur die zweite Methode ebenfalls ein cM-Wertvon 1,3.

CM =

OSG-USG 6 .s

-

104-96 6.1

-

8 6

-

1.3

Durch eine harmlos anrnutende ,,Anpassung" oder ,,Optimierung" von Speziiikationsgrenzen kann eine Methode ..fahig"gernacht werden. ... Positiv ausgedriickt: Eine kleine Ausweitung von Spezifikationsgrenzen (durch die die Qualitat des Produktes nicht unbedingt leiden rnuR!) erlaubt, mit dieser Methode weiterhin zu arbeiten, die sonst f u r den vorliegenden Fall als unfiihig zu bezeichnen ware. b) Werden Fiihigkeitsindizes zur Beurteilung einer Methode herangezogen, so eignet sich dafur nur der korrigierte Fahigkeitsindex. Auch hier sol1 ein Zahlenbeispiel der Verdeutlichung dienen:

3. I I ProzeJ- und Methodenfihigkeit

199

Spezifikationsgrenze: 98 % bis 102 %, s = 0,5 Dazu betrachten wir die zwei Falle, daB der Mittelwert in der Mitte der Spezifikationsgrenze (100) liegt und daB er naher an der unteren Spezifikationsgrenze (99) liegt. Irn ersten Fall gilt: CM

=

OSG - USG 6s

CMK =

x,, - U S G

3s

-

102 - 98 - 1,3 und 3

2 - 100-98 - -

3 . 0,5

13

1,45

1

... und irn Zweiten: CM =

CMK

102 - 98 OSG - USG = 1,3 und 6s 3

=

x,, - U S G

3s

-

99-98 - 1 - 0,67 3 . 0,5 1,5

Wahrend der cM-wertin beiden Fallen 1,3 betragt, ist der CMK-Wert im ersten Fall 1,45, irn zweiten Fall nur 0,67; die zweite Methode ist nicht akzeptabel. Bei der zweiten Methode haben wir bei einer Streuung der Werte von k3 s um den Mittelwert folgendes Ergebnis: k3 . 0,5 = +1,5 urn den Wert 99, also von 97,5 bis 100,5.2,28 % der statistischen Werte befinden sich unterhalb der unteren Spezifikationsgrenze von 98 %, das ist irnmerhin ca. jeder 40. Wert. Sornit ist nur der cMK-Werteine aussagefahige KenngroBe, da er irn Gegensatz zum cMWert beriicksichtigt, wenn ein Mittelwert nicht in der Mitte der Spezifikationsgrenzen liegt. Das bedeutet, der CMK-Werterlaubt eine Aussage iiber Streubreite und Lage des Mittelwertes der betrachteten Methode relativ zu der am nachsten liegenden Spezifikationsgrenze. Zur Veranschaulichung siehe Abb. 3-50 und 3-51. Genaueres zur Problematik von Analysenergebnissen in der Nahe der Spezifikationsgrenze siehe [65].

1

OSG

99 98

USG

Abb. 3-51 h e r die VerlaRlichkeit von Daten innerhalb der Spezifikationsgrenze.

3. I 1.3 Akzeptanzkriterien, Bewertung von Prozessen und Methoden Es liegt aufder Hand, dalj Prozesse (oder auch Methoden) mit cp < 1 ungeeignet aind, denn dies bedeutet ja, daB die Streubreite des Prozesses griiljer ist als der Bereich zwischen unterer und oberer Spezifikationsgrenze. cp= 1 bedeutet, dalj der ProzeB zwar innerhalb der Spezifikationsgrenze streut, die ProzeljfBhigkeit ist allerdings eingeschrgnkt. es ist einfach kein ,,Puffer" da. Ein Prozelj wird ab einem c,-Wert von I ,33 als sicher angesehen. Wo kommt die ,,1,33" her? Ein ,,Puffer", eine ..Sicherheitszone" von 1 s zwischen der Streuung des Prozesses und der oberen bzw. unteren Spezitikationsgrenze wird allgemein als ausreichend angesehen. Bei einer konventionell akzeptierten Streuung von +3 s (die Wahrscheinlichkeit ist 99,73 ?h, dal3 der Wert in einem Bereich von 13 s anzutreffen ist) ,,darf' der ProzeR um k4 s streuen. bzw.

-[-)

f 4 . s 8 = 1,33 k3.s 6

Zusammengefaljt heil3t es wie folgt: cp> 1,33 Proze6 sicher (Abb. 3-S2a [65]) I < cp < 1,33 ProzeB ziemlich sicher (Abb. 3-S2b [6S]) CP < 1 Prozelj unsicher (Abb. 3-S2c [6S]) Das alles gilt, es sei erlaubt es noch einmal zu betonen, fur ISK-Prozesse. Wird der Mittelwert verschoben, so ist der ProzeBldie Methode trotz eines Fiihigkeitsindeces von > 1.33 nicht ,,fBhig". Das wird graphisch in Abb. 3-53 demonstriert [28]. Bei einem konstanten c,,Wert von 1,66 (10s : 6s) ergeben sich durch die Mittelwertverschiebung immer kleinere cp,-Werte. Eine stete, leichte Verschiebung des Mittelwertes ist trugerisch und stellt eine grolje Gefahr im Laboralltag dar: Die Standardabweichung bleibt konstant und der gefundene Mittelwert Bhnelt weiterhin dem Referenzwert. Kein Wunder, denn auch der Referenzwert verschiebt sich! Solche und weitere Bhnlich diffizile Situationen kann man mittels Regelkarten erkennen (s. Kapitel 8). Bei solchen ProzessenMethoden ist es eine Glucksache, ob der aktuell ermittelte Wert und der nkhste und der vom nlchsten Tag gerade unterhalb oder oberhalb der Spezifikationsgrenze sich befindet. Das Ergebnis sind unprazise Werte, die nicht nachvollziehbar sind. N u n zuruck zur Methodenfghigkeit. Diese Forderung ist fur die Produktanalytik, d. h. dort, wo Spezifikationsforderungen vorgegeben sind, eminent. Wenn ,,Methodenfiihigkeit" wiirtlich genommen wird, so sollte ein cMvon kleiner ca. 2 nicht akzeptiert werden, solche Werte bedeuten eine nicht akzeptable Streuung der Methode von ca. 50 c70 innerhalb der vorgegebenen Spezitlkationsgrenzen. Erliiuterung Eine analytische Methode in der Produktanalytik hat die Aufgabe, einen ProduktionsprozeR zu uberwachen. Das bedeutet, zu prufen, ob bei ungewollten (oder gewollten) etwaigen Anderungen der Herstellbedingungen - und damit niiiglicherweise verbunden eine Anderung von relevanten Produkteigenschaften - die Spezifikationsforderung immer noch ein-

3. I I ProzeJ- und Methodenfahigkeit

20 1

Stetiqe Qualitatsverbesserung Zuku nft

Stetiae Qualitatsverbesserung Zur Zeit

Spezifi kationen

Spezifikationen

Charakteristik

Charakteristik

Abb. 3-52a Der ProzelJ ist sicher; die schraffierte Flache gibt den ,,Puffer"zwischen Streuung des Prozesses und Spezifikationsgrenze wieder.

*

Abb. 3-52b Der ProzeB ist ziemlich sicher; trotz einer groaeren Streuung des Prozesses sind die Spezifikationsgrenzen ,,weit" genug entfernt.

Stetiae Qualitatsverbesserung Vergangenheit

I---

Spezifikationen +I- 3s

Charakteristik

Abb. 3-52c Der Prozel!, ist unsicher, denn die Streuung ist griiRer a k der Bereich, der der Spezifikationcforderung entspricht.

Prozesfa higkeit

Verteilungskurve

Cpk

cP

+a=

% aui3erh Spez.

< 1.0

Toleranzbreite

1121L

=

l,o

Toleranzbreite

> l,o

Toleranzbreite

USG I,66

0,003

1,33

--

~

USG 1.66

1,o

0,14

0,67

2,28

0.33

16,O

0.0

50,O

USG

1 USG

1.66

1

.~

USG

1

1,66

.-

~

USG

1,66

Abb. 3-53 ProA3fahigkeit und Mitrelwertvrrsc~hiebung.

-0,33

84,O

3. I I Prozej- und Methodenfahigkeit

203

gehalten wird. Um eben eine Streuung des Prozesses uberpriifen zu konnen, darfdie Streuung der Werte durch den MeRvorgang selbst nicht ,,zu" stark sein. 1st es dennoch der Fall, so wurde man streuende Werte einem streuenden ProzeR zuschreiben, die Streuung der Werte jedoch rtihren in Wirklichkeit von der unprazisen Methode her. Die Methodenstreuung sollte hochstens 25 bis 30 % der erwarteten Streuung des (Produktions)Prozesseseinnehmen. Das heiBt, die ProzeRtoleranz (Abstand zwischen USG und OSG des Produktes) sollte ungefahr das vierfache der durch die Methode bedingten Streuung sein: Eine Streuung von +3 s bedeutet eine Gesamtstreuung von 6 s. Wenn nun die Streuung der Methode in etwa 25 bis 30 % der ProzeRtoleranz ausmachen sollte, so miil3te die ProzeBtoleranz 24 s betragen:

Die Streuung eines Wertes um +3 s, also insgesamt 6 s, entspricht 25 % von 24 s.

Beispiel Bei einer Spezifikationsgrenze von 98 bis 102 % und einer Standardabweichung, s,von 0,2 hatten wir: CM =

CM

=

OSG - USG 6s

102-98 4 6 . 0,2 1,2

2

cp = 3,34

Die Streuung von 6 s, gleich 1,2, entspricht 30 % des Spezifikationsbereichs von 4 (98 bis 102). Bei einern s-Wert von 0,3 hatten wir: 102-98 6 . 0,3

CM==--

-

4 1,8

s

CM =

2,2

Die Streuung von 1,8 entspricht ca. 45 % der vorgegebenen Spezifikation von 4 (98 bis 102). Was zeigen diese Beispiele? Es sei noch einmal das anvisierte Ziel wiederholt: Die Streuung einer Methode sollte bis ca. 30 % der vorgegebenen Spezifikationsgrenzen einnehmen (s. auch Abschnitt 5.2). Nur in einem solchen Fall befindet sich der Gesamtpro-

zeR innerhalb der Spezifikationsgrenzen, wenn j a eine eventuelle Streuung der Produktion zu der Streuung der Methode hinzukiime. DaB die Streuung einer Methode im Vergleich zu den Spezifikationsforderungen des Produktes gering sein muB, leuchtet sicherlich ein. Es ist jedoch in der Praxis kaum realisierbar, Methoden mit einer Streuung von s-OJ zu finden, was bei einer Spezifikationsforderung 98 his 102 %, wie im obigen Beispiel dargestellt, notwendig wiire. Patentlasungen fur dieses Dilemma gibt es leider nicht. Man sollte Werte auBerhalb der Spezifikationsgrenze nicht all ,,zu Ernst" nehmen - wir erwarten ja solche bei einer unfiihigen Methode! Arbeitet man mit unprazisen = unfiihigen Methoden, so mu8 man leider hiiufige Wiederholungen und hin und wieder die Bearbeitung von Reklamationen hinnehmen. Nachfolgend werden einige Mafinahmen vorgeschlagen, die ersten zwei sind die Effektivsten, siehe auch Abschnitt 5.2.

3.1 1.4 Mafinahmen bei unzureichender Methodenfahigkeit zu kleine cMK's -

-

-

-

-

-

Wenn dem Labor die Miiglichkeit gegeben wird, sollte es zusammen mit der Produktion/Kontrollbehorde realistische Spezifikationsforderungen formulieren. 1st cMK< cM,handelt es sich um einen NISK (NISK: Nicht In Statistischer Kontro1le)Prozek Hier besteht unbedingt Handlungsbedarf. Ein hervorragendes Werkzeug zur Verfolgung und Optimierung von Prozessen ist die statistische ProzeRkontrolle, SPC. Es sollte noch einmal uberpriift werden, oh der Mittelwert richtig ermittelt wurde. Zufillige Fehler sollen durch Verbesserung der Priizision, beispielsweise durch robustere Methodenbedingungen, minimiert werden oder es ist auf eine andere, priizisere Methode zuruckzugreifen. Es sol1 ein interner Standard verwendet werden; das ist zwar keine ..Losung". erhoht aber die Sicherheit der Aussage bei unpriizisen Methoden. In einem Betriebslabor ist eine OOS-Situation alle 10-20 Chargen durchaus tolerierbar. Tritt bei einer priizisen Methode diese Situation hiiufiger ein, so sollte als erstes gepriift werden, oh die Geriite aus dem Betriebslabor die gleiche Priizision aufweisen wie die Geriite in der Entwicklungsanalytik.

Handbuch Validierung in der Analytik Stavros Kromidas Copvriaht 0 2000 WILEY-VCH Verlaa GmbH

4

Haufige Fragen zur Validierung

4.1

Ermittlung der interessantesten Fragen

Welche Fragen uber Validierung beschaftigen am starksten die Anwender? Diesem Thema ist der Autor nachgegangen: In Seminaren uber Validierung in der Analytik wurden die Teilnehmer nach den fur sie drei, vier wichtigsten Fragen bzw. Themenbereiche befragt, die im Seminar intensiver behandelt werden sollten. Es wurden die Antworten von ca. 340 Teilnehmer ii ca. 3 Fragen, das entspricht ca. 1000 Fragen, aus Veranstaltungen in den Jahren 19961999 ausgewertet. Es erfolgte zunachst eine Zuordnung der Fragen in Themenbereiche und anschlieBend eine Gewichtung nach der Haufigkeit der angegebenen Fragen, siehe Abb. 4- 1. Aus Abb. 4- 1 wird folgendes ersichtlich: Von den unten aufgefuhrten sieben Themenbereiche waren die ersten zwei fur die Befragten mit Abstand die wichtigsten gewesen. Die sieben ermittelten Themenbereiche sind folgende (die Nummerierung entspricht den Ziffern in Abb. 4- 1 ):

loo0 800

I

700

Anzahl der Fragen

600 500

(Mehrfachnennung moglich) 400

300 200 100

0 1

2

3

4

5

6

7

Abb. 4-1 Haufigkeit von Fragen zur Validicrung nach Themen sortiert, Erliuterung siehe Tcxt

1. ,,W-Fragen" aus dem Validierungs-Alltag: z. B. ,,Wer legt den Validierungsumfang fest?" ,,Was ist wirklich notwendig?" ,,Wie oft mu13 ich validieren?" ,,Wann brauche ich uberhaupt Validierung?" usw. 2. Es besteht ein starkes Bedurfnis fur eine genaue Erlauterung der einzelnen Validierungselemente und Tips fur deren Ermittlung z. B. ,,Was ist eigentlich Prazision, Nachweisgrenze, ... und wie bestimme ich sie?" 3 . Problem: Mangelnde Zeit fur Validierungsarbeiten; .,Wie kann ich Zeit sparen?" Geld spielt in diesem Zusammenhang offensichtlich eine untergeordnete Rolle. 4. Behordliche/rechtliche Anforderungen? 5. Gibt es Hilfen fur mich? 6. Zum Teil sehr detaillierte Fragen zum Validierungsumfang abhangig a) vom installierten oder beabsichtigten QM-System b) von der Methode c ) von der analytischen Fragestellung. 7. Sonstiges; hierunter fallen sehr unterschiedliche Fragen zur Dokumentation, MalJnahmen in ,,out of spec"-Fallen, Anzahl der Einwaagen, Grenzen der Validierung usw.

4.2

Antworten auf die sieben wichtigsten Fragenkomplexe

Nachfolgend wird versucht, sehr knapp auf typische, Fragen zu antworten, b7w. es wird auf die entsprechende Stelle im Buch verwiesen. Ein Teil der Antworten stammt von Wolfgang Gottwald, Provadis, und Dr. Joachim Ermer, Aventis. Bei den Fragen handelt es sich um Zitate. 1. a) ,,Was ist der Mindestumfang einer Validierung?"

,,Was ist notwendig festzulegen und was bleibt dem einzelnen Labor als Spielraum?" .,Was rnuP unbedingt gemacht und auf was kann verzichtet werden?" Zu diesen Fragen heiBt es in der I S 0 17025: ,,Die Validierung mu13 in dem Umfang durchgefuhrt werden, der zur Erfullung der Erfordernisse der beabsichtigten Anwendung oder des betreffenden Anwendungsgebiets notwendig ist". Das bedeutet nichts anderes als daB das Labor, ausgehend vom Validierungszweck, selbst Umfang und Vorgehensmodus bestimmen kann und sollte. Soweit zum analytischen Aspekt und zum Geist der IS0 17025. DaR Inspektoren, nationale Behorden und Verbiinde oft den Umfang direkt oder indirekt stark oder ausschliel3lich bestimmen, ist eine hautige Praxis. Auf diese Problematik wird in Kapitel 7 eingegangen. b) ,,Wofur benotige ich die Validierung?" ,,lst Validierung fur meine Arbeit wichtig?"

4.2 Antworten uuf die sieben wichrigsten Frugenkornplexe

207

,,Wie weit ist Validierung fur mich sinnvoll, wenn ich nicht an gesetzliche Vorgaben gebunden bin?" ,,Ich bin heute zwar hier im Seminar, aber wann mu13 ich uberhaupt validieren?' Diese Fragen entsprechen generell der Frage nach dem ,,Wann?' In folgenden Fallen ist Validierung notwendig: - Es wird demnachst rnit einer neuen Methode, z. B. Hausmethode oder Methode, mit der das Labor noch nie konfrontiert war, gearbeitet. Man sollte die Methode durch Ermittlung deren Merkmale naher kennenlernen, d. h. dann, wenn es um die Bewertung einer Methode auf ihre Qualitamignung geht. - Dem Labor steht eine Akkreditierung/Zulassung ins Haus. - Wichtige analytische Fragestellungen sind Grund fur eine Validierung, z. B. wenn ein vielversprechendes Produkt vor der Markteinfuhrung steht, oder ein Produkt rnit einem gesundheitlichem Risikopotential vorliegt usw. - Verkaufschancen sollen erhoht werden, Validierung ist ein wichtiges Argument fur das Labor bei Gesprachen rnit Kunden. - Zu der Frage welche Verfahren validiert werden sollten steht in der IS0 17025: ,,Das Laboratorium mu13 nicht genormte, selbst entwickelte Verfahren, genormte Verfahren, die aurjerhalb ihres vorgesehenen Anwendungsbereiches angewendet werden und Erweiterungen von genormten Verfahren validieren, um zu bestatigen, da13 die Verfahren fur den beabsichtigten Gebrauch geeignet sind." c) ,,Wie oft mu13 ich validieren?" Zu Beginn des Lebenszyklus der Methode; im Routinebetrieb empfiehlt sich das Fuhren von Regelkarten rnit Kontrollproben. d) ,,Wenn die HPLC-Saule verkurzt wurde - mu13 das ganze Verfahren revalidiert werden?" Nein; es sollten die Merkmale der Methode uberpriift werden, die durch die konkrete Anderung beeinfluat werden konnten. Im vorliegenden Fall: - Ja: Auflosung, Linearitat (Uberladung der Saule?), Lebensdauer der Saule (gleiche Packungsqualitat?) - Vielleicht: Nachweis-Bestimmungsgrenze. - Nein: Richtigkeit, Wiederfrndungsrate, Methodenprazision. Beim Wechsel jedoch zu einer vollig anderen Matrix, neue Formulierung, andere Konzentration sollten alle Merkmale noch einmal uberpriift werden - zunachst mit einer kleineren Anzahl an MeBpunkten. Dazu die IS0 17025: ,,Wenn einige Anderungen in den validierten nicht genormten Verfahren vorgenommen werden, sollte der Einflu13 solcher Anderungen dokumentiert werden, und sofern angemessen, sollte eine neue Validierung vorgenommen werden. ''

e ) ..Was inacht in1 Routinebetrieb Sinn?"

So wenig Messungen wie moglich ligente" Systemeignungstests.

-

verstiirkter Einsatz von Regelkarten und ,,intel-

f) .Jst ruckwirkende Validierung uberhaupt Lulassig?"

Teilweise ja. Zeigen die Daten der Vergangenheit durch Verwendung von Regelkarten, daR der ProzeU in statistischer Kontrolle ist, erfihrt man einiges uber Robustheit, Priizision und Methodenfahigkeit. Man erhalt natiirlich keine Information daruber, ob das Ergebnis richtig ist (methodenbedingter systematischer Fehler) und wie die Bestimmungsgrenze der Methode ist. Man unterscheidet wie folgt: Prospektii*e,vorausschauende Vtrlidienrng: AbschluB der Validierung vor Nutzung des Prozesses. Rrtrosprktive, ruckwirkende Vulidierung: Validierung bereits bestehender Prozesse.

g) .,Kann eine ordentliche Kalibrierung die Validierung ersetzen?" Ja, wenn im konkreten Fall - einfach ausgedruckt - der MeRvorgang und nicht die Probe selbst als kritisch anzusehen ist, oder bei ,,El-gebnisvalidierungen", wenn eine geeignete Kalibriersubstanz vorhanden ist. Merkr

Kalibriert werden Instrumente und MeRmittel. Validiert werden Verfahren, Methoden und Prozesse. Dnzu die IS0 17025: ,,Zur Bestinimung der Verfahrensmerkniale kann als Methode eine ,Kalibrierung mit Bezugsnormalen oder Referenzmaterialein ' verwendet werden." h ) ..Was passiert mit Ergebnissen, die auaerhalb der ,,limits" sind?"

Es gibt keine einheitlichen Regelungen: Fur manche Organisationen gibt es prinzipiell keine AusreiRer, es werden alle Werte berucksichtigt. In manchen SOP'S wird vorgeschrieben. daB der Wert wiederholt wird, bei manchen darf der Wert ersatzlos gestrichen werden, usw. Die Vor- und Nachteile der einzelnen Vorgehensweisen liegen auf der Hand: ,,Saubere" Mathematik (,,es gibt keine AusreiBer") auf der einen Seite, Realitiit des Analytikalltags auf der anderen Seite. Durch eine plotzlich auftretende Luftblase in einer HPLC-Pumpe iindert sich der Flu13 und damit die Peakfliiche. der resultierende Gehalt 1st nicht brauchbar. Drei Wiederholwerte erhiihen zwar die Sicherheit, doch ist der Aufwand fur diese Analyse gerechtfertigt? Pragmatisch gesehen ist es unerheblich, wie das Problem geregelt wird, es ist nur wichtig. daB alle Beteiligten mit den Daten nach festgelegten, objektiven Kriterien umgehen.

4.2 Aniwrtrten &'die sieben ivichtigsten Fragenkortipkxe

209

i) ,,Welche Konsequenzen sollen bei ,,out of spec"-Situationen folgen? Auch hier hangen die Konsequenzen von der Fragestellung ab. Folgende Aspekte bestimmen die erforderliche Reaktion: - Sicherheitsaspekte fur Mensch, Tier und Umwelt. - Relevanz der Spezifikationsgrenze (,,Was fordert der Kunde? Was kann wirklich passieren?') - Juristische Aspekte, sonstiger Konflikt denkbar? Empfehlung: Drei Doppelbestimmungen durchfuhren, jeder Mittelwert mu8 innerhalb der Spezifikation liegen. Merke: Generell gilt, daB der Mittelwert bei 00s entscheidend ist. nicht die einzelnen Werte! j) ,,Bestmogliche Methodenabsicherung nach heutigem Standard?" Diese Frage ist in dieser Form aus prinzipiellen Grunden nicht zu beantworten. ,,Bestmoglich" hangt von Geld, Zeit, Wichtigkeit etc. ab, s. auch Kapitel 7. 2. ,,Was ist eigentlich Prazision . . .?'Die Erlauterung der einzelnen Validierungsparameter und deren Ermittlung finden sich ausfuhrlich in Abschnitt 3.3 bis 3.11.

a) ,,Der Korrelationskoeffizient r bzw. das BestimmtheitsmaB r2 sagen nichts uber die mathematische Verteilung aus. Welche Bedeutung hat r2?"

. . . genauso wenig uber die Empfindlichkeit des Verfahrens. Die Bedeutung des ,,BestimmtheitsmaB" ist lediglich die vergroaerte ,,Scharfe" des Indexes ( r = 0,9 entspricht r 2 = 0,8 I ) . b) ,,Ein F-Test sol1 entscheiden helfen, ob unabhangig voneinander berechnete Standardabweichungen s, und s2 aus zwei unterschiedlichen Grundgesamtheiten stammen. Dieser Test stellt somit nur ein ,,Vortest" auf Zuverllssigkeit des t-Testes dar. Inwieweit ist es aus mathematisch/statistischer Sicht zulassig, den F-Test z. B. auch mit a = 0,Ol durchzufuhren, bzw. zu einem anderen Signifikanzniveau als den t-Test'?" Die Signifikanzniveaus 90, 95, 99 und 99,9 % sind stellvertretend fur ,,zufiillige Abweichung"; ,,wahrscheinliche Abweichung, aber nicht signifikant"; ,,signifikante Abweichung" und ,,hochsignifikante Abweichung". Es macht keinen Sinn, bei Fund ?-Test unterschiedliche Signifikanzniveaus anzulegen. c ) ,,Bitte erlautern Sie die Begriffe ,,Kalibrierfunktion des Grundverfahrens" und ,,Reststandardabweichung der Wiederfindungsfunktion". ,,Unter dem Grundverfahren wird in der ,,Wasseranalytik" das Kalibrierungsverfahren des reinen Standards, d. h. ohne Matrixeinflusse und ohne besondere Bearbeitungsschritte verstanden. Es wird die Kalibrierfunktion des Grundverfahrens erhalten.

AnschlieBend werden Standardlosungen der neuen Analysenprozedur mit Matrixeinflussen unterworfen und die Signalhohe rnit der Grundfunktion berechnet. Es ergibt sich der ,,reale" Wert, der gegen den ,,theoretischen" Wert aufgetragen wird. Die Steigung der Wiederfindungsfunktion ist im Idealfall 1,00, der Ordinatenabschnitt a = 0, die Reststandardabweichung der Wiederfindungsfunktion entspricht dann der des ,,Grundverfahrens". Mit Hilfe der Reststandardabweichung der Wiederfindungsfunktion (= Verfahrensstandardabweichung, da Steigung b = 1) und des Grundverfahrens sol1 uber die Varianzen eine Varianzenhomogenitlt nachgewiesen werden. Bei (wahrscheinlichen) Abweichungen wird der Vertrauensbereich VB ( P = 9.5 %) errechnet. Es liegt dann eine konstant systematische Abweichung vor, wenn der Vertrauensbereich des Ordinatenabschnitts b den Wert 0 nicht mit einschlieBt. Es liegt eine proportional-systematische Abweichung vor, wenn der Vertrauensbereich der Steigung den Wert mit 1,0 nicht mit einschlieflt. d) ,,Der Mittelwert-Test (Zwei-Stichproben-t-Test) darf nur dann durchgefuhrt werden, wenn die Nullhypothese CT, = 0,nicht verworfen wurde. Eine Aus